UNIVERZITET U BEOGRADU FARMACEUTSKI FAKULTET Tijana M. Miletić KARAKTERIZACIJA I MODELOVANJE PROCESA SUŠENJA RASPRŠIVANJEM U RAZVOJU ČVRSTIH FARMACEUTSKIH OBLIKA PRIMENOM KONCEPTA DIZAJNIRANJA KVALITETA doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHARMACY Tijana M. Miletić SPRAY DRYING PROCESS CHARACTERISATION AND MODELLING IN THE SOLID DOSAGE FORMS DEVELOPMENT BY APPLICATION OF QUALITY BY DESIGN CONCEPT Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentor: Dr sci Svetlana Ibrić, vanredni profesor, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu Članovi komisije: 1. Dr sci Svetlana Ibrić, vanredni profesor, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu 2. Dr sci Zorica Đurić, redovni profesor, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu 3. Dr sci Vjera Pejanović, naučni savetnik, Sektor istraživanja i razvoja, Hemofarm a.d., Vršac Ova doktorska disertacija je urađena u Sektoru istraživanja i razvoja Hemofarma a.d. u Vršcu i na Katedri za farmaceutsku tehnologiju Aristotelovog univerziteta u Solunu. Želim posebno da se zahvalim prof. dr Svetlani Ibrić, pod čijim rukovodstvom je izrađena ova disertacija, na nesebičnoj pomoći, ohrabrenjima i savetima koje mi je pružila. Zahvaljujem se prof. dr Kachrimanis Kyriakos na pruženoj mogućnosti da deo eksperimentalnog rada ove disertacije obavim na Katedri za farmaceutsku tehnologiju Aristotelovog univerziteta u Solunu, kao i na nesebičnoj pomoći i savetima prilikom obrade rezultata eksperimentalnog rada. Zahvaljujem se dr Vjeri Pejanović na pruženoj podršci prilikom izrade doktorske disertacije. Zahvaljujem se prof. dr Zorici Đurić na pruženoj podršci prilikom izrade doktorske disertacije. Posebno se zahvaljujem svim kolegama iz Sektora istraživanja i razvoja Hemofarma na saradnji, pruženoj podršci i razumevanju. Zahvaljujem se kolegama sa Katedre za farmaceutsku tehnologiju i kozmetologiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu na pruženoj podršci. Ovu doktorsku disertaciju posvećujem svojoj porodici i mužu koji su mi pružili beskrajnu ljubav i podršku na ovom putu. Karakterizacija i modelovanje procesa sušenja raspršivanjem u razvoju čvrstih farmaceutskih oblika primenom koncepta dizajniranja kvaliteta Rezime Koncept dizajniranja kvaliteta predstavlja sistematski pristup farmaceutskom razvoju proizvoda koji podrazumeva procenu, unapređenje razumevanja i optimizaciju formulacije i proizvodnog procesa kombinovanom primenom prethodnog znanja, analize rizika i izvođenja eksperimenata. Tehnologija sušenja raspršivanjem našla je primenu u farmaceutskoj industriji zahvaljujući jednostavnosti i fleksibilnosti procesa, kao jednostepeni proces kojim se tečnost pretvara u prašak čije se brojne osobine mogu kontrolisati manipulacijom procesnih promenljivih. Razumevanje kako promene procesnih parametara mogu uticati na fizičkohemijske osobine dobijenog proizvoda posebno je važno u proizvodnji čvrstih doziranih oblika koja ima za cilj obezbeđenje predviđanja i kontrole performansi. Cilj ovog istraživanja je unapređenje razumevanja sušenja raspršivanjem kroz karakterizaciju i modelovanje procesa, primenom koncepta dizajniranja kvaliteta. Istraživanje se sastoji iz dva dela sa ciljevima: razvoja procesa sušenja raspršivanjem kao tehnologije pogodne za obezbeđivanje homogenosti praškova i, posledično, ujednačenosti doziranja nisko doziranih lekovitih supstanci (model supstanca naratriptan hidrohlorid); i razvoja procesa sušenja raspršivanjem u postupku proizvodnje praška sa teško rastvorljivim model supstancama, u cilju poboljšanja rastvorljivosti formiranjem kompleksa sa ciklodekstrinima (model supstance vorikonazol i aripiprazol). Istraživanje takođe obuhvata ispitivanje mogućnosti primene dva derivata beta-ciklodekstrina: 2-hidroksipropil- beta-ciklodekstrina (HPBCD) i 2-O-metil-beta-ciklodekstrina (2-O-MBCD) u razvoju formulacije rastvora za raspršivanje sa ciljem poboljšanja rastvorljivosti i brzine rastvaranja odabranih model supstanci. Tokom razvoja, u skladu sa ciljanim profilom praška kao međuproizvoda definisanom u smislu kvaliteta, identifikovani su kritični atributi kvaliteta međuproizvoda, zatim definisani kritični atributi kvaliteta ulaznih parametara (osobine materijala, procesni parametri) i određivane su njihove funkcionalne veze sa kritičnim atributima kvaliteta proizvoda. U prvom delu istraživanja ispitivani su efekti procesnih parametara sušenja raspršivanjem (temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe, brzina aspiratora, koncentracija rastvora) na karakteristike procesa i kompozitnog praška naratriptan/laktoza/maltodekstrin (proizvodni prinos, sadržaj vlage i srednja veličina čestica). U drugom delu istraživanja sprovedene su studije rastvorljivosti teško rastvorljivih model supstanci sa ciklodekstrinima, simulacije molekularnog vezivanja, izvršena je karakterizacija praškova dobijenih sušenjem raspršivanjem rastvora lek:ciklodekstrin. Na odabranoj formulaciji sa aripiprazolom i HPBCD, izvršena je karakterizacija i modelovanje sušenja raspršivanjem. Ispitivani su efekti procesnih parametara sušenja raspršivanjem (temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe, koncentracija rastvora) na karakteristike procesa i kompozitnog praška lek:ciklodekstrin (proizvodni prinos, sadržaj vlage). U karakterizaciji i modelovanju procesa primenjeni su eksperimentalni dizajn, metodologija površine odgovora (RSM) i veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona (MLP). Primena frakcionog faktorijalnog dizajna (24-1) kao skrining metode omogućila je procenu značajnosti ispitivanih parametara, na osnovu koje je iz daljeg istraživanja isključena brzina aspiratora. Primena centralnog kompozitnog dizajna (CCD), RSM i MLP omogućila je modelovanje i karakterizaciju procesa sušenja raspršivanjem ispitivanih formulacija sa sve tri model supstance, tako što su razvijeni značajni modeli (p-vrednost<0.05). Analizom rezultata primene RSM opisane su funkcionalne veze između ulaznih parametara i praćenih odgovora. U slučaju naratriptan hidrohlorida i aripiprazola, postojala su slična zapažanja. Parametar koji je imao najveći uticaj na svaki ispitivani odgovor bila je brzina pumpe. U slučaju naratriptan hidrohlorida polinom drugog reda dobijen je samo za sadržaj vlage, i za ovaj odgovor, interakcija između temperature ulaznog vazduha i koncentracije rastvora je bila jedina statistički značajna interakcija. Analiza rezultata za formulaciju sa aripiprazolom nije pokazala postojanje statistički značajnih interakcija među faktorima, a samo kod proizvodnog prinosa su dobijeni polinomi drugog reda koji opisuju postojanje kvadratnog efekta brzine pumpe. Sa obe model supstance modelovanjem sušenja raspršivanjem primenom MLP mreže koja optimizuje odgovore istovremeno, dobijeni su modeli sa boljom korelacijom između predviđenih i zabeleženih rezultata, jer MLP poseduje bolju sposobnost modelovanja nelinearnih, složenih sistema u odnosu na RSM. Za prašak sa naratriptan hidrohloridom dobijeni su koeficijenti korelacije: za prinos R2MLP1=0.898, R2RSM1=0.842; sadržaj vlage R2MLP1=0.642, R2RSM1=0.550; srednju veličinu čestica R2MLP1=0.779, R2RSM1=0.712 i temperaturu izlaznog vazduha R2MLP1=0.933, R2RSM1=0.862. Za prašak sa aripiprazolom dobijeni su rezultati: za prinos R2MLP1=0.854, R2RSM1=0.846; sadržaj vlage R2MLP1=0.886, R2RSM1=0.871; temperaturu izlaznog vazduha R2MLP1=0.893, R2RSM1=0.899. Ispitivanjem novih načina kombinovanja RSM i MLP prepoznat je potencijal primene MLP u dopunjavanju podataka u setu definisanom eksperimentalnim dizajnom neophodnim za primenu RSM, tako da se omogući smanjenje broja praktično izvedenih eksperimenata. Za prašak sa naratriptan hidrohloridom dobijeni su koeficijenti korelacije: za prinos: R2RSM2=0.828; za temperaturu izlaznog vazduha R2RSM2=0.786. Za prašak sa aripiprazolom dobijeni su rezultati: za prinos R2RSM2a=0.828, R2RSM2b=0.338; sadržaj vlage R2RSM2a=0.783, R2RSM2b=0.656, i temperaturu izlaznog vazduha R2RSM2a=0.856, R2RSM2b=0.737. Model sa boljom sposobnošću predviđanja je bio RSM2a model, što je bila posledica boljih preformansi MLP2a modela koji je korišćen za dopunjavanje grupe podataka u sklopu CCD. Naime, u slučaju praška sa aripiprazolom, u dopunjavanju dela podataka korišćene su dve veštačke neuronske mreže sa različitim kvalitetom predviđanja (MLP2a i MLP2b modeli). Dobijeni rezultati potvrdili su pretpostavku da se pomoću eksperimentalnog dizajna (DOE) mogu obezbediti podaci boljeg kvaliteta jer iz njih proizilaze modeli koji bolje opisuju sistem i vrše tačnija predviđanja. Međutim, važno je da je mreža MLP koja se koristi u ove svrhe dovoljno robusna. Takođe je prepoznat i potencijal primene modelovanja zasnovanog na DOE u dešifrovanju “crne kutije” veštačkih neuronskih mreža (definisanje značaja i veza među faktorima). Predviđanja MLP1 modela (najbolji R2) za sve eksperimente u okviru CCD, obrađena su primenom RSM i dobijeni su modeli RSM3. Za prašak sa naratriptan hidrohloridom dobijeni su koeficijenti korelacije: za prinos R2=0.994; sadržaj vlage R2=0.961; temperaturu izlaznog vazduha R2=0.916. Za prašak sa aripiprazolom dobijeni su rezultati: za prinos R2=0.931; sadržaj vlage R2=0.920; temperaturu izlaznog vazduha R2=0.941. Ovaj pristup modelovanju procesa omogućio je prikaz veza između faktora i odgovora koje su mnogo složenije nego što pokazuju modeli RSM1, što bi mogao biti razlog za bolju sposobnost predviđanja modela MLP1. Zaključeno je da se kombinovanom primenom RSM i MLP objedinjuju prednosti obe metodologije zahvaljujući čemu je poboljšano razumevanje procesa. Primenom pristupa poželjnosti izvršena je numerička optimizacija procesnih parametara za rastvor koncentracije 25%, sa zahtevima za postizanje što većeg prinosa i što manjeg sadržaja vlage u prašku. Korišćenjem modela RSM1 odvojeno razvijenih za svaku model supstancu, definisani su optimalni procesni parametri za prašak sa naratriptan hidrohloridom: brzina pumpe 10%, temperatura ulaznog vazduha 190°C, i za prašak sa aripiprazolom: brzina pumpe 10 %, temperatura ulaznog vazduha 180°C. Izvedeni su eksperimenti pod definisanim procesnim parametrima, i rezultati dobijeni za prinos, sadržaj vlage i temperaturu izlaznog vazduha bili su slični sa predviđenim vrednostima kod obe formulacije. Jedino je u slučaju aripiprazola za proizvodni prinos uočena nešto veća razlika između predviđenih i realno dobijenih vrednosti, što je objašnjeno većom vrednošću parametra Lack of fit (mera neusklađenosti). Karakterizacija praškova dobijenih sušenjem raspršivanjem ispitivanih formulacija sa sve tri model supstance pokazala je određene sličnosti među praškovima. Proizvodi osušeni raspršivanjem čuvani tokom dužeg vremena (6-12 meseci) u blagim ambijentalnim uslovima su bili bez kristalne lekovite supstance (odsustvo karakterističnih pikova kod DSC termograma i FTIR spektara) ukazujući na relativno dobru fizičku stabilnost formulacija. Na laboratorijskom uređaju za raspršivanje prilikom sušenja rastvora u skladu sa očekivanjima, dobijen je sitan, voluminozni prašak koji se karakteriše lošom protočnošću. Međutim, u pilot i industrijskim uređajima se zbog veće komore za sušenje i mogućnosti da se ostvari dobro sušenje krupnijih kapi i dobiju krupnije sferne čestice, može očekivati da bi se dobili znatno protočniji praškovi. Vizuelizacija čestica je vršena pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije. Fotomikrografije pokazuju da su dobijene čestice sfernog oblika, glatke do vrlo smežurane površine, a primećeno je i prisustvo šupljih čestica. U slučaju nisko dozirane model supstance, naratriptan hidrohlorida, pokazano je da se dobija prašak vrlo ujednačenog sadržaja (RSD 0.23%). U drugom delu istraživanja pre odabira formulacije za modelovanje procesa, sa obe teško rastvorljive model supstance sprovedeno je ispitivanje uticaja ciklodekstrina na solubilizaciju leka i karakteristike praškova dobijenih sušenjem raspršivanjem pripremljenih rastvora kompleksa lek:CD. Prema izvedenim studijama rastvorljivosti sa vorikonazolom, 2-O-MBCD derivat je bio efikasniji u kompleksaciji nego HPBCD, dok u slučaju aripiprazola kompleksacija je rezultovala sličnim povećanjem rastvorljivosti leka sa oba CD. Ovi zaključci su potvrđeni studijama sprovedenim u vidu faktorijalnog eksperimentalnog dizajna. Kapacitet solubilizacije aripiprazola zavisio je od pH i jonskog sastava rastvora pufera više nego od tipa ciklodekstrina, a maksimalna solubilizacija je postignuta u citratnom puferu pH 3.0. Analizom dobijenih kriva rastvorljivosti zaključeno je da je najverovatnija stehiometrija vezivanja lek:HPBCD 1:3 sa obe model supstance, i aripiprazolom i 2-O-MBCD, a što se tiče kompleksacije vorikonazola sa 2- O-MBCD, nije mogao biti izveden zaključak. Sprovedene simulacije molekularnog vezivanja lek:CD doprinele su razumevanju prirode kompleksacije i kako ona može uticati na rastvorljivost, brzinu rastvaranja i stabilnost leka. U slučaju obe teško rastvorljive model supstance, sušenjem raspršivanjem dobijeni su praškovi sa velikom brzinom rastvaranja (više od 80 % leka za 10 minuta). Tokom kondicioniranja kompleksa sa aripiprazolom potvrđena je dobra hemijska stabilnost aripiprazola (sve nečistoće manje od 0.05%). Međutim, u kompleksu sa oba ispitivana derivata vorikonazol nije bio dovoljno zaštićen od hemijske degradacije (Nečistoća 1: 0.24%, 0.16%; Nečistoća 2: 0.46%, 0.31% sa HPBCD, odnosno 2-O-MBCD, respektivno). Stoga je za karakterizaciju i modelovanje sušenja raspršivanjem odabrana formulacija sa aripiprazolom i HPBCD čiji se kompleks priprema u citratnom puferu pH 3.0, a zatim prevodi u prašak sušenjem raspršivanjem sa koncentracijom leka u prašku od 5%. Ispitana je i primenljivost razvijenih modela na druge formulacije sa ciklodekstrinima: aripiprazol- HPBCD-PVP-citratni pufer, aripiprazol-2-O-MBCD-citratni pufer, vorikonazol-HPBCD-voda. Poređenjem dobijenih rezultata zaključeno je da se u formulacijama sa HPBCD dobija relativno dobro slaganje sa predviđanjima modela. Sa 2-O-MBCD dobijen je nešto manji prinos i veći sadržaj vlage, jer se 2-O-MBCD derivat suši nešto teže nego HPBCD. Sušenje raspršivanjem pokazalo se kao tehnologija pogodna za dobijanje praškova ujednačenog sastava, i u slučaju teško rastvorljivih supstanci pogodna za dobijanje lako rastvorljivih kompleksa sa ciklodekstrinima. U formulacijama sa ciklodekstrinima, kombinovanje primenjenih metoda pomoglo je u unapređenju razumevanja prirode kompleksacije lek:CD. Primenom koncepta dizajniranja kvaliteta i prikazanih metoda za karakterizaciju formulacije i procesa, postignuto je unapređenje razumevanja procesa sušenja raspršivanjem ispitivanih formulacija. Zaključeno je da je za postizanje što boljeg proizvodnog prinosa a što manjeg sadržaja vlage u prašku, kao osnovnih parametara kvaliteta procesa i proizvoda, potrebno da se procesni parametri izbalansiraju kako bi se obezbedilo što efikasnije sušenje i separacija čestica (kapi optimalne veličine, koncentracije i viskoziteta; dovoljno toplotne energije naspram količine tečnosti koja se dovodi u sistem i koja treba da ispari). Zaključeno je da svaka od primenjenih metodologija u modelovanju sušenja raspršivanjem ima svoje prednosti i nedostatke, i kada je potrebno izvršiti karakterizaciju i uspostaviti bolje razumevanje procesa najbolje je kombinovati više metoda. Koristeći RSM, moguće je identifikovati efekte nezavisnih promenljivih i njihove interakcije. Međutim, kod sistema kod kojih postoji veći broj odgovora kao što to može biti slučaj sa sušenjem raspršivanjem, primena MLP mreže rezultuje modelom koji može da optimizuje odgovore istovremeno sa boljom korelacijom između predviđenih i zabeleženih rezultata. Demonstrirani načini kombinovanja RSM i MLP prikazali su nove potencijale u karakterizaciji i modelovanju procesa. Ključne reči: sušenje raspršivanjem, eksperimentalni dizajn, metodologija površine odgovora, veštačke neuronske mreže, naratriptan hidrohlorid, vorikonazol, aripiprazol, ciklodekstrini. Naučna oblast: Farmacija Uža naučna oblast: Farmaceutska tehnologija UDK broj: Spray drying process characterisation and modelling in the solid dosage forms development by application of quality by design concept Abstract Quality by design concept represents systematic approach to pharmaceutical product development which consists of assessment, improvement of formulation and process understanding and optimization by combined use of previous knowledge, risk analysis and experimental work. Spray drying technology has found its use in pharmaceutical industry thanks to process simplicity and flexibility, as a single-step process in which liquid is transferred into powder with properties easily controlable by process variables manipulation. Understanding how changes in process parameters can influence the physicochemical properties of resulting product, is especially important in production of solid dosage forms where assurance of predictions and control of performance are the main goals. Main goal of this research is spray drying understanding improvement through process characterization and modelling performed by quality by design concept. The research consists of two sections with following goals: spray drying process development as technology suitable for providing homogeneous powders and subsequently, dose uniformity of low-dose drug substances (model substance naratriptan hydrochloride); and spray drying process development in production of powders with poorly soluble drug substances (model substances voriconazole and aripiprazole). The research is also dealing with examination of potential use of two beta-cyclodextrin derivatives: 2- hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HPBCD) and 2-O-methyl-beta-cyclodextrin (2-O-MBCD) for the purpose of solubility and dissolution improvement of selected model substances. Within the development process, according to quality target product profile for powder as a intermediate product, critical product quality attributes were identified, and then critical quality attributes for input parameters (material properties, process parameters) were defined and their functional relationships with critical product quality attributes were determined. In first section of research, effects of spray drying process parameters (inlet air temperature, pump speed, aspirator, feed concentration) on process and powder characteristics (production yield, moisture content and mean particle size) were examined. In the second section of research solubility studies with poorly soluble substances and cyclodextrins were conducted, as well as molecular docking simulations, and characterisation of spray dried drug:CD powders was performed. For selected formulation with aripiprazole and HPBCD, spray drying process characterisation and modelling was performed. Effects of spray drying process parameters (inlet air temperature, pump speed, feed concentration) on process and powder characteristics (production yield and moisture content) were examined. Design of experiments, response surface methodology (RSM) and artificial neural networks multilayer perceptron (MLP) were used in process characterisation and modelling. Fractional factorial design (24-1) applied as a screening method enabled examined parameters significance assessment, based on which parameter aspirator was excluded from further study. Use of central composite design (CCD), RSM and MLP helped in spray drying process characterisation and modelling for formulations with all threee model drug substances, and significant models were developed (p-value<0.05). RSM results analysis resulted in definition of functional relationships between input parameters and monitored responses. In case of naratriptan hydrochloride and aripiprazole formulation, observations were similar. Parameter that had the greates influence on each investigated response was pump speed. In case of naratriptan hydrochloride second order polynome was obtained only for moisture content, for which interaction between inlet air temperature and feed concentration was the only statistically significant interaction. Result analysis for aripiprazole formulation did not show any statistically significant interaction between the parameters, and only for yield second order polynomial equation were obtained which described quadratic effect of pump speed. With both model substances, models developed by MLP which considers monitored responses simultaneously, had better predictability expressed as correlation between predicted and experimental results, because MLP has the ability to better model nonlinear, intricate systems in comparison to RSM. For powder with naratriptan hydrochloride following correlation coefficients were obtained: for yield R2MLP1=0.898, R2RSM1=0.842; moisture content R2MLP1=0.642, R2RSM1=0.550; mean particle size R2MLP1=0.779, R2RSM1=0.712 and outlet air temperature R2MLP1=0.933, R2RSM1=0.862. For powder with aripiprazole following results were obtained: for yield R2MLP1=0.854, R2RSM1=0.846; moisture content R2MLP1=0.886, R2RSM1=0.871; outlet air temperature R2MLP1=0.893, R2RSM1=0.899. By investigation of new ways in combining RSM and MLP, for the purpose of lowering the necessary number of practically executed experiments, potential of MLP use for completion of the data set defined by a experimental design necessary for RSM application, was recognized. For powder with naratriptan hydrochloride following correlation coefficients were obtained: for yield R2RSM2=0.828; outlet air temperature R2RSM2=0.786. For powder with aripiprazole following results were obtained: for yield R2RSM2a=0.828, R2RSM2b=0.338; moisture content R2RSM2a=0.783, R2RSM2b=0.656; outlet air temperature R2RSM2a=0.856, R2RSM2b=0.737. Model with better predictability was RSM2a, which was the result of using MLP2a neural network with better performance for CCD data completion. Namely, in case of powder with aripiprazole, in data completion two neural networks were used, which had the different predictability performance (MLP2a and MLP2b models). Obtained results confirmed the assumption that by design of experiments (DOE) data of better quality can be provided because they render models which are better describing the system and result in more accurate predictions. However, it is important that the MLP use is robust enough. Also, potential of DOE based modelling was recognized for decoding the black-box nature of neural networks predictions (determination of significance and relationships between factors). Predictions of MLP1 model (best R2) for all the experiments within CCD, were processed by RSM and models RSM3 were developed. For powders with naratriptan hydrochloride following correlation coefficients were obtained: for yield R2=0.994; moisture content R2=0.961; outlet air temperature R2=0.916. For powder with aripiprazole following results were obtained: for yield R2=0.931; moisture content R2=0.920; outlet air temperature R2=0.941. This approach in process modelling enabled determination of relationships between factors and responses which are much more complicated than RSM1 models indicated, which could be the reason for better predictability of MLP1 model. It has been concluded that by combined application of RSM and MLP benefits of both methodologies are gained, therefore process understanding improvement was achieved. By application of desirability approach numerical optimization of process parameters for 25% solutions was performed, with requirement for maximizing the yield while minimizing the moisture content in powder. By using the RSM1 models developed separately for each drug substance, optimal process parameters were defined for powder with naratriptan hydrochloride: pump speed 10% and inlet air temperature 190°C, and for powder with aripiprazole: pump speed 10% and inlet air temperature 180°C. Experiments were executed under these process parameters and results obtained for yield, moisture content and outlet air temperature were similar to predicted values for both formulations. Only in case of aripiprazole, there was a slightly bigger difference in predicted and observed yield, which was explained by a larger value obtained for Lack of fit. Spray dried powders characterisation of formulations with all three model substances revealed a certain similarities between the powders. Spray dried products stored under mild ambient conditions during prolonged time period (6-12 months), were all without the presence of crystalline drug (absence of characteristic peaks on DSC thermograms and FTIR spectra), indicating relatively good physical stability of formulations. As expected, on laboratory spray drying device, powder with small particles, and voluminous powder of poor flowability were obtained. However, on pilot and industrial scale devices, due to larger drying chamber and the ability for efficient drying of larger droplets and larger particle production, significant improvement in resulting powders can be expected. Particle visualization was performed by scanning electron microscopy. Photomicrographs are showing that particles are spherically shaped, with surface from smooth to shriveled, and presence of hollow particles was also observed. In case of naratriptan hydrochloride as a low-dose model drug substance it has been shown that powder of good content uniformity can be obtained (RSD 0.23%). In second section of research, before the selection of formulation for process modelling was made, examination of cyclodextrin effect on drug solubilization was performed with both poorly soluble drug substances, and drug:CD spray dried powders were characterized. According to solubility study with voriconazole, 2-O-MBCD was found to be more efficient solubilizer than HPBCD, while in case of aripiprazole complexation resulted in similar solubility improvement with both CD. These conclusions were confirmed by factorial experimental design studies. Aripiprazole solubilization capacity was more pH and ionic composition dependent than it was influenced by CD type, and maximal solubilization was achieved in citrate buffer pH 3.0. By phase-solubility diagrams analysis, it was concluded that the most probable drug:HPBCD stoichiometry was 1:3 for both model substances, and aripiprazole and 2-O-MBCD, while for voriconazole and 2-O-MBCD conclusion could not be drawn. Performed molecular docking simulations drug:CD helped in better understanding the nature of complexation and how it can affect drug’s solubility, dissolution and stability. In case of both model substances by spray drying, powders with high dissolution rate were obtained (more than 80% of drug after 10 minutes). During conditioning of complexes with aripiprazole good chemical stability was confirmed (all impurities less than 0.05%). However, in complexes with voriconazole and both CD, drug was not protected from degradation (Impurity 1:0.24%, 0.16%; Impurity 2: 0.46%, 0.31% with HPBCD and 2-O-MBCD, respectively). For spray drying process characterisation and modelling, formulation with aripiprazole and HPBCD was therefore selected, with preparation in citrate buffer pH 3.0, and then solution transfering by spray drying into powder with drug concentration 5%. Applicability of resulting models was also examined for different CD formulations: aripiprazole-HPBCD-PVP-citrate buffer, aripiprazole-2-O-MBCD-citrate buffer, voriconazole-HPBCD-water. By comparison of predicted and experimental results it was concluded that with HPBCD formulations relatively good correlation with model predictions existed. With 2-O-MBCD lower yield and higher moisture content was obtained because drying of 2-O-MBCD was more difficult. Spray drying proved to be technology suitable for obtaining the powders of uniform composition, and in case of poorly soluble substances, suitable for producing freely soluble complexes with cyclodextrins. In formulation with cyclodextrins, combining the applied methods helped in understanding drug:CD complexation and how it can influence drug’s solubility, dissolution and stability. By application of quality by design concept together with presented methods for process and formulation characterisation, improvement in product and process understanding was achieved for spray drying of examined formulations. It was concluded that in order to achieve the highest possible yield and the lowest possible moisture content in powders, process parameters need to be balanced in order to provide the efficient drying and separation of particles (droplets of optimal size, concentration and viscosity; sufficient heat supply against the amount of liquid that is pumped into system and that needs to be evaporated). It was concluded that each of applied methodologies in spray drying modelling has its own pros and cons, and when characterisation and better process understanding needs to be achieved, it is best to combine them. By using RSM, it is possible to identify effects of process independent variables and their interactions. However, in systems where larger number of responses exists as it can occur in spray drying process, application of MLP results in model that can optimize the responses simultaneously and result in better correlation between predicted and experimental results. Demonstrated ways of combining RSM and MLP showed the new potentials for process characterisation and modelling. Keywords: spray drying, design of experiments, response surface methodology, artificial neural networks, naratriptan hydrochloride, voriconazole, aripiprazole, cyclodextrins. Scientific field: Pharmacy Specific scientific field: Pharmaceutical technology UDK number: Sadržaj 1. UVOD I TEORETSKE OSNOVE ISTRAŽIVANJA U FARMACEUTSKOM RAZVOJU 1 1.1. Koncept dizajniranja kvaliteta u farmaceutskom razvoju 1 1.2. Sušenje raspršivanjem 5 1.2.1. Teorija procesa sušenja raspršivanjem 6 1.2.1.1. Priprema medijum za raspršivanje 7 1.2.1.2. Raspršivanje medijuma (atomizacija) 8 1.2.1.3. Sušenje kapi ili formiranje čestica 9 1.2.1.4. Odvajanje čestica od vazdušne struje 11 1.2.2. Aspekti primene sušenja raspršivanjem odabrani za istraživanje 11 1.3. Ciklodekstrini u farmaceutskoj industriji 12 1.3.1. Derivati ciklodekstrina 16 1.3.2. Prednosti i ograničenja upotrebe ciklodekstrina 18 1.3.3. Simulacija molekularnog vezivanja lek:ciklodekstrin 19 1.3.3.1. Početna podešavanja pre simulacije 19 1.3.3.2. Scoring funkcija i algoritam pretraživanja 20 1.3.3.3. Grupisanje konformacija (clustering) 20 1.3.3.4. Optimizacija posle simulacije 21 1.3.3.5. Vizuelizacija 22 1.4. Metodologija za karakterizaciju i modelovanje procesa sušenja raspršivanjem 22 1.4.1. Modelovanje primenom eksperimentalnog dizajna 22 1.4.1.1. Skrining pomoću frakcionog faktorijalnog dizajna 25 1.4.1.2. Karakterizacija i modelovanje primenom metodologije površine odgovora 26 1.4.2. Modelovanje primenom veštačkih neronskih mreža 29 1.4.2.1. Proces učenja veštačke neuronske mreže 30 1.4.2.2. Višeslojni perceptron 32 2. CILJ ISTRAŽIVANJA 34 3. PRVI DEO ISTRAŽIVANJA 35 3.1. Uvod 35 3.1.1. Fizičkohemijske karakteristike naratriptan hidrohlorida 35 3.1.2. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda 37 3.1.3. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda 37 3.1.4. Definisanje potencijalno kritičnih atributa kvaliteta polaznih materijala i procesnih parametara 39 3.1.4.1. Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance 39 3.1.4.2. Odabir ekscipijenasa 41 3.1.4.3. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem 41 3.2. Materijali i metode 42 3.2.1. Materijali 42 3.2.2. Priprema praškova 44 3.2.3. Karakterizacija praškova 44 3.2.3.1 Sadržaj vlage 44 3.2.3.2. Veličina čestica 45 3.2.3.3. Vizuelizacija čestica praška 45 3.2.3.4. Ujednačenost sadržaja naratriptan hidrohlorida praškova 45 3.2.3.5. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) 46 3.2.3.6. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) 46 3.2.3.7. Nasipna i tapkana gustina praškova 46 3.2.3.8. Protočnost praškova 47 3.2.4. Eksperimentalni dizajn: skrining ispitivanje i metodologija površine odgovora 47 3.2.4.1. Skrining ispitivanje 47 3.2.4.2. Metodologija površine odgovora 49 3.2.5. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona 50 3.2.6. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža i metodologije površine odgovora 51 3.2.7. Optimizacija sušenja raspršivanjem 53 3.3. Rezultati i diskusija 53 3.3.1. Skrining ispitivanje 53 3.3.2. Metodologija površine odgovora 55 3.3.3. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona 58 3.3.4. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža (MLP) i metodologije površine odgovora (RSM) 65 3.3.4.1. Primena MLP u dopunjavanju podataka u setu definisanom eksperimentalnim dizajnom neophodnim za primenu RSM 65 3.3.4.2. Primena RSM u dobijanju matematičkih modela korišćenjem predviđanja MLP mreže u cilju boljeg razumevanja procesa 67 3.3.5. Optimizacija sušenja raspršivanjem 68 3.3.6. Karakterizacija dobijenih praškova 68 3.3.6.1. Ujednačenost sadržaja naratriptan hidrohlorida 69 3.3.6.2. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) 69 3.3.6.3. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) 72 3.3.6.4. Nasipna i tapkana gustina praškova 73 3.3.6.5. Protočnost praškova 74 4. DRUGI DEO ISTRAŽIVANJA 75 4.1. Uvod 75 4.1.1. Fizičkohemijske karakteristike vorikonazola 75 4.1.2. Fizičkohemijske karakteristike aripiprazola 76 4.1.3. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda 78 4.1.4. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda 79 4.1.5. Definisanje potencijalno kritičnih atributa kvaliteta polaznih materijala i procesnih parametara 79 4.1.5.1. Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance 79 4.1.5.2. Odabir ekscipijenasa 82 4.1.5.3. Analiza rizika za pripremu rastvora kompleksa lek:ciklodekstrin 83 4.1.5.4. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem 84 4.2. Materijali i metode 87 4.2.1. Materijali 88 4.2.2. Studije rastvorljivosti 88 4.2.2.1. Studije fazne rastvorljivosti 88 4.2.2.2. Primena faktorijalnog dizajna 89 4.2.3. Simulacija molekularnog vezivanja lek:ciklodekstrin 90 4.2.3.1 Dodatna semiempirijska optimizacija geometrije kompleksa vorikonazol:CD 92 4.2.4. Priprema praškova 93 4.2.4.1. Praškovi dobijeni sušenjem raspršivanjem 93 4.2.4.2. Praškovi dobijeni drugim metodama pripreme 94 4.2.5. Karakterizacija praškova 95 4.2.5.1. Određivanje sadržaja vode 95 4.2.5.2. Sadržaj vlage 95 4.2.5.3. Termogravimetrijska analiza 95 4.2.5.4. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) 96 4.2.5.5. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) 96 4.2.5.6. Ispitivanje brzine rastvaranja 96 4.2.5.7. Određivanje nečistoća vorikonazola 97 4.2.6. Modelovanje, karakterizacija i optimizacija sušenja raspršivanjem za odabranu formulaciju sa aripiprazolom 98 4.2.6.1. Eksperimentalni dizajn i metodologija površine odgovora 98 4.2.6.2. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona 100 4.2.6.3. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža i metodologije površine odgovora 100 4.2.6.4. Optimizacija sušenja raspršivanjem 103 4.2.6.5. Primenljivost dobijenih modela na različite formulacije 103 4.2.6.6. Dodatna karakterizacija dobijenih praškova nakon optimizacije 103 4.2.6.6.1. Vizuelizacija čestica praška 103 4.2.6.6.2. Nasipna i tapkana gustina praškova 104 4.2.6.6.3. Protočnost praškova 104 4.2.6.6.4. Kondicioniranje odabranih uzoraka sa aripiprazolom u komorama za studije stabilnosti 104 4.3. Rezultati i diskusija 106 4.3.1. Studije rastvorljivosti sa vorikonazolom 106 4.3.1.1. Određivanje sadržaja vode u ciklodekstrinima 106 4.3.1.2. Studije fazne rastvorljivosti 107 4.3.1.3. Primena faktorijalnog dizajna 109 4.3.2 Simulacija molekularnog vezivanja vorikonazol:ciklodekstrin 110 4.3.3. Karakterizacija praškova sa vorikonazolom 112 4.3.3.1. Termalna analiza 112 4.3.3.2. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) 114 4.3.3.3. Ispitivanje brzine rastvaranja 115 4.3.3.4. Dugoročna stabilnost kompleksa vorikonazol:ciklodekstrin 117 4.3.4. Studije rastvorljivosti sa aripiprazolom 119 4.3.4.1. Studije fazne rastvorljivosti 119 4.3.4.1.1. Uticaj pH i jonskog sastava medijuma, i dodatka polivinilpirolidona (PVP) na kompleksaciju sa HPBCD 119 4.3.4.1.2. Analiza dijagrama fazne rastvorljivosti sa HPBCD 122 4.3.4.1.3. Uticaj tipa ciklodekstrina na rastvorljivost – dijagrami fazne rastvorljivosti 124 4.3.4.1.4. Uticaj tipa ciklodekstrina na rastvorljivost – primena faktorijalnog dizajna 124 4.3.5. Simulacija molekularnog vezivanja aripiprazol:ciklodekstrin 126 4.3.6. Karakterizacija praškova sa aripiprazolom 127 4.3.6.1. Termalna analiza 127 4.3.6.2. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) 129 4.3.6.3. Ispitivanje brzine rastvaranja 130 4.3.7. Modelovanje, karakterizacija i optimizacija sušenja raspršivanjem za odabranu formulaciju sa aripiprazolom 133 4.3.7.1. Eksperimentalni dizajn i metodologija površine odgovora 133 4.3.7.2. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona 136 4.3.7.3. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža (MLP) i metodologije površine odgovora (RSM) 138 4.3.7.3.1. Primena MLP u dopunjavanju podataka u setu definisanom eksperimentalnim dizajnom neophodnim za primenu RSM 138 4.3.7.3.2. Primena RSM u dobijanju matematičkih modela korišćenjem predviđanja MLP mreže u cilju boljeg razumevanja procesa 142 4.3.7.3.3. Kratak rezime primenjenih pristupa u modelovanju i tip informacija koje pružaju 143 4.3.7.4. Optimizacija sušenja raspršivanjem 144 4.3.7.5. Primenljivost dobijenih modela na različite formulacije 146 4.3.7.6. Dodatna karakterizacija dobijenih praškova 146 4.3.7.6.1. Vizuelizacija čestica praška 146 4.3.7.6.2. Nasipna i tapkana gustina praškova 148 4.3.7.6.3. Protočnost praškova merenjem protoka kroz otvor 148 4.3.7.6.4. Ispitivanje stabilnosti kompleksa aripiprazol:ciklodekstrin 149 5. ZAKLJUČAK 152 6. LITERATURA 163 7. BIOGRAFIJA AUTORA 172 1 1. UVOD I TEORETSKE OSNOVE ISTRAŽIVANJA U FARMACEUTSKOM RAZVOJU 1.1. Koncept dizajniranja kvaliteta u farmaceutskom razvoju U poređenju sa konvencionalnim pristupom razvoju farmaceutskog proizvoda, noviji pristup razvoju primenom koncepta dizajniranja kvaliteta (quality by design (engl.) pristup, QbD), razmatran u smernicama FDA i ICH Q8 (R2), Q9 i Q10, ima tu prednost da olakšava kontinuirano poboljšanje i uvođenje inovacija tokom celokupnog životnog ciklusa proizvoda. U pitanju je sistematski pristup razvoju proizvoda koji podrazumeva procenu, unapređenje razumevanja i optimizaciju formulacije i proizvodnog procesa kombinovanom primenom prethodnog znanja, analize rizika i izvođenja eksperimenata. Tokom farmaceutskog razvoja, u skladu sa ciljanim profilom proizvoda definisanim u smislu kvaliteta, identifikuju se kritični atributi kvaliteta proizvoda, zatim se definišu kritični atributi kvaliteta ulaznih parametara (osobine materijala, procesni parametri) i određuju se njihove funkcionalne veze sa kritičnim atributima kvaliteta proizvoda. Ovakav pristup razvoju može da unapredi postizanje željenog kvaliteta proizvoda, tako što obezbeđuje postavljanje odgovarajuće strategije kontrole (definisanje prostora za dizajn (design space, engl.) i obezbeđivanje izvođenja proizvodnje unutar njegovih granica). Alatke koje omogućavaju implementaciju koncepta dizajniranja kvaliteta jesu eksperimentalni dizajn, analiza rizika i procesna analitička tehnologija (engl. Process Analytical Technology, PAT) (FDA guidance, 2004; ICH Q8(R2), 2009; ICH Q9, 2005; ICH Q10, 2007; Woodcock, 2004). Ciljni profil kvaliteta (CPK) proizvoda opisuje se karakteristikama koje utiču na performanse, kliničku bezbednost i efikasnost proizvoda kao što su put primene, dozirani oblik, doza, atributi koji utiču na farmakokinetičke karakteristike, stabilnost itd. Kritični atributi kvaliteta (KAK) proizvoda se na osnovu CPK identifikuju tako da se karakteristike proizvoda koje utiču na performanse proizvoda mogu pratiti, analizirati i kontrolisati. Za čvrste oralne dozirane oblike to su obično aspekti koji utiču na čistoću 2 proizvoda, jačinu, oslobađanje leka i stabilnost. Lista potencijalnih KAK može se modifikovati kada su odabrani formulacija i proizvodni proces, i kako znanje o proizvodu i razumevanje procesa rastu. Kritični atributi ulaznih parametara (atributi materijala, procesni parametri) definišu se u skladu sa potencijalom za uticaj na KAK proizvoda, koji se procenjuje primenom analize rizika obično rano u procesu razvoja i može se ponavljati kako sve više informacija postaje dostupno i kako se znanje povećava. Najpre se procenjuju KAK lekovite supstance, zatim se vrši odabir ekscipijenasa i proizvodne tehnologije i procena kritičnosti njihovih atributa i parametara na kvalitet proizvoda. Identifikacija kritičnih atributa ulaznih parametara i njihovih poželjnih opsega na osnovu ustanovljenih funkcionalnih veza sa KAK proizvoda omogućava definisanje prostora za dizajn. Prostor za dizajn se sastoji od multidimenzionalne kombinacije i interakcija ulaznih promenljivih (atributi materijala, procesni parametri), i operacije u okviru tog prostora treba da obezbede proizvod željenog kvaliteta. Analiza rizika se bazira na prethodnom znanju i inicijalnim eksperimentalnim podacima i lista sa potencijalnim parametrima na početku može biti opširna, ali se vremenom modifikuje kroz dalje izvođenje eksperimenata i analizu rezultata koja omogućava definisanje značajnosti pojedinih promenljivih i potencijalnih interakcija (kombinacija eksperimentalnog dizajna, matematičkih modela i drugih studija koje obezbeđuju mehanističko razumevanje). Metode analize rizika koje se najčešće koriste u početnim fazama razvoja proizvoda su PHA analiza (engl. Preliminary Hazard Assesment – PHA, preliminarna analiza opasnosti) i FMEA analiza (engl. Failure Mode Effects Analysis – FMEA, analiza modaliteta ispada i efekata) (ICHQ9, 2005; Rausand, 2005; Sakura tablet case study, 2008; RMWG-07 case study, 2008). PHA analiza se sastoji od identifikacije mogućnosti dešavanja rizičnog događaja, kvalitativne evaluacije ozbiljnosti uticaja i relativnog rangiranja opasnosti kombinovanjem težine (ozbiljnosti) i verovatnoće događaja, i identifikacije mogućih korisnih mera. Definicije težine (ozbiljnosti) i verovatnoće rizika su prikazani u Tabelama 1.1-1 i 1.1-2. Može se koristiti pri prioritizaciji opasnosti, u dizajnu proizvoda ili procesa. Najčešće se koristi rano u razvoju projekta kada postoji malo informacija o 3 detaljima dizajna ili operacijama, tako da često prethodi studijama gde se identifikovane opasnosti procenjuju dalje drugim metodama. Tabela 1.1-1. Definicija težine rizika Težina Ocena Definicija Manja 1 Nema uticaja na karakteristike kvaliteta Veća 2 Odstupanje od specifikacije na osnovu stepena uticaja rizika Kritična 3 Zaustavljanje proizvodne linije na osnovu stepena uticaja rizika Katastrofalna 4 Povlačenje proizvoda na osnovu stepena uticaja rizika Tabela 1.1-2. Definicija verovatnoće rizika Verovatnoća Ocena Definicija Veoma neverovatno 1 Oko 1 u 100 godina ili manje Daleko 2 Oko 1 u 10 godina Povremeno 3 Oko 1 godišnje Verovatno 4 Oko 1 mesečno Često 5 Ne manje od 1 mesečno uzimajući u obzir proizvodnju od oko 100 serija godišnje Rizik se ocenjuje prema težini posledica i verovatnoći javljanja i klasifikuje kao visoko rizičan (H), srednje-rizičan (M) i nisko-rizičan (L) (Tabela 1.1-3). Tabela 1.1-3. Matrica rizika Verovatnoća/ Težina 1 2 3 4 5 Katastrofalna: 4 M H H H H Kritična: 3 L M M H H Veća: 2 L L M M H Manja: 1 L L L M M 4 FMEA analiza obezbeđuje evaluaciju potencijalnih modaliteta ispada u procesima i verovatnog efekta na ishod i/ili performanse proizvoda. Kada se modaliteti ispada utvrde, smanjenje rizika se može koristiti da eliminiše, ograniči, smanji ili kontroliše moguće ispade. FMEA metodično deli analizu složenih procesa na korake koji se mogu kontrolisati i moćna je alatka za sumiranje važnih modaliteta ispada, faktora koji uzrokuju ove ispade, i verovatne efekte ispada. Koristi se za prioritizaciju rizika i praćenje efektivnosti aktivnosti kontrole rizika. Može se primeniti u analizi proizvodnih operacija i njihovog efekta na proizvod i proces. Identifikuje elemente/operacije u sistemu koje ga čine ranjivim. Rezultati analize mogu se koristi kao osnova za dizajn ili dalju analizu ili iskorišćenje resursa. Rizik se procenjuje na osnovu tri kriterijuma: težine, verovatnoće javljanja i detektabilnosti (vremena detekcije) (Tabele 1.1-4-6). Tabela 1.1-4. Kategorija težine Kategorija težine Ocena Napomena Odstupanje 1 U slučaju koji značajno utiče na kvalitet, rangiranje iznosi 3 ili 4 Prošao ponovni test 2 --------- Pod-serija ili odbačena serija 3 --------- Zaustaviti tok proizvodnje 4 Utiče na stabilno snabdevanje lekom Povlačenje 5 --------- Tabela 1.1-5. Kategorija verovatnoće Kategorija verovatnoće Ocena Napomena ≤ 10000 1 Ne više od jednom na 10000 serija 1/1000 2 Ne više od jednom na 1000 serija i ne manje od jednom na 10000 serija 1/100 3 Ne više od jednom na 100 serija i ne manje od jednom na 1000 serija 1/10 4 Ne više od jednom na 10 serija i ne manje od jednom na 100 serija > 1/10 5 Ne manje od jednom na 10 serija Tabela 1.1-6. Kategorija detektabilnosti Kategorija detektabilnosti Ocena Napomena Pre svake pojedinačne operacije 1 ------------ Tokom pojedinačne operacije 2 ------------ Tokom serije pojedinačnih operacija 3 ------------ Testiranje finalnog proizvoda 4 ------------ Utvrđeno od strane korisnika 5 ------------ 5 Broj prioritetnog rizika je vrednost koja se dobija množenjem težine, verovatnoće i vremena detekcije: kada je taj broj < 20 postoji nizak rizik; kada je ≥ 20 i < 40 postoji srednji rizik; kada je vrednost ≥ 40 postoji visok rizik. U slučaju visokog ili srednjeg rizika cilj je uspostaviti kontrolu do nivoa niskog rizika, primenom odgovarajuće kontrolne strategije koja proizilazi iz dizajna lekovitog proizvoda. Smanjivanje rizika po kvalitet proizvoda zasniva se na razumevanju izvora varijabilnosti i uspostavljanju odgovarajuće kontrolne strategije u sklopu koje se vrši kontrola atributa materijala, procesnih parametara, in-procesno testiranje ili testiranje u realnom vremenu tokom proizvodnje, definiše specifikacija proizvoda i sl. 1.2. Sušenje raspršivanjem Tehnologija sušenja raspršivanjem u farmaceutskoj industriji zastupljena je skoro 50 godina, međutim potreba za radom na novim razvojnim programima ne prestaje jer je potrebno odražavati korak sa novim zahtevima za kvalitet, efikasnost i bezbednost farmaceutskih proizvoda, imajući u vidu odgovornosti prema bezbednosti i zaštiti životne sredine, kao i ekonomske elemente. O tome koliko je ova tehnologija aktuelna svedoči i činjenica da se koristi u pogonu oko 20,000 industrijskih postrojenja širom sveta, i verovatno postoji dvostruko više lokacija dostupnih za testiranje proizvoda na laboratorijskoj i pilot opremi. U fokusu razvoja i obezbeđenja napretka ove tehnologije trenutno su sledeći izazovi: usaglašenost sa zahtevima tržišta za specifikacije praškova, smanjenje formiranja neželjenih naslaga proizvoda na opremi, smanjenje troškova proizvodnje po jedinici težine osušenog proizvoda, usaglašenost sa sve strožim zahtevima za bezbednost i zaštitu životne sredine. Posebno se izdvaja važnost bliske saradnje praktično usmerenih akademskih istraživanja i industrije, na polju poboljšanja razumevanja osnova sušenja raspršivanjem i razvoja tzv. computer-friendly (engl.) matematičkih modela koji će bolje predstavljati proces i omogućiti uspešno ostvarenje projekata (Masters, 2004). U farmaceutskoj industriji koja je dugo bila usmerena na šaržni tip proizvodnje, u poslednje vreme povećava se interes za sušenje raspršivanjem kao kontinuiranim procesom koji odgovara zahtevima direktiva koje su izdvojene u okviru PAT Inicijative (FDA guidance, 2004). 6 Tehnologija sušenja raspršivanjem je našla primenu u farmaceutskoj industriji zahvaljujući jednostavnosti i fleksibilnosti procesa. U pitanju je jednostepeni proces kojim se tečnost pretvara u prašak čije se brojne osobine mogu kontrolisati (oblik i veličina čestica, poroznost, nasipna gustina, protočnost, sadržaj vlage, stabilnost, oblik čvrstog stanja itd.), izborom odgovarajuće opreme i manipulacijom procesnih promenljivih, tako da se smanji broj procesnih koraka do finalnog proizvoda. U poređenju sa drugim konvencionalnim procesima granulacije, ovaj proces se smatra relativno robusnim i jednostavnim za scale-up (engl.). Sušenje raspršivanjem nudi nekoliko prednosti i kada treba promeniti osobine čvrstog stanja lekovitih supstanci, jer je moguće povećati rastvorljivost i brzinu rastvaranja teško rastvorljivih materijala, kao i ostvariti značajno poboljšanje stabilnosti amorfnog oblika. Sposobnost brzog dobijanja pojedinačnih čestica obezbeđuje uslove za inženjering čestica pogodan za proizvodnju praškova za inhalacionu primenu, mikrokapsula, čestica sa kontrolisanim oslobađanjem, nanočestica, liposoma (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008; Celik i Wendel, 2005). Razumevanje kako promene procesnih parametara mogu uticati na fizičkohemijske osobine dobijenog proizvoda posebno je važno u proizvodnji čvrstih doziranih oblika koja ima za cilj obezbeđenje predviđanja i kontrole performansi. 1.2.1. Teorija procesa sušenja raspršivanjem Proces sušenja raspršivanjem je konceptualno jednostavan: tečnost (rastvor, suspenzija, emulzija) se pumpa kroz raspršivač, formiraju se kapi tečnosti sa čvrstim komponentama i izlažu se pogodnoj struji gasa koja potpomaže isparavanje putem brzog masenog transfera tečnog nosača u gas. Kada se dovoljna količina tečne mase transformiše u paru, preostali čvrsti materijal u kapi formira pojedinačnu česticu koja se zatim odvaja iz struje gasa. Vreme postojanja kapi i brzina formiranja čestice traje od nekoliko milisekundi do nekoliko minuta. Vreme potrebno za formiranje čestice kontrolisano je inicijalnom veličinom kapi i brzinom isparavanja. Isparavanje je kontrolisano transferom toplote u kapi, transferom mase pare van kapi u struju gasa i specifičnim sastojcima formulacije (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Brzina formiranja čestice je ključni parametar koji je određen veličinom komore za sušenje te stoga i dimenzijama opreme potrebne za proizvodnju čestica željene veličine, 7 pri željenoj brzini proizvodnje. Sušenjem raspršivanjem obično se dobijaju čestice protočnosti pogodne za prikupljanje pod uticajem silazne vazdušne struje. Ovaj koncept je implementiran u sklopu opreme različite veličine od laboratorijskih uređaja do višespratnih komercijalnih kula za sušenje. Brzina proizvodnje za tipični laboratorijski uređaj za sušenje raspršivanjem je reda veličine nekoliko grama na sat, dok komercijalni uređaji proizvode nekoliko tona godišnje (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Bez obzira na tip uređaja, četiri fundamentalna podprocesa moraju se dogoditi u cilju uspešnog sušenja raspršivanjem (Slika 1.2-1) (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008): • priprema medijuma za raspršivanje; • raspršivanje medijuma; • sušenje kapi ili formiranje čestica; • odvajanje čestica od vazdušne struje. Tečni medijum za raspršivanje Rezervoar Priprema tečnog medijuma za raspršivanje Raspršivač Raspršivanje medijuma Kap tečnosti Sušenje kapi ili formiranje čestica Čestica Izlazni gas Prašak Odvajanje čestica od vazdušne struje Slika 1.2-1. Šematski prikaz procesa sušenja raspršivanjem (Augsburger i Hoag, 2008). 1.2.1.1. Priprema medijuma za raspršivanje Medijumi različitih reoloških osobina se mogu sušiti raspršivanjem: rastvori, suspenzije, emulzije niskog viskoziteta ili čak i vrlo viskozne suspenzije. Dizajn medijuma vrši se u skladu sa određenim ciljnim karakteristikama proizvoda, stabilnošću, rastvorljivošću sastojaka formulacije, površinskim naponom, viskozitetom. Najjednostavnija priprema šarže podrazumevala bi pripremu vodenog rastvora niskog viskoziteta rastvaranjem svih sastojaka mešanjem u sudu i pumpanje u uređaj za sušenje raspršivanjem. Vehikulum je obično vodeni, ali koriste se i organski rastvarači uz određene mere opreza i dodatke uređaju. Priprema treba da osigura da dobijeni medijum za raspršivanje bude odgovarajućih reoloških karakteristika zbog raspršivanja, kako bi bila formirana 8 odgovarajuća veličina kapi i odgovarajuće osobine praška. Za bilo koju formulaciju, sistem koji se dovodi u uređaj za sušenje raspršivanjem, tj. konzistencija sistema koji se procesira tokom određenog vremena vrlo je važna kako bi se kvalitet proizvoda održavao konstantnim kroz celu šaržu. (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). 1.2.1.2. Raspršivanje medijuma (atomizacija) Medijum za raspršivanje se dovodi do raspršivača (engl. atomization nozzle, atomizer) gde se prevodi u kapi. Glavni parametar performansi dizajna raspršivača je rezultujuća distribucija veličine kapi, jer srednja vrednost i širina distributivne krive utiču na veličinu čestica finalnog proizvoda kao i na prinos u procesu. Idealno bi bilo da distribucija veličine kapi bude što uža, kako bi bilo obezbeđeno ujednačeno sušenje i kako bi bili izbegnuti gubici na zidu suda uređaja zbog nepotpunog sušenja krupnijih kapi (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Proizvođači opreme za sušenje raspršivanjem za farmaceutsku primenu nude više tipova raspršivača, a najčešći su mlazni raspršivač sa dva fluida i rotacioni raspršivač. Mlazni raspršivači koriste struju gasa velike brzine (vazduha u slučaju vodenih sistema ili inertnog gasa azota u slučaju rada sa organskim rastvaračima), kojim se tečnost raspršuje u kapi kao što je ilustrovano na Slici 1.2-2. V A Z D U H V A Z D U H T E Č N O S T Slika 1.2-2. Mlazni raspršivač sa dva fluida (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Atomizer raspršuje tečnost u vidu pojedinačnih kapi i ovo prvobitno razdvajanje delova tečnosti u kapi prvi je faktor koji određuje veličinu osušenih čestica. Smatra se da je veličina čestica finalnog proizvoda prvenstveno zavisna od inicijalne veličine kapi, a u manjoj meri od koncentracije rastvora i odnosa gustine rastvora i čestica. Metoda kojom 9 se vrši ekstrakcija čestica iz struje procesnog vazduha takođe menja krajnju veličinu čestica. Ako je proizvod dobijen sušenjem raspršivanjem samo međuproizvod koji se dalje procesira kompaktiranjem, granulacijom ili tabletiranjem, stroga kontrola veličine kapi ne mora biti glavna promenljiva procesne kontrole (Snyder and Lechuga- Ballesteros, 2008). 1.2.1.3. Sušenje kapi ili formiranje čestica Proces formiranja čestica uključuje prevođenje raspršenih kapi u čvrste čestice koje je višestepeno i traje dok je kap izložena gasovitom medijumu za sušenje. Najčešća je konfiguracija uređaja u kojoj se sprej i gas za sušenje kreću kroz uređaj u istom smeru, kada postoji tzv. ko-kurentni protok (co-current, engl.) (Celik i Wendel, 2005). Formiranje čestica se može podeliti u tri faze (Slika 1.2-3): • inicijalna faza porasta brzine sušenja koja se dešava neposredno nakon kontakta kapi sa gasom za sušenje; • faza u kojoj je brzina sušenja najveća i konstantna; • finalna faza u kojoj brzina sušenja opada. Brzina sušenja se menja tokom vremena i zavisi od oblika kapi, sastava, fizičke strukture, koncentracije čvrstih materija, temperature i vlažnosti vazduha koji okružuje kap (Celik i Wendel, 2005). Vreme Period opadanja brzine Period konstantne brzine Početni period Br zin a su še n ja Slika 1.2-3. Kriva brzine sušenja (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Najpre se temperatura kapi menja u skladu sa temperaturom u okolini raspršivača. Kod raspršivača sa dva fluida koji koristi vazduh za raspršivanje, zbog jakog pritiska pod kojim je gas koji vrši atomizaciju tečnosti, dolazi do pada lokalne temperature kapi. 10 Temperatura kapi zatim postepeno raste, kako se raspršene kapi mešaju sa gasom za sušenje. Druga faza dešava se kada je u kapi postignut ekvilibrijum isparavanja rastvarača u okolnu struju gasa. Tokom perioda sušenja konstantnom brzinom, brzina isparavanja će biti pokretana toplotnim transferom na kap, koji mora da izbalansira energiju koja se uklanja usled efekta hlađenja tokom isparavanja. Dok traje period konstantne brzine isparavanja, kap tečnosti dostiže temperaturu koja je značajno ispod lokalne temperature gasa kojim se vrši sušenje. Na primer, kap tečnosti dostiže temperaturu samo 40˚C kada je unutrašnjost komore za sušenje ispunjena vrućim vazduhom koji ima temperaturu 80˚C i relativnu vlažnost 10 % (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Treća faza formiranja čestica dešava se pošto deo rastvarača nosača ispari, i kada čvrsti sadržaj u kapi utiče na brzinu isparavanja u gasoviti medijum. Obično ovo redukuje maseni transfer preostalog rastvarača i zbog toga se ova faza često zove period opadanja brzine sušenja. U ovoj vremenskoj tački, pošto koncentracija rastvorka dostiže vrednost koja odgovara njegovoj rastvorljivosti, površina kapi počinje da očvršćava i da formira ljusku. Ovo stvara maseni transfer kontrolisan unutrašnjom fuzijum u kapi, kojim se usporava bekstvo rastvarača iz unutrašnjeg jezgra na površinu pre isparavanja u gasoviti medijum (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Za medijum za raspršivanje tipa rastvora, čestična morfologija se formira u ovoj trećoj fazi sušenja. Kinetika formiranja čestice, kontrolisana brzinom isparavanja u kombinaciji sa porastom viskoziteta kapi, stvara izvesne stresne uslove koji utiču na formiranje površine čime se kontroliše morfologija čestica. Čestice dobijene pri većoj brzini sušenja imaju površinu sa otvorima, dok niža brzina sušenja dovodi do stvaranja sfernijih čestica sa manje naboranom površinom. Detaljniji mehanizmi nastanka kompletnih čestica od kapi, vrlo su kompleksni i zavise od velikog broja međusobno isprepletenih faktora, kao što su procesni parametri i fizičko-hemijske karakteristike formulacije (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Tokom procesa se dešavaju promene u energiji koje rezultuju poremećajem kristalne rešetke, formiranjem polimorfnih i/ili pseudopolimorfnih oblika, eliminisanjem kristalnosti ili u slučaju višekomponentnih sistema formiranjem kompleksa. Navedene promene mogu značajno uticati na biofarmaceutske osobine i stabilnost doziranih oblika 11 i mogu se kvalitativno i kvantitativno evaluirati primenom termalnih analitičkih metoda (Corrigan, 1995). 1.2.1.4. Odvajanje čestica od vazdušne struje Na završetku faze formiranja čestica, u uređaju za sušenje raspršivanjem stvara se dispergovani aerosol u kome je visoka koncentracija čvrstih čestica koje treba odvojiti iz struje procesnog vazduha. Kod farmaceutskog sušenju raspršivanjem, postoje dve različite metode prikupljanja proizvoda i to su separacija ciklonom i filtracija pomoću vrećastih filtera. Ciklonski separatori imaju prednost u prikupljanju čestica u farmaceutskim procesima sušenja raspršivanjem, uključujući mehaničku jednostavnost bez pokretnih delova, visoku efikasnost i pogodnost primene čišćenja u mestu (engl. cleaning in place, CIP). Nedostaci uključuju veličinu opreme i efikasnost prikupljanja zavisnu od veličine čestica koje treba imati u vidu tokom transfera procesa i scale-up-a. Ciklon, ili inerciona separaciona metoda zasniva se na razlici u gustinama između faza. Ovaj koncept je pogodan za guste čestice jer dolazi do usporavanja brzine kretanja ovakvih čestica u odnosu na vazduh kao medijum niske gustine u polju rotirajućeg vrtloga. Efikasnost separacije ciklonom zavisna je od dizajna ciklona, procesnih parametara, čestične raspodele ulaznog materijala i mehaničkih osobina čvrstih čestica (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). 1.2.2. Aspekti primene sušenja raspršivanjem odabrani za istraživanje Primenom sušenja raspršivanjem mogu se kontrolisati brojne osobine praška kao što su oblik, veličina čestica, nasipna gustina, poroznost, sadržaj vlage, protočnost, čvrsto stanje, stabilnost, disperzibilnost, frijabilnost. Sušenje raspršivanjem ima veliki broj ulaznih parametara kojima se može uticati na ishod procesa i definisati prostor za dizajn, i neophodno je sprovesti sistematičan pristup izučavanja kao što je QbD pristup kako bi se prepoznali faktori najznačajniji za određeni cilj primene (Snyder i Lechuga- Ballesteros, 2008; Gonnissen i autori, 2008; Nekkanti i autori, 2009; Billon i autori, 2000; Vaithiyalingam i Khan, 2002; Tagne i autori, 2006; Tajber i autori, 2009). 12 Obezbeđenje ujednačenosti doziranja u smešama praškova za tabletiranje, ponekad može biti problematično zbog raslojavanja čestica različitih veličina ili različite adhezivnosti na unutrašnje zidove mešača. Dovoljna ujednačenost smeše se ponekad teško može postići posebno kod smeša koje sadrže male doze lekova. Sušenje raspršivanjem multikomponentnih rastvora mogla bi biti alternativna i pogodnija metoda za dobijanje kompozitnih praškova sa niskom dozom leka, obezbeđujući konstantan sastav svake čestice (Corrigan i autori, 2006). Naratriptan hidrohlorid je odabran kao model supstanca koja je prisutna u čvrstim doziranim oblicima u malim dozama. Poznato je da je broj novih lekovitih supstanci koje su teško rastvorljive u vodi u porastu, tako da je istraživanje načina poboljšanja njihove rastvorljivosti i bioraspoloživosti vrlo aktuelna tema. Jedna od strategija u poboljšanju rastvorljivosti lekova je kompleksiranje sa ciklodekstrinima, sa kojima je moguće na relativno jednostavan način pripremiti vodeni rastvor kompleksa lek:ciklodekstrin i prevesti ga u čvrsto stanje sušenjem raspršivanjem (Nekkanti i autori, 2009, Brewster i Loftsson, 2007; Challa i autori, 2005; Szejtli, 2004). Vorikonazol i aripiprazol su odabrani kao model supstance koje su teško rastvorljive. Bez obzira na cilj primene, procesni parametri treba da obezbede postizanje najboljeg procesnog prinosa kao jednog od glavnih pokazatelja kvaliteta procesa. Među brojnim osobinama proizvoda dobijenog sušenjem raspršivanjem, sadržaj vlage i veličina čestica se izdvajaju kao najčešće praćeni zbog njihovog uticaja na procesibilnost, performanse i stabilnost proizvoda (Adamiec i Modrezejewska, 2005; Chegini i Ghobadian, 2005; Goula i Adamopoulos, 2004; Goula i Adamopoulos, 2008; Goula i autori, 2004). 1.3. Ciklodekstrini u farmaceutskoj industriji Komercijalna upotreba ciklodekstrina (CD) u farmaceutskoj industriji ustanovljena je prisustvom brojnih lekova sa ovim ekscipijensima na tržištu. Njihova primena pruža nove mogućnosti za poboljšanje kvaliteta lekova (neželjena dejstva, terapijska aktivnost, rastvorljivost), jer proces kompleksacije lekova i ciklodekstrina može da 13 doprinese poboljšanju fizičkohemijskih svojstava farmaceutskih supstanci (Szejtli, 2004; Challa i autori, 2005; Brewster i Loftsson, 2007; Mosher i Thompson, 2007). Ciklodekstrini su ciklični oligosaharidi koji se sastoje od 6, 7, ili 8 glukopiranoznih jedinica i nazivaju se α-, β-, i γ-CD. Svaka jedinica ima dva sekundarna alkohola na C-2 i C-3 i primarni alkohol na C-6 poziciji, tako da postoji 18-24 mesta za hemijsku modifikaciju i derivatizaciju (Slika 1.3-1) (Mosher i Thompson, 2007). Slika 1.3-1. Hemijska struktura β-CD. Strelice pokazuju 2-, 3- i 6-hidroksilne grupe glukopiranozne jedinice (Mosher i Thompson, 2007). Trodimenzionalna struktura ciklodekstrina može se ilustrovati kao šupljina koja je hidrofobna u odnosu na vodenu sredinu (Slika 1.3-2). Hidrofobni lek Lek:CD kompleks Hidrofobna šupljina Hidrofilna spoljašnjost Slika 1.3-2. Kompleksacija leka unutar hidrofobne šupljine CD (Mosher i Thompson, 2007). Ciklodekstrini su primer supstanci koje grade inkluzione komplekse koji nastaju tako što se molekul gost delimično ili potpuno uklapa u molekul ciklodekstrina bez kovalentnog povezivanja. Uključivanje hidrofobnih lekova unutar šupljine CD može poboljšati rastvorljivost i stabilnost leka u vodi, i brzinu rastvaranja kompleksa lek:CD, i potencijalno bioraspoloživost (Challa i autori, 2005; Brewster i Loftsson, 2007; Mosher i Thompson, 2007). Obično su poželjne sledeće karakteristike lekovite supstance kako bi bila pogodna za kompleksaciju sa ciklodekstrinom: skelet molekula sa ne više od pet atoma (C, P, S, N), temperatura topljenja susptance ispod 250°C, 14 rastvorljivost u vodi manje od 10 mg/ml, molekulska struktura sa manje od pet kondenzovanih prstenova, molekulska masa između 100 i 400 (Vyas i autori, 2008). Prilikom rada na formulaciji sa CD potrebno je na odgovarajući način proceniti njihovu sposobnost kompleksacije sa određenim lekom. Jedna od najčešće korišćenih metoda je tehnika fazne rastvorljivosti (engl. phase-solubility). Tehnika podrazumeva dodavanje jednake količine supstance koja treba da se kompleksira (količina veća od rastvorljivosti) u nekoliko sudova, jednake količine rastvarača i sukcesivno rastućih količina kompleksirajućeg agensa, koji se zatim zatvoreni mešaju određeno vreme i na određenoj temperaturi. U fazi rastvora se zatim određuje količina rastvorene supstance. Fazni dijagram se konstruiše u vidu zavisnosti molarne koncentracije rastvorene supstance (y-osa) od molarne koncentracije dodatog kompleksirajućeg agensa (x-osa). Generalno postoje dva tipa faznih dijagrama: tip A gde se formiraju rastvorljivi kompleksi, i tip B gde se formiraju kompleksi sa ograničenom rastvorljivošću (Slika 1.3-3). Kod tipa A dijagrama, rastvorljivost supstance raste sa porastom količine kompleksirajućeg agensa i u zavisnosti od tipa kompleksa koji se formira dijagram može biti linearan (AL), pozitivno (AP) ili negativno zakrivljen (AN) (Brewster i Loftsson, 2007; Mosher i Thompson, 2007). [Ciklodekstrin] [Lek] u rastvoru Slika 1.3-3. Mogući tipovi dijagrama fazne rastvorljivosti (Mosher i Thompson, 2007). AL tip dijagrama se tumači kao posledica toga da u svakom kompleksu učestvuje jedan molekul kompleksirajućeg agensa, AP kada je to više molekula, a AN može biti posledica samoasocijacije, ili promene prirode rastvarača pri visokim koncentracijama kompleksirajućeg agensa. U slučaju postojanja kompleksa višeg reda tumačenje rezultata dobijenih primenom ne samo phase-solubility tehnike, nego i drugih različitih metoda u karakterizaciji kompleksa može biti veoma složeno (Loftsson i autori, 2005). 15 Razlog tome može biti i to što se razmatra samo model koji pretpostavlja da se između leka i CD dešava samo interakcija u vidu formiraja nekovalentnih inkluzionih kompleksa, a ne uzimaju se u obzir moguće međusobne interakcije ovih kompleksa, neinkluzione interakcije, interakcije slične onima kod površinski aktivnih supstanci i molekularna agregacija, koji takođe doprinose korisnim efektima ciklodekstrina (Slika 1.3-4) (Loftsson i autori, 2002; Loftsson i autori, 2004; Messner i autori 2010; Mosher i Thompson, 2007). Slobodan molekul leka Lek u neinkluzionom kompleksu Lek u inkluzionom kompleksu Prazan molekul ciklodekstrina Lek/CD inkluzioni kompleks Slika. 1.3-4. Ilustracija nekonvencionalnih kompleksa ciklodekstrina Faktori koji utiču na kompleksaciju pored tipa CD i dimenzija šupljine jesu sterni efekti, stanje jonizacije odnosno naelektrisanje CD i leka (Li i autori, 1998). Ciklodekstrini formiraju komplekse sa supstancama čija je veličina kompatibilna sa dimenzijama šupljine. Kada je lekovita supstanca veća od šupljine, kompleksi se mogu graditi tako da samo određene grupe ili bočni lanci ulaze u ugljovodonični kanal. Derivatizacija hidroksilnih grupa CD tj. prisustvo voluminoznih grupa može sterno da ometa prilaz supstance šupljini CD. Međutim, moguće je i da određene grupe, u zavisnosti od njihovog broja, fleksibilnosti i pozicije dovedu do proširenja šupljine i olakšaju kompleksaciju. Tako na primer, metil supstitucija na pozicijama 2- i 6- dovodi do proširenja, dok istovremeno postojanje supstituenata na pozicijama 2-, 3- i 6- dovodi do smanjenja šupljine. Krupniji supstituent kao što je hidroksipropil grupa, iako je hidrofilnija i povećava rastvorljivost CD u vodi, voluminoznija je od metil grupe i zahteva manji stepen supstitucije kako bi se olakšalo vezivanje bez sternog ometanja ulaza u šupljinu CD. Može se reći da postoji kompromis između sternog ometanja supstituenata i njihove sposobnosti da prošire hidrofobnu šupljinu, kao i između 16 sposobnosti formiranja kompleksa i povećanja rastvorljivosti u vodi. Što se tiče naelektrisanja, ukoliko je suviše blizu šupljine CD može poremetiti termodinamiku koja dovodi do kompleksacije. Takođe je važna međusobna pozicija i interakcija naelektrisanih grupa leka i CD. Faktori koji mogu dodatno olakšati solubilizaciju i povećati kompleksaciju CD i leka su podešavanje pH medijuma u kojem se vrši rastvaranje, hidrosolubilini polimeri, hidroksi kiseline (Brewster i Loftsson, 2007; Challa i autori, 2005; Loftsson i autori, 1999; Messner i autori, 2010; Mosher i Thompson, 2007; Redenti i autori, 2000). Postoji nekoliko metoda pripreme kompleksa lek:CD, a najefikasnijima se smatraju sušenje raspršivanjem i sušenje zamrzavanjem (Challa i autori, 2005). Kompleksacija lekova pomoću ciklodekstrina poboljšava karakteristike njihove isporuke i ne utiče na njihovu aktivnost jer je kompleksacija reverzibilan proces. U vodenom rastvoru, kompleksi lek:CD se kontinuirano formiraju i disociraju sa vremenima trajanja od milisekunde ili manje. Iako spora kinetika disocijacije postoji kod jačeg vezivanja, brzina je i dalje velika i suštinski trenutna. Razblaženje 1:100 se ostvaruje za intravenske proizvode kao i tokom razblaženja u stomačnom i crevnom sadržaju. Posle primene, lek se oslobađa iz kompleksa tokom razblaženja, i u nekim slučajevima tome doprinosi kompetitivna zamena sa endogenim lipofilnim supstancama. (Mosher i Thompson, 2007; Challa i autori, 2005). 1.3.1. Derivati ciklodekstrina Među brojnim derivatima CD, samo oni koji se sastoje od hidroksipropil (HP), metil (M) i sulfobutiletar (SBE) supstituenata u poziciji su da se koriste komercijalno kao farmaceutski ekscipijensi. Dobijaju se reakcijom sa jednom ili više hidroksilnih grupa glukopiranoznih jedinica. Hidroksipropilacija se izvodi na primarnim i sekundarnim alkoholnim grupama, dovodeći do stvaranja smeše brojnih izomernih formi, što rezultuje heterogenim proizvodima amorfne prirode. Hidroksipropil derivati γ- i β-CD su derivati od interesa za farmaceutsku industriju, od kojih je hidroksipropil-β-CD (HPBCD) među najčešće korišćenim i izučavanim derivatima CD, zahvaljujući velikoj rastvorljivosti u vodi i pogodnosti za oralnu i parenteralnu primenu, sa već registrovanim proizvodima 17 (Mosher i Thompson, 2007; Brewster i Loftsson, 2007; Szejtli, 2004; Loftsson i autori, 2005). Uvođenjem metil supstituenata rastvorljivost u vodi se povećava u odnosu na roditeljski ciklodekstrin do broja metil grupa 14, pa se smanjuje kako se broj približava 21. Supstitucija na pozicijama C-2 i C-6 povećava sposobnost kompleksiranja. Supstitucija na poziciji C-3 smanjuje sposobnost kompleksiranja, verovatno zbog promene konformacije koja se dešava (Mosher i Thompson, 2007). Metil derivati su lipofilniji od hidroksipropil derivata, i imaju veći toksični potencijal pa je njihova primena ograničena (Brewster i Loftsson, 2007; Mosher i Thompson, 2007). Metil derivati koji su od interesa za farmaceutsku industriju su randomizirano metilovani β-CD (RAMEB), dimetilovani (DIMEB) i monometilovani (2-O-MBCD). 2-O-MBCD je noviji derivat i stoga manje izučavan i za sada ne postoje proizvodi registrovani na tržištu (Mosher i Thompson, 2007). Prednosti primene u odnosu na HPBCD bi mogle biti potencijalno veća efikasnost kompleksacije usled blago proširene šupljine i linearnog porasta rastvorljivosti sa porastom koncentracije CD, bez pojave samoasocijacije pri višim koncentracijama (Roquette, Francuska). Ciklodekstrini koji su odabrani za istraživanje su HPBCD i 2-O-MBCD i njihove osnovne karakteristike prikazane su u Tabeli 1.3-1. Tabela 1.3-1. Osnovne karakteristike odabranih ciklodekstrina (www.roquette- pharma.com) Ciklodekstrin 2-hidroksipropil-beta-ciklodekstrin (HPBCD) 2-O-metil-beta-ciklodekstrin (2-O-MBCD) Izgled Beli amorfni prašak Beli prašak sa sposobnošću kristalizacije iz vode i nastanka štapićastih bezbojnih kristala koji sadrže 13% vode Prosečna molekulska masa 1135 + 7 x MS x 58.1 1135 + 7 x MS x 14 Rastvorljivost u vodi 65 % (25°C) 80 % (50°C) 20 % (20°C) 65 % (70°C) Temperatura raspadanja >300°C >300°C Sadržaj vlage Max. 5 % Max. 5 % Unutrašnji prečnik šupljine 0.62 nm, delimično zaklonjena 0.62 nm, blago proširena MS je prosečni molarni stepen supstitucije 18 1.3.2. Prednosti i ograničenja upotrebe ciklodekstrina Formulacije sa ciklodekstrinima obezbeđuju rastvorljivost u vodi lekovima koji su teško rastvorljivi, i kompleksi lek:CD često ispoljavaju poboljšane karakteristike brzine rastvaranja u poređenju sa drugim formulacijama leka. Poboljšanje brzine rastvaranja leka može poboljšati brzinu resorpcije leka. Smanjenje vremena kontakta između leka i tkiva sluzokože može da doprinese smanjenoj iritaciji tkiva od strane lekova. Takođe, kompleksacija može dovesti do maskiranja neprijatnog gorkog ukusa lekova (Mosher i Thompson, 2007; Challa i autori, 2005; Szejtli, 2004). Ciklodekstrini se uobičajeno smatraju stabilizirajućim agensima u farmaceutskim formulacijama. Postoje primeri stabilizacije ali i destabilizacije lekova na hidrolizu, hidrolitičku dehalogenizaciju, oksidaciju, dekarboksilaciju i izomerizaciju, i u rastvoru i u čvrstom stanju. Priroda uticaja korišćenog CD zavisi i od pozicije molekula unutar CD. Kada pozicija dozvoljava interakciju sa mestom podložnom hidrolizi može doći do smanjenja stabilnosti, ali ako je to mesto locirano potpuno unutar CD obično to rezultuje poboljšanjom stabilnošću. Stepen stabilizacije/destabilizacije leka kompleksiranog sa CD zavisi ne samo od brzine degradacije unutar kompleksa, nego i od frakcije leka koja je u kompleksu i od stehiometrije kompleksa. Povećana stabilnost se često zapaža za supstance koje imaju visoke konstante asocijacije i one koji imaju sklonost ka formiranju kompleksa višeg reda (Mosher i Thompson, 2007; Challa i autori, 2005; Vyas i autori, 2008). Primena CD je ograničena samo na lekove određenih fizičkohemijskih osobina koje moraju biti ispunjene da bi kompleksacija sa CD bila moguća. Neizbežan ograničavajući faktor je i doza kompleksa odnosno leka koja mora da se primeni. Ako se ima u vidu da je poželjno da masa tablete ne bude veća od 500 mg i da je molekulska masa lekova koji se kompleksiraju 100-400 i da CD imaju veliku molekulsku masu (>1000), 100 mg kompleksa obično sadrži oko 5-25 mg leka. Ako je doza leka manja od 25 mg onda je i koncentracija 5% leka u kompleksu dovoljna da obezbedi potrebnu dozu u tableti od 500 mg. Ako je doza veća od 25 mg, treba razmotriti mogućnost formulacije u vidu praška u kesicama (engl. sachet) ili šumećih tableta. U slučaju kompleksacije lekova, odnos između potrebne doze i molekulske težine određuje izvodljivost oralne primene u obliku kompleksa sa CD (Szejtli, 2012). 19 1.3.3. Simulacija molekularnog vezivanja lek:ciklodekstrin Simulacija molekularnog vezivanja je računarska procedura koja pokušava na efikasan način da predvidi nekovalentno vezivanje makromolekula ili češće, makromolekula (receptor, protein, ciklodekstrin) i malog molekula (ligand, lek), polazeći od njihove strukture u nevezanom obliku (Trott i Olson, 2009). Ova metoda predviđa orijentaciju molekula u prostoru nakon povezivanja s drugim molekulom. Poznavanje orijentacije molekula pruža informacije o tome koliko čvrsta veza će se uspostaviti između ta dva molekula. Cilj je predvideti vezane konformacije i afinitet vezivanja, tako da je tačnost predviđanja najveća a vreme potrebno za proračun najkraće. U tom smislu neophodno je da postoje određene aproksimativne pretpostavke. Pretpostavlja se da se određeno protonovano stanje molekula i raspored naelektrisanja ne menjaju u njihovim vezanim i nevezanim stanjima. Dodatno, prepostavlja se da je veći deo makromolekula rigidan, kovalentne dužine i uglovi konstantni, dok se samo izabrani set kovalentnih veza smatra slobodno rotirajućim. Simulacija se bavi aproksimacijom hemijskih potencijala sistema koji određuju najverovatniju konformaciju u vezanom stanju i slobodnu energiju vezivanja, pri čemu softverski programi koriste scoring funkciju tj. funkciju ocenjivanja (engl. scoring function) (Trott i Olson, 2009). 1.3.3.1. Početna podešavanja pre simulacije Za male molekule (ligande, lekove) dobra početna tačka je njihova kristalna struktura. Koordinate kristalne strukture se mogu pronaći u bazi podataka Cambridge Structural Database ili, kreira se molekularni model i njegova geometrija se optimizuje na nivou molekularne mehanike (CHARMm force field parameters, Momany i Rone, 1992). Neki programi za simulaciju, kao AutoDock Vina, zahtevaju specifikaciju prostora za pretraživanje u koordinatnom sistemu receptora u okviru koga se razmatraju razni položaji liganda, koji treba da bude dovoljno veliki da omogući rotaciju liganda (Trott i Olson, 2009). Program zahteva i da se ligandima dodele parcijalna atomska naelektrisanja. Grafički interfejs AutoDockTools (ADT) se koristi da se nepolarni atomi vodonika (vezani za atome ugljenika) identifikuju i izostave iz razmatranja, a da se polarni atomi vodonika zadrže (atomi vezani za elektronegativne atome kao što su 20 kiseonik i azot), i da se molekulima dodaju parcijalna naelektrisanja (korišćenjem metoda dodavanja Kollman united-atom ili Gasteiger naelektrisanja). Takođe je potrebno opisati rotirajuće veze u ligandu (Morris i autori, 1998; Huey i autori, 2011; Stigliani i autori, 2012). Ono što čini program kao što je AutoDock Vina lakim za korišćenje, je to što nije potrebno ručno podešavanje parametara jer program automatski brzo vrši potrebna izračunavanja i rangira i grupiše rezultate bez predstavljanja međukoraka korisniku (Trott i Olson, 2009). Atomski parametri solvatacije se takođe mogu dodeliti pomoću ADT (Morris i autori, 1998). Softverski programi kao NAMD molecular dynamics program (Phillips i autori, 2005), omogućavaju minimizaciju energije vezivanja. 1.3.3.2. Scoring funkcija i algoritam pretraživanja Ključni rezultati u simulaciji su dobijene vezane konformacije i energije ovih vezanih struktura i njihova međusobna sličnost. Najbolji rezultati vezivanja se rangiraju na osnovu određene scoring funkcije (engl. scoring). Koliko će simulacija biti uspešna zavisi od scoring funkcija i algoritma pretraživanja. Scoring funkcije predstavljaju skup matematičkih metoda koje služe za eliminaciju netačnih struktura kompleksa dobijenih eksperimentalnim metodama. Njima se može ustanoviti afinitet vezivanja između liganda i receptora, a temelje se na električnim karakteristikama molekula, hidrofobnosti površina i raznim drugim hemijskim i mehaničkim karakteristikama interakcija. Algoritam pretraživanja pronalazi strukture za koje scoring funkcija daje visoku verovatnoću vezivanja, koja je zavisna od konformacije i intermolekularnih i intramolekularnih doprinosa. AutoDock Vina program koristi sofisticirani metod optimizacije gradijenta u svojoj proceduri lokalne optimizacije. Optimizacioni algoritam pokušava da nađe globalni minimum funkcije tokom čega se vrši prečišćavanje strukture, a zatim se konformacije grupišu (Trott i Olson, 2009). 1.3.3.3. Grupisanje konformacija (clustering, engl.) Sličnost vezanih struktura (konformacija) koje se grupišu meri se proračunavanjem RMSD vrednosti (engl. root-mean-square-deviation), koja predstavlja meru prosečne 21 udaljenosti koja se meri uz pomoć koordinata atoma. Ovaj proces uključuje rangiranje svih konformacija prema energiji od najniže do najviše. Konformacija sa najnižom energijom se koristi kao prvi član prve grupe (engl. cluster). Zatim se druga konformacija poredi sa prvom. Ako se dobija rezultat u okviru RMSD tolerancije, pridodaje se prvoj grupi. U suprotnom, postaje prvi član nove grupe. Proces se ponavlja sa ostalim rezultatima simulacije vezivanja, grupisanjem u porodice sličnih konformacija (Huey i autori, 2011). Za dve strukture, a i b, identičnog molekula, RMSD se definiše na sledeći način: RMSDab = max(RMSD’ab, RMSD’ba), (1.3-1) gde je (1.3-2) i sumiranje se vrši za svih N teških atoma u strukturi a; minimum udaljenosti min r se odnosi na sve atome u strukturi b sa istim tipom elementa kao atom i u strukturi a (Trott i Olson, 2009). Tokom proračuna vezivanja program računa slobodnu energiju vezivanja (Huey i autori, 2011). 1.3.3.4. Optimizacija posle simulacije Kombinovanje simulacije vezivanja i semiempirijske optimizacije geometrije je pogodno jer može da poveća tačnost simulacije. Svođenje energije na minimum (minimizacija) svih vezanih konformacija može da se izvede korišćenjem semiempirijskih izračunavanja. Na primer, PM6 Hamiltonian metod se koristi u proceni entalpija interakcija i u cilju boljeg opisa nekovalentnih interakcija kao što su interakcije vodoničnih veza. Dodavanjem korekcije prenosivih vodoničnih veza korišćenjem modifikovane PM6-DH2 metode može se izvršiti dalja minimizacija energije (Stigliani i autori, 2012). Energije vezivanja ∆E, mogu se izračunati iz razlike u toploti formiranja, ∆fΗ, individualnih komponenti i njihovih kompleksa, prema jednačini: ∆Ε = ∆fΗ(ligand-receptor kompleks) – ∆fΗ(ligand) – ∆fΗ(receptor), (1.3-3) 22 gde na primer, ligand može biti lek, a receptor ciklodekstrin. Potrebni proračuni se mogu vršiti korišćenjem programa MOPAC koji se inače koristi za izučavanje hemijskih reakcija među molekulima, jonima i linearnim polimerima, tako što se vrši implementacija semiemprijske metode Hamiltonian i kombinuju se razni proračuni vibracionih spektara, termodinamičkih parametara itd. u potpuno integrisanom programu (Stewart, 1990). Dodatno se mogu simulirati i efekti solvatacije pomoću kontinuum modela COSMO (Klamt i Schümann, 1993). 1.3.3.5. Vizuelizacija Program simulacije molekularnog vezivanja može dati vizuelnu prezentaciju vezanih konformacija. Vizuelna provera interakcija između vezanog liganda i makromolekula se koristi za evaluaciju da li su, na primer, nepolarni atomi u ligandu pozicionirani blizu okolnih nepolarnih atoma u receptoru, polarni atomi u ligandu blizu polarnih atoma u receptoru, da li su neke poznate interakcije prikazane i u simuliranom rezultatu, da li interakcije deluju razumno u kontekstu onoga što se već zna o izučavanom kompleksu ligand-receptor na osnovu drugih eksperimentalnih rezultata (Huey i autori, 2011). 1.4. Metodologija za karakterizaciju i modelovanje procesa sušenja raspršivanjem 1.4.1. Modelovanje primenom eksperimentalnog dizajna Primena eksperimentalnog dizajna je sistematičan pristup u izučavanju faktora koji mogu uticati na kvalitet procesa i proizvoda. Da bi eksperimentalni dizajn bio što je moguće jednostavniji i usklađen sa zahtevima problema, neophodno je da postoji dobro definisan cilj istraživanja, zatim poznavanje ne samo teorije eksperimenata već i teorijskih osnova i prirode objekta istraživanja. (Billon i autori, 2000; Gonnissen i autori, 2008; Ibrić, 2006; Nekkanti i autori, 2009; Snyder i Lechuga-Ballestros, 2008; Tagne i autori, 2006; Tajber i autori, 2009; Vaithiyalingam i Khan, 2002). 23 Dizajn je zapravo skup eksperimenata u eksperimentalnom prostoru. Eksperiment je termin koji opisuje eksperimentalnu probu kao praktičnu manipulaciju faktorima izvedenu pod definisanim uslovima (nivo različitih faktora, nezavisno promenljivih, koji se menjaju u dizajnu i onih koji se održavaju na konstantnom nivou), tako da se dobija jedna vrednost za svaki odgovor, zavisno promenljivu, koja se meri. Obično se polazi od modela tipa “crne kutije” koji se sastoji od nekoliko diskretnih ili kontinualnih ulaznih faktora koji se mogu kontrolisati, i nekoliko izlaznih odgovora, za koje se pretpostavlja da su kontinualni (Slika 1.4-1). Na rezultate eksperimenata često utiču i nekontrolisani faktori koji mogu biti diskretni (mašine, operateri) ili kontinualni (ambijentalni uslovi) (e-Handbook of Statistical Methods, 2012). 1 2 3 k 1 2 3 r Kontinuirani Diskretni Nekontrolisani ulazi (Ko-faktori) Ko n tro lis a n i u la zi (Fa kt or i) Iz la zi (O dg o vo ri) Temperatura Vlaga Ra liz č ite m a šin e Ra liz č iti o pe ra te ri Proces Slika 1.4-1. Šema tipičnog procesa sa kontrolisanim ulazima, izlazima i nekontrolisanim faktorima tipa “crne kutije” (e-Handbook of Statistical Methods, 2012). Nakon odabira dizajna, formira se eksperimentalni plan za određeni broj eksperimenata sa definisanim uslovima i poretkom izvođenja eksperimenata koji treba da bude nasumični (randomizacija) (Ibrić, 2006). Treba istaći prednosti koje eksperimentalni dizajn (višefaktorski metod) ima u poređenju sa klasičnim konceptom promene samo po jednog faktora (jednofaktorski metod): (Lazić, 2004) • mogućnost uočavanja određenih zakonitosti ispitivanog fenomena u okviru celog domena prostora tako da zaključivanje na osnovu rezultata ima širu upotrebu; 24 • šira mogućnost testiranja efekata variranja faktora na finalni rezultat jer se koriste rezultati svih eksperimenata u izračunavanju efekata; • mogućnost određivanja jačine interakcije faktora; • bolja tačnost prikupljenih podataka nudi kompletnije i preciznije informacije; • krajnji cilj istraživanja se ostvaruje na sistematičan, dobro osmišljen i organizovan način za kratko vreme sa značajno smanjenim brojem eksperimenata i smanjenim troškovima materijala; • randomizacija omogućava postizanje nasumičnog karaktera faktora koji su nekontrolisani i koji se teško stabilišu (onemogućava uticaj nekontrolisanih faktora na rezultat); • postoji osobina sukcesivnosti, što znači da je svaka sledeća faza izvođenja eksperimenata bazirana na rezultatima prethodne serije eksperimenata; • menja se način razmišljanja istraživača, povećava se njegova intuicija i povećava aktivno učešće u planiranju narednih faza izvođenja eksperimenata, koje zahteva upotrebu empirijskog i naučnog predznanja; • dobija se informacija o ukupnom efektu promenljivih jer se sve istovremeno variraju u eksperimentima. Eksperimentalni dizajn koristi dobijene eksperimentalne podatke u razvijanju matematičkih modela sistema. Važno je imati na umu da je svaki model približno rešenje i generalno nije tačan opis predmeta istraživanja što je sa jedne strane dobro jer model nije previše komplikovan, ali sa druge strane je nedovoljno realan što smanjuje pouzdanost rešenja (Lazić, 2004). Najčešće se dobijaju modeli koji odgovaraju linearnom ili kvadratnom modelu. Primer linearnog modela sa tri faktora, i jednim odgovorom bi izgledao ovako: Y=β0 + β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β123X1X2X3 + eksp. greška; (1.4-1) gde je Y posmatrani odgovor, X su glavni efekti, zatim postoje 3 dvostruke i jedna trostruka interakcija (koja se često izostavlja zbog jednostavnosti). Kada se podaci analiziraju, svi nepoznati parametri β se procenjuju i koeficijeni uz X se testiraju da se proceni koji su značajni. 25 Kvadratni model se uobičajeno koristi kod metodologije površine odgovora i ne uključuje trostruke interakcije ali uključuje nove članove kao na primer β11X12 + β22X22 + β33X32. Pun model bi podrazumevao uključivanje mnogih ukrštenih činilaca i interakcije sa X2, ali generalno oni nisu neophodni i većina softvera ih izostavlja iz modela (e- Handbook of Statistical Methods, 2012). Među često korišćenim metodama eksperimentalnog dizajna u farmaceutskom razvoju nalaze se frakcioni faktorijalni dizajn kao skrining metoda (engl. screening) pomoću koje se od mnogih faktora izdvajaju oni koji su najznačajniji, i metodologija površine odgovora koja pomaže u razumevanju efekata interakcija odnosno kombinovanih efekata i u predviđanju performansi (Allen, 2006). 1.4.1.1. Skrining pomoću frakcionog faktorijalnog dizajna Skrining dizajn je ekonomični eksperimentalni plan čiji cilj nije dobijanje kompletnih i egzaktnih numeričkih podataka o osobinama sistema koji omogućavaju kompletan opis sistema, već dobijanje odgovora da li određeni faktori imaju ili nemaju efekta na ispitivani proces ili sistem. Izvodi se na samom početku istraživanja kako bi se pojednostavio problem i omogućilo eksperimentatoru da obrati pažnju na detaljnija ispitivanja faktora od značaja (Ibrić, 2006). Eksperimentalni plan se naziva frakcionim jer su zasnovani na frakciji svih kombinacija nivoa svih faktora od interesa (Allen, 2006). Primena skrining dizajna podrazumevala bi nekoliko koraka: definisanje problema, definisanje eksperimentalnog polja, dizajn eksperimenata pomoću kodiranih vrednosti promenljivih, definisanje eksperimentalnog plana zamenom kodiranih vrednosti faktora realnim vrednostima, definisanje redosleda izvođenja eksperimenata (randomizacija), dobijanje matematičkog modela, izračunavanje efekata, izračunavanje preciznosti eksperimenta (eksperimentalna ponovljivost), određivanje aktivnih efekata, odluka da li će se manje aktivni efekti držati na konstantnom nivou u sledećim istraživanjima, ili će biti nekontrolisani (Ibrić, 2006). Vrednosti izračunatih efekata ovakvog dizajna su uvek pomešane, pa je potrebno imati na umu koliko je ozbiljno mešanje efekata, što je definisano rezolucijom. Na primer 24-1 dizajn ima rezoluciju IV što znači da se svi glavni efekti mogu izračunati nezavisno i 26 nisu pomešani sa interakcijama prvog reda, već samo sa interakcijama drugog reda. Međutim, vrednosti interakcija prvog reda su pomešane jedne sa drugim. Kada se faktori variraju na dva nivoa obično su predstavljena kodiranim vrednostima -1 i + 1, tako da -1 zamenjuje realnu vrednost za faktor na nižem nivou, a +1 na višem nivou, što pojednostavljuje postavljanje matematičkih modela i interpretaciju dobijenih koeficijenata. Koeficijenti jednačina se računaju korišćenjem kodiranih vrednosti; na taj način se različite promenljive mogu direktno porediti bez obzira na njihovu veličinu. Izračunavanje koeficijenata modela izvodi se uobičajeno primenom kompjuterskih programa korišćenjem multiple regresije zasnovane na metodi najmanjih kvadrata (Ibrić, 2006). Pozitivan predznak koeficijenta za određeni parametar govori da se izlaz povećava povećanjem nivoa promenljive, a negativan predznak govori da se izlaz povećava smanjenjem nivoa promenljive. Pritom treba definisati i koja je željena verovatnoća da se pod standardnim pretpostavkama pronađe da je značajan bar jedan faktor, kada u realnosti nijedan faktor ne utiče na izlaz i obično se uzima da je ta verovatnoća 5 % (Allen, 2006). 1.4.1.2. Karakterizacija i modelovanje primenom metodologije površine odgovora Nakon skrining studije koja se izvodi u početnoj fazi istraživanja, i nakon izbora nekoliko faktora koji imaju uticaj na odgovore ispitivanog sistema, sledi detaljna kvantitativna studija uticaja faktora od značaja. Metodologija koja se često koristi prilikom razvoja formulacije i procesa je metodologija površine odgovora (engl. Response Surface Methodology, RSM), koja predstavlja sistematsku i istovremenu evaluaciju više promenljivih (procesnih ili formulacionih) u cilju razvoja proizvoda sa željenim atributima kvaliteta. Ova metodologija između ostalog pruža mogućnost i predviđanja odgovora u celoj eksperimentalnoj oblasti budući da se dobijaju matematički modeli koji adekvatno opisuju promene, zahvaljujući tome što se uzimaju u obzir i interakcije odnosno kombinovani efekti faktora (Gonnissen i autori, 2008; Nekkanti i autori, 2009; Billon i autori, 2000; Vaithiyalingam i Khan, 2002; Tagne i autori, 2006; Tajber i autori, 2009). Stoga je prilikom primene ove metode važnije definisati adekvatnost modela od interpretacije individualnih koeficijenata u modelu. Modeli koji se koriste za opisivanje odgovora su najčešće polinomi prvog i drugog reda. 27 Često se u farmaceutskim realnim sistemima zavisnosti bolje opisuju modelima drugog reda tj. kvadratnim modelima, koji uključuju i kvadratne efekte promenljivih pri čemu je površina takvog modela zakrivljena. Za izračunavanje koeficijenata kvadratnog modela potrebno je vrednost faktora varirati na najmanje tri nivoa (Ibrić, 2006). Jedan od često korišćenih metoda je centralni kompozitni dizajn (engl. central composite design, Box-Wilson dizajn), koji odgovara eksperimentalnom planu koji varira faktore na 5 nivoa (Allen, 2006). U svom sastavu sadrži faktorijalni ili frakcioni faktorijalni dizajn rezolucije V (jasno određivanje glavnih efekata i dvofaktorskih interakcija), centralne tačke, i još dodatno grupu zvezdastih (aksijalnih, osovinskih) tačaka koje omogućavaju procenu kvadratnih efekata odnosno zakrivljenosti površine odgovora. Centralni kompozitni dizajn uvek sadrži duplo više zvezdastih tačaka nego ispitivanih faktora. One predstavljaju nove ekstremne vrednosti (niske i visoke) za svaki faktor u dizajnu. Originalni oblik centralnog kompozitnog dizajna za tri faktora omogućava kvalitetna predviđanja u okviru celog prostora za dizajn zahvaljujući podešavanjima ispitivanih faktora van opsega obuhvaćenog faktorijalnim delom dizajna. Naziva se sfernim, jer tačke njegovog dizajna opisuju loptu oko faktorijalne kocke (Slika 1.4-2) (e-Handbook of Statistical Methods, 2012). Slika 1.4-2. Šematski prikaz kružnog centralnog kompozitnog dizajna (MathWorks , e- Documentation Center). Pošto ove metode zahtevaju više eksperimenata za određeni broj faktora, nego što je to slučaj sa skrining metodom kao što je frakcioni faktorijalni dizajn, za dobijanje odgovarajućih modela važno je da su svi faktori koji se ispituju značajni. Naziv metodologije potiče od mogućnosti da se modeli za predviđanje mogu iskoristiti za dobijanje trodimenzionalnih dijagrama površine (Allen, 2006). Značaj uticaja faktora se ispituje primenom raznih statističkih analiza kao što je ANOVA test koji u okviru multiple regresije omogućava ispitivanje odnosa između 28 jedne zavisno promenljive i jedne ili više nezavisno promenljivih koristeći metodu najmanjih kvadrata. F-test ili Fišerov odnos varijanse predstavlja vrlo pouzdan test za ispitivanje stepena uticaja faktora pri uklapanju modela u eksperimentalne podatke i često se naziva testom značaja regresije. Ovaj test pruža mogućnost za istovremeno ispitivanje značaja više parametara ili za ispitivanje slaganja multiparametarskog modela sa eksperimentalnim podacima. Izračunate vrednosti Fcal testiraju se u odnosu na tabelarne vrednosti Fcrit pri datom nivou pouzdanosti i ukoliko je Fcal>Fcrit, uticaj faktora je značajan. Test koji se koristi za procenu adekvatnosti modela je tzv. Lack of fit test, kojim se utvrđuje da li se neusklađenost eskperimentalno dobijenih odgovora i onih predviđenih modelom može objasniti eksperimentalnom greškom. Za ovaj test neophodno je izvesti ponovljeni eksperiment u centru eksperimentalnog polja. Dobijena F vrednost za ovaj test mora biti manja od teorijske F vrednosti pri datom nivou verovatnoće. Ukoliko je veća, zaključuje se da se neusklađenost eksperimentalnih podataka i onih dobijenih modelom ne može objasniti eksperimentalnom greškom i tada se model odbacuje. Prilikom primene metodologije površine odgovora, u cilju optimizacije procesa sa više praćenih odgovora, može se primeniti pristup funkcije poželjnosti kao jedan od često korišćenih metoda u industriji (Castillo, 2007). Proizvod ili proces retko imaju samo jednu poželjnu karakteristiku. Obično ih ima više i često su tako povezane da poboljšanje jedne uzrokuje pogoršanje druge karakteristike. Bilo koji proizvod je zapravo kompromis između tih raznih poželjnih izlaznih karakteristika. Razumevanje ograničenja kompromisa omogućava pravljenja ispravnih izbora. Ovo se postiže ili konstrukcijom težinske objektivne funkcije (funkcija poželjnosti) i njene optimizacije, ili ispitivanjem konturnih dijagrama odgovora kreiranih kompjuterskim programom (e- Handbook of Statistical Methods, 2012). Metod pronalazi uslove pod kojima se dobijaju najpoželjnije vrednosti odgovora. Za svaki odgovor funkcija poželjnosti dodeljuje brojeve između 1 i 0 mogućim vrednostima odgovora, gde 0 predstavlja potpuno nepoželjnu vrednost odgovora, a 1 predstavlja potpuno poželjnu ili idealnu vrednost odgovora. Pojedinačne poželjnosti su zatim iskombinovane koristeći geometrijsku srednju vrednost, što rezultuje ukupnom poželjnošću. U zavisnosti da li je za pojedini odgovor cilj da bude najveći, najmanji ili da ima konkretnu ciljnu vrednost, koriste se različite funkcije poželjnosti (Castillo, 2007). Pristup poželjnosti se sastoji od nekoliko 29 koraka: posle izvođenja eksperimenata se razvijaju modeli za sve odgovore, zatim se definišu pojedinačne funkcije poželjnosti za svaki odgovor, i na kraju se maksimizira ukupna poželjnost odgovrajućim odabirom faktora uticaja (e-Handbook of Statistical Methods, 2012). 1.4.2. Modelovanje primenom veštačkih neuronskih mreža Primena veštačkih neuronskih mreža sa eksperimentalnim dizajnom je noviji pristup u proučavanju farmaceutskih sistema koji ima značajne prednosti kao što su modelovanje i optimizacija. Koriste se u dizajniranju formulacija lekova (Ibrić i autori, 2002; Ivić i autori, 2010), optimizaciji proizvodnih procesa (Turkoglu i autori, 1999), kontroli kvaliteta, stabilnosti lekova (Ibrić i autori, 2007), in vitro ispitivanjima oslobađanja leka (Leane i autori, 2003), i in vitro-in vivo korelaciji (Parojčić i autori, 2007). Novi aspekti primene obuhvataju kombinovanje eksperimentalnog dizajna, metodologije površine odgovora i veštačkih neuronskih mreža u modelovanju i karakterizaciji farmaceutsko- tehnoloških proizvodnih procesa (Hussain i autori, 1994; Plumb i autori, 2002; Miguelez-Moran, 2009). Veštačke neuronske mreže (engl. Artificial Neural Networks, ANN) su biološki inspirisani sistemi za obradu podataka i daju dobre rezultate prilikom predviđanja i modelovanja sistema gde fizički procesi nisu jasni ili su veoma kompleksni. Sačinjene su od velikog broja međusobno povezanih obrađujućih elemenata (neurona) koji su, slično biološkim neuronima, povezani vezama koje sadrže propusne (težinske) koeficijente, koje su po ulozi slične sinapsama (Slika 1.4-3). Slika 1.4-3. Šematski prikaz strukture neurona (u1..n – ulazni podaci; w1..n – težinski koeficijenti; f( ) – aktivaciona funkcija; i – izlazni podatak) (Ilić, 1999). 30 Većina mreža ima neku vrstu pravila za obučavanje, čime se koeficijenti veza između neurona podešavaju na osnovu ulaznih podataka. Zbir ulaznih vrednosti neurona pomnoženih sa odgovarajućim težinskim koeficijentima se propušta kroz aktivacionu funkciju i dobijena vrednost predstavlja izlaz iz neurona (Ilić, 1999; Kasabov, 1996; Krose i van der Smagt, 1996). 1.4.2.1. Proces učenja veštačke neuronske mreže Postoji tri tipa obučavanja u zavisnosti od vrste podataka koji se predstavljaju mreži (nadgledano, obučavanje ocenjivanjem, samoorganizacija), i najčešće se koristi nadgledano obučavanje gde se mreži predstavljaju ulazni podaci i očekivani izlazni podaci. Generalno je proces učenja neuronske mreže opisan karakteristikom koja se zove konvergencija. Učenje se odigrava kroz nekoliko ciklusa (iteracija, epoha) propagacije jednog ili više primera za trening kroz mrežu, dobijene vrednosti na izlazu mreže se upoređuju sa očekivanim, vrši se izračunavanje greške i podešavanje težine veza kako bi se smanjila razlika između trenutnog i željenog izlaza. Mreža reaguje sve bolje na podatke za treniranje što se više puta predstavljaju mreži tokom treniranja, sve dok se ne postigne željeni izlaz. Učenje je završeno kada se težine sinaptičkih veza više ne menjaju (Ilić, 1999; Kasabov, 1996). Druga generalna karakteristika neuronskih mreža je generalizacija. Po završenom treniranju mreže, novi ulazni podaci predstavljeni mreži aktiviraju poznate procedure, tj. mreža proizvodi izlaz sličan izlazu prilikom treniranja, ukoliko je ulaz sličan onom iz faze treniranja, tj. slični stimulusi izazivaju slične reakcije (Kasabov, 1996). Tokom učenja mreže dolazi do podešavanja težine veza između jedinica u skladu sa određenim pravilima modifikacije (Krose i van der Smagt, 1996). Primena generalizovanog delta pravila omogućava pronalaženje optimalnih vrednosti težina koje minimizuju grešku metodom koja se zove pad gradijenta. Pravi pad gradijenta zahteva da se izvršavaju vrlo mali koraci. Iz praktičnih razloga treba izabrati što veću brzinu učenja, a bez stvaranja oscilacija. Jedan od načina da se izbegnu velike oscilacije je stvaranje zavisnosti promene težine od prethodne promene težine veze, dodavanjem momentuma koji doprinosi inerciji pre sledeće promene težine u zavisnosti od pravca prethodne promene. Kada se ne koristi momentum, pri malim brzinama učenja potrebno 31 je mnogo vremena kako bi se postigao minimum greške, dok se pri velikim brzinama učenja minimum nikada ne postiže zbog oscilacija. Uvođenjem momentuma minimum se postiže brže (Slika 1.4-4) (Krose i van der Smagt, 1996). Slika 1.4-4. Prostor opadanja težine: (a) mala brzina učenja; (b) velika brzina učenja gde su primetne oscilacije; (c) velika brzina učenja sa dodatim momentumom (Krose i van der Smagt, 1996). Evaluacija greške aproksimacije mreže može da se izvede kroz procenu dva tipa greške. Prvi tip je greška koja procenjuje koliko dobro trenirana mreža aproksimira primere korišćene za trening. Drugi tip greške procenjuje koliko dobro mreža može da generalizuje odnosno reaguje na nove ulazne vektore (Kasabov, 1996). Opšta formula za izračunavanje greške bila bi: RMSE=[Σ(yi p – yi m)2/n]1/2 (1.4-2) gde je RMSE koren kvadrata srednje greške, yp je predviđeni odgovor, ym je odgovor dobijen u eksperimentu, i n je broj eksperimenata, podataka za treniranje MLP (Bishop, 1995). Greška aproksimacije je pod uticajem nekoliko faktora: algoritma za učenje i broja ciklusa jer to određuje koliko je greška smanjena posle treniranja, zatim od broja i kvaliteta uzoraka za učenje jer je pitanje koliko dobro uzorci predstavljaju aktuelnu funkciju, i na kraju od broja skrivenih jedinica jer to određuje ekspresivnu moć mreže (Krose i van der Smagt, 1996). Veliki broj skrivenih jedinica vodi ka maloj grešci tokom treniranja ali to ne vodi obavezno ka maloj grešci kod testiranja. Može se da desiti da je mreža odlično usklađena sa uzorcima za učenje ali zbog prevelikog broja skrivenih jedinica njena funkcija može biti mnogo složenija u odnosu na originalnu funkciju i sa test podacima može davati loša predviđanja. Mreža takođe može da fituje i “šum” koji postoji kod 32 svakog realnog uzorka, umesto da izvrši aproksimaciju tako da “šum” ne narušava predviđanje sa test podacima (Krose i van der Smagt, 1996). Preterano treniranje (engl. overtraining) je fenomen koji se dešava kada posle određenog broja ciklusa greška testiranja počinje da raste a greška treniranja nastavi da opada i u tom trenutku bi trebalo prekinuti proces treniranja (Kasabov, 1996). Sa porastom broja uzoraka za učenje obično greška učenja raste, a test greška opada (Slika 1.4-5). (Krose i van der Smagt, 1996). Slika 1.4-5. Efekat grupe podataka za učenje na generalizaciju. Isprekidana linija predstavlja željenu funkciju, primeri za učenje su kružići, aproksimacija od strane mreže je puna linija. Korišćeno je 5 skrivenih jedinica i (a) 4 primera za učenje; (b) 20 primera za učenje (Krose i van der Smagt, 1996). 1.4.2.2. Višeslojni perceptron Najčešće korišćena veštačka neuronska mreža danas je višeslojni perceptron (engl. Multiple Layer Perceptron, MLP). U pitanju je višeslojna neuronska mreža koja pored ulaznog i izlaznog sloja sadrži neurone na bar jednom srednjem (skrivenom) sloju (Slika 1.4-6). Slika 1.4-6. Model neuronske mreže sa ulaznim, skrivenim i izlaznim slojem (Ilić, 1999). Povezivanje neurona u višeslojnu mrežu omogućava obradu veoma složenih (nelinearnih) funkcija, zahvaljujući nelinearnim aktivacionim funkcijama na skrivenim slojevima. Arhitekturu ANN određuju broj neurona, broj neuronskih slojeva i specifično uređenje i povezivanje neurona u okviru mreže. Prvi sloj (ulazni) je jedini sloj koji prima signale iz okruženja i prenosi ih sledećem sloju (skriveni sloj), koji obrađuje ove 33 podatke i izdvaja osobine i šeme iz primljenih signala. Podaci koji se smatraju važnim upućuju se izlaznom, poslednjem sloju mreže kada se dobijaju konačni rezultati obrade (Ilić, 1999). Informacije se pri tom prostiru samo u jednom smeru, od ulaza ka izlazu (engl. feedforward). Prilikom obučavanje mreže koristi se nelinearna, sigmoidna aktivaciona funkcija, a algoritam koji nadzire obučavanje je BP algoritam, što znači da se signal propagira unapred a greška unazad (error backpropagation (engl.)) (Slika 1.4- 7) (Ilić, 1999). Signal Greška Ulazni sloj Skriveni sloj Izlazni sloj (Željeni izlaz) Slika 1.4-7. Šematski prikaz učenja MLP (Kasabov, 1996). Algoritam se razvija postupno kroz određen broj epoha. U svakoj epohi podaci za treniranje se ponovo šalju u mrežu, i ciljni i realni izlazi se porede i računa se greška. Početna konfiguracija mreže je nasumična a treniranje prestaje kada prođe određeni broj epoha, kada greška dostigne prihvatljivi nivo, ili kada prestane smanjenje greške. Jedan od problematičnih aspekata primene višeslojnog perceptrona sa BP algoritmom je rešavanje pitanja na koji način izabrati optimalne parametre kao što su broj skrivenih slojeva i broj jedinica u ovim slojevima i podesiti nekoliko kontrolnih parametara kao što su broj epoha (ciklusa), brzina učenja, momentum i dr (Bishop, 1995; Haykin, 1994; Kasabov, 1996). 34 2. CILJ ISTRAŽIVANJA: Cilj istraživanja je unapređenje razumevanja procesa sušenja raspršivanjem primenom koncepta dizajniranja kvaliteta u farmaceutskom razvoju (Quality by Design, engl.). Istraživanje se sastoji iz dva dela koja imaju za cilj: 1. Razvoj procesa sušenja raspršivanjem kao tehnologije pogodne za obezbeđivanje homogenosti praškova i, posledično, ujednačenosti doziranja nisko doziranih lekovitih supstanci (model supstanca naratriptan hidrohlorid). Istraživanje obuhvata karakterizaciju i modelovanje procesa sušenja raspršivanjem odabrane formulacije, kao i optimizaciju procesa primenom metodologije površine odgovora i veštačkih neuronskih mreža, uz fizičkohemijsku karakterizaciju polaznih materijala (lekovite supstance i ekscipijenasa) i dobijenog praška. 2. Razvoj procesa sušenja raspršivanjem u postupku proizvodnje praška sa teško rastvorljivim model supstancama, u cilju poboljšanja rastvorljivosti formiranjem kompleksa sa ciklodekstrinima (model supstance vorikonazol i aripiprazol). Istraživanje obuhvata ispitivanje mogućnosti primene dva derivata beta-ciklodekstrina i razvoj formulacije rastvora za raspršivanje sa slabo rastvorljivim supstancama, karakterizaciju i modelovanje procesa sušenja raspršivanjem odabrane formulacije, kao i optimizaciju procesa primenom metodologije površine odgovora i veštačkih neuronskih mreža, uz fizičkohemijsku karakterizaciju korišćenih polaznih materijala (lekovite supstance i ekscipijenasa) i dobijenih praškova. U okviru razvoja procesa sušenja raspršivanjem cilj je definisati kritične atribute kvaliteta proizvoda, kritične atribute polaznih materijala i procesa, a zatim okarakterisati prostor za dizajn kvaliteta. 35 3. PRVI DEO ISTRAŽIVANJA 3.1. UVOD U skladu sa principima dizajniranja kvaliteta u farmaceutskom razvoju proizvoda (QbD), na osnovu fizičkohemijskih karakteristika odabrane model lekovite supstance i karakteristika čvrstih farmaceutskih oblika sa trenutnim oslobađanjem leka, najpre je definisan ciljani profil kvaliteta praška kao međuproizvoda koji se može u daljim fazama razvoja koristiti u proizvodnji čvrstih doziranih oblika. Na osnovu ciljanog profila kvaliteta praška definisani su kritični atributi kvaliteta praška, i izvršena je analiza rizika u cilju definisanja potencijalno kritičnih formulacijskih i procesnih promenljivih za sušenje raspršivanjem vodenog rastvora formulacije sa nisko doziranom lekovitom supstancom. 3.1.1. Fizičkohemijske karakteristike naratriptan hidrohlorida Naratriptan hidrohlorid je relativno nova lekovita supstanca iz grupe selektivnih 5- hidroksitriptamin agonista (triptana) koja se koristi u terapiji migrene. Hemijska struktura leka prikazana je na Slici 3.1.1-1. Slika 3.1.1-1. Naratriptan hidrohlorid (N-metil-3-(1-metil-4-piperidinil)-1H-indol-5- etansulfonamid hidrohlorid, molekulska formula C17H25N3O2S·HCl, Mr 371.93). Naratriptan hidrohlorid je skoro beo do bledo žut kristalan prašak sa temperaturom topljenja oko 246ºC. Ne ispoljava polimorfizam. Slaba je organska baza sa pKa vrednošću 9.7 (piperidinil azot). Nepolarna je lekovita supstanca sa koeficijentom distribucije logD= −0.34. Naratriptan hidrohlorid je lako rastvorljiv u dimetilsulfoksidu 36 i teško rastvorljiv u metanolu (Product information, Naramig tablets, GlaxoSmithKline). Jedna od važnijih karakteristika lekovite supstance je rastvorljivost u vodenim medijumima, jer ona može biti ograničavajući faktor u pripremi rastvora za raspršivanje, kao i faktor važan za oslobađanje iz lekovitog oblika. Rezultati ispitivanja rastvorljivosti u vodenim medijumima različitih pH vrednosti, dobijeni primenom standardne shake-flask (engl.) metode, prikazani su u Tabeli 3.1.1-1 (in-house metoda, Hemofarm a.d., Srbija). Na osnovu dobijenih rezultata rastvorljivost naratriptan hidrohlorida u ispitivanom pH opsegu definiše se kao umerena, prema definicijama rastvorljivosti iz Evropske farmakopeje. S druge strane, prema FDA smernici za Biofarmaceutski sistem klasifikacije (BCS) u cilju klasifikacije leka potrebno je razmotriti rastvorljivost i permeabilnost leka. Moglo bi se reći da naratriptan hidrohlorid pripada BCS klasi 3 jer se odlikuje visokom rastvorljivošću i niskom permeabilnošću. Naime, lek se smatra visoko rastvorljivim ako se maksimalna doza rastvara u manje od 250 ml vode u ispitivanom opsegu pH vrednosti, što je ispunjeno za rastvorljivost maksimalne doze 2.5mg naratriptana. Što se tiče permeabilnosti, lek se smatra visoko permeabilnim ako je nivo resorpcije kod ljudi veći od 90 % od primenjene doze u poređenju sa intravenskom referentnom dozom (apsolutna bioraspoloživost). Studija u kojoj je određivana apsolutna bioraspoloživost naratriptana pokazuje da bioraspoloživost posle oralne primene u odnosu na intravenski put primene iznosi 63-74 %. (Product information, Naramig tablets, GlaxoSmithKline). Tabela 3.1.1-1. Rastvorljivost naratriptan hidrohlorida u različitim vodenim medijumima Medijum Rastvorljivost (mg/ml) na 37°C na 25°C Prečišćena voda 28.1 27.4 0.1M hlorovodonična kiselina pH 1.2 11.5 9.4 Acetatni pufer pH 4.5 27.6 26.8 Fosfatni pufer pH 6.8 30.4 23.6 Studije forsirane degradacije ukazuju da je u pitanju relativno stabilna lekovita supstanca, termostabilna i fotostabilna je, a kao put degradacije izdvaja se oksidacija (Naratriptan hydrochloride Drug Master File, Hetero Drugs Limited, Indija). 37 3.1.2. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda (CPK) Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda (praška) sa naratriptan hidrohloridom prikazan je u Tabeli 3.1.2-1. Tabela 3.1.2-1. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda Elementi kvaliteta Cilj Međuproizvod Prašak Put primene Oralni Profil oslobađanja leka Trenutno oslobađanje leka Koncentracija leka 1.3%1 Atributi kvaliteta Izgled Identifikacija Sadržaj Ujednačenost sadržaja Brzina rastvaranja Hemijska stabilnost Fizička stabilnost Rezidualni rastvarači Sadržaj vlage Mikrobiološka čistoća Specifikacije u skladu sa oficinalnim ili drugim standardima kvaliteta koje potvrđuju bezbednost i efikasnost tokom roka trajanja leka 1Terapijska oralna doza naratriptan hidrohlorida je 2.5 mg tako da bi u čvrstim doziranim oblicima koncentracija leka bila niska, a za potrebe istraživanja kao ciljna koncentracija leka u prašku kao međuproizvodu definisana je koncentracija 1.3%. 3.1.3. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (KAK) Kada je koncentracija leka u doziranom obliku niska kao što je to slučaj sa naratriptan hidrohloridom (manja od 5 %), postizanje ujednačenosti sadržaja može biti poseban izazov. Imajući to u vidu, kao i karakteristike naratriptan hidrohlorida, kao potencijalno pogodan proces izrade praška odabrana je tehnologija sušenja raspršivanjem vodenog rastvora lekovite supstance i ekscipijenasa. U odnosu na tu polaznu osnovu, kao i uzimajući u obzir ciljani profil definisani su kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (praška dobijenog sušenjem raspršivanjem) (Tabela 3.1.3-1). 38 Tabela 3.1.3-1. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (KAK) Atributi kvaliteta Cilj Kritičnost Opravdanost Izgled Homogeni izgled Ne Izgled nije direktno povezan sa bezbednošću i efikasnošću. Identifikacija Pozitivna na lekovitu supstancu Da1 Iako je identifikcija kritična za bezbednost i efikasnost, ovaj atribut se može efikasno kontrolisati i pratio bi se tokom puštanja leka u promet. Sadržaj 95-105% od deklarisane vrednosti Da Varijabilnost sadržaja utiče na bezbednost i efikasnost. Procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Ujednačenost sadržaja 90-110%, RSD ≤5% Da Varijabilnost u ujednačenosti sadržaja utiče na bezbednost i efikasnost. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Brzina rastvaranja Ne manje od 80% od deklarisane vrednosti za 45 minuta Da Neusaglašenost sa specifikacijom za brzinu rastvaranja može da utiče na bioraspoloživost. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Hemijska stabilnost Profil nečistoća u skladu sa oficinalnim zahtevima/ICH smernicama i u skladu sa profilom nečistoća referentnog proizvoda. Da Degradacioni proizvodi mogu da utiču na bezbednost i efikasnost i moraju biti kontrolisani. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Fizička stabilnost Što manja promena tokom vremena Da Fizička stabilnost može uticati na kvalitet i mora biti kontrolisana. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Rezidualni rastvarači Profil rezidualnih rastvarača u skladu sa oficinalnim zahtevima/ICH smernicama Da1 Rezidualni rastvarači mogu uticati na bezbednost. U proizvodnji se ne bi koristili organski rastvarači. Sadržaj vlage Pratiti Da Sadržaj vlage može uticati na degradaciju i mikrobiološki rast u lekovitom proizvodu. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Mikrobiološka čistoća U skladu sa EP 2.6.12 i 2.6.13 Da1 Neusaglašenost sa specifikacijom utiče na bezbednost pacijenta. Generalno, rizik od mikrobiološkog rasta je mali kod čvrstih doziranih oblika. 1Formulacijske i procesne promenljive ne utiču na ove kritične atribute kvaliteta, tako da se izostavljaju iz daljeg razmatranja iako su važni elementi kvaliteta. 39 Kao kritični atribut kvaliteta međuproizvoda posebno se izdvaja homogenost praška, odnosno ujednačenost sadržaja lekovite supstance u prašku. Kritični atributi kvaliteta svakako bi bili i odgovarajuća hemijska stabilnost, kao i profil oslobađanja lekovite supstance sa ciljem da se obezbedi trenutno oslobađanje. Pošto na ove atribute dodatno mogu da utiču ekscipijensi i procesni parametri proizvodnih faza koje bi usledile nakon proizvodnje praška sušenjem raspršivanjem, fokus se trenutno ne usmerava na ove atribute. S druge strane, pošto bi se u fazi proizvodnje praškova sušenjem raspršivanjem, podešavanjem procesnih parametara moglo uticati na sadržaj vlage u praškovima i sa tog aspekta potencijalno na stabilnost, kao kritični atribut kvaliteta proizvoda izdvaja se i sadržaj vlage u dobijenim praškovima. 3.1.4. Definisanje potencijalno kritičnih atributa kvaliteta polaznih materijala i procesnih parametara 3.1.4.1. Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance Na osnovu fizičkohemijskih i bioloških osobina lekovite supstance, i u odnosu na odabranu tehnologiju izrade (sušenje raspršivanjem rastvora) izvršena je analiza rizika atributa lekovite supstance za kritične atribute kvaliteta međuproizvoda. U analizi rizika korišćena je tehnika Preliminarne analize opasnosti (engl. Preliminary Hazard Analysis – PHA) (Rausand, 2005; Sakura tablet case study, 2008). Najpre su iz ciljanog profila izdvojeni sledeći parametri kvaliteta: sadržaj, ujednačenost sadržaja, brzina rastvaranja, hemijska i fizička stabilnost i sadržaj vlage. Zatim su izdvojene osobine lekovite supstance koje mogu da utiču na parametre kvaliteta: oblik čvrstog stanja (amorfno ili kristalno), veličina čestica, hemijska stabilnost, protočnost. Za svaku od tih osobina procenjen je nivo rizika uticaja korišćenjem PHA na osnovu težine (ozbiljnosti) rizika i verovatnoće dešavanja. Rezultati ocene i rangiranja rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance prikazani su u Tabeli 3.1.4-1 40 Tabela 3.1.4-1 Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance Rizik Događaj Težina Verovatnoća Ocena rizika Oblik čvrstog stanja Sadržaj 1 1 L Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 2 1 L Hemijska stabilnost 2 1 L Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 2 1 L Veličina čestica Sadržaj 3 1 L Ujednačenost sadržaja 3 1 L Brzina rastvaranja 3 1 L Hemijska stabilnost 1 1 L Fizička stabilnost 1 1 L Sadržaj vlage 1 1 L Hemijska stabilnost Sadržaj 2 3 M Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 1 1 L Hemijska stabilnost 3 3 M Fizička stabilnost 2 2 L Sadržaj vlage 1 1 L Protočnost Sadržaj 2 1 L Ujednačenost sadržaja 3 1 L Brzina rastvaranja 2 1 L Hemijska stabilnost 1 1 L Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 1 1 L L – nizak nivo rizika; M – srednji nivo rizika. Proizvodni postupak podrazumeva rastvaranje lekovite supstance i sušenje rastvora raspršivanjem. Na taj način je rizik svih navedenih polaznih atributa kvaliteta lekovite supstance, osim hemijske stabilnosti, mali za sve atribute kvaliteta međuproizvoda. Hemijska stabilnost lekovite supstance kritična je za atribute kvaliteta kao što su sadržaj i degradacioni proizvodi. Iako se zahvaljujući relativno dobroj stabilnosti lekovite supstance odabrana tehnologija može smatrati pogodnom jer može rezultovati praškom homogenog sastava i dobre rastvorljivosti, zbog očekivanog prelaska u amorfni oblik stabilnost može biti smanjena što bi se ispitivalo u daljim fazama razvoja. 41 3.1.4.2. Odabir ekscipijenasa Prilikom odabira ekscipijenasa pogodnih za proizvodnju praška sušenjem raspršivanjem rastvora, kritični atributi bili su njihova rastvorljivost u vodi, i procesibilnost odnosno mogućnost efikasnog sušenja raspršivanjem. Rastvaranjem polaznih materijala mogu se eliminisati razlike u osobinama među različitim proizvodnim serijama, kao što je veličina čestica koja može biti uzrok nehomogenosti praškova kao i drugih proizvodnih problema. Prednost u formulacijama sa niskim udelom lekovite supstance je ta što u formulaciji dominiraju osobine ekscipijenasa zahvaljujući kojima je olakšano izvođenje proizvodnog procesa. Odabrani su ekscipijensi laktoza i maltodekstrin, poznati po relativno dobroj rastvorljivosti u vodi i procesibilnosti prilikom sušenja raspršivanjem (Chidavaenzi i autori, 1997; Gonnissen i autori, 2007; Goula i Adamopoulos, 2008). Vodeni rastvor naratriptana, laktoze i maltodekstrina je korišćen kao najprostiji tip medijuma za raspršivanje. Laktoza monohidrat ima ulogu punioca i prisutna je u najvećem udelu (83.4 %). Maltodekstrin (15.3 %) obezbeđuje poboljšanje proizvodnog prinosa prilikom sušenja raspršivanjem i inhibitor je kristalizacije, zahvaljujući tome što povećava temperaturu staklastog prelaza komponenata formulacije (Adhikari i autori, 2004; Goula i Adamopoulos, 2008). Lekovita supstanca prisutna je u relativno niskoj koncentraciji (1.3%). 3.1.4.3. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem Iako se smatra složenim tehnološkim procesom, sušenje raspršivanjem omogućava da se podešavanjem brojnih procesnih parametara u skladu sa postavljenim ciljem definiše širok prostor za dizajn. Kao ciljna osobina koprocesiranog praška sa naratriptan hidrohloridom definisana je što manja vrednost za sadržaj vlage, a što se tiče kvaliteta procesa kao cilj je definisano postizanje što većeg proizvodnog prinosa. Za definisane ciljeve, izvršena je inicijalna analiza rizika za sledeće procesne parametre: temperaturu ulaznog vazduha (temperaturu vazduha za sušenje na ulazu u komoru), brzinu pumpe (brzinu kojom se rastvor dovodi do raspršivača), brzinu aspiratora (brzinu protoka vazduha za sušenje podešavanjem rada aspiratora tj. brzinu kojom se vazduh za 42 sušenje izvlači kroz uređaj), koncentraciju rastvora (medijuma koji se raspršuje), vlažnost ulaznog vazduha, i atomizaciju (količinu energije koja se troši za raspršivanje) (Tabela 3.1.4-2.). Analiza rizika izvedena je primenom FMEA analize (engl. Failure Mode Effects Analysis). Rizik je procenjen na osnovu tri kriterijuma: težine, verovatnoće javljanja i detektabilnosti (vremena detekcije), tako što je broj prioritetnog rizika dobijen množenjem ove tri vrednosti korišćen u rangiranju rizika (Sakura tablet case study, 2008; RMWG-07 case study, 2008). Za ispitivanje uticaja i optimizaciju odabrana su četiri potencijalno kritična procesna parametra: temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe, brzina aspiratora i koncentracija rastvora. Temperatura ulaznog vazduha obezbeđuje dovod toplotne energije, brzina pumpe i koncentracija rastvora utiču na količinu tečnosti koja se dovodi za isparavanje i samim tim na ishod prenosa mase i energije i formiranje čestica, a aspirator može da utiče na ukupnu ulaznu energiju i da dovede do povećanja temperature izlaznog vazduha. Uticaj parametara koji nisu uključeni u optimizaciju smanjen je održavanjem u uskim granicama ili održavanjem konstantnih vrednosti (vlažnost ulaznog vazduha, atomizacija). Parametri koji su odabrani da se dodatno prate bez unapred definisane specifikacije su temperatura izlaznog vazduha (koja odgovara temperaturi proizvoda tokom procesa) i veličina čestica dobijenog praška, i za njih nije izvršena formalna analiza rizika. 3.2. MATERIJALI I METODE 3.2.1. Materijali Naratriptan hidrohlorid (Hetero Drugs Limited, Indija), maltodekstrin DE 14 (Cargill, Belgija), laktoza monohidrat 200 mesh (Alpavit, Nemačka), i prečišćena voda (Hemofarm a.d., Srbija) su sastojci formulacije koja je bila korišćena u eksperimentima. 43 Tabela 3.1.4-2. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem Ciljni profil proizvoda/svojstva kvaliteta Potencijalni modalitet ispada Efekat Težina Verovatnoća javljanja Detektabilnost Broj prioritetnog rizika1 Sadržaj vlage Temperatura ulaznog vazduha Na nižim temperaturama zbog veće relativne vlažnosti vazduha kojim se vrši sušenje i manje efikasnosti sušenja, može doći do povećanja sadržaja rezidualne vlage u prašku. 2 5 3 30 Sadržaj vlage Brzina pumpe Veća brzina može da dovede do povećanja sadržaja vlage zbog toga što treba da ispari veća količina vode. 3 5 3 45 Sadržaj vlage Brzina aspiratora Veća brzina može da dovede do povećanja sadržaja vlage u prašku zbog skraćenog zadržavanja u komori. 1 5 3 15 Sadržaj vlage Koncentracija rastvora Niža koncentracija može da dovede do povećanja sadržaja vlage jer ima više vode za isparavanje. 4 5 1 20 Sadržaj vlage Vlažnost vazduha Veća vlažnost vazduha može da dovede do povećanja sadržaja vlage jer je smanjen kapacitet sušenja ali rad uređaja u klimatizovanom prostoru smanjuje rizik. 3 2 1 6 Sadržaj vlage Atomizacija Nema direktnog uticaja na sadržaj vlage u prašku. - - - - Proizvodni prinos Temperatura ulaznog vazduha Viša temperatura ulaznog vazduha može da dovede do povećanja prinosa zbog toga što je suvlji proizvod manje lepljiv. 3 4 4 36 Proizvodni prinos Brzina pumpe Veća brzina može da dovede do smanjenja prinosa ako se dobija vlažniji proizvod pa je više lepljiv. 3 5 4 60 Proizvodni prinos Brzina aspiratora Veća brzina može da dovede do povećanja prinosa zbog boljeg odvajanja u ciklonu. 1 5 4 20 Proizvodni prinos Koncentracija rastvora Veća koncentracija može da dovede do povećanja prinosa zbog toga što se krupnije čestice bolje odvajaju u ciklonu. 4 5 1 20 Proizvodni prinos Vlažnost ulaznog vazduha Veća vlažnost vazduha može da dovede do smanjenja prinosa jer može da se poveća lepljivost proizvoda, ali rad uređaja u klimatizovanom prostoru smanjuje rizik. 3 2 1 6 Proizvodni prinos Atomizacija Nema direktnog uticaja na prinos. - - - - 1Kada je broj prioritetnog rizika: < 20, postoji nizak rizik; ≥ 20 i < 40, postoji srednji rizik; ≥ 40, postoji visok rizik. 44 3.2.2. Priprema praškova Kompozitni sistemi su sušeni raspršivanjem vodenih rastvora na uređaju Büchi 290- Mini Spray Dryer (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Švajcarska) opremljenom sa standardnim mlaznim raspršivačem sa dva fluida. U svim eksperimentima količina rastvora je bila 100 g i brzina vazduha za raspršivanje je bila podešena na 600L/h. Preostali procesni parametri su bili podešeni prema zahtevima pojedinačnih eksperimenata određenih eksperimentalnim dizajnom. Temperatura izlaznog vazduha je merena pomoću temperaturnog senzora koji se nalazi u delu uređaja za sušenje raspršivanjem odmah posle cilindra u kome se vrši raspršivanje (koji je ujedno i komora za sušenje), tako da je omogućeno merenje temperature vazduha koji nosi čvrste čestice pre njihovog ulaska u ciklonski separator. Stoga se merena temperatura označava kao temperatura izlaznog vazduha. Proizvodni prinos, odnosno masa praška prikupljena posle svakog eksperimenta sušenja raspršivanjem izražena je kao procenat početne količine praškova od kojih je pripremljen rastvor. 3.2.3. Karakterizacija praškova Određivanje sadržaja vlage i veličine čestica praškova vršeno je za svaki eksperiment u okviru određenog eksperimentalnog dizajna, dok su ostale osobine praškova ispitivane na uzorcima dobijenim nakon optimizacije procesa. 3.2.3.1. Sadržaj vlage Sadržaj vlage (gubitak sušenjem) određivan je termogravimetrijski na aparatu Mettler- Toledo HR 83 Halogen moisture analyzer (Mettler-Toledo, Švajcarska) na temperaturi 105°C i u trajanju testa do postizanja pada mase manjeg od 1 mg na 50 sekundi, na veličini uzorka od 1 g. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje dva merenja. 45 3.2.3.2. Veličina čestica Veličina čestica praškova je određivana metodom koja se zasniva na difrakciji laserske svetlosti korišćenjem uređaja Malvern Mastersizer 2000 particle size analyzer (Malvern Instruments, Velika Britanija). Dispergovanje čestica je vršeno pomoću uređaja Scirocco 2000 dry powder feeder (Malvern Instruments, Velika Britanija) sa pritiskom 2 bar i brzinom rada uređaja za dispergovanje 50-70%. Raspodela veličine čestica određivana je korišćenjem pratećeg softvera uz odabir Fraunhofer-ovog modela. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje dva merenja. 3.2.3.3. Vizuelizacija čestica praška Vizuelizacija praškova sa ciljem opisivanja oblika, morfologije i karakteristika površine čestica, izvršena je pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa Philips ESEM XL 30 FEG (Philips Electron Optics, Holandija). Uzorci su fiksirani pomoću karbonskog adheziva na aluminijumski držač i prevučeni zlatom i zatim fotografisani pri naponu od 10kV. Posmatrani su pod uvećanjem od 1000 do 5000 puta. 3.2.3.4. Ujednačenost sadržaja naratriptan hidrohlorida Ujednačenost sadržaja naratriptan hidrohlorida u praškovima dobijenim sušenjem raspršivanjem proverena je odgovarajućom HPLC metodom. Analiza je vršena na uređaju Agilent HPLC system, 1200 Series (Agilent, SAD). Korišćena je kolona 150x4.6mm punjena silika česticama sa hemijski vezanim fenil grupama, veličine 3µm (Waters Spherisorb Phenyl, Waters Corporation, SAD). Mobilna faza se sastojala od natrijum dihidrogen fosfatnog pufera (pH 5.0) i izopropanola u odnosu 90:10. Protok mobilne faze je bio 1.3 ml/min, injekciona zapremina 50 µl, temperatura kolone 35°C, i UV detektor je bio podešen na 282 nm. 46 3.2.3.5 Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Termička karakterizacija praškova vršena je pomoću diferencijalnog skenirajućeg kalorimetra Shimadzu DSC-50 Differential Scanning Calorimeter (Shimadzu Corporation, Japan). Ispitivani su uzorci: polazni materijali pojedinačno (naratriptan hidrohlorid, laktoza, maltodekstrin), njihove fizičke smeše dobijene mešanjem u kesi i mešanjem pomoću tarionika i pistila, i prašak dobijen sušenjem raspršivanjem. Ispitivani uzorci (2–5 mg u zatvorenoj aluminijumskoj posudici) su bili tretirani u temperaturnom opsegu 30-300ºC, pri brzini zagrevanja od 10°C/min u struji inertnog gasa azota, pri protoku od 25 cm3/min. Prazna aluminijumska posudica je korišćena kao slepa proba. 3.2.3.6. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) ATR-FTIR spektroskopija, primenjena je za snimanje FTIR spektara direktno iz praškova, pomoću Shimadzu IR-Prestige-21 FT-IR spektrometra (Shimadzu Europa GmbH, Nemačka), kuplovanog sa horizontalnim sistemom za smanjenje totalne refleksije Golden Gate MKII single-reflection ATR system (Specac, Velika Britanija) opremljenim sa sočivom od cink-selenida, kojim se omogućava direktno snimanje uzoraka. Ispitivani su uzorci: sirovine pojedinačno (naratriptan hidrohlorid, laktoza, maltodekstrin), njihova fizička smeša dobijena mešanjem u kesi, i prašak dobijen sušenjem raspršivanjem. Spektri su snimani u oblasti 500-4000cm-1, pri rezoluciji od 4cm-1, sa 32 skeniranja za svaki spektar. 3.2.3.7. Nasipna i tapkana gustina praškova Nasipna i tapkana gustina praškova je određivana pomoću graduisane menzure i aparata za merenje tapkane zapremine Erweka SVM (Erweka, Nemačka). Nasipna gustina je određivana tako što je prethodno prositan prašak (sito 1 mm) pažljivo sipan u graduisanu menzuru od 100 ml (sa podeocima očitavanja do 1 ml), do zapremine od 100ml i nakon očitane mase m izvršen je preračun nasipne gustine ρN(g/ml)=m/100. Zatim je menzura fiksirana na aparaturu, na kojoj je vršeno tapkanje praška do 47 postizanja smanjenja nivoa praška u menzuri ≤ 2 ml, između dva uzastopna seta tapkanja. Pomoću vrednosti m i očitane tapkane zapremine Vf izvršen je preračun tapkane gustine ρT(g/ml) = m/Vf. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje tri merenja. 3.2.3.8. Protočnost praškova Protočnost praškova je određivana na aparatu Erweka GWF (Erweka, Nemačka), merenjem vremena potrebnog za proticanje određene količine praška iz levka kroz kružni otvor promera 12.5 mm, sa uključenom vibracijom. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje tri merenja. 3.2.4. Eksperimentalni dizajn: skrining ispitivanje i metodologija površine odgovora Eksperimentalni dizajn je izveden iz dva koraka: prvi korak je bila skrining studija i drugi korak je bilo modelovanje površine odgovora. Sva ispitivanja koja se zasnivaju na eksperimentalnom dizajnu bila su podržana primenom softverskog paketa Design- Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, SAD). 3.2.4.1. Skrining ispitivanje Budući da izbor eksperimentalnog dizajna zavisi od ciljeva eksperimenata i broja faktora koje treba ispitati, u svrhu razvoja proizvodnog procesa, izveden je set višefaktorskih eksperimenata prema takozvanom frakcionom faktorijalnom dizajnu, koji uključuje samo deo punog seta eksperimenata. Svrha je bila da se ispita efekat četiri procesna parametra: temperature ulaznog vazduha, brzine pumpe, brzine aspiratora i koncentracije rastvora na prinos, sadržaj vlage dobijenih praškova, i na temperaturu izlaznog vazduha (Tabela 3.2.4.-1). Procesni parametri su podešavani u skladu sa 24-1 frakcionim faktorijalnim dizajnom. Četiri procesne promenljive su varirane na dva nivoa, tako da je ukupno bilo osam eksperimenata sa različitim kombinacijama nivoa 48 promenljivih, izvedenih nasumičnim redosledom. Realne i kodirane vrednosti ispitivanih promenljivih su prikazane u Tabeli 3.2.4-1. Eksperimenti 3 i 6 su ponovljeni kako bi se izračunao statistički značaj nezavisnih promenljivih. Tabela 3.2.4-1. Nezavisne procesne promenljive u 24-1 frakcionom faktorijalnom dizajnu (kodirane i realne vrednosti) i praćeni odgovori Eksp. br. X1 = Brzina aspiratora (%) kodirano realno X2 = Brzina pumpe (%) kodirano realno X3 = Temp. ulaznog vazduha (˚C) kodirano realno X4 = Konc. rastvora (%) kodirano realno Odgovori 1 -1 80 -1 10 -1 170 -1 10 Y1= Prinos (%) Y2= Sadržaj vlage (%) Y3= Temperatura izlaznog vezduha (˚C) 2 +1 100 -1 10 -1 170 +1 30 3 -1 80 +1 30 -1 170 +1 30 4 +1 100 +1 30 -1 170 -1 10 5 -1 80 -1 10 +1 190 +1 30 6 +1 100 -1 10 +1 190 -1 10 7 -1 80 +1 30 +1 190 -1 10 8 +1 100 +1 30 +1 190 +1 30 Vrednosti za brzinu aspiratora: 100% predstavlja maksimalni protok vazduha od 40 m3/h i 80% predstavlja protok vazduha od 32 m3/h. Vrednosti za brzinu pumpe: 10% odgovara protoku rastvora od oko 3 ml/min, i 30% odgovara protoku rastvora od oko 9 ml/min. Opsezi ispitivanih parametara su izabrani kako bi se postigli najveći mogući proizvodni prinosi. Izabrane vrednosti za podešavanje brzine aspiratora i brzine pumpe su definisane prema preporukama proizvođača uređaja, imajući u vidu osnovne principe sušenja raspršivanjem. Viša vrednost za podešavanje brzine aspiratora (100%, što odgovara protoku vazduha od 40 m3/h) može da obezbedi bolje ciklonsko odvajanje i bolji proizvodni prinos, dok niža vrednost za podešavanje aspiratora (80%, što odgovara protoku vazduha od 32 m3/h) može da dovede do postizanja nižeg sadržaja vlage tako što se vreme zadržavanja proizvoda u komori za sušenje povećava kada je izvlačenje vazduha nižeg intenziteta. Brzina pumpe 10% (što odgovara protoku medijuma od oko 3 ml/min) ili 30% (što odgovara protoku medijuma od oko 9 ml/min) su vrednosti izabrane u skladu sa preporukom proizvođača uređaja. Uobičajeno je da se rastvori ili suspenzije laktoze suše raspršivanjem pri nešto višoj temperaturi ulaznog vazduha, oko 49 170-190°C, i ove vrednosti su izabrane za eksperimentalni dizajn (Berggren i Alderborn, 2004; Chidavaenzi i autori, 1997). Nivo komprimovanog vazduha kojim se vrši raspršivanje medijuma je bio podešen na 4 cm na skali na uređaju (što odgovara 400L/h), što je u okviru opsega vrednosti koje se uobičajeno koriste, i bio je fiksiran na ovoj vrednosti za sve eksperimente (Berggren i Alderborn, 2004; Goula i Adamopoulos, 2004; Mosen i autori, 2006; Murtoma i autori, 2004). Izabrane vrednosti koncentracije rastvora za sušenje raspršivanjem su bile 10% i 30% jer je ovaj opseg korišćen u nekim prethodnim studijama sušenja raspršivanjem rastvora/suspenzija koji su sadržali laktozu (Cassidy i autori, 2000; Islam i Langrish, 2010). Rezultati dobijeni primenom FFD evaluirani su korišćenjem linearnog modela: Y = bo + b1X1 + b2X2 + b3X3 + b4X4 (3.2.4-1) gde vrednosti b1-b4 predstavljaju regresione koeficijente; Y je predviđena vrednost za praćeni odgovor: prinos (Y1), sadržaj vlage (Y2), i temperaturu izlaznog vazduha (Y3); a vrednosti X predstavljaju glavne efekte variranih promenljivih: brzine aspiratora (X1), brzine pumpe (X2), temperature ulaznog vazduha (X3), koncentracije rastvora (X4). 3.2.4.2. Metodologija površine odgovora (engl. Response surface methodology, RSM) Posle izvođenja skrining ispitivanja, tri procesna parametra: brzina pumpe (A), temperatura ulaznog vazduha (B), koncentracija rastvora (C), izabrana su za dalju analizu primenom trifaktorskog sfernog centralnog kompozitnog dizajna (engl. Central composite design, CCD) sačinjenog od 20 eksperimenata. Analiza varijanse (ANOVA) je izvršena kako bi se odredio značaj svakog faktora, pri nivou značajnosti od 5%. Polinomne jednačine su kreirane kako bi se ustanovile veze među faktorima i odgovorima. Praćeni odgovori su bili prinos (R1); sadržaj vlage (R2); srednja veličina čestica (R3); i temperatura izlaznog vazduha (R4). Realne i kodirane vrednosti evaluiranih promenljivih, praćenih odgovora i eksperimentalni matriks prikazani su u Tabeli 3.2.4-2. 50 Tabela 3.2.4-2. Nezavisne procesne promenljive u centralnom kompozitnom dizajnu (kodirane i realne vrednosti) i praćeni odgovori Eksp. br. A = Brzina pumpe (%) kodirano realno B = Temp. ulaznog vazduha (˚C) kodirano realno C = Koncentracija rastvora (%) kodirano realno Odgovori 1 -1.68 3.18 0 180 0 20 R1= Prinos (%) R2= Sadržaj vlage (%) R3= Srednja veličina čestica (µm) R4= Temperatura izlaznog vazduha (˚C) 2 +1 30 +1 190 -1 10 3 0 20 0 180 0 20 4 -1 10 +1 190 +1 30 5 +1.68 36.82 0 180 0 20 6 0 20 0 180 0 20 7 0 20 0 180 +1.68 36.82 8 0 20 0 180 0 20 9 0 20 0 180 0 20 10 0 20 -1.68 163.18 0 20 11 -1 10 +1 190 -1 10 12 0 20 0 180 0 20 13 -1 10 -1 170 -1 10 14 +1 30 -1 170 -1 10 15 0 20 0 180 0 20 16 -1 10 -1 170 +1 30 17 0 20 +1.68 196.82 0 20 18 0 20 0 180 -1.68 3.18 19 +1 30 +1 190 +1 30 20 +1 30 -1 170 +1 30 Vrednosti za brzinu pumpe: 3.18% odgovara protoku rastvora od oko 1 ml/min, 10% odgovara protoku rastvora od oko 3 ml/min, 20% odgovara protoku rastvora od oko 6 ml/min, 30% odgovara protoku rastvora od oko 9 ml/min i 36.82% odgovara protoku rastvora od oko 11 ml/min. 3.2.5. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona U modelovanju procesa sušenja raspršivanjem korišćena je veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona (engl. Multilayer perceptron, MLP). Pre treniranja mreže i razvoja modela, definisana je specifikacija za broj skrivenih slojeva i broj jedinica u ovim slojevima. Za aktivaciju neurona odabrana je sigmoidna transfer funkcija. Za treniranje mreže odabran je BP algoritam (engl. back-propagation, BP) i podešavani su parametri kao što su broj epoha, brzina učenja, momentum, broj kombinacija. MLP je primenjen korišćenjem komercijalno dostupnog softvera Statistica Neural Network software (StatSoft, SAD). 51 3.2.6. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža i metodologije površine odgovora Ispitivan je potencijal kombinovane primene metodologije površine odgovora (RSM) i veštačkih neuronskih mreža (MLP) u poboljšanju razumevanja procesa i kvaliteta razvoja procesa (Miguélez-Morán, 2009; Plumb i autori, 2002). Neuronske mreže su korišćene za upotpunjavanje liste podataka koji se dalje mogu obraditi matematičkim modelovanjem zasnovanom na eksperimentalnom dizajnu (RSM). S druge strane, metodologija površine odgovora korišćena je za dešifrovanje predviđanja veštačkih neuronskih mreža koja imaju prirodu takozvane crne kutije (Miguélez-Morán, 2009). Šema eksperimenata koji su korišćeni u razvoju i testiranju različitih modela predstavljena je na Slici 3.2.6-1. Eksp. br. RSM1 RSM2 RSM3 MLP1 MLP2 1 MLP2 MLP1 2 MLP1 3 MLP2 MLP1 4 MLP1 5 MLP2 MLP1 6 MLP2 MLP1 7 MLP2 MLP1 8 MLP2 MLP1 9 MLP2 MLP1 10 MLP2 MLP1 11 MLP1 12 MLP2 MLP1 13 MLP1 14 MLP1 15 MLP2 MLP1 16 MLP1 17 MLP2 MLP1 18 MLP2 MLP1 19 MLP1 20 MLP1 21 Eksperimentalni podaci korišćeni za razvoj modela Predviđeni podaci korišćeni za razvoj modela Eksperimentalni podaci korišćeni za testiranje modela Eksperimenti koji nisu uključeni u analizu Slika 3.2.6-1. Šema eksperimenata koji su korišćeni u razvoju i testiranju različitih modela. 52 Najpre su razvijeni modeli korišćenjem samo eksperimentalno dobijenih podataka CCD dizajna (eksperimenti 1-20, Tabela 3.2.4-2, Slika 3.2.6-1.), primenom metodologije površine odgovora (RSM1 modeli) i neuronske mreže tipa višeslojnog perceptrona (MLP1 model). Zatim, kako bi se ispitao potencijal MLP za upotpunjavanje liste podataka (koja odgovara određenom eksperimentalnom dizajnu) iz koje je moguće izvršiti matematičko modelovanje (RSM), korišćenjem jednog manjeg dela eksperimentalnih podataka trenirana je neuronska mreža kako bi se dobio model MLP2. Korišćeni su eksperimentalni podaci koji odgovaraju 23 faktorijalnom dizajnu u okviru CCD (eksperimenti 2, 4, 11, 13, 14, 16, 19, 20, Tabela 3.2.4-2., Slika 3.2.6-1.). Model MLP2 korišćen je za predviđanje rezultata i upotpunjavanje grupe podataka za preostalih 12 eksperimenata koji po dizajnu odgovaraju CCD. Na ovaj način omogućeno je matematičko modelovanje (primena RSM) dobijene grupe podataka koja se sastoji od kombinacije eksperimentalnih i predviđenih rezultata, i dobijeni su modeli RSM2 (Slika 3.2.6-1). U cilju ispitivanja potencijala primene RSM u dešifrovanju takozvane prirode crne kutije predviđanja veštačkih neuronskih mreža, korišćeni su samo predviđeni rezultati za sve eksperimente koji pripadaju CCD, i to oni dobijeni predviđanjem MLP modela sa najboljom korelacijom između predviđenih i stvarno dobijenih rezultata. Primenom RSM na taj način dobijeni su RSM3 modeli za svaki odgovor kako bi bili definisani značaj i veze među faktorima (Slika 3.2.6-1). Dobijene matematičke jednačine su analizirane kako bi se na osnovu sličnosti i razlika među modelima unapredilo razumevanje procesa i objasnilo zašto jedan model ima bolju moć predviđanja od drugog. Sposobnost predviđanja modela ispitivana je test eksperimentom (eksperiment br. 21, Slika 3.2.6-1) koristeći novi set ulaznih promenljivih (brzina pumpe 6 %, temperatura ulaznog vazduha 175°C, koncentracija rastvora 15 %). Sposobnost predviđanja različitih modela izražavana je kroz preračun koeficijenata korelacije (R2) za eksperimentalno dobijene i predviđene rezultate. 53 3.2.7. Optimizacija sušenja raspršivanjem Nakon izvršene analize procesa, korišćenjem softverskog paketa Design-Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, SAD) izvršena je numerička optimizacija procesnih parametara za rastvor koncentracije 25%, sa zahtevima za postizanje najvećeg mogućeg prinosa i najmanjeg mogućeg sadržaja vlage, primenom takozvanog pristupa poželjnosti (engl. Desirability approach) (Nekkanti i autori, 2009). Zatim je izvršena fizičkohemijska karakterizacija dobijenog praška. 3.3. REZULTATI I DISKUSIJA 3.3.1. Skrining ispitivanje Dobijene eksperimentalne vrednosti (Tabela 3.3.1-1.) za praćene odgovore nakon sprovedenog 24-1 FFD dizajna uklapane su u linearni model i dobijene su sledeće jednačine (u obliku kodiranih faktora): Y1 = 78.05 + 0.72*X1 - 6.28*X2 + 1.85*X3 - 2.50*X4 (3.3.1-1) Y2 = 3.26 - 0.013*X1 + 0.29*X2 - 0.24*X3 - 0.29*X4 (3.3.1-2) Y3 = 81.00 + 0.25*X1 - 0.25*X2 + 2.50*X3 + 0.00*X4 (3.3.1-3) gde vrednosti Y predstavljaju predviđene vrednosti za praćene odgovore: prinos (Y1), sadržaj vlage (Y2), i temperaturu izlaznog vazduha (Y3); a vrednosti X predstavljaju glavne efekte variranih promenljivih: brzine aspiratora (X1), brzine pumpe (X2), temperature ulaznog vazduha (X3), koncentracije rastvora (X4). 54 Tabela 3.3.1-1. Nezavisne procesne promenljive u 24-1 frakcionom faktorijalnom dizajnu (kodirane i realne vrednosti) i dobijeni odgovori Br. probe X1 = Brzina aspiratora (%) kodirano realno X2 = Brzina pumpe (%) kodirano realno X3 = Temperatura ulaznog vazduha (˚C) kodirano realno X4 = Koncentracija rastvora (%) kodirano realno Odgovori Y1= Prinos (%) Y2= Sadržaj vlage (%) Y3= Temperatura izlaznog vezduha (˚C) 1 -1 80 -1 10 -1 170 -1 10 84.4 3.1 81 2 +1 100 -1 10 -1 170 +1 30 84.6 3.0 81 3 -1 80 +1 30 -1 170 +1 30 62.7 3.8 77 4 +1 100 +1 30 -1 170 -1 10 73.1 4.1 75 5 -1 80 -1 10 +1 190 +1 30 82.9 2.5 80 6 +1 100 -1 10 +1 190 -1 10 85.4 3.3 83 7 -1 80 +1 30 +1 190 -1 10 79.3 3.7 85 8 +1 100 +1 30 +1 190 +1 30 72.0 2.6 86 Vrednosti za brzinu aspiratora: 100% predstavlja maksimalni protok vazduha od 40 m3/h i 80% predstavlja protok vazduha od 32 m3/h. Vrednosti za brzinu pumpe: 10% odgovara protoku rastvora od oko 3 ml/min, i 30% odgovara protoku rastvora od oko 9 ml/min. 55 Dobijeni rezultati za 24-1 FFD pokazali su da samo za proizvodni prinos (Y1) postoji statistički značajan faktor, brzina pumpe (X2), gledajući izračunatu p-vrednost <0,05 (5% nivo značajnosti). Veća brzina pumpe je rezultovala smanjenim proizvodnim prinosom jer je uticala na razliku u temperaturi između ulaznog i izlaznog vazduha, odnosno pad temperature izlaznog vazduha je bio veći. Što je protok rastvora veći potrebno je više energije za sušenje kapi i ako rezultujuće čestice nisu dovoljno osušene, dolazi do lepljenja proizvoda na zidove u cilindru i smanjenja prinosa. Za odabrani faktorijalni dizajn i formulaciju, nisu pronađeni značajni modeli. Stoga su izračunati regresioni koeficijenti iskorišćeni da se na osnovu njihove apsolutne vrednosti eliminiše iz daljeg ispitivanja faktor sa najmanjim uticajem na praćene odgovore, a to je brzina aspiratora. Uticaj tri preostala procesna parametra (brzina pumpe, temperatura ulaznog vazduha i koncentracija rastvora) ispitivan je primenom CCD. 3.3.2. Metodologija površine odgovora (RSM) Primenom metodologije površine odgovora (RSM) izvršena je obrada rezultata svih 20 eksperimenata CCD dizajna (Tabela 3.3.2-1) i razvijeni su modeli RSM1 za praćene odgovore. Za većinu odgovora, interakcija između faktora nije bila statistički značajna za ispitivani sistem ispitivan pri nivou značajnosti 5%. S druge strane, neki autori su zaključili da kod sušenja raspršivanjem mnoge interakcije među procesnim parametrima mogu biti značajne za osobine praškova, kao što su veličina čestica i efikasnost separacije u kolektoru, odnosno proizvodni prinos (Chawla i autori, 1994; Tajber i autori, 2009). Polinom drugog reda je dobijen samo za sadržaj vlage, gde je interakcija između temperature ulaznog vazduha i koncentracije rastvora bila najznačajnija. Svi dobijeni RSM1 modeli su procenjeni kao značajni. Regresioni koeficijenti koji povezuju odgovore sa eksperimentalnim promenljivama i interakcijama su prikazani u Tabeli 3.3.2-2. Posmatranjem izračunatih p-vrednosti, identifikovani su najznačajniji parametri i detaljnije analizirani nakon sagledavanja rezultata primene obe razmatrane metodologije u modelovanju i karakterizaciji procesa. 56 Tabela 3.3.2-1. Nezavisne procesne promenljive u centralnom kompozitnom dizajnu (kodirane i realne vrednosti) i dobijeni odgovori Br. probe A = Brzina pumpe (%) kodirano realno B = Temperatura ulaznog vazduha (˚C) kodirano realno C = Koncentracija rastvora (%) kodirano realno Odgovori R1= Prinos (%) R2= Sadržaj vlage (%) R3= Srednja veličina čestica (µm) R4= Temperatura izlaznog vazduha (˚C) 1 -1.68 3.18 0 180 0 20 87.3 3.0 4.94 105 2 +1 30 +1 190 -1 10 74.7 3. 6 4.52 90 3 0 20 0 180 0 20 74.2 3.2 5.16 90 4 -1 10 +1 190 +1 30 83.3 2.3 5.64 106 5 +1.68 36.82 0 180 0 20 63.8 3.3 6.30 82 6 0 20 0 180 0 20 81.2 3.2 5.21 94 7 0 20 0 180 +1.68 36.82 72.7 2.9 6.25 89 8 0 20 0 180 0 20 79.0 3.1 6.14 95 9 0 20 0 180 0 20 79.5 3.1 5.87 95 10 0 20 -1.68 163.18 0 20 81.2 3.3 5.18 78 11 -1 10 +1 190 -1 10 80.0 2.7 3.92 104 12 0 20 0 180 0 20 77.2 3.2 5.38 89 13 -1 10 -1 170 -1 10 85.0 2.6 3.72 97 14 +1 30 -1 170 -1 10 72.0 2.9 5.43 79 15 0 20 0 180 0 20 79.4 2.9 4.35 94 16 -1 10 -1 170 +1 30 82.6 2.8 6.89 101 17 0 20 +1.68 196.82 0 20 79.6 2.7 5.67 103 18 0 20 0 180 -1.68 3.18 78.3 2.8 2.67 95 19 +1 30 +1 190 +1 30 65.9 2.4 5.77 96 20 +1 30 -1 170 +1 30 67.3 2.8 7.28 85 Vrednosti za brzinu pumpe: 3.18% odgovara protoku rastvora od oko 1 ml/min, 10% odgovara protoku rastvora od oko 3 ml/min, 20% odgovara protoku rastvora od oko 6 ml/min, 30% odgovara protoku rastvora od oko 9 ml/min i 36.82% odgovara protoku rastvora od oko 11 ml/min. 57 Tabela 3.3.2-2. Regresioni koeficijenti koje povezuju parametre sušenja raspršivanjem (kodirani faktori) sa odgovorima R1 / Prinos R2 / Sadržaj vlage R3 / Srednja veličina čestica R4 / Temperatura izlaznog vazduha F-vrednost (p-vrednost) F-vrednost (p-vrednost) F-vrednost (p-vrednost) F-vrednost (p-vrednost) Model 77.21 28.52 3.03 3.43 5.31 21.03 93.35 33.31 A / Brzina pumpe -6.63 80.45 (< 0.0001) +0.13 3.81 (0.0710) +0.37 4.95 (0.0399) -7.08 61.48 (< 0.0001) B / Temperatura ulaznog vazduha -0.42 0.31 (0.5806) -0.081 1.44 (0.2498) / / +5.57 38.04 (< 0.0001) C / Koncentracija rastvora -1.61 4.76 (0.0444) -0.098 2.07 (0.1714) +1.03 37.11 (< 0.0001) +0.58 0.41 (0.5303) BC / Interakcija između faktora B i C / -0.21 5.78 (0.0306) / / C2 / Kvadratni efekat faktora C / -0.13 4.05 (0.0636) / / Lack of fit (neusklađenost) 1.38 (0.379) 6.55 (0.020) 0.98 (0.547) 1.86 (0.253) R2 0.842 0.550 0.712 0.862 R2 – koeficijent korelacije 58 3.3.3. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona (MLP) je odabrana u cilju razvoja modela MLP1 korišćenjem podataka iz svih 20 eksperimenata CCD dizajna za unos vrednosti ulaza i izlaza (Tabela 3.3.2-1). Podešavanje parametara neuronske mreže je podrazumevalo definisanje broja skrivenih slojeva i neurona, tipa aktivacione funkcije, brzine učenja, momentuma, i broja kombinacija. U aktivaciji neurona korišćena je hiperbolična tangens sigmoidna transfer funkcija. Za krosvalidaciju mreže korišćeno je 15% podataka, i dodatni set podataka je korišćen za testiranje mreže. Period učenja je bio završen kada je dostignuta najmanja RMSE: RMSE=[Σ(yi p – yi m)2/n]1/2 (3.3.3-1) gde je RMSE koren srednje vrednosti kvadrata greške, yp je predviđeni odgovor, ym je odgovor dobijen u eksperimentu, i n je broj eksperimenata, podataka za treniranje MLP (Bishop, 1995). Kada je proces treniranja završen, MLP mreža je testirana sa test podacima. Test uzorak je pripremljen kako bi se proverila sposobnost mreže za predviđanje, koristeći brzinu pumpe 6 %, temperaturu ulaznog vazduha 175°C, koncentraciju rastvora 15 %. Odabrana struktura MLP (Slika 3.3.2-1) je imala tri sloja: prvi sloj sa tri ulazne jedinice, drugi sloj sa tri skrivene jedinice, i treći sloj sa 4 izlazne jedinice. Struktura i optimalne vrednosti za treniranje MLP mreže su bili sledeći: brzina učenja 0.6, momentum 0.3, RMSE treniranja 0.15, RMSE krosvalidacije 0.24, broj epoha 10,000. ulazi izlazi skriveni sloj Slika 3.3.3-1. Struktura mreže tipa višeslojnog perceptrona (MLP). 59 Performanse modela veštačke neuronske mreže procenjene su preko RMSE i koeficijenta korelacije R2 između eksperimentalnih i predviđenih vrednosti. Poređenje sposobnosti predviđanja odgovora korišćenjem modela RSM1 (modeli dobijeni metodologijom površine odgovora) i MLP1 (model dobijen primenom veštačke neuronske mreže tipa višeslojnog perceptrona) predstavljeno je u Tabeli 3.3.3-1. i na korelacionim graficima (eksperimentalno dobijene naspram predviđenih vrednosti; Slika 3.3.3-2). Na osnovu prikazanih rezultata MLP1 ima bolju sposobnost predviđanja odgovora u poređenju sa RSM1 modelima. Površine odgovora, kreirane korišćenjem MLP1, predstavljene su na Slici 3.3.3-3. One pomažu u vizuelizaciji modela. Brzina pumpe je imala najveći uticaj na proizvodni prinos (Slika 3.3.3-3a). Veća vrednost brzine pumpe imala je negativan uticaj na prinos, zato što je uzrokovala smanjenje temperature izlaznog vazduha, i toplotna energija obezbeđena kroz temperaturu ulaznog vazduha nije bila dovoljna za potpuno sušenje. Zbog lepljenja u komori za sušenje, prinos je bio snižen i sadržaj vlage je bio povišen. Slično je primećeno i u nekim drugim studijama (Billon i autori, 2000; Tajber i autori, 2009). Za sadržaj vlage, interakcija između brzine pumpe i koncentracije rastvora se pokazala kao značajna. Koncentrovaniji rastvori sa većom temperaturom ulaznog vazduha rezultovali su uzorcima sa nižim sadržajem vlage. Slično je primećeno od strane autora Goula i Adamopoulos (2004) koji su to objasnili kao posledicu uticaja povećanja sadržaja čvrstih supstanci na formiranje suve površine. Rezultati za sadržaj vlage su prikazani u Tabelama 3.3.2-1 i 3.3.3-1 i izraženi su kao srednje vrednosti najmanje dva merenja, sa standardnom devijacijom u opsegu 0.01–0.18% (u proseku 0.07%). Efekat temperature ulaznog vazduha nije bio značajan za proizvodni prinos, što se podudara sa zaključcima autora Tajber i autora (2009). Koncentracija rastvora je imala negativan uticaj na proizvodni prinos. Mnogi autori su pronašli da koncentracija medijuma za raspršivanje ima pre svega pozitivan uticaj na prinos u procesu sušenja raspršivanjem (Billon i autori, 2000; Chawla i autori, 1994; Prinn i autori, 2002). Pri višim temperaturama i većim koncentracijama medijuma, potpunije sušenje sprečava lepljenje proizvoda i dešava se bolja ciklonska separacija (Billon i autori, 2000). Takođe, koncentrovaniji rastvori obezbeđuju krupnije čestice koje se bolje odvajaju u ciklonskom separatoru (Prinn i autori, 2002). 60 Tabela 3.3.3-1. Poređenje sposobnosti predviđanja RSM1 i MLP1 za modelovane odgovore Parametri Prinos (%) Sadržaj vlage (%) Srednja veličina čestica (µm) Temperatura izlaznog vazduha (oC) RSM1 MLP1 RSM1 MLP1 RSM1 MLP1 RSM1 MLP1 RSME 2.44 1.98 0.347 0.190 0.573 0.528 2.98 2.13 R2 0.842 0.898 0.550 0.642 0.712 0.779 0.862 0.933 Test uzorak Predviđene vrednosti 84.21 85.43 2.64 2.74 4.43 4.76 101 103.2 Test uzorak Eksperimentalno dobijena vrednost 86.7 Eksperimentalno dobijena vrednost 2.88 Eksperimentalno dobijena vrednost 4.98 Eksperimentalno dobijena vrednost 104 RSME - koren kvadrata srednje vrednosti greške R2 - koeficijent korelacije RSM1 – Modeli dobijeni primenom metodologije površine odgovora (RSM) MLP1– Modeli dobijeni primenom neuronske mreža tipa višeslojnog perceptrona (MLP) 61 (a) (b) (c) (d) Slika 3.3.3-2. Poređenje eksperimentalnih i predviđenih podataka pomoću MLP1 i RSM1 modela za sledeće odgovore: prinos (a), sadržaj vlage (b), srednja veličina čestica (c) i temperatura izlaznog vazduha (d). 60 65 70 75 5 85 90 95 100 60 65 70 75 80 85 90 95 100 eksperimentalni podaci p r e d v i đ e n i p o d a c i MLP RSM 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 eksperimentalni podaci p r e d v i đ e n i p o d a c i i MLP RSM 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 eksperimentalni podaci p r e d v i đ e n i p o d a c i MLP RSM 80 85 90 95 100 105 80 85 90 95 100 105 eksperimentalni podaci p r e d v i đ e n i p o d a c i MLP RSM 62 (a) p r i n o s ( % ) (b) (c) s r e d n j a v e l i č i n a č e s t i c a ( μ m ) (d) t e m p e r a t u r a i z l a z n o g v a z d u h a ( ° C ) Slika 3.3.3-3. Grafici površine odgovora koji pokazuju efekte dva glavna parametra od najvećeg uticaja na dati odgovor. Ostali parametri su na nivoima koji obezbeđuju maksimalni odgovor: prinos (a), sadržaj vlage (b), srednja veličina čestica (c) i temperatura izlaznog vazduha (d). 63 Sa druge strane, Elversson i autori (2003) su uočili niže prinose pri većim koncentracijama medijuma što se može objasniti time da povećan sadržaj čvrstih supstanci u medijumu može da poveća sklonost kapi da koalesciraju po sudaru jedna sa drugom ili sa zidom, zbog veće sile udara. Goula i Adamopoulos (2004) su uočili da veće koncentracije suvih supstanci uzrokuju smanjenje čvrste mase koja se kreće zajedno sa izlaznim vazduhom zbog uticaja na veličinu čestica. Veća koncentracija uzrokuje i nešto veće viskozitete, povećava veličinu kapi a time i veličinu čestica. Temperatura izlaznog vazduha je najviše pod uticajem podešavanja pumpe, kao što je i očekivano. Što je veća brzina pumpe, više tečnosti se dovodi do komore za sušenje i stvara se veća količina pare rastvarača, što dovodi do pada izlazne temperature (Slika 3.3.3-3d). Ovi zaključci su u skladu i sa radom Tajber i drugih autora (2009). Veličina čestica je dodatno praćena kako bi se proverilo koji se opseg veličine čestica može dobiti na korišćenom uređaju za sušenje raspršivanjem. Dobijene vrednosti za veličinu čestica prikazane su u Tabelama 3.3.2-1. i 3.3.3-1. i izražene su kao srednje vrednosti najmanje dva merenja, sa prosečnom standardnom devijacijom 0.13 µm. Osim brzine atomizacije koja je održavana konstantnom, koncentracija rastvora i brzina pumpe bili su parametri sa najvećim potencijalom za uticaj na veličinu čestica. Pronađeno je da najrazblaženiji rastvori rezultuju najsitnijim česticama, i da brzina pumpe negativno utiče na veličinu čestica (Slika 3.3.3-3c). Kao što je opisano u nekim drugim studijama, kada je koncentracija medijuma niska, formiraju se sitne čestice zato što je količina čvrstih supstanci po kapi koja izlazi iz raspršivača smanjena, tako da po isparavanju vode iz kapi, ostaje sitna čestica (Chawla i autori 1994; Corrigan i autori, 2006; Gonnissen i autori, 2008; Elversson i autori, 2003; Prinn i autori, 2002; Tajber i autori, 2009). Takođe, veličina kapi obično raste sa porastom koncentracije medijuma ili viskoziteta, i energija dostupna za atomizaciju opada. Na taj način, efekat koncentracije medijuma na veličinu osušene čestice potiče od efekta na veličinu kapi (Goula i Adamopoulos, 2004). Sa druge strane, pri konstantnoj atomizaciji, prilikom povećanja brzine pumpe, nema dovoljno energije za atomizaciju rastvora povećanog protoka i formiraju se krupnije kapi, što rezultuje krupnijim česticama. Ovo je primećeno kako u ovoj tako i u nekim drugim studijama (Chegini i Ghobadian, 2005; Tajber i autori, 2009; Gonnissen i autori, 2008). 64 Vizuelizacija čestica je vršena pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije. Fotomikrografije čestica osušenih raspršivanjem su predstavljene na Slici 3.3.3-4. Primećuje se da su dobijene čestice sfernog oblika i glatke površine. Ovo je uobičajeno za sušenje raspršivanjem rastvora gde su sve komponente dobro rastvorljive i povlače se kontinuirano kako se kap suši, rezultujući glatkim, sfernim česticama. Primećeno je i prisustvo šupljih čestica. Šuplja unutrašnjost može nastati zbog širenja gasa u kapima sa formirajućim filmom (ljuskom) koji teško propušta paru, ili zbog vazduha zarobljenog u tečnosti. Filmovi koji nastaju na površini kapi tokom sušenja i formiranja čestica sačinjeni od hidrofilnih materijala kao što je laktoza, imaju sposobnost propuštanja vode, pa je moguće da se tokom isparavanja vode formira negativan pritisak. (a) (b) Slika 3.3.3-4. Sferne čestice osušene raspršivanjem rastvora naratriptan hidrohlorida, laktoze i maltodekstrina pri uvećanju 1000 puta (a) i 3000 puta (b). Zapaža se i da su neke čestice smežurane. Pošto je kinetika formiranja čestica kontrolisana brzinom isparavanja i u vezi sa porastom viskoziteta kapi, tokom sušenja su kapi/čestice izložene stresnijim uslovima koji utiču na formiranje površine i kontrolišu morfologiju dobijenih čestica. Smatra se da su čestice nastale pri većim brzinama sušenja smežuranije usled kolapsa koji im se dešava, dok su čestice nastale pri manjim brzinama sušenja sfernijeg oblika. Proces transformacije kap-čestica vrlo je složen i zavisi od međusobne povezanosti procesnih promenljivih i fizičkohemijskih osobina formulacije (Snyder i Lechuga-Ballesteros, 2008). Uslovi sušenja kojima su izložene pojedinačne kapi može značajno da varira, tako da se može desiti da su 65 prisutne čestice koje su smežurane i šuplje, nastale usled izloženosti većim brzinama sušenja. Fotomikrografija skenirajuće elektronske mikroskopije smeše praškova korišćene za pripremu rastvora za sušenje raspršivanjem (Slika 3.3.3-5a), pokazuje nasumični raspored igličastih kristala naratriptan hidrohlorida u smeši u kojoj dominiraju čestice laktoze i maltodekstrina, i ukazuju da postoji potencijal za lošu homogenost neprocesiranog praška. (a) (b) Slika3.3.3-5. Smeša praškova naratriptan hidrohlorida, laktoze i maltodekstrina pre rastvaranja i sušenja raspršivanjem pri uvećanju 1000 puta (a) i 5000 puta (b). 3.3.4. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža (MLP) i metodologije površine odgovora (RSM) 3.3.4.1. Primena MLP u dopunjavanju podataka u setu definisanom eksperimentalnim dizajnom neophodnim za primenu RSM Upotreba MLP mreže (MLP2 model) u dopunjavanju jednog dela podataka u sklopu seta definisanog eksperimentalnim dizajnom dala je zadovoljavajuće rezultate za neke odgovore (prinos, temperatura izlaznog vazduha), uzimajući u obzir broj eksperimentalnih podataka koji su korišćeni za modelovanje (Tabela 3.3.4-1, Slika 3.3.4-1). Ova ideja može biti korisna u karakterizaciji sušenja raspršivanjem i modelovanju, jer može da omogući smanjenje broja izvedenih eksperimenata. Međutim, mreža koja se koristi u ove svrhe morala bi da bude dovoljno robusna. Ipak, model sa 66 najboljom sposobnošću predviđanja bio je MLP1 model, dobijen iz veće grupe podataka (Tabela 3.3.4-1). Tabela 3.3.4-1. Koeficijenti korelacije (R2) za eksperimentalne i predviđene podatke za različite modele Izlaz RSM1 MLP1 MLP2 RSM2 Prinos 0.842 0.898 0.790 0.828 Sadržaj vlage 0.550 0.642 0.328 0.368 Temperatura izlaznog vazduha 0.862 0.933 0.776 0.786 (a) 60 70 80 90 100 60 70 80 90 100 pr e dv iđ e n i p o da c i eksperimentalni podaci MLP1 MLP2 RSM1 RSM2 (b) 2 2.5 3 3.5 4 2 2.5 3 3.5 4 pr e d v iđ e n i p o da c i eksperimentalni podaci MLP1 MLP2 RSM1 RSM2 (c) 80 85 90 95 100 105 110 80 85 90 95 100 105 110 pr e d v iđ e n i p o d a c i eksperimentalni podaci MLP1 MLP2 RSM1 RSM2 Slika 3.3.4-1. Poređenje eksperimentalnih i predviđenih podataka dobijenih pomoću različitih modela, za odgovore: prinos (a), sadržaj vlage (b), temperaturu izlaznog vazduha (c) 67 3.3.4.2. Primena RSM u dobijanju matematičkih modela korišćenjem predviđanja MLP mreže u cilju boljeg razumevanja procesa Predviđeni rezultati MLP1 modela (najbolji R2) obrađeni su primenom RSM i dobijene matematičke jednačine su analizirane (RSM3 modeli) kako bi se videle sličnosti i razlike sa jednačinama RSM1 modela (Tabela 3.3.4-2). Primećeno je da modeli RSM3 koji su dobijeni na osnovu predviđanja MLP1 imaju veće vrednosti R2 u poređenju sa modelima RSM1 (Tabele 3.3.4-1 i 3.3.4-2.). Modeli predstavljeni u Tabeli 3.3.4-2 pokazuju da su veze između faktora i odgovora mnogo složenije nego što pokazuju modeli RSM1, što bi moglo biti razlog za bolju sposobnost predviđanja modela MLP1. Slično kao kod modela RSM1, generisane su kvadratna i linearna jednačina za sadržaj vlage i temperaturu izlaznog vazduha, redom. Takođe, izračunati koeficijenti parametara bili su vrlo slični (Tabela 3.3.2-2. i 3.3.4-2). Tabela 3.3.4-2. Regresioni koeficijenti koje povezuju parametre sušenja raspršivanjem sa odgovorima – RSM3 modeli dobijeni korišćenjem samo predviđenih vrednosti Ulaz R1 (p) R2 (p) R3 (p) A -6.21 (<0.05) +0.20 (<0.05) -7.35 (<0.05) B - -0.12 (<0.05) +5.17 (<0.05) C -2.18 (<0.05) -0.12 (<0.05) +0.14 (0.834) AB +0.56 (<0.05) - - BC - -0.12 (<0.05) - AC -1.04 (<0.05) -0.06 (<0.05) - A2 -0.87 (<0.05) -0.11 (<0.05) - B2 - -0.07 (<0.05) - C2 -0.39 (<0.05) -0.17 (<0.05) - R2 0.994 0.961 0.916 A – brzina pumpe; B – temperatura ulaznog vazduha; C – koncentracija rastvora; R1 – prinos; R2 – sadržaj vlage; R3 – temperatura izlaznog vazduha, R2 – koeficijent korelacije. Opšti zaključak bi bio da se bolja predviđanja obično dobijaju primenom MLP modela. Iako matematički modeli (u ovoj studiji dobijeni primenom RSM) ne daju podjednako dobro predviđanje vrednosti, analizom matematičkih jednačina mogu se dobiti korisne informacije o načinu i značaju uticaja ispitivanih faktora koje mogu pomoći u 68 poboljšanju razumevanja sušenja raspršivanjem. Kombinovanom primenom objedinjuju se prednosti obe metodologije. 3.3.5. Optimizacija sušenja raspršivanjem Nakon izvršene analize pomoću softvera Design-Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, SAD) primenom pristupa poželjnosti (engl. Desirability approach) (Nekkanti i autori, 2009) izvršena je numerička optimizacija procesnih parametara za rastvor koncentracije 25 %, sa zahtevima za postizanje što većeg prinosa i što manjeg sadržaja vlage u prašku. Korišćeni su modeli RSM1 i modeli RSM3 dobijeni obradom vrednosti predviđenih pomoću MLP1, i dobijene su slične vrednosti optimalnih parametara. Izveden je eksperiment pod definisanim procesnim parametrima, i dobijeni su rezultati slični predviđenim vrednostima (Tabela 3.3.5-1). Tabela 3.3.5-1. Optimizacija procesnih parametara Rešenja Eksperiment Zahtevi za parametar Cilj RSM1 RSM3 (MLP1) Brzina pumpe U opsegu 10 % 10 % 10 % Temperatura ulaznog vazduha U opsegu 190°C 188°C 190°C Koncentracija rastvora 25 % 25 % 25 % 25 % Prinos Maksimalni 82.62 % 82.41 % 85.76 % Gubitak sušenjem Minimalni 2.57% 2.65% 2.50 % Temperatura izlaznog vazduha U opsegu 104.6 °C 104.6 °C 102°C Poželjnost 0.860 0.844 3.3.6. Karakterizacija dobijenih praškova Nakon izvršene optimizacije sušenja raspršivanjem odabrane formulacije izvršena je karakterizacija dobijenog praška. 69 3.3.6.1. Ujednačenost sadržaja naratriptan hidrohlorida Rezultati analize ujednačenosti sadržaja naratriptan hidrohlorida pokazuju da je dobijen prašak vrlo ujednačenog sastava (RSD=0.23%˂˂5%), u skladu sa očekivanjima (Slika 3.3.6-1.). 80 90 100 110 120 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S a d rž a j n a ra tr ip ta n a u o d n o su n a d e k la ri sa n u v re d n o st (% ) Uzorak Rezultati Cilj Granice specifikacije Slika 3.3.6-1. Rezultati analize ujednačenosti sadržaja naratriptan hidrohlorida u prašku dobijenom sušenjem raspršivanjem 3.3.6.2. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Primenom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije izvršena je termička karakterizacija uzoraka dobijenih sušenjem raspršivanjem u poređenju sa polaznim materijalima i njihovim fizičkim smešama (Slika 3.3.6-2.). Termogrami uzoraka osušenih raspršivanjem, zbog odsustva pikova karakterističnih za sastojke formulacije, ukazuju da je tokom procesa formirana amorfna struktura uzorka. Iz termograma izostaje očekivana rekristalizacija amorfne laktoze, verovatno usled stabilišućeg efekta maltodekstrina koji se molekularno dispergovao u amorfnoj laktozi tokom procesa sušenja raspršivanjem, tako da je stupio u interakciju sa molekulima laktoze gradeći međumolekulske vodonične veze (Takeuchi i autori, 1998). Istog izgleda je i termogram dobijen analizom uzorka dobijenog sušenjem raspršivanjem skladištenog u staklenoj bočici na sobnoj temperaturi 12 meseci, što može ukazivati na dobru fizičku stabilnost formulacije. 70 Slika 3.3.6-2. Reprezentativni DSC termogrami uzoraka: naratriptan hidrohlorid (a), laktoza monohidrat (b), maltodekstrin (c), fizička smeša naratriptan hidrohlorida, laktoze monohidrat i maltodekstrina dobijena mešanjem u kesi (d), uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora, inicijalno (e), uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora, nakon godinu dana stajanja (f) i fizička smeša naratriptan hidrohlorida, laktoze monohidrat i maltodekstrina dobijena mešanjem pomoću tarionika i pistila (g). Na termogramu fizičke smeše sastojaka formulacije, jasno se uočavaju pikovi karakteristični za α-laktozu monohidrat, gde prvi endotermni pik na temperaturi oko 150°C odgovara procesu dehidratacije (gubitak vezane, kristalne vode), a drugi endotermni pik oko 210°C odgovara topljenju uz raspadanje. Treći pik koji se javlja na temperaturi oko 175°C, mogao bi se pripisati anomerizaciji α-laktoze u β-laktozu, koja se dešava ukoliko je u uzorku preostala dovoljna količina vode posle dehidratacije na 150°C (Listiohadi i autori, 2009). Slični pikovi se uočavaju na termogramu same laktoze monohidrat, gde se do temperature 130°C posebno uočava i gubitak slobodne, površinske vode (Listiohadi i autori, 2009). Smeša dobijena mešanjem pistilom u tarioniku takođe pokazuje dva karakteristična pika laktoze monohidrat na oko 150°C i 210°C. Međutim, treći pik koji se vidi u fizičkoj smeši dobijenoj prostim mešanjem u kesi ovde je vrlo slabo uočljiv, što znači da je verovatno mešanjem pistilom uzrokovana neka vrsta promene kristalne strukture laktoze i dinamike gubitka hidratisane vode. Karakteristični pik naratriptan hidrohlorida se ne uočava u fizičkoj smeši verovatno zbog toga što je prisutan u niskoj koncentraciji i zbog teškoće da se uniformno umeša 71 uzorak, tako da se lek nađe u dovoljnoj količini u uzorku od 2-5 mg smeše da bi bio detektovan DSC metodom. Tokom sušenja raspršivanjem veće količine rastvora, u kolektoru koji je odmah ispod komore za sušenje, primećeno je izdvajanje male količina praška. Nakon analize DSC termograma ovog uzorka (Slika 3.3.6-3), prepoznato je prisustvo anhidrovane α-laktoze zahvaljujući odsustvu pika koji odgovara dehidrataciji na oko 150°C i prisustvu pika koji odgovara topljenju na oko 210°C (Listiohadi i autori, 2009). Slika 3.3.6-3. Reprezentativni DSC termogrami uzoraka: uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora iz kolektora ispod komore za sušenje (a), uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora iz kolektora ispod ciklonskog separatora (b), fizička smeša naratriptan hidrohlorida, laktoze monohidrat i maltodekstrina dobijena mešanjem u kesi (c). Može se reći da se u ovom slučaju struktura praška prikupljenog u kolektoru ispod komore za sušenje razlikuje od strukture u prašku izdvojenom u kolektoru ispod ciklonskog separatora (gde nije uočeno prisustvo pikova i pretpostavljena je amorfna priroda uzorka), i odlučeno je da se ova manja količina praška ne pripoji prašku iz ciklonskog separatora. Moguć razlog ovoj pojavi mogla bi biti razlika u putanjama kretanja i dužini zadržavanja tokom sušenja određene frakcije kapi/čestica tako da je proces sušenja trajao nešto duže i da je umesto stvaranja amorfne strukture makar delimično došlo do stvaranja kristalne bezvodne α-laktoze, odnosno u toj meri da se 72 može detektovati DSC metodom. Tome doprinosi i kompleksnost ponašanja laktoze u smislu broja faznih promena kroz koje može proći tokom procesiranja, o čemu svedoče brojni radovi (Chidavaenzi i autori, 1997; Kirk i autori, 2007; Listiohadi i autori, 2009; Takeuchi i autori, 1998). 3.3.6.3. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) FTIR spektri dobijeni analizom različitih uzoraka prikazani su na Slici 3.3.6-4. Karakteristični pikovi FTIR spektra naratriptan hidrohlorida potiču od vibracije istezanja N-H veze na oko 3220cm-1, zatim vibracije istezanja alifatične C-H veze na oko 2964cm-1, vibracije istezanja N+-H veze na oko 2685cm-1, vibracije savijanja alifatične C-H veze na oko 1474cm-1, vibracije istezanja C-N veze na oko 1314cm-1, vibracije istezanja S=O veze na oko 1152cm-1, vibracije savijanja aromatične C-H veze na oko 856cm-1 i vibracije istezanja C-S veze na oko 637cm-1. Međutim, pikovi naratriptana su teško uočljivi u spektru fizičke smeše, možda zbog problema sa uniformnošću uzorka ili su maskirani pikovima laktoze koja dominira u formulaciji. FTIR spektri laktoze i maltodekstrina su slični u oblasti oko 3000-3500cm-1, jer poseduju široku traku koja potiče od vibracije istezanja O-H veze, i u oblasti oko 1000cm-1, zbog postojanja vibracije istezanja C-O veze (Cilurzo i autori, 2008). U spektru laktoze monohidrat, i u fizičkoj smeši, primetne su trake na oko 3524cm-1 koja potiče od slobodnih O-H vibracija slobodnih molekula vode. Široka vibracija koja se dešava oko 3300cm-1 odgovara intramolekulskom istezanju O-H veza. Regija ispod 1500cm-1 je regija otiska prsta i trake iz ovog dela spektra je teško pripisivati, ali su karakteristične za uzorak. U oblasti nižih talasnih brojeva (915-976cm-1) nalazi se relativno dobra dijagnostička regija po pitanju prisustva tipa polimorfnih oblika laktoze jer različito izgleda u zavisnosti od polimorfa (Kirk i autori, 2007). Ova regija se vezuje uglavnom za istezanje i uvrtanje C-H veza koje su van prstena. Kod laktoze monohidrat kakva postoji i u fizičkoj smeši, karakterističan pik se nalazi na oko 915cm-1, ali on izostaje kod amorfne laktoze, što potvrđuje da je u uzorku dobijenom sušenjem raspršivanjem laktoza prisutna u amorfnom obliku jer ovog pika nema. 73 Slika 3.3.6-4. Reprezentativni ATR-FTIR spektri uzoraka: naratriptan hidrohlorid (a), laktoza monohidrat (b), maltodekstrin (c), fizička smeša naratriptan hidrohlorida, laktoze monohidrat i maltodekstrina dobijena mešanjem u kesi (d), uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora, inicijalno (e) i uzorak dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora, nakon godinu dana stajanja (f). U spektrima uzoraka dobijenih sušenjem raspršivanjem, zapaža se pomeranje pika koji se pripisuje C-O vezi ka višim talasnim brojevima, što može ukazivati na formiranje vodoničnih veza između C-O grupa i O-H grupa u koprocesiranom prašku (Cilurzo i autori, 2008). Takođe, ovi spektri potvrđuju prisustvo isključivo amorfnog materijala jer se razlikuje od spektra sa kristalnim materijalom po broju pikova i po tome što su pikovi slabije definisani (Listiohadi i autori, 2009). Spektri ostaju nepromenjeni i kod uzoraka skladištenih 12 meseci na sobnoj temperaturi ukazujući na potencijalno dobru fizičku stabilnost formulacije. 3.3.6.4. Nasipna i tapkana gustina praškova Zbog male veličine čestica (srednja veličina čestica 5-6 µm), koja je karakteristična za uzorke dobijene sušenjem raspršivanjem rastvora na laboratorijskom uređaju (koji ima malu komoru za sušenje i kapi moraju biti sitne kako bi se obezbedilo dobro sušenje i izdvajanje proizvoda), dobijeni prašak je vrlo kohezivan i voluminozan. Dobijene 74 vrednosti za nasipnu gustinu su bile 0.29 g/ml, a za tapkanu gustinu 0.63 g/ml. Izračunavanjem odnosa tapkane i nasipne gustine dobijena je vrednost za Hausnerov odnos 2.17 > 1.60 što svrstava dobijeni prašak u vrlo, vrlo loše protočne praškove, što je očekivano s obzirom na veličinu čestica praška (‹1174› Powder Flow in USP 29–NF 24). 3.3.6.5. Protočnost praškova Zbog izražene voluminoznosti i kohezivnosti praška a samim tim i loše protočnosti dobijenih praškova, određivanje protočnosti merenjem protoka kroz otvor, moralo je biti vršeno sa najvećim promerom otvora na levku (12.5 mm), i uz korišćenje vibracije kako bi se podstakao protok praška. Protočnost je bila izražena kao vreme potrebno da određena količina praška (10 g) protekne kroz levak i dobijena je vrednost od 8.3 sec (standardna devijacija tri merenja 0.9 sec). Uređaj pruža mogućnost određivanja i nasipnog ugla α kao mere protočnosti i dobijena je vrednost od 50° (standardna devijacija tri merenja 1.7°). Vrednosti 46-55° svrstavaju prašak u grupu slabo protočnih praškova (‹1174› Powder Flow in USP 29–NF 24) kojima je potrebna agitacija, vibracija kako bi se održavao protok, što se u industriji obično smatra neprihvatljivim. Međutim, treba napomenuti da se na laboratorijskom uređaju za raspršivanje prilikom sušenja rastvora uvek dobijaju vrlo sitne čestice, koje se inače karakterišu lošom protočnošću, dok se u pilot i industrijskim uređajima zbog veće komore za sušenje i mogućnosti da se ostvari dobro sušenje krupnijih kapi dobijaju krupnije sferne čestice tj. može se očekivati da bi se dobili znatno protočniji praškovi. 75 4. DRUGI DEO ISTRAŽIVANJA 4.1. UVOD U skladu sa principima dizajniranja kvaliteta u farmaceutskom razvoju proizvoda (QbD), na osnovu fizičkohemijskih karakteristika odabranih model lekovitih supstanci i karakteristika čvrstih farmaceutskih oblika sa trenutnim oslobađanjem leka, najpre je definisan ciljani profil kvaliteta praška kao međuproizvoda koji se može u daljim fazama razvoja koristiti u proizvodnji čvrstih doziranih oblika. Na osnovu ciljanog profila kvaliteta praška definisani su kritični atributi kvaliteta praška, i izvršena je analiza rizika u cilju definisanja potencijalno kritičnih formulacijskih i procesnih promenljivih za sušenje raspršivanjem vodenih rastvora kompleksa lekovite supstance i ciklodekstrina. 4.1.1. Fizičkohemijske karakteristike vorikonazola Vorikonazol je antifungalni lek novije generacije iz grupe triazola i koristi se u terapiji gljivičnih infekcija. Hemijska struktura leka prikazana je na Slici 4.1.1-1. Slika 4.1.1-1. Vorikonazol ((2R,3S)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(5-fluoro-4-pirimidinil)-1-(1H- 1,2,4-triazol-1-il)-2-butanol, molekulska formula C16H14F3N5O, Mr 349.3). Vorikonazol je beo do skoro beo kristalan prašak. Slaba je organska baza sa dve pKa vrednosti 4.98 i 12.0. Ima dva hiralna centra i farmakološki aktivan je 2R, 3S izomer 76 (Buchanan i autori, 2007). Nepolarna je lekovita supstanca sa logP vrednošću 2.561 (Spriet i autori, 2009). Vorikonazol ispoljava polimorfizam, a u ovom istraživanju koristi se vorikonazol kristalne forme I (Benito i autori, 2009). Bez obzira na polimorfni oblik, vorikonazol se smatra u vodi vrlo teško rastvornom supstancom. Lako je rastvoran u acetonu i metilen hloridu (Voriconazole monograph 2576, European pharmacopoeia 7.3). Jedna od važnijih karakteristika lekovite supstance je rastvorljivost u vodenim medijumima, jer ona može biti ograničavajući faktor u pripremi rastvora za raspršivanje, kao i faktor važan za oslobađanje iz lekovitog oblika. Rezultati rastvorljivosti vorikonazola u vodenim medijumima različitih pH vrednosti, dobijeni primenom standardne shake-flask (engl.) metode, prikazani su u Tabeli 4.1.1-1 (in- house metoda, Hemofarm a.d., Srbija). Na osnovu dobijenih rezultata vorikonazol se svrstava u grupu teško do vrlo teško rastvorljivih supstanci, prema definicijama rastvorljivosti iz Evropske farmakopeje. Tabela 4.1.1-1. Rastvorljivost vorikonazola u različitim vodenim medijumima Medijum Rastvorljivost (mg/ml) na 25°C na 37°C Prečišćena voda 0.57 0.78 0.1M hlorovodonična kiselina pH 1.2 2.87 3.35 Acetatni pufer pH 4.5 0.40 0.52 Fosfatni pufer pH 6.8 0.44 0.65 U kliničkim studijama sa vorikonazolom, ova lekovita supstanca se svrstava u BCS klasu 2, zbog niske rastvorljivosti i visoke permeabilnosti (FDA accessdata, Vfend). Studije forsirane degradacije ukazuju da je u pitanju relativno stabilna lekovita supstanca, termostabilna i fotostabilna, a kao put degradacije izdvaja se oksidacija (Voriconazole Drug Master File, Medichem Manufacturing Limited, Malta). 4.1.2. Fizičkohemijske karakteristike aripiprazola Aripiprazol je relativno nova lekovita supstanca koja pripada trećoj generaciji atipičnih antipsihotika i koristi se u terapiji šizofrenije. Hemijska struktura leka prikazana je na Slici 4.1.2-1. 77 Slika 4.1.2-1. Aripiprazol (7-[4-[4-(2, 3-dihlorofenil)-1-piperazinil] butoksi]-3, 4- dihidrokarbostiril, molekulska formula C23H27Cl2N3O2, Mr 448.39). Aripiprazol je beo do skoro beo kristalan prašak. Slaba je organska baza sa pKa vrednošću 7.6 (20% etanol, na 25°C). Particioni koeficijent (P(u/v)) kreće se od 3.4 pri pH 2.0 do >1000 pri pH 6.0 (Product information, Abilify tablets, Otsuka Pharmaceutical Co). Aripiprazol ispoljava polimorfizam, a u ovom istraživanju koristi se aripiprazol kristalne forme III (Braun i autori, 2009). Bez obzira na polimorfni oblik, aripiprazol se smatra u vodi gotovo nerastvornom supstancom. Rastvorljivost u vodenim medijumima je jedna od važnijih karakteristika lekovite supstance, jer ona može biti ograničavajući faktor u pripremi rastvora za raspršivanje, kao i faktor važan za oslobađanje iz lekovitog oblika. Rezultati rastvorljivosti aripiprazola u vodenim medijumima različitih pH vrednosti, dobijeni primenom standardne shake-flask (engl.) metode, prikazani su u Tabeli 4.1.2-1. (in-house metoda, Hemofarm a.d., Srbija). Tabela 4.1.2-1. Rastvorljivost aripiprazola u različitim vodenim medijumima Medijum Rastvorljivost (mg/ml) na 25°C na 37°C Prečišćena voda 0.001 0.001 0.1M hlorovodonična kiselina pH 1.2 0.14 0.20 Acetatni pufer pH 4.5 0.10 0.13 Fosfatni pufer pH 6.8 0.001 0.001 Fosfatni pufer pH 3.0- 0.86 0.98 Citratni pufer pH 3.0 0.22 0.38 Acetatni pufer pH 4.1 0.23 0.29 78 Na osnovu dobijenih rezultata aripiprazol se definiše kao vrlo teško rastvorljiva odnosno gotovo nerastvorljiva supstanca, prema definicijama rastvorljivosti iz Evropske farmakopeje. Prema studiji u kojoj je vršena procena rezultata rastvorljivosti, brzine rastvaranja i permeabilnosti, aripiprazol se svrstava u BCS klasu 4, zbog niske rastvorljivosti i permeabilnosti (FDA accessdata, Abilify). Studije forsirane degradacije ukazuju da je u pitanju relativno stabilna lekovita supstanca, termostabilna i fotostabilna, a kao put degradacije izdvaja se oksidacija (Aripiprazole Drug Master File, Neuland Laboratories, Indija). 4.1.3. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda (CPK) Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda (praška) sa odabranim model supstancama prikazan je u Tabeli 4.1.3-1. Tabela 4.1.3-1. Ciljani profil kvaliteta međuproizvoda Elementi kvaliteta Cilj Međuproizvod Prašak Put primene Oralni Profil oslobađanja leka Trenutno oslobađanje leka Koncentracija leka 5%1 Atributi kvaliteta Izgled Identifikacija Sadržaj Ujednačenost sadržaja Brzina rastvaranja Hemijska stabilnost Fizička stabilnost Rezidualni rastvarači Sadržaj vlage Mikrobiološka čistoća Specifikacije u skladu sa oficinalnim ili drugim standardima kvaliteta koje potvrđuju bezbednost i efikasnost tokom roka trajanja leka 1Terapijska oralna doza aripiprazola kreće se od 2 mg do 30 mg, a za vorikonazol je 50 mg ili 200 mg; za potrebe istraživanja kao ciljna koncentracija leka u prašku kao međuproizvodu, formulisanom sa ciklodekstrinom, definisana je koncentracija 5%. 79 4.1.4. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (KAK) Kada su u pitanju teško rastvorljive lekovite supstance kao što su vorikonazol i aripiprazol, postizanje trenutnog oslobađanja leka iz lekovitog oblika moglo bi biti poseban izazov. Imajući to u vidu, kao i karakteristike odabranih model supstanci, kao potencijalno pogodan proces izrade praška odabrana je tehologija sušenja raspršivanjem vodenog rastvora kompleksa lekovite supstance i ciklodekstrina. U odnosu na tu polaznu osnovu, kao i uzimajući u obzir ciljani profil definisani su kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (praška dobijenog sušenjem raspršivanjem) (Tabela 4.1.4-1). Kao kritični atribut kvaliteta međuproizvoda posebno se izdvaja brzina rastvaranja lekovite supstance. Kritični atributi kvaliteta svakako bi bili i odgovarajuća hemijska stabilnost i ujednačenost sadržaja. Pošto je odabrana tehnologija sušenja raspršivanjem rastvora koja se smatra pogodnom za dobijanje praškova homogenog sastava, fokus se trenutno ne usmerava na ovaj atribut. S druge strane, pošto bi se u fazi proizvodnje praškova sušenjem raspršivanjem, podešavanjem procesnih parametara moglo uticati na sadržaj vlage u praškovima i sa tog aspekta potencijalno na stabilnost, kao kritični atribut kvaliteta proizvoda izdvaja se i sadržaj vlage u dobijenim praškovima. 4.1.5. Definisanje potencijalno kritičnih atributa kvaliteta polaznih materijala i procesnih parametara 4.1.5.1. Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance Na osnovu fizičkohemijskih i bioloških osobina lekovitih supstanci, i u odnosu na odabranu tehnologiju izrade (sušenje raspršivanjem rastvora kompleksa lek:ciklodekstrin), izvršena je analiza rizika atributa lekovite supstance po kritične atribute kvaliteta međuproizvoda. U analizi rizika korišćena je tehnika Preliminarne analize opasnosti (engl. Preliminary Hazard Analysis – PHA) (Rausand, 2005; Sakura tablet case study, NIHS, 2008). 80 Tabela 4.1.4-1. Kritični atributi kvaliteta međuproizvoda (KAK) Atributi kvaliteta Cilj Kritičnost Opravdanost Izgled Homogeni izgled Ne Izgled nije direktno povezan sa bezbednošću i efikasnošću. Identifikacija Pozitivna na lekovitu supstancu Da1 Iako je identifikcija kritična za bezbednost i efikasnost, ovaj atribut se može efikasno kontrolisati i pratio bi se tokom puštanja leka u promet. Sadržaj 95-105% od deklarisane vrednosti Da Varijabilnost sadržaja utiče na bezbedost i efikasnost. Procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Ujednačenost sadržaja 90-110%, RSD ≤5% Da Varijabilnost u ujednačenosti sadržaja utiče na bezbednost i efikasnost. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Brzina rastvaranja Ne manje od 80% od deklarisane vrednosti za 45 minuta Da Neusaglašenost sa specifikacijom za brzinu rastvaranja može da utiče na bioraspoloživost. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Hemijska stabilnost Profil nečistoća u skladu sa oficinalnim zahtevima/ICH smernicama i u skladu sa profilom nečistoća referentnog proizvoda. Da Degradacioni proizvodi mogu da utiču na bezbednost i efikasnost i moraju biti kontrolisani. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Fizička stabilnost Što manja promena tokom vremena Da Fizička stabilnost može uticati na kvalitet i mora biti kontrolisana. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Rezidualni rastvarači Profil rezidualnih rastvarača u skladu sa oficinalnim zahtevima/ICH smernicama Da1 Rezidualni rastvarači mogu uticati na bezbednost. U proizvodnji se ne bi koristili organski rastvarači. Sadržaj vlage Pratiti Da Sadržaj vlage može uticati na degradaciju i mikrobiološki rast u lekovitom proizvodu. Formulacijske i procesne promenljive mogu uticati na ovaj atribut. Mikrobiološka čistoća U skladu sa EP 2.6.12 i 2.6.13 Da1 Neusaglašenost sa specifikacijom utiče na bezbednost pacijenta. Generalno, rizik od mikrobiološkog rasta je mali kod čvrstih doziranih oblika. 1Formulacijske i procesne promenljive ne utiču na ove kritične atribute kvaliteta, tako da se izostavljaju iz daljeg razmatranja iako su važni elementi kvaliteta. 81 Najpre su iz ciljanog profila izdvojeni sledeći parametri kvaliteta: sadržaj, ujednačenost sadržaja, brzina rastvaranja, hemijska i fizička stabilnost i sadržaj vlage. Zatim su izdvojene osobine lekovite supstance kao rizici koji mogu da utiču na parametre kvaliteta: oblik čvrstog stanja (amorfno ili kristalno), veličina čestica, hemijska stabilnost, protočnost. Za svaku od tih osobina procenjen je nivo rizika uticaja korišćenjem PHA na osnovu težine (ozbiljnosti) rizika i verovatnoće dešavanja. Rezultati ocene i rangiranja rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance prikazani su u Tabeli 4.1.5-1. Tabela 4.1.5-1. Analiza rizika za atribute kvaliteta lekovite supstance Rizik Događaj Težina Verovatnoća Ocena rizika Oblik čvrstog stanja Sadržaj 1 1 L Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 2 1 L Hemijska stabilnost 2 1 L Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 2 1 L Veličina čestica Sadržaj 3 1 L Ujednačenost sadržaja 3 1 L Brzina rastvaranja 3 1 L Hemijska stabilnost 1 1 L Fizička stabilnost 1 1 L Sadržaj vlage 1 1 L Hemijska stabilnost Sadržaj 2 3 M Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 1 1 L Hemijska stabilnost 3 3 M Fizička stabilnost 2 2 L Sadržaj vlage 1 1 L Protočnost Sadržaj 2 1 L Ujednačenost sadržaja 3 1 L Brzina rastvaranja 2 1 L Hemijska stabilnost 1 1 L Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 1 1 L L – nizak nivo rizika; M – srednji nivo rizika. Proizvodni postupak podrazumeva rastvaranje (kompleksiranje) lekovite supstance pomoću ciklodekstrina i sušenje rastvora raspršivanjem. Na taj način je rizik svih navedenih polaznih atributa kvaliteta lekovite supstance, osim hemijske stabilnosti, mali 82 za sve atribute kvaliteta međuproizvoda. Hemijska stabilnost lekovite supstance kritična je za atribute kvaliteta kao što su sadržaj i degradacioni proizvodi. Njena inicijalna hemijska čistoća bi se pratila prilikom ulazne kontrole kvaliteta. Iako se zahvaljujući relativno dobroj stabilnosti lekovite supstance i primeni ciklodekstrina odabrana tehnologija može smatrati pogodnom jer može rezultovati praškom homogenog sastava i dobre rastvorljivosti, zbog očekivanog prelaska u amorfni oblik stabilnost može biti smanjena što bi se ispitivalo u daljim fazama razvoja. 4.1.5.2. Odabir ekscipijenasa Prilikom odabira ekscipijenasa pogodnih za proizvodnju praška sušenjem raspršivanjem, uzeto je u obzir prethodno znanje u vezi sa odabranim model supstancama i formulacijama sa teško rastvorljivim lekovitim supstancama i ciklodekstrinima (CD). Kada su teško rastvorljive supstance u pitanju, formulacija doziranih oblika sa ciklodekstrinima deluje kao dobro rešenje problema niske bioraspoloživosti. Dodatno, tehnologija sušenjem raspršivanjem se smatra pogodnom za efikasno prevođenje rastvora kompleksa lek:ciklodekstrin u prašak ujednačenog sastava i veličine čestica. Potencijal aripiprazola i vorikonazola da budu dobri kandidati za kompleksaciju sa ciklodekstrinima je već prepoznat, i na tržištu postoji proizvod sa kompleksom aripiprazola i derivata beta-ciklodekstrina u obliku intramuskularnog rastvora za injekciju, i sa kompleksom vorikonazola i derivata beta-ciklodekstrina u obliku praška za rastvor za intravensku injekciju. Dva nejonska derivata beta-ciklodekstrina odabrana su za istraživanje: (2- hidroksi)propil-beta-ciklodekstrin (HPBCD), poznat po svojoj dobroj rastvorljivosti u vodi i niskoj toksičnosti, i 2-O-metil beta-ciklodekstrin (2-O-MBCD), noviji metilovani derivat dobre rastvorljivosti, efikasan solubilizator i sa potencijalom da se koristi i za parenteralnu primenu. Razvoj formulacije sa vorikonazolom obuhvatao je odabir ciklodekstrina i uslova pogodnih za kompleksaciju i pripremu vodenog rastvora kompleksa, sa ciljem da se ostvari kompleksacija leka do koncentracije 5% u rezultujućem prašku osušenom raspršivanjem rastvora. 83 S druge strane, zbog svoje veće molekulske mase, kompleksacija aripiprazola i ciklodekstrina bila je nešto izazovniji zadatak. Stoga je pored odabira odgovarajućeg derivata ciklodekstrina razmatrana mogućnost dodatnog povećanja efikasnosti kompleksiranja manipulacijom faktora koji utiču na interakciju lek:ciklodekstrin, kao što su pH medijuma (vrsta pufera) i dodatak hidrosolubilnog polimera. Za ispitivanje su odabrani sledeći medijumi: voda, citratni pufer (pH 3.0), fosfatni pufer (pH 3.0) i hidrosolubilni polimer polivinilpirolidon (PVP). Dakle, razvoj formulacije sa aripiprazolom obuhvatao je nešto složeniju analizu i odabir ekscipijenasa i uslova pogodnih za kompleksaciju i pripremu vodenog rastvora kompleksa, sa ciljem da se takođe ostvari kompleksacija leka do koncentracije 5% u rezultujućem prašku osušenom raspršivanjem rastvora. 4.1.5.3. Analiza rizika za pripremu rastvora kompleksa lek:ciklodekstrin Izvršena je analiza rizika za pripremu rastvora lek:ciklodekstrin. U preliminarnoj analizi rizika korišćena je tehnika Preliminarne analize opasnosti (engl. Preliminary Hazard Analysis – PHA) (Rausand, 2005; Sakura tablet case study, 2008). Najpre su iz ciljnog profila izdvojeni sledeći parametri kvaliteta međuproizvoda: sadržaj, ujednačenost sadržaja, brzina rastvaranja, hemijska i fizička stabilnost i sadržaj vlage. Zatim su izdvojeni potencijalno rizični faktori koji mogu da utiču na parametre kvaliteta međuproizvoda: tip ciklodekstrina (CD), koncentracija CD, pH medijuma, vrsta pufera, prisustvo hidrosolubilnog polimera, vreme mešanja. Za svaku od tih osobina procenjen je nivo rizika korišćenjem PHA na osnovu težine (ozbiljnosti) rizika i verovatnoće dešavanja. Rezultati ocene i rangiranja rizika za pripremu rastvora lek:CD prikazani su u Tabeli 4.1.5-2. Odabran je opseg koncentracija CD koji obuhvata rastvorljivost CD u vodi na sobnoj temperaturi. Prilikom izvođenja uporednih studija u okviru istog seta eksperimenata korišćeno je isto vreme mešanja. U slučaju vorikonazola ispitivan je uticaj tipa ciklodekstrina (HPBCD i 2-O-MBCD) na efikasnost kompleksiranja i osnovne karakteristike dobijenih kompleksa. 84 U slučaju aripiprazola, najpre je sa HPBCD izvršeno detaljnije ispitivanje uticaja faktora kao što su vrsta medijuma i prisustvo hidrosolubilnog polimera na efikasnost kompleksiranja. Zatim je pod odabranim optimalnim uslovima ispitivan uticaj tipa ciklodekstrina (HPBCD i 2-O-MBCD) na efikasnost kompleksiranja. Na odabranoj formulaciji izvršena je optmizacija procesa sušenja raspršivanjem. 4.1.5.4. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem Iako se smatra složenim tehnološkim procesom, sušenje raspršivanjem omogućava da se podešavanjem brojnih procesnih parametara u skladu sa postavljenim ciljem definiše širok prostor za dizajn. Kao ciljna osobina koprocesiranog praška definisana je što manja vrednost za sadržaj vlage, a što se tiče kvaliteta procesa kao cilj je definisano postizanje što većeg proizvodnog prinosa. Za definisane ciljeve, izvršena je inicijalna analiza rizika sledećih procesnih parametara: temperature ulaznog vazduha (temperature vazduha za sušenje na ulazu u komoru), brzine pumpe (brzine kojom se rastvor dovodi do raspršivača), brzine aspiratora (brzine protoka vazduha za sušenje podešavanjem rada aspiratora tj. brzine kojom se vazduh za sušenje izvlači kroz uređaj), koncentracije rastvora (medijuma koji se raspršuje), vlažnosti ulaznog vazduha, i atomizacije (količine energije koja se troši za raspršivanje) (Tabela 4.1.5-3.). Analiza rizika izvedena je primenom FMEA analize (engl. Failure Mode Effects Analysis). Rizik je procenjen na osnovu tri kriterijuma: težine, verovatnoće javljanja i detektabilnosti (vremena detekcije), tako što je broj prioritetnog rizika dobijen množenjem ove tri vrednosti korišćen u rangiranju rizika (Sakura tablet case study, 2008; RMWG-07 case study, 2008). Za ispitivanje uticaja i optimizaciju odabrana su tri potencijalno kritična procesna parametra: temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe i koncentracija rastvora. Temperatura ulaznog vazduha obezbeđuje dovod toplotne energije, brzina pumpe i koncentracija rastvora utiču na količinu tečnosti koja se dovodi za isparavanje i samim tim na ishod prenosa mase i energije i formiranje čestica. Uticaj parametara koji nisu uključeni u optimizaciju smanjen je održavanjem u uskim granicama ili održavanjem konstantnih vrednosti (vlažnost ulaznog vazduha, atomizacija). 85 Tabela 4.1.5-2. Analiza rizika za pripremu rastvora kompleksa lek:CD Rizik Događaj Težina Verovatnoća Ocena rizika Tip CD Sadržaj 4 5 H Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 4 4 H Hemijska stabilnost 3 4 H Fizička stabilnost 3 3 M Sadržaj vlage 2 3 M Koncentracija CD Sadržaj 4 5 H Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 4 4 H Hemijska stabilnost 3 4 H Fizička stabilnost 3 3 M Sadržaj vlage 2 2 L pH medijuma Sadržaj 3 3 M Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 2 2 L Hemijska stabilnost 3 4 H Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 1 1 L Vrsta pufera Sadržaj 3 3 M Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 2 2 L Hemijska stabilnost 3 4 H Fizička stabilnost 2 1 L Sadržaj vlage 1 1 L Prisustvo hidrosolubilnog polimera Sadržaj 3 3 M Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 2 2 L Hemijska stabilnost 3 3 M Fizička stabilnost 3 3 M Sadržaj vlage 2 3 M Vreme mešanja Sadržaj 3 5 H Ujednačenost sadržaja 1 1 L Brzina rastvaranja 1 1 L Hemijska stabilnost 2 3 M Fizička stabilnost 1 1 L Sadržaj vlage 1 1 L L – nizak nivo rizika; M – srednji nivo rizika; H – visok nvo rizika. 86 Tabela 4.1.5-3. Analiza rizika za procesne parametre sušenja raspršivanjem Ciljni profil proizvoda/svojstva kvaliteta Potencijalni modalitet ispada Efekat Težina Verovatnoća javljanja Detektabilnost Broj prioritetnog rizika1 Sadržaj vlage Temperatura ulaznog vazduha Na nižim temperaturama zbog veće relativne vlažnosti vazduha kojim se vrši sušenje i manje efikasnosti sušenja, može doći do povećanja sadržaja rezidualne vlage u prašku. 2 5 3 30 Sadržaj vlage Brzina pumpe Veća brzina može da dovede do povećanja sadržaja vlage zbog toga što treba da ispari veća količina vode. 3 5 3 45 Sadržaj vlage Brzina aspiratora Veća brzina može da dovede do povećanja sadržaja vlage u prašku zbog skraćenog zadržavanja u komori. 1 4 3 12 Sadržaj vlage Koncentracija rastvora Niža koncentracija može da dovede do povećanja sadržaja vlage jer ima više vode za isparavanje. 4 5 1 20 Sadržaj vlage Vlažnost vazduha Veća vlažnost vazduha može da dovede do povećanja sadržaja vlage jer je smanjen kapacitet sušenja ali rad uređaja u klimatizovanom prostoru smanjuje rizik. 3 2 1 6 Sadržaj vlage Atomizacija Nema direktnog uticaja na sadržaj vlage u prašku. - - - - Proizvodni prinos Temperatura ulaznog vazduha Viša temperatura ulaznog vazduha može da dovede do povećanja prinosa zbog toga što je suvlji proizvod manje lepljiv. 3 4 4 36 Proizvodni prinos Brzina pumpe Veća brzina može da dovede do smanjenja prinosa ako se dobija vlažniji proizvod pa je više lepljiv. 3 5 4 60 Proizvodni prinos Brzina aspiratora Veća brzina može da dovede do povećanja prinosa zbog boljeg odvajanja u ciklonu. 1 4 4 16 Proizvodni prinos Koncentracija rastvora Veća koncentracija može da dovede do povećanja prinosa zbog toga što se krupnije čestice bolje odvajaju u ciklonu. 4 5 1 20 Proizvodni prinos Vlažnost vazduha Veća vlažnost vazduha može da dovede do smanjenja prinosa jer može da poveća se lepljivost proizvoda, ali rad uređaja u klimatizovanom prostoru smanjuje rizik. 3 2 1 6 Proizvodni prinos Atomizacija Nema direktnog uticaja na prinos. - - - - 1Kada je broj prioritetnog rizika: < 20, postoji nizak rizik; ≥ 20 i < 40, postoji srednji rizik; ≥ 40, postoji visok rizik. 87 Izlazni parametar koji je odabran da se dodatno prati bez unapred definisane specifikacije je temperatura izlaznog vazduha, i za nju nije izvršena formalna analiza rizika. 4.2. MATERIJALI I METODE Materijali i metode koji su korišćeni kod izabranih model supstanci vorikonazola i aripiprazola šematski su prikazani na Slici 4.2-1. Fazna rastvorljivost •HPBCD (48h): voda, citratni pufer pH 3, fosfatni pufer pH 3, PVP • HPBCD i 2-OMBCD (4h): citratni pufer pH 3 Faktorijalni dizajn tip CD, konc. CD, vreme mešanja Studije rastvorljivosti Simulacija molekularnog vezivanja lek:CD aripiprazol i dva izomera HPBCD Priprema praškova Sušenje raspršivanjem Zajedničko usitnjavanje sa CD Fizička smeša Karakterizacija praškova Sadržaj vlage, TGA, DSC, FTIR, brzina rastvaranja Modelovanje, karakterizacija i optimizacija procesa odabrane formulacije ANN- MLP Kombinovana primena RSM i ANN-MLP DOE i RSM Optimizacija procesa Primenljivost modela Dodatna karakterizacija praškova SEM, nasipna/tapkana gustina, protočnost Ispitivanje stabilnosti: sadržaj, nečistoće, brzina rastvaranja Aripiprazol Fazna rastvorljivost • HPBCD (48h): voda • 2-OMBCD (48h): voda Faktorijalni dizajn tip CD, količina lekovite supstance, vreme mešanja Studije rastvorljivosti Simulacija molekularnog vezivanja lek:CD vorikonazol i dva derivata CD: HPBCD i 2-O-MBCD Semiempirijska optimizacija geometrije Priprema praškova Sušenje raspršivanjem Zajedničko usitnjavanje sa CD Fizička smeša Karakterizacija praškova Sadržaj vlage, TGA, DSC, FTIR, brzina rastvaranja, nečistoće Vorikonazol Slika 4.2-1. Šematski prikaz korišćenih materijala i metoda za model supstance vorikonazol (levo) i aripiprazol (desno). 88 4.2.1. Materijali U istraživanju su korišćeni su sledeći materijali: vorikonazol (Medichem Manufacturing Limited, Malta); aripiprazol (Neuland Laboratories, Indija); (2- hidroksi)propil-beta-ciklodekstrin, stepen molarne supstitucije MS~0.99 (Kleptose HP, Roquette, Francuska); 2-O-metil beta-ciklodekstrin, MS~0.57 (Kleptose Crysmeb, Roquette, Francuska); polivinilpirolidon MW 50,000 (BASF, Nemačka). Svi drugi sastojci su bili analitičkog kvaliteta (p.a., pro analysi, lat.). 4.2.2. Studije rastvorljivosti 4.2.2.1. Studije fazne rastvorljivosti (phase-solubility, engl.) Poboljšanje rastvorljivosti lekovite supstance stvaranjem kompleksa lek:CD ispitivan je u sklopu studija fazne rastvorljivosti (phase-solubility, engl). U vodene rastvore rastućih koncentracija ciklodekstrina, 2-O-MBCD (0–160 mM) ili HPBCD (0–320 mM), dodavana je lekovita supstanca u višku. Nakon 48h mešanja (osim kod uporednog ispitivanja uticaja tipa CD na rastvorljivost aripiprazola gde je mešanje trajalo 4h), magnentnom mešalicom na sobnoj temperaturi, izvršeno je odvajanje bistrog rastvora iz suspenzije filtriranjem kroz 0.45µm membranski filter, iz koga je nakon odgovarajućeg razblaženja merenjem na odgovarajućoj talasnoj dužini (255 nm za vorikonazol, 217.5 nm za aripiprazol), spektrofotometrijski određivana dobijena rastvorljivost lekovite supstance (Camspec M330 UV spectrophotometer (Camspec Inc., Velika Britanija); 8453 UV-visible spectrophotometer (Agilent, SAD). U slučaju vorikonazola korišćena je voda, a u slučaju aripiprazola su pored vode korišćena i dva različita pufera pH vrednosti 3.0, citratni (Ph. Eur. 4008000) i fosfatni pufer (Ph. Eur. 4010000). Na osnovu dobijenih rezultata, konstruisan je fazni dijagram u vidu zavisnosti molarne koncentracije rastvorene supstance (y-osa) od molarne koncentracije ciklodekstrina (x- osa). Analizom oblika dobijenih dijagrama rastvorljivosti izvršena je klasifikacija po tipu dijagrama. Primenom regresione analize izvršeno je uklapanje krive sa linearnim, kvadratnim ili kubnim modelom (Microsoft Office Excel 97-2003, Microsoft 89 Corporation, SAD), i na osnovu koeficijenata korelacije za dobijene modele izvedena je pretpostavka o tome koji kompleksi lek:CD su najverovatniji: 1:1, 1:2 ili 1:3: y = ax + b, za kompleks 1:1 (4.2.2-1) y = ax2 + bx + c, za kompleks 1:2 (4.2.2-2) y = ax3 + bx2 + cx + d, za kompleks 1:3 (4.2.2-3) gde je x molarna koncentracija ciklodekstrina, y molarna koncentracija rastvorene supstance, a a-d su konstante. 4.2.2.2. Primena faktorijalnog dizajna Faktorijalni dizajn 23 koji je primenjen za vorikonazol, podrazumevao je ispitivanje statističkog značaja uticaja tipa CD (HPBCD, 2-O-MBCD), količine lekovite supstance (500 mg i 1000 mg) i vremena mešanja (30 i 60 minuta mešanja), na solubilizaciju vorikonazola. U svim eksperimentima korišćeni su 5 % vodeni rastvori CD. Nakon dodatka lekovite supstance u višku, dobijene disperzije su mešane određeno vreme magnetnom mešalicom na sobnoj temperaturi, posle čega su centrifugirane i dobijeni supernatanti su na odgovarajući način razblaženi i analizirani spektrofotometrijski na talasnoj dužini 255 nm (8453 UV-visible spectrophotometer, Agilent, SAD). Faktorijalni dizajn 23 koji je primenjen za aripiprazol, podrazumevao je ispitivanje statističkog značaja uticaja tipa CD (HPBCD, 2-O-MBCD), koncentracije CD (12.5% i 25%) i vremena mešanja (60 i 120 minuta mešanja), na solubilizaciju aripiprazola. U svim eksperimentima dodato je 1000 mg aripiprazola. Disperzije su mešane magnetnom mešalicom na sobnoj temperaturi, posle čega su centrifugirane i dobijeni supernatanti su na odgovarajući način razblaženi i analizirani spektrofotometrijski na talasnoj dužini 250nm (8453 UV-visible spectrophotometer, Agilent, SAD). Dobijeni rezultati za rastvorljivost statistički su analizirani kao odgovori na različite kombinacije ispitivanih faktora, uz pomoć programa Design-Expert 7.0 software (Stat- Ease Inc, SAD). 90 4.2.3. Simulacija molekularnog vezivanja lek:ciklodekstrin (molecular docking simulation, engl.) U cilju boljeg razumevanja dobijenih rezultata studija rastvorljivosti simulacija molekularnog vezivanja lek:CD izvršena pomoću je programa Auto-Dock Vina koji primenjuje računarsku proceduru u predviđanju najverovatnije konformacije molekula u vezanom stanju i slobodne energije vezivanja. U slučaju vorikonazola simulirano je molekularno vezivanje leka sa dva tipa CD: HPBCD i 2-O-MBCD. Početne koordinate koje odgovaraju kristalnoj strukturi vorikonazola preuzete su iz baze podataka Cambridge Structural Database (CSD) (Ravikumar i autori, 2007; CSD Ref CEXMAU). Pošto je praktično nemoguće da se simuliraju svi mogući izomeri supstituisanih ciklodekstrina, jedan reprezentativni izomer HPBCD je izabran za simulaciju na osnovu deklarisane molekularne supstitucije (M.S.) komercijalnog proizvoda (Kleptose HP, sa M.S.0.99), sa ukupno sedam (2-hidroksi)propil supstituenta: sa četiri supstituenta pozicionirana na O6 atomima kiseonika kao najreaktivnijem mestu, i tri na sledećem najreaktivnijem mestu, O2 atomima kiseonika (Gramera i Caimi, 1969) (Slika 4.2.3-1a). Slika 4.2.3-1. Izomeri (2-hidroksi)propil-beta-ciklodekstrina (a), i 2-O metil-beta-ciklodekstrina (b) korišćene u simulaciji. Za 2-O-MBCD (Slika 4.2.3-1b), početne koordinate su uzete iz kristalne strukture objavljene u bazi podataka Cambridge Structural Database (CSD Ref code IQOZIX), prilagođene deklarisanoj molekularnoj supstituciji M.S. 0.57 pozicioniranjem četiri metil grupe na O2 atomima kiseonika. Inicijalna geometrija svih struktura optimizovana 91 je pre simulacije vezivanja, korišćenjem parametara polja sile (AMMP force field program implementiran u softver VegaZZ molecular modeling software (Pedretti i autori, 2002)). Zatim su spojeni nepolarni atomi vodonika, dodeljena su Kollman united-atom naelektrisanja i solvatacioni parametri (AutoDockTools program, Morris i autori, 1998). U slučaju aripiprazola, simulirano je molekularno vezivanje leka sa dva izomera HPBCD. Početne koordinate koje odgovaraju kristalnoj strukturi aripiprazola preuzete su iz baze podataka Cambridge Structural Database (CSD Ref No 285534), definisani su parametri polja sile (CHARMm program, Momany i Rone, 1992), dodeljena su Gasteiger naelektrisanja atomima liganda (VEGA ZZ molecular modeling software program, Pedretti i autori, 2002), i izvršena je minimizacija energije (NAMD molecular dynamics program, Phillips i autori, 2005). Zatim su spojeni nepolarni atomi vodonika, i definisane su veze koje mogu da rotiraju. Pošto je praktično nemoguće da se simuliraju svi mogući izomeri supstituisanih ciklodekstrina, za simulaciju su izabrana dva reprezentativna izomera (2- hidroksi)propil-beta-ciklodekstrina na osnovu deklarisane molekularne supstitucije (M.S.) korišćenog CD (Kleptose HP, M.S.0.99) (Slika 4.2.3-2). Slika 4.2.3-2. Izomeri (2-hidroksi)propil-beta-ciklodekstrina korišćeni u simulacijama: izomer a, sa supstitucijom na O6 poziciji (a), i izomer b, sa suptituentima na O6 i O2 pozicijama (b). Izomer a ima sedam (2-hidroksi)propil supstituenata pozicioniranih na O6 atomima kiseonika kao najreaktivnijim mestima (Gramera i Caimi, 1969), a nasumično supstituisani izomer b ima četiri (2-hidroksi)propil supstituenta pozicionirana na O6 92 atomima kiseonika, i tri na sledećem najreaktivnijem mestu, O2 atomima kiseonika (Gramera i Caimi, 1969). Zatim su spojeni nepolarni atomi vodonika, dodeljena su Kollman united-atom naelektrisanja i solvatacioni parametri (AutoDockTools program, Morris i autori, 1998). 4.2.3.1. Dodatna semiempirijska optimizacija geometrije kompleksa vorikonazol:CD U slučaju vorikonazola je nakon simulacije molekularnog vezivanja izvršena semiempirijska optimizacija geometrije kompleksa. Kombinovana primena simulacije vezivanja sa semiempirijskom optimizacijom geometrije doprinosi boljoj tačnosti simulacije vezivanja (Stigliani i autori, 2012). Izvršena je optimizacija onih pozicija leka i CD u kompleksu koje su imale najveću vrednost scoring funkcije, korišćenjem AMMP force field programa. Za komplekse sa najnižom energijom izvršena je puna optimizacija geometrije na semiempirijskom nivou teorije, korišćenjem funkcije PM6 Hamiltonian sa lokalizovanom molekularnom orbitalnom metodom, i simulacijom efekata solvatacije pomoću kontinuum modela COSMO sa dielektričnom konstantom 78.4 (Klamt i Schumann, 1993). Izvršena je dalja obrada strukture uzimanjem u obzir efekata nekovalentnih interakcija (disperziono i vodonično vezivanje), primenom PM6-DH2 metode (Single point energy run) (Korth i autori, 2010). Energije vezivanja, ∆Ε, računate su na osnovu razlike u toploti formiranja, ∆fΗ, individualnih komponenti (∆fΗ(lek), ∆fΗ(CD)) i njihovih kompleksa (∆fΗ(lek:CD kompleks)), prema jednačini (4.2.3-1): ∆Ε = ∆fΗ(lek:CD kompleks) – ∆fΗ(lek) – ∆fΗ(CD) (4.2.3-1) Svi proračuni su vršeni korišćenjem programa MOPAC (evaluacija rezultata korišćenjem WinMostar (TENCUBE Institute, Ltd.) grafičkog korisničkog interfejsa). 93 4.2.4. Priprema praškova 4.2.4.1. Praškovi dobijeni sušenjem raspršivanjem Inicijalno, čvrsti sistemi lek:ciklodekstrin pripremljeni su sušenjem raspršivanjem bistrih rastvora dobijenih nakon filtracije suspenzija dobijenih tokom studija rastvorljivosti, na laboratorijskom uređaju za sušenje raspršivanjem Büchi B-191-Mini Spray Dryer (Büchi Laboratoriums-Technik AG, Švajcarska) (Slika 4.2.4-1a). Korišćeni su sledeći procesni parametri: temperatura ulaznog vazduha 120ºC, temperatura izlaznog vazduha 70ºC, brzina pumpe 15%, rad aspiratora 100%, atomizacija 550l/h. Temperatura izlaznog vazduha je merena kao odgovor pomoću temperaturnog senzora koji se nalazi u delu uređaja za sušenje raspršivanjem odmah posle cilindra u kome se vrši raspršivanje (koji je ujedno i komora za sušenje), tako da je omogućeno merenje temperature vazduha koji nosi čvrste čestice pre njihovog ulaska u ciklonski separator. Stoga je merena temperatura označena kao temperatura izlaznog vazduha. Proizvodni prinos je računat tako što je masa praška prikupljena posle svakog eksperimenta sušenja raspršivanjem izražena kao procenat početne količine praškova od kojih je pripremljen rastvor, umanjen za dobijeni sadržaj vlage. U fazi modelovanja i optimizacije sušenja raspršivanjem odabrane formulacije sa aripiprazolom, korišćen je uređaj Büchi 290-Mini Spray Dryer (Büchi Laboratoriums- Technik AG, Švajcarska) opremljen sa standardnim mlaznim raspršivačem sa dva fluida (Slika 4.2.4-1b). U svim eksperimentima količina rastvora je bila 10 g osim ako nije drugačije navedeno, brzina aspiratora je bila podešena na 100% (što odgovara maksimalnom protoku vazduha za sušenje od 40 m3/h) i brzina vazduha za raspršivanje na 600L/h. Odabrane su ove vrednosti parametara jer se uobičajeno koriste kod sušenja raspršivanjem na pomenutom uređaju (Goula i autori, 2004). Preostali procesni parametri su bili podešeni prema zahtevima pojedinačnih eksperimenata određenih eksperimentalnim dizajnom. 94 (a) (b) Slika 4.2.4-1. Laboratorijski uređaji za sušenje raspršivanjem: Büchi B-191-Mini Spray Dryer (a); Büchi 290-Mini Spray Dryer (b). 4.2.4.2. Praškovi dobijeni drugim metodama pripreme Praškasti uzorci su pripremljeni i tehnikom zajedničkog usitnjavanja u prisustvu male količine rastvarača. U slučaju vorikonazola korišćen je odnos CD:lek 1:1, a u slučaju aripiprazola, korišćen je odnos CD:lek 16:1 sa HPBCD, i 40:1 sa 2-O-MBCD (prema studiji rastvorljivosti u čistoj vodi sa najvećom ispitivanom koncentracijom CD). Ciklodekstrin je okvašen pomoću nekoliko kapi metanola u keramičkom tarioniku. Postepeno je dodavana definisana količina lekovite supstance i praškovi su mešani pomoću keramičkog pistila oko 15 minuta. Tokom ovog procesa, dodavan je metanol u kapima kako bi se održala pogodna konzistencija smeše. Finalni proizvod je sušen u komornoj sušnici na temperaturi 40ºC oko 2h i zatim ostavljen da se uravnoteži na sobnoj temperaturi oko 24h. Fizičke smeše lekovite supstance i ciklodekstrina pripremljene su mešanjem praškova u polietilenskoj vreći simulirajući mešanje u kontejnerskom mešaču i korišćene su za poređenje tokom analiza. 95 4.2.5. Karakterizacija praškova 4.2.5.1. Određivanje sadržaja vode Poznato je da ciklodekstrini formiraju hidrate, i u zavisnosti od stanja hidratacije sadrže određenu količinu vode, tako da je za pripremu vodenih rastvora definisane molarne koncentracije potrebno i to uzeti u obzir kako bi se izmerila odgovarajuća količina ciklodekstrina. Za inicijalnu karakterizaciju ciklodekstrina i analizu određenih kondicioniranih praškova osušenih raspršivanjem, izvršeno je semi-mikro određivanje vode Karl Fischer titrimetrijom, koja se zasniva na kvantitativnoj reakciji vode sa sumpor dioksidom i jodom u pogodnom bezvodnom medijumu u prisustvu baze dovoljnog puferskog kapaciteta (Ph.Eur. 2.5.12 Metod A), na uređaju Karl Fischer titrator (835 Titrando, Švajcarska). 4.2.5.2. Sadržaj vlage Sadržaj vlage (gubitak sušenjem) određivan je termogravimetrijski na aparatu Mettler- Toledo HR 83 Halogen moisture analyzer (Mettler-Toledo, Švajcarska) na temperaturi 105°C i u trajanju testa do postizanja pada mase manjeg od 1 mg na 50 sekundi, na veličini uzorka od 0.5 g. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje dva merenja. 4.2.5.3. Termogravimetrijska analiza (TGA) TGA merenja na praškovima izvršena su pomoću uređaja Shimadzu TGA50 Thermogravimetric Analyzer (Shimadzu Corporation, Japan). Gubitak mase je praćen tokom zagrevanja uzoraka (2-5 mg) u aluminijumskoj posudici, pri temperaturi 30ºC do 120ºC, pri brzini 10ºC/min, u inertnoj atmosferi azota (protok 25cm3/min). 96 4.2.5.4. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) DSC merenja na praškovima izvršena su na uređaju Shimadzu DSC50 Differential Scanning Calorimeter (Shimadzu Corporation, Japan). Termalno ponašanje je izučavano zagrevanjem uzoraka (2-5 mg) u presom zatvorenoj aluminijumskoj posudici, pri temperaturi 30ºC do 300ºC, pri brzini 10ºC/min, u inertnoj atmosferi azota (protok 25cm3/min). Prazna aluminijumska posudica je korišćena kao slepa proba. 4.2.5.5 Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) ATR-FTIR spektroskopija primenjena je za snimanje FTIR spektara direktno iz praškova, u oblasti od 500 do 4000 cm-1, pri rezoluciji 4 cm-1, sa 64 skeniranja za svaki spektar. Korišćen je uređaj Shimadzu IR Prestige 21 spectrometer (Shimadzu Europa GmbH, Nemačka), kuplovan sa horizontalnim sistemom za smanjenje totalne refleksije Golden Gate MKII single-reflection ATR system (Specac, Velika Britanija) opremljenim sa sočivom od cink-selenida, kojim se omogućava direktno snimanje uzoraka. 4.2.5.6. Ispitivanje brzine rastvaranja Ispitivanje brzine rastvaranja izvršeno je u uređaju Dissolution Tester DT800 (Erweka, Nemačka), 37±0.5 °C, u 900 ml medijuma. Korišćeni su sledećimedijumi: 0.1M hlorovodonična kiselina (pH 1.2), acetatni pufer (pH 4.5) i fosfatni pufer (pH 6.8). Korišćena je aparatura sa rotirajućom lopaticom sa brzinom mešanja 50 rpm. Samo su u slučaju aripiprazola kod ispitivanja u 0.1M hlorovodoničnoj kiselini korišćene dve brzine mešanja: (a) 60 rpm kako je navedeno u bazi podataka za metode za ispitivanje brzine rastvaranja (www.fda.gov), i (b) 50 rpm (standardna brzina mešanja, diskriminatorniji uslov). Čvrste formulacije (čista lekovita supstanca, kompleksi leka i CD dobijeni sušenjem raspršivanjem i fizička smeša leka i CD) punjene su u tvrde želatinske kapsule (veličine 0), sa masom punjenja koja odgovara oko 10-11 mg leka. U definisanim vremenskim tačkama izvršeno je uzorkovanje medijuma koji je profiltriran kroz 0.45µm membranski filter, iz koga je spektrofotometrijski određivan sadržaj leka merenjem na odgovarajućoj 97 talasnoj dužini, poređenjem sa kalibracionom krivom koja je konstruisana korišćenjem referentnog standarda vorikonazola (korišćena je talasna dužina 255 nm za vorikonazol, 250 nm za aripiprazol) (8453 UV–visible spectrophotometer, Agilent, SAD). Test je ponovljen tri puta, i izračunate su srednje vrednosti i relativna standardna devijacija. 4.2.5.7. Određivanje nečistoća vorikonazola U kompleksima vorikonazola dobijenim sušenjem raspršivanjem praćeno je nekoliko nečistoća: Nečistoća 1 (4-etil-5-fluoropirimidin) i Nečistoća 2 (1-(2,4-difluorofenil)-2- (1H-1,2,4-triazol-1-il)etanon) koje su degradacioni proizvodi (Slika 4.2.5-1), i Nečistoća 3, epi-vorikonazol, koja je 2S, 3R izomer of vorikonazola. (a) (b) Slika 4.2.5-1. Nečistoća 1 (4-etil-5-fluoropirimidin) (a); Nečistoća 2 (1-(2,4-difluoro fenil)-2- (1H-1,2,4-triazol-1-il)etanon) (b). Nečistoće su određivane odgovarajućom HPLC metodom. Analiza Nečistoće 1 i Nečistoće 2 je vršena na uređaju Agilent HPLC system, 1200 Series (Agilent, Santa Clara, SAD). Hromatografska procedura je izvršena korišćenjem kolone tipa C-18, dimenzija 100 x 4.0 mm napunjena sa silika česticama (3µm) (Hypersil, Thermo, Thermo Fisher Scientific Inc, SAD). Korišćena je mobilna faza sa 0.0125 M rastvorom natrijum-dihidrogen-fostfat-dihidrata (pufer pH 4.0) i acetonitrilom u odnosu 90:10. Korišćen je protok 1.0 ml/min, injekciona zapremina 50µl, temperatura kolone 35°C i UV detektor podešen za rad na 254 nm. Pripremljeni su standradni rastvori koristeći 98 vorikonazol, i referentne standarde Nečistoće 1 i Nečistoće 2 proizvođača, acetonitrila i diluenta, koncentracije 2 µg/ml vorikonazola i Nečistoće 1 i 2. Nečistoća 3 je analizirana na uređaju Agilent HPLC system, 1200 Series (Agilent, Santa Clara, SAD). Hromatografska procedura je izvršena korišćenjem kolone tipa C-18, dimenzija 150 x 4.6 mm napunjena sa silika česticama (5µm) (Zorbax Eclipse, Agilent, Santa Clara, SAD). Korišćena je mobilna faza sa 0.01M rastvorom amonijum acetata i 0.02 g/ml HPBCD (pufer pH 5.0) i acetonitrilom u odnosu 78:22. Korišćen je protok 2.0ml/min, injekciona zapremina 50µl, temperatura kolone 25°C i UV detektor podešen za rad na 254 nm. Pripremljeni su standradni rastvori koristeći vorikonazol, i referentni standard Nečistoće 3 proizvođača, acetonitrila i diluenta, koncentracije 5µg/ml vorikonazola i Nečistoće 3. U analizi uzorka prašak je odmeren prenet u normalni sud i nakon odgovarajućeg razblaženja dobijeni test rastvor je injektovan u HPLC sistem. Odgovori (površina pika) glavnih pikova su izmereni i izvršen je preračun korišćenjem formule Cs x (Au/As), gde je Au površina pika u test rastvoru, As je površina pika u standardnom rastvoru i Cs je koncentracija ispitivanih supstanci u standardnom rastvoru. 4.2.6. Modelovanje, karakterizacija i optimizacija sušenja raspršivanjem za odabranu formulaciju sa aripiprazolom Odabrana je formulacija aripirazola sa HPBCD čiji se kompleks priprema u citratnom puferu pH 3.0, a zatim prevodi u prašak sušenjem raspršivanjem sa koncentracijom leka u prašku od 5%. 4.2.6.1. Eksperimentalni dizajn i metodologija površine odgovora Tri procesna parametra, faktora (koncentracija rastvora (A), brzina pumpe (B), temperatura ulaznog vazduha (C)), izabrana su za modelovanje procesa primenom centralnog kompozitnog dizajna (engl. Central composite design, CCD) sačinjenog od 20 eksperimenata. Analiza varijanse (ANOVA) je izvršena kako bi se odredio značaj svakog faktora, pri nivou značajnosti od 5%. Polinomne jednačine su kreirane kako bi se ustanovile veze među faktorima i odgovorima. Praćeni odgovori su bili prinos (R1); 99 sadržaj vlage (R2) i temperatura izlaznog vazduha (R3). Realne i kodirane vrednosti evaluiranih promenljivih, praćenih odgovora i eksperimentalni matriks prikazani su u Tabeli 4.2.6-1. Tabela 4.2.6-1. Nezavisne procesne promenljive u centralnom kompozitnom dizajnu (realne i kodirane vrednosti) i praćeni odgovori Eksp br. A, Konc. rastvora (%) kodirano realno B, Brzina pumpe (%) kodirano realno C, Temperatura ulaz. vazd. (˚C) kodirano realno Odgovori 1 0 20 -1.68 3.18 0 170 R1= Prinos (%) R2= Sadržaj vlage (%) R3= Temperatura izlaznog vezduha (˚C) 2 -1 10 +1 30 -1 160 3 +1 30 +1 30 -1 160 4 0 20 0 20 -1.68 153.18 5 0 20 0 20 0 170 6 +1 30 +1 30 +1 180 7 -1.68 3.18 0 20 0 170 8 0 20 0 20 0 170 9 -1 10 -1 10 -1 160 10 +1.68 36.82 0 20 0 170 11 0 20 0 20 0 170 12 0 20 0 20 0 170 13 0 20 0 20 0 170 14 -1 10 +1 30 +1 180 15 +1 30 -1 10 +1 180 16 +1 30 -1 10 -1 160 17 0 20 +1.68 36.82 0 170 18 0 20 0 20 0 170 19 -1 10 -1 10 +1 180 20 0 20 0 20 +1.68 186.82 Vrednosti brzine pumpe 3.18%, 10%, 20%, 30%, i 36.82% predstavljaju brzinu koja odgovara protoku oko 1ml/min, 3ml/min, 6ml/min, 9ml/min i 11ml/min, respektivno. Opsezi ispitivanih parametara su birani tako da se dobije najbolji proizvodni prinos uz minimalni sadržaj vlage u praškovima. Opseg za temperaturu ulaznog vazduha je odabran na osnovu nekoliko preliminarnih eksperimenata tako da se postigne temperatura izlaznog vazduha oko 70-80°C, koja je korišćena u nekim prethodnim studijama o sušenju raspršivanjem formulacija sa ciklodekstrinima (Ribeiro i autori, 2008; Fini i autori, 2008). Koncentracija rastvora je odabrana da bude 10% i 30% (što odgovara vrednostima −1 i +1 u CCD, respektivno), jer je sličan opseg ispitivan u nekim prethodnim studijama sušenja raspršivanjem (Fini i autori, 2008; Goula i Adamopoulos, 2004). Opseg za brzinu pumpe koji odgovara vrednostima −1 i +1 CCD, 10% i 30%, odabran je kao optimalan u skladu sa preporukom proizvođača uređaja. 100 Odabrana formulacija sastojala se od aripiprazola solubilizovanog u rastvoru HPBCD u citratnom puferu pH 3, budući da je izdvojena kao najpogodnija sa aspekta postignutog povećanja rastvorljivosti. Sva ispitivanja koja se zasnivaju na eksperimentalnom dizajnu bila su podržana primenom softverskog paketa Design-Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, Minneapolis, SAD). 4.2.6.2. Veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona U modelovanju procesa sušenja raspršivanjem korišćena je veštačka neuronska mreža tipa višeslojnog perceptrona (engl. Multilayer perceptron, MLP). Pre treniranja mreže i razvoja modela, definisana je specifikacija za broj skrivenih slojeva i broj jedinica u ovim slojevima. Za aktivaciju neurona odabrana je sigmoidna transfer funkcija. Za treniranje mreže odabran je BP algoritam (engl. back-propagation, BP) i podešavani su parametri kao što su broj epoha, brzina učenja, momentum, broj kombinacija. MLP je primenjen korišćenjem komercijalno dostupnog softvera Statistica Neural Network software (StatSoft, SAD). 4.2.6.3. Ispitivanje potencijala novih načina kombinovanja veštačkih neuronskih mreža i metodologije površine odgovora Razmotreno je nekoliko pristupa modelovanju procesa. Šema eksperimenata koji su korišćeni u razvoju i testiranju modela predstavljena je na Slici 4.2.6-1. Sposobnost predviđanja modela izražavana je izračunavanjem koeficijenta korelacije (R2) između eksperimentalno dobijenih i predviđenih razultata. Najpre su razvijeni modeli RSM1 i MLP1 pomoću eksperimentalnih podataka CCD dizajna (Tabela 4.2.6-1, Slika 4.2.6-1), primenom metodologije površine odgovora (RSM) i neuronske mreže tipa višeslojnog perceptrona (MLP), respektivno. Rezultati dodatno izvedenih 9 eksperimenata sa nasumično dizajniranim ulaznim parametrima, korišćeni su za testiranje predviđanja dobijenih modela (Tabela 4.2.6-2, Slika 4.2.6-1). 101 Eksp. br. RSM1 RSM2a RSM2b RSM3 MLP1 MLP2a MLP2b 1 MLP2a MLP1 2 MLP2b MLP1 3 MLP2b MLP1 4 MLP2a MLP2b MLP1 5 MLP2a MLP2b MLP1 6 MLP2b MLP1 7 MLP2a MLP2b MLP1 8 MLP2a MLP2b MLP1 9 MLP2b MLP1 10 MLP2a MLP1 11 MLP2a MLP2b MLP1 12 MLP2a MLP2b MLP1 13 MLP2a MLP2b MLP1 14 MLP2b MLP1 15 MLP2b MLP1 16 MLP2b MLP1 17 MLP2a MLP2b MLP1 18 MLP2a MLP2b MLP1 19 MLP2b MLP1 20 MLP2a MLP1 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Eksperimentalni podaci korišćeni za razvoj modela Predviđeni podaci korišćeni za razvoj modela Eksperimentalni podaci korišćeni za testiranje modela Eksperimenti koji nisu uključeni u analizu Slika 4.2.6-1. Šema eksperimenata koji su korišćeni u razvoju i testiranju modela Zatim, kako bi se ispitao potencijal MLP za upotpunjavanje liste podataka (koja odgovara određenom eksperimentalnom dizajnu) iz koje je moguće izvršiti matematičko modelovanje (RSM), trenirane su dve različite neuronske mreže za popunjavanje nedostajućih podataka u okviru CCD dizajna. U prvom slučaju, korišćeni su podaci koji odgovaraju 23 faktorijalnom dizajnu u okviru CCD (Tabela 4.2.6-1, Slika 4.2.6-1) i koji predstavljaju sistematično osmišljene, dizajnirane eksperimente, tako da je dobijen MLP2a model. U drugom slučaju, korišćeni su podaci dobijeni iz 8 eksperimenata sa nasumično dizajniranim ulaznim parametrima (Tabela 4.2.6-1, eksperiment br. 1, 10 i 20; Tabela 4.2.6-2, eksperiment br. 21-25; Slika 4.2.6-1), koji predstavljaju podatke koji 102 se obično dobijaju prilikom takozvanih pokušaj-greška eksperimenata što znači da nisu sistematično osmišljeni i izvedeni, tako da je dobijen MLP2b model. Tabela 4.2.6-2. Nezavisne procesne promenljive nasumično dizajniranih eksperimenata i praćeni odgovori Eksp. br. A, Konc. rastvora (%) B, Brzina pumpe (%) C, Temperatura ulaz. vazd. (˚C) Odgovori 21 20 10 160 R1, Prinos (%) R2, Sadržaj vlage (%) R3,Temp izlaz.vazduha (˚C) 22 10 20 165 23 20 15 170 24 22 13 180 25 15 15 180 26 22 15 160 27 10 10 170 28 15 10 165 Vrednosti brzine pumpe 10%, 13%, 15% i 20% predstavljaju brzinu koja odgovara protoku oko 3ml/min, 3.9ml/min, 4.5ml/min i 6ml/min, respektivno. Modeli dobijeni na ovaj način su zatim korišćeni u predviđanju rezultata i upotpunjavanju grupe podataka koji po dizajnu odgovaraju CCD, što u slučaju modela MLP2a znači predviđanje za preostalih 12 eksperimenata, a u slučaju MLP2b modela preostalih 17 eksperimenata (Slika 4.2.6-1). Na ovaj način omogućeno je matematičko modelovanje (primena RSM) dobijene grupe podataka koja se sastoji od kombinacije eksperimentalnih i predviđenih rezultata, i dobijeni su modeli RSM2a i RSM2b modeli (Slika 4.2.6-1). Za testiranje ovih modela korišćeni su rezultati dobijeni izvođenjem eksperimenata br. 26-28 (Tabela 4.2.6-2, Slika 4.2.6-1), u cilju poređenja sposobnosti predviđanja modela sa predviđanjima dobijenim od strane RSM1 i MLP1 modela koji su dobijeni korišćenjem samo eksperimentalnih rezultata. Takođe, razmatrano je da li se mogu dobiti korisne informacije iz nasumično dizajniranih ekspermenata (koji predstavljaju istorijski tip podataka koji se dobijaju primenom metode pokušaj-greška), korišćenjem MLP u modelovanju, a ne samo iz onih eksperimenata koji pripadaju specifičnom eksperimentalnom dizajnu i za koje se smatra da pružaju rezultate boljeg kvaliteta. U cilju ispitivanja potencijala modelovanja zasnovanog na eksperimentalnom dizajnu u dešifrovanju takozvane prirode “crne kutije” predviđanja veštačkih neuronskih mreža, korišćeni su samo predviđeni rezultati za sve eksperimente koji pripadaju CCD, i to oni dobijeni predviđanjem MLP modela sa najboljom korelacijom između predviđenih i 103 stvarno dobijenih rezultata. Primenom RSM na taj način dobijeni su RSM3 modeli za svaki odgovor kako bi bili definisani značaj i veze među faktorima (Slika 4.2.6-1). Dobijene matematičke jednačine su RSM1 i RSM3 modela su analizirane kako bi se na osnovu sličnosti i razlika unapredilo razumevanje procesa i objasnilo zašto jedan model ima bolju moć predviđanja od drugog. 4.2.6.4. Optimizacija sušenja raspršivanjem Nakon izvršene analize procesa, pomoću softvera Design-Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, SAD) primenom pristupa poželjnosti (engl. Desirability approach) (Nekkanti i autori, 2009), izvršena je numerička optimizacija procesnih parametara za rastvor koncentracije 25% (određena kao najpogodnija za kompleksaciju). Izvršena je optimizacija sa zahtevima za postizanje najvećeg prinosa i najmanjeg sadržaja vlage. Zatim je izvršena fizičkohemijska karakterizacija dobijenog praška. 4.2.6.5. Primenljivost dobijenih modela na različite formulacije Koristeći optimalne uslove dobijene za odabranu formulaciju aripiprazol-HPBCD- citratni pufer, izvršeno je sušenje raspršivanjem nekoliko različitih formulacija: aripiprazol-HPBCD-PVP-citratni pufer (0.1% w/w PVP u rastvoru), aripiprazol-2-O- MBCD-citratni pufer, vorikonazol-HPBCD-voda. U svim formulacijama je koncentracija leka u prašku bila 5%. Zatim je izvršeno poređenje dobijenih rezultata sa predviđanjima modela u cilju procene primenljivosti na različite formulacije sa ciklodekstrinima. 4.2.6.6. Dodatna karakterizacija dobijenih praškova nakon optimizacije 4.2.6.6.1. Vizuelizacija čestica praška Vizuelizacija praškova sa ciljem opisivanja oblika, morfologije i karakteristika površine čestica, izvršena je pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa Phenom G2 Pro 104 (Phenom-World, Holandija). Uzorci su fiksirani pomoću karbonskog adheziva na aluminijumski držač, postavljeni u vakuumsku komoru i fotografisani pri naponu 5 kV. Posmatrani su pod uvećanjem od 1600 do 11500 puta. 4.2.6.6.2. Nasipna i tapkana gustina praškova Nasipna i tapkana gustina praškova je određivana pomoću graduisane menzure i aparata za merenje tapkane zapremine Erweka SVM (Erweka, Nemačka). Nasipna gustina je određivana tako što je prethodno prositan prašak (sito 1 mm) pažljivo sipan u graduisanu menzuru od 100 ml (sa podeocima očitavanja do 1 ml), do zapremine od 100ml i nakon očitane mase m izvršen je preračun nasipne gustine ρN(g/ml)=m/100. Zatim je menzura fiksirana na aparaturu, na kojoj je vršeno tapkanje praška do postizanja smanjenja nivoa praška u menzuri ≤ 2 ml, između dva sukcesivna seta tapkanja. Pomoću vrednosti m i očitane tapkane zapremine Vf izvršen je preračun tapkane gustine ρT(g/ml) = m/Vf. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje tri merenja. 4.2.6.6.3. Protočnost praškova Protočnost praškova je određivana na aparatu Erweka GWF (Erweka, Nemačka), merenjem vremena potrebnog za proticanje određene količine praška iz levka kroz kružni otvor promera 12.5 mm, sa uključenom vibracijom. Prikazani rezultati predstavljaju srednje vrednosti od najmanje tri merenja. 4.2.6.6.4. Kondicioniranje odabranih uzoraka sa aripiprazolom u komorama za studije stabilnosti Odabrani uzorci su upakovani u tamne staklene bočice koje su u zavisnosti bile ili otvorene ili zatvorene zatvaračem punjenim silika gelom kao desikantom i kondicionirane u komorama pod uslovima dugotrajnog starenja (25°C/60% RH) i ubrzanog starenja (40°C/75% RH) u periodu od 90 dana (komore Pharma 2000 i 105 Pharma 600, Weiss Technik, Nemačka). Praćeni su sadržaj, nečistoće i profil brzine rastvaranja aripiprazola i sadržaj vlage u praškovima. Sadržaj aripiprazola u kondicioniranim praškovima određivan je odgovarajućom HPLC metodom. Analiza je izvršena na uređaju Agilent HPLC system, 1200 Series (Agilent, SAD). Hromatografsko razdvajanje je postignuto korišćenjem C-18 kolone ,150 x 4.6 mm, 5µm (Zorbax Eclipse XDB, Agilent, SAD). Mobilna faza je uvođena u aparat iz dva odvojena kanala u odnosu 50:50; mobilna faza u jednom kanalu se sastojala od fosfatnog pufera pH 3.0 (dobijenog rastvaranjem 3.00 g natrijum dihidrogen fosfata u 1000 ml vode, uz dodatak 5.0 ml trietilamina i uz korekciju do pH 3.0 pomoću ortofosforne kiseline), a u drugom kanalu od smeše metanol:acetonitril (1:1). Protok mobilne faze je bio 1.0 ml/min, zapremina injektovanja 10 µl, temperatura kolone 25°C i korišćen je UV detektor na 255 nm. U kompleksima dobijenim sušenjem raspršivanjem praćene su dve poznate nečistoće aripiprazola: N-oksid nećistoća (7-[4-[4-(2,3-dihlorofenil)-piperazin-1-il]butoksi]-3,4- dihidrohinolin-2(1H)-on) i dehidro nečistoća (7-[4-[4-(2,3-dihlorofenil)-1-piperazinil] butoksi]-2(1H)-hinolinon) koje su degradacioni proizvodi kako se navodi u DMF-u proizvođača sirovine (Aripiprazole Drug Master File, Neuland Laboratories, Indija) (Slika 4.2.5-1). Nečistoće su određivane odgovarajućom HPLC metodom. Analiza je izvršena na uređaju Agilent HPLC system, 1200 Series (Agilent, SAD). Hromatografsko razdvajanje je postignuto korišćenjem C-18 kolone, 250 x 4.6 mm, 5µm (Luna, Phenomenex, SAD). Mobilna faza se sastojala od fosfatnog pufera pH 3.0 (dobijenog rastvaranjem 1.11 g kalijum dihidrogen fosfata i 1.2 g natrijum pentan-sulfonata u 1000 ml vode, uz korekciju do pH 3.0 pomoću ortofosforne kiseline) u kombinaciji sa acetonitrilom. Korišćena metoda je tipa gradijenta, protok mobilne faze je bio 1.0 ml/min, zapremina injektovanja 20 µl, temperatura kolone 25°C i korišćen je UV detektor sa analizom na 215 nm. Metode za određivanje ostalih praćenih parametara opisane su u poglavlju 4.2.5. 106 (a) (b) Slika 4.2.6-2. Degradacione nečistoće aripiprazola: N-oksid (a) i dehidro nečistoća (b). 4.3. REZULTATI I DISKUSIJA 4.3.1. Studije rastvorljivosti sa vorikonazolom 4.3.1.1 Određivanje sadržaja vode u ciklodekstrinima Analiza inicijalnog sadržaja vode u ciklodekstrinima je pokazala da se slični rezultati dobijaju Karl Fischer metodom i gravimetrijskom metodom halogenog analizatora vlage (Tabela 4.3.1-1, rezultati izraženi kao srednje vrednosti tri određivanja). Rezultati dobijeni na uređaju za TGA analizu su se nešto više razlikovali, sa većom standardnom devijacijom. Rezultati dobijeni Karl Fischer metodom su korišćeni u preračunu odgovarajućih količina HPBCD i 2-O-MBCD, u pripremi vodenih rastvora definisane koncentracije potrebnih za studije rastvorljivosti. Tabela 4.3.1-1. Rezultati određivanja sadržaja vode u CD različitim metodama. Metoda tip CD HPBCD 2-O-MBCD Gravimetrijska metoda TGA analizator 6.12 % (1.2%) 5.09 % (0.8 %) Halogeni analizator vlage 4.27 % (0.14%) 4.16 % (0.13 %) Karl Fischer metoda 4.38 % (0.15%) 3.96 % (0.06%) Standardna devijacija je predstavljena u zagradama 107 4.3.1.2. Studije fazne rastvorljivosti (phase-solubility, engl.) Slika 4.3.1-1 objedinjuje rezultate studija fazne rastvorljivosti. (a) HPBCD (mM) 0 50 100 150 200 250 300 Vo rik o n a zo l (m M ) 0 50 100 150 200 250 300 (b) 2-OMBCD (mM) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Vo rik o n a zo l (m M ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Slika 4.3.1-1. Dijagrami fazne rastvorljivosti vorikonazola u vodenim rastvorima HPBCD (a) i 2-O-MBCD (b). Uklapanje sa linearnom funkcijom - puna linija, uklapanje sa kubnom funkcijom - isprekidana linija. Za oba ciklodekstrina, 2-O-MBCD i HPBCD, rastvorljivost vorikonazola linearno raste sa porastom koncentracije CD do koncentracije 160 mM, što odgovara takozvanom AL tipu dijagrama (Brewster i Loftsson, 2007). Sa HPBCD posle 160mM koncentracija leka dolazi do postizanja platoa što je indikacija AN tipa dijagrama (Brewster i Loftsson, 2007). Za rastvore vorikonazola i HPBCD, Buchanan i autori (2007) prepoznali su postojanje AL tip dijagrama u nižem opsegu koncentracija HPBCD, kao i postojanje AN tipa dijagrama pri višim koncentracijama. Profili AN su objašnjeni bulk promenama rastvarača uzrokovanih solubilizatorom (HPBCD) i/ili samoasocijaciom solubilizatora pri većim koncentracijama. Slaganje sa linearnim delom krive rastvorljivosti moglo bi da se koristi u proračunu konstante vezivanja, koja pruža informacije o relativnoj jačini interakcije lek:CD. Međutim, rastvorljivost teško rastvorljive lekovite supstance je obično toliko niska da je teško tačno odrediti je, a ta vrednost značajno utiče na tačnost dobijene vrednosti konstante vezivanja (Brewster i Loftsson, 2007; Miro i autori, 2012). Stoga, kada se porede ciklodekstrini u datom medijumu, posmatranje razlika u postignutoj rastvorljivosti leka pri istim koncentracijama CD može biti pogodnije (Buchanan i autori, 2007). Sa 2-O-MBCD se postiže veća rastvorljivost nego sa HPBCD pri istim molarnim koncentracijama. Pošto je nagib prave dobijen sa 2-O- 108 MBCD veći nego sa HPBCD, izgleda da je 2-O-MBCD efikasniji solubilizator za vorikonazol. Jednostavnom analizom dijagrama fazne rastvorljivosti teško je odrediti da li se formiraju jednostavni kompleksi (1:1) ili kompleksi višeg reda (Brewster i Loftsson, 2007; Loftsson i autori, 2005). Stehiometrija sistema se može naslutiti uklapanjem krive sa linearnim, kvadratnim ili kubnim modelom, i u ovom ispitivanju je kriva rastvorljivosti sa HPBCD malo bolje odgovarala kubnoj funkciji (R2=0.978) nego linearnoj i kvadratnoj funkciji (R2=0.958, R2=0.958, respektivno), sugerišući formiranje 1:3 lek:CD kompleksa verovatnije nego 1:1 ili 1:2 kompleksa (Slika 4.3.1-1a). Slična stehiometrija je sugerisana i u patentu za formulaciju vorikonazola sa sulfo-butil-etar-beta-ciklodekstrinom (Harding, 2003). Što se tiče kompleksacije sa 2-O-MBCD, kriva podjednako dobro odgovara linearnoj, kvadratnoj i kubnoj funkciji (R2=0.9990, 0.9992 i 0.9994 respektivno), stoga ne pružajući informaciju o tome da li se grade kompleksi 1:1 ili kompleksi višeg reda (Slika 4.3.1-1b). Za 2-O-MBCD, beta-ciklodekstrin derivat koji još nije u široj upotrebi, navodi se od strane proizvođača (Kleptose® Crysmeb exp e-brošura), da bi solubilizacija lekova u vodenim rastvorima 2-O-MBCD trebalo da bude visoka i linearno zavisna od koncentracije CD. Ne bi trebalo da dođe do komplikacija kao što su samoasocijacija ili nelinearno opadanje efikasnosti solubilizacije pri visokim koncentracijama CD, koje su uobičajene za neke derivate CD kao što je i HPBCD (Buchanan i autori, 2007; Loftsson i autori, 2004; Piel i autori, 2006). Ovo se može objasniti veličinom metil supstituenata, koji su mali i ne funkcionišu kao gosti koji teže da se uklope u šupljinu CD, pri višim koncentracijama CD. Takođe, šupljina beta- ciklodekstrina je blago proširena metil supstituentima, koji su podjednako stereorigidni kao i sama šupljina (Mosher i Thompson, 2007). Sve ovo govori u prilog solubilizacionoj moći 2-O-MBCD, što je u saglasnosti sa dobijenim rezultatima. Owens i autori (2000) su izučavali prirodu interakcije između vorikonazola i brojnih derivata CD i zaključili su da veličina toroidne šupljine CD ali i priroda bočnih lanaca značajno utiču na prirodu kompleksacije, i da je važno razmatranje i trodimenzionalnog prostornog rasporeda svakog ispitivanog stereoizomera vorikonazola. Stoga, primena tehnika molekularnog modelovanja može koristiti u razjašnjavanju prirode interakcije leka i CD dajući predloge za stabilne trodimenzionalne modele kompleksa. 109 4.3.1.3. Primena faktorijalnog dizajna Rezultati analize faktorskih efekata pokazuju da je najznačajniji faktor (p<0.05) za solubilizaciju vorikonazola tip ciklodekstrina (Tabela 4.3.1-2 i 4.3.1-3). Tabela 4.3.1-2. Dizajn eksperimenata i odgovori dobijeni za 23 faktorijalni dizajn Uzorak br. Nezavisno promenljive Odgovor A B C R 1 + 1 + 1 + 1 7.20 2 + 1 - 1 + 1 6.95 3 + 1 + 1 - 1 4.65 4 + 1 - 1 - 1 4.55 5 - 1 + 1 + 1 4.64 6 - 1 - 1 + 1 4.28 7 - 1 + 1 - 1 4.52 8 - 1 - 1 - 1 4.17 Šifre faktora i nivoa faktora: A = tip ciklodekstrina: - 1 odgovara HPBCD, + 1 2-O-MBCD; B = vreme mešanja: - 1 odgovara 30 minuta, + 1 60 minuta; C = količina vorikonazola: - 1 odgovara 500 mg, + 1 1000 mg; R = rastvorljivost vorikonazola (mg/ml). Tabela 4.3.1-3. Rezultati dobijeni korišćenjem 23 faktorijalnog dizajna (ANOVA). Suma Stepeni Srednja F p-vrednost Faktor ili interakcija kvadrata slobode vrednost kvadrata vrednost prob > F Model 10.38 6 1.73 785.86 0.0273 A – tip ciklodekstrina 4.11 1 4.11 1867.45 0.0147 B – vreme mešanja 0.14 1 0.14 64.92 0.0786 C – količina vorikonazola 3.33 1 3.33 1512.21 0.0164 AB interakcija 0.017 1 0.017 7.75 0.2195 AC interakcija 2.78 1 2.78 1261.39 0.0179 BC interakcija 3.170 x 10-3 1 3.170 x 10-3 1.44 0.4423 Ostatak 2.201 x 10-3 1 2.201 x 10-3 Cor Total 10.38 7 R2: 0.9998 Količina leka koji se dodaje u višku je takođe značajna, jer se smatra da se u koncentrovanijim sistemima olakšava interakcija između leka i CD i kompleksi se brže stvaraju (Borghetti i autori, 2009). Jedina značajna interakcija je ona između tipa ciklodekstrina i vremena mešanja. Što je duže vreme mešanja, sa HPBCD se postiže veća rastvorljivost vorikonazola, a sa 2-O-MBCD isti nivo solubilizacije se odigrava za 110 kraće vreme (Tabele 4.3.1-2 i 4.3.1-3). Primećeno je da se posle dodatka 1000 mg vorikonazola rastvara veća količina vorikonazola u ispitivanom periodu mešanja sa 2-O- MBCD, nego sa HPBCD u rastvoru (Tabela 4.3.1-2). To znači da je solubilizacija leka lakša i brža sa 2-O-MBCD, što je takođe pretpostavljeno na osnovu vizuelnog izgleda disperzija (prisustva vidljivih nerastvorenih čestica) tokom mešanja. Stoga, rezultati primene faktorijalnog dizajna sugerišu da je 2-O-MBCD efikasniji solubilizator nego HPBCD, što je u skladu i sa rezultatima ispitivanja fazne rastvorljivosti. 4.3.2. Simulacija molekularnog vezivanja vorikonazol:ciklodekstrin Simulacija molekularnog vezivanja i naknadna optimizacija geometrije kompleksa sa najvećom vrednošću scoring funkcije, pokazala je da je najstabilniji kompleks između vorikonazola i 2-O-MBCD formiran kada je fluoropirimidinski prsten uključen u šupljinu CD (Tabela 4.3.2-1, Slika 4.3.2-1 (a1); ∆Ε= -14.6 kcal/mol), dok je manje stabilan kompleks koji ima triazolni i difluorofenilni prsten u šupljini (Tabela 4.3.2-1, Slika 4.3.2-1 (a2 i a3); ∆Ε= -9.1 i -6.0 kcal/mol, respektivno). Može se reći da su interakcije odgovorne za inkluziju isključivo hidrofobne prirode, jer nema indikacija da postoji sistem vodoničnih veza u optimalnim geometrijama kompleksa. Tabela 4.3.2-1. Semiempirijski nivo energija vezivanja vorikonazol-CD kompleksa, izračunat korišćenjem PM6-DH2 Hamiltonian funkcije. Kompleks broj1 PM6-DH2 energija vezivanja, ∆Ε (kcal/mol) 2-O-MBCD HPBCD 1 -14.6 -88.9 2 -9.1 -84.8 3 -6.0 -57.3 1oznaka kao na Slici 4.3.2-1. Sa druge strane, za HPBCD je pokazano da je najverovatniji i najstabilniji kompleks u kome je difluorofenilni prsten u šupljini CD (Tabela 4.3.2-1, Slika 4.3.2-1 (b1 i b3); ∆Ε= -88.9 i -57.3 kcal/mol, respektivno) ili fluropirimidinski prsten (Tabela 4.3.2-1, Slika 4.3.2-1 (b2); ∆Ε=-84.8 kcal/mol). Owens i autori (2000) su opisujući interakciju HPBCD i vorikonazola i njegovih stereoizomera, diskutovali o verovatnoj inkluziji difluorofenilnog prstena u šupljinu CD, i interakciji bočnih lanaca CD i triazolnog i 111 pirimidinskog prstena vorikonazola. Jake hidrofilne interakcije uključujući vodonične veze između hidroksipropil grupa HPBCD i nekoliko hidrofilnih grupa vorikonazola mogu biti razlog za izračunatu nisku energiju vezivanja unutar kompleksa. Slika 4.3.2-1. Kompleksi sa najnižom energijom vezivanja: vorikonazol-2-O-MBCD (a1-3), i vorikonazol-HPBCD (b1-3), dobijeni pomoću minimizacije energije primenom PM6-DH2 funkcije. Zanimljivo je da je izračunata energija vezivanja vorikonazol:HPBCD kompleksa mnogo niža nego za komplekse sa 2-O-MBCD, što bi značilo da bi HPBCD trebalo da bude mnogo bolji solubilizator vorikonazola (Tabela 4.3.2-1). Neslaganje između računarskih simulacija i eksperimentalnih rezultata može se objasniti fenomenom samoasocijacije koji je karakterističan za HPBCD i formiranjem složenih kompleksa sa HPBCD, što je u skladu i sa rezultatima studija fazne rastvorljivosti na osnovu kojih je pretpostavljeno da se između HPBCD i vorikonazola dešava složenija kompleksacija 112 nego što je to formiranje 1:1 kompleksa. Samoasocijacija HPBCD molekula je vrlo verovatna jer su prisutne grupe koje su donori i akceptori vodoničnih veza na obodu šupljine CD. Formiranje HPBCD-HPBCD kompleksa bi moglo da spreči ulaz vorikonazola u šupljinu CD i formiranje stabilnih kompleksa predviđenih simulacijama vezivanja 1:1. 4.3.3. Karakterizacija praškova sa vorikonazolom 4.3.3.1. Termalna analiza Na DSC termogramima (Slika 4.3.3-1), uočava se topljenje vorikonazola sa maksimumom endoterme topljenja na 133°C, što je u okviru opsega temperature topljenja 128-134°C koji se može naći u literaturi (Herbrecht i autori, 2004), i može se reći da vorikonazol pripada polimorfnom obliku I opisanom u patentu US patent US20090023922 (Benito i autori, 2009). Slika 4.3.3-1. Reprezentativni DSC termogrami: vorikonazol (a), HPBCD (b), 2-O-MBCD (c), fizička smeša vorikonazola i HPBCD (d), fizička smeša vorikonazola i 2-O-MBCD (e), vorikonazol-HPBCD inkluzioni kompleks dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora sa koncentracijom 160mM CD (f), vorikonazol -2-O-MBCD inkluzioni kompleks dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora sa koncentracijom 160 mM CD (g), prašak dobijen zajedničkim usitnjavanjem vorikonazola i HPBCD u prisustvu rastvarača (h) i prašak dobijen zajedničkim usitnjavanjem vorikonazola i 2-O-MBCD u prisustvu rastvarača (i). 113 Kod proizvoda sušenja raspršivanjem, endoterma topljenja izostaje, dok u fizičkim smešama i proizvodima zajedničkog usitnjavanja postoji, što govori o prisustvu vorikonazola u kristalnom obliku (pik topljenja na132°C sa HPBCD i na 133°C sa 2-O- MBCD za fizičke smeše, i za usitnjene proizvode 129°C sa HPBCD, i 131°C sa 2-O- MBCD). Ovo blago smanjenje tačke topljenja može ukazivati na neku vrstu interakcije koja se dešava sa ciklodekstrinima tokom zajedničkog usitnjavanja (Lin i autori, 2012), iako u nekim prethodnim studijama slično smanjenje temperature topljenja vorikonazola u prisustvu polimera nije smatrano značajnim (Beinborn i autori, 2012). Iako metoda zajedničkog usitnjavanja u prisustvu male količine rastvarača može biti privlačna sa aspekta utroška količine rastvarača i energije potrebno je još eksperimentalnog rada kako bi se ispitala mogućnost optimizacije parametara. Odsustvo endoterme topljenja leka u proizvodima osušenim raspršivanjem ukazuje da je ukupna količina vorikonazola u kompleksiranom obliku i amorfna je (Slika 4.3.3-1 f i g). Još jedna zanimljiva karakteristika termograma je prisustvo široke endoterme u opsegu od sobne temperature do 100°C, sa maksimumom u opsegu 79-80°C što verovatno odgovara gubitku vode jako vezane za ciklodekstrin. Među termogramima dobijenih analizom uzoraka osušenih iz rastvora sa različitim koncentracijama CD, nije bilo razlike što može značiti da je u dobijenim rastvorima koji su osušeni raspršivanjem količina CD bila dovoljna da ostvari inkluziju leka u molekularnom stanju. Rezultati termogravimetrijske analize praškova dobijenih različitim metodama su predstavljene u Tabeli 4.3.3-1. Tabela 4.3.3-1. Rezultati termogravimetrijske analize praškova pripremljenih različitim metodama. Uzorak tip CD HPBCD 2-O-MBCD Fizička smeša (CD i lek) 6.04 % 4.04 % Kompleks lek:CD dobijen sušenjem raspršivanjem 2.97 % 7.39 % Uzorak dobijen zajedničkim usitnjavanjem u prisustvu rastvarača (CD i leka) 4.68 % 6.01 % Standardna devijacija <1.2% 114 Rezultati za fizičke smeše i uzorke dobijene usitnjavanjem leka i CD u prisustvu rastvarača, slični su rezultatima dobijenim za čiste ciklodekstrine (Tabela 4.3.1-1). Za uzorke sa dva različita ciklodekstrina, pripremljene sušenjem raspršivanjem pri istim procesnim parametrima, primećuje se da proizvodi sa 2-O-MBCD imaju veći sadržaj vode nego proizvodi sa HPBCD, verovatno zato što postoji razlika u hidrataciji ova dva ciklodekstrina u rastvoru, ili u dehidrataciji tokom sušenja. Formulacija sa 2-O-MBCD je higroskopnije nego sa HPBCD, odnosno teže se suši, što bi moglo da utiče na odnos utroška energije i efektivnosti procesa sušenja raspršivanjem i potencijalno na stepen fizičke i hemijske stabilnosti rezultujućih praškova i budućih čvrstih doziranihoblika, tokom dužeg vremenskog perioda. 4.3.3.2. Infracrvena spektroskopija sa Furijeovom transformacijom (FTIR) Slika 4.3.3-2 pokazuje ATR-FTIR spektar vorikonazola, ciclodekstrina, proizvoda osušenih raspršivanjem i odgovarajućih fizičkih smeša. Vorikonazol (Slika 4.3.3-2a) pokazuje karakteristične trake polimorfa I (patent US20090023922), što je u skladu sa zabeleženim opsegom topljenja na DSC termograma. Slika 4.3.3-2. Reprezentativni ATR-FTIR spektri: vorikonazol (a), HPBCD osušen raspršivanjem (b), 2-O-MBCD osušen raspršivanjem (c), fizička smeša vorikonazola i HPBCD (d), fizička smeša vorikonazola i 2-O-MBCD (e), vorikonazol-HPBCD inkluzioni kompleks dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora sa koncentracijom 160mM CD (f), i vorikonazol -2-O- MBCD inkluzioni kompleks dobijen sušenjem raspršivanjem rastvora sa koncentracijom 160 mM CD (g). 115 Specifično, CN, CF i CC trake istezanja pojavljuju se na 3190-3046 cm-1, 1495-1451 cm-1 i 1585-1451 cm-1 respektivno, u skladu sa navodim Xiang-Gen i autora (2011). FTIR spektri ciklodekstrina osušenih raspršivanjem (Slika 4.3.3-2 b i c) pokazuju široku traku refleksije u 3100-3600 cm-1 sa maksimumom oko 3340 cm-1, što se pripisuje vibracijama istezanja OH grupa, i ukazuje na snažnu asocijaciju hidroksilnih grupa u vidu vodoničnih veza. Međutim, postojanje oštrih pikova manjeg intenziteta u opsegu 3600-3700 cm-1, ukazuju na prisustvo slobodnih OH grupa koje moguće je da pripadaju adsorbovanoj vodi koja nije uključena u vodonične veze. Spektri fizičkih smeša CD i vorikonazola (Slika 4.3.3-2 d i e) pokazuju tipične trake CD i vorikonazola, što znači da ne postoji ili je vrlo slaba interakcija između leka i CD. FTIR spektri dobijeni za vorikonazol-CD komplekse osušene raspršivanjem (Slika 4.3.3-2 f i g) pokazuju samo tipične trake CD, a slobodni vorikonazol se ne može detektovati u uzorcima. Moglo bi se reći da je vorikonazol potpuno uključen u šupljine ciklodekstrina, slično kao što su Yang i autori (2010) povezali odsustvo karakterističnih traka iz FTIR spektra i definisanje mesta kompleksacije itrakonazola i HPBCD, i time potvrdili postojanje pravih inkluzionih kompleksa. Ovi podaci zajedno sa rezultatima studije fazne rastvorljivosti i simulacije molekularnog vezivanja mogu doprineti u definisanju mesta vezivanja leka i CD u kompleksima (Peeters i autori, 2002). 4.3.3.3. Ispitivanje brzine rastvaranja Brzina rastvaranja je ispitivana u tri različita medijuma u cilju procene poboljšanja brzine rastvaranja vorikonazola Slika 4.3.3-3 pokazuje profile brzine rastvaranja za komplekse vorikonazol:HPBCD i vorikonazol:2-O-MBCD, u poređenju sa odgovarajućim fizičkim smešama i čistim vorikonazolom. Među pomenutim uzorcima postoji očigledna razlika u brzini rastvaranja. U fizičkim smešama leka i CD, prisustvo CD doprinelo je poboljšanju brzine rastvaranja in-vitro. Vorikonazol se brže rastvarao iz fizičke smeše sa HPBCD nego iz fizičke smeše sa 2-O- MBCD ili iz kapsula sa čistim vorikonazolom. Razlog za razliku u brzini rastvaranja iz smeša sa dva CD mogao bi biti različita rastvorljivost derivata CD i/ili manja veličina čestica 2-O-MBCD i vazduh adsorbovan na njihovoj površini, što nije bio slučaj sa krupnijim česticama HPBCD. Takođe, tokom 116 pripreme rastvora ciklodekstrina primećeno je da čestice 2-O-MBCD plutaju po površini i bilo je potrebno intenzivnije mešanje kako bi se prašak pokvasio i rastvorio. Slika 4.3.3-3. Profili brzine rastvaranja vorikonazola iz različitih čvrstih uzoraka – uslovi: aparatura II (lopatice), brzina mešanja 50 rpm, 900 ml medijuma: 0.1M hlorovodonična kiselina (pH 1.2) (a), acetatni pufer (pH 4.5) (b) i fosfatni pufer (pH 6.8) (c) Iz uzoraka osušenih raspršivanjem više od 80 % vorikonazola je rastvoreno u sva tri medijuma u roku od 10 minuta, bez obzira na tip ciklodekstrina. Ako se uzme u obzir da je rastvorljivost vorikonazola pH zavisna, zanimljivo je da je profil rastvaranja vorikonazola iz kompleksa osušenih raspršivanjem nezavistan od pH sredine medijuma. 117 Mogućnost promene profila rastvaranja leka putem kompleksacije sa ciklodekstrinima ispitivana je od strane Nacsa i autora (2009) i Buchanan i autora (2007). Poređenjem vrednosti relativne standardne devijacije (predstavljena u vidu tzv. error bars, engl., na Slici 4.3.3-3), zaključuje se da je brzina rastvaranja vrlo brza i ujednačena samo iz uzoraka osušenih raspršivanjem, što je takođe važna karakteristika profila brzine rastvaranja. Na osnovu prikazanih rezultata moglo bi se reći da je kompleksacija vorikonazola sa oba derivata beta-ciklodekstrina dobra formulaciona strategija za poboljšanje rastvorljivosti i brzine rastvaranja. Nije bilo velike razlike između maksimalne rastvorljivosti između kompleksa i smeša leka i CD, verovatno jer su se u slučaju smeša formiranje kompleksa i solubilizacija odigrali u medijumu. Međutim, ova pojava se možda ne bi odigrala u gastrointestinalnom traktu, gde se dešava resorpcija nakon rastvaranja, tako da je očekivano da je prethodno formiranje kompleksa poželjno. 4.3.3.4. Dugoročna stabilnost kompleksa vorikonazol:ciklodekstrin Nakon 12 meseci stajanja u ambijentalnim uslovima ispitivana je stabilnost kompleksa vorikonazol:ciklodekstrin, primenom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije i termogravimetrijske analize. Na termogramima nisu primećeni znaci kristalizacije vorikonazola (potpuno odsustvo endotermnih pikova koji odgovaraju topljenju vorikonazola). Dodatno, ispitivanje sadržaja vode primenom TGA nije pokazalo značajne promene. Ovi rezultati mogu ukazivati na dobru fizičku stabilnost. Iako je inicijalno nivo nečistoća vorikonazola u praškovima bio ispod 0.05%, zabeleženi porast nečistoća nakon 12 meseci u uzorcima sa oba ciklodekstrina ukazuje na potencijalne probleme sa hemijskom stabilnošću (Tabela 4.3.3-2). Što se tiče Nečistoće 3 ili epi-vorikonazola nije zabeležen porast, što znači da postoji mala verovatnoća epimerizacije vorikonazola tokom pripreme kompleksa u rastvoru i tokom sušenja raspršivanjem, i stajanjem tokom vremena. Nečistoća 1 i Nečistoća 2 su degradacioni proizvodi koji su rezultat cepanja molekula vorikonazola na butanolnom lancu (Slika 4.2.5-1). Primećena razlika u nivou nečistoća u kompleksima sa HPBCD i 2-O-MBCD, iako je mala, mogla bi biti u vezi sa razlikama u afinitetu vezivanja i orijentaciji molekula vorikonazola u inkluzionom kompleksu sa različitim derivatima 118 CD, kao što je primećeno i u studiji fazne rastvorljivosti i simulacijama molekularnog vezivanja. U slučaju 2-O-MBCD, nešto proširena šupljina u odnosu na HPBCD mogla bi dodatno doprineti boljoj stabilnosti leka. Tabela 4.3.3-2. Rezultati za nečistoće u praškovima dobijenim sušenjem raspršivanjem posle 12 meseci stajanja. Nečistoća Kompleks sa HPBCD Kompleks sa 2-O-MBCD Nečistoća 11 0.24% 0.16% Nečistoća 22 0.46% 0.31% Nečistoća 33 0.05% 0.06% Ukupne nečistoće 0.75% 0.53% 1Nečistoća 1: 4-etil-5-fluoropirimidin 2Nečistoća 2: 1-(2,4-difluorofenil)-2-(1H-1,2,4-triazol-1-il)etanon 3Nečistoća 3: (2S,3R)-2-(2,4-difluorofenil)-3-(5-fluoropirimidin-4-il)-1-(1H-1,2,4-triazol-1- il)butan-2-ol; (epi-vorikonazol) U svakom slučaju, kompleksacija ni sa HBCD ni sa 2-O-MBCD nije sprečila degradaciju vorikonazola koji je u kompleksu bio prisutan u manje stabilnom, amorfnom obliku. Kao što je pokazano i u nekim drugim studijama, veća pokretljivost amorfnog lek:CD kompleksa može biti uzrok hemijske nestabilnosti bez obzira na hemijsku prirodu bočnog lanca ili dimenzija šupljine CD (Hong i autori, 2011). Drugi razlog za nestabilnost bi mogla biti specifičnost vezane konformacija lek:CD kompleksa, koja nije mogla da stabilizuje lek (Mosher i Thompson, 2007). Rezultati molekularnog modelovanja su otkrili da su delovi molekula vorikonazola koji su unutar šupljine ciklodekstrina zapravo samo njegovi prstenovi (difluorofenil, fluoropirimidin, ili triazol). Stoga, sa oba derivata ciklodekstrina čak i u slučaju formiranja višestrukih kompleksa, najosetljiviji deo molekula vorikonazola, butanol lanac, verovatno bi ostao izvan šupljine CD i stoga nezaštićen od degradacije i formiranja Nečistoće 1 i 2. Moguće je da bi u cilju sprečavanja degradacije vorikonazola u kompleksu, bilo neophodno kao kompleksirajući agens koristiti derivat ciklodekstrina sa većim supstituentima kako bi se obezbedila sterna barijera koja bi mogla da stabilizuje lek (Mosher i Thompson, 2007). 119 4.3.4. Studije rastvorljivosti sa aripiprazolom 4.3.4.1. Studije fazne rastvorljivosti (phase-solubility, engl.) 4.3.4.1.1. Uticaj pH i jonskog sastava medijuma, i dodatka polivinilpirolidona (PVP) na kompleksaciju sa HPBCD Količina ciklodekstrina potrebna da se postigne maksimalna rastvorljivost leka može se odrediti u studijama fazne rasvorljivosti. Aripiprazol je lek baznog karaktera, i pokazuje pH zavisnu rastvorljivost koja je nešto veća u kiselom opsegu pH vrednosti. Procena efekta pH i jonskog sastava medijuma na rastvorljivost aripiprazola u prisustvu CD vršena je sa HPBCD, a kao medijumi su korišćeni: voda, citratni pufer pH 3.0 i fosfatni pufer pH 3.0. Takođe, ispitivan je potencijal za dodatno poboljšanje rastvorljivosti dodatkom male količine PVP pošto je poznato da može imati uticaja na solubilizacioni efekat HPBCD (Mura i autori, 2001). Pored toga, PVP je poznat kao inhibitor nukleacije (Brewster i Loftsson, 2007; Raghavan i autori, 2001), tako da bi mogao da doprinese stabilnosti uzoraka. Rezultati su sumirani na Slici 4.3.4-1 i u Tabelama 4.3.4- 1 i 4.3.4-2. Slika 4.3.4-1. Dijagrami fazne rastvorljivosti za aripiprazol i HPBCD u različitim medijumima. Vidi se da je rastvorljivost aripiprazola u čisto vodenim rastvorima CD niska, ali da se značajno poboljšanje postiže u citratnom puferu pH 3.0 (Tabela 4.3.4-1). Li i autori (1998) su opisali značaj kombinovanog efekta pH i kompleksiranja na rastvorljivost i 120 važnost jonizovanih vrsta u doprinosu sveukupnoj kompleksaciji lekova. Često se pretpostavlja da su prvenstveno nejonizovane vrste odgovorne za formiranje kompleksa i posledični porast rastvoljivosti. Međutim, jonizacija leka takođe može da rezultuje poboljšanjem kompleksacije, i rastvorljivost kompleksa sa jonizovanim lekom može ponekad da bude veća od rastvorljivosti kompleksa sa nejonizovanim lekom. Tabela 4.3.4-1. Uticaj pH i jonskog sastava medijuma na rastvorljivost aripiprazola sa i bez HPBCD Medijum Rastvorljivost aripiprazola (mM) Voda 0.009 Citratni pufer pH 3 1.576 Fosfatni pufer pH 3 2.420 160 mM HPBCD rastvor u vodi 1.508 160 mM HPBCD rastvor u citratnom puferu pH 3 149.884 160 mM HPBCD rastvor u fosfatnom puferu pH 3 15.687 Tabela 4.3.4-2. Uticaj dodatka PVP na rastvorljivost aripiprazola sa i bez HPBCD Medijum Rastvorljivost aripiprazola (mM) Voda 0.009 Citratni pufer pH 3 1.576 Citratni pufer 3, 0.2%w/w PVP 0.934 260 mM HPBCD rastvor u vodi 9.729 260 mM HPBCD rastvor u vodi, PVP/CD 0.0051 10.961 260 mM HPBCD rastvor u vodi, PVP/CD 0.00252 7.788 260 mM HPBCD u citratnom puferu pH 3 172.502 260 mM HPBCD u citratnom puferu pH 3, PVP/CD 0.005a 155.032 260 mM HPBCD u citratnom puferu pH 3, PVP/CD 0.0025b 184.317 1 PVP koncentracija 0.2%w/w 2 PVP koncentracija 0.1%w/w Može se primetiti da je rastvorljivost aripiprazola zavisna ne samo od pH medijuma nego i od tipa pufera prisutnog u medijumu. Poredeći rastvorljivost leka u fosfatnom 121 puferu pH 3.0 (neorganska so) i u citratnom puferu pH 3.0 (hidroksikarboksilna kiselina), u odsustvu HPBCD nema velike razlike. Međutim, u prisustvu HPBCD uticaj vrste pufera je značajan za rastvorljivost leka. Ovaj fenomen su takođe opisali Buchanan i autori (2007) kod antimikotika i HPBCD. Posmatranjem St/So odnosa (St predstavlja rastvorljivost leka u prisustvu HPBCD, So rastvorljivost leka u istom medijumu bez HPBCD), izračunate vrednosti za čisto vodeni medijum su 167.6, za fosfatni pufer 6.5, a za citratni pufer 95.1. Jasno je da ciklodekstrin igra važnu ulogu u solubilizaciji aripiprazola, zajedno sa jonskim sastavom pufera, više nego sama pH vrednost medijuma. Rastvorljivost odgovarajućih kompleksa može biti mnogo veća nego što bi se moglo očekivati povećanjem ukupne rastvorljivosti leka samo pomoću odgovarajućeg podešavanja pH. To je moguće zbog specifične interakcije hidroksi kiseline sa sistemom vodoničnih veza “domaćina“ i/ili modifikacije mreže vodoničnih veza okolnih molekula vode (Redenti i autori, 2000). Lekovi mogu biti jako vezani unutar CD šupljine iako su u jonizovanom obliku zato što se njihov bazni centar (a samim tim i naelektrisanje) može nalaziti prilično daleko od hidrofobnog dela molekula koji se nalazi u šupljini CD, tako da sposobnost kompleksacije nije značajno ugrožena. Dodatno, hidroksi kiselina može da stupi u interakciju sa spoljnim sistemom vodoničnih veza ciklodekstrina mehanizmom koji uključuje vezivanje hidrofobnog dela leka i istovremeno formiranje jakog jonskog para. Redenti i autori (2000) izdvojili su nekoliko zahteva za iskorišćenje tehnologije višekomponentne kompleksacije, među kojima su rastvorljivost leka manja od 0.1 mg/ml, prisustvo amino grupe sa blago baznim karakterom (pKa>5.0). Što se tiče efekta PVP, na Slici 4.3.4-1 vidi se da dodatak PVP (maseni odnos PVP/CD 0.005) dovodi do pada rastvorljivosti, što je u skladu sa nekim prethodnim studijama (Quan i autori, 2009), i može se pripisati kompeticiji polimera i leka za kompleksaciju sa ciklodekstrinom. Međutim, optimizacijom koncentracije PVP moglo bi se izvršiti poboljšanje rastvorljivosti leka što sugerišu rezultati dobijeni u rastvorima ciklodekstrina iste koncentracije, ali sa različitim koncentracijama PVP (različit maseni odnos PVP/CD; Tabela 4.3.4-2). Na osnovu rezultata studija fazne rastvorljivosti sa HPBCD, može se zaključiti da je poboljšanje rastvorljivosti aripiprazola najznačajnije u citratnom puferu pH 3.0. U ovom 122 medijumu, kompleksacija aripiprazola pomoću HPBCD je bila najefikasnija pri koncentraciji 160mM, što se odražava na najmanji maseni odnos CD/rastvoreni lek. 4.3.4.1.2. Analiza dijagrama fazne rastvorljivosti sa HPBCD Generalno, na osnovu oblika kriva rastvorljivosti, može se identifikovati nekoliko tipova dijagrama tj. profila rastvorljivosti prilikom kompleksacije (Loftsson i autori, 2005). Dobijene krive rastvorljivosti u različitim medijumima (Slika 4.3.4-1), pokazuju da su u solubilizaciju aripiprazola uključeni složeni mehanizmi. Rastvorljivost aripiprazola je ispitivana u širokom opsegu koncentracije ciklodekstrina, i u zavisnosti od posmatranog opsega može se prepoznati nekoliko različitih A tipova dijagrama. Kod takozvanog A tipa dijagrama, rastvorljivost leka raste u funkciji koncentracije CD. U vodenom medijumu koji se sastoji samo od aripiprazola i HPBCD, uočava se AP tip dijagrama, sugerišući da se pri višoj koncentraciji CD formiraju kompleksi višeg reda (Slika 4.3.4-2). Pošto se stehiometrija sistema može pretpostaviti uklapanjem dijagrama u linearne, kvadratne ili kubne modele, za ovu krivu kubna funkcija je pokazala najbolje uklapanje (R2=0.996), sugerišući formiranje 1:3 kompleksa (lek(CD)3). Slika 4.3.4-2. Dijagrami fazne rastvorljivosti aripiprazola u HPBCD rastvoru u vodi. Krive dobijene u citratnom puferu sa i bez dodatka PVP (Slika 4.3.4-3) pokazuju da dijagrami mogu biti klasifikovani kao AN tip zato što pri višim koncentracijama CD postoji negativno odstupanje od linearnosti, što znači da je CD manje efektivan pri 123 višim koncentracijama. Najbolje uklapanje dobijeno je takođe sa kubnom funkcijom (R2=0.996 sa PVP, R2=0.987 bez PVP) sugerišući formiranje 1:3 kompleksa (lek(CD)3). Slika 4.3.4-3. Dijagrami fazne rastvorljivosti aripiprazola u medijumima sa najznačajnijim povećanjem rastvorljivosti: citratni pufer pH 3.0 (a) i citratni pufer pH 3.0 sa PVP (b). Slični oblici krive dobijeni su u studijama rastvorljivosti autora Buchanan i drugih (2007) za antimikotike i HPBCD u nekim puferima. Dobijeni AN profili su objašnjeni bulk promenama rastvarača uzrokovanih prisustvom solubilizatora pri različitim koncentracijama i/ili samoasocijaciji solubilizatora (HPBCD) pri višim koncentracijama. Dijagram odnosno profil rastvorljivosti bi takođe mogao biti okarakterisan i kao normalan profil sa negativnom devijacijom pri niskim koncentracijama CD (AL-), sa odsečkom na y-osi u negativnom delu ose. Ovo ponašanje su opisali i Loftsson i autori (2005) i objasnili samoasocijacijom teško rastvornih lekova i lek:ciklodekstrin kompleksa, neinkluzionom kompleksacijom i interakcijama među ekscipijensima. Moguće je da je uočeni porast rastvorljivosti aripiprazola posledica kooperativnog efekta nekoliko različitih solubilizacionih procesa i interakcija. Različite nepravilnosti primećene u dijagramima fazne rastvorljivosti, kao što su značajna devijacija eksperimentalno dobijene rastvorljivosti bez ciklodekstrina od rastvorljivosti koja se očitava na preseku sa y-osom, ili je čak i negativna vrednost, ukazuju na mogućnost formiranja multikomponentnih kompleksa i istovremeno formiranje inkluzionih i neinkluzionih kompleksa, ili fenomen samoasocijacije (Brewster i Loftsson, 2007; Loftsson i autori, 2005; Messner i autori, 2010). 124 4.3.4.1.3. Uticaj tipa ciklodekstrina na rastvorljivost – dijagrami fazne rastvorljivosti Kako bi se ispitao uticaj tipa CD na efikasnost kompleksacije i rastvorljivost aripiprazola, sprovedena je studija fazne rastvorljivosti u rastvorima HPBCD (0- 160mM) i 2-O-MBCD (0-160mM) u vodi i citratnom puferu. Sa oba derivata beta- ciklodekstrina dobijene su slične krive rastvorljivosti, i sa najboljim uklapanjem sa kubnom funkcijom (u vodi: R2=0.996 sa HPBCD, R2=0.992 sa 2-O-MBCD; u citratnom puferu: R2=0.968 sa HPBCD, R2=0.993 sa 2-O-MBCD), i verovatnim formiranjem 1:3 kompleksa (lek(CD)3) (Slika 4.3.4-4). Čini se da se u oba ispitivana medijuma krive malo značajnije razilaze pri koncentraciji CD 160 mM. Slika 4.3.4-4. Krive rastvorljivosti aripiprazola sa HPBCD i 2-O-MBCD u čisto vodenim rastvorima (a) i citratnom puferu pH 3.0 (b). Kako bi se dodatno ispitao uticaj tipa CD na rastvorljivost aripiprazola, primenjen je 23 faktorijalni dizajn. 4.3.4.1.4. Uticaj tipa ciklodekstrina na rastvorljivost – primena faktorijalnog dizajna Faktorijalni dizajn 23 primenjen je kako bi se proverio značaj uticaja tipa CD, koncentracije CD i vremena mešanja na solubilizaciju aripiprazola (Tabela 4.3.4-3). Dobijeni rezultati za rastvorljivost aripiprazola su zatim statistički analizirani kao odgovori na različite kombinacije ispitivanih faktora (Tabela 4.3.4-4). 125 Tabela 4.3.4-3. Dizajn eksperimenata i dobijeni odgovori za 23faktorijalni dizajn Eksperiment br. Nezavisno promenljive Odgovor A B C R 1 + 1 + 1 + 1 18.98 2 + 1 - 1 + 1 12.86 3 + 1 + 1 - 1 13.33 4 + 1 - 1 - 1 10.43 5 - 1 + 1 + 1 4.79 6 - 1 - 1 + 1 3.28 7 - 1 + 1 - 1 3.91 8 - 1 - 1 - 1 2.73 Šifre realnih vrednosti: A = koncentracija CD: - 1 odgovara 12.5%, + 1 25%; B = tip CD: - 1 odgovara HPBCD, + 1 2-O-MBCD; C = vreme mešanja: - 1 odgovara 60 minuta, + 1 120 minuta; R = rastvorljivost aripiprazola (mg/ml). Tabela 4.3.4-4. Rezultati dobijeni primenom 23 faktorijalnog dizajna (ANOVA) Suma Stepeni Srednja vrednost F p-vrednost Faktor ili interakcija kvadrata slobode kvadrata vrednost prob > F Model 237.42 3 79.14 24.12 0.0051 A – koncentracija CD 209.00 1 209.00 63.71 0.0013 B – tip CD 17.19 1 17.16 5.23 0.0841 C – vreme mešanja 11.27 1 11.27 3.43 0.1375 Residual 13.12 4 3.28 Cor Total 250.55 7 R2: 0.9476 U rastvorima iste koncentracije CD i sa istim vremenima mešanja, dobijena je nešto veća rastvorljivost aripiprazola sa 2-O-MBCD nego sa HPBCD što može da znači da je kompleksacija nešto efikasnija i lakša sa 2-O-MBCD i sa ovom model supstancom (0.05 1.60 što svrstava dobijeni prašak u vrlo, vrlo loše protočne praškove, što je očekivano s obzirom na veličinu čestica praška (‹1174› Powder Flow in USP 29–NF 24). 4.3.7.6.3. Protočnost praškova merenjem protoka kroz otvor Zbog izražene voluminoznosti i kohezivnosti praška a samim tim i loše protočnosti dobijenih praškova, određivanje protočnosti merenjem protoka kroz otvor, merenje nije moglo biti izvršeno ni sa najvećim promerom otvora na levku (12.5 mm), uz korišćenje vibracije kako bi se podstakao protok praška. Treba napomenuti da se na laboratorijskom uređaju za raspršivanje prilikom sušenja rastvora uvek dobijaju vrlo sitne čestice, koje se inače karakterišu lošom protočnošću, dok se u pilot i industrijskim uređajima zbog veće komore za sušenje i mogućnosti da se ostvari dobro sušenje krupnijih kapi dobijaju krupnije sferne čestice tj. može se očekivati da bi se dobili znatno protočniji praškovi. 149 4.3.7.6.4. Ispitivanje stabilnosti kompleksa aripiprazol:ciklodekstrin Dugoročna stabilnost kompleksa je bila ispitivana posle 6 i 12 meseci skladištenja u ambijentalnim uslovima primenom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije i termogravimetrijske analize (rezultati nisu prikazani). Na termogramima nije bilo uočeno prisustvo kristalizacije aripiprazola (potpuno odsustvo endotermnih pikova koji odgovaraju topljenju aripiprazola), što sugeriše da su inkuzioni kompleksi stabilni, i da se tokom dužeg perioda skladištenja u blagim ambijentalnim uslovima ne dešava spontana kristalizacija leka. Kako bi se ispitala stabilnost praškova u nešto stresnijim uslovima, izvršeno je kondicioniranje praškova pod uslovima dugotrajnog starenja (25°C/60% RH) i ubrzanog starenja (40°C/75% RH) u periodu od 90 dana i praćeni su sadržaj, nečistoće, profil brzine rastvaranja i sadržaj vlage (Tabela 4.3.7.10). Primećeno je da već nakon nekoliko dana kondicioniranja pod uslovima 40°C/75% RH u otvorenim bočicama započinje promena konzistencije iz praškaste u providnu staklastu masu (Slika 4.3.7-7). U ostalim uzorcima to nije bio slučaj. (a) (b) Slika 4.3.7-7. Izgled praška pre kondicioniranja (a) i nakon 2 dana kondicioniranja u otvorenim bočicama u uslovima ubrzanog starenja (40°C/75% RH) (b). Primećen je i porast sadržaja vlage u skladu sa uslovima kondicioniranja, kao i to da postoji određena razlika u rezultatima dobijenim gravimetrijskom ili titrimetrijskom (Karl Fisher) metodom, što govori da pored slobodne vode, u uzorcima postoji i voda koja je u vezanom stanju. Dobijeni su nešto niži rezultati za sadržaj aripiprazola, jer tokom merenja praška za analizu nije uzet u obzir sadržaj vlage, a kada se to uzme u 150 obzir i dobijeni sadržaj se koriguje, zapaža se da tokom 90 dana nije došlo do pada sadržaja aripiprazola ni u jednom uzorku. U skladu sa tim nakon 90 dana kondicioniranja nisu pronađene degradacione ni druge nepoznate nečistoće, čak ni u uzorcima koji su promenili konzistenciju (90 dana, 40°C/75% RH) što govori o relativno dobroj hemijskoj stabilnosti aripiprazola u kompleksu sa HPBCD. Tabela 4.3.7.10. Rezultati ispitivanja stabilnosti kompleksa aripiprazol:HPBCD posle 90 dana kondicioniranja Uslov kondic. Test Inicijalno Uslovi dugotrajnog starenja (25°C/60% RH) Uslovi ubrzanog starenja (40°C/75% RH) Zatvorena bočica Otvorena bočica Zatvorena bočica Otvorena bočica Sadržaj aripiprazola 94.4% 91.6% 88.8% 91.9% 85.4% Nečistoće N-oksid Dehidro Nepoznate Ukupno <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% <0.10% Gubitak sušenjem 3.5% 5.2% 9.0% 4.2% / Sadržaj vode / 7.1% 11.3% 6.2% 14.1% Korigovani sadržaj aripiprazola 97.9% 98.7% 100.1% 98.1% 99.5% Profil brzine rastvaranja (masa punjenja kapsule uvećana za sadržaj vode) Postiže se plato posle 10 minuta na oko 100% Postiže se plato posle 10 minuta na oko 100% Postiže se plato posle 10 minuta na oko 100% Postiže se plato posle 10 minuta na oko 85% Postiže se plato posle 10 minuta na oko 85% Izgled praška Beli prašak Beli prašak Beli prašak Beli prašak Providna staklasta masa Međutim, što se tiče profila brzine rastvaranja, plato se postiže već nakon 10 minuta i u uslovima ubrzanog starenja zabeležen je pad od oko 15%, što bi moglo ukazivati na neki vid fizičke nestabilnosti kompleksa u stres uslovima, koja bi mogla dovesti do destabilizacije kompleksa i “izlaska” određene frakcije aripiprazola iz kompleksa i 151 posledično pada rastvorljivosti. U cilju boljeg razumevanja ove pojave bilo bi neophodno sprovesti dodatna ispitivanja. Pošto se radi o uzorcima koji su amorfne prirode, očekivano je da postoji veća higroskopnost i određena tendencija ka fizičkim promenama, tako da je svakako neophodno tokom proizvodnje i skladištenja obezbediti uslove niske relativne vlage od najviše 25% RH i temperature oko 25°C, slično uslovima koji se propisuju prilikom proizvodnje efervescentnih formi koje su takođe osetljive na uticaj vlage. 152 5. ZAKLJUČAK Prvi deo istraživanja odnosio se na razvoj procesa sušenja raspršivanjem kao tehnologije pogodne za obezbeđivanje homogenosti praškova i, posledično, ujednačenosti doziranja nisko doziranih lekovitih supstanci (model supstanca naratriptan hidrohlorid). • Efekti ispitivanih procesnih parametara sušenja raspršivanjem (temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe, brzina aspiratora, koncentracija rastvora) na karakteristike kompozitnog praška naratriptan/laktoza/maltodekstrin (sposobnost efikasnog prikupljanja odnosno prinos, sadržaj vlage i srednju veličina čestica) evaluirani su primenom RSM i MLP neuronske mreže. o Primena frakcionog faktorijalnog dizajna (24-1) kao skrining metode omogućila je procenu značajnosti ispitivanih parametara, na osnovu koje je iz daljeg istraživanja isključena brzina aspiratora, što je pojednostavilo dalji razvoj procesa sušenja raspršivanjem. o Primena centralnog kompozitnog dizajna, metodologije površine odgovora (RSM) i veštačke neuronske mreže tipa višeslojnog perceptrona (MLP) omogućila je modelovanje i karakterizaciju procesa sušenja raspršivanjem. Razvijeni su značajni modeli (p-vrednost<0.05). Parametar koji je imao najveći uticaj na svaki ispitivani odgovor bila je brzina pumpe, odnosno značajno je uticala na prinos, sadržaj vlage i veličinu čestica. Interakcija između temperature ulaznog vazduha i koncentracije rastvora je bila jedina statistički značajna interakcija, i uticala je na sadržaj vlage. Parametri koncentracija rastvora i brzina pumpe imali su najveći uticaj na veličinu čestica. Sušenjem odabrane formulacije dobijeni su prinosi koji se smatraju relativno dobrim za rad na laboratorijskom uređaju za sušenje raspršivanjem (63.8-87.3%), a sadržaj vlage u dobijenim praškovima kretao se od 2.3% do 3.6%. Zaključeno je da je za postizanje što boljeg proizvodnog prinosa a što manjeg sadržaja vlage u prašku, kao osnovnih parametara kvaliteta procesa i proizvoda, potrebno da se procesni parametri izbalansiraju kako bi se obezbedilo što efikasnije sušenje i separacija 153 čestica (kapi optimalne veličine, koncentracije, viskoziteta, dovoljno toplotne energije naspram količine tečnosti koja se dovodi u sistem i koja treba da ispari). o Poređenjem dve primenjene metodologije, RSM i MLP, može se zaključiti da obe imaju svoje prednosti i nedostatke. Koristeći RSM, moguće je identifikovati efekte nezavisnih promenljivih i njihove interakcije. Lako se koristi u slučaju da postoji jedan ili dva odgovora. Međutim, kod sistema kod kojih postoji veliki broj odgovora kao što je to slučaj sa sušenjem raspršivanjem, primena MLP mreže rezultuje modelom koji može da optimizuje odgovore istovremeno sa boljom korelacijom između predviđenih i zabeleženih rezultata (dobijeni R2 za odgovore prinos: 0.842 odnosno 0.898; sadržaj vlage: 0.550 odnosno 0.642; srednju veličinu čestica: 0.712 odnosno 0.779 i temperaturu izlaznog vazduha 0.862 odnosno 0.933, za modele RSM1 odnosno MLP1, respektivno). Eksperimentalni dizajn i veštačke neuronske mreže pokazali su se kao korisne QbD alatke u optimizaciji procesa sušenja raspršivanjem, i definisanju prostora za dizajn u kojem se postižu najbolji procesni prinosi, i optimalne karakteristike praška. Kombinovana primena ove dve metodologije može dodatno doprineti poboljšanju razumevanja i kvaliteta razvoja procesa. o Ispitivanjem novih načina kombinovanja RSM i MLP prepoznat je potencijal primene MLP u dopunjavanju podataka u setu definisanom eksperimentalnim dizajnom neophodnim za primenu RSM, jer može da omogući smanjenje broja praktično izvedenih eksperimenata (modeli RSM2: dobijeni R2 za odgovore prinos 0.828; i temperaturu izlaznog vazduha 0.786). Međutim, mreža koja se koristi u ove svrhe morala bi da bude dovoljno robusna. Takođe je prepoznat i potencijal primene RSM u dobijanju matematičkih modela korišćenjem predviđanja MLP u cilju boljeg razumevanja procesa (modeli RSM3: dobijeni R2 za odgovore prinos 0.994; sadržaj vlage 0.961; temperaturu izlaznog vazduha 0.916). Na taj način je omogućen prikaz veza između faktora i odgovora koje su mnogo složenije nego što pokazuju modeli RSM1, što bi mogao biti razlog za bolju sposobnost predviđanja modela MLP1. Zaključeno je da se kombinovanom primenom objedinjuju prednosti obe metodologije zahvaljujući čemu je poboljšano se razumevanje procesa. 154 o Nakon izvršene analize, pomoću softvera Design-Expert® 7.0.0 (Stat-Ease Inc, SAD) primenom pristupa poželjnosti (engl. Desirability approach) izvršena je numerička optimizacija procesnih parametara za rastvor koncentracije 25 %, sa zahtevima za postizanje što većeg prinosa i što manjeg sadržaja vlage u prašku. Korišćenjem modela RSM1 i RSM3, definisani su optimalni procesni parametri: brzina pumpe 10%, temperatura ulaznog vazduha 190°C, sa dobijenim vrednostima parametra poželjnost (koji istovremena balansira sve postavljene ciljeve) 0.860, i 0.844, za modele RSM1, i RSM3 respektivno. Izveden je eksperiment pod definisanim procesnim parametrima, i dobijeni su rezultati slični predviđenim vrednostima (dobijeni rezultati za prinos: 82.62%, 82.41%, 85.76% i gubitak sušenjem: 2.57%, 2.65%, 2.50%, za RSM1 predviđanje, RSM3 predviđanje, eksperimentalni rezultat, respektivno). • Nakon izvršene optimizacije sušenja raspršivanjem odabrane formulacije izvršena je karakterizacija dobijenog praška. o Sušenjem raspršivanjem rastvora ispitivane formulacije dobijen je amorfni prašak (odsustvo karakterističnih pikova kod DSC termograma i FTIR spektara), ujednačenog sastava (RSD 0.23%), relativno dobre fizičke stabilnosti tokom skladištenja na sobnoj temperaturi, a u narednim fazama ispitivanja potrebno bi bilo ispitati i hemijsku stabilnost formulacije. o Na laboratorijskom uređaju za raspršivanje prilikom sušenja rastvora u skladu sa očekivanjima, dobijene su vrlo sitne čestice (2.67-7.28 µm), odnosno voluminozni prašak (0.29 g/ml), koji se karakteriše lošom protočnošću, dok se u pilot i industrijskim uređajima zbog veće komore za sušenje i mogućnosti da se ostvari dobro sušenje krupnijih kapi i dobiju krupnije sferne čestice, može očekivati da bi se dobili znatno protočniji praškovi. o Vizuelizacija čestica je vršena pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije. Primećeno je da su dobijene čestice sfernog oblika i glatke površine, što je uobičajeno za sušenje raspršivanjem rastvora lako rastvorljivih komponenti. Zapaženo je i da su neke čestice smežurane, što se pripisuje razlikama u izloženosti kapi tokom prolaska kroz komoru. Čestice nastale pri većim brzinama sušenja smežuranije su usled kolapsa koji im se dešava tokom procesa, dok su čestice nastale pri manjim brzinama sušenja sfernijeg oblika. 155 Drugi deo istraživanja odnosio se na razvoj procesa sušenja raspršivanjem u postupku proizvodnje praška sa teško rastvorljivim model supstancama, u cilju poboljšanja rastvorljivosti formiranjem kompleksa sa ciklodekstrinima (model supstance vorikonazol i aripiprazol). • Sa model supstancom vorikonazolom sprovedene su studije rastvorljivosti sa HPBCD i 2-OMBCD u vodi, i izvršena je simulacija molekularnog vezivanja sa semiepmirijskom optimizacijom geometrije kompleksa sa HPBCD i 2-O-MBCD. Zatim je izvršena karakterizacija praškova dobijenih sušenjem raspršivanjem rastvora kompleksa lek:CD u poređenju sa smešama lek:CD. o Prema izvedenim studijama rastvorljivosti sa vorikonazolom, 2-O-MBCD derivat je efikasniji u kompleksaciji vorikonazola nego HPBCD, što je pokazano većim nagibom dobijene krive rastvorljivosti. To je potvrđeno studijom u vidu faktorijalnog eksperimentalnog dizajna, gde je među ispitivanim faktorima (tip CD, vreme mešanja, količina vorikonazola) za solubilizaciju najznačajniji faktor bio tip CD (p<0.05), i kompleksacija se lakše i brže odigravala sa 2-O-MBCD. Na osnovu studija rastvorljivosti uklapanjem dobijenih kriva u linearne, kvadratne i kubne modele, zaključeno je da je najverovatnija stehiometrija vezivanja lek:HPBCD 1:3 jer je najveći koeficijent korelacije dobijen kod kubnog modela (AN tip dijagrama, R2=0.978 naspram R2=0.958 i R2=0.958 za linearnu i kvadratnu funkciju, respektivno). Što se tiče kompleksacije sa 2-O- MBCD, kriva podjednako dobro odgovara linearnoj, kvadratnoj i kubnoj funkciji (R2=0.9990, R2=0.9992 i R2=0.9994 respektivno), stoga ne pružajući informaciju o tome da li se grade kompleksi 1:1 ili kompleksi višeg reda. o Simulacija molekularnog vezivanja i naknadna optimizacija geometrije kompleksa, pokazala je da je najstabilniji kompleks između vorikonazola i 2-O- MBCD formiran kada je fluoropirimidinski prsten uključen u šupljinu CD (∆Ε= -14.6 kcal/mol), dok je manje stabilan kompleks koji ima triazolni i difluorofenilni prsten u šupljini (∆Ε= -9.1 i -6.0 kcal/mol, respektivno). Sa druge strane, za HPBCD je pokazano da je najverovatniji i najstabilniji kompleks, u kome je difluorofenilni prsten u šupljini CD (∆Ε= -88.9 kcal/mol), ili fluropirimidinski prsten (∆Ε=-84.8 kcal/mol). Uočena je izražena razlika u 156 afinitetu vezivanja lek:CD 1:1, gde je sa HPBCD dobijeno da se formiraju kompleksi mnogo niže energije vezivanja (-14.6 kcal/mol) u odnosu na 2-O- MBCD (-88.9 kcal/mol). Ovo neslaganje između predviđenih i eksperimentalno dobijenih sposobnosti solubilizacije HPBCD sugeriše da je verovatnije da između leka i CD postoji višestruko umesto 1:1 vezivanje, što je u skladu sa rezultatima studije fazne rastvorljivosti. o Sušenjem raspršivanjem rastvora kompleksa sa dva tipa CD pri istim uslovima u slučaju kompleksa sa 2-O-MBCD dobijene su veće vrednosti za sadržaj vlage (7.39%) nego sa HPBCD (2.97%) što može ukazivati na veću higroskopnost formulacije sa 2-O-MBCD, ali ova pojava nije rezultovala izraženijom degradacijom. Sa aspekta pripremanja visoko i lako rastvorljivih inkluzionih kompleksa vorikonazola (brzina rastvaranja više od 80 % leka za 10 minuta), pokazalo se da je sušenje raspršivanjem efikasna tehnika za sa oba ispitivana derivata CD. Proizvodi osušeni raspršivanjem čuvani tokom dužeg vremena u blagim ambijentalnim uslovima su bili bez kristalne lekovite supstance (odsustvo karakterističnih pikova kod DSC termograma i FTIR spektara) i posedovali su veću rastvorljivost i brzinu rastvaranja. Međutim, u kompleksu sa oba ispitivana derivata vorikonazol nije bio dovoljno zaštićen od hemijske degradacije (Nečistoća 1: 0.24%, 0.16%; Nečistoća 2: 0.46%, 0.31% u kompleksu sa HPBCD, odnosno 2-O-MBCD, respektivno). Rezultati molekularnog modelovanja su otkrili da su delovi molekula vorikonazola koji su unutar šupljine ciklodekstrina zapravo samo njegovi prstenovi (difluorofenil, fluoropirimidin, ili triazol). Stoga, sa oba derivata ciklodekstrina čak i u slučaju formiranja višestrukih kompleksa, najosetljiviji deo molekula vorikonazola, butanolni lanac, verovatno bi ostao izvan šupljine CD i stoga nezaštićen od degradacije. Ovaj problem ukazuje na potrebu za dodatnim ispitivanjima i optimizacijom formulacije. o Kombinovanje primenjenih metoda pomoglo je u unapređenju razumevanja prirode kompleksacije vorikonazola sa dva ispitivana derivata CD i kako ona može uticati na rastvorljivost, brzinu rastvaranja i stabilnost leka. • Sa model supstancom aripiprazolom sprovedene su studije rastvorljivosti sa HPBCD u vodi, fosfatnom puferu pH 3, citratnom puferu pH 3 sa i bez PVP, i sa 2- 157 O-MBCD u vodi i citratnom puferu 3, i izvršena je simulacija molekularnog vezivanja sa dva izomera HPBCD. Zatim je izvršena karakterizacija praškova dobijenih sušenjem raspršivanjem rastvora kompleksa lek:CD u poređenju sa smešama lek:CD. o Kapacitet solubilizacije aripiprazola sa HPBCD zavisio je od pH i jonskog sastava rastvora pufera više nego od tipa ciklodekstrina, a maksimalna solubilizacija je postignuta u citratnom puferu pH 3.0. U ovom medijumu, kompleksacija aripiprazola pomoću HPBCD je bila najefikasnija pri koncentraciji 160mM, što se odražava na najmanji maseni odnos CD/rastvoreni lek. Na osnovu studija rastvorljivosti uklapanjem dobijenih kriva u linearne, kvadratne i kubne modele, zaključeno je da je najverovatnija stehiometrija vezivanja lek:ciklodekstrin 1:3 jer je najveći koeficijent korelacije dobijen kod kubnog modela (u vodi je prepoznato postojanje AP tipa dijagrama, R2=0.996; u citratnom puferu pH 3, AN tip dijagrama, R2=0.996 i R2=0.987 sa PVP, odnosno bez PVP, respektivno). Različite nepravilnosti primećene u dijagramima fazne rastvorljivosti, kao što su značajna devijacija eksperimentalno dobijene rastvorljivosti vorikonazola bez ciklodekstrina od rastvorljivosti koja se očitava na preseku sa y-osom, ili čak i negativna vrednost (AL- tip dijagrama), ukazuju na mogućnost formiranja multikomponentnih kompleksa i istovremeno formiranje inkluzionih i neinkluzionih kompleksa, ili fenomen samoasocijacije. Na osnovu dobijenih rezultata sa PVP, pretpostavlja se da bi prisustvom PVP u rastvoru za sušenje raspršivanjem moglo značajno da se utiče na kapacitet solubilizacije aripiprazola, ali potrebno je izvesti još eksperimenata kako bi se taj efekat u potpunosti razumeo. Uporedne studije rastvorljivosti sa 2-O-MBCD pokazale su da je efikasnost kompleksiranja sa oba tipa CD slična (uklapanje dijagrama rastvorljivosti sa kubnim funkcijama: u vodi R2=0.996 sa HPBCD, R2=0.992 sa 2-O-MBCD; u citratnom puferu R2=0.968 sa HPBCD, R2=0.993 sa 2-O-MBCD). o Simulacije molekularnog vezivanja su potvrdile sposobnost aripiprazola da gradi stabilne inkluzione komplekse sa HPBCD i sugerisale su da su komplikovane interakcije posledica fleksibilnosti butanolnog dela molekula aripiprazola, i postojanja različitih izomera HPBCD. Najstabilniji kompleks se formira kada 158 aripiprazol zauzima savijenu konformaciju, iako je moguće formiranje kompleksa i kada je u linearnoj konformaciji. Postojanje vodonične veze između N-H vodonika aripiprazola i susednog O-H kiseonika HPBCD sa visokom energijom –0.54 kcal/mol ukazuje na značaj interakcija u vidu vodoničnih veza u stabilizaciji kompleksa. o Sušenje raspršivanjem rastvora ciklodekstrina pokazalo se kao efikasna tehnika za pripremanje visoko i lako rastvorljivih inkluzionih kompleksa aripiprazola sa oba ispitivana derivata CD (brzina rastvaranja više od 80 % leka za 10 minuta). Proizvodi osušeni raspršivanjem čuvani tokom dužeg vremena u blagim ambijentalnim uslovima su bili bez kristalne lekovite supstance (odsustvo karakterističnih pikova kod DSC termograma i FTIR spektara) i posedovali su veću rastvorljivost i brzinu rastvaranja. Tokom kondicioniranja u stres uslovima potvrđena je dobra hemijska stabilnost aripiprazola (sve nečistoće manje od 0.05%), ali je primećeno sniženje platoa u profilu brzine rastvaranja (sa oko 100 % na oko 85 %), što može biti posledica fizičke nestabilnosti kompleksa. U cilju razumevanja ove pojave potrebno bi bilo sprovesti dodatna ispitivanja. • U cilju modelovanja i karakterizacije, kao i optimizacije procesa sušenja raspršivanjem formulacije sa ciklodekstrinom, na odabranoj formulaciji sa aripiprazolom primenjeni su metodologija površine odgovora (RSM) i veštačke neuronske mreže (ANN). Odabrana je formulacija aripirazola sa HPBCD čiji se kompleks priprema u citratnom puferu pH 3.0, a zatim prevodi u prašak sušenjem raspršivanjem sa koncentracijom leka u prašku od 5 %. Efekti ispitivanih procesnih parametara sušenja raspršivanjem (temperatura ulaznog vazduha, brzina pumpe, koncentracija rastvora) na karakteristike kompozitnog praška lek:CD (sposobnost efikasnog prikupljanja proizvoda odnosno prinos, i sadržaj vlage) evaluirani su primenom RSM i MLP neuronske mreže. o Primena centralnog kompozitnog dizajna, metodologije površine odgovora (RSM) i veštačke neuronske mreže tipa višeslojnog perceptrona (MLP) omogućila je modelovanje i karakterizaciju procesa sušenja raspršivanjem. Razvijeni su značajni modeli (p-vrednost<0.05). Analiza rezultata nije pokazala postojanje statistički značajnih interakcija među faktorima za odabranu formulaciju. Samo kod proizvodnog prinosa su dobijeni polinomi drugog reda 159 koji opisuju postojanje kvadratnog efekta brzine pumpe. Koncentracija rastvora je imala negativan uticaj na proizvodni prinos, slično kao i u drugim istraživanjima. Pored brzine pumpe, značajan uticaj na sadržaj vlage imala je i temperatura ulaznog vazduha. Zaključeno je da je za postizanje što boljeg proizvodnog prinosa a što manjeg sadržaja vlage u prašku, kao osnovnih parametara kvaliteta procesa i proizvoda, potrebno da se procesni parametri izbalansiraju kako bi se obezbedilo što efikasnije sušenje i separacija čestica. o Bolja predviđanja su dobijena pomoću MLP jer poseduju bolju sposobnost modelovanja nelinearnih, složenih sistema, i jer postojanje složenih interakcija nije moglo biti modelovano primenom RSM (prinos R2MLP1=0.854; R2RSM1=0.846; sadržaj vlage R2MLP1=0.886; R2RSM1=0.871; temperatura izlaznog vazduha R2MLP1=0.893; R2RSM1=0.899). o U dopunjavanju dela podataka koji pripadaju eksperimentalnom dizajnu korišćene su dve veštačke neuronske mreže razvijene su iz manje količine podataka, sa različitim kvalitetom predviđanja (MLP2a i MLP2b modeli: R2 je bio veći kod MLP2a modela: R2=0.872, R2=0.918 i R2=0.873, u poređenju sa MLP2b modelom: R2=0.777, R2=0.851 i R2=0.852 za izlaze prinos, sadržaj vlage i temperaturu izlaznog vazduha, respektivno); dale su relativno dobre rezultate imajući u vidu broj eksperimentalnih podataka korišćenih u modelovanju. Obradom dobijene grupe podataka koja se satojala delom od eksperimentalnih, a delom od predviđenih rezultata, razvijeni su modeli (RSM2a i RSM2b modeli). Model sa boljom sposobnošću predviđanja je bio RSM2a model, što je bila posledica boljih preformansi MLP2a modela koji je korišćen za dopunjavanje grupe podataka u sklopu CCD (prinos: R2RSM2a=0.828; R2RSM2b=0.338; sadržaj vlage: R2RSM2a=0.783; R2RSM2b=0.656, i temperatura izlaznog vazduha: R2RSM2a=0.856; R2RSM2b=0.737). Ova činjenica potvrđuje pretpostavku da se pomoću eksperimentalnog dizajna (DOE) mogu obezbediti podaci boljeg kvaliteta jer iz njih proizilaze modeli koji bolje opisuju sistem i vrše tačnija predviđanja, time doprinoseći boljem razumevanju procesa, u poređenju sa eksperimentima tipa pokušaj-greška koji nisu sistematično osmišljeni. Sa druge strane, ideja korišćenja veštačkih neuronskih mreža u dopunjavanju nedostajućih podataka specifičnog eksperimentalnog dizajna i 160 razvoj RSM modela bez praktičnog izvođenja svih, dizajnom predviđenih, eksperimenata i dalje ostaje privlačna. o Ispitan je potencijal primene modelovanja zasnovanog na DOE u dešifrovanju “crne kutije” veštačkih neuronskih mreža (definisanje značaja i veza među faktorima), tako što su predviđanja MLP1 modela za sve eksperimente u okviru CCD, obrađena primenom RSM (model RSM3). Najbolja predviđanja (najbolji R2) u istraživanju dao je MLP1 model zato što je razvijen iz najveće grupe podataka, i zbog toga su njegova predviđanja korišćena u modelovanju RSM3 (prinos: R2=0.931; sadržaj vlage: R2=0.920; temperatura izlaznog vazduha: R2=0.941). Poređenjem sa modelima RSM1 razvijenim pomoću eksperimentalnih vrednosti, iako su izračunati koeficijenti bili slični za RSM1 i RSM3, glavna razlika kod RSM3 je bila ta da su sva tri procesna parametra prepoznata kao značajna za praćene odgovore, što bi moglo objasniti zašto su njihova predviđanja bila najbolja. o Zaključeno je da svaka od primenjenih metodologija u modelovanju sušenja raspršivanjem ima svoje prednosti i nedostatke, i kada je potrebno izvršiti karakterizaciju i uspostaviti bolje razumevanje procesa najbolje je kombinovati više metoda. o Primenom pristupa poželjnosti koji uzima u obzir definisane ciljne vrednosti više odgovora istovremeno, za odabranu formulaciju definisani su optimalni procesni parametri sušenja raspršivanjem za rastvor koncentracije 25% (određena kao najpogodnija za kompleksaciju): brzina pumpe 10 %, temperatura ulaznog vazduha 180°C. Izvedene su tri uzastopne manje probe i proizvedena je još jedna veća šarža. Vrednosti dobijene za prinos, sadržaj vlage i temperaturu izlaznog vazduha bile su uporedive sa predviđenim vrednostima. Za proizvodni prinos uočena je nešto veća razlika između predviđenih i realno dobijenih vrednosti, što bi se i moglo očekivati ako se uzme u obzir da je parametar Lack of fit (mera neusklađenosti) za ovaj model bio nešto veći nego kod modela za druge praćene odgovore. Kod veće šarže (Proba 4), primećeno je da je prinos nešto manji nego kod manjih proba. Ovo se može objasniti razlikama u dizajnu ciklonskog separatora koji se koristi kod malih i velikih šarži rastvora za sušenje, koji u slučaju većih šarži nije tako efikasan u odvajanju sitnijih čestica 161 kao visoko-efikasan ciklon specijalno dizajniran i uparen sa kolektorom pogodnim za manje šarže. Nakon izvršene optimizacije sušenja raspršivanjem odabrane formulacije izvršena je dodatna karakterizacija dobijenog praška. Vizuelizacija čestica je vršena pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije. Fotomikrografije pokazuju da su dobijene čestice sfernog oblika, glatke do vrlo smežurane površine, a primećeno je i prisustvo šupljih čestica. Šuplja unutrašnjost može nastati zbog širenja gasa u kapima sa formirajućim filmom (ljuskom) koji teško propušta paru, ili zbog vazduha zarobljenog u tečnosti. Na laboratorijskom uređaju za raspršivanje prilikom sušenja rastvora u skladu sa očekivanjima, dobijene su vrlo sitne čestice (5-15µm), odnosno voluminozni prašak (0.21 g/ml). Dugoročna stabilnost kompleksa je bila ispitivana posle 6 i 12 meseci skladištenja u ambijentalnim uslovima primenom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije i termogravimetrijske analize. Na termogramima nije bilo uočeno prisustvo kristalizacije aripiprazola (potpuno odsustvo endotermnih pikova koji odgovaraju topljenju aripiprazola), što sugeriše da su inkuzioni kompleksi stabilni, i da se tokom dužeg perioda skladištenja u blagim ambijentalnim uslovima ne dešava spontana kristalizacija leka. Ispitana je stabilnost praškova u nešto stresnijim uslovima, kondicioniranjem praškova pod uslovima dugotrajnog starenja (25°C/60% RH) i ubrzanog starenja (40°C/75% RH) u periodu od 90 dana i praćeni su sadržaj, nečistoće, profil brzine rastvaranja i sadržaj vlage. Nakon 90 dana kondicioniranja nisu pronađene degradacione ni druge nepoznate nečistoće, čak ni u uzorcima koji su promenili konzistenciju (90 dana, 40°C/75% RH) što govori o relativno dobroj hemijskoj stabilnosti aripiprazola u kompleksu sa HPBCD. Međutim, što se tiče profila brzine rastvaranja, iako se plato u brzini rastvaranj postiže već nakon 10 minuta, u uslovima ubrzanog starenja zabeležen je pad od oko 15%, što bi moglo ukazivati na neki vid fizičke nestabilnosti kompleksa u stres uslovima, koja bi mogla dovesti do destabilizacije kompleksa i “izlaska” određene frakcije aripiprazola iz kompleksa i posledično pada rastvorljivosti. U cilju boljeg objašnjenja ove pojave potrebno bi bilo sprovesti dodatna ispitivanja. Pošto se radi o uzorcima koji su amorfne prirode, očekivano je da postoji veća higroskopnost i određena tendencija ka fizičkim promenama, tako da je 162 neophodno tokom proizvodnje i skladištenja obezbediti uslove niske relativne vlage od najviše 25% RH i temperature oko 25°C. • Ispitana je i primenljivost dobijenih modela na različite formulacije sa ciklodekstrinima i dobijeno je relativno dobro slaganje. Koristeći optimalne uslove dobijene za odabranu formulaciju aripiprazol-HPBCD-citratni pufer, izvršeno je sušenje raspršivanjem nekoliko različitih formulacija: aripiprazol-HPBCD-PVP- citratni pufer (0.1% PVP u rastvoru), aripiprazol-2-O-MBCD-citratni pufer, vorikonazol-HPBCD-voda. Poređenjem dobijenih rezultata može se reći da je u formulacijama sa HPBCD dobijeno relativno dobro slaganje sa predviđanjima modela. Verovatni razlog tome je to što najveći deo formulacije čini ciklodekstrin tako da njegove osobine dominiraju, lek je inkorporiran u vidu kompleksa tako da se ponašanje sistema tokom sušenja ne razlikuje značajno za ispitivane formulacije sa različitim lekovitim supstancama. Primećeno je da je sadržaj vlage nešto viši u formulaciji sa PVP, što je možda i očekivano jer je PVP higroskopan i može uticati na higroskopnost formulacije. Sa 2-O-MBCD dobijen je nešto manji prinos i veći sadržaj vlage, što je u saglasnosti sa prethodnim zaključcima u vezi sa 2-O-MBCD, odnosno ovaj derivat CD se suši nešto teže nego HPBCD. Sušenje raspršivanjem pokazalo se kao tehnologija pogodna za dobijanje praškova ujednačenog sastava, i u slučaju teško rastvorljivih supstanci pogodna za dobijanje lako rastvorljivih kompleksa sa ciklodekstrinima. Primenom koncepta dizajniranja kvaliteta i prikazanih metoda za karakterizaciju formulacije i procesa, postignuto je unapređenje razumevanja procesa sušenja raspršivanjem ispitivanih formulacija sa odabranim model supstancama. 163 6. LITERATURA • ‹1174› Powder Flow in USP 29–NF 24 (US Pharmacopeial Convention, Rockville, MD), p. 3017. • Adamiec, J.; Modrzejewska, Z. Some structural properties if spray-dried chitosan microgranules. Drying Technology 2005, 23, 1601–1611. • Adhikari, B.; Howes, T.; Bhandari, B.; Truong, V. Effect of addition of maltodextrin on drying kinetics and stickiness of sugar and acid-rich foods during convective drying: Experiments and modeling. Journal of Food Engineering 2004, 62(1), 53–68. • Allen, T.T. Introduction to engineering statistics and six sigma: statistical quality control and design of experiments and systems. Springer Science+Bussines Media, NY, USA. 2006. • Beinborn, N.A.; Lirola, H.L.; Williams, R.O. 3rd. Effect of process variables on morphology and aerodynamic properties of voriconazole formulations produced by thin film freezing. International Journal of Pharmaceutics 2012, 429, 46–57. • Benito, M.; Molins, E.; Contreras, J. Process for preparing voriconazole, new polymorphic form of intermediate thereof, and uses thereof. US Patent application number: 20090023922, 2009. • Berggren, J.; Alderborn, G. Long-term stabilisation potential of poly(vinylpyrrolidone) for amorphous lactose in spray-dried composites. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2004, 21, 209–215. • Billon, A.; Bataille, B.; Cassanas, G.; Jacob, M. Development of spray dried acetaminophen microparticles using experimental designs. International Journal of Pharmaceutics 2000, 203,159–68. • Bishop, C. Neural Networks for Pattern Recognition; University Press; Oxford, 1995. • Borghetti, G.S.; Lula, I.S.; Sinisterra, R.D.; Bassani, V.L. Quercetin/β- cyclodextrin solid complexes prepared in aqueous solution followed by spray- drying or by physical mixture. AAPS Pharm Sci Tech 2009, 10(1), 235–242. • Braun, D.E.; Gelbrich, T.; Kahlenberg, V.; Tessadri, R.; Wieser, J.; Griesser, U.J. Conformational polymorphism in aripiprazole: preparation, stability and structure of five modifications. Journal of Pharmaceutical Sciences 2009, 98, 2010–26. • Brewster, M. E.; Loftsson, T. Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers. Advanced Drug Delivery Reviews 2007, 59, 645–666. • Buchanan C.M.; Buchanan, N.L.; Edgar, K.J.; Ramsey, M.G. Solubility and dissolution studies of antifungal drug:hydroxybutenyl-β-cyclodextrin complexes. Cellulose, 2007, 14:35–47. • Cassidy, O.E.; Carter, P.A.; Rowley, G.; Merrifield, D.R. Triboelectrification of spray-dried lactose prepared from different feedstock concentrations. Journal of Pharmacy and Pharmacology 2000, 52(1), 13–17. 164 • Castillo E. Process optimization. A statistical approach. Springer Science+Business Media, LLC, NY, USA. 2007. • Celik, M.; Wendel, S. Spray drying and pharmaceutical applications. In Handbook of granulation technology. Parikh, D.M. Ed; Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, USA, 2005, 152-157. • Challa, R.; Ahuja, A.; Ali, J.; Khar, R.K. Cyclodextrins in drug delivery: an updated review. AAPS Pharm Sci Tech 2005, 6(2), E329–57, Article 43. • Chawla, A.; Taylor, K.M.G.; Newton, J.M.; Johnson, M.C.R. Production of spray dried salbutamol sulfate for use in dry powder aerosol formulation. International Journal of Pharmaceutics 1994, 108, 233–240. • Chegini, G.R.; Ghobadian, B. Effect of spray-drying conditions on physical properties of orange juice powder. Drying Technology 2005, 23, 657–668. • Chidavaenzi, O.C.; Buckton, G.; Koosha, F.; Pathak, R. The use of thermal techniques to assess the impact of feed concentration on the amorphous content and polymorphic forms present in spray dried lactose. International Journal of Pharmaceutics 1997, 159, 67–74. • Cilurzo, F.; Cupone, I.E.; Minghetti, P.; Selmin, F.; Montanari, L. Fast dissolving films made of maltodextrins. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008, 70, 895–900. • Corrigan O.I. Thermal analysis of spray dried products, Thermochimica Acta 248 1995, 245-258. • Corrigan, D.O.; Corrigan, O.I.; Healy, A.M. Physicochemical and in vitro deposition properties of salbutamol sulphate-ipratropium bromide and salbutamol sulphate-excipient spray dried mixtures for use in dry powder inhalers. International Journal of Pharmaceutics 2006, 322, 22–30. • Elversson, J.; Millqvist-Fureby, A.; Alderborn, G.; Elofsson, U. Droplet and particle size relationship and shell thickness of inhalable lactose particles during spray drying. Journal of Pharmaceutical Sciences 2003, 92, 900–910. • FDA guidance for industry on Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System. www.fda.gov. • FDA. Guidance for Industry, PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance. 2004. • Fini, A.; Ospitali, F.; Zoppetti, G.; Puppini, N. ATR/Raman and fractal characterization of HPBCD/progesterone complex solid particles. Pharmaceutical Research 2008, Vol. 25, No. 9. DOI: 10.1007/s11095-008-9593- 4. • Gonnissen, Y.; Goncalves, S.I.V.; De Geest, B.G.; Remon, J.P.; Vervaet, C. Process design applied to optimise a directly compressible powder produced via a continuous manufacturing process. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2008, 68, 760–770. 165 • Gonnissen, Y.; Remon, J.P.; Vervaet, C. Development of directly compressible powders via co-spray drying. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2007, 67, 220–226. • Goula, A.M.; Adamopoulos, K.G. Effect of maltodextrin addition during spray drying of tomato pulp in dehumidified air: I. Drying kinetics and product recovery. Drying Technology 2008, 26, 714–725. • Goula, A.M.; Adamopoulos, K.G. Spray drying of tomato pulp: Effect of feed concentration. Drying Technology 2004, 22, 2309–2330. • Goula, A.M.; Adamopoulos, K.G.; Kazakis, N.A. Influence of spray drying conditions on tomato powder properties. Drying Technology 2004, 22, 1129– 1151. • Gramera, R.E.; Caimi, R.J. Cyclodextrin polyethers and their production. US Patent 3,459,731, August 5, 1969. • Harding, V.D. Pharmaceutical formulations containing voriconazole. US patent 006632803B1, 2003. • Haykin, S. Neural Networks: A Comprehensive Foundation; Macmillan Publishing; New York, 1994. • Herbrecht, R. Voriconazole: therapeutic review of a new azole antifungal. Expert Review of Anti-infective Therapy 2004, 2, 485–497. • Hong, J.; Shah, J.C.; McGonagle, M.D. Effect of cyclodextrin derivation and amorphous state of complex on accelerated degradation of ziprasidone. Journal of pharmaceutical sciences 2011, 100, 2703–2716. • Huey, R.; Morris, G.M.; Forli, S. Using AutoDock 4 and Vina with AutoDockTools: A Tutorial. Scripps Research Institute, California, USA, 2011. • Hussain, A. S.; Shivanand, P.; Johnson, R.D.; Application of neural computing in pharmaceutical product development: computer aided formulation design. Drug Development and Industrial Pharmacy 1994, 20, 1739-1752. • Ibrić, S. Primena matematičke teorije eksperimenata u farmaceutskoj tehnologiji. Konstisi doo, Beograd, Srbija. 2006. • Ibric, S.; Jovanovic, M.; Djuric, Z.; Parojcic, J.; Solomun, L. The application of generalized regression neural network in the modeling and optimization of aspirin extended release tablets with Eudragit RS PO as matrix substance. Journal of Controlled Release 2002, 82, 213-222. • Ibric, S.; Jovanovic, M.; Djuric, Z.; Parojcic, J.; Solomun, L.; Lucic, B. Generalized regression neural networks in prediction of drug stability. Journal of Pharmacy and Pharmacology 2007, 59, 745-750. • ICH Topic Q10. Guidance for Industry: Pharmaceutical Quality System. 2007. • ICH Topic Q8(R2). Guidance for Industry: Pharmaceutical Development. 2009. • ICH Topic Q9. Guidance for Industry: Quality Risk Management. 2005. • Ilić, V. Neuronske mreže, http://solair.eunet.rs/~ilicv/neuro.html#Aktivacione funkcije, datum izrade novembar 1999, pristupljeno 21. oktobra 2012. 166 • Islam, M.I.U.; Langrish, T.A.G. An investigation into lactose crystallization under high temperature conditions during spray drying. Food Research International 2010, 43, 46–56. • Ivic, B.; Ibric, S.; Cvetkovic, N.; Petrovic, A.; Trajkovic, S.; Djuric, Z. Application of design of experiments and multilayer perceptrons neural network in the optimization of diclofenac sodium extended release tablets with Carbopol® 71G. Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo) 2010, 58 (7), 947-949. • Kasabov, N.K. Foundations of neural networks, fuzzy systems and knowledge engineering. A Bradford Book, The MIT Press, Cambridge, Massachusetts, London, England, 1996. • Kirk, J.H.; Dann S.E.; Blatchford, C.G. Lactose: A definitive guide to polymorph determination. International Journal of Pharmaceutics 2007, 334, 103–114. • Klamt, A.; Schumann, G. COSMO: A new approach to dielectric screening in solvents with explicit expressions for the screening energy and its gradient. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 1993, 2, 799–805. • Kleptose® Crysmeb Exp methyl beta-cyclodextrin from Roquette, e-brochure. Pristupljeno oktobra 2012. http://www.roquette- pharma.com/brochures/03/visio.html. • Korth, M., Pitonak, M., Rezac, J., Hobza, P. A transferable H-bonding correction for semiempirical quantum-chemical methods. Journal of Chemical Theory and Computation 2010, 6, 344–352. • Krose, B., Van der Smagt, P. An introduction to neural networks. University of Amsterdam, 1996. Pristupljeno oktobra 2012. http://math.uni.lodz.pl/~fulmanp/zajecia/ssn/materialy/neuro-intro.pdf. • Lazić, Ž.R. Design of experiments in chemical engineering. A practical guide. Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2004. • Leane, M.; Cumming, I.; Corrigan O.I. The use of artificial neural networks for the selection of the most appropriate formulation and processing variables in order to predict the in vitro dissolution of sustained release minitablets. AAPS PharmSciTech 2003, 4 (2), article 26. • Li, P.; Tabibi, S.E.; Yalkowski, S.H. Combined effect of complexation and pH on solubilization. Journal of Pharmaceutical Sciences 1998, 87(12),1535–1537. • Lin, H.-L., Lin, S.-Y., Lin, C.-C., Hsu, C.-H., Wu, T.-K., Huang, Y.-T. Mechanical grinding effect on thermodynamics and inclusion efficiency of loratadine-cyclodextrin inclusion complex formation. Carbohydrate Polymers 2012, 87, 512– 517. • Listiohadi, Y.; Hourigan, J.A.; Sleigh, R.W.; Steele, R.J. Thermal analysis of amorphous lactose and α-lactose monohydrate. Dairy Science Technology 2009, 89, 43–67. 167 • Loftsson, T.; Hreinsdottir, D.; Masson, M. Evaluation of cyclodextrin solubilization of drugs. International Journal of Pharmaceutics 2005, 302, 18– 28. • Loftsson, T.; Magnúsdóttir, A.; Másson, M.; Sigurjónsdóttir, J.F. Self- association and cyclodextrin solubilization of drugs. Journal of Pharmaceutical Sciences 2002, 91, 2307-2316. • Loftsson, T.; Másson, M.; Brewster, M.E. Self-Association of cyclodextrins and cyclodextrin complexes. Journal of Pharmaceutical Sciences 2004,93, 1091- 1099. • Loftsson, T.; Hreinsdottir, D.; Masson, M. Evaluation of cyclodextrin solubilization of drugs. International Journal of Pharmaceutics 2005, 302, 18– 28. • Loftsson, T.; Masson, M.; Sigurjonsdottir, J.F. Methods to enhance the complexation efficiency of cyclodextrins. Stp Pharma Sciences 1999, 9 (3), 237–242. • Masters, K. Current market-driven spray drying development activities. Drying Technology 2004, 22(6), 1351-1370. • MathWorks e-Documentation Center, http://www.mathworks.com/help/stats/response-surface-designs.html#bq_oe60, pristupljeno 21. oktobra 2012. • Maury, M.; Murphy, K.; Kumar, S.; Shi, L.; Lee, G. Effects of process variables on the powder yield of spray-dried trehalose on a laboratory spray-dryer. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2005, 59(3), 565-73. • Messner, M.; Kurkov, S.V.; Jansook, P.; Loftsson, T. Self-assembled cyclodextrin aggregates and nanoparticles, review article. International Journal of Pharmaceutics 2010, 387(1–2), 199–208. • Miguélez-Morán, A-M.. Roller compaction of pharmaceutical ingredients: on the undrestanding of the compaction and the use of knowledge based applications in the formulation of tablets, PhD Dissertation, URL: http://www.ub.uniheidelberg.de/archiv/10111 (2009). • Miro, A.; Ungaro, F.; Balzano, F.; Masi, S.; Musto, P.; Manna, P.L.; Uccello- Barretta, G.; Quaglia, F. Triamcinolone solubilization by (2-hydroxypropyl)- beta-cyclodextrin: A spectroscopic and computational approach. Carbohydrate Polymers 2012, 90, 1288–1298. • Momany, F.A.; Rone, R. Validation of the general purpose QUANTA ®3.2/CHARMm® force field. Journal of Compututational Chemistry 1992, 13, 888–900. • Morris, G.M.; Goodsell, D.S.; Halliday, R.S.; Huey, R.; Hart, W.E.; Belew, R.K.; Olson, A.J. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function. Journal of Computational Chemistry 1998, 19, 1639–1662. 168 • Mosen, K.; Backstrom, K.; Thalberg, K.; Shaefer, T.; Axelsson, A.; Kristensen, H.G. The apparent plasticizing effect of polyethylene glycol (PEG) on the crystallinity of spray dried lactose-PEG composites. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2006, 64, 206–211 • Mosher, G.; Thompson, D.O. Complexation: cyclodextrins, in Encyclopedia of pharmaceutical technology, third edition, edited by James Swarbrick. Informa Healthcare USA, New York, USA. 2007; 671-696. • Mura, P.; Faucci, M.T.; Bettinetti, G.P. The influence of polyvinylpyrrolidone on naproxen complexation with hydroxypropyl β-cyclodextrin. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2001, 13, 187–94. • Murtoma, M.; Savolainen, M.; Christiansen, L.; Rantanen, J.; Laine, E.; Yliruusi, J. Static electrification of powders during spray drying. Journal of Electrostatics 2004, 62, 63–72. • Nacsa, A., Berkesi, O., Szabo-Revesz, P., Aigner, Z. Achievement of pH- independence of poorly-soluble, ionizable loratadine by inclusion complex formation with dimethyl-β-cyclodextrin. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2009, 64, 249–254. • Nekkanti, V.; Muniyappan, T.; Karatgi, P.; Hari1, M.S.; Marella, S.; Pillai, R. Spray-drying process optimization for manufacture of drug–cyclodextrin complex powder using design of experiments. Drug Development and Industrial Pharmacy 2009, 35(10), 1219–1229. • NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods, http://www.itl.nist.gov/div898/handbook/, pristupljeno oktobra 2012. • Owens, P.K.; Fell, A.F.; Coleman, M.W.; Berridge, J.C. Complexation of voriconazole stereoisomers with neutral and anionic derivatised cyclodextrins. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2000, 38, 133–151. • Parojčić, J.; Ibrić, S.; Djurić, Z.; Jovanović, M.; Corrigan, O. I. An investigation into the usefulness of generalized regression neural network analysis in the development of level A in vitro–in vivo correlation. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2007, 30, 264-272. • Pedretti, A.; Villa, L.; Vistoli, G. VEGA: A versatile program to convert, handle and visualize molecular structure on Windows-based PCs. Journal of Molecular Graphics 2002, 21, 47–49. • Peeters, J.; Neeskens, P.; Tollenaere, J.P.; Van Remoortere, P.; Brewster, M.E. Characterization of the interaction of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin with itraconazole at pH 2, 4 and 7. Journal of Pharmaceutical Sciences 2002, 91, 1414–1422. • Phillips, J.; Braun, R.; Wang, W.; Gumbart, J.; Tajkhorshid, E.; Villa, E.; Chipot, C.; Skeel, R.D.; Kale, L.; Schulten, K. Scalable molecular dynamics with NAMD. Journal of Computational Chemistry 2005, 26, 1781-1802. 169 • Piel, G.; Piette, M.; Barillaro, V.; Castagne, D.; Evrard, B.; Delattre, L. Betamethasone-in-cyclodextrin-in-liposome: The effect of cyclodextrins on encapsulation efficiency and release kinetics. International Journal of Pharmaceutics 2006, 312, 75–82. • Plumb, A.P.; Rowe, R.C.; York, P.; Doherty, C.; The effect of experimental design on the modelling of a tablet coating formulation using artificial neural networks. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2002, 16, 281-288. • Prinn, K.B.; Costantino, H.R.; Tracy, M. Statistical modeling of protein spray drying at the lab scale. AAPS Pharm. Sci. Tech. 2002, 3, E4. • Process improvement. http://www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/pri.htm. Pristupljeno oktobra 2012. • Product information: Abilify tablets. http://www.medicines.org.au/files/bqpabili.pdf. Pristupljeno decembra 2012. • Product information: Naramig tablets. www.gsk.au. Pristupljeno septembra 2012. • Product Quality Research Institute Publications. Manufacturing Technology Committee – Risk Management Work Group, Case Study RMWG-07 Defining Process Space. December 2008. http://www.pqri.org/publications/index.asp Pristupljeno decembra 2012. • Quan, P.; Liu, D.F.; Li, R.; Zhang, Q.; Qian, Y.; Xu, Q.W. The effects of water- soluble polymers on hydroxypropyl-β-cyclodextrin solubilization of oleanolic acid and ursolic acid. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2009, 63, 181–188. • Raghavan, S.L.; Trividic, A.; Davis, A.F.; Hadgraft, J. Crystallization of hydrocortisone acetate: influence of polymers. Internation Journal of Pharmaceutics 2001, 212, 213–221. • Rattes, A.L.R.; Oliveira, W.P. Spray drying conditions and encapsulating composition effects on formation and properties of sodium diclofenac microparticles. Powder Technology 2007, 171, 7–14. • Rausand, M. Preliminary Hazard Analysis. Norwegian University of Science and Technology. 2005. http://www.ntnu.no/ross/srt/slides/pha.pdf • Ravikumar, K., Sridhar, B., Prasad, D.K., Rao, A.K.S.B. Voriconazole, an antifungal drug. Acta Crystallographica 2007, E63, 565–567. • Redenti, E.; Szente, L.; Szejtli, J. Mini-review drug/cyclodextrin/ hydroxy acid multicomponent systems, properties and pharmaceutical applications. Journal of Pharmaceutical Sciences 2000, 89(1), 1–8. • Ribeiro, A., Figueiras, A., Santos, D., Veiga, F. Preparation and solid-state characterization of inclusion complexes formed between miconazole and methyl-β-cyclodextrin. 2008. AAPS Pharm Sci Tech 2008, 9(4), 1102–1109. • Sakura Tablet Case Study. National Institute of Health Sciences (NIHS), Japan. 2008, http://www.nihs.go.jp/drug/PhForum/FileCEnglish.pdf 170 • Snyder, H.E.; Lechuga-Ballesteros, D. Spray drying: Theory and pharmaceutical applications. In Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets. Vol. 1: Unit Operations and Mechanical Properties; Augsburger, L.L.; Hoag, S.W., Eds.; Informa Healthcare USA: New York, 2008, 227–256. • Spriet, I.; Annaert, P.; Meersseman, P.; Hermans, G.; Meersseman, W.; Verbesselt, R.; Willems, L. Pharmacokinetics of caspofungin and voriconazole in critically ill patients during extracorporeal membrane oxygenation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2009, 63(4), 767-770. • Stewart, J. MOPAC: A semiempirical molecular orbital program. Journal of Computer-Aided Molecular Design 1990, 4, 1–105. • Stigliani, J.-L.; Bernardes-Genisson, V.; Bernadou, J.; Pratviel, G. Cross- docking study of InhA inhibitors: a combination of Autodock Vina and PM6- DH2 simulations to retrieve bio-active conformations. Organic and Biomolecular Chemistry 2012, 10, 6341–6349. • Szejtli, J. Molecular encapsulation by cyclodextrins. http://www.touchbriefings.com/pdf/ 750/outs_041_cyclolab_tech.pdf. Pristupljeno decembra 2012. • Szejtli, J. Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure and Applied Chemistry 2004, 76 (10), 1825–1845. • Tagne, P.T.M.; Briancon, S.; Fessi, H. Spray-dried microparticles containing polymeric nanocapsules: Formulation aspects, liquid phase interactions and particle characteristics. International Journal of Pharmaceutics 2006, 325,63–74. • Tajber, L.; Corrigan, O.I.; Healy, A.M. Spray drying of budesonide, formoterol fumarate and their composites - II. Statistical factorial design and in vitro deposition properties. International Journal of Pharmaceutics 2009, 367, 86-96. • Takeuchi, H.; Yasuji, T.; Hino, T.; Yamamoto, H.; Kawashima, Y. Spray-dried composite particles of lactose and sodium alginate for direct tabletting and controlled releasing. International Journal of Pharmaceutics 1998, 174, 91–100. • Trott, O., Olson, A.J. Software news and update AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. Journal of Computational Chemistry 2010, 31, 455–461. • Turkoglu, M.; Aydin, I.; Murray, M.; Sakr, A. Modeling of a roller-compaction process using neural networks and genetic algorithms. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 1999, 48, 239-245. • U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), • User Manual, Statistica Neural Networks; StatSoft, Inc.: Tulsa, OK. 171 • Vaithiyalingam, S.; Khan, M.A. Optimization and characterization of controlled release multi-particulate beads formulated with a customized cellulose acetate butyrate dispersion. International Journal of Pharmaceutics 2002, 234, 179–193. • Vyas, A.; Saraf, S.; Saraf, S. Cyclodextrin based novel drug delivery systems. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry 2008, 62, 23–42. • Woodcock, J. The concept of pharmaceutical quality. American Pharmaceutical Review 2004, Nov/Dec:1-3. • www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2002/21- 436_Abilify_biopharmr_P2.pdf. Pristupljeno decembra 2012. • www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2003/021630s000_Vfend_ClinPh arm.pdf. Pristupljeno decembra 2012. • www.roquette.com • www.roquette-pharma.com/brochures/03/visio.html • www.sprayconsultants.com • Xiang-Gen, W.; Li-Na, Y.; Meng, X.; Hao-Ran, J. Anti-infectious activity of intravitreal injectable voriconazole microspheres on experimental rabbit fungal endophthalmitis caused by aspergillus fumigatus. Journal of Pharmaceutical Sciences 2011, 100(5), 1745–1759. • Yang, W.; Chow, K.T.; Lang, B.; Wiederhold, N.P.; Johnston, K.P.; Williams, R.O. 3rd. In vitro characterization and pharmacokinetics in mice following pulmonary delivery of itraconazole as cyclodextrin solubilized solution. European Journal of Pharmaceutical Sciences 2010, 39, 336–347. 172 7. BIOGRAFIJA AUTORA Tijana Miletić (rođena Mihajlović, 27.02.1982. godine u Vršcu) osnovnu i srednju školu završila je u Vršcu. Farmaceutski fakultet u Beogradu upisala je školske 2000/2001. godine. Diplomirala je 2006. godine sa prosečnom ocenom 9,39 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. U periodu 2003/2006 bila je korisnik stipendije Hemofarm Fondacije i Hemofarm koncerna koja se dodeljuje uspešnim i perspektivnim studentima. Doktorske akademske studije iz farmaceutske tehnologije na Farmaceutskom fakultetu upisala je školske 2007/2008. godine. Od oktobra 2006. godine radi kao stručni saradnik u Pogonu čvrstih formi, zatim kao stručni saradnik u Službi istraživanja i razvoja u Hemofarmu, a od aprila 2011. godine kao samostalni nosilac projekta u Odeljenju farmaceutskog razvoja u Sektoru istraživanja i razvoja u Hemofarmu. Tijana Miletić (born Mihajlović, on February 27th 1982 in Vršac) finished elementary and high school in Vršac. She enrolled in the Faculty of Pharmacy, University of Belgrade in 2000/2001. She graduated in 2006 with average grade 9,39 and her diploma thesis was graded with 10. In 2003/2006 Tijana received a scholarship from Hemofarm foundation and Hemofarm koncern which is awarded to successful and perspective students. She started her PhD studies in the field of pharmaceutical technology at the Faculty of Pharmacy in Belgrade, in 2007/2008. From October 2006 she was working as associate in Solid dosage forms plant, then as associate in Research and development service, and from April 2011 she has been at the position of expert associate in Pharmaceutical development department in Research and development service in Hemofarm.