UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Višnja B. Popović Analiza sekundarnih metabolita i ispitivanje farmakološke aktivnosti odabranih vrsta roda Laserpitium L. (Apiaceae) Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Višnja B. Popović Analiza sekundarnih metabolita i ispitivanje farmakološke aktivnosti odabranih vrsta roda Laserpitium L. (Apiaceae) Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Višnja B. Popović Analysis of secondary metabolites and investigation of pharmacological activity of selected species of the genus Laserpitium L. (Apiaceae) Doctoral dissertation Belgrade, 2013. Doktorska disertacija je urađena na Katedri za farmakognoziju Univerziteta u Beogradu – Farmaceutskog fakulteta. Deo eksperimenata je urađen na Katedri za farmakologiju i Katedri za mikrobiologiju i imunologiju Univerziteta u Beogradu – Farmaceutskog fakulteta i u Laboratoriji za farmakognoziju i fitohemiju Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Gentu – Belgija (Laboratory for Pharmacognosy and Phytochemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent University, Belgium). Mentor __________________________________ Prof. dr Silvana Petrović, Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet Članovi komisije 1. __________________________________ Prof. dr Radica Stepanović-Petrović, Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet 2._________________________________ Prof. dr Marina Milenković Univerzitet u Beogradu – Farmaceutski fakultet 3._________________________________ Dr sc. Marjan Niketić, viši naučni saradnik, Prirodnjački muzej, Beograd 4. __________________________________ Dr sc. Arne Heyerick, naučni saradnik Fakultet farmaceutskih nauka, Univerzitet u Gentu Datum odbrane _________________________ Mentoru, prof. dr Silvani Petrović, najsrdačnije zahvaljujem na iskrenom i sveobuhvatnom angažovanju, pomoći, savetima i podršci u toku doktorskih studija i izrade ove doktorske disertcije. Rukovodiocima projekata, prof. dr Nadi Kovačević i prof. dr Radici Stepanović- Petrović zahvaljujem na poverenju, razumevanju i pruženoj mogućnosti da se uključim u projekte Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije. Erasmus Mundus Action 2 programu Evropske komisije zahvaljujem na dodeljenoj Basileus stipendiji (№ 1011092) za studijski boravak od 10 meseci u Laboratoriji za farmakognoziju i fitohemiju Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Gentu – Belgija (Laboratory for Pharmacognosy and Phytochemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Ghent University, Belgium). Dr Arne Heyerick-u zahvaljujem na nesebičnoj pomoći, iskrenoj podršci i razumevanju tokom prijave, samog studijskog boravka i izrade ove doktorske disertacije. Prof. dr Radici Stepanović-Petrović i njenom timu, doc. dr Maji Tomić i asist. dipl. farm. Аni Micov zahvaljujem na velikoj pomoći i strpljenju prilikom eksperimentalnog rada, kao i vrednim smernicama i savetima u vezi sa testiranjem antinociceptivne i antiedematozne aktivnosti. Prof. dr Marini Milenković veliku zahvalnost dugujem za stručnu pomoć i savete prilikom eksperimentalnog rada testiranja antimikrobne aktivnosti, ali i iskrenu i prijateljsku pomoć i podršku tokom čitavih doktorskih studija. Dr Marjanu Niketiću, kustosu prirodnjačkog muzeja, dugujem neizmernu zahvalnost na velikoj pomoći u terenskom prikupljanju biljnog materijala i idejama, smernicama i savetima u ovoj oblasti. Divnim ljudima dobre volje, Jeleni, Jeleni i bratu Vukašinu, koji su učestvovali u prikupljanju biljnog materijala, dugujem veliku zahvalnost za pomoć, podršku i entuzijazam na terenu. Takođe bih se zahvalila i prof. dr Dieter Deforce-u, prof. dr Serge Van Calenbergh-u i njegovom timu, kao i MSc. Jan Goeman-u za sredstva i pomoć prilikom rada u njihovim laboratorijama. Doc. dr Milici Pavlović-Drobac i prof. dr Maria Couladis dugujem veliku zahvalnost za pomoć u hemijskoj analizi etarskih ulja. Prof. dr Dragiću Bankoviću se zahvaljujem za veliku pomoć u statističkim proračunima. Kolektivu Katedre za farmakognoziju, Univerziteta u Beogradu – Farmaceutskog fakulteta, zahvaljujem na velikoj podršci i razumevanju u toku doktorskih studija. Svojim najmilijima, porodici i prijateljima, zahvaljujem za bezrezervnu i najiskreniju podršku i razumevanje, bez koje sve ovo ne bi bilo ni moguće, a ni važno. Najveću zahvalnost dugujem osobi koja je jako volela farmakognoziju i koja bi bila neizmerno srećna i ponosna da čita ovaj rad. Disertaciju posvećujem mom najvećem uzoru i anđelu čuvaru, majci Milici. Analiza sekundarnih metabolita i ispitivanje farmakološke aktivnosti odabranih vrsta roda Laserpitium L. (Apiaceae) Rezime Predmet doktorske disertacije je analiza sekundarnih metabolita i ispitivanje farmakološke aktivnosti hloroformskih i metanolnih ekstrakata i etarskih ulja tri vrste roda Laserpitium L. (Apiaceae): Laserpitium latifolium L., Laserpitium zernyi Hayek i Laserpitium ochridanum Micevski. Laserpitium latifolium je višegodišnja biljka, koja je široko rasprostranjena na evropskom kontinentu. Laserpitium zernyi je skardo-pindska endemična vrsta, sa prirodnim staništem na prostorima Srbije (Kosovo), Albanije, Makedonije i Grčke. Ranije je smatrana podvrstom Laserpitium siler L., subsp. zernyi (Hayek) Tutin. Laserpitium ochridanum je stenoendemit planine Galičice u Makedoniji. Sekundarni metaboliti vrsta roda Laserpitium do sada su analizirani samo u nekoliko šire distribuiranih predstavnika. Od biljaka koje predstavljaju predmet ove doktorske disertacije, široko rasprostranjena vrsta L. latifolium je do sada samo delimično ispitivana u pogledu hemijskog sastava. Druge dve, endemične biljne vrste - L. zernyi i L. ochridanum, nisu hemijski i farmakološki proučavane. Etarska ulja odabranih vrsta roda Laserpitium izolovana su destilacijom vodenom parom i hemijski okarakterisana metodama GC-FID i GC-MS. U etarskim uljima podzemnih organa sve tri ispitivane vrste roda Laserpitium, α-pinen je predstavljao najzastupljeniju komponentu (44,4%, 33,2% i 31,6% u uljima L. latifolium, L. ochridanum i L. zernyi, redom). U etarskim uljima podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum utvrđen je i značajan sadržaj α-bisabolola (30,9% i 10,3%, redom), a u etarskom ulju podzemnih organa L. ochridanum i hamazulena (14,9%). U etarskim uljima plodova L. latifolium i L. ochridanum utvrđen je visok sadržaj monoterpenskih ugljovodonika: u etarskom ulju L. latifolium α-pinena (44,0%), dok je u etarskom ulju L. ochridanum dominanatan satojak limonen (57,7%), a u oba etarska ulja detektovan je značajan procenat sabinena (26,8% i 14,4%, u etarskim uljima plodova L. latifolium i L. ochridanum, redom). U etarskom ulju herbe L. ochridanum najzastupljenija komponenta je sabinen (25,9%). U etarskom ulju cvasti L. zernyi najzastupljenije komponente su sabinen, limonen i β-felandren (18,5%, 12,0% i 12,0%, redom), a u etarskom ulju herbe L. zernyi β-pinen (20,0%). Ova dva ulja su, za razliku od drugih ispitivanih ulja vrsta roda Laserpitium, imala relativno visok sadržaj monoterpenskog alkohola terpinen-4-ola (10,6% i 12,0% u etarskom ulju herbe i cvasti L. zernyi, redom). Iz dela hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium rastvorljivog u metanolu, kombinovanjem pogodnih hromatografskih tehnika (hromatografija na koloni silikagela i semipreparativna HPLC) i instrumentalnih metoda za određivanje strukture (1D i 2D NMR i IR spektroskopija i HR-MS ESI+ spektrometrija), kao glavni sastojci izolovana su i okarakterisana dva daukanska estra: laserpicin (1) i acetildezoksodehidrolaserpicin (2), i dva fenilpropana: laserin (3) i latifolon (4). Uporednom HPLC analizom, u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, uočena je velika kvalitativna sličnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium. Kvantifikacija ekstrakata izvršena je pod istim uslovima, korišćenjem izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda. Konstatovano je da je sadržaj sva četiri jedinjenja viši u ekstraktu podzemnih organa u odnosu na ekstrakt herbe L. latifolium. Iz dela hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi rastvorljivog u metanolu, kombinovanjem pogodnih hromatografskih tehnika (hromatografija na koloni, semipreparativna HPLC) i instrumentalnih metoda za određivanje strukture (1D i 2D NMR i IR spektroskopija, HR-MS ESI+ spektrometrija), izolovano je i strukturno okarakterisano pet seskviterpenskih laktona slovanolidne strukture, tačnije osnovne strukture 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida. To su jedinjenja koja su prethodno izolovana iz ekstrakata drugih vrsta roda Laserpitium: tarolid (5), acetilizomontanolid (6), acetilmontanolid (7), izomontanolid (9) i montanolid (10), kao i jedan eudezmanolidni lakton - silerolid (8). Iz ekstrakta podzemnih organa L. zernyi, u znatno manjoj količini, izolovan je još jedan gvajanolidni lakton: 8α-senecioiloksi,10β- -hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (11), koji je po prvi put izolovan iz predstavnika roda Laserpitium. Uporednom HPLC analizom, u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, uz korišćenje izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda, utvrđeno je da su ekstrakti cvasti i herbe znatno kompleksnijeg sastava u odnosu na ekstrakt podzemnih organa L. zernyi. U tri ekstrakta identifikovani su laktoni tarolid (5), izomontanolid (9) i montanolid (10). Samo u ekstraktima herbe i cvasti utvrđeno je prisustvo laserpicina (1), i to kao jedne od glavnih komponenata, dok je latifolon (4) detektovan samo u ekstraktu podzemnih organa. Deo hloroformskog ekstrakta podzemnih organa vrste L. ochridanum rastvorljiv u metanolu imao je nešto kompleksniji hemijski sastav. Kombinovanjem hromatografskih tehnika (hromatografija na koloni i semipreparativna HPLC) i instrumentalnih metoda za određivanje strukture (1D i 2D NMR i IR spektroskopija i HR-MS ESI+ spektrometrija), pored laktona koji su izolovani iz podzemnih organa L. zernyi, izolovano je i strukturno okarakterisano još pet novih, visoko hidroksilovanih i esterifikovanih derivata slovanolida od kojih su četiri esterifikovana u položaju 2β. Novi gvajanolidi izolovani iz ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum su: 8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (12); 2β,8α- -diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (13); 8α-angeloiloksi- -11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (14); 2β,8α- -diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid (15), koji, za razliku od ostalih izolovanih laktona, ima dvostruku vezu u laktonskom prstenu i 8α-acetoksi- 2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (16). Takođe, iz ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum izolovani su još jedan gvajanolidni lakton 8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (17) i eudezmanolid izosilerolid (18), koji su prethodno izolovani iz drugih vrsta roda Laserpitium. Uporednom HPLC analizom u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, uz korišćenje izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda, uočena je izvesna kvalitativna sličnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum. U svim ovim ekstraktima detektovani su laktoni tarolid (5), izomontanolid (9) i montanolid (10), dok je u ekstraktu herbe detektovan i silerolid (8). Pored laktona, u ekstraktima herbe i ploda detektovan je i laserpicin (1), a u ekstraktu podzemnih organa i latifolon (4). U metanolnim ekstraktima cvasti i herbe (bez cvasti) L. zernyi sadržaj ukupnih polifenola određivan je spektrofotometrijski pomoću Folin-Ciocalteu reagensa. Sadržaj ukupnih polifenola iznosio je 14,32% i 6,83%, preračunato kao galna kiselina, u metanolnom ekstraktu cvasti i herbe, redom. HPLC analizom, metodom eksternog standarda, u odgovarajućem gradijent sistemu, utvrđeno je prisustvo flavona: apigenina, luteolina i njihovih 7−O glukozida, kao i fenolkarboksilne, hlorogenske kiseline. Sadržaj flavona i hlorogenske kiseline bio je nešto viši u metanolnom ekstraktu cvasti u odnosu na ekstrakt herbe L. zernyi. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja izolovanih iz plodova i podzemnih organa L. latifolium, herbe, plodova i podzemnih organa L. ochridanum i cvasti, herbe i podzemnih organa L. zernyi određivana je bujon mikrodilucionim testom prema standardnim sojevima četiri Gram(+) bakterije (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Micrococcus luteus i Enterococcus faecalis), tri Gram(–) bakterije (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i Pseudomonas aeruginosa) i dva soja Candida albicans i upoređivana sa aktivnošću referentnih supstanci (ampicilin, amikacin i nistatin). Rezultati su izraženi kao minimalne inhibitorne koncentracije (MIK). Najveću antibakterijsku aktivnost ispoljila su etarska ulja plodova L. latifolium i L. ochridanum, i podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi prema Gram(+) bakterijama S. aureus, S. epidermidis i M. luteus, kao i etarsko ulje herbe L. ochridanum prema S. aureus. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum pokazala su umeren efekat prema po jednom soju C. albicans. Antimikrobna aktivnost etarskog ulja cvasti i herbe L. zernyi ispitivana je i agar difuzionim testom prema tri Gram(+) i tri Gram(–) bakterije i jednom soju C. albicans i bila je slaba, što je u skladu sa rezultatima dobijenim bujon mikrodilucionim testom. Etarska ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi ispitivana su u pogledu antinociceptivnog i antiedematoznog dejstva nakon per os (p.o.) primene, u modelu karageninom (i.pl.) izazvane inflamacije šape u pacova. Ispoljeni efekti upoređivani su sa efektima referentnih lekova ibuprofena i indometacina. U testu inflamatorne hiperalgezije etarska ulja su dozno- i vremenski-zavisno i statistički značajno smanjivala razliku u pritiscima između zdrave šape i šape sa hiperalgezijom, a izazvani efekat bio je uporediv sa efektom ibuprofena. U najvišoj ispitivanoj dozi (100 mg/kg) maksimalan ispoljen efekat etarskog ulja podzemnih organa L. zernyi (61,7%) bio je u intervalu 210 – 240 min, a maksimalan efekat etarskog ulja podzemnih organa L. ochridanum (61,4%) postignut je u intervalu 180 – 240 min posle primene. Ibuprofen (100 mg/kg) je ispoljio najjači efekat (82,3%) u 210. min nakon primene. Etarska ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum pokazala su dozno- i vremenski-zavisno i statistički značajno antiedematozno dejstvo uporedivo sa efektom indometacina. Testirana etarska ulja smanjivala su edem, odnosno zapreminu šape merene pomoću pletizmometra. Efekat etarskog ulja L. zernyi u najvišoj primenjenoj dozi (100 mg/kg) iznosio je 81,3% u intervalu 120 – 150 min nakon primene, dok je efekat iste doze etarskog ulja podzemnih organa L. ochridanum iznosio 68,6% u intervalu 120 – 240 min. Maksimalni efekat indometacina (8 mg/kg) dostignut je u 300. min nakon primene i iznosio je 70,6% antiedematozne aktivnosti. Hloroformski ekstrakti podzemnih organa i herbi L. latifoilum, L. zernyi i L. ochridanum, kao i sva iz njih izolovana jedinjenja, izuzev latifolona (4), testirana su u pogledu citotoksične aktivnosti u dva in vitro kolorimetrijska testa (MTT i SRB), na dve ćelijske linije humanog adenokarcinoma dojke, MCF 7/6 i MCF 7/AZ, invazivnog i neinvazivnog tipa, redom. Vinblastin-sulfat je korišćen kao referentno jedinjenje. Rezultati su izraženi preko koncentracije ekstrakta/izolovanog jedinjenja/vinblastin- sulfata koja inhibira 50% ćelijskog rasta (IC50 vrednosti). Svi ekstrakti su ispoljili koncentraciono-zavisno citotoksično dejstvo uz konstataciju da su hloroformski ekstrakti podzemnih organa ispoljili generalno jači efekat u odnosu na hloroformske ekstrakte herbi sve tri ispitivane vrste roda Laserpitium. Među testiranim jedinjenjima najjaču aktivnost ispoljilo je jedinjenje 2, tj. daukanski triestar acetildezoksodehidrolaserpicin (IC50 vrednosti 0,60 µM i 0,50 µM na MCF 7/6 ćelijsku liniju u MTT i SRB testu, redom), a među testiranim laktonima 2β esterifikovani gvajanolid sa dvostrukom vezom u laktonskom prstenu - jedinjenje 15, tj. 2β,8α- -diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid (IC50 vrednosti 0,72 µM i 0,71 µM na MCF 7/6 ćelijsku liniju u MTT i SRB testu, redom). Antioksidantna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi ispitivana je u tri in vitro testa: određivanjem ukupnog antioksidantnog potencijala FRAP testom i testovima neutralizacije DPPH i ˙OH radikala. Ekstrakt cvasti ispoljio je veću ukupnu antioksidantnu aktivnost (1,55 µmol Fe2+/mg suvog ekstrakta cvasti) i jače antiradikalsko dejstvo (SC50 vrednosti 38,95 µg/ml i 10,32 µg/ml, u testovima neutralizacije DPPH i ˙OH radikala, redom) u odnosu na ekstrakt herbe. Aktivnost ekstrakta cvasti L. zernyi ipak je bila slabija u odnosu na kvercetin koji je korišćen kao standard (ukupna antioksidantna aktivnost 7,69 µmol Fe2+/mg kvercetina i SC50 vrednosti 2,75 µg/ml i 3,10 µg/ml, u testovima neutralizacije DPPH i ˙OH radikala, redom). Takođe, ispitivana je i antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi mikrodilucionim testom prema pet sojeva Gram(+) bakterija, tri soja Gram(–) bakterija i dva soja C. albicans, a antimikrobne aktivnosti izražene su preko MIK vrednosti. Oba ekstrakta su ispoljila najjaču aktivnost prema sojevima C. albicans, a ekstrakt herbe ispoljio je i jaku aktivnost prema B. subtilis. Aktivnost ekstrakta herbe L. zernyi prema svim ostalim testiranim sojevima bakterija bila je umerena i identična, dok je ekstrakt cvasti pokazao nešto slabiju aktivnost u odnosu na ekstrakt herbe prema sojevima M. luteus, E. faecalis i P. aeruginosa. Metanolni ekstrakti cvasti i herbe L. zernyi ispitivani su u pogledu antiedematoznog efekta nakon p.o. primene u modelu i.pl. injekcijom karagenina izazvanog edema u pacova. Testirani metanolni ekstrakti pokazali su dozno-zavisno i statistički značajno smanjenje edema, a ispoljeni efekti su bili uporedivi sa efektom indometacina. Maksimalan efekat ekstrakta cvasti L. zernyi nastupio je u 360. min nakon primene i iznosio je 57,5% pri dozi od 100 mg/kg, a maksimalan efekat ekstrakta herbe nastupio je u 300. min nakon primene i iznosio je 43,9% pri dozi od 100 mg/kg. Indometacin, primenjen u dozi od 8 mg/kg, dostigao je maksimalni efekat (70,6%) u 300. min nakon primene. Ispitivanjem vrsta L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum dobijene su informacije o vrsti i količini pojedinih sekundarnih metabolita i farmakološkoj aktivnosti izolata (ekstrakata, izolovanih jedinjenja i etarskih ulja). Dobijeni rezultati ukazuju na znatan lekoviti potencijal ispitivanih predstavnika roda Laserpitium, i time na njihov značaj kao potencijalno novih prirodnih lekovitih sirovina. Ključne reči: Laserpitium latifolium, L. zernyi, L. ochridanum, sekundarni biljni metaboliti, seskviterpenski laktoni, farmakološka aktivnost. Naučna oblast: Farmacija. Uža naučna oblast: Farmakognozija. UDK broj: 615.322:581.13:582.794.1(043.3) Analysis of secondary metabolites and investigation of pharmacological activity of selected species of the genus Laserpitium L. (Apiaceae) Abstract In the scope of the doctoral dissertation are analysis of secondary metabolites and testing of pharmacological activity of chloroform and methanol extracts and essential oils of three species of the genus Laserpitium L. (Apiaceae): Laserpitium latifolium L., Laserpitium zernyi Hayek and Laserpitium ochridanum Micevski. Laserpitium latifolium is perenial species, widely distributed throughout European continent. Laserpitium zernyi is scardo-pindic endemic species, that is distributed in Serbia (Kosovo), Albania, Former Yugoslav Republic of Macedonia (FYROM) and Greece. Previously, it was treated as a subspecies of colsely related Laserpitium siler L., subsp. zernyi (Hayek) Tutin. Laserpitium ochridanum is endemic species at Galičica Mountain, FYROM. Secondary metabolites of Laserpitium species have been so far analyzed just in several widely distributed plants. Considering investigation of the species that are in the scope of this dissertation, only widely distributed L. latifolium has been partially chemically examined. The other two endemic species - L. zernyi and L. ochridanum have not been either chemically or pharmacologically investigated before. Essential oils of selected Laserpitium species are isolated by a steam distillation and chemically characterised by GC-FID and GC-MS. In the essential oils of the underground parts of three Laserpitium species, the main constituent was α-pinene (44.4%, 33.2% and 31.6% in essential oils of L. latifolium, L. ochridanum and L. zernyi, respectively). In the essential oils of underground parts of L. zernyi and L. ochridanum certain content of α-bisabolol was found (30.9% and 10.3%), and in essential oil of underground parts of L. ochridanum was also detected chamazulene (14.9%). The fruit oils of L. latifolium and L. ochridanum were rich is monoterpene hydrocarbons: essential oil of L. latifolium was rich in α-pinene (44.0%), whilst in essential oil of L. ochridanum dominant constituent was limonene (57.7%), and in both oils certain percent of sabinene was detected (26.8% and 14.4%, in fruit oil of L. latifolium and L. ochridanum, respectively). In herb essential oil of L. ochridanum the most abundand constituent was sabinene (25.9%). In the essential oil flower of L. zernyi sabinene, limonene and β-phellandrene were detected in higher percent (18.5%, 12.0% and 12.0%, respectively), and in oil of L. zernyi herb higher content of β-pinene (20.0%) was detected. Two latter oils, unlike the other oils, were characterised with relatively high content of terpinene-4-ol (12.0% and 10.6% in oils of L. zernyi flower and herb, respectively). From the methanol-soluble part of chloroform extract of the underground parts of L. latifolium, by combination of adequate chromatographic techniques (FC and semi-preparative HPLC) and instrumental methods for structure elucidation (1D and 2D NMR and IR spectroscopy and HR-MS (ESI+) spectrometry), as the main constituents were isolated and elucidated the two daucane esters: laserpitin (1) and acetyldesoxodehydrolaserpitin (2), as well as the two phenylpropanes: laserin (3) and latifolon (4). By comparative HPLC analysis in a system optimised for terpenoid separation, a huge qualitative similarity of chloroform extracts of the underground parts and herb of L. latifolium was observed. Quantitative analyses was conducted in the same system, using isolated compounds as external standards. It was demonstrated that all compounds were present in higher concentrations in the extract of the underground parts than in the herb extract of L. latifolium. From the methanol-soluble part of chloroform extract of underground parts of L. zernyi by combination of chromatographic techniques (FC and semi-preparative HPLC) and spectroscopic and spectrometric techniques (1D and 2D NMR and IR spectroscopy, and HR-MS (ESI+) spectrometry), five lactones of slovanolide scaffold i.e. 1βH,5βH,6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide, were isolated and elucidated. These are compounds that were previously isolated from other Laserpitium species: tarolide (5), acetylisomontanolide (6), acetylmontanolide (7), isomontanolide (9) and montanolide (10), as well as an eudesmanolide lactone silerolide (8). Besides metioned lactones, from the chloroform extract of L. zernyi, as a minor constituent was isolated another guaianolide lacton, 8α-senecioyloxy,10β-hydroxy-6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide (11), that is for the first time isolated from the genus Laserpitium. By comparative HPLC analyses in the system optimised for the terpenoid separation, using the isolated compounds as the external standards, a more complex composition of herb and flower chloroform extracts of L. zernyi in comparison to chloroform extract of the underground parts was observed. In three extracts were identified lactones tarolide (5), isomontanolide (9) and montanolide (10). Laserpitin (1), being one of the main components, was detected only in the herb and flower extract of L. zernyi, whilst latifolon (4) was detected in the extract of the underground parts of this plant. The metanol-soluble part of chloroform extract of underground parts of L. ochridanum was shown to be of a more complex composition. By combination of chromatographic techniques (FC and semi-preparative HPLC) and instrumental methods for structure elucidation (1D and 2D NMR and IR spectroscopy and HR-MS (ESI+) spectrometry), in addition to lactones isolated from the extract of the underground parts of L. zernyi, five novel highly oxigenated and esterified slovanolide derivatives, four of them being additionaly 2β esterified, were isolated and elucidated from the extract of the underground parts of L. ochridanim. Novel guaianolide lactones isolated from this extract are: 8α-acetoxy-2β,10β-diangeloyloxy-6αH,7αH-guaian-3-en- -12,6-olide (12); 2β,8α-diangeloyloxy-10β-hydroxy-6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide (13); 8α-angeloyloxy-11α-senecioyloxy-10β-hydroxy-6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide (14); 2β,8α-diangeloyloxy-10β-hydroxy-6αH-guaian-3,(7-11)-dien-12,6-olide (15), which, unlike the other isolated lactones, has additional double bond in a lactone ring, and 8α-acetoxy-2β,11α-diangeloyloxy-10β-hydroxy-6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide (16). Also, from the extract of underground parts of L. ochridanum were isolated 8α-angeloyloxy-10β-acetoxy-6αH,7αH-guaian-3-en-12,6-olide (17) and eudesmanolide isosilerolide (18), both previously isolated from other species of the genus Laserpitium. By comparative HPLC analysis, in the conditions optimised for the terpenoid separation, using isolated compounds as the external standards, certain qualitative similarity of chloroform extracts of underground parts, herb and fruit of L. ochridanum was shown. In all theese extracts were detected lactones tarolide (5), isomontanolide (9) and montanolide (10), while silerolide (8) was also detected in the herb extract. Besides lactones, laserpitin (1) was detected in the extracts of herb and fruit, whilst latifolon (4) was present in the extract of underground parts of L. ochridanum. Methanol extracts of flower and herb (without flower) of L. zernyi contain phenolic compounds, whose total content was determined by spectrofotometric method using Folin-Ciocalteu reagent. Total polyphenol content was 14.32% and 6.83% calculated as gallic acid in methanol extract of flower and herb of L. zernyi, respectively. In optimised gradient HPLC system using an external standard method, following flavones: apigenin, luteolin and their 7−O glucosides, as well as chlorogenic acid were detected and quantified in both extracts. Contents of flavones and chlorogenic acid were higher in methanol extract of flower than in methanol extract of herb of L. zernyi. Antimicrobial activity of isloated essential oils from: fruit and underground parts of L. latifolium, fruit, herb and underground parts of L. ochridanum, and flower, fruit and underground parts of L. zernyi was tested by microdillution method against following microorganisms: four strains of Gram(+) bacteria (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Micrococcus luteus and Enterococcus faecalis), three strains of Gram(–) bacteria (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa), and two Candida albicans strains, and compared to the effects of referent drugs (ampicillin, amikacin, nystatin). Results were experssed as minimal inhibitory concentrations (MIC). The highest antimicrobial effects exerted essential oils of fruits of L. latifolium and L. ochridanum and underground parts of L. zernyi and L. ochridanum against Gram(+) bacteria S. aureus, S. epidermidis, M. luteus, as well as essential oil of herb of L. ochridanum against S. aureus. Essential oils of underground parts, herb and fruit of L. ochridanum exerted moderate effect against one strain of C. albicans. Antimicrobial activity of essential oils of flower and herb of L. zernyi was also assessed by agar diffusion test and was low, which corresponds to results obtained by microdillution test. Essential oils of underground parts of L. ochridanum and L. zernyi were tested for their antinociceptive and antiedematous activity after per os (p.o.) administration, in a rat model of inflammation induced by i.pl. injection of carageenan. Exerted effects were compared to effects of reference drugs ibuprofen and indomethacin. In the test of inflammation induced hyperalgesia, essential oils of the underground parts of L. zernyi and L. ochridanum dose- and time-dependently and significantly reduced the difference in the pressure of inflammed and non-inflammed paw, and effect was comparable to the effect of ibuprofen. In the highest tested doses (100 mg/kg) the essential oil of L. zernyi exerted highest effect (61.7%) in the interval 210 – 240 min after administration, whilst the maximal effect of L. ochridanum essential oil (61.4%) was achieved in the interval 180 – 240 min after administration. Ibuprofen (100 mg/kg) exerted highest effect (82.3%) in 210. min after administration. The essential oils of underground parts of L. zernyi and L. ochridanum exerted significant dose- and time-dependent antiedematous activity, comparable to the effect of indomethacin, in a rat model of inflammation induced edema. The tested oils reduce edema i.e. paw volume, which is measured using plethismometer. Maximal effect of essential oil of L. zernyi in highest applied dose (100 mg/kg) was 81.3% in the interval of 120 – 150 min after application, and the highest effect of L. ochridanum essential oil in the same dose was 68.6% in the interval of 120 – 240 min after administration. Maximal effect of indomethacin (8 mg/kg) was achieved in 300. min after administration, and it was 70.6% of antiedematous activity. Chloroform extracts of underground parts and herbs of L. latifolium, L. zernyi and L. ochridanum, as well as the isolated compounds except latifolon (4), were tested for their cytotoxic activities in two in vitro, colorimetric tests (MTT and SRB), on the two cell lines of human breast adenocarcinoma MCF 7/6 and MCF 7/AZ, invasive and non-invasive type, respectively. Vinblastine sulphate was used as reference compound. Results were expressed as concentration of extract/isolated compound/vinblastine sulphate that inhibited 50% of the cell growth (IC50 values). All extracts exerted concentration-dependent cytotoxic activity and it was observed that the extracts of underground parts generally exerted higher activity in comparison to the chloroform extracts of herbs of the three Laserpitium species. Among the tested compounds, the most active was compound 2, i.e. daucane trieser acetydesoxodehydrolaserpitine (IC50 values 0.60 µM and 0.50 µM on MCF 7/6 cell line in MTT and SRB test, respectively), and among lactones 2β esterified guaianolide with additional unsaturation in lactone ring - compound 15, i.e. 2β,8α-diangeloyloxy-10β-hydroxy-6αH-guaian-3,(7- -11)-dien-12,6-olide (IC50 values 0.72 µM and 0.71 µM on MCF 7/6 cell line in MTT and SRB test, respectively). Antioxidant activity of methanol extracts of flower and herb of L. zernyi was assessed in three in vitro tests: total antioxidant potential was determined in FRAP test and antiradical activity was evaluated in tests of neutralisation of DPPH and ˙OH radical. The flower extract exerted higher total antioxidant activity (1.55 µmol Fe2+/mg of dry extract) and also higher anti-radical activity (SC50 values 38.95 µg/ml and 10.32 µg/ml, in the tests of neutralisation of DPPH and ˙OH radical, respectively) in comparison to the herb extract. Activity of extract of L. zernyi was lower than those of quercetine, that was used as standard (total antioxidant potential 7.69 µmol Fe2+/mg quercetine and SC50 values 2.75 µg/ml and 3.10 µg/ml, in tests of neutralisation of DPPH and ˙OH radical, respectively). Also, antimicrobial activity of methanol extracts of flower and herb of L. zernyi was tested using microdillution test against five Gram(+) bacterial strains, three Gram(–) bacterial strains and two strains of C. albicans, and exerted activities were expressed as MIC values. Both extracts exerted highest activity against strains of C. albicans, and herb extract also exerted high antibacterial activity against B. subtilis. Activities of extract of herb of L. zernyi against all other tested bacterial strains was moderate and identical, whilst flower extract showed slightly lower activity than herb extract against bacteria M. luteus, E. faecalis and P. aeruginosa. Methanol extracts of flower and herb of L. zernyi were tested for their antiedematous activity, after p.o. administration in a model of i.pl. injection of carageenan induced rat paw edema. Tested methanol extracts of flower and herb of L. zernyi exerted dose-dependent and significant reduction of the paw edema, and exerted effects are comparable to the effect of indomethacin. The highest entiedematous effect of flower extract of L. zernyi (100 mg/kg) was in 360. min after administration, and was 57.5%, and the effect of the same dose of the herb extract of L. zernyi was 43.9% in 300. min after administration. Indomethacin (8 mg/kg), exerted maximal effect (70.6%) in 300. min after administration. By investigation of the species L. latifolium, L. zernyi and L. ochridanum information on chemical structure and content of seconary plant metabolites and pharmacological activities of isolates (extracts, isolated compounds and essential oils) were obtained. Results presented imply certain medicinal potential of analyzed Laserpitium species and their importance as novel natural medicinal raw materials. Keywords: Laserpitium latifolium, L. zernyi, L. ochridanum, secondary plant metabolites, sesquiterpene lactones, pharmacological activity. Academic expertise: Pharmacy. Major in: Pharmacognosy. UDC number: 615.322:581.13:582.794.1(043.3) SADRŽAJ UVOD...............................................................................................................................1 1. ROD LASERPITIUM L. ............................................................................................2 1.1. Opis i rasprostranjenje vrste Laserpitium latifolium L. ..........................................6 1.2. Opis i rasprostranjenje vrste Laserpitium zernyi Hayek..........................................8 1.3. Opis i rasprostranjenje vrste Laserpitium ochridanum Micevski. ........................10 2. SEKUNDARNI METABOLITI RODA LASERPITIUM.....................................11 2.1. Seskviterpenski laktoni..........................................................................................12 2.1.1. Biosinteza seskviterpenskih laktona................................................................13 2.1.2. Važnije klase seskviterpenskih laktona zastupljenih u vrstama roda Laserpitium......................................................................................................15 2.1.3. Hromatografske tehnike u analizi seskviterpenskih laktona...........................17 2.1.4. Metode za određivanje strukture seskviterpenskih laktona.............................19 2.1.5. Biološka aktivnost seskviterpenskih laktona...................................................22 2.1.6. Seskviterpenski laktoni izolovani iz vrsta roda Laserpitium...........................24 2.2. Seskviterpenski estri..............................................................................................30 2.2.1. Daukanski estri................................................................................................31 2.3. Etarska ulja............................................................................................................34 2.4. Fenilpropani..........................................................................................................37 2.5. Flavonoidi..............................................................................................................39 2.6. Kumarini................................................................................................................41 3. TRADICIONALNA UPOTREBA VRSTA RODA LASERPITIUM....................42 4. FARMAKOLOŠKA AKTIVNOST VRSTA RODA LASERPITIUM..................43 CILJ................................................................................................................................44 MATERIJAL I METODE............................................................................................46 1. Biljni materijal.............................................................................................................47 2. Aparatura.....................................................................................................................48 3. Izolovanje, određivanje sadržaja i analiza sastava etarskih ulja..................................49 3.1. Izolovanje etarskih ulja..........................................................................................49 3.2. GC-FID i GC-MS analiza etarskih ulja.................................................................50 4. Izrada ekstrakata..........................................................................................................51 5. Izolovanje sekundarnih metabolita iz hloroformskih ekstrakata podzemnih organa L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum.......................................................................53 5.1. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. latifolium........................................53 5.1.1. Hromatografija na stubu silikagela..................................................................53 5.1.2. Semipreparativna HPLC hromatografija.........................................................54 5.2. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. zernyi..............................................55 5.2.1. Hromatografija na stubu silikagela..................................................................55 5.2.2. Semipreparativna HPLC hromatografija.........................................................56 5.3. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. ochridanum.....................................57 5.3.1. Hromatografija na stubu silikagela..................................................................57 5.3.2. Semipreparativna HPLC hromatografija.........................................................58 6. HPLC analiza hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum......60 7. Određivanje ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi..61 8. HPLC analiza metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi.....................................61 9. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti...........................................................................62 9.1. Ispitivanje ukupnog antioksindantnog potencijala − FRAP test...........................63 9.2. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala − DPPH test......................63 9.3. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije ˙OH radikala − 2-Dezoksiriboza test.........64 10. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti...........................................................................66 10.1. Bujon mikrodilucioni test....................................................................................68 10.2. Agar difuzioni test...............................................................................................68 11. Ispitivanje citotoksične aktivnosti.............................................................................69 11.1. MTT test..............................................................................................................69 11.2. SRB test...............................................................................................................71 12. Ispitivanje antinociceptivne i antiedematozne aktivnosti..........................................72 12.1. Ispitivanje antinociceptivne aktivnosti................................................................78 12.2. Ispitivanje antiedematozne aktivnosti.................................................................79 REZULTATI I DISKUSIJA.........................................................................................81 HEMIJSKA ANALIZA...............................................................................................82 1. Etarska ulja..................................................................................................................82 1.1. Etarska ulja podzemnih organa i ploda L. latifolium.............................................82 1.2. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i cvasti L. zernyi.......................................85 1.3. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum..............................88 1.4. Uporedna analiza hemijskog sastava etarskih ulja odabranih vrsta roda Laserpitium..........................................................................91 2. Identifkacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium...................................................................................94 2.1. Jedinjenje 1 (laserpicin).........................................................................................94 2.2. Jedinjenje 2 (acetildezoksodehidrolaserpicin).......................................................97 2.3. Jedinjenje 3 (laserin)............................................................................................101 2.4. Jedinjenje 4 (latifolon).........................................................................................103 3. Identifkacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi......................................................................................104 3.1. Jedinjenje 5 (tarolid)............................................................................................104 3.2. Jedinjenje 6 (acetilizomontanolid).......................................................................109 3.3. Jedinjenje 7 (acetilmontanolid)...........................................................................112 3.4. Jedinjenje 8 (silerolid).........................................................................................115 3.5. Jedinjenje 9 (izomontanolid)...............................................................................117 3.6. Jedinjenje 10 (montanolid)..................................................................................119 3.7. Jedinjenje 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)……………...121 4. Identifikacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum.............................................................................124 4.1. Jedinjenje 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)................124 4.2. Jedinjenje 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)...............130 4.3. Jedinjenje 14 (8α-angeloiloksi- -11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)......................133 4.4 Jedinjenje 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid)...........137 4.5. Jedinjenje 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi- -10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)..................................................142 4.6. Jedinjenje 17 (8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid)……………...145 4.7. Jedinjenje 18 (izosilerolid)..................................................................................147 5. HPLC analiza hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum....150 5.1. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. latifolium.............................................................150 5.2. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. zernyi...................................................................152 5.3. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. ochridanum........................................................155 5.4. Uporedna analiza rezultata dobijenih HPLC analizom hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum.............................................158 6. Sadržaj ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi........162 7. HPLC analiza metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi...................................162 7.1. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi.................................................162 FARMAKOLOŠKA ISPITIVANJA..........................................................................167 1. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum.........167 1.1. Bujon mikrodilucioni test....................................................................................167 1.2. Agar difuzioni test...............................................................................................171 2. Antinociceptivna aktivnost etarskih ulja L. zernyi i L. ochridanum..........................172 3. Antiedematozna aktivnost etarskih ulja L. zernyi i L. ochridanum...........................175 4. Citotokosična aktivnost hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum i izolovanih jedinjenja.....................................................................178 4.1. Citotokosična aktivnost hloroformskih ekstrakata L. latifolium i izolovanih jedinjenja.........................................................................................178 4.2. Citotokosična aktivnost hloroformskih ekstrakata L. zernyi i L. ochridanum i izolovanih jedinjenja.........................................................................................181 5. Antioksidantna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi.................186 6. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi....................187 7. Antiedematozna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi................191 ZAKLJUČCI...............................................................................................................195 LITERATURA............................................................................................................202 PRILOG.......................................................................................................................214 1 UVOD 2 1. ROD LASERPITIUM L. U biljnoj klasifikaciji (Nikolić, 1973; Tutin, 1968), pripadnost roda Laserpitium L.* višim taksonomskim jedinicama može se prikazati na sledeći način: Klasa: Dicotyledones Red: Apiales Familija: Apiaceae (Umbelliferae) Potfamilija: Apioidae. Familija Apiaceae Lindley (Umbelliferae Juss. 1789. Gen. Plant.: 218) obuhvata oko 300 rodova sa oko 3000 vrsta, rasprostranjenih po čitavoj Zemlji, i to uglavnom u severnoj umerenoj zoni. U Flori Srbije, ova familija je zastupljena sa 55 rodova i 148 vrsta (Nikolić, 1973, 1977; Sarić i Diklić, 1986). Predstavnici familije Apiaceae su uglavnom jednogodišnje, dvogodišnje ili višegodišnje zeljaste biljke (često monokarpne), retko polužbunovi. Stabljike su najčešće sa šupljim internodijama i izraženim kolenhimom, što omogućava dostizanje visine i do 5 m kod nekih predstavnika. Listovi su uglavnom naizmenično raspoređeni, najčešće su jednostruko ili višestruko perasto deljeni na različite načine, tako da lisni režnjevi mogu biti različitih oblika; lisna drška ili liska pri osnovi prelaze u lisni rukavac koji obuhvata stabljiku. Cvetovi su sitni, dvopolni, ređe jednopolni, najčešće aktinomorfni, a ponekad se po obodu javljaju i zigomorfni cvetovi; grupisani su u proste štitove (ponekad u obliku glavica), a mnogo češće u složene štitove, kod kojih se bočne grane ne završavaju cvetovima već prostim štitovima. Pri osnovi cvasti, manji ili veći broj priperaka obrazuje omotač involukrum, a ispod štitića involucelum. Cvetovi se sastoje od 5 čašičnih i pet kruničnih listića, 5 prašnika i 2 oplodna listića. Prašnici su slobodni, a tučak je sa dvookim, retko jednookim, potcvetnim plodnikom sa po jednim semenim zametkom u svakom okcu. Na plodniku se nalaze nektarije u obliku mesnatog jastučića (discus) ili se na vrhu nalaze dva manje više istaknuta proširenja (stylopodium), sa kojih polaze stubići, često sa lepljivim žigovima. Plod je sušni * Naziv roda Laserpitium potiče od grčkih reči laser ─ sok ili lasarion ─ smola srodne apeninsko- balkanske vrste Thapsia garganica (syn. T. silphium), koja je u antičko vreme bila cenjena i kao začin i kao lek, i od reči pitizo ─ kapati, curiti, jer iz zasečenog korena ove biljke curi sok, koji se zgruša u smolu (Simonović, 1959). 3 cepajući šizokarpijum koji se zreo raspada na dva plodića (merikarpije), koji su neko vreme vezani za končast izraštaj ─ karpofor. Plodići su sa unutrašnje, ventralne strane, gde se dodiruju, većinom pljosnati, a sa suprotne, dorzalne strane ispupčeni. Na svakom plodiću se nalazi obično po pet glavnih, uzdužnih rebara (juga primaria) u kojima se nalaze sprovodni snopići, a često se između ovih nalaze i sporedna rebra (juga secundaria). Na gornjem kraju plodića nalaze se ostaci čašice i stubića. U zidu plodnika, svuda okolo ili između glavnih rebara u brazdama nalaze se kanali sa etarskim uljem. Seme je različitog oblika i građe, a često prirasta za zid plodnika. Rod Laserpitium L. pripada potfamiliji Apioidae Drude, čiji predstavnici imaju listove bez zalistaka, mekan endokarp, stubiće koji polaze sa vrha stilopodijuma i plod koji nije obrastao ljuspama. Rodu Laserpitium pripadaju dvogodišnje ili višegodišnje, često monokarpne biljke. Koren vretenast, na vrhu prelazi u kratak zadebljali rizom koji je često prekriven končastim čupercima. Stabljika je uspravna, rebrasta ili okrugla i prugasta. Donji listovi su krupni, gornji nekoliko puta perasto deljeni, celog ili nazubljenog oboda. Prisutan je lisni rukavac. Cvetovi su hermafroditni i muški, grupisani u cvasti – štitove. Zupci na čašici su lancetasti ili šilasti. Krunični listići su obrnuto srcasti, na vrhu savijeni. Plod je merikarpijum koji se raspada na dva spljoštena, eliptična šizokarpijuma. Plodovi polukružni na poprečnom preseku; raspadaju se na dva spljoštena eliptična merikarpijuma. U zidu plodnika (perikarpu) u sekundarnim rebrima nalaze se pojedinačni kanali sa etarskim uljem; na ventralnoj strani plodića nalaze se dva kanala (Nikolić, 1973). Rod Laserpitium obuhvata oko 20 vrsta sa rasprostranjenjem od Kanarskih ostrva na zapadu, do Sibira i Irana na istoku (Hartvig, 1986; Nikolić, 1973). U Flori Evrope, Flora Europaea 2 (Tutin, 1968) navedeno je 14 predstavnika ovog roda: • L. siler (Siler montanum Crantz), vrsta rasprostranjena u planinskim predelima južne i centralne Evrope, koja obuhvata tri podvrste: o L. s. subsp. siler, sa širokim rasprostranjenjem, izuzev na jugoistoku Evrope; o L. s. subsp. garganicum (Ten.) Arcangeli, sa arealom u južnom delu Balkanskog poluostrva i u južnoj Italiji; 4 o L. s. subsp. zernyi (Hayek) Tutin sa arealom u severoistočnoj Albaniji, Grčkoj i južnim delovima bivše Jugoslavije. • L. latifolium L., vrsta rasprostranjena u najvećem delu Evrope, izuzev priobalnog područja i ostrva, rasprostranjena od centralne Španije do 61° s.g.š. na severu u Švedskoj i do centralne Ukrajine, Bugarske i evropskog dela Turske; • L. longiradium Boiss., vrsta iz južne Španije (Sierra Nevada); • L. nestleri Soyer-Willemet, vrsta rasprostranjena u planinskim predelima južne Francuske i Iberijskog poluostrva; • L. krapfii Crantz, vrsta rasprostranjena u planinskim predelima istočnog dela centralne Evrope i na Balkanskom poluostrvu, sa podvrstama: o subsp. krapfii (L. marginatum Waldst. & Kit.; incl. L. alpinum Waldst. & Kit.), sa arealom u severnom i centralnom delu Balkanskog poluostrva, severoistočnoj Italiji i na Karpatima; o subsp. gaudinii (Moretti) Thell., sa arealom u severnoj Italiji, severozapadnim delovima Balkana, zapadnoj Austriji i Švajcarskoj; • L. peucedanoides L., u jugoistočnim Alpima i severozapadnim planinskim područjima bivše Jugoslavije; • L. archangelica Wulfen, u planinskim predelima istočnog dela centralne Evrope i na Balkanskom poluostrvu; • L. nitidum Zanted., sa arealom u severnoj Italiji; • L. halleri Crantz, vrsta rasprostranjena u Alpima i na Korzici; • L. gallicum L., sa arealom u planinskim predelima južne Evrope, od Španije do Italije; • L. paradoxum A. Bolós & Font Quer, opisan kao varijetet vrste L. gallicum, sa prirodnim rasprostranjenjem u severoistočnoj Španiji; • L. pseudomeum Orph., Heldr. & Sart. ex Boiss., sa arealom u planinskom području centralne i južne Grčke; • L. prutenicum L., vrsta rasprostranjena u centralnim i istočnim delovima južne Evrope, od severne Nemačke i centralne Rusije, do severa Portugalije, severa Italije i u Bugarskoj. Opisane su dve podvrste: 5 o subsp. prutenicum sa staništem u navedenim oblastima, izuzev jugozapada Francuske i severozapada Španije; o subsp. dufourianum (Roy & Camus) Tutin (L. prutenicum forme dufourianum Roy & Camus) sa staništem u jugozapadnoj Francuskoj i severozapadnoj Španiji; • L. hispidum Bieb., sa staništem u južnoj i istočnoj Ukrajini. Interesantno je da sve prethodno navedene vrste naseljavaju isključivo evropski kontinent, dok veći deo areala L. hispidum obuhvata područje zapadne Azije. U Flori Srbije (Nikolić, 1973) navedeno je pet vrsta ovog roda: L. siler L. (raskovnik*), L. latifolium L. (javorak), L. marginatum W. K. (sinonim za L. krapfii Crantz subsp. krapfii), L. alpinum W. K. (sinonim za L. krapfii subsp. krapfii) i L. prutenicum L. S obzirom da u botaničkim krugovima danas preovlađuje mišljenje da pomenuta dva imena (L. marginatum i L. alpinum) zapravo predstavljaju sinonime za L. krapfii, moglo se pretpostaviti da su za floru Srbije poznate samo četiri vrste. Međutim, Stevanović i sar. (1993) kao novu vrstu za floru Srbije navode L. zernyi Hayek sa područja Šar-planine u Metohiji, tako da je realnija procena da je do sada konstatovano ukupno pet vrsta u flori Srbije: L. siler, L. zernyi, L. latifolium, L. krapfii i L. prutenicum. U Flori Makedonije, Флора на Република Македонија (Micevski, 2005), navedene su četiri vrste roda Laserpitium: • L. garganicum (Ten.) Bertol, (syn.: L. siler L. subsp. garganicum (Ten.) Arcangeli; L. siler auct. non L.) sa dva varijeteta; • L. zernyi Hayek; • L. ochridanum Micevski, vrsta endemična za planinu Galičicu; • L. archangelica Wulfen. * Narodno ime “raskovnik“ odnosi se na vrste L. siler i Laser trilobum L., jer se verovalo da ova trava otvara i otključava svaku bravu ili zaklop, kada se njome dodirne. Takođe, u okolini Boljevca se verovalo da raskovnik može da “otvori“ i ženu, koja ne može da dobije dete. U Leskovačkoj Moravi postoji verovanje da ova biljka “raskiva mnoge bolesti“ kod ljudi i životinja. Čudotvorne moći su delom pripisane i obliku podzemnog dela biljke koji je navodno “debeo kao ruka i mek“ i na njemu se raspoznaju delovi kao glava, kosa, vrat, ruke, noge i oči, a ponekad “liči na čoveka s decom“ (Čajkanović, 1985.) 6 1.1. Opis i rasprostranjenje vrste Laserpitium latifolium L. Vrsta L. latifolium (Slika 1), u narodu nazvana javorak, je višegodišnja biljka, sa mestimično zadebljalim rizomom, na čijem se gornjem kraju nalaze končasti čuperci. Stabljika je uspravna, visine 60–150 cm, u najvećem delu gola, okrugla, po površini tanko izbrazdana, a u gornjem delu razgranata. Donji listovi su vrlo krupni, na drškama, trostruko perasto deljeni, režnjevi poslednjeg reda su veliki, dužine 3–10 cm i širine 2–6 cm, najčešće široko jajastog oblika, tupi i pri osnovi srcasti, po obodu krupno testerasto nazubljeni (Slika 2), gornji listovi su sedeći, sa izduženim rukavcem i užim režnjevima, često na vrhu sa po tri listića. Svi listovi su goli, a lisne drške mogu biti kratko dlakave. Štitaste cvasti su velike, sa po 20–30 zrakova različite dužine, hrapavih u donjem delu. Štitići su sa velikim brojem cvetova na dugačkim drškama. Involukrum je sastavljen iz većeg broja linearnih, ili linearno lancetastih, golih listića, a involucelum je građen iz linearno končastih listića. Zupci na čašici su šilasti. Krunični listići su beli ili purpurni, dugački 2–2,5 mm, široki 1,5–2 mm, objajasti, pri osnovi manje ili više klinasti. Plod je prošireno-elipsoidnog oblika (Slika 2), dužine 8–9 mm, širine 3–7 mm, sa široko krilatim sporednim rebrima (Slika 2), bočna rebra su sa krilima širine ploda. Cveta od juna do avgusta. Biljka samoniklo raste na kamenitim mestima, u šikarama, pored potoka, na stepskim livadama, u suvim i svetlim listopadnim šumama; najčešće na krečnjaku, granitnim i bazaltnim stenama (Nikolić, 1973). Laserpitium latifolium je vrsta široko rasprostranjena na Evropskom kontinentu, i pripada srednjeevropskom (mediteranskom) flornom elementu (Nikolić, 1973; Tutin, 1968). U Flori Srbije (Nikolić, 1973) navedene su dvе forme: • L. l. f. latifolium golih listova koji je rasprostranjen u Vojvodini na Fruškoj gori, u zapadnoj Srbiji u kanjonu Dervente i na Jablaniku, Medvedniku, Stolovima, kao i u jugoistočnoj Srbiji u okolini Pirota*; • L. l. f. asperum (Cr.) Neilr. kod koga su lisne drške i listovi na naličju hrapavo dlakavi i koji se navodi za Đerdapsku klisuru i okolinu Pirota. * Tokom ovih istraživanja pronađen je i na planini Gučevo u zapadnoj Srbiji. 7 Slika 1. Laserpitium latifolium L. (http://luirig.altervista.org/flora) a) habitus; b) lisni rukavac; c) involukrum; d) involucelum; e) lisni režnjevi 8 Slika 2. Laserpitium latifolium L. 1 – gornji deo stabljike sa listovima i cvetovima; 1a – deo prizemnog lista; 1b – plod; 1c – poprečan presek ploda (Nikolić, 1973) 1.2. Opis i rasprostranjenje vrste L. zernyi Hayek U Flori Evrope, Flora Europaea 2 (Tutin, 1968) ova vrsta se smatra podvrstom - L. siler L. subsp. zernyi (Hayek) Tutin (Slika 3). To je višegodišnja zeljasta biljka, visine 40─60 cm. Stabljika je gola i u gornjem delu granata, snažna, okrugla i gusto 9 uzdužno isprugana, u osnovi obavijena končastim ostacima osušenih listova. Prizemni listovi su trodelni, 2─3 puta perasto deljeni, režnjevi su celog oboda, 60─90 mm dužine, 10─30 mm širine, lancetastog do izduženo eliptičnog oblika, sa kratkim oštrim vrhom, sa jasno istaknutim centralnim nervom na naličju i izraženom mrežastom nervaturom; prvi par lisnih režnjeva ispod terminalnog režnja se krilasto u obliku klina spušta ka drugom paru, a isto tako i drugi par režnjeva može krilasto da se spušta ka trećem paru lisnih režnjeva; lisne drške prizemnih i listova stabljike mogu biti proširene u rukavac. Štitovi su krupni sa 20─30 štitića, listići involukruma su brojni, jajasto lancetasti do lancetasti, po obodu opnasti, oštrih vrhova. Štitići sa drškama dostižu dužinu 30─50 mm, i sačinjeni su od 10─15 cvetova, listići involuceluma su lancetastog oblika, sa opnastim obodom i jednim nervom, postepeno zaoštrenih vrhova, dugački koliko i cvetne drške i sa unutrašnje strane hrapavi. Cvetovi su crvenkastobele boje. Plod je izdužen, oko 8 mm dug, primarna rebra se skoro ne mogu uočiti, a dva leđna sekundarna rebra i dva bočna su sa širokim krilima. Laserpitium zernyi naseljava planinske krečnjačke kamenjare od 1400-2200 m nadmorske visine. Vrsta je rasprostranjena u pojedinim krajevima Makedonije (Mavrovo, Gornja Radika, Bistra, Korab, Dešat, Jablanica, Luben i Baba Sač), ali raste i u planinskim predelima istočne Albanije, Grčke, kao i na Šar-planini u Srbiji (Hartvig, 1986; Stevanović i sar., 1993). 10 Slika 3. Laserpitium zernyi Hayek a) habitus; b) štitići sa nedozrelim plodovima; c) cvetovi 1.3. Opis i rasprostranjenje vrste L. ochridanum Micevski Laserpitium ochridanum je višegodišnja zeljasta biljka visine 40─60 cm. Stabljika je gola, uspravna, celom dužinom izbrazdana uskim i plitkim brazdama, u osnovi sa končastim ostacima osušenih listova; u gornjem delu je slabo razgranata. Prizemni listovi na kratkim drškama, koje su u osnovi proširene u rukavac, trodelni su, dvostruko do trostruko perasto deljeni, lisni režnjevi su kožasti, lancetasti do široko lancetasti, zašiljeni na vrhu, celog oboda, pri osnovi zaobljeni ili se neki delimično krilasto produžavaju prema dršci, dugi su 15─20 mm, široki 5─8 mm. Tri terminalna lisna režnja se spajaju u osnovi i krilasto se spuštaju do donjeg para režnjeva. Štitovi sa 16─25 štitića, na drškama jednake dužine, hrapavi i sa uskim uzdužnim rebrima. Involukrum je sastavljen od 6─8 listića lancetastog oblika povijenih na dole. Listići involukruma su po obodu opnasti, takoreći poluprozračni. Štitići od velikog broja cvetova: listića involuceluma 5─8, široko lancetastog oblika, oštrog vrha, sitno testerastog oboda, sa jednim nervom i skoro poluprozračni. Krunični listići beli. Plod izdužen, dug 9─11 mm, primarna rebra se ne uočavaju, dok su dva leđna i dva bočna 11 sekundarna rebra sa opnastim krilima. Leđna krila su oko 0,3 mm široka, a bočna 0,5 mm. Nastanjuje planinske krečnjačke kamenjare, u visinskom dijapazonu od 1600 do 2000 m nadmorske visine. Stenoendemit planine Galičice u Makedoniji (Micevski, 2005). Slika 4. Laserpitium ochridanum Micevski a) habitus; b) lisni režnjevi; c) štit sa plodovima 2. SEKUNDARNI METABOLITI VRSTA RODA LASERPITIUM Sekundarni metaboliti biljaka roda Laserpitium do sada su analizirani samo u desetak šire distribuiranih vrsta, od kojih je sedam sa evropskog kontinenta, dve iz zapadne Azije, dok je jedna vrsta (L. hispidum) rasprostranjena u zapadnoj Aziji i istočnoj Evropi. Vrste ovog roda su aromatične biljke, tako da su pojedini predstavnici do sada ispitivani u pogledu hemijskog sastava etarskog ulja, u kojima su bili detektovani gotovo isključivo monoterpeni. 12 Analizom ekstrakata različitih organa predstavnika roda Laserpitium utvrđeno je uglavnom prisustvo seskviterpenskih jedinjenja, pre svega laktona gvajanolidnog i eudezmanolidnog tipa i daukanskih estara. Terpeni su najbrojnija grupa sekundarnih metabolita biljaka, a nastaju metabolizmom aktivnih C5-jedinica, tj. „aktivnog izoprena“. Još je Ružička 1953. god. postavio „biosintetsko izoprensko pravilo“, objašnjavajući nastanak kako malih monoterpenskih, tako i politerpenskih jedinjenja, zajedničkim metaboličkim putevima. Karakteristika ove grupe prirodnih proizvoda je da su nastali metabolizmom iz izopentenilpirofosfata (IPP) i njegovog izomera (DMAPP), pa je prvi korak u biosintetskom putu ovih metabolita biosinteza IPP, odnosno DMAPP jedinice. Sledeći korak uključuje kondenzaciju ove dve jedinice u geranilpirofosfat (GPP). Daljim vezivanjem izopentenilpirofosfat jedinice (IPP) formira se farnezilpirofosfat (FPP). Metabolizam može ići u smeru daljeg dodavanja IPP jedinica na farnezilpirofosfat, pri čemu nastaju veći izoprenski prekursori. Farnezilpirofosfat (FPP), kao C15 jedinica predstavlja osnovni molekul od koga daljim biotransformacijama pod dejstvom terpenoid-sintaza (ciklaza) dolazi do različitih redoks modifikacija, pri čemu nastaje veliki broj seskviterpena (Petrović i sar., 2009; Evans, 2009; Drew i sar., 2009). U pojedinim predstavnicima roda Laserpitium utvrđeno je prisustvo fenilpropana. U ekstraktima herbe L. latifolium (Vereskovskii i sar., 1992) utvrđeno je prisustvo flavonoida i fenolkarboksilnih kiselina, dok su iz ekstrakata podzemnih organa i herbe L. archangelica Wulfen izolovana po dva kumarina (Bohlmann i Thefeld, 1970). 2.1. Seskviterpenski laktoni Do sada je iz biljaka izolovano više od 5000 seskviterpenskih laktona, dok je nekoliko stotina dobijeno sintetski. Najveći broj seskviterpenskih laktona izolovan je iz biljaka koje uglavnom pripadaju velikim familijama kao što su Apiaceae i Asteraceae, ali takođe i Lauraceae, Burseraceae i Magnoliaceae. Prema strukturi, seskviterpenski laktoni se mogu podeliti u više od trideset klasa. Seskviterpenski laktoni imaju veliki ekološki značaj, ispoljavaju širok spektar bioloških aktivnosti, a često su i hemotaksonomski markeri. Kao ekološki agensi učestvuju u odbrani biljaka od insekata i životinja, štite biljke od infekcija i učestvuju u alelopatskim interakcijama. Mnogi 13 deluju antiinflamatorno, antimikrobno i/ili antiproliferativno/citotoksično. Mnogobrojne studije povezanosti aktivnosti i strukture (eng. Structure Activity Relationship Studies - SAR studies) se izvode da bi se okarakterisali specifični strukturni elementi, koji su odgovorni za ispoljene aktivnosti (Drew i sar., 2009; Tadić i sar., 2009; Merfort, 2011). 2.1.1. Biosinteza seskviterpenskih laktona Kao što je prethodno pomenuto, svi terpeni nastaju metabolizmom IPP i DMAPP, u reakcijama katalizovanim prenil-transferazama, koje su svrstane u četiri grupe, u zavisnosti od veličine terpenskog molekula koji nastaje. Grupa (I) su prenil- -sintaze kratkih lanaca, koje su prisutne u svim živim organizmima i stvaraju izoprenske molekule veličine do 20 C atoma. Ovi enzimi zahtevaju samo jone Mg2+ ili Mn2+ kao kofaktore. Grupa (I) prenil-transferaza stvara u prvom stupnju geranilpirofosfat (GPP), a daljim dodavanjem izoprenske jedinice trans,trans-farnezilpirofosfat (E,E-FPP), koji je prekursor svih seskviterpenskih laktona (Drew i sar., 2009). Postoji nekoliko mogućih reakcija ciklizacije E,E-FPP kao polaznog molekula, čime nastaje osnovna struktura više od 300 cikličnih seskviterpenskih laktonskih skeleta. Reakcije ciklizacije započinju izomerizacijom E,E-FPP (Slika 5). Ovaj prvi korak u biosintezi seskviterpena prati dalja ciklizacija, usled reakcije nastalih karbokatjona pod dejstvom specifičnih enzima ciklaza, prisutnih u biljnom tkivu. Tako dolazi do sinteze različitih cikloheksanskih, ciklodekanskih, cikloundekanskih i bicikloheksanskih struktura. Reakcije karbokatjona, pre svega elektrofilna adicija na dvostruke veze, premeštanje metil grupe, Wagner-Meerwein-ova premeštanja i pomeranja hidridnog anjona su osnovni hemijski procesi biosinteze velikog broja terpenskih jedinjenja koja nalazimo u prirodi, a od kojih seskviterpenski laktoni predstavljaju samo jednu klasu (Dewick, 2009; Drew i sar., 2009; Đermanović, 1990). Na Slici 5 dat je biosintetski put nekoliko osnovnih skeleta seskviterpenskih laktona (Dewick, 2009). 14 E E E, E-farnezil katjon humulil katjon germakril katjon H gvajil katjon H eudezmil katjon Slika 5. Biosinteza osnovnih struktura (karbokatjona) najzastupljenijih strukturnih tipova seskviterpenskih laktona (Dewick, 2009) 15 2.1.2. Važnije klase seskviterpenskih laktona zastupljene u vrstama roda Laserpitium Germakranolidi čine najveću grupu seskviterpenskih laktona, sa oko 300 prirodnih predstavnika. Osnovnu strukturu predstavlja dimetilizopropildekadien, a germakradien B (Slika 6) se smatra jednim od važnijih intermedijera u biosintezi. Položaj C6 predstavlja dvostruki alilni centar, zbog čega se izuzetno lako oksiduje, čime se objašnjava postojanje velikog broja germakranolidnih laktona u prirodi (Đermanović, 1990). Dva germakranolida izolovana su iz ekstrakata podzemnih organa L. gallicum L. (Appendino i sar., 1993). Takođe, iz Laser trilobum L., koji pripada istom tribusu Laserpitiae (Holub i Budĕšinský, 1986; Smitalova i sar., 1985), izolovano je nekoliko jedinjenja ove klase. Slika 6. Germakradien B; *C6-dvostruki alilni centar Eudezmanolidi su seskviterpenski laktoni sa osnovnom strukturom eudezmana (Slika 7). Položaj dvostrukih veza i epoksidnih funkcija je kod većine laktona ovog tipa u položajima C3 – C4, C4 – C5 i C4 – C15, a hidroksilne grupe se uglavnom nalaze u položajima C-1, C-3 i C-8. Slika 7. Eudezman U nekim vrstama roda Laserpitium utvrđeno je prisustvo laktona eudezmanolidnog tipa, preciznije 1β,11α-dihidroksi-6αH,7αH-eudezman-3en-6,12-olida, odnosno tipa silerolida. NMR i IR spektroskopijom, kao i analizom X zracima, utvrđen je i položaj prstenova, pa se zna da su veze C5-C10 trans i C6-C7 cis. Karakterističan 16 način vezivanja laktonskog prstena može se odrediti na osnovu hemijskih pomeranja i konstanti kuplovanja signala za protone na položajima C-6 i C-7 (Đermanović, 1990; Milosavljević i sar., 1999). Gvajanolidi su velika grupa prirodnih proizvoda od kojih mnogi pokazuju farmakološku aktivnost. U osnovi strukture gvajanolida je seskviterpen gvajan, kondenzovan sa γ-laktonskim prstenom u C-6 i C-7 ili C-7 i C-8 u cis ili trans položaju (Đermanović, 1990). U ovu grupu spadaju seskviterpenski laktoni koji nastaju iz germakrana A-D. Karakterističnim zatvaranjem prstena gvajanolida nastaju petočlani i sedmočlani prstenovi. Među gvajanolidima, najjednostavniju strukturu imaju slovanolidi, izolovani iz vrsta roda Laserpitium. Slovanolide karakteriše odsustvo ili prisustvo samo jedne dvostruke veze unutar ugljeničnih prstenova, a u hemijskom smislu oni su derivati 8α,10β,11α-trihidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-6,12-olida. Što se ostalih gvajanolida tiče, u farmakološkom smislu najinteresantniji su tapsigargini. Kod tapsigargina, jedna ili više dvostrukih veza u cikličnom sistemu se u daljim metaboličkim reakcijama hidroksiluje, što dalje povećava broj hiralnih centara molekula (Drew i sar., 2009). Pretpostavlja se da se sinteza gvajanolida odvija ciklizacijom anti- Markovnikov-ljevog tipa. Polazni prekursor farnezilpirofosfat prevodi se u 4,5-epoksi germakrolid stoličaste konformacije, koji se dalje ciklizuje pa oksiduje u položajima C-6 ili C-8. Daljom ciklizacijom, odnosno 6,12 i 8,12 zatvaranjima laktonskih prstenova dobijaju se skeleti dva osnovna strukturna tipa gvajanolidnih laktona (Slike 8a i 8b). Za oba su zajednički prisustvo laktonskog prstena i metil grupe u položaju C-13 (Đermanović, 1990; Drew i sar., 2009). (a) (b) Slika 8. Glavni strukturni tipovi gvajanolida Biosintetski put seskviterpenskih laktona u vrstama familije Apiaceae nije još uvek sa sigurnošću utvrđen, jer se konformacija izolovanih laktona razlikuje od 17 konformacije laktona predstavnika familije Asteraceae. Sekundarni metabolizam i prisustvo specifičnih enzima povećava kompleksnost gvajanolida u stereohemijskom smislu, naročito u položajima oko laktonskog prstena. Iako postoje sličnosti u metabolizmu, zna se da su različite konformacije gvajanolida izolovanih iz predstavnika familije Apiaceae i Asteraceae posledica prisustva različitih enzima u vrstama ove dve familije. Laktonski prsten zastupljen kod predstavnika familije Apiaceae je ili 6β, 8α ili 6β, 8β, dok su u vrstama familije Asteraceae poznati isključivo gvajanolidi konfiguracije 6α, 8β (Drew i sar., 2009). 2.1.3. Hromatografske tehnike u analizi seskviterpenskih laktona De novo sinteza seskviterpenskih laktona je izuzetno kompleksna sa stanovišta tradicionalne organske hemije, zbog prisustva velikog broja hiralnih centara. Iz ovog razloga se seskviterpenski laktoni i dalje najčešće dobijaju izolovanjem iz biljnih sirovina, iako su koncentracije u pojedinim biljnim vrstama veoma niske. Seskviterpenski laktoni su jedinjenja male molekulske mase, relativno neisparljiva i većinom termolabilna, što dosta otežava procese razvdvajanja i prečišćavanja. Ipak, savremenim hromatografskim tehnikama moguće je izolovanje iz biljnog materijala i kvantifikovanje ovih jedinjenja u biljnim ekstraktima, čak i kada su prisutni u maloj količini (Drew i sar., 2009; Merfort, 2002). Tečna hromatografija (HPLC) Tečna hromatografija (HPLC), uglavnom reverzno-fazna, predstavlja metodu izbora kada je u pitanju analiza seskviterpenskih laktona u sirovim ekstraktima. Ipak, moguće je optimizovati i normalno-faznu HPLC odgovarajućim gradijentom mobilne faze (kombinacija n-heksan-acetonitri (CH3CN)-izopropanol), u zavisnosti od hemijske prirode i strukture laktona. Nekada se može koristiti gradijent HPLC sa mobilnim fazama CH3CN : H2O i MeOH : H2O. Da bi se poboljšalo razdvajanje, tj. da bi se izbeglo širenje zona na hromatogramu, naročito kod komponenata koje se relativno brzo eluiraju, potrebno je da uzorci budu rastvoreni u smeši rastvarača što približnijeg sastava početnom sastavu mobilne faze. Zbog relativno niske stabilnosti ove klase sekundarnih metabolita predloženo je da se teži ka što kraćem vremenu analize, pa se 18 stoga biraju i kraće kolone. U slučajevima gde je to moguće, predlaže se i upotreba mikrokolona. Veliki problem, kada je HPLC analiza seskviterpenskih laktona u pitanju, je niska UV-apsorptivnost ove klase jedinjenja. Pojava apsorpcionih maksimuma u oblasti 210-220 nm jako otežava HPLC analizu laktona, posebno onih koji su prisutni u malim koncentracijama u sirovom ekstraktu. Derivatizacija pogodnim reagensom može biti rešenje ovog problema. Na primer, laktoni sa α-metilenbutanolnom grupom mogu da se derivatizuju pomoću 9-tiometilantracena (Merfort, 2002). Tehnike kombinovane sa tečnom hromatografijom: HPLC-MS i HPLC-NMR UV detekcija, pa samim tim i HPLC sa UV detektorom često nije metoda izbora u analizi seskviterpenskih laktona, zbog slabe apsorptivnosti hromofora ili čak njihovog odsustva u molekulu laktona. Brojni limitirajući faktori u detekcionim tehnikama uticali su na razvoj primene HPLC u kombinaciji sa masenom spektometrijom (MS) u analizi seskviterpenskih laktona. Vrlo često se za jonizaciju koristi termosprej jonizacija (TSP). HPLC-TSP dovodi do pojave kvazimolekulskih jona [M+H]+, [M+NH4]+ kao različitih proizvoda jonizacije rastvarača. Moguće je da se u spektru vide i joni nastali daljom fragmentacijom molekula seskviterpenskog laktona, posle gubitka vode ili kiselinskih ostataka iz estarskih grupa. Neke tehnike koje daju slične rezultate kao TSP su hemijska jonizacija pod atmosferskim pritiskom (eng. Atmospheric Pressure Chemical Ionization ─ APCI) i elektrosprej jonizacija (eng. Electrospray Ionisation ─ ESPI) u kombinaciji sa HPLC. Tečna hromatografija u kombinaciji sa nuklearno magnetno rezonantnom spektroskopijom (LC – NMR) je tehnika koja kombinuje visoko efikasnu separacionu tehniku sa spektroskopskom metodom kojom je moguće utvrditi tačnu strukturu jedinjenja. Ipak, nedostatak ove metode je niska osetljivost zbog interferencije signala rastvarača (Merfort, 2002). Gasna hromatografija (GC) Iako za analizu velikog broja seskviterpenskih laktona gasna hromatografija (GC) nije metoda izbora zbog termolabilnosti molekula, ona se može koristiti kod nekih 19 ekstrakata u rutinskim skriningu prisustva ovih jedinjenja. Često je derivatizacija sa trimetilsilanom neophodna da bi se seskviterpenski laktoni analizirali pomoću GC (Merfort, 2002). Hromatografija na tankom sloju (TLC) Hromatografija na tankom sloju (TLC) više nema značaj koji je nekada imala u analizi seskviterpenskih laktona. Ipak, kombinovanjem ove metode sa odgovarajućim reagensima za vizuelizaciju zona, može se dobiti pouzdana informacija o tipu laktona koji se nalazi u ekstraktu. Reagensi za vizuelizaciju su razni, najčešće vanilin-suporna ili vanilin-o–fosforna kiselina, anisaldehid, p-dimetilaminobenzaldehid-sumporna kiselina, sumporna kiselina i drugi. Uglavnom, u zavisnosti od strukturnog tipa seskviterpenskih laktona koji se u nekom ekstraktu očekuje, može se odabrati najpogodniji reagens za derivatizaciju. Većina ovih reagenasa nije specifična, ali je izvođenje TLC analize jednostavno i brzo. Često se koristi u kombinaciji sa hromatografijom na koloni za praćenje efikasnosti razdvajanja, kao i za kontrolu kvaliteta ekstrakata koji su deklarisani da sadrže određeni seskviterpenski lakton (Merfort, 2002). 2.1.4. Metode za određivanje strukture seskviterpenskih laktona Najčešće korišćene metode su nuklearna magnetna rezonantna i infracrvena spektroskopija, ali se u praksi, kada je to moguće, koriste i masena spektrometrija i ultraljubičasta spektroskopija, kao i kristalografska analiza. Nuklearna magnetna rezonantna spektroskopija (NMR spektroskopija) NMR spektroskopija, metoda kojom se meri nuklearni magnetizam, odnosno promena nuklearnog magnetizma pri apsorpciji radiofrekventnog zračenja, predstavlja metodu izbora kada je analiza seskviterpenskih laktona u pitanju (Milosavljević, 2004). Jezgra sa neparnim zbirom protona i neutrona (polucelobrojna vrednost spinskog kvantnog broja) kao što su 1H, 13C, 15N, 31P, kao i jezgra kod kojih je broj protona i neutrona neparan, a njihov zbir paran (celobrojna vrednost spinskog kvantnog broja), predstaljaju NMR aktivna jezgra. 20 Pogodnim kombinovanjem metoda jednodimenzionalne (1H i 13C) NMR spektroskopije, eksperimenata prenosa polarizacije (eng. Distortionless Enhancement by Polarization Transfer – DEPT) i dvodimenzionalnih NMR tehnika: • homonuklearne 2D razložene spektroskopije (eng. Coorrelation Spectroscopy – COSY); • heteronuklearne korelisane 2D NMR spektroskopije (eng. Gradient- selected Heteronuclear Single Quantum Coherence – gHSQC); • daljinskog 1H – 13C COSY sprezanja (eng. Gradient-selected Heteronuclear Multiplebond Coherence – gHMBC) i • Dvodimenzionalne NOE spektroskopije (eng. Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy – NOESY), moguće je dobiti tačnu informaciju o broju protona, ugljenika, njihovoj međusobnoj vezi, čak i stereohemiji molekula (Milosavljević, 2004). Analizom protonskih NMR (1H NMR) spektara dobijamo informaciju o hemijskom pomeranju (δH) i konstantama kuplovanja (J, u Hz). Hemijsko pomeranje je veličina bez dimenzije, da bi se izbegao uticaj jačine primenjenog magnetnog polja na hemijsko pomeranje. Položaj signala u 1H NMR spektru se izražava u odnosu na položaj standardnog jedinjenja tetrametilsilana – TMS. Najkarakterističniji signali za seskviterpenske laktone se nalaze na hemijskom pomeranju od 3,60-5,10 ppm, a potiču od protona koji se nalaze ispod laktonskog prstena (Đermanović, 1990). Analiza NMR spektara ugljenika-13 (13C NMR) daje informaciju o broju hemijski ne-ekvivalentnih ugljenika, u spektralnom opsegu koji je mnogo širi nego kod 1H NMR spektara, jer ugljenici osećaju znatno jače direktne uticaje supstituenata. Prirodna obilnost 13C ugljenika je manja u odnosu na vodonik 1H, pa 13C NMR spektroskopija zahteva veću količinu uzorka. Hemijska pomeranja karakteristična za laktonski ugljenik su, u zavisnosti od strukture, u opsegu od 160-185 ppm. Eksperimenti prenosa polarizacije (DEPT) se koriste za klasifikaciju 13C NMR signala prema protonizovanosti ugljenika. Fenomen prenosa polarizacije je u osnovi prenos polarizacije sa jezgara sa većim žiromagnetnim odnosom (1H) na jezgra sa manjim žiromagnetnim odnosom (13C) posredstvom heteronuklearnog sprezanja. Dvodimenzionalni NMR eksperimenti pružaju dodatne informacije o strukturi u odnosu na jednodimenzionalne NMR eksperimente. Položaj svakog signala definiše se 21 pomoću dve radiofrekventne ose, a na svakoj od osa su hemijska pomeranja određene vrste jezgara. Heteronuklearna korelisana 2D NMR spektroskopija (1H, 13C NMR COSY, gHSQC), omogućava nedvosmislenu identifikaciju signala protona s kojim se svaki ugljenik u analiziranom molekulu spreže. Svaki signal je definisan pomoću dve ose: na jednoj su hemijska pomeranja iz protonskog (1H) NMR spektra, a na drugoj signali iz NMR spektra ugljenika-13 (13C), pa svaki korelacioni signal u gHSQC spektru povezuje parove 1H i 13C signala koji se skalarno sprežu. Daljinsko 1H – 13C COSY sprezanje, odnosno gHMBC eksperiment, takođe daje informaciju o skalarnim sprezanjima u molekulu, ali zbog odlaganja u pulsnoj sekvenci (oko 50 ms) signali u 2D spektru su posledica preklapanja 1H i 13C signala koji su na udaljenosti od 2 do 3, a po nekim autorima i do 5 hemijskih veza. Pošto su signali preklopljeni, nije moguće razgraničiti koliko je tačno rastojanje. Homonuklearna razložena 2D spektroskopija (COSY) predstavlja NMR tehniku kojom se u vezu dovode skalarno spregnuti protoni u molekulu, na rastojanju od 2–3 veze. Slično kao i kod heteronuklearnih tehnika, položaj svakog signala određuju dve skale na kojima se nalaze hemijska pomeranja iz protonskog spektra: signali koji se nalaze na dijagonali ovog spektra su autokorelacioni, a signali van dijagonale dovode u vezu skalarno spregnute protone. NOESY eksperimenti daju 2D spektar koji izgleda slično kao i COSY, samo što signali ovde povezuju protone između kojih postoji dipolarna interakcija, dakle prenos polarizacije nuklearnih spinova se dešava kroz prostor. Metoda je razvijena za analizu biopolimera, ali se danas uspešno koristi i u analizi manjih molekula kao što su seskviterpenski laktoni. Povezuje signale hemijskih grupa koje se konformaciono sporo izmenjuju, pa na taj način pruža informaciju o stereohemiji molekula, što je u analizi seskviterpenskih laktona veoma važno (Williams i Fleming, 1995; Milosavljević, 2004). Infracrvena spektroskopija (IR) Infracrvena spektroskopija se koristi za analizu prečišćenih prirodnih proizvoda i daje informaciju o prisutnim funkcionalnim grupama. Jedna od najkarakterističnijih traka seskviterpenskih laktona je između 1760 cm-1 i 1800 cm-1, koja potvrđuje prisustvo γ-laktonskog karbonila u molekulu. Traka karbonila, pa samim tim i laktonska ili estarska, je obično najintenzivnija u IR spektru. Na položaj maksimuma utiču i ostali supstituenti, koji mogu uzrokovati pomeranje ka višem ili nižem polju. Zbog relativno 22 niske osetljivosti ove metode i mogućeg preklapanja traka maksimuma, IR spektroskopija se u analizi seskviterpenskih laktona koristi u kombinaciji sa NMR spektroskopijom i MS spektrometrijom (Đermanović, 1990; Milosavljević 2004; Williams i Fleming, 1995). 2.1.5. Biološka aktivnost seskviterpenskih laktona Seskviterpenski laktoni su sekundarni metaboliti odgovorni za farmakološku aktivnost nekih biljaka. Savremena istraživanja su usmerena na pronalaženje strukturnih karakteristika koje su odgovorne, pre svega, za antitumorsko i antiinflamatorno delovanje (Siedle i sar., 2004; Ghantous i sar., 2010). U nekoliko in vivo studija pokazano je da seskviterpenski laktoni inhibiraju enzime ili oslobađanje medijatora inflamacije, koji su uključeni u zapaljenski proces. Neki seskviterpeni inhibiraju migraciju i hemotaksu neutrofila, egzocitozu granula polimorfonuklearnih leukocita ili oslobađanje histamina iz mast ćelija (Merfort, 2011). Ipak, najvažnijim mehanizmom antiinflamatornog dejstva seskviterpenskih laktona se smatra njihova sposobnost inhibicije nuklearnog transkripcionog faktora-κB (NF-κB). On ima centralnu ulogu u kontrolisanju ekspresije gena koji kodiraju medijatore inflamacije, koji dalje mogu biti uključeni u etiologiju toksičnog šoka, astme, reumatoidnog artritisa i karcinoma. U odgovoru na zapaljenske stimuluse, NF-κB faktor reguliše ekspresiju preko 150 ciljnih gena, koji su odgovorni za sintezu medijatora, kao što su interleukini: IL-1, IL-2 i IL-6 ili tumornekrozni faktor-α (TNF-α), za sintezu imunoreceptora, ćelijskih adhezionih molekula i enzima, kao što su ciklooksigenaza II (COX-II) i inducibilna NO-sintaza (iNOS). Zbog centralne uloge NF-κB faktora u regulisanju zapaljenskog odgovora, inhibicija njegove aktivnosti dovodi do ispoljavanja antiinflamatornog dejstva (Siedle i sar., 2004). Ispitivanjem povezanosti strukture i aktivnosti prirodnih seskviterpenskih laktona različitih klasa, ustanovljeno je da postoji direktna korelacija visoke inhibicije NF-κB faktora i broja reaktivnih centara u molekulu laktona. Reaktivni centri su delovi strukture kao što su metilenski lakton ili konjugovane keto ili aldehidne funkcionalne grupe, koje Michael-ovom adicijom stupaju u reakciju sa ćelijskim nukleofilima. Pored α-metilen-γ-laktona i broja α,β-nezasićenih karbonilnih grupa, elektronski i sterni efekti, kao što su geometrija molekula i prisustvo i položaj određenih funkcionalnih grupa imaju znatan uticaj na ispoljenu aktivnost (Siedle i sar., 2004; Merfort, 2011). 23 Karcinom je skup bolesti i poremećaja u osnovi kojih je nekontrolisana deoba i širenje abnormalnih formi sopstvenih ćelija po organizmu. Pojmovi karcinom, maligna neoplazma i maligni tumor se koriste da opišu grupe ćelija koje karakterišu smanjena mogućnost diferencijacije, velika invazivnost i sposobnost da metastaziraju, što ova patološka stanja odvaja od benignih tumora. Pojava ovih abnormalnih formi ćelija je posledica izmenjene ekspresije gena u ćelijama kancera, odnosno genetskih mutacija u njima. Hemioterapija karcinoma je kompleksan terapijski proces, kako zbog toksičnosti samog leka po zdrave ćelije u organizmu, tako i zbog rezistencije, koju tumorske ćelije vremenom razvijaju. Zbog toga je iznalaženje novih antitumorskih agenasa veoma aktuelno u farmaceutskoj industriji, koja se sve više okreće prirodnim agensima sa potencijalnom terapijskom primenom (Rang i sar., 2003). Smatra se da je citotoksična i antiproliferativna aktivnost seskviterpenskih laktona, slično antiinflamatornoj aktivnosti, posledica prisustva reaktivnog alkilacionog centra u strukturi, lipofilnosti bočnog lanca i specifične geometrije molekula. Hartwell i Abbott su 1969. god., testirali oko 50 laktona za koje je bilo poznato da ispoljavaju citotoksičan efekat na različite ćelije tumora i dobili indirektan dokaz o vezi biološke aktivnosti i prisustva α-metilen-γ-laktona. α-Metilen-γ-lakton se adira Michael-ovom adicijom na bio-nukleofile, od kojih su najreaktivniji oni sa reziduama cisteina koji sadrže tiolne grupe, formirajući pri tom stabilne adukte. Dalja proučavanja su pokazala da analozi helenalina koji sadrže endocikličnu α,β-nezasićenu keto grupu imaju jači citotoksični efekat od α-metilen-γ-laktona. Prisustvo nezasićene karbonilne, odnosno “en-onske“ grupe, bilo u laktonu ciklopentenonskog prstena ili u estarskom bočnom lancu, povećava citotoksičnost seskviterpenskih laktona prema ćelijama tumora. Dalje studije su potvrdile da su ovi “en-onski“ sistemi, koji su odgovorni za ispoljenu citotoksičnost in vitro, odgovorni i za inhibiciju rasta tumora in vivo. Ipak, za neke od seskviterpenskih laktona je utvrđeno da se vezuju za proteine krvi koji sadrže sulfhidrilne grupe, što smanjuje njihovu biorasploživost i onemogućava dostizanje koncentracije koja je neophodna za citotoksičan efekat. Smatra se da su iste ove strukture, sličnim mehanizmima dejstva, odgovorne i za alergijske reakcije, tipa kontaktnog dermatitisa (Ghantous i sar., 2010). Pretpostavlja se da je inhibicija NF-κB faktora odgovorna za citotoksično dejstvo pojedinih seskviterpenskih laktona. Neki seskviterpenski laktoni, npr. 24 artemizinin, tapsigargin i partenolid, kao i njihovi polusintetski derivati (Tabela 1), su u različitim fazama kliničkih ispitivanja zbog svojih antiproliferativnih i citotoksičnih dejstava. Ova jedinjenja su selektivna prema tumorskim ćelijama, jer kao ciljno mesto dejstva imaju signalne puteve, i to ih čini vodećom klasom jedinjenja u kliničkim studijama karcinoma (Ghantous i sar., 2010). Tabela 1. Seskviterpenski laktoni koji se nalaze u različitim fazama kliničkih ispitivanja (Ghantous i sar., 2010) Seskviterpenski lakton/derivat Karcinom ili inflamatorno stanje Artemizinin Lupus nefritis Metastatski karcinom dojke Kolorektalni karcinom Artesunat Makrocitni karcinom pluća Metastatski uvealni melanom Karcinom skvamoznih ćelija larinksa Artemeter Makroadenom hipofize Dimetilaminopartenolid AML, ALL i ostali tumori krvnih ćelija Tapsigargin Uznapredovali tumori čvrstih tkiva 2.1.6. Seskviterpenski laktoni izolovani iz vrsta roda Laserpitium Iako široko rasprostranjene na evropskom kontinentu, vrste roda Laserpitium su do sada samo delimično ispitivane u pogledu hemijskog sastava. U vrstama L. siler, L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum), L. krapfii subsp. krapfii (sub L. alpinum), L. gallicum i L. latifolium identifikovani su seskviterpenski laktoni gvajanolidnog, eudezmanolidnog i germakranolidnog tipa (Đermanović i sar., 1994; Appendino i sar., 1993; Appendino i sar., 1986; Holub i Budĕšinský, 1986; Đermanović i sar., 1982; Stefanović i sar., 1977). Najveći broj seskviterpenskih laktona izolovanih iz vrsta roda Laserpitium pripada gvajanolidnom tipu, i uglavnom su to derivati slovanolida, osnovnog skeleta 8α,10β,11α- trihidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-6,12-olida. Najčešće su oksidovani u položajima C-2, C-3, C-4, C-8, C-10 i C-11 (Holub i Budĕšinský, 1986; Đermanović, 1990). Laktoni eudezmanolidnog tipa izolovani iz vrsta roda Laserpitium najčešće su derivati silerolida, tj. 1β,11α-dihidroksi-6αH,7αH-eudezman-3en-6,12-olida (Holub i sar., 1986; Milosavljević i sar., 1999). 25 U Tabeli 2 dat je pregled struktura seskviterpenskih laktona do sada izolovanih iz vrsta roda Laserpitium. Tabela 2. Seskviterpenski laktoni izolovani iz vrsta roda Laserpitium Seskviterpenski lakton Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca 2β-angeloiloksi-7α,10α-epoksi-6βH- gvajan-3-en-6,12-olid L. krapfii subsp. krapfii (sub L. alpinum) herba Đermanović, i sar., 1982 R1=Ac; R2=i-But; R3=Ang Ang* = 2β-angeloiloksi-8α-(2׳-metil)butiriloksi- 10β,11α-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3- en-6,12-olid L. archangelica rizom, koren Holub i Samek, 1973 * Ang – angeloil grupa 26 Tabela 2. (nastavak) Seskviterpenski lakton Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca R=Ang R=Sen 6β esterifikovani derivati 11β-(2׳-metil) butiriloksi-7βH,8βH-germakra-3,9-dien- 7,12-olida L. gallicum rizom, koren Appendino i sar., 1993. R=Ang R=Sen Sen*= 8α esterifikovani derivati 11α-(2׳- metil)butiriloksi-1β-hidroksi-6αH,7αH- eudezman-3en-6,12-olida L. gallicum rizom, koren Appendino i sar., 1993 R=Ang R=Sen 8α esterifikovani derivati 3-metilen-11α-(2׳-metil)butiriloksi-1β- hidroksi-6αH,7αH-eudezman-6,12-olida L. gallicum rizom, koren Appendino i sar., 1993 * Sen – Senecioil grupa 27 Tabela 2. (nastavak) Seskviterpenski lakton Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca Slovanolid: 8α,10β,11α-trihidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-6,12-olid R1=Ang R2=Ac R3=Ang L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) rizom, koren Appendino i sar., 1986 Acetilizomontanolid: R1= Ang R2=Ac R3=Ac L. siler rizom, koren Holub i sar., 1978 L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) rizom, koren Appendino i sar., 1986 Tarolid (gradolid): R1=Ang R2=H R3=Ang L. siler herba Đermanović, 1990 L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) rizom, koren Appendino i sar., 1986 L. siler plod Holub i sar., 1972 rizom, koren Holub i sar., 1978 Izomontanolid: R1=Ang R2=H R3=Ac herba Stefanović i sar., 1977 R1= R2=H R3=Ac L. siler rizom, koren R1=R3=Ac R2=H R1=H R2=iBu R3=Ac Smitalova i sar., 1984 R1=H R2=MeBu R3=Ac Montanolid: R1=H R2=Sen R3=Ac L. siler rizom, koren Holub i sar., 1978 R1=R3=Ac R2=iBut L. siler plod Holub i sar., 1972 28 Tabela 2. (nastavak) Seskviterpenski lakton Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca Silerolid: 1β,11α-dihidroksi-6αH,7αH-eudezman-3en-6,12-olid Izosilerolid: R1=Ac R2=Ang L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) rizom, koren Appendino i sar., 1986 L. siler rizom, koren Holub i sar., 1986 Silerolid: R1=Ac R2=Sen L. siler herba Stefanović i sar., 1977 rizom, koren Holub i sar., 1986 8α,10β-dihidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-6,12-olid R=Ac L. krapfii subsp. krapfii (sub L. alpinum) herba Holub i Budĕšinský, 1986 R=H L. krapfii subsp. krapfii (sub L. marginatum) herba Milosavljević i sar., 1999 L. latifolium herba Milosavljević i sar., 1999 2-okso-8α,11α-dihidroksi-6αH,7αH- gvajan-3,10-dien-6,12-olid R1=Ac; R2=Ang R1=Ac; R2=Ang R1=Ang; R2=Ang L. prutenicum koren, rizom Rychlewska i sar., 1985 29 Tabela 2. (nastavak) Seskviterpenski lakton Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca 2-okso-10-metilen-8α-acetoksi,11α- angeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en- 6,12-olid L. prutenicum koren, rizom Holub i Budĕšinský, 1986 11α-angeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3,10- dien-6,12-olid L. prutenicum koren, rizom Holub i Budešinský, 1986 2β-hidroksi-8α-angeloiloksi-10β,11α- diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3,10-dien- 6,12-olid L. siler rizom, koren Smitalova i sar., 1984 O OAc OMeBu O OH OH H AngO Trilobolid: 2α-angeloiloksi-8α-(2׳- metil)butiriloksi-10β-acetoksi-7β,11α- dihidroksi-6αH,7αH-gvajan-4-en-6,12- olid L. siler L. archangelica rizom, koren rizom, koren Smitalova i sar., 1984 Kmonickova i sar., 2009 30 2.2. Seskviterpenski estri Iz vrsta roda Laserpitium izolovani su seskviterpenski estri sa osnovnom strukturom germakrana, pseudogvajana (Tabela 3), i karotana (daukana), koji su obrađeni u narednom poglavlju (Đermanović, 1990). Tabela 3. Seskviterpenski estri izolovani iz vrsta roda Laserpitium Seskviterpenski estar Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca 8-acetoksi-2β-angeloiloksi-9α,10α- epoksi-7α-hidroksi-pseudogvajan L. krapfii subsp. krapfii (sub L. alpinum) herba Đermanović i sar., 1982 Halerin: derivat furano-germakra- 1(10),4-diena (anomerni γ-laktoli) L. halleri subsp. halleri koren Appendino i sar., 1986 6-acetoksi, 8-angeloiloksi, 4β,5α-epoksigermakra-1(10)-en L. halleri subsp. halleri plod Appendino i sar., 1986 R=Ac; R=H Gvajanski estri, derivati cikolširomodiol- 8-O-angelata L. halleri subsp. halleri plod Appendino i sar., 1986 31 2.2.1. Daukanski estri Daukanska klasa seskviterpena je relativno mala grupa sekundarnih biljnih metabolita, za koju se dugo smatralo da je ograničena samo na vrste familije Apiaceae. Novija istraživanja su pokazala da i pojedine vrste familija Asteraceae, Rosaceae, ali i pojedine gljive i morski organizmi sintetišu daukanske metabolite (Ghisalberti, 1994). Osnovne strukture daukanskih derivata date su na Slici 9. Numerisanje položaja u daukanskom skeletu je u saglasnosti sa brojanjem u acikličnom C15 prekursoru. Slika 9. Osnovne strukture daukanskih derivata Biosinteza Uprkos relativno jednostavnoj strukturi daukanskog skeleta, biosinteza daukanskih estara u biljnim vrstama nije do kraja razjašnjena. Daukani vode poreklo od cis, trans farnezilpirofosfata (Z,E-FPP) i njihova biosinteza ne uključuje sintezu makrocikličnog germakrana kao intermedijernog molekula. U mnogim biljnim vrstama daukanski derivati su prisutni pored drugih tipova seskviterpena, kao što su geramakrani, gvajani, humulani ili selinani, ali nijedan od navedenih strukturnih tipova ne može da se dovede u vezu sa cikličnim perhidroazulenskim skeletom daukana. Sa druge strane, postoje pretpostavke da postoji biosintetska korelacija između bisabolana i akorana i daukana. Pretpostavljeni biosintetski put dat je na Slici 10. Prva struktura na Slici 10 nastaje ciklizacijom farnezilpirofosfata, pa može biti prekursor bisabolen alkohola ili akroen jona ili cikoheptenil jona od kojih poslednji predstavlja intermedijer u biosintezi daukana. Formiranje ciklopentanskog prstena uključuje stvaranje tercijernog karbonijum jona, sa trans spojenim prstenovima (Ghisalberti, 1994). 32 Slika 10. Pretpostavljena biosinteza daukana u biljnoj ćeliji (Ghisalberti, 1994) Biološka aktivnost Uzevši u obzir relativno ograničenu rasprostranjenost daukanskih derivata u prirodi, njihova biološka aktivnost je samo delimično ispitivana. Neki daukanski estri deluju antimikrobno, repelentno i citotoksično (Ghisalberti, 1994). Daukanski estri izolovani iz vrsta roda Laserpitium Prvi izolovani daukanski estar je laserpicin, gorka kristalna supstanca iz korena L. latifolium (Hegi, 1906; Ghisalberti, 1994). Kasnije su iz podzemnih organa L. latifolium izolovana još dva daukanska estra (Tabela 4). Iz ekstrakata ploda L. halleri subsp. halleri izolovan je jedan daukanski estar, vaginatin, prethodno izolovan iz korena Selinum vaginatum C. B. Clarke (Appendino i sar., 1986). U Tabeli 4 dat je pregled struktura daukanskih estara izolovanih iz vrsta roda Laserpitium. 33 Tabela 4. Daukanski estri izolovani iz vrsta roda Laserpitium Daukanski estar Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca R=Ang, laserpicin R=iBut L. latifolium rizom, koren Moldt i sar., 1987. Holub i sar., 1967. R=Ang, vaginatin L. halleri subsp. halleri plod Appendino i sar., 1986. H OAng HO OAng OH OH Laserpicinol L. latifolium rizom, koren Holub i sar., 1967. H OAng OAng O 1β,5β-diangeloiloksi-2,3-epoksi- daukan L. latifolium rizom, koren Holub i sar., 1959. 34 2.3. Etarska ulja Do sada je ispitivan hemijski sastav etarskih ulja vrsta L. archangelica, L. gallicum, L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum), L. glaucum, L. halleri, L. hispidum, L. krapfii, L. latifolium, L. petrophilum Boiss. et Heldr., L. prutenicum i L. siler (Tirillini i sar., 2009; Kapetanos i sar., 2008; Chizzola, 2007; Chizzola i Novak, 1999; Baser i Duman, 1997; Timchuk, 1981; Adcock i Betts, 1974; Motl, 1973; Rutovskii i Makarova-Zemlyanska, 1930). U ovim etarskim uljima najzastupljenije komponente su uglavnom iz grupe monoterpenskih ugljovodonika i oksidovanih monoterpena (Tabela 5). 35 Tabela 5. Pregled najzastupljenijih komponenata u do sada analiziranim etarskim uljima vrsta roda Laserpitium Jedinjenje Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Udeo u etarskom ulju (%) Referenca α-Pinen L. gallicum L. glaucum L. latifolium L. siler L. petrophilum L. gallicum plod herba list 17,0; 28,5% do 45,0% do 76,0% 13,9% 48,9% 20,1% Chizzola, 2007 Adcock i Betts, 1974 Kapetanos i sar., 2008 Baser i Duman, 1997 Chizzola, 2007 Sabinen L. gallicum L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) L. petrophilum L. gallicum plod herba list 17,2% 9,7% 25,9% 10,4% Chizzola, 2007 Tirillini i sar., 2009 Baser i Duman, 1997 Chizzola, 2007 β-Pinen L. gallicum L. archangelica L. glaucum L. hispidum L. krapfii L. latifolium L. prutenicum L. hispidum L. gallicum plod herba list 14,8; 38,5% do 100,0% do 48% do 30,0% do 19,0% do 96,0% do 14,0% 25,5% 24,0% Chizzola, 2007 Adcock i Betts, 1974 Timchuk, 1981 Chizzola, 2007 Mircen L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) L. gallicum L. gallicum plod list 15,7% 11,8% 14,6% Tirillini i sar., 2009 Chizzola, 2007 Chizzola, 2007 36 Limonen L. siler L. halleri L. krapfii L. latifolium plod 22,0% 10,5% 16,9% do 100,0% do 77,0% do 73,0% Chizzola i Novak, 1999 Motl, 1973 Kapetanos i sar., 2008 Adcock i Betts, 1974 β-Felandren L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) plod 14,4% Tirillini, 2009 O Perilaldehid L. siler plod 89,5% 75,0% 41,1% Motl, 1973 Chizzola i Novak, 1999 Kapetanos i sar., 2008 Geraniol L. hispidum plod do 42,0% Rutovskii i Makarova- Zemlyanska, 1930 Geranilacetat L. hispidum L. hispidum L. prutenicum herba plod 45,7% do 65,0% do 90,0% Timchuk, 1981 Adcock i Betts, 1974 37 2.4. Fenilpropani Fenilpropani su jedinjenja sa karakterističnom C6-C3 strukturnom jedinicom u svom molekulu. Obuhvataju više različitih klasa jedinjenja i u prirodi su široko zastupljeni (Petrović i sar., 2009; Dewick, 2009). U vrstama roda Laserpitium utvrđeno je prisustvo fenilpropanskih jedinjenja i derivata (Tabela 6). Neka su široko rasprostranjena u predstavnicima familije Apiaceae (latifolon, fenolkarboksilne kiseline hlorogenska i neohlorogenska), dok su pojedina karakteristična za nekoliko rodova. U etanolnim ekstraktima lista L. latifolium identifikovane su hlorogenska i neohlorogenska kiselina (Vereskovskii i sar., 1992). Pošto su fenolkarboksilne kiseline po hemijskoj prirodi polifenolna jedinjenja, biološka aktivnost i farmakološki efekti biće pomenuti u odeljku koji se tiče farmakološke aktivnosti polifenola. Tabela 6. Fenilpropanska jedinjenja vrsta roda Laserpitium Fenilpropansko jedinjenje Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca O O O OMe Latifolon L. archangelica L. latifolium L. siler rizom i koren rizom, koren rizom, koren Holub i Samek, 1973 Holub i sar., 1959 Holub i sar., 1970 O O O OMe OAng α-Angeloiloksi-latifolon L. siler herba Đermanović, 1990 O O MeO OAng AngO Laserin L. archangelica L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) rizom, koren rizom, koren Holub i Samek, 1973 Appendino i sar., 1986 38 OH OH O O OH HO OH COOH Hlorogenska kiselina (5’-kafeoilhina kiselina) L. latifolium list Vereskovskii i sar., 1992 OH OH O OH COOH O OH HO Neohlorogenska kiselina (3’-kafeoilhina kiselina) L. latifolium list Vereskovskii i sar., 1992 39 2.5. Flavonoidi Flavonoidi, sa oko 9000 u prirodi otkrivenih struktura, predstavljaju jednu od brojnijih grupa sekundarnih metabolita biljaka i najbrojniju grupu prirodnih polifenola. Naziv su dobili od latinske reči flavus, što znači žut, jer su korišćeni za bojenje tkanina u žuto. Danas se u klasu flavonoida svrstavaju i neka jedinjenja koja su bezbojna (katehini, leukoantocijanidini), kao i antocijanidini koji su u zavisnosti od pH sredine obojeni crveno, plavo ili ljubičasto (Martens i Mithöfer, 2005; Petrović i sar., 2009, Evans, 2009). Biosintetski flavonoidi nastaju iz tri acetatne i jedne fenilpropanske jedinice. U hemijskom smislu predstavljaju derivate benzo-γ-pirona. Sastoje se iz dva benzenova prstena povezana C-3 mostom. U zavisnosti od stepena oksidacije, odnosno strukture C-3 mosta, flavonoidi su podeljeni na veći broj potklasa. Aromatični prstenovi mogu biti supstituisani u različitim položajima. Supstituenti su najčešće hidroksilne ili metoksi grupe, ali se sreću i C-alkil derivati, naročito u položajima 6 i 8 koji su izuzetno reaktivni (Petrović i sar., 2009; Evans, 2009). Biološka aktivnost Flavonoidi ispoljavaju širok spektar farmakoloških aktivnosti. Droge koje sadrže flavonoide tradicionalno se primenjuju u terapiji mnogih stanja i poremećaja. Flavonoidi vrlo često deluju i kao sinergisti u sadejstvu sa drugim prirodnim jedinjenjima. Flavonoidne droge imaju diuretično ili spazmolitično dejstvo, često ispoljavajući istovremeno i antibakterijsko ili antifungalno dejstvo. Ispitivanjem farmakološke aktivnosti izolovanih jedinjenja, utvrđeno je da su flavonoidi sekundarni biljni metaboliti koji su odgovorni za antialergijsko, antivirusno, antiinflamatorno, hepatoprotektivno, antioksidantno, vazodilatatorno i antikancerogeno dejstvo u živim organizmima. Antioksidantno i antiradikalsko dejstvo su aktivnosti koje se intenzivno proučavaju u poslednje vreme, a posledica su prisustva specifičnih struktura u molekulu flavonoida koje imaju sposobnost smanjivanja produkcije slobodnih radikala, kao i sposobnost „hvatanja“, odnosno neutralizacije već formiranih radikala (eng. radical scavenging activity). Flavonoidi, slično nekim drugim polifenolnim jedinjenjima, su u hemijskom smislu veoma aktivni donori protona ili elektronskog para, što je jedno od 40 objašnjenja visoke antiradikalske aktivnosti ispoljene u in vitro i in vivo testovima (Seyoum i sar., 2006; Chirumbolo, 2012). Iako je in vivo ispitivanjem u različitim modelim potvrđena antiinflamatorna aktivnost flavonoida, njihova bioraspoloživost nakon oralne primene je umanjena usled intenzivnog metabolizma (Chirumbolo, 2012). Flavonoidi identifikovani i izolovani iz vrsta roda Laserpitium U etanolnom ekstraktu lista L. latifolium utvrđeno je prisustvo heterozida kvercetina i kemferola (Vereskovskii i sar., 1992). Iz hloroformskog ekstrakta herbe L. siler izolovan je artemetin (Đermanović, 1990) (Tabela 7). Tabela 7. Flavonoidi identifikovani i izolovani iz vrsta roda Laserpitium Flavonoid Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Referenca O O OH OH OR OH HO Kvercetin-3-O- R=arabinoza (avikularin); R=glukoza (izokvercitrin); R=ramnoza (kvercitrin); R=rutinoza (rutin). L. latifoilum list Vereskovskii i sar., 1992 O O OH OR OH HO Astragalin: kemferol-3-O-glukozid L. latifoilum list Vereskovskii i sar., 1992 O O OMe OMe OMe OH MeO MeO Artemetin L. siler herba Đermanović, 1990 41 2.6. Kumarini Kumarini u hemijskom smislu predstavljaju derivate benzo-α-pirona ili glikozide O-hidroksi-cimetne kiseline. Oko 1300 različitih kumarinskih struktura je izolovano iz viših biljaka, gljiva i bakterija. Mnogi predstavnici familije Apiaceae su izvori ovih jedinjenja, naročito furanokumarina. Kumarini mogu biti sastojci etarskih ulja. Mnogi jednostavni kumarini imaju prijatan miris nalik mirisu pokošenog sena. Neka jedinjenja kompleksne strukture, kao što su antikoagulansi dikumarol (C3-C3′ kondenzacioni derivat dva kumarinska molekula) i varfarin, aflatoksin, ili fotosenzibilišući agensi psoraleni, u osnovi imaju kumarinsku strukturu. In vivo studijama na životinjama i ljudima pokazano je da kumarin izaziva smanjenje edema nastalih usled povrede tkiva ili nekog poremećaja (Evans, 2009). Kumarini izolovani iz vrsta roda Laserpitium Iz L. archangelica izolovana su četiri kumarina, derivata dihidroseselina (Bohlmann i Thefeld, 1970): dva iz ekstrakata podzemnih organa i dva iz ekstrakata herbe (Tabela 8). Tabela 8. Kumarini, derivati dihidroseselina izolovani iz L. archangelica (Bohlmann i Thefeld, 1970) Kumarin Biljni organ/ deo bilje R1=Ang; R2==CO(CH3)COCH(CH3) R1=Ac; R2==CO(CH3)COCH(CH3) R1=R2==CO(CH3)COCH(CH3) herba koren, rizom herba O OO O OR1 R1=Ang koren, rizom 42 3. TRADICIONALNA UPOTREBA VRSTA RODA LASERPITIUM Pojedine, široko rasprostranjene vrste roda Laserpitium koriste se u tradicionalnoj medicini nekih evropskih naroda. Infuz pripremljen od osušenih plodova raskovnika, L. siler (Siler montanum Crantz) je korišćen kod nadimanja i drugih gastrointestinalnih poremećaja, dismenoreje, kao diuretik i nakon ujeda zmija. Takođe, u Austriji i Nemačkoj, plod ove biljke je korišćen kao začin, zbog svog gorkog i aromatičnog ukusa i arome nalik aromi mešavine kima i korijandera. U nekim krajevima (Alpi) od ploda ove biljke izrađuje se alkoholni liker. Podzemni organi vrste L. siler su korišćeni za izradu tonika zbog karakterističnog gorkog i oštrog ukusa, kao i lokalno za ublažavanje zubobolje. Nadzemni delovi L. siler su smatrani izuzetno kvalitetnom stočnom hranom (Hegi, 1906). Upotreba vrste L. latifolium je takođe poznata u nemačkoj narodnoj medicini, gde su podzemni organi korišćeni za izradu tonika za osvežavanje i jačanje, kao i zbog emenagognog i diuretičnog dejstva. Sprašeni rizom i koren su korišćeni i kao dodaci pivu zbog stomahičnog i antacidnog dejstva (Hoppe, 1958). U ruskoj tradicionalnoj medicini alkoholni ekstrakti podzemnih organa korišćeni su u slične svrhe, a takođe i kod želudačnih tegoba, bolesti srca, jetre, plućne tuberkuloze, reumatizma i spolja kod nekih upalnih procesa, kao što su prurične dermatomikoze (Kuprevič, 1974; Vereskovskii i sar., 1992). 43 4. FARMAKOLOŠKA AKTIVNOST VRSTA RODA LASERPITIUM I pored činjenice da su iz ekstrakata vrsta roda Laserpitium izolovani metaboliti od značaja za medicinu i farmaciju, farmakološka aktivnost biljaka ovog roda, kao i njihovih sekundarnih metabolita do sada je vrlo malo ispitivana. Tirillini i saradnici (2009) su analizirali antifungalno dejstvo etarskog ulja ploda L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum). Ovo etarsko ulje je pokazalo jaku in vitro aktivnost prema šest sojeva fitopatogena i patogena koji izazivaju oportunističke infekcije kod ljudi: Aspergillus niger, A. tereus, Chaetomium globosum, Penicillium chrysogenum, P. pinophilum i Trichoderma viride. Hemijska sličnost seskviterpenskog laktona trilobolida i tapsigargina koji se nalazi u kliničkim studijama uznapredovalih tumora čvrstih tkiva, dovela je do povećanog naučnog interesa za proučavanje farmakoloških efekata trilobolida i optimizovanja procesa njegovog izolovanja iz podzemnih organa L. siler i L. archangelica. Trilobolid je ireverzibilni inhibitor Ca2+ pumpe sarko/endoplazmatskog retikuluma (eng. SERCA inhibitor), pa dovodi do povećanja intracelularnog nivoa kalcijuma (Ca2+) i izmenjene ćelijske signalizacije. Kao rezultat ovih promena, dolazi do pojačane sekrecije interferona gama (IFN-γ). In vitro testovi na ćelijama imunskog sistema (peritonealne makrofage miša i pacova i humani monociti), pokazali su da trilobolid u nanomolarnim koncentracijama izaziva pojačanu sekreciju interferona gama (IFN-γ), ključnog medijatora Th1 ćelijskog imunskog odgovora. Kompromitovan Th1 ćelijski odgovor može dovesti do razvoja infekcije ili karcinoma. Takođe, ispituje se uloga trilobolida kao adjuvantnog agensa u tretmanu rezistentinih sojeva mikroorganizama standardnim antibioticima, odnosno antimikoticima, kao i potencijalna primena ovog laktona u terapiji neinvazivnih, sporo-proliferišućih karcinoma, kao što je karcinom prostate (Kmonickova i sar., 2009). 44 CILJ 45 Cilj doktorske disertacije je hemijska i farmakološka karakterizacija tri vrste roda Laserpitium: • Laserpitium latifolium L. • Laserpitium zernyi Hayek i • Laserpitium ochridanum Micevski. Iako je upotreba vrste L. latifolium zabeležena u tradicionalnoj medicini u nekim delovima Evrope, ova vrsta je do sada samo delimično hemijski ispitivana. U dosadašnjim ispitivanjima vrste L. latifolium hemijski je okarakterisano etarsko ulje ploda, i utvrđeno je prisustvo pojedinih klasa sekundarnih metabolita (daukanski estri, fenilpropani, seskviterpenski laktoni, flavonoidi i fenolkarboksilne kiseline) u ekstraktima podzemnih organa i herbe. Endemične vrste L. ochridanum i L. zernyi nisu do sada hemijski okarakterisane. Hemijska analiza odabranih vrsta roda Laserpitium obuhvatiće izolovanje i strukturnu karakterizaciju sekundarnih metabolita od značaja za medicinu i farmaciju, kao i kvalitativnu i kvantitativnu analizu hloroformskih i metanolnih ekstrakata i izolovanih etarskih ulja. Nijedna od vrsta roda Laserpitium koje su predmet ove doktorske disertacije nije do sada ispitivana u pogledu farmakoloških efekata. Farmakološka karakterizacija obuhvatiće ispitivanje antimikrobnog, antinociceptivnog i antiedematoznog dejstva izolovanih etarskih ulja, citotoksičnog dejstva hloroformskih ekstrakata i jedinjenja izolovanih iz njih, kao i antioksidantne aktivnosti, antimikrobnog i antiedematoznog dejstva metanolnih ekstrakata. 46 MATERIJAL I METODE 47 1. Biljni materijal Biljni materijal za istraživanja u okviru ove doktorske disertacije predstavljaju podzemni organi (rizom i koren), herba, cvast i plod tri vrste roda Laserpitium: L. latifolium, L. ochridanum i L. zernyi. Identifikaciju biljnog materijala izvršio je dr sc. Marjan Niketić, kustos Prirodnjačkog muzeja u Beogradu. Herbarski primerci su deponovani u Herbarijumu Prirodnjačkog muzeja u Beogradu (BEO). Lokaliteti, vreme sakupljanja biljnog materijala, kao i herbarski podaci, dati su u Tabeli 9. Sakupljen biljni materijal je osušen na senovitom, dobro provetrenom mestu, na sobnoj temperaturi, i čuvan na tamnom i hladnom mestu do ekstrakcije/destilacije vodenom parom. Tabela 9. Ispitivane vrste roda Laserpitium – lokaliteti i vreme sakupljanja Biljna vrsta Lokalitet i vreme sakupljanja Kolektorski broj (BEO) Gučevo (Srbija), oktobar 2008. god. ko03102008 L. latifolium Basara - Planinica (Srbija), maj 2011. god. ko20110507/15 Galičica (Makedonija), avgust 2008. god. ko2008070215 L. ochridanum Galičica (Makedonija), oktobar 2009. god. ko2008070215 Jablanica (Makedonija), jul 2006. god. ko20060702/1 L. zernyi Šar-Planina - Ošljak (Srbija), jul 2008. god. ko20080709 48 2. Aparatura GC-FID analiza etarskih ulja izvedena je na gasnom hromatografu SRI 8610C opremljenom FID detektorom, split-splitless injektorom i kapilarnom kolonom DB-5 (30 m × 0,32 mm; debljina filma 0,25 µm). Helijum (He) je korišćen kao noseći gas. Temperature injektora i detektora iznosile su 280 ºC. GC-MS analiza etarskih ulja urađena je na gasnom hromatografu HP 6890 sa MS detektorom HP 5973, split-splitless injektorom i kapilarnom kolonom HP-5MS (30 m × 0,25 mm; debljina filma 0,25 µm). Helijum (He) korišćen je kao noseći gas. Temperaturni program je bio identičan programu za GC analizu. HPLC analiza hloroformskih ekstrakata izvršena je na Waters 2695 Alliance HPLC-DAD uređaju sa 996 Photodiode Array detektorom (Waters, Milford, MA) i Varian Omnispher C18 kolonom (250 × 4,6 mm; veličina čestica 5 µm). HPLC analiza metanolnih ekstrakata izvršena je na uređaju Aglient 1100 sa DAD detektorom, uz upotrebu Zorbax Eclipse XDB C18 kolone (250 × 4,6 mm; veličina čestica 10 µm). Semipreparativna hromatografija je izvođena na Gilson instrumentu sa 506 C sistemskim interfejsom, sistemom pumpi Gilson 322 i 156 UV-vis detektorom i Gilson 206 skupljačem frakcija (Gilson, Middleton, Sjedinjene Američke Države), koristeći Varian Omnisphere C18 kolonu (250 × 21,4 mm; veličina čestica 10 µm, Varian, St. Katelijne-Wawer, Belgija). Hromatografija na koloni izvođena je na stubu silikagela Kiesselgel Merck Typ 9385, 230 – 400 mesh, 60A (Merck, Nemačka). Kao adsorbens je korišćen celit, Celite 545 (Acros Organics, Geel, Belgija). Hromatografija na tankom sloju silikagela je izvođena na silikagel TLC pločama 60 F254 (Merck, Nemačka). IR spektri su snimani na spektrometru Perkin Elmer FT-IR Spectrometer SPECTRUM 1000. Jednodimenzionalni (1H NMR, 13C NMR) i dvodimenzionalni NMR spektri, (gHSQC, gHMBC, COSY i NOESY) snimljeni su na Varian Mercury 300 spektrometru. Uzorci su rastvarani u deuterohloroformu (CDCl3) koristeći tetrametilsilan (Sigma-Aldricht, Bornem, Belgija) kao interni standard. 49 Maseni spektri i precizna masa (MS) su snimani na Waters LCT Premier XE Orthogonal Acceleration Time Of Flight (TOF) masenom spektrometru. Uzorci su analizirani pri pozitivnom modu elektrosprej jonizacije, ESI+ (eng. Electrospray Ionisation). Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih polifenola, kao i merenje apsorbancije u testovima ispitivanja antioksidantne aktivnosti (FRAP test i ispitivanje neutralizacije DPPH i ˙OH radikala) urađeno je na spektrofotometru SPECOL 11 (Carl Zeiss, Jena). U in vitro citotoksičnim testovima, za merenje apsorbancije korišćen je ELISA čitač (eng. ELISA plate reader, Safire2TM, Tecan, Männedorf, Švajcarska) na transparentnim mikrotitracionim pločama sa 96 bazena ravnog dna (Nunc A/S, Roskilde, Danska). U ispitivanju antinociceptivne aktivnosti, pritisak na zadnje šape pacova („paw pressure“ test) meren je pomoću aparata Hugo Sachs Elektronik (March-Hugstetten, Nemačka). U ispitivanju antiedematozne aktivnosti, za merenje zapremine šape pacova korišćen je pletizmometar (Ugo Basile, Italija). 3. Izolovanje, određivanje sadržaja i analiza sastava etarskih ulja 3.1. Izolovanje etarskih ulja Etarska ulja su izolovana iz: • podzemnih organa (rizom i koren) L. latifolium sakupljenih na planini Gučevo, Srbija, oktobra 2008. god., L. zernyi sakupljenih na planini Ošljak, Srbija, jula 2008. god., i L. ochridanum sakupljenih na planini Galičica, Makedonija, avgusta 2008. god. • herbi (bez cvasti) L. zernyi sakupljenih na planini Jablanica, Makedonija, jula 2006. god., i L. ochridanum sakupljenih na planini Galičica, Makedonija, avgusta 2008. god. • cvasti L. zernyi sakupljenih na planini Jablanica, Makedonija, jula 2006. god. • plodova L. latifolium sakupljenih na planini Gučevo, Srbija, oktobra 2008. god., i L. ochridanum sakupljenih na planini Galičica, Makedonija, avgusta 2008. god. 50 Neposredno pre izolovanja etarskih ulja osušen biljni materijal usitnjen je do stepena grubog praška (zbog endogene lokalizacije etarskog ulja). Etarska ulja su izolovana postupkom destilacije vodenom parom u aparaturi po Clevenger-u, po propisu datom u Ph. Eur. 6, uz dodatak n-heksana (1 ml) u bočnu cev. Etarska ulja podzemnih organa i plodova L. latifolium dobijena su destilacijom vodenom parom u trajanju od 2 h, dok su etarska ulja L. ochridanum i L. zernyi, koja su bila obojena plavo od prisutnih azulena, dobijena postupkom koji je trajao 4 h. Zapremina izolovanih etarskih ulja merena je nakon otparavanja n-heksana na sobnoj temperaturi. Sadržaj etarskih ulja određivan je gravimetrijski (m/m) i izračunavan prema formuli: % (m) etarskog ulja = b/a × 100 a – masa osušenog biljnog materijala (g); b – masa etarskog ulja (g). 3.2. GC-FID i GC-MS analiza etarskih ulja Kvalitativna i kvantitativna analiza etarskih ulja urađena je GC-FID i GC-MS metodama. Uslovi GC-FID analize: • gasni hromatograf: SRI 8610C; • kapilarna kolona DB-5 (30 m × 0,32 mm; debljina filma 0,25 µm); • FID detektor (280 ºC); • temperatura injektora 280 ºC; • noseći gas helijum (1,2 ml/min); • temperaturni program 60-280 ºC, linearan porast 3 ºC/min. Uslovi GC-MS analize: • aparat HP 6890- 5973 GC-MS; • kapilarna kolona HP 5MS (30 m × 0,25 mm; debljina filma 0,25 µm); • split-splitless injektor (200 ºC), split mod (1:10); • temperatura transfer linije 250 ºC; • noseći gas He (1,0 ml/min); 51 • tehnika jonizacije: EI, 70 eV; • zapremina injektovanog uzorka 1,0 µl. Za GC-FID i GC-MS analizu pripremani su rastvori etarskih ulja u n-heksanu (10% V/V). Identifikacija komponenata analiziranih etarskih ulja izvršena je poređenjem njihovih retencionih vremena, Kovačevih indeksa (RI) i masenih spektara sa odgovarajućim podacima za referentne supstance i/ili jedinjenja iz kompjuterske datoteke (Wiley, NIST/NBS) i literature (Adams, 2001; SDBS). Linearni retencioni indeksi (Kovačevi indeksi, RI) određivani su u odnosu na homologi niz n-alkana (C9-C24) pod istim eksperimentalnim uslovima (Van den Dool i Kratz, 1963). Procentualni sadržaj pojedinačnih komponenti određivan je metodom normalizacije integrisanih površina pikova. 4. Izrada ekstrakata Osušen, sprašen biljni materijal ekstrahovan je u tamnim bocama tokom 48 h uz mešanje u ravnomernim vremenskim intervalima. Odnos droga : ekstrakciono sredstvo iznosio je 1:10 (m/V). Posle završene ekstrakcije, vršena je i re-ekstrakcija u toku 48 h, pod istim uslovima. Biljni materijal je ekstrahovan najpre hloroformom, a zatim, nakon filtriranja, na isti način metanolom. Rastvarači su uklonjeni uparavanjem pod sniženim pritiskom. Mase dobijenih suvih hloroformskih (CHCl3) i metanolnih (MeOH) ekstrakata koji su korišćeni za dalju analizu, kao i prinos ekstrakcije dati su u Tabeli 10. Hloroformski ekstrakti su, neposredno pre separacije hromatografijom na koloni silikagela i HPLC analize, rastvarani u metanolu u odnosu 1 : 10 (m/V) u ultrazvučnom kupatilu tokom 30 min, i filtrirani u cilju odstranjivanja masti, voskova i drugih lipofilnih materija, koje bi ometale dalju analizu ekstrakata. Za dalju hemijsku analizu korišćeni su u metanolu rastvorljivi delovi hloroformskih ekstrakata. Tabela 10. Masa i prinos suvih hloroformskih (CHCl3) i metanolnih (MeOH) ekstrakata ispitivanih vrsta roda Laserpitium Biljna vrsta (lokalitet i vreme sakupljanja) Biljni organ/deo biljke Masa biljnog materijala Masa suvog CHCl3 ekstrakta Prinos suvog CHCl3 ekstrakta Masa suvog MeOH ekstrakta Prinos suvog MeOH ekstrakta L. latifolium (Gučevo, 2008. god.) rizom i koren 632,0 g 31,8 g 5,0% 52,7 g 8,3% L. latifolium (Basara, 2011. god.) herba 24,4 g 1,1 g 4,5% 2,1 g 8,6% L. ochridanum (Galičica, 2009. god.) rizom i koren 49,4 g 6,1 g 12,4% 6,2 g 12,6% L. ochridanum (Galičica, 2008. god.) herba 504,1 g 17,5 g 3,5% 54,8 g 19,9% L. ochridanum (Galičica, 2008. god.) plod 75,2 g 8,9 g 11,8% 8,8 g 11,7% L. zernyi (Ošljak, 2008. god.) rizom i koren 417,9 g 28,5 g 6,8% 50,2 g 12,0% L. zernyi (Ošljak, 2008. god.) herba 522,1 g 18,1 g 3,5% 47,6 g 9,11% L. zernyi (Jablanica, 2006. god.) herba 324,1 g 10,1 g 3,1% 41,9 g 12,9% L. zernyi (Jablanica, 2006. god.) cvast 289,2 g 7,7 g 2,7% 3,4 g 1,2% 52 5. Izolovanje sekundarnih metabolita iz hloroformskih ekstrakata podzemnih organa L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum 5.1. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. latifolium 5.1.1. Hromatografija na stubu silikagela U cilju izolovanja sekundarnih metabolita iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium izvedeno je hromatografsko razdvajanje na stubu silikagela (Kiesselgel Merck Typ 9385, 230 – 400 mesh, 60A), dimenzija 65×5 cm. Hloroformski ekstrakt (4,81 g) je prethodno rastvaran u metanolu u toku 30 min u ultrazvučnom kupatilu i filtriran kako bi se uklonile masti, voskovi i druge lipofilne materije, koje bi ometale dalju analizu. Nakon filtriranja, metanol je uklonjen uparavanjem pod sniženim pritiskom. Dobijeni suvi ostatak (4,46 g) rastvoren je u minimalnoj količini metanola, a zatim adsorbovan na celit (19,7 g). Metanol je ponovo uklonjen uparavanjem pod sniženim pritiskom, a suvi ostatak nanet na vrh stuba silikagela. Eluiranje je vršeno gradijent sistemom mobilnih faza sa postupnim povećanjem polarnosti: početo je smešom heksan-etilacetat (EtOAc) u odnosu 5:1 (V/V) do čistog EtOAc, uz dalje eluiranje smešom EtOAC-MeOH, u odnosu 1:1 (V/V) do čistog MeOH. Brzina eluiranja iznosila je 3 ml/min. Prikupljeno je 120 frakcija, zapremine od po 20 ml. Razdvajanje na koloni je praćeno hromatografijom na tankom sloju silikagela (TLC 60 F254, 5×3 cm, Merck, Nemačka), korišćenjem mobilne faze identičnog sastava onoj kojom je frakcija eluirana sa kolone. Vanilin-sumporna kiselina reagens korišćen je za posthromatografsku derivatizaciju. Frakcije su spajane na osnovu sličnosti njihovih TLC hromatograma. Jedinjenje 1 nalazilo se u frakcijama 71-99, dobijenih sa kolone eluiranjem smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V). Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 1 boji se smeđecrveno nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 2 je sa kolone eluirano smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V) u frakcijama 63-68. Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 2 se boji tamnoplavo nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. 53 54 Jedinjenje 3 je sa kolone eluirano u frakcijama 58-64 smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V). Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 3 se boji sivo nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 4 sa kolone je eluirano smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V) u frakcijama 34-42. Jedinjenje 4 je na TLC hromatogramu gasilo fluorescenciju na 365 nm, i nije se uočavala obojena zona nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. 5.1.2. Semipreparativna HPLC hromatografija Semipreparativno prečišćavanje spojenih frakcija eluiranih sa kolone silikagela vršeno je na Gilson semipreparativnom HPLC hromatografu sa UV detektorom i Omnisphere C18 kolonom. Protok mobiline faze bio je 10 ml/min, zapremina injektovanja 250 µl, a detekciona talasna dužina 225 nm. Frakcije 71-99 u kojima se nalazilo jedinjenje 1 su spojene i eluent je uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (70% MeOH : 30% H2O). Nakon spajanja odgovarajućih frakcija, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a jedinjenje 1 (1577,8 mg) je iskristalisalo u obliku igličastih kristala. Suvi ostatak dobijen nakon spajanja frakcija 63-68 i uparavanja eluenta pod sniženim pritiskom, rastvoren je u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (75% MeOH : 25% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, dobijeno je 90,8 mg bezbojne tečnosti (jedinjenje 2). Frakcije 58-63 u kojima se nalazilo jedinjenje 3 su spojene, i eluent je uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 35 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (72% MeOH : 28% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 66,1 mg bezbojne tečnosti (jedinjenje 3). Nakon spajanja frakcija 34-42 u kojima se nalazilo jedinjenje 4, i uparavanja eluenta pod sniženim pritiskom, dobijen je suvi ostatak, koji je rastvoren u metanolu u koncentraciji 20 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (50% MeOH : 50% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 56,8 mg beličaste amorfne supstance (jedinjenje 4). 55 5.2. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. zernyi 5.2.1. Hromatografija na stubu silikagela U cilju izolovanja sekundarnih metabolita iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi, izvršeno je hromatografsko razdvajanje na stubu silikagela (Kiesselgel Merck Typ 9385, 230 – 400 mesh, 60A), dimenzija 65×5 cm. Hloroformski ekstrakt (5,16 g) je prethodno rastvaran u metanolu u toku 30 min u ultrazvučnom kupatilu i filtriran. Nakon filtriranja, metanol je uparen pod sniženim pritiskom. Dobijeni suvi ostatak (4,76 g) rastvoren je u minimalnoj količini metanola, a zatim adsorbovan na celit (21,2 g). Metanol je uklonjen uparavanjem pod sniženim pritiskom, a suvi ostatak nanet na stub silikagela. Kolona je eluirana gradijent sistemom mobilnih faza sa postupnim povećanjem polarnosti: početo je smešom heksan-etilacetat (EtOAc) u odnosu 5:1 (V/V) do čistog EtOAc, uz dalje eluiranje smešom EtOAc-MeOH, u odnosu 1:1 (V/V) do čistog metanola. Brzina eluiranja iznosila je 1 ml/min. Prikupljeno je 135 frakcija, zapremine od po 20 ml. Razdvajanje na koloni praćeno je hromatografijom na tankom sloju silikagela (TLC 60 F254, 5×3 cm, Merck, Nemačka), korišćenjem mobilne faze identičnog sastava onoj kojom je frakcija eluirana sa kolone. Vanilin-sumporna kiselina reagens korišćen je za posthromatografsku derivatizaciju. Frakcije su spajane na osnovu sličnosti njihovih TLC hromatograma. Jedinjenje 5 je sa kolone eluirano smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V) u frakcijama 81-90, zajedno sa još nekim terpenskim jedinjenjima. Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 5 se bojila mrkocrveno nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 6 je sa kolone eluirano smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V) u frakcijama 71-78, zajedno sa jedinjenjem 8. Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 6 bojila se mrkosmeđe nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 7 je sa kolone eluirano u frakcijama 80-88 smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V). Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 7 bojila se mrkosmeđe nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 8 je sa kolone eluirano u frakcijama 71-78 smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V), zajedno sa jedinjenjem 6. Na TLC hromatogramu, zona koja potiče od jedinjenja 8 bojila se smeđe nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. 56 Jedinjenje 9 je sa kolone eluirano u frakcijama 99-105 smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V). Na TLC hromatogramu nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom, zona koja potiče od jedinjenja 9 bojila se crveno. Jedinjenje 10 eluirano je sa kolone u frakcijama 90-98 smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V). Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 10 bojila se mrkosmeđe nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 11 je sa kolone eluirano u frakcijama 91-95 smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V), zajedno sa jedinjenjem 10. Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 11 bojila se smeđe nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. 5.2.2. Semipreparativna HPLC hromatografija Semipreparativno prečišćavanje spojenih frakcija eluiranih sa kolone silikagela, u cilju izolovanja jedinjenja 5-11, vršeno je na Gilson semipreparativnom HPLC hromatografu sa UV detektorom i Omnisphere C18 kolonom. Protok mobiline faze bio je 10 ml/min, zapremina injektovanja 250 µl, a detekciona talasna dužina 225 nm. Frakcije 81-90 u kojima su se nalazila jedinjenja 5 i 7 su spojene, eluent je uparen pod sniženim pritiskom, a dobijeni suvi ostatak rastvoren u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml. Ovako dobijen rastvor je prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu. Komponente su razdvajane izokratskim eluiranjem (73% MeOH : 27% H2O). Prikupljene su frakcije koje sadrže jedinjenje 5, odnosno jedinjenje 7. Nakon uklanjanja rastvarača uparavanjem pod sniženim pritiskom dobijeno je 117,3 mg jedinjenja 5 u obliku igličastih, bezbojnih kristala i 226,6 mg jedinjenja 7 u obliku beličastog praška. U suvom ostatku koji je dobijen spajanjem frakcija 71-78 i uparavanjem eluenta pod sniženim pritiskom, nalazila su se jedinjenja 6 i 8. Ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml, pa potom izokratski eluiran (35% MeCN* : 35% MeOH : 30% H2O) u semipreparativnom HPLC sistemu. Iz odgovarajućih frakcija, nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, dobijeno je 346,6 mg beličastog praška (jedinjenje 6) i 136,1 mg bezbojne tečnosti (jedinjenje 8). Frakcije 99-105 u kojima se nalazilo jedinjenje 9 su spojene i eluent uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml. * MeCN – acetonitril 57 Ovako dobijen rastvor je injektovan na semipreparativnu HPLC kolonu i eluiran izokratski (65% MeOH : 35% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 142,2 mg bezbojnih igličastih kristala (jedinjenje 9). Nakon spajanja frakcija 90-98 u kojima se nalazilo jedinjenje 10 kao glavna komponenta i jedinjenje 11 u nižoj koncentraciji, eluent je uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 50 mg/ml. Ovako pripremljen uzorak dalje je razdvajan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (65% MeOH : 35% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 440,0 mg bezbojne tečnosti koja se lepila po zidovima suda (jedinjenje 10) i 6,7 mg bezbojne tečnosti (jedinjenje 11). 5.3. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. ochridanum 5.3.1. Hromatografija na stubu silikagela Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. ochridanum bio je kompleksnijeg sastava u odnosu na hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. zernyi. U ovom ekstraktu utvrđeno je prisustvo svih komponenata koje su izolovane iz ekstrakta podzemnih organa L. zernyi (jedinjenja 5-10), kao i još nekoliko drugih jedinjenja. U cilju izolovanja onih komponenata koje nisu bile izolovane iz ekstrakta L. zernyi, izvršeno je hromatografsko razdvajanje hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum na stubu silikagela (Kiesselgel Merck Typ 9385, 230 – 400 mesh, 60A), dimenzija 40×4 cm. Hloroformski ekstrakt (2,61 g) je prethodno rastvaran u metanolu u toku 30 min u ultrazvučnom kupatilu i filtriran. Nakon filtriranja, metanol je uparen pod sniženim pritiskom. Dobijeni suvi ostatak (2,22 g) rastvoren je u minimalnoj količini metanola, a zatim adsorbovan na celit (10,8 g). Metanol je uklonjen uparavanjem pod sniženim pritiskom, a suvi ostatak nanet u kolonu silikagela. Kolona je eluirana gradijent sistemom mobilnih faza sa postupnim povećanjem polarnosti: početo je smešom heksan-etilacetat (EtOAc) u odnosu 5:1 (V/V) do čistog EtOAc, uz dalje eluiranje smešom EtOAC-MeOH, u odnosu 1:1 (V/V) do čistog metanola. Brzina eluiranja iznosila je 1 ml/min. Prikupljeno je 135 frakcija, zapremine od po 20 ml. Razdvajanje na koloni praćeno je hromatografijom na tankom sloju silikagela (TLC 60 F254, 5×3 cm, Merck, Nemačka), korišćenjem mobilne faze identičnog sastava onoj 58 kojom je frakcija eluirana sa kolone. Vanilin-sumporna kiselina reagens korišćen je za posthromatografsku derivatizaciju. Jedinjenje 12 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 64-74, mobilnom fazom heksan-EtOAc 5:1 (V/V). Zona koja potiče od jedinjenja 12 se nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom bojila crvenkasto. Jedinjenja 13, 14 i 15 su sa kolone silikagela eluirana smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V) u frakcijama 93-98. Odgovarajuće zone jedinjenja 13, 14 i 15 na TLC hromatogramu su se nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom bojile crvenkasto, smeđecrveno i crveno, redom. Jedinjenje 16 se nalazilo u frakcijama 99-101, prikupljenim eluiranjem kolone silikagela smešom heksan-EtOAc 3:2 (V/V). Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 16 bojila se mrkocrveno nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom. Jedinjenje 17 se nalazilo u frakcijama 48-51, dobijenim eluiranjem kolone silikagela smešom heksan-EtOAc 5:1 (V/V). Na TLC hromatogramu, nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom, zona koja potiče od jedinjenja 17 bojila se mrkocrveno. Jedinjenje 18 je sa kolone silikagela eluirano smešom mobilnih faza heksan- EtOAc 5:1 (V/V), u frakcijama 57-60. Zona na TLC hromatogramu koja potiče od jedinjenja 18, nakon derivatizacije vanilin-sumporna kiselina reagensom bojila se mrkocrveno. 5.3.2. Semipreparativna HPLC hromatografija Semipreparativno prečišćavanje spojenih frakcija eluiranih sa kolone silikagela, u cilju izolovanja jedinjenja 12-18, vršeno je na Gilson semipreparativnom HPLC hromatografu sa UV detektorom i Omnisphere C18 kolonom. Protok mobilne faze bio je 10 ml/min, zapremina injektovanja 100 µl, a detekciona talasna dužina 225 nm. U suvom ostatku koji je dobijen nakon spajanja frakcija 64-74 i uparavanja eluenta pod sniženim pritiskom, nalazilo se jedinjenje 12. Ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 10 mg/ml, a zatim prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (70% MeOH : 30% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 5,1 mg beličaste čvrste supstance (jedinjenje 12). 59 Frakcije 93-98 u kojima su se nalazila jedinjenja 13, 14 i 15 su spojene i eluent uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 20 mg/ml. Ovako dobijen rastvor je injektovan na semipreparativnu HPLC kolonu i eluiran izokratski (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Iz prikupljenih frakcija koje sadrže izolovana jedinjenja, rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Dobijeno je 14,2 mg jedinjenja 13 u obliku finog kristalnog praška, 7,8 mg jedinjenja 14 u obliku beličastog kristalnog praška i 7,6 mg jedinjenja 15 u obliku bezbojne čvrste supstance. U suvom ostatku koji je dobijen nakon spajanja frakcija 99-101 i uparavanja eluenta pod sniženim pritiskom, nalazilo se jedinjenje 16. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 10 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (60% MeOH : 40% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 6,4 mg čvrste bezbojne supstance (jedinjenje 16). Suvi ostatak dobijen nakon spajanja frakcija 48-51 i uparavanja eluenta pod sniženim pritiskom, rastvoren je u metanolu u koncentraciji 10 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (60% MeOH : 40% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom, dobijeno je 8,3 mg bezbojne čvrste supstance (jedinjenje 17). Frakcije 57-60 u kojima se nalazilo jedinjenje 18 su spojene i eluent uparen pod sniženim pritiskom. Suvi ostatak je rastvoren u metanolu u koncentraciji 10 mg/ml i prečišćavan u semipreparativnom HPLC sistemu, uz izokratsko eluiranje (70% MeOH : 30% H2O). Nakon uparavanja rastvarača pod sniženim pritiskom dobijeno je 8,9 mg beličaste praškaste supstance (jedinjenje 18). 60 6. HPLC analiza hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum U metanolu rastvorljivi delovi hloroformskih ekstrakata podzemnih organa (koren i rizom) i herbi svih odabranih vrsta roda Laserpitium, kao i cvasti L. zernyi i ploda L. ochridanum analizirani su tečnom hromatografijom (HPLC) sa DAD detektorom (Waters 2695 Alliance uređaj i 996 Photodiode Array detektor), metodom koja je optimizovana za razdvajanje terpenoida. Uzorci su rastvarani u metanolu, a potom profiltrirani kroz membranski filter (0,45 µm). Brzina protoka mobilne faze bila je 0,7 ml/min; radna temperatura 35 °C, zapremina injektovanja 20 µl, a talasna dužina detekcije 225 nm. Sastav mobilne faze ovog gradijent sistema dat je u Tabeli 11, pri čemu je • eluent A: 0,025% HCOOH u H2O • eluent B: 0,025% HCOOH u smeši MeCN i MeOH 50 : 50 (V/V). Dalje je, u istom sistemu i pod istim eksperimentalnim uslovima, izvršena kvantifikacija prethodno izolovanih i strukturno okarakterisanih komponenata, koristeći izolovana jedinjenja kao eksterne standarde, u opsegu koncentracija 0,06-1,00 mg/ml. Linearnost kalibracionih krivih je potvrđena odgovarajućim faktorima korelacije. Tabela 11. Režim eluiranja (gradijent sistem) optimizovan za razdvajanje terpenoida (daukanskih estara i seskviterpenskih laktona) u metanolu rastvorljivih delova hloroformskih ekstrakata odabranih vrsta roda Laserpitium Vreme (min) Gradijent A (%) Gradijent B (%) 0 35 65 3 35 65 25 15 85 28 0 100 30 0 100 32 35 65 35 35 65 61 7. Određivanje ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi Sadržaj ukupnih polifenola određivan je u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi, koji su dobijeni ekstrakcijom biljnog materijala sakupljenog na planini Jablanica (Makedonija) u julu 2006. god. Spektrofotometrijsko određivanje sadržaja ukupnih polifenola zasniva na reakciji polifenolinih jedinjenja sa Folin-Ciocalteu (FC) reagensom (fosfomolibdovolframova kiselina) u baznoj sredini, pri čemu polifenoli redukuju Wo6+-jon do Wo4+-jona i Mo6+-jon do Mo4+ jona (volfram molibdensko plavo), a sami se oksiduju do o-hinona (Velioglu i sar., 1998; Petrović i sar., 2009). Metanolni ekstrakti cvasti i herbe L. zernyi rastvoreni su u metanolu u koncentraciji 1 mg/ml. Po 100 µl ovako pripremljenih rastvora pomešano je sa 750 µl 10 puta razblaženog komercijalnog FC reagensa i ostavljeno na 22 ºC u toku 5 min. Zatim je dodato 750 µl rastvora Na2CO3 (60 g/l). Posle 90 min merena je apsorbancija rastvora na 725 nm. Rezultati su izraženi kao % galne kiseline, odnosno mg galne kiseline/100 mg suvog ekstrakta. 8. HPLC analiza metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi Metanolni ekstrakti cvasti i herbe L. zernyi prikupljeni na planini Jablanica (Makedonija) analizirani su tečnom hromatografijom sa DAD detektorom. Radni protok mobilne faze na 35 °C bio je 0,7 ml/min, a talasne dužine na kojima su detektovane komponente 250, 320, 330, 350 i 370 nm. Svi ekstrakti su analizirani u sistemu optimizovanom za separaciju polifenola (flavonoida i fenolkarboksilnih kiselina). Sastav mobilnih faza ovog gradijent sistema dat je u Tabeli 12. Eluent A predstavlja 0,033% H3PO4 u H2O, dok je eluent B 10% eluenta A u MeCN. Pri istim eksperimentalnim uslovima izvedena je i kvantitativna analiza koristeći metodu eksternog standarda. Kao eksterni standardi korišćeni su komercijalni standardi jedinjenja identifikovanih u ekstraktima. Opsezi koncentracija eksternih standarda bili su: 0,50-4,00 mg/ml za apigenin; 0,25-2,00 mg/ml za apigenin 7-O-glukozid, luteolin 7-O-glukozid i luteolin, i 1,00-10,00 mg/ml za hlorogensku kiselinu. Linearnost kalibracionih krivih je potvrđena odgovarajućim faktorima korelacije. 62 Tabela 12. Režim eluiranja (gradijent sistem) optimizovan za separaciju polifenola (flavonoida i fenolkarboksilnih kiselina) Vreme (min) Gradijent A (%) Gradijent B (%) 0 90 10 5 75 25 15 75 25 20 70 30 25 50 50 30 30 70 35 90 10 9. Ispitivanje antioksidantne aktivnosti Veliki broj patoloških procesa kao što su kardiovaskularna oboljenja, neurodegenerativni procesi i poremećaji imunskog sistema, kao i sam proces fiziološkog starenja su posledica oksidativne degradacije aminokiselina, razgradnje peptida usled reakcije sa slobodnim radikalima i razgradnje ćelijskih membrana usled peroksidacije lipida. Slobodni radikali su atomi, molekuli ili joni sa nesparenim elektronima koji su izuzetno nestabilni i lako stupaju u reakciju sa biomolekulima. Potiču od tri elementa: kiseonika, azota i sumpora, od kojih nastaju reaktivni kiseonični radikali (eng. Reactive Oxigen Species – ROS), reaktivni azotni radikali (eng. Reactive Nitrogen Species – RNS) i reaktivni sumporni radikali (eng. Reactive Sulfur Species – RSS). Reaktivni kiseonični radikali su najviše proučavani, i tu spadaju superoksidni anjon (O2˙), vodonik-peroksidni radikal (HO2˙), hidroksi radikal (˙OH), azot-monoksid (NO), vodonik-peroksid (H2O2) i dr. Dovođenjem nekih od najučestalijih poremećaja i bolesti u vezu sa oksidativnim stresom, povećano je interesovanje za ispitivanje prirodnih jedinjenja sa antioksidantnim svojstvima. Danas se zna da su mnogi predstavnici iz klase polifenola, kao što su flavonoidi, antocijanidini, katehini, oligomerni proantocijanidini i fenolkarboksilne kiseline nosioci antioksidantnog dejstva, primenjeni u određenim koncentracijama (Carocho i Ferreira, 2013). Za ispitivanje antioksidantne aktivnosti metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi korišćena su tri in vitro testa: • FRAP test, koji se koristi za određivanje ukupne antioksidantne aktivnosti; • DPPH test, kojim se određuje sposobnost neutralizacije DPPH radikala i 63 • 2-dezoksiriboza test, za ispitivanje sposobnosti neutralizacije ˙OH radikala. 9.1. Ispitivanje ukupnog antioksidantnog potencijala – FRAP test FRAP test (eng. Ferric Reducing Antioxidant Power) se koristi za određivanje ukupnog antioksidantnog potencijala, a zasniva se na redukciji Fe3+ - TPTZ kompleksa (Fe3+ -2,4,6-tripiridil-S-triazin) do plavo obojenog Fe2+ oblika, čiji se intenzitet boje meri na 593 nm (Szőllősi i Szőllősi Varga, 2002; Luximon-Ramma i sar., 2002). Postupak Uzeto je 5 µl i 10 µl rastvora ekstrakta cvasti L. zernyi (5 mg/ml) u metanolu, i 10 µl i 20 µl rastvora ekstrakta herbe L. zernyi (5 mg/ml) u metanolu. Svaka od zapremina je dopunjena do 100 µl odgovarajućom količinom metanola, i u tako pripremljene rastvore je dodato po 3 ml FRAP reagensa. Apsorbancija je merena posle 5 min na 593 nm, a kao slepa proba (rastvor za kompenzaciju) korišćen je FRAP reagens. Priprema FRAP reagensa Pomeša se 25 ml acetatnog pufera (300 mM, pH=3,6) sa 2,5 ml rastvora TPTZ (10 mM TPTZ u 40 mmol/l HCl) i 2,5 ml FeCl3 (20 mM u vodi). Rezultati se izražavaju kao µmol Fe2+/mg suvog ekstrakta (FRAP vrednost), a za izračunavanje ovih vrednosti koriste se kalibracione krive konstruisane pomoću rastvora FeSO4 u opsegu koncentracija 100-1000 µmol/l. Aktivnost ekstrakata je upoređivana sa aktivnošću L-askorbinske kiseline. 9.2. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala – DPPH test Princip testa je merenje intenziteta promene boje ljubičastog 2,2-difenil-1- -pikrilhidrazil (DPPH) radikala u reakciji sa „scavenger“-ima slobodnih radikala do žuto obojenog difenilpikrilhidrazina. Ova promena boje predstavlja meru jačine antiradikalske aktivnosi i određuje se spektrofotometrijski, na 517 nm (Slika 11) (Cuendet i sar., 1997). 64 N+ N(C6H5)2 NO2 NO2 O2N (517 nm) antioksidans NO2 O2N NO2 HN N(C6H5)2 Slika 11. Redukcija stabilnog ljubičasto obojenog DPPH radikala u prisustvu antioksidansa, pri čemu nastaje žuto obojeni difenilpikrilhidrazin Postupak Metanolni ekstrakti herbe i cvasti L. zernyi rastvoreni su u metanolu u koncentracijama 5,14 mg/ml i 5,10 mg/ml, redom. Korišćeno je po 2,5 ml ovako pripremljenih rastvora. Svakom od uzoraka dodato je po 1 ml 0,5 mM metanolnog rastvora DPPH. Smeše su potom snažno promućkane i ostavljene 30 min u mraku na sobnoj temperaturi. Apsorbancije su merene na 517 nm, uz metanol kao slepu probu (poredbeni rastvor), a kao kontrola je korišćen 1 ml 0,5 mM metanolnog rastvora DPPH kome je dodato 2,5 ml metanola. Neutralizacija DPPH radikala se izračunava korišćenjem sledeće formule: I(%)=(Ak – Aa)×100/Ak gde je Ak apsorbancija kontrole, a Aa apsorbancija analize. Rezultati se izražavaju kao neutralizacija DPPH radikala (%) i kao SC50 vrednost (µg/ml), odnosno kao koncentracija uzorka koja dovodi do 50% neutralizacije DPPH radikala. 9.3. Ispitivanje sposobnosti neutralizacije ˙OH radikala – 2-Dezoksiriboza test Smatra se da je ovo jedan od najčešće formiranih slobodnih radikala u ljudskom organizmu i nastaje u reakciji: H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + ˙OH 65 2-Dezoksiriboza test se koristi za procenu sposobnosti neutralizacije ˙OH radikala, a princip reakcije je razgradnja 2-dezoksiriboze posredstvom ˙OH radikala, nastalog iz vodonik-peroksida u askorbat/Fe2+ indukovanoj reakciji: Fe3+ - EDTA + askorbat → Fe2+ - EDTA + oksidovani askorbat- Fe2+ - EDTA + H2O2 → Fe3+ + OH- + ˙OH ˙OH radikal se vezuje za 2-dezoksiribozu i dovodi do njene razgradnje. Proizvodi ove reakcije reaguju dalje sa tiobarbiturnom kiselinom gradeći purpurno obojene komplekse sa apsorpcionim maksimumom na 532 nm (Lee i Lim, 2000). Priprema reagensa Reagens se priprema od sledećih sastojaka: fosfatni pufer (pH=7,4, I=0,1) EDTA (0,004 M) FeCl3 (0,004 M) 2-dezoksiriboza (0,05 M) H2O2 (1,5%) L-askorbinska kiselina (0,004 M) trihlorsirćetna kiselina (TCA, 2,8% u vodi) tiobarbiturna kiselina (TBA, 1% u 0,05 M NaOH). Postupak Metanolni ekstrakti L. zernyi su rastvoreni u metanolu u određenim koncentracijama (ekstrakt herbe u koncentraciji 39,11 mg/ml i ekstrakt cvasti u koncentraciji 38,15 mg/ml), i po 20 µl ovako pripremljenih rastvora je korišćeno za pripremu rastvora opadajućih koncentracija koji su dalje korišćeni u testu. Svaka reakciona smeša je sadržavala reagense (u finalnim koncentracijama): FeCl3 (100 µM), EDTA (100 µM), H2O2 (2,2 mM), 2-dezoksiriboza (2,5 µM) i L-askorbinska kiselina (100 µM). Fosfatni pufer (pH = 7,4; I = 0,1), dodat je do konačne zapremine od 4 ml. Mešavine su inkubirane 60 min na 37 °C, zatim je u svaku smešu dodato po 1 ml 1% (m/V) tiobarbiturne kiseline (TBA) u 0,05 M NaOH i po 1 ml 2,8% (m/V) trihlorsirćetne 66 kiseline (TCA), a smeše su potom zagrevane 15 min na 100 °C. Nakon hlađenja na ledu merena je apsorbancija rastvora na 532 nm, u odnosu na odgovarajuću slepu probu (rastvor za kompenzaciju) i kontrolu (Lee i Lim, 2000). Procenat neutralizacije se izračunava prema formuli: I(%) = (Ak ─ Aa)×100/Ak gde je Ak apsorbancija kontrole, a Aa apsorbancija analize. Rezultati se izražavaju kao neutralizacija ˙OH radikala (%) i kao SC50 vrednost (µg/ml), odnosno kao koncentracija uzorka koja dovodi do 50% neutralizacije ˙OH radikala. 10. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti Etarska ulja su kompleksne smeše isparljivih sastojaka, i nastaju procesima sekundarnog metabolizma u biljnim tkivima. Etarska ulja se od davnina koriste zbog svojih baktericidnih, virucidnih, fungicidnih, antiparazitskih i insekticidnih svojstava. Takođe, neka etarska ulja, kao i droge koje ih sadrže (aromatične droge), koriste se kao začini za poboljšanje arome i konzerviranje hrane, ali i za saniranje manjih rana i infekcija. Biološka aktivnost etarskog ulja donekle je određena prisutnim glavnim komponentama, ali sinergistički efekat pojedinih komponenti koje su prisutne u manjim koncentracijama nije zanemariv (Bakkali i sar., 2008; Ulrich-Merzenich i sar., 2010). Antimikrobno dejstvo etarskih ulja potvrđeno je in vitro na velikom broj patogenih Gram(+) i Gram(–) bakterija, virusima i gljivama, uključujući i kvasce. Ispitivanja su pokazala da su mikroorganizmi koji se brzo dele osetljiviji na dejstvo etarskih ulja, a generalno jači antimikrobni efekat pokazuju etarska ulja sa većim sadržajem fenola, aldehida i alkohola (Bakkali i sar., 2008). Za utvrđivanje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja izolovanih iz odabranih vrsta roda Laserpitium, kao i metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi korišćeni su in vitro testovi: agar difuzioni (Acar i Goldstein, 1996) i bujon mikrodilucioni (Candan i sar., 2003). Standardni sojevi mikroorganizama U eksperimentalnom radu korišćeni su standardni mikroorganizmi iz kolekcija: • ATCC (American Type of Culture Collection) • NCIMB (National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen). 67 Svi standardni sojevi su nabavljeni iz Instituta za imunologiju i virusologiju Torlak u Beogradu. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti etarskih ulja sprovedeno je na sedam standardnih sojeva bakterija. Gram(+) bakterije: • Staphylococcus aureus ATCC 25923 • Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 • Micrococcus luteus ATCC 9341 • Enterococcus faecalis ATCC 29212. Gram(–) bakterije: • Escherichia coli ATCC 25922 • Klebsiella pneumoniae NCIMB 9111 • Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Ispitivanje je, takođe, sprovedeno na dva standardna soja kandide: • Candida albicans ATCC 10259 • Candida albicans ATCC 24433. Antibakterijska aktivnost metanolnih ekstrakata ispitivana je na osam sojeva bakterija: sedam navedenih i Gram(+) soju Bacillus subtilis ATCC 6633. Antifungalna aktivnost takođe je ispitivana na dva navedena soja kandide. Kultivacija mikroorganizama Sve bakterije korišćene u eksperimentima prvo su presejane u 10 ml hranljive Müller-Hinton bujon podloge i dalje inkubirane na 37 ºC. Posle 24 h bakterije su presejane na 10 ml sveže tečne podloge, pa inkubirane 18 h. Dobijena kultura mikroorganizama presejana je na agar. Identičan postupak korišćen je pri kultivaciji sojeva C. albicans, ali je u tom slučaju korišćen Sabouraud bujon. Standardni antibiotici Standardne antibiogram tablete proizvedene su u Institutu za imunologiju i virusologiju Torlak iz Beograda. Korišćeni su sledeći antibiotici: • ampicilin (10 µg/disk) 68 • amikacin (30 µg/disk) • nistatin (100 IJ/disk). 10.1. Bujon mikrodilucioni test Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) etarskih ulja i metanolnih ekstrakata određena je primenom bujon mikrodilucionog testa (Candan i sar., 2003) u mikrotitracionim pločama sa ravnim dnom i 96 mesta. Korišćene su osamnaestočasovne kulture navedenih bakterijskih sojeva (gustine 5×105 bakterija/ml) u Müller-Hinton bujonu (za ispitivane bakterijske sojeve) i Sabouraud bujonu (za dva soja kandide) sa dodatkom Tween 80 (finalna koncentracija 0,5% V/V). Za ispitivanje su korišćeni rastvori etarskih ulja u dimetilsulfoksidu (DMSO) i rastvori ekstrakata u MeOH. Etarska ulja ispitivana su u pogledu antimikrobnog dejstva u pet koncentracija u rasponu od 2,0-146,0 µg/ml, a metanolni ekstrakti herbe, odnosno cvasti vrste L. zernyi u pet koncentracija u rasponu od 31,3-500,0 µg/ml. Pozitivnu kontrolu su predstavljale bakterije inkubirane sa odgovarajućom količinom DMSO, odnosno MeOH. Ploče su inkubirane u termostatu u aerobnoj atmosferi na 37 ºC u toku 24 h za bakterije, odnosno na 30 °C u toku 48 h za dva soja kandide. Nakon toga je semikvantitativno očitavan porast broja mikroorganizama na osnovu zamućenja tečne podloge i formiranja taloga na dnu bazenčića. 10.2. Agar difuzioni test Agar difuzioni test (Acar i Goldstein, 1996) kojim je takođe ispitivana antimikrobna aktivnost etraskih ulja cvasti i herbe L. zernyi, izveden je na Müller- Hinton agaru debljine 4 mm (za bakterijske sojeve) i Sabouraud agaru (za kandidu). Navedene podloge zasejane su inokulumom gustine 106 bakterija, odnosno gljiva/ml, u cilju postizanja semikonfluentnog rasta. Etarska ulja su nanošena na diskove, a kao standardi, odnosno kontrola osetljivosti mikroorganizama korišćeni su diskovi ampicilina (10 µg/disk), amikacina (30 µg/disk), kao i nistatina (100 IJ/disk) za dva soja kandide. 69 Na zasejane podloge naneti su diskovi sa uzorcima etarskog ulja, a ispitivanja za svaki uzorak su rađena u triplikatu. Inkubacija je vršena u aerobnim uslovima 18 h na 37 ºC za bakterije, odnosno 48 h na 26 ºC za dva soja kandide, a potom su mereni dijametri zona inhibicije u mm. 11. Ispitivanje citotoksične aktivnosti Ćelijske linije U testovima ispitivanja citotoksične aktivnosti korišćene su dve ćelijske linije humanog adenokarcinoma dojke, invazivni (MCF 7/6) i neinvazivni tip (MCF 7/AZ). Ćelijske linije je obezbedila Labolatorija za eksperimentalna istraživanja karcinoma, Univerzitetske Bolnice u Gentu, Belgija (eng. Experimental Cancer Research, Ghent University Hospital, Belgija). Ćelije su kultivisane u medijumu dobijenom mešanjem jednakih zapremina Dulbecco modifikovanog Eagle medijuma i Ham F12 medijuma (DMEM/F12, Invitrogen, Merelbeke, Belgija) sa L-glutaminom u koji je dodato 10% fetalnog goveđeg seruma, FBS (Greiner Bio-One, Wemmel, Belgija), 50 IU/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina (Invitrogen, Merelbeke, Belgija). Ćelijske kulture su čuvane na 37 °C u atmosferi sa 5% CO2 i vlažnošću vazduha 95%. Subkonfluentne ćelije (ćelijske kulture koje prekrivaju 80% dna bočice za kultivaciju) tretirane su rastvorom koji je sadržao 1% tripsina i 0,02% EDTA. Nakon ove operacije, ćelije su se odvajale od zidova bočice za kultivaciju, i bilo ih je moguće dalje podeliti, prebrojati i prebaciti u mikrotitracione ploče sa 96 bazena ravnog dna. Ćelije su deljene najviše 10 puta, nakon čega su za testove korišćene nove ćelijske kulture. 11.1. MTT test MTT test je in vitro, spektrofotometrijski test koji je korišćen za ispitivanje citotoksične aktivnosti hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbi sve tri odabrane vrste roda Laserpitium, kao i svih izolovanih jedinjenja, osim latifolona. MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliumbromid) je žuta, hidrosolubilna so. U metabolički aktivnim ćelijama ona se konvertuje u liposolubilni, plavoljubičasti formazan, reduktivnim otvaranjem tetrazolijum prstena (Slika 12). Redukcija MTT reagensa, koja se uočava kao promena boje, proporcionalna je broju živih, metabolički aktivnih ćelija u toku eksponencijalne faze rasta ćelija u kulturi (Mosmann, 1983). 70 Ranije je smatrano da se redukcija MTT reagensa dešava u mitohondrijama, ali je kasnije pokazano da se ova redukcija najvećim delom dešava van mitohondrija, preko NAD(P)H – zavisnih oksidoreduktaza (Berridge i Tan, 1993). Na taj način se u MTT testu, merenjem intenziteta boje pomoću ELISA čitača (ELISA plate reader), određuje broj metabolički aktivnih, živih ćelija, tj. test se koristi za procenu ćelijske vijabilnosti. Slika 12. Redukcija MTT do tamnoljubičastog formazana (Kim i sar., 2009) Postupak Nakon enzimskog razdvajanja i brojanja ćelija, one su zasejavane (5 × 103 ćelija po bazenu) u providne mikrotitracione ploče sa 96 bazena ravnog dna (Nunc A/S, Roskilde, Danska). Korišćen je MTT reagens (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgija). Kao referentna supstanca korišćen je vinblastin-sulfat (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgija). Nakon zasejavanja, sledila je inkubacija ćelija u medijumu (48 h), a zatim su ekstrakt/izolovano jedinjenje/vinblastin-sulfat dodavani u određenoj koncentraciji, pa su mikrotitracione ploče pod istim uslovima inkubirane dodatnih 48 h. Nakon isteka ovog vremena, medijum je uklonjen pomoću vakuma i 100 µl rastvora MTT boje (koncentracije 5 mg/ml u PBS-u) dodato je u svaki bazen. Mikrotitracione ploče su dalje inkubirane narednih 2 h. Nakon tog vremena, zaostali medijum je uklonjen, a kristali formazana su rastvarani u 100 µl DMSO. Apsorbancije rastvora su očitavane na ELISA čitaču na talasnim dužinama 570 i 560 nm. Smatra se da je apsorbancija u direktnoj korelaciji sa brojem živih, metabolički aktivnih ćelija. Koncentracije izolata/supstanci koje su izazvale smanjenje broja ćelija za 50% (IC50) u poređenju sa negativnim kontrolama (grupe koje su inkubirane u čistom medijumu, predstavljaju 100% ćelijskog rasta u datim eksperimentalnim uslovima), određivane su iz krivih rasta ćelijskih linija. 71 11.2. SRB test Za procenu citotoksične aktivnosti hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbi sve tri odabrane vrste roda Laserpitium, kao i svih izolovanih jedinjenja, osim latifolona, korišćen je sulforhodamin B (SRB) test, još jedan in vitro spektrofotometrijski test, koji su Skehan i saradnici razvili 1990. god. SRB test je brz i osetljiv test koji se koristi za određivanje ćelijskog proteinskog sadržaja. SRB reagens hemijski predstavlja ružičastu aminoksantonsku boju (Slika 13), koja se u blago kiseloj sredini vezuje za rezidue aminokiselina, i na taj način predstavlja reagens koji je “osetljivo merilo“ proteinskog sadržaja u ćelijama. Proteinski sadržaj je u korelaciji sa brojem ćelija, i na taj način se dobija informacija o broju živih ćelija, bez obzira na njihovu metaboličku aktivnost (Skehan et al., 1990). Slika 13. Sulforhodamin B reagens Postupak SRB so, glacijalna sirćetna kiselina, trihlorsirćetna kiselina i trizma baza kupljeni su od Sigma-Aldrich (Bornem, Belgija). Kao referentna supstanca korišćen je vinblastin-sulfat (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgija). Nakon enzimskog razdvajanja i brojanja ćelija, one su zasejavane (5 × 103 ćelija po bazenu) u providne mikrotitracione ploče sa 96 bazena ravnog dna (Nunc A/S, Roskilde, Danska). Sledila je inkubacija ćelija u medijumu (48 h), pa su zatim dodati ekstrakt/izolovano jedinjenje/vinblastin- sulfat u određenoj koncentraciji i mikrotitracione ploče su pod istim uslovima inkubirane dodatnih 48 h na 37 °C. Nakon isteka ovog vremena, medijum je uklonjen pomoću vakuuma i dodato je 50 µl 50% rastvora trihlorsirćetne kiseline, radi selektivnog fiksiranja ćelijskih proteina i mikrotitracone ploče su ostavljene tokom 1 h u 72 frižideru. Nakon toga, ploče su isprane pet puta pomoću destilovane vode, da bi se uklonili nefiksirani proteini i ostatak trihlorsirćetne kiseline. Ploče su zatim sušene u sušnici, a potom je u svaki bazen mikrotitracione ploče dodato 200 µl 0,4% rastvora SRB boje u 1% sirćetnoj kiselini i ploče su ostavljene na tamnom mestu u toku sledećih 30 min. Nakon uklanjanja viška SRB boje (ploče se ispiraju uzastopno četiri puta sa po 200 µl glacijalne sirćetne kiseline), ploče su osušene i u svaki bazen je dodato po 200 µl 10 mM rastvora trizma baze. Apsorbancija je merena na ELISA čitaču na talasnim dužinama 570 i 650 nm. Izmerena apsorbancija je u direktnoj korelaciji sa sadržajem proteina u ćelijama. Koncentracije ekstrakata/izolovanih jedinjenja/vinblastin-sulfata koje su izazvale smanjenje broja ćelija za 50% (IC50) u poređenju sa negativnim kontrolama (grupe koje su primale čist medijum, predstavljaju 100% ćelijskog rasta u datim eksperimantalnim uslovima), određivane su iz krivih rasta ćelijskih linija. Statistička analiza Statistički značajne razlike ispoljene citotoksične aktivnosti testiranih ekstrakata/izolovanih jedinjenja/vinblastin-sulfata i odgovarajućih negativnih kontrola (ćelije koje su inkubirane u odgovarajućim zapreminama čistog medijuma), računate su uz pomoć nelinearne regresione analize (ANOVA) uz Bonferonijevu korekciju za višestruka poređenja (SPSS 15.0). Statistički značajna razlika u inhibiciji određivana je u poređenju sa kontrolnim grupama za nivoe značajnosti * p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001. Korelacija između broja ćelija i izmerene apsorbancije procenjivana je iz odgovarajućih krivih ćelijskog rasta, uz korišćenje softvera za numeričku nelinearnu analizu (Wolfram Matematica 7.0). 12. Ispitivanje antinociceptivne i antiedematozne aktivnosti Antinociceptivna aktivnost Bol se definiše kao neprijatan osećaj i emocionalno iskustvo izazvano stvarnim ili potencijalnim oštećenjem tkiva (Međunarodno udruženje za proučavanje bola). Ukoliko je visokog intenziteta i/ili dugotrajan (hroničan), bol značajno narušava kvalitet života i radnu sposobnost pacijenta. 73 Prema mehanizmu nastanka bol možemo klasifikovati kao nociceptivni (može biti somatski ili visceralni) i neuropatski bol, dok po dužini trajanja, bol može biti akutni i hronični. Razumevanje neuralnih mehanizama bolne senzacije veoma je važno za terapiju bola, jer se potencijalni analgetici i biraju tako da deluju na ključne događaje u nastanku osećaja bola. Nociceptivni bol je posledica aktivnosti nervnog sistema kojom se mozak upozorava da na organizam deluje bolni stimulus (noksa). Nokse mogu biti mehaničke, toplotne ili hemijske. Sa aspekta lečenja bola najvažnije su hemijske nokse, koje se oslobađaju iz ishemičnog ili povređenog tkiva u toku zapaljenja, i to su bradikinin, serotonin, histamin, mlečna kiselina i drugi medijatori. Oni prouzrokuju stvaranje nervnih impulsa u nociceptorima - ogoljenim nervnim završecima primarnih senzornih neurona. Stvoreni nervni impulsi prenose se duž aksona ovih neurona do zadnjih rogova kičmene moždine, gde informaciju, posredstvom neurotransmitera prenose sekundarnim neuronima bolnog puta. Ovi neuroni ushodno sprovode bolne impulse do tercijarnih senzornih neurona smeštenih u talamusu, posredstvom kojih informacija stiže u somatosenzorni korteks (kada bol možemo lokalizovati i opisati) i limbički sistem (kada nastaje emocionalno doživljavanje bola) (Tomić i Stepanović-Petrović, 2011). Pored sistema za transmisiju bola, u nervnom sistemu funkcioniše i sistem za modulaciju bola. Modulacija bola je neuralna aktivnost koja kontroliše prenos bolnih impulsa na svim nivoima nociceptivnog puta. Na nivou primarnih neurona bolnog puta modulatorno deluju prostaglandini. Oni snižavaju prag za generisanje impulsa u nociceptorima i tako ih čine pojačano osetljivim za dejstvo različitih stimulusa, odnosno dovode do njihove senzitizacije. O značaju ovog procesa govori i činjenica da najčešće korišćeni analgetici – nesteroidni antiinflamatorni lekovi smanjuju stvaranje prostaglandina, a samim tim i senzitizaciju nociceptora u inflamiranom tkivu. Drugo važno mesto za modulaciju bola su zadnji rogovi kičmene moždine, gde se susreću pronociceptivni uticaji sa periferije (koji ushodnim putevima nose informaciju o bolu prema CNS-u) i antinociceptivni uticaji iz viših nervnih centara (koji iz CNS-a nishodnim putevima suprimiraju bol). Postoji nekoliko teorija o prenošenju bolne senzacije kroz kičmenu moždinu, kao što je teorija kapije ili „gate theory“ koju su postavili Melzack i Wall. Oni su pretpostavili da se transmisija bolnih impulsa modulira 74 mehanizmom „nociceptivne kapije“ u substantia gelatinosa. Da li će informacija o bolu „proći“ kroz zadnje rogove kičmene moždine i stići u mozak ili ne (tj. da li će „nociceptivna kapija“ biti otvorena ili zatvorena), zavisi od toga koja komponenta preovladava. Nishodni inhibitorni putevi polaze iz CNS-a i koče transmisiju bola u zadnjim rogovima kičmene moždine. Iz njihovih završetaka oslobađaju se endogeni opioidi (enkefalini i endorfini), serotonin i noradrenalin (Sweetman, 2007; Tomić i Stepanović-Petrović, 2011). Poznavanje kompleksnih mehanizama u nastanku i transmisiji bola je od velikog značaja, a jedan od osnovnih koraka u istraživanju novog antinociceptivnog agensa je pogodan test na životinjskom modelu. U testovima se koriste različiti tipovi nociceptivnih stimulusa (električni, termički, mehanički ili hemijski), uz napomenu da nijedna vrsta nociceptivnog stimulusa nije idealna, iako neki autori smatraju da je hemijska nocicepcija najpribližnija stvarnom stanju kod akutnog bola. Reakcije životinja koje se prate u modelima bola su gotovo uvek motorne reakcije – od spinalnih refleksa do kompleksnih bihejvioralnih manifestacija (Le Bars et al., 2001). Za ispitivanje antinociceptivnog dejstva etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum korišćen je model inflamatorne hiperalgezije u pacova. Inflamatorni bol (inflamatorna hiperalgezija) je bol koji se javlja u stanjima u kojima se razvija inflamatorni proces, i smatra se da su prostaglandini najznačajniji medijatori u ovoj vrsti bola. Neki od najefikasnijih analgetika su upravo inhibitori sinteze prostaglandina. Bolna preosetljivost zadnje desne šape pacova izaziva se intraplantarnom injekcijom pro-inflamatorne supstance, a meri se modifikovanim testom pritiska na zadnje šape pacova („paw pressure“ test) pomoću posebnog aparata (Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten, Nemačka). Supstance sposobne da redukuju bolnu preosetljivost izazvanu inflamacijom, u poređenju sa kontrolnom grupom, poseduju antinociceptivnu aktivnost u modelu inflamatornog bola (Tomić i sar., 2004; Randall i Selitto 1957; Morris, 2003). Antiedematozna aktivnost Za ispitivanje antiedematozne aktivnosti korišćen je model inflamacije proinflamatornom supstancom, karageninom, u pacova. Pri izazivanju inflamacije 75 zadnje desne šape pacova intraplantarnom injekcijom karagenina, gotovo istovremeno se javljaju ključni znaci inflamacije – edem, hiperalgezija i eritrem. Znaci inflamacije se javljaju pod dejstvom proinflamatornih supstanci – bradikinina, histamina, tahikinina, komplementa i reaktivnih kiseoničnih i azotnih radikala. Inflamatorni odgovor se najčešće kvantifikuje uvećanjem (edemom) tretirane šape, koje dostiže maksimum oko 5 h nakon injekcije karagenina, a koji se može modulirati inhibitorima specifičnih molekula unutar inflamatorne kaskade. Model inflamacije izazvane karageninom je dobro proučen i visoko reproducibilan, pa ima važnu ulogu u proučavanju antiinflamatorne aktivnosti i razvoju novih lekova (Morris, 2003). Model inflamacije izazvane proinflamatornom supstancom, karageninom, u pacova korišćen je za ispitivanje antiedematozne aktivnosti etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum i metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi korišćen je. Inflamacija zadnje desne šape pacova izazivana je intraplantarnom (i.pl.) injekcijom karagenina, a nastali edem meren je pletizmometrom (Ugo Basile, Italija). Supstance sposobne da redukuju edem izazvan karageninom, u poređenju sa kontrolnim vrednostima, poseduju antiedematoznu aktivnost (Helyes i sar., 2004). Eksperimentalne životinje U eksperimentima su korišćeni albino pacovi muškog pola “Wistar“ soja, mase od 180 do 220 g. Životinje su čuvane u vivarijumu na temparaturi 20-25 °C i relativnoj vlažnosti vazduha 60%, u toku tri dana radi aklimatizacije na uslove identične eksperimentalnim. U toku boravka smeštani su u kaveze od pleksiglasa (42,5 cm × 27 cm × 19 cm), sa žičanom rešetkom postavljenom odozgo. Kao podloga u kavezima korišćena je sterilisana strugotina od drveta. U jednom kavezu je smeštano po 6-8 pacova. Voda i hrana (specijalni briketi za hranjenje životinja, Vetzavod, Subotica), bile su im dostupne u toku čitavog dana (24 h), osim u toku trajanja eksperimenta. Životinje su čuvane u uslovima sa prirodnom ciklusom dan/noći (12/12 h svetlost–mrak režim), a svetla su paljena u 6:00 h. Eksperimenti su izvođeni u isto vreme, između 8:00 i 16:00 h, da bi se izbegla cirkardijalna varijabilnost u bihevioralnim testovima. Za svaku vrstu eksperimenta postojala je test grupa koja je dobijala biljni izolat (etarsko ulje ili ekstrakt), grupa koja je dobijala standardni lek (ibuprofen ili indometacin) i grupa koja je u istoj zapremini dobijala vehikulum za rastvaranje ili 76 suspendovanje ispitivanih supstanci. Sve tri grupe su bile podvrgnute identičnom eksperimentalnom protokolu. Svaka životinja korišćena je u eksperimentu samo jednom. Nakon završenog eksperimenta, životinje su žrtvovane etrom. Životinje su kupljene od Farme Vojnomedicinske akademije u Beogradu, Srbija. Tokom rukovanja eksperimentalnim životinjama i izvođenja eksperimenata primenjivani su etički Pravilnik o čuvanju i korišćenju labolatorijskih životinja (eng. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) koji je izdao Američki Nacionalni Institut zdravlja (eng. US National Institutes of Health, NIH publication no. 85 –23, revised 1996) i takođe bili odobreni od strane Etičkog komiteta Univerziteta u Beogradu - Farmaceutskog fakulteta. Način primene testiranih etarskih ulja/ekstrakata Ibuprofen (Aliapharm, GmbH, Nemačka) i indometacin (Belupo, Koprivnica, Hrvatska), kao referentni lekovi, odnosno etarska ulja/ekstrakti, suspendovani su u vehikulumu, koji je predstavljao 0,5% rastvor natrijum-karboksimetilceluloze, NaCMC (PP1000 Lucel®, „Milan Blagojević“, Lučani, Srbija) u destilovanoj vodi, i sonifikovani 15 min u ultrazvučnom kupatilu, radi ravnomerne distribucije. Lekovi, odnosno etarska ulja/ekstrakti, aplikovani su gladnim pacovima oralnom sondom (p.o.) u zapremini od 2 ml/kg. Karagenin (Sigma-Aldrich Chemie, Nemačka) je suspendovan u fiziološkom rastvoru 24 h pre eksperimenta, u koncentraciji od 1%, i injektovan i.pl. u zadnju desnu šapu svih eksperimentalnih životinja, u zapremini 0,1 ml/šapi, koristeći špric od 1 ml i iglu (0,45 × 12 mm). Eksperimentalni protokol Test grupama “Wistar“ pacova muškog pola, etarska ulja ili metanolni ekstrakti aplikovani su per os (p.o.) u tri doze (25, 50 i 100 mg/kg). Jedan sat kasnije, rastvorom karagenina (1%) koji je aplikovan intraplantarno (i.pl.) u zadnju desnu šapu izazvana je inflamacija. U skladu sa istim eksperimentalnim protokolom, dve grupe pacova su dobile indometacin (8 mg/kg; p.o.), odnosno ibuprofen (100 mg/kg; p.o.) kao standardne lekove. Kao što je već pomenuto, za svaki eksperiment je korišćena i grupa koja je u istoj zapremini dobijala vehikulum za rastvaranje ili suspendovanje ispitivanih supstanci, koja je smatrana kontrolom (Slika 14). 77 Slika 14. Eksperimentalni protokol ispitivanja antiedematozne i antinociceptivne aktivnosti etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum i ispitivanja antiedematozne aktivnosti metanolnih ekstrakata herbe i cvasti L. zernyi u modelu karageninom izazvane inflamacije u pacova 78 12.1. Ispitivanje antinociceptivne aktivnosti Akutna inflamacija je izazivana intraplantarnom (i.pl.) injekcijom karagenina u zadnju desnu šapu pacova, što je prouzrokovalo nociceptivnu (bolnu) preosetljivost i razvoj edema (Morris, 2003). Bolna preosetljivost je merena modifikovanim „paw- pressure“ testom (Randall i Selitto, 1957; Tomić i sar. 2004). Korišćen je aparat za merenje sile pritiska (izražene u gramima) aplikovanih na zadnje šape pacova u cilju određivanja razlike u pritisku desne i leve šape (šape pod inflamacijom i neinflamirane). Pacov se postavlja tako da se zadnjim šapama osloni na dve platforme, koje su preko transdjusera povezane sa kućištem aparata. Blagim pokretom pacov se gura na dole vodeći računa da se pritisci rasporede ravnomerno na obe šape, sve dok se ne dostigne najveća vrednost sile (“trigger level“) od 100 g na jednoj od šapa. U tom trenutku se čuje zvučni signal, merenje se prekida i vrednosti sile pritiska (sa tačnošću 0,1 g) aplikovanih na desnu i levu šapu se očitavaju na kontrolnoj ploči. Ova vrednost „okidača“, odnosno najveće sile izabrana je tako da odražava blag nociceptivni stimulus koji je potreban da bi se detektovala nociceptivna hiperosetljivost (hiperalgezija). Kako je desna šapa inflamirana i bolna, pacov se više oslanja na levu (zdravu) šapu, „štedeći“ šapu koja je pod inflamacijom. To rezultuje smanjenjem sile pritiska primenjene na inflamiranu šapu. Razlika između sila pritiska (df) koje su primenjene na zdravu i inflamiranu šapu, smatrane su merom bolne preosetljivosti (hiperalgezije) izazvane inflamacijom, i određivane su nakon svakog merenja koristeći sledeću jednačinu (Tomić i sar., 2004): df = sila (g) primenjena na neinflamiranu šapu – sila (g) primenjena na inflamiranu šapu. Merenja su ponavljana četiri puta, u svim vremenskim intervalima (tačkama merenja) i srednja vrednost df za svaku eksperimentalnu životinju ponaosob korišćena je za dalje proračune. Za svaku dozu etarskog ulja/ibuprofena ili kontrole formirana je grupa od 6-8 pacova. Vrednost df pre tretmana je određivana pre aplikacije karagenina ili karagenina i etarskog ulja/ibuprofena. Vrednosti df posle aplikacije karagenina i etarskih ulja/ibuprofena su merene 120, 150, 180, 210, 240, 300 i 360 min posle primene etarskih ulja/ibuprofena (Slika 14). 79 Agensi koji izazivaju smanjenje razlike u pritiscima šapa (df) imaju antinociceptivno dejstvo. U cilju izražavanja vrednosti smanjenja df koja se javlja nakon primene antinociceptivnog agensa u test (karagenin + etarsko ulje/ibuprofen tretiranim) grupama životinja u odnosu na df vrednosti kontrolnih grupa kojima je aplikovan samo karagenin, procenat antinociceptivne aktivnosti (%AA) je računat prema sledećoj formuli (Tomić i sar., 2004): %AA = [(srednja vrednost df kontrolne grupe – izmerena vrednost df pojedinačne životinje) / (srednja vrednost df kontrolne grupe)] × 100. Ako je df vrednost test grupe bila veća u odnosu na df vrednost kontrolne grupe, znači da u toj grupi nema antinociceptivnog dejstva i beleži se vrednost od 0%AA. 12.2. Ispitivanje antiedematozne aktivnosti Antiedematozna aktivnost je određivana merenjem edema šape pacova pomoću pletizmometra. Pletizmometar se sastoji od dva vertikalna Perspex cilindra koji su međusobno povezani i napunjeni rastvorom elektrolita. U veći cilindar se uranja šapa pacova, a u drugom se nalazi čitač. Kada se šapa pacova potopi do tibio-tarzalnog zgloba (Bianchi i sar., 1995), nivoi tečnosti se promene u oba cilindra i čitač detektuje zapreminu istisnute tečnosti koja odgovara zapremini šape. Zapremina šape (u mililitrima) se prikazuje na digitalnom displeju. Bazalna zapremina šape je očitana opisanim postupkom, pre primene karagenina ili karagenina+etarskih ulja/ekstrakata/indometacina. Zapremina šape merena je 120, 150, 180, 210, 240, 300 i 360 min posle primene etarskog ulja/ekstrakta/indometacina (Slika 14). Posle merenja zapremine šape u svakoj vremenskoj tački navedenih vremenskih intervala, razlika u zapremini (dv) između tretirane (inflamirane) i bazalne zapremine šape računata je prema izrazu: dv = zapremina inflamirane šape (ml) – bazalna zapremina šape (ml). Merenja su ponovljena dva puta u svakoj vremenskoj tački navedenih intervala i srednja vrednost dv je korišćena za svaku eksperimentalnu životinju za dalja preračunavanja. 80 Agensi koji su smanjivali vrednost dv su smatrani agensima sa antiedematoznom aktivnošću. U cilju izražavanja smanjenja vrednosti dv koju je izazvala primena antiedematoznih agenasa u test (karagenin + etarsko ulje/ekstrakt/indometacin tretiranim) grupama u odnosu na vrednost dv kontrolnih (karageninom tretiranih) grupa, procenat antiedematozne aktivnosti (%AE) je računat prema sledećem izrazu (Stepanović-Petrović i sar., 2012): %AE = [(srednja vrednost dv kontrolne grupe – srednja vrednost dv test grupe)/ (srednja vrednost dv kontrolne grupe)] × 100. Ako je srednja vrednost dv test grupe bila viša od srednje vrednosti dv kontrolne grupe, znači da u toj grupi nema antiedematozne aktivnosti test supstance i dodeljivana joj je vrednost od 0%AE Izražavanje i statistička obrada rezultata ispitivanja antinociceptivne i antiedematozne aktivnosti Vrednost ED50 (doza koja ispoljava 50%AA, odnosno 50%AE) sa 95%-nim intervalima poverenja je računata pomoću odgovarajući logaritamskih krivih odnosa doza i efekata (Tallarida i Murray, 1986). Pri merenju sile pritiska šapa i razlike u zapreminama, eksperimentator nije znao kojoj grupi eksperimentalne zivotinje pripadaju. Vrednosti %AA i %AE su računate nakon svakog merenja df, odnosno dv vrednosti, da bi se odredio maksimalan efekat primenjenog agensa. Pri statističkoj obradi rezultata korišćeni su jednosmerna ANOVA i Tukey HSD test. Podaci su statistički obrađivani i prikazivani uz pomoć kompjuterskih programa SPSS for Windows i Microsoft Excel. 81 REZULTATI I DISKUSIJA 82 HEMIJSKA ANALIZA 1. Etarska ulja Vrste roda Laserpitium su aromatične biljke, koje sintetišu etarsko ulje u endogeno lokalizovanim sekretornim strukturama. Etarska ulja odabranih vrsta ovog roda izolovana su destilacijom vodenom parom u aparaturi po Clevenger-u, postupkom koji propisuje Evropska farmakopeja 6 (Ph. Eur. 6). Osušen biljni materijal usitnjen je do stepena grubog praška neposredno pre izolovanja etarskog ulja. Sadržaj etarskog ulja u biljnim organima/delovima L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum, kao i lokaliteti i vreme sakupljanja biljnog materijala dati su u Tabeli 13. Tabela 13. Sadržaj etarskog ulja u ispitivanim vrstama roda Laserpitium Biljna vrsta Biljni organ/ deo biljke Lokalitet i vreme sakupljanja Sadržaj etarskog ulja (% m/m) L. latifolium rizom i koren Gučevo, oktobar 2008. god. 0,63 L. latifolium plod Gučevo, oktobar 2008. god. 2,67 L. zernyi rizom i koren Ošljak, jul 2008. god. 1,74 L. zernyi herba Jablanica, jul 2006. god. 0,14 L. zernyi cvast Jablanica, jul 2006. god. 0,22 L. ochridanum rizom i koren Galičica, avgust 2008. god. 1,21 L. ochridanum herba Galičica, avgust 2008.god. 0,33 L. ochridanum plod Galičica, avgust 2008. god. 7,55 1.1. Etarska ulja podzemnih organa i ploda L. latifolium Etarska ulja izolovana iz podzemnih organa i ploda L. latifolium su lako pokretljive, bezbojne tečnosti, specifičnog mirisa koji podseća na koren peršuna. Etarsko ulje podzemnih organa L. latifolium nije do sada hemijski analizirano. GC-FID i GC-MS analizom ovog etarskog ulja utvrđeno je prisustvo trideset devet komponenata, koje čine 83,9% ulja. Monoterpenska frakcija je dominantna (69,5%), dok su seskviterpenska jedinjenja prisutna u manjem procentu (14,4%). Najzastupljenija komponenta ispitivanog etarskog ulja je monoterpen α-pinen (44,4%), a po količini 83 slede β-felandren (11,8%) i 14-hidroksi-α-murolen (6,9%). Sva ostala jedinjenja su prisutna u količini manjoj od 3,5% ili u tragovima (Tabela 14). U etarskom ulju ploda L. latifolium identifikovano je dvadeset sedam komponenata, koje predstavljaju 99,0% ukupnog sadržaja ulja, od čega monoterpenski ugljovodonici čine čak 96,1%. Najzastupljenije komponente su α-pinen (44,0%), sabinen (26,8%) i β-pinen (13,9%), a po količini sledi limonen (5,2%). Seskviterpenski ugljovodonici čine svega 1,6% ukupnog sadržaja (Tabela 14). Tabela 14. Sastav etarskih ulja podzemnih organa i plodova L. latifolium Jedinjenje KI Lita KI Expb Etarsko ulje podzemnih organac Etarsko ulje plodac Triciklen 927 925 tr trd α-Pinen 939 937 44,4 44,0 Kamfen 954 953 3,1 1,8 Sabinen 975 971 1,4 26,8 β-Pinen 979 978 3,3 13,9 Mircen 991 989 3,4 2,2 n-Oktanal 999 997 - 0,7 α-Felandren 1003 1001 0,6 0,2 α-Terpinen 1017 1015 tr tr p-Cimen 1025 1022 1,0 0,3 Limonen 1029 1027 - 5,2 β-Felandren 1030 1028 11,8 1,0 (E)-β-Ocimen 1050 1049 tr - γ-Terpinen 1060 1058 0,5 0,7 n-Oktanol 1068 1066 - 0,6 Terpinolen 1089 1085 tr tr 6-Kamfenon 1097 1095 tr - 1,3,8-p-Mentatrien 1110 1108 tr - α-Kamfolenal 1126 1124 tr tr 1,5,8-p-Mentatrien - 1142 tr - Pinokarvon 1165 1164 - tr Kripton 1186 - tr - Mirtenol 1196 1193 tr - Mirtenal 1196 1194 tr - n-Dekanal 1202 1199 - tr Verbenon 1205 1202 tr - 84 Bornilacetat 1289 1285 - tr Mirtenilacetat 1327 1325 tr - α-Terpinilacetat 1349 1347 tr - α-Kopaen 1377 1375 tr 0,4 β-Kubeben 1388 1387 1,0 tr β-Elemen 1391 1389 tr - (E)-Kariofilen 1419 1418 tr tr β-Gurjunen 1434 1430 tr tr α-Humulen 1455 1450 tr - (E)-β-Farnezen 1457 1454 tr tr γ-Murolen 1480 1476 1,2 tr γ-Himahalen 1483 1479 tr - γ-Kurkumen 1483 1479 - 1,2 Germakren D 1485 1481 0,8 - α-Murolen 1500 1498 1,6 - Kuparen 1505 1501 - tr β-Bisabolen 1506 1511 0,6 - δ-Kadinen 1523 1520 1,0 - 14-hidroksi-α-Murolen 1780 - 6,9 - Ukupno 99,0 83,9 Monoterpenski ugljovodonici 96,1 69,5 Oksidovani monoterpeni tr tr Seskviterpenski ugljovodonici 1,6 7,5 Oksidovani seskviterpeni - 6,9 Ostalo 1,3 - a KI lit − Retencioni indeksi dati u literaturi b KI exp − Relativni retencioni indeksi izračunati preko serije homologih n-alkana na HP-5MS koloni. c % − Relativni udeo komponente (procenat površine pika) u odnosu na ukupnu površinu pikova hromatograma detektovanog FID detektorom. d Komponenta u tragu (< 0,05 %). Dobijeni podaci, pre svega izuzetno visok sadržaj monoterpena, u skladu su sa literaturnim podacima za etarsko ulje ploda L. latifolium. Naime, Adcock i Betts (1974) su ispitivali hemijski sastav etarskih ulja ekstrahovanih etrom iz petnaest uzoraka ploda L. latifolium, sakupljenih u botaničkim baštama širom Evrope. U svim ovim etarskim uljima kao glavne komponente identifikovani su α-pinen, β-pinen i limonen, ali je njihov sadržaj varirao od uzorka do uzorka. 85 1.2. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i cvasti L. zernyi Endemična vrsta L. zernyi do sada nije ispitivana u pogledu sadržaja i sastava etarskog ulja. Etarska ulja izolovana iz podzemnih organa, herbe i cvasti L. zernyi u okviru ove doktorske disertacije bila su svetloplave boje i slabog, prijatnog aromatičnog mirisa. U etarskom ulju izolovanom iz podzemnih organa L. zernyi detektovane su četrdeset tri komponente (čine 94,0% ukupnog sadržaja ulja) (Tabela 15). Sadržaj monoterpenske i seskviterpenske frakcije bio je približno isti (42,6% i 41,4%, redom). Najzastupljenije komponente bile su α-pinen (31,6%) i α-bisabolol (30,9%). U nešto nižem procentu su detektovani monoterpeni 1,5,8-p-mentatrien (6,3%) i β-felandren (4,3%). Sve ostale detektovane komponente bile su zastupljene u količini nižoj od 3%. U etarskom ulju herbe L. zernyi detektovano je pedeset osam komponenata, koje predstavljaju 89,4% ukupnog sadržaja ulja (Tabela 15). Udeo monoterpenske frakcije (59,1%) bio je veći u odnosu na seskviterpensku frakciju (29,2%). Najzastupljenije komponenete su β-pinen (20,0%) i terpinen-4-ol (12,0%), dok su β-felandren i α-pinen zastupljeni u nižim koncentracijama (4,7 i 3,8%, redom). Od seskviterpena, α-bisabolol je najzastupljeniji sastojak (6,4%), a po količini slede spatulenol (4,1%), biciklogermakren (3,8%) i (E)-kariofilen (2,5%). Svetloplava boja izolovanog ulja potiče od hamazulena (1,8%). U etarskom ulju cvasti L. zernyi identifikovano je pedeset pet komponenata (96,8% ukupnog sadržaja ulja) (Tabela 15). Sadržaj monoterpena je bio viši (75,6%) u odnosu na seskviterpene (21,2%). Najzastupljenije komponente bile su monoterpeni: sabinen (18,5%), β-felandren (12,4%), limonen (12,0%) i terpinen-4-ol (10,6%). Po količini slede α-pinen (8,0%) i γ-terpinen (5,8%). Od seskviterpenskih jedinjenja, u nešto višem procentu bili su zastupljeni (E)-kariofilen (6,8%) i α-bisabolol (4,0%). U etarskom ulju cvasti L. zernyi prisutan je takođe hamazulen (1,1%) od koga potiče njegova svetloplava boja. 86 Tabela 15. Sastav etarskih ulja podzemnih organa, herbe i cvasti L. zernyi Jedinjenje KI Lita KI Expb Etarsko ulje podzemnih organac Etarsko ulje herbec Etarsko ulje cvastic α-Tujen 930 929 - tr 0,2 α-Pinen 939 937 31,6 3,8 8,0 Kamfen 954 953 0,2 - - Verbenen 968 966 0,4 - - Sabinen 975 971 0,7 1,0 18,5 β-Pinen 979 978 2,2 20,0 1,1 Mircen 991 989 0,6 0,5 0,7 α-Felandren 1003 1001 0,4 tr tr α-Terpinen 1017 1015 tr 1,1 1,7 p-Cimen 1025 1022 0,5 0,5 0,6 Limonen 1029 1027 - 0,5 12,0 β-Felandren 1030 1028 4,3 4,7 12,0 (E)-β-Ocimen 1050 1049 - tr tr γ-Terpinen 1060 1058 tr 3,2 5,7 cis-Sabinen hidrat - 1069 - 1,7 1,0 Terpinolen 1089 1085 - 0,9 1,0 6-Kamfenon 1097 1095 1,1 tr tr Linalol 1097 1096 - tr tr trans-Sabinen hidrat 1098 1097 - 1,2 0,6 1,3,8-p-Mentatrien 1110 1108 tr - - cis-p-Ment-2-en-1-ol - 1120 - 0,8 0,6 α-Kamfolenal 1126 1124 0,3 0,6 tr trans-Pinokarveol 1139 1137 - 0,5 0,2 trans-p-Ment-2-en-1-ol 1141 1138 - 1,2 0,5 1,5,8-p-Mentatrien - 1142 6,3 - - trans-Verbenol 1145 1143 - 2,5 0,3 Pinokarvon 1165 1164 tr tr tr p-Menta-1,5-dien-8-ol 1170 1168 1,2 - - Terpinen-4-ol 1177 1175 - 12,0 10,6 α-Terpineol 1189 1187 - 0,7 0,3 Mirtenol 1196 1193 - 0,9 - Mirtenal 1196 1194 - 0,8 - cis-Piperitol 1193 1195 - - tr Verbenon 1205 1202 0,5 - - trans-Karveol 1217 1215 - tr - Bornilacetat 1289 1285 - tr tr 87 Mirtenilacetat 1327 1325 1,0 - - Bicikloelemen 1339 1332 tr - - α-Longipinen 1351 1350 - tr tr α-Julangen 1375 1373 tr - - α-Kopaen 1377 1375 0,4 1,3 0,3 Daucen 1382 1379 - 0,9 0,3 trans-Mirtanolacetat 1387 1385 1,6 - - β-Burbonen 1387 1386 - tr - β-Kubeben 1388 1387 0,2 0,4 tr β-Elemen 1391 1389 0,3 tr tr 7-epi-Seskvitujen 1391 1390 tr - - Seskvitujen 1417 1415 tr - - (E)-Kariofilen 1419 1418 tr 2,5 6,8 β-Gurjunen 1434 1430 tr tr tr α-trans-Bergamoten 1435 1432 - tr tr α-Humulen 1455 1450 tr 0,3 0,8 (E)-β-Farnezen 1457 1454 0,9 1,2 0,5 γ-Murolen 1480 1476 0,4 - - Germakren D 1485 1481 0,5 0,9 0,3 (E)-β-Jonon 1485 1485 - tr tr Biciklogermakren 1500 1497 2,4 3,8 1,0 α-Murolen 1500 1498 tr - - Kuparen 1505 1501 tr - - β-Bisabolen 1506 1501 0,7 tr tr β-Himahalen 1511 1511 - 0,9 tr δ-Kadinen 1523 1520 0,5 tr tr β-Sekvifelandren 1523 1521 tr - - Kesan 1528 1535 - 0,8 0,2 (Z)-Nerolidol 1534 1529 - tr - Spatulenol 1578 1575 2,7 4,1 2,0 Kariofilen oksid 1583 1580 - 1,8 2,1 Gvajol 1601 1596 tr - - Humulen epoksid II 1608 1604 - tr tr Kariofila-4(14),8(15)- dien-5α-ol - 1637 - tr 0,3 Kariofila-4 (14),8(15)- dien-5β-ol - 1638 - - 0,7 epi-α-Murolol 1641 1638 - tr 0,3 α-Murolol 1646 1642 1,5 2,1 0,5 88 α-Kadinol 1653 1650 - tr tr α-Bisabolol 1686 1682 30,9 6,4 4,0 Hamazulen 1732 1728 - 1,8 1,1 Neofitadien - 2216 - 1,1 tr Ukupno 94,3 89,4 96,8 Monoterpenski ugljovodonici 47,2 36,2 61,5 Oksidovani monoterpeni 5,7 22,9 14,1 Seskviterpenski ugljovodonici 6,3 14,0 11,1 Oksidovani seskviterpeni 35,1 15,2 10,1 Ostalo - 1,1 - a KI lit − Retencioni indeksi dati u literaturi b KI exp − Relativni retencioni indeksi izračunati preko serije homologih n-alkana na HP-5MS koloni. c % − Relativni udeo komponente (procenat površine pika) u odnosu na ukupnu površinu pikova hromatograma detektovanog FID detektorom. d Komponenta u tragu (< 0,05 %). 1.3. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum Endemična vrsta L. ochridanum do sada nije ispitivana u pogledu sadržaja i sastava etarskog ulja. Etarska ulja izolovana iz podzemnih organa, herbe i ploda ove biljke su tamnoplave boje i izuzetno prijatnog, aromatičnog mirisa. U etarskom ulju podzemnih organa (rizoma i korena) L. ochridanum identifikovane su četrdeset četiri komponente (čine 94,0% ukupnog sadržaja ulja) (Tabela 16). Za razliku od ostalih etarskih ulja analiziranih u okviru ove doktorske disertacije, seskviterpeni su bili zastupljeni u višem procentu (51,4%), u odnosu na monoterpene (42,6%). Seskviterpenski ugljovodonici čine 33,0% ukupnog sadržaja ulja, dok su oksidovani seskviterpeni zastupljeni sa 18,4%. Najzastupljeniji je bio α-pinen (33,2%), a u značajnoj količini bili su zastupljeni i hamazulen (14,9%), α-bisabolol (10,3%) i biciklogermakren (8,7%). U etarskom ulju herbe L. ochridanum identifikovane su četrdeset četiri komponente (čine 87,1% ukupnog sadržaja ulja) (Tabela 16). Udeo monoterpenske frakcije bio je 55,3%, a seskviterpenske 30,2%. Glavna komponenta je sabinen (25,9%). Po količini slede α-pinen (7,4%), spatulenol (6,4%), kariofilen oksid (6,1%), terpinen-4-ol (5,5%) i (E)-kariofilen (5,3%). U ulju je detektovan i hamazulena (4,1%), od koga potiče njegova plava boja. Etarsko ulje ploda L. ochridanum takođe je bilo plavo. Karakteriše ga izuzetno visok udeo monoterpenske frakcije (87,8%), dok seskviterpenska jedinjenja čine samo 8,8% ulja (Tabela 16). U ovom ulju je identifikovano dvadeset šest komponenata, od kojih su najzastupljenije limonen (57,7%), sabinen (14,4%), i peril aldehid (9,3%). Od seskviterpena, 89 jedino je (E)-kariofilen prisutan u nešto višem procentu (4,1%). I u ovom ulju L. ochridanum je bio prisutan plavi hamazulen (0,4%). Tabela 16. Sastav etarskih ulja herbe, plodova i podzemnih organa L. ochridanum Jedinjenje KI Lita KI Expb Etarsko ulje podzemnih organac Etarsko ulje herbec Etarsko ulje plodac α-Tujen 930 929 - tr 0,2 α-Pinen 939 937 33,2 7,4 2,8 Kamfen 954 953 tr tr - Verbenen 968 966 tr - - Sabinen 975 971 1,0 25,9 14,4 β-Pinen 979 978 2,8 1,0 0,4 Mircen 991 989 1,0 - 1,0 α-Felandren 1003 1001 tr - - α-Terpinen 1017 1015 tr 1,4 - p-Cimen 1025 1022 0,1 1,2 - Limonen 1029 1027 0,8 2,2 57,7 β-Felandren 1030 1028 tr 0,3 - (E)-β-Ocimen 1050 1049 - tr tr γ-Terpinen 1060 1058 tr 2,4 1,0 Terpinolen 1089 1085 - 0,9 0,1 6-Kamfenon 1097 1095 tr tr - Linalol 1097 1096 - 0,9 - 1,3,8-p-Mentatrien 1110 1108 tr - 0,2 α-Kamfolenal 1126 1124 tr 0,8 - 1,5,8-p-Mentatrien - 1142 1,5 - - Pinokarvon 1165 1164 tr 0,6 - p-Menta-1,5-dien-8-ol 1170 1168 tr - - Terpinen-4-ol 1177 1175 - 5,5 0,7 Kripton 1186 1184 - 0,5 - α-Terpineol 1189 1187 - 1,3 - Mirtenol 1196 1193 - 0,8 - Mirtenal 1196 1194 - 0,7 - Verbenon 1205 1202 tr 0,9 - Kumin aldehid 1242 1240 - tr - Peril aldehid 1268 1272 - - 9,3 Bornilacetat 1289 1285 - 0,6 - p-Cimen-7-ol 1291 - - tr - 90 Mirtenilacetat 1327 1325 0,5 - - Bicikloelemen 1339 1332 tr - - α-Terpinilacetat 1349 1347 - tr - α-Julangen 1375 1373 tr - - α-Kopaen 1377 1375 1,5 tr 0,1 Daucen 1382 1379 - 2,4 0,7 trans-Mirtanolacetat 1387 1385 1,7 - - β-Kubeben 1388 1387 2,3 0,3 0,3 β-Elemen 1391 1389 tr - tr 7-epi-Seskvitujen 1391 1390 tr - - Seskvitujen 1417 1415 tr - - (E)-Kariofilen 1419 1418 0,6 5,3 4,1 β-Gurjunen 1434 1430 tr - - α-Humulen 1455 1450 tr 0,7 0,5 (E)-β-Farnezen 1457 1454 tr tr tr γ-Murolen 1480 1476 0,8 - tr γ-Himahalen 1483 1479 - 2,0 0,2 Germakren D 1485 1481 3,2 1,5 0,6 (E)-β-Jonon 1485 1485 - tr - Biciklogermakren 1500 1497 8,7 1,1 1,3 α-Murolen 1500 1498 tr - - β-Bisabolen 1506 1511 tr tr - δ-Kadinen 1523 1520 1,0 tr tr α-Kalakoren 1542 - - tr - Spatulenol 1578 1575 2,7 6,4 0,6 Kariofilen oksid 1583 1580 - 6,1 - Gvajol 1601 1596 2,0 - - Humulen epoksid II 1608 1604 - 0,7 - α-Murolol 1646 1642 2,8 - - Blunezol 1672 1668 0,6 - - α-Bisabolol 1686 1682 10,3 - - Hamazulen 1732 1728 14,9 4,1 0,4 Neofitadien - 2216 - 1,2 - Ukupno 94,0 87,1 96,6 Monoterpenski ugljovodonici 40,4 42,7 77,8 Oksidovani monoterpeni 2,2 12,6 10,0 Seskviterpenski ugljovodonici 33,0 17,4 8,2 Oksidovani seskviterpeni 18,4 13,2 0,6 Ostalo - 1,2 - 91 a KI lit − Retencioni indeksi dati u literaturi b KI exp − Relativni retencioni indeksi izračunati preko serije homologih n-alkana na HP-5MS koloni. c % − Relativni udeo komponente (procenat površine pika) u odnosu na ukupnu površinu pikova hromatograma detektovanog FID detektorom. d Komponenta u tragu (< 0,05 %). 1.4. Uporedna analiza hemijskog sastava etarskih ulja ispitivanih vrsta roda Laserpitium Već nakon izolovanja destilacijom vodenom parom mogle su se uočiti razlike u karakteristikama etarskih ulja ispitivanih vrsta roda Laserpitium. Sadržaj etarskih bio je najveći u plodovima L. ochridanum i L. latifolium: 7,55% i 2,67% (V/m), redom. Po količini etarskih ulja sledili su podzemni organi sve tri ispitivane vrste sa prinosima 1,74% (V/m) u L. zernyi, 1,21% (V/m) u L. ochridanum i 0,63% (V/m) u L. latifolium. Herbe L. ochridanum i L. zernyi, i cvast L. zernyi sadržale su najmanju količinu etarskog ulja: 0,33%, 0,14% i 0,22% (V/m), redom. Prethodna ispitivanja etarskih ulja vrsta roda Laserpitium su uglavnom obuhvatala šire rasprostranjene predstavnike ovog roda. Hemijski su analizirana etarska ulja izolovana iz ploda, herbe i lista, dok etarska ulja iz cvasti i podzemnih organa nisu ispitivana. Adcock i Betts (1974) su analizirali etarska ulja ekstrahovana etrom iz plodova devet vrsta ovog roda: L. archangelica, L. gallicum, L. glaucum, L. halleri, L. hispidum, L. krapfii, L. latifolium, L. prutenicum i L. siler, prikupljenih sa više lokaliteta. Navedena etarska ulja, izuzev etarskog ulja ploda L. siler, bila su sličnog hemijskog sastava, sa izrazitom dominacijom monoterpenskih sastojaka, i to cikličnih monoterpenskih ugljovodonika, kao što su limonen, α-pinen i β-pinen, ili su, kao jedan od glavnih sastojaka imali, sa biosintetskog aspekta još “primitivniji“ sastojak – geranilacetat. Konstatovali su, takođe, da je etarsko ulje ploda L. siler, zbog relativno visokog sadržaja peril aldehida i limonena, hemijski bliže etarskom ulju ploda Laser trilobum. Rezultati novijih istraživanja etarskih ulja vrsta roda Laserpitium idu u prilog prethodno pretpostavljenim sličnostima i razlikama. Glavni sastojci etarskog ulja ploda L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) iz Italije (Tirillini i sar., 2009), su mircen (15,7%), β-felandren (14,4%) i sabinen (9,7%), dok su seskviterpeni zastupljeni u manjem procentu (25,0%), sa γ-murolenom kao glavnim sastojkom. U plodu i listu L. gallicum prikupljenom na dva staništa u Francuskoj, glavni sastojci su α-pinen (17,0–28,5%) i β-pinen (14,8–38,5%). U uzorcima sa jednog staništa (Rougon), pored pinena, detektovane su i 92 značajne količine sabinena (17,2 i 10,4%) i mircena (11,8 i 14,6%) (Chizzola, 2007). I etarsko ulje ploda L. petrophilum (endemične vrste koja raste u Anatoliji), ima najviši sadržaj α-pinena (48,9%) i sabinena (25,9%) (Baser i Duman, 1997). Sa druge strane, etarsko ulje ploda L. siler, prikupljenog u Francuskoj, kao glavne komponente sadrži peril aldehid (75,0%) i limonen (22,0%) (Chizzola i Novak, 1999). Rezultati hemijske analize etarskih ulja vrsta roda Laserpitium dobijeni u okviru ove doktorske disertacije pružaju dodatni uvid u bogatstvo struktura isparljivih metabolita vrsta ovog roda. Etarska ulja izolovana iz ploda i podzemnih organa L. latifolium imaju izuzetno visok procenat monoterpena (96,1% i 69,5%, redom) i najzastupljenija komponenta je α-pinen (44,0% i 44,4%, redom). U etarskom ulju ploda u nešto višem procentu zastupljeni su još i sabinen (26,8%) i β-pinen (13,9%). Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima koje su dobili Adcock i Betts (1974), da etarsko ulja ploda L. latifolium pripada pinenskom tipu. Sa druge strane, u etarskom ulju ploda L. ochridanum, gde su monoterpeni takođe dominantna frakcija (87,8%), najzastupljenije komponente su sabinen (14,4%), limonen (57,7%) i peril aldehid (9,3%), tako da je u pogledu hemijskog sastava etarsko ulje ploda L. ochridanum sličnije etarskom ulju ploda L. siler. Etarsko ulje herbe L. ochridanum karakteriše manja razlika u sadržaju monoterpenske (55,3%) i seskviterpenske (30,2%) frakcije, sa relativno visokim sadržajem sabinena (25,9%) i α-pinena (7,4%), ali i seskviterpena kao što su spatulenol (6,4%), kariofilen oksid (6,1%) i (E)-kariofilen (5,3%). Etarsko ulje herbe L. zernyi ima odnos monoterpenske (59,1%) i seskviterpenske frakcije (29,2%), sličan ulju herbe L. ochridanum, sa najzastupljenijim komponenetama β-pinenom (20,0%) i terpinen-4-olom (12,0%). Najzastupljeniji seskviterpenski sastojak etarskog ulja herbe L. zernyi je α-bisabolol (6,4%). U etarskom ulju cvasti L. zernyi sadržaj monoterpena takođe je bio viši (75,6%) u odnosu na seskviterpene (21,2%). Pored glavnih komponenata sabinena (18,5%), limonena (12,0%) i β-felandrena (12,4%), u ulju cvasti L. zernyi takođe je detektovan α-bisabolol u značajnoj količini (4,0%). U etarskom ulju herbe L. ochridanum i u uljima herbe i cvasti L. zernyi detektovan je i hamazulen (4,1%, 1,1% i 1,8%, redom). Za razliku od prethodnih, etarska ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi karakteriše visok udeo seskviterpenske frakcije: 51,4% u ulju L. ochridanum i 41,4% u ulju L. zernyi. Najzastupljenija komponenta u ovim etarskim uljima je α-pinen (33,2% i 31,6%, 93 redom), ali je u relativno visokoj količini prisutan i sekviterpenski alkohol α-bisabolol (10,3 i 30,9%, redom). U etarskom ulju podzemnih organa L. ochridanum detektovan je i hamazulen u značajnom procentu (14,9%). Kao što je pomenuto, etarska ulja podzemnih organa endemičnih vrsta L. ochridanum i L. zernyi sadrže značajnu količinu α-bisabolola, aktivnog sastojka etarskog ulja kamilice, Matricariae aetheroleum. Cvast kamilice se tradicionalno koristi kod različitih gastrointestinalnih poremećaja, kao što su bolni spazmi, upalni procesi i poremećaji varenja. Takođe, cvast kamilice je česta sirovina u kozmetičkoj industriji zbog svog umirujućeg i antiinflamatornog dejstva (smanjuje crvenilo kože) (Blumenthal i sar., 2003). Ispitivanja su pokazala da farmakološkoj aktivnosti cvasti kamilice doprinosi njeno etarsko ulje bogato upravo α-bisabololom, kao i njegovim oksidima, hamazulenom i spiroetrima (Della Loggia i sar., 1990; Blumenthal i sar., 2003; Sticher, 2007). α-Bisabolol je prirodni seskviterpenski alkohol, koji je u širokoj upotrebi u kozmetičkim i dermatološkim preparatima, zbog protektivnog i umirujućeg dejstva na kožu, ali i zbog svojstva pospešivanja penetracije drugih aktivnih supstanci, kao što je 5-fluorouracil (De Andrade, 2004; Madhavan, 1999). Različitim in vitro i in vivo testovima potvrđena je antiinflamatorna, antibakterijska i antialergijska aktivnost α-bisabolola (Kamatou i Viljoen, 2010). Zbog njegove relativno široke upotrebe sprovedene su i odgovarajuće studije bezbednosti, na osnovu kojih je od strane Američke agencije za hranu i lekove (FDA - eng. Food and Drug Administration), dobio GRAS status (eng. Generaly Regarded As Safe) (Kamatou i Viljoen, 2010). α-Bisabolol je izuzetno vredan kozmetički sastojak, koji je prema Evropskoj farmakopeji 7 (European Pharmacopoeia 7.0), u etarskom ulju kamilice zastupljen u količini 10─65%, u zavisnosti od hemotipa. Njegova zastupljnost u komercijalnim uzorcima etarskih ulja u proseku iznosi oko 17% (Viljoen i sar., 2006). Visoka cena etarskog ulja kamilice i relativno velika varijabilnost sadržaja α-bisabolola doprineli su velikom naučnom interesu za iznalaženje novih etarskih ulja sa visokim sadržajem ovog jedinjenja (De Andrade i sar., 2004). Rezultati hemijske analize etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum ukazuju da ona predstavljaju nove biljne izvore ovog seskviterpenskog alkohola. 94 2. Identifikacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium 2.1. Jedinjenje 1 (laserpicin) Jedinjenje 1 eluirano je sa kolone silikagela u frakcijma 71-99. Dalje prečišćavanje spojenih frakcija izvršeno je na semipreparativnom HPLC uređaju, uz izokratski režim eluiranja (70% MeOH : 30% H2O). Po uparavanju rastvarača, jedinjenje 1 je iskristalisalo u vidu belih igličastih kristala. Analizom HR-MS (ESI+) spektra jedinjenja 1 (Slika 58 u Prilogu), na osnovu pojave molekulskog jona na m/z 451,2759 (preračunato 451,2690 za [M + H]+), utvrđeno je da jedinjenju 1 odgovara molekulska formula C25H38O7. U IR spektru (Slika 76 u Prilogu), najintenzivnija traka na 1711,1 cm─1 odgovara valencionim C=O vibracijama zasićenog ketona. Dva signala u IR spektru ukazuju na prisustvo slobodne hidroksilne grupe: širok signal na 3368,6 cm─1 za intramolekularne vodonične veze slobodne OH grupe i 1144,0 cm─1 za deformacionu vezu C─O hidroksilne grupe (Williams i Fleming, 1995). U 13C NMR spektru (Slika 15) vidljivo je dvadeset pet signala, što ukazuje na prisustvo istog broja ugljenikovih atoma u strukturi i odgovara predloženoj molekulskoj formuli. Izvesni signali se javljaju “u paru“, tj. na veoma sličnim hemijskim pomeranjima (168,8 i 167,6 ppm; 140,6 i 139,7 ppm; 127,6 i 127,3 ppm; 20,7 i 20,7 ppm; 16,1 i 16,1 ppm), što ukazuje na prisustvo dve strukturno identične jedinice. Slika 15. 13C NMR spektar jedinjenja 1 (75 MHz) 95 U protonskom NMR spektru uočeno je dvadeset različitih signala, za koje je integraljenjem utvrđeno da potiču od trideset osam protona. Uočeni su signali višeg reda (m) na hemijskim pomeranjima δH 6,16 ppm i δH 6,13 ppm. Na hemijskom pomeranju 2,02 ppm nalazi se multiplet za koji je integraljenjem utvrđeno da potiče od šest protona. Na pomeranjima δH 1,87 ppm i δH 1,94 ppm uočavaju se složeni multipleti, koji potiču od po tri protona. Delovi 1H NMR spektra jedinjenja 1 dati su na Slici 16. Slika 16. Delovi 1H NMR (300 MHz) spektra jedinjenja 1 U dvodimenzionalnom gHSQC spektru uočavaju se vandijagonalni, korelacioni signali, koji spajaju direktno vezane, skalarno spregnute C i H atome. U gHMBC spektru uočavaju se vandijagonalni signali koji daju informaciju o skalarno spregnutim 13C i 1H signalima na udaljenosti od 2 do čak 4-5 veza. Analizom gHSQC i gHMBC spektara jedinjenja 1 ustanovljeno je signali koji se javljaju “u paru“ potiču od dva estra angelične kiseline (Moldt i sar., 1987; Holub i sar., 1967). Daljom analizom dvodimenzionalinih NMR spektara, uključujući i COSY spektar (koji daje informacije o homonuklearnom H-H sprezanju na udaljenosti od 2-3 veze), dobijeni su podaci dati u Tabeli 17. 96 Tabela 17. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 1 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 - 46,3 5, 10, 11 - 2 α: 1,65 d (4,8) β: 1,59 d (6,3) 34,7 10, 11 geminalno kuplovanje 3 α: 1,99 m β: 1,60 m 31,5 - geminalno kuplovanje 4 - 84,7 12, 13, 14 - 5 2,09 d (11,1) 51,4 6, 7, 11 - 6 5,51 dd (11,1; 4,8) 68,7 5, 7 - 7 α: 2,26 d (16,9) β: 2,52 dd (17,0; 4,8) 40,3 15 geminalno kuplovanje 8 - 76,6 7, 15 - 9 - 210,1 7, 15 - 10 5,26 s 81,1 11 - 11 1,42 s 21,9 5 - 12 1,61 m 36,9 13, 14 13, 14 13 0,76 d (6,5) 18,4 12, 14 12 14 0,88 d (6,7) 17,5 12, 13 12 15 1,42 s 29,2 - - Angeloil grupa ─C=O - - 168,8 167,6 ─C(CH3)= ─C(CH3)= - - 127,6 127,2 ─C=CH─ ─C(CH3)= ─C=CH─ 6,16 m, (ql) 6,13 m, (ql) 140,6 139,7 ─CH(CH3) ─C(CH3) ─CH(CH3) 2,02 m 2,02 m 16,1 16,1 ─C(CH3) 1,87 m 1,94 m 20,7 20,7 Zaključeno je da jedinjenje 1 predstavlja laserpicin, diestar laserola i dva molekula angelične ((Z)-2-metil-2-butenske) kiseline (Slika 17). Laserpicin, tj. 6α,10α- -diangeloiloksi-4β-hidroksi-dihidrodaukan-9-on je prvi izolovani daukanski estar (Ghisalberti, 1994), opisan još početkom dvadesetog veka kao gorka supstanca koja 97 kristališe iz ekstrakata podzemnih organa L. latifolium (Hegi, 1906), a čija je struktura sa sigurnošću utvrđena tek posle nekoliko revizija (Holub i sar., 1967). HO O O OHO O O 1 4 6 8 10 9 H Slika 17. Jedinjenje 1 (laserpicin) 2.2. Jedinjenje 2 (acetildezoksodehidrolaserpicin) Jedinjenje 2 eluirano je sa kolone silikagela u frakcijama 63-68, koje su spojene i dalje prečišćavane na HPLC semipreparativnoj koloni u izokratskom režimu eluiranja (75% MeOH : 25 % H2O). Nakon uparavanja rastvarača, dobijeno je jedinjenje 2, bezbojna, lepljiva tečnost koja se sakupljala na zidovima epruveta. Analizom HR-MS (ESI+) spektra (Slika 59 u Prilogu), uočavaju se molekulski jon na m/z 477,2843 (preračunato 477,2847 za [M + H]+) i signal kvazimolekulskog jona na m/z 499,2658 (preračunato 499,2666 za [M + Na]+), što odgovara jedinjenju molekulske formule C27H40O7. Najintenzivnija traka u IR spektru (Slika 77 u Prilogu) je na 1228,5 cm─1 i potiče od C─O valencione vibracije alkoholne grupe. Druga, nešto slabija traka je na 1710,6 cm─1 i potiče od valencionih vibracija C=O veze estra (Williams i Fleming, 1995). U 1H NMR spektru (Slika 18) jedinjenja 2 su, slično kao kod laserpicina, uočeni spektri višeg reda na karakterističnim pomeranjima (δH 6,13 i 6,06 ppm, m; i složeni multipleti višeg reda na δH 1,88 ppm i δH 2,02 ppm, koji predstavljaju signale šest protona), što su karakteristična pomeranja za protone estara angelične kiseline (Slika 98 18). Pored toga, singlet na δH 2,06 ppm koji odgovara protonima metil grupe (δC 48,8 ppm), ima karakteristično pomeranje za metil grupu acetata (Miski i Mabry, 1986; Smitalova i sar., 1984). Pored karakterističnih signala za dva angelična i jedan acetatni estar, ostala hemijska pomeranja ukazuju na daukanski skelet. Podaci iz 1D (1H i 13C) i 2D NMR spektara, dati su u Tabeli 18. Slika 19. COSY spektar jedinjenja 2. Na spektru su označeni vandijagonalni, homonuklearni korelacioni signali, koji spajaju skalarno spregnute protone preko 2─3 hemijske veze Slika 18. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja 2 sa označenim karakterističnim hemijskim pomeranjima (δH ppm) i konstantama kuplovanja (Hz) 99 Tabela 18. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 2 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 - 48,0 2, 3, 11 - 2 4,74 d (9,9) 74,2 3, 11 3 3 α: 2,48 dd (14,4; 8,7) β: 1,56 (14,1; 10,2) 36,7 12 3 4 - 82,0 3, 12, 13, 14 - 5 2,70 bm 48,8 2, 11 - 6 5,36 td (10,8; 2,7) 69,7 7 7 α: 2,14 dd (14,4; 3,3) β: 2,71 d (11,1) 40,5 15 6 8 - 138,2 10, 15 - 9 5,73 d (7,5) 124,1 10, 15 10 10 4,78 d (7,5) 71,4 7, 8, 9 9 11 1,20 s 21,9 - - 12 1,88 m 37,1 13, 14 13, 14 13 0,98 d (6,8) 18,4 12, 14 12 14 0,90 d (6,8) 17,3 12, 13 12 15 1,81 s 27,6 - - Angeloil grupa ─C=O - - 168,2 167, 8 ─C(CH3)= ─C(CH3)= - - 127,9 127,7 ─C=CH─ ─C(CH3)= ─C=CH─ 6,13 m 6,06 m 139,9 138,7 ─CH(CH3) ─C(CH3) ─CH(CH3) 2,02 m 2,02 m 16,1 16,1 ─C(CH3)= ─C(CH3) 1,88 m 1,88 m 20,9 20,7 ─C=CH─ ─C(CH3)= Acetil grupa ─C=O - 170,4 10 ─CH3 2,06 s 21,1 - Analiza COSY spektra (Slika 19) omogućila je određivanje rasporeda unutar samog daukanskog prstena, a gHSQC spektar povezivanje direktno vezanih, skalarno spregnutih ugljenika i vodonika. 100 101 Analizom dobijenih podataka i poređenjem sa literaturnim podacima, zaključeno je da je jedinjenje 2 acetildezoksodehidrolaserpicin, tj. 2β,6α-diangeloiloksi-10α- -acetoksi-daukan-4-ol (Slika 20), retko jedinjenje, do sada izolovano samo iz korena Ferula tingitana L. (Miski i Mabry, 1986). 1H NMR podaci odgovaraju ranije publikovanim vrednostima hemijskih pomeranja i konstanti kuplovanja za ovo jedinjenje (Miski i Mabry, 1986). U okviru ove doktorske disertacije 13C NMR i 2D NMR spektri snimljeni su po prvi put (Slike 94-97 u Prilogu). HO O O O O O O H 1 2 4 5 6 8 10 12 13 14 11 15 Slika 20. Jedinjenje 2 (acetildezoksodehidrolaserpicin) 2.3. Jedinjenje 3 (laserin) Jedinjenje 3 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 58─64, koje su dalje prečišćavane na semipreparativnoj koloni u izokratskom režimu eluiranja (72% MeOH : 28 % H2O). Izolovano jedinjenje 3 je bezbojna tečnost. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 60 u Prilogu), uočavaju se dominantni signali na m/z 413,1584 i m/z 429,1335, koji odgovaraju kvazimolekulskim jonima jedinjenja molekulske formule C21H26O7 (preračunate m/z 413,1600 i 429,1300 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom). Traka u IR spektru (Slika 78 u Prilogu) na 1710,7 cm─1 potiče od valencionih vibracija C=O veze estra (Williams i Fleming, 1995). 102 1H, 13C NMR i 2D NMR (COSY, gHSQC i gHMBC) spektralni podaci (Tabela 19) su u skladu sa prethodno objavljenim spektralnim podacima za laserin, tj. 1-[3,4- -metilendioksi-5-metoksi-fenil]-1,2-diangeloiloksi-propan (Yang i sar., 2008). Tabela 19. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 3 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 - 101,8 6, 1’ 2 6,57 d (1,2) 101,9 6, 1’ 3 - 135,5 4 - 149,2 ─OCH2O─ 5 - 143,7 6, ─OCH3 6 6,55 d (1,5) 107,4 2, 1’ 1’ 5,76 d (7,2) 77,7 6, 3’ 2’ 2’ 5,34 ql (6,9) 71,4 1’, 3’ 1’ 3’ 1,16 d (7,0) 17,0 - 2’ ─OCH2O─ 5,95 s 131,2 ─OCH3 3,88 s 56,8 Angeloil grupa ─C=O - - 167,4 166,9 ─C(CH3)= - - 128,1 127,0 ─C=CH─ 6,08 m 6,05 m 139,2 138,4 ─CH(CH3) 1,95 m 1,95 m 16,0 15,9 ─C(CH3) 1,87 m 1,84 m 20,8 20,8 103 Slika 21. Jedinjenje 3 (laserin) Laserin (Slika 21) je fenilpropansko jedinjenje prethodno izolovano iz podzemnih organa L. archangelica (Holub i Samek, 1973) i L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) (Appendino i sar., 1986). Ovo jedinjenje izolovano je iz još nekoliko biljaka familije Apiaceae, npr. iz korena šargarepe, Daucus carota L. (Yang i sar., 2008), podzemnih organa nekih vrsta roda Ferula (Fraga i sar., 1989; Gonzalez i sar., 1988; Appendino i sar., 1990), herbe Seseli vayredanum L. (Barrero i sar., 1992) i korena Laser trilobum (Holub i sar., 1968). 2.4. Jedinjenje 4 (latifolon) Jedinjenje 4 eluirano je u frakcijama 34-42 sa kolone silikagela. Nakon prečišćavanja prikupljenih frakcija na semipreparativnoj koloni, u izokratskom sistemu eluiranja (50% MeOH : 50% H2O), izolovano je amorfno jedinjenje beličaste boje. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 61 u Prilogu), signal molekulskog jona nalazi se na m/z 209,0826 (preračunato za [M + H]+, 209,0736), pa je zaključeno da jedinjenju 4 odgovara molekulska formula C11H12O4. U IR spektru (Slika 79 u Prilogu) preklopljene trake u oblasti od 1679,3 cm─1 do 1095,7 cm─1 potiču od aromatičnog prstena i C─O valencionih vibracija (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1H i 13C NMR spektara uočena je podudarnost sa spektralnim karakteristikama latifolona, tj. 3,4-metilendioksi-5-metoksi-propiofenona (Slika 22), jedinjenja koje je prethodno već izolovano iz podzemnih organa L. latifolium (Holub i sar., 1958). Snimljeni 1D i 2D NMR spektralni podaci dati su u Tabeli 20. 104 Tabela 20. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY za jedinjenje 4 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 - 132,1 - 2 7,21 d (1,5) 188,8 6 3 - 139,7 - 4 - 149,1 ─OCH2O─ 5 - 143,7 ─OCH3 6 7,21 d (1,5) 102,9 2 1’ - 199,1 2, 2’, 3’ 2’ 2,85 q (7,2) 31,8 3’ 3’ 3’ 1,14 m 8,7 2’ 2’ ─OCH2O─ 6,02 s 102,5 - ─OCH3 3,88 s 56,9 - Slika 22. Jedinjenje 4 (latifolon) 3. Identifikacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi 3.1. Jedinjenje 5 (tarolid) Jedinjenje 5 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 81-90, zajedno sa još nekim terpenskim jedinjenjima. Jedinjenja u spojenim frakcijama razdvajana su na semipreparativnoj HPLC koloni izokratskim eluiranjem (73% MeOH : 27% H2O). Nakon uparavanja rastvarača, jedinjenje 5 je iskristalisalo u vidu bezbojnih, igličastih kristala. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 62 u Prilogu), javljaju se signal molekulskog jona na m/z 447,2400 (preračunato m/z 477,2377 za [M + H]+) i dva signala kvazimolekulskih jona na m/z 469,2214 i 485,1693 (preračunato m/z 469,2197 i 105 485,1936 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), što odgovara jedinjenju molekulske formule C25H34O7. U IR spektru (Slika 80 u Prilogu), traka na 1764,5 cm─1 potiče od valencionih vibracija C=O veze laktonskog prstena. Izražena traka na 1695,3 cm─1 ukazuje na estarsku vezu, gde je karbonilna grupa estra konjugovana sa dvostrukom vezom, a široka traka na 3495,1 cm─1 ukazuje na prisustvo hidroksilne grupe u molekulu (Williams i Fleming, 1995). 1H NMR spektar jedinjenja 5 prikazan je na Slici 23. Slika 23. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja 5. Karakteristični signali su uveličani i prikazane su konstante kuplovanja (Hz). 106 Signali na δH 4,78 ppm (dd: 11,7 i 10,2 Hz) i δH 3,77 ppm (dd: 11,4 i 10,2 Hz) su karakteristični za protone koji se nalaze ispod laktonskog prstena (Đermanović, 1990). U 13C NMR spektru vidljivi su signali dvadeset pet ugljenikovih atoma. Slično kao kod laserpicina i acetildezoksodehidrolaserpicina, određeni signali javljaju se “u paru“, što zajedno sa pojavom karakterističnih složenih multipleta na δH 6,13 ppm i δH 6,18 ppm, kao i signala višeg reda na δH 1,84 ppm i δH 1,86 ppm, odnosno δH 2,00 ppm i δH 1,97 ppm, ukazuje na prisustvo dva angelična estra u strukturi. Da bi se odredila struktura i povezali određeni signali iz 1D NMR spektara, izvedeni su dalje 2D NMR eksperimenti: gHSQC i gHMBC, koji daju uvid u heteronuklearna sprezanja, kao i COSY koji povezuje skalarno spregnute protone. NOESY eksperiment je izvršen sa ciljem da se odredi stereohemijska struktura, naročito položaj prstenova, jer NOESY spektar daje informaciju o dipolarno spregnutim, prostorno bliskim protonima. NOESY spektar sa naznačenim spregnutim protonima dat je na Slici 24. 1D i 2D NMR spektralni podaci dati su u Tabeli 21. Slika 24. NOESY spektar jedinjenja 5 sa označenim karakterističnim dipolarnim sprezanjima prostorno bliskih protona 107 108 Tabela 21. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC, COSY i NOESY, za jedinjenje 5 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY NOESY 1 2,43 qui (5,4) 56,1 9β 5 5 2 α: 2,13 m β: 2,19 m 32,4 - geminalno kuplovanje - 3 5,56 bs 125,9 5, 15 2 - 4 - 147,5 15 - - 5 2,61 q (5,7) 48,6 - 1, 6 1 6 4,78 dd (11,7; 10,2) 78,4 5, 7 5, 7 7 7 3,77 dd (11,4; 10,2) 47,7 9, 13 6 6 8 5,60 dd (11,4; 9,0) 67,1 9β - 13 9 α: 2,07 pt β: 1,83 m 43,9 14 geminalno kuplovanje - 10 - 71,5 9, 14 - - 11 - 78,5 7, 13 - - 12 - 174,5 13 - - 13 1,61 s 20,3 - - 8 14 1,23 s 31,3 - - - 15 1,91 s 19,0 - - - Angeloil grupa ─C=O - - 168,1 166,8 ─C(CH3)= - - ─C(CH3)= - - 127,3 126,9 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─C=CH─ 6,18 m 6,13 m 141,1 140,5 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─CH(CH3) 2,00 m 2,00 m 16,2 16,1 ─C=CH─ - - ─C(CH3) 1,84 m 1,86 m 20,5 20,4 ─C=CH─ - - Analizom dobijenih spektara zaključeno je da je jedinjenje 5 tarolid, tj. 8α,11α- diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (Slika 36), seskviterpenski lakton slovanolidne strukture, čija je karakteristična 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en- -12,6-olidna struktura potvrđena izvedenim NOESY eksperimentom. Ovaj lakton je po prvi put izolovan iz herbe L. siler (Stefanović i sar., 1977), i dobio je trivijalan naziv po planini (Tara, Srbija) sa koje je sakupljen biljni materijal. Tarolid je kasnije izolovan i iz 109 podzemnih organa ove biljke (Smitalova i sar., 1984), kao i iz korena L. siler subsp. garganicum (sub L. garganicum) (Appendino i sar., 1985). Do sada publikovani 1H i 13C NMR spektri za tarolid odgovaraju spektrima jedinjenja 5, a snimljeni 2D spektri su u saglasnosti sa predloženom strukturom (Tabela 21). Predložen 3D model (Slika 25) je nacrtan u ChemBioOfiice 2008 programu, uz opciju preračuna minimalne energije. Vodonikovi atomi su zbog preglednosti izostavljeni, a kiseonikovi atomi su, zbog razlikovanja od ugljeničnih, obojeni crveno. Slika 25. Jedinjenje 5 (tarolid): a) hemijska i b) 3D struktura minimalne energije (atomi kiseonika prikazani su crvenom bojom, atomi vodonika su, zbog preglednosti, izostavljeni) 3.2. Jedinjenje 6 (acetilizomontanolid) Jedinjenje 6 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 71-78, zajedno sa jedinjenjem 8. Spojene frakcije (71-78) razdvajane su dalje na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskom režimu (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Nakon uparavanja rastvarača, jedinjenje 6 se izdvojilo kao beličasta praškasta supstanca. Na osnovu pojave signala kvazimolekulskog jona na m/z 471,2002 (preračunato m/z 471,1984 za [M + Na]+) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 63 u Prilogu), zaključeno je da jedinjenju 6 odgovara molekulska formula C24H32O8. 110 U IR spektru (Slika 81 u Prilogu), traka na 1787,5 cm─1 potiče od valencionih vibracija C=O veze laktonskog prstena. Izražena traka na 1713,3 cm─1 ukazuje na estarsku vezu, gde je karbonilna grupa estra konjugovana sa dvostrukom vezom (Williams i Fleming, 1995). Podaci dobijeni 1D i 2D NMR eksperimentima ukazuju da jedinjenje 6 ima strukturu slovanolida, odnosno gvajanolida sa 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olidnom strukturom, sa dva acetatna estra i jednim estrom angelične kiseline. Analizom gHMBC spektara zaključeno je da se radi o 8α-angeloiloksi-11α,10β-diacetoksi- 6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidu, tj. acetilizomontanolidu (Slika 26). Holub i saradnici (1972) su ovo jedinjenje prvi put izolovali iz ploda L. siler i pretpostavlil strukturu na osnovu fizičko-hemijskih (tačka topljenja i hemijska derivatizacija) i spektroskopskih karakteristika (1H NMR, IR i MS spektri). Stefanović i saradnici (1977) su ga izolovali i iz herbe ove biljke, a nekoliko godina kasnije 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olidna struktura slovanolida je potvrđena kristalografskim metodama (Rychlewska i sar. 1984). Dobijeni 1D i 2D NMR podaci prikazani su u Tabeli 22. Hemijska formula acetilizomontanolida data je na Slici 26. 111 Tabela 22. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 6 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,77 m 53,5 9, 14 2 α: 2,20 m β: 2,31 m 31,8 1, 5 3 3 5,57 bs 125,7 5, 15 2 4 - 146,2 5, 15 5 2,60 q (6,0) 49,3 1, 7, 15 6 6 4,73 dd (11,7; 10,8) 78,3 7, 13 5, 7 7 3,67 t (10,5) 48,0 8, 9, 13 6, 8 8 5,67 t (10,2) 64,2 7, 9, 14 7, 9 9 α: 2,66 bm β: 2,16 bd (2,1) 41,1 14 geminalno kuplovanje 10 - 82,7 1, 8, 9, 14 11 - 77,7 5, 7, 13 12 - 174,0 6, 13 13 1,60 s 20,3 - - 14 1,54 s 24,8 9 15 1,90 s 18,6 - Angeloil grupa ─C=O - 166,2 ─C(CH3)= ─C(CH3)= - 127,4 ─CH(CH3) ─C=CH─ 6,08 m 138,7 ─C(CH3)= ─CH(CH3)= 1,98 m 15,7 ─C(CH3) 1,86 m 20,3 Acetil grupa ─C=O - - 170,4 169,7 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,13 s 2,02 s 22,7 20,9 - - 112 O O OO O H H 1 23 4 5 6 7 8 9 10 1112 14 15 O H O O Slika 26. Jedinjenje 6 (acetilizomontanolid) 3.3. Jedinjenje 7 (acetilmontanolid) Jedinjenje 7 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 80-88, zajedno sa jedinjenjem 5. Spojene frakcije (80-88) razdvajane su dalje na semipreparativnoj koloni u izokratskom režimu eluiranja (73% MeOH : 27% H2O). Već po retencionim karakteristikama, i reakciji bojenja sa vanilin-sumporna kiselina reagensom, uočena je znatna sličnost sa jedinjenjem 6. Jedinjenje 7 je, kao i jedinjenje 6, beličasta praškasta supstanca kojoj odgovara molekulska formula C24H32O8, na osnovu pojave signala kvazimolekulskih jona na m/z 471,2025 i 487,1774 (preračunate m/z su 471,1984 i 487,1729, za [M + Na]+ i [M + K]+, redom) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 64 u Prilogu). U IR spektru (Slika 82 u Prilogu), traka na 1785,1 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O grupe u laktonskom prstenu. Izražena traka na 1720,3 cm─1 ukazuje na estarsku vezu, gde je karbonilna grupa estra konjugovana sa dvostrukom vezom (Williams i Fleming, 1995). 1H i 13C NMR spektri ukazuju da se radi o derivatu slovanolida sa 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidnom strukturom, sa dva acetatna estra, kod koga, za razliku od acetilizomontanolida, treći estar potiče od kiseline koja ima pet ugljenikovih atoma (δC 165,0; 158,1; 115,8; 27,7 i 20,6 ppm), ali nešto drugačijih 113 pomeranja u 13C NMR spektru od angelične kiseline. Pojava multipleta na δH 5,59 ppm i dva široka singleta na δH 1,91 i 2,18 ppm koji odgovaraju metil grupama, ukazuju na prisustvo senecioil estra (β,β-dimetilakroiloksi) (Slika 27). Poređenjem 1H NMR spektra sa prethodno publikovanim podacima za slovanolide slične strukture, zaključeno je da je jedinjenje 7 acetilmontanolid, odnosno 8α-senecioiloksi-11α,10β-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid, prethodno izolo- van iz ploda (Holub i sar., 1972) i podzemnih organa L. siler (Holub i sar. 1978), a čija je predložena struktura potvrđena kristalografskom analizom (Rychlewska i sar., 1984). Podaci dobijeni iz 1D i 2D NMR eksperimenata za jedinjenje 7 dati su u Tabeli 23. 114 Tabela 23. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 7 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,78 m 53,5 14 2 α: 2,19 m β: 2,25 m 32,0 - 3 3 5,57 bs 125,9 15 2 4 - 146,4 15 5 2,58 m 49,5 - 6 6 4,72 dd (11,4; 9,9) 78,5 7, 13 5, 7 7 3,63 t (10,5) 48,1 8, 13 6, 8 8 5,61 t (10,2) 63,7 7 7, 9 9 α: 2,62 bm β: 1,97 bd (4,8) 41,3 14 geminalno kuplovanje 10 - 83,0 9, 14 11 - 78,1 13 12 - 174,4 13 13 1,59 s 20,6 - - 14 1,53 s 25,2 - 15 1,90 s 18,7 - Senecioil grupa ─C=O - 165,0 ─C(CH3)= ─CH= 5,59 m 115,8 =C(CH3)2 ─C=C(CH3)2 - 158,1 ─CH= =C(CH3)2 1,91 bs 15,7 ─CH= =C(CH3)2 2,18 bs 20,3 ─CH= Acetil grupa ─C=O - - 170,6 169,9 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,12 s 2,03 s 22,9 21,1 - - 115 O O OO O H H 1 23 4 5 6 7 8 9 10 1112 14 15 O H O O Slika 27. Jedinjenje 7 (acetilmontanolid) 3.4. Jedinjenje 8 (silerolid) Jedinjenje 8 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 71-78, zajedno sa jedinjenjem 6. Spojene frakcije su dalje razdvajane na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskom režimu eluiranja (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Jedinjenje 8 je bezbojna tečna supstanca, koja se lepi po zidovima sudova. Ovom jedinjenju odgovara molekulska formula C22H30O6 na osnovu pojave molekulskog jona na m/z 391,2126 (preračunato m/z 391,2115 za [M + H]+) i kvazimolekulskog jona na m/z 413,1944 (preračunato m/z 413,1936 za [M + Na]+) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 65 u Prilogu). U IR spektru (Slika 83 u Prilogu), traka na 1759,1 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O u laktonu. Izražena traka na 1720,1 cm─1 ukazuje na estarsku vezu, gde je karbonilna grupa estra konjugovana sa dvostrukom vezom (Williams i Fleming, 1995). U 1D i 2D NMR spektrima uočeni su karakteristični signali koji potiču od acetatnog i senecioil estra, ali za razliku od prethodnih jedinjenja, 1H i 13C NMR spektri ukazuju da jedinjenje 8 nije lakton gvajanolidne strukture. Hemijsko pomeranje u 13C NMR spektru za karbonilnu grupu laktona je na 175,2 ppm, dok protonima H-6 i H-7 odgovaraju signali na δH 4,84 ppm (dd: 11,1; 8,7 Hz) i 3,25 ppm (m), što ukazuje na eudezmanolidnu strukturu (Holub i sar., 1986). Analizom 1D i 2D spektara 116 ustanovljeno je da je jedinjenje 8: 1β-acetoksi,11α-senecioiloksi-6αH,7αH-eudezman-3- -en-6,12-olid, odnosno silerolid (Slika 28), prethodno izolovan iz podzemnih organa (rizom i koren) L. siler (Holub i sar., 1986). Kompletni 1D i 2D NMR podaci dati su u Tabeli 24. Tabela 24. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 8 Pozicija δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 4,62 d (4,2) 75,2 14 2 α: 2,11 m β: 2,36 m 29,0 - 3 3 5,34 bs 119,8 15 2 4 - 133,6 15 5 2,43 bs 42,1 14 6 6 4,84 dd (11,1; 8,7) 78,4 - 5, 7 7 3,25 m 39,6 13 6 8 α: 1,85 m β: 1,78 m 19,0 - 9 α: 1,64 m β: 1,20 m 30,7 14 geminalno kuplovanje 10 - 36,2 14 11 - 79,7 13 12 - 175,2 13 13 1,57 s 20,3 - - 14 0,88 s 18,2 - 15 1,91 s 23,2 - Senecioil grupa ─C=O - 165,3 ─C(CH3)= ─CH= 5,34 bs 115,3 =C(CH3)2 ─C=C(CH3)2 - 160,0 ─CH= =C(CH3)2 1,91 bs 27,8 ─CH= =C(CH3)2 2,15 bs 20,6 ─CH= Acetil grupa ─C=O - 170,6 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,05 s 21,5 - - 117 Slika 28. Jedinjenje 8 (silerolid) 3.5. Jedinjenje 9 (izomontanolid) Jedinjenje 9 je sa kolone eluirano u frakcijama 99─105, i dalje prečišćavano na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskom sistemu mobilnih faza (65% MeOH : 35% H2O). Po uparavanju rastvarača, jedinjenje 9 je iskristalisalo u vidu bezbojnih, igličastih kristala. Na osnovu pojave signala kvazimolekulskih jona na m/z 429,1892 (preračunato 429,1884 za [M + Na]+) i 445,1619 (preračunato 445,1623 za [M + K]+) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 66 u Prilogu), zaključeno je da jedinjenju 9 odgovara molekulska formula C22H30O7. U IR spektru (Slika 84 u Prilogu), traka na 1758,9 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O u laktonu. Izražene trake na 1745,2 i 1692,2 cm─1 ukazuju na prisustvo estarskih grupa, od kojih je jedna konjugovani sistem (Williams i Fleming, 1995). 1H i 13C NMR spektri takođe ukazuju da je jedinjenje 9 derivat slovanolida sa 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidnom strukturom, vrlo sličnom strukturi acetilizomontanolida (jedinjenje 6), ali sa jednim acetatnim i jednim angeličnim estrom. Poređenjem dobijenih 1H i 13C NMR podataka sa odgovarajućim literaturnim podacima zaključeno je da je jedinjenje 9: 8α-angeloiloksi,11α-acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid, odnosno izomontanolid (Slika 29). Ovaj slovanolidni derivat prethodno je izolovan iz podzemnih organa (Holub i sar., 1978), herbe (Milosavljević i 118 sar., 1999) i ploda (Holub i sar., 1972) L. siler. 1D i 2D NMR podaci jedinjenja 9 prikazani su u Tabeli 25. Tabela 25. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 9 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,42 m 56,1 14 - 2 α: 2,05 m β: 2,11 m 32,4 - 3 3 5,57 bs 126,0 15 2 4 - 147,3 15 - 5 2,58 q (5,7) 49,5 - 6 6 4,72 dd (11,4; 9,9) 78,4 - 5, 7 7 3,67 dd (11,4; 9,6) 47,6 13 6, 8 8 5,54 dd (11,4; 9,0) 67,1 9 7 9 α: 2,10 m β: 1,85 m 43,7 14 geminalno kuplovanje 10 - 71,5 9, 14 - 11 - 78,6 13 - 12 - 174,3 13 - 13 1,55 s 20,3 - - 14 1,23 s 31,3 - - 15 1,89 s 19,0 - - Angeloil grupa ─C=O - 168,0 ─C(CH3)= ─C(CH3)= - 127,1 ─CH(CH3) ─C=CH─ 6,02 m 141,1 ─C(CH3)= ─CH(CH3)= 2,03 m 16,1 ─C(CH3) 1,89 m 20,6 Acetil grupa ─C=O - 170,0 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,06 s 21,2 - - 119 Slika 29. Jedinjenje 9 (izomontanolid) 3.6. Jedinjenje 10 (montanolid) Jedinjenje 10 je sa kolone eluirano u frakcijama 90 − 98, i dalje prečišćavano na HPLC semipreparativnoj koloni u izokratskom sistemu mobilnih faza (65% MeOH : 35% H2O). Jedinjenje 10 je bezbojna tečnost, koja se lepi za zidove sudova. Jedinjenju 10 odgovara molekulska formula C22H30O7, na osnovu pojave signala kvazimolekulskih jona na m/z 429,1910 (preračunato 429,1884 za [M + Na]+) i m/z 445,1649 (preračunato 445,1623 za [M + K]+) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 67 u Prilogu). U IR spektru (Slika 85 u Prilogu), traka na 1784,6 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O u laktonu. Izražena traka na 1711,6 cm─1 potiče od estarske grupe (Williams i Fleming, 1995). 1H i 13C NMR spektri ukazuju da se radi o derivatu slovanolida sa 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidnom strukturom, vrlo sličnom strukturi izomontanolida (9), samo što se u spektrima vide karakteristična pomeranja za senecioiloksi grupu, umesto angeloiloksi grupe, prisutne u strukturi izomontanolida. Na osnovu prethodno objavljenih podataka, zaključeno je da je jedinjenje 10: 8α-senecioiloksi,11α-acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid, trivijalno nazvan montanolid (Slika 30), slovanolidni derivat prethodno izolovan iz podzemnih organa (Holub i sar., 1978; Smitalova i sar., 1984), herbe (Milosavljević i sar., 1999) i ploda (Holub i sar., 1972) L. siler. 1D i 2D NMR podaci jedinjenja 10 dati su u Tabeli 26. 120 Tabela 26. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY za jedinjenje 10 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,40 m 56,1 2, 9, 14 5 2 α: 2,04 m β: 2,12 d (9,6) 32,4 1, 5 3 3 5,56 bs 126,0 5, 15 2 4 - 147,3 5, 15 - 5 2,58 q (5,7) 49,4 6, 7, 15 6 6 4,71 dd (11,4; 10,2) 78,5 5, 7 5, 7 7 3,61 dd (11,1; 10,2) 47,5 9, 13 6, 8 8 5,52 dd (11,1; 9,6) 66,2 7, 9 7, 9 9 α: 1,99 d (9,6) β: 1,82 m 43,7 14 geminalno kuplovanje 10 - 71,4 1, 9, 14 - 11 - 78,6 6, 7, 13 - 12 - 174,4 6, 13 - 13 1,55 s 20,3 - - 14 1,22 s 31,3 - - 15 1,88 s 19,0 - - Senecioil grupa ─C=O - 166,8 ─C(CH3)= ─CH= 5,62 m 115,6 ─CH(CH3) ─C=C(CH3)2 - 159,4 ─C(CH3)= =C(CH3)2 2,20 bd (1,2) 20,7 =C(CH3)2 1,94 bd (1,2) 27,9 Acetil grupa ─C=O - 170,0 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,08 s 21,2 - - 121 OH O OO O H H 1 23 4 5 6 7 8 9 10 1112 14 15 H O O Slika 30. Jedinjenje 10 (montanolid) 3.7. Jedinjenje 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) Jedinjenje 11 je u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa L. zernyi prisutno u veoma niskoj koncentraciji. Sa kolone silikagela eluirano je u frakcijama 91─95, zajedno sa jedinjenjem 10. Dalje razdvajanje spojenih frakcija vršeno je na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskom režimu eluiranja (65% MeOH : 35% H2O). Jedinjenje 11 je bezbojna tečnosti, koja se lepi za zidove sudova. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 68 u Prilogu), uočavaju se dva signala kvazimolekulskih jona na m/z 371,0713 (preračunato 371,1829 za [M + Na]+) i m/z 387,0435 (preračunato 387,1568 za [M + K]+), što odgovara jedinjenju molekulske formule C20H28O5. U IR spektru jedinjenja 11 (Slika 86 u Prilogu), traka na 1759,1 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O u laktonu. Traka na 3498,1 cm─1 potiče od deformacionih vibracija slobodne hidroksilne grupe (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1D i 2D NMR spektara utvrđeno je prisustvo slobodne hidroksilne grupe na C-10 (δC 71,7 ppm u 13C NMR spektru). Multiplet na δH 2,73 ppm odgovara protonu na položaju C-11 (δC 36,6 ppm). To znači da jedinjenje 11 nema estar na položaju 11β. Takođe, signal tri protona metil grupe na položaju C-13 (δH 1,31 ppm) ima oblik dubleta, sa konstantom kuplovanja 7,8 Hz, što potvrđuje prisustvo protona na položaju C-11. 122 Analizom NMR spektara zaključeno je da je jedinjenje 11: 12 (Slika 31), lakton koji je prethodno izolovan iz herbe Seseli vayredanum (Barrero i sar., 1994). U okviru ove doktorske disertacije ovo jedinjenje je prvi put izolovano iz vrste roda Laserpitium – ekstrakta podzemnih organa L. zernyi. Podaci dobijeni 1D i 2D NMR eksperimentima za jedinjenje 11 dati su u Tabeli 27. 123 Tabela 27. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 11 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,43 m 55,9 14 5 2 α: 2,06 m β: 2,14 m 32,5 1 3 3 5,53 bs 125,5 5, 15 2 4 - 147,3 5, 15 - 5 2,62 q (5,7) 50,3 - 6 6 4,58 dd (11,4; 9,3) 81,0 5, 7 5, 7 7 3,07 m 45,7 13 6, 8 8 5,42 dd (10,5; 9,6) 66,7 - 7 9 α: 2,01 m β: 1,84 m 43,5 14 geminalno kuplovanje 10 - 71,7 14 - 11 2,73 m 36,6 13 13 12 - 179,8 13 - 13 1,31 d (7,8) 13,7 - 11 14 1,23 s 31,4 - - 15 1,88 s 18,9 - - Senecioil grupa ─C=O - 167,1 ─C(CH3)= ─CH= 5,66 m 115,7 ─CH(CH3) ─C=C(CH3)2 - 159,3 ─C(CH3)= =C(CH3)2 2,19 bd (1,2) 20,6 =C(CH3)2 1,93 bd (1,2) 27,8 OH O OO O H H 1 23 4 5 6 7 8 9 10 1112 14 15 H 13 Slika 31. Jedinjenje 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) 124 4. Identifikacija sekundarnih metabolita izolovanih iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum Ekstrakt podzemnih organa L. ochridanum imao je nešto kompleksniji hemijski sastav u odnosu na ekstrakt podzemnih organa L. zernyi. Iz njega je izolovano pet novih visoko hidroksilovanih i esterifikovanih derivata slovanolida (jedinjenja 12-16). Jedinjenja 12, 13, 15 i 16 su slovanolidni derivati sa dodatnom esterifikacijom u položaju 2β, po strukturi slični nekim visoko hidroksilovanim laktonima izolovanim iz korena Thapsia villosa L. i Laser trilobum (Smitalova i sar., 1985; Wagner Smitt i sar., 1990). Takođe, iz ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum izolovani su i jedan gvajanolidni i jedan eudezmanolidni lakton (jedinjenja 17 i 18), koji su prethodno izolovani iz nekih drugih vrsta roda Laserpitium (Stefanović i sar., 1977; Đermanović 1990; Milosavljavić i sar., 1999). 4.1. Jedinjenje 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olid) Jedinjenje 12 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 64-74, i dalje prečišćavano na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (70% MeOH : 30% H2O). Jedinjenje 12 je bezbojna čvrsta supstanca, koja se lepi za zidove sudova. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 69 u Prilogu), uočava se pojava signala kvazimolekulskog jona na m/z 511,2315 (preračunato 511,2302 za [M + Na]+), na osnovu čega je zaključeno da jedinjenju 12 odgovara molekulska formula C27H36O8. U IR spektru jedinjenja 12 (Slika 95 u Prilogu), traka na 1777,0 cm─1 koja potiče od valencionih vibracija veze C=O ukazuje na prisustvo laktonskog prstena (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1H (Slika 32) i 13C NMR spektara, uočeni su karakteristični signali za dva angelična i jedan acetatni estar (Tabela 28). U COSY spektru su uočljivi vandijagonalni signali skalarnog sprezanja protona na položajima C-1 sa protonima na C-2 i C-5, i protona na C-6 sa protonima na C-5 i C-7. Dalje, u NOESY spektru (Slika 33), vidi se sprezanje protona na C-1 (δH 3,37 ppm, dd: 8,1 i 3,3 Hz) i na C-5 (δH 3,15 ppm, m), kao i protona na C-6 (δH 4,68 ppm, dd: 11,0; 8,4 Hz), protona na C-7 (δH 3,06 ppm, dt: 10,5 i 9,0 Hz) i protona metil grupe C-14 (δH 1,48 ppm). Navedeni spektralni podaci ukazuju na 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidni skelet, 125 identičan prethodno opisanoj strukturi slovanolida (Smitalova i sar., 1984). Vandijagonalni signal za magnetno sprezanje (kroz prostor) protona na C-8 (δH 5,60 ppm, td: 11,4 i 2,7 Hz) i protona na C-1, ukazuje na β orjentaciju protona na C-8. Multiplet na δH 2,74 ppm koji se heteronuklearno spreže sa signalom ugljenikovog atoma C-11 (δC 36,9 ppm) u gHSQC spektru ukazuje da, kao i kod jednjenja 11, položaj 11 nije hidroksilovan i esterifikovan, kao što je to slučaj sa slovanolidima koji su ranije izolovani iz vrsta roda Laserpitium (Smitalova i sar., 1984; Stefanović i sar., 1977). U NOESY spektru uočen je vandijagonalni signal za dipolarno sprezanje protona na C-11 i na C-7, što ukazuje α orjentaciju protona na C-11. Takođe, u NOESY spektru uočava se i signal za dipolarno sprezanje protona na C-5, C-8 i protone metil grupe C-13 (1,36 ppm, d:7,5 Hz), što ukazuje na β orjentaciju metil grupe C-13. Ovo je potvrđeno i 1D NOE eksperimentima: ozračivanje protona na hemijskom pomeranju 1,36 ppm utiče na signale protona na C-5 i C-8. Razlika u hemijskom pomeranju za C-2 (δC 79,6 ppm) u 13C NMR spektru jedinjenja 12 u odnosu na hemijsko pomeranje za C-2 u 13C NMR spektru izomontanolida (δC 31,9 ppm) (Appendino i sar., 1985), posledica je esterifikacije položaja C-2. Signal protona na C-2 je širok dublet (δH 5,83 ppm) sa konstantom kuplovanja 2,7 Hz, što je u saglasnosti sa objavljenim konstantama kuplovanja za proton na položaju C-3 i α orjentisan proton na C-2 u molekulu slovanolida (Smitalova i sar., 1984). Dalje, u NOESY spektru se uočava vandijagonalni signal za dipolarno sprezanje protona α orjentisane metil grupe C-14 i protona na položaju C-2, što potvrđuje njegovu α orjentaciju. U 1D NOE eksperimentu, ozračivanje signala na δH 2,07 ppm, s, koji odgovara metil grupi acetatnog estra utiče na signal α orjentisanog protona na C-9 (δH 2,69 ppm), što ukazuje na α položaj acetatnog estra na C-8. Slika 32. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja 12. Karakteristični signali su uveličani i date su konstante kuplovanja (Hz). 126 Slika 33. NOESY spektar jedinjenja 12 sa obeleženim karakterističnim interakcijama Analizom 1D i 2D NMR spektara (Slike 100-104 u Prilogu) zaključeno je da je jedinjenje 12: 8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (Slika 34). Hemijska pomeranja i konstante kuplovanja ovog jedinjenja u skladu su sa prethodno objavljenim rezultatima za 2β-esterifikovane gvajanolidne laktone (Appendino i sar., 1985; Smitalova i sar., 1985; Wagner Smit i sar., 1990). Podaci dobijeni iz 1D i 2D NMR spektara dati su u Tabeli 28. Odabrane NOESY interakcije su prikazane na 3D strukturi minimalne energije, nacrtane u Chem3D programu (Slika 35). 127 128 Tabela 28. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC, COSY i NOESY, za jedinjenje 12 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY NOESY 1 3,37 dd (8,1; 3,3) 52,8 14 2,5 5,8 2 5,83 bd (2,7) 79,6 1 1, 3 3,14 3 5,66 bd (2,7) 127,0 15 2 2,15 4 - 149,1 15 - - 5 3,15 m 51,2 15 1, 6 1, 13 6 4,68 dd (11,0; 8,4) 79,6 - 5, 7 7,14 7 3,06 dt (10,5; 9,0) 47,3 13 6 6, 11 8 5,60 td (11,4; 2,7) 66,2 9 - 1, 13 9 α: 2,69 dd (15,0; 2,7) β: 2,14 d (15,3) 44,1 14 8, geminalno kuplovanje α: Ac (–CH3) 10 - 81,5 1, 9 α, 14 - - 11 2,74 m 36,9 13 13 7 12 - 179,0 13 - - 13 1,36 d (7,5) 13,9 - 11 5, 8, 11 14 1,48 s 26,8 - - 2, 6 15 1,91 s 19,0 - - 3 Angeloil grupa ─C=O - - 167,8 166,5 ─C(CH3)= - - ─C(CH3)= - - 128,1 127,0 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─C=CH─ 6,09 m 6,04 m 139,3 138,1 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─CH(CH3) 1,96 m 1,98 m 16,1 16,0 ─C=CH─ - - ─C(CH3) 1,89 m 1,85 m 20,8 20,8 ─C=CH─ - - Acetil grupa ─C=O - 170,5 ─CH3 (Ac) - - ─CH3 2,07 s 22,6 - - 9α 129 O O O O H O H O H O 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 O Slika 34. Jedinjenje 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olid) 130 Slika 35. Odabrane NOESY interakcije jedinjenja 12, prikazne na 3D strukturi minimalne energije, nacrtane u Chem3D programu: (a) naznačene su interakcije između β orjentisanih protona (1-hemijska fomula; 2-predložen 3D model); (b) naznačene su interakcije između α orjentisanih protona (1-hemijska fomula; 2-predložen 3D model) 4.2. Jedinjenje 13 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olid) Jedinjenje 13 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 93 − 98, zajedno sa jedinjenjima 14 i 15. Ova tri jedinjenja su iz spojenih frakcija dalje razdvajana na 131 semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Po uparavanju rastvarača, jedinjenje 13 iskristalisalo je u vidu finog kristalnog praška bele boje. Na osnovu pojave signala kvazimolekulskih jona na m/z 469,2212 i 485,1936 (preračunate m/z 469,2197 i 485,1936 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom) u HR-MS (ESI+) spektru (Slika 70 u Prilogu), zaključeno je da jedinjenju 13 odgovara molekulska formula C25H34O7. U IR spektru (Slika 88 u Prilogu), traka na 1770,1 cm─1 koja potiče od valencionih vibracija C=O veze, ukazuje na prisustvo laktonskog prstena, a široka traka na 3458,1 cm─1 ukazuje na prisustvo hidroksilne grupe u molekulu (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1H i 13C NMR spektara ustanovljena je velika sličnost jedinjenja 13 sa prethodno okarakterisanim jedinjenjem 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi- 6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olidom). U NMR spektrima jedinjenja 13 (Slike 103-107 u Prilogu), uočljivi su karakteristični signali koji potiču od dve angeloiloksi grupe. Hemijska pomeranja u protonskom i ugljeničnom NMR spektru ukazivala su na strukturu slovanolida sa identično vezanim prstenovima kao kod jedinjenja 12. Kao i u slučaju jedinjenja 12, prisustvo protona (δH 2,75 ppm, m) na C-11 ukazuje da ni jedinjenje 13 nije esterifikovano u ovom položaju. U NOESY spektru jedinjenja 13 uočeni su vandijagonalni signali sprezanja protona metil grupe C-13 (δH 1,33 ppm, d: 7,8 Hz) sa β orjentisanim protonom na C-5 (δH 3,00 ppm, dd: 11,5 i 6,9 Hz) i C-8 (δH 5,45 ppm, td: 9,3 i 2,4 Hz), kao i vandijagonalni signali sprezanja α protona na C-7 (δH 3,13 ppm, dt: 10,8 i 9,0 Hz) i na C-11. Sa druge strane, hemijsko pomeranje u 13C NMR spektru za C-10 (δC 71,2 ppm) ukazuje na prisustvo slobodne hidroksilne grupe na C-10, što objašnjava i veću polarnost ovog jedinjenja u odnosu na jedinjenje 12. Hemijsko pomeranje protona na C-2 (δH 5,70 ppm, bdd: 5,7 i 1,8 Hz), kao i COSY spektar ukazuju, kao i u slučaju jedinjenja 12, na esterifikaciju položaja 2. U NOESY spektru, proton na C-2 daje vandijagonalne signale sa protonima na C-6 i α orjentisanom metil grupom C-14, što ukazuje da su ovi protoni prostorno bliski, odnosno da je proton na C-2 α orjentisan. Takođe, odgovarajući spektralni podaci i 132 konstante kuplovanja su u saglasnosti sa spektrima za 2β-esterifikovane gvajanolide (Smitalova i sar., 1985; Bruno i sar., 1997; Vajs i sar., 2000; Wagner Smitt i sar., 1990). Zaključeno je da je jedinjenje 13: 8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid (Slika 36). 1D i 2D NMR podaci jedinjenja 13 dati su u Tabeli 29. Tabela 29. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC, COSY i NOESY, za jedinjenje 13 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY NOESY 1 2,76 m 57,9 5, 9, 14 2, 5 5, 8, 13 2 5,70 bdd (5,7; 1,8) 79,1 1 1, 3 3, 6, 14 3 5,57 bd (1,8) 126,6 5, 15 2 2, 15 4 - 150,1 5, 15 - - 5 3,00 dd (11,5; 6,9) 51,2 1, 15 1, 6 1, 13 6 4,58 dd (11,7; 8,7) 81,4 1, 5, 7 5, 7 2, 7, 14 7 3,13 dt (10,8; 9,0) 46,8 9, 13 6 6, 11 8 5,45 td (9,3; 2,4) 66,5 7, 9, 14 9 1, 13 9 α: 2,14 dd (15,0; 2,4) β: 2,08 d (15,3) 46,2 1, 14 8, geminalno kuplovanje α: 14 10 - 71,2 1, 9, 14 - - 11 2,75 m 36,3 13 13 7 12 - 179,1 13 - - 13 1,33 d (7,8) 13,8 11 11 1, 5, 8 14 1,24 s 30,5 1 - 2, 6, 9α 15 1,95 s 18,3 3 - 3 Angeloil grupa ─C=O - - 168,5 167,8 ─C(CH3)= - - ─C(CH3)= - - 127,7 127,4 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─C=CH─ 6,16 m 6,12 m 139,8 139,3 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─CH(CH3) 2,00 m 1,98 m 16,1 16,1 ─C=CH─ - - ─C(CH3) 1,87 m 1,88 m 20,7 20,7 ─C=CH─ - - 133 O OH O O H O H O O H 1 2 5 3 4 6 7 8 9 10 14 11 12 13 15 Slika 36. Jedinjenje 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6- -olid) 4.3. Jedinjenje 14 (8α-angeloiloksi-11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid) Jedinjenje 14 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 93 − 98, zajedno sa jedinjenjima 13 i 15. Spojene frakcije su razdavjane na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Jedinjenje 14 je iskristalisalo u vidu beličastog kristalnog praška. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 71 u Prilogu), uočavaju se molekulski jon na m/z 447,2411 (preračunato 447,2377 za [M + H]+) i kvazimolekulski joni na m/z 469,2241 i 485,1982 (preračunato 469,2197 i 485,1936 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), iz čega sledi da jedinjenju 14 odgovara molekulska formula C25H34O7. U IR spektru jedinjenja 14 (Slika 89 u Prilogu), traka na 1783,5 cm─1 potiče od valencionih vibracija veze C=O u laktonskom prstenu (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1D (1H i 13C) i 2D (COSY, gHSQC, gHMBC) NMR spektara, zaključeno je da je jedinjenje 14 lakton slovanolidne strukture sa karakterističnim esterifikacijama u položajima C-8 i C-11, i slobodnom hidroksilnom grupom u položaju C-10. Karakteristična skalarna sprezanja protona označena su u COSY spektru jedinjenja 14 (Slika 37). Analizom karakterističnih hemijskih pomeranja u 1D NMR spektrima (protonski NMR spektar je dat na Slici 110 u Prilogu), zaključeno je da je jedinjenje 14 veoma 134 slično prethodno okarakterisanom tarolidu (Odeljak 3.1), čija je 1βH,5βH,6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olidna struktura potvrđena NOESY eksperimentom. U 1D NOE eksperimentu, ozračivanje signala na δH 4,75 ppm (dd: 11,4 i 9,9 Hz) koji je signal protona na C-6, pogađa i signal protona na C-7 (δH 3,71 ppm, dd: 11,1 i 9,9 Hz), što je u saglasnosti sa podacima za cis položaj laktonskog prstena u strukturi slovanolida. Jedinjenje 14 i tarolid razlikuju se po estarski vezanom bočnom lancu: u slučaju tarolida za osnovni skelet vezane su dve angeloiloksi grupe, dok jedinjenje 14 ima jednu angeloiloksi i jednu senecioiloksi grupu. Potvrda prisustva senecioil estra je pojava multipleta alkenskog protona na δH 5,63 ppm i signala po tri protona metil grupa (δH 1,89 ppm bs i δH 2,14 ppm bd: 1,6 Hz), što je zajedno sa drugim 1D NMR podacima u saglasnosti sa prethodno objavljenim podacima za senecioil estar (Wagner Smitt i sar., 1990). 1D (1H i 13C) i 2D (COSY i gHMBC) NMR podaci jedinjenja 14 dati su u Tabeli 30. U gHMBC spektru uočava se korelacioni signal između karbonilnog ugljenika angeloil estra i β orjentisanog protona na C-9 (δH 1,79 ppm m), iz čega se zaključuje da je jedinjenje 14: 8α-angeloiloksi,11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en- -12,6-olid (Slika 38). 135 Slika 37. COSY spektar jedinjenja 14 sa karakterističnim skalarnim sprezanjima protona koja ukazuju na strukturu slovanolida 136 Tabela 30. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 14 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,41 m 56,1 9β 5 2 α: 2,04 m β: 2,12 m 32,4 - geminalno kuplovanje 3 5,55 bd (1,9) 125,9 5, 15 2 4 - 147,5 15 - 5 2,59 q (5,7) 49,6 - 1, 6 6 4,75 dd (11,4; 9,9) 78,4 5, 7 5, 7 7 3,71 dd (11,1; 9,9) 47,8 9, 13 6 8 5,54 bt (10,1) 67,2 9β - 9 α: 2,09 dd (16,8; 2,7) β: 1,79 m 43,8 14 - 10 - 71,5 9, 14 - 11 - 77,8 7, 13 - 12 - 174,8 13 - 13 1,55 s 20,4 - - 14 1,22 s 31,3 - - 15 1,85 s 19,0 - - Angeloil grupa ─C=O - 168,1 ─C(CH3)= - ─C(CH3)= - 127,3 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─C=CH─ 6,17 m 140,8 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─CH(CH3) 1,99 m 16,1 ─C=CH─ - ─C(CH3) 1,85 m 20,5+ ─C=CH─ - Senecioil grupa ─C=O - 165,4 ─C(CH3)= ─CH= 5,63 m 115,0 ─CH(CH3) ─C=C(CH3)2 - 160,3 ─C(CH3)= =C(CH3)2 1,89 bs 27,8 =C(CH3)2 2,19 bd (1,2) 20,6 137 O OH O O H H O H 1 2 5 3 4 6 7 8 9 10 14 11 12 13 15 O O Slika 38. Jedinjenje 14 (8α-angeloiloksi-11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid) 4.4. Jedinjenje 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien- -12,6-olid) Jedinjenje 15 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 93 − 98, zajedno sa jedinjenjima 13 i 14. Dalje prečišćavanje vršeno je na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (35% MeCN : 35% MeOH : 30% H2O). Po uparavanju rastvarača, jedinjenje 15 se u vidu bezbojne čvrste supstance lepilo po zidovima suda. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 72 u Prilogu), na osnovu pojave dva signala kvazimolekulskih jona na m/z 467,2043 i 483,1810 (preračunate m/z 467,2040 i 483,1780 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), zaključeno je da jedinjenju 15 odgovara molekulska formula C25H32O7. U IR spektru (Slika 90 u Prilogu), traka na 1740,9 cm─1 ukazuje na prisustvo α,β-nezasićenog petočlanog laktonskog prstena (Williams i Fleming, 1995). Pojava apsorpcione trake na pomeranju karakterisičnom za nezasićene laktone, ali i 13C NMR spektar (Tabela 31), koji je bio sličan prethodno objavljenim spektrima za gvajanolide sa nezasićenjem u laktonskom prstenu (Smitalova i sar., 1984), kao i razlika u molekulskoj formuli, navela je na zaključak da jedinjenje 15 ima jednu dvostruku vezu više u odnosu na prethodno izolovana i strukturno okarakterisana jedinjenja. Takođe, karakteristični signali u 1H NMR spektru (Slika 39) nisu imali oblik i hemijska pomeranja kao kod prethodno izolovanih i okarakterisanih slovanolidnih derivata, a u 138 COSY spektru (Slika 40) nije bilo karakterističnih skalarnih sprezanja između protona na C-6 i C-7, kao ni između protona C-7 i C-8, što je ukazalo na odsustvo protona na položaju C-7. U NOESY spektru uočava se vandijagonalni korelacioni signal za sprezanje protona na položaju C-6 (δH 4,94 ppm, bd: 9,0 Hz) i protona metil grupe C-14 (δH 1,34 ppm, s), što ukazuje na činjenicu da su ovi protoni α orjentisani. Navedeni podaci ukazuju na prisustvo još jedne dvostruke veze u strukturi gvajanolida između položaja C-7 i C-11, što potvrđuju signali na δC 158,8 i 128,2 ppm za C-7 i C-11, redom u 13C NMR spektru. Signal na δC 71,7 ppm (C-10) u 13C NMR spektru odgovara ugljeniku C-10 za koji je vezana hidroksilna grupa (Appendino i sar., 1985). Takođe, u NMR spektrima uočljivi su karakteristični signali za dva angelična estra. Slično jedinjenjima 12 i 13, gHSQC spektar (Slika 114 u Prilogu) jedinjenja 15 ukazuje na skalarno heteronuklearno sprezanje protona (δH 5,82 ppm, bd: 7,0 Hz) i C-2 ugljenika (δC 78,9 ppm), zbog prisustva estra na položaju C-2. U NOESY spektru (Slika 116 u Prilogu) prisutni su vandijagonalni signali sprezanja protona na položaju C-6, protona metil grupe C-14 i protona na položaju C-2, što ukazuje na β orjentaciju estra na C-2. Ovi podaci su u saglasnosti sa prethodno objavljenim podacima za C-2 β esterifikovane gvajanolide (Smitalova i sar., 1985; Wagner Smit i sar., 1990). Takođe, u NOESY spektru uočava se i vandijagonalni signal sprezanja protona na C-8 (δH 6,22 ppm) i β protona na C-9 (δH 2,20 ppm). Iz svega navedenog zaključeno je da je jedinjenje 15: 2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid (Slika 41). Slika 39. 1H NMR (300 MHz) spektar jedinjenja 15. Karakteristični signali su uveličani i označene su konstante kuplovanja (u Hz). 139 Slika 40. COSY spektar jedinjenja 15. Na spektru su označena karakteristična skalarna sprezanja. 140 141 Tabela 31. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC, COSY i NOESY, za jedinjenje 15 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY NOESY 1 2,66 m 60,0 3, 9, 14 2,5 5 2 5,82 bd (7,0) 78,9 1,3 1 3, 6, 9α, 14 3 5,60 bs 126,9 15 - 2, 15 4 - 149,3 3, 15 - - 5 2,61 m 54,5 1, 3, 15 1, 6 1 6 4,94 bd (9,0) 84,0 5, 8 5 2, 9α, 14 7 - 158,8 8, 9, 13 - - 8 6,22 dd (9,5; 5,4) 64,3 9 9 9β, 13 9 α: 2,34 d (9,5) β: 2,20 d (15,3) 40,1 14 8, geminalno kuplovanje α: 2, 6, 14 β: 8 10 - 71,7 1, 9, 14 - - 11 - 128,2 13 - - 12 - 173,6 13 - - 13 1,90 s 20,5 8 - 8 14 1,34 s 31,9 9 - 2, 6, 9α 15 2,02 s 17,8 - - 3 Angeloil grupa ─C=O - - 168,3 166,7 ─C(CH3)= - - ─C(CH3)= - - 127,6 127,2 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─C=CH─ 6,12 m 6,12 m 139,9 139,5 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─CH(CH3) 1,98 m 1,97 m 16,1 16,1 ─C=CH─ - - ─C(CH3) 1,90 m 1,89 m 20,8 20,7 ─C=CH─ - - 142 Slika 41. Jedinjenje 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien- 12,6-olid) 4.5. Jedinjenje 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid) Jedinjenje 16 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 99 − 101. Dalje prečišćavanje spojenih frakcija vršeno je na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (60% MeOH : 40% H2O). Po uparavanju rastvarača, jedinjenje 16 se istaložilo kao prozirna čvrsta supstanca. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 73 u Prilogu), na osnovu pojave dva signala kvazimolekulskih jona na m/z 527,2263 i 543,2035 (preračunate m/z 527,2252 i 543,1991 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), zaključeno je da jedinjenju 16 odgovara molekulska formula C27H36O9. U IR spektru jedinjenja 16 (Slika 91 u Prilogu), traka na 1781,9 cm─1 ukazuje na prisustvo petočlanog laktonskog prstena (Williams i Fleming, 1995). To potvrđuje i prisustvo signala na δC 178,6 ppm u 13C NMR spektru. NMR podaci (Tabela 32) ukazuju na prisustvo dva angelična i jednog acetatnog estra u strukturi. NMR spektri jedinjenja 16 (Slike 117-121, u Prilogu), u izvesnoj meri su slični NMR spektrima jedinjenja 12, ali i prethodno objavljenim NMR spektrima za lakton tarolid. Takođe, NOESY spektar jedinjenja 16 ukazivao je na karakterističnu strukturu slovanolida. Odsustvo signala u 1H NMR spektru za proton na položaju C-11 (δC 73,6 ppm), ukazuje 143 na esterifikaciju tog položaja. Hemijsko pomeranje protona na C-2 (δH 5,82 ppm, bm) ukazuje na prisustvo estra na položaju C-2. Korelacioni signal protona na položaju C-2 i protona na položaju C-6 (δH 4,68 ppm, dd: 12,0 i 9,6 Hz) i protona metil grupe C-14 (δH 1,43 ppm, s) u NOESY spektru, ukazuje na α orjentaciju protona na položaju C-2. Protoni acetatnog estra daju korelacione signale sa α orjentisanim protonom na položaju C-9 (δH 2,70 ppm, dd: 15,4 i 2,0 Hz), ali i sa protonima metil grupe C-14, što ukazuje na α orjentaciju acetatnog estra na položaju C-8. Analizom gHSQC i gHMBC spektara jedinjenja 16, kao i poređenjem sa podacima prethodno analiziranih jedinjenja, zaključeno je da je jedinjenje 16: 8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi- -6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (Slika 42). 144 Tabela 32. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC, COSY i NOESY, za jedinjenje 16 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY NOESY 1 3,33 q (3,6) 52,8 14 2, 5 5, 8 2 5,82 bm 79,1 - 1, 3 3, 14 3 5,67 bd (2,7) 127,3 15 2 2, 15 4 - 149,0 15 - - 5 3,11 m 49,6 15 1, 6 1, 13 6 4,68 dd (12,0; 9,6) 77,6 - 5, 7 2, 7, 14 7 3,06 dd (10,5; 9,3) 53,9 13 6 6 8 5,80 td (10,8; 1,8) 65,2 9 7, 9 1, 13 9 α: 2,70 dd (15,4; 2,0) β: 2,19 d (15,4) 44,3 14 8, geminalo kuplovanje α: Ac (–CH3) 10 - 81,3 9, 14 - - 11 - 73,6 13 - - 12 - 178,6 13 - - 13 1,60 s 23,1 - - 5, 8 14 1,43 s 26,9 - - 2, 6 15 1,93 s 17,7 - - 3 Angeloil grupa ─C=O - - 167,7 166,7 ─C(CH3)= - - ─C(CH3)= - - 128,0 127,7 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─C=CH─ 6,12 m 6,07 m 139,3 138,2 ─CH(CH3) ─C(CH3) - - ─CH(CH3) 1,99 m 1,97 m 16,1 16,0 ─C=CH─ - - ─C(CH3) 1,88 m 1,87 m 20,8 20,6 ─C=CH─ - - Acetil grupa ─C=O - 170,5 ─CH3 (Ac) - - ─CH3 2,06 s 22,6 - - 9α 145 O OH O O H H O H 1 2 5 3 4 6 7 8 9 10 14 11 12 13 15 O O O O Slika 42. Jedinjenje 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid) 4.6. Jedinjenje 17 (8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) Jedinjenje 17 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 48 − 51. Dalje prečišćavanje vršeno je na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (60% MeOH : 40% H2O). Jedinjenje 17 izolovano je kao prozirna čvrsta supstanca koja se lepila po zidovima suda. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 74 u Prilogu), na osnovu pojave signala molekulskog jona m/z 391,2177 (preračunato 319,2115 za [M + H]+) i pojave dva signala kvazimolekulskih jona na m/z 413,1970 i 429,1727 (preračunate m/z 413,1935 i 4429,1674 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), zaključeno je da jedinjenju 17 odgovara molekulska formula C22H30O6. U IR spektru jedinjenja 17 (Slika 92 u Prilogu), traka na 1773,7 cm─1 ukazuje na prisustvo petočlanog laktonskog prstena u strukturi. Traka na 1715,1 cm─1 potiče od karbonilne grupe α,β-konjugovanog estra (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1D i 2D NMR spektara utvrđeno je da se radi o laktonu gvajanolidne strukture. U NMR spektrima uočeni su karakteristični signali jedne angeloiloksi i jedne acetoksi grupe. Prisustvo multipleta u 1H NMR spektru (δH 2,69 ppm) koji u gHSQC spektru daje korelacioni signal sa C-11 (δC 36,7 ppm), ukazuju da položaj C-11 nije 146 esterifikovan. Signal u 13C spektru za ugljenik C-10 je na δC 83,2 ppm, što ukazuje na esterifikaciju položaja C-10. Daljom analizom COSY, gHSQC i gHMBC spektara (Tabela 33), zaključeno je da je jedinjenje 17: 8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH- -gvajan-3-en-12,6-olid (Slika 43). Ovaj lakton je ranije izolovan iz herbe L. krapfii subsp. krapfii (sub L. marginatum) (Đermanović, 1990; Milosavljević i sar., 1999). Tabela 33. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 17 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 2,81 m 53,1 5, 14 2, 5 2 α: 2,20 m β: 2,29 m 32,3 - 2, 3, geminalno kuplovanje 3 5,54 bm 125,5 15 2 4 - 146,3 15 - 5 2,63 m 50,5 15 1, 6 6 4,61 dd (11,4; 9,0) 80,6 5 5, 7 7 3,06 ql (9,0) 47,0 5, 9, 13 6 8 5,58 dd (10,8; 9,9) 65,2 9 - 9 α: 2,68 d (12,0) β: 2,06 m 41,0 14 geminalno kuplovanje 10 - 83,2 14 - 11 2,69 m 36,7 13 13 12 - 179,4 13 - 13 1,37 d (7,8) 14,0 - 11 14 1,56 s 25,3 - - 15 1,89 bs 18,6 - - Angeloil grupa ─C=O - 166,7 ─C(CH3)= - ─C(CH3)= - 127,8 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─C=CH─ 6,05 m 138,2 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─CH(CH3) 1,95 m 16,0 ─C=CH─ - ─C(CH3) 1,85 m 20,7 ─C=CH─ - Acetil grupa ─C=O - 170,7 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,12 s 22,9 - - 147 O O O O H H H 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13 14 15 O O Slika 43. Jedinjenje 17 (8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) 4.7. Jedinjenje 18 (izosilerolid) Jedinjenje 18 je sa kolone silikagela eluirano u frakcijama 57 − 60. Dalje prečišćavanje vršeno je na semipreparativnoj HPLC koloni u izokratskim uslovima (70% MeOH : 30% H2O). Jedinjenje 18 izolovano je kao beličasta praškasta supstanca. U HR-MS (ESI+) spektru (Slika 75 u Prilogu), javljaju se signali molekulskog jona na m/z 319,2120 (preračunato 319,2115 za [M + H]+) i dva kvazimolekulska jona na m/z 413,1944 i 429,1689 (preračunate m/z 413,1935 i 429,1674 za [M + Na]+ i [M + K]+, redom), što znači da jedinjenju 18 odgovara molekulska formula C22H30O6. U IR spektru jedinjenja 18 (Slika 93 u Prilogu), traka na 1780,6 cm─1 ukazuje na prisustvo laktonskog prstena. Traka na 1724,0 cm─1 potiče od karbonilne grupe estra sa konjugovanom dvostrukom vezom (Williams i Fleming, 1995). Analizom 1D i 2D NMR spektara utvrđeno je da se radi o laktonu eudezmanolidne strukture, tačnije sa strukturom 6αH,7αH-eudezman-3-en-6,12-olida, esterifikovnog u položajima 1β i 11α. U NMR spektrima je uočena izvesna podudarnost sa strukturom silerolida. Ali, na osnovu prisustva multipleta na δH 6,15 ppm i signala protona dve metil grupe na δH 1,88 ppm (m) i 1,98 ppm (m), utvrđeno je prisustvo jedne angeloiloksi grupe, pored jedne acetoksi grupe. Daljom analizom NMR spektara (podaci dati u Tabeli 34), zaključeno je da je jedinjenje 18 izosilerolid, odnosno 148 1β-acetoksi,11α-angeloiloksi-6αH,7αH-eudezman-3-en-6,12-olid (Slika 44), prethodno izolovan iz podzemnih organa L. siler (Smitalova i sar., 1984; Milosavljević i sar., 1999). Tabela 34. Podaci dobijeni iz NMR spektara: 1H (300 MHz), 13C (75 MHz), gHMBC i COSY, za jedinjenje 18 Položaj δH (J u Hz) δC gHMBC COSY 1 4,61 d (3,6) 75,3 14 2 2 α: 2,04 m β: 2,37 m 29,0 - 1, 3, geminalno kuplovanje 3 5,33 bs 119,8 15 2 4 - 133,5 15 - 5 2,42 bs 42,1 14 6 6 4,85 dd (11,1; 8,7) 78,5 - 5, 7 7 3,24 dd (14,7; 6,6) 39,6 13 6 8 α: 1,81 m β: 1,68 m 19,0 - geminalno kuplovanje 9 α: 1,65 m β: 1,21 m 30,7 14 geminalno kuplovanje 10 - 36,3 14 - 11 - 80,3 13 - 12 - 174,9 13 - 13 1,60 s 20,3 - - 14 0,87 s 18,3 - - 15 1,90 s 23,2 - - Angeloil grupa ─C=O - 166,6 ─C(CH3)= - ─C(CH3)= - 127,2 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─C=CH─ 6,15 m 140,7 ─CH(CH3) ─C(CH3) - ─CH(CH3) 1,98 m 16,2 ─C=CH─ - ─C(CH3) 1,88 m 20,6 ─C=CH─ - Acetil grupa ─C=O - 170,9 ─CH3 (Ac) - ─CH3 2,04 s 21,5 - - 149 Slika 44. Jedinjenje 18 (izosilerolid, tj. 1β-acetoksi,11α-angeloiloksi-6αH,7αH- eudezman-3-en-6,12-olid) 150 5. HPLC analiza hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum 5.1. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. latifolium HPLC analizom hloroformskih ekstrakata (u metanolu rastvorljivih delova) podzemnih organa i herbe L. latifolium utvrđena je njihova međusobna sličnost u pogledu glavnih sastojaka. HPLC hromatogrami dobijeni u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida (detekciona talasna dužina 225 nm) dati su na Slici 45. Glavna jedinjenja ovih ekstrakata obeležena su brojevima 1-4. Dominantan pik (retenciono vreme 18,22 min) na oba HPLC hromatograma odgovara laserpicinu (jedinjenje 1). Pik na retencionom vremenu 25,84 min potiče od acetildezoksodehidrolaserpicina (jedinjenje 2), a pik na 20,86 min potiče od laserina (jedinjenje 3). Pik na znatno kraćem retencionom vremenu (6,47 min) potiče od latifolona (jedinjenje 4). Slika 45. HPLC hromatogrami u metanolu rastvorljivih delova hloroformskih ekstrakata (1 mg/ml) L. latifolium (225 nm) u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida: a) HPLC hromatogram ekstrakta podzemnih organa; b) HPLC hromatogram ekstrakta herbe. Određivanje sadržaja laserpicina (1), acetildezoksodehidrolaserpicina (2), laserina (3) i latiofolona (4), izvršena je u gradijent HPLC uslovima optimizovanim za 151 razdvajanje terpenoida, na detekcionoj talasnoj dužini 225 nm. Kvantifikacija je izvršena metodom eksternog standarda. Izolovana jedinjenja korišćena su kao eksterni standardi u opsegu koncentracija 6,75–100 µg/ml. Konstruisane su kalibracione krive (linearnost potvrđena koeficijentima korelacije) i iz njih je preračunavan sadržaj jedinjenja u ekstraktima. Sadržaj jedinjenja 1-4 u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa L. latifolium, kao i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 35. Tabela 35. Sadržaj jedinjenja 1-4 u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu podzemnih organa L. latifolium i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u delu CHCl3 ekstrakta rastvorljivom u MeOH (mg/g) 1 laserpicin 327,91 353,73 2 acetildezoksi- dehidrolaserpicin 18,86 20,35 3 laserin 13,33 14,38 4 latifolon 11,74 12,76 Sadržaj jedinjenja 1-4 određen u hloroformskom ekstraktu herbe L. latifolium, kao i u delu hloroformskog ekstrakta restvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 36. Tabela 36. Sadržaj jedinjenja 1-4 u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu herbe L. latifolium i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u delu CHCl3 ekstrakta rastvorljivom u MeOH (mg/g) 1 laserpicin 237,77 263,31 2 acetildezoksi- dehidrolaserpicin 15,20 16,83 3 laserin 12,37 13,70 4 latifolon 8,42 9,32 152 5.2. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. zernyi HPLC analizom hloroformskih ekstrakata podzemnih organa, herbe i cvasti vrste L. zernyi (u metanolu rastvorljivih delova), uočena je izvesna sličnost u pogledu njihovih glavnih sastojaka. HPLC hromatogrami dobijeni u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida na detekcionoj talasnoj dužini 225 nm dati su na Slici 46. U Tabeli 37 dat je zbirni prikaz jedinjenja identifikovanih u svim ekstraktima L. zernyi, zajedno sa njihovim retencionim vremenima. Iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi u okviru ove doktorske disertacije, izolovano je i jedinjenje 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan- 3-en-12,6-olid), ali je njegova koncentracija u sirovom ekstraktu bila suviše niska da bi se uočio odgovarajući pik na HPLC hromatogramu. Inače, izolovano jedinjenje 11 na HPLC hromatogramu dobijenom u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida daje pik na retencionom vremenu 10,81 min. Tabela 37. Trivijalni nazivi i retenciona vremena jedinjenja identifikovanih u hloroformskim ekstraktima L. zernyi u HPLC uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida. Oznake pikova na HPLC hromatogramima odgovaraju brojevima jedinjenja Jedinjenje Trivijalan naziv Retenciono vreme 1 laserpicin 18,22 min 4 latifolon 6,47 min 5 tarolid 17,49 min 6 acetilizomontanolid 16,92 min 7 acetilmontanolid 16,40 min 8 silerolid 15,76 min 9 izomontanolid 10,60 min 10 montanolid 10,81 min 153 Slika 46. HPLC hromatogrami delova hloroformskih ekstrakata L. zernyi rastvorljivih u metanolu (1 mg/ml), u sistemu optimizovanom za razdvajanje terpenoida (λ=225 nm): a) HPLC hromatogram ekstrakta podzemnih organa; b) HPLC hromatogram ekstrakta herbe; c) HPLC hromatogram ekstrakta cvasti. Oznake pikova na HPLC hromatogramima odgovaraju brojevima jedinjenja datim u Tabeli 37. Kvantifikacija najzastupljenijih komponenata izvršena je u HPLC uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, na detekcionoj talasnoj dužini 225 nm. Kvantifikacija je izvršena metodom eksternog standarda. Kao eksterni standardi korišćena su jedinjenja 5-10, prethodno izolovana iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi, kao i jedinjena 1 i 4, prethodno izolovana iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium. Svi eksterni standardi korišćeni su u opsegu 154 koncentracija 6,75–100 µg/ml. Konstruisane su kalibracione krive (linearnost potvrđena koeficijentima korelacije) i iz njih je preračunavan sadržaj. Sadržaj jedinjenja 4-10 u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa L. zernyi, kao i delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 38. Tabela 38. Sadržaj jedinjenja 4-10 u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa L. zernyi i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u delu CHCl3 ekstrakta rastvorljivom u MeOH (mg/g) 4 latifolon 3,02 3,28 5 tarolid 22,73 24,65 6 acetilizomontanolid 66,46 72,08 7 acetilmontanolid 43,89 47,60 8 silerolid 26,37 28,60 9 izomontanolid 27,57 29,90 10 montanolid 88,17 95,63 Sadžaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom ekstraktu herbe L. zernyi, kao i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 39. Tabela 39. Sadržaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu herbe L. zernyi i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u delu CHCl3 ekstrakta rastvorljivom u MeOH (mg/g) 1 laserpicin 37,64 45,31 5 tarolid n. o.a n. o. 9 izomontanolid n. o. n. o. 10 montanolid 3,11 3,75 an. o.-sadržaj jedinjenja nije bilo moguće odrediti zbog suviše niske koncentracije 155 U hloroformskom ekstraktu cvasti L. zernyi detektovani su laserpicin, montanolid, izomontanolid i tarolid, ali su njihovi sadržaji bili previše niski da bi im se utvrdila tačna koncentracija. 5.3. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u hloroformskim ekstraktima L. ochridanum HPLC analizom hloroformskih ekstrakata podzemnih organa, herbe i ploda vrste L. ochridanum (u metanolu rastvorljivih delova), uočena je njihova izvesna međusobna sličnost u pogledu glavnih sastojaka. HPLC hromatogrami dobijeni u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida na detekcionoj talasnoj dužini 225 nm dati su na Slici 47. Zbirni prikaz jedinjenja identifikovanih u svim ekstraktima L. ochridanum i njihovih retencionih vremena identičan je onom datom za ekstrakte L. zernyi u Tabeli 37. Iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum u okviru ove doktorske disertacije, izolovana su i jedinjenja 12-18, ali je njihova koncentracija u sirovom ekstraktu bila suviše niska da bi se uočili njihovi pikovi na HPLC hromatogramu. Inače, izolovana jedinjenja 12, 13, 14, 15, 16, 17 i 18 na HPLC hromatogramu dobijenom u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, daju pikove na retencionim vremenima 20,90, 15,50, 17,50, 18,51, 16,62, 16,62 i 15,92 min, redom. 156 Slika 47. HPLC hromatogrami delova hloroformskih ekstrakata L. ochridanum rastvorljivih u metanolu (1 mg/ml), u sistemu optimizovanom za razdvajanje terpenoida (λ=225 nm): a) HPLC hromatogram ekstrakta podzemnih organa; b) HPLC hromatogram ekstrakta herbe; c) HPLC hromatogram ekstrakta ploda. Oznake pikova na HPLC hromatogramima odgovaraju brojevima jedinjenja u Tabeli 37. Kvantifikacija najzastupljenijih komponenata izvršena je u HPLC uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, na detekcionoj talasnoj dužini 225 nm, metodom eksternog standarda. Kao eksterni standardi korišćena su jedinjenja 5-10, prethodno izolovana iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi, kao i jedinjena 1 i 4, prethodno izolovana iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa 157 L. latifolium. Svi eksterni standardi korišćeni su u opsegu koncentracija 6,75–100 µg/ml. Konstruisane su kalibracione krive (linearnost potvrđena koeficijentima korelacije) i iz njih je preračunavan sadržaj. Sadržaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa L. ochridanum, kao i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivog u metanolu, dat je u Tabeli 40. Tabela 40. Sadržaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu podzemnih organa L. ochridanum i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u delu CHCl3 ekstrakta rastvorljivom u MeOH (mg/g) 4 latifolon 1,34 1,58 5 tarolid 174,34 205,11 6 acetilizomontanolid 79,48 93,50 7 acetilmontanolid n. o.a n. o. 8 silerolid n. o. n. o. 9 izomontanolid 34,56 40,66 10 montanolid 2,17 2,55 an. o.- sadržaj jedinjenja nije bilo moguće odrediti zbog suviše niske koncentracije Sadžaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom ekstraktu herbe L. ochridanum, kao i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 41. 158 Tabela 41. Sadržaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu herbe L. ochridanum i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u MeOH rastvorljiv deo CHCl3 ekstrakta (mg/g) 1 laserpicin 24,44 30,17 5 tarolid n. o.a n. o. 8 silerolid n. o. n. o. 9 izomontanolid n. o. n. o. 10 montanolid 4,15 5,12 an. o.- sadržaj jedinjenja nije bilo moguće odrediti zbog suviše niske koncentracije Sadžaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom ekstraktu ploda L. ochridanum, kao i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu, dat je u Tabeli 42. Tabela 42. Sadržaj najzastupljenijih jedinjenja u hloroformskom (CHCl3) ekstraktu ploda L. ochridanum i u delu hloroformskog ekstrakta rastvorljivom u metanolu (MeOH). Koncentracije su izražene u mg jedinjenja/g suvog ekstrakta. Jedinjenje Naziv Koncentracija u CHCl3 ekstraktu (mg/g) Koncentracija u MeOH rastvorljiv deo CHCl3 ekstrakta (mg/g) 1 laserpicin n. o.a n. o. 5 tarolid n. o. n. o. 9 izomontanolid 21,96 24,40 10 montanolid 14,65 16,28 an. o.- sadržaj jedinjenja nije bilo moguće odrediti zbog suviše niske koncentracije 5.4. Uporedna analiza rezultata dobijenih HPLC analizom hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum HPLC analizom, u uslovima optimizovanim za razdvajanje terpenoida, može se uočiti sličnost u pogledu hemijskog sastava hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium. Najzastuljenije komponente, odnosno jedinjenja 1-4, identične su u oba ekstrakta, samo je koncentracija svih detektovanih komponenata viša u hloroformskom ekstraktu podzemnih organa u odnosu na ekstrakt herbe L. latifolium. 159 Na HPLC hromatogramima hloroformskih ekstrakata podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum, uočava se prisustvo identičnih najzastupljenijih komponenata, jedinjenja 4-10, ali je dobijeni HPLC hromatogram podzemnih organa L. ochridanum kompleksnijeg izgleda. Pored seskviterpenskih laktona, u oba hloroformska ekstrakta podzemnih organa detektovan je latifolon (jedinjenje 4). Ekstrakti herbi vrsta L. zernyi i L. ochridanum, cvasti L. zernyi i ploda L. ochridanum su nešto kompleksnijeg sastava u odnosu na ekstrakte podzemnih organa. Zanimljivo je da je u ekstraktima herbi L. zernyi i L. ochridanum, kao i u ekstraktima cvasti L. zernyi i ploda L. ochridanum prisutan laserpicin (jedinjenje 1), glavni sastojak ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium. Laserpicin nije detektovan u ekstraktima podzemnim organima vrsta L. zernyi i L. ochridanum. Uporedni prikaz komponenata detektovanih HPLC analizom u analiziranim hloroformskim ekstraktima odabranih vrsta roda Laserpitium dat je u Tabeli 43. Tabela 43. Uporedni prikaz rezultata kvalitativne i kvantitativne HPLC-DAD analize delova hloroformskih ekstrakata rastvorljivih u metanolu u odabranim vrstama roda Laserpitium Sadržaj jedinjenja (%) L. latifolium L. zernyi L. ochridanum Jedinjenje Naziv podzemni organi herba podzemni organi herba cvast podzemni organi herba plod 1 laserpicin 35,37 26,33 - 4,53 + - 3,02 + 2 acetildezoksodehidrolaserpicin 2,03 1,68 - - - - - - 3 laserin 1,44 1,37 - - - - - - 4 latifolon 1,28 0,93 0,33 - - 0,16 - - 5 tarolid - - 2,47 + + 20,51 + + 6 acetilizomontanolid - - 7,21 - - 9,35 - - 7 acetilmontanolid - - 4,76 - - + - - 8 silerolid - - 2,86 - - + + - 9 izomontanolid - - 2,99 + + 4,07 + 2,44 10 montanolid - - 9,59 0,38 + 0,26 0,51 1,63 11 8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid - - + - - - - - 12 8α-acetoksi,2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid - - - - - + - - 13 2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid - - - - - + - - 14 8α-angeloiloksi-11α-senecioiloksi- 10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3- en-12,6-olid - - - - - + - - 160 161 Tabela 43 (nastavak) Sadržaj jedinjenja (%) L. latifolium L. zernyi L. ochridanum Jedinjenje Naziv podzemni organi herba podzemni organi herba cvast podzemni organi herba plod 15 2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid - - - - - + - - 16 8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi- 10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3- en-12,6-olid - - - - - + - - 17 8α-angeloiloksi-10β-acetoksi--6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-oli - - - - - + - - 18 izosilerolid - - - - - + - - „+“ – nije kvantifikovano, „-“– nije detektovano. 6. Sadržaj ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi Sadržaj ukupnih polifenola određen je u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe bez cvasti vrste L. zernyi prikupljenih na planini Jablanica u Makedoniji u julu 2006. godine. Sadržaj ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti oderđen je spektrofotometrijskim postupkom koji se zasniva na reakciji polifenolnih jedinjenja sa Folin-Ciocalteu reagensom (FC) u baznoj sredini, a rezultati su izraženi kao % galne kiseline, tj. kao mg galne kiseline u 100 mg suvog ekstrakta. Sadržaj ukupnih polifenola u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe (bez cvasti) L. zernyi iznosio je 14,32% i 6,83%, redom, preračunato kao galna kiselina. 7. HPLC analiza metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi 7.1. Identifikacija i kvantifikacija sekundarnih metabolita u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi HPLC analiza metanolnih ekstrakata cvasti i herbe (bez cvasti) vrste L. zernyi, prikupljene na planini Jablanica 2006. godine, izvršena je u gradijent sistemu optimizovanom za separaciju polifenolnih jedinjenja (flavonoida i fenolkarboksilnih kiselina). Hromatogrami metanolnih ekstrakata cvasti (5 mg/ml) i herbe (10 mg/ml) u sistemu optimizovanom za separaciju polifenola dati su na Slikama 48 i 49 (detekciona talasna dužina 330 nm). 162 163 Slika 48. Hromatogram metanolnog ekstrata cvasti L. zernyi u sistemu optimizovanom za separaciju polifenola, detekcija na 330 nm. Jedinjenja: 1) luteolin 7–O–glukozid, 2) apigenin 7– O–glukozid, 3) luteolin, 4) apigenin, 5) hlorogenska kiselina Slika 49. HPLC hromatogram metanolnog ekstrakta herbe L. zernyi u sistemu optimizovanom za separaciju polifenola, detekcija na 330 nm. Jedinjenja: 1) luteolin 7–O–glukozid, 2) apigenin 7–O–glukozid, 3) luteolin, 4) apigenin, 5) hlorogenska kiselina Uporedni prikaz HPLC hromatograma metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi pri identičnim koncentracijama (5 mg/ml) dat je na Slici 50. 164 Slika 50. Uporedni prikaz hromatograma metanolnih ekstrakata A) cvasti i B) herbe L. zernyi (5 mg/ml). Jedinjenja: 1) luteolin 7–O–glukozid, 2) apigenin 7–O–glukozid, 3) luteolin, 4) apigenin, 5) hlorogenska kiselina HPLC analizom, uz korišćenje standardnih supstanci, u oba uzorka konstatovano je prisustvo hlorogenske kiseline (Rt=7,84 min) i flavona: apigenina (Rt=28,85 min), luteolina (Rt=26,62 min), apigenin 7−O−glukozida (Rt=14,94 min) i luteolin 7−O-−glukozida (Rt=11,34 min) (Slike 53, 54 i 55). UV spektri identifikovanih jedinjenja su dati na Slici 51, a hemijske strukture flavonoida na Slici 52. Identifikovani flavoni i hlorogenska kiselina su pod istim eksperimentalnim uslovima kvantifikovani metodom eksternog standarda (opsezi koncentracija korišćeni za konstruisanje kalibracionih krivih: 0,50-4,00 mg/ml za apigenin; 0,25-2,00 mg/ml za apigenin 7−O−glukozid, luteolin 7−O−glukozid, i luteolin i 1,00-10,00 mg/ml za hlorogensku kiselinu). Linearnost kalibracionih krivih je potvrđena odgovarajućim faktorima korelacije. Sadržaj identifikovanih flavona i hlorogenske kiseline dat je u Tabeli 44. 165 nm200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 *DAD1, 11.664 (3137 mAU,Apx) Ref=4.384 & 19.504 of LC.D nm200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 *DAD1, 14.757 (1952 mAU, - ) Ref=4.384 & 19.504 of LC.D UV spektar luteolin 7−O−glukozida UV spektar apigenin 7−O−glukozida nm200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 *DAD1, 27.117 (1232 mAU, - ) Ref=19.504 & 34.197 of LC.D nm200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 *DAD1, 29.197 (1734 mAU, - ) Ref=19.504 & 34.197 of LC.D UV spektar luteolina UV spektar apigenina nm200 225 250 275 300 325 350 375 mAU 0 200 400 600 800 1000 1200 *DAD1, 7.984 (1298 mAU,Apx) Ref=4.384 & 19.504 of LC.D UV spektar hlorogenske kiseline 166 Slika 51. UV spektri jedinjenja identifikovanih u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi O OH HO O OH 1 45 7 4' 2) OH 3' Slika 52. Flavoni identifikovani u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi: 1) apigenin, 2) luteolin, 3) apigenin 7−O−glukozid, 4) luteolin 7−O−glukozid Tabela 44. Sadržaj identifikovanih flavona i hlorogenske kiseline u metanolnim ekstrakltima cvasti i herbe L. zernyi Jedinjenje MeOH ekstrakt cvasti L. zernyi (%) MeOH ekstrakt herbe L. zernyi (%) luteolin 7−O−glukozid 34,40 10,20 apigenin 7−O−glukozid 4,45 0,26 luteolin 0,19 n. o.a apigenin 2,21 0,09 hlorogenska kiselina 1,46 1,33 a n. o. sadržaj jedinjenja nije bilo moguće odrediti zbog suviše niske koncentracije Za razliku od etanolnih ekstrakata lista L. latifolium u kojima je, pored hlorogenske i neohlorogenske kiseline, detektovano prisustvo flavonola, odnosno heterozida kemferola i kvercetina (Vereskovskii i sar., 1992), metanolne ekstrakte cvasti i herbe vrste L. zernyi karakteriše, pored hlorogenske kiseline, i prisustvo flavona, tačnije apigenina i luteolina i njihovih 7−O−glukozida. 167 FARMAKOLOŠKA ISPITIVANJA 1. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum Antimikrobna aktivnost aromatičnih biljaka često je posledica antibakterijskog i antifungalnog dejstva njihovih etarskih ulja. Postoje brojne in vitro, in vivo i kliničke potvrde da etarska ulja, naročito ona bogata fenolima, deluju antimikrobno na različite sojeve Gram(+), Gram(−) bakterija i gljiva (Edris, 2007). Antimikrobni efekat, slično ostalim biološkim aktivnostima etarskih ulja, najverovatnije je posledica nekoliko istovremenih procesa, kao što su prolazak fenolnih sastojaka ulja kroz lipidni sloj membrane i povećanje membranske propustljivosti. Ovi procesi dovode do daljeg gubitka intracelularnog sadržaja i promene potencijala ćelijske membrane mikroorganizma. Takođe, neka etarska ulja menjaju sastav ćelijskih membrana, uključujući i bakterijske, pa to dovodi do gubitka integriteta i lize ćelije (Bevilacqua i sar., 2012). 1.1. Bujon mikrodilucioni test Antimikrobna aktivnost etarskih ulja izolovanih iz: ploda i podzemnih organa L. latifolium, herbe, ploda i podzemnih organa L. ochridanum i cvasti, herbe i podzemnih organa L. zernyi ispitivana je bujon mikrodilucionim testom, koristeći seriju razblaženja etarskih ulja u DMSO i odgovarajuće rastvore standardnih antibiotika: ampicilina i amikacina za ispitivanje antibakterijskog, i nistatina za ispitivanje antifungalnog dejstva. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK) ispitivanih uzoraka određivana je kao najmanja primenjena koncentracija etarskog ulja ili antibiotika/antimikotika, koja je dovela do inhibicije rasta mikroorganizma. Rezultati ispitivanja antibakterijske aktivnosti etarskih ulja i referentnih antibiotika ampicilina, amikacina i nistatina prema standardnim sojevima: četiri Gram(+) bakterije: Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228, Micrococcus luteus ATCC 9341, Enterococcus faecalis ATCC 29121, kao i tri Gram(–) bakterije: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae NCIMB 9111 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 i dva soja kandide: Candida albicans (ATCC 10259 i 24433) dati su u Tabeli 45. Tabela 45. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja odabranih vrsta roda Laserpitium i referentnih antibiotika ispitivana bujon mikrodilucionim testom M i k r o o r g a n i z a m S . a u r e u s A T C C 2 5 9 2 3 S . e p i d e r m i d i s A T C C 1 2 2 2 8 M . l u t e u s A T C C 9 3 4 1 E . f a e c a l i s A T C C 2 9 1 2 1 E . c o l i A T C C 2 5 9 2 2 K . p n e u m o n i a e N C I M B 9 1 1 1 6 P . a e r u g i n o s a A T C C 2 7 8 5 3 7 C . a l b i c a n s A T C C 1 0 2 5 9 C . a l b i c a n s A T C C 2 4 4 3 3 Etarsko ulje MIK (µg/ml) L. latifolium - podzemni organi >133,0 133,0 >133,0 >133,0 >133,0 >133,0 >133,0 >133,0 >133,0 L. latifolium - plod 36,5 73,0 18,3 >146,0 >146,0 >146,0 >146,0 >146,0 >146,0 L. ochridanum - podzemni organi 55,3 55,3 55,3 >110,7 >110,7 >110,7 >110,7 >110,7 27,7 L. ochridanum - herba 63,0 >126,0 >126,0 >126,0 >126,0 >126,0 >126,0 126,0 63,0 L. ochridanum - plod 13,0 13,0 52,1 >104,3 >104,3 >104,3 >104,3 52,1 104,3 L. zernyi - podzemni organi 63,7 31,8 63,7 >127,33 >127,33 >127,33 >127,33 127,3 >127,33 L. zernyi - herba >0,6×103 >0,6×103 0,6×103 n. t. 0,6×103 >0,6×103 >0,6×103 >0,6×103 n. t. L. zernyi - cvast 1,2×103 0,6×103 1,2×103 n. t. 0,6×103 0,6×103 1,2×103 0,6×103 n. t. Ampicilina 1,0 n. t. n. t. n. t. 8,0 n. t. n. t. n. t. n. t. Amikacin 2,0 n. t. n. t. n. t. 4,0 n. t. 2 n. t. n. t. Nistatin n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. 3,0 n. t. n. t. − nije testirano 168 Najjaču antibakterijsku aktivnost ispoljila su etarska ulja: ploda L. latifolium prema M. luteus (MIK=18,3 µg/ml), S. aureus (MIK=36,5 µg/ml) i S. epidermidis (MIK=73,0 µg/ml); ploda L. ochridanum prema S. aureus i S. epidermidis (MIK=13,0 µg/ml) i M. luteus (MIK=52,1 µg/ml); podzemnih organa L. ochridanum prema S. aureus, S. epidermidis i M. luteus (MIK=55,3 µg/ml) i podzemnih organa L. zernyi prema S. epidermidis (MIK=31,8 µg/ml) i S. aureus i M. luteus (MIK=63,7 µg/ml). Etarsko ulje herbe L. ochridanum ispoljilo je umeren antimikrobni efekat prema bakteriji S. aureus (MIK=63,0 µg/ml). Etarsko ulje ploda L. latifolum, kao i etarska ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum bogata su α-pinenom (44,0, 31,6 i 33,2%), dok je u etarskom ulju herbe L. ochridanum detektovan nešto niži sadržaj ovog monoterpena (7,4%). Antimikrobna aktivnost α-pinena potvrđena je brojnim in vitro testovima (Ojeda-Sana i sar., 2013; Rivas da Silva i sar., 2012; Stojković i sar., 2011). Ojeda-Sana i saradnici (2013) testirali su antibakterijsku aktivnost etarskog ulja lista ruzmarina, Rosmarinus officinalis L., i njegovih najzastupljenijih komponenata, među kojima je i α-pinen. U ovom ispitivanju α-pinen je ispoljio jak in vitro antibakterijski efekat prema S. aureus, E. faecalis, E. coli i K. pneumoniae (MIK=0,8-8,0 µl/ml). Stojković i saradnici (2011) utvrdili su za α-pinen jaku antibakterijsku aktivnost prema Gram(+) bakterijama: S. aureus, M. luteus i B. subtilis, kao i prema Gram(─) sojevima E. coli i Salmonella typhimurium (MIK= 5-10 µg/ml). Ovo jedinjenje je uz sabinen i 1,8-cineol najzastupljeniji sastojak etarskog ulja nedozrelih plodova i lista vrste Vitex agnus castus L., pa je u istom ispitivanju i ispoljena aktivnost etarskih ulja objašnjena delom i aktivnošću α-pinena. U etarskom ulju ploda L. latifolium detektovan je, u nešto višem sadržaju, i β-pinen (13,3%). U jednom istraživanju pokazano je da i (+)-β-pinen, pored (+)-α-pinena, ispoljava antimikrobno dejstvo na meticilin-rezistentni S. aureus (MRSA) i tri gljivična soja: C. albicans, Cryptococcus neoformans i Rhizopus oryzae (Rivas da Silva i sar., 2012). Ispoljeno antimikrobno dejstvo etarskog ulja ploda L. latifolum može se, dakle, dovesti u vezu sa relativno visokim sadržajem α- i β-pinena u njemu. Etarsko ulje ploda L. ochridanum izuzetno je bogato limonenom (57,7%). Ovaj monoterpenski ugljovodonik pokazao je izuzetno visoku aktivnosti prema četiri soja biljnih patogenih gljiva: Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Penecillium digitatum i Asperigallus niger (Rasoul i sar., 2012). Za neka etarska ulja koja kao glavnu 169 170 komponentu sadrže limonen, kao što su etarska ulja lista i stabla Chloroxylon swietenia D.C., pokazana je in vitro jaka antimikrobna aktivnost prema četiri bakterijska i četiri soja gljiva agar difuzionim i mikrodilucionim testom (Kiran i sar., 2008). Limonen se smatra aktivnim sastojkom ekstrakata vrsta roda Citrus, jer zajedno sa bioflavonoidima doprinosi njihovom jakom antimikrobnom efektu. Da bi se ispitala potencijalna upotreba limonena kao konzervansa u prehrambenoj industriji, testirana je in vitro antifungalna aktivnost na Saccharomyces bayanus, koja dovodi do fermentativnog kvarenja soka jabuke. Izolovan limonen, kao i “biocitro“ ekstrakt pripremljen od vrsta roda Citrus koji sadrži limonen, dovode do značajnog smanjenja brojnost kolonije S. bayanus ispod detekcionog limita u toku šest dana (Bevilacqua i sar., 2012). Etarska ulja podzemnih organa vrsta L. zernyi i L. ochridanum pokazala su antimikrobnu aktivnost prema Gram(+) bakterijskim sojevima S. aureus, S. epidermidis i M. luteus. Ova etarska ulja imaju, pored visokog sadržaja α-pinena, i relativno visok sadržaj α-bisabolola (30,9% i 10,3% u etarskom ulju podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum, redom), koji je čest sastojak kozmetičkih preparata zbog svojih antiiritantnih, antiinflamatornih i antibakterijskih svojstava (Kamatou i Viljoen, 2010). Van Zyl i saradnici (2006) su bujon mikrodilucionim testom utvrdili da α-bisabolol ima relativno nisku aktivnost prema S. aureus, Bacillus cereus i E. coli, i značajnu antifungalnu aktivnost (MIK=36 mM) prema C. albicans. Etarsko ulje lista Salvia rucinata L. (sa oko 60% α-bisabolola) ispoljilo je in vitro antibakterijsku aktivnost prema sojevima S. aureus, S. epidermidis, B. cereus i B. subtilis (MIK=1,6─3,1 mg/ml) (Kamatou i sar., 2005). Ispoljene aktivnosti etarskih ulja podzemnih organa L. latifolium, kao i aktivnosti etarskih ulja cvasti i herbe L. zernyi prema svim testiranim sojevima bile relativno slabe (MIK>100 µg/ml). Rezultati testiranja antifungalne aktivnosti prema dva soja kandide pokazuju da su najjači efekat ispoljila etarska ulja podzemnih organa i herbe L. ochridanum prema soju C. albicans ATCC 24433 (MIK=27,7 i 63,0 µg/ml, redom) i etarsko ulje ploda L. ochridanum prema soju C. albicans ATCC 10259 (MIK=52,1 µg/ml). Antifungalno dejstvo svih ostalih ispitivanih etarskih ulja bilo je slabo (MIK>100 µg/ml). U prethodnim istraživanjima α-pinen je pokazao izuzetno jak antifungalni efekat (MIK=5-8 µg/ml) na osam gljivičnih sojeva (Stojković i sar., 2011). Za 171 α-bisabolol, prisutan u višem procentu u etarskim uljima podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum, utvrđeno je da inhibira rast micelijuma gljive Botrytis cinerea čak pri koncentraciji 50 ppm (Nuňez i sar., 2007). Ranije potvrđeni antifungalni efekti α-pinena i α-bisabolola ukazuju na njihov mogući doprinos ispoljenom antifungalnom efektu ispitivanih etarskih ulja vrsta roda Laserpitium. Generalno se može zaključiti da su najsnažniji efekat ispoljila etarska ulja plodova L. latifolium i L. ochridanum i etarska ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi prema Gram(+) bakterijama S. aureus, S. epidermidis i M. luteus, kao i etarsko ulje herbe L. ochridanum prema bakteriji S. aureus. Etarska ulja podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum inhibirala su rast po jednog soja C. albicans. Ispoljena antimikrobna aktivnost etarskih ulja se može objasniti prisustvom komponenata za koje je ranije utvrđeno da ispoljavaju antibakterijsko dejstvo kao što su α-pinen, detektovan u znatnoj količini u etarskim uljima ploda L. latifolium i podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi, limonen, koji je dominantan sastojak etarskog ulja ploda L. ochridanum, kao i α-bisabolol u etarskim uljima podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum. 1.2. Agar difuzioni test Antimikrobna aktivnost etarskih ulja cvasti i herbe L. zernyi ispitivana je i agar difuzionim testom, a rezultati su dati u Tabeli 46. Prečnici zona ihibicije za referentne antibiotike (ampicilin i amikacin) i antimikotik nistatin, dati su takođe u Tabeli 46. Etarska ulja su primenjena u koncentraciji 225 µg po disku. Dobijeni rezultati, odnosno relativno mali prečnici zona inhibicije ukazuju na nisku antimikrobnu aktivnost etarskih ulja cvasti i herbe L. zernyi, što je u skladu sa rezultatima bujom mikrodilucionog testa, u kome su oba ulja ispoljila relativno nizak efekat prema svim mikroorganizmima. 172 Tabela 46. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja cvasti i herbe L. zernyi ispitivana agar difuzionim testom. Prečnici zona inhibicije izraženi su u milimetrima. Mikroorganizam S. a ur eu s A T C C 2 59 23 S. e pi de rm id is A T C C 1 22 28 M . l ut eu s A T C C 9 34 1 P. a er ug in os a A T C C 2 78 53 K. p ne um on ia e N C IM B 9 11 1 E. c ol i A T C C 2 59 22 C. a lb ic an s A T C C 1 02 59 Etarsko ulje Zona inhibicije (mm) L. zernyi - cvast 225 µg/disk 12,0±2,0 19,2±1,7 18,2±2,5 13,7±3,4 18,0±2,4 17,7±0,9 17,5±1,5 L. zernyi - herba 225 µg/disk 13,7±3,5 15,5±2,5 20,5±4,1 13,2±0,9 15,0±3,5 20,7±1,5 18,5±1,5 Ampicilin 10 µg/disk 27,0±0,5 n. t. n. t. n. t. 12,0±0,0 18,0±0,0 n. t. Amikacin 30 µg/disk 26,0±0,0 n. t. n. t. 26,5±0,5 23,0±0,0 24,0±0,0 n. t. Nistatin 100 IU/disk n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. 20,8±0,8 n. t. − nije testirano 2. Antinociceptivna aktivnost etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum Etarska ulja podzemih organa L. ochridanum i L. zernyi ispitivana su u pogledu antinociceptivnog dejstva u modelu inflamatornog bola u pacova. Etarska ulja L. ochridanum i L. zernyi, primenjena u dozama 25 - 100 mg/kg (p.o.), dozno-zavisno i statistički značajno smanjuju razliku u pritiscima između zdrave šape i šape sa hiperalgezijom izazvanom i.pl. injekcijom karagenina, df (g) (p<0,01, 120-360 min nakon primene etarskog ulja L. zernyi i p<0,05 u dozi 25 mg/kg 120 min nakon primene etarskog ulja L. ochridanum i p<0,01, u svim dozama i ostalim vremenskim tačkama intervala 120-360 min nakon primene etarskog ulja L. ochridanum, jednosmerna ANOVA) u testu pritiska na šapu pacova (Slika 53, veliki grafikon). Antinociceptivni efekat etarskog ulja podzemnih organa L. zernyi dostiže svoj maksimum u intervalu 210–240 min nakon primene. Vrednosti ispoljenog antinociceptivnog dejstva su 38,6, 53,9 i 61,7% u dozama 25, 50 i 100 mg/kg, redom (mali grafikon A na Slici 53). Srednja efektivna doza (ED50 ± SEM, sa 95%-nim intervalom poverenja) etarskog ulja podzemnih organa L. zernyi pri maksimalnom efektu je 45,9 ± 4,9 (11,7–179,8) mg/kg. Maksimum antinociceptivnog dejstva etarskog ulja 173 podzemnih organa L. ochridanum dostignut je u intervalu 180–240 min posle primene. Odgovarajuće vrednosti maksimuma ovog efekta bile su 42,2, 53,2 i 61,4% za doze 25, 50 i 100 mg/kg, redom (mali grafikon B na Slici 53). Srednja efektivna doza (ED50 ± SEM, sa 95%-nim intervalom poverenja) etarskog ulja podzemnih organa L. ochridanum pri maksimalnom efektu je 42,4 ± 2,1 (22,7–79,1) mg/kg. Ibuprofen, NSAIL lek u dozi 100 mg/kg p.o., korišćen je radi poređenja. Maksimum antinociceptivnog dejstva ibuprofena iznosio je 82,3% u 210. min nakon primene. U ovom ispitivanju pokazano je da etarska ulja podzemnih organa vrsta L. zernyi i L. ochridanum ispoljavaju dozno-zavisno i statistički značajno antinociceptivno dejstvo, koje je uporedivo sa efektom ibuprofena, referentnog NSAIL, u modelu inflamatorne hiperalgezije u pacova. Od komponenata ispitivanih etarskih ulja, do sada su jedino α-pinen i (−)-α-bisabolol testirani u pogledu antinociceptivnog dejstva. α-Pinen (500 mg/kg, p.o.) je ispitivan u testu p-benzohinonom izazvanih abdominalnih kontrakcija u miša, modelu akutne nocicepcije sa zapaljenskom komponentom, pri čemu je pokazan neznatan antinociceptivni efekat ovog jedinjenja (Orhan i sar., 2006). Rocha i sar. (2011) su pokazali da (−)-α-bisabolol u dozama 25−200 mg/kg, p.o., statistički značajno smanjuje mehaničku, inflamatornu hiperalgeziju šape miša, izazvanu karageninom, kao i da smanjuje manifestacije bola (nocicepcije) u testu abdominalnih kontrakcija izazvanih sirćetnom kiselinom u miša, kao i u drugoj, inflamatornoj fazi formalinskog testa na šapi miša. U skladu sa literaturnim podacima, antinociceptivno dejstvo etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum, je najverovatnije povezano sa relativno visokim sadržajem α-bisabolola u oba ispitivana ulja (30,9% i 10,3%, redom). Zna se da različiti proinflamatorni medijatori učestvuju u nocicepciji, odnosno bolnoj senzaciji koja se javlja nakon injekcije karagenina: histamin, 5-hidroksitriptamin, bradikinin, prostaglandini (PGs) i drugi (Moris, 2003). Ranije je pokazano da (−)-α-bisabolol inhibira ciklooksigenazu (COX), enzim koji je uključen u sintezu prostaglandina (PGs) (Ammon i sar., 1996; Kim i sar., 2011). Takođe je pokazano da (−)-α-bisabolol smanjuje ekscitabilnost n. ischiadicus-a u miša, najverovatnije ireverzibilnom blokadom voltažno-zavisnih natrijumovih kanala (Alves i sar., 2010). Smanjenje bolne preosetljivosti koje su izazvala oba testirana ulja, najverovatnije se može, u izvesnoj meri povezati sa smanjenom ekscitabilnošću neurona i inhibicijom sinteze prostaglandina, efektima koje ispoljava (−)-α-bisabolol. 174 Slika 53. Vremenski tok antinociceptivnih dejstava etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi (A) i L. ochridanum (B), nakon peroralne primene u pacova, izraženih kao razlika u pritiscima (df) oslanjanja na zdravu šapu i šapu sa hiperalgezijom (izraženu u gramima, veliki grafikon), odnosno kao procenat antinociceptivne aktivnosti (%AA) (mali grafikon). Na velikom grafikonu bazalna razlika u pritiscima prikazana je na y-osi, a merena je neposredno pre primene leka. Etarska ulja su davana 60 min pre, a ibuprofen neposredno pre izazivanja inflamacije (označeno strelicom). Svaka tačka predstavlja aritmetičku sredinu ± SEM u razlici u pritiscima (df) (veliki grafikon) ili %AA (mali grafikon) dobijenu testiranjem 5 životinja. Statistička značajnost (*p < 0,05, **p < 0,01; jednosmerna ANOVA i dalje korišćenje Tukey’s HSD testa) je određivana u odnosu na kontrolnu grupu (vehikulum). EU - etarsko ulje; KAR - karagenin, i.pl. - intraplantarno, p.o. - per os. Napomena: simboli na malom grafikonu odgovaraju legendi prikazanoj na velikom grafikonu. 175 3. Antiedematozna aktivnost etarskih ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi Etarska ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi, primenjena u dozama 25−100 mg/kg (p.o.), dozno-zavisno i statistički značajno smanjuju edem šape izazvan i.pl. injekcijom karagenina u odnosu na kontrolu (zapreminu zdrave šape) u testu merenja edema pletizmometrom (Slika 54, A i B) (p<0,01, 120-360 min nakon primene etarskog ulja L. zernyi u dozama 50 i 100 mg/kg, i u dozi 25 mg/kg u intervalu 240 – 360 min; p<0,01 u svim tačkama vremenskog intervala pri primeni etarskog ulja L. ochridanum u dozi 100 mg/kg, i u intervalu 180 – 360 min za doze 25 i 50 mg/kg, i p<0,05 u intervalu 120 – 150 min za doze 25 i 50 mg/kg, jednosmerna ANOVA). Antiedematozni efekat etarskog ulja podzemnih organa L. zernyi bio je najveći 120 - 150 min nakon primene, posle čega je usledio pad aktivnosti koji je održavan do 360. min. Efekat ulja L. zernyi u 120. min nakon primene iznosio je 35,0, 65,7 i 81,3% u dozama od 25, 50 i 100 mg/kg (mali grafikon A na Slici 54). Srednja efektivna doza (ED50 ± SEM, sa 95%-nim intervalom poverenja) pri maksimalnom efektu je 36,3 ± 4,5 (6,0-220,7) mg/kg. Antiedematozni efekat etarskog ulja podzemnih organa L. ochridanum bio je najveći nakon 120−240 min od primene ulja, i iznosio je 42,1, 45,3 i 68,6% za doze 25, 50 i 100 mg/kg, redom (mali grafikon B na slici Slici 54). Odgovarajuća srednja efektivna doza (ED50 ± SEM, sa 95%-nim intervalom poverenja) pri maksimalnom efektu je 45,1 ± 11,3 (1,9-1085,6) mg/kg. Maksimalni efekat indometacina, referentnog antiinflamatornog leka u dozi 8 mg/kg, p.o. iznosio je 70,6% antiedematozne aktivnosti u 300. min nakon primene. U ovom ispitivanju pokazano je da etarska ulja podzemnih organa vrsta L. zernyi i L. ochridanum ispoljavaju dozno- i vremenski-zavisno i statistički značajno smanjenje inaflamacijom izazvanog edema, koje je uporedivo sa efektom indometacina. Etarska ulja, pored prethodno pokazanog antinociceptivnog dejstva u modelu inflamatorne hiperalgezije, ispoljavaju i antiedematoznu aktivnost, smanjujući otok koji je još jedna karakteristika inflamatorne reakcije. U prethodnim istraživanjima je pokazano da (−)-α-bisabolol i hamazulen, primenjeni u dozama 350 – 1400 mg/kg p.o. pokazuju antiedematozno dejstvo u modelu lokalizovane inflamacije u pacova 176 (Jakovlev i sar., 1983). Orhan i saradnici (2006) su pokazali da α-pinen (500 mg/kg, p.o.) ispoljava umerenu antiedematoznu aktivnost u karageninom izazvanoj inflamaciji šape u miša. Doze etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum koje su efikasne u gore navedenom eksperimentu, su značajno niže (između 25 i 100 mg/kg, p.o.) nego doze (−)-α-bisabolola, hamazulena i α-pinena koje su korišćene u eksperimentima Jakovleva i sar. (1983) i Orhana i sar. (2006). Pokazani antiedematozni efekat testiranih etarskih ulja je najverovatnije posledica dejstva minimalnih efektivnih doza (−)-α-bisabolola i α-pinena u oba etarska ulja, kao i hamazulena u etarskom ulju podzemnih organa vrste L. ochridanum, ili moguće sinergističke interakcije između aktivnih sastojaka u etarskim uljima. Poznato je, da kada je u dejstvo smeše uključen sinergistički efekat aktivnih komponenata, da su efektivne doze pojedinačnih aktivnih komponenata u smeši značajno niže. Nastanak edema nakon injekcije karagenina je posledica dejstva medijatora, kao što su histamin, 5-hidroksitriptamin, bradikinin, prostaglandini i druge porinflamatorne supstance (Morris, 2003). Leukotrijeni (LT) su takođe uključeni u ovaj proces, pošto je pokazano da inhibitori 5-lipooksigenaze (5-LOX), enzima koji je uključen u njihovu sintezu, redukuju karageninom izazvan edem (Thabrew i sar., 2003; Singh i sar., 2008). In vitro eksperimentima pokazano je da su (−)-α-bisabolol i hamazulen 5-LOX inhibitori (Ammon i sar., 1996). Zbog ovoga, antiedematozni efekat ispitivanih ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum može biti povezan sa smanjenom produkcijom leukotrijena. Dodatni mehanizam bi mogao biti u vezi sa smanjenom produkcijom prostaglandina (PG) usled inhibicije COX enzima izazvane (−)-α-bisabololom (Ammon i sar., 1996; Kim i sar., 2011), što je takođe moguće obajšnjenje ispoljene antiedematozne aktivnosti oba testirana ulja. 177 Slika 54. Vremenski tok antiedematoznih dejstava etarskih ulja podzemnih organa L. zernyi (A) i L. ochridanum (B), nakon peroralne primene u pacova, izraženih kao razlika u zapreminama u ml (dv) između inflamirane desne šape i zdrave desne šape, odnosno zapremine posle i pre izazivanja inflamacije (veliki grafikon), odnosno kao procenat antiedematozne aktivnosti ( %AE) (mali grafikon). Bazalna zapremina, odnosno zapremina šape pre primene etarskog ulja/indometacina i izazivanja inflamacije karageninom (označeno strelicama). Etarska ulja/indometacin su davani 60 min pre izazivanja inflamacije (označeno strelicom). Svaka tačka predstavlja aritmetičku sredinu ± SEM razlike u zapreminama (dv) (veliki grafikon) ili %AE (mali grafikon) dobijenu testiranjem na 6-7 životinja. Statistička značajnost (*p < 0,05, **p < 0,01; jednosmerna ANOVA i dalje korišćenje Tukey’s HSD testa) je određivana u odnosu na kontrolnu grupu (vehikulum). Skraćenice: EU - etarsko ulje; KAR - karagenin, i.pl. - intraplantarno, p.o. - per os. Napomena: simboli na malom grafikonu odgovaraju legendi prikazanoj na velikom grafikonu. 178 4. Citotoksična aktivnosti hloroformskih ekstrakata L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum i izolovanih jedinjenja Karcinom je jedan od vodećih uzroka rane smrti u razvijenim zemljama, a u osnovi je skup poremećaja koji uključuju nekontrolisanu deobu i metastaziranje abnormalnih ćelijskih formi u čovečijem organizmu (Saklani i Kutty, 2008). Rezistencija malignih ćelija je veliki problem u hemioterapiji karcinoma, naročito učestalih tipova kao što je humani adenokarcinom dojke, što povećava naučni interes za iznalaženje novih citostatika. Jedinjenja izolovana iz biljaka imaju važnu ulogu u otkrivanju i razvoju novih hemioterapijskih agenasa, jer su biljke izvori velikog broja jedinjenja različite hemijske strukture i mehanizama citotoksičnih i antitumorskih dejstava. Terpenoidi, kako je ranije pomenuto, su moćni citotoksični agensi, koji svoju aktivnost ispoljavaju kroz interakciju sa nekoliko regulatornih proteina i inhibicijom NF-κB signalizacije, koji se smatraju ključnim činiocima u patogenezi poremećaja kao što su inflamacija i karcinom (Wu i sar., 2012; Newman i Cregg, 2012; Salminen i sar., 2008). Humani adenokarcinom dojke je najučestaliji tip karcinoma u ženskoj populaciji širom sveta, za koji je često vezana “multidrug“ rezistencija, što dalje rezultuje većim morbiditetom i troškovima lečenja (Wu i sar., 2012). U okviru ove doktorske disertacije za ispitivanje citotoksične aktivnosti ekstrakata i izolovanih jedinjenja korišćene su dve ćelijske linije humanog karcinoma dojke MCF 7/6 i MCF 7/AZ, invazivni i neinvazivni tip, redom. Ispitivanja su sprovedena in vitro korišćenjem: MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2- -il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) testa, kojim se može odrediti broj živih, metabolički aktivnih ćelija (Mosmann, 1983), i SRB (sulforhodamin B) testa za određivanje ćelijskog proteinskog sadržaja (Skehan i sar., 1990). 4.1. Citotoksična aktivnost hloroformskih ekstrakata L. latifolium i izolovanih jedinjenja Ispitivana je citotoksična aktivnosti hloroformskog ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium i izolovanih jedinjenja 1-3. Hloroformski ekstrakti podzemnih organa i herbe L. latifolium testirani su u pet koncentracija u opsegu: 7,5-750 µg/ml, dok su laserpicin (jedinjenje 1), acetildezoksodehidrolaserpicin (jedinjenje 2) i laserin 179 (jedinjenje 3) testirani u pet koncentracija u opsegu 0,5-100 µM. Vinblastin-sulfat je korišćen kao referentna supstanca (pozitivna kontrola), u pet koncentracija u opsegu 0,1 − 40 nM. Rezultati su izraženi kao IC50 vrednosti (koncentracija koje inhibira 50% ćelijskog rasta) i dati su u Tabeli 47. Negativnu kontrolu su predstavljale ćelijske kulture pripremljene na isti način, tretirane samo odgovarajućom zapreminom medijuma, i predstavljaju 100% ćelijskog rasta. Tabela 47. In vitro citotoksična aktivnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium, izolovanih jedinjenja (1-3) i referentne supstance (vinblastin- sulfata). Aktivnost je izražena preko IC50 vrednosti. MTT test SRB test Ispitivani uzorak MCF 7/6 MCF 7/AZ MCF 7/6 MCF 7/AZ Ekstrakt podzemnih organaa 184,72 208,94 208,85 397,16 Ekstrakt herbea 253,90 264,79 292,17 277,29 Jedinjenje 1b 31,80 87,13 >100 >100 Jedinjenje 2b 0,60 2,29 0,51 31,87 Jedinjenje 3b 4,57 2,46 62,04 7,36 Vinblastin-sulfatb 5,98 ×10-3 15,41 × 10-3 4,11 × 10-3 3,66 ×10-3 aIC50 vrednosti hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium su date u µg/ml; bIC50 vrednosti za laserpicin (jedinjenje 1), acetildezoksodehidrolaserpicin (jedinjenje 2), laserin (jedinjenje 3) i vinblastin-sulfat (referentno jedinjenje) date su u µM. Oba ekstrakta L. latifolium su pokazala koncentraciono-zavisno citotoksično dejstvo, sa IC50 vrednostima u opsegu od 184,72–397,16 µg/ml za hloroformski ekstrakt podzemnih organa, odnosno od 253,90–292,17 µg/ml za hloroformski ekstrakt herbe. Citotoksična aktivnost ekstrakta podzemnih organa je bila nešto izraženija u odnosu na ekstrakt herbe, osim u SRB testu na ćelijskoj liniji MCF 7/AZ (Tabela 47). Među testiranim jedinjenjima, acetildezoksodehidrolaserpicin (jedinjenje 2) je ispoljilo najveću aktivnost (Tabela 47), naročito na visoko invazivnu MCF 7/6 ćelijsku liniju u oba testa. Odgovarajuće IC50 vrednosti su u niskom mikromolarnom opsegu (0,51 i 0,60 µM na MCF 7/6 liniji u SRB i MTT testu, redom i 2,29 µM na MCF 7/AZ liniji u MTT testu), izuzev IC50 vrednosti u SRB testu na MCF 7/AZ, gde je ispoljena citotoksična aktivnost bila znatno niža (31,87 µM). Procenat inhibicije ćelijskog rasta izazvan acetildezoksodehidrolaserpicinom (jedinjenje 2) (u koncentraciji 5 µM) i vinblastin- 180 sulfatom (u koncentraciji 10 nM) su dati na Slici 55. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD četiri nezavisna ponavljanja. Slika 55. Procenat inhibicije ćelijskog rasta dve linije humanog adenokarcinoma dojke MCF 7/6 i MCF 7/AZ u MTT i SRB testu, u poređenju sa negativnim kontrolama (100% ćelijskog rasta) posle primene 5 µM acetildezoksodehidrolaserpicina (ADODHL) i 10 nM vinblastin-sulfata kao referentnog jedinjenja. Rezultati su izraženi kao srednje vrednosti ± SD četiri nezavisna ponavljanja. Statistički značajna razlika u inhibiciji ćelijskog rasta određivana je u poređenju sa kontrolnim grupama za nivoe značajnosti * p≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001. U hloroformskim ekstraktima podzemnih organa i herbe L. latifolium utvrđeno je prisustvo dva terpena, tačnije dva daukanska estra: laserpicina (jedinjenje 1) i acetildezoksodehidrolaserpicina (jednjenje 2), kao i fenilpropana laserina (jedinjenje 3). Daukanski derivati su, kao što je već pomenuto, mala grupa sekundarnih metabolita koja ispoljava različite biološke efekte (Ghisalberti, 1994). Ranija istraživanja su pokazala da neki daukani pojedinih vrsta roda Ferula, bar delom, doprinose njihovoj citotoksičnoj aktivnosti (Dall’Acqua i sar., 2011; Jabrane i sar., 2010; Alkhatib i sar., 2008). Eleohitrin A, 6-antraniloil daukanski estar izolovan iz F. elaeochytris Korovin je pokazao visoku aktivnost u MTT testu na dve rezistentne ćelijske linije humane (K562R) i mišje (DA1-3b/M2BCR-ABL) leukemije (Alkhatib i sar., 2008), a preračunate IC50 vrednosti su bile 12,4 i 7,8 µM, redom. U panel istraživanju citotoksičnosti 16 daukanskih estara izolovanih iz dve vrste roda Ferula i jedne vrste roda Ferulago, na 181 sedam ćelijskih linija humanih karcinoma, 14 jedinjenja je ispoljilo citotoksični efekat na bar jednu ćelijsku liniju (Dall’Acqua i sar., 2011). Palinin, 6α,10α-diangeloil daukanski estar, bio je najaktivniji sa ispoljenim IC50 vrednostima u nižem mikromolarnom opsegu na šest ćelijskih linija (Dall’Acqua i sar., 2011). Pokazano je da β orjentacija estarske grupe na položaju C-2 značajno povećava citotoksičnu aktivnost. Takođe, prisustvo α,β-nezasićenog ketona (“en-ona”) u bočnim lancima u strukturi seskviterpena i seskviterpenskih laktona povećava citotoksičnost prema različitim tumorskim ćelijskim linijama (Ghantous i sar., 2010). Acetildezoksodehidrolaserpicin (jedinjenje 2) je triestar, sa dve “en-onske” angeloiloksi grupe u strukturi, od kojih je jedna β orjentisana na položaju C-2, što predstavlja nekoliko strukturnih faktora koji doprinose ispoljenoj visokoj citotoksičnoj aktivnosti ovog jedinjenjna prema ćelijskim linijama humanog adenokarcinoma. Laserpicin (jedinjenje 1) nema strukturne elemente koji doprinose citotoksičnom dejstvu, i ispoljio je znatno nižu citotoksičnu aktivnost u oba testa na obe ćelijske linije (Tabela 47) Laserin (jedinjenje 3) je ispoljio znatan koncentraciono-zavisan citotoksičan efekat u oba testa na obe ćelijske linije, a efikasniji je bio u MTT testu (IC50 vrednosti su 4,57 i 2,46 µM na MCF 7/6 i MCF 7/AZ, redom). Ovaj fenilpropanoid je gorki princip izolovan iz šargarepe, Daucus carota. Laserin, a naročito njegov eritro izomer 2-epilaserin su ispoljili citotoksičnu aktivnost prema HL-60 ćelijama akutne humane promijelocitične leukemije (Yang i sar., 2008). Jače citotoksično dejstvo hloroformskog ekstrakta podzemnih organa u odnosu na ekstrakt herbe L. latifolium moglo bi se objasniti većim sadržajem acetildezoksodehidrolaserpicina i laserina (jedienjenja 2 i 3), za koje je pokazano da ispoljavaju relativno visoko cititoksično dejstvo na obe ćelijske linije u oba kolorimetrijska testa. 4.2. Citotoksična aktivnost hloroformskih ekstrakata L. zernyi i L. ochridanum i izolovanih jedinjenja Seskviterpenski laktoni su sekundarni metaboliti biljaka sa širokim spektrom farmakoloških aktivnosti, kao što su antiinflamatorna, antitumorska, citotoksična, antibakterijska, antihelmintična, amtimalarijska, neurotoksična i alergena (Merfort, 2011). Neki od seskviterpenskih laktona kao što su artemizinin, tapsigargin i dimetilaminopartenolid su jedinjenja koja se nalaze u različitim fazama kliničkih studija 182 kao potencijalni hemioterapeutici u terapiji različitih karcinoma (Ghantous i sar., 2010). Ispoljena dejstva pojedinih seskviterpenskih laktona utiču na veliki naučni interes u oblasti ispitivanja seskviterpenskih laktona u pogledu citotoksičnog dejstva. U hloroformskim ekstraktima L. ochridanum i L. zernyi upravo su seskviterpenski laktoni glavni sastojci. Iz tog razloga su hloroformski ekstrakti podzemnih organa i herbi ovih vrsta, kao i izolovani seskviterpenski laktoni testirani u pogledu citotoksičnog dejstva na dve ćelijske linije humanog adenokarcinoma dojke MCF 7/6 i MCF 7/AZ, invazivnog i neinvazivnog tipa, redom. Citotoksična aktivnost je ispitivana nakon inkubacije ekstrakta/jedinjenja ili vinblastin-sulfata (kao referentnog jedinjenja) u toku 48 h. Ekstrakti su testirani u pet koncentracija u opsegu 8-800 µg/ml, a seskviterpenski laktoni u pet koncentracija u opsegu 0,5-100 µM. Vinblastin-sulfat testiran je u pet koncentracija u opsegu 0,1-40 nM. Citotoksična aktivnost je testirana korišćenjem kolorimetrijskih testova: MTT, kojim se određuje broj živih, metabolički aktivnih ćelija (Mosmann, 1983) i SRB, kojim se kvantifikuje ćelijski proteinski sadržaj (Skehan i sar., 1990). Citotoksična aktivnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbi vrsta L. ochridanum i L. zernyi izražena je preko IC50 vrednosti (koncentracija ekstrakta koja izaziva inhibiciju 50% ćelijskog rasta) i prikazana je u Tabeli 48. Kontrolne grupe (negativna kontrola) su inkubirane u odgovarajućoj količini medijuma i predstavljaju 100% rast ćelija. Svi ekstrakti su ispoljili koncentraciono-zavisan citotoksičan efekat na obe ćelijske linije. Uočljivo je da je efekat ekstrakata podzemnih organa obe vrste bio jači u odnosu na efekte koje su ispoljili hloroformski ekstrakti herbi, izuzev efekta ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum u SRB testu na ćelijsku liniju MCF 7/6, koji je bio nešto niži. Ova razlika se može objasniti višim koncentracijama seskviterpenskih laktona u ekstraktima podzemnih organa. Sa druge strane, aktivnost ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum je bila izraženija u odnosu na ekstrakt podzemnih organa L. zernyi, naročito u MTT testu, gde su odgovarajuće IC50 vrednsti bile 66,09 i 65,21 µg/ml na ćelijskim linijama MCF 7/6 i MCF 7/AZ, redom. Jača citotoksična aktivnost ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum može biti povezana sa prisustvom visoko hidroksilovanih i esterifikovanih gvajanolida. 183 Tabela 48. In vitro citotoksična aktivnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbi L. zernyi i L. ochridanum na MCF 7/6 i MCF 7/AZ ćelijskim linijama u MTT i SRB testu, izražena preko IC50 vrednosti (µg/ml). MTT test SRB test Ekstrakt MCF 7/6 MCF 7/AZ MCF 7/6 MCF 7/AZ Podzemni organi L. zernyi 126,86 95,95 295,06 106,56 Herba L. zernyi 260,76 272,41 329,47 338,15 Podzemni organi L. ochridanum 66,09 65,21 348,25 224,82 Herba L. ochridanum 217,54 277,49 300,79 298,38 Svi seskviterpenski laktoni (jedinjenja 5-18) su testirani u pogledu citotoksične aktivnosti u MTT i SRB testu. U Tabeli 49 date su IC50 vrednosti za jedinjenja 5-18. Tabela 49. In vitro citotoksična aktivnost seskviterpenskih laktona izolovanih iz hloroformskih ekstrakata L. ochridanum i L. zernyi na MCF 7/6 i MCF 7/AZ ćelijskim linijama u MTT i SRB testu izražena kao IC50 vrednost (µM). Vinblastin-sulfat je korišćen kao referentno jedinjenje (pozitivna kontrola). MTT SRB Jedinjenje MCF 7/6 MCF 7/AZ MCF 7/6 MCF 7/AZ 5 >100 >100 >100 >100 6 97,54 88,95 >100 49,21 7 9,38 33,22 2,70 7,75 8 >100 >100 >100 >100 9 >100 >100 >100 >100 10 >100 >100 >100 >100 11 >100 >100 >100 >100 12 4,32 5,63 5,05 21,24 13 9,03 8,23 >100 >100 14 9,06 57,24 61,41 34,76 15 0,72 5,67 0,71 38,00 16 6,35 16,75 8,35 33,40 17 >100 >100 >100 >100 18 >100 >100 >100 >100 Vinblastin- sulfat 3,96×10-3 15,41×10-3 3,05×10-3 3,16×10-3 184 Jedinjenje 15, odnosno 2β,8α-diangeloiloksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6- -olid, koje ima dvostruku vezu u laktonskom prstenu ispoljilo je najjaču citotoksičnu aktivnost od svih testiranih laktona, sa IC50 vrednostima od 0,72 µM i 0,71 µM na invazivnu MCF 7/6 ćelijsku liniju u MTT i SRB testu, redom. Takođe, ovo jedinjenje je imalo relativno nisku IC50 vrednost na MCF 7/AZ ćelijskoj liniji u MTT testu (5,67 µM). Jedinjenje 12, odnosno 8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH, 7αH-gvajan- 3-en-12,6-olid takođe je ispoljilo znatan citotoksični efekat na obe ćelijske linije, sa IC50 vrednostima u MTT testu 4,32 µM i 5,63 µM na linije MCF 7/6 i MCF 7/AZ, redom, i takođe visok efekat na MCF 7/6 ćelijsku liniju u SRB testu (IC50 5,05 µM). I jedinjenje 16, odnosno 8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en- -12,6-olid ispoljilo je visok citotoksični efekat na invazivnu ćelijsku liniju MCF 7/6, sa IC50 vrednostima 6,35 µM i 8,35 µM u MTT i SRB testu, redom. Slovanolidi koji u strukturi nemaju estar na položaju C-2, kao što je tarolid (jedinjenje 5), nisu dostigli 50% inhibicije ćelijskog rasta čak ni u najvećoj primenjenoj koncentraciji od 100 µM. Ovi rezultati su u skladu sa prethodno objavljenim nalazima da laktoni sa α,β-nezasićenom karbonilnom grupom, bilo u laktonskom prstenu ili estarskom bočnom lancu, kao i laktoni sa većim brojem esterifikacija, imaju jači citotokisčni efekat na ćelijske linije karcinoma (Ghantous et al., 2010). Interesantno je da je prethodno izolovan slovanolid acetilmontanolid (jedinjenje 7) ispoljio jaku aktivnost na obe testirane ćelijske linije u SRB testu, sa IC50 vrednostima od 2,70 µM i 7,75 µM na invazivnu i neinvazivnu ćelijsku liniju humanog adenokarcinoma dojke, redom. Gvajanolidi sa manjim brojem estara u strukturi, kao i eudezmanolidi, nisu dostigli 50% inhibicije ćelijskog rasta čak ni u najvećoj testiranoj koncentraciji (100 µM). Za najaktivnija jedinjenja ispoljeni citotoksični efekat bio je koncentraciono-zavisan. Na Slici 56, grafički je prikazan procenat inhibicije ćelijskog rasta nakon primene najaktivnijih jedinjenja u koncentraciji 5 µM. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD šest nezavisnih ponavljanja. Slika 56. Procenat inhibicije ćelijskog rasta dve linije humanog adenokarcinoma dojke MCF 7/6 i MCF 7/AZ u MTT i SRB testu, u odnosu na negativne kontrole (ćelije koje su inkubirane u čistom medijumu) posle primene laktona koji su ispoljili najjači citotoksičan efekat u koncentraciji 5 µM i vinblastin-sulfata (referentnog jedinjenja) u koncentraciji 10 nM. Rezultati su izraženi kao srednja vrednost ± SD šest nezavisnih ponavljanja. Statistička značajnost inhibicije ćelijskog rasta upoređivana je u odnosu na kontrolne grupe (negativne kontrole) za nivoe značajnosti * p≤ 0,05; ** p≤ 0,01; *** p≤ 0,001. 185 5. Antioksidantna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi Biljni polifenoli su brojna grupa sekundarnih metabolita koja predstavlja bogat izvor jedinjenja koja se koriste u terapiji poremećaja kao što su alergijske reakcije, inflamatorna stanja i imunološki poremećaji, a u novije vreme ispituje se njihovo mesto u hemioterapiji karcinoma. Smatra se da polifenolna jedinjenja veći deo farmakoloških efekata ispoljavaju usled jake antioksidantne aktivnosti, ali jednim delom i direktnim vezivanjem za signalne molekule koji su uključeni u zapaljenski proces i karcinogenezu. Na ovaj način, oni su regulatori ćelijske aktivnosti pojedinih ključnih medijatora u različitim patološkim procesima. Generalno, polifenoli mogu da utiču na intracelularne signalne proteine i transkripcione faktore, kao što je NF-κB. Flavonoidi i fenolkarboksilne kiseline predstavljaju brojnu klasu polifenola (Chirumbolo, 2012; Dos Santos i sar., 2006). U metanolnim ekstraktima cvasti i herbe (bez cvasti) L. zernyi HPLC analizom detektovano je prisustvo polifenolnih jedinjenja: flavona (apigenina, luteolina i njihovih 7-O-glukozida) i hlorogenske kiseline. Zbog toga su ovi ekstrakti testirani u pogledu ukupne antioksidantne aktivnosti i sposobnosti neutralizacije DPPH i ˙OH radikala, a za poređenje je korišćen kvercetin (Tabela 50). Tabela 50. Antioksidatna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi Antiradikalska aktivnost Neutralizacija DPPH radikala (µg/ml) Neutralizacija ˙OH radikala (µg/ml) Ukupna antioksidantna aktivnost* Ekstrakt cvasti L. zernyi 38,95 10,32 1,55 Ekstrakt herbe L. zernyi 109,54 35,97 0,68 Kvercetin 2,75 3,10 7,69 * – rezultati izraženi u µmol Fe2+/mg ekstrakta/kvercetina Ukupna antioksidantna aktivnost ekstrakata cvasti L. zernyi bila je viša od aktivnosti ekstrakta herbe L. zernyi, ali ipak znatno niža od aktivnosti kvercetina. Ovi ekstrakti ispoljili su koncentraciono-zavisnu sposobnost neutralizacije DPPH radikala. Niska vrednost SC50 za ekstrakt cvasti ukazala je na značajnu anti-DPPH aktivnost, ali je ova aktivnost ipak bila manja od 186 187 aktivnosti kvercetina. Oba ekstrakta su pokazala visoku sposobnost neutralizacije ˙OH radikala, pri čemu je ekstrakt cvasti bio nešto efikasniji u odnosu na ekstrakt herbe. Antioksidantna svojstva flavona apigenina, luteolina i njihovih 7-O-glukozida, kao i hlorogenske kiseline, pokazana su ranije u različitim in vitro testovima od strane drugih autora. Za luteolin 7-O-glukozid, najzastupljeniju komponentu u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi (34,4% i 10,2%, redom), prethodno je pokazano da ispoljava jaku anti-DPPH aktivnost (u koncentraciji 20 µM inhibira 62,0% DPPH radikala). Ovo jedinjenje je, pored rozmarinske kiseline, pokazalo najjaču antiradikalsku aktivnost među polifenolnim jedinjenjima izolovanim iz butanolne frakcije etanolnog ekstrakta lista žalfije, Salvia officinalis L. (Wang i sar., 1998). Süntar i sar. (2013) su iz metanolnog eksrtakta cvasti Helichrysum graveolens (Bieb.) Sweet izolovali apigenin kao aktivan princip odgovoran za jaku antioksidantnu aktivnost ovog ekstrakta. Apigenin je, u ovom istraživanju, pokazao jaku aktivnost u testu neutralizacije DPPH radikala (IC50=31,04 µg/ml). Hlorogenska kiselina, izolovana iz metanolnog ekstrakrakta ljuske badema Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb, pokazala je koncentraciono-zavisnu antioksidantnu aktivnost u testu inhibicije oksidacije metil-linoleata, a antioksidantni efekat ovog jedinjenja u koncentraciji 50 µg/ml je trajao u toku 4 dana (Takeoka i Dao, 2003) Jači antioksidantni efekat metanolnog ekstrakta cvasti L. zernyi može se objasniti većim sadržajem ukupnih polifenolinih jedinjenja i višim koncentracijama detektovanih flavona i hlorogenske kiseline, u odnosu na ekstrakt herbe L. zernyi. 6. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi testirana je bujon mikrodilucionim testom prema Gram(+) bakterijama Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228, Micrococcus luteus ATCC 9341, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus subtilis ATCC 6633, Gram(–) bakterijama: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae NCIMB 9111, Escherichia coli ATCC 25922, i dva soja Candida albicans (ATCC 10259 i ATCC 24433). Za određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK), ekstrakti su primenjeni u razblaženjima od 500 do 30 µg/ml, a rezultati su prikazani u Tabeli 51. Najveću antimikrobnu aktivnost oba ekstrakta ispoljila su prema C. albicans, kao i ekstrakt herbe prema B. subtilis (MIK 30 µg/ml). Aktivnost ekstrakta herbe L. zernyi prema svim 188 ostalim testiranim sojevima bakterija bila je umerena i identična (MIK=62,5 µg/ml). Ekstrakt cvasti pokazao je nešto slabiju aktivnost u odnosu na ekstrakt herbe prema sojevima M. luteus, E. faecalis i P. aeruginosa (MIK=125 µg/ml). Pojedina polifenolna jedinjenja ispoljavaju antimikrobnu aktivnost, što je potvrđeno različitim in vitro i in vivo testovima (Chirumbolo, 2012). Smatra se da je ovaj efekat delom posledica antioksidantne aktivnosti, ali i supresivnog delovanja polifenolnih jedinjenja na faktore virulencije mikroorganizama, kao što su inhibicija formiranja biofilma i neutralizacija bakterijskih toksina (Daglia, 2012). Apigenin, luteolin i njihovi 7−O−glukozidi spadaju u biljne polifenole za koje je antimikrobna aktivnost potvrđena brojnim ispitivanjima (Cushine i Lamb, 2005). U testiranju antimiktrobne aktivnosti flavona izolovanih iz herbe Achillea atrata L. subsp. multifida agar difuzionim testom, apigenin je pokazao znatan efekat prema B. subtilis, E. coli i C. albicans (prečnici zona ihibicije 6 – 10 mm pri primeni apigenina u koncentraciji 1 µg/µl). U bujon mikrodilucionom testu, apigenin je pokazao jaku aktivnost prema C. albicans, koja je bila uporediva sa nistatinom, dok je apigenin 7-O-glukozid pokazao umerenu aktivnost prema B. subtilis (Aljančić i sar., 1999). Antimikrobna aktivnost hlorogenske kiseline i apigenin 7-O-glukozida, izolovanih iz ekstrakta lista artičoke, Cynara scolymus L. (Zhu i sar., 2004), takođe je ispitivana u bujon mikrodilucionom testu. Efekat hlorogenske kiseline bio je najjači prema kvasnicama Candida albicans i C. lusitaniae (MIK = 50 µg/ml), ali je bio izražen i prema M. luteus (MIK = 100 µg/ml). Nešto slabije dejstvo hlorogenska kiselina ispoljila je prema bakterijama S. aureus, B. subtilis i P. aeruginosa (MIK = 200 µg/ml). Apigenin 7-O-glukozid pokazao je jak efekat prema M. luteus (MIK = 100 µg/ml) i umeren efekat prema S. aureus i B. subtilis (MIK = 200 µg/ml), ali nije dovodio do inhibicije rasta ostalih bakterija, kao ni C. albicans i C. lusitaniae (MIK > 200 µg/ml). Luteolin izolovan iz semena Senna petersiana (Bolle) Lock ispoljio je znatan antibakterijski efekat prema tri Gram(+) bakterije, Bacillus cereus, B. pumilus i S. aureus (MIK = 100 µg/ml), dok je efekat prema B. subtilis i Gram(–) bakterijama izostao (Tshikalange i sar., 2005). Za apigenin i luteolin, koji su izolovani iz herbe Scutellaria barbata D. Don, pokazano je da ispoljavaju aktivnost prema meticilin-rezistentnin i meticilin osetljivim sojevima S. aureus, pri čemu je aktivnost apigenina bila nešto izraženija (MIK = 3,9 – 15,6 µg/ml i 62,5 – 125 µg/ml za apigenin i luteolin, redom). Efekti oba flavonola prema S. epidermidis, E. faecalis i E. coli bili su znatno niži (MIK > 250 µg/ml) (Sato i sar., 2000). 189 U novijem istraživanju, ispitivana je aktivnost hlorogenske kiseline, kao i sva četiri flavona detektovana u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi prema tri Gram(+) bakterije: S. aureus, S. epidermidis i B. subtilis, i dve Gram(–) bakterije E. coli i Salmonella typhimurium, kao i aktivnost prema osam sojeva mikromiceta mikrodilucionim testom (Kukić i sar., 2008). Primećeno je da su svi gljivični sojevi bili generalno osetljiviji od baketrijskih na delovanje flavona i hlorogenske kiseline. Najjače dejstvo ispoljio je luteolin prema S. aureus, B. subtilis, E. coli i S. typhimurium (MIK = 50 µg/ml). Nešto slabiju aktivnost (MIK = 100 µg/ml), ispoljio je luteolin prema S. epidermidis, hlorogenska kiselina i apigenin 7-O-glukozid prema B. subtilis, E. coli i S. typhimurium i apigenin i luteolin prema E. coli i S. typhimurium. Antimikrobne aktivnosti svih jedinjenja bile su niže od streptomicina i mikonazola koji su korišćeni kao referentni antibiotici. Ispoljeno antimikrobno dejstvo metanolnih ekstrakta cvasti i herbe L. zernyi najverovatnije je posledica dejstva flavona i hlorogenske kiseline, koji su detektovani u ovom ekstraktu. Tabela 51. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi i referentnih antibiotika ispitivana bujon mikrodilucionim testom M i k r o o r g a n i z a m S . a u r e u s A T C C 2 5 9 2 3 S . e p i d e r m i d i s A T C C 1 2 2 2 8 M . l u t e u s A T C C 9 3 4 1 E . f a e c a l i s A T C C 2 9 1 2 1 B . s u b t i l i s A T C C 6 6 3 3 E . c o l i A T C C 2 5 9 2 2 K . p n e u m o n i a e N C I M B 9 1 1 1 6 P . a e r u g i n o s a A T C C 2 7 8 5 3 7 C . a l b i c a n s A T C C 1 0 2 5 9 C . a l b i c a n s A T C C 2 4 4 3 3 MIK (µg/ml) Ekstrakt cvasti 62,5 62,5 125 125 62,5 62,5 62,5 125 30 30 Ekstrakt herbe 62,5 62,5 62,5 62,5 30 62,5 62,5 62,5 30 30 Ampicilina 0,5 0,25 n. t.* 0,5 n. t. 2 2 3 n. t. n. t. Amikacin 2,0 n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. 0,5 n. t. n. t. Nistatin n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. n. t. 3,0 3 *n. t. − nije testirano 190 7. Antiedematozna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi Metanolni ekstrakti cvasti i herbe (bez cvasti) L. zernyi, u kojima je utvrđeno prisustvo flavonoida: apigenina, luteolina i njihovih 7–O–glukozida, kao i hlorogenske kiseline, ispitivani su u pogledu antiedematoznog efekta u testu karageninom izazvane inflamacije šape u pacova. Zapremine šapa merene su pomoću pletizmometra. Oba ekstrakta primenjena u dozama 25 - 100 mg/kg (p.o.), dozno-zavisno i statistički značajno smanjuju edem šape izazvan i.pl. injekcijom karagenina (Slika 57 A i B). Antiedematozni efekat metanolnog ekstrakta cvasti L. zernyi bio je najveći u 360. min nakon primene i iznosio je 46,7%, 53,2% i 57,5% u dozama od 25, 50 i 100 mg/kg, redom (mali grafikon A na Slici 57). Srednja efektivna doza (ED50 ± SEM, sa 95%-nim intervalom poverenja) pri maksimalnom efektu je 36,45 ± 2,83 (13,55-98,05) mg/kg. Antiedematozni efekat metanolnog ekstrakta herbe (bez cvasti) L. zernyi bio je najveći nakon 300 min od primene ekstrakta, nakon čega se beleži blag pad. Ovaj maksimalni efekat iznosio je 34,7%, 42,6% i 43,9% za doze 25, 50 i 100 mg/kg, redom (mali grafikon B na slici Slici 57). Odgovarajuću srednju efektivnu dozu (ED50) za metanolni ekstrakt herbe L. zernyi nije bilo moguće odrediti. Indometacin, referentni NSAIL, primenjen u dozi od 8 mg/kg p.o., dostigao je maksimalni efekat u 300. min nakon primene i taj efekat je iznosio 70,6% antiedematozne aktivnosti. 191 192 Slika 57. Vremenski tok antiedematoznih dejstava metanolnih ekstrakata cvasti (A) i herbe (B) L. zernyi, nakon peroralne primene u pacova, izraženih kao razlika u zapreminama u ml (dv) između inflamirane desne šape i zdrave desne šape, odnosno zapremine posle i pre izazivanja inflamacije (veliki grafikon), odnosno kao procenat antiedematozne aktivnosti (%AE) (mali grafikon). Bazalna zapremina, odnosno zapremina šape pre primene ekstrakta/indometacina i izazivanja inflamacije karageninom (označeno strelicama). Ekstrakti/indometacin su davani 60 min pre izazivanja inflamacije (označeno strelicom). Svaka tačka predstavlja aritmetičku sredinu ± SEM razlike u zapreminama (dv) (veliki grafikon) ili %AE (mali grafikon) dobijenu testiranjem na 6-7 životinja. Statistička značajnost (*p < 0,05, **p < 0,01; jednosmerna ANOVA i dalje korišćenje Tukey’s HSD testa) je određivana u odnosu na kontrolnu grupu (vehikulum). Skraćenice: EKSTR - ekstrakt; KAR - karagenin, i.pl. - intraplantarno, p.o. - per os. Napomena: simboli na malom grafikonu odgovaraju legendi prikazanoj na velikom grafikonu. 193 Flavonoidi su široka klasa polifenolnih jedinjenja, koji ispoljavaju antiinflamatorno dejstvo, zbog čega se pojedine flavonoidne droge tradicionalno koriste u tretmanu zapaljenskih procesa. Smatra se da je jedan od ključnih mehanizama antiinflamatornog dejstva flavonoida inhibicija enzima koji su uključeni u sintezu eikozanoida: fosfolipaze A2, COX i 5-lipooksigenaze. Dejstvom na COX smanjuje se sinteza prostaglandina (PG), važnih medijatora inflamatornog procesa. Smanjena sinteza PG modulira i sve ćelijske odgovore u kojima PG učestvuju. Samim tim, ublažavaju se i ostali aspekti inflamacije, kao što su povišena temperatura, bol i oticanje inflamiranog mesta (Harborne i Williams, 2000; Havsteen, 2002; Kelm i sar., 2000; Kim i sar., 2004). Pored inhibicije enzima, flavonoidi, naročito klasa flavona, suprimiraju gensku ekspresiju za COX-2 i inducibilnu NO sintazu, enzime uključene u inflamatornu reakciju. Smatra se da je ova modulirana genska ekspresija delom posledica inhibicije transkripcionog faktora NF-κB (Kim i sar., 2004). Flavonoidi imaju sposobnost neutralizacije slobodnih radikala koji mogu pokrenuti inflamatornu reakciju aktivacijom redoks-senzitivnog NF-κB faktora, pa mogu imati povoljne terapijske efekte u prevenciji i ranim fazama bolesti u čijoj osnovi leži inflamatorna reakcija (Chirumbolo, 2012; Havsteen, 2002; Menegazzi i sar., 2006). Apigenin, luteolin i njihovi heterozidi, spadaju u klasu flavona, koji su česti sastojci biljnih namirnica, čija se svakodnevna upotreba u ishrani povezuje sa smanjenim rizikom nastanka različitih hroničnih inflamatornih stanja (Martens, Mithöfer, 2005). Uprkos ovoj činjenici, ograničen je broj podataka o antiinflamatornoj aktivnosti jedinjenja ove klase. Metanolni ekstrakt vrste Ficus pumila L., u kome su kao glavne komponente detektovani upravo apigenin i luteolin, kao i flavonolni heterozid rutin, pokazao je dozno- i vremenski-zavisno, statistički značajno antiedematozno dejstvo u poređenju sa kotrolnom grupom u karageninom (i.pl.) izazvanoj inflamaciji šape u miša. Ekstrakt (0,1-1,0 g/kg, p.o.) je dat 60 min nakon injektovanja karagenina, a maksimalni efekat je postignut i održavan u toku 3., 4., i 5. sata nakon injektovanja. Ispoljeni antiedematozni efekat ekstrakta u dozama 0,5 i 1,0 mg/kg je uporediv sa efektom indometacina (10 mg/kg, p.o.), referentnog leka (Liao i sar., 2012). Luteolin 7–O–glukozid i apigenin 7–O–glukozid izolovani iz herbe Vrebascum salviifolium Boiss., primenjeni u dozi 200 mg/kg (p.o.) ispoljavaju statistički značajno, vremenski-zavisno antiedematozno dejstvo u modelu karageninom (i.pl.) izazvane 194 inflamacije šape u miša. Prema nekim autorima, nastanak edema izazvanog karageninom je dvofazni proces: prvu fazu karakteriše oslobađanje histamina i serotonina, a kasna faza koja počinje oko 3 h nakon injektovanja posledica je dejstva bradikinina, prostaglandina i proteaza (Olajide i sar., 1999). Efekat oba heterozida je bio izraženiji u kasnoj fazi inflamatorne reakcije (270-360 min nakon injekcije karagenina), kada se u inflamatorni proces uključuju prostaglandini, što je u skladu sa mehanizmom antiinflamatornog dejstva flavonoida. Ipak, efekat oba jedinjenja bio je slabiji od efekta indometacina (10 mg/kg, p.o.), koji je korišćen kao referentni lek (Tatli i sar., 2008). Pored podataka o antiedematoznoj aktivnosti flavona pri per os primeni, u jednom testu luteolin i apigenin, injektovani su u šape miša (i.pl.) u dozama 25 i 50 mg/kg, 30 min pre i.pl. injekcije karagenina. Oba aglikona pokazala su dozno-zavisno i statistički značajano antiedematozno dejstvo u odnosu na kontrolnu grupu, a razlika između inflamirane i neinflamirane šape merena je 16 h nakon injektovanja karagenina (Funakoshi- Tago i sar., 2011). Hlorogenska kiselina je ubikvitarna fenolkarboksilna kiselina detektovana u oba ekstrakta, koja je takođe ispitivana u pogledu antiedematoznog dejstva. Hlorogenska kiselina je ispoljila dozno-zavisan i statistički značajan antiedematozni efekat, u odnosu na kontrolnu grupu, pri dozama 10-100 mg/kg, p.o. u karageninom izazvanom edemu šape u pacova (dos Santos i sar., 2006). Hlorogenska kiselina je data pacovima 60 min pre izazivanja inflamacije, a značajan antiedematozni efekat pri primeni u dozama 50 i 100 mg/kg nastupio je 3. časa nakon primene i održavan tokom naredna dva sata, dok je primenom niže doze (10 mg/kg, p.o.) značajan antiedematozni efekat nastupio u 4. i održavan tokom 5. sata. Mehanizam nije u potpunosti razjašnjen, ali se pretpostavlja da je povezan sa inhibicijom oslobađanja i sinteze medijatora inflamacije (dos Santos i sar., 2006). Metanolni ekstrakti cvasti i herbe L. zernyi pokazali su statistički značajnu dozno- zavisnu antiedematoznu aktivnost, koja se najverovatnije može dovesti u vezu sa flavonima i hlorogenskom kiselinom iz oba ekstrakta. Najvećom dozom (100 mg/kg, p.o.) metanolnog ekstrakta cvasti L. zernyi dobijen je efekat uporediv sa efektom dobijenim sa indometacinom, ali nižeg intenziteta, dok je nakon primene ekstrakta herbe L. zernyi u najvećoj dozi efekat bio ispod 50% antiedematozne aktivnosti. Razlika u intenzitetu ispoljenih efekata može se povezati sa značajnom razlikom u sadržajima heterozida: luteolin 7–O–glukozida (34,40% i 10,23% u ekstraktu cvasti i herbe L. zernyi, redom), kao i apigenin 7–O–glukozida (4,45% i 0,26% u ekstraktu cvasti i herbe L. zernyi, redom). 195 ZAKLJUČCI 196 1. U doktorskoj disertaciji ispitivani su sekundarni metaboliti i farmakološka aktivnost izolata tri odabrane vrste roda Laserpitium: u Evropi široko rasprostranjene vrste L. latifolium, koja je do sada samo delimično ispitivana, i dve vrste endemične za Balkansko poluostrvo: L. zernyi i L. ochridanum, koje do sada nisu proučavane. 2. Etarska ulja, izolovana destilacijom vodenom parom, hemijski su okarakterisana metodama GC-FID i GC-MS. 3. Bezbojna etarska ulja izolovana iz ploda i podzemnih organa L. latifolium karakteriše izuzetno visok procenat monoterpena sa α-pinenom kao najzastupljenijom komponentom (44,0% i 44,4%, redom), a u ulju ploda su u nešto višem procentu zastupljeni sabinen i β-pinen (26,8% i 13,9%, redom). 4. U svetloplavim etarskim uljima cvasti i herbe L. zernyi monoterpeni su takođe zastupljeniji u odnosu na seskviterpene. U etarskom ulju cvasti L. zernyi najzastupljenije komponente su sabinen, limonen i β-felandren (18,5%, 12,0% i 12,0%, redom), a u etarskom ulju herbe L. zernyi β-pinen (20,0%). Ova dva ulja su, u odnosu na druga ispitivana ulja, imala relativno visok sadržaj monoterpenskog alkohola terpinen-4-ola (10,6% i 12,0% u etarskom ulju herbe i cvasti L. zernyi, redom). Svetloplavo etarsko ulje podzemnih organa L. zernyi imalo je približno isti sadržaj monoterpenske i seskviterpenske frakcije, a α-pinen (31,6%) i α-bisabolol (30,9%) su najzastupljenije komponente. 5. Plavo etarsko ulje podzemnih organa L. ochridanum, za razliku od prethodno okarakterisanih etarskih ulja, ima viši sadržaj seskviterpenske frakcije (51,4%) u odnosu na monoterpensku (42,6%). Najzastupljenije komponente ovog etarskog ulja su α-pinen (33,2%), hamazulen (14,9%) i α-bisabolol (10,3%). U plavom etarskom ulju ploda L. ochridanum dominiraju monoterpeni, a najzastupljenije komponente su limonen (57,7%) i sabinen (14,4%). Etarsko ulje herbe L. ochridanum, takođe je plave boje i bogato je monoterpenima (55,3%), a najzastupljenija komponenta je sabinen (25,9%). 6. S obzirom na široku primenu α-bisabolola u farmaceutskoj i kozmetičkoj industriji sa jedne strane i njegovu ograničenu zastupljenost u biljnom svetu sa druge strane, etarska ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum 197 imaju poseban značaj kao novi prirodni izvori ovog seskviterpenskog alkohola. 7. Hromatografijom na koloni silikagela i semipreparativnom HPLC hromatografijom, iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. latifolium izolovana su dva daukanska estra: laserpicin (1) i acetildezoksodehidrolaserpicin (2), kao i dva fenilpropanska jedinjenja: laserin (3) i latifolon (4). U okviru ove doktorske disertacije acetildezoksodehidrolaserpicin (2) je prvi put izolovan iz vrste roda Laserpitium, a laserin (3) prvi put iz vrste L. latifolium. Struktura izolovanih jedinjenja određivana je IR i NMR spektroskopijom i HR-MS ESI+ masenom spektrometrijom. 8. Uporednom HPLC analizom, korišćenjem izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda, uočena je velika kvalitativna sličnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium, pri čemu je konstatovan viši sadržaj sva četiri jedinjenja u ekstraktu podzemnih organa. 9. Hromatografijom na koloni silikagela i semipreparativnom HPLC hromatografijom, iz hloroformskog ekstrakta podzemnih organa L. zernyi izolovano je i strukturno okarakterisano (IR i NMR spektroskopija, i HR-MS ESI + masena spektrometrija) sedam seskviterpenskih laktona. Pet laktona je osnovne strukture slovanolida, tj. 1βH,5βH,6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida: tarolid (5); acetilizomontanolid (6); acetilmontanolid (7); izomontanolid (9) i montanolid (10), a izolovan je i jedan eudezmanolidni lakton silerolid (8). Takođe izolovan je još jedan lakton: 8α-senecioiloksi-10β-hidroksi- -6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (jedinjenje 11), koji je po prvi put izolovan iz vrste roda Laserpitium. 10. Uporednom HPLC analizom, uz korišćenje izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda, utvrđeno je da su ekstrakti herbe i cvasti L. zernyi nešto kompleksnijeg sastava u odnosu na ekstrakt podzemnih organa. U sva tri ekstrakta detektovani su laktoni tarolid (5), izomontanolid (9) i montanolid (10). U ekstraktu podzemnih organa detektovan je i latifolon (4), dok je u ekstraktima herbe i cvasti L. zernyi utvrđeno i prisustvo laserpicina (1). 11. Hloroformski ekstrakt podzemnih organa L. ochridanum imao je nešto kompleksniji sastav u odnosu na hloroformski ekstrakt podzemnih organa 198 L. zernyi. Iz ovog ekstrakta je, pored laktona slovanolidne strukture i silerolida, prethodno izolovanih iz ekstrakta podzemnih organa L. zernyi, izolovano još pet novih, visoko hidroksilovanih i esterifikovanih derivata slovanolida (jedinjenja 12-16), od kojih četiri karakteriše dodatna esterifikacija u položaju 2β. Struktura ovih jedinjenja određivana je IR i NMR spektroskopijom i HR-MS ESI+ spektrometrijom. Nova jedinjenja izolovana iz podzemnih organa L. ochridanum su: 8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (12); 8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (13); 8α-angeloiloksi-11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (14); 2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid (15); 8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en- -12,6-olid (16). Takođe, izolovana su i okarakterisana još dva seskviterpenska laktona: 8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid (17) i izosilerolid (18). 12. Uporednom HPLC analizom, uz korišćenje izolovanih jedinjenja kao eksternih standarda, uočena je kvalitativna sličnost hloroformskih ekstrakata podzemnih organa, herbe i ploda L. ochridanum: komponente prisutne u sva tri ekstrakta su laktoni tarolid (5), izomontanolid (9) i montanolid (10), a u ekstraktu herbe detektovan je i silerolid (8). Pored laktona, u ekstraktima herbe i ploda detektovan je i laserpicin (1), a u ekstraktu podzemnih organa i latifolon (4). 13. U metanolnim ekstraktima cvasti i herbe (bez cvasti) L zernyi sadržaj ukupnih polifenola određivan je spektrofotometrijskim postupkom. Sadržaj ukupnih polifenola bio je nešto viši u metanolnom ekstraktu cvasti (14,32% preračunato kao galna kiselina). 14. HPLC analizom u uslovima optimizovanim za razdvajanje polifenola, uz korišćenje standardnih supstanci, u metanolnim ekstraktima cvasti i herbe L. zernyi konstatovano je prisustvo hlorogenske kiseline i flavona: apigenina, luteolina i njihovih 7−O−glukozida. Sadržaj detektovanih flavona bio je viši u metanolnom ekstraktu cvasti u odnosu na metanolni ekstrakt herbe L. zernyi. 15. Antimikrobna aktivnost izolovanih etarskih ulja: ploda i podzemnih organa L. latifolium, herbe, ploda i podzemnih organa L. ochridanum i cvasti, herbe i podzeminh organa L. zernyi određivana je bujon mikrodilucionim testom, uz 199 korišćenje ampicilina, amikacina i nistatina kao referentnih antimikrobnih agenasa. Rezultati su izraženi kao minimalne inhibitorne koncentracije (MIK). Najjaču antibakterijsku aktivnost ispoljila su etarska ulja plodova L. ochridanum i L. latifolium, i etarska ulja podzemnih organa L. zernyi i L. ochridanum prema bakterijama Staphyloccocus aureus, S. epidermidis i Microccocus luteus, kao i etarsko ulje herbe L. ochridanum prema S. aureus. Najjači antifungalni efekat ispoljilo je etarsko ulje podzemnih organa i herbe L. ochridanum na soj Candida albicans ATCC 24433 i etarsko ulje ploda L. ochridanum na soj C. albicans ATCC 10259. Antimikrobna aktivnost navedenih etarskih ulja prema ostalim mikroorganizmima, kao i aktivnost svih ostalih etarskih ulja bila je slaba. 16. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja cvasti i herbe L. zernyi ispitivana je i agar difuzionim testom. Ispoljeni efekat bio je slab, što je u skladu sa rezultatima mikrodilucionog testa. 17. Etarska ulja podzemnih organa L. ochridanum i L. zernyi ispitivana su i u pogledu antinociceptivnog i antiedematoznog dejstva nakon p.o. primene u modelu karageninom (i.pl.) izazvane inflamacije u pacova. 18. Ova etarska ulja su pokazala dozno- i vremenski-zavisno i statistički značajno antinociceptivno dejstvo uporedivo sa efektom ibuprofena, referentnog leka, u modelu inflamatorne hiperalgezije u pacova. Rezultat ukazuje da testirana etarska ulja mogu biti novi prirodni proizvodi efikasni u terapiji bola u različitim inflamatornim stanjima. 19. Etarska ulja su pokazala dozno- i vremenski-zavisno i statistički značajno antiedematozno dejstvo uporedivo sa efektom indometacina, referentnog leka, u modelu i.pl. injekcijom karagenina izazvanog edema u pacova. Etarska ulja podzemnih organa vrsta L. zernyi i L. ochridanum su efikasna u smanjenju edema, što je još jedna od manifestacija inflamatorne reakcije. Ispitivana etarska predstavljaju nove prirodne sirovine koje mogu biti efektivne protiv edema nastalih u različitim zapaljenskim reakcijama. 20. Ispitivanjem citotoksične aktivnosti hloroformskih ekstrakata podzemnih organa i herbe L. latifolium u MTT i SRB kolorimetrijskim testovima utvrđeno je da oba ekstrakta ispoljavaju koncentraciono-zavisnu aktivnost na dve ćelijske linije humanog adenokarcinoma dojke MCF 7/6 i MCF 7/AZ, invazivnom i 200 neinvazivnom tipu, redom. Ekstrakt podzemnih organa, u kome je koncentracija daukanskih estara i fenilpropana laserina bila viša, ispoljio je generalno i jaču citotoksičnu aktivnost. 21. Ispitivanjem citotoksičnih aktivnosti daukanskih estara i laserina, utvrđeno je i da ova jedinjenja ispoljavaju koncentraciono-zavisan efekat, te da doprinose, bar delimično, ispoljenoj citotoksičnoj aktivnosti ekstrakata L. latifolium. Među izolovanim jedinjenjima, najjači citotoksičan efekat ispoljio je acetildezoksodehidrolaserpicin. Invazivna ćelijska linija MCF 7/6 je bila naročito osetljiva na dejstvo acetildezoksodehidrolaserpicina: preračunate IC50 vrednosti su u niskom mikromolarnom opsegu, a efekat je uporediv sa efektom vinblastin-sulfata, referentnog jedinjenja. 22. Ekstrakti podzemnih organa i herbi L. zernyi i L. ochridanum, kao i laktoni izolovani iz njih isptivani su u pogledu citotoksične aktivnosti u istim in vitro kolorimetrijskim testovima na istim ćelijskim linijama. Efekat hloroformskih ekstrakata podzemnih organa bio je jači u odnosu na efekte koje su ispoljili ekstrakti herbi, izuzev aktivnosti ekstrakta podzemnih organa L. ochridanum u SRB testu na ćelijskoj liniji MCF 7/6. 23. Među izolovanim laktonima najjači citotoksični efekat ispoljio je, 2β,8α- -diangeloiloksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olid, koji jedini ima dvostruku vezu u laktonskom prstenu. Gvajanolidi sa manjim brojem estara u strukturi, kao i eudezmanolidi, nisu dostigli 50% inhibicije ćelijskog rasta čak ni u najvećoj testiranoj koncentraciji (100 µM). Za najaktivnija jedinjenja ispoljeni citotoksični efekat bio je koncentraciono-zavisan. 24. Antioksidantna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi određivana je in vitro testovima: ispitivanjem ukupne antioksidantne aktivnosti i sposobnosti neutralizacije DPPH i ˙OH radikala. Metanolni ekstrakt cvasti L. zernyi, u kome je konstatovan viši sadržaj ukupnih polifenola, kao i identifikovanih flavona i hlorogenske kiseline, ispoljio je i jači antioksidantni efekat u sva tri testa u odnosu na ekstrakt herbe, ali i slabiji antioksidantni efekat od kvercetina. 25. Antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata cvasti i herbe L. zernyi testirana je mikrodilucionim testom prema pet sojeva Gram(+) bakterija, tri soja Gram(–) 201 bakterija i dva soja C. albicans. Oba ekstrakta su ispoljila najjaču antimikrobnu aktivnost prema sojevima C. albicans, a ekstrakt herbe ispoljio je i jaku aktivnost prema B. subtilis. Aktivnost ekstrakta herbe L. zernyi prema svim ostalim testiranim sojevima bakterija bila je umerena i identična. 26. Metanolni ekstrakti cvasti i herbe L. zernyi ispitivani su i u pogledu entiedematoznog efekta u karageninom (i.pl.) izazvanoj inflamaciji šape u pacova nakon p.o. primene. Ekstrakti su dozno-zavisno i statistički značajno smanjili edem šape izazvan i.pl. injekcijom karagenina. Najvećom dozom metanolnog ekstrakta cvasti L. zernyi dobijen je efekat uporediv sa efektom indometacina, dok je nakon primene ekstrakta herbe u najvećoj dozi efekat bio nižeg intenziteta. 27. Hemijskim ispitivanjem vrsta L. latifolium, L. zernyi i L. ochridanum dobijene su informacije o strukturi i sadržaju njihovih sekundarnih metabolita, a poseban značaj ogleda se u izolovanju retkih i novih jedinjenja. Rezultati ispitivanja farmakološke aktivnosti izolata ukazuju na znatan lekoviti potencijal ispitivanih predstavnika roda Laserpitium, i time na njihov značaj kao potencijalno novih prirodnih lekovitih sirovina. 202 LITERATURA 203 Acar JF, Goldstein FW. Disc susceptibility test. U: Antibiotics in Laboratory Medicine 4th ed. Uredio: Lorain V. Baltimore: Williams & Wilkins, 1996, str. 1-51. Adams RP. Identification of essential oils bz gas chromatography quadrupole mass spectrometry. Carol Stream: Allured publishing corporation, 2001, str. 1-455. Adcock JW, Betts TJ. A chemotaxonomic survey of essential oil constituents in the tribe Laserpitiae (fam Umbelliferae). Planta Med. 1974;26:52-64. Aljančić I, Vajs V, Menković N, Karadžić I, Juranić N, Milosavljević S, Macura S. Flavones and sesquiterpene lactones from Achillea atrata subsp. multifida: Antimicrobial activity. J Nat Prod. 1999;62:909-911. Alkhatib R, Hennebelle T, Joha S, Idziorek T, Preudhomme C, Quesnel B, Sahpaz S, Bailleul F. Activity of elaeochytrin A from Ferula elaeochytris on leukemia cell lines. Phytochemistry. 2008;69:2979-2983. Alves AMH, Gonçalves JCR, Cruz JS, Araújo DAM. Evaluation of the sesquiterpene (–)-α-bisabolol as a novel peripheral nervous blocker. Neurosci Lett. 2010;472:11-15. Ammon HPT, Sabieraj J, Kaul R. Kamille. Mechanismus der antiphlogistischen Wirkung von Kamillenextrakten und -inhaltsstoffen. Deutsch Apoth Ztg. 1996;136:1821-1834. [Na nemačkom] Appendino G, Valle MG, Gariboldi P. Structural and conformational studies on sesquiterpenoid esters from Laserpitium halleri Crantz subsp. halleri. J Chem Soc Perkin Trans. 1986;1:1363-1372. Appendino G, Valle MG, Caniato R, Cappeletti EM. Sesquiterpene lactones from Laserpitium garganicum. Phytochemistry. 1985;25:1747-1749. Appendino G, Tagliapietra S, Paglino L, Nano GM, Monti D, Picci V. Sesquiterpenoid esters from the fruits of Ferula communis. Phytochemistry. 1990;29:1481-1484. Appendino G, Cravotto G, Nano GM. Sesquiterpene lactones from Laserpitium gallicum. Phytochemistry. 1993;33:883-886. Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils ─ A review. Food Chem Toxicol. 2008;46:446-475. Barrero AF, Herrador MM, Arteaga P. Sesquiterpene lactones and other constituents of Seseli vayredanum. Phytochemistry. 1994;37:1351-1358. Barrero AF, Herrador MM, Arteaga P. Sesquiterpenes and phenylpropanoids from Seseli vayredanum. Phytochemistry. 1992;31:203-207. Baser KHC, Duman H. Composition of the essential oil of Laserpitium petrophilum Boiss. et Heldr. J Essent Oil Res. 1997;9:707-708. Berridge MV, Tan AS. Characterisation of the cellular reduction of 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT): subcellular 204 localization, substrate dependence and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction. Arch Biochem Biophys. 1993;303:474-482. Bevilacqua A, Corbo MR, Sinigaglia M. Use of natural antimicrobials and high pressure homogenization to control the growth of Saccharomyces bayanus in apple juice. Food Control. 2012;24:109-115. Bianchi M, Rossoni G, Sacerdote P, Panerai AE, Berti F. Carbamazepine exerts anti-inflammatory effects in the rat. Eur J Pharmacol. 1995;294:71-74. Blumenthal M, Brinckmann J, Wollschlager B. The ABC Clinical Guide to Herbs. Uredili: Hall T, Goldberg A, Kuntz T, Dinda K. Austin: American Botanical Council; 2003, str. 51-63. Bohlmann F, Thefeld W. Naturally occuring coumarin derivatives. V. Dihydroseselin derivatives from Laserpitium archangelica. Tetrahedron Lett. 1970;41:3577-3580. Bruno M, Bondi ML, Vassallo N, Gedris TE, Herz W. Guaianolides and other terpenoids from Anthemis aetnensis. Phytochemistry. 1997;37:1351-1358. Candan F, Unlu M, Tepe B, Daferera D, Polissou M, Sökmen A, Akpulat A. Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae). J Ethnopharmacol. 2003;87:215-20. Carocho M, Ferreira ICFR. A review on antioxidants, prooxidants and related controversy: Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food Chem Toxicol. 2013;51:15-25. Chirumbolo S. Plant phytochemicals as new potential drugs for immune disorders and cancer therapy: really a promising path? J Sci Food Agric. 2012;92:1573-1577. Chizzola R. Composition of the essential oil from Laserpitium gallicum grown in the wild in southern France. Pharm Biol. 2007;45:182-184. Chizzola R, Novak J. Fruit oil of Laserpitium siler L. grown in France. J Essent Oil Res. 1999;11:197-8. Cuendet M, Hostettmann K, Potterat O. Iridoid glucosides with free radical scavenging properties from Fagraea blumei. Helv Chim Acta. 1997;80:1144-1152. Cushine TTP, Lamb AJ. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Ag. 2005;26:343-356. Čajkanović V. Rečnik srpskih narodnih verovanja o biljkama. Uredio: Đurić V. Beograd: Srpska književna zadruga, Srpska akademija nauka i umetnosti; 1985, str. 309-310. Daglia M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 2012;23:174- 181. 205 Dall’Acqua S, Linardi MA, Maggi F, Nicoletti M, Petitto V, Innocenti G, Basso G, Viola G. Natural daucane sesquiterpenes with antiproliferative and proapoptotic activity against human tumor cells. Bioorgan Med Chem. 2011;19:5876-5885. De Andrade IL, Bezerra JNS, Lima MAA, de Faria RAPG, Lima MAS, Andrade- Neto M. Chemical composition and insecticidal activity of essential oils friom Vanillosmopsis pohlii against Bemisia argentifolii. J Agr Food Chem. 2004;52:5879-5881. Della Loggia R, Carle R, Sosa S, Tubaro A. Evaluation of the anti-inflammatory activity of chamomile preparations. Planta Med. 1990;56:657-658. Dewick, PM. Medicinal Natural Products ─ A biosynthetic approach, 3th edition. Chichester: John Wiley and Sons Ltd. 2009, str. 187-247. Drew DP, Kirchau N, Reichwald K, Simonsen HT. Guaianolides in Apiaceae: perspectives on pharmacology and biosynthesis. Phytochem Rev. 2009;8:581-599. Đermanović M, Mladenović S, Ristić N, Stefanović M. Sesquiterpene lactones from Laserpitium alpinum L. (Umbelliferae). Bull Soc Chim Beo. 1982;47:317-318. Đermanović M. Hemijsko ispitivanje biljaka iz roda Laserpitium L. (Umbellifeare). Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu - Hemijski fakultet. 1990, str. 1-92. Đermanović M, Stefanović M, Đermanović V, Milovanović M. Sesquiterpene lactones from Laserpitium latifolium L. Fitoterapia. 1994;65:556. Edris AE. Pharmaceutical and therapeutic potentials of essential oils and their individual volatile constituents: A review. Phytother Res. 2007;21:308-323. European Pharmacopoeia, Sixth Edition. Strasbourg: Council of Europe, 2007. European Prarmacopoeia, Seventh Edition. Strasbourg: Council of Europe, 2011. Evans WC. Pharmacognosy, Trease and Evans, 16th Edition. Uredio: Evans D. Edinburgh, London, New York, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto, Saunders Elsevier, 2009. Fraga BM, Hernandez MG, Diaz JG. Carotidol esters from Ferula linkii. Phytochemistry. 1989;28:1649-1652. Funakoshi-Tago M, Nakamura K, Tago K, Mashino T, Kasahara T. Anti- inflammatory activity of structurally related flavonoids, apigenin, luteolin and fisetin. Int Immunopharmacol. 2011;11:1150-1159. Ghantous A, Gali-Muhtasib H, Vuorela H, Saliba NA, Darwiche N. What made sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials? Drug Discov Today. 2010;15:668-678. Ghisalberti EL. The daucane (carotane) class of sesquiterpenes. Phyochemistry. 1994;37:597-623. 206 Gonzalez AG, Bermejo J, Diaz JG, Arancibia L. Humulenes and other constituents of Ferula latipinna. J Nat Prod. 1988;51:1140-1147. Harborne JB, Williams CA. Advances in flavonoid research since 1992. Phytochemistry. 2000;55:481-504. Hartvig P. Laserpitium L. U: Mountain Flora of Greece 1. Uredio: Strid, A. Cambridge: Cambridge University Press; 1986, str. 726–733. Havsteen BH. The biochemistry and medicinal significance of the flavonoids. Pharmacol Therapeut. 2002;96:67-202. Hegi G. Siler Miller, Laserpitium L. U: Illustrierte Flora von Mitteleuropa, Band V (2), Uredio Beger H. Wien: A. Pichler’s Witwe & Sohn; 1906, str. 1467-1501. Helyes Z, Szabo A, Nemeth J, Jakab B, Pinter E, Banvolgyi A, Kereski L, Keri G, Szolcsányi J. Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund’s adjuvant–induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 2004;50:1677-1685. Holub M, Herout V, Sorm F. Analysis of extractable substances from the root of Laserpitium latifolium. Chem Listy. 1958;52:2348-2354. Holub M, Herout V, Šorm F. Analysis of the extractable substances from the root of Laserpitium latifolium. Coll Czech Chem Commun. 1959;24:3926-3933. Holub M, Samek Z, Herout V, Šorm V. Constitution of isolaserpitin, deoxodehydrolaserpitin and laserpitinol. Monatshefte F Chem. 1967;98:1138-1153. Holub M, Samek Z, Herout V, Šrom F. The constitution of laserpitine – A sesquiterpenic compound from Laserpitium latifolium L. root. Coll Czech Chem Commun. 1967;32:591-609. Holub M, De Groote R, Herout V, Sorm F. Oxygen-containing components of petroleum ether extract of Laser trilobum root. Structure of laserine. Coll Czech Chem Commun. 1968;33:2911-2917. Holub M, Popa DP, Samek Z, Herout V, Šorm F. Neutral components of the light petroleum extract of the root of Laserpitium siler L. The structure of sesquiterpene lactone montanolide. Coll Czech Chem Commun. 1970;35:3296-3308. Holub M, Motl O, Samek Z, Herout V. The structure of two sesquiterprne lactones isomontanolide and acetylisomontanolide from Laserpitium siler L. Coll Czech Chem Commun. 1972;37:1186-1194. Holub M, Samek Z. The structure of archangenolide, a sesquiterpenic lactone from Laserpitium archangelica Wulf. Coll Czech Chem Commun. 1973;38:731-738. Holub M, Molt O, Samek Z. The structure and relative and absolute configurations of the sesquiterpenic lactones gradolide and pohlovide from Laserpitium siler L. Coll Czech Chem Commun. 1978;43:2471-2477. 207 Holub M, Budĕšinský M, Smitalova Z, Šaman D, Rychlewska U. Structure of isosilerolide, relative and absolute configuration of silerolide and lasolide – sesquiterpene lactones of new stereoisomeric type of eudesmanolides. Coll Czech Chem Commun. 1986;51:903-929. Holub M, Budĕšinský M. Sesquiterpene lactones of the Umbelliferae. Phytochemistry. 1986;25:2012-2026. Hoppe HA, Drokenkunde. Hamburg: Cram, De Gruyter & Co; 1958, str. 232-233. Hoult JRS, Paya M. Pharmacological and biochemical actions of simple coumarins: Natural products with therapeutic potential. Gen Pharmac. 1996;27:713-722. Jabrane A, Jannet BH, Mighri Z, Mirjolet JF, Duchamp O, Harzallah-Sikhiri F, Lacaille-Dubois MA. Two new sesquiterpene derivatives from the Tunisian endemic Ferula tunetana Pom. Chem Biodivers. 2010;7:392-399. Jakovlev V, Isaac O, Flaskamp E. Pharmakologische Untersuchungen von Kamillen-Inhaltsstoffen. VI. Untersuchungen zur antiphlogistischen Wirkung von Chamazulen und Matricin. Planta Med. 1983;49:67-73. [Na nemačkom] Kamatou GPP, Viljoen AM, Lourens ACU, Baser KHC, Demrici B, Lindsey KL, Van Staden J, Steenkamp P. The in vitro pharmacological activities and a chemical investigation of three South African Salvia species. J Ethnopharmacol. 2005;102:382-390. Kamatou GPP, Viljoen AM. A review of application of α-bisabolol and α-bisabolol- rich oils. J Am Oil Chem Soc. 2010;87:1-7. Kapetanos C, Karioti A, Bojović S, Marin P, Veljić M, Skaltsa H. Chemical and principal-component analyses of the essential oils of Apioidae taxa (Apiaceae) from Central Balkan. Chem Biodivers. 2008;5:101-119. Kelm MA, Nair MG, Strazburg GM, DeWitt DL. Antioxidant and cyclooxygenase inhibitory phenolic compounds from Ocimum sanctum Linn. Phytomedicine. 2000;7:7-13. Kim HP, Son KH, Chang HW, Kang SS. Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci. 2004;96:229-245. Kim KN, Ham YM, Moon JY, Kim MJ, Kim DS, Lee WJ, Lee NH, Hyun CG. In vitro cytotoxic activity of Sargassum thunbergii and Dictyopteris divaricata (Jeju seaweeds) on the HL-60 tumour cell line. Int J Pharmacol. 2009;5:298-306. Kim S, Jung E, Kim J-H, Park Y-H, Lee J, Park D. Inhibitory effects of (−)-α- bisabolol on LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages. Food Chem Tox. 2011;49:2580-2585. Kiran SR, Devi PS, Reddz KJ. Evaluation of in vitro antimicrobial activity of leaf and stem essential oils of Chloroxylon swietenia DC. World J Microb Biot. 2008;24:1909-1914. 208 Kmonickova E, Zidek Z, Harmatha J, Budesinsky M, Vokac K. Immunostimulatory activity of trilobolide and method of preparation thereof. International Applocation Number: PTC/CZ2008/000083; Internbational Publication Number: WO 2009/010021 A1. Kukić J, Popović V, Petrović S, Mucaji P, Ćirić A, Stojković D, Soković M. Antioxidant and antimicrobial activity of Cynara cardunculus extracts. Food Chem. 2008;107:861-868. Kuprevič VF. Lekarstvenije rasteniju i ih primenie. Uredili: Jurkevič ID, Mišenin ID. Minsk: Izdateljstvo „Nauka i tehnika“; 1974, str. 520-521. Le Bars D, Gozariu M, Cadden SW. Animal models of nociception. Pharmacol Rev. 2001;53:597-652. Lee J-C, Lim K-T. Effects of cactus and ginger extracts as dietary antioxidants on reactive oxidant and plasma lipid levels. Food Sci Biotechnol. 2000;9:83-88. Liao CR, Kao CP, Peng WH, Chang YS, Lai SC, Ho YL. Analgestic and anti- inflammatory activities of methanol extract of Ficus pumila L. in mice. Evid-Based Compl Alt. 2012;ID340141,9 pages. Luximon-Ramma A, Bahorun T, Soobrattee MA, Aruoma OI. Antioxidant activities of phenolic, proanthocyanidin, and flavonoid components in extracts of Cassia fistula. J Agric Food Chem. 2002;50:5042-5047. Madhavan BN. Final report on the safety assesment of bisabolol. Int J Toxicol. 1999;18:33-40. Martens S, Mithöfer A. Flavones and flavone synthases. Phytochemistry. 2005;66:2399-2407. Menegazzi M, Di Paola R, Mazzon E, Muia C, Genovese T, Crisafulli C, Suzuki H, Cuzzocrea S. hypreicum perforatum attenuates the development of carrageenan- induced lung injuru in mice. Frre Rad Biol Med. 2006;40:740-753. Merfort I. Review of the analytical techniques for sesquiterpenes and sesquiterpene lactones. J Chrom A. 2002;967:115-130. Merfort I. Perspectives on sesquiterpene lactones in inflammation and cancer. Curr Drug Targets. 2011;12:1560-1573. Micevski K, Laserpitium L. U: Flora na Republika Makednoija, Tom I (6), Uredio: Matevski V. Skopje: Makednoska Akademija na Naukite i Umetnostite, 2005; str. 1647-1650. Milosavljević S, Bulatović V, Stefanović M. Sesquiterpene lactones from the Yugoslavian wild growing plant families Asteraceae and Apiaceae. J Serb Chem Soc. 1999;64:397-442. Milosavljević S. Strukturne instrumentalne metode. Beograd: Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu; 2004, str.108-172. 209 Miski M, Mabry TJ. New daucane esters from Ferula tingitana. J Nat Prod. 1986;49:657-660. Moldt P, Smitt UW, Brogger Christensen S. A new sesquiterpene from Laserpitium latifolium. J Nat Prod. 1987;50:974-975. Morris CJ. Carrageenan-induced paw edema in the rat and mouse. U: Inflammation Protocols (Methods in Molecular Biology), Uredili: Winyard PG, Willoughby DA. New Jersey, Totowa: Humana Press Inc; 2003, str. 115–123. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55-63. Motl O. Plant substances. XXXVI. Components of Laserpitium siler fruits. Coll Czech Chem Comm. 1973;38:3737-3741. Newman DJ, Cragg GM. Natural products as sources of new drugs over 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 2012;75:311-355. Nikolić V. Rod Laserpitium L. U: Flora SR Srbije, Tom V, Uredio: Josifović M. Beograd: Srpska akademija nauka i umetnosti; 1973, str. 308-313. Nikolić V. Fam. Apiaceae U: Flora SR Srbije, Tom IX, Uredio: Josifović M. Beograd: Srpska akademija nauka i umetnosti; 1977, str. 144-150. Nuňez ZO, Salabarria IS, Collado IG, Hernaney-Galan R. Sesquiterpenes from the wood of Juniperus lucayana. Phytochemistry. 2007;68:2409-2414. Ojeda-Sana AM, van Baren CM, Elechosa MA, Juarez MA, Moreno S. New insights into antibacterial and antioxidant activities of rosemary essential oils and their main components. Food Control. 2013;31:189-195. Olajide OA, Makinde JM, Awe SO. Effects of aqueous extract of Bridelia ferruginea stem bark on carrageenan-induced oedema and granuloma tissueformation on rats and mice. J Ethnopharm. 1999;66:113-117. Orhan I, Küpeli E, Aslan M, Kartal M, Yesilada E. Bioassay-guided evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive activities of pistachio, Pistacia vera L. J Ethnopharm. 2006;105:235-240. Petrović S, Maksimović Z, Kundaković T. Analiza sastojaka biljnih droga. Beograd: Farmaceutski fakultet Univerziteta u Beogradu; 2009, str. 48-59. Randall LO, Selitto JJ. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn Ther. 1957;111:409–419. Rang HP, Dale MM, Ritter JM, Moore PK. Pharmacology, Fifth edition. Edinburgh, London, New York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto: Churchill Livingstone; 2003, str. 217-260. Rasoul MAA, Marei GIK, Abdelgaleil SAM. Evaluation of antibacterial properties and biochemical effects of monoterpenes on plant pathogenic bacteria. Afr J Microbiol Res. 2012;6:3667-3672. 210 Rivas da Silva AC, Monteiro Lopes P, Barros de Azevedo MM, Machado Costa DC, Sales Alviano C, Sales Alviano D. Biological activities of α-pinene and β- pinene enantiomers. Molecules. 2012;17:6305-6316. Rocha NF, Rios ER, Carvalho AM, Cerqueira GS, Lopes AA, Leal LK, Dias ML, de Sousa DP, de Sousa FC. Anti-nociceptive and anti-inflammatory activities of (−)- α-bisabolol in rodents. N-S Arch Pharm. 2011;384:525-533. Rutovskii BN, Makarova-Semlyanska N. Investigation of the essential oil of Laserpitium hispidum MB. Trudy Nauchn Khim-Farmatsev Inst. 1930;22:85-94. Rychlewska U, Hodgson DJ, Holub M, Budĕšinský M, Smitalova Z. The structure of 2-oxo-8α-angeloyloxy-11α-acetoxy-5βH,6αH,7αH-guai-1(10),3-dien-6,12-olide, a sesquiterpenic lactone from Laserpitium prutenicum L. Revision of the stereostructures of native 2-oxoguai-1(10),3-dien-6,12-olides from the species of the Umbelliferae family. Coll Czech Chem Commun. 1985;50:2607-2624. Saklani A, Kutty SK. Plant-derived compounds in clinical trials. Drug Discov Today. 2008;13:161-171. Salminen A, Lehtonen M, Suuronen T, Kaarniranta K, Huuskonen J. Terpenoids: natural inhibitors of NF-κB signaling with anti-inflammatory and anticancer potential. Cell Mol Life Sci. 2008;65:2979-2999. Dos Santos MD, Almeida MC, Lopes NP, de Souza GEP. Evaluation of the anti- inflammatory, analgestic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid. Biol Pharm Bull. 2006;29:2236-2240. Sarić M. Diklić V. (urednici) Flora SR Srbije, Tom X Beograd: Srpska akademija nauka i umetnosti; 1986, str. 287-305. Sato Y, Suzaki S, Nishikawa T, Kihara M, Shibata H, Higuti T. Phytochemical flavones isolated from Scutellaria barbata and antibacterial activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Ethnopharmacol. 2000;72:483-488. Seyoum A, Asres K, El-Fiky FK. Structure-radical scavenging relationship activity of flavonoids. Phytochemistry. 2006;67:2058-2070. Siedle B, García-Pineres AJ, Murillo R, Schulte-Mönting J, Castro V, Rüngeler P, Klaas CA, Da Costa FB, Kisiel W, Merfort I. Quantitative structure-activity relationship of sesquiterpene lactones as inhibitors of the transcription factor NF-κB. J Med Chem. 2004;47:6042-6054. Simonović D. Botanički rečnik. Beograd: Srpska akademija nauka i umetnosti, Posebna izdanja, knjiga CCCXVIII, Institut za srpskohrvatski jezik, knjiga 3; 1959, str. 262-263. Singh S, Khajuria A, Taneja SC, Johri RK, Singh J, Qazi GN. Boswellic acids: A leukotriene inhibitor also effective through topical application in inflammatory disorders. Phytomedicine. 2008;15:400-407. 211 Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, Warren JT, Boeksch HM, Kenney S, Boyd MR. New colorimetric citotoxicity assay for anticancer-drug screening. J Natl Cancer I. 1990;82:1107-1112. Smitalova Z, Budĕšinský M, Šaman D, Vašičkova S, Holub M. Components of the extract from the underground parts of Laserpitium siler L. of slovenian origin, mainly sesquiterpene lactones. Coll Chech Chem Commun. 1984;49:852-870. Smitalova Z, Budĕšinský M, Šaman D, Holub M. Minor sesquiterpenic lactones of Laser trilobum (L.) Borkh. species. Collect Czech Chem Commun. 1985;51:1323- 1339. Süntar I, Küpeli Akkol E, Keles H, Yesilada E, Sarker SD. Exploration of the wound healing potential of Helichrysum graveolens (Bieb.) Sweet: Isolation of apigenin as an active component. J Ethnopharmacol. http://dx.doi.org/10.1016/j.jep.2013.06.006 Stefanović M, Mladenović S, Đermanović M, Jeremić D. Sesquiterpene lactones from Laserpitium siler L. (Umbelliferae). Bull Soc Chim Beo. 1977;42:639-647. Stepanović-Petrović RM, Micov AM, Tomić MA, Ugrešić ND. Local peripheral antihyperalgesic effect of levetiracetam and its mechanism of action in an inflammatory pain model. Anesth Analg. 2012;115:1457-1466. Stevanović V, Niketić M, Lakušić D. Distribution of the vascular plants in Yugoslavia (Serbia, Montenegro) and Macedonia. I. Glasnik Instituta za botaniku i Botaničke bašte Univerziteta u Beogradu, Beograd 1993;24-25:33-54. Sticher O. Ätherische Öle und Drogen, die ätherisches Öl enthalten. U: Pharmacognosie – Phytopharmazie. Uredili: Hänsel R, Sticher O. Heidelberg: Springer Medizin Verlag. 2007, str. 1086-1087. Stojković D, Soković M, Glamočlija J, Džamić A, Ćirić A, Ristić M, Grubišić D. Chemical composition and antimicrobial activity of Vitex agnus-castus L. fruits and leaves essential oil. Food Chem. 2011;128:1017-1022. Szőllősi R, Szőllősi Varga I. Total antioxidant power in some species of Labiatae (Adaptation of FRAP method). Acta Biol Szeged. 2002;46:125-127. Sweetman SC. Martindale – The Complete Drug Reference, 35th edition. London: The Pharmaceutical Press, 2007, str 1-3322. Tadić VM, Dobrić S, Marković GM, Bojović D. Analysis of natural products – Sesquiterpene lactones as anti-inflammatory agents. U: The Analysis of Pharmacologically Active Compounds and Biomolecules in Real Samples. Uredio: Injac R. Kerala, India: Transworld research Network; 2009, str. 97-128. Takeoka GR, Dao LT. Antioxidant constituents of almond (Prunus dulcis (Mill.) D.A. Webb) Hulls. J Agric Food Chem. 2003;51:496-501. 212 Tallarida RJ, Murray RB. Manual of Pharmacologic Calculations with Computer Programs, second ed. New York, Berlin, Heidelberg, London, Paris, Tokyo: Springer Verlag. 1986, str. 1-297. Tatli II, Akdemir ZS, Yesilada E, Kupeli E. Anti-inflammatory and antinociceptive potential of major phenolics from Verbascum salviifolium Boiss. Z Naturforsch C. 2008;63:196-202. Thabrew MI, Dharmasiri MG, Senaratne L. Anti-inflammatory and analgestic activity in the polyherbal formulation Maharasnadhi Quathar. J Ethnopharmacol. 2003;85:261-267. Timchuk KS. Gas chromatographic study of essential oils from plants. Izvestiya Akademii Nauk Moldavskoi SSR, Biologicheskie i Khimicheskie Nauki. 1981;6:73- 77. [Na ruskom] Tirillini B, Pagiotti R, Angelni P, Pintore G, Chessa M, Menghini L. Chemical composition and fungicidal activity of the essential oil of Laserpitium garganicum from Italy. Chem Nat Compd. 2009;45:103-105. Tomić MA, Vučković SM, Stepanović-Petrović RM, Ugrešić N, Prostran MS, Bošković B. The anti-hyperalgesic effects of carbamazepine and oxcarbazepine are attenuated by treatment with adenosine receptor antagonists. Pain. 2004;111:253- 260. Tomić M. Efekti okskarbazepina u eksperimentalnim modelima fazičnog i toničnog bola u miševa i pacova. Magistarska teza, Univerzitet u Beogradu – Medicinski fakultet, 2004, str. 18-70. Tomić M, Stepanović-Petrović R. Terapija bola i glavobolje. U: Farmakoterapija za farmaceute. Uredili: Ugrešić N, Stepanović-Petrović R, Savić M. Beograd: Farmaceutski fakultet, 2011, 357-386. Tshikalange TE, Meyer JJM, Hussein AA. Antimicrobial activity, toxicity and the isolation of a bioactive compound from plants used to treat sexually transmitted diseases. J Ethnopharmacol. 2005;96:515-519. Tutin TG. Laserpitium L. U: Flora Europaea 2. Uredili: Tutin TG, Heywood VH, Burges NA, Moore DM, Valentine DH, Walters SM, Webb DA. Cambridge: Cambridge University Press; 1968, str. 368-370. Ulrich-Merzenich G, Panek D, Zeitler H, Vetter H, Wagner H. Drug development from natural products: exploiting synergistic effects. Indian J Exp Biol. 2010;48:208-219. Vajs V, Todorović N, Bulatović V, Menković N, Macura S, Juranić N, Milosavljević S. Further sesquiterpene lactones from Anthemis carpatica. Phytochemistry. 2000;54:625-633. Van den Dool H, Kratz PD. A generalization of retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chrom. 1963;11:463-471. 213 Van Zyl RL, Seatholo ST, Van Vuuren SF, Viljoen AM. The biological activities of 20 nature identical essential oil constituents. J Essent Oil Res. 2006;129-133. Velioglu YS, Mazza G, Gao L, Oomah BD. Antioxidant activity and total phenolics in selected fruits, vegetables and grain products. J Agric Food Chem. 1998;46:4113- 4117. Vereskovskii VV, Kuznetsova ZP, Loznukho IV, Sokolov IV, Osokin DM. Phenolic compounds of Laserpitium latifolium. Khim Prir Soedin. 1992;6:724-726. Viljoen AM, Gono-Bwalya A, Gamatou GPP, Baser KHC, Demirici B. The essential oil composition and chemotaxonomy of Salvia stenophylla and its allies S. repens and S. rucinata. J Essent Oil Res. 2006;18:37-45. Wagner Smitt U, Cornett C, Andersen A, Brogger Christensen S. New proazulene guaianolides from Thapsia villosa. J Nat Prod. 1990;53:1479-1484. Wang M, Li J, Rangarajan M, Shao Y, LaVoie EJ, Huang TC, Ho CT. Antioxidative phenolic compounds from sage (Salvia officinalis). J Agric Food Chem. 1998;46:4869-4873. Williams DH, Fleming I. Spectroscopic Methods in Organic Chemistry, fifth ed. London: The Mc Graw Hill Companies; 1995, str. 28-169. Wu X, Zhang X, Zhang H, Su P, Li W, Li L, Wang Y, Liu W, Gao P, Zhou G. Progesteron receptor downregulates breast cancer resisitance protein expression via binding to the progesterone responsive element in breast cancer. Cancer Sci. 2012;103:959-967. Yang RL, Yan ZH, Lu Y. Cytotoxic phenylpropanoids from carrot. J Agric Food Chem. 2008;56:3024-3027. Zhu X, Zhang H, Lo R. Phenolic compounds from the extract of artichoke (Cynara scolymus L.) and their antimicrobial activities. J Agric Food Chem. 2004;52:7272- 7278. 214 PRILOG 215 Slika 58. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 1 (laserpicina) Slika 59. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 216 Slika 60. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 3 (laserina) Slika 61. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 4 (latifolona) 217 Slika 62. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 5 – tarolida (8α,11α-diangeloiloksi-10β- hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) Slika 63. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 6 (acetilizomontanolida, tj. 8α-angeloiloksi- 11α,10β-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 218 Slika 64. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 7 (acetilmontanolida, tj. 8α-senecioiloksi- 11α,10β-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) Slika 65. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 8 (silerolida, tj. 1β-acetoksi,11α- senecioiloksi -6αH,7αH-eudezman-3-en-6,12-olida) 219 Slika 66. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 9 (izomontanolida, tj. 8α-angeloiloksi,11α- acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) Slika 67. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 10 (montanolida, tj. 8α-senecioiloksi,11α- acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 220 Slika 68. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH- gvajan-3-en-12,6-olida) Slika 69. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi- 6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 221 Slika 70. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi- 6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) Slika 71. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 14 (8α-angeloiloksi,11α-senecioiloksi-10β- hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 222 Slika 72. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH- gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) Slika 73. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β- hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 223 Slika 74. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 17 (8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH- gvajan-3-en-12,6-olida) Slika 75. HR-MS (ESI+) spektar jedinjenja 18 (izosilerolida, tj. 2β,8α-diangeloiloksi- 10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 224 Slika 76. IR spektar jedinjenja 1 (laserpicina) 225 Slika 77. IR spektar jedinjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 226 Slika 78. IR spektar jedinjenja 3 (laserina) 227 Slika 79. IR spektar jedinjenja 4 (latifolona) 228 Slika 80. IR spektar jedinjenja 5 (tarolida, tj. 8α,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 229 Slika 81. IR spektar jedinjenja 6 (acetilizomontanolida, tl. 8α-angeloiloksi-11α,10β-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 230 Slika 82. IR spektar jedinjenja 7 (acetilmontanolida, tj. 8α-senecioiloksi-11α,10β-diacetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 231 Slika 83. IR spektar jedinjenja 8 (silerolida, tj. 1β-acetoksi,11α-senecioiloksi -6αH,7αH-eudezman-3-en-6,12-olida) 232 Slika 84. IR spektar jedinjenja 9 (izomontanolida, tj. 8α-angeloiloksi,11α-acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 233 Slika 85. IR spektar jedinjenja 10 (montanolida, tj. 8α-senecioiloksi,11α-acetoksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olid) 234 Slika 86. IR spektar jedinjenja 11 (8α-senecioiloksi,10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 235 Slika 87. IR spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 236 Slika 88. IR spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 237 Slika 89. IR spektar jedinjenja 14 (8α-angeloiloksi,11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 238 Slika 90. IR spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 239 Slika 91. IR spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 240 Slika 92. IR spektar jedinjenja 17 (8α-angeloiloksi-10β-acetoksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 241 Slika 93. IR spektar jedinjenja 18 – izosilerolida (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 242 Slika 94. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 243 Slika 95. COSY (2D) NMR spektar jedinjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 244 Slika 96. gHSQC (2D) NMR spektar jeidnjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 245 Slika 97. gHMBC (2D) NMR spektar jeidnjenja 2 (acetildezoksodehidrolaserpicina) 246 Slika 98. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 5 (tarolida, tj. 8α,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 247 Slika 99. NOESY spektar jedinjenja 5 (tarolida, tj. 8α,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 248 Slika 100. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 249 Slika 101. COSY (2D) NMR spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 250 Slika 102. gHSQC (2D) NMR spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 251 Slika 103. gHMBC (2D) NMR spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 252 Slika 104. NOESY (2D) NMR spektar jedinjenja 12 (8α-acetoksi-2β,10β-diangeloiloksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 253 Slika 105. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 254 Slika 106. COSY (2D) NMR spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 255 Slika 107. gHSQC (2D) NMR spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 256 Slika 108. gHMBC (2D) NMR spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 257 Slika 109. NOESY (2D) NMR spektar jedinjenja 13 (8α,2β-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 258 Slika 110. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 14 (8α-angeloiloksi,11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 259 Slika 111. COSY (2D) NMR spektar jedinjenja 14 (8α-angeloiloksi,11α-senecioiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 260 Slika 112. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 261 Slika 113. COSY spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 262 Slika 114. gHSQC spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 263 Slika 115. gHMBC spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 264 Slika 116. NOESY spektar jedinjenja 15 (2β,8α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH-gvajan-3,(7-11)-dien-12,6-olida) 265 Slika 117. 1H NMR spektar (300 MHz) jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 266 Slika 118. COSY spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 267 Slika 119. gHSQC spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 268 Slika 120. gHMBC spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida) 269 Slika 121. NOESY spektar jedinjenja 16 (8α-acetoksi-2β,11α-diangeloiloksi-10β-hidroksi-6αH,7αH-gvajan-3-en-12,6-olida OBJAVLJENI I SAOPŠTENI REZULTATI KOJI ČINE DEO DOKTORSKE DISERTACIJE Radovi publikovani u međunarodnim časopisima 1. Popović V, Heyerick A, Petrović S, Van Calenbergh S, Karalić I, Niketić M, Deforce D. Sesquiterpene lactones from the extracts of two Balkan endemic Laserpitium species and their cytotoxic activity. Phytochemistry. 2013;87:102-111. 2. Popović V, Heyerick A, Petrović S, Van Calenbergh S, Karalić I, Niketić M, Deforce D. Cytotoxic activity of Laserpitium latifolium L. extract and its daucane and phenylpropanoid constituents. Records of Natural Products. 2013;7:245-249. 3. Popović V, Petrović S, Pavlović M, Milenković M, Couladis M, Tzakou O, Duraki Š, Niketić M. Essential oil from the underground parts of Laserpitium zernyi: potential source of α-bisabolol and its antimicrobial activity. Natural Product Communication. 2010;5:307-310. 4. Petrović S, Pavlović M, Popović V, Couladis M, Tzakou O, Milenković M, Vučićević D, Niketić M. Composition and antimicrobial activity of essential oils from flower and leaf of Laserpitium zernyi Hayek. Journal of Essential Oil Research. 2009;21:467- 470. Radovi saopšteni na skupovima međunarodnog značaja štampani u izvodima (M34) 1. Popović V, Petrović S, Drobac M, Milenković M, Couladis M, Tzakou O, Duraki Š, Niketić M. Composition and antimicrobial activity of essential oils from the underground parts of Laserpitium zernyi Hayek (Apiaceae). 5th Balkan Botanical Congress, 07-11.09. 2009, Beograd, Srbija. Book of Abstracts, pp. 149. 2. Popović V, Petrović S, Heyerick A, Van Calenbergh S, Deforce D, Niketić M. Sesquiterpene lactones from the extracts of Laserpitium zernyi and L. ochridanum and their cytotoxic activity. 7th CMAPSEEC - Conference on Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries. 27-30.05.2012, Subotica, Srbija. Book of Abstracts, pp. 10. Radovi saopšteni na skupovima nacionalnog značaja štampani u izvodu (M64) 1. Popović V, Petrović S, Milenković M, Tomić A, NIketić M. Antioksidantna, antimikrobna aktivnost i fenolski sastojci metanolnih ekstrakata Laserpitium zernyi Hayek (Apiaceae). XXVIII Savetovanje o lekovitim i aromatičnim biljkama. 08- 11.10.2008, Vršac, Srbija, Zbornik apstrakata, str. 125-126. 2. Popović V, Micov A, Tomić M, Stepanović-Petrović R, Petrović S. Antiedematozna aktivnost etarskih ulja iz podzemnih organa Laserpitium zernyi Hayek i cvasti kamilice, Matricaria recutita L. V Kongres farmaceuta Srbije sa međunarodnim učešćem. 13-17.10.2010, Beograd, Srbija, Arh farm, 60: 1012-1013. 3. Popović V, Petrović S, Pavlović-Drobac M, Milenković M, Couladis M, Niketić M. Hemijski sastav i antimikrobna aktivnost etarskih ulja Laserpitium latifolium L. i Laserpitium ochridanum Micevski (Apiaceae). V Kongres farmaceuta Srbije sa međunarodnim učešćem. 13-17.10.2010, Beograd, Srbija, Arh farm, 60: 1024- 1025. BIOGRAFIJA Višnja Popović je rođena 18.03.1981. god. u Beogradu. Osnovnu školu i Prvu kragujevačku gimnaziju završila je u Kragujevcu. Farmaceutski fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je školske 2000/01. god., diplomirala je 2006. god., sa ocenom 10 na diplomskom ispitu i prosečnom ocenom 9,03. Stručni ispit za diplomirane farmaceute položila je 2008. god. Doktorske akademske studije iz farmakognozije na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Beogradu upisala je školske 2007/08. god. Tokom studija bila je stipendista Ministarstva prosvete i sporta (2001-02. god.), Republičke fondacije za razvoj naučnog i umetničkog podmlatka (2002-06. god.), kao i fonda ''Dragoslav Srejović'' (2001-04. god.). Kao član Nacionalne asocijacije studenata farmacije, 2006. god. obavila je jednomesečnu praksu u apoteci u Varšavi, Poljska. Kao stipendista Vlade Slovačke 2005. god. studijski je boravila tri meseca u Institutu za famakologiju i botaniku Univerziteta Komenski u Bratislavi. Kao stipendista Basileus projekta (Erasmus Mundus Program, European Commision), tokom deset meseci 2010– 11. god., studijski je boravila u Labolatoriji za farmakognoziju i fitohemiju Fakulteta farmaceutskih nauka Univerziteta u Gentu. Dobitnica je Prve Godišnje nagrade 2011. god. za naučnoistraživački rad na poslediplomskim studijama Univerziteta u Beogradu – Farmaceutskog fakulteta. Od 2011. god. angažovana je na projektima Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije: ''Ispitivanje lekovitog potencijala biljaka: morfološka, hemijska i farmakološka karakterizacija'' (br. 173021), i ''Ispitivanje mehanizama dejstva, interakcija i toksičnih efekata adjuvantnih analgetika'' (br. 175045). U periodu od 2007– 2013. god. bila je angažovana kao saradnik u nastavi na Katedri za farmakognoziju Univerziteta u Beogradu – Farmaceutskog fakulteta. Autor je i koautor 5 radova u časopisima međunarodnog značaja. Govori engleski, a služi se nemačkim i holandskim jezikom. flpvinor 1. 113jaBa o ayTopcTBy FloTnincamn -a Bmtiaba llonomih 6poj inHgeKca 9/07 113jaB.rbyjerm ga je gorropcKa gincepTaqinja nog Hacnoeom AHanm3a ceKyHgapHmx meTa6onwra ii mcnmTmBaEbe cpapmaKonowKe aKTIIBHOCTM oga6paHmx Bpc -ra poga Laserpitium L. (Apiaceae) • pe3yriTaT C011CTBeHOr vicTpamnBaLiKor papa, • ga npe,Ano>KeHa gincepTaLtuja y [4env1mi HL1 y genoeinma Hinje 6inna npegno>KeHa 3a go6injaFbe 6inn0 Koje gvinnome npema cTygvijcKvim nporpaminma gpynnx BACOKOWK0.11CKV1X ycTaHoea, • ga cy pe3yrrrarvi KOpeKTHO HaeegeHvi • ga Hvicam Kpwino/na ayTopcKa npaea 1.1 K0pl4CTI10 viHrenerryanHy CBOiV1Hy gpynnx nOTr114C goKTopaHga Y Beorpa,gy, 10.06.2013. ("Iati(Mte-17—' otzt:It- Ilmanor 2. M3jaBa 0 14CTOBeTHOCTI4 wTamnaHe m eneKTpoHcKe Bep3mje goKTopcKor paga VIme vi npe3ume ayTopa BtawFba flonoevth Bpoj viHgeKca 9/07 C -rygvicKvi nporpam gOKTOpCKe aKagemcKe c -rymaje 143 cpapmaKorHo3Laje HacnoB paga AHarna3a ceKyHgapmax meTa6onwra 14 lacruaTiaBmbe cpapmaKonowKe aKTHHHoc -na oga6pamax Hpera poga Laserpitium L. (Apiaceae) MeH -rop I1pocf3. gp CHnHaHa Ile -rpomah, pegoema npocPecop floTnvicamea BmwEba Illonoavth I/13jaBrbyjem ja je wTamnaHa Bep3vija MOr gOKTOpCK01 papa VICTOBeTHa aneK -rpoHcKoj Bep3vijm Kojy cam npegao/na 3a oojaanDmBaHDe Ha nopTany rbarwranHor peno3wropHjyma YHHHep3wre -ra y Beorpagy. no3BorbaBam ga ce o6jaBe mojvi nwAHL4 nogaLtvi Be3aHm 3a ,go6v1jaHDe aKagemcKor 3BaFba goKTopa HayKa, Kao WTO cy vime LI npe3vime, rogviHa LI mec -ro pofjeFba frigaTym ogopaHe pa/a. OBV1 1111/14H1/1 nogaum mory ce objaByTvi Ha mpexcHmm c -rpaHmLtama gvirvi -ranHe 6146cmoTeKe, y eneKTpoHcKom KaTanory u y ny6nviKawijama YHuBep3vvre -ra y Beorpagy. floTmac goKTopaHga Y Beorpagy, 10.06.2013. ilpHnor 3. 143jaBa o KopmwheH3y Osnawhyjem YHinsep3oTeTcKy 6inonvioTeKy „CseTo3ap MapKosoh" a y eqvirviTanHin peno3vvropojym Ym1sep3v1TeTa y Beorpagy yHece mojy goKTopcmy oci,incepTaLky nog Hacnosom: AHarnma ceKyHgapmax meTa6onwra 11 HcruiTHearrbe cPapmaKonowKe aKTHI3HOCTH oga6pamix epcTa poga Laserpitium L. (Apiaceae) Koja je moje ayTopcKo eno. FtvicepTaLky ca CBMM npvinouma npegao/na cam y eneKTpoHcKom cipopmary norogHom 3a TpajHo apxvisinpaFbe. Mojy gOKTOpCKy gvicepTaqinjy noxpaFbeHy y nV11MTB.11HM peno3wropinjym YFunsep3viTeTa y Beorpagy M01 a Kopincre CBM KOil/1 nourryjy o,gpeg6e cagp)KaHe y oga6paHom Tviny rinteHuLe KpeaTosHe 3ajegHint4e (Creative Commons) 3a Kojy cam ce ognyt-mo/na. 1. AyTopc-rso (TAyTopcTso - HeKomepqvijanHo 3. AyTopcTeo — HeKomepumjanHo — 6e3 npepage 4. AyTopc-rso — HeKomepwjanHo — genvynn FlOR WCTMM ycnosvima 5. AyTopc-rso — 6e3 npepage 6. AyTopcTso — genvrrvi flOp MCTMIVI ycnosinma (Moninmo 3aoKpymanTe camo jegHy og wecT noHyrieHox nuLeHLL.1 , KpaTaK onvic nviLleHum gaT je Ha nonefm-un nvicTa). IrloTniac goKTopaHga Y Beorpagy, 10.06.2013 :Ay-0c? U7L- 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.