NASTAVNO-NAUČNOM VEĆU FARMACEUTSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU -Komisiji za poslediplomsku nastavu-doktorske studije- Nastavno-naučno veće Farmaceutskog fakulteta, na sednici održanoj 15.5.2014. godine, donelo je Odluku (broj 944/2) kojom se imenuje Komisija za ocenu i odbranu završene doktorske disertacije pod nazivom „Uticaj starenja na fenotipske i funkcijske karakteristike dendritskih ćelija različitih sojeva pacova“, kandidata mr sc. dr med. Biljane Bufan, u sastavu: 1. Dr Zorica Stojić-Vukanić- mentor (Predsednik), vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet 2. Dr Gordana Leposavić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet 3. Dr Mirjana Dimitrijević, naučni savetnik, Centar za imunološka istraživanja „Branislav Janković“ Institut za virusologiju, serume i vakcine „Torlak“, Beograd Mr sc. dr med. Biljana Bufan je zaposlena kao saradnik u nastavi na Katedri za mikrobiologiju i imunologiju Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kandidat je student doktorskih akademskih studija- modul farmakologija na Farmaceutskom fakultetu- Univerziteta u Beogradu. Članovi Komisije su pregledali priloženu disertaciju i podnose Nastavno-naučnom veću Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu sledeći IZVEŠTAJ A. PRIKAZ SADRŽAJA DOKTORSKE DISERTACIJE Doktorska disertacija mr sc. dr med. Biljane Bufan pod nazivom: „Uticaj starenja na fenotipske i funkcijske karakteristike dendritskih ćelija različitih sojeva pacova“ napisana je na 161 strani i sadrži 26 slika, 1 tabelu i 345 literaturnih navoda. Sadržaj doktorske disertacije izložen je u sledećim poglavljima: Uvod (27 strana), Ciljevi istraživanja (3 strane), Materijal i metode (27 strana), Rezultati (43 strane), Diskusija (27 strana), Zaključak (5 strana) i Literatura. U poglavlju UVOD, na pregledan način izneti su relevantni podaci iz literature, koji nedvosmisleno ukazuju na opravdanost istraživanja, koja su prikazana u disertaciji i iz kojih jasno proizilazi da su ciljevi istraživanja smisleno i precizno definisani. CILJ ISTRAŽIVANJA ove doktorske disertacije je bio da se ispita uticaj starenja na fenotipske i funkcijske karakteristike konvencionalnih dendritskih ćelija (kDĆ) pacova Albino Oxford (AO) i Dark Agouti (DA) soja i da se utvrdi da li ove promene koreliraju sa promenom u osetljivosti na indukciju organ-specifičnih autoimunskih bolesti. Poglavlje MATERIJAL I METODE sadrži detaljan opis metoda koje su korišćene za izolovanje i kultivaciju kDĆ, kao i metode koje su korišćene za ispitivanje fenotipskih i funkcijskih karakteristika kDĆ. Osim toga, budući da je za ispitivanje korelacije izmeñu promena u funkcijskim karakteristikama kDĆ i osetljivosti na indukciju organ-specifičnih autoimunskih bolesti korišćen eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis (EAE), eksperimentalni model za mulpiplu sklerozu, detaljno je opisan postupak za indukciju ove bolesti, kao i parametri za praćenje razvoja bolesti. U istraživanjima su korišćene mlade (3 meseca) i stare (26 meseci) ženke pacova AO i DA soja. Životinjama su, nakon žrtvovanja slezine pažljivo vañene; manji deo tkiva je uziman za analizu ekspresije gena za citokine, a ostatak je korišćen za izolovanje splenocita enzimskom digestijom, a potom je na gustinskom gradijentu izdvajana ćelijska frakcija niske gustine u kojoj se nalaze DĆ. Jedan deo ovih ćelija je je upotrebljen za ispitivanje ispoljenost površinskih molekula (CD4, CD11b, MHC II, CD40, CD80, CD86 i TLR4). Ćelije koje ispoljavaju CD103 (subjedinica αOX-62 integrina) molekul su identifikovane korišćenjem monoklonskog MRC OX62 antitela (u daljem tekstu kDĆ) i potom je ispitivana njihova endocitozna sposobnost. Iz drugog dela ćelija iz iste frakcije su izdvajane OX62+ ćelije korišćenjem magnetnih kuglica vezanih za MRC OX62 monoklonsko antitelo. Jedan deo ovako izdvojenih ćelija je iskorišćen za ispitivanje ekspresije gena za citokine (TNF-α, IL-6, IL-1β, TGF-β i IL-10) i TLR (engl. Toll like receptor) 4, receptor koji prepoznaje molekulske obrasce patogena. Izdvojene kDĆ su, tokom noći, kultivisane u kompletnom medijumu sa ili bez dodatka lipopolisaharida (LPS), liganda za TLR4, koji stimuliše aktivaciju/sazrevanje DĆ. Nakon kultivacije ispitivana je: • vijabilnost ćelija, korišćenjem 7-aminoaktinomicin D (7-AAD), metodom protočne fluorocitometrije, • ispoljavanje površinskih molekula (MHC II, CD40, CD80, CD86) korišćenjem metode protočne fluorocitometrije, • produkcija citokina (IL-10, TNF-α, IL-6, TGF-β, IL-12, IL-23), odreñivanjem njihove koncentracije u supernatantima enzimskim imunotestovima (engl. Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) i ekspresije relevantnih gena u samim ćelijama, metodom lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (engl. Real-time polimerase chain reaction, RT-PCR). Alostimulatorna sposobnost kDĆ je procenjivana merenjem proliferativnog odgovora CD4+ T limfocita koji su prethodno obeleženih fluorescentnom bojom- 5(6)- karboksifluorescein diacetat sukcinimidil estrom (CFSE), metodom protočne citofluorimetrije. U drugom segmentu studije ispitivana je osetljivost pacova na indukciju EAE-a. Životinje su imunizovane ubrizgavanjem paste koja se sastojala od homogenata kičmene moždine DA pacova i kompletnog Freund-ov adjuvansa i subkutanog davanja Bordetella pertussis vakcine. Kod ovih životinja svakodnevno je praćen tok bolesti i kvantifikovani su klinički znaci. Dozvolu za rad sa eksperimentalnim životinjama, u sklopu istraživanja čiji su rezultati prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji, je izdala Etička komisija Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, odlukom od 19.6.2012. godine, zavedenom pod brojem 6/12. Statistička značajnost razlika izmeñu grupa različite starosti u ispoljenosti površinskih markera na sveže izolovanim kDĆ je odreñivana Studentovim t- tesom, dok je značajnost promena ekspresije iRNK odreñivana Mann-Whitney U-testom. Uticaj starenja i kultivacije/LPS-a na kDĆ je testiran dvofaktorskom analizom varijanse, uz primenu Bonferroni testa za post hoc poreñenje. Kruskal-Wallis test, uz primenu Mann-Whitney U testa za post hoc poreñenje, je korišćen za testiranje uticaja starenja/LPS-a na ekspresiju iRNK za citokine. Statistička značajnost je testirana korišćenjem komercijalnih statističkih paketa (SPSS for Windows 16.0. i GraphPad Prism v 5.0). P vrednost < 0.05 je smatrana statistički značajnom. REZULTATI su prikazani na 26 slika uz 1 tabelu. U poglavlju DISKUSIJA dobijeni rezultati su kritički diskutovani u svetlu relevantnih podataka iz literature. Na kraju disertacije, dati su ZAKLJUČCI, koji proizilaze iz rezultata istraživanja i njihove analize. B. OPIS POSTIGNUTIH REZULTATA U prvom segmentu poglavlja REZULTATI opisani su podaci dobijeni analizom uticaja starenja na fenotipske i funkcijske karakteristika kDĆ sveže izolovanih iz slezine pacova AO i DA soja. Analiza zastupljenosti CD4+ i CD4- subpopulacija u okviru populacije kDĆ AO pacova je pokazala da je starenje dovelo do promene njihovog odnosa, tako da je, za razliku od mladih životinja, kod kojih su dominantnu subpopulaciju činile CD4+ kDĆ, kod starih životinja je odnos ovih subopulacija promenjen u korist CD4- kDĆ. Promena odnosa subpopulacija kDĆ sa starenjem nije nañena kod pacova DA soja. Kod oba uzrasta životinja ovog soja CD4- subpopulacija je bila dominantna. Analiza fenotipa sveže izolovanih kDĆ životinja AO soja je pokazala da su sveže izolovane kDĆ starih životinja imale značajno veću (p<0.001) površinsku gustinu (engl. mean fluorescence intensity, MFI) MHC molekula II klase, dok je površinska gustina kostimulatornih molekula (CD80, CD86 i CD40) bila značajno manja (p<0.05) u odnosu na ćelije mladih životinja. Takoñe, u sveže izolovanim kDĆ starih životinja bila je manja procentualna zastupljenost ćelija koje su eksprimirale TLR4 molekul u odnosu na istu populaciju ćelija kod mladih životinja. Kod sveže izolovanih kDĆ starih životinja DA soja je, u odnosu na sveže izolovane kDĆ mladih životinja, nañen manji (p<0.01) procenat MHC II+ i CD40+ ćelija. Sa druge strane, u okviru iste populacije ćelija starih životinja, nañen je veći (p<0.01) procenat ćelija koje ispoljavaju CD80 i CD86 molekule u poreñenju sa ćelijama mladih pacova. Za razliku od AO soja, kod DA soja starenje je povećalo (p<0.001) procentualnu zastupljenost TLR4+ u okviru populacije sveže izolovanih kDĆ slezine. Starenje je povećalo (p<0.001) preuzimanje dekstrana endocitozom od strane kDĆ pacova AO soja, a smanjilo (p<0.05) njegovo preuzimanje od strane kDĆ DA pacova. Analiza ekspresije gena za pro-inflamatorne/imunostimulatorne citokine je pokazala da slezinske kDĆ starih AO pacova sadrže veće količine iRNK za TNF-α (p<0.05) i IL-1β (p<0.01) i manje količine (p<0.05) iRNK za IL-6, u odnosu na kDĆ mladih životinja istog soja. Ekspresija gena za imunomodulatorne/imunosupresivne citokine IL-10 i TGF-β, nije se značajnije promenila starenjem kod ovih pacova. Kada je analizirana ekspresija gena za iste citokine u kDĆ DA pacova, dobijeni su nešto drugačiji rezultati. Ove ćelije starih DA pacova su eksprimirale veće količine iRNK za TNF-α (p<0,05) i IL-6 (p<0.01), a manju (p<0.05) količinu iRNK za IL-β u odnosu na odgovarajuće ćelije mladih životinja. Ekspresija iRNK za IL-10 je bila veća u kDĆ starih pacova. Starenje nije uticalo na ekspresiju iRNK za TGF-β . Količina iRNK za TLR4 u kDĆ starih pacova oba soja je bila u saglasnosti sa rezultatom površinske ispoljenosti ovog molekula. Naime, starenje je smanjilo (p<0.01) količinu iRNK za TLR4 u sveže izolovanim kDĆ starih AO pacova, a povećalo je (p<0.01) u istim ćelijama DA pacova. U drugom segmentu poglavlja REZULTATI su opisani podaci dobijeni ispitivanjem uticaja starenja na sposobnost aktivacije/sazrevanja kDĆ pacova AO i DA soja nakon stimulacije LPS-om u kulturi. Analiza fenotipskih karakteristika kDĆ mladih i starih AO pacova stimulisanih LPS- om, pokazala je statistički značajno povećanje procentualne zastupljenosti ili površinske gustine svih ispitivanih markera (MHC II, CD80, CD86 i CD40) u poreñenju sa ćelijama iste uzrastne grupe koje su gajene bez prisustva ovog faktora sazrevanja. Poreñenjem fenotipskih karakteristika kDĆ nakon stimulacije LPS-om mladih i starih AO pacova nañena je manja (p<0.001) površinska gustina MHC II i veća kostimulatornih molekula u poreñenju sa stimulisanim ćelijama mladih životinja. Analiza uticaja LPS-a na fenotipske karakteristike kDĆ mladih DA pacova je pokazala da je ovaj faktor sazrevanja uticao na povećanje ekspresije svih ispitivanih markera, osim CD40. Kod kDĆ starih životinja, LPS je značajnije uticao samo na promenu ekspresije CD86, jer je povećao i procentualnu zastupljenost CD86+ ćelija (p<0.05) i gustinu njegove ispoljenosti (p<0.001), u poreñenju sa kDĆ starih životinja gajenih u odsustvu LPS-a. Prethodno navedene promene u ispoljenosti ispitivanih površinskih molekula su rezultirale manjom (p<0.001) gustinom ispoljenosti MHC II i CD40 molekula i manjim (p<0.05) procentom CD86+ ćelija u okviru populacije kDĆ starih životinja koje su stimulisane LPS-om, u poreñenju sa odgovarajućim kDĆ mladih životinja. Analiza alostimulatorne sposobnosti kDĆ je pokazala da su nestimulisane kDĆ, bez obzira na soj i uzrast životinja iz kojih su izolovane, indukovale proliferaciju alogenih CD4+. T limfocita, ali su bile manje efikasne u poreñenju sa kDĆ stimulisanim LPS-om. Pored toga, LPS-om stimulisane kDĆ starih životinja su pokazale manju sposobnost indukovanja proliferacije alogenih CD4+ T limfocita u odnosu na ove ćelije mladih životinja istog soja. Ispitivanja ekspresije gena za citokine u kDĆ u ćelijama iz kulture su pokazala da su ove starih životinja AO soja, gajene samo u kompletnom medijumu, eksprimirale veće bazalne nivoe iRNK za: TNF-α (p<0.05), IL-12p35 (p<0.001), IL-23p19 (p<0.001) i IL-6 (p<0.05) i manje (p<0.001) za IL-10 u odnosu na ćelije mladih životinja gajene pod istim uslovima. Količine eksprimirane iRNK za TGF-β se nisu razlikovale kod nestimulisanih kDĆ mladih i starih životinja. Pod uticajem LPS-a, kDĆ mladih životinja su značajno povećale (p<0.001) ekspresiju samo iRNK za IL-10 u poreñenju sa nestimulisanim ćelijama životinja istog uzrasta. Suprotno, u kDĆ starih pacova nakon stimulacije LPS-om nañena je povećana ekspresija iRNK za: TNF-α (p<0.001), IL-12p35 (p<0.001), IL-23p19 (p<0.01), IL-6 (p<0.001) i TGF-β (p<0.001), dok se ekspresija iRNK za IL-10 nije značajnije menjala, u poreñenju sa nestimulisanim kDĆ životinja iste starosti. Uočeno je, takoñe, da kDĆ starih pacova posle stimulacije LPS-om eksprimiraju značajno veće (p<0.001) količine iRNK za: TNF-α, IL-12p35, IL-23p19, IL-6 i TGF-β i manje (p<0.001) za IL-10 nego ove ćelije mladih pacova. Analiza bazalne ekspresije iRNK u nestimulisanim kDĆ mladih i starih DA pacova je pokazala višestruko veće (p<0.001) količine iRNK za IL-23p19 u ćelijama starih životinja, dok se ekspresije gena za druge ispitivane citokine (TNF-α, IL-12p35, IL-6, IL-10 i TGF-β) nisu razlikovale. Nakon aktivacije pod uticajem LPS-a, kDĆ mladih pacova su značajno povećale (p<0.05) sadržaj iRNK za TNF-α, dok se ekspresija iRNK za IL-12p35, IL-6, IL-23p19, IL- 10 i TGF-β nije značajnije promenila, u poreñenju sa kontrolnim ćelijama životinja istog uzrasta. Sa druge bstrane, LPS je uticao na povećanje ekspresije iRNK za IL-6 (p<0.01), IL- 10 (p<0.001) i TGF-β (p<0.001) u kDĆ starih životinja. Ispitivanje uticaja LPS-a na kDĆ mladih i starih životinja je pokazalo da ove ćelije starih životinja ispoljavaju značajno veće (p<0.001) količine iRNK za IL-6, IL-23p19, IL-10 i TGF-β nego ćelije mladih životinja. Koncentracije citokina u supernatantima kultura kDĆ mladih i starih pacova oba ispitivana soja u prisustvu ili bez LPS-a bila je u saglasnosti sa rezultatima ekspresije njihove iRNK. Sposobnosti kDĆ da usmeravaju diferencijaciju i polarizaciju CD4+ T ćelijskog odgovora odreñivna je na osnovu koncentracije IFN-γ, marker CD4+ pomoćničkih (Th)1 limfocita, IL-4 (marker Th2 ćelija) i IL-17 (marker Th17 ćelija) u supernatantima kokultura kDĆ i CD4+ T limfocita. U supernatantima kokultura stimulisanih kDĆ mladih AO pacova, u odnosu na one iz kokultura sa nestimulisanim kDĆ životinja istog uzrasta, koncentracije IFN-γ i IL-17 se nisu značajno razlikovale. Za razliku od njih, nañena je veća koncetracija IFN-γ (p<0.001) i IL-17 (p<0.05) u supernatantima kokultura kDĆ stimulisanih LPS-om starih životinja i CD4+ ćelija u odnosu na supernatante kokultura sa nestimulisanim kDĆ životinja iste starosti. Konačno, poreñenjem koncentracija citokina u supernatantima kokultura kDĆ starih životinja stimulisanih LPS-om i CD4+ limfocita sa koncentracijom citokina u supernatantima odgovarajućih kokultura mladih životinja, nañene su značajno veće (p<0.001) koncentracije IFN-γ i IL-17. Kod mladih DA pacova u supernatantima kokultura kDĆ aktivisanih LPS-om i alogenih CD4+ T limfocita izmerene su veće (p<0.05) koncentracije IFN-γ u poreñenju sa supernatantima kokultura sa nestimulisanim kDĆ mladih pacova. Zatim, značajno veće (p<0.05) koncentracije IL-17 nañene su u supernatanima kokultura, kako nestimulisanih tako i stimulisanih kDĆ starih životinja i CD4+ ćelija, u poreñenju sa odgovarajućim supernatantima kokultura mladih životinja. Bez obzira na prisustvo LPS-a, nisu nañene razlike u koncentracijama IL-4 u supernatantima kokultura CD4+ T limfocita i kDĆ mladih i starih životinja oba ispitivana soja. U trećem delu poglavlja REZULTATI opisani su podaci dobijeni praćenjem razvoja EAE-a kod mladih i starih životinja AO i DA soja. Kod starih imunizovanih životinja relativno rezistentnog AO soja nañeno je povećanje incidence obolevanja (0% mlade vs 60% stare). Prvi znaci bolesti u ovoj grupi životinja su registrovani 10.3 ± 1.36 dana, dok je maksimalni klinički znak bio 2, što odgovara paraparezi zadnjih ekstremiteta. Kod starih imunizovanih životinja osetljivog DA soja, nañeno je smanjenje incidence obelevanja (100% mlade vs. 27.3% stare). Kod ovih životinja nije bilo razlike u danu početka bolesti (11.67±0.41 mlade i 11.33±0.41 stare), a stare životinje su ispoljile blažu kliničku sliku bolesti, što je procenjeno na osnovu maksimalnog kliničkog znaka 4 (tetraplegija tj. moribundno stanje) kod mladih i 2 kod starih životinja. C. UPOREDNA ANALIZA POSTIGNUTIH REZULTATA SA PODACIMA IZ LITERATURE U literaturi postoje podaci o uticaju starenja na DĆ različitih životinjskih vrsta (primati, miševi, ljudi) (Agrawal i sar., 2007b; Wong i sar., 2010; Pereira i sar., 2011; Asquith i sar., 2012), ali ne i o ticaju starenja na DĆ pacova. Podaci o uticaju starenja na DĆ su umnogome kontradiktorni, a često i neuporedivi jer se: 1) odnose na ćelije različitog porekla (slezina, periferna krv, kostna srž), 2) ćelije nisu gajene pod istim uslovima, 3) su korišćeni različiti protokoli za stimulaciju aktivacije/sazrevanja, 4) ne postoji potpuna podudarnost izmeñu različitih populacija/subpopulacija DĆ izolovanih iz različitih životinjskih vrsta i 5) ćelije potiču iz jedinki različite starosti. Sa druge strane, iako je pacov, posle miša, najčešće korišćena laboratorijska životinja nedostaju podaci o uticaju starenja na DĆ pacova. Iz tog razloga, istraživanja prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji su bila usmerena na ispitivanje uticaja starenja na DĆ pacova dva soja različite sklonosti ka razvoju Th1/Th17 posredovanih autoimunskih bolesti, od kojih je jedan relativno rezistentan (AO), a drugi (DA) osetljiv (Lukić i sar., 2001; Miljković i Mostarica Stojiković, 2006; Miljković i sar., 2006; Marković i sar., 2009). Prema dostupnim literaturnim podacima, u okviru kDĆ pacova (svih osim kDĆ u timusu) se mogu razlikovati bar dve, morfološki, fenotipski i funkcijski različite supopulacije, za čiju se identifikaciju koristi, pre svega prisustvo tj. odsustvo CD4 molekula na površini ćelija (Liu i sar., 1998; Turnbull i MacPherson, 2001; Trinite i sar., 2000; Voisine i sar., 2002; Yrlid i MacPherson, 2003). Hubert i saradnici (Hubert i sar., 2006) su pokazali da se odnosi subpopulacija DĆ u slezinama pacova Sprague-Dawley, Lewis i Brown Norway sojeva razlikuju i da su sojno zavisni. Rezultati ove studije su to potvrdili. Osim toga, oni su pokazali i kakvi su odnosi glavnih subpopulacija u okviru populacije kDĆ pacova AO i DA soja, koji nisu postojali u dostupnoj literaturi. Takoñe, pokazano je da starenje dovodi do promena u odnosu subpopulacija kod AO, ali ne i DA pacova. Ovakvi rezultati navode na zaključak da se promena odnosa subpopulacija ne dešava nužno tokom starenja i da je i sojno zavisna. Prema dostupnim literaturnim podacima, promena odnosa subpopulacija slezinskih kDĆ opisana je kod starih miševa C57BL/6 soja (Wong i sar., 2010), dok nema podataka o uticaju starenja na zastupljenost pojedinačnih subpopulacija kDĆ kod pacova. S obzirom na različite funkcijske karakteristike navedih subpopulacija kDĆ, njihova relativna zastupljenost se povezuje sa sklonošću ka usmeravanju Th ćelijskog odgovora u pravcu Th1 ili Th2 (Fournie i sar., 2001; Hubert i sar., 2006). Shodno tome, dominacija CD4+ ćelija, koje karakteriše produkcija male količine IL-12 i odsustvo produkcije TNF-α, kod mladih životinja AO soja, mogla bi biti povezana sa relativnom neosetljivošću ovog soja na razvoj Th1/Th17 posredovanih autoimunskih bolesti (Fournie i sar., 2001; Marković i sar., 2009). Suprotno ovome, kod pacova DA soja, koji je osetljiv na indukovanje autoimunskih bolesti posredovanih Th1/Th17 ćelijskim odgovorom (Lukić i sar., 2001; Miljković i Mostarica-Stojković, 2006; Miljković i sar., 2006), nañena je dominacija CD4- ćelija, koje odlikuje produkcija velikih količina pro-inflamatornih citokina (Voisine i sar., 2002; Hubert i sar., 2006). Promene odnosa CD4+ i CD4- kDĆ koja je nañena kod starih AO pacova, mogla bi se povezati sa promenom njihove osetljivosti na indukciju Th1/Th17 posredovanih autoimunskih bolesti, što je takoñe ispitivano u ovoj studiji. Ispitivanja karakteristika kDĆ mladih životinja su pokazala da ove ćelije imaju odlike nezrelih DĆ, što je u skladu sa literaturnim podacima, prema kojima gotovo sve DĆ slezine miša imaju karakteristike nezrelih ćelija (Iwasaki i Kelsall, 1999; Wilson i sar., 2003). Rezultati ove studije su pokazali da starenje utiče na promenu fenotipskih karakteristika kDĆ, kao i da je većina tih promena sojno zavisna. Starenje je dovelo do promenjene endocitozne aktivnosti kDĆ, važne karakteristike nezrelih DĆ (Banchereau i sar., 2000) i ono je bilo u saglasnosti sa opisanim fenotipskim promenama ovih ćelija. Naime, kDĆ starih životinja AO soja su pokazale veću, a DA soja manju sposobnost preuzimanja dekstrana u poreñenju sa ćelijama mladih životinja odgovarajućeg soja. Rezultati koje su dobili Agrawal i saradnici (Agrawal i sar., 2007a) ukazuju na smanjeno preuzimanje antigena od strane humanih DĆ monocitnog porekla kod starih osoba i ovakav nalaz pripisuju promena u prenosu signala u okviru PI3K/AKT signalnog puta u tim ćelijama (Agrawal i sar., 2007a). Analiza produkcije citokina od strane sveže izolovanih kDĆ je obuhvatila odreñivanje količine iRNK za TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-10 i TGF-β. Produkcija TNF-α je kod kDĆ starih životinja oba soja bila veća u poreñenju sa istim ćelijama mladih životinja odgovarajućeg soja. Povećanu bazalnu produkciju ovog citokina od strane DĆ su našle i druge grupe istraživača i povezuju ga sa povećanim bazalnim nivoom aktiviranog transkripcionog nuklearnog faktora-kapa B (engl. nuclear factor kB NF-kB) (Agrawal i sar., 2009; Panda 2010; Gupta i sar., 2014). Takoñe, ovakav nalaz govori u prilog hroničnog sistemskog pro- inflamatornog statusa kod starih jedinki različitih vrsta (Brüünsgaard i Pedersen, 2003; Gómez i sar., 2006; Vasto i sar., 2007; Wong i Magnusson, 2013) i ukazuje na moguću ulogu DĆ u razvoju ovog fenomena. Osim toga, promena produkcije IL-6 i IL-1β kod kDĆ starih životinja bila je sojno- zavisna. Rezultati dobijeni na mišijem modelu pokazuju da IL-6 ima dominantu ulogu u regulaciji aktivacionog statusa DĆ u stanju bez infekcije/inflamacije u slezini, koja se ogleda u sprečavanju njihove aktivacije/sazrevanja (Park i sar., 2004). Ovakve tvrdnje ne potkrepljuju dobijene rezultate, budući da je ekspresija gena za ovaj citokin bila niža kod DĆ starih AO pacova, nezrelijeg fenotipa, a viša kod DA pacova. Moguće objašnjenje bi bilo da neki drugi faktor/i imaju dominantniju ulogu u regulaciji aktivacionog statusa DĆ kod pacova ili kod starih životinja. Kada su u pitanju imunosupresivni citokini, ekspresija iRNK za TGF-β se nije značajno promenila sa starenjem kod kDĆ ispitivanih sojeva, dok je efekat na IL-10 bio različit. Kod kDĆ starih AO pacova je produkcija ostala nepromenjena, dok su kDĆ starih DA pacova eksprimirale više nivoe ovog citokina, u odnosu kDĆ mladih životinja istog soja. U literaturi se DĆ koje produkuju ovaj citokin označavaju kao ćelije sa tolerogenom funkcijom (Steinman i sar., 2003). Disregulacija produkcije ovog citokina bi mogla biti posledica intrizičkih promena, budući da je kod nekih ljudi uočena genetski uslovljena osobina, da se u starosti, u odgovoru na povećan nivo pro-inflamatornih medijatora, aktivira anti-inflamatorni odgovor, produkcija IL-10 i TGF-β, koji treba da spreči potencijalno štetno dejstvo hronične inflamacije (Larbi i sar., 2008). Naravno, osim intrizičnih i promene koje potiču iz okruženja DĆ bi mogle da uslove promene u produkciji citokina. Nalazi Huberta i saradnika (Hubert i sar., 2006) ukazuju na to da obe subpopulacije pacovskih kDĆ eksprimiraju iRNK za TLR4. U ovom istraživanju, osim ekspresije iRNK za TLR4 u kDĆ pacova, potvrñeno je i prisustvo produkta na površini ovih ćelija. Takoñe, rezultati ove studije su pokazali sojno-zavisan uticaj starenja na promenu ekspresije TLR4 kod kDĆ, jer je kod starih AO pacova nañena manja, a kod DA veća ekspresija ovog molekula. Literaturni podaci koji se odnose na promene ekspresije TLR4 kod starih jedinki nisu konzistentni. Renshaw i saradnici (Renshaw i sar., 2002) su našli da kod slezinskih i peritonealnih makrofaga, starenje snižava ekspresiju TLR4, koja je zavisna od lokalizacije i aktivacionog statusa ćelija. Sa druge strane, studije na miševima nisu pokazale da se ekspresija TLR4 na limfocitima, makrofagama i peritonealnim makrofagama menja sa starenjem (Boehmer i sar., 2004; Sun i sar., 2012), dok su Asquith i saradnici (Asquith i sar., 2012), našli povećanu ekspresiju ovog molekula na mononuklearnim ćelijama periferne krvi starih rhesus majmuna (Macaca mulatta). LPS-om stimulisane kDĆ starih AO pacova je karakterisala veća espresija kostimulatornih molekula (CD80, CD86 i CD40), veća produkcija TNF-α, IL12, IL-6, IL-23 i TGF-β i manja IL-10, u odnosu na kDĆ mladih životinja. Ove ćelije su ispoljile sposobnost da indukuju Th1 i Th17 ćelijski odgovor, ali su imale i nižu alostimulatornu aktivnost u poreñenju sa stimulisanim kDĆ mladih životinja. Za razliku od njih, LPS-om stimulisane kDĆ starih životinja DA soja su imale nezreliji fenotip, sa manjom ispoljenošću MHC II, CD86 i CD40 molekula, u odnosu na stimulisane ćelije mladih. Ove ćelije su produkovale veće količine IL-10, IL-6 i IL-23 i imale veću ekspresiju TGF-β, dok je produkcija TNF-α bila manja u poreñenju sa kontrolnim, stimulisanim kDĆ mladih životinja. Stimulisane kDĆ starih životinja nisu imale sposobnost da indukuju Th1 ćelijski odgovor, za razliku od stimulisanih kDĆ mladih. Kada je u pitanju sposobnost indukovanja Th17 ćelijskog odgovora, iako je pokazano da su kDĆ starih jedinki indukovale produkciju IL-17 kod alogenih CD4+ T limfocita u većoj meri nego što su to činile ćelije mladih životinja, ova njihova sposobnost nije povećana pod uticajem LPS-a. Takoñe, LPS-om stimulisane kDĆ starih pacova oba soja su imale sniženu sposobnost stimulacije alogenih CD4+ T limfocita u poreñenju sa kDĆ mladih životinja istog soja. Brojne studije su imale za cilj da ispitaju sposobnost DĆ starih jedinki da odgovore na aktivacione stimuluse, najčešće na agoniste TLR4, TLR2/6 i TLR9 i dobijeni su različiti rezultati. Najveći broj ispitivanja je sproveden na mišijim DĆ poreklom iz slezine ili dobijenim in vitro od matičnih ćelija kostne srži, a manji broj na humanim DĆ dobijenim od monocita periferne krvi i DĆ poreklom od nehumanih primata (Tesar i sar., 2006; Grolleau- Julius i sar., 2006; Agrawal i sar., 2007b; Agrawal i sar., 2009; Jones i sar., 2010; Asquit i sar., 2012). Rezultati većine sprovedenih studija pokazuju da starenje umanjuje sposobnost DĆ da odgovore na inflamatorni stimulus (Grollesu-Julius i sar., 2006; Pereira i sar., 2011; Li i sar., 2012), dok je jedan broj studija pokazao nepomenjenu sposobnost (Tesar i sar., 2006; Jones i sar., 2010) ili čak pojačanu sposobnost ćelija da odgovore na aktivacione stimuluse (Agrawal i sar., 2007b; Agrawal i sar., 2009). Poslednji segment istraživanja je bio posvećen ispitivanju osetljivosti starih ženki AO i DA pacova na indukciju EAE. Mlade životinje ova dva soja se razlikuju prema osetljivosti na indukciju ove bolesti, što ukazuje na snažan uticaj genetskih faktora na ovu njihovu osobinu (Fournié i sar., 2001; Swanborg, 2001; Miljković i Mostarica-Stojković, 2006). U skladu sa literaturnim podacima (Mostarica-Stojković i sar., 1982; Lukić i sar., 2001; Stošić- Grujičić i sar., 2004), pokazano je da su mlade ženke DA pacova osetljive na indukciju EAE, dok su mlade ženke AO soja relativno rezistentne. Rezultati istraživanja koji su prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji pokazuju promenjenu osetljivost na indukciju EAE-a kod starih životinja. Tačnije, stari pacovi AO soja su postali osetljiviji, dok su stari pacovi DA soja postali manje osetljivi i imali su blažu kliničku sliku u poreñenju sa mladim pacovima odgovarajućeg, istog soja. Ovakav nalaz ne iznenañuje, s obzirom da je ranije pokazano da je kod glodara, moguća promena podložnosti razvoju EAE-a i kliničke slike bolesti sa starenjem i da su ove promene sojno-zavisne (Kallen i Nilsson, 1989; Ludowyk i sar., 1993; Ditamo i sar., 2005). Naime, kod starih mužjaka Fisher pacova i kod starih BALB/c miševa je uočena smanjena osetljivost (Levine i Sowinski, 1976, Endoh i sar., 1990), dok je kod starih Lewis pacova promenjen klinički oblik bolesti (Ludowyk i sar., 1993). Citirana literatura: Agrawal A, Agrawal S, Cao JN, Su H, Osann K, Gupta S. Altered innate immune functioning of dendritic cells in elderly humans: a role of phosphoinositide 3-kinase-signaling pathway. J Immunol 2007a;178:6912-22. Agrawal A, Agrawal S, Gupta S. Dendritic cells in human aging. Exp Gerontol 2007b;42:421-6. Agrawal A, Tay J, Ton S, Agrawal S, Gupta S. Increased reactivity of dendritic cells from aged subjects to self- antigen, the human DNA. J Immunol 2009;182:1138-45. Aspinall R, Goronzy JJ. Immune senescence. Curr Opin Immunol 2010;22:497-9. Asquith M, Haberthur K, Brown M, Engelmann F, Murphy A, Al-Mahdi Z, et al. Age-dependent changes in innate immune phenotype and function in rhesus macaques (Macaca mulatta). Pathobiol Aging Age Relat Dis 2012;2. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, et al. Immunobiology of dendritic cells. Ann Rev Immunol 2000;18:767-811. Boehmer ED, Goral J, Faunce DE, Kovacs EJ. Age-dependent decrease in Toll-like receptor 4-mediated proinflammatory cytokine production and mitogen-activated protein kinase expression. J Leukoc Biol 2004;75:342-9. Bruunsgaard H, Pedersen BK. Age-related inflammatory cytokines and disease. Immunol Allergy Clin North Am 2003;23:15-39. Ditamo Y, Degano AL, Maccio DR, Pistoresi-Palencia MC, Roth GA. Age-related changes in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunol Cell Biol 2005;83:75-82. Endoh M, Rapoport SI, Tabira T. Studies of experimental allergic encephalomyelitis in old mice. J Neuroimmunol 1990;29:21-31. Fournie GJ, Cautain B, Xystrakis E, Damoiseaux J, Mas M, Lagrange D, et al. Cellular and genetic factors involved in the difference between Brown Norway and Lewis rats to develop respectively type-2 and type-1 immune-mediated diseases. Immunol Rev 2001;184:145-60. Gomez CR, Acuna-Castillo C, Nishimura S, Perez V, Escobar A, Salazar-Onfray F, et al. Serum from aged F344 rats conditions the activation of young macrophages. Mech Ageing Dev 2006;127:257-63. Grolleau-Julius A, Garg MR, Mo R, Stoolman LL, Yung RL. Effect of aging on bone marrow-derived murine CD11c+CD4-CD8alpha- dendritic cell function. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2006;61:1039-47. Gupta S. Role of dendritic cells in innate and adaptive immune response in human aging. Exp Gerontol 2014;54:47-52. Hubert FX, Voisine C, Louvet C, Heslan JM, Ouabed A, Heslan M, et al. Differential pattern recognition receptor expression but stereotyped responsiveness in rat spleen dendritic cell subsets. J Immunol 2006;177:1007-16. Iwasaki A, Kelsall BL. Freshly isolated Peyer's patch, but not spleen, dendritic cells produce interleukin 10 and induce the differentiation of T helper type 2 cells. J Exp Med 1999;190:229-39. Jones SC, Brahmakshatriya V, Huston G, Dibble J, Swain SL. TLR-activated dendritic cells enhance the response of aged naive CD4 T cells via an IL-6-dependent mechanism. J Immunol 2010;185:6783-94. Kallen B, Nilsson O. Age as a factor determining susceptibility for experimental autoimmune encephalomyelitis in the rat. Int Arch Allergy Appl Immunol 1989;90:16-9. Larbi A, Franceschi C, Mazzatti D, Solana R, Wikby A, Pawelec G. Aging of the immune system as a prognostic factor for human longevity. Physiology 2008;23:64-74. Levine S, Sowinski R. Experimental allergic encephalomyelitis in aged F344 rats. J Gerontol 1976;31:271-4. Li G, Smithey MJ, Rudd BD, Nikolich-Zugich J. Age-associated alterations in CD8alpha+ dendritic cells impair CD8 T-cell expansion in response to an intracellular bacterium. Aging Cell 2012;11:968-77. Liu L, Zhang M, Jenkins C, MacPherson GG. Dendritic cell heterogeneity in vivo: two functionally different dendritic cell populations in rat intestinal lymph can be distinguished by CD4 expression. J Immunol 1998;161:1146-55. Ludowyk PA, Hughes W, Hugh A, Willenborg DO, Rockett KA, Parish CR. Astrocytic hypertrophy: an important pathological feature of chronic experimental autoimmune encephalitis in aged rats. J Neuroimmunol 1993;48:121-34. Lukic ML, Mensah-Brown E, Galadari S, Shahin A. Lack of apoptosis of infiltrating cells as the mechanism of high susceptibility to EAE in DA rats. Dev Immunol 2001;8:193-200. Markovic M, Miljkovic D, Momcilovic M, Popadic D, Miljkovic Z, Savic E, et al. Strain difference in susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis in rats correlates with T(H)1 and T(H)17-inducing cytokine profiles. Mol Immunol 2009;47:141-6. Miljkovic D, Mostarica- Stojkovic M. Resistance to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis –a tool for studying pathogenesis of the central nervous system autoimmunity. Iugoslavi Physiol Pharmacol Acta 2006: 42(1): 1-18. Miljkovic D, Stosic-Grujicic S, Markovic M, Momcilovic M, Ramic Z, Maksimovic-Ivanic D, et al. Strain difference in susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis between Albino Oxford and Dark Agouti rats correlates with disparity in production of IL-17, but not nitric oxide. J Neurosci Res 2006;84:379-88. Mostarica-Stojkovic M, Petrovic M, Lukic ML. Cellular and genetic basis of the relative resistance to the induction of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in albino oxford (AO) rats. Adv Exp Med Biol 1982;149:699-702. Panda A, Arjona A, Sapey E, Bai F, Fikrig E, Montgomery RR, et al. Human innate immunosenescence: causes and consequences for immunity in old age. Trends Immunol 2009;30:325-33. Panda A, Qian F, Mohanty S, van Duin D, Newman FK, Zhang L, et al. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J Immunol 2010;184:2518-27. Park SJ, Nakagawa T, Kitamura H, Atsumi T, Kamon H, Sawa S, et al. IL-6 regulates in vivo dendritic cell differentiation through STAT3 activation. J Immunol 2004;173:3844-54. Pawelec G, Barnett Y, Forsey R, Frasca D, Globerson A, McLeod J, et al. T cells and aging, January 2002 update. Fronti Biosci 2002;7:d1056-183. Pereira LF, de Souza AP, Borges TJ, Bonorino C. Impaired in vivo CD4+ T cell expansion and differentiation in aged mice is not solely due to T cell defects: decreased stimulation by aged dendritic cells. Mech Ageing Dev 2011;132:187-94. Renshaw M, Rockwell J, Engleman C, Gewirtz A, Katz J, Sambhara S. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. J Immunol 2002;169:4697-701. Shaw AC, Joshi S, Greenwood H, Panda A, Lord JM. Aging of the innate immune system. Curr Opin Immunol 2010;22:507-13. Solana R, Tarazona R, Gayoso I, Lesur O, Dupuis G, Fulop T. Innate immunosenescence: effect of aging on cells and receptors of the innate immune system in humans. Semin Immunol 2012;24:331-41. Steinman RM, Hawiger D, Nussenzweig MC. Tolerogenic dendritic cells. Ann Rev Immunol 2003;21:685-711. Stockwin LH, McGonagle D, Martin IG, Blair GE. Dendritic cells: immunological sentinels with a central role in health and disease. Immunol Cell Biol 2000;78:91-102. Stosic-Grujicic S, Ramic Z, Bumbasirevic V, Harhaji L, Mostarica-Stojkovic M. Induction of experimental autoimmune encephalomyelitis in Dark Agouti rats without adjuvant. Clin Exp Immunol 2004;136:49-55. Sun Y, Li H, Yang MF, Shu W, Sun MJ, Xu Y. Effects of aging on endotoxin tolerance induced by lipopolysaccharides derived from Porphyromonas gingivalis and Escherichia coli. PloS one 2012;7:e39224. Swanborg RH. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the rat: lessons in T-cell immunology and autoreactivity. Immunol Rev 2001;184:129-135. Tesar BM, Walker WE, Unternaehrer J, Joshi NS, Chandele A, Haynes L, et al. Murine [corrected] myeloid dendritic cell-dependent toll-like receptor immunity is preserved with aging. Aging Cell 2006;5:473-86. Trinite B, Voisine C, Yagita H, Josien R. A subset of cytolytic dendritic cells in rat. J Immunol 2000;165:4202- 8. Turnbull E, MacPherson G. Immunobiology of dendritic cells in the rat. Immunol Rev 2001;184:58-68. Vasto S, Candore G, Balistreri CR, Caruso M, Colonna-Romano G, Grimaldi MP, et al. Inflammatory networks in ageing, age-related diseases and longevity. Mech Ageing Dev 2007;128:83-91. Voisine C, Hubert FX, Trinite B, Heslan M, Josien R. Two phenotypically distinct subsets of spleen dendritic cells in rats exhibit different cytokine production and T cell stimulatory activity. J Immunol 2002;169:2284-91. Wilson NS, El-Sukkari D, Belz GT, Smith CM, Steptoe RJ, Heath WR, et al. Most lymphoid organ dendritic cell types are phenotypically and functionally immature. Blood 2003;102:2187-94. Wong CP, Magnusson KR, Ho E. Aging is associated with altered dendritic cells subset distribution and impaired proinflammatory cytokine production. Exp Gerontol 2010;45:163-9. Wong CP, Magnusson KR, Ho E. Increased inflammatory response in aged mice is associated with age-related zinc deficiency and zinc transporter dysregulation. J Nutr Bioch 2013;24:353-9. Yrlid U, Macpherson G. Phenotype and function of rat dendritic cell subsets. APMIS 2003;111:756-65. D. OBJAVLJENI I SAOPŠTENI REZULTATI KOJI ČINE DEO DOKTORSKE DISERTACIJE Rezultati doktorske disertacije mr sc. dr med. Biljane Bufan su publikovani u 2 rada u meñunarodnim časopisima, od čega jedan rad u vrhunskom meñunarodnom časopisu (M21) i jedan rad u meñunarodnom časopisu (M23). Kandidat je deo rezultata svoje disertacije izlagao u vidu jednog saopštenja na meñunarodnom naučnom skupu štampanog u izvodu (M34) i jednog saopštenja na skupu nacionalnog značaja štampanog u izvodu (M64). Publikovani radovi iz doktorske disertacije: 1. Stojic-Vukanic Z, Bufan B, Arsenovic-Ranin N, Kosec D, Pilipovic I, Perisic-Nanut M, Leposavic G. Aging affects AO rat splenic conventional dendritic cell subset composition, cytokine synthesis and T- helper polarizing capacity. Biogerontology 2013; 14(4): 443-459. (M21) 2. Bufan B, ðikić J, Nacka-Aleksić M, Stojić-Vukanić Z, Dimitrijević M, Leposavić G. Strain-specific differences in age-related changes in rat susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis and dendritic cell cytokine gene expression. Genetika 2014; 46(1):287-301. (M23) Saopštenje na meñunarodnom skupu štampano u izvodu 1. Bufan B, Stojic-Vukanic Z, , Arsenovic-Ranin N, Kosec D, Pilipovic I, Perisic M, ðikić J, Leposavic G. Age-asssociated shift in rat dendritic cell T-helper polarizing capacity. 15th International Congress of Immunology. August 22-27 2013, Milan, Italy. Book of Abstracts P1.09.04 p284. (M34) Saopštenje na skupu nacionalnog značaja štampano u izvodu 1. Bufan B, Stojić-Vukanić Z, Arsenović-Ranin N, Pilipović I, Kosec D, Nacka-Aleksić M, ðikić J, Perišić M, Leposavić G. Uticaj starenja na fenotipske i funkcijske karakteristike dendritskih ćelija slezine pacova. Svetski dan imunologije-2012. 24.4.2012. Srpska akademija nauka i umetnosti, Beograd. (M64) E. ZAKLJUČAK- OBRAZLOŽENJE NAUČNOG DOPRINOSA DOKTORSKE DISERTACIJE Interesovanje istraživača za promene imunskog odgovora kod starih životinja i ljudi je u porastu. Razlog za ovo jesu demografski podaci koji ukazuju na produženje životnog veka i povećanje broja starih ljudi i shvatanje da je očuvana funkcija imunskog sistema jedan od ključnih faktora koji odreñuje dužinu životnog veka (Aspinall i Goronzy, 2010). U tom kontekstu, treba istaći da incidenca infektivnih bolesti i mortalitet od infektivnih bolesti značajno raste kod starih, dok se efikasnost odgovora na vakcinaciju dramatično smanjuje. Pored toga, uočava se i povećanje incidence malignih bolesti, dok su podaci vezani za autoimunske bolesti kod starih kontrodiktorni. Kada je u pitanju uticaj starenja na pojedine ćelijske komponente ovog sistema, ranije je smatrano da promene primarno pogañaju odeljak stečenog imuniteta (Pawelec i sar., 2002), a da komponente uroñenog imuniteta (gde spadaju i DĆ) tokom starenja ne podležu promenama, ili podležu znatno manje izraženim promenama. Rezultati brojnih istraživanja koja su vršena poslednjih desetak godina su pokazala suprotno (Panda i sar., 2009; Shaw i sar., 2010; Solana i sar., 2012). Imajući u vidu sve prethodno navedeno, verujemo da bi rezultati prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji mogli da budu od značaja za bolje razumevanju promena u funkciji DĆ, kao profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija sa važnom ulogom u započinjanju, održavanju i regulaciji imunskog odgovora kod starih jedinki (Banchereau i sar., 2000). Osim toga, važno je istaći da rezultati ove disertacije ukazuju i na ulogu genetskih faktora u nastanaku promena funkcije DĆ starih jedinki. S obzirom na ulogu DĆ u imunskom odgovoru, jasno je da bi ove promene mogle da imaju i važne patofiziološke implikacije, što dalje sugeriše značaj genetskih faktora u imunopatologiji koja se javlja kod starih. Posebno, treba istaći rezultate koji ukazuju da je promena u osetljivosti eksperimentalnih životinja na indukciju organ specifičnih autoimunskih bolesti, kao što je EAE, kod starih genetski uslovljena, što bi moglo da doprinese razumevanju ranije uočenog fenomena da genestski faktori utiču na vreme pojave prvih simptoma autoimunske bolesti, težinu i tok bolesti. Konačno, treba istaći da bi rezultati ove doktorske disertacije, ukazujući na neke od celularnih i molekulskih mehanizama koji stoje u osnovi promena koje se uočavaju kod DĆ starih eksperimentalnih životinja, mogli da predstavljaju dobru polaznu osnovu za razvoj imunofarmakoloških „intervencija“ s ciljem da se spreče/umanje neželjeni efekti starenja na imunski sistem i patologiju koja je vezana za poremećaje njegove funkcije, odnosno da se poveća efikasnost imunskog odgovora, onda kada je to potrebno, npr. pred velike hirurške zahvate, pri davanju sezonske vakcine protiv gripa itd. Na osnovu svega izloženog može se zaključiti da rezultati kandidata mr sc. dr med. Biljane Bufan, koji su prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji predstavljaju originalan i značajan naučni doprinos oblasti Farmakologije - Imunofarmakologije. Rezultati doktorske disertacije su publikovani u dva rada: jedan rad u vrhunskom meñunarodnom časopisu kategorije M21 i jedan rad u meñunarodnom časopisu kategorije M23 i u vidu jednog saopštenja na meñunarodnom naučnom skupu (M34) i jednog saopštenja na skupu nacionalnog značaja štampanog u izvodu (M64). Uzimajući u obzir sve izloženo, Komisija u navedenom sastavu pozitivno ocenjuje doktorsku disertaciju mr sc. dr med. Biljane Bufan i predlaže Nastavno-naučnom veću Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati ovaj izveštaj i uputi Veću naučnih oblasti medicinskih nauka, radi dobijanja saglasnosti za javnu odbranu doktorske disertacije pod nazivom: „Uticaj starenja na fenotipske i funkcijske karakteristike dendritskih ćelija različitih sojeva pacova“. _____________________________________________ Dr Zorica Stojić-Vukanić-mentor (Predsednik komisije), vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet _____________________________________________ Dr Gordana Leposavić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet _____________________________________________ Dr Mirjana Dimitrijević, naučni savetnik, Centar za imunološka istraživanja „Branislav Janković“ Institut za virusologiju, serume i vakcine „Torlak“, Beograd Beograd, 04.07.2014.