UNIVERZITET U BEOGRADU HEMIJSKI FAKULTET Nikola L. Lončar UKLANJANJE FENOLA I BOJA IZ OTPADNE VODE PRIRODNIM I REKOMBINANTNIM OKSIDATIVNIM ENZIMIMA doktorska disertacija Beograd, 2012 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF CHEMISTRY Nikola L. Lončar REMOVAL OF PHENOLS AND DYES FROM WASTEWATER USING NATIVE AND RECOMBINANT OXIDATIVE ENZYMES Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 KOMISIJA: ___________________________________ dr Zoran Vujĉić, vanredni profesor, mentor Hemijski fakultet Univerzitet u Beogradu ___________________________________ dr Miroslava Vujĉić, nauĉni saradnik, mentor IHTM ̶ Centar za hemiju Univerzitet u Beogradu ___________________________________ dr Marija Gavrović-Jankulović, vanredni profesor, ĉlan Hemijski fakultet Univerzitet u Beogradu ________________________________ Datum odbrane doktorske disertacije Ova doktorska disertacija je urađena na Katedri za Biohemiju Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, pod rukovodstvom vanrednog profesora dr Zorana Vujčića. Mentoru dr Zoranu Vujčiću zahvaljujem se prije svega na neprocjenjivoj pomoći i posvećenosti u svakom trenutku izrade ove disertacije, počevši od planiranja eksperimenata, realizacije istih, pa do tumačenja rezultata i uobličavanja finalne forme. Zahvalan sam na svemu što sam u prilici da naučim, a naročito na sticanju kritičkog pristupa eksperimentalnom radu, kreativnog razmišljanja i samostalnosti, kao i na podršci za svaki vid profesionalnog usavršavanja. Mentoru dr Miroslavi Vujčić naročito se zahvaljujem za dragocjene sugestije, diskusije, usmjeravanje i nesebičnu pomoć od prvih eksperimenata do pisanja ove disertacije. Zahvaljujem se dr Mariji Gavrović-Jankulović na korisnim sugestijama i pomoći tokom izrade disertacije. Zahvalnost dugujem i dr Aleksandri Trifunović sa Instituta za Genetiku u Kelnu na pruženoj prilici za usavršavanje u oblasti molekularne biologije, kao i dr Josep Lopez- Santinu i kolegama sa Katedre za Hemijsko inžinjerstvo Autonomnog Univerziteta u Barseloni na pomoći pri izradi disertacije. Dragim kolegama Biljani, Aleksandri, Marici, Marineli, Barbari, Anji, Ratku i Nikoli veliko hvala na nesebičnoj pomoći u radu, druženju i podršci u svakom trenutku. Zahvaljujem se i svim dragim kolegama sa Hemijskog fakulteta i Centra za hemiju- IHTM kao i prijateljima koji su svojom pomoći i druženjem olakšali rad na disertaciji. Posebno se zahvaljujem svojim roditeljima, bratu, sestri i Nataši za bezrezervnu i neprocjenjivu pomoć, podršku i razumjevanje. Doktorska disertacija Uklanjanje fenola i boja iz otpadne vode prirodnim i rekombinantnim oksidativnim enzimima IZVOD Boje i halogenovani fenoli koji imaju dezaktivirano aromatiĉno jezgro ĉine znaĉajnu kategoriju veoma toksiĉnih i teško razgradljivih zagaĊivaĉa u raznim industrijskim granama. Glavni cilj ove disertacije je bio dobivanje jeftinih rastvornih i imobilizovanih enzima za uklanjanje fenola i boja iz otpadnih voda. Korišćeno je ĉetiri prirodna (nativna) enzima (polifenoloksidaza iz krompira, tri lakaze na sporama izolovanih sojeva Bacillus amyloliquefaciens, lakaza iz gljive Trametes versicolor, kisele i bazne izoforme peroksidaze iz rena) i dva rekombinantna enzima (hloroperoksidaza iz Caldariomyces fumago proizvedena u Aspergillus niger i lakaza iz soja B. amyloliquefaciens 12B1 proizvedena u Escherichia coli). Djelimiĉno preĉišćena polifenoloksidaza (PPO) iz krompira je imobilizovana na razliĉitim nosaĉima. Od dobijenih biokatalizatora, tri sa najvećim aktivnostima PPO, Eupergit C250L-PPO, Celit-PPO i CelulozaM-PPO, su testirani u reaktoru za uklanjanje fenola, p-hlorfenola i p-bromfenola. U sluĉaju 2,5 mM supstrata sa Eupergit C250L- PPO, postignuto je oko 45% razgradnje p-bromfenola, dok su p-hlorfenol i fenol razgraĊeni 35% odnosno 20%. Testirana je i sposobnost višestruke upotrebe Eupergit C250L-PPO imobilizata za uklanjanje p-hlorfenola. Iz eksperimenata sinteze novog nosaĉa sa pipcima i njegove primjene za imobilizaciju PPO može se zakljuĉiti da je imobilizovana PPO bila znatno otpornija na denaturaciju u odnosu na solubilni enzim. Biokatalizator je testiran u šaržnom reaktoru za uklanjanje p-hlorfenola i p-bromfenola iz vodenih rastvora. Postignuto je uklanjanje pomenutih fenola preko 90% pri koncentraciji fenola 100 mg/L. Za oba halogenfenola TC-PPO je pokazao stepen uklanjanja od preko 90% u prva tri ciklusa, nakon ĉega efikasnost opada do 60% nakon šest ciklusa od po 8 ĉasova. Rastvornom PPO pod optimizovanim uslovima moguće je ukloniti 93-99.9% boje nakon tretmana u trajanju od 1 ĉas sa 424-1700 U/mL PPO, zavisno od boje. Pokazano je da je optimalno pH za proces obezbojavanja bilo 3,0. Obezbojavanje je postignuto uz formiranje nerastvornih polimera koji su uklonjeni filtrovanjem ili centrifugiranjem. Formiranje polimera potvrĊeno je infracrvenom spektroskopijom. Od testiranih oko 100 sojeva iz prirode izolovanih Bacillus sp., kod deset sojeva je detektovana aktivnost lakaze na površini spora. Tri soja sa najvećom specifiĉnom aktivnošću (BBS14, 12B1 i MB24a) su odabrana za dalji rad i identifikovani su metodom sekvenciranja 16S rDNA ĉime je potvrĊeno da se radi o sojevima vrste B. amyloliquefaciens. Lakaza iz soja 12B1 je pokazala izuzetno visoki temperaturni optimum (80 ̶ 85ºC), pa je odabrana za rekombinantnu heterologu produkciju ekspresijom u E. coli. Rekombinantna lakaza pokazula je znaĉajnu termostabilnost na 80ºC, što je zajedno sa pokazanim potencijalom za uklanjanje boja na pH 7,0 izuzetna prednost ovog enzima u odnosu na enzime porijeklom iz gljiva. Razvijena je procedura frakcionisanja kiselih i baznih izoformi HRP i ispitana efikasnost ovih izoformi za uklanjanje boja. Pokazano je da efikasnost uklanjanja boja kiselim peroksidazama u sluĉajevima nekih boja daje znatno bolje rezultate od baznih peroksidaza. Ovo je važno, jer iskljuĉiva upotreba baznih peroksidaza u komercijalnim preparatima i odbacivanje kiselih peroksidaza u procesu preĉišćavanja ĉini ovaj enzim praktiĉno besplatnim za upotrebu u tretmanu otpadnih voda. Pokazali smo da je hloroperoksidaza izrazito efikasnija kada umjesto vodonik-peroksida koristi t-butil peroksid. Ovaj rezultati zajedno sa pokazanim potencijalom za uklanjanje halogenfenola i boja otvara novi pravac za primjenu hloroperoksidaze. Rezultati ove disertacije ukazuju na to da bi koktel oksidativnih enzima (rastvornih i imobilizovanih) mogao da služi za uklanjanje širokog spektra ksenobiotika iz otpadnih voda. Kljuĉne rijeĉi: biohemijski procesi, prerada otpadne vode, oksidativni enzimi, rekombinantni enzimi, fenol, hlorfenol, bromfenol, boja. Naučna oblast: Hemija Uža naučna oblast: Biohemija UDK broj: 66.09 : 628.35 (043.3) Doctoral dissertation Removal of phenols and dyes from wastewater using native and recombinant oxidative enzymes SUMMARY Dyes and phenols containing halogens which tend to deactivate the aromatic nuclei constitute a significant category of highly toxic and difficult-to-degrade pollutants from a wide variety of industries. Main goal of this dissertation was the production of inexpensive soluble and immobilized enzymes for removal of phenols and dyes from wastewater. Four native enzymes (potato polyphenoloxidase, three laccases on spores of isolated strains of Bacillus amyloliquefaciens, laccase from Trametes versicolor, acidic and basic isoforms of horseradish peroxidase) and two recombinant enzymes (chloroperoxidase from Caldariomyces fumago produced in Aspergillus niger and laccase from B. amyloliquefaciens 12B1 strain produced in Escherichia coli). Partially purified potato polyphenol oxidase (PPO) was immobilized onto different commercial and laboratory produced carriers. The three of the obtained biocatalysts, with the highest PPO activities, namely Eupergit C250L-PPO, Celite-PPO and CelluloseM-PPO, were tested in the batch reactor for phenol, p-chlorophenol and p- bromophenol removal. In the case of 2.5 mM substrates with Eupergit C250L-PPO, around 45% removal of p-bromophenol was achieved, while p-chlorophenol and phenol were removed 35% and 20%, respectively. The reusability of Eupergit C250L-PPO for the removal of p-chlorophenol has been tested. From experiments of synthesis of new tentacle carrier and its application for PPO immobilization we can conclude that immobilized PPO was more resistant to denaturation when compared with its soluble counterpart. Biocatalyst was tested in the batch reactor for p-chlorophenol and p- bromophenol removal from aqueous solution. More than 90% removal was achieved for both halogenophenols at concentration of 100 mg/l from aqueous solution. For both halogenophenols TC-PPO works with over 90% removal during first three cycles which decrease to 60% removal efficiency after six cycles each of 8 hours duration. With soluble PPO, under optimized conditions 93-99.9% removal of dyes was achieved after 1h using 424 – 1700 U/mL of PPO, depending on dye. Optimum pH for decolorization process was found to be 3.0. Decolorization was accomplished via insoluble polymers formations that were separated by filtration or centrifugation. Polymer formation was confirmed with infrared spectroscopy. From approximately 100 wild type strains of Bacillus sp. tested for laccase activity, ten strains were positive for spore laccase activity. Three strains with highest specific activity (BBS14, 12B1 and MB24a) have been chosen for further work and were identified by 16S rRNA sequencing method by which it was confirmed that these strains belong to species of B. amyloliquefaciens. Laccase from strain 12B1 shown remarkably high temperature optimum (80 ̶ 85 ºC) so it was chosen for recombinant heterologous production by expressing it in E. coli. Recombinant laccase shown to be thermostable at 80ºC, which is together with demonstrated potential for dye removal at pH 7.0 major advantage when compared with fungal laccase. Purification of acidic and basic isoforms of HRP was developed and their efficacy for dye removal was tested. It was shown that acidic isoforms efficacy in dye removal is much higher than efficacy of basic isoforms in case of some dyes. This is important since basic isoforms are mainly used in commercial preparation of HRP and acidic HRP are being discarded, which makes them inexpensive for wastewater treatment. We have shown that chloroperoxidase was much more efficient when instead of hydrogen peroxide it used t-butyl peroxide. This result with demonstrated potential for halogenophenols and dyes removal opens up new area of application for chloroperoxidase. Results of this dissertation points to possible use of coktail of oxidative enzymes (soluble and immobilized) for removal of wide spectrum of xenobiotics from wastewater. Keywords: biochemical processes, wastewater treatment, oxidative enzymes, recombinant enzymes, phenol, chlorophenol, bromophenol, dye. Area of science: Chemistry Sub-area of science: Biochemistry UDC number: 66.09 : 628.35 (043.3) Skraćenice korišćene u tekstu: 4-AAP 4-amino-antipirin ABTS 2,2,-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) BPK Biohemijska potrošnja kiseonika CBB Coomassie brilliant blue CPO Hloroperoksidaza CR Congo red DMF Dimetilformamid DMSO Dimetilsulfoksid DNA Dezoksiribonukleinska kiselina DTT Ditiotreitol EDTA Etilendiamintetraacetat HPK Hemijska potrošnja kiseonika HRP Peroksidaza iz rena IC Indigo carmine IDA Imino-diacetat IPTG Izopropil-β-D-1-tiogalaktopiranozid kDa Kilodalton L-cys L-cistein p-BP p-bromfenol p-CP p-hlorfenol PCR Lanĉana reakcija polimerizacije PPO Polifenoloksidaza RB 5 Reactive black 5 SDS Natrijum-dodecil sulfat SGZ Siringaldazin TC Tentacle carrier x Sadržaj 1. Uvod ................................................................................................................................... 1 2. Opšti dio............................................................................................................................. 3 2.1 Fenolni zagaĊivaĉi ...................................................................................................... 3 2.1.1 Uticaj fenola na zdravlje ...................................................................................... 4 2.1.2 Pravna regulativa .................................................................................................. 5 2.2 Boje kao zagaĊivaĉi .................................................................................................... 6 2.2.1 Tekstilna industrija ............................................................................................... 6 2.2.2 Uticaj efluenata tekstilne industrije na okolinu .................................................. 7 2.2.3 Klasifikacija boja.................................................................................................. 8 2.3 Metode za uklanjanje ksenobiotika .......................................................................... 12 2.3.1 Fiziĉke metode uklanjanja ksenobiotika ........................................................... 12 2.3.2 Hemijske metode uklanjanja ksenobiotika ....................................................... 16 2.3.3 Biološke metode uklanjanja ksenobiotika ........................................................ 19 2.3.4 Tretman fenolne i obojene otpadne vode rastvornim i imobilizovanim enzimima ...................................................................................................................... 21 2.4 Polifenol oksidaze (fenoloksidaze) .......................................................................... 22 2.4.1 Lakaza ................................................................................................................. 22 2.4.2 Tirozinaza ........................................................................................................... 30 2.5 Peroksidaze ................................................................................................................ 32 2.5.1 Peroksidaza iz rena (HRP) ................................................................................. 34 2.5.2 Hloroperoksidaza (CPO).................................................................................... 38 2.6 Redoks potencijal oksidativnih enzima i upotreba medijatora............................... 39 2.7 Imobilizacija enzima ................................................................................................. 40 3. Naši radovi....................................................................................................................... 42 3.1. Uklanjanje fenola fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) ................ 42 3.1.1 Preĉišćavanje PPO ............................................................................................. 43 3.1.2 Imobilizacija PPO .............................................................................................. 45 3.1.3 Sinteza novog nosaĉa sa pipcima i njegova primjena za imobilizaciju PPO . 50 3.2 Uklanjanje boja fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) .................... 59 3.2.1 Uticaj pH na obezbojavanje tekstilnih boja ...................................................... 60 3.2.2 Uticaj koncentracije PPO i dužine inkubacije na obezbojavanje .................... 62 xi 3.2.3 Vis i FTIR spektrometrijska analiza tekstilnih efluenata tretiranih sa PPO ... 63 3.3 Uklanjanje ksenobiotika bakterijskom lakazom ..................................................... 65 3.3.1 Identifikacija izolovanih sojeva i dobijanje spora iz razliĉitih Bacillus sp. ... 66 3.3.2 Provjera prisustva lakazne aktivnosti u sporama Bacillus sp. ......................... 67 3.3.3 Identifikacija izolovanih sojeva Bacillus sp. .................................................... 68 3.3.4 Karakterizacija lakaza ........................................................................................ 70 3.3.5 Primjena lakaza u obezbojavanju ...................................................................... 76 3.3.6 Primjena lakaza za uklanjanje fenola ................................................................ 77 3.4 Uklanjanje ksenobiotika rekombinantno proizvedenom lakazom iz soja B.amyloliquefaciens 12B1 eksprimiranoj u E. coli BL21 ............................................ 78 3.4.1 Kloniranje Lacc gena u ekspresioni vektor pET21a ........................................ 79 3.4.2 Ispitivanje ekspresije rekombinantne lakaze .................................................... 85 3.4.3 Izolovanje i preĉišćavanje rLac iz E. coli BL21 pET21a-Lacc ....................... 86 3.4.4 OdreĊivanje biohemijskih parametara korišćenih lakaza ................................ 86 3.4.5 Primjena rekombinantno proizvedene lakaze u obezbojavanju ...................... 89 3.5 Uklanjanje ksenobiotika peroksidazom iz rena (Armoracia rusticana) ................ 91 3.5.1 Hromatografsko frakcionisanje izoformi peroksidaze ..................................... 91 3.5.2 PoreĊenje efikasnosti izoformi HRP za uklanjanje tekstilnih boja ................. 93 3.6 Primjena CPO u obezbojavanju reaktivnih boja i halogenfenola .......................... 99 3.7 Zakljuĉci .................................................................................................................. 102 4.Eksperimentalni dio ....................................................................................................... 104 Spisak glavne korišćene opreme: ................................................................................. 104 Spisak korišćenih kitova za molekularnu biologiju: ................................................... 104 4.1. Uklanjanje fenola fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) .............. 105 4.1.1 Preĉišćavanje PPO ........................................................................................... 105 4.1.2 Imobilizacija PPO na razliĉitim nosaĉima..................................................... 106 4.1.3 Sinteza novog nosaĉa sa pipcima i njegova primjena za imobilizaciju PPO 108 4.2 Uklanjanje boja fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) .................. 111 4.2.1 Uticaj pH na aktivnost PPO obezbojavanje tekstilnih boja ........................... 111 4.2.2 Uticaj koncentracije PPO i dužine inkubacije na obezbojavanje .................. 111 4.2.3 Vis i FTIR spektrometrijska analiza tekstilnih efluenata tretiranih sa PPO . 112 4.3 Uklanjanje ksenobiotika bakterijskom lakazom ................................................... 112 xii 4.3.1 Identifikacija izolovanih sojeva i dobijanje spora iz razliĉitih Bacillus sp. . 112 4.3.2 Provjera prisustva lakazne aktivnosti u sporama Bacillus ............................. 113 4.3.3 Identifikacija izolovanih sojeva Bacillus sp. .................................................. 116 4.3.4 Karakterizacija lakaza ...................................................................................... 120 4.3.5 Zamrzavanje najaktivnijih pojedinaĉnih kolonija .......................................... 124 4.4 Uklanjanje ksenobiotika rekombinantno proizvedenom lakazom iz soja B.amyloliquefaciens 12B1 eksprimiranoj u E. coli BL21 .......................................... 124 4.4.1 Kloniranje Lacc gena u ekspresioni vektor pET21a ...................................... 124 4.4.2 Ispitivanje ekspresije rekombinantne lakaze .................................................. 127 4.4.3 Izolovanje i preĉišćavanje rLac iz E. coli ....................................................... 128 4.4.4 OdreĊivanje biohemijskih parametara korišćenih lakaza .............................. 129 4.4.5 Primjena rekombinantno proizvedene lakaze u obezbojavanju reaktivnih boja .................................................................................................................................... 129 4.5 Uklanjanje ksenobiotika peroksidazom iz rena (Armoracia rusticana) .............. 129 4.5.1 Hromatografsko frakcionisanje izoformi peroksidaze ................................... 129 4.5.2 PoreĊenje efikasnosti izoformi HRP u uklanjanju tekstilnih boja ................ 132 4.6 Primjena CPO u obezbojavanju reaktivnih boja i halogenfenola ........................ 132 4.6.1 Produkcija CPO fermentacijom A.nigera ....................................................... 133 4.7 Eksperimenti sa lakazom iz Trametes versicolor ATCC 42530 .......................... 137 4.7.1 Održavanje soja i priprema inokuluma ........................................................... 137 4.7.2 Priprema peleta ................................................................................................. 137 5. Literatura ....................................................................................................................... 139 1 1. Uvod Tradicionalni hemijski i biološki tretmani industrijskih otpadnih voda ne daju uvijek zadovoljavajuće rezultate. Stoga, u fokusu istraživanja nalazi se primjena enzima (solubilnih i imobilizovanih) izolovanih iz biljaka, gljiva i bakterija, kao i rekombinantno proizvedeni enzimi. Enzimski tretmani se svrstavaju izmeĊu dvije tradicionalne kategorije: hemijskih i bioloških procesa, s obzirom na to da ukljuĉuju hemijske reakcije koje se odvijaju posredstvom biokatalizatora. Izolovani enzimi su poželjniji u odnosu na intaktni organizam jer se postiže veća specifiĉnost, moguće je odrediti aktivnost enzima, olakšano je rukovanje i skladištenje, a koncentracija enzima ne zavisi od brzine rasta mikroorganizma. Zbog njihove velike specifiĉnosti prema pojedinim vrstama ili klasama jedinjenja, enzimski procesi mogu biti razvijeni specifiĉno ciljajući odreĊena jedinjenja štetna po okolinu (zagaĊivaĉe). Jedinjenja koja su kandidati za ovu vrstu tretmana su ona koja obiĉno nije moguće tretirati efikasno ili pouzdano koristeći tradicionalne tehnike. Pored toga, enzimski tretman može biti korišćen i kao predtretman da bi se uklonilo jedno ili više jedinjenja koja ometaju korake koji slijede u daljoj obradi otpadne vode. Na primjer, ako možemo selektivno da uklonimo inhibitor ili toksiĉno jedinjenje, onda ostatak organskog materijala može efikasno da bude obraĊen biološkim tretmanom, tako maksimalno smanjujući cijenu ĉitavog postupka. Smatra se da u sledećim sluĉajevima enzimski tretman može biti od najveće koristi u tretmanu fenolima ili bojama zagaĊene vode:  Uklanjanje specifiĉnih, katkada veoma toksiĉnih, jedinjenja iz kompleksnih smješa industrijskog otpada prije biološkog tretmana.  Uklanjanje specifiĉnih jedinjenja iz razblaženih smješa, za koje konvencionalni biološki tretman (miješane kulture) nije isplativ.  Dodatno preĉišćavanje već tretirane otpadne vode, kako bi se ispunili kriterijumi za ograniĉenja za odreĊeni kontaminant.  Tretman otpada koji se generiše povremeno ili na izolovanim lokacijama, ukljuĉujući mjesta ispuštanja hemikalija ili napuštene deponije, gdje nema stalnih instalacija za preĉišćavanje. 2  Tretman visokokoncentrovane otpadne vode (male zapremine) na mjestu generisanja u fabriĉkim postrojenjima sa ciljem da se omogući ponovno korišćenje procesne vode, da bi se omogućila regeneracija rastvornih produkata ili da bi se uklonili zagaĊivaĉi za koje se zna da uzrokuju problem pri miješanju sa ostalim otpadom iz postrojenja. Trenutna istraživanja primjene enzima se fokusiraju na rešavanje ovih problema, posebno na razvoj tretmana enzimskim sistemima koji ciljano uklanjaju aromatiĉna jedinjenja iz vodenih rastvora. Halogenovana jedinjenja vjerovatno predstavljaju grupu najopasnijih zagaĊivaĉa po okolinu zbog njihove široke rasprostranjene upotrebe kao biocidnih, fungicidnih, dezinfikujućih reagenasa, rastvaraĉa i drugih industrijskih hemikalija. Halogenovani fenoli imaju dezaktivirano aromatiĉno jezgro i ĉine znaĉajnu kategoriju veoma toksiĉnih i teško razgradljivih zagaĊivaĉa u raznim industrijskim granama. Neke potencijalne primjene enzima identifikovane za poboljšanje kvaliteta otpadne vode ukljuĉuju transformaciju aromatiĉnih jedinjenja, cijanida, boja, pesticida, surfaktanata i drugih. Da bi bili u mogućnosti da iskoristimo pun potencijal primjene enzima, ostaju brojni problemi koje treba riješiti, stoga su postavljeni sledeći ciljevi ovog rada:  Nalaženje jeftinog izvora efikasnog enzima.  Nalaženje novih bakterijskih enzima, kako bi se prevazišla ograniĉenja koja imaju enzimi izolovani iz gljiva ili biljaka.  Imobilizacija oksidativnih enzima na razliĉitim nosaĉima.  Sinteza novog, jeftinog i biodegradabilnog nosaĉa za imobilizaciju enzima.  Optimizacija procesa uklanjanja fenola i boja dejstvom oksidativnih enzima.  Optimizacija procesa uklanjanja boja iz realne otpadne vode.  Karakterizacija proizvoda reakcije. 3 2. Opšti dio Povećana proizvodnja plastiĉnih masa, boja, pesticida i drugih hemikalija generiše velike koliĉine opasnog hemijskog otpada kojim se zagaĊuje okolina. Otporni zagaĊivaĉi, ukljuĉujući fenolna jedinjenja i boje, se prenose putem vode i vazduha i po nekoliko stotina kilometara ugrožavajući kako život u divljini, tako i opštu populaciju (Hakulinen et al., 1985). Ovi zagaĊivaĉi nisu biodegradabilni i poznate su njihove karcinogene i mutagene osobine, kao i izazivanje hroniĉnih toksiĉnih efekata (Nicell et al., 1993). Tretmani otpadne vode biološkim metodama se smatraju jeftinijim od fiziĉkih i hemijskih metoda za smanjenje koncentracija fenola (Goi et al., 2004). Mikroorganizmi koji se koriste su obiĉno aerobi, ukljuĉujući Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Azotobacter sp., Rhodococcus sp. i Cryptococcus sp. (Armenante et al., 1999; Valenzuela et al., 1997). Većina studija uraĊena je sa ĉistim kulturama. Toksiĉnost hlorfenola ili intermedijera koji nastaju u toku njihove razgradnje onemogućava sposobonost ĉistih kultura da kompletno mineralizuju hlorfenole prisutne u otpadnoj vodi. S toga, biološke metode, ukoliko se koriste samostalno imaju ozbiljan nedostatak prilikom tretiranja ne-biodegradabilnih i toksiĉnih jedinjenja. Alternativa bi mogla da bude upotreba enzima poput polifenoloksidaza, lakaza i peroksidaza. Brojni oksidativni enzimi porijeklom iz bakterija, gljiva i biljaka su pokazali potencijal za primjenu u tretmanu otpadne vode sa raznovrsnim sadržajem kontaminanata. 2.1 Fenolni zagađivači Fenol je jedan od najĉešćih zagaĊivaĉa vode, jer je toksiĉan i pri vrlo niskim koncentracijama, a njegovo prisustvo u otvorenim vodenim sistemima može da dovede do formiranja supstituisanih halogenovanih jedinjenja prilikom procesa dezinfekcije i oksidacije. Fenol je znaĉajan u istraživanjima koja se odnose na tretman industrijske otpadne vode, jer se ĉesto koristi kao model-zagaĊivaĉ. Trenutna proizvodnja fenola u svijetu iznosi 6 miliona tona godišnje, sa trendom povećanja (Jordan et al., 2002). Sa povećanjem proizvodnje raste i stepen zagaĊenja otpadnih voda. Fenol je prvi put izolovao iz katrana 1834. godine njemaĉki hemiĉar Runge. To je aromatiĉno jedinjenje. 4 Na sobnoj temperaturi i pritisku je ĉvrst, higroskopni kristal. Kada je u ĉistom stanju, nalazi se u formi bijelih kristala, ali je ĉesto roze do ljubiĉasto obojen zbog prisustva sopstvenih polimernih neĉistoća. Dobro je rastvoran u etanolu, etru i nekoliko drugih polarnih rastvaraĉa, kao i ugljovodonicima. Rastvorljivost fenola u vodi je ograniĉena, a ponaša se kao slaba kiselina. Teĉni fenol nagriza gumu i plastiku. Vreli teĉni fenol može da nagrize aluminijum, magnezijum, olovo i cink. Ima karakteristiĉan slatkast miris. Kao ĉista supstancija, fenol se koristi kao dezinfekciono sredstvo, za pripremu krema, pjena za brijanje (zbog svojih germicidnih osobina i kao lokalni anestetik), u veterini kao želudaĉni anestetik, kao ekstrakciono sredstvo u rafinerijama i proizvodnji lubrikanata, kao reagens u hemijskim analizama itd. Najviše se koristi (35%) za proizvodnju fenolnih smola poput fenol-formaldehidnih smola (bakelit) koje se koriste kao jeftini termoizolatori u graĊevini, automobilskoj i industriji kućnih aparata. Reakcijom sa acetonom može da se prevede u bisfenol A, koji je monomer za proizvodnju epoksi-materijala (28%). TakoĊe, selektivnom katalitiĉkom hidrogenizacijom se dobijaju cikloheksanon i cikloheksanon-cikloheksanol smješe. Cikloheksanon se kasnije prevodi u oksim i dalje u ɛ-kaprolaktam, monomer za dobijanje najlona 6 (16% od proizvodenog fenola). Smješa cikloheksanon- cikloheksanol se oksiduje azotnom kiselinom do adipinske kiseline, jednog od monomera za proizvodnju najlona 6,6. Fenol se takoĊe koristi za dobijanje polifenoksi i polisulfonskih polimera, poliestera otpornog na koroziju i poliester poliola. Može biti preveden u ksilenole, alkilfenole, hlorfenole, aniline i druge intermedijere u procesima proizvodnje surfaktanata, Ċubriva, eksploziva, boja, tekstila, gume, plastike i antioksidanasa, ljekova itd. 2.1.1 Uticaj fenola na zdravlje Sterilišuće dejstvo fenola je otkrio engleski hirurg Džozef Lister 1865. godine. Germicidna aktivnost fenola je posledica njegove sposobnosti da denaturiše proteine. Sa druge strane, ima zanĉajan uticaj na zdravlje ljudi. Proizvodnja i transport fenola, kao i njegova mnogostruka upotreba može da dovede do kontakta radnika sa ovim jedinjenjem putem udisanja, ingestije, kontakta sa kožom ili oĉima i apsorpcijom preko kože. Apsorpcija preko kože je brza i dovodi do ozbiljnih opekotina (sa oĉima takoĊe). 5 Koma, konvulzije, cijanoza i smrt su rezultati prekomjernog izlaganja fenolu. Od unutrašnjih organa, fenol pogaĊa jetru, bubrege, pluća i vaskularni sistem. Unošenje 1 g fenola je smrtonosno za ljude. Hlorovana organska jedinjenja su posebno poznata po rezistenciji na biohemijsku degradaciju. Monohlorfenoli, kao i druga fenolna jedinjenja, se javljaju kao meĊuproizvodi u produkciji pesticida (Sejáková et al., 2009). TakoĊe se koriste i kao antimikrobni reagensi u širokom spektru proizvoda poput lijepkova, ulja i u tekstilnoj industriji. Fenoli su prisutni u otpadnoj vodi razliĉitih industrija, poput rafinerija (6-500 mg/L), proizvodnji koksa (28-3900 mg/L), obradi uglja (9-6800 mg/L) i u petrohemijskoj industriji (2,8-1220 mg/L). Drugi izvori fenolnih zagaĊivaĉa su farmaceutska industrija, industrija plastike, drvnih proizvoda, boja i pulpe i papirna industrija (0,1-1600 mg/L) (Busca et al., 2008; Contrerasa et al., 2003). 2.1.2 Pravna regulativa Otpadne fenolne vode se ne smiju ispuštati u otvorene tokove prije predtretmana zbog toksiĉnosti fenola i njegovih derivata. Zbog toksiĉnih efekata ovih jedinjenja ameriĉka Agencija za zaštitu okoline (Environmental Protection Agency, EPA) je postavila standard za preĉišćavanje vode na 1 µg/L fenola u vodi za piće. Šta više, studija ove agencije je pokazala da korišćenje hlora za dezinfekciju fenolne vode može da dovede do stvaranja toksiĉnog 2-hlorfenola (EPA, 1980). Gornja granica odreĊena regulativama za ispuštanje fenolne otpadne vode u otvorene tokove se razlikuje od zemlje do zemlje, ali se uglavnom kreće oko 10 mg/L (Yamada et al., 2005). U Republici Srbiji ispuštanje otpadne vode je regulisano mnoštvom zakona i pravilnika koji se većim dijelom slažu sa meĊunarodnim zakonima, poput pravila EPA da se fenol u vodi za piće ne smije nalaziti u koncentraciji većoj od 1 µg/L. Uredbom o klasifikaciji voda (Službeni glasnik SRS, br. 5/68) vode su podijeljene u ĉetiri klase i to: 1. klasa I – vode koje se u prirodnom stanju ili posle dezinfekcije mogu upotrebljavati ili iskorišćavati za snadbevanje naselja vodom za piće, u prehrambenoj industriji i za gajenje plemenitih vrsta riba (salmonida). 6 2. klasa II – vode koje su podesne za kupanje, rekreaciju i sportove na vodi, za gajenje manje plemenitih vrsta riba (ciprinida), kao i vode koje se uz normalne metode obrade (kaogulacija, filtracija i dezinfekcija) mogu upotrebljavati za snadbevanje naselja vodom za piće i u prehrambenoj industriji. 3. klasa III – vode koje se mogu upotrebljavati i iskorišćavati za navodnjavanje i u industriji, osim prehrambene industrije. 4. klasa IV – vode koje se mogu upotrebljavati ili iskorišćavati samo posle posebne obrade. Po Pravilniku o opasnim materijama u vodama (Službeni glasnik SRS, br. 31/82) maksimalni sadržaj fenola u vodama kategorija I i II je 1 µg/L, dok je za vode kategorija III i IV ograniĉenje 300 µg/L. Prema Uredbi o graniĉnim vrednostima emisije zagaĊujućih materija u vode i rokovima za njihovo dostizanje (Službeni glasnik RS, br.67/2011 i 48/2012) graniĉna vrijednost emisije fenola za tehnološke otpadne vode, prije ispuštanja u javnu kanalizaciju je 50 mg/L. 2.2 Boje kao zagađivači Prva poznata organska boja, plavi indigo je korišćena prilikom umotavanja mumija u Egipatskim grobnicama prije otprilike 4000 godina (Gordon i Gregory 1983). Sve boje korišćene do 1856. godine su bile prirodnog porijekla i pripremane su na maloj skali, uglavnom ekstrahovane iz biljaka, insekata i školjki. Engleski hemiĉar Vilijam Perkin (William H. Perkin) je 1856. godine otkrio prvu sintetiĉku boju, mauvein i od tada poĉinje proizvodnja sintetiĉkih boja na velikoj skali (Hunger 2003, Venkataraman 1965). Automatizacija procesa je donijela revoluciju u tekstilnoj industriji tako omogućivši rast i industrije boja. 2.2.1 Tekstilna industrija Tekstilna industrija obuhvata komplikovani sektor industrijskog lanca i veliku raznovrsnost sirovih materijala, procesa, proizvoda i opreme. Negativan uticaj tekstilne industrije na okolinu je posledica ispuštanja zagaĊivaĉa i potrošnje velike koliĉine vode i energije (Lacasse i Baumann, 2006). Tekstilna industrija obuhvata ĉetiri glavne 7 aktivnosti: tretiranje sirovih materijala, proizvodnju tekstila, bojenje i finalne procese i proizvodnju odjeće. Glavni zagaĊivaĉi u tekstilnoj otpadnoj vodi dolaze iz procesa bojenja i finalne obrade koja obuhvata izbjeljivanje, bojenje i štampanje aplikacija. Svrha finalne obrade je adaptacija proizvoda kako bi se ispunili zahtjevi modne industrije i funkcija (Savin i Butnaru 2008). Da bi se postigli željeni efekti koristi se široki spektar boja i pomoćnih sredstava (Savin i Butnaru 2008). 2.2.2 Uticaj efluenata tekstilne industrije na okolinu Tekstilna industrija obuhvata oko dvije trećine ukupnog tržišta boja (Riu et al., 1998) i troši velike koliĉine vode i hemikalija za mokre procese. Ispuštanje otpadne vode je glavni uzrok negativnog uticaja na okolinu. Primarni udarac na okolinu se odnosi na potrošnju vode (80-100 m3/t obraĊenog tekstila) i ispuštanje otpadne vode (115-175 kg HPK/t obraĊenog tekstila, veliki opseg organskih molekula, slaba biodegradabilnost, obojenost i salinitet) (Savin i Butnaru, 2008). Stoga, višestruka upotreba efluenata predstavlja ekonomski i ekološki izazov za ĉitav sektor tekstilne industrije (Li Rosi et al., 2007). Hemijski reagensi koji se koriste u procesovanju tekstila su vrlo razliĉiti u pogledu sastava, od neorganskih jedinjenja pa sve do polimera i organskih molekula i zavise od prirode poĉetnih sirovina i tipa proizvoda (Mishra i Tripathy, 1993). Rezultujući efluenti iz ovih procesa se meĊusobno razlikuju obzirom na to da se u razliĉitim procesima koriste razliĉite boje, materijali koji se boje i razliĉite mašine (Bisschops i Spanjers, 2003). Od zagaĊivaĉa prisutnih u tekstilnim efluentima (suspendovane ĉestice, HPK, toplota, boja, kiseline), prisustvo boje se primjećuje pri koncentracijama od 1 mg/L ili manjim. Otprilike 800000 tona boje se proizvodi godišnje, od ĉega 40% u Evropi (Hessel et al., 2007). Tokom procesa bojenja, 2-60% od poĉetne boje ili njenih derivata se ne vezuje za tekstil i ispušta se kao efluent (Hessel et al., 2007). Prisustvo boja u vodenom ekosistemu smanjuje prodiranje sunĉevih zraka u dublje slojeve, ĉime se onemogućuje fotosintetska aktivnost, smanjuje kvalitet vode, smanjuje rastvorljivost gasova što sve uzrokuje akutno trovanje vodene flore i faune (Nilsson et al., 1993). Sem vizuelnih efekata, razliĉiti uticaji u vidu HPK i njihovih toksiĉnih, kancerogenih i genotoksiĉnih efekata uĉinili su tekstilnu industriju jednim od glavnih izvora ozbiljnih ekoloških problema širom svijeta (Vandevivere et al., 1998). U 8 zakonima Evropske unije koji se tiĉu industrijske otpadne vode, neprestano se donose nove uredbe koje obavezuju industriju na tretman otpadne vode (European Water Framework Directive 2000/60/EC). 2.2.3 Klasifikacija boja MeĊunarodni sistem klasifikacije je Indeks boja (eng. Colour index, CI); to je publikacija koju je objavilo Society of Dyers and Colourists 1924. godine (O´Neill et al., 1999). Boje su klasifikovane davanjem generiĉkog imena odreĊenog upotrebnom karakteristikom boje, što je praćeno CI brojem koje se daje na osnovu hemijske strukture boje. Dodatno, boje mogu biti klasifikovane po hemijskoj strukturi ili po metodi primjene. 2.2.3.1 Klasifikacija boja na osnovu hemijske strukture Boje se sastoje od funkcionalne grupe odgovorne za boju, tj. hromofore i elektron-privlaĉnih ili elektron-donorskih supstitutenata koji se nazivaju auksohromi (Christie 2001), koji pojaĉavaju boju i doprinose velikoj rastvorljivosti boja u vodi. Neki auksohromi takoĊe pojaĉavaju afinitet boje za vezivanje za tekstil (prirodni ili sintetiĉki). Najvažnije hromofore su azo (–N=N–), karbonil (–C=O), metin (–CH=), nitro (–NO2) i hinoidne grupe. Najvažnije auksohromne grupe su hidroksilna (–OH), sulfonatna (–SO3H), karboksilna (–COOH) i amino (–NH3). Najĉešće klase boja, podjeljene na osnovu prisutne hromofore su prikazane u tabeli 1. 2.2.3.2 Klasifikacija boja na osnovu metode primjene Kisele boje - koriste se za vlakna kao što su najlon, vuna, svila, modifikovana akrilna vlakna i donekle za bojenje papira, kože, ink-jet štampaĉe, hranu i kozmetiku, ali ne znaĉajno za bojenje celuloznih vlakana. Vezivanje za vlakno se dijelom ostvaruje putem elektrostatiĉkih interakcija izmeĊu anjonske grupe boje i katjonske grupe na vlaknu. Glavne klase ovih boja su azo (ukljuĉujući metalizovane), antrahinonske, trifenilmetanske, azinske, ksantenske, nitro i nitrozo boje. One su uglavnom rastvorne u vodi. Primjeri ovih boja su: CI Acid red 128, CI Acid blue 113, CI Acid blue 29, CI Acid yellow 7 itd. 9 Tabela 1. Klasifikacija boja na osnovu prisutne hromofore. 10 Bazne (katjonske) boje - koriste se za bojenje papira, poliakrilonitrila, modifikovanog najlona i modifikovanih polestara. MeĊutim, originalno su korišćene za bojenje vune, svile i taninom-fiksiranih/impregniranih pamuka. Obiĉno se dodaje sirćetna kiselina u rastvor boje da bi se favorizovalo vezivanje boje za vlakna. Glavne hemijske klase su diazahemicijaninska, triarilmetanska, cijaninska i hemicijaninska, tiazinska, oksazinska i akridinska. Primjeri ovih boja su: Red 2GL, Light Yellow 7GL, Brilliant Blue RL, Pink FG, Turquoise Blue GB, Black WHL itd. Direktne boje - koriste se za bojenje pamuka, rejona, papira, kože, vune, svile i donekle najlona. TakoĊe se koriste kao pH indikatori i za razna bojenja u biologiji. Direktno bojenje su uglavnom odvija na neutralnom ili blago baznom pH, blizu temperature kljuĉanja sa dodatkom natrijum-sulfata ili natrijum-hlorida. Obiĉno su to boje iz klasa poliazo jedinjenja, zajedno sa nekim stilbenima, ftalocijaninima i oksazinima. Primjeri ovih boja su: CI Direct Yellow 50, CI Direct Red 23, CI Direct Blue 98, CI Direct Brown 116, CI Direct Black 22 itd. Disperzne boje - originalno razvijene za bojenje celulozo-acetata, ali se uglavnom koriste za poliester i donekle za bojenje najlona, celuloze i akrilnih vlakana. U osnovi to su u vodi nerastvorne nejonske boje koje se koriste za bojenje hidrofobnih vlakana iz vodenih disperzija. Ove boje se fino melju u prisustvu disperzionog sredstva i prodaju se kao paste ili kao prašak (spray dried). Uglavnom sadrže azo, atrahinonske, stiril, nitro i benzodifuranonske grupe. Primjeri ovih boja su: CI Disperse Yellow 218, CI Disperse Violet 33, CI Disperse Navy 35, Disperse Black C-MDA itd. Mordant (fiksirajuće) boje - koriste se za bojenje vune (30% od ukupnih boja koje se koriste za vunu), kožu i prirodna vlakna nakon predtretmana sa metalima i anodizovanim aluminijumom. Vrlo su korisne za crne i teget nijanse. Većina prirodnih boja pripada ovoj grupi i može se naći mnoštvo literaturnih podataka o njihovoj primjeni. Mnoge od ovih boja, naroĉito one koje sadrže jone teških metala, mogu biti opasne po zdravlje ljudi. Neke od njih imaju azo i antrahinonske grupe. Primjeri ovih boja su: CI Mordant yellow 1, Mordant orange 6, Mordant red 15, Mordant green 17 itd. 11 Vat boje - uglavnom se koriste za bojenje pamuka. Nerastvorne su u vodi i nisu sposobne da oboje vlakna direktno. Ipak, leuko-forma boje, koja se dobija redukcijom u alkalnom rastvoru (bazne soli metala), je rastvorna u vodi i ima visok afinitet za tekstilna vlakna. Naknadna oksidacija vraća originalnu, nerastvornu, boju. Boje iz ove grupe sadrže antrahinonske (ukljuĉujući policikliĉne hinone) i indigoidne boje. Primjeri ovih boja su: Vat black 16, Vat black 25, Vat brown 57, Vat orange 7, Vat green 3, Indanthren Yellow G itd. Reaktivne boje - koriste se uglavnom za bojenje celuloznih materijala, ali takoĊe u manjoj mjeri za bojenje vune i najlona. Ove boje koriste hromoforu koja je vezana za grupu koja može direktno da reaguje sa vlaknom. Ove boje formiraju kovalentne veze sa prirodnim vlaknima, što ih ĉini trajnim bojama. Neke reaktivne boje poput boja Procion MX, Cibarcron F i Drimarene K mogu da se koriste na sobnoj temperaturi i nazivaju se “hladnim” reaktivnim bojama. Reaktivne boje sadrže grupe azo, antrahinonske, triarilmetanske, ftalocijaninske, formazanske, oksazinske itd. Njihove hemijske strukture su jednostavnije od struktura drugih boja. Njihovi apsorpcioni spektri pokazuju oštrije pikove i finalna boja je svjetlija u odnosu na bojenje direktnim bojama. One su najviše rasprostranjene i najĉešći su izbor za bojenje pamuka i drugih celuloznih vlakana u kućnoj radinosti ili umjetniĉkim radionicama. Sumporne boje - koriste se za bojenje pamuka i rejona i imaju ograniĉenu upotrebljivost sa poliamidnim vlaknima, svilom, kožom, papirom i drvetom. Mala cijena i velika brzina ispiranja su ih uĉinile važnom klasom boja sa ekonomske taĉke gledišta. Ove boje imaju dva koraka u bojenju. Prvo bojenje daje žutu ili žutozelenu boju, ali nakon sumpornog tretmana dobija se tamno crna boja, ĉesto korišćena za bojenje ĉarapa. Primjeri ovih boja su: Liquid sulphur red GGF, Liquid sulphur light green, Liquid sulphur sky blueCV, Liquid sulphur black BN,BRN itd. Boje za rastvaraĉe - uglavnom se koriste za bojenje plastiĉnih masa, benzina, lubrikanata, ulja i voskova. Nerastvorne su u vodi i uglavnom nepolarne do slabo polarne. Dominantne grupe su azo- i antrahinonske, ali koriste se i one sa ftalocijaninskim i triarilmetanskim grupama. Koriste se u tekstilnoj i kožnoj industriji, 12 proizvodnji papira, tehnologiji hrane, poljoprivredi, sistemima za korišćenje solarne energije, fotoelektriĉnim ćelijama, bojenju kose i kozmetici. Najvažnija industrijska upotreba je bojenje tekstila. MeĊu boje za rastvaraĉe spadaju: Solvent Yellow 2, Solvent Red 23, Solvent Orange 2, Solvent Blue 35, Solvent Black 5, Solvent Green 7 itd. 2.3 Metode za uklanjanje ksenobiotika Ksenobiotici su sve supstancije koje nisu prirodno prisutne u organizmu ili životnoj sredini. Naziv ksenobiotik vodi porijeklo od grĉkih rijeĉi xenos (stran) i bios (život). U ksenobiotike se ubrajaju: industrijske hemikalije, proizvodi za liĉnu higijenu i kozmetiĉki proizvodi, ljekovi koji se koriste u medicine i veterini, pesticidi, fenolna jedinjenja, boje itd. Tretman ksenobiotika u otpadnim vodama nije razmatran u većoj mjeri sve do 1980. godine. Za više od polovine boja koje su tada korišćene nije se znala struktura. Ipak, sa porastom brige o zdravstvenim problemima i mogućim uticajima na okolinu proizvoĊaĉi boja, korisnici i vlade mnogih zemalja su poĉeli da posvećuju pažnju ovom problemu (Gupta i Suhas, 2009). Od tada su predložene razliĉite metodologije za tretman efluenata, a koje su klasifikovane u tri kategorije: fiziĉke, hemijske i biološke. 2.3.1 Fizičke metode uklanjanja ksenobiotika 2.3.1.1 Odvajanje fenola ekstrakcijom Nekoliko organskih rastvaraĉa, poput ugljovodonika i jedinjenja sa kiseonikom mogu da se koriste za ekstrakciju fenola iz vodenih sistema (n-heksan, cikloheksan, benzen, toluen, etilbenzen, kumen, acetatni estri). Voda bogata fenolom koja nastaje u procesu proizvodnje kumena (prilikom baznog pranja i destilacije sirovog acetona koji nastaje u procesu baznog pranja kumena) i koja sadrži do 1-3% fenola (Jordan et al., 2002; Schmidt, 2005) se ekstrahuje nekim od pomenutih rastvaraĉa i tako se oslobaĊa većine fenola. Ovim tretmanom je moguće smanjiti koncentraciju fenola na 20-500 mg/L (Busca et al., 2008). Ostatak fenola se mora ukloniti nekim drugim tretmanom, biološkim npr. 13 2.3.1.2 Adsorpcija Adsorpcioni procesi se najviše koriste u preĉišćavanju otpadne vode. Konvencionalni napakovani reaktori ukljuĉuju faze zasićenja (adsorpcije, tj. nanošenja) nakon kojih slijedi desorpcija (eluiranje, tj. regeneracija). MeĊutim, regeneracija nije uvijek moguća ili pogodna. U tom sluĉaju adsorbens se uklanja i odlaže, a u sluĉaju fenolnih zagaĊivaĉa uništava se spaljivanjem u posebnim pećima. Pojam adsorpcija odnosi se na procese u kojima se supstancija koncentruje na ĉvrstoj površini iz teĉnog ili gasovitog okruženja. Postoje dva tipa adsorpcije po tipu privlaĉnih sila izmeĊu ĉvrste površine i adsorbovanog molekula. Ukoliko je privlaĉna sila fiziĉka po prirodi onda govorimo o fiziĉkoj adsorpciji (fiziosorpciji) i u tom sluĉaju van der Waalsove sile pokreću proces. Adsorpcija je slaba i reverzibilna. U drugom sluĉaju, ako je privlaĉna sila rezultat hemijskog vezivanja, govorimo o hemijskoj adsorpciji (hemisorpciji). Zbog jaĉih (hemijskih) veza, teško je ukloniti hemisorbovane molekule sa površine. Adsorpcione metode se koriste u velikoj mjeri zbog svoje efikasnosti u uklanjanju otpornih toksiĉnih jedinjenja koja je teško tretirati drugim metodama. Adsorpcija se ne koristi samo za uklanjanje boja i fenola, već ima široku primjenu u tretmanu otpadne vode generalno (Bansal i Goyal, 2005; Mantel 1951). 2.3.1.2.1 Aktivni ugalj Korišćenje uglja kao adsorbensa za preĉišćavanje vode datira iz antiĉkih vremena (Cheremisinoff, 2002). Adsorpcija na poroznom uglju opisana je u Egipatskom papirusu iz 1550. godine pne, a opisana je i od strane Hipokrata i Plinija Starijeg. 1785. godine Lovic (Lowitz) je ispitivao reverzibilnu adsorpciju boje i mirisa iz vode na uglju (Tien, 1994). Najĉešći adsorbens za fenolna jedinjenja je aktivni ugalj. U teĉnom sistemu adsorpcioni kapacitet aktivnog uglja zavisi od brojnih faktora kao što su fiziĉka priroda adsorbensa (struktura pora, sadržaj pepela, funkcionalne grupe, od kog je prekursornog materijala dobijen i na koji naĉin), priroda adsorbenta (rastvorljivost, pKa, prisutne funkcionalne grupe, polarnost, molekulska masa i veliĉina molekula) i uslovi sredine (pH, jonska sila i dostupnost kiseonika). Kao moguće interakcije izmeĊu površine 14 aktivnog uglja i fenolnih molekula su predložene (Laszlo et al., 2003): (a) elektron donor-akceptor interakcije izmeĊu aromatiĉnog prstena fenola i baznih kiseonikovih atoma na površini, kao što su karbonilne grupe, (b) disperzioni efekat izmeĊu aromatiĉnog prstena fenola i π-elektrona grafitne strukture, (c) elektrostatiĉka privlaĉenja i odbijanja u prisustvu jona. Zahvaljujući amfoternim osobinama površine aktivnog uglja njegove adsoprcione osobine zavise od pH vrijednosti rastvora. Ako se adsorpcija odigrava u nepuferisanom rastvoru, blizu neutralnom ili u slabo kiselom pH, sve tri vrste pomenutih interakcija mogu da se dešavaju istovremeno. U kiselim rastvorima (pH≤3) fenolna jedinjenja se nalaze u nejonizovanom obliku, a funkcionalne grupe na površini uglja su neutralne ili pozitivno naelektrisane. Pri ovakvim uslovima što je polarnija površina uglja, slabija je adsorptivnost fenola, jer su adsorpcija vode i fenola kompetitivne. Za pH>pKa (npr, na pH 11), fenoli disosuju formirajući fenolatne anjone, dok su površinske funkcionalne grupe neutralne ili negativno naelektrisane. Elektrostatiĉko odbijanje istoimenih naelektrisanja smanjuje adsorpcioni kapacitet. Sem toga, fenolatni anjoni su rastvorljiviji u vodi u odnosu na same fenole, pa je neophodno raskinuti jaĉe adsorbat-voda veze prije nego što doĊe do adsorpcije (Busca et al., 2008). Poznato je da se neki fenoli i njihovi derivati adsorbuju na aktivni ugalj ireverzibilno (nije moguća desorpcija ni grijanjem na 800ºC) (Busca et al., 2008). Adsorpcija fenola zavisi od prisustva kiseonika u rastvoru (Terzyk, 2007). Dva su važna efekta: hemisorpcija i oksidativno kuplovanje. Hemisorpcija vodi formiranju kovalentnih veza izmeĊu fenola i površine aktivnog uglja, dok oksidativno kuplovanje daje dimerne, trimerne i multimerne fenolne proizvode reakcije. Regeneracija aktivnog uglja, neophodna da bi adsorptivni tretman bio ekonomski isplativ, je znatno otežana ireverzibilnom adsorpcijom fenola (Busca et al., 2008). Aktivni ugalj je takoĊe najĉešće korišćeni materijal za adsorpciju boja, jer je vrlo efikasan u uklanjanju katjonskih, mordant i kiselih boja (Nasser i el Geundi 1991). Ipak, da bi se proces uklanjanja boja ubrzao moraju da se koriste ogromne koliĉine aktivnog uglja (Robinson et al., 2001), tako da je ova metoda izuzetno skupa; pored toga, regeneracija (gubitak 10-15% poĉetnog adsorpcionog kapaciteta) i odlaganje finalnog otpada moraju posebno da se rešavaju za svaki pojedinaĉni sluĉaj. 15 2.3.1.2.2 Silika-gel Silika-gel je porozan i amorfan, razliĉite granulacije; priprema se koagulacijom koloidne silikatne kiseline. U poreĊenju sa aluminijum-oksidom silika-gel ima znatno veću aktivnu površinu u opsegu od 250 do 900 m2/g (Do, 1998). Ovaj materijal je efikasan za uklanjanje baznih boja (Alexander i McKay, 1977); ipak, njegova visoka cijena i moguće sporedne reakcije su ga uĉinile nepogodnim za komercijalnu upotrebu (McKay et al., 1999). 2.3.1.2.3 Zeoliti Zeoliti su prirodni mikroporozni adsorbensi, ali mogu da budu i sintetiĉki. Smatraju se selektivnim adsorbentima i pokazuju molekulsku adsorpciju (Caputo i Pepe, 2007) i jonoizmjenjivaĉke osobine (Adebajo et al., 2003). Mnogi zeoliti su korišćeni za uklanjanje boja, meĊutim ne uvijek uspješno, jer je pokazano da adsorpcija zavisi od koncentracije boje, pH i temperature, pa je potrebna optimizacija procesa za svaku boju pojedinaĉno (Alpat et al., 2008). 2.3.1.2.4 Jeftini adsorbensi (Low-cost adsorbent, LCA) LCA su obiĉno prirodni materijali, otpad/nusproizvod industrije ili sintetiĉki materijali koji mogu da budu korišćeni kao adsorbensi i obiĉno imaju malu ili nultu cijenu u industrijskom lancu. Takvi materijali mogu da budu od velike koristi manje industrijalizovanim zemljama u razvoju koje se suoĉavaju sa velikim problemom otpadne vode. Skorije, Gupta i Suhas (2009) su dali predlog protokola baziranog na brojnim studijama za razvoj i primjenu LCA. Oni su dali pregled prednosti i mana adsorbenasa, povoljnih uslova i odreĊenih adsorbat-adsorbens sistema. 2.3.1.3 Membranska filtracija Filtraciona tehnologija se koristi za proizvodnju pijaće vode i tretman otpadne vode. Uopšteno, pojam filtracije obuhvata mikrofiltraciju, ultrafiltraciju, nanofiltraciju i 16 procese reverzne osmoze. Ovi procesi su ispitivani i za uklanjanje boja. Mikrofiltracija nije mnogo korisna zbog velikih pora (Cheremisinoff, 2002). Ultrafiltracija i nanofiltracija su efikasne za uklanjanje svih vrsta fenola i boja, ali boje ĉesto zapuše pore membrane, ograniĉavajući upotrebu ovih separacionih sistema za tretman tekstilnih efluenata (Cheremisinoff, 2002). Glavne mane filtracionih sistema su veliki radni pritisci i potrošnja energije, cijena membrane i njihov kratak upotrebni vijek. Sa druge strane, reverzna osmoza se pokazala kao efikasni sistem za obezbojavanje i desalinaciju, ali ograniĉavajući faktor je cijena procesa (Marcucci et al., 2001). 2.3.2 Hemijske metode uklanjanja ksenobiotika 2.3.2.1 Koagulacija/flokulacija sa dodatkom reagenasa Fino dispergovane ĉestice (koloidi) suspendovane u otpadnoj vodi su stabilizovane negativnim naelektrisanjem na površini ĉestica, što ih meĊusobno odbija i spreĉava spajanje i formiraje ĉestica veće mase (flokove), pa ne mogu da se uklone sedimentacijom. Da bi se ovakve ĉestice uklonile potrebne su hemijska kaogulacija i flokulacija. Ovi uzastopni procesi su kombinacija fiziĉkih i hemijskih metoda. Hemijska sredstva se dodaju otpadnoj vodi kako bi se favorizovala agregacija suspendovanih ĉestica u dovoljno velike ĉestice da mogu da se uklone sedimentacijom. Koagulacija je destabilizacija koloida neutralisanjem sila koje ih ĉine razdvojenim. Rezultat je nastajanje većih ĉestica (flokova), koje dalje aglomerišu dodatkom polimera za flokulaciju. Jedan od najrobustnijih naĉina za uklanjanje boje iz obojene otpadne vode je hemijski tretman sa koagulišućim/flokulirajućim reagensom (Zhou et al., 2008). Proces ukljuĉuje dodatak jona aluminijuma (Al3+), kalcijuma (Ca2+) ili govžĊa (Fe3+). Ovaj proces je ekonomski isplativ i daje zadovoljavajuće rezultate u uklanjanju disperznih, sumpornih i vat boja. MeĊutim, rezultati sa azo-reaktivnim, kiselim- i posebno baznim- bojama nisu dobri. Glavna mana ovog procesa je formiranje mulja u velikim koliĉinama, kao i to što je proces pH zavisan (Kace i Linford, 1975). Koagulacija u sinergizmu sa tretmanom enzimima je efikasna za tretman fenolne otpadne vode (Wada et al., 1993), jer koagulansi poput hitozana i polietilenimina uklanjaju reaktivne meĊuproizvode time spreĉavajući inaktivaciju enzima. 17 2.3.2.2 Napredni oksidacioni procesi (advanced oxidation processes, AOP) AOP se obiĉno koriste za uklanjanje boja djelimiĉno ili u potpunosti. Oni su meĊu najĉešće korišćenim metodama za obezbojavanje, jer zahtjevaju male koliĉine reagenasa i imaju kratka reakciona vremena. 2.3.2.2.1 Fenton-ov reagens Konvencionalna Fentonova reakcija (Neyens i Baeyens, 2003) koristi vodonik peroksid i soli gvožĊa (II) za dobijanje velike koliĉine hidroksil radikala koji mogu da oksiduju organska jedinjenja u rastvoru. Korišćenje Fentonovog reagensa je jedan od najefikasnijih naĉina generisanja •OH radikala. Zbog jednostavne opreme i blagih reakcionih uslova (atmosferski pritisak i sobna temperatura) smatra se jednom od ekonomski isplativih oksidacionih alternativa. Mehanizam generisanja • OH radikala je kompleksan. Ukratko, vodonik peroksid se katalitiĉki raspada dejstvom Fe2+ na kiselom pH (pH ≤ 3) dajući hidroksil radikale: Fe 2+ + H2O2→ Fe 3+ + − OH + • OH Fe 3+ može da reaguje, na kiselom pH, sa H2O2 u tako zvanoj Fentonu-sliĉnoj reakciji, regenerišući katalizator i dajući HO2 • radikal, tako održavajući proces. Ovaj reagens je atraktivan oksidacioni sistem za tretman otpadne vode, zbog ĉinjenice da je gvožĊe lako dostupno i netoksiĉno, a vodonik-peroksid je lak za rukovanje. Organski molekuli bi mogli da budu kompletno mineralizovani. Ipak, za efikasnu reakciju je potrebno kiselo pH i stehiometrijski višak vodonik-peroksida, a to obiĉno znaĉi da je potrebno odlaganje znaĉajne koliĉine feri soli nakon završene reakcije (Busca et al., 2008). Dodatno, tehniĉki zahtjevi za optimizaciju i praćenje efikasnosti Fentonove reakcije su kompleksni i skupi (Busca et al., 2008), što ograniĉava njenu široku upotrebu. Ĉak i sa optimizacijom efikasnosti reakcije ova tehnika zahtjeva velika ulaganja, što je veliko ograniĉenje. Zbog pobrojanih razloga, Fentonova reakcija bi mogla da bude jedan od predtretmana kako bi se poboljšali dalji koraci – mikrobiološka ili enzimska transformacija. Fentonov reagens je vrlo efikasan u uklanjanju rastvornih i nerastvornih boja (kiselih, direktnih, u kompleksu sa metalima) (Pak i Chang, 1999; Wang, 2008). Mana 18 ovog procesa je uski radni pH opseg (< 3.5) (Cheng et al., 2004), formiranje mulja i dugo reakciono vrijeme. 2.3.2.2.2 Hlor i hlorni derivati Hlor je jako oksidaciono sredstvo i može da se koristi kao kalcijum ili natrijum- hipohlorit. Mnogo se koristi u procesu uklanjanja boja, dok u tretmanu fenolne otpadne vode može da dovede do dobijanja toksiĉnijih hlorovanih fenola. Reaktivne, kisele, direktne i metalne boje se u znaĉajnoj mjeri uklanjaju hipohloritom. U vodi nerastvore disperzne i vat boje su otporne na ovaj tretman (Namboodri et al., 1994). Korišćenje hlora kao gasa je jeftin proces, ali generiše hlorovana organska jedinjenja, koja mogu da budu toksiĉnija od polaznih jedinjenja. 2.3.2.2.3 Ozonoizacija Ozonizacija je tehnologija koja je korišćena 70-ih godina prošlog vijeka i odvija se generisanjem ozona. Ova tehnologija je bila vrlo efikasna, ali je skupa za uklanjanje boja (Soares et al., 2006). Predloženo je da se ozonizacija koristi za potpuno uklanjanje boje i smanjivanje HPK donekle, što bi omogućilo vraćanje vode u proces. Mana ove tehnologije sem visoke cijene je potreba za in situ proizvodnjom ozona. Ozonizacija podrazumjeva molekulski ozon koji djeluje na nukleofilnim mjestima i nezasićenim vezama organskih molekula. Ozon predstavlja jedan od najsnažnijih oksidanasa koji se koristi (Chedeville et al., 2007), sudeći po njegovom visokom redoks potencijalu i na kiselom i na baznom pH (Eº=2,07V i Eº=1,24V, respektivno). 2.3.2.2.4 Elektrohemijska metoda Obezbojavanje se postiže elektrooksidacijom sa nerastvornom anodom ili elektrokoagulacijom korišćenjem potrošnog materijala. Postignuto je uspješno elektro- degradiranje boja korišćenjem razliĉitih anodnih materijala, kao što su provodni polimeri (Dogan i Turkdemir, 2005). Ova tehnologija nije efikasna samo u uklanjanju 19 rastvornih i nerastvornih boja, nego i u smanjenju HPK. Velika mana je cijena elektriĉne energije, proizvodnja mulja i zagaĊenje uzrokovano hlorovanim organskim jedinjenjima i teškim metalima zbog indirektne oksidacije. 2.3.2.3 Fotohemijska oksidacija 2.3.2.3.1 Fotohemijski tretman Degradacija molekula boje UV zracima u prisustvu oksidansa (H2O2 npr.) je posledica proizvodnje hidroksil radikala u velikoj koncentraciji. Brzina degradacije zavisi od intenziteta UV zraĉenja, pH, strukture boje i sastava otpadne vode (Slokar i Le Marechal, 1998). 2.3.2.3.2 Foto-Fenton Kombinacija Fentonove reakcije i UV zraka naziva se foto-Fentonovom reakcijom. Ova tehnika poboljšava efikasnost Fentonove reakcije i daje obećavajuće rezultate za tretman obojene otpadne vode (Bandala et al., 2008). 2.3.3 Biološke metode uklanjanja ksenobiotika Biološke metode mogu da budu aerobne ili anaerobne i smatraju se najefikasnijim metodama za uklanjanje većine zagaĊivaĉa iz otpadne vode. Razliĉite vrste mikroorganizama se koriste u zavisnosti o kom tipu otpadne vode se radi. Glavna prednost ove tehnike je niska operativna cijena procesa. Bakterije i gljive su dvije grupe mikroorganizma koje su mnogo prouĉavane za tretman obojene otpadne vode. Sekretovani bakterijski enzimi mogu da razgrade organska jedinjenja, pa se izolovanje aerobnih bakterijskih sojeva sposobnih za razgradnju razliĉitih boja odvija više od dvije decenije (Rai et al., 2005). TakoĊe, razni sojevi gljiva i njihovi enzimi su detaljno prouĉavani od mnogih autora za iste svrhe (Duran i Esposito, 2000). Gljive bijelog truljenja su takoĊe korišćene za uklanjanje boja. Ovaj proces uklanjanja boja može da se odvija adsorpcijom boje na micelijum gljive, pravom razgradnjom molekula boje ili 20 kombinovanim procesom. Ipak, postoje važna ograniĉenja upotrebe gljiva bijelog truljenja. Dodatak nutrijenata da bi se obezbijedio optimalan rast je neophodan, pošto je proces degradacije boja pripisan putevima sekundarnog metabolizma. Važno je naglasiti da razliĉiti faktori poput koncentracije zagaĊivaĉa, koncentracije boje, poĉetnog pH i temperature efluenta utiĉu na proces obezbojavanja (Duran i Esposito, 2000). TakoĊe, produkcija enzima ukljuĉenih u razgradnju boje nije konstantna sa vremenom i na nju utiĉe prisustvo inhibitora koji se mogu naći u efluentima. Da bi se prevazišli ovi problemi, upotreba enzima ukljuĉenih u razgradnju boje, umjesto ĉitavih mikrobnih kultura privlaĉi pažnju istraživaĉa. Prednost korišćenja enzima umjesto kultura se zasniva na kraćem tretmanu, radu sa visokim i niskim koncentracijama supstrata, odsustvu lag perioda neophodnog za formiranje biomase, smanjenju koliĉine formiranog mulja i lakoći kontrole procesa (Akhtar i Husain 2006; Lonĉar et al., 2011). Pored toga, eliminiše se potreba za in situ produkcijom ligninolitiĉkih enzima, koja zavisi od metaboliĉkog stanja kultura, koje sa druge strane zavisi od fizioloških uslova kao što su pH sredine i sastav efluenta. Samostalni tretman enzimima može da bude dovoljan posebno u sluĉajevima kada enzimi transformišu toksiĉna jedinjenja u manje toksiĉne proizvode. U takvim sluĉajevima, kompletna degradacija kontaminanta možda nije ni potrebna. Praktiĉna ograniĉenja upotrebe solubilnih enzima su visoka cijena proizvodnje, izolovanja i preĉišćavanja i kratak poluživot. Cijena proizvodnje može da bude snižena izolovanjem enzima iz agrootpada ili gajenje mikrobnih producenata oksidativnih enzima na takvim materijalima fermentacijom na ĉvrstoj fazi, nakon ĉega se enzim koristi ili u sirovoj ili djelimiĉno preĉišćenoj formi (Roriz et al., 2009; Sun et al., 2009). Ideja višestruke upotrebe enzima sugeriše da stabilnost enzima mora da bude dovoljna da omogući višestruku upotrebu, što znaĉi da imobilizovani enzim mora da bude veoma stabilan da bi se razvio odgovarajući proces. Dakle, iako postoje stotine protokola za imobilizaciju enzima, dizajn novih protokola koji poboljšavaju stabilnost enzima je i dalje izazov. 21 2.3.4 Tretman fenolne i obojene otpadne vode rastvornim i imobilizovanim enzimima Industrijsko bojenje tekstila konzumira velike koliĉine vode i energije, dok se istovremeno 5–40% korišćenih boja oslobaĊa u efluentima (Silva et al., 2010). OsloboĊene boje mogu ozbiljno da ugroze fotosintetiĉku aktivnost ekosistema u otvorenim površinskim vodama jer onemogućavaju apsorpciju sunĉevog zraĉenja i integritet ekosistema zbog svoje toksiĉnosti. Kako su neke od boja otporne na mikrobiološku degradaciju postoji potreba za poboljšanjem postojećih tehnologija i uvoĊenjem novih, ĉistih i efikasnijih tehnologija koje bi omogućile njihovu razgradnju (Verma et al., 2003). Alternativna tehnologija je, kao i u sluĉaju fenolne otpadne vode, upotreba oksidativnih enzima. U sluĉaju obojene vode javlja se novi problem, a to je pitanje isplativosti korišćenja imobilizovanih enzima, jer brzo dolazi do adsorpcije boje po biokatalizatoru, a samim tim se i vezani enzim inaktivira. Polifenoloksidaze i peroksidaze mogu da djeluju na specifiĉne otporne zagaĊivaĉe precipitiranjem ili transformacijom u neke manje toksiĉne ili manje otporne proizvode, omogućavajući finalnu obradu vode. Dodatne prednosti enzimskog tretmana u poreĊenju sa konvencionalnim tretmanom su: primjena na otporne ksenobiotike, upotreba prilikom malih i velikih koncentracija ksenobiotika u širokom opsegu pH, temperature i saliniteta, kao i olakšana kontrola procesa. Ipak, glavna prepreka u komercijalnoj primjeni rastvornih enzima za pomenute svrhe je njihova ograniĉena operaciona stabilnost, što znaĉi da je potrebno kontinualno snabdijevanje velikih koliĉina svježeg i djelimiĉno preĉišćenog enzima. Poboljšanje operacione stabilnosti enzima i poluživota, samim tim i smanjenje cijene procesa je postignuto imobilizacijom enzima (Duran i Esposito, 2000). Procedure za imobilizaciju enzima ĉesto zahtjevaju preĉišćene enzime i skupe nosaĉe ili reagense (Levy et al., 2003). Svrha ovih procedura je naravno višestruka upotreba enzima. MeĊutim, sve pomenuto ĉini dobijeni biokatalizator skupim, pa su potrebni novi protokoli za imobilizaciju kako bi se dostigla masivna implementacija/eksploatacija enzima kao katalizatora u kompleksnim hemijskim procesima pod blagim eksperimentalnim uslovima koji bi ujedno bili i bezbjedni po okolinu. S toga postoji stalna potreba za nalaženjem novih, jeftinih nosaĉa za imobilizaciju, kao i jeftinih izvora enzima koji bi se koristili za imobilizaciju sa ciljanom primjenom u tretmanu otpadne fenolne vode. 22 2.4 Polifenol oksidaze (fenoloksidaze) Fenoloksidaze su oksidoreduktaze koje katalizuju oksidaciju fenolnih jedinjenja. Podijeljene su u dvije subklase, tirozinaze i lakaze. Obje grupe koriste molekulski kiseonik i nije im potreban kofaktor. 2.4.1 Lakaza Lakaza je kuproprotein koji pripada maloj grupi enzima nazvanih plave oksidaze (Karam i Nicell, 1997). Lakaza (E.C. 1.10.3.2., p-benzendiol:kiseonik oksidoreduktaza) je oksidoreduktaza koja može da katalizuje oksidaciju razliĉitih aromatiĉnih jedinjenja (naroĉito fenola) uporedo sa redukcijom kiseonika do vode (Karam i Nicell, 1997; Thurston 1994). Uopšteno, lakaze sadrže ĉetiri bakarna jona koji imaju važnu ulogu u katalitiĉkom mehanizmu enzima. Bakarni joni su rasporeĊeni u razliĉitim vezivnim mjestima i klasifikovani su u tri tipa, zavisno od specifiĉnih spektroskopskih i funkcionalnih osobina. Osnovni aspekti fenoloksidaza su takoĊe opisani u preglednim radovima (Burton, 1994; Duran i Esposito, 2000; Duran et al., 2002; Gianfreda, 1999; Sanchez-Ferrer, 1995). U tipiĉnoj reakciji lakaze, fenolni susptrat podleže jedno- elektronskoj oksidaciji dajući ariloksiradikal. Aktivna vrsta može da bude prevedena u hinon u drugom koraku oksidacije. I hinon kao i slobodno radikalski proizvod podleže ne-enzimskom kuplovanju što vodi polimerizaciji. Za lakaze su karakteristiĉni slaba specifiĉnost ka supstratu i to što njihova katalitiĉka sposobnost znaĉajno varira zavisno od izvora enzima. Jednostavni difenoli kao što je hidrohinon i kateholi su dobri supstrati za većinu lakaza, ali gvajakol i 2,6-dimetoksifenol su generalno bolji supstrati (Yaropolov, 1994). Lakaze su takoĊe sposobne da katalizuju oksidaciju drugih supstituisanih polifenola, aromatiĉnih amina, benzentiola i ĉitave serije drugih jedinjenja, ali za razliku od tirozinaza, ne mogu da oksiduju tirozin (Majeau et al., 2010). N-hidroksibenzotriazol, 5-hidroksiiminobarbiturna kiselina (violurinska kiselina) i N-hidroksiacetanilin su tri N-hidroksi jedinjenja sposobna za medijaciju razliĉitih lakazom katalizovanih biotransformacija (Xu et al., 2000). Lakaze su široko rasprostranjene meĊu višim biljkama i gljivama, a u skorije vrijeme potvrĊeno je da su lakaze široko rasprostranjene i meĊu bakterijama (Alexandre i Zhulin, 2000). Kod gljiva 23 je uoĉena varijabilnost u mehanizmu indukcije ekspresije lakaza, stepenu polimorfizma i fiziĉko-hemijskim (molekulska masa, izoelektriĉna taĉka i sadržaj ugljenih hidrata) i kinetiĉkim osobinama (Bollag i Leonowicz, 1984). U nekim vrstama gljiva, dodatak inducera tokom gajenja rezultuje biosintezom novih ekstraćelijskih izoformi. 2.4.1.1 Aktivno mjesto lakaze Lakaza sadrži ĉetiri jona bakra koji su klasifikovani prema njihovim osobinama u elektron paramagnetnoj rezonantnoj spektroskopiji (EPR): Tip 1 ̶ plavi, Tip 2 ̶ normalni i Tip 3 ̶ kuplovani binuklearni bakarni centar u kom je bakar antiferomagnetno kuplovan preko premošćujućeg liganda (ne može se detektovati EPR spektroskopijom) (Sundaran et al., 1997). Spektroskopijom kombinovanom sa kristalografijom dobijen je detaljni opis aktivnog mjesta lakaze. Magnetni cirkularni dihroizam (MCD) i apsorpciona spektroskopija X-zraka lakaze su pokazale da se Tip 2 i 3 centri kombinuju da bi funkcionisali kao trinuklearni bakarni klaster koji interaguje sa egzogenim ligandom ukljuĉujući reakciju sa dikiseonikom1 (Cole et al., 1990). Tip 2 centar je 3- koordinovan sa dva histidinska liganda i vodom. Tip 3 bakar je 4 puta koordinovan i to sa tri histidina i premošćujućim hidoksidom (slika 1). Slika 1. Prikaz sadrži ĉetiri jona bakra koji su klasifikovani prema njihovim osobinama u elektron paramagnetnoj rezonantnoj spektroskopiji (EPR): Tip 1 - plavi, Tip 2 - normalni i Tip 3 - kuplovani binuklearni bakarni centar. 1 U nomenklaturi oksidativnih enzima, dikiseonikom se smatra molekulski kiseonik, kod koga su oba atoma kiseonika koordinativno povezana. 24 Analizom sekvencija lakaza porijeklom iz razlitĉitih vrsta uoĉena je oĉekivana visoka konzerviranost ostataka histidina (slika 2). Slika 2. PoreĊenje sekvencija lakaza porijeklom iz gljiva i bakterija. Uoĉavaju se visoko konzervirani ostaci histidina, triptofana i cisteina (oznaĉeni strelicama). PoreĊenje sekvencija uraĊeno je korišćenjem ClustalW2 algoritma dostupnom na URL: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/. Strukturni model premošćavanja izmeĊu Tipa 2 i 3 (slika 3A i 3B) (Cole et al., 1990; Palmer et al., 1999; Sundaran et al., 1997) je dao uvid u katalitiĉko redukovanje kiseonika do vode. Zakljuĉeno je da je bakar Tipa 2 neophodan za redukciju kiseonika, jer je premošćavanje do ovog centra ukljuĉeno u stabilizaciju peroksidnog intermedijera. Redukcija kiseonika lakazom se odigrava u dva dvoelektronska koraka. Prvi odreĊuje brzinu reakcije. U ovom Tip 2/3 modu nakon prve dvoelektronske redukcije peroksidni intermedijer omogućava drugu dvoelektronsku redukciju (od centara Tipa 2 i 1) tako što je peroksid direktno koordinovan za redukovani Tip 2 bakar, a redukovani Tip 1 bakar je kuplovan sa Tip 3 bakrom preko kovalentnih Cys-His veza (Clark i Solomon, 1992). U prethodnim studijama (Cole et al., 1990) pokazano je da 40% Tip 1 i Tip 3 centara koji reaguju sa dikiseonikom odgovara nativnoj lakazi (slika 3C). Oĉigledno je da je Tip 2 bakar neophodan za reaktivnost dikiseonika u lakazi i da se redukcija dikiseonika odigrava u odsustvu bakra Tipa 1. Ovo pokazuje da Tip 2/3 trinuklearni centar predstavlja aktivno mjesto za vezivanje i multielektronsku redukciju dikiseonika. Tip 1 Cu nije neophodan za reaktivnost sa kiseonikom, a u njegovom odsustvu formira se intermedijer koji dijeli neke osobine sa intermedijerom kiseonika prethodno opisanog kod nativne lakaze. 25 Slika 3. Dva moguća spektroskopska modela peroksidnog premošćavanja u trinuklearnom centru: A. premošćavanje izmeĊu Tip2 i jednog od Tip3 bakarnih jona. B. premošćavanje sva tri bakarna jona (modifikovano po Sunduran et al., 1997). C. Reaktivnost derivata lakaze sa kiseonikom (modifikovano po Cole et al., 1990). 2.4.1.2 Katalitički ciklus lakaze Katalitiĉki ciklus lakaze i predloženi mehanizam redukcije i reoksidacije bakarnih centara ilustrativno je prikazan na slici 4. Poĉevši od ,,nativnog intermedijera”, supstrat redukuje centar Tipa 1 (sredina na slici 4), koji za uzvrat prenosi elektron trinuklearnom jezgru. Moguća su dva mehanizma za redukciju trinuklearnog jezgra: (A) Tip 1 i Tip 2 centri zajedno redukuju par Tipa 3 ili (B) svaki bakarni jon u trinuklearnom jezgru je uzastopno redukovan prenosom elektrona iz centra Tipa 1. U tom sluĉaju Tip 3 centar više ne djeluje kao dvoelektronski akceptor. Spori raspad (lijevo na slici 4) “nativnog intermedijera” vodi do potpuno oksidovane forme. U ovom stanju, Tip 1 centar i dalje može da bude redukovan supstratom, ali elektronski transfer ka trinuklearnom centru je previše spor da bi bio katalitiĉki znaĉajan (McGuirl i Dooley, 1999). 2.4.1.3 Primjena lakaza u biotehnologiji Lakaze se smatraju industrijski znaĉajnim enzimima zbog njihovog širokog spektra supstrata i velikog opsega reakcija koje katalizuju, ukljuĉujući umrežavanje fenolnih jedinjenja, razgradnju polimera, otvaranje aromatiĉnih prstenova i oksi- funkcionalizovanje aromatiĉnih jedinjenja. Ovi enzimi su naroĉito interesantni kao biokatalizatori, jer ne zahtijevaju skupe kofaktore poput NADH ili NADPH kao što je sluĉaj sa nekim drugim oksidoreduktazama. 26 Slika 4. Katalitiĉki ciklus lakaze. Modifikovano iz Solomon i Sundaran (1996). Biotehnološka primjena lakaza ukljuĉuje tretman pulpe u proizvodnji papira, izbjeljivanje boja u tekstilnoj industriji, detoksifikaciju vode od ksenobiotika i organske sinteze (Mayer i Staples, 2002). Potencijalna polja primjene su sinteza prirodnih proizvoda kao što su pigmenti i antioksidansi preko dimerizacije fenolnih i nefenolnih kiselina (Mustafa et al., 2005). Trenutno su lakaze iz gljiva jedine koje se koriste u industrijskim procesima (Xu et al., 2007). Korišćenje bakterijskih lakaza bi otvorilo nove pravce biotehnološke primjene, jer je njihov nivo ekspresije, aktivnost i selektivnost mnogo lakše poboljšati dirigovanom evolucijom i racionalnim dizajnom, nego što je to sluĉaj sa lakazama iz gljiva. Samo je nekoliko bakterijskih lakaza do sad detaljno ispitano, iako brzi razvoj analize genoma sugeriše da su ovi enzimi široko rasprostranjeni meĊu bakterijama (Claus, 2003). 2.4.1.2 Lakaze iz Bacillus sp. Bakterije roda Bacillus su Gram pozitivne, sporogene, štapićaste, ĉije su ćelije veliĉine 0,5 ̶ 2,5 ∙ 1,2 ̶ 10 µm, ĉesto grupisane u parove ili lance, sa okruglim ili 27 ĉetvrtastim krajevima, pokretljive su zahvaljujući flagelama. Uz vegetativne oblike stvaraju i spore, ĉim se naĊu u nepovoljnim uslovima sredine. Endospore su ovalne, ponekad okrugle ili cilindriĉne i izuzetno su otporne na razliĉite negativne uticaje. Ovaj rod karakteriše bacilni tip sporulacije (ćelija zadržava prvobitni oblik). Predstavnici ovog roda podrazumijevaju aerobne i fakultativno anaerobne, većinom katalaza-pozitivne bakterije. Po tipu metabolizma su hemoorganotrofi. Bakterije roda Bacillus se mogu selektivno izolovati iz zemljišta, hrane ili vode zagrijavanjem uzorka na 80ºC, 10 min. Ovim postupkom se ubijaju vegetativne ćelije, dok spore preživljavaju. Zasijavanjem ovakvih uzoraka na odgovarajućoj podlozi i aerobnim inkubiranjem dobijaju se vrste roda Bacillus (Madigan i Martinko, 2006). Formiranje spora se pokreće nepovoljnim uslovima kao što su nedostatak hrane ili inhibitorna temperatura za rast. Ovi spoljašnji faktori se prate pomoću senzornih kinaza koje prilikom aktivacije fosforiluju sporulacione faktore. Bakterije roda Bacillus stvaraju endospore, odnosno spore koje nastaju u majĉinskoj ćeliji. Prije formiranja spora ćelija se dijeli asimetriĉno. Manja ćelija prerasta u endosporu i biva ubaĉena u majku ćeliju (veći dio). Nakon sazrijevanja endospore majka ćelija puca i oslobaĊa zrelu sporu. Spore roda Bacillus imaju tri strukturna dela koja se mogu uoĉiti elektronskom mikroskopijom. Prvi dio spore koji se naziva jezgro sadrži hromozomalnu DNA. Korteks je tanki peptidoglikanski sloj iznad jezgra koji sadrži neke proteine ukljuĉene u procesu germinacije. Treći sloj se naziva omotaĉ spore i sastoji se iz dva sloja, unutrašnjeg i spoljašnjeg. U sastav omotaĉa ulaze brojni proteini koji doprinose specifiĉnoj morfologiji ćelija i koji omogućavaju visoku rezistentnost spora. Mali broj njih je okarakterisan zbog teškoće izolovanja. Spore odgovaraju brzo na hranljive supstance i vraćaju se u fiziološki aktivno stanje procesom germinacije (Kuwana et al., 2002; Madigan i Martinko, 2006). Bakterije roda Bacillus sintetišu i deponuju proteinski omotaĉ oko endospore. Omotaĉ spore sadrži bar 25 razliĉitih polipeptida sa rasponom masa od 5-65 kDa, a neki od njih su jako umreženi (Hullo et al., 2001). Ovi proteini zajedno ĉine lamelarni sloj koji štiti sporu od razliĉitih stresora. U omotaĉu je identifikovano prisustvo lakaze, a prva i najbolje opisana bakterijska lakaza je CotA iz Bacillus subtilis, protein omotaĉa endospora koji pokazuje visoku termostabilnost (Hullo et al., 2001). Transkripcija od cotA promotora poĉinje kad i sinteza omotaĉa spore (4-5 ĉasova nakon poĉetka 28 sporulacije), što sugeriše da je transkripcija ovog gena ukljuĉena (direktno ili posredno) u razvoj morfoloških ili fizioloških osobina sporangije (Sandman et al., 1988). Gen cotA kodira protein ĉija je masa 65 kDa i koji je lociran u spoljašnjem omotaĉu spore i za koji je potvrĊeno da pripada grupi lakaza spektroskopskim i biohemijskim ispitivanjima. Druge bakterijske lakaze su izolovane iz Escherichia coli (Roberts et al., 2002), Bacillus halodurans (Ruijssenaars i Hartmans, 2004), Thermus thermophilus (TTC1370) (Miyazaki, 2005), kao i iz nekoliko streptomiceta (Endo et al., 2003; Suzuki et al., 2003). Analizom sekvencija gena koji kodiraju lakazu iz razliĉitih vrsti roda Bacillus zakljuĉujemo da se ovaj gen mijenja specijacijom, tj. da postoji zajedniĉki predak (slika 5). Slika 5. Filogenetsko stablo lakaze CotA iz Bacillus amyloliquefaciens (crveno) i veza sa lakazama iz srodnih vrsta. Stablo ukazuje na to da se cotA gen mijenjao procesom specijacije gena. Filogenetsko stablo je napravljeno korišćenjem algoritma Gene Tree dostupnog na URL: www.ensembl.org. Kristalne strukture dvije bakterijske lakaze, CotA i CueO su dobro opisane (Enguita et al., 2003; Roberts et al., 2002) i mjesto-dirigovana mutageneza je korišćena da se ispita efekat izmjene nekoliko konzerviranih aminokiselinskih ostataka na strukturu, redoks potencijal i aktivnost ovih enzima (Durao et al., 2006, 2008; Li et al., 2007). Dok nekoliko radova opisuje uspješnu primjenu metode dirigovane evolucije za lakaze iz gljiva (Festa et al., 2008; Zumarraga, 2008), nasumiĉna mutageneza do sada nije korišĉena za poboljšanje katalitiĉke efikasnosti bakterijske lakaze sem u sluĉaju Koschoreck et al., (2009). Autori su prethodno opisali kloniranje i ekspresiju cotA (GenBank broj: YP_077905) iz Bacillus lichenoformis u E. coli. Ovako dobijena rekombinantna lakaza katalizuje dimerizaciju mono i supstituisanih mono i dimetoksi 29 derivata 3-(4-hidroksifenil)-2-propenske kiseline kao što su ferulinska ili sinapinska kiselina, ĉime je pokazano da enzim predstavlja dobrog kandidata za sintezu prirodnih proizvoda. Kako je nivo ekspresije bio nizak, autori su ispitali i nasumiĉnu i mjesto- dirigovanu mutagenezu za poboljšanje ekspresije u E. coli, prilikom ĉega su dobili tri mutanta sa većim stepenom ekspresije u odnosu na enzim dobiven iz sojeva izolovanih iz prirode (eng. wild type, wt). Kombinacijom najboljih mutanata dobijen je dupli mutant sa većom aktivnosti u dimerizaciji ferulinske kiseline i obezbojavanja u odnosu na wt i pojedinaĉne mutante. 2.4.1.3 Supstrati lakaze Tipiĉni supstrati lakaze ukljuĉuju monofenole, npr. sinapinsku kiselinu ili gvajakol. Priroda supstituenta i njegova pozicija na fenolnom prstenu utiĉu na efikasnost oksidacije odreĊenom lakazom. Elektrofilne funkcionalne grupe, posebno one u orto-položaju negativno utiĉu na afinitet enzima ka supstratu, dok suprotno važi za nukleofilne funkcionalne grupe (Majeau et al., 2010). Sterne smetnje i visoki redoks potencijal negativno utiĉu na brzinu oksidacije lakazom. Lakaze takoĊe mogu da oksiduju poliamine, aminofenole, lignine, aril diamine, neke neorganske jone, neke policikliĉne aromatiĉne ugljovodonike (PAH), organofosforne pesticide i azo boje, pri ĉemu to smanjuje ili potpuno ukida toksiĉnost tih jedinjenja (Majeau et al., 2010). Iako su lakaze porijeklom iz gljiva zastupljenije u polju obezbojavanja i uklanjanja fenola u odnosu na bakterijske, ipak je njihova eksploatacija na industrijskom nivou ograniĉena. Jedan od razloga je problem u kloniranju i heterologoj ekspresiji, što je posledica prisustva introna i egzona u eukariotskoj ćeliji. S druge strane produkcija rekombinantnih bakterijskih enzima ima veći potencijal zbog mogućnosti dobijanja velike koliĉine enzima u fermentorima na primjer metodom fermentacije sa visokom gustinom ćelija (eng. high cell density). Favorizaciji prokariotskih enzima doprinose i lake genetske manipulacije i odsustvo glikozilovanja, što kod eukariotskih enzima zna da izazove razne probleme. 30 2.4.2 Tirozinaza Tirozinaza (E.C. 1.14.18.1, monofenol monooksigenaza), ĉesto nazivana polifenoloksidaza (PPO) je široko rasprostranjena kroz sva filogenetska stabla poĉevši od bakterija do sisara, a sreću se i tirozinaze razliĉitih karakteristika u razliĉitim organima istog organizma, poput korijena i lišća viših biljaka. Dobro je poznato da tirozinaze katalizuju dvije razliĉite uzastopne kiseonik-zavisne reakcije: o-hidroksilacija monofenola molekulskim kiseonikom pri ĉemu nastaju o-difenoli (tzv. krezolazna aktivnost), nakon ĉega slijedi oksidacija o-difenola do o-hinona (kateholazna aktivnost) koji zatim podleže ne-enzimskoj polimerizaciji. 2.4.2.1 Aktivno mjesto tirozinaze Hemijske i spektroskopske studije tirozinaze su pokazale da aktivno mjesto sadrži spregnuti bakarni binuklearni kompleks. Tirozinaza posjeduje bakarni centar Tipa 3 kao što je prikazano na slici 6. Slika 6. Prikaz bakarnih centara prisutnih kod tirozinaze. 2.4.2.2 Katalitički ciklus tirozinaze Oksigenisana forma (oksitirozinaza, Eoxy) se sastoji od dva tetragonalna Cu(II) jona, od kojih je svaki koordinovan sa dva jaka ekvatorijalna i jednim slabim aksijalnim NH ligandom. Egzogeni molekul kiseonika je vezan kao peroksid i premošćuje dva Cu centra. Met-tirozinaza (Emet), kao i oksigenisana forma, sadrži dva tetragonalna Cu(II) jona antiferomagnetiĉno kuplovanih preko endogenog mosta, iako su hidroksilni egzogeni ligandi vezani za bakarni centar umjesto peroksida. Dezoksi-tirozinaza (Edeoksi) ima bibakarnu strukturu [Cu(I)–Cu(I)]. Ova tri stanja bakra u aktivnom 31 mjestu tirozinaze sugerišu strukturni model za mehanizam reakcije koju obuhvata o- hidroksilaciju monofenola i oksidaciju rezultujućih difenola (slika 7) (Sanchez-Ferrer et al., 1995). Mehanicistiĉki aspekti strukture su opisani (Ducros et al., 1998; Klabunde et al., 1998). Slika 7. Katalitiĉki ciklus oksidacije monofenol i difenol supstrata do o-hinona tirozinazom u prisustvu kiseonika. Peroksidaze iz rena i tikve, u rastvornom i imobilizovanom obliku su uspješno korišćene za uklanjanje fenola na laboratorijskoj skali (Cooper i Nicell, 1996). Kako su i ren i tikva dostupni u velikoj koliĉini samo sezonski, to ih ĉini skupim izvorima za izolovanje enzima. Naprotiv, krompir je dostupan cijele godine, pa PPO iz krompira predstavlja enzim sa velikim potencijalom za biotehnologiju zbog svoje izuzetno niske cijene, jer se može izolovati iz otpada prehrambene industrije (Khan et al., 2006; Vujĉić 32 et al., 2010). Pokazano je (Thygesen et al., 1995) da je aktivnost PPO najveća na obodu krtole, ukljuĉujući koru i tkivo koje se nalazi neposredno ispod kore, 1 do 2 mm, što otvara mogućnosti za eksploataciju kora od krompira. Ovaj proces može da se dovede u direktnu vezu sa industrijom krompirovog ĉipsa, gdje višak proteina u otpadnoj vodi jeste jedan od velikih problema. Efikasnost enzimskog tretmana je nezavisna od ĉistoće enzima, pa sirovi ili djelimiĉno preĉišćeni enzim ima prednost u tretmanu otpadne vode, jer je zaštićeniji od inaktivacije zbog velike koliĉine drugih proteina prisutnih u rastvoru (Cooper i Nicell, 1996). Upotreba djelimiĉno preĉišćenih enzima je u prednosti u poreĊenju sa sirovim ekstraktima zbog mnogo razloga, a glavni su uklanjanje neželjenih endogenih fenola iz biljnih izvora tokom procesa preĉišćavanja i izbjegavanje viška proteina što bi izazvalo povećanje biohemijske potrebe za kiseonikom (BPK) u otpadnoj vodi. Kako svi industrijski procesi teže znaĉajnom smanjenju cijene tretmana, to je bio motiv da se koristi djelimiĉno preĉišćena PPO iz krompira. PPO je preĉišćena samo jednim hromatografskim korakom pod azotom, sa ciljem obogaćivanja fenoloksidazne aktivnosti i uklanjanja endogenih fenola. 2.5 Peroksidaze Peroksidaza iz rena (EC 1.11.1.7) je, sem zbog velike primjene i istorijski važan enzim na kome se radi više od osamdeset godina (Elliott, 1932). MeĊutim, u oblasti enzimskog tretmana fenolnih voda, peroksidaza je enzim-pionir, jer je ova oblast otvorena korišćenjem HRP za uklanjanje fenola, anilina i aromatiĉnih amina iz otpadne prije više od 30 godina (Klibanov et al., 1980, 1981, 1983). Ovaj enzim je i dalje aktuelan u oblasti uklanjanja kseonbiotika i kao model sistem za razvijanje novih naĉina imobilizacije enzima, ali i za ispitivanje moguće primjene u novim procesima. Svi živi organizmi produkuju peroksidaze, a o njihovoj zastupljenosti govori i podatak da je poznato blizu 11000 sekvencija peroksidaza sakupljenih u jedinstvenoj internet bazi posvećenoj ovog grupi enzima (PeroxiBase, 2012). Ovi enzimi su ukljuĉeni u razliĉite biosintetske procese, kao i u procese degradacije ili kao dio odbrane protiv patogena ili oksidativnog pritiska (Henriksen et al., 1998). Klasifikacija peroksidaza je kompleksna, a poĉinje sa podjelom na peroksidaze koje sadrže ili ne sadrže hem prostetiĉnu grupu, koje obuhvataju mnoštvo podklasa (slika 8). Većina 33 poznatih peroksidaza pripada superfamiliji neanimalnih peroksidaza koja može da se podijeli u tri velike klase na osnovu strukturne divergencije. Neanimalne peroksidaze klase I se nalaze intraćelijski u biljkama, kvascima i bakterijama. Ovoj klasi pripadaju citosolna askorbat oksidaza i citohrom c peroksidaza. Neanimalne peroksidaze klase II i III se nalaze kod gljiva i biljaka i obiĉne su locirane u vanćelijskom prostoru. Neanimalne peroksidaze klase II su najbolje predstavljene primjerima poput lignin degradirajuće mangan-peroksidaze iz gljive Phanaerochaete chrysosporium, dok neanimalne peroksidaze klase III obuhvataju široko prouĉavanu peroksidazu iz rena (Henriksen et al., 1998). Slika 8. Klasifikacija peroksidaza (preuzeto i modifikovano sa internet stranice PeroxiBase). Vanćelijske peroksidaze su locirane uglavnom u rastućim ćelijskim zidovima (Fry, 1986) i ukljuĉene su u procese lignifikacije koji doprinosi strukturnoj rigidnosti biljnih ćelijskih zidova. Odatle slijedi da su prirodni supstrati peroksidaza fenolni prekursori lignina, poznati kao monolignoli poput p-kumaril ili koniferil alkohola (Lewis et al., 1999). TakoĊe, postoje dokazi da peroksidaze djeluju na fenolne molekule vezane za polimere ćelijskog zida gdje uĉestvuju u umrežavanju susjednih makromolekula (Fry, 1986). 34 2.5.1 Peroksidaza iz rena (HRP) Shannon i saradnici (1966) su izolovali sedam izoformi peroksidaze iz korijena rena koje su se razlikovale u elektroforetskoj pokretljivosti, aminokiselinskom sastavu i sadržaju ugljenih hidrata. Ovi izoenzimi su podijeljeni u dvije grupe. Prva se sastoji od kiselih izoformi (HRP-A1, HRP -A2, HRP -A3), dok druga obuhvata baznije izoforme, od kojih je izoforma C (HRP-C) najzastupljenija. Kasnije studije su otkrile karakteristiĉne razlike meĊu ove dvije grupe izoformi u pogledu katalitiĉke aktivnosti prema razliĉitim supstratima (Hiner et al., 1996; Kay et al., 1967; Marklund et al., 1974). Komercijalni preparati sadrže uglavnom izoformu C (Dunford, 1991). HRP-C je slabo bazni glikoprotein koji ima 332, 351 ili 353 amino-kiselinskih ostataka, zavisno o kojoj njegovoj izoformi govorimo (Fujiyama et al., 1988). Aktivno mjesto enzima sadrži prostetiĉnu grupu hem sa feri jonom (Dunford, 1991). Osam oligosaharidnih boĉnih nizova su vezani za protein preko ostataka asparagina. Smatra se da saharidna komponenta doprinosi stabilnosti enzima na povišenim temperaturama (Dunford i Stillman, 1976). Dva jona kalcijuma su jako vezana za svaki molekul HRP. Ovi joni su neophodni za održavanje strukturnog okruženja hema (Ogawa et al., 1979). Ukupna molekulska masa HRP-C je oko 42 kDa (Dunford, 1991). Kristalnom strukturom HRP- C (Gajhede et al., 1997) je pokazano da se molekul sastoji od 10 heliksa (A-J). Dva domena su jasno definisana: N-terminalni domen I (sastoji se od heliksa A ̶ D) i C- terminalni domen II (heliksi F ̶ J). Heliks E vezuje dva domena. Vezivanje hema dešava se u “džepu” koji ĉine oba domena (heliks B i C-terminus heliksa F). Hem prostetiĉna grupa nativnog enzima, oznaĉena i kao feriprotoporfirin IX, sadrži Fe3+ jon u svom centru koji je koordinovan sa ĉetiri atoma azota iz pirolovih prstenova (planarna struktura porfirinskog prstena) (slika 9). Peto koordinaciono mjesto je okupirano imidazolovim prstenom iz boĉnog ostatka histidina iz heliksa F. Šesto koordinativno mjesto je prazno. Formalno naelektrisanje feriprotoporfirina IX je +1, jer dva od ĉetiri pirolova azota nose negativno naelektrisanje (Dunford, 1991). Porfirinski prsten je aromatiĉne prirode i stoga je odliĉan provodnik elektrona (Dunford i Stillman, 1976). 35 Slika 9. Feriprotoporfirin IX - hem prostetiĉna grupa HRP (Dunford i Stillman, 1976). 2.5.1.1 Katalitička aktivnost Mehanizam primarnog katalitiĉkog ciklusa HRP je prikazan na slici 10. Prvi korak je oksidacija nativnog enzima (feriperoksidaza) vodonik-peroksidom. Poĉetno vezivanje H2O2 se dešava na praznom šestom koordinativnom mjestu. Nakon transfera protona distalnom histidinu (His 42) formira se gvožĊe-peroksid veza, što je praćeno heterolitiĉkim raskidanjem O-O veze oslobaĊajući vodu kao dobru odlazeću grupu. Ovu reakciju pomaže stabilizacija negativnog naelektrisanja na His 170 i pozitivnog na ostacima His 42 i Arg 38 (Dunford 1991). Nakon ovih procesa, feri jon [Fe(III)] 3+ se oksiduje do feril grupe [Fe(IV)=O] 2+ , a porfirinski system (Porph) 2- prelazi u π- radikalski intermedijer (Porph·) -. Rezultujuća enzimska forma sadrži π-katjonski radikal (Porph·[Fe(IV)=O]) + u aktivnom mjestu i naziva se jedinjenje I (HRPI) (Dunford, 1991). Sledeći korak je redukcija jedinjenja I u jednoelektronskom koraku redukujućim supstratom, obiĉno fenolnim molekulom (ROH) (Dunford, 1991). Elektronski transfer se dešava od molekula supstrata ka porfirinskom prstenu tako da π-katjonski radikal nestaje. Proton se prenosi simultano sa fenolne hidroksilne grupe na imidazolski boĉni niz ostatka His 42, što je pomognuto vodoniĉnom vezom izmeĊu Arg 38 i fenolnog kiseonika (Henriksen et al., 1999). Dobijeni fenolni radikal disosuje od enzima ostavaljajući peroksidazu u formi (Porph[Fe(IV)=O]), koja se naziva jedinjenje II (HRPII). U finalnom koraku katalitiĉkog ciklusa, drugi fenolni molekul redukuje jedinjenje II u jednoelektronskom koraku, vraćajući enzim u nativno stanje (HRPN). 36 Slika 10. Primarni katalitiĉki ciklus peroksidaze iz rena. U jedinjenju II, protonovana distalna grupa, najvjerovatnije His 42, je vodoniĉno vezana za feril kiseonikov atom, što je od izuzetne važnosti za katalitiĉku aktivnost ovog peroksidaznog intermedijera (Dunford, 1991). Prenos protona i elektrona od fenolnog supstrata na feril grupu se dešava simultano, redukujući gvožĊe (IV) do gvožĊa (III) i dajući vodu kao odlazeću grupu, sa kiseonikom porijeklom iz [Fe(IV)=O] 2+ (Dunford, 1991). Dva protona u odlazećem molekulu vode su dobijeni od protonovane distalne grupe i redukujućeg susptrata. Rezultat je formiranje drugog fenolnog radikala i povratak peroksidaze u feri stanje (Porph[Fe(III)]) + (Dunford, 1991). 37 Supstrati peroksidaze iz rena Organski supstrati koji redukuju jedinjenje I i jedinjenje II su uglavnom aromatiĉni molekuli, koji nose bar jednu hidroksilnu ili amino grupu. Razliĉiti fenoli, naftoli, anilini i benzidini pripadaju ovoj grupi jedinjenja (Josephz et al., 1982; Klibanov et al., 1980; Klibanov i Morris, 1981). HRP takoĊe može da oksiduje brojna neorganska jedinjenja ukljuĉujući ferocijanide, jodide, nitrite i vodonik-sulfit (Dunford i Stillman, 1976). Jodid i vodonik- sulfit su zanimljivi izuzeci meĊu redukujućim supstratima, jer redukuju jedinjenje I direktno do nativnog enzima u dvoelektronskom koraku. 2.5.1.3 Stabilnost peroksidaze iz rena HRP je inaktivirana kada se inkubira u prisustvu H2O2 na dva moguća naĉina, zavisno od koncentracije vodonik peroksida. Pri nižim koncentracijama H2O2 (ispod 1,0 mM u odsustvu fenola) inaktivacija je reverzibilna, a rezultat je formiranja i nagomilavanja katalitiĉki inertnog intermedijernog jedinjenja III (Baynton et al., 1994). Pri višim koncentracijama H2O2 dolazi do ireverzibilne inaktivacije formiranjem verdohemoproteina (P670) (Arnao et al., 1990; Baynton et al., 1994), dok se inkubiranjem u prisustvu fenolnog supstrata ne gubi aktivnost (Nicell et al., 1993). HRP posjeduje neobiĉno visoku stabilnost u vodenim rastvorima. Koncentrovani rastvori mogu da se drže u destilovanoj vodi na 4ºC barem mjesec dana bez znaĉajnog gubitka aktivnosti (Nicell et al., 1993). Ipak, kao i većina enzima, HRP se inaktivira tokom dužeg inkubiranja na povišenoj temperaturi. Enzimi su stabilni unutar ograniĉenog opsega pH vrijednosti. Van ovog opsega, promjene u naelektrisanju jonizabilnih aminokiselinskih ostataka rezultuju modifikacijama tercijarne strukture enzima i vode ka denaturaciji. HRP zadržava više od 90% aktivnosti nakon 48h inkubiranja na pH 6 ̶ 9, ali je znaĉajno inaktivirana van ovog opsega (Nicell et al., 1993). Inaktivacija HRP na kiselim pH vrijednostima može bar djelimiĉno da se pripiše razbijanju proteinske strukture i oslobaĊanju hema što je potvrĊeno od strane Chattopadhyay i Mazumdar (2000), a ovaj princip se inaĉe koristi i za izolovanje hema iz hemoproteina. Stabilnost HRP se smanjuje sa opadanjem 38 koncentracije enzima, povećanjem koncentracije pufera i prisustvom EDTA. Stepen inaktivacije zavisi takoĊe i od vrste korišćenog pufera. HRP je najstabilnija u citratnim puferima, a najmanje stabilna u fosfatnim puferima. Uticaj EDTA može se objasniti ĉinjenicom da se slobodni joni Ca2+ izmjenjuju sa jonima Ca2+ vezanim za HRP-C (Haschke i Friedhoff, 1978) tako da se nakon inkubiranja sa EDTA, vezani Ca 2+ joni polako uklanjanju sa enzima, što vodi olakšanom otpuštanju hema. Većina istraživanja koja se bave primjenom HRP za uklanjanje ksenobiotika bazirano je na korišćenju komercijalnog preparata HRP (izoforma HRP-C), pa o stabilnosti drugih izoformi HRP nema podataka u literaturi. 2.5.2 Hloroperoksidaza (CPO) Hloroperoksidaza (EC 1.11.1.10) iz filamentozne gljive Caldariomyces fumago ima masu od 42 kDa, 321 aminokiselinski ostatak i pI u opsegu 3,2-4,0. To je glikoprotein ĉiji je sadržaj ugljenih hidrata 25-30%, a glavne gradivne jedinice su glukozamin i arabinoza. CPO je enzim sa najviše raznovrsnih funkcija u familiji hem- peroksidaza. Ovaj enzim može da katalizuje formiranje veze halogen-ugljenik u prisustvu odgovarajućeg akceptorskog supstrata i peroksida koristeći hloridni, bromidni ili jodidni, ali ne i fluoridni jon (Hager et al., 1966). Sem ove funkcije peroksid- zavisnog hlorinovanja, CPO takoĊe katalizuje tipiĉne reakcije za hem-peroksidaze, katalaze i citohrom P450 monooksigenaze (uvoĊenje kiseonika). Reakcije halogenovanja CPO katalizuje u kiseloj sredini (pH<3), dok nehalogenujuće reakcije katalizuje u neutralnoj sredini (pH=5-6). Katalazna aktivnost CPO se odigrava u odsustvu halogenih jona i organskog supstrata i rezultuje disproporcionisanjem vodonik peroksida na molekulski kiseonik i vodu (Sun et al., 1994). Razlog zbog kog CPO ispoljava toliko razliĉitih funkcija leži u strukturi njenog aktivnog mjesta. CPO ima cistein (Cys29) poput citohroma P450, dok ostale peroksidaze imaju histidin kao peti aksijalni ligand, ali okruženje se znaĉajno razlikuje (Blanke i Hager, 1988; Torres i Ayala, 2010). Distalni džep za hem u CPO, koji je odgovoran za vezivanje peroksida sadrži polarne amino kiseline, što je tipiĉno za peroksidaze (nasuprot citohromu P450). Ipak, distalni aminokiselinski ostatak koji djeluje kao kiselo-bazni katalizator nije histidin, kao kod ostalih hem-peroksidaza, već 39 glutaminska kiselina (Glu183) (Yi et al., 1999). Iako je CPO enzim sa obećavajućim karakteristikama, njegova praktiĉna upotreba je ograniĉena malom operacionom stabilnošću u prisustvu peroksida. Inaktivacija CPO peroksidom je uzrokovana uništavanjem hema (Ayala et al., 2011). Taĉan molekulski mehanizam inaktivacije CPO nije razjašnjen. Potencijal CPO za primjenu u tretmanu fenolne otpadne vode je pokazan na model sistemu p-CP (La Rota i Bon, 2002) i pentahlorofenola (Longoria et al., 2008). U literaturi se slabo mogu naći podaci o primjeni CPO u obezbojavanju, mada su skoriji radovi potvrda o aktuelnosti istraživanja koja se bave ovim enzimom (Zhang et al., 2012). 2.6 Redoks potencijal oksidativnih enzima i upotreba medijatora Redoks potencijal je katalitiĉki relevantna osobina oksidaza koja, bar po teoriji, odreĊuje granice oksidativne moći enzima. Standardni redoks potencijal za aktivnost lakaza je obiĉno izmeĊu 0,5-0,8 V, što nije dovoljno za oksidaciju nekoliko vrsta ksenobiotika (Majeau et al., 2010). Ovo predstavlja znaĉajno ograniĉenje za primjenu lakaza za detoksifikaciju i industrijske svrhe. Otkriće medijatora omogućilo je proširivanje reaktivnosti lakaza ka neuobiĉajenim supstratima. Medijatori predstavljaju lako oksidujuće supstrate koji djeluju kao redoks intermedijeri izmeĊu aktivnog mjesta enzima i ne-fenolnog supstrata. Benzil alkoholi, molekuli sa visokim redoks potencijalom i sterno zaštićeni molekuli su dobri kandidati za lakazni medijatorski sistem (LMS). Najĉešće korišćeni medijatori su 2,2 , -azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) (ABTS) i 1-hidroksi benzotriazol (HBT) (Majeau et al., 2010). Velika prepreka u upotrebi medijatora je njihova visoka toksiĉnost i cijena (Majeau et al., 2010). HBT inaktivira lakazu tokom vremena, a pokazuje veliku toksiĉnost i pri malim koncentracijama (Majeau et al., 2010), pa je malo vjerovatno da je primjenjiv u budućim procesima. 40 2.7 Imobilizacija enzima Nedostatak većine potencijalno primjenjivih industrijski važnih enzima je njihova nestabilnost i mala produkcija (Godfrey, 1996). Najĉešće korišćen naĉin stabilizacije enzima je imobilizacija, koja takoĊe pruža pogodnosti višestruke upotrebe iste koliĉine enzima, olakšano odvajanje proizvoda i olakšanu kontrolu procesa (Cao et al., 2003; Hartmeier 1988; Mateo et al., 2007). Pored toga, poznato je da se imobilizacijom mijenjaju osobine enzima poput: pH i temperaturnog optimuma, kinetiĉkih parametara i fluidnost (fleksibilnost) proteinske strukture (Cao et al., 2003; Hartmeier 1988; Mateo et al., 2007). Povećana termostabilnost enzima omogućava izvoĊenje procesa na višim temperaturama i tako se smanjuje reakciono vrijeme. Prednosti i nedostaci imobilizacije enzima su sažeti u tabeli 2 (van de Velde et al., 2002; Bornscheuer, 2003). Prva imobilizaciju enzima uradili su Nelson i Griffin 1916. godine. Oni su adsorbovali invertazu na aktivnom uglju i aluminijum oksidu sa oĉuvanjem katalitiĉke aktivnosti. Ipak, razvoj tehnologije imobilizacije enzima se odigrao davno, polovinom prošlog vijeka. Tako je 1969. godine u Japanu razvijen proces proizvodnje L-aminokiselina korišćenjem imobilizovanih enzima, što je praćeno razvojem procesa izomerizacije glukoze u fruktozu glukozo-izomerazom 1972. godine u SAD. Od tada se razvijaju novi procesi, nosaĉi i metode imobilizacije. Tabela 2. Prednosti i nedostaci imobilizaacije enzima (van de Velde et al., 2002; Bornscheuer, 2003). Prednosti Lakše odvajanje i rekuperacija enzima i proizvoda Višestruka upotreba Povećanje termostabilnosti i otpornosti ka denaturišućim reagensima Lakše zaustavljanje reakcije Olakšana upotreba u kontinualnim procesima Veća fleksibilnost u dizajnu bioreaktora Smanjenje kontaminacije proteinima u finalnom proizvodu Lakša kontrola mikrobioloških kontaminacija Nedostaci Manja enzimska aktivnost uzrokovana procesom imobilizacije Povećanje Mihaelis-Mentenine konstante 41 Za imobilizaciju enzima na ĉvrstim materijalima i gelovima koriste se razliĉite metode koje se zasnivaju na fiziĉkim i hemijskim mehanizmima (Duran et al., 2002). Hemijske metode ukljuĉuju kovalentno vezivanje enzima i nosaĉa, umrežavanje enzima i nosaĉa, kao i umrežavanje multifunkcionalnim reagensima. Fiziĉke metode ukljuĉuju adsorpciju, zarobljavanje enzima u nerastvornim polimernim gelovima (hidrogelovima) ili u micelama (enkapsulacija) (Duran et al., 2002; Hartmeier, 1988). Sa ciljem da se poveća potencijal industrijske upotrebe, fenoloksidaze i lakaze su imobilizovane na raznovrsnim nosaĉima (Duran et al., 2002 i citirane reference). Tehnike koje su do sada korišćene su adsorpcija na poroznom staklu (Rogalski et al., 1995), zarobljavanje u alginatnim kuglicama (Palmieri et al., 1994) i želatinu (Grecchio et al., 1995), ili kovalentno vezivanje na inertnim i polimernim materijalima (Hublik i Schinner, 2000). Imobilizacija enzima je izuzetna tehnika koja omogućava prevazilaženje problema koji se postavljaju pred rastvorne enzime, jer se imobilizacijom omogućava duže skladištenje i bolja kontrola katalitiĉkog procesa (Wada et al., 1993). Za tretman velikih zapremina otpadne vode poželjno je korišćenje reaktora sa imobilizovanim enzimima zbog velike cijene enzima. Imobilizacija enzima, pored željene višestruke upotrebe enzima omogućava neprevaziĊenu mogućnost direktnog odvajanja proizvoda i kontinualnu upotrebu (Tatsumi et al., 1996). 42 3. Naši radovi Da bi se enzimski tretmani implementirali veoma je važno uzeti u obzir cijenu enzima. Oksidativni enzimi su i dalje skupi zbog visoke cijene produkcije, izolovanja i preĉišćavanja. Problemi koji moraju da se razmotre/riješe su identifikacija nusproizvoda reakcije i smanjenje cijene tretmana. Imobilizacija igra znaĉajnu ulogu u smanjenju cijene biokatalizatora. Metode koje se trenutno koriste za uklanjanje ksenobiotika iz efluenata imaju nekoliko mana poput visoke cijene procesa, formiranje mulja, mala efikasnost, a nisu primjenjive za širi spektar zagaĊivaĉa. Bioremedijacija oksidativnim enzimima predstavlja obećavajuću alternativu. MeĊu njima, enzimi koji koriste molekulski kiseonik kao akceptor elektrona su najzanimljiviji. Tako su lakaza i PPO naroĉito interesantni za primjenu u uklanjanju boja. Primjena lakaza za industrijske procese zahtjeva produkciju velike koliĉine enzima po niskoj cijeni. S toga je naš cilj bio potraga za efikasnim produkcionim sistemom enzima ili jeftini izvor za izolovanje PPO kao što je krompir, odnosno kora krompira. Drugi naĉin dobijanja jeftinog enzima je produkcija rekombinantnih enzima. Da bi pronašli enzim sa željenim karakteristikama testirano je oko 100 sojeva Bacillus sp. izolovanih iz prirode. Za potrebe referentnog enzima proizvedena je lakaza iz gljive Trametes versicolor. Ispitana je upotreba peroksidaze iz rena, sa novog aspekta, poreĊenjem efikasnosti u uklanjanju boja kiselih i baznih izoformi ovog enzima. Uklanjanje ksenobiotika je ispitano i korišćenjem enzima sa neobiĉnim katalitiĉkim osobinama, rekombinantne hloroperoksidaze iz gljive Caldariomyces fumago, proizvedenoj u gljivici Aspergillus niger. 3.1. Uklanjanje fenola fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) U ovom radu je ispitivano mnoštvo nosaĉa za imobilizaciju PPO, dijelom komercijalno dostupnih, a dijelom sintetisanih. Pored toga, sintetisan je potpuno novi nosaĉ za imobilizaciju PPO na bazi potrošenog jonoizmjenjivaĉkog matriksa i okarakterisan je kako sam matriks, tako i biokatalizator dobijen imobilizacijom PPO na 43 njemu. Rastvorna PPO je takoĊe testirana za upotrebu u uklanjanju tekstilnih boja iz sintetiĉkih i realnih eflueanta. 3.1.1 Prečišćavanje PPO Jedan od problema koji se javlja prilikom izolovanja PPO iz biljnog materijala je prisustvo endogenih fenolnih jedinjenja koja PPO oksiduje do hinona, koji formiraju kovalentne veze sa enzimom, što rezultuje agregacijom enzima. Dva su naĉina za spreĉavanje tamnjenja ekstrakta, a oba se zasnivaju na uklanjanju jednog od dva supstrata koja PPO koristi u katalitiĉkoj reakciji. Jedan naĉin je uklanjanje fenolnih jedinjenja, a drugi rad u atmosferi bez kiseonika. Strategija korišćena u ovom radu snižava na minimum neželjene efekte rasoljavanjem sirovog ekstrakta odmah nakon izbistrivanja centrifugiranjem. Endogeni fenoli moraju da budu uklonjeni u toku preĉišćavanja, jer fenoksi radikali koji nastaju prilikom njihove oksidacije napadaju aktivno mjesto enzima i tako ga inaktiviraju (Kwon i Kim, 1996). Uklanjanje fenola (rasoljavanje) je uraĊeno na Sephadex-G25 krupne (eng. coarse) granulacije što omogućava brzo hromatografsko razdvajanje proteina od malih molekula. Jonoizmjenjivaĉka hromatografija je uraĊena u atmosferi bez kiseonika da bi se sprijeĉila oksidacija male koliĉine fenola zaostalih i nakon rasoljavanja. QAE Sephadex je dobro poznati hromatografski matriks za industrijske namjene. Njegova široka upotreba je posledica velikog kapaciteta za vezivanje proteina i mala cijena što omogućava jednokratnu upotrebu i spreĉavanje kontaminacija. Koraci u preĉišćavanju su dizajnirani tako da se iskoristi maksimalan prinos koji se dobija metodom zarobljavanja (eng. capturing) hromatografije, sa ciljem optimizacije što kraćeg procesa. Da bi proces mogao lako da bude prilagoĊen za industrijsku skalu korišćeni su jeftini fosfatni pufer i šaržna (baĉ) hromatografija. Ova procedura daje prinos od 69% fenoloksidazne aktivnosti u poreĊenju sa poĉetnim ekstraktom. Preĉišćavanje enzima praćeno je odreĊivanjem aktivnosti sa supstratom L-DOPA (Poglavlje 4.1.2.1). Djelimiĉno preĉišćena PPO pokazuje aktivnost od 8600 U/mL pod opisanim uslovima eseja. Rezultati preĉišćavanja prikazani su u tabeli 3. 44 Tabela 3. Djelimiĉno preĉišćavanje PPO iz krompira. Sirovi ekstrakt Rasoljeni s.ekstrakt Frakcije eluirane sa QAE-Sephadex A475 1,000 1,060 0,860 V (mL) 600 650 480 Aktivnost (U/ml) 10 000 10 600 8 600 Ukupna aktivnost (U) Prinos (%) 6 000 000 100 6 890 000 114,8 4 128 000 68,8 Proteini u sirovom ekstraktu su razdvojeni izoelektriĉnim fokusiranjem na 7,5% poliakrilamidnom gelu. Bojenje proteinskih traka CBB-om i zimogramska detekcija PPO u sirovom ekstraktu pokazuju prisustvo dvije izoforme PPO ĉije je pI 6,5 i 5,9 (slika 11). Slika 11. Izoelektriĉno fokusiranje sirovog ekstrkta krompira. Traka 1: CBB bojenje. Traka 2: Zimogramska detekcija PPO. Strelice pokazuju mjesto traka koje se odnose na PPO aktivnost. (-) pI 10, (+) pI 3. 45 3.1.2 Imobilizacija PPO Glavni cilj ovog rada je bio dobijanje jeftinog imobilizovanog enzima za uklanjanje fenola. Krompir predstavlja poželjan izvor za izolovanje polifenoloksidaze (PPO, EC 1.14.18.1), jer je moguće ovaj enzim izolovati iz otpada prehrambene industrije, npr. kore od krompira u industriji krompirovog ĉipsa. Djelimiĉno preĉišćena polifenoloksidaza (PPO) iz krompira je imobilizovana na razliĉitim komercijalnim i laboratorijski sintetizovanim nosaĉima inkubiranjem preparata PPO sa odgovarajućim nosaĉem. Ispitana je moguća upotreba tri komercijalno dostupna adsorbensa koji se koriste u tretmanu voda za uklanjanje neorganskih komponenti (Birm ® , GreenSand ® , MTM ® ), dijatomejska zemlja tj. celit, kao i nekoliko varijanti mikrokristalne celuloze impregnirane sa Ti-oksidom, koje su sintetisane u laboratoriji. Ovi materijali su odabrani zbog dostupnosti u velikim koliĉinama i niskoj cijeni (Birm®, GreenSand®, MTM ® , Celite ® ) i zbog pretpostavljenog potencijala za vezivanje proteina (modifikovane celuloze) po analogiji sa imobilizovanom metal-afinitetnom hromatografijom (Lonĉar et al., 2011). Birm ® je engleska skraćenica za metodu uklanjanja gvožĊa po Burgesu („Burgess Iron Removal Method“) (Premier Water, 2011). Koristi se u opštinskim postrojenjima za tretman vode. Birm može da oksiduje jone gvožĊa, ali nije mnogo efikasan u oksidovanju arsena (III). Birm se proizvodi impregnacijom aluminijum- silikatnog pijeska manganovim solima do zasićenja. Joni mangana se zatim oksiduju do ĉvrste forme mangan-oksida kalijum-permanganatom. Po sliĉnom postupku se proizvodi i manganov zeleni pijesak (Greensand ® (CEI Filtration, 2006). To je ljubiĉasto-crni granularni adsorbens koji se dobija obradom glaukonita (gvožĊe- kalijum-filosilikat, (K,Na)(Al,Mg,Fe)2(Si,Al)4O10(OH)2), a koristi se za uklanjanje jona gvožĊa, mangana, kao i vodonik-sulfida. MTM® je granularni mangan-dioksid koji se koristi za iste svrhe kao Greensand (Safe Water Technologies, Inc, 2012). Dijatomejska zemlja (celit) je prirodni silikatni materijal, koji se lako melje u fini bijeli pijesak. Sastoji se od fosilnih ostataka dijatomejskih algi. Koristi se kao pomoćno sredstvo pri filtraciji, kao abraziv, adsorbens, porozni nosaĉ za hemijske katalizatore, stabilizator za dinamit itd. CelulozaM predstavlja celuloza-TiO2 modifikovanu sa organosilikonom. Dobija se reakcijom celuloze sa titanijum-hloridom, nakon ĉega slijedi reakcija sa 46 4-aza-6-aminoheksil trietoksisilanom. Originalno je napravljena za adsorpciju jona Hg(II), Cu(II), Pb(II), Fe(III) i Cr(III) (Meng et al., 2002). Uprkos inherentnom svojstvu da oksiduju L-DOPA, što se ogleda u trenutnoj promjeni boje reakcione smješe nakon miješanja nosaĉa sa supstratom, MTM, MTM obogaćen sa 10%Ti, Birm i Greensand su korišćeni za imobilizaciju, jer je bilo moguće izmjeriti aktivnost koja je rezultat djelovanja PPO u odnosu na slijepu probu. Celulozna zrna granulacije (90 µm) obogaćena sa razliĉitom koliĉinom Ti (0,25, 0,7 i 1,0 %, w/w), kao i Celuloza M, takoĊe modifikovana titanijumom (Meng et al., 2002) su korišćeni u ovim eksperimentima. Pored njih, komercijalno dostupni nosaĉi, Eupergit C 250L, Celit, kao i nemodifikovana mikrokristalna celuloza su testirani za vezivanje PPO (slika 12). M TM Bi rm M TM -1 0% T i Ce lu lo za Ce lu lo za -1 % Ti Ce lu lo za -0 .7 % T i Ce lu lo za -0 .2 5% T i G re en sa nd Ce lu lo za M Ce lit Eu pe rg it C 25 0L 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 A k ti v n o s t (U /g ) Slika 12. PoreĊenje aktivnosti dobijenih biokatalizatora prema 2.3 mM L-DOPA. Prikazane vrijednosti predstavljaju specifiĉnu aktivnost dobijenih biokatalizatora (U/g suvog nosaĉa). Pokazano je da MTM ® , MTM 10%Ti, Birm ® i Greensand ® nisu pogodni nosaĉi za imobilizaciju PPO, jer vezuju malu koliĉinu PPO. Što se tiĉe celuloznih nosaĉa, samo imobilizat Celuloza M-PPO je pokazala dovoljno visoku aktivnost, dok su ostali celulozni nosaĉi bili meĊusobno sliĉni i pokazivali malu PPO aktivnost prema 47 L-DOPA. Znaĉajna aktivnost je detektovana sa dobijenim biokatalizatorima Celit-PPO, Celuloza M-PPO i Eupergit C250L-PPO (slika 12). Eupergit C250L-PPO je pokazao najveću specifiĉnu aktivnost. Imobilizati sa najvećim aktivnostima PPO, Eupergit C250L-PPO, Celit-PPO i CelulozaM-PPO, su testirani u reaktoru za uklanjanje fenola, p-hlorfenola i p- bromfenola. Kao model sistem izabrani su fenol, p-bromfenol (p-BP) i p-hlorfenol (p- CP), jer su u širokoj upotrebi kao dezinfekciona sredstva u kućnim uslovima, bolnicama, farmama itd. (Merck Index 2006), a korišćeni su i ranije kao model sistemi (Ashraf i Husain, 2010; Levy et al., 2003; Lonĉar et al., 2011; Tong et al., 1997). Uklanjanje odabranih fenola ispitano je na model sistemu sintetiĉke otpadne vode: 50 mM fosfatni pufer pH 6,8 sa dodatkom fenola u finalnim koncentracijama od 2,5 mM i 10 mM i na 25ºC. U zapreminu od 3 mL sintetiĉke otpadne vode dodato je po 100 mg polusuvog imobilizata i inkubirano 5 ĉasova uz miješanje na rotacionoj mućkalici da bi se obezbijedio kontinualan dotok kiseonika. Nakon 5 ĉasova odreĊena je koncentracija zaostalih fenola kolorimetrijskim testom sa 4-aminoantipirinom (4-AAP) (Poglavlje 4.1.2.3). Eksperimentalni podaci pokazuju da najbolje rezultate daje biokatalizator Eupergit C250L-PPO. PoreĊenjem imobilizata dobija se stepeniĉasti histogram u sluĉaju 2,5 mM supstrata (slika 13), a sliĉan profil efikasnosti sa manjim vrijednostima se dobiju i u sluĉaju 10 mM supstrata (slika 14). Slika 13. Uklanjanje 2,5 mM p-BP, 2,5 mM p- CP i 2,5 mM fenola nakon ciklusa od 5 ĉasova u baĉ reaktoru sa biokatalizatorima: Eupergit C250L-PPO, Celit-PPO i Celuloza M-PPO. 48 Najveći stepen uklanjanja fenola i derivate fenola iz vode ima Eupergit C250L- PPO, zatim Celit-PPO imobilizat, a Celuloza M-PPO ima najmanje postignuto uklanjanje. Najslabije uklanjanje je u sluĉaju fenola, jer PPO iz krompira ima slabu monofenolaznu aktivnost (Selinheimo et al., 2007). Dobijeni rezultati uporedivi su sa rezultatima za imobilizovanu lakazu (Cordi et al., 2007). Pri koncentracijama supstrata od 2,5 mM, korišćenjem imobilizata Eupergit C250L-PPO, postignuto je 44% razgradnje p-BP, dok je p-CP razgraĊen 35%, a fenol 20%. Na slici 14. se uoĉava da imobilizat Celuloza M-PPO postiže veći stepen uklanjanja p-CP u odnosu na p-BP. Imobilizati Eupergit C250L-PPO i Celit-PPO pokazuju sliĉan profil efikasnosti pri koncentracijama fenola od 10 mM (slika 14), kao i pri koncentracijama od 2,5 mM (slika 13), samo sa manjim stepenom uklanjanja. Slika 14. Uklanjanje 10 mM p-BP, 10 mM p-CP i 10 mM fenola nakon ciklusa od 5 ĉasova u baĉ reaktoru sa biokatalizatorima: Eupergit C250L-PPO, Celit-PPO i Celuloza M-PPO. U radu Levy et al. (2003) gdje je korišćena imobilizovana peroksidaza iz rena na celulozi postignuto je uklanjanje samo 17% p-BP od poĉetne koncentracije od 0,2 mM. Obiĉno, što je niža poĉetna koncentracija zagaĊivaĉa, postiže se bolje uklanjanje, jer je slabija inhibicija enzima supstratom. Ako se to uzme u obzir, može se zakljuĉiti da Eupergit C250L-PPO ipak pokazuje znaĉajnu efikasnost u uklanjanju p-BP i p-CP pri 2,5 mM koncentracijama supstrata. Kada se koriste supstrati koncentracije 10 mM, imobilizati su i dalje sposobni da postignu odreĊeni stepen uklanjanju, ali bi za upotrebu 49 u realnim sistemima bilo isplativije razblažiti fenolne vode do nižih radnih koncentracija fenola, pogodnih za enzimsko uklanjanje. Za svaki imobilizat potrebno je odrediti broj ciklusa koji može da se uradi i da se ispita efikasnost, što je i uraĊeno za Eupergit C250L-PPO za uklanjanje p-CP. Nakon osam uzastopnih ciklusa, od kojih je svaki trajao po 5h, efikasnost uklanjanja p-CP pomenutim biokatalizatorom pokazuje trend pada na 55%, slika 15 (Lonĉar et al., 2011). Zapaženo je formiranje i akumulacija tamnih precipitata na imobilizatu, što prividno smanjuje aktivnost imobilizata, jer se akumulacijom precipitata na imobilizatu onemogućava kontakt enzima sa supstratom. Sliĉne studije drugih autora pokazale su da imobilizovana peroksidaza zadržava 40% aktivnosti nakon osam ponovljenih ciklusa (Matto i Husain, 2009). Slika 15. Efikasnost uklanjanja p-CP katalizatorom Eupergit C 250L-PPO u ponovljenim ciklusima. Mogućnost korišćenja imobilizata dobijenog vezivanjem PPO na celit nakon taloženja PPO amonijum sulfatom su ispitivali i drugi. Khan i saradnici (Khan et al., 2006) su pokazali da je imobilizovani enzim u odnosu na rastvorni enzim otporniji na denaturacione faktore kao što su promjena pH, porast temperature, urea, detergente (SDS, Triton X-100, Tween 20), kao i organske rastvaraĉe mješljive sa vodom (acetonitril, dimetilformamid, dioksan i n-propanol). Ovi rezultati i rezultati dobijeni u okviru ove disertacije povećavaju spektar mogućih nosaĉa za imobilizaciju PPO i drugih enzima sa potencijalom za upotrebu u tretmanu otpadne vode. 50 3.1.3 Sinteza novog nosača sa pipcima i njegova primjena za imobilizaciju PPO Kovalentna imobilizacija enzima za nosaĉ se smatra metodom izbora. MeĊutim, nedostaci su što mnoge od preporuĉenih procedura zahtijevaju prederivatizaciju matriksa, dugi vremenski period potreban za reakciju kuplovanja i posebne uslove koji mogu da oštete enzim (Woodward, 1985). U nekim uslovima dolazi i do znaĉajnog gubitka aktivnosti prilikom imobilizacije, nekad ĉak i do 85% kao što je to sluĉaj sa imobilizacijom peroksidaze na Eupergit nosaĉu (Pramparo et al., 2010). Imobilizacija enzima uz formiranje koordinativnih veza sa dvovalentnim metalnim jonima postaje atraktivna metoda zbog svoje reverzibilne prirode, što omogućava da se enzim eluira sa matriksa (nakon gubitka aktivnosti) jednostavnim tretmanom nekim helirajućim reagensom, kao što je EDTA. Imobilizacija nove koliĉine enzima na isti matriks daje ĉistu, jednostavnu i jeftinu tehnologiju za tretman otpadne vode. Da bi se izbjegli pomenuti mogući nedostaci kovalentnog vezivanja, kao i da bi se izbjegla derivatizacija matriksa nakon vezivanja enzima u ovoj disertaciji korišćena je osobina bakra-(II) da se koordinativno vezuje za aminokiselinske ostatke na površini proteina što se ĉesto koristi prilikom preĉišćavanja proteina metodom imobilizovane metal-afinitetne hromatografije i imobilizacije fenoloksidaza (Richard-Forget et al., 1994). Ovime se postiže brzo vezivanje, pod blagim uslovima i jednostavnim postupkom. Koristeći ovu osobinu, dodatno obogaćivanje oksidazne aktivnosti se postiže usled većeg afiniteta PPO za vezivanje na matriks u odnosu na druge proteine prisutne u rastvoru. Sliĉan pristup je korišćen za direktnu imobilizaciju tirozinaze na celitu, D-sorbitol cimetnom estru i bakar-alginatnom gelu (Khan et al., 2006; Marin- Zamora et al., 2006; Palmieri et al., 1994). Sepharose® i agarozni derivati koji sadrže metal-helirajuće grupe poput iminodiacetata (IDA) ili nitriloacetata (NTA) su najĉešći korišćeni nosaĉi (Bickerstaff, 1997; Duran et al., 2002; Piacquadio, 1997). Visoka cijena komercijalno dostupnih helirajućih agaroza i celuloza je njihovo najveće ograniĉenje. Pored toga, kratki distancijali ograniĉavaju pokretljivost vezanog enzima i smanjuju prividnu katalitiĉku moć. Sve ovo otvara mogućnost za sintezu novog nosaĉa, sa dužim helirajućim distancijalima (pipcima) koji nudi veću fleksibilnost enzimu i dostupnost supstrata, time povećavujući kontakt enzima i supstrata. Na laboratorijskoj i industrijskoj skali preĉišćavanje proteina se većinom odvija na jonoizmjenjivaĉkim matriksima, što nije neobiĉno ako se uzme u obzir njihov veliki 51 kapacitet za vezivanje proteina i visoka moć razdvajanja. Ovi matriksi mogu da se koriste konaĉan broj puta, nakon ĉega njihova moć razdvajanja nestaje. U ovoj disertaciji je iskorišćen potrošeni jonoizmjenjivaĉkim matriks, dietilaminoetil (DEAE)- celuloza kao poĉetni sirovi materijal za sintezu novog nosaĉa za imobilizaciju. DEAE celuloza je katjonski derivat prirodnog polimera i posjeduje poželjnu hidrodinamiĉku strukturu, jer fibrilarna struktura ima veliku aktivnu površinu. Izabrana je zbog svoje biodegradabilnosti, hidrofilnosti i prisustva hidroksilnih grupa, kao i prirodnog porijekla (Arica et al., 2000; Kok et al., 1999). Slika 16. Sinteza TC. Epihlorhidrinska aktivacija DEAE celuloze je praćena uvoĊenjem iminodiacetatnih grupa. Joni bakra se koordinativno vezuju za iminodiacetatne grupe, a tri molekula vode se u toku imobilizacije zamijenjuju koordinovanjem sa atomima N, O ili S u boĉnim aminokiselinskim ostacima na površini proteina (Lonĉar i Vujĉić, 2011). ak ̶ amino- kiselinski ostatak na površini proteina. 52 Nosaĉ sa ,,pipcima” (eng. tentacle carrier, TC) je sintetisan aktivacijom aminogrupa DEAE celuloze epihlorhidrinom (slika 16a,b). Nakon toga su uvedene iminodiacetatne grupe, koje su kasnije zasićene bakarnim jonima (slika 16c,d). Postupak imobilizacije se sastoji od jednostavnog inkubiranja rastvora enzima, sa nosaĉem, preko noći uz miješanje, ĉime se dobija TC-PPO. Vezivanje enzima (imobilizacija) se postiže vezivanjem za bakar N, O i S atoma boĉnih aminokiselinskih ostataka na površini enzima (Lonĉar i Vujĉić, 2011). Ovako dobijen biokatalizator je testiran za uklanjanje halogenfenola u šaržnom reaktoru i pokazao je izuzetan potencijal uklanivši skoro u potpunosti p-CP i p-BP iz sintetiĉke otpadne vode. Tokom sinteze DEAE-celuloze pored dietilaminoetil grupa ostaje nekoliko procenata rezidualnih amino grupa koje su primarno derivatizovane epihlorhidrinom u korišćenoj proceduri (Smith i Gillespie, 1989). Ovo se dešava zato što su DEAE grupe sterno zaštićenije i s toga manje reaktivne od primarnih amina pa neke od njih ostanu neizreagovane nakon aktivacije matriksa epihlorhidrinom, ĉime se dobija miješani IMAC/IEX nosaĉ. Epihlorhidrinski distancijali se uvode u DEAE celulozu stvaranjem veze sa azotovim atomom kao što je prikazano na slici 16a. Pod opisanim uslovima OH grupe celuloze su manje reaktivne od NH2, jer je većina “potrošena” u toku sinteze DEAE celuloze, a preostale su manje reaktivne zbog sternih smetnji. Helirajuća grupa, IDA, je ireverzibilno kuplovana na epoksi-aktiviranu DEAE-celulozu (slika 16a-c). Joni bakra formiraju reverzibilne koordinativne veze sa helirajućom grupom time stvarajući TC (slika 16d.). 3.1.3.1 Karakterizacija TC Da bi se polimer bolje opisao neophodno je da mu se odrede fiziĉko-hemijski parametri. Tako je sadržaj vode odreĊen sušenjem u vakuumu do konstantne mase i iznosio je 85%. Koliĉina uvedenih epoksi grupa prije uvoĊenja IDA grupa je odreĊena po metodi Axen et al. (1975) i iznosi 0.144 mmol/g (obraĉunato na suvu masu matriksa). Sadržaj bakra je odreĊen metodom induktivno spregnuta plazma atomskom emisionom spektroskopijom (ICP-AES) i iznosi 7.3110 mg/g (obraĉunato na suvu masu matriksa), što je uporedivo sa komercijalno dostupnim helirajućim matriksim poput Chelating-Sepharose ® . 53 3.1.3.2 Imobilizacija PPO na TC Imobilizacija PPO na TC se postiže reverzibilnim vezivanjem bakra i odreĊenih aminokiselinskih ostataka proteina (ak1-ak3 na slici 16d). U ovom koraku, jon metala može se posmatrati kao elektron-par akceptor (Luisova kiselina) dok se N, O i S atomi aminokiselinskog boĉnog ostatka mogu posmatrati kao elektron-par donori (Luisove baze). Tri aminokiseline moraju biti locirane na površini proteina da bi bile dostupne za koordinativno vezivanje. Ovaj nosaĉ nudi veću fleksibilnost, a samim tim i dostupnost supstrata vezanom enzimu u poreĊenju sa konvencionalnin nosaĉima ovog tipa sa mnogo kraćim distancijalima. Koristeći djelimiĉno preĉišćenu PPO pod datim uslovima imobilizacije (Poglavlje 4.1.3.2) dobijen je biokatalizator TC-PPO kome je odreĊena specifiĉna aktivnost od 310 000 U/g suvog nosaĉa. 3.1.3.3 Uticaj pH i temperature rastvora na aktivnost TC-PPO Ispitivan je uticaj temperature i pH rastvora na aktivnost TC-PPO. Svi drugi parametri reakcije su održavani konstantnim, dok je temperatura varirana u opsegu od 0 do 95ºC, a pH u opsegu od 4.3 do 10. Dobijeni eksperimentalni rezultati za uticaj poĉetnog pH na brzinu oksidacije supstrata L-DOPA su prikazani na slici 17. Ovi rezultati pokazuju da je TC-PPO aktivan prema L-DOPA u širem opsegu pH u poreĊenju sa rastvornom PPO. pH optimum za TC-PPO iznosi 7,0 ̶ 8,0. Ovo predstavlja radnu pogodnost, jer je pH blisko neutralnom pH poželjno za uklanjanje halogenfenolnih efluenata. Kako pKa vrijednosti za p-BP i p- CP na 25ºC iznose 9.37 i 9.41, respektivno (Lideed, 2005), efikasnost njihovog uklanjanja pomoću TC-PPO će se smanjivati sa porastom pH do 9,5 i ovo je pripisano formiranju konjugovanih baza p-BP i p-CP koje ne dozvoljavaju da fenolna jedinjenja djeluju kao vodonik donori. 54 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80 100 Rastvorna PPO TC-PPO R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) pH Slika 17. Uticaj pH rastvora na brzinu oksidacije L-DOPA rastvornom i imobilizovanom PPO. Na slici je prikazana relativna aktivnost rastvornog enzima i TC-PPO pri ĉemu je najvećoj aktivnosti dodijeljena vrijednost 100%. Grafik zavisnosti aktivnosti TC-PPO od temperature rastvora je prikazan na slici 18. OdreĊivanje temperaturnog optimuma je dalo sliĉne krive i za rastvornu i za imobilizovanu PPO. 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Rastvorna PPO TC-PPO R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Temperatura (oC ) Slika 18. Uticaj temperature rastvora na brzinu oksidacije L-DOPA rastvornom i imobilizovanom PPO. Na slici je prikazana relativna aktivnost rastvornog enzima i TC-PPO pri ĉemu je najvećoj aktivnosti dodijeljena vrijednost 100%. 55 Kao što se sa grafika vidi, aktivnost PPO, a samim tim i njena sposobnost da oksiduje fenolna jedinjenja je najveća na 25ºC. Povišena temperatura ima negativan efekat na aktivnost PPO; ipak, imobilizovani enzim pokazuje 34% zaostale aktivnosti na 90ºC. Izlaganje niskim temperaturama bi trebalo da uspori enzimsku reakciju, ali je TC- PPO ipak pokazao skoro 100% aktivnosti na 0ºC pod opisanim uslovima eseja. Ovo je još jedna interesantna karakteristika TC-PPO, jer ukazuje na to da nije potrebno regulisanje temperature za primjenu u velikim reaktorima, što predstavlja znaĉajnu uštedu energije. 3.1.3.4 Uticaj detergenta na aktivnost TC-PPO Otpadna voda je ĉesto kontaminirana detergentima, kako iz industrije, tako i iz gradskih kanalizacija, pa je potrebno ispitati efikasnost biokatalizatora u njihovom prisustvu (Prigione et al., 2008). Ispitivana je stabilnost TC-PPO i PPO u prisustvu natrijum-dodecilsulfata u opsegu koncentracija 0,1-1,0% (w/V). Khan i saradnici (2006) su pokazali da PPO imobilizovana na Celite pokazuje veću otpornost ka denaturaciji indukovanoj SDS detergentom u odnosu na rastvorni enzim. Naši rezultati se slažu sa ovim podacima, pošto je stabilnost imobilizovanog oblika lako uoĉljiva na grafiku (slika 19), kao i to da dolazi do aktivacije TC-PPO pri koncentraciji SDS od 1%. 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 20 40 60 80 100 120 Rastvorna PPO TC-PPO R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Koncentracija detergenta (m/V %) Slika 19. Uticaj SDS na aktivnost rastvorne i imobilizovane PPO. Na slici je prikazana relativna aktivnost rastvornog enzima i TC-PPO pri ĉemu je poĉetnoj aktivnosti dodijeljena vrijednost 100%. 56 Aktivacija polifenoloksidaza submicelarnim koncentracijama SDS detergenta je dobro poznata osobina ovih enzima i to porijeklom iz biljaka, gljiva i bakterija (Espin i Wichers, 1999; Lopez-Serrano et al., 2002; Moore i Flurkey, 1990). Sa druge strane, SDS denaturiše većinu proteina izazivajući konformacione promjene i tako smanjuje aktivnost rastvornog enzima. Aktivacija imobilizovane PPO može da se objasni ograniĉenim konformacionim promjenama koje bi bile posledica vezivanja male koliĉine SDS koje indukuju aktivaciju enzima. Koncentracija od 1% (m/V) koja indukuje prividnu aktivaciju je 4,25 puta veća od kritiĉne micelarne koncentracije, ali možemo da pretpostavimo da je imobilizovani enzim manje podložan dejstvu detergenta u odnosu na rastvorni enzim, pa je potrebna veća koncentracija detergenta da bi došlo do već opisane aktivacije polifenoloksidaza. Ograniĉene konformacione promjene su direktna osobina imobilizovanih enzima. Inkubacija rastvornog enzima sa 1,0% SDS u trajanju od 1 ĉasa rezultuje gubitkom 77% poĉetne aktivnosti pod istim eksperimentalnim uslovima pod kojim TC-PPO pokazuje prividnu aktivaciju. Moguće je i da prisustvo detergenta pogoduje asosovanju dobijenih polimera u rastvoru i da spreĉava precipitaciju istih po katalizatoru. 3.1.3.5 Ispitivanje upotrebe TC-PPO za uklanjanje halogenfenola Tokom uklanjanja p-BP i p-CP dobijeni su sliĉni rezultati. Pokazano je da je moguće ukloniti više od 90% p-BP za 8 ĉasova pri koncentraciji od 100 mg/L (slika 20). p-CP je uklonjen istom brzinom. Ovaj eksperiment je uraĊen pri konstantnoj temperaturi od 25ºC. pH rastvora je nepromijenjen tokom cijelog eksperimenta. MeĊutim, formiranje boje se zapaža kao promjena od prozirne na poĉetku procesa do braonkaste u toku prva 2-3 ĉasa. Nakon toga dolazi do formiranja tamno braon/crnih precipitata koji predstavljaju polimere oksidovanih halogenfenola. Ovi precipitati se djelimiĉno adsorbuju na biokatalizatoru, a djelimiĉno ostaju u rastvoru. Sa ciljem da se potvrdi oksidacija p-BP i p-CP i kvantifikuje nastali derivat, uraĊena je spektrofotometrijska analiza filtrovanih uzoraka. 57 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 U k la n ja n je h a lo g e n o fe n o la ( % ) Vrijeme (h) p-CP p-BP Slika 20. Uklanjanje halogenfenola (100 mg/L) iz vodenih rastvora upotrebom TC-PPO. Alikvoti su uzimani u vremenskim intervalima i odreĊivana je koncentracija halogenfenola. Nestajanje pikova u spektru tretiranog uzorka u odnosu na spektar poĉetnog uzorka je oĉigledan dokaz uklanjanja halogenfenola (slika 21). Slika 21. UV-Vis spektri tretiranih rastvora p-BP (A) i p-CP (B) (isprekidane linije) u poreĊenju sa spektrima poĉetnih rastvora (puna linija). Opisanim tretmanom koncentracija halogenfenola je smanjena ispod 10 mg/L što je gornja granica odreĊena regulativama za ispuštanje fenolne otpadne vode u otvorene tokove (Yamada et al., 2005). Skoro podjednako uspješan je postupak koji 58 koristi peroksidazu iz gorke tikve (Ashraf i Husain, 2010). Ipak, neki biokatalizatori dobijeni korišćenjem komercijalnih nosaĉa poput Eupergit-a pokazuju mnogo manju efikasnost u uklanjanju halogenfenola kao što je već opisano u odjeljku 3.1.2. Ovi katalizatori mogu da uklone samo 50% of p-BP i 45% fenola (Pramparo et al., 2010; Lonĉar et al., 2011) i ti podaci ukazuju na potrebu za stvaranjem novih nosaĉa i daljim poboljšanjem procesa. 3.1.3.6 Ispitivanje efikasnosti TC-PPO u ponovljenim ciklusima uklanjanja halogenfenola Kako je glavni cilj imobilizacije enzima višestruka upotreba potrebno je ispitati efikasnost imobilizata za uklanjanje halogenfenola u više uzastopnih ciklusa. Za oba testirana jedinjenja imobilizat radi sa efikasnošću od preko 90% u prva tri ciklusa, od kojih svaki traje 8 ĉasova. Nakon šest ciklusa efikasnost uklanjanja p-CP pada na 55%, a za p-BP ona iznosi 60% (slika 22). 1 2 3 4 5 6 0 20 40 60 80 100 U k la n ja n je p -B P ( % ) Broj ciklusa Slika 22. Uticaj ponavljanja ciklusa na efikasnost TC-PPO. Kao što je opisano u Odjeljku 3.1.3.5 uoĉena je akumulacija tamnih precipitata na imobilizatu. Akumulacija precipitata se postepeno povećava iz ciklusa u ciklus i ovo je vjerovatno razlog smanjenja efikasnosti uklanjanja u sledećim ciklusima, pošto precipitat interaguje sa vezanom PPO hidrofobnim interakcijama spreĉavajući 59 pokretljivost enzima, a moguće je da dolazi i do inhibicije, jer precipitat djeluje kao pseudo supstrat (Lonĉar i Vujĉić, 2011). Moguće je da bi se upotrebom kontinualnog reaktora sprijeĉilo akumuliranje produkata reakcije na biokatalizatoru. Neki autori sugerišu primjenu koagulanasa bogatih amino grupama (poput hitozana i polietilenimina) za uklanjanje produkata reakcije (Wada et al., 1993), jer je poznato da obojeni produkti koji nastaju oksidacijom fenola reaguju sa poliaminima. Da bi se vrijeme potrebno za uklanjanje fenola u baĉ reaktoru smanjilo moguća je upotreba koagulanasa, jer bi se uklanjanjem proizvoda dovelo do toga da reakcija teĉe istom brzinom kao na poĉetku reakcije. MeĊutim, tu se javlja problem odlaganja generisanog ĉvrstog otpada, a i cijena procesa raste. Alternativa bi mogla da bude upotreba TC-PPO u kontinualnom reaktoru, jer bi se tako smanjilo kontaktno vrijeme izmeĊu enzima i reaktivnih hinona, ĉime bi se povećao broj ciklusa sa zadovoljavajućom efikasnošću. Iz eksperimenata sinteze novog nosaĉa sa pipcima i njegove primjene za imobilizaciju PPO može se zakljuĉiti da je dobijeni katalizator TC-PPO pokazao pH optimum na 7,0 ̶ 8,0 i temperaturni optimum na 25°C. Imobilizovana PPO pokazuje skoro 100% aktivnosti na 0ºC. TC-PPO je znatno otpornija na denaturaciju indukovanu detergentom natrijum-dodecilsulfatom (SDS) u odnosu na solubilni enzim, a pokazao je i odreĊeni stepen aktivacije ovim detergentom pri koncentraciji od 1%. TC-PPO je testiran u šaržnom reaktoru za uklanjanje p-CP i p-BP iz vodenih rastvora. Postignuto je uklanjanje pomenutih fenola preko 90% pri koncentraciji fenola 100 mg/L. Za oba halogenfenola TC-PPO je pokazao stepen uklanjanja od preko 90% u prva tri ciklusa, nakon ĉega efikasnost opada do 60% nakon šest ciklusa od po 8 ĉasova. 3.2 Uklanjanje boja fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) Da bi se proširio opseg moguće primjene PPO za uklanjanje ksenobiotika, u ovom radu ispitivana je i mogućnost korišćenja djelimiĉno preĉišćenog PPO za uklanjanje 7 razliĉitih, do sada sa ovim enzimom netestiranih tekstilnih boja, kao i tri realna uzorka (industrijska efluenta). Reprezentativne strukture testiranih boja prikazane su na slici 23. Optimizacija procesa obezbojavanja ukljuĉuje ispitivanje uticaja pH, 60 koncentracije PPO i dužine inkubacije. Svi parametri su optimizovani na temperaturi od 25ºC. Slika 23. Strukture boja Reactive blue 52 (A), Congo red (B) i Procion Yellow (C). 3.2.1 Uticaj pH na obezbojavanje tekstilnih boja Oksidativni enzimi koji se ispituju za primjenu uklanjanja ksenobiotika iz otpadnih voda potiĉu iz biljaka, gljiva i bakterija. Poznato je za većinu ovih enzima da pH optimum odreĊen sa uobiĉajenim supstratima za odreĊivanje enzimske aktivnosti ne 61 korelišu sa optimalnim pH za uklanjanje datog ksenobiotika. Objašnjenje za ovu pojavu moguće je potražiti u složenim strukturama ksenobiotika i prisustvu razliĉitih jonizabilnih grupa, ĉije naelektrisanje zavisi od pH sredine, a vezivanje za mjesto za vezivanje supstrata enzima zavisi od naelektrisanja i supstrata i površinskih amino- kiselinskih ostataka. Da li će odreĊeni oksidativni enzim moći da oksiduje odabrane ksenobiotike na datom pH najlakše (i najpouzdanije) se odreĊuje empirijski. Za PPO ispitivanje uticaja pH na efikasnost obezbojavanja uraĊeno je u ĉetiri razliĉita pufera (natrijum-acetat, pH 3,0 i pH 5,0, natrijum-fosfat, pH 7,0 i glicin-natrijum hidroksid, pH 9,0). Nakon 1 ĉasa dobijeni polimerni precipitati su uklonjeni iz rastvora filtracijom na Whatman No.1 papiru, a mjerenjem apsorbancije na karakteristiĉnoj talasnoj dužini odreĊen je sadžaj preostale boje u odnosu na apsorbanciju poĉetnog rastvora koja je raĉunata kao 100%. Rezultati eksperimenata za ispitivanje uticaja poĉetnog pH rastvora na obezbojavanje tekstilnih boja su prikazani u tabeli 4. Tabela 4. Uticaj poĉetnog pH rastvora na obezbojavanje boja sa PPO (424 U/mL). λmax C (mg/L) % zaostale boje* pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 Aminohlorotriazinske boje Procion yellow (PY) 420 65 7 ± 0.46 50 ± 1.06 95 ± 1.15 100 Procion red brown (PRB) 460 50 26 ± 0.86 67 ± 2.60 97 ± 1.2 100 Procion dark blue (PDB) 600 50 47 ± 1.60 93 ± 1.65 100 100 Azo-boje Reactive blue 52 (RB52) 615 50 5 ± 0.17 71 ± 2.15 91 ± 1.24 92 ± 1.7 Reactive green 15 (RG15) 625 100 9 ± 0.31 59 ± 1.69 93 ± 1.0 93 ± 1.2 Reactive yellow 125 (RY125) 390 65 11 ± 0.29 54 ± 1.87 97 ± 0.9 100 Congo red (CR) 522 65 0.5 ± 0.04 5 ± 0.03 83 ± 1.1 90 ± 0.8 *Statistiĉka znaĉajnost potvrĊena je Studentovim t-testom za p<0,05. Postignut je veći stepen obezbojenja na nižim pH vrijednostima, sa maksimumom na pH 3,0. Postoje raniji podaci za maksimalno obezbojavanje razliĉitim biljnim peroksidazama (Akhtar et al., 2005) i mikrobnim polifenoloksidazama (Unyayar et al., 2005) na kiselom pH. Povišavanjem pH na 5,0 stepen obezbojavanja se rapidno smanjuje. Ovo predstavlja prednost za upotrebu pomenutih enzima u tretmanu industrijske obojene vode, kod obojenih otpadnih voda koje su kiseli efluenti (de Souza 62 et al., 2007). U sluĉajevima kada to nisu, bilo koji jeftini izvor kiseline se može koristiti da se pH podesi na 3,0. 3.2.2 Uticaj koncentracije PPO i dužine inkubacije na obezbojavanje Da bi se dobio ekonomski isplativ proces, potrebno je odrediti minimalnu koncentraciju enzima potrebnu za uklanjanje odreĊene boje (de Souza et al., 2007). Varirana je koncentracija enzimske aktivnosti u opsegu od 212 U/mL efluenta do 1700 U/mL efluenta u 50 mM natrijum-acetatnom puferu pH 3,0 na 25ºC 1 ĉas. Stepen obezbojenja je praćen na već opisani naĉin. Histogram prikazan na slici 24. prikazuje uticaj razliĉite koliĉine enzima na obezbojavanje testiranih boja. Efikasnost uklanjanja boja se postepeno povećava sa povećanjem koliĉine dodatog enzima. Slika 24. Nalaženje minimalne koncentracija PPO aktivnosti potrebne za obezbojavanje boja. Za uklanjanje boja pod datim uslovima nije dovoljno 212 U/mL, iako je u sluĉaju boje Congo red otprilike 75% boje uklonjeno. Pri koncentracijama enzima od 424 U/mL dolazi do maksimalnog obezbojavanja boja RB52, RG15, RY125, CR i PY, što znaĉi da dalje povećanje koncentracije enzima nije dalo znaĉajno bolje rezultate. 0 20 40 60 80 100 RB52 RG15 RY125 CR PY PRB PDB % z a o s ta le b o je kontrola 212 U 424 U 848 U 1272 U 1700 U 63 Boje PRB i PDB su pokazale otpornost ka dejstvu PPO i bilo je neophodno utrošiti 1272 U/mL boje da bi se postiglo skoro potpuno obezbojenje za 1 ĉas (slika 24). Obezbojavanje tekstilnih boja krompirovom fenoloksidazom je ispitivano i u zavisnosti od vremena reakcije (rezultati nisu prikazani). Pojava obojenih precipitata je uoĉena već nakon 15 minuta u sluĉaju boja RB52, RG15 i CR, dok je kod drugih boja precipitat postepeno nastajao tokom jednog sata. U opisanim uslovima nije dobijeno znaĉajno povećanje obezbojenja inkubiranjem dužim od 1 ĉasa. Postoji znaĉajna prednost u obezbojavanju koje se postiže precipitaticijom, u odnosu na obezbojavanje bez precipitacije (dobijaju se rastvorni produkti, uglavnom sluĉaj kod peroksidaza i lakaza). Prednost se ogleda u tome da je u prvom sluĉaju ukupan sadržaj organskog ugljenika znaĉajno smanjen, dok u drugom sluĉaju ukupan sadržaj ugljenika ostaje nepromijenjen. 3.2.3 Vis i FTIR spektrometrijska analiza tekstilnih efluenata tretiranih sa PPO Sem optimizacije procesa obezbojavanja, karakterizacija proizvoda dobijenih reakcijom enzimske oksidacije ksenobiotika je neophodna kako bi se utvrdilo narušavanje strukture koja ih ĉini opasnim, a to su reaktivne grupe i hromofore. U tom smislu uraĊene su spektrofotometrijske analize poĉetnih obojenih rastvora i rastvora nakon enzimskog tretmana, kao i analiza dobijenih polimernih precipitata infracrvenom spektroskopijom. Tekstilni efluenti sakupljeni u lokalnoj bojari tekstila analizirani su spektrofotometrijski samo u vidljivoj oblasti, jer se karakteristiĉni apsorpcioni pikovi za hromofore boja nalaze u ovoj oblasti (slika 25). Nakon tretmana, znaĉajno smanjenje apsorpcije (nestajanje pikova) je uoĉljivo u ĉitavom vidljivom regionu. Ovo je rezultat degradacije hromofornih grupa prisutnih u bojama (Akhtar et al., 2005). Iako su efluenti nepoznatog sastava (jer su industrijske smješe boja poslovna tajna), logiĉno je pretpostaviti da su neke od induvidualno testiranih boja prisutne u efluentima (ili boje sliĉnih struktura). Tretman ovih efluenata enzimom rezultovao je kao i kod pojedinaĉnih boja formiranjem nerastvornog, obojenog precipitata koji nastaje spontanom polimerizacijom hinona, što dovodi do agregacije aromatiĉnih zagaĊivaĉa (Khan i Husain, 2007). Tretman boja i fenola enzimima daje nerastvorne agregate koje je 64 moguće lako odvojiti iz smješe (Akhtar et al., 2005; Lonĉar et al., 2012; Wada et al., 1995). Slika 25. Vidljivi spektri tretiranih i netretiranih efluenata. Spektri polaznih rastvora su prikazani punom linijom, a spektri tretiranih rastvora isprekidanom. A) roze efluent, B) braonkast efluent, C) tamno zeleni efluent. Analiza FTIR spektara poĉetne boje RB52 i produkta koji nastaje njenom oksidacijom sa PPO pokazuje nestanak nekih pikova koji se uoĉavaju u poĉetnom jedinjenju i pojavu novih pikova u dobijenom proizvodu (slika 26). Slika 26. FTIR spektri: gornji spektar prikazuje boju RB52, dok donji prikazuje spektar osušenog precipitata dobijenog nakon tretmana RB52 sa PPO. 65 Spektar produkta sa širokim trakama ukazuje na formiranje polimera tokom reakcije obezbojavanja. Nekoliko važnih traka nedostaje u spektru proizvoda, kao što su traka na 1580 cm -1 za N=N istežuće vibracije (Telke et al., 2010), kao i traka na 1188 cm-1 za fenolna C-O istezanja. Uoĉljive nove trake na 1640 cm-1 i 1530 cm-1 mogu biti pripisane o-hinonskim C=O i C=N istežućim vibracijama, respektivno. Trake za sulfo- i amino- grupe, kao i one karakteristiĉne za aromatiĉni prsten su prisutne i u spektru poĉetne boje i u spektru proizvoda oksidacije. Novi pikovi u FTIR spektru proizvoda u poreĊenju sa RB52 ukazuju na formiranje polimera. Sliĉni rezultati su dobijeni prilikom oksidativne polimerizacije α-naftola i katehola kada se koristi lakaza (Aktas et al., 2000, 2003). Kako su sliĉni rezultati dobijeni i za ostale ispitivane boje u ovoj disertaciji, prikazan je samo jedan, ilustrativni rezultat. Postojanje dvije izoforme u preparatu PPO (slika 11, odjeljak 3.1.1) može da bude odgovorno za široki spektar boja koje PPO može da oksiduje. Autori koji su ranije ispitivali upotrebu PPO (Khan i Husain, 2007) su koristili djelimiĉno preĉišćenu PPO dobijenu frakcionisanjem sirovog ekstrakta taloženjem amonijum-sulfatom, što nije primjenjivo u industriji zbog visoke cijene amonijum-sulfata i potrebe za njegovim uklanjanjem iz preparata. Za potrebe izuĉavanja molekulskog mehanizma oksidacije boja svakako je neophodno koristiti potpuno preĉišćeni enzim i ĉist preparat boje. Iz eksperimenata uklanjanja boja rastvornom PPO može se zakljuĉiti da je pod optimizovanim uslovima 93-99.9% boja uklonjeno nakon tretmana u trajanju od 1 ĉas sa 424-1700 U/mL PPO, zavisno od boje. pH optimum za proces obezbojavanja za sve boje je 3,0. Korišćeni enzim je sposoban da ukloni sve testirane boje i da obezboji testirane efluente bez upotrebe medijatora. Obezbojavanje je postignuto uz formiranje nerastvornih polimera koji su uklonjeni filtrovanjem ili centrifugiranjem. Formiranje polimera potvrĊeno je infracrvenom spektroskopijom. 3.3 Uklanjanje ksenobiotika bakterijskom lakazom U ovoj studiji je testirano oko 100 sojeva Bacillus sp. izolovanih iz poljoprivrednog i industrijskog zemljišta, termalnih izvora, slanih izvora, kravljeg mlijeka, krompira itd. Izolovani sojevi Bacillus sp. su odgajeni na sporulacionoj 66 podlozi i dobijene spore su testirane na lakaznu aktivnost. Kod jedanaest sojeva je detektovana lakazna aktivnost na površini spora korišćenjem supstrata ABTS i siringaldazina što se zajedno sa nemogućnošću da se oksiduje tirozin smatra dovoljnim dokazom da se radi o lakazi (Majeau et al., 2010). Testirani enzimi su inhibirani azidom, a prividno inhibirani tiolnim jedinjenjima (𝛽-merkaptoetanol, L-cistein, ditiotreitol) koja zapravo ometaju stvaranje ABTS radikala (Johannes i Majcherzyk, 2000). Izolovani sojevi su identifikovani korišćenjem metode sekvenciranja 16S rDNA. 3.3.1 Identifikacija izolovanih sojeva i dobijanje spora iz različitih Bacillus sp. Testiranje potencijala bakterijskih lakaza za tretman otpadne vode se obiĉno izvodi upotrebom ĉitavih spora. Ovo je posledica rigoroznog procesa izolovanja enzima iz spora koji rezultuje dobijanjem male koliĉine aktivnog enzima. Prilikom jednog od pokušaja izolovanja lakaze iz spora dobijen je prinos od samo 6% od poĉetne aktivnosti (Held et al., 2005). MeĊutim, autori Claus i Filip (1997) su pokušali ekstrakciju lakaze iz spora Bacillus sphaericus tretmanom enzimima, kiselinom, bazom, detergentima, organskim rastvaraĉima i sonifikacijom i nijedna od isprobanih metoda nije dala rezultat. Ekstrakt spore dobijen sa izoamilalkoholom je bio pozitivan na lakaznu aktivnost. Nakon centrifugiranja aktivnost je detektovana samo u talogu, ĉime je pokazano da je lakaza vezana za ostatke spora (što su potvrdili i mikroskopijom). Iz ovoga se može zakljuĉiti da izolovanje lakaze iz spora nije moguće/isplativo, pa je ovu lakazu moguće koristiti ili kao ĉitave spore ili je proizvesti rekombinantnom heterologom ekspresijom ĉime bi se dobio rastvorni enzim. Slika 27. Preparat spora obojenih po Šefer-Fultonu. 67 Sojevi su zasijani u Petrijevim šoljama sa sporulacionom podlogom i inkubirani 4 dana na 37 ºC. Nakon toga spore su sakupljene sa sporulacione podloge. Potvrda o prisustvu spora i odsustvu vegetativnih ćelija dobijena je bojenjem po Šefer-Fultonu. Preparat je posmatran pod svjetlosnim mikroskopom (slika 27). Na slici se uoĉavaju spore zelene boje. 3.3.2 Provjera prisustva lakazne aktivnosti u sporama Bacillus sp. UraĊena je pretraga spora koje eksprimiraju aktivnu lakazu na površini spora u mikrotitar ploĉicama koristeći ABTS na pH 4,0 (0,1 M acetatni pufer) i na pH 7,0 (0,1 M fosfatni pufer). Pretraga je uraĊena na 37ºC. Aktivne spore oksiduju ABTS koji mijenja boju iz svijetlo zelene u tamno zeleno/plavu. Uoĉava se da neki sojevi pokazuju aktivnost i na pH 7 i na pH 4, ali je promjena boje intenzivnija na pH 4 što se slaže sa publikovanim podacima (Cho et al., 2011; Martins et al., 2002; Reiss et al., 2011). Testiranjem svih sojeva dobijeno je devet sojeva koji su pokazali najvišu aktivnost. To su sojevi 12B1, MB 20, BBS 14, MB 7, MB 24A, MB 5B, MB 17B, MB 22A, MB 16B i BBS 6. Ovi sojevi su testirani sa siringaldazinom (SGZ) na pH 4 i pH 7. Aktivnost je detektovana u svim sojevima na pH 7, što je u saglasnosti sa publikovanim podacima (Claus, 2003). 3.3.2.1 Dobijanje pojedinačnih kolonija Bacillus sp. Dobijanje pojedinaĉnih kolonija Bacillus sp. je uraĊeno metodom razblaženja tako što su aktivne spore zasijane na hranljivom agaru, a dobijene pojedinaĉne kolonije presijane na sporulacionu podlogu; nakon inkubacije na 37ºC, 4 dana, skupljene su spore. 3.3.2.2 Određivanje aktivnosti lakaza Lakazna aktivnost je odreĊena za spore dobijenih pojedinaĉnih kolonija sojeva Bacillus sp. Od svakog soja je testirano 2-6 dobijenih pojedinaĉnih kolonija. Jedinica enzimske aktivnosti je izražena kao ona koliĉina enzima koja katalizuje transformaciju 68 1 µmol supstrata u minuti. Specifiĉna aktivnost je izražena u U/g, odnosno aktivnost po jedinici mase suvih spora. Korišćeni supstrati su ABTS i SGZ. Esej je raĊen na pH 4 za ABTS i pH 7 za SGZ na temperaturi od 60ºC. Rezultati su prikazani u tabeli 5. Formula za izraĉunavanje enzimske aktivnosti (U/g) je: 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 = 𝐴 ∙ 𝑉𝑠𝑚𝑗𝑒š𝑒 ∙ 𝑅 𝑒 ∙ 𝑙 ∙ 𝑚 A ̶ apsorbancija, V ̶ zapremina reakcione smješe, e ̶ ekstinkcioni koeficijent, l ̶ debljina kivete, m ̶ masa suvih spora, R ̶ razblaženje. Tabela 5. Aktivnost lakaza iz spora dobijenih pojedinaĉnih kolonija sojeva Bacillus sp. Soj Aktivnost (U/g) ABTS Aktivnost (U/g) SGZ 12B1 1037 93 BBS 14 970 80 BBS 6 400 26 MB 16B 260 15 MB 17B 500 40 MB 20 650 29 MB 22A 400 54 MB 24A 1080 100 MB 5B 400 30 MB 7 460 14 Najaktivniji sojevi su 12B1, BBS14 i MB24a. Oni su korišćeni u daljim eksperimentima. 3.3.3 Identifikacija izolovanih sojeva Bacillus sp. Najĉešće korišćeni genski marker za prouĉavanje bakterijske filogenije i taksonomije je 16S rDNA gen, tj. njegova sekvencija. Ovaj gen spada u grupu ,,ĉuvarkuća“ (eng. housekeeping) gena. To su obiĉno geni koji se konstitutivno 69 eksprimiraju i neophodni su za odvijanje osnovnih ćelijskih funkcija. Gen 16S rDNA kodira 16S ribozomalnu RNA koja ulazi u sastav 30S male subjedinice prokariotskih ribozoma i njena veliĉina je oko 1,5 kbp. Razlozi za odabir 16S rDNA gena za genski marker su: (1) prisutan je kod skoro svih bakterija, (2) njegova funkcija se nije promijenila tokom vremena, sugerišući da su nasumiĉne promjene sekvencije dobar pokazatelj vremenske udaljenosti vrsta (evolucije) i (3) sekvencija ovog gena dužine 1500 bp je dovoljno velika za potrebe bioinformatiĉke analize. Za potrebe taksonomske identifikacije sojeva kao templat DNA korišćena je hromozomska DNA izolovana iz prekonoćnih kultura odabranih sojeva metodom ekstremno brzog izolovanja DNA (Cheng i Jiang, 2006). UraĊen je PCR za 16S rDNA gen tri najaktivnija soja, BBS 14, 12B1 i MB 24A. Korišćeni su prajmeri koji su specifiĉni za rod Bacillus (Lane 1991). Gen 16S rDNA je umnožen lanĉanom reakcijom polimerizacije (PCR) u 30 ciklusa sa standardnim prajmerima 20F (5’- GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’) i 1492R (5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3'). Temperatura hibridizacije prajmera (aniling temperatura, eng. annealing) je 45ºC. Proizvodi PCR reakcije su analizirani elektroforetski na 1% agaroznom gelu. Nakon završene elektroforeze PCR produkti su isjeĉeni iz gela i ekstrahovani rastvorom iz Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) komercijalnog kita, a zatim preĉišćeni hromatografski na kolonici (iz istog kita). Ekstrahovani produkti su sekvencirani. Na osnovu fenotipskih karakteristika i 16S rDNA homologije sekvencija, izolatima BBS14, 12B1 i MB24a je potvrĊena pripadnost rodu Bacillus, a sva tri soja su po homologiji pripadnici vrste B.amyloliquefaciens (99% sliĉnosti). Pored toga, generisano je filogenetsko stablo dobijenih 16S rDNA sekvencija korišćenjem sekvencija dostupnih u Ribosomal Database Project (URL:https://rdp.cme.msu.edu). Sa filogenetskog stabla se uoĉava srodnost sa ostalim sojevima B.amyloliquefaciens, kao i evolutivna bliskost ovih sojeva sa sojevima B.subtilis (slika 28). Sojevi B.amyloliquefaciens, kao i izolovani sojevi se nalaze na kraćim granama u odnosu na sojeve B.subtilis što ukazuje na genetsku udaljenost ove dvije vrste. MeĊutim kako razmjernik oznaĉava skalu vjerovatnoće od 0,001 supstitucije po nukleotidu, onda proizilazi zakljuĉak da su vrste B.subtilis i B.amyloliquefaciens veoma bliske i da je za neke sojeve, na osnovu ove metode, teško reći o kom soju se radi. 70 Slika 28. Filogenetska analiza sekvencija za 16S rDNA gena sojeva BBS14 i MB24a i druge srodne Bacillus vrste. Brojevi na mjestima grananja oznaĉavaju procenat “bootstrap sampling”, dobijenog od 1000 replika. B.licheniformis YW1258 je korišćen kao vangrupna vrsta (eng. outgroup), da bi se ukazalo na udaljenost prethodnog grananja evolutivnog stabla. 3.3.4 Karakterizacija lakaza 3.3.4.1 Određivanje pH optimuma lakaza Optimalna temperatura i pH vrijednost sredine su glavni limitirajući faktori za primjenu enzima u bilo kojoj grani biotehnologije, tako da je jedan od prvih koraka u provjeri podobnosti enzima za odreĊenu primjenu, u ovom sluĉaju uklanjanje ksenobiotika, odreĊivanje pH optimuma. On je odreĊen za sojeve MB 24A i BBS 14. Rezultati su prikazani na slici 29. 3 4 5 6 7 8 -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 A k ti v n o s t (U /g ) pH BBS 14 MB 24a A 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 A k ti v n o s t (U /g ) pH BBS 14 MB 24a B Slika 29. Ispitivanje zavisnosti aktivnosti lakaze od pH vrijednosti rastvora. Korišćeni su supstrati ABTS (A) i SGZ (B). Sa grafika se vidi da se optimalno pH za aktivnost lakaza mijenja u zavisnosti od supstrata i iznosi 4 za ABTS, odnosno 6,5 za siringaldazin, što je u skladu sa 71 publikovanim podacima (Cho et al., 2011; Koschorreck et al., 2008; Lu et al., 2011; Martins et al., 2002; Reiss et al., 2011; Wang et al., 2011). Ovaj podatak nam govori da pH optimum odreĊen za karakteristiĉni supstrat ne može da nas uputi na pogodno pH za uklanjanje ksenobiotika, jer se radi o složenim strukturama sa jonizabilnim grupama koje o(ne)mogućavaju prilaz mjestu za vezivanje supstrata na površini enzima ili aktivnom mjestu enzima, pa je pH optimum potrebno empirijski odrediti. Optimizaciju procesa je moguće uraditi za pojedinaĉne, specifiĉne sluĉajeve, mada to nije održiv naĉin rada. Rješenje problema može se naći u upotrebi enzimskih koktela razliĉitih pH i temperaturnih optimuma, kao i supstratnih specifiĉnosti. 3.3.4.2 Određivanje temperaturnog optimuma lakaza Temperaturni optimum je odreĊen u opsegu od 25-100ºC pri ĉemu je korišćen supstrat ABTS. RaĊeno je sa 0,1 M acetatnim puferom, pH 4 (optimalno pH). Rezultati za tri testirana soja su predstavljeni grafiĉki na slici 30. 20 30 40 50 60 70 80 90 100 100 200 300 400 500 600 700 800 A k ti v n o s t (U /g ) Temperatura ( o C) BBS 14 MB 24a Slika 30. Zavisnost aktivnosti lakaza na sporama sojeva BBS14 i MB24A od temperature. Temperaturni optimum lakaza je u sluĉaju sojeva BBS14 i MB24a 65ºC, dok je u sluĉaju soja 12B1 znatno viši, 80-85ºC. Temperaturni optimum lakaza iz raznih vrsti Bacillus sp. varira od 40 ºC do 85 ºC, a njihov pregled je dat u tabeli 6. 72 Tabela 6. Uporedni prikaz temperaturnih optimuma testiranih sojeva i literaturnih vrijednosti za srodne vrste. Soj temp.opt. (ºC) Forma enzima Referenca Bacillus sp. ADR 40 Ekstraćel. sekr. Telke et al., 2010 B. sphaericus 60 Spore Claus i Filip 1997 B.licheniformis LS04 60 Spore Lu et al., 2011 B. subtilis WD23 60 Spore Wang et al., 2011 B.amyloliquefaciens BBS14 65 Spore Ova disertacija B.amyloliquefaciens MB24a 65 Spore Ova disertacija B. pumilus 70 Rekombinantni Reiss et al., 2011 B. subtilis 75 Spore i rekomb. Martins et al., 2002 B.subtilis 75 Rekombinantni Pereira et al., 2009 B.subtilis DB104 80 Spore (rekomb.) Cho et al., 2011 B.amyloliquefaciens 12B1 80 Spore Ova disertacija B.licheniformis DSM13 85 Rekombinantni Koschorreck et al., 2008 Za sojeve BBS 14 i MB 24a možemo zakljuĉiti da pokazuju umjereno visoke temperaturne otpimuma, a kako je vrijednost za najviši temperaturni optimum dobijena za soj B.amyloliquefaciens 12B1, on je odabran za kloniranje i ekspresiju lakaze u E.coli. Dalja karakterizacija spora ovog soja je uraĊena uporedo sa rekombinantno dobijenim enzimom (Poglavlje 3.4.4). 3.3.4.3 Ispitivanje dejstva inhibitora na aktivnost lakaza sojeva BBS14 i MB24a Ispitivana su dejstva razliĉitih reagenasa na aktivnost enzima. Za ispitivanje uticaja inhibitora korišćeni su klasiĉni lakazni inhibitori: dinatrijum- etilendiamintetraacetat (Na2EDTA), L-cistein (L-cys), natrijum-azid (NaN3), ditiotreitol (DTT), askorbinska kiselina i NaCl. Ovi reagensi heliraju Cu 2+ jone, modifikuju aminokiselinske ostatke i mijenjaju konformaciju enzima. Finalne koncentracije inhibitora su bile 1 mM, osim EDTA (10 mM) i NaCl koji je ispitan u koncentracijama od 0,2, 0,5 i 1 M. RaĊeno je na optimalnom pH za ABTS 73 (pH 4,0) i temperaturi od 37ºC. Rezultati su prikazani na slici 31. kao procenat rezidualne aktivnosti u odnosu na kontrolu. ED TA 1M Na Cl 0,5 M N aCl 0,2 M N aCl Na- azid L-c ys DTT C-v itam in 0 10 20 30 40 50 60 70 80 R e z id u a ln a a k ti v n o s t (% ) BBS14 MB24a Slika 31. Uticaj inhibitora i razliĉitih koncentracija NaCl na aktivnost lakaze. Rezultati pokazuju da su lakaze potpuno inhibirane prisustvom DTT, L-cys i askorbinske kiseline (slika 31). Jak inhibitorni efekat DTT, L-Cys i askorbinske kiseline odgovara ranije opisanim inhibitornim efektima na lakaze gljiva i bakterija (Forootanfar et al., 2011; Lu et al., 2011; Telke et al., 2010). Kako je lakaza ukotvljena u omotaĉ spore, koji se sastoji od velikog broja umreženih proteina (Hullo et al., 2001), rezistentnost na dejstvo metalnih helatora (EDTA) se može objasniti sternom zaštitom jona bakra koji ĉine aktivna mjesta lakaze (Lu et al., 2011). Lakazna aktivnost u prisustvu 10 mM EDTA je inhibirana 25% za soj MB24a i 30% za soj BBS14 (slika 31), što je uporedivo sa lakazom iz soja Bacillus ADR (Telke et al., 2010) koja je inhibirana 30% u prisustvu dva puta manje koncentracije EDTA (5mM). Neki sojevi, poput B.licheniformis LS04 (Lu et al., 2011) pokazuju potpunu rezistenciju na dejstvo EDTA (10mM), kao i lakaza 12B1 (odjeljak 3.4.4). 74 Proces industrijskog bojenja zahtjeva prisustvo elektrolita u rastvoru boje. Neutralni elektroliti poput NaCl su neophodni da bi se postiglo veliko iskorišćenje boje. U bojenju pamuka koncentracija NaCl se kreće od 25-30g/L (~0,5 M) za tamnije tonove i oko 15 g/L za svjetlije tonove, ali u nekim sluĉajevima može da bude i do 50 g/L (Fibre2Fashion, internet stranica). Jedna od glavnih prepreka za primjenu lakaza u tretmanu voda je rad u prisustvu velike koncentracije hlorida (Jimenez-Juarez et al., 2005). Lakaza iz B.licheniformis LS04 (Lu et al., 2011) ima relativnu aktivnost od 105% u prisustvu 0,5 M NaCl i 78% u prisustvu 1M NaCl. Sliĉno, bakterijska lakaza klonirana iz morskog metagenoma zadržava poĉetnu aktivnost u prisustvu 1M NaCl (Fang et al., 2011), dok je većina lakaza iz gljiva inaktivirana NaCl u koncentracijama većim od 100 mM zbog njihove inherentne osjetljivosti ka halidima (Jimenez-Juarez et al., 2005). Visoka rezistencija lakaze na sporama ka NaCl predstavlja prednost, jer efluenti iz tekstilne i sliĉnih industrija obiĉno imaju visoki sadržaj soli (Fang et al., 2011). 3.3.4.4 Ispitivanje uticaja organskih rastvarača na aktivnost lakaza Kako se u otpadnoj vodi mogu naći neki organski rastvaraĉi (prilikom proizvodnje boja ili ispuštanjem efluenata nakon bojenja „vat“ bojama, rastvornih u organskim rastvaraĉima), potrebno je ispitati uticaj organskih rastvaraĉa na aktivnost lakaze. Druga industrijska primjena lakaze koja zahtjeva rezistentnost na organske rastvaraĉe bila bi organska sinteza ili sinteza nekih farmaceutika. Od organskih rastvaraĉa ispitan je uticaj acetona, metanola, etanola i dimetilsulfoksida (DMSO) pri finalnim koncentracijama od 25% i 50%. Smješa je po dodatku rastvaraĉa inkubirana 30 min na sobnoj temperaturi nakon ĉega je dodat ABTS (Wang et al., 2011). Posle 10 min inkubiranja na 37ºC, odreĊena je rezidualna aktivnost. Rezultati su prikazani na slici 32. kao procenat rezidualne aktivnosti u odnosu na kontrolu. 75 metanol etanol aceton DMSO 0 10 20 30 40 50 60 R e z id u a ln a a k ti v n o s t (% ) BBS14 MB24a A metanol etanol aceton DMSO 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 R e z id u a ln a a k ti v n o s t (% ) BBS14 MB24a B Slika 32. Ispitivanje uticaja organskih rastvaraĉa na lakaznu aktivnost u koncentracijama od 25% (A) i 50% (B). Nestabilnost lakaze (i uopšteno enzima) u organskim rastvaraĉima se pripisuje deformaciji proteinske strukture kao posledica hidrofobnog efekta ili zamjene molekula vode molekulima rastvaraĉa u aktivnom mjestu enzima. Enzimske reakcije u prisustvu organskih rastvaraĉa bi omogućile pristup u vodi nerastvornim supstratima, što bi pomoglo u detoksifikaciji mnogih otpornih zagaĊivaĉa (Torres et al., 2003). Pokazano je da se neke bakterijske lakaze aktiviraju prisustvom organskih rastvaraĉa pri koncentraciji od 20% (Lu et al., 2011), dok je za neke pokazano da ih metanol snažno inhibira (Wang et al., 2011). Lakaza soja MB24a pokazuje veću rezistenciju na dejstvo rastvaraĉa pri koncentraciji od 25% u poreĊenju sa lakazom soja BBS14. MeĊutim, pri koncentraciji rastvaraĉa od 50% lakaza BBS14 zadržava veći procenat poĉetne aktivnosti. 3.3.4.5 Temperaturna stabilnost lakaza Temperaturna stabilnost enzima je važan parametar za industrijsku primjenu. OdreĊena je temperaturna stabilnost lakaze na 50°C i 65°C. Zaostala aktivnost je odreĊivana ABTS-om na pH 4. Rezultati su prikazani na slici 33. 76 0 50 100 150 200 250 300 350 400 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Vrijeme (min) MB 24A.1 BBS 14.1 A 0 50 100 150 200 250 300 350 400 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Vrijeme (min) MB 24A.1 BBS 14.1 B Slika 33. Ispitivanje temperaturne stabilnosti lakaza na 50ºC (A) i 65ºC (B). Vidi se da je vrijeme poluživota enzima na 50ºC oko 4 ĉasa, dok je na 65ºC oko 1 ĉas, što lakaze ovih sojeva svrstava meĊu umjereno termostabilne enzime. 3.3.5 Primjena lakaza u obezbojavanju Za testiranje primjene cijelih spora sa lakaznom aktivnosti u obezbojavanju korišćene su boje indigo carmine (IC), Congo red (CR) i Reactive black 5 (RB 5). Koncentracija boja iznosila je 50 mg/mL. Testirano je obezbojavanje u zavisnosti od poĉetnog pH. Stepen obezbojavanja je prikazan u tabeli 7. Kao što se vidi testirane spore pokazuju visoku efikasnost u uklanjanju boje Congo red na blago kiselom i neutralnom pH, dok su boje Indigo carmin i RB5 slabo podložne dejstvu lakaza. Tabela 7. Uticaj poĉetnog pH rastvora na obezbojavanje testiranih boja sa lakazama na sporama sojeva MB24A i BBS 14. λmax C (mg/L) % zaostale boje pH 3,0 pH 4,5 pH 5,7 pH 6,5 pH 8,0 MB 24A Indigo carmine (IC) 610 50 74,67 99,39 97,05 98,22 86,53 Reactive black 5 (RB5) 603 50 53,14 94,32 98,85 100 100 Congo red (CR) 565/495 50 83,09 38,15 13,83 23,74 78,87 BBS 14 Indigo carmine (IC) 610 50 72,39 100 99,06 95,94 76 Reactive black 5 (RB5) 603 50 52,36 92,8 98,49 100 99,03 Congo red (CR) 565/495 50 85,81 19,26 12,47 23,27 73,59 77 Najveća efikasnost za Congo red je dobijena pri pH 5,7 i iznosi nešto više od 85% obezbojenja, tj. zaostaje 13-14% boje u rastvoru. 3.3.6 Primjena lakaza za uklanjanje fenola Testirana je mogućnost lakaza da uklanjaju fenol u prisustvu 0,5 mM ABTS-a kao medijatora (Kurniawati i Nicell, 2007). Uklanjanje fenola je testirano pri koncentraciji od 25 mg/L na pH 4 i 6 nakon 6 sati inkubiranja. Rezultati su prikazani na slici 34. pH 4,0 pH 6,5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 U k la n ja n je f e n o la ( % ) MB 24A BBS 14 Slika 34. Uklanjanje fenola (25 mg/L) na pH 4 i 6,5 sa ABTS medijatorom (0,5mM). Procenat uklanjanja je veći na pH 4 u odnosu na pH 6. Sliĉni podaci su publikovani u literaturi, gdje je uklanjanje fenola u prisustvu ABTS-a bolje pri kiselim uslovima (pH 3-6) (Kurniawati i Nicell, 2007). Testirano je i uklanjanje fenola pri većim koncentracijama fenola (50 mg/L i 100 mg/L) nakon 20 ĉasova inkubiranja, na pH 4. Rezultati su prikazani na Tabeli 8. Testirane lakaze su postigle uklanjanje fenola u prisustvu ABTS-a kao medijatora, naroĉito pri ekvimolarnoj i višoj koncentraciji medijatora. Test sa 100 µM ABTS-om nije dao rezltat (nije prikazano), što se slaže sa literaturnim podacima, gdje je pokazano da se fenoli bolje uklanjaju pri ekvimolarnim i većim koncentracijama medijatora u odnosu na fenol (Kurniawati i Nicell, 2007). 78 Tabela 8. Uklanjanje fenola pri koncentracijama od 50 i 100 mg/L fenola i 0,5 mM medijatora (ABTS). uklanjanje fenola (%) Konc.fenola (mg/L) MB 24A BBS 14 50 47.0 42.5 100 31.0 35.5 3.4 Uklanjanje ksenobiotika rekombinantno proizvedenom lakazom iz soja B.amyloliquefaciens 12B1 eksprimiranoj u E. coli BL21 Zahvaljujući visokom redoks potencijalu bakra tipa I, lakaze iz gljiva imaju mnogo prednosti za komercijalnu primjenu u odnosu na biljne i bakterijske enzime. MeĊutim, enzimi iz gljiva imaju i nekoliko nedostataka, kao što su spori rast gljiva, a time i spora produkcija i poteškoće u kontrolisanju glikozilovanja pri rekombinantnoj produkciji (Rodgers et al., 2010). Zbog toga je u okviru ove disertacije ispitana mogućnost rekombinantne produkcije lakaze kloniranjem Lacc gena iz soja B.amyloliquefaciens 12B1 za ĉiju je lakazu iz omotaĉa spora pokazano da ima temperaturni optimum 80ºC (Poglavlje 3.4.4). Sa aspekta isplativosti redizajniranja enzima, bakterijske lakaze iz roda Bacillus (Hullo et al., 2001; Koschorreck et al., 2008) su pogodnije za genetske manipulacije od lakaza iz gljiva (Koschorreck et al., 2009). Sem toga, bakterijske lakaze pokazuju veću termostabilnost, izmeĊu ostalog i zato što su asocirane sa omotaĉem spore (Martins et al., 2002). Bakterijski ekspresioni sistemi i tehnike dirigovane evolucije su dobro razvijeni, pa bakterijske lakaze mogu da posluže kao model sistem za razvijanje procesa obezbojavanja, delignifikacije i uklanjanje ksenobiotika iz otpadne vode. Lakaza prirodno imobilizovana na sporama Bacillus sp. ima prednost da ne zahtjeva dodatne korake za imobilizaciju i pokazuje veliku stabilnost, ali ipak u ovom obliku niju potpuno primjenjiva za tretman otpadnih voda. Sporulacija zahtjeva gajenje bakterija na sporulacionoj podlozi nekoliko dana, a prinos enzimske aktivnosti je mali. Mogućnost prelaska spora u vegetativni oblik, a samim tim i prestajanje postojanja 79 lakazne aktivnosti i nekontrolisan rast bakterija u otpadnoj vodi su dodatni razlozi za rekombinantnu produkciju lakaza. Sa ciljem dobijanja željenog enzima u većoj koliĉini, korisno je produkovati enzime iz Bacillus sp. u poznatom bakterijskom domaćinu. Za ove svrhe, E. coli je najjednostavniji i jedan od najĉešće korišćenih mikroorganizama (Baneyx i Mujaĉić, 2004, Puertas i Betton, 2009). E. coli ekspresioni sistem se dugo koristi za produkciju aktivnih enzima i unutarćelijski i vanćelijski (Baneyx, 1999, Pines, 1999). Zbog toga je u okviru ove disertacije razvijena proizvodnja rekombinantne lakaze kloniranjem Lacc gena u ekspresioni vektor pET21a i heterologom u E. coli. Tako proizvedeni rekombinantni enzim je okarakterisan i ispitana je njegova primjena u uklanjanju ksenobiotika. 3.4.1 Kloniranje Lacc gena u ekspresioni vektor pET21a Ekspresioni pET sistem je razvijen za potrebe kloniranja i ekspresije rekombinantnih proteina u E. coli. Ciljani geni se kloniraju u pET plazmide (slika 35) pod kontrolom jakih bakteriofagnih T7 transkripcionih i (opciono) translacionih signala; ekspresija se indukuje obezbjeĊivanjem izvora T7 RNA polimeraze u ćeliji domaćinu. T7 RNA polimeraza je selektivna i aktivna toliko da, kada je potpuno indukovana, skoro svi resursi ćelije se aktiviraju za potrebe ekspresije ciljnog gena. U izuzetnim sluĉajevima, željeni produkt ĉini i do 50% ukupnih ćelijskih proteina nekoliko sati nakon indukcije. Nivo ekspresije je moguće umanjiti jednostavnim smanjenjem doze inducera, ĉime se povećava prinos solubilnog proteina. Važna prednost pET sistema je mogućnost da održi gen transkripciono tihim kada inducer nije prisutan. Gen od interesa se prvo klonira korišćenjem sojeva koji ne sadrže gen za T7 RNA polimerazu, tako eliminišući nestabilnost plazmida koja je posledica produkcije proteina potencijalno toksiĉnih za ćeliju. Kad se potvrdi uspješno kloniranje ciljanog gena u pET plasmid u ne-ekspresionom domaćinu, moguće je indukovati ekspresiju na dva naĉina. Jedan je inficiranje domaćina sa λCE6, fagom koji nosi gen za T7 RNA polimerazu pod kontrolom λpL i pI promotora, a drugi (danas mnogo ĉešći) naĉin je transfer plazmida u ekspresioni soj koji sadrži hromozomsku kopiju T7 RNA polimeraznog gena pod lacUV5 kontrolom. U drugom sluĉaju, ekspresija se indukuje dodatkom izopropil-β-D- 1-tiogalaktopiranozida (IPTG) u bakterijsku kulturu (Sambrook i Russell, 2001). 80 Slika 35. Mapa pET21a vektora sa uvećanim mjestom za kloniranje inserta. Pvi korak u kloniranju je bio izolovanje hromozomske DNA iz prekonoćne kulture B.amyloliquefaciens 12B1 koja je korišćena kao DNA templat. Za umnožavanje gena za lakazu PCR reakcijom korišćeni su prajmeri dizajnirani prema lakazi iz B.amyloliquefaciens DSM7 iz NCBI baze podataka (Gene ID: 9780652), kao i prajmeri za lakazu iz B.licheniformis (Koschoreck, 2008). Korišćeni prajmeri sa dodatim nukleotidima za kasniju digestiju restrikcionim enzimima i optimizovana aniling temperatura su dati su tabeli 9. Tabela 9. Lista prajmera korišćenih u eksperimentima umnožavanja DNA fragmenta. Podvuĉeni nukleotidi su mjesta prepoznavanja od strane restrikcionih enzima. Ime prajmera Sekvencija Restr. enzim Referenca Kosc Fw CGGTGCATATGAAACTTGAAAAATTCGTTGACCGGC NdeI Koschorreck, 2008. Kosc Rev CGTCGAATTCTTATTGATGACGAACATCTGTCACTTC EcoRI Koschorreck, 2008. CotA Fw GCA CAT ATG ATG GCA CTT GAA AAA TTT GC NdeI Ova disertacija CotA Rev ACT GAA TTC TTA CTG CTT TTC TGT GAC GTC EcoRI Ova disertacija 81 Reakcioni uslovi za PCR su optimizovani korišćenjem Taq DNA polimeraze (porijeklom iz Thermus aquaticus) (DreamTaq, Fermentas) po uputstvu proizvoĊaĉa. PCR reakcije su uraĊene korišćenjem gradijent PCR aparata. Vrijeme trajanja polimerizacije, tj. elongacije zavisi od dužine produkta i iznosi otprilike 1min/kbp za Taq polimerazu i 2min/kbp za Pfu polimerazu (Sambrook i Russell, 2001). Nakon optimizacije reakcionih uslova, polimerizacija je raĊena sa Pfu polimerazom (Fermentas), koja daja PCR proizvod sa slijepim krajevima. Ove polimeraze posjeduju ,,proofreading” aktivnost, pa je vjerovatnoća unošenja greške mnogo manja u odnosu na Taq DNA polimerazu. Prilikom optimizovanja PCR reakcije uraĊeno je testiranje razliĉitih aniling temperatura korišćenjem gradijent PCR mašine. Dobijeni su PCR proizvodi korišćenjem novodizajniranih prajmera; fragmenti odgovaraju masi izmeĊu 1,5-2 kbp (slika 36). Sa slike 36. se uoĉava da prajmeri za lakazu iz B.licheniformis ne daju proizvod ni na jednoj od ĉetiri razliĉite testirane aniling temperature (50, 55,5, 60 i 65ºC), dok prajmeri dizajnirani na osnovu pretpostavljenog gena iz soja B.amyloliquefaciens DSM7 daju najintenzivniju traku kada se za annealing temperaturu uzme 55,0ºC (položaj 7 na gelu), dok za temperature 53,0ºC i 57,0ºC daju trake slabijeg intenziteta (položaji 6 i 8 na gelu). U daljem radu korišćen je program sa temperaturom hibridizacije prajmera na 55,0ºC. Slika 36. Elektroforetska analiza dobijenih PCR fragmenata korišćenjem dva para prajmera za lakazu (molekulski markeri ̶ traka 1; PCR reakcija sa Kosc Fw/Kosc Rev prajmerima ̶ trake 2- 5; PCR reakcija sa CotA Fw/CotA Rev prajmerima ̶ trake 6-8). 82 Za potrebe kloniranja u pET21a ekspresioni vektor potrebno je proizvesti PCR proizvod sa lepljivim krajevima kako bi se favorizovala reakcija ligacije sa T4 DNA ligazom. Lepljivi krajevi se dobijaju digestijom PCR proizvoda i vektora sa restrikcionim enzimima. U ovoj disertaciji korišćen je pristup direkcionog kloniranja, tj. korišćena sa dva razliĉita restrikciona enzima koja daju razliĉite lepljive krajeve ĉime se izbjegava da se fragment insertuje u vektor u pogrešnoj orijentaciji. Digestija PCR proizvoda restrikcionim enzimima je ĉesto problematiĉan korak u kloniranju, jer restrikcioni enzimi pokazuju daleko manju efikasnost na PCR proizvodu u odnosu na plazmid (Sambrook i Russell, 2001). Zbog toga je u ovoj disertaciji korišćen postupak subkloniranja, tj. kloniranja fragmenata umnoženih Pfu ili KOD polimerazom (koje daju slijepe krajeve) u linearizovani vektor sa slijepim krajevima nakon ĉega je uraĊena digestija restrikcionim enzimima. Umnoženi Lacc fragmenti su klonirani u pJET1.2/blunt vektor koji je zatim korišćen za transformaciju E. coli Top10 ćelija. Vektor pJET1.2/blunt (slika 37) je linearizovani vektor za kloniranje koji prihvata inserte od 6 bp do 10 kbp. PCR produkti sa slijepim krajevima dobijeni nekom od ,,proofreading” DNA polimeraza mogu direktno da se koriste za ligaciju. Svi standardni sojevi E. coli mogu da se transformišu ovim vektorom. Recirkulisani pJET1.2/blunt vektor eksprimira letalni restrikcioni enzim nakon transformacije. Rezultat toga je da samo rekombinantni klonovi koji sadrže željeni insert rastu na selektivnom medijumu. Slika 37. Mapa pJET1.2/blunt vektora sa uvećanim mjestom za insertovanje PCR produkta. 83 Transformisane ćelije su zasijane na selekcionu podlogu sa ampicilinom. Pozitivni klonovi su odgajeni u prekonoćnim kulturama i iz njih je izolovan plazmid korišćenjem komercijalnog kita. UraĊena je provjera prisustva gena u plazmidu tako što je nakon dvostruke restrikcione digestije sa parom enzima EcoRI//NdeI reakciona smješa elektroforetski analizirana. Plazmidi koji su bili pozitivni na prisustvo inserta od 1,5 kbp su sekvencirani. Analizom dobijene sekvencije potvrĊeno je da klonirani gen kodira lakazu koja ima najviše sliĉnosti sa genima za lakazu drugih sojeva B.amyloliquefaciens (slika 2). Korišćenjem alatke “Konzervirani Domeni” dostupnoj na NCBI serveru (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) uraĊena je analiza dobijene sekvencije za lakazu i time je potvrĊena pripadnost Citohrom C oksidaznoj superfamiliji, odnosno prisustvo tri konzervirana domena karakteristiĉna za Cu- oksidaze (slika 38). Slika 38. PoreĊenje sekvencije dobijenog Lacc gena sa NCBI bazom podataka i korišćenje programskog paketa za pronalaženje konzerviranih domena. Dobijeni rezultat pokazuje da klonirani gen kodira enzim koji pripada COX2 superfamiliji proteina. Slika je dobijena korišćenjem Conserved domains search alatke NCBI servisa (URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) Za potrebe kloniranja u ekspresioni vektor izolovani plazmid pJET1.2-Lacc je digestovan parom restrikcionih enzima NdeI/EcoRI. Reakciona smješa je elektroforetski razdvojena, pa je traka koja odgovara genu za lakazu ekstrahovana iz gela. Istim parom restrikcionih enzima digestovan je i vektor pET21a, koji je takoĊe preĉišćen elektroforezom i ekstrakcijom iz gela (slika 39). 84 Slika 39. Restrikciona digestija Lacc gena i pET21a da bi se dobili “lepljivi krajevi” neophodni za ligaciju T4 DNA ligazom. UraĊena je ligacija Lacc gena i linearizovanog pET21a vektora korišćenjem T4 DNA ligaze. Ligaciona smješa je korišćena za transformaciju elektrokompetentnih E.coli TOP10 ćelija. Nakon selekcije pozitivnih klonova na LBamp ploĉama i ColonyPCR provjere prisustva inserta, uraĊeno je izolovanje plazmida i ekspresionim vektorom pET21a-Lacc transformisane su E. coli BL21 ćelije. Dobijeni klonovi su provjereni selekcijom na LBamp ploĉama, kao i ColonyPCR metodom (slika 40). Slika 40. ColonyPCR provjera pozitivnih klonova E. coli BL21 pET21a-Lacc. 85 3.4.2 Ispitivanje ekspresije rekombinantne lakaze Pet pozitivnih klonova E. coli BL21 pET21a-Lacc je testirano da bi se uporedili nivoi ekspresije lakaze. Korišćen je 0,25 mM IPTG za indukciju ekspresije kada kultura dostigne OD ~1, pri ĉemu je dodavan i 2 mM CuSO4 (finalna koncentracija) da bi se omogućilo dobijanje nativnog enzima (Koschorreck, 2009). Nakon liziranja ćelijskog taloga ultrazvukom uraĊeno je odreĊivanje lakazne aktivnosti i potvrĊeno da klon 5 ima najveći nivo ekspresije (Tabela 10), što odgovara rezultatima dobijenim u ColonyPCR eksperimentima (slika 40). Tabela 10. PoreĊenje aktivnosti lakaze produkovane razliĉitim klonovima. Oznaka klona Relativna aktivnost (%) 1 46,43 2 67,86 4 64,28 5 100,00 6 53,57 3.4.2.1 Ispitivanje uticaja koncentracije Cu2+ jona na ekspresiju lakaze Ekspresija rekombinantne lakaze se pospješuje dodatkom egzogenog bakra i smanjenjem temperature (Koschorreck et al., 2008). Pokazano je da je samo jedan dio eksprimiranog enzima katalitiĉki aktivan, vjerovatno zbog nedovoljne intraćelijske koncentracije bakra (Koschorreck et al., 2008). Povećanje intraćelijske koncentracije bakra dodatkom egzogenog bakra je ograniĉeno toksiĉnim efektom bakra. Za neke bakterijske rekombinante lakaze moguće je uraditi rekonstituisanje neaktivnog enzima inkubiranjem sa jonima bakra ili dijalizom prema rastvoru koji sadrži jone bakra (Li et al., 2007), a za neke druge poput CotA iz B.licheniformis to nije moguće (Koschorreck et al., 2008). U ovom radu ispitivan je uticaj koncentracije dodatih Cu 2+ jona prilikom indukcije ekspresije IPTG-om. Ispitivan je uticaj dodatih Cu 2+ jona u opsegu 0,2 ̶ 4 mM, pri ĉemu je najveća pokazana razlika izmeĊu najmanje (0,2 mM) i najveće korišćene 86 (4,0 mM) koncentracije Cu 2+ jona ̶ dobijeno je dvostruko povećanje enzimske aktivnosti. Nasuprot Koschorreck et al. (2008) rezultatima gdje je dodati bakar toksiĉan u koncentracijama većim od 2 mM, u našem sluĉaju najveća aktivnost dobijena je korišćenjem 4 mM CuSO4. 3.4.3 Izolovanje i prečišćavanje rLac iz E. coli BL21 pET21a-Lacc Rekombinantna lakaza je djelimiĉno preĉišćena homogenizacijom ćelijskog taloga ultrazvukom, rasoljavanjem i jednim hromatografskim korakom na koloni Q- Sepharose, ĉime je postignuto uklanjanje ćelijskih komponenti koje bi mogle da interferiraju u eksperimentima obezbojavanja. Aktivne frakcije su spojene i koncentrovane liofilizacijom i naknadnim rastvaranjem. Ovako pripremljen preparat lakaze je korišćen za dalju karakterizaciju lakaze i eksperimente uklanjanja ksenobiotika. Koristeći ABTS supstrat, odreĊena je aktivnost polupreĉišćene lakaze i ona iznosi 0,235 U/mL, što približno odgovara aktivnosti referentnog enzima, lakaze iz T.versicolor (0,291 U/mL). 3.4.4 Određivanje biohemijskih parametara korišćenih lakaza Kao što je napomenuto u odjeljku 3.3.4.1, prije moguće primjene enzima za potrebe biotehnologije, neophodno je odrediti im pH i temperaturni otpimum. OdreĊeni su parametri za lakaze na sporama soja 12B1 (sLac) i rekombinantno dobijene lakaze kloniranjem gena koji kodira lakazu iz soja B.amyloliquefaciens 12B u E. coli Bl 21 (rLac), kao i za referentnu lakazu iz gljive Trametes versicolor (TvLac) i za rekombinantnu hloroperoksidazu (CPO) iz gljive Caldariomyces fumago proizvedenoj u Aspergillus niger. Za sLac i TvLac pH optimum iznosi 4,0, dok je pH optimum za rLac pomjeren u odnosu na nativni enzim za ĉitavu pH jedinicu i iznosi 5,0, mada je manje definisan i kreće se u intervalu 4-6, sa maksimum na pH 5 (slika 41). Ovo može biti posledica drugaĉijeg ponašanja lakaze kada se ne nalazi ukotvljena u proteinski omotaĉ spore. 87 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) pH sLac rLac Slika 41. Ispitivanje pH optimum rekombinantno proizvedene lakaze (rLac) i lakaze na sporama soja 12B1 (sLac). Temperaturni optimumi sLac i rLac znaĉajno odudaraju od temperaturnih optimuma TvLac i CPO. Temperaturni optimum za CPO je 35 ºC (http://www.brenda- enzymes.info), a za TvLac se kreće oko 50ºC, dok je temperaturni optimum za sLac i rLac 85ºC. 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Temperatura ( o C) rLac sLac Slika 42. Ispitivanje zavisnosti enzimske aktivnosti od temperature rekombinantno proizvedene lakaze (rLac) i lakaze na sporama soja 12B1 (sLac). Iako sLac i rLac imaju približno iste profile zavisnosti aktivnosti od temperature (slika 42), uoĉava se da rLac pokazuje veću aktivnost na 100ºC. Po pitanju temperaturne stabilnosti, kod TvLac i CPO dolazi do potpune inaktivacije enzima već nakon inkubiranja od 15 min na 50ºC, dok je poluživot rLac 88 mnogo duži kako na 50ºC (nije prikazano), tako i na 65ºC i 80ºC (slika 43). Poluživot lakaze iz soja 12B1 se poklapa sa poluživotom lakaze na sporama prirodnog izolata Bacillus SF (Held et al., 2005). Temperaturna stabilnost rLac je mnogo veća u odnosu na sLac. Na slici 43A uoĉava se blaga aktivacija rLac na poĉetku inkubiranja na 65ºC, nakon ĉega slijedi pad aktivnosti. Proteinski omotaĉ prividno smanjuje aktivnost sLac, pa je porast aktivnosti na poĉetku inkubacije moguće objasniti konformacionim promjenama u proteinskom omotaĉu koje za kratko vrijeme omogućavaju veći kontakt enzim-supstrat (Martins et al., 2002), nakon ĉega dolazi do denaturacije proteina. Iz ovih eksperimenata ne možemo da kažemo da li rLac zaista ima veću termostabilnost ili je sLac prividno manje termostabilan zbog denaturacije proteinskog omotaĉa koji kolabira i onemogućuje kontakt sLac i supstrata. Visoka termostabilnost rLac bi mogla da omogući njenu upotrebu za direktan tretman toplih efluenata odmah nakon ispuštanja (kod bojenja direktnim bojama), što bi omogućilo povratak vruće vode u proces, a samim tim i znaĉajnu uštedu energije. 0 20 40 60 80 100 120 30 40 50 60 70 80 90 100 110 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Vrijeme (min) sLac rLac A 0 10 20 30 40 50 60 70 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 R e la ti v n a a k ti v n o s t (% ) Vrijeme (min) rLac sLac B Slika 43. Temperaturna stabilnost rekombinantno proizvedene lakaze (rLac) i lakaze na sporama soja 12B1 (sLac). (A) 65 ºC, (B) 80 ºC. Uticaj inhibitora je ispitivan pod istim uslovima koji su opisanu u odjeljku 3.3.4.3. Na slici 44. dat je uporedni prikaz rezultata dobijenih za sLac i rLac. Testirani enzimi pokazuju izuzetnu rezistenciju na dejstvo 10 mM EDTA, 90% za rLac i 100% rezidualne aktivnosti za sLac. MeĊu publikovanim podacima, samo lakaza soja B.licheniformis LS04 (Lu et al., 2011) pokazuju isti stepen rezistencije na EDTA. 89 ED TA 1M Na Cl 0,5 M N aCl 0,2 M N aCl Azi d L-c ys DTT 0 20 40 60 80 100 R e z id u a ln a a k ti v n o s t (% ) rLac sLac Slika 44. Ispitivanje uticaja inhibitora i razliĉitih koncentracija hloridnih jona (NaCl) na aktivnost rekombinantno proizvedene lakaze (rLac) i lakaze na sporama soja 12B1 (sLac). U odnosu na lakaze sojeva BBS14 i MB24a, sLac i rLac pokazuju manju rezistenciju na velike koncentracije hloridnih jona, pri ĉemu rLac zadržava ~40% aktivnosti, dok sLac zadržava 20-30% aktivnosti. Pokazana je potpuna inhibicija L- cisteinom i ditiotreitolom, kao i za lakaze sojeva BBS14 i MB24a. MeĊutim, sLac pokazuje specifiĉnu osobinu-rezistenciju na inhibiciju azidnim jonom, dok pri istoj koncentraciji lakaza koju opisuju Lu et al. (2011) zadržava samo 23% aktivnosti. 3.4.5 Primjena rekombinantno proizvedene lakaze u obezbojavanju U ovim eksperimentima korišćena je djelimiĉno preĉišćena rekombinantno proizvedena lakaza i referentna lakaza iz T.versicolor proizvedena fermentacijom na sladnom ekstraktu. Kako se radi o ekstracelularnom enzimu, on nije preĉišćen, već je koncentrovan 10x, liofilizacijom i naknadnim rastvaranjem. Enzimske aktivnosti su iznosile 0,235 U/mL za rLac i 0,291 U/mL za TvLac. Korišćene su boje RB52, RG15 i 90 PDB pri koncentraciji boje od 50 mg/L, a ispitivan je uticaj pH na efikasnost obezbojavanja na 37ºC sa mućkanjem na 150 o/min. Već nakon 1 ĉasa primjećuje se nestanak boje u rastvorima PDB i RB52. Snimljeni su UV-Vis spektri, a najbolji rezultati koji su dobijeni su prikazani na slikama 45 i 46. 200 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm)A 300 400 500 600 700 800 0 1 2 B A p s o rb a n c ija (nm) Slika 45. UV/Vis spektri boja RB52 (A) i PDB (B) snimljeni nakon tretmana lakazama u toku 1h na pH 4,0. Kontrola (isprekidana linija), uzorak tretiran rLac (puna linija), uzorak tretiran TvLac (taĉkasta linija). 200 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm) A 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm) B Slika 46. UV/Vis spektri boja RB52 (A) i PDB (B) snimljeni nakon tretmana lakazama u toku 20h na pH 4,0. Kontrola (isprekidana linija), uzorak tretiran rLac (puna linija), uzorak tretiran TvLac (taĉkasta linija). Rekombinantna lakaza, za razliku od lakaze iz T.versicolor nije bila u stanju da obezboji boju RG15 na pH 4 (slika 47A). MeĊutim, ono što je zanimljivo je rezultat koji je dobijen na pH 7, pri ĉemu lakaza iz T.versicolor nije mogla da oksiduje boje RB52 i PDB, a rLac je oksidovala sa približno istom efikasnošću kao i na pH 4 (prikazan je spektar samo za eksperiment sa RB52, slika 47B). Ovo je još jedan od podataka koji 91 govori u prilog bakterijskim lakazama, jer iako je nivo produkcije ovih enzima znatno manji u odnosu na gljivne, ipak razlike u supstratnoj specifiĉnosti i pH i temperaturnim optimumima mogu omogućiti ovim enzimima primjenu tamo gdje to nije moguće uraditi sa gljivnim enzimima, a to je upravo na neutralnom i nešto baznijem pH. 200 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm) A 200 300 400 500 600 700 800 0 1 2 3 A p s o rb a n c ija  (nm) B Slika 47. UV/Vis spektri boja RG15 (A) i RB52 (B) snimljeni nakon tretmana lakazama u toku 20h na pH 7,0. Boja RG15 je tretirana na pH 4, a RB52 na pH 7. Kontrola (isprekidana linija), uzorak tretiran rLac (puna linija), uzorak tretiran TvLac (taĉkasta linija). 3.5 Uklanjanje ksenobiotika peroksidazom iz rena (Armoracia rusticana) 3.5.1 Hromatografsko frakcionisanje izoformi peroksidaze Kako se za potrebe komercijalne upotrebe HRP (dijagnostika, imuno eseji, obilježavanje proteina i sl.) koristi bazna izoforma HRP, jedan od ciljeva ovog rada bio je testiranje baznih i kiselih izoformi kako bi se našla moguća primjena kiselih izoformi HRP (koje se u procesu preĉišćavanja HRP-C izoforme odbacuju). Dobijeni podaci mogu da budu zanimljivi i sa aspekta fundamentalne enzimologije, jer pokazuju razliĉitu supstratnu specifiĉnost ovih izoenzima i ukazuju na to da se vjerovatno mjesta za vezivanje supstrata razlikuju, a moguće je i da zbog razliĉitog stepena glikozilacije pristup supstratu nije isti. Preparat peroksidaze dobijen po ranije opisanoj proceduri (Vujĉić, 2002) je rasoljen na koloni Sephadex-a G 25. Rasoljeni uzorak je frakcionisan na koloni XK 16/10 Q-Sepharose FF, ekvilibrisanoj u 5 mM natrijum fosfatnom puferu pH 7,1 χ=594 92 μS/cm2. Sakupljana je nevezana frakcija, a vezane peroksidaze su eluirane 0,5 M NaCl u istom puferu. Dobijene frakcije su analizirane izoelektriĉnim fokusiranjem (IEF) u pH gradijentu od 3 do 10, na poliakrilamidnom gelu. Razdvojene peroksidaze su detektovane zimogramski reakcijom sa gvajakolom i vodonik peroksidom. Peroksidaze se uoĉavaju kao braon obojenje na IEF gelu, a intenzitet boje odgovara zastupljenosti odgovarajućih izoformi (slika 48). Na osnovu rezultata zimograma frakcionisanih peroksidaza iz poĉetnog preparata može se zakljuĉiti da je frakcija k1 kisela peroksidaza zadovoljavajuće preĉišćenosti (slika 48, uzorak k1), pa je korišćena za dalji rad. Bazne frakcije b1 i b2 su kontaminirane kiselim izoformama (uoĉavaju se u donjem dijelu gela), s toga je za dalji rad bilo neophodno njihovo rehromatografisanje. Frakcija b1 je korišćena za rehromatografiju. Sakupljene su ĉetiri nevezane frakcije (b1.1, b1.2, b1.3, b1.4). Eluiranje je nastavljeno sa 0,5 M NaCl u istom puferu i sakupljena je jedna frakcija kiselih peroksidaza (k3). Slika 48. Zimogramska detekcija peroksidaza frakcionisanih na koloni Q-Sepharose FF. (A) b1- bazne peroksidaze 1, b2-bazne peroksidaze 2, k1- kisele peroksidaze 1, k2- kisele peroksidaze 2, P- poĉetni preparat peroksidaze. (B) rehromatografisanje frakcije b1 na Q-Sepharose FF. b1.1- b1.4- sakupljene frakcije baznih peroksidaza, k3- kisele peroksidaze 3. (-)=pI 10, (+)=pI 3. Analitiĉkim izoelektriĉnim fokusiranjem i zimogramskom detekcijom pri istim uslovima je provjerena efikasnost rehromatografije frakcije b1 (slika 48B). Na 93 zimogramu (slika 48B) su uoĉava smanjen udio kisele izoforme peroksidaze u frakcijama baznih peroksidaza. OdreĊena je peroksidazna aktivnost u frakcijama dobijenim rehromatografisanjem frakcije b1. Rezultati su prikazani u tabeli 11. Tabela 11. Enzimska aktivnost preĉišćenih izoformi peroksidaza na koloni Q-Sepharose FF. b1 ̶ prva nevezana frakcija, b2 ̶ druga nevezana frakcija, k1 ̶ prva eluirana frakcija sa 0,5 M NaCl, k2 ̶ druga eluirana frakcija sa 0,5 M NaCl. P ̶ poĉetni preparat peroksidaze. Enzimska aktivnost frakcija dobijenih rehromatografisanjem frakcije b1. b1.1 ̶ prva nevezana frakcija, b1.2 ̶ druga nevezana frakcija, b1.2 ̶ treća nevezana frakcija, b1.4 ̶ ĉetvrta nevezana frakcija, k3 ̶ frakcija eluirana sa 0,5 M NaCl. Preĉišćene frakcije Rehromatografisane frakcije Oznaka frakcije Enzimska aktivnost (U/mL) Oznaka frakcije Enzimska aktivnost (U/mL) b1 71,58 b1.1 78,64 b2 34,4 b1.2 85,55 k1 7,2 b1.3 79,2 k2 12,0 b1.4 13,89 P 133,2 k3 11,58 U daljem radu su korišćene frakcije k1 kao glavne kisele peroksidaze (KP) i b1.1 kao glavne bazne peroksidaze (BP). BP je razblaživana 10 x za dalji rad, kako bi jedinice enzimske aktivnosti glavnih baznih i glavnih kiselih peroksidaza bile približno izjednaĉene (7,2 U/mL za KP i 7,89 za BP). 3.5.2 Poređenje efikasnosti izoformi HRP za uklanjanje tekstilnih boja Za potrebe poreĊenja KP i BP testirane su azo boje (RB52, RG15, CR, MO, RBBR), kisela diazo boja (AB) i predstavnik aminohlorotriazinskih boja (PDB). Rad je zapoĉet obezbojavanjem RB 52 (Drimaren blue X-3LR), koja spada u kategoriju reaktivnih boja, pri razliĉitim reakcionim uslovima. Nakon toga sniman je vidljiv spektar reakcione smješe sa najvećim obezbojavanjem. Rezultati obezbojavanja su prikazani na slici 49. 94 pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 100 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SPP SP B Slika 49. Obezbojavanje RB52 u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja RB52 na pH 5,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SPP- rastvor RB52 sa H2O2, SP- rastvor RB52. Sa slike 49. možemo da zakljuĉimo da je najbolje obezbojavanje postignuto na pH 5,0 i pH 7,0 dejstvom BP i KP (100%). Na osnovu spektra obezbojavanja RB52 na pH 7,0 prikazanog na slici 6, vidi se da je uticaj H2O2 na boju primjetan, ali nedovoljan za potpunu dekolorizaciju. Vidljiv je nestanak karakteristiĉnog 𝐴𝑚𝑎𝑥 625 , odnosno došlo je do promjene hromogene grupe boje. Za postizanje 99% obezbojavanja RB52 po literaturnim podacima je potrebno zagrijavanje reakcione smješe na 35°C i veća koncentracija H2O2 (0,55 mM) (da Silva et al., 2011). U našem testu to nije dalo najbolji rezultat, već je bila dovoljna temperatura od 25°C i finalna koncentracija H2O2 od 0,44 mM. Razlike je moguće objasniti time da je Silva (2011) koristio komercijalni preparat peroksidaze, a u dobijenom stepenu obezbojavanja vjerovatno ima udjela i veća koncentracije peroksida. Na slici 49B se uoĉava znaĉajan uticaj vodonik-peroksida na obezbojavanje RB52. Sliĉni rezultati dobijeni su i sa RG 15 (Drimaren green X-2BL), slika 50, koja takoĊe spada u kategoriju reaktivnih boja. Kao što se sa slike 51 vidi najbolje obezbojavanje (98%) je postignuto dejstvom KP na pH 5,0. Na osnovu spektra vidljivo je smanjenje karakteristiĉnog 𝐴𝑚𝑎𝑥 615 uslijed djelovanja KP. Oĉigledno je i ovdje došlo do promjene u strukturi hromogene grupe RG 15. Ipak, uoĉavamo veliku specifiĉnost KP za obezbojavanje RG 15, u odnosu na BP, pri istim reakcionim uslovima. 95 pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 50. Obezbojavanje RG 15 u zavinosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja RG 15 na pH 5,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor RG15. Ovo je prva potvrda da isti preparat HRP može da ima razliĉitu efikasnost zavisno od sadržaja prisutnih izoformi u preparatu koji je korišćen u reakciji obezbojavanja. Ovo je nametnulo potrebu daljih testiranja efikasnosti KP i BP u obezbojavanju razliĉitih boja, pri istim reakcionim uslovima. Prva u tom nizu je bila boja ĉija je struktura nepoznata, sa komercijalnim imenom Procion dark blue (PDB) i koja pripada aminohlorotriazinskim bojama. Ova boja se pokazala veoma podložnom djelovanju HRP. Bilo je potrebno svega 5 minuta da doĊe do vidljivog nestanke boje (slika 51). Nakon 1 ĉasa procenat obezbojavanja je iznosio 99% dejstvom KP na pH 5,0 i 98% na pH 7,0. I ovdje je potvrĊena razliĉita supstratna specifiĉnost BP i KP prema boji. pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 100 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 51. Obezbojavanje PDB u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja PDB na pH 5,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor PDB. 96 Na spektru prikazanom na slici 51B vidljiv je gubitak karakteristiĉnog 𝐴𝑚𝑎𝑥 600 . Uticaj dodatog H2O2 na obezbojavanje rastvora PDB je zanemarljiv. U okviru degradacije kiselih diazo boja ispitivano je obezbojavanje boje Amido black 10B (AB), koja se pokazala kao veoma podložna obezbojavanju pod uticajem HRP u širem opsegu pH (slika 52). Dejstvom BP i smešom KB i BP postignuto je 92% obezbojavanje AB 10B. pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 52. Obezbojavanje AB u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja AB na pH 9,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor AB. Osim smanjenja 𝐴𝑚𝑎𝑥 620 vidljiva je i promjena spektra derivata boje nakon djelovanja HRP (pomeranje Amax na 490nm – hipsohromni efekat), slika 52B. Obezbojavanje Amido crne 10b na pH 5,0 je u skladu sa dosadašnjim literaturnim podacima tretiranja ove boje sa HRP (80-90%). 92% obezbojenje na pH 5,0 dejstvom HRP je postignuto (Onder et al., 2011), ali tek na 500C. Metil Orange-MO (Acid Orange 52) spada u kategoriju azo boja. Najbolje obezbojenje (87%) je postignuto KP na pH 7,0 (slika 53). Proces obezbojavanja je praćen hipsohromnim efektom 𝐴𝑚𝑎𝑥 460 . Visok stepen obezbojenja MO je postignut i na pH 5,0 (84%). Obezbojavanje MO na pH većem od pH 5,0 nije u skladu sa dosadašnjim rezultatima, koji prikazuju smanjenje efikasnosti obezbojavanja sa porastom pH. Hemijski modifikovanom HRP je postignuto obezbojavanje MO na pH većem od 3,0 (Liu et al., 2006). Potpuno uklanjanje MO je postignuto peroksidazom iz Momordica charantia samo uz dodatak medijatora (Akhtar et al., 2005). Problem 97 ostajanja medijatora u rastvoru nakon obezbojavanja ĉini da ovaj rezultat ima samo teorijski, ali ne i praktiĉni znaĉaj. pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 100 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 53. Obezbojavanje MO u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja MO na pH 7,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor MO. U obezbojavanju reaktivnih azo boja ima najviše problema, pa je dio naših napora usmjeren na prikupljanje što većeg broja ovakvih boja i testiranje efikasnosti njihovog obezbojavanja. Remazol brilliant blue R (Reactive blue 19, RBBR) je jedna od ĉesto testiranih azo-boja. Nakon 5 minuta nestanak boje je bio vidljiv (gubitak karakteristiĉne plave boje). Nakon 15 minuta obezbojenje je iznosilo na pH 5,0 84%, slika 54. pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 100 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 54. Obezbojavanje RBBR u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja RBBR na pH 7,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor RBBR. 98 Sa spektra prikazanog na slici 54, vidljivo je znaĉajno smanjenje 𝐴𝑚𝑎𝑥 595 (praktiĉno njegovo nestajanje) usled delovanja KP. Postignuto obezbojavanje Remazol brilliant blue je u skladu sa dosadašnjim literaturnim podacima (da Silva et al., 2011), sa razlikom što reakciona smeša nije inkubirana na 35°C i koncentracija H2O2 je bila veća. Obezbojavanje Remazol brilliant blue u našim eksperimentima je postignuto na temperaturi 25°C pri finalnoj koncentraciji H2O2 0,44 mM. TakoĊe dobijeni rezultati su u suprotnosti sa inhibicijom HRP RBBR na pH većim od 6,0 (Bhunia et al., 2001). Rezultati dobijeni sa RBBR su utoliko znaĉajniji, jer se zna da mogućnost degradacije ove boje koreliše sa mogućnošću degradacije polihlorovanih bifenila (PCB) (Chroma et al., 2002). Kongo crveno (Congo red - CR) je takoĊe diazo boja, ali sa benzidinskim jezgrom, slika 23B. Koristi se prevashodno u industriji bojenja celuloznih vlakana. pH 3 pH 5 pH 7 pH 9 0 20 40 60 80 100 Z a o s ta la b o ja ( % ) kHRP bHRP A 400 500 600 700 800 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 A p s o rb a n c ija  (nm) KP BP SP B Slika 55. Obezbojavanje CR u zavisnosti od pH i izoforme HRP (A) i spektar nakon obezbojavanja CR na pH 7,0 (B). Legenda: B-bazna peroksidaza, K-kisela peroksidaza, SP- rastvor CR. Najbolje obezbojavanje je postignuto na pH 5,0 dejstvom KP (84,8%). Spektri pokazuju praktiĉno nestajanje 𝐴𝑚𝑎𝑥 490 (slika 55). Iz dobijenih rezultata može se zakljuĉiti da efikasnost uklanjanja boja frakcijom kiselih peroksidaza u nekim sluĉajevima odgovara efikasnosti baznih peroksidaza (RB52, RG15 i MO), a u specifiĉnim sluĉajevima, kao što je obezbojavanje PDB, RBBR i CR daje znatno bolje rezultate. Ovo je važno sa dva aspektra. Prvi je poznata ĉinjenica da iz mogućnosti uklanjanja RBBR možemo da ekstrapoliramo mogućnost 99 uklanjanja jako rezistentnih ksenobiotika, kao što su PCB (Chroma et al., 2002). Drugi aspekt je iskljuĉiva upotreba baznih peroksidaza u komercijalnim preparatima i odbacivanje kiselih peroksidaza u procesu preĉišćavanja, što ovaj enzim ĉini praktiĉno besplatnim za upotrebu u tretmanu otpadnih voda. 3.6 Primjena CPO u obezbojavanju reaktivnih boja i halogenfenola Hloroperoksidazu odlikuju jedinstvene osobine meĊu testiranim enzimima. Pored peroksidazne i katalazne aktivnosti, ovaj enzim ispoljava i hlorinujuću/dehlorinujuću aktivnost, pa je stoga zanimljivo ispitati njen potencijal za uklanjanje reaktivnih boja. Testirane su sledeće boje: PDB, RB52, RG15, AB i fenoli p- CP, p-BP i TCP. Finalna koncentracija boja je 50 mg/L. Testovi su uraĊeni u 0,1 M acetatni puferu, pH 5. Ispitan je uticaj vodonik-peroksida i terc-butil peroksida (tBuOOH) na obezbojavanje, jer je poznato da, pri organskim sintezama, CPO vrlo brzo disproporcioniše vodonik peroksid katalaznom aktivnošću (Pešić et al., 2012), dok je tBuOOH manje podložan tom dejstvu. Uzorcima su snimljeni UV-Vis spektri nakon 2 ĉasa inkubiranja boja sa CPO/H2O2 i CPO/tBuOOH na sobnoj temperaturi, a najbolji dobijeni rezultati su prikazani na slici 56. Uoĉava se da su spektri boja inkubiranih sa CPO i H2O2 skoro identiĉni spektrima poĉetnih rastvora boja, što ukazuje na nemogućnost CPO da iskoristi H2O2 za oksidaciju boja (slika 56). Nasuprot tome, na slici 56. jasno je vidljivo nestajanje karakteristiĉnih apsorpcionih pikova svake od testiranih boja nakon inkubiranja sa CPO i tBuOOH, iz ĉega se može zakljuĉiti da tBuOOH vjerovatno zbog svoje sterne zaštićenosti pokazuje rezistenciju na katalaznu aktivnost CPO, pa je time dobar ko-supstrat za oksidaciju aromatiĉnih struktura. Efikasnost CPO za uklanjanje ksenobiotika testirana je i na fenolima (p-CP, p- BP i 2,4,6 trihlorfenol ̶ TCP). Nihove finalne koncentracije u sintetiĉkoj otpadnoj vodi su bile 50 mg/L. Testiranje je uraĊeno na pH 3, 5 i 6 u odgovarajućim 50 mM puferima (acetat, pH 3,0 i pH 5,0; fosfat, pH 6,0). Spektri su snimljeni nakon 1h, a najbolji dobijeni rezultati su prikazani na slici 57. 100 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm) A 300 400 500 600 700 800 0 1 A p s o rb a n c ija  (nm) B 300 400 500 600 700 800 0 1 A p s o rb a n c ija  (nm) C 300 400 500 600 700 800 0 1 2 A p s o rb a n c ija  (nm) D Slika 56. UV-Vis spektri boja i dobijenih proizvoda nakon tretmana CPO sa H2O2 i tBuOOH. Amido black 10A (A), Reactive Green 15 (B), Reactive blue 52 (C), Procion Dark blue (D). Kontrola (isprekidana linija), CPO + H2O2 (taĉkasta linija) i CPO + tBuOOH (puna linija). 300 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 A p s o rb a n c ija  (nm) A 300 400 500 600 700 800 0.0 0.5 1.0 1.5 A p s o rb a n c ija  (nm) B Slika 57. UV-Vis spektri dobijeni snimanjem uzoraka nakon uklanjanja p-CP (A) i TCP (B) na pH 6 korišćenjem CPO i tBuOOH. Legenda: kontrola (isprekidana linija), uzorak nakon tretmana (puna linija). 101 Pokazano je da CPO brže uklanja p-CP (33%) nego p-BP (15,5%). Prilikom inkubiranja CPO sa trihlorfenolom uoĉava se pojava roze boja, vjerovatno kao posledica formiranja polimera. Kako postupak odreĊivanja trihlorfenola sa 4-AAP nije moguć, zakljuĉak je samo kvalitativan. CPO pokazuje veći stepen efikasnosti uklanjanja kseonbiotika na pH 5 - 6, nego na pH 3, što je ĉini komplementarim enzimom sa prethodno (u ovoj disertaciji) opisanim enzimima time omogućavajući potencijalnu primjenu u koktelu enzima koji bi djelovao na široki spektar ksenobiotika. U eksperimentima primjene CPO za uklanjanje boja i fenola pokazali smo da ono što su Pešić et al. (2012) pokazali vezano za oksidaciju Cbz-etanolamina sa CPO, važi i za oksidaciju boja – CPO je izrazito efikasnija kada koristi tBu-peroksid, a ne vodonik-peroksid. Na spektrima se uoĉava potpuni nestanak hromofore odgovorne za karakteristiĉne apsorpcione pikove, pa ovi rezultati zajedno sa pokazanim potencijalom za uklanjanje halogenfenola otvaraju novi pravac za primjenu hloroperoksidaze. 102 3.7 Zaključci  Razvijena je procedura preĉišćavanja PPO iz krompira šaržnom (baĉ) hromatografijom na QAE-Sepahdex, pri ĉemu ova procedura daje prinos od 69%; djelimiĉno preĉišćena PPO pokazuje aktivnost od 8600 U/mL.  Testirana je efikasnost vezivanja PPO za 11 komercijalnih i sintetisanih nosaĉa, pri ĉemu se kao najefikasniji pokazao Eupergit C 250L.  Eupergit C250L-PPO je postigao 45% uklanjanja p-bromfenola, a nakon osam uzastopnih ciklusa od po 5h, efikasnost uklanjanja pada na 55%.  Sintetisan je novi nosaĉ uvoĊenjem iminodiacetatnih grupa u potrošenu DEAE celulozu, za koje su zatim joni bakra koordinativno vezani, time omogućivši imobilizaciju PPO kooridanitivnim vezivanjem atoma N, O ili S u boĉnim aminokiselinskim ostacima na površini proteina.  Dobijeni katalizator TC-PPO ima pH optimum na 7,0 ̶ 8,0 i temperaturni optimum na 25°C, a zadržava skoro 100% aktivnosti na 0ºC. TC-PPO je znatno otpornija na dejstvo detergenta u odnosu na solubilni enzim, a pokazala je i odreĊeni stepen aktivacije ovim detergentom pri koncentraciji od 1%.  TC-PPO je testirana u šaržnom reaktoru za uklanjanje p-CP i p-BP. Postignuto je uklanjanje preko 90% pri koncentraciji fenola 100 mg/L.  Za oba halogenfenola TC-PPO ima stepen uklanjanja od preko 90% u prva tri ciklusa, nakon ĉega efikasnost opada do 60% nakon šest ciklusa od po 8 ĉasova.  Optimalno pH za ukanjanje tekstilnih boja za rastvornu PPO iznosi 3,0.  Pod optimizovanim uslovima 93 ̶ 99.9% boja je uklonjeno tretmanom od 1 ĉas sa 424 ̶ 1700 U/mL PPO, zavisno od boje. Formiranje polimera potvrĊeno je infracrvenom spektroskopijom.  Na lakaznu aktivnost su testirane spore dobijene iz oko sto sojeva Bacillus sp. izolovanih iz prirode, a lakaze iz tri najaktivnija soja su okarakterisane.  Izolovani sojevi su identifikovani korišćenjem metode sekvenciranja 16S rDNA i potvrĊeno je da se radi o sojevima vrste Bacillus amyloliquefaciens.  pH optimum za aktivnost lakaza mijenja se u zavisnosti od supstrata i iznosi 4,0 za ABTS, odnosno 6,5 za siringaldazin.  Temperaturni optimum lakaza sojeva BBS14 i MB24a je 65ºC. 103  Nativne lakaze iz sva tri soja, kao i rekombinantno proizvedena lakaza pokazuju rezistenciju na inhibiciju sa EDTA, kao i umjerenu rezistenciju na dejstvo visoke koncentracije hloridnih jona, a u 25% metanolu zadržavaju 50 ̶ 60% aktivnosti.  Lakaze sojeva BBS 14 i MB24a imaju vrijeme poluživota na 50ºC oko 4 ĉasa, dok je na 65ºC oko 1 ĉas, što lakaze ovih sojeva svrstava meĊu umjereno termostabilne enzime.  Lakaze sojeva BBS 14 i MB 24a postižu 85% uklanjanja boje Congo red, dok se uklanjanje fenola (31 ̶ 47%) postiže sa ABTS medijatorom (0,5 mM).  Lacc gen je kloniran iz B.amyloliquefaciens 12B1 u pET21a vektor i eksprimiran u E. coli BL21.  Postoji velika sliĉnost sekvencije kloniranog gena sa genima za lakazu iz drugih vrsta Bacillus sp.  pH optimum za sLac iznosi 4,0, dok za rLac on iznosi 5,0.  Temperaturni optimum lakaza sLac i rLac je 80 ̶ 85ºC.  Pokazano je da je rLac termostabilan na 80ºC, a temperaturna stabilnost rLac je mnogo veća u odnosu na sLac na 50, 65 i 80ºC.  Korišćenjem rLac postignuto je obezbojavanje boja RB52 i PDB na pH 4,0, a sa približno istom efikasnošću i na pH 7,0, što je znaĉajna prednost ovog enzima u odnosu na lakaze iz gljiva.  Razvijena je procedura frakcionisanja kiselih i baznih izoformi HRP.  Pokazano je da uklanjanje boja frakcijom kiselih peroksidaza u sluĉajevima PDB, RBBR i CR daje znatno bolje rezultate u odnosu na bazne peroksidaze.  Pokazano je da efikasnost uklanjanja ksenobiotika hloroperoksidazom zavisi od vrste korišćenog peroksida i da se najbolji rezultati dobijaju korišćenjem tBuOOH.  CPO izuzetno efikasno uklanja boja AB, RG15, RB52 i PDB.  Rezultati ovog rada (Lonĉar et al., 2011, 2012; Lonĉar i Vujĉić 2011) kao i naši nepublikovani rezultati pokazuju da bi koktel oksidativnih enzima (rastvornih i imobilizovanih) mogao da služi za uklanjanje širokog spektra ksenobiotika iz otpadne vode. 104 4.Eksperimentalni dio Spisak glavne korišćene opreme: FPLC sistem Pharmacia LCC501-plus Tehniĉka vaga Mettler PE 3600 i analitiĉka vaga Mettler Protoĉni vodeni termostat Pharmacia Biotech, Multitemp III Kada za horizontalnu elektroforezu Pharmacia LKB Multiphor II Kada za horizontalnu elektroforezu Hoefer HE33 Ispravljaĉi Pharmacia Biotech EPS 3500, Pharmacia ECPS 2000/300, Bio Rad Inkubator-mućkalica IKA KS 4000i control Inkubator Memmert INB 300 Kolone za hromatografiju proizvoĊaĉa LKB, Pharmacia i GE Spektrofotometri Philips PU 8630, Shimadzu UV1800 i Nano Drop 1000 Konduktometar i pH metar, InoLab Centrifuga, miniSpin plus, Eppendorf Eppendorf Vacuum Concentrator Model 5301 iCap 6500Duo with a CID86 chip detector, Thermo Scientific, UK ETHOS 1, Advanced Microwave Digestion System, MILESTONE, Italy Nicolet 6700FT-IR, Thermo Scientific Eppendorf Personal MasterCycler i Bio Rad S1000 PCR MasterCycler Bio Rad Geldoc EZ Bio Rad Micropulser Electroporator Spisak korišćenih kitova za molekularnu biologiju: PureYield™ Plasmid Miniprep System, Promega Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen GoTaq® Green Master Mix, Promega DreamTaq i Pfu polimeraze, Fermentas i KOD polimeraza, Toyobo Sve ostale korišćene hemikalije su bile kvaliteta p.a. i kupljene su od firmi Merck (Darmstadt, Germany) i Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). Hromatografski matriksi tipa Sephadex i Sepharose su kupljeni od firme GE Healthcare Life Sciences. 105 4.1. Uklanjanje fenola fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) 4.1.1 Prečišćavanje PPO 4.1.1.1 Priprema sirovog ekstrakta Crveni krompir (Solanum tuberosum) je kupljen u lokalnom supermarketu i inkubiran je na 3˚C 12h. Nakon toga, cijeli (oprani) krompiri su homogenizovani u LaLane’s sokovniku uz dodatak par kapi zasićenog rastvora Na2S. Homogenat (1L) je centrifugiran na 3500 o/min na 4˚C. Dobijeno je 600 mL bistrog supernatanta (sirovi ekstrakt) koji je zatim rasoljen prema 10 mM Na-fosfatnom puferu pH 7,3 na koloni 6x60 cm Sephadex G25 Coarse. 4.1.1.2 Prečišćavanje PPO bač hromatografijom na QAE-Sephadex 60 g prethodno nabubrenog QAE Sephadex A-50 je ekvilibrisano sa 10 zapremina 10 mM Na-fosfatnog pufera, pH 7,3 (provjeravan je konduktivitet i pH u eluatu dok nisu dobijene identiĉne vrijednosti na ulazu i izlazu). Ekvilibrisani i dezaerisani jonoizmjenjivaĉ je dodat u 680 mL rasoljenog sirovog ekstrakta i miješan na magnetnoj miješalici 30 min u atmosferi bez kiseonika (pod azotom). Nevezani proteini su isprani sa 3 zapremine poĉetnog (ekvilibracionog) pufera, a PPO je eluirana sa 500 mL 0,75M NaCl u 10 mM Na-fosfatnom puferu pH 7,3. Ovako dobijen djelimiĉno preĉišćen preparat PPO je ĉuvan na -20˚C do upotrebe. 4.1.1.3 Izoelektrično fokusiranje Izoelektriĉno fokusiranja je uraĊeno korišćenjem Multuphor II sistema za horizontalnu elektroforezu (Pharmacia-LKB Biotechnology) po uputstvu proizvoĊaĉa. Fokusiranje je uraĊeno na 7,5% poliakrilamidnom gelu sa amfolitima pH opsega 3,0 - 10,0, na konstantnoj snazi od 7W u trajanju od 1,5h na 10˚C. Nakon fokusiranja jedan dio gela je bojen bojom CBB. Zimogramska detekcija PPO je uraĊena na drugom dijelu gela (sa ponovljenim uzorcima) koji je ispran dva puta po 5 min dejonizovanom vodom, 106 a zatim ekvilibrisan u 100 mM fosfatnom puferu pH 7,4 (2 x 5 min). Nakon toga gel je uronjen u 10 mg/mL rastvor L-DOPA u 100 mM fosfatnom puferu pH 7,4 i inkubiran 10 min na 30˚C. Nakon pojave braon traka koje se odnose na aktivnost PPO, gel je skeniran na HP ScanJet G3110 skeneru. 4.1.2 Imobilizacija PPO na različitim nosačima Svaki nosaĉ je izmjeren u triplikatu (po 10 mg) i dodat u 200 µL preparata enzima (8471 U/mL). Ista masa nosaĉa je dodata i u 0,9% NaCl kao slijapa proba. Smješe su ostavljene 24 h na IKA KS125 orbitalnoj mućkalici na 400 rpm. Biokatalizatori su odvojeni centrifugiranjem i isprani šest puta sa 0,9% NaCl. Za dalja ispitivanja tri najaktivnija biokatalizatora su pripremljena na analogan naĉin na skali od 1 g. 4.1.2.1 Određivanje aktivnosti PPO Aktivnost PPO je odreĊivana korišćenjem supstrata L-3,4-dihidroksifenilalanina (L-DOPA) na 25˚C mjerenjem poĉetne brzine formiranja dopahroma (Kwon i Kim, 1996). Standardna smješa za odreĊivanje aktivnosti sastoji se od 0,1 mL rastvora enzima u 1,5 mL 9,3 mM L-DOPA u 50 mM Tris HCl pH 7,0. Apsorbancija na 475 nm je mjerene korišćenjem spektrofotometra (Philips UV-VIS-NIR PU 8630 ili Shimadzu UV1800). Jedna jedinica PPO aktivnosti je definisana kao ona koliĉina enzima koja katalizuje povećanje apsorbancije za 0,001 u minuti na 25˚C. Aktivnost PPO imobilizata je odreĊivana korišćenjem modifikovane procedure po Kwon i Kim (1996). 10 mg polusuvog biokatalizatora (enzim + nosaĉ) je dodato u 800 µL 2.325 mM L-DOPA u 50 mM Tris HCl puferu pH 7.0 na 25˚C. Smješa je miješana 3 min i zatim centrifugirana na 14000 o/min. Povećanje apsorbancije zbog formiranja dopahinona u rezultujućem supernatantu je mjerena na 475 nm. Slijepa proba sadrži 10 mg samog nosaĉa umjesto biokatalizatora, ostale komponente su iste. Ovo je neophodno obzirom na to da su neki od nosaĉa (MTM, MTM obogaćen sa 10% Ti, Greensand i Birm) pokazali inherentno svojstvo oksidacije L-DOPA. Specifiĉna 107 aktivnost imobilizovane PPO je definisana kao povećanje apsorbancije od 0.001 u minuti po gramu imobilizata pod opisanim uslovima. 4.1.2.2 Ispitivanje mogućnosti korišćenja imobilizovane PPO u šaržnom reaktoru Uklanjanje fenola iz sintetiĉke otpadne vode je ispitivano sa 100 mg polusuvog biokatalizatora koji je dodat u 3 mL 2,5 i 10 mM rastvora fenola, p-CP i p-BP. Inkubacija je trajala 5h uz mućkanje na IKA KS125 mućkalici da bi se obezbijedio kontinualan dotok kiseonika. Nakon 5h u rastvorima je odreĊivana koncentracija zaostalih fenola koristeći 4-aminoantipirinski (AAP) test (Wagner i Nicell, 2001). 4.1.2.3 Određivanje koncentracije fenola Koncentracija fenola je odreĊena kolorimetrijskim testom u kom fenolna jedinjenja reaguju sa 2,08 mM AAP i 8,34 mM kalijum-fericijanidom u 0,25 M natrijum-bikarbonatu dajući crvenu boju hinonskog tipa koja ima apsorpcioni maksimum na 510 nm. Potrebni rastvori: 1. 0.25 M NaHCO3 (1.05 g u 50 mL H2O) 2. 10.4 mM 4–AAP (21.2 mg u 10 mL rastvora 1) 3. 41.7 mM K-fericijanida (137.3 mg u 10 mL rastvora 1) Postupak SP: 600 µL r.1. + 200 µL r.2. – vorteksovati pa dodati 200 µL r.3. – saĉekati 6 min pa izmjeriti A 510 Proba: 50 µL rastvora fenola + 550 µL r.1. + 200 µL r.2. – vorteksovati pa dodati 200 µL r.3. – saĉekati 6 min pa izmjeriti A510 Konstrukcija kalibracione krive Napraviti štok rastvor fenola: 18.82 mg fenola + 10 mL 96% EtOH = 20 mM fenol 108 Od štoka napraviti serijskim razblaženjem sa d.vodom (1:1) rastvore koncentracija 20, 10, 5, 2.5, 1.25 mM. Od ovih rastvora uzeti po 50 µL i razblažiti sa 950 µL d.vode. Time se dobijaju rastvori sledećih koncentracija: 1, 0.5, 0.25, 0.125 i 0.0625 mM. 4.1.2.4 Određivanje životnog vijeka Eupergit C250L-PPO imobilizata pri uklanjanju 4- hlorfenola Efikasnost uklanjanja p-CP je ispitivana u osam uzastopnih ciklusa od po 5 sati sa Eupergit C250L-PPO imobilizatom. IzmeĊu svakog od ciklusa imobilizat je sakupljen centrifugiranjem i ispran tri puta sa puferom. 4.1.3 Sinteza novog nosača sa pipcima i njegova primjena za imobilizaciju PPO Komercijalno dostupna DEAE-celuloza (Sigma-Aldrich) je korišćena u ovoj disertaciji. MeĊutim, korišćena je potrošena DEAE-celuloza, tj ona koja više nije pogodna za preĉišćavanje proteina, jer je korišćena u velikom broju ciklusa i ne pruža potrebnu rezoluciju za razdvajanje proteina. 5 g nabubrene korišćene DEAE celuloze je resuspendovano u 20 ml 3 M NaOH i 2 ml epihlorhidrina. Aktivacija matriksa je trajala 2h uz miješanje, nakon ĉega je ispran i prebaĉen u rastvor koji sadrži 2 g NaOH, 3 g Na2CO3 i 4.3 g IDA. Suspenzija je ostavljena da se inkubira 2 h na 50 ºC, a zatim na sobnoj temperaturi preko noći. Nakon ispiranja sa 500 mL vode, dobijeni tentacle matriks je napunjen jonima bakra (1 g CuSO4 ∙ 5H2O u 25 ml H2O), ponovo ispran sa vodom, a zatim i sa 7% sirćetnom kiselinom. TC nosaĉ je do upotrebe ĉuvan u 20% etanolu na 4 °C. 4.1.3.1 Karakterizacija TC nosača Sadržaj vode je odreĊen u 10 ponovljenih mjerenja uzimanjem 200 mg polusuvog TC-PPO koji je sušen na 60 ºC u Eppendorf vakuum koncentratoru (Model 5301) do dobijanja konstante mase. Koliĉina vezanih epoksi grupa prije uvoĊenja IDA grupa je odreĊen po metodi Axen et al. (1975), dok je koliĉina Cu(II) jona odreĊena induktivno-spregnutom plazma 109 apsorpciono-emisionom spektroskopijom (ICP-AES) na aparatu iCap 6500Duo, opremljenom sa CID86 ĉip detektorom (Thermo Scientific, UK). Instrumentalni uslovi za ICP-AES su RF snaga: 1150W, plasma pogled: aksijalni, protok gasa za raspršivanje: 0.50 L/min, protok pomoćnog gasa: 0.50 L/min, protok gasa za hlaĊenje: 12 L/min, brzina pumpe za analizu: 50 rpm). TC je prethodno rastvoren u 10 ml 65% HNO3, 0.2 ml H2O2 pomoću ETHOS 1, naprednog sistema za mikrotalasnu digestiju (MILESTONE, Italy). Mikrotalasna digestija je uraĊena po dvostepenom programu, prvi koji ukljuĉuje grijanje na 200 ºC 15 min i drugi koji održava temperaturu na 200 ºC tokom 20 min. Uzorak je zatim razblažen do 25 mL. Slijepa proba je pripremljena na isti naĉin bez uzorka. 4.1.3.2 Imobilizacija PPO na TC 150 mg suvog nosaĉa TC (1 g polusuvog) je ekvilibrisan sa 25 mL 0.15 M kalijum-fosfatnog pufera pH 7.0 sa 0.5 M NaCl da bi se sprijeĉila nespecifiĉna jonska adsorpcija. TC nosaĉ je zatim resuspendovan u 30 ml enzimskog preparata (192000 U). Ista koliĉina nosaĉa je dodata u 0.5 M NaCl kao slijepa proba. Smješe su ostavljene na IKA orbitalnoj mućkalici na 400 o/min da se mućkaju 12h. Biokatalizatori su sakupljeni centrifugiranjem na 14000 x g, nakon ĉega su isprani po šest puta sa 30 mL 0.9% NaCl (dok sav nevezani enzim nije ispran). 4.1.3.3 Uticaj pH i temperature rastvora na aktivnost TC-PPO 4.1.3.3.1 Određivanje pH optimuma TC-PPO i PPO Da bi se odredio pH optimum TC-PPO prema L-DOPA, 10 mg TC-PPO i 50 µl PPO je inkubirano 30 min sa 750 µl odgovarajućeg 50 mM pufera (acetatni, pH 4.3- 5.8; Tris-HCl, pH 7.0-8.0; kalijum-fosfatni, pH 9.0-10.0), nakon ĉega je dodato 250 µl rastvora 9.3 mM L-DOPA. Dalji koraci su isti kao što je opisano u odjeljku 4.1.2.1. 110 4.1.3.3.2 Određivanje temperaturnog optimuma TC-PPO Da bi se odredio temperaturni optimum TC-PPO prema L-DOPA, 10 mg TC- PPO i 50 µl PPO je preinkubirano sa 750 µl kalijum-fosfatnog 50 mM pufera pH 7,0 na odgovarajućoj temperature (0-95 ºC) nakon ĉega je dodato 250 µl rastvora 9,3 mM L- DOPA preinkubiranog na istoj temperaturi. Dalji koraci su isti kao što je opisano u odjeljku 4.1.5. Za rastvorni enzim je korišćena procedura opisana u odjeljku 4.1 .2.1. Najvećoj izmjerenoj aktivnosti je pripisana vrijednost 100%. 4.1.3.4 Uticaj detergenta na aktivnost TC-PPO Rastvorni i imobilizovani enzim su inkubirani sa SDS detergentom (0,25-1,0%) u 50 mM kalijum-fosfatnom puferu pH 7,0 na 25 ºC 100 min. Zaostala PPO aktivnost je odreĊivana kao što je opisano u 4.1.2.1 i 4.1.3.3.1. Aktivnost netretiranog enzima je uzeta kao kontrola (100%). 4.1.3.5 Ispitivanje upotrebe TC-PPO za uklanjanje halogenfenola u šaržnom reaktoru Uklanjanje halogenfenola iz sintetiĉke otpadne vode je ispitivano sa 30 mg suvog biokatalizatora (310 000 U/g) koji je dodat u 20 mL 100 mg/L rastvora p-CP i p- BP rastvorenih u 50 mM natrijum-fosfatnom puferu pH 7,0. Uzorci su inkubirani na orbitalnoj mućkalici da bi se obezbijedio kontinualni dotok kiseonika. Rastvori fenola su oksigenisani produvavanjem vazduha u trajanju od 10 min neposredno prije tretmana. 4.1.3.5.1 UV spektrofotometrijska analiza rastvora halogenfenola nakon tretmana sa TC- PPO Da bi se potvrdilo uklanjanje p-BP i p-CP dejstvom TC-PPO, uraĊena je spektralna analiza u UV oblasti. Spektri su snimljeni aparatom Cintra 40 UV Vis Spectrometer u opsegu 200–380 nm. Spektri su snimljeni za rastvore p-BP i p-CP prije i posle tretmana sa TC-PPO kao što je opisano u 4.1.8.8. 111 4.1.3.6 Ispitivanje efikasnosti TC-PPO u ponovljenim ciklusima uklanjanja halogenfenola Ponavljanjem ciklusa opisanih u odjeljku 4.1.8.8. je ispitivan poluživot TC-PPO. IzmeĊu ciklusa imobilizat je sakupljen filtracijom i ispran tri puta fosfatnim puferom pH 7,0. 4.2 Uklanjanje boja fenoloksidazom iz krompira (Solanum tuberosum) 4.2.1 Uticaj pH na aktivnost PPO obezbojavanje tekstilnih boja Koncentracije i karakteristiĉni apsorpcini maksimumi (λmax) za ĉetiri azo i tri aminohlorotriazinske boje korišćene u ovim eksperimentima su dati u tabeli 4. Koncentracije su odabrane tako da apsorbancija poĉetnog rastvora na λmax bude 1,0. Svaka od boja je inkubirana 1h sa PPO (424 U/mL) u odgovarajućem 50 mM puferu (natrijum-acetat, pH 3,0 i pH 5,0; natrijum-fosfat, pH 7,0; glicine-NaOH, pH 9,0) na 25°C. Nastali precipitati su uklonjeni filtracijom kroz Whatman No1 filter papir ili centrifugiranjem na 600 x g i sadržaj zaostale boje je odreĊen mjerenjem apsorbancije na λmax. Poĉetna apsorbancija za svaku od boja na λmax je uzeta kao kontrola i dodijeljena joj je vrijednost 100%. Stepen dekolorizacije (Rd) je definisan formulom: Rd (%) = [( A0-A1)/A0] x100, gdje je A0 apsorbancija netretirane boje, dok je A1 izmjerena apsorbancija nakon tretmana. 4.2.2 Uticaj koncentracije PPO i dužine inkubacije na obezbojavanje Uticaj koncentracije PPO na brzinu obezbojavanja je analiziran za svaku od testiranih boja sa povećanjem koncentracije PPO u opsegu od 212-1700 U/mL boje u 50 mM natrijum-acetatnom puferu pH 3.0 na 25°C za 1h. Efekat dužine inkubiranja je praćen inkubiranjem rastvora boje sa PPO (424 U/mL) u 50 mM natrijum-acetatnom puferu, pH 3,0 na 25°C u vremenskom periodu od 0 ̶ 5 ĉasova. Stepen obezbojenja je praćen na karakteristiĉnom λmax kao što je prethodno opisano u odjeljku 4.2.1. 112 4.2.3 Vis i FTIR spektrometrijska analiza tekstilnih efluenata tretiranih sa PPO 4.2.3.1 Vis spektrofotometrijska analiza tekstilnih efluenata nakon tretmana sa PPO Tekstilni efluenti su ĉuvani na sobnoj temperaturi. Izmjerena je pH vrijednost i u svim efluentima iznosi 7,1. Podešavanje pH na 3,0 je uraĊeno dodatkom razblažene sirćetne kiseline. Zakišeljavanje nije imalo vidljivih efakta na efluente. Obezbojavanje je uraĊeno dodatkom 424 U/mL PPO u svaki od efluenata. Vidljivi spektri efluenata su snimljeni na spektrofotometru Cintra 40u opsegu 380 – 800 nm prije i posle tretmana sa PPO. 4.2.3.2 FTIR spektrometrijska analiza boje Reactive blue 52 i produkta dobijenog nakon tretmana sa PPO FTIR spektri boje Reactive blue 52 (RB52) i njenog polimernog produkta su snimljeni u opsegu od 400-4000 nm korišćenjem metode prigušene totalne refleksije (eng. attenuated total reflectance, ATR) na FTIR spektrofotometru (Nicolet 6700FT-IR, Thermo Scientific) što je i ranije opisano u literaturi (Aktas et al., 2000, 2003). Polimerni produkt je sakupljen centrifugiranjem nakon tretmana sa PPO i osušen do konstantne suve mase na Eppendorf vakuum koncentratoru. 4.3 Uklanjanje ksenobiotika bakterijskom lakazom 4.3.1 Identifikacija izolovanih sojeva i dobijanje spora iz različitih Bacillus sp. 4.3.1.1 Izolovanje divljih sojeva (wt) Bacillus sp. iz zemljišta Priprema uzoraka sa terena za izolovanje bakterijske kulture ̶ 1 g zemlje je rastvoren u 99 ml sterilisane dejonizovane vode i dobro je promiješan, zatim je 1 ml tog rastvora prebaĉeno u epruvetu. Krompir je izrendan na veoma sitne komade, pa je 1 g krompira dodat u 99 ml sterilisane dejonizovane vode, dobro promiješan, a zatim je 1 ml tog rastvora prebaĉeno u epruvetu. 1 mL ĉistog, nerazblaženog kravljeg mlijeka je prebaĉeno u jednu epruvetu, a takoĊe je napravljen i razblažen uzorak 1:50 u sterilnoj vodi. Epruvete sa uzorcima, pokrivene aluminijumskom folijom, inkubirane su u 113 vodenom kupatilu na 80°C 10 min. Nakon hlaĊenja do sobne temperature uzorci su zasijani na LBagar podloge i inkubirani 24h na 37°C. Uoĉava se bakterijski tepih karakteristiĉne (sluzave) morfologije za vrste roda Bacillus. Oznaka Lokacija sakupljanja MB7 Bogatić termalni izvor MB22A Tuleži, pljoprivredno zemljište MB5B Bogatić termalni izvor MB20 razblaženo kravlje mleko MB16B Borĉa, zemlja iz dvorišta MB24A Ovĉa banja, slani izvor vode MB17B krompir 12B1 Zemlja BBS6 Laboratorijska zbirka sojeva 4.3.2 Provjera prisustva lakazne aktivnosti u sporama Bacillus 4.3.2.1 Dobijanje spora Izolovane kolonije su zasijane na sporulacionu podlogu. Sporulaciona podloga (1L) se sastoji od: Sastojak Masa (g) Hranljivi agar 41,300 KCl 1,000 MgSO4x7H2O 0,250 MnCl2x4H2O 0,002 Destilovana voda do 1L Autoklaviranje 20 min, 121 ºC. 114 Nakon autoklaviranja dodaju se mikrofiltrovani rastvori: CaCl2 (finalna konc. 5x10 -4 M) i FeSO4 (finalna konc. 10 -6 M). Inkubiranje traje 3 dana na 37ºC (Schaeffer et al., 1965). Spore se sastružu ezom sa podloge, a zatim suspenduju u sterilnoj vodi i tretiraju lizozimom (0,1 mg/ml), 10-20 min na 37ºC da bi se lizirale preostale vegetativne ćelije. Spore se zatim preĉiste sukcesivnim ispiranjem sa 1M NaCl, 0,14M NaCl, 0,1% SDS i sterilnom vodom pri ĉemu svi rastvori sadrže 10 mM EDTA. Spore se zatim zagrijavaju 10 min na 80 ºC i dva puta ispiraju sterilnom dejonizovanom vodom (Lu et al., 2012). Od sakupljenih spora su dobijene pojedinaĉne kolonije metodom razbaženja, tako što su spore razblažene do 10-9. Razblaženja su pravljena sterilnom destilovanom vodom od poĉetnog uzorka (kome je dodato 1 ml dest. vode). Razblaženja od 10-5 do 10-9 su zasijana na hranljivom agaru u Petri šoljama koristeći ezu po Drigalskom. Na ĉvrstu podlogu je sipano po 25 µl odgovarajućeg razblaženja spora i ravnomjerno razvuĉeno po površini podloge. Zasijane Petri šolje su ostavljene na 37ºC, 24 ĉasa, nakon ĉega su spore sakupljene po gore opisanoj proceduri. 4.3.2.2 Pretraga spora sa aktivnom lakazom na pH 4 i pH 7 Puferi: 0,1 M acetatni pufer, pH 4: Glacijalna kiselina 5,69 ml Voda do 1 L pH podešeno 1 M rastvorom NaOH 0,1 M fosfatni pufer, pH 7: NaH2PO4 12 g Voda 1L pH podešeno 1 M rastvorom NaOH 20 mM ABTS: ABTS 10,29 mg Voda 1 ml Od ovog rastvora su pravljeni ostali rastvori odgovarajuće koncentracije 115 1 mM siringaldazin: SGZ 2,9 mg DMF 500 µl Voda 7,5 ml Siringaldazin je potrebno ostaviti na sobnoj temperaturi par sati da se kompletno rastvori. Preĉišćene spore su suspendovane u po 1 ml destilovane vode, koje su zatim 10 x razblažene. Pretraga aktivnosti lakaza je uraĊena u mikrotitar ploĉi (96 mjesta) pri ĉemu je sastav smješe u svakom bunaru bio: Spore (10x razblažene u vodi) 50 µl Pufer (0,1 M acetatni, pH 4 ili 0,1 M fosfatni, pH 7) 50 µl Supstrat (2 mM ABTS ili 1 mM SGZ) 100 µl Po dodavanju supstrata ploĉa je inkubirana na 37ºC, 30 min. Pozitivan rezultat je bio pojava zelene boje za ABTS ili roze za SGZ. 4.3.2.3 Određivanje lakazne aktivnosti spora Sastav reakcione smješe: Pufer 850 µl Spore (10 x razblažene) 50 µl Supstrat (ABTS, SGZ) 100 µl Enzimska aktivnost prema ABTS-u je odreĊivana koristeći 1 mM ABTS supstrat u 0,1 M Na-acetatnom puferu pH 4 na 60ºC. Vrijeme inkubiranja je 5 min, nakon ĉega su reakcione smeše centrifugirane (14500 rpm, 1 min) i mjerena je A436 nm u supernatantu. Za siringaldazin se koristi 0,1 M fosfatni pufer, pH 7 u kome je siringaldazinu finalna koncetracija 0,1 mM. Vrijeme inkubiranja je 10min nakon ĉega se uzorak centrifugira i mjeri se A525nm u bistrom supernatantu. 116 Masa suvih spora je odreĊena tako što je u prethodno odmerenim ependorfima sipano po 250 µl 10 x razblaženih spora. Suspenzije su uparene do suva na vakuum koncentratoru i iz razlike masa ependorfa sa i bez spora je dobijena masa suvih spora, nakon ĉega je preraĉunata specifiĉna aktivnost lakaza na sporama. 4.3.3 Identifikacija izolovanih sojeva Bacillus sp. LB podloga: Tripton 10 g Ekstrakt kvasca 5 g NaCl 10 g Voda do 1L Autoklaviranje 20 min, 121 ºC. Prekonoćne kulture bakterija odgajene u LB podlozi su korišćene za ekstrakciju DNA. 4.3.3.1 Izolovanje DNA iz bakterija Korišćena je metoda ekstremno brze ekstrakcije DNA iz Bakterija (Cheng et al., 2006). Koraci u dobijanju DNA su opisani niže: - Pripremljena je prekonoćna bakterijska kultura. - Potrebni rastvori : STE pufer : 100 µL NaCl TE pufer : 10 mM TrisHCl 10 mM TrisHCl 1 mM EDTA 1 mM EDTA pH 8.0 pH 8.0 Trisom zasićen fenol : 2 mL fenola + 2 mL 1,5 M TrisHCl pH 8,8. Dobro se miješa 30 min i drži u toploj vodi. Kad se izdvoje dvije faze, izbacuje se gornja faza u kojoj je pufer i dodaje se ponovo isti pufer. pH fenola treba da bude 8 ! Postupak se ponovlja sve dok pH donjeg fenolskog sloja ne bude 8. 117 a) 1 mL ćelijske suspenzije se centrifugira na 8000g 2 min. b) Odbaci se supernatant. c) Talog se resuspenduje u 400 µL STE pufera pH 8.0. d) Centrifugira se na 8000g 2 min. e) Ponove se koraci c) i d). f) Talog se resuspenduje u 200 µL TE pufera pH 8.0. g) Doda se 100 µL trisom zasićenog fenola pH 8.0 (uzima se samo donji sloj) i vorteksuje 60s. h) Centrifugira se na 13 000 g 5 min da se odvoji vodena faza od organske. i) 160 µL gornjeg, vodenog sloja prebaci se u ĉist ependorf od 1,5 mL i doda 40 µL TE pufera, a zatim i 100 µL hloroforma. j) Centrifugira se na 13 000 g 5 min da se odvoji vodena faza (gornji sloj) od organske k) Lizat (vodena faza) se ekstrahuje hloroformom sve dok se u meĊufazi više ne nalazi bijela boja ( 2 – 3x). Uzima se gornji sloj a baca se donji hloroformski sloj. l) 160 µL gornjeg vodenog sloja se prebaci u ĉist ependorf od 1,5 mL, doda se 40 µL TE pufera i 5 µL RNA-ze ( 10 mg/mL ) i inkubira se 10 min na 37 ºC. m) Doda se 100 µL hloroforma, dobro izmiješa i centrifugira se 5 min na 13 000 g n) 150 µL gornje vodene faze prebaci se u ĉist ependorf, on sadrži ĉistu DNA i može da se koristi direktno ili da se ĉuva na – 20 ºC do upotrebe. 4.3.3.2 Identifikacija sojeva Bacillus sp. poređenjem 16 S rDNA sekvencija Korišćeni sojevi su identifikovani analizom sekvencija 16 S rDNA gena. Genomska DNA izolovana je po proceduri opisanoj u 4.3.3.1. Gen 16S rDNA je umnožen lanĉanom reakcijom polimerizacije (PCR) sa standardnim prajmerima 20F (5’- GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’) i 1492R (5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3') (Lane 1991). Za umnožavanje gena korišćena je KOD Hot Start Polimeraza (Novagen, TOYOBO) porijeklom iz Thermocccus kodakaraensis. Ovaj proizvod predstavlja smješu KOD HiFi DNA Polimeraze i dva monoklonska antitijela koja inhibiraju DNA polimerazu i 3’ ̶ 5’ egzonukleaznu aktivnost tokom pripremanja PCR reakcije na sobnoj 118 temperaturi. Ovim se postiže dobijanje vjerodostojnog proizvoda, velika brzina polimerizacije i procesivnost KOD HiFi sa visokom specifiĉnošću antitijelom postignutog Hot Start poĉetka reakcije. Nespecifiĉno umnožavanje je sprijeĉeno, jer su onemogućena pogrešna spajanja prajmera sa templatom koja se dešavaju tokom pripreme reakcije i poĉetnog povišenja temperature. Sastav reakcione smeše: 60 μl vode PCR kvaliteta (bez prisustva nukleaza) 10 μl 10X PCR pufer za KOD Hot Start DNA Polimerazu 10 μl dNTP (finalna koncentracija 0.2 mM) 4 μl MgSO4 (finalna koncentracija 1 mM) 2 μl DNA matrice 6 μl 5' prajmer (5 pmol/μl, finalna koncentracija 0.3 μM) 6 μl 3' prajmer (5 pmol/μl, finalna koncentracija 0.3 μM) 2 μl KOD Hot Start DNA Polimeraza (1 U/μl) 100 μl ukupna zapremina Program za PCR mašinu: 1. Inicijalna denaturacija 2 min 94 ºC 2. Denaturacija 15 s 94 ºC 3. Vezivanje prajmera 30 s 45 ºC 4. Umnožavanje 30 s 72 ºC (20 s/kbp) 5. finalno umnožavanje 5 min 72 ºC 6. HlaĊenje reakcije na 8 ºC. Koraci 2-4 su ponovljeni 30 puta. Ĉitava reakcija je zatim elektroforetski razdvojena na 1,5% agaroznom gelu u 0,5% TBE puferu sa SYBR safe (Invitrogen) bojom za DNA. Nakon elektroforeze traka koja odgovara poziciji markera za masu od 1,5 kbp je isjeĉena sterilnim skalpelom i fragment je ekstrahovan iz gela komercijalnim kitom Qiagen Gel Extraction kit. Koncentracija ekstrahovanog fragmenta je izmjerena NanoDrop 1000 119 spektrofotometrom i iznosila je ~60 ng/μL. Fragmenti su sekvencirani korišćenjem istog para prajmera. Seqmatch alatka je korišćena za pretragu sliĉnih sekvencija sakupljenih u Ribosomal Database Project-II Release 10 (RDP; http://rdp.cme.msu.edu) (Cole et al., 2009) paralelno sa BLASTN pretragom (Altschul et al., 1997). Filogenetsko stablo je konstruisano pomoću programske alatke TreeBuilder koja se nalazi u okviru RibosomalDatabase projekta. 4.3.3.3 Potopna elektroforeza DNA na agaroznom gelu TBE pufer (5 x koncentrovani): Tris 54 g Borna kiselina 27,5 g EDTA, 0,5 M (pH 8) 20 ml Za rad se koristi 10x razblaženi pufer. 1% agarozni gel: Agaroza 0,3 g TBE pufer 0,5x 30 ml Agaroza je rastvorena u puferu u mikrotalasnoj pećnici, a zatim razlivena u sistem za nalivanje gela. Nakon geliranja ĉešljevi su izvaĊeni, a gel je prebaĉen u horizontalnu kadu sa 0,5x TBE puferom. Na gel je nanošeno po 10 µl uzorka koji je prethodno pomješan sa 2 µl komercijalne boje (6x koncentrovana). Naneto je i 5 µl standarda Fermentas 1 kb Gene Ruler. Nakon elektroforeze gel je bojen na sledeći naĉin: 50 ml vode, 5 µl etidijum-bromida 20 min Ispiranje vodom 4x 120 Trake su vizuelizovane iluminacijom UV svjetlom, a slika zabilježena Canon digitalnim aparatom ili BioRad GelDoc EZ sistemom za snimanje gelova. 4.3.4 Karakterizacija lakaza 4.3.4.1 Određivanje pH optimuma lakaza Smješe su inkubirane 5 min sa odgovarajućim puferom (odjeljak 4.1.3.3), a potom je dodat supstrat i nakon 10 min izmjerena apsorbancija supernatanta. U sluĉaju pH optimuma za SGZ, raĊeno je na temperaturi od 37ºC dok je za ABTS raĊeno na 65ºC. 4.3.4.2 Određivanje temperaturnog optimuma lakaza Da bi se odredio temperaturni optimum lakaza prema ABTS supstratu, spore su preinkubirane u 900 uL natrijum-acetatnog 50 mM pufera pH 4,0 na odgovarajućoj temperaturi (0-95 ºC) nakon ĉega je dodato 100 µl 10 mM rastvora ABTS preinkubiranog na istoj temperaturi. Dalji koraci su isti kao što je opisano u odjeljku 4.3.2. Najvećoj izmjerenoj aktivnosti je pripisana vrijednost 100%. 4.3.4.3 Ispitivanje dejstva inhibitora na aktivnost lakaza sojeva BBS14 i MB24a Napravljeno je po 5 ml 100 mM vodenih rastvora korišćenih inhibitora i 2 M rastvor NaCl. Za njihovo pravljenje su izmerene sledeće koliĉine supstancija: EDTA 0.1861 g DTT 0.0771 g Askorbinska kiselina 0.0881 g L-cistein 0.0877 g NaN3 0.0325 g NaCl 0.58 g 121 Sastav reakcionih smješa: Pufer (0,1 M acetatni, pH 4) 750 µl Spore (10 x razblažene) 50 µl Inhibitor 100 µl ABTS (10 mM) 100 µl U sluĉaju NaCl finalne koncentracije soli su bile 0,2, 0,5 i 1 M. 4.3.4.4 Ispitivanje uticaja organskih rastvarača na aktivnost lakaza Sastav reakcionih smeša: Rastvaraĉ 500 µl (za 50%) ili 250 µl (za 25%) Spore (10 x razblaženih) 50 µl Pufer (0,1 M acetatni, pH 4) 350 µl (za 50%) ili 600 µl (za 25%) Po dodatku rastvaraĉa reakciona smješa je inkubirana 15 min na 37ºC nakon ĉega je dodat supstrat (ABTS) i posle 10 min inkubiranja mjerena je apsorbancija na 436 nm. 4.3.4.5 Temperaturna stabilnost lakaza Sastav reakcione smješe: Pufer (0,1 M acetatni, pH 4) 850 µl Spore (20 x razblažene) 50 µl ABTS (10 mM) 100 µl Suspenzija spora u puferu je inkubirana u vodenom kupatilz na 50ºC, odnosno na 65°C. U odreĊenim vremenskim intervalima uzorci su uzimani i stavljani u frižider. Za nulto vreme deo spora je odmah stavljen u frižider. Kada su svi uzorci uzeti, ostavljeni su na 37°C, 5 min, nakon ĉega je dodato po 100 µl 10 mM ABTS-a i smeše inkubirane na 37°C 10 min. Mjerena je A436 nm. 122 4.3.4.6 Primjena lakaza u obezbojavanju Pravljenje rastvora boja, 0,5 mg/ml: Boja 2,5 mg Voda 5 ml Svi korišćeni puferi su već navedeni. Vrijeme inkubacije je 24 ĉasa i raĊeno je na 25ºC uz mješanje na rotacionoj mućkalici IKA KS125. Proces obezbojavanja je praćen spektofotometrijski. Prije mjerenja apsorbancije, smješe su centrifugirane i korišćen je supernatant. Procenat obezbojenja je izraĉunat uzimajući da je vrijednost apsorbancije poĉetnog uzorka 100%. Sastav reakcione smješe: Spore (koncentrovane) 50 µl Pufer (acetatni, pH 3, 4,5, 5,7, 6,5 i tris, pH 9,2) 850 µl Boja 100 µl Apsorbancije su merene na 610 nm za indigo carmine, 565 i 495 nm za Congo red (u zavisnosti od pH reakcione smeše), i 603 nm za RB 5. Sastav reakcionih smješa za razliĉite koncentracije spora: Spore 200, 100, 50 i 20 µl Pufer (acetatni, pH 3, 4,5, 5,7, 6,5 i tris, pH 9,2) 1,6, 1,7, 1,75 i 1,78 ml Boja 200 µl Ovaj test je raĊen samo za Congo red boju i apsorbancija je mjerena na 565 nm (za pH 3 i 4,5) i 495 nm (za pH 5,7, 6,5 i 9,2). Sastav reakcione smješe sa inhibitorom (azidom): Boja (congo red) 200 µl Spore (koncentrovane, prethodno inkubirane sa 5 mM azidom) 100 µl Pufer (0,1 M acetatni, pH 5,7) 1,7 ml Spore su inkubirane u 5 mM azidu, 30 min. Posle inkubiranja spore su isprane destilovanom vodom i dodate u reakcionu smješu. 123 4.3.4.7 Primjena lakaza za uklanjanje fenola Sastav smješe za 0,25 mM fenol Spore (koncentrovane) 50 µl ABTS (1mM) 1 ml Pufer (0,1 M acetatni, pH 4 i 6,5) 700 µl Fenol (2 mM) 250 µl Rastvor fenola je napravljen na sledeći naĉin: Za 100 mM fenol: Fenol 0,19 g Voda 20 ml Za 2 mM fenol: Fenol (100 mM) 2 ml Voda 98 ml Sastavi smješa za 50 i 100 mg/L fenola: Spore (koncentrovane) 50 µl Fenol (400 mg/L) 250 µl (za 100 mg/L) i 125 µl (za 50 mg/L) Pufer (0,1 M acetatni, pH 4) 600 µl (za 100 mg/L) i 725 µl (za 50 mg/L) ABTS (1 mM) 100 µl (za 100 µM) i 500 µl (za 500 µM) Rastvor fenola (400 mg/L) je napravljen na sledeći naĉin: Fenol 100 mg Voda 250 ml Koncentracija fenola je odreĊivana spektrofotometrijski mjerenjem apsorbancije supernanta. Kontrole su sadržavale sve sem spora. Prilikom mjerenja fenola kao i kod boja smeše su prvo cenrifugirane i za mjerenje apsorbancije su korišćeni supernatanti. 124 4.3.5 Zamrzavanje najaktivnijih pojedinačnih kolonija Sastav smeša za zamrzavanje: Spore 400 µl Sterilna voda 400 µl Sterilni glicerol 200 µl Po dodavanju glicerola, smješe su vorteksovane i zamrznute na -80ºC. 4.4 Uklanjanje ksenobiotika rekombinantno proizvedenom lakazom iz soja B.amyloliquefaciens 12B1 eksprimiranoj u E. coli BL21 4.4.1 Kloniranje Lacc gena u ekspresioni vektor pET21a Kao templat za dizajn prajmera je korišćena sekvencija CotA iz B.amyloliqufaciens DSM7 (GenBank pristupni broj YP_003919218). Prajmerima su dodata restrikciona mjesta za NdeI i EcoRI. Dizajnirani prajmeri: Fw GCA CAT ATG ATG GCA CTT GAA AAA TTT GC Rev ACT GAA TTC TTA CTG CTT TTC TGT GAC GTC 4.4.1.1 Održavanje sojeva i čuvanje bakterija Soj E. coli Top10 je korišćen u koracima subkloniranja, a E. coli BL21 DE3 je korišćen za ekspresiju rekombinantne lakaze. 4.4.1.2 Uslovi gajenja Medijum korišćen za gajenje E. coli je standardni bogati medijum Luria-Bertani (LB). Kulture su gajene na 37°C u incubator-mućkalici pri rotaciji od 150 o/min. U selektivni medijum je dodavan ampicilin (štok rastvor konc. 100 mg/mL) do finalne koncentracije od 100 µg/mL, dok je za ĉvrste medijume dodavan agar do finalne 125 koncentracije 15%. Sojevi se ĉuvaju su u glicerolskim štokovima na -70°C, kao i na kosom agaru na 8°C. 4.4.1.3 Umnožavanje Lacc gena PCR reakcijom Koristeći dva para prajmera navedene u tabeli 9. uraĊen je PCR kao što je opisano u odjeljku 4.3.3.2. UraĊena je optimizacija PCR reakcije mijenjanjem annealing temperature, kako bi se optimizovalo vezivanje prajmera za templat DNA. Isprobane su annealing temperature od 50, 55,5, 60 i 65ºC za Kosc Fw/Kosc Rev par prajmera i annealing temperature od 53, 55 i 57ºC za novodizajnirani par prajmera CotA Fw/CotA Rev. Nakon optimizacije korišćena je annealing temperatura od 55ºC za par prajmera CotA Fw/CotA Rev. 4.4.1.4 Digestija restrikcionim enzimima Digestija je uraĊena sa parom brzo digestujućih restrikcionih enzima NdeI i EcoRI na 37ºC, po uputstvu proizvoĊaĉa (Fermentas). Specifiĉnost ove digestije je pojava tzv. “star” aktivnosti kod EcoRI enzima već nakon 20 min, pa je potrebno DNA fragment inkubirati sa enzimom NdeI 40min, a zatim u reakcionu smješu dodati EcoRI i inkubirati još 15-20 minuta. Inaktivacija enzima se obavlja inkubiranjem na 80ºC 5 minuta. Sastav reakcione smješe: Sastojak: V (µL): NdeI 2 EcoRI 2 10xpuf 6 DNA 25 Voda 25 Plazmid pET21a je digestovan na isti naĉin, sem što je vrijeme inkubiranja 10 min. Nakon inaktivacije enzima sve reakcione smješe su elektroforetski razdvojene na semipreparativnom 1,5% agaroznom gelu. Trake koje sadrže fragmente su isjeĉene iz gela sterilnim skalpelom i DNA fragmenti izolovani korišćenjem komercijalnog kita (Qiagen Gel Extraction kit ili Promega Wizard SV Gel and PCR kit). 126 4.4.1.5 Ligacija korišćenjem T4 DNA ligaze Ligacija uraĊena po uputstvu proizvoĊaĉa (Roche) sa T4 DNA ligazom inkubiranjem na 16 ºC preko noći. Sastav ligacione smješe: Insert 10,5 uL Linearizovani vektor 6,5 uL 10x T4 Lig pufer 2 uL T4 DNA Ligaza 1 uL Ligaciona smješa je direktno korišćena za transformaciju svježe pripremljenih elektrokompetentnih ćelija. 4.4.1.6 Priprema elektrokompetentnih ćelija i transformacija elektroporacijom Potrebno je sterilisati autoklaviranjem sve rastvore, nastavke za pipete i sudove (kivete za centrifugu). 4.4.1.6.1 Priprema kompetentnih celija  Inokulisati 10 mL LBamp podloge kolonijom sa Petrijeve šolje ili iz glicerolskog štoka. Inkubirati preko noći na 37 C.  Prebaciti 2 mL inokuluma u 100 mL LBamp podloge u erlenmajeru od 500 mL.  Inkubirati na 37 C i 150 o/min dok OD600 ne dostigne 0,6-0,7. Ohladiti kulturu 10 min na ledu. Od ovog trenutka ćelije moraju da budu na hladnom.  Centrifugirati 10 min na 5000 o/min u sterilnim ohladjenim kivetama u centrifugi sa hlaĊenjem (4 C).  Odliti supernatant i aspirirati ostatak medijuma.  Dodati 50 mL hladnog 10% glicerola i resuspendovati ćelije pipetiranjem.  Centrifugirati 10 min na 5000 o/min u sterilnim ohladjenim kivetama u centrifugi sa hlaĊenjem (4 C). 127  Odliti supernatant i aspirirati ostatak medijuma.  Dodati 25 mL hladnog 10% glicerola i resuspendovati ćelije pipetiranjem.  Centrifugirati 10 min na 5000 o/min u sterilnim ohladjenim kivetama u centrifugi sa hlaĊenjem (4 C).  Odliti supernatant i aspirirati ostatak medijuma.  Resuspendovati ćelije u 1 mL hladnog 10% glicerola i alikvotirati po 50 µL.  Ćelije mogu da se koriste za transformaciju odmah, a mogu id a se zamrznu na - 70 C za kasniju upotrebu (ćelije su upotrebljive do 6 mjeseci). 4.4.1.6.2 Transformacija  2 µL ligacione smješe se pomiješa sa 50 µL kompetentnih ćelija i inkubirati na ledu 2 min.  Prebaciti ćelije u kivetu za elektroporaciju i koristeći program za E. coli uraditi transformaciju.  Dodati 600 µL SOC medijuma u kivetu i promiješati pipetiranjem. Prebaciti suspenziju ćelija u sterile epruvetu od 15 mL i inkubirati 1 h na 37 C uz mućkanje.  Zasijati 50, 100 i 250 µL na LBamp agar i inkubirati Petrijeve šolje preko noći na 37 C. 4.4.2 Ispitivanje ekspresije rekombinantne lakaze Klonovi E. coli pET21a-Lac su zasijani u po 3 mL LBamp i inkubirani na 37 C i 150 rpm. Nakon 16 h uzeto je po 2 mL i presijano u erlenamjere od 500 mL sa 100 mL LBamp podloge. Kada je OD600 ~ 1, indukovana je ekspresija dodatkom 250 µL 100 mM IPTG (finalna koncentracija 0,25 mM) i 200 uL 1M CuSO4∙5H2O (finalna koncentracija 2 mM). Temperatura je snižena na 25ºC, a nakon 6 ĉasova brzina mućkanja je smanjena na 75 o/min saglasno referenci Durao et al. (2008a) kako bi se postigli mikroaerofilni uslovi i tako se smanjio toksiĉan efekat bakra. 128 4.4.2.1 Određivanje aktivnosti Lacc Aktivnost lakaze je odreĊivana na 25 ºC praćenjem oksidacije ABTS-a na 420 nm (ε420= 3.6 x 10 4 M -1 cm -1). Reakciona smješa sadrži 2 mM ABTS, 100 mM Na- acetatni pufer pH 3.0. Lakazna aktivnost prema DMP je odreĊivana u smješi koja sadrži 1 mM DMP u 100 mM fosfatnom puferu pH 7,0. Oksidacija DMP je praćena mjerenjem promjene apsorbancije 477 nm (ε477= 1.48 x 10 4 M -1 cm -1 ). Podaci o korišćenim supstratima za odreĊivanje lakazne aktivnosti: Supstrat Mr Talasna dužina (nm) Finalna konc. (mM) Odmjeriti (mg) za 10 mL rastvora Rastvoriti u: pH ABTS 514,60 420 0,50 2,60 Puferu 4,0 SGZ 360,36 525 0,05 0,18 DMSO 7,0 DMP 154,16 468 0,50 0,80 Puferu 7,0 4.4.2.2 Ispitivanje uticaja koncentracije Cu2+ jona na ekspresiju lakaze Postupak je identiĉan opisanom postupku u odjeljku 4.4.2, sem što je varirana finalna koncentracija CuSO4∙5H2O (0,2, 1,0, 2,0 i 4,0 mM). 4.4.3 Izolovanje i prečišćavanje rLac iz E. coli 4.4.3.1 Homogenizacija Nakon 22h od indukcije ćelije su skupljene centrifugiranjem na 4000 o/min, 30 minuta na 4ºC. Talog ćelija je zatim resuspendovan u zapremini koja odgovara 1/10 od zapremine culture (10 mL za kulturu od 100 mL)100 mM trisHCl pufera pH 7,5 sa koktelom inhibitora proteaza (Roche Complete mini EDTA-free). Ćelije su lizirane ultrazvuĉnom sondom sa ĉetiri tretmana od 15 sekundi, pri ĉemu je ćelijska suspenzija držana na ledu da se sprijeĉi prekomjerno zagrijevanje. 129 4.4.3.2 Jonoizmjenjivačka hromatografija na koloni Q-Sepharose Dobijeni homogenat je izbistren centrifugiranjem, nakon ĉega je rasoljen dijalizom prema 10 mM fosfatnom puferu pH 7,0. Dijalizovani uzorak je nanešen na kolonu Q-Sepharose XK 16/10, ekvilibrisanu u 10 mM fosfatnom puferu pH 7,0. Nakon ispiranja nevezanih proteina startnim puferom kolona je eluirana gradijentom jonske sile od 0-0,5M NaCl u 5 zapremina kolone. Dobijene frakcije su testirane na aktivnost lakaza. Aktivne frakcije su spojene i koncentrovane liofilizacijom i naknadnim rastvaranjem. 4.4.4 Određivanje biohemijskih parametara korišćenih lakaza Biohemijski parametri su odreĊeni analogno postupcima opisanim u odjeljku 4.3.4, s tim da je aktivnost rekombinantne lakaze odreĊivana po proceduri opisanoj u odjeljku 4.4.2.1. 4.4.5 Primjena rekombinantno proizvedene lakaze u obezbojavanju reaktivnih boja Postupak je analogan postupku opisanom u odjeljku 4.3.4.6. 4.5 Uklanjanje ksenobiotika peroksidazom iz rena (Armoracia rusticana) 4.5.1 Hromatografsko frakcionisanje izoformi peroksidaze 4.5.1.1 Rasoljavanje preparata peroksidaze na koloni Sephadex G 25 Kolona Sephadex G 25 (400 mL) je ekvilibrisana 5 mM natrijum fosfatnim puferom pH 7,1 propuštanjem 5 zapremina kolone (2 L). Na koloni je rasoljeno 118 mL preparata peroksidaze, sakupljena je frakcija od 138 mL. 130 5mM natrijum fosfatni pH 7,1 NaH2PO4 0,68 g Dejonizovana voda do 1 L Podešeno je na pH 7,1. 4.5.1.2 Jonoizmenjivačka hromatografija preparata peroksidaze na koloni Q- Sepharose FF Kolona Q-Sepharose FF XK 16/10 je ekvilibrisana 5 mM natrijum fosfatnim puferom pH 7,1 dok konduktivitet i pH na ulazu i izlazu iz kolone nije bio jednak (χ=594 μS/cm2, pH 7,1). Nevezane frakcije (b1 i b2) su eluirane istim puferom. Vezane frakcije (k1 i k2) su elirane 0,5 M NaCl u startnom puferu. 0,5 M NaCl u 5 mM natrijum fosfatnom puferu pH 7,1 NaH2PO4 0,68 g NaCl 29,3 g Dejonizovana voda do 1 L Podešeno je pH na 7,1. 4.5.1.3 Izoelektrično fokusiranje frakcija peroksidaze sa kolone Q-Sepharose FF Izoelektriĉno fokusiranje je uraĊeno kao što je opisano u odjeljku 4.1.1.3. 4.5.1.4 Zimogramska detekcija peroksidazne aktivnosti gvajakolom nakon izoelektričnog fokusiranja Nakon fokusiranja gel je ispran 3 x 10 minuta u dejonizovanoj vodi. Nakon toga je ekvilibrisan u puferu 50 mM natrijum fosfatni pH 7,5. Potom je dodat supstrat za detekciju peroksidaze. 131 Potrebni rastvori: 1. 50 mM natrijum fosfatni pufer pH 7,5 NaH2PO4 6,9 g Dejonizovana voda do 1 L Podešeno pH 7,5 2. Rastvor supstrata Gvajakol 20 μL 4,41 M H2O2 20 μL 50 mM Na-fosfatni pufer pH 7,5 20 mL Rastvor se pravi neposredno pre upotrebe. 4.5.1.5 Analiza slika gelova Gelovi su skenirani na Canon CanoScan Lide 90 skeneru pri rezoluciji od 300 dpi. 4.5.1.6 Određivanje aktivnosti HRP gvajakolom Potrebni rastvori: 100 mM natrijum fosfatni pufer pH 7,0 NaH2PO4 13,8 g Dejonizovana voda do 1 L Podešeno pH 7,0 0,02 M gvajakol Gvajakol 58,8 μL Dejonizovana voda do 24 mL 0,008 M H2O2 4,41 M H2O2 0,1 mL Dejonizovana voda do 60 mL Uzorak 0,1 mL Enzimski uzorak se po potrebi razblaži u puferu u kome je rastvoren i supstrat. 132 Sve komponente se pomiješaju u kiveti. Za mjerenje na A436 se poništi- to je slepa proba i dalje se meri A436 u vremenu na svakih 15 sekundi. Aktivnost peroksidaze se raĉuna prema formuli: U/ml= ∆𝐴436/ min ∙ 4∙𝑉𝑟𝑠 25.5∙𝑉𝑒 𝑥 𝑅 4.5.2 Poređenje efikasnosti izoformi HRP u uklanjanju tekstilnih boja Obezbojavanje boja dejstvom HRP je ispitano na dvadeset boja razliĉitih strukturnih motiva. Ispitivana je zavisnost enzimske aktivnosti od pH rastvora boje, pa je stoga polazni koncentrovani rastvor boje (koncentracije 0,5 g/L) razblažen u puferima ĉetiri razliĉita pH i sastava (100 mM acetatni pufer pH 3,0 i pH 5,0, 100 mM natrijum fosfatni pufer pH 7,0 i 100 mM bikarbonatno-karbonatni pufer pH 9,0). U zavisnosti od apsorpcionog maximum (Amax ) na odreĊenoj talasnoj dužini, svaka boja je razblažena toliko puta da je bilo moguće pratiti smanjenja apsorbancije (A) u linearnom opsegu spektrofotometrijski tj. svedena je na vrednost od približno 1,0 na maksimumu svoje talasne dužine. Obezbojavanje je raĊeno u epruvetama, a reakciona smješa je sadržavala 1mL boje odgovarajućeg razblaženja, 0,16 U/mL HRP (BP ili KP) i H2O2 u finalnoj koncentraciji od 0,44 mM. Epruvete su tokom reakcije držane u mraku, kako bi se izbjegao efekat fotohemijske degradacije boje. Nakon 2 ĉasa je mjerena Amax svake reakcione smješe, a nakon 24 ĉasa VIS spektar od 380 do 800 nm. Procenat obezbojenja je izraĉunat na osnovu sledeće formule: % obezbojenja=(Ao-Ai)/Ao*100 gdje Ai predstavlja apsorbanciju nakon tretiranja HRP, Ao apsorbanciju slijepe probe (boja). 4.6 Primjena CPO u obezbojavanju reaktivnih boja i halogenfenola Soj A.niger MGG029 koji nosi vektor pCPO3.I-AmdS je dobijen ljubaznošću prof. Punt sa katedre za primjenjenu mikrobiologiju i gensku tehnologiju, TNO Nutrition and Food Research Institute, Zeist, Holandija. 133 4.6.1 Produkcija CPO fermentacijom A.nigera 4.6.1.1 Izolovanje hemina U ovom eksperimentu hemin se koristi da bi se povećao nivo ekspresije hloroperoksidaze. Endogena sinteza hema je metaboliĉki zahtjevan proces i sastoji se od mnogo koraka. Standardni naĉin izolovanja hemina polazi od životinjskih eritrocita koji se dobijaju centrifugiranjem krvi u koju je dodat Na-citrat i glukoza da bi se sprijeĉila kaogulacija. Hemoglobin se tretiranjem vrelim rastvorom sirćetne kiseline i NaCl raspada u globin (denaturiše se i taloži) i hemin (crvena supstanca). U korišćenom postupku hemin se ekstrahuje rastvorom stroncijum-hlorida u sirćetnoj kiselini i acetonu. Zagrevanje olakšava precipitaciju proteina i povećava ĉistoću hemina. Postupak Na jedan dio 2% stroncijum-hlorida heksahidrata u glacijalnoj sirćetnoj kiselini dodato je tri djela acetona. U jednu zapreminu eritrocita dodato je tri zapremine destilovane vode uz energiĉno miješanje. Liziranje eritrocita zbog osmotskog šoka je ubrzano dodatkom par kapi toluola. U odmjerenu zapreminu acetonsko-sirćetne smješe dodat je u kapima rastvor liziranih eritrocita. Nakon dodatka celokupne koliĉine lizata, smješa je zagrejana do kljuĉanja. Uoĉava se precipitiranje globulina. Da bi se olakšala estrakcija nakon zagrijevanja dodata je jednaka zapremina acetona u smesu. Precipitirani globulini odvojeni su cijeĊenjem kroz nabrani filter papir. Filtrat je uparen na vakuum-uparivaĉu. Suvi ostatak je rastvoren u e 50%-noj sirćetnoj kiselini, a zatim ekstrahovan hloroformom u lijevku za odvajanje. Hloroformski rastvor je uparen do suva na vakuum-uparivaĉu, a dobijeni suvi ostatak je liofilizovan da bi se uklonili tragovi vode. Preparat hemija je ĉuvan u frižideru do korišćenja. 4.6.1.2 Priprema inokuluma 1 mL spora A.niger MGG029 koji nosi vektor pCPO3.I-AmdS konc. 1,6 x 106 je korišćeno za inokulaciju 30 mL YPD medijuma u erlenmajeru od 500 mL . Ostavljeno preko noći u rotacionoj mućkalici-inkubatoru na 200 rpm i 28°C. 134 Sastav YPD medijuma: Rastvor 1. Ekstrakt kvasca 10g Pepton 20g Rastvoriti u 900 mL dejonizovane vode i autoklavirati. Rastvor 2. Glukoza 20g Rastvoriti u 80 mL vode i autoklavirati. Pomiješati rastvore 1 i 2. 4.6.1.3 Priprema podloge Podloga za produkciju CPO je minimalna podloga za Aspergillus sa 5% maltodekstrinom i obogaćena sa 0,5% kazein-hidrolizatom i 500 mg/L heminom (dodaje se rastvoren u razblaženom amonijaku) (Conesa et al., 2001). Aspergillus minimalna podloga (Baratt et al., 1965). Sastojak za 1 L NaNO3 6.0 g KCl 0.52 g MgSO4 7H2O 0.52 g KH2PO4 1.52 g podesiti pH na 6.5 sa NaOH Glukoza 10.0 g Hutner-ovi elementi u tragovima 2 mL 135 Hutner-ovi elementi u tragovima H20 100 ml ZnSO4 7H20 2.2 gm H3BO3 1.1 gm MnCl2 4H20 0.5 gm FeSO4 7H20 0.5 gm CoCl2 6H20 0.16 gm CuS04 5H20 0.16 gm (NH4)Mo7024 4H20 0.11 gm Na2EDTA 5.0 gm Priprema elemenata u tragovima: Zagrijati rastvor do kljuĉanja, ohladiti do 60°C i podesiti pH rastvorom KOH na 6,5-6,8. Rastvor mijenja boju u tamno ljubiĉastu stajanjem. Ukoliko se prilikom titrovanja pH pretitruje preko 7,0 odbaciti rastvor i napraviti novi. 4.6.1.4 Fermentacija Ĉitav inokulum (30 mL) je prebaĉen u pripremljenu podlogu u erlenmajer od 2 L. Nakon 24h dodato je 1 mL zasićenog rastvora K3PO4 radi održavanja pH vrijednosti podloge. Nakon 48h fermentacija je prekinuta; biomasa je odvojena centrifugiranjem na 3200 rpm na 4°C 30 min. Dobijeni supernatant je dodatno izbistren cijeĊenjem na filter papiru, nakon ĉega je dodat PMSF da se sprijeĉi dejstvo proteaza. Rastvor se ĉuva u frižideru do daljih koraka u preĉišćavanju. 4.6.1.5 Izolovanje rekombinantne hloroperoksidaze iz fermentacione tečnosti A.niger Fermentaciona teĉnost (415 ml) je ponovo centrifugirana na Sorval centrifugi na 10000 o/min 20 min, proceĊena kroz naborani filter papir i ultrafiltrovana do 15 ml. Aktivnost CPO je iznosila 24 U/ml. 136 Retentant je frakcionisan jonoizmenjivaĉkom hromatografijom. Korišćena je kolona sa 50 mL DEAE celuloze (Whatman) ekvilibrisana u 20 mM fosfatnom puferu. Uzorak je prije nanošenja na kolonu rasoljen da bi se uklonili prisutni pigmenti. Prvo su eluirani nevezani proteini poĉetnim puferom, a potom je elucija uraĊena sa 200 mM fosfatnim puferom. Skupljane su frakcije od po 10 ml. Aktivnost frakcije sa najvećom koncentracijom CPO aktivnosti je iznosila 8 U/ml. Aktivnost katalaze na pH 2,75 je u ovim frakcijama bila jako mala. 4.6.1.6 Određivanje aktivnosti CPO U fermentacionoj teĉnosti je odreĊena enzimska aktivnost za CPO na sledeći naĉin: reakciona smješa sadrži u finalnim koncentracijama 20 mM KCl, 2 mM H2O2, 100 mM K-fofsatni pufer, pH 2,75 i 0,16 mM monohlordimedon. Za kontinualne eseje koji su raĊeni u zapreminama od 0,5 ml reakcione smješe su pravljene dodavanjem 50 µl 1,6 mM monohlordimedona, 100 µl 100 mM KCl, 262,2 µl pufera 0,25 M, 62,5 µl 16 mM H2O2 i 25 µl testiranog uzorka. 4.6.1.7 Ispitivanje mogućnosti primjene CPO za uklanjanje fenola i boja Korišćena je najaktivnija frakcija dobijena nakon IEX hromatografijem kojoj je odreĊena peroksidazna aktivnost testom sa gvajakolom (postupak opisan u odjeljku koji se odnosi na odreĊivanje aktivnosti peroksidaze). Testirane su sledeće boje: PDB, RB52, RG15 i AB, ĉija je finalna koncentracija iznosila 50 mg/L. Korišćen je 0,1 M acetatni pufer, pH 5. Ispitana je efikasnost obezbojavanja sa vodonik-peroksidom i terc-butil peroksidom (tBuOOH). Reakciona smješa sa H2O2: Boja (rastvorena već u puferu) 900 µl CPO 100 µl H2O2 (0,3%) 10 µl 137 Reakciona smješa sa tBuOOH: Boja 900 µl CPO 100 µl tBuOOH (80%) 5 µl Uzorcima su snimljeni spektri nakon 2h inkubiranja na sobnoj temperaturi. Za potrebe testiranja efikasnosti CPO za uklanjanje fenola (p-CP, p-BP i 2,4,6 trihlorfenol), korišćene su finalne koncentracije fenola od 50 mg/L. Osnovni rastvori fenola su razblaživani u puferu. Testirana je reakcija na pH 3, 5 i 6 (0,1 M acetatni pufer i 0,1M fosfatni pufer). Reakciona smješa: CPO 25 µl Fenoli 975 µl tBuOOH (20xR) 5 µl Uzorcima su snimljeni spektri nakon 2h inkubiranja na sobnoj temperaturi. 4.7 Eksperimenti sa lakazom iz Trametes versicolor ATCC 42530 Soj T.versicolor ATCC42530 je dobijen ljubaznošću Dr Gloria Caminal Saperas sa katedre za hemijsko inžinjerstvo, Universitat Autònoma de Barcelona, Barselona, Španija. 4.7.1 Održavanje soja i priprema inokuluma Soj je održavan na Petri šoljama sa sladnim agarom presijavanjem jednom mjeseĉno i gajenjem na 25°C. Sa ploĉe stare 7 dana isjeĉeni komadi agara 1x1 cm su korišćeni za inokulaciju teĉnog medijuma. 4.7.2 Priprema peleta Rastvoru sladnog ekstrakta (20g/L) podesi se pH na 4,5 i odmjeri se 250 mL ovog rastvora u erlenmajer od 1L. Nakon autoklaviranja inokuliše se sa 4 komada 1x1cm prerasle ploĉe sladnog agara. Nakon sedam dana dobijena masa micelijuma se prebaci u sterilni rastvor 0,85% NaCl i homogenizuje rotor/stator homogenizatorom. Za 138 produkciju peleta koristi se 1 mL dobijene suspenzije kojim se inokuliše 250 mL 2% sladnog ekstrakta. Za rast peleta potrebno je 5-7 dana. Tokom ovog perioda lakaza se aktivno sintetiše i luĉi u medijum. Nakon odvajanja biomase filtrovanjem fermentaciona teĉnost se koncentruje deset puta liofilizacijom i koristi u eksperimentima obezbojavanja. Statistika Svi eksperimentalni rezultati dobijeni u ovoj disertaciju predstavljaju srednje vrijednosti ponovljenih eksperimentalnih rezultata (duplikati ili triplikati, zavisno od eksperimenta). Standardna devijacija (SD), statistiĉka znaĉajnost (odreĊivana t-testom, p < 0,05), kao i grafiĉki rezultati uraĊeni su u softverskom paketu Origin 8.0. 139 5. Literatura Adebajo MO, Frost RL, Kloprogge JT, Carmody O, Kokot S, Porous materials for oil spill cleanup: a review of synthesis and absorbing properties. J Porous Materials 10 (2003) 159–170. Alexandre G, Zhulin IB, Laccases are widespread in bacteria. Trend Biotechnol 18 (2000) 41–42. Alpat SK, Ozbayrak O, Alpat S, Akcay H, The adsorption kinetics and removal of cationic dye, Toluidine Blue O, from aqueous solution with Turkish zeolite. J Hazard Mater 151 (2008) 213–220. Akhtar S, Khan AA, Husain Q, Potential of immobilized bitter gourd (Momordica charantia) peroxidases in the decolorization and removal of textile dyes from polluted wastewater and dyeing effluent. Chemosphere 60 (2005) 291-301. Akhtar S, Khan AA, Husain Q, Partially purified bitter gourd (Momordica charantia) peroxidase catalyzed decolorization of textile and other industrially important dyes. Biores Tech 96 (2005) 1804–1811. Aktas N, Kibarer G, Tanyolac A, Effects of reaction conditions on laccase catalyzed α- naphthol polymerization. J Chem Tech Biotech 75 (2000) 840-846. Aktas N, Sahiner N, Kantoglu O, Salih B, Tanyolac A, Biosynthesis and characterization of laccase catalyzed poly(catechol). J Polym Environ 11 (2003) 123- 128. Alemzadeh I, Nejati S, Phenols removal by immobilized horseradish peroxidase, J Hazard Mater 166 (2009) 1082 – 1086. 140 Alexander F, McKay G, Kinetics of removal of basic dye from effluent using silica. Chem Eng 319 (1977) 243–246. Arica MY, Immobilization of polyphenol oxidase on carboxymethylcellulose hydrogel beads: preparation and characterization. Polym Int 49 (2000) 775 – 781. Armenante PMD, Kafkewitz D, Lewandowski GA, Jou CJ, Anaerobic-aerobic treatment of halogenated phenolic compounds. Water Res 33 (1999) 681-692. Arnao MB, Acosta M, del Rio JA, Varon R, Garcia-Canovas F, A kinetic study on the suicide inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide. Biochim Biophys Acta 1041 (1990) 43-47. Ashraf H, Husain Q, Studies on bitter gourd peroxidase catalyzed removal of p- bromophenol from wastewater. Desalination 262 (2010) 267 – 272. Axen R, Drevin H, Carlsson J, Preparation of modified agarose gels containing thiol groups, Acta Chem Scan B 29 (1975) 471 – 474. Ayala M, Batista CV, Vazquez-Duhalt R, Heme destruction, the main molecular event during the peroxide-mediated inactivation of chloroperoxidase from Caldariomyces fumago. J Biol Inorg Chem 16 (2011) 63-8. Bandala ER, Pelaez MA, Garcia-Lopez AJ, Salgado MJ, Moeller G, Photocatalytic decolourisation of synthetic and real textile wastewater containing benzidine-based azo dyes. Chem Eng Proces 47 (2008) 169–176. Baneyx F, Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotech 10 (1999) 411–421. Baneyx F, Mujacic M, Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli. Nat Biotechnol 22 (2004) 1399-1408. 141 Bansal RC, Goyal M, Activated Carbon Adsorption. Taylor & Francis Group, Boca Raton (2005). Barratt RW, Johnson GB, Ogata WN, Wild-type and mutant stocks of Aspergillus nidulans. Genetics 52 (1965) 233-46. Baynton KJ, Bewtra JK, Biswas N, Taylor KE, Inactivation of horseradish peroxidase and hydrogen peroxide: a kinetic investigation. Biochim Biophys Acta 1206 (1994) 272- 278. Bhunia A, Durani S, Wangikar P, Horseradish Peroxidase Catalyzed Degradation od Industrially important dyes. Biotech bioeng 72 (2001) 562-567. Bickerstaff G, Immobilization of enzymes and cells, Humana Press (1997). Bisschops I, Spanjers H, Literature review on textile wastewater characterization. Environ Tech 24 (2003) 1399-1411. Blanke SR, Hager LP, Identification of the fifth axial heme ligand of chloroperoxidase. J Biol Chem 263 (1988) 18739-18743. Bollag JM, Leonowicz A, Comparative studies of extracellular fungal laccases. Appl Environ Microbiol 48 (1984) 849–854. Bornscheuer UT, Immobilizing enzymes: how to create more suitable biocatalysts. Angewandte Chemie Int Ed 42 (2003), 3336-3337. Burton SG, Biocatalysis with polyphenoloxidase: a review. Catal Today 22 (1994) 459– 487. 142 Busca G, Berardinelli S, Resini C, Arrighi L, Technologies for the removal of phenol from fluid streams: A short review of recent developments. J Hazard Mater 160 (2008) 265-288. Cao L, van Langen L, Sheldon RA, Immobilised enzymes: carrier-bound or carrier- free? Cur Opin Biotech 14 (2003), 387–394. Carbon Enterprises Inc. (CEI) Filtration, Internet stranica, URL: http://www.ceifiltration.com/filtration.asp?p=greensand. Chattopadhyay K, Mazumdar S, Structural and conformational stability of horseradish peroxidase: effect of temperature and pH. Biochemistry 39 (2000) 263-270. Chedeville O, Debacq M, Ferrante Almanza M, Porte C, Use of an ejector for phenol containing water treatment by ozonation. Sep Purif Technol 57 (2007) 201–208. Cheng MM, Ma WH, Li J, Huang YP, Zhao JC, Visible-light-assisted degradation of dye pollutants over Fe(III)-loaded resin in the presence of H2O2 at neutral pH values. Environ Sci Tech 38 (2004) 1569–1575. Cheng HR, Jiang N, Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and yeasts. Biotech Lett 28 (2006) 55-59. Cheremisinoff NP, Handbook of Water and Wastewater Treatment Technologies. Butterworth-Heinemann, Boston (2002). Cho E, Seo J, Lee DW, Pan JG, Decolorization of indigo carmine by laccase displayed on Bacillus subtilis spores. Enz Microb Tech 49 (2011) 100–104. Christie R, Colour Chemistry. The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK (2001). 143 Chroma L, Macek T, Demnerova K, Mackova M, Decolorization of RBBR by plant cells and correlation with the transformation of PCBs. Chemosphere 49 (2002) 739-748. Clark PA, Solomon EI, Magnetic circular-dichroism spectroscopic definition of the intermediate produced in the reduction of dioxygen to water by native laccase. J Am Chem Soc 114 (1992) 1108–1112. Claus H, Laccases and their occurrence in prokaryotes. Arch Microbiol 179 (2003) 145- 150. Claus H, Filip Z, The evidence of a laccase-like enzyme activity in a Bacillus sphaericus strain. Microbiol Res 152 (1997) 209-216. Cole JL, Tan GO, Yang EK, Hodgson KO, Solomon EI, Reactivity of the laccase trinuclear copper active site with dioxygen: an X-ray absorption Edge Study. J Am Chem Soc 112 (1990) 2243–9. Conesa A, de Velde F, Rantwijk F, Sheldon RA, den Hondel C, Punt PJ, Expression of the C. fumago chloroperoxidase in A.niger and characterization of the recombinant enzyme. J Biol Chem 276 (2001) 17635-17640. Contreras S, Rodriguez M, Al Momania F, Sansa C, Esplugasa S, Contribution of the ozonation pre-treatment to the biodegradation of aqueous solutions of 2,4- dichlorophenol. Water Res 37 (2003) 3164-3171. Cooper VA, Nicell JA, Removal of phenols from a foundry wastewater using horseradish peroxidase. Water Res 30 (1996) 954-964. Cordi L, Minussi RC, Freire V, Duran N, Fungal laccase: copper induction, semi- purification, immobilization, phenolic effluent treatment and electrochemical measurement. Afric J Biotech 6 (2007) 1255-1259. 144 de Souza, SMAGU, Forgiarini E, de Souza AAU, Toxicity of textile dyes and their degradation by the enzyme horseradish peroxidase (HRP). J Hazard Mater 147 (2007) 1073–1078. Do DD, Adsorption Analysis: Equilibria and Kinetics. Imperial College Press, London (1998). Dogan D, Turkdemir H, Electrochemical oxidation of textile dye indigo. J Chem Tech Biotech 80 (2005) 916–923. Ducros V, Brzozowski AM, Wilson KS, Brown SH, Östergaard P, Schneider P, Crystal structure of the Type 2 Cu depleted laccase from Coprinus cinereus at 2.2 Å resolution. Nat Struct Biol 5 (1998) 310–6. Dunford HB, Stillman JS, On the function and mechanism of action of peroxidases. Coord Chem Rev 19 (1976) 187-251. Dunford HB, Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties. In: Everse, J., Everse, K.E. and Grisham, M.B. (eds.), Peroxidases in Chemistry and Biology Vol. II. (pp. 1-24). CRC Press, Boca Raton, Florida (1991). Duran N, Esposito E, Potential applications of oxidative enzymes and phenoloxidase- like compounds in wastewater and soil treatment: a review, Appl Catal B Environ 28 (2000) 83 – 99. Duran N, Rosa MA, D’Annibal A, Gianfreda L, Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. Enz Microb Technol 31 (2002) 907 – 931. Durao P, Chen Z, Fernandes AT, Hilderbrandt P, Murgida DH, Todorovic S, Pereira MM, Melo EP, Martins LO, Copper incorporation into recombinant CotA laccase from 145 Bacillus subtilis: characterization of fully copper loaded enzymes. J Biol Inorg Chem 12 (2008a) 183-193. Durao P, Bento I, Fernandes AT, Melo EP, Lindley PF, Martins LO: Perturbations of the T1 copper site in the CotA laccase from Bacillus subtilis: structural, biochemical, enzymatic and stability studies. J Biol Inorg Chem 11 (2006) 514-526. Durao P, Chen Z, Silva CS, Soares CM, Pereira MM, Todorovic S, Hildebrandt P, Bento I, Lindley PF, Martins LO: Proximal mutations at the type 1 copper site of CotA laccase: spectroscopic, redox, kinetic and structural characterization of I494A and L386A mutants. Biochem J 412 (2008b) 339-346. Elliott KA, Oxidations catalysed by horseradish- and milk-peroxidases. Biochem J 26 (1932) 1281-1290. Endo K, Hayashi Y, Hibi T, Hosono K, Beppu T, Ueda K, Enzymological characterization of EpoA, a laccase-like phenol oxidase produced by Streptomyces griseus. J Biochem 133 (2003) 671-677. Enguita FJ, Martins LO, Henriques AO, Carrondo MA, Crystal structure of a bacterial endospore coat component. A laccase with enhanced thermostability properties. J Biol Chem 278 (2003) 19416-19425. Environmental Protection Agency, EPA, internet stranica URL: http://nepis.epa.gov/Adobe/PDF//2000LNAI.PDF Espin JC, Wichers HJ, Activation of a latent mushroom (Agaricus bisporus) tyrosinase isoform by sodium dodecyl sulfate (SDS). Kinetic properties of the SDS-activated isoform. J Agric Food Chem 47 (1999) 3518 – 3525. 146 Fang Z, Li T, Wang Q, Zhang X, Peng H, Fang W, Hong Y, Ge H, Xiao Y, A bacterial laccase from marine microbial metagenome exhibiting chloride tolerance and dye decolorization ability. Appl Microbiol Biotech 89 (2011) 1103–1110. Festa G, Autore F, Fraternali F, Giardina P, Sannia G, Development of new laccases by directed evolution: functional and computational analyses. Proteins 72 (2008) 25-34. Fibre2Fashion, internet stranica, URL: http://www.fibre2fashion.com/industry- article/textile-industry-articles/textile-effluent-treatment/textile-effluent-treatment1.asp Forootanfar H, Faramarzi MA, Shahverdi AR, Yazdi MT, Purification and biochemical characterization of extracellular laccase from the ascomycete Paraconiothyrium variabile, Biores Tech 102 (2011) 1808–1814. Fry SC, Polymer-bound phenols as natural substrates of peroxidases. In: Greppin H, Penel C, Gaspar Th (eds.), Molecular and Physiological Aspects of Plant Peroxidases (pp. 169-182). University of Geneva, Switzerland (1986). Fujiyama K, Takemura H, Shibayama S, Kobayashi K, Choi JK, Shinmyo A, Takano M, Yamada Y, Okada H, Structure of the horseradish peroxidase isozyme C genes. Eur J Biochem 173 (1988) 681–687. Gajhede M, Schuller DJ, Henriksen A, Smith AT, Poulos TL, Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 Å resolution. Nat Struct Biol 4 (1997) 1032-1038. Gianfreda L, Xu F, Bollag JM, Laccases: a useful group of oxidoreductive enzymes. Bioremediation J 3 (1999) 1–25. Goi A., M. Trapido, T. Tukhanen, A study of toxicity, biodegradability, and some by- products of ozonised nitrophenols. Adv Environ Res 8 (2004) 303-311. 147 Godfrey T, West S, Industrial Enzymology, 2nd ed., Macmillan Press, United Kingdom (1996) 30–36. Gordon PF, Gregory P, Organic Chemistry in Colour. Springer, Berlin (1983). Grecchio C, Ruggiero P, Pizzigallo M, Polyphenoloxidases immobilized in organic gels: Properties and applications in the detoxification of aromatic compounds. Biotech Bioeng 48 (1995), 585-591. Gupta VK, Suhas Application of low-cost adsorbents for dye removal – A review. J Environ Manag 90 (2009), 2313-2342. Hager LP, Morris DR, Brown FS, Eberwein H., Chloroperoxidase 2. Ultilization of Halogen Anions. J Biol Chem 241 (1966) 1769-1777. Hakulinen R, Woods S, Ferguson J, Benjamin M, The Role of Facultative Anaerobic Micro-Organisms in Anaerobic Biodegradation of Chlorophenols. Water Sci Tech 17 (1985) 289-301. Hartmeier W, Immobilized biocatalysts, An introduction, 1988, Springer-Verlag. Held C, Kandelbauer A, Schroeder M, Cavaco-Paulo A, Guebitz GM, Biotransformation of phenolics with laccase containing bacterial spores, Environ Chem Lett 3 (2005) 74–77. Henriksen A, Smith AT, Gajhede M, The structure of the horseradish peroxidase C- ferulic acid complex and the ternary complex with cyanide suggesthow peroxidases oxidize small phenolic substrates. J Biol Chem 274 (1999) 35005- 35011. Hessel C, Allegre C, Maisseu M. Charbit F, Moulin P, Guidelines and legislation for dye house effluents. J Environ Manag 83 (2007) 171-180. 148 Hiner ANP, Hernandez-Ruiz J, Arnao MB, Garcia-Canovas F, Acosta M, A comparative study of the purity, enzyme activity, and inactivation by hydrogen peroxide of commercially available horseradish peroxidase isoenzymes A and C. Biotech Bioeng 50 (1996) 655-662. Hublik C, Schinner F, Characterization and immobilization of the laccase from Pleurotus ostreatus and its use for the continuous elimination of phenolic pollutants. Enz Microb Tech 27 (2000), 330-336. Hullo MF, Moszer I, Danchin A, Martin-Verstraete I: CotA of Bacillus subtilis is a copper-dependent laccase. J Bacteriol 183 (2001) 5426-5430. Hunger K, Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. Wiley-VCH, Weinheim; Cambridge (2003). Josephy DP, Eling T, Mason RP, The horseradish peroxidase-catalyzed oxidation of 3,5,3`,5`-tetramethylbenzidine. J Biol Chem 7 (1982) 3669-3675. Johannes C, Majcherczyk A, Laccase acitivity tests and laccase inhibitors. J Biotech 78 (2000) 193-199. Jordan W, van Barneveld H, Gerlich O, Kleine-Boymann M, Ullrich J, Phenol, in: Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH Verlag (2002). Kace JS, Linford HB, Reduced cost flocculation of a textile dyeing wastewater. J Water Pol Ctrl Fed 47 (1975) 1971-1980. Karam J, Nicell JA. Potential applications of enzymes in waste treatment. J Chem Tech Biotech 69 (1997) 141–53. Kay E, Shannon LM, Lew JY, Peroxidase isoenzymes from horseradish roots. II Catalytic properties. J Biol Chem 242 (1967) 2470-2473. 149 Khan AA, Akhtar S, Husain Q, Direct immobilization of polyphenol oxidase on Celite 545 from ammonium sulphate fractionated proteins of potato (Solanum tuberosum). J Mol Cat B Enz 40 (2006) 58–63. Khan AA, Husain Q, Decolorization and removal of textile and non-textile dyes from polluted wastewater and dyeing effluent by using potato (Solanum tuberosum) soluble and immobilized polyphenol oxidase. Biores Tech 98 (2007) 1012-1019. Klabunde T, Eicken T, Sacchettini JC, Krebs B, Crystal structure of a plant catechol oxidase containing a dicopper center. Nat Struct Biol 5 (1998) 1084–1090. Klibanov AM, Alberti BN, Morris ED, Felshin LM, Enzymatic removal of toxic phenols and anilines from waste waters. J Appl Biochem 2 (1980) 414-421. Klibanov AM, Morris ED, Horseradish peroxidase for the removal of carcinogenic aromatic amines from water. Enz Microb Technol 3 (1981) 119-122. Klibanov AM, Tu TM, Scott KP, Peroxidase-Catalyzed Removal of Phenols from Coal- Conversion Waste Waters. Science 221 (1983) 259-261. Kok FN, Arica MY, Gencer O, Abak K, Hasirci V, Controlled Release of aldicarb from carboxymethylcellulose microspheres in vitro and field applications. Pesticide Sci 55 (1999) 1194 - 1202. Koschorreck K, Richter SM, Ene AB, Roduner E, Schmid RD, Urlacher VB, Cloning and characterization of a new laccase from Bacillus licheniformis catalyzing dimerization od phenolic acids. Appl Microbiol Biotechnol 79 (2008) 217-224. Koschorreck K, Schmid RD, Urlacher VB, Improving the functional expression of a Bacillus licheniformis laccase by random and site-directed mutagenesis, BMC Biotech (2009) doi:10.1186/1472-6750-9-12. 150 Kurniawati S, Nicell JA, Efficacy of mediators for enhancing the laccase-catalyzed oxidation of aqueous phenol. Enz Microb Tech 41 (2007) 353–361. Kuwana R, Kasahara Y, Fujibayashi M, Takamatsu H, Ogasawara N, Watabe K, Proteomics characterization of novel spore proteins of Bacillus subtilis. Microbiology 148 (2002) 3971–3982. Kwon DY, Kim WY, Purification of the glycosylated polyphenol oxidase from potato tuber. J Biochem Mol Biol 29 (1996) 163-168. Lacasse K, Baumann W, Textile Chemicals. Environmental Data and Facts, Springer. (2006). Lane DJ, 16S/23S rRNA sequencing. In: Stackebrandt E, Goodfellow MM (eds) Nucleic acid techniques in bacterial systematic. Wiley, Chichester (1991) 115–175. La Rotta CE, Bon EP, 4-chlorophenol degradation by chloroperoxidase from Caldariomyces fumago: formation of insoluble products. Appl Biochem Biotechnol 98 (2002) 191-203. Laszlo K, Podkoscielny P, Dabrowski A, Heterogeneity of polymer-based active carbons in the adsorption of aqueous solutions of phenol and 2,3,4- trichlorophenol, Langmuir 19 (2003) 5287–5294. Li Rosi O, Casarci M, Mattioli D, De Florio L, Best available technique for water reuse in textile SMEs (BATTLE LIFE Project). Desalination 206 (2007), 614-619. Li X, Wei ZY, Zhang M, Peng XH, Yu GZ, Teng MK, Gong WM, Crystal structures of E.coli laccase CueO at different copper concentrations. Biochem Biophys Res Commun 354 (2007) 21-26. 151 Liu JZ, Wang TL, Ji LN, Enhanced dye decolorization efficiency by citraconic anhydride-modified horseradish peroxidase. J Mol Catal B Enz 42 (2006) 81-86. Levy I, Ward G, Hadar Y, Shoseyov O, Dosoretz CG, Oxidation of 4-bromophenol by the recombinant fused protein cellulose-binding domain-horseradish peroxidase immobilized on cellulose. Biotech. Bioeng 82 (2003) 223 - 231. Lewis NG, Davin LB, Sarkanen S, The nature and function of lignins. In: Barton, D., Nakanishi, K. and Meth-Cohn, O. (eds.), Comprehensive Natural Products Chemistry Vol. 3. (pp 617). Elsevier Science, New York (1999). Lideed DR, CRC Handbook of Chemistry and Physics, Internet Version 2005, , CRC Press, BocaRaton, FL, 2005. Lonĉar N, Božić N, AnĊelković I, Milovanović A, Dojnov B, Vujĉić M, Roglić G, Vujĉić Z, Removal of aqueous phenol and phenol derivatives by immobilized potato polyphenol oxidase. J Serb Chem Soc 76 (2011) 513-522. Lоnĉar N, Janović B, Vujĉić M, Vujĉić Z, Decolorization of textile dyes and effluents using potato (Solanum tuberosum) phenoloxidase. Int Biodeter Biodeg 72 (2012) 42-45. Lоnĉar N, Vujĉić Z, Tentacle carrier for immobilization of potato phenol oxidase and its application for halogenophenols removal from aqueous solutions. J Hazard Mater 196 (2011) 73-78. Longoria A, Tinoco R, Vázquez-Duhalt R, Chloroperoxidase-mediated transformation of highly halogenated monoaromatic compounds. Chemosphere 72 (2008) 485–490. Lopez-Serrano D, Sanhez-Amat A, Solano F, Cloning and Molecular Characterization of a SDS-Activated Tyrosinase from Marinomonas mediterranea. Pigment Cell Res 15 (2002) 104 – 111. 152 Lu L, Zhao M, Wang TN, Zhao LY, Du MH, Li TL, Li DB, Characterization and dye decolorization ability of an alkaline resistant and organic solvents tolerant laccase from Bacillus licheniformis LS04. Biores tech 115 (2012) 35-40. Madigan, M.T., Martinko J.M., Brock Biology Of Microoranisms, 11 th Ed, Pearson, Prentice Hall (2006). Majeau JA, Brar SK, Tyagi RD, Laccases for removal of recalcitrant and emerging pollutants. Biores Tech 101 (2010), 2331-2350. Mantell CL, In: Adsorption, second ed. McGraw-Hill Book Company, Inc., New York (1951). Marcucci M, Nosenzo G, Capannelli G, Ciabatti I, Corrieri D, Ciardelli G, Treatment and reuse of textile effluents based on new ultrafiltration and other membrane technologies. Desalination 138 (2001) 75–82. Marin-Zamora ME, Rojas-Melgarejo F, Garcia-Canovas F, Garcia-Ruiz PA, Direct immobilization of tyrosinase enzyme from natural mushrooms (Agaricus bisporus) on D-sorbitol cinnamic ester. J Biotech 126 (2006) 295 - 303. Marklund S, Ohlsson PI, Opara A, Paul KG, The substrate profiles of the acidic and slightly basic horseradish peroxidase. Biochim Biophys Acta 350 (1974) 304-313. Martins LO, Soares CM, Pereira MM, Teixeira M, Costa T, Jones GH, Henriques, AO, Molecular and Biochemical Characterization of a Highly Stable Bacterial Laccase That Occurs as a Structural Component of the Bacillus subtilis Endospore Coat. J Biol Chem 277 (2002) 18849–18859. Matto M, Husain Q, Decolorization of direct dyes by immobilized turnip peroxidase in batch and continuous processes. Ecotoxicol Env Saf 72 (2009) 965-971. 153 Mateo C, Fernandez-Lorente G, Abian O, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM, Multifunctional epoxy supports: a new tool to improve the covalent immobilization of proteins. The promotion of physical adsorptions of proteins on the supports before their covalent linkage. Biomacromolecules 1 (2000) 739–745. Mayer AM, Staples RC, Laccase: new functions for an old enzyme. Phytochem 60 (2002) 551-565. McGuirl MA, Dooley DM. Copper-containing oxidases. Curr Opin Chem Biol 3 (1999) 138–144. McKay G, Porter JF, Prasad GR, The removal of dye colours from aqueous solutions by adsorption on low-cost materials. Water Air Soil Pol 114 (1999) 423–438. Meng LZ, Du CQ, Chen YY, He YB, Preparation, Characterization, and Behavior of Cellulose–Titanium(IV) Oxide Modified with Organosilicone. J Appl Polymer Sci 84 (2002) 61-66. Merck Index, 14 th Ed., Merck & Co. Inc., NJ, USA, 2006. Mishra G, Tripathy M, A critical review of the treatments for decolourization of textile effluent. Colourage 40 (1993) 35–38. Miyazaki K, A hyperthermophilic laccase from Thermus thermophilus HB27. Extremophiles 9 (2005) 415-425. Moore BM, Flurkey WH, Sodium dodecyl sulfate activation of a plant polyphenoloxidase. J Biol Chem 265 (1990) 4982 – 4988. Mustafa R, Muniglia L, Rovel B, Girardin M, Phenolic colorants obtained by enzymatic synthesis using a fungal laccase in a hydro-organic biphasic system. Food Res Int 38 (2005) 995-1000. 154 Namboodri CG, Perkins WS, Walsh WK, Decolorizing dyes with chlorine and ozone: Part I. Am Dyestuff Rep 83 (1994), 17–22. Nasser NM, el Geundi M, Comparative cost of color removal from textile effluents using natural adsorbents. J Chem Tech Biotech 50 (1991) 257-264. Nelson JM, Griffin EG, Adsorption of invertase. J Am Chem Soc 38 (1916) 1109–1115. Neyens E, Baeyens J, A review of classic Fenton’s peroxidation as an advanced oxidation technique. J Hazard Mater 98 (2003) 33–50. Nicell JA, Bewtra JK, Biswas N, St. Pierre C, Taylor KE, Enzyme catalyzed polymerization and precipitation of aromatic compounds from aqueous solutions. Can J Civ Eng 20 (1993) 725-735. Nilsson R, Nordlinder R, Wass U, Asthma, rhinitis and dermatitis in workers exposed to reactive dyes. Brit J Ind Med 50 (1993) 65-70. Ogawa S, Shiro Y, Morishima I, Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme environmental structure. Biochem Biophys Res Commun 90 (1979) 674-678. O’Neill C, Hawkes FR, Hawkes DL, Lourenco ND, Pinheiro HM, Delée W, Colour in textile effluents – sources, measurement, discharge contents and simulation: a review. J Chem Tech Biotech 74 (1999) 1009-1018. Onder S, Celebi M, Altikatoglu M, Hatipoglu A, Kuzu H, Decolorization of Naphtol Blue Black using the Horseradish Peroxidase. Appl Biochem Biotechnol 163 (2011) 433-443. Pak D, Chang W, Decolorizing dye wastewater with low temperature catalytic oxidation. Water Sci Tech 40 (1999) 115-121. 155 Palmer AE, Randall DW, Xu F, Solomon EI, Spectroscopic studies and electronic structure description of the high potential Type 1 copper site in fungal laccase: insight into the effect of the axial ligand. J Am Chem Soc 121 (1999) 7138–7149. Palmieri G, Giardina P, Desiderio B, Marzullo L, Giamberini M, Sannia G, A new immobilization procedure using copper alginate gel: Application to a fungal phenol oxidase. Enz Microb Technol 16 (1994) 151 – 158. PeroxiBase, Interent stranica, URL: http://peroxidase.isb-sib.ch Pesic M, Lopez C, Alvaro G, Chloroperoxidase catalyzed oxidation of Cbz- ethanolamine to Cbz-glycinal. Biochem Eng J 67 (2012) 218-224. Piacquadio P, De Stefano G, Sammartino M, Sciancalepore V, Phenols removal from apple juice by laccase immobilized on Cu 2+ -chelate regenerable carrier. Biotechnol Techniq 11 (1997) 515 – 517. Pines O, Inouye M, Expression and secretion of proteins in E. coli, Mol Biotechnol 12 (1999) 25–34. Pramparo L, Stuber F, Font J, Fortuny A, Fabregat A, Bengoa C, Immobilisation of horseradish peroxidase on Eupergit C for the enzymatic elimination of phenol, J Hazard Mater 177 (2010) 990 - 1000. Premier Water, Internet stranica, URL: http://www.premierwatermn.com/birm-iron- filter-whole-house-water-filter/ Prigione V, Tigini V, Pezzella C, Anastasi A, Sannia G, Varese GC, Decolourisation and detoxification of textile effluents by fungal biosorption. Water Res 42 (2008) 2911– 2920. 156 Puertas JM, Betton JM, Engineering an efficient secretion of leech carboxypeptidase inhibitor in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (2009) 57-62. Rai HS, Bhattacharyya MS, Singh J, Bansal TK, Vats P, Banerjee UC, Removal of dyes from the effluent of textile and dyestuff manufacturing industry: a review of emerging techniques with reference to biological treatment. Crit Rev Environ Sci Tech 35 (2005) 219–238. Reiss R, Ihssen J, Thöny-Meyer L, Bacillus pumilus laccase: a heat stable enzyme with a wide substrate spectrum. BMC Biotech (2011) doi:10.1186/1472-6750-11-9. Richard-Forget F, Goupy P, Nicolas J, New approaches for separating and purifying apple polyphenol oxidase isoenzymes: hydrophobic, metal chelate and affinity chromatography. J Chrom A 667 (1994) 141 - 153. Riu J, Schonsee I, Barcelo D, Determination of sulfonated azo dyes in groundwater and industrial effluents by automated solid-phase extraction followed by capillary electrophoresis/ mass spectrometry. J Mass Spec 33 (1998) 653-663. Roberts SA, Weichsel A, Grass G, Thakali K, Hazzard JT, Tollin G, Rensing C, Montfort WR, Crystal structure and electron transfer kinetics of CueO, a multicopper oxidase required for copper homeostasis in Escherichia coli. Proc Nat Ac Sci USA 99 (2002) 2766-2771. Robinson T, McMullan G, Marchant R, Nigam P, Remediation of dyes in textile effluent: a critical review on current treatment technologies with a proposed alternative. Biores Tech 77 (2001) 247–255. Rodgers CJ, Blanford CF, Giddens SR, Skamnioti P, Armstrong FA, Gurr SJ, Designer laccases: a vogue for high-potential fungal enzymes? Trends Biotech 28 (2010) 63–72. Rogalski J, Jozwik E, Hataka A, Leonowicz A, Immobilization of laccase from Phlebia 157 radiata on controlled porosity glass. J Mol Cat A Chem 95 (1995) 99-108. Roriz MS, Osma JF, Teixeira JA, Rodríguez Couto S, Application of response surface methodological approach to optimise Reactive Black 5 decolouration by crude laccase from Trametes pubescens. J Hazard Mater 169 (2009) 691-696. Ruijssenaars HJ, Hartmans S, A cloned Bacillus halodurans multicopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl Microbiol Biotechnol 65 (2004) 177-182. Safe Water Technologies, Inc, internet stranica, 2012, URL: http://www.swtwater.com/catalog/1305_mtm.htm Sambrook J , Russell DW , Molecular cloning ̶ a laboratory manual . CSHL Press (2001). Sanchez-Ferrer A, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Canovas F, Garcia-Carmona F. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. Biochim Biophys Acta 1247 (1995) 1–11. Sandman K, Kroos L, Cutting S, Youngman P, Losick R, Identification of the promoter for a spore coat protein gene in Bacillus subtilis and studies on the regulation of its induction at a late stage of sporulation. J Mol Biol 200 (1988) 461-473. Savin II, Butnaru R, Wastewater characteristics in textile finishing mills. Environ Eng Manag J 7 (2008) 859-864. Schaeffer P, Millet J, Aubert JP, Catabolic repression of bacterial sporulation, Proc Natl Acad Sci USA 54 (1965) 704–711. Schmidt RJ, Industrial catalytic processes-phenol production. Appl Catal A Gen 280 (2005) 89–103. 158 Selinheimo E, NiEidhin D, Steffensen C, Nielse J, Lomascolo A, Halaouli S, Record E, O’Beirne D, Buchert J, Kruus K, Comparison of the characteristics of fungal and plant tyrosinases. J Biotechnol 130 (2007) 471-480. Shannon LM, Kay E, Lew JY, Peroxidase isoenzymes from horseradish roots. J Biol Chem 241 (1966) 2167-2172. Silva MR, Sa LRV, Russo C, Scio E, Ferreira-Leitao VS, The use of HRP in decolorization of reactive dyes and toxicological evaluation of their products. Enz Res (2010) doi:10.4061/2010/703824. Slokar YM, Le Marechal AM, Methods of decoloration of textile wastewaters. Dyes Pig 37 (1998) 335–356. Smith MA, Gillespie PC, Ionization of deae-cellulose: dependence of pK on ionic strength. J Chrom A 469 (1989) 111 - 120. Soares OSGP, Orfao JJM, Portela D, Vieira A, Pereira MFR, Ozonation of textile effluents and dye solutions under continuous operation: Influence of operating parameters. J Hazard Mater 137 (2006) 1664–1673. Solomon EI, Sundaran UM, Machonkin TE, Multicopper oxidase and oxygenases. Chem Rev 96 (1996) 2563–605. Sun W, Kadima TA, Pickard MA, Dunford HB, Catalase activity of chloroperoxidase and its interaction with peroxidase activity. Biochem Cell Biol 72 (1994) 321-331. Sun QY, Hong YZ, Xiao YZ, Fang W, Fang J, Decolorization of textile reactive dyes by the crude laccase produced from solid-state fermentation of agro-byproducts. World J Microb Biotech 25 (2009) 1153–1160. 159 Sundaran UM, Zhang HH, Hedman B, Hodgson KO, Solomon EI. Spectroscopic investigation of peroxide binding to the trinuclear copper cluster site in laccase: correlation with the peroxy-level intermediate and relevance to catalysis. J Am Chem Soc 119 (1997) 12525–12540. Suzuki T, Endo K, Ito M, Tsujibo H, Miyamoto K, Inamori Y, A thermostable laccase from Streptomyces lavendulae REN-7: purification, characterization, nucleotide sequence, and expression. Biosci Biotechnol Biochem 67 (2003) 2167-2175. Tatsumi K, Wada S, Ichikawa H, Removal of chlorophenols from wastewater by immobilized horseradish peroxidase. Biotechnol Bioeng 51 (1996) 126-130. Telke AA, Joshi SM, Jadhov SU, Tamboli DP, Govindwar SP, Decolorization and detoxification of Congo red and textile industry effluent by an isolated bacterium Pseudomonas sp. SU-EBT. Biodegradation 21 (2010) 283-296. Telke AA, Ghodake GS, Kalyani DC, Dhanve RS, Govindwar SP, Biochemical characteristics of a textile dye degrading extracellular laccase from a Bacillus sp. ADR, Biores Tech 102 (2011) 1752–1756. Terzyk AP, The impact of carbon surface chemicalcomposition on the adsorption of phenol determined at the real oxic and anoxic conditions. Appl Surf Sci 253 (2007) 5752–5755. Thurston CF, The structure and function of fungal laccases. Microbiology 140 (1994) 19–26. Thygesen PW, Dry IB, Robinson SP, Polyphenol Oxidase in Potato (A Multigene Family That Exhibits Differential Expression Patterns). Plant Phys 109 (1995) 525-531. Tien M, Kirk TK, Lignin-degrading enzyme from the hymenomycete Phanerochaete chrysosporium Burds. Science 221 (1983) 661–663. 160 Tong Z, Qingxiang Y, Hui H, Qin L, Yi Z, Removal of toxic phenol and 4-chlorophenol from waste water by horseradish peroxidase. Chemosphere 34 (1997) 893 - 903. Torres E, Ayala M, Biocatalysis Based on Heme Peroxidases. Springer (1995). Torres E, Bustos-Jaimes I, Borgne, SL, Potential use of oxidative enzymes for the detoxification of organic pollutants. Appl Catal B Environ 46 (2003) 1–15. Unyayar A, Mazmanci MA, Atacag H, Erkurt EA, Coral G, A Drimaren Blue X3LR dye decolorizing enzyme from Funalia trogii: one step isolation and identification. Enz Microb Tech 36 (2005) 10–16. Valenzuela J, Bumann U, Cespedes R, Padilla L, Gonzalez B, Degradation of Chlorophenols by Alcaligenes eutrophus JMP134(pJP4) in Bleached Kraft Mill Effluent. Appl Environ Microbiol 63 (1997) 227-232. van de Velde F, Lourenco ND, Pinheiro HM, Bakker M, Carrageenan: a foodgrade and biocompatible support for immobilisation techniques. Adv Synth Catal 344 (2002) 815- 835. Vandevivere PC, Bianchi R, Verstraete W, Treatment and Reuse of Wastewater from the Textile Wet-Processing Industry: Review of Emerging Technologies. J Chem Tech Biotech 72 (1998) 239-302. Verma P, Baldrian P, Nerud F, Decolorization of structurally different synthetic dyes using cobalt( II )/ascorbic acid/hydrogen peroxide system. Chemosphere 50 (2003) 957- 979. Venkataraman K, The Chemistry of Synthetic Dyes. Academic Press Inc., New York (1965). 161 Vujĉić Z, Lonĉar N, Dojnov B, Milovanović A, Vujĉić M, Božić N, Characterization of leucylaminopeptidase from Solanum tuberosum tuber. Food Chem 121 (2010) 418–423. Vujĉić Z, Eksperimentalna biohemija, Praktikum, Beograd, 2002. Wada S, Ichikawa H, Tatsumi K, Removal of phenols from wastewater by soluble and immobilized tyrosinase. Biotech Bioeng 42 (1993) 854 – 858. Wada S, Ichikawa H, Tatsumi K, Removal of phenols and aromatic amines from wastewater by a combination treatment with tyrosinase and a coagulant. Biotech Bioeng 45 (1995) 304–309. Wang S, A Comparative study of Fenton and Fenton-like reaction kinetics in decolourisation of wastewater. Dyes Pig 76 (2008) 714–720. Wang CL, Lei Lu MZ, Wei XD, Li TL, Characterization of spore laccase from Bacillus subtills WD23 and its use in dye decolorization, Afr J Biotech 10 (2011) 2186-2192. Wagner M., J. A. Nicell, Treatment of a foul condensate from Kraft pulping with horseradish peroxidase and hydrogen peroxide. Water Res 35 (2001) 485-495. Woodward J, Immobilized cells and enzymes, a practical approach, IRL press, Oxford Washington DC (1985). Xu F, Damhus T, Danielsen S, Ostergaard LH, Catalytic applications of laccase. In Modern Biooxidation Edited by: Schmid RD, Urlacher VB. Weinheim: Wiley-VCH; (2007) 43-75. Xu F, Kulys JJ, Duke K, Li KC, Krikstopaitis K, Deussen HJW, et al. Redox chemistry in laccase-catalyzed oxidation of N-hydroxy compounds. Appl Environ Microbiol 66 (2000) 2052–2056. 162 Yamada K, Akiba Y, Shibuya T, Kashiwada A, Matsuda K, Hirata M, Water purification through bioconversion of phenol compounds by tyrosinase and chemical adsorption by chitosan beads. Biotechnol Prog 21 (2005) 823 – 829. Yaropolov AI, Skorobogatko OV, Vartanov SS, Varfolomeyer SD, Laccase: properties, catalytic mechanism, and applicability. Appl Biochem Biotechnol 49 (1994) 257–80. Yi X, Mroczko M, Manoj KM, Wang X, Hager LP, Replacement of the proximal heme thiolate ligand in chloroperoxidase with a histidine residue. Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 12412-12417. Zhang J, Fenga M, Jianga Y, Hua M, Li S, Zhai Q, Efficient decolorization /degradation of aqueous azo dyes using buffered H2O2 oxidation catalyzed by a dosage below ppm level of chloroperoxidase. Chem Eng J 191 (2012) 236– 242. Zhou Y, Liang Z, Wang Y, Decolorization and COD removal of secondary yeast wastewater effluents by coagulation using aluminum sulfate. Desalination 225 (2008) 301–311. Zumarraga M, Camarero S, Shleev S, Martinez-Arias A, Ballesteros A, Plou FJ, Alcalde M, Altering the laccase functionality by in vivo assembly of mutant libraries with different mutational spectra. Proteins 71 (2008) 250-260. Sejáková Z, Dercová K, Tóthová L, Biodegradation and ecotoxicity of soil contaminated by pentachlorophenol applying bioaugmentation and addition of sorbents. World J Microb Biotech 25 (2009) 243-252. 163 Biografija autora Nikola Lonĉar je roĊen 16. novembra 1986. godine u Podgorici, Republika Crna Gora. Upisao je Hemijski fakultet Univerziteta u Beogradu, smer diplomirani biohemiĉar, 2005. godine, a diplomirao 2009. godine sa proseĉnom ocenom 9,50 po ubrzanom programu studija i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Studijski program doktor biohemijskih nauka na Hemijskom fakultetu Univerziteta u Beogradu upisao je u oktobru 2009. godine. Od 01.10.2009. godine zaposlen je na Hemijskom fakultetu, Univerziteta u Beogradu, kao istraživaĉ-pripravnik, a od 01.04.2010. zaposlen je u zvanju istraživaĉ saradnik u Inovacionom centru Hemijskog fakulteta. Trenutno je angažovan na projektima koje finansira Ministarstvo prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije pod brojevima 172048 i 172055. Oblasti nauĉnog interesovanja su ispitivanja oksidativnih enzima (fenol-oksidaze, peroksidaze i lakaze) u smislu izolovanja i karakterizacije, kao i upotrebe u uklanjanju fenola i boja iz vodenih rastvora. Dobitnik je (a) EMBO short term fellowship za tromeseĉni boravak u Institutu za Genetiku, Keln, Nemaĉka, 2010.god.; (b) FEBS grant za “Practical Course: Bioinformatics for the Bench Biologist”, Dubrovnik, Hrvatska, 2012.god.; (c) ICGEB grant za Teorijski i praktiĉni kurs “Bioinformatics: Computer Methods in Molecular and Systems Biology", Trst, Italija, 2012.god.; (d) ima dva studijska boravka na Katedri za hemijsko inžinjerstvo Autonomnog Univerziteta Barselone (Barselona, Španija) u cilju realizacije projekta bilateralne saradnje, 2011.god. i 2012.god. Objavio je 8 nauĉnih radova u meĊunarodnim ĉasopisima, od toga 4 iz kategorije M21, 1 iz kategorije M22 i 3 iz kategorije M23. Ĉlan je Srpskog hemijskog društva, Biohemijskog društva Srbije i Srpskog mikrobiološkog društva. PRILOZI 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.