УНИВЕРЗИТЕТ У БЕОГРАДУ ФАРМАЦЕУТСКИ ФАКУЛТЕТ Белетић Д. Анђело УТИЦАЈ НАСЛЕДНИХ И СТЕЧЕНИХ ФАКТОРА НА НИВО ХОМОЦИСТЕИНА У КРВИ БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОПСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА докторска дисертација Београд, 2014 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Beletić D. Anđelo INFLUENCE OF INHERITED AND ACQUIRED FACTORS ON HOMOCYSTEINE BLOOD LEVEL IN PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Mентор: Др Душко Мирковић, ванредни професор Универзитет у Београду - Фармацеутски факултет Чланови комисије: 1. Др Душко Мирковић, ванредни професор Универзитет у Београду - Фармацеутски факултет 2. Др Нада Мајкић-Singh, редовни професор у пензији Универзитет у Београду - Фармацеутски факултет 3. Др Светлана Игњатовић, редовни професор Универзитет у Београду - Фармацеутски факултет 4. Др Валентина Ђорђевић, научни сарадник Универзитет у Београду - Институт за молекуларну генетику и генетичко инжењерство 5. Др Александра Дудварски-Илић, доцент Универзитет у Београду - Медицински факултет Датум одбране: ________________ ЗАХВАЛНИЦА Ментору, Проф. Др Душку Мирковићу, захваљујем на поверењу, помоћи и подршци током израде дисертације, као и на несебично пренешеном знању за време студија на Фармацеутском факултету и током рада у Служби за ургентну лабораторијску дијагностику. Посебну захвалност упућујем мом првом и дугогодишњем Учитељу, Проф. Др Нади Мајкић-Singh, која ми је својим непроцењивим ангажовањем и искреним разумевањем помогла и у овом делу професионалног развоја. Проф. Др Светлани Игњатовић захваљујем на помоћи и саветима у експерименталном раду и писању дисертације. Професионална помоћ, сугестије, и надасве безгранична подршка Др Валентине Ђорђевић, научног сарадника, били су драгоцени за успешан завршетак дисертације. Доц. Др Александри Дудварски-Илић дугујем захвалност на вољи и стрпљењу да ми помогне да савладам клиничке аспекте дисертације. На помоћи око сакупљања узорака и података о болесницима и здравим испитаницима захваљујем се и Проф. Др Бранислави Миленковић и Проф. Др Људмили Нагорни-Обрадовић са Клинике за пулмологију Клиничког центра Србије, као и Асист. Др Небојши Антонијевићу са Клинике за кардиологију Клиничког центра Србије. Др Драгици Радојковић, научном саветнику Института за молекуларну генетику и генетичко инжењерство Универзитета у Београду и Др Небојши Довезенском из фирме LKB Vertriebs GmbH се захваљујем на могућности да овладам молекуларним методама коришћеним у експерименталном раду, а Др Мили Љујић, научном сараднику Института за молекуларну генетику и генетичко инжењерство Универзитета у Београду, на помоћи око примене методе секвенцирања ДНК. УТИЦАЈ НАСЛЕДНИХ И СТЕЧЕНИХ ФАКТОРА НА НИВО ХОМОЦИСТЕИНА У КРВИ БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОПСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА Резиме Хомоцистеин (Hcy) је непротеинска аминокиселина, која се ствара током метаболизма метионина и катаболише транссулфурацијом до цистеина или реметилује до метионина. Генетски узроци благе хиперхомоцистеинемије (HHcy) се могу приписати полиморфизмима у гену за метилентетрахидрофолат редуктазу (МТНFR) - С677Т и А1298С, док су недостатк фолата и витамина Б12 најчешћи стечени фактори. Хронична обструктивна болест плућа (ХОБП) је мултифакторско обољење, са глобалном учесталошћу од 6%, при чему се процењује да годишње умре око 3 милиона оболелих. Главни разлог за истраживање повезаности HHcy и ХОБП је чињеница да је ННсу укључена у патогенезу скоро свих коморбидитета ХОБП: кардиоваскуларних болести, мишићне дисфункције, остеопорозе, депресије, канцера плућа итд. Међу предикторима концентрације Нсу чији су ефекти испитивани код оболелих од ХОБП, за концентрације фолата и витамина Б12 је показано да имају значајан ефекат, док то није био случај са старошћу и бубрежном функцијом. Разлике по полу као и корелација са концентрацијом CRP су тестиране, међутим резултати су били неусаглашени. Осим тога, у тренутно доступној литератури нема података о повезаности полиморфизама у гену за MTHFR и ННсу код болесника са ХОБП. Основни циљ истраживања је био да се у групи болесника са ХОБП одреде ниво Нсу и инциденца ННсу, односно да се процени како на њих утичу пол, старост, полиморфизами MTHFR (С677Т и А1298С) и концентрација фолата и витамина Б12, као и да се процени да ли појава ННсу може представљати биомаркер дефицијенције поменутих витамина. Истраживање је за додатне циљеве имало да испита повезаност нивоа Нсу, односно инциденце ННсу са присуством дефицијенције алфа-1-антитрипсина (AATD), до сада најбоље описаним генетским фактором ризика за ХОБП, као и концентрацијом СRP, маркером инфламације код оболелих. Такође, циљ је био и да се процени заједнички утицај испитиваних фактора на ниво Нсу и инциденцу ННсу код болесника са ХОБП. У ширем контексту повезаности ННсу и тромбофилије, циљеви су обухватили и испитивање учесталости мутација FV Leiden и FII G20210A у истој групи болесника. Опсервационо "case-control" истраживање је укључило 50 болесникa (49,0±14,5 година) којима је ХОБП дијагностикована пре 45. године живота и контролну групу од 48 здравих особа (47,2±9,7 година). Концентрације Нсу, фолата и витамина Б12 су одређиване хемилуминисцентним имуноодређивањем на микро честицама (CМIA), а ниво CRP имунонефелометријски. ННсу је дефинисана као концентрација Нсу изнад 12 μmol/L. За анализу генских варијанти MTHFR С677Т и А1298С, односно FV Leiden и FII G20210A, коришћена је метода заснована на реакцији ланчаног умножавања полимеразом (PCR) и реверзној хибридизацији са алел- специфичним олигонуклеотидима (rASO). Присуство AATD је испитивано применом интегративног алгоритма који укључује имунонефелометријску анализу, PCR-rASO, изоелектрично фокусирање и секвенцирање ДНК. Расподела вредности континуираних варијабли је тестирана Shapiro-Wilk тестом и у зависности од резултата вредности су изражене као медијане са интерквартилним односно распоном између минималних и максималних вредности, или као средње вредности са стандардном девијацијом. За испитиване факторе израчунаван је оdds ratio (OR) са интервалом поузданости од 95% (95% СI). У статистичкој анализи резултата примењени су Студент t, Kruskal-Wallis и Mann-Whitney U тест, без и са Boniferroni корекције, односно тестови Chi-square, Fisher exact и McNemar Chi-square with exact P модулом, Spearman-ова непараметарска корелација, мултипла и логистичка регресиона анализа, као и Receiver Operating Characteristic (ROC) анализа. Ниво Нсу код болесника 13,22 (11,31−16,08) μmol/L је био већи (Р<0,001) у односу на вредност код контролне групе 9,80 (8,55−11,92) μmol/L. Инциденца ННсу међу оболелима је била за 47% већа него међу испитаницима у контролној групи, што је такође представљало значајну разлику (Р<0,001). OR од 3,889 (1,677−9,017) је указао да је ХОБП значајан фактор ризика за појаву ННсу (Р=0,002). Пол и старост нису утицали на ниво Нсу и инциденцу ННсу код испитиваних болесника. Мушки болесници су имали веће концентрације Нсу (Р=0,019) и учесталост ННсу (Р=0,019) у односу на здраве мушкарце. Аналогне разлике су уочене и међу испитаницама, како у погледу концентрације Нсу (Р=0,003), тако и по инциденци ННсу (Р<0,001). Фреквенција MTHFR 677 T алела код испитиване групе болесника је била 37,8%, док је MTHFR 1298 С алел био присутан код 30,0% оболелих. Повећана концентрација Нсу је уочена код болесника са MTHFR 677 TТ генотипом, док се MTHFR 1298 С алелом није могао повезати са разликама у нивоу Нсу. Такође присуство поменутих алела није доводило до повећане учесталости ННсу. Ниво Нсу код болесника није био повезан са концентрацијом фолата, али је показао значајну негативну корелацију са нивоом витамина Б12 (ρs=−0,310, Р=0,029). Појава ННсу није била поуздан маркер дефицита поменутих витамина у испитиваној групи оболелих. Присуство AATD није повезано са повишеном концентрацијом Нсу и инциденцом ННу. Међутим, уочен је тренд присуства виших концентрација Нсу код болесника који су носиоци ретких алела SERPINA1 гена. Концентрација CRP је била значајно већа код болесника него у контролној групи (Р=0,032), међутим није била у корелацији са нивоом Нсу ни код оболелих (ρs=−0,046, Р=0,749) ни код здравих испитаника (ρs=−0,034, Р=0,818). Присуство ХОБП je у подједнакој мери повећаваo ризик од настанка ННсу код особа различитог пола и старости, а такође је уочено да ризик не зависи од присуства MTHFR 677 T алела односно повишених вредности CRP. Заједнички утицај испитиваних фактора је био одговоран за приближно 64,7% варијације у нивоу Нсу код болесника у студији. Значајне предикторе концентрације Нсу су представљали MTHFR 677 TT генотип (у просеку доводи до пораста концентрације Нсу за 9,037 μmol/L), концентрација витамина Б12 (пораст од 1 ng/L доводи до просечног снижења концентрације Нсу за 0,007 μmol/L) и присуство AATD (повезује са просечним порастом концентрације Нсу од 9,558 μmol/L). Међутим, једино je недостатак витамина Б12 представљаo фактор ризика за настанак ННсу код испитиваних болесника (Р=0,028), у смислу да његово присуство повећава вероватноћу за настанак ННсу око 14 пута. Резултати истраживања су потврдили значајну повезаност ХОБП и поремећаја у метаболизму Нсу. Посматрани појединачно, једино присуство MTHFR 677 TT генотипа и концентрација витамина Б12 показују значајан утицај на ниво Нсу код испитиваних болесника. Заједнички утицај испитиваних фактора је одговоран за приближно 65% варијације у нивоу Нсу у испитиваној групи оболелих, а као значајни предиктори су идентификовани присуство MTHFR 677 TT генотипа, концентрација витамина Б12 и присуство AATD. Међу испитиваним факторима дефицијенција витамина Б12, дефинисана као серумска концентрација мања од 473 ng/L, приближно је 14 пута повећавалa ризик од настанка ННсу у испитиваној групи болесника са ХОБП. Kључне речи: хомоцистеин, хронична опструктивна болест плућа, MTHFR, фолат, витамин Б12, дефицијенција алфа-1-антитрипсина, CRP Научна област: Медицинске науке-Фармација Ужа научна област: Медицинска биохемија УДК број: 577.2 : 577.1.386 : 616.24 (043.3) УДК број: 577.1 : 577.164.1 (043.3) INFLUENCE OF INHERITED AND ACQUIRED FACTORS ON HOMOCYSTEINE BLOOD LEVEL IN PATIENTS WITH CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE Summary Homocysteine (Hcy) is a non-protein aminoacid, formed in methionine metabolism and catabolized via transsulphuration to cysteine or remethylated to methionine. Genetic causes of mild hyperhomocysteinemia (HHcy) can be attributed to the polymorphisms in the gene for the methylenetetrahydrofolate reductase (МТНFR) - С677Т и А1298С, while the deficiency of folate and vitamin B12 are the major acquired causes. Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a multifactorial disease, with the global incidence of 6% and estimation that 3 million affected patients die annually. The main rationale to investigate the association between HHcy and COPD is the involvement of HHcy in pathogenesis of almost all diseases which can coexist with COPD: cardiovascular disease, muscle dysfunction, osteoporosis, depression and lung cancer etc. Among the determinants of Hcy concentration with the effects investigated in COPD patients, folаte and vitamin B12 concentrations were shown to have significant effect, while that was the case for age and renal function. Gender related differences as well as the correlation with CRP concentration were tested, but the results were inconsistent . Moreover, in the currently available literature there are no data about relationship between MTHFR polymorphisms and HHcy in COPD patients. The main objective of the study was to determine the Hcy level and HHcy incidence in the group of COPD patients, to assess whether these variables are influenced by gender, age, MTHFR (С677Т and А1298С) polymorphisms and concentrations of folate and vitamin B12, as well as to evaluate if HHcy occurrence can represent the biomarker of vitamin deficiency. Additionally the study aimed to evaluate the association of Hcy level and HHcy incidence with alpha-1-antitrypsin deficiency (AATD), currently best described genetic risk factor for COPD, and CRP level, the inflammation biomarker in COPD patients. Also the combined impact of the investigated factors was assessed. In a broader context of association between HHcy and thrombophilia, the aims of the study included the determination of the F V Leiden and F II G20210A mutations' frequencies in the same group of patients. Observational "case-control study" included 50 patients (49.0±14.5 years) diagnosed with COPD before the age of 45 and a control group of 48 healthy persons (47.2±9.7 years). Concentrations of Hcy, folate and vitamin B12 were determined using chemiluminescent microparticle immunoassays (CMIA), while immunonephelometry was applied for CRP level. HHcy was defined as the Hcy concentration above 12 μmol/L. Analyses of genetic variants MTHFR C677T, MTHFR A1298C, F V Leiden, F II G20210A were performed using a method based on amplification with polymerase chain reaction (PCR) and reverse hybridization with allele-specific oligonucleotides (rASO). The AATD was detected with an integrative algorithm which included immunonephelometry, PCR-rASO, isoelectric focussing and DNA sequencing. Distribution of continuous variables was tested with the Shapiro-Wilk test and depending on the result expressed as median with interquartile/ minimum-maximum range, or as mean with standard deviation. For the investigated factors odds ratio (OR) with the 95% confidence interval (95% CI) was calculated. Statistical analysis included Student t, Kruskal-Wallis and Mann- Whitney U test, with and without Boniferroni correction, Chi-square, Fisher exact and McNemar Chi-square with exact P, Spearman's correlation, multiple and logistic regression analysis, as well as Receiver Operating Characteristic (ROC) analysis. Hcy concentration in patients 13.22 (11.31−16.08) μmol/L was higher (Р<0.001) in comparison with the control group 9.80 (8.55−11.92) μmol/L. ННсу incidence in the investigated patients was for 47% higher than in heathy participants, thus representing another significant difference (Р<0.001). OR of 3.889 (1.677−9.017) indicated that COPD was significant risk factor for the HHcy occurrence (Р=0.002). Gender and age showed no impact on Hcy level and HHcy incidence in the investigated patients. Male patients had higher Hcy concentrations (P=0.019) and HHcy incidence (P=0.019) than healthy men. Similar differences were observed among female participants, regarding both concentration (P=0.003) and incidence (Р<0.001). The frequency of MTHFR 677 T allele in the investigated group of patients was 37.8%, while the MTHFR 1298 C allele was present in the 30.0% of patients included in the study. Increased Hcy concentration was observed in patients with MTHFR 677 TT genotype, while MTHFR 1298 C allele could not be associated with the differences in Hcy level. Also, the presence of the mentioned alleles was not responsible for the increased HHcy incidence. Hcy concentration was not associated with the folate concentration, but the significant negative correlation with the vitamin B12 concentration was encountered (ρs=−0.310, Р=0.029). HHcy occurrence was not a reliable marker of the vitamins' deficiencies in the investigated groups of patients. AATD presence was not associated with the increased Hcy level and HHcy incidence. Nevertheless, a trend of higher Hcy concnetrations was observed in the patients who were carriers of the SERPINA1 rare alleles. Although CRP concentration was higher in patients than in controls (Р=0.032) it could not be correlated with Hcy level in patients (ρs=−0.046, Р=0.749) and healthy participants (ρs=−0.034, Р=0.818). The presence of COPD equally increased risk for HHcy development in subjects with different gender and age, and it was also observed that the risk is not influenced by the presence of the MTHFR 677 T allele and increased CRP concentrations. Joint influence of the investigated factors was found responsible for the 64.7% of variation in the Hcy levels measured in the enrolled patients. Significant predictors of Hcy level were MTHFR 677 TT genotype (associated with the average increase of 9.037 μmol/L), concentration of vitamin B12 (increase of 1 ng/L causes average decrease of 0.007 μmol/L) and the presence of AATD (associated with the average increase in Hcy concentration of 9.558 μmol/L). However, only the vitamin B12 deficiency, defined as the concentration bellow 473 ng/L, represented a risk factor for the development of HHcy in the investigated patients (Р=0.028), in the sense that if it was present the probability for the HHcy occurrence was increased 14 times. Results of the study confirmed significant association between COPD and disturbance in the Hcy metabolism. Regarded individually, only the presence of the MTHFR 677 TT genotype and vitamin B12 concentration showed significant impact on the Hcy level in the investigated patients. Joint influence of the investigated factors was responsible for the approximately 65% of variation in the Hcy levels measured in the enrolled patients. As the significant predictors were identified presence of the MTHFR 677 TT genotype, vitamin B12 concentration and AATD presence. Among the investigated factors, the deficiency of the vitamin B12 14 times increased the risk of the HHcy development in the investigated group of patients with COPD. Keywords: homocysteine, chronic obstructive pulmonary disease, MTHFR, folate, vitamin B12, alpha-1-antitrypsin deficiency, CRP Scientific field: Medical Sciences-Pharmacy Subfield: Medical Biochemistry UDC number: 577.2 : 577.1.386 : 616.24 (043.3) UDC number: 577.1 : 577.164.1 (043.3) Скраћенице: Нсу - хомоцистеин Кm - константа Mihaelis-a и Menten-ове Меt - метионин МАТ - метионин аденозилтрансфераза (EC 2.5.1.6) BHMT - бетаин-хомоцистеин S-метилтрансфераза (EC 2.1.1.5) MS - метионин синтаза (EC 2.1.1.13) MTHFR - 5,10-метилентетрахидрофолат редуктаза (EC 1.5.1.20) PEMT - фосфатидилетаноламин N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.17) GAMT - гванидиноацетат N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.2) GNMT - глицин N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.20) АНН - S-аденозил-L-хомоцистеин хидролазе (EC 3.3.1.1) CВS - цистатионин-β-синтаза (EC 4.2.1.22) CSЕ - цистатионин γ-лигаза (ЕС 4.4.1.1) ННсу - хиперхомоцистеинемија РОN1 - параоксоназа 1 (ЕС 3.1.8.1) HDL - липопротеини велике густине LDL - липопротеини мале густине SOD - супероксид дисмутаза (EC 1.15.1.1) GPx - глутатион пероксидаза (EC 1.11.1.9) NADPH - никотинамид аденин динуклеотид фосфат HPLC - течна хроматографија високе ефикасности EC - електрохемијска детекција LC-MS-MS - течна хроматографија са двојном спектрометријом маса GC-MS - гасна хроматографија са спектрометријом маса FPIA - Флуоресцентно поларизационо имуноодређивање MEIA - Ензимско имуноодређивање на микрочестицама CМIA - Хемилуминисцентно имуноодређивање на микро честицама ECLIA - Електро-хемилуминисцентно имуноодређивање ХОБП - Хронична опструктивна болест плућа NF-κB - нуклеарни фактор κB ААТD - дефицијенција алфа-1-антитрипсина ААТ - алфа-1-антитрипсин СYР - цитохром FEV1 - форсирани експиријумски волумен у првој секунди FVC - форсирани витални капацитет плућа CRР - Ц реактивни протеин F V - V фактор коагулације (проакцелерин) F II - II фактор коагулације (протромбин) PCR - реакција ланчаног умножавања полимеразом АSО - алел специфични ологонуклеотиди ИЕФ - Изоелектрично фокусирање  - средња вредност SD - стандардна девијација IQR - интерквартилни распон OR - Odds ratio СI - интервал поузданости (confidence interval) ρs - Spearman-ов коефицијент корелације ROC анализа - Receiver Operating Characteristic анализа AUC - површина испод криве (area under the curve) при ROC анализи SE - стандардна грешка В - нестандардизовани коефицијент у мултиплој регресионој анализи β - стандардизовани коефицијент у мултиплој регресионој анализи 1 Садржај 1. УВОД ........................................................................................................................... 3 1. 1. ХОМОЦИСТЕИН .................................................................................................... 3 1. 1. 1. Метаболизам хомоцистеина .................................................................. 3 1. 1. 2. Хомоцистеин у крви ................................................................................ 6 1. 1. 3. Хиперхомоцистеинемија - подела и узроци...................................... 7 1. 1. 4. Механизми штетног деловања хиперхомоцистеинемије .............. 9 1. 1. 5. Клинички значај хиперхомоцистеинемије...................................... 12 1. 1. 6. Одређивање концентрације хомоцистеина .................................... 15 1. 2. ХРОНИЧНА ОПСТРУКТИВНА БОЛЕСТ ПЛУЋА (ХОБП) ................................... 17 1. 2. 1. Епидемиологија и узроци .................................................................... 18 1. 2. 2. Патофизиолошки механизми ............................................................. 20 1. 2. 3. Дијагностиковање, ток и лечење ........................................................ 23 1. 3. ЗНАЧАЈ ИСПИТИВАЊА МЕТАБОЛИЗМА ХОМОЦИСТЕИНА КОД БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОБСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА .................................... 26 2. ЦИЉЕВИ ................................................................................................................. 30 3. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ ..................................................................................... 31 3. 1. ДИЗАЈН СТУДИЈЕ ................................................................................................ 31 3. 2. ИЗБОР ИСПИТАНИКА ........................................................................................ 31 3. 3. ПРЕАНАЛИТИЧКА ОБРАДА УЗОРАКА ............................................................... 32 3. 4. ОДРЕЂИВАЊЕ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ ХОМОЦИСТЕИНА ......................................... 33 3. 5. АНАЛИЗА ГЕНСКИХ ВАРИЈАНТИ MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, FV Leiden (G1691A) и FII G20210A ............................................................... 33 3. 6. ОДРЕЂИВАЊЕ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ ФОЛАТА ........................................................ 35 3. 7. ОДРЕЂИВАЊЕ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ ВИТАМИНА Б12 ............................................. 36 3. 8. ИСПИТИВАЊЕ ПРИСУСТВА ААТD .................................................................. 37 3. 8. 1. Одређивање концентрације ААТ....................................................... 38 3. 8. 2. Молекуларна анализа присуства Z и S алела ................................. 38 2 3. 8. 3. Фенотипизација ААТ ............................................................................ 39 3. 8. 4. Секвенцирање SERPINA1 гена ........................................................... 40 3. 9. ОДРЕЂИВАЊЕ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ CRP .............................................................. 41 3. 10. СТАТИСТИЧКА ОБРАДА ПОДАТАКА ............................................................... 41 4. РЕЗУЛТАТИ ............................................................................................................ 42 4. 1. КОНЦЕНТРАЦИЈА НСУ И УЧЕСТАЛОСТ ННСУ ................................................ 42 4. 2. УТИЦАЈ ПОЛА ..................................................................................................... 45 4. 3. УТИЦАЈ СТАРОСТИ ............................................................................................. 47 4.4. УЧЕСТАЛОСТ ПОЛИМОРФИЗАМА MTHFR С677Т И А1298С И УТИЦАЈ НА КОНЦЕНТРАЦИЈУ НСУ ................................................................................. 49 4.5. УТИЦАЈ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ ФОЛАТА И ВИТАМИНА Б12 ..................................... 53 4.6. ПОВЕЗАНОСТ СА ААТD .................................................................................... 61 4.7. ПОВЕЗАНОСТ СА КОНЦЕНТРАЦИЈОМ СRP ....................................................... 66 4.8. ЗАЈЕДНИЧКИ УТИЦАЈ ИСПИТИВАНИХ ФАКТОРА ............................................. 68 4.9. УЧЕСТАЛОСТ МУТАЦИЈА FV LEIDEN И FII G20210A ...................................... 70 5. ДИСКУСИЈА ........................................................................................................... 73 5. 1. КОНЦЕНТРАЦИЈА НСУ И УЧЕСТАЛОСТ ННСУ ................................................ 73 5. 2. УТИЦАЈ ПОЛА ..................................................................................................... 77 5. 3. УТИЦАЈ СТАРОСТИ ............................................................................................. 78 5. 4. УТИЦАЈ ПОЛИМОРФИЗАМА MTHFR C677T И A1298C ................................. 79 5. 5. УТИЦАЈ КОНЦЕНТРАЦИЈЕ ФОЛАТА И ВИТАМИНА Б12 .................................... 81 5. 6. ПОВЕЗАНОСТ СА ААТD .................................................................................... 84 5. 7. ПОВЕЗАНОСТ СА КОНЦЕНТРАЦИЈОМ СRP ...................................................... 86 5. 8. ЗАЈЕДНИЧКИ УТИЦАЈ ИСПИТИВАНИХ ФАКТОРА ............................................ 87 5.9. УЧЕСТАЛОСТ МУТАЦИЈА FV LEIDEN И FII G20210A ...................................... 89 5. 10. ОГРАНИЧЕЊА СТУДИЈЕ И СМЕРНИЦЕ ЗА ДАЉА ИСТРАЖИВАЊА ................ 90 6. ЗАКЉУЧЦИ............................................................................................................ 91 7. ЛИТЕРАТУРА ......................................................................................................... 93 3 1. Увод 1. 1. Хомоцистеин 1. 1. 1. Метаболизам хомоцистеина Хомоцистеин (Нсу) односно 2-амино-4 сулфанил бутанску киселину (Слика 1) први пут је описао Vincent du Vigneaud 1931. године. Слика 1. Хемијска структура хомоцистеина (преузето са www.wiley.com). Заједно са цистеином и глутатионом ова сулфхидрилна аминокиселина сачињава групу амино тиолних једињења присутних код сисара. Са биолошког аспекта значајне су следеће особине тиолне групе у молекулу Нсу: рКа вредност ≈ 10, редокс потенцијал у опсегу од −0,4 до −0,2 V, капацитет за формирање слободних радикала и реактивност према карбонилној одн. карбоксилној групи (1, 2). Нсу не учествује у биосинтези протеина, већ је у биохемијском смислу значајан као интермедијер у метаболизму метионина (Меt) (2). Извесна количина ове есенцијалне аминокиселине се деловањем метионин аденозилтрансферазе (EC 2.5.1.6) (МАТ) преводи у S-аденозил- Меt (Слика 2). Поменути ензим се јавља у три изоформе, од којих се две (I и III) карактеристичне за хепатоците, активирају производом реакције и имају значајно више Кm у односу на изоформу II, која се налази у осталим ткивима, према којој производ реакције показује инхибиторно дејство. На 4 овај начин се постиже да хепатоцити позитивно одговоре на повећан садржај Меt у циркулацији, и да се спречи нагомилавање S-аденозил-Меt у екстрахепатичким ткивима. Слика 2. Биохемијски значај хомоцистеина (преведено са www.totalpict.com/folic acid and b12 vitamin) На Слици 2 показано је да у следећој реакцији, катализованој метилтрансферазама, S-аденозил-Меt предаје метил групу акцептору и прелази у S-аденозил-Нсу. Зависно од врсте акцептора одн. метилтрансферазе, у реакцији могу настати креатин, извесни неуротрансмитери, фосфатидилхолин и друга једињења, а метил групе се могу "искористити" за метилацију ДНК, РНК, протеина итд. Најзначајније метил трансферазе, у смислу стварања највећих количина метилованих акцептора, представљају фосфатидилетаноламин N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.17) (PEMT) и гванидиноацетат N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.2) (GAMT), а глицин N-метилтрансфераза (EC 2.1.1.20) (GNMT) има запажену улогу у регулацији метаболизма Нсу (4). У последњем кораку из 5 S-аденозил-Нсу настаје Нсу деловањем S-аденозил-L-хомоцистеин хидролазе (EC 3.3.1.1) (АНН). Као што је илустровано на Слици 2, метаболичка "судбина" насталог Нсу одређена је компетицијом између три метаболичка пута, два реметилациона и транссулфурационог. У реметилационим путевима учествују бетаин-хомоцистеин S-метилтрансфераза (EC 2.1.1.5) (BHMT) и метионин синтаза (EC 2.1.1.13) (MS). BHMT користи бетаин као извор метил групе. Деловање MS је зависно од расположивости донора метил остатка, 5-метил тетрахидрофолата, који настаје деловањем 5, 10- метилентетрахидрофолат редуктазе (EC 1.5.1.20) (MTHFR) на 5, 10-метилен тетрахидрофолат, и витамина Б12, који има улогу кофактора (2, 3). Транссулфурација која Нсу преводи до цистеина, односно сулфата и таурина који се излучују урином, зависи од присуства витамина Б6, коензима цистатионин-β-синтазе (EC 4.2.1.22) (CВS) и цистатионин γ- лигазе (ЕС 4.4.1.1) (CSЕ), најзначајнијих ензима овог пута (5). Ензими који учествују у метаболизму Нсу су различито распоређени по органима. У јетри делују ензими укључени у све описане путеве, МАТ II, BHMT, МS, GNMT, CВS и CSЕ су присутни у бубрезима, а активност МАТ II и CВS постоји у свим ћелијама сисара. Транссулфурациони пут се осим у јетри и бубрезима може одвијати и у танком цреву и панкреасу. Услед одсуства CВS сав Нсу створен у срцу, плућима, тестисима, надбубрежној жлезди и слезини улази у процес реметилације (2, 3, 6). Регулација метаболизма хомоцистеина одсликава равнотежу између циклуса ресинтезе Меt и транссулфурационог пута, која се успоставља захваљујући различитом афинитету ензима за Нсу као и алостерним ефектима интермедијера (2). Значајно нижа Кm вредност за Hcy код BHMT (0,012−0,06 mmol/L) одн. МS (0,06 mmol/L) у односу на вредност коју има CВS (1−25 mmol/L) указује да је реметилациони пут доминантан одн. да се тек након засићења његових капацитета активира транссулфурациони (2, 6 6). Алостерне ефекте показују S-аденозил-Меt, S-аденозил-Нсу и 5- метилтетрахидрофолат. CВS се активира, а BHMT и MTHFR инхибирају под утицајем S-аденозил-Меt док S-аденозил-Нсу показује супротне ефекте на њихову активности. GNMT се инхибира дејством 5- метилтетрахидрофолата и на тај начин успорава превођење S-аденозил- Меt у S-аденозил-Нсу. Алостерни механизми омогућавају да S-аденозил- Меt буде "индикатор" концентрације Меt односно трансметилационог потенцијала у ћелији чији ће пораст у случају појаве вишка Меt активирати транссулфурациони пут његове елиминације из организма, а у супротном активирати путеве ресинтезе (3−5). 1. 1. 2. Хомоцистеин у крви У људском организму постоје различити облици Нсу: слободан, хомоцистин, Нсу-цистеин, S-аденозил-Нсу, Нсу-тионолактон као и Нсу везан за протеине формирањем дисулфидних веза односно амида са слободним амино групама у бочним ланцима аминокиселина (N-Нсу- протеини). Када је равнотежа у метаболизму Нсу очувана, фракција дисулфидно везана за протеине (највећим делом албумин) представља приближно 80% од укупне количине Нсу присутне у плазми, хомоцистин и Нсу-цистеин заједно 19% и слободни хомоцистеин око 1%, а количине осталих облика су занемарљиве. Када је равнотежа нарушена, јавља се пораст концентрација S-аденозил-Нсу, Нсу-тионолактона и N-Нсу- протеина (2, 7). Вредности интра- и итериндивидуалних коефицијената варијације за Нсу, који износе 8,3% одн. 33,5% (8) указују на значајну биолошку варијацију. За њу се најчешће сматрају старост, пол, трудноћа и начин живота (2, 9). Концентрација Нсу се континуирано повећава током живота и у старости најчешће има дупло већу вредност него у детињству (9). Вредности код мушкараца су у просеку 21−25% веће него код жена пре менопаузе што се објашњава разликама у мишићној маси и хормонском 7 профилу. Међутим, значај повећаног нивоа Нсу као фактора ризика за настанак васкуларних болести, сматра се једнаким код оба пола (9−11). У трудница се уочава снижење концентрације Нсу које се приписује хемодилуцији и смањеној концентрацији албумина (2, 9). Уношење фолне киселине и витамина Б12 снижава ниво Нсу. Пушење и конзумација кафе могу довести до пораста нивоа, док унос етанола показује различит утицај. Седентарни стил живота се такође повезује са порастом концентрације Нсу (9). Препоручене вредности за концентрацију Нсу зависе од старости као и од тога да ли је особа на режиму суплементације фолном киселином, конзумирањем обогаћене хране односно коришћењем препарата. Код трудница и деце до 15 година који нису на режиму суплементације препоручене вредности би требало да су мање од 10 μmol/L, код одраслих до 65 година испод 15 μmol/L, док након те старосне границе вредности не би требало да премаше 20 μmol/L. Уколико се примењује суплементација препоручене вредности су мање за 2−4 μmol/L (9). Међутим анализа података о повезаности пораста концентрације Нсу и ризика за настанак кардиоваскуларних обољења указала је на потрбу за нижим препорученим вредностима. Резултати Фрамингемске студије су показали повећање ризика код особа са концентрацијом Нсу изнад 11,4 μmol/L (12), док су извесни аутори уочили чак дупло повећан ризик повезан са нивоом Нсу већим од 10,2 μmol/L (13). У складу са овим подацима је промењен концепт препоручених вредности, увођењем "граничне" зоне, која обухвата концентрације 12−15 μmol/L (13, 14). 1. 1. 3. Хиперхомоцистеинемија - подела и узроци Хиперхомоцистеинемија (ННсу) може имати благу (15−25 μmol/L), умерену (25−50 μmol/L) и тешку (50−500 μmol/L) форму. Осим по нивоу Нсу, наведени облици се разликују и по учесталости и узроцима (15). 8 Блага ННсу је најчешћа и узрокована је присуством полиморфизама у гену за MTHFR, умереним недостатком фолата и/или витамина Б12, смањеном бубрежном функцијом, хипотироидизмом и деловањем одређених лекова (9). Највише проучавани полиморфизам у гену за MTHFR је С677Т. Доводи до замене аланина валином и смањења активности, за 35% у случају СТ односно за 70% код ТТ генотипа. Последично се региструје и смањен ниво фолата у еритроцитима, за 10% код СТ односно 18% код ТТ генотипа, као и повишена концентрација Нсу код појединаца са ТТ генотипом у просеку за 2,5 μmol/L у односу на особе са СС генотипом (9, 16). Учесталост Т алела варира међу популацијама и може се наћи у опсегу 7−40% (17). Полиморфизам MTHFR А1298С је такође проучаван, премда у значајно мањем обиму. Услед замене аланина глутаматом долази до смањења активности које је мање наглашено у односу на MTHFR С677Т. Подаци о утицају полиморфизма на промене концентрација фолата и Нсу су неусаглашени (16). Хомозиготно присуство овог полиморфизма се јавља са просечном учесталошћу око 9%, а хетерозиготно са приближно 37% (17). Фолат и витамин Б12 учествују као кофактори у реметилацији Нсу, па неквалитетна исхрана или малапсорпција ових супстанци може довести до ННсу. Појава благе ННсу у случајевима субклиничког недостатка ових витамина дала је основу да се одређивање Нсу препоручи као метаболички маркер недостатка ових витамина у општој популацији (18−22). Смањена гломеруларна функција, хипотиреоидизам и узнапредовала фаза шећерне болести су најчешћа стања и болести која узрокују благу ННсу (9). Примена релативно великог броја лекова може као нежељени ефекат имати појаву благе ННсу. Метотрексат, триметоприм, фенитоин и карбамазепин се понашају као анти-фолатни агенси, а азот-моноксид метформин, Н2 блокатори и омепразол као антагонисти витамина Б12. L-ДОПА повећава синтезу Нсу служећи као акцептор метил групе са S-аденозил-Меt, а циклоспорин успорава транссулфурациони пут (9, 23−26). 9 Умерена ННсу има приближно 10 пута мању учесталост од благе форме. Као најзначајнији узроци се наводе тешка дефицијенција фолата и/или витамина Б12, као и узнапредовали стадијуми бубрежне инсуфицијенције (15). Учесталост тешке ННсу је око 500 пута мања у односу на благи облик и карактеристична је за особе са хомоцистинуријом. Најчешћи узрок овог урођеног метаболичког поремећаја је дефицијенција СВS (9). 1. 1. 4. Механизми штетног деловања хиперхомоцистеинемије У основи штетног деловања ННСу је поремећај функција ендотела који настаје као последица развоја оксидативног стреса, проинфламаторних механизама, нарушавања равнотеже у хемостазном систему, умањене биорасположивости NО, промена у структури и функцији протеина, апоптозе и епигенетских модификација (15, 27). Неопходно је нагласити да штетни ефекти постају много израженији након превођења Нсу "нагомиланог" унутар ћелије у Нсу-тиолактон, реакцијом коју катализује метионил-тРНК синтетаза (EC 6.1.1.10) (28, 29). Нсу-тиолактон се разграђује деловањем параоксоназе 1 (РОN1/ЕС 3.1.8.1) (28), ензима који се у циркулацији налази везан за честице липопротеина велике густине (НDL). Осим "детоксикације" Нсу-тиолактона, РОN1 "штити" честице липопротеина мале густине (LDL) од оксидативног оштећења и учествује у метаболизму лекова и других ксенобиотика. На активност утицај показују полиморфизми у гену за РОN1, али и бројни стечени фактори као што су унос фолне киселине, антиоксиданата, конзумација алкохола итд (30). Развој оксидативног стреса у ННсу се објашњава комбинованим ефектом повећаног стварања слободних радикала и смањеном синтезом компоненти система антиоксидатне заштите (31). Тиолна група се лако оксидује при чему настају супероксидни и дисулфидни анјон, тиил радикали и Н2О2 (28). Најзначајније последице овако изазваног пораста 10 нивоа слободних радикала су ендотелна дисфункција, оксидација липопротеина, активација леукоцита и тромбоцита као и директно ћелијско оштећење (32). Показано је да ННсу може довести до смањења синтезе глутатиона унутар ћелије, што је објашњено компетицијом за исти трансмембрански трансортни систем између Нсу и цистеина, компоненте глутатиона (33). Повишење концентрације Нсу утиче и на експресију гена за ензиме укључене у регулацију редокс равнотеже у ћелији и то тако што се експресија гена за супероксид дисмутазу (EC 1.15.1.1) (SOD) повећава (33), а за глутатион пероксидазу (EC 1.11.1.9) (GPx) смањује (34). Такође се сматра да се између ННсу и оксидативног стреса успоставља "зачарани круг"-иницијална оксидативна оштећења доводе до значајног смањења нивоа фолата које за последицу има даље "нагомилавање" Нсу (32). Повећано стварање слободних радикала у ННсу се у великој мери сматра одговорним за покретање проинфламаторних механизама. Поред тога и саме повишене концентрације Нсу могу започети и/или појачати инфламаторни одговор и продукцију цитокина (моноцитног хемоатрактантног протеина-1, интерлеукина 1β, 6 и 8). Стања генерализоване инфламације нису удружена са ННсу па се сматра да пораст нивоа Нсу представља "окидач", а не маркер инфламације (15, 33). Равнотежа у систему хемостазе се у стању ННсу "помера" у смеру хиперкоагулабилности из више разлога. Показано је да Нсу и Нсу тиолактон потенцирају адхезију активираних тромбоцита, при чему је ефекат и до хиљаду пут израженији код тиолактона (35). Услед везивања Нсу за пети фактор коагулације делимично се онемогућава његова инактивација деловањем активираног протеина Ц. Такође долази и до инхибиције деловања тромбомодулина, а на површини ендотела се смањује капацитет везивања антитромбина, највероватније услед прекомерног стварања Н2О2. Ефективност фибринолизе је смањена услед инхибиције превођења плазминогена у плазмин (15), али и измењене структуре угрушка која отежава деловање плазмина (36, 37). 11 Биорасположивост NО је снижена у ННсу услед пада активности азот оксид синтазе, отежаног уласка аргинина у ћелије и трошења насталих количина NО у реакцији са слободним радикалима (38). Недостатак NО у садејству са смањеним стварањем одређених вазоактивних медијатора (ендотелин-1, простациклини) додатно доприноси ендотелној дисфункцији (15). Поред убрзања деградације (39), ННсу може довести и до веома значајних промена у структури и фукнцији различитих врста протеина. Грађењем дисулфидних мостова између Нсу и различитих протеина настају S-хомоцистеинил деривати. Међутим, много озбиљније последице има грађење N-хомоцистеинил деривата, у реакцији ε-амино групе лизина са Нсу-тиолактоном (15, 28). Овако настали протеини су склони стварању агрегата који доводе до оштећења ендотела иницирајући "стрес ендоплазматског ретикулума" (40). Осим тога код појединих протеина попут албумина, LDL-а, фибриногена, антитрипсина описан је и губитак функције различитог степена (15). Појава аутоантитела на ове деривате може објаснити зашто се штетне последице јављају чак и када су присутни у веома малим количинама (41). Апоптотски механизми су одговорни за директне цитотоксичне ефекте Нсу односно Нсу-тиолактона на ендотелним ћелијама и кардиомиоцитима. Поред активације каспазе-3 у овим процесима долази до унутарћелијске транслокације никотинамид аденин динуклеотид фосфат зависних (NADPH) оксидаза и пораста концентрације нитротирозина чиме је показано да су цитотоксични и прооксидантни ефекти ННсу међусобно повезани (28, 42−44). Резултати клиничких студија нису показали да кардиоваскуларни "догађаји" имају мању учесталост код болесника који узимају фолат и витамин Б12 у циљу смањења нивоа Нсу, што је дало повода за претпоставку да између ННсу и развоја васкуларне патологије "посредују" епигенетички механизм, прецизније метилација ДНК. За ННсу је 12 карактеристично да доводи до хипометилације ДНК услед нагомилавања S-аденозил-Нсу који инхибира већину метилтрансфераза (45, 46). Премда се сматра да метилација ДНК најчешће доводи до смањења експресије гена, постоји могућност и за активацију транскрипције, услед присуства молекула који се везују за метиловане нуклеотиде или путем наизменичних циклуса метилације/деметилације (47−49). Приликом процене клиничког значаја описаних промена у интензитету метилације потребно је узети у обзир различите чиниоце попут брзине ћелијског циклуса, доступност хроматина, расположивост S-аденозил-Met и фолата, степен и дужину трајања ННсу, инфламацију, дислипидемију, оксидативни стрес и старење. Такође треба размотрити ограничену поузданост тестова који процењују укупни степен метилације с обзиром да се метилација не дешава истим интензитетом на целој ДНК (50). Додатни епигенетички механизми који се повезују са ННсу су ремоделовање хроматина (51) и промене у експресији микроРНК (52). 1. 1. 5. Клинички значај хиперхомоцистеинемије Tешки облик ННсу указује на присуство урођених поремећаја регулације метаболизма Нсу, у првом реду на недостатак СВS (9, 15). Овај генетски поремећај је аутозомно рецесивног карактера и на светском нивоу показује просечну учесталост од 1 на 300 000 новорођене деце. За особе са недостатком СВS је карактеристично да су још од изузетно младог животног доба изложене повећаном ризику за развој тромбоемболијских поремећаја, који неретко могу имати и леталан исход (9). Умерена ННсу се појављује у терминалним стадијумима инсуфицијенције бубрега као и код особа са тешком дефицијенцијом фолата и витамина Б12. Релативно често се као узрок хиповитаминозе наводи генетски дефицит протеина укључених у апсорпцију и транспорт поменутих витамина (15). Блага ННсу је најчешћа и од највећег значаја са аспекта општег јавног здравља јер представња фактор ризика за настанак кардио- и цереброваскуларних, 13 неуродегенеративних, психијатријских и гастроинтестиналних обољења, остеопорозе, дијабетеса итд (3, 4). Велику пажњу истраживача је привукла и могућност да се кроз превентивну и терапијску надокнаду витаминима неопходних у метаболизму Нсу умањи ризик настанка поменутих врста обољења. Ефекти фортификације зрна житарица фолатом су показали позитивне ефекте на редукцију нивоа Нсу, али је и запажено да исхрана овако модификованим житарицама може појачати клиничке симптоме недостатка витамина Б12 (пернициозна анемија, когнитивни поремећаји). Претпостаља се да би комбинована фортификација са ова два витамина могла унапредити постојећи превентивни приступ (53). У терапијском приступу дозирање је вршено у складу са концентрацијом Нсу, али и присуством додатних фактора ризика. Код особа са нивоом Нсу у опсегу 12−20 μmol/L и породичном историјом срчаних обољења, хипертензије и дислипидемије препоручене количине су износиле 2000 μg фолне киселине, 500 μg витамина Б12 и 50 mg витамина Б6. У случају да се концентрација Нсу нађе између 16 и 30 μmol/L код особа са ангином пекторис, бубрежним обољењима и дијабетесом препоручују се удвостручене дозе витамина (54). Највећи број студија о клиничком значају је посматрао ННсу као фактора ризика за настанак кардиоваскуларних обољења (3, 4). Доказана је позитивна корелација са инциденцом акутног инфаркта миокарда, чак и у присуству традиционалних фактора ризика, при чему динамика промене концентрације може бити различита (55−57). Испитивања у српској популацији су показала да болесници са акутним инфарктом миокарда и ангином пекторис имају веће вредности Нсу него здраве особе (2, 58). ННсу може представљати фактор ризика и за настанак венског тромбоемболизма, али је степен асоцијације значајно мањи него код артеријских тромбоза (59−62). Резултати скоријих испитивања су указали да ННсу може представљати фактор ризика за настанак артеријске 14 хипертензије (63, 64). Међутим досадашње клиничке студије нису показале да терапијске мере суплементације са циљем редукције или превенције ННсу доводе и до значајног смањења општег кардиоваскуларног морталитета и морбидитета. Овакви резултати указују да би даља клиничка испитивања ННсу требало усмерити ка специфичним групама кардиоваскуларних болесника (65−68). Присуство ННсу представља фактор ризика за настанак можданог удара, нарочито код млађих болесника (69, 70). Терапија фолатом са циљем редукције ННсу је дала боље резултате у примарној превенцији, док су у секундарној аналогни ефекти изостали (71). Код 10−30% оболелих од Паркинсонове болести долази до развоја ННсу (72) и повезује се са развојем коморбидитета (деменција, депресија, дискинезија и сл.) (73). Поремећај метаболизма Нсу је повезан са развојем Алцхајмерове болести и других врста деменција (74−76). До сада није било већих клиничких студија које би процениле ефикасност суплементације витаминима у превенцији развоја неуродегенеративних обољења премда прелиминарна истраживања указују да би ефекти могли бити бољи него у области кардиоваскуларне патологије (77). Показано је да је поремећај у регулацији метаболизма Нсу повезан са повећањем ризика за настанак депресије за 26% као и да витаминска надокнада доводи до редукције како нивоа Нсу тако и клиничких симптома депресије (78, 79). Протромботско деловање ННсу се може манифестовати и на нивоу гастроинтестиналног система (мезентерична тромбоза, инфаркт црева) (80). Појава ННсу је забележена и код опстипације, Кронове и других инфламаторних обољења црева, као и код колоректалног карцинома. Поуздани подаци о ефективности витаминске надокнаде код ових група болесника за сада нису расположиви (81, 82). Познато је да Нсу може утицати на процес ремоделовања костију тако што повећава остеокластну и смањује остеобластну активност, смањује проток крви кроз коштано ткиво, активира матрикс 15 металопротеиназе и показује директно цитотоксично дејство. Негативне промене биомеханичких карактеристика костију у стању ННсу односно недостатка фолата и витамина Б12 су доказане, али је такође и постулирано да надокнада витамина може побољшати ове карактеристике и механизмима који су независни од Нсу (83). Промене у метаболизму Нсу код болесника са шећерном болешћу су нешто специфичније. У иницијалној фази болести, без обзира на тип, долази до смањења концентрације Нсу, да би у каснијим стедијумима болести, дошло до развоја ННсу, највероватније услед смањења бубрежне функције (84−86). Додатно, и терапијски приступ може утицати на ниво Нсу. Терапија инсулином показује повољан утицај и на поремећен метаболизам Нсу (87), док се примена оралних антидијабетика сматра једним од јатрогених узрока ННсу (24, 26). Присуство ННСу је важан фактор који доприноси прогресији бубрежне инсуфицијенције. Претпоставља се да до гломеруларне склерозе долази услед оштећења подоцита, узрокованим активацијом инфламазома у мијелоидним ћелијама великом количином слободних радикала која настаје у ННсу (88). Рутинско одређивање концентрације Нсу код ових болесника није препоручено, премда постоје подаци да снижење нивоа Нсу за више од 20% има позитивне ефекте у редукцији кардиоваскуларног ризика. Поред суплементације витаминима за болеснике на хемодијализи постоји и могућност да се елиминација Нсу поспеши давањем тиолних деривата који истискују Нсу из комплекса са протеинима чиме се олакшава његов пролаз кроз дијализне мембране (89, 90). 1. 1. 6. Одређивање концентрације хомоцистеина Велики број преаналитичких фактора може имати утицај на резултате одређивања. Узорковање крви се препоручује ујутру, 10−12 часова након лаганог оброка који не садржи велике количине протеина 16 животињског порекла који представљају извор метионина и могу довести до пораста концентрације Нсу (2, 9, 91). Венепункцију треба изводити у седећем, а не у лежећем положају да би се избегло смањење концентрације Нсу услед снижења нивоа албумина. Као узорак се могу користити серум и плазма добијена коришћењем етилендиаминотетраацетата (ЕДТА) као антикоагуланса. Метаболизам Нсу у еритроцитима се наставља након венепункције и може довести до пораста концентрације чак и до 35% за 4 сата стајања на собној температури (2). Да би се овакав ефекат избегао неопходно је да се узорак одмах након венепункције смести у посуду са ледом, центрифугира у року од 1 часа и одвоји серум односно плазма (2, 9). У исту сврху поједини аутори препоручују коришћење вакуум епрувета у којима се налазе инхибитори изласка Нсу из еритроцита као што су натријум флуорид, 3-деаза-аденозин и лимунска киселина. Благо хемолизирани узорци се могу користити за одређивање Нсу. Концентрација је стабилна 4 дана у узорцима серума и плазме чуваним на собној температури, неколико недеља на 4−8 °С односно неколико година на −20 °С (9). Први корак у одређивању, након депротеинизације је редукција Нсу којом се различити облици у којима се Нсу налази у крви преводе у један, тиолни облик. Као редукциони агенси се користе тиоалкохоли (дитиотреитол, дитиоеритритол и меркаптоетанол), борохидрати алкалних метала и фосфини (три-n-бутил фосфин, трис-2-карбоксиетил фосфин) (2). Слободни облик се директно може квантификовати коришћењем течне хроматографије високе ефикасности (HPLC) са електрохемијском детекцијом као и течне хроматографије са двојном спектрометријом маса (LC-MS-MS). Уколико се не користе ове методе неопходно је извршити хемијску дериватизацију Нсу са флуорогеним агенсима, односно превођењем у S-аденозил-Нсу деловањем АНН. Деривати са флуоресцентним особинама се могу квантификовати коришћењем HPLC са флуориметријском детекцијом, гасне 17 хроматографије са спектрометријом маса (GC-MS), капиларне електрофорезе као и на аминоанализаторима. За мерење количине насталог S-аденозил-Нсу могу се користити различита имуноодређивања (флуоресцентно поларизационо, електро-хемилуминисцентно, ензимско и хемилуминисцентно на микрочестицама) (2, 9). Код већине имунохемијских метода могућа је потпуна аутоматизација аналитичког процеса. Из овог разлога се оне најчешће користе у лабораторијско- дијагностичкој пракси, док је HPLC са флуориметријском детекцијом нашла примену у значајно мањем броју лаборатрија (2). Резулатати студије спроведене у једном од америчких дијагностичких центара адекватно одсликавају трендове у захтевима за анализирање хомоцистеина. Врло изражени пораст броја тестирања је забележен у периоду од 1997. до 2003. године. Након објављивања налаза клиничких студија који нису потврдили ефикасност витаминске суплементације, 2004. односно 2006. године, број захтева је значајно смањиван и усталио се 2008. године. У општој популацији најчешћи разлог за тестирање је сумња на присуство дефицијенције фолата и витамина Б12, као и испитивање тромбофилије. Одређивање са циљем процене кардиоваскуларног ризика је и даље присутно, али је значајно мање учестано и врши се у специфичним групама болесника (92). Такође, квантитативна анализа је незаобилазна у дијагностици урођених грешака метаболизма Нсу (2). 1. 2. Хронична опструктивна болест плућа (ХОБП) Хроничну опструктивну болест плућа (ХОБП) карактерише прогресивна опструкција протоку ваздуха у дисајним путевима, која може бити делимично реверзибилна или у потпуности иреверзибилна. У патофизиолошкој основи овог обољења се налази појачан инфламаторни 18 одговор на штетне честице и гасове. Ограничен проток ваздуха настаје комбинованим деловањем два патофизиолошка ентитета: опструктивног бронхиолитиса и емфизема, поремећаја који представља трајно повећање ваздушног простора дистално од терминалне бронхиоле, деструкцију плућног паренхима, губитак еластичне ретрактилности плућа и затварање малих дисајних путева. Између оболелих постоји изражена варијабилност у погледу степена у којима су изражени поменути поремећаји (93). 1. 2. 1. Епидемиологија и узроци ХОБП је значајан узрок морталитета и морбидитета у популацији одраслих широм света. Глобална учесталост ове болести се креће између 4 и 10% (94), при чему се процењује да 60−85% болесника са благом и умереном формом болести није дијагностиковано (95). Предвиђања указују да ће до 2020. године, ХОБП постати трећи по реду узрок смрти широм света (93). Подаци везани за популацију Републике Србије указују на 400 000 до 600 000 оболелих (96). Пушење се сматра главним узроком и процењује се да 10−20% пушача развије ХОБП (97). Међутим значајни су и други фактори који могу повећати ризик и довести до појаве болести и код непушача. Деца мајки пушача као и она са честим респираторним инфекцијама имају повећани ризик. Аерозагађење, изложеност прашини и штетним гасовима и пасивно пушење су најчешће навођени фактори који увећавају ризик код одраслих (95). На значај генетичких фактора указала је чињеница да је опструкција ваздушних путева израженија код особа у првом степену сродства са оболелима од ХОБП у односу на контролне испитанике (98, 99). Генетска предиспозиција за ХОБП се повезује са групама гена одговорним за равнотежу протеиназе-антипротеиназе, укљученим у одржавање равнотеже оксиданти-антиоксиданти, регулацију имунског одговора, инфламације, продукције мукуса и мукоцилијарног клиренса 19 1-антитрипсина (ААТD) је тренутно најбоље описани генетички фактор ризика. Примарна физиолошка улога овог протеина је заштита плућног паренхима од прекомерног деловања 1-антитрипсина (ААТ) у крви здравих особа износи од 0,9 до 2,0 g/L. ААТD је генетски поремећај узоркован хомозиготним присуством једног или комбинованим хетерозиготним присуством два дефицијента алела SERPINA1, генa за AAT. За разлику од функционалних (М) алела, ове варијанте су повезане са смањеном функционалношћу и нивоом ААТ у крви, услед којих долази до пораста еластазне активности. По фреквенцији појављивања дефицијентни алели су подељени на "честе" (Z, S) и ретке (Mmalton, Siiyama, Mheerlen, Mprocida, нулти и др) (101). Учесталост ААТD међу оболелим од ХОБП се креће у опсегу 1−5% и најчешће обухвата болеснике млађе животне доби. Међутим, у више од 95% случајева ААТD остаје неоткривена (102). Осим за ХОБП, присуство ААТD повећава и ризик за настанак обољења јетре, попут цирозе или хепатоцелуларног карцинома (101). Препоруке Светске здравствене организације и различитих пулмолошких удружења наводе потребу за "screening" одређивањем концентрације ААТ код болесника са ХОБП, посебно код оних којима је болест дијагностикована у млађем животном добу или имају позитивну породичну анамнезу. У случају снижених концентрација даља испитивања укључују фено- или генотипизацију (101). С обзиром да бројни стечени фактори, као што су инфламација, болести јетре или бубрега, значајно утичу на поузданост налаза концентрације ААТ, предложено је да се "screening" приступ замени интегративним лабораторијским алгоритмом који на комплементаран начин комбинује биохемијске и молекуларно-биолошке методе. 20 1. 2. 2. Патофизиолошки механизми Опструкција протока ваздуха током експиријума код болесника са ХОБП је примарно иреверзибилна и резултат је инфилтрације инфламаторним ћелијама, ремоделовања, фиброзе и присуства мукусних чепова у малим дисајним путевима (терминални бронхиолитис). Сужење малих дисајних путева доводи до хиперинфлације плућа, која нису у стању да се празне, што се клинички манифестује диспнејом, која је са прогресијом болести присутна и током мировања. Пораст отпора у периферним дисајним путевима је последица губитка еластичности и деструкције алвеоларних веза што резултира губитком подршке и затварањем малих дисајних путева током експиријума. Описани процеси су повезани и на молекуларном нивоу, где се остварују заједничким деловањем механизама оксидативног стреса, инфламације и апоптозе. Такође је потребно нагласити да фактори ризика најчешће активирају поменуте механизме истовремено (104, 105). Услед високог садржаја слободних радикала и других про- оксиданата (106), изложеност дуванском диму изазива оксидативни стрес, инфламацију, поремећаје ћелијског раста и репарације, апоптозу, оштећује међућелијски матрикс, олакшава настанак инфекција и убрзава процесе старења. Поменути процеси су посредовани активираним неутрофилима, макрофагима, дендритичним ћелијама, лимфоцитима, фибробластима и глатким мишићним ћелијама који ослобађају бројне цитокине, протеазе и реактивне кисеоничне врсте. Значајним се сматра и допринос аутоимуних механизама које потврђује присуство антитела на протеине оштећене хроничним дејством дуванског дима (нпр. антиеластин-антитела, антиепителијална-антитела итд) (105, 107). Дувански дим доводи и до активације ћелија респираторног епитела и интерлеукини (IL) 1β и 8, епидермални фактор раста, васкуларни ендотелни фактор раста итд.), дефенсина и других пептида са 21 антимикробним деловањем. Повећано је и стварање мукуса од стране пехарастих ћелија који штити од бактерија и штетних честица. Респираторни епител оболелих често показује и сквамозне метаплазије услед повећане пролиферације ћелија (108). Аерозагађење се сматра фактором ризика за ХОБП услед тога што присутни гасови (О3, SО2, NО2) и микро честице делују про-оксидантно и про-инфламаторно у контакту са плућним епителом и узрокују оксидативни стрес. Последично долази до смањења функције плућа, инфламације, респираторне хиперреактивности, модификације имунског одговора итд (109). До сада су предложена два механизма путем којих бактеријске и вирусне инфекције учествују у настанку и прогресији ХОБП. Први се заснива на чињеници да су инфекције најчешћи покретач егзацербација. Са друге стране колонизација и хроничне инфекције доњих делова респираторног тракта могу повећати и одржавати интензитет хроничног инфламаторног одговора код болесника у стабилној фази болести (105, 110−112). Неравнотежа у систему протеиназе-антипротеиназе представља једну од теорија патогенезе ХОБП. Протеолиза везивних компоненти плућа, нарочито еластина, различитим протеиназама представља кључни механизам у настанку. Овом хипотезом се може објаснити повезаност ААТD и настанак ХОБП, која је најбоље описана код хомозиготних носилаца Z алела. Услед стварања агрегата мутираног протеина у хепатоцитима, до плућа циркулацијом доспева изузетно мала количина ААТ, чиме се повећава количина неинхибиране неутрофилне еластазе што даље доводи до повећане разградње алвеоларног еластина. Дефицијенција има и два додатна аспекта. Први се односи на нефункционалност мутираних молекула ААТ тј. смањен афинитет према НЕ. Други се заснива на чињеници да и у плућима долази до стварања агрегата мутираних молекула молекула ААТ који имају изражено 22 хемотаксично дејство. На овај начин "привучени" неутрофили се додатно задржавају у интестицијуму, где их агрегати ААТ активирају, што ослобађа додатне количине еластазе (113). Код оболелих пушача, компоненте дуванског дима потенцирају агрегацију и оксидативно оштећују молекуле ААТ, чиме је убрзан настанака емфизема (114). Не треба занемарити ни могућност, која до сада није интензивно проучавана, да агрегати ААТ у плућима константно активирају нуклеарни фактор κB (NF-κB), чиме се убрзава синхрона апоптоза у великом броју алвеоларних ћелија (113). Поред ААТD, теорија нарушене равнотеже активности протеаза и антипротеаза је обухватила и протеиназу 3, катепсине и матрикс металопротеиназе 1, 9 и 12. (108, 115). Једна од најистакнутијих молекуларних карактеристика ХОБП, оксидативни стрес, може бити узрокован ксенобиотицима из дуванског дима или загађеног ваздуха, али и прекомерном продукцијом слободних радикала од стране активираних неутрофила и макрофагама у плућима. (116, 117). Једињења настала пероксидацијом фосфолипида ћелијских мембрана поседују хемотаксична својства и способност додатне активације неутрофила, доводе до промена у ћелијској пролиферацији, активирају апоптотске путеве и индукују експресију проинфламаторних гена (118). Смањено антиинфламаторно деловање ендогених глукокортикоида у ХОБП се такође сматра последицом оксидативног стреса (107, 118). Антиоксидантна заштита у плућима обухвата ензимску детоксикацију ксенобиотика и директно деловање антиоксиданата присутних у течности која облаже плућа (муцини, редуковани глутатион, уреа, албумин и аскорбинска киселина). Ензимска неутрализација ксенобиотика започиње фазом биоактивације, деловањем цитохрома Р-450 и флавин зависних монооксигеназа, на коју се наставља фаза детоксикације, у коју су укључени глутатион-S-трансфераза, сулфо- и глукуронил-трансферазе као и микрозомална хидролаза епоксида. Варијанте у генима за ензиме 23 укључене у ксенобиотички метаболизам и одбрану од оксидативног стреса, представљају факторе ризика за настанак ХОБП (116, 119). Инфламаторни процеси карактеристични за ХОБП се одигравају и у плућима пушача који нису оболели, али много мањим интензитетом. Као могући узроци појачаног инфламаторног одговора код болесника наводе се латентна аденовирусна инфекција, инхибиција епигенетичких механизама услед оксидативног стреса као и присуство мутација одн. полиморфизама у генима значајним за регулацију антиинфламаторних и антипротеазних процеса. Наведени узроци могу у извесној мери објаснити и чињеницу да престанак пушења не доводи до смањења инфламаторног одговора у плућима, поготову у тежим облицима болести (108). 1. 2. 3. Дијагностиковање, ток и лечење Тегобе узроковане ХОБП почињу да се испољавају годинама након првих знакова инфламације, патофизиолошких промена и поремећаја дисајне функције, најчешће када је особа у средњој и старијој животној доби. Ранија појава обољења је карактеристична за болеснике са генетским факторима ризика. Први знаци болести обично су кашаљ и искашљавање, који могу трајати и неколико година пре него што дође до бронхоопструкције. Болест се најчешће дијагностикује тек када тегобе, пре свега диспнеја, почну да угрожавају свакодневне активности или када дође до егзацербације болести (96). Дијагностиковање и процена тежине ХОБП се заснива на спирометријским мерењима - постбронходилататорном форсираном експиријумском волумену у првој секунди (FEV1), форсираном виталном капацитету плућа (FVC) и њиховом односу (FEV1/FVC). Основни критеријум за дијагностику ХОБП је вредност FEV1/FVC испод 0,7. На основу вредности FEV1 процењује се тежина болести односно изражава као један од четири стадијума, названих према акрониму организације Global initiative for Obstructive Lung Disease (GOLD). У Табели I су 24 наведени тежина болести и спирометријски критеријуми који одговарају GOLD стадијумима. Табела I GOLD стадијуми, тежина болести и вредности FEV1 (93). Стадијум Тежина болести FEV1 (%) GOLD 1 благ > 80 % GOLD 2 умерен 50-80 % GOLD 3 тежак 30-50 % GOLD 4 веома тежак < 30 % Дефиниција коју је GOLD усвојио, егзацербација ХОБП представља акутни догађај окарактерисан погоршањем респираторних симптома које превазилази оквире уобичајних варијација "из дана у дан" и захтева промену у лечењу болесника (93). Манифестују се као периоди интензивираног кашља, диспнеје и стварања спутума у трајању од најмање 48 часова (95). У 60−80% узроковане су бактеријским (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae) или вирусним инфекцијама (инфлуенца, риновируси). Остали преципитирајући фактори укључују срчану инсуфицијенцију, плућни тромбоемболизам, пнеумоторакс, пушење, изложеност аерозагађењу, непоштовање терапијског режима, боравак на хладноћи итд (120). Појава егзацербација је повезана са вишеструким погоршањем квалитета живота оболелих, убрзањем прогресије болести и повећањем ризика од развоја коморбидитета и смртног исхода. Због ових разлога се болесници са честим егзацербацијама издвајају као специфична подгрупа оболелих. За сада нема биомаркера који би са задовољавајућом поузданошћу могао предвидети појаву егзацербација (95, 121). Оболели од ХОБП су изложени значајном ризику од развоја великог броја коморбидитета у које спадају исхемијска болест срца, дијабетес, губитак мишићне масе, остеопороза, депресија и карциноми плућа (122, 25 123). Присуство коморбидитета смањује вероватноћу повољних здравствених исхода, повећава ризик од хоспитализације и смртног исхода, а нису занемарљиви ни трошкови медицинског збрињавања таквих болесника. Заједничко за ХОБП и придружена обољења и стања је присуство хроничне инфламације (95, 124). Полазна тачка у објашњењу атерогенезе код болесника са ХОБП је "преливање" проинфламаторних цитокина из плућа у системску циркулацију. Њихови системски ефекти обухватају индукцију синтезе CRР, фибриногена и фактора VIII као и пораст броја неутрофила, моноцита и тромбоцита. Са друге стране хипоксија доводи до симпатикусне и активације система ренин- ангиотензин те на тај начин појачава ендотелну дисфункцију и повећава стварање адхезионих молекула. Њихово стимулативно деловање на агрегацију тромбоцита, хемотакса моноцита и макрофага у садејству са повећаним преузимањем оксидованог LDL-а доводи до стварања атеросклеротских плакова. Егзацербације ХОБП представљају додатне инфламаторне стимулусе који могу довести до дестабилизације и руптуре плака, са последичним развојем атеротромботичких догађаја (125). Код оболелих пушача први корак у лечењу ХОБП је престанак пушења чиме се успорава напредовање болести и морталитет за 18% (126). Препоручује се и смањење изложености аерозагађењу и вакцинација против вируса грипа (95). Специфичне фармакотерапијске мере код болесника са стабилном ХОБП најчешће обухватају примену бронходилататора (β2 агониста или антихолинергика). У стадијуму GOLD 1 се примењују краткоделујући, док се у стадијумима 2, 3 и 4 комбинују са најмање још једним дугоделујућим бронходилататором. Инхалациона примена глукокортикоида је индикована у стадијумима 3 и у случајевима тешких егзацербација, с тим што се у последњем стадијуму по потреби уводи и оксигенотерпија. За болеснике у стадијумима 2, 3 и 4 препоручује се и респираторна рехабилитациона терапија. У случају развоја егзацербација повећавају се дозе и фреквенција давања бронходилататора, 26 у зависности од стања болесника препоручује се и перорална примена глукокортикоида, антибиотика, као и оксигенотерпија (95). 1. 3. Значај испитивања метаболизма хомоцистеина код болесника са хроничном обструктивном болешћу плућа На повезаност ХОБП и повишеног нивоа Нсу у плазми одн. сниженог нивоа редукованог глутатиона први је указао Andersson 2001. године (127). Резултати његове студије су првенствено послужили да потврде значај Нсу за развој оксидативног стреса карактеристичног за ХОБП. Након тога, уследиле су 3 унакрсне студије које су проучавале однос плућне функције, ХОБП и хомоцистеина у релативно малим групама оболелих пореклом из Јапана, Тринидада и Тобага, односно Италије (128−130). У све три студије је доказано да је ниво хомоцистеина значајно повећан у односу на здраве особе. Поменуте студије се разликују у погледу резултата о утицаја пола, старости, недостатка витамина и хроничне инфламације на промене концентрације Нсу. У групи оболелих у Јапану нису испитивани утицаји поменутих фактора (128). Seemungal и сарадници (129) су код групе оболелих са територије Тринидада и Тобага уочили веће вредности Нсу код мушкараца, док животна доб није показала значајан утицај. Концентрације Нсу код болесника италијанског порекла, укључених у студију Fimognari и сарадника (130), била је у корелацији са старошћу, а разлике између мушких и женских испитаника нису биле значајне. Повишен ниво СRР-а, традиционалног маркера инфламације, нађен је код болесника у обе студије, али је позитивна корелација са концентрацијом Нсу је потврђена само у студији Seemungal и сарадника (129, 130). Такође у тој студији није доказана повезаност дефицита витамина и појаве ННсу, али треба имати у виду да је присуство хиповитаминозе процењивано на 27 основу података о начину исхране добијених анкетирањем оболелих (129). Код групе италијанских болесника одређиване су концентрације витамина у серуму и доказано је да су недостатк фолата и витамина Б12 значајни предиктори појаве ННсу (130). Бројни нутритивни поремећаји попут убрзаног базалног метаболизма, смањеног индекса телесне масе удруженог са губитком скелетне мускулатуре, чине оболеле од ХОБП склоним развоју дефицита фолата и витамина Б12 (130, 131), што је и експериментално доказано (132). Поред макроцитозе, когнитивних поремећаја и неуропатије, карактеристичних за тешке форме недостатка, код болесника са ХОБП значајна може бити и субклиничка дефицијенција обзиром да се повезује са бројним коморбидитеима као што су кардиоваскуларне болести, малигни тумори, остеопороза итд (133, 134). Стога се чини значајним да се испита повезаност ННсу и дефицита витамина и у супротном смеру, односно да се процени да ли пораст концентрације ННсу код ових болесника може бити маркер недостатка фолата и витамина Б12. Наследни узроци ННсу код оболелих од ХОБП до сада нису испитивани. Чињеница да су у све три претходно поменуте студије концентрације Нсу биле у интервалу који одговара благој ННсу, указује да је у групи ових болесника потребно испитати присуство полиморфизама МТНFR С677Т и А1298С, као и последични утицај на концентрацију Нсу и учесталост ННсу. Повезаност ННсу и ААТD, до сада најбоље описаног генетског фактора ризика за ХОБП, такође није испитивана. Хипотеза о њеном постојању се може заснивати на постојању убрзане метилације ДНК, РНК и бројних протеина током репарације плућног паренхима, додатно оштећеног услед нарушене еластазно-антиеластазне равнотеже. Овај процес захтева да на располагању буде повећана количина метил група, а коришћење S-аденозил метионина као њиховог извора има за последицу генерисање додатних количина Нсу и појаву ННсу (135). Ови ефекти могу 28 бити појачани кроз заједничко проинфламаторно и прооксидантно дејство мутираних ААТ молекула односно њихових агрегата, о коме говоре и следећи подаци. Број неутрофила као и концентрација интерлеукина 8 односно леукотриена В4 у бронхоалвеоларном лавату су већи код оболелих од ХОБП са ZZ у односу на оне са ММ генотипом (136−138). Поред хемоатрактантног деловања, агрегати мутираних ААТ молекула, формирани у плућном ткиву активирају и NF-κB чиме се додатно активира експресија проинфламаторних цитокина- IL 8 (114). Продукцију слободних радикала од стране неутрофила и макрофага односно последично оксидативно оштећење биомолекула могу индуковати агрегати мутираних молекула ААТ (139), али и повећана количина деградационих продуката еластина за чији настанак је одговорна неадекватно регулисана активност еластазе (140). У ширем контексту повезаности ННсу и тромбофилије, једним од преципитирајућих фактора за егзацербације, важно је нагласити да за популацију оболелих од ХОБП за сада нема довољно података о учесталости два најчешћа генетска фактора ризика за тромбофилију- мутација FV Leiden (FV G1691A) и F II G20210A. Ризик од настанка венског тромбоемболизма се повећава приближно пет пута у случају хетерозиготног присуства F V Leiden односно око четири пута код хетерозиготних носилаца FII G20210A мутације (141). Досадашња сазнања указују да постоји значајан степен сличности између механизама помоћу којих ННсу остварује штетне ефекте и оних који су укључени у развој ХОБП и њених егзацербација односно одговарајућих коморбидитета. Посматрано са аспекта унапређења дијагностичко-терапијског приступа оболелима, од даљих испитивања се првенствено очекује да процене поузданост Нсу као биомаркера којим би се код оболелих од ХОБП могао процењивати ризик настанка коморбидитета. Испитивање утицаја наследних и стечених фактора на ниво Нсу код ових болесника је од двојаког значаја. Добијени резултати би 29 могли понудити додатна објашњења молекуларних механизама повезаних са поремећајем метаболизма Нсу код оболелих од ХОБП. Осим тога, на основу њих би се могло проценити које факторе је неопходно узети у обзир приликом интерпретације налаза ННсу односно који "reflex" тестови су неопходни у даљем медицинском збрињавању код ове групе болесника. Као крајњи резултат оваквог приступа би се могло очекивати успостављање интегративног алгоритма за испитивање ННсу код оболелих од ХОБП, у складу са начелима персонализоване медицине. У склопу ових разматрања неопходно је истаћи чињеницу да код оболелих од ХОБП у Републици Србији до сада није испитиван ниво Нсу у крви, као ни утицај који на њега показују извесни наследни фактори, недостатак витамина и инфламација. 30 2. Циљеви Основни циљеви овог истраживања су били да се у групи болесника са ХОБП одреди, односно процени: - ниво Нсу односно инциденца ННсу, - утицај пола и старости на ниво Нсу, - учесталост полиморфизама MTHFR С677Т и А1298С , као и њихов утицај на ниво Нсу и инциденцу ННсу, - утицај концентрација фолата и витамина Б12 на ниво Нсу и инциденцу ННсу, као и могућност да се на основу појаве ННсу предвиди недостатак поменутих витамина. Истраживање је за додатне циљеве имало да испита повезаност нивоа Нсу, односно инциденце ННсу са: - присуством ААТD, и - концентрацијом СRP. Такође, циљ је био и да се процени заједнички утицај испитиваних фактора на ниво Нсу и инциденцу ННсу. У ширем контексту повезаности ННсу и тромбофилије, циљеви су обухватили и испитивање учесталости мутација FV Leiden и FII G20210A у истој групи. 31 3. Материјал и методе 3. 1. Дизајн студије Опсервационо "case-control" истраживање је укључило болеснике из Клинике за пулмологију Клиничког центра Србије. Лабораторијска испитивања су урађена у Центру за медицинску биохемију Клиничког центра Србије и Институту за молекуларну генетику и генетички инжењеринг Универзитета у Београду. Етички одбор Клиничког центра Србије је дао сагласност за спровођење студије. 3. 2. Избор испитаника Испитана је група од 50 болесника (28 мушкараца и 22 жене) којима је ХОБП дијагностикована пре 45. године живота. Просечна старост групе је износила 49,0±14,5 (±SD) година. Критеријум за дијагностиковање ХОБП су били FEV1/FVC мањи од 0,7 и FEV1 испод 80%. Емфизем је био радиографски потврђен код 18 болесника. Амбулантно је било лечено 15, док је 35 хоспитализованих болесника укључено након стабилизације клиничке слике и постизања ремисије. Код испитиваних болесника није била присутна исхемијска болест срца, цереброваскуларни, бубрежни, гастроинтестинални и аутоимуни поремећаји, шећерна болест као ни малигнитети. Контролну групу је сачињавало 48 здравих особа (20 мушкараца и 28 жена) старости 47,2±9,7 година. Заједнички критеријуми за обе групе испитаника су били да су непушачи, не конзумирају алкохол и не добијају фолну киселину и/или витамина Б12 у терапијске или превентивне сврхе. 32 3. 3. Преаналитичка обрада узорака Припрема испитаника за узимање узорка је подразумевала 12 часова гладовања након лаганог оброк без протеина животињског порекла. Венепункција је вршена ујутру, између 8 и 9 часова. Од сваког испитаника је узимано по 15 mL венске крви, узорковане у две Vacutainer® епрувете (BD Vacutainer, Franklin Lakes, NJ, USA) - једну SST® II Advance и другу са 0,105 mol/L натријум цитратом. Одмах по узорковању узорци су смештани у посуду са ледом и транспортовани у лабораторију. Серум је издвајан у року од 1 сата, након центрифугирања у трајању од 15 минута при убрзању од 1500g, и аликвортиран у 2 порције. Једна је одмах коришћена за одређивање концентрације испитиваних параметара. Друга је чувана на −20 °С за случај да је било потребе за фенотипизацијом ААТ. ДНК је изолована из крви узорковане са натријум цитратом, комерцијалним сетом регенаса Illustra bloоd genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Little Chalfont, UK; каталошки број 28-9042-65), према упутствима произвођача. Метода изолације се заснива на заједничком деловању протеиназе К (EC 3.4.21.64) и "хаотропног" агенса, којим се постиже екстракција ДНК из леукоцита, денатурација хистона и омогућава селективно везивање ДНК за силика мембрану, смештену унутар колона за "solid-phase" екстракцију. Након испирања колоне етанолним пуфером, ДНК се елуира редестилованом водом загрејаном на 70 °С. Изолована ДНК је чувана на +4 °С до испитивања, односно на −20 °С након тога. Према подацима произвођача, када се за изолацију користи хумана крв, концентрација ДНК у финалном елуату је у опсегу од 28-46 ng/μL, а чистоћа изоловане ДНК, изражена као однос А260/А280, износи 1,7±0,04. 33 3. 4. Одређивање концентрације хомоцистеина Концентрација хомоцистеина (Нсу) је одређивана у серуму једностепеном CMIA. Одређивање започиње редукцијом различитих форми Нсу из серума до слободног Нсу који се преводи у S-аденозил хомоцистеин, деловањем АНН. Настали S-аденозил хомоцистеин се са својим акридинијумом обележеним аналогом "такмичи" за реакцију са моноклонским антителом, чијим су молекулима обложене микрочестице. Након испирања и раздвајања деловањем магнетног поља, додатком одговарајућих реагенаса изазива се појава хемилуминисценције чији је интензитет обрнуто пропорционална концентрацији Нсу у серуму. Коришћен је комерцијални сет реагенаса (Homocysteine, Abbott Diagnostics, Wiesbaden, Germany) на анализатору ARCHITECT® ci8200 Integrated System, истог произвођача. Према подацима произвођача реагенаса коришћена метода има "within run" CV 1,2−4,0% одн. укупни CV 2,1−6,3%, границу детекције од 0,64 μmol/L и опсег мерења од 1,0 до 50,0 μmol/L. Опсег референтних вредности обухвата концентрације између 5,08 и 15,39 μmol/L. На основу разматрања о горњој граници опсега референтих вредности, изнетих у уводном делу, у истраживању је под ННсу сматрана концентрација Нсу изнад 12,0 μmоl/L. Додатно, у испитивању поузданости ННсу као биомаркера дефицијенција фолата и витамина Б12 код ове групе болесника, тестиране су и концентрације Нсу од 10,0 односно 15,0 μmоl/L као граничне. 3. 5. Анализа генских варијанти MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, FV Leiden (G1691A) и FII G20210A Aнализе су вршене на узорцима ДНК, методом заснованом на реакцији ланчаног умножавања полимеразом (PCR) и реверзној хибридизацији са алел-специфичним олигонуклеотидима (rASO), која омогућава истовремену анализу наведених полиморфизама и мутација. 34 Поред комерцијалног сета реагенаса "ТhromboType® plus" (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany) коришћени су и PCR пуфер, MgCl2 и ДНК полимераза, набављени од произвођача Affymetrix UK Ltd (High Wycombe, United Kingdom). Смеша за PCR реакцију је припремана у DNA/RNA UV-CLEANER UVT-S-AR BOX-у (Biosan, Riga, Latvia). Састав смеше је био: - 17,5 μL смеше биотинилованих прајмера и деоксинуклеотида (компонента сета "ТhromboType® plus") - 2,5 μL PCR пуфера (100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, pH 8,6) - 2,5 μL MgCl2 (25 mmol/L) - 1,0 μL ДНК полимеразе (Hot Start-IT® Taq Polymerase, 1,25 un/μL) - 2,5 μL изоловане ДНК PCR реакција је извођена према протоколу приказаном у Табели II, коришћењем апарата Qcycler (LKB Vertriebs GmbH, Vienna, Austria) Табела II Протокол PCR реакције за истовремену анализу генских варијанти MTHFR С677Т, MTHFR А1298С, FVLeiden и FII G20210A. Иницијална денaтурација: 5 минута на 95 °С 35 поновљених циклуса денатурација 30 секунди на 95 °С везивање прајмера 30 секунди на 54 °С полимеризација 30 секунди на 72 °С Финална полимеризација 10 минута на 72 °С Детекција применом rASO је вршена у TwinCubator®-у (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany), кроз следеће кораке: хемијска денатурација ампликона, хибридизација једноланчаних биотином обележених ампликона са алел-специфичним комплементарним олигонуклеотидима везаним за мембрану, испирање, додатак коњугата алакална фосфатаза/стрептавидин и додатак супстрата. По завршетку 35 бојене реакције, распоред обојених поља на мембрани указивао је на одсуство односно хетерозиготно или хомозиготно присуство испитиваних генских варијанти. У оквиру оптимизације методе провераван је принос PCR реакције електрофоретском анализом ампликона на агарозном гелу, уз визуелизацију етидијум бромидом. Осим тога, тачност добијених резултата је проверена тако што је анализа урађена на узорцима 55 болесника са Клинике за васкуларну хирургију упућених на лабораторијско испитивање тромбофилије. Добијени резултати су упоређени са појединачно одређеним генотиповима у истим узорцима, применом PCR-а умножавања и анализе разлике у дужинама фрагмената добијених након деловања рестрикционих ендонуклеаза (RFLP) (142). 3. 6. Одређивање концентрације фолата Концентрација фолата је одређивана у серуму методом двостепене CMIA. Фолат, који се у узорку серума налази у комплексу са ендогеним фолат-везујућим протеином, ослобађа се редукцијом у алкалној средини и реагује са егзогеним фолат-везујућим протеином којим су обложене парамагнетичне микрочестице. У другом кораку у реакциони систем се додаје акридинијумом обележени коњугат птероичне киселине који гради комплекс са микрочестицама које нису "заузете" молекулима фолата из узорка. Додатком одговарајућих реагенаса изазива се појава хемилуминисценције чији је интензитет обрнуто пропорционална концентрацији фолата у серуму. Коришћен је комерцијални сет реагенаса (Folate, Abbott Diagnostics, Wiesbaden, Germany) на анализатору ARCHITECT® ci8200 Integrated System, истог произвођача. Према подацима произвођача реагенаса коришћена метода има "within run" CV 1,4−5,4% одн. укупни CV 3,1−7,8%, границу детекције од 0,50 μg/L и опсег мерења од 1,5 до 20,0 μg/L. Опсег референтних вредности износи од 3,1 до 20,5 μg/L. У складу са 36 разматрањима у уводном делу, при испитивању поузданости ННсу као биомаркера дефицијенције фолата, као cut-off вредности су коришћене концентрације од 4,0, 6,6 и 8,0 μg/L. 3. 7. Одређивање концентрације витамина Б12 Концентрација витамина Б12 је одређивана у серуму методом двостепене CMIA. Након претретмана, дејством алфа монотиоглицерола и кобинамид дицијанида у алкалној средини, долази до везивања витамина Б12 за молекуле интринзичног фактора којим су обложене микрочестице. У следећем кораку се у реакциони систем додаје акридинијумом обележени коњугат витамина Б12 који преко интринзичног фактора остварује везу са преосталим микрочестицама тј. онима које нису "заузете" молекулима витамина Б12 из узорка. Додатком одговарајућих реагенаса изазива се појава хемилуминисценције чији је интензитет обрнуто пропорционална концентрацији витамина Б12 у серуму. Коришћен је комерцијални сет реагенаса (В12, Abbott Diagnostics, Wiesbaden, Germany) на анализатору ARCHITECT® ci8200 Integrated System, истог произвођача. Према подацима произвођача реагенаса коришћена метода има "within run" CV 2,7−5,6% одн. укупни CV 3,4−6,8%, границу детекције од 125,0 ng/L и опсег мерења од 146 до 2000 ng/L. Опсег референтних вредности износи од 187 и 883 ng/L. У складу са разматрањима у уводном делу, при испитивању поузданости ННсу као биомаркера дефицијенција витамина Б12, као cut-off вредности су коришћене концентрације од од 203 и 473 ng/L. 37 3. 8. Испитивање присуства ААТD Лабораторијски протокол заснован на интегративној примени биохемијских и молекуларно-биолошких метода, примењен за испитивање присуства ААТD шематски је приказан на Слици 3. "Прву линију" лабораторијске дијагностике представља истоврмено одређивање концентрације ААТ у крви и генотипизација у смислу потврде присуства Z и S алела. Уколико су налази концентрације и генотипа усклађени, може се закључити да ли је испитаник хомо- или хетерозиготни носилац клинички најзначајнијих алела. Дискрепантни резултати, попут концентрације AAT испод 0,9 g/L без доказаног присуства најчешћих дефицијентних алела или налаз хетерозиготног присуства Z или S алела праћен неочекивано ниском AAT (мања од 0,61 g/L за MZ односно испод 0,84 g/L за МS генотип), могу бити узроковани стеченим недостатком или присуством ретких алела. ниво ААТ у серуму генотипизација за Z и S алел усклађени резултати ? изоелектрично фокусирање ретки алели? секвенционирање ДНК извештај: ~ без дефицијентних алела ~ хомо/хетерозигот за Z алел ~ хомо/хетерозигот за S алел ДА НЕ НЕ нулти алел? извештај ДА ~  AAT концентрација, а Z и S алел нису детектовани ~ МZ или МS генотип са "непримерено" ниском концентрацијом AAT Слика 3. Алгоритам за испитивање ААТD (преведено из (142)). 38 Следећи корак у дијагностичком алгоритму је примена изоелектричног фокусирања (ИЕФ) као "reflex" теста који може указати на узрок неслагања. Уколико изглед "pattern"-а трака у гелу након ИЕФ укаже на присуство неких од ретких алела, његова идентификација се врши секвенцирањем ДНК. Такође, секвенцирање је индиковано применити и у случају сумње на присуство нултих алела (142). 3. 8. 1. Одређивање концентрације ААТ Концентрација ААТ је одређивана у серуму методом имунонефелометрије. Метода се заснива на стварању имунских комплекса између молекула ААТ и анти-ААТ антитела. Интензитет светлости расуте услед њиховог присуства директно је пропорционалан концентрацији ААТ у узорку. За одређивање је коришћен комерцијални реагенс (N Antiserum to Human α1-Antitrypsin, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) на нефелометру Siemens Dade Behring Nephelometer Analyzer II®, истог произвођача. Према подацима произвођача реагенаса коришћена метода има "within run" CV 2,7−4,5% одн. укупни CV 3,1−4,7%, границу детекције од 0,021 g/L и опсег мерења до 0,16−5,20 g/L. Опсег референтних вредности је између 0,9 и 2,0 g/L. 3. 8. 2. Молекуларна анализа присуства Z и S алела Aнализе су вршене на узорцима ДНК, методом заснованом на реакцији ланчаног умножавања полимеразом (PCR) и реверзној хибридизацији са алел-специфичним олигонуклеотидима (rASO). Поред комерцијалног сета реагенаса "GenoType® AAT" (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany) коришћени су и PCR пуфер, MgCl2 и ДНК полимераза, набављени од произвођача Affymetrix UK Ltd (High Wycombe, United Kingdom). 39 Однос компоненти приликом припреме смеше за PCR реакцију као и остали услови анализе су већ описани у одељку 3.5. Метода за молекуларну анализу присуства Z и S алела је раније оптимизирана (143). 3. 8. 3. Фенотипизација ААТ Фенотипизација ААТ је вршена у узорцима серума, методом изоелектричног фокусирања на полиакриламидном гелу у рН градијенту од 4 до 5. "Рattern" који указује на хомозиготно присуство функционалних алела садржи 2 главне и 3 "пратеће" протеинске фракције. У случају присуства дефицијентних алела, промењена је покретљивост појединих фракција или неке од њих нису видљиве. Коришћени су комерцијални полиакриламидни гелови (Т=5%, С=3%; 245 x 110 x 1 mm) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Као анодни раствор коришћена је Н3РО4 (1 mol/L), а као катодни L-глицин (1 mol/L). Линију за ИЕФ су сачињавали 2197 Power Supply, 2117 MULTIPHOR II Electorphoresis Unit и 2219 MULTITEMP II Thermostatic circulator (LKB Vertriebs GmbH, Vienna, Austria). ИЕФ је извођено при напону од 1400 V, јачини струје од 50 mA и температури од 10 °С. Након префокусирања од једног часа, наношено је 20 μL узорка серума и ИЕФ настављано у наредна два часа. За фиксирање, бојење и одбојавање гелова након ИЕФ коришћени су следећи раствори: - фиксирање: трихлор сирћетна (0,72 mol/L) и сулфосалицилна киселина (0,16 mol/L) у дестилованој води. - одбојавање: етанол (4,00 mol/L) и сирћетна киселина (1,37 mol/L) у дестилованој води. Пре коришћења раствор је неопходно загрејати на 60 °С. - бојење: Commasie brilliant blue G-250 (3,75 g/L) у раствору за одбојавање. 40 Након ИЕФ гелови су фиксирани 45 минута, бојени 10 минута и одбојавани током 48 часова. Фенотип је одређиван поређењем положаја карактеристичних трака са распоредом добијеним анализом узорка са познатим фенотипом. За поређење су коришћени комерцијални узорци који су садржавали хомозиготне и хетерозиготне комбинације М, Z и S алела (Sebia, Evry Cedex, France). Фенотип је независно идентификован од стране две особе. 3. 8. 4. Секвенцирање SERPINA1 гена SERPINA1 ген је директно секвенциран, коришћењем ABI Prism BigDye Terminator Kit v3.1 Cycle Sequencing Kit na aparatu ABI PRISM 310 Genetic Analyzer, према упутствима произвођача (Applied Biosystems, Life Technologies,Thermo Fisher Scientific brand of Waltham, Massachusetts, USA). За анализу добијених података је коришћен Sequencing Analysis Software v5.2 Patch програмски пакет. Секвенца коришћених прајмера (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL, USA) је приказана у Табели III. Табела III Прајмери коришћени за секвенционирање SERPINA1 гена. Прајмери Егзон 2 5’-TGTCAATCCCTGATCACT-3’ 5’-TTGCTTGTTTCTATGGGAAC-3’ Егзон 3 5’-GGTTTCTTTATTCTGCTACA-3’ 5’-TCAGTCCCAACATGGCTAA-3’ Егзон 4 5’-GGCAGAAATAATCAGAAAAG -3’ 5’- TGGTATCTGTAGGGAAGA -3’ Егзон 5 5’- GTGACAGGGAGGGAGAGGA -3’ 5’-GGAGGGATTTACAGTCACAT-3’ 41 3. 9. Одређивање концентрације CRP Концентрација CRP је одређивана у серуму имунонефелометријски. Принцип методе се заснива на агрегацији полистиренских честица обложених моноклонским анти-CRP антителима приликом мешања са узорком који садржи CRP. Интензитет светлости расуте приликом проласка кроз тако насталу смешу директно је пропорционалан концнентрацији CRP у узорку. За одређивање је коришћен комерцијални реагенс (CardioPhase® hsCRP, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany) на нефелометру Siemens Dade Behring Nephelometer Analyzer II®, истог произвођача. Према подацима произвођача реагенаса коришћена метода има "within run" CV 2,1−4,6% одн. укупни CV 2,2−5,8%, границу детекције од 0,2 mg/L и опсег мерења до 55,7 mg/L. Референтни опсег је до 3,0 mg/L. 3. 10. Статистичка обрада података Расподела квантитативних података је тестирана Shapiro-Wilk тестом, а значајност разлике Студент t, Kruskal-Wallis и Mann-Whitney U тестом, без и са Boniferroni корекцијом. За поређење категоричких података коришћени су Chi-square, Fisher exact и McNemar Chi-square са exact-P тестови. Међузависност варијабли је тестирана Spearman непараметарском корелацијом. Значај испитиваних фактора као предиктора концентрације Нсу анализиран је мултиплом регресионом анализом, док је за њихову процену у смислу фактора ризика за настанак ННсу коришћена логистичка регресиона анализа. За процену поузданости концентрације Нсу као предиктора дефицијенције фолата и витамина Б12 коришћена је Receiver Operating Characteristic ROC анализа. Статистичка значајност је била дефинисана Р вредношћу мањом од 0,05. За статистичку анализу коришћен је статистички програм SPSS® (IBM®, New York, USA) верзије 20.0 и 22.0. 42 4. Резултати 4. 1. Концентрација Нсу и учесталост ННсу Вредности концентрације Нсу добијене у испитиваним групама приказане су у Табели IV. Табелa IV Вредности концентрације Нсу Нсу (μmоl/L) Болесници Контролна група  (SD) 14,65 (6,37) 10,87 (4,36) Медијана (Ме) 13,22 9,80 Распон (мин.-макс.) 5,92−40,22 5,30−30,90 Интерквартилни распон (IQR) 11,48−16,08 8,55−11,92 Пре тестирања разлика у концентрацији Нсу између болесника и контролне групе проверено је да ли се групе разликују у старости и заступљености мушкараца и жена, као и да ли је расподела добијених вредности Гаусовог типа. Коришћењем Студент t теста закључено је да нема статистички значајне разлике (Р=0,478) у старости између оболелих и контролне групе. Исто је закључено за заступљеност мушкараца и жена у групи болесника (28 мушкараца/22 жене) и контролној групи (20 мушкараца/28 жена), када је упоређивање вршено Chi-square тестом (Р=0,165). Расподела вредности концентрације Нсу у групи болесника je приказана на Слици 4. Shapiro-Wilk тест је показао да дистрибуција не прати Гаусову расподелу (Р<0,001). 43 28,0 58,0 8,0 2,0 2,0 2,0 Р ел а ти вн а ф р ек ве н ц и ја (% ) Нсу (μmol/L) Слика 4. Расподела вредности концентрације Нсу у групи болесника. На Слици 5 приказана је расподела вредности концентрације Нсу у контролној групи. Слагање са Гаусовом расподелом је проверено Shapiro- Wilk тестом и доказано је да постоје значајна одступања (Р<0,001). Екстремне вредности нису одбациване с обзиром да је распон између њих и њима најближих вредности био мањи од 0,33 у односу на укупан распон вредности (144). Концентрација Нсу у испитиваним групама у облику Box-and- Whisker графика приказана је на Слици 6. Вредност медијане је код групе болесника била за 3,42 μmоl/L већа у односу на контролну групу, што је представљало статистички значајну разлику (Р<0,001). Са Слике 7 се уочава да је инциденца ННсу међу оболелима била за 47% већа него међу испитаницима у контролној групи. Уочена разлика је такође била статистички значајна (Р<0,001). Odds ratio са интервалом поузданости од 95%(OR (95% СI)) је износио 3,889 (1,677−9,017) што је указивало да је ХОБП значајан фактор ризика за појаву ННсу (Р=0,002). 44 75,0 20,8 2,1 2,1 Р ел а ти вн а ф р ек ве н ц и ја (% ) Нсу (μmol/L) Слика 5. Расподела вредности концентрације Нсу у контролној групи. Болесници Контролна група Н су (μ m o l/ L ) Слика 6. Нсу код болесника и у контролној групи. 45 28,0 72,0 75,0 25,0 Болесници Контролна група У ч ес та л о ст ( % ) Слика 7. Учесталост Нсу код болесника и у контролној групи. Такође, између Ме (IQR) вредности концентрације Нсу добијене код амбулантних (13,05 (10,83−17,79) μmоl/L) и хоспитализованих болесника (13,38 (11,47−14,39) μmоl/L) није било статистички значајне разлике (Р=0,680). Приликом аналогног поређења између болесника са радиографски доказаним емфиземом (12,74 (10,54−17,82 μmоl/L) и без овог налаза (13,47 (11,47−16,82) μmоl/L) добијен је исти закључак (Р=0,976). 4. 2. Утицај пола На Слици 8 су приказане концентрације Нсу код мушкараца и жена. Разлика између вредности код болесника мушког и женског пола није била статистички значајна (Р=0,282), док су у контролној групи мушкарци имали значајно веће вредности Нсу (Р=0,005) од жена. Концентрација Нсу је била значајно већа (Р=0,019) код мушкараца оболелих од ХОБП у односу на здраве. Такође, значајна разлика у 46 концентрацији Нсу је уочена између женских болесника и испитаника женског пола у контролнј групи (Р=0,003) 12,79 (11,12-18,82) 13,42 (10,92-14,22) 11,50 (9,30-13,45) 9,10 (7,37-11,02) Н су (μ m o l/ L ) Мушкарци са ХОБП Жене са ХОБП Здрави мушкарци Здраве жене Слика 8. Нсу код мушкараца и жена - Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. Учесталост ННсу код мушкараца и жена је приказана на Слици 9. Разлика између полова није била значајна код оболелих (Р=0,753) као ни код контрола (Р=0,088). Учесталост је била виша (Р=0,019) код мушкараца са ХОБП у односу на здраве, као и код болесница у поређењу са женама у контролној групи (Р<0,001). Применом логистичке регресионе анализе за мушки пол као фактор ризика за настанак ННсу у групи оболелих, израчуната је вредност OR од 1,167 (0,346−3,933) која није била статистички значајна (Р=0,804). 47 75,0 68,2 40,0 14,2 У ч ес та л о ст Н Н су (% ) Мушкарци са ХОБП Жене са ХОБП Здрави мушкарци Здраве жене Слика 9. ННсу код мушкараца и жена. 4. 3. Утицај старости Повезаност старости и концентрације Нсу је графички приказана на Сликама 10 и 11. Spearman-ов коефицијент корелације (ρs) од 0,039 у групи болесника није указивао на значајну повезаност (Р=0,786). За контролну групу израчунат је ρs од 0,199, који такође није био статистички значајан (Р=0,175). У циљу процене значаја старости као фактора ризика за ННсу болесници су подељени у две групе: млађи и старији од 50 година. Вредности Нсу код млађих (13,43 (10,09−14,72) μmol/L) и старијих (12,90 (12,13−16,84) μmol/L) болесника се нису статистички значајно разликовале (Р=0,470). Старост изнад 50 година као фактор ризика за ННсу код оболелих од ХОБП је имала OR од 0,561 (0,164−1,918), који се није показао значајним (Р=0,357). 48 Н су (μ m o l/ L ) Старост (године) Слика 10. Корелација старости и концентрације Нсу у групи болесника. Н су (μ m o l/ L ) Старост (године) Слика 11. Корелација старости и концентрације Нсу у контролној групи. 49 4.4. Учесталост полиморфизама MTHFR С677Т и А1298С и утицај на концентрацију Нсу Расподела MTHFR С677Т генотипова у групи болесника, графички представљена на Слици 12, је била у Hardy Weinberg-овој равнотежи (P=0,549). Фреквенције алела су износиле 62,2% за С и 37,8% за Т алел. 12,0 % 36,0% 52,0% Слика 12. Расподела MTHFR С677Т генотипова у групи болесника. Фреквенције генотипова се нису значајно разликовале од оних добијених у контролној групи: 39,6% за СС, 36,2% за СТ и 24,2% за ТТ (Р=0,669). Kонцентрацијe Нсу измеренe код болесника са различитим MTHFR С677Т генотиповима су приказане на Слици 13. Разлике између генотипова СС и ТТ односно СТ и ТТ су биле статистички значајне (Р=0,012 за СС/ТТ тј. Р=0,002 за СТ/ТТ), док поређење између СС и СТ генотипа није упућивало на овакав закључак (Р=0,223). Премда постоји тренд повећане учесталости ННсу између генотипова, што је приказано на Слици 14, није доказана његова статистичка значајност (Р=0,111). OR за присуство Т алела као фактора ризика за ННсу болесника са ХОБП од 2,857 (0,899−9,989) није био статистички значајан (Р=0,100). Значај MTHFR 677 ТТ генотипа као 50 фактора ризика за ННсу није могао бити процењен израчунавањем OR јер је учесталост ННсу у групи са овим генотипом износила 100% 14,19 (9,45-17,05) 13,42 (11,89-14,46) 19,77 (16,16-22,55) Н су (μ m o l/ L ) Генотип Слика 13. Генотипови MTHFR С677Т и ниво Нсу у групи болесника-Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. 55,5 73,1 100,0 Генотип У ч ес та л о ст Н Н су (% ) Слика 14. Генотипови MTHFR С677Т и учесталост ННсу у групи болесника. 51 Расподела MTHFR А1298С генотипова у групи болесника је графички представљена на Слици 15. Алелне фреквенције су износиле 70,0% за А и 30,0% за С. Уочено је одступање од Hardy Weinberg-ове равнотеже (P=0,024). 18,0 % 58,0% 24,0% Слика 15. Расподела MTHFR А1298С генотипова у групи болесника . Kонцентрацијe Нсу измеренe код болесника са различитим MTHFR А1298С генотиповима су приказане на Слици 16. Није доказано да су разлике између њих статистички значајне (Р=0,610). Аналогно, ни учесталост ННсу се није значајно разликовала (Р=1,000) међу болесницима са различитим MTHFR А1298С генотиповима (Слика 17). OR за присуство С алела као фактора ризика за ННсу код оболелих је износио 0,583 (0,172−1,974) и није био статистички значајан (Р=0,386). Утицај комбинованог присуства MTHFR 677 Т и MTHFR 1298 С алела је испитан поређењем концентрација Нсу и учесталости ННсу између болесника који су имали оба поменута алела у генотипу (6 са хаплотипом 677 СТ/1298 АС, 2 са 677 СТ/1298 СС и 1 са 677 СС/1298 АС) и оних у чијем је генотипу био присутан само један од њих. Резултати, приказани у Табели V, нису 52 указали на значајну разлику у нивоу Нсу (Р=0,174) ни учесталости ННсу (Р=0,705). 13,67 (10,54-16,89) 13,48 (12,21-18,49) 15,54 (11,06-15,21) Н су (μ m o l/ L ) Генотип Слика 16. Генотипови MTHFR А1298С и ниво Нсу у групи болесника-Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. 70,0 72,7 66,7 Генотип У ч ес та л о ст Н Н су (% ) Слика 17. Генотипови MTHFR А1298С и учесталост ННсу у групи болесника. 53 Табела V Утицај комбинованог присуства MTHFR 677 Т и MTHFR 1298 С алела на коцентрацију Нсу и учесталост ННсу у групи болесника. Комбиновано присуство Без комбинованог присуства Нсу (Ме (IQR)) 13,59 (12,38−40,22) 12,84 (10,54−16,89) Удео болесника са ННсу 7/9 28/41 У случају комбинованог присуства MTHFR 677 Т и MTHFR 1298 С алела OR вредности су износиле 2,705 (0,677−10,806) за Т односно 0,882 (0,222−3,497) за С алел. Наведене вредности нису биле статистички значајне (Р=0,159 за Т односно Р=0,858 за С алел). 4.5. Утицај концентрације фолата и витамина Б12 Слагање са Гаусовом расподелом је показано за вредности концентрација фолата (Р=0,200) и витамина Б12 (Р=0,200) у испитиваној групи болесника. Средње вредности (SD) су износиле 4,13 (2,16) μg/L за фолат односно 463,6 (271,0) ng/L за витамин Б12. Концентрација фолата (Me (IQR)) измерена код мушких болесника 3,40 (2,92−4,52) μg/L није била значајно различита (Р=0,311) у поређењу са вредношћу добијеном код женских 3,55 (2,92−4,42) μg/L. Аналогно, између нивоа витамина Б12 код мушкараца 433,7 (345,4−521,1) ng/L и жена 447,5 (309,3−497,8) са ХОБП није доказана статистички значајна разлика (Р=0,325). Вредност ρs од 0,279 је указивала на статистички значајну повезаност старости болесника и нивоа фолата (Р=0,047). За корелацију између година оболелих и концентрације витамина Б12 израчунат је ρs од −0,103, који није био статистички значајан (Р=0,477). 54 Повезаност нивоа фолата односно витамина Б12 и Нсу код испитиваних болесника је графички приказана на Сликама 18 и 19. Н су (μ m o l/ L ) Фолат (μg/L) Слика 18. Корелација концентрација фолата и Нсу код испитиваних болесника. Н су (μ m o l/ L ) Витамин Б12 (ng/L) Слика 19. Корелација концентрација витамина Б12 и Нсу код испитиваних болесника. 55 Вредност ρs=−0,138 за корелацију Нсу са фолатом није указивала на статистички значајну повезаност (Р=0,340). Међутим, корелација нивоа Нсу и витамина Б12, окарактерисана са ρs од –0.310, је била статистички значајна (Р=0,029). Концентрације фолата и витамина Б12 код болесника са ННсу и оних код којих се она није појавила су приказане на Сликама 20 и 21. Док разлике у нивоу фолата нису биле статистички значајне (Р=0,281), показано је да су болесници код којих је дошло до развоја ННсу имали значајно ниже концентрације витамина Б12 у поређењу са онима који су имали концентрацију Нсу испод 12,0 μmоl/L (Р=0,010). 3,30 (2,70-4,50) 3,60 (3,10-5,50) Ф о л а т (μ g / L ) Присутна ННсу Без ННсу Слика 20. Присуство ННсу и ниво фолата код болесника - Ме (IQR) и Box-and- Whisker графиk. 56 418,7 (264,7-490,3) 490,8 (420,0-602,2) Присутна ННсу Без ННсу В и та м и н Б 12 (n g / L ) Слика 21. Присуство ННсу и ниво витамина Б12 код болесника - Ме (IQR) и Box- and-Whisker графиk. Појединачни утицај полиморфизама MTHFR С677Т и А1298С на концентрацију фолата код болесника је приказан на Сликама 22 и 23. Разлике у нивоу фолата између генотипова нису биле статистички значајне (Р=0,096 за MTHFR С677Т, односно Р=0,921 за MTHFR А1298С). Концентрација фолата је износила 4,00 (3,35−6,15) μg/L код болесника који су у генотипу имали и MTHFR 677 Т и 1298 С алела, односно 3,30 (2,75−4,30) код оних где је само један од њих био присутан. Наведене концентрације се нису статистички значајно разликовале (Р=0,274). 57 3,30 (2,75-4,25) 3,90 (3,15-5,87) 3,10 (2,27-3,32) Ф о л а т (μ g / L ) Генотип Слика 22. MTHFR С677Т генотипови и ниво фолата код болесника - Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. 3,40 (2,80-4,20) 3,75 (3,02-4,95) 3,30 (2,65-6,30) Ф о л а т (μ g / L ) Генотип Слика 23. MTHFR А1298С генотипови и ниво фолата код болесника - Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. 58 Као cut-off вредности за дефицијенцију фолата, приликом испитивања њеног значаја као фактора ризика за настанак ННсу код болесника коришћене су концентрације од 4,0, 6,6 и 8,0 μg/L, изабране на основу литературних података (20−22). Учесталост ННсу и OR за поменуте вредности су приказане у Табели VI. Табелa VI Учесталост ННсу и OR код различитих cut-off вредности коришћене за дефицијенцију фолата код испитиваних болесника. Сut-off (μg/L) Учесталост ННсу (%) OR (95%СI) Р 4,0 32,0 0,231 (0,045−1,184) 0,079 6,6 84,0 1,345 (0,239−7,577) 0,737 8,0 90,0 0,394 (0,050−3,098) 0,376 Генерално, разлике у учесталости ННсу између cut-off вредности су биле значајне (Р<0,001). Детаљнија анализа је показала да овакав закључак треба приписати разликама када су као граничне коришћене концентрације од 4,0 и 8,0 μg/L (Р=0,012), с обзиром да значајност разлике није доказана приликом упоређивања концентрација 4,0 и 6,6 μg/L (Р=0,100) односно 6,6 и 8,0 μg/L (Р=0,554). Такође, неопходно је истаћи да ни за једну од испитиваних cut-off вредности није доказана статистичка значајност за OR вредност. Приликом испитивања поузданости појаве ННсу као предиктора дефицијенције фолата код испитиваних болесника, испитане су концентрације Нсу од 10, 12 и 15 μmоl/L. Резултати Receiver Operating Characteristic (ROC) анализе, приказани у Табели VII, су показали да поузданост одређивања Нсу као маркера дефицијенције фолата није задовољавајућа. 59 Табелa VII ROC анализа ННсу као предиктора дефицијнеције фолата код испитиваних болесника. Фолат cut-off (μg/L) HHcy cut-off (μmol/L) AUC SE 95% CI P 4,0 10 0,514 0,101 0,317−0,711 0,721 12 0,556 0,103 0,354−0,757 0,584 15 0,620 0,094 0,435−0,805 0,235 6,6 10 0,552 0,112 0,332−0,773 0,651 12 0,603 0,113 0,382−0,824 0,375 15 0,615 0,104 0,410−0,819 0,322 8,0 10 0,686 0,109 0,472−0,900 0,229 12 0,661 0,139 0,389−0,933 0,298 15 0,671 0,113 0,451−0,892 0,267 Приликом испитивања значаја дефицијенције витамина Б12 као фактора ризика за настанак ННсу, као cut-off вредности су коришћене концентрације од 203 и 473 ng/L, такође преузете из литературе (20−22). Учесталост ННсу и OR за поменуте вредности су приказане у Табели VIII. Разлике у учесталости ННсу између cut-off вредности су биле значајне (Р<0,001), док за вредност OR није показана статистичка значајност. 60 Табелa VIII Учесталост ННсу и OR за различите cut-off вредности коришћене за дефинисање дефицијенције витамина Б12 код испитиваних болесника. Сut-off (ng/L) Учесталост ННсу (%) OR (95%СI) Р 203 4,0 /* /* 473 58,0 0,348 (0,100−1,210) 0,097 *вредност није могла бити израчуната јер је већина болесника (48) имала ниво изнад сut-off-а. Приликом испитивања поузданости појаве ННсу као предиктора дефицијенције витамина Б12 код испитиваних болесника, такође су испитане концентрације Нсу од 10, 12 и 15 μmоl/L. Резултати Receiver Operating Characteristic (ROC) анализе су приказани Табели IX. Показано је да поузданост одређивања Нсу као маркера дефицијенције витамина Б12 није задовољавајућа. Табелa IX ROC анализа ННсу као предиктора дефицијенције витамина Б12 код испитиваних болесника. Витамин Б12 cut-off (ng/L) HHcy cut-off (μmol/L) AUC SE 95% CI P 203 10 0,553 0,267 0,029−1,000 0,859 12 0,632 0,224 0,193−1,000 0,657 15 0,842 0,108 0,631−1,000 0,248 473 10 0,633 0,097 0,443−0,824 0,166 12 0,671 0,094 0,487−0,854 0,076 15 0,504 0,096 0,316−0,693 0,965 61 4.6. Повезаност са ААТD Повезаност концентрација ААТ и Нсу код болесника је графички приказана на Слици 24. Корелација, окарактерисана са ρs од –0,046, није показала статистичку значајност (Р=0,750). Н су (μ m o l/ L ) AAT (g/L) Слика 24. Корелација концентрација ААТ и Нсу код испитиваних болесника Применом интегративног лабораторијског алгоритма присуство AATD је откривено код 7 испитиваних болесника. Њих пет су били хомозиготни носиоци Z алела, док је код двоје доказано комбиновано хетерозиготно присуство Z и ретких алела, Mmalton и Q0amersfoort. За укупно 10 болесника, 8 са МZ и 2 са МS генотипом је показано да су хетерозиготни носиоци AATD. Код преостала 33 болесника није доказано присуство AATD (ММ генотип). Алелне фреквенције за испитивану групу болесника су износиле 20% за Z, 2% за S и 76% за М алел, а ретки алели су заједно имали фреквенцију од 2%. Разлике у нивоу Нсу између болесника са различитим 62 генотиповима, приказане у Табели Х, нису биле статистички значајне (Р=0,115). Табелa X SERPINA1 генотип и концентрација Нсу код болесника. Генотип Број болесника Нсу (Me(мин−макс), μmоl/L) ZZ 5 10,11 (7,83−34,64) ZРетки алели 2 31,87 (23,52−40,22) МZ 8 13,63 (9,30−18,73) МS 2 15,45 (13,05−17,82) ММ 33 12,74 (5,92−27,70) Концентрације Нсу и учесталост ННсу код болесника са различитим ААТД статусом су приказане на Сликама 25 и 26. 12,01 (10,04-34,64) 13,63 (12,65-17,17) 12,74 (11,16-15,66) Н су (μ m o l/ L ) AATD Хетерозигтни носиоци Без AATD Слика 25. AATD статус и ниво Нсу код болесника - Ме (IQR) и Box-and-Whisker графиk. 63 42,8 80,0 72,7 У ч ес та л о ст Н Н су (% ) AATD Хетерозигтни носиоци Без AATD Слика 26. AATD статус и учесталост ННсу код болесника. Поређењем групе са AATD, хетерозиготних носилаца и болесника без овог генетског поремећаја, нису показане значајне разлике у нивоу Нсу (Р=0,785) и учесталости ННсу (0,249). ОR од 0,258 (0,050-1,337) је указао да ААТД није значајан фактор ризика за појаву HHcy (Р=0,107). Испитивање AATD код болесника укључених у студију омогућило је и да се процени ефикасност интегративног лабораторијског алгоритма за детекцију AATD. Концентрације ААТ измерене код болесника са различитим SERPINA1 генотиповима су приказане у Табели ХI. Табелa XI SERPINA1 генотип и концентрација ААТ код болесника. Генотип Број болесника ААТ (Me(мин−макс), g/L ) ZZ 5 0,21 (0,20−0,26) ZРетки алели 2 0,16 (0,11−0,20) МZ 8 0,77 (0,65−2,27) МS 2 1,72 (1,14−2,30) ММ 33 1,36 (0,92−2,35) 64 Концентрација AAT код болесника са AATD (0,20 (0,11−0,26) g/L) је била значајно нижа у поређењу са хетерозиготним носиоцима (0,96 (0,65−2,30) g/L; P<0,001) и болесницима без AATD (1,31 (0,92−2,35) g/L; P<0,001), при чему није показана значајна разлика између последње две групе болесника (P=0,125). Значајна је и чињеница да је код половине хетерозиготних носилаца (3 са MZ и 2 са MS генотипом) концентрација ААТ била у опсегу референтних вредности. Резултати добијени у "првој линији" тестирања су били довољни за процену присуства AATD код 48 болесника. Неслагање између концентрације ААТ и резултата генотипизације се појавило код два болесника. У првом случају је налаз MZ генотипа пратила концентрација ААТ од 0,20 g/L. Након ИЕФ је уочена додатна трака која је побудила сумњу на присуство Mmalton алела (Слика 27А). Секвенцирањем је потврђен генотип ZMmalton (Слика 27Б). Слика 27. A - Фенотипизација AAT код болесника са ZMmalton генотипом. B - Секвенца дела егзона 2 у гену SERPINA1. Означена је хетерозиготна "in- frame" делеција TTC кодона за Phe75 или Phe76. 65 У другом случају је код болесника са MZ генотипом измерена концентрација AAT од 0,11 g/L. Након ИЕФ није уочено присуство додатних трака у гелу, што је отворило могућност присуства неког од нултих алела. Секвенцирањем је потврђено присуство нултог алела Q0amersfoort (Слика 28). Слика 28. Секвенца дела егзона 2 у гену SERPINA1. Означена је хетерозиготна мутација Tyr184TAC – stop184TAG. На основу добијених резултата било је могуће проценити и ефикасност детекције AATD у испитиваној групи болесника када би се користио "screening" приступ заснован на концентрацији ААТ. У том случају 5 хетерозиготних носилаца би остало недетектовано, док генотип код болесника са AATD који су двоструки хетерозиготи за Z и ретке алеле не би могао бити поуздано одређен. Без обзира на ове податке, интегративни алгоритам није показао бољу ефикасност у детекцији AATD (P=0,500) односно хетерозиготних носилаца (P=0,063). 66 4.7. Повезаност са концентрацијом СRP Дистрибуција вредности СRP није била Гаусовог типа ни код болесника (Р<0,001) ни у контролној групи (Р=0,030). Болесници су имали значајно веће концентрације (Табела XII). Табелa XII Концентрација СRP код болесника и у контролној групи СRP (Ме (IQR), mg/L ) Р Болесници 2,60 (0,80−6,57) 0,032 Контролна група 1,70 (0,86−2,56) Повезаност концентрација СRP и Нсу код болесника и у контролној групи су графички приказане на Сликама 29 и 30. Вредност ρs од –0.046 у групи оболелих, указивала је да није било статистички значајне корелације (Р=0,749). Н су (μ m o l/ L ) CRP (mg/L) Слика 29. Корелација концентрација СRP и Нсу код испитиваних болесника. 67 За контролну групу вредност ρs је износила -0,034 што такође није указивало да је корелација значајна (Р=0,818). Н су (μ m o l/ L ) CRP (mg/L) Слика 30. Корелација концентрација СRP и Нсу у контролној групи. Додатно, није показано да се вредности СRP статистички значајно разликују у зависности од тога да ли је код болесника присутна ННсу (Табелa XIII). Табелa XIII Концентрација СRP и појава ННсу код испитиваних болесника СRP (Ме (IQR), mg/L) Р Присутна ННсу 2,30 (0,70−16,30) 0,743 Без ННсу 3,40 (2,10−5,39) ОR од 1,333 (0,375−4,742) је указао да повишена вредност СRP није значајан фактор ризика за појаву HHcy код оболелих од ХОБП (Р=0,657). 68 4.8. Заједнички утицај испитиваних фактора Процена заједничког утицаја испитиваних фактора започета је испитивањем да ли је значај присуства ХОБП као фактора ризика за развој ННсу различит код мушкараца и жена, односно да ли на њега има утицај старост особе, MTHFR 677 T алел и повишене вредности СRP. Примењена је метода логистичке регресионе анализе, чији су резултати приказани у Tабели XIV. Табелa XIV Утицај додатних чинилаца на значај ХОБП као фактора ризика за настанак ННсу. OR 95% CI Р ХОБП 3,913 1,573−9,732 0,003 Пол 1,563 0,647−3,776 0,321 Старост изнад 50 година 1,307 0,509−3,355 0,578 MTHFR 677 TT 4,080 0,906−18,376 0,067 MTHFR 677 T алел 1,325 0,515−3,409 0,559 Повишен CRP 1,233 0,439−3,466 0,691 Поређењем са вредношћу OR када се ХОБП посматра изоловано (3,889, Р=0,002) закључено је да наведени додатни чиниоци не утичу у значајној мери на значај који има присуство ХОБП као фактор ризика за настанак ННсу. Такође је уочено да поменути чиниоци не представљају значајне факторе ризика за настанак ННсу. Значај испитиваних фактора као предиктора концентрације Нсу код оболелих од ХОБП је процењен мултиплом регресионом анализом. У Табели XV су приказане добијене вредности нестандардизованих (В) и стандардизованих коефицијената (β) односно њихова значајност. 69 Табелa XV Предиктори концентрације Нсу код оболелих од ХОБП. В β Р Пол 1,063 0,084 0,568 Старост изнад 50 година −0,988 −0,078 0,595 MTHFR 677 TT 9,291 0,479 0,004 MTHFR 677 T алел −3,583 −0,218 0,220 MTHFR 1298 СС −0,485 −0,037 0,871 MTHFR 1298 С алел 1,788 0,141 0,606 MTHFR 677 T + 1298 С алел 1,475 0,090 0,724 Фолат 0,060 0,020 0,886 Витамин Б12 −0,007 −0,302 0,025 Повишен CRP 0,064 0,187 0,213 AATD 9,558 0,526 0,001 Мултипла регресиона анализа је показала да су наведени чиниоци одговорни за 64,7% варијације у концентрацији Нсу у испитиваној групи болесника са ХОБП. Као статистички значајни предиктори идентификовани су MTHFR 677 TT генотип, концентрација фолата и присуство ААТD. Присуство MTHFR 677 TT генотип у просеку доводи до пораста концентрације Нсу за 9,037 μmol/L. Пораст нивоа витамина Б12 за 1 ng/L изазива просечно снижење концентрације Нсу за 0,007 μmol/L, док се присуство AATD повезује са порастом концентрације Нсу који износи у просеку 9,558 μmol/L. Логистичка регресиона анализа је примењена и за процену ризка за настанак ННсу у случају заједничког присуства испитиваних фактора ризика (Табела XVI). 70 Табелa XVI Фактори ризика за настанак ННсу у испитиваној групи болесника. OR 95% CI Р Пол 0,998 0,181−5,506 0,998 Старост изнад 50 година 1,267 0,190−8,456 0,807 MTHFR 677 TT /* /* /* MTHFR 677 T алел 1,315 0,103−16,745 0,833 MTHFR 1298 CC 5,861 0,421−81,654 0,188 MTHFR 1298 C алел 0,086 0,002−3,647 0,199 MTHFR 677 T + 1298 С алел 3,086 0,061−155,994 0,573 Фолат < 6,6 μg/L 1,146 0,113−11,593 0,908 Витамин Б12 < 473 ng/L 14,440 1,331−156,604 0,028 Повишен CRP 0,612 0,089−4,193 0,617 AATD 0,699 0,068−7,164 0,763 *вредност није могла бити израчуната јер су сви болесници MTHFR 677 TT са генотипом имали ННсу. Статистичка значајност за OR вредност је показана једино за дефицијенцију витамина Б12, дефинисану као концентрација мању од 473 ng/L. Уколико је присутна ризик за настанак ННсу се просечно повећава око 14 пута. 4.9. Учесталост мутација FV Leiden и FII G20210A Међу 50 испитиваних болесника хетерозиготно присуство мутације FV Leiden је доказано код једне особе, док присуство мутације FII G20210A није детектовано. Резултати су упоређени са претходно објављеним подацима добијеним у испитивању у којем је међу 120 здравих особа са 71 територије Србије идентификовано 7 хетерозиготних носилаца мутације FV Leiden и 5 хетерозиготних носилаца мутације FII G20210A (141), што је графички приказано на Сликама 31 и 32. На основу резултата Fisher's Exact Test-а закључено је да између ове две групе не постоји статистички значајна разлика у учесталости мутација FV Leiden (Р=0,439) и FII G20210A (Р=0,171). Слика 31. Учесталост мутације FV Leiden код испитиване групе болесника и код здравих добровољаца. 72 У ч ес та л о ст ( % ) Болесници са ХОБП Здраве особе Слика 32. Учесталост мутације FII G20210A код испитиване групе болесника и код здравих добровољаца. 73 5. Дискусија 5. 1. Концентрација Нсу и учесталост ННсу Резултати студије указују да у је у групи испитиваних болесника са ХОБП ниво Нсу за 3,42 μmоl/L односно приближно 25% виши у односу на здраве особе исте старости (Табела IV). Нађен је благи облик ННсу код 64% испитиваних болесника, док су концентрације које одговарају умереној ННсу измерене код 6% болесника укључених у студију (Слика 4). У претходним студијама код болесника са ХОБП аналогне разлике су биле изражене у различитом степену. Код јапанских болесника просечна вредност концентрације Нсу је била већа за приближно 31% односно 13% у зависности да ли је поређена са нивоом код непушача или код пушача са очуваном плућном функцијом (128). Seemungal и сарадници (129) су код здравих уочили ниво Нсу нижи за око 21% него код оболелих од ХОБП. За групу италијанских болесника је нађени ниво Нсу био за приближно 17% виши него у контролној групи разлика (130). На основу података о расподели концентрација Нсу може се закључити је да је код болесника у све три студије постојала блага ННсу (128-30). Литературни подаци говоре у прилог томе да је разлику у нивоу Нсу, уочену између групе болесника и контролне групе у овој студији, оправдано сматрати значајном и са клиничког аспекта. Процењено је да пораст концентрације Нсу од 2,5 μmоl/L последично увећава укупни кардиоваскуларни ризик за 10% (145). Резултати мета-анализа су показали да присуство благе ННсу 2−3 пута увећава ризик за настанак венског тромбоемболизма, при чему је повећање ризика посебно изражено код болесника млађих од 60 година (146). У овом контексту треба имати у виду да процењени пораст ризика значајним делом зависи и од дизајна саме студије. Проспективне студије повезују пораст концентрације Нсу од 5,0 μmоl/L са повећањем ризика за 27%, док је у ретроспективним иста 74 разлика у концентрацији доводила до пораста ризика од 60% (147). За разлику од венских, повезаност артеријских тромбоза са благом ННсу није још увек процењена са задовољавајућом поузданошћу, премда постоје литературни подаци који је потврђују (146). Пораст нивоа Нсу код оболелих од ХОБП у односу на здраве особе, показан у овој студији, је компарабилан са повећањем од 21%, уоченим у истраживању која је укључило болеснике са плућном емболијом са територије Републике Србије (148). Такође, скоро идентичан пораст нивоа Нсу као у овој студији је добијен испитивањем у групи формираној од болесника који су имали артеријске или венске тромбозе (149). Поређење са резултатима студије о Нсу као фактору ризика за настанак коронарне болести у српској популацији показало је нешто израженији пораст код старијих болесника са акутним инфарктом миокарда (приближно 31%) (2). Код болесника са ангином пекторис, укључених у исту студију, забележен је пораст од око 13% (2), што је дупло мање у односу на болеснике са ХОБП. С обзиром да су болесници у студији били млађи од 45 година када им је дијагностикована ХОБП, значајан може бити и податак да је пораст концентрације Нсу био скоро три пута већи од повећања присутног у групи болесника код којих је до развоја инфаркта миокарда дошло пре 45 године (150). Код 75% болесника са ХОБП укључених у студију била је присутна ННсу, што представља три пута већу учесталост него у контролној групи (Слика 7). С обзиром да резултати претходних студија о повезаности ННсу и ХОБП не укључују учесталост ННсу, наведени податак представља прву процену о појави тог метаболичког поремећаја код оболелих особа. Такође инциденца ННсу у овој студији је значајно већа од учесталости забележене у претходним студијама код болесника са територије Републике Србије. У групи са плућном емболијом ННсу се појавила са инциденцом од 51,5% (148), код особа са историјом артеријске или венске 75 тромбозе 55% (149), док је код болесника са инфарктом миокарда млађих од 45 година учесталост износила 34,6% (150). Применом логистичке регересионе анализе показана је значајна повезаност ХОБП и поремећаја у метаболизму Нсу, у смислу да је код оболелих 3,9 пута повећан ризик од појаве ННсу. Код италијанских болесника ХОБП и ННсу су били повезани на сличан начин, са том разликом што је ризик био повећан 1,3 пута, што је такође представљало значајно повећање, али мање изражено него у овој студији (130). Seemungal и сарадници (129) су повезаност испитивали мултиплом регресионом анализом и утврдили да је присуство ХОБП значајан позитиван предиктор нивоа Нсу. Поређењем вредности Нсу код хоспитализованих и амбулантно лечених болесника, као и између оболелих са радиографски доказаним емфиземом и групе без таквог налаза нису откривене значајне разлике. Овакви резултати могу на индиректан начин упутити на закључак да се степен тежине болести не рефлектује кроз ниво Нсу. Међутим, узимајући у обзир чињеницу да тежина болести није процењена према GOLD критеријума, наведени закључак је поузданије посматрати као хипотезу коју би било значајно испитати у даљим студијама. У прилог оваквом становишту говоре и контрадикторни резултати претходних студија. Код болесника јапанског порекла појава ННсу је била карактеристична за стадијуме GOLD 1 и 2, док су болесници чија је тежина болести описивана као GOLD 3 и 4 имали ниже вредности Нсу (128). Насупрот њима Seemungal и сарадници (129)су показали да су тежи облици болести повезани са вишим концентрацијама Нсу. У студији на италијанским болесницима није доказано да постоји статистички значајна повезаност концентрације Нсу и степена бронхоопструкције (130). Сходно томе, изнета су два становишта о узроку уочених неслагања. Прво је да она могу бити последица разлике у етничкој структури болесника. Такође, као други узрок је наведена могућност да евентуалну повезаност није било 76 могуће поуздано проценити услед релативно малог броја испитаника које су укључиле поменуте студије (130). Претпоставља се да иницијатор појаве ННсу у ХОБП представљају репарациони механизми који су веома активни у плућном ткиву оболелих. Њих карактерише интензивна метилација ДНК, РНК и различитих протеина, за шта је неопходна велика количина донора метил група тј. S- аденозил-Меt. Последично долази до генерисања велике количине S- аденозил-Нсу односно Нсу, у самом ткиву и у крви (135). Повећање нивоа Нсу активира више механизама који продубљују оштећење плућа. Приликом објашњења повезаности ХОБП и ННсу аутори наглашавају да су штетне компоненте дуванског дима "окидач" који води појави ННсу. У контексту таквих разматрања важно је напоменути да болесници у овој студији нису били пушачи у моменту укључења. Нађени повишен ниво Нсу и учесталост ННсу могу указивати на чињеницу да је овај метаболички поремећај присутан код оболелих од ХОБП без обзира да ли је изложеност дуванском диму била фактор ризика за настанак ХОБП. Међу поменутим механизмима оксидативни стрес је најдуже проучаван. Сматра се да ННсу иницијално ремети равнотежу синтезе различитих компоненти система антиоксидантне заштите (33, 34). Настала неравнотежа у редокс систему ћелије доводи до снижења расположиве количине фолата чиме се генеришу нове количине Нсу и појачава оксидативни стрес (32). Повећање концентрације Нсу такође представља сигнал за активацију леукоцита, у првом реду неутрофила и моноцита, те и на тај начин доприноси ендотелној дисфункцији (33). Поред ових механизма, који говоре у прилог тога да је појава ННсу последица присуства ХОБП, извесни експериментални подаци указују на могућност да је ННсу укључена у патогенезу ХОБП. Стварање великих количина Нсу-тиолактона и последично стварање N-хомоцистеинил деривата са различитим протеинима укљученим у хуморални и ћелијски имуни одговор може бити повезана са аутоимунским механизмима 77 настанка ХОБП (7). У овом контексту треба посматрати и способност ННсу да активира апопототске путеве. 5. 2. Утицај пола Ниво Нсу се није разликовао између мушких и женских болесника у овом истраживању (Слика 8). За разлику од њих, у контролној групи је показано да је концентрација Нсу виша код мушкараца него код жена (Слика 8), што је у складу са раније објављеним литературним подацима (9). Такође није било значајне разлике у инциденци ННсу између особа мушког и женског пола, без обзира да ли су оболеле од ХОБП или су здраве (Слика 9). Логистичка регресиона анализа је показала да пол не представља значајан фактор ризика за настанак ННсу код особа са ХОБП. Наведени резултати су сагласни са налазима студије у групи италијанских болесника, у којој такође није показана значајна разлика у нивоу Нсу између мушкараца и жена (130). Насупрот овим запажањима, Seemungal и сарадници (129) су и код испитиваних болесника показали да је ниво Нсу виши код мушкараца. Разлике у концентрацији Нсу између мушкараца и жена нису процењиване у студији на јапанским болесницима (128). У студији је уочено да мушки и женски болесници имају значајно више концентрације Нсу односно инциденцу ННсу у поређењу са здравим особама истог пола. Резултате оваквих поређења у основи треба тумачити као додатни доказ да је ризик од појаве ННсу исти код оба пола. Међутим, додатно се може запазити да су разлике, како у нивоу Нсу тако и у учесталости ННсу, нису у истој мери изражене код мушкараца и жена. Жене оболеле од ХОБП су имале ниво Нсу већи за 4,3 μmol/L, што је представљало разлику која је била 3,3 пута већу од оне уочене код мушкараца. Аналогно поређење разлике у инциденци ННсу указује да је она 1,5 пута већа у женском делу популације укључене у студију. Наведене разлике не само да сведоче у прилог становишта да је ризик за настанак 78 васкуларне болести повезане са ННсу једнак код оба пола, чак и пре менопаузе (9−11), већ уводе и хипотезу да би ризик могао бити повишен код жена, коју је неопходно проверити у већим проспективним студијама. 5. 3. Утицај старости Старост и ниво Нсу нису били у значајној корелацији ни код болесника ни у контролној групи (Слике 10 и 11). Додатно, болесници су били подељени у две групе (старији и млађи од 50 година) између којих није доказана значајна разлика у нивоу Нсу. Додатно, логистичком регресијом је показано да старост не представља значајан фактор ризика за настанак ННсу код оболелих. Добијени резултати нису били у сагласности са претходним литературним наводима који су и старост, поред пола, означили као најзначајнију биолошку детерминанту концентрације Нсу (9). Аналогно подацима о утицају пола на ниво Нсу, претходне студије код болесника са ХОБП су дале и различите резултате по питању корелације са годинама испитаника. Резултати Seemungalа и сарадника (129), слично резултатима у овој студији, нису указали да постоји значајна корелација. Са друге стране, у студији код италијанских болесника је доказан значајан степен повезаности између старости болесника и концентрације Нсу (130). При интерпретацији различитих закључака о повезаности старости и концентрације Нсу треба узети у обзир и чињеницу да је број испитаника у овој, као и у остале две студије, релативно мали, као и да постоји разлика у старости испитаних болесника. Болесници укључени у ову студију су били више од две деценије млађи од оболелих које су испитивали Seemungal и сарадници (129), односно италијански аутори (130), али је истовремено и опсег старости био знатно шири. На основу оваквих разматрања могуће је одсуство корелације између нивоа Нсу и старости објаснити чињеницом да старост већине испитаника није била изнад 65 година, што представља границу када, према литертатурним 79 подацима, корелација нивоа Нсу и старости постаје израженија (9). Ово објашњење такође указује на потребу за већим проспективним студијама у којима би старији испитаници били заступљенији. 5. 4. Утицај полиморфизама MTHFR C677T и A1298C Полиморфизам MTHFR C677T је био нађен код укупно 64% испитиваних болесника, код 12% у хомозиготном односно код 52% у хетерозиготном облику (Слика 12), што је одговарало фреквенцији Т алела од 37,8%. Добијене вредности представљају прве податке о учесталости овог полиморфизма код оболелих од ХОБП. Поређењем са фреквенцијама добијеним за контролну групу може се закључити да Т алела није заступљенији код оболелих у односу на здраве. У прилог оваквом закључку говори и чињеница да се процењена фреквенца Т алел на глобалном нивоу креће у опсегу 7−40% (17). Такође и у истраживању на групи здравих особа пореклом са територије Србије добијена је фреквенција Т алела од 31,2% односно збирна учесталост носилаца од 50,4% (39,2% хетерозиготних и 11,2% хомозиготних) (141). Код хомозиготних носилаца Т алела концентрација Нсу је била већа за 5,6 μmol/L у односу на ниво измерен код хомозиготних носилаца С алела (Слика 13), што је представљало значајну разлику како са статистичког, тако и са биолошко-клиничког аспекта, обзиром да је била дупло већа од оне која се наводи у литератури (9, 16, 151). Потребно је нагласити и да је разлика у веома сличном степену била изражена и када је концентрација Нсу упоређена између болесника са ТТ и СТ генотипом. Смањење активности MTHFR услед присуства овог полиморфизма, које код хомозиготних носилаца може износити и до 70% (9, 16), може у великој мери објаснити постојање наведених разлика. Међутим, при тумачењу чињенице да су разлике израженије у односу на оне које се наводе у литератури, требало би размотрити и могућност да су за њихов настанак одговорни механизми специфични за ХОБП, првенствено изражена 80 хиперметилација приликом репарације оштећеног плућног парехнима. На заснованост овакве хипотезе упућују и резултати ранијих студија код болесника са територије републике Србије, у којима није доказано да присуство полиморфизма MTHFR С677Т утиче на ниво Нсу код болесника са плућном емболијом или код особа код којих је дошло до развоја инфаркта миокарда пре 45. године живота (148, 150). Премда са статистичког аспекта није показано да су разлике у учесталости ННсу код болесника са различитим MTHFR С677Т генотиповима значајне, уочава се јасан тренд пораста-од 55,5% код хомозигота за "wild type" алел, преко 73,1% код хетерозиготних носилаца полиморфизма па до 100% код хомозигота за Т алел (Слика 14). Додатно, чињеница да су уочене инциденце прилично високе, као и да логистичка регересија није показала да је присуство MTHFR 677 Т алела фактор ризика за настанак ННсу, такође може указивати да до појаве ННсу долази кроз синергистичку интеракцију полимофизама MTHFR C677T и патофизиолошких механизама у ХОБП. Резултати добијени у овој студији такође су и први подаци о учесталости полиморфизма MTHFR A1298C код болесника са ХОБП. Расподела генотипова (58,0% АА, 24,0% АС и 18,0% СС) (Слика 15) је одступала од Hardy Weinberg-ове равнотеже и то у смислу да је СС генотип имао дупло већу учесталост од очекиване. Овакво запажање може бити потврђено и поређењем са подацима доступним у литератури (17, 151). Међутим, биомедицински значај уоченог одступања не може бити поуздано процењен на основу резултата ове студије. Разлог за то је релативно мали број испитаника, али и чињеница да није показано да присуство полиморфизма утиче на ниво Нсу и појаву ННсу. Наиме, скоро идентичне концентрације Нсу су нађене код болесника са АА и АС генотипом. Вредности код хомозиготних носилаца полиморфизма су биле нешто веће, при чему разлика није била значајна (Слика 16). Такође и инциденца ННсу у групама оболелих са различитим 81 MTHFR А1298С генотипом се кретала у веома уском опсегу (66,7−72,7) (Слика 17). Ови резултати су, за разлику од података о дистрибуцији генотипова, били у складу се литературним наводима (16, 17, 151). Комбиновано присуство оба полиморфизма је откривено код 9 болесника. Међу њима је било 6 комбинованих хетерозигота, два са хетерозиготним присуством MTHFR С677Т заједно са генотипом MTHFR 1298 СС, а један болесник је био хомозиготни носилац MTHFR С677Т и хетерозиготни носилац MTHFR А1298С. Међутим литературни подаци да је ниво Нсу повећан код особа код којих су присутна оба полиморфизма (16, 17, 151) нису потврђени резултатима студије (Табела V). 5. 5. Утицај концентрације фолата и витамина Б12 Просечне вредности концентрације фолата (4,13 μg/L) односно витамина Б12 (463,6 ng/L), измерене код болесника укључених у студију, су се разликовале у односу на нивое који су добијени у претходним студијама код оболелих од ХОБП. Тако су у истраживању на шведским болесницима добијене више вредности фолата (7,0 μg/L) и витамина Б12 (540,0 ng/L) (132), док су у италијанској групи вредности биле ниже како за фолат (2,5 μg/L), тако и за витамин Б12 (324,5 ng/L) (130). У интерпретацији поменутих разлика треба узети у обзир чињеницу да су болесници у шведској студији били старији, као и да није наведен прецизан податак о методи мерења нивоа витамина (132), док је италијанска група формирана од болесника који су најмање 6 месеци били у ремисији (130). Резултати добијени у овој студији такође указују да пол и старост показују другачији утицај на ниво фолата и витамина Б12 код оболелих од ХОБП у односу на здраве особе. Тако је у здравој популацији показано да је код жена ниво фолата већи у односу на мушкарце (21, 152), као и да постоји позитивна корелација између старости и концентрације фолата (21, 152) односно витамина Б12 (21). Код болесника мушког и женског пола, укључених у ову 82 студију, нису уочене разлике у нивоу витамина, а корелација са годинама живота је показана само код фолата. Резултати истраживања указују на различиту повезаност нивоа поменутих витамина и концентрације Нсу код болесника са ХОБП. Прецизније, корелација нивоа фолата и Нсу није била значајна (Слика 18), док је код витамина Б12 уочена значајна негативна повезаност (Слика 19). Оваква запажања су потврђена и чињеницом да између болесника код којих је дошло до појаве ННсу и оних без таквог налаза, разликују концентрације витамина Б12, док су концентрације фолата компарабилне (Слике 20 и 21). Овакви резултати се у извесној мери разликују од оних који су добијени у претходним студијама. Seemungal и сарадници (129) нису нашли повезаност дефицијенције фолата и витамина Б12 са концентрацијом Нсу. Међутим, применљивост њиховог закључка је ограничена чињеницом да нивои витамина нису одређивани, већ су били процењени поређењем података из "food frequency" упитника са препорученим дневним уносом витамина (129). У групи италијанских болесника добијена је значајна корелација нивоа Нсу и концентрације фолата, док је повезаност са концентрацијом витамина Б12 описана као тренд без статистичког значаја (130). Концентрације фолата се нису разликовале између болесника са различитим MTHFR С677Т генотиповима (Слика 22), што није било у сагласности са претходним подацима из литературе (16, 151). Када је у питању полиморфизам MTHFR А1298С, резултати студије (Слика 23) су потврдили претходне податке да нема утицаја на концентрацију фолата (16, 151). Наведена запажања би се могла интерпретирати као додатна потврда да утицај интензивне метилације током репарације оштећеног плућног паренхима на пораст Нсу може надвладати утицаје осталих генетских и стечених фактора утицаја. За дефинисање дефицијенција витамина, приликом испитивања њиховог значаја као фактора ризика за појаву ННсу коришћене су 83 литературне cut-off вредности - за фолат 4,0, 6,6 и 8,0 μg/L односно 203 и 473 ng/L за витамин Б12 (18, 20−22, 152, 153). Без обзира што су добијене значајне разлике у учесталости недостатка одговарајућих витамина, није показано да оне представљају значајан фактор ризика за појаву ННсу (Табеле VI и VIII). Повезаност недостака витамина и концентрације Нсу је испитана и у супротном смеру, како би се проверило да ли појава ННсу може послужити као биомаркер њихове дефицијенције. У ову сврху, поред cut-off-a 12 μmol/L, ННсу je дефинисана и као концентрација Нсу изнад 10 односно 15 μmol/L. Међутим, резултати ROC анализе су показали да се код испитиваних болесника на основу појаве ННсу не може предвидети недостатак фолата односно витамина Б12, без обзира које се концентрације користе за дефинисање ННсу, односно дефицијенције витамина (Табеле VII и IX). Премда оваква запажања могу упућивати на закључак да одређивање Нсу нема значаја при процени недостатка фолата односно витамина Б12 код оболелих од ХОБП, потребно их је проверити у већим студијама. Поред веће поузданости резултата, укључивање значајно већег броја испитаника би дало могућност и да се идентификују нове cut-off вредности које би омогућиле да процена међусобног утицаја нивоа витамина и концентрације Нсу буде прецизнија у односу на ону која је добијена коришћењем литературних cut-off вредности. Као додатни фактор утицаја коме би требало посветити пажњу у дизајну будућих студија је и дужина трајања ремисије у моменту када се болесници буду укључивали. Наведени фактор може бити значајан с обзиром да је показано да ниво фолата опада услед оксидативног стреса (32), као и да је интензитет оксидативног стреса повећан када се постигне ремисија болести (154). На основу ових чињеница може се поставити хипотеза да је у моменту настанка ремисије повећање нивоа Нсу одраз хиперметилације услед репарације ткива, а да је на овај начин изазвани оксидативни стрес почиње да "троши" резерве фолата, те да би тек након извесног времена, пораст нивоа Нсу почео да буде индикатор дефицита витамина (155). У 84 прилог оваквој хипотези би могла говорити и чињеница да је већина болесника у ову студију укључена непосредно по постизању ремисије, а да је су у италијанској студији, која је потврдила инверзну корелацију са нивоом фолата, групу сачињавали болесници код којих је ремисија трајала најмање шест месеци (130). 5. 6. Повезаност са ААТD Посматрано искључиво са статистичког становишта резултати студије нису потврдили повезаност поремећаја метаболизма Нсу и ААТD. Корелација између концентрације ААТ и нивоа Нсу није доказана (Слика 24), ниво Нсу се није значајно разликовао између генотипова SERPINA1 (Табела X), а између болесника са ААТD, хетерозиготних носилаца и оболелих без овог генетског поремећаја нису уочене значајне разлике у концентрацији Нсу, односно инциденци ННсу (Слике 25 и 26). Међутим, и поред оваквих закључака статистичке анализе извесне карактеристике добијених резултата, као и епидемиолошки подаци о ААТD указују да постоји оправдање да се настави са истраживањем повезаности ових поремећаја. Уочава се релативно велики распон концентрација Нсу измерених код болесника са ААТD, при чему су вредности код хомозиготних носилаца Z алела биле видљиво ниже у односу на оне измерене код болесника где је ААТD узрокован комбинованим хетерозиготним присуством Z и ретких алела SERPINA1 (Табела Х). У овом контексту се може тумачити и податак да су од укупно три болесника са умереном ННсу два имала и тежак облик ААТД, узрокован управо оваквом генотипском комбинацијом. Такође се чини важним нагласити и да је највећа концентрација у студији (40,22 μmоl/L) измерена код болеснице у чијем су генотипу били присутни Z и нулти алел Q0amersfoort, а која при томе није била носилац полиморфизама MTHFR C677T и A1298C нити је имала недостатак фолата и витамина Б12. И појединачно запажање, попут 85 овог, говори у прилог томе да болесници, генетски предиспонирани за ХОБП услед присуства нултих алела SERPINA1, у патофизиолошком и клиничком погледу предстаљају специфичну групу (156). Генерално посматрано релативно ниска стопа детекције болесника погођених са ААТD ограничава ефективност специфичних мера у њиховом лечењу и поузданост процена повезаности овог генетског поремећаја са коморбидитетима ХОБП. Најчешће примењиван дијагностички присуп је заснован на screening-у, одређивањем концентрације ААТ и фено- односно генотипизацијом у случају ниских концентрација (101, 102). С обзиром да стечени фактори, у првом реду инфламација, значајно утичу на концентрацију ААТ и самим тим на поузданост резултата screening-а, препоручена је примена интегративног лабораторијског алгоритма, заснованог на комбинацији биохемијских и молекуларно-биолошких метода (103). Степен детекције ААТD код болесника укључених у студију применом оваквог алгоритма је износио 14% и био је значајно виши у поређењу са литературним подацима о проценту особа са ААТD детектованих међу оболелима од ХОБП, како у иностраним (0,5−10,4%) (157), тако и у српској популацији (2,3%) (158). Повећана ефикасност детекције се са једне стране може објаснити употребом интегративног алгоритма, али треба узети у обзир и чињеницу да је студија укључила болеснике код којих је дијагноза ХОБП постављена пре 45. године живота, те је можда и за очекивати да међу њима буде већи проценат особа са ААТD у односу на неселектовану популацију оболелих (102). Овакво објашњење поткрепљују и резултати италијанске студије где је степен детекције ААТD износио око 40% у циљано одабраној групи болесника (ХОБП у млађем животном добу и/или без јасног фактора ризика, бронхиектазије) (159). Истовремена примена квантификације и генотипизације за Z и S алел је "спречила" да 5 хетерозиготних носилаца остану недетектовани (Табела ХI). Примена "reflex" тестова, ИЕФ и секвенцирања, омогућила је исправну идентификацију два ретка алела 86 (Слике 27 и 28). Први од њих, Мmalton, карактеришу концентрације у крви испод 15% од доње границе референтног интервала, а код носилаца је могућ и преурањени развој ХОБП и оштећење јетре (160). Према расположивим литературним подацима болесник са генотипом ZМmalton је друга особа са таквим генотипом детектована у српској популацији (161). Други ретки алел детектован у студији, Q0amersfoort, је откривен 2008. године (162), а болесница са генотипом ZQ0amersfoort је прва особа у српској популацији код које је потврђено његово присуство (163). Без обзира на наведене чињенице неопходно је нагласити да статистички није доказано да је дијагностичка ефективност, постигнута применом интегративног алгоритма, унапређена у односу на ефективност која би била постигнута screening-ом заснованом на одређивању концентрације ААТ. Највероватнији узрок оваквог резултата статистичке анализе треба потражити у малом броју испитаника (163). Студија је испитала само један "смер" међусобног утицаја ННсу и ААТD. Претпостављени други "смер" би се односио на могућност да оксидативни стрес, проузрокован и појачан присуством ННсу, доводи до оксидације бочног остатка метионина у молекулу ААТ, који је неопходан за инхибицију еластазе. Услед тога, молекуле ААТ би могле постати дисфункционалне, без обзира да ли је болесник носилац дефицијентних алела SERPINA1 (164). У ширем смислу, поменути механизам би могао повезати ННсу и протеазно-антипротеазни дизбаланс као узрок ХОБП. 5. 7. Повезаност са концентрацијом СRP Степен хроничне инфламације, рефлектован кроз повишење концентрације СRP-а, се сматра веома важним чиниоцем код оболелих од ХОБП и то како у смислу механизама одговорних за прогресију болести, тако и као фактор ризика за појаву коморбидитета (124, 165, 166). Болесници укључени у студију су имали више вредности СRP у односу на здраве особе (Табела ХII), што је у складу са наведеним литературним 87 подацима. Међутим, корелација између нивоа СRP и Нсу није била значајна ни код оболелих ни у контролној групи (Слике 29 и 30). Такође, ниво Нсу се није разликовао између болесника са ННсу и оних код којих је концентрација Нсу била испод 12 μmol/L (Табела ХIII). Покушаји процене повезаности концентрација СRP и Нсу у претходним студијама су имали различите резултате. У студији Seemungal и сарадника (129) је такође уочен повећан ниво СRP када су болесници упоређени са здравим особама, али је показано и да је он у значајној позитивној корелацији са концентрацијом Нсу. За разлику од ових резултата, код италијанских болесника је нађено да концентрације Нсу и СRP нису у корелацији, иако је и ова група оболелих имала значајно повишене вредности у односу на контролну групу (130). У интерпретацији уочених разлика у добијеним резултатима потребано је узети у обзир неколико чињеница. Све три студије су укључиле релативно мали број испитаника, који су поред тога били и различите етничке припадности. Додатно, повезаност ННсу и системске инфламације је релативно неконзистентно запажање, чак и у већим и неселективним групама болесника (167). Наведене чињенице упућују на неопходност да се хипотеза о постојању повезаности ННсу и системске инфламације у ХОБП, коју је оправдано посматрати и као индикатор тежине болести, процени на основу резултата обимнијих студија (130). 5. 8. Заједнички утицај испитиваних фактора Почетно питање везано за заједнички утицај испитиваних фактора је било да ли је присуство ХОБП подједнако значајан фактор ризика за настанак ННсу код особа различитог пола и старости, односно да ли је повезан са присуством MTHFR 677 T алела и повишених вредности СRP. Применом логистичке регресионе анализе (Табела ХIV) дошло се до одговора да наведени чиниоци, поред тога што не представљају значајне факторе ризика за настанак ННсу, не показују ни значајан модулациони 88 ефекат на вероватноћу настанка овог метаболичког поремећаја код оболелих од ХОБП. Студија на италијанским болесницима је показала да дужина пушачког стажа утиче на асоцијацију ХОПБ и ННсу, док ефекти системске инфламације, рефлектоване кроз повишене вредности CRP, бубрежне и срчане слабости нису били значајни (130). Посматрани заједно, овакви резултати наговештавају да само присуство ХОБП односно пушење, као њен најчешћи узрок, представљају довољно јак независни чинилац који не само да може довести до појаве ННсу, већ његови ефекти могу надјачати утицај фактора који се традиционално посматрају као предиктори концентрације Нсу. Додатне смернице у тумачењу оваквих запажања су дали резултати мултипле регресионе анализе код болесника укључених у студију (Табела ХV). Показано је да је заједничко деловање испитиваних генетских и стечених фактора одговорно за чак 65% варијације у нивоу Нсу. Као значајни предиктори концентрације Нсу идентификовани су присуство MTHFR 677 TT генотипа, дефицит витамина Б12 (дефинисан cut-off-ом од 473 ng/L) и присуство AATD. Чињеница да посматрани засебно, генотип MTHFR 677 TT и недостатак витамина Б12 нису значајни фактори ризика за појаву ННсу, док њихово заједничко присуство у значајној мери одређује ниво Нсу може представљати извесну врсту прелиминарног доказа о значају нутригенетичких интеракција код оболелих од ХОБП (168). Овакав закључак потврђују и резултати логистичке регресије у групи болесника (Табела ХVI). Узимајући у обзир све чиниоце испитиване у овој студији недостатак витамина Б12, дефинисан као серумска концентрација нижа од 473 ng/L, идентификован је као једини значајан фактор ризика за настанак ННсу код оболелих од ХОБП. Овакви резултати се донекле разликују од налаза код Италијана оболелих од ХОБП који указују да су концентрације фолата и витамина Б12, заједно са нивоом триглицерида, значајни предиктори концентрације Нсу код болесника са ХОБП (130). Међутим, при поређењу је потребно имати у виду да у овој студији није 89 испитиван утицај триглицерида, док италијанска студија није проучавала значај полиморфизама у гену за MTHFR, као и да су укључени болесници који су били најмање у шестомесечној ремисији. На улогу AATD као предиктора нивоа Нсу су по први пут указали резултати ове студије. Као једно од могућих објашњења оваквог запажања би могла послужити хипотеза да је присуство овог генетског поремећаја код оболелих изазива израженије оштећење плућног паренхима, а самим тим и већу брзину метилације приликом репарације и последични настанак додатних количина Нсу (113, 135). Међутим, при интерпретацији овог резултата потребно је узети у обзир да је испитивана група укључила релативно мали број болесника код којих је дошло до преурањеног развоја ХОБП, да је AATD у њој имала велику учесталост, као и да су најизраженија повећања уочена код болесника који су носиоци ретких алела SERPINA1. 5.9. Учесталост мутација FV Leiden и FII G20210A У ширем контексту повезаности ННсу и тромбофилије (146), у студији су испитане учесталост мутације FV Leiden односно FII G20210A, које представљају најчешће генетске факторе ризикa за настанак венског тромбоемболизма. Премда је показано да је он веома значајан коморбидитет ХОБП (141, 169), с обзиром да се може појавити у 3−29% случајева егзацербација ХОБП (170, 171), количина података о учесталости ових мутација, добијена у популацији оболелих од ХОБП није задовољавајућа. Међу испитиваним болесницима је идентификован један хетерозиготни носилац мутације FV Leiden, док присуство мутације FII G20210A није доказано ни код једног од болесника укључених у студију (Слике 31 и 32). Поређењем са литературним подацима о учесталости ових мутација у здравој популацији Републике Србије (5,83% за FV Leiden, 4,12% за FII G20210A) (141) закључено је да не постоји значајна разлика. Премда 90 би овакви прелиминарни резултати могли указивати да ризик од венског тромбоемболизма код оболелих од ХОБП не би требало приписати повећаној инциденци ових мутација, неопходно их је проверити у студијама на већим популација оболелих. 5. 10. Ограничења студије и смернице за даља истраживања Релативно мали број испитаника је најзначајније ограничење истраживања, услед кога је неопходно значајан број добијених резултата означити као "прелиминарне". Међутим, поређења са претходним студијама код болесника са ХОБП се могу сматрати релевантним, с обзиром да су и оне урађене на релативно малом укупном броју испитаника - 47 у јапанској популацији, 54 у студији Seemungal-а и сарадника односно 71 у италијанској студији. У овом контексту су са клиничког аспекта значајне чињенице да су болесници били са једне стране преселектовани, у смислу да је ХОБП дијагностикована у млађем животном добу и да у моменту укључења у студију нису били пушачи, док са друге стране присуство вишемесечне ремисије није био критеријум за њихов одабир, односно није вршена процена стадијума болести према GOLD критеријумима. Међутим чак и као "прелиминарни", резултати студије представљају поуздану основу у развоју хипотеза за даља истраживања значаја поремећаја метаболизма Нсу код болесника са ХОБП. Kao што је већ напоменуто у претходним одељцима дискусије, студије на већем броју неселектованих болесника би повећале поузданост добијених резултата. Поред њих, неопходне су и проспективне студије које би провериле поузданост појаве ННсу као биомаркера за процену "квалитета живота" оболелих, као и ризика од развоја коморбидитета. Такође, чини се значајним испитати и повезаност нивоа Нсу и брзине опадања плућне функције, како код оболелих од ХОБП тако и код "здравих" пушача. (128−130, 172−174). 91 6. Закључци 1. На основу изложених резултата може се закључити да оболели од ХОБП имају у просеку 25% већи ниво Нсу и скоро три пута већу учесталост ННсу у односу на здраве особе, као и да присуство ХОБП приближно 3,9 пута повећава ризик од настанка ННсу. 2. Пол и старост, као најчешће помињане биолошке детерминанте концентрације Нсу, не показују значајан утицај на његов ниво и инциденцу ННсу код испитиваних болесника са ХОБП. Међутим, пораст концентрације Нсу односно инциденце ННсу у односу на здраве особе је знатно израженији код женских болесника. 3. Фреквенција MTHFR 677 T алела код испитиване групе оболелих од ХОБП је 37,8%, док је MTHFR 1298 С алел нађен код 30,0% оболелих. Концентрација Нсу је повећана код болесника са MTHFR 677 TТ генотипом, док се MTHFR 1298 С алел не може повезати са разликама у нивоу Нсу. Такође присуство поменутих алела не доводи до значајно повећане учесталости ННсу. 4. Ниво Нсу код болесника са ХОБП укључених у студију није значајно повезан са концентрацијом фолата, али показује значајан степен негативне корелације са нивоом витамина Б12. Дефицит поменутих витамина у испитиваној групи оболелих се не може поуздано предвидети на основу пораста концентрације Нсу. 5. Концентрација Нсу и инциденца ННу нису повезане са присуством AATD код оболелих. Међутим, уочен је тренд појаве виших концентрација Нсу код болесника који су носиоци ретких алела SERPINA1 гена. Такође, повишене вредности CRP нису у корелацији са нивоом Нсу и учесталошћу ННсу у испитиваној групи болесника са ХОБП. 6. Присуство ХОБП у подједнакој мери повећава ризик од настанка ННсу код особа различитог пола и старости, а такође је уочено да ризик не зависи од присуства MTHFR 677 T алела односно повишених вредности 92 CRP. Заједнички утицај испитиваних наследних и стечених фактора се показао одговорним за приближно 65% варијације у нивоу Нсу код болесника укључених у истраживање, при чему су као значајни предиктори идентификовани MTHFR 677 TT генотип, дефицијенција витамина Б12, дефинисана као серумска концентрација мања од 473 ng/L, и присуство AATD. Међутим, једино недостатк витамина Б12 представља фактор ризика за настанак ННсу код испитиваних болесника. 7. Фреквенција мутације FV Leiden у испитиваној групи оболелих је износила 2%, док ни код једног болесника није доказано присуство мутације FII G20210A. Овакви резултати се не разликују значајно од фреквенција са којом се наведене мутације јављају у популацији здравих особа са територије Републике Србије. 93 7. Литература 1. Bing FC. Vincent du Vigneaud (1901-1978): a biographical sketch. J Nutr 1982; 112: 1463−73. 2. Мирковић Д. Хомоцистеин као фактор ризика за настанак коронарне болести [дисертација]. Београд, Србија: Универзитет у Београду; 2004. 3. Schalinske KL, Smazal AL. Homocysteine imbalance: a pathological metabolic marker. Adv Nutr 2012; 3: 755−62. 4. Williams KT, Schalinske KL. Homocysteine metabolism and its relation to health and disease. Biofactors 2010; 36: 19−24. 5. Stipanuk MH, Ueki I. Dealing with methionine/homocysteine sulfur: cysteine metabolism to taurine and inorganic suflur. J Inherit Metab Dis 2011; 34: 17−32. 6. Finkelstein JD. The metabolism of homocysteine: pathways and regulation. Eur J Pediatr 1998; 157: (Suppl 2): 40−44. 7. Jakubowski H. The molecular basis of homocysteine thiolactone- mediated vascular disease. Clin Chem Lab Med 2007; 45: 1704−16. 8. Desirable Biological Variation Database specifications. Доступно на http://www.westgard.com/biodatabase1.htm. Приступано 12. маја 2014. 9. Refsum H, Smith AD, Ueland PM, Nexo E, Clarke R, McPartlin J et al. Facts and recommendations about total homocysteine determinations: an expert opinion. Clin Chem 2004; 50: 3−32. 10. Cesari M, Rossi GP, Sticchi D, Pessina AC. Is homocysteine important risk factor for coronary heart disease? Nutr Metab Cardiovasc Dis 2005; 15: 140−7. 94 11. Verhoef P, Meleady R, Daly LE, Graham IM, Robinson K, Boers GH et al. Homocysteine, vitamin status and risk of vascular disease; effects of gender and menopausal status. Eur Heart J 1999; 20: 1234−44. 12. Boushey CJ, Beresford SAA, Omen GS, Motulsky AG. A quantitative assessment of plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease: Probable benefits of increasing folic acid intakes. J Am Med Assoc 1995; 274: 1049−57. 13. Wald DS, Law M, Morris JK. Homocysteine and cardiovascular disease: evidence on causality from meta-analysis. BMJ 2002; 325: 1202−6. 14. Herrmann W. Significance of hyperhomocysteinemia. Clin Lab Med 2006; 52: 367−74. 15. Perła-Kaján Ј, Twardowski Т, Jakubowski H. Mechanisms of homocysteine toxicity in humans. Amino Acids 2007; 32: 561−72. 16. Nazki FH, Sameer AS, Ganaie BA. Folate: Metabolism, genes, polymorphisms and the associated diseases. Gene 2014; 533: 11−20. 17. Botto LD, Yang Q. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: A HuGE review. Am J Epidemiol 2000; 151: 862−77. 18. Green R. Indicators for assessing folate and vitamin B-12 status and for monitoring the efficacy of intervention strategies. Am J Clin Nutr 2011; 94: Suppl 2: 666−72. 19. Jiang B, Ding C, Yao G, Yao C, Zhang Y, Ge J, et al. Intervention effect of folic acid and vitamin B12 on vascular cognitive impairment complicated with hyperhomocysteinemia. J Med Biochem 2014; 33: 169−74. 20. Dhonukshe-Rutten RA, de Vries JH, de Bree A, van der Put N, van Staveren WA, de Groot LC. Dietary intake and status of folate and vitamin B12 and their association with homocysteine and cardiovascular disease in European populations. Eur J Clin Nutr 2009; 63: 18−30. 95 21. Zappacosta B, Persichilli S, Iacoviello L, Di Castelnuovo A, Graziano M, Gervasoni J et al. Folate, vitamin B12 and homocysteine status in an Italian blood donor population. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2013; 23: 473−80. 22. De Bruyn E, Gulbis B, Cotton F. Serum and red blood cell folate testing for folate deficiency: new features? Eur J Haematol. 2014; 92: 354−9. 23. Desouza C, Keebler M, McNamara DB, Fonseca V. Drugs affecting homocysteine metabolism: impact on cardiovascular risk. Drugs 2002; 62: 605−16. 24. Ntaiosa G, Savopoulosa C, Chatzopoulosa S, Mikhailidisb D, Hatzitoliosa A. Iatrogenic hyperhomocysteinemia in patients with metabolic syndrome: A systematic review and metaanalysis. Atherosclerosis 2011; 214: 11−9. 25. Belcastro V, Striano P. Antiepileptic drugs, hyperhomocysteinemia and B-vitamins supplementation in patients with epilepsy. Epilepsy Res 2012; 102: 1−7. 26. Mazokopakis EE, Starakis IK. Recommendations for diagnosis and management of metformin-induced vitamin B12 (Cbl) deficiency. Diabetes Res Clin Pract 2012; 97: 359−67. 27. Jakubowski H. Molecular basis of homocysteine toxicity in humans. Cell Mol Life Sci 2004; 61: 470−7. 28. Yilmaz N. Relationship between paraoxonase and homocysteine: crossroads of oxidative diseases. Arch Med Sci 2012; 8: 138−53. 29. Jakubowski H. Homocysteine thiolactone: metabolic origin and protein homocysteinylation in humans. J Nutr 2000; 130: Suppl 2: 377−81. 30. Perła-Kaján Ј, Jakubowski H. Paraoxonase 1 and homocysteine metabolism. Amino Acids 2012; 43:1405−17. 31. Tyagi N, Sedoris KC, Steed M, Ovechkin AV, Moshal KS, Tyagi SC. Mechanisms of homocysteine-induced oxidative stress. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 289: 2649−56. 96 32. Hoffman M. Hypothesis: hyperhomocysteinemia is an indicator of oxidant stress. Med Hypotheses 2011; 77: 1088−93. 33. Veeranki S, Tyagi SC. Defective homocysteine metabolism: potential implications for skeletal muscle malfunction. Int J Mol Sci 2013; 14: 15074−91. 34. Jurkovic S, Osredkar J, Marc J. Molecular impact of glutathione peroxidases in antioxidant processes. Biochem Med 2008; 18: 162−74. 35. Malinowska J, Tomczynska M, Olas B. Changes of blood platelet adhesion to collagen and fibrinogen induced by homocysteine and its thiolactone. Clin Biochem. 2012; 45: 1225−8. 36. Sauls DL, Wolberg AS, Hoffman M. Elevated plasma homocysteine leads to alterations in fibrin clot structure and stability: implications for the mechanism of thrombosis in hyperhomocysteinemia. J Thromb Haemost 2003; 1: 300−6. 37. Undas A, Brozek J, Jankowski M, Siudak Z, Szczeklik A, Jakubowski H. Plasma homocysteine affects fibrin clot permeability and resistance to lysis in human subjects. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006; 26: 1397−404. 38. Steed, M.M.; Tyagi, S.C. Mechanisms of cardiovascular remodeling in hyperhomocysteinemia. Antioxid Redox Signal 2011; 15: 1927−43. 39. Stern F, Berner YN, Polyak Z, Komarnitsky M, Sela BA, Hopp M, Dror Y. Homocysteine effect on protein degradation rates. Clin Biochem 2004; 37: 1002−9. 40. Gates AT, Lowry M, Fletcher KA, Murugeshu A, Rusin O, Robinson JW et al. Capillary electrophoretic screening for the inhibition of homocysteine thiolactone-induced protein oligomerization. Anal Chem 2007; 79: 8249−56. 41. Undas A, Perla J, Lacinski M, Trzeciak WH, Kazmierski R, Jakubowski H. Autoantibodies against N-homo cysteinylated proteins in humans: implications for atherosclerosis. Stroke 2004; 35: 1299−304. 97 42. Sipkens JA, Hahn N, van den Brand CS, Meischl C, Cillessen SA et al. Homocysteine-induced apoptosis in endothelial cells coincides with nuclear NOX2 and peri-nuclear NOX4 activity. Cell Biochem Biophys 2013; 67: 341−52. 43. Meischl C, Krijnen PA, Sipkens JA, Cillessen SA, Muñoz IG, Okroj M et al. Ischemia induces nuclear NOX2 expression in cardiomyocytes and subsequently activates apoptosis. Apoptosis 2006; 11: 913−21. 44. Sipkens JA, Krijnen PA, Meischl C, Cillessen SA, Smulders YM, Smith DE et al. Homocysteine affects cardiomyocyte viability: concentration- dependent effects on reversible flip-flop, apoptosis and necrosis. Apoptosis 2007; 12: 1407−18. 45. Handy DE, Castro R, Loscalzo J. Еpigenetic modifications: Вasic mechanisms and role in cardiovascular disease. Circulation 2011; 123: 2145−56 . 46. Cacciapuoti F. Hyper-homocysteinemia: a novel risk factor or a powerful marker for cardiovascular diseases? Pathogenetic and therapeutical uncertainties. J Thromb Thrombolysis 2011; 32: 82−8. 47. NiesenMI, Osborne AR, Yang H, Rastogi S, Chellappan S, Cheng JQ et al. Activation of a methylated promoter mediated by a sequence-specific DNA-binding protein. J Biol Chem 2005; 280: 38914−22. 48. Kangaspeska S, Stride B, Metivier R, Polycarpou-Schwarz M, Ibberson D, Carmouche RP et al. Transient cyclical methylation of promoter DNA. Nature 2008; 452: 112−5. 49. Metivier R, Gallais R, Tiffoche C, Le Peron C, Jurkowska RZ, Carmouche RP et al. Cyclical DNA methylation of a transcriptionally active promoter. Nature 2008; 452: 45−50. 50. Ingrosso D, Perna AF. Epigenetics in hyperhomocysteinemic states: a special focus on uremia. Biochim Biophys Acta 2009; 1790: 892−9. 51. Jamaluddin MS, Yang X, Wang H. Hyperhomocysteinemia, DNA methylation and vascular disease. Clin Chem Lab Med 2007; 45: 1660−6. 98 52. Kalani A, Kamat PK, Tyagi SC, Tyagi N. Synergy of homocysteine, microRNA, and epigenetics: a novel therapeutic approach for stroke. Mol Neurobiol 2013; 48:157−68. 53. Selhub J, Paul L. Folic acid fortification: why not vitamin B12 also? Biofactors 2011; 37: 269−71. 54. McCully KS. Homocysteine, vitamins, and vascular disease prevention. Am J Clin Nutr 2007; 86: (Suppl 1): 1563−8. 55. Woodward M, Rumley A, Rumley A, Rumley C, Lewington S, Morrison CE, Lowe GD. The association between homocysteine and myocardial infarction is independent of age, sex, blood pressure, cholesterol, smoking and markers of inflammation: the Glasgow Myocardial Infarction Study. Blood Coagul Fibrinolysis 2006; 17: 1−5. 56. Al-Obaidi MK, Stubbs PJ, Amersey R, Noble MI. Acute and convalescent changes in plasma homocysteine concentrations in acute coronary syndromes. Heart 2001; 85: 380−4. 57. Osorio A, Ortega E, Ruiz-Requena E. Two models of homocysteine behavior in acute myocardial infarction. Clin Biochem 2008; 41: 277−81. 58. Beletić A, Mirković D, Antonijević N, Jakovljević B, Peruničić J, Ilić M, Vasiljević Z, Majkić-Singh N. Incidence of hyperhomocysteinemia among patients with acute myocardial infarction younger than 45 years. J Med Biochem 2007; 26: 38−41. 59. Konkle BA, and AI Schafer (2008) Hemostasis, thrombosis, fibrinolysis and cardiovascular disease; homocysteine. У: Zipes DP, Libby P, Bonow RO, Braunwald E. Braunwald’s Heart Disease. Philadelphia: Elsevier Saunders, 2008: 2077−8. 60. Den Heijer M, Lewington S, and R Clarke. Homocysteine, MTHFR and risk of venous thrombosis: a metaanalysis of published epidemiological studies. J Thromb Haemost 2005; 3: 292−9. 61. Hirmerová Ј. Homocysteine and venous thromboembolism—Is there any link? Cor et Vasa 2013; 55: 248−58. 99 62. Radovanović N, Antonijević N, Beletić A, Peruničić J, Kočica M, Mirković D, Lačković V, Lačković M. Hyperhomocysteinemia in patients with pulmonary embolism. Arch Biol Sci 2010; 62: 907−14. 63. Fukami A, Adachi H, Hirai Y, EnomotoM, OtsukaM, Nanjo Y et al. High levels of plasma homocysteine predicts development of hypertension in a general population: the Tanushimaru study. J Epidemiol Community Health 2011; 65: 245−7. 64. Bogdanski P, Miller-Kasprzak E, Pupek-Musialik D, Jablecka A, Lacinski M, Jagodzinski P, Jakubowski H. Plasma total homocysteine is a determinant of carotid intima-media thickness and circulating endothelial progenitor cells in patients with newly diagnosed hypertension. Clin Chem Lab Med. 2012; 50: 1107−13. 65. Joseph J, Handy DE, Loscalzo J. Quo vadis: whither homocysteine research? Cardiovasc Toxicol 2009; 9: 53−63. 66. Clarke R, Halsey J, Bennett D, Lewington S. Homocysteine and vascular disease: review of published results of the homocysteine-lowering trials. J Inherit Metab Dis 2011; 34: 83−91. 67. Smulders YM, Blom HJ. The homocysteine controversy. J Inherit Metab Dis 2011; 34: 93−9. 68. Ueland PM, Loscalzo J. Homocysteine and cardiovascular risk: the perils of reductionism in a complex system. Clinical Chemistry 2012; 58: 1623−5. 69. Pezzini A, Grassi M, Del Zotto E, Assanelli D, Archetti S, Negrini R et al. Interaction of homocysteine and conventional predisposing factors on risk of ischaemic stroke in young people: consistency in phenotype- disease analysis and genotype-disease analysis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2006; 77: 1150−6. 70. Casas JP, Bautista LE, Smeeth L, Sharma P, Hingorani AD. Homocysteine and stroke: evidence on a causal link from mendelian randomisation. Lancet 2005; 365: 224−32. 100 71. Kernan WN, Ovbiagele B, Black HR, Bravata DM, Chimowitz MI, Ezekowitz MD et al. Guidelines for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke 2014; [Epub ahead of print] Доступно на http://stroke.ahajournals.org/content/early/2014/04/30/STR.0000000 000000024. Приступано 15. маја 2014. 72. Jankovic J. Parkinson's disease: clinical features and diagnosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2008; 79: 368−76. 73. O'Suilleabhain PE, Oberle R, Bartis C, Dewey RB Jr, Bottiglieri T, Diaz- Arrastia R. Clinical course in Parkinson's disease with elevated homocysteine. Parkinsonism Relat Disord 2006; 12: 103−7. 74. Herrmann W, Obeid R. Homocysteine: a biomarker in neurodegenerative diseases. Clin Chem Lab Med 2011; 49: 435−41. 75. Hooshmand B, Polvikoski T, Kivipelto M, Tanskanen M, Myllykangas L, Erkinjuntti T. Plasma homocysteine, Alzheimer and cerebrovascular pathology: a population-based autopsy study. Brain 2013; 136: 2707−16. 76. Hachinski V, Sposato LA. Dementia: from muddled diagnoses to treatable mechanisms. Brain 2013; 136: 2652−4. 77. Cacciapuoti F. Lowering homocysteine levels with folic acid and B- vitamins do not reduce early atherosclerosis, but could interfere with cognitive decline and Alzheimer's disease. J Thromb Thrombolysis 2013; 36: 258−62. 78. Gu P, Defina LF, Leonard D, John S, Weiner MF, Brown ES. Relationship between serum homocysteine levels and depressive symptoms: the Cooper Center Longitudinal Study. J Clin Psychiatry 2012; 73: 691−5. 79. Gariballa S. Testing homocysteine-induced neurotransmitter deficiency, and depression of mood hypothesis in clinical practice. Age Ageing 2011; 40: 702−5. 101 80. Munjal C, Givvimani S, Qipshidze N, Tyagi N, Falcone JC, Tyagi SC. Mesenteric vascular remodeling in hyperhomocysteinemia. Mol Cell Biochem. 2011; 348: 99−108. 81. Givvimani S, Munjal C, Narayanan N, Aqil F, Tyagi G, Metreveli N, Tyagi SC. Hyperhomocysteinemia decreases intestinal motility leading to constipation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2012; 303: 281−90. 82. Oussalah A, Guéant JL, Peyrin-Biroulet L. Meta-analysis: hyperhomocysteinaemia in inflammatory bowel diseases. Aliment Pharmacol Ther 2011; 34: 1173−84. 83. Vacek TP, Kalani A, Voor MJ, Tyagi SC, Tyagi N. The role of homocysteine in bone remodeling. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 579−90. 84. Hofmann MA, Kohl K, Zumbach MS, Borcea V, Bierhaus A, Henkels A, Amira J, Fiehn W, Ziegler R, Wahl P, et al. Hyperhomocyst(e)inemia and endothelial dysfunction in IDDM. Diabetes Care 1997; 20: 1880−6. 85. Poirier LA, Brown AT, Fink LM, Wise CK, Randolph CJ, Delongchamp RR, Fonseca VA. Blood S-adenosylmethionine concentrations and lymphocyte methylenetetrahydrofolate reductase activity in diabetes mellitus and diabetic nephropathy. Metabolism 2001; 50: 1014−8. 86. Robillon JF, Canivet B, Candito M, Sadoul JL, Jullien D, Morand P, Chambon P, Freychet P. Type 1 diabetes mellitus and homocyst(e)ine. Diabete Metab 1994; 20: 494−6. 87. Tessari P, Coracina A, Kiwanuka E, Vedovato M, Vettore M, Valerio A, Zaramella M, Garibotto G. Effects of insulin on methionine and homocysteine kinetics in type 2 diabetes with nephropathy. Diabetes 2005; 54: 2968−76. 88. Abais JM, Xia M, Li G, Gehr TW, Boini KM, Li PL. Contribution of endogenously produced reactive oxygen species to the activation of podocyte NLRP3 inflammasomes in hyperhomocysteinemia. Free Radic Biol Med 2014; 67: 211−20. 102 89. de Koning L, Hu FB. Homocysteine lowering in end-stage renal disease: is there any cardiovascular benefit? Circulation 2010; 121: 1379−81. 90. Wu CC, Zheng CM, Lin YF, Lo L, Liao MT, Lu KC. Role of homocysteine in end-stage renal disease. Clin Biochem 2012; 45: 1286−94. 91. Simundic AM, Cornes M, Grankvist K, Lippi G, Nybo M. Standardization of collection requirements for fasting samples. Clin Chim Acta 2013; [Epub ahead of print]Доступно на http://dx.doi.org/10.1016/j.cca.2013.11.008. Приступано 15. маја 2014. 92. Klykov CM, Lentz SR. Trends in clinical laboratory homocysteine testing from 1997 to 2010: the impact of evidence on clinical practice at a single institution. Clin Chem Lab Med 2013; 51: 671−5. 93. Global initiative for Obstructive Lung Disease (GOLD). Global strategy for diagnosis, management and prevention of COPD (Updated 2014). Доступно на http://www.goldcopd.org/uploads/users/files/GOLD_Report_2014_J an23.pdf. Приступано 17. маја 2014. 94. Halbert RJ, Isonaka S, George D, Iqbal A. Interpreting COPD prevalence estimates: what is the true burden of disease? Chest 2003; 123: 1684−92. 95. DecramerM, Janssens W, Miravitlles M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet 2012; 379: 1341−51. 96. Национални водич добре клиничке праксе за дијагностиковање и лечење хроничне опструктивне болести плућа. Доступно на http://www.zdravlje.gov.rs/downloads/2013/Novembar/VodicZaDij agnostikovanjeiLecenjeHronicneOpstruktivneBolestiPluca.pdf. Приступано 17. маја 2014. 97. Fletcher C, Peto R. The natural history of chronic airflow obstruction. Br Med J 1977;1: 1645−8. 98. Kueppers F, Miller RD, Gordon H, Hepper NG, Offord K. Familial prevalence of chronic obstructive pulmonary disease in a matched pair study. Am J Med 1977; 63: 336−42. 103 99. Cohen BH. Chronic obstructive pulmonary disease: a challenge in genetic epidemiology. Am J Epidemiol 1980; 112: 274−88. 100. Sampsonas F, Karkoulias K, Kaparianos A, Spiropoulos K. Genetics of chronic obstructive pulmonary disease, beyond a1-antitrypsin deficiency. Curr Med Chem. 2006; 13: 2857−73. 101. de Serres F, Blanco I. Role of alpha-1 antitrypsin in human health and disease. J Intern Med 2014; [Epub ahead of print]. Доступно на http://dx.doi.org/10.1111/joim.12239. Приступано 7. маја 2014. 102. Brode SK, Ling SC, Chapman KR. Alpha-1 antitrypsin deficiency: a commonly overlooked cause of lung disease. Can Med Assoc J 2012; 184: 1365−71. 103. Beletić A, Dudvarski-Ilić A, Milenković B, Nagorni-Obradović Lj, Ljujić M, Đordjević V, Radojković D, Majkić-Singh N. Alpha-1-antitrypsin deficiency- molecular basis, clinical presentation, therapeutic options and an integrative approach in diagnostics. J Med Biochem 2014; 33: 88−96. 104. Filipović M, Đinđić B, Cekić S. Patogeneza hronične opstruktivne bolesti pluća. Acta Med Median 2006; 45: 73−81. 105. Brusselle GG, Joos GF, Bracke KR. New insights into the immunology of chronic obstructive pulmonary disease. Lancet 2011; 378: 1015−26. 106. MacNee W. Oxidants/antioxidants and COPD. Chest 2000; 117(Suppl 1): 303−17. 107. Chung KF, Adcock IM. Multifaceted mechanisms in COPD: inflammation, immunity, and tissue repair and destruction. Eur Respir J 2008; 31: 1334−56. 108. Barnes PJ, Shapiro SD, Pauwels RA. Chronic obstructive pulmonary disease: molecular and cellular mechanisms. Eur Respir J 2003; 22: 672−88. 109. Ciencewicki J, Trivedi S, Kleeberger SR. Oxidants and the pathogenesis of lung diseases. J Allergy Clin Immunol 2008; 122: 456−68. 104 110. Sethi S, Murphy TF. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2008; 359: 2355−65. 111. Sethi S, Maloney J, Grove L, Wrona C, Berenson CS. Airway inflammation and bronchial bacterial colonization in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2006; 173: 991−8. 112. Hurst JR, Vestbo Jr, Anzueto A, et al. Susceptibilty to exacerbation in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2010; 363: 1128−38. 113. Gooptu B, Lomas DA. Conformational Pathology of the Serpins: Themes, Variations and Therapeutic Strategies. Annu Rev Biochem 2009; 78: 147−76. 114. Janciauskiene SM, Bals R, Koczulla R, Vogelmeier C, Kӧhnlein T, Welte Т. The discovery of a1-antitrypsin and its role in health and disease. Resp Med 2011; 105: 1129−39. 115. Belvisi MG, Bottomley KM. The role of matrix metalloproteinases (MMPs) in the pathophysiology of chronic obstructive pulmonary disease (COPD): a therapeutic role for inhibitors of MMPs? Inflamm Res 2003; 52: 95−100. 116. MacNee W. Oxidative stress and lung inflammation in airways disease. Eur J Pharmacol 2001; 429: 195−207. 117. MacNee W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Proc Am Thorac Soc 2005; 2: 258−66. 118. Rahman I, Adcock IM. Oxidative stress and redox regulation of lung inflammation in COPD. Eur Respir J 2006; 28: 219−42. 119. Castell JV, Donato MT, Gómez-Lechón MJ. Metabolism and bioactivation of toxicants in the lung. The in vitro cellular approach. Exp Toxicol Pathol 2005; 57(Suppl 1): 189−204. 120. Papi A, Bellettato CM, Braccioni F, et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. Am J Respir Crit Care Med 2006; 173: 1114−21. 105 121. Wedzicha JA, Brill SE, Allinson JP, Donaldson GC. Mechanisms and impact of the frequent exacerbator phenotype in chronic obstructive pulmonary disease. BMC Med. 2013; 11: 181. 122. Decramer M, Rennard S, Troosters T, et al. COPD as a lung disease with systemic consequences-clinical impact, mechanisms and potential for early intervention. COPD 2008; 5: 235−56. 123. Fabbri LM, Luppi F, Beghe B, et al. Complex chronic comorbidities of COPD. Eur Respir J 2008; 31: 204−12. 124. Ukena C, Mahfoud F, Kindermann M, Kindermann I, Bals R, Voors AA et al. The cardiopulmonary continuum systemic inflammation as 'common soil' of heart and lung disease. Int J Cardiol 2010; 145: 172−6. 125. Bhatt SP, Dransfield MT. Chronic obstructive pulmonary disease and cardiovascular disease. Transl Res 2013; 162: 237−51. 126. Anthonisen NR, Skeans MA, Wise RA, et al. The eff ects of a smoking cessation intervention on 14.5-year mortality: a randomized clinical trial. Ann Intern Med 2005; 142: 233−9. 127. Andersson A, Ankerst J, Lindgren A, Larsson K, Hultberg B. Hyperhomocysteinemia and changed plasma thiol redox status in chronic obstructive pulmonary disease. Clin Chem Lab Med 2001; 39: 229−33. 128. Kai S, Nomura A, Morishima Y, Ishii Y, Sakamoto T, Hegab AE, Sekizawa K. The effect of smoking-related hyperhomocysteinemia on spirometric declines in chronic obstructive pulmonary disease in elderly Japanese. Arch Gerontol Geriatr 2006; 42: 117−24. 129. Seemungal TA, Lun JC, Davis G, Neblett C, Chinyepi N, Dookhan C et al. Plasma homocysteine is elevated in COPD patients and is related to COPD severity. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2007; 2: 313−21. 106 130. Fimognari FL, Loffredo L, Di Simone S, Sampietro F, Pastorelli R, Monaldo M et al. Hyperhomocysteinaemia and poor vitamin B status in chronic obstructive pulmonary disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2009; 19: 654−9. 131. Hirayama F, Lee AH, Terasawa K, Kagawa Y. Folate intake associated with lung function, breathlessness and the prevalence of chronic obstructive pulmonary disease. Asia Pac J Clin Nutr 2010; 19: 103−9. 132. Andersson I, Grönberg A, Slinde F, Bosaeus I, Larsson S.Vitamin and mineral status in elderly patients with chronic obstructive pulmonary disease. Clin Respir J 2007; 1: 23−9. 133. McNulty H, Scott JM. Intake and status of folate and related B-vitamins: considerations and challenges in achieving optimal status. British Journal of Nutrition 2008; 99: Suppl 3: 48−54. 134. Guéant JL, Alpers DH. Vitamin B12, a fascinating micronutrient, which influences human health in the very early and later stages of life. Biochimie 2013; 95: 967−9. 135. Dudman NPB. An alternative view of homocysteine. Lancet 1999; 354: 2072−4. 136. Mulgrew AT, Taggart CC, Lawless MW, Greene CM, Brantly ML, O'Neill SJ, McElvaney NG. Z alpha1-antitrypsin polymerizes in the lung and acts as a neutrophil chemoattractant. Chest 2004; 125: 1952−7. 137. Mahadeva R, Atkinson C, Li Z, Stewart S, Janciauskiene S, Kelley DG et al. Polymers of Z alpha1-antitrypsin co-localize with neutrophils in emphysematous alveoli and are chemotactic in vivo. Am J Pathol 2005; 166: 377−86. 138. Hill AT, Bayley DL, Campbell EJ, Hill SL, Stockley RA. Airways inflammation in chronic bronchitis: the effects of smoking and alpha1- antitrypsin deficiency. Eur Respir J 2000; 15: 886−90. 107 139. Alam S, Li Z, Atkinson C, Jonigk D, Janciauskiene S, Mahadeva R. Z α1- Antitrypsin Confers a Proinflammatory Phenotype That Contributes to Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Am J Respir Crit Care Med 2014; 189: 909−31. 140. Fulop T Jr, Larbi A, Fortun A, Robert L, Khalil A. Elastin peptides induced oxidation of LDL by phagocytic cells. Pathol Biol 2005; 53: 416−23. 141. Đorđević V, Pruner I, Radojković D. Molecular basis of thrombophilia. J Med Biochem 2014; 33: 22−7. 142. Djordjevic V, Rakicevic LJ, Mikovic D, Kovac M, Miljic P, Radojkovic D Savic A. Prevalence of factor V Leiden, factor V Cambridge, factor II G20210A and methylenetetrahydrofolate reductase C677T mutations in healthy and thrombophilic Serbian populations. Acta Haematol 2004; 112: 227−9. 143. Белетић А. Примена интегративног алгоритма у дијагностици дефицијенције алфа-1-антитрипсина [специјалистички рад]. Београд, Србија: Универзитет у Београду; 2012. 144. http://supa.pharmacy.bg.ac.rs/courses/33/posts. Приступано 15. маја 2014. 145. Castro R, Rivera I, Blom HJ, Jakobs C, Travares de Almeida I. Homocysteine metabolism, hyperhomocysteinaemia and vascular disease: an overview. J Inherit Metab Dis 2006; 29: 3−20. 146. Božič-Mijovski M. Hyperhomocysteinemia and thrombophilia. Clin Chem Lab Med 2010; 48(Suppl 1): 89−95. 147. Den Heijer M, Lewington S, R Clarke. Homocysteine, MTHFR and risk of venous thrombosis: a metaanalysis of published epidemiological studies. J Thromb Haemost 2005; 3: 292−9. 108 148. Antonijevic N, Beletic A, Mirkovic D, Sango V, Novakovic I, Djordjevic V Obradovic S, Perunicic J, Jakovljevic B, Vasiljevic Z. Incidence of hyperhomocisteinemia and methylentetrahydofolate reductase 677 genotypes in patients with pulmonary thromboembolism. Eur Heart J 2007; 8 (Abs Suppl):181. 149. Vučković BA, Čabarkapa VS, Ilić TA, Salatić IR, Lozanov-Crvenković ZS, Mitić GP. Clinical significance of determining plasma homocysteine: case-control study on arterial and venous thrombotic patients. Croat Med J 2013; 54: 480−8. 150. Beletić A, Mirković D, Antonijević N, Đorđević V, Šango V, Jakovljević B, Peruničić J, Ilić M, Vasiljević Z, Majkić-Singh N. Incidence of hyperhomocysteinemia and MTHFR C677T polymorphism among young patients with acute myocardial infarction. J Med Biochem 2009; 28: 41−5. 151. Kölling К, Ndrepepa G, Koch W, Braun S, Mehilli J, Schömig A, Kastrati A. Methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T and A1298C polymorphisms, plasma homocysteine, folate and vitamin B12 levels and the extent of coronary artery disease. Am J Cardiol 2004; 93: 1201−6. 152. WHO. Serum and red blood cell folate concentrations for assessing folate status in populations. Vitamin and Mineral Nutrition Information System. Geneva, World Health Organization, 2012. Available at: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/75584/1/WHO_NMH_NH D_EPG_12.1_eng. pdf. Приступано 10. априла 2014. 153. Conclusions of a WHO Technical Consultation on folate and vitamin B12 deficiencies. Food and Nutrition Bulletin 2008; 29: Suppl 2: 238−44. 154. Stanojkovic I, Kotur-Stevuljevic J, Milenkovic B, Spasic S, Vujic T, Stefanovic A et al. Pulmonary function, oxidative stress and inflammatory markers in severe COPD exacerbation. Respir Med 2011; 105: Suppl 3: 31−7. 109 155. Beletić A, Mirković D, Dudvarski-Ilić A, Milenković B, Nagorni- Obradović Lj, Đorđević V, Ignjatović S, Majkić-Singh N. Questionable reliability of homocysteine as the metabolic marker for folate and vitamin b12 deficiency in patients with chronic obstructive pulmonary disease. J Med Biochem [Epub ahead of print]. Доступно на http://dx.doi.org/10.2478/jomb-2014-0046. Приступано 3. јуна 2014. 156. Fregonesea L, Stolka J, Frants RR, Veldhuisen B. Alpha-1 antitrypsin Null mutations and severity of emphysema. Resp Med 2008; 102: 876−84. 157. Stoller JK, Brantly M. The challenge of detecting alpha-1 antitrypsin deficiency. COPD 2013; 10(Suppl1): 26−34. 158. Topic A, Stankovic M, Divac-Rankov A, Petrovic-Stanojevic N, Mitic- Milikic M, Nagorni-Obradovic L, Radojkovic D. Alpha-1-antitrypsin de!ciency in Serbian adults with lung diseases. Genet Test Mol Biomarkers 2012; 16: 1282−6. 159. Corda L, Bertella E, Pini L, Pezzini A, Medicina D, Boni E, et al. Diagnostic flow chart for targeted detection of alpha1-antitrypsin deficiency. Resp Med 2006; 100: 463−70. 160. Salahuddin P. Genetic Variants of α1-Antitrypsin. Curr Prot Pept Sc 2010; 11: 101−7. 161. Topic A, Jelic Z, Ilic A. A case of severe alpha-1 antitrypsin deficiency associated with the rare Pi MmaltonZ genotype. Balkan J Clin Lab 1995; 2: 95. 162. Prins J, van der Meijden BB, Kraaijenhagen RJ, Wielders JPM. Inherited Chronic Obstructive Pulmonary Disease: new selective-sequencing workup for α1-antitrypsin deficiency identifies 2 previously unidentified Null alleles. Clin Chem 2008; 54: 101−7. 163. Beletic А, Dudvarski-Ilic А, Milenkovic B , Nagorni-Obradovic Lj, Ljujic М, Djordjevic V, Mirkovic D, Radojkovic D, Majkic-Singh N. Is an integrative laboratory algorithm more effective in detecting alpha-1- antitrypsin deficiency in patients with premature chronic obstructive 110 pulmonary disease than AAT concentration based screening approach? Bioch Med 2014; 24: 293−8. 164. Flotte TR, Mueller C. Gene therapy for alpha-1-antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet 2011; 20: 87−92. 165. Dahl M, Vestbo J, Lange P, Bojesen SE, Tybjærg-Hansen A, Nordestgaard BG. C-reactive protein as a predictor of prognosis in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2007; 175: 250−5. 166. Rosenberg SR, Kalhan R. Biomarkers in chronic obstructive pulmonary disease. Translational Research 2012; 159: 228−37. 167. Folsom AR, Desvarieux M, Nieto FJ, Boland LL, Ballantyne CM, Chambless LE. B vitamin status and inflammatory markers. Atherosclerosis 2003; 169: 169−74. 168. Reilly R, McNulty H, Pentieva K, Strain JJ, Ward M. MTHFR 677TT genotype and disease risk: is there a modulating role for B-vitamins? Proc Nutr Soc 2014; 73: 47−56. 169. Cavaillès A, Brinchault-Rabin G, Dixmier A, Goupil F, Gut-Gobert C, Marchand-Adam S et al. Comorbidities of COPD. Eur Respir Rev 2013; 22: 454−75. 170. Tillie-Leblond I, Marquette CH, Perez T, Scherpereel A, Zanetti C, Tonnel AB, Remy-Jardin M. Pulmonary embolism in patients with unexplained exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease: prevalence and risk factors. Ann Intern Med 2006; 144: 390−6. 171. Gunen H, Gulbas G, In E, Yetkin O, Hacievliyagil SS. Venous thromboemboli and exacerbations of COPD. Eur Respir J 2010; 35: 1243−8. 172. Izquierdo JL, Martínez A, Guzmán E, de Lucas P, Rodríguez JM. Lack of association of ischemic heart disease with COPD when taking into account classical cardiovascular risk factors. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2010; 5: 387−94. 111 173. Nunomiya K1, Shibata Y, Abe S, Inoue S, Igarashi A, Yamauchi K et al. Hyperhomocysteinaemia predicts the decline in pulmonary function in healthy male smokers. Eur Respir J 2013; 42: 18−27. 174. Folchini F, Nonato NL, Feofiloff E, D'Almeida V, Nascimento O, Jardim JR. Association of oxidative stress markers and C-reactive protein with multidimensional indexes in COPD. Chron Respir Dis 2011; 8: 101−8. Биографија Анђело Белетић је рођен 10.01.1978. у Београду. Оcновну школу и Гимназију је завршио у Краљеву. На Фармацеутски факултет Универзитета у Београду се уписао школске 1996/97. године и дипломирао 25.01.2002. са просечном оценом 9,31. Од 04.02.2002. до 30.09.2003. био је запослен на Институту (сада Катедра) за медицинску биохемију Фармацеутског факултета у Београду, Од 04.01.2004. ради у Институту (сада Центар) за медицинску биохемију Клиничког центра Србије. Школске 2008/2009. године уписао је специјалистичке студије из Медицинске биохемије на Фармацеутском факултету Универзитета у Београду. Специјалистички испит положио 15.06.2012. са одличним успехом. На докторске академске студије из Медицинске биохемије на Фармацеутском факултету Универзитета у Београду пребачен је са магистарских последипломских студија школске 2006/2007. године. Активно учествује у раду иностраних и домаћих удружења из области клиничке хемије и лабораторијске медицине. У оквиру European Fedreation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (EFLM) ангажован је као Young Scientist Member у Working Group Congresses and Postgraduate Education (WG CPE). Члан је Друштва медицинских биохемичара Србије (ДМБС), у коме обавља функцију председника Комитета за унапређење рада подмлатка ДМБС и учествује у раду више Комитета. Представник је Коморе биохемичара Србије у Програмском савету Центра за развој фармацеутске и биохемијске праксе Фармацеутског факултета Универзитета у Београду. Објавио је 10 научних радова штампаних у целини и више од 40 саопштења са међународних и домаћих скупова штампаних у изводу. Од јуна 2013. године обавља дужност помоћног уредника часописа Biochemia Medica, а такође је и рецензент у часописима Journal of Medical Biochemistry и Molecular Biology Reports. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Aнђело Белетић број индекса 62/06 _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом УТИЦАЈ НАСЛЕДНИХ И СТЕЧЕНИХ ФАКТОРА НА НИВО ХОМОЦИСТЕИНА У КРВИ БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОПСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, 5. јун 2014. _________________________ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора Анђело Белетић Број индекса 62/06 Студијски програм Докторске академске студије из Медицинске биохемије Наслов рада УТИЦАЈ НАСЛЕДНИХ И СТЕЧЕНИХ ФАКТОРА НА НИВО ХОМОЦИСТЕИНА У КРВИ БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОПСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА Ментор Др Душко Мирковић, ванредни професор, Универзитет у Београду- Фармацеутски факултет Потписани/а Анђело Белетић Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, 5. јун 2014. _________________________ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: УТИЦАЈ НАСЛЕДНИХ И СТЕЧЕНИХ ФАКТОРА НА НИВО ХОМОЦИСТЕИНА У КРВИ БОЛЕСНИКА СА ХРОНИЧНОМ ОПСТРУКТИВНОМ БОЛЕШЋУ ПЛУЋА која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, 5.јун 2014. ____________________ 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.