UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET ALEKSANDRA M. STOJKOVIĆ BIOFARMACEUTSKA KARAKTERIZACIJA INTERAKCIJE CIPROFLOKSACINA I JONA METALA doktorska disertacija Beograd, 2014 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY ALEKSANDRA M. STOJKOVIĆ BIOPHARMACEUTICAL CHARACTERISATION OF CIPROFLOXACIN METALLIC CATION INTERACTION Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Doktorska disertacija je urađena na Katedri za farmaceutsku tehnologiju i kozmetologiju Univerziteta u Beogradu - Farmaceutskog fakulteta. Mentor _______________________________ Dr sc Jelena Parojčić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet Članovi komisije ________________________________ Dr sc Zorica Đurić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu - Farmaceutski fakultet _________________________________ Dr sc Owen I. Corrigan, professor emeritus School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Trinity College, University of Dublin, gostujući profesor na Univerzitetu u Beogradu Datum odbrane _____________________ BIOFARMACEUTSKA KARAKTERIZACIJA INTERAKCIJE CIPROFLOKSACINA I JONA METALA Rezime Biofarmaceutska karakterizacija podrazumeva sprovođenje odgovarajućih in vitro, in vivo i in silico ispitivanja s ciljem da se deo in vivo ispitivanja u ljudi zameni reproduktivnim i dobro standardizovanim laboratorijskim testovima. Mogućnost in vitro simuliranja dešavanja u ljudskom organizmu dobila je veći značaj sa primenom Biofarmaceutskog sistema klasifikacije lekova i primenom in vitro metoda u cilju predviđanja lek/lek interakcija i otkrivanja potencijalnih uzroka koji dovode do promena u apsorpciji lekovite supstance u gastrointestinalnom traktu. U in vitro uslovima se ne mogu u potpunosti reprodukovati uslovi koji postoje u organizmu, ali pažljiv odabir eksperimentalnih uslova može dati korisne podatke koji su u korelaciji sa in vivo podacima. Takođe, razvoj računarskih programa koji simuliraju proces apsorpcije iz gastrointestinalnog trakta, omogućio je korišćenje in silico metoda u predviđanju potencijalnih interakcija. Rezultati in vivo studija ukazuju na smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina nakon istovremene primene sa preparatima koji sadrže jone metala, a kao uzrok interakcije se navodi građenje kompleksa koji ne mogu da permeiraju membranu gastrointestinalnog trakta. Rezultati objavljenih in vitro studija su prilično kontradiktorni. Ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta u prisustvu jona metala pokazuju usporeno i nepotpuno oslobađanje ciprofloksacina, dok izvesni autori izveštavaju o povećanju rastvorljivosti u prisustvu jona metala. Cilj ove studije je bio da se otkrije mehanizam interakcije ciprofloksacina i jedinjenja gvožđa, aluminijuma, kalcijuma i cinka i razviju in vitro i in silico modeli za njihovu karakterizaciju kroz pregled rezultata in vivo, in vitro (ispitivanje rastvorljivosti, brzine rastvaranja, karakterizacija nastalih produkata interakcije) i in silico studija. U okviru eksperimentalnog rada, analizirani su literaturni in vivo podaci, sprovedeno je in vitro ispitivanje rastvorljivosti i brzine rastvaranja ciprofloksacina bez, kao i u prisustvu jedinjenja koja sadrže jone metala (gvožđe, aluminijum, kalcijum, cink). Čvrste faze prikupljene u toku in vitro ispitivanja su analizirane primenom odgovarajućih analitičkih metoda (XRD, DSC, TGA i FTIR). Za in silico simulaciju interakcije između ciprofloksacina i jona metala primenjen je GastroPlus tm softverski paket. Kao ulazni parametri neophodni za simulaciju (fizičkohemijske i farmakokinetičke osobine ciprofloksacina) korišćeni su literaturni podaci, eksperimentalno dobijene vrednosti i in silico predviđene vrednosti. Na osnovu rezultata ispitivanja rastvorljivosti, brzine rastvaranja i karakterizacije čvrstih faza zaključeno je da se mehanizmi interakcije razlikuju u zavisnosti od vrste i količine jona metala uključenih u interakciju. Za interakciju ciprofloksacin-hidrohlorida i jona metala, prilikom ispitivanja brzine rastvaranja, neophodno je obezbediti visoke koncentracije reaktanata u medijumu, a u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije veliki značaj ima korišćenje aparature sa mini lopaticom i malih zapremina medijuma. U in vitro uslovima nije uočena interakcija između ciprofloksacin-hidrohlorida i jona aluminijuma. U interakciji ciprofloksacin- hidrohlorida i jona kalcijuma dolazi do izdvajanja hidratisanog oblika ciprofloksacin baze, usled značajnog povećanja pH vrednosti sredine. Kao proizvod interakcije ciprofloksacin-hidrohlorida sa gvožđe(II)-sulfatom i cink-sulfatom izolovani su slabo rastvorljivi kompleksi, sa strukturom istog tipa Me(SO4)2(Cl)2(cf)2×12H2O (Me = Fe ili Zn) koji do sada nisu opisani u literaturi. U interakciji ciprofloksacin-hidrohlorida i cink-hlorida izolovan je slabo rastvorljiv kompleks čija je struktura (cfH2)2(ZnCl4)×2H2O. U in silico ispitivanju, rastvorljivost i permeabilnost leka su identifikovani kao kritični faktori koji utiču na brzinu i obim apsorpcije pri čemu je pokazano da na biološku raspoloživost ciprofloksacina u prisustvu jona metala najviše utiče promena rastvorljivosti. Dobijeni rezultati pokazuju da sveobuhvatna analiza in vivo rezultata, uz primenu odgovarajućih in vitro i in silico metoda predstavlja korisno sredstvo za simulaciju potencijalnih fizičkohemijskih interakcija lekova. Ključne reči: brzina rastvaranja, ciprofloksacin, in silico simulacija interakcije, karakterizacija čvrste faze, lek-lek interakcija, rastvorljivost Naučna oblast: Farmacija Uža naučna oblast: Farmaceutska tehnologija UDK broj: 615.33 : 542.2 (043.3) 615.033 : 615.2 (043.3) BIOPHARMACEUTICAL CHARACTERISATION OF CIPROFLOXACIN METALLIC IONS INTERACTION Abstract Biopharmaceutical characterisation involves relevant in vitro and in silico methods that have been recognized as key tools that should provide an insight into the dosage form in vivo performance. With the introduction of Biopharmaceutics Classification System (BCS) and the increased understanding of gastrointestinal physiology in vitro methodology is increasingly considered as biorelevant and predictive of drug product bioperformance. There is an increased interest for in vitro investigation of drug–drug and food–drug interactions and it has been shown that in vitro studies can be used to predict physicochemical interactions that are likely to influence drug absorption rate in vivo. Although, in vivo conditions can’t be adequately reproduced in vitro, it is expected that in certain situations, in vitro tests can reflect in vivo drug performance and may be used as a surrogate for in vivo bioequivalence studies. In addition, gastrointestinal simulation technology can be successfully used as a tool for investigating the mechanism of drug-drug interactions observed in vivo. Numerous in vivo studies have shown reduced bioavailability of ciprofloxacin after simultaneous administration of metallic cations containing preparations. Formation of a nonabsorbable complex has been postulated as the interaction mechanism. However, literature in vitro data related to ciprofloxacin interaction with metallic ions are somewhat contradictory. Ciprofloxacin tablet dissolution has been shown to be retarded, while some solubility studies indicate increased solubility in the presence of metallic ions containing preparations. The aim of this study was to investigate the potential mechanisms of ciprofloxacin metallic ions interaction observed in vivo by performing in vitro solubility and dissolution studies in the reactive media containing different metallic compounds. Different compounds of iron, calcium, aluminium and zinc have been used throughout the study. In order to identify the nature of any physicochemical interactions, characterisation of the solid phases formed was performed. Gastrointestinal mechanistic simulation model was employed in order to simulate interactions between ciprofloxacin and the selected metallic ions and elucidate potential interaction mechanism/s. A detailed survey of the literature data available on ciprofloxacin–metallic ions interaction has been performed. Solubility and dissolution studies were performed without and with metallic compounds addition. The solid phases generated from the interaction mixture of ciprofloxacin hydrochloride and metallic compounds were examined by powder XRD, DSC, TGA, and FTIR. Commercially available software GastroPlus tm was used for gastrointestinal simulations of drug absorption. The required input parameters related to ciprofloxacin physicochemical and pharmacokinetic characteristics were experimentally determined, in silico generated or taken from the literature. Ciprofloxacin hydrochloride-metallic ion in vitro interaction studies revealed that drug solubility and dissolution were impaired to a different extent depending on the type and the amount of the metallic compound present. Interaction occurs in mixtures containing relatively high drug concentration and the results obtained emphasize the importance of using mini scale apparatus in biopharmaceutical characterisation of drug-drug interactions. In the case of aluminium, no phase changes were observed. The solid phase generated in the presence of calcium carbonate was identified as hydrated ciprofloxacin base. In the presence of ferrous sulfate and zinc sulfate, a novel complex consistent with a stoichiometry of Me(SO4)2(Cl)2(cf)2×12H2O (Me = Fe or Zn) was formed. Interaction between ciprofloxacin hydrochloride and zinc chloride resulted in low soluble complex formation with chemical structure (cfH2)2(ZnCl4)×2H2O. The results obtained from gastrointestinal simulation identified solubility and permeability as critical parameters affecting the rate and extent of ciprofloxacin absorption. It was found that reduced ciprofloxacin absorption in the presence of metallic cations was accounted for by reduced drug solubility. Comprehensive analysis of in vivo, in vitro and in silico data is necessary for biopharmaceutical characterisation of drug-drug interaction and the approach presented could be applied to other fluorquinolone–metal interactions showing reduced absorption in vivo. Keywords: ciprofloxacin, dissolution, drug-drug interaction, in silico simulation, solid state characterisation, solubility Scientific field: Pharmacy Specific scientific field: Pharmaceutical technology UDC number: 615.33 : 542.2 (043.3) 615.033 : 615.2 (043.3) Sadržaj: I OPŠTI DEO......................................................................................................... 1 1.Interakcije lekova................................................................................................ 2 1.1 Farmakodinamičke interakcije......................................................................... 3 1.2 Farmakokinetičke interakcije........................................................................... 3 1.2.1 Mehanizam interakcija koje utiču na proces apsorpcije............................... 5 1.2.1.1 Fizičko-hemijske interakcije...................................................................... 5 1.2.1.2 Fiziološke interakcije................................................................................. 7 1.2.1.3 Ostale interakcije....................................................................................... 8 1.3 Ispitivanja interakcija lekova........................................................................... 9 2. Biofarmaceutska karakterizacija interakcije lekova.......................................... 11 2.1 Biofarmaceutski sistem klasifikacije lekova................................................... 11 2.1.1. Primena Biofarmaceutskog sistema klasifikacije u ispitivanju interakcija lekova.................................................................................................................... 12 2.2 In vivo metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova............. 14 2.3 In vitro metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova............ 15 2.3.1 Rastvorljivost................................................................................................ 16 2.3.2 Ispitivanje brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata...................... 17 2.3.3 Određivanje permeabilnosti.......................................................................... 20 2.4 In silico metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova........... 22 2.4.1 Unapređeni prostorni model apsorpcije i tranzita......................................... 22 3. Ciprofloksacin.................................................................................................... 26 3.1 Fizičko-hemijske i biofarmaceutske karakteristike ciprofloksacina................ 26 3.1.1 Soli, polimorfizam i kristalni oblici, građenje kompleksa............................ 26 3.1.2 Konstante disocijacije................................................................................... 27 3.1.3 Rastvorljivost................................................................................................ 27 3.1.4 Particioni i distribucioni koeficijent.............................................................. 29 3.1.5 Permeabilnost................................................................................................ 29 3.1.6 Klasifikacija prema BSK.............................................................................. 30 3.2 Farmakokinetičke karakteristike...................................................................... 30 3.3 Interakcije ciprofloksacina sa jonima metala................................................... 31 3.3.1 Pregled in vivo studija................................................................................... 31 3.3.2 Pregled in vitro studija.................................................................................. 35 4. CILJ ISTRAŽIVANJA..................................................................................... 38 II EKSPERIMENTALNI DEO............................................................................ 39 5. MATERIJAL I METODE................................................................................. 40 5.1 Materijal........................................................................................................... 40 5.2 Metode............................................................................................................. 40 5.2.1 In vivo podaci................................................................................................ 40 5.2.2 Ispitivanje rastvorljivosti............................................................................... 41 5.2.3 Ispitivanje brzine rastvaranja........................................................................ 42 5.2.4 Građenje kompleksa...................................................................................... 43 5.2.5 Metode karakterizacije čvrste faze................................................................ 43 5.2.5.1 Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)........................................ 43 5.2.5.2 Termogravimetrija (TGA).......................................................................... 43 5.2.5.3 Difrakcija X-zraka (XRD)......................................................................... 44 5.2.5.4 Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR)......... 44 5.2.5.5 Kvantitativno određivanje cinka................................................................ 44 5.2.5.6 Kvantitativno određivanje gvožđa, sulfata i hlorida.................................. 44 5.2.6 In silico metode............................................................................................. 45 5.2.6.1 Numerička dekonvolucija.......................................................................... 45 5.2.6.2 GastroPlus tm programski paket.................................................................. 45 6 REZULTATI I DISKUSIJA.............................................................................. 47 6.1. In vivo ispitivanja............................................................................................ 47 6.1.1 In vivo interakcija ciprofloksacina sa jonima metala.................................... 50 Soli gvožđa............................................................................................................. 50 Jedinjenja aluminijuma i kalcijuma....................................................................... 51 Jedinjenja cinka...................................................................................................... 52 6.2. In vitro ispitivanja........................................................................................... 58 6.2.1. Ispitivanje rastvorljivosti ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida..... 58 6.2.2 Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta............................... 60 6.2.3. Interakcija ciprofloksacina i jona gvožđa.................................................... 63 6.2.3.1 Interakcija između ciprofloksacina i gvožđe(II)-sulfata............................ 63 Ispitivanje rastvorljivosti........................................................................................ 63 Ispitivanje brzine rastvaranja................................................................................. 64 Građenje kompleksa............................................................................................... 69 Karakterizacija čvrste faze..................................................................................... 70 6.2.3.2 Interakcija između ciprofloksacina i gvožđe(II)-glukonata/ gvožđe(II)- fumarata................................................................................................................. 74 Ispitivanje rastvorljivosti........................................................................................ 74 Ispitivanje brzine rastvaranja................................................................................. 75 6.2.4 Interakcija između ciprofloksacina i jedinjenja aluminijuma....................... 77 Ispitivanje rastvorljivosti........................................................................................ 78 Ispitivanje brzine rastvaranja................................................................................. 80 Karakterizacija čvrstih faza.................................................................................... 85 6.2.5 Interakcija između ciprofloksacina i jedinjenja kalcijuma........................... 88 Ispitivanje rastvorljivosti........................................................................................ 88 Ispitivanje brzine rastvaranja................................................................................. 90 Građenje kompleksa............................................................................................... 95 Karakterizacija čvrstih faza.................................................................................... 95 6.2.6 Interakcija između ciprofloksacina i jona cinka........................................... 99 Ispitivanje rastvorljivosti........................................................................................ 99 Ispitivanje brzine rastvaranja................................................................................. 102 Građenje kompleksa............................................................................................... 106 Karakterizacija čvrstih faza.................................................................................... 108 6.3 In silico ispitivanja........................................................................................... 131 6.3.1 Gastrointestinalna simulacija apsorpcije ciprofloksacina............................. 131 6.3.2 Simulacija interakcije ciprofloksacina i jona gvožđa............................................... 136 Simulacija interakcije ciprofloksacina sa gvožđe(II)-sulfatom......................................... 137 Simulacija interakcije ciprofloksacina sa gvožđe(II)-glukonatom.................................... 140 6.3.3 Simulacija interakcije ciprofloksacina sa aluminijum-hidroksidom............. 143 6.3.4 Simulacija interakcije ciprofloksacina sa kalcijum-karbonatom.................. 148 6.3.5 Simulacija interakcije ciprofloksacina i jona cinka.................................................. 152 7. ZAKLJUČCI..................................................................................................... 166 8. LITERATURA.................................................................................................. 171 BIOGRAFIJA....................................................................................................... 188 Prilog 1 IZJAVA O AUTORSTVU Prilog 2 IZJAVA O ISTOVETNOSTI ŠTAMPANE I ELEKTRONSKE VERZIJE DOKTORSKOG RADA Prilog 3 IZJAVA O KORIŠĆENJU 1 I OPŠTI DEO 2 1. Interakcije lekova Apsorpcija lekovite supstance iz gastrointestinalnog trakta (GIT) zavisi od velikog broja faktora koji se odnose na karakteristike same lekovite supstance, formulaciju farmaceutskog oblika, kao i fiziološke uslove u GIT-u. S obzirom da se u toku terapije, lekovi često kombinuju ili se primenjuju uz obrok u cilju poboljšanja komplijanse, promene u GIT-u, nastale kao posledica prisustva drugog leka ili komponenata hrane, mogu uticati na biološku raspoloživost lekovite supstance i dovesti do varijacija u terapijskoj efikasnosti. Apsorpcija lekovite supstance u prisustvu druge lekovite supstance ili nekog od sastojaka hrane može biti ubrzana, odložena, smanjena ili povećana usled fizioloških promena, kao i usled fizičkih i/ili hemijskih interakcija. Usled promene uslova u GIT-u može doći do promene rastvorljivosti, hemijske stabilnosti i/ili permeabilnosti lekovite supstance. U savremenoj farmakoterapiji nije moguće izbeći istovremeno propisivanje većeg broja lekova jednom bolesniku, pa ''polifarmacija'' značajno povećava potencijal za pojavu interakcija. Prisustvo hrane u GIT-u može u značajnoj meri uticati na brzinu pražnjenja želuca, dovesti do promene intestinalne pH vrednosti, intraluminalnog viskoziteta, kao i stepena solubilizacije slabo rastvorljivih lekovitih supstanci. Takođe, nakon uzimanja obroka može doći do promena u lučenju želudačne kiseline, žuči i pankreasnog soka, promena u pokretljivosti, kao i promena u viscelarnom protoku krvi i limfe, što može dovesti do promene u apsorpciji lekovite supstance i uticati na njen metabolizam. Interakcije se mogu definisati kao promene u farmakodinamičkim i/ili farmakokinetičkim osobinama lekovitih supstanci, koje su izazvane istovremenom primenom sa drugim lekovitim supstancama ili komponentama hrane (1). Veliko interesovanje za ispitivanje interakcije lekova je počelo kada je, na osnovu rezultata odgovarajućih studija, pokazano da interakcije lekova predstavljaju važan činilac u pojavi neželjenih dejstava lekova (1-7). U literaturi se mogu pronaći brojne studije koji se bave lek-lek i lek-hrana interakcijama. Primena jedne lekovite supstance može promeniti dejstvo druge lekovite supstance jednim od dva mehanizma: - modifikacija farmakološkog efekta lekovite supstance bez promene koncentracije u telesnim tečnostima (farmakodinamičke interakcije); - promena koncentracije lekovite supstance koja dospeva na mesto dejstva 3 (farmakokinetičke interakcije) (1). 1.1 Farmakodinamičke interakcije Karakteristika ovog tipa interakcije jeste da lekovite supstance stupaju u interakciju ili na mestu dejstva (direktne) ili na različitim mestima (indirektne). Direktne interakcije se dešavaju kada dve lekovite supstanca deluju na isti organ kao sinergisti ili antagonisti (1, 8). Indirektne interakcije se dešavaju kada lek „izazivač“ na posredan način menja dejstvo „glavnog“ leka. 1.2 Farmakokinetičke interakcije Farmakokinetičke interakcije se mogu javiti u toku svih farmakokinetičkih procesa (apsorpcija, distribucija, metabolizam i izlučivanje). Farmakokinetičke interakcije su predmet velikog interesovanja, a dejstvo lekovitih supstanci, usled interakcije, može biti oslabljeno ili pojačano (1). U fazi apsorpcije, sastojci hrane ili drugi lekovi, uglavnom, usporavaju prelazak lekova u cirkulaciju ili smanjuju biološku raspoloživost lekovitih supstanci stvarajući u intestinumu nerastvorljive ili slabo permeabilne komplekse. Primena vazokonstriktora na mestu odakle se apsorbuje lek dovodi do usporavanja apsorpcije drugog leka, a takođe i lekovi koji usporavaju motilitet GIT-a (spazmolitici) mogu da uspore apsorpciju drugih lekova. Apsorpcija može biti ubrzana posle primene lekova koji ubrzavaju pražnjenje želuca (metoklopramid, na primer) (1, 8). U fazi distribucije, jedna lekovita supstanca može promeniti distribuciju druge, paralelno primenjene lekovite supstance, ali su takve interakcije retko klinički značajne. Istiskivanje leka sa njegovih mesta za vezivanje na proteinima plazme ili u tkivima, prolazno povećava količinu slobodnog (nevezanog) leka, ali je to praćeno povećanim izlučivanjem, pa nastupa novo stanje ravnoteže. Posledice ovakvih interakcija su pojačanje dejstva i, potencijalno, toksičnosti, a one se mogu izbeći pravilnim izborom lekova i postepenim uvođenjem novog leka u terapiju (1, 4, 8). U fazi metabolizma postoji najviše mogućnosti za interakcije lekova, budući da se lekovite supstance dominantno metabolišu u jetri, koristeći pri tome često iste metaboličke puteve, odnosno, konkurišući za iste grupe enzima. Kao posledica interakcije može doći do 4 indukcije ili inhibicije enzima, što smanjuje, odnosno, povećava farmakološku aktivnost drugih lekovitih supstanci (1, 8, 9). Česte su i interakcije u fazi izlučivanja jer lekovi konkurišu za procese aktivnog transporta ili sekrecije u tubulima. Zato u plazmi dolazi do povećanja koncentracije lekovite supstance, pa se pojačava njihovo dejstvo i toksičnost. Ukoliko je dominantni put eliminacije leka ekskrecijom preko bubrega, interakcije se mogu događati na nivou promena u vezivanju za proteine plazme i na nivou brzine glomerularne filtracije. Pored toga, uticaj na pH urina, proces pasivne reapsorpcije lekova, kao i proces tubularne sekrecije može biti od značaja za promenu koncentracije leka u plazmi (1). Sa biofarmaceutskog aspekta su značajne interakcije na nivou apsorpcije. Šematski prikaz faktora koji mogu uticati na proces apsorpcije oralno primenjenih lekova dat je na slici 1. Slika 1. Šematski prikaz faktora koje utiču na proces apsorpcije (prema ref. 10) Fig. 1. Factors that lead to potential interactions in oral drug absorption (according to ref. 10) Lekoviti preparat raspadanje, rastvaranje lekovite supstance u intestinalnoj tečnosti lekovita supstanca u obliku rastvora dostupna za apsorpciju promena pH vrednosti sredine, kompleksiranje, adsorpcija Fizičkohemijske interakcije promena motiliteta, vremena prolaska kroz GIT, stepena eliminacije, sekrecije žuči i pankreasnih enzima Fiziološke interakcije 5 1.2.1 Mehanizam interakcija koje utiču na proces apsorpcije Interakcije koje se dešavaju na nivou procesa apsorpcije mogu uticati na brzinu rastvaranja lekovite supstance, difuziju rastvorene lekovite supstance do mesta apsorpcije, pražnjenje sadržaja iz GIT-a i vreme prolaska kroz intestinalni trakt i permeabilnost lekovite supstance. Kao posledica interakcije mogu se javiti ubrzanje procesa apsorpcije lekovite supstance, odložen početak apsorpcije, smanjen ili povećan obim apsorpcije (10). Kod većine lekova proces apsorpcije kroz epitel creva se odvija pasivnom difuzijom i prolaz lekovite supstance je direktno proporcionalan koncentracionom gradijentu i particionom koeficijentu lekovite supstance. Promena pH vrednosti sredine, interakcija sa jonima prisutnim u GIT-u ili prisustvo lekova koji usporavaju pražnjenje želuca mogu uticati na proces apsorpcije pasivnom difuzijom (7). Interakcije lekova i/ili interakcije lekova sa hranom se mogu klasifikovati kao: (I) fizičko-hemijske i (II) fiziološke (10). 1.2.1.1 Fizičko-hemijske interakcije Fizičko-hemijske interakcije se mogu javiti između lekova i hrane, između dva lekovita preparata ili lekovite supstance i nekog od prisutnih ekscipijensa. Brzina i obim apsorpcije oralno datog leka zavisi od brzine oslobađanja aktivne supstance iz preparata, njene rastvorljivosti i permeabilnosti. Svi faktori koji mogu uticati na ove parametre, potencijalno, mogu dovesti i do promene u biološkoj raspoloživosti, a time i ispoljavanju terapijskog efekta leka. Na brzinu rastvaranja lekovite supstance može uticati promena pH vrednosti sredine, kompleksiranje sa jonima metala poreklom iz hrane, drugih lekovitih preparata ili dijetetskih suplemenata ili adsorbovanje na sastojke hrane ili sastojke drugih lekovitih preparata. Hemijska degradacija lekovite supstance u GIT-u takođe može uticati na proces apsorpcije. Fizičke barijere, kao što je povećan viskozitet u lumenu intestinuma mogu da uspore difuziju lekovite supstance kroz intestinalnu membranu i da smanje stepen apsorpcije (10). Promena pH vrednosti sredine može dovesti do promene u stabilnosti lekovite supstance i do različitih fizičkih ili hemijskih promena. pH vrednost u želucu varira u rasponu 1-3 kod zdravih osoba, a prelaskom u druge delove GIT-a dolazi do porasta pH vrednosti. 6 Na slici 2 dat je šematski prikaz promena pH vrednosti u različitim delovima GIT-a (5). Promena pH vrednosti dovodi do promene odnosa jonizovanog i nejonizovanog oblika lekovite supstance što može uticati na njenu apsorpciju (5). Slika 2: pH vrednosti u različitim delovima GIT-a (prema ref. 5) Fig. 2. pH values in different GIT compartments (according to ref. 5) Primena antacida i hrane dovodi do promene pH vrednosti u želucu. Jedinjenja koja imaju karakteristike slabih kiselina ne jonizuju u želucu i uglavnom se apsorbuju pasivnom difuzijom. Istovremena primena antacida povećava pH vrednost u želucu, pri čemu slaba kiselina jonizuje, što dovodi do smanjenja apsorpcije. Osim antacida, u ovim interakcijama mogu učestvovati i lekovi koji direktno deluju na sekreciju želudačne kiseline (ranitidin, famotidin, cimetidin i H2-antagonisti) i time indirektno utiču na pH vrednost želuca (5, 9). Interakcija između jonizovanih supstanci može dovesti do nastanka i precipitacije slabo rastvorljivih soli i kompleksa. Kompleksiranje i precipitacija mogu biti uslovljeni promenama u jonskoj jačini, temperaturi ili pH vrednosti sredine. Da bi se sprečile ove interakcije potrebno je poznavati fizičke i hemijske karakteristike supstanci koje stupaju u interakciju (5). U formiranju kompleksa najčešće učestvuju joni metala i, kao ligand, lekovita supstanca želudac proksimalni deo intestinuma distalni deo intestinuma 7 koja poseduje u strukturi grupe koje mogu biti helirane. Da bi se nagradio kompleks, potrebno je da postoje najmanje dva liganda koja mogu da vežu jon metala. Nakon stvaranja kompleksa, rastvorljivost i permeabilnost supstance-liganda može biti promenjena, pa dolazi do smanjenja ili povećanja apsorpcije lekovite supstance (5). U literaturi se navodi primer građenja kompleksa tetraciklina sa jonima metala, pri čemu dolazi do smanjenja apsorpcije tetraciklina (11). Interakcija kumarina sa jonima magnezijuma dovodi do građenja kompleksa i apsorpcija kumarina se povećava (12). U literaturi se mogu naći i podaci o interakciji jona metala i fluorohinolonskih antibiotika, pri čemu se kao mehanizam interakcije navodi građenje kompleksa koji ne mogu da permeiraju membranu GIT-a (13-17). Supstance koje poseduju sposobnost adsorbovanja, kao što su hidroksidi magnezijuma i aluminijuma se često upotrebljavaju istovremeno sa drugim lekovima, pri čemu mogu stupiti u interakciju sa njima. Ove interakcije su nespecifične, a istovremena upotreba može u manjem ili većem stepenu uticati na proces apsorpcije. Ukoliko do adsorpcije dođe pre dolaska do mesta apsorpcije, koncentracija supstance dostupna na mestu apsorpcije biće smanjena. Pod uticajem elektrolita u GIT-u, lekovita supstanca se može odvojiti od adsorbensa pre mesta apsorpcije i proces apsorpcije se u tom slučaju odvija nesmetano (5). 1.2.1.2 Fiziološke interakcije Istovremena primena većeg broja lekova ili primena lekova sa hranom može uticati na fiziološke uslove u GIT-u i na proces apsorpcije, pa se takve interakcije svrstavaju u fiziološke (10). Fiziološke karakteristike pojedinih regiona GIT-a (motilitet, pH vrednost) takođe mogu doprineti pojavi interakcija. Usled interakcije sa hranom/lekovima, uslovi u lumenu GIT-a mogu biti promenjeni, pa može doći do promena u motilitetu, vremenu prolaska kroz intestinum, brzini pražnjenja ili promena u sekreciji pankreasnih ili žučnih sokova. Na apsorpciju lekovite supstance prisutne u rastvoru nakon oslobađanja iz lekovitog oblika značajno utiče varijabilno vreme prolaska i zadržavanja u različitim delovima GIT-a (10). Većina lekovitih supstanci se apsorbuje u proksimalnim delovima intestinuma, pa supstance koje utiču na pražnjenje želuca mogu uticati na oslobađanje lekovite 8 supstance i na njenu dostupnost na mestu apsorpcije. Brzina pražnjenja želuca zavisi od sadržaja u želucu, pH, osmolarnosti, viskoziteta i temperature (10). Obrok bogat proteinima može uticati na pH vrednost u želucu, pa se menja i brzina pražnjenja želuca. Ukoliko se brzina pražnjenja želuca smanji, to može dovesti do smanjenja apsorpcije lekovitih supstanci koje su nestabilne u kiseloj sredini. Ukoliko dođe do povećanja pH vrednosti u želucu, slabo bazne lekovite supstance mogu da precipitiraju što, takođe, utiče na proces apsorpcije. Sporije pražnjenje želuca može da ima povoljan uticaj u slučaju nejonizovanih, slabo rastvorljivih lekovitih supstanci, s obzirom da može pospešiti njhovo rastvaranje i apsorpciju (10). Interakcije koje se dešavaju u proksimalnim delovima intestinuma u najvećoj meri utiču na proces apsorpcije lekovite supstance. Vreme prolaska kroz intestinum uglavnom traje između 3 i 4 h i ne zavisi u velikoj meri od primene hrane (10). Razlozi za smanjenje apsorpcije mogu biti precipitacija lekovitih supstanci koje pokazuju pH zavisnu rastvorljivost, degradacija pod dejstvom enzima pankreasa i kompleksiranje. Usled prisustva hrane, dolazi do povećanja lučenja žučnih soli. Žučne soli solubilizuju slabo rastvorljive supstance, pa dolazi do povećanja obima apsorpcije (10). 1.2.1.3 Ostale interakcije Poseban tip interakcija predstavljaju interakcije koje se dešavaju na zidu creva i ispoljavaju kao promena permeabilnosti membrane (10). U ovaj tip interakcija spadaju interakcije sa mukusom i epitelom GIT-a, interakcije koje dovode do promena u paracelularnom transportu, promena u transportnim enzimima, protoku krvi, kao i promene u putevima eliminacije (10, 18). Kompeticija između lekovitih supstanci ili komponenata hrane za transportere u intestinalnoj membrani takođe može dovesti do promena u procesu apsorpcije. Do smanjenja količine apsorbovanog leka dolazi usled zasićenja kapaciteta transportera koji se nalaze na membrani (10). Na proces apsorpcije može uticati i proces intestinalne eliminacije koji obuhvata sekreciju i metabolizam. Intestinalna eliminacija supstanci pod dejstvom P- glikoproteina ograničava apsorpciju velikog broja lekovitih supstanci (10). Utvrđeno je da se P-glikoprotein nalazi na velikom broju enterocita gde ispoljava zaštitnu ulogu tako 9 što transportuje toksične supstance ili metabolite izvan ćelija. Povećana ekspresija P- glikoproteina u intestinumu može da ograniči apsorpciju supstrata ovog transportnog proteina, smanjujući, na taj način, njegovu bioraspoloživost i otežavajući održavanje terapijskih koncentracija u plazmi (9). 1.3 Ispitivanje interakcija lekova Istovremena primena lekova može dovesti do toga da lekovite supstance stupe u interakciju, pri čemu dolazi do potenciranja ili slabljenja njihovog dejstva. Razvoj nauke u oblasti farmakokinetike i proučavanje farmakodinamičkih osobina lekovite supstance doveo je do pojave ciljanih studija o interakcijama lekova u postupku razvoja novog leka. U zavisnosti od strukturnih i fizičko-hemijskih osobina supstanci, potrebno je sprovesti odgovarajuća in vitro ispitivanja, kao i određena in vivo ispitivanja u fazi kliničkih studija. Na osnovu dobijenih rezultata mogu se predvideti klinički značajne interakcije. Pojava sve većeg broja zabeleženih slučajeva lek-lek ili lek-hrana interakcija koje utiču na terapijsku efikasnost primenjenog leka, bila je podsticaj da EMA 1997. godine izda regulatorne smernice za ispitivanje interakcija (19), koje su dopunjene 2012. godine (20). Takođe, FDA je izdala dokument sa regulatornim smernicama za ispitivanje interakcija lekova (21). Ove regulatorne smernice sadrže uputstva za ispitivanje lek-lek ili lek-hrana interakcija i preporuke kako prilagoditi način primene i dozu leka da bi se izbegla pojava interakcija. Zahvaljujući smernicama moguće je, uz korišćenje određenog broja in vitro i in vivo ispitivanja, predvideti pojavu klinički značajnih interakcija lekova. Preporuka je da se mogućnost pojave interakcija ispita u fazi razvoja leka i trebalo bi da bude sastavni deo dokumentacije o bezbednosti i efikasnosti leka. Da bi se sprečila pojava neželjenih efekata ili promena u terapijskoj efikasnosti potrebno je utvrditi potencijal za stupanje u interakciju. EMA regulatorne smernice daju preporuke za ispitivanje kako farmakokinetičkih, tako i farmakodinamičkih interakcija, dok su smernice FDA usmerene samo na ispitivanje farmakokinetičkih interakcija koje se javljaju na nivou metabolizma. Preporuka je da se ispitivanje farmakokinetičkih interakcija in vivo obavlja u ljudi, jer je teško uspostaviti korelaciju između pojedinih životinjskih vrsta i čoveka. Ispitivanje 10 lek-hrana interakcije bi trebalo da se sprovodi u ljudi, ispitivanjem uticaja obroka bogatog mastima na apsorpciju primenjenog leka. Trebalo bi razmotriti i pojavu interakcija na nivou apsorpcije, distribucije, metabolizma i eliminacije. Ukoliko je in vivo uočena pojava interakcije, u cilju otkrivanja potencijalnog mehanizma interakcije potrebno je sprovesti odgovarajuće in vitro i in vivo studije. Ispitivanje interakcija na nivou apsorpcije može pomoći u otkrivanju kritičnih faktora koji utiču na rastvorljivost, brzinu rastvaranja ili permeabilnost lekovite supstance in vivo. Ova ispitivanja se rade za preparate za oralnu primenu, ali i za pojedine inhalacione preparate. Lek-lek ili lek-hrana interakcije koje utiču na proces apsorpcije su relativno česta pojava, pa se prilikom proučavanja ovog tipa interakcija moraju analizirati fizičko-hemijske karakteristike supstanci i njihovih formulacija (pH zavisna rastvorljivost, brzina rastvaranja, adsorpcija i mogućnost građenja kompleksa), farmakokinetičke osobine (mehanizam apsorpcije, biološka raspoloživost, metabolizam prvog prolaza, enterohepatička cirkulacija), farmakodinamičke karakteristike (efekat na pokretljivost i pražnjenje u GIT-u, sekrecija žuči, pH vrednost u želucu, protok krvi i gastrointestinalna flora), kao i toksični efekti i mogućnost oštećenja GIT membrana. U slučaju lek-hrana interakcija se mora uzeti u obzir da dejstvo hrane na apsorpciju može trajati nekoliko sati, pa se u in vivo studijama mora ispitati trajanje efekta, kako bi se adekvatno podesilo doziranje (19). Ukoliko lekovita supstanca pokazuje pH zavisnu rastvorljivost, potrebno je ispitati njenu rastvorljivost u fiziološkom opsegu pH vrednosti, kako bi se procenio uticaj na apsorpciju istovremeno primenjenih lekova koji dovode do povećanja pH vrednost u želucu. 11 2. Biofarmaceutska karakterizacija interakcije lekova Pod biofarmaceutskom karakterizacijom se podrazumeva sprovođenje in vivo, in vitro i in silico ispitivanja lekovitih supstanci i lekovitih preparata sa ciljem da se deo in vivo ispitivanja u ljudi zameni reproduktivnim i dobro standardizovanim laboratorijskim testovima. Ovim su obuhvaćena in vitro ispitivanja vezana za klasifikaciju lekovite supstance u skladu sa konceptom Biofarmaceutskog sistema klasifikacije lekova (određivanje rastvorljivosti i permeabilnosti), kao i karakterizaciju samog preparata u pogledu brzine rastvaranja lekovite supstance. Poželjno je da se lekovita supstanca okarakteriše i svrsta u odgovarajuću grupu Biofarmaceutskog sistema klasifikacije (BSK) kako bi se predvideli ograničavajući faktori za njenu apsorpciju i olakšao rad na razvoju odgovarajuće formulacije lekovitog preparata, kao i razvoj biorelevantne metodologije za ispitivanje brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata. 2.1 Biofarmaceutski sistem klasifikacije lekova Polazeći od biofarmaceutskih principa i mehanističkih modela koji opisuju proces apsorpcije lekovitih supstanci nakon oralne primene preparata, 1995. godine je predložen, takozvani, Biofarmaceutski sistem klasifikacije lekova (22). Ovaj sistem je zasnovan na podeli prema rastvorljivosti i permeabilnosti lekovite supstance, i, za sada, se odnosi na konvencionalne farmaceutske oblike lekova za oralnu primenu. Kada se govori o konvencionalnim preparatima za oralnu primenu, podrazumeva se da brzina oslobađanja lekovite supstance iz farmaceutskog oblika zavisi od njene rastvorljivosti, a brzina apsorpcije u organizmu od permeabilnosti same lekovite supstance. BSK je takođe osnova za prihvatanje biowaivera, odnosno izostavljanje in vivo ispitivanja biološke ekvivalentnosti (BE) na osnovu in vitro karakterizacije farmaceutskog preparata (22, 23). S obzirom da se, u većini slučajeva, lekovita supstanca primenjuje u čvrstom stanju, kao preduslov za apsorpciju, potrebno je da se lekovita supstanca oslobodi iz lekovitog oblika i rastvori u telesnim tečnostima. Zbog toga se najveći broj ispitivanja u okviru biofarmaceutske karakterizacije lekova odnosi na procenu rastvorljivosti i brzine 12 rastvaranja lekovite supstance. Karakterizacija lekovite supstance u pogledu brzine rastvaranja i brzine apsorpcije se može izvršiti na osnovu bezdimenzionih parametra kao što su: dozni broj (Do), broj brzine rastvaranja (Dn) i apsorpcioni broj (An) (22-24). Ovi parametri su definisani imajući u vidu uticaj različitih fizičko-hemijskih (in vitro) i fizioloških (in vivo) parametara i predstavljaju osnov za klasifikaciju lekovitih supstanci, kao i predviđanje frakcije apsorbovanog leka (Fa). Rastvorljivost, kao i permeabilnost, se mogu opisati kao „visoka“ ili „niska“, pa su, u okviru predloženog sistema klasifikacije, formirane četiri grupe. 2.1.1. Primena Biofarmaceutskog sistema klasifikacije u ispitivanju interakcija lekova Kao što je već napomenuto, prednost BSK je identifikacija ključnih faktora koji kontrolišu proces apsorpcije lekovite supstance iz preparata. Takođe je definisana mogućnost uspostavljanja in vitro-in vivo korelacije (IVIVK) (25, 26). Supstance koje pripadaju BSK grupi 1 karakteriše visoka rastvorljivost i visoka permeabilnost. Apsorpcija lekova iz ove grupe, primenjenih u obliku preparata sa trenutnim oslobađanjem ne zavisi od brzine rastvaranja lekovite supstance i/ili vremena prolaska kroz GIT, već zavisi od brzine pražnjenja želuca (22). Uspostavljanje IVIVK je moguće ukoliko je brzina rastvaranja lekovite supstance sporija od brzine pražnjenja želuca (22, 23, 25, 26). Lekovite supstance koje pripadaju ovoj grupi su dobri kandidati za formulaciju lekova sa modifikovanim oslobađanjem. S obzirom da brzina pražnjenja želuca kontroliše brzinu i obim apsorpcije ovih lekova, očekuje se da će interakcije koje odlažu pražnjenje želuca odložiti i proces apsorpcije (10). Supstance koje pripadaju BSK grupi 2 karakteriše niska rastvorljivost i visoka permeabilnost. Rastvorljivost i/ili brzina rastvaranja u in vivo uslovima je kritični faktor koji ograničava apsorpciju lekova BSK grupe 2 (22). Preporuka je da se prilikom ispitivanja brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata sa trenutnim oslobađanjem u in vitro uslovima koriste medijumi različitih pH vrednosti (1.2 - 6.8). Takođe je, kada je opravdano, dozvoljen dodatak surfaktanata u medijum ili korišćenje fiziološki zasnovanih medijuma za ispitivanje brzine rastvaranja (22, 27). Apsorpcija lekova iz ove grupe je često poboljšana u prisustvu obroka koji je bogat mastima, jer dolazi do 13 solubilizacije slabo rastvorljive lekovite supstance (10). Takođe, interakcije koje dovode do povećanja rastvorljivosti ili brzine rastvaranja u GIT-u, imaju pozitivan efekat na proces apsorpcije (10). U slučaju lekovitih supstanci BSK grupe 3, permeabilnost je ograničavajući faktor za apsorpciju (22). Supstance koje pripadaju ovoj grupi često poseduju „prozor za apsorpciju“ u gornjim delovima intestinuma (10). Proces apsorpcije lekova iz ove klase se uglavnom odvija u gornjim delovima intestinuma, tako da svaka interakcija koja ometa apsorpciju u tom delu intestinuma, dovodi do smanjene bioraspoloživosti lekovite supstance. Uticaj hrane na apsorpciju lekova ove grupe se može objasniti tako što hrana stvara fizičku barijeru koja ometa proces difuzije kroz membranu ili prisustvo hrane povećava viskozitet intestinalne tečnosti pri čemu se smanjuje apsorpcija (10). Smatra se da su lekovite supstance koji pripadaju ovoj grupi dobri kandidati za biowaiver ukoliko se nalaze u obliku preparata sa trenutnim oslobađanjem koji sadrži standardnu količinu ekscipijenasa, koje nisu supstrat za transportne sisteme prisutne u zidu intestinuma (influks/efluks proteinske pumpe) i koje ne podležu metabolizmu prvog prolaska (28). Lekovite supstance iz BSK grupe 4 ne poseduju ni dovoljnu rastvorljivost, ni permeabilnost da bi proces apsorpcije bio kompletan. Praktično je mali broj ovih supstanci koje su namenjene za oralnu primenu (22). Lekovite supstance ove grupe in vivo ispoljavaju veliku varijabilnost i ne mogu se smatrati kandidatima za uspostavljanje IVIVK. U tabeli 1 dat je prikaz očekivanog uticaja hrane i lekova na apsorpciju supstanci koje pripadaju različitim grupama BSK prema Fleisher i sar. (10). 14 Tabela 1. Biofarmaceutska klasifikacija lekova: uticaj hrane i interakcije lekova na proces apsorpcije (prema ref. 10) Table 1. Biopharmaceutical Classification System: food and drug-drug interaction effect on absorption (10) BSK grupa Uticaj hrane Interakcije lekova 1 nema uticaja ili odložena apsorpcija odložena apsorpcija usled odloženog pražnjenja želuca 2 primena sa hranom bogatom mastima povećava apsorpciju promena rastvorljivosti i brzine rastvaranja; građenje kompleksa 3 smanjena apsorpcija uticaj na proces apsorpcije u gornjem delu intestinuma 4 slaba apsorpcija sa/bez hrane građenje kompleksa 2.2 In vivo metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova In vivo ispitivanje interakcije lekova je najpouzdaniji način da se utvrdi mogućnost ispoljavanja lek-lek i lek-hrana interakcija. Međutim, ova ispitivanja su dugotrajna, skupa i podrazumevaju angažovanje ispitanika/dobrovoljaca. Ispitivanje se najčešće izvodi u grupi zdravih dobrovoljaca, mada se ispitivanje može izvesti i u grupi pacijenata. Prilikom ispitivanja interakcija potrebno je razmotriti klinički značaj lek-lek interakcija. Potrebno je odrediti koncentraciju leka u plazmi u funkciji vremena ili se prati kumulativno izlučivanje leka urinom. Takođe, prati se brzina apsorpcije određivanjem maksimalne koncentracije i vremena pri kome je postignuta maksimalna koncentracija leka u plazmi (Cmax i tmax) i stepen apsorpcije određivanjem površine ispod krive koncentracije leka u plazmi u funkciji vremena (AUC) u prisustvu i u odsustvu interagujućeg leka. Dizajn studije može biti paralelan ili randomiziran ukršteni dizajn. Kod paralelnog dizajna, jedna grupa dobrovoljaca primenjuje samo lek-supstrat, dok druga grupa primenjuje istovremeno lek-supstrat i interagujući lek. Kod randomiziranog ukrštenog dizajna jedna grupa dobrovoljaca prima prvo lek-supstrat, a zatim oba leka koja interaguju istovremeno, dok druga grupa prima prvo oba leka, a zatim samo lek-supstrat. Ispitivanje lek-lek interakcija se najčešće izvodi na gladno. Ukoliko se ispituje lek-hrana interakcija, uticaj hrane se procenjuje nakon istovremene primene preparata i obroka bogatog mastima. Takođe se mora ispitati i pojava lek-lek interakcija, na različitim nivoima ADME procesa (25, 26). 15 Razvojem Biofarmaceutskog sistema klasifikacije (BSK) i procenom apsorpcije lekovitih supstanci na osnovu njihove rastvorljivosti, permeabilnosti kroz membrane i brzine rastvaranja iz farmaceutskog preparata, proširene su mogućnosti za sagledavanje in vivo ponašanja lekova i postavljena osnova za savremeni, zasnovan na analizi rizika pristup ispitivanju biološke raspoloživosti i biološke ekvivalentnosti. 2.3 In vitro metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova Na početku ovog poglavlja navedeno je da biofarmaceutska karakterizacija lekovitih supstanci i preparata obuhvata in vitro ispitivanja rastvorljivosti i permeabilnosti, kao i karakterizaciju preparata u pogledu brzine rastvaranja lekovite supstance. Sa aspekta primene saznanja o rastvorljivosti leka u cilju predviđanja njegovog ponašanja u in vivo sredini, ključnu ulogu ostvaruju „osnovna“ rastvorljivost (primarni parametar koji zavisi od hemijske strukture), kao i pH-zavisni profil rastvorljivosti i rastvorljivost supstance u prisustvu surfaktanata (micele žučnih soli, fosfolipidi). Ispitivanje brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata je in vitro ispitivanje koje je osmišljeno s ciljem da omogući predviđanje brzine rastvaranja lekovite supstance iz lekovitog preparata u organizmu, nakon njegove primene. Takođe, ispitivanje brzine rastvaranja u in vitro uslovima dobija sve veći značaj prilikom ispitivanja i predviđanja lek-hrana i interakcija između lekova, što će biti razmatrano u daljem tekstu. FDA preporučuje da se uticaj hrane na apsorpciju lekovite supstance ispituje u in vivo studijama bioraspoloživosti nakon istovremene primene preparata lekovite supstance sa obrokom bogatim mastima (29). Dizajniranje fiziološki zasnovanih medijuma omogućilo je da se ispitivanje uticaja hrane vrši in vitro, ispitivanjem brzine rastvaranja lekovite supstance u medijumima koji simuliraju stanje nakon obroka i stanje gladovanja (27). Jedan od novijih pristupa in vitro simulacije uticaja hrane predstavlja razvoj, takozvanog, ''veštačkog gastrointestinalnog sistema'' (Artificial gastrointestinal system). Aparatura ima nekoliko segmenata koji predstavljaju pojedine delove gastrointestinalnog trakta (želudac, tanko i debelo crevo) u kojima su pažljivo kontrolisani temperatura, pH vrednost, hidrodinamika, lučenje enzima i apsorpcija vode, 16 lekova i svarenih komponenata hrane (30). 2.3.1 Rastvorljivost Rastvorljivost se definiše kao maksimalna količina supstance koja može da se rastvori u datoj zapremini određenog rastvarača pri konstantnoj temperaturi. Rastvorljivost lekovite supstance je jedan od osnovnih faktora koji utiču na brzinu rastvaranja lekovite supstance iz preparata, pa time i na biološku raspoloživost leka. Prema principima BSK, kada govorimo o rastvorljivosti lekovite supstance, posmatramo njenu rastvorljivost pri uslovima koji postoje u GIT-u, pri čemu moramo uzeti u obzir i terapijsku dozu primenjene supstance. pH profil rastvorljivosti se eksperimentalno određuje u opsegu pH 1-7.5 i pri temperaturi od 37ºC u puferskim rastvorima koje preporučuje Američka farmakopeja (USP) (32). Kao referentna vrednost za rastvorljivost se uzima najmanja vrednosti za rastvorljivost u fiziološkom opsegu pH vrednosti. Dobro rastvorljiva supstanca ima dozni broj veći od 1, tj. u predloženom opsegu pH vrednosti, najveća doza se rastvara u ≤ 250 ml vodenog medijuma (25). Postojeće preporuke koje propisuje EMA (26) navode da je, za farmaceutske preparate sa trenutnim oslobađanjem, koji sadrže dobro rastvorljivu lekovitu supstancu, moguće, u određenim situacijama, izostaviti in vivo ispitivanja biološke ekvivalencije na osnovu rezultata ispitivanja brzine rastvaranja in vitro. Prilikom razmatranja rastvorljivosti u in vivo uslovima, mora se ispitati i potencijalni uticaj hrane, što može dovesti do promene rastvorljivosti i precipitacije lekovite supstance. Dodatak površinski aktivnih materija u medijum može poboljšati rastvorljivost lekovitih supstanci sa niskom rastvorljivošću. S obzirom da su micele žučnih kiselina i fosfolipida fiziološki prisutne površinski aktivne materije, ove supstance su iskorišćene za razvoj, takozvanih, fiziološki zasnovanih medijuma za ispitivanje brzine rastvaranja. Za lekovite supstance koje ne podležu jonizaciji, rastvorljivost u disperziji micela tauroholne kiseline i lecitina u odnosu 4:2, može se odrediti na osnovu sledeće jednačine (31): 17 SR= 0,75 × log Kow + 2,27 SR - odnos rastvorljivosti supstance u disperziji površinski aktivnih materija i rastvorljivosti supstance u vodi Kow – particioni koeficijent oktanol-voda Odnos lecitina i tauroholne kiseline u in vivo uslovima je obično 1:2 ili 1:5 (27), a s obzirom da su one prirodni surfaktanti u GIT-u, prisustvo određene koncentracije ovih supstanci u fiziološki zasnovanim medijumima utiče na brzinu rastvaranja lekovite supstance. U fiziološki zasnovanim medijumima odnos lecitina i natrijum-tauroholata (so tauroholne kiseline) je približno 1:3. U medijumu koji sumulira uslove u organizmu na gladno žučne soli su prisutne u koncentraciji do 5 mM, dok je u medijumu koji simulira uslove u organizmu nakon obroka njihova koncentracija 15 mM (27). Pored pH vrednosti i prisustva površinski aktivnih supstanci, na rastvorljivost mogu uticati i drugi faktori, kao što je uticaj zajedničkog jona i puferski kapacitet medijuma. Prilikom ispitivanja interakcija lekova treba dodatno razmotriti njihovu mogućnost kompleksiranja i građenja novih jonskih vrsta (33-36). Pojedine lekovite supstance imaju sposobnost da se ponašaju kao ligandi, pri čemu grade sa jonima metala, helatni kompleks. Ova kompleksna jedinjenja su često karakteristično obojena, slabo disosovana i vrlo često slabo rastvorljiva u vodi (33, 34). 2.3.2 Ispitivanje brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata Mogućnost predviđanja kinetike oslobađanja i rastvaranja leka in vivo na osnovu rezultata dobijenih in vitro, dobila je veći značaj nakon uvođenja Biofarmaceutskog sistema klasifikacije lekova (22) i sve većeg rada vezanog za uspostavljanje in vitro-in vivo korelacija. Dobro osmišljen test za ispitivanje brzine rastvaranja lekovite supstance treba da omogući smanjenje vremena i troškova razvoja formulacije, smanjenje broja eksperimenata in vivo, poboljšan biofarmaceutski kvalitet proizvoda, što dovodi do bolje kliničke efikasnosti i bezbednosti (25, 26, 37). U zavisnosti od cilja ispitivanja, zahtevi i uslovi za ispitivanje brzine rastvaranja mogu biti različiti, ali je uvek preporučljivo da se pokuša da se uspostavi veza između in vitro i in vivo dobijenih 18 rezultata. Uporedo sa rastućim značajem in vitro ispitivanja brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata u predviđanju kinetike apsorpcije lekovite supstance in vivo, pojavio se i interes za razvoj, takozvanog, biorelevantnog in vitro testa. Iako je usvojen stav da rezultati dobijeni in vitro treba da ukažu na in vivo ponašanje supstance, metode koje se mogu naći u farmakopejama (32, 38) ne pružaju dovoljno uvida u in vivo situaciju. S obzirom da uslovi definisani farmakopejom, ne mogu uvek da prikažu in vivo situaciju, prilikom razvoja biorelevantnog in vitro testa mora se izvesti: - identifikacija odgovarajućeg profila brzine rastvaranja lekovite supstance koji se postavlja kao ciljni profil. Identifikaciju ciljnog profila je moguće postići koristeći dostupne podatke vezane za fizičko-hemijska, farmakokinetička i farmakodinamička svojstva lekovite supstance ili preparata i važeće farmakopejske propise i zahteve ili, na osnovu eksperimentalnih rezultata dobijenih u okviru in vivo ispitivanja biološke raspoloživosti preparata u maloj grupi dobrovoljaca; - opsežna ispitivanja uticaja različitih eksperimentalnih uslova s ciljem identifikacije i optimizacije faktora koji utiču na kinetiku oslobađanja lekovite supstance (23, 25). Na brzinu rastvaranja supstance u GIT-u utiču dva ključna faktora: sastav i volumen tečnosti i hidrodinamički uslovi. U tabeli 2 dat je prikaz fizičko-hemijskih i fizioloških parametara koji mogu uticati na brzinu rastvaranja lekovite supstance u GIT-u. Očekuje se da je, kada se ovi uslovi adekvatno reprodukuju u in vitro uslovima, moguće da se na osnovu profila brzine rastvaranja, definišu ograničavajući faktori za apsorpciju leka (27). Veličina čestica i prisustvo prirodnih surfaktanata u GIT-u utiču na površinu koja je dostupna za rastvaranje, a samim tim i na brzinu rastvaranja (27). pH vrednost u GIT- u zavisi od prisustva hrane i njene zapremine, lučenja želudačnog soka, žuči i drugih digestivnih tečnosti i varira u toku prolaska kroz različite delove intestinuma. Uticaj pH vrednosti na rastvorljivost je razmatran u prethodnom poglavlju i prilikom dizajna biorelevantnog testa mora se razmotriti očekivana pH vrednost regiona u kojem se lekovita supstanca apsorbuje, uticaj hrane na apsorpciju, kao i rastvorljivost u prisustvu surfaktanata. U literaturi su prisutni različiti pristupi razvoju biorelevantnog in vitro testa, pa su dizajnirani testovi koji imaju zadatak da direktno oponašaju uslove u želucu ili tankom crevu (27, 39-44) i oni koji koriste jednostavnije medijume različitih pH vrednosti uz 19 dodatak površinski aktivnih materija (45). Vodeni rastvori pH vrednosti koje odgovaraju fiziološkom rasponu u GIT-u, koji se koriste kao medijumi prilikom ispitivanja brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata ne mogu u potpunosti da reprodukuju fiziološke uslove u GIT-u. Smatra se da fiziološki zasnovani medijumi koji oponašaju uslove u želucu ili tankom crevu, mogu bolje da predvide ponašanje supstance in vivo (27, 39-44). Fiziološki zasnovani medijumi koji simuliraju sadržaj u GIT-u u uslovima na gladno i u prisustvu hrane (Fasted State Simulated Intestinal Fluid - FaSSIF i Fed State Simulated Intestinal Fluid – FeSSIF) su dizajnirani tako da mogu da ''oponašaju'' pH, osmolarnost i prisustvo fizioloških surfaktanata u intestinalnim tečnostima i pružaju biorelevantne uslove za ispitivanje uticaja hrane i predviđanje lek- hrana interakcija (41, 42, 44). Ovi medijumi bi mogli biti iskorišćeni i u predviđanju interakcija lekova. Ipak, postoje brojni nedostaci vezani za praktičnu primenu ovih medijuma (visoka cena prirodnih surfaktanata, komplikovana priprema, varijabilnost u kvalitetu sirovina u zavisnosti od izvora dobijanja), pa se ovi medijumi često zamenjuju puferovanim vodenim rastvorima uz dodatak sredstava za povećanje viskoziteta i/ili površinski aktivnih materija (46). Uobičajena eksperimentalna procedura koja se koristi u ispitivanju brzine rastvaranja podrazumeva obezbeđenje sink uslova, ali se u poslednje vreme ovaj zahtev sve češće zanemaruje, jer se smatra da sink uslovi ne odslikavaju u potpunosti in vivo situaciju (47). Da bi se adekvatno definisalo vreme trajanja testa, treba poznavati regionalnu apsorpciju lekovite supstance duž intestinuma, kao i vreme prolaska kroz intestinum (27). Ispitivanje brzine rastvaranja u in vitro uslovima može se iskoristiti i u cilju predviđanja lek-lek interakcija i otkrivanja potencijalnih uzroka koji prethode promeni u apsorpciji lekovite supstance u GIT-u (10, 48-52). Preparati koji sadrže jon metala mogu uticati na proces apsorpcije kada se primene istovremeno sa pojedinim lekovima (tetraciklini, ibuprofen, fluorohinoloni). U literaturi se mogu naći podaci o in vitro ispitivanjima uticaja jona metala na brzinu rastvaranja lekovite supstance iz tableta uz primenu medijuma u koji se dodaje so ili preparat koji sadrži jon metala (49-51, 53). Na sličan način, pojedini autori su pokušali da simuliraju uticaj hrane koristeći kao medijum komponente hrane, ali priprema ovog medijuma i detekcija rastvorene lekovite supstance je otežana usled heterogenosti smeše (46). U literaturi su opisani i pokušaji upotrebe gotovih dijetetskih napitaka kao medijuma za 20 ispitivanje brzine rastvaranja, kao i upotreba mleka kao medijuma (39, 49, 54-56). Tabela 2. Fizičko-hemijski i fiziološki parametri koji utiču na brzinu rastvaranja lekovite supstance u GIT-u (prema ref 27) Table 2. Physicochemical and physiological parameters important for drug dissolution in GIT (ref 27) Faktor Fizičko-hemijski parametar Fiziološki parametar kontaktna površina veličina čestica, stepen kvašenja surfaktanti u želudačnom soku i žuči difuzioni koeficijent veličina molekula viskozitet luminalnog sadržaja rastvorljivost hidrofilnost, kristalna struktura, solubilizacija motilitet i brzina protoka količina leka koja je već rastvorena pH, kapacitet pufera, žučne soli, prisustvo hrane volumen raspoloživog medijuma permeabilnost, sekrecija, tečnost uneta kao hrana ili piće 2.3.3 Određivanje permeabilnosti Permeabilnost je, pored rastvorljivosti i brzine rastvaranja lekovite supstance iz preparata, najznačajniji faktor koji utiče na apsorpciju lekovite supstance. Prema BSK konceptu, supstanca se smatra dobro permeabilnom ako je ispitivanjem u ljudi pokazano da poseduje obim apsorpcije veći od 90 % primenjene doze (25, 26). Pokazano je da supstance sa vrednošću za distribucioni koeficijent (logD) u opsegu 0-3, predstavljaju idealne kandidate sa aspekta apsorpcije mehanizmom pasivne difuzije. Vrednosti za particioni koeficijent (logP) i logD koje su manje od 0 odgovaraju hidrofilnim supstancama, koje su slabo permeabilne. Vrednosti ovih parametara iznad 3 su karakteristične za liposolubilne suspstance, usled čega njihova raspodela između ćelijske membrane i vodene sredine ograničava permeaciju supstanci kroz enterocite (57). Brzina permeacije leka kroz membranu je određena vrednošću efektivne permeabilnosti membrane (Peff), vrednošću efektivne površine intestinalne membrane za permeaciju (AGI) i koncentracijom lekovite supstance u određenom segmentu GIT-a (CGI) 21 Apsorbovana količina supstance (Xabs) se može izračunati iz sledeće jednačine (22): )( )()( tCAP dt tdX dt tdX GIGIeff soluabs  Peff - brzina permeacije leka kroz membranu AGI - vrednost efektivne površine intestinalne membrane za permeaciju CGI - koncentracija lekovite supstance u određenom segmentu GIT-a Količina apsorbovane supstance u toku vremena zavisi i od odnosa doze i brzine rastvaranja, hemijske degradacije i metabolizma u lumenu GIT-a, građenja kompleksa u lumenu i vremena prolaska kroz intestinum. Permeabilnost zida tankog creva je važan faktor jer ostvaruje značajnu ulogu u obezbeđenju sink uslova (koncentracija supstance u rastvoru je znatno manja od koncentracije zasićenja, pa je njen uticaj na brzinu rastvaranja zanemarljiv). Utvrđeno je da se proces rastvaranja in vivo odvija pod sink uslovima kod lekovitih supstanci koje karakteriše visoka permeabilnost (27). Permeabilnost lekovite supstance se određuje na osnovu rezultata - farmakokinetičkih studija u ljudi (određivanje apsolutne biološke raspoloživosti, studija balansa mase- Mass balance study); - in vivo studija intestinalne perfuzije u ljudi; - in situ studija intestinalne perfuzije u animalnim modelima; - in vitro ispitivanja permeacije na humanom/animalnom tkivu intestinuma, monosloju epitelnih ćelija u kulturi (Caco-2) ili veštačkim membranama (PAMPA); - matematičkih predviđanja/izračunavanja na osnovu hemijske strukture molekula. Iako su prva direktna ispitivanja permeabilnosti urađena osamdesetih godina prošlog veka, in vivo studije u ljudi su retke, jer su takva ispitivanja dugotrajna i skupa. Validirana metoda ispitivanja je tehnika jejunalne perfuzije, pa dobijeni rezultati ne daju jasnu sliku procesa apsorpcije u drugim delovima intestinuma. Validirana tehnika je zasnovana na jednostrukoj (single-pass) perfuziji kroz segment jejunuma koji je 22 izolovan između dva balona (58). U poslednje vreme se intenzivno radi na proceni primene in silico pristupa u proučavanju permeabilnosti lekovitih supstanci, tako da su ispitivanja usmerena na određivanje permeabilnosti na osnovu fizičko-hemijskih karakteristika lekovite supstance (molekulska masa, particioni koeficijent, površina polarnog dela molekula, afinitet uspostavljanja vodoničnih veza) (59). Potencijalan uzrok promene permeabilnosti lekovite supstance može biti interakcija između lekova. U in vitro uslovima predviđanje interakcija lekova bi moglo da se vrši ispitivanjem permeabilnosti na izolovanom crevu pacova, u kulturi Caco-2 ćelija ili veštačkim membranama. Dostupni podaci u literaturi uglavnom prikazuju ispitivanje interakcije lekovite supstance sa membranom intestinuma i njen uticaj na transportne proteine, dok postoji malo podataka o ispitivanju mehanizma interakcije lekova (60, 61). Kmetec i sar. (60) su ispitivali i upoređivali in vitro permeabilnost ciprofloksacina i ciprofloksacina u kompleksu sa jonima gvožđa koristeći Sartorijusov simulator apsorpcije, dok su Žakelj i sar. (61) permeabilnost ciprofloksacin/metal kompleksa ispitivali na izolovanom delu creva (jejunum) pacova. 2.4 In silico metode u biofarmaceutskoj karakterizaciji interakcije lekova In silico metode obuhvataju računarsku simulaciju apsorpcije, modelovanje mehanizma i kinetike procesa sa ciljem da se na osnovu teorijskih saznanja i eksperimentalnih in vitro rezultata predvidi ponašanje leka u in vivo uslovima, odnosno u organizmu čoveka. U poslednje vreme razvijeni su i matematički modeli koji se koriste za in silico predviđanje apsorpcije lekova iz GIT-a. Ovi modeli zasnivaju se na karakteristikama lekovite supstance i fiziologiji GIT-a i na taj način omogućavaju simulaciju ovog procesa uz identifikaciju ključnih i ograničavajućih faktora koji na njega utiču (63). 2.4.1 Unapređeni prostorni model apsorpcije i tranzita Unapređeni prostorni model apsorpcije i tranzita (Advanced Compartmental Absorption and Transit Model - ACAT) obuhvata analizu sledećih faktora koji mogu uticati na proces apsorpcije: brzina rastvaranja, pH-zavisna rastvorljivost, modifikovano 23 oslobađanje lekovite supstance iz preparata, apsorpcija u želucu ili kolonu, efekti prvog prolaska kroz jetru, degradacija u digestivnom traktu, izmene u površini za apsorpciju, promene u aktivnosti efluks proteina (64). ACAT model opisuje oslobađanje, brzinu rastvaranja, degradaciju, metabolizam i apsorpciju u toku prolaska leka kroz različite delove GIT-a. Apsorpcija lekovite supstance je jednaka ukupnoj apsorpciji u svakom od prostora GIT-a. Apsorpcioni faktori proporcionalnosti - ASF ukazuju na stepen promene permeabilnosti u toku prolaska leka kroz gastrointestinalni trakt. ASF se izračunavaju na osnovu fizičko-hemijskih osobina lekovite supstance, ali se mogu dodatno podešavati na osnovu podataka dobijenih iz in vivo studija. U ACAT model su uključeni linearna kinetika transfera leka, nelinearna kinetika metabolizma, 6 stanja u kojima lek može da se nađe u prostoru (neoslobođen, nerastvoren, rastvoren, razgrađen, metabolisan i apsorbovan), 9 prostora (želudac, 7 prostora za tanko crevo i jedan za kolon), kao i tri stanja ekskretovanog materijala (neoslobođen, nerastvoren, rastvoren) (slika 3). Na osnovu in vitro parametara za aktivnost enzima i transportnih proteina (Vmax i kmax) simulira se nelinearna, saturabilna Michaelis-Mentenova kinetika metabolizma i transporta. Za simulaciju je neophodno poznavati odgovarajuće fizičko- hemijske parametre (rastvorljivost, pKa, logP, veličina i gustina čestica), fiziološke parametre (vreme zadržavanja u želucu, brzina prolaska kroz intestinum, metabolizam prvog prolaska, luminalni transport) i farmaceutsko-tehnološke karakteristike lekovitog preparata (64). 24 Slika 3. Šematski prikaz ACAT modela (prema ref. 64) Fig. 3. ACAT model schematic (according to ref 64) Komercijalno dostupna verzija ACAT modela, GastroPlus tm (65) obuhvata više različitih modula koji omogućavaju in silico simuliranje gastrointestinalne apsorpcije i eliminacije, hepatičkog metabolizma, metabolizma u enterocitima/zidu creva, aktivnog transporta i efekta efluks procesa. Model se može koristiti za simuliranje i predviđanje apsorpcionih profila različitih lekovitih supstanci, kao i za uspostavljanje IVIVK (66, 67). Primena računarskih programa koji simuliraju proces apsorpcije leka iz gastrointestinalnog trakta, omogućila je simuliranje interakcija u in silico uslovima (51, 68-70). Na osnovu rezultata in silico studija, pokazano je da metode gastrointestinalne simulacije mogu biti primenjene kako bi jasnije bio sagledan uticaj fizičko-hemijskih, fizioloških i farmaceutsko-tehnoloških faktora na apsorpciju leka. 25 Analiza osetljivosti parametara (Parameter Sensitivity Analysis, PSA) omogućava procenu značaja varijabilnosti ulaznih parametara na predviđanje parametara koji mogu uticati na proces apsorpcije. Parametri, čiji se uticaj na dispoziciju leka, uključuju parametre kompartmenta, ACAT parametre, farmakokinetičke parametre, svojstva lekovite supstance i farmaceutsko-tehnološke faktore. Primenom ove metodologije se mogu identifikovati faktori koji su od kritičnog značaja za biološku raspoloživost, a identifikacija tih faktora može biti korisno sredstvo za otkrivanje potencijalnog mehanizma interakcije. U PSA analizi uticaj svakog parametra se procenjuje nezavisno, a simulacije se sprovode od najmanje do najveće izabrane vrednosti parametra. Simuliranje farmakokinetičkih interakcija u fazi metabolizma može ukazati na eventualnu pojavu neželjenih efekata nakon primene lekovite supstance i posebno su interesantne u fazama ispitivanja novog leka (71-74). U novijim verzijama programskog paketa GastroPlus tm postoji poseban modul za simuliranje interakcija na nivou metabolizma, što govori o aktuelnosti problema i značaju ispitivanja interakcija lekova. 26 3 Ciprofloksacin Slika 4. Strukturna formula ciprofloksacina (1–ciklopropil-6–fluoro-1,4–dihidro–4 okso-7- (piperazin–1–il)–hinolin–3-karbonska kiselina) Fig. 4. Ciprofloxacin structural formula. IUPAC name 1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7- piperazin-1-quinoline-3-carboxylic acid Ciprofloksacin je antibiotik širokog spektra dejstva iz grupe fluorohinolona, efikasan protiv Gram-pozitivnih i Gram-negativnih mikroorganizama. Mehanizam dejstva se zasniva na inhibiciji aktivnosti enzima topoizomeraze II (DNK giraze) koji omogućava transkripciju i replikaciju DNK osetljivih bakterija. Ciprofloksacin je veoma efikasan protiv enterobakterija, uključujući i mnoge druge mikroorganizme rezistentne na peniciline, cefalosporine i aminoglikozide, a takođe je efikasan i protiv H. influenzae, N. gonorrhoeae, Campilobacter i Pseudomonas vrsta (75-77). 3.1 Fizičko-hemijske i biofarmaceutske karakteristike ciprofloksacina 3.1.1 Soli, polimorfizam i kristalni oblici, građenje kompleksa U važećim farmakopejama su oficinalni ciprofloksacin i so ciprofloksacin-hidrohlorid (32, 38). Ciprofloksacin se koristi u formulaciji suspenzija i parenteralnih preparata, dok se u formulaciji tableta koristi ciprofloksacin-hidrohlorid. Literaturni podaci pokazuju da ciprofloksacin nema polimorfne oblike, ali pokazuje pseudopolimorfizam, odnosno postoji u bezvodnom i u obliku heksahidrata. Ovi oblici 27 ciprofloksacina pokazuju različitu rastvorljivost i brzinu rastvaranja. Ciprofloksacin- hidrohlorid se javlja u dva kristalna oblika u zavisnosti od upotrebljenog rastvarača i uslova kristalizacije (78, 79). U formulaciji tableta najviše se koristi ciprofloksacin- hidrohlorid u vidu monohidrata. Kompleksiranje ciprofloksacina sa jonima metala i karakterizacija nastalih kompleksa bila je tema brojnih istraživanja (15, 51, 80-99). U strukturi ciprofloksacina postoje dve grupe koje mogu da jonizuju, karboksilna grupa i sekundarna amino grupa iz piperazinskog prstena i smatra se da ove grupe učestvuju u građenju kompleksa sa jonima metala. Rastvorljivost ciprofloksacina je najmanja u opsegu pH vrednosti 6.5- 8.5 i tada se on dominantno nalazi u obliku cviter-jona. U opsegu pH vrednosti 3.5-4.5 ciprofloksacin se nalazi u protonovanom obliku i kompleksiranje je praćeno oslobađanjem protona sa piridinske karboksilne grupe (85, 86). Turel i sar. (83) navode da je u kiseloj sredini favorizovano građenje kompleksa molarnog odnosa 1:1, dok se u sredini sa pH > 5 obično grade kompleksi u odnosu 1:2. Sinteza kompleksa se u najvećem broju studija odvija uz korišćenje organskih rastvarača i katalizatora, mešanjem rastvora ciprofloksacina ili soli ciprofloksacin-hidrohlorida i soli metala (hloridi, acetati, sulfati, perhlorati) u različitim molarnim odnosima. 3.1.2 Konstante disocijacije Ciprofloksacin karakteriše cviterjonska struktura i dve pKa vrednosti, pKa1 6.16 i pKa2 8.62 (100). Eksperimentalno dobijene vrednosti za pKa1 i pKa2 ciprofloksacina se donekle razlikuju u zavisnosti od metode kojom je vršeno određivanje. Potenciometrijskom titracijom su dobijene sledeće vrednosti za pKa1 6.09 i pKa2 8.62; UV-spektrofotometrijskim određivanjem pKa1 6.42 i pKa2 8.29, a kapilarnom elektroforezom pKa1 6.35 i pKa2 8.95 (101). Vrednosti određene na temperaturi 37ºC iznose pKa1 6.20 i pKa2 8.59 (102). 3.1.3 Rastvorljivost Ciprofloksacin je gotovo nerastvorljiv u vodi, a vrlo teško rastvorljiv u etanolu i metilenhloridu (38). S obzirom da ima dve pKa vrednosti, pokazuje pH-zavisnu 28 rastvorljivost u vodenim medijumima (100). U zavisnosti od pH vrednosti, ciprofloksacin može postojati u četiri oblika: katjonski, anjonski, neutralan i cviterjonski. Neutralni oblik spontano prelazi u cviterjon, a izoelektrična tačka je na pH 7.4. U literaturi se mogu naći podaci da rastvorljivost ciprofloksacina na pH 5 iznosi 6.9 mg/ml, a na pH 7 je 0.15 mg/ml, na temperaturi od 37°C (103). Građenjem soli hidrohlorida poboljšava se rastvorljivost, pa je ciprofloksacin-hidrohlorid umereno rastvorljiv u vodi, teško rastvorljiv u metanolu, vrlo teško rastvorljiv u etanolu, a gotovo nerastvorljiv u metilenhloridu (38). Rastvorljivost ciprofloksacina i njegove soli hidrohlorida u vodi se menja sa promenom temperature, pa je rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida na 20ºC 30 mg/ml, na 30ºC 40 mg/ml, a na 40ºC 55 mg/ml, dok je rastvorljivost ciprofloksacina na 20ºC ~ 0.08 mg/ml, na 30ºC ~ 0.09 mg/ml, a na 40ºC ~ 0.12 mg/ml (104, 105). Osnovna rastvorljivost (intrinsic solubility) ciprofloksacina na pH 7 je 0.037 mg/ml na 6ºC, 0.086 mg/ml na 25ºC, 0.14 mg/ml na 30ºC i 0.17 mg/ml na 40ºC (106). Slika 5. Prikaz pH zavisne rastvorljivosti ciprofloksacina Fig. 5. Ciprofloxacin pH dependent solubility profile 29 3.1.4 Particioni i distribucioni koeficijent Određivanje particionog i distribucionog koeficijenta može da ukaže kakva je rastvorljivost supstance u lipidima i na sposobnost prolaska kroz lipidne membrane. Takođe, ove vrednosti imaju značajnu ulogu i prilikom određivanja MIC (minimalne inhibitorne koncentracije) jer antibiotik, da bi ispoljio svoje dejstvo, mora proći kroz lipidnu membranu bakterijske ćelije. Eksperimentalno određena vrednost za distribucioni koeficijent (logD) ciprofloksacin-hidrohlorida pri pH 4.8 je -1.17, pri pH 7.4 je -1.13, a pri pH 9.1 je -1.5 (107). Eksperimentalno određena vrednost za particioni koeficijent (logP) je -0.94 na 37ºC, -1.7 na 25ºC pri pH 7.2. Na ovoj pH vrednosti ciprofloksacin bi trebao da se dominantno nalazi u neutralnom obliku, ali s obzirom da neutralni oblik brzo prelazi u cviterjonski, mala vrednost particionog koeficijenta se može objasniti činjenicom da cviter-jon ciprofloksacina slabije prelazi u n-oktanol fazu (107). In silico (CLogP program) određena vrednost particionog koeficijenta ciprofloksacin-hidrohlorida je 1.32 (108). Ovako male vrednosti distribucionog i particionog koeficijenta ukazuju na nisku permeabilnost ciprofloksacina. 3.1.5 Permeabilnost Na osnovu ispitivanja permeabilnosti ciprofloksacina na Caco-2 kulturi ćelija, Volpe i sar. (109) su zaključili da ciprofloksacin pokazuje nisku permeabilnost kroz apikalnu i bazolateralnu membranu intestinuma. Vrednost za Papp, kada je ciprofloksacin prisutan u koncentraciji od 3 mg/ml, je bila 2.49 ± 0.43 × 10 6 cm/s, a kada je prisutan u koncentraciji od 0.3 mg/ml 0.42 ± 0.06 × 10 6 cm/s (109). Slični rezultati su dobijeni i nakon ispitivanja permeabilnosti kroz izolovan jejunum pacova (110, 111). Ispitivanje permeabilnosti PAMPA metodom pri različitim pH vrednostima je pokazalo da je permeabilnost ciprofloksacina kroz lipidne membrane intestinuma pH zavisna (112). Transport ciprofloksacina prilikom apsorpcije se odvija i paracelularno kroz pore koje imaju veći afinitet ka prolasku katjona (110). U intestinumu je moguća i sekrecija ciprofloksacina. Smatra se da se sekrecija odvija pomoću dva proteina, P-glikoproteina i MRP2 (Multidrug resistance associated protein 2) pri čemu se jedan nalazi na bazolateralnoj membrani epitelne ćelije, a drugi na apikalnoj membrani. Rezultati 30 studija izvedenih na izolovanom crevu pacova i Caco-2 ćelijama, u prisustvu inhibitora ova dva proteina, su pokazali da oni ne učestvuju u sekreciji ciprofloksacina, a kao mogući mehanizam sekrecije se navodi ''specifican put sekrecije ciprofloksacina'' (ciprofloxacin sensitive pathway) (110, 113, 114). 3.1.6 Klasifikacija prema BSK Ciprofloksacin pokazuje pH zavisnu rastvorljivost, pri čemu je dobro rastvorljiv u kiseloj sredini, a slabo rastvorljiv pri pH vrednostima koje su prisutne u intestinumu. Prema zahtevima FDA (25) da bi se supstanca smatrala visoko permeabilnom mora da pokazuje obim apsorpcije veći od 90 %, dok je zahtev EMA (26) za visoko permeabilne supstance obim apsorpcije veći od 85 %. Ciprofloksacin pokazuje varijabilnu permeabilnost i smatra se da postoji “prozor za apsorpciju“ u gornjim delovima intestinuma. Imajući u vidu rezultate ispitivanja permeabilnosti na Caco-2 ćelijama i izolovanom jejunumu pacova i vrednost za particioni koeficijent, ciprofloksacin se može svrstati u supstance sa niskom permeabilnošću. S obzirom da pokazuje nisku rastvorljivost i nisku permeabilnost većina autora svrstava ciprofloksacin u BSK grupu 4 (98, 115, 116). 3.2 Farmakokinetičke karakteristike Ciprofloksacin se, nakon oralne primene, relativno dobro i brzo apsorbuje u GIT-u. Bioraspoloživost ciprofloksacina nakon oralne primene varira u rasponu od 52-90 % (117-122). Koncentracije ciprofloksacina u plazmi su dozno-zavisne i dostižu maksimum 0.58-1.75 h nakon primene leka. Studija sa hf-kapsulom koja je dizajnirana da oslobađa sadržaj u pojedinačnim delovima GIT-a je pokazala da se ciprofloksacin dominantno apsorbuje u gornjim delovima intestinuma (duodenum, jejunum i ileum), pri čemu je više od 78 % doze apsorbovano u duodenumu i jejunumu (123). Ciprofloksacin se brzo distribuira po tkivima i telesnim tečnostima u kojima dostiže visoku koncentraciju (pluća, jetra, bubrezi i reproduktivni organi) (75). Vezivanje za proteine plazme je 30 % (124). Volumen distribucije je visok i kod zdravih osoba iznosi oko 2.27 l/kg kada se primeni doza od 100 mg i 2.44 l/kg nakon primene doze od 200 31 mg (120). Metabolizam ciprofloksacina se odvija u jetri dejstvom enzima CYP-450 i biotransformacijom nastaju metaboliti koji poseduju izvesnu antimikrobnu aktivnost. Samo 10-20 % pojedinačne oralne ili intravenske doze se eliminiše u obliku metabolita. Utvrđena su četiri različita antimikrobno-aktivna metabolita, desetilenciprofloksacin (M1), sulfociprofloksacin (M2), oksaciprofloksacin (M3) i formilciprofloksacin (M4). M2 i M3 čine po jednu trećinu metabolisane supstance, a M1 se nalazi u malim količinama (1.3-2.6 % doze) (75-77). Poluvreme eliminacije je od 3.5 - 4.5 h, dok kod pacijenata sa renalnom insuficijencijom poluvreme eliminacije može biti produženo (t ½ = 5-8 h) (75- 77, 125). Ciprofloksacin i njegovi metaboliti se posle pojedinačne ili intravenske doze eliminišu prvenstveno putem bubrega (55 %, odnosno 75 % doze), dok se 39 %, odnosno 14 % eliminiše putem fecesa (75-77). Glavni metabolit u urinu je oksiciprofloksacin, a u fecesu sulfociprofloksacin (75-77). Bubrežni klirens iznosi 0.18 - 0.3 l/h/kg, a ukupni klirens 0.48 - 0.60 l/h/kg (75-77, 126, 128). Približno 1 % doze ciprofloksacina se izluči putem žuči (75-77). 3.3 Interakcije ciprofloksacina sa jonima metala 3.3.1 Pregled in vivo studija Interakcije između lekova su klinički značajne ukoliko dolazi do promene u biološkoj raspoloživosti i/ili farmakološkom efektu leka. Uticaj različitih jona metala na bioraspoloživost ciprofloksacina varira u zavisnosti od oblika u kome se nalazi jon metala (hrana, lek, dijetetski suplement), vremena primene i primenjene doze preparata koji sadrži jon metala. Interesovanje za interakcije ciprofloksacina sa jonima metala je počelo 1985. godine kada su Hoffken i sar. prvi put ukazali na značajno smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina nakon istovremene primene sa preparatima aluminijuma i magnezijuma (13). To je podstaklo istraživače da pokušaju da otkriju potencijalni mehanizam interakcije, ne samo sa preparatima aluminijuma i magnezijuma, nego i sa preparatima gvožđa, cinka i kalcijuma poreklom iz hrane, lekova ili dijetetskih suplemenata (14-17, 132-148). Iako su rezultati sprovedenih studija varijabilni, često i kontradiktorni, jasno se uočava smanjen obim apsorpcije 32 ciprofloksacina primenjenog istovremeno sa preparatima koji sadrže jone metala. Na osnovu dobijenih rezultata, usvojena je generalna preporuka da se preparati koji sadrže jone metala ne primenjuju u isto vreme sa preparatima ciprofloksacina, već sa određenim vremenskim intervalom, tako da je moguće kombinovati ih poštujući preporuke o vremenskom razmaku (17, 75). Na apsorpciju ciprofloksacina može uticati prisustvo hrane (129-131), s obzirom da je uočeno produženo vreme dostizanja maksimalne koncentracije u plazmi, a nije uočen uticaj na ostale farmakokinetičke parametre (Cmax, AUC) (130). Pokazano je, takođe, da kalcijum prisutan u hrani može da utiče na biološku raspoloživost ciprofloksacina (131, 140, 147, 148). Frost i sar. (147) su ispitivali uticaj sira kao namirnice bogate mastima i kalcijumom na bioraspoloživost ciprofloksacina i zabeleženo je povećanje biološke raspoloživosti nakon primene leka uz obrok koji sadrži sir. Za razliku od Frosta (147), Neuvonen (148) beleži smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina za 30-36 % kada se primeni istovremeno sa mlekom ili jogurtom. Rezultati dobijeni u ove dve studije se prilično razlikuju, a uzrok tome može biti i vrsta hrane u kojoj je jon kalcijuma prisutan, što može uticati na stepen oslobađanja jona i stupanja u interakciju sa ciprofloksacinom. Istovremena primena ciprofloksacina sa sokovima obogaćenim kalcijum-laktatom može smanjiti bioraspoloživost ciprofloksacina za 36 % (140). Takođe, primena ciprofloksacina sa sokom od pomorandže obogaćenim kalcijumom smanjuje koncentraciju ciprofloksacina u plazmi za 41 % (131). Interakcija između jona kalcijuma i ciprofoksacina je ispitivana nakon istovremene primene ciprofloksacina i antacidnih preparata koji sadrže kalcijum-karbonat. Fleming i sar. (139) su zabeležili smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 7.3 % (doza kalcijum-karbonata nije navedena) kod pacijenata na peritonealnoj dijalizi. Smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina za oko 40 % je uočeno nakon istovremene primene tableta sa ciprofloksacinom i 4 tablete sa po 850 mg kalcijum-karbonata (136). Sa druge strane, Lomaestro i sar. (137) su pokazali da primena tableta sa 500 mg kalcijuma (1250 mg kalcijum-karbonata) ne utiče na biološku raspoloživost ciprofloksacina ako se primeni 2 h pre doze antibiotika, dok Sahai i sar. (146) navode da hronična upotreba kalcijum-karbonata u istoj dozi smanjuje bioraspoloživost ciprofloksacina za 43 %. Interakcija između ciprofloksacina i gvožđa je uočena nakon istovremene primene 33 preparata koji sadrže različite soli gvožđa (sulfat, fumarat, glukonat) (14-16, 99, 133- 135). U većini navedenih studija je ispitivan uticaj gvožđa nakon oralne primene, a smanjenje biološke raspoloživosti se objašnjava građenjem slabo permeabilnih kompleksa, pri čemu u interakciji učestvuje 4-okso i karboksilna grupa ciprofloksacina koje su odgovorne i za antibiotsku aktivnost ovog fluorohinolona (14-16, 133, 141). Neki autori navode da i drugi fizičko-hemijski faktori, kao što je rastvorljivost, mogu uticati na smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina (14), ali i da soli gvožđa mogu ispoljiti takozvani ''nespecifični efekat'' na apsorpcioni kapacitet u GIT-u i na taj način uticati na bioraspoloživost ciprofloksacina (16). Lehto i sar. (14) su ispitivali uticaj tableta sa gvožđe(II)-sulfatom (100 mg elementarnog gvožđa) na farmakokinetiku ciprofloksacina nakon istovremene primene i dobijeni rezultati su ukazali na smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 54 %. Polk i sar. (16) su smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi, nakon istovremene primene sa tabletom koja sadrži 325 mg gvožđe(II)-sulfata, objasnili građenjem kompleksa koji se ne apsorbuje, u čijem građenju učestvuju 4-keto i 3-karboksilna grupa ciprofloksacina. U studiji Kara i sar. (15) uočeno je smanjenje maksimalne koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 37- 57 % nakon istovremene primene sa različitim solima gvožđa. Smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina za oko 50 % nakon istovremene primene sa gvožđe(II)- glukonatom uočili su i Pazzucconi i sar. (141), dok su Brouwers i sar. (133) ukazali na smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina za 70 % nakon istovremene primene sa 200 mg gvožđe(II)-fumarata. S obzirom da se građenje slabo permeabilnih kompleksa navodi kao glavni uzrok smanjene biološke raspoloživosti ciprofloksacina, Kozjek i sar. (99) su sproveli in vivo ispitivanje u grupi od sedam pasa kojima su davali prethodno sintetisane komplekse ciprofloksacin-gvožđe, ciprofloksacin-cink ili ciprofloksacin-bizmut. Rezultati studije su pokazali da je apsolutna biološka raspoloživost ciprofloksacina, kada se primeni kao kompleks sa gvožđem 12.33 %, 31.44 % kada se primeni kao kompleks sa cinkom i 84.28 % kada se primeni kao kompleks sa bizmutom (99). U studiji Hoffken i sar. (13) zabeleženo je smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 94 % nakon primene 500 mg ciprofloksacina 24 h nakon visoke doze antacidnog preparata (9 g aluminijum-hidroksida i 6 g magnezijum-hidroksida). Fleming i sar. (139) su zabeležili smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 34 više od 50 % prilikom primene sa preparatima koji su sadržavali jedinjenja aluminijuma i magnezijuma kod pacijenata na peritonealnoj dijalizi. Frost i sar. (136) su dobrovoljcima, u razmaku od 5 minuta, davali tablete ciprofloksacina i tablete aluminijum-hidroksida i uočili smanjenje bioraspoloživosti za oko 85 %. Zabeleženo je, da kod dobrovoljaca koji su primenjivali tablete sa aluminijum-hidroksidom nema značajnih interindividualnih razlika u smanjenju koncentracije ciprofloksacina u plazmi, dok kod dobrovoljaca koji su primenjivali tablete sa kalcijum-karbonatom postoje značajne interindividualne razlike. Nix i sar. (17) su ispitivali kako vreme između primene antacida i ciprofloksacina utiče na pojavu interakcije. Ispitanici su primenjivali antacidni preparat sa aluminijum- hidroksidom i magnezijum-hidroksidom (30 ml suspenzije Maloox ® ) ili ranitidin tablete 10 minuta i 2, 4 ili 6 sati pre doziranja ciprofloksacina. Najveće smanjenje biološke raspoloživosti (za 80 %) je zabeleženo kada je Maloox® primenjen 10 minuta pre ciprofloksacina, a nije zabeležen značajan uticaj kada je Maloox® primenjen 6 h pre ciprofloksacina ili kada je primenjen sa ranitidinom (17, 144). Hoffken i sar. (13) i Lode (144) su u svojim studijama koristili visoke doze preparata Maloox ® što je uslovilo smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi za 94 % (13), odnosno smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina za 91 % (144). Sa druge strane, rezultati o biološkoj raspoloživosti dobijeni u studiji Frost i sar. (136) su slični rezultatima Nix i sar. (17), pa je pretpostavljeno da aluminijum-hidroksid ima najveći uticaj na smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi. Nix i sar. su pokazali da primena sukralfata istovremeno ili 2 sata pre ciprofloksacina može da smanji biološku raspoloživost ciprofloksacina za 30 % (132). Takođe, Garrelts i sar. (145) su pokazali da je smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina čak 90 % nakon istovremene primene 1 g sukralfata. In vivo ispitivanja interakcije ciprofloksacina sa cinkom su rađena sa dijetetskim suplementima u kojima se cink nalazi u sastavu kompleksa vitamina i minerala. Cink se u dijetetskim suplementima može naći u obliku cink-laktata, cink-glukonata, cink- acetata ili cink-sulfata. Polk i sar. (16) su zabeležili smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina za 24 % kada se primeni sa preparatom koji sadrži 23.9 mg cinka, dok su Kara i sar. (15) zabeležili smanjenje biološke raspoloživosti ciprofloksacina za 53 % kada se primeni preparat koji u svom sastavu ima 15 mg cinka u kombinaciji sa jonima 35 gvožđa, magnezijuma, kalcijuma, bakra i mangana. 3.3.2 Pregled in vitro studija U literaturi se mogu naći brojni podaci koji govore o in vitro interakciji jona metala i ciprofloksacina. U okviru in vitro studija proučavano je građenje kompleksa, ispitivana je stabilnost kompleksa, rastvorljivost i brzina rastvaranja ciprofloksacina u prisustvu jona gvožđa, aluminijuma, kalcijuma i cinka, kao i permeabilnost nastalih kompleksa (49, 51, 60, 61, 84, 88, 94, 96-98, 149-160). Dok se rezultati in vivo studija slažu da prilikom istovremene primene sa jonima metala dolazi do smanjenja biološke raspoloživosti ciprofloksacina, u rezultatima in vitro studija koji se bave prirodom kompleksa i rastvorljivošću ciprofloksacina u prisustvu jona metala mogu se uočiti značajne razlike. Ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta u prisustvu jona metala pokazuju usporeno i nepotpuno oslobađanje ciprofloksacina (51, 97, 155), dok izvesni autori izveštavaju o porastu rastvorljivosti u prisustvu jona metala (98, 149, 150). Kompleksiranje ciprofloksacina sa jonima metala i karakterizacija nastalih kompleksa bila je tema brojnih istraživanja (80-89). Sa biofarmaceutskog aspekta, kompleksiranje ciprofloksacina sa jonima metala u prisustvu organskih rastvarača ili katalizatora nije relevantno, pa su razmatrani samo kompleksi koji nastaju u interakciji ciprofloksacina i jedinjenja metala koja se primenjuju u terapiji. Treba istaći da, prilikom ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacina u prisustvu različitih soli metala, istraživači obično koriste ciprofloksacin čija je rastvorljivost u vodi više od četiri stotine puta manja u odnosu na rastvorljivost soli hidrohlorida koja se koristi u formulaciji tableta. Rezultati tih ispitivanja ukazuju na povećanje rastvorljivosti ciprofloksacina u prisustvu jona metala (149, 150). Na promenu rastvorljivosti ciprofloksacina može uticati više faktora: promena pH sredine, građenje kompleksa, pa do danas sam mehanizam interakcije nije do kraja razjašnjen. Potencijalan uzrok smanjene bioraspoloživosti može biti i smanjena permeabilnost nastalih kompleksa. Prilikom interakcije ciprofloksacina i jona gvožđa, neki istraživači su zabeležili pomeranje u spektru ciprofloksacina ka većim talasnim dužinama (15, 84, 153). Kara i sar. (15) su tu pojavu objasnili pretpostavkom da u građenju kompleksa učestvuje 36 gvožđe(III) jon koji nastaje oksidacijom gvožđe(II) jona u puferu koji je korišćen u studiji. Sanchez i sar. (84) su ispitivali interakciju između ciprofloksacina i jona gvožđa, aluminijuma, magnezijuma i kalcijuma mešanjem rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida sa solima metala, a zatim su vršili karakterizaciju dobijenih precipitata. Na osnovu dobijenih rezultata odbacili su tvrdnju da se između ciprofloksacina i metala gradi kompleks. Ovu tvrdnju su potkrepili činjenicom da su za građenje kompleksa koristili veći odnos između ciprofloksacina i metala nego što je to u organizmu kada se ove dve supstance nađu zajedno (84). Allemandi i sar. (153) i Alovero i sar. (154) su se bavili sintezom ciprofloksacin- aluminijum kompleksa koji bi imao veću rastvorljivost u odnosu na ciprofloksacin- hidrohlorid. Dobijeni kompleks, čija je hemijska formula (HCl cf)3Al je zatim zaštićen patentom (155). Prema Breda i sar. (98), rastvorljivost kompleksa ciprofloksacina sa aluminijum- hloridom je oko 10 puta veća od rastvorljivosti ciprofloksacina u fiziološkom rasponu pH vrednosti. Takođe, ciprofloksacin-aluminijum kompleks se za oko 65 % brže oslobađa iz tableta u odnosu na ciprofloksacin-hidrohlorid u medijumu pH 6.8 (98). Zupančič i sar. (95) su sintetisali komplekse ciprofloksacina i jona cinka mešanjem rastvora ciprofloksacina i cink-hlorida ili cink-sulfata u molarnom odnosu 2:1. Uočeno je da je pogodan pH za nastanak kompleksa veći od 7 i da se, shodno tome, kompleksiranje in vivo verovatno odvija u intestinumu. Kozjek i sar. (99) su ispitivali rastvorljivost ciprofloksacin-cink kompleksa i utvrdili da je kompleks rastvorljiviji od ciprofloksacin baze i da, kao hidrofilniji, teže permeira kroz intestinalne membrane. Patel i sar. (96, 159) su u svojim studijama pokazali da kompleksi dobijeni mešanjem metanolnih rastvora cink-acetata i ciprofloksacin-hidrohlorida u opsegu pH vrednosti 6- 7.5 poseduju veću antibakterijsku aktivnost od ciprofloksacin baze. Rodriguez Cruz i sar. (97) su uočili da se u toku in vitro ispitivanja brzine rastvaranja, oslobađanje ciprofloksacina iz tableta smanjuje sa povećanjem procenta rastvorenog gvožđa iz tableta i da se u prisustvu 2 tablete sa produženim oslobađanjem sa 525 mg gvožđe(II)-sulfata oslobađanje ciprofloksacina smanjilo za više od 40 %, dok je oslobađanje ciprofloksacina iz tableta smanjeno za oko 20 % u prisustvu aluminijum- hidroksida (količina koja sadrži 2.5 g aluminijuma). 37 Arayne i sar. (156) su ispitivali uticaj aluminijum-hidroksida, Magaldrat tm tableta (koje predstavljaju kombinaciju aluminijum-hidroksida, aluminijum-sulfata i magnezijum- hidroksida, magnezijum-sulfata), kalcijum-hidroksida i kalcijum-karbonata na brzinu rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u veštačkom želudačnom soku (0.1 M HCl + pepsin) i u puferu pH 6.8. Brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida je bila značajno smanjena u prisustvu jedinjenja aluminijuma i jedinjenja kalcijuma. U toku ispitivanja nisu uočene promene pH vrednosti medijuma kada su u njemu prisutna jedinjenja aluminijuma ili kalcijuma, a adsorpcija ciprofloksacina na jedinjenja kalcijuma i aluminijuma se navodi kao potencijalni mehanizam interakcije (156-158). In vitro ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u 500 ml medijuma različitih pH vrednosti (1.2, 4.5, 6.8) uz dodatak mleka sa niskim procentom masti, kazeina ili kalcijuma (510 mg kalcijuma u obliku kalcijum-hlorida, heksahidrata) je pokazalo da je procenat oslobođenog ciprofloksacin-hidrohlorida u različitim medijumima smanjen u prisustvu mleka, kazeina i kalcijuma (49). S obzirom da je brzina rastvaranja ciprofloksacina u različitim medijumima u prisustvu mleka i kazeina slična, Papai i sar. (49) smatraju da je ta komponenta mleka odgovorna za smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina u prisustvu mleka in vivo, a da je uticaj kalcijuma slabije izražen. Potencijalan uzrok smanjene biološke raspoloživosti ciprofloksacina u prisustvu jona metala može biti i smanjena permeabilnost nastalih kompleksa (60, 61, 160). Kmetec i sar. (60) nisu uočili značajne razlike u permeabilnosti između ciprofloksacina i ciprofloksacina u kompleksu sa gvožđem. Prilikom ispitivanja permeabilnosti ciprofloksacina kroz izolovan jejunum pacova, Sanchez-Navarro i sar. (160) su zabeležili smanjenje permeabilnosti ciprofloksacina za 35 % u prisustvu kalcijum- karbonata. Žakelj i sar. (61) su pokušavali da u in vitro uslovima simuliraju proces apsorpcije in vivo. Pri tome su koristili visoke koncentracije ciprofloksacina i jona metala (gvožđe, kalcijum, aluminijum), a rezultati su pokazali da kompleksi ciprofloksacina i aluminijuma, gvožđa ili kalcijuma ne permeiraju membranu GIT-a (61) 38 4. CILJ ISTRAŽIVANJA Opšti cilj istraživanja je da se utvrdi mehanizam/mehanizmi interakcije koja dovodi do smanjene apsorpcije ciprofloksacin-hidrohlorida primenjenog istovremeno sa drugim lekovima, dijetetskim suplementima ili hranom koja sadrži jedinjenja gvožđa, aluminijuma, kalcijuma i cinka i da se predlože biorelevantni uslovi za in vitro ispitivanje interakcije lekova. Specifični ciljevi podrazumevaju: (i) ispitivanje uticaja različitih soli gvožđa, kao i kalcijuma, aluminijuma i cinka na rastvorljivost ciprofloksacina i njegovu brzinu rastvaranja iz tableta; (ii) fizičko-hemijsku karakterizaciju nastalih produkata interakcije da bi se utvrdilo da li je u pitanju isti interakcioni mehanizam ili su prisutni različiti mehanizmi u zavisnosti od vrste jona; (iii) in silico ispitivanje faktora koji mogu uticati na apsorpciju ciprofloksacin- hidrohlorida i mogućnost primene gastrointestinalne simulacije zasnovane na Unapređenom modelu prostorne apsorpcije i tranzita kao metode za predviđanje interakcije lekova i, (iv) razvoj biorelevantnog testa za in vitro ispitivanje interakcija lekova. Aim of the research The general research aim is to identify interaction mechanism/s involved in the reduced ciprofloxacin hydrochloride absorption when co-administered with other drugs, dietary supplements or food containing iron, aluminium, calcium or zinc compounds and define biorelevant dissolution conditions for drug interaction studies. Specific aims include: (i) investigation into the effect of various iron salts, as well as calcium, aluminium and zinc salts on ciprofloxacin solubility and tablet dissolution; (ii) solid state characterisation of the precipitates formed in order to identify if there is a common interaction mechanism, or an “ion specific” one; (iii) in silico study of factors affecting ciprofloxacin hydrochloride absorption and potential of gastrointestinal simulations using ACAT as a tool for drug interaction prediction, and (iv) development of biorelevant dissolution test for drug interaction studies. 39 II EKSPERIMENTALNI DEO 40 5. MATERIJAL I METODE 5.1 Materijal Za pripremu medijuma za ispitivanje rastvorljivosti i brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta korišćene su sledeće supstance: hlorovodonična kiselina (Centrohem, Srbija), kalijum-dihidrogenfosfat (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemačka), natrijum-hidroksid (Centrohem, Srbija), glacijalna sirćetna kiselina (99.8 % p.a, Lachema, Češka), kalijum-hlorid (Centrohem, Srbija), natrijumova so tauroholne kiseline (Fluka Chemie AG, Buchs, Švajcarska), L-α fosfatidilholin poreklom iz jajeta (min 60 % TLC, Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Nemačka). Prilikom ispitivanja rastvorljivosti korišćen je ciprofloksacin (poklon od Hemofarm- STADA, Srbija) i ciprofloksacin-hidrohlorid (poklon od Zdravlje-Actavis, Srbija). U ispitivanju brzine rastvaranja lekovite supstance korišćene su komercijalno dostupne film tablete ciprofloksacin-hidrohlorida od 500 mg (Hemofarm-STADA, Srbija). Prilikom in vitro ispitivanja interakcije između ciprofloksacin-hidrohlorida i jona metala korišćene su sledeća jedinjenja analitičke čistoće: gvožđe(II)-sulfat, heptahidrat (Centrohem, Srbija), gvožđe(II)-glukonat (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemačka), gvožđe(II)-fumarat (Sigma–Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemačka), kalcijum-karbonat (Centrohem, Srbija), kalcijum-hlorid, dihidrat (Centrohem, Srbija), aluminijum-hlorid, heksahidrat (Centrohem, Srbija), aluminijum-hidroksid (Fluka, Buchs, Švajcarska), zink-hlorid, anhidrovani (Centrohem, Srbija), cink-sulfat, heptahidrat (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Nemačka). 5.2 Metode 5.2.1 In vivo podaci Da bi se stekao uvid u in vivo situaciju, sprovedeno je opsežno pretraživanje literaturnih podataka koji se odnose na (I) farmakokinetička svojstva ciprofloksacina, (II) njegovu biološku raspoloživost, kao i (III) studije u okviru kojih su proučavane interakcije ciprofloksacina nakon istovremene primene sa lekovima, hranom ili dijetetskim 41 suplementima koji sadrže jone metala. Korišćene su baze podataka: PubMed Central, Scopus i Science Direct. Za pretragu su primenjene sledeće ključne reči: ciprofloxacin and ciprofloxacin hydrochloride kombinovane sa absorption, absolute bioavailability (BA), bioequivalence, dissolution, partition coefficient, permeability, pharmacokinetics, solubility, drug interaction, metallic compounds interaction. Pristup bazama podataka omogućen je posredstvom Konzorcijuma biblioteka Srbije za objedinjenu nabavku (KoBSON). 5.2.2 Ispitivanje rastvorljivosti Rastvorljivost ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida je određena u vodi, 0.1 M HCl, 0.05 M H2SO4, fosfatnom puferu pH 6.8 i fiziološki zasnovanim medijumima (FaSSIF, FeSSIF). Ravnotežna rastvorljivost je određena dodavanjem praškaste supstance u višku u određenu zapreminu medijuma za ispitivanje i mešanjem do postizanja stanja ravnoteže. Uzorci su stavljani na šejker (Unimax 1010, Heidolph, Schwabach, Nemačka) i mešani u toku 6 sati. U određenim vremenskim intervalima uzimani su uzorci medijuma, centrifugirani i profiltrirani kroz membranski filter (veličina pora 0.45 µm). Ispitivanja rastvorljivosti u prisustvu jona metala su sprovedena u vodi uz dodatak različitih jedinjenja koja u svom sastavu imaju jon metala (gvožđe(II)-sulfat, heptahidrat, gvožđe(II)-glukonat, gvožđe(II)-fumarat, aluminijum- hlorid, aluminijum-hidroksid, kalcijum-hlorid, kalcijum-karbonat, cink-hlorid, cink- sulfat, heptahidrat). Uzeti uzorci su analizirani UV spektrofotometrijski (Evolution 300, ThermoFisher, Madison, Wisconsin) na talasnoj dužini maksimuma apsorpcije. Sva ispitivanja su rađena na sobnoj temperaturi. Prilikom izračunavanja koncentracije ciprofloksacina u uzorcima medijuma korišćene su sledeće jednačine kalibracionih kriva: a) A= 0.1092c + 0.0138, c (μg/ml), λ= 275 nm (voda i 0.1 M HCl); b) A= 0.00956c + 0.0012, c (μg/ml), λ= 270 nm (fosfatni pufer pH 6.8) c) A= 0.106c + 0.0445, c (µg/ml), λ = 276 nm (0.05 M H2SO4) d) A= 0.0666c + 0.1004, c (µg/ml), λ = 272 nm (FaSSIF) e) A= 0.0781c + 0.2056, c (µg/ml), λ = 278 nm (FeSSIF) f) A= 0.0971c + 0.011, c (µg/ml), λ = 275 nm (acetatni pufer pH 4.5) 42 Tabela 3. Sastav fiziološki zasnovanih medijuma (FaSSIF i FeSSIF) (preuzeto iz ref. 27) Table 3. Composition of media simulating Fasted State conditions in the Small Intestine (FaSSIF) and Fed State conditions in the Small Intestine (FeSSIF) (according to ref 27) Substance (mM) FaSSIF FeSSIF KCl 220 190 KH2PO4, monobasic 29 - Acetic acid 144 Sodium taurocholate 5 15 Lecithin 1.5 4 NaOH Disstiled water q.s q.s 1 l q.s 1 l pH osmolarity [mOsm] buffer capacity[mEq/l/pH] 6.8 280-310 10±2 5 485-535 76±2 5.2.3 Ispitivanje brzine rastvaranja Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz komercijalno dostupnih tableta je sprovedeno u vodi, 0.1 M HCl, acetatnom puferu pH 4.5, fosfatnom puferu pH 6.8 i fiziološki zasnovanim medijumima (FaSSIF i FeSSIF). Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz komercijalno dostupnih tableta je sprovedeno u vodi, i fiziološki zasnovanim medijumima (FaSSIF i FeSSIF) u prisustvu jedinjenja koja sadrže jon metala (gvožđe, kalcijum, aluminijum, cink). Ispitivanja su izvršena u standardnoj aparaturi sa lopaticom i u aparaturi sa mini lopaticom (Erweka DT 600, Heusenstamm, Nemačka) pri brzini od 50 o/min i temperaturi 37 ± 0.5°C, koristeći 900 ml, 250 ml, 150 ml i 50 ml medijuma. U tačno određenim vremenskim intervalima (5, 10, 20, 30, 45, 60, 90 i 120 min) je vršeno uzorkovanje, uzorci su filtrirani kroz membranski filter (veličina pora 0.45 µm), a neposredno pre određivanja sadržaja aktivne supstance su razblaživani. Određivanje sadržaja ciprofloksacin-hidrohlorida u uzorcima je sprovedeno UV spektrofotometrijski na talasnoj dužini maksimuma apsorpcije (Evolution 300, ThermoFisher, Madison, Wisconsin). 43 5.2.4 Građenje kompleksa Interakcija između ciprofloksacin-hidrohlorida i izabranih soli metala je praćena u in vitro uslovima mešanjem rastvora ispitivanih komponenata u različitim molarnim odnosima. Pripremljen je 0.05 M rastvor ciprofloksacin-hidrohlorida i 0.1 M rastvor gvožđe(II)-sulfata, 0.3 M rastvor kalcijum-hlorida, 0.2 M rastvor cink-hlorida ili 0.1 M rastvor cink-sulfata, heptahidrata. Rastvor ciprofloksacin-hidrohlorida je mešan sa rastvorom soli metala u odnosima 9:1; 7:3; 1:1; 3:7 i 1:9. U uzorcima u kojima je došlo do precipitacije, dobijeni talog je izolovan i analiziran metodama karakterizacije navedenim u odeljku 5.2.5. 5.2.5 Metode karakterizacije čvrste faze Čvrsta faza prikupljena u okviru ispitivanja brzine rastvaranja i građenja kompleksa je analizirana pogodnim metodama karakterizacije: DSC, TGA, FTIR, difrakcija X-zraka. Takođe je sprovedena kvantitativna analiza izabranih uzoraka. 5.2.5.1 Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Pri ispitivanju uzoraka korišćen je uređaj Mettler-Toledo DSC 821 (Schwerzenbach, Švajcarska) sa uređajem za hlađenje LabPlant RP-100. Uzorci su odmereni na vagi i masa uzorka je bila u rasponu 5-20 mg. Uzorci su zatvarani u aluminijumske posudice i termički tretirani pri različitim brzinama grejanja u temperaturnom intervalu od sobne pa do temperature od 400ºC. Merenja su vršena u inertnoj, dinamičkoj atmosferi azota, brzinom od 10ºC/min. Uređaj je kalibrisan pomoću standarda indijuma i cinka. Podaci su obrađeni pomoću softvera Mettler Toledo STAR® (verzija 6.1). 5.2.5.2 Termogravimetrija (TGA) Pri ispitivanju uzoraka korišćen je uređaj Mettler TG 50 (Greifensee, Švajcarska). Uzorci mase 5-12 mg su zatvarani u aluminijumske posudice i grejani brzinom od 10º C/min. Merenja su vršena u inertnoj, dinamičkoj atmosferi azota. Podaci su obrađeni pomoću softvera Mettler Toledo STAR® (verzija 6.1). 44 5.2.5.3 Difrakcija X-zraka (XRD) Pri ispitivanju uzoraka korišćen je uređaj Miniflex II Desktop X-ray difraktometar Rigaku sa Ilaskris uređajem za hlađenje (Rigaku, Tokio, Japan). U sastavu uređaja se nalazi bakarna cev sa filterom od nikla koji suzbija Kϐ radijaciju. Merenja su vršena na 2θ skali u rasponu 5-40 sa pomeranjem od 0.05º u sekundi. 5.2.5.4 Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) Snimanje uzoraka je vršeno na Nicolet Magna IR 560 E.S.P spektrofotometru sa MCT/A detektorom (SpectraLab Scientific Inc, Kanada). Opseg snimanja je bio 650- 4000 cm -1 , rezolucija 2 cm -1 i korišćena je metoda sa KBr diskovima. KBr diskovi su pripremani direktnom kompresijom pri pritisku od 8 bar-a i u trajanju od 1 minuta. 5.2.5.5. Kvantitativno određivanje cinka Određivanje sadržaja cinka u uzorcima je izvršeno primenom induktivno kuplovanog plazma masenog spektrometra (ICP-MS). Nakon digestije uzorka određene mase 69 % koncentrovanom azotnom kiselinom i 30 % vodonik-peroksidom, reaktivna smeša je tretirana na 1000 W 20 minuta na 200°C. Uzorci su zatim razblaženi u prečišćenoj vodi i kvanitativni sadržaj cinka je određen na ICP-MS Varian 820 (Palo Alto, CA, USA). 5.2.5.6.Kvantitativno određivanje gvožđa, sulfata i hlorida Sadržaj gvožđa u uzorcima je određen masenom spektrofotometrijom. Razaranje uzorka se vrši u smeši koncentrovane azotne kiseline i vodonik-peroksida, uzorci su po potrebi razblaživani u prečišćenoj vodi i sadržaj je određivan na masenom spektrometru Varian 820 (Palo Alto, CA, USA). Određivanje koncentracije sulfatnog anjona se zasniva na metodi građenja barijum- sulfata, a koncentracija sulfatnog anjona se određuje fotometrijski na talasnoj dužini od 430 nm. Koncentracija hloridnih jona se takođe određuje fotometrijski na 468 nm, indirektno određivanjem Fe(III)-tiocijanata, koji nastaje u reakciji između hloridnog jona i živa- tiocijanata, a oslobođeni tiocijanatni jon se vezuje sa gvožđem gradeći gvožđe(III)- tiocijanat. 45 5.2.6 In silico metode 5.2.6.1 Numerička dekonvolucija Stepen i brzina kojom lekovita supstanca dospeva u sistemsku cirkulaciju se može proceniti numeričkom dekonvolucijom kao jednom od konvencionalnih farmakokinetičkih metoda. Numerička dekonvolucija in vivo profila koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez i nakon istovremene primene sa preparatima koji sadrže jone metala (15, 16, 136) je rađena u Kinetika 5.0 programu (Thermo Kinetica version 5.0, Thermo Fisher Scientific). Podaci o koncentraciji ciprofloksacina u plazmi nakon intravenske primene (161) su korišćeni kao težinska funkcija. 5.2.6.2 GastroPlus tm programski paket In silico simuliranje interakcije je izvršeno uz primenu programa GastroPlustm (GastroPlus 6.1, SimulationPlus, Lancaster, Kalifornija, SAD). Kao ulazni parametri neophodni za simulaciju (fizičko-hemijske i farmakokinetičke osobine ciprofloksacina) korišćeni su literaturni podaci, eksperimentalno dobijene i in silico predviđene vrednosti odgovarajućih parametara. Da bi se generisao odgovarajući model bilo je neophodno uneti sledeće fizičko.hemijske parametre: Peff, rastvorljivost i pH na kojoj je određena, pKa vrednost, koeficijent difuzije, logP, gustinu i radijus čestica. Kao ulazni parametar korišćena je eksperimentalno određena vrednost za rastvorljivost u vodi dok je vrednost efektivne permeabilnosti (Peff) dobijena korišćenjem literaturnih podataka za biološku raspoloživost ciprofloksacina uz korišćenje eksponencijalne jednačine (22): Fa=(1-e -1,47Peff )*100 Sve simulacije su rađene sa setom fizioloških parametara koji opisuje primenu leka na gladno. ASF faktori su optimizovani u cilju što boljeg podudaranja in vivo i in silico dobijenog profila koncentracije leka u plazmi. Analiza osetljivosti parametara Procenjen je uticaj četiri ulazna parametra (rastvorljivost, permeabilnost, vreme prolaska kroz želudac i vreme prolaska kroz tanko crevo) na procenat apsorpcije ciprofloksacina. U toku PSA analize jedan parametar se varira i uticaj svakog parametra 46 procenjuje se nezavisno. Rastvorljivost je varirana u opsegu 0.1 - 100 mg/ml, a permeabilnost u opsegu 0.79 - 3.14 ×10-4 cm/s (što obuhvata opseg 0.5-2 puta veće vrednosti od vrednosti koja je korišćena kao ulazni parameter). Vreme prolaska kroz želudac je varirano u opsegu 0.25 - 3 h, dok je vreme prolaska kroz tanko crevo varirano u opsegu 3 – 4 h (163). Validacija metode U situaciji kada su dostupne studije koje su sprovedene u in vivo uslovima, tačnost predviđanja programa procenjuje se na osnovu uporedne analize stvarnih i predviđenih vrednosti parametara izračunavanjem procenta greške predviđanja (Percent Prediction Error, % PE), koji se definiše kao relativni odnos razlike stvarne i simulirane vrednosti parametara. Za procenu greške predviđanja pojedinačnih farmakokinetičkih parametara (Cmax, tmax, PIK0-∞) korišćen je sledeći izraz: PE(%) = A – B A x 100 gde je PE(%) – greška predviđanja izražena u procentima, A – uočena (eksperimentalna) vrednost i B – predviđena (simulirana) vrednost. Predviđanje se smatra uspešnim ukoliko je prosečna greška predviđanja manja od 10 % (162). In vivo uočeni i in silico simulirani profili koncentracije leka u plazmi u funkciji vremena, su upoređeni i na osnovu vrednosti statističkih parametara (koeficijent korelacije r 2 , sume kvadrata greške SSE, korena iz srednje vrednosti kvadrata greške RMSE, srednje vrednosti apsolutne greške MAE). 47 6. REZULTATI I DISKUSIJA 6.1. In vivo ispitivanja U ovom poglavlju prikazana je analiza literaturnih podataka koji se odnose na in vivo ispitivanje biološke raspoloživosti ciprofloksacina, kao i njegove interakcije sa istovremeno primenjenim preparatima koji sadrže jone metala. Detaljna analiza in vivo studija dostupnih u literaturi pruža uvid u intenzitet promena u biološkoj raspoloživosti ciprofloksacina nakon istovremene primene sa preparatima koji sadrže jone metala. Na osnovu prikupljenih podataka sprovedena je identifikacija kinetike apsorpcije ciprofloksacina u uslovima primene bez, kao i pri istovremenoj primeni različitih preparata koji sadrže jone gvožđa, kalcijuma, aluminijuma i cinka, što je primenjeno kao osnov za in vitro i in silico modelovanje i simulaciju procesa koji se odvijaju in vivo. U tabeli 4 je dat pregled in vivo studija biološke raspoloživosti ciprofloksacina. U tabeli 5 dat je pregled rezultata in vivo studija interakcije ciprofloksacina sa jonima metala. In vivo određivanje bioraspoloživosti ciprofloksacina je bila tema brojnih istraživanja (117-122) i u studijama su korišćene doze ciprofloksacina u opsegu 50-1000 mg. Pokazano je da apsolutna bioraspoloživost ciprofloksacina varira u opsegu 52-90 % (tabela 4). Korišćenje različitih doza, dizajn studija, varijabilna permeabilnost i postojanje prozora za apsorpciju, kao i različita raspadljivost tableta i brzina rastvaranja aktivne supstance iz tableta koje sadrže različite doze ciprofloksacina predstavljaju potencijalne uzroke za uočenu varijabilnost u bioraspoloživosti ciprofloksacina. Istovremena primena hrane, lekova ili dijetetskih suplemenata koji sadrže jone metala smanjuje maksimalnu koncentraciju ciprofloksacina u plazmi, dok neznatno utiče na vreme postizanja maksimalne koncentracije u plazmi (tabela 5). Bioraspoloživost ciprofloksacina u prisustvu jona metala je smanjena u opsegu 40-85 % (14-17, 132- 148). Istovremena primena ciprofloksacina sa preparatima koji sadrže aluminijum- hidroksid dovodi do smanjenja bioraspoloživosti ciprofloksacina za više od 80 %. Iako se, generalno, smatra da je smanjena biološka raspoloživost ciprofloksacina primenjenog sa preparatima koji sadrže jone metala posledica nastanka kompleksa sa smanjenom permeabilnošću i/ili smanjenom rastvorljivošću, ovakvi rezultati mogu 48 nastati i usled precipitacije ciprofloksacina u uslovima promenjene pH vrednosti u lumenu creva, kao i usled adsorpcije ciprofloksacina na nerastvorene komponente prisutne u GIT-u. Tabela 4. Pregled literaturnih in vivo studija bioraspoloživosti ciprofloksacina Table 4. Summary of the literature in vivo data on ciprofloxacin bioavailability Dose (mg) Cmax (mg/l) tmax (h) ka (h -1 ) kel AUC (mgh/l) BA (%) No of volunteers Ref. 50 0.28 0.58 NA NA 1.00 77.0 12 117 100 0.49 0.82 NA NA 1.90 63.0 750 2.65 1.16 NA NA 12.20 54.0 100 0.73 1 3.633 0.545 2.10 82.7 12 118 250 1.59 1.25 3.367 0.441 5.28 83.1 500 2.77 1.54 3.120 0.283 9.61 75.7 1000 5.57 1.75 2.433 0.302 22.84 89.9 100 0.37 1.16 1.782 NA 1.77 64.0 12 119 250/fasting 1.04 1.00 2.034 NA 4.23 NA 10 250/fed 0.83 1.34 2.142 NA 3.58 NA 10 500 1.51 1.18 1.476 NA 6.78 52.0 10 750 1.97 1.26 1.842 NA 8.77 - 12 200 1.20 0.71 - - - 69.0 12 120 200 1.18 0.69 8.580 -- 4.18 69.0 8 121 750 2.97 1.38 1.480 - 15.30 69.1 500 2.70 - - - 10.70 75.0 12 122 750 3.80 - - - 16.80 78.0 49 Tabela 5. Pregled in vivo rezultata interakcije ciprofloksacina sa jonima metala nakon oralne primene 500 mg ili 750 mg ciprofloksacin-hidrohlorida u obliku tableta Table 5. Summary of the in vivo data on ciprofloxacin – metal ion interaction following oral administration of 500 mg or 750 mg ciprofloxacin tablets Study description Dose/ metal (mg) Dose/ ciprofloxacin (mg) Cmax (mg/l) tmax (h) AUC (mgh/l) No of volunt. Ref . Control 1 - 500 2.80 - 14.66 12 16 Control 2 - 500 3.20 - 15.71 Ferrous sulfate 65.0 500 0.70 - 5.37 Multivitamins with zinc 23.9 500 1.90 - 11.29 Control - 500 2.10 1.50 13.30 8 133 Ferrous fumarate 70.0 500 0.60 1.50 4.00 Control - 500 3.00 1.20 16.20 8 15 Ferrous sulfate 60.0 500 2.00 0.90 9.40 Ferrous gluconate 69.6 500 1.30 1.10 5.80 Oligominerals with zinc 15.0 500 1.40 0.90 7.70 Control - 500 2.15 1.30 12.20 8 14 Ferrous sulfate 100.0 500 0.95 1.00 5.00 Control - 750 3.18 1.24 13.50 12 136 Calcium carbonate 1360.0 750 1.69 1.29 7.82 Aluminium hydroxide 623.0 750 0.60 1.61 2.08 Control - 750 3.42 1.25 16.07 12 17 Maloox (aluminium/magnesi um hydroxide suspension 30 ml) - 750 0.68 0.66 2.42 Grafički prikaz dostupnih literaturnih podataka dat je na slici 6. U rezultatima in vivo studija bioraspoloživosti ciprofloksacina nakon oralne primene može se uočiti velika varijabilnost, kako za vrednosti bioraspoloživosti ciprofloksacina bez (control), tako i nakon istovremene primene sa lekovima, dijetetskim suplementima ili hranom koja sadrži jone metala (slika 6). Može se uočiti da je bioraspoloživost ciprofloksacina smanjena u prisustvu jona metala (gvožđe, kalcijum, aluminijum, cink). 50 Slika 6. Bioraspoloživost ciprofloksacina bez/nakon istovremene primene sa preparatima koji sadrže jone metala: rezime literaturnih podataka (''control'' predstavlja apsolutnu bioraspoloživost ciprofloksacina; “Zn multivit, Ca, Fe, Al/Mg,” predstavljaju relativnu bioraspoloživost ciprofloksacina nakon istovremene primene sa preparatima koji sadrže jone metala; srednja vrednost ±SD su prikazani za svaki set podataka) Fig. 6. Ciprofloxacin bioavailability with and without metal ion containing products co- administration: summary of available literature data (“control” denotes absolute bioavailability of ciprofloxacin tablets; “Zn multivit, Ca, Fe, Al/Mg,” denote relative bioavailability of ciprofloxacin when co-administered with preparations containing different metallic ions; average value ±SD for each data set is included). 6.1.1. In vivo interakcija ciprofloksacina sa jonima metala Soli gvožđa In vivo studija Kara i sar. (15) pružila je uvid u intenzitet promena u farmakokinetičkim parametrima i bioraspoloživosti ciprofloksacina bez, kao i nakon istovremene primene sa različitim solima gvožđa. Srednji profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon primene sa preparatom gvožđe(II)-sulfata/gvožđe(II)-glukonata su korišćeni za in silico simulaciju interakcije između ciprofloksacina i jona gvožđa (poglavlje 6.3.2). 51 U studiji je učestvovalo 8 zdravih dobrovoljaca kod kojih je ispitivan uticaj istovremeno primenjene tablete ciprofloksacina (500 mg) sa 300 mg gvožđe(II)-sulfata (60 mg gvožđa), tablete sa 600 mg gvožđe(II)-glukonata (69.6 mg gvožđa) ili Centrum tablete sa 10 mg elementarnog gvožđa. Smanjenje maksimalne koncentracije ciprofloksacina u plazmi nakon primene sa tabletom gvožđe(II)-sulfata je bilo 37 %, dok je u slučaju tableta gvožđe(II)-glukonata smanjenje bilo čak 57 %. Biološka raspoloživost ciprofloksacina je bila smanjena za 46 % u prisustvu gvožđe(II)-sulfata, a za 67 % u prisustvu gvožđe(II)-glukonata. Razlike u smanjenju biološke raspoloživosti ciprofloksacina se objašnjavaju različitom brzinom rastvaranja tableta gvožđa u in vivo uslovima, pa je zbog toga interakcija jače izražena sa gvožđe(II)-glukonatom (15). Kao potencijalni mehanizam interakcije je predloženo građenje kompleksa između ciprofloksacina i jona gvožđa. Profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon primene sa preparatom gvožđe(II)-sulfata su prikazani na slici 7a. Jedinjenja aluminijuma i kalcijuma U in vivo studijama je uglavnom ispitivana bioraspoloživost ciprofloksacina nakon istovremene primene sa preparatima aluminijuma i magnezijuma. Frost i sar. (136) su in vivo ispitivali uticaj aluminijum-hidroksida i kalcijum-karbonata na bioraspoloživost ciprofloksacina. Ova studija je izabrana kao model za in silico ispitivanje interakcije između ciprofloksacina i jona aluminijuma, kao i ciprofloksacina i jona kalcijuma. Srednji profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon primene sa preparatom aluminijuma/kalcijuma su korišćeni za in silico simulaciju. U studiji Frost i sar. je učestvovalo 12 zdravih dobrovoljaca. Ispitivan je uticaj aluminijum-hidroksida na biološku raspoloživost ciprofloksacina kada se tableta sa 750 mg ciprofloksacina primeni 5 minuta nakon doze od 1800 mg (3 tablete po 600 mg) aluminijum-hidroksida. Uočeno je značajno smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina (za 85 %) u prisustvu aluminijum-hidroksida. U zaključku autori daju preporuku da se preparati sa aluminijum-hidroksidom, koji se koriste u lečenju gastritisa, ne primenjuju istovremeno sa preparatima ciprofloksacina. Kao predlog potencijalnog uzroka smanjene bioraspoloživosti ciprofloksacina pominje se mogućnost građenja kompleksa i promene u gastričnoj pH vrednosti (136). U istom istraživanju uočeno je i značajno smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina 52 (za oko 40 %) nakon primene četiri tablete sa po 850 mg kalcijum-karbonata. Interesantno je to da su, kod dobrovoljaca koji su primenjivali tablete sa kalcijum- karbonatom, zabeležene značajne interindividualne razlike (Cmax u opsegu 0.9-1.7 µg/ml), dok kod dobrovoljaca koji su primenjivali tablete sa aluminijum-hidroksidom nisu zabeležene značajne interindividualne razlike u smanjenju koncentracije ciprofloksacina u plazmi (Cmax ~0.6 µg/ml) (136). Profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon primene sa preparatima aluminijum-hidroksida i kalcijum- karbonata su prikazani na slici 7b. Jedinjenja cinka U in vivo studijama nije ispitivan uticaj preparata koji sadrže samo jedinjenja cinka na bioraspoloživost ciprofloksacina. Kara i sar. (15) i Polk i sar. (16) su u in vivo ispitivanjima koristili multivitaminske/oligomineralne preparate koji sadrže različite količine soli cinka u kombinaciji sa jedinjenjima drugih metala ili vitamina B-grupe. U studiji Polka i sar. (16) korišćeni preparat sa cinkom sadržavao je 23.9 mg cinka i vitamine, dok je oligomineralni preparat korišćen u studiji Kara i sar. (15) pored 15 mg cinka, sadržavao i 10 mg gvožđa, 100 mg magnezijuma, 162 mg kalcijuma, 2 mg bakra i 5 mg mangana koji, takođe, mogu da stupe u interakciju sa ciprofloksacinom i doprinesu smanjenju njegove koncentracije u plazmi. Za in silico simulaciju interakcije ciprofloksacina i jona cinka korišćeni su srednji profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon istovremene primene sa multivitaminskim preparatom koji sadrži cink (16). Polk i sar. (16) su smanjenje koncentracije ciprofloksacina u plazmi objasnili građenjem kompleksa koji se ne apsorbuje, a u čijem građenju učestvuju 4- keto i 3-karboksilna grupa ciprofloksacina. U ovoj studiji učestvovalo je 12 dobrovoljaca i zabeleženo je smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina za 24 %, nakon istovremene primene sa dijetetskim suplementom koji sadrži 23.9 mg cinka. S obzirom da nije uočen uticaj primenjenih preparata na promenu pH vrednosti u GIT-u, autori su istakli da je glavni mehanizam interakcije građenje kompleksa (16). Profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi bez, kao i nakon primene sa preparatom cinka su prikazani na slici 7c. Na osnovu prikaza farmakokinetičkih parametara za sve tri in vivo studije (tabela 5), može se uočiti da nema značajnih razlika u vrednosti maksimalnih koncentracija 53 ciprofloksacina u plazmi, bez obzira na razliku u primenjenoj dozi ciprofloksacina. Slika 7a-c. Profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi nakon primene 500/750 mg ciprofloksacin-hidrohlorida u obliku tableta bez/sa preparatima: a) gvožđa b) kalcijum- karbonata ili aluminijum-hidroksida c) cinka Fig. 7a-c. Ciprofloxacin plasma concentration profiles following oral administration of 500/750 mg ciprofloxacin tablets without (control) and with a) iron salts b) calcium carbonate or aluminium hydroxide, c) multivitamins with zinc a) b) c) 54 Na slici 7a-c dati su grafički prikazi in vivo profila koncentracije ciprofloksacina u plazmi nakon primene tablete od 500 mg ili 750 mg ciprofloksacina sa gvožđe(II)- sulfatom, kalcijum-karbonatom, aluminijum-hidroksidom ili preparatom koji sadrži cink i može se uočiti da se profili koncentracije ciprofloksacina u plazmi nakon primene ciprofloksacina sa preparatom koji sadrži jon metala poprilično razlikuju. Slika 8. Profili apsorpcije ciprofloksacina bez/nakon istovremene primene sa preparatima gvožđe(II)-sulfata, gvožđe(II)-glukonata, kalcijum-karbonata, aluminijum-hidroksida ili multivitamina sa cinkom dobijeni numeričkom dekonvolucijom Fig. 8. Ciprofloxacin absorption profiles without and with ferrous sulfate, ferrous gluconate, calcium carbonate, aluminium hydroxide or multivitamin zinc tablets co-administration calculated by numerical deconvolution Na slici 8 dat je prikaz profila apsorpcije ciprofloksacina za kontrolne studije (15, 16, 136) i studije interakcije sa jedinjenjima gvožđa, aluminijuma, kalcijuma i cinka dobijene numeričkom dekonvolucijom u odnosu na profil koncentracije ciprofloksacina u plazmi uočen nakon intravenske primene ciprofloksacin-hidrohlorida u dozi od 10 mg (161). Može se uočiti da je apsorpcija ciprofloksacina brza i da se dešava u najvećem stepenu u prvih 2 - 4 sata nakon primene. Istovremena primena preparata koji sadrže gvožđe, kalcijum, aluminijum ili cink, utiče na procenat apsorbovanog ciprofloksacina u različitom stepenu, u zavisnosti od vrste i doze jona metala. 55 6. Results and discussion 6.1 In vivo data Detailed survey of the literature data related to ciprofloxacin bioavailability without, as well as with metallic cations containing preparations co-administered is given in this chapter. Summary of the literature data on ciprofloxacin absolute bioavailability (117-122) is given in Table 4. Doses of ciprofloxacin used were in the range 50-1000 mg. The in vivo data indicate rapid and somewhat variable ciprofloxacin absorption with the absolute bioavailability values ranging from 52 to 90 %. Ciprofloxacin variable bioavailability may depend on different doses of ciprofloxacin administered, different study designs, ciprofloxacin permeability and narrow absorption window in the upper small intestine and differences in disintegration and dissolution rates of tablets containing ciprofloxacin. Reduced ciprofloxacin bioavailability ranging from 40-85 % from tablets containing ciprofloxacin hydrochloride when co-administered with metallic ion containing preparations has been reported in a number of in vivo studies (14-17, 132-148). Formation of a nonabsorbable complex has been postulated as the interaction mechanism, although some authors commented that other physicochemical factors, such as solubility (14) or adsorption (156), may also play a role. Overviews of the literature data related to ciprofloxacin bioavailability without/with concomitant administration of metallic cations containing preparations are given in Table 4 and Table 5, respectively. Graphical summary of the in vivo data is presented in Fig. 6, where the first column represents ciprofloxacin absolute bioavailability data obtained from a number of studies (117- 122), while other columns represent ratio of average AUC values obtained following ciprofloxacin administration with and without different metallic ion containing preparations. Relatively high variability in drug bioavailability is evident, both in the pharmacokinetic studies following oral administration of ciprofloxacin hydrochloride tablets alone, as well as in the interaction studies in which various drug products or dietary supplements containing different metallic compounds were co-administered. 6.1.1 In vivo interaction between ciprofloxacin and metallic cations Iron Kara et al. (15) investigated the effects of ferrous sulfate (300 mg), ferrous gluconate (600 mg), and Centrum tablets containing 10 mg of iron on ciprofloxacin bioavailability in eight healthy subjects. Co-administration of ferrous sulfate resulted in a 37 % decrease in peak serum drug concentration, while decrease in ciprofloxacin serum concentration was 57 % with ferrous gluconate. Ciprofloxacin bioavailability was reduced by 46 % and 67 % in the presence of ferrous sulfate and ferrous gluconate, respectively. However, effects of ferrous gluconate and ferrous sulfate co-administration were found to be different and this discrepancy was attributed 56 to differences in the dissolution rates of ferrous sulfate and ferrous gluconate tablets. The authors suggested that the formation of a ciprofloxacin-iron complex was probably the cause of the reduction in ciprofloxacin bioavailability in the presence of iron. Mean plasma profiles observed in vivo after administration of ciprofloxacin tablets with iron salt (i.e sulfate, gluconate) were used for in silico simulation of ciprofloxacin/iron interaction. The respective profiles are presented in Fig. 7a. Aluminium and calcium compounds Reduced ciprofloxacin bioavailability after concomitant administration of preparations containing mixture of aluminium hydroxide and magnesium hydroxide has been reported (13, 17). Frost el al. (136) investigated effects of aluminium hydroxide and calcium carbonate on ciprofloxacin bioavailability. In the study of Frost et al. (136), 750 mg of ciprofloxacin was administered orally to 12 healthy volunteers alone and with: (I) four 850-mg calcium carbonate tablets taken 5 min before ciprofloxacin or (II) three 600-mg aluminium hydroxide tablets taken 5 min before ciprofloxacin. Relative bioavailability of ciprofloxacin when given with calcium carbonate was approximately 60 % of the control value. When ciprofloxacin was given with aluminium hydroxide, the relative bioavailability was approximately 15 %. Although ciprofloxacin bioavailability was reduced after concomitant calcium carbonate administration, the effect in individual subjects varied (Cmax was in range 0.9-1.7 µg/ml) and interaction with calcium was not observed in all volunteers. In contrast, the effects of aluminium hydroxide on ciprofloxacin bioavailability were similar in all volunteers. Authors concluded that aluminium hydroxide should not be given concomitantly with ciprofloxacin. The mechanism for ciprofloxacin-aluminium or ciprofloxacin-calcium interaction according to Frost et al. (136) includes formation of chelate complexes. Frost et al. (136) suggested that carboxyl group of ciprofloxacin was the most likely site for chelation and that the gastric pH would need to be elevated sufficiently to ionize the carboxyl group in the presence of cations. Mean plasma profiles observed in vivo after administration of ciprofloxacin tablets without and with aluminium hydroxide or calcium carbonate were used for in silico simulation of ciprofloxacin/aluminium and ciprofloxacin/calcium interaction. The respective profiles are presented in Fig. 7b. Zinc Kara et al (15) and Polk et al (16) evaluated the effects of multivitamins/oligominerals with zinc co-administration on ciprofloxacin bioavailability in healthy volunteers. Polk et al (16) used multivitamin containing 23.9 mg of zinc, while Kara et al (15) used dietary supplement containing 15 mg of zinc, 10 mg of iron, 100 mg of magnesium, 162 mg of calcium, 2 mg of copper and 5 mg of manganese. In the study of Polk et al. (16) 500 mg of ciprofloxacin was administered orally to 12 healthy volunteers alone and with multivitamins containing zinc. Concomitant administration of multivitamins containing zinc reduced the mean bioavailability of 57 ciprofloxacin by 24 %. Polk et al (16) suggested that formation of nonabsorbable chelates was the potential mechanism of ciprofloxacin-zinc interaction observed in vivo and that chelation probably occurred between the cation and the 4-keto oxygen and 3-carboxylic acid groups of ciprofloxacin. For in silico simulation of ciprofloxacin-zinc interaction, mean plasma profiles observed in vivo after administration of ciprofloxacin tablets without and with zinc containing multivitamin were used. The respective profiles are presented in Fig. 7c. Ciprofloxacin absorption profiles without and with ferrous sulfate, ferrous gluconate, calcium carbonate, aluminium hydroxide or multivitamins with zinc co-administration calculated by numerical deconvolution are presented in Fig. 8. The in vivo input profiles obtained suggest that after oral administration, either with or without metallic compounds, ciprofloxacin absorption kinetics exhibit initial rapid absorption in the first 2 - 4 h after administration. Percent of drug absorbed was reduced with concomitant metallic compounds administration in different extent depending on the dose and type of metallic cation co-administered. 58 6.2 In vitro ispitivanja Literaturni izvori navode da je osnovni uzrok smanjene biološke raspoloživosti ciprofloksacina u prisustvu jona metala građenje slabo permeabilnih kompleksa (13-17). Takođe, navodi se da i fizičko-hemijski parametri kao što je rastvorljivost mogu uticati na promenu bioraspoloživosti ciprofloksacina (14). Međutim, nijedan od ovih mehanizama interakcije nije eksperimentalno dokazan. Rezultati in vitro studija su relativno kontradiktorni i navodi se da kao produkt interakcije mogu nastati kompleksi koji imaju veću rastvorljivost u odnosu na polazno jedinjenje, da nastali kompleksi imaju smanjenu rastvorljivost, kao i da građenje kompleksa izostaje (80-84, 95, 98, 153- 155). Iako je kompleksiranje ciprofloksacina sa jonima metala i karakterizacija nastalih kompleksa bila tema brojnih istraživanja, sa biofarmaceutskog aspekta, značajne su interakcije između ciprofloksacin-hidrohlorida i jedinjenja metala koja su prisutna u terapiji, kao lekovi ili dijetetski suplementi. Na promenu rastvorljivosti može uticati promena pH sredine, kompleksiranje, uticaj zajedničkog jona, pa bi rezultati in vitro ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacin- hidrohlorida u prisustvu jona metala trebalo da ukažu koji od navedenih faktora utiče na promenu u rastvorljivosti u prisustvu jona metala. Rezultati ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacina i karakterizacija čvrstih faza prikupljenih u toku in vitro ispitivanja u prisustvu jona metala koji su opisani u okviru ovog poglavlja imaju ulogu u identifikaciji potencijalnih uzroka i mehanizama in vivo uočenih interakcija. 6.2.1 Ispitivanje rastvorljivosti ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida Rastvorljivost ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida je određena u vodi, 0.1 M HCl, 0.05 M H2SO4, fosfatnom puferu pH 6.8 i fiziološki zasnovanim medijumima za ispitivanje brzine rastvaranja (FaSSIF i FeSSIF). Eksperimentalno dobijene vrednosti prikazane su u tabeli 6. Na slici 9 dat je prikaz pH zavisnog profila rastvorljivosti ciprofloksacina sa eksperimentalno određenim vrednostima za rastvorljivost ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida u različitim medijumima. 59 Tabela 6. Rastvorljivost ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida u različitim medijumima Table 6. Solubility of ciprofloxacin and ciprofloxacin-hydrochloride in various media Media ciprofloxacin mM mg/ml pH ciprofloxacinHCl mM mg/ml pH water 0.29 0.099 7.0 109.0 42.00 4.04 0.1 M HCl - - - 33.0 12.68 1.20 0.05 M H2SO4 - - - 55.0 21.20 1.52 phosphate buffer pH 6.8 0.30 0.117 6.8 0.3 0.12 6.79 FaSSIF 1.00 0.34 6.5 13.0 4.94 5.20 FeSSIF 9.97 3.30 5.0 43.0 16.40 4.70 Slika 9. Rastvorljivost ciprofloksacina Fig. 9. Ciprofloxacin solubility Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi je 42 mg/ml, u fosfatnom puferu pH 6.8 je 0.117 mg/ml, a rastvorljivost ciprofloksacin baze u vodi je 0.099 mg/ml. Uočava se da je rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u medijumu pH 6.8 i ciprofloksacina u vodi slična, pa se može očekivati da na pH 6.8, dolazi do taloženja i izdvajanja ciprofloksacin baze. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u 0.1 M HCl je niža u odnosu na rastvorljivost u vodi, što može biti uslovljeno prisustvom hloridnog jona koji 60 suzbija disocijaciju ciprofloksacin-hidrohlorida i smanjuje njegovu rastvorljivost (efekat zajedničkog jona). Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u 0.05 M sumpornoj kiselini je 21.2 mg/ml, a smanjenje rastvorljivosti može ukazati na eventualno građenje slabije rastvorljive soli ciprofloksacin-sulfata. Rastvorljivost ciprofloksacin- hidrohlorida u FaSSIF-u je 4.94 mg/ml, dok je rastvorljivost ciprofloksacina u istom medijumu 0.34 mg/ml. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida je dosta veća od rastvorljivosti u puferu pH 6.8 verovatno usled prisustva solubilizatora (žučnih soli) u FaSSIF medijumu. Sa druge strane, rastvorljivost u FeSSIF-u (16.4 mg/ml) je skoro tri puta manja od rastvorljivosti u vodi. Rastvorljivost ciprofloksacina u FeSSIF-u je 3.3 mg/ml što je oko trideset puta više od njegove rastvorljivosti u vodi. Iako je rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u FaSSIF-u i FeSSIF-u znatno niža od one određene u vodi, viša je u odnosu na teorijski izračunatu vrednost za datu pH. Odnos između eksperimentalno dobijene i teorijske vrednosti za rastvorljivost na pH vrednostima medijuma je 6.4 za FaSSIF i 7.2 za FeSSIF. Uzrok nešto niže rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida u FeSSIF-u u odnosu na vodu pored razlike u pH vrednosti može biti i prisustvo zajedničkog, hloridnog jona u medijumu. Uzimajući u obzir da ciprofloksacin ima dve pKa vrednosti, može se pretpostaviti da se u FaSSIF-u (pH 6.8) ciprofloksacin nalazi u obliku cviter-jona, dok je u FeSSIF-u (pH 5.0) u obliku katjona. U studiji Ottaviani i sar. (164) uočeno je da je rastvorljivost većine supstanci veća u FaSSIF-u u odnosu na pufer pH 6.8. Razlog tome je bolja solubilizacija pozitivno naelektrisanih supstanci, usled postojanja elektrostatičkih interakcija. Ako se uporedi odnos eksperimentalno dobijene i teorijski izračunate rastvorljivosti za supstance koje su analizirane u radu Ottaviani i sar. (164), može se uočiti da su eksperimentalno dobijene vrednosti do tri puta veće od teorijskih, što navodi na zaključak da rastvorljivost u FaSSIF-u zavisi od liposolubilnosti supstance, jer se u FaSSIF-u povećava rastvorljivost slabo rastvorljivih supstanci. 6.2.2 Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta Brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta je određena u aparaturi sa standardnom lopaticom i zapreminom od 900 ml vode kao medijuma i aparaturi sa mini lopaticom i zapreminama vode 250, 150 i 50 ml, pri brzini okretanja lopatice od 50 61 o/min (slika 10). Na slici 11 prikazani su profili brzine rastvaranja ciprofloksacin- hidrohlorida iz tableta u aparaturi sa mini lopaticom, u 50 ml vode, 0.1 M HCl, USP fosfatnom puferu pH 6.8, acetatnom puferu pH 4.5, FaSSIF i FeSSIF-u. Slika 10. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u vodi u aparaturi sa standardnom (900 ml) i mini lopaticom (250, 150 i 50 ml) Fig. 10. Ciprofloxacin tablet dissolution in water as dissolution media in standard paddle (900 ml) and mini paddle apparatusses (250, 150, 50 ml) Na osnovu rezultata ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta u aparaturi sa standardnom i aparaturi sa mini lopaticom, pri različitim zapreminama vode kao medijuma, može se uočiti da su profili brzine rastvaranja slični i da promena hidrodinamike i zapremine medijuma ne utiče značajno na oslobađanje ciprofloksacin- hidrohlorida iz tableta. Takano i sar. (165) preporučuju korišćenje aparature sa mini lopaticom u biofarmaceutskoj karakterizaciji preparata, pa je, brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta ispitana u aparaturi sa mini lopaticom u 50 ml medijuma različitih pH vrednosti. Ciprofloksacin-hidrohlorid se brzo oslobađa iz tableta u vodi i kiselim medijumima, dok je oslobađanje u fosfatnom puferu pH 6.8 nepotpuno, usled ograničene rastvorljivosti na toj pH vrednosti (slika 11). 62 Slika 11. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u 50 ml različitih medijuma Fig. 11. Ciprofloxacin tablet dissolution in 50 ml of various media (water, pH 1.2, pH 4.5, pH 6.8, FaSSIF, FeSSIF) Brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u FeSSIF-u dostiže plato u prvih 10 minuta. U FaSSIF-u je nakon 90 minuta oslobođeno 57 % (pH 5.3) ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta. Početna pH vrednost FaSSIF-a je 6.5, pa se može pretpostaviti da je brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u ovom medijumu ograničena njegovom rastvorljivošću pri pH > 6. Kada se uporede profili brzine rastvaranja ciprofloksacina u puferu pH 6.8 i FaSSIF-u, može se uočiti da prisustvo solubilizatora u FaSSIF-u utiče na brzinu rastvaranja ciprofloksacina u ovom medijumu. U FeSSIF-u se nakon 90 minuta oslobodilo 94.7 % ciprofloksacin- hidrohlorida iz tableta, a pH vrednost medijuma se nije značajno promenila. Može se uočiti da se ciprofloksacin-hidrohlorid sporije oslobađa iz tableta u FeSSIF-u u odnosu na vodu, mada je više od 85 % supstance oslobođeno za 30 minuta. 63 6.2.3 Interakcija ciprofloksacina i jona gvožđa U in vivo studijama, interakcija između ciprofloksacina i gvožđa je uočena nakon istovremene primene preparata koji sadrže različite soli gvožđa (sulfat, fumarat, glukonat) (14, 15, 133). U in vitro ispitivanjima interakcije ciprofloksacina sa gvožđem često se koriste soli gvožđa(III) koje daju stabilnije komplekse, ali biofarmaceutski značaj tih ispitivanja se dovodi u pitanje jer se gvožđe u preparatima za oralnu primenu, za koje je u in vivo studijama uočen uticaj na biološku raspoloživost ciprofloksacina, nalazi u obliku gvožđa(II) i u tom obliku se i apsorbuje iz GIT-a. In vitro ispitivanje interakcije ciprofloksacina i jona gvožđa koje je opisano u ovom poglavlju, obuhvata ispitivanje rastvorljivosti, brzine rastvaranja, građenje kompleksa ciprofloksacin- hidrohlorida u prisustvu soli gvožđa(II) (gvožđe(II)-sulfata, gvožđe(II)-glukonata i gvožđe(II)-fumarata). 6.2.3.1 Interakcija između ciprofloksacina i gvožđe(II)-sulfata Ispitivanje rastvorljivosti Ispitivanje rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida je izvršeno u vodi uz dodatak rastućih koncentracija soli gvožđe(II)-sulfata (7.2, 36 i 72 mM soli). Dodatak soli gvožđa u medijum sa ciprofloksacinom dovodi do pojave žute boje koja ostaje prisutna u toku ispitivanja. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida se smanjuje u prisustvu gvožđe(II)-sulfata (Tabela 7). Eksperimentalno određena rastvorljivost ciprofloksacin baze u prisustvu gvožđe(II)-sulfata je 4.7 mg/ml (14.3 mM; pH 4.99). Rezultati ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacin baze u prisustvu gvožđe(II)-sulfata ukazuju na povećanje rastvorljivosti ciprofloksacina u prisustvu soli gvožđa, što je u skladu sa rezultatima koje su objavili Žakelj i sar. (149) i Eboka i sar. (150). Dobijeni rezultati takođe ukazuju da promena u rastvorljivosti nije samo posledica promene pH vrednosti. Na slici 12 dat je grafički prikaz koncentracije ciprofloksacina (sa odgovarajućim pH vrednostima) u medijumu u zavisnosti od količine dodate soli gvožđe(II)-sulfata, heptahidrata. 64 Slika 12. Koncentracija ciprofloksacin-hidrohlorida rastvorenog u medijumu koji sadrži različite koncentracije gvožđe(II)-sulfata Fig. 12. Concentration of ciprofloxacin hydrochloride dissolved in media containing different concentrations of ferrous sulfate Tabela 7. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi u prisustvu različitih količina gvožđe(II)-sulfata Table 7. Ciprofloxacin hydrochloride solubility in water with different amounts of ferrous sulfate added Amount of ferrous sulfate added (mM) ciprofloxacinHCl solubility mM mg/ml pH 0 109 42 4.04 7.2 90 35 2.40 36 61 24 2.57 72 33 12 3.40 Ispitivanje brzine rastvaranja Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta je rađeno u vodi kao medijumu u aparaturi sa standardnom lopaticom (900 ml) i u aparaturi sa mini lopaticom i zapreminama medijuma 250, 150 i 50 ml. Uzimajući u obzir činjenicu da je pH 2.57 65 za interakciju neophodno obezbediti visoke koncentracije i ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata, ispitivanje brzine rastvaranja je rađeno sa tri tablete ciprofloksacin- hidrohlorida i tri doze gvožđe(II)-sulfata (terapijska doza gvožđa je 100 mg) u 900, 250 i 150 ml medijuma. Molarni odnos ciprofloksacin/gvožđe u različitim zapreminama medijuma je uvek bio 1.2, dok su koncentracije ciprofloksacina i gvožđa u 900 ml bile 5 i 6 mM, u 250 ml 18 i 21 mM, u 150 ml 30 i 36 mM. Na slici 13 dat je prikaz profila brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata u različitim zapreminama medijuma. Slika 13. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta u prisustvu 6, 21 i 36 mM (1489 mg u 900, 250 i 150 ml/496 mg u 50 ml) gvožđe(II)-sulfata u različitim zapreminama medijuma Fig. 13. Ciprofloxacin tablet dissolution in different volumes of dissolution media in the presence of 6, 21 and 36 mM (1489 mg in 900, 250 and 150 ml/496 mg in 50 ml) of ferrous sulfate U standardnoj aparaturi sa lopaticom u 900 ml vode kao medijuma, celokupna količina ciprofloksacin-hidrohlorida se oslobodila u prisustvu soli gvožđa i interakcija nije uočena (slika 13). Sa druge strane, oslobađanje ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu gvožđa u aparaturi sa mini lopaticom je usporeno i nepotpuno, a interakcija se može uočiti u manjim zapreminama medijuma. Ispitivanje brzine rastvaranja je rađeno i u 66 zapremini medijuma od 50 ml, koristeći jednu tabletu ciprofloksacina i jednu dozu gvožđa (496 mg gvožđe(II)-sulfata, heptahidrata; 100 mg gvožđa). Oslobađanje ciprofloksacina je bilo smanjeno na 43.5 % u zapremini od 50 ml (slika 13). Dobijeni rezultati ukazuju da ispitivanje brzine rastvaranja u malim zapreminama medijuma može biti korisno za simulaciju fizičkohemijskih interakcija koje se događaju u GIT-u. Ovi rezultati se slažu sa podacima iznetim u studiji Takano i sar. (165) koji naglašavaju značaj korišćenja aparatura sa mini lopaticom u biofarmaceutskoj karakterizaciji preparata. Takođe, ovakvi rezultati su u skladu sa najnovijim podacima koji ukazuju da zahtev za uspostavljanjem sink uslova prilikom ispitivanja brzine rastvaranja nije u potpunosti opravdan i ne odslikava in vivo situaciju (47). Na slici 14 dat je prikaz profila brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tablete od 500 mg u prisustvu različitih količina gvožđe(II)-sulfata u 50 ml vode u aparaturi sa mini lopaticom. Može se uočiti da se koncentracija rastvorenog ciprofloksacina smanjuje sa povećanjem koncentracije gvožđe(II)-sulfata u medijumu. Slika 14. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta bez/u prisustvu 14, 36 and 50 mM gvožđe(II)-sulfata u 50 ml vode Fig. 14. Ciprofloksacin tablet dissolution in 50 ml water as dissolution media without and with addition of 14, 36 and 50 mM of ferrous sulfate 67 Količina gvožđe(II)-sulfata od 496 mg (100 mg gvožđa) odgovara dozi koja je korišćena u in vivo studiji (14) ispitivanja interakcije ciprofloksacina i gvožđa i dozi gvožđe(II)-sulfata koja se nalazi u tabletama za oralnu primenu. Koncentracija gvožđe(II)-sulfata u 50 ml medijuma koji sadrži 100 mg gvožđa iznosi 36 mM. Ova doza gvožđe(II)-sulfata je korišćena i prilikom ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu jona gvožđa u fiziološki zasnovanim medijumima koji simuliraju uslove u GIT-u na gladno (FaSSIF) i u stanju sitosti (FeSSIF). Na slici 15 dat je prikaz profila brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu 100 mg (36 mM) gvožđa u obliku gvožđe(II)-sulfata u 50 ml vode i fiziološki zasnovanim medijumima (FaSSIF i FeSSIF). Slika 15. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacina iz tableta sa/bez prisustva gvožđe(II)-sulfata u vodi, FaSSIF i FeSSIF Fig. 15. Ciprofloxacin tablet dissolution in water, FaSSIF and FeSSIF without/with ferrous sulfate added Nakon 90 minuta, u prisustvu gvožđe(II)-sulfata u vodi je oslobođeno 43.5 % ciprofloksacin-hidrohlorida, 42 % u FeSSIF-u, dok je u FaSSIF-u oslobođeno 63 % (slika 15). Izmerena pH vrednost FaSSIF medijuma na kraju ispitivanja je bila 4.5, dok 68 je pH vrednost u FeSSIF medijumu ostala nepromenjena (pH 5.0). Uticaj prisustva ciprofloksacina i jona gvožđa u medijumu na pH vrednost FaSSIF-a može se objasniti činjenicom da ovaj medijum poseduje mali puferski kapacitet i da dodatak supstanci koje reaguju kiselo snižava pH vrednost medijuma. Eksperimentalno određena rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u FeSSIF-u je 16.4 mg/ml, a u FaSSIF-u je 4.9 mg/ml. Koncentracija ciprofloksacin-hidrohlorida u medijumu nakon ispitivanja brzine rastvaranja u FaSSIF-u u prisustvu gvožđe(II)-sulfata je bila 6.3 mg/ml, a u FeSSIF-u 4.2 mg/ml. Oslobađanje ciprofloksacin-hidrohlorida bez, kao i u prisustvu gvožđe(II)-sulfata je slično u FaSSIF-u. U FeSSIF-u se može uočiti jasan uticaj gvožđe(II)-sulfata na koncentraciju ciprofloksacin-hidrohlorida u medijumu. Brzina rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu gvožđe(II)-sulfata u FeSSIF-u je u početku sporija u odnosu na vodu, pri čemu se plato dostiže nakon 20 minuta. Slika 16. Ispitivanje brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi u prisustvu gvožđe(II)-sulfata - izgled uzorka Fig. 16. Ciprofloxacin hydrochloride dissolution in water in the presence of ferrous sulfate – samples appearance Na slici 16 prikazan je izgled uzoraka prilikom ispitivanja brzine rastvaranja 69 ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi u prisustvu gvožđe(II)-sulfata. Pojava žute boje koja ostaje prisutna u toku ispitivanja i precipitata ukazuju na eventualni nastanak nove jonske vrste u interakciji sa gvožđe(II)-sulfatom. Građenje kompleksa Da bi se ispitao uticaj jona gvožđa na rastvorljivost i brzinu rastvaranja ciprofloksacin- hidrohlorida, interakcija između ciprofloksacin-hidrohlorida i soli gvožđa je praćena u in vitro uslovima mešanjem rastvora ispitivanih komponenata u različitim molarnim odnosima. Pripremljen je 0.05 M rastvor ciprofloksacin-hidrohlorida i 0.1 M rastvor gvožđe(II)-sulfata i ta dva rastvora su mešana u odnosima 9:1; 7:3; 1:1; 3:7 i 1:9. U svim uzorcima prilikom mešanja rastvora došlo je do pojave žute boje. U uzorku koji je mešan u odnosu 1:1 i u kome se nalazilo 25 mM ciprofloksacin-hidrohlorida i 50 mM gvožđe(II)-sulfata uočena je precipitacija, a čvrsta faza je izolovana i ispitana analitičkim metodama karakterizacije (XRD, DSC, TGA, FTIR). Koncentracija ciprofloksacin-hidrohlorida u rastvoru iznad taloga je bila 2.2 mg/ml (pH 2.8). Sanchez i sar. (84) su interakciju između ciprofloksacina i gvožđe(II) jona (u obliku soli gvožđe(II)-nitrata) takođe ispitivali u vodenom medijumu i zatim su vršili karakterizaciju dobijenih precipitata. Na osnovu dobijenih rezultata, odbacili su tvrdnju da se između ciprofloksacina i jona gvožđa gradi kompleks. Razlog za dobijanje ovakvih rezultata Sancheza i sar. se može objasniti činjenicom da su autori koristili veoma niske koncentracije i ciprofloksacina i soli gvožđa i da u tako razblaženom rastvoru nije moglo da dođe do interakcije. Ovakva situacija ne odgovara situaciji u in vivo uslovima gde su i ciprofloksacin i joni metala prisutni u mnogo većim koncentracijama. Eksperimentalno određena rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi je oko 20 puta veća od rastvorljivosti proizvoda nastalog u interakciji sa gvožđe(II)-sulfatom, pa se može postaviti pitanje da li u, in vivo uslovima, ograničena zapremina tečnosti u intestinumu, na mestu apsorpcije može biti ograničavajući faktor za rastvaranje. Koncentracija ciprofloksacina koja se može očekivati in vivo je oko 150 mM, ako se uzme u obzir da je zapremina tečnosti u intestinumu 10-350 ml (166-168). Kada ciprofloksacin dođe u deo intestinuma sa većom pH vrednošću dolazi do njegove precipitacije i ograničena je apsorpcija. Može se pretpostaviti da, prilikom istovremene 70 primene ciprofloksacina i preparata koji sadrži jon gvožđa, dolazi do građenja slabo rastvorljivog kompleksa koji ograničava proces apsorpcije. Karakterizacija čvrste faze Rezultati karakterizacije čvrste faze prikupljene nakon mešanja rastvora ciprofloksacin- hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata, kao i čvrste faze prikupljene nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorid tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata su prikazani na slikama 17-19. Slika 17. XRD spektri: a) ciprofloksacin baza, b) ciprofloksacin-hidrohlorid, c) sprašena ciprofloksacin tableta, d) čvrsta faza prikupljena nakon mešanja rastvora ciprofloksacin- hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata, e) čvrsta faza prikupljena nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata Fig. 17. XRD scans of ciprofloxacin base (a), ciprofloxacin HCl monohydrate (b), powdered ciprofloxacin tablets (c), solid phase from the mixture of ciprofloxacin HCl/ferrous sulfate solution (d), and solid phase collected from ciprofloxacin tablet dissolution in media containing ferrous sulfate (e) 71 Rezultati dobijeni metodom difrakcije X-zraka su pokazali da izolovane čvrste faze pokazuju jak pik na 9.40 2θ i imaju različit difraktogram od ciprofloksacina i ciprofloksacin-hidrohlorida. Ispitivani uzorci su imali kristalnu strukturu, pri čemu je intenzitet pika bio jači u uzorku nastalom mešanjem rastvora ciprofloksacin- hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata. Smanjeni intenzitet pika u uzorku dobijenom nakon ispitivanja brzine rastvaranja iz tablete je verovatno uslovljen prisustvom ekscipijenasa (slika 17). Slika 18. DSC spektri: a) ciprofloksacin baza, b) ciprofloksacin-hidrohlorid c) čvrsta faza prikupljena nakon mešanja rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata, d) čvrsta faza prikupljena nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata Fig. 18. DSC scans of ciprofloxacin base (a), ciprofloxacin hydrochloride (b), solid phase collected from the mixture of ciprofloxacin hydrochloride/ferrous sulfate solution (c) and solid phase collected from ciprofloxacin tablet dissolution in media containing ferrous sulfate (d) TGA analiza izolovanih čvrstih faza je pokazala gubitak od 19.5 % mase kod čvrste faze nastale mešanjem rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata i gubitak od 16.6 % mase kod čvrste faze nastale nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu gvožđe(II)-sulfata. Gubitak u masi je nastao usled evaporacije adsorbovane i kristalne vode prisutne u analiziranim uzorcima. a) b) c) d) 72 Gubitak mase ciprofloksacin-hidrohlorida je bio 6.9 %. Jak endotermni pik u DSC analizi prilikom analize čvrste faze izolovane nakon mešanja rastvora ciprofloksacin- hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata je uočen na 115ºC. Kod čvrste faze prikupljene nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata jak pik je bio na temperaturi od 110ºC i rezultati ukazuju na pojavu termalne dekompozicije. Endotermski pikovi ciprofloksacin-hidrohlorida i ciprofloksacin baze su na 320ºC, odnosno 270ºC, a na tim temperaturama nema pojave pikova u termogramima čvrstih faza (slika 18). Literaturni izvori navode da su u kompleksima ciprofloksacina sa jonima metala molekuli vode vezani za metalne jone i da do oslabađanja vode dolazi na temperaturama 150-170ºC (80, 92). Prilikom DCS analize kompleksi pokazuju termalnu dekompoziciju koja se odvija u dva koraka, prvo dolazi do dehidratacije koja se odvija na nižim temperaturama (do 200ºC), a zatim dolazi do pirolitičke dekompozicije anhidrovanog kompleksa do metala ili oksida metala (na temperaturama 200-300ºC) (80). Rezultati dobijeni DSC analizom izolovanih čvrstih faza nakon mešanja rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata i nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata takođe pokazuju termalnu dekompoziciju koja se odvija u dva koraka, što ukazuje na to da je u analiziranim čvrstim fazama prisutan kompleks ciprofloksacina i jona gvožđa. Analizirane čvrste faze izolovane nakon mešanja rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata ili nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu gvožđe(II)-sulfata imaju skoro identične FTIR spektre (slika 19). Na spektru se mogu uočiti trake koje potiču od OH grupe (na 3416 cm-1) i dve trake sa oštrim pikovima na 1701 i 1630 cm-1 koje potiču od karboksilne i ketonske grupe. Takođe, u spektru se može uočiti traka koja potiče od vibracije sulfatne grupe na 1103 cm -¹. U FTIR spektrima kompleksa ciprofloksacina i jona metala koji su opisani u literaturi, ne mogu se uočiti trake koje potiču od vibracija karboksilne grupe na oko 1700 cm-1, već se uočavaju dve trake koje karakterišu karboksilnu grupu na 1650-1510 cm-1 i na 1400-1280 cm -1. Traka koja karakteriše keto grupu iz piperazinskog prstena se nalazi na oko 1600 cm -1 (78, 80-83, 85). S obzirom da se pik koji karakteriše karboksilnu grupu uočava na FTIR spektru 73 dobijenom analizom izolovanih čvrstih faza, do kompleksiranja verovatno dolazi preko protonovanog piperazinskog prstena (trake između 2600 i 2400 cm-1) što je kontradiktorno tvrdnji nekih autora (82) da u građenju kompleksa učestvuje karboksilna grupa. Slika 19. FTIR spektri: a) ciprofloksacin baza, b) ciprofloksacin-hidrohlorid, c) čvrsta faza prikupljena nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin tableta u prisustvu gvožđe(II)- sulfata d) čvrsta faza prikupljena nakon mešanja rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata Fig. 19. FTIR scans of a) ciprofloxacin base, b) ciprofloxacin hydrochloride, c) solid phase collected from ciprofloxacin tablet dissolution in media containing ferrous sulfate d) solid phase collected from mixture containing ciprofloxacin hydrochloride and ferrous sulfate Kvantitativni sastav ispitivanih čvrstih faza izolovanih nakon mešanja rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-sulfata i nakon ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu gvožđe(II)-sulfata je sličan. Određeni sadržaj ciprofloksacina je oko 60 %, gvožđa oko 5 %, oko 19 % vode, 15 % sulfata i oko 5 % hlorida. Na osnovu ovih rezultata predložena struktura ciprofloksacin-gvožđe kompleksa je Fe(SO4)2(Cl)2(cf)2×(H2O)12. 74 6.2.3.2 Interakcija između ciprofloksacina i gvožđe(II)-glukonata/gvožđe(II)- fumarata U terapiji se, pored gvožđe(II)-sulfata, koriste i organske soli glukonat i fumarat. In vivo ispitivanja ukazuju da je i u prisustvu ovih soli biološka raspoloživost ciprofloksacina smanjena (15, 133). Ispitivanje rastvorljivosti Na slici 20 i u tabelama 8 i 9 dati su prikazi rezultata ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi u prisustvu različitih koncentracija gvožđe(II)- glukonata i gvožđe(II)-fumarata. Sva ispitivanja su vršena u vodi kao medijumu. Kao i prilikom ispitivanja interakcije između ciprofloksacina i gvožđe(II)-sulfata, prilikom ispitivanja rastvorljivosti i brzine rastvaranja u prisustvu gvožđe(II)-glukonata i gvožđe(II)-fumarata došlo je do stvaranja žute boje (glukonat) ili narandžasto-žute boje (fumarat). Slika 20. Koncentracija ciprofloksacin-hidrohlorida rastvorenog u medijumu koji sadrži različite količine gvožđe(II)-fumarata ili gvožđe(II)-glukonata Fig. 20. Concentration of ciprofloxacin hydrochloride dissolved in media containing different amounts of ferrous fumarate and ferrous gluconate 75 Tabela 8. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu različitih količina gvožđe(II)- fumarata Table 8. Ciprofloxacin hydrochloride solubility in water containing different amounts of ferrous fumarate Amount of ferrous fumarate added (mM) ciprofloxacinHCl solubility mM mg/ml pH 0 109.0 42 4.04 11.8 105.2 40 4.00 58.8 88.3 34 4.04 118 69.9 27 4.14 Tabela 9. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu različitih količina gvožđe(II)- glukonata Table 9. Ciprofloxacin hydrochloride solubility in water containing different amounts of ferrous gluconate Amount of ferrous gluconate added (mM) ciprofloxacinHCl solubility mM mg/ml pH 0 109.0 42 4.04 4.3 109.0 42 3.43 21.6 106.5 41 3.37 43.1 96.1 37 3.29 112 94.1 36 3.22 Može se uočiti da se rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida smanjuje sa povećanjem koncentracije gvožđe(II)-fumarata u medijumu, pri čemu nije zabeležena promena u pH vrednosti medijuma. Sa druge strane, u prisustvu gvožđe(II)-glukonata nije značajno smanjena količina rastvorenog ciprofloksacin-hidrohlorida. U slučaju soli glukonata, pokušano je i građenje kompleksa mešanjem rastvora ciprofloksacin-hidrohlorida i gvožđe(II)-glukonata u različitim molarnim odnosima, ali ni u jednom uzorku nije uočena pojava precipitata. Ispitivanje brzine rastvaranja S obzirom da se interakcija između ciprofloksacina i jona gvožđa može uočiti u malim zapreminama medijuma, ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta u prisustvu gvožđe(II)-glukonata ili gvožđe(II)-fumarata su rađena u aparaturi sa 76 mini lopaticom i 50 ml vode kao medijuma. Korišćeni su isti uslovi i ista količina gvožđa (u obliku soli glukonata/fumarata) kao i prilikom ispitivanja interakcije sa gvožđe(II)-sulfatom. Na slici 21 dat je uporedni prikaz profila brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi uz dodatak 100 mg gvožđa u obliku soli: gvožđe(II)- sulfata (496 mg), gvožđe(II)-fumarata (303 mg) ili gvožđe(II)-glukonata (829 mg). Slika 21. Profili brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta bez/u prisustvu gvožđe(II) glukonata, gvožđe(II)-fumarata i gvožđe(II)-sulfata u 50 ml medijuma Fig. 21. Ciprofloxacin tablet dissolution without/with ferrous gluconate, ferrous fumarate, ferrous sulfate addition in 50 ml of water as dissolution media Na oslobađanje ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta najviše utiče dodatak gvožđe(II)- sulfata. Oslobađanje ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu soli fumarata je smanjeno za 10 %, dok su neznatne razlike u oslobađanju ciprofloksacina uočene kada je u medijumu prisutna so glukonat. Nakon dodavanja gvožđe(II)-fumarata u medijum, ova so gvožđa je ostala suspendovana u vodi, dok se gvožđe(II)-glukonat u potpunosti rastvara po dodavanju u vodu. pH vrednost medijuma sa gvožđe(II)-fumaratom nakon ispitivanja je bila 4.14, dok je pH vrednosti medijuma sa gvožđe(II)-glukonatom bila 3.24. Gvožđe(II)-fumarat se slabo rastvara u vodi, pa je to verovatno jedan od razloga 77 za slabije izraženu interakciju ciprofloksacina sa ovom soli gvožđa. In vivo podaci ukazuju da je biološka raspoloživost ciprofloksacina smanjena za 70 % u prisustvu gvožđe(II)-fumarata. Može se pretpostaviti da je oslobađanje jona gvožđa iz soli izraženije u kiseloj sredini želuca i da se interakcija teže uočava in vitro usled ograničene rastvorljivosti soli gvožđa u vodi. U in vivo uslovima je zabeleženo smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina za 46 % nakon istovremene primene sa gvožđe(II)-sulfatom i za 67 % nakon istovremene primene ciprofloksacina sa gvožđe(II)-glukonatom. Ipak, u in vitro uslovima nisu primećene promene u oslobađanju ciprofloksacina u prisustvu gvožđe(II)-glukonata. Pojava žute boje u medijumu, u ovom slučaju verovatno ne ukazuje na interakciju, već potiče od rastvaranja gvožđe(II)-glukonata. Ciprofloksacin gradi soli sa organskim kiselinama koje imaju veću rastvorljivost od soli ciprofloksacina sa neorganskim kiselinama (169). Uočena pojava bi mogla da se objasni činjenicom, da prisustvo glukonata u medijumu može da pomeri ravnotežu reakcije ka stvaranju rastvorljivih proizvoda, sprečavajući pritom nastanak kompleksa. Nastanak soli ciprofloksacin- glukonata koja ima veću rastvorljivost od ciprofloksacin-hidrohlorida bi mogao biti razlog zašto se interakcija između ciprofloksacina i jona gvožđa ne može uočiti in vitro. 6.2.4 Interakcija između ciprofloksacina i jedinjenja aluminijuma U in vivo studijama, interakcija između ciprofloksacina i jedinjenja aluminijuma uočena je nakon istovremene primene sa aluminijum-hidroksidom, pri čemu je zabeleženo značajno smanjenje bioraspoloživosti ciprofloksacina (136). Sa druge strane, rezultati in vitro ispitivanja se poprilično razlikuju. Rastvorljivost ciprofloksacina je povećana u prisustvu aluminijum-hlorida, pri čemu dolazi do građenja rastvorljivih kompleksa (98, 153, 154), dok je prilikom ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacina u prisustvu aluminijum-hidroksida uočeno usporeno i nepotpuno oslobađanje ciprofloksacina iz tableta (97, 156, 157). U cilju identifikacije potencijalnog mehanizma interakcije ciprofloksacina i jedinjenja aluminijuma, sprovedeno je in vitro ispitivanje rastvorljivosti, brzine rastvaranja i karakterizacija čvrstih faza prikupljenih u toku in vitro ispitivanja u prisustvu jedinjenja aluminijuma. 78 Ispitivanje rastvorljivosti Ispitivanje rastvorljivosti je rađeno u vodi kao medijumu, a korišćena su dva jedinjenja aluminijuma, aluminijum-hlorid, heksahidrat i aluminijum-hidroksid. U tabelama 10 i 11, kao i na slici 22 dat je prikaz rezultata ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacin- hidrohlorida u prisustvu različitih količina aluminijum-hidroksida i aluminijum-hlorida, heksahidrata. Tabela 10. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu različitih količina aluminijum-hidroksida Table 10. Ciprofloxacin hydrochloride solubility in water containing different amounts of aluminium hydroxide Amount of aluminium hydroxide added (mM) ciprofloxacinHCl solubility mM mg/ml pH 0 109.0 42 4.04 26 99.0 38 4.50 128 56.0 22 4.80 385 62.6 24 4.90 Tabela 11. Rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu različitih količina aluminijum-hlorida Table 11. Ciprofloxacin hydrochloride solubility in water containing different amounts of aluminium chloride, hexahydrate Amount of aluminium chloride, hexahydrate added (mM) ciprofloxacinHCl solubility mM mg/ml pH 0 109.0 42.0 4.04 8.3 108.9 41.9 2.13 41.4 56.2 21.6 1.44 81.8 56.3 21.7 1.34 207 62.9 24.2 1.19 79 Slika 22. Koncentracija ciprofloksacin-hidrohlorida rastvorenog u medijumu koji sadrži različite količine aluminijum-hlorida, heksahidrata ili aluminijum-hidroksida Fig. 22. Concentration of ciprofloxacin hydrochloride dissolved in media containing different amounts of aluminium chloride and aluminium hydroxide U in vitro studijama uglavnom je ispitivana rastvorljivost ciprofloksacin baze u prisustvu aluminijum-hlorida i rezultati tih studija ukazuju na povećanje rastvorljivosti (149, 150, 153). Na osnovu rezultata ispitivanja rastvorljivosti prikazanih na slici 22, može se uočiti da koncentracija rastvorenog ciprofloksacin-hidrohlorida opada nakon dodatka 10 mg/ml (41.5 mM) aluminijum-hlorida i da se koncentracija rastvorenog ciprofloksacina ne menja ni nakon dodatka većih količina soli aluminijuma (82 mM i 207 mM). pH vrednost medijuma opada nakon dodatka aluminijum-hlorida, ali imajući u vidu pH zavisni profil rastvorljivosti ciprofloksacina, ne očekuje se da promena pH vrednosti u uočenom rasponu značajno utiče na rastvorljivost. Hloridni anjon iz aluminijum-hlorida, može uticati na rastvorljivost ciprofloksacin- hidrohlorida ako se nalazi u velikoj koncentraciji u rastvoru koji sadrži ciprofloksacin- hidrohlorid i aluminijum-hlorid (uticaj zajedničkog jona na rastvorljivost). Kada je u medijumu prisutan aluminijum-hlorid u koncentraciji od 10 mg/ml, koncentracija 80 hloridnog anjona je 0.1242 mol/l 1 Ukoliko je izračunata rastvorljivost ciprofloksacin- hidrohlorida u prisustvu te koncentracije hloridnog anjona manja od eksperimentalno određene rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi (109 mM), hloridni jon iz aluminijum-hlorida utiče na rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida. S obzirom da je izračunata vrednost za rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu 124.1 mM hloridnog jona, 97.7 mM, što je manje od eksperimentalno određene rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi, može se pretpostaviti da hloridni jon poreklom iz aluminijum-hlorida dovodi do smanjenja koncentracije ciprofloksacina u medijumu. Na osnovu rezultata ispitivanja rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida u prisustvu aluminijum-hidroksida, može se uočiti da se u prisustvu koncentracija aluminijum- hidroksida većih od 100 mM smanjuje koncentracija rastvorenog ciprofloksacin- hidrohlorida. Dodatak aluminijum-hidroksida ne utiče značajno na pH vrednost medijuma, pa se i u ovom slučaju uticaj pH vrednosti može isključiti. S obzirom da je aluminijum-hidroksid teško rastvorljiv u vodi, prisustvo velike količine aluminijum- hidroksida može delovati kao fizička barijera koja sprečava kontakt sa medijumom i rastvaranje ciprofloksacina. Takođe, potencijalan uzrok smanjene koncentracije ciprofloksacin-hidrohlorida bi mogla biti i adsorpcija jona ciprofloksacin-hidrohlorida na čestice aluminijum-hidroksida. Ispitivanje brzine rastvaranja Ispitivanja brzine rastvaranja ciprofloksacin-hidrohlorida iz tableta su rađena u zapremini medijuma od 50 ml u aparaturi sa mini lopaticom, uz dodatak 2 g aluminijum-hlorida, heksahidrata (166 mM jona aluminijuma) ili 1.8 g aluminijum- hidroksida (462 mM jona aluminijuma). Doza od 1.8 g aluminijum-hidroksida odgovara dozi koja je korišćena u in vivo studiji Frosta i sar. (131). Ispitivanje brzine rastvaranja 1 R=0.109 mol/l rastvorljivost ciprofloksacin-hidrohlorida u vodi (ciprofloxacin solubility in water) K (ciproHCl)= 1.2×10-2 mol2/l2 proizvod rastvorljivosti ciprofloksacin-hidrohlorida (ciprofloxacin hydrochloride solubility product) R'=[Cipro]= = 0.097 mol/l R'KMBaHKor pafla, fla npefljio>KeHa flucepTaunja y qennHn HM y flejiosuwa HMJe 6nna npeflno>KeHa sa flo6njahbe 6nno Koje flun/ioivie npeivia cryflujcKUM nporpaMMMa flpyrux BMCOKOLUKOnCKMX yCT3HOBa, fla cy pesynrajn KopexrHo HasefleHM n fla HMcaM KpiUMO/na ayropCKa npasa n Kopucrno MHTeneKTyanHy flpyrnxnmta. flOKTOpaHTa Y Beorpafly, IS". 'M-2o-'2x npunor 2. khjaea o MCToeeTHOCTii wraMnaHe M e/ieiopoHCKe eepsHJe flOKTOpCKor pafla Mivie M npesnivie ayropa AneKcaHflpa Bpoj MHfleKca 17/08 nporpaM aoKTOpcKe aKafleMCKe CTvanje us cbapMauevTCKe TexHo/iornie HacnoB pafla BnodjapiyiaueyrcKa KapaKrepusaunia unnpocbnoKcaunHa n jona Merana MeHTop ripocti. flp JeneHa rioTnnc3HM/3 fla je luraivinaHs sepsuja Mor floicropCKor pafla ncioBeTHa eneicrpoHCKOj sepsuJM Kojy cawi npeflao/ns sa o6jaBfbHBahbe Ha noprany flurnranHor penoanTopujyivia YHUBepsnTeTa y Beorpafly. a ce oOjase MOJM JIMHHH noflsun Besann 33 floOnjahte flOKTOpa HayKa, K30 LUTO cy MMG M npesMMe, roflMHa n MecTO poFjehta n flarywi e pafla. OBH .TWHHH noflaun Mory ce o6jaBmn Ha MpexoHMM CTpaHMqaivia 6n6nnoTeKe, y ejieicrpoHCKOM Karanory n y nySnuKaunjaivia YHnBepsnTera y Beorpafly. riorniic flOKTopaHra Y Beorpafly, tS.44- 2-o1l>. flpmiorS. Msjaea o C-BJiawfiyjeM YHMBepSMTeTCKy 6n6nnoTeKy ..Cserossp MapKosufi" fl3 y penosMTopMJyM YHMBepsnTera y BeorpaAy ynece Mojy AQicropCKy Ancepisqujy HacnoBOM: BnocpapMcmeyTCKa KapaKTepn3aunja MHiepaKunje unnpocpAOKcauMHa M JOHCI MeiQAQ Koja je Moje ayropcKO cs CBMM npmiosnivia npeAao/na caM y eneicrpoHCKOM 4)opiviaTy noroAHowi 33 rpaJHo Mojy AOKTopcKy Ancepiaunjy noxpafteHy y flurmajinn penosmopujyivi y BeorpaAy Mory f\a Kopucie CBM KOJM noujTyjy OApeASe caAp>KaHe y OAa6panoM TMny KpeaiMBHe sajeAHMue (Creative Commons) 33 Kojy CSM ce 1 . AyropCTBO 2. AyropCTBO - - HeKOMepMMJaJlHO - 6es npepSAe 4. AyropcTBO - HeKOMepi4MJ3JiHO - AenMTM noA MCTMM ycnoBMMS 5. AyropcTBO - 6es npepaAe 6. AyropCTBO - ASHMTM HOA MCTMM (MOHMMO A3 330Kpy>KMTe C3MO J6AHy OA LJJ6CT nOHyf)6HMX JlMUeHL(M, Kp3T3K OHMC A3T je H3 nOJiefjMHM HMCT3). norniic flOKTOpama Y BeorpsAy, J5". --M lol'b 1. AyropcTBo - floseorbaeaTe yMHOxosaite, flncTpn6yMHjy n jasHo caoniirraBafte Aena, n npepaAe, BKO ce HaBeAe nivie ayropa Ha HannH OApefjen OA crpane ayropa , Max n y KOMepMHjanne cspxe. OBO je HajcnoGoflHuja OA CBMX 2. AyropcTBo - HeKOMepqujanHO. flosBorbaBaie yMHOxosahbe, AHCTpn6yi4MJy v\ jaBHO caoninTaeaHbe Aena, n npepaAe, a«o ce HaseAe HMe ayropa Ha namiH OApefjen OA crpane ayiopa nnn AaBaoqa jinqeHLie. Osa m/menua ne AOSBO/tasa ynoipeSy 3. AyropcTBo - neKOMepMUJanno - 6es npepaAe, flosBorbaBaie yMHo>KaBahbe, AncTpn6yi4Mjy n jaeHo caonLUTaBafce Aena, 6es npowieHa, npeo6nnKOBahba nnn ynoipe6e Aena y CBOM Aeny, aKO ce HaBeAe nivie ayropa na Hanun OApefjen OA cipane ayropa nnn AaBaoqa jiMMeHqe. Osa nnqeHLia ne Aosso/baBa KowepMnjanny ynorpeSy Aena. y oAHOcy na cse ocrane nnqenMe, OBOM ntmeHMow ce orpaHMMasa Hajsenn o6nivi npasa KopniuneHja 4. AyropcTBO - HeKOMepunjanno - Aenmn noA HCTMM ycnoBuwa. yMHOxaBaH=e, AncrpnGytinjy n jaeno caoniiiraBahbe Aena, n npepaAe, aKo ce Hwe ayropa na nannH OApefjen OA crpane ayropa nnn AaBaoqa nnqeHMe n aKo ce npepaAa AncipuSyupa noA MCTOM nnn cnnHHOM nnueHLjoM, Osa nni4eni4a ne KOMepi4njanHy ynoipe6y Aena n npepaAa. 5. AyropciBO - 6ea npepaAe. flosso/basaie yMHOKasahte, Ancrpn6yi4njy n jasno caonturaBahbe Aena, 6es npoiviena, npeo6nnKOB3hba nnn ynoipeBe Aena y CBOM Aeny, aKo ce naseAe nwe ayiopa Ha naMnn oApefien OA crpane ayropa nnn . Osa nwueHqa AOSBonDasa KOMepMHjanny ynoipe6y Aena. 6. AyropcTBo - Aennrn noA MCTMM ycnoBMMa. flosBorbaeare Ancipn6yi4kijy n jasno caonujTaBahbe Aena, n npepaAe, BKO ce HaseAe mvie ayropa na H3HMH oApefjen OA crpane ayropa nnn Aaeaoua nnueHLte n SKO ce npepa^a Ancrpn6ynpa noA MCTOM nnn cnnHHOM nmieHqoM. Osa nnqeHqa KOMepunjanHy ynorpeSy Aena n npepaAa. Cnnnna je cocpTBepCKMM OAHOCHO nuMenqaMa oTBopenor