UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Jelena Č. Živković MORFOLOŠKA, HEMIJSKA I FARMAKOLOŠKA KARAKTERIZACIJA ODABRANIH VRSTA RODA VERONICA L. (PLANTAGINACEAE) doktorska disertacija Beograd, 2014. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Jelena Č. Živković MORPHOLOGICAL, CHEMICAL AND PHARMACOLOGICAL CHARACTERISATION OF SELECTED VERONICA L. SPECIES (PLANTAGINACEAE) Doctoral Dissertation Belgrade, 2014. Mentori ___________________________________________ Prof. dr Zoran Maksimoviš, vanredni profesor, mentor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet ___________________________________________ Dr Teodora Jankoviš, viši nauţni saradnik, mentor, Institut za prouţavanje lekovitog bilja "Dr Josif Panţiš", Beograd Članovi komisije ___________________________________________ Prof. dr Slavica Raţiš, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet ___________________________________________ Prof. dr Branislava Lakušiš, vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet ___________________________________________ Dr Tatjana Šeboviš, docent, Univerzitet u Novom Sadu - Medicinski fakultet Datum odbrane_______________________________ Svojim mentorima, vanrednom profesoru dr Zoranu Maksimoviću i višem naučnom saradniku dr Teodori Janković, izražavam veliku zahvalnost na sveobuhvatnom angažovanju i podršci, stručnoj pomoći i korisnim savetima tokom izrade ove disertacije. Vanrednom profesoru dr Branislavi Lakušić, redovnom profesoru dr Slavici Ražić i docentu dr Tatjani Ćebović najiskrenije se zahvaljujem na svestranoj stručnoj pomoći, korisnim sugestijama i podršci u toku izrade ovog rada. Najtoplije se zahvaljujem dr Dragani Rančić na stručnoj pomoći u morfološkoj analizi ispitivanih vrsta, Dejanu Stojkoviću na pomoći u izvođenju eksperimenata za procenu antibakterijske aktivnosti, dr Đurđici Ignjatović i dr Gordani Tovilović na nesebičnom angažovanju u eksperimentalnom radu pri ispitivanju neuroprotektivne aktivnosti, dr Isabel Ferreira na pomoći u hemijskoj karakterizaciji ekstrakata, kao i dr Ivani Beara, dr Mariji Lesjak i Jeleni Ristić na dragocenoj pomoći pri izvođenju eksperimenata za procenu antiinflamatorne aktivnosti. Posebnu zahvalnost dugujem dr Katarini Šavikin i dr Gordani Zdunić na brojnim sugestijama u planiranju, izvođenju eksperimentalnog dela i pisanju teze, a pre svega na iskrenom prijateljstvu. Svim kolegama iz Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“, koji su mi svako na sebi svojstven način pomogli u izradi ovog rada, dugujem veliku zahvalnost. Prijateljima i porodici, beskrajno hvala na ljubavi i podršci. Morfološka, hemijska i farmakološka karakterizacija odabranih vrsta roda Veronica L. (Plantaginaceae) Rezime U okviru doktorske disertacije izvršeno je morfološko, hemijsko i farmakološko ispitivanje tri taksona roda Veronica L.: V. urticifolia Jacq., V. jacquinii Baumg. i V. teucrium L., široko rasprostranjenih na teritoriji Srbije. Odabrane vrste su do sada samo delimiţno hemijski ispitivane, dok nema podataka o njihovom farmakološkom delovanju. Sa ciljem utvrŤivanja mikromorfoloških obeleţja kao i anatomske graŤe, sprovedena je mikroskopska analiza sprašene herbe, i popreţnih preseka lista i stabla odabranih Veronica vrsta. Histohemijska analiza ukazala je na prisustvo lipida, alkaloida, skroba i fenolnih jedinjenja u ispitivanim vrstama, dok je primenom fluorescentne mikroskopije pokazano da su fenolna jedinjenja lokalizovana u kutikularnom sloju, trihomima i lignificiranim šelijskim zidovima ksilema listova i stabla. Analizom sadrţaja teških metala primenom plamene atomske apsopcione spektrometrije (FAAS) i atomske apsorpcione spektrometrije sa grafitnom kivetom (GF-AAS) u biljnim uzorcima nije pokazana znaţajna razlika izmeŤu testiranih Veronica vrsta sa istog lokaliteta, ukazujuši na to da obrazac preuzimanja teških metala nije karakteristika vrste. Na osnovu sadrţaja Cr u herbi vrsta V. jacquinii i V. urticifolia raslih na serpentinskom zemljištu, zakljuţeno je da one predstavljaju potencijalne hiperakumulatore ovog teškog metala. U okviru preliminarne hemijske analize, primenom kolorimetrijskih metoda, u metanolnim, vodenim i 70%-nim acetonskim ekstraktima nadzemnih delova ispitivanih biljaka u cvetu odreŤen je sadrţaj ukupnih polifenola, fenilpropanoida i iridoida. Obzirom da je spektrofotometrijska analiza izdvojila 70%-ne acetonske ekstrakte kao najbogatije pomenutim klasama sekundarnih metabolita, oni su odabrani za dalju hemijsku i farmakološku analizu. Tenikama visokoefikasne teţne hromatografije (HPLC) i visokoefikasne tankoslojne hromatografije (HPTLC), uz primenu standardnih supstanci, odreŤen je sadrţaj aukubina i akteozida u 70%-nim acetonskim ekstraktima ispitivanih taksona. Za razliku od akteozida koj je prisutan u sve tri ispitivane vrste, aukubin je identifikovan samo u ekstraktu nadzemnog dela vrste V. urticifolia. Primešena razlika u sadrţaju jedinjenja odreŤenih primenom HPLC-DAD i HPTLC tehnika nije imala statistiţku znaţajnost. Kvantitativna analiza ispitivanih taksona roda Veronica izvršena je primenom teţnog hromatografa kuplovanog sa detektorom sa diodnim nizom i masenim spektrometrom. U ekstraktima herbi V. urticifolia i V. teucrium glavnu frakciju ţinili su flavoni (derivati apigenina, luteolina i izoskutelareina), dok su pored njih bili zastupljeni i derivati hidroksicimetnih kiselina (kafene, p-kumarinske i protokatehinske). U ekstraktu herbe V. jacquinii dominirali su derivati fenolkarbonskih kiselina, kafene i protokatehinske kiseline, a osim njih bili su prisutni i flavonoli (derivati kvercetina) i flavoni (derivati luteolina i izoskutelareina). Dok je akteozdi najzastupljenije jedinjenje u ekstraktu vrsta V. jacquinii i V. urticifolia, u herbi V. teucrium je to izoskutelarein 7- O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alozil-(1‟‟‟→2‟‟‟)-β-glukopiranozid. Dodatna saznanja o hemijskom sastavu herbi ispitivanih vrsta dobijena su kvantifikacijom odabranih fenolnih jedinjenja (14 fenolnih kiselina, 25 flavonoida, 3 kumarina i 2 lignana) i hina kiseline u 70%-nim acetonskim ekstraktima primenom visoko selektivne i specifiţne teţne hromatografije sa trostrukim kvadrupolom masenim spektrometrom sa elektrosprej jonizacijom. Fenolne komponente prisutne u znaţajnijoj koliţini su hlorogenska kiselina, bajkalin, izokvercitrin i hiperozid, kao i derivat cikloheksana hina kiselina. Iako u tragovima, genistein je po prvi put identifikovan u familiji Plantaginaceae, dok je u rodu Veronica po prvi put utvrŤeno prisustvo kumarina. U okviru farmakološke karakterizacije ispitivana je antioksidantna, neuroprotektivna, antiinflamatorna, antitumorska i antibakterijska aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata testiranih Veronica vrsta. In vitro antioksidantna aktivnost acetonsko-vodenih ekstrakata herbi odabranih Veronica vrsta odreŤena je primenom FRAP i DPPH testa. Ispitivani ekstrakti pokazali su znaţajnu dozno-zavisnu inhibiciju DPPH radikala, kao i ukupnu antioksidantnu aktivnost. Najveša redukciona sposobnost i antiradikalski efekat pokazani su za ekstrakt herbe V. teucrium, dok je najniţa aktivnost zabeleţena za ekstrakt herbe V. urticifolia. Antioksidantna aktivnost in vivo ispitivana je na modelu hepatotoksiţnosti indukovane primenom CCl4 kod pacova. Prašenjem nivoa enzimskih i neenzimskih antioksidanasa pokazano je da ispitivani ekstrakti imaju zaštitnu ulogu. Prema rezultatima sadrţaja GSH i TBARS nivoa zakljuţeno je da u oksidativnom stresu vrste V. jacquinii i V. teucrium pokazuju sliţni antioksidantni efekat koji je nešto izraţeniji od efekta vrste V. urticifolia, što je u saglasnosti sa rezultatima in vitro testova. Neuroprotektivni efekat acetonsko-vodenih ekstrakata odabranih Veronica vrsta ispitivan je u kulturi humane neuroblastomske šelijske linije SH-SY5Y gde je testom kisele fosfataze prašen uticaj ekstrakata na preţivljavanje ovih šelija nakon kombinovanog tretmana stresora (SNP ili H2O2) i odgovarajušeg ekstrakta. Ispitivani ekstrakti su ispoljili blagu protektivnu aktivnost što se manifestovalo povešanjem preţivljavanja šelija izloţenih SNP (9,7-12,0%) ili H2O2 (17,0-18,3%). Najjaţu zaštitu kod primene SNP je pokazao ekstrakt vrste V. jacquinii, dok je najefikasniji u preţivljavanju šelija tretiranih sa H2O2 bio ekstrakt vrste V. teucrium. Prašenjem produkcije superoksid jona (O2 -* ), kao i intenziteta lipidne peroksidacije zakljuţeno je da je za ispoljeno neuroprotektivno delovanje ekstrakata kod primene SNP kao stresora odgovoran mehanizam ‟‟hvatanja‟‟ slobodnih radikala, dok kod primene H2O2 to nije bio sluţaj. Antiinflamatorni efekat acetonsko-vodenih ekstrakata odreŤen je primenom ex vivo metode zasnovane na prašenju produkcije metabolita 12-HHT, TXB2 i PGE2 kao proizvoda ciklooksigenaznog puta i 12-HETE kao proizvoda lipooksigenaznog puta metabolizma arahidonske kiseline. Ekstrakt herbe V. urticifolia je pokazao znaţajno veši potencijal inhibicije COX-1 enzima, dok je najsnaţniju inhibiciju 12-LOX aktivnosti postigao ekstrakt vrste V. jacquinii. Obzirom da su svi ispitivani ekstrakti pokazali i snaţno antioksidantno delovanje, moţe se pretpostaviti da takva njihova aktivnost delom doprinosi ispoljenom antiinflamatornom efektu. Antitumorska svojstva ispitivanih ekstraktata procenjivana su kod miševa sa Erlihovim ascitnim tumorom prašenjem zapremine ascitesa, broja tumorskih šelija i njihove vijabilnosti. Svi primenjeni ekstrakti su statistiţki znaţajno smanjili zapreminu ascitesa, dok je statistiţki znaţajno smanjenje šelijske vijabilnosti primešeno samo nakon aplikacije V. urticifolia ekstrakta. TakoŤe, u grupama ţivotinja koje su primale ekstrakte došlo je do blage redukcije broja tumorskih šelija u poreŤenju sa kontrolnom grupom (bez statistiţkog znaţaja), ukazujuši na njihov onkostatski efekat. Antibakterijska aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata odabranih taksona roda Veronica testirana je bujon mikrodilucionim testom prema sojevima ţetiri Gram (+) i tri Gram (-) bakterije. Ispitivani ekstrakati su ispoljili umerenu do slabu aktivnost. Najizraţeniji efekat prema vešini testiranih mikroorganizama ispoljio je ekstrakt herbe V. teucrium. Rezultati dobijeni u okviru ove doktorske disertacije otvaraju put daljim istraţivanjima u cilju primene ispitivanih vrsta u fitoterapiji kao prirodnih lekovitih sirovina. Ključne reči: Veronica jacquinii, V. teucrium, V. urticifolia, morfološka karakterizacija, hemijska karakterizacija, farmakološka karakterizacija Naučna oblast: Farmacija Uža naučna oblast: Farmakognozija UDK 615.3:582.933 (043.3) 581.4:581.192 (043.3) Morphological, chemical and pharmacological characterization of selected Veronica L. species (Plantaginaceae) Abstract Morphological, chemical and pharmacological characterization of three taxa from genus Veronica L: V. urticifolia Jacq., V. jacquinii Baumg. i V. teucrium L., was performed. The selected species were only scarcely chemically investigated so far, while there is no information regarding their pharmacological effects. To determine micromorphological and anatomical characteristics, microscopic analysis of pulverized aerial parts was conducted together with cross-sections of leaf and stem of selected Veronica species. Histochemical analysis revealed the presence of lipids, alkaloids, starch and phenolic compounds in selected species, while the application of fluorescence microscopy demonstrated that phenolic compounds are located in cuticle, tirchomes and lignified cell walls in xylem of leaves and stems of investigated species. Analysis of heavy metal contents by flame and electrothermal absortion spectroscopy techniques after microwave-assisted acid digestion of samples showed no significant differences in heavy metal concentrations between the tested plant species from the same location, indicating that their heavy metal uptake pattern was not species specific. The results of Cr content in aerial parts of V. jacquinii and V. urticifolia grown on serpentine soil confirmed that these species are promising Cr hyperaccumulator plants. In the preliminary chemical analysis of methanolic, 70% aqueous acetone and water extracts of flowering aerial parts of investigated plant species, total contents of phenolics, phenylethanoids and iridoids have been determined using colorimetric methods. Since the spectrophotometric analysis revealed that aqueous acetone extracts are the richest with abovementioned classes of secondary metabolites, they were selected for further chemical and pharmacological investigation. The content of aucubin and acteoside in aqueous acetone extracts of investigated taxa was determined using high performance liquid chromatography (HPLC) and high performance thin layer chromatography (HPTLC). Contrary to acteoside which was detected in all of the investigated extracts, aucubin was identified only in V. urticifolia extract. No significant differences between the conducted methods were observed. Phenolic compounds in tested Veronica species were tentatively identified by HPLC-DAD-ESI/MS. In V. urticifolia and V. teucrium extracts flavones (apigenin, luteolin and isoscutellarein derivatives) provided a dominant fraction and derivatives of hydroxycinnamic acids were also observed (caffeic, p-coumaric and prorocatechuic acid). Derivatives of caffeic and protocatechuic acids prevailed in extract of V. jacquinii aerial parts, while flavonols (quercetin derivatives) and flavones (luteolin and isoscutellarein derivatives) were also present. While acteoside was the most abundant compound in V. jacquinii and V. urticifolia extracts, in V. teucrium extract it was isoscutellarein 7-O-(6‟‟‟-O-acetyl)-β-allosyl-(1‟‟‟→2‟‟‟)-β-glucopiranoside. Further information on qualitative composition of selected species was obtained using liquid chromatograph coupled with tripl quad tandem mass spectrometer with electrospray ion source. The content of quinic acid and 44 selected phenolic compounds (14 phenolic acids, 25 flavonoids, 3 coumarins and 2 lignans) was investigated in aqueous acetone extracts. Compounds present in significant quantities were baicalin, hyperoside, isoquercetine, chlorogenic acid and quinic acid. Although in traces, the presence of isoflavonoid genistein was recorded for the first time in Plantaginaceae family, while this is the first report of the presence of coumarins in genus Veronica. As the part of pharmacological investigation aqueous acetone extracts of tested Veronica species were evaluated for their antioxidant, neuroprotective, anti- inflammatory, antitumour and antibacterial activity. Antioxidant potential of 70% aqueous acetone extracts of selected Veronica species were estimated using two different in vitro assays: FRAP assay (total antioxidant activity) and DPPH assay (antiradical activity). All of the extracts exhibited strong free radical scavenging activity, as well as total antioxidant activity. The highest reducing power as well as free-radical scavenging capacity were shown for V. teucrium extract. The results obtained from in vitro analysis were confirmed with in vivo tests using CCl4-induced hepatotoxicity model in rats. Based on the results from multiple assay systems (TBA-RS, GSH, GR, GSHPx, XOD, CAT and Px) after treatment with tested extracts in combination with CCl4 we demonstrated their protective role in oxidative stress. According to the results obtained for the values of TBA-RS and GSH content it can be concluded that antioxidant effects of V. jacquinii and V. teucrium species were similar to each other and higher than that of V. urticifolia, which is in accordance with the results from in vitro tests. Neuroprotective effect of 70% aqueous acetone extracts was evaluated on human neuroblastoma SH-SY5Y cell line. The influence of extracts on survival of stressed cells was assessed by acid phosphatase assay. All extracts exhibited modest protective activity by increasing cell survival in cells stressed with SNP (9-12%) and H2O2 (16-21%), compared to non-treated cells. The strongest protection against SNP- induced cellular damage was achieved with V. jacquinii extract, while the highest survival rate after exposure of cells to H2O2 was noticed after treatment with V. teucrium extract. Neuroprotection on cells stressed with SNP was accompanied by the reduction in amount of superoxide radicals and index of lipid peroxidation, while in the case of H2O2 application this was not the case. The anti-inflammatory potential of 70% acetone aqueous extracts was determined using ex vivo method based on monitoring of the production of 12-HHT, TXB2 i PGE2 and 12-HETE as main arachidonic acid metabolites formed by enzymes COX-1 and 12-LOX. V. urticifolia extract exerted the strongest COX-1 inhibition, while V. jacquinii extract exhibited the highest ability to inhibit 12-LOX activity. Since all of the tested extracts exhibited also strong antioxidant activity, it can be assumed that showed antioxidant properties contributed to observed anti-inflammatory activity. Antitumour activity of investigated extracts was assessed in Ehrlich ascites carcinoma (EAC) model by parameters such as ascites volume, tumour cell count and cell viability. All of the investigated extracts statistically significantly decreased the ascites volume, while statistically significant decrease of cell viability was observed only after administration of V. urticifolia extract. Also, application of tested extracts led to slight but insignificant reduction of number of tumour cells as compared to control group, demonstrating oncostatic activity. Antibacterial activity of 70% aqueous acetone extracts of selected Veronica species was investigated using microbroth dilution assay against four G (+) and three G (-) bacterial strains. Investigated extracts expressed low to moderate activity. V. teucrium extract showed the most pronounced inhibitory effect against most of the tested microorganisms. The results obtained within the framework of this doctoral dissertation suggest the areas for further research aiming to implement investigated species as phytotherapy medicines. Keywords: Veronica jacquinii, V. teucrium, V. urticifolia, morphological characterisation, chemical charactersation, pharmacological characterisation. Academic expertise: Pharmacy Major in: Pharmacognosy UDK 615.3:582.933 (043.3) 581.4:581.192 (043.3) Sadržaj UVOD 1 1. Položaj roda Veronica L. u sistemu klasifikacije, rasprostranjenje i opis 2 1.1. Zastupljenost vrsta roda Veronica u Flori Evroe i Flori Srbije 4 1.2. Odabrane vrste roda Veronica 6 1.2.1. Veronica urticifolia Jacq. 6 1.2.2. Veronica jacquinii Baumg. 8 1.2.3. Veronica teucrium L. 10 2. Tradicionalna upotreba vrsta roda Veronica 12 3. Sekundarni metaboliti vrsta roda Veronica 16 3.1. Flavonoidi 16 3.1.1. Flavonoidni aglikoni 17 3.1.2. Flavonoidni glikozidi 23 3.2. Iridoidi 32 3.3. Feniletanoidni glikozidi 42 3.4. Ostale grupe jedinjenja roda Veronica 50 4. Dosadašnja proučavanja sadržaja teških metala u vrstama roda Veronica L. 50 5. Dosadašnja farmakološka proučavanja vrsta roda Veronica 52 6. Slobodni radikali i oksidativni stres 53 6.1. Oksidativni stres i neurodegenerativne bolesti 54 6.2. Oksidativni stres i iinflamacija 55 6.3. Oksidativni stres i kancerogeneza 56 CILJ 57 MATERIJAL I METODE 59 1. Biljni materijal 60 2. Instrumenti i operativni uslovi 64 3. Priprema ekstrakata 65 4. Morfološko-anatomska karakterizacija 67 4.2. Mikroskopska analiza 67 4.3. Histohemijska analiza 67 4.4. Fluorescentna mikroskopija 67 5. Hemijska analiza 68 5.1. OdreŤivanje sadrţaja teških metala u biljnim i uzorcima zemljišta 68 5.1.1. OdreŤivanje kiselosti zemljišta 68 5.1.2. Mikrotalasna digestija 68 5.1.3. Atomska apsorpciona spektrometrija 68 5.2. VIS spektrofotometrijske metode 69 5.2.1. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih fenola 69 5.2.2. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih fenilpropanoida 69 5.2.3. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih iridoida 70 5.3. Kvantitativna HPTLC analiza aukubina i akteozida 70 5.4. Kvantitativna HPLC analiza aukubina i akteozida 71 5.5. HPLC-DAD/ESI-MS analiza 71 5.6. Kvantitativna LC-MS/MS analiza odabranih fenolnih jedinjenja 72 6. Farmakološka analiza 76 6.1. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti 76 6.1.1. In vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti 76 6.1.1.1. Ispitivanje ukupne antioksidantne aktivnosti (FRAP test) 77 6.1.1.2. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala 78 6.1.2. In vivo ispitivanje antioksidantne aktivnosti 79 6.1.2.1. Eksperimentalne ţivotinje 79 6.1.2.2. Postupak in vivo ispitivanja 79 6.1.2.3. Biohemijska ispitivanja 80 6.1.2.4. Statistiţka analiza 83 6.2. Ispitivanje neuroprotektivne aktivnosti 83 6.2.1. Šelijska linija 83 6.2.2. OdreŤivanje vijabilnosti šelija testom kisele fosfataze 84 6.2.3. OdreŤivanje indeksa lipidne peroksidacije 84 6.2.4. Merenje produkcije superoksidnih jona 84 6.2.5. Statistiţka analiza 84 6.3. Ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti 85 6.3.1. Priprema uzoraka 85 6.3.2. LC-MS/MS analiza 86 6.3.3. Statistiţka analiza 87 6.4. In vivo ispitivanje citotoksiţne aktivnosti 87 6.4.1. Statistiţka analiza 88 6.5. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti 88 6.5.1. Kultivacija mikroorganizama 89 6.5.2. Bujon mikrodilucioni test 89 6.5.3. Statistiţka analiza 90 REZULTATI I DISKUSIJA 91 1. Morfološka analiza 92 1.1. Mikroskopska analiza sprašenog biljnog materijala 92 1.2. Anatomsko-morfološka analiza popreţnih preseka 94 1.2.1. Veronica urticifolia 94 1.2.2. Veronica jacquinii 97 1.2.3. Veronica teucrium 97 1.3. Histohemijska analiza 102 1.4. Flurescentna mikroskopija 106 2. Hemijska analiza 110 2.1. Analiza sadrţaja teških metala u biljnim i uzorcima zemljišta 110 2.1.1. Analiza teških metala u biljnim uzorcima 110 2.1.2. Analiza teških metala u zemljištu 113 2.1.3. Korelaciona analiza 115 2.2. Analiza sadrţaja aktivnih komponenti odabranih Veronica vrsta 119 2.2.1. Kolorimetrijske tehnike 119 2.2.1.1. Sadrţaj ukupnih polifenola 119 2.2.1.2. Sadrţaj ukupnih fenilpropanoida 120 2.2.1.3. Sadrţaj ukupnih iridoida 121 2.2.2. OdreŤivanje sadrţaja sekundarnih metabolite primenom hromatografskih metoda 122 2.2.2.1. OdreŤivanje sadrţaja aukubina i akteozida primenom HPLC i HPTLC metoda 122 2.2.2.2. Analiza fenolnih jedinjenja primenom LC- DAD/ESI-MS metode 133 2.2.2.3. Kvantitativna LC-MS/MS analiza odabranih fenolnih jedinjenja 146 3. Farmakološka analiza 155 3.1. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti 155 3.1.1. In vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti 155 3.1.2. In vivo ispitivanje antioksidantne aktivnosti 158 3.2. Ispitivanje neuroprotektivne aktivnosti 167 3.3. Ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti 174 3.4. In vivo ispitivanje citotoksiţne aktivnosti 184 3.5. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti 187 8. ZAKLJUŢCI 190 9. LITERATURA 192 UVOD 2 1. Položaj roda Veronica L. u sistemu klasifikacije, rasprostranjenje i opis Red Lamiales u okviru cvetnica obuhvata nekoliko velikih i dobro poznatih familija. Dugo se smatralo da je kosmopolitska familija Scrophulariaceae najveša meŤu njima, meŤutim odsustvo zajedniţkih karakteristika za taksone koji joj pripadaju ukazalo je na mogušnost njenog polifiletskog porekla (Olmstead, 2001). Ubrzo nakon pojave ove hipoteze, rod Veronica, familije Scrophulariaceae, postao je predmet vešeg broja taksonomskih studija u cilju njegovog odgovarajušeg pozicioniranja. Na osnovu molekularnih istraţivanja, familija Scrophulariaceae je podeljena i jedan broj rodova prebaţen je u familiju Plantaginaceae (Albach i sar., 2005a). Predloţena je i nova klasifikacija roda Veronica prema kojoj je podeljen na 13 podrodova i koja se znaţajno razlikuje od prethodne zasnovane iskljuţivo na morfološkim karakterima (Albach i sar., 2004). I rezultati hemotaksonomskih istraţivanja su potvrdili odnose uspostavljene novom klasifikacijom. Primenjivani su razliţiti hemotaksonomski karakteri iz grupe flavonoidnih glikozida i iridoidnih glukozida (Grayer-Barkmeijer, 1973; Grayer-Barkmeijer, 1978; Taskova i sar., 2002; Taskova i sar., 2004). Dakle, prema poslednjoj klasifikaciji skrivenosemenica (Angiosperm Phylogeny Group, 2003) rod Veronica sa oko 450 vrsta predstavlja najveši rod familije Plantaginaceae. Vrste roda Veronica su rasprostranjene širom sveta sa centrima diverziteta u zapadnoj Aziji, na Novom Zelandu (Albach i Meudt, 2010), centralnoj i juţnoj Evropi i Turskoj (Albach i sar., 2003). Rod Veronica ţine biljne vrste razliţitih ţivotnih formi (od jednogodišnjih zeljastih do niskog drveša) i staništa (od polupustinjskih do vodenih; tropskih do polarnih i od nadmoskih visina bliskih nivou mora do alpskih) (Albach i Meudt, 2010). Nekoliko vrsta roda, kao kosmopolitski korovi, poseduje i ekonomski znaţaj (Albach i Chase, 2001). Na osnovu molekularnih istraţivanja rod Veronica podeljen je na 13 podrodova (Albach i sar., 2004): - Veronica subg. Veronica; - Veronica subg. Beccabunga; - Veronica subg. Pseudolysimachium; 3 - Veronica subg. Synthyris; - Veronica subg. Cochlidiosperma; - Veronica subg. Pellidosperma; - Veronica subg. Stenocarpon; - Veronica subg. Pocilla; - Veronica subg. Pentasepalae; - Veronica subg. Chamaedrys; - Veronica subg. Derwentia; - Veronica subg. Hebe; - Veronica subg. Triangulicapsula. Predstavnici roda Veronica su jednogodišnje ili višegodišnje zeljaste biljke, reŤe poluţbunovi. Stabljika je uspravna, puzi po zemlji ili se izdiţe. Listovi su naspramni, retko u pršljenovima. Cvetovi su zigomorfni, pojedinaţni, nalaze se u pazuhu listova ili su sloţeni u vršne ili boţne grozdaste ili klasaste cvasti. Ţašica je najţešše duboko deljena na 4-5 reţnjeva, dok je krunica sa sraslim kruniţnim listišima. Kruniţna cev je valjkasta, kratka ili skoro neprimetna; otvor krunice je tanjirast ili zvonast, duboko deljen na 4-5 reţnjeva, reţnjevi se po veliţini malo razlikuju. Dva su prašnika, prašniţki konci su uţvrššeni za kruniţnu cev, kraši ili duţi od krunice, prašnica je sa dve paralelne, razdvojene ili na vrhu spojene poluprašnice. Stubiš je razliţite duţine, ţig je glaviţast. Plod je ţaura sa dva okca, uglavnom boţno spljoštena, reŤe je naduvena, na vrhu je ţesto više ili manje duboko useţena, sa stubišem u urezu, gola ili pokrivena dlakama, glatka ili sa istaknutim, mreţasto povezanim nervima. Seme moţe biti razliţitih oblika i veliţine (Dikliš, 1974). Osnovne razlike vrsta roda Veronica podrazumevaju ţivotnu formu (višegodišnje ili jednogodišnje; zeljaste ili poluţbunaste), poloţaj cvasti (lateralno ili terminalno postavljene), laminu lista (velika ili mala; linearna, nedeljena ili deljena), veliţinu krunice, oblik semena (ravno ili izdubljeno) i indumentum (struktura dlaka, glandularne ili neglandularne). 4 1.1. Zastupljenost vrsta roda Veronica u Flori Evrope i Flori Srbije Prema Waltersu i Webbu (1972), u Flori Evropi zabeleţene su 62 vrste roda Veronica u okviru 5 sekcija (Tabela 1). Tabela 1. Rod Veronica u Flori Evrope (Walters i Webb, 1972) Sekcija Veronica Sekcija Pocilla Sekcija Veronicastrum V. allionii Vill. V. acinifolia L. V. alpina L. V. aphylla L. V. agrestis L. V. bellidioides L. V. aragonensis Stroh. V. arvensis L. V. erinoides Boiss. & Sprunen V. austriaca L. V. aznavourii Dőrfler V. fruticans Jacq. V. baumgartenii Roem. & Schult. V. chamaepithyoides Lam. V. fruticulosa L. V. chamaedrys L. V. cymbalaria Bodard V. gentianoides Vahl. V. dabneyi Hochst. V. dillenii Crantz V. fruticulosa L. V. melissifolia Poiret V. filiformis Sm. V. nummalaria Gouan. V. micrantha Hoffmanns. & Link V. glauca Sibth. & Sm. V. ponae Gouan. V. montana L. V. grisebachii Walters V. saturejoides Vis. V. multifida L. V. hederifolia L. V. officinalis L. V. opaca Fries Sekcija Beccabunga V. orientalis Miller V. peregrina L. V. anagallis-aquatica L. V. pectinata L. V. persica Poiret V. anagalloides Guss. V. peduncularis Bieb. V. polita Fries V. beccabunga L. V. prostrata L. V. praecox All. V. catenata Pennell V. rhodopaea (Velen.) Degen V. triphyllos L. V. scardiaca Griseb. V. rosea Desf. V. verna L. V. scutellata L. V. tenuifolia Asso Sekcija Pseudolysimachium V. thessalica Bentham V. bachofenii Heuffel V. thymifolia Sibth & Sm. V. longifolia L. V. turrilliana Stoj. & Stefanov V. paniculata L. V. urticifolia Jacq. V. spicata L. 5 U spontanoj flori Srbije zabeleţene su 43 Veronica vrste u okviru 5 sekcija (Dikliš, 1974) (Tabela 2). Tabela 2. Rod Veronica u Flori Srbije (Dikliš, 1974) Sekcija Diplophyllum Sekcija Pseudolysimachion V. agrestis L. V. andrasovszkyi Jav. V. hederifolia L. V. crassifolia Wierzb. V. opaca Fr. V. incana L. V. persica Poir. V. longifolia L. V. polita Fr. V. orchidea Crantz V. spicata L. Sekcija Beccabunga V. spuria L. V. anagallis-aquatica L. V. anagalloides Guss. Sekcija Veronicastrum V. aquatica Bernh. V. acinifolia L. V. beccabunga L. V. alpina L. V. scardica Gris. V. arvensis L V. balcanica Vel. Sekcija Veronica V. bellidioides L. V. aphylla L. V. dillenii Crantz V. austriaca L. V. fruticans Jacq. V. baumgartenii Roem & Scult. V. peregrina L. V. chamaedrys L. V. praecox All. V. crinita Kit. V. satureoides Visiani V. jacquinii Baumg. V. serpyllifolia L. V. montana L. V. triphyllos L. V. officinalis L. V. verna L. V. orsiniana Ten. V. prostrata L. V. scutallata L. V. teucrium L. V. urticifolia Jacq. 6 1.2. Odabrane vrste roda Veronica U okviru ove doktorske disertacije, ispitane su tri vrste roda Veronica, široko rasprostranjene na teritoriji Srbije: V. urticifolia Jacq., V. jacquinii Baumg., V. teucrium L. 1.2.1. Veronica urticiolia Jacq. (syn. V. latifolia L.) Vrsta V. urticifolia (veliţje) (Slika 1) je višegodišnja biljka sa razgranatim, puzešim rizomom. Stabljika je visine 10-50 (70) cm, uspravna ili se izdiţe, nerazgranata, sa svih strana ravnomerno pokrivena kratkim dlakama ili gola, reŤe je u gornjem delu pokrivena ţlezdanim dlakama. Listovi su naspramni, široko jajasti, duţ oboda grubo oštro nazubljeni, na licu i na naliţju proreŤeno pokriveni dlakama. Donji listovi su mali, okruglasti i na vrhu šiljati sa kratkom lisnom drškom, pri osnovi zaokrugljeni, dok su srednji i gornji listovi znatno veši, duţine 4-8 cm, širine 2-5 cm, pri osnovi skoro asimetriţni i plitko srcasto urezani, sedeši, na vrhu šiljati. Cvetovi su sloţeni u 2-5 naspramnih, rastresitih grozdastih cvasti; drške cvasti su kose i polaze iz pazuha gornjih listova stabla. Priperci su lancetasti do linearni, 1,5-3 puta kraši od cvetnih drški. Cvetne drške su srazmerno dugaţke, 2-3 puta duţe od ţašice, kao i osovina cvasti pokrivene su ţlezdanim dlakama, u vreme plodonošenja naniţe savijene. Ţašica je deljenja u 4 nejednaka, lancetasta reţnja, pokrivena duţ oboda ţlezdanim dlakama. Krunica je tanjirasta, široka 4-7 mm, bledo ruţiţasta, vrlo retko bela, deljena na nejednake reţnjeve pokrivene duţ oboda trepljama. Ţaura je skoro okrugla, boţno spljoštena, na vrhu plitko useţena, dugaţka oko 3 mm, pokrivena proreŤeno ţlezdanim dlakama. Seme je ţuškasto, štitastog oblika, dugaţko oko 1 mm. Cveta od juna do avgusta. Raste u šumama i šikarama, na stenama, u planinskom i subalpijskom pojasu. Pripada alpsko-balkanskm vrstama. U Srbiji je široko rasprostranjena, i zabeleţena je u mnogim vlaţnim liššarskim i ţetinarskim šumama (Dikliš, 1974). 7 Slika 1. Veronica urticifolia 8 1.2.2. Veronica jacquinii Baumg. (syn. V. multifida Kern, Scop., Vel., Petroviš; V. pinnatifida Andrae; V. austriaca L. subsp. Jacquini (Baumg.) Maly) Vrsta V. jacquinii (Slika 2) je višegodišnja zeljasta biljka sa kosim, valjkastim rizomom. Stabljike mogu biti mnogobrojne, ili samo jedna, uspravna, visine (10) 30-70 cm, reŤe izdignuta. Stabljika je pokrivena sivim dlakama, katkad manje ili više gola. Listovi su okruglasti ili široko lancetasti, perasto iseţeni, perasto ili dvojno perasto deljeni, reţnjevi su uzani, linearni ili linearno lancetasti, duţ oboda nenazubljeni ili nazubljeni, više ili manje uvijeni, pokriveni dlakama ili reŤe goli. Listovi sterilnog dela izdanka na vrhu stabljike su manje deljeni ili skoro celi. Cvetovi su sloţeni u 2-4 boţne, naspramne, u kasnijem stadijumu razvoja izduţene grozdaste cvasti, ţije drške polaze iz pazuha gornjih listova stabla. Ţašica je deljena u 4, reŤe 5 linearno lancetastih, nejednakih reţnjeva. Krunica je tanjirasta, širine 7-10 mm, intenzivno plave boje, reţnjevi krunice su nejednaki, jajasti. Ţaura je spljoštena, okruglasto, obrnuto srcasta, na vrhu useţena, široka 4-5 mm, dugaţka kao i ţašica ili malo duţa, pri osnovi je zaokrugljena, pokrivena dlakama ili gola, stubiš je skoro 2 puta duţi od ţaure. Seme je spljošteno, skoro okruglo. Cveta od juna do jula. Raste na osunţenim, sušnim mestima, na kamenjarima, pašnjacima, u šibljacima. Najţešše uţestvuje u izgradnji kserofilnih biljnih zajednica, na kreţnjaku i serpentinu. Pripada pontsko-balkansko-kavkavskim vrstama. U Srbiji je rasprostranjena vrsta (Dikliš, 1974). 9 Slika 2. Veronica jacquinii 10 1.2.3. Veronica teucrium L. (syn. V. latifolia Panţiš; V. pseudochamedrys Jacq.; V. teucrium L. subsp. pseudochamaedrys (Jacq.) Nym.) Vrsta V. teucrium (Slika 3) je višegodišnja zeljasta biljka sa valjkastim, ţvornovatim, puzešim i razgranatim rizomom. Stabljika (manji broj, reŤe samo jedna) visine 30-70 (100) cm, je uspravna, ili se izdiţe, pokrivena manje više proreŤenim dlakama, sterilni izdanci su uspravni. Listovi su sedeši, okruglasto jajasti, jajasti do lancetasti, duţine 3-5,5 cm, širine 1,5-2,5 cm, pri osnovi su zaobljeni ili odseţeni do plitko srcasto urezani, tako da skoro obuhvataju stabljiku, na vrhu su šiljati, duţ oboda grubo tupo testerasto nazubljeni. Na licu su pokriveni proreŤenim priljubljenim dlakama ili skoro goli, dok su na naliţju, naroţito duţ nerava, pokriveni kovrdţavim dlakama. Listovi sterilnog dela izdanka su na vrhu stabljike uţi i testerasto nazubljeni. Cvetovi su sloţeni u boţne, naspramne, u poţetku zbijene, a kasnije jako izduţene cvasti, duţine 6- 15 cm; drške cvasti polaze iz pazuha gornjih listova stabla. Ţašica je gola ili pokrivena proreŤenim dlakama, deljena je u 5 nejednakih, linearno lancetastih reţnjeva, duţine 3-4 mm. Krunica je tanjirasta, širine 10-13 mm, azurno plave boje, reţnjevi krunice su nejednaki, donji je najmanji i najtanji. Ţaura je obrnuto srcasta ili okruglasta, na vrhu je plitko urezana, pri osnovi je više manje zaokrugljena, gola ili pokrivena dlakama. Seme je štitastog oblika. Cveta od maja do jula. Raste na padinama pokrivenim ţbunjem, u šikarama, kserotermnim šumama, na livadama, od nizija do subalpijskog pojasa. Pripada evroazijskim vrstama, rasprostranjena je u srednjoj i juţnoj Evropi, na Kavkazu, Sibiru, Armeniji. U Srbiji je zabeleţena u vešem broju šumskih i livadskih zajednica (Dikliš, 1974). 11 Slika 3. Veronica teucrium L. (http://www.actaplantarum.org/acta/galleria1.php?id=3403) 12 2. Tradicionalna upotreba vrsta roda Veronica MeŤu vrstama roda Veronica najpoznatija i najţešše koriššena u tradicionalnoj medicini je kosmopolitska vrsta V. officinalis (ţestoslavica, razgon, trava od ušljeme, propinjaţa, ljudska vernost, zmijina ţestoslavica, verolima)1. Još u XVI i XVII veku ova vrsta primenjivana je kod renalne litijaze, kolika, poremešaja gastrointestinalnog i respiratornog trakta (Gründemann i sar., 2013). Ţajkanoviš (1985) u „Reţniku srpskih narodnih verovanja o biljkama“ pominje razgon kao „lek od glavobolje (privija se pelenom), kao i za ranu kada se podljuti“. Danas se infuz pripremljen od osušenog nadzemnog dela ţestoslavice u Bugarskoj upotrebljava kao apetizer, antitusik, antiinflamatorni ekspektorans u terapiji astme i faringitisa, a u Italiji kao diuretik i za umirenje koţnih iritacija (Leporatti i Ivancheva, 2003). U tradicionalnoj medicini Španije ova biljka koristi se u leţenju ekcema (Pardo De Santayana i sar., 2005), kao laksans (Rigat i sar., 2007) i ekspektorans (Rigat i sar., 2013), a u Rumuniji kod renalnih i respiratornih poremešaja, kao i spolja u leţenju rana (Gründemann i sar., 2013) U oblasti crnogorskih Prokletija herba ţestoslavice primenjuje se interno kod bronhitisa i reumatskih bolova, a spolja kod rana i razliţtih koţnih oboljenja (Menkoviš i sar., 2011). U Srbiji je zabeleţena njena primena kao ekspektoransa u kombinaciji sa drugim biljnim vrstama, kao blagog diuretika i kod bolova u stomaku (Jariš i sar., 2007). U Austriji se V. officinalis koristi interno u obliku ţaja kod oboljenja nervnog, respiratornog i kardiovaskularnog sistema, kao i kod poremešaja metabolizma (Vogl i sar., 2013). U Tabeli 3 navedena je primena i nekih drugih vrsta ovog roda u narodnoj medicini. Za biljke koje predstavljaju predmet ove doktorske disertacije nisu naŤeni podaci o tradicionalnoj upotrebi. 1 Konjeviš i Tatiš, 2006 – Reţnik naziva biljaka 13 Tabela 3. Primena nekih vrsta roda Veronica u narodnoj medicini Vrsta Zemlja Deo biljke Oblik primene Primena Referenca V. anagallis- aquatica L. Iran Herba Dekokt Kod opekotina Mosaddegh i sar., 2012 Juţnoafriţka Republika List - Kod karcinoma i bolova u leŤima; kao kupka kod umornih stopala De Beer i Van Wyk, 2011 Turska Herba Suva biljka se kuva u mleku i primenjuje kao obloga Kod reumatskih bolova Harput i sar., 2004 Kina Kod prehlade i trbušne kile Küpeli i sar., 2005 V. austriaca L. Bosna i Hercegovina Herba, cvet, list - Kod tuberkuloze, glavobolje, bolova u stomaku, opstipacije i ţireva Šariš-Kundališ i sar., 2011 Španija Herba - Kod glavobolje Agelet i Vallés, 2001 V. beccabunga L. Italija Herba Dekokt, sveţa biljka Diuretik Pieroni i sar., 2004 14 V. cephaloides Pennell Butan Herba - Za zaustavljanje krvarenja, ublaţavanje ţireva i obnavljanje oštešenih šelija. Za sniţavanje temperature udruţene sa ranama Wangchuk i sar., 2011 V. chamaedrys L. Bosna i Hercegovina Herba, cvet, list - Kod tuberkuloze, glavobolje, bolova u stomaku, opstipacije i ţireva Šariš-Kudališ i sar., 2011 Austrija Herba Kod oboljenja nervnog, respiratornog i kardiovaskularnog sistema, kao i kod poremešaja metabolizma Vogl i sar., 2013 V. cymbalaria Bodard Italija Herba Dekokt Antimalarik De Natale i Pollio, 2007 V. incana L. Mongolija, Rusija Herba Kod oboljenja kardiovaskularnog sistema, digestivnog trakta, bubrega, poremešaja metabolizma, i neuroza. Spolja kod akni, apscesa, dermatitisa i opekotina Gusev i Nemereshina, 2005 Ukrajina Herba Kod prehlade i povišenog krvnog pritiska V. kotschyana Benth. Nigerija Koren - Kod dijareje Etuk i sar., 2009 15 V. orientalis Miller Turska Herba Infuz Kod kamena u bubregu i respiratornih oboljenja Altundag i Ozturk, 2011 V. peregrina L. Kina Kod dismenoreje, razliţitih krvarenja i preloma Kwak i sar., 2009 Koreja Kod ţira na ţelucu Jeon, 2012 V. serpyllifolia L. Španija Herba Dekokt Kod infekcije oka Rigat i sar., 2007 V. undulata Wall. Kina Cela biljka Dekokt Za zaustavljanje krvarenja, kod zapušenog nosa i menstrualnih bolova Weckerle i sar., 2009 16 3. Sekundarni metaboliti vrsta roda Veronica Medicinski znaţaj i interes za taksonomiju roda Veronica bili su podstrek za njegova intenzivna fitohemijska ispitivanja. Morfološka raznovrsnost, razliţiti ekološki faktori i hibridizacija uslovili su veliku raznovrsnost u strukturi sekundarnih metabolita prisutnih u vrstama ovog roda. Dosadašnja fitohemijska ispitivanja ukazala su na prisustvo iridoidnih glukozida, feniletanoidnih i flavonoidnih glikozida (Chari i sar., 1981; Harput i sar., 2002a; Harput i sar., 2002b; Harput i sar., 2002c; Harput i sar., 2003; Saracoglu i sar., 2002; Taskova i sar., 1998; Taskova i sar., 2002). 3.1. Flavonoidi Flavonoidi predstavljaju najvešu grupu polifenola biljaka. U osnovi molekula aglikona kod ove grupe jedinjenja nalazi se 2-fenil-benzo-γ-piron (flavon) (Slika 4). Do danas je opisano više od 8000 razliţitih flavonoida (Kuntiš i sar., 2014) koji se, u zavisnosti od stepena oksidacije centralnog piranovog prstena, mogu klasifikovati u nekoliko grupa: flavoni, flavonoli, flavanoni, izoflavoni, flavanoli i antocijani (Anand i Singh, 2013). Flavonoidi se ţesto koriste kao markeri u hemosistematici zahvaljujuši njihovoj hemijskoj stabilnosti (moţe se koristiti i herbarski, ne samo ţivi materijal), velikom strukturnom diverzitetu, relativno lakoj identifikaciji i gotovo univerzalnom prisustvu u višim biljkama (Pavloviš, 2008). O O A C B Slika 4. Struktura flavona 17 3.1.1. Flavonoidni aglikoni Aglikoni flavonoida kao lipofilna jedinjenja imaju ograniţenu distribuciju u biljkama u poreŤenju sa njihovim hidrosolubilnim glikozidima koji su karakteristiţni za vešinu angiospermi. Ovi aglikoni obiţno su akumulirani na površini listova i drugih nadzemnih organa, u obliku eksudata ili su rastvoreni u lipofilnom matriksu. Smatra se da je njihova distribucija na površini lista uslovljena hemo-ekološkom funkcijom (zaštita od zagrevanja i UV zraţenja, antimikrobna i alelopatska aktivnost, kao i odbijanje insekata) (Nikolova i sar., 2005). Ovo je potvrŤeno i u okviru roda Veronica. Naime, u uzorcima sakupljenim na vešim nadmorskim visinama uoţena je kompleksnija smeša aglikona u poreŤenju sa uzorcima sa niţih nadmorskih visina. TakoŤe, znaţajna akumulacija ovih jedinjenja primešena je kod kserofitnih vrsta (Nikolova i sar., 2005). Slobodni aglikoni izolovani iz vrsta roda Veronica uglavnom su flavonski, uz znaţajan broj metilovanih derivata flavonola (Tabela 4). Apigenin i luteolin su najţešši površinski aglikoni, prašeni metilovanim derivatima: apigenin 4‟-metilestrom, apigenin 7,4‟-dimetilestrom i luteolin-3‟-metilestrom. Nešto reŤi u Veronica vrstama su luteolin- 7,4‟-dimetil estar, kao i 6-metoksi flavoni skutelarein 6,7,4‟-trimetil estar i 6-hidroksi luteolin 6,7,3‟-trimetil estar (Nikolova i sar., 2005). Struktura nekih flavonoidnih aglikona izolovanih iz nadzemnih delova vrsta roda Veronica data je u Tabeli 4. 18 Tabela 4. Flavonoidni aglikoni vrsta roda Veronica Aglikon Podrod Biljna vrsta Referenca O R4 R3 R2 R1 R5 R6 O R7 Apigenin (R1=R3=R6=OH, R2=R4=R5=R7=H) Pentasepale V. turrilliana, V. teucrium ssp. teucrium, V. teucrium ssp. crinite, V. austriaca ssp. jacquinii, V. austriaca ssp. tenuissiana, V. multifida Nikolova i sar., 2005 V. prostrata Nikolova i sar., 2002 Pocilla V. persica, V. polita, V. triphyllos, V. praecox Nikolova i sar., 2005 Chamaedrys V. chamaedrys, V. vindobonensis, V. orbelica, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Stenocarpon V. fruticulosa, V. fruticans, V. kellererii 19 Cochlidiosperma V. hederifolia, V. sublobata, V. triloba, V. cymbalaria, Veronica V. alpine, V. bellidioides, V. officinalis, V. urticifolia Beccabunga V. beccabunga, V. scardica, V. serpyllifolia V. acinifolia Pseudolysimachium V. spicata Gusev i sar., 1978 Apigenin 4‟-metil etar - akacetin (R1=R3=OH, R2=R4= R5=R7=H, R6=OCH3) Pentasepale V. turrilliana, V. austriaca ssp. jacquinii, V. multifida Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. persica, V. polita, V. praecox Chamaedrys V. chamaedrys, V. vindobonensis, V. orbelica, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Cochlidiosperma V. hederifolia, V. sublobata, V. triloba Veronica V. bellidioides, V. officinalis Beccabunga V. beccabunga, V. scardica, V. serpyllifolia Apigenin 7,4‟-dimetil etar (R1=OH, R2=R4= R5=R7=H, Pentasepale V. austriaca ssp. jacquinii Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. persica, V. polita 20 R3=R6=OCH3) Chamaedrys V. vindobonensis, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Veronica V. urticifolia, V. officinalis Skutelarein 6,4‟-dimetil etar (R1=R3=OH, R2=R6=OCH3, R4= R5=R7=H) Chamaedrys V. vindobonensis Nikolova i sar., 2002 Skutelarein 6,7,4‟-trimetil etar (R1=OH, R2=R3=R6=OCH3, R4= R5=R7=H) Pentasepale V. teucrium ssp. teucrium Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. polita, V. praecox Chamaedrys V. vindobonensis, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Stenocarpon V. fruticans Cochlidiosperma V. hederifolia Beccabunga V. acinifolia Luteolin (R1=R3=R5=R6=OH, R2= R4=R7=H) Pentasepale V. multifida Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. persica, V. polita,V. triphyllos, V. praecox Chamaedrys V. vindobonensis, V. orbelica, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Stenocarpon V. fruticulosa, V. fruticans, V. kellererii 21 Cochlidiosperma V. hederifolia, V. sublobata, V. teriloba, V. cymbalaria Veronica V. alpine, V. bellidioides, V. officinalis Nikolova i sar., 2005 V. urticifolia Nikolova i sar., 2002 Beccabunga V. beccabunga, V. serpyllifolia, V. acinifolia Nikolova i sar., 2005 Pseudolysimachium V. spicata Gusev i sar., 1978 Luteolin 3‟-metil etar - hrizoeriol (R1=R3=R6=OH, R2= R4=R7=H, R5==CH3) Chamaedrys V. chamaedrys, V. vindobonensis, V. krumovii, V. arvensis, V. verna Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. praecox Luteolin 7,4‟-dimetil etar (R1=R5=OH, R2= R4=R7=H, R3=R6=OCH3) Pocilla V. persica, V. praecox Nikolova i sar., 2005 Chamaedrys V. arvensis, V. verna Luteolin 7,3‟-dimetil etar (R1=R6=OH, R2= R4=R7=H, R3=R6=OCH3) Pentasepale V. austriaca ssp. jacquinii Nikolova i sar., 2005 Pocilla V. polita Veronica V. bellidoides, V. officinalis Beccabunga V. serpyllifolia 6-hidroksiluteolin 6,7,3‟-trimetil etar Pocilla V. persica, V. polita, V. praecox Nikolova i sar., 2005 Chamaedrys V. verna 22 (R1=R6=OH, R2=R3=R5=OCH3, R4=R7=H) Kvercetin (R1=R3=R5=R6=R7=OH, R2=R4=H) Pocilla V. francispetae, V. siaretensis Lehmann Mehrvarz i sar., 2008 Kvercetin 3‟,4‟,5‟,7‟-tetrametil etar (R1=R3=R5=R6=OCH3, R2=H, R7=OH) Pocilla V. persica, V. polita Mehrvarz i sar., 2008 5,4‟-dihidroksi-6,7,3‟- trimetoksiflavon (circilineol) (R1= R2=R7=H, R3=R4=R5=OCH3, R6=OH) Pentasepalae V. pectinata var. glandulosa Saracoglu i sar., 2004a Pocilla V. persica 23 3.1.2. Flavonoidni glikozidi Flavonski heterozidi su najzastupljeniji tip flavonoida u vrstama roda Veronica. Najţešše se radi o heterozidima luteolina i apigenina, odnosno njihovih derivata. Njihova bitna karakteristika je prisustvo hidroksil grupe na poloţaju C-6 ili C-8 aglikona. Prisustvo 6-hidroksi flavona (flavona sa OH grupama u poloţajima 5, 6 i 7 u prstenu A je karakteristiţno za red Lamiales i to za familije Plantaginaceae, Globulariaceae, Lamiaceae, Valerianaceae i Scrophulariaceae (Tomás-Barberán, 1988). Za razliku od njih, 8-hidroksi flavoni (flavoni sa OH grupama u poloţajima 5, 7 i 8 prstena A) su reŤe zastupljeni, pronaŤeni su kod predstavnika rodova Veronica (Plantaginaceae), i Stachys, Sideritis i Teucrium (Lamiaceae), pa se mogu koristiti kao markeri u hemotaksonomiji (Albach i sar., 2005b). U okviru roda Veronica do sada su identifikovani u podrodovima Pocilla, Pentasepalae i Hebe. U vrstama Severne hemisfere podrodova Pocilla i Pentasepalae prisustvo 6-hidroksiflavon glikozida iskljuţuje prisustvo 8-hidroksiflavon glikozida i obrnuto. Izuzetak je vrsta V. persica gde su prisutne obe grupe jedinjenja. Kod vrsta Juţne hemisfere podroda Pentasepalae prisustvo jedinjenja obe grupe je ţesto, što ukazuje na alipoliploidno poreklo predaka ove grupe (Taskova i sar., 2008). Luteolin 4‟- i 3‟- glikozidi zastupljeni su u vrstama Severne hemisfere i sporadiţno su prisutni u vrstama Juţne hemisfere. Dodatno, glikozidi luteolin 3‟-metil etra (hrizoeriola) karakteristiţni su za vrste Severne hemisfere, dok u vrstama Juţne hemisfere do sada nisu identifikovani (Taskova i sar., 2008). Glikozilovanje kod flavonoid glikozida najţešše se dešava na poloţajima C-5 i C-7 (Saracoglu i sar., 2004a), a acilovanje šešerne komponente je još jedna karakteristika ovih jedinjenja u rodu Veronica (Albach i sar., 2003). Struktura nekih flavonoidnih heterozida izolovanih iz nadzemnih delova vrsta roda Veronica prikazana je u Tabeli 5. Ostali tipovi flavonoidnih heterozida u vrstama ovog roda su retki. Flavonolni heterozidi (derivati kemferola) su sporadiţno zastupljeni u podrodu Pocilla (Mehrvarz i sar., 2008). Antocijani su odgovorni za plavu i ruţiţastu boju cvetova roda Veronica. Najţešše su zasnovani na delfinidinu kao aglikonu (Grayer-Barkmeijer, 1978). U 24 cvetovima vrste V. persica identifikovani su visoko glikozilovani flavonoidi delfinidin 3-O-(2-O-(6-O-p-kumaroil-glukozil)-6-O-p-kumaroil glukozid)-5-O-glukozid (Ono i sar., 2010), kao i poliacilovani antocijani 3-di-p-kumaroilzoforozid-5-malonil glukozid i demalonil derivat (Mori i sar., 2009). MeŤu taksonima koji su predmet ove doktorske disertacije, iz nadzemnog dela V. teucrium do sada su identifikovani 8-hidroksi flavon glikozidi, dok 6-hidroksi flavon glikozidi nisu naŤeni (Albach i sar., 2005). Za vrste V. jacquinii i V. urticifolia nema podataka o prisustvu flavonoid glikozida. Struktura nekih flavonoidnih glikozida izolovanih iz nadzemnih delova vrsta roda Veronica data je u Tabeli 5. 25 Tabela 5. Flavonoidni glikozidi vrsta roda Veronica Jedinjenje Podrod Vrsta Referenca OO OH O OH OH O OH OH OH OH Kemferol-7-O-β-G-glukopiranozid Pocilla V. francispetae, V. siaretensis, V. polita V. persica Mehrvarz i sar., 2008 26 O O OH OH OH O OH OH OH OH Luteolin-7-O-β-D-glukozid (cinarozid) Veronica V. officinalis Gusev i sar., 1975 Pentasepalae V. fuhsii Ozipek i sar., 1999 O O OH OOH O OMe OH OH OH HOOC 27 Hrizoeriol-7-O-glukuronid Beccabunga V. peregrina Kwak i sar., 2009 O O OO O O OH OH OH OH OH OH OH OH O CH 3 OR Izoskutelarein 7-O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alopiranozil-(1‟‟‟-2‟‟)-β-glukopiranozid (R=H) Pocilla V. intercendens Albach i sar., 2003 Izoskutelarein 4‟-metil etar-7-O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alopiranozil-(1‟‟‟-2‟‟)-β- glukopiranozid (R=CH3) Pentasepalae V. orientalis, Albach i sar., 2003 Pocilla V. intercendens 28 O OO O O OH OH OH OH OH O OR OH OH OH 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-(E)-kafeoilglukozid) (spikozid A) (R=H) Pseudolysimachium V. longifolia, V. orchidea, V. ovata, V. spicata, V. spuria Albach i sar., 2005a 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-feruloilglukozid) (spikozid B) (R=CH3) Pseudolysimachium V. spicata, V. spuria Albach i sar., 2005b Pentasepalae V. thymoides ssp. pseudocinerea Saracoglu i sar., 2004b 29 O OO O O OH OH OH OH OH O R1 R 2 O OH OH 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-p-hidroksibenzoilglukozid) (spikozid C) (R1= R2= H) Pseudolysimachium V. spicata Albach i sar., 2005b 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-protokatehuoilglukozid) (spikozid D) (R1=OH, R2= H) Pseudolysimachium V. orchidea, V. spicata, V. spuria Albach i sar., 2005b Pentasepalae V. thymoides ssp. pseudocinerea Saracoglu i sar., 2004b 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-vaniloilglukozid) (spikozid E) (R1=OCH3, R2= H) Pseudolysimachium V. spicata, V. spuria Albach i sar., 2005b 6-hidroksiluteolin 7-(6‟‟-veratroilglukozid) (spikozid F) (R1=OCH3 R2= CH3) Pseudolysimachium V. spicata Albach i sar., 2005b 30 O O OO O O OHOH OH CH 3 OH OH OH OH OH O CH 3 OH OH O OH OMeO 3‟-hidroksi-4‟-O-metilskutelarein-7-O-[2‟‟-O-α-L-ramnopiranozil-3‟‟-O- (6‟‟‟‟-O-acetil-β-D-glukopiranozil)]-β-D-glukopiranozid (sarahozid) Pentasepalae V. pectinata var. glandulosa Saracoglu i sar., 2004a O O R1 R2 O OH OH O O OH OH OH OH OH OH OCOCH 3 O 4‟-O-metilizoskutelarein-7-O-2‟‟-O-(6‟‟‟-O-acetil-β-D-glukopiranozid) (R1=H, R2=OCH3) Pocilla V. persica Saracoglu i sar., 2004a 31 Izoskutelarein-7-O-2‟‟-O-(6‟‟‟‟-O-acetil-β-D-alopiranozil)-β-D- glukopiranozid (R1=H, R2=OH) Pocilla V. persica Saracoglu i sar., 2004a Pentasepalae V. multifida Ozipek i sar., 2002 3‟-hidroksi-4‟-O-metilizoskutelarein-7-O-2‟‟-O-(6‟‟‟-O-acetil-β-D- alopiranozil)-β-D-glukopiranozid (R1=OH, R2=OCH3) Pocilla V. persica Saracoglu i sar., 2004a 32 3.2. Iridoidi Iridoidi su bicikliţna, monoterpenska jedinjenja. U biljnim tkivima najţešše su vezani za šešere. Do sada je u biljkama identifikovano preko 2500 iridoidnih jedinjenja meŤusobno razliţitih po stepenu i tipu supstitucije na osnovnom ciklopentanskom prstenu (Slika 5) (Marin, 2003). O Slika 5. Struktura iridana Iridoidi su do sada izolovani samo iz grupe dikotiledonih biljaka, uglavnom su prisutni u familijama Apocynaceae, Lamiaceae, Loganiaceae, Rubiaceae, Scrophulariaceae, Gentianaceae i Verbenaceae i mogu se uspešno koristiti kao hemotaksonomski markeri (Marin, 2003). Iridoidna jedinjenja karakteristiţna za rod Veronica su aukubin i katalpol, kao i estri katalpola sa derivatima cimetne (verminozid i minekozid) i benzoeve kiseline (veronikozid, katalpozid, verprozid, amfikozid) (Slika 6). Dodatno, u brojnim Veronica vrstama identifikovani su karboksilovani iridoidi: epiloganinska kiselina, gardozid, musaenozidinska kiselina, arboreskozidinska kiselina, genipozidinska kiselina, kao i njihovi estri (Slika 7). Musaenozid, estar musaenozidinske kisline, karakteristiţan je za podrod Veronica, ali nije ograniţen samo na njega (Jensen i sar., 2005). U okviru podroda Pocilla utvrŤeno je prisustvo ajugola i 5-hidroksilovanih iridoida melitozida i globulorifolina. Ova jedinjenja karakteristiţna su za familiju Lamiacae, ali se sporadiţno mogu naši i u familiji Plantaginaceae (Jensen i sar., 2005). 33 O H H O-Glu OH OH O H H O-Glu OH O OH Aukubin Katalpol O H H O-Glu O OH O O OH OH O H H O-Glu O OH O O OH OH Verprozid Verminozid O H H O-Glu O OH O O O H H O-Glu O OH O O OH Veronikozid Katalpozid O H H O-Glu O OH O O OH MeO O H H O-Glu O OH O O OH MeO Minekozid Amfikozid Slika 6. Iridoidni glukozidi karakteristiţni za rod Veronica 34 O OGlu COOH O OGlu COOH O OGlu COOH OH Epiloganinska kiselina Gardozid Musaenozidinska kiselina O OGlu COOH OH O OGlu COOH OH O OGlu COOH O CH 3 Genipozidinska kiselina Arboreskozidinska kiselina Alpinozid Slika 7. Karboksilovani iridoidni glukozidi prisutni u brojnim vrstama roda Veronica 35 U pojedinim vrstama roda Veronica identifikovani su iridoidni heterozidi specifiţne strukture (Tabela 7). Iridoidni sastav vrsta koje su predmet ove doktorske disertacije je veš ispitivan (Tabela 6). Za herbu V. teucrium karakteristiţno je prisustvo aukubina, katalpola i estara katalpola sa derivatima benzoeve kiseline (katalpozid, verprozid, amfikozid, 6- veratroilkatalpozid), dok estri katalpola sa derivatima cimetne kiseline nisu identifikovani (Taskova i sar., 2002). Pored aukubina i katalpola, za herbu V. jacquinii karakteristiţno je prisustvo estara katalpola sa derivatima benzoeve kiseline (veronikozid, katalpozid, verprozid, amfikozid, 6-O-izovaniloilkatalpol, 6-O-veratroilkatalpozid), dok je spidozid jedini identifikovan estar katalpola sa derivatom cimetne kiseline (Taskova i sar., 2002). Od iridoidnih heterozida u herbi V. urticifolia detektovani su aukubin, katalpol, musaenozid, estri katalpola sa derivatima benzoeve kiseline (veronikozid i katalpozid), kao i estri katalpola sa derivatima cimetne kiseline (minekozid) (Taskova i sar., 2002). Tabela 6. Iridoidni heterozidi identifikovani u vrstama V. teucrium, V. jacquinii i V. urticifolia Iridoidni heterozid Vrsta 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 V. teucrium * * * * * * V. jacquinii * * * * * * * * * V. urticifolia * * * * * * Legenda: 1-katalpol, 2-veronikozid, 3-katalpozid, 4-verprozid, 5-amfikozid, 6-6-O- izovaniloilkatalpol, 7-6-O-veratroilkatalpozid, 8-verminozid, 9-minekozid, 10-spidozid, 11- velozid, 12-aukubin, 13-genipozidinska kiselina, 14-musaenozid, 15-alpinozid. Uloga iridoida u biljkama nije u potpunosti razjašnjena. Obzirom na veliku raznovrsnost ove grupe jedinjenja i ţinjenicu da se nalaze u tkivima sa intenzivnom metaboliţkom aktivnoššu, jasno je da je reţ o jedinjenjima od velikog znaţaja za biljku. Zahvaljujuši svom gorkom ukusu predstavljaju naţin odbrane biljaka od herbivora. TakoŤe, mnogi iridoidi sluţe kao prekursori drugih tipova jedinjenja (Marin, 2003). Iridoidni glukozidi su biološki aktivna jedinjenja. Do sada je poznato više razliţitih aktivnosti iridoida, kao što su: antimikrobna, antidijabetiţna, antiinflamatorna, 36 antinociceptivna, antihiperlipidemijska, hepatoprotektivna, antitumorska i imunostimulatorna. TakoŤe, deluju kao inhibitori osteoporoze, humane neutrofilne elastaze i melanogeneze (Dinda i sar., 2007). 37 Tabela 7. Iridoidni glikozidi specifiţne strukture identifikovani u pojedinim vrstama roda Veronica Jedinjenje Podrod Vrsta Referenca O OGlc COOR 1 R 2 O Lavaudiozid A (R1=1-manitil; R2=kafeoil) Hebe V. lavaudiana Taskova i sar., 2011 O OGlc COOR 1 R 2 O Lavaudiozid B (R1=1-manitil; R2=kafeoil) Hebe V. lavaudiana Taskova i sar., 2011 38 O OGluOH RO OH OH Asistaziozid E (R=H) Pseudolysimachion V. longifolia Jensen i sar., 2010 Longifoliozid A (R=3,4-dihidroksibenzoil) Longifoliozid B (R=kafeoil) Urfozid B (R=vaniloil) O OGlu OR OH OH OH Urfozid A (R=vaniloil) Pentasepalae V. pectinata var. glandulosa Harput i sar., 2003 39 O COOH OH O OH OH OH O R O Akvatikozid A (R=H) Beccabunga V. anagalis- aquatica Harput i sar., 2004 Akvatikozid B (R=OH) O COOH OH CH 2 O OH OH OH O O Akvatikozid C Beccabunga V. anagalis- aquatica Harput i sar., 2004 40 O COOH OH OGluOH O RO Pikurozid (R=vaniloil) Cochlidiosperma V. hederifolia Harput i sar., 2002c O OGluOH RO Dervenciozid A (R=benzoil) Hebe V. derwentiana Jensen i sar., 2008 Dervenciozid B (R=p-OH-benzoil) Dervenciozid C (R=vaniloil) 41 O OGlu RO OH O Spidozid (R=4‟-O-Glu-kafeoil) Veronicastrum V. alpina, V. bellidioides Taskova i sar., 2002 Veronica V. officinalis, V. austriaca Taskova i sar., 2002 Velozid (R=4‟-O-Glu-feruloil) Veronicastrum V. bellidioides Taskova i sar., 2002 42 3.3. Feniletanoidni glikozidi Feniletanski glikozidi su široko rasprostranjeni u biljnom carstvu. Ovi sekundarni metaboliti karakteristiţni su za red Lamiales a najveši broj njih je identifikovan u taksonima familija Scrophulariaceae, Plantaginaceae, Oleaceae, Lamiaceae i Orobanchaceae. Do sada je poznato više razliţitih aktivnosti feniletanskih heterozida kao što su: antioksidantna, antiinflamatorna, antibakterijska, antivirusna, antitumorska, imunomodulatorna, hepatoprotektivna i neuroprotektivna (Kukiš-Markoviš, 2013). Feniletanski heterozidi karakteristiţni su i za vrste roda Veronica i iz njih je izolovan veliki broj jedinjenja ove klase. Neka od njih kao što su akteozid, martinozid i kornozid su široko rasprostranjena u biljnom carstvu, dok su druga identifikovana samo u vrstama ovog roda (turiliozid A i B). Kafeoil feniletanoidni glukozidi sa 3‟-O-glukozil supstituentom zabeleţeni su samo u rodovima Plantago i Veronica familije Plantaginaceae (Jensen i sar., 2011). Obzirom da je kornozid prisutan samo u podrodu Chamaedrys, ovaj feniletanski glikozid moţe biti znaţajan hemotaksonomski marker roda Veronica (Jensen i sar., 2005). Stuktura do sada identifikovanih feniletanskih heterozida u rodu Veronica data je u Tabeli 8. 43 Tabela 8. Feniletanski heterozidi identifikovani u pojedinim vrstama roda Veronica Jedinjenje Podrod Vrsta Referenca GlcO OH Salidrozid Chamaedrys V. arvensis Jensen i sar., 2005 Hebe V. raoulii Taskova i sar., 2012 Beccabunga V. beccabunga Jensen i sar., 2011 O OH GlcO Kornozid Chamaedrys V. arvensis, V. dillenii, V. micans, V. verna, V. vindobonensis Jensen i sar., 2005 44 O O OR 1 OR 4 R 2 O R 3 O R5 R6 Akteozid (R1=H; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Pocilla V. persica Harput i sar., 2002b Chamaedrys V. dillenii, V. micans, V. vindobonensis Jensen i sar., 2005 Hebe V. pentasepalae Taskova i sar., 2012 V. brachysiphon, V. odora Johansen i sar., 2007 V.stenophylla, V. topiaria Pedersen i sar., 2007 Izoakteozid (R1=H; R2=Rha; R3=H; R4=kafeoil; R5=R6=OH) Pocilla V. persica Harput i sar., 2002b Veronica V. officinalis Crişan i sar., 2007 Kalceolariozid C (R1=H; R2=H; R3=kafeoil; R4=Xyl; R5=R6=OH) Pentasepalae V. teucrium Taskova i sar., 2002 Persikozid (R1=Glu; R2=Glu; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Pocilla V. persica Harput i sar., 2002b Hebe V. hulkeana Taskova i sar., 2012 45 V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 Izopersikozid (R1=Glc; R2=Glc; R3=OH; R4=kafeoil; R5=R6=OH) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Lavandulifoliozid (R1=H; R2=Glu(2→1)Ara; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Pocilla V. persica Harput i sar., 2002b Verpektozid A (R1=Ara; R2=Rha; R3=feruloil; R4=H; R5=R6=OH) Pentasepalae V. multifida Ozipek i sar., 2002 V. pectinata Saracoglu i sar., 2002 Verpektozid B (R1=Glu; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Chamaedrys V. micrantha Jensen i sar., 2005 Pentasepalae V. pectinata Saracoglu i sar., 2002 Poliumozid (R1=H; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=Rha; R5=R6=OH) Hebe V. odora Johansen i sar., 2007 Angarozid A (R1=H; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=Ara; R5=R6=OH) Hebe V. elliptica Johansen i sar., 2007 Martinozid (R1=H; R2=Rha; R3=feruloil; R4=H; R5=OH; R6=OCH3) Beccabunga V. anagallis- aquatica Harput i sar., 2004 Plantamajozid (R1=H; R2=Glu; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Beccabunga V. beccabunga Jensen i sar., 2011 Pentasepalae V. fuhsii Ozipek i sar., 1999 Fušiozid Pentasepalae V. fuhsii Ozipek i sar., 1999 46 (R1=R2=R3=H; R4=kafeoil; R5=R6=OH) Hebeozid (R1=Xyl; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. cupressoides Pedersen i sar., 2007 Parahebeozid (R1=H; R2=Glu(2→1)Xyl; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. hookeriana Maggi i sar., 2009 Kuprozid (R1=Xyl; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=Glc; R5=R6=OH) Hebe V. cupressoides Pedersen i sar., 2007 Aragozid (R1=Ara; R2=Glc; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 V. lavaudiana Taskova i sar., 2011 V. raoulii, V. pentasepalae Taskova i sar., 2012 Izoaragozid (R1=Ara; R2=Glc; R3=OH; R4=kafeoil; R5=R6=OH) Hebe V. raoulii, V. pentasepalae Taskova i sar., 2012 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid A (R1=Ara; R2=Glc; R3=feruloil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. raoulii Taskova i sar., 2012 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Izohionozid A (R1=Ara; R2=Glc; R3=OH; R4=feruloil; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid B (R1=Ara; R2=Glc; R3=feruloil; R4=H; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 47 Izohionozid B (R1=Ara; R2=Glc; R3=OH; R4=feruloil; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid C (R1=Ara; R2=6-Fer-Glc; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid D (R1=Ara; R2=Glc; R3=kafeoil; R4=Glc; R5=R6=OH) Hebe V. lavaudiana Taskova i sar., 2011 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid E (R1=Ara; R2=Glc; R3=feruloil; R4=Glc; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid F (R1=Ara; R2=Glc; R3=kafeoil; R4=Rha; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Hionozid G (R1=Glc; R2=Glc; R3=kafeoil; R4=H; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 Izohionozid G (R1=Glc; R2=Glc; R3=OH; R4=kafeoil; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 Hionozid H (R1=Glc; R2=Glc; R3=feruloil; R4=H; R5=R6=OH) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 Izohionozid H (R1=Glc; R2=Glc; R3=OH; R4=feruloil; R5=R6=OH) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 Hionozid I (R1=Glc; R2=Glc; R3=feruloil; R4=H; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 48 Izohionozid I (R1=Glc; R2=Glc; R3=OH; R4=feruloil; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Izohionozid J (R1=H; R2=Glc(2→1); R3=H; R4=kafeoil; R5=R6=OH) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Izohionozid K (R1=Ara; R2=Glc; R3=OH; R4=kafeoil; R5= OH; R6=OCH3) Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Ehrenozid (R1=Ara; R2=Rha; R3=kafeoil; R4=H; R5=R6=OH) Pentasepalae V. pectinata Saracoglu i sar., 2002 Hebe V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Lagotozid (R1=Ara; R2=Rha; R3=feruloil; R4=H; R5=OH; R6=OCH3) Hebe V. raoulii Taskova i sar., 2012 V. pulvinaris Taskova i sar., 2010 V. thomsonii Taskova i sar., 2010 Heliozid A (R1=Ara; R2=Glc; R3=kafeoil; R4=Xyl; R5=R6=OH) Hebe V. lavaudiana Taskova i sar., 2011 V. raoulii, V. hulkeana, V. pentasepalae Taskova i sar., 2012 Heliozid C (R1=Ara; R2=Glc; R3=feruloil; R4=Xyl; R5=R6=OH) Hebe V. lavaudiana, V. pentasepalae Taskova i sar., 2011 Heliozid F (R1=Xyl; R2=Glc; R3= kafeoil; R4=Glc; R5=R6=OH) Hebe V. hulkeana Taskova i sar., 2012 49 Turiliozid A (R1=H; R2=K; R3= kafeoil; R4=Glc(1→4)Rha; R5=R6=OH) Pentasepalae V. turrilliana Kostadinova i sar., 2007 Turiliozid B (R1=H; R2=H; R3= kafeoil; R4=6-O-feruloil-Glc(1→4)Rha; R5=R6=OH) Pentasepalae V. turrilliana Kostadinova i sar., 2007 50 3.4. Ostale grupe jedinjenja roda Veronica Iz vrsta roda Veronica izolovani su steroidni saponozidi. Oni su u prirodi retki i karakteristika su monokotiledonih biljaka familija Dioscoreaceae, Liliaceae i Amaryllidaceae. Sporadiţno se javljaju u biljkama familija Fabaceae i Scrophulariaceae (Kovaţeviš, 2000). Iz vrste V. chamaedrys L. izolovani su steroidni saponozidi spirostan tipa (hamedrozidi C i C1), furostan tipa (hamedrozidi E i E1), kao i furospirostan tipa (hamedrozidi C2 i E2) (Marchenko i sar., 2012). U metanolnom ekstraktu herbe V. turriliana Stoj. & Stef. utvrŤeno je prisustvo steroidnog saponozida spirostan tipa - turilianozida (Kostadinova i sar., 2007). Steroidni saponozid nautigenin tipa, multifidozid, izolovan je iz vrsta V. multifida i V. fuhsii, dok je akuleatizid A identifikovan u vrsti V. fuhsii (Ozipek i sar., 2002). U pojedinim Veronica vrstama pokazano je i prisustvo acetofenona i alkaloida (Taskova, 1998). Manitol je šešerna komponenta karakteristiţna za tribus Veroniceae (Taskova i sar., 2006). Iz vrste V. turrilliana izolovani su arbutin i 6-O-E-kafeoilarbutin (Kostadinova i sar., 2007). 4. Dosadašnja proučavanja sadržaja teških metala u vrstama roda Veronica Teški metali su sve prisutniji u okolini, posebno u industrijalizovanim društvima. Kontaminacija tla metalima se znaţajno razlikuje od zagaŤenja vazduha ili vode po tome što se teški metali u zemljištu zadrţavaju znatno duţe u odnosu na ostale delove biosfere. Remedijacija zemljišta zagaŤenog metalima obiţno ukljuţuje njihovu imobilizaciju ili ekstrakciju primenom skupih fiziţko-hemijskih tehnika koje ţesto imaju negativan uticaj na biološku aktivnost, plodnost i strukturu zemljišta. Tokom poslednih nekoliko decenija sve je popularnija primena biljaka za uklanjanje kontaminenata iz zemljišta procesom poznatim kao fitoremedijacija (DalCorso i sar., 2013). 51 Sve biljke imaju mogušnost da iz tla ili vode akumuliraju metale esencijalne za njihov rast. Neke biljke sposobne su da preuzimaju i druge metale i metaloide koji nemaju odreŤenu fiziološku funkciju i toksiţni su za samu biljku. Teški metali preko biljaka dospevaju u lanac ishrane, i u prekomerenim koliţinama predstavljaju opasnost po ljudsko zdravlje. Sa druge strane, sposobnost pojedinih biljaka da akumuliraju teške metale u korenu i/ili nadzemnim delovima, moţe se iskoristiti za regeneraciju kontaminiranog tla (DalCorso i sar., 2013). Za razliku od sekundarnih metabolita, malo je podataka o neorganskim komponentama Veronica vrsta, ili o odnosu neorganskih komponenti u biljci i zemljištu na kojem je ona rasla. Zurayk i sar. (2001) pokazali su znaţaj pojedinih Veronica hidrofita u fitoremedijaciji vode zahvaljujuši mogušnosti hiperakumulacije hroma u korenu ovih biljaka uz minimalnu translokaciju u nadzemne delove. Za vrstu Veronica didydima pokazana je visoka akumulaciona sposobnost za Zn (Wang i sar., 2005), dok je meŤu pet testiranih makrohidrofita, Veronica anagallis-aquatica pokazala najveši sadrţaj Fe3+ jona (Abu Ziada i sar., 2008). Dodatno, Bayoumi (2012) je utvrdio da V. anagallis-aquatica predstavlja potencijalnu biljnu vrstu za fitoremedijaciju sredine sa radioaktivnim otpadom, posebno ukoliko je kontaminirana radiaktivnim cezijumom ili kobaltom. Sadrţaj teških metala u biljakama koje su predmet istraţivanja u okviru ove doktorske disertacije do sada nije ispitivan. 52 5. Dosadašnja farmakološka proučavanja vrsta roda Veronica Nakon pregleda literaturnih podataka moţe se zakljuţiti da iako su dosadašnja fitohemijska ispitivanja pojedinih Veronica vrsta pokazala da su izvor biološki aktivnih jedinjenja, vešina predstavnika ovog roda nije farmakološki okarakterisana. Na razliţitim linijama malignih šelija (Hep-2, RD i L-20B) pokazan je bifazan (citotoksiţan i citostatiţan) efekat iridoidnih jedinjenja izolovanih iz tri Veronica vrste (V. anagallis-aquatica, V. persica i V. thymoides) u zavisnosti od hemijske strukture i tipa karcinomskih šelija (Saracoglu i sar., 2012), kao i citotoksiţni efekat vodenih ekstrakata vrsta V. cuneifolia subsp. cuneifolia i V. cymbalaria (Saracoglu i sar., 2011). Iridoidna jedinjenja izolovana iz metanolnog ekstrakta vrste V. americana (amerikanozid i 10-O-protokatehuil-katalpol) ispoljila su selektivno citotoksiţno delovanje prema HF-6 i PC-3 šelijskim linijama (Moreno-Escobar i sar., 2013). In vitro testovima za pojedine Veronica vrste i za jedinjenja izolovana iz njih, pokazana je snaţna sposobnost hvatanja slobodnih radikala (DPPH, SO i NO) (Harput i sar., 2011; Jensen i sar., 2010; Kwak i sar., 2009; Nikolova, 2011, Saracoglu i sar., 2002). Kwak i saradnici (2009) su pokazali znaţajnu antioksidantnu aktivnost EtOAc frakcije MeOH ekstrakta cele biljke V. peregrina ORAC testom. Izolovana jedinjenja koja su ispoljila najvešu aktivnost u istom testu su luteolin, minekozid, speciozid, amfikozid, 6-O-cis-p-kumaroilkatalpol i hrizoeriol-7-glukuronid. Antioksidantnu aktivnost uporedivu sa sintetskim antioksidansom Troloxom pokazala su jedinjenja verminozid i protokatehinska kiselina. Za vrstu V. officinalis pokazano je da smanjuje nivo holesterola i triglicerida u serumu ţivotinja ţija je ishrana bogata holesterolom. Efekat nije ispoljen kod ţivotinja ţija je ishrana osloboŤena holesterola (Crisan i sar., 2007). Za istu vrstu, Gründemann i sar. (2013) pokazali su antiinflamatorno delovanje u humanim epitelnim šelijama pluša (A549 šelijama). Kao mehanizmi kojima se ostvaruje pokazana aktivnost predloţeni su inhibicija genske i proteinske ekspresije hemokina eotaksina, kao i inhibicija oslobaŤanja proinflamatornog medijatora PGE2 u TNF-α aktiviranim šelijama. 53 Pokazana je in vitro antiinflamatorna aktivnost za pet Veronica vrsta (V. cymbalaria, V. hederifolia, V. pectinata var. glandulosa, V. persica i V. polita) putem procene inhibitornog efekta na produkciju NO u makrofagama peritoneuma miša stimulisanim lipopolisaharidima, kao i ciotoksiţna aktivnost prema KB epidermoidnom karcinomu i B16 melanomu (Harput i sar., 2002a). Küpeli i sar. (2005) pokazali su snaţno antiinflamatorno delovanje metanolnog ekstrakta vrste V. anagallis-aquatica L. u karageninskom testu inflamacijskog edema šapice miša, kao i antinociceptivno delovanje u testu p-benzohinonom indukovanih abdominalnih kontrakcija. UtvrŤeno je da su za ispoljenu aktivnost ekstrakta odgovorni derivati katalpola verprozid i katalpozid. Gusev i sar. (2012) analizirali su antibakterijsko delovanje pojedinih Veronica vrsta i pokazali su da najizraţeniji efekat ispoljavaju ekstrakti herbi V. officinalis i V. spicata prema bakteriji Staphylococcus aureus. Autori su ispoljeni efekat pripisali visokom sadrţaju fenolkarboksilnih kiselina u ispitivanim ekstraktima. Za biljke koje predstavljaju predmet ove doktorske disertacije nema podataka o farmakološkom delovanju. 6. Slobodni radikali i oksidativni stres Slobodni radikali nastaju tokom aerobnih metaboliţkih procesa u organizmu. Oni predstavljaju atome, jone ili molekule sa jednim ili više nesparenih elektrona u svojoj strukturi, a mogu nastati prenosom jednog elektrona na neradikalsku vrstu, ili homolitiţkim cepanjem kovalentne veze (Cadenas i Davies, 2000). Kao posledica teţnje da spare nesparen(e) elektron(e) u poslednjoj orbitali, slobodni radikali se ponašaju kao snaţni elektrofili, odnosno jaki oksidacioni agensi (Đukiš, 2008). Reaktivne vrste kiseonika (ROS 2 ) obuhvataju kiseonikove radikale (superoksid radikal – O2 - , hidroksil radikal - * OH) i neradikalske vrste koje predstavljaju oksidativna sredstva i lako se prevode u radikale (HOCl, HOBr, O3, i H2O2). Pored ROS, znaţajnu grupu slobodnoradikalskih jedinjenja ţine i reaktivne vrste hlora (RCS3), broma (RBS4) i 2 ROS – reactive oxygen species. 3 RCS – reactive chlorine species. 54 azota (RNS 5 ) (Lesjak, 2011). Šelijska odbrana od ovih reaktivnih molekula, ukljuţuje enzimske sisteme (katalazu, superoksid dismutazu, glutation peroksidazu, glutation reduktazu) i antioksidantne neenzimske komponente kao što su glutation (GSH), ksantin, koenzim Q-10 i mokrašna kiselina. U šeliji, mitohondrijalni respiratorni lanac, aktivnost enzima citohrom P450 u mikrozomima, flavoprotein oksidaze, kao i metabolizam masnih kiselina u peroksizomima su glavni izvori produkcije ROS (Wang i sar., 2010). U fiziološkim uslovima, ROS imaju vaţnu ulogu u regulisanju razliţitih procesa u šeliji kao što su proliferacija, diferencijacija, agregacija, pokretljivost i apoptoza (Filippin i sar., 2008). TakoŤe, kao sekundarni glasnici oni uţestvuju u transdukciji signala u procesima aktiviranja imunog odgovora. Kada se naruše šelijska homeostaza i redoks status dolazi do povešane produkcije ROS, što vodi u oksidativni stres. Pokazano je da je oksidativni stres povezan sa preko 100 razliţitih oboljenja, bilo kao njihov uzrok ili kao posledica (Poljsak i sar., 2013). 6.1. Oksidativni stres i neurodegenerativne bolesti Usled velike metaboliţke aktivnosti i visokog sadrţaja polinezasišenih masnih kiselina osetljivih na peroksidaciju, a sa druge strane usled slabe antioksidantne zaštite (nizak nivo katalaze i glutation peroksidaze), mozak je pogodan za stvaranje slobodnih radikala i osetljiv je na njihovo delovanje (Jovanoviš, 2011). ROS i RNS predstavljaju glavni uzrok oksidativnog stresa u centralnom nervnom sistemu (Emerit i sar., 2004). Proces oksidativne fosforilacije u mitohondrijama je glavni izvor ROS. Kada nivo formiranih ROS prekoraţi kapacitet šelija i mitohondrija za njihovo uklanjanje, aktiviraju se tranzicione pore mitohondrijalne membrane. Otvaraju se kanali, i omogušava slobodna difuzija malih molekula izmeŤu matriksa i citosola. Ovo poslediţno vodi do kolapsa trans-membranskog elektrohemijskog gradijenta, gubitka teţnosti u matriksu, oticanja mitohondrija i oslobaŤanja faktora koji indukuju apoptozu neurona (Emerit i sar., 2004). 4 RBS – reactive bromine species. 5 RNS – reactive nitrogen species. 55 Glutamat je ekscitatorni neurotransmiter prisutan kod vešine ekscitatornih sinapsi u CNS sisara. U velikim koncentracijama glutamat ispoljava neurotoksiţno delovanje. Jedan od mehanizama neurotoksiţnosti glutamata je i oksidativna toksiţnost nezavisna od glutamatnih receptora (Lee i sar., 2003). Visoka koncentracija ekstracelularnog glutamata inhibira preuzimanje cisteina u neurone, što poslediţno dovodi do razgradnje cisteina u njima i do gubitka glutationa (GSH). Bez snabdevanja šelija glutationom, formiraju se velike koliţine ROS što vodi šeliju u apoptozu. TakoŤe, poznato je da glutamat deluje na svoje receptore putem NO mehanizma, pa prekomerena stimulacija ovih receptora moţe dovesti i do akumulacije RNS (Sundaram i sar., 2012). 6.2. Oksidativni stres i inflamacija Razvoj zapaljenske, odnosno imune reakcije u organizmu je posledica odbrambenog odgovora organizma na napad patogena. TakoŤe, i sam odgovor moţe da prouzrokuje oštešenje i na taj naţin doprinese procesu razvoja oboljenja. Zaštita organizma od patogena posredovana je ranim reakcijama uroŤenog i kasnijom reakcijom adaptivnog imunog odgovora. UroŤeni (nespecifiţni) imuni odgovor se aktivira neposredno nakon infekcije, usmerava odgovor domašina na infektivni organizam i šalje pobuŤujuši signal za steţeni (adaptivni) imuni odgovor (Rang, 2004). Nakon aktivacije, šelije uroŤenog imunog sistema sekretuju proinflamatorne citokine kao što su interferon-γ (IFN-γ), interleukini (IL) i faktor nekroze tumora (TNF-α) koji na mestu oštešenja indukuju i stvaranje ROS/RNS. I TNF-α i ROS aktiviraju redoks- osetljivi transkripcioni faktor NF-κB koji reguliše ekspresiju razliţitih gena ukljuţenih u procese inflamacije, imunog odgovora i karcinogeneze. Oksidativni stres moţe i na indirektan naţin da uţestvuje u aktivaciji NF-κB i to putem regulisanja aktivnosti protein kinaza koje fosforilišu NF-κB i na taj naţin omogušavaju migraciju ovog transkripcionog faktora iz citoplazme u jedro, kao i vezivanje za promotere odgovarajuših gena (Mantena i Katiyar, 2006). Ukoliko tokom akutnog inflamatornog odgovora organizma ne doŤe do uklanjanja egzogenog stimulusa, odgovor moţe preši u hroniţni i poslediţno moţe biti uzrok razliţitih oboljenja. Hroniţna inflamacija u šeliji pokazuje svoje neţeljene efekte kroz povešanje produkciju slobodnih radikala i razgradnju antioksidanasa. Tokom 56 inflamacije slobodni radikali mogu reagovati sa molekulom DNK u mitotskim šelijama i na taj naţin dovesti do stalnih genetskih mutacija ( taţkaste mutacije, delecije gena ili njihovo premeštanje). Na ovaj naţin hroniţna inflamacija ubrzava transformaciju šelija i postaje prekursor za formiranje kancera (Khansari i sar., 2009). 6.3. Oksidativni stres i kancerogeneza Kancer je višestepeni proces ţije formiranje prate tri faze šelijske transformacije: inicijacija, promocija i progresija. Svaka od njih je povezana sa oksidativnim stresom. Tokom faze inicijacije, slobodni radikali dovode do strukturnih promena DNK i poslediţnih genskih mutacija. U fazi promocije, oni blokiraju komunikaciju meŤu šelijama što rezultuje povešanjem proliferacije i/ili smanjenjem apoptoze u iniciranoj šelijskoj populaciji. Na kraju, oksidativni stres ostvaruje efekat i na fazu progresije kancera, uzrokovanjem dodatnih DNK izmena u veš transformisanoj šelijskoj populaciji. Reaktivne vrste kiseonika mogu povešati i stopu migracije šelija utiţuši tako na invazivnost i metastaze tumora (Todoroviš, 2013). U poreŤenju sa normalnim šelijama, jedna od kljuţnih karakteristika šelija kancera je njihova povešana sposobnost preţivljavanja. Slobodni radikali se smatraju kancerogenim zahvaljujuši sposobnosti da povešaju stepen proliferacije i migracije ovih šelija. Oštešenjem DNK nastaju genske lezije koje za posledicu imaju inicijaciju i progresiju tumora. Sa druge strane, povešana produkcija ROS vodi do starenja i smrti tumorskih šelija, pa se oni mogu smatrati i antikancerogenim agensima. Na koji naţin še ROS delovati zavisi od vrste šelija i tkiva, koncentracije ROS, kao i od aktivnosti antioksidantnog sistema (Todoroviš, 2013). 57 CILJ 58 Iako je upotreba nekih taksona roda Veronica poznata u narodnoj medicini, vešina delovanja nije zabeleţena i razjašnjena, a njihovi sekundarni metaboliti nisu dovoljno prouţeni. Cilj ovog rada je morfološka, hemijska i farmakološka karakterizacija tri odabrana taksona roda Veronica L.: - Veronica urticifolia Jacq., - Veronica jacquinii Baumg., - Veronica teucrium L. Ove vrste su do sada samo delimiţno hemijski ispitane, dok podataka o njihovoj farmakološkoj aktivnosti nema. Tokom terenskih ispitivanja koja smo izvršili, nije ustanovljena njihova tradicionalna primena. Morfološka karakterizacija podrazumeva analizu popreţnih preseka nadzemnih delova vrsta V. teucrium, V. jacquinii i V. urticifolia, kao i sprašenog biljnog materijala, primenom histohemijskih metoda i svetlosne mikroskopije. Naredni cilj disertacije je odreŤivanje sadrţaja teških metala (Cu, Zn, Fe, Mn i Cr) nakon mikrotalasne digestije uzoraka u kiseloj sredini primenom tehnika plamene i elektrotermalne atomske apsorpcione spektroskopije u uzorcima odabranih Veronica vrsta i odgovarajušeg zemljišta. TakoŤe, u okviru hemijske karakterizacije primenom kolorimetrijskih metoda biše odreŤen sadrţaj sekundarnih metabolita od znaţaja za farmaciju u metanolnim, 70%-nim acetonskim i vodenim ekstraktima herbi odabranih taksona roda Veronica. Uporedna kvalitativna i kvantitativna analiza odabranih ekstrakata ispitivanih vrsta biše sprovedena primenom razliţitih hromatografskih tehnika. Sadrţaj aukubina i akteozida u njima biše odreŤen primenom visokoefikasne teţne hromatografije (HPLC) i visokoefikasne teţne hromatografije na tankom sloju (HPTLC). Farmakološka karakterizacija podrazumeva ispitivanje antioksidantne, antiinflamatorne, antimikrobne, neuroprotektivne i citotoksiţne aktivnosti metanolnih i 70%-nih acetonskih ekstrakata taksona V. jacquinii, V. teucrium i V. urticifolia. 59 MATERIJAL I METODE 60 1. Biljni materijal Biljni materijal koriššen za analizu predstavljaju nadzemni delovi u cvetu ispitivanih vrsta roda Veronica, prikupljeni na odgovarajušim staništima planinskih regiona Srbije (Tabela 9). Determinacija biljnog materijala i taksonomska nomenklatura istraţivanih taksona uraŤena je prema Flori SR srbije VI (1974). Herbarski materijal je deponovan na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Beogradu, na Katedri za botaniku, kao i u Institutu za prouţavanje lekovitog bilja „Dr Josif Panţiš“. Veši deo biljnog materijala je osušen prirodnim putem na promajnom mestu u hladu, dok je za morfološku karakterizaciju koriššen sveţ biljni materijal u 50% etanolu. Neposredno pre pripreme odgovarajuših ekstrakata osušen biljni materijal je usitnjen mlevenjem. Tabela 9. Lokaliteti i vreme sakupljanja Vrsta Lokalitet i vreme sakupljanja Kolektorski broj V. jacquinii Vršaţke planine jun 2008. godine Leg. Ţivkoviš J. VR 159 Goţ* Jun 2009. godine Leg. Ţivkoviš J. VR 213 Stol* 10.06. 2009. godine Leg. Ţivkoviš J. & Arsenijeviš J., HFF 3219 Zlatibor** jun 2011. godine Leg. Ţivkoviš J. HFF 3536 V. teucrium Vršaţke planine jun 2008. godine Leg. Ţivkoviš J. VR 157 Stol* 10.06. 2009. godine Leg. Ţivkoviš J. & Arsenijeviš J., HFF 3218 Zlatibor** 61 jun 2011. godine V. urticifolia Goţ 9.06. 2009. godine Leg. Ţivkoviš J. VR 165 Zlatibor** jun 2011. godine Legenda: * - biljni materijal koriššen za ispitivanje neorganskog sastava; ** - biljni materijal koriššen za morfološku analizu Sa lokaliteta na kojima je sakupljen biljni materijal za odreŤivanje sadrţaja teških metala sakupljeni su i uzorci zemljišta (Tabela 10). Za ove lokalitete birane su oblasti sa najguššim vegetacionim pokrivaţem. Zemljište je sakupljeno sa površine udaljenosti do 10 m u odnosu na odgovarajušu biljku. Pre poţetka analize biljni i uzorci zemljišta su osušeni na sobnoj temperaturi i nakon toga samleveni. 62 Tabela 10. Lista biljnih uzoraka i lokaliteta sakupljanja Lokalitet Vrsta Stanište Koordinate Geološka podloga* 1. Goţ Veronica urticifolia Livada N 43° 33' 39.2'' E 20° 44' 24.8'' H 870 m Serpentinit 2. Goţ Veronica urticifolia Pilana N 43° 33' 29.5'' E 20° 44' 53.3'' H 840 m Serpentinit 3. Goţ Veronica urticifolia Livada pored sportskog terena N 43° 33' 28.6'' E 20° 44' 53.3'' H 858 m Serpentinit 4. Goţ Veronica urticifolia Livada N 43° 33' 32.8'' E 20° 45' 04.4'' H 844 m Serpentinit 5. Goţ Veronica jacquinii Livada N 43° 33' 39.2'' E 20° 44' 24.8'' H 870 m Serpentinit 6. Vršaţke planine Veronica teucrium Planinski put (umeren saobrašaj) N 45° 07' 11.7'' E 21° 19' 47.1'' H 293 m Gnajs 63 7. Vršaţke planine Veronica teucrium Šumska staza N 45° 07' 10.5'' E 21° 19' 57.6'' H 291 m Gnajs 8. Vršaţke planine Veronica teucrium Šumska staza N 45° 07' 18.5'' E 21° 21' 10.0'' H 418 m Gnajs 9. Vršaţke planine Veronica jacquinii Planinarski dom N 45° 07' 37.7'' E 21° 20' 31.9'' H 357 m Gnajs 10. Stol Veronica jacquinii Šuma N 44° 10' 08.3'' E 22° 07' 41.8'' H 831 m Kreţnjak 11. Stol Veronica teucrium Planinarski dom N 44° 10' 19.6'' E 22° 07' 30.0'' H 855 m Kreţnjak * Markoviš i sar., 1984 64 2. Instrumenti i operativni uslovi Za morfološku, hemijsku i farmakološku analizu ispitivanih taksona koriššene su razliţite instrumentalne metode i aparati. Za histohemijsku analizu koriššen je LEICA DCML svetlosni mikroskop opremljen digitalnom kamerom i softverom IM 1000. Za fluorescentnu mikroskopiju biljnih preseka koriššen je epifluorescentni mikroskop LEICA DMLS opremljen HBO 50 W ţivinom lampom i rasponom filter blokova (A: BP 340 - 380, I3: BP 450-490 i N2.1: BP 515-580). Aktivna i potencijalna kiselost zemljišta merena je na pHM 240 Radiometer analitiţkom pH-metru. Za mikrotalasnu digestiju biljnih i uzoraka zemljišta u kiseloj sredini koriššena je mikrotalasna pešnica CEM MDS-2000. OdreŤivanje sadrţaja Cu, Zn, Mn i Fe u biljnim i uzorcima zemljišta vršeno je na atomskom apsorpcionom spektrofotometru Perkin-Elmer, model 5000 sa šupljom katodnom lampom. Za odreŤivanje Cr koriššen je takoŤe atomski apsorpcioni spektrofotometar Perkin- Elmer, model 5000, ali sa grafitnom peši HGA 400 sa automatskim kontrolorom sagorevanja i pirolitiţkim grafitnim kivetama. Spektrofotometrijsko odreŤivanje sadrţaja ukupnih iridoida, fenola i fenilpropanoida je uraŤeno na UV/VIS spektrofotometru Hewlett-Packard, model HP 8543. Visokoefikasna teţna hromatografija (HPLC) izvedena je na aparatu Agilent 1200 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) opremljenim detektorom sa diodnim nizom (DAD) model G1315B, binarnom pumpom model G1312A i autosemplerom model G1313A, na koloni Agilent Zorbax SB – C18, veliţine ţestica 5 µm i dimenzija 150 × 4,6 mm. Visokoefikasna tankoslojna hromatografija (HPTLC) izvedena je na Camag aparatu (Švajcarska) opremljenom Linomat 5 aplikatorom, automatskom komorom za razvijanje ploţe ADC2, Scanner 3 spektrodensitometrom i Reprostar 3 sistemom za dokumentaciju. Za LC-DAD-ESI/MS analizu ispitivanih herbi koriššen je Agilent 1100 aparat kuplovan sa kvaternernom pumpom i DAD detektorom. Kontrola instrumenata, prikupljanje i obrada podataka vršeni su primenom HPChem Station softvera (ver. A. 05. 04). Primenjena je Waters Spherisorb S3 ODS-2 C18 kolona, veliţine ţestica 3 μm i dimenzija 150 × 4,6 mm. 65 Za MS detekciju primenjen je API 3200 Qtrap opremljen ESI izvorom i tripl – kvadrupol analizatorom mase koji je kontrolisan primenom Analyst 5.1. softvera. Za LC-MS/MS analizu odabranih fenolnih jedinjenja u ekstraktima odabranih taksona, kao i za kvantitativnu analizu metabolita arahidonske kiseline, koriššen je Agilent 1200 aparat kuplovan sa 6410B trostrukim kvadrupolom masenim spektrometrom sa elektrosprej jonizacijom (ESI). Kontrola instrumenata, prikupljanje i obrada podataka vršeni su primenom Agilent softvera „MassHunter“ (ver. B.03.01). 3. Priprema ekstrakata Osušen i sprašen biljni materijal ekstrahovan je u tamnim bocama tokom 48 h uz povremeno mešanje. Odnos droge i ekstrakcionog sredstva je iznosio 1:20 (m/v). Nakon završene ekstrakcije, pod istim uslovima izvršena je i re-ekstrakcija. Dobijeni ekstrakti su sjedinjeni, a rastvaraţ je uklonjen uparavanjem pod sniţenim pritiskom. Ekstrakti su dodatno osušeni do konstantne mase u vakuum-eksikatoru, na sobnoj temperaturi. Kako razlike u polaritetu odabranog ekstrakcionog sredstva utiţu na rastvorljivost sekundarnih metabolita prisutnih u uzorku, svaka od tri ispitivane Veronica vrste ekstrahovana je posebno sa vodom, metanolom i 70%-nim acetonom. Prinos dobijenih ekstrakata prikazan je u Tabeli 11. Dobijeni suvi ekstrakti su ţuvani u vakuum eksikatoru i neposredno pre hemijskih i farmakoloških ispitivanja rastvarani su u odgovarajušem rastvaraţu primenom ultrazvuţnog kupatila i nakon toga su filtrirani. Tabela 11. Prinos ekstrakata odabranih Veronica vrsta dobijenih procesom maceracije uz primenu metanola, vode i 70%-nog acetona kao ekstrakcionog sredstva Vrsta Prinos nakon maceracije metanolom (%) Prinos nakon maceracije 70% acetonom (%) Prinos nakon maceracije vodom (%) V. urticifolia 18,52 26,18 26,22 V. teucrium 26,32 41,34 34,21 V. jacquinii 26,78 36,74 37,01 66 4. Morfološko-anatomska karakterizacija 4.2. Mikroskopska analiza Mikroskopska analiza sprašenog biljnog materijala (Veronicae jacquinii pulvis, Veronicae teucrium pulvis i Veronicae urticifoliae pulvis) izvršena je primenom opšteg reaktiva. Opšti reaktiv za mikroskopiranje sadrţi sledeše reagense: anilin sulfat (boji odrvenjene elemente zlatnoţuto), feri-amonijum sulfat (boji tanine plavocrveno ili zeleno), sudan III (boji masna i etarska ulja, smole, suberin, kutin i vosak crveno) i jod (boji skrob plavoljubiţasto). Anatomska graŤa stabla i lista istraţivanih biljaka analizirana je na trajnim preparatima pravljenim standardnom parafinskom metodom (debljine 5-10 μm) i dvojno obojenim primenom alcian plavog i safranina (1% u 50% etanolu) primenom svetlosne mikroskopije. 4.3. Histohemijska analiza Za sva histohemijska ispitivanja koriššen je sveţ biljni materijal. Popreţni preseci stabla i lista ispitivanih vrsta su ruţno pravljeni. Koriššeni su sledeši reagensi: Lugol za skrob (Johansen, 1940), Sudan III (Johansen, 1940; Lison, 1960), fero sulfat i feri hlorid za fenolna jedinjenja (Johansen 1940), aluminijum-trihlorid za flavonoide (Guerin i sur., 1971), gvoţŤe- sulfat i gvoţŤe-hlorid (Clark, 1981; Johansen, 1940) za tanine/fenolna jedinjenja, Wagner-ov i Dittmar-ov reagens za alkaloide (Furr i Mahlberg, 1981) i antimon-trihlorid za steroide (Hardman i Sofowora, 1972). Standardni kontrolni postupci u svim testovima su uraŤeni istovremeno. 4.4. Fluorescentna mikroskopija Nebojeni preseci su posmatrani na epifluorescentnom mikroskopu pod UV svetlom (340-380 nm), kako bi se ispitala prisutnost fenola koji autofluoresciraju na ovim talasnim duţinama (Ruzin, 1999). Ispitivani uzorci su takoŤe tretirani aluminijum trihloridom u cilju ispitivanja prisustva flavonoida (Guerin i sar., 1971). 67 5. Hemijska analiza 5.1. OdreĎivanje sadržaja teških metala u biljnim i uzorcima zemljišta 5.1.1. OdreŤivanje kiselosti zemljišta Kiselost uzoraka zemljišta merena je u supernatantu suspenzije zemljišta. Za odreŤivanje aktivne (stvarne) kiselosti suspenzija je dobijena mešanjem zemljišta i destilovane vode u odnosu 1 : 2,5. Isti odnos primenjen je i kod odreŤivanja potencijalne kiselosti, ali je umesto destilovane vode koriššen 1 M rastvor KCl kako bi postali dostupni i H + joni adsorbovani za koloidne ţestice zemljišta. 5.1.2. Mikrotalasna digestija Za razaranje materijala koriššena je mikrotalasna digestija u kiseloj sredini. U 0,5 g uzorka (suva masa) dodato je 2 ml H2O2 (30% v/v) i 7 ml HNO3, a zatim je izvršeno spaljivanje po zadatom temperaturnom programu. Nakon spaljivanja, uzorci su hlaŤeni i razblaţivani redestilovanom vodom do zapremine od 25 ml. Uporedo je pripremana i slepa proba. 5.1.3. Atomska apsorpciona spektrometrija OdreŤivanje sadrţaja Cu, Zn, Mn i Fe izvršeno je metodom plamene atomske apsorpcione spektrometrije (FAAS) uz primenu šupljih katodnih lampi. Signali su mereni uz primenu deuterijumske lampe za pozadinsku korekciju pri optimalnoj visini plamena. OdreŤivanje sadrţaja Cr izvršeno je metodom atomske apsorpcione spektrometrije sa grafitnom kivetom (GF-AAS) uz primenu sledešeg temperaturnog programa: 110, 1650, 2500 i 2650°C, za sušenje, pirolizu, atomizaciju i ţiššenje. U Tabeli 12 prikazane su radne talasne duţine za svaki od analiziranih elemenata, kao i limiti detekcije za primenjenu metodu. 68 Tabela 12. Radni uslovi za atomsku apsorpcionu spektroskopiju Element λa [nm] λb [nm] MDL [mg/kg] Radni opseg [mg/kg] Cu 324,7 - 0,05 4 Fe 248,3 - 0,05 10 Mn 279,5 - 0,05 2 Zn 213,9 - 0,05 1 Cr - 357,6 0,005 0,2 a FAAS, b GF-AAS, MDL – detekcioni limit metode. Taţnost metode je potvrŤena analizom ispitivanih teških metala u uzorcima standardnih referentnih materijala (NIST SRM 1547 – Peach Leaves i NIST SRM 2711 – Montana II Soil) (Tabela 13). Kvantifikacija je izvršena eksternom kalibracijom nakon regresione i korelacione analize. Tabela 13. Sadrţaj teških metala u uzorcima standardnih referentnih materijala NIST SRM 1547 – Peach Leaves NIST SRM 2711 – Montana II Soil Element Dobijeni sadrţaj (μg/g) Sertifikovana vrednost (μg/g) Taţnost (%) Dobijeni sadrţaj (μg/g) Sertifikovana vrednost (μg/g) Taţnost (%) Cu 4,2 ± 0,5 3,7 ± 0,4 113,5 120,0 ± 3,0a 114,0 ± 2,0a 95,0a Fe 199,0 ±12,0 218,0 ± 14,0 91,2 2,7 ± 0,1b 2,9 ± 0,1b 92,4b Mn 113,0 ± 8,0 98,0 ± 3,0 115,3 685,0 ± 30,0a 638,0 ± 28,0a 107,4a Zn 19,6 ± 0,5 17,9 ± 0,4 109,5 325,1 ± 3,2a 350,4 ± 4,8a 92,8a Cr 0,9 1,0 89,0 51,0 a 47,0 a 108,5 a a – μg/ml; b - %. 69 5.2. VIS spektrofotometrijske metode 5.2.1. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih fenola Sadrţaj ukupnih fenola u vodenim, metanolnim i 70%-nim acetonskim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica je odreŤivan spektrofotometrijski na bazi reakcije sa Folin- Ciocalteu (FC) reagensom (Velioglu i sar., 1998). Ispitivani suvi ekstrakti su rastvoreni u 25 ml odgovarajušeg ekstrakcionog sredstva. Sto mikrolitara dobijenog teţnog ekstrakta je dodato u 750 μl razblaţenog (1:10) FC reagensa. Pet minuta kasnije, dodato je 750 μl natrijum-karbonata (60 mg/ml). Nakon 90 min inkubacije na sobnoj temperaturi, izmerena je apsorbancija na 725 nm. Za kalibraciju standardne krive koriššena je galna kiselina (0-100 mg/l). Rezultati su izraţeni kao ekvivalenti galne kiseline po gramu suvog ekstrakta. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri odreŤivanja. 5.2.2. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih fenilpropanoida Sadrţaj ukupnih fenilpropanoida u ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica odreŤivan je spektrofotometrijskom metodom, po proceduri opisanoj u Evropskoj farmakopeji 6.0 za drogu Ballotae nigrae herba (Ph. Eur. 6.0., 2007). Suvi ekstrakt rastvoren je u odgovarajušem ekstrakcionom sredstvu (metanol, voda ili 70%-ni aceton). Dobijeni teţni ekstrakt prenet je odmernu tikvicu od 100 ml, i nakon toga dopunjen istim ekstrakcionim sredstvom. Jedan ml dobijenog osnovnog rastvora prenet je u odmernu tikvicu od 10 ml, dodata su 2 ml hlorovodoniţne kiseline (0,5 M), i 2 ml rastvora nastalog rastvaranjem 10 g natrijum nitrita i 10 g natrijum molibdata u 100 ml vode. Nakon toga je dodato i 2 ml rastvora natrijum hidroksida (2 M) i dopunjeno je vodom do crte. Slepa proba dobijena je prenošenjem 1 ml osnovnog ekstrakta u odmernu tikvicu od 10 ml, dodavanjem 2 ml hlorovodoniţne kiseline (0,5 M), a zatim i 2 ml rastvora natrijum hidroksida (2 M) i dopunjavanjem do crte. Apsorbancija uzorka merena je uz slepu probu na 525 nm. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri odreŤivanja. Sadrţaj fenilpropanoida izraţen je kao sadrţaj derivata hidroksicimetne kiseline, prema formuli: 70 % akteozida = (A × 1000 / m × 185) A - apsorbancija uzorka m - masa ekstrakta u g. 5.2.3. OdreŤivanje sadrţaja ukupnih iridoida Sadrţaj ukupnih iridoida u metanolnim, vodenim i 70%-nim acetonskim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica odreŤivan je spektrofotometrijskom metodom, na bazi reakcije sa Trimm-Hill reagensom (Jankoviš i sar., 2012). Suvi ekstrakt (5 mg), rastvoren je u odgovarajušem ektrakcionom sredstvu (metanol, voda, 70%-ni aceton). Sto mikrolitara dobijenog teţnog ekstrakta pomešano je sa 1 ml Trim-Hill reagensa (siršetna kiselina: 0,2% bakar (II) sulfat: koncentrovana hlorovodoniţna kiselina/ 10:1:0.5). Uzorak je grejan 5 min na 100°C. OhlaŤenom rastvoru merena je apsorbancija na 609 nm. Za kalibraciju standardne krive koriššen je aukubin (0,1-1 mg/ml). Rezultati su izraţeni kao ekvivalenti aukubina po gramu suvog ekstrakta. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri odreŤivanja. 5.3. Kvantitativna HPTLC analiza aukubina i akteozida Za HPTLC analizu 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi ispitivanih vrsta roda Veronica, po 40 mg suvog ekstrakta je ekstrahovano sa 2 ml metanola. Ovako dobijeni ekstrakti su pre injektovanja filtrirani kroz membranski filter (0,45 m). Za analizu je koriššena HPTLC silika gel 60F254 staklena ploţa (Merk, Nemaţka), dimenzija 20 x 10 cm. Ploţe su razvijane u mobilnoj fazi etilacetat: mravlja kiselina: siršetna kiselina: voda u odnosu 90: 15: 15: 20 (v/v/v/v) u automatskoj komori koja je prethodno zasišena parama mobilne faze u trajanju od 20 min uz primenu filtar papira. Ekstrakti su naneti na ploţu u zapremini 1-4 μl, dok su rastvori aukubina koncentracije 250 μg/ml i akteozida koncentracije 500 μg/ml naneti u zapremini od 0,5 – 4 μl. Svi rastvori su naneti u vidu trake duţine 9 mm, na visini 8 mm od ivice ploţe pomošu šprica Hamilton (zapremine 100 μl). Ploţa je razvijana do visine od 80 mm od ivice ploţe. Nakon razvijanja, ploţe su osušene na 120 °C tokom 10 min. Posthromatografska derivatizacija ploţe izvršena je njenim uranjanjem na par sekundi u reagens 71 anisaldehid/sumporna kiselina, nakon ţega je ploţa osušena na 105 °C tokom 5 min. Pošto je vizuelizacija omogušena, ploţa je skenirana na 520 nm, a evaluacija je izvršena polinomijalnom regresionom analizom preko površine pika. 5.4. Kvantitativna HPLC analiza aukubina i akteozida Za HPLC analizu ispitivani ekstrakti rastvoreni su u eluentu A (1%-na ortofosforna kiselina u vodi), a zatim profiltrirani kroz membranski filter (0,45 μm). Kao mobilna faza koriššena je 1%-na ortofosforna kiselina u vodi (faza A) i acetonitril (faza B). Injekciona zapremina uzorka je bila 5 μl, a eluiranje je vršeno gradijentom po sledešoj šemi: 0 – 5 min, 2 – 10% B; 5 – 10 min, 10 – 15% B; 10 – 30 min, 15% B, 30 – 32 min, 15 – 18% B; 32 – 42 min, 18% B; 42 – 50 min, 18 – 25% B; 50 – 55 min, 25 – 40% B; 55 – 60 min, 40 – 70% B; 60 – 63 min, 70 – 100% B. Brzina protoka iznosila je 1 ml/min, a UV apsorbancija je merena na 204, 270 i 330 nm. Statistiţka analiza Podaci su obraŤeni u programu Origin, verzija 8,0. Za procenu znaţajnosti razlike vrednosti aukubina dobijenih primenom HPLC i HPTLC tehnika koriššen je Studentov t-test. Nivo znaţajnosti je postavljen na 0,05. 5.5. HPLC-DAD/ESI-MS analiza Jedan g droge ekstrahovan je sa 30 ml 80%-nog metanola na sobnoj temperaturi, tokom 1 h uz neprekidno mešanje. Dobijeni ekstrakt je profiltriran, dok je ostatatak reekstrahovan sa 2 puta po 30 ml istog ekstrakcionog sredstva. Ekstrakti su spojeni, upareni do suva i potom rastvoreni u 80% metanolu do koncentracije 5 mg/ml. Kao mobilna faza koriššeni su 0,1%-na mravlja kiselina u vodi (faza A) i acetonitril (faza B). Injekciona zapremina uzorka je 5 μl, a eluiranje je vršeno gradijentom po sledešoj šemi: 0 – 5 min, 15% B; 5 – 10 min, 15 – 20% B; 10 – 20 min, 20 – 25% B; 20 – 30 min, 25 – 35% B; 30 – 40 min, 35 – 50% B, nakon ţega sledi re-ekvilibracija kolone. 72 Brzina protoka iznosila je 0,5 ml/min, a UV apsorbancija je merena na 280 i 370 nm. Pritisak nosešeg gasa (N2) iznosio je 20 psi, dok je pritisak raspršivaţa bio 40 psi na 400 ºC. Za elektrosprej jonizaciju primenjen je negativan mod pri kapilarnom naponu od 4500 V. Identifikacija jedinjenja je izvšena nа osnovu kаrаkteristiţnog izgledа UV spektrа i molekulske formule izrаţunаte iz preciznih mаsа kvаzimolekulskih jonа u ESI mаsenim spektrima. UV spektri, MS spektri i retenciona vremena identifikovanih jedinjenja su potom uporeŤeni sa odgovarajušim podacima za standardna jedinjenja, ili sa literaturnim podacima. Za kvantitativnu analizu fenolnih jedinjenja koriššene su kalibracione krive dobijene nakon injektovanja poznatih koncentracija (1-100 μg/ml) razliţitih standardnih jedinjenja: luteolin- 7-O-glukozida, apigenin-7-O-glukozida, hlorogenske kiseline, kafene kiseline, p-kumarinske kiseline. 5.5. Kvantitativna LC-MS/MS analiza odabranih fenolnih jedinjenja Odabrane fenolne komponente u 70%-nim acetonskim ekstrakatima kvantifikovane su primenom LC-MS/MS tehnike i metode prethodno opisane u doktorskoj disertaciji Marije Lesjak (2011). Za hromatografsko razdvajanje je koriššena reverzno fazna kolona Zorbax Eclipse XDB-C18 RR, veliţine ţestice 1,8 µm i dimenzija 50 × 4,6 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Binarna mobilna faza se sastojala od 0,05%-ne mravlje kiseline (A) i metanola (B). Injekciona zapremina je iznosila 5 µl a eluiranje je vršeno gradijentom po sledešoj šemi: 0-6 min 30-70% B, 6-9 min 70-100% B, 9-12 min 100% B, uz post-vreme od 3 min, pri protoku od 1 ml/min i temperaturi od 45 ºC. Protok nosešeg gasa (N2) je bio 9 l/min, pritisak raspršivaţa 40 psi a temperatura nosešeg gasa 350°C. Za elektrosprej jonizaciju (ESI) primenjeni su negativna jonska polarnost i kapilarni napon 4000 V. Sva jedinjenja su kvantifikovana prašenjem višestrukih reakcija (MRM reţim). Optimizirani MS/MS parametri su dati u Tabeli 14. Ispitivani ekstrakti su rastvoreni u mobilnoj fazi do koncentracije 0,2 mg/ml, a standardna jedinjenja u DMSO do koncentracije 10 mg/ml. Pripremljena je smeša ovih rastvora pri ţemu je koncentracija svakog standarda u smeši iznosila 100 μg/ml. Za izradu kalibracione krive napravljena je serija razblaţenja pri ţemu je opseg koncentracija standardnih jedinjenja iznosio od 0,0015 do 25 μg/ml. Iz površine pikova primenom jednaţine za linearnu regresionu analizu dobijene primenom 73 kalibracionih krivih (r 2 >0,995) odreŤena je njihova koncentracija u ispitivanim ekstraktima. Identifikacija jedinjenja je izvšena nа osnovu molekulske formule izrаţunаte iz preciznih mаsа kvаzimolekulskih jonа u ESI mаsenim spektrima. MS spektri i retenciona vremena identifikovanih jedinjenja su potom uporeŤeni sa odgovarajušim podacima za standardna jedinjenja. Svi koriššeni standardi nabavljeni su od proizvoŤaţa Sigma-Aldrich Chem (Steinheim, Germany), Fluka Chemie GmBH (Buchs, Swizerland) ili ChromaDex (Santa Ana, USA). Tabela 14. LC-MS/MS podaci za standardna jedinjenja (Lesjak, 2011) Jedinjenje Prekursor jon m/z Produkt jon m/z Napon fragmentora (V) Koliziona energija (V) Retenciono vreme (min) Hina kiselina 191 85 150 20 0.52 Galna kiselina 169 125 90 10 0.58 Katehin 289 245 150 10 0.74 Protokatehinska kiselina 153 109 105 9 0.79 Hlorogenska kiselina 353 191 100 10 0.80 Epigalokatehin galat 457 169 165 16 0.81 Epikatehin 289 245 150 10 0.95 2,5- dihidroksibenzoeva kiselina 153 109 100 9 1.03 p-hidroksibenzoeva kiselina 137 93 80 10 1.08 Eskuletin 177 133 105 15 1.13 Kafena kiselina 179 135 100 10 1.18 Vanilinska kiselina 167 108 100 15 1.24 Siringinska kiselina 197 182 90 7 1.31 p-kumarinska 163 119 90 9 1.69 74 kiselina Umbeliferon 161 133 120 19 1.73 Skopoletin 191 176 80 8 1.77 Ferulna kiselina 193 134 90 11 1.90 Viteksin 431 311 200 22 1.90 Sinapinska kiselina 223 193 100 17 1.92 Luteolin-7-O- glukozid (Cinarozid) 447 285 230 30 2.13 Kvercetin-3-O- galaktozid (Hiperozid) 463 300 200 30 2.16 Kvercetin-3-O- glukozid (Izokvercetin) 463 300 210 30 2.25 Kvercetin-3-O- rutinozid (Rutin) 609 300 135 42 2.33 Apiin 563 269 250 36 2.60 o-kumarinska kiselina 163 119 100 5 2.62 Miricetin 317 179 150 20 2.67 Kvercetin-3-O- ramnozid (Kvercitrin) 447 300 190 27 2.67 Kempferol-3-O- glukozide (Astragalin) 447 284 190 30 2.80 Apigenin-7-O- glukozid (Apigetrin) 431 268 135 41 2.81 Sekoizolaricirezinol 361 165 130 26 2.90 3,4- 207 103 110 7 2.99 75 dimetoksicimetna kiselina Bajkalin 445 269 140 22 3.40 Daidzein 253 208 145 31 3.43 Matairezinol 357 122 130 24 3.66 Kvercetin 301 151 130 15 3.43 Naringenin 271 151 130 16 3.87 Cimetna kiselina 147 103 100 5 3.91 Luteolin 285 133 135 25 4.03 Genistein 269 133 145 32 4.12 Kemferol 285 285 130 0 4.55 Apigenin 269 117 130 25 4.71 Izoramnetin 315 300 160 21 4.79 Hrizoeriol 299 284 125 20 4.82 Bajkalein 269 269 165 0 5.15 Amentoflavon 537 375 220 35 5.78 76 6. Farmakološka analiza 6.1. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti 6.1.1. In vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti Za in vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi odabranih taksona roda Veronica primenjena su dva testa: - FRAP test za odreŤivanje ukupne antioksidantne aktivnosti i - DPPH test za odreŤivanje sposobnost neutralizacije DPPH radikala. 6.1.1.1. Ispitivanje ukupne antioksidantne aktivnosti (FRAP test) FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma) test primenjuje se za odreŤivanje ukupnog antioksidantnog potencijala uzorka, a zasnovan je na redukciji Fe 3+ - 2,4,6,-tripiridil-S-triazin (Fe 3+ - TPTZ) kompleksa do plavo obojenog Fe 2+ - TPTZ kompleksa pri niskoj pH vrednosti ţiji se intenzitet boje meri na 593 nm (Pellegrini i sar., 2003). Reagens za FRAP test je dobijen mešanjem 2,5 ml rastvora TPTZ (10 mmol/l 2,4,6-tripiridil-s-triazina u 40 mmol/l hlorovodoniţne kiseline), 2,5 ml rastvora FeCl3 × 6 H2O (20 mmol/l u destilovanoj vodi) i 25 ml acetatnog pufera (300 mmol/l, pH = 3,6). U epruvete je sipano 3 ml FRAP reagensa, 100 µl ekstrakta odgovarajuše koncentracije rastvorenog u smeši acetona i vode, nakon ţega je sadrţaj inkubiran 30 min na 37 °C. Apsorbancija rastvora je zatim merena na 593 nm. Za kalibraciju su koriššeni vodeni rastvori FeSO4 poznate koncentracije (u rasponu od 100-1000 mmol/l). Ukupna antioksidantna aktivnost ekstrakata je izraţena kao µmol Fe2+/mg. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri odreŤivanja. 6.1.1.2. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala Sposobnost ekstrakata herbi odabranih vrsta roda Veronica da neutrališu 2,2-difenil-1- pikrilhidrazil (DPPH) radikal je ispitivana po metodi Cuendet-a i saradnika (1997). Usled prisustva nesparenog elektrona DPPH snaţno apsorbuje u vidljivom delu spektra na talasnoj 77 duţini od 517 nm (ljubiţasta boja). Nakon sparivanja elektrona boja prelazi u ţutu, što predstavlja merilo intenziteta antiradikalske aktivnosti i odreŤuje se spektrofotometrijski. Na poţetku testa napravljena je serija razblaţenja ispitivanih ekstrakata u 70%-nom acetonu. Po 4 ml dobijenih teţnih ekstrakata je pomešano sa 1 ml 0,5 mM rastvora DPPH u 70%-nom etanolu i ostavljeno u mraku 30 min. Apsorbancija rastvora je zatim merena na 517 nm. Procenat neutralizacije DPPH radikala je izraţunat koriššenjem sledeše formule: I (%) = [(Ak-Aa) / Ak] × 100 gde je Ak apsorbancija negativne kontrole (koja umesto rastvora ekstrakta sadrţi 4 ml odgovarajušeg rastvaraţa), a Aa je apsorbancija uzoraka. Koncentracija ekstrakata potrebna za neutralizaciju 50% DPPH radikala (EC50 vrednosti) je odreŤena iz grafika zavisnosti procenta neutralizacije DPPH radikala od koncentracije ekstrakta, primenom algoritma nelinearne regresije. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri odreŤivanja. 6.1.2. In vivo ispitivanje antioksidantne aktivnosti In vivo ispitivanje antioksidantne aktivnosti 70%-nih ekstrakata odabranih vrsta roda Veronica sprovedeno je primenom postupka opisanog u doktorskoj disertaciji Tatjane Šeboviš (2006). 6.1.2.1. Eksperimentalne ţivotinje Postupak rada sa eksperimentalnim ţivotinjama, kao i primenjeni eksperimentalni protokoli u skladu su sa Pravilnikom o radu i koriššenju laboratorijskih ţivotinja koji ureŤuje Etiţka komisija pri Univerzitetu u Novom Sadu. Koriššeni su pacovi soja Spargue Dawley dobijeni iz laboratorije Samostalnog odseka za biohemiju Instituta za laboratorijsku medicinu, Kliniţkog centra Novi Sad (Novi Sad, Vojvodina, Srbija). Ţivotinje su ţuvane u odgovarajušim kavezima, u strogo kontrolisanim uslovima temperature (25 °C) i vlaţnosti vazduha (30-50%), pri reţimu svetlo - tama 12h:12h, uz slobodan pristup odgovarajušoj 78 standardnoj hrani za pacove (PA sa 20% proteina, Veterinarski zavod Subotica, Vojvodina, Srbija) i vodi. Pacovi koriššeni u ispitivanju bili su oba pola, telesne mase 200-250 g. 6.1.2.2. Postupak in vivo ispitivanja Eksperimenti su uraŤeni sa pripremljenim 70%-nim acetonskim ekstraktima odbranih taksona. Sve ţivotinje su jednakrotno intraperitonealno (i.p.) primale odgovarajuše ekstrakte, odnosno fiziološki rastvor (kontrolna grupa). Ispitivanja na Spargue Dawley pacovima su sprovedena i planirana prema protokolu prikazanom u Tabeli 15. Na kraju eksperimenta ţivotinje su izmerene, anestezirane izofluranom i dekapitovane. Uzorci krvi za biohemijske analize dobijeni su iz donje šuplje vene, a masa jetre je izmerena nakon uklanjanja ţuţne kese. Uzorci tkiva jetre mase 1 g su homogenizovani u TRIS-HCl/saharoznom medijumu (50 mM, 0.25M, pH 7.40) odnos 1:3, 4°C, primenom Potter-Elvehjem-ovog seta za homogenizaciju. Dobijeni homogenat je centrifugiran na 3000 o/min tokom 10 min, a koncentracija proteina odreŤena je biuretskom metodom primenom bovinog serum albumina kao standarda (Wood, 1989). Eksperiment je ponovljen za svaki ispitivani ekstrakt. Uzorci krvi i jetre koriššeni su za odreŤivanje biohemijskih parametara oksidativnog stresa. 79 Tabela 15. Protokol tretmana eksperimentalnih ţivotinja Grupe ţivotinja: 1 2 3 4 5 6 7 8 V re m e kontrolna grupa CTRL negativna kontrolna grupa CTRL-CCL4 A B C А-CCl4 B-CCl4 C-CCl4 1 – 6 . d a n fiziološki rastvor 2,0 mL/kg i.p. fiziološki rastvor 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 1,0% 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 2,0% 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 5,0% 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 1,0% 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 2,0% 2,0 mL/kg i.p. ispitivani ekstrakt 5,0% 2,0 mL/kg i.p. 7 . d a n CCL4 2,0 mL/kg i.p. - - - CCL4 2,0 mL/kg i.p. CCL4 2,0 mL/kg i.p. CCL4 2,0 mL/kg i.p. 8 . d a n ţrtvovanje 80 6.1.2.3. Biohemijska ispitivanja In vivo ispitivanje antioksidantnih svojstava 70%-nih acetonskih ekstrakata odabranih Veronica vrsta podrazumevalo je prašenje biohemijskih parametara (iz homogenata jetre i hemolizata krvi) oksidativnog stresa. Ovi biohemijski testovi ukljuţivali su odreŤivanje aktivnosti nekoliko antioksidantnih enzima: ksantin oksidaze (XOD) (Bergmayer, 1970), katalaze (CAT) (Beers i Sizer, 1950), peroksidaze (Px) (Simon i sar., 1974), glutation peroksidaze (GSHPx) (Chin, 1976), glutation reduktaze (GR) (Goldberg i Spooner, 1983), kao i sadrţaja redukovanog glutationa (GSH) (Beuthler, 1983), i intenziteta lipdne peroksidacije (LPx) (Buege i Aust, 1978). Ksantin oksidaza (XOD) Sadrţaj ksantin oksidaze (XOD) odreŤen je spektrofotometrijski merenjem promene apsorbancije na 293 nm, pri transformaciji ksantina u mokrašnu kiselinu (Bergmayer, 1970). U uzorak homogenata jere zapremine 20-50 μl dodato je 3 ml rastvora EDTA i ksantina (1 mol/l) u fosfatnom puferu (pH 7,5). Nakon odreŤenog vremena reakcija je zaustavljena, a reakciona smeša je centrifugirana na 3000 o/min u toku 10 min. Apsorbancija reakcionog proizvoda je izmerena na 293 nm. Rezultati su izraţunati na osnovu specifiţnog apsorpcionog koeficijenta mokrašne kiseline (ε=1,2×104 l/mol˖cm) i izraţeni u nmol mokrašne kiseline koji nastaje tokom 1 min po 1 mg proteina homogenata jetre. Katalaza (CAT) Sadrţaj katalaze odreŤen je primenom vodonik peroksida (H2O2) kao supstrata (Beers i Sizer, 1950). Uzorak homogenata jetre zapremine 20-50 μl dodat je u 3 ml rastvora H2O2 u fosfatnom puferu (pH 7) pripremljenog mešanjem 0,075 ml 30% H2O2 sa puferom (0,05 mol/l; pH 7) i dopunjen do 50,0 ml. Nakon odreŤenog vremena reakcija je zaustavljena, a reakciona smeša je centrifugirana na 3000 o/min tokom 10 min. Izmerena je apsorbancija na 240 nm, a rezultati su izraţeni u nmol/mg proteina (ε=4,36×104 L/mol˖cm). 81 Peroksidaza (Px) Sadrţaj peroksidaze (Px) odreŤen je primenom vodonik peroksida kao supstrata (Simon i sar., 1974). Na uzorak homogenata jetre zapremine 20-50 μl dodato je 3 ml fosfatnog pufera (0,1 mol/l, pH 7), 50 μl rastvora gvajakola (0,02 mol/l) i 40 μl rastvora vodonik peroksida (0,14 ml 30% H2O2 u 100 ml H2O). Nakon odreŤenog vremena reakcija je zaustavljena, a reakciona smeša centrifugirana je na 3000 o/min tokom 10 min. Merena je apsorbancija reakcionog proizvoda na 436 nm, a rezultati su izraţeni u nmol/mg proteina (ε=2,3×104 l/mol˖cm). Glutation peroksidaza (GSHPx) Sadrţaj glutation peroksidaze (GSHPx) odreŤen je primenom kumol hidroperoksida (α- dimetil-benzilhidroperoksid) kao supstrata (Chin, 1976). Smeša uzorka homogenata jetre zapremine 20-50 μL i 0,75 ml TRIS/HCl pufera (0,05 mol/l, pH=7,6) je termostatirana 10 min na temperturi od 37°C, a potom je dodato 0,1 ml rastvora GSH koncentracije 0,0021 mol/l i 0,1 ml metanolnog rastvora kumol hidroperoksida (1:200). Dobijena smeša je termostatirana 5 min na 37 °C. Za zaustavljanje reakcije dodat je 1 ml 20%-nog rastvora TCA. Reakciona smeša je centrifugirana na 3000 o/min tokom 10 min. Potom je u 2 ml TRIS/HCl pufera pH vrednosti 8,9 (pufer II) koncentracije 0,4 mol/L dodat 1 ml supernatanta i 0,1 ml rastvora Elmanovog reagensa (0,02 g 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoeve kiseline) DTNB (0,02 g u 5 ml pufera II). Merena je apsorbancija reakcionog proizvoda na 412 nm. Rezultati su izraţeni u nmol/mg proteina (ε=1,36×104 L/mol˖cm). Glutation reduktaza (GR) Sadrţaj glutation reduktaze odreŤen je prašenjem enzimske reakcije redukcije oksidovanog gutationa (GSSG) u prisustvu NADPH (Goldberg i Spooner, 1983). Reakciona smeša je pripremljena od 20-50 μl homogenata jetre, 0,2 ml 2%-nog rastvora GSSG, 0,3 ml rastvora NADPH (0,001 mol/l) i 2 ml fosfatnog pufera (pH=7,6). Nakon odreŤenog vremena reakcija je stopirana, a reakciona smeša je centrifugirana na 3000 o/min tokom 10 min. Apsorbancija nastalog proizvoda merena je na 340 nm. Rezultati su izraţeni u nmol/mg poteina (ε=6,22×10-3 l/mol˖cm). 82 Redukovani glutation (GSH) Sadrţaj redukovanog glutationa (GSH) odreŤen je na osnovu sadrţaja neproteinskih sulfhidrilnih ostataka odreŤenog pomošu Ellman-ovog reagensa (Beuthler, 1984). Nakon centrifugiranja smeše homogenata jetre zapremine 1 ml i 2 ml rastvora 4%-ne sulfosalicilne kiseline tokom 10 min na 3000 o/min, supernatant je pomešan sa Ellman-ovim reagensom u odnosu 1:40. Apsorbancija dobijenog proizvoda merena je na 412 nm. Sadrţaj GSH izraţunat je iz molarnog apsorpcionog koeficijenta, a preraţunat na masu (mg) proteina preko ukupnih proteina. Određivanje koncentracije ukupnih proteina Ukupni proteini odreŤeni su biuretskom metodom (Wood, 1989). Na uzorak homogenata jetre zapremine 20-50 μl dodato je 3 ml rastvora biuretskog reagensa (CuSO4×5H2O – 0,15%; K, Na tartarat – 0,6%; rastvor KI – 0,1% u 0,85 mol/l NaOH i deoksiholat – 1,5%) i nakon 30 min merena je apsorbancija nastalog proizvoda na 540 nm. Sadrţaj proteina odreŤen je preko kalibracione krive dobijene merenjem razliţite koncentracje albumina goveŤeg seruma - BSA (5-50 mg/l). Intenzitet lipidne peroksidacije (LPx) Intenzitet lipdne peroksidacije odreŤen je spektrofotometrijski na osnovu reakcije tiobarbiturne kiseline (TBA) sa TBA-reaktivnim vrstama (TBARS) (Buege i Aust, 1978). TBARS podrazumevaju karbonilne produkte peroksidacije lipida šelijske membrane. Smeša 20-50 μl homogenata jetre i 3 ml Ţinidle rastvora izraŤenog od 3,75 g TBA, 15 g CCl3COOH, 20,72 ml 37% HCl i jedne do dve kapi α-tokoferola na 1 l rastvora, zagrevana je tokom 15 min na kljuţalom vodenom kupatilu. Rastvor je zatim centrifugran 10 min na 3000 o/min. Apsorbancija supernatanta merena je na 535 nm. Rezultati su izraţeni u nmol/mg proteina (ε=1,56×105 l/mol×cm). 83 6.1.2.4. Statistiţka analiza Statistiţki znaţajne razlike ispoljene antioksidantne aktivnosti testiranih ekstrakata i odgovarajuših kontrola izraţunate su primenom jednofaktorske analize varijanse (ANOVA) uz Bonferoni-jevu korekciju za višestruka poreŤenja (Origin 8.0). Statistiţki znaţajna razlika odreŤivana je nakon poreŤenja sa kontrolnim grupama za sledeše nivoe znaţajnosti: *p≤0,05; **p≤0,01; ***p≤0,001. 6.2. Ispitivanje neuroprotektivne aktivnosti Neuroprotektivna aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata ispitivana je u kulturi šelija humanog neuroblastoma SH-SY5Y odreŤivanjem vijabilnosti šelija, indeksa lipidne peroksidacije, i produkcije superoksid jona (O2 *- ) primenom postupaka opisanih u doktoratu Gordane Toviloviš (2012). Za ovu svrhu, ekstrakti su rastvoreni u dimetil sulfoksidu (DMSO) i potom razblaţeni u odgovarajušem medijumu. Konaţna DMSO koncentracija iznosila je 0,5 % (v/v), što je unutar opsega u kom se ne ostvaruje znaţajan uticaj ovog rastvaraţa na rezultat. 6.2.1. Šelijska linija U testu ispitivanja neuroprotektivne aktivnosti koriššene su šelije humanog neuroblastoma (SH-SY5Y šelije), a šelijska linija dobijena je iz ATCC kolekcije (American Type Culture Collection). Ove šelije su kultivisane u medijumu nastalom mešanjem jednakih zapremina modifikovanog Eagle medijuma i F12 medijuma obogašenog neesencijalnim amino kiselinama (1%), 2mM L-glutaminom, fetalnim goveŤim serumom (FBS) (10%) i smešom antibiotik/antimikotik (1%). Šelije su, u cilju procene vijabilnosti i produkcije superoksid jona, zasejavane u ploţe sa 96 bunara (20×103 šelija po bunaru). Za MDA test šelije su rasle u sudovima zapremine 25 mL. Nakon 24 h nediferencirane šelije su tretirane stresorima natrijum nitroprusidom (SNP) i vodonik peroksidom (H2O2) i/ili razliţitim ekstraktima. Šelijska vijabilnost odreŤivana je 24 h nakon tretmana. Za procenu neuroprotektivne aktivnosti ekstrakata kod šelija izloţenih oksidativnom stresu, ekstrakti su primenjeni kao pretretman, 30 min pre dodatka 1 mM SNP ili 100 μM H2O2. 84 6.2.2. OdreŤivanje vijabilnosti šelija testom kisele fosfataze Za procenu šelijske vijabilnosti koriššen je test kisele fosfataze (Connolly i sar., 1986). Nakon perioda inkubacije, medijum je uklonjen, a dodat je 10 mM p-nitrofenil fosfat kao supstrat za kiselu fosfatazu. Reakcija je zaustavljena posle 1 h inkubacije dodatkom 0,1 M NaOH na 37 °C. Razvoj boje koji je u korelaciji sa brojem ţivih, metaboliţki aktivnih šelija, prašen je na 405 nm uz primenu ELISA ţitaţa (Multiscan spectrum, Thermo Electron Corporation). Nakon oduzimanja pozadinskog signala (samo NaOH), rezultati su izraţeni kao procenat vijabilnosti netretiranih šelija koje su 100% vijabilne. 6.2.3. OdreŤivanje indeksa lipidne peroksidacije Indeks lipidne peroksidacije odreŤivan je spektrofotometrijski, kao nivo TBARS. SH- SY5Y šelije tretirane su sa SNP/H2O2 i/ili razliţitim ekstraktima i sakupljane su primenom tripsinizacije uz dodatak tripsina/EDTA. Nakon centrifugiranja, supernatanti su odbaţeni i šelije su lizirane dvostrukim zamrzavanjem i odmrzavanjem u dejonizovanoj vodi. Sadrţaj sponatno formiranih TBARS je meren nakon tretiranja uzoraka ohlaŤenim reagensom tiobarbiturne kiseline (10%-na trihlorsiršetna kiselina, 0,6%-na tiobarbiturna kiselina) i zagrevanja nastale smeše na 100 °C (Rehncrona i sar., 1980). Apsorbancija je merena na 520 nm. 6.2.4. Merenje produkcije superoksidnih jona Koliţina superoksidnih jona merena je putem redukcije nitro plavih tetrazolijum soli po prethodno opisanoj metodi (Song i sar., 2011). Obojeni formazan proizvod koji tom prilikom nastaje kvantifikovan je spektrofotometrijski. Redukcija nitro plavog tetrazolijuma merena je na 560 nm uz primenu ELISA ţitaţa (Multiscan spectrum, Thermo Electron Corporation). 6.2.5. Statistiţka analiza Statistiţki znaţajne razlike ispoljene neuroprotektivne aktivnosti testiranih ekstrakata i odgovarajuše negativne kontrole odre]ene su primenom jednofaktorske analize varijanse 85 (ANOVA) uz Bonferoni-jevu korekciju za višestruka poreŤenja (Origin 8.0). Statistiţki znaţajna razlika odreŤivana je u poreŤenju sa kontrolnim grupama za sledeše nivoe znaţajnosti: *p≤0,05, **p≤0,01 i ***p≤0,001. 6.3. Ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti Antiinflamatorna aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata vrsta V. jacquinii, V. urticifolia i V. teucrium odreŤena je primenom ex vivo metode zasnovane na odreŤivanju sposobnosti inhibicije produkcije medijatora inflamacije i to: 12-HHT, TXB2, PGE2 koji nastaju delovanjem enzima ciklooksigenaze-1 i 12-HETE koji se formira delovanjem enzima 12-lipooksigenaze. Proces inflamacije je indukovan delovanjem kalcijumove jonofore A23184 (kalcimicinom) (Lesjak, 2011). Optimizacija i validacija ove metode detaljno su opisane u doktorskoj disertaciji Ivane Beare (2010). U eksperimentu su primenjeni trombociti kao intaktan šelijski sistem i izvor ovih enzima, kao i visoko osetljiva i specifiţna LC-MS/MS tehnika za odreŤivanje glavnih metabolita arahidonske kiseline formiranih u njihovom prisustvu. 6.3.1. Priprema uzoraka Alikvot humanih trombocita sa 4×108 šelija suspendovan je u puferu (0,137 mol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCl, 2,0 mmol/l KH2PO4, 5,0 mmol/l Na2HPO4 i 5,0 mmol/l glukoze, pH 7,2) do konaţne zapremine 2 mL. Tokom narednih 5 min smeša je lagano mešana na 37 °C. Nakon toga dodati su ekstrakti i standardna jedinjenja rastvorena u DMSO (koncentracioni opseg iznosio je od 10,0 do 300,0; od 0,156 do 5,0 i od 0,01 do 0,6 mg/ml za ekstrakte, kvercetin i aspirin), kao i 0,1 ml kalcimicina (125 μmol/l u DMSO). Tokom naredna 2 min smeša je inkubirana na 37 °C uz umereno mešanje. Ekstrakt u kontroli i kalcimicin u slepoj probi zamenjeni su rastvaraţem (DMSO). Smeši je potom dodato 0,3 ml vodenog rastvora CaCl2 (16,7 mmol/l) ili vode (slepa proba), nakon ţega je inkubirana narednih 5 min na 37 °C uz mešanje. Reakcija je stopirana zakišeljavanjem sa 1%-nom mravljom kiselinom do pH 3 (5,8 ml). Interni standard prostaglandina B2 (50 μl rastvora u DMSO koncentracije 6 μg/ml) je dodat i ekstrakcija proizvoda reakcije je izvršena smešom hloroforma i metanola (1:1, 8,0 ml) uz snaţno muškanje tokom 15 min. Nakon centrifugiranja na 7012 × g tokom 15 min na 4 °C, 86 organski sloj je odvojen, uparen do suva. Nakon rastvaranja u metanolu i filtriranja koriššen je za dalju LC-MS/MS analizu. Sve analize raŤene su u triplikatu. 6.3.2. LC-MS/MS analiza Za razdvajanje je koriššena reverzno fazna kolona Zorbax Eclipse XDB-C18 RR, veliţine ţestice 3,5 µm i dimenzija 30 × 2,1 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Injekciona zapremina je iznosila 5 µl. Kao mobilna faza A je koriššena 0,6%-na siršetna kiselina, a kao mobilna faza B metanol. Razdvajanje komponenti je izvršeno prema sledešem gradijentnom programu: 0-2 min 65-100% B, 2-3,5 min 100% B, sa post-vremenom od 3 min, pri protoku mobilne faze od 1 ml/min i temperaturi od 65 ºC. Nakon razdvajanja, eluat je usmeravan na ESI jonski izvor. Protok nosešeg gasa (N2) je iznosio 9 l/min, pritisak raspršivaţa 30 psi a temperatura nosešeg gasa 350 °C. Za elektrosprej jonizaciju (ESI) primenjeni su negativna jonska polarnost i kapilarni napon od 4000 V. Sva jedinjenja su kvantifikovana u negativnom MRM reţimu, a optimizovani parametri za kvantifikaciju prikazani su u Tabeli 16. Metoda internog standarda je primenjena kako bi se izbegla potreba za izradom kalibracionih krivih za svako pojedinaţno jedinjenje. Za sve preraţune koriššen je odnos površina pika analita i internog standarda. Tabela 16. Optimizovani parametri za kvantifikaciju 12-HHT, TXB2, PGE2, 12-HETE i PGB2 (Lesjak, 2011) Jedinjenje Reţim Polaritet jona Jonska vrsta Jon prekursor (m/z) Jon proizvod (m/z) Koliziona energija (V) Napon fragmentora (V) 12-HHt MRM NI [M-H] - 279 261 5 120 TXB2 MRM NI [M-H] - 369 169 15 120 PGE2 MRM NI [M-H] - 351 271 15 120 12-HETE MRM NI [M-H] - 319 310 7 120 PGB2 MRM NI [M-H] - 333 315 13 120 87 6.3.3. Statistiţka analiza Procenat inhibicije COX-1 i 12-LOX enzima ostvaren primenom razliţitih koncentracija ispitivanih ekstrakata izraţunat je primenom sledeše jednaţine: I (%)=100×(R0- R)/R0, gde R0 i R predstavljaju nivo odgovora (površina pika metabolita/površina pika internog standarda) u kontrolnoj i u reakciji ispitivanih uzoraka. Vrednosti R i R0 su korigovane za vrednost slepe probe. Primenom softvera Origin verzija 8.0 napravljene su odgovarajuše inhibiciono-koncentracione krive i sa njih su odreŤene IC50 vrednosti (koncentracija ekstrakta koja inhibira formiranje COX-1 i 12-LOX metabolita). Rezultati su izraţeni kao srednja vrednost za tri merenja. Statistiţka obrada rezultata izvršena je primenom jednofaktorske analize varijanse (ANOVA). Statistiţki znaţajnim su smatrane razlike srednjih vrednosti za p<0,05. 6.4. In vivo ispitivanje citotoksične aktivnosti Rukovanje ţivotinjama i svi eksperimentalni protokoli sprovedeni su u skladu sa Pravilnikom o radu i koriššenju laboratorijskih ţivotinja koji ureŤuje Etiţka komisija pri Univerzitetu u Novom Sadu. Za ispitivanje citotoksiţnog efekta koriššeni su miševi soja Hannover National Medical Institute (Hann:NMRI). Sve ţivotinje dobijene su iz laboratorije Samostalnog odseka za biohemiju Instituta za laboratorijsku medicinu, Kliniţkog centra Novi Sad (Novi Sad, Vojvodina, Srbija). Ţuvane su u odgovarajušim kavezima, u strogo kontrolisanim uslovima temperature (25ºC) i vlaţnosti vazduha (30-50%), pri reţimu svetlo- tama 12 h:12 h, uz slobodan pristup standardnoj hrani za miševe (LM2 sa 19% proteina, Veterinarski zavod Subotica, Vojvodina, Srbija) i vodi. Za ispitivanje citotoksiţne aktivnosti koriššeni su NMRI miševi oba pola, starosti 7-8 nedelja, telesne mase 200-250g. Eksperimenti su izvoŤeni sa 70%-nim acetonskim ekstraktima odabranih Veronica vrsta. Sve ţivotinje jednokratno su primale intraperitonealno (i.p.) odgovarajuši ekstrakt, odnosno fiziološki rastvor (kontrolna grupa). Miševi soja NMRI podeljeni su sluţajnim izborom u grupe od po 6 jedinki i tretirane su po sledešem protokolu (Šeboviš, 2008): Grupa EAC - ţivotinje sa implantiranim šelijama Ehrlich-ovog ascitnog karcinoma (EAC) tretirane sa po 2 ml/kg fizološkog rastvora, i.p., (n=6) 88 Grupa PRETRETMAN – ţivotinje su pretretirane sa 2 ml/kg ispitivanog ekstrakta, i.p., tokom 7 dana (n=6) Nakon 14 dana od dana implementacije EAC, sve ţivotinje su ţrtvovane i ascites je sakupljen za dalje biohemijske analize. Eksperiment je ponovljen za svaki od ispitvanih ekstrakata. Da bi se proverila hipoteza da se uticaj ekstrakata na rast i razvoj tumora zasniva na promeni antioksidantnog statusa u šelijama EAC, isti postupak sproveden je i sa antioksidansom, N-acetil-L-cisteinom (Sigma, 5 mM). Dozna zavisnost primene ekstrakata je ispitana primenom 5 doza rastvora ekstrakata (1,5 ml/kg, 1 ml/kg, 0,5 ml/kg, 0,2 ml/kg i 0,1 ml/kg). U ovom delu ispitivanja prašen je procenat oštešenih šelija. Nastavak ogleda sproveden je primenom doze od 2,0 ml/kg telesne mase. 6.4.1. Statistiţka analiza Statistiţka obrada rezultata izvršena je primenom jednofaktorske analize varijanse (ANOVA) (Origin 8.0). Statistiţki znaţajnim su smatrane razlike srednjih vrednosti za p<0,05. 6.5. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti Za ispitivanje antibakterijskog delovanja 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi odabranih vrsta roda Veronica primenjen je bujon mikrodilucioni test (Hanel i Raether, 1988). U eksperimentalnom radu koriššeni su standardni mikroorganizmi iz kolekcije ATCC (American Type of Culture Collection). Svi sojevi nabavljeni su iz Instituta za biološka istraţivanja ‟‟Siniša Stankoviš‟‟ u Beogradu. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti sprovedeno je na sedam sojeva bakterija: G (–) bakterije: 1. Escherichia coli ATCC 35210 2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 3. Enterobacter cloacae humani izolat G (+) bakterije: 89 1. Staphylococcus aureus ATCC 6538 2. Bacillus cereus humani izolat 3. Micrococcus flavus ATCC 10240 4. Listeria monocytogenes NCTC 7973 Za procenu aktivnosti ekstrakata kao standardno jedinjenje koriššen je antibiotik streptomicin (Sigma P 7794) (0,05– 3mg/ml). 6.5.1. Kultivacija mikroorganizama Bakterije koriššene u ispitivanju kultivisane su na TBS (Tryptic Soy Broth) medijumu na 37 °C. Nakon 18h formirana je bakterijska suspenzija uz dodatak sterilnog fiziološkog rastvora, pri ţemu je konaţna koncentracija bakterijskog inokuluma iznosila 1,0×106 u zapremini od 100 μl. Dobijeni inokulum je ţuvan na +4°C do dalje upotrebe. 6.5.2. Bujon mikrodilucioni test Minimalna koncentracija ispitivanih ekstrakata koja inhibira vidljivi rast mikroorganizama odreŤena je primenom bujon mikrodilucionog testa u mikrotitracionim ploţama sa ravnim dnom i 96 mesta. Uzorci za testiranje pripremljeni su razblaţivanjem u 5%-nom vodenom rastvoru DMSO. Serijska razblaţenja ispitivanih ekstrakata dodata su u ţašice sa hranljivom podlogom (Mueller Hinton) sa 10 μl bakterijske suspenzije (105 CFU/ml), tako da je finalna zapremina iznosila 100 μl. Nakon dodavanja uzoraka u ţašice, mikrotitarske ploţe su inkubirane na 37 °C tokom 24 h. Najniţa koncentarcija pri kojoj nije došlo do vidljivog rasta bakterija (posmatrano na binokularnom mikroskopu) definisana je kao minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). Minimalna baktericidna koncentracija (MBC) oznaţava najniţu koncentraciju koja ubija 99,9% bakterija. DMSO je koriššen kao kontrola, dok je streptomicin koriššen kao pozitivna kontrola. 90 6.5.3. Statistiţka analiza Jednofaktorska analiza varijanse koriššena je za statistiţku obradu dobijenih podataka i utvrŤivanje znaţajnosti razlike izmeŤu srednjih vrednosti (Origin 8.0). Statistiţki znaţajnim su smatrane razlike srednjih vrednosti za p<0,05. 91 REZULTATI I DISKUSIJA 92 1. Morfološka analiza Sa ciljem utvrŤivanja mikromorfoloških obeleţja, kao i anatomske graŤe, u okviru ove disertacije sprovedena je mikroskopska analiza sprašene herbe, kao i popreţnih preseka lista i stabla odabranih Veronica vrsta. 1.1. Mikroskopska analiza sprašenog biljnog materijala Mikroskopska analiza sprašene herbe vrste V. urticifolia pokazala je prisustvo sledeših elemenata: - fragmenata epidermisa sa stomama anomocitnog tipa, - brojnih neţlezdanih, višešelijskih, uniserijatnih, dlaka, - retkih, ţlezdanih dlaka, tipa kapitatnih koje se sastoje od višešelijske drške i sekretorne glave od 1, 2 ili 4 šelije (Slika 8). Slika 8. Morfološki elementi u prašku herbe V. urticifolia 93 Mikroskopska analiza sprašenog materijala vrste V. jacquinii pokazala je prisustvo sledeših elemenata: - fragmenti epidermisa sa stomama anomocitnog tipa, - brojne neţlezdane višešelijske, uniserijatne, negranate mehaniţke dlake, - ţlezdane dlake tipa kapitatnih, - grupe brahisklereida (Slika 9). Slika 9. Morfološki elementi u prašku herbe V. jacquinii Mikroskopska analiza sprašenog materijala vrste V. teucrium pokazala je prisustvo sledeših elemenata: - fragmenti epidermisa sa stomama anomocitnog tipa, - brojne neţlezdane višešelijske, uniserijatne dlake, - ţlezdane dlake tipa kapitatnih, - fragmenti traheja i traheida (Slika 10). 94 Slika 10. Morfološki elementi u prašku herbe V. teucrium 1.2. Anatomsko-morfološka analiza poprečnih preseka 1.2.1. Veronica urticifolia GraĎa lista: List je dorzoventralne graŤe (Slika 11). Na površini je jednoslojan epidermis. Šelije epidermisa lica su znatno krupnije od šelija epidermisa naliţja lista. Mezofil lista diferenciran je na palisadno i sunŤerasto tkivo. Palisadni parenhim je jednoslojan, a sunŤerasto tkivo je formirano od šelija loptastog oblika, izmeŤu kojih se mogu uoţiti krupni intercelulari. Dominira provodni snopiš glavnog nerva, dok su ostali snopiši znatno manji. GraĎa stabla: Stablo je na popreţnom preseku okruglo. Ispod jednoslojnog epidermisa sa retkim neţlezdanim dlakama nalazi se 5-6 slojeva hlorenhima. U centralnom cilindru dominira ksilem. Najveši deo stabla zauzimaju krupne parenhimske šelije srţi (Slika 12). 95 Slika 11. V. urticifolia – popreţni presek lista 96 Slika 12. V. urticifolia – popreţni presek stabla 97 1.2.2. Veronica jacquinii GraĎa lista: List je sa blago savijenim ivicama liske prema naliţju lista (Slika 13). Na površini jednoslojnog epidermisa je debeo sloj kutikule. Šelije epidermisa lica krupnije su od šelija epidermisa naliţja. U epidermisu lica i naliţja lista se nalaze stome – amfistomatiţan tip lista. Mezofil lista je diferenciran na palisadno i sunŤerasto tkivo. Ispod epidermisa lica lista prisutna su dva do tri sloja palisadnog tkiva, a ostatak mezofila ţini sunŤerasto tkivo. Oko provodnih snopiša je parenhimska sara od krupnih šelija. Od trihoma vidljivi su neţlezdani i ţlezdani kapitatni trihomi. GraĎa stabla: Stablo je na popreţnom preseku okruglo (Slika 14). Ispod jednoslojnog epidermisa sa retkim neţlezdanim dlakama nalazi se 5-6 slojeva hlorenhima. U centralnom cilindru floem i ksilem su u cilindrima – tip stabla bez provodnih snopiša, a u centru stabla je srţ od parenhimskih šelija koja je raskinuta, tako da se formira reksigena šupljina. 1.2.3.Veronica teucrium GraĎa lista: List je dorzoventralne graŤe. Na površini lista nalazi se jednoslojni epidermis. Mezofil lista je diferenciran na palisadno i sunŤerasto tkivo. Palisadni parenhim ţini sloj izduţenih, gusto zbijenih, šelija ispod epidermisa lica, dok je ispod epidermisa naliţja manje ili više rastesito sunŤerasto tkivo. U centralnom delu lista prisutan je glavni, izraţen, zatvoren kolaterni provodni snopiš, dok su boţni provodni snopiši slabije razvijeni. Od trihoma vidljivi su glandularni kapitatni trihomi (Slika 15). GraĎa stabla: Stablo je na popreţnom preseku okruglo (Slika 16). Razlikuju se tri zone: epidermis, primarna kora i centralni cilndar. Jednoslojni epidermis je sa prisutnim neţlezdanim i ţlezdanim dlakama. Ispod epidermisa je 7-8 slojeva parenhimskih šelija koje sadrţe hloroplaste, što ukazuje da u izvesnoj meri imaju fotosintetiţku ulogu. Poslednji sloj primarne kore ţine krupne parenhimske šelije rasporeŤene u obliku prstena. Centralni cilindar sastoji se od provodnih elemenata floema i ksilema koji formiraju cilindre. U centru stabla dominira srţ od krupnih parenhimskih šelija. 98 Slika 13. V. jacquinii – popreţni presek lista i detalj lista 99 Slika 14. Veronica jacquinii – popreţni presek stabla i detalj stabla 100 Slika 15. V. teucrium – popreţni presek lista i detalji lista 101 Slika 16. V. teucrium – popreţni presek stabla i detalj stabla 102 1.3. Histohemijska analiza Rezultati histohemijske analize (Tabela 17) su ukazali na prisustvo lipida, alkaloida, skroba, fenolnih jedinjenja i meŤu njima flavonoida u ispitivanim vrstama roda Veronica. Lipidi su detektovani u epidermisu lista vrste V. jacquinii (Slika 17), kao i u epidermisu stabla, i to u spoljašnjem zidu - kutikularnom sloju stabla sva tri taksona (Slika 18). Nakon bojenja Lugolovim reagensom pokazano je prisustvo skroba u hlorenhimu stabla ispitivanih vrsta (Slika 19). U ţlezdanim trihomima na površini lista vrste V. teucrium nakon primene Wagner-ovog reagensa utvrŤeno je prisustvo alkaloda (Slika 20). Dittmar-ovim reagensom detektovani su alkaloidi u trihomima i floemu stabla sva tri ispitivana taksona, kao i u poslednjem sloju kore stabla V. teucrium (Slika 21). Do sada, prisustvo alkaloida pokazano je u vrsti V. officinalis (Hultin i Torssell, 1965). Prisustvo alkaloida u ţlezdanim trihomima utvrŤeno je i u rodovima Lippia (Argyropolou i sar, 2010), Cannabis (Furr i Mahlberg, 1981), Nicotiana (Zador i Jones, 1968), Camptotheca (Valleta i sar., 2013) i Isodon (Liu i Liu, 2012), dok su u rodu Erythrina (Da Silva i sar., 2013) pored glandularnih, alkaloidi zastupljeni i u tektornim trihomima, kao i u parenhimskim šelijama stabla. Slika 17. Lipidi u epidermisu lista V. jacquinii 103 Slika 18. Lipidi u kutikularnom sloju – V. urticifolia Slika 19. Skrob u hlorenhimu stabla– V. urticifolia 104 Slika 20. Alkaloidi u ţlezdanim trihomima – V. teucrium Slika 21. Alkaloidi u poslednjem sloju parenhima kore i u floemu – V. teucrium 105 Tabela 17. Ispitivana grupa metabolita, histohemijski reagensi i rezultati primene na tkivu lista i stabla odabranih Veronica vrsta List Stablo Procedura bojenja Ciljna jedinjenja Primešena boja V. jacquinii V. teucrium V. urticifolia V. jacquinii V. teucrium V. urticifolia Sudan III Lipidi Crvena + - - + + + Nadi Etarska ulja Plavo-ljubiţasta - - - - - - Smolne kiseline Crvena - - - - - - Lugol Skrob Tamno-plava do crvena - - - + + + Feri sulfat Fenolna jedinjenja Tamno-plava + + + + + + Feri hlorid Fenolna jedinjenja Tamno-zelena + + + + + + Wagner-ov reagens Alkaloidi Crveno-braon - + - - - - Dittmar-ov reagens Alkaloidi Crveno-braon - - + + + + Antimon hlorid Steroidi Crvena - - - - - - 106 1.4. Fluorescentna mikroskopija Fenolna jedinjenja imaju znaţajnu funkciju u interakciji biljaka i njihove ţivotne sredine. Ona mogu privlaţiti insekte oprašivaţe a odbijati herbivore, uţestvovati u alelopatskim interakcijama, ili u interakcijama izmeŤu biljaka i simbiotskih, ili patogenih organizama. Ovi sekundarni metaboliti akumuliraju se u razliţitim biljnim tkivima i šelijama, tokom ontogeneze pod razliţitim uticajima spoljašnje sredine. UtvrŤivanje lokalizacije fenolnih jedinjenja obezbeŤuje neophodnu osnovu za razumevanje njihove ekološke funkcije (Hutzler i sar., 1998). Autofluorescencija u UV delu spektra ukazuje na prisustvo fenolnih jedinjenja (Ruzin, 1999). Pojedine klase fenolnih jedinjenja (hidroksicimetne kiseline, kumarini i stilbeni) snaţno autofluoresciraju pod UV svetlom. Dakle, fluorescentna mikroskopija je znaţajna tehnika u ispitivanju lokalizacije ovih klasa jedinjenja. U okviru ove disertacije, na ispitivanim presecima listova i stabla utvrŤene su intenzivna svetlo plava autofluorescencija na 340-380 nm, kao i slabe svetlo ţuta fluorescencija na 450-490 nm i svetlo crvena autofluorescencija na 515-580 nm. Pokazano je da su fenolna jedinjenja prisutna u ksilemu, trihomima i kutikularnom sloju (posebno izraţeno iznad glavnog nerva) listova sva tri ispitivana taksona (Slika 22). U stablu su fenolna jedinjenja detektovana u kutikularnom sloju, trihomima, i u ksilemu (Slika 23). Na presecima se jasno vidi da je fluorescencija u šelijama provodnih snopiša vezana iskljuţivo za lignificirane šelijske zidove ksilema. Lignin kao najţešši polimer sekundarnih šelijskih zidova ksilema (Alberts i sar., 2002) predstavlja heterogeni polimer koji ţine tri tipa monomernih jedinica (monolignoli) i to: p-kumaroil, koniferil i sinapil alkoholi. Nakon biosinteze monolignoli se moraju transportovati u šelijske zidove gde podleţu oksidaciji i polimerizaciji pri ţemu dolazi do formiranja lignina (Li i Chapple, 2010). 107 Slika 22. Fluorescencija fenolnih jedinjenja u listu V. jacquinii 108 Slika 23. Fluorescencija fenolnih jedinjenja u stablu V. jacquinii 109 Tabela 18. Ispitivana jedinjenja, histohemijski reagensi i rezultati primene na tkivu listova i stabla odabranih Veronica vrsta List Stablo Procedura bojenja Ciljna jedinjenja Primešena boja V. jacquinii V. teucrium V. urticifolia V. jacquinii V. teucrium V. urticifolia Autofluorescencija neobojenih preseka A: BP 340-380 Lignini i fenolna jedinjenja Svetlo-plava do beliţasta + + + + + + Autofluorescencija neobojenih preseka I3: BP 450-490 Lignini i fenolna jedinjenja Svetlo-ţuta + + + + + + Autofluorescencija neobojenih preseka N2.1: BP 515-580 Fenolna jedinjenja Svetlo-crvena + + + + + + Aluminijum trihlorid u UV oblasti A: BP 340- 380 Flavonoidi Plavo-zelena + + + + + + 110 2. Hemijska analiza 2.1. Analiza sadržaja teških metala u biljnim i uzorcima zemljišta Primarni znaţaj zemljišta za biljke leţi u ţinjenici da je ono izvor mineralnih elemenata neophodnih za osnovne ţivotne funkcije, sintezu organskih jedinjenja, rast i produkciju biljaka. Biljke korenovim sistemom apsorbuju jednostavna neorganska jedinjenja, katjone i anjone iz okolnog zemljišta (Stevanoviš i Jankoviš, 2001). Mineralni elementi su u tlu prisutni u rastvorenom ili vezanom obliku (kao kompleksi sa neorganskim ili organskim ligandima). Apsorpcijom od strane biljaka hemijski elementi se distribuiraju i ugraŤuju u biljno tkivo, a preko lanca ishrane stiţu i do drugih organizama. Osim toga, razlaganjem odbaţenih biljnih delova, ovi hemijski elementi se vrašaju nazad u spoljašnju sredinu (Stevanoviš i Jankoviš, 2001). Kontaminacija zemljišta teškim metalima jedan je od najznaţajnijih ekoloških problema danas. U poslednje vreme, razvojem industrije i intenziviranjem poljoprivrede došlo je do primene raznih materija koje dovode do povešane koncentracije teških metala u zemljištu. Obzirom da nisu biorazgradivi, i da imaju dugo poluvreme ţivota u zemljištu, oni mogu ostvariti znaţajnu toksiţnost kod svih ţivih organizama (Del Bubba i sar., 2013). Primena viših biljaka kao indikatora zagaŤenosti zemljišta zasnovana je na njihovoj sposobnosti da apsorbuju metale i druge toksiţne supstance iz zemljišta, transportuju ih kroz organizam, ili ih na odreŤenom mestu akumuliraju. Vešina biljaka osetljiva je i na minimalne koliţine teških metala u podlozi, ipak izvestan broj njih je u stanju da akumulira velike koliţine teških metala, a da pri tom fiziološke funkcije biljke ne budu ugroţene. Takve biljke su, tokom evolucije, razvile brojne adaptivne mehanizme kojima savladavaju nepovoljne uslove staništa (Stevanoviš i Jankoviš, 2001). 2.1.1. Analiza teških metala u biljnim uzorcima U manjim koncentracijama pojedini teški metali (Cu, Zn, Fe i Mn) neophodni su za optimalan rast i razvoj biljaka, dok drugi (Cr 6+) pokazuju štetno dejstvo i pri veoma niskim koncentracijama, pa se definišu kao zagaŤivaţi (Ali i sar., 2013a). Biljke ne pokazuju visoku selektivnost za usvajanje metala, veš preuzimaju i one koji nemaju poznatu funkciju u 111 biljnom svetu, i koji na taj naţin, dospevaju u lanac ishrane. U ljudskom organizmu oni imaju kumulativna svojstva, tj. nakupljaju se u pojedinim tkivima i organima, gde ispoljavaju svoje štetno delovanje (Jakšiš i sar., 2013). Hrom, tj. njegova šestovalentna forma, je danas jedan od glavnih kontaminanata ţivotne sredine. Poslednjih decenija došlo je do znaţajnog povešanja njegove primene u razliţitim industrijskim granama kao što su: elektrohemijska i drvna, kao i u industrijama koţe i boja (Choppala i sar., 2013). Njegova raspoloţivost i toksiţnost zavise od oksidacionog stanja. U ţivotnoj sredini dominantan je kao Cr(III) i Cr(VI). Za razliku od Cr(III) koji je u malim koliţinama (50-200 μg/ml) esencijalan za ljude, Cr(VI) je toksiţan, mutagen i teratogen. Osim toga Cr(VI) minerali su rastvorljiviji i mobilniji u odnosu na Cr(III) vrste. Hrom je toksiţan za biljke i moţe indukovati promene u brojnim fiziološkim procesima u njima. Dezorganizacija ultrastrukture hloroplasta i inhibicija procesa elektronskog transporta moguše su objašnjenje za Cr-indukovano smanjenje nivoa fotosinteze (Ali i sar., 2013b). U herbama ispitivanih Veronica sadrţaj hroma je iznosio 0,44-18,96 mg/kg (Tabela 22). Najniţi sadrţaj pokazan je u uzorcima sa Vršaţkih planina (0,44-0,59 mg/kg), dok je najveši sadrţaj utvrŤen u uzorku 3 sa Goţa. Prema rezultatima Zurayk-a i saradnika (2003) vrste V. beccabunga, V. lysimachioides i V. anagalloides predstavljaju bioindikatore zagaŤenja hromom. TakoŤe, isti autori pokazali su da se Cr najvešim delom akumulira u korenu ovih biljaka. Translokacija hroma od korena do izdanka je izuzetno ograniţena, i njegov sadrţaj u korenu je obiţno oko 100 puta veši u odnosu na izdanak, bez obzira na ispitivanu vrstu. Prema Chaney-u i saradnicima (1997) svaka biljna vrsta ţiji je sadrţaj u nadzemnom delu veši od 5 mg/kg, od interesa je kao potencijalni hiperakumulator. Na osnovu rezultata dobijenih pri izradi ove disertacije, ovakav zakljuţak izvodi se za vrste V. urticifolia i V. jacquinii koje su rasle na serpentinskom zemljištu. Joni mangana aktiviraju brojne enzime u biljnoj šeliji. Najznaţajnija uloga ovog elementa u zelenim biljkama je funkcija u razgradnji molekula vode uz oslobaŤanje kiseonika (Prasad i Hagemeyer, 1999). Za obavljanje metaboliţkih funkcija, Mn je biljci neophodan u malim koncentracijama (20 mg/kg s.m. 6 ). U ispitivanim biljnim uzorcima, njegova koncentracija je bila relativno uniformna (od 25,38 do 49,50 mg/kg s.m.), uz izuzetak uzorka 8 (89,25 mg/kg) kod kojeg je i zemljište na kom je biljka rasla bilo sa znaţajno vešim sadrţajem ovog elementa (Tabela 22). Dobijene vrednosti odgovaraju koncentraciji Mn u nadzemnom delu V. officinalis (52,3 mg/kg) do koje su došli Mezyk i Wieckowski (1999). 6 s.m. – suva masa 112 Uniformnost koncentracije Mn u biljnim uzorcima uprkos njenih velikih variranja u zemljištu moţe se objasniti unutrašnjim mehanizmima ispitivanih Veronica vrsta da kontrolišu/preveniraju preuzimanje Mn u koren, i/ili izbegavaju translokaciju Mn u nadzemne delove biljke. Ovi mehanizmi su kontrolisani njihovom potrebom za mikronutritientima i kapacitetom da apsorbuju ili eliminišu toksiţne elemente. Cink je znaţajan kao komponenta enzima koji uţestvuju u sintezi proteina i proizvodnji energije, kao i za odrţavanje strukturnog integriteta bioloških membrana (Hänsch i Mendel, 2009). Granice toksiţnosti za biljku zavise od biljne vrste i faze rasta (300-400 mg/kg) (Kabata-Pendias i Pendias, 2001). Za lekovite biljke Svetska zdravstvena organizacija još nije ustanovila graniţne vrednosti za Zn. Prema Allaway-u (1968) koncentracija ovog elementa u poljoprivrednim proizvodima treba da iznosi izmeŤu 15 i 200 ppm. U ispitivanim uzorcima Veronica vrsta njegova koncentracija varirala je od 27,66 do 58,01 mg/kg (Tabela 22). Bakar je esencijalan za procese fotosinteze i šelijskog disanja u mitohondrijama, metabolizam ugljenika i azota, zaštitu od oksidativnog stresa, kao i za sintezu komponenti šelijskog zida (Hänsch i Mendel, 2009). Njegov sadrţaj u biljnim uzorcima kretao se od 6,04 do 12,8 mg/kg, u zavisnosti od lokaliteta na kom su uzorci sakupljeni (Tabela 22). Srednje vrednosti iznosile su 10,17, 6,64 i 12,49 mg/kg za uzorke sakupljene na planinama Goţ, Vršaţke planine i Stol, redom. Najniţa koncentracija Cu dobijena je u uzorcima sa Vršaţkih planina, gde je zabeleţena i najveša koncentracija Fe. Ovo je u saglasnosti sa literaturnim podacima koji ukazuju na to da bioraspoloţivost Cu moţe biti redukovana visokim sadrţajem Fe u rastvoru zemljišta (Mallick i sar., 2010). U rastresitim zemljištima, Fe se uglavnom nalazi u formi Fe(III)-oksida ili hidroksida (Lindsay i Schwab, 1982), koji predstavljaju efikasne adsorbense za neorganske jone (Raţiš i Đogo, 2010). Prema Allaway-u (1968) koncentracija Cu u poljoprivrednim proizvodima treba da iznosi od 4-15 ppm, što je u saglasnosti sa dobijenim rezultatima. GvoţŤe je jedan od kljuţnih elemenata za normalno funkcionisanje enzima, posebno onih ukljuţenih u redoks procese, kao što su sinteza porfirina, redukcija nitrita i sulfata, i N2- fiksacija (Prasad i Hagemeyer, 1999). Sadrţaj Fe u ispitivanim uzorcima Veronica vrsta iznosio je od 35,53 do 563,26 mg/kg, sa najvešim koncentracijama zabeleţenim u uzorcima sa planine Goţ (Tabela 22). Kako su i Fe i Mn ukljuţeni u metaboliţke procese, za adekvatan rast biljaka potrebno je da njihov odnos bude izmeŤu 1,5 i 2,5 (Kabata-Pendias i Pendias, 2001). U našem ispitivanju za vešinu ispitivanih uzoraka (uz izuzetak uzoraka 1 i 10), ovaj odnos nije bio u oţekivanom opsegu. 113 Generalno, nisu pokazane znaţajne razlike izmeŤu testiranih Veronica spp. sa istog lokaliteta, ukazujuši na to da obrazac preuzimanja teških metala nije karakteristika vrste. 2.1.2. Analiza teških metala u zemljištu Sadrţaj teških metala u zemljištu zavisi od prirodnih i antropogenih izvora u ekosistemima. U nezagaŤenim zemljištima oni su prisutni u relativno niskim koncentracijama i rezultat su raspadanja matiţnog supstrata. Pod uticajem antropogenog faktora i daljinskog transporta polutanata ove prirodne koncentracije mogu se znaţajno povešati i premašiti kritiţne ili toksiţne koncentracije za odreŤeni ekosistem (Belanoviš i sar., 2004). Ponašanje teških metala u zemljištu uslovljeno je mnogobrojnim faktorima koji mogu uticati na njihovu mobilnost i akumulaciju od strane biljaka, a najznaţajniji su kiselost zemljišta, sadrţaj organske materije i koloidne gline. Kiselost zemljišta indirektno utiţe na raspoloţivost i toksiţnost teških metala, izazivajuši njihov minimalan ili maksimalan efekat, u zavisnosti od pH opsega (Wong, 2003). Mobilnost teških metala u zemljištu je generalno mala, posebno pri alkalnim pH vrednostima. Dobijene pH vrednosti stvarne i potencijalne kiselosti za ispitivane uzorake zemljišta iznose od 5,24 do 7,43 i od 4,09 do 7,09 (Tabela 19), pri ţemu srednje pH vrednosti za uzorke zemljišta sa Goţa, Vršaţkih planina i Stola iznose 6,62, 5,91 i 6,97. Uz izuzetak uzorka 4, uzorci zemljišta sa Vršaţkih planina imaju nešto niţe pH vrednosti u poreŤenju sa ostalim lokalitetima. Planina Stol nalazi se u Karpatskoj oblasti istoţne Srbije, u blizini grada Bor. Prerada rude bakra u rudarsko topioniţarskom basenu Bor dovodi do masivnog zagaŤenja vazduha sumpor dioksidom. Visoke koncentracije ovog polutanta vode do formiranja kiselih kiša. Njihov efekat na ţivotnu sredinu u velikoj meri zavisi od sposobnosti zemljišta da ih neutrališe. Alkalna zemljišta, kao što su ona bogata kreţnjakom (CaCO3) mogu da neutrališu kiselinu direktno. Ovo moţe biti objašnjenje za nešto više pH vrednosti uzoraka zemljišta sa planine Stol gde je zastupljeno kreţnjaţko zemljište. 114 Tabela 19. Kiselost uzoraka zemljišta Uzorak Lokalitet pH Stvarna kiselost Potencijalna kiselost Z1 Goţ 6,77 5,44 Z2 Goţ 6,39 5,28 Z3 Goţ 7,43 7,09 Z4 Goţ 5,87 4,74 Z5 Goţ 6,77 5,44 Z6 Vršaţke planine 6,09 4,87 Z7 Vršaţke planine 6,14 5,43 Z8 Vršaţke planine 6,18 5,41 Z9 Vršaţke planine 5,24 4,09 Z10 Stol 7,18 6,45 Z11 Stol 6,76 5,80 Hrom se veoma ţesto veţe u zemljištima bogatim glinom i organskom materijom. Kao takav slabo je pokretljiv i adsorbovan u površinskom sloju dubine 5-10 cm. Koliţina hroma u zemljištu kreše se u intervalu od 5 do 100 mg/kg, ali se ţesto mogu naši i mnogo veše koncentracije, posebno kod zemljišta formiranih na serpentinitima (Ubaviš i Bogdanoviš, 1995). U ispitivanim uzorcima zemljišta izmerena koncentracija hroma iznosi od 36,18 do 115,15 mg/kg, pri ţemu su najveše vrednosti zabeleţene u uzorcima sa Goţa (95,74-115,15 mg/kg) (Tabela 22), što je u saglasnosti sa postoješim literaturnim podacima za isti lokalitet (Obratov-Petkoviš i sar., 2008). Planina Goţ predstavlja jednu od serpentinskih oblasti centralne Srbije (Dudiš i sar., 2007), a visoke koncentracije potencijalnih fitotoksiţnih elementa (Ni, Cr i Co) predstavljaju karakteristiku ovog tipa zemljišta (Kazakou i sar., 2008). U uzorcima zemljišta nivo Cu varirao je od 12,38 do 47,77 mg/kg (Tabela 22). Povešane koncentracije Cu u uzorcima sa Stola u poreŤenju sa drugim lokalitetima, mogu biti posledica emisije tokom industrijsko-tehnoloških procesa rudnika Bor. Prema velikom broju autora (Kabata-Pendias i Pendias, 2001; Adriano, 1986) sadrţaj ukupnog cinka u zemljištu kreše se od 10-300 mg/kg. Na ispitivanim lokalitetima izmerene koncentracije variraju od 62,78 do 138,00 mg/kg, pri ţemu proseţan sadrţaj iznosi 95,47 mg/kg (Tabela 22). Na lokalitetima sa Vršaţkih planina sadrţaj Zn bio je veši u uzorcima 6 i 115 9 u odnosu na uzorke 7 i 8, ukazujuši na moguši uticaj antropogenih aktivnosti. Naime, lokalitet 9 je u blizini planinarskog doma, dok su lokaliteti 7 i 8 u šumskoj oblasti, bez uticaja antropogenih aktivnosti. Prema Adrianu (1986) oţekivani sadrţaj Mn za vešinu tipova zemljišta iznosi od 500- 1000 mg/kg. Kabata-Pendias i Pendias (2001) predloţili su „‟kritiţnu‟‟ koncentraciju 1500 mg/kg pri kojoj se mogu javiti toksiţni simptomi na biljkama. Koliţina za biljke pristupaţnog Mn u zemljištu je utoliko veša ukoliko su redoks potencijal i pH vrednost manji, odnosno, što su uslovi za redukcione procese u zemljištu povoljniji (Kadoviš i sar., 2005). U okviru ove disertacije, sadrţaj Mn u uzorcima zemljišta varirao je od 517,58 do 1675,78 mg/kg i bio je najveši na staništima sa Vršaţkih planina (Tabela 22). Gvoţde je najzastupljeniji teški metal u ispitivanim uzorcima zemljišta sa koncentracijom od 13,57 g/kg do 35,92 g/kg (Tabela 22). Veša koncentracija zabeleţena je u uzorcima sa Vršaţkih planina (22,1 do 35,92 g/kg). Dobijeni rezultati mogu se objasniti ţinjenicom da zemljišta formirana na geološkoj podlozi gnajs sadrţe visok nivo ovog metala. Za potencijalno toksiţne elemente (Cu, Zn i Cr) izraţunati su biokoncentracioni faktori, kao odnos koncentracija odgovarajušeg elementa u biljci i zemljištu (Tabela 20). Uz izuzetak vrednosti BCF faktora za Cr u uzorku 3, koji je bio blizu dozvoljenog limita, za sve ostale uzorke BCF factor bio je niţi u odnosu na maksimalne vrednosti predloţene od strane Idaho National Engineering and Environmental Laboratory (BCFCu=0,80; BCFZn=1,50; BCFCr=0,19) ukazujuši na odsustvo znaţajnog zagaŤenja. 2.1.3. Korelaciona analiza Korelaciona analiza primenjena je za procenu odnosa teških metala u ispitivanim biljnim i uzorcima zemljišta (Tabela 21). Nameše se nekoliko zakljuţaka. Izuzev u sluţaju Mn (r=0,694, p<0,05), nije primešena direktna korelacija izmeŤu koncentracije analiziranih teških metala u uzorcima zemljišta i ispitivanih biljnih vrsta. Sadrţaj hroma je u snaţnoj pozitivnoj korelaciji sa sadrţajem Fe u biljnim uzorcima (r=0,721, p<0,001). Ovakav rezultat je u saglasnosti sa literaturnim podacima koji svedoţe o sinergistiţkoj interakciji izmeŤu ova dva metala (Kabata-Pendias i Pendias, 2001). Dodatno, pokazana je visoka korelacija (r=0,721, p<0,05) sadrţaja Zn i Cu u uzorcima zemljišta, ukazujuši na mogušu kontaminaciju na pojedinim lokalitetima koja moţe biti posledica saobrašaja, ili industrijskih aktivnosti. 116 Tabela 20. Preraţunate BCF vrednosti za Cu, Cr i Zn Uzorak Cu Cr Zn 1 0,34 0,03 0,52 2 0,51 0,04 0,33 3 0,34 0,19 0,35 4 0,33 0,03 0,35 5 0,42 0,07 0,63 6 0,22 0,01 0,23 7 0,58 0,01 0,44 8 0,46 0,01 0,92 9 0,26 0,01 0,25 10 0,25 0,03 0,29 11 0,44 0,16 0,45 117 Tabela 21. Korelaciona analiza - koncentracija elemenata u Veronica vrstama i zemljištu Uzorak Element Biljka Zemljište Cu Fe Mn Zn Cr Cu Fe Mn Zn Biljka Fe 0,172 - - - - - - - - Mn -0,383 -0,001 - - - - - - - Zn -0,028 -0,238 0,558 - - - - - - Cr 0,442 0,928 a -0,077 -0,060 - - - - - Zemljište Cu 0,601 0,011 -0,436 -0,154 -0,442 - - - - Fe -0,728 b -0.281 -0,076 -0,397 -0,558 -0,189 Mn -0,512 -0,368 0,694 0,307 -0,519 -0,327 0,448 - - Zn 0,147 -0,158 -0,554 -0,283 -0,085 0,721 b 0,328 -0,199 - Cr 0,194 0,355 -0,164 0,183 -0,491 -0,022 -0,511 -0,574 0,081 118 Tabela 22. Sadrţaj teških metala u biljnim i uzorcima zemljišta Uzorak Cr Zn Cu Fe Mn Biljka Zemljište Biljka Zemljište Biljka Zemljište Biljka Zemljište Biljka Zemljište 1 3,55 111,33 46,69 88,87 8,40 24,41 102,73 13574,20 49,5 517,58 2 5,18 115,15 34,53 105,15 11,17 21,91 182,82 18226,40 30,47 665,97 3 18,96 97,13 31,41 91,06 10,83 31,36 563,26 14164,30 43,33 536,22 4 2,48 95,74 33,04 94,98 10,10 30,40 100,95 17667,20 38,55 750,38 5 7,43 111,33 55,76 88,87 10,33 24,41 175,55 13574,20 27,88 517,58 6 0,59 54,19 31,66 112,43 6,64 29,53 158,29 33580,00 34,21 803,53 7 0,53 48,86 27,66 63,29 7,17 12,38 143,44 26560,00 32,27 927,37 8 0,44 48,93 58,01 62,78 6,69 14,63 98,18 22100,00 89,25 1675,78 9 0,48 65,86 31,61 125,87 6,04 22,97 97,62 35920,00 33,00 980,20 10 1,62 53,08 39,59 138,00 12,18 47,77 35,53 20169,90 25,38 923,57 11 3,84 36,18 35,45 78,84 12,80 29,05 118,16 15435,70 36,43 639,00 Min 0,44 36,18 27,66 62,78 6,04 12,38 35,53 13574,22 25,38 517,58 Max 18,96 115,15 58,01 138,00 12,80 47,77 563,26 35920,00 89,25 1675,78 xsr 4,10 76,16 38,67 95,47 9,30 26,26 161,50 20997,44 40,02 812,47 Sd 5,420 30,040 10,312 23,668 2,407 9,427 139,770 7876,856 17,707 332,371 max/min 43,09 3,18 2,10 2,20 2,12 3,86 15,85 2,65 3,52 3,24 119 2.2 Analiza sadržaja aktivnih komponenti odabranih Veronica vrsta 2.2.1 Kolorimetrijske tehnike Kvalitativni i kvantitativni sastav ekstrakata moţe biti smernica za dalje farmakološke analize, obzirom da je na osnovu njega moguše pretpostaviti koji tip biološke aktivnosti bi on mogao ispoljavati (Kukiš-Markoviš, 2013). Kolorimetrijske tehnike se kao brze i jednostavne za izvoŤenje najţešše koriste za preliminarnu analizu biljnih sirovina i njihovih derivata. 2.2.1.1. Sadrţaj ukupnih fenola Fenolna jedinjenja predstavljaju jednu od najšire rasprostranjenih grupa sekundarnih metabolita biljaka. Pored uloge u rastu i reprodukciji, ova jedinjenja uţestvuju i u zaštiti biljaka od predatora i patogena. Dodatno, fenolna jedinjenja ispoljavaju i ţitav niz bioloških aktivnosti (antialergijska, antiarterogena, antimikrobna, antioksidantna, antitrombotska, kardioprotektivna, vazodilatatorna) koje mogu doprineti oţuvanju ljudskog zdravlja (Balasundram i sar., 2006). Sadrţaj ukupnih fenola u metanolnim, vodeno-acetonskim i vodenim ekstraktima ispitivanih taksona je odreŤivan spektrofotometrijski na bazi bojene reakcije sa Folin- Ciocalteu (FC) reagensom, a rezultati su izraţeni u miligram ekvivalentima galne kiseline po gramu suvog ekstrakta (mg GAE/g suvog ekstrakta). Sadrţaj ukupnih fenola varirao je od 116 do 201 mg GAE/ g suvog ekstrakta (Tabela 23). Najveši sadrţaj detektovan je u ekstraktima herbe V. jacquinii, dok je najniţi sadrţaj zabeleţen u ekstraktima herbe V. teucrium. Najniţe vrednosti ukupnih fenola dobijene su sa vodom kao ekstrakcionim sredstvom, dok se smeša acetona i vode pokazala kao najbolji rastvaraţ za ekstrakciju fenolnih jedinjenja. Ovo se moţe objasniti ţinjenicom da prisustvo organskog rastvaraţa olakšava penetraciju ekstrakcionog sredstva u šelije biljke, ţime se ubrzava rastvaranje fenolnih jedinjenja u vodenoj sredini (Moure i sar., 2001). Rezultati dobijeni u okviru ove doktorske disertacije sliţni su utvrŤenom sadrţaju ukupnih fenola u metanolnim ekstraktima herbi drugih vrsta roda Veronica (40,90 - 200,20 mg GAE/g suvog ekstrakta) (Harput i sar., 2011). Prema rezultatima ispitivanja koje je sprovela Nikolova (2011) sadrţaj ukupnih fenola u metanolnim ekstraktima herbi pojedinih 120 Veronica vrsta (meŤu kojima su i taksoni ispitivani u okviru ove disertacije) iznosio je od 23,12 do 79,93 mg GAE/g ekstrakta, pri ţemu su vrednosti za V. jacquinii, V. teucrium i V. urticifolia iznosile oko 30 mg GAE/g ekstrakta, što je znatno niţe od vrednosti dobijenih u ovom radu i moţe se objasniti razliţitim ekstrakcionim procedurama. Tabela 23. Sadrţaj ukupnih fenola u metanolnim, vodeno-acetonskim i vodenim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica Biljna vrsta Ukupni fenoli (mg GAE/g) Metanolni ekstrakt Vodeno- acetonski ekstrakt Vodeni ekstrakt V. urticifolia 167,6 ± 1,3 171,5 ±2,2 143,6 ±0,9 V. jacquinii 195,4 ± 1,5 201,4 ±3,1 174,7 ± 1,5 V. teucrium 156,7 ± 0,9 172,1 ±1,5 116,4 ± 0,8 2.2.1.2. Sadrţaj ukupnih fenilpropanoida Fenilpropanoidni glikozidi su široko rasprostranjeni sekundarni metaboliti u biljnom svetu. I pored interesantnih svojstava ove klase jedinjenja, nizak sadrţaj u biljkama (manje od 5% w/w) ograniţio je njihovu izolaciju i komercijalnu primenu (López-Munguía i sar., 2011). Rezultati odreŤivanja ukupnih fenilpropanoida u metanolnim, vodenim i 70%-nim acetonskim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica prikazani su u Tabeli 24. Najviši sadrţaj je izmeren u 70%-nim acetonskim ekstraktima, dok je najniţi zabeleţen nakon primene vode kao ekstrakcionog sredstva. TakoŤe, meŤu ispitivanim taksonima, vrsta V. teucrium najbogatija je ovom grupom sekundarnih metabolita. Iako su fenilpropanoidni derivati široko rasprostranjeni u vrstama roda Veronica, ne postoje literaturni podaci o odreŤivanju njihovog ukupnog sadrţaja u njima. 121 Tabela 24. Sadrţaj ukupnih fenilpropanoida u metanolnim, vodeno-acetonskim i vodenim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica Biljna vrsta Ukupni fenilpropanoidi (mg akteozida/g) Metanolni ekstrakt Vodeno- acetonski ekstrakt Vodeni ekstrakt V. urticifolia 13,4 ± 0,2 35,0 ± 0,6 11,2 ± 0,2 V. jacquinii 18,7 ± 0,3 31,5 ± 0,4 11,8 ± 0,4 V. teucrium 26,3 ± 0,5 38,0 ± 0,6 17,9 ± 0,5 2.2.1.3. Sadrţaj ukupnih iridoida Sadrţaj iridoida u ispitivanim ekstraktima odreŤivan je spektrofotometrijski na bazi reakcije sa Trimm-Hill reagensom. Rezultati odreŤivanja iridoidnih jedinjenja u nadzemnim delovima u cvetu odabranih Veronica vrsta prikazani su u Tabeli 25. Sadrţaj ovih jedinjenja bio je najveši u ekstraktima herbe V. urticifolia, dok je najniţi sadrţaj zabeleţen u ekstraktima herbe V. jacquinii. TakoŤe, na osnovu rezultata moţe se zakljuţiti da je najbolje ekstrakciono sredstvo za iridoidna jedinjenja 70%-ni aceton, dok je najniţi prinos ove grupe jedinjenja postignut primenom vode kao ekstrakcionog sredstva. Tabela 25. Sadrţaj ukupnih iridoida u metanolnim, vodeno-acetonskim i vodenim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica Biljna vrsta Ukupni iridoidi (mg aukubina/g) Metanolni ekstrakt Vodeno- acetonski ekstrakt Vodeni ekstrakt V. urticifolia 270,2 ± 4,5 359,7 ± 4,8 187,6 ± 4,3 V. jacquinii 167,8 ± 3,2 249,6 ± 3,6 94,3 ± 2,5 V. teucrium 231,0 ± 5,1 322,9 ± 6,1 124,6 ± 3,7 122 Sadrţaj odreŤivanih grupa sekundarnih metabolita u suvim metanolnim, vodenim i 70%-nim acetonskim ekstraktima je radi bolje preglednosti prikazan i grafiţki (Slika 25). Kod vešine ispitivanih ekstrakata, dominantna klasa jedinjenja su iridoidi. Izuzetak predstavljaju metanolni i vodeni ekstrakt vrste V. jacquinii, gde su fenoli zastupljeniji. Obzirom da je spektrofotometrijska analiza izdvojila 70%-ne acetonske ekstrakte kao najbogatije ukupnim fenolima, ukupnim fenilpropanoidima i ukupnim iridoidima, oni su primenjivani kod dalje hemijske i farmakološke analize. Slika 25. Odnos ukupnih fenilpropanoida, iridoida i fenola u ispitivanim ekstraktima 2.2.2 OdreĎivanje sadržaja sekundarnih metabolita primenom hromatografskih metoda 2.2.2.1. OdreŤivanje sadrţaja aukubina i akteozida primenom HPLC i HPTLC metoda MeŤu analitiţkim metodama koje se koriste u ispitivanju lekovitog bilja, hromatografske tehnike imaju znaţajnu ulogu i uvedene su u sve savremene farmakopeje. Najţešše primenjivane hromatografske metode u fitohemijskoj analizi su tankoslojna hromatografija (TLC), visokoefikasna teţna hromatografija (HPLC) i gasna hromatografija (GC) (Waksmundzka-Hajnos i Sherma, 2011). 123 HPLC je najţešše koriššena tehnika za razdvajanje, kvalitativnu i kvantitativnu analizu polifenolnih jedinjena. Njena visoka efikasnost zasnovana je na primeni reverzno-fazne stacionarne faze u kombinaciji sa razliţitim sistemima detekcije. Najţešše koriššen tip detekcije je UV/VIS detekcija uz primenu detektora na principu fotodioda (Waksmundzka- Hajnos i Sherma, 2011). U okviru ove disertacije sadrţaj aukubina i akteozida odreŤen je HPLC-DAD tehnikom. Njihova kvantifikacija vršena je preko površine pikova dobijenih integracijom sa odgovarajuših hromatograma uz primenu eksternog standarda. Retenciona vremena aukubina i akteozida iznose 5,42 i 26,90 min sa standardnim devijacijama od 0,01 i 0,46. U UV spektru akteozida uoţavaju se apsorpcioni maksimumi karakteristiţni za feniletanoidna jedinjena na 246, 290 i 330 nm, dok je u UV spektru aukubina prisutan samo jedan apsorpcioni maksimum na 210 nm. Rezultati odreŤivanja aukubina i akteozida prikazani su u Tabeli 26, a odgovarajuši HPLC profili dati su na Slikama 31-33. Tabela 26. Sadrţaj aukubina i akteozida u 70%-nim acetonskim ekstraktima odreŤen primenom HPLC tehnike Uzorak Sadrţaj aukubina (mg/g suvog ekstrakta) Sadrţaj akteozida (mg/g suvog ekstrakta) V. jacquinii n.d. 30,93 ± 0,58 V. teucrium n.d. 33,29 ± 0,40 V. urticifolia 10,15±0,86 90,62 ± 2,20 n.d. – nije detektovan U odnosu na sadrţaj aukubina i akteozida, ispitivane biljne vrste do sada nisu analizirane. Aukubin je prisutan uglavnom u biljkama familija Scrophulariaceae, Plantaginaceae i Rubiaceae, gde igra znaţajnu ulogu kao hemotaksonomski marker (Marin, 2003). Njegovo prisustvo je takoŤe pokazano u brojnim Veronica vrstama (Crişan i sar., 2010). Zbog bioloških aktivnosti aukubina pokazanih tokom poslednjih decenija, interes za biljkama bogatim ovim sekundarnim metabolitom raste. U okviru ove studije aukubin je identifikovan samo u ekstraktu herbe V. urticifola, gde njegov sadrţaj iznosi 10,15 mg/g suvog ekstrakta, što preraţunato po gramu suve biljne sirovine iznosi 5,24 mg. 124 Sadrţaj aukubina do sada je odreŤivan primenom razliţitih metoda: LC-MS (Xu i sar., 2012; Jankoviš i sar., 2010), HPLC-DAD (Jankoviš i sar., 2010; Luo i sar., 2004), HPTLC (Jankoviš i sar., 2010; Hajimehdipoor i sar., 2011; Biringanine i sar., 2006; Rischer i sar.; 1998), kapilarne hromatografije (MECC) i kapilarne elektroforeze (Li i sar., 2008). U Veronica vrstama aukubin je kvantifikovan samo primenom LC/MS (Crişan i sar., 2010) i MECC-MS metoda (Suomi i sar., 2001). Sadrţaj aukubina odreŤen primenom LC/MS tehnike varirao je od 0,69 do 12,80 mg/g s.m., pri ţemu je u vrsti V. urticifolia iznosio 10,66 mg/g (Crişan i sar., 2010). Razlika u odnosu na sadrţaj dobijen u okviru ove doktorske disertacije moţe se objasniti primenom metanola kao ekstrakcionog sredstva. U vrstama V. spicata, V. longifolia i V. chamaedrys sadrţaj aukubina odreŤen primenom MECC-MS metode, je iznosio 4-24 mg/g s.m. (Suomi i sar., 2000; Suomi i sar., 2001). Sadrţaj akteozida u herbi V. urticifolia je pribliţno tri puta veši u odnosu na njegov sadrţaj u herbama V. jacquinii i V. teucrium (Tabela 26). Njegov sadrţaj do sada je odreŤivan primenom LC-MS (Wu i sar., 2006), HPTLC (Deepak i Handa, 2000; Biringanine i sar., 2006; Umek i sar., 2005) i HPLC-UV (Deepak i Handa, 2000) metoda. Prema dostupnim literaturnim podacima, do sada nije kvantifikovan u Veronica vrstama. Sadrţaj akteozida preraţunat po gramu suve biljne sirovine za V. urticifolia (23,80 mg/g) uporediv je sa njegovim sadrţjem u vrsti Plantago lanceolata koja je oficinalna prema vaţešoj Evropskoj farmakopeji (Ph. Eur. VII), gde on iznosi 21,71 mg/g (Jankoviš i sar., 2012). Distribucija i sadrţaj aukubina i akteozida u ispitivanim taksonima roda Veronica u skladu je sa njihovom taksonomskom pripadnoššu. Najveša sliţnost uoţava se izmeŤu ekstrakata herbi V. jacquinii i V. teucrium koje pripadaju istom podrodu Pentasepalae, dok V. urticifolia spada u podrod Veronica. Visokoefikasna tankoslojna hromatografija (HPTLC) se zbog svoje ekonomiţnosti, brzine, jednostavnosti izvoŤenja, mogušnosti testiranja više uzoraka istovremeno, kao i primene vešeg broja rastvaraţa u sastavu mobilne faze, u poslednje vreme sve više koristi kao tehnika izbora za kvalitativnu i kvantitativnu analizu aktivnih komponenti u biljnim uzorcima (Srivastava, 2011). Zbog toga je u okviru ove doktorske disertacije HPTLC metoda koriššena za kvantifikaciju aukubina i akteozida u 70%-nim acetonskim ekstraktima odabranih vrsta roda Veronica. Rezultati odreŤivanja aukubina i akteozida primenom HPTLC tehnike prikazani su u Tabeli 27, a odgovarajuši HPTLC profili dati su na Slikama 27-30. Na HPTLC ploţi 125 crvenoljubiţaste zone sa Rf vrednostima 0,24 i 0,72 odgovaraju aukubinu, odnosno akteozidu (Slika 26). Tabela 27. Sadrţaj aukubina i akteozida u 70% acetonskim ekstraktima odreŤen HPTLC metodom Uzorak Sadrţaj aukubina (mg/g suvog ekstrakta) Sadrţaj akteozida (mg/g suvog ekstrakta) V. jacquinii n.d. 29,28 ± 1,60 V. teucrium n.d. 32,89 ± 1,42 V. urticifolia 11,04 ± 0,33 88,37 ± 4,58 n.d. – nije detektovan Primena dva nezavisna metoda sa razliţitim mehanizmima razdvajanja poţeljna je za precizno odreŤivanje sadrţaja biljnih metabolita (Jankoviš i sar., 2010). HPTLC metodom potvrŤeni su rezultati HPLC analize. Studentovim t-testom koji je koriššen za procenu statistiţke znaţajnosti razlike izmeŤu vrednosti dobijenih HPTLC i HPLC metodama, pokazano je da su one ekvivalentne. Predloţena HPTLC hromatografska metoda moţe biti pogodna za rutinsku identifikaciju i kvantifikaciju aukubina i akteozida u Veronica vrstama, i moţe biti deo protokola za procenu autentiţnosti biljnog materijala. Slika 26. HPTLC hromatogram akteozida u ispitivanim Veronica vrstama 126 Slika 27. HPTLC hromatogram ekstrakta herbe V. urticifolia (metoda za odreŤivanje akteozida) 127 Slika 28. HPTLC hromatogram ekstrakta V. urticifolia (metoda za odreŤivanje aukubina) 128 Slika 29. HPTLC hromatogram ekstrakta V. jacquinii (metoda za odreŤivanje akteozida) 129 Slika 30. HPTLC hromatogram ekstrakta herbe V. teucrium (metoda za odreŤivanje akteozida) 130 Slika 31. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. jacquinii (λ=204 nm); AK – akteozid. min 10 20 30 40 50 60 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 AK 131 Slika 32. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. teucrium (λ=204 nm); AK – akteozid. min 10 20 30 40 50 60 mAU 0 200 400 600 800 1000 AK 132 Slika 33. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. urticifolia (λ=204 nm); AU – aukubin, AK – akteozid. min 10 20 30 40 50 60 mAU 0 100 200 300 400 500 600 AK AU 133 2.2.2.2. Analiza fenolnih jedinjenja primenom LC-DAD/ESI-MS metode Detaljna kvalitativna i kvantitativna hemijska analiza fenolnih jedinjenja u herbi vrsta V. jacquinii, V. teucrium i V. urticifolia izvršena je primenom HPLC-DAD-ESI/MS metode. HPLC hromatogrami dobijeni u uslovima optimizovanim za razdvajanje fenolnih jedinjenja na detekcionoj talasnoj duţini 280 nm dati su na Slikama 34-36. Identifikаcijа jedinjenjа je izvršenа nа osnovu kаrаkteristiţnog izgledа UV spektrа i molekulske formule izrаţunаte iz preciznih mаsа kvаzimolekulskih jonа u ESI mаsenim spektrima. Oţitane vrednosti retencionih vremena, talasnih duţina, molekulske mase pseudomolekularnih jona, i glavnih fragmentnih jona, date su u Tabelama 28-30. UV i maseni spektri dobijeni HPLC-DAD-ESI/MS analizom pokazali su da je profil ispitivanih ekstrakata okarakterisan prisustvom fenolnih kiselina (derivati hidroksibenzoeve i cimetne kiseline), flavonoida i fenilpropanoida. Analiza MS 2 fragmenata ukazala je na prisustvo O- i C- glikozida flavonoida, i to: flavanola (derivati kvercetina) i flavona (derivati apigenina, luteolina, izoskutelareina i hrizoeriola). a) Veronica urticifolia U ekstraktu herbe V. urticifolia glavnu frakciju ţinili su flavonoidi (oko 61%), i to flavoni kao jedini detektovani flavonoidi. Pikovi 5 i 12 identifikovani su kao derivati apigenina, dok su pikovi 9 i 13 identifikovani kao derivati luteolina na osnovu njihovih UV i MS spektralnih karakteristika. Analizom masenih spektara jedinjenja 5 i 12 utvrŤeno je prisustvo kvazi molekulskih jona na m/z 621 i 445, redom, koji predstavljaju molekulsku masu umanjenu za jedinicu. Kod oba jedinjenja prisustvo fragmentnog jona na m/z 269 ([M- 176] - i [M-176-176] - ) ukazuje na prisustvo glukuronil ostataka. MS analizom za jedinjenja 5 i 12 utvrŤene su molekulske mase 622 i 445, ţemu odgovaraju molekulske formule C27H26O17 i C21H18O11, redom. U oba sluţaja molekulska masa aglikona iznosi 270. Jedinjenja 5 i 12 prvobitno su identifikovana kao apigenin-O-diglukuronid i apigenin-O-glukuronid. Na osnovu pojave signala fragmentnog jona na m/z 445 kod jedinjenja 5 zakljuţeno je da je svaki glukuronidni ostatak lociran na razliţitim poloţajima apigenin aglikona. Kod jedinjenja 9 uoţava se prisustvo kvazi molekulskog jona na m/z 461 koji predstavlja molekulsku masu umanjenu za jedinicu [M-H] - , kao i fragmentnog jona na m/z 285 ([M-H-176] -) što odgovara gubitku jedne glukuronil jedinice. Masa aglikona iznosi 286 134 što odgovara luteolinu, pa je jedinjenje 9 identifikovano kao luteolin-7-O-glukuronid. Kod jedinjenja 13 je prisutan isti kvazi molekulski jon na m/z 461, ali i fragmentni jon na m/z 299 ([M-H-162] - ) koji ukazuje na prisustvo molekula heksoze, kao i fragmentni jon na m/z 285 koji svedoţi o prisustvu metil grupe (-14 masenih jedinica). Dakle, ovo jedinjenje je derivat luteolina, i to hrizoeriola (3‟-metil-luteolin) ili diosmetina (4‟-metil-luteolin). Na osnovu navedenih karakteristika jedinjenje 13 je prvobitno identifikaovano kao metil-luteolin-O- glukuronid. Eluiranje nakon luteolin-7-O-glukuronida je u saglasnosti sa smanjenjem polarnosti usled prisustva dodatne metil grupe. MeŤu navedenim flavonima dominantan je luteolin-7-O-glukuronid ţija koncentracija u analiziranom ekstraktu inosi 14,2 mg/g. Pored flavona u herbi V. urticifolia prisutni su i derivati hidroksicimetnih kiselina, i to kafene (jedinjenja 1-4, 6-8 i 10) i p-kumarinske kiseline (jedinjenje 11). Jedinjenje 1 je identifikovano kao 3-O-kafeoilhina kiselina na osnovu prisustva fragmentnog jona deprotonovane hina kiseline (m/z na 179) kao osnovnog pika i drugog fragmentnog jona na m/z 179 ([kafena kiselina-H] -) ţiji je intenzitet veši od polovine intenziteta osnovnog pika. Ovakav fragmentacioni model karakteristiţan je za 3-acilhlorogenske kiseline (Clifford i sar., 2005). Kod jedinjenja 2 i 3 prisutan je isti kvazi molekulski jon [M-H] - na m/z 487, kao i sliţan fragmentacioni model koji ukazuje na gubitak 308 masenih jedinica (heksozil i deoksiheksozil jedinice), pri ţemu nastaju osnovni pik na m/z 179 ([kafena kiselina-H]-) i dva fragmentna jona na m/z 161 ([kafena kiselina-H-H2O2] - ) i na m/z 135 ([kafena kiselina-H- CO2] - ). Podatak da nema fragmentnih jona koji bi ukazali na alternativni gubitak heksozil (- 162 masene jedinice) i deoksiheksozil (-146 masenih jedinica) ostataka svedoţi o tome da su ove dve šešerne komponente deo disaharida (npr. rutinoza ili neohesperidoza). Ipak, prava priroda šešernog ostatka ne moţe se utvrditi samo na osnovu MS analize. Iz tog razloga, jedinjenja 2 i 3 su prvobitno identifikovana kao kafeoil deoksiheksozil-heksozidi I i II. Jedinjenje 4 identifikovano je kao kafena kiselina na osnovu poreŤenja retencionog vremena, UV i MS spektara sa odgovarajušim retencionim vremenom i spektrima komercijalno dostupnog standardnog jedinjenja. Jedinjenja 6, 7, 8 i 10 sa kvazi molekulskim jonom [M-H] - na m/z 477 i m/z 453, oznaţena su kao derivati kafene kiseline na osnovu prisustva fragmentnih jona na m/z 179, 161 i 135. UV spektri jedinjenja 7 i 10 pokazali su apsorpcione maksimume na 234 i 330 nm, karakteristiţne za feniletanoidne glikozide. HPLC-DAD/ESI-MS analiza jedinjenja 7 je pokazala prisustvo deprotonovanog molekulskog jona [M-H] - na m/z 623 koji moţe biti pripisan akteozidu. Ovo je potvrŤeno i putem dostupnih literaturnih podataka o UV spektru i 135 MS 2 fragmentacionom modelu akteozida (Li i sar., 2005). Na osnovu MS 2 spektra jasno je da od molekulskog jona na m/z 623 nastaje glavni fragmentni jon na m/z 461 gubitkom kafeoil grupe ([M-H-161] - ), kao i slabiji jon na m/z 315 koji ukazuje na gubitak ramnoze, ali i joni na m/z 161 i m/z 135 koji svedoţe o prisustvu kafeoil ostatka. Jedinjenje 7 je prvobitno identifikovano kao akteozid u skladu sa podacima do kojih su došli Li i saradnici (2005). Sadrţaj akteozida u herbi V. urticifolia (14,9 mg/g) ţini je znaţajnim izvorom ovog bioaktivnog jedinjenja. Jedinjenje 10 prvobitno je identifikovano kao izomer akteozida. Za jedinjenje 11 pokazano je prisustvo molekulskog jona [M-H] - na m/z 437 koji dalje fragmentacijom daje MS 2 osnovni pik na m/z 163 ([kumarinska kiselina-H] -), što u kombinaciji sa UV spektrom (λmax na 312 nm) potvrŤuje da je u pitanju derivat kumarinske kiseline. b) Veronica teucrium U ekstraktu herbe V. teucrium glavnu frakciju ţinili su flavonoidi (oko 61%) i to flavoni kao jedini detektovani flavonoidi. Pikovi 3 i 11 identifikovani su kao derivati apigenina, dok su pikovi 10 i 12 identifikovani kao derivati izoskutelareina na osnovu njihovih UV i MS spektralnih karakteristika. Osim flavonoida prisutni su i derivati fenolkarbonskih kiselina, ţiji sadrţaj u ispitivanom ekstraktu iznosi 39%. Iako je na osnovu UV spektra jasno da je u pitanju derivat apigenina, u MS spektru jedinjenja 3 u herbi V. teucrium nema fragmentnog jona na m/z 269 koji bi ukazao na aglikon apigenina. Ovo jedinjenje identifikovano je kao C-glikozilovani derivat. Pored niskog retencionog vremena, ovaj tip jedinjenja okarakterisan je gubitkom karakterisitiţnih fragmenata nastalih cepanjem pirano prstena šešera veliţine 120 i 90 masenih jedinica u sluţaju heksozida. U masenom spektru jedinjenja 3 uoţava se prisustvo kvazi molekulskog jona [M-H] - na m/z 593, kao i karakteristiţnih fragmentnih jona na m/z 503 (-90 masenih jedinica), 473 (-120 masenih jedinica), 383 (-120-90 masenih jedinica) i 353 (-120-120 masenih jedinica). Fragmentacioni model jedinjenja 3 u saglasnosti je sa literaturnim podacima za apigenin-6,8-di-C-glukozid (vicenin 2) (Grayer i sar., 2000). Na osnovu podataka iznetih za LC-MS/ESI-MS analizu herbe V. urticifolia jedinjenje 11 identifikovano je kao apigenin-7-O-glukuronid. UV spektri jedinjenja 10 i 12 karakteristiţni su za izoskutelarein derivate i pokazuju λmax na 278, 302 i 333 nm, što je u saglasnosti sa prethodno objavljenim podacima za derivate 136 izoskutelareina prisutne u Veronica vrstama (Saracoglu i sar., 2004b). U MS spektrima jedinjenja 9 i 10 prisutni su kvazi molekulski ([M-H] - ) na m/z 651 i fragmentni jon ([M-H-42- 162-162] - ) na m/z 285 koji predstavlja molekulsku masu aglikona umanjenu za jedan. TakoŤe, prisutni su i fragmentni jon na m/z 609 koji svedoţi o prisustvu acetil grupa kod oba jedinjenja, kao i [(M-H-42-162) - ] koji je rezultat gubitka obe heksozil grupe. Fragmentni jon ([M-H-42-180] - ) na m/z 429 kod jedinjenja 11 ukazuje na prisustvo acetil grupe na molekulu terminalne heksoze (Karioti i sar., 2010). Glavni fragmentni jon na m/z 285 nastaje gubitkom jedinice od 324 Da, što ukazuje na O-glikozilovanje fenolne grupe diheksozom (Ferreres i sar., 2004). Fragmentni jon [M-H-180] - na m/z 429 ukazuje na 1→2 glikozidnu vezu izmeŤu šešernih komponenti (Ferreres i sar., 2004; Petreska i sar., 2011). Na osnovu prethodnih podataka o derivatima izoskutelareina u Veronica vrstama (Albach i sar., 2005b), kao i na osnovu zastupljenosti pojedinih fragmentnih jona (Pereira i sar., 2012), jedinjenje 10 je prvobitno identifikovano kao izoskutelarein 7-O-[alozil-(1→2)]-glukopiranozid. Njegovo prisustvo prethodno je pokazano u biljkama familije Lamiaceae, i to u okviru rodova Sideritis, Stachys i Lamium (Perreira i sar., 2012). Jedinjenje 12 prvobitno je identifikovano kao izoskutelarein 7-O-(6’’’-O-acetil)-β-alozil-(1’’’→2’’’)-β-glukopiranozid. Saracoglu i saradnici (2004b) pokazali su prisustvo jedinjenja 12 i u vrsti Veronica thymoides subsp pseudocinerea. Pored flavona u herbi V. teucrium prisutna je i protokatehinska kiselina (jedinjenje 1), kao i derivati hidroksicimetnih kiselina, i to kafene (jedinjenja 2, 5, 6, 7, 8 i 9) i protokatehinske kiseline (jedinjenje 4). Jedinjenje 1 identifikovano je kao protokatehinska kiselina poreŤenjem UV spektra i retencionog vremena sa istim parametrima standardnog jedinjenja. Na sliţan naţin, jedinjenje 2 identifikovano je kao 5-O-kafeoilhina kiselina na osnovu poreŤenja sa autentiţnim standardom, kao i na osnovu MS fragmentacionog modela. Jedinjenje 4, sa UV spektrom karakteristiţnim za benzojeve kiseline, identifikovano je kao derivat protokatehinske kiseline na osnovu kvazi molekulskog jona [M-H] - na m/z 497 i fragmentacionog modela koji nastaje cepanjem heksozil jedinice (- 162 masene jedinice), kao i dva fragmentna jona na m/z 153 ([protokatehinska kiselina-H] - ) i 109 ([protokatehinska kiselina-H-CO2] - ). UV spektri jedinjenja 5, 6,7, 8 i 9 pokazali su apsorpcione maksimume na 234 i 330 nm, karakteristiţne za feniletanoidne glikozide. Vešina feniletanoidnih glukozida ukljuţuje supstituente kao što su feruloil, ili kafeoil grupa koje su vezane najţešše za hidroksilnu grupu poloţaja 4 ili 6 centralnog molekula šešera. Za njihov MS spektar karakteristiţno je prisustvo 137 fragmentnih jona na m/z 179, 161 i 135, koji ukazuju na cepanje kafeoil grupe, anhidroglukoze i anhidrofenetanola. Na osnovu podataka iznetih za LC-DAD/ESI-MS analizu herbe V. urticifolia jedinjenje 7 identifikovano je kao akteozid. Sliţne karateristike pokazuje i pik 8, što ukazuje na to da su ova dva jedinjenja izomeri. Na osnovu redosleda eluiranja, kao i prema literaturnim podacima do kojih su došli Li i sar. (2008) jedinjenje 8 identifikovano je kao izoakteozid. Jedinjenja 5 i 9 imaju isti kvazi molekulski jon na m/z 771. U njihovom MS 2 spektru prisutni su sledeši fragmentni joni: ([M-H-162]-) na m/z 609 koji ukazuje na gubitak kafeoil/heksozil jedinice, ([M-H-162-132] - ) koji nastaje gubitkom dodatne pentozil jedinice na m/z 477 i ([M-H-162]) na m/z 315 koji je rezultat cepanja još jedne kafeoil/heksozil grupe. Detektovan je i fragmentni jon na m/z 161 kao karakteristika kafeoil ostatka kao i u sluţaju prethodnih feniletanoidnih glikozida. Jedinjenja 5 i 9 su prvobitno identifikovana kao aragozid i izoaragozid. Njihovo prisustvo i ranije je pokazano u Veronica vrstama, i to u herbi V. lavaudiana (Taskova i sar., 2011; Taskova i sar., 2012), V. pentasepala i V. raoulii (Taskova i sar., 2012). Za jedinjenje 6 pokazane su sliţne karakteristike. Na osnovu kvazi molekulskog jona na m/639 i fragmentnih jona na m/z 179, m/z 161 i m/z 135, kao i nakon poreŤenja sa dostupnim literaturnim podacima (Qi i sar., 2012), ovo jedinjenje je prvobitno identifikovano kao plantamajozid. Na osnovu njegovog sadrţaja u ekstraktu V. teucrium moţe se zakljuţiti da je dominantno feniletanoidno jedinjenje u ovoj biljnoj vrsti. Njegovo prisustvo je ranije pokazano i u vrsti V. fuhsii (Ozipek i sar., 1999). c) Veronica jacquinii U ekstraktu herbe V. jacquinii glavnu frakciju ţinili su derivati fenolkarbonskih kiselina (oko 63%), kafene i protokatehinske kiseline. Pored njih prisutni su i flavonoidi (37%) i to flavonoli i flavoni kao jedini detektovani flavonoidi. Pikovi 1, 4, 9-11 identifikovani su kao derivati kvercetina, pik 6 kao derivat luteolina, dok su pikovi 14 i 15 identifikovani kao derivati izoskutelareina na osnovu njihovih UV i MS spektralnih karakteristika. Jedinjenje 10 identifikovano je kao kvercetin-3-O-glukozid na osnovu poreŤenja retencionog vremena, MS i UV spektara sa retencionim vremenima i spektrima komercijalnog standarada. Jedinjenje 11 sa UV spektrom karakteristiţnim za derivate kvercetina, kvazi molekulskim jonom na m/z 463 identifikovano je kao kvercetin heksozid. U njegovom MS spektru prisutan je fragmentni jon na m/z 301 koji ukazuje na jedinicu heksoze vezanu za atom kiseonika. Jedinjenja 1 i 4 identifikovana kao kvercetin diheksozidi I i II ([M-H] - na 138 m/z 625). Njihova identifikacija vršena je putem njihovih kvazi molekulskih jona, kao i fragmentnih jona koji nastaju cepanjem jednog ili dva heksozil ostatka (162 masene jedinice). Ni kod jednog od ovih jedinjenja nije moguše utvrditi identitet šešerne komponente, kao ni poloţaj supstituenta samo na osnovu MS analize. U masenom spektru jedinjenja 10 uoţen je fragmentni jon ([M-H-42] - ) na m/z 625 koji odgovara gubitku acetil grupe, kao i fragmentni joni na ([M-H-42-162] - ) na m/z 463 i ([M-H-42-162-162] - ) na m/z 301 koji ukazuju na prisustvo dva molekula heksoze. Jedinjenje 9 je prvobitno identifikovano kao kvercetin acetil-di-heksozid. Kvercetin i njegovi derivati do sada su identifikovani samo u podrodu Pocilla. Mehrvarz i sar. (2008) pokazali su da je kvercetin prisutan u vrstama V. franisetae i V. siaretensis, dok u vrstama V. polita i V. persica on predstavlja prekursor za sintezu kvercetin 3‟,4‟,5,7-tetrametiletra. Kao jedinjenje 6 na hromatogramu je identifikovan derivat luteolina sa kvazi molekulskim jonom ([M-H] - ) na 623, kao i MS 2 fragmentnim jonima ([M-134] - ) na m/z 489, ([M-134-162] - ) na m/z 327 i ([M-134-126-42] -) na m/z 285. Dok poreklo prvog meŤu njima nije utvrŤeno, druga dva potiţu od gubitka heksozil i acetil grupa, redom. UV spektri jedinjenja 13 i 14 karakteristiţni su za izoskutelarein derivate. Na osnovu kvazi molekulskog jona ([M-H] - ) na m/z 651, i fragmentnih jona ([M-H-324-42] - ) na m/z 285 koji ukazuje na O-acetil glikozilovanje fenolne hidroksilne grupe, i jona ([M-H-42-180] - ) na m/z 429 koji ukazuje na prisustvo acetil grupe na terminalnoj šešernoj komponenti, jedinjenje 13 je prvobitno identifikovano kao izoskutelarein 7-O-(6-O- acetilalozil)(1→2)glukopiranozid. Jedinjenje 14 je prvobitno identifikovano kao izoskutelarein 7-O-(6'''-O-acetil)-β-alopiranozil-(1'''→2''')-β-glukopiranozid. Pored flavona u herbi V. jacquinii prisutni su i derivati hidroksicimetnih kiselina, i to kafene (jedinjenja 3, 5, 7, 8, 12 i 13) i protokatehinske kiseline (jedinjenje 2). Jedinjenje 2 identifikovano je kao derivat protokatehinske kiseline na osnovu kvazi molekulskog jona [M-H] - na m/z 335 i dva fragmentna jona na m/z 153 ([protokatehinska kiselina-H] - ) i 109 ([protokatehinska kiselina –H-CO2] - ). Jedinjenja 3, 5 i 7 na osnovu fragmentnih jona na m/z 179 ([kafena kiselina-H] - ), m/z 161 ([kafena kiselina-H-H2O] - ) i m/z 135 ([kafena kiselina-H- CO2] - ) prvobitno su identifikovana kao derivati kafene kiseline I, II i III. Šešerne komponente ţine heksoza, deoksiheksoza, disaharidi i glukuronidi, što se moţe zakljuţiti na osnovu gubitka 162 Da, 146 Da, 308 Da i 176 Da. Jedinjenje 8 identifikovano je kao akteozid. Na osnovu UV spektra jedinjenja 13 i njegovog kvazi molekulskog jona koji je za 14 Da manji u odnosu na kvazi molekulski jon 139 akteozida, ukazujuši na prisustvo metil grupe, jasno je da je u pitanju njegov derivat. U MS2 spektru ovog jedinjenja prisutni su fragmentni joni na m/z 461 i 315, što ukazuje na gubitak feruloil grupe, kao i feruloil i ramnozil grupe, redom. Primešeni su fragmentni joni [ferulna kiselina-H-] na m/z 193 i [ferulna kiselina-H-H2O]. Prema ovim podacima, kao i prema rezultatima do kojih je došao Innocenti sa saradnicima (2006) jedinjenje 12 prvobitno je identifikovano kao eukovozid. Ovo jedinjenje do sada je identifikovano u biljkama familija Verbenaceae (Dawoud i El-Morsy, 2012; Quirantes-Piné i sar., 2009), Orobanchaceae (Shuya i sar., 2004) i Scrophulariaceae (Emam, 2010), a ovo je prvi podatak o njegovom prisustvu u familiji Plantaginaceae i rodu Veronica. 140 Tabela 28. Prvobitna identifikacija i kvantifikacija fenolnih jedinjenja u ekstraktu herbe V. urticifolia Pik Rt (min) λmax (nm) [M-H] - (m/z) MS 2 (m/z) Prvobitna identifikacija Kvantifikacija (mg/g ekstrakta) 1 5,56 324 353 191(100), 179(75), 173(7), 135(57) 3-O-kafeoilhina kiselina 0,160±0,010 2 5,74 330 487 179(100), 161(11), 135(56), 119(3) Kafeoil deoksiheksozil-heksozid I 0,048±0,005 3 6,04 330 487 179(100), 161(24), 135(76) Kafeoil deoksiheksozil-heksozid II 0,031±0,001 4 14,51 326 179 135(43) Kafena kiselina 0,050±0,010 5 15,47 268/328 621 445(65), 269(60) Apigenin-O-diglukuronid 2,100±0,010 6 18,06 330 477 315(2), 179(13), 161(76), 135(13) Derivat kafene kiseline 0,090±0,010 7 18,50 330 623 461(43), 315(4), 161(29), 135(2) Akteozid 14,923±0,101 8 19,57 328 453 341(27), 281(26), 251(29), 221(34), 179(100), 161(22), 135(34) Derivat kafene kiseline 0,171±0,011 9 21,32 348 461 285(100) Luteolin-7-O-glukuronid 14,210±0,100 10 21,59 326 623 461(55), 315(5), 161(14), 135(2) Izomer akteozida 0,760±0,021 11 24,85 312 437 265(92), 235(36), 163(100), 145(44), 119(36) Derivat p-kumarinske kiseline 0,082±0,012 12 26,04 330 445 269(100), 175(7), 113(18) Apigenin-O-glukuronid 2,080±0,043 13 27,35 348 461 299(37), 285(16) Metil-luteolin-O-glukuronid 6,610±0,041 141 Tabela 29. Prvobitna identifikacija i kvantifikacija fenolnih jedinjenja u ekstraktu herbe V. jacquini Peak Rt (min) max (nm) Molekulski jon [M-H] - (m/z) MS 2 (m/z) Prvobitna identifikacija Kvantifikacija (mg/g ekstrakta) 1 8,6 356 625 463(47), 301(52) Kvercetin di-heksozid I 0,622±0,002 2 14,1 264 497 335(25) ,221(22), 153(29), 109(11) Derivat protokatehinske kiseline 0,555±0,002 3 15,1 332 539 377(36), 341(36), 281(18), 251(14), 179(45), 161(18), 135(18) Derivat kafene kiseline I 0,280±0,008 4 15,9 344 625 463(8), 301(56) Kvercetin diheksozid II 0,654±0,004 5 16,6 334 433 323(86),179(24),161(100),135(14) Derivat kafene kiseline II 0,779±0,001 6 17,3 350 623 489(4), 327(22), 285(100) Derivat luteolina 1,420±0,009 7 17,8 330 477 179(14), 161(56), 135(13) Derivat kafene kiseline III 1,712±0,046 8 18,5 330 623 461(28), 315(2), 161(16), 135(3) Akteozid 5,000±0,015 9 19,7 352 667 625(43), 463(6), 301(51) Kvercetin acetil-diheksozid 0,614±0,003 10 21,0 350 463 301(100) Kvercetin 3-O-glukozid 0,314±0,005 11 21.4 350 463 301(100) Kvercetin heksozid 1,342±0,023 12 23,4 330 637 491(4), 461(54), 315(2), 193(5), 175(8), 161(5), 135(2) Eukovozid 1,679±0,006 13 27,1 268/298/328 651 609(6), 429(22), 285(86) Izoskutelarein 7-O-(6-O-acetilalozil) (1→2)-β-glukopiranozid 0,144±0,004 14 28,5 280/306/328 651 609(4), 447(4), 429(17), 285(80) Izoskutelarein 7-O-(6‟‟‟-O-acetil)-β- alozil (1‟‟‟2‟‟‟)-β-glukopiranozid 0,386±0,005 142 Tabela 30. Prvobitna identifikacija i kvantifikacija fenolnih jedinjenja u ekstraktu herbe V. teucrium Peak Rt (min) max (nm) Molekulski jon [M-H] - (m/z) MS 2 (m/z) Prvobitna identifikacija Kvantifikacija (mg/g extract) 1 6,4 258 153 109(100) Protokatehinska kiselina 0,169±0,006 2 8,7 326 353 191(100), 179(3), 173(3), 161(59), 135(4) 5-O-kafeoilhina kiselina 1,199±0,029 3 11,9 330 593 503(4), 473(16), 383(11), 353(26) Apigenin-C-heksozid-C-heksozid 0,040±0,000 4 14,1 264 497 335(38), 221(34), 153(41), 109(17) Derivat protokatehinske kiseline I 0,570±0,013 5 15.4 328 771 609(50), 477(33), 315(4), 161(7) Aragozid 1,663±0,007 6 16.4 328 639 477(41), 315(5), 179(2), 161(31), 135(3) Plantamajozid 10,060±0,033 7 18.5 330 623 461(42), 315(2), 161(25), 135(3) Akteozid 5,240±0,007 8 19.3 326 623 461(20), 315(2), 161(18) Izoakteozid 0,317±0,004 9 21,4 330 771 609(18), 477(14), 315(3), 161(3) Izoaragozid n.k. 10 22,6 330 609 447(4), 429(20), 285(100) Izoskutelarein-7-O-alozil-glukozid 3,239±0,032 11 26,1 336 445 269(100) Apigenin-7-O-glukuronid 0,978±0,003 12 28,4 278/306/326 651 609(7), 447(9), 429(33), 285(100) Izoskutelarein 7-O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alozil (1‟‟‟2‟‟‟)-β-glukopiranozid 26,326±0,117 143 Slika 34. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. teucrium (λ=280 nm) 144 Slika 35. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. jacquinii (λ=280 nm) 145 Slika 36. HPLC hromatogram ekstrakta herbe V. urticifolia (λ=280 nm) 146 2.2.2.3. Kvantitativna LC-MS/MS analiza odabranih fenolnih jedinjenja Dodatna saznanja o hemijskom sastavu herbi ispitivanih vrsta dobijena su kvantifikacijom odabranih jedinjenja u 70%-nim acetonskim ekstraktima primenom visoko selektivne i specifiţne LC-MS/MS tehnike sa trostrukim kvadrupolom masenim spektrometrom sa elektrosprej jonizacijom. Fitohemijski skrining obuhvatio je analizu 1 cikloheksan karboksilne kiseline, 14 fenolnih kiselina, 25 flavonoida, 3 kumarina i 2 lignana od kojih je vešina detektovana po prvi put u ispitivanim Veronica vrstama. Odgovarajuši hromatogami ispitivanih ekstrakata prikazani su na Slikama 37-39. Sadrţaj odreŤivanih fenolnih jedinjenja je dat u Tabeli 31 i znaţajno se razlikuje u zavisnosti od ispitivane Veronica vrste. Rezultati analize pokazuju da je meŤu kiselinama u 70%-nom acetonskom ekstraktu vrste V. teucrium dominantna hlorogenska kiselina (749,71 μg/g suve mase ekstrakta), dok je hina kiselina dominantna u ekstraktima vrsta V. jacquinii i V. urticifolia (310,03 i 38,44 μg/g s.m. ekstrakta). U poreŤenju sa ostalim fenolnim kiselinama, galna kiselina (prisutna samo u ekstraktu vrste V. jacquinii) i siringinska kiselina prisutne su u najmanjim koliţinama. U ispitivanim ekstraktima nije pokazano prisustvo o-kumarinske, cimetne, sinapinske i 3,4 dimetoksicimetne kiseline. Sadrţaj hlorogenske kiseline znaţajno varira meŤu ispitivanim vrstama (749,71; 195,63 i 7,32 μg/g s.m. u ekstraktima vrsta V. teucrium, V. jacquinii i V. urticifolia). Uz izuzetak hlorogenske i hina kiseline, sadrţaj ostalih ispitivanih kiselina je uglavnom ujednaţen. Ekstrakt herbe V. jacquinii ima najveši procenat fenolkarbonskih kiselina, dok je taj procenat najmanji u ekstraktu herbe V. urticifolia. Dosadašnja analiza flavonoidnog profila Veronica vrsta pokazala je da su flavoni dominantna klasa flavonoidnih jedinjenja (Albach i sar., 2003). Naši rezultati pokazuju da je bajkalin glavni flavonoid u ekstraktima vrsta V. urticifolia (779,05 μg/g s.m.) i V. teucrium (347,02 μg/g s.m.), dok u ekstraktu vrste V. jacquinii nije detektovan. Prethodna ispitivanja (Samuelsen, 2000) ukazala su na prisustvo bajkalina i u Plantago vrstama, ali je ovo prvi takav podatak za Veronica vrste. Apigenin, apigenin-7-O-glukozid, viteksin i hrizoeriol prisutni su u tragovima, i to apigenin, apigenin-7-O-glukozid, i hrizoeriol detektovani su u svim ispitivanim ekstraktima, dok je viteksin prisutan samo u ekstraktima vrsta V. jacquinii i V. urticifolia. Sliţna situacija je i sa luteolinom i luteolin-7-O-glukozidom u ekstraktu vrste V. teucrium, dok su nešto veše koncentracije zastupljene u ekstraktima vrsta V. jacquinii i V. urticifolia (11,73-37,33 μg/g s.m.). Dakle, rezultati pokazuju da vrste V. teucrium i V. 147 urticifolia mogu biti klasifikovane u flavon hemotip. Za razliku od fenolnih kiselina, ukupan sadrţaj analiziranih flavona bio je najveši u ekstraktu V. teucrium, dok je u ekstraktu herbe V. jacquinii on zanemarljiv u poreŤenju sa druge dve vrste. U okviru ovog ispitivanja naţinjen je pokušaj za detektovanjem prisustva drugih klasa flavonoida kao što su flavanoni, flavanoli, izoflavoni i flavanoli. Izokvercetin i hiperozid dominantni su flavonoli u analiziranim ekstraktima, a njihova najveša koncentracija je zabeleţena u ekstraktu V. jacquinii. Iako u tragovima, interesantno je prisustvo izoflavona genisteina u ekstraktu vrste V. jacquinii. Ovo je prvi podatak o identifikaciji izoflavonoida u familiji Plantaginaceae. Njihovo prisustvo je gotovo u potpunosti ograniţeno na familiju Fabaceae, ali su predstavnici ove klase sporadiţno detektovani i u nekoliko desetina drugih familija, meŤu njima i u familiji Scrophulariaceae (Mackova i sar., 2006). Kako je rod Veronica premešten iz familije Scrophulariaceae u familiju Plantaginaceae, prisustvo genisteina u njemu svedoţi o njihovoj bliskoj vezi. Naša prethodna ispitivanja pokazala su prisustvo derivata genisteina i u vrstama V. montana, V. polita i V. spuria (Barreira i sar., 2014). Što se tiţe drugih klasa flavonoida, u ispitivanom ekstraktu vrste V. teucrium detektovan je flavanon naringenin u tragovima (0,23 μg/g suve mase), dok je prisustvo flavanola primešeno samo u ekstraktu vrste V. urticifolia gde je odreŤen katehin u koncentraciji 2,68 μg/g s.m. Po prvi put je utvrŤeno i prisustvo tri kumarina u rodu Veronica, umbeliferona, skopoletina i eskuletina. U najvešoj koncentraciji kumarini su prisutni u ekstraktu vrste V. jacquinii, dok je u ekstraktu vrste V. teucrium zastupljen samo eskuletin. U vrsti V. urticifolia umbeliferon i eskuletin su prisutni u tragovima. Lignan sekoizolaricirezinol detektovan je u ispitivanom ekstraktu vrste V. urticifolia (6,94 μg/g s.m). Fenolni profil odabranih vrsta roda Veronica bio je predmet malobrojnih ispitivanja, a pregled dostupnih podataka dat je u Uvodu. U navedenim publikacijama postoje samo rezultati o kvalitativnom sastavu ovih jedinjenja. Uopšteno, fenolne komponente koje se nalaze u znaţajnijoj koliţini u ekstraktima odabranih Veronica vrsta su hlorogenska kiselina, bajkalin, kvercetin-3-O-glukozid i hiperozid, kao i derivat cikloheksana hina kiselina. Imajuši u vidu da ova jedinjenja poseduju veliki biološki potencijal i ispoljavaju aktivnosti kao što su antioksidantna, neuroprotektivna, antiinflamatorna, antitumorska, antimikrobna, sadrţaj ovih jedinjenja u ispitivanim ekstraktima ukazuje nam na njihovo potencijalno delovanje i usmerava dalja ispitivanja njihovih farmakoloških efekata. 148 Dobijeni rezultati fitohemijskog skrininga su izuzetno vaţni za karakterizaciju roda Veronica, obzirom da predstavljaju nove podatke o fenolnom sastavu tri ispitivane vrste, pa se mogu smatrati i potencijalnim hemotaksonomskim markerima. Tabela 31. Koncentracije odabranih fenolnih jedinjenja u ispitivanim 70%-nim acetonskim ekstraktima Jedinjenje Sadrţaj fenolnih jedinjenja u ispitivanim Veronica ekstraktima (μg/g suvog ekstrakta) V. teucrium V. jacquinii V. urticifolia Fenolne kiseline p-Hidroksibenzoeva kiselina 53,06 ± 0,10a 25,08 ± 0,04b 17,08 ± 0,06c 2,5- Dihidroksibenzoeva kiselina 31,37 ± 0.33a 53,48 ± 0.84b 6,10 ± 0,09c Protokatehinska kiselina 28,93 ± 0,31a 53,57 ± 0,97b 5,93 ± 0,04c Vanilinska kiselina 17,39 ± 0,77a 46,14 ± 0,74b 9,07 ± 0,32c Galna kiselina 1,05 ± 0,05a n.db n.d.b Siringinska kiselina 0,56 ± 0,06a 0,90 ± 0,03b 0,30 ± 0,03c Cimetna kiselina n.d. n.d. n.d. o-Kumarinska kiselina n.d. n.d. n.d. p-Kumarinska kiselina 14,36 ± 0,11a 13,62 ± 0,04b 11,32 ± 0,14c Kafena kiselina 39,52 ± 0,11a 28,15 ± 0,15b 11.67 ± 0,13c Ferulna kiselina 5,50 ± 0,19a 7,20 ± 0,20b 4,59 ± 0,08c 3,4- Dimetoksicimetna n.d. n.d. n.d. 149 kiselina Sinapinska kiselina n.d. n.d. n.d. Hlorogenska kiselina 749,71 ± 1,14a 195,63 ± 0,57b 7,32 ± 0,10c Hina kiselina 310,91 ± 3,78a 310,03 ± 2,87a 38,44 ± 0,55b Flavonoidi Apigenin 3,27 ± 0,08a 4,25 ± 0,33b 10,19 ± 0,07c Apigenin-7-O- glukozid 1,39 ± 0,04a 5,17 ± 0,02b 4,43 ± 0,03c Apiin n.d. n.d. n.d. Viteksin n.d. a 0,06 ± 0,00b 2,72 ± 0,03c Amentoflavon n.d. n.d. n.d. Bajkalein n.d. n.d. n.d. Bajkalin 347,02 ± 0,46a 9,66 ± 0,20b 779,10 ± 0,47c Daidzein n.d. n.d. n.d. Genistein n.d. a 3,37 ± 0,06b n.d.a Isoramnetin 0,16 ± 0,02a 0,11 ± 0,04ab 0,05 ± 0,00b Kemferol n.d. n.d. n.d. Kemferol-3-O- glukozid 4,76 ± 0,02a 19,89 ± 0,05b 1,00 ± 0,01c Hrizoeriol 1,90 ± 0,05a 0,38 ± 0,02b 7,70 ± 0,04c Luteolin 2,39 ± 0,03a 24,30 ± 0,06b 11,73 ± 0,16c Luteolin-7-O- glukozid 2,18 ± 0,02a 37,33 ± 0,04b 33,54 ± 0,05c Kvercetin n.d. n.d. n.d. Kvercitrin n.d. a 0,81 ± 0,03b 0,25 ± 0,01c Kvercetin-3-O- glukozid 5,39 ± 0,04a 377,08 ± 0,08b 1,98 ± 0,04c Hiperozid 5,83 ± 0,04a 362,37 ± 0,41b 2,25 ± 0,04c 150 Rutin 4,91 ± 0,02a 14,61 ± 0,03b 22,72 ± 0,03c Mircetin n.d. n.d. n.d. Naringenin n.d. a 0,22 ± 0,01b n.d.a Epikatehin n.d. n.d. n.d. Katehin n.d. a n.d. a 2,68 ± 0,13b Epigalokatehin galat n.d. n.d. n.d. Kumarini Umbeliferon n.d. a 14,30 ± 1,42b 0,74 ± 0,04c Eskuletin 2,46 ± 0,08a 1,70 ± 0,04b 1,03 ± 0,03c Skopoletin n.d. a 0,13 ± 0,01b n.d.a Lignani Matairezinol n.d. n.d. n.d. Sekoizolaricirezinol n.d. a n.d. a 6,94 ± 0,29b n.d. – nije detektovano. 151 Slika 37. LC/MS-MS hromatogram ekstrakta herbe V. jacquinii: 1: galna kiselina, 2: katehin, 3: epigalokatehin galat, 4: protokatehinska kiselina, 5: hlorogenska kiselina, 6: epikatehin, 7: 2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, 8: p-hidroksibenzoeva kiselina, 9: eskuletin, 10: kafena kiselina, 11: vanilinska kiselina, 12: siringinska kiselina, 13: p-kumarinska kiselina, 14: skopoletin, 15: umbeliferon, 16: ferula kiselina, 17: viteksin, 18: sinapinska kiselina, 19: luteolin 7-O-glukozid, 20: hiperozid, 21: kvercetin 3-O-glukozid, 22: rutin, 23: apiin, 24: o-kumarinska kiselina, 25: apigenin 7-O-glukozid, 26: mircetin, 27: kvercitrin, 28: kemferol 3-O-glukozid, 29: sekoizolaricirezinol, 30: 3,4-dimetoksicimetna kiselina, 31: bajkalin, 32: daidzein, 33: matairezinol, 34: kvercetin, 35: naringenin, 36: cimetna kiselina, 37: luteolin, 38: genistein, 39: kemferol, 40: apigenin, 41: izoramnetin, 42: hrizoeriol, 43: bajkalein, 44: amentoflavon, 45: hina kiselina. 152 Slika 38. LC/MS-MS hromatogram ekstrakta herbe V. teucrium: 1: galna kiselina, 2: katehin, 3: epigalokatehin galat, 4: protokatehinska kiselina, 5: hlorogenska kiselina, 6: epikatehin, 7: 2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, 8: p-hidroksibenzoeva kiselina, 9: eskuletin, 10: kafena kiselina, 11: vanilinska kiselina, 12: siringinska kiselina, 13: p-kumarinska kiselina, 14: skopoletin, 15: umbeliferon, 16: ferula kiselina, 17: viteksin, 18: sinapinska kiselina, 19: luteolin 7-O-glukozid, 20: hiperozid, 21: kvercetin 3-O-glukozid, 22: rutin, 23: apiin, 24: o-kumarinska kiselina, 25: apigenin 7-O-glukozid, 26: mircetin, 27: kvercitrin, 28: kemferol 3-O-glukozid, 29: sekoizolaricirezinol, 30: 3,4-dimetoksicimetna kiselina, 31: bajkalin, 32: daidzein, 33: matairezinol, 34: kvercetin, 35: naringenin, 36: cimetna kiselina, 37: luteolin, 38: genistein, 39: kemferol, 40: apigenin, 41: izoramnetin, 42: hrizoeriol, 43: bajkalein, 44: amentoflavon, 45: hina kiselina. 153 Slika 39. LC/MS-MS hromatogram ekstrakta herbe V. urticifolia: 1: galna kiselina, 2: katehin, 3: epigalokatehin galat, 4: protokatehinska kiselina, 5: hlorogenska kiselina, 6: epikatehin, 7: 2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, 8: p-hidroksibenzoeva kiselina, 9: eskuletin, 10: kafena kiselina, 11: vanilinska kiselina, 12: siringinska kiselina, 13: p-kumarinska kiselina, 14: skopoletin, 15: umbeliferon, 16: ferula kiselina, 17: viteksin, 18: sinapinska kiselina, 19: luteolin 7-O-glukozid, 20: hiperozid, 21: kvercetin 3-O-glukozid, 22: rutin, 23: apiin, 24: o-kumarinska kiselina, 25: apigenin 7-O-glukozid, 26: mircetin, 27: kvercitrin, 28: kemferol 3-O-glukozid, 29: sekoizolaricirezinol, 30: 3,4-dimetoksicimetna kiselina, 31: bajkalin, 32: daidzein, 33: matairezinol, 34: kvercetin, 35: naringenin, 36: cimetna kiselina, 37: luteolin, 38: genistein, 39: kemferol, 40: apigenin, 41: izoramnetin, 42: hrizoeriol, 43: bajkalein, 44: amentoflavon, 45: hina kiselina. 154 Slika 40. LC/MS hromatogram smeše standarda: 1: galna kiselina, 2: katehin, 3: epigalokatehin galat, 4: protokatehinska kiselina, 5: hlorogenska kiselina, 6: epikatehin, 7: 2,5-dihidroksibenzoeva kiselina, 8: p-hidroksibenzoeva kiselina, 9: eskuletin, 10: kafena kiselina, 11: vanilinska kiselina, 12: siringinska kiselina, 13: p-kumarinska kiselina, 14: skopoletin, 15: umbeliferon, 16: ferula kiselina, 17: viteksin, 18: sinapinska kiselina, 19: luteolin 7-O-glukozid, 20: hiperozid, 21: kvercetin 3-O-glukozid, 22: rutin, 23: apiin, 24: o-kumarinska kiselina, 25: apigenin 7-O-glukozid, 26: mircetin, 27: kvercitrin, 28: kemferol 3-O-glukozid, 29: sekoizolaricirezinol, 30: 3,4-dimetoksicimetna kiselina, 31: bajkalin, 32: daidzein, 33: matairezinol, 34: kvercetin, 35: naringenin, 36: cimetna kiselina, 37: luteolin, 38: genistein, 39: kemferol, 40: apigenin, 41: izoramnetin, 42: hrizoeriol, 43: bajkalein, 44: amentoflavon, 45: hina kiselina. 155 3. Farmakološka aktivnost 3.1. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti Organizam se od oštešenja slobodnim radikalima štiti antioksidantnim enzimima (superoksid dizmutaza, katalaza, ksantin oksidaza, glutation zavisni enzimi), kao i jedinjenjima poput askorbinske kiseline, α-tokoferola i glutationa (Datta i sar., 2000). Kako ovi mehanizmi zaštite mogu biti narušeni kod razliţitih patoloških procesa, ţesto su antioksidantni suplementi esencijalni za borbu sa oksidativnim oštešenjima. Tokom poslednjih decenija raste interes istraţivaţa za prirodne antioksidanse, kao posledica ustanovljene karcinogenosti sintetskih (Valyova i sar., 2009). 3.1.1. In vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti Acetonsko-vodeni ekstrakti odabranih Veronica vrsta testirani su u pogledu antiradikalske aktivnosti testom sposobnosti neutralizacije DPPH radikala, kao i u pogledu ukupne antioksidantne aktivnosti FRAP testom. Ispoljena aktivnost ekstrakata i butil hidroksitoluena (BHT) koriššenog za poreŤenje, data je u Tabeli 32. DPPH je slobodni organski radikal koji se koristi za odreŤivanje sposobnosti ‟‟hvatanja‟‟ slobodnih radikala antioksidanasa zahvaljujuši njegovoj velikoj osetljivosti (Zou i sar., 2004). Iako su ispitivani ekstrakti pokazali znaţajnu dozno-zavisnu inhibiciju DPPH radikala, njihova aktivnost nije bila snaţnija od aktivnosti BHT. Koncentracija neophodna za ‟‟hvatanje‟‟ 50% prisutnih DPPH radikala varirala je od 12,58 do 25,24 μg/ml, dok je IC50 vrednost za BHT iznosila 9,57 μg/ml. FRAP test je jednostavan i brz metod koji meri redukcionu sposobnost antioksidanasa. FRAP vrednosti ispitivanih ekstrakata kretale su se od 2,10 do 4,85 mmol Fe 2+/g. Najveša redukciona sposobnost pokazana je za ekstrakt V. teucrium što je u saglasnosti sa njegovim antiradikalskim efektom, dok je najniţa aktivnost zabeleţena za ekstrakt V. urticifolia. Dobijeni rezultati pokazuju da su ispitivane Veronica vrste snaţni antioksidantni agensi koji mogu da utiţu na spreţavanje slobodnoradikalskih procesa zasnovanih na transferu elektrona. 156 Tabela 32. Antioksidantna aktivnost ispitivanih Veronica vrsta u in vitro testovima Uzorak DPPH IC50 vrednost (μg/ml) FRAP vrednosti (mmol Fe 2+ /g) V. jacquinii 25,24 3,74 V. teucrium 12,58 4,85 V. urticifolia 22,70 2,10 BHT 9,57 10,58 Prethodnim ispitivanjima je za pojedine Veronica vrste, kao i za neka iz njih izolovana jedinjenja, pokazano da ispoljavaju znaţajno antioksidantno delovanje. Harput i sar. (2011) pokazali su visoku antiradikalsku aktivnost za vodeni ekstrakt V. officinalis, ţiji je efekat (IC50 iznosi 40,93 µg/ml) uporediv sa efektom ekstrakata testiranih u okviru ove doktorske disertacije. U istom ispitivanju, ekstrakti drugih ispitivanih vrsta pokazali su slabiju antioksidantnu aktivnost (IC50 se kretala od 53,96 do 390,09 µg/ml). Osim toga, vodeni ekstrakt nadzemnog dela V. cuneifolia subsp. cuneifolia u znaţajnoj meri neutralisao je DPPH radikal (IC50=32,9 µg/ml), dok je aktivnost ekstrakta V. cymbalaria (IC50=153,6 µg/ml) bila znatno niţa (Saracoglu i sar., 2011). Snaţnu anti-DPPH aktivnost (IC50=14,1 μg/ml), uporedivu sa aktivnoššu BHT-a (IC50=12,3) ispoljava i V. polita (Harput i sar., 2002a). Dosadašnja istraţivanja ukazuju da su najznaţajniji antioksidansi biljnog porekla razliţiti polifenoli (flavonoidi, fenolkarbonske kiseline i sl.). Iako veoma raznovrsna, ova jedinjenja u osnovi sadrţe jednu ili više fenolnih grupa, koje zahvaljujuši sposobnosti da doniraju vodonik neutrališu slobodne radikale (Kukiš-Markoviš, 2013). Antioksidantna aktivnost flavonoidnih jedinjenja zavisi od broja i poloţaja hidroksilnih grupa u prstenovima A, B i C, kao i od prisustva dvostruke veze izmeŤu poloţaja C2 i C3 (Balasundram i sar., 2006). Veši broj hidroksilnih grupa (naroţito u prstenu B) znaţi i vešu sposobnost flavonoida za hvatanje slobodnih radikala. Lee i Kim (2010) pokazali su da antioksidantna aktivnost opada sledešim redom: flavanoli˃ flavanoni˃ flavoni. Visoka antiradikalska aktivnost kvercetina najvešim delom je posledica prisustva 1, 2 dihidroksibenzen (katehol) grupe u prstenu B. Ipak, iako je kvercetin snaţan antioksidans, za najveši broj njegovih derivata pokazano je da ispoljavaju niţu aktivnost u poreŤenju sa slobodnim aglikonom, što je posledica blokiranja hidroksilnih grupa šešernim ili alkoksil substituentima (Materska, 2008). Za hiperozid i izokvercetin, dominantne derivate kvercetina 157 u vrsti V. jacquinii, Sukito i Tachibana (2014) pokazali su vešu anti-DPPH aktivnost u odnosu na askorbinsku kiselinu i kvercetin (IC50=21,6 i 27,5 i mM za izokvercetin i hiperozid i 27,8 i 32,2 mM za askorbinsku kiselinu i kvercetin). Sa druge strane, za glikozilovane kvercetin derivate pokazana je smanjena sposobnost redukcije Fe(III) do Fe(II) jona u FRAP testu (Procházková i sar., 2011). Na osnovu strukture bajkalina moţe se pretpostaviti da je aktivan antioksidans. Njegova anti-DPPH aktivnost bila je slabija u odnosu na askorbinsku kiselinu, meŤutim, snaţnija u odnosu na BHT (Peng-Fei i sar., 2013). Srednja IC50 vrednost u DPPH testu za bajkalin iznosi 16,4 µg/ml, dok je FRAP testom utvrŤeno da je njegova ukupna redukciona sposobnost snaţnija u odnosu na askorbinsku kiselinu i BHT. Tehnikom elektrospin rezonancije (ESR) odreŤena IC50 vrednost izoskutelarein 7-O-[6'''- O-acetil-β-D-alopiranozil-(1→2)]-β-D-glukopiranozida iznosila je 66 µg/ml. Anti-DPPH aktivnost ovog jedinjenja bila je veša u odnosu na BHT, odnosno jednaka α-tokoferolu (Saracoglu i sar., 2004a). Visok sadrţaj ovog jedinjenja u ekstraktu V. teucrium moţe biti odgovoran za najvešu ispoljenu aktivnost meŤu ispitivanim ekstraktima. Fenolkarbonske kiseline prisutne u ispitivanim vrstama takoŤe pokazuju snaţnu antiradikalsku aktivnost. Hidroksicimetne kiseline, koje su i zastupljenije u analiziranim ekstraktima, ostvaruju snaţniju aktivnost u odnosu na odgovarajuše hidroksibenzoeve kiseline zahvaljujuši prisustvu boţnog propeinskog lanca. Konjugovana dvostruka veza u ovom lancu moţe stabilisati fenoksil radikal rezonantnim efektom, na taj naţin snaţeši antioksidantnu aktivnost aromatiţnog prstena (Natella i sar., 1999). Efekat hidroksicimetnih kiselina u odnosu na sintetske antioksidanse opada sledešim redom: kafena>hlorogenska>α- tokoferol>ferula>BHT (Chen i Ho, 1997). Za hlorogensku kiselinu IC50 vrednost u DPPH testu iznosi 9,3 µM (Akihisa i sar., 2013), dok je njena FRAP vrednost za 44% veša u odnosu na FRAP vrednost akteozida (Georgiev i sar., 2011). Razliţitim in vitro testovima pokazano je da fenilpropanoidni glikozidi deluju kao snaţni inhibitori oksidacije lipoproteina male gustine putem razliţitih mehanizama kao što su hvatanje slobodnih radikala i heliranje metalnih jona, a zahvaljujuši fenilpropanoidnoj grupi u njihovoj strukturi (López-Munguía i sar., 2011). Za akteozid prisutan u sva tri ispitivana ekstrakta utvrŤena je snaţna antiaradikalska aktivnost, uporediva sa aktivnoššu butilhidroksitoluena (BHT) i znaţajno veša od aktivnosti α-tokoferola (Kukiš-Markoviš, 2013). Delazar i sar. (2008) pokazali su da IC50 akteozida u DPPH testu iznosi 7,9 μg/ml. U vrstama Plantago depressa Willd. i Plantago media L., dominantna fenilpropanoidna 158 jedinjenja akteozid i plantamajozid ujedno su i jedinjenja odgovorna za izraţenu antiradikalsku aktivnost ovih biljnih vrsta (Olenikov i sar., 2011). Upravo ova dva jedinjenja dominantni su fenilpropanoidi u ekstraktu vrste V. teucrium koji je pokazao i najznaţajniji antioksidantni efekat u oba in vitro testa. Sadrţaj ukupnih fenola u ispitivanim ekstraktima pokazao je slabu korelaciju sa pokazanom antioksidantnom aktivnoššu. Slaba povezanost moţe biti posledica razliţitih faktora: npr. samo flavonoidi sa odreŤenom strukturom tj. poloţajem hidroksil supstituenata u molekulu mogu delovati kao proton donori i ispoljiti antiradikalsku aktivnost. Dodatno, merenje ukupnih fenola primenom Folin-Ciocalteu testa ne mora nuţno biti dobar indikator antioksidantne aktivnosti usled mogušnosti interferencije (Ghimre i sar., 2011). Osim toga, još jedan od razloga slabe korelacije moţe biti i sinergizam polifenolnih jedinjenja meŤusobno, kao i sinergizam sa drugim komponentama prisutnim u ekstraktu. Prethodna ispitivanja pokazala su da i iridoidi prisutni u Veronica vrstama pokazuju snaţnu antiradikalsku aktivnost. 3.1.2. In vivo ispitivanje antioksidantne aktivnosti Rezultati dobijeni in vitro analizom pokazali su da su ispitivani ekstrakti efikasni antioksidansi. Ipak, ove rezultate neophodno je potvrditi i in vivo testovima. Izmene u strukturi polifenolnih jedinjenja tokom metaboliţkih procesa mogu znaţajno uticati na njihovu biološku aktivnost, ukljuţujuši i redoks potencijal (Santos i sar., 2008). Osim toga, prooksidantni efekti fenolnih jedinjenja mogu postati znaţajni u in vivo uslovima ukoliko su slobodni tranzicioni metali ukljuţeni u oksidacione procese (Procházková i sar., 2011). Model hepatotoksiţnosti indukovane ugljen tetrahloridom (CCl4) ţesto se koristi za procenu antioksidantnog delovanja biljnih ekstrakata i izolovanih jedinjenja (Kaurinoviš i sar., 2011). Mehanizam hepatotoksiţnosti CCl4 je sloţen i zasnovan je na stvaranju reaktivnih metabolita trihlormetil (CCl3 * ) i trihlormetil peroksi radikala (CCl3O2 * ) nakon aktivacije enzima citohroma P450. Ove reaktivne vrste su sposobne da se kovalentno veţu za šelijske makromolekule. Napadom na polinezasišene masne kiseline u šelijskoj membrani, ovi slobodni radikali zapoţinju proces lipidne peroksidacije i poslediţnu lanţanu reakciju. Kao rezultat javlja se promena permeabilnosti šelijske membrane, kao i membrane mitohondrija i endoplazmatskog retikuluma. Usled narušenog integriteta membrana dolazi do izlaska 159 mikrozomalnih enzima i poremešaja sekvestracije kalcijuma i šelijske homeostaze, što znaţajno doprinosi oštešenju šelije (Kukiš-Markoviš, 2013). Efekat ispitivanih ekstrakata na nekoliko biohemijskih parametara oksidativnog stresa procenjivan je u homogenatu jetre pacova tretiranih sa CCl4 kao generatotom slobodnih radikala. Analizirani su intenzitet lipidne peroksidacije (LPx), sadrţaj glutationa (GSH), kao i nivo aktivnosti glutation peroksidaze (GSHPx), glutation reduktaze (GR), peroksidaze (Px), ksantin oksidaze (XOD) i katalaze (CAT). Dobijeni rezultati prikazani su u Tabelama 33 i 34. Intraperitonealna primena ekstrakata je odabrana umesto oralne primene kako bi se izbegle moguše hemijske izmene nakon oralne primene ekstrakata. U poreŤenju sa kontrolnom grupom, kod ţivotinja kod kojih je primenjen CCl4 pokazana je znaţajna redukcija CAT, Px i GR aktivnosti, kao i nivoa GSH i LPx. Nije primešena znaţajna izmena XOD aktivnosti. Ksantin oksidaza je enzim koji koristi ksantin ili hipoksantin kao supstrat i O2 kao kofaktor za proizvodnju superoksid jona ( * O2 - ) i mokrašne kiseline (Chung i sar., 1997). Sluţi kao znaţajan biološki izvor slobodnih radikala koji doprinose oksidativnom oštešenju ţivih tkiva. Rezultati dobijeni u okviru ove disertacije potvrdili su da CCl4 ne dovodi do izmena u aktivnosti XOD (Šeboviš i sar., 2006). Sliţni rezultati dobijeni su i u grupama ţivotinja tretiranih ispitivanim ekstraktima. Katalaza katalizuje razgradnju H2O2 do vode i kiseonika i štiti šelije od oksidativnog oštešenja indukovanog putem H2O2 (Preethi i sar., 2006). Kod ţivotinja koje su primile samo ekstrakte nije došlo do statistiţki znaţajnih izmena u aktivnosti CAT. TakoŤe, povešanje koncentracije primenjenog ekstrakta nije dovelo do izmena ovog parametra. Nakon primene CCl4 došlo je do skoro trostrukog pada aktivnosti enzima, dok je kombinovana primena ekstrakata i CCl4 rezultovala dozno zavisnim povešanjem aktivnosti enzima. Svi ispitivani ekstrakti primenjeni u dozi 100 mg/kg t.m. 7 znaţajno su redukovali efekat CCl4 odrţavajuši aktivnost CAT na fiziološkom nivou zabeleţenom u kontrolnoj grupi. Nije pokazana statistiţki znaţajna razlika u efektima ekstrakata u zavisnosti od biljne vrste. Peroksidaza katalizuje redukciju hidroperoksida uljkuţujuši i H2O2 i na taj naţin štiti šelije od peroksidativnog oštešenja (Sandhir i Gill, 1999). Intraperitonealna primena 2 ml/kg t.m. CCl4 izazvala je smanjenje aktivnosti Px u homogenatu jetre, što ukazuje na povešanje produkcije H2O2. Svi ispitivani Veronica ekstrakti u kombinovanom tretmanu sa CCl4 doveli 7 t.m. – telesna masa 160 su do dozno zavisnog povešanja aktivnosti Px. Primenjeni u dozi 100 mg/kg znaţajno su redukovali hepatotoksiţnost CCl4 vrašajujši nivo Px na nivo blizak fiziološkom. Glutation je šelijski neenzimski antioksidans sa znaţajnom ulogom u zaštiti šelija od oksidativnog stresa. Smanjenje nivoa GSH u jetri povezano je sa toksiţnoššu brojnih hemijskih supstanci, ukljuţujuši i CCl4 (Tirmenstein i sar., 2000). Kod grupe ţivotinja kod koje je primenjen samo CCl4 došlo je do velikog smanjenja nivoa GSH, što ukazuje na znaţajno oštešenja šelija jetre. Ekstrakti V. jacquinii i V. teucrium primenjeni u dozi 100 mg/kg redukovali su efekat CCl4 na GSH sadrţaj, vrašajuši ga na nivo zabeleţen u kontrolnoj grupi. Povešanje nivoa GSH u jetri moţe biti posledica de novo GSH sinteze ili GSH regeneracije. Glutation peroksidaza katalizuje redukciju hidroperoksida putem GSH. Dakle njena glavna funkcija je zaštita šelija od štetnog efekta endogeno formiranih hidroperoksida (Preethi i sar., 2006). Samostalna primena ekstrakta V. urticifolia u dozi 100 mg/kg t.m. znaţajno je redukovala GSH-Px aktivnost ukazujuši na smanjenu produkciju H2O2. Tretman ţivotinja sa CCl4 doveo je povešanja aktivnosti ovog enzima, dok je kombinovana primena sa ekstraktima dozno zavisno smanjila aktivnost GSH-Px u homogenatu jetre. Samo 70%-ni acetonski ekstrakt V. teucrium uspeo je da u potpunosti zaštiti hepatocite od prekomerene produkcije slobodnih radikala izazvane primenom CCl4, što je u saglasnosti sa njegovim efektom na nivo GSH. Osnovna funkcija glutation reduktaze je odrţavanje visokog nivoa GSH i niskog nivoa glutation disulfida (GSSG) (Kulinsky i Kolesnichenko, 2009). Ovaj enzim redukuje potrebe za GSH sintezom. Nakon pojedinaţne doze CCl4 dolazi do snaţnog pada aktivnosti pomenutog enzima. Znaţajno smanjenje nivoa GSH u korelaciji je sa redukcijom GR aktivnosti. Simultana primena ispitivanih ekstrakata i CCl4 dovela je do dozno zavisnog povešanja GR aktivnosti, ali i dalje je taj nivo bio statistiţki znaţajno razliţit u odnosu na kontrolni. Iako su odgovarajuše vrednosti ostale niţe u poreŤenju sa bazalnom GR aktivnoššu, zaštitni efekat Veronica ekstrakata bio je nesumnjiv. Prema našim ispitivanjima nije bilo znaţajnih razlika u efektu ispitivanih ekstrakata u zavisnosti od biljne vrste. Pojaţana lipidna peroksidacija merilo je membranskog oštešenja, kao i izmene u strukturi i funkciji šelijske membrane. Smatra se da je jedan od osnovnih uzroka CCl4 indukovanog oksidativnog stresa upravo lipidna peroksidacija putem slobodnih radikala izvedenih iz CCl4 (Recknagel i sar., 1989). U okviru ove disertacije intenzitet LPx meren je kao nivo formiranja reaktivnih vrsta tiobarbiturne kiseline (TBARS). Ovaj nivo je bio statistiţki znaţajno niţi kod 161 grupa ţivotinja koje su primale samo Veronica ekstrakte u razliţitim koncentracijama u odnosu na kontrolnu grupu. Pokazani efekat bio je najizraţeniji kod ţivotinja koje su primale V. jacquinii ekstrakt. Intraperitonealna primena CCl4 snaţno je indukovala formiranje TBARS u poreŤenju sa kontrolom. U grupama ţivotinja koje su primale kombinovan tretman, ekstrakti V. jacquinii i V. teucrium primenjeni u dozi 100 mg/kg smanjili su nivo formiranih TBARS do nivoa zabeleţenog u kontrolnoj grupi ispoljivši znaţajan hepatoprotektivan efekat. Rezultati dobijeni u okviru ove doktorske disertacije pokazuju da ispitivani ekstrakti imaju zaštitnu ulogu u oksidativnom stresu. Veronica ekstrakti redukovali su nivo slobodnih radikala odrţavajuši fiziološki nivo enzimskih i neenzimskih antioksidanasa, kao i lipidne peroksidacije. Prema rezultatima sadţaja GSH i TBARS nivoa zakljuţeno je da V. jacquinii i V. teucrium pokazuju sliţni antioksidantni efekat koji je nešto izraţeniji u odnosu na efekat V. urticifolia u oksidativnom stresu. Ovakav rezultat u saglasnosti je sa prethodno prikazanim rezultatima in vitro testova. Prethodna ispitivanja su pokazala da oralna primena alkoholnog ekstrakta herbe V. officinalis statistiţki znaţajno smanjuje intenzitet lipidne peroksidacije u modelu hepatotoksiţnosti indukovane primenom CCl4, ali ne ostvaruje efekat na nivo GSH (Kiss i sar., 2009). O antioksidantnoj aktivnosti jedinjenja prisutnih u ispitivanim taksonima postoje brojni literaturni podaci. U modelu hepatotoksiţnosti indukovane brombenzenom kod miševa, bajkalin je pokazao visok stepen zaštite hepatocita od lipidne peroksidacije. Njegov efekat bio je veši od efekta polifenola zelenog ţaja, ili vitamina E. Efekat bajkalina na serumski nivo alanin transaminaze (ALT) kod ţivotinja koje su primile brombenzen potvrdio je hepatoprotektivno delovanje ovog jedinjenja (Zhang i Shen, 1997). Osim toga, za bajkalin je pokazano da ima višestruku ulogu u oksidativnom stresu ukljuţujuši hvatanje slobodnih radikala, inhibiciju enzima ukljuţenih u produkciju slobodnih radikala (ksantin i NADPH oksiadaza), povešanje aktivnosti enzima koji uţestvuju u antioksidantnoj odbrani organizma (SOD), i heliranje metalnih jona (Fe 2+ i Cu 2+ ) (Cheng i sar., 2013). UtvrŤeno je da su 7-O-(β-D-alopiranozil-(1→2)-β-D-glukopiranozil derivati 5,8- dihidroksiflavona relativno snaţni antioksidansi, ţija je aktivnost uporediva sa aktivnoššu kvercetina (Kukiš-Markoviš, 2013). MeŤu njima je i izoskutelarein 7-O-[β-D-alopiranozil- (1→2)]-β-D-glukopiranozil, dominantno jedinjenje u herbi V. teucrium. 162 Hiperozid, jedan od dva dominantna derivata kvercetina u ekstraktu V. jacquinii, u modelu CCl4 indukovanog akutnog oštešenja kod miša ispoljio je zaštitni efekat jaţanjem antioksidantnih odbrambenih sistema organizma i suprimiranjem inflamatornog odgovora (Choi i sar., 2011). Silva i sar. (2009) pokazali su da izokvercitrin, drugi glikozilovani kvercetin zastupljen u V. jacquinii, znaţajno povešava toleranciju eukariotskog mikroorganizma Saccharomyces cerevisiae na H2O2 i menadion, generatore superoksidnog jona. Snaţan antioksidantan efekat izokvercitrin je pokazao i u modelu Cd2+ indukovane toksiţnosti kod miševa štiteši od lipidne peroksidacije i oksidativnog oštešenja proteina u jetri i bubrezima (Li i sar., 2011). Za akteozid koji je prisutan u sva tri ispitivana ekstrakta ranije je utvrŤeno da ispoljava hepatoprotektivan efekat na modelu CCl4 indukovanog oštešenja jetre kod miševa (Lee i sar., 2004). Primenjen kao pretretman u koncentraciji 50 mg/kg i.p. akteozid vraša nivo GSH nakon intoksikacije CCl4 na nivo zabeleţen u kontrolnoj grupi eksperimentalnih ţivotinja. Osim toga dozno zavisno redukuje nivo lipidne peroksidacije jetre što se ogleda znaţajnim smanjenjem nivoa malondialdehida u serumu. Akteozid takoŤe inhibira apoptozu i dalja oštešenja jetre izazavana D-galaktozaminom i LPS-om. Najverovatniji mehanizam je neutralizacija slobodnih radikala ţije stvaranje indukuje TNF-α, koji je centralni medijator u ovim modelima hepatotoksiţnosti (Xiong i sar., 1999). Aukubin primenjivan intraperitonealno u dozi 5 mg/kg t.m. tokom 15 dana kod pacova sa streptozocin indukovanim dijabetesom znaţajno je povešao aktivnost CAT, GPx i SOD (Jin i sar., 2008). U humanoj fibroblastnoj šelijskoj liniji HS68, pretretman aukubinom (1 μg/ml) umanjio je produkciju slobodnih radikala u oksidativnom stresu indukovanom UVB zraţenjem za 34% (Ho i sar., 2005). Osim toga, u istom istraţivanju, aukubin je pokazao znaţajno smanjenje nivoa lipidne peroksidacije i povešanje sinteze GSH. Zaštitni efekat hlorogenske kiseline u modelu acetaminofenom indukovanog oštešenja jetre zasnovan je povešanju ekspresije katalitiţke jedinice glutamat cistein ligaze (GCLC)8, a samim tim i biosinteze GSH (Ji i sar., 2013). Prekursor hlorogenske kiseline, hina kiselina, zastupljena u ekstraktima V. jacquinii i V. teucrium, ostvaruje svoj antioksidantni efekat in vivo stimulisanjem sinteze triptofana i nikotinamida u gastrointestinalnom traktu (Pero i sar., 2009). 8 Prvi korak u biosintezi GSH katalizovan je enzimom glutamat cistein ligaza (GCL) koji se sastoji iz katalitiţke (GCLC) i regulatorne (GCLM) subjedinice (Lu i sar., 2013). 163 Na osnovu iznetih podataka jasno je da su jedinjenja iz grupe flavonoidnih i fenilpropanoidnih heterozida, kao i fenolkarbonske kiseline nosioci antioksidantnog delovanja ispitivanih biljaka. Obzirom da su ekstrakti vrsta V. jacquinii i V. teucrium ispoljili nešto viši antioksidantni potencijal, moţe se zakljuţiti da su heterozidi izoskutelareina, kvercetina i hlorogenska kiselina bar delom odgovorni za pokazano delovanje. 164 Tabela 33. Efekat ispitivanih ekstrakata i CCl4 na aktivnost XOD, CAT i Px u homogenatu jetre pacova Uzorak Grupa XOD CAT Px Kontrola 1,93 ± 0,17 9,56 ± 2,25 10,77 ± 1,89 Kontrola + CCl4 1,89 ± 0,20 3,35 ± 1,88a** 4,92 ± 1,03a** Veronica jacquinii E1 2,02 ± 0,27 9,55 ± 1,97 9,29 ± 0,78 E2 1,79 ± 0,23 10,29 ± 1,92 10,56 ± 1,44 E3 2,03 ± 0,24 10,79 ± 1,74 10,66 ± 1,49 E1 + CCl4 1,79 ± 0,14 4,10 ± 2,48 a* 4,62 ± 0,76a** E2 + CCl4 1,93 ± 0,20 6,58 ± 2,16 a*,b* 7,57 ± 0,97a* E3 + CCl4 2,02 ± 0,24 8,34 ± 2,81b* 9,93 ± 1,46b** Veronica urticifolia E1 1,87 ± 0,13 9,71 ± 2,00 10,29 ± 2,24 E2 1,99 ± 0,12 11,08 ± 2,77 11,29 ± 1,58 E3 2,02 ± 0,26 10,76 ± 2,17 11,75 ± 3,05 E1 + CCl4 1,86 ± 0,03 4,95 ± 2,72 a* 4,19 ± 1,79a** E2 + CCl4 1,78 ± 0,12 5,99 ± 1,66 a*,b* 6,12 ± 1,42a** E3 + CCl4 1,79 ± 0,21 7,54 ± 1,80b* 10,56 ± 2,20b** Veronica teucrium E1 1,94 ± 0,09 9,30 ± 1,97 11,12 ± 2,85 E2 1,81 ± 0,11 10,88 ± 2,37 11,74 ± 1,65 E3 1,77 ± 0,17 10,76 ± 2,22 12,61 ± 2,41 E1 + CCl4 1,90 ± 0,12 3,81 ± 2,07a** 4,09 ± 0,98a** E2 + CCl4 1,79 ± 0,23 5,79 ± 1,62a*,b* 4,99 ± 1,46a** E3 + CCl4 1,72 ± 0,24 8,98 ± 4,27b* 8,49 ± 2,51 b* Legenda: Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S.D. za 6 ţivotinja. Aktivnost XOD, CAT i Px izraţena je u nmol/mg proteina min-1. aStatistiţka razlika u odnosu na kontrolnu grupu; bStatistiţka razlika u odnosu na negativnu kontrolnu grupu (+ CCl4); * p<0,05; ** p<0,001. 165 Tabela 34. Efekat ispitivanih ekstrakata bi CCl4 na biohemijske parametre u homogenatu jetre pacova (nivo GSH, intenzitet LPx, aktivnost GSHPx i GR) Uzorak Grupa GSH GSHPx GR LPx Kontrola 4,97 ± 1,37 8,50 ± 1,27 6,10 ± 1,60 2,98 ± 0,81 Kontrola + CCl4 0,73 ± 0,40a** 21,27 ± 6,67a** 1,23 ± 0,55a** 9,66 ± 1,41a** Veronica jacquinii E1 4,26 ± 0,53 8,43 ± 1,05 6,00 ± 0,35 1,98 ± 0,59 a* E2 4,35 ± 0,80 8,64 ± 0,81 6,63 ± 0,69 1,83 ± 0,45a* E3 4,18 ± 0,37 7,26 ± 1,80 6,60 ± 1,24 1,78 ± 0,18a* E1 + CCl4 0,70 ± 0,22 a** 27,28 ± 2,64a** 1,24 ± 0,54a** 7,18 ± 2,45a* E2 + CCl4 1,74 ± 0,50 a**,b* 22,07 ± 1,96a** 2,84 ± 1,07a**,b* 4,57 ± 2,09b** E3 + CCl4 3,74 ± 0,31b** 15,77 ± 1,30a** 4,40 ± 1,18a*,b** 2,03 ± 0,89b** Veronica urticifolia E1 5,67 ± 0,87 8,79 ± 1,11 6,16 ± 1,40 3,10 ± 0,29 E2 6,51 ± 1,11 9,57 ± 1,67 6,88 ± 1,17 2,90 ± 0,48 E3 7,61 ± 0,52 a* 6,42 ± 1,66a* 7,16 ± 1,01 2,83 ± 0,36 E1 + CCl4 0,54 ± 0,22 a** 21,87 ± 2,55a** 1,12 ± 0,60a** 8,01 ± 0,93a**,b* E2 + CCl4 1,73 ± 0,29 a**,b** 20,07 ± 1,86a** 1,17 ± 0,82a** 6,21 ± 1,11a**,b** E3 + CCl4 3,21 ± 0,69a*,b** 14,25 ± 2,40a**,b* 2,62 ± 0,76a**,b* 4,03 ± 0,78a*,b** Veronica E1 5,11 ± 0,70 8,70 ± 1,04 6,01 ± 1,68 3,01 ± 0,73 166 teucrium E2 4,57 ± 0,39 7,69 ± 1,57 6,99 ± 0,91 2,93 ± 0,13 E3 3,81 ± 0,75 7,15 ± 1,47 7,14 ± 1,75 2,89 ± 0,21 E1 + CCl4 0,51 ± 0,28 a** 24,08 ± 2,84a** 1,20 ± 0,43a** 8,19 ± 2,29a** E2 + CCl4 1,70 ± 0,34 a**,b* 20,57 ± 1,98a** 2,00 ± 0,97a** 5,62 ± 0,56a**,b** E3 + CCl4 4,63 ± 0,31b** 9,30 ± 3,13b* 3,62 ± 0,86 a*,b** 3,11 ± 1,06b** Legenda: Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S.D. za 6 ţivotinja. Nivo reaktivnih vrsta tiobarbiturne kiseline (TBA-RS) izraţen je u nmol MDA 9/mg proteina; Sadrţaj redukovanog glutationa (GSH) izraţen je u nmol GSH/mg proteina. Aktivnost GSHPx i GR izraţena je u nmol/mg proteina min-1. aStatistiţka razlika u odnosu na kontrolnu grupu; bStatistiţka razlika u odnosu na negativnu kontrolnu grupu (+ CCl4); * p<0,05; ** p<0,001. 9 Malondialdehid 167 3.2. Ispitivanje neuroprotektivne aktivnosti Centralni nervni sistem (CNS) je veoma osetljiv na oksidativna oštešenja posredovana reaktivnim oblicima kiseonika i azota zbog velike metaboliţke aktivnosti, znaţajne koliţine polinezasišenih masnih kiselina, a sa druge strane slabe antioksidantne zaštite (Jovanoviš, 2011). Pored niske aktivnosti antioksidantnih enzima, krvno-moţdana barijera redukuje preuzimanje pojedinih antioksidanasa kao što je vitamin E u neurone i glija šelije (Shukla i sar., 2011). Usled pojaţanog oksidativnog stresa u mozgu se nakupljaju oštešeni biomakromolekuli: karbonilovani i nitrirani proteini, lipidni peroksidi, kao i 8-hidroksi-2‟- deoksiguanozin, marker oksidacije DNK molekula (Toviloviš, 2012). Terminom neuroprotektivnost definiše se homeostatski mehanizam unutar centralnog nervnog sistema koji štiti neurone od apoptoze ili degeneracije kao posledice akutnog oštešenja mozga ili hroniţnih neurodegenerativnih oboljenja. Terapija neuroprotektivnim agensima danas se koristi kod Parkinsonove i Alchajmerove bolesti i multiple skleroze (Kim, 2010). Neuroprotektivni efekat acetonsko-vodenih ekstrakata odabranih Veronica vrsta ispitivan je testom kisele fosfataze u kulturi humane neuroblastomske šelijske linije SH-SY5Y. Ova linija se ţesto koristi kao model za šelije sliţne neuronima, jer poseduje mnoge biohemijske i funkcionalne osobine neurona (Xie i sar., 2010). Ispitivani ekstrakti su rastvoreni u DMSO, pri ţemu je najveša finalna koncentracija ekstrakta pri kojoj DMSO ne ostvaruje uticaj na šelijsku vijabilnost iznosila 50 μg/ml. Uticaj ekstrakata na preţivljavanje šelija ispitivan je nakon kombinovanog tretmana stresora (1 mM natrijum nitroprusida/100 μM H2O2) i najveše pripremljene koncentracije ekstrakata. Kod neurodegenerativnih oboljenja dešava se nakupljanje azot monoksida (NO) koji aktivirani astrociti i mikroglijalne šelije proizvode u koncentracijama vešim od fizioloških. Rezultat je nitrozativni stres koji se karakteriše nastankom reaktivnih azotnih vrsta i koji moţe biti uzrok smrti neurona. Smatra se da ovaj molekul svoje toksiţne efekte ispoljava inhibicijom komponenti transportnog lanca elektrona u mitohondrijama, što dovodi do gubitka potencijala membrane mitohondrija i oslobaŤanja citohroma c u citosol. Citohrom c zatim aktivira kaspaze, koje nizom katalitiţkih reakcija razaraju sadrţaj šelija, dovodeši do fragmentacije DNK molekula i smrti neurona apoptozom (Toviloviš, 2012). Kao donor NO u ovom ispitivanju primenjen je natrijum nitroprusid (SNP), koji na dozno-zavisan naţin 168 smanjuje vijabilnost SH-SY5Y šelija u kulturi. Lim i sar. (2009) pokazali su da ovaj stresor smanjuje vijabilnost SH-SY5Y šelija humanog neuroblastoma. Iako je H2O2 slab oksidans i lako se neutrališe u prisustvu CAT i GSH-Px, u prisustvu unutaršelijskih metalnih jona kao što su joni Fe i Cu dolazi do formiranja visoko toksiţnih hidroksil radikala iz H2O2 koji poslediţno dovode do oštešenja makromolekula ukljuţujuši DNK, proteine i lipide membrane (Okuda i sar., 1996). Rezultati ispitivanja neuroprotektivne aktivnosti ekstrakata herbi odabranih taksona roda Veronica dati su u Tabeli 35. Ekstrakti su ispoljili blagu protektivnu aktivnost što se manifestuje povešanjem preţivljavanja šelija izloţenih SNP (9,7-12,0%) ili H2O2 (17,0- 18,3%). Najjaţi zaštitini efekat u kulturi SH-SY5Y šelija tretiranih SNP-om je pokazao ekstrakt V. jacquinii, dok je najefikasniji kod šelija tretiranih sa H2O2 bio ekstrakt V. teucrium. Prethodna ispitivanja pokazala su da metanolni ekstrakt V. peregrina inhibira NO produkciju putem supresije inducibilne azot oksid sintetaze (iNOS) (Jeon, 2012). Tabela 35. Povešanje SH-SY5Y šelijske vijabilnosti nakon pretretmana ispitivanim ekstraktima Veronica jacquinii 70%-ni acetonski ekstrakt Veronica teucrium 70%-ni acetonski ekstrakt Veronica urticifolia 70%-ni acetonski ekstrakt Povešanje šelijske vijabilnosti (%) a 12,0±2,6 9,7±3,8 11,0±3,5 Povešanje šelijske vijabilnosti (%) b 17,0±4,6 18,3±4,9 17,0±3,6 Testirani ekstrakti primenjivani su kao pretretman, 30 min pre dodatka a SNP ili b H2O2. Povešanje šelijske vijabilnosti predstavljeno je kao procenat bazalnog nivoa vijabilnosti (100%) primešenog kod netretiranih šelija. Rezultati su izraţeni kao srednja vrednost ± SD tri nezavisna merenja. Da bi utvrdili da li mehanizam zaštitnog dejstva ispitivanih ekstrakata ukljuţuje i neutralisanje slobodnih radikala u kulturi neuroblastoma tretiranih stresorima, prašena je i produkcija superoksid jona (O2 -* ), kao i intenzitet lipidne peroksidacije. 169 Slika 41. Uticaj ispitivanih ekstrakata na koliţinu superoksidnog radikala u šelijama izloţenim SNP stresoru Slika 42. Uticaj ispitivanih ekstrakata na koliţinu superoksidnog radikala u šelijama izloţenim H2O2 kao stresoru 170 Slika 43. Uticaj ispitivanih ekstrakata na koliţinu TBARS u šelijama izloţenim SNP kao stresoru Slika 44. Uticaj ispitivanih ekstrakata na koliţinu TBARS u šelijama izloţenim H2O2 kao stresoru Intenzitet lipidne peroksidacije kvantifikovan je prašenjem nivoa reaktivnih vrsta tiobarbiturne kiseline (TBARS). Nakon primene stresora SNP i H2O2 došlo je do statistiţki znaţajnog povešanja nivoa TBARS u odnosu na kontrolu. Preinkubacija šelija sa ispitivanim ekstraktima znaţajno je inhibirala produkciju TBARS indukovanu primenom SNP, ali nije ostvaren statistiţki znaţajan efekat na nivo TBARS formiran nakon primene H2O2. Statistiţkom analizom nije pokazana razlika u efektu ispitivanih ekstrakata u zavisnosti od biljne vrste. 171 U uslovima primene odabranih stresora zapazili smo da dolazi do povešanja sinteze superoksidnog anjona (O2 *- ). Pretretman SH-SY5Y šelija ispitivanim ekstraktima smanjio je produkciju O2 *- nakon izlaganja SNP, ali nije ostvaren statistiţki znaţajan efekat na produkciju ovog radikala indukovanu primenom H2O2 kao stresora. Znaţajniju inhibiciju produkcije superoksidnih jona indukovanu SNP stresorom postigli su acetonsko vodeni ekstrakti nadzemnog dela V. jacquinii (54,0%) i V. urticifolia (56,3%) ţiji je efekat uporediv. Statsitiţkom analizom pokazano je da je u istom testu ispoljena aktivnost vrste V. teucrium nešto slabija. Vešu neuroprotektivnu aktivnost ispitivani ekstrakti pokazali su kod oštešenja neurona indukovanog oksidativnim u odnosu na nitrozativni stres, pri ţemu nema statistiţki znaţajnih razlika u efektu ispitivanih vrsta. Dobijeni rezultati svedoţe da je za ispoljeno neuroprotektivno delovanje kod primene SNP kao stresora odgovoran mehanizam „hvatanja“ slobodnih radikala, dok kod primene H2O2 to nije sluţaj. Prema mehanizmu delovanja neuroprotektivni agensi mogu biti grupisani u nekoliko kategorija: hvataţi slobodnih radikala, antiekscitotoksiţni agensi, inhibitori apoptoze, neurotrofni agensi i modulatori jonskih kanala (Kim, 2010). Osim toga, moguše je da ovi neuroprotektivni agensi indukuju ushodnu regulaciju endogenih antioksidantnih enzima in vivo, i na taj naţin ostvaruju „indirektan“ antioksidantni efekat (Stevenson i Hurst, 2007). Neuroprotektivni efekat velikog broja polifenolnih jedinjenja rezultat je njihovog prolaska kroz krvno-moţdanu barijeru nakon ţega direktno uţestvuju u hvatanju ROS i RNS, kao i u heliranju tranzicionih metala (Kovacsova i sar., 2010). Najveši broj prirodnih proizvoda sa neuroprotektivnim delovanjem pripada klasi flavonoida i fenilpropanoida (Kim, 2010). Od dominantnih komponenata ispitivanih ekstrakata i vrsta, do sada su akteozid, bajkalin, aukubin, izokvercitrin i hiperozid testirani u pogledu neuroprotektivnog delovanja. Deng i sar. (2008) pokazali su da akteozid antagonizuje apoptozu SH-SY5Y šelija indukovanu primenom 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridina (MPP + ). U njihovom ekperimentu, tretman šelija sa MPP+ tokom 24 h indukovao je porast procenta apoptoze na 38,9%, dok je pretretman akteozidom tokom 12 h u koncentracijama 0,1; 1,0 i 10,0 mg/l redukovao ovaj procenat na 29,5; 15,3 i 8,6. Dodatno, akteozid izolovan iz listova Callicarpa dichotoma Raeuschel (Verbenaceae) ispoljio je znaţajan neuroprotektivan efekat u modelu glutamatom indukovane neurotoksiţnosti u primarnoj kulturi kortikalnih šelija pacova (Koo i sar., 2006). Primenjen u koncentracijama 1 i 10 μM redukovao je nivo osloboŤenog NO sa 64,9 na 29,2 i 19,3 μM, što je odgovaralo kontrolnom nivou (18,2 μM). Osim toga, u pomenutim koncentracijama 172 redukovao je formiranje peroksida sa 483,8 na 331,1 i 219,5 arbitrarnih jedinica (AU) (kontrolni nivo iznosio je 217,4 AU). Autori zakljuţuju da je akteozid smanjio produkciju ROS obnavljanjem antioksidantnog odbrambenog sistema (nivo GSH, aktivnost enzima SOD, GPx i GR) ţija je inhibicija indukovana primenom glutamata kao stresora. Akteozid ispoljava neuroprotektivno delovanje i na SH-SY5Y šelijama kod kojih je oštešenje indukovano primenom β-amiloidnih plakova (Wang i sar., 2009). Primenjen u koncentracijama 20 i 30 μg/ml kao pretretman redukovao je produkciju ROS i indukovanu mitohondrijalnu disfunkciju ukljuţujuši smanjen membranski potencijal, povešan odnos proteina Bax/Bcl2, oslobaŤanje citohroma c i cepanje kaspaze-3. Akteozid primenjen kao pretretman u koncentraciji 10, 20 i 40 mg/l tokom 6 h statistiţki znaţajno je indukovao oslobaŤanje laktat dehidrogenaze nakon primene rotenona (0,5 µM/l) (Gao i Pu, 2007). Esposito i sar. (2010) pokazali su da je u osnovi neuroprotektivnog efekta akteozida nishodna regulacija inflamacije. Preinkubacija akteozidom (10-100 μg/ml) u modelu inflamacije CNS-a indukovane primenom bakterijskog endotoksina/citokina (lipopolisaharid/interferon γ) na dozno zavisan naţin inhibirala je ekspresiju proinflamatornih enzima iNOS i COX-2. Za brojne flavonoide pokazano je da ispoljavaju neuroprotektivno delovanje u šelijskim i ţivotinjskim modelima putem razliţitih mehanizama kao što su ublaţavanje oksidativnog stresa, ekscitotoksiţnosti i apoptoze neurona. Pojedini flavonoidi inhibiraju enzim acetilholin esterazu, ciljno mesto delovanja u terapiji Alchajmerove bolesti. Flavonoidi inhibiraju i neuroinflamatorne procese koji doprinose patogenezi neurodegenerativnih oboljenja (Romano i sar., 2013). Xu i sar. (2013) pokazali su da bajkalin, zahvaljujuši sposobnosti hvatanja peroksinitrit anjona, ispoljava neuroprotektivno delovanje kod povreda nastalih u cerebralnoj ishemiji. Primenjen u koncentraciji 200 µM, bajkalin je kod H2O2 indukovanog oštešenja primarnih neurona in vitro znaţajno povešao šelijsku vijabilnost i aktivnost SOD (Cheng i sar., 2013). Dodatno, pretretman bajkalinom (100 mg/kg, i.p.) inhibirao je povešanje nivoa lipidne peroksidacije, sadrţaj NO i smanjenje aktivnosti GSH u modelu epilepsije indukovane pilokarpinom (Liu i sar., 2012a). Gao i sar. (2001) pokazali su da bajkalin u koncentraciji 10 µM znaţajno štiti SH-SY5Y šelije od oštešenja indukovanih primenom H2O2. Ovaj flavonoid antagonizuje povešanje koncentracije Ca2+ unutar šelije koje je indukovano primenom H2O2. I za glikozilovane derivate kvercetina postoje brojni literaturni podaci koji ukazuju na njihovo neuroprotektivno delovanje. U šelijskom modelu Parkinsonovog oboljenja indukovanog primenom 6-hidroksidopamina u PC12 šelijama pacovskog feohromocitoma, primenjen kao pretretman (10 μM), izokvercitrin je pokazao znaţajan zaštitni efekat 173 stimulacijom antioksidantnih enzima (SOD, CAT i GPx) i GSH (Magalingam i sar., 2014). Liu i sar. (2012b) pokazali su da hiperozid štiti primarnu kulturu kortikalnih neurona od oštešenja indukovanog lišavenjem šelija kiseonika i glukoze, što je prašeno reperfuzijom. U ovom ispitivanju hiperozid primenjen u koncentraciji 10-100 μM smanjio je iNOS ekspresiju putem inhibicije NF-κB aktivacije. Najsnaţniji efekat ekstrakta V. jacquinii na intenzitet lipidne peroksidacije indukovane primenom SNP, moţe se objasniti i prisustvom hlorogenske kiseline u najvešem procentu. Oboh i sar. (2013) pokazali su da ova fenolna kiselina znaţajno redukuje formiranje malondialdehida u mozgu pacova nakon izlaganja SNP-u kao stresoru. Iridoidi takoŤe ispoljavaju neuroprotektivno delovanje. Za aukubin je pokazano da ispoljava zaštitnu ulogu kod neurodegenerativnih oboljenja indukovanih oksidativnim stresom. Primenjen u dozama 5 i 10 mg/kg kod pacova sa streptozocin indukovanim dijabetesom, aukubin ostvaruje neuroprotektivno delovanje putem redukovanja sadrţaja lipidnih peroksida, kao i regulisanjem aktivnosti antioksidantnih enzima i smanjenjem aktivnosti sintetaze azotnog oksida (NOS) (Xue i sar., 2009). Osim toga, Xue i sar. (2012) pokazali su da pri koncentraciji 0,1 mM aukubin smanjuje procenat apoptoze šelija linije PC12 pacovskog feohromocitoma tretiranih sa H2O2 sa 31,0 ± 3,0 na 23,1 ± 1,1. Aukubin znaţajno povešava njihovu vijabilnost u poreŤenju sa netretiranim šelijama i redukuje oslobaŤanje („curenje“) laktat dehidrogenaze iz njih.10 Za sve ispitivane ekstrakte herbi odabranih taksona pokazano je da deluju antioksidantno, pa se moţe pretpostaviti da takva njihova aktivnost delom doprinosi i njihovom neuroprotektivnom delovanju. Dok je u modelu neurodegeneracije indukovane nitrozativnim stresom glavni mehanizam neuroprotektivnog delovanja direktno „hvatanje“ slobodnih radikala, pri ţemu je najaktivniji bio ekstrakt V. jacquinii, u modelu neurodegeneracije indukovane oksidativnim stresom to moţe biti ushodna regulacija endogenih antioksidantnih enzima. Ovo se naroţito odnosi na ekstrakt herbe V. teucrium koji meŤu ispitivanim taksonima najsnaţnije stimuliše endogene enzime CAT i GSHPx za koje se zna da mogu redukovati H2O2 do molekula H2O, a koji ispoljava i najsnaţniji efekat u datom modelu. 10 Gubitak intracelularne LDH i njeno oslobaŤanje u medijum sa šelijama indikator je ireverzibilne šelijske smrti kao posledice oštešenja šelijske membrane (Gómez-Lechón i sar., 2002) 174 3.3. Ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti Inflamacija se danas smatra glavnim uzrokom vešine hroniţnih oboljenja kao što su dijabetes, Alchajmerovo oboljenje, astma i ateroskleroza (Ayissi Owona i sar., 2013). Tokom inflamatornog procesa makrofagi i endotelne šelije stvaraju veliku koliţinu faktora rasta, citokina i slobodnih radikala (ROS i RNS) koji mogu izazvati oštešenje DNK molekule. Na taj naţin hroniţna inflamacija predstavlja i uvod u malignitet (Esquivel-Chirino i sar., 2013). Brojne epidemiološke studije pokazale su da prirodna jedinjenja igraju znaţajnu ulogu u prevenciji, ublaţavanju i leţenju hroniţnih inflamatornih oboljenja (Pan i sar., 2010). Eikozanoidi, ukljuţujuši prostanoide i leukotriene, proizvodi su metabolizma arahidonske kiseline i snaţni medijatori inflamacije. Kao lipidni medijatori imaju kljuţnu ulogu kako u fiziološkim, tako i u patološkim procesima. Familije enzima ciklooksigenaza i lipooksigenaza odgovorne su za metabolizam arahidonske kiseline i proizvodnju prostaglandina i leukotriena. Ovi enzimi predstavljaju ciljno mesto delovanja supstanci koje se koriste u terapiji inflamacije, bola, astme i alergije (Greene i sar., 2011). Podaci o tradicionalnoj primeni pojedinih Veronica vrsta kod razliţitih zapaljenja koţe i sluzokoţe bili su povod za ispitivanje antiinflamatorne aktivnosti 70%-nih acetonskih ekstrakata tri ispitivana taksona. U cilju odreŤivanja antiinflamatornog potencijala ekstrakata i standardnih jedinjenja aspirina i kvercetina primenjena je prethodno opisana (Lesjak, 2011) ex vivo metoda zasnovana na prašenju potencijala inhibicije enzima ciklooksigenaznog (COX-1) i lipooksigenaznog (12-LOX) puta metabolizma arahidonske kiseline. Kao intaktni šelijski sistem, odnosno izvor COX-1 i 12-LOX enzima koriššeni su humani trombociti, a inflamacija je izazvana dodatkom dvovalentne kalcijumove jonofore A23184 (kalcimicin) i kalcijum- hlorida. Produkcija metabolita (12-HHT, TXB2 i PGE2 kao proizvoda ciklooksigenaznog puta i 12-HETE kao proizvoda lipooksigenaznog puta metabolizma arahidonske kiseline) prašena je primenom visoko osetljive i specifiţne LC-MS/MS metode (Lesjak, 2011). Stepen inhibicije odreŤen je na osnovu odnosa površine pikova pomenutih metabolita i internog standarda, a rezultati su prikazani u Tabeli 36. Dakle, primenom ove ex vivo tehnike, pored podataka o ukupnom antiinflamatornom potencijalu, dobijamo i podatke na osnovu kojih je moguše pretpostaviti mehanizme delovanja ispitivanih ekstrakata. Standardi kvercetin i aspirin, kao i testirani ekstrakti herbi odabranih Veronica vrsta pokazali su dozno zavisnu inhibiciju produkcije ţetiri prašena metabolita (Slike 45-47). 175 Svi ispitani acetonsko-vodeni ekstrakti herbi odabranih taksona inhibirali su produkciju 12-HHT metabolita postiţuši IC50 vrednosti od 0,4 (V. urticifolia) do 2,033 mg/ml (V. teucrium). Ove vrednosti bile su veše od vrednosti dobijenih za aspirin (IC50=0,001 mg/ml), dok kvercetin u ispitanom opsegu koncentracija (6.24-200 μg/ml) nije pokazao inhibitornu aktivnost. Acetonsko-vodeni ekstrakt vrste V. urticifolia jedini je pokazao inhibiciju produkcije PGE2 metabolita (IC50=2,279), dok su druga dva ekstrakta ostala neaktivna pri ispitivanim koncentracijama. Pokazani efekat bio je niţi od efekta standardnih jedinjenja aspirina (IC50=0,004 mg/mL) i kvercetina (IC50=0,054 mg/mL). Pri inhibiciji produkcije TXB2 metabolita postignute IC50 vrednosti iznosile su od 0,4 (V. urticifolia) do 2,779 (V. teucrium). Ove vrednosti bile su veše od vrednosti dobijenih za aspirin (IC50=0,006 mg/mL) i kvercetin (IC50=0,013 mg/mL). Na osnovu pokazanih rezultata zakljuţeno je da je meŤu ispitivanim taksonima V. urticifolia pokazala znaţajno veši potencijal inhibicije COX-1 enzima. Dobijeni rezultat moţe biti znaţajan za buduša ispitivanja, obzirom da je nivo ovog konstitutivnog enzima povešan kod razliţitih tipova karcinoma, pa njegovi selektivni inhibitori mogu uticati na rast, proliferaciju i apoptozu karcinomskih šelija. COX-1 enzim moţe biti ciljno mesto za prevenciju i terapiju epitelijalnog karcinoma jajnika (Daikoku i sar., 2005). Dodatno, redukcija rasta šelija linija HTB26 i MCF-7 humanog karcinoma dojke u prisustvu katehina pokazala je da ovaj sekundarni metabolit kao i drugi COX-1 inhibitori predstavljaju potencijalne agense za terapiju karcinoma dojke (McFadden i sar., 2006). Enzim 12-LOX, kao i proizvodi njegove aktivnosti imaju znaţajnu uţlogu u proliferaciji tumorskih šelija. Znaţajno veši nivo ovog enzima zabeleţen je u malignim u odnosu na benigne šelije tumora prostate, pankreasa, dojke i pluša (Lesjak, 2011). Osim toga, 12-LOX je ukljuţen u progresiju razliţitih hroniţnih oboljenja kao što su psorijaza, ateroskleroza i reumatoidni arthritis (Simin i sar., 2013). Metabolit 12-HETE ukljuţen je u modulisanje proliferacije i apoptoze tumorskih šelija i jedan je od kljuţnih parametrara koji se odnose na njihov metastaski potencijal (Schneider i Bucar, 2005). Iz navedenih razloga pronalaţenje potencijalnih inhibitora 12-LOX danas je veoma aktuelno. Ispitivani ekstrakti su inhibirali i 12-LOX enzim, ali nisu dostigli vrednost kvercetina (IC50=0.084 mg/ml). Najsnaţniju inhibiciju produkcije 12-HETE metabolita postigao je ekstrakt vrste V. jacquinii (IC50=1,072 mg/ml), dok je najslabija inhibicija primešena za ekstrakt vrste V. urticifolia (IC50=3,992 mg/ml). 176 Za sve ispitivane ekstrakte nadzemnog dela odabranih taksona roda Veronica pokazano je da ostvaruju znaţajnu antioksidantnu aktivnost, pa se moţe pretpostaviti da ona delom doprinosi ispoljenim antiinflamatornim efektima. Rezultati dobijeni u okviru ovog ispitivanja u saglasnosti su sa podacima o njihovoj primeni u narodnoj medicini. Iako su Veronica vrste ţesto primenjivane u tradicionalnoj, orijentalnoj medicini kod razliţitih inflamatornih stanja, farmakološki efekti ovih vrsta nisu bili predmet ispitivanja vešeg broja studija. Ipak, neki rezultati pokazali su potvrdu ovakvog delovanja. Küpeli i sar. (2005) ispitivali su antiinflamatorni efekat vodenog i metanolnog ekstrakta vrste V. anagalis-aquatica, kao i izolovanih jedinjenja u testu karageninom izazvane inflamacije šape u pacova. Za razliku od vodenog, metanolni ekstrakt ispoljio je znaţajnu antiinflamatornu aktivnost. U dozi od 500 mg/kg per os ovaj ekstrakt suprimirao je inflamatorni odgovor za 38,9%, što je uporedivo sa efektom referentnog NSAIL indometacina koji je u dozi od 5 mg/kg suprimirao inflamaciju za 40,3%. MeŤu izolovanim jedinjenjima, iridoidi verprozid i katalpozid ispoljili su najsnaţniju antiinflamatornu aktivnost bez indukovanja vidljive akutne toksiţnosti i gastriţnog oštešenja. Metanolni ekstrakt vrste V. peregrina inhibirao je lipopolisaharidima (LPS) indukovanu produkciju NO u peritonealnim makrofagama miša (C57BL/&) putem supresije ekspresije inducibilne NO sintaze. Dodatno, ovaj ekstrakt je dozno zavisno umanjio ekspresiju COX-2 (Jeon, 2012). Sliţan efekat na NO produkciju pokazali su i Harput i sar. (2002a) za metanolne ekstrakte vrsta V. cymbalaria, V. hederifolia, V. pectinata var. glandulosa, V. persica i V. polita. Ispoljeni antiinflamatorni efekat posledica je sposobnosti neutralizacije slobodnih radikala (NO * ) proizvedenih u makrofagama. Vodeno-etanolni ekstrakt herbe V. officinalis znaţajno sniţava citokinima indukovano oslobaŤanje PGE2 u humanim epitelnim šelijama pluša (A549 šelijama) putem inhibicije ekspresije COX-2 u NF-κB signalnom putu. Kao glavne komponente ovog ekstrakta identifikovani su iridoidni glikozidi verprozid i verminozid (Gründemann i sar., 2013). Razliţiti pro-inflamatorni agensi nastaju metabolizmom arahidonske kiseline reakcijama koje podrazumevaju formiranje slobodnih radikala (Smith, 1989). Moţe se zakljuţiti da je visok sadrţaj fenolnih jedinjenja, za koje je poznato da su hvataţi slobodnih radikala, odgovoran za pokazano protivupalno delovanje ispitivanih ekstrakata. Za pojedine biljne vrste koje se tradicionalno upotrebljavaju kod inflamatornih stanja, pokazano je da kao glavne aktivne sastojke sadrţe akteozid i druge feniletanske heterozide (Kukiš-Markoviš, 2013). Akteozid znaţajno i koncentraciono zavisno inhibira oslobaŤanje 177 TXB2 metabolita u humanim trombocitima, ali ne ispoljava efekat na produkciju PGE2 u A23187 stimulisanim makrofagama (Diaz i sar., 2004). Postoješi literaturni podaci svedoţe o ukljuţenosti razliţitih mehanizama u antiinflamatorno delovanje akteozida: nishodna regulacija ekspresije intercelularnog adhezionog molekula (ICAM-1) 11 na endotelnim šelijama (Hayashi i sar., 1996), aktivacija neutrofila (Akbay i sar., 2002), influks T limfocita (Hayashi i sar., 1994), inhibicija 5-lipoksigenaze (Kimura i sar., 1987) i inhibicija protein kinaze C (Herbert i sar., 1991). TakoŤe, akteozid umanjuje produkciju proinflamatornih citokina, interleukina 10 (IL-10), faktora nekroze tumora α (TNF-α), interferona γ (IFN-γ) i granulocitno-makrofagnog faktora rasta kolonije (GM-CSF) i aktivnost mijeloperoksidaze (MPO) kod akutnog i hroniţnog kolitisa in vivo (Kukiš-Markoviš, 2013). Jedan od znaţajnih mehanizama antiinflamatornog delovanja flavonoida jeste inhibicija enzima ukljuţenih u sintezu eikozanoida: fosfolipaze A2, COX i 5-lipooksigenaze. Delovanjem na COX oni smanjuju sintezu prostaglandina, znaţajnih medijatora inflamatornog procesa i na taj naţin modulišu i sve šelijske odgovore u kojima prostaglandini uţestvuju. Samim tim, ublaţavaju se i ostali aspekti inflamacije, kao što su povišena temperature, bol i oticanje inflamiranog mesta (Popoviš, 2013). Za izoskutelarein 7-O-(6‟‟‟- O-acetil)-β-alozil-(1‟‟‟→2‟‟‟)-β-glukopiranozid pokazana je nešto slabija antiinflamatorna aktivnost u odnosu na akteozid. U modelu PGE2 indukovanog edema šapice miša, primenjen u dozi 100 mg/kg ovaj derivat izoskutelareina pokazao je maksimalnu inhibiciju debljine otoka (23,4%) nakon 15 min, dok je akteozid svoj maksimalni efekat (25,8 %) ispoljio nakon 30 minuta (Güvenc i sar., 2010). Osim toga, Küpeli i sar. (2007) pokazali su da je ovaj derivat izoskutelareina u smeši sa izoskutelarein 7-O-[6‟‟‟-O-acetil-β-D-alopiranozil-(1→2)]-6‟‟-O- acetil-β-D-glukopiranozidom ispoljava znaţajno antiinflamatorno i antinociceptivno delovanje bez indukovanja gastriţnog oštešenja. Xu i sar. (2012) su pokazali da izokvercitrin u LPS-stimulisanim RAW 264,7 makrofagama koncentraciono zavisno inhibira PGE2 produkciju i COX-2 ekspresiju sa IC50 vrednostima 25 µM i 65 µM. Za hiperozid, drugi derivat kverecetina zastupljen u vrsti V. jacquinii, pokazano je da u koncentraciji 5 μM ispoljava snaţno antiinflamatorno delovanje u LPS-stimulisanim peritonealnim makrofagama miša putem inhibicije produkcije TNF-α, IL-6 i NO sa maksimalnim stepenom inhibicije 32,31, 41,31 i 30,31% (Kim i sar., 2011). U istom ispitivanju hiperozid je inhibirao i NF-κB 11 Na mestu inflamacije osloboŤeni inflamatorni citokini indukuju ispoljavanje ICAM-1 na vaskularnim endotelnim šelijama, što je neophodan korak u migraciji leukocita na mesto zapaljenja (Selakoviš i sar., 2002). 178 aktivaciju, kao i IκB-α degradaciju. Lee i sar. (2004) su utvrdili da hiperozid znaţajno suprimira PGE2 i NO produkciju in vitro sa IC50 vrednostima 24,3 i 32,9 μM. Tabela 36. OdreŤene IC50 vrednosti za COX-1 i 12-LOX inhibitornu aktivnost ispitivanih ekstrakata i standardnih jedinjenja Ekstrakt IC50 (mg/ml) COX-1 inhibicija 12-LOX inhibicija 12-HHT PGE2 TXB2 12-HETE V. urticifolia <0,4 2,279±0,154 <0,4 3,992±0,260 V. jacquinii 1,176±0,069 n.d. a 1,337±0,046 1,072±0,018 V. teucrium 2,033±0,109 n.d. a 2,779±0,232 2,779±0,232 Aspirin 0,001±0,00008 4,98±0,06 × 10 -3 5,58±0,53 × 10-3 n.d.a Kvercetin n.d. a 53,63±2,47 × 10-3 12,57±0,26 × 10-3 0,084±0,007 a Nije dostignuta IC50 pri ispitivanim koncentracijama Buduši da je za vešinu fenolnih jedinjenja detektovanih i kvantifikovanih u ispitanim Veronica vrstama pokazano da su izuzetno potentni antiinflamatorni agensi, uraŤena je odgovarajuša regresiona analiza u cilju ispitivanja korelacije sadrţaja ovih jedinjenja i pokazane antiinflamatorne aktivnosti. Znaţajna korelacija pokazana je izmeŤu stepena inhibicije produkcije 12-HHT i sadrţaja bajkalina u testiranim ekstraktima. Bajkalin se u Japanu, Kini i Koreji koristi u terapiji inflamatornih stanja kao što su bronhitis, nefritis, hepatitis, astma i atopijski dermatitis (Li i sar., 2000). Njegova antiinflamatorna aktivnost povezuje se sa NF-κB faktorom, što je i pokazano u razliţitim akutnim i hroniţnim inflamatornim modelima (Guo i sar., 2013). Liu i sar. (2006) pokazali su da tretman bajkalinom sniţava nivo serumskog TNF-α i IL-6 kod C57BL/6J pacova sa hiperlipidemijom indukovanom dijetom, kod kojih je inflamacija izazvana infekcijom bakterijom Chlamydopila pneumoniae. U modelu karageninom indukovanog edema šapice pacova hlorogenska kiselina je ispoljila antiedematozno delovanje (Dos Santos i sar., 2006), dok je u LPS-aktiviranim makrofagima regulisala produkciju inflamatornih citokina (Shan i sar., 2009). 179 Za brojne iridoide pokazano je da deluju antiinflamatorno putem inhibicije COX i LOX, smanjuju ekspresiju i sintezu TNF-α i IL-6 putem inhibicije NF-κB (Kukiš-Markoviš, 2013). Biljke koje sadrţe aukubin se u orijentalnoj medicini koriste za leţenje reumatskih i drugih zapaljenskih oboljenja. Nakon topikalne primene, aukubin u dozi 0,1 mg u modelu 12-O- tetradekanoliforbol-13-acetatom (TPA) indukovanog edema uva miša ispoljava antiinflamatornu aktivnost sliţnu indometacinu (83,08 i 71,54% inhibicije edema za indometacin i aukubin, redom) (Carrillo-Ocampo i sar., 2013). Aglikon aukubina pokazuje umerenu inhibiciju enzima COX-2 (IC50=8,83 mM), i znatno niţu inhibiciju enzima COX-1 (IC50=68,90 mM) (Park i sar., 2010). Sam aukubin u istom testu nije ispoljio znaţajniju aktivnost. Benito i sar. (2000) pokazali su da je inhibicija TX sintaze primarni mehanizam putem kog iridoidna jedinjenja ispoljevaju svoje anti-inflamatorno delovanje. Naime, ispitivani iridoidi, meŤu kojima je i aukubin, znaţajno su inhibirali oslobaŤanje TXB2 iz humanih trombocita stimulisanih jonoforama Ca, sa stepenom inhibicije nešto niţim u odnosu na ibuprofen. Ovaj literaturni podatak u saglasnosti je sa rezultatima dobijenim u okviru ove disertacije, gde je najvešu inhibiciju sinteze TXB2 postigao ekstrakt V. urticifolia u kom je jedino detektovano prisustvo aukubina. U istom ispitivanju (Benito i sar., 2000), nijedno od testiranih iridoidnih jedinjenja nije ostvarilo statistiţki znaţajan efekat na produkciju PGE2. Obzirom da su LOX osetljive na prisustvo antioksidanasa moţe se zakljuţiti da pokazano antioksidantno delovanje ispitivanih ekstrakata delom doprinosi i utvrŤenom antiinflamatornom delovanju. Antioksidansi inhibiraju formiranje lipidnih hidroperoksida usled hvatanja lipidoksi- ili lipidperoksi- radikala koji nastaju tokom enzimske peroksidacije. Na ovaj naţin ograniţava se raspoloţivost lipidnih peroksida kao neophodnog supstrata za katalitiţki ciklus LOX (Rackova i sar., 2007). Ovo se naroţito uoţava u sluţaju ekstrakata herbi V. jacquinii i V. teucrium koji su ispoljili snaţnu 12-LOX inhibitornu aktivnost, a pritom i najsnaţnije antioksidantno delovanje. Sa druge strane, obzirom da je ekstrakt V. urticifolia pokazao najsnaţniju COX-1 inhibiciju, ali i najslabiju antioksidantnu aktivnost, moţe se zakljuţiti da je neki drugi mehanizam u osnovi njegovog antiinflamatornog delovanja. 180 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije 1 2 -H H T ( % ) Radna koncentracija VJ AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije T X B 2 ( % ) Radna koncentracija VJ AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije 1 2 -H E T E ( % ) Radna koncentracija VJ AV (mg/mL) Slika 45. Antiinflamatorni efekat 70%-nog ekstrakta V. jacquinii (inhibicija produkcije 12-HHT, 12-HETE i TXB2 181 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije 1 2 -H H T ( % ) Radna koncentracija VU AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije P G E 2 ( % ) Radna koncentracija VU AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije T X B 2 ( % ) Radna koncentracija VU AV (mg/mL) 182 0 2 4 6 8 10 12 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije 1 2 -H E T E (% ) Radna koncentracija VU AV (mg/mL) Slika 46. Antiinflamatorni efekat 70%-nog ekstrakta V. urticifolia (inhibicija produkcije 12-HHT, 12-HETE i TXB2 183 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ije p ro d u k c ije 1 2 -H H T ( % ) Radna koncentracija VT AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 -20 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije T X B 2 ( % ) Radna koncentracija VT AV (mg/mL) 0 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 In h ib ic ija p ro d u k c ije 1 2 -H E T E (% ) Radna koncentracija VT AV (mg/mL) Slika 47. Antiinflamatorni efekat 70%-nog ekstrakta V. teucrium (inhibicija produkcije 12-HHT, 12-HETE i TXB2 184 3.4. In vivo ispitivanje citotoksične aktivnost (antitumorsko delovanje) Maligna oboljenja su pored kardiovaskularnih bolesti vodeši uzrok smrti širom sveta. Pod karcinomom se podrazumeva grupa od preko 100 razliţitih oboljenja okarakterisanih nekontrolisanim šelijskim rastom, lokalnom invazijom tkiva i udaljenim metastazama (Madhusudan i Middleton, 2005). Karcinogeneza predstavlja višefazan proces transformacije normalne šelije u tumorsku. Prva faza, faza inicijacije, dešava se kada genom šelije pretrpi promene koje potom ostaju neispravljenje, ili bivaju pogrešno ispravljene. Za transformaciju normalne šelije u malignu potreban je veši broj mutacija, što obiţno zahteva i duţi vremenski period. U fazi promocije, oštešena šelija se deli formirajuši premaligni tumor. Pod dejstvom razliţitih faktora tumor prelazi u poslednju, ireverzibilnu fazu progresije. Nastaju šelije – klonovi sa povešanim kapacitetom proliferacije, invazivnoššu i sposobnoššu metastaziranja. Postepeno dolazi i do morfoloških promena u tkivu (Orţiš, 2010). Jedinjenja izolovana iz biljaka imaju vaţnu ulogu u otkrivanju i razvoju novih hemioterapijskih agenasa. Jedan od pristupa pri identifikaciji antikancerogenih agenasa prirodnog porekla je izbor biljnih vrsta zasnovan na etnomedicinskim podacima, i njihovo testiranje modernim nauţnim metodama. Obzirom da se u tradicionalnoj medicini zemalja Azije pojedine Veronica vrste primenjuju u terapiji karcinoma (Harput i sar., 2002a), u okviru ove disertacije ispitivan je efekat odabranih vrsta kod ţivotinja sa Erlihovim ascitnim karcinomom (EAC). Ovaj karcinom je inicijalno opisan kao spontani adenokarcinom glodara. U pitanju je brzorastuši karcinom veoma agresivnog ponašanja. Njegova implantacija indukuje lokalnu inflamatornu reakciju, uz povešanje ascitne zapremine i broja šelija, što je u vezi sa povešanjem peritonealne vaskularne permeabilnosti (Gomes i sar., 2008). Ukljuţenost slobodnih radikala u razvoj tumora je dobro dokumentovana. Prethodna ispitivanja su pokazala da su miševi sa EAC pod vešim oksidativnim stresom u odnosu na kontrolne ţivotinje, što za posledicu ima povešanu oksidaciju proteina i lipida, kao i redukovanje endogenih antioksidanasa u jetri (Al Abdan, 2012). Ukoliko je oksidativni stres ukljuţen u nastanak EAC, odgovarajuša terapija antioksidansom treba da zaštiti od ovog oštešenja. Kako bi ispitali hipotezu da je rast tumorskih šelija posledica izmene antioksidantnog statusa u EAC šelijama, kao pozitivna kontrola koriššen je tiolni antioksidans i prekursor glutationa N-acetil-L-cistein (NALC) (Šeboviš, 2008). Antitumorska svojstva ispitivanih ekstraktata i NALC procenjivana su prašenjem sledeših parametara: zapremina ascitesa, broj tumorskih šelija i njihova vijabilnost. 185 Ascitna teţnost esencijalna je za rast tumora jer predstavlja izvor hrane za rast tumorskih šelija (Agrawal i sar., 2011). U kliniţkim situacijama se formiranje ascitesa ţesto primešuje kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom. Rezultati dobijeni u okviru ove doktorske disertacije pokazuju da primena NACL znaţajno redukuje ascitnu zapreminu kod miševa sa implantiranim EAC. TakoŤe, primenjeni ekstrakti su statistiţki znaţajno smanjili zapreminu ascitesa, i to ekstrakti V. teucrium i V. urticifolia jednako efikasno kao NACL, dok je ekstrakt V. jacquinii ostvario nešto slabiji efekat. Tabela 37. Uticaj ispitivanih ekstrakata i NALC na parametre EAC Grupa Broj šelija/mm3 Zapremina ascitesa (ml) Vijabilnost šelija (%) EAC kontrolna grupa 120500 ± 10609 7,24 ± 0,48 8,74 ± 1,71 NALC grupa 110000 ± 2280 3,78 ± 0,56 9,87 ± 1,39 V. jacquinii 137750 ± 20934a** 5,75 ± 0,54a*,** 7,85 ± 3,09 V. teucrium 119583 ± 19595 3,50 ± 1,47a* 7,47 ± 2,42 V. urticifolia 107833 ± 15512 3,87 ± 0,85a* 6,35 ± 0,73a*,** aStatistiţka razlika u odnosu na EAC kontrolnu grupu, *p<0,05; **p<0,001. Akumulacija ascitne teţnosti dešava se paralelno sa proliferacijom tumorskih šelija (Ozaslan i sar., 2011). Citotoksiţna aktivnost moţe se odrediti kao smanjenje broja šelija usled šelijske smrti, dok citostatska ili aktivnost inhibicije šelijskog rasta moţe biti odreŤena kao supresija povešanja šelijskog broja, bez indukovanja šelijske smrti. Primena NALC i ispitivanih ekstrakata dovela je do blage redukcije (bez statistiţkog znaţaja) broja tumorskih šelija u poreŤenju sa kontrolnom grupom, ukazujuši na njihov onkostatski efekat. ANOVA testom nije pokazana statistiţki znaţajna razlika u efektu ispitivanih ekstrakata na broj tumorskih šelija. Primena NALC nije pokazala efekat na vijabilnost tumorskih šelija. U grupama ţivotinja koje su primale ekstrakte, statistiţki znaţajno smanjenje šelijske vijabilnosti primešeno je samo nakon aplikacije V. urticifolia ekstrakta. Pretraţivanjem literature nisu naŤeni podaci o in vivo ispitivanju antitumorske aktivnosti Veronica vrsta, ali su u prethodnim ispitivanjima biljke ovog roda pokazale snaţnu citotoksiţnu aktivnost na razliţitim šelijskim linijama. Metanolni ekstrakt vrste V. americana ispoljio je citotoksiţnu aktivnost prema HF-6 i PC-3 šelijskim linijama humanih karcinoma 186 kolona i prostate, redom (Moreno-Escobar i sar., 2013). Iridoidna jedinjenja izolovana iz ove vrste 4β-hidroksi-6-O-(p-hidroksibenzoil)-tetrahidrolinarid i 10-O-protokatehuil-katalpol pokazala su aktivnost vešu od aktivnosti kamptotecina koji je koriššen kao pozitivna kontrola. Osim toga, Saracoglu i Harput (2012) utvrdili su da iridoidi prisutni u Veronica vrstama, u zavisnosti od strukture, deluju citostatski ili citotoksiţno na šelijskoj liniji humanog epidermoidnog karcinoma (Hep-2), humanog rabdomiosarkoma (RD), kao i na šelijskoj liniji transgenih murinskih L-šelija (L-20B). Testirana jedinjenja nisu ispoljila citotoksiţnost na ne- kanceroznoj šelijskoj liniji bubreţnih šelija afriţkog zelenog majmuna (Vero). U pomenutom ispitivanju aukubin primenjen u koncentraciji 0-200 μg/ml nije pokazao efekat na rast karcinomskih šelija. Metanolni ekstrakti vrsta V. persica, V. polita, V. hederifolia, V. pectinata var. glandulosa i V. cymbalaria ispoljili su dozno-zavisnu citotoksiţnost prema KB i B16 šelijskim linijama. Frakcionisanjem je pokazano da su jedinjenja odgovrna za pokazanu aktivnost prisutna u nepolarnoj, hloroformskoj frakciji ekstrakta (Harput i sar., 2002a). Malo je podataka o in vivo ispitivanju antitumorske aktivnosti jedinjenja prisutnih u vrstama ispitivanim u okviru ove disertacije, ali su izvršena brojna in vitro ispitivanja sa njima. Akteozid primenjen i.p. u koncentraciji 50 mg/kg kod C57BL/6 miševa kao pretretman tokom 13 dana pre injektovanja B16 melanomskih šelija statistiţki znaţajno je povešao preţivljavanje bolesnih ţivotinja (Ohno i sar., 2002). Osim toga, u in vitro ispitivanjima akteozid je pokazao snaţno citotoksiţno delovanje prema sledešim tumorskim linijama: dRLh-84 šelijama hepatoma pacova, S-180 šelijama sarkoma, P-388/D1 šelijama limfoidnih neoplazmi miša, HL-60 šelijama humanog promijelocitnog limfoma i HeLa šelijskoj liniji humanog epitelijalnog karcinoma (Saracoglu i sar., 1995). Bajkalin, prisutan u ekstraktima vrsta V. urticifolia i V. jacquinii, inhibirao je rast inokuliranih SW620 šelija kolorektalnog karcinoma kod miša (Chen i sar., 2012). Nakon 28 dana terapije primenjen u dozi 50 mg/kg bajkalin je inhibirao rast tumora za 55%. U in vitro uslovima ovo jedinjenje ispoljava dozno i vremenski zavisnu inhibiciju rasta humanih mukoepidermoidnih Mc3 karcinomskih šelija (Chiu i sar., 2011). Literaturni podaci svedoţe o znaţajnoj antitumorskoj aktivnosti iridoidnih jedinjenja kod ţivotinja sa EAC. Naime, Pikroliv, smeša iridoidnih glikozida, primenjen per os u dozi 375 mg/kg tokom deset dana dovodi do znaţajnog produţetka ţivota ţivotinja sa inokuliranim EAC, kao i do znaţajne redukcije ascitne zapremine (Rajeshkumar i sar., 2001). Za aukubin prisutan u vrsti V. urticifolia nema podataka o in vivo testovima, ali su Gálvez i sar. (2005) 187 pokazali in vitro da aukubin antitumorski efekat ostvaruje putem inhibicije topoizomeraze I. Ovaj enzim kontroliše izmene u DNK strukturi katalizom prekidanja i spajanja fosfodiestarske osnove DNK lanaca tokom normalnog šelijskog ciklusa. Smatra se da inhibitori topoizomeraze blokiraju fazu ligacije ţime se generišu jedno i dvolanţani DNK prekidi, što dalje narušava integritet genoma. Nastanak tih prekida naknadno dovodi do apoptoze (Kümler i sar., 2013). Navedeni podaci ukazuju da su jedinjenja iz grupe flavonoidnih, feniletanskih heterozida i iridoidnih sekundarnih metabolita nosioci pokazane onkostatske aktivnosti ispitivanih ekstrakata. Ekstrakt herbe V. urticifolia koji sadrţi i najveši procenat akteozida, aukubina i bajkaleina ispoljio je najbolji antitumorski efekat. Ovakav rezultat nije u saglasnosti sa rezultatima antioksidantnih testova, što ukazuje da u osnovi pokazanog onkostatskog delovanja leţe neki drugi mehanizmi. 3.5. Ispitivanje antibakterijske aktivnosti Neracionalna primena antibiotika dovela je do pojave rezistencije pojedinih bakterijskih sojeva na njihovo delovanje. U vezi sa tim, pronalazak novih jedinjenja sa antibakterijskim delovanjem jedna je od znaţajnijih oblasti istraţivanja danas. Prirodni proizvodi su bogat izvor antimikrobnih agenasa širokog spektra delovanja, niske toksiţnosti i zadovoljavajuše farmakokinetike (Cushnie i sar., 2003). Prema dostupnim literaturnim podacima, odabrane vrste roda Veronica do sada nisu ispitivane u pogledu antimikrobne aktivnosti. Antibakterijska aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi V. jacquinii, V. teucrium i V. urticifolia testirana je bujon mikrodilucionim testom prema Gram (+) bakterijama Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus cereus humani izolat, Micrococcus flavus ATCC 10240, Listeria monocytogenes NCTC 7973, i Gram (-) bakterijama Escherichia coli ATCC 35210, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Enterobacter cloacae humani izolat. Rezultati antibakterijskog delovanja dati su u Tabeli 38. Ispitivani ekstrakati su ispoljili umerenu do slabu aktivnost prema svim testiranim sojevima bakterija. Izuzev u sluţaju soja Enterobacter cloacae, najizraţeniji efekat prema primenjenim sojevima ispoljio je ekstrakt herbe V. teucrium. Primešeno je da su G (+) sojevi generalno osetljiviji na delovanje ovog ekstrakta u odnosu na G (-) bakterije. Najizraţeniji je bio efekat prema S. aureus, B. cereus i L. monocytogenes (MIK 7,5 mg/ml), dok je najslabiju aktivnost ovaj 188 ekstrakt pokazao prema P. aeruginosa (MIK 22,5 mg/ml). U odnosu na ostale ekstrakte herbi, ovaj ekstrakt ima veši sadrţaj derivata izoskutelareina i hrizoeriola. Nema dostupnih literaturnih podataka o antibakterijskom delovanju dominantnog jedinjenja izoskutelarein 7- O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alozil (1‟‟‟→2‟‟‟)-β-glukozida. Najizraţeniji efekat ekstrakt V. urticifolia pokazao je u odnosu na S. aureus, dok je najosetljiviji na dejstvo V. jacquinii bio soj E. cloacae. Rezultati dobijeni u okviru ove doktorske disertacije u skladu su sa rezultatima ispitivanja antibakterijske aktivnosti metanolnog ekstrakta vrste V. montana gde je pokazano da je rast testiranih mikroorganizama potpuno inhibiran pri koncentracijama od 7,5 do 22,5 mg/ml, pri ţemu je najveša aktivnost ispoljena prema S. aureus (Stojkoviš i sar., 2013). Sa druge strane, Abu Ziada i sar. (2008) su pokazali agar difuzionom metodom da metanolni ekstrakt herbe V. anagallis-aquatica ima najjaţi efekat na Bacillus subtillis, dok je manje efikasan prema soju S. aureus. O antimikrobnoj aktivnosti jedinjenja prisutnih u ispitivanim taksonima postoje literaturni podaci. Za akteozid koji je prisutan u sva tri ispitivana ekstrakta je ranije pokazano da ispoljava umereno antimikrobno delovanje. Njegova antibakterijska aktivnost prema S. aureus je posledica inhibicije preuzimanja leucina, pri ţemu se inhibira sinteza proteina (Avila i sar., 1999). Vrednost MIK akteozida za S. aureus iznosi 65 μg/ml (Pendota i sar., 2013). Za bajkalin koji je prisutan u ekstraktima V. urticifolia i V. jacquinii je pokazan sinergistiţki efekat sa tetraciklinom i oksitetraciklinom u terapiji infekcija izazvanih visoko rezistentnim sojevima S. aureus (Novy i sar., 2011). Sa druge strane, rastvoren u 0,05%-nom rastvoru natrijum karbonata (w/v) ili 0,1%-nom amonijum hidroksidu (v/v) i primenjen samostalno u koncentraciji od 100 μl nije pokazao efekat na rast S. aureus, E. coli i P. aeruginosa (Cushnie i sar., 2003). Za hlorogensku kiselinu utvrŤeno je da ne deluje na G (+) bakterije (Kukiš-Markoviš, 2013). 189 Tabela 38. Antibakterijska aktivnost odabranih Veronica vrsta V. jacquinii V. urticifolia V. teucrium Streptomycin Bakterija MIC MBC MIC MBC MIC MBC MIC MBC Staphylococcus aureus 22,5 22,5 7,5 7,5 7,5 7,5 0,030 0,060 Bacillus cereus 22,5 22,5 22,5 45,0 7,5 22,5 0,010 0,030 Micrococcus flavus 22,5 22,5 22,5 37,5 15,0 22,5 0,006 0,030 Listeria monocytogenes 15,0 22,5 37,5 45,0 7,5 15,0 0,010 0,030 Pseudomonas aeruginosa 22,5 22,5 22,5 37,5 22,5 22,5 0,050 0,100 Escherichia coli 15,0 15,0 22,5 37,5 15,0 15,0 0,100 0,200 Enterobacter cloacae 7,5 15,0 15,0 22,5 15,0 22,5 0,050 0,100 190 ZAKLJUČCI U skladu sa postavljenim ciljevima ove doktorske teze, a na osnovu dobijenih rezultata mogu se izvesti sledeši zakljuţci: 1. U okviru doktorske disertacije izvršeno je morfološko, hemijsko i farmakološko ispitivanje tri taksona roda Veronica L.: V. urticifolia Jacq., V. jacquinii Baumg., V. teucrium L., široko rasprostranjenih na teritoriji Srbije. Ove vrste su do sada samo delimiţno hemijski ispitivane, dok nema podataka o njihovom farmakološkom delovanju. 2. Sa ciljem utvrŤivanja mikromorfoloških obeleţja, kao i anatomske graŤe, sprovedena je mikroskopska analiza sprašene herbe i popreţnih preseka lista i stabla odabranih Veronica vrsta. Analizom sprašenog biljnog materijala uoţeno je prisustvo sledeših zajedniţkih karakteristika: stoma anomocitnog tipa u epidermisu, neţlezdanih, višešelijskih dlaka i ţlezdanih dlaka kapitatnog tipa. Mikroskopskom analizom popreţnog preseka lista primešene su jasne razlike samo na nivou broja slojeva palisadnog tkiva. Dok je u listu vrsta V. urticifolia i V. teucrium prisutan jednoslojni palisadni parenhim, u listu vrste V. jacquinii on je višeslojan. Kod svih ispitivanih vrsta pokazano je da su šelije epidermisa lica krupnije od šelija epidermisa naliţja. Analiza popreţnog preseka stabla pokazala je da je ono primarne graŤe i da pripada tipu stabla bez provodnih snopiša. Rezultati histohemijske analize ukazali su na prisustvo lipida, alkaloida, skroba i fenolnih jedinjenja u analiziranim taksonima. Fluorescentnom mikroskopijom utvrŤeno je da su fenolna jedinjenja lokalizovana u kutikularnom sloju, trihomima i lignificiranim šelijskim zidovima ksilema listova i stabla. 3. Analiza sadrţaja teških metala primenom FAAS i GF-AAS u biljnim uzorcima nije pokazala znaţajne razlike izmeŤu testiranih Veronica vrsta sa istog lokaliteta, ukazujuši na to da obrazac preuzimanja teških metala nije karakteristika vrste. Na osnovu sadrţaja Cr u herbi vrsta V. jacquinii i V. urticifolia raslih na serpentinskom zemljištu, zakljuţeno je da one predstavljaju potencijalne hiperakumulatore ovog 191 teškog metala. Sadrţaj odreŤivanih metala u uzorcima zemljišta bio je u oţekivanom opsegu za odgovarajušu geološku podlogu. 4. U okviru preliminarne hemijske analize u metanolnim, vodenim i 70%-nim acetonskim ekstraktima ispitivanih Veronica vrsta odreŤen je sadrţaj ukupnih polifenola, fenilpropanoida i iridoida primenom kolorimetrijskih tehnika. a) Sadrţaj ukupnih fenola varirao je od 116,0 do 201,0 mg GAE/g suvog ekstrakta, pri ţemu je najveši sadrţaj zabeleţen u ekstraktima herbe V. jacquinii. b) Sadrţaj ukupnih fenilporopanoida varirao je od 11,2 do 38,0 mg akteozida/g suvog ekstrakta. Uzorci vrste V. teucrium bili su najbogatiji ovom klasom jedinjenja. c) Sadrţaj ukupnih iridoida kretao se od 94,3 do 322,9 mg aukubina/g suvog ekstrakta. Najveši sadrţaj zabeleţen je u ekstraktima vrste V. urticifolia. Obzirom da je spektrofotometrijska analiza izdvojila 70%-ne acetonske ekstrakte kao najbogatije pomenutim klasama jedinjenja, oni su odabrani za dalju hemijsku i farmakološku analizu. 5. HPLC-DAD i HPTLC tehnikama, uz koriššenje standardnih supstanci, odreŤen je sadrţaj aukubina i akteozida u 70%-nim acetonskim ekstraktima ispitivanih taksona. Dok je sadrţaj akteozida u ekstraktu herbe V. urticifolia bio pribliţno tri puta veši u odnosu na njegov sadrţaj u herbama vrsta V. jacquinii i V. teucrium, za aukubin je pokazano da je prisutan samo u ekstraktu herbe V. urticifolia. Primešena razlika u sadrţaju jedinjenja odreŤenih primenom HPLC-DAD i HPTLC tehnika nije imala statistiţku znaţajnost. 6. Kvalitativna i kvantitativna analiza ispitivanih taksona roda Veronica izvršena je primenom LC-DAD/ESI-MS tehnike. a) U ekstraktu herbe V. urticifolia glavnu frakciju ţinili su flavoni (derivati apigenina i luteolina), a pored njih su bili prisutni i derivati hidroksicimetnih kiselina (kafene i p-kumarinske kiseline). Dominantna jedinjenja u ispitivanom ekstraktu bila su 192 akteozid (14,92 mg/g suvog ekstrakta) i luteolin-7-O-glukuronid (14,22 mg/g suvog ekstrakta). b) U ekstraktu herbe V. teucrium glavnu frakciju ţinili su flavoni (derivati apigenina i izoskutelareina), a pored njih su bili prisutni i derivati hidroksicimetnih kiselina (kafene i protokatehinske kiseline). Dominantno jedinjenje u ispitivanom ekstraktu je bio izoskutelarein 7-O-(6‟‟‟-O-acetil)-β-alozil-(1‟‟‟→2‟‟‟)-β-glukopiranozid (26,33 mg/g suvog ekstrakta). c) U ekstraktu herbe V. jacquinii glavnu frakciju ţinili su derivati fenolkarbonskih kiselina, kafene i protokatehinske kiseline. Osim njih su bili prisutni i flavonoli (derivati kvercetina) i flavoni (derivati luteolina i izoskutelareina). Dominantno jedinjenje u ekstraktu V. jacquinii bio je feniletanoid akteozid (5,00 mg/g suvog ekstrakta). 7. Dodatna saznanja o hemijskom sastavu herbi ispitivanih taksona dobijena su kvantifikacijom odabranih fenolnih jedinjenja (14 fenolnih kiselina, 25 flavonoida, 3 kumarina i 2 lignana) i hina kiseline u 70%-nim acetonskim ekstraktima primenom visoko selektivne i specifiţne LC-MS/MS tehnike sa trostrukim kvadrupolom masenim spektrometrom sa elektrosprej jonizacijom. Fenolne komponente koje se nalaze u znaţajnijoj koliţini u ekstraktima odabranih Veronica vrsta su hlorogenska kiselina (V. teucrium), bajkalin (V. urticifolia i V. teucrium), izokvercitrin (V. jacquinii) i hiperozid (V. jacquinii), kao i derivat cikloheksana hina kiselina (V. jacquinii i V. teucrium). Iako u tragovima, genistein je po prvi put identifikovan u familiji Plantaginaceae. TakoŤe, novina je i prisustvo tri kumarina (umbeliferona, skopoletina i eskuletina) u Veronica vrstama. 8. In vitro antioksidantna aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi odabranih Veronica vrsta odreŤena je spektrofotometrijski, primenom FRAP testa (ukupna antioksidantna aktivnost) i DPPH testa (neutralizacija DPPH radikala). U oba testa ispitivani ekstrakti pokazali su znaţajnu dozno-zavisnu aktivnost. Najveša redukciona sposobnost i antiradikalski efekat pokazani su za ekstrakt herbe V. teucrium, dok je najniţa aktivnost zabeleţena za ekstrakt herbe V. urticifolia. 193 9. In vivo antioksidantna aktivnost je ispitivana na modelu hepatotoksiţnosti indukovane primenom CCl4 kod pacova. Prašenjem biohemijskih parametara oksidativnog stresa pokazano je da ispitivani ekstrakti imaju zaštitnu ulogu. Odrţavajuši fiziološki nivo enzimskih i neenzimskih antioksidanasa, kao i lipidne peroksidacije, primenjeni u dozi 100 mg/kg t.m. redukovali su nivo slobodnih radikala. Prema rezultatima sadrţaja GSH i TBARS nivoa zakljuţeno je da u oksidativnom stresu vrste V. jacquinii i V. teucrium pokazuju sliţan antioksidantni efekat koji je nešto izraţeniji od efekta vrste V. urticifolia, što je u saglasnosti sa rezultatima in vitro testova. 10. Neuroprotektivni efekat 70%-nih acetonskih ekstrakata odabranih Veronica vrsta ispitivan je u kulturi humane neuroblastomske šelijske linije SH-SY5Y gde je testom kisele fosfataze prašen uticaj ekstrakata na preţivljavanje ovih šelija nakon njihovog kombinovanog tretmana sa stresorom (SNP ili H2O2). Ispitivani ekstrakti su ispoljili blagu protektivnu aktivnost što se manifestovalo povešanjem preţivljavanja šelija izloţenih SNP (9,7-12,0%) ili H2O2 (17,0-18,3%). Najjaţi zaštitini efekat u kulturi SH-SY5Y šelija tretiranih sa SNP je pokazao ekstrakt vrste V. jacquinii, dok je najefikasniji u preţivljavanju šelija tretiranih sa H2O2 bio ekstrakt vrste V. teucrium. Prašenjem produkcije superoksid jona (O2 -* ), kao i intenziteta lipidne peroksidacije zakljuţeno je da je za ispoljeno neuroprotektivno delovanje ekstrakata kod primene SNP kao stresora odgovoran mehanizam „hvatanja“ slobodnih radikala, dok kod primene H2O2 to nije sluţaj. 11. Antiinflamatorni efekat 70%-nih acetonskih ekstrakata odreŤen je primenom ex vivo metode zasnovane na prašenju produkcije metabolita 12-HHT, TXB2 i PGE2 kao proizvoda ciklooksigenaznog puta i 12-HETE kao proizvoda lipooksigenaznog puta metabolizma arahidonske kiseline. Na osnovu dobijenih rezultata zakljuţeno je da je meŤu ispitivanim taksonima V. urticifolia pokazala znaţajno veši potencijal inhibicije COX-1 enzima (IC50<0,40 mg/ml) , dok je najsnaţniju inhibiciju produkcije 12-HETE metabolita postigao ekstrakt vrste V. jacquinii (IC50=1,07 mg/ml). Obzirom da svi ispitivani ekstrakti pokazuju znaţajnu antioksidantnu aktivnost, moţe se pretpostaviti da takva njihova aktivnost delom doprinosi ispoljenom antiinflamatornom efektu. 194 12. Antitumorska svojstva ispitivanih ekstraktata procenjivana su kod miševa sa Erlihovim ascitnim tumorom prašenjem parametara kao što su zapremina ascitesa, broj tumorskih šelija i njihova vijabilnost. U dozi od 100 mg/kg primenjeni ekstrakti su statistiţki znaţajno smanjili zapreminu ascitesa, i to ekstrakti vrsta V. teucrium i V. urticifolia jednako efikasno kao pozitivna kontrola NACL, dok je ekstrakt vrste V. jacquinii ostvario nešto slabiji efekat. TakoŤe, u grupama ţivotinja koje su primale ekstrakte došlo je do blage redukcije (bez statistiţkog znaţaja) broja tumorskih šelija u poreŤenju sa kontrolnom grupom, što ukazuje na njihov onkostatski efekat, dok je statistiţki znaţajno smanjenje šelijske vijabilnosti primešeno samo nakon aplikacije V. urticifolia ekstrakta. 13. Antibakterijska aktivnost 70%-nih acetonskih ekstrakata herbi V. jacquinii, V. teucrium i V. urticifolia testirana je bujon mikrodilucionim testom prema ţetiri Gram (+) i tri Gram (-) bakterije. Ispitivani ekstrakati su ispoljili umerenu do slabu aktivnost prema svim testiranim sojevima bakterija. Primešeno je da su G (+) sojevi generalno osetljiviji na delovanje ovog ekstrakta u odnosu na G (-) bakterije. Izuzev u sluţaju soja Enterobacter cloacae, najizraţeniji antibakterijski efekat ispoljio je ekstrakt herbe V. teucrium. On je najvešu aktivnost pokazao prema bakterijama Staphylococcus aureus, Bacillus cereus i Listeria monocytogenes (MIK 7,5 mg/ml). U sluţaju delovanja ekstrakta vrste V. urticifolia najosetljiviji soj je bio S. aureus, dok je kod ekstrakta vrste V. jacquinii to bio soj E. cloacae. 14. Moţe se zakljuţiti da doktorska disertacija daje doprinos poznavanju sekundarnih metabolita prisutnih u herbi tri vrste roda Veronica (V. urticifolia, V. jacquinii i V. teucrium) što moţe biti od znaţaja za dalja hemotaksonomska ispitivanja kako samog roda Veronica, tako i familije Plantaginaceae. Pokazana antioksidantna, antiinflamatorna, neuroprotektivna i antitumorska aktivnost ispitivanih taksona otvara put daljim istraţivanjima u cilju primene ispitivanih vrsta u fitoterapiji kao prirodnih lekovitih sirovina. 195 LITERATURA 1. Abu-Ziada ME, Mashaly IA, El-Monem MA, Torky M. Economic potentialities of some aquatic plants growing in North East Nile Delta, Egypt. J Appl Sci. 2008; 8: 1395-1405. 2. Adriano DC. Trace Elements in the Terrestrial Environment. New York: Springer; 1986. 3. Agelet A, Vallès J. Studies on pharmaceutical ethnobotany in the region of Pallars (Pyrenees, Catalonia, Iberian Peninsula). Part I. General results and new or very rare medicinal plants. J Ethnopharmacol. 2001; 77: 57-70. 4. Agrawal SS, Saraswati S, Mathur R, Pandey M. Antitumor properties of boswellic acid against Ehrlich ascites cell bearing mouse. Food Chem Toxicol. 2011; 49: 1924- 1934. 5. Akbay P, Calis I, Ȕndeger Ȕ, Basaran N, Ahmet Basaran A. In vitro immunomodulatory activity of verbascoside from Nepeta ucrainica L. Phytother Res. 2002; 16: 593-595. 6. Akihisa T, Kawashima K, Orido M, Akazawa H, Matsumoto M, Yamamoto A, Ogihara E, Fukatsu M, Tokuda H, Fuji J. Antioxidative and melanogenesis-inhibitory activities of caffeoylquinic acids and other compounds from Moxa. Chem Biodivers. 2013; 10: 313-327. 7. Al Abdan M. Alfa-lipoic acid controls tumor growth and modulates hepatic redox state in Ehrlich-ascites carcinoma bearing mice. Sci World J. 2012; article ID 509838. 8. Albach DC, Chase MW. Paraphyly of Veronica (Veroniceae; Scrophulariaceae): Evidence from the internal transcribed spacer (ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA. J Plant Res. 2001; 114: 9-18. 9. Albach DC, Grayer RJ, Jensen SR, Ȫzgȫkce F, Veitch NC. Acylated flavone glycosides from Veronica. Phytochem. 2003; 64: 1295-1301. 10. Albach DC, Martínez-Ortega MM, Fischer MA, Chase MW. A new classification of the tribe Veroniceae – problems and a possible solution. Taxon. 2004; 53: 429-452. 11. Albach DC, Meudt HM, Oxelman B. Piecing together the „new“ Plantaginaceae. Am J Bot. 2005a; 92: 297-315. 12. Albach DC, Grayer RJ, Kite GC, Jensen SR. Veronica: Acylated flavone glycosides as chemosystematic markers, Biochem Syst Ecol. 2005b; 33: 1167-1177. 196 13. Albach DC, Meudt HM. Phylogeny of Veronica in the Southern and Northern Hemispheres based on plastid, nuclear ribosomal and nuclear low-copy DNA. Mol Phyl Evol. 2010; 54: 457-471. 14. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Wolter P. Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science. 2002. 15. Ali H, Khan E, Anwar Sajad M. Phytoremediation of heavy metals – Concepts and applications. Chemosphere. 2013a; 91: 869-881. 16. Ali S. Farooq MA, Jahangir MM, Abbas F, Bharwana SA, Zhang CP. Effects of chromium and nitrogen form on photosynthesis and anti-oxidative system in barley. Biol Plant. 2013b; 57: 758-763. 17. Allaway WH. Agronomic controls over the environmental cycling of trace elements. Adv Agron. 1968; 20: 235-274. 18. Altundag E, Ozturk M. Ethnomedicinal studies on the plant resources of east Anatolia, Turkey. Procedia Soc Behav Sci. 2011; 19: 765-777. 19. Anand P, Singh B. Flavonoids as lead compounds modulating the enzyme targets in Alzheimer‟s disease. Med Chem Res. 2013; 22: 3061-3075. 20. Angiosperm Phylogeny Group (APG). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Bot J Linn Soc. 2003; 141: 399-436. 21. Argyropoulou C, Akoumianaki-Ioannidou A, Christodoulakis NS, Fasseas C. Leaf anatomy and histochemistry of Lippia citriodora (Verbenaceae). Aust J Bot. 2010; 58: 398-409. 22. Avila JG, De Liverant JG, Martínez A, Martínez G, Muńoz JL, Arciniegas A, De Viavar AR. Mode of action of Buddleja cordata verbascoside against Staphylococcus aureus. J. Ethnopharmacol. 1999; 66: 75-78. 23. Ayissi Owona B, Njayou NF, Laufer S, Moundipa PF, Schluesener HJ. A fraction of stem bark extract of Entoda africana suppresses lipopolysaccharide-induced inflammation in RAW264.7 cells. J Ethnopharmacol. 2013; 149: 162-168. 24. Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri- industrial by-products: Antioxidant activity, occurence, and potential uses. Food Chem. 2006; 99: 191-203. 197 25. Barreira JCM, Dias MI, Ţivkoviš J, Stojkoviš D, Sokoviš M, Santos-Buelga C, Ferreira ICFR. Phenolic profiling of Veronica spp. grown in mountain, urban and sandy soil environments. Food Chem. 2014; 163: 275-283. 26. Bayoumi TA. Bioaccumulation of 137Cs and 60Co from radioactive waste streams using Veronica anagallis-aquatica. BioTech Ind J. 2012; 6: 282-288. 27. Beara I. Fitohemijski skrining i procena antioksidantnog i antiinflamatornog potencijala sekundarnih biomolekula u vrstama roda Plantago L. Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu; Prirodno-matematiţki fakultet; 2010. 28. Beers RFJ, Sizer JW. Spectrophotometric method for measuring of break down of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 1950; 195: 133-140. 29. Belanoviš S, Kneţeviš M, Miliţiš B, Šoroviš M. Odnos teških metala i mikroflore u nekim zemljištima Stare planine. Glasnik šumarskog fakulteta. 2004; 89: 53-61. 30. Benito PB, Lanza AMD, Sen AMS, Galindez JDS, Matellano LF, Gómez AS, Martinez MJA. Effects of some iridoids from plant origin on arachidonic acid metabolism in cellular systems. Planta Med. 2000; 66: 324-328. 31. Bergmayer UH. Methods of enzymatic analysis. Weinheim: Verlag Chemie; 1970. 32. Beuthler E, Duron O, Kelly B. Improved methods for the determination of blood glutathione. J Lab Clin Med. 1983; 61: 882-889. 33. Biringanine G, Chiarelli MT, Faes M, Duez P. A validation protocol for the HPTLC standardization of herbal products: Application to the determination of acteoside in leaves of Plantago palmata Hook. f.s. Talanta. 2006; 69: 418-424. 34. Buege AL, Aust DS. Microsomal lipid peroxidation. U: Fleisher S, Parker L, urednici. Methods in Enzymology. New York: Academic Press; 1978. 35. Carrillo-Ocampo D, Bazaldúa-Gómez S, Bonilla-Barbosa JR, Aburto-Amar R, Rodriguez-Lopez V. Anti-inflammatory activity of iridoids and verbascoside isolated from Castilleja tenuiflora. Molecules. 2013; 18: 12109-12118. 36. Cadenas E, Davies KJA. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Rad Biol Med. 2000; 29: 222-230. 37. Chaney RL, Malik M, Li YM, Brown SL, Brewer EP, Angle JS, Baker AJM. Phytoremediation of soil metals. Current Opin Bitech. 1997; 8: 279-284. 38. Chari VM, Grayer-Barkmeijer RJ, Harborne JB, Österdahk BG. An acylated allose- containing 8-hydroxyflavone glycoside from Veronica filliformis. Phytochem. 1981; 20: 1977-1979. 198 39. Chen JH, Ho CT. Antioxidant activities of caffeic acid and its related hydroxycinnamic acid compounds. J Agric Food Chem. 1997; 45: 2374-2378. 40. Chen WC, Kuo TH, Tzeng YS, Tsai YC. Baicalin induces apoptosis in SW620 human colorectal carcinoma cells in vitro and suppresses tumor growth in vivo. Molecules. 2012; 17: 3844-3857. 41. Cheng F, Lu Y, Zhong X, Song W, Wang X, Sun X, Qin J, Guo S, Wang Q. Baicalin therapeutic time window of neuroprotection during transient focal cerebral ischemia and its antioxidative effects in vitro and in vivo. Evid Based Complement Alternat Med. 2013; article ID 120261. 42. Chin PTY, Stults FH, Tappel AL. Purification of rat lung soluble glutathione peroxidase. Biochem Biophys Acta. 1976; 445: 558-660. 43. Chiu YW, Lin TH, Huang WS, Teng CY, Lion YS, Kuo WH, Lin WL, Huang HI, Tung JN, Huang CY, Lin JY, Wang WH, Hwang JM, Kuo HC. Baicalein inhibits the migration and invasive properties of human hepatoma cells. Toxicol Appl Pharmacol. 2011; 255: 316-326. 44. Choi JH, Kim DW, Yun N, Choi JS, Islam MdN, Kim YS, Lee SM. Protective effects of hyperoside against carbon tetrachloride-induced liver damage in mice. J Nat Prod. 2011; 74: 1055-1060. 45. Choppala G, Bolan N, Lamb D, Kunhikrishnan A. Comparative sorption and mobility of Cr(III) and Cr(VI) species in a range of soils: Implications to bioavailability. Water Air Soil Poll. 2013; 224: 1-12. 46. Chung HY, Baek BS, Song SH, Kim MS, Huh JI, Shim KH, Kim KW, Lee KH. Xanthine dehydrogenase/xanthine oxidase and oxidative stress. Age. 1997; 20: 127- 140. 47. Clark G. Staining procedures. Williams&Wilkins, Baltimore; 1981. 48. Clifford MN, Knight S, Kuhnert A. Discriminating between the six isomers of dicaffeoylquinic acid by LC-MS n . J Agric Food Chem. 2005; 53: 3821-3832. 49. Connolly DT, Knight MB, Harakas NK, Wittwer AJ, Feder J. Determination of the number of endothelial cells in culture using an acid phosphatase assay. Anal Biochem. 1986; 152: 136-140. 50. Crişan G, Tămas M, Miclâuş V, Krusz T, Sandor V. A comparative study of some Veronica species. Rev Med Sci Med Natur Iasi. 2007; 111: 280-284. 199 51. Crişan G, Vlase L, Balica G, Muntean D, Ştefănescu C, Păltinean R, Tămas M, Leucuta S. LC/MS analysis of aucubin and catalpol in some Veronica species. Farmacia. 2010; 58: 237-242. 52. Cuendet M, Hostettmann K, Potterat O, Dyatmiko W. Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei. Helv Chim Acta. 1997; 80: 1144- 1152. 53. Cushnie TPT, Hamilton VES, Lamb AJ. Assessment of the antibacterial activity of selected flavonoids and consideration of discrepancies between previous reports. Microbiol Res. 2003; 158: 281-289. 54. Šeboviš T, Spasiš S, Popoviš M, Borota J, Leposaviš G. The European mistletoe (Viscum album L.) grown on plums extract inhibits CCl4-induced liver damage in rats. Fresenius Environ Bull. 2006; 15: 393-400. 55. Šeboviš T. Uticaj ekstrakata imele (Viscum album L.) sa razliţitih domašina na stvaranje slobodnih radikala kiseonika i aktivnost antioksidantnih enzima. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu, Farmaceutski fakultet; 2008. 56. Ţajkanoviš V. Reţnik srpskih narodnih verovanja o biljkama. Đuriš V. (rukopis priredio i dopunio). Beograd: Srpska knjiţevna zadruga; 1985. 57. Daikoku T, Wang D, Tranguch S, Morrow JD, Orsulic S, DuBois RN, Dey SK. Cyclooxygenase-1 is a potential target for prevention and treatment of ovarian epithelial cancer. Cancer Res. 2005; 65: 3735-3744. 58. DalCorso G, Manara A, Furini A. An overview of heavy metal challenge in plants: from roots to shoots. Metallomics. 2013; 5: 1117-1132. 59. Da Silva MMB, Santana ASCO, Pimentel RMM, Silva FCL, Randau KP, Soares LAL. Anatomy of leaf and stem of Erythrina velutina. Braz J Pharmacog. 2013; 23: 200- 206. 60. Datta K, Sinha S, Chattopadhyay P. Reactive oxygen species in health and disease. Natl Med J India. 2000; 13: 304-310. 61. Dawoud GT, El-Morsy TH. Phytochemical and microbiological studies of Petrea volubilies L. J Am Sci. 2012; 8: 202-208. 62. De Beer JJJ, Van Wyk BE. An ethnobotanical survey of the Agter-Hantam, Northern Cape Province, South Africa. S Afr J Bot. 2011; 77: 741-754. 200 63. Deepak M, Handa SS. Quantitative determination of the major constituents of Verbena officinalis using high performance thin layer chromatography and high pressure liquid chromatography. Phytochem Anal. 2000; 11: 351-355. 64. Delazar A, Sabzevari A, Mojarrab M, Nazemiyeh H, Esuaashari S, Nahar L, Razavi SM, Sarker SD. Free-radical-scavenging principles from Phlomis caucasia. J Nat Med. 2008; 62: 464-466. 65. Del Bubba M, Ancillotti C, Checchini L, Ciofi L, Fibbi D, Gonnelli C, Mosti S. Chromium accumulation and changes in plant growth, selected phenolics and sugars of wild type and genetically modified Nicotiana langsdorfii. J Hazard Mater. 2013; 262: 394-403. 66. De Natale A, Pollio A. Plants species in the folk medicine of Montecorvino Rovella (inland Campania, Italy). J Ethnopharmacol. 2007; 109: 295-303. 67. Deng M, ju XD, Fan DS, Tu PF, Zhang J, ShenY. Verbascoside rescues the SH-SY5Y neuronal cells from MPP + - induced apoptosis. Chinese Pharm Bull. 2008; 24: 1297- 1301. 68. Diaz AM, Abad MJ, Fernandez L, Silvan AM, De Santos J, Bermejo P. Phenylpropanoid glycosides from Scrophularia scorodonia: in vitro anti-inflammatory activity. Life Sci. 2004; 74: 2515-2526. 69. Dikliš N. Veronica L. U: Josifoviš M, urednik. Flora SR Srbije, Vol. 6. Beograd: Srpska akademija nauka i umetnosti; 1974. str. 175-220. 70. Dinda B, Debnath S, Harigaya Y. Naturally occuring secoiridoids and bioactivity of naturally occuring iridoids and secoiridoids. A review, part 2. Chem Pharm Bull. 2007; 55: 689-728. 71. Dos Santos MD, Almeida MC, Lopes NP, De Souza GEP. Evaluation of the anti- inflammatory, analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid. Biol Pharm Bull. 2006; 29: 2236-2240. 72. Dudiš B, Rakiš T, Šinţar-Sekuliš J, Atanackoviš V, Stevanoviš B. Differences of metal concentrations and morpho-anatomical adaptations between obligate and facultative serpentinophytes from Western Serbia. Arch Biol Sci. 2007; 59: 341-349. 73. Đukiš MM. Oksidativni stres: slobodni radikali, prooksidansi, antioksidansi. Beograd: Mono i Manjana. 2008. 74. Emam SS. Glycosides of Verbascum letourneuxii asch. and its antioxidant activity. Aust J Basic Appl Sci. 2010; 4: 5038-5050. 201 75. Emerit J, Edeas M, Bricaire F. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Biomed Pharmacother. 2004; 58: 39-46. 76. Esposito E, Dal Toso R, Pressi G, Bramanti P, Meli R, Cuzzocrea S. Protective effect of verbascoside in activated C6 glioma cells: possible molecular mechanisms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2010; 381: 93-105. 77. Esquivel-Chirino C, Esquivel-Soto J, Morales-Gonzáles JA, Sánchez DM, Ventura- Gallegos JV, Hernandez-Mora LE, Zentella-Dehesa A. Inflammatory, Environmental, Oxidative Stress in Tumoral Progression. U: Morales-Gonzáles JA, urednik. Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases – a role for antioxidants; 2013. str. 187-209. 78. Etuk EU, Ugwah MO, Ajagbonna OP, Onyeyilli PA. Ethnobotanical survey and preliminary evaluation of medicinal plants with antidiarrhoea properties in Sokoto state, Nigeria. J Med Plant Res. 2009; 3: 763-766. 79. Filippin LI, Vercelino R, Marroni NP, Xavier RM. Redox signalling and the inflammatory response in rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol. 2008; 152: 415- 422. 80. Ferreres F, Llorach R, Gil-Izquierdo A. Characterization of the interglycosidic linkage in di-, tri-, tetra- and pentaglycosilated flavonoids and differentiation of positional isomers by liquid chromatography/electrosparay ionization tandem mass spectrometry. J Mass Spectrom. 2004; 39: 312-321. 81. Furr M, Mahlberg PG. Histochemical analyses of laticifers and glandular trichomes in Cannabis sativa. J Nat Prod (Lloydia). 1981; 44: 153-159. 82. Gálvez M, Martín-Cardero C, Jesús Ayuso M. Iridoids as DNA topoisomerase I poisons. J Enz Inhib Med Chem. 2005; 20: 389-392. 83. Gao Z, Huang K, Xu H. Protective effects of flavonoids in the roots of Scutellaria baicalensis Georgi against hydrogen peroxide – induced oxidative stress in HS-SY5Y cells. Pharmacol Res. 2001; 43: 173-178. 84. Gao Y, Pu XP. Neuroprotective effect of acteoside against rotenone-induced damage of SH-SY5Y cells and its possible mechanism. Chin Pharmacol Bull. 2007; 23: 161- 165. 85. Georgiev M, Alipieva K, Orhan I, Abrashev R, Denev P, Angelova M. Antioxidant and cholinesterases inhibitory activities of Verbascum xanthophoeniceum Griseb. and its phenylethanoid glycosides. Food Chem. 2011; 128: 100-105. 202 86. Ghimre BK, Seong ES, Kim EH, Ghimeray AK, Yu CY, Ghimire BK, Chung IM. A comparative evaluation of the antioxidant activity of some medicinal plants popularly used in Nepal. J Med Plants Res. 2011; 5: 1884-1891. 87. Goldberg DM, Spooner RJ. Glutathione reductase. U: Bergmayer HU, urednik. Methods of Enzymatic Analysis. Basel: Weinheim; 1983. 88. Gomes NJM, Rezende CDM, Fontes SP, Hovell AMC, Landgraf RG, Matheus ME, Pinto ADC, Fernandes PD. Antineoplastic activity of Capaifera multijuga oil and fractions against ascitic and solid Ehrlich tumor. J. Ethnopharmacol. 2008; 119: 179- 184. 89. Gómez-Lechón MJ, O‟Connor E, Castell JV, Jover R. Sensitive markers used to identify compounds that trigger apoptosis in cultured hepatocytes. Tox Sci. 2002; 65: 299-308. 90. Grayer RJ, Kite GC, Aou-Zaid M, Archer LJ. The application of atmospheric pressure chemical ionisation liquid chromatography – mass spectrometry in the chemotaxonomic study of flavonoids: characterisation of flavonoids from Ocimum gratissimum var. gratissimum. Phytochem Anal. 2000; 11: 257-267. 91. Grayer-Barkmeijer RJ. A chemosystematic study of Veronica: iridoid glucosides. Biochem Syst Ecol. 1973; 1: 101-110. 92. Grayer-Barkmeijer RJ. Flavonoids in Parahebe and Veronica: A chemosystematic study. Biochem Syst Ecol. 1978; 6: 131-137. 93. Greene ER, Huang S, Serhan CN, Panigrahy D. Regulation of inflammation in cancer by eicosanoides. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2011; 96: 27-36. 94. Gründemann C, Garcia-Käufer M, Sauer B, Stangenberg E, Könczöl M, Merfort I, Zehl M, Huber R. Traditionally used Veronica officinalis inhibits proinflammatory mediators via the NF-κB signalling pathway in a human lung cell line. J Ethnopharmacol. 2013; 145: 118-126. 95. Guerin HP, Delaveau PG, Paris RR. Localisation histochemiques 11: procedes simples de localisation de pigments Bavoniques. Application a quelques Phanerogames. Bull Soc Bot France. 1971; 118: 29-36. 96. Guo M, Zhang N, Li D, Liang D, Liu Z, Li F, Fu Y, Cao Y, Deng X, Yang Z. Baicalin plays an anti-inflammatory role through reducing nuclear factor-κB and p38 phosphorylation in S. aureus – induced mastitis. Int. Immunopharmacol. 2013; 16: 125-130. 203 97. Gusev NF, Glumov GA, Teslov SV. Flavonoids of Veronica officinalis. Chem Nat Comp. 1975; 11: 259. 98. Gusev NF, Glumov GA, Guseva NM, Teslov SV. Flavonoids of Veronica spicata. Chem Nat Comp. 1978; 13: 588-589. 99. Gusev NF, Nemereshina ON. On the study of flavonoids Veronica incana L. Urals. Bulletin of the Orenburg State University. 2005; 12: 96-99. 100. Gusev NF, Nemereshina ON, Petrova GV, Sychev MV. Evaluation of antibacterial activity and biologically active substances of herbal drugs from Veronica L. Russ J Biopharm. 2012; 4: 17-22. 101. Güvenc A, Okada Y, Küpeli Akkol E, Duma H, Okuyama T, Çaliş I. Investigations of anti-inflammatory, antinociceptive, antioxidant and aldose reductase inhibitory activities of phenolic compounds from Sideritis brevibracteata. Food Chem. 2010; 118: 686-692. 102. Hajimehdipoor H, Shekardi M, Hamedami MP, Abedi Z, Zahedi H, Gohari AR. A validated HPTLC-densitometric method for assay of aucubin in Vitex agnus-castus L. 2011; 10: 705-710. 103. Hänsch R, Mendel RR. Physiological function of mineral micronutrients (Cu, Zn, Mn, Fe, Ni, Mo, B, Cl). Curr Opin Plant Biol. 2009; 12: 259-266. 104. Hanel H, Raether W. A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water-insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses. 1988; 31: 148-154. 105. Hardman R, Sofowora EA. Antimony trichloride as test reagents for steroids, especially diosgenin and yamogenin in plant tissues. Stain Technol. 1972; 47: 205- 208. 106. Harput US, Saracoglu I, Inoue M, Ogihara I. Anti-inflammatory and cytotoxic activities of five Veronica species. Biol Pharm Bull. 2002a; 25: 483-486. 107. Harput US, Saracoglu I, Inoue M, Ogihara Y. Phenylethanoid and iridoid glycosides from Veronica persica. Chem Pharm Bull. 2002b; 50: 869-871. 108. Harput US, Saracoglu I, Nagatsu A, Ogihara Y. Iridoid glucosides from Veronica hederifolia. Chem Pharm Bull. 2002c; 50: 1106-1108. 109. Harput US, Nagatsu A, Ogihara Y, Saracoglu I. Iridoid glucosides from Veronica pectinata var. glandulosa. Z Naturforsch C. 2003; 58: 481-484. 204 110. Harput US, Varel M, Nagatsu A, Saracoglu I. Acylated iridoid glucosides from Veronica anagallis-aquatica. Phytochem. 2004; 65: 2135-2139. 111. Harput US, GençY, Khan N, Saracoglu I. Radical scavenging effects of different Veronica species. Rec Nat Prod. 2011; 5: 100-107. 112. Hayashi K, Nagamatsu T, Ito M, Hattori T, Suzuki Y. Acteoside, a component of Stachys sieboldii MIQ, may be a promising antinephritic agent (2): Effect of acteoside on leukocyte accumulation in the glomeruli of nephritic rats. Jpn J Pharmacol. 1994; 66: 47-51. 113. Hayashi K, Nagamatsu T, Ito M, Yagita H, Suzuki Y. Acteoside, a component of Stachys sieboldii MIQ, may be a promising antinephritic agent (3): Effect of acteoside on expression of intercellular adhesion molecule-1 in experimental nephritic glomeruli in rats and cultured endothelial cells. Jpn J Pharmacol. 1996; 70: 157-168. 114. Herbert JM, Maffrand JP, Taoubi K, Augerean JM, Fourastle I, Gleye J. Verbascoside isolated from Lantana camara, an inhibitor of protein kinase C. J Nat Prod; 1991; 54: 1595-1600. 115. Ho JN, Jee YH, Park JS, Jun WJ, Kim HK, Hong BS, Shin DH, Cho HY. Protective effects of aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced oxidative stress in human skin fibroblasts. Biol Pharm Bull. 2005; 28: 1244-1248. 116. Hultin E, Torssell K. Alkaloid-screening of Swedish plants. Phytochem. 1965; 4: 425- 433. 117. Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, Schmitz R, Veit M, Weissenböck G, Schnitzler JP. Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J Exp Bot. 1998; 49: 953-965. 118. Innocenti M, La Marca G, Malvagia S, Giaccherini C, Vincieri FF, Mulinacci N. Electrospray ionisation tandem mass spectrometric investigation of phenylpropanoids and secoiridoids from solid olive residue. Rapid Commun Mass Spectrom. 2006; 20: 2013-2022. 119. Jakšiš SP, Vuţkoviš SM, Vasiljeviš SL, Grahovac NL, Popoviš VM, Šunjka DB, Dozet GK. Akumulacija teških metala u Medicago sativa L. i Trifolium pratense L. na kontaminiranom fluvisolu. Hem Ind. 2013; 67: 95-101. 120. Jankoviš T, Menkoviš N, Zduniš G, Beara I, Balog K, Šavikin K, Mimica-Dukiš N. Quantitative determination of aucubin in seven Plantago species using HPLC, HPTLC, and LC-ESI-MS methods. Analyt Chem. 2010; 43: 2487-2495. 205 121. Jankoviš T, Zduniš G, Beara I, Balog K, Pljevljakušiš D, Steševiš D, Šavikin K. Comparative study of some polyphenols in Plantago species. Biochem Syst Ecol. 2012; 42: 69-74. 122. Jariš S, Popoviš Z, Maţunkoviš-Jociš M, ĐurŤeviš L, Mijatoviš M, Kradţiš B, Mitroviš M, Pavloviš P. An ethnobotanical study on the usage of wild medicinal herbs from Kopaonik Mountain (Central Saerbia). J Ethnopharmacol. 2007; 111: 160-175. 123. Jensen SR, Albach DC, Ohno T, Grayer RJ. Veronica: iridoids and cornoside as chemosystematic markers. Biochem Syst Ecol. 2005; 33: 1031-1047. 124. Jensen SR, Gotfredsen CH, Grayer RJ. Unusual iridoid glycosides in Veronica sects. Hebe and Labiatoides. Biochem Syst Ecol. 2008; 36: 207-215. 125. Jensen SR, Gotfredsen CH, Harput US, Saracoglu I. Chlorinated iridoid glucosides from Veronica longifolia and their antioxidant activity. J Nat Prod. 2010; 73: 1593- 1596. 126. Jensen SR, Wieland Opitz SE, Gotfredsen CH. A new phenylethanoid triglycoside in Veronica beccabunga L. Biochem Syst Ecol. 2011; 39: 193-197. 127. Jeon H. Anti-inflammatory activity of Veronica peregrina. Nat Prod Sci. 2012; 17: 142-146. 128. Ji L, Jiang P, Lu B, Sheng Y, Wang X, Wang Z. Chlorogenic acid, a dietary polyphenol protects acetaminophen – induced liver injury and its mechanism. J Nutr Biochem. 2013; 24: 1911-1919. 129. Jin L, Xue HY, Jin LJ, Li SY, Xu YP. Antioxidant and pancreas-protective effect of aucubin on rats with streptozotocin-induced diabetes. Eur J Pharmacol. 2008; 582: 162-167. 130. Johansen DA. Plant microtechnique. McGraw-Hill, New York, London. 1940. 131. Johansen M, Larsen TS, Mettebjerg MA, Gotfredsen CH, Jensen SR. Chemical markers in Veronica sect. Hebe. BiochemSyst Ecol. 2007; 35: 614-620. 132. Jovanoviš Z. Oksidativni stres u patogenezi neurodegenerativnih oboljenja. Med ţas. 2011; 45: 16-23. 133. Kabata-Pendias A, Pendias H. Trace elements in soil and plants. Boca Raton: CRC Press; 2001. 134. Kadoviš R, Košanin O, Belanoviš S, Kneţeviš M. Teški metali u organskom sloju zemljišta bukovih šuma Srbije. Bull Fac Forestry. 2005; 92: 55-67. 206 135. Karioti A, Bolognesi L, Vincieri FF, Bilia AR. Analyisis of the constituents of aqueous preparations of Stachys recta by HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS. J Pharm Biomed Anal. 2010; 53. 15-23. 136. Kaurinoviš B, Popoviš M, Vlaisavljeviš S, Rašeta M. Antioxidant activities of Melittitis melissophyllum L. (Lamiaceae). Molecules. 2011; 16: 3152-3167. 137. Kazakou E, Dimitrakopoulos PG, Baker AJM, Reeves AP, Troumbis AY. Hypothesis, mechanisms and trade-offs of tolerance and adaptation to serpentine soils: From species to ecosystem level. Biol Rew. 2008; 83: 495-508. 138. Khansari N, Shakiba Y, Mahmoudi M. Chronic inflammation and oxidative stress as a major cause of age-related diseases and cancer. Rec Pat Inflammation Allergy Drug Discov. 2009; 3: 73-80. 139. Kim YC. Neuroprotective phenolics in medicinal plants. Arch Pharma Res. 2010; 33: 1611-1632. 140. Kim SJ, Um JY, Hong SH, Lee JY. Antiinflammatory activity of hyperoside through the suppression of nuclear factor-κB activation in mouse peritoneal macrophages. Am J Chin Med. 2011; 39: 171-181. 141. Kimura Y, Okuda H, Nishibe S, Arichi S. Effects of caffeoyl glycosides on arachidonate metabolism in leukocytes. Planta Med. 1987; 53: 148-153. 142. Kiss B, Popa DS, Crişan G, Bojită M, Loghin F. The evaluation of antioxidant potential of Veronica officinalis and Rosmarinus officinalis extracts by monitoring malondialdehide and glutathione levels in rats. Farmacia. 2009; 57: 432-440. 143. Konjeviš R, Tatiš B. Reţnik naziva biljaka. Beograd: NNK Internacional; 2006. 144. Koo KA, Kim SH, Oh TH, Kim YC. Acteoside and its aglycones protect primary cultures of rat cortical cells from glutamate – induced excitotoxicity. Life Sci. 2006; 79: 709-716. 145. Kostadinova EP, Alipieva KI, Kokubun T, Taskova RM, Handjieva NV. Phenylethanoids, iridoids and a spirostanol saponin from Veronica turrilliana. Phytochem. 2007; 68: 1321-1326. 146. Kovacsova M, Barta A, Parohova J, Vrankova S, Pechanova O. Neuroprotective mechanisms of natural polyphenolic compounds. Act Nerv Super Rediviva. 2010; 52: 181-186. 147. Kovaţeviš N. Osnovi farmakognozije. Beograd: Srpska školska knjiga; 2000. 207 148. Kukiš-Markoviš J. Hemijska i farmakološka karakterizacija Stachys anisochila, S. beckeana, S. plumosa i S. alpina subsp. dinarica (Lamiaceae). Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu, Farmaceutski fakultet; 2013. 149. Kulinsky VI, Kolesnichenko LS. The glutathione system. II. Other enzymes, thiol – disulfide metabolism, inflammation, and immunity, functions. Biochem (Mosc) Suppl Ser B: Biomed Chem. 2009; 3: 211-220. 150. Kümler I, Brünner N, Stenvang J, Balsvlev E, Nielsen DL. A systematic review on topoisomerase I inhibition in the treatment of metastatic breast cancer. Breast Canc Res Treat. 2013; 138: 347-358. 151. Kuntiš V, Brboriš J, Holclajtner-Antunoviš I, Uskokoviš-Markoviš S. Evaluating the bioactive effects of flavonoid hesperidin – A new literature data survey. Vojnosanit Pregl. 2014; 71: 60-65. 152. Küpeli E, Harput US, Varel M, Yesilada E, Saracoglu I. Bioassay-guided isolation of iridoid glucosides with antinociceptive and anti-inflammatory activities from Veronica anagallis-aquatica L. J Ethnopharmacol. 2005; 102: 170-176. 153. Küpeli E, Sąhin EP, Yeşilada E, Ҫaliş I, Ezer N. In vivo anti-inflammatory and antinociceptive activity evaluation of phenolic compounds from Sideritis stricta. Z Naturforsch. 2007; 62c: 519-529. 154. Kwak JH, Kim JH, Lee KH, Kang Sc, Zee OP. Antioxidative iridoid glycosides and phenolic compounds from Veronica peregrina. Arch Pharm Res. 2009; 32: 207-213. 155. Lee HH, Yang LL, Wang CC, Hu SY, Ghang SF, Lee YH. Differential effects of natural polyphenols on neuronal survival in primary cultured central neurons against glutamate- and glucose deprivation-induced neuronal death. Brain Res. 2003; 986: 103-113. 156. Lee S, Sang HJ, Yeon SL, Yamada M, Kim BK, Ohuchi K, Kuk HS. Antiinflammatory activity of hyperin from Acanthopanax chiisanensis roots. Arch Pharma Res. 2004; 27: 628-632. 157. Lee KJ, Woo ER, Choi CY, Shin DW, Lee DG, You HJ, Jeong HG. Protective effect of acteoside on carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity. Life Sci. 2004; 74: 1051- 1064. 158. Lee JH, Kim GH. Evaluation of antioxidant and inhibitory activities of different subclasses flavonoids on enzymes for rheumatoid arthritis. J Food Sci. 2010; 75: 212- 217. 208 159. Leporatti ML, Ivancheva S. Preliminary comparative analysis of medicinal plants used in the traditional medicine of Bulgaria and Italy. J Ethnopharmacol. 2003; 87: 123- 142. 160. Lesjak M. Biopotencijal i hemijska karakterizacija ekstrakata i etarskih ulja vrsta roda Juniperus L. (Cupressaceae). Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu; Prirodno-matematiţki fakultet; 2011. 161. Li X, Chapple C. Understanding lignification: challengesbeyond monolignol biosynthesis. Plant Physiol. 2010; 154: 449-452. 162. Li BQ, Fu T, Gong WH, Dunlop N, Kung HF, Yan Y, Kang J, Wang JM. The flavonoid baicalin exhibits anti-inflammatory activity by binding to chemokines. Immunopharmacol. 2000; 49: 295-306. 163. Li J, Huang X, Lai D, Li J, Sun W. Simultaneous determination of four major iridoid glycosides in Scrophularia ningpoensis by CE. Chromatographia. 2008; 63: 989-993. 164. Li L, Tsao R, Liu Z, Liu S, Yang R, Young JC, Zhu H, Deng Z, Xie M, Fu Z. Isolation and purification of acteoside and isoacteoside from Plantago psyllium L. by high- speed counter-current chromatography. J Chromatogr A. 2005; 1063: 161-169. 165. Li L, Tsao R, Yang R, Liu C, Young JC, Zhu H. Isolation and purification of phenylethanoid glycosides from Cistanche deserticola by high-speed counter-current chromatography. Food Chem. 2008; 108: 702-710. 166. Li R, Yuan C, Dong C, Shuang S, Choi MMF. In vivo antioxidative effect of isoquercitrin on cadmium-induced oxidative damage to mouse liver and kidney. Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 2011; 383: 437-445. 167. Li Z, Tang T, Liang S, Ning X, Bai M, Wu H. The synthesis and storage sites of phenolic compounds in the root and rhizome of Echinacea purpurea. Am J Plant Sci. 2012; 3: 551-558. 168. Lim W, Kim JH, Gook E, Kim J, Ko Y, Kim I, Kwon H, Lim H, Jung B, Yang K, Choi N, Kim M, Kim S, Choi H, Kim O. Inhibition of mitochondria – dependent apoptosis by 635 – nm irradiation in sodium nitroprusside – treated SH-SY5Y cells. Free Radic Biol Med. 2009; 47: 850-857. 169. Lindsay WL, Schwab AP. The chemistry of iron in soils and its availability to plants. J Plant Nutr. 1982; 5: 821-840. 170. Lison : Histochemie et cytochemie animales: principes et methodes. Gauthier-Villars, Paris; 1960. 209 171. Liu Y, Wu W, Wang S, Kuang Z, Li R, Huang Y. The influence of CPn infection on the formation and stability of atherosclerosis plaque and the intervention of baicalin. Lishizhen Med Mat Med Res. 2006; 17: 2377-2379. 172. Liu YF, Gao F, Li XW, Jia RH, Meng XD, Zhao R, Jing YY, Wang Y, Jiang W. The anticonvulsant and neuroprotective effects of baicalin on pilocarpine induced epileptic model in rats. Neurochem Res. 2012a; 1670-1680. 173. Liu MQ, Liu JF. Structure and histochemistry of the glandular trichomes on the leaves of Isodon rubescens (Lamiaceae). Afr J Biotechnol. 2012; 11: 4069-4078. 174. Liu RL, Xiong QJ, Shu Q, Wu WN, Cheng J, Fu H, Wang F, Chen JG, Hu ZL. Hyperoside protects cortical neurons from oxygen-glucose deprivation-reperfusion induced injury via nitric oxide signal pathway. Brain Res. 2012b; 1469: 164-173. 175. López-Munguía A, Hernández-Romero Y, Pedraza-Chaverri J, Miranda-Molina A, Regla I, Martínez A, Castillo E. Phenylpropanoid glycoside analogues: enzymatic synthesis, antioxidant activity and theoretical study of their free radical scavenger mechanism. PLoS One. 2011; 6: e20115. 176. Lu SC. Glutathione synthesis. Biochim Biophys Acta Gen Subjects. 2013; 1830: 3143- 3153. 177. Luo X, Ma M, Chen B, Yao S, Wan Z, Yang D, Hang H. Analysis of nine bioactive compounds in Euccomia ulmoides Oliv. and their preparation by HPLC-photodiode array detection and mass spectrometry. J Liq Chromatogr R T. 2004; 27: 63-81. 178. Mackova Z, Kablovska R, Lapcik O. Distribution of isoflavonoids in non-leguminous taxa – an update. Phytochem. 2006; 67: 849-855. 179. Madhusudan S, Middleton MR. The emerging role of DNA repair proteins as predictive, prognostic and therapeutic targets in cancer. Cancer Treat Rev. 2005; 31: 603-617. 180. Magalingam KB, Radhakrishnan A, Haleagrahara N. Protective effects of flavonol isoquercitrin, against 6-hydroxy dopamine (6-OHDA)-induced toxicity in PC12 cells. BMC Res Notes. 2014; 7:2-8. 181. Maggi A, Taskova R, Gotfredsen CH, Bianco A, Jensen SR. Chemical markers in Veronica sect. Hebe III. Biochem Syst Ecol. 2009; 37: 731-736. 182. Mallick S, Sinam G, Kumar Mishra R, Sinha S. Interactive effects of Cr and Fe treatments on plants growth, nutrition and oxidative status in Zea mays L. Ecotox Environ Saf. 2010; 73: 987-995. 210 183. Mantena SK, Katiyar SK. Grape seed proanthocyanidins inhibit UV-radiation-induced oxidative stress and activation of MAPK and NF-κB signaling in human epidermal keratinocytes. Free Rad Biol Med. 2006; 40: 1603-1614. 184. Marchenko A, Kintya P, Wyrzykiewicz B, Gorincioi E. Steroidal glycosides from Veronica chamaedrys L. Part I. The structures of chamaedrosides C, C1, C2, E, E1 and E2. Nat Prod Comm. 2012; 7: 565-568. 185. Marin PD. Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK Internacional, Beograd. 2003. 186. Markoviš B, Obradinoviš Z, Veselinoviš M, AnŤelkoviš J, Stevanoviš P, Rakiš M. Osnovna geološka karta SFRJ, 1:100 000. Beograd: Savremeni geološki zavod; 1984. 187. Materska M. Quercetin and its derivatives: Chemical structure and bioactivity – a review. Pol J Food Nutr Sci. 2008; 58: 407-413. 188. McFadden DW, Riggs DR, Jackson BJ, Cunningham C. Additive effects of COX-1 and COX-2 inhibition on breast cancer in vitro. Int J Oncol. 2006; 29: 1019-1023. 189. Mehrvarz SS, Mahmoodi NO, Asadian R, Khamki GB. Iridoid and flavonoid patterns of the genus Veronica sect. Alsinebe subsect. Agrestis (Benth.) Stroh (Lamiales) and their systematic significance. Aust J Crop Sci. 2008; 1: 1-5. 190. Menkoviš N, Šavikin K, Tasiš S, Zduniš G, Steševiš D, Milosavljeviš S, Vincek D. Ethnobotanical study on traditional uses of wild medicinal plants in Prokletije Mountains (Montenegro). J Ethnopharmacol. 2011; 133: 97-107. 191. Mezyk Z, Wieckowski SK. Studies of trace element content in selected medical herbs. Pol J Environ Sci. 1999; 8: 129-130. 192. Moreno-Escobar JA, Alvarez L, Rodríguez-López V, Bahena SM. Cytotoxic glucosydic iridoids from Veronica americana. Phytochem Lett. 2013; 6: 610-613. 193. Mori M, Kondo T, Yoshida K. Anthocyanin components and mechanism for color development in blue Veronica flowers. Biosci Biotech Biochem. 2009; 73: 2329-2331. 194. Mosaddegh M, Naghibi F, Moazzeni H, Pirani A, Esmaeili S. Ethnobotanical survey of herbal remedies traditionally used in Kohghiluyeh va Boyer Ahmad province of Iran. J Ethnopharmacol. 2012; 141: 80-95. 195. Moure A, Cruz JM, Franco D, Dominguez JM, Siherio J, Dominguez H. Natural antioxidants from residual sources. Food Chem. 2001; 72: 145-171. 196. Natella F, Nardini M, Di Felica M, Scaccini C. Benzoic and cinnamic acid derivatives as antioxidants: Structure-activity relation. J Agric Food Chem. 1999; 47: 1453-1459. 211 197. Nikolova M, Berkov S, Ivancheva S. Determination of apigenin content in some Bulgarian Veronica species. 7 th Symposium on Flora of Southeastern Serbia and Neighbouring Regions. 2002; Proceedings: 77-81. 198. Nikolova MT, Taskova RM, Peev DR. Exudate flavonoid aglycones of Veronica: Ecological and systematic implications. Biochem Syst Ecol. 2005; 33: 1258-1268. 199. Nikolova M. Screening of radical scavenging activity and polyphenol content of Bulgarian plant species. Phcog Res. 2011; 3: 256-259. 200. Novy P, Urban J, Leuner O, Vadlejch J, Kokoska L. In vitro synergistic effects of baicalin with oxytetracycline and tetracycline against Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother. 2011; 66: 1298-1300. 201. Oboh G, Agunloye OM, Akinyemi AJ, Ademiluyi AO, Adefegha SA. Comparative study on the inhibitory effect of caffeic and chlorogenic acids on key enzymes linked to Alzheimer‟s disease and some pro-oxidant induced oxidative stress in rats brain in- vitro. Neurochem Res. 2013; 38: 413-419. 202. Obratov-Petkoviš D, Bjedov I, Belanoviš S. Teški metali u listovima Hypericum perforatum L. na serpentinskim zemljištima Srbije. Bull Fac Forestry. 2008; 98: 143- 154. 203. Ohno I, Inoue M, Ogihara Y, Saracoglu I. Antimetastatic activity of acteoside, a phenylethanoid glycoside. Biol Pharm Bull. 2002; 25: 666-668. 204. Okuda S, Nishiyama N, Saito H, Katsuki H. Hydrogen peroxide-mediated neuronal cell death induced by an endogenous neurotoxin, 3-hydroxykynurenine. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 12553-12558. 205. Olennikov DN, Tankhaeva LM, Stolbikova AV, Petrov EV. Phenylpropanoids and polysaccharides from Plantago depressa and P. media growing in Buryatia. Chem Nat Compd. 2011; 47; 165-169. 206. Olmstead RG, De Pamphilis C, Wolfe AD, Young ND, Elisons WJ, Reeves PA. Disintegration of the Scrophulariacea. Am J Bot. 2001; 88: 348-361. 207. Ono E, Ruike M, Iwashita T, Nomoto K, Fukui Y. Co-pigmentation and flavonoid glycosiltransferases in blue Veronica persica flowers. Phytochem. 2010; 71: 726-735. 208. Orţiš D. Vrste tribusa Scandiceae (Apiaceae Lindley 1836, subfam. Apioideae). Potencijalni izvor biološki i farmakološki aktivnih sekundarnih biomolekula. Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu; Prirodno – matematiţki fakultet. 2010. 212 209. Ozaslan M, Karagoz ID, Kilic IH, Guldur ME. Ehrlich ascites carcinoma. Afr J Biotech. 2011; 10: 2375-2378. 210. Ozipek M, Saracoglu I, Kojima K, Ogihara Y, Calis I. Fuhsioside, a new phenylethanoid glucoside from Veronica fuhsii. Chem Pharm Bull. 1999; 47: 561-562. 211. Ozipek M, Saracoglu I, Ogihara Y, Ҫaliş I. Nautigenin-type steroidal saponins from Veronica fuhsii and V. multifida. Z Naturforsch. 2002; 57: 603-608. 212. Pan MH, Lai CS, Ho CT. Anti-inflammatory activity of natural dietary flavonoids. Food Funct. 2010; 1: 15-31. 213. Pardo De Santayana M, Blanco E, Morales R. Plants known as tè in Spain: An ethno- pharmaco-botanical review. J Ethnopharmacol. 2005; 98: 1-19. 214. Park KS, Kim BH, Chang IM. Inhibitory potencies of several iridoids on cyclooxygenase-1, cyclooxigenase-2 enzymes activities, tumor necrosis factor-α and nitric oxide production in vitro. Evid Based Complement Altern Med. 2010; 7: 41-45. 215. Pavloviš M. Prouţavanje sastojaka Anthemis triumfetti (Asteraceae) i poreŤenje sa drugim vrstama podroda Cota. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu, Farmaceutski fakultet; 2008. 216. Pedersen P, Gotfredsen CH, Wagstaff SJ, Jensen SR. Chemical markers in Veronica sect. Hebe II. Biochem Syst Ecol. 2007; 35: 777-784. 217. Pellegrini N, Serafini M, Colombi B, Del Rio D, Salvatore S, Bianchi M, Brighenti F. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils consumed in Italy assessed by three different in vitro assays. J Nutr. 2003; 133: 2812-2819. 218. Pendota SC, Aderagba MA, Ndhala AR, Van Staden J. Antimicrobial and acetylchlinesterase inhibitory activities of Buddleja salvifolia (L.) Lam. leaf extract and isolated compounds. J. Ethnopharmacol. 2013; 148: 515-520. 219. Peng-Fei L., Fu-gen H., Bin-bin D., Tian-sheng D., Xiang-lin H., Ming-qin Z. Purification and antioxidant activities of baicalin isolated from the root of huangqin (Scutellaria baicalin gcorsi). J Food Sci Technol. 2013; 50: 615-619. 220. Pereira OR, Domingues MRM, Silva AMS, Cardoso SM. Phenolic constituents of Lamium album: Focus on isoscutellarein derivatives. Food Res Int. 2012; 48: 330-335. 221. Petreska J, Stefova M, Ferreres F, Moreno DA, Tomás-Barberán FA, Stefkov G, Kulevanova S, Gil-Izquierdo A. Potential bioactive phenolics of Macedonian Sideritis species used for medicinal „‟Mountain Tea‟‟. Food Chem. 2011; 125: 13-20. 213 222. Pero RW, Lund H, Leanderson T. Antioxidant metabolism induced by quinic acid. Increased urinary excretion of tryptophan and nicotinamide. Phytother Res. 2009; 23: 335-346. 223. Ph. Eur. 6.0. European Pharmacopoeia, 6th edition, Strasbourg: Council of Europe (COE) – European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), 2007. 224. Ph. Eur. 7.0. European Pharmacopoeia, 7th edition, Strasbourg: Council of Europe (COE) – European Directorate for the Quality of Medicines (EDQM), 2011. 225. Pieroni A, Quave CL, Santoro RF. Folk pharmaceutical knowledge in the territory of the of the Dolomiti Lucane, inland southern Italy. J Ethnopharmacol. 2004; 95: 373- 384. 226. Poljsak B, Šuput D, Milisav I. Achieving the balance between ROS and antioxidants: When to use the synthetic antioxidants. Oxid Med Cell Longev. 2013; art. no. 956792. 227. Popoviš V. Analiza sekundarnih metabolita i ispitivanje farmakološke aktivnosti odabranih vrsta roda Laserpitium L. (Apiaceae). Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu; Farmaceutski fakultet. 2013. 228. Prasad MNV, Hagemeyer J. Heavy Metal Stress in Plants. Berlin: Springer-Verlag; 1999. 229. Preethi KC, Kuttan G, Kuttan R. Antioxidant potential of an extract of Calendula officinalis flowers in vitro and in vivo. Pharmaceut Biol. 2006; 44: 691-697. 230. Procházková D, Boušová I, Wilhelmová N. Antioxidant and prooxidant properties of flavonoids. Fitoterapia. 2011; 82: 513-523. 231. Qi M, Xiong A, Geng F, Yang L, Wang Z. A novel strategy for target profiling analysis of bioactive phenylethanoid glycosides in Plantago medicinal plants using ultra-performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole mass spectrometry. J Sep Sci. 2012; 35: 1470-1478. 232. Quirantes-Piné, Funes R, Micol V. Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A. High- performance liquid chromatography with diode array detection coupled to electrospray time-of-flight and ion-trap tandem mass spectrometry to identify phenolic compounds from a lemon verbena extract. J Chromatogr A. 2009; 1216: 5391-5397. 233. Rackova L, Oblozinsky M, Kostalova D, Kettmann V, Bezakova L. Free radical scavenging activity and lipoxygenase inhibition of Mahonia aquifolium extract and isoquinoline alkaloids. J Inflamm. 2007; 4: 1-7. 214 234. Rajeshkumar NV, Kuttan R. Protective effect of Picroliv, the active constituent of Picrorhiza kurroa against chemical carcinogenesis in mice. Teratogen Carcin Mut. 2001; 21: 303-313. 235. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Moore PK. Farmakologija. Beograd: Data Status; 2004. 236. Raţiš S, Đogo S. Determination of chromium in Mentha piperita L. and soil by graphite furnace atomic absorption spectrometry after sequential extraction and microwave-assisted acid digestion to assess potential bioavailability. Chemosphere. 2010; 70: 451-456. 237. Recknagel RO, Glende JEA, Ugazio G. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. Pharmacol Therapeut. 1989; 43: 139-154. 238. Rehncrona S, Smith DS, Akesson B, Westerberg E, Siesjo BK. Peroxidative damages in brain cortical fatty acids and phospholipids, as characterized during Fe 2+ and ascorbic acid-stimulated lipid peroxidation in vitro. J Neurochem. 1980; 34: 1630- 1638. 239. Rigat M, Bonet MA, Garcia S, Garnatje T, Vallès J. Studies on pharmaceutical ethnobotany in the high river Ter valley (Pyrenees, Catalonia, Iberian Peninsula). J Ethnopharmacol. 2007; 28: 267-277. 240. Rigat M, Vallès J, Iglesias J, Garnatje T. Traditional and alternative natural therapeutic products used in the treatment of respiratory infectious diseases in the Eastern Catalan Pyrenees (Iberian Peninsula). J Ethnopharmacol. 2013; 148: 411-422. 241. Rischer M, Adamczyk M, Ratz H, Hose S, Marchesan M, Paper DH, Franz G, Wolf- Heuss E, Engel J. Quantitative determination of the iridoid glycosides aucubin and catalpol in Plantago lanceolata L. extracts by HPTLC and HPLC. J Planar Chromat. 1998; 11: 374-378. 242. Romano B, Pagano E, Montanaro V, Fortunato AL, Miliš N, Borrelli F. Novel insights into the pharmacology of flavonoids. Phytother Res. 2013; 27: 1588-1596. 243. Ruzin SE. Plant microtechnique and microscopy. New York: Oxford University Press; 1999. 244. Samuelsen AB. The traditional uses, chemical constituents and biological activities of Plantago major L. A review. J Ethnopharmacol. 2000; 71: 1-21. 245. Sandhir R, Gill KD. Hepatoprotective effects of LIV-52 on ethanol induced liver damage in rats. Indian J Exp Biol. 1999; 37: 762-766. 215 246. Santos MR, Rodríguez-Gómez MJ, Justino GC, Charra N, Florencio MH, Mira L. Influence of the metabolic profile on the in vivo antioxidant activity of quercetin under a low dosage oral regimen in rats. Br J Pharmacol. 2008; 153: 1750-1761. 247. Saracoglu I, Inoue M, Calis I, Ogihara Y. Studies on constituents with cytotxic and cytostatic activity of two Turkish medicinal plants Phlomis armeniaca and Scutellaria salviifolia. Biol Pharm Bull. 1995; 18: 1396-1400. 248. Saracoglu I, Harput US, Inoue M, Ogihara y. New phenylethanoid glycosides from Veronica pectinata var. glandulosa and their free radical scavenging activities. Chem Pharm Bull. 2002; 50: 665-668. 249. Saracoglu I, Harput US, Ogihara Y. Acylated flavone glycosides from Veronica pectinata var. glandulosa and Veronica persica. Phytochem. 2004a; 65: 2379-2385. 250. Saracoglu I, Varel M, Harput US, Nagatsu A. Acylated flavonoids and phenol glycosides from Veronica thymoides subsp. pseudocinerea. Phytochem. 2004b; 65: 2379-2385. 251. Saracoglu I, Oztunca FH, Nagatsu A, Harput US. Iridoid content and biological activities of Veronica cuneifolia subsp. cuneifolia and V. cymbalaria. Pharm Biol. 2011; 49: 1150-1157. 252. Saracoglu I, Harput S. In vitro cytotoxic activity and structure activity relationships of iridoid glucosides derived from Veronica species. Phytother Res. 2012; 26: 148-152. 253. Schneider I, Bucar F. Lipoxygenase inhibitors from natural plant sources. Part 2: Medicinal plants with inhibitory activity on arachidonate, 12-lipoxygenase, 15- lipoxygenase and leukotriene receptor antagonists. Phytother Res. 2005; 19: 263-272. 254. Selakoviš V, Ţoliš M, Milosavljeviš P. Inflamatorna reakcija i athezijski molekuli u ishemiji mozga. Vojnosanit Pregl. 2002; 59: 661-667. 255. Shan J, Fu J, Zhao Z, Kong X, Huang H, Luo L, Yin Z. Chlorogenic acid inhibits lipopolysaccharide-induced cyclooxigenase-2 expression in RAW264.7 cells through suppressing NF-κB and JNK/AP-1 activation. Int Immunopharmacol. 2009; 9: 1042- 1048. 256. Shukla V, Mishra SK, Pant HC. Oxidative stress in neurodegeneration. Adv Pharm Sci. 2011; 2011: article ID 572634. 257. Shuya C, Shengda Q, Xingguo C, Zhide H. Identification and determination of effective components in Euphrasia regelii by capilary zone electrophoresis. Biomed Chromatogr. 2004; 18: 857-861. 216 258. Silva CG, Raulino RJ, Cerqueira DM, Mannarino SC, Pereira MD, Panek AD, Silva JFM, Menezes FS, Eleutherio ECA. In vitro and in vivo determination of antioxidant activity and mode of action of isoquercitrin and Hyptis fasciculata. Phytomedicine. 2009; 16: 761-767. 259. Simin N, Orţiš D, Šetojeviš-Simin D, Mimica-Dukiš N, Anackov G, Beara I, Mitiš- Šulafiš D, Boţin B. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotxic activities of small yellow onion (Allium flavum L. subsp. flavum, Alliaceae). LWT Food Sci Techn. 2013; 54: 139-146. 260. Simon LM, Fatrai Z, Jonas DJ, Matkovics B. Study of metabolism enzymes during the development of Phaseolus vulgaris. Biochem Physiol Pfl. 1974; 166: 389-393. 261. Smith WL. The eicosanoids and their biochemical mechanisms of action. Biochem J. 1989; 259: 315-324. 262. Song JX, Lin X, Wong RN, Sze SC, Tong Y, Show PC, Zhang YB. Protective effects of dibenzo cyclooctadiene lignans from Schisandra chinensis against beta-amyloid and homocysteine neurotoxicity in PC12 cells. Phytother Res. 2011; 25: 435-443. 263. Srivastava MM. U: Srivastava MM, urednik,. High-Performance Thin-Layer Chromatography (HPTLC). Springer-Verlag, Berlin. 2011. 264. Stevanoviš BM, Jankoviš M. Ekologija biljaka sa osnovama fiziološke ekologije biljaka. Beograd: NNK International; 2001. 265. Stevenson DE, Hurst RD. Polyphenolic phytochemicals – just antioxidants or much more? Cell Mol Life Sci. 2007; 64: 2900-2916. 266. Stojkoviš DS, Ţivkoviš J, Sokoviš M, Glamoţlija J, Ferreira ICFR, Jankoviš T, Maksimoviš Z. Antibacterial activity of Veronica montana L. extract and of protocatechuic acid incorporated in a food system. Food Chem Toxicol. 2013; 55: 209-213. 267. Sukito A, Tachibana S. Isolation of hyperoside and isoquercitrin from Camellia sasanqua as antioxidant agents. Pak J Biol Sci. 2014; 17: 999-1006. 268. Sundaram RS, Gowtham L, Nayak BS. The role of excitatory neurotransmitter glutamate in brain physiology and pathology. Asian J Pharm Clin Res. 2012; 5: 1-7. 269. Suomi J, Siren H, Hartonene K, Riekkala ML. Extraction of iridoid glycosides and their determination by micellar electrokinetic capillary chromatography. J Chromatogr A. 2000; 868: 76-83. 217 270. Suomi J, Wiedmer SK, Jussila M, Riekkola ML. Determination of iridoid glycosides by micellar electrokinetic capillary chromatography-mass spectrometry with use of the partial filling technique. Electrophoresis. 2001; 22: 2580-2587. 271. Šariš-Kundališ B, Dobeš C, Klatte-Asselmeyer V, Saukel J. Ethnobotanical survey of traditionally used plants in human therapy of east, north and north-east Bosnia and Herzegovina. J Ethnopharmacol. 2011; 133: 1051-1076. 272. Taskova R, Handjieva N, Peev D, Popov S. Iridoid glucosides from three Veronica species. Phytochem. 1998; 49: 1323-1327. 273. Taskova R, Peev D, Handjieva N. Iridoid glucosides of the genus Veronica s.l. and their systematic significance. Plant Syst Evol. 2002; 231: 1-17. 274. Taskova RM, Albach DC, Grayer RJ. Phylogeny of Veronica – a combination of molecular and chemical evidence. Plant Biol. 2004; 6: 673-682. 275. Taskova RM, Gotfredsen CH, Jensen SR. Chemotaxonomy of Veroniceae and its allies in the Plantaginaceae. Phytochem. 2006; 67: 286-301. 276. Taskova RM, Kokubun T, Grayer RJ, Ryan KG, Garnock-Jones PJ. Flavonoid profiles in the Heliohebe group of New Zealad Veronica (Plantaginaceae). Biochem Syst Ecol. 2008; 36: 110-116. 277. Taskova RM, Kokubun T, Ryan KG, Garnock-Jones PJ, Jensen SR. Phenylethanoid and iridoid glycosides in the New Zealand snow hebes (Veronica, Plantaginaceae). Chem Pharm Bull. 2010; 58: 703-711. 278. Taskova RM, Kokubun T, Ryan KG, Garnock-Jones PJ, Jensen SR. Iridoid and phenylethanoid glucosides from Veronica lavaudiana. J Nat Prod. 2011; 74: 1477- 1483. 279. Taskova RM, Kokubun T, Garnock-Jones PJ, Jensen SR. Iridoid and phenylethanoid glycosides in the New Zealand sun hebes (Veronica, Plantaginaceae). Phytochem. 2012; 77: 209-217. 280. Tirmenstein MA, Nicholls-Grzemski FA, Zhang GJ, Fariss MW. Glutathione depletion and the production of reactive oxygen species in isolated hepatocyte suspensions. Chem Biol Interact. 2000; 127: 201-217. 281. Todoroviš A. Ekspresija antioksidativnih enzima i transkripcionog faktora Nrf2 kod pacijentkinja sa benigno, premaligno i maligno transformisanim endometrijumom. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu; Biološki fakultet; 2013. 218 282. Tomás-Barberán FA, Grayer-Barkmeijer RJ, Gil MI, Harborne JB. Distribution of 6- hydroxy, 6-methoxy and 8-hydroxyflavone glycosides in the labiatae, the schrophulariaceae and related families. Phytochem. 1988; 27: 2631-2645. 283. Toviloviš G. Mehanizam zaštitnog dejstva arilpiperazinskih liganada za dopaminske D2 receptore u azot monoksidom i 6-hidroksidopaminom izazvanoj smrti SH-SY5Y šelija humanog neuroblastoma. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet; 2012. 284. Ubaviš M, Bogdanoviš D. Agrohemija. Novi Sad: Poljoprivredni fakultet; 1995. 285. Umek A, Rupert A, Mlinariţ A, Kac J. HPTLC method for determination of acteoside in ribwort plantain (Plantago lanceolata L.). J Planar Chromat Modern TLC. 2005; 18: 147-150. 286. Valletta A, Santamaria AR, Canini A, Canuti L, Pasqua G. Trichomes in Camptotheca acuminata Decaisme (Nyssaceae): Morphology, distribution, structure and secretion. Plant Biosyst. 2013; 147: 548-556. 287. Valyova M, Hadjimitova V, Stoyanov S, Ganeva Y, Petrov T, Petrov I. Free radicals scavenging activity of extracts from Bulgarian Veronica officinalis L. and GC-MS analysis of ethanol extract. Inter J Aesth Antiag Med. 2009; 2 (1). 288. Velioglu YS, Mazza G, Gao L, Oomah BD. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J Agric Food Chem. 1998; 46: 4113- 4117. 289. Vogl S, Picker P, Mihaly-Bison J, Fakhrudin N, Atanasov AG, Heiss EH, Wawrosch C, Reznicek G, Dirsch VM, Saukel J, Kopp B. Ethnopharmacological in vitro studies on Austria's folk medicine – an unexplored lore in vitro anti-inflammatory activities of 71 Austrian traditional herbal drugs. J Ethnopharmacol. 2013; 149: 750-771. 290. Waksmundzka-Hajnos M, Sherma J. U: Waksmundzka-Hajnos M, Sherma J, urednici. High Performance Liquid Chromatography in Phytochemical Analysis. CRC Press, Boca Raton, Florida; 2011. str. 3-13. 291. Walters SM, Webb DA. Veronica L. U: Tutin TG, Heywood VH, Burges NA, Moore DM, Valentine DH, Walters SM, Webb DA, urednici. Flora Europaea, Vol. III. Cambridge: University Press. 1972; str. 242-251. 292. Wang G, Wang L, Li Z, Ding J, Lin D. Characteristics of accumulation and content of heavy metals of weeds. Chin J Ecol. 2005; 24: 639-643. 219 293. Wang H, Xu Y, Yan J, Zhao X, Sun X, Zhang Y, Guo J, Zhu C. Acteoside protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against β amiloid – induced cell injury. Brain Res. 2009; 1283: 139-147. 294. Wang Z, Li Y, Sarkar FH. Signaling mechanis(s) of reactive oxygen species in epithelial-mesenchymal transition reminiscent of cancer stem cells in tumor progression. Current Stem Cell Research & Therapy. 2010; 5: 74-80. 295. Wangchuk P, Keller PA, Pyne SG, Taweechotipatr M, Tonsomboon A, Rattanajak R, Kamchonwongpaisan S. Evaluation of an ethnopharmacologically selected Bhutanese medicinal plants for their major classes of phytochemicals and biological activites. J Ethnopharmacol. 2011; 137: 730-742. 296. Weckerle CS, Ineichen R, Huber FK, Yang Y. Mao‟s heritage: medicinal plant knowledge among the Bai in Shaxi, China, at a crossroads between distinct local and common widespread practice. J Ethopharmacol. 2009; 123: 213-228. 297. Wong MH. Ecological restoration of mine degraded soils, with emphasis on metal contaminated soils. Chemosphere. 2003; 50: 775-780. 298. Wood EJ. Practical biochemistry for colleges. Oxford: Pergamon Press; 1989. 299. Wu YT, Lin LC, Sung JS, Tsai TH. Determination of acteoside in Cistanche deserticola and Boschniakia rossica and its pharmacokinetics in freely-moving rats using LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2006; 844: 89- 95. 300. Xie HR, Hu LS, Li GY. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line in vitro cell made of dopaminergic neurons in Parkinson‟s disease. Chin Med J (Engl). 2010; 123: 1086- 1092. 301. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Namba T, Kadota S. Acteoside inhibits apoptosis in D- galactosamine and lipopolysaccharide-induced liver injury. Life Sci. 1999; 65: 421- 430. 302. Xu W, Deng Z, Guo H, Ling P. A rapid and sensitive determination of aucubin in rat plasma by liquid chromatography – tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic application. Biomed Chromtogr. 2012; 26: 1066-1070. 303. Xu Y, Wang C, Wu L, Li Z, Chen M, Wang Y, Li F, Luo C. Comparison of inhibitory effects of nine flavonoids on prostaglandin E2 production and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Proceedings of the 2012 International Conference on Biomedical Engineering and Biotechnology. 2012: 981-984. 220 304. Xu M, Chen X, Gu Y, Peng T, Yang D, Chang RCC, So KF, Liu K, Shen J. Baicalin can scavenge peroxynitrate and amelirate endogenous peroxynitrite – mediated neurotoxicity in cerebral ischemia – reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 2013; 150: 116-124. 305. Xue HY, Jin L, Jin LJ, Li XY, Zhang P, Ma YS, Lu YN, Xia YQ, Xu YP. Aucubin prevents loss of hippocampal neurons and regulates antioxidative activity in diabetic encephalopathy rats. Phytother Res. 2009; 23: 980-986. 306. Xue HY, Gao GZ, Lin QY, Jin LJ, Xu YP. Protective effects of aucubin on H2O2- induced apoptosis in PC12 cells. Phytother Res. 2012; 26: 369-374. 307. Zador E, Jones D. The Biosynthesis of a novel nicotine alkaloid in the trichomes of Nicotiana stocktonii. Plant Physiol. 1986; 82: 479-484. 308. Zhang J, Shen X. Antioxidant activities of baicalin, green tea polyphenols and alizarin in vitro and in vivo. J Nutr Environ Med. 1997; 7: 79-89. 309. Zou Y, Lu Y, Wei D. Antioxidant activity of a flavonoid-rich extract of Hypericum perforatum L. in vitro. J Agric Food Chem. 2004; 52: 5032-5039. 310. Zurayk R, Sukkariyah B, Baalbaki R. Common hydrophytes as bioindicators of nickel, chromium and cadmium pollution. Water Air Soil Pollut. 2001; 127: 373-388. 221 BIOGRAFIJA Dipl. farm. Jelena Ţivkoviš roŤena je 2. decembra 1980. godine u Bihašu. Nakon završene V beogradske gimnazije, upisala je Farmaceutski fakultet Univerziteta u Beogradu školske 1999/2000. godine. Diplomirala je na Farmaceutskom fakultetu 2005. godine sa proseţnom ocenom 8,68 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Struţni ispit za diplomirane farmaceute poloţila je 2006. godine. Doktorske akademske studije iz farmakognozije upisala je školske 2007/08. godine. Od 2010. godine zaposlena je u Institutu za prouţavanje lekovitog bilja “Dr Josif Panţiš”, najpre kao glavni tehnolog za proizvodnju ekstrakata i fitopreparata u Sektoru proizvodnje, a od 2013. godine kao istraţivaţ saradnik u Odseku za farmaceutsko istraţivanje i razvoj. Autor je i koautor 13 radova u ţasopisima meŤunarodnog znaţaja, od ţega je 9 u vrhunskim meŤunarodnim ţasopisima. 222 223 224