I Univerzitet u Beogradu Farmaceutski fakultet Ivana R. Baralić UTICAJ SUPLEMENTACIJE ASTAKSANTINOM NA NIVO MARKERA OKSIDATIVNOG STRESA I NIVO SEKRETORNOG IgA U SALIVI KOD MLADIH FUDBALERA Doktorska disertacija Beograd, 2012. II University of Belgrade Faculty of Pharmacy Ivana R. Baralić EFFECT OF ASTAXANTHIN SUPPLEMENTATION ON OXIDATIVE STRESS STATUS AND SECRETORY IgA IN SALIVA IN YOUNG SOCCER PLAYERS Doctoral dissertation Belgrade, 2012. III Komisija za ocenu i odbranu doktorske disertacije: Dr sc. Brižita Đorđević, vanredni profesor - mentor Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu ________________________________________ Dr sc. Jelena Kotur-Stevuljević, docent Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu ________________________________________ Dr sc. Ljiljana Dimitrijević, naučni savetnik Institut za virusologiju, vakcine i serume ”Torlak” ________________________________________ Datum odbrane: IV Zahvalnice Zahvaljujem se svom učitelju i mentoru, prof. dr Brižiti Đorđević, bez čije dragocene pomoći ovaj rad ne bi bio moguć, koja je svojim nesebičnim zalaganjem učinila da zavolim bromatologiju i pružila mi mogućnost da uđem u krug sjajnih ljudi i naučnika, za punu slobodu koju mi pruža tokom zajedničkog rada, kao i tokom ovog istraživanja. Neizmerno sam zahvalna prof. emeritus Ivanki Miletić što mi je otvorila vrata predivnog sveta nauke, na ukazanom poverenju, strpljenju, savetima i pomoći koju mi je davala u toku mog celokupnog rada. Zahvaljujem se doc. dr Jeleni Kotur-Stevuljević za sav uloženi trud, znanje i energiju u toku realizacije ovog rada, od ulaska u biohemijsku laboratoriju do završne obrade doktorske disertacije. Njen analitički duh i korisne sugestije su pomogli da se studija uradi što bolje i temeljnije. Zahvaljujem se dr sc. Ljiljani Dimitrijević na ukazanom poverenju, ostvarenoj saradnji i razumevanju u toku pisanja doktorske disertacije. Dr Nenadu Dikiću se zahvaljujem na velikoj i nesebičnoj pomoći u planiranju i organizaciji ovog istraživanja i stalnom podsticaju da ono bude privedeno kraju. Zahvalna sam dr Mariji Anđelković i dr Nenadu Radivojeviću na izvanrednom trudu tokom sportsko-medicinskih pregleda i pomoći u sakupljanju uzoraka. Zahvaljujem se dr Aleksandri Stefanović i mr ph. Jasmini Ivanišević na velikoj pomoći i strpljenju u toku eksperimentalnog rada u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Zahvaljujem se Vesni Stanković i Marini Baranin na pomoći u toku obrade biološkog materijala. Svojoj sestri, doc. dr Sanji Radojević Škodrić, se zahvaljujem na strpljenju, podršci i ljubavi u svim fazama izrade ove doktorske disertacije. Zahvaljujem joj se što je uvek imala snage da me pokrene kada sam posustajala i što je uvek bila puna entuzijazma i novih ideja. Zahvaljujem se svim zaposlenima na Katedri za bromatologiju, Katedri za medicinsku biohemiju i kolegama iz kompanije „Velefarm” AD Holding na velikom razumevanju, pomoći i širenju pozitivne energije. Zahvaljujem se mladim fudbalerima fudbalskog kluba “Partizan” i “Teleoptik”i karatistima karate kluba “CIS Centar” na učešću u studiji. Svojoj porodici zahvaljujem na strpljenju i razumevanju. V Uticaj suplementacije astaksantinom na nivo markera oksidativnog stresa i nivo sekretornog IgA u salivi kod mladih fudbalera Saţetak Intenzivni treninzi dovode do povećanja produkcije slobodnih radikala i mogu doprineti nastanku oksidativnog stresa kod sportista. Pored toga, poremećaj ćelijske homeostaze u mišićima uzrokovan slobodnim radikalima rezultira oštećenjem mišića, bolom, zamorom i smanjenjem sportskih performansi. Do sada je sproveden veliki broj istraţivanja sa ciljem da se odredi efekat antioksidanasa na smanjenje oksidativnog stresa i oštećenja mišića, koje nastaju kao posledice intenzivne fiziĉke aktivnosti. Astaksantin (Asx) je liposolubilna supstanca koja pripada grupi ksantofila, oksidovanih derivata karotenoida, široko rasprostranjen u prirodi. Rezultati do sada sporovedenih istraţivanja pokazuju da astaksantin, zbog izvanredne antioksidativne aktivnosti, moţe imati znaĉajnu ulogu u ishrani ljudi u cilju oĉuvanja zdravlja i prevenciji hroniĉnih bolesti. Fiziološki stres uzrokovan dugim i intenzivnim treninzima se ogleda i u prolaznim, ali znaĉajnim promenama u imunom sistemu što se dovodi u vezu sa povećanom incidencom infekcija, naroĉito infekcija gornjih respiratornih puteva kod sportista. Do sada je ispitivan uticaj nekoliko nutritivnih mera na promene u imunom sistemu uzrokovanih intenzivnim treninzima: ugljeno-hidratni napici, omega-3 masne kiseline, razni antioksidansi, cink, glutamin, ehinacea i kolostrum, meĊutim ĉvrstih dokaza za efikasnost ovih suplemenata još uvek nema. Stoga je cilj istraţivanja bio ispitivanje uticaja suplementacije Asx na oksidativni stres i oštećenje mišića kod mladih fudbalera u toku sezone. Pored toga, ispitivan je i uticaj suplementacije Asx i senzorne stimulacije aromatizovanim napitkom na bazi surutke na mukozni imunitet sportista. U istraţivanju je uĉestvovalo 40 fudbalera, 28 ispitanika koji nisu imali redovnu intenzivnu fiziĉku aktivnosti i 20 ispitanika koji su se rekreativno bavili karateom. Studija je planirana u skladu sa etiĉkim standardima datim u Helsinkiškoj deklaraciji i u skladu sa pravilima Etiĉkog komiteta Udruţenja za medicinu sporta Srbije. Dugogodišnje treniranje fudbala uslovljava povećanje aktivnosti antioksidativnih mehanizama zaštite, ali su i pored toga mladi fudbaleri izloţeni većem nivou oksidativnog stresa i oksidativnog oštećenja u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe. VI Intenzivni fudbalski trening je povezan sa povećanom produkcijom slobodnih radikala, što moţe smanjiti totalni antioksidativni status. Suplementacija astaksantinom moţe delimiĉno spreĉiti povećanu produkciju slobodnih radikala i trošenje neenzimske antioksidativne zaštite kod mladih fudbalera. Naporan program treniranja u toku sezone dovodi do povećanja produkcije superoksidnog anjona i smanjenja aktivnosti enzima superoksid dizmutaze. Ipak, uoĉeno smanjenje totalnog oksidativnog statusa i prooksidativno-antioksidativnog balansa, ukazuje na smanjenje nivoa oksidativnog stresa, što je verovatno posledica adaptivnog odgovora na intenzivne treninge. Suplementacija astaksantinom ima povoljan efekat na unapreĊenje aktivnosti enzima paraoksonaze 1 i ukupan sadrţaj sulfhidrilnih grupa kod mladih fudbalera. Primena astaksantina u toku sezone moţe stabilisati mišićnu membranu i na taj naĉin smanjiti oštećenje mišićnih ćelija do odreĊenog stepena. Intenzivan trening kod fudbalera, ali i rekreativni karate trening dovode do pada nivoa sekretornog IgA u salivi. Primena aromatizovanog napitka na bazi surutke nakon treninga moţe biti od koristi u cilju odrţavanja salivarnog protoka, a na taj naĉin i koliĉine sIgA u salivi. Rezultati pokazuju da suplementacija astaksantinom moţe imati povoljan efekat na produkciju sIgA u salivi kod mladih fudbalera u periodu intenzivnih treninga tokom sezone. Kljuĉne reĉi: oksidativni stres, paraoksonaza 1, mukozni imunitet, astaksantin, fudbal Nauĉna oblast: Farmacija Uţa nauĉna oblast: Hemija hrane i dijetetskih suplemenata UDK: VII Effect of astaxanthin supplementation on oxidative stress status and secretory IgA in saliva in young soccer players Abstract Exhaustive physical activity is associated with increased production of reactive oxygen species and oxidative stress. Enhanced free radical production leads to cellular loss of redox homeostasis and might result in muscular injury, soreness, and fatigue, and, consequently, decrements in physical performance. Methods to reduce free radical production and subsequent oxidative stress and muscle damage during and following physical exercise have been a priority of much research activity. Various antioxidants and their combinations were investigated. Astaxanthin is one of the main pigments belonging to the family of the xanthophylls, which is generally distributed in seafood. Recent studies continue to evidence the multiple possibilities of astaxanthin application in providing benefits to human health. The physiologic stress induced by prolonged and intensive exertion is reflected in transient yet significant immune system perturbations in multiple body compartments. The influence of several nutritional countermeasures to exercise-induced alterations of mucosal immunity have been investigated including carbo-hydrate, zinc, glutamine, bovine colostrum, caffeine, as well as several antioxidants. The purpose of the present investigation was to determine the effects of astaxanthin supplementation on oxidative stress and muscle damage in young soccer players while following their habitual dietary pattern and training program during competitive season. In addition, the effect of couple nutritional measures (sensory stimulation and astaxanthin supplementation) on mucosal immunity were investigated The study was performed in a group of 40 soccer players, 28 high school pupils, who did not practice intensive physical exercise regularly and 20 subjects who practiced karate recreationally. The study was conducted according to the guidelines laid down in Declaration of Helsinki. Experimental procedures were approved by the Ethical Committee of Sports Medicine Association of Serbia. Long-term soccer training is accompanied by an increased capacity of antioxidant systems. However, soccer players are exposed to higher level of oxidative stress in comparison to sedentary people. Soccer exercise is associated with excessive production of free radicals and oxidative stress which might diminish total antioxidant VIII status. Supplementation with astaxanthin could prevent exercise induced free radical production and depletion of non enzymatic antioxidant defense in young soccer players. Regular soccer training over the period of 90 days provokes increased production of superoxide anion and decreased activity of superoxide dismutase. On the other hand, soccer training may result in decreased total oxidant status and prooxidant-antioxidant balance, probably due to an up regulation in the body's antioxidant defense system. Astaxanthin supplementation had beneficial effect on improving paraoxonase 1 activity toward paraoxon and diazoxon, as well as total sulphydryl groups content in young soccer players. Supplementation with astaxanthin might stabilize sarcolemma leading to less muscle damage. Intensive soccer exercise, as well as recreational karate exercise induced decrease in sIgA absolute concentration and sIgA secretion rate and the magnitude of these alterations reflects the intensity, duration and chronicity of the exercise. Application of flavored whey-based drink elevated salivary flow and might be helpful in maintenance of total sIgA amount covering mucosal surface. Astaxanthin might have beneficial effect on sIgA production in saliva in young soccer player during training season. Kljuĉne reĉi: oxidative stress, paraoxonase 1, mucosal immunity, astaxanthin, soccer, Scientific field: Pharmacy Major in: Chemistry of food and dietary products UDK: IX SADRŢAJ 1.UVOD 1 1.1. Oksidativni stres 2 1.2. Antioksidativna zaštita 4 1.2.1.Antioksidativni enzimi 4 1.2.2. Neenzimski antioksidansi 7 1.3. Merenje oksidativnog stresa 10 1.4. Oksidativni stres u sportu 12 1.4.1. Produkcija slobodnih radikala tokom fiziĉke aktivnosti 12 1.4.2. Oksidativni stres i aerobni trening 14 1.4.3. Oksidativni stres i anaerobni trening 16 1.4.4. Oksidativni stres i redovno treniranje – fenomen hormeze 17 1.4.5. Uticaj slobodnih radikala na oštećenje mišića 18 1.4.6. Oksidativni stres i oštećenje mišića u fudbalu 18 1.5. Primena antioksidanasa u sportu 19 1.5.1. Primena antioksidanasa u cilju smanjenja oksidativnog stresa 19 1.5.2. Primena antioksidanasa u cilju smanjenja oštećenja mišića 20 1.5.3. Primena anitoksidanasa u cilju smanjenja oksidativnog stresa i oštećenja mišića u fudbalu 21 1.6. Imuni sistem sportista 22 1.6.1. Uticaj fiziĉke aktivnosti na mukozni imunitet 22 1.6.2. Uloga ishrane u optimalnoj funkciji imunog sistema 23 1.6.3. Primena antioksidanasa u prevenciji supresije mukoznog imuniteta 23 1.7. Astaksantin 24 1.7.1. Hemijska struktura astaksantina 25 1.7.2. Bioraspoloţivost i metabolizam astaksantina 26 1.7.3. Izvori astaksantina 27 1.7.4. Astaksantin kao antioksidans 28 1.7.5. Anti-inflamatorne osobine astaksantina 29 1.7.6. Primena astaksantina u promociji zdravlja 31 2. CILJEVI ISTRAŢIVANJA 35 X 3. ISPITANICI I METODE 36 3.1. Ispitanici 36 3.2. Dizajn eksprimenta 37 3.3. Metode 39 3.3.1. Antropometrijska merenja i odreĊivanje VO2max 40 3.3.2. OdreĊivanje biohemijskih i hematoloških parametara 41 3.3.3. OdreĊivanje parametara oksidativnog stresa 41 3.3.3.1. Određivanje koncentracije tiobarbiturna kiselina reagujućih supstanci (TBKRS) 41 3.3.3.2. Određivanje uznapredovalih produkata oksidacije proteina (AOPP) 42 3.3.3.3. Određivanje nivoa superoksid anjon radikala (O2 .- ) u plazmi 43 3.3.4. OdreĊivanje parametara antioksidativne zaštite 44 3.3.4.1. Određivanje aktivnosti enzima superoksid dismutaza (SOD) u plazmi 44 3.3.4.2. Određivanje ukupnog sadržaja sulfhidrilnih (-SH) grupa 46 3.3.4.3. Određivanje aktivnosti enzima paraoksonaza 1(PON 1) 47 3.3.5. OdreĊivanje parametara oksidativnog statusa 50 3.3.5.1. Određivanje totalnog oksidativnog statusa u serumu (TOS) 50 3.3.5.2. Određivanje totalnog antioksidativnog statusa u serumu (TAS) 51 3.3.5.3. Određivanje prooksidativno-antioksidativnog balansa (PAB) 53 3.3.6. OdreĊivanje sekretornog IgA u salivi 55 3.3.7. Hemijska analiza teĉne surutke i aromatizovanog napitka na bazi surutke 56 3.4. Statistiĉka obrada podataka 57 4. REZULTATI ISTRAŢIVANJA 58 XI 4.1. Uticaj dugotrajnog redovnog treniranja na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite 58 4.2. Uticaj treniranja i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite 61 4.2.1. Opšti podaci o sportistima 61 4.2.2. Osnovni biohemijski i hematološki parametri 63 4.2.3. Parametri oksidativnostresnog statusa 68 4.2.3.1. Parametri oksidativnog stresa 68 4.2.3.2. Parametri antioksidativne zaštite 71 4.2.3.3. Parametri oksidativnog statusa 74 4.3. Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite 76 4.3.1. Parametri oksidativnog stresa 76 4.3.2. Parametri antioksidativne zaštite 78 4.3.3. Parametri oksidativnog statusa 82 4.4. Uticaj suplementacije astaksantinom na oštećenje mišića kod mladih fudbalera 84 4.5. Uticaj razliĉitih preventivnih mera na nivo sekretornog IgA u salivi 88 4.5.1. Uticaj senzorne stimulacije na nivo sekretornog IgA u salivi kod karatista rekreativaca 88 4.5.2. Uticaj suplementacije astaksantinom na nivo sekretornog IgA u salivi kod mladih fudbalera 93 5. DISKUSIJA 98 5.1. Uticaj dugotrajnog treniranja na oksidativnostresni status mladih fudbalera 99 5.2. Uticaj treniranja i suplementacije astaksantinom na aktivnost paraoksonaze 1 i nivo oksidativnog stresa kod mladih fudbalera 102 XII 5.3. Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije astaksantinom na oksidativnostresni status mladih fudbalera 108 5.4. Uticaj suplementacije astaksantinom na oštećenje mišića kod mladih fudbalera 111 5.5. Uticaj razliĉitih nutritivnih mera na nivo sekretornog IgA u salivi 112 5.5.1. Uticaj senzorne stimulacije na nivo sekretornog IgA u salivi kod karatista rekreativaca 113 5.5.2. Uticaj suplementacije astaksantinom na mukozni imunitet mladih fudbalera 115 6.ZAKLJUĈCI 119 7.LITERATURA 121 BIOGRAFIJA 150 PRILOZI 1-3 151 XIII LISTA SKRAĆENICA KORIŠĆENIH U TEKSTU 8-OhdG- 8-hidroksi 2-deoksiguanozin ABTS- azinobis-etilbenztiazolin sulfonska kiselina ADP- adenozin-di-fosfat ALT- alanin aminotransferaza AMD- adultna makularna degeneracija ANCOVA- analiza kovarijanse ANOVA- analiza varijanse AOPP- advanced oxidation protein products, produkti uznapredovale oksidacije proteina PK- proteinski karbonili (PK) AP 1- aktivator proteina 1 AST- aspartat aminotransferaza ASX- astaksantin ATP- adenozin-mono-fosfat ATP- adenozin-tri-fosfat CAT- katalaza CK- kreatin kinaza CRP- C reaktivni protein DMSO- dimetilsulfoksida DNK- dezoksiribonukleinska kiselina DOMS- delayed onset of muscle soreness, odloţena upala mišića DTNB- dinitro-ditio-benzojeva kiselina DZOazna- diazoksonazna EDTA- etilendiaminotetrasirćetna kiselina ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay ESRS- electron spin resonance spectroscopy, elektronska spinalna rezonantna spektroskopija FRAP- ferric reducing ability of plasma, test sposobnosti redukcije feri jona GPX- glutation peroksidaza GR- glutation reduktaza GSH- redukovani glutation XIV GSSG- oksidovani glutation H2O2- vodonik peroksid Hb- hemoglobin Hct-hematokrit HDL- high density lipoprotein, lipoprotein velike gustine HDL-H- HDL holesterol HKU- hidrogen-peroksid komplementarne jedinice HOLuk- ukupni holesterol (HOLuk), IL-6- interleukin 6 IMHP- izopropil-metil-hidroksipirimidin ITM- indeks telesne mase LDH (laktat dehidrogenaza LDL- low density lipoprotein, lipoprotein male gustine LDL-H- LDL holesterol LPO- lipidnih hidroperoksida MAPK- mitogen aktivisane protein kinaze MDA- malondialdehid NAC- N-acetil cistein NADH- redukovani nikotinamid-adenin-dinukleotid NADPH- redukovani nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat NBT- nitrobluetetrazolijuma NF-κB- nuklearni faktor-κB O2·¯- superoksidani anjon radikal ORAC- oxygen radical absorbance capacity, kapacitet apsorpcije reaktivnih kiseonikovih jedinjenja PAB- prooksidativno-antioksidativni balans PAB- prooksidativno-antioksidativni balans PLA2- fosfolipaza A2 POazna- paraoksonazna PON1- paraokonaza 1 RDA- reccomended dietary alowances RNS- reactive nitrogen species XV ROS- reactive oxigen species RPE- ratings of perceived exertion, subjektivna procena zamora RSS- reactive sulfur species SH - sulfhidrilne grupe SOD- superoksid dismutaza SR- sarkoplazmatski retikulum TAC- totalni antioksidativni kapacitet TAS- totalni anitoksidativni status TBA- tiobarbiturna kiselina TBKRS- tiobarbiturna kiselina reagujuće supstance TEAC- trolox equivalent antioxidant capacity, troloks ekvivalentni anioksidativni kapacitet TG- trigliceridi TMB- tetrametilbenzidin TNF- α - tumor necrosis factor-α TOS- totalni oksidativni status TP- ukupni proteini URTI- upper respiratory tract infection, infekcija gornjih respiratonih puteva UV/VIS- ultraviolet/vidljiva svetlost VLDL- very low density lipoprotein, lipoprotein male gustine VO2max – maksimalna potrošnja kiseonika ili aerobni kapacitet XDH- ksantin dehidrogenaza 1 1. UVOD Redovna i umerena fiziĉka aktivnost ima brojne povoljne fiziološke efekte koji unapreĊuju fiziĉko stanje organizma i doprinose smanjenju rizika od razvoja brojnih hroniĉnih bolesti. Rizik od razvoja bolesti se smanjuje kao funkcija fiziĉke aktivnosti do jednog odreĊenog nivoa, dok sa daljim povećanjem inteniziteta i trajanja veţbanja, raste i rizik nastanka hroniĉnih bolesti. Smatra se je upravo oksidativni stres veza izmeĊu intenzivne fiziĉke aktivnosti i bolesti. OdreĊeni, optimalni nivo produkcije slobodnih radikala omogućava poboljšanje zdravstvenog stanja, dok produkcija prooksidanasa koja prevazilazi optimalni nivo, moţe prekoraĉiti kapacitet antioksidativne zaštite i tako izazvati nepopravljiva oksidativna oštećenja i potencijalno dovesti do razvoja bolesti. Tokom poslednje 3 decenije znanje o biološkim posledicama oksidativnog stresa, uzrokovanog intenzivnom i dugotrajnom fiziĉkom aktivnošću, znaĉajno se proširilo. Ranije se smatralo da povećana produkcija slobodnih radikala u toku intenzivnih treninga predstavlja veliku opasnost za fiziološke funkcije sportista i da je treba smanjiti ili eliminisati. Ipak, novija otkrića su pokazala da povećana produkcija slobodnih radikala moţe prestavljati stimulus za ushodnu regulaciju antioksidativnih enzima i povećanje aktivnosti zaštitinih mehanizama. Sa druge strane, ovaj adaptivni odgovor ponekad ne moţe da kompenzuje poremećenu redoks ravnoteţu u organizmu, pa su potrebe sportista za antioksidansima povećane, naroĉito u periodu intenzivnih treninga i takmiĉenja. Pored toga, unos antioksidanasa putem hrane kod sportista je vrlo ĉesto niţi od preporuĉenog. Stoga, suplementacija antioksidansima moţe pruţiti znaĉajnu potporu endogenim antioksidansima u cilju smanjenja povećane produkcije slobodnih radikala i oksidativnog stresa. Potrebna su dodatna ispitivanja veze izmeĊu fiziĉke aktivnosti i oksidativnog stresa i posledica koje moţe imati, kao i istraţivanja o efektima suplementacije antioksidansima. 2 1.1. Oksidativni stres Oksidativni stres je stanje u kome je delikatna ravoteţa izmeĊu produkcije proksidanasa-slobodnih radikala i njihovog uklanjanja putem antioksidativnih zaštitinih mehanizama pomerena u smeru stvaranja slobodnih radikala (Fisher-Welman K, 2009). Slobodni radikali su molekuli ili delovi molekula koje imaju jedan ili više nesparenih elektrona u poslednjoj orbitali (Finaud J, 2006). OdreĊena stanja ubrzavaju, odnosno uslovljavaju hroniĉnu produkciju slobodnih radikala, što moţe dovesti do preopterećenja kapaciteta antioksidativnih mehanizama zaštite, stalnog poremećaja redoks ravnoteţe i promena u redoks senzitivnim signalnim putevima. Ovaj poremećaj uslovljava oksidativna oštećenja nukleinskih kiselina, lipida i proteina, a preko promena u ekspresiji gena, moţe dovesti do apoptoze zdravih ćelija i sistemske inflamacije (Droge W, 2002). Umerene, kao i izrazite promene u redoks potencijalu, kao posledica hroniĉnog oksidativnog stresa najverovatnije imaju ulogu u nastanku i razvoju velikog broja akutnih i hroniĉnih bolesti. Kada govorimo o slobodnim radikalima uglavnom se misli na reaktivna kiseonikova jedinjenja (eng. reactive oxigen species-ROS), zato što su ona ukljuĉena u esencijalne fiziološke fenomene, kao što je imuni odgovor i oksidativni stres. Pored toga slobodni radikali mogu da sadrţe atom azota (eng. Reactive nitrogen species-RNS) ili sumpora (eng. reactive sulfur species-RSS) (Tabela 1) (Finaud J, 2006). Bazalni nivo ROS se konstantno produkuje i eliminiše iz organizma. U ţivim organizmima ova delikatna ravnoteţa je odgovorna za uspostavljanje intracelularnog redoks stanja, koji ima ulogu u optimizaciji ćelijskih funkcija. U ćelijama sisara postoji veliki broj signalnih puteva koji su osetljivi na intracelularno redoks okruţenje i mogu biti aktivirani posredstvom oksidativnog stresa. Prolazne promene u redoks ravnoteţi, koje nastaju usled povećane produkcije reaktivnih kiseonikovih jedinjenja ili smanjene antioksidativne zaštite, dovode do pomeranja ravnoteţe ka sredini koja ima oksidativne karakteristike, što predstavlja signal za aktivaciju odreĊenih mehanizama od znaĉaja za optimalne fiziološke funkcije (Droge W, 2002). Neke primeri specifiĉnih redoks osetljivih funkcija i njihovih signalnih mehanizama su: 3 1. Regulacija vaskularnog tonusa preko guanilat ciklaze ili transkripciona/post- transkripciona regulacija azot oksid sintaze preko aktivacije nuklearnog faktora-κB (NF-κB) i mitogen aktivisane protein kinaze (MAPK). 2. Amplifikacija imunog odgovora i apoptoze preko aktivacije aktivator proteina 1 (AP1) i NF-κB transkripcionog faktora u humanim T ćelijama. 3. Regulacija insulin receptor kinazne aktivnosti preko povećane aktivnosti protein tirozin fosfataze. 4. Povećanje ekspresije antioksidativnih enzima i glutationa kao odgovor na MAPK i NF-κB aktivaciju u cilju ponovnog uspostavljanja redoks ravnoteţe. Ovaj poslednji primer je naroĉito krakteristiĉan za sport, jer se smatra da povećana produkcija ROS tokom i posle treninga predstavlja signal za povećanje aktivnosti antioksidativnih zaštitnih mehanizama (Fisher-Welman K, 2009). Tabela 1. Klasifikacija i osnovna delovanja slobodnih radikala Slobodni radikal Oznaka Poluţivot Delovanje Reaktivna kiseonikova jedinjenja ROS Superoksidani anjon O2 ¯ 10 -5 sek Singletni kiseonik 1 O2 1 μsek Ozon O3 Stabilan Oksidacija i Hidroksil radikal HO  10 -9 sek Peroksidacija Vodonik peroksid H2O2 Stabilan Lipida Hipohlona kiselina HOCl Stabilna Oksidacija protein Alkoksi radikal RO  10 -6 sek Oštećenje DNK Peroksi radikal ROO  7 sek Hidroperoksi radikal ROOH  - Slobodni radikali azota RNS Azotmonoksid radikal NO  - Peroksidacija lipida Azotdioksid radikal NO2  1-10 sek Oštećenje DNK Peroksinitrit ONOO - 0,005 sek Oksidacija protein Slobodni radikali sumpora RSS Tili radikal RS Oksidacija proteina Oštećenje DNK 4 1.2. Antioksidativna zaštita Antioksidansi su jedinjenja koja umanjuju oksidativna oštećenja u biološkim sistemima tako što spreĉavaju formiranje slobodnih radikala ili reaguju sa njima pre nego stupe u reakciju sa vaţnim biomolekulama. Ćelije su zaštićene od oksidativnih oštećenja kompleksnom mreţom antioksidanasa, koja ukljuĉuje enzimske i neenzimske antioksidanse (Close DC, 2006). Neenzimski antioksidansi su jedinjenja male molekulske teţine, koja se sintetišu u organizmu ili se unose putem hrane. Da bi obezbedili efikasnu zaštitu, ovi antioksidansi su strateški rasporeĊeni u intra i ekstracelularnom prostoru. Slika 1. ilustruje ćelijske lokacije najvaţnijih antioksidanasa (Powers SK, 2004). Efikasnost antioksidativnog sistema zavisi od unosa vitamina i mikronutrijenata putem hrane i sinteze antioksidativnih enzima, koja se moţe menjati pod uticajem redovnih i jednokratnog treninga, ishrane ili starenja (Finaud J, 2006). 1.2.1. Antioksidativni enzimi Antioksidativni enzimi katalizuju reakcije uklanjanja ROS iz sistema ili reakcije regeneracije, odnosno redukcije oksidovanih antioksidanasa (Deaton CM, 2003). Najvaţniji enzimski antioksidansi su: SUPEROKSID DIZMUTAZA (SOD) je enzim koji neutrališe superoksidni anjon i predstavlja prvi enzim u liniji odbrane od oksidativnog stresa. Ovaj enzim je primarno lokalizovan u mitohondrijama i u citosolu ćelija. U skeletnim mišićima postoje dve izoforme: CuZnSOD (SOD1), koja je prvenstveno lokalizovana u citosolu i MnSOD (SOD2) koja se nalazi u mithondrijama (Powers SK, 2008). U mirovanju, u svim ćelijama, najveći deo formiranog superoksidnog anjona neutrališe SOD u mitohondrijama, a samo mali deo SOD u citosolu. MeĊutim, u mišićnim ćelijama, 65 % - 85 % aktivnosti SOD se odvija u citosolu (Finaud J, 2006). Postoji i ekstracelularna forma SOD (SOD3), koja zahteva prisustvo Cu i Zn za svoju aktivnost, a nalazi se i u plazmi i tkivima. Ovaj protein se sekretuje u ekstracelularni prostor i formira glikozilirani homotetramer koji se vezuje za ekstraceullarni matriks (ECM) i površinu ćelija. Jedan deo sintetisanog enzima se cepa blizu C terminalnog kraja pre oslobaĊanja u ekstraceularni prostor i formira cirklišuće tetramere koji se ne vezuju za ECM (Zelko IN, 2003). 5 GLUTATION PEROKSIDAZA (GPX) se nalazi u mitohondrijama, citosolu i membranama ćelija i katalizuje redukciju vodonik peroksida (H2O2) i organskih hidroperoksida u prisustvu redukovanog glutationa (GSH) kao donora elektrona, pri ĉemu se formira oksidovani glutation (GSSG). Aktivnost GPX zavisi od prisustva selena. Postoji pet vrsta ovog enzima koji se razlikuju prema specifiĉnosti supstrata i lokalizaciji u ćeliji (Powers SK, 2008). GLUTATION REDUKTAZA (GR) je esencijalna za konverziju oksidovanog glutationa (GSSG) u redukovani oblik (GSH) uz prisustvo NADPH (redukovani nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat) kao redukcionog faktora (Deaton CM, 2003). Odnos oksidovanog i redukovanog glutationa je vaţan indikator oksidativnog stresa. Usled povećane produkcije ROS, dolazi do uznapredovale oksidacije GSH u GSSG, a recikliranje GSH je limitirano aktivnošću GR i sadrţajem NADPH (Ji LL, 1995). Smanjenje GSH/GSSG se uoĉava sa starenjem ili nakon fiziĉke aktivnosti, a moţe imati ulogu i u etiologiji nekih neurodegenerativnih bolesti (Finaud J, 2006). Odrţavanje optimalnog odnosa GSH/GSSG je vrlo vaţno, s obzirom na višestruku ulogu koju glutation ima u antioksidativnom sistemu zaštite. Pored toga, akumulacija GSSG je toksiĉna jer moţe uticati na formiranje disulfidnih veza u proteinima enzimima i DNK. Ipak nema dokaza da se ovi procesi dešavaju tokom fiziĉke aktivnosti (Ziegler DM, 1985). Slika 1. Lokalizacija najvaţnijih antioksidativnih enzima i neenzimskih antioksidanasa u ćeliji. PON1-paraoksonaza 1; GPX-glutation peroksidaza; SOD-superoksid dizmutaza; CAT-katalaza (preuzeto iz Powers SK i sar./ Physiological Reviews 2008). 6 KATALAZA (CAT) ima nekoliko vaţnih bioloških funkcija od kojih je najvaţnija eliminacija H2O2 iz sistema razlaganjem na vodu i kiseonik. Široko je rasporostranjena u ćelijama, prvenstveno u peroksizomima i mitohondrijama (Finaud J, 2006). GvoţĊe je neophodni kofaktor, vezan za aktivno mesto enzima. I GPX i CAT imaju istu funkciju- neutralizacija H2O2, s tim što je prvi enzim efikasniji u prisustvu većih koncentracija H2O2, dok katalaza ima funkciju u eliminaciji H2O2 u manjim koncentracijama (Powers S, 2008). HUMANA SERUMSKA PARAOKSONAZA 1 (EC 3.1.8.1, arildialkilfosfataza, PON1) je kalcijum zavisna esteraza koji se sintetiše u jetri, a zatim sekretuje u krv gde se vezuje za lipoproteine velike gustine (eng. high density lipoprotein – HDL) (Draganov DI, 2004). PON1 ima vaţnu ulogu u prevenciji ateroskleroze, jer je pokazano da PON1 spreĉava oksidativne modifikacije lipoproteina male gustine (eng. low density lipoprotein – LDL) i HDL ĉestica uzrokovane slobodnim radikalima (Costa LG, 2011). Antiaterogene osobine PON1 se karakterišu sposobnošću ovog enzima da hidrolizuje lipidne perokside u humanoj aterosklerotskoj leziji (La Du BN, 1999). Humani PON1 enzim je polimorfan i razliĉite osobe imaju kako razliĉite koncentracije ovog enzima tako i znaĉajne varijacije u aktivnosti prema istom supstratu. Enzim PON1 ima dva uobiĉajena kodirajuća polimorfizma: supstitucija metionina (M) leucinom (L) na poziciji 55 i supstitucija glutamina (Q) argininom (R) na poziciji 192 (Humbert R, 1993). Prouĉavanjem katalitiĉkih aktivnosti odgovarajućih genotipova prema razliĉitim supstratima uoĉene su varijacije u afinitetima prema razliĉitim nefiziološkim supstratima. Dokazane su supstrat-zavisne razlike izmeĊu PON1Q192R izoformi: PON1R192 varijanta ima jaĉe izraţen afinitet prema paraoksonu kao sustratu u odnosu na PON1Q192, dok prema dizaoksonu, ne postoji razlika u afinitetima izmeĊu PON1Q192 i PON1R192 izoformi, ali su reakcioni uslovi podešeni tako da smanjuju afinitet R varijante prema ovom supstratu (Mackness B, 2008). Pored toga, PON1Q192 fenotip je efikasniji u metabolizmu oksidovanih HDL i LDL ĉestica u odnosu na PON1R192 (Costa LG, 2011). Ipak, faktori sredine kao što su ishrana, fiziĉka aktivnost, pušenje, kao i lekovi mogu menjati aktivnost ovog enzima (Ferre N, 2003). S obzirom na ulogu PON1 u zaštiti od kardiovaskularnih bolesti, kao i na ĉinjenicu da je njena aktivnost smanjena u nekim patološkim stanjima (Rajković MG, 2010; Kotur-Stevuljevic J, 2006), posebna paţnja se poklanja faktorima koji mogu menjati aktivnosti PON1. 7 1.2.2. Neenzimski antioksidansi TIOLI su grupa molekula koje imaju sulfhidrilne ostatke na aktivnim mestima. Sintetišu se iz aminokiselina koje sadrţe sumpor (cisteina ili metionina). Imaju brojne funkcije u biološkim sistemima - uloga u sintezi proteina, redoks sistemima, imunitetu. Zauzimaju vaţno mesto u kompleksnoj mreţi endogenih antioksidansa (Finaud J, 2006). Glutation (GSH) je najzastupljeniji neproteinski tiol u ćelijama. On se primarno sintetiše u jetri i transportuje se putem krvi do tkiva. Tkiva koja su intenzivno izloţena prooksidansima imaju visok nivo GSH - soĉivo u oku, jetra. GSH reaguje direktno sa velikim brojem slobodnih radikala, doniranjem jednog vodonikovog atoma. On je supstrat za GPX u reakciji eliminacije H2O2 i organskih hidroperoksida. Pored toga, GSH omogućava odrţavanje drugih antioksidansa, kao što su vitamin E i C, u redukovanom stanju (Powers SK, 2008). Smatra se da je odnos GSH/GSSG in vivo preko 100:1, ali eksperimentalni podaci pokazuju da je taj odnos 10 do 50:1, zbog neizbeţne oksidacije GSH tokom testa (Ji LL, 1995). U stanju oksidativnog stresa, moguće je smanjenje odnosa redukovanog i oksidovanog GSH (GSH/GSSG), kao i smanjenja ukupnog sadrţaja tiola (Finaud J, 2006). α-Liponska kiselina je tiol koji inhibira peroksidaciju lipida i pomaţe redukciju oksidovanih formi vitamina E i C. TakoĊe, redukuje cistin do cisteina u procesu sinteze tiola (Finaud J, 2006). α-liponska kiselina je kofakor za α dehidrogenaza komplekse i uĉestvuje u reakcijama S-O transfera. Nalazi se u malim koliĉinama u tkivu ţivotinja i vezana je za enzimski kompleks što ograniĉava njenu funkciju kao antioksidansa (Powers SK, 2008). MOKRAĆNA KISELINA je krajnji ekskretorni produkt metabolizma purina i vaţan antioksidans male molekulske teţine u biološkim teĉnostima kod ljudi. Mokraćna kiselina moţe da neutrališe peroksil, hidroksil radikale i singletni kiseonik (Finaud J, 2006). BILIRUBIN je krajnji proizvod metabolizma hemproteina. Ima snaţni antioksidativni potencijal protiv peroksil radikala i štiti ćelije od toksiĉnih nivoa vodonik peroksida (Powers SK, 2008). FERITIN- GvoţĊe je neophodan mikronutrijent za normalan rast i proliferaciju ćelija, a ima antioksidativni efekat kao kofaktor enzima katalaza. Ipak, joni gvoţĊa mogu delovati i prooksidativno, jer oksiduju vitamin C i katalizuju reakciju konverzije 8 vodonik peroksida do hidroksil radikala (Powers SK, 2008). Stoga je gvoţĊe potencijalni prooksidans, a feritin, jedan od proteina ukljuĉenih u metabolizam gvoţĊa, ima vaţnu ulogu u odrţavanju optimalne ravoteţe gvoţĊa. (Finaud J, 2006). Povećana sinteza feritina je uoĉena kao odgovor na treniranje, oštećenje ćelija ili inflamaciju, odnosno na stanja koja promovišu oksidativni stres (Orino K, 2001; Arosio P, 2002). TRANSFERIN i CERULOPLAZMIN su helatni agensi koji vezuju metale i spreĉavaju metalne jone da uĉestvuju u formiranja peroksil radikala. Pored toga, albumin i drugi proteini krvi doprinose ukupnom antioksidativnom kapacitetu krvi nespecifiĉnim vezivanjem slobonih radikala (Close DC, 2006). VITAMIN E- Pod vitaminom E se podrazumeva 8 strukturnih izomera tokoferola i tokotrienola, od kojih je α-tokoferol najpoznatiji i ima najveću antioksidativnu aktivnost. (Lukaski CH, 2004). Vitamin E prvenstveno štiti polinezasićene masne kiseline ćelijskih membrana i subćelijskih struktura od oksidativnih oštećenja. Kao antioksidans, vitamin E je naroĉito vaţan, jer ima sposobnost da konvertuje superoksid, hidroksil i peroksil radikale u manje reaktivne forme. Iako je vitamin E efikasan antioksidans, interakcija sa slobodnim radikalima dovodi do smanjenja funkcionalnog vitamina E i formiranja vitamin E radikala (Powers SK, 2004). Deficit vitamina E je povezan sa neurološkim oštećenjima i hemolizom eritrocita, negativno utiĉe na funkciju skeletnih mišića - povećava oksidativni stres u mišićima, menja tip mišićnih vlakana, uzrokuje degradaciju i inflamatorne procese koji mogu dovesti do distrofiĉnih stanja (Pette D, 1986). Rezultati analize 22 studije koje su obuhvatile i sportiste koji se bave sportovima izdrţljivosti i snage, pokazali su da oni konzumiraju dovoljne koliĉine vitamina E. Ipak, većina sportista je uzimala dijetetske suplemente (Economos CD, 1993). Ostale studije su pokazale da 53% sportista na koledţu, 50% gimnastiĉara u adolescentskom dobu i 38% balerina uzima vitamin E u koliĉini koja je manja od 70% preporuĉenog dnevnog unosa (eng. reccomended dietary alowances-RDA) (Lukaski CH, 2004). VITAMIN C - Za razliku od vitamina E, vitamin C je hidrosolubilan i svoju antioksidativnu aktivnost ispoljava u vodenoj sredini. Vitamin C direktno vezuje superoksid, hidroksil i hidroperoksil radikale. Druga vaţna uloga vitamina C je regeneracija oksidovanog vitamina E. Ipak, visoke koncentracije vitamina C mogu ispoljiti prooksidativni efekat u prisustvu metalnih jona kao što su Fe3+ ili Cu2+ (Powers 9 SK, 2004). Pored toga što je antioksidans, vitamin C ima odreĊene biološke funkcije koje mogu da utiĉu na performanse sportiste: neophodan je za sintezu karnitina i kateholamina, za resorpciju nehemskog gvoţĊa, redukciju folne kiseline i sintezu kortizola. Deficit vitamina C moţe negativno uticati na razliĉite aspekte sportske sposobnosti. Posledice nedovoljnog unosa vitamina C mogu biti zamor i mišićna slabost, a u nekim sluĉajevima i anemija. OdreĊeni faktori, infekcija, pušenje, veća nadmorska visina, ekstremne temperature, ali intenzivna fiziĉka aktivnost mogu povećati dnevne potrebe za vitaminom C. Većina fiziĉki aktivnih odraslih osoba unosi dovoljne koliĉine vitamina C. Ipak, pokazano je da 23% rvaĉa, 20% fudbalera, 13% košarkašica, 22% gimnastiĉarki i 25% biciklistkinja dnevno konzumira manje od 70% RDA vrednosti za vitamin C (Lukaski CH, 2004). KAROTENOIDI su liposolubilni antioksidansi, primarno lokalizovani u biološkim membranama. Antioksidativne osobine karotenoida su posledica njihove strukture - niz konjugovanih dvostrukih veza omogućava vezivanje slobodnih radikala, ukljuĉujući singletni kiseonik, superoksid i peroksil radikal. U uslovima fiziološkog parcijalnog pritiska kiseonika, β-karoten ima antioksidativne karakteristike. Ipak, povećani parcijalni pritisak kiseonika uslovljava gubitak anitoksidativnog kapaciteta β-karotena i ispoljavanje prooksidativnih osobina (Powers SK, 2004). Epidemiloške studije su pokazale da trkaĉi na duge staze, ţene i muškarci atletiĉari na koledţu, ţene veslaĉi unose adekvatne koliĉine vitamina A (Guilland JC, 1989; Welch PK, 1987; Nelson Steen S, 1995). Adolescenti i mladi koji se takmiĉe u rvanju, baletu, gimnastici uzimaju manje od 70% preporuĉenih dnevnih vrednosti za vitamin A (Steen SN, 1986; Benson J, 1985; Loosli AR, 1986). FLAVONOIDI su velika familija difenilpropana, koji su široko rasprostranjeni u biljkama zastupljenim u ljudskoj ishrani. Pokazano je da flavonoidi imaju razliĉite biološka dejstva - od inhibicije inflamatornih enzima (lipooksigenaze, ciklooksigenaze, ksantin oksidaze, NADH-oksidaze, fosfolipaze A2) do antialergijskog, antivurusnog, antiinflamatornog i antitumorskog efekta. Mnogi od ovih bioloških efekata su posledica antioksidativnih karakteristika flavonoida. Sposobnost vezivanja slobodnih radikala podrazumeva neutralizaciju peroksil, hidroksil i superoksid anjon radikala, kao i vodonik-peroksida (Powers SK, 2004). 10 Adekvatni unos antioksidansa putem hrane je od kljuĉnog znaĉaja u borbi protiv oksidativnog stresa. Deficit dijetarnih antioksidanasa moţe biti uzrok povećane osetljivosti na oksidativna oštećenja tokom fiziĉke aktivnosti, ali i uticati na slabljenje performansi sportiste. S obzirom da sportisti koji imaju redovne, naporne treninge mogu imati potrebu za unosom antioksidanasa većim od preporuĉenih da bi imali odgovarajuću zaštitu tokom treninga, dijetarni antioksidansi predstavljaju vaţnu dodatnu zaštitu protiv oksidativnog stresa. 1.3. Merenje oksidativnog stresa Slobodni radikali su veoma reaktivni i imaju izuzetno kratak poluţivot (Tabela 1). Direktna procena produkcije slobodnih radikala je moguća primenom elektronske spinske rezonantne spektroskopije (eng. electron spin resonance spectroscopy –ESRS), zatim radiolize i laserske fotolize. S obzirom da je svaka od ove tri direktne metode jako skupa i zahteva puno rada i vremena, većina istraţivanja koja se odnosi na oksidativni stres u sportu, upotrebljava indirektne metode (Fisher-Wellman K, 2009). Indirektno merenje oksidativnog stresa podrazumeva merenje stabilnijih molekulskih produkata koji nastaju reakcijom oksidacije izmeĊu slobodnih radikala i odreĊenih biomolekula - lipida, proteina i DNK. Malondialdehid (MDA) je produkt degradacije oksidovanih lipida, koji se moţe odrediti putem jednostavne kolorimetrijske metode-tiobarbiturna kiselina reagujuće supstance (TBKRS) testa ili selektivnije HPLC metode. Nešto preciznije metode su spektrofotometrijsko odreĊivanje lipidnih peroksida ili specifiĉnih oksidovanih lipida, kao što su izoprostani (Close DC, 2006). Proteini su meta delovanja ROS zbog toga što ih ima u izobilju u biološkim sistemima i zato što se proteini mogu da reaguju i neutrališu znaĉajan deo ROS koji nastaje u organizmu. Najĉešće korišćeni postupci za merenje oksidativnog oštećenja proteina su odreĊivanje proteinskih karbonila (PK), merenje produkata uznapredovale oksidacije proteina (eng. advanced oxidation protein products-AOPP) i odreĊenih oksidovanih aminokiselina (Fisher-Wellman K, 2009). Delovanje slobodnih radikala na DNK dovodi do formiranja razliĉitih modifikovanih produkata nukleinskih baza i šećera. Oni nisu produkti normalnog metabolizma nukleotida, pa se smatraju indikatorima oksidativnog stresa. 11 Najĉešće se odreĊuju 8-hidroksi 2-deoksiguanozin (8-OHdG) ili oksidovane DNK baze putem komet testa (Deaton CM, 2003). Oksidativni stres se moţe odrediti preko promena u antioksidativnom sistemu zaštite. Ĉesto se prate promene koncentracije glutationa, kao i nivo vitamina C i E. Aktivnost odreĊenih enzima –SOD, GPX, CAT i GR, moţe posluţiti kao indikator oksidativnog stresa kome je tkivo izloţeno. S obzirom na veliki broj antioksidanasa, merenje njihove koncentracije i aktivnosti moţe biti teško i komplikovano. Stoga je razvijeno nekoliko metoda za merenje ukupna antioksidativne aktivnosti, kao što su troloks ekvivalentni anioksidativni kapacitet (eng. Trolox Equivalent Antioxidant Capacity-TEAC), totalni antioksidativni status (eng. Total Antioxidant Status-TAS), test sposobnosti redukcije feri jona (eng. Ferric Reducing Ability of Plasma-FRAP), kapacitet apsorpcije reaktivnih kiseonikovih jedinjenja (eng. Oxygen Radical Absorbance Capacity-ORAC) (Finaud J, 2006). Još jedna kategorija biomarkera oksidativnog stresa podrazumeva merenje ćelijske redoks ravnoteţe. Jedan od najĉešće korišćenih markera je odnos redukovanog i oksidovanog glutationa (GSH/GSSH). Ovaj test moţe biti koristan zbog toga što povećana produkcija slobodnih radikala dovodi do smanjenja odnosa GSH/GSSH, ukazujući na povećanje oksidovanog glutationa GSSG na raĉun redukovanog GSH (Powers SK, 2008). OdreĊivanjem vrednosti prooksidativno-antioksidativnog balansa (PAB) omogućava se istovremeno odreĊivanje prooksidanasa i antioksidanasa u datom uzorku, a time i merenje ravnoteţe izmeĊu njih (Alamdari DH, 2007). Svaka kategorija biomarkera ima svoja ograniĉenja. Izbor adekvatnog biomarkera prestavlja veliki izazov, jer oksidovani produkti mogu biti nestabilni i teško merljivi ili je njihova koliĉina jako mala. Biološki specifiĉni markeri za odreĊena tkiva nisu još identifikovani (Close DC, 2006). Iz tih razloga, potrebno je izmeriti nekoliko biomarkera da bi se potvrdilo prisustvo oksidativnog stresa (Poweres SK, 2008) 12 1.4. Oksidativni stres u sportu Podruĉje ispitivanja oksidativnog stresa u sportu se znaĉajno proširilo od prvog otkrića, 1978. godine kada je pokazano da se nivo lipidnih peroksida povećava nakon akutnog aerobnog veţbanja. Povećano interesovanje za ovu temu je posledica spoznavanja uloge ROS u etiopatogenezi brojnih hroniĉnih bolesti, kao i zbog konstantog promovisanja veţbanja i fiziĉke aktivnosti u cilju odrţavanja i unapreĊenja zdravlja, ali i zbog razvoja i dostupnosti sve većeg broja razliĉitih antioksidanasa. 1.4.1. Produkcija slobodnih radikala tokom fiziĉke aktivnosti Postoji veliki broj potencijalnih izvora slobodnih radikala tokom fiziĉke aktivnosti. Na slici 2. prikazana su mesta na kojima se formira superoksidni anjon u skeletnim mišićima. MITOHONDRIJE - U respiratornom lancu mitohondrija 95 % - 99 % kiseonika se redukuje do vode u prisustvu koenzima Q. Ipak, jedan deo, 1 % - 5 % udahnutog kiseonika, usled curenja elektrona u respiratornom lancu formira superoksidni anjon (Jenkins RR, 1993). S obzirom da se potrošnja kiseonika u toku fiziĉke aktivnosti povećeva 100-200 puta, dolazi i do znaĉajnog povećanja produkcije superoksidnog anjona. Produkcija slobodnih radikala izmerena ESRS snaţno korelira sa maksimalnom potrošnjom kiseonika (Deaton CM, 2003). Druga studija je pokazala da se u mitohondrijama ~0,15 % udahnutog kiseonika transformiše do superoksidnog anjona, što je znaĉajno manje od prvobitne predpostavke. Manji stepen produkcije superoksidanog anjona u mitohondrijama se obrašnjava prisustvom dekuplujućih proteina, za koje se smatra da imaju vaţnu ulogu regulatora produkcije ROS u cilju zaštite mitohondrija od oksidativnog oštećenja (Brand MD, 2004). S obzirom da novije studije pokazuju da mitohondrije nisu dominanti izvor slobodnih radikala, dalja istraţivanja su neohodna da bi se u potpunosti utvrdila uloga koju mitohondrije imaju u produkciji ROS (Powers SK, 2008). KSANTIN DEHIDROGENAZA (XDH) katalizuje poslednju fazu degradacije purinskih baza (ATP, ADP i AMP), odnosno prevoĊenje hipoksantina u ksantin i ksantina u mokraćnu kiseline uz prisustvo NAD+ kao akceptora elektrona. Tokom intenzivnog veţbanja, mišićna vlakna zbog kontrakcija mogu biti u hipoksiji. U 13 uslovima hipoksije koja dovodi do ishemije, ksantin se formira iz ATP-a anaerobnim metabolizmom, a XDH se proteolitiĉkom degradacijom konvertuje u ksantin oksidazu (XO). Kada se uspostavi normalni protok krvi (reperfuzija), povećava se i dotok kiseonika, a XO i dalje konvertuje purinske baze u mokraćnu kiselinu, ali koristi kiseonik kao akceptor elektrona, pri ĉemu nastaje superoksidni anjon. Ipak, uloga XO u generisanju ROS kod ljudi je diskutabilna zbog malih koliĉina XDH odnosno XO (Deaton CM, 2003). Slika 2. Ilustracija odabranih mesta koja su odogovorna za produkciju slobodnih radikala u skeletnim mišićima (Preuzeto iz Powers SK i sar./ Free Radical Biology & Medicine 2011). NIKOTINAMID ADENIN DINUKLEOTID FOSFAT (NADPH) OKSIDAZA generiše superoksidni anjon transferom elektrona sa NADPH na molekulski kiseonik (Powers SK, 2011). Fagocitna NADPH oksidaza je odgovorna za produkciju superoksidnog anjona u aktiviranim makrofagama i neutrofilima. Kombinovana aktivnost NADPH oksidaze i mijeloperoksidaze u fagocitima pored superoksidnog anjona dovodi do produkcije i hipohlorne kiseline, koja je jedan od najjaĉih fizioloških oksidanasa i moćan antimikrobni agens. Masivna produkcija ROS koji ima antimikrobne i tumoricidne karakteristike predstavljaju prvu liniju odbrane od patogena (Droge W, 2002). Kao posledica intenzivnog veţbanja nastaje mehaniĉko oštećenje mišića, koje dovodi do aktivacije makrofaga i neutrofila i formiranja slobodnih radikala posredstvom NADPH oksidaze (Deaton CM, 2003). 14 Pored toga, postoji nefagocitna NADPH oksidaza koja se nalazi u sarkoplazmatskom retikulumu (SR), sarkolemi i u transverznim tubulama (T tubule) i ĉija aktivnost takoĊe doprinosi doprinosi produkciji ROS tokom fiziĉke aktivnosti (Powers SK, 2011). FOSFOLIPAZA A2 (PLA2) katalizuje razgradnju fosfolipida ćelijskih membrana i oslobaĊa arahidonsku kiselinu. Delovanjem enzima kao što su lipooksigenaza i ciklooksigenaza dolazi do formiranja prostanoida, ali i superoksidnog anjona. Pored toga, PLA2 aktivira i NADPH oksidazu, a moţe da stimuliše i produkciju ROS u mitohondrijama i citosolu mišića i njihovo oslobaĊanje u ekstraceulularni prostor (Powers S, 2011). Koncentracija kateholamina se povećava tokom veţbanja i ROS nastaju kao posledica njihove autooksidacije. Autoksidacija oksihemoglobina do methemoglobina dovodi do nastanka superoksidnog anjona, a stepen formiranja methemoglobina se povećava sa fiziĉkim naporom. Hipertermija uzrokovana treningom moze takoĊe da prouzrokuje oksidativni stres. Povećanje temperature i relativne vlaţnosti od 20°C i 40%, na 30°C i 80 %, je povezano sa povećenjem oksidacije glutationa u eritrocitima u hemolizatu i lipidne peroksidacije u plazmi nakon submaksimlnog treninga kod konja. (Deaton CM, 2003). Nakon inicijalnog povećanja produkcije ROS tokom veţbanja, dolazi i do sekundarnog generisanje prooksidanasa od strane aktiviranih makrofaga i neutrofila (fagocita), zatim gubitka homeostaze kalcijuma i destrukcije proteina koji sadrţe gvoţĊe. Formiranje ROS zavisi od naĉina treninga –aerobni ili anaerobni, intenziteta kao i trajanja veţbanja, jer se razliĉiti tipovi fiziĉke aktivnosti meĊusobno razlikuju po energetskim potrebama, po nivou potrošnje kiseonika, kao i po mehaniĉkom oštećenjeu tkiva tokom treninga (Fisher-Wellman K, 2009). 1.4.2. Oksidativni stres i aerobni trening Postoje neslaganja izmedju studija koje su ispitivale oksidativni stres u toku i nakon aerobnog treninga. Brojna istraţivanja su pokazale povećanje peroksidacije lipida i nivoa produkata oksidacije proteina (Nikolaidis MG i Kyparos A, 2007; Alessio HM, 1997; Steinberg JG, 2006; Bryant RJ, 2003; Goldfarb AH, 2007; Goto C, 15 2007; Waring WS, 2003; Bloomer RJ, 2006) nakon maksimalnog i submaksimalnog aerobnog treninga u trajanju do dva sata. Ipak, pojedine studije nisu uoĉile znaĉajno povećanje parametara oksidativnog stresa (Jamurtas AZ, 2006; Gaeini AA, 2006; Bloomer RJ and Goldfarb AH, 2005; Cholewa J, 2008; Orhan H, 2004; Rush JW, 2003; Watson TA, 2005) kod sliĉnih protokola. Studije koje su uoĉile znaĉajno povećanje ovih parametara oksidativnog stresa uglavnom su primenjivale protokole maksimalnog napora (~75%VO2max), što ukazuje na znaĉaj intenziteta veţbanja na oksidativna oštećenja lipida. Primena kometa testa pokazala je prisustvo oksidativnih oštećenja DNK nakon aerobnog veţbanja (Niess AM, 1996; Hartman A, 1995). Većina studija nije uoĉila promene nivoa 8-OHdG nakon veţbanja u trajanju do dva sata (Bloomer RJ, 2006; Bloomer RJ and Goldfarb AH, 2005). Ekstremne aerobne fiziĉke aktivnosti, kao što su polumaraton, maraton, ultramaraton ili triatlon, dovode do povećanja nivoa produkata peroksidacije lipida, povećane koncentracije proteinskih karbonila, oksidativnog oštećenja DNK, kao i promena u odnosu oksidovanog i redukovanog GSH (Tian Y, 2010; Knez WL, 2007; Tauler P, 2006, Child RB, 2000; McAnulty SR, 2005; Nieman DC, 2002; Palmer FM, 2003; Mastaloudis A i Morrow JD, 2004; Turner JE, 2011; Radak Z, 2000; Mastaloudis A i Yu TW, 2004; Aguilo A, 2005). Ovo stanje oksidativnog stresa, u zavisnosti od ispitivanih parametara, moţe biti izraţeno i do nekoliko sati, pa ĉak do 30 dana nakon sportskog dogaĊaja (Neubauer O, 2008; Turner JE, 2011). Ipak, u literaturi postoji manji broj studija u kojima nisu detektovane promene u parametrima oksidativnog stresa nakon aerobne fiziĉke aktivnosti koje traju duţe od dva sata (Rokitzki L, 1994; Child RB, 2000; McAnulty SR, 2007; Ginsburg GS, 1996; Hartman A, 1998). Kapacitet antioksidativne zaštite moţe biti smanjen tokom i nakon intenizivnih treninga koji traju do dva sata usled korišćenja njegovih komponenti na neutralizaciju slobodnih radikala (Watson TA, 2005; Steinberg JG, 2006), dok se u periodu oporavka uoĉava njegov rast (Nikolaidis MG i Kyparos A, 2007; Michailidis Y, 2007; Watson TA, 2005). Nasuprot tome, zapaţen je i porast antioksidativnog kapaciteta nakon intenzivnih treninga, verovatno zbog povećane produkcije mokraćne kiseline i povlaĉenja anitoksidativnih vitamina iz depoa (McAnulty SR, 2003; Waring WS, 2003). Nedosledni rezultati su dobijeni za svaki od 4 glavna antioksidativna enzima, gde su studije pokazale povećanje (Buczynski A, 1991; Elosua R, 2003; Nikolaidis MG i 16 Kyparos A, 2007), ali i smanjenje aktivnosti ovih enzima (Akova B, 2001). Neki istraţivaĉi nisu uoĉili promene u aktivnosti ovih enzima (Cholewa J, 2008; Rush JW, 2003; Tauler P i Aguilo A, 2006), nakon veţbanja submaksimalnog do maksimalnog intenziteta u trajanju do dva sata. Dobijeni razliĉiti rezultati su verovatno posledica delovanja nekoliko faktora, kao što su vreme uzimanja uzoraka, duţina i intenzitet veţbanja, koji su varirali izmeĊu studija. U većini studija koja je ispitivala uticaj aerobne aktivnosti duţe od 2 sata uoĉeno je povećanje antioksidativnog kapaciteta (Child RB, 2000; McAnulty SR, 2007; McAnulty SR, 2005). Razliĉiti rezultati su dobijeni kada su u pitanju specifiĉni antioksidativni enzimi. Uoĉeno je prolazno povećanje aktivnosti enzima (Tauler P, 2003; Tauler P i Sureda A, 2006; Aguilo, A, 2005; Tian Y, 2010), smanjenje (Rokitzki L, 1994; Aguilo, A, 2005; Knez WL, 2007; Mastaloidis A i Morrow JD, 2004), dok neke studije nisu uoĉene promene aktivnosti antioksidativnih enzima (Marzatico 1997; Tauler P, 2003; Aguilo A, 2005; Tian Y, 2010). Smatra se da je razlog izostajanja znaĉajnih promena u parametrima oksidativnog stresa povezana sa ĉinjenicom da su ispitanici visoko utrenirani sportisti, kod kojih je povećan kapacitet antioksidativne zaštite. Iako je duţina ovih protokola dovoljna za indukciju proizvodnje ROS, intenzitet je manji, tako da ovi sportisti imaju dovoljan nivo antioksidativne zaštite da se izbore sa ROS, tako maskirajući akumulaciju biomarkera oksidativnog stresa (Margaritis I, 1997). Ispitivani biomarkeri, vreme uzorkovanja, nekontrolisani unos ugljenih hidrata, su još neki od razloga što oksidativni stres u nekim studijama nije bio detektovan (Mastaloudis A, 2001; McAnulty S, 2003) . 1.4.3. Oksidativni stres i anaerobni trening Većina studija je pokazala da i anaerobni trening dovodi do stanja oksidativnog stresa, što je zakljuĉeno na osnovu povećanja peroksidacije lipida, oksidacije proteina, promenama u glutation redoks statusu (Liu JF, 2005; Goldfarb AH i Bloomer RJ, 2005; Viitala PA, 2004; Nikolaidis MG i Paschalis V, 2007; Childs A, 2001; Paschalis V, 2007; Bloomer RJ, 2007; Panza VS, 2008). Vrednosti parametara oksidativnog stresa su dostizale maksimum izmeĊu 48h i 72h nakon treninga, ukazujući da je verovatno glavna determinanta oksidativnog stresa kao odgovor na veţbanje inflamacija kao posledica oštećenja mišića i produkcija slobodnih radikala posredstvom NADPH oksidaze u 17 aktiviranim makrofagama i neutrofilima (Goldfarb AH i Bloomer RJ, 2005; Paschalis V, 2007). Ipak, manji broj studija nije pokazao promene u nivou oksidativno modifikovanih lipida, proteina i glutationa (Bloomer RJ, 2007; Panza V, 2008; Child R, 1999; Liu JF, 2005). Nijedna studija nije pokazala znaĉajno povećanje oštećenja DNK nakon anaerobnog treninga sa opterećenjem (Bloomer RJ i Fry AC, 2007; Bloomer RJ, 2005). Rezultati ispitivanja kapaciteta antioksidativne zaštite su razliĉiti, s obzirom da su neke studije pokazale povećanje (Childs A, 2001; Paschalis V, 2007) ili smanjenje (Liu JF, 2005), dok neke studije nisu detektovale znaĉajne promene razliĉitih markera antioksidativne zaštite (Child R, 1999). Nedostatak oksidativnog stresa je verovatno povezan sa specifiĉnim markerima koji su mereni, vremenom uzorkovanja, intenzitetom veţbanja, dijetarnim unosom, kao i sa trenaţnim statusom ispitanika. 1.4.4. Oksidativni stres i redovno treniranje - fenomen hormeze S obzirom da najveći broj studija potvrĊuje povećanje biomarkera oksidativnog stresa nakon aerobnih i anaerobnih treninga, jasno je da jednokratna fiziĉka aktivnost predstavlja fiziološki stres za organizam. Intenzivni treninzi kroz duţi vremenski period uslovljavaju viši nivo razliĉitih parametara oksidativnog stresa kod ispitanika koji se aktivno bave sportom u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe (Kürkçü R, 2010; Bonina FP, 2005). Ipak, rezultati nekih studija ukazuju na smanjenje oksidativnog stresa u miru kod sportista (Metin G, 2003). Pored toga što je odreĊeni nivo ROS neophodan za optimalne fiziološke funkcije organizma, ove studije pokazuju da povećana produkcija slobodnih radikala kod sportista ne mora uzrokovati dugotrajne negativne posledice na fiziološke funkcije, već naprotiv, dovodi do adaptacije, odnosno ushodne regulacije antioksidativih mehanizama zaštite (Djordjevic D, 2011; Kürkçü R, 2010; Metin G, 2003; Zembron-Lacny A, 2009), što za cilj nema potpunu eliminaciju ROS iz sistema, već smanjenje potencijalnih oksidativnih oštećenja u toku budućih treninga. Sa druge strane, povećana produkcija ROS koja prevazilazi kapacitet antioksidativne zaštite dovodi do izrazitih oksidativnih oštećenja, smanjenja performansi i bolesti, što je potvrĊeno povećanjem rizika od bolesti u sluĉaju dugotrajnih, vrlo intenzivnih treninga u toku duţeg vremenskog perioda. Posledica je i smanjenje efikasnosti antioksidativnih mehanizama zaštite i ciljnim tkivima i krvi profesionalnih sportista koji imaju naporne treninge i ĉesta takmiĉenja (Bonina FP, 2005; Schroder H, 2000) . 18 1.4.5. Uticaj slobodnih radikala na oštećenje mišića Intenzivan trening, naroĉito ekcentriĉni trening u kome se mišići aktivno isteţu, uzrokuje oštećenje mišićnih vlakana. Inicijalna mehaniĉka povreda poĉinje vrlo brzo, u roku od 15 minuta od poĉetka treninga i prenosi se sporadiĉno kroz vlakno (Bloomer RJ, 2007). Peroksidacija lipida sarkoleme uzrokovana ROS tokom veţbanja moţe imati ulogu u etiologiji oštećenja mišića uzrokovanog fiziĉkom aktivnošću. Uoĉena je korelacija izmeĊu efluksa enzima kreatin kinaza (CK), kao indikatora oštećenja mišića i TBKRS, biomarkera lipidne peroksidacije (Teixeira VH, 2009). Mehaniĉko oštećenje mišića i/ili povećan nivo ROS stimulišu akutni lokalni inflamatorni odgovor koji podrazumeva oslobaĊanje inflamatornih citokina u cilju mobilizacije neutrofila i monocita na mesto inflamacije da bi se oporavilo oštećeno tkivo. Iz infiltriranih fagocita oslobaĊaju se slobodni radikali, koji dodatno mogu oštetiti mišićno tkivo i uĉestvovati u razvoju odloţene upale mišića (eng. delayed onset of muscle soreness-DOMS). Poremećaji u oslobaĊanju i preuzimanju kalcijuma mogu dovesti do smanjenja kontraktilnosti mišića i produkcije snage. ROS moţe uzrokovati i oksidaciju proteina, što doprinosi zamoru mišića. Poremećaj ćelijske homeostaze u mišićima uzrokovan ROS rezultira oštećenjem mišića, bolom, zamorom i smanjenjem sportskih performansi (Powers SK, 2004). 1.4.6. Oksidativni stres i oštećenje mišića u fudbalu Visok apsolutni nivo potrošnje kiseonika, visok nivo cirkulišućih kateholamina, ostećenje mišića usled ekcentriĉnih kontrakcija i poslediĉna inflamacija, intermitentni ponavljajući sprintovi, koji prouzrokuju privremenu ishemiju, a potom reperfuziju u skeletnim mišićima, mogući su faktori koji utiĉu na produkciju ROS tokom i posle treninga kod fudbalera (Ascensão A, 2008). Redovni treninzi kod profesionalnih fudbalera se povezuju sa povećanom produkcijom slobodnih radikala i sa većim stepenom oksidativnog stresa u odnosu na odgovarajuću grupu ispitanika koja se ne bavi fiziĉkom aktivnošću (Cazzola R, 2003). Oksidativni stres kod fudbalera moţe biti komponezovan povećanjem ukupnog antioksidativnog kapaciteta i nivoa solubilnih antioksidansa male molekulske teţine (vitamina E i C), ali i povećanjem aktivnosti antioksidativnih enzima (Cazzola R, 2003; Brites F 1999; Tauler P, 2008; Metin G, 2003). 19 Pokazano je da fudbalske utakmice dovode do povećanja parametara oksidativnog stresa, verovatno delom usled inflamatornog odgovora koji nastaje nakon utakmice. Povećani oksidativni stres se moţe videti kroz povećanje nivoa MDA, TBKRS, proteinskih karbonila (PK) i kroz znaĉajno smanjenje sulfhidrilnih ostataka, odnosno smanjenje odnosa GSH/GSSG (Fatouros IG, 2010; Asensao A, 2008; Andersson H, 2010). Nakon treninga uoĉeno je i povećanje TAS i mokraćne kiseline u plazmi, što ukazuje na kompenzatorni odgovor na intenzivni trening. Malo je objavljenih podataka o uticaju oksidativnog stresa na sportske sposobnosti kod fudbalera. Postoji mogućnost da predhodna oksidativna oštećenja uzrokovana periodima intenzivnih treninga mogu kompromitovati zdravstveni status sportiste, kao i njegove performanse. Povećanje oksidativnog stresa je praćeno smanjenjem anaerobnih performansi u periodu do 72h nakon utakmice, dok su CK i DOMS su povećani nakon utakmice i ostaju povišeni tokom 48h (Fatouros IG, 2010). Pokazano je da je DOMS povišen, a snaga donjih ekstremiteta i sposobnost sprinta smanjena do 72h posle utakmice u odnosu na pre utakmice (Ascensão A, 2008) 1.5. Primena antioksidanasa u sportu 1.5.1. Primena antioksidanasa u cilju smanjenja oksidativnog stresa Do sada je sproveden veliki broj istraţivanja sa ciljem da se odredi efekat antioksidanasa na smanjenje ili eliminaciju oksidativnih oštećenja kao posledice intenzivne fiziĉke aktivnosti. Najĉešće ispitivani antioksidansi su vitamin E i vitamin C, posebno ili u kombinaciji sa drugim antioksidansima, primenjivani u razliĉitim periodima - hroniĉno od 1-8 nedelja, ili akutno 1-2 dana pre sportskog dogaĊaja. Pored ovih, ispitivani su i koenzim Q10 (Braun B, 1991), N-acetil cistein (Childs A, 2001), kvercetin (Pelletier DM, 2012), borovnica (McAnulty SR, 2004), ekstrakt zelenog ĉaja (Panza VS, 2008), ekstrakt crvene pomorandţe (Bonina FP, 2005), α-liponska kiselina (Zembron-Lacny A, 2009). Nekoliko studija je zabeleţilo smanjenje oksidativnog stresa izazvanog aerobnim treningom nakon hroniĉne primene vitamina C (Alessio HM, 1997; Goldfarb, 2005) i vitamina E (Hartmann A, 1995; Itoh H, 2000; Mastaloudis A, 2004), kao i 20 kombinacije antioksidanasa (Bloomer RJ, 2006; Goldfarb AH, 2007; Tauler P, 2006). Ipak, nije uoĉeno smanjenje nivoa svih parametara oksidativnog stresa. Pored toga, neke studije nisu zabeleţile povoljne efekte pojedinaĉne primene vitamina C (Bryant RJ, 2003; Nieman DC, 2002; Cholewa J, 2008; Palmer FM, 2003) ili vitamina E (Gaeini AA, 2006; Bryant RJ, 2003). Ĉak je i pokazan prooksidativni efekat vitamina E kada se primenjuje u visokim dozama kod aerobne aktivnosti visokog intenziteta (McAnulty SR, 2005; Nieman DC, 2004). Povoljni efekti nisu uoĉeni posle primene koenzima Q10 (Braun B, 1991). Neslaganje u literaturi je posledica nekoliko faktora ukljuĉujući trenaţni status ispitivane populacije, unos antioksidanasa preko hrane, kao i trajanje suplementacionog perioda. Ispitivanje efekta antioksidanasa na oksidativni stres uzrokovan anaerobnim treningom je takoĊe imalo mešovite rezultate. Smanjenje oksidativnog stresa je uoĉeno nakon primene vitamina E (McBride JM, 1998), kombinacije vitamina C, vitamina E i selena (Golfarb AH, 2005) i zelenog ĉaja (Panza VS, 2008). Poboljšanje nije uoĉeno nakon nakon vitamin E (Viitala PA, 2004), kombinacije vitamina C i vitamina E (Bloomer RJ i Falvo MJ, 2007), nakon mešavine antioksidantnih vitamina i minerala (Teixeira V, 2009), kao ni nakon kombinacije vitamina C i NAC (Childs A, 2001). 1.5.2. Primena antioksidanasa u cilju smanjenja oštećenja mišića S obzirom da ROS uĉestvuju u inicijaciji i progresiji oštećenja mišića tokom veţbanja, veruje se da primena antioksidanasa moţe ublaţiti znake i simptome oštećenja mišića, umanjujući negativan uticaj ROS. Ipak, na osnovu rezultata studija koje su ispitivale uticaj antioksidanasa, pojedninaĉnih ili u kombinaciji, na oštećenje mišića ne moţe se doneti konaĉan zakljuĉak. Nekoliko studija je pokazalo smanjenje aktivnosti CK i laktat dehidrogenaze (LDH) nakon intenzivnih treninga kod ispitnika suplementiranih sa vitaminom E (Rokitzki L, 1994; McBride JM, 1998; Tsakiris S, 2009), ali bez uticaja na druge parametre oštećenja mišića, kao što su DOMS, oštećenje citoskeleta, mišićna snaga. Jedna studija je ĉak pokazala povećanje CK nakon 3 nedelje stuplementacije sa 1200 IU vitamina E, bez uticaja na ostale parametre (Avery NG, 2003). Kratkotrajna suplementacija visokim dozama vitamina C, dovela do smanjenje DOMS nakon anaerobnog treninga (Kaminsky M, 1992). Kombinacija vitamina C i NAC u periodu 21 od 7 dana nije izazvala nikakve promene u DOMS nakon ekcentriĉnog trenaţnog protokola, ali je uzrokovala veći nivo CK i LDH (Childs A, 2001). Kombinacija vitamina C, E i selena u periodu od 14 dana smanjila je CK i DOMS, bez uticaja na maksimalnu izometrijsku snagu i opseg pokreta (eng. range of motion –ROM) (Bloomer RJ, 2004). Ipak, kombinacija vitamina E i C u nekim studijama nije pokazala efikasnost u smanjenju oštećenja mišića (Bloomer RJ i Falvo MJ, 2007; Shafat A, 2004). Kombinacija vitamina i minerala sa antioksidativnim delovanjem takoĊe ne spreĉava oštećenje mišića (Texeira VH, 2009). Mešavina tokoferola i flavonoida, 7 dana nakon ekcentriĉnog treninga, je dovela do smanjenje inflamatornih markera CRP i IL-6, ali nije bilo razlike u CK, LDH i DOMS izmeĊu suplementirane i kontrolne grupe (Philips TAC, 2003). 1.5.3. Primena anitoksidanasa u cilju smanjenja oksidativnog stresa i oštećenja mišića u fudbalu Ispitivanja uticaja antioksidanasa na oksidativni stres kod fudbalera su retka. Suplementacija sa antioksidativnim koktelom sa koenzimom Q10 nije uticala na bazalne vrednosti parametara oksidativnog stresa – MDA i PK. Ipak, vrednosti MDA i PK su bile manje u suplementiranoj u odnosu na placebo grupu nakon fudbalskog meĉa (Tauler P, 2008). Nije bilo uticaja suplementacije na markere oksidativnog stresa u neutrofilima. Suplementacija sa 1000 mg vitamina C i 800 mg α-tokoferola u periodu od 3 meseca, smanjila je peroksidaciju lipida (izmereno preko MDA) i oštećenje mišića (mereno preko CK) tokom perioda intenzivnih treninga, ali nije imalo uticaja na poboljšanje sportskih performansi. Nije uoĉen znaĉajan efekat suplementacije ni redovnih treninga na aktivnost enzima GR i CAT u eritrocitima. (Zoppi, 2006). Suplementacija mešavinom anitoksidanasa je pokazala povoljan efekat na smanjenje porasta nivoa lipidnih hidroperoksida (LPO), 8-izo prostaglandina F2α i CK, nakon maksimalnog testa na traci kod fudbalera, nakon 20 dana suplementacije. Znaĉajan efekat suplementacije na sportske performanse fudbalera nije uoĉen (Arent SM, 2010). 22 1.6. Imuni sistem sportista Oksidativni stres, inflamacija, mikrotraume mišića, suprimirana odbrana protiv patogena iz spoljašnje sredine su negativni uticaji kojima je istovremeno izloţen organizam sportiste. Fiziološki stres uzrokovan dugim i intenzivnim treninzima se ogleda i u prolaznim, ali znaĉajnim promenama u imunom sistemu što se dovodi u vezu sa povećanom incidencom infekcija, naroĉito infekcija gornjih respiratornih puteva kod sportista (Nieman DC, 2007). Produţeni trening visokog intenziteta dovodi do mobilizacije imunokompetentnih ćelija u krv. Broj cirkulišućih neutrofila raste tokom, ali i nakon završetka treninga. Koncentracija limfocita raste tokom treninga, ali u periodu oporavka opada ispod bazalnog nivoa (McCarthy DA, 1988). Povećan broj limfocita tokom treninga je posledica mobilizacije svih subpopulacija u krv. I broj NK ćelija prvo raste, ali u periodu oporavka znaĉajno opada (McCarthy DA, 1988). Pored toga, aktivnost NK ćelija, funkcija T i B limfocita i funkcija neutrofila je suprimirana najmanje nekoliko sati tokom perioda oporavka (Gabriel H, 1997; Nieman DC, 2001, 2003b, 2002a, Davidson G, 2010). Poremećaj funkcije imunog sistema je najverovatnije posledica imunosupresivnog efekta hormona kao što su adrenalin, noradrenalin i kortizol. Intenzitet kao i trajanje treninga i utreniranost sportiste, ali i njegov nutritivni status su vaţni fakori koji utiĉu na promene u imunom sistemu (Gleeson M, 2006). 1.6.1. Uticaj fiziĉke aktivnosti na mukozni imunitet Efekat treninga na humoralni imuni odgovor se procenjuje merenjem nivoa serumskih i sekretornih imunoglobulina (sIgA) in vivo i in vitro sinteze imunoglobulina nakon mitogen stimulacije limfocita. Nivo imunoglobulina u serumu u toku i nakon fiziĉke aktivnosti uglavnom ostaje isti ili se uoĉava blagi rast. Aktivnost mukoznog imuniteta se uglavnom procenjuje merenjem sIgA u salivi. Većina ispitivanja pokazuju smanjenje nivoa sIgA u salivi nakon fiziĉke aktivnosti visokog intenziteta kod elitnih sportista, dok umerena fiziĉka aktivnost kod sportista rekreativaca ne dovodi do znaĉajnih promena u nivou sIgA u salivi (Gleeson M, 2000). Istraţivanje uticaja redovne fiziĉke aktivnosti na mukozni imunitet je manjeg obima. Rezultati većine istraţivanja pokazuju kontinuirano smanjenje nivoa sIgA tokom duţeg perioda intenzivnih treninga (Fahlman MM, 2005; Glesson M, 1999; Levando VA, 1988). Viši 23 nivo sIgA kod osoba koje se redovno bave sportom u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe je uoĉeno i malom broju studija (Gleeson M, 1995; Nehlsen-Cannarella SL, 2000). 1.6.2. Uloga ishrane u optimalnoj funkciji imunog sistema Deficit proteina i ugljenih hidrata, ali i specifiĉnih mikronutrijenata dovodi se u vezu sa depresijom imunog odgovora i povećanjem osetljivosti na infekcije. Da bi se omogućilo pravilno finkcionisanje imunog sistema sportisti moraju imati optimalno izbalansiranu dijetu sa dovoljnim energetskim i unosom proteina, jer imuni odgovor zavisi od brze replikacije ćelija i produkcije proteina sa vaţnim biološkim funkcijama, kao što su imunoglobulini, proteini akutne faze i citokini. Dovoljan unos ugljenih hidrata je takodje neophodan, jer smanjeni unos dovodi do povećanja nivoa hormona stresa koji negativno utiĉu na nekoliko funkcija imunog sistema (Gleeson M, 2006). Nekoliko minerala ima uticaj na imunitet, ukljuĉujući cink, gvoţĊe, magnezijum, selen, bakar. Deficiti minerala su retki kod sportista, sa izuzetkom cinka i gvoţĊa. Potrebe sportista za ovim mineralima su veće u poreĊenju sa neaktivnim osobama, ali prekomerni unos minerala, naroĉito gvoţĊa i cinka takoĊe moţe negativno da utiĉe na funkciju imunog sistema. Suplemente treba uzimati samo ako je to neophodno i pratiti status gvoţĊa (preko feritina i hemoglobina) i cinka (sadrţaj cinka u eritrocitima ili leukocitima). Nekoliko vitamina imaju vaţnu ulogu u imunom odgovoru. Deficit vitamin A i E i folne kiseline, vitamina B6, B12 i vitamina C negativno utiĉe na funkciju imunog sistema i smanjuje otpornost organizma na infekcije. Ispravljanje eventualnog deficita sa specifiĉnim vitaminskim suplementima moţe biti efikasno u vraćanju imune funkcije na normalan nivo, a umereno povećanje unosa nekih vitamina, prvenstveno vitamina A i E iznad RDA moţe poboljšati imunu funkciju prvenstveno kod veoma mladih ili starih osoba. Uzimanje visokih doza pojedinih vitamina moţe narušiti imunitet i ispoljiti druge toksiĉne efekte (Calder PC, 2002). 1.6.3. Nutritivne mere u prevenciji supresije mukoznog imuniteta . Do sada je ispitivan efekat nekoliko nutritivnih mera u cilju smanjenja negativnog uticaja intenzivnih treninga na mukozni imunitet: ugljenohidratni napici (Gleeson M i Li TL, 2005), omega-3 masne kiseline, cink, glutamin (Krzywkowski K, 2001), kolostrum (Mero A, 2002), kofein (Bishop NC, 2006), kvercetin (Nieman DC, 24 2007), ekstrakt alge Chlorella vulgaris (Otsuki T, 2011), senzorna stimulacija (Schiffman SS, 1999). Povoljan efekat na nivo sIgA je pokazan nakon primene kofeina, hlorele i senzorne stimulacije. S obzirom da oksidativni stres kao posledica intenzivne fiziĉke aktivnosti potencijalno moţe inhibirati imuni odgovor, ukljuĉujući ćelijsku adheziju, inflamaciju i proliferaciju limfocita, ispitivan je i uticaj nekoliko antioksidanasa na mukozni imunitet sportista. Suplementacija sa 1500 mg vitamin C dnevno tokom 7 dana pre ultramaratona nije uticala na nivo oksidativnog stresa, citokina i sIgA nakon trke (Nieman DC, 2002). Nivo parametara oksidativnog stresa- F2-izoprostana i lipidnih hidroperoksida znaĉajno raste, dok je nivo sIgA znaĉajno smanjen nakon ultramaratona, pri ĉemu suplementacija sa 1500 mg vitamina C u periodu od 7 dana nije imala uticaj na izmerene parametre (Palmer FM, 2003). Suplementacija sa 1500 mg vitamina C u toku 12 dana spreĉava porast koncentracije kortizola, ali ne utiĉe na nivo sIgA i simptome infekcija gornjih respiratornih puteva (eng. upper respiratory tract infection-URTI) nakon produţenog treninga u uslovima povišene temperature (Carrillo AE, 2008). Suplementacije kvercetinom u periodu od 2 nedelje nije uticala na promene nivoa sIgA, aktivnosti NK ćelija i stimulisanu proliferaciju limfocita nakon produţenog intenzivnog treninga kod biciklista, ali je znaĉajno smanjila incidencu URTI u periodu oporavka nakon treninga (Nieman DC, 2007). 1.7. Astaksantin Astaksantin (Asx) je liposolubilna supstanca koja pripada grupi ksantofila, oksidovanih derivata karotenoida. Široko je rasprostranjen u prirodi: u mikroorganizmima (bakterije, alge, kvasac), rakovima (škampi, jastog), ribama (losos, pastrmka) i nekim pticama (flamingo, prepelica). Asx ima vaţne biološke funkcije u organizmu ovih ţivotinja: zaštita esencijalnih polinezasićenih masnih kiselina od oksidacije, zaštita od UV zraĉenja, uloga u imunom odgovoru i reprodukciji (Guerin M, 2003). Zbog izvanredne antioksidativne aktivnosti, smatra se da Asx moţe imati znaĉajnu ulogu u ishrani ljudi u cilju oĉuvanja zdravlja i prevenciji hroniĉnih bolesti (Yuan JP, 2011). Zato je sporoveden veliki broj studija koje su ispitivale potencijalne pozitivne efekte na zdravlje ljudi. UraĊene su neophodne studije za ispitivanje 25 potencijalnih toksiĉnih efekata Asx na ţivotinje i ljude. Cilj brojnih studija bio i ispitivanje metoda za identifikaciju, bolje naĉine proizvodnje i iskorišćenja prirodnih izvora Asx (Higuera-Ciapara I, 2006). 1.7.1. Hemijska struktura astaksantina Karotenoidi su grupa jedinjenja koja se sastoji od oko 600 pigmenata koja se sintetiše de novo u višim biljkama, algama, bakterijama i gljivama. Većina karotenoida su ugljovodnici koji sadrţe dva terminalna prstena spojena preko lanca konjugovanih dvostrukih veza, odnosno polienskog niza. Dve grupe jedinjenja su izdvojene kao najvaţnije: karoteni, koji se sastoje samo iz ugljenika i vodonika i ksantofili koji su oksidovani derivati karotena. Kiseonik je prisutan u obliku hidroksilne grupe kao što je kod zeaksantina ili kao keto grupe kod kantaksantina ili u kombinaciji obe kod astaksantina (Higuera-Ciapara I, 2006). Asx ima dve karbonilne grupe, dve hidroksilne grupe i 11 konjugovanih dvostrukih veza. Prisustvo hidroksilne i karbonilne grupe na svakom jononskom prstenu objašnjava jedinstvene karakteristike Asx, mogućnost esterifikacije i polarniju strukturu u odnosu na druge karotenoide (Hussein G, 2006). Hemijska struktura nekih karotenoida je prikazana na Slici 1. Svaka dvostruka veza u polienskom nizu moţe biti u dve konfiguracije-cis i trans. Cis izomeri astaksantina su termodinamiĉki manje stabilni od trans izomera. UtvrĊeno je da mikroalga H. pluvialis sadrţi 36,7 mg/g trans-astaksantina (73,1 %) i 13,5 mg/g cis-astaksantina (26,9 %) (Yuan JP, 2011). S obzirom da svaki molekul ima 2 hiralna centra (C-3 i C-3'), astaksantin ima tri kofiguraciona izomera – dva enantiomera (3R,3'R i 3S,3'S) i mezo formu (3R,3'S). Od svih izomera, 3S,3'S je najrasprostranjeniji oblik u prirodi (Higuera-Ciapara I, 2006). U slobodnom obliku Asx je jako nestabilan i podloţan oksidaciji, pa se u prirodi uglavnom nalazi u obliku mono i diestara sa razliĉitim masnim kiselinama (Hussein G, 2006). Masne kiseline koje grade Asx estre su oleinska, palmitinska i linolenska kiselina, a oleinska kiselina ĉini 51% masnih kiselina Asx estara (Yuan, JP, 2011). TakoĊe se moţe naći i u hemijskom kompleksu sa proteinima ili lipoproteinima (mišići lososa, egzoskelet jastoga) (Hussein G, 2006). 26 Slika 3. Hemijska struktura karotenoida 1.7.2. Bioraspoloţivost i metabolizam astaksantina Karotenoidi su vrlo lipofilne supstance i imaju nisku oralnu bioraspoloţivost. Polarni karotenoidi, kao što je Asx, imaju veću bioraspoloţivost od apolarnih vrsta, na primer β karotena i likopena (Yuan JP, 2011). Inkorporiranje Asx u formulacije na bazi ulja povećavaju bioraspoloţivost kod ljudi (Odeberg JM, 2003). Neke predkliniĉke studije su pokazale povećanu rastvorljivost upotrebom emulgatora kao što su polioksietilen sorbitan monopalmitat i monooleat, kao i sulfobutil etar β-ciklodekstrin (Hussein G, 2006). 27 Mnogi ksantofili, ukljuĉujući i Asx su uglavnom prisutni u obiku mono i di estara i moraju biti hidrolizovani pre apsorpcije. Apsorpcija iz intestinalnog trakta je uglavnom pasivni proces koji ne ukljuĉujuće specijalne transportere. Rastvaranje u matriksu i inkorporiranje u mešovite micele su dva vaţna koraka koja predhode apsorpciji. U enterocitima ksantofili se inkorporiraju u hilomikrone i prelaze u limfni sistem pre ulaska u sistemsku cirkulaciju, a zatim se transportuju do jetre. Ksantofili koji nisu inkorporirani u hilomikrone verovatno se vraćaju u lumen (Zaripheh, 2002). Dok se nepolarni karotenoidi, kao što su β-karoten i likopen uglavnom transportuju preko VLDL i LDL ĉestica, polarniji karotenoidi kao što su Asx nalaze u plazmi u sastavu LDL i HDL ĉestica (Guerin M, 2003). Maksimalna koncentracija u krvi se dostiţe za ~8h i ne zavisi od tehnološke formulacije preparata (Odeberg JM, 2003). Pokazano je da se Asx akumulira u mišićima, jetri i bubrezima (Aoi W, 2003). Postoji vrlo malo podataka o metabolizmu Asx. Studije izvoĊene na hepatocitima pacova pokazale su konverziju Asx do dva metabolita: 3-hidroksi-4-okso-β-jonon i njegovog redukovanog oblika 3-hidroksi-4-okso-7,8-dihidro-β-jonon (Wolz E,1999). Druga studija je utvrdila da postoje 4 metabolita, pomenuti jononi i odgovarajući jonoli (Kistler A, 2002). Farmakokinetika Asx se moţe opisati kao model od jednog prostora. Eliminacije je linearna sa poluţivotom 15,9±5,3h (Odeberg JM, 2003) 1.7.3. Izvori astaksantina Postoje dva prirodna izvora koja mogu da zadovolje ekonomske kriterijume proizvodnje: zelena alga Haematococcus pluvialis i crveni kvasac Phaffia rhodozyma. U ovom ispitivanju korišćen je Asx dobijen iz alge Haematoccpcus pluvialis. Proizvodni proces se sastoji od uzgoja algi u velikim sudovima pod kontrolisanim uslovima, nakon ĉega se cepaju ćelijski zidovi da bi se povećala bioiskoristljivost karotenoida. Dobijena biomasa se suši da bi se dobio fini prašak crvenkaste boje. Trenutno se na trţištu nalazi nekoliko proizvoda na bazi Asx koji su dobijeni iz ove mikroalge. Oni sadrţe 1,5 % - 2 % Asx i koriste se kao pigmenti i nutrijenti. Postoji i sintetski oblik koji je identiĉne hemijske strukture kao prirodni i sastoji se od mešavine izomera u odnosu 1:2:1 (Higuera-Ciapara I, 2006). 28 1.7.4. Astaksantin kao antioksidans Karotenoidi brzo reaguju sa slobodnim radikalima, a njihova reaktivnost zavisi od duţine polienskog niza i terminalnih prstenova. Karotenoidi vezuju ekscitiranu energiju singletnog kiseonika na polienski niz, što dovodi do degradacije molekule karotenoida, ali štiti ostale molukule od oksidativnog oštećenja (Higuiera-Ciapara I, 2006). Razliĉito antioksidativno i prooksidativno ponašanje karotenoida zavisi od specifiĉnih grupa, zatim broja i rasporeda metil grupa na terminalnim prstenovima. Prisustvo hidroksilne i keto grupe na svakom jononskom prstenu je razlog visoke antioksidativne aktivnosti i hidrofilnih karakterstika Asx (Guerin M, 2003). Slika 4. Transmembranska orjentacija astaksantina u ćeliji (preuzeto iz Pashkow FJ./ The American Journal of Cardiology 2008) Asx se pozicionira duţ ćelijske membrane i neutrališe slobodne radikale sa unutrašnje i spoljašnje strane membrane, ali i unutar fosfolipidnog dvosloja (Slika 4). Pokazano je da Asx ima oko 10 puta veću antioksidativnu aktivnost od ostalih karotenoida i oko 100 puta veću od α-tokoferoala. Prisustvo hidroksilne i keto grupe na svakom jononskom prstenu je razlog visoke antioksidativne aktivnosti i hidrofilnih karakterstika Asx (Guerin M, 2003). Naguib i sar. su merili antioksidativnu aktivnost razliĉitih karotenoida fluorimetrijskom metodom. Pokazano je Asx ima veću antioksidativnu aktivnost od luteina, likopena, α- i β-karotena i α- tokoferola (Naguib YMA, 2000). Ispitivanje 29 sposobnosti hvatanja-neutralizacije singletnog kiseonika razliĉitih antioksidanasa pomoću hemiluminescencije (uz endoperoksid 1,4 dimetilnaftalena kao generatora singletnog kiseonika) pokazalo je da α-tokoferol i α-liponska kiselina imaju znaĉajnu antioksidativnu aktivnost, dok je aktivnost askorbinske kiseline, koenzima Q10 i polifenola bila zanemarljiva. Karotenoidi su imali veću sposobnost neutralizacije slobodnih radikala u odnosu na ostale antioksidanse, a Asx je pokazivao najveću aktivnost od svih karotenoida (Nishida Y, 2007). 1.7.5. Anti-inflamatone osobine astaksantina In vitro i ex vivo studije su pokazale da Asx moţe spreĉiti inflamatorne procese blokadom ekspresije pro-inflamatornih gena i to preko supresije aktivacije nuklearnog faktora κB (Nf-κB) (Lee SJ, 2003). Naime, Nf-κB je lokalizovan u citoplazmi vezan za inhibitorni protein IκB, što ga ĉini neaktivnim. Veliki broj ekstracelularnih imunih stimulanasa indukuje aktivaciju IκB kinaze (IKK), koja ovaj inhibitorni protein fosforiliše i oslobaĊa Nf-κB iz neaktivnog kompleksa. Aktivirani NF-κB ulazi u jedro, gde zapoĉinje transkripciju gena koji su vaţni za imunitet, inflamaciju, ćelijski rast, diferencijaciju, proliferaciju i apoptozu (Vaughan S, 2011). Postoji veliki broj razliĉitih puteva koji dovode do aktivacije i translokacije NF-kB. ROS interaguju sa NF-κB signalnim putem na više naĉina. Transkripcija NF-κB-zavisnih gena utiĉe na nivo ROS u ćeliji, a takoĊe i aktivnost NF-κB je regulisana ćelijskim redoks balansom. Direktna oksidacija NF-kB preko ROS inhibira njegovu sposobnost vezivanja za DNK. Modifikacija IkB proteina ili IKK pod uticajem ROS, moţe dovesti do inhibicije aktivacije NF-κB. Sa druge strane, ROS mogu preko razliĉitih puteva i stimulisati aktivaciju NF-kB. ROS mogu usloviti aktivaciju NF-κB, koji će dovesti do transkripcije ciljnih gena i sinteze proteina koji mogu smanjiti produkciju ROS, spreĉiti dalja oksidativnog oštećenja i omogućiti preţivljavanje ćelije, kao što su SOD, glutation peroksidaza, glutation S transferaza, feritin. Ipak, ako u oštećenja prevelika, moţe doći i do stimulacije ekspresije gena koji su odgovorni za apoptozu ćelije. S obzirom da je NF-κB vaţan za process inflamacije, njegova aktivacija moţe dovesti do produkcije enzima koji stimulišu formiranje ROS (iNOS, COX2), odnosno proinflamatornih citokina koji dovode do inflamacije i daljeg povećanja produkcije ROS (Morgan MJ, 2011). 30 Kakav će uticaj ROS imati na aktivnost NF-kB zavisi od puta aktivacije ali od vrste ćelije. Iako se mnogo zna o naĉinima na koji ROS utiĉu na ovaj signalni put, ipak postoji još mnogo pitanja koja nemaju odgovor. Slika 5. Aktivacija NF-κB i regulacija transkripcije ciljnih gena (Preuzeto iz Montagut C. I sar./ Drugs Today 2005) Pokazano je da tretiranje ćelija Asx smanjuje sekeciju proinflamatornih citokina IL-1β, IL-6 and TNF-α, koja je indikovana primenom H2O2. Smatra se da je ovaj efekat Asx posledica smanjene nuklearne ekspresije NF-κB. Naime, nuklearna translokacija fosforilisane subjedinice NF-kB p65, indukovana tretiranjem ćelija sa H2O2, blokirana je primenom Asx (Speranza L, 2012). Asx inhibira lipopolisaharid stimulisanu sintezu IL-6 proteina i mRNA u mikroglijalnim ćelijama. Pored toga, povećan nivo fosforilisanih IKKα, IκBα i subjedinice p65 su suprimirani pod uticajem Asx. Nuklearna translokacija p65 subjedinice je takoĊe inhibirana primenom Asx. (Kim YH, 2010). Asx moţe znaĉajno da smanji produkciju proinflamatornih citokina TNF-α (eng. tumor necrosis factor-α) i IL-6 u stimulisanim neutrofilima. Rezultat je da Asx popravlja fagocitnu i mikrobicidnu funkciju neutrofila, tako što smanjuje produkciju superoksidnog anjona i vodonik peroksida (Macedo RC, 2010). Primena Asx, zahvaljujući anti-inflamatornom delovanju, moţe imati povoljan efekat kod hroniĉnih inflamatornih bolesti kao što su reumatoidni artritis, inflamatorna bolest creva, ateroskleroza (Yuan JP, 2011). 31 1.7.6. Primena astaksantina u promociji zdravlja Astaksantin i kardiovaskularne bolesti Mnoge studije su pokazale da je visok nivo LDL u korelaciji sa prevalencom kardiovaskularnih bolesti kao što je angina pektoris, infarkt miokarda, tromboza. Rizik od razvoja ateroskleroze kod ljudi korelira sa nivoom LDL holesterola. Inhibicija oksidacije LDL je predloţeni mehanizam preko koga antioksidansi mogu spreĉiti razvoj ateroskleroze. Rezultati in vivo i ex vivo studija Iwamota i sar. (2000) pokazuju da Asx znaĉajno smanjuje oksidaciju LDL-a, a samim tim i aterosklerozu krvnih sudova. Suplementacija Asx dva puta po 4 mg dnevno u periodu od tri meseca je smanjila in vivo oksidaciju masnih kiselina (Karppi J, 2007). Pokazano je da suplementacije Asx u periodu od 12 nedelje sigurna i efikasna u prevenciji poremećaja lipidnog statusa i oksidativnog stresa kod zdravih ispitanika sa prekomernom telesnom teţinom (Choi HD, 2011). Znaĉajan kardioprotektivni efekat primene Asx zabeleţen je u većem broju eksperimentalnih modela (na pacovima, zeĉevima i psima) ishemijsko-reperfuzijskog oštećenja (Lauver DA, 2005; Gross GJ, 2004; Gross GJ, 2005). Hussein G i Goto H (2006) su pokazali da primena Asx kod miševa sa hipertenzijom u periodu od 7 nedelja smanjuje krvni pritisak, zatim smanjuje broj elastiĉnih vlakana u aorti i smanjuje odnos zid/lumen u koronarnim arterijama i arteriolama. Primena Asx u dozi od 6 mg u periodu od 10 dana znaĉajno poboljšava reološke karakteristike krvi kod 20 odraslih muškaraca, pri ĉemu nisu uoĉeni nikakvi neţeljeni efekti (Miyawaki H, 2008). Astaksantin i tumori Karotenoidi su postali predmet interesovanja, kada je utvrĊeno da postoji veza izmeĊu niskog nivoa ovih supstanci u organizmu i prevalence tumora. Chew and Park su ukazali da iako Asx, kantaksantin, β-karoten pokazuju inhibitorni efekat na rast tumora, najveću antitumorsku aktivnost ima Asx, pri ĉemu je inhibicija tumorskog rasta zavisna od doze (Chew BP i Park JS, 1999). Inhibitorni efekat na rast Asx je uoĉen u nekoliko kultura tumorskih ćelija - kolona, oralnog fibrosarkoma, dojke, prostate i embrionskih fibroblasta. Istraţivanja na laboratorijskim ţivotinjama su pokazala primena Asx smanjuje kancerogenezu u bešici kod miševa, kolona, usta i jezika kod pacova. Smatra se da Asx ima ovakav efekat zbog supresije ćelijske proliferacije. Kod miševa, koji su inokulisani ćelijama fibrosarkoma, predhodna primena Asx suprimirala 32 je rast tumora i stimulisala imuni odgovor protiv antigena koje tumor eksprimira (Higuera-Ciapara I, 2006). Tripathi DN i sar. (2009) su utvrdili da Asx moţe da smanji oksidativni stres, oštećenje DNK i ćelijsku smrt, kao i indukciju rane hepatokarcinogeneze kod miševa, indukovanu ciklofosfamidom. Astaksantin i neurodegenerativne bolesti Postoje dokazi da je oksidativni stres uzrok ili barem jedan od kljuĉnih faktora u patogenezi neurodegenerativnih bolesti (Alchajmerove, Hantingtonove, Parkinsonove, amiotrofiĉne lateralne skleroze). Tso MOM i Lam TT (1996) su detektovali Asx u mozgu pacova koji su hranjeni sa prirodnim Asx, ukazujući da Asx moţe proći hemoencefalnu barijeru. Pored toga, pokazan je i neuroprotektivan efekat Asx, što ukazuje da Asx moţe biti efikasan nutrijent koji štiti nervi sistem od oksidativnog stresa, apoptoze neurona, pa ĉak i od starenje nervnog sistema. Tretiranje dopaminergiĉke ćelijske linije SH-SY5Y sa Asx u koncentraciji od 100nM, je smanjilo DHA-OOH- i 6-OHDA-indukovanu apoptozu, poremećaj funkcije mitohondrija i smanjilo intracelularno generisanje ROS (Liu X, 2009). Studija na P12 ćelijama, diferentovanim pod uticajem nervnog faktora rasta, je pokazala da primena Asx ima znaĉajan antioksidativni i antiinflamatorni efekat. Izloţenost P12 ćelija prooksidativnim faktorima znaĉajno povećava nivo MDA i ROS i smanjuje sadrţaj GSH i aktivnost enzima GPX i CAT. Predhodno tretiranje ćelija sa Asx je spreĉio negativan efekat prooksidanasa na antioksidativnu zaštitu i smanjilo produkciju slobodnih radikala, ali i nivo proinflamatonih citokina IL-1, IL-6 i TNF-α (Chan K, 2009). Astaksantin i oči Dva vodeća uzroka slepila su adultna makularna degeneracija (AMD) i katarakta. Niz nalaza potvrĊuje ulogu oksidativnog stresa u etiopatogenezi ovih bolesti. Normalni metaboliĉki procesi i UV svetlost dovode po generisanja slobodnih radikala koji uzrokuju oksidativna oštećenje fotoreceptora u retini i proteina soĉiva. Rezultati epidemioloških studija povezuju visok unos karotenoida, posebno luteina i zeaksantina sa smanjenjem rizika od nastanka ovih bolesti. Zahvaljujući antioksidativnim karakteristikama i sposobnosti da proĊe kroz barijere krv-mozak i krv-mreţnjaĉa, astaksantin je idealnan suplement u borbi protiv ovih bolesti. In vitro studija na epitelnim ćelijama humanog soĉiva je pokazala da tretiranje kompleksom ksantofila koji sadrţi i Asx znaĉajno smanjuje lipidnu peroksidaciju pod uticajem UVB zraka i da je 33 Asx efikasniji od vitamina E u zaštiti ćelija soĉiva od UVB oštećenja (Hussein G, 2006). Primena Asx moţe smanjiti simpotome zamora oka, povećati oštrinu vida, a ima i pozitivan uticaj na parametre akomodacije oka, kao što je povećanje amplitude akomodacije i poboljšanje akomodacionog refleksa. (Nagaki Y, 2002; Nakamura A, 2004; Nitta T, 2005; Shiratori K, 2005). Suplementacija sa 6 mg Asx tokom 4 nedelje je znaĉajno poboljšalo cirkulaciju krvi u kapilarima mreţnjaĉe, dok taj efekat nije uoĉen kod placebo grupe. (Yasunori N, 2005). Asx ima dozno zavisni anti-inflamatorni efekat na indukovanu inflamaciju u uvei, sa znaĉajno smanjenom produkcijom inflamatornih jedinjenja - azot oksida, prostanglandina 2 i TNF-α (Ohgami K, 2003; Suzuki Y, 2006). Astaksantin i imunitet Jyonouchi i sar. su izveli većinu studija koja se odnosi na potencijalnu aktivnost Asx kao modulatora imunog sistema. Asx povećava produkciju T-pomoćnih limfocita i povećava broj sekretornih ćelija u kulturi ćelija slezine (Jyonouchi H, 1996). Ovi autori su takodje ispitivali efekat Asx na produkciju imunoglobulina in vitro u humanim ćelijama krvi i ustanovili povećanje produkcije IgA, IgG, i IgM kao odgovor na T- zavisni stimulus (Jyonouchi H, 1995). Druge in vivo studije na miševima su pokazale imunomodulatorno dejstvo Asx i ostalih karotenoida na humoralni odgovor na T- zavisne antigene, što ukazuju da suplementacija sa karotenoidima moţe biti korisna za poboljšanje oslabljenog imunog odgovora (Jyonouchi H, 1994). Park JS i sar. (2010) su ispitivali potencijalne imunomodulatorne, antioksidativne i antiinflamatorne osobine Asx u populaciji mladih, zdravih ţena i pokazali da suplementacije Asx moţe smanjiti oštećenje DNK, nivo biomarkera oksidativnog stresa i inflamacije i poboljšati imuni odgovor. Asx je povećao mitogen indukovanu proliferaciju limfocita, citotoksiĉnu aktivnost NK ćelija, povećao ukupan broj broj T i B limfocita, ali bez uticaja na populaciju T-pomoćniĉkih, T citotoksiĉnih i NK ćelije. Astaksantin i sport . Primena Asx moţe smanjiti oštećenje skeletnih i srĉanih mišićnih ćelija, spreĉiti oksidativna oštećenja DNK i peroksidaciju lipida nakon produţenog veţbanja (Aoi W, 2003). Ista grupa istraţivaĉa je pokazala da Asx favorizuje korišćenje masti u odnosu na glukozu tokom fiziĉke aktivnosti, i na taj naĉin povećava izdrţljivost i efikasnost 34 smanjenja telesne masti sa treniranjem (Aoi W, 2008). Još jedna studija je pokazala sa Asx moţe smanjiti korišćenje glukoze na raĉun masnih ksielina. Saĉuvan glikogen je dostupan izvor energije za kasnije stadijume treniranja, pa sporije iskorišćavanje glukogena povećava izdrţljivost i odlaţe zamor (Ikeuchi M, 2006). Pored toga Asx moţe smanjiti DOMS kod utreniranih sportista (Fry A, 2004). Ipak, primena Asx u toku 3 nedelje nije uticala na nivo CK, LDH i DOMS nakon anaerobnog treninga (Bloomer RJ, 2005). Šestomeseĉna suplementacija sa 4 mg Asx, znaĉajno povećava broj ĉuĉnjeva pod kontrolisanim uslovima, ukazujući da je Asx efikasan u povećanju snage i izdrţljivosti kod sportista (Malmstain CL, 2008). Kod profesionalnih biciklista pokazano je znaĉajno smanjenje vremena završetka trke na 20 km nakon suplementacije sa 4 mg Asx u periodu od 28 dana u odnosu na placebo grupu. Promene u metabolizmu ugljenih hidrata i masti nisu uoĉene (Earnest CP, 2011). Primena Asx iz alge H. Pluvialis znaĉajno smanjuje nivo laktata kod odraslih muških dobrovoljaca 2 minuta nakon trke na 1200m (Sawaki, 2002). 35 2. CILJEVI ISTRAŢIVANJA  Utvrditi da li postoji razlika u koncentraciji parametara oksidativnog stresa i aktivnosti antioksidativne zaštite, kao i u aktivnosti enzima PON1 kod mladih fudbalera i zdravih ispitanika koji nemaju redovnu intenzivnu fiziĉku aktivnost  Ispitati uticaj redovnih treninga i suplementacije astaksantinom u periodu od 3 meseca na bazalne vrednosti parametara oksidativnog stresa, antioksidativne zaštite, kao i na aktivnosti enzima PON1 kod fudbalera.  Ispitati uticaj intenzivnog treninga i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite.  Ispitati uticaj suplementacije astaksantinom na parametre oštećenja mišića.  Ispitati efekat razliĉitih preventivnih mera na nivo sekretornog IgA u salivi: -Ispitati efekat senzorne stimulacije na nivo sekretornog IgA u salivi kod karatista rekreativaca. -Ispitati uticaj suplementacije astaksantinom na nivo sekretornog IgA u salivi kod mladih elitnih fudbalera. 36 3. ISPITANICI I METODE 3.1. Ispitanici Ispitivanje uticaja suplementacije astaksantinom na oksidativnostresni status i mukozni imunitet obuhvatilo je 40 fudbalera. U cilju ispitivanja nivoa oksidativnog stresa kod fudbalera u odnosu na osobe koje se ne bave sportom, uvrstili smo i kontrolnu grupu koja se sastojala od 28 ispitanika. Uticaj senzorne stimulacije na mukozni imunitet ispitivan je grupi od 20 osoba koje se rekreativno bave karateom. Sportisti, ukljuĉeni u studiju, su bili igraĉi fudbalskog kluba „Teleoptik― i mlade selekcije fudbalskog kluba „Partizan―, Beograd, Srbija, uzrasta od 17 do 21 godine. Svi ispitanici su bili nepušaĉi, bez hroniĉnih oboljenja, bez povreda u toku studije ili u predhodnih godinu dana, koji nisu koristili lekove koji utiĉu na redoks status organizma, najmanje tri meseca pre poĉetka i tokom trajanja studije. Tokom trajanja studije voĊen je dnevnik sportskih aktivnosti, koji obuhvata i treninge i utakmice. Igraĉi su imali 5 treninga na terenu (~525 min) i jednu utakmicu nedeljno, tokom prvih 8 nedelja posmatranog perioda. Tokom narednih 5 nedelja, imali su 6 treninga (~670 min) i jednu utakmicu nedeljno. Trening se sastojao od serija trĉanja niskog do umerenog intenziteta, intervalnog trĉanja umerenog do visokog intenziteta, fiziĉko-tehniĉkih ciklusa i simulacije utakmice u malim grupama na velikoj površini. Pored toga, ispitanici su imali 2 treninga u teretani nedeljno (~115 min). Kontrolnu grupu su ĉinili ispitanici koji nisu imali redovnu intenzivnu fiziĉku aktivnost. Ova grupa se sastojala od 15 deĉaka i 13 devojĉica uzrasta od 14 do 15 godina. Grupa ispitanika koja se rekreativno bavila karateom obuhvatila je 8 muškaraca i 12 ţena, starosti izmeĊu 20 i 25 godina. Ispitanici su bili nepušaĉi, bez hroniĉnih bolesti, bez bolesti zuba, simptoma respiratornih infekcija. Nisu koristili lekove ni suplemente mesec dana pre studije. Imali su treninge u trajanju od 1 h, tri puta nedeljno. 37 3.2. Dizajn eksprimenta Studija je planirana u skladu sa etiĉkim standardima datim u Helsinškoj deklaraciji i u skladu sa pravilima Etiĉkog komiteta Udruţenja za medicinu sporta Srbije. Ispitanici i roditelji su detaljno obavešteni o samoj proceduri studije, potencijalim rizicima uĉešća u studiji, kao i o obavezama uĉešća i mogućnosti povlaĉenja iz studije u svakom trenutku. Uĉesnici su dali pristanak za dobrovoljno uĉešće u studiji. Uticaj aktivnog bavljenja sportom na nivo oksidativnog stresa ispitan je poreĊenjem parametara oksidativnog stresa i anitoksidativne zaštite izmeĊu grupe fudbalera i ispitanika koji nemaju redovnu intenzivnu fiziĉku aktivnost. Na homogenoj grupi od 40 fudbalera ispitivan je uticaj treninga i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i anitoksidativne zaštite u toku 90 dana posmatranog perioda. Istraţivanje je sprovedeno kao randomizirana, dvostruko slepa i placebo kontrolisana studija. Ispitanici su podeljeni u dve grupe. Jedna grupa je suplementirana sa 4 mg astaksantina jednom dnevno tokom 12 nedelja, dok je druga dobijala placebo kapsule, koje su identiĉnog ukusa i izgleda kao kapsule sa astaksantinom. Tokom studije, treneri su na svakom jutarnjem treningu davali sportistima kapsulu da popiju. U danima kada nemaju trening, sportistima je dan ranije data kapsula uz podsećanje narednog dana da obaveznu popiju kapsulu. Ĉetiri dana na poĉetku studije sportisti su vodili detaljan dnevnik ishrane. Energetski unos, unos makronutrijenata i mikronutrijenata je izraĉunat upotrebom CRON-O-Meter v0.9.6 softvera. Tokom trajanja studije sportisti su zadrţali ustaljeni reţim ishrane. Uzimanje uzoraka krvi i salive je sprovedeno na sledeći naĉin: pre suplementacije, prvi uzorak krvi i salive je uzet ujutru izmeĊu 8 i 9 sati sati, 10 sati od poslednjeg obroka, i posle 24 – ĉasovnog odmora. Posle prvog uzimanja uzoraka, a pre treninga, ispitanici su imali standadizovani doruĉak, pribliţne energetske vrednosti od 650 kcal. Ovaj obrok je imao sledeći sadrţaj makronutrijenata i mikronutrijenata: 16 g - 17 g proteina, 131 g - 135 g ugljenih hidrata, 4 g - 5 g masti, oko 190 IU vitamina A, 30 mg vitamina C, 0,5 mg vitamina E, 0,4 mg bakra, 2,1 mg mangana, 44,5 µg selena i 2,1 mg cinka. Drugi uzorak je uzet, istog dana, posle intenzivnog treninga koji je trajao dva sata. Isti raspored uzimanja uzorka je ponovljen posle 45 i 90 dana suplementacije. 38 Ovo istraţivanje je obuhvatilo i odreĊivanje uticaja nutritivnih mera na mukozni imunitet sportista. Na grupi od 40 fudbalera je ispitivan efekat suplementacije Asx na mukozni imunitet. Pre ovog eksperimenta sprovedena je pilot studija na grupi od 20 osoba koje se rekreativno bave karateom, u kojoj je ispitivan uticaj senzorne stimulacije na produkciju salive i nivo sIgA. Ispitanici su imali tri treninga nedeljno u trajanju od 60 min. Ispitanicima je savetovano da ne uzimaju vodu i hranu 1 sat pre treninga, a kozumiranje vode tokom treninga nije bilo dozvoljeno. Srĉana frekvenca i subjektivna procena zamora (eng. ratings of perceived exertion - RPE) su mereni u intervalima od 15 minuta. Ispitanici su podeljeni u dve grupe. Senzorna stimulacija je u grupi 1 uraĊena sa teĉnom surutkom 15 i 30 minuta nakon treninga, a u grupi 2 sa napitkom na bazi surutke sa aromom pomorandţe u isto vreme. Ispitanici su drţali teĉnost u ustima 20 s a zatim progutali. Uzorci salive su uzeti pre treninga, neposredno posle treninga, zatim nakon svake aplikacije napitka, odnosno surutke, tj. 15 i 30 minuta nakon treninga. Uzimanje uzoraka je sprovedeno tri puta u toku jedne nedelje, kada su sportisti imali trening, i to uvek u isto vreme da bi se izbegao uticaj cirkadijalnog ritma na sIgA. Uzorci krvi su uzeti iz prednje kubitalne vene. Krv je sakupljena vakutejner sistemima sa etilendiaminotetrasirćetnom kiselinom i sa litijum-heparinom za izdvajanje plazme i vakutejnerima sa serum separator gelom za dobijanje seruma (Vacuette, Greiner Bio-One, Kremsmuenster, Austrija). Uzorci su nakon uzimanja ĉuvani na +4C, a zatim u što je moguće kraćem roku centrifugirani na 1500xg u toku 10 minuta. Plazma i serum su odvojeni, podeljeni u alikvote i ĉuvani na –80C do analize. Za higijensko i efikasno sakupljanje salive korišćene su salivete (Salivete-Sarstedt, Germany). Vaterolna iz saliveta je postavljena ispod jezika i uzorak mešovite salive sakupljan je u toku 2 minuta. Uzorci salive su centrifugovani na 3000 obrtaja u toku 10 minuta. Supernatant je odvojen, podeljen u alikvote i ĉuvan na –80 C do analize. Pre i posle uzimanja uzorka salive, salivete su izmerene na analitiĉkoj vagi. Koliĉina salive u gramima je prevedena u mililitre, pod predpostavkom da je specifiĉna teţina salive 1 g/ml, a zatim podeljena sa 2 da bi se izraĉunao salivarni protok (ml/min). Laboratorijske analize su uraĊene na Katedri za bromatologiju i Katedri za medicinsku biohemiju, Farmaceutskog fakulteta u Beogradu i laboratoriji „Beolab― u Beogradu. Antropometrijska merenja i odreĊivanje aerobnog kapaciteta je uraĊeno u ordinaciji „ Vita Maxima―, Beograd, Srbija. 39 3.3. Metode Kod ispitanika su odreĊivani su sledeći parametri: Antropometrijski podaci  Uzrast  Visina  Teţina  Indeks telesne mase (ITM)  Duţina trenaţnog staţa Aerobni kapacitet - VO2max Osnovni biohemijski i hematološki parametri  Alanin aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), bilirubin, kreatinin, kreatin kinaza (CK), laktat dehidrogenaza (LDH), glukoza, urea, ukupni proteini, mokraćna kiselina, gvoţĊe, feritin i transferin  Lipidni status - ukupni holesterol (HOLuk), HDL holesterol (HDL-H), LDL holesterol (LDL-H) i trigliceridi (TG)  Kompletna krvna slika: broj leukocita, eritrocita, tromocita, hemoglobin (Hb), hematokrit (Hct), zapremina eritrocita ( eng. mean cell volume-MCV), proseĉna koliĉina hemoglobina u eritrocitu (eng. mean cell hemoglobin-MCH), proseĉna koncentracija hemoglobina u eritrocitu (eng. mean cell hemoglobin concentration-MCHC). Parametri oksidativnog stresa  Tiobarbiturna kiselina reagujuće supstance (TBKRS)  Produkti uznapredovale oksidacije proteina (AOPP)  Superoksidani anjon radikal (O2·¯)  Aktivnost enzima plazmatske superoksid dismutaze (SOD)  Sadrţaj sulfhidrilnih grupa (SH)  Aktivnost enzima paraoksonaze prema paraoksonu kao supstratu (POazna) 40  Aktivnosti enzima paraoksonaze prema diazoksonu kao supstratu (DZOazna)  Totalni oksidativni status (TOS)  Totalni anitoksidativni status (TAS)  Prooksidativno-antioksidativni balans (PAB) Mukozni imunitet  Salivarni protok  Apsolutna koncentracija sIgA  Brzina izluĉivanja sIgA 3.3.1. Antropometrijska merenja i odreĊivanje VO2max Na poĉetku studije, a pre suplementacije uraĊeno je antropometrijsko merenje na vagi BC-418, na bazi bioimpedance (Tanita, Tokyo, Japan) i odreĊeni telesna masa i procenat telesne masti. Visina je izmerena na prenosivom stadiometru sa taĉnošću od 0,1 cm. ITM je izaĉunat kao odnos telesne mase u kilogramima i visine u metrima stepenovane sa 2 (kg/m 2 ). Pored toga, sprovedeno je i ergospirometrijsko ispitivanje na pokretnoj traci (Quark b2-Cosmed). UraĊen je maksimalni test opterećenja gde se otpor, a time i intezitet veţbanja postepeno povećavaju, dok se meri odnos koncentracije udahnutog kiseonika i izdahnutog ugljen dioksida. Inspirijum i ekspirijum se mere posebnom aparaturom, a da bi se to postiglo sportista u toku testa nosi masku koja je stavljena na lice. Maksimalni VO2 (VO2max) se dostiţe kada se potrošnja kiseonika ustali na nekom nivou i pored povećavanja opterećenja. VO2max je maksimalna potrošnja kiseonika ili aerobni kapacitet koji organizam moţe da transportuje i iskoristi u toku veţbanja sa postepenim pojaĉavanjem inteziteta. 41 3.3.2.OdreĊivanje biohemijskih i hematoloških parametara Biohemijski parametri su odreĊeni rutinski, primenom automatizovanih metoda na automatskom analizatoru Ilab 300+ reagensima proizvoĊaĉa Biosystems S.A. (Barcelona, Spain) i Byoanalitica (Belgrade, Serbia). Kompletna krvna slika odreĊivana je na hematološkom brojaĉu Cell-Dyn 3700 (Abbott Diagnostics, Illinois, USA). 3.3.3. OdreĊivanje parametara oksidativnog stresa 3.3.3.1. Određivanje koncentracije tiobarbiturna kiselina reagujućih supstanci (TBKRS) Princip metode za odreĊivanje koncentracije TBKRS zasniva se na ĉinjenici da krajnji proizvodi peroksidacije lipida imaju sposobnost reagovanja sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA) i graĊenja obojenog kompleksa ĉiji je maksimum apsorbance na 535 nm (Girroti MJ, 1991). Slika 6. Mehanizam reakcije TBKRS sa tiobarbiturnom kiselinom Reagensi TBA reagens: 0,917 mmol/L trihlorsirćetne kiseline (TCA, 15% rastvor), 2,6 mol/L (0,375%) TBA-tiobarbiturne kiselin, 0,25 mol/L HCl. Ove komponenete se rastvaraju u destilovanoj vodi a reagens se ĉuva u friţideru na +4°C. TRIS-Cl pufer: 0,05 mol/L, pH 7,4. 42 Tabela 2. Postupak za odreĊivanje TBKRS Slepa proba Analiza Plazma - 0,3 mL TRIS-Cl puffer 0,3 mL - Standard - - TBA reagens 0,6 mL 0,6 mL Promešati i inkubirati na 100°C, u vodenom kupatilu 5 minuta. Ohladiti, centrifugirati na 10.000 g, deset minuta na +4°C i oĉitati apsorbance na 535 nm. Koncentracija TBKRS se izraĉunava metodom molarog apsorpcionog koeficijenta koji iznosi 1,56 x 10 5 L x mol -1 x cm -1 za nastali obojeni kompleks. 3.3.3.2. Određivanje uznapredovalih produkata oksidacije proteina (AOPP) Spektralnom analizom razblaţenog uzorka plazme ili seruma fosfatnim puferom pH 7,4 u opsegu talasnih duţina 200-400 nm uoĉava se karakteristiĉan pik oko 340 nm. Dodavanjem sirćetne kiseline u razblaţen serum i rastvora kalijum-jodida 1,16 M dolazi do promene apsorbance koja se meri na 340nm. Koncentracija AOPP se izraţava preko ekvivalenata hloramina T koji se koristi za izradu standardne krive u koncentracijama 10-100 µmol/L, pri ĉemu njegova apsorbanca linearno raste sa porastom koncentracije (Selmeci L, 2005). Reagensi (sastav i priprema) Standardni rastvor Hloramina T (N-hloro-p-toluensulfonamid natrijum), 100 µmol/L. Odmeriti 0,028 g Hloramin T-trihidrata i rastvoriti destilovanom vodom do 1000 mL. Glacijalna sirćetna kiselina Rastvor kalijum jodida 1,16 M. Odmeriti 19,257 g KJ i rastvoriti destilovanom vodom do 1000 mL. Regens ĉuvati u tamnoj boci. Fosfatni pufer 20 mM, pH 7,4. Rastvoriti 3,4 g KH2PO4 u 250 mL vode, a zatim 4,45 g Na2HPO4 rastvoriti u 250 mL vode. U rastvor Na2HPO4 dodavati KH2PO4 sve dok pH ne bude 7,4. 43 Postupak za odreĊivanje AOPP Nivo AOPP je odreĊivan na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Tip reakcije je metoda završne taĉke sa slepom probom reagensa. Za odreĊivanje standardne krive mogu se koristiti koncentracije Hloramina-T: 12,5, 25, 50, 100 µmol/L pripremljene od Hloramin-T stock rastvora (100 µmol/L). Glacijalna sirćetna kiselina izmešana sa PBS u odnosu 1:8 ĉine reagens 1(R1), dok reagens 2 (R2) sadrţi kalijum jodid pripremljen takoĊe u PBS. Uzorku plazme, odnosno standardu (60 µL) se dodaje 300 µL R1 i nakon inkubacije od 60s oĉitava se prva apsorbanca uzorka. Posle dodavanja kalijum jodida reakcionoj smeši i inkubacionog intervala od 180s, oĉitava se absorbanca ponovo na talasnoj duţini 340 nm. Koncentracija AOPP se izraĉunava iz standardne krive ili pomoću jednaĉine prave, a izraţava se u jedinicama µmol/L ekvivalenata Hloramina T. 3.3.3.3. Određivanje nivoa superoksid anjon radikala (O2 .- ) u plazmi Metoda za odreĊivanje nivoa O2 .- zasniva se na ĉinjenici da O2 .- redukuje nitro grupu aromatiĉnog jedinjenja nitrobluetetrazolijuma [NBT, 2,2'-di-p-nitrofenil-5,5'- difenil-3,3'-(3,3'-dimetoksi-4,4'-difenilen)-ditetrazolijum hlorid]. Metodu su prvi opisali Auclair i Voisin (Auclair C, 1985). Redukcija NBT-a se odvija u dva stupnja, nepotpuna redukcija do monoformazana i potpuna redukcija do diformazana. NBT je jedinjenje koje je rastvorljivo u vodi, meĊutim redukcijom do diformazana on postaje nerastvorljiv. Zbog toga se u reakcionu smešu dodaje ţelatin ĉije je uloga da odrţava diformazan u rastvorenom obliku. U vodenim rastvorima, u reakcijama u kojima se stvara O2 .- , NBT se nepotpuno redukuje do monoformazana. Pojaĉana redukcija NBT-a pri višim pH vrednostima u stvari predstavlja posledicu inhibicije reakcije spontane dismutacije kiseonika, koje je kompetentna reakciji redukcije NBT-a. UvoĊenje azota pod pritiskom 1 h pre odreĊivanja u NBT reagens smanjuje pritisak kiseonika i povećava redukciju NBT-a. Promena boje ţutog NBT-a u plavi monoformazan, meri se spektrofotometrijski i predstavlja nivo stvaranja O2 .- . Nivo O2 .-je odreĊivan na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. 44 Reagensi Fosfatni pufer: 0,05 mol/L, pH 8,6 uz dodavanje EDTA u koncentraciji 0,1 mmol/L Radni reagens : 1 mmol/L NBT-a rastvoriti u sveţe napravljenom fosfatnom puferu uz dodatak 0,1 mg/mL ţelatina. U pripremljeni reagens uvoditi 1 h azot pod pritiskom, neposredno pre analize. Tabela 3. Postupak za odreĊivanje konentracije superoksidnog anjona Radni reagens 0,2 mL Plazma 0,02 mL Pomešati i pratiti povećanje apsorbance na 550 nm. Meriti promenu apsorbance na svakih 15 s u toku jednog minuta. Oĉitati ΔA/Δt. Brzina generisanja superoksidnog anjona se izraţava preko brzine stvaranja redukovanog NBT-a. Brzina redukovanja NBT-a se odreĊuje kinetiĉkim postupkom, a izraĉunava se metodom molarnog apsorpcionog koeficijenta. Krajnji izraz za izraĉunavanje glasi: Red NBT, μmol/min/L = Δ A/ min x 1466 3.3.4. OdreĊivanje parametara antioksidativne zaštite 3.3.4.1. Određivanje aktivnosti enzima superoksid dismutaza (SOD) u plazmi OdreĊivanje aktivnosti ovog enzima u plazmi izvodi se po originalnoj metodi koju su dali Misra i Fridovich, uz odreĊene modifikacije (Misra HP, 1972). Metoda se zasniva na sposobnosti SOD da inhibira spontanu autooksidaciju adrenalina u baznoj sredini na pH 10,2. Adrenalin je priliĉno stabilan u kiseloj sredini. Autooksidacija adrenalina je inicirana tragovima teških metala prisutnih kao neĉistoće u reagensima. Aktivnost ovog enzima se izraţava u relativnim jedinicama, koje se dobijaju merenjem apsorbance nastalog crvenog proizvoda oksidacije adrenalina na 480 nm, bez prisustva SOD (kontrola) i u prisustvu SOD (analiza). Aktivnost SOD u uzorku se izraĉunava kao procenat inhibicije autooksidacije adrenalina. Aktivnost SOD je odreĊivana na 45 automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Reagensi Karbonatni pufer, 0,05 mmol/L, pH 10,2 , kome je dodat 1 mmol/L EDTA Hlorovodoniĉna kiselina, 15 mmol/L Osnovni rastvor adrenalina, 10 mmol/L, rastvoren u 15 mmol/L HCl. Tabela 4. Postupak za odreĊivanje aktivnosti enzima SOD Kontrola Analiza Plazma - 0,010mL Pufer 0,700mL 0,690mL Adrenalin 0,050mL 0,050mL Reakcija poĉinje dodavanjem adrenalina u reakcionu smešu. Nakon mešanja kivetu ostaviti na tamnom mestu, na 25 0 C, 3 minuta (vreme preinkubacije). Oĉitavati apsorbancu na svaki minut u toku naredna 3 minuta. Izraĉunati A/min za kontrolu i analize. Izraĉunavanje: Relativna jedinica aktivnosti SOD definisana je kao ona aktivnost koja dovodi do 50 % inhibicije autooksidacije adrenalina pod odreĊenim uslovima. Izabrana je ona koncentracija adrenalina koja će u kontroli dati promenu apsorbance u minuti od 0,025. Pri tome se polazi od koncentracije adrenalina od 10 mmol/L, a zatim se on razblaţuje sve dok se ne postigne A/min od 0,025. Izabrana je promena apsorbance od 0,025 u minuti, jer je utvrĊeno da SOD tada postiţe najviši procenat inhibicije autooksidacije adrenalina. Pod uslovima u kojima je bila izvoĊena reakcija bila je potrebna koncentracija adrenalina od 5 mmol/L da bi se postigla odgovarajuća promena apsorbance. Obzirom na definiciju relativne jedinice aktivnosti enzima SOD, jediniĉna aktivnost bi dovela do 50%-nog smanjenja apsorbance odnosno A/min bi u takvom uzorku bila 0,0125. 46 Aktivnost SOD-e u relativnim jedinicama se izraĉunava preko sledeće proporcije: 0,0125 : 1U =  0,025 - ( Aanalize/min)  : X Da bi se dobila aktivnost u 1 mL plazme dobijena vrednost se mnoţi sa razblaţenjem uzorka (Vukupna / Vuzorka ), a zatim sa 1000 da bi se dobila aktivnost u zapremini od 1L plazme. SOD, U/L = X x Vuz Vuk x 1000 3.3.4.2. Određivanje ukupnog sadržaja sulfhidrilnih (-SH) grupa Ukupni sadrţaj sulfhidrilnih grupa u plazmi odreĊivan je Ellman-ovom metodom (Ellman E, 1959). Princip metode zasniva se na ĉinjenici da 2,2'-dinitro-5,5'- ditio-benzojeva kiselina (DTNB) u baznoj sredini reaguje sa alifatiĉnim tiolima i daje obojeni p-nitrofenol. Jedan mol p-nitrofenola se stvara u reakciji jednog mola tiola. Nastali anjon je u baznoj sredini (pH 9) ţuto obojen i boja nastalog jedinjenja meri se spektrofotometrijski na 412 nm. Ukupni sadrţaj SH grupa je odreĊivan na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Slika 7. Redukcija Ellman-ovog reagensa slobodnim sulfhidrilnim grupama. 47 Reagensi Fosfatni pufer: 0,2 mol/L K 2HPO4, 2 mmol/L EDTA, pH 9,0 DTNB reagens, 10 mmol/L, rastvoren u 50 mmol/L fosfatnog pufera, pH 7,0 Tabela 5. Postupak za odreĊivanje koncentracije sulfhidrilnih grupa Slepa proba Analiza Pufer 0,95mL 0,90mL Plazma - 0,05mL DTNB reagens 0,02mL 0,02mL Smeša se inkubira 25 minuta na 25C, u mraku, a oĉitava apsorbanca na 412 nm, prema slepoj probi. Koncentracija ukupnog sadrţaja SH grupa u plazmi izraĉunava se preko molarnog apsorpcionog koeficijenta p-nitrofenola na 412 nm, koji za date uslove iznosi 13600 Lmol -1 cm -1 . SH grupe, mmol/L = 1000 Vuz VukAA    = 13 600 Lx mol-1xcm-1 Vuk - ukupna zapremina (0,97 mL) Vuz - zapremina uzorka (0,05 mL) 3.3.4.3. Određivanje aktivnosti enzima paraoksonaza 1 (PON 1) Aktivnost enzima paraoksonaza je odreĊivana po metodi Richter-a i Furlong-a ( Richter R, 1999). S obzirom da priznat biološki supstrat enzima PON1 još uvek nije utvrĊen, njegova aktivnost se odreĊuje preko brzine razgradnje veštaĉkih supstrata: paraoksona (paraoksonazna, POazna aktivnost) i diazoksona (diazoksonazna, DZOazna aktivnost). Određivanje aktivnosti paraoksonaze prema paraoksonu OdreĊivanje aktivnosti PON 1 prema paraoksonu zasniva se na delovanju enzima iz seruma na supstrat paraokson, pri ĉemu dolazi do konverzije paraoksona do p-nitrofenola. Brzina reakcije se prati kinetiĉki na 405 nm, što je maksimum apsorbance 48 p-nitrofenoksidnog anjona u koji prelazi p-nitrofenol u baznoj reakcionoj sredini. POazna aktivnost je odreĊivana na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Slika 8. Reakcija koju katalizuje paraoksonaza sa paraoksonom kao supstratom Reagensi Radni pufer – 116 g NaCl-a se rastvori u 800 mL destilovane vode koja već sadrţi 100 mL 1 mol/L TRIS-HCl pufera, pH 8,5 i 2 mL 1mol/L rastvora CaCl2. Rastvor se dopuni destilovanom vodom do 1000 mL. Ĉuva se na sobnoj temperaturi. Diluent pufer – U 800 mL destilovane vode, doda se 10 mL 1 mol/L TRIS-HCl pufera, pH 8,5 i 2 mL 1 mol/L rastvora CaCl2 i dopuni se vodom do 1000 mL. Ĉuva se na sobnoj temperaturi. Zasićen rastvor NaOH – rastvor NaOH, minimalne koncentracije 2 mol/L. Koristi se za dekontaminaciju korišćenog posuĊa i razgradnju preostalog paraoksona i diazoksona pre bacanja u slivnik. Paraokson supstrat, 1,2 mmol/L – 12,9 μL paraoksona se rastvori u 50 mL radnog pufera u normalnom sudu i dobro promeša. Postupak za odreĊivanje paraoksonazne aktivnosti Za odreĊivanje POazne aktivnosti serum se razblaţuje diluent puferom u odnosu 1:10. 4 μL seruma pomeša se sa 400 μL rastvora paraoksona i meri se promena apsorbance na 405 nm u toku 3 minuta. POazna aktivnost se izraţava kao μmol stvorenog p-nitrofenola/min/L ili jednostavnije kao IU/L. 49 Određivanje aktivnosti paraoksonaze prema diazoksonu OdreĊivanje diazoksonazne aktivnosti zasniva se na delovanju PON1 enzima iz seruma na supstrat diazokson (diazinon-O-analog), pri ĉemu se diazokson konvertuje do 2-izopropil-4-metil-6-hidroksipirimidina (IMHP). Brzina ove promene se prati kinetiĉki na maksimalnoj talasnoj duţini apsorbance IMHP-a, 270 nm. Promena aktivnosti se prati u toku tri minuta i raĉuna se promena apsorbance po minuti. Spektrofotometar je povezan sa kompjuterskim softverom koji selektuje samo linearni deo reakcije i samo njega koristi za raĉunanje ΔA/min. Slika 9. Reakcija koju katalizuje enzim paraoksonaza sa diazoksonom kao supstratom Reagensi Radni pufer – 116 g NaCl-a se rastvori u 800 mL destilovane vode koja već sadrţi 100 mL 1 mol/L TRIS-HCl pufera, pH 8,5 i 2 mL 1 mol/L rastvora CaCl2. Rastvor se dopuni destilovanom vodom do 1000 mL. Ĉuva se na sobnoj temperaturi. Diluent pufer – U 800 mL destilovane vode, doda se 10 mL 1 mol/L TRIS-HCl pufera, pH 8,5 i 2 mL 1 mol/L rastvora CaCl2 i dopuni se vodom do 1000 mL. Ĉuva se na sobnoj temperaturi. Zasićen rastvor NaOH – rastvor NaOH, minimalne koncentracije 2 mol/L. Koristi se za dekontaminaciju korišćenog posuĊa i razgradnju preostalog paraoksona i diazoksona pre bacanja u slivnik. Diazokson supstrat, 1,0 mmol/L – 2,8 μL diazkosona se rastvori u 10 mL radnog pufera i dobro promeša. 50 Postupak za odreĊivanje diazoksonazne aktivnosti Za odreĊivanje DZOazne aktivnosti serum se razblaţuje diluent puferom u odnosu 1:20. U epruvetu se odmeri 50 μL razblaţenog seruma i doda se 500 μL rastvora diazoksona, meša se na vorteks mešalici, sipa u kivetu ili aspirira u sluĉaju protoĉne kivete i aktivira poĉetak merenja na spektrofotometru. U ovoj studiji je korišćen UV/VIS spektrofotometar (Jasco, Jasco Corporation, Japan) koji je povezan sa kompjuterom, tako da je promena apsorbance oĉitavana softverski. Diazoksonazna aktivnost se odreĊuje na 23ºC, na pH 8,5 uz upotrebu 1 mmol/L TRIS-HCL pufera i u prisustvu rastvora NaCl-a. DZOazna aktivnost se izraţava kao μmol stvorenog IMHP/min/L ili kao IU/L. Krajnja formula za izraĉunavanje aktivnosti PON1 prema paraoksonu glasi: ΔA/min x 73 333 = μmol IMHP po minuti u litru rastvora = IU/L PON1 aktivnosti UporeĊivanjem enzimske aktivnosti PON1 prema ova dva supstrata, moţe se odrediti fenotip PON1 na poloţaju 192. Naime, u koordinatni sistem se za svaku osobu unesu na x-osu paraoksonazne aktivnosti a na y-osu diazoksonazne aktivnosti. PON1Q192R fenotip se odreĊuje pregledanjem poloţaja taĉaka na grafiku koji predstavlja presek ove dve aktivnosti (Jarvik GP, 2000, Richter RJ, 2004) i odreĊivanjem odnosa DZOazne/POazne aktivnosti. Na osnovu izraĉunatog odnosa enzimskih aktivnosti osobe se mogu podeliti u tri fenotipa: PON1Q192, PON1Q192R i PON1R192 fenotip. 3.3.5. OdreĊivanje parametara oksidativnog statusa 3.3.5.1. Određivanje totalnog oksidativnog statusa u serumu (TOS) Kao glavne komponente TOS u serumu su prisutni H2O2 i lipidni hidroperoksidi. Ukupni oksidansi prisutni u uzorku oksiduju fero jon-orto-dianizidni kompleks u feri jon. Reakcija oksidacije olakšana je molekulom glicerola koji je prisutan u reakcionom medijumu. Nastali feri jon zatim gradi obojeni kompleks sa ksilenol-oranţom u kiseloj sredini. Intezitet boje se meri spektrofotometrijski (λ=560 nm) i proporcionalan je ukupnom sadrţaju oksidacionih molekula u uzorku. Kao standard se koristi vodeni rastvor vodonik-peroksida opsega koncentracije 10-200 μmol/L, što odgovara 51 linearnosti metode i oĉekivanim koncentracijama u biološkom materijalu (Erel O, 2005). TOS je odreĊivan na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Instituta za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Reagensi Reagens 1-TOS 1: Pripremljen je rastvaranjem ksilenol- oranţa (114mg) i NaCl (8,18g) u 900mL rastvora H2SO4 (c=25mM). U tako dobijeni rastvor dodato je 100 mL glicerola. pH vrednost ovog reagensa treba podesiti na 1.75. Reagens 2- TOS 2: Pripremljen je rastvaranjem feroamonijum sulfata (1,96g) i o – dianizidin dihidrohlorida (3,17g) u 1000ml rastvora H2SO4 (c=25mM) . Tabela 6. Postupak odreĊivanja TOS Analiza Standard Slepa proba TOS 1 450μL 450μL 450μL TOS 2 22μL 22μL - Serum 70μL - - Dejonizovana Voda - - 70μL Standard - 70μL - Sadrţaj se promeša i inkubira 3 minuta, nakon ĉega se apsorbance ĉitaju pri talasnoj duţini od 560 nm. 3.3.5.2. Određivanje totalnog antioksidativnog statusa u serumu (TAS) Za odreĊivanje totalnog antioksidativnog statusa korišćena je metoda koju je formulisao Erel, uz odreĊene modifikacije (Erel O, 2004). Totalni antioksidativni status odreĊen je kolorimetrijskim testom uz upotrebu stabilnog of 2,2’-azinobis-(3- etilbenztiazolin)-6- sulfonska kiselina katjona (ABTS + ) kao hromogena. Sam rastvor ABTS-a je bezbojan. Oksidacijom do ABTS + katjona, pomoću vodonik-peroksida u kiselom medijumu (acetatni pufer; pH=3,6) rastvor dobija karakteristiĉnu smaragdnu boju. Kada se obojeni ABTS + jon pomeša sa nekom supstancom koja moţe da se 52 oksiduje (antioksidans), redukuje se do bezbojnog ABTS-a što se manifestuje promenom boje odnosno obezbojavanjem ispitivanog rastvora. Intenzitet obezbojavanja srazmeran je koncentraciji prisutnih ukupnih antioksidanasa u uzorku. Koncentracija prisutnih antioksidanasa u uzorku odreĊuje se upotrebom standardne krive. Najĉešće upotrebljavani standard za odreĊivanje TAS je Trolox, hidrosolubilni ekvivalent vitamina E. Dobijeni rezultati izraţavaju se u mmol Trolox ekvivalenta po L. Pri konstruisanju standardne krive korišćeni su rastvori Troloksa rastućih koncentracija i to: 0,125 mmol/L; 0,25 mmol/L; 0,5 mmol/L; 0,75 mmol/L; 1 mmol/L; 1,5 mmol/L; 2 mmol/L, što je ujedno i gornja granica linearnosti metode. TAS je odreĊivan na automatskom analizatoru ILab 300+, nakon optimizacije originalne metode u laboratoriji Katedre za medicinsku biohemiju Farmaceutskog fakulteta u Beogradu. Reagensi Reagens 1: Acetatni pufer (pH = 5,8; 0,4 mol/L). Priprema se mešanjem 940 mL CH3COONa (0,4mol/L) i 60 ml CH3COOH (0,4mol/L) za 1000 mL rastvora (prvo se dodaje bazna komponenta, a potom kisela dok se ne postigne potrebna pH vrednost). Rastvor pufera je stabilan šest meseci na temperaturi od +4ºC. Reagens 2: Rastvor ABTS-a [2,2-azobis (3-etilbenzotiazolidin-6-sulfonat)]. Priprema se mešanjem 30 ml acetatnog pufera (pH=3,6; 30 mmol/L), 70 mL rastvora H2O2 (2 mmol/L). Potom se 0,549 g ĉvrstog ABTS-a rastvori u 100 mL prethodno pripremljenog rastvora (finalna koncentracija rastvora ABTS-a je 10 mmol/L). Inkubira se 1h na sobnoj temperaturi, dok rastvor ne poprimi karakteristiĉnu intenzivnu plavo-zelenu boju ABTS+ jona. Ovako pripremljen reagens je stabilan šest meseci na +4ºC. Reagens 3: Rastvor Troloksa. Kao standard koristi se hidrosolubilni analog vitamina E – Trolox (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina, Mr=250,29 g/mol). Rastvor Troloxa priprema se rastvaranjem u fosfatnom puferu, pH=7,4; 30 mmol/L. 53 Tabela 7. Postupak odreĊivanja TAS Analiza Standardi Slepa proba Serum 12,5µL - - Reagens 1 200µL 200µL 200µL Reagens 2 37,5µL 37,5µL 37,5µL Rastvor standarda - 12,5µL - Dejonizovana voda - - 12,5µL Apsorbance ispitivanih rastvora oĉitavane na talasnoj duţini od 660 nm nakon inkubacije od 10 minuta na sobnoj temperaturi. 3.3.5.3. Određivanje prooksidativno-antioksidativnog balansa (PAB) PAB testom se odreĊuje koncentracija vodonik-peroksida (H2O2) u antioksidativnom okruţenju. Hromogen 3,3´5,5´-tetrametilbenzidin (TMB) reaguje i sa vodonik-peroksidom i sa antioksidansima (mokraćnom kiselinom) u isto vreme, obzirom da se nalaze u istoj sredini. Reakcija H2O2 i hromogena je enzimski katalizovana enzimom peroksidazom, pri ĉemu oksidovanjem TMB-a nastaje intenzivno plavo obojeni proizvod. Za razliku od toga reakcija mokraćne kiseline i hromogena je nekatalizovana, hemijska reakcija u kojoj se TMB katjon redukuje do bezbojnog proizvoda. Intenziteti obojenja standardnih rastvora su srazmerni odnosu dodatih koliĉina H2O2 i mokraćne kiseline. Za pravljenje standardne krive se koriste rastvori H2O2 i mokraćne kiseline u razliĉitim odnosima, tako da na poĉetku dominira mokraćna kiselina a na kraju H2O2. Ove dve komponente su izabrane za predstavnike prooksidanasa i antioksidanasa jer ne reaguju jedna sa drugom i ne ometaju aktivnost jedna drugoj prema hromogenu (Alamdari, 2007). Reagensi TMB I rastvor: 60 mg TMB (3,3´5,5´-tetrametilbenzidin) supstance se rastvori u 10mL dimetilsulfoksida (DMSO), rastvor se podeli na zapremine od 1,1 mL i ĉuva na -20ºC TMB katjon: Za pripremu TMB katjona 1 mL TMB/DMSO (TMB I) se doda u 50 mL acetatnog pufera (0,05M, pH 4,5), zatim se doda 175 μL sveţe 54 pripremljenog hloramina T (100 mmolxL -1), dobro se promeša i inkubira 1 sat na 37 ºC, na tamnom mestu uz stalno mešanje. Nakon inkubacije u 50 mL TMB katjona doda se 25 U enzima peroksidaze. Dobijeni rastvor se paţljivo promeša, podeli u zapremine od 1,1 mL i ĉuva na -20 ºC. TMB II rastvor: 200 μL TMB/DMSO se rastvori u 10 mL acetatnog pufera (0,05M, pH 5,6). Ovako pripremljen rastvor najbolje je koristiti odmah ili maksimalno u roku od 2 dana, pri ĉemu se ĉuva na temperaturi od 4 ºC. Radni rastvor: 1 mL TMB katjona se doda u 10 mL TMB rastvora II i 6 minuta se meša na sobnoj temperaturi i na tamnom mestu. Ovako pripremljen radni rastvor se koristi odmah. Standardni rastvor: Standardni rastvori se pripremaju mešanjem razliĉitih odnosa (0-100%) 1mmolxL -1 H2O2 sa 6 mmolxL -1 mokraćnom kiselinom (rastvorenom u 10 mM NaOH). Priprema standardnih rastvora prikazana je u tabeli 1. Tabela 8. Priprema standardnih rastvora za PAB test mešanjem mokraćne kiseline i H2O2 u razliĉitim odnosima Standardni rastvor 1 2 3 4 5 Mokraćna kiselina (µl) 100 75 50 25 0 H2O2 (µl) 0 25 50 75 100 Postupak odreĊivanja PAB 10 μL svakog uzorka, standardnog rastvora i slepe probe (destilovana voda) se pomeša sa 180μL radnog rastvora u svaki od 96 bazena ploĉe, koja se onda inkubira 12 minuta na 37 ºC, na tamnom mestu. Nakon inkubacije reakcija se prekida dodatkom 40μL 2 mol/L hlorovodoniĉne kiseline, pri ĉemu se dobijena plava boja prevodi u ţutu. Apsorbanca se odmah oĉitava na ELISA ĉitaĉu na 450 nm. Na osnovu apsorbanca koje se dobijaju u standardnim rastvorima konstruiše se kalibraciona kriva iz koje se oĉitavaju koncentracije uzoraka. Vrednosti PAB-a se izraţavaju u arbitrarnim 55 jedinicama-HKU (hidrogen-peroksid komplementarne jedinice), koje predstavljaju procenat H2O2 u standradnim rastvorima pomnoţen sa 6. Zahvaljujući ovoj multiplikaciji, moguće je oĉitavanje većeg raspona dobijenih vrednosti. 3.3.6. OdreĊivanje sekretornog IgA u salivi Koncentracija sIgA je odreĊena enzimsko imunološkom metodom-ELISA (eng. enzyme-linked immunosorbent assay) testom (Miletić, 1997). Reagensi 0,1 mol/L bikarbonatnog pufera, pH9,5 Kozje anti-humano IgA Antitelo (Sigma Chemical, St. Louis, MO) TTBS pufer 3% rastvor ţelatina u TTBS-u Ig-G anti – IgA antitelo obeleţeno peroksidazom (Sigma Chemical, St. Louis, MO) σ-fenilen diamin 3M HCl Standard sekretornog IgA Kozje anti-humano antitelo (Sigma Chemical, St. Louis, MO) je rastvoreno u 0,1M bikarbonatnom puferu, pH 9,5 i adsorbovano na polistrensku ploĉu sa 96 bazena (NUNC, Denmark) i ostavljeno preko noći na 40C. Nakon ispiranja sa TTBS puferom, u bazene se dodaje po 200μL 3% ţelatina u TTBS koji blokira višak slobodnih mesta za vezivanje na ploĉi. Ploĉa se potom inkubira 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja, po 100 μL standardnih rastvora sIgA i uzoraka se dodaju u bazene ploĉe. Kao standard je korišćen sekretorni IgA izolovan iz humanog kolostruma (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Ploĉa se zatim inkubira na sobnoj temperaturi u toku jednog sata. Nakon ispiranja sa TTBS puferom bazeni se ispune sa 100 μL anti-IgA antitela obeleţenog enzimom peroksidaza (Sigma Chemical, St. Louis, MO). Nakon inkubacije od jednog sata, bazeni se dobro isperu, i ispune sa 100 μL rastvora supstrata σ-fenilen diamin u 0.05 M fosfo-citratnom puferu uz dodatak 0,03% H2O2 Nakon inkubacije od 56 pola sata, na tamnom mestu, reakcija se prekida dodatkom 50μL 2 mol/L hlorovodoniĉne kiseline, pri ĉemu se dobijena plava boja prevodi u ţutu. Apsorbanca se odmah oĉitava na ELISA ĉitaĉu na 490 nm (Victor2 Multilabel Counter, Wallac). Svi uzorci su uneti u triplikatu i proseĉna vrednost je uzeta kako reprezentativna. Na osnovu apsorbanca koje se dobijaju u standardnim rastvorima regresionom analizom se izraĉunava jednaĉina prave na osnovu koje se izraĉunava koncentracija uzorka. Brzina izluĉivanja sIgA u salivi se dobija mnoţenjem apsolutne koncentracije sIgA(mg/mL) i salivarnog protoka (mL/min). Koncentracija proteina u salivi odreĊena je BCA testom uz albumin (Sigma Chemical, St. Louis, MO) kao standard (Miletic, 1997). 3.3.7. Hemijska analiza teĉne surutke i aromatizovanog napitka na bazi surutke Koliĉina suve materija je odreĊena gravimetrjski, sušenjem na 105oC do konstantne mase. Za odreĊivanje šećera korišćena je metoda po Luff-Schoorl-u. Sadrţaj proteina u uzorcima odreĊen je metodom po Kjeldahl-u. OdreĊivanje sadrţaja lipida u uzorcima izvršeno je standradnom metodom po Soxhlet-u (AOAC). Procenat pepela se dobija ţarenjem uzorka do konstantne mase na 850oC i merenjem mase zaostalog pepela. Energetska vrednost 100g uzorka je dobijena raĉunskim putem na osnovu odreĊenog sadrţaja šećera, proteina i masti i energije koja se dobija sagorevanjem 1g odreĊenog nutrijenta. Sadrţaj mineralnih materija - kalcijuma (Ca), natrijuma (Na), kalijuma (K), magnezijuma (Mg) i cinka (Zn) odreĊen je plamenom atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom na aparatu Varian SpectrAA-10. Predhodno su uzroci mineralizovani suvim spaljivanjem. 57 3.4. Statistiĉka obrada podataka Normalnost distribucije podataka je proveravana upotrebom Kolmogorov- Smirnov testa. Kontinuirani podaci su prikazani kao srednja vrednost i standardna greška, ukoliko je raspodela ispitivanih podataka sledila normalni tok. Kod parametara ĉija distribucija nije sledila normalni tok, proveravana je distibucija logaritmovanih vrednosti i rezultati su prikazani kao geometrijska sredina i 95 % interval pouzdanosti. Kontinuirane varijable koje slede normalnu raspodelu, kao i kontinuirane varijable koje posle logaritmovanja slede normalnu raspodelu, poreĊene su Studentovim t-testom. Varijable koje ne prate normalnu raspodelu poreĊene su Wilkilson neparametarskim testom Analiza kovarijanse (ANCOVA) je primenjena za utvrĊivanje statistiĉki znaĉajne razlike izmeĊu grupa u cilju eliminacije uticaja promenljive kovarijanse na ispitivane zavisne parametre. Za analiziranje više grupa parametarskih podataka korišćena je jednofaktorska i dvofaktorska analiza varijanse (ANOVA) sa ponavljanjem, sa „Bonferoni― post hoc testom". Razlike izmeĊu kategoriĉkih podataka su testirane su upotrebom χ2 testa. Za ispitivanje korelacije izmeĊu razliĉitih parametara koji su odreĊivani u studiji, korišćena je Spearmanova neparametarska korelaciona analiza. Minimalni uslov za postojanje statistiĉki znaĉajne razlike je p (nivo znaĉajnosti) manji ili jednak 0,05. Statistiĉka obrada podataka izvedena je korišćenjem raĉunarskih programa PASW Statistics ver. 18.0 i Medcalc (MedCalc ver. 11.4 Software, Belgium). 58 4. REZULTATI ISTRAŢIVANJA 4.1. Uticaj dugotrajnog redovnog treniranja na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite U ovom delu istraţivanju uĉestvovalo je 40 fudbalera i 28 zdravih ispitanika koji nemaju redovnu fiziĉku aktivnost visokog intenziteta. Uzeti su podaci o starosti, godinama treniranja, izmerena im je visina, teţina, procent masti, izraĉunat indeks telesne mase. Antropometrijske karakteristike fudbalera i kontrolne grupe su prikazane u tabeli 9. Table 9. Antropometrijske karakteristike ispitanika Fudbaleri Kontrolna grupa P Starost (godine) 17,7±0,67 14,8±0,25 <0,001 Visina (cm) 179±6,4 166±6,7 <0,001 Telesna masa (kg) 71,6±7,61 60,2±9,73 <0,001 Masti (%) 9,6±3,24 15,0±1,51 <0,001 ITM (kg/m2) 22,3±1,62 21,8±3,17 0,327 Godine treniranja 10,1±1,21 _ Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S.D. S obzirom na razliku u godinama, fudbaleri su bili viši i teţi u odnosu na kontrolnu grupu. TakoĊe, procenat masti je bio znaĉajno manji kod sportista. Ipak, nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u ITM izmeĊu sportista i kontrolne grupe. 59 Lipidni profil i hematološki parametri fudbalera i kontrolne grupe su prikazani u tabelama 10 i 11. Analiza kovarijanse, uz korekciju parametara u odnosu na godine, je pokazala da nema statistiĉki znaĉajne razlike u kocentraciji triglicerida, ukupnog, LDL i HDL holesterola izmeĊu fudbalera i kontrolne grupe. Pored toga, nije uoĉena znaĉajna razlika u hematološkim parametrima izmeĊu fudbalera i kontrolne grupe. Tabela 10. Lipidni profil fudbalera i kontrolne grupe Fudbaleri Kontrolna grupa P HOLuk, (mmol/L) 4,52±0,32 4,21±0,26 0,567 HDL-H (mmol/L) 1,24±0,12 1,38±0,09 0,481 LDL-H (mmol/L) 2,51±0,29 2,72±0,21 0,667 TG (mmol/L) 0,86±0,14 0,73±0,12 0,596 Rezultati su prikazani kao korigovane srednje vrednosti±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Analiza kovarijanse). Tabela 11. Osnovni hematološki parametri fudbalera i kontrolne grupe Fudbaleri Kontrolna grupa P Leukociti (x 10*9/L) 6,1±0,44 6,0±0,22 0,564 Eritrociti (x10*12/L) 5,4±0,17 5,1±0,13 0,217 Hb (g/L) 148±7,1 143±5,7 0,687 Hct (L/L) 0,471±0,023 0,422±0,018 0,166 MCV (fL) 84±1,3 86±1,1 0,352 MCH (pg) 27±0,5 29±0,4 0,101 MCHC (g/L) 335±14,5 318±11,4 0,496 Trombociti (x 10*9/L) 269±20,6 211±16,5 0,106 Rezultati su prikazani kao korigovane srednje vrednosti±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Analiza kovarijanse) 60 Zbog razlike u godinama, parametre oksidativnostresnog statusa smo poredili primenom analize kovarijanse, nakon korekcije u odnosu na godine. Rezultati su prikazani kao korigovane srednje vrednosti ± SEM. Fudbaleri su imali znaĉajno više vrednosti TBKRS u odnosu na kontrolnu grupu. Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u nivou AOPP, mada su vrednosti ovog parametra bile više u grupi fudbalera. Aktivnost SOD u plazmi i ukupan sadrţaj SH grupa je znaĉajno viši kod sportista u odnosu na kontrolnu grupu, dok razlika u aktivnosti PON1 prema paraoksonu i diazoksonu nije bila statistiĉki znaĉajna. Eksperimentalno dobijeni podaci i statistiĉki znaĉajne razlike su prikazani u tabeli 12. Tabela 12. Parametri oksidativnog stresa, antioksidativne zaštite i aktivnost enzima PON1 fudbalera i kontrolne grupe Fudbaleri Kontrolna grupa p TBKRS (µmol/L) 1,2±0,05 0,8±0,11 <0,05 AOPP (µmol/L) 24,8±5,65 16,9±4,88 0,438 SH groupe (mmol/L) 0,605±0,027 0,440±0,023 <0,01 SOD (U/L) 129±9,6 56±19,3 <0,05 POazna aktivnost (U/L) 403±123,3 372±96,4 0,881 DZOazna aktivnost (U/L) 9095±1557,8 8730±1190,1 0,890 Rezultati su prikazani kao korigovane srednje vrednosti±SEM. Parametri su poreĊeni testom Analiza kovarijanse. 61 4.2. Uticaj treniranja i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i antoksidativne zaštite U okviru ovog dela istraţivanja, ispitivan je uticaj redovnih treninga i suplementacije Asx na bazalne vrednosti pojedinaĉnih parametara oksidativnog stresa i anitoksidativne zaštite, kao i parametara oksidativnog statusa mladih elitnih fudbalera. Pored toga, uraĊena je i kompletna biohemijska analiza i krvna slika na poĉetku, posle 45 i posle 90 dana redovnih treninga i suplementacije. 4.2.1. Opšti podaci o sportistima Kao što je napred navedeno, ovim istraţivanjem je obuhvaćeno 40 fudbalera. Uzeti su podaci o starosti, godinama treniranja, izmerena im je visina, teţina, procent masti, izraĉunat indeks telesne mase i odreĊena maksimalna potrošnja kiseonika (VO2max). Antropometrijske karakteristike fudbalera su prikazane u tabeli 13. Tabela 13. Antropometrijske karakteristike fudbalera Astaksantin Placebo P Starost (godine) 17.9±0.16 17.6±0.14 0,289 Visina (cm) 178±1.4 180±1.4 0,255 Telesna masa (kg) 70.9±1.72 72.3±1.79 0,582 ITM (kg/m2) 22.4±0.33 22.2±0.41 0,812 Masti (%) 9.4±0.74 9.7±0.81 0,773 VO2 max (ml/min/kg) 55.5±1.21 52.9±0.74 0,780 Godine treniranja 10.2±0.32 9.9±0.21 0,443 Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Studentov t test) 62 Ispitivana grupa mladih fudbalera je bila homogena, s obzirom da nije pokazana znaĉajna razlika izmeĊu suplementirane i placebo grupe u pogledu antropometrijskih karakteristika primenom Studentovog t-testa. Rezultati analize dnevnika ishrane koji su fudbaleri vodili u periodu od 4 dana na poĉetku studije, prikazani su u tabelama 14 i 15 i slici 12. Tabela 14. Proseĉan dnevni unos makro i mikronutrijenata kod fudbalera Astaksantin Placebo P Energija (kcal) 3154±247 2932±147 0,445 Proteini (g) 124±8.7 125±6.3 0,916 Ugljeni hidrati (g) 412±33 366±23 0,258 Monosaharidi (g) 109±12 123±18 0,525 Vlakna (g) 13.2±1.4 12.6±1.5 0,776 Masti (g) 104±9 101±7 0,791 Zasićene masti (g) 33.2±3.5 29.9±3.2 0,485 Holesterol (mg) 328±23 344±38 0,712 Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Student t test) Slika 10. Zastupljenost makronutrijenata u ishrani fudbalera 63 Tabela 15. Proseĉan unos dijetarnih antioksidanasa kod fudbalera Astaksantin Placebo P Vitamin A (IU) 2312± 442 2120 ± 389 0,775 Vitamin C(mg) 149 ±25 135 ±30 0,438 Vitamin E(mg) 5.4±0.7 6.1±1.5 0,738 Bakar(mg) 2.3 ±0.4 1.92±0.5 0,410 GvoţĊe (mg) 14.4 ±0.9 15.1 ±1.6 0,435 Mangan(mg) 4.9 ±0.3 4.0 ±0.9 0,247 Selen(µg) 187±15 164 ±8 0,353 Zink(mg) 13.0± 1.4 13.5±1.8 0,386 Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Student T test) Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u unosu makronutrijenata i mikronutrijenata izmeĊu suplementirane i placebo grupe. Proseĉan unos ugljenih hidrata je nedovoljan, jer su oni zastupljeni sa manje od 55 % - 60 % energetskog unosa, dok je unos masti na gornjoj granici unosa koji po preporukama treba da bude manji od 30 %. TakoĊe, unos zasićenih masnih kiselina i holesterola je veći od preporuĉenog. Nutritivna analiza je pokazala da je unos vitamin A i E znaĉajno niţi od preporuĉenog dnevnog unosa (DRI za vitamin A-3000 IU; DRI za vitamin E-15 mg). 4.2.2. Osnovni biohemijski i hematološki parametri Osnovni biohemijski hematološki parametri fudbalera na poĉetku studije, posle 45 dana i posle 90 dana redovnih treninga i suplementacije prikazani su u tabelama 16 i 17. 64 Tabela 16. Krvna slika na pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi 0 dan 45 dan 90 dan T S TxS Leukociti (x 10*9/L) Astaksantin 6.3±0.34 5.9±0.3 6.0±0.32 <0.05 <0.05 0,942 Placebo 6.0±0.28 5.7±0.22 6.7±0.44 # Eritrociti (x10*12/L) Astaksantin 5.5±0.11 5.3±0.08* 5.4±0.11 <0.05 0,626 0,910 Placebo 5.4±0.10 5.2±0.07* 5.3±0.05 Hb (g/L) Astaksantin 156±2.6 151±2.0* 153±3.4 <0.01 0,937 0,891 Placebo 157±3.9 151±2.0* 152±2.1 Hct (L/L) Astaksantin 0.486±0.007 0.461±0.006** 0.463±0.005* <0.01 0,763 0,959 Placebo 0.482±0.010 0.457±0.006** 0.462±0.005 MCV (fL) Astaksantin 88.74±1.17 86.88±0.75** 86.25±0.89** <0.001 0,745 0,729 Placebo 88.64±0.89 87.58±0.40 86.81±0.73* MCH (pg) Astaksantin 28.6±0.38 28.5±0.39 28.4±0.39 0,110 0,665 0,331 Placebo 28.9±0.31 28.9±0.33 28.5±0.31 MCHC (g/L) Astaksantin 322±2.2 328±2.1 330±1.6** <0.01 0,621 0,361 Placebo 326±2.3 330±3.0 329±2.4 Trombociti (x 10*9/L) Astaksantin 235±8.0 227±6.8 234±9.0 0,369 0,095 0,992 Placebo 253±12.7 247±10.6 249±9.5 65 Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ±SEM. ANOVA: T-glavni uticaj treninga; S-glavni uticaj suplementacije; TxS-uticaj interakcije treninga i suplemenacije. p<0,05 (*) , p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Pokazan je znaĉajan uticaj interakcije suplementacije i redovnih treninga (p<0,05) i znaĉajan uticaj redovnih treninga (p<0,05) na broj leukocita. Uoĉeno je znaĉajno povećanje broja leukocita u placebo grupi, ali ne i u Asx nakon 90 dana redovnih treninga i suplementacije. Broj eritrocita, Hb, Hct i MCV se znaĉajno smanjuje, dok se MCH i broj trombocita nije menjao u toku posmatranog perioda. Nije bio razlike u posmatranim parametrima izmeĊu suplementirane i placebo grupe. Tabela 17. Osnovni biohemijski parametri pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi 0 dan 45 dan 90 dan T S TxS ALT (U/L) # Astaksantin 21(16,8-25,6) 18(15,1-22,6) 18(15,6-21,6) 0,125 0,974 0,844 Placebo 20(18,6-22,5) 18(16,7-20,1) 19(16,1-22,6) Bilirubin (µmol/L) Astaksantin 10,5±1,75 16,4±1,71** 15,7±2,03** <0,01 0,080 0,546 Placebo 12,6±1,80 16,8±1,89* 19,6±2,18* Kreatinin (µmol/L) Astaksantin 130±2 131±2 126±2 # <0,01 0,364 0,898 Placebo 133±3 135±3 131±3 ## Glukoza (mmol/L) Astaksantin 5,9±0,12 6,1±0,13 5,7±0.09* # <0,01 0,766 0,438 Placebo 6,1±0,17 6,0±1,9 5,6±0,13 # Ukupni proteini (g/L) Astaksantin 75±0,8 76±1,4 73±1,1 # <0,01 0,793 0,259 Placebo 77±0,9 75±1,6 73±1,2* # 66 Urea (mmol/L) Astaksantin 6,4±0,31 6,4±0,33 6,2±0,35 0,715 0,396 0,321 Placebo 6,6±0,36 6,5±0,38 7,0±0,41 Mokraćna kiselina (µmol/L) Astaksantin 324±24,9 334±19,4 306±17,0 <0,05 0,305 0,648 Placebo 355±16,6 368±23,5 314±13,7* # GvoţĊe (μmol/L) Astaksantin 9,8±0,60 10,8±0,79 10,4±0,98 0,970 0,925 0,186 Placebo 10,8±0,70 9,6±0,92 10,3±0,84 Feritin (μg/L) # Astaksantin 50(24,4-102,5) 79(59,9-103,3) 84(63,7-111,8) <0,05 0,572 0,709 Placebo 49(32,1-77,8) 63(49,6-80,7) 69(51,7-91,8) Transferin (g/L) Astaksantin 2,63±0,07 2,48±0,07*** 2,56±0,06 <0,001 0,071 0,448 Placebo 2,87±0,09 2,66±0,08* 2,72±0,08 HOLuk (mmol/L) Astaksantin 4,28±0,20 4,61±0,22* 4,39±0,24 <0,05 0,661 0,517 Placebo 4,54±0,23 4,67±0,26* 4,50±027 HDL-H (mmol/L) Astaksantin 1,27±0,05 1,21±0,05* 1,30±0,05 <0,01 0,952 0,693 Placebo 1,29±0,07 1,19±0,06 1,31±0,06 # LDL-H (mmol/L) Astaksantin 2,63±0,19 2,98±0,20* 2,73±0,20 <0,05 0,451 0,588 Placebo 2,97±0,24 3,13±0,24 2,91±0,25 # TG (mmol/L) Astaksantin 0,84±0,12 0,91±0,08 0,80±0,08 0,111 0,833 0,130 Placebo 0,95±0,14 0,80±0,09 0.70±0,09 67 Rezultati su prikazani srednje vrednosti i SEM; geometrijske srednje vrednosti i interval pouzdanosti (#). ANOVA: T-glavni uticaj treninga; S-glavni uticaj suplementacije; TxS-uticaj interakcije treninga i suplemenacije. p<0,05 (*) , p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#) i p<0,01(##) : znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Uoĉeno je statistiĉki znaĉajno povećanje nivoa bilirubina u obe grupe fudbalera kao posledica redovnih treninga (p<0,05). Nivo kreatinina i ukupnih proteina opada u periodu od 90 dana redovnih treninga u obe grupe fudbalera (p<0,01). Koncentracija mokraćne kiseline opada u P grupi tokom 90 dana redovnih treninga. Nivo ALT i uree se ne menjaju u posmatranom periodu. Iako redovni treninzi u toku 90 dana nisu znaĉajno uticali na nivo gvoţĊa u obe grupe fudbalera, zabeleţena srednja vrednosti nivoa gvoţĊa je na donjoj granici osega referentnih vrednosti. Uoĉeno je znaĉajno povećanje nivoa feritina u obe grupe fudbalera tokom posmatranog perioda. Nivo transferina znaĉajno opada posle 45 dana redovnih treninga u odnosu na poĉetak posmatranog perioda. Srednje vrednosti nivoa feritina i trensferina su bile u opsegu referentnih vrednosti tokom studije. ANOVA sa ponavljanjem je pokazala znaĉajan uticaj treninga na ukupni, HDL i LDL holesterol (p<0,05, p<0,01 i p<0,05, redom). U obe grupe fudbalera nivo HDL holesterola opada, dok nivo ukupnog i LDL holesterola raste posle 45 dana. Vrednosti ovih parametara se vraćaju na poĉetne vrednosti na kraju posmatranog perioda. Srednje vrednosti parametara lipidnog profila su bile u opsegu referentnih vrednosti. A) 68 B) Slika 11. Leukocitarna formula pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx (A) i placebo (B) grupi. Na slici 13 su prikazane promene u procentu pojedinih frakcija leukocita tokom 90 dana redovnih treninga i suplementacije. ANOVA sa ponavljanjem je pokazala statistiĉki znaĉajan efekat redovnih treninga na broj limfocita i neutrofila kod mladih fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,01). Naime, intenzivni treninzi u toku posmatranog perioda uslovili su znaĉajno povećanje broja neutrofila (p<0,05) i smanjenje procenta limfocita (p<0,01) u P grupi. Nasuprot tome, promene u broju neutrofila i limfocita u Asx grupi nisu bile statistiĉki znaĉajne. 4.2.3. Parametri oksidativnostresnog statusa 4.2.3.1. Parametri oksidativnog stresa Da bismo procenili nivo oksidativnog stresa i dinamiku njegove promene pod uticajem redovnih treninga, kao i njegovu modulaciju pod uticajem Asx kao antioksidansa, odreĊivali smo koncentraciju TBKRS, AOPP i nivo superoksid anjon radikala u plazmi. TBKRS je krajnji produkt razgranje lipidnih hidroperoksida, tako da predstavlja marker kasne faze oštećenja oksidansima. 69 Slika 12. Koncentracija TBKRS pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,05 (*) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#) i p<0,001(###): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. ANOVA sa ponavljanjem je pokazala statistiĉki znaĉajan uticaj treninga (glavni uticaj treninga, p<0,001) na koncentraciju TBKRS kod mladih fudbalera. Uoĉen je znaĉajan pad nivoa TBKRS nakon 45 dana redovnih treninga i suplementacije i u Asx i P grupi (p<0,001 i p<0,05, redom, Bonferoni test), koji je praćen povećanjem do kraja studije (p<0,001 i p<0,05, redom, Bonferoni test). Nivo TBKRS u Asx grupi je bio znaĉajno niţi posle 45 dana suplementacije u u odnosu na P grupu (p<0,05). AOPP je pouzdan indirektni parametar oksidativnog oštećenja proteina, koji nastaje kao posledica dugotrajnog uticaja oksidativnog stresa, kao što je sluĉaj nakon dugotrajnih perioda intenzivnih treninga kod fudbalera. *** * ### # 70 Slika 13. Nivo AOPP pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. Uoĉene promene u AOPP su pratile promene koncentracije TBKRS, sa smanjenjem posle 45 dana i povećanjem nakon 90 dana redovnih treninga. ANOVA sa ponavljanjem nije pokazala znaĉajan uticaj ni treninga ni suplementacije na nivo AOPP. Superoksidni anjon je jedan od slobodnih radikala koji se normalno stvara u metaboliĉkim reakcijama. Rezultati naše studije pokazuju da redovni treninzi u periodu od 90 dana dovode do znaĉajno povećanje nivoa O2 ,– u obe grupe mladih fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,001). Slika 14. Nivo O2 ,– pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska sredina i interval pouzdanosti. p<0,05 (*): znaĉajna razlika u odnosu 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan * # * 71 4.2.3.2. Parametri antioksidativne zaštite Endogeni sistem antioksidativne zaštite podrazumeva antioksidativne enzime i neenzimske antioksidanse. SH grupe proteina imaju vrlo vaţnu ulogu u kompleksnoj mreţi endogenih neenzimskih antioksidansa. Slika 15. Ukupni sadrţaj SH grupa pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. p<0,05 (*) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. ANOVA sa ponavljanjem je pokazala znaĉajan efekat interakcije suplementacije i treninga (p<0,05) i znaĉajan glavni efekat treninga (p<0,01) na ukupan sadrţaj SH grupa. Uoĉeno je povećanje nivoa SH grupa u Asx grupi nakon 45 i 90 dana suplementacije u odnosu na nivo pre suplementacije (p<0,05, p<0,001, redom, Bonferoni test), dok promene u P grupi nisu bile statistiĉki znaĉajne. Na poĉetku studije postojala je razlika u ukupnom sadrţaju SH grupa izmeĊu suplementirane i placebo grupe (p=0,060, Student t-test). Superoksid dismutaza je glavni enzim koji neutrališe superoksidni anjon i predstavlja prvi enzim u liniji odbrane od oksidativnog stresa. Uticaj redovnih treninga i suplementacije na akitvnost SOD u periodu od 90 dana prikazan je na slici 18. *** * 72 Slika 16. Aktivnost SOD pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska sredina i interval pouzdanosti. p<0,05 (*): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan Primenom ANOVE sa ponavljanjem pokazano je znaĉajno smanjenje aktivnosti SOD u periodu od 90 dana u obe grupe fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,001). Aktivnost enzima PON1 je odreĊivana preko brzine razgradnje veštaĉkih supstrata - paraoksona i diazoksona. Aktivnost PON1 prema paraoksonu-POazna i diazoksonu-DZOazna aktivnost kod mladih fudbalera su prikazane na slikama 19 i 20. Na poĉetku studije postojala je razlika u aktivnosti PON1 prema diazoksonu izmeĊu suplementirane i placebo grupe (p=0,073). Slika 17. POazna aktivnost pre, posle 45 i 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. * # * # 73 Slika 18. DZOazna aktivnost pre, posle 45 i 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. p<0,01 (**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. Analiza podataka primenom ANOVA testa sa ponavljanjem je pokazala znaĉajan efekat interakcije suplementacije i treninga na aktivnost PON1 prema paraoksonu (p<0,05), dok je znaĉajan efekat redovnih treninga zabeleţen na PON1 aktivnost prema diazoksonu. Nakon 90 dana suplementacije, PON1 aktivnost prema diazoksonu je povećana za 42% (p<0,01, Bonferroni test), dok u P grupi nije zabeleţena statitiĉki znaĉajna promena. Slika 19. Raspodela PON1 Q1192R fenotipova u suplementiranoj i placebo grupi. ** 74 Fenotip PON1 za poloţaj 192 (PON1Q192, PON1Q192R i PON1R192) kod mladih fudbalera odreĊivan je uporeĊivanjem enzimske aktivnosti PON1 prema paraoksonu i diazoksonu. Ispitanici sa vrednošću odnosa dve PON1 aktivnosti ≥ 43 imaju PON1Q192 fenotip, sa vrednostima izmeĊu 13 i 43 PON1Q192r, fenotip i sa vrednostima ≤ 13 PON1R192 fenotip. Iz rezultata dobijenih χ 2 testom, moţe se zakljuĉiti da je bilo razlike u raspodeli fenotipova PON1 Q1192R izmeĊu suplementirane i P grupe (χ 2 =3.987; p=0.136) 4.2.3.3. Parametri oksidativnog statusa S obzirom da je broj jedinjenja sa prooksidativnim i antioksidativnim delovanjem veliki, pojedinaĉno merenje njihove koncentracije i aktivnosti ne samo da je teško i komplikovano, već i ne daje pravu sliku o oksidativnom statusu organizma. Zbog toga smo merili i tri sveobuhvatna parametra: TOS, kao marker prooksidativnih procesa, TAS, kao marker sveukupne antioksidativne zaštite u plazmi i PAB, kao meru ravnoteţe izmeĊu njih. Slika 20. TOS pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. ANOVA sa ponavljanjem je pokazala znaĉajan uticaj redovnih treninga na TOS kod mladih fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,001). Post hoc analiza je pokazala znaĉajno smanjenje TOS u Asx i P grupi nakon 45 dana (p<0,001, p<0,01, redom, Bonferoni test) i nakon 90 dana (p<0,01, p<0,001, redom, Bonferoni test) redovnih treninga i suplementacije u odnosu na poĉetak studije. *** *** ** ** 75 Slika 21. TAS pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. Nije uoĉen statistiĉki znaĉajan uticaj redovnih treninga ni suplementacije Asx- om na bazalne vrednosti TAS u obe grupe fudbalera, na osnovu ANOVA testa sa ponavljanjem. Slika 22. PAB pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,001 (***) : znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#) i p<0,001(###): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Redovni treninzi u periodu od 90 dana su imali znaĉajan uticaj na PAB u obe grupe fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,001), što je pokazano ANOVA testom sa ponavljanjem. Post hoc analiza je pokazala znaĉajno smanjenje PAB u Asx grupi nakon 90 dana u poreĊenju sa vrednostima pre i posle 45 dana suplementacije (p<0,001, # *** ### 76 Bonferoni test). PAB je znaĉajno smanjen posle 90 dana u odnosu na 45 dan posmatranog perioda u P grupi (p<0,05, Bonferoni test). Na poĉetku studije uoĉili smo marginalno znaĉajnu razliku u PAB izmeĊu suplementirane i placebo grupe (p=0,080). 4.3.Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije astaksantinom na parametre oksidativnog stresa i antioksidativne zaštite U okviru ovog dela istraţivanja ispitivan je uticaj intenzivnog jednokratnog treninga pre i posle 90 dana suplementacije Asx na vrednosti parametara oksidativnog stresa i anitoksidativne zaštite, kao i parametara oksidativnog statusa mladih elitnih fudbalera. 4.3.1. Parametri oksidativnog stresa Da bismo procenili nivo oksidativnog stresa nakon intenzivnog treninga, kao i njegovu modulaciju pod uticajem Asx, odreĊivali smo koncentraciju TBKRS, AOPP i nivo superoksid anjon radikala u plazmi pre i posle intenzivnog treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije. Dobijene vrednosti smo poredili primenom dvofaktorske ANOVE sa ponavljanjem. 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Astaksantin Placebo μ m o l/ L TBKRS 0 dan pre treninga 0 dan posle treninga 90 dan pre treninga 90 dan posle treninga Slika 23. Koncentracija TBKRS pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ±SEM. 77 Nisu uoĉene znaĉajne promene u nivou TBKRS nakon intenzivnog treninga ni u suplementiranoj ni u placebo grupi. Slika 24. Nivo AOPP pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. Intenzivni treninzi pre i posle 90 dana suplementacije nisu izazvali znaĉajne promene u nivou AOPP ni u jednoj grupi fudbalera. Slika 25. Koncentracija O2•¯ pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (*) i p<0,01 (**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. p<0,01 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. ** * ## 78 Redovni treninzi u periodu od 90 dana dovode do znaĉajnog povećanja nivoa O2•¯ kod mladih fudbalera (glavni uticaj redovnih treninga, p<0,001). Intenzivan trening na poĉetku posmatranog perioda nije izazvao znaĉajne promene u nivou O2•¯. Intenzivan trening nakon 90 dana suplementacije izazvao je znaĉajno povećanje koncentracije O2•¯ samo u placebo grupi (znaĉajan uticaj interakcije akutnog treninga i suplementacije, p<0,05; uticaj akutnog treninga, p<0,01). 4.3.2. Parametri antioksidativne zaštite Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije Asx-om na neenzimske antioksidanse i enzimske antioksidanse je ispitivan odreĊivanjem ukupnog sadrţaja SH grupa i aktivnosti enzima SOD i PON1. Slika 26. Ukupni sadrţaj SH grupa pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,01(**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. Intenzivan trening nije izazvao znaĉajne promene u ukupnom sadrţaju sulfhidrilnih grupa na poĉetku ni na kraju perioda suplementacije kod mladih fudbalera. ** 79 Slika 27. Aktivnost SOD pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0.01(**) i p<0.05(*): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. Intenzivan trening na poĉetku studije izazvao je znaĉajan pad aktivnosti SOD u obe grupe fudbalera, dok na kraju posmatranog perioda nisu uoĉene znaĉajne promene u SOD aktivnosti nakon akutnog treninga (znaĉajan uticaj interakcije redovnih i akutnog treninga , p<0,05; glavni uticaj akutnog treninga, p<0,001). 0 100 200 300 400 500 600 Astaksantin Placebo U /L POazna aktivnost 0 dan pre treninga 0 dan posle treninga 90 dan pre treninga 90 dan posle treninga Slika 28. POazna aktivnost pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. ** ** * ** 80 0 2500 5000 7500 10000 Astaksantin Placebo IU /L DZOazna akivnost 0 dan pre treninga 0 dan posle treninga 90 dan pre treninga 90 dan posle treninga Slika 29. DZOazna aktivnost pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0.01(**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. Pokazan je znaĉajan uticaj interakcije redovnih i jednokratnog treninga (p<0,01), sa povećanjem POazne aktivnosti na poĉetku i smanjenjem na kraju posmatranog perioda. Intenzivan trening nije uslovio znaĉajne promene u DZOazne aktivnosti na poĉetku ni na kraju perioda suplementacije kod mladih fudbalera. Mokraćna kiselina i bilirubin su normalni produkti metaboliĉkih procesa u organizmu, ali kao jedinjenja sa antioksidativnim osobinama daju doprinos ukupnom antioksidativnom kapacitetu plazme. Promene u nivou mokraćne kiseline i bilirubina posle intenzivnog treninga na poĉetku i na kraju posmatranog perioda su prikazane na slikama 30 i 31. ** 81 0 100 200 300 400 Astaksantin Placebo µ m o l/ L Mokraćna kiselina 0 dan pre treninga 0 dan posle treninga 90 dan pre treninga 90 dan posle treninga Slika 30. Koncentracija mokraćne kiseline pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,05(*) i p<0,01(**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. Dvofaktorska ANOVA sa ponavljanjem je pokazala znaĉajan efekat redovnih i jednokratnog treninga na koncentraciju mokraćne kiseline (p<0,001, p<0,01). Akutni trening izaziva znaĉajno povećanje koncentracije mokraćne kiseline u obe grupe fudbalera na poĉetku, ali ne i na kraju posmatranog perioda (znaĉajan uticaj interakcije redovnih i akutnog treninga, p<0,05). Slika 31. Koncentracija bilirubina pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0.01(**) i p<0.001(***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. * ** *** ** ** 82 Uoĉen je znaĉajan uticaj interakcije suplementacije i redovnih treninga (p<0,05), sa niţim vrednostima bilirubina u Asx grupi u odnosu na placebo grupu posle 90 dana suplementacije. Koncentracija bilirubina raste kao posledica intenzivnog treninga u obe grupe fudbalera, ali su ove promene dostigle statistiĉku znaĉajnost samo na poĉetku posmatranog perioda (znaĉajan uticaj interakcije redovnih i akutnog treninga, p<0,05; glavni uticaj akutnog treninga, p<0,001). 4.3.3. Parametri oksidativnog statusa Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije na tri sveobuhvatna parametra: TOS, TAS i PAB je prikazan na slikama 32, 33 i 34. Dobijene vrednosti smo poredili primenom dvofaktorske ANOVE sa ponavljanjem. Slika 32. TOS pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ±SEM. p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. p<0,001 (###) i p<0,01 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. TOS je znaĉajno sniţen posle 90 dana redovnih treninga i suplementacije u odnosu na poĉetak posmatranog perioda u obe grupe fudbalera (glavni uticaj redovnih treninga, p<0,001). Na poĉetku studije intenzivan trening nije izazvao statistiĉki znaĉajne promene u TOS, dok je posle 90 dana suplementacije došlo do znaĉajnog povećanja TOS nakon intenzivnog treninga i u suplementiranoj i u placebo grupi (znaĉajan uticaj interakcije redovnih i akutnog treninga, p<0,05). *** *** ## ### 83 Slika 33. TAS pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ±SEM. p<0,05(*): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. p<0,001 (# # #): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. Uoĉen je znaĉajan glavni efekat intenzivnog treninga (p<0,001) i efekat interakcije suplementacije i treninga (p<005). Naime, vrednosti TAS su znaĉajno smanjene nakon intenzivnog treninga u obe grupe fudbalera pre suplementacije i u placebo grupi posle 90 dana suplementacije. Nisu uoĉene znaĉajne promene u TAS posle intenzivnog treninga u Asx grupi posle 90 dana suplementacije. Slika 34. PAB pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0.05 (*) i p<0.01(**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treninga. Nije uoĉena znaĉajna promena u PAB kao odgovor na intenzivan trening ni na poĉetku ni na kraju posmatranog perioda. ** * * * ### 84 4.4. Uticaj suplementacije astaksantinom na oštećenje mišića kod mladih fudbalera U cilju ispitivanja uticaja suplementacije Asx na oštećenje mišića izazvano redovnim treniranjem u toku 90 dana, poredili smo bazalne vrednosti aktivnosti enzima mišića - AST, CK i LDH izmeĊu suplementirane i placebo grupe primenom ANOVA testa sa ponavljanjem. Slika 35. Aktivnost AST pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (*), p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,01 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Aktivnost AST u plazmi se znaĉajno smanjuje kao posledica redovih treninga u periodu od 90 dana (glavni uticaj treninga, p<0,001). Pored toga, uoĉen je i znaĉajan uticaj suplementacije (p<0,05). Aktivnost AST je znaĉajno niţa u suplementiranoj u odnosu na placebo grupu. *** ## ** * 85 Slika 36. Aktivnost CK pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (*): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Redovni treninzi u periodu od 90 dana imaju znaĉajan uticaj na aktivnost CK u plazmi kod mladih fudbalera (glavni uticaj treninga, p<0,01). Post hoc analiza je pokazala znaĉajno smanjenje aktivnosti CK u Asx grupi nakon 90 dana suplementacije u odnosu na vrednosti pre i posle 45 dana suplementacije. Promene aktivnosti CK u placebo grupi nisu dostigle statistiĉku znaĉajnost. Slika 37. Aktivnost LDH pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0.01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. * # *** # ** 86 Redovni treninzi u periodu od 90 dana doveli su do znaĉajnog smanjenja aktivnosti LDH u plazmi (glavni uticaj treninga, p<0,001). Uoĉen je znaĉajan uticaj suplementacije (p<0,05), s obzirom na niţe aktivnosti LDH u suplementiranoj u odnosu na placebo grupu. U okviru ovog dela istraţivanja ispitivan je i uticaj suplementacije Asx-om na oštećenje mišića izazvano intenzivnim jednokratnim treningom. Aktivnosti enzima mišića - AST, CK i LDH, izmerene pre i posle intenzivnog treninga na poĉetku i na kraju perioda suplementacije, u Asx i placebo grupi smo poredili primenom dvofaktorske ANOVE sa ponavljanjem. Slika 38. Aktivnost AST pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (*) , p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treininga. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. Intenzivan trening izaziva znaĉajno povećanje aktivnosti AST u plazmi kod mladih fudbalera (glavni uticaj jednokratnog treninga, p<0,001). Uoĉen je marginalno znaĉajan uticaj suplementacije (p=0,060) sa niţim vrednostima AST u suplementiranoj u odnosu na placebo grupu. * # *** ** *** 87 Slika 39. Aktivnost CK pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (*) i p<0,01 (**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treininga. p<0,01 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. Intenzivni trening povećava aktivnost CK u plazmi kako na poĉetku, tako i na kraju perioda suplementacije u obe grupe fudbalera (glavni uticaj intenzivnog treninga, p<0,001). Slika 40. Aktivnost LDH pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. p<0,05 (*), p<0,01 (**) i p<0,001 (***): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan pre treininga. p<0,01 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. ** ** ## ## * * ## ## *** ** ** 88 Uoĉeno je znaĉajno povećanje aktivnosti LDH kao posledica intenzivnog treninga u obe grupe fudbalera na poĉetku i na kraju posmatranog perioda (glavni uticaj akutnog treninga, p<0,001). Uoĉen je znaĉajan uticaj suplementacije (p<0,05) sa niţim vrednostima LDH u Asx u odnosu na placebo grupu nakon 90 dana suplementacije. 4.5. Uticaj razliĉitih preventivnih mera na nivo sekretornog IgA u salivi Fiziološki stres uzrokovan dugim i intenzivnim treninzima se ogleda i u prolaznim, ali znaĉajnim promenama u mukoznom imunitetu i smanjenu nivoa sekretornog IgA, što se dovodi u vezu sa povećanom incidencom infekcija gornjih respiratornih puteva kod sportista. U ovom delu istraţivanja smo ispitivali uticaj dve vrste nutritivnih mera–senzorne stimulacije i suplementacije Asx, na nivo sIgA kod sportista. 4.5.1. Uticaj senzorne stimulacije na nivo sekretornog IgA u salivi kod karatista rekreativaca Ispitivanje uticaja senzorne stimulacije na nivoa sIgA je sprovedeno na grupi od 20 ispitanika koji su reakreativno trenirali karate. Uzeti su podaci o starosti, izmerena im je visina, teţina, izraĉunat indeks telesne mase i odreĊena maksimalna potrošnja kiseonika (VO2max). Antropometrijske karakteristike ispitanika su prikazane u tabeli 18. Tabela 18. Antropometrijske karakteristike ispitanika Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ±SEM. Nije uoĉena razlika izmeĊu grupa (Student t test). Napitak Surutka Starost (godine) 22.9±0.9 22.2±0.7 Telesna masa (kg) 73.6±3.8 74.8±2.6 Visina (cm) 180±0.1 183±0.05 VO2max 46±4.1 48.6±8.2 Srĉana frekvenca u miru 63±5 61±4 89 Rezultati hemijske analize teĉne surutke i aromatizovanog napitka od surutke prikazani su u Tabelama 19 i 20. Tabela 19. Hemijski sastav, pH vrednosti i energetska vrednost aromtatizovanog napitka i teĉne surutke Tabela 20. Mineralni sastav aromatizovanog napitka i surutke Srĉana frekvenca i subjektivna procena zamora su mereni tokom svakog treninga u intervalima od 15 minuta. Srednja vrednost srĉane frekvence tokom tri treninga je bila 143±11/min, 139±11/min and 144±11/min. Subjektivna procena zamora je beleţena na svakih 15 minuta u toku svakog treninga i proseĉne vrednosti su iznosile 12,6±1,2, 11,8±1.0 i 12,8±1.5. Napitak Surutka Suva materija (g/100g) 14.48 12.25 Šećeri (g/100g) 13.27 6.85 Proteini (g/100g) 0.64 0.71 Mast (g/100g) 0.3 0.35 Pepeo (g/100g) 0.27 0.21 pH 4.0 4.3 Energetska vrednosti (kcal/100g) 60.01 54.20 Napitak Surutka Kalcijum (g/kg) 0.36 0.29 Natrijum (g/kg) 0.35 0.70 Kalijum (g/kg) 1.00 1.16 Magnezijum (g/kg) 0.10 0.05 Cink (mg/kg) 1.27 0.1 GvoţĊe (mg/kg) 0.51 0.29 Bakar (mg/kg) 0.24 0.05 90 Uticaj senzorne stimulacije na mukozni imunitet je ispitivan merenjem salivarnog protoka, apsolutne koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA u uzorcima salive. Dobijene vrednosti su poreĊene primenom ANOVA testa sa ponavljanjem. Slika 41. Salivarni protok (mL/min) kod karatista pre i posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije surutkom tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. Slika 42. Salivarni protok (mL/min) kod karatista pre i posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije aromatizovanim napitkom na bazi surutke tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM Salivarni protok pre i posle treninga i posle senzorne stimulacije je prikazan na slici 41 i 42. Karate trening je izazvao znaĉajno smanjenje salivarnog protoka u obe grupe ispitanika u toku sva tri dana (glavni uticaj treninga, p<0,001, p<0,01, p<0,05, redom) Senzorna stimulacija aromatizovanim napitkom je dovela do znaĉajnog povećanja salivarnog protoka nakon treninga prvog i drugog dana (p<0,05), dok je 91 aplikacija surutke izazvala povećanje salivarnog protoka samo prvog dana posle treninga (p<0,05). Prvog i drugog dana uoĉen je i znaĉajan uticaj interakcije senzorne stimulacije i grupe (p<0,05, p<0,01, redom), jer je aplikacija aromatizovanog napitka uslovila znaĉajno veće povećanje salivanog protoka posle treninga u odnosu na surutku. Trećeg dana, senzorna stimulacija nakon treninga nije dovela do znaĉajnog povećanja salivarnog protoka ni u jednoj grupi karatista rekreativaca. Slika 43. Apsolutna koncentracije sIgA (μg/mL) kod karatista pre i posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije aromatizovanim napitkom na bazi surutke tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. Slika 44. Apsolutna koncentracija sIgA (µg/mL) kod karatista pre treninga, posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije surutkom tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. Uoĉen je znaĉajan pad koncentracije sIgA u miru tokom nedelje u kojoj su karatisti imali treninge (p<0,05). Karate trening izaziva smanjenje apsolutne koncentracija sIgA obe grupe karatista nakon treninga. Ovaj pad je dostigao statitiĉku 92 znaĉajnost u obe grupe prvog i trećeg dana (p<0,001). Koncentracija sIgA je pala na 24 % bazalne vrednosti prvog dana u grupi 2, što je i najveći pad apsolutne koncentracije posle treninga. Uoĉen je znaĉajan pad apsolutne koncentracije sIgA i posle aplikacije napitka i surutke, prvog i drugog dana ispitivanja (p<0,001, p<0,01, redom). Znaĉajan uticaj interakcije senzorne stimulacije i grupe ukazuje da je pad apsolutne koncetracije bio izraţeniji u grupi koja je stimulisana aromatizovanim napitkom prvog i drugog dana testiranja (p<0,01, p<0,05, redom). Trećeg dana, uoĉeno je blago povećanje koncentracije sIgA u grupi 2, nakon primene aromatozovanog napitka i blago smanjenje u grupi 1, nakon aplikacije surutke. Ove promene nisu dostigle statistiĉku znaĉajnost. Slika 45. Brzina izluĉivanja sIgA (µg/min) kod karatista pre treninga, posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije aromatizovanim napitkom na bazi surutke tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. Slika 46. Brzina izluĉivanja sIgA (µg/min) kod karatista pre treninga, posle treninga, 15 minuta posle i 30 minuta posle senzorne stimulacije surutkom tokom tri dana. Rezultati su prikazani srednja vrednost±SEM. 93 Brzina izluĉivanja sIgA u miru se nije znaĉajno menjala tokom tri merenja ni u jednoj grupi karatista. Pokazano je smanjenje u brzine izluĉivanja sIgA (slika 45 i 46) posle rekreativnog karate treninga. Ove promene su dostigle statistiĉku znaĉajnost posle treninga prvog i trećeg dana (p<0,001). Najizraţeniji pad je uoĉen prvog dana nakon treninga u grupi 2, a primena aromatizovanog napitka u periodu od 30 minuta nakon treninga nije podigla brzinu izluĉivanja do bazalnih vrednosti. Pokazan je i znaĉajan uticaj interakcije senzorne stimulacije i grupe (p<0,01), sa znaĉajnim smanjenjem brzine izluĉivanja sIgA u grupi 2, dok promene u grupi 1 nisu dostigle statistiĉku znaĉajnost. Drugog dana senzorna stimulacija posle treninga nije uslovila znaĉajne promene brzine izluĉivanja sIgA ni u jednoj grupi ispitanika. Trećeg dana senzorna stimulacija dovodi do povećanja brzine izluĉivanja sIgA (p<0,05), ali bez znaĉajne razlike izmedju grupa. Pokazan je znaĉajan uticaj treninga na nivo proteina u salivi. Koncentracije proteina izmerena pre i posle treninga se menjala od 0,73±0,25g/L do 1,54±0,44 g/L prvog dana, od 0,74±0,4 g/L do 1,45±0,50 g/L drugog dana i od 0,75±0,2 g/L do 1,60±0,4 g/L trećeg dana. 4.5.2. Uticaj suplementacije astaksantinom na nivo sekretornog IgA u salivi kod mladih fudbalera U cilju ispitivanja uticaja redovnih treninga i suplementacije astaksantinom na mukozni imunitet mladih fudbalera, poredili smo bazalne vrednosti salivarnog protoka, apsolutne koncentracije sIgA, kao i brzine izluĉivanja sIgA u suplementiranoj i placebo grupi. Dobijene vrednosti su prikazane na slikama 47, 48 i 49. 94 Slika 47. Salivarni protok (mL/min) pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. Slika 48. Apsolutna koncentracija sIgA (μg/mL) pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pozdanosti. p<0,01 (**): znaĉajna razlika u odnosu na 0 dan. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. ** # 95 Slika 49. Brzina izluĉivanja sIgA (μg/min) pre, posle 45 i posle 90 dana suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (#): znaĉajna razlika u odnosu na 45 dan. Izmerene vrednosti ispitivanih parametara su poreĊene primenom ANOVA testa sa ponavljanjem. Redovni treninzi i suplementacija nisu uticali na bazalni salivarni protok kod mladih fudbalera. Pokazan je znaĉajan uticaj interakcije redovnih treninga i suplementacije na koncentraciju sIgA (p<0,05). Naime, uoĉeno je znaĉajno povećanje koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA u Asx grupi posle 90 dana suplementacije u odnosu na vrednosti posle 45 dana, dok promene nivoa sIgA u placebo grupi nisu dostigle statistiĉku znaĉajnost u istom posmatranom periodu. U okviru ovog istraţivanja ispitivan je i uticaj intenzivnog jednokratnog treninga na poĉetku i na kraju perioda suplementacije na mukozni imunitet. Ispitivani parametri: salivarni protok, apsolutna koncentracija i brzina izluĉivanja sIgA su prikazani na slikama 50, 51 i 52. # 96 Slika 50. Salivarni protok (mL/min) pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost±SEM. Slika 51. Apsolutna koncentracija sIgA (μg/mL) pre i posle treninga, na poĉetku i na karaju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pozdanosti. p<0,05 (##): znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. ## ## 97 Slika 52. Brzina izluĉivanja sIgA (μg/min) pre i posle treninga, na poĉetku i na kraju perioda suplementacije u Asx i placebo grupi. Rezultati su prikazani kao geometrijska srednja vrednost i interval pouzdanosti. p<0,05 (#) i p<0,01 (##):: znaĉajna razlika u odnosu na 90 dan pre treninga. Izmerene vrednosti ispitivanih parametara smo poredili primenom dvofakorske ANOVE sa ponavljanjem. Intenzivan trening i suplementacija nisu uticali na salivarni protok kod mladih fudbalera. Intenzivan trening u trajanju od 2 sata uslovljava pad apsolutne koncentracije sIgA u obe grupe mladih fudbalera (glavni uticaj akutnog treninga, p<0,001). Ipak, ove promene su dostigle statistiĉku znaĉajnost na kraju, ali ne i na poĉetku perioda suplementacije (uticaj interakcije redovnih i jednokratnog treninga, p<0,05). Pokazan je i znaĉajan uticaj interakcije suplementacije i redovnih treninga (p<0,05), sa povećanjem koncentracije sIgA u suplementiranoj grupi i bez promena u placebo grupi. Brzina izluĉivanja sIgA se smanjuje kao posledica intenzivnog treninga u obe grupe fudbalera, ali su ove promene dostigle statistiĉku znaĉajnost samo na kraju posmatranog perioda (glavni uticaj akutnog treninga, p<0,001). # ## 98 5. DISKUSIJA Rezultati ovog istraţivanja su pokazali da intenizivni treninzi kod fudbalera uzrokuju povećanu produkciju slobodnih radikala, što dovodi do nastanka oksidativnog stresa i znaĉajnog oštećenja mišićnih ćelija. Pored toga, pokazano je da treninzi i kod fudbalera, ali i kod rekrativaca uzrokuju smanjenje nivoa sekretornog IgA u salivi, ĉime je ugroţen mukozni imunitet sportista. Suplementacija astaksantinom delimiĉno smanjuje povećanu produkciju slobodnih radikala i pruţa znaĉajnu podršku u oĉuvanju antioksidativne zaštite kod mladih fudbalera. Primena astaksantina u toku takmiĉarske sezone je imala povoljan efekat unapreĊenje aktivnosti enzima paraoksonaze 1 i ukupan sadrţaj sulfhidrilnih grupa. Pokazan je i povoljan efekat suplementacije astaksantina na smanjenje oštećenja mišićnih ćelija. Suplementacija astaksantinom je imala povoljan efekat na produkciju sIgA kod mladih fudbalera u periodu intenzivnih treninga tokom sezone. Uzimanje aromatizovanog napitka na bazi surutke moţe biti od koristi tokom dugotrajnih intenzivnih treninga u cilju odrţavanja salivarnog protoka, a na taj naĉin i nivoa sIgA u salivi. 99 5.1. Uticaj dugotrajnog treniranja na oksidativnostresni status mladih fudbalera Od prvog otkrića da se nivo lipidne peroksidacije povećava nakon akutnog aerobnog treninga, ispitivanje povezanosti oksidativnog stresa i fiziĉke aktivnosti je tema velikog broja studija. Na osnovu radova koji su objavljeni, aerobno i anaerobno veţbanje odreĊenog inetenziteta mogu dovesti do povećane produkcije slobodnih radikala, što za posledicu moţe imati oksidativna oštećenja vaţnih biomolekula: lipida, proteina i DNK (Powers SK, 2004). Ipak, povećana produkcija slobodnih radikala u toku treninga predstavlja i neophodan stimulus za indukciju optimalnog adaptivnog odgovora i povećanja aktivnosti antioksidativnih zaštitnih mehanizama. (Fisher- Wellman K, 2009). Ispitivanja uticaja dugogodišnjeg (10 i više godina) treniranja fudbala na parametre oksidativnog stresa su retka. U jednoj studiji je pokazan niţi nivo oksidativnog stresa kod fudbalera u odnosu na ispitanike koji se ne bave fiziĉkom aktivnošću, što je zakljuĉeno na osnovu niţeg bazalnog nivoa MDA (Metin G, 2003). Sa druge strane, brojne studije su pokazale povećanje biomarkera oksidativnog stresa kao posledicu aerobnih i anaerobnih treninga. Mladi rvaĉi imaju znaĉajno viši nivo lipidnih peroksida i viši TOS u poreĊenju sa kontrolnom grupom (Kürkçü R, 2010), dok je kod dţudista pokazan povećan nivo MDA (El Abed K, 2011). Nivo TBKRS je znaĉajno veći kod kajakaša i kanuista u odnosu na pojedince bez fiziĉke aktivnosti (Teixeira VH, 2009). Pokazano je da se kod odbojkašica nivo reaktivnih kiseonikovih metabolita znaĉajno povećava, dok nivo superoksidnog anjona znaĉajno opada sa godinama treniranja (Martinovic J, 2009). U našoj studiji, fudbaleri su imali znaĉajno viši nivo TBKRS u plazmi u odnosu na kontrolnu grupu. Pored toga, uoĉen i viši nivo AOPP, ali ta razlika nije dostigla statistiĉku znaĉajnost. Rezultati dobijeni u ovoj studiji ukazuju da su fudbaleri koji imaju redovne, intenzivne treninge i utakmice, izloţeni većem oksidativnom stresu u odnosu na osobe koje nemaju fiziĉku aktivnost (Tabela 12). SOD je glavni enzim koji neutrališe superoksidni anjon u organizmu. Ovaj enzim ima veoma vaţnu ulogu u antioksidativnoj zaštiti tokom dugotrajnih i intenzivnih treninga (Finud J, 2006). Mladi fudbaleri, ispitivani u ovoj studiji, su imali znaĉajno 100 veću aktivnost SOD u odnosu na kontrolnu grupu, što je u skladu sa predhodnim studijama na fudbalerima (Cazzola R, 2003; Brites FD, 1999). Veća aktivnost SOD je uoĉena i kod karatista (Naghizadeh H, 2009), rukometaša (Djordjevic D, 2011), ragbista (Evelson P, 2002), dţudista (El Abed K, 2011), skakaĉa (Ortenblad N, 1997), košarkaša (Melikoglu MA, 2008). Povećana aktivnost enzimske antioksidativne zaštite spreĉava štetne efekte slobodnih radikala i oksidativnog stresa. Smatra se da promene u redoks statusu uzrokovane redovnim treninzima aktiviraju intracelularne signalne puteve i povećavaju ekspresiju antioksidativnih enzima (Harris DE, 1992). Redovni treninzi povećavaju nivo i neenzimskih antioksidativnih mehanizma zaštite, kao što su ukupni antioksidativni kapacitet, zatim vitamin C, vitamin E ili mokraćna kiselina (Brites FD, 1999; Cazzola R, 2002; Evelson P, 2002). Tioli, ĉija se aktivnost zasniva na prisustvu sulfhidrilnih grupa, su integralni deo neenzimske antioksidativne zaštite i igraju vaţnu ulogu u regulaciji produkcije slobodnih radikala. U našoj studiji, uoĉili smo znaĉajno povećanje ukupnog sadrţaja sulfhidrilnih grupa kod fudbalera, što je znaĉajan doprinos ukupnom povećanju kapaciteta antioksidativnih mehanizama. Naši rezultati su u skladu sa rezultatima studije Martinovic i sar. koji pokazuju znaĉajno povećanje nivoa SH grupa kod odbojkašica sa godinama treniranja (Martinovic J, 2009). Za razliku od mešovih i aerobnih sportova, anaerobni treninzi dovode do smanjenja ukupnog sadrţaja SH grupa, što je pokazano sportista koji treniraju sa opterećenjem, koji su imali dvostruko niţe vrednosti nivoa SH grupa u odnosu na fiziĉki neaktivne pojedince. Smatra se da trening, naroĉito trening sa opterećenjem, smanjuje nivo ukupnih tiola u plazmi, verovatno zbog povlaĉenja tiola u aktivne mišiće (Zembron-Lacny A, 2009). Uticaj redovne fiziĉke aktivnosti na aktivnost enzima PON1 još uvek nije precizno definisan. Pokazano je se aktivnost PON1 povećava kod pojedinaca koji imaju redovnu fiziĉku aktivnost u odnosu na osobe sa povremenom ili bez fiziĉke aktivnosti (Arslan C, 2005). Aktivnost PON1 prema supstratu paraoksonu je veća kod košarkaša u odnosu na sedentarne osobe (Yilmaz N, 2007). Kod odbojkašica dolazi do povećanja aktivnosti PON1 prema paraoksonu, ali ne i prema diazoksonu (Martinovic J, 2009). Jedno od objašnjenja je da redovni treninzi uzrokuju povećanu produkciju reaktivnih kiseonikovih jedinjenja, koji mogu indukovati tranksripciju gena za endogene enzimske antioksidanse, naroĉito PON1 (Sun Y i Oberley LW, 1996). Pored toga, moguće je da je 101 povećana PON1 aktivnost kod fiziĉki aktivnoh osoba posledica smanjenja oksidativnog stresa zbog povećanog kapaciteta antioksidativne zaštite. Ipak, neke studije nisu pokazale povećanje PON1 aktivnosti kod osoba koje se redovni bave sportom (Richter B, 2005; Brites F, 2006). U skladu sa tim, naši rezultati pokazuju da nema razlike u aktivnosti enzima PON 1 izmeĊu sportista i osoba koje nemaju redovnu fiziĉku aktivnost (Tabela 12). TakoĊe je pokazano da se ekspresija PON1 kod pacova ne menja pod uticajem treniranja. Sa druge strane, nivo PON3 se znaĉajno povećava pod uticajem redovnih treninga, što ukazuje da je fiziĉka aktivnost utiĉe na PON3, ali ne i na PON1 (Romani R, 2009). Pored toga, poboljšana aktivnost antioksidativne zaštite nije bila dovoljna da smanji oksidativni stres kome su fudbaleri izloţeni. S obzirom da prekomerna produkcija slobodnih radikala i peroksidacijalipida znaĉajno smanjuju aktivnost PON1 (Aviram, 1999), moguće je da oksidativni status kod fudbalera spreĉava povećanje aktivnosti PON1. Uzimajući u obzir da je PON1 vezan za HDL-C, moguće je da je aktivnost PON1 u korelaciji sa HDL-C. Ipak u ovoj studiji nije pokazana veza izmeĊu nivoa HDL-C i aktivnosti PON1. PON1 je vezan za malu populaciju HDL-C (10%) (James RW i Deakin SP, 2004), pa je malo verovatno da ukupni HDL-C predstavlja dobar biomarker za mali deo HDL-C koji nosi PON1 i za aktivnost PON1. Redovna fiziĉka aktivnost ima povoljan efekat na lipidni profil sportista. Pokazan je manji nivo triglicerida, HOLuk i LDL-C, a viši nivo HDL-C kod sportista u odnosu na osobe koje se ne bave sportom (Nikolaidis MG, 2003; Popovic M, 2010; Brites FD, 1999; Evelson P, 2002). Ipak, naša studija nije pokazala znaĉajne razlike u parametrima lipidnog profila izmeĊu sportista i sedentarnih osoba (Tabela 10), što je u skladu sa nekim ranije objavljenim rezultatima (Cazzola R, 2002; Ghloum K, 2011). Postoji veliko interesovanje za nivo parametara krvne slike kod sportista, s obzirom na ulogu u transportu kiseonika, što je od krucijalnog znaĉaja za sportske performanse. Vrednosti ovih parametara kod sportista se nisu razlikovale u odnosu na osobe koje nisu fiziĉki aktivne. Iako je nekoliko autora pokazalo smanjenje Hb, Hct i broja crvenih krvnih zrnaca kad sportista, drugi smatraju da ove promene nisu uslovljene samo fiziĉkom aktivnošću, veĉ da zavise i od specifiĉnosti sporta (Guglielmini C, 1989; Green HJ, 1991). Rezultati ovog istraţivanja ne pruţaju dokaz da redovno treniranje fudbala negativno utiĉe na parametre krvne slike (Tabela 11). 102 Na osnovu rezultata ovog istraţivanja, moţemo zakljuĉiti da dugogodišnje treniranje fudbala uslovljava povećanje nivoa neenzimskih antioksidanasa i povećanje aktivnosti antioksidativnih enzima. Ipak, i pored toga mladi fudbaleri su, usled redovnih, intenzivnih treninga, izloţeni većem nivou oksidativnog stresa i oksidativnog oštećenja u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe. 5.2. Uticaj treniranja i suplementacije astaksantinom na aktivnost paraoksonaze 1 i nivo oksidativnog stresa kod mladih fudbalera Razumevanje promena u redoks ravnoteţi koje nastaju kao posledica redovnih treninga u fudbalu u toku sezone moţe pruţiti nova saznanja o efektima koje fudbal ima na organizam igraĉa i mogućnostima primene nutritivnih preventivnih mera koje se zasnivaju na suplementaciji antioksidansima. Uticaj redovne fiziĉke aktivnosti na aktivnost enzima PON1 još uvek nije u potpunosti razjašnjen. Neke studije su pokazale da je aktivnost PON1 prema razliĉitim supstratima veća kod osoba koje se bave sportom u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe (Evelson P, 2002; Arslan C, 2005). Kontinuirana produkcija reaktivnih kiseonikovih jedinjenja koja nastaje u toku fiziĉke aktivnosti moţe hipotetiĉki stimulisati transkripciju gena za antioksidativne enzime (Sun Y, 1996). Ipak, nisu sve studije pokazale povećanje aktivnosti PON1 kod fiziĉki aktivnih pojedinaca (Richter B, 2005). Pored toga, aerobno treniranje visokog i umerenog intenziteta u periodu od 8 nedelja nije imalo znaĉajan uticaj na aktivnost PON1 kod zdravih fiziĉki neaktivnih muškaraca (Gharakhanlou R, 2007). Redovni treninzi u periodu od 6 nedelje nisu imali znaĉajan uticaj na aktivnost PON1 kod profesionalnih obojkašica (Martinovic J, 2011). U skladu sa tim, naši rezultati pokazuju da redovni treninzi u periodu od 90 dana ne utiĉu na aktivnosti PON1 prema paraoksonu i diazoksonu. Moguće je da je aktivnost PON1 već dostigla svoj maksimum kao posledica adaptivnog odgovora na treniranje fudala u periodu od 10 godina, kao šo je pokazano kod elitnih odbojkašica (Martinovic J, 2009). Suplementacija sa Asx ispitivana u ovoj studiji imala je pozitivan efekat na povećanje aktivnosti PON1 prema paraoksonu (Slika 17). Pored toga, u Asx grupi pokazano je povećanje aktivnosti PON1 prema diazoksonu (Slika 18). Naši rezultati su 103 u skladu sa predhodno objavljenim rezultatima koje pokazuju da ishrana i antioksidansi mogu imati modulatorni efekat na aktivnost PON1. Jarvik GP i sar. (2002) su pokazali da je unos vitamina C u vezi sa povećanjem aktivnosti PON1. Aviram M i sar. (2004) su uoĉili znaĉajno povećanje aktivnosti PON1 kod pacijenata sa stenozom karotide koji su redovno konzumirali sok od nara, koji je bogat polifenolima. Suplementacija α- tokoferolom je imala povoljan efekat na paraoksonaznu i arilesteraznu aktivnost ovog enzima kod mladih košarkaša (Tsakiris S, 2009). Uzimajući u obzir da aktivnost enzima PON1 moţe biti znaĉajno smanjena pod uticajem slobodnih radikala (Nguyen SD, 2003), moguće je da antioksidativne karakteristike Asx mogu zaštititi PON1 od inaktivacije uzrokovane oksidativnim modifikacijama. PON1 sadrţi 3 ostatka aminokiseline cistein na poloţajima 42, 284 i 353 (Cys- 42, Cys-353 i Cys-284). Cys-42 i Cys-353 su vezane disulfidnom vezom, koja je esencijalna za hidrolaznu aktivnost enzima. Ostatak Cys-284 ima slobodnu sulfhidrilnu grupu, koja je od znaĉaja za esteraznu aktivnost enzima, što ukazuje da je Cys-284 blizu ili u aktivnom centru (Sorenson RC, 1995). Slobodan ostatak Cys-284 je takoĊe neophodan i za protektivnu ulogu enzima protiv oksidacije LDL-holesterola (Aviram M, 1998). Pokazano je da izloţenost PON1 hidroksil radikalima i superoksidnom anjonu znaĉajno smanjuje aktivnost, ali i broj slobodnih sulfhidrilnih grupa (Jaouad L, 2006). Stoga, odreĊeni antioksidansi mogu imati povoljan efekat na aktivnost PON1 (Aviram M, 2004). Povećanje aktivnosti PON1 prema paraoksonu i diazoksonu kod mladih fudbalera uoĉeno nakon suplementacije Asx, moţe biti posledica zaštite sulfihidrilnih grupa od oksidativnih modifikacija u aktivnom centru enzima. Pored toga, kod fudbalera koji su suplementirani Asx uoĉeno je i povećanje ukupnog sadrţaja sulfhidrilnih grupa u plazmi posle 90 dana redovnih treninga i suplementacije, što ukazuje da Asx moţe pruţiti dodatnu zaštitu od oksidativnih modifikacija (Slika 15). Predhodne studije su pokazale da suplementacije antioksidansima moţe komponezovati smanjenje koncentracije ukupnih tiola i GSH, koje nastaje kao posledica intenzivne fiziĉke aktivnosti (Bonina FP, 2005; Naziroglu M, 2010). Veza izmeĊu PON1 i HDL-C je vaţna za odrţavanje normalne aktivnosti enzima. Ipak, PON1 je vezan za malu subpopulaciju HDL ĉestica (10%), ĉime se moţe 104 objasniti nepostojanje korelacije izmeĊu PON1 aktivnosti i nivoa HDL-C u ovom istraţivanju (James RW, 2004). PON1Q192R fenotipovi su odreĊivani metodom dva supstrata (paraoksonazna i diazoksonazna aktivnost). PON1Q192 fenotip karakterišu visoke DZOazne aktivnosti, a PON1R192 fenotip, usled reakcionih uslova niske DZOazne aktivnosti. Ovakav naĉin analize, znaĉi, merenje PON1 aktivnosti prema paraoksonu i diazoksonu a zatim odreĊivanje PON1Q192R fenotipa, Richter i Furlong (Jarvik GP, 2000) su definisali kao odreĊivanje "PON1 statusa" i pokazali da ovakav pristup enzimu PON1 daje mnogo više informacija nego odreĊivanje PON1 genotipa, a takoĊe je i korisno u epidemiološkim studijama koje istraţuju vezu izmeĊu PON1192 polimorfizma i aktivnosti enzima PON1 u razliĉitim bolesima. Dokazane su supstrat-zavisne razlike izmeĊu PON1Q192R izoformi. PON1R192 varijanta ima jaĉe izraţen afinitet prema paraoksonu kao suptratu, dok prema dizaoksonu, ne postoji razlika u afinitetima izmeĊu PON1Q192 i PON1R192izoformi, ali su reakcioni uslovi podešeni tako da smanjuju afinitet R varijante prema ovom supstratu (Mackness B, 2008). Ove razlike u katalitiĉkoj aktivnosti izmeĊu PON1Q192 i PON1R192 izoformi omogućava razlikovanje u tri fenotipa PON1Q192, PON1Q192R i PON1R192. Fenotipovi se razlikuju i prema nivou zaštite od oksidativnih oštećenja LDL i HDL ĉestica, jer PON1Q192 pruţa bolju zaštitu u odnosu na PON1R192. Evaluacijom raspodele PON1Q192R fenotipova kod mladih fudbalera ustanovljeno je da postoji razlika u raspodeli fenotipova izmeĊu suplementirane i placebo grupe (rezultat je na granici znaĉajnosti), što je prikazano na slici 19. U skladu sa tim, na poĉetku studije DZOazna aktivnost i ukupni sadrţaj SH grupa je bio niţi, dok je PAB bio viši u Asx u odnosu na placebo grupu, ali sa marginalno znaĉajnom razlikom. DZOazna aktivnost i sadrţaj SH grupa mogu biti smanjene kao posledica povećanog PAB u Asx grupi. U jednoj novijoj sutidiji uoĉena je jaka povezanost izmeĊu PAB i smanjene DZOazne aktivnosti u toku trudnoće koja je, kao i sport, model za prouĉavanje oksidativnog stresa (Stefanovic A, 2012). Sportisti su, kao i trudnice, zdravi mladi ljudi u fiziološki izmenjenim stanjima, koje karakteriše povećana produkcija slobodnih radikala i veća mogućnost nastanka oksidativnog stresa. Ipak, do kraja studije, nije bilo razlike u ovim parametrima izmeĊu Asx i P grupe. 105 Suplementacija Asx moţe biti znaĉajna u cilju smanjenja PAB i povećanja DZOazne aktivnosti i sadrţaja SH grupa kod sportista koji su podloţniji oksidativnom stresu. Postoje dokazi da redovna fiziĉka aktivnost smanjuje nivo triglicerida, ukupnog i LDL holestorola, dok povećava nivo HDL holesterola. Ove promene u lipidnom profilu sportista su posledica uticaja redovne fiziĉke aktivnosti na enzime koji uĉestvuju u metabolizmu lipoproteina, kao što su lipoproteinska lipaza i lecitin holesterol acil transferaza (Evelson P, 2002). Ipak, u grupi mladih fudbalera uoĉeno je prolazno smanjenje HDL holesterola i povećanje ukupnog i LDL holesterola tokom 90 dana redovnih treninga i suplementacije. Iako je u predhodnim studijama pokazan povoljan efekat suplementacije Asx- om na lipidni status, rezultati našeg istraţivanja ne ukazuju na to (Juan Y, 2011). Ispitanici u našoj studiji su bili mladi, zdravi, aktivni ljudi kod kojih su parametri lipidnog profila u granicama referentnih vrednosti, što moţe biti razlog nedostatka znaĉajnog efekta Asx. SOD je jedan od glavnih enzimskih antioksidanasa koji neutrališe superoksidni anjon radikal. Povećanje aktivnosti SOD odgovara poboljšanoj otpornosti na oksidativni stres (Urso ML, 2003). Do sada objavljene studije pokazuju da sportisti imaju veću aktivnosti SOD u krvi i u mišićima u odnosu na sedenterne osobe (Brites FD, 1999; Cazzola R, 2003; Metin G, 2003) i da se aktivnost SOD povećava kao odgovor na oksidativni stress usled redovnih treninga (Marzatico, 1997). Ipak, neke studije nisu uoĉile promene aktivnosti SOD (Tauler P, 1999; Tian Y, 2010), a neke su pokazale znaĉajno smanjenje aktivnosti SOD neposredno nakon intenzivnog aerobnog treninga (Hubner-Wozniak E, 1994; Hessel E, 2000; Neubauer O, 2008). Redovni treninzi u periodu od 90 dana su uzrokovali smanjenje aktivnosti SOD u miru u ispitivanoj grupi fudbalera. Kao što se moţe videti na slikama 14 i 16, znaĉajno smanjenje aktivnosti SOD je praćeno znaĉajnim povećanjem nivoa O2 •¯, što ukazuje da kontinuirani, intenzivni treninzi i utakmice izlaţu fudbalere povećanom oksidativnom stresu u toku sezone. Modifikacija aktivnosti enzima nakon intenzivnog treninga moţe ići u smeru adaptacije, odnosno povećanja aktivnosti ili smanjenja aktivnosti ako oksidativni stress prevazilazi kapacitete atioksidativne zaštite (Finaud J, 2006). Visoka produkcija slobodnih radikala dovodi do promene u intracelularnom redoks statusu statusu i/ili modifikaciji katalitiĉkih centara antioksidativnih enzima, što 106 zajedno dovodi do inhibicije aktivnosti (Knez WL, 2007). Povoljan efekat Asx na aktivnost enzima SOD je pokazan u nekoliko in vitro studija (Tripathi DN, 2009; Chan K, 2009; Bolin AP, 2010). Naša studija, prva humana studija koja ispituje uticaj suplementacije Asx na aktivnost SOD, nije pokazala znaĉajan uticaj kod mladih fudbalera. Redovni treninzi i utakmice uzrokuju povećanje bazalnog oksidativnog stresa kod fudbalera što je pokazano preko povećaja nivoa MDA (Zoppi CC, 2006; Tauler P, 2008). U našoj studiji, uoĉen je znaĉajan uticaj redovnih treninga na nivo TBKRS u obe grupe fudbalera, što je prikazano na slici 12. Viši nivo TBKRS na poĉetku studije ukazuje na visok fiziološki stres kome su fudbaleri izloţeni. Povećanje nivoa TBKRS u drugoj polovini posmatranog perioda moţe biti posledica treninga većeg intenziteta u ovom perioda, kao i kumulativnog efekta fiziĉke aktivnosti tokom sezone. Rezultati ranijih studija ukazuju da je Asx jedan od najefikasnijih antioksidanasa koji spreĉava lipidnu peroksidaciju i oksidativni stress i u in vitro and in vivo sistemima (Tripathi DN, 2009; Chan K, 2009; Choi HD, 2011). U ovoj studiji uoĉen je znaĉajno niţi nivo TBKRS u suplementiranoj grupi u odnosu na placebo posle 45 dana redovnih treninga i suplementacije. Moguće je da Asx moţe smanjiti peroksidaciju lipida u toku treniranja manjeg intenziteta, u toku prvog dela sezone, ali ne i u periodima intenzivnijih treninga. Pored toga, uticaj Asx moţe biti i modifikovan niskim unosom dijetarnih antioksidanasa tokom studije. U većini do sada izvedenih humanih studija primenjena doza Asx je bila od 6 mg do 12 mg dnevno u periodu od 4 do 8 nedelje. Uzimajući u obzir da su ispitanici u ovoj studiji zdravi, mladi sportisti i da je period trajanja studije bio 12 nedelja, izabrana je doza od 4 mg. Promene nivoa AOPP su sledile promene u nivou TBKRS tokom posmatranog perioda, ali bez statistiĉki znaĉajne razlike. I predhodne studije nisu pokazale znaĉajne oksidativne promene na proteinima tokom tri meseca redovnih treninga (Zoppi CC, 2006; Tauler P, 2008). AOPP je pouzdan biomarker oksidativnih promena na proteinima nastalih usled dugotrajnog delovanja oksidativnog stresa, kao što je duţi period intenzivnih treninga. (Neubauer O, 2008). Moguće je da primenjen program treninga nije dovoljno intenzivan i/ili dug da bi uzrokovao znaĉajnu oksidaciju proteina. Pored toga, na nivo AOPP nije uticala ni suplementacija Asx-om. Grupa mladih fudbalera je imala niţi nivo AOPP u poreĊenju sa vrednostima prijavljenim u 107 drugim studijama (Martinovic J, 2009; Pialoux V, 2009), pa je moguće da su endogeni antioksidativni mehanizmi dovoljni da spreĉe znaĉajnje promene u nivou AOPP tokom posmatranog perioda. Visoke vrednosti TOS, ĉije su glavne komponente vodonik peroksid i lipidni peroksidi, i PAB, koji odreĊuje prooksidativno opterećenje i antioksidativni kapacitet u jednom testu, na poĉetku studije ukazuju da fudbal moţe znaĉajno da poveća produkciju reaktivnih kiseonikovih jedinjenja i izazove oksidativni stres (Slika 20 i 22). Ipak, redovni treninzi dovode do smanjenja produkcije slobodnih radikala, što je verovatno posledica povećanja aktivnosti endogenih antioksidativnih mehanizama zaštite. Nije uoĉena znaĉajna razlika izmeĊu suplementirane i P grupe, što ukazuje da adaptacija endogenih zaštitinih mehanizama obezbeĊuje znaĉajniju zaštitu u odnosu na egzogene antioksidanse. Ispitivanje promena u hematološkim parametrima privlaĉi veliku paţnju zbog izuzetnog uticaja na fiziĉke performanse sportiste. Rezultati naše studije, prikazani u tabeli 16, pokazuju smanjenje broja eritrocita, nivo hemoglobina, hematokrita, MCV i ukupnih proteina seruma u posmatranom periodu, dok se nivo bilirubina povećava tokom 90 dana redovnih treninga. Rezultati ranijih studija takoĊe pokazuju smanjenje broja eritrocita, Hb i Hct kod sportista naroĉito sportova izdrţljivosti, a posledica su povećanja zapremine plazme. Povećanje zapremine plazme je nastaje zbog zadrţavanja teĉnosti i moţe povećati kapacitet veţbanja usled povećanja udarnog volumena i smanjenja viskoziteta krvi (Schmidt W, 1989). Smanjenje Hb i Hct i povećanje koncentracije bilirubina moţe da bude i posledica hemolize eritrocita (Eichner ER, 1985). Iako su opisane promene dostigle statistiĉku znaĉajnost srednja vrednost ovih parametara se i dalje nalaze u opsegu referentnih vrednosti. Nivo gvoţĊa i naroĉito nivo feritina mogu biti sniţeni kod sportista zbog brţeg metabolizma gvoţĊa, povećane sinteze nosećih proteina gvoţĊa, zatim poremećaja u intestinalnoj apsorpciji i povećanog gubitka preko znoja, gastrointestinalnog trakta i bubrega (Schumacher YO, 2001). Ipak, u našoj grupi sportista nivo gvoţĊa je ostao nepromenjen tokom redovnih treninga, dok se nivo feritina povećava. Povećana sinteza feritina moţe biti odgovor na povećanje oksidativnog stresa usled intenzivnih treninga kod sportista (Orino K, 2001). 108 Naporan program treniranja u toku sezone povezan je sa povećanom produkcijom slobodnih radikala i oksidativnim stresom kod mladih fudbalera. Ipak, uoĉeno smanjenje oksidativnog statusa (prikazano kroz TOS i PAB) verovatno je posledica adaptivnog odgovora na intenzivne treninge. Suplementacija Asx ima povoljan efekat na unapreĊenje aktivnosti enzima PON1 i ukupan nivo SH grupa kod mladih fudbalera. Suplementacija moţe biti od posebnog interesa za sportiste koji su podloţniji oksidativnom stresu kao dodatna podrška endogenim enzimskim i ne- enzimskim zaštitnim sistemima. 5.3. Uticaj intenzivnog treninga i suplementacije astaksantinom na oksidativnostresni status mladih fudbalera Većina studija je pokazala znaĉajno povećanje produkcije ROS i smanjenje efikasnosti antioksidativnih sistema u tkivima i krvi profesionalnih sportista nakon intenzivnog i dugotrajnog treninga (Alessio HM, 1993; Paker L, 1997). Iako, povećana produkcija ROS kao posledica intenzivne fiziĉke aktivnosti predstavlja neophodan stimulus za adaptivni odgovor i povećanje aktivnosti antioksidativne zaštite, svakako moţe da uzrokuje oksidativni stres i fiziološka oštećenja (Bloomer RJ, 2007). Iz tog razloga, suplementacija antioksidansima u periodima intenzivnih treninga i takmiĉenja, kao i u sluĉaju nedovoljnog unosa antioksidanasa putem hrane, moţe imati povoljan efekat na smanjenje oksidativnog stresa kod sportista. Intenzivni trening utiĉe na nivo neenzimskih antioksidanasa. Vrlo ĉesto se uoĉava povećanje totalnog antioksidativnog kapaciteta (TAC) kao odgovor na oksidativni stress tokom treninga (Neubauer O, 2008; Ascensão A, 2008). Povećanje TAC je verovatno posledica mobilizacije vitamina E i C iz rezervi u cilju borbe protiv slobodnih radikala (Finaud J, 2006) ili zbog povećanja produkcije mokraćne kiseline zbog aktivacije ksantin oksidaze tokom treninga (Teixeira VH, 2009; Ascensão A, 2008). Ipak, antioksidativni kapacitet moţe biti privremeno smanjen tokom ili neposredno posle treninga (Watson TA, 2005), nakon ĉega se povećava tokom perioda oporavka (Tsakiris S, 2009). U ovoj studiji, trening je uzrokovao znaĉajno smanjenje TAS kod fudbalera u placebo grupi i na poĉetku i na kraju posmatranog perioda, uprkos povećanju koncentracije mokraćne kiseline u plazmi. Sliĉne promene su uoĉene u Asx 109 grupi pre suplementacije, što ukazuje da se antioksidansi koji se nalaze u plazmi odmah koriste za neutralizaciju povećane produkcije slobodnih radikala (Slika 32). Watson i sar. (2005) su uoĉili da ishrana siromašna antioksidansima u periodu od 15 dana nije znaĉajno uticala na TAC, iako je TAC bio niţi kod ispitanika sa niţim unosom dijetarnih antioksidanasa u poreĊenju sa sportistima koji su imali ishranu bogatu antioksidansima. Nutritivna analiza je pokazala da fudbaleri u ovoj studiji imaju ishranu koja ne zadovoljava RDA vrednosti za vitamin A i E u periodu od najmanje 3 meseca. Moguće je da endogeni antioksidansi nisu dovoljni da kompenzuju nizak dijetarni unos antioksidanasa i spreĉe znaĉajno smanjenje TAS tokom intenzivnog treninga. Iako Asx suplementacija nije uticala na TAS nivo u miru, kao i u drugim studijama (Margaritis I, 2003; Teixeira VH, 2009), moguće je svojim antioksidativnim delovanjem spreĉava znaĉajnu potrošnju rastvornih antioksidansa u plazmi tokom intenzivnog treninga. Mokraćna kiselina je snaţan antioksidans, jer kompleksira prooksidativne metale - gvoţĊe i bakar, ali moţe i direktno da reaguje sa ROS. Tokom veţbanja visokog intenziteta i uslovima ishemije, purinski nukleotidni sistem je vrlo aktivan i uslovljava povećanu sintezu hipoksantina u mišićima i plazmi. Hipoksantin se posredstvom XO konvertuje u mokraćnu kiselinu uz nastanak superoksidnog anjona. U našoj studiji, nivo mokraćne kiseline kod mladih fudbalera, raste posle intenzivnog treninga na poĉetku studija, što je u skladu sa drugim studijama (Texeira VH, 2009; Asensao A, 2008). Stoga je verovatno aktivacija ksantin oksidaze, barem delimiĉno, odgovorna za oksidativni stres i oštećenja tokom intenzivnih treninga kod fudbalera. Ipak, nakon tri meseca redovnih treninga, nivo mokraćne kiseline ostaje nepromenjen posle intenzivnog treninga fudbalera. Moguće je da se aktivnost XO menja kao posledica adaptivnog odgovora na intenzivnu fiziĉku aktivnost u periodu od 3 meseca. Već je dokazano da intenzivna fiziĉka aktivnost dovodi do povećanja nivoa bilirubina (Kratz A, 2002; Wu HJ, 2004). Pored toga što bilirubin ima snaţan antioksidativni potencijal, povećan nivo bilirubina je posledica hemolize. Intenzivan trening na poĉetku posmatranog perioda kod fudbalera izaziva znaĉajno oštećenje eritrocita i povećanje nivoa bilirubina u krvi, dok se na kraju nivo bilirubina se ne menja znaĉajno nakon intenzivnog treninga ni u jednoj grupi fudbalera. Pored toga, niţi nivo bilirubina u suplementiranoj grupi fudbalera posle 90 dana je verovatno posledica protektivnog dejstva Asx na membranu eritrocita i prevenciju hemolize. 110 Veliki broj studija je pokazao da fiziĉka aktivnost submaksimalnog i maksimalnog intenziteta uzrokuju peroksidaciju lipida (Silva LA, 2009; Mastaloudis A Morrow JD, 2004; McAnulty SR, 2005). I fudbalska utakmica znaĉajno povećava nivo TBKRS (Fatouros IG, 2010), nivo MDA (Tauler P, 2008) i nivo hidroperoksida u serumu (Kingsley MI, 2005). Pored toga, naši rezultati ukazuju da redovni treninzi uzrokuju povećanje bazalnog nivoa TBKRS u grupi fudbalera u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe. Ipak, nismo uoĉili znaĉajan uticaj intenzivnog treninga ni suplementacije na nivo TBKRS ni na poĉetku ni na kraju posmatranog perioda (Slika 23). Moguć razlog za nedostatak promene nivoa TBKRS kod fudbalera jeste uzimanje jednog uzroka krvi, nakon treninga. Promene nivoa razliĉitih parametara oksidativnog stresa pokazuju specifiĉan vremenski tok. TBKRS nivo ostaje nepromenjen u ranom periodu opravka, 2-4h nakon fiziĉke aktivnosti, dok se njegova koncentracija povećava u kasnijem periodu oporavka (Tian Y, 2010). Nisu zapaţene znaĉajne promene u nivou AOPP u našoj grupi fudbalera nakon intenzivnog treninga, što je u skladu sa drugim studijama koje nisu detektovale povećanje oksidacije proteina nakon treninga ili fudbalskog meĉa (Zoppi CC, 2006; Tauler P, 2008). Nakon 90 dana redovnih treninga i suplementacije, dve grupe fudbalera su razliĉito reagovale na intenzivan trening. Naime, pokazano je znaĉajno povećanje nivoa O2 • ¯ samo u placebo grupi, dok se produkcija O2 • ¯ tokom treninga u suplementiranoj grupi nije menjala, što ukazuje da Asx, moţe barem delom da smanji povećanu produkciju slobodnih radikala tokom i nakon intenzivnih treninga (Slika 25). Efekat smanjenja produkcije O2 • ¯ je do sada pokazan samo u in vitro studijama (Liu X, 2009; Bolin AP, 2010). Rezultati ove studije ukazuju da je intenzivni fudbalski trening povezan sa povećanom produkcijom slobodnih radikala i oksidativnim stresom, koji mogu smanjiti kapacitet antioksidativne zaštite Suplementacija Asx moţe delimiĉno spreĉiti povećanu produkciju slobodnih radikala i trošenje neenzimske antioksidativne zaštite kod mladih fudbalera. Uzimajući u obzir modifikaciju antioksidativnih zaštitinih mehanizama pod uticajem intenzivnih fudbalskih treninga i nedovoljan unos dijetarnih antioksidanasa, suplementacija Asx moţe povoljno uticati na antioksidativni odbrambeni sistem kod fudbalera u toku sezone. 111 5.4. Uticaj suplementacije astaksantinom na oštećenje mišića kod mladih fudbalera U ovom delu istraţivanja ispitivali smo da li primena Asx moţe spreĉiti ili smanjiti oštećenja mišića u toku sezone kod mladih fudbalera u realnom okruţenju, dok prate svoj uobiĉajeni naĉin ishrane, program treniranja i takmiĉenja Smatra se da aktivnost mišićnih enzima CK i LDH u serumu odraţava promene u normalnoj strukturi membrane mišićnih ćelija, koje nastaju kao posledica oštećenja mišića i ĉine je permeabilnom za ove molekule. U tom smislu, povećane aktivnosti enzima CK i LDH u serumu smatraju se indirektnim markerom oštećenja mišićnih vlakana (Bloomer RJ, 2007). Pokazano je da je aktivnost AST je znaĉajno povećana odmah nakon intenzivnog veţbanja i ostaje povišena i posle 24 h. Iz tog razloga, kod sportista povećane vrednosti AST treba razmatrati zajedno sa CK i LDH (Lippi G, 2008). U našoj studiji aktivnost mišićnih enzima AST, CK i LDH su znaĉajno povišene iznad referentnih vrednosti tokom posmatranog perioda, što se moţe videti na slikama 35,36 i 37. Intenzivan trening dovodi do znaĉajnog povećanja aktivnost enzima u serumu i na poĉetku i na kraju trajanja studije, što ukazuje na izuzetno visoke fiziološke zahteve fudbala i na znaĉajno oštećenje mišića nakon svakog treninga. Ipak, tokom 90 dana redovnih treninga uoĉeno je znaĉajno smanjenje bazalnih aktivnosti mišićnih enzima AST, CK i LDH u serumu u obe grupe fudbalera. Smanjenje vrednosti ovih indirektnih parametara je deo adaptivnog odgovora na intenzivnu fiziĉku aktivnost tokom 90 dana. Mišićno tkivo sportista postaje jaĉe i izdrţljivije nakon redovnih treninga, i mišići postaju otporniji na oštećenja. Ovakav adaptivni odgovor na dugotrajni trening je pokazan i u drugim studijama (Razmjou S, 2010; Miura M, 2005). Upotreba antioksidanasa u cilju smanjenja oštećenja mišića nije imala potpun uspeh. Neke studije nisu pokazale povoljan efekat primene antioksidativnih vitamina i cilju smanjenja oštećenja mišića (Bloomer RJ i Falvo MJ, 2007; Texeira VH, 2009). Ipak, rezultati nekih istraţivanja pokazuju da suplementacija antioksidansima moţe smanjiti nivo lipidne peroksidacije membrane mišićnih ćelija i na taj naĉin spreĉiti oštećenja (Schroder H, 2001; Rokitski 1994; Tsakiris S, 2009; Silva LA, 2009). 112 Ako uzmemo u obzir sve procese koji su povezani sa znacima i simptomima povrede mišića tokom treninga, neki odreĊeni antioksidans ili njihova kombinacija verovatno ne moţe potpuno eliminisati oštećenje mišića (Bloomer RJ, 2007). To i nije cilj, jer oštećenje mišića posredovano slobodnim radikalima moţe uzrokovati smanjenje kontraktilne funkcije mišića što moţe biti jedan od protektivnih mehanizama da se ograniĉi i spreĉi dalje oštećenje mišića (Teixeira VH, 2009). Nivo aktivnosti mišićnih enzima je niţi u suplementiranoj grupi posle 90 dana redovnih treninga i suplementacije, što ukazuje da primena Asx moţe smanjiti oštećenje mišića do odreĊenog stepena. Naši rezultati su u skladu sa rezultatima do sada objavljenih studija koje se odnose na Asx suplementaciju i oštećenje mišićA kod . Aoi i sar. su pokazali da Asx smanjuje oštećenje skeletnih i srĉanog mišića uzrokovano intenzivnim veţbanjem kod miševa, ali i infiltraciju neutrofila koji uzrokuju dodatna oštećenja (Aoi W, 2003). U eksperimantu Ikeuchi i sar. povećanje CK nakon treninga je inhibirano suplementacijom sa Asx (Ikeuchi M, 2006). Niţe aktivnosti enzima mišića AST, CK i LDH u serumu fudbalera koji su suplementirani Asx ukazuju da Asx moţe stabilisati mišićnu membranu i na taj naĉin smanjiti oštećenje mišićnih ćelija Ipak, procena povrede mišića samo na osnovu merenja aktivnosti enzima u serumu nije dovoljna. Pored ovih, postoje i drugi parametri oštećenja mišića koje bi trebalo ispitati zajedno sa enzimima, kao što su mišićna snaga, mišićne performanse i oštećenje citoskeleta (Bloomer RJ, 2007). 5.5. Uticaj razliĉitih nutritivnih mera na nivo sekretornog IgA u salivi Mukozni imunitet gornjih respiratornih puteva predstavlja prvu liniju odbrane od patogena, sa glavnim efektorom sekretornim IgA (Brandtzaeg P, 1985). Regulacija sinteze i izluĉivanja sIgA ne zavisi samo od predhodne stimulacije antigenima, već je pod snaţnim uticajem neuroendokrinog sistema. Tako da promene u neuroendokrinom sistemu koje izazivaju stres, fiziĉka aktivnost, trudnoća, menstrualni ciklus, lekovi, mogu uticati na nivo sekretornog IgA (Teeuw W, 2004). Većina ispitivanja pokazuju smanjenje nivoa sIgA u salivi nakon fiziĉke aktivnosti visokog intenziteta kod elitnih sportista, dok umerena fiziĉka aktivnost kod sportista rekreativaca ne dovodi do znaĉajnih promena u nivou sIgA u salivi (Gleeson 113 M, 2000). Iz tog razloga, u okviru ovog istraţivanja, odreĊivali smo uticaj dve vrste nutritivnih mera - senzorne stimulacije i suplementacije Asx mukozni imunitet sportista. 5.5.1. Uticaj senzorne stimulacije na nivo sekretornog IgA u salivi kod karatista rekreativaca Rezultati naše studije pokazuju znaĉajno smanjenje salivarnog protoka odmah posle rekreativnog treninga u trajanju od 1 sata, što je u skladu sa rezultatima predhodno objavljenih studija (Dimitriou L, 2002; Laing SJ, 2005; Palmer FM, 2003). Najveće smanjenje salivarnog protoka uoĉava se posle najintenzivnijeg treninga (Mackinnon LT i Ginn E, 1993). Povećanje aktivnosti simpatiĉkog nervnog sistema (SNS) moţe objasniti smanjenje salivarnog protoka nakon treninga usled vazokonstrikcije krvnih sudova pljuvaĉnih ţlezda što ograniĉava dostupnost vode za proizvodnju salive (Chicharro JL, 1998). Laing SJ i sar. su pokazali da produţeno veţbanje sa unosom dovoljne koliĉine teĉnosti spreĉava smanjenje salivrnog protoka. S obzirom da ispitanici nisu uzimali vodu tokom i 30 minuta posle treninga, gubitak teĉnosti objašnjava smanjenje nestimulisanog salivarnog protoka nakon treninga. Smanjenje apsolutne koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA posle karate treninga pokazano u ovoj studiji je u skladu sa rezultatima drugih istraţivanja (Gleeson M, 2005; Krzywkowski K, 2001; Laing SJ, 2005). Nivo sIgA se smanjuje tokom i posle ultramaratona (Palmer FM, 2003). Krzywkowski K i sar. su uoĉili smanjenje nivoa sIgA posle 2 h veţbanja na 75% VO2max (Krywkowski K, 2001). Igranje tenisa u periodu od 1 sata takoĊe znaĉajno smanjuje brzinu izluĉivanja sIgA (Novas AM, 2003). Ipak, nisu sve studije pokazale smanjenje koncentracije sIgA (Dimitriou L, 2002; Laing SJ, 2005; Tiollier E, 2005). Sakupljanje salive se razlikuje izmeĊu studija (nestimulisana, stimulisana, stimulisana parotidna saliva, mešovita saliva), što oteţava poreĊenje rezultata. Promene u nivou sIgA zavisi i od duţine i intenziteta treninga (Palmer FM, 2003). Pored toga, koncentracija sIgA u miru direktno je povezana sa treningom od predhodnog dana odnosno nedelje (Novas AM, 2003). To je posledica ĉinjenice da uticaj intenzivnog treninga na koncentraciju sIgA traje odreĊeno vreme (Mackinnon LT, 1987). Smanjenje apsolutne koncentracije (Slike 43 i 44) i brzine izluĉivanja sIgA (Slike 45 i 46) u našoj studiji je dostiglo statistiĉku znaĉajnost prvog-D1 i trećeg dana- 114 D3, ali ne i drugog dana-D2. Tada je zabeleţena najniţa ocena subjektivne procene zamora, što ukazuje da intenzitet treninga direktno utiĉe na sekreciju sIgA. Neke studije us pokazale da treninzi umerenog intenziteta i u trajanja ne utiĉu na nivo sIgA (Tomasi TB, 1992). Rezultati ove studije pokazuju da reakretivni karate trening izaziva smanjenje brzine izluĉivanja sIgA, koje traje najmanje pola sata nakon treninga. Stoga, nakon treninga sportisti mogu biti podloţniji infekcijama gronjih resporatornih puteva. Koncentracija ukupnih proteina u salivi karatista je znaĉajno povećana nakon svakog treninga. S obzirom da fiziĉka aktivnosti povećava aktivnost SNS, povećanja koncentracije proteina moţe biti posledica aktivnosti beta simpatiĉkog sistema u pljuvaĉnom ţlezdama (Sari-Sarraf V, 2007). Sa druge strane, koncentracija sIgA je smanjena nakon treninga, što ukazuje na specifiĉno smanjenje sinteze i/ili sekrecije sIgA u toku i posle fiziĉke aktivnosti. Ispitivanje uloge α i β-adrenergiĉkih puteva na mukozni imunitet pod uticajem razliĉitih induktora stresa (submaksimalna fiziĉka aktivnost, aritmetiĉki zadaci), su pokazala da je smanjenje koncentracije sIgA posredovano α-adrenergiĉkim putevima (Tiollier E, 2005). Arome su mešavine isparljivih molekula koje mogu da se eksprahuju iz hrane ili mogu biti sintetisane. Pored isparljivih, arome sadrţe i neisparljive komponente, kao što su aminokiseline i soli koje izazivaju somatosenzornu stimulaciju (Schiffman SS, 2000). Schiffman SS i Warwick ZS su pokazali da dodavanja aroma u hranu kod starijih osoba dovodi do poboljšanja u imunom sistemu, povećanja nivoa B i T limfocita, a da su ova povećanja najverovatnije posledica senzorne stimulacije, a ne unosa hrane (Schiffman SS, 1993). Schiffman SS i Miletić IĐ su pokazali da senzorna stimulacija moţe da poveća brzinu izluĉivanja sIgA i tako poveća aktivnost mukoznog imuniteta (Schiffman SS i Miletić IĐ, 1999). Aplikacije teĉne surutke i aromatizovanog napitka na bazi surutke uzrokovalo je refleksnu sekreciju salive. Nakon senzorne stimulacije u obe grupe je povećan salivarni protok (Slike 41 i 42). Pored toga, aplikacija aromatizovanog napitka uslovila je znaĉajno veće povećanje salivarnog protoka posle treninga u odnosu na surutku. Refleksna sekrecija salive na senzornu stimulaciju ĉula mirisa i ukusa je deo neuroanatomske povezanosti izmeĊu salivarnog jedra i tractus solitarius-a u produţenoj moţdini (Schiffman SS, 1999). Kao posledica povećanog salivarnog protoka, smanjena je apsolutna koncentracija sIgA nakon senzorne stimulacije napitkom i surutkom. Pored 115 toga, aplikacija surutke i aromatizovanog napitka nije imala znaĉajan uticaj brzinu izluĉivanja sIgA. Treninzi dovode do smanjenja salivarnog protoka, apsolutne koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA, pri ĉemu stepen ovih promena reflektuje intenzitet, trajanje u uĉestalost treninga (Tiollier E, 2005). Uzimanje aromatizovanog napitka na bazi surutke moţe biti od koristi tokom dugotrajnih intenzivnih treninga u cilju odrţavanja salivarnog protoka, a na taj naĉin i koliĉine sIgA. S obzirom na smanjenje efikasnosti mukoznog imuniteta odmah nakon treninga trebalo bi maksimalno smanjiti kontakt sa velikim brojem ljudi da bi se spreĉio kontakt sa patogenima koji izazivaju infekcije gronjih respiratornih puteva. 5.5.2. Uticaj suplementacije astaksantinom na mukozni imunitet mladih fudbalera U ovom delu istraţivanja je, po prvi put, ispitivan uticaj suplementacije sa Asx na nivo sIgA u salivi u miru, kao i posle treninga kod mladih fudbalera. Prednost ove studije je postojanje kontrolne placebo grupe i izvoĊenje studije u toku sezone, dok su sportisti imali uobiĉajeni naĉin ishrane i program treninga. Treninzi umerenog i visokog intenziteta mogu da utiĉu na nivo sIgA u mukozni površinama. Većina studija je pokazala znaĉajno smanjenje sIgA nakon treniranja razliĉitog intenziteta i to kod plivanja (Gleeson M, 1999), intervalnog veţbanja (Mackinnon LT i Jenkins DG, 1993), kajaka (Mackinnon LT i Ginn E, 1993), trĉanja (Nieman DC, 2002a), nakon „Wingate‖ testa (test za merenje maksimalne snage i anaerobnog kapaciteta) (Fahlman MM, 2001). Povećanje do nivoa pre treninga se obiĉno dešava u toku 24 h, ali nakon treninga ekstremnog intenziteta nivo sIgA moţe ostati sniţen i duţi period. Sa druge strane, neke studije nisu pokazale promene (Koch, AJ, 2007), a neke ĉak i povećanje nivoa sIgA u salivi nakon akutnog treninga (Tharp, GD,1991). Postoji relativno malo podataka o mukoznom imunitetu koji su dobijeni od fudbalera u njihovom realnom okruţenju, naroĉito kada su u pitanju profesionalci, uprkos ĉinjenici da je uticaj treninga na promene u sIgA u salivi od velikog znaĉaja za sportsku medicinu. Jedna studija je pokazala da uĉešće u fudbalskoj utakmici koja traje 70 minuta ne utiĉe znaĉajno na nivo sIgA kod profesionalnih fudbalera (Moreira A, 2009). U našoj studiji, uoĉili smo smanjenje apsolutne koncentracije i brzine izluĉivanja 116 sIgA posle intenzivnog treninga kod obe grupe mladih fudbalera. Ipak, ove promene su dostigle statistiĉku znaĉajnost samo na kraju posmatranog perioda, ali ne i na poĉetku. Ovi rezultati pokazuju da redovni treninzi kod fudbalera mogu imati kumulativan supresivni efekat na mukozni imunitet, uzrokujući znaĉajan pad nivoa sIgA nakon treninga na kraju posmatranog perioda. Produkcija slobodnih radikala i antioksidativni status moţe biti u vezi sa promenama u imunom sistemu nakon treninga, kao što su ćelijska adhezija, inflamacija i proliferacija limfocita. Povećana produkcija ROS tokom i nakon fiziĉke aktivnosti moţe inhibirati imuni odgovor. ROS suprimira lokomotornu i baktericidnu aktivnost neutrofila, citotoksiĉnu aktivnost NK ćelija, smanjuje proliferaciju T i B limfocita i stimuliše apoptozu limfocita (Gleeson M, 2006). Nekoliko antioksidansa je ispitivano kao preventivna mera protiv promena u mukoznom imunitetu uzrokovanim fiziĉkom aktivnošću. Suplementacija sa 1500 mg/d vitamin C u periodu od 7 dana pre ultramaratona nije spreĉila promene u koncentraciji sekretornim nivoa sIgA maratonaca nakon trke (Palmer FM, 2003). Koncentracija sIgA triatlonaca je znaĉajno smanjena odmah nakon trke u poreĊenju sa vrednostima pre trke, uprkos suplementaciji sa vitaminom E (Nieman DC, 2004). Suplementacija kvercetinom u periodu od 3 nedelje nije uticala na promene u nekoliko parametara funkcije imunog sistema, ukljuĉujući nivo sIgA nakon trke od 160 km (Nieman DC, 2007). Promene koncentracije sIgA zdravih Finaca nisu uoĉene posle suplementacije β- karotenom u periodu od 60 dana (Lumikara M, 1988). U našoj studiji, suplementacija Asx nije spreĉila smanjenje koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA uzrokovane intenzivnim treningom (Slike 50 i 51). Ipak, suplementacija je uticala na znaĉajno povećanje ovih parametara u miru, kao što je prikazano ma slikama 48 i 49. Opisan povoljan efekat Asx moţe biti posledica antioksidativne aktivnosti. Okai i sar. (1996) su pokazali da Asx ima najveći imunomodulatorni efekat u poreĊenju sa drugim karotenoidima, β karotenom i kantaksantinom. Ovakav imunomodulatorni uticaj karotenoida odgovara njihovoj antioksidatinoj aktivnosti. I zaista, pokazano je da Asx najefikasnije spreĉava peroksidaciju lipida i oksidativni stres in vitro i in vivo sistemima. Rezultati našeg ispitivanja su pokazali da suplementacija astaksantinom delimiĉno spreĉava povećanu produkciju slobodnih radikala i smanjenje kapaciteta neenzimske antioksidativne zaštite 117 kod mladih fudbalera. Smanjenje oksidativnih oštećenja moţe biti posredovano antioksidativnim delovanjem Asx, što ima povoljan uticaj na mukozni imunitet. Predhodne studije su pokazale modulatorni efekat Asx na odreĊene aspekte imunog odgovora, koji podrţavaju rezultate ovog istraţivanja i povoljan efekat Asx na nivu sIgA u salivi. Primena Asx je dovela do poboljšanja reakcije preosteljivosti odloţenog tipa kod maĉaka, pasa i ljudi (Chew BP, 2011; Park JS, 2011; Park JS, 2010). Uoĉeno je i povećanje citotoksiĉne aktivnosti NK ćelija (Chew BP, 2011; Park JS, 2010). U jednoj humanoj studiji pokazano je povećanje broja T i B limfocita i povećanje mitogen indukovane proliferacije limfocita nakon suplementacije Asx u preiodu od 8 nedelja kod zdravih ţena (Park JS, 2010). Pored uticaja Asx na ćelijski imunitet, predhodne studije pokazuju stimulaciju humoralnog imuniteta pod uticajem suplementacije Asx: povećanje produkcije antitela u slezini miševa (Jyonouchi H, 1993), delimiĉno poboljšan humoralni imuni odgovor kod starih miševa (Jyonouchi H, 1994), povećanje in vitro produkcije imunoglobulina na T- zavisni stimulus (Jyonouchi H, 1995) i povećavanje in vitro produkcije poliklonskih IgG i IgM antitela u ćelijama slezine (Okai Y, 1996). Primena Asx povećava produkciju IL-1α u adherentnim ćelijama. Adherentne ćelije imaju vaţnu ulogu u povećanju produkcije antitela posredstvom citokina kao što je IL-1α, koji je najvaţniji regulator diferecijacije B limfocita (Giri, 1984). Moguće je da povećano oslobaĊanje IL- 1α pod uticajem Asx doprinelo povećanoj produkciji antitela. Intenzivan trening dovodi do brzog i izrazitog povećanja broja neutrofila u krvi. Nekoliko sati kasnije broj neutrofila u krvi se dalje povećava, a stepen povećanja zavisi od intenziteta i trajanja treninga (Peake JM, 2002). Povećanje limfocita se takoĊe uoĉava u toku i neposredno nakon treninga. Ipak tokom nekoliko sati nakon treninga broj limfocita znaĉajno opada ispod bazalnih vrednosti (Shek PN,1995). Redovni treninzi u duţem vremenskom periodu ne dovode do znaĉajnih promena u broju leukocita, ukljuĉujući i neutrofile i limfocite (Nieman DC, 2000). Ipak, i jednokratni i hroniĉni treninzi mogu uzrokovati supresiju i uroĊenog i steĉenog imuniteta kod sportista. U našem istraţivanju, redovni treninzi u periodu od 90 dana uzrokuju znaĉajno povećanje broja neutrofila i smanjenje broja limfocita kod mladih fudbalera. Ove promene nisu detektovane u suplementiranoj grupi (Slika 11). 118 Rezultati istraţivanja ukazuju da primena Asx moţe imati povoljan efekat na produkciju sIgA kod mladih fudbalera u periodu intenzivnih treninga tokom sezone. TakoĊe, primena Asx je spreĉila povećanje broja neutrofila i smanjenje broja limfocita, izazvano napornim programom treniranja tokom sezone. Iako Asx pokazuje povoljan efekat na unapreĊenje imunog ogovora, neophodne su detaljnije analize koje bi utvrdile mehanizam delovanja Asx na mukozni imunitet u budućim studijama. 119 6.ZAKLJUĈCI U skladu sa postavljenim ciljevima studije, na osnovu rezultati ispitivanja moţemo zakljuĉiti sledeće: 1. Dugogodišnje treniranje fudbala uslovljava povećanje nivoa neenzimskih antioksidanasa i aktivnosti antioksidativnih enzima. Ipak, i pored toga mladi fudbaleri su, usled redovnih, intenzivnih treninga, izloţeni većem nivou oksidativnog stresa i oksidativnog oštećenja u odnosu na fiziĉki neaktivne osobe. 2. Intenzivni fudbalski trening je povezan sa povećanom produkcijom slobodnih radikala i oksidativnim stresom, što moţe smanjiti kapacitet antioksidativne zaštite. Suplementacija astaksantinom delimiĉno spreĉava povećanu produkciju slobodnih radikala i smanjenje kapaciteta neenzimske antioksidativne zaštite kod mladih fudbalera. Uzimajući u obzir modifikaciju antioksidativnih zaštitinih mehanizama pod uticajem intenzivnih fudbalskih treninga i nedovoljan unos dijetarnih antioksidanasa, suplementacija astaksantinom ima povoljan uticaj na antioksidativni odbrambeni sistem kod fudbalera u toku sezone. 3. Naporan program treniranja u toku sezone dovodi do povećanja produkcije slobodnih radikala. Ipak, uoĉeno smanjenje oksidativnog statusa (prikazano kroz TOS i PAB) verovatno je posledica adaptivnog odgovora na intenzivne treninge. Suplementacija astaksantinom ima povoljan efekat na unapreĊenje aktivnosti enzima paraoksonaze 1 i ukupan sadrţaj sulfhidrilnih grupa kod mladih fudbalera. Suplementacija moţe biti od posebnog interesa za sportiste koji su 120 podloţniji oksidativnom stresu kao dodatna podrška endogenim enzimskim i neenzimskim zaštitnim sistemima. 4. Intenzivan trening dovodi do znaĉajnog povećanja aktivnosti enzima mišića u serumu i na poĉetku i na kraju suplementacionog perioda, što ukazuje na izuzetno visoke fiziološke zahteve fudbala i na znaĉajno oštećenje mišića nakon svakog treninga. Smanjenje oštećenja mišićnih ćelija je deo adaptivnog odgovora na intenzivnu fiziĉku aktivnost tokom 90 dana. Primena astaksantina u toku sezone smanjuje oštećenje mišićnih ćelija do odreĊenog stepena. 5. Redovni treninzi kod fudbalera imaju kumulativan supresivni efekat na mukozni imunitet, uzrokujući znaĉajan pad nivoa sIgA nakon treninga na kraju posmatranog perioda. Suplementacija astaksantinom ima povoljan efekat na produkciju sIgA kod mladih fudbalera u periodu intenzivnih treninga tokom sezone. Ipak, novija istraţivanja koja ukljuĉuju ispitivanje distribucije limfocita, proliferacije i aktivacije limfocita, kao i produkciju citokina, su neophodna da bi se preciznije utvrdio imunomodulatorni efekat astaksantina. 6. Rekreativni treninzi takoĊe dovode do smanjenja salivarnog protoka, apsolutne koncentracije i brzine izluĉivanja sIgA, pri ĉemu stepen ovih promena reflektuje intenzitet, trajanje u uĉestalost treninga. Aromatizovani napitak na bazi surutke pomaţe u odrţavanju salivarnog protoka, a na taj naĉin i koliĉine sIgA u toku i nakon intenzivnih treninga. S obzirom na smanjenje efikasnosti mukoznog imuniteta odmah nakon treninga trebalo bi maksimalno smanjiti kontakt sa velikim brojem ljudi da bi se spreĉio kontakt sa patogenima koji izazivaju infekcije gornjih respiratornih puteva. 121 7. LITERATURA 1.Aguilo A, Tauler P, Fuentespina E, Tur JA, Cordova A, Pons A. Anti-oxidant response to oxidative stress induced by exhaustive exercise. Physiol Behav 2005; 84: 1- 7. 2.Akova B, Surmen-Gur E, Gur H, Dirican M, Sarandol E, Kucukoglu S. Exercise- induced oxidative stress and muscle performance in healthy women: role of vitamin E supplementation and endogenous oestradiol. Eur J Appl Physiol 2001; 84: 141-147. 3.Alamdari DH, Paletas K, Pegiou T, Saraigianni M, Befani C, Koliakos G. A novel assay for the evaluation of the prooxidant–antioxidant balance, before and after antioxidant vitamin administration in type II diabetes patients. Clin Biochem 2007; 40: 248–254. 4.Alessio HM, Goldfarb AH, Cao G. Exercise-induced oxidative stress before and after vitamin C supplementation. Int J Sport Nutr 1997; 7: 1-9. 5.Alessio HM. Exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 1993; 25: 218- 224. 6.Andersson H, Karlsen A, Blomhoff R, Raastad T, Kadi F. Plasma antioxidant responses and oxidative stress following a soccer game in elite female players. Scand J Med Sci Sports 2010; 20: 600–608. 7.AOAC, 1975. Official methods of analysis (12th edition). Association of Official Analytical Chemists, Washington, DC. 8.Aoi W, Naito Y, Sakuma K, Kuchide M, Tokuda H, Maoka T, Toyokuni S, Oka S, Yasuhara M, Yoshikawa T. Astaxanthin limits exercise-induced skeletal and cardiac muscle damage in mice. Antioxid Redox Signal 2003; 5: 139–144. 9.Aoi W, Naito Y, Takanami Y, Ishii T, Kawai Y, Akagiri S, Kato Y, Osawa T, Yoshikawa T. Astaxanthin improves muscle lipid metabolism in exercise via inhibitory 122 effect of oxidative CPT I modification. Biochem Biophys Res Commun 2008; 366: 892–897. 10.Arent SM, Pellegrino JK, Williams CA, Difabio DA, Greenwood JC. Nutritional supplementation, performance, and oxidative stress in college soccer players. J Strength Cond Res 2010; 24: 1117-1124. 11.Arosio P, Levi S. Ferritin, iron homeostasis, and oxidative damage. Free Radic Biol Med 2002; 33: 457-463. 12.Arslan C, Gulcu F, Gursu MF. Effects of oxidative stress caused by acute and regular exercise on levels of some serum metabolites and the activities of paraoxonase and arylesterase. Biol Sport 2005; 22: 375-383. 13.Ascensão A, Rebelo A, Oliveira E, Marques F, Pereira L, Magalhães J. Biochemical impact of a soccer match - analysis of oxidative stress and muscle damage markers throughout recovery. Clin Biochem 2008; 41: 841-851. 14.Auclair C, Voisin E. Nitroblue tetrazolium reduction. In: Greenwald RA, editor. CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton FL: CRC Press; 1985. p. 123 – 132 15.Avery NG, Kaiser JL, Sharman MJ, Scheett TP, Barnes DM, Gómez AL, Kraemer WJ, Volek JS. Effects of vitamin E supplementation on recovery from repeated bouts of resistance exercise. J Strength Cond Res 2003; 17: 801-809. 16.Aviram M, Billecke S, Sorenson R, Bisgaier CL, Newton RS, Rosenblat M, Erogul J, Hsu C, Dunlop C, La Du B. Paraoxonase active site required for protection against LDL oxidation involved its free sulfhydryl group and is different than that required for its arylesterase/paraoxonase activities: selective action of human paraoxonase allozymes Q and R. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998;18:1617–1624. 17.Aviram M, Rosenblat M, Gaitini D, Nitecki S, Hoffman A, Dornfeld L, Volkova N, Presser D, Attias J, Liker H, Hayek T. Pomegranate juice consumption for 3 years by patients with carotid artery stenosis reduces common carotid intima-media thickness, blood pressure and LDL oxidation. Clin Nutr 2004; 23: 423-433. 123 18.Aviram M, Rosenblat M, Billecke S, Erogul J, Sorenson R, Bisgaier Cl, Newton RS, La Du B. Human serum paraoxonase (PON1) is inactivated by oxidised low density lipoprotein and preserved by antioxidants. Free Radic Biol Med 1999; 26: 892–904. 19.Baeuerle PA, Baltimore D. NF-kappa B: ten years after. Cell 1996; 87: 13-20. 20.Benson J, Gillien DM, Bourdet K, Loosli AR. Inadequate nutrition and chronic calorie restriction in adolescent ballerinas. Phys Sports Med 1985; 13: 79-90. 21.Bishop NC, Walker GJ, Scanlon GA, Richards S, Rogers E. Salivary IgA responses to prolonged intensive exercise following caffeine ingestion. Med Sci Sports Exerc 2006; 38: 513-519. 22.Bloomer RJ, Goldfarb AH, McKenzie MJ. Oxidative stress response to aerobic exercise: comparison of antioxidant supplements. Med Sci Sports Exerc 2006; 38: 1098-1105. 23.Bloomer RJ, Falvo MJ, Schilling BK, Smith WA. Prior exercise and antioxidant supplementation: effect on oxidative stress and muscle injury. J Int Soc Sports Nutr 2007; 4: 9. 24.Bloomer RJ, Fry A, Schilling B, Chiu L, Hori N, Weiss L. Astaxanthin supplementation does not attenuate muscle injury following eccentric exercise in resistance-trained men. Int J Sport Nutr Exerc Metab 2005; 15: 401-412. 25.Bloomer RJ, Fry AC, Falvo MJ, Moore CA. Protein carbonyls are acutely elevated following single set anaerobic exercise in resistance trained men. J Sci Med Sport 2007; 10: 411-417. 26.Bloomer RJ, Goldfarb AH, McKenzie MJ, You T, Nguyen L. Effects of antioxidant therapy in women exposed to eccentric exercise. Int J Sport Nutr Exerc Metab 2004 ; 14: 377-388. 27.Bloomer RJ, Goldfarb AH, Wideman L, McKenzie MJ, Consitt LA. Effects of acute aerobic and anaerobic exercise on blood markers of oxidative stress. J Strength Cond Res 2005; 19: 276-285. 124 28.Bloomer RJ. The role of nutritional supplements in the prevention and treatment of resistance exercise-induced skeletal muscle injury. Sports Med 2007; 37: 519-532. 29.Bolin AP, Macedo RC, Marin DP, Barros MP, Otton R. Astaxanthin prevents in vitro auto-oxidative injury in human lymphocytes. Cell Biol Toxicol 2010; 26: 457-467. 30.Bonina FP, Puglia C, Cimino F. Oxidative stress in handball players: effect of supplementation with a red orange extract. Nutr Res 2005; 25: 917–924. 31.Brand MD, Affourtit C, Esteves TC, Green K, Lambert AJ, Miwa S, Pakay JL, Parker N. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, activation of uncoupling proteins. Free Radic Biol Med 2004; 37: 755–767. 32.Brandtzaeg P. The human secretory immune neither system: General review. In: Revillard JP, Voisin C, Wierzbicki N, editors. Mucosal immunity: IgA and polymorphonuclear neutrophils. Asnieres (France): Foundation Franco Allemande; 1985. p.11-43. 33.Braun B, Clarkson PM, Freedson PS, Kohl RL. Effects of coenzyme Q10 supplementation on exercise performance, VO2max, and lipid peroxidation in trained cyclists. Int J Sport Nutr 1991; 1: 353-365. 34.Brites F, Zago V, Verona J, Muzzio M, Wikinski R, Schreier L. HDL capacity to inhibit LDL oxidation in well-trained triathletes. Life Sci 2006; 78: 3074– 3081. 35.Brites FD, Evelson PA, Christiansen MG, Nicol MF, Basilico MJ, Wikinski RW, Llesuy SF. Soccer players under regular training show oxidative stress but improved plasma antioxidant status. Clin Sci 1999; 96: 381-385. 36.Bryant RJ, Ryder J, Martino P, Kim J, Craig BW. Effects of vitamin E and C supplementation either alone or in combination on exercise-induced lipid peroxidation in trained cyclists. J Strength Cond Res 2003; 17: 792-800. 37.Buczynski A, Kedziora J, Tkaczewski W, Wachowicz B: Effect of submaximal physical exercise on antioxidative protection of human blood platelets. Int J Sports Med 1991; 12: 52-54. 125 38.Calder PC, Field CJ, Gill HS, editors. Nutrition and Immune Function. Oxford: CABI Publishing; 2002. 39.Carrillo AE, Murphy RJ, Cheung SS. Vitamin C supplementation and salivary immune function following exercise-heat stress. Int J Sports Physiol Perform 2008; 3: 516-530. 40.Cazzola R, Russo-Volpe S, Cervato G, Cestaro B. Biochemical assessments of oxidative stress, erythrocyte membrane fluidity and antioxidant status in professional soccer players and sedentary controls. Eur J Clin Invest 2003; 33: 924-930. 41.Chan K, Mong M, Yin M. Antioxidative and anti-inflammatory neuroprotective effects of astaxanthin and canthaxanthin in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Food Sci 2009; 74: H225-231. 42.Chew BP, Mathison BD, Hayek MG, Massimino S, Reinhart GA, Park JS. Dietary astaxanthin enhances immune response in dogs. Vet Immunol Immunopathol 2011; 140: 199-206. 43.Chew BP, Park JS, Wong MW, Wong TS. A comparison of the anticancer activities of dietary beta-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo. Anticancer Res 1999; 19: 1849-1853. 44.Chicharro JL, Lucia A, Perez M, Vaquero AF, Urena R. Saliva composition and exercise. Sports Med 1998 ; 26: 17-27. 45.Child R, Brown S, Day S, Donnelly A, Roper H, Saxton J. Changes in indices of antioxidant status, lipid peroxidation and inflammation in human skeletal muscle after eccentric muscle actions. Clin Sci 1999; 96: 105–115. 46.Child RB, Wilkinson DM, Fallowfield JL. Effects of a training taper on tissue damage indices, serum antioxidant capacity and half-marathon running performance. Int J Sports Med 2000; 21: 325-331. 47.Childs A, Jacobs C, Kaminski T, Halliwell B, Leeuwenburgh C. Supplementation with vitamin C and N-acetyl-cysteine increases oxidative stress in humans after an acute muscle injury induced by eccentric exercise. Free Radic Biol Med 2001; 31: 745-753. 126 48.Choi HD, Youn YK, Shin WG. Positive effects of astaxanthin on lipid profiles and oxidative stress in overweight subjects. Plant Foods Hum Nutr 2011; 66: 363–369. 49.Cholewa J, Poprzecki S, Zajac A, Waskiewicz Z. The influence of vitamin C on blood oxidative stress parameters in basketball players in response to maximal exercise. Sci Sport 2008; 23: 176–182. 50.Close DC, Hagerman AE. Chemistry of reactive oxygen species and antioxidants . In: Alessio HM, Hagerman AE, editors. Oxidative stress, exercise and aging. London: Imperial College Press; 2006. p. 1-8. 51.Costa LG, Giordano G, Furlong CE. Pharmacological and dietary modulators of paraoxonase 1 (PON1) activity and expression: The hunt goes on. Biochem Pharmacol 2011; 81: 337–344. 52.Davison G, Gleeson M, Phillips S. Antioxidant supplementation and immunoendocrine responses to prolonged exercise. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 645-652. 53.Deaton CM, Marlin DJ. Exercise-Associated Oxidative Stress. Clin Tech Equine Pract 2003; 2: 278-291. 54.Dimitriou L, Sharp NCC, Doherty M. Circadian effects on the acute responses of salivary cortisol and IgA in well trained swimmers. Br J Sports Med 2002; 36: 260-264. 55.Djordjevic D, Cubrilo D, Macura M, Barudzic N, Djuric D, Jakovljevic V. The influence of training status on oxidative stress in young male handball players. Mol Cell Biochem 2011; 351: 251–259. 56.Draganov DI, La Du BN. Pharmacogenetics of paraoxonases: a brief review. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol 2004; 369: 78–88. 57.Droge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002; 82: 47-95. 58.Earnest CP, Lupo M, White KM, Church TS. Effect of astaxanthin on cycling time trial performance. Int J Sports Med 2011; 32: 882-888. 127 59.Economos CD, Bortz SS, Nelson ME. Nutritional practices of elite athletes: recommendations. Sports Med 1993; 16: 381. 60.Eichner ER. Runner’s macrocytosis: a clue to footstrike hemolysis: runner’s anemia as a benefit versus runner’s hemolysis as a detriment. Am J Med 1985; 78: 321–325. 61.El Abed K, Rebai H, Bloomer RJ, Trabelsi K, Masmoudi L, Zbidi A, Sahnoun Z, Hakim A, Tabka Z. Antioxidant status and oxidative stress at rest and in response to acute exercise in judokas and sedentary men. J Strength Cond Res 2011; 25: 2400-2409. 62.Ellman E. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys 1959; 82: 70 – 77. 63.Elosua R, Molina L, Fito M, Arquer A, Sanchez-Quesada JL, Covas MI, Ordonez- Llanos J, Marrugat J. Response of oxidative stress biomarkers to a 16-week aerobic physical activity program, and to acute physical activity, in healthy young men and women. Atherosclerosis 2003; 167: 327-334. 64.Erel O. A new automated colorimetric method for measuring total oxidant status. Clin Biochem 2005; 38: 1103–1111. 65.Erel O. A novel automated method to measure total antioxidant response against potent free radical reactions. Clin Biochem 2004; 37: 12– 119. 66.Evelson P, Gambino G, Travacio M, Jaita G, Verona J, Maroncelli C, Wikinski R, Llesuy S, Brites F. Higher antioxidant defences in plasma and low density lipoproteins from rugby players. Eur J Clin Invest 2002; 32: 818-825. 67.Fahlman MM, Engels HJ. Mucosal IgA and URTI in American college football players: a year longitudinal study. Med Sci Sports Exerc 2005; 37: 374-380. 68.Fahlman MM, Engels HJ, Morgan AL, Kolokouri I. Mucosal IgA response to repeated Wingate tests in females. Int J Sports Med 2001; 22: 127-131. 69.Fatouros IG, Chatzinikolaou A, Douroudos II, Nikolaidis MG, Kyparos A, Margonis K, Michailidis Y, Vantarakis A, Taxildaris K, Katrabasas I, Mandalidis D, Kouretas D, Jamurtas AZ. Time-course of changes in oxidative stress and antioxidant status responses following a soccer game. J Strenght Cond Red 2010; 24: 3278-3286. 128 70.Ferre N, Camps J, Fernandez-Ballart J Arija V, Murphy MM, Ceruelo S, Biarnés E, Vilella E, Tous M, Joven J. Regulation of serum paraoxonase activity by genetic, nutritional and lifestyle factors in the general population. Clin Chem 2003; 49: 1491- 1497. 71.Finaud J, Lac G, Filaire L. Oxidative stress - relationship with exercise and training. Sports Med 2006; 36: 327-358. 72.Fisher-Wellman K, Bloomer RJ. Acute exercise and oxidative stress: a 30 year history. Dynamic Med 2009; 8:1. 73.Food and Nutrition Board, Institute of Medicine. Dietary Reference Intakes: Applications in Dietary Assessment. Washington (DC): National Academic Press; 2000. p. 71–144. 74.Fry A, Schilling B, Chiu L, Hori N, Weiss L. Fiber type-specific responses to perceptions of delayed onset muscle soreness with astaxanthin supplementation. Med Sci Sports Exerc 2004; 36: S175. 75.Furlong CE. Paraoxonases: an historical perspective. In: Mackness B, Mackness M, Aviram M, Paragh G, editors. The Paraoxonases: Their Role in Disease Development and Xenobiotic Metabolism. Dordrecht, The Netherlands: Springer; 2008. p. 3–31. 76.Gabriel H, Kindermann W. The acute immune response to exercise: what does it mean? Int J Sports Med 1997; 18: S28-45. 77.Gaeini AA, Rahnama N, Hamedinia MR. Effects of vitamin E supplementation oxidative on stress at rest and after exercise to exhaustion in athletic students. J Sports Med Phys Fitness 2006; 46: 458-461. 78.Ghloum K, Hajji S. Comparison of diet consumption, body composition and lipoprotein lipid values of Kuwaiti fencing players with international norms. J Int Soc Sports Nutr 2011; 8: 13. 79.Ginsburg GS, Agil A, O'Toole M, Rimm E, Douglas PS, Rifai N. Effects of a single bout of ultraendurance exercise on lipid levels and susceptibility of lipids to peroxidation in triathletes. JAMA 1996; 276: 221-225. 129 80.Giri JG, Kincade PW, Mizel SB. Interleukin l-mediated induction of K-light chain synthesis and surface immunoglobulin expression on pre-B cells. J Immun 1984; 118: 1213-1218. 81.Girotti MJ, Khan N, McLellan BA. Early measurement of systemic lipid peroxidation products in plasma of major blunt trauma patients. J Trauma 1991; 31: 32- 36. 82.Gleeson M, Li TL. The effects of carbohydrate supplementation during repeated bouts of prolonged exercise on saliva flow rate and immunoglobulin A. J Sports Sci 2005; 23: 713-722. 83.Gleeson M, McDonald WA, Cripps AW, Pyne DB, Clancy RL, Fricker PA. The effect on immunity of long-term intensive training in elite swimmers. Clin Exp Immunol 1995; 102: 210–216. 84.Gleeson M, McDonald WA, Pyne DB, Cripps AW, Francis JL, Fricker PA, Clancy RL. Salivary IgA levels and infection risk in elite swimmers. Med Sci Sports Exerc 1999; 31: 67-73. 85.Gleeson M. Can nutrition limit exercise-induced immunodepression? Nutr Rev 2006; 64: 119-131. 86.Gleeson M. Mucosal immunity and respiratory illness in elite athletes. Int J Sports Med 2000; 21: S33-43 87.Goldfarb AH, Bloomer RJ, McKenzie MJ. Combined antioxidant treatment effects on blood oxidative stress after eccentric exercise. Med Sci Sports Exerc 2005; 37: 234- 239. 88.Goldfarb AH, McKenzie MJ, Bloomer RJ. Gender comparisons of exercise-induced oxidative stress: influence of antioxidant supplementation. Appl Physiol Nutr Metab 2007; 32: 1124-1131. 89.Goldfarb AH, Patrick SW, Bryer S, You T. Vitamin C supplementation affects oxidative-stress blood markers in response to a 30-minute run at 75% VO2max. Int J Sport Nutr Exerc Metab 2005; 15: 279-290. 130 90.Goto C, Nishioka K, Umemura T, Jitsuiki D, Sakagutchi A, Kawamura M, Chayama K, Yoshizumi M, Higashi Y. Acute moderate-intensity exercise induces vasodilation through an increase in nitric oxide bioavailiability in humans. Am J Hypertens 2007; 20: 825-830. 91.Green HJ, Sutton JR, Coates G, Ali M, Jones S. Response of red cell and plasma volume to prolonged training in humans. J Appl Physiol 1991; 70: 1810 –1815. 92.Gross G, Lockwood, S. Cardioprotection and myocardial salvage by a disodium disuccinate astaxanthin derivative (Cardax™). Life Sci 2004; 75: 215-224. 93.Gross G, Lockwood S. Acute and chronic administration of disodium disuccinate astaxanthin (Cardax) produces marked cardioprotection in dog hearts. Mol Cell Biochem 2005; 272: 221-227. 94.Guerin M, Huntley ME, Olaizola M. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol 2003; 21: 210-216. 95.Guglielmini C, Casoni I, Patracchini M, Manfredini F, Grazzi G, Ferrari M, Conconi F. Reduction of hemoglobin levels during the racing season in nonsideropenic professional cyclists. Int J Sports Med 1989; 10: 352–356. 96.Guilland JC, Penarand T, Gallet C, Boggio V, Fuchs F, Klepping J. Vitamin status of young athletes including the effects of supplementation. Med Sci Sports Exerc 1989; 21: 441-449. 97.Harris DE. Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J 1992; 6: 2675–2683. 98.Hartmann A, Niess AM, Grunert-Fuchs M, Poch B, Speit G. Vitamin E prevents exercise-induced DNA damage. Mutat Res 1995; 346: 195-202. 99.Hartmann A, Pfuhler S, Dennog C, Germadnik D, Pilger A, Speit G. Exercise- induced DNA effects in human leukocytes are not accompanied by increased formation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine or induction of micronuclei. Free Radic Biol Med 1998; 24: 245-251. 131 100.Hessel E, Haberland A, Muller M, Lerche D, Schimke I. Oxygen radical generation of neutrophils: a reason for oxidative stress during marathon running? Clin Chim Acta 2000; 298: 145–156. 101.Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L, Goycoolea FM. Astaxanthin: A review of its chemistry and applications. Crit Rev Food Sci Nutr 2006; 46: 185-196. 102.Hubner-Wozniak E, Panczenko-Kresowka B, Lerczak K, Posnik J. Effects of graded treadmill exercise on the activity of blood antioxidant enzymes, lipid peroxides and nonenzymatic anti-oxidants in long-distance skiers. Biol Sport 1994; 11: 217-226. 103.Humbert R, Adler DA, Disteche CM, Hassett C, Omiecinski CJ, Furlong CE. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity polymorphism. Nat Genet 1993; 3: 73-76. 104.Hussein G, Goto H, Oda S, Sankawa U, Matsumoto K, Watanabe H. Antihypertensive potential and mechanism of action of astaxanthin: III. Antioxidant and histopathological effects in spontaneously hypertensive rats. Biol Pharm Bull 2006; 29: 684-688. 105.Hussein G, Sankawa U, Goto H, Matsumoto K, Watanabe H. Astaxanthin, a Carotenoid with Potential in Human Health and Nutrition. J Nat Prod 2006; 69: 443- 449. 106.Ikeuchi M, Koyama T, Takahashi J, Yazawa K. Effects of astaxanthin supplementation on exercise-induced fatigue in mice. Biol Pharm Bull 2006; 29: 2106– 2110. 107.Itoh H, Ohkuwa T, Yamazaki Y, Shimoda T, Wakayama A, Tamura S, Yamamoto T, Sato Y, Miyamura M. Vitamin E supplementationattenuates leakage of enzymes following 6 successive days of running training. Int J Sports Med 2000; 21: 369-374. 108.Iwamoto T, Hosoda K, Hirano R, Kurata H, Matsumoto A, Miki W, Kamiyama M, Itakura H, Yamamoto S, Kondo K. Inhibition of low-density lipoprotein oxidation by astaxanthin. J Atheroscler Thromb 2000; 7: 216–222. 132 109.James RW, Deakin SP. The importance of high-density lipoproteins for paraoxonase-1 secretion, stability and activity. Free Radic Biol Med 2004; 37: 1986–1994. 110.Jamurtas AZ, Fatouros IG, Koukosias N, Manthou E, Tofas T, Yfanti C, Nikolaidis MG, Koutedakis Y. Effect of exercise on oxidative stress in individuals with glucose-6- phosphate dehydrogenase deficiency. In Vivo 2006; 20: 875-880. 111.Jaouad L, de Guise C, Berrougui H, Clotier M, Isabelle M, Fulop T, Payette H, Khalil A. Age-related decrease in high-density lipoproteins antioxidant activity is due to an alteration in the PON1's free sulfhydryl groups. Atherosclesrosis 2006; 185: 191– 200. 112.Jarvik GP, Rozek LS, Brophy VH, Hatsukami TS, Richter RJ, Schellenberg GD, Furlong CE. Paraoxonase (PON1) Phenotype Is a Better Predictor of Vascular Disease Than Is PON1192 or PON155 Genotype. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000; 20: 2441 - 2447. 113.Jarvik GP, Tsai NT, McKinstry LA, Wani R, Brophy VH, Richter RJ, Schellenberg GD, Heagerty PJ, Hatsukami TS, Furlong CE. Vitamin C and E intake is associated with increased paraoxonase activity. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 1329– 1333. 114.Jenkins RR, Goldfarb A. Introduction: oxidant stress, aging and exercise. Med Sci Sport Exerc 1993; 25: 210-212. 115.Ji LL. Oxidative stress during exercise implication of antioxidant nutrients. Free Radic Biol Med. 1995; 18: 1079-1086. 116.Jyonouchi H, Sun S, Mizokami M, Gross MD. Effects of various carotenoids on cloned, effector-stage T-helper cell activity. Nutr Cancer 1996; 26: 313-324. 117.Jyonouchi H, Sun S, Tomita Y, Gross MD. Astaxanthin, a carotenoid without vitamin A activity, augments antibody responses in cultures including T-helper cell clones and suboptimal doses of antigen. J Nutr 1995, 125: 2483-2492. 118.Jyonouchi H, Zhang L, Gross M, Tomita Y. Immunomodulating actions of carotenoids: enhancement of in vivo and in vitro antibody production to T-dependent antigens. Nutr Cancer 1994; 21: 47-58. 133 119.Jyonouchi H, Zhang L, Tomita Y. Studies of immunomodulating actions of carotenoids II. Astaxanthin enhances in vitro antibody production to T-dependent antigens without facilitating polyclonal B-cell activation. Nutr Cancer 1993; 19: 269- 280. 120.Kaminsky M, Boal R. An effect of ascorbic acid on delayed-onset muscle soreness. Pain 1992; 50: 317-321. 121.Karppi J, Rissanen TH, Nyyssönen K, Kaikkonen J, Olsson AG, Voutilainen S, Salonen JT. Effects of astaxanthin supplementation on lipid peroxidation. Int J Vitam Nutr Res 2007; 77: 3-11. 122.Kim YH, Koh HK, Kim DS. Down-regulation of IL-6 production by astaxanthin via ERK-, MSK-, and NF-κB-mediated signals in activated microglia. Int Immunopharmacol 2010; 10: 1560-1572. 123.Kingsley MI, Wadsworth D, Kilduff LP, McEneny J, Benton D. Effects of phosphatidylserine on oxidative stress following intermittent running. Med Sci Sports Exerc 2005; 37: 1300-1306. 124.Kistler A, Liechti H, Pichard L, Wolz E, Oesterhelt G, Hayes A, Maurel P. Metabolism and CYP-inducer properties of astaxanthin in man and primary human hepatocytes. Arch Toxicol 2002; 75: 665-675. 125.Knez WL, Jenkins DG, Coombes JS. Oxidative stress in half and ironman triathletes. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 283-288. 126.Koch AJ, Wherry AD, Petersen MC, Johnson JC, Stuart MK, Sexton WL. Salivary immunoglobulin A response to a collegiate rugby game. J Strength Cond Res 2007; 21: 86-90. 127.Kotur-Stevuljevic J, Spasic S, Stefanovic A et al.Paraoxonase-1 (PON1) activity, but not PON1Q192R phenotype, is a predictor of coronary artery disease in a middle- aged Serbian population. Clin Chem Lab Med 2006; 44: 1106–1113. 134 128.Kratz A, Lewandrowski KB, Siegel AJ, Chun KY, Flood JG, Van Cott EM, Lee- Lewandrowski E. Effect of marathon running on hematologic and biochemical laboratory parameters, including cardiac markers. Am J Clin Pathol 2002; 118: 856-863. 129.Krzywkowski K, Petersen EW, Ostrowski K, Link-Amster H, Boza J, Halkjaer- Kristensen J. Effect of glutamine and protein supplementation on exercise-induced decreases in salivary IgA. J Appl Physiol 2001; 91: 832-838. 130.Kürkçü R, Tekin A, Özda S, Akçakoyun F. The effects of regular exercıse on oxıdatıve and antıoxıdatıve parameters ın young wrestlers. Afr J Pharm Pharmacol 2010; 4: 244-251. 131.La Du BN, Aviram M, Billecke S, Navab M, Primo-Parmo S, Sorenson RC, Standiford TJ. On the physiological role(s) of the paraoxonases. Chem Biol Interact 1999; 119-120: 379-388. 132.Laing SJ, Gwynne D, Blackwell J, Williams M, Walters R, Walsh NP. Salivary IgA response to prolonged exercise in a hot environment in trained cyclists. Eur J Appl Physiol 2005; 93: 665-671. 133.Lauver DA, Lockwood SF, Lucchesi BR. Disodium Disuccinate Astaxanthin (Cardax) attenuates complement activation and reduces myocardial injury following ischemia/ reperfusion. Pharmacol Exp Ther 2005; 314: 686-692. 134.Lee SJ, Bai SK, Lee KS, Namkoong S, Na HJ, Ha KS, Han JA, Yim SV, Chang K, Kwon YG, Lee SK, Kim YM. Astaxanthin inhibits nitric oxide production and inflammatory gene expression by suppressing I kappa B kinase-dependent NF-kappa B activation. Mol Cells 2003; 16: 97–105. 135.Levando VA, Suzdalnitskii RS, Pershin BB, Zykov MP. Study of secretory and antiviral immunity in sportsmen. Sports Training Med Rehab 1988; 1: 49–52. 136.Lippi G, Schena F, Salvagno GL, Montagnana M, Gelati M, Tarperi C, Banfi G, Guidi GC. Acute variation of biochemical markers of muscle damage following a 21-km, half marathon run. Scand J Clin Lab Invest 2008; 68: 667–672. 135 137.Liu JF, Chang WY, Chan KH, Tsai WY, Lin CL, Hsu MC. Blood lipid peroxides and muscle damage increased following intensive resistance training of female weightlifters. Ann N Y Acad Sci 2005; 1042: 255-261. 138.Liu X, Shibata T, Hisaka S, Osawa T. Astaxanthin inhibits reactive oxygen species- mediated cellular toxicity in dopaminergic SH-SY5Y cells via mitochondria-targeted protective mechanism. Brain Res 2009; 1254: 18-27. 139.Loosli AR, Benson J, Gillien DM, Bourdet K. Nutritional habits and knowledge in competitive adolescent female gymnasts. Phys Sportsmed 1986; 14: 118 –130. 140.Lukaski CH. Vitamin and Mineral Status: Effects on Physical Performance. Nutrition 2004; 20: 632– 644. 141.Lumikara M, Johansson I, Ericson T, Virtamo J. Saliva concentrations of some selected proteins and glycoprotein markers in man after supplemen- tary intake of beta- carotene. Int J Vit Nutr Res 1988; 58: 171–177. 142.Macedo RC, Bolin AP, Marin DP, Otton R. Astaxanthin addition improves human neutrophils functionin vitro study. Eur J Nutr 2010; 49: 447-457. 143.Mackinnon LT, Chick TW, van As A, Tomasi TB. The effect of exercise on secretory and natural immunity. Adv Exp Med Biol 1987; 216A: 869-876. 144.Mackinnon LT, Ginn E, Seymour G. Decreased salivary immunoglobulin A secretion rate after intense interval exercise in elite kayakers. Eur J Appi Physiol Occup Physiol 1993; 61: 180-184. 145.Mackinnon LT, Jenkins DG. Decreased salivary immunoglobulins after intense interval exercise before and after training. Med Sci Sports Exerc 1993; 25: 678-683. 146.Mackness MI, Harty D, Bhatnagar D, Winocour PH, Arrol S, Ishola M, Durrington PN. Serum paraoxonase activity in familial hypercholesterolaemia and insulin dependent diabetes mellitus. Atherosclerosis 1991; 86: 193–199. 147.Malmsten CL, Lignell A. Dietary Supplementation with Astaxanthin-Rich Algal Meal Improves Strength Endurance – A Double Blind Placebo Controlled Study on Male Students . Carotenoid Science 2008; 13: 20-22. 136 148.Margaritis I, Palazzetti S, Rousseau AS, Richard MJ, Favier A. Antioxidant supplementation and tapering exercise improve exercise-induced antioxidant response. J Am Coll Nutr 2003; 22: 147–156. 149.Margaritis I, Tessier F, Richard MJ, Marconnet P. No evidence of oxidative stress after a triathlon race in highly trained competitors. Int J Sports Med 1997; 18:186-190. 150.Martinovic J, Dopsaj V, Dopsaj MJ, Kotur-Stevuljevic J, Vujovic A, Stefanovic A, Nesic G. Long-term effects of oxidative stress in volleyball players. Int J Sports Med 2009; 30: 851-856. 151.Marzatico F, Pansarasa O, Bertorelli L, Somenzini L, Della Valle G: Blood free radical antioxidant enzymes and lipid peroxides following long-distance and lactacidemic performances in highly trained aerobic and sprint athletes. J Sports Med Phys Fitness 1997; 37: 235-239. 152.Mastaloudis A, Morrow JD, Hopkins DW, Devaraj S, Traber MG. Antioxidant supplementation prevents exercise-induced lipid peroxidation, but not inflammation, in ultramarathon runners. Free Radic Biol Med 2004; 36: 1329-1341. 153.Mastaloudis A, Leonard SW, Traber MG. Oxidative stress in athletes during extreme endurance exercise. Free Radic Biol Med 2001; 31: 911-922. 154.Mastaloudis A, Yu TW, O'Donnell RP, Frei B, Dashwood RH, Traber MG. Endurance exercise results in DNA damage as detected by the comet assay. Free Radic Biol Med 2004; 36: 966-975. 155.McAnulty S, McAnulty L, Nieman D, Morrow J, Dumke C, Utter A. Carbohydrate effect: hormone and oxidative changes. Int J Sports Med 2007; 28: 921-927. 156.McAnulty SR, McAnulty LS, Nieman DC, Dumke CL, Morrow JD, Utter AC, Henson DA, Proulx WR, George GL. Consumption of blueberry polyphenols reduces exercise induced oxidative stress compared to vitamin C. Nutr Res 2004; 24: 209 –221 157.McAnulty SR, McAnulty LS, Nieman DC, Morrow JD, Shooter LA, Holmes S, Heward C, Henson DA. Effect of alpha-tocopherol supplementation on plasma 137 homocysteine and oxidative stress in highly trained athletes before and after exhaustive exercise. J Nutr Biochem 2005; 16: 530-537. 158.McAnulty SR, McAnulty LS, Nieman DC, Morrow JD, Utter AC, Henson DA, Dumke CL, Vinci DM. Influence of carbohydrate ingestion on oxidative stress and plasma antioxidant potential following a 3 h run. Free Radic Res 2003; 37: 835-840. 159.McAnulty SR, Owens JT, McAnulty LS, Nieman DC, Morrow JD, Dumke CL, Milne GL. Ibuprofen use during extreme exercise: effects on oxidative stress and PGE2. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 1075-1079. 160.McBride JM, Kraemer WJ, Triplett-McBride T, Sebastianelli W. Effect of resistance exercise on free radical production. Med Sci Sports Exerc 1998; 30: 67-72. 161.McCarthy DA, Dale MM. The leucocytosis of exercise. A review and model. Sports Med 1988; 6: 333-363. 162.Melikoglu MA, Kaldirimci M, Katkat D, Sen I, Kaplan I, Senel K. The effect of regular long term training on antioxidant enzymatic activities. J Sport Med Phys Fit 2008; 48: 388-390. 163.Mero A, Kähkönen J, Nykänen T, Parviainen T, Jokinen I, Takala T, Nikula T, Rasi S, Leppäluoto J. IGF-I, IgA, and IgG responses to bovine colostrum supplementation during training. J Appl Physiol 2002; 93: 732-739. 164.Metin G, Atukeren P, Alturfan AA, Gulyasar T, Kaya M, Gumustas MK. Lipid peroxidation, erythrocyte superoxide-dismutase activity and trace metals in young male footballers. Yonsei Med J 2003; 44: 979-986. 165.Michailidis Y, Jamurtas AZ, Nikolaidis MG, Fatouros IG, Koutedakis Y, Papassotiriou I, Kouretas D. Sampling time is crucial for measurement of aerobic exercise-induced oxidative stress. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 1107-1113. 166.Miletić VD, Miletić I: Imunohemijske metode, Društvo medicinskih biohemiĉara Jugoslavije, 1997. god., Beograd. 138 167.Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autooxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase J Biol Chem 1972; 247: 3170 – 3175. 168.Miura M, Umeda T, Nakaji S, Liu Q, Tanabe M, Kojima A ET AL. Effect of 6 months’ training on the reactive oxygen species production capacity of neutrophils and serum opsonic activity in judoists. Luminescence 2005; 20: 1–7. 169.Miyawaki H, Takahashi J, Tsukahara H, Takehara I. Effects of Astaxanthin on Human Blood Rheology J Clin Biochem Nutr 2008; 43: 69–74. 170.Moreira A, Arsati F, Cury PR, Franciscon C, de Oliveira PR, de Araújo VC. Salivary immunoglobulin a response to a match in top-level brazilian soccer players. J Strength Cond Res 2009; 23: 1968-1973. 171.Morgan MJ, Liu Y. Crosstalk of reactive oxygen species and NF-κB signaling. Cell Res 2011; 21: 103-115. 172.Nagaki Y, Mihara M, Tsukahara H, Ono S. The supplementation effect of astaxanthin on accommodation and asthenopia. J Clin Ther Med 2006; 22: 41–54. 173.Naghizadeh H, Afzalpour ME, Zarban A. The comparison of antioxidant status and lipid profile of karate athletes with nonathletes. J Birjand Univ Med Sci 2009; 16: 54– 61. 174.Naguib YMA. Antioxidant activities of astaxanthin and related carotenoids. J Agric Food Chem 2000; 48: 1150–1154. 175.Nakamura A, Isobe R, Otaka Y, Abematsu Y, Nakata D, Honma C, Sakurai S, Shumada Yoshiaki, Horiguchi Masayuki. Changes in visual function following peroral astaxanthin. Jpn J Clin Opthamol 2004; 58: 1051–1054. 176.Naziroğlu M, Kilinç F, Uğuz AC, Celik O, Bal R, Butterworth PJ, Baydar ML. Oral vitamin C and E combination modulates blood lipid peroxidation and antioxidant vitamin levels in maximal exercising basketball players. Cell Biochem Funct 2010; 28: 300-305. 139 177.Nehlsen-Cannarella SL, Nieman DC, Fagoaga OR, Kelln WJ, Henson DA, Shannon M, Davis JM. Saliva immunoglobulins in elite women rowers and controls. Eur J Appl Physiol 2000; 81: 222–228. 178.Nelson Steen S, Mayer K, Brownell KD, Wadden TA. Dietary intake of female collegiate heavy weight rowers. Int J Sports Nutr 1995; 5: 225-231. 179.Neubauer O, Konig D, Kern N, Nics L, Wagner KH. No indications of persistent oxidative stress in response to an ironman triathlon. Med Sci Sports Exerc 2008; 40: 2119-2128. 180.Nguyen SD, Sok DE. Oxidative inactivation of paraoxonase 1 an antioxidant protein and its effect on antioxidant action. Free Radic Res 2003; 37: 77–83. 181.Nieman DC, Dumke CL, Henson DA, McAnulty SR, McAnulty LS, Lind RH, Morrow JD. Immune and oxidative changes during and following the Western States Endurance Run. Int J Sports Med 2003b; 24: 541-547. 182.Nieman DC, Henson DA, Fagoaga OR, Utter AC, Vinci DM, Davis JM, Nehlsen- Cannarella SL. Change in salivary IgA following a competitive marathon race. Int J Sports Med 2002a; 23: 69-75. 183.Nieman DC, Henson DA, Gross SJ, Jenkins DP, Davis JM, Murphy EA, Carmichael MD, Dumke CL, Utter AC, McAnulty SR, McAnulty LS, Mayer EP. Quercetin reduces illness but not immune perturbations after intensive exercise. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 1561-1569. 184.Nieman DC, Henson DA, McAnulty SR, McAnulty L, Swick NS, Utter AC, Vinci DM, Opiela SJ, Morrow JD. Influence of vitamin C supplementation on oxidative and immune changes after an ultramarathon. J Appl Physiol 2002; 92: 1970-1977. 185.Nieman DC, Henson DA, McAnulty SR, McAnulty LS, Morrow JD, Ahmed A, Heward CB. Vitamin E and immunity after the Kona Triathlon World Championship. Med Sci Sports Exerc 2004, 36: 1328-1335. 186.Nieman DC. Exercise immunology: nutritional countermeasures. Can J Appl Physiol 2001; 26: S45-S55. 140 187.Nieman DC. Is infection risk linked to exercise workload? Med Sci Sports Exerc 2000; 32: S406-S411. 188.Niess AM, Hartmann A, Grunert-Fuchs M, Poch B, Speit G. DNA damage after exhaustive treadmill running in trained and untrained men. Int J Sports Med 1996; 17: 397-403. 189.Nikolaidis MG, Kyparos A, Hadziioannou M, Panou N, Samaras L, Jamurtas AZ, Kouretas D. Acute exercise markedly increases blood oxidative stress in boys and girls. Appl Physiol Nutr Metab 2007; 32(2):197-205. 190.Nikolaidis MG, Paschalis V, Giakas G, Fatouros IG, Koutedakis Y, Kouretas D, Jamurtas AZ. Decreased blood oxidative stress after repeated muscle-damaging exercise. Med Sci Sports Exerc 2007; 39: 1080-1089. 191.Nikolaidis MG, Protosygellou MD, Petridou A, Tsalis G, Tsigilis N, Mougios V. Hematologic and biochemical profile of juvenile and adult athletes of both sexes: implications for clinical evaluation. Int J Sports Med 2003; 24: 506-511. 192.Nishida Y, Yamashita E, Miki W. Quenching activities of common hydrophilic and lipophilic antioxidants against singlet oxygen using chemiluminescence detection system. Carotenoid Science 2007; 11: 16-20. 193.Nitta T, Ogami K, Shiratori K. The effects of astaksantin on accommodation and asthenopia—dose finding study in healthy volunteers. Clin Med 2005; 21: 543-556. 194.Novas AM, Rowbottom DG, Jenkins DG. Tennis , incidence of URTI and salivary IgA. Int J Sports Med 2003; 24: 223-229. 195.Odeberg JM, Lignell A, Pettersson A, Hoglund P. Oral bioavailability of the antioxidant astaxanthin in humans is enhanced by incorporation of lipid based formulations. Eur J Pharm Sci 2003; 19: 299–304 196.Ohgami K, Shiratori K, Kotake S, Nishida T, Mizuki N, Yazawa K, Ohno S. Effects of astaxanthin on lipopolysaccharide-induced inflammation in vitro and in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: 2694–2701. 141 197.Okai Y, Higashi-Okai K. Possible immunomodulating activities of carotenoids in in vitro cell culture experiments. Int J Immunopharmacol 1996; 18: 753-758. 198.Orhan H, van Holland B, Krab B, Moeken J, Vermeulen NP, Hollander P, Meerman JH. Evaluation of a multi-parameter biomarker set for oxidative damage in man: increased urinary excretion of lipid, protein and DNA oxidation products after one hour of exercise. Free Radic Res 2004; 38: 1269-1279. 199.Orino K, Lehman L, Tsuji Y. Ferritin and the response to oxidative stress. Biochem J 2001; 357: 241-247. 200.Ortenblad N, Madsen K, Djurhuus MS. Antioxidant status and lipid peroxidation after short-term maximal exercise in trained and untrained humans. Am J Physiol 1997; 272: R1258–R1263. 201.Otsuki T, Shimizu K, Iemitsu M, Kono I. Salivary secretory immunoglobulin A secretion increases after 4-weeks ingestion of chlorella-derived multicomponent supplement in humans: a randomized cross over study. Nutr J 2011; 10: 91. 202.Paker L. Oxidants, antioxidants nutrients and the athlete. J Sport Sci 1997; 15: 353– 363. 203.Palmer FM, Nieman DC, Henson DA, McAnulty SR, McAnulty L, Swick NS, Utter AC, Vinci DM, Morrow JD. Influence of vitamin C supplementation on oxidative and salivary IgA changes following an ultramarathon. Eur J Appl Physiol 2003; 89: 100-107. 204.Panza VS, Wazlawik E, Ricardo Schütz G, Comin L, Hecht KC, da Silva EL. Consumption of green tea favorably affects oxidative stress markers in weight-trained men. Nutrition 2008; 24: 433-442. 205.Park JS, Chyun JH, Kim Y, Line LL, ChewBP. Astaxanthin decreased oxidative stress and inflammation and enhanced immune response in humans. Nutr Metab 2010; 7: 18. 142 206.Park JS, Mathison BD, Hayek MG, Massimino S, Reinhart GA, Chew BP. Astaxanthin stimulates cell-mediated and humoral immune responses in cats. Vet Immunol Immunopathology 2011; 144: 455-461. 207.Paschalis V, Nikolaidis MG, Fatouros IG, Giakas G, Koutedakis Y, Karatzaferi C, Kouretas D, Jamurtas AZ. Uniform and prolonged changes in blood oxidative stress after muscle-damaging exercise. In Vivo 2007; 21: 877-883. 208.Peake JM. Exercise-induced alterations in neutrophil degranulation and respiratory burst activity: possible mechanisms of action. Exerc Immunol Rev 2002; 8: 49-100. 209.Pelletier DM, Lacerte G, Goulet E DB. Effects of Quercetin Supplementation on Endurance Performance and Maximal Oxygen Consumption: A Meta-Analysis. Int J Sport Nutr Exerc Metab 2012, in press. 210.Pette D, Spamer C. Metabolic properties of muscle fibers. Fed Proc 1986; 45: 291. 211.Philips TAC, Childs DM, Dreon S, Phinney S, Leeuwenburgh C. A dietary supplement attenuates IL-6 and CRP after eccentric exercise in untrained males. Med Sci Sports Exerc 2003; 35: 2032-2037. 212.Pialoux V, Mounier R, Brugniaux JV, Rock E, Mazur A, Richalet JP, Robach P, Couldert J, Fellmann N. Thirteen days of „live high-train low― does not affect prooxidant/antioxidant balance in elite swimmers. Eur J Appl Physiol 2009; 106: 517- 524. 213.Popovic M, Puchner S, Endler G, Foraschik C, Minar E, Bucek RA. The effects of endurance and recreational exercise on subclinical evidence of atherosclerosis in young adults. Am J Med Sci 2010; 339: 332-336. 214.Powers SK, Nelson WB, Hudson MB. Exercise-induced oxidative stress in humans: cause and consequences. Free Radic Biol Med 2011; 51: 942-950. 215.Powers SK, Deruisseau KC, Quindry J, Hamilton KL. Dietary antioxidants and exercise. J Sport Sci 2004; 22: 81–94. 143 216.Powers SK, Jackson MJ. Exercise-induced oxidative stress: cellular mechanisms and impact on muscle force production. Physiol Rev 2008; 88: 1243–1276. 217.Radak Z, Pucsuk J, Boros S, Josfai L, Taylor AW. Changes in urine 8-hydroxy deoxyguanosine levels of super-marathon runners during a four-day race period. Life Sci 2000; 66: 1763-1767. 218.Rajković MG, Rumora L, Juretić D, Grubisić TZ, Flegar-Mestrić Z, Vrkić N, Sinjeri Z, Barisić K. Effect of non-genetic factors on paraoxonase 1 activity in patients undergoing hemodialysis. Clin Biochem 2010; 43: 1375-1380. 219.Razmjou S, Rajabi H, Jannati M, Azizi M, Jahandideh AA. The effects of delorme and oxford techniques on serum cell injury indices and growth factor in untrained women. World Journal of Sport Sciences 2010; 3: 44-52 220.Richter B, Niessner A, Penka M, Grdić M, Steiner S, Strasser B, Ziegler S, Zorn G, Maurer G, Simeon-Rudolf V,Wojta J, Huber K. Endurance training reduces circulating asymmetric dimethylarginine and myeloperoxidase levels in persons at risk of coronary events. Thromb Haemost 2005; 94: 1306-1311. 221.Richter R, Furlong CE. Determination of paraoxonase 1 (PON1) status requires more than genotyping. Pharmacogenetics 1999; 9: 745–753. 222.Richter RJ, Jampsa RL, Jarvik GP, Costa LG, Furlong CE. Determination of paraoxonase 1 status and genotypes at specific polymorphisms sites. In: Maines M, Costa LG, Reed DJ, Hodgson E, editors. Current Protocols in Toxicology. New York: John Wiley and Sons, 2004. 223.Rokitzki L, Logemann E, Sagredos AN, Murphy M, Wetzel-Roth W, Keul J. Lipid peroxidation and antioxidative vitamins under extreme endurance stress. Acta Physiol Scand 1994; 151: 149-158. 224.Romani R, De Medio G, di Tullio S, Lapalombella R, Pirisinu I, Margonato V, Veicsteinas A, Marini M, Rosi G. Modulation of paraoxonase 1 and 3 expression after moderate exercise training in the rat. J Lipid Res 2009; 50: 2036–2045. 144 225.Rush JW, Sandiford SD. Plasma glutathione peroxidase in healthy young adults: influence of gender and physical activity. Clin Biochem 2003; 36: 345-351. 226.Sari-Sarraf V, Reully T, Doran DA, Atkinson G. The effects of single and repeated bouts of soccer-speceific exercise on salivary IgA. Arch Oral Biol 2007; 52: 526-532. 227.Sawaki K, Yoshigi H, Aoki K, Koikawa N, Azumane A, Kaneko K, Yamaguchi M. Sports performance benefits from taking natural astaxanthin characterized by visual acuity and muscular fatigue improvements in humans. J Clin Ther Med 2002; 18: 1085–1100. 228.Schiffman SS, Miletic IĐ. Effect of taste and smell on secretion rate of salivary IgA in elderly and young persons. J Nutr Health Aging 1999; 3:158-64. 229.Schiffman SS, Warwick ZS. Effect of flavor enhancement of foods for elderly on nutritional status: food intake, biochemical indices and anthropometric measures. Physiol Behav 1993; 53: 395-402. 230.Schiffman SS. Intensification of sensory properties of foods for the elderly. J Nutr 2000; 130 (suppl): 927-930. 231.Schmidt W, Maassen N, Tegtbur U, Braumann KM. Changes in plasma volume and red cell formation after a marathon competition. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 1989; 58: 453–458. 232.Schroder H, Navarro E, Mora J, Galiano D, Tramullas A. Effects of α-tocopherol, β-carotene and ascorbic acid on oxidative, hormonal and enzymatic exercise stress markers in habitual training activity of professional basketball players. Eur J Nutr 2001; 40: 178–184. 233.Schroder H, Navarro E, Tramullas A. Nutrition antioxidant status and oxidative stress in profesional basketball players: effects of three compound antioxidative supplement. Int J Sports Med 2000; 21: 146-150. 234.Schumacher YO, Schmid A, Grathwohl D, Bultermann D, Berg A. Hematological indices and iron status in athletes of various sports and performances. Med Sci Sports Exerc 2002; 34: 869-875. 145 235.Selmeci L, Seres L, Antal M, Lukács J, Regöly-Mérei A, Acsády G. Advanced oxidation protein products (AOPP) for monitoring oxidative stress in critically ill patients: a simple, fast and inexpensive automated technique. Clin Chem Lab Med 2005; 43: 294 – 297. 236.Shafat A, Butler P, Jensen RL, Donnelly AE. Effects of dietary supplementation with vitamin C and E pn muscle function during and after eccentric contractions in humans. Eur J Appl Physiol 2004; 93: 196-202. 237.Shek PN, Sabiston BH, Buguet A and Radomski MW. Strenuous exercise and immunological changes: a multiple-time-point analysis of leukocyte subsets, CD4/CD8 ratio, immunoglobulin production and NK cell response. Int J Sports Med 1995; 16: 466-474. 238.Shiratori K, Ogami K, Nitta T. The effects of Astaksantin on Accommodation and Asthenopia—Efficacy Identification Study in Healthy Volunteers. Clin Med 2005; 21: 637-650. 239.Silva LA, Pinho CA, Scarabelot CS, Fraga DB, Volpato AM, Boeck CR, De Souza CT, Streck EL, Pinho RA. Physical exercise increases mitochondrial function and reduces oxidative damage in skeletal muscle. Eur J Appl Physiol 2009; 105: 861–867. 240.Sorenson RC, Primo-Parmo SL, Kuo CL, Adkins S, Lockridge O, La Su BN. Reconsideration of the catalytic center and mechanism of mammalian paraoxonase/ arylesterase. Proc Natl Acad Sci 1995; 92: 7187–7191. 241.Speranza L, Pesce M, Patruno A, Franceschelli S, de Lutiis MA, Grilli A, Felaco M. Astaxanthin Treatment Reduced Oxidative Induced Pro-Inflammatory Cytokines Secretion in U937: SHP-1 as a Novel Biological Target. Mar Drugs 2012; 10: 890-899. 242.Steen SN, McKinney S. Nutritional assessment of college wrestlers. Phys Sports Med 1986; 14: 101 243.Stefanovic A, Ardalic D, Kotur-Stevuljevic J, Vujovic A, Spasic S, Spasojevic- Kalimanovska V, Jelic-Ivanovic Z, Mandic-Markovic V, Mikovic Z, Cerovic N. 146 Longitudinal changes in PON1 activities, PON1 phenotype distribution and oxidative status throughout normal pregnancy. Repro Tox 2012; 33: 20-26. 244.Steinberg JG, Delliaux S, Jammes Y. Reliability of different blood indices to explore the oxidative stress in response to maximal cycling and static exercises. Clin Physiol Funct Imaging 2006; 26: 106-112. 245.Sun Y, Oberley LW . Redox regulation of transcriptional activators. Free Radic Biol Med 1996; 21: 335–348. 246.Suzuki Y, Ohgami K, Shiratori K, Jin XH, Ilieva I, Koyama Y, Yazawa K, Yoshida K, Kase S, Ohno S. Suppressive effects of astaxanthin against rat endotoxin- induced uveitis by inhibiting the NF-kB signaling pathway. Exp Eye Res 2006; 82: 275–281. 247.Tauler P, Aguilo A, Gimeno I, Fuentespina E, Tur JA, Pons A. Response of blood cell antioxidant enzyme defences to antioxidant diet supplementation and to intense exercise. Eur J Nutr 2006; 45: 187-195. 248.Tauler P, Aguilo A, Gimeno I, Fuentespina E, Tur JA, Pons A. Influence of vitamin C diet supplementation on endogenous anti-oxidant defences during exhaustive exercise. Pflugers Arch 2003; 446: 658-664. 249.Tauler P, Ferrer MD, Sureda A, Pujol P, Drobnic F, Tur JA, Pons A. Supplementation with an antioxidant cocktail containing coenzyme Q prevents plasma oxidative damage induced by soccer. Eur J Appl Physiol 2008; 104: 777-785. 250.Tauler P, Gimeno I, Aguiló A, Guix MP, Pons A, Regulation of erythrocyte antioxidant enzyme activities in athletes during competition and short-term recovery. Pflugers Arch 1999; 438: 782-787. 251.Tauler P, Sureda A, Cases N, Aguilo A, Rodriguez-Marroyo JA, Villa G, Tur JA, Pons A. Increased lymphocyte antioxidant defences in response to exhaustive exercise do not prevent oxidative damage. J Nutr Biochem 2006; 17: 665-671. 252.Teeuw W, Bosch JA, Veerman ECI, Nieuw Amerongen AV. Neuroendocrine regulation of salivary IgA synthesis and secretion: impications for oral health. Biol Chem 2004; 385: 1137-1146. 147 253.Teixeira V, Valente H, Casal S, Marques F, Moreira P. Antioxidant status, oxidative stress, and damage in elite trained kayakers and canoeists and sedentary controls. Int J Sport Nutr Exerc Metab 2009; 19: 443-456. 254.Teixeira VH, Valente HF, Casal SI, Marques AF, Moreira PA. Antioxidants do not prevent postexercise peroxidation and may delay muscle recovery. Med Sci Sports Exerc 2009; 41: 1752-1760. 255.Tharp GD. Basketball exercise and secretory immunoglobulin A. Eur J Appl Physiol Occup Physiol 1991; 63: 312-314. 256.Tian Y, Nie J, Tong TK, Baker JS, Thomas NE, Shi O. Serum oxidant and antioxidant status during early and late recovery periods following an all-out 21-km run in trained adolescent runners. Eur J Appl Physiol 2010; 110: 971–976. 257.Tiollier E, Gomez-Merino D, Burnat P, Jouanin JC, Bourrilhon C, Filaire E. Intense training: mucosal immunity and incidence of respiratory infections. Eur J Appl Physiol 2005; 93: 421-428. 258.Tomasi TB. The discovery of secretory IgA and the mucosal immune system. Immunol Today 1992; 13: 416-418. 259.Tripathi DN, Jena GB. Intervention of astaxanthin against cyclophosphamide- induced oxidative stress and DNA damage: A study in mice. Chem-Biol Interact 2009; 180: 398–406. 260.Tsakiris S, Karikas GA, Parthimos T, Tsakiris T, Bakogiannis C, Schulpis KH. Alpha-tocopherol supplementation prevents the exercise-induced reduction of serum paraoxonase 1/arylesterase activities in healthy individuals. Eur J Clin Nutr 2009; 63: 215–221. 261.Tso MOM, Lam TT. Method of retarding and meliorating central nervous system and eye damage. U.S. Patent, #5527533. 1996. 262.Turner JE, Hodges NJ, Bosch JA, Aldred S. Prolonged depletion of antioxidant capacity after ultraendurance exercise. Med Sci Sports Exerc 2011; 43: 1770-1776. 148 263.Urso ML, Clarkson PM. Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation. Toxicology 2003; 189: 41-54. 264.Vaughan S, Jat PS. Deciphering the role of nuclear factor-kappa B in cellular senescence. Aging (Albany N.Y.) 2011; 3: 913-919. 265.Viitala PE, Newhouse IJ, LaVoie N, Gottardo C: The effects of antioxidant vitamin supplementation on resistance exercise induced lipid peroxidation in trained and untrained participants. Lipids Health Dis 2004; 3: 14. 266.Waring WS, Convery A, Mishra V, Shenkin A, Webb DJ, Maxwell SR. Uric acid reduces exercise-induced oxidative stress in healthy adults. Clin Sci (Lond) 2003; 105: 425-430. 267.Watson TA, Callister R, Taylor RD, Sibbritt DW, MacDonald-Wicks LK, Garg ML. Antioxidant restriction and oxidative stress in short-duration exhaustive exercise. Med Sci Sports Exerc 2005; 37: 63-71. 268.Welch PK, Zager KA, Endres J, Poon SW. Nutrition education, body composition and dietary intake of female college athletes. Phys Sports Med 1987; 15: 63-74 269.Wolz E, Liechti H, Notter B, Oesterhelt G, Kistler A. Characterization of metabolites of astaxanthin in primary cultures of rat hepatocytes. Drug Metab Dispos 1999; 27: 456-462. 270.Wu HJ, Chen KT, Shee BW, Chang HC, Huang YJ, Yang RS. Effects of 24 h ultra- marathon on biochemical and hematological parameters. World J Gastroenterol 2004; 10: 2711-2714. 271.Yasunori N, Miharu M, Jiro T, Akitoshi K, Yoshiharu H, Yuri S, Hiroki T. The effect of astaksantin on retinal capillary blood flow in normal volunteers. J Clin Ther Med 2005; 21: 537-542. 272.Yılmaz N, Eren E, Erel O. Activity paraoxonase and arylesterase and its relationship to antioxidat profiles in young basketball players and sedentarycontrols. Medicina Sportiva 2007; 11: 20-26. 149 273.Yuan J, Peng J, Yin K, Wang J. Potential health-promoting effects of astaxanthin: A high-value carotenoid mostly from microalgae. Mol Nutr Food Res 2011; 55: 150– 165. 274.Zaripheh S, Erdman Jr JW. Factors that influence the bioavailability of xanthophylls. J Nutr 2002; 132: 531S–534S 275.Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med 2003; 33: 337–349. 276.Zembron-Lacny A, Slowinska-Lisowska M, Szygula Z. Asseeement of the antioxidant effectivness of alpha-lipoic acid in healthy men exposed to muscle damaging exercise. J Physiol Pharmacol 2009; 60: 139-143. 277.Ziegler DM. Role of reversible oxidation-reduction of enzyme thiol-disulfides in metabolic regulation. Ann Rev Biochem 1985; 54: 305-329. 278.Zoppi CC, Hohl R, Silva FC, Lazarim FL, Neto JM, Stancanneli M, Macedo DVl. Vitamin C and E supplementation effects in professional soccer players under regular training. J Int Soc Sports Nutr 2006; 3: 37-44. 150 Biografija Ivana Baralić je roĊena 26. maja 1976. godine u Ĉaĉku. Na Farmaceutski fakultet u Beogradu, smer diplomirani farmaceut, upisana je školske 1995/96. godine, a diplomirala 2002. godine sa srednjom ocenom 9,26 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Po obavljenom jednogodišnjem pripravniĉkom staţu za farmaceute, poloţila je struĉni ispit 27.07.2004. godine. Školske 2002/2003. godine upisana je na poslediplomske magistarske studije na predmetu Bromatologija, a od oktobra 2009. godine pohaĊa doktorske akademske studije, modul Bromatologija. Novembra 2006. godine upisala je specijalistiĉke studije iz Farmakoekonomije i farmaceutske legislative na Farmaceutskom fakultetu. Aprila 2008. godine specijalizirala je iz oblasti farmaceutske legislative sa radom »Analiza dijetetskih suplemenata na bazi glukozamina na trţistu Srbije« sa odliĉnom ocenom. Autor je i koautor u 5 originalnih radova objavljenih u ĉasopisima od meĊunarodnog znaĉaja, kao i 23 saţetaka radova prezentovanih na domaćim i meĊunarodnim skupovima farmaceuta i doktora medicine. Uĉestvovala je u nauĉno-istraţivaĉkom radu u okviru istraţivaĉkog razvojnog projekta »Napitak od surutke-nova tehnologija« u okviru »Nacionalnog programa biotehnologije i agroindustrije«, ĉiji je nosilac Tehnološki fakultet iz Novog Sada. U okviru ovog projekta radila je ispitivanje uticaja senzorne stimulacije napicima od surutke na produkciju sekretornog IgA u salivi kod karatista. Uĉestvovala je ispitivanju potencijalnih prognostiĉkih markera za Wilms-ov tumor na Insititutu za Patologiju, Medicinskig fakulteta u Beogradu. Uĉestvuje u nauĉno-istraţivaĉkom radu Katedre za Bromatologiju, Farmaceutskog fakulteta u Beogradu i Udruţenja za Medicinu Sporta Srbije. Od 2011. godine je aktivan ĉlan Centra za sportsku ishranu i suplementaciju. TakoĊe je angaţovana kao doping kontrolor u okviru Antidoping agencije Republike Srbije. Od oktobra 2002. godine do aprila 2005. godine je bila zaposlena u Institutu za Bromatologiju, Farmaceutskog fakulteta kao struĉni saradnik. Uĉestvovala je u izvoĊenju praktiĉne nastave na Farmaceutskom fakultetu u Banja Luci. Od aprila 2005. godine je zaposlena u Velefarmu A.D. Holding kao viši komercijalno struĉni saradnik. 151 Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Ивана Баралић број уписа 31/09 Изјављујем да је докторска дисертација под насловом „Утицај суплементације астаксантином на ниво маркера оксидативног стреса и ниво секреторног ИгА у саливи код младих фудбалера―  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, __23.10.2012._______ 152 Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора ____Ивана Баралић_____________________________ Број уписа ______31/09_____________________________________________ Студијски програм _Докторске академске студије -модул Броматологија_______ Наслов рада _„Утицај суплементације астаксантином на ниво маркера оксидативног стреса и ниво секреторног ИгА у саливи код младих фудбалера―___ Ментор ___др сц. Брижита Ђорђевић____________________________________ Потписани ____Ивана Баралић_____________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, __23.10.2012._________ 153 Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић― да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: „Утицај суплементације астаксантином на ниво маркера оксидативног стреса и ниво секреторног ИгА у саливи код младих фудбалера― која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, __23.10.2012.__________