Универзитет у Београду Факултет за физичку хемију Јелена Ч. Платиша-Поповић Синтеза и карактеризација генетички кодираних флуоресцентних волтажних индикатора Докторска дисертација Београд, 2013 University of Belgrade Faculty of Physical Chemistry Jelena Č Platiša-Popović Synthesis and characterization of genetically encoded fluorescent voltage indicators Doctoral dissertation Belgrade, 2013 Ментори др Горан Г. Бачић, редовни професор, Факултет за физичку хемију, Универзитет у Београду др Винсент A. Пирбон (Vincent A. Pieribone), редовни професор, The John B Pierce Laboratory-Yale University Чланови комисије др Павле Р. Анђус, редовни професор, Биолошки факултет, Универзитет у Београду др Милош Мојовић, доцент, Факултет за физичку хемију, Универзитет у Београду Датум одбране Захвалница Рад који сам уложила у израду ове дисертације је био свесрдно помогнут залагањем од стране немалог броја људи из неколико лабораторија са којима сам имала задовољство и срећу да сарађујем. Изузетно сам сретна да могу да се захвалим мом ментору др Винсенту Пирбону (Vincent Pieribone). Сарадња са њим је изузетан изазов, и кроз све успоне и падове за ово кратко време колико траје је представљала константан мотив за напредак не само у професионалном смислу. Хвала на пруженој шанси, поштовању, толеранцији, ентузијазму и имагинацији који чине нашу свакодневницу у лабораторији све сем досадном. Искрену захвалност дугујем др Горану Бачићу. Хвала на уложеном времену и енергији. Хвала за толеранцију и разумевање које су омогућиле израду овог рада упркос свим техничким изазовима (укључујући и саму кандидаткињу). Посебну захвалност дугујем др Марку Поповићу који ми је помогао да уђем у свет у коме електрична активност нервних ћелија “светли у хиљаду боја”. Пружена подршка и разумевање су ретке драгоцености. Хвала што држиш “лествицу” високо, хвала за све дискусије и расправе које су ми помогле да изађем из “кутије”. Хвала за све минуте који трају сатима а које си провео “фризирајући” мој “риг”. Хвала др Милошу Мојовићу на подршци и разумевању. Хвала за време утрошено на бављење разноразном “папирологијом” које је у мом одсуству углавном завршавала у твом “дворишту”. Врло сам захвална члновима Пирбон лабораторије др Џоу Хану (Zhou Han), Ахмеду Осману (Ahmad Osman) и др Евану Парку (Evan Park). Хвала др Лоренсу Коену (Lawrence Cohen) и члановима његове лабораторије др Леи Ђин (Lei Jin) и др Бредли Бејкеру (Bradley Baker), др Томасу Хјузу (Thomas Hughes) и Лорен Барнет (Lauren Bаrnett), др Мајкл Нитебаху (Michael Nitabach) и члановима његове лабораторије др Гуан Цау (Guan Cao), др Мајклу Кунсту (Michael Kunst) и др Дејвиду Ракуљи (David Racugglia). Захваљујем се др Павлу Анђусу, др Нади Зечевић и др Дејану Зечевићу. Почетни стадијум мојих докторских студија је био помогнут пројектима Министарсва науке и технолошког развоја Србије 173015 и 143026 под вођством др Бранке Винтерхалтер. Ја јако волим овај рад и период живота који сам провела радећи на њему и због тога га посвећујем мојим родитељима Марији и Чедомиру, и сећању на једну Марину. Сажетак Синтеза и карактеризацја генетички кодираних флуоресцентних волтажних индикатора Електричне промене представљају начин комуникације између неурона и чине основу комплексних феномена у понашању као што су перцепција, сензорно- моторна интеграција, учење и памћење. Активност неурона представља колекцију различитих електричних догађаја који варирају како у трајању, тако и у простирању. Праћење електричне активности неурона у свој просторној и временској комплексности подразумева развијање метода које поседују високу темпоралну резолуцију и висок однос сигнала према шуму. Идеални метод би био у стању да прати подпражне и надпражне промене мембранског потенцијала на нивоу појединачне ћелије и са резолуцијом мањом од секунде. Примена оптичких метода за снимање електричне активности мозга представља мање деструктивну алтернативу традиционалним електрофизиолошким методама базираним на примени електрода. Oптичка снимања нуде високу просторну резолуцију омогућујући симултана снимања са различитих локација у оквиру видног поља, од нивоа појединачних ћелија и делова ћелије до нивоа нервних кола која се састоје од стотина, ако не и хиљада неурона. Током вишедеценијског развоја, почевши од раних експеримената базираних на снимању урођених сигнала који се јављају при нервној активност па све до развоја бројних волтажних боја мале молекулске масе, оптичка снимања су омогућила стицање значајнх сазнања о функционисању мозга и неуралној обради података. Ипак, и у најразвијенијој верзији овим методама недостаје просторна/временска резолуција и ћелијска специфичност која би омогућила опширне студије у будним и активним животињама. У овом раду је описан развој синтетичког протеинског конструкта који експримиран у сисарским неуронима показује промену интензитета флуоресценције у одговору на промене у мембранском потенцијалу. Развој оваквих индикатора је део великих напора који се већ дуже време улажу у области оптичког снимања а који су окренути развоју генетички кодираних волтажних индикатора. Главна предност развоја оваквих проба у односу на доступне волтажне боје малих молекулских маса је могућност циљане експресије у специфичним ћелијама која би даље омогућила снимање електричне активности из жељених ћелија. Током последње две деценије напори да се издизајнира оваква проба су се базирали на примени два концепта. Оригинални концепт у дизајну проба се базира на прављењу фузија између природних волтажно-сензитивних домена (ВСД) изолованих из волтажно-сензитивних протеина и једног или пара флуоресццентних протеина. Недавно представљен алтернативни концепт у дизајну проба се базира на слабој флуоресценцији бактеријских родопсина за коју је показано да може бити модификована променама у мембранском потенцијалу. И док су до сада у литератури описани многобројни генетички кодирани индикатори, ниједан од њих се још увек није нашао у рутинској употреби за оптичку детекцију спонтаних промена у мембранском потенцијалу у интактном нервном ткиву. Циљ овог рада је био дизајн волтажно-осетљивих, флуоресцентних протеинских проба које показују највећу промену у флоресценцији за дату промену напона и које могу бити употребљене за оптичка снимања у неуронима in vivo. За развој и тестирање пробе која се базира на фузији ВСД-а изолованог из Ciona intestinalis волтажно-осетљиве фосфатазе и различитих варијанти зеленог флуоресцентног протеина кориштене су методе из области молекуларне биологије, ћелијске културе, електрофизиологије и оптичког осликавања. Напредак техника које се користе у молекуларној биологији нам је омогућио креирање проба које су фузија између природних протеина и њихову експресију у различитим типовима ћелија помоћу трансфера комплементарне ДНК. Једном развијене нове потенцијалне пробе су даље тестиране електрофизиолошким и оптичким методама. Иницијално тестирање уз употребу конфокалне микроскопије је омогућило процену и поређење различитих конструката на основу мембранске експресије у бесмртној сисарској ћелијској линији HEK293 и у примарној култури хипокампалних неурона миша. Примена комбинације техника наметнуте волтаже на целу ћелију и широкопољне епи-флуоресцентне микроскопије је омогућила детаљну анализу карактеристика потенцијалних волтажних индикатора. Коначна процена проба је урађена на основу добијених резултата из HEK293 ћелија и неурона, и то како за однос сигнала према шуму, тако и за фракциону промену у интензитету флуоресценције.   У овом раду истражена је могућност употребе циркуларно-пермутоване варијанте побољшаног зеленог фуоресцентног протеина (cpEGFP) у дизајну волтажних проба. Ова варијанта ФП се претходно показала врло успешном приликом дизајна протеинских Ca++ проба (такозвана GCaMP-серија индикатора). Пробе у којима је кориштен cpEGFP су показале изузетно високу сензитивност као Ca++ индикатори што нас је навело да истражимо могућу примену овако измељеног ФП у дизајну волтажних индикатора. Од 24 потенцијалне пробе чија је сензитивност тестирана методом наметнуте волтаже на целу ћелију, девет није показало волтажну сензитивност или је она била занемарљиво ниска (~0.1% ΔF/F) у одговору на тест пулсеве (деполаризациона промена од 100 mV док је ћелија држана на потенцијалу од −70 mV). Остали конструкти су у одговору на исти тест пулс показали промену у интензитету флоресценције која се кретала од +0.33% до −1.2% ΔF/F. Проба која је показала највећу осетљивст из ове серије конструката је pLB2.7 (−1.2 ± 0.18% ΔF/F), названа ElectricPk. Ову пробу одликује брза кинетика активације (~ 2ms) и деактивације (~ 2ms). ElectricPk је прва проба базирана на CiVS која успешно прати брза померања у волтажном сензору, што указује на чињеницу да примена циркуларно пермутованих протеина у дизајну ових проба може имати предности. Експресија индикатора ElectricPk у неуронима миша је показала мембранску локализацију пробе у ћелијској соми и наставцима, али и присуство извесне количине интраћелијскиог депозита. ElectricPk индикатор се показао способним за детекцију појединачних акционих потенцијала са високом временском резолуцијом. Узлазна и силазна фаза акционих потенцијала су јасно уочљиве. Упркос скромној величини сигнала (~0.7% ΔF/F), која варира у зависности од нивоа експресије, низове акционих потенцијала је било могуће уочити без упросечавања сигнала. Иницијална проба која је довела до развоја ArcLight-фамилије волтажних индикатора се базирала на употреби pH-сензитивне варијанте зеленог флуоресцентног протеина, ecliptic pHluorin. И док је волтажни индикатор који садржи ecliptic pHluorin показао ниску волтажну осетљивост (-1.3% ± 0.3% ΔF/F за +100mV тест пулсеве), у једној од HEK293 ћелијских линија која стабилно експримира ову пробу смо открили ненамерну мутацију А227D у оквиру флуоресцентног протеина. Мутирана проба је показала 14 пута већу волтажну осетљивост (-18.1% ± 1.4 %, n = 6) у ΔF/F за деполаризационе пулсеве од 100mV у односу на оригиналну пробу. Даља модификација ове пробе која је подразумевала употребу светлије верзије ФП-а, super ecliptic pHluorin и скраћивање аминокиселинске секвенце која повезује волтажни сензор и ФП је довела до развоја низа проба које показују и до ~40% у ΔF/F за 100mV у HEK293 ћелијама. Експресија ArcLight у сисарским хипокампалним неуронима у култури и интактном мозгу винске мушице (Drosophila melanogaster) је довела до јасне појаве флуоресценције а сигнал који производи омогућава поуздану детекцију појединачних акционих потенцијала беѕ потребе за упросечавањем сигнала. Пробом је могуће детектовати подпражне промене у мембранском потенцијалу, као и промене које се дешавају на нивоу финих наставака нервне ћелије. ArcLight је прва гентички кодирана проба која производи поуздане и велике сигнале in vivo, и као таква представља очигледан напредак у развоју групе метода које ће омогућити неурофизиолошка истраживања базирана искључиво на оптичким методама. Кључне речи: зелени флуоресцентни протеин, генетички кодирани волтажни индикатори, биосензори, оптичо снимање. Abstract Synthesis and characterization of genetically encoded fluorescent voltage indicators Electrical events are the mode of communication among neurons that underly all complex behaviors including perception, sensory-motor integration, learning and memory. Neurons exhibit a collection of different transient electrical events that vary in both spatial and temporal domains. To be able to analyze these events we need methods with both high temporal resolution and large signal to noise ratio. The ideal method would be able to detect both subthreshold and suprathreshold level changes in membrane potential, in single cells (or subcellular domains) at submillisecond resolution. Use of light to record brain electrical activity represents a less invasive alternative to classical electrode-based methods and can provide high spatial resolution. Optical methods allow simultaneous recordings from different locations within a field of view, from the level of single cell and cell compartments to the level of neuronal circuits comprising of hundreds, if not thousands neurons simultaneously. Over the last couple of decades, with early experiments using intrinsic signals that arise with neuronal activity all the way to development of numerous small molecule synthetic dyes optical methods provided unique information on brain function and neuronal information processing. However, even in its most advanced form these methods lack the spatial/temporal sensitivity and cell specificity that would allow comprehensive studies of neuronal function. The present studies describe the development of synthetic protein constructs which when expressed in mammalian neurons produce change in fluorescence intensity in response to changes in membrane potential. Development of the indicators presented here is part of a greater efforts in the field of optical imaging to produce genetically- encoded voltage indicator (GEVI). These probes would allow cell targeted expression and consequently cell type specific recordings of neuronal activity. In the last two decades efforts to produce such probes have employed two major design concepts. In the first approach, indicators are made as a fusions between naturally occurring voltage sensing domains (VSD) derived from voltage-sensitive proteins and fluorescent protein(s). The more recent approach is based on the use of the weak fluorescence of a bacterial rhodopsins that has been shown to be modulated by transmembrane potential. While multiple genetically encoded voltage indicators have been previously reported, none have proven routinely usable in intact neural tissue for optical detection of spontaneous changes in membrane potential. The aim of the current work was to design voltage sensitive, protein-based optical probes that produce the largest fluorescence response for a given voltage change and have practical utility in in vivo experiments in neurons. In our work we used techniques in molecular biology, cell culture, electrophysiology, and imaging to develop voltage probes that are fusions between the voltage sensor domain derived from Ciona intestinalis voltage-sensor-containing phosphatase (Ci-VSP) and several variants of green fluorescent protein (GFP). We used advances in molecular biology techniques that allowed us to create artificial fusions between naturally occurring proteins and expressed them via cDNA transfer into cultured cells. Once novel probes were developed, they were tested with a variety of electrophysiology/imaging paradigms. An initial step included examination under a confocal microscope in order to estimate and compare different probes for membrane expression in mammalian HEK293 cells and in rodent hippocampal neurons. Patch clamp technique combined with wide-field fluorescence imaging allowed us to screen potential probes for their performance as voltage change detectors. The final evaluation of probes was based on both signal-to- noise ratio (SNR) and fractional change in fluorescence detected in both HEK293 cell line, hippocampal rodent neurons and in vivo in Drosophila neurons. One approach in this study was to investigate the use of circularly permuted, enhanced green fluorescent protein (cpEGFP). Probes using cpEGFP have generated Ca ++ sensors (GCamPs) of remarkable sensitivity and led us to explore whether this design could be extended to voltage sensors. Out of 90 constructs that we made, 24 constructs that were tested in patch clamp experiments for voltage sensitivity, nine showed negligible (~0.1% ΔF/F) or no change in fluorescence in response to test voltage steps (+100 mV from a −70 mV holding potential). The remaining constructs exhibited from +0.33% to −1.2% ΔF/F response to such voltage steps. The probe with the greatest response magnitude in this series was pLB2.7 (−1.2 ± 0.18% ΔF/F), named ElectricPk, also exhibited a fast kinetics of activation (~ 2ms) and deactivation (~2 ms). This makes ElectricPk the first probe based on CiVSP that captures the rapid movements of the voltage sensor, suggesting that voltage probes designed with circularly permuted fluorescent proteins may have some advantages. When expressed in cultured mouse hippocampal neurons ElectricPk shows good membrane localization evident in the cell soma and processes, with some intracellular deposits. Testing of a voltage sensitivity showed that ElectricPk is capable of resolving action potentials with extraordinary temporal fidelity. The rising and falling phases of the action potential were evident. The signal size was modest (~0.7% ΔF/F), and varied with expression intensity, yet action potential trains were detectable without trial averaging. The starting point for the development of the ArcLight-family of probes was a pH-sensitive version of GFP, ecliptic pHluorin. While the original probes containing ecliptic pHluorin exhibited small voltage-dependent changes in fluorescence intensity (~-1.3%) to a +100mV voltage step, we discovered one stable HEK293 cell line in which contained an unintended point mutation (A227D) within the inserted ecliptic pHluorin. The mutant sensor produced a 14-fold increase (~-18.1%) in ΔF/F per +100mV. Further modifications that included use of brighter FP (super ecliptic pHluorin) and shortening the length of the amino acid sequence (linker) that connects VSD to FPs led us to a series of probes that exhibited up to ~40% in ΔF/F per 100mV when tested in HEK293 cultured cells. Expression of ArcLight in cultured mouse hippocampal neurons and in the intact brain of transgenic fruit flies (Drosophila melanogaster) produced fluorescence that is both bright enough and produces a large enough response to reliable detect action potentials in single trials. In addition the probe can report subthreshold changes in membrane potential as well as voltage changes in fine processes and dendrites. All this makes the ArcLight probe the first genetically encoded probe that produces reliable and robust signals in vivo. These probes have widespread potential as genetically targetable, minimally invasive probes of cellular membrane potential. Keywords: green fluorescent protein, genetically encoded voltage indicators (GEVI), biosensors, optical imaging. Садржај I. Увод 3 • Снимање електричне активности мозга уз употребу електрода 3 • Оптичка снимања електричне активности мозга 9 Оптичка снимање базирана на урођеним сигналима и синтетичким бојама малих молекулских маса 10 Генетички кодирани волтажни индикатори 12 Принципи дизајна генетички кодораних волтажних проба 14 Развој генетички кодираних волтажних проба 14 II. Материјал и методе 24 • Молекуларна биологија 24 • Ђелијска култура in vitro- имортализована ћелијска линија HEK293 и примарни сисарски неурони 25 • Генерисање трансгених ArcLight винских мушица 26 • Пречишћавање флуоресцентних протеина 27 • Спектрофлуориметрија 28 • Комбиновање метода наметнуте волтаже/струје на целу ћелију и оптичког снимања 28 • Контролне студије утицаја експресије ArcLight GEVI на физиологију винске мушице 31 • In vivo препарат винске мушице и апликација мириса 32 • Конфокална микроскопија 32 • Анализа података 33 III. Резултати 36 • Флуоресцентне волтажно-зависне протеинске пробе базиране на циркуларно пермутованом флуоресцентном протеину 36 1 • Флуоресцентне волтажно-зависне протеинске пробе базиране на pH- сензитивном зеленом флуоресцентном протеину 45 IV. Дискусија 74 V. Литература 83 VI. Биографија 93 Библиографија 93 Зборници са међународних/националних научних скупова 94 2 Увод Снимање електричне активности мозга уз употребу електрода Од пионирских експеримената Кахала (Santiago Ramón y Cajal) и Голџија (Camillo Golgi) са почетка века до данас опште је прихваћена чињеница да је понашање животиња резултат активности настале у нервном ткиву. У својој основи проучавање електричне активности мозга подразумева одговор на питање: како електрична активност неурона генерише функционисање организма? И најбазичнији одговор на ово питање подразумева да знамо који неурони су умешани у дати процес, где су те ћелије лоциране (Levitan and Kaczmarek, 1997), као и детаљан опис просторне и временске динамике веза које постоје међу тим ћелијама. Постоји велики број различитих приступа у решавању проблема обраде информација у нервном ткиву и они се крећу од веома поједностављених до целовитих. Тако постоје студије која се баве физиологијом на нивоу појединачних неурона које за циљ имају дефинисање комплексних веза које постоје између великог броја неурвних ћелија и њихово мапирање у функционалне мреже. На другом крају овог широког спектра су студије понашања у којима се истраживањем понашања покушава растумачити функционисање мозга. У том смислу, приступ који појединац има у свом раду је питање личних преференци и/ или уверења и представља предмет жустрих расправа међу научницима. Упркос или можда управо захваљујући овим размирицама, резултати рада великог броја истраживача у области неуронаука је довео до импресивне количине сазнања о томе како мозак функционише. Захваљујући пионирском раду Галванија електрична природа нервне активности је позната већ више од 200 година. Већ у то време постало је извесно да се функционисање нервног система базира на некој врсти електричне активности. Модерна истраживања су показала да електрична активност неурона проистиче из разлике у концентрацији јона која постоји унутар и ван ћелије 3 (Hodgkin et al., 1952). Ова неједнака дистрибуција јона је резултат рада енергетски зависних транспортера. Електрична активност у ћелији се јавља као последица рада читавог низа трансмембранских јонских канала који омогућавају проток јона са једне на другу страну ћелијске мембране. Разлика у концентрацији јона са две стране ћелијске мембране и разлика у проводљивости мембране за различите јоне продукују трансмембрански мембрански потенцијал (Johnston and Wu, 1995; Hille, 2001). Поред читавог низа улога које трансмембрански потенцијал игра у физиологији ћелије као што су мембрански транспорт и продукција АТП-а у митохондријама, у овом раду ће бити речи о нервним импулсма који чине основу функционисања нервног систем а чија пропагација је директна последица постојања трансмембранског потенцијала. Електричне промене представљају начин комуникације између неурона и чине основу комплексних феномена у понашању као што су перцепција, сензорно- моторна интеграција, учење и памћење. Активност неурона представља колекцију различитих електричних догађаја који варирају како у трајању, тако и у простирању (Слика 1 и 2). Нервни импулси, постсинаптички потенцијали (ПСП), потпражне осцилације (тј. мождани ритмови) и полустабилне промене потенцијала (тј. горња и доња стања) имају темпоралне и просторне карактеристике које се протежу преко три реда величина, од микросекунда до минута односно од микрометара до милиметара. Очито је дакле, да је праћење нервне активности један од најважнијих циљева у неуронауци. Праћење електричне активности неурона у свој просторној и временској комплексности подразумева развијање метода које поседују високу темпоралну резолуцију и висок однос сигнала према шуму. Идеални метод би био у стању да прати подпражне и надпражне промене мембранског потенцијала на нивоу појединачне ћелије и са резолуцијом мањом од секунде (Scanziani and Hausser, 2009; Peterka et al., 2011). 4 Класичне методе праћења мембранског потенцијала подразумевају примену металних, стаклених или силиконских микроелектрода које се пласирају унутар (интрацелуларно) или у непосредној околини ћелије (екстрацелуларно). Данас методе које подразумевају употребу електрода омогућавају праћење електричне активности на различитим нивоима, од делова нервне ћелије (нпр. дендрита) до синхронизоване активности милиона неурона (Слика 1 и 3). Са једне стране, метод наметнуте волтаже/струје омогућава директно праћење разлике у потенцијалу са две стране мембране путем електроде која се налази у унутрашњости неурона (Hamill et al., 1981). Спој високе импендансе који се формира између електроде и ћелијске мембране обезбеђује очување високе отпорности мембранe и омогућава релативно неинвазивно мерење дискретних промена мембранског потенцијала/струја. Модеран дизајн опреме која се користи приликом ових снимања (појачивачи и мерне главе појачивача са ниским шумом) омогућава тако високу временску и просторну резолуцију да је могуће регистровати активност на нивоу појединачних јонских канала (Scanziani and Hausser, 2009). И док су методом наметнуте волтаже примењеном на ћелије гајене у in vitro условима, ћелије у можданим исечцима или анестезираним животињама добијена непроцењива сазнања о физиологији нервног система, овај приступ није могућ за in vivo физиолошке студије у будном животињама. Примена ове методе је најчешће ограничена на експерименте у којима се користе крупне ћелије или ћелијски делови гајени у in vitro условима. Употреба електрода у овим студијама је довољно инвазивна да за последицу има физичка оштећења ћелије и наставака чиме се искључује могућност хроничних мерења. Такође, употреба електрода најчешће ограничава снимања на појединачне ћелије док симултана снимања која укључују више ћелија иако могућа ипак представљају херојске подухвате (Scanziani and Hausser, 2009; Peterka et al., 2011). Низ метода које подразумевају пласирање електрода изван ћелијског тела спадају у екстрацелуларне методе снимања. Овим методама се могу снимати колекције неурона (и до неколико стотина неурона) како у можданим исечцим, 5 6 Слика 1. Употреба електрофизиолошких метода за мерење “када” електричне активности неурона. Репрезентативни примери записа низа електричних догађаја добијених електрофизиолошким методама уз употребу електрода: а) отварање појединачног никотин ацетилхолинског канала; б) нервни импулс у неурону церебелума снимљен in vivo; в) побуђујућа постсинаптичка струја (EPSC); г) и д) побуђујући постсинаптички потенцијал (EPSP) и низ нервних импулса из грануларних ћелија церебелума снимљених in vivo; ђ) гама осцилације (потенцијал локалне површине мозга- LFP) снимљених у хипокампусу анестезираног пацова; е) електроенцефалограм добијен снимањем мозга анестезираног миша током визуелне стимулације. Преузето из Scanziani and Hausser, 2009. Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orientation map in rat visual cortex measured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtained using electrophysiological or imaging approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orientation map i rat visual cortex measured using two-photon micros opy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtained using electrophysiological or imaging approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time ( ) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Електрофизиологија: када Нервни импулс Побуђујући постсинаптички потенцијал Побуђујућа постсинаптичка струја Потенцијал локалне површине мозга Јонски канала. б. в. г. Низ нервних импулсад. ђ. Електроенцефалограме. е. Електроенцефалограм ђ. Потенцијал локалне површине мозга . з нервних импулса . Нервн импулс а. Јонски канал в. Побуђујућа постсинаптичка струја Електро з ологија: када г. Побуђујући постсинаптичка потенцијал 7 Слика 2. Употреба оптичких метода за мерење “где” електричне активности неурона. Репрезентативни примери података добијених оптичким методама: а) компартментализације калцијума у појединачној нервној реси снимљена уз помоћ генетички кодираног сензора за калцијум и 2-фотонске микроскопије; б) локалне промене нивоа калцијума изазване синаптичким дејством паралелних влакана у односу на синаптичким квржицама богате танке гране дендритског стабла Пуркињеове ћелије у церебелуму; в) пирамидални неурон из 2/3 слоја визуелног кортекса миша снимљен 2- фотонском микроскопијом уз помоћ интрацелуларно апликоване калцијумске боје мале молекулске масе; г) орјентациона мапа у визуелном кортексу пацова измерена 2- фотонском микроскопијом; д) оптичко снимање уз употребу флуоресцентне волтажно- осетљиве боје у визуелном кортексу мачке. Преузето из Scanziani and Hausser, 2009. Оптичко снимање: где Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orientation map in rat visual cortex measured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtained using electrophysiological or imaging approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ а. Дендритска квржица б. Дендрит в. Неурон Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orie tation map i r t visual cortex measured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal inform tion can be obtained using electrophysiological or imag g approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ г. Нервно коло д. Површина 8 Слика 3. Употреба електрофизиолошких и оптичких метода за мерење “где” и “када” електричне активности неурона. Приказани су следећи примери: а) мерење интеракције између уназад простирућих нервних импулса и калцијумске активности у дендриту пирамидалног неурона из слоја 5 (L5) добијени методом наметнуте струје на целу ћелију уз употребу три електроде; б) праћење настанка потенцијала локалне површине мозга у визуелном кортексу мачке уз употребу вишеелектродног система који садржи 96 електроде при чему је просторна резолуција 400 µm (запис референтне активности је обележен црвеним); в) оптичко мапирање места иницијације нервног импулса у неурону из слоја 5 уз употребу волтажне боје; г) оптичко праћење активности у визуелном кортексу пацова уз употребу калцијумске боје (зелено) и специфичног маркера за астроците (сулфородамин 101, наранџаста) уз употребу 2-фотонске микроскопије где су уочљиве промене у нивоу калцијума и нервни импулси (растерска мапа, за ≥2 уочена импулса; 2 импулса црвена, 3 зелена, 4 тамно плава, 5 светло плава, 6 роза и 7 браон) у 13 симултано сниманих неурона у будној животињи. Преузето из Scanziani and Hausser, 2009. Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orientation map in rat visual cortex measured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtained using electrophysiological or imaging approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ а Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cortex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University College London); an orientation map in rat visual cortex me sured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtained using electrophysiological or imaging appr aches on their own. Examples includ measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recordings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated i red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of neuronal signals using electrophysiological and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combination of time resolution and sensitivity, allowing the precise determination of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples shown are of a single nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chadderton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual cort x in vivo using two-photon microscopy (courtesy f S. L. Smith, University College London); an orientation map in rat visual cortex measured using two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (courtesy of A. Benucci and M. Carandini, University Co lege London). c, In some cas s, bo h spatial and t mporal information can be obtained using electrophysiological or imaging approaches on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simultaneous patch-clamp recor ings (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of he LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiol gy: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ f n ur nal signals using electrophysiolo ical and optical approaches. a, The primary strength of electrophysiology is its combin tion of time re olut n and sensitivity, allowing the precise determinati n of the t poral patter of neuronal signals over many orders of mag itude, with high sign l-to-nois ratio. Representative ex mples shown are of a singl nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. H llerm , D. Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, German ); an ction potential in a cerebellar interneuron in vivo (court sy of P. Chadd rton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadderton) from cerebellar granule cells in vivo; gamma oscillations (local field pote tial, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of Ca if r ia, Sa Diego); and a lectroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse visual c rtex in vivo using two-photon microscopy (courtesy of S. L. Smith, University ollege London); an orientation map in rat visual c rtex measured using two-photon icroscopy8; and optical imaging of voltage-s nsitive-dye fluorescence to record receptive-field properties ac ss cat visual cortex (cou esy f A. Benucci and M. Carandini, University College London). c, In some cases, both spatial and temporal informati n can be obtained using electrophysiological or imaging approach s on their own. Examples include measuring the interaction of backward-propagating a tion otentials with dendritic calcium spikes recorded i layer-5 (L5) cortical pyramidal neurons using three sim ltaneous patch-cla p rec rdi s (courtesy of M. Larkum, University of Bern, Switzerland); recording the origin of the LFP signal in cat visual cortex sing a 96-elect ode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, U iversity College London); optical mapping of the initiation site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calcium dye (green), counterstained with an astrocyte-specific marker (sulforhodamine 101, orange) and imaged using two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Figure 2 | Measuring the ‘when’ and ‘wh re’ of neuronal s gnals usi g electrophysiolo ical and optical approaches. a, T p imary stre g h of electrophysiology is its combi ation of tim resolution and sensitivity, allowing the precise det rmination of the temporal pattern of neuro al signals over many orders of magnitude, with high signal-to-noise ratio. Representative examples s own are f a si gle nicotinic acetylcholine channel opening (courtesy of S. Hallerman, . Ljaschenko and M. Heckmann, University of Würzburg, Germany); an action potenti l in a cerebellar interneuron i vivo (court sy f P. Cha derton, Univ rsity College London, UK); an excitatory postsyn ptic current (EPSC), an excitatory postsynaptic potential (EPSP; courtesy of I. Duguid, University College London) and a spike train (P. Chadd ton) from cerebellar granu e cells in vivo; gamma oscilla i ns (local field potential, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of California, San Diego); and an electroencephalogram from an anaesthetized mouse during visual stimulation (B. Atallah . b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over a wide range of scales. Representative examples shown are of calcium compartmentalizatio in a single hippocampal spine measured using a genetically encoded calcium sensor and two-photon mi roscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Fr edrich M scher Institute, Basel, Switzerla d); loc l calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet i the dendritic tree of a cerebellar Purkinj cell (courtesy of A. Konnerth, Technical University Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal neuron filled with a calcium dye and visualized in mouse i ual cortex in vivo using two-photon micr sc py (courtesy of S. L. Smi , University Coll g Lo don); an rientation map in rat visual cortex measured usi g two-photon microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitive-dye fluorescence to record receptive-field properties across cat visual cortex (co rtesy of A. Benucci and M. Carandini, University College L ndon). c, In some cases, both spatial and temporal information can be obtaine using electrophysiological or imaging approaches on t ir wn. Examples inclu e measur g the interaction of backward-prop gating action pote tials with dendritic calcium spikes recorded in layer-5 (L5) cort cal pyramidal neurons using three simultaneous pa ch-clamp rec rdings ( ourtesy of M. Larkum, University of Ber , Switz rla ); recordi the o igin f th LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array with a spatial resolution of 400 μm (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Carandini, University College London); optical mapping of the initiat on site of the action potential in layer-5 pyramidal neurons using voltage-sensitive dyes (courtesy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns in rat visual cortex loaded with a calciu dye (green), counterstained with a astrocyte-specific marker (sulforh damine 101, orange) and imaged usi g two-photon microscopy, with traces showing calcium transients and detect spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 da k blue, 5 light bl e, 6 p k and 7 brow ) simultaneously recorded f om 13 ne rons in the awake animal (courtesy of D. Greenberg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ Fig re 2 | Measuring the ‘when’ and ‘where’ of ne r l sig als u i g electrophysiological and optical ppr ac es. a, The primary st ength of electrophysiology is its c mbination of time resolution a d sensitivity, allowi g th precise determin tion of the temporal pattern of neuronal signals over many orders of magnitude, with high signal-t -noise ratio. Represent tive exa pl s shown are f a single nicotinic acetylchol ne channel openi g (courtesy of S. Hallerman, D. Ljaschenko and M. Heckmann, U iversity of Würzburg, Germany); an ction potential in a cerebellar interneuron in vivo (courtesy of P. Chad erton, University College London, UK); an excitatory postsynaptic current (EPSC), an excitatory posts naptic potential (EPSP; court sy f I. Duguid, Unive ity College London) and a spike tr in (P. Chadderton) from cerebellar gr nule cells in vi o; gamm oscillations (local fi ld poten ial, LFP) recorded in the hippocampus of an anaesthetized rat (courtesy of B. Atallah, University of Californi , San Diego); and n electroencephalogram from an anaesthetized m use during v sual stimula n (B. Atallah). b, The primary strength of imaging approaches is their spatial resolution, allowing physiological events to be localized with high spatial precision over wide range of scales. Rep esentative examples shown are of calcium compartmentalization in a single hippocampal spin measured using a genetically encoded calcium sensor and two- hoton microscopy (courtesy of Y.-P. Zhang and T. Oertner, Friedrich Miescher Institute, Basel, Switzerland); local calcium transient triggered by parallel-fibre synaptic input to a fine spiny branchlet in the dendritic tree of a cerebellar Purkinje ce l (courtesy of A. Konn rth, Technical Unive sity Munich, Germany); a layer-2/3 pyramidal euron filled with a calcium dye and visualized in ouse visual cortex in vivo using two-photon microsc py (courtesy of S. L. Smith, University College London); an ori nt tion map i rat visual cortex measured using two-phot n microscopy8; and optical imaging of voltage-sensitiv -dye fluorescence to r cord rec ptive-field properties across cat visu l cortex (courtesy of A. Be ucci and M. Carandini, Unive sity College London). c, In s me ases, both spatial and temporal inform tion can be obtained using electrop ysiological or imaging approa hes on their own. Examples i clude measuring the inter ction of backward-propagating action potentials with dendritic calcium spikes recorded in lay -5 (L5) cortical pyramidal neurons using three simulta eous patch-c amp rec rdings ( urtesy of M. Lark m, Univers y of Bern, Switzerland); ecording the origin of the LFP signal in cat visual cortex using a 96-electrode array wi h a spatial resolut on of 400 μ (reference spike from the electrode indicated in red; courtesy of I. Nauhaus and M. Car dini, Univ rs ty College London); optical mapping of the initiation site of the acti potential in layer-5 pyramidal neurons using volta e-sensitive dyes (court sy of L. Palmer and G. Stuart, Australian National University, Canberra, Australia); and optical monitoring of activity patterns i rat visu l cortex lo de with a calci m dye (green), ountersta ned with an astroc te-specific marker (sulforhodamine 101, orange) nd imaged using two-photon microscopy, with t aces showing cal ium transients and detected spiking activity (raster; for ≥2 detected spikes; 2 spikes red, 3 green, 4 dark blue, 5 light blue, 6 pink and 7 brown) simultaneously recorded from 13 neurons in the awake animal (courtesy of D. Gree berg, A. Houweling and J. Kerr, Max Planck Institute for Biological Cybernetics, Tübingen, Germany). 100 Nm1 Nm Spine Dendrite Neuron Circuit Area Channel EPSCSpike Spike trainEPSP LFP EEG b Imaging: where c When and where a Electrophysiology: when 50 Ns 1 ms 5 ms 10 ms 50 ms 100 ms 1 s Electrophysiology Imaging 10 Nm 50 Nm L1 L4 L5 L2/3 Pia 20 ms 40 mV 100 Nm Hillock 10–20 Nm 30–40 Nm 50–60 Nm 70–80 Nm Soma 90–100 Nm 1 ms 1% 0.5% 10 Nm 0 40% %F/F N eu ro n 1 13 Time (s) 0 10 20 30 400 Nm 2 mm 30 Nm 932 NATURE|Vol 461|15 October 2009INSIGHT REVIEW 930-939 Insight Hausser NS.indd 932 1/10/09 16:54:36 Ÿ)''0DXZd`ccXeGlYc`j_\ijC`d`k\[%8cci`^_kji\j\im\[ гв б тако и у анестезираним или будним животињама чиме је омогућено праћење електричне активности у субкортикалним и кортикалним деловима великих нервних кола (Nicoleis, 2008; Wiest et al., 2008; Hai et al., 2010). Развој ових метода је омогућио дуже трајање експеримената који у зависности од препарата који се користи трају од по неколико месеци (глодари) до чак неколико година (примати). Обзиром да омогућавају симултана снимања великог броја надражљивих ћелија са темпоралном резолуцијом мањом од секунде и без механичких оштећења ћелијске мембране (али не и околног ткива) употреба метода са мултиелектродама стално расте. Ипак, врло низак однос сигнала према шуму који спречава детектовање других догађаја сем акционих потенцијала (нпр. подпражних синаптичких потенцијала, мембранских осцилација) као и недостатак информације са ког типа ћелије сигнал потиче доприносе немогућности да се подаци адекватно анализирају (Hai et al., 2010). Са друге стране групе ћелија се рутински снимају са високом временском резолуцијом (милисекунде) уз помоћ електричног (ЕЕГ) и магнетног (МЕГ) енцефалограма. Ове методе омогућавају неинвазивна снимања популација неурона повезаних у мреже неурона. Методе се базирају на чињеници да је синхронизовану активност неурона могуће детектовати применом електрода које се смештају на површину лобање. И мада ове методе омогуђавају детекцију активности са високом темпоралном резолуцијом недостатак просторне резолуције (Akemann et al., 2012) и могућности да се прецизно установи извор електричних транзијената су главни недостаци ових метода. Оптичка снимања електричне активности мозга Примена оптичких метода за снимање електричне активности мозга пр ед с т а вља мање д е с т ру кти вну а л т е рн ати ву т р а дицион а лним електрофизиолошким методама базираним на примени електрода. Oптичка снимања такође нуде високу просторну резолуцију омогућујући симултана 9 снимања са различитих локација уоквиру видног поља а без физичког утицаја на осетљиво нервно ткиво које се испитује (Слика 2 и 3). Поред тога, оптичко снимање нуди могућност праћења активности различитих делова ћелије укључујући и најмањих структура недоступних електродама, као што су дендритске квржице. На нивоу нервних кола било би могуће спроводити функционалне студије које укључују активацију комплексних шема понашања уз параћење активности више стотина, ако не и хиљада неурона у различитим можданим регионима. И док сами неурони непоседују урођене оптичке сигнале који би се могли користити за праћење промена у трансмембранском потенцијалу, примена егзогених проба омогућава трансформацију електричне активности у промене које се могу регистровати оптички. Уобичајени приступ подразумева примену синтетичких, флуоресцентних боја мале молекулске масе (<1kD) које се везују за плазма мембрану, при чему варијације у потенцијалу мембране доводе до промене у интензитету флуоресценције боје. Новији метод се базира на примени протеинских проба које су развијене фузијом природних волтажно сензитивних домена са флуоресцирајућим протеинима чиме су креиране генетички кодиране волтажне пробе. Оптичко снимање мождане активности која се базира на примени генетички кодираних проба представља потенцијалну могућност за праћење електричне активности у генетички индентификованим ћелијама током дугих временских периода а уз минимално мешање у физиолошке процесе. Ипак, тренутно не постоје функционалне генетички кодиране пробе које би се могле користити за студије in vivo. Развој и карактеризација оваквих проба је у фокусу истраживања описаних у овој тези. Оптичка снимање базирана на урођеним сигналима и синтетичким бојама малих молекулских маса Први покушаји примене светлости за снимање активности неурона су изведени током 50-тих година и подразумевали су праћење инхерентних промена 10 у расипању светлости које се јављају при примени низа стимулуса на нерве (Hill and Keynes, 1949; Cohen, 2010). Електричне промене у ћелији могу изазвати мерљиве промене у локалној концентрацији јона и воде, промене у ћелијском волумену и лучењу неуротрансмитера које се одражавају на расипање светлости (Frostig and Chen-Bee, 2009). Напредак у методама обраде сигнала (упросечавање сигнала) током 60-их година је омогућио снимање много мањих сигнала и открића попут промена у расипању светлости и бирефригенцији која се јављају при акционим потенцијалима у нервним ћелијама и појединачним аксонима (Cohen et al., 1968). Урођени сигнали се могу јавити и као резултат промена у оптичким карактеристикама молекула који природно имају значајан ниво апсорпције или флуоресценције (цитохроми, хемоглобин). Ове промене су зависне од промена у метаболичким процесима који прате повишену активност неурона. У ове метаболичке процесе спадају промене у потрошњи кисеоника и протоку крви које мењају укупан ниво сатурације хемоглобина кисеоником, локалне промене у волумену крви које мењају апсорпцију светла и које могу бити детектоване употребом светлости различитих таласних дужина (Frostig and Chen-Bee, 2009). Ипак, поред чињенице да су ове промене само нуспојаве које се јављају при електричној активности неурона, недостци ове методе су и низак однос сигнала према шуму и просторна резолуција од приближно ~100µm (Scanziani and Hausser, 2009; Peterka et al., 2011). Развој волтажно осетљивих синтетичких боја мале масе (<1000 далтона) који је почео крајем 70-тих година је означио почетак развоја волтажно-зависног оптичког снимања (Cohen et al., 1974; Homma et al., 2009; Cohen, 2010; Loew, 2010). Примена боја мале молекулске масе које детектују промене у мембранском потенцијалу, или читавом низу других физиолошки релевантних параметара (pH, концднтрација калцијума, итд.), као промене у оптичким сигналима (углавном флуоресценцији) је омогућила физиолошке студије како на нивоу појединачних неурона, тако и на нивоу великих колекција неурона (Grynkiewicz et al.; 1985, An- tic and Zecevic, 1995; Grinvald and Hildesheim, 2004). За детекцију сигнала се 11 користе различити светлосни феномени као што су флуоресценција, рефлексија, апсорбанција или промена у односу флуоресценције две различите флуорофоре (флуоресцентно резонантни трансфер енергије- ФРЕТ) (Cohen, 2010; Loew, 2010). Волтажно-сензитивне боје су осетљиве на читав низ електричних догађаја. Тренутно примена ових боја омогућава снимање акционих потенцијала у дисталним дендритима без потребе за упросечавањем сигнала, уз упросечавање сигнала могуђе је регистровати постсинаптичке потенцијале у дендритским квржицама. Ове боје се, такође доста користе за праћење макроскопских промена на нивоу великих површина у можданој кори сисара. Ове студије су омогућиле детекцију брзих (милисекундских) електричних промена приликом сензорне и моторне активности (Feldmeyer et al., 2012). Како се волтажне боје неселективно везују за све ћелијске мембране, нежељено бојење електрично неактивних мембрана (нпр. мембране глијалних ћелија,, ендоплазматичног ретикулума, митохондрија, мијелин) за последицу има значајно позадинско зрачење које лимитира однос сигнала према шуму. Додатно ове боје карактерише лоша пермеабилност за велики број различитих типова ћелија и генерална токсичност (Scanziani and Hausser, 2009; Peterka et al., 2011; Looger and Grisbeck, 2012). Коначно, примена ових боја у in vivo експериментима када се боја наноси на веће површине искључује могућност циљаног обележавања ћелија одређеног типа. Генетички кодирани волтажни индикатори Напредак у области молекуларне биологије и развој у области генетичких манипулација на нивоу ћелије довео је до развоја протеинских оптичких индикатора. Ове пробе је могуће експримирати путем трансфера комплементарне ДНК (cDNA) у ћелију. Идентификација и клонирање гена који кодира зелени флуоресцентни протеин изолован из Aequorea victoria и откриће да његова флуорофора сазрева независно од других фактора (домаћина) је означио прекретницу у оптичком снимању ћелије (Chalfie et al., 1994; Inouye and Tsuji, 1994). У многим областима биолошких наука ово откриће је дословно изазвало 12 ефекат “паљења светла”. Нова сазнања о флуоресцентним протеинима су допринела формирању идеје о генетички кодираним индикаторима за волтажу (Siegel and Isacoff, 1997), Ca2+ (Miyawaki et al., 1997) и pH (Miesenboch et al., 1998). Данас смо сведоци убрзаног развоја како генетички кодираних волтажних инддикатора, тако и Ca2+ сензора. Недавно су развијене и протеинске пробе које омогућавају манипулацију електричне активности ћелије (Boyden et al., 2005). Ове методе у односу на синтетичке боје нуде неколико значајних предности као што су могућност циљаног обележавања специфичних типова ћелија и мање инвазивну хроничну експресију. ДНА кодиране пробе, такође омогућавају циљано обележавање у односу на развојни ступањ, регион мозга, тип ћелија и делове ћелијe. Упркос чињеници да су резултати са првом генетички кодираном пробом (Siegel and Isacoff, 1997) добијени исте године када и резултати са њеном пандан пробом за Ca++ (Miyawaki et al., 1997), развој функционалне Ca++ пробе је засенио развој волтажних проба (Looger and Grisbeck, 2011). Напори да се добије бољи Ca++ индикатор су довели до развоја високо осетљивих проба чији сигнали омогућавају детекцију промена у нивоу калцијума из ћелија које се налазе дубоко у живом ткиву (Dombeck et al., 2007; Tian et al., 2009; Akerboom et al., 2012). Ови сензори омогућавају примену 2-фотонске микроскопије за регистровање сигнала из ткива које има висок коефицијент расипања светлости и могућност снимања електричне активности у стотинама, чак и хиљадама неурона. Могуће је оптичко снимање појединачних нервних импулса без потребе за упросечавањем а просторна резолуција омогућава детекцију инфлукса Ca2+ који се јавља при синаптичкој активности на нивоу појединачних дендритских квржица (Peterka et al., 2011). Постоји неколико разлога зашто развој волтажних прба касни за развојем Ca++ индикатора, од којих је већина везана за природу сигнала које покушавамо да меримо (тј. разлике између природе мембранског потенцијала и нивоа слободног цитоплазматског Ca++). Мерење у цитоплазми раствореног Ca++ 13 захтева да се и сензор налази растворен у цитоплазми, што и јесте најчешћи случај за солубилне протеине који улазе у састав ћелије. Насупрот томе, мерење трансмембранског потенцијала захтева да се сензор простире кроз плазма мембрану, предуслов који отежава циљану и локализовану експресију и представља додатну потешкоћу у дизајну у односу на калцијумске пробе. Такође, приликом дизајна волтажних проба морају се узети у обзир и њихов потенцијално деструктиван утицај на капацитанцу мембране, захтеви везани за кинетику пробе која мора бити брза као и потреба за максималном експресијом у плазма мембрани (Peterka et al., 2011). Сви ови аспекти дизајна волтажних проба резултују потребом за софистицираним методама тестирања које није лако прилагодити за примену на великом броју узорака, као што је то био случај у раду са Ca2+ пробама. Принципи дизајна генетички кодораних волтажних проба Обзиром да у природи не постоје флуоресцентни протеини (ФП) чија се флуоресценција мења у зависности од волтажних промена да би се добио овакав индикатор потребно га је изконструисати. Највећи број протеинских волтажних проба је развијен прављењем синтетичких фузија између ФП-а и природних волтажно-осетљивих домена са намером да се волтажно-зависне промене у протеинској структури преведу у промене у флуоресценцији. Напори који су до сада уложени у процес добијања функционалане волтажне пробе су се углавном концентрисали на истраживање и развој волтажних сензора и флуоресцентних протеина. Развој генетички кодираних волтажних проба Прва генерација волтажних проба- Прве функционалне пробе су развијене у распону од неколико година и базирале су се на фузији волтажно-сензитивних домена из волтажно-зависних јонских канала са ФП-а (Siegel & Isacoff, 1997; Sakai et al., 2001; Ataka & Pieribone, 2002; Слика 4). У то време једини познати 14 протеини са деловима који су осетљиви на брзе промене у мембранском потенцијалу су били волтажно-зависни јонски канали. Улога волтажно-зависних јонских канала је да врше транспорт јона преко ћелијске мембране и овај транспорт се одиграва под утицајем промена у трансмембранском потенцијалу (Bezanilla, 2008). Промене у трансмембранском електричном пољу овај тип јонских канала детектују помоћу волтажно-осетљивог домена (ВСД) који се састоји од четри трансмембранска сегмента (С1-С4). Аминокиселине које имају наелектрисане остатке су стратешки распоређене дуж волтажно-осетљивог домена јонсих канала а промене у трансмембранском електричном пољу доводе до померања ових наелектрисаних честица. Последњи од четри трансмембранска сегмента (С4) ВСД-а поседује аминокиселине са базним остатком (аргинин и лизин) на свакој трећој позицији (Bezanilla, 2008). Ова померања базних остатака аминокиселина доводе до конформационих промена у структури канала које резултују отварањем поре канала (С5-С6) и пропуштањем јона. Дизајн волтажних проба се базира на идеји да померања наелектрисања могу довести до промене у интензитету флуоресценције прикаченог ФП-а. Флуоресцентни Shaker (FlaSH; Siegel and Isacoff, 1997)- Прва проба која је показала волтажну осетљивост је била базирана на Shaker калијумовом каналу из винске мушице (Drosophila melanogaster). Зелени флуоресцентни протеин из Ae- quorea victoria (wtGFP) коме су одстрањене неке од неесецијалних аминокиселина (233-238) је уграђен одмах иза С6 сегмента јонског канала. Методом наметнуте волтаже у ооцитама жабе (Xenopus laevis) је показано да проба реагује са смањењем у интезитету флуоресценције од 5.1% при промени потенцијала од +100mV, при чему је ћелија држана на мембранском потенцијалу од -80mV (Слика 4а). И мада су делови канала који формирају пору (С5-С6) остали интактни при конструисању пробе, проводљивост канала је укинута мутацијом фенилаланина на позицији 434 у триптофан (W434F). Ова мутација не утиче на волтажну осетљивост канала. Промена флуоресценције ФП-а у односу на волтажу је показала зависност која се може описати кривом сигмоидалног облика. Овакав 15 однос је сличан односу који постоји између померања наелектрисаних аминокиселинских остатака у ВСД-у и волтаже. Проба је стабилно експримирана у ћелијама током две недељеи и током тог перида није показала значајно смањење у флуоресценцији или температурну осетљивост. Тестирање на повишеној температури је показало благи утицај температуре на убрзавање, иначе споре кинетике индикатора. Иста група је након пар година објавила студију са побољшаним варијантама FlaSH-а (Guerrero et al., 2002). Развијене су варијанте индикатора са побољшаном кинетиком, веће сензитивности и бољим спектралним карактеристикама. Такође, добијена је и проба која је показивала већу стабилност при постизању коначне конформације на 37°C. До ових побољшања се дошло мутацијама у волтажном сензору и ФП-у. Волтажно сензитивни флуоресцентни протеин (VSFP )1.0 (Sakai et al., 2001)- Ова проба је добијена фузијом С1-4 домена сисарског Kv2.1 калијумовог канала и ФРЕТ пара који чине плаво- (cyan -CFP) и жуто- (yellow-YFP) емитујући протеини. Делови канала који граде пору С5-С6 су одстрањени приликом конструкције ове пробе. Промене мембранског потенцијала су детектоване као промене у ефикасности ФРЕТ процеса између два ФП-а. Приликом тестирања ове пробе вршена је ексцитација плавог ФП-а (λ=432 nm) а мерен је однос емисија плавог (λ>460) и жутог (λ>515) ФП-а. У случају овог индикатора однос промене у флуоресценцији и волтажи је био изненађујуће близу линеарног (r=0.99). Индикатор је показивао брзу кинетику активације и деактивације (Слика 4б). Потенцијалом активиран протеински канал базиран на натријумовом каналу (SPARC; Ataka and Pieribone, 2002)- Последња проба из такозване “прве генерације” је индикатор базиран на натријумовом каналу из скелетних мишића пацова. Две варијанте зелено флуоресентног протеина (wtGFP или EGFP) су уграђиване на различитим локацијама дуж секвенце јонског канала чиме је добијена серија од десет проба. Најуспешнијим се показао конструкт у коме је ФП уграђен између другог (С2) и трећег (С3) домена јонског канала. Пробу је карактерисала слаба осетљивост (0.5% ΔF/F за +100mV промену) али и изузетно 16 17 Слика 4. Прва генерација генетички кодираних волтажних индикатора базираних на волтажно сензитивном домену (ВСД) изолованом из волтажно сензитивних јонских канала. У свим случајевима горњи панел jе шематски приказ дизајна пробе, доњи панел је пример записа добијеног при тестирању пробе методом наметнуте волтаже на целу ћелију. а) FlaSH-волтажни индикатор је базиран на фузији између ВСД из Drosophila melanogaster Shaker-type калијумовог канала и wild-type зеленог ФП-а. Симултано симање помоћу две електроде и фотометрије у ооцитама X. laevis показују промену у струји и интезитету флуоресценције као одговор на низ волтажних тест пулсева (V) измећу -60 mV и 10 mV, са повећањима од 10 mV. Потенцијал мировања је -80 mV. FlaSh показује присуство струја отварања вратница (Ig) и одсуство јонских струја. Интензитет флуоресценције пробе (F) опада у одговору на деполаризацију мембране. Приказани запис је добијен упросечавањем 20 покушаја. Скала флуоресценције, 5% ΔF/F. Преузето из Siegel and Isacoff, 1997. б) VSFP1- је базирана на ВСД-у из сисарског Kv2.1 калијумовог канала и ФРЕТ пара који чине плаво зелена-(CFP) и жуто-емитујући (YFP) ФП. Проба је тестирана у стабилно експримирајућој линији HEK293 ћелија. Приказан је пример записа који се добија при одговору на 100mV деполаризациони пулс при чему интензитет жуте флуоресценције (горњи запис) прати мембрански напон. Преузето из Sakai et al., 2001. в) SPARC-проба базирана на фузији између ВСД-а из натријумовог канала скелетних мишића пацова и зеленог ФП-а. Сигнал флуоресценције (горе) из ооците X. laevis при примени прогресивно већих волтажних корака (доле). Сваки запис интензитета флуоресценције је добијен упросечавањем 48 –56 покушаја. Преузето из Ataka and Pieribone, 2002. A B Cа б ва б в брза кинетика (Слика 4в). Компаративна студија у којој су све три описане пробе тестиране у сисарским ћелијама гајеним у in vitro условима (HEK293 имортализована ћелијска линија или примарна линија хипокампалних неурона миша) је показала одсуство било какве значајније волтажне сензитивности (Baker et al., 2007). Конфокалном микроскопијом, при којој је као маркер површинске експресије кориштена хидрофобна волтажно-осетљива боја (di8-ANEPPS), је показана лоша мембранска локализација све три пробе. Недовољна присуност проба у плазма мембрани је највероватнији разлог недовољне сензитивности.   Друга генерација волтажних проба- Током 2005. године, Мурата и сарадници (Murata et al., 2005; Murata & Okamura, 2007) су анализирајући геном туникате Ciona intestinalis идентификовали протеин који поседује волтажно сензитивне делове (С1-С4), по аминокиселинском саставу сличне онима који налазе у волтажно-осетљивим јонским каналима, али не и делове који формирају пору (С5-С6). Показало се да овај нови протеин има липид-фосфатазну активност која је волтажно-сензитивна, те је стога назван Ciona intestinalis волтажни-сензор- садржећа фосфатаза (C. intestinalis voltage-sensor-containing phosphatase; Ci-VSP). Анализа ВСД секвенце је показала значајну хомологију са волтажно-зависним каналима поготово у четвртом трансмембранском сегменту (С4). Анализа која је укључивала и ВСД из хомолог протеина изолованог из рибе Danio rerio је показала да промене у волтажи изазивају асиметричне струје какве се виђају у јонским каналима (струје отварања јонских вратница- gating currents) потврђујући улогу ВСД-а као волтажног сензора (Murata et al., 2005; Murata & Okamura, 2007; Hossain et al., 2008). Такође, показало се да је сензор функционално самосталан обзиром да задржава волтажну-сензитивност и након одстрањивања ензимског дела протеина (Murata et al., 2005). Ово откриће је довело до развоја друге генерације волтажно-сензитивнх проба у којима је ВСД јонскоих канала замењена са ВСД-ом из волтажно-сензитивне фосфатазе из Ciona-е (Dimitrov et al., 2007; 18 Lundby et al., 2008; Mutoh et al., 2009; Perron et al., 2009; Burnett et al., 2012; Jin et al., 2012; Слика 5, 6 и 7). Први индикатор који се базирао на новом протеину, назван VSFP2.1, је показао значајно бољу мембранску локализацију и пораст у осетљивости у сисарским ћелијама (Dimitrov et al., 2007; Слика 5). Проба је развијена након неколико покушаја током којих је тестирана ФРЕТ комбинација плавог и жутог ФП-а који су уграћивани на различитим местима близу С4 домена. Поред тога што је из конструкта уклоњен ензимски део, волтажна-зависност пробе је модификована тако да показује највећу сензитивност за волтажне промене које се налазе у физиолошки релеввантном опсегу (тј. вредност за полу-максимум одговора V1/2 је померена са ~+80mV на ~-40mV). Ово померање волтажне осетљивости је постигнуто мутацијом у С4 домену ВСД-а, где је аминокиселина глутамин 217 мутирана у аргинин (R217Q). VSFP2.1 индикатор транзиентно експримиран у PC12 имортализованој ћелијској линији је показао промену у флуоресценцији од 5% ΔR/R (однос флуоресценције два ФП-а) на 22ºC, и 8.6% промену на 35ºC за 100mV деполаризационе пулсеве. Брзина сензора изражена кроз tau (τ) вредност је 71ms на 22ºC или 15ms на 35ºC при активацији, и 96ms на 22ºC или 75ms на 35ºC током деактивације (Dimitrov et al., 2007). Активност коју је овај индикатор показао у сисарским неуронима гајеним у in vitro условима је отворила врата за даљи развој проба базираних на новооткривеном волтажном сензору (Gautam et al., 2009; Lundby et al., 2008; Mutoh et al., 2009; Perron et al., 2009; Слика 6 и 7). Након иницијалног успеха који је постигнут употребом новог, мање комплексног волтажног сензора даљи рад на побољшању проба се базирао на модификовању обе компоненте, како волтажног сензора тако и ФП-а. Развијене су пробе побољшаних карактеристика: повећане флуоресценције, повишене сензитивности (повишен ∆F/∆V и однос сгнала према шуму) и кинетике (при активацији и деактивацији индикатора), пробе са спектрима побуђивања и зрачења већих таласних дужина (помереним ка црвеном делу спектра). Једна од 19 првих проба, названа Mermaid, која је показала повишену сензитивност (виши ∆F/ ∆V) се базирала на новооткривеном ФП ФРЕТ пару (из корала изоловани зелени mUKG и црвени mKoK). Повишена сензитивност пробе је делимично постигнута изменом аминокиселинског састава секвенце која повезује ВСД и ФП (Tsutsui et al., 2008). Овај сензор је показао високу осетљивост која је у ооцитама жабе износила 40 % ΔR/R за 100 mV деполаризационе промене, али која је значајно редукована у сисарским ћелијама (2-7 %). Такође, карактеристике ове пробе тестиране у in vivo условима су се показале лошим што је највероватнија последица интрацелуларног нагомилавања ФП-а, познате мане флуоресцентних протеина изолованих из корала (Anthozoa). Недавно је публикована на ФРЕТ-у базирана проба (Lam et al., 2012) у којој је кориштен нови пар ФП-а (зелени Clover и црвени mRuby2) и која је показала већу сензитивност у поређењу са својом претходницом VSFP2.3. Сензитивност и кинетика ове пробе тестиране in vitro на хипокампалним неуронима је показала да проба успешно прати појединачне нервне импулсе. Кинетика већине до сада поменутих проба, укључујући VSFP2s (Lundby et al., 2008; Mutoh et al., 2009) и Mermaid (Tsutsui et al., 2008) је релативно спора што је највероватније последица комплексне активације ВСД-а чија инхерентно спора компонента има највећи утицај на промену флуоресценције проба (Villalba-Galea et al., 2008). Индикатори са нешто бржом кинетиком (VSFP3s) су развијени када су као репортери волтажних промена, уместо ФРЕТ парова употребљени појединачни флуоресцирајући протеини који су са ВСД-ом повезани преко краће аминокиселинске секвенце (Perron et al., 2009). Пробе побољшане кинетике су добијене и манипулацијом волтажног сензора. Брзе пробе су добијене конструисањем химера између волтажно-сензитивних домена Ciona-е и волтажно- зависног канала за калијум Kv3.1, као и применом Ci-VSD ортолога изолованог из рибе Danio rerio (Baker et al., 2012). Ипак, практична примена ових проба је лимитирана недовољном сензитивношћу. 20 За оптичка снимања in vivo, која су крајњи циљ развоја волтажних сензора, флуоресцентни протеини са емисионим спектром помереним ка црвеном делу спектра нуде неколико значајних предности. Употреба црвенијих ФП-а је пожељна због веће пропустљивости ткива за светлост већих таланих дужина (и при ексцитацији и при емисији), аутофлуоресценција ткива је много мања на овим таласним дужинама што повољно утиче на смањење артефакта. Такође, са померањем спектра ка црвеном смањује се нтерференција која потиче од апсорпције хемоглобина. Протеине који емитују у црвеном делу спектра је због боље могућности раздвајања спектара лакше користити у комбинацији са другим флуоресцирајућим протеинима а показују и мању токсичност. До сада су објављене две студије у којима се радило са протеинима оваквих спектралних карактеристика. Perron и сарадници (2009) су развили низ проба у којима је волтажно-сензитивни домен Ciona-е комбинован са црвенијим ФП-има (mOran- ge2, TagRFP and mKate2). Тестиране у сисарским неуронима in vivo добијене пробе су показале малу сензитивност. Потпуно нови принцип у дизајну волтажних сензора представља примена слабе флуоресценције бактеријског родопсина (Archaerhodopsin 3 (Arch) из Halorubrum sodomenseза) за коју се показало да је волтажно осетљива (Kralj et al., 2011). Овакав приступ дизајну протеинских сензора има неколико потенцијално добрих страна: велика и линеарна промена флуоресценције у зависности од волтаже, спектралне карактеристике великих таласних дужина и отпорност на фото-избељивање. Ипак, квантна ефикасност флуоресценције ових родопсина је тако ниска (квантни принос родопсина је 0.001 у поређењу са зелено флуоресцирајућем протеином 0.65) да је њихова примена за оптичка снимања in vivo мало вероватна. И док је у in vitro условима могуће оптимизовати услове за детекцију интензитета флуоресценције, ниска флуоресценција ових проба захтева употребу ласера високог интензитета (1800 mW/cm2) и осетљиве камере (Electron Multiplying Charge Coupled Device- EMCCD) за детекцију сигнала. Обзиром на повећани степен расипања светла у in vivo условима и на потенцијалну фототоксичност 21 узроковану оптичким условима које ова проба намеће мало је вероватно да ће ове пробе наћи ширу примену у пракси. Такође, покушаји да се протеин измени (Kralj et al., 2011) како би изгубио своју урођену активност протонске пумпе су довели до значајног успоравања кинетике (τ<1ms за Arch у поређењу са 45ms за мутирану, непроводљиву варијанту ArchD95N). На основу свега реченог можемо закључити да упркос великим напорима који су уложени у развој протеинских волтажних индикатора ниједна до сада публикована проба нема довољну сензитивност која би дозволила извођење чак и најрудиментарнијих студија in vivo. И док одређени број проба одликује низак ниво базалне флуоресценције који онемогућава поуздану детекцију промена in vivo, друге карактрише висок ниво базалне флуоресценције али физиолошке промене не доводе до промене у интензитету флуоресценције. Многе пробе које су се показале функционалним у in vitro гајеним имортализованим, сисарским ћлијским линијама из нама непознатих разлога не функционишу у неуронима in vivo. Постоји велики број потенцијалних разлога укључујући и недовољну мембранску локализацију, убрзану деградацију или инактивацију изазвану интеракцијама са нама непознатим протеинима које неурони експримирају. Нажалост, напредак у развоју бољих проба није довео до доношења рационалних закључака везаних за утицај појединих особина пробе на њене перформансе (тј. сензитивност, брзину одговора, однос сигнала према шуму). На овом ступњу наш приступ развоју проба је и даље крајње емпиријски, а чак и основне законитости у конструкцији проба тек треба открити. Циљ овог рада је дизајн волтажно осетљивих протеинских оптичких проба које показују највећу промену у флоресценцији за дату промену напона и које могу бити употребљене за оптичка снимања у неуронима in vivo. Један од тестираних приступа се базира на примени циркуларно-пермутоване варијанте зелено флуоресцентног протеина (cpEGFP) (Baird et al., 1999; Topell et al., 1999) који је претходно врло успешно употребљен у дизајну протеинских Ca++ проба (тзв. GCaMP серија) (Nakai et al., 2001; Nagai et al., 2001). Чињеница да су пробе у 22 којима је кориштен cpEGFP показале изузетно високу сензитивност као Ca++ индикатори (Tien et al., 2009, Zhao et al., 2011; Akerboom et al., 2012), навела нас је да истражимо могућност примене овако модификованог протеина у дизајну волтажних индикатора. Желели смо да испитамо могућност конверзије волтажно- зависних промена у структури CiVS у велике, брзе промене у флуоресценцији циркуларно-пермутованог зелено флуоресцентног протеина. Студија у којој је испитивана кристализована структра GCaMP2 индикатора је показала да калцијум-зависна интеракције између М13 и калмодулина доводи до структурне промене која се огледа у појави слободне површине која затварајући отвор на циркуларно-пермутованом ФП-у доводи до пораста флуоресценције са порастом концентрације Ca2+ (Akerboom et al., 2009). Обзиром да су наши конструкти фузија између cpEGFP и CiVS немогуће је предвидети која од околних структура је слободна за интеракцију са отвором на ФП-у. Ипак, развој Ca++ (Nagai et al., 2001) и волтажних индикатора (Lundby et al., 2008) до сада је показао велике ефекте које имају и врло мале промене у аминокиселинској секвенци која повезује волтажни сензор и ФП. Резултати нас наводе на закључак је да велики број варијанти мора бити тестиран да би се добила проба побољшаних карактеристика. Иако идеји да се у дизајну волтажних сензора употреби циркуларно пермутована верзија ФП-а недостаје снажна хипотеза о механизму, она није нова (Gautam et al., 2009). Ранија студија је ову хипотезу само делимично истражила конструисањем и тестирањем 8 конструката и није дала значајније резултате (Gautam et al., 2009; Слика 7). Са друге стране, још од најранијих студија у овом пољу уређеним на индикатору Flash (Guerrero et al., 2002) било је јасно да побољшање флуоресценције ФП-а утиче на укупне карактеристике индикатора. У овом раду ми ћемо показати колики је утицај флуоресцентног протеина на сензитивност и кинетику сензора, где и тако мала промена као што је мутација једног аминокиселинског остатка у протеину дугом ~230 амино киселина може произвести волтажни индикатор битно измењених карактеристика. 23 Материјал и методе Молекуларна биологија Синтеза конструката базираних на циркуларно пермутованом зелено флуросцентном протеину је постигнута умножавањем одговарајућих сегмената волтажног сензора и варијанте зеленог флуросцентног протеина (тзв. побољшани зелени флуросцентни протеин- EGFP). Умножавање волтажног сензора је урађенo уз помоћ прајмера комплементарних секвенци протеина где почиње транслација и дела 3' секвенце која одговара предпостављеном четвртом трансмембранском домену чиме је постигнуто одстрањивање ензимског дела протеина и укидање фосфатазне активности Ciona intes- tinalis   волтажно зависне фосфатазе. Варијација места споја волтажног сензора и флуросцентног протеина је постигнута применом прајмера обрнутог смера који одговарају кодирајућој секвенци волтажног сензора а завршавају се са различитим амино киселинама чиме се добијају варијанте протеина различите дужине. Ови прајмери такође садрже 15 базних парова (5 кодона) који кодирају линкер секвенцу која повезује волтажни сензор и флуросцентни протеин. Ми смо тестирали 9 варијанти циркуларне пермутције зеленог флуросцентног протеина из GCaMP3 калцијумске пробе које резултују отворима у терцијарној структури протеина различитог састава и величине. Оваква структура флуросцентног протеина је постигнута комбиновањем 6 прајмера на 9 различитих начина. Добијене делове секвенце могуће је спајати са волтажним сензором захваљујући крајевима од којих 15 базних парова на почетку одговара линкер секвенци на 5' крају а на 3' крају секвенци експримирајућег плазмида. Комбиновање умножених делова волтажно- осетљивог домена Ciona intestinalis и флуросцентног протеина у CMV експримирајућем плазмиду прилагођеном за аутоматизовано (роботизовано) клонирање је урађено помоћу In-Fusion реакције клонирања (Clontech, САД). Конструкти кориштени у другом делу студије су иницијално добијени изменом раније публиковане генетички кодиране волтажно осетљиве пробе зване Mermaid (Tsutsui et al., 2008). Ова проба је базирана на ФРЕТ пару (mUKG и mKOk) који је за потребе наше студије замељен pH осетљивом варијантом зеленог флуросцентног протеина познатом као ecliptic pHluorin (Miesenbock et al., 1998). Кодирајућа секвенца ФП је амплификована помоћу полимеразне ланчане реакције (PCR) за коју је кориштена pfu DNA полимераза (Agilent Technologies, САД). Након третмана рестрикционим ензимима BamHI и XbaI 24 секвенца је уграђена у одговарајући део Mermaid конструкта. Прајмери кориштени за полимеразне ланчане реакције су: 5’-CGCGGATCCCAT GAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG-3’ 5’-GCGTCTAGATCATTT GTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCC-3’ Модификације на конструктима које укључују тачкасте мутације и промене места споја волтажног сензора и флуросцентног протеина су постигнуте применом протокола за усмерену мутагенезу (QuickChange II XL site-directed mutagenesis kit, Agilent Technologies, САД). Верификација свих синтетисаних конструката је потврђена провером секвенце. Ђелијска култура in vitro- имортализована ћелијска линија HEK293 и примарни сисарски неурони Потенцијални волтажни сензори су иницијално тестирани in vitro у имортализованим сисарским ћелијама HEK293 (AATC, САД). Ћелијска линија је одржавана у Dulbecco's Modified Eagle Medium, High Glucose-DMEM медијуму (In- vitrogen, САД) допуњеног са 8% серума из фетуса говеда (FBS; Sigma-Aldrich, САД). Пробе које су показале задовољавајућу волтажну сензитивност су даље тестиране in vitro у сисарским хипокампалним неуронима. За процедуру изоловања хипокампалних неурона кориштене су трудне женке мишева соја CD-1. Све процедуре које укључују употребу животиња су изведене у складу са протоколом одобреним од стране Комитета за коришћење животиња Џон Б. Пирс Лабораторије (The John B. Pierce Laboratory), САД. Увод у процедуру изоловања хипокампалних неурона је дубока анестезија трудне женке миша постигнута одговарајућом (3-5%) дозом изофлуорина. Дисекција мозга 18 дана старих ембриона изолованих из утеруса је праћена дисекцијом хипокампуса. Комплетна процедура од тренутка изолације ембриона је обављана у охлађеном раствору HBSS pH 7.2 (Invitrogen, САД). Изолација 25 појединачних ћелија из хипокампуси је олакшана потапањем ткива у раствор папаина 2мг/мл (Worlighton Labs, САД). Ензимска реакција је додатно убрзана иинкубацијом у воденом купатилу на температури од 37° Целзијуса у трајању од 20 минута. Коначна дисоцијација ткива на појединачне ћелије је постигнута физичком третманом ткива током које се ткиво пропушта кроз стерилне Пастерове пипете различитог дијаметра. Појединачне ћелије су потом у одговаракућој густини засејаване на поли-д-лизином (poly-D-lysine, Sigma-Aldrich, САД) третирана покровна стакалца бр.1. Ћелије су одржаване у Neurobasal медијуму у који је додато 0.5мМ глутамата (Glutamax-I) и Б-27 суплемент (Invitrogen, САД). Обе културе ћелија су гајене у инкубатору под константном температуром од 37°C у атмосфери 5% угљен-диоксида. У случајевима када је за тестирање кориштен инвертовани микроском ћелије су гајене у стерилним, полистиренским Петријевим кутијама дијаметра 35 мм чије је дно прерађено тако да је за њега причврчшћено покровно стакалце број 1. У раду са усправним микроскопом коришћене су ћелије причвршћене за покровна стакалца број 1 која су чувана у одговарајућим судовима. У оба случаја покровна стакалца су третирана са поли-д- лизином (poly-D-lysine, Sigma-Aldrich, САД) који омогућава причвршћивање ћелија за стакло. Експресија конструката у ћелијској култури је постигнута методом транзиентне трансфекције базиране на примени катјонских липозома. Задовољавајући ниво експресије проба је постигнут применом половине од фабрички препоручене дозе ДНК и Lipofectamine 2000 (Invitrogen, САД). Применом смањене количине Lipofectamine 2000 умањује се негативан ефекат протокола на ћелију (ћелијску мембрану). Генерисање трансгених ArcLight винских мушица Кодон оптимизована клонирајућа ДНК (cDNA) за експресију у винској мушици (Drosophila melanogaster) је синтетисана на основу аминокиселинске 26 секвенце волтажне пробе ArcLight A242 из које су избрисане две амино киселине које се налазе на неконзервативном, унутарћелијском домену на N крају (Pro38 и Ala109). Овако добијена ДНК-а је потом клонирана у pJFRC7-20xUAS вектор (Pfeiffer et al., 2010) чиме се генеришу UAS-ArcLight трансгени, а убризгавањем оплођених ембриона уграђена је у attP2 и attP40 phiC (Groth et al., 2004). У свим овде описаним експериментима кориштена је attP2 уградња UAS-ArcLight. ArcLight је специфично експримиран у PDF-позитивним сат неуронима употребом pdf-GAL4 драјвера (Renn et al., 1999), у олфакторним пројекционим неуронима употребом GH146-GAL4 (Stocker et al., 1997), и у олфакторним рецепторним неуронима употребом Or83b-GAL4 (Larsson et al., 2004). Kir2.1 и NaChBac јонски канали су експримирани у LNVs употребом pdf-GAL4 драјвера UAS-Kir2.1 односно UAS-NaChBac (Baines et al., 2001; Nitabach et al., 2002). Пречишћавање флуоресцентних протеина У PCR реакцији умножени фрагменти који кодирају зелени флуоресцентни протеина ecliptic pHluorin или ecliptic pHluorin A227D су уграђени у одговарајући вектор (pCR4BluntTOPOvector-Invitrogen, САД) чиме су добијени експримирајући конструкти. Овом процедуром се у N-терминус фузионог протеина уграђује 6xHis таг који омогућава пречишћавање протеина. Након трансформације Top10 бактерија са експресионим конструктом протеин је пречишћен уз помоћ His-Select Nickel Affinity Gel (Sigma-Aldrich, САД) а према упутству произвођача. Концентровање пречишћених протеина је извршено центрифугирањем уз употребу Amicon Ultra-15 филтера. 27 Спектрофлуориметрија Апсорпциони спектар пречишћених протеина је измерен на спектрофотометру Shimadzu UV-1601PC UV-VIS (Shimadzu , Јапан). Флуоресцентни ексцитациони и емисиони спектри протеина су измерени на Horiba Jobin Yvon Fluorolog 3 спектрофотометру. У намери да се измери зависност флуоресценције у односу на pH вредност пречишћени протеини су разблажени до концентрације од 0.35 mM у пуферу који садржи 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, и 1 mM MgCl2. pH пуфера је подешена са 25 mM MES (за pH 3.5, 4.5, и 5.5), 25 mM HEPES (за pH 6.5 и 7.5), или 25mM Bicine (за pH 8.5 и 9.5). Концентрација протеина је мерена спектрофотометријски на Beckman Coulter DU 730 uv/vis спектрофотометру (Beckman Coulter, САД). Апсорпција пречишћених протеина који су претходно денатурисани у 0.1Н NaOH је мерена на 280 nm. У случају оба протеина, протеинска концентрација је израчуната на основу ексцитационог коефицијента од 20,010 M-1 cm-1. Комбиновање метода наметнуте волтаже/струје на целу ћелију и оптичког снимања Тестирање волтажне осетљивости потенцијалних проба је рађена употребом комбинације оптичког снимања и метода наметнуте волтаже. Кроз комору у којој су смештене ћелије током тестирања константно протиче екстрацелуларни раствор чија температура је контролисана и износи 33-35° Целзијуса. Екстрацелуларни раствор кориштен током тестирања проба у HEK293 ћелијама и примарним неуронима миша је: 150 mM NaCl, 5 mM глукозе, 4 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.4. Екстрацелуларни раствор кориштен за снимања у неуронима и интактном мозгу мушице се састојао од: 101 28 mM NaCl, 3 mM KCl, 1 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 5 mM глукозе, и 20.7 mM NaHCO3, pH 7.2, при чему је осмоларитет 250 mmol/kg. Током снимања кориштене су пипете добијене од стаклених капилара спољашњег дијаметра 1.5 мм и унутрашњег дијаметра 0.75 мм (WPI, САД). Пипете су добијане извлачењем на P-97 Flaming/Brown хоризонталном пулеру (Sutter Instrument Company, САД). Раствор у пипети је прављен тако да што приближније одражава састав интрацелуларне средине и да не утиче на биофизичке особине ћелије. Састав раствора у пипети у случају HEK293 ћелија је: 120 mM K-аспартат, 4 mM NaCl, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM EGTA, 3 mM Na2ATP, 5 mM HEPES, а pH 7.2 је подешен са KOH. Састав раствора у пипети у случају хипокампалних неурона је: 120 mM K-глуконат, 3 mM KCl, 7 NaCl, 4 mM Mg2ATP, 0.3 mM Na-GTP, 20 mM HEPES, 14 mM Трис-фосфокреатин, а pH 7.3 је подешен са KOH (Popovic et al., 2011). Састав раствора у пипети у случају LNVs неурона мушице је 102 mM калијум глуконат, 17 mM NaCl, 0.085 mM CaCl2, 4 mM Mg-ATP, 0.5 mM Na-GTP, 0.94 mM EGTA, и 8.5 HEPES, pH 7.2, при чему је осмоларитет of 235 mmol/kg. Контрола мембранског потенцијала и примена одговарајућих тест пулсева је вршена уз помоћ Patch Clamp PC-505B амплифајерa (Warner Instruments, САД). У случају метода наметнуте волтаже на целу ћелију који је примењиван при тестирању проба у HEK293 ћелијама, ћелије су након постизања гигаомског споја одржаване на мембранском потенцијалу од -70 mV. Основни протокол је подразумевао примену деполаризационих корака од 100 mV и у трајању од 200-300 ms. За детаљније анализе протоколи су варирани тако да су примењивани хиперполаризациони и деполаризациони стимулуси различите јачине (20, 40, 60, 80 и 100 mV). Трајање стимулуса је такође варирано при чему је најкраћи примењивани протокол трајао 1 ms a најдужи 300 ms. За оптичко снимање ћелија кориштена су два система. У случају инвертованог микроскопа Nikon Eclipse TE300 за снимање је кориштен објектив за имерзију у уљу 60х/1.4NA (Nikon Inc., Јапан). На усправном микроскопу Nikon 29 Eclipse E6000FN смо користили објектив за имерзију у води 60х/1.0 NA (Nikon Inc, Јапан). На микроскоп су монтирани додаци за епи-флуоресценицију и дигитална CCD камера за мерење интензитета флуоресценције. У одређеном броју експеримената извор ексцитационе светлости је била 150 W ксенонска лучна лампа са специјалним уређајем за напајање малог шума 1700XT/A (Opti-Quip, Highland Mills, САД). У раду са зелено-флуоресцирајућим протеином користили смо два сета филтера. Прва комбинација филтера се састојала од ексцитационог HQ480/30X и емисионог филтера HQ510LP, и дихроичног огледала 505DCXR (Chroma, САД). Друга комбинација су филтери који се налазе у филтер коцки GFP-3035B фирме Семрок у којој је ексцитациони филтер 472/30, дихроично огледало 495 nm и емисиони филтер 520/35 (Semrock, САД). При тестирању проба у сисарским неуронима ексцитација је вршена применом ласерске светлости за коју смо користили три врсте ласера: MLL-III-473 nm 50mW ласер, MLL-FN-473nm 50mW (Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Кина) или 488 nm 50mW ласер (DL488-050, CrystaLaser, САД). У случају ласерске илуминације кориштени су раније описани филтери са изузетком ексцитационог филтера. У раду са винском мушицом за оптичко снимање је кориштен Olympus BX61WI усправан микроскоп опремљен са LUMFL 60x N.A. 1.10, LUMPlan FL 40x N.A. 0.80, или XLUMPlan FI 20x N.A. 0.95 објектив за имерзију у води (Olympus, Japan). За ексцитацију ArcLight пробе u мозгу мушице кориштен је ласер 488nm 50mW (DL488-050, CrystaLaser, САД), у комбинацији са 495nm дихроичним огледалом и 520/35nm емисионим филтером (Semrock, Inc., САД). У свим случајевима ласерска светлост је усмеравана у микроскоп уз помоћ мултимодалног каплера за влакно (Siskiyou, САД), кварцног оптичког кабла и ахроматичног кондензора за епифлуоресценцију (Achromatic EPI-Fluorescence-Till Photonics, САД). Флуоресцентна светлост са ћелије је усмерена на CCD камеру (NeuroCCD- RedShirtImaging LLC, САД) за аквизицију која је била смештена у равни 30 формирања примарног лика. Флуоресцентна слика је коригована (смањена) употребом 0.1x Optem zoom A45699 (Qioptiq LINOS Inc., САД). У експериментима рађеним са винском мушицом флуоресцентна слика је коригована употребом или Optem® zoom system A45731 0.1x или Optem® C-to-C mount 25-70-54 0.38x (Qioptiq LINOS, Inc, САД). Оптички сигнали су регистровани фреквенцијом од 1000 или 2000 слика у секунди (1000 или 2000 Hz) у случају сисарских ћелија, и фреквенцијом од 500 Hz (PDF неурони) или 125 Hz (олфакторни неурони) у мозгу винске мушице. Измерена флуоресценција је просек интензитета флуоресценције измерене на површини целе ћелије. Контролне студије утицаја експресије ArcLight GEVI на физиологију винске мушице Биофизичке особине мембране ArcLight-експримирајућим lLNVs су поређене са контролом у којој lLNVs експримирају цитоплазматични ФП. Мерења су вршена у 3-8 дана старим мушицама применом метода наметнуте струје на целу ћелију у препарату мозга у присуству AChR антагониста (+)-tubocurarine (200µM), како би се блокирала активност у нервној мрежи и утишала синаптичка активност. Правилна фаза и величина јутарње и вечерње активности зависи од нормалног функционисања LNVs и њихове способности да комуницирају са другим сат неуронима који улазе у састав циркадијане контролне мреже. Локомоторна активност је мерена помоћу стандардног система (Drosophila Activity Monitor system-TriKinetics, САД), у коме се мушице чувају засебно у стакленим тубама где се на једном крају налази храна а на другом чеп који је пропусан за гасове. Праћење кретања мушице дуж тубе је омогућено инфрацрвеним зраком који пролази кроз центар тубе. 31 In vivo препарат винске мушице и апликација мириса За тестирање волтажно сензитивне пробе ArcLight у олфакторном систему винске мушице кориштене су женке старости 3-14 дана. Кориштен је in vivo препарат који је издизајниран и направљен на основу раније објављеног рада (Fi- ala and Spall, 2003). Укратко, за in vivo оптичко снимање комплетна глава мушице је провучена кроз отвор направљен на парчету самолепљиве траке и уз додатно причвршћивање лепком. Покровно стакалце је смештено у посебно дизајнирану коморицу која омогућава апликацију мириса преко система танких цевчица. Апликација мириса је омогућена константним протоком ваздуха који је усмерен у два правца тако да прелази преко филтер папира натопљеног у једном случају чистим минералним уљем а у другом комбинацијом уља и мириса. Кориштени су скоро чисти (> 99%) концентровани мириси (бутанол и/или пропионска киселина; Sigma-Aldrich, САД) који су разблажени 1:10 у минералном уљу а укупна количина која је нанета на филтер папир је износила 50 µl. Мириси су апликовани аутоматизованом алтернацијом између два могућа пута за проток ваздуха када ваздух прелази или преко филтер папира са уљем или преко филтер папира са комбинацијом уља и мириса (Warner Instruments, САД). Конфокална микроскопија За пробе које су базиране на циркуларно пермутованом зеленом флуоресцентном протеину слике су добијене употребом Olympus Fluoview FV1000 (Olympus, Japan) конфокалног ласер скенирајућег микроскопа опремљеног са Olympus LUMFL 60×/1.10 W објективом. За ексцитацију хромофоре кориштен је 488 nm аргонски ласер у комбинацији са одговарајућим филтер сетом који укључује: ексцитациони филтер 488BP (480–495 nm), дихроично огледало 505 nm и емисиони филтер BP515 (505–525 nm). За аквизицију и обраду слика кориштен је компијутерски програм FV10-ASV. ArcLight пробе су осликаване на Zeiss 780 LSM (Carl Zeiss AG, Немачка) конфокалном микроскопу са скенирајућим ласером 32 уз употребу Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC M27 објектива. Ексцитација је потигнута применом аргонског ласера таласне дужине 488 nm при чему је кориштено дихроично огледало MBS 488 и емисиони филтер 493–598 nm. Zeiss Zen 2009 је софтвер којим је систем опремљен и који је кориштен за аквизицију и обраду слика. Анализа података За аквизицију оптичких сигнала и електрофизиолошких података кориштен је NeuroPlex компијутерски програм (RedShirtImaging, САД). Добијени подаци су анализирани применом рачунарских програма који су развијани у току овог рада и написани у LabView (National Instruments Inc., САД) или Igor (WaveMetrics, САД). Промене у интензитету флуоресценције волтажних индикатора су приказане као фракционе промене сигнала –ΔF/F= (F0–F)/F0, где је F интензитет флуоресценције, а F0 флуоресценца у стању мировања. Подаци су представљени као процентуална промена у ΔF/F. Вредност % ΔF/F је израчуната тако што се прво од сваког фрејма одузме слика добијена у одсуству светлости (корекција за изворе светла који не потичу од флуоресценције). Потом се просечна вредност добијена за интензитет флуоресценције у региону од интереса у сваком фрејму (F) одузме од просечне вредности добијене за регион од десет фрејмова пре догађаја од интереса (F0). Добијена вредност се потом подели са вредношћу за F0. Корекција ефекта изазваног избељивањем ФП-а је вршена тако што је идеализована крива (описана са два експоненцијална фактора и подешена у односу на делове сигнала који се налазе ван опсега волтажног пулса) подељена са мерним флуоресцентним сигналом (Perron et al., 2009). y=a1e-x/τ1 +a2e-x/τ2 1 y је флуоресценција у функцији времена x. a1+a2 је иницијални ниво 33 флуоресценције при чему се a1 експоненцијално мења са брзом временском константом τ1, а a1 се експоненцијално мења са споријом временском константом τ2. Добијени подаци су даље обрађивани употребом Origin8.1 (Origin-Lab, САД), LabView (National Instruments, САД), Igor Pro 6 (WaveMetrics, САД) и Excel (Microsoft, САД) компијутерских програма. За мерење брзине одговора волтажно-зависних проба флуоресцентни одговори су подешавани помоћу једначине са једним експоненцијалним фактором, y= y0 + a1e-(x-x0)/τ1 2 и са два експоненцијалана фактора, y=y0 + a1e-(x-x0)/τ1 + a2e-(x-x0)/τ2 3 при чему је y флуоресценција у функцији времена x, а x0 је почетак тест пулса волтаже. y0 + a1 +  а2  је уравнотежени ниво флуоресценције пре задатог тест пулса волтаже, a1 је део флуросценције који се експоненцијално мења са брзом временском константом τ1, док је a2 део флуросценције који се експоненцијално мења са спором временском константом τ2,   y0 је уравнотежени ниво флуоресценције при задатом тест пулсу. Однос промене интезитета флуоресценције према промени волтаже је анализирана Болцмановом (Boltzmann) једначином: 4 Однос нормализоване ΔF/F према V је израчунат помоћу једначине: 34 ! ! = !! + !! − !!!+ ! !!!!! /!! 5 где су a1 и а2 асимптотске вредности за % промену флуоресценције при малим, односно великим вредностима за x (мембрански потенцијал, mV), x1/2 је вредност за мембрански потенцијал при коме ΔF/F има половину од своје максималне вредности. S је нагиб криве (mV). ). 35 ! ! = !!+ !(!!!!!)/!! Резултати Флуоресцентне волтажно-зависне протеинске пробе базиране на циркуларно пермутованом флуоресцентном протеину J Направили смо 9 верзија циркуларно пермутованог зеленог флуоресцентног протеина у којима је варирана величина отвора. Намера је била да се систематски испита могућност да ће отвор у неком од ФП-а бити такав да га је могуће затворити неком од околних површина. Приликом дизајнирања отвора у циркуларно пермутованом зелено флуоресцентном протеину водили смо се за принципом да је у GCaMP3 индикатору формирање отвора постигнуто уклањањем аминокиселина ФП које се налазе на позицијама 145 до 148 (Tian et al., 2009). Ова варирања у аминокиселинском саставу резултују отворима који се разликуу по саставу и локализацији (Слика 8, Табела 1). Сваку од 9 варијанти циркуларно пермутованог зеленог флуоресцентног протеина смо уградили на десет различитих локација уоквиру CiVS. Избор места уградње ФП-а уоквиру волтажног сензора су биране тако да одговарју локацијама које су се показале успешне у ранијим пробама или да се налазе у њиховој непосредној близини. Места уградње ФП-а су варирана тако да се крећу од С4 домену најближег аминокиселинског остатка лизина 241 (К241) и низ секвенцу ВСД-а све до гуанина 259 (G259). Клонирање ФП-а на одређене позиције је урађено уз помоћ mUKG секвенце која садржи 5 амино киселина (Слика 8, Табела 1). Намера нам је била да овако формираним разликама у растојању између cpEGFP и С4 испитамо варијације у кинетици промена које се под утицјем волтажних промена дешавају у С4 региону. Комбинацијом варијанти ФП-а и места уградње је добијено 90 потенцијалних проба. 36 Ниво експресије свих конструкта је испитиван транзијентном експресијом у HEK293 ћелијама. Након 48 сати експресије, 55 од 90 конструката је довело до појаве флуоресценције у ћелијама (Табела 1) која је генерално говорећи била слабијег интензитета и лошије мембранске локализације (Слика 9) у поређењу са другим CiVSP волтажним пробама (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Gautam et al., 2009; Perron et al., 2009). Компаративна анализа интензитета флуоресценције у ћелијама урађена применом конфокалне микроскопије је 37 Табела 1. Дизајн проба, ниво експресије и ΔF/ΔV осетљивост CiVS::cpEGFP конструката. Систематски су испитиване две променљиве: 1) позиција амино киселине у оквиру CiVS где је уграђен cpEGFP (хоризонтална оса, односно 1.x), и 2) величина и позиција (вертикална оса, односно x.1) отвора у cpEGFP. Сивим бројевима су означени бројеви конструката. Зеленим осенчена поља се односе на пробе које показују базални ниво флуоресценције у трансфекованим HEK293 ћелијама. Осенчени бројеви у пољима означавају упросечне вредности измерене за максималну % ΔF/F ± SEM за +100 mV/200 ms волтажне пулсеве, потенцијал мировања је -70 mV; NS = нема ΔF/F сигнала; Црвеним бројевима у пољима су обележени сигнали који су показали обрнуту поларизованост (пораст флуоресценције) при деполаризационим пулсевима. Values expressed as maximum %∆F/F ± SEM from a 200 ms /100mV step from a holding potential of -70 mV; NS = no detectable ∆F/F; Red values in table indicate reversed (increase in fluorescence) for depolarizing steps. Green shading indicates probes which produced fluorescence when expressed in HEK293 cells. pLB1.x K241 pLB2.x S243 pLB3.x R245 pLB4.x I248 pLB5.x S249 pLB6.x N251 pLB7.x K252 pLB8.x Y255 pLB9.x K257 pLB10.x G259 pLBx.1 pLBx.2 pLBx.3 pLBx.4 pLBx.5 pLBx.6 pLBx.7 pLBx.8 pLBx.9 NS <+0.1 NS < -0.1 +0.2 ±0.05 NS < -0.1 NS -0.29 ±0.03 -1.2 ±0.18 -0.71 ±0.01 -0.6 ±0.003 -0.83 ±0.23 -0.45 ±0.16 -0.45 ±0.09 +0.16 ±0.02 -0.52 ±0.06 -0.27 ±0.03 -0.22 ±0.04 NS NS -0.17 ±0.03 +0.33 ±0.03 +0.28 ±0.09 GHKLEYNYNSHNVYIKADKQ GHKLEYNY- SHNVYIKADKQ GHKLEYN- - SHNVYIKADKQ GHKLEYNYN- HNVYIKADKQ GHKLEYNY- - HNVYIKADKQ GHKLEYN- - - HNVYIKADKQ GHKLEYNYN- - NVYIKADKQ GHKLEYNY- - - NVYIKADKQ GHKLEYN- - - - NVYIKADKQ . . . .L L R V V R L A R I F Y S H Q Q M K A S S R R T I S Q N K R R Y R K D G . . . CiVSP S4 Место уградње cpEGFP у CiVS Ва ри ја ци ја у о тв ор у у cp EG FP 1.1 2.1 3.1 4.1 5.1 6.1 7.1 8.1 9.1 10.1 1.2 2.2 3.2 4.2 5.2 6.2 7.2 8.2 9.2 10.2 1.3 2.3 3.3 4.3 5.3 6.3 7.3 8.3 9.3 10.3 1.4 2.4 3.4 4.4 5.4 6.4 7.4 8.4 9.4 10.4 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 1.6 2.6 3.6 4.6 5.6 6.6 7.6 8.6 9.6 10.6 1.7 2.7 3.7 4.7 5.7 6.7 7.7 8.7 9.7 10.7 1.8 2.8 3.8 4.8 5.8 6.8 7.8 8.8 9.8 10.8 1.9 2.9 3.9 4.9 5.9 6.9 7.9 8.9 9.9 10.9 38 Figure 2 ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnkrryrkdgfdldltyvtdh……CionaVSP ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnkrrcgrCFP………………………………VSFP2.1 ...larllrvvrlarifyshqqcgrRFP………………………………………………………………………VSFP3.1 ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisgdpmUKG…………………………………………Mermaid ...larllrvvrlarifyshqqmkmsvikGFP……………………………………………………………1.X ...larllrvvrlarifyshqqmkasmsvikGFP………………………………………………………2.X ...larllrvvrlarifyshqqmkassrmsvikGFP…………………………………………………3.x ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtimsvikGFP…………………………………………4.x ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtismsvikGFP………………………………………5.x ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnmsvikGFP…………………………………6.x ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnkmsvikGFP………………………………7.X ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnrrymsvikGFP…………………………8.X ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnrryrkmsvikGFP……………………9.X ...larllrvvrlarifyshqqmkassrrtisqnrryrkdgmsvikGFP……………10.X ...larllrvvrlarifyshqqmkasmsvikshnv…………………………………ElectricPK Слика 8. Протеинске секвенце различитих места спајања између cpEGFP и CiVS. Од врха: CiVSP секвенца укључује С4 домен (јарко плаво зелена), линкер домен (плаво зелено и црно) и део секвенце за фосфатазу (црвено). Места споја и линкер секвенце у пробама VSFP 2.1, 3.1 (Dimitrov et al., 2007; Lundby et al., 2009) и Mermaid (Tsutsui et al., 2008. У раду смо истражили десет различитих места спајања и линкера (pLB1.x-10.x; види Табелу 1). Тачно место споја је идентификвано на основу последње амино киселине у CiVS присутне у проби (јарко црвена). У свим случајевима на овај аминокиселински остатак се наставља додатна секвенца од 5 амино кислина (љубичаста) и секвенца ФП-а (зелена). Врста амино киселине која се налази на почетку cpEGFP зависи од величине и позиције отвора у cpEGFP (Види Табелу 1). показала варијације у интензитету и субцелуларној локализацији између различитих конструката (Слика 9). Конструкти у којима је место уградње ФП-а ближе С4 домену и који поседују највећу предвиђену величину отвора у највећем броју случајева не доводе до флуоресценције. Експресија свих конструката у којима је ФП удаљен од С4 домена и који имају мањи отвор на ФП-у је довела до флуоресценције у ћелијама (Табела 1). Од 24 потенцијалне пробе чија је волтажна сензитивност тестирана методом наметнуте волтаже, девет није показало сензитивност или је она била занемарљиво ниска (~0.1% ΔF/F) у одговору на волтажне стимулусе (деполаризациона промена од 100 mV док је ћелија држана на потенцијалу од −70 mV). Остали конструкти су у одговору на исти стимулус показали промену у интензитету флоресценције која се кретала од +0.33% до −1.2% ΔF/F ( Табела 1, Слика 9). Највећа сензитивност је уочена у конструктима са најмањим отвором на ФП-у. У већини конструката, деполаризциони стимулус изазива смањење интензитета флуоресценције (Табела 1, Слика 9а-в) док је у пет конструката (четри на локацији G259 и једна на K257) на исти тест стимулус одреаговало повећањем у флуоресценцији (Табела 1, Слика 9г). И док су два (pLB 7.7 и pLB 7.8) конструкта показала предоминантно спору кинетику при активацији и деактивацији (τ~69ms; Слика 9б), 13 конструката (10.5, 1.7, 2.7, 4.7, 5.7, 1.8, 10.8, 2.9, 4.9, 5.9, 8.9, 9.9, 10.9) се одликује изузетно брзом кинетиком (τ~2 ms; Слика 9а и 9в). Наша процена је да је детекција брзине тестираних одговара највероватније ограничена брзином које су примењене експерименталне методе (метод наметнуте волтаже ~1ms и узорковање оптичког сигнала од 2,000 fps) имале у нашим рукама. Кинетику одговора у девет конструката (9.1, 10.1, 5.5, 6.5, 1.6, 2.6, 8.6, 6.9, 7.9) који не показују волтажну сензитивност или је иста врло ниска је практично било немогуће прецизно одредити. Међу описаним конструктима највећу сензитивност је показала проба pLB2.7 (−1.2 ± 0.18% ΔF/F; Слика 9а), коју смо назвали ElectricPk, и која је даље детаљније испитивана. ElectricPk се одликује брзом стопом активације (τon = 2.24 39 40 Слика 9. Примери експресије CiVS::cpEGFP конструката експримираних у HEK293 ћелијама и њихова волтажна сензитивност. У свим случајевима горњи панел је слика HEK293 ћелија које транзијентно експримирају конструкт добијена конфокалном микроскопијом. Доњи панел је флуоресцентни сигнал (црвени запис) добијен упросечавањем десет одговора на +100 mV/200 ms волтажни пулс применом метода наметнуте волтаже на целу ћелију. Корекција ефекта изазваног избељивањем ФП-а је вршена тако што је идеализована крива (описана са два експоненцијална фактора и подешена у односу на делове сигнала који се налазе ван опсега волтажног пулса) подељена са мерним флуоресцентним сигналом. а) ElectricPk (pLB 2.7) проба је локализована углавном у мембани и делимично унутар ћелије. Проба показује брзо смањење у интензитету флуоресценције са релативно ниским односом сигнала према шуму што је последица релативно ниског нивоа флуоресценције. б) Висока експресија конструкта pLB7.7 показује релативно висок однос сигнала према шуму, међутим уочљиво је и присуство одрећеног нивоа флуоресценције унутар ћелије. Кинетика смањења интензитета флуоресценције је спора. в) Конструкт pLB1.8 је локализован подједнако у мембрани и унутарћелијски а на промену волтаже реагује брзо и са малим смањењем у интензитету флуоресценције. г) pLB10.8 проба је углавном локализована интрацелуларно и за разлику од већине других конструката показује мало повећање у интезитету флуоресценције. -0.2% ∆F/F 100 ms a б в г 2.7 7.7 10.81.8 -70mV +30mV -0.2% ∆F/F 100 ms -0.2% ∆F/F 100 ms -0.2% ∆F/F 100 ms Figure 3 20 ms 1% ∆F/F ± 0.58 ms, n = 8) и деактивације (τ1off = 2.09 ± 0.74 ms, τ2off = 69.07 ± 20.29 ms; Слика 10а). Стопа активације ElectricPk је 5 пута бржа (Слика 10б) него иста код CiVS-базиране пробе Mermaid (τon = 2.24 ms код ElectricPk у поређењу са 12 ms код Mermaid; Tsutsui et al., 2008)). Стопа деактивације је 11 пута бржа (τoff = 2.09 ms код ElectricPk у поређењу са 23 ms код Mermaid). Брзина реакције и осетљивост ове пробе омогућавају детектовање вишеструких, високо фреквентних кратких (1–3 ms) деполаризационих тест пулсева од којих сваки производи дискретан одговор у промени интензитета флуоресценције а да при томе не долази до значајнијег одступања од основне линије (Слика 10в, г). Тестирана низом хиперполаризационих и деполаризационих тест пулсева (−100 - +200 mV) ElectricPk проба је показала да се промена у флуоресценцији мења линеарно са променом волтаже (Слика 11). Даља карактеризација ElectricPk пробе је урађена у примарној култури неурона миша гајених у in vitro условима. Уз добру мембранску локализацију у ћелијској соми и наставцима, уочено је и присуство извесне количине унутараћелијскиог депозита (Слика 12а). Флуоресцирајуће ћелије су тестиране методом наметнуте струје на целу ћелију где је електрична активност неурона у виду акционих потенцијала изазивана убризгавањем кратких (2 ms) струјних пулсева. ElectricPk индикатор се показао способним за детекцију појединачних акционих потенцијала са високом временском резолуцијом (Слика 12б). Узлазна и силазна фаза акционих потенцијала су јасно уочљиве. Упркос скромној величини сигнала (~0.7% ΔF/F), која варира у зависности од нивоа експресије, низове акционих потенцијала је било могуће уочити без потребе за упросечавањем сигнала (Слика 12в). 41 42 0.2% ∆F/F 15ms30ms 0.2% ∆F/F 15ms30ms 0.2% ∆F/F 15ms30ms в г -70mV -70mV +30mV Figure 4 +30mV 30 3ms 1ms 3ms 0.2% ∆F/F 6005004003002001000 No rm ali ze d ∆F /F mUKG ElectricPk No rm ali ze d ∆F /F 230220210200190 430420410400390 ElectricPk mUKG Time (ms) Time (ms) -70mV +30mV -70mV +30mV 1ms 12ms 1.5ms 23ms B A Време Но рм ал из ов ан а ∆F /F Време Но рм ал из ов ан а ∆F /F а б Слика 10. Волтажна осетљивост и брзина реакције ElectricPk. а) Волтажно-зависна промена флуоресценције у HEK293 ћелијама када транзијентно експримирају ElectricPk (запис црвеним) у односу на mUKG у проби Mermaid (горњи запис црним) је тестирана пулсевима од +100 mV/ 200 ms, при чему је ћелија држана на -70 mV основном потенцијалу (доњи запис црним). У свим случајевима интензитет флуоресценције је нормализован у односу на почетни и максимални ниво. б) Идеализоване криве описане једним експоненцијалним фактором су подешене на доминатне стопе активације (on) и деактивације (оff) промене флуоресценције у ElectricPk и mUKG у Mermaid у ћелијама тестираним под (а). в) и г) Одговор HEK293 ћелије која експримира ElectricPk (запис црвеним) на низ волтажниг тест пулсева јачине +100 mV а различитог трајања 100 ms, 3 ms и 1 ms (запис црним). Ћелија је држана на -70 mV основном потенцијалу. 43 No rm ali ze d Flu or es ce nc e (∆ F/ F) 230220210200190 430420410400390 ElectricPk mUKG 1ms 12ms 1.5ms 23ms Time (ms) A B C а б F G Figure 1 F 1.5 1.0 0.5 0.0 -0.5 -1.0 -1.5 % ∆ F/ F -2 -1 0 1 2 % ∆ F/ F -150 -100 -50 0 Membrane Potential (mV) -70mV 30mV -170mV 100ms20ms 5ms 0.2% 0.2% 100ms-70mV 30mV 3ms 1ms Мембрански потенцијал (mV) % ∆ F/ F % ∆ F/ F -70mV -170 30mV No rm al ize d Fl uo re sc en ce (∆ F/ F) Слика 11. Линеаран однос ∆F/∆V ElectricPk. а) Промена флуоресценције (горњи запис) у ћелијама које транзијентно експримирају ElectricPk као одговор на низ деполаризационих и хиперполаризационих тест пулсева (-170 до +30 mV, при чему је ћелија држана на -70 mV основном потенцијалу, доњи запис). б) ∆F/∆V крива за Elec- tricPk добијена на основу података приказаних под (а). 44 Слика 12. Детекција нервних импулса у хипокампалним неуронима уз помоћ ElectricPk. а) Слика хипокампалног неурона миша гајеног у култури in vitro који експримира ElectricPk добијена је применом широкопољне епифлуоресцентне микроскопије и RedShirtImaging NeuroCCD камера. Линија =15 µm. б) Појединачан (запис светло црвеним) и упросечен (запис црвеним) оптички одговор на изазване нервне импулсе у неурону приказаном у (а). Упросечени сигнал је добијен обрадом сигнала добијених за 32 нервна импулса. Сва снимања су урађена на 2000 fps. в) Промена флуоресценције (запис светло црвеним-нефилтриран, запис цвеним- филтриран) која се јавља при низу изазваних нервних импулса у in vitro гајеним хипокампалним неуронима миша који експримирају ElectricPk. Доњи запис црним је електрични запис снимљен применом методе наметнуте струје на целу ћелију. Сви записи су кориговани за артефакт избељивања ФП-а, у случајевима где је назначено филтрирање је урађено са Bessel филтером на 350 Hz. а б в Figure 6 5ms 20ms 0.5% ∆F/F 0.8% ∆F/F Флуоресцентне волтажно-зависне протеинске пробе базиране на pH-сензитивном зеленом флуоресцентном протеину У намери да се испита ефекат употребе различитих ФП-а у дизајну CiVS- базираних волтажних индикатора, FRET пар (mUKG и mKOk) који се оригинално налази у индикатору Mermaid (Tsutsui et al., 2008) је замењен са варијантом зелено флуоресцентног протеина ecliptic pHluorin (GenBank: AAC40226.1; Miesenböck et al., 1998). Еcliptic pHluorin је развијен као pH-осетљива проба која је добијена мутирањем шест аминокиселинских остатака у зелено флуоресцентном протеину wild-type aqGFP (Miesenbock et al., 1998). У односу на aqGFP однос pH и интезитета флуоресценције у ecliptic pHluorin је померен према базним вредностима (Miesenböck et al., 1998). Волтажни индикатор који садржи ecliptic pHluorin је показао ниску волтажну осетљивост (-1.3% ± 0.3% ΔF/F) за +100mV тест пулсеве (Слика 13а и 13б). Ради даљег истраживања ове пробе развијене су варијанте HEK293 ћелијске линије које стабилно експримирају ову пробу и у једној од њих смо открили ненамерну мутацију која је довела до промене амино киселине аланин на позицији 227 у оквиру флуоресцентног протеина (за одређивање позиције амино киселина као референцу смо користили сквенцу wild- type aqGFP; Слика 14a) у аспартичну киселину (A227D). Мутирана проба је показала 14 пута већу волтажну-осетљивост (-18.1% ± 1.4 %, n = 6) у ΔF/F (Слика 13a и 13б) за деполаризационе пулсеве од100mV у односу на оригиналну пробу. У покушају да расветлимо механизам који је довео до овако рапидног повећања у волтажној осетљивости развили смо низ додатних проба. У намери да одредимо да ли је високу амплитуду сигнала до које је довела мутација A227D могуће репродуковати у другим пробама истражили смо ефекат ове мутације у ФП волтажним индикаторима који садрже или super ecliptic pHluorin (Sankar- 45 46 Слика 13. Мутација A227D повећава распон флуоресцентног одговора на CiVS- базираним пробама које садрже ecliptic pHluorin или Super Ecliptic pHluorin. а) Промена интезитета флуоресценције у HEK293 ћелијама које експримирају или CiVS- ecliptic pHluorin (црна, n = 9 ћелија; 10 покушаја по ћелији) или CiVS- ecliptic pHluorin A227D (црвена, n = 6) у одговору на 100mV деполаризационе пулсеве (-70mV основни потенцијал). Записи обележени светлијим тоновима (сива или розе) представљају израчунате стандардне грешке. б) Фракционална промена у интезитету флуоресценције % ΔF/F (средња вредност ± SEM) настала при 100mV деполаризационим пулсевима у седам волтажних индикатора у којима су различити ФП-и уграђени у CiVS на позицији S249: ecliptic pHluorin (црна; n = 9), ecliptic pHluorin A227D (црвена; n = 6), eGFP (црна; n = 10), eGFP A227D (црна; n = 5), super ecliptic pHluorin (црна; n = 9), super ecliptic pHluorin A227D (ArcLight, црвена; n = 8), и mUKG из Mermaid (зелена; n = 25). в) Лево: максимум % ΔF/F (средња вредност ± SEM) у односу на мембрански потенцијал и подешене Болцманове (Boltzmann-једначина 4) криве за три CiVS-базиране волтажне пробе које садрже различите ФП-е: ecliptic pHluorin (црна), ecliptic pHluorin A227D (црвена) и super ecliptic pHluorin A227D (ArcLight, роза). Десно: Болцманова подешавања на криве нормализованих флуоресценција за три пробе (једначина 5). г) Доле: промена флуоресценције super ecliptic pHluorin A227D (ArcLight) током деполаризације (лево) и реполаризације (десно) при 100mV деполаризационом пулсу, ћелија је држана на -70mV (црна, један покушај) и подешавање на идеализовану криву која се описује са два експоненцијална фактора (црвена, једначина 3). Q80 A227 N149 S147 S202 Q204 A206 F E A C D B G в Об рн ут и % Δ F/ F Об рн ут и % Δ F/ F Време (ms)Мембрански потенцијал (mV) а б г 47 Alignment Report of Untitled ClustalV (PAM250) Page 1 Wednesday, August 10, 2011 6:06 AM M - S K G E E L F T G V V P I L V E L D G D V N G H K F S V 29eclipseGFP M V S K G E E L F T G V V P I L V E L D G D V N G H K F S V 30eGFP S G E G E G D A T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W P T 59eclipseGFP S G E G E G D A T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W P T 60eGFP L V T T F S Y G V Q C F S R Y P D H M K R H D F F K S A M P 89eclipseGFP L V T T L T Y G V Q C F S R Y P D H M K Q H D F F K S A M P 90eGFP E G Y V Q E R T I F F K D D G N Y K T R A E V K F E G D T L 119eclipseGFP E G Y V Q E R T I F F K D D G N Y K T R A E V K F E G D T L 120eGFP V N R I E L K G I D F K E D G N I L G H K L E Y N Y N D H Q 149eclipseGFP V N R I E L K G I D F K E D G N I L G H K L E Y N Y N S H N 150eGFP V Y I M A D K Q K N G I K A N F K I R H N I E D G G V Q L A 179eclipseGFP V Y I M A D K Q K N G I K V N F K I R H N I E D G S V Q L A 180eGFP D H Y Q Q N T P I G D G P V L L P D N H Y L F T T S T L S K 209eclipseGFP D H Y Q Q N T P I G D G P V L L P D N H Y L S T Q S A L S K 210eGFP D P N E K R D H M V L L E F V T A A G I T H G M D E L Y K 238eclipseGFP D P N E K R D H M V L L E F V T A A G I T L G M D E L Y K 239eGFP A227 Mutations (ecliptic pHluorin to eGFP) described in this report Additional differences between ecliptic pHluorin and eGFP Beta sheets eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP eclipti pHluorin eGFP Supplemental figure 1 ArcLightS249 MEGFDG....FYSHQQMKASSRRTISGDPM..* ▲ ▲ ▲ 1 239 249 Arclight Q239 MEGFDG....FYSHQQGDPM..* Arclight M240 MEGFDG....FYSHQQMGDPM..* Arclight K241 MEGFDG....FYSHQQMKGDPM..* Arclight A242 MEGFDG....FYSHQQMKAGDPM..* Arclight S243 MEGFDG....FYSHQQMKASGDPM..* Note: “GDP” is translated from a BamH I restriction site. Ciona VSD Super ecliptic pHluorin (A227D) A B а б Слика 14. Секвенце протеина кориштених у овом раду и структура ArcLight пробе. а) Поређење протеинских секвенци флуоресцентних протеина ecliptic pHluorin и ЕGFP. Остатак амино киселине A227 је уоквирен плавим. Остаци амино киселина који се разликују између ecliptic pHluorin и ЕGFP су уоквирени црвеним. Интензивнијом црвеном бојом су уоквирени остаци амино киселина ecliptic pHluorin који су мутирани тако да одговарају онима који се налазе у ЕGFP. Светло зеленом бојом су осенчени остаци амино киселина које формирају бета равни у структури ФП-а. б) Померањем ФП-а ближе С4 домену CiVS добијене је низ проба из ArcLight S249. У свим пробама фосфатазни део је избрисан из CiVSP. Преостали део волтажног сензора (осенчен жутим) је спојен са флуоресцентним протеином super ecliptic pHluorin A227D (осенчен зеленом) на различитим локацијамаs. Три амино киселине, GDP које се налазе између CiVS и ФП су унесене у процесу клонирања из рестрикционог места BamHI рестрикционог ензима који је оригинално кориштен у конструкцији пробе Mermaid, која је родитељска проба за ArcLight. anarayanan et al., 2000) или EGFP (тзв. побољшани зелено флуоресцентни протеин). Ова две варијанте зелено флуоресцентног протеина су врло сличне и обе су добијене мутагенезом wild type aqGFP. Super ecliptic pHluorin је добијен комбинацијом мутација које се налазе у ecliptic pHluorin и двема мутацијама, F64L и S65T које се налазе у ЕGFP (Sankaranarayanan et al., 2000; Слика 14а). F64L и S65T мутације које се налазе у ЕGFP доводе до промене ексцитационог спектара super ecliptic pHluorin редукујући га на само један максимум (~490 nm), и продукују светлији и фото-сатбилнији ФП не утичући при том на његову pH- сензитивност (Sankaranarayanan et al., 2000). Волтажни индикатори базирани на super ecliptic pHluorin (+0.5 ± 0.1% ΔF/F) или ЕGFP (+0.3 ± 0.1% ΔF/F) ФП-у нису показали значајнију промену у интезитету флуоресценције при примени деполаризационих пулсева (Слика 13б). Уношење мутације A227D је, међутим довело до драматичног пораста у величини одговора пробе базиране на super ecliptic pHluorin (-15.2 ± 0.9% ΔF/F; Слика 13б). Уношење ове мутације у пробу која се базира на ЕGFP, насупрот није довела до пораста у величини одговора (+0.5 ± 0.1 % ΔF/F; Слика 13б). Ови резултати упућују на закључак да су мутације присутне у ecliptic pHluorin неопходне да би A227D мутација имала ефекат. Такође, јасно је да ексцитациони спектар са два максимума који се налази у eclip- tic pHluorin није неопходан за побољшање сензитивности пробе. Анализа нивоа експресије двеју побољшаних проба је показала да су ћелије које експримирају пробу базирану на super ecliptic pHluorin A227D светлије од оних које експримирају пробу са ecliptic pHluorin A227D (3460 ± 609 AU, n = 12 ћелија са super ecliptic pHluorin A227D у односу на 373 ± 40 AU, n = 11 ћелија са ecliptic pHluorin A227D). Насупрот овом резултату су стопе избељивања ФП-а које нису показале значајну разлику у вредностима измереним у ове две тестиране пробе (~4.8% ± 0.8% ΔF/F, насупрот ~6.4% ± 0.7% ΔF/F током периода осветљавања ласерском светлошћу у трајању од 2s). Обзиром да смо закључили да су ћелије које експримирају пробу базирану на super ecliptic pHluorin A227D светлије од оних које експримирају пробу са ecliptic pHluorin A227D, за даљи 48 наставак студије смо одабрали ову пробу. ФП волтажни индикатор који садржи super ecliptic pHluorin A227D је назван ArcLight. Мутација A227D није утицала на ниво експресије индикатора у ћелијској плазма мембрани нити на базални ниво интензитета флуоресценције у HEK293 ћелијама. У покушају да се објасни овај феномен први корак је подразумевао тестирање општих фотофизичких карактеристика ФП и процену евентуалног утицаја промене у аминокиселинскм саставу ФП на њих. Експерименти који су изведени на пречишћеном мутираном и немутираном протеину нису показали разлику у ексцитационом или емисионом спектру или у pH сензитивности између ова два протеина (Слика 15). Однос између промене интензитета флуоресценције и промене волтаже (ΔF/ΔV) је остао непромењен у проби која саджи A227D мутацију. Као и већина до сада описаних Ci-VS проба (Lundby et al., 2008; Perron et al., 2009b), ArcLight индикатор показује однос флуоресценције према волтажи који се може описати сигмоидалном кривом (Слика 9в). Кинетика овог индикатора је такође слична динамици која се може наћи у већини других публикованих проба са брзином активације за +100mV тест пулсеве која се најбоље описује дуплом експоненцијалном кривом (Слика 9г и 16а). Измерене вредности за временске константе (tau, τ), износе ~10 ms за брзу компоненту и ~50 ms за спору компоненту (Слика 16б) што су вредности објављене за већину до сада описаних проба (Akemann et al., 2012). 49 50 Слика 15. Спектри побуђивања и емисије и pH сензитивност super ecliptic pHluorin и super ecliptic pHluorin A227D. а) Спектри побуђивања и емисије super ecliptic pHluorin (црна) и super ecliptic pHluorin A227D (црвена). Таласна дужина емисије кориштена за мерење побуђивања је 550 nm. Таласна дужина побуђивања кориштена за мерење емисије је 465 nm. б) Емисиони спектри super ecliptic pHluorin (лево) и super ecliptic pHluorin A227D (десно) у растворима различите pH вредности: 9.5 (љубичаста), 8.5 (плава), 7.5 (плаветна), 6.5 (зелена), 5.5 (наранџасто жута), 4.5 (наранџасто црвена) и 3.5 (црвена). в) Нормализован интезитет флуоресценције у односу према pH super ecliptic pHluorin (црна) и super ecliptic pHluorin A227D (црвена). Supplemental figure 2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Fl uo re sc en ce E m . ( No rm al ize d) 987654 pH Super ecliptic pHlourin A227 D227 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Em is si on in te ns ity 650600550500 9.5 8.5 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 650600550500 Super ecliptic pHluorin Super ecliptic pHluorin (A227D) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Ex ci ta tio n/ Em is si on (A U) 650600550500450400350 Wavelength (nm) Super ecliptic pHluorin A227 D227 Wavelength (nm) A B C Super ecliptic pHluorin Ек сц ит ац иј а/ ем ис иј а (A U) Ин те зи те т е ми си је Ф лу ор ес ен ци ја Е м. (Н ор ма ли зо ва на ) Таласна дужина (nm) pH б a Таласна в 51 Слика 16. Динамика ArcLight и других проба кориштених у овом раду је подешена употребом идеализованих криви описаних са једним или два експоненцијална фактора. а) Доле: Приказана су два примера оптичких записа који су резултат 100 mV деполаризационих пулсева (од -70 mV до 30 mV). Временски ток активације се може успешно подесити на криве описане са једним (црним, једначина 3) или са два (црвеним, једначина 3) експоненцијална фактора. Горе: Анализа показује да је подешавање на криву која се описује са два експоненцијална фактора прецизније у првих 100ms деполаризације. б) τ брзе и споре компоненте и релативне амплитуде за сваку компоненту (средња вредност ± SEM) израчунате на основу идеализоване криве описане са два експоненцијална фактора за следеће CiVS ФП волтажне индикаторе: ecliptic pHluorin A227D уграђен на позицији S249 (n=8), ArcLight (n=9), ArcLight Q239 (n=6), ArcLight M240 (n=8), ArcLight K241 (n=7), ArcLight A242 (n=6), ArcLight S243 (n=7). Supplemental figure 3 On 1 On 2 Off 1 Off 2 τ Amplitude τ τ Amplitude τ Ecliptic (A227D) S249 14 ± 2 0.68 ± 0.06 78 ± 28 27 ± 3 0.55 ± 0.04 72 ± 19 ArcLight S249 10 ± 1 0.63 ± 0.05 47 ± 4 19 ± 2 0.53 ± 0.09 62 ± 9 ArcLight Q239 9 ± 1 0.50 ± 0.03 48 ± 4 17 ± 1 0.79 ± 0.03 60 ± 7 ArcLight M240 10 ± 1 0.55 ± 0.03 52 ± 4 20 ± 1 0.68 ± 0.05 77 ± 11 ArcLight K241 12 ± 1 0.51 ± 0.04 51 ± 6 20 ± 1 0.83 ± 0.03 68 ± 10 ArcLight A242 10 ± 1 0.65 ± 0.03 53 ± 4 22 ± 1 0.70 ± 0.04 74 ± 4 ArcLight S243 9 ± 1 0.62 ± 0.03 44 ± 5 18 ± 1 0.68 ± 0.04 53 ± 9 -2 -1 0 1 2 -25 -20 -15 -10 -5 0 % ∆ F/ F 12080400 Time (ms) 12080400 -2 -1 0 1 2Re si du al 250200150100500 Double Exp FIt Single Exp FIt B A Време (ms) а б У намери да установимо који остаци амино киселина, поред мутације A227D доприносе повећаној осетљивости пробе направљене су додатни конструкти у којима су најважније амино киселине у super ecliptic pHluorin ФП-у промењене у аналогне амино киселине из ЕGFP (Слика 17а). Од ~238 амино киселина колико улази у састав зелено флуоресцентног протеина, super ecliptic pHluorin се разликује од ЕGFP у девет које заузимају следеће позиције: 80, 147, 149, 163, 175, 202, 204, 206, и 231 (Слика 14). Од ових девет амино киселинa свe сем једнe (163), имају бочне ланце који су окренути ка споља на површини ФП-а, а многи од њих се налазе на истој страни бета буре (Слика 17а), као и A227. Појединачним мутацијама направљено је шест варијанти ArcLight конструката у којима су амино киселине из super ecliptic pHluorin замењене са онима из ЕGFP: R80Q, D147S, Q149N, F202S, T204Q, и T206A (Слика 17). Промена амино киселине аргинин у глутамин (R80Q) или глутамин у аспаргин (Q149N) је није показала утицај на сензитивност ArcLight-а. Промена D147S (аспартичне киселине у серин) је довела до великог пада у осетљивости пробе (-10.9 ± 0.9% ΔF/F) а још израженије смањење у величини сигнала је добијено при замени фенилаланина са серином (F202S; -2.3 ± 0.2 % ΔF/F) и треонина у глутамат (T204Q; -3.6 ± 0.3% ΔF/ F) од којих је свака практично довела до елиминације одговора ArcLight-а (Figure 17б и 17 в). Једина мутација која је допринела порасту сигнала је промена треонина у аланин на позицији 206 (T206A) која доводи до просечне промене од ΔF/F -27.9 ± 1%. 52 53 Слика 17. Модулаторни ефекат мутације A227D зависи од негативног наелектрисања на тој позицији и других остатака амино киселина који се налазе на површини ФП-а. Сви представљени одговори су изазвани +100mV волтажним пулсевима у HEK293 ћелијама. а) Лево: 3D структура ЕGFP (PDB идентификација 1EMG) у којој је приказана позиција аминокиселинских остатака у super ecliptic pHluorin (ArcLight) који су мутирани тако да одговарају онима који се налазе у ЕGFP: Q80 (светло плава), S147 (циклама), N149 (жута), S202 (плава), Q204 (наранџаста), и A206 (зелена). A227D мутација је обележена црвеним. Десно: фракциона промена у интезитету флуоресценције, % ΔF/F (средња вредност ± SEM), седам CiVS волтажних проба које садрже различите мутације у оквиру super ecliptic pHluorin који је уграђен на позицији S249. Ове модификације су мутације уоквиру super ecliptic pHluorin (A227D) на местима која су приказана у левом панелу. ArcLight (црвена, n = 10), ArcLight са појединачним мутацијама: R80Q (плаво зелена, n = 6), D147S (пурпурно црвена, n = 7), Q149N (жута, n = 6), F202S (плава, n = 8), T204Q (наранџаста, n = 8) и T206A (зелена, n = 6). По један покушај је снимљен у свакој ћелији, добијене максималне вредности су потом упросечени. в) Табеларни приказ резултата из графика под б. ArcLight response (Figure 2A). Conversely, the T206A mutation increased the signal size. We also explored whether replacing the A227 in ecliptic pHluorin with amino acids other than aspartic acid would modulate the response of the probe. We found that replacement of A227 with glutamic acid enhanced the DF/F response over A227; however, this was a significantly smaller increase than that seen with aspartic acid (Figure 2B). Basic residues (i.e., arginine and lysine) at position 227 eliminated the voltage- dependent fluorescence change (Figure 2B). These findings indi- cate that the presence of a negative charge at position 227 is essential for the increase in fluorescence response magnitude but the single additional carbon present in the glutamic acid side chain reduces this effect. Replacement of A227 with polar residues (i.e., histidine, glutamine, or asparagine) also improved the fluorescence response, but not as much as aspartic acid (Figure 2B). Moving an FP to different positions along the linker between the CiVS and the phosphatase has been shown to alter the signal size and response speed of the resulting probes (Baker et al., 2008). We sought to determine whether the improvement in response magnitude caused by the A227D mutation persists when the FP is placed after sites other than S249 of the linker. Five new probes were engineered with super ecliptic pHluorin A227D relocated closer to the S4 domain of the CiVS, after amino acids Q239, M240, K241, A242, or S243 (Figure S1B). Each of the five derivatives of ArcLight resulted in a further increase of the response magnitude (!35% versus !18% DF/F) to a 100mV depolarization step (Figure 2C). Thus the large improvement of signal size seen with this mutation is not limited to a specific location along the linker segment; an even greater increases in signal size was achieved by moving the FP closer to the S4 domain. Optical methods offer the promise of less invasive, better tar- geted, and greater multisite monitoring of neuronal activities compared to traditional electrode-based methods. A number of FP-based, self-contained probes of membrane potential have been described (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al., 2001a; Ataka and Pieribone, 2002; Baker et al., 2007; Dimitrov et al., 2007; Lundby et al., 2008; Tsutsui et al., 2008). While Q80 A227 N149 S147 S202 Q204 A206 B A C 30 25 20 15 10 5 0 % F/ F A227D R80Q D147S Q149N F202S T204Q T206A Super ecliptic pHluorin A227DSuper ecliptic pHluorin -40 -30 -20 -10 0 % F/ F Q239 M240 K241 A242 S243 S249 Q239 M240 K241 A242 S243 S249 -5% F/F 100mV D E K R H Q N A 20 15 10 5 0 % F/ F D K Q AE R H N - 5% - - - - F/F 100mV Fluorescent protein insertion site Amino acid at position 227 Figure 2. The Modulatory Effect of the A227DMutation Is Dependent on a Negative Charge at that Position and on Other Surface Residues of the FP A larger response magnitude was achieved when the FP was relocated closer to the S4 domain of the CiVS. All responses are produced by +100mV voltage steps in HEK293 cells. (A) Left: the 3D structure of eGFP (PDB identifier 1EMG) illustrating the position of residues in super ecliptic pHluorin (ArcLight) that were mutated to those found in eGFP: Q80 (cyan), S147 (magenta), N149 (yellow), S202 (blue), Q204 (orange), and A206 (green). The A227D mutation is marked with red. Right: the fractional fluorescence change, % DF/F (mean ± SEM), of seven CiVS-based voltage sensors containing different mutations of super ecliptic pHluorin inserted at S249 of the linker. These modifications were mutations of super eclipticpHluorin (A227D)at thesites indicated in the left panel. ArcLight (red, n = 10), ArcLightwith single point mutations: R80Q (cyan, n = 6), D147S (magenta,n=7),Q149N (yellow,n=6), F202S (blue, n = 8), T204Q (orange, n = 8) and T206A (green, n = 6). A single trialwas recorded fromeachcell and the peak values of these trials were averaged. (B) Left: averaged optical traces of CiVS-ecliptic pHluorin and seven mutant probes carrying different point mutations at residue 227 of the FP. CiVS-ecliptic pHluorin (A, gray, n = 9). Point mutations at residue 227: A227D (red, n = 6), A227E (pink, n = 8), A227K (dark blue, n = 4), A227R (intermediate blue, n = 8), A227H (light blue, n = 6), A227Q (green, n = 5), or A227N (light green, n = 9). Ten trials were averaged for each cell and then the values from the different cells aver- aged. Right: summary of the peak%DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. (C) Left: averaged optical traces of ArcLight and ArcLight-derived probes with super ecliptic pHluorin A227D moved to different locations within CiVS: ArcLight Q239 (pu ple, n = 7), ArcLight M240 (blue, n = 8), ArcLight K241 (cyan, n = 7), ArcLight A242 (green, n = 7), ArcLight S243 (orange, n = 7), and ArcLight (S249; red, n = 10). A single trial was recorded from each cell and the optical traces of these trials were averaged. Right: summary of the peak % DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. Neuron Optical Single Action Potential Recordings Neuron 75, 779–785, September 6, 2012 ª2012 Elsevier Inc. 781 а б в Место уградње флуоресцентног протеина Амино киселине на позицији 227 ба Мутација амино киселина у секвенци super ecliptic pHluorin % ΔF/F (средња вредност ± SEM) R80Q Q149N D147S F202S T204Q T206A A227D - 20.7 ± 1.1 -19.0 ± 1 -10.9 ± 0.9 -2.3 ± 0.2 -3.6 ± 0.3 -27.9 ± 1 -18.1% ± 1.4 в Ми смо такође, истражили потенцијалну могућност да би замена A227 (аланина) у ecliptic pHluorin са неком другом амино киселином, сем аспартичне киселине (D) могла да утиче на сензитивност пробе. У ту сврху су издизајниране пробе у којима се на позицији 227 налазе или амино киселине са јако киселим остацима (глутаминска киселина-E), или са поларним остацима а сличне у величини (глутамин-Q и аспарагин-N) или са позитивно наелектрисаним остацима хистидин (H), лизин (K) и аргинин (R). Глутаминска киселина је довела до повећања ΔF/F одговора у односу на аланин али је пораст био упола мањи у односу на пробу са аспартичном киселином на истој позицији (-5.9 ± 0.7% ΔF/F у односу на -1.3 ± 0.3%; Слика 18). Две амино киселине базних остатака (аргинин и лизин) на позицији 227 дале су пробе мале сензитивности -0.4 ± 0.2% ΔF/F, односно -0.7 ± 0.2% (Слика 18). Хистидин (H) резултује у проби која даје сигнал од -7.8 ± 0.2% ΔF/F, што је уједно највиши сигнал који је добијен после оног са аспартичном киселином (D) (18.1 ± 1.4 % ΔF/F). Глутамин (-1.9 ± 0.2% ΔF/F) или аспаргин (-3.7 ± 0.5% ΔF/F) су такође довели до побољшања у промени интензитета флуоресценције али ово побољшање је и даље мање у односу на оно које је постигнуто са асапартичном киселином (Слика 18). Ови резултати указују да је присуство негативно наелектрисане групе на позицији 227 неопходно за повећање у промени флуоресценције, али и да присуство само једног додатног угљениковог атома који је присутан у глутаминској киселини доводи до смањења овог ефекта. Замена A227 са амино киселинама поларних остатака (хистидин, глутамин или аспарагин) такође доводи до повећања сигнала али је овај ефекат мањи од оног који изазива аспартична киселина (Слика 18). Ови резултати показују да су за овај ефекат значајни како наелектрисање тако и величина аминокиселинских остатака. 54 55 Слика 18. Модулаторни ефекат мутације A227D зависи како од наелектрисања тако и величине аминокиселинских остатака. а) Упросечени оптички записи добијени тестирањем CiVS-ecliptic pHluorin и седам проба које су мутанти који носе различите аминокиселинске остатке на позицији 227 у оквиру ФП-а. CiVS-ecliptic pHluorin (A, сива, n = 9). Појединачне мутације на позицији 227: A227D (црвена, n = 6), A227E (роза, n = 8), A227K (тамно плава, n = 4), A227R (светлије плава, n = 8), A227H (светло плава, n = 6), A227Q (зелена, n = 5), или A227N (светло зелена, n = 9). Десет покушаја је упросечено за сваку ћелију а потом су тако добијени записи за појединачне ћелије упросечени. б) и в) Графички и табеларни преглед максимума % ΔF/F (средња вредност ± SEM) проба представљених под а. ArcLight response (Figure 2A). Conversely, the T206A mutation increased the signal size. We also explored whether replacing the A227 in ecliptic pHluorin with ami o acids other than aspartic acid would modulate the response of the probe. We found that replacement of A227 with glutamic acid enhanced the DF/F response over A227; however, this was a significantly smaller increase than that seen with aspartic acid (Figure 2B). Basic residues (i.e., arginine and lysine) at position 227 eliminated the voltage- dependent fluorescence change (Figure 2B). These findings indi- cate that the presence of a negative charge at position 227 is essential for the increase in fluorescence response magnitude but the single additional carbon present in the glutamic acid side chain reduces this effect. Replacement of A227 with polar residues (i.e., histidine, glutamine, or asparagine) also improved the fluorescence response, but not as much as aspartic acid (Figure 2B). Moving an FP to different positions along the linker between the CiVS and the phosphatase has been shown to alter the signal size and response speed of the resulting probes (Baker et al., 2008). We sought to determine whether the improvement in response magnitude caused by the A227D mutation persists when the FP is placed after sites other than S249 of the linker. Five new probes were engineered with super ecliptic pHluorin A227D relocated closer to the S4 domain of the CiVS, after amino acids Q239, M240, K241, A242, or S243 (Figure S1B). Each of the five derivatives of ArcLight resulted in a further increase of the response magnitude (!35% versus !18% DF/F) to a 100mV depolarization step (Figure 2C). Thus the large improvement of signal size seen with this mutation is not limited to a specific location along the linker segment; an even greater increases in signal size was achieved by moving the FP closer to the S4 domain. Optical methods offer the promise of less invasive, better tar- geted, and greater multisite monitoring of neuronal activities compared to traditional electrode-based methods. A number of FP-based, self-contained probes of membrane potential have been described (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al., 2001a; Ataka and Pieribone, 2002; Baker et al., 2007; Dimitrov et al., 2007; Lundby et al., 2008; Tsutsui et al., 2008). While Q80 A227 N149 S147 S202 Q204 A206 B A C 30 25 20 15 10 5 0 % F/ F A227D R80Q D147S Q149N F202S T204Q T206A Super ecliptic pHluorin A227DSuper ecliptic pHluorin -40 -30 -20 -10 0 % F/ F Q239 M240 K241 A242 S243 S249 Q239 M240 K241 A242 S243 S249 -5% F/F 100mV D E K R H Q N A 20 15 10 5 0 % F/ F D K Q AE R H N - 5% - - - - F/F 100mV Fluorescent protein insertion site Amino acid at position 227 Figure 2. The Modulatory Effect of the A227DMutation Is Dependent on a Negative Charge at that Position and on Other Surface Residues of the FP A larger response magnitude was achieved when the FP was relocated closer to the S4 domain of the CiVS. All responses are produced by +100mV voltage steps in HEK293 cells. (A) Left: the 3D structure of eGFP (PDB identifier 1EMG) illustrating the position of residues in super ecliptic pHluorin (ArcLight) that were mutated to those found in eGFP: Q80 (cyan), S147 (magenta), N149 (yellow), S202 (blue), Q204 (orange), and A206 (green). The A227D mutation is marked with red. Right: the fractional fluorescence change, % DF/F (mean ± SEM), of seven CiVS-based voltage sensors containing different mutations of super ecliptic pHluorin inserted at S249 of the linker. These modifications were mutations of super eclipticpHluorin (A227D)at thesites indicated in the left panel. ArcLight (red, n = 10), ArcLightwith single point mutations: R80Q (cyan, n = 6), D147S (magenta,n=7),Q149N (yellow,n=6), F202S (blue, n = 8), T204Q (orange, n = 8) and T206A (green, n = 6). A single trialwas recorded fromeachcell and the peak values of these trials were averaged. (B) Left: averaged optical traces of CiVS-ecliptic pHluorin and seven mutant probes carrying different point mutations at residue 227 of the FP. CiVS-ecliptic pHluorin (A, gray, n = 9). Point mutations at residue 227: A227D (red, n = 6), A227E (pink, n = 8), A227K (dark blue, n = 4), A227R (intermediate blue, n = 8), A227H (light blue, n = 6), A227Q (green, n = 5), or A227N (light green, n = 9). Ten trials were averaged for each cell and then the values from the different cells aver- aged. Right: summary of the peak%DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. (C) Left: averaged optical traces of ArcLight and ArcLight-derived probes with super ecliptic pHluorin A227D moved to different locations within CiVS: ArcLight Q239 (purple, n = 7), ArcLight M240 (blue, n = 8), ArcLight K241 (cyan, n = 7), ArcLight A242 (green, n = 7), ArcLight S243 (orange, n = 7), and ArcLight (S249; red, n = 10). A single trial was recorded from each cell and the optical traces of these trials were averaged. Right: summary of the peak % DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. Neuron Optical Single Action Potential Recordings Neuron 75, 779–785, September 6, 2012 ª2012 Elsevier Inc. 781 а б в Место уградње флуоресцентног протеина Амино киселине на позицији 227 ба в Амино киселина на позицији 227 у секвенци ecliptic pHluorin % ΔF/F (средња вредност ± SEM) аспартична киселина (D) глутаминска киселина (E) лизин (K) аргинин (R) хистидин (H) глутамин (Q) аспаргин (N) аланин (А) -18.1 ± 0.3 -5.9 ± 0.7 -0.7 ± 0.2 -0.4 ± 0.2 -7.8 ± 0.2 -1.9 ± 0.2 -3.7 ± 0.5 -1.3 ± 0.3 Из ранијих студија које су се бавиле развојем протеинских волтажних индикатора (Baker et al. 2008; Lundby et al., 2008) познато је да промена локације уградње ФП дуж аминокиселинске секвенце која повезује CiVS и фосфатазу може довести до промене у величини сигнала или брзини одговора пробе. Са намером да испитамо стабилност повишене волтажне сензитивности у односу на место уградње ФП уоквиру волтажног индикатора пет нових конструката је направљено у којима је super ecliptic pHluorin A227D уграђен ближе С4 домену CiVS-а, и то после амино киселина Q239, M240, K241, A242, или S243 (Слика 19). Волтажни индикатори у којима је ФП уграђен после амино киселина Q239, M240, K241, A242, и S243 су, за 100mV деполаризациони тест пулс, дали сигнале од -39.2 ± 2.3%, -35.6 ± 2.6%, -34.3 ± 3.3%, -34.2 ± 1.9% и -33.4 ± 0.8% редом (Слика 19). Дакле, велика побољшање у величини сигнала која су добијена овом мутацијом нису ограничена на специфичне локације уградње ФП дуж линкер сегмента. Из ових експеримената је евидентно да је чак и веће побољшање у сензитивности пробе добијено померањем ФП ближе ка С4 домену. 56 57 ArcLight response (Figure 2A). Conversely, the T206A mutation increased the signal size. We also explored whether replacing the A227 in ecliptic pHluorin with amino acids other than aspartic acid would modulate the response of the probe. We found that replacement of A227 with glutamic acid enhanced the DF/F response over A227; however, this was a significantly smaller increase than that seen with aspartic acid (Figure 2B). Basic residues (i.e., arginine and lysine) at position 227 eliminated the voltage- dependent fluorescence change (Figure 2B). These findings indi- cate that the presence of a negative charge at position 227 is essential for the increase in fluorescence response magnitude but the single additional carbon present in the glutamic acid side chain reduces this effect. Replacement of A227 with polar residues (i.e., histidine, glutamine, or asparagine) also improved the fluorescence response, but not as much as aspartic acid (Figure 2B). Moving an FP to different positions along the linker between the CiVS and the phosphatase has been shown to alter the signal size and response speed of the resulting probes (Baker et al., 2008). We sought to determine whether the improvement in response magnitude caused by the A227D mutation persists when the FP is placed after sites other than S249 of the linker. Five new probes were engineered with super ecliptic pHluorin A227D relocated closer to the S4 domain of the CiVS, after amino acids Q239, M240, K241, A242, or S243 (Figure S1B). Each of the five derivatives of ArcLight resulted in a further increase of the response magnitude (!35% versus !18% DF/F) to a 100mV depolarization step (Figure 2C). Thus the large improvement of signal size seen with this mutation is not limited to a specific location along the linker segment; an even greater increases in signal size was achieved by moving the FP closer to the S4 domain. Optical methods offer the promise of less invasive, better tar- geted, and greater multisite monitoring of neuronal activities compared to traditional electrode-based methods. A number of FP-based, self-contained probes of membrane potential have been described (Siegel and Isacoff, 1997; Sakai et al., 2001a; Ataka and Pieribone, 2002; Baker et al., 2007; Dimitrov et al., 2007; Lundby et al., 2008; Tsutsui et al., 2008). While Q80 A227 N149 S147 S202 Q204 A206 B A C 30 25 20 15 10 5 0 % F/ F A227D R80Q D147S Q149N F202S T204Q T206A Super ecliptic pHluorin A227DSuper ecliptic pHluorin -40 -30 -20 -10 0 % F/ F Q239 M240 K241 A242 S243 S249 Q239 M240 K241 A242 S243 S249 -5% F/F 100mV D E K R H Q N A 20 15 10 5 0 % F/ F D K Q AE R H N - 5% - - - - F/F 100mV Fluorescent protein insertion site Amino acid at position 227 Figure 2. The Modulatory Effect of the A227DMutation Is Dependent on a Negative Charge at that Position and on Other Surface Residues of the FP A larger response magnitude was achieved when the FP was relocated closer to the S4 domain of the CiVS. All responses are produced by +100mV voltage steps in HEK293 cells. (A) Left: the 3D structure of eGFP (PDB identifier 1EMG) illustrating the position of residues in super ecliptic pHluorin (ArcLight) that were mutated to those found in eGFP: Q80 (cyan), S147 (magenta), N149 (yellow), S202 (blue), Q204 (orange), and A206 (green). The A227D mutation is marked with red. Right: the fractional fluorescence change, % DF/F (mean ± SEM), of seven CiVS-based voltage sensors containing different mutations of super ecliptic pHluorin inserted at S249 of the linker. These modifications were mutations of super eclipticpHluorin (A227D)at thesites indicated in the left panel. ArcLight (red, n = 10), ArcLightwith single point mutations: R80Q (cyan, n = 6), D147S (magenta,n=7),Q149N (yellow,n=6), F202S (blue, n = 8), T204Q (orange, n = 8) and T206A (green, n = 6). A single trialwas recorded fromeachcell and the peak values of these trials were averaged. (B) Left: averaged optical traces of CiVS-ecliptic pHluorin and seven mutant probes carrying different point mutations at residue 227 of the FP. CiVS-ecliptic pHluorin (A, gray, n = 9). Point mutations at residue 227: A227D (red, n = 6), A227E (pink, n = 8), A227K (dark blue, n = 4), A227R (intermediate blue, n = 8), A227H (light blue, n = 6), A227Q (green, n = 5), or A227N (light green, n = 9). Ten trials were averaged for each cell and then the values from the different cells aver- aged. Right: summary of the peak%DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. (C) Left: averaged optical traces of ArcLight and ArcLight-derived probes with super ecliptic pHluorin A227D moved to different locations within CiVS: ArcLight Q239 (purple, n = 7), ArcLight M240 (blue, n = 8), ArcLight K241 (cyan, n = 7), ArcLight A242 (green, n = 7), ArcLight S243 (orange, n = 7), and ArcLight (S249; red, n = 10). A single trial was recorded from each cell and the optical traces of these trials were averaged. Right: summary of the peak % DF/F (mean ± SEM) for probes in the left panel. Neuron Optical Single Action Potential Recordings Neuron 75, 779–785, September 6, 2012 ª2012 Elsevier Inc. 781 а б в Место уградње флуоресцентног протеина Амино киселине на позицији 227 а б Амино киселина у секвенци CiVS % ΔF/F (средња вредност ± SEM) Q239 M240 K241 A242 S243 -39.2 ± 2.3 -35.6 ± 2.6 -34.3 ± 3.3 -34.2 ± 1.9 -33.4 ± 0.8 в Слика 19. Утицај места уградње ФП уоквиру волтажног индикатора на модулаторни ефекат мутације A227D. а) Упросечени оптички записи добијени за ArcLight и ArcLight-изведене пробе са super ecliptic pHluorin A227D помереним на различите локације уоквиру CiVS: ArcLight Q239 (љубичаста, n = 7), ArcLight M240 (тамно плава, n = 8), ArcLight K241 (плаво, n = 7), ArcLight A242 (зелена, n = 7), ArcLight S243 (наранџаста, n = 7), и ArcLight (S249; црвена, n = 10). По један покушај је снимљен у свакој ћелији, овако добијени оптички записи су потом упросечени. б) и в) Графички и табеларни преглед максимума % ΔF/F (средња вредност ± SEM) проба представљених под а. Иницијално тестирање нивоа експресије и дистрибуције ArcLight пробе у примарним културама неурона је урађено применом конфокалне микроскопије (Слика 20а). Експресија пробе у хипокампалним неуронима миша у култури in vivo је дала светлу флуоресценцију која је присутна у соми и у дендритима (Слика 20а). У дендритима је приметно да је флуоресценција углавном мембрански локализована (Слика 20а). Потенцијални ефекат експресије пробе на побудљивост неурона је истражен поређењем појаве спонтаних акционих потенцијала у нетрансфекованим, лажно-трансфекованим и ArcLight-трансфекованим неуронима. У све три групе неурони нису показали статистички значајну разлику у ширини и амплитуди нервних импулса наводећи нас на закључак да експресија пробе не доводи до значајних промена у побудљивости неурона (Слика 20б). Експресија пробе не доводи до повишене фототоксичности обзиром да је појаву спонтаних нервних импулса чије се карактеристике нису мењале било могуће детектовати и после 4 минута (најдужи тестирани период) ексцитације (Слика 20в). Упркос релативно спором одговору индикатора који је измерен при тестирању у HEK293 ћелијама (fast τ~10 ms), спонтане (Слика 21а) и провоциране (Слика 21в) нервне импулсе је било могуће детектовати у неуронима који експримирају ArcLight пробе. Измерене су промене у интензитету флуоресценције које се крећу у распону од -1 до -5% ΔF/F (-3.2% ± 2.2%, n = 20 ћелија). Као што се и дало очекивати на основу измерених вредности за брзину пробе ова ΔF/F је нижа у односу на резултате добијене при тестирањима са пулсевима дужег трајања која с рађена у HEK293 ћелијама (Слике 13 и 17). Сличне вредности су добијене приликом тестирања у којима је снимана активност у HEK293 ћелијама као одговор на волтажне тест пулсеве који имају карактеристике акционих потенцијала (Слике 22). Спора кинетика пробе је разлог и што се при провоцираним високо-фреквентним електричним активностима флуоресценција не враћа на базални ниво између појединачних акционих потенцијала (Слика 21а). Ипак, и у овом случају било је могуће јасно детектовати појединачне акционе 58 59 Supplemental figure 4 80 60 40 20 0 Ac tio n po te nt ial a m pli tu de (m V) 7 6 5 4 3 2 1 0Ac tio n po te nt ial w idt h at h alf m ax (m s) None None Mock ArcLight Mock ArcLight B C 0 min 4 min 30mV 80 60 40 20 0 Ac tio n po te nt ial a m pli tu de (m V) 7 6 5 4 3 2 1 0Ac tio n po te nt ial w idt h at h alf m ax (m s) None None Mock ArcLight Mock ArcLight Aа в Ам пл ит уд а АП (m V) Ш ир ин а АП н а по ло ви ни м ак си му ма (m s) Ништа Lipofectamin ArcLight Ништа Lipofectamin ArcLight б Слика 20. Нервна ђелија која експримира ArcLight Q239 пробу снимљена уз употребу конфокалне микроскопије а експресије пробе не доводи до промене у амплитуди и трајању нервних импулса. а) Увеличано: увећани приказ уоквиреног дела ћелије који показује мембранску експресију ArcLight Q239 у дендритима. Линија = 10 µm. Одсуство ефекта експресије пробе на амплитуду или ширину нервних импулса измерена на половини максималне вредности за амплитуду. б) Лево: Амплитуда спонтаних нервних импулса (средња вредност ± SEM) снимљених методом наметнуте струје на целу ћелију у хипокампалним неуронима миша гајеним in vitro: нетрансфековани (49 нервна импулса у 6 неурона), лажно трансфековани (изложени Li- pofectamine 2000; 27 нервна импулса у 5 неурона) и ArcLight Q239 или A242 трансфековани неурони (91 нервна импулса у 16 неурона). Десно: Ширина нервних импулса (средња вредност ± SEM) измерена на половини максималне амплитуде у хипокампалним неуронима миша гајених in vitro. в) Облик спонтаних нервних импулса у ArcLight Q239 трансфекованим хипокампалним неуронима миша гајених in vitro нису значајно промењени ласерском илуминацијом у трајању од 4 мин. Линија временске скале је 5 ms. потенцијале. У поређењу са акционим потенцијалима дужи подпражни електрични догађаји мање амплитуде (највероватније ексцитаторни постсинаптички потенцијали) су лакши за детекцију и њих је неколико варијанти ArcLight проба, укључујући ArcLight Q239 и A242 успешно детектовало (Слика 23 и 24а). Електрична активност у нервним мрежама кортекса се базира на два типа сигнала: потпражним потенцијалима (рефлектују синаптички унос информација у дендрите) и супрапражним нервним импулсима (формирају реакцију нервних ћелија) (Grinvald et al., 2010). У складу са добром мембранском локализацијом 60 -2% ∆F/F 200ms C 200ms -2% ∆F/F Bа в б Слика 21. Праћење нервних импулси у нервним ћелијама помоћу ArcLight Q242 пробе. а) Приказан је пример записа добијеног снимањем спонтаних нервних импулса у нервној ћелији приказаној под (б). Сви оптички записи су кориговани за ефекат избељивања ФП-а и филтрирани применом Kaiser-Bessel 30 филтера. б) 80 x 80 депикселизована слика неурона чија је активност представљена под (а). Линија: 50 µm. в) Оптички и волтажни запис изазваних нервних импулса у неурону који експримира ArcLight A242 пробу. 61 Supplemental figure 5 20ms -2% ∆F/F Слика 22. Флуоресцентни одговор који производи ArcLight A242 експримиран у HEK293 ћелији на деполаризационе промене које имају форму нервних импулса. Горњи запис је промена флуоресценције на пулс који има форму појединачног акционог потенцијала примењен на HEK293 ћелију која експримира ArcLight A242. Доњи запис је волтажни пулс који је издвојен из спонтаних нервних импулса снимљених у хипокампалним неуронима. У флуоресцентном сигналу је урађена корекција за ефекат избељивања ФП-а. Bа б Слика 23. Праћење подпражних деполаризација у нервним ћелијама помоћу ArcLight Q239 пробе. а) Приказан је пример записа добијеног снимањем спонтане подпражне активности и нервних импулса у нервној ћелији приказаној под (б). Сви оптички записи су кориговани за ефекат избељивања ФП-а и филтрирани применом Kaiser-Bessel 30 филтера. Стрелице указују на деполаризације (вероватно ЕПСП) које су изазвале видљиве промене у оптичком сигналу. б) 80 x 80 депикселизована слика неурона чија је активност представљена под (а). Линија: 50 µm. која се може видети у дендритима, појединачни деполаризациони догађаји до којих долази при појави акционих потенцијала и подпражних догађаја су били лако уочљиви у дисталним дендритским сегментима при снимању са ArcLight Q239 (Слика 24). И док су до данас бројни генетички-кодирани волтажни индикатори описани (Baker et al., 2008; Kralj et al., 2011; Mutoh et al., 2012), за ниједан од ових индикатора се није показало да је погодан за рутинску употребу у оптичким снимањима спонтаних промена мембранског потенцијала у интактном мозгу. Специфична експресија ArcLight-а у бочно-вентралним циркадијаним сат неуронима (LNVs) у мозгу винске мушице (Drosophila melanogaster) је постигнута применом GAL4/UAS бинарног експресионог система. Ови неурони су кључни 62 Слика 24. Праћење подпражних догађаја и нервних импулса у ћелијском телу и дендритима у нервној ћелији помоћу ArcLight Q239 пробе. а) Приказан је пример записа добијеног снимањем нервниог импулса (леви панел) и подпражних догађаја (десни панел) са четри локације у нервној ћелији приказаној под (б). Оптички записи (обојени): %ΔF/F из области од интереса у истој боји под (б); запис снимљен електродом пласираном у ћелијско тело неурона. Сви оптички записи су кориговани за ефекат избељивања ФП-а и филтрирани применом Kaiser-Bessel 30 филтера. б) 80 x 80 а слика неурона чија је активност представљена под (а), обележени региони су упросечени чиме су добијени записи приказани под (а). Линија: 50 µm. A Bа б даваоци темпа (pacemakers) контролог кола за циркадијану активност и есенцијали су за правилно одржавање временске активности (Nitabach and Taghert, 2008). И док су неки аспекти електрофизиолошке активности ових неурона детаљно истражени употребом метода наметнуте волтаже/струје на целу ћелију (Cao and Nitabach, 2008; McCarthy et al., 2011), многи детаљи о њиховој физиологији остају недоступним за истраживања у којима се користе на електродама-базиране методе. ArcLight је експримиран у ћелијским телима, нервним наставцима и дисталним пептидо-секреторним завршецима како великих, тако и малих LNV неуронима (lLNVs и sLNVs; Слика 25а). У студији је кориштен in situ препарат целог мозга за експерименте у којима је комбинација метода наметнуте волтаже/струје на целу ћелију и оптичког сликања омогућила симултано снимање електрофизиолошких и оптичких сигнала у мозгу мушице. Симултано снимање методом наметнуте струје на целу ћелију и снимање флуоресценције великом брзином (500Hz) показују да ArcLight поуздано прати спонтане подпражне догађаје и нервне импулсе у lLNVs, при чему деполаризација изазива смањење а хиперполаризација пораст у интензитету флуоресценције (Слика 25б), као што је претходно показано у сисарским неуронима. Подпражни догађаји и акциони потенцијали снимљени електрично одговарају спорим и брзим променама у флуоресценцији ArcLight-а што се може видети у сваком од овде приказана три репрезентативна симултана оптичко-електрична мерења. Нервни импулси у ћелијским телима lLNVs су јасно оптички уочљиви упркос чињеници да имају врло малу амплитуду (<20 mV), што је случај и са већином других неурона Drosophila-е за које је било могуће добити податке применом метода наметнуте струје на целу ћелију. ArcLight поуздано прати како деполаризационе тако и хиперполаризационе промене у мембрани неурона (Слика 25б и Слика 26), те тако омогућава оптичку детекцију инхибиторних синаптичких потенцијала. Да би детаљније проучили однос између мембранског потенцијала и флуоресценције ArcLight-а у интактном мозгу мушице методом наметнуте волтаже на целу ћелију на ArcLight-експримирајуће lLNVs примењен је низ 63 64 Слика 25. Оптичко снимање подпражне активности и нервних импулса у интактном нервном колу помоћу ArcLight пробе. а) Шематски приказ експресије ArcLight у бочно-вентралним сат неуронима (lateral ventral clock neurons-LNVs) Drosophila melanogaster је горе лево. Велики LNVs (lLNVs) и њихови наставци су приказани плавим, а мали LNVs (sLNVs) и њихове дорзомедијалне пептосекреторне терминалне пројекције (dorsomedial peptidergic terminal projections) су црвене. Приказане су слике добијене конфокалном микроскопијом уз имунохистохемијско бојење целог мозга (доле, лево), LNV ћелијских тела (горе, десно), lLNV нервни наставци у оптичком лобусу (средина, десно), и sLNV дорзомедијални пептосекреторни наставци (доле, десно). Линије = 100µm са леве стране, 10µm са десне стране. б) Дата су три примера симултаног снимања методом наметнуте струје на целу ћелију и оптичког снимања lLNvs in situ у препарату целог мозга. Лево су приказани примери 80x80 депикселизованих слика за сваки запис са обележеним регионима где се налази неурон чија је активност снимана и електрично; црним су обележени записи електричне активности, а обојеним записи оптичких сигнала. Увеличани приказ уоквиреног региона приказаног десно. Све линије: 10µm. Приказана су три примера од укупно осам колико је урађено. A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI а б A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI а б волтажних пулсева при чему је мерена промена у интезитету флуоресценције (Слика 27, једначина 4). Промена флуоресценције у односу на промену потенцијала је мерена уз примену 2 µM TTX како би се утишали нервни импулси и синаптички потенцијали. Интересантно је да је Болцманова крива донекле померена у лево у односу на исту добијену тестирањем пробе у HEK293 ћелијама (Слика 13в), наглашавајући већу промену у флуоресценцији која настаје при 65 A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI а в б г д ђ A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI A B mV C1 C2 C3 N1 D Cao et al. Figure 1 1 sec -5% ǻ)) WT 2 sec Kir2.1E mV C1 C2 C3 N1 2 sec -3% ǻ)) ) NaChBac mV C1 C2 C3 2 sec -10% ǻ)) 25 mV -3% ǻ)) 20 mV 15 mV 120 mV ILNv sLNv 2 sec -3% ǻ)) 30 mV C 10 mV -2% ǻ)) 50 msec -45 mV -40 mV -40 mV -40 mV -50 mV -85 mV -100 mV -40 mV )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI а в б г д ђ а б Слика 26. Оптичко снимање провоциране и спонтане нервне активности у интактном нервном колу помоћу ArcLight пробе. a) Симултано снимање методом наметнуте струје на целу ћелију и оптичким снимањем lLNvs у препарату целог мозга уз примену пулса хиперполаризационе и деполаризационе струје од 10 pA. Струја је приказана сивим, запис добијен из електроде је црн, ArcLight оптички сигнал је црвен. Пример представља седам урађених експеримената. б) Оптички снимак ћелијских тела неколико неурона (C1-3) и једног наставка (N1) показује синхронизовану мембранску активност у wild-type lLNVs. Региони са којих је мерена активност су уоквирени бојом која одговара боји оптичког записа, при чему је запис електричне активности који одговара ћелији обележеној црвеним приказан црним. Ово је пример од осам урађених експеримената. хиперполаризацији него при деполаризацији (Слика 26а). Ова разлика у волтажној осетљивости ArcLight-а је највероватније последица разлике у липидном саставу плазма мембране између ова два типа ћелија (Villalba-Galea et al., 2009a). 66 -150 50 0 -50 -100 A B Cao et al. Supplemental Figure 2 M em br an e Po te nt ia l (m V) 2% ǻ)) Time (msec) 0 600400200 10 8 6 4 2 0 -2 -4 % ) ) -150 -100 -50 0 50 Membrane Potential (mV) 6XSSOHPHQWDO)LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG6XSSOHPHQWDO)LJXUHFDRBHWBDOVXSSOBILJXUHBEROW]PDQQSGI а б Мембрански потенцијал (m ) М ем бр ан ск и по те нц иј ал (m V) Време (ms) Слика 27. Болцманова крива описује промену у флоресценцији ArcLight у односу на промену мембранског потенцијала. Крива је добијена на основу праћења активности lLNvs ћелија уз примену методе наметнуте волтаже на целу ћелију. Снимање активности ћелија је урађено у препарату целог мозга и уз примену 2 µM TTX како би се утишали нервни импулси и синаптички потенцијали. а) ArcLight оптички сигнали из репрезентативне ћелије и одговарајући протокол који се састојао од низа хиперполаризујућих и деполаризујућих пулсева, ћелија је држана на потенцијалу од -50 mV. б) Болцманова крива је добијена на основу упросечених оптичких одговора добијених из пет lLNVs ћелија које експримирају ArcLight (средња вредност ± SEM). Обзиром на могућност да експресија ArcLight пробе може да доведе до пораста у електричној капацитанци ћелијске мембране и тиме промени физиолошке особине ћелије (Sjulson and Miesenböck, 2008), изведен је низ биофизичких тестова на ArcLight-експримирајућим lLNVs (Слика 28, Слика 29 и Слика 30). Просечна измерена вредност за потенцијал мировања (RMP) је -48.4 ± 2.1 mV (n=17) у ArcLight-експримирајућим lLNVs и - 44.0 ± 1.2 mV (n= 10) у контролним lLNVs (Слика 28а), што не показује статистички значајну разлику (p=0.15, неупарени Студентов т-тест). Мембранка капацитанца (Слика 28б) у ArcLight-експримирајућим lLNVs је 9.15 ± 0.66 pF (n=25), што је статистички значајно више у односу на вредности добијене за контролне lLNVs (7.0 ± 0.63 pF, n=12) (p < 0.05, неупарени Студентов т-тест). 67 WT ArcLight RM P (m V) -30 -80 -40 -50 -60 -70 A -30 -50 -45 -40 -35 AP T hr es ho ld (m V) WT ArcLight G Current Injection (pA) 0 2 4 6 8 10 12 N o. o f A Ps 0 252015105 F-5 -4 -3 -2 -1 0 WT ArcLightA P M ax . D ec ay S lo pe (m V/ m s) E 0 2 4 6 8 10 WT ArcLight A P M ax . R is e Sl op e (m V/ m s) * D 0 2 4 6 8 10 12 WT ArcLight Ca pa ci ta nc e (p F) * B WT ArcLight 0 5 10 15 20 25 30 1s t A P Am pl itu e (m V) H 5mV 100ms C ArcLight WT Cao et al. Supplemental Figure 3 n.s. n.s. n.s. no signficant effect of genotype n.s. 6XSSOHPHQWDO)LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG6XSSOHPHQWDO)LJXUHFDRBHWBDOVXSSOBILJXUHBELRSK\VLFVSGI Ка па ци та нц а (p F) ба Слика 28. Процена утицаја експресије ArcLight-а на биофизичке карактеристике мембране lLNVs је вршена поређењем са контролним ћелијама које експримирају ФП цитоплазматично. Сви подаци су представљени као средња вредност ± SEM. а) Потенцијал мировања мембране (RMP) lLNVs је мерен методом наметнуте струје на целу ћелију. б) Капацитанца мембране lLNVs је мерена тако што су на ћелију примењивани хиперполаришући волтажни пулсеви применом метода наметнуте волтаже на целу ћелију и мерењем временске константе резултујуће мембранске струје подешавањем на експоненцијалну криву објашњену са једним фактором. Максималан нагиб узлазне фазе нервних импулса (Слика 29б) износи 7.52 ± 0.93 mV/ms (n=10) у ArcLight-експримирајућим lLNVs и 4.58 ± 0.51 mV/ms (n=10) у контроли, што показује статистички значајну разлику (p < 0.05, неупарени Студентов т-тест). Максимални нагиб силазне фазе нервног импулса (Слика 29в) 68 а б в г Слика 29. Процена утицаја експресије ArcLight-а на карактеристике нервних импулса у lLNVs је вршена поређењем са контролним ћелијама које експримирају ФП цитоплазматично а) Репрезентативни записи спонтаних нервних импулса (APs) снимљених у ArcLight-експримирајућим (црвена) и контролним (црна) lLNVs. б) Поређење максималаног нагиба узлазне фазе акционих потенцијала у ArcLight- експримирајућим (n=10) и контролним lLNVs (n=10), показује значајну статистичку разлику (p < 0.05). в) Поређење максималаног нагиба силазне фазе акционих потенцијала у ArcLight-експримирајућим lLNVs (n=11) и у WT (n=10) неуронима не показује значајну разлику (p = 0.48). г) Активност је изазвана применом 500ms струјних пулсева јачине -10 до +25 pA при чему су пулсеви појачавани у корацима од 5pA, број изазвани нервних импулса је квантификован. је -3.21 ± 0.23 mV/ms у ArcLight-експримирајућим lLNVs (n=11) и 2.92 ± 0.32 mV/ ms у WT (n=10), што није значајно различито (p=0.48, неупарени Студентов т- тест). Активност је изазвана применом 500ms струјних пулсева јачине -10 до +25 pA при чему су пулсеви појачавани у корацима од 5pA, број изазвани нервних импулса је квантификован (Figure 29г). Нема статистички значајне разлике између броја изазваних акционих потенцијала између ArcLight-експримирајућим lLNVs (n=11) и контролних lLNvs (n=10) (p = 0.132, двофакторска ANOVA). Праг акционих потенвијала (Слика 30а) износи -33.3 ± 0.84 mV у ArcLight- експримирајућим lLNVs (n=11) и -35.0 ± 0.80 mV у контроли (n=10), што статистички није значајна разлика (p = 0.185, неупарени Студентов т-тест). Просечна амплитуда (Слика 30б) првог изазваног нервног импулса је 22.43 ± 2.13 mV ArcLight-експримирајућим lLNVs (n=11) и 18.57 ± 1.40mV у контролним (n=10), што статистички није значајна разлика (p = 0.19, неупарени Студентов т- тест). 69 Слика 30. Утицај експресије ArcLight-а на осетљивост мембране у lLNVs у поређењу са контролним ћелијама које експримирају ФП цитоплазматично а) Праг нервних импулса је дефинисан као мембранска волтажа на почетку брзог узлазног нагиба нервног импулса који је изазван убризгавањем струје у ArcLight- експримирајући lLNVs (n=11) и у контроле (n=10), није показана статистички значајна разлика (p = 0.185). б) Просечне амплитуде првог струјом-изазваног нервног импулса у ArcLight-експримирајући lLNVs (n=11) и у контроле (n=10). WT ArcLight RM P (m V) -30 -80 -40 -50 -60 -70 A -30 -50 -45 -40 -35 AP T hr es ho ld (m V) WT ArcLight G Current Injection (pA) 0 2 4 6 8 10 12 N o. o f A Ps 0 252015105 F-5 -4 -3 -2 -1 0 WT ArcLightA P M ax . D ec ay S lo pe (m V/ m s) E 0 2 4 6 8 10 WT ArcLight A P M ax . R is e Sl op e (m V/ m s) * D 0 2 4 6 8 10 12 WT ArcLight Ca pa ci ta nc e (p F) * B WT ArcLight 0 5 10 15 20 25 30 1s t A P Am pl itu e (m V) H 5mV 100ms C ArcLight WT Cao et al. Supplemental Figure 3 n.s. n.s. n.s. no signficant effect of genotype n.s. 6XSSOHPHQWDO)LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG6XSSOHPHQWDO)LJXUHFDRBHWBDOVXSSOBILJXUHBELRSK\VLFVSGI е ж Пр аг А П (m V) Ам пл ит уд а пр во г А П (m V) а б Мушице које експримирају ArcLight у LNVs показују нормалне дневне шеме у локомоторној активности у условима 12h:12h светло:мрак. Ово укључује и предвиђене јутарње и вечерње скокове у активности који претходе паљењу и гашењу светла, као и јутарње повећање активности као одговор на паљење светла и вечерње смањење активности у одговору на гашење светла (Слика 31а). Мушице које експримирају ArcLight у LNVs показују нормалну циркадијану шему активности током првог дана у условима константног мрака након прелаза из услова 12h:12h светло:мрак. Ово важи и за јутарње и вечерње максимуме у активности који су вођени циркадијаном контролном мрежом и који су показатељ нормалног рада LNVs и њихове способности да комуницирају са другим сат неуронима у циркадијаној контролној мрежи (Слика 31б). 70 а б Слика 31. Дневна и циркадијана локомоторна активност мушких мушица које експримирају или ArcLight (n=29) или за мембрану везани CD4-GFP као негативна контрола (n=30) у LNVs ћелијама. а) Мушице које експримирају ArcLight у LNVs показују нормалне шеме дневне локомоторне активности при 2h:12h светло:мрак условима (бело = светло; црно = мрак). б) Мушице које експримирају ArcLight у LNVs показују нормалну циркадијану шему активности током првог дана у условима константног мрака након прелаза из услова 12h:12h светло:мрак (сива = субјективан дан; црно = субјективна ноћ). Иако експресија ArcLight у lLNVs доводи до статистички значајног повећања капацитанце мембране и промена у кинетици нервних импулса (у поређењу са контролним ћелијама које експримирају ФП у цитоплазми) ове промене не утичу значајније на способност функционалне обраде информација у овим ћелијама. Однос улаз-излаз у овим ћелијама који је праћен мерењем броја нервних импулса изазваних струјним импулсима различите јачине не показује разлику између ћелија које експримирају ArcLight и контроле (Слика 29). Мушице које експримирају ArcLight показују нормалану циркадијану локомоцију (Слика 31), што је карактеристика у понашању која је изузетно осетљива према променама у биофизичким карактеристикама мембране sLNVs и lLNVs ћелија (Nitabach et al., 2002; 2006; Wu et al., 2008; Choi et al., 2012). Ови резултати показују да је, при тестираном нивоу експресије пробе који не доводи до значајније промене физиолошких особина неурона, јачина оптичких сигнала које производи ArcLight довољна за детекцију електричних транзијената у мембрани нервних ћелија. Ми смо, такође тестирали способност ArcLight да детектује мирисним надражајима изазвану мембранску активност у пресинаптичким и постсинаптичким компартмантима првог олфакторног релеја у гломерулима антеналног лобуса Drosophila-е. У ову сврху користили смо in vivo препарат који омогућава симултану аутоматизовану контролу апликације мириса и снимања промене флуоресценције (Слика 32а). Зависно од примењеног мириса, бутанола или пропионске киселине ArcLight експримиран у свим рецепторним неуронима олфакторног система јасно детектује деполаризационе и хиперполаризационе догађаје у централним пресинаптичким завршецима у појединачним гломерулусима (Слика 32б). Специфична промене детектоване у гломерулусима у одговору на два тестирана мириса су у генералном сагласју са резултатима добијеним при директном мерењу броја нервних импулса изазваних мирисним надражајима применом екстрацелуларно пласираних електрода на ћелијска тела рецепторних неурона на периферији (Wilson et al., 2004; Hallem and Carlson, 2006). 71 Добијени резултати су у складу и са резултатима добијеним употребом оптичких индикатора за Ca2+ који детектују индиректни нисходни другостепеним 72 Cao et al. Figure 2 A DM2 DC2 DL5 X3 VA1lm AN C DM2 DC2 DL5 X3 VA1lm AN C ORNs PNs B C butanol propionic acid DM2 DC2 X3 VA1lm DL5 DM2 DC2 X3 VA1lm DL5 -8% ǻ)) 2 sec -4% ǻ)) -4% ǻ)) 2 sec -2% ǻ)) )LJXUH &OLFNKHUHWRGRZQORDG)LJXUHFDRBHWBDOILJXUHBSGI Пропионска киселинаБутанол а б в Слика 32. Појединачни оптички сигнали добијени in vivo праћењем мембранске активности при примени мирисних надражаја. а) Дијаграм in vivo препарата кориштеног за оптичко праћење мембранске активности изазване мирисним надражајима у антеналном лобусу Drosophile melanogaster. б) Записи добијени оптичким снимањем мембранске активности изазване мирисним надражајима бутанолом или пропионском киселином у пресинаптичким завршецима олфакторних рецепторних неурона. Жутим квадратом је обележен тренутак апликације мириса, а гломерулуси у антеналном лобусу су обележени стандардним именима као у (Hallem and Carlson, 2006; Silbering et al., 2008). в) Записи добијени оптичким снимањем мембранске активности изазване мирисним надражајима у постсинаптичким завршецима у пројекционим неуронима. гласнцима омогућен пренос сигнала до кога долази услед промена у мембранској активности (Silbering et al., 2008). 73 Дискусија У поређењу са традиционалним методама које подразумевају употребу ектрода оптичко снимања нервне активности представља мање инвазивну опцију која нуди прецизније усмерена мерења са бројних локација истовремено. Ипак, овај циљ до данас није заиста био могућ обзиром на слабе перформансе свих до сада развијених синтетичких и протеинских боја. У овом раду је описан развој синтетичког протеинског конструкта који при експресији у сисарским нервним ћелијама показује смањење у интезитету флуоресценције у одговору на промене у мембранском потенцијалу. Експресија пробе ArcLight у хипокампалним неуронима сисара и у нервним ћелијама у интактном мозгу трансгене винске мушице (Drosophila melanogaster) доводи до појаве флуоресценције која је и по интензитету, и по волтажној сензитивности довољно велика да омогућава поуздану детекцију акционих потенцијала без потребе за упросечавањем сигнала. Проба је такође, довољно осетљива да омогућава детекцију подпражних догађаја и волтажних промена у финијим структурама нервне ћелије (нпр. дендритима). ArcLight је прва гентички кодирана проба која производи поуздане и велике сигнале in vivo, и као таква представља очигледан напредак у развоју групе метода које ће омогућити неурофизиолошка истраживања базирана искључиво на оптичким методама. ElectricPk је прва проба базирана на CiVS која успешно прати брза померања у волтажном сензору, што указује на чињеницу да примена циркуларно пермутованих протеина у дизајнy ових проба нуди извесне предности. Брза кинетика реакције ElectricPk-а (2 ms) је у супротности са доминантно спором брзином реакције (>12 ms) других CiVS проба (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Lundby et al., 2010; Perron et al., 2009; Jin et al., 2012). Пробе које показују сличну, брзу кинетику (SPARC; Ataka and Pieribone, 2002; Zahra; Baker et al., 2012; Mishina et al., 2012) имају недовољну сензитивност и лошу мембранску експресију што их чини практично неупотрбљивим за релевантне експерименте са сисарима. Механизам који доводи до промене флуоресценције ElectricPk-а није 74 јасан, али је условљен циркуларном пермутацијом ФП-а обзиром да конструкт који садржи немодификовани ФП уграђен на истој позицији у волтажном сензору непоказује волтажну сензитивност. Досадашња сазнања показују да промена волтаже изазива неколико реаранжмана у структури волтажно-осетљивог сензора. Промена волтаже иницијално доводи до брзог померања наелектрисаних група у ВСД-у која се могу мерити као струја. Ова струја је аналогна такозваној струји отварања вратница која се јавља у волтажно-зависним јонским каналима. Ове брзе промене се у већини волтажних проба виде као иницијална, брза промена у флуоресценцији док је највећи део промене интезитета флуоресценције изазван каснијим, споријим конформацоним променама волтажног сензора (Villalba-Galea et al., 2008). Чини се да промена флуоресценције ElectricPk, као и већине циркуларно пермутованих проба које су описане у овом раду прати само брзу компоненту у волтажно-зависном реаранжману CiVSP. Ови резултати потврђују да је могуће издизајнирати пробу која ће успешно пратити само брзе промене у структури волтажног сензора и то како у бесмртним ћелијским линијама, тако и у неуронима. ElectricPk карактерише и линеаран однос промене флуоресценцијe у односу на волтажу што није случај са осталим CiVS пробама (Dimitrov et al., 2007; Tsutsui et al., 2008; Lundby et al., 2010; Perron et al., 2009; Jin et al., 2012). Овај резултат додатно указује да промена флуоресценције ове пробе највероватније прати брза померања наелектрисаних група у С4 домену. Ово откриће показује да је могуће добити пробу која ће пратити волтажне промене са адекватном брзином, а која се базира на примени најпопуларнијег волтажног сензора CiVSP. Идеја да се cpEGFP из калцијумских индикатора (GCaMP фамилија индикатора) примени у дизајну волтажних проба је претходно истраживана у лабораторији Томаса Кнопфела (Thomas Knöpfel). У овој студији конструкти аналогни овде описаним су добијени употребом cpEGFP из GCaMP2 индикатора (Gautam et al., 2009). Једино конструкт VSFP (A) cpEGFP из поменуте студије има место уградње ФП-а које се не може поредити са овде описаним конструктима, али зато је VSFP(B)cpEGFP аналоган pLB1.1 или pLB2.1, VSFP(C)cpEGFP је 75 сличан pLB4.1, а VSFP(D)cpEGFP је упоредив са pLB7.1. Обе студије показују да су комбинације ових отвора на ФП-у (величина и локација) и места споја волтажног сензора и ФП-а неповољне за дизајн проба. У оба случаја добијене пробе су показале слабу базалну флуоресценцију и нису даље тестиране. Резултати обе студије још једном потврђују да и врло дискретне промене у конструкцији проба могу суштински утицати на њихове карактеристике. Чини се да је систематска анализа великог броја потенцијалних проба критична за проналажење успешних комбинација. Обзиром да хиперполаризујући тест пулсеви изазивају линеарно повећање у флуоресценцији ElectricPk, могуће је да би неки од конструката који нису показали присуство базалне флуоресценције показали повећање у интензитету флуоресценције под утицајем промене у волтажи. Како смо током рада на волтажну осетљивост тестирали само пробе које су показивале базалну флуоресценцију могуће је да смо пропустили да детектујемо пробе које би на промене у волтажи реаговале повећањем у интезитету флуоресценције. Већина волтажних проба базираних на CiVS, које су до сада развијене су због своје споре кинетике неодговарајуће за праћење брзих промена карактеристичних за нервну активност (тј. нервне импулсе). Тестирана у in vitro гајеним сисарским неуронима ElectricPk проба успешно прати акционе потенцијале са временском резолуцијом која је у рангу сигнала који се добијају употребом синтетичких боја малих молекулских маса. Ово је први ФП сензор који би се уз додатне корекције у сензитивности могао користити у студијама праћења порекла настанка и пропагације акционих потенцијала на нивоу појединачних нервних ћелија. ElectricPk показује да је могуће применити принципе који су се показали успешним у дизајну калцијумских индикатора за добијање бољих волтажних сензора. Иако развијање ФРЕТ проба теоретски нуди предности рациометријског снимања, и изузетне осетљивости према врло малим променама у растојању/oрјентацији две флуорофоре недавна открића у пољу калцијумских индикатора показују да пробе базиране на појединачним, циркуларно- пермутованим ФП могу произвести изузетно велике сигнале. У овде описаном 76 случају, ElectricPk за разлику од осталих сличних волтажних сензора прати само брзе промене у волтажно осетљивом домену CiVS. Иако врло брзи, сигнали које производи ElectricPk су релативно мали. За очекивати је да ће даљи циклуси модификација ове пробе довести до побољшања у сензитивности, слично као што се десило у случају калцијумским сензорима. У овој студији је такође, описан развој фамилије флуоресцирајућих протеинских волтажних сензора ArcLight који показују велике промене у интензитту флуоресценције у одговору на промене у волтажи. И након читавог низа експеримената остаје нејасно како мутација A227D изазива тако драматичан пораст у сензитивности волтажне пробе. Могуће је да D227 интереагује са мембраном, са другим аминокиселинским остацима на ФП-у или са групама које улазе у састав секвенце која повезује волтажни сензор и ФП. Такође. могуће је и да је D227 асоциран са унутрашњом страном плазма мембране. Померена pH сензитивност карактеристична за ecliptic pHluorin и super ecliptic pHluorin ФП-а је могуће неопходна за модуларни ефекат D227. Иако ова студија показује да мутација D227 не утиче на ексцитациони и емисиони спектар, или pH сензитивност слободног ФП-а, могуће је да промена у локалном наелектрисању на једној страни површине ФП-а до које мутација доводи има значај за волтажну модулацију. Могуће је и да D227 делује као ‘‘локална киселина’’ изазивајући реверзну протонацију остатака локалних амино киселина Т203 и/или H148 за које се од раније зна да могу бити под утицајем промена у pH вредности (Brejc et al., 1997; Elsliger et al., 1999) или пак, да производи промене у кретању протона како преко површине ФП-а, тако и у бета бурету ФП-а (Agmon, 2005; Shinobu et al., 2010). Обзиром на чињеницу да аспартична киселина, која спада у киселе амино киселине са својим малим стерним ефектом, изазива највећи модуларни ефекат од свих амино киселина које су тестиране на критичној 227 позицији говори у прилог хипотезе о ‘‘локалној киселини’’. Такође, изгледа да модуларни ефекат A227D зависи од неколико других група које су присутне у ecliptic pHluorin, обзиром да интродукција ове мутације није довела до повећања сензитивности у конструкту 77 базираном на врло сличном флуоресцирајућем протеину ЕGFP. Просторна близина неопходних аминокиселинских група које се све налазе на истој површини бета буре указују да ова поршина највероватније интерреагује са спољашњим фактором који је неопходан за модулацију флуоресценције. Спора кинетика промене ArcLight индикатора указује да је највећи део промене интензитета флуоресценције повезан са волтажно-зависним секундарним реаранжманима наелектрисаних група у волтажном сензору (Villalba-Galea et al., 2009). Такође, сигмоидалан облик криве која описује однос волтаже према флуоресценцији указује да је процес повезан са конформационим променама које настају услед померања наелектрисања и да се хромофора не налази под директним утицајем промена у електричном пољу (као што је случај са органским волтажним бојама мале молекулсе масе). Недостатак линеарности у односу волтаже и флуоресценције и спора кинетика ArcLight индикатора искључују могућност детаљних студија облика и пропагације акционих потенцијала на нивоу појединачних ћелија као што је то могуће са органским бојама (Popovic et al., 2011). Ипак, детекција акционих потенцијала овом пробом је могућа уз употребу снимања нижег пропусног опсега. Фамилија ArcLight проба представља највеће побошање у величини сигнала у волтажним индикаторима базираним на ФП које омогућавају праћење акционих потенцијала и подпражних деполаризација у неуронима и потенцијално другим типовима ћелија и органела. Студија на трансгеним винским мушицама показује да ArcLight проба прати како потпражне сигнале, тако и акционе потенцијале у циљаним неуронима у интактном мозгу. ArcLight индикатором је било могуће праћење пропагације електричних сигнала дуж нервних наставака. У овој студији употреба ArcLight-а нам је омогућила оптичко снимање синаптичких инпута у неуроне укључене у контролу циркадијаног ритма чија је активност раније праћена употребом метода наметнуте струје на целу ћелију. Оптичким снимањем мембранске активности у пресинаптичким и постсинаптичким мембранама које улазе у састав првог синаптичког преноса у олфакторном 78 систему винске мушице потврдђена је ефектност ове пробе за оптичка снимања у другим деловима нервног система. Овде приказани резултати су показатељ да ArcLight по први пут омогућава поуздано симултано праћење активности у већем броју циљаних неурона у нервном колу у интактном мозгу без потребе за упросечавањем сигнала. И као што су генетички кодирани флуоресцирајући сензори довели до револуције у пољу детекције сигнала базираних на интрацелуларном Ca2+, ArcLight сада омогућава оптичка мерења мембранског потенцијала у интактним нервним колима, кључног ћелијског параметра који лежи у основи обраде информација у нервном систему. У поређењу са другим спонтано флуоресцирајућим протеинима који се могу користити у дизајну волтажних сензора (Kralj et al., 2011, 2012), флуоресцирајући протеини који су структурно слични зеленом флуоресцентном протеину (GFP) се одликују значајно већим интензитетом флуоресценције. Волтажни индикатори који се базирају на родопсинима из микроорганизама нуде предности као што су спектар који је померен ка већим таласним дужинама (црвени део спектра) али је интензитет флуоресценције ових проба значајно мањи него проба које су базиране на ФП. Arch D95N има квантни принос од 0.0004 (Kralj et al., 2012) у односу на 0.54 за ЕGFP (Ilagan et al., 2010). Уз то кинетика ове пробе драстично опада са модификацијама које се морају спровести да би се добио непроводљиви облик пробе. Непосредан циљ будућих истраживања је наставак тестирања и процене могућности практичне примене ових проба у студијама на другим физиолошким препаратима. Постоји читав низ експерименталних услова који укључују употребу различитих типова микроскопије (стандардна епифлуоресцентна микроскопија, мултифотон микроскопија) за in vitro студије на неуронима гајеним у култури и можданим исечцима, као и за in vivo студије у другим модел организмима као што су Caenorhabditis elegans, Danio rerio и глодари. Разлике које смо нашли у карактеристикама волтажне осетљивости ArcLight пробе тестиране у сисарској ћелијској линији (HEK293 ћелије) и неуронима винске мушице указују да свака од 79 поменутих парадигми захтева потврду перформанси пробе и карактеризацију флуоресцентног сигнала у датом типу ћелија и под датим условима. И док тренутне пробе представљају значајан напредак у поређењу са раније развијеним пробама њихова сензитивност је и даље мала у поређењу са најпопуларнијим генетички кодираним пробама које припадају фамилији GCaMP индикатора. Ови калцијумски сензори (тренутна верзија, GCaMP 6) се одликују ниском базалном флуоресценцијом и врло високом променом у интезитету флуоресценције (и до >1000% у неким случајевима) која прати промене у нивоу унутарћелијског Ca2+. Сама чињеница да GCaMP индикатори на промене реагују са порастом у интензитету флуоресценције је предност у односу на ArcLight у коме долази до смањења флуоресценције. Пораст у флуоресценцији омогућава већу промену ∆F/F за исту промену у интезитету. Такође, пратећи проблеми везани за избељивање ФП-а су мање изражени у ситуацији када протеин проводи највећи део времена у непобуђеном стању. Са друге стране, велики модуларни ефекат који показује мутација D227 уводи као нов концепт у дизајну волтажних проба могућност модификације ФП-а као начин да се добију побољшане пробе. У претходним студијама модификације су се базирале или на употреби различитих ФП-а или на промени локације његове уградње у оквиру волтажног сензора али покушаји мутације самог ФП-а нису до сада објављени. У овој студији, показано је да мали број појединачних мутација у структури ФП-а доводи до драматичног пораста у волтажној осетљивости пробе. Мутације одговорне за ову драматично повећану волтажну сензитивност не довде до очиглених промена у биофизичким карактеристикама ФП-а (нпр. екситационом и емисионом спектру, pH осетљивости) које би омогућиле a priori идентификацију употребом класичних метода мутагенезе и тестирања у бактеријама соја Escherichia coli. Будући мутирани сезори и даље морају бити тестирани у еукариотским ћелијама у којима ће конструкт бити локализован у плазма мембрани и у којима је могуће контролисати потенцијал мировања. Дизајн платформе која би омогућила синтезу и тестирање великог броја проба би олакшао тренутну ситуацију у којој 80 недостатак рационалног приступа отежава бржи напредак у овом пољу. Технике у молекуларној биологији као што су континуални циклуси усмерених и случајних мутагенеза се успешно примењују у дизајну флуоресцентних протеина и нуде могућност креирања читавих библиотека конструката са различитим карактеристикама које би највероватније резултирале побољшаним пробама. Много већи изазов представља дизајн платформе за тестирање проба која би имала високу продуктивност уз одговарајућу поузданост у одговарајућем временском периоду. Обзиром да перформансе пробе зависе од типа ћелија у којима се врши тестирање, постаје јасно да се поуздани резултати могу очекивати само у случају да се платформа базира на тестирању у побудљивим сисарским ћелијама (нервним ћелијама). Примена техника гајења ћелијских културе које би омогућиле адекватне услове раста и одржавања нервних ћелија су још увек врло захтевне. Такође, од свих потенцијалних метода које омогућавају експресију проба само оне на употреби модификованих вируса имају задовољавајућу стопу успеха уз минималне пратеће ефекте. Ове методе још увек нису широко доступне. Додатну групу проблема представљају технички изазови везани за колекцију сигнала и даља обраду добијенх података. У мозгу сисара обрада информација везаних за специфичне феномене у понашању укључује велики број неурона који се простиру преко релативно великих површина ткива. Да бисмо били у стању да разумемо како нервна активност доводи до одређеног понашања неопходно је да се активност прати барем у делу неурона који улазе у састав већих површина које контролишу одређене догађаје . Ова активност потом може бити корелисана у вишедимензионалном простору у односу на специфичне аспекте понашања. Методе оптичког снимања сличне методама које су описане у овом раду нуде највећу шансу за успех у постизању овог захтевног циља. Поред тога што је потребно добити нформације о великом броју неурона који се простиру преко великих површина, сигнали морају имати високу темпоралну резолуцију која би омогућила дискриминацију догађаја који се одигравају у милисекундама у 81 неуронима који су есенцијални за обраду датих информација. И док још увек немамо оптички метод који омогућава довољно брзу стандардну епифлуоресцентну микроскопију уз низак шум напредак у овој области постигнут у последњих пар година наводи на оптимизам. Оно што је потребно је комбинација оптичких волтажних проба и метода оптичког снимања које омогућавају снимање нервне активности у горњим деловима мождне коре са високом фреквенцијом и резолуцијом. Постизање овог циља би представљао драматичан корак напред ка разумевању глобалне функције мозга у кичмењацима. Комбинација оптичких метода снимања активности нервних ћелија са недавно развијеним методама које омогућују дискретну, генетички дефинисану оптичку контролу њихове активности ће умногоме проширити наше разумевање како се информације обрађују у нерном систему сисара. 82 Литература Agmon N (2005) Proton pathways in green fluorescence protein. Biophys J 88: 2452– 2461. Akemann W, Mutoh H, Perron A, Park YK, Iwamoto Y, Knöpfel T (2012) Imaging neural circuit dynamics with a voltage-sensitive fluorescent protein. J Neurophysiol 108: 2323–2337. Akerboom J, Rivera JDV, Guilbe MMR, Malave ECA, Hernandez HH, Tian L, Hires SA, Marvin JS, Looger LL, Schreiter ER (2008) Crystal Structures of the GCaMP Calcium Sensor Reveal the Mechanism of Fluorescence Signal Change and Aid Rational Design. Journal of Biological Chemistry 284: 6455–6464. Akerboom JJ et al. (2012) Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci 32:13819–13840. Antić SS, Zecević DD (1995) Optical signals from neurons with internally applied voltage-sensitive dyes. J Neurosci 15:1392–1405. Ataka K, Pieribone VA (2002) A genetically targetable fluorescent probe of channel gating with rapid kinetics. Biophys J 82: 509–516. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M (2001) Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci 21:1523–1531. Baird GS, Zacharias DA, Tsien RY (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci USA 96:11241–11246. Baker B, Lee H, Pieribone V, Cohen L (2007) Three fluorescent protein voltage sensors exhibit low plasma membrane expression in mammalian cells. J Neurosci 161: 32-38. 83 Baker BJ, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W, Perron A, Iwamoto Y, Jin L, Cohen LB, Isacoff EY, Pieribone VA, Hughes T, Knöpfel T (2008) Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Bio 36: 53–67. Baker BJ, Jin L, Han Z, Cohen LB, Popovic M, Platisa J, Pieribone V (2012) Genetically encoded fluorescent voltage sensors using the voltage-sensing domain of Nematostella and Danio phosphatases exhibit fast kinetics. J Neurosci Methods 208:190–196. Barnett L, Platisa J, Popovic M, Pieribone VA, Hughes T (2012) A fluorescent, genetically-encoded voltage probe capable of resolving action potentials. PLoS ONE 7: e43454. Bezanilla F (2008) Ion channels: from conductance to structure. Neuron 60: 456–468. Boyden ES, Zhang F, Bamberg E, Nagel G (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature 8(9): 1263-1268. Brejc K, Sixma TK, Kitts PA, Kain SR, Tsien RY, Ormö M, Remington SJ (1997) Structural basis for dual excitation and photoisomerization of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci USA 94: 2306–2311. Cao G, Nitabach MN (2008) Circadian control of membrane excitability in Drosophila melanogaster lateral ventral clock neurons. J Neurosci 28: 6493–6501. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805. Choi CC, Cao GG, Tanenhaus AKA, McCarthy EVE, Jung MM, Schleyer WW, Shang YY, Rosbash MM, Yin JCPJ, Nitabach MNM (2012) Autoreceptor control of peptide/neurotransmitter corelease from PDF neurons determines allocation of circadian activity in drosophila. Cell Rep 2: 332–344. 84 Cohen LB, Keynes RD, Hille B (1968) Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218 (5140): 438-441. Cohen LB, Salzberg BM, Davila HV, Ross WN (1974) Changes in axon fluorescence during activity: molecular probes of membrane potential. J Membrain Biol 19: 1-36. Cohen LB (2011) Historical Overview and General Methods of Membrane Potential Imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. In: Membrane Potential Imaging in the Nervous System: Methods and Applications. Canepari M, Zecevic D (eds.), DOI 10.1007/978-1-4419-6558-5_1. Springer Sciencie+Buisness Media. LLC. Dimitrov D, He Y, Mutoh H, Baker BJ, Cohen L, Akemann W, Knöpfel T (2007) Engineering and Characterization of an Enhanced Fluorescent Protein Voltage Sensor. PLoS ONE 2: e440. Dombeck D, Khabbaz A, Collman F (2007) Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron 56: 43-57. Elsliger MA, Wachter RM, Hanson GT, Kallio K (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry 38: 5296-5301. Feldmeyer D, Brecht M, Helmchen F, Petersen CCH, Poulet JFA, Staiger JF, Luhmann HJ, Schwarz C (2012) Barrel cortex function. Prog Neurobiol. DOI:10.1016/j.pneurobio.2012.11.002 Fiala A, Spall T (2003) In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE 2003: PL6. Frostig RD, Chen-Bee CH (2009) Visualizing adult cortical plasticity using intrinsic signal optical imaging. In: In vivo optical imaging of Brain Function. Frostig R (ed.). CRC Press. 85 Gautam SG, Perron A, Mutoh H, Knopfel T (2009) Exploration of Fluorescent Protein Voltage Probes Based on Circularly Permuted Fluorescent Proteins. Frontiers in Neuroengineering 2: 1-8 Grinvald A, Hildesheim R (2004) VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci 5: 874-885. Groth AC, Fish M, Nusse R, Calos MP (2004) Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics 166:1775–1782. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry 260: 3440-3450. Guerrero GG, Siegel MSM, Roska BB, Loots EE, Isacoff EYE (2002) Tuning FlaSh: Redesign of the Dynamics, Voltage Range, and Color of the Genetically Encoded Optical Sensor of Membrane Potential. Biophys J 83: 3607–3618. Hai A, Shappir J, Spira ME (2010) In-cell recordings by extracellular microelectrodes. Nat Meth 7: 200–202. Hallem EA, Carlson JR (2006) Coding of odors by a receptor repertoire. Cell 125:143– 160. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ (1981) Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch 391:85–100. Hill DK, Keynes RD (1949) Opacity Changes in Stimulated Nerve. J Physiol (Lond) 108: 278–281. Hille B (2001) Ion Channels of Excitable Membranes. Sinauer Associates, Incorporated, USA. 86 Hodgkin AL, Huxley AF, Katz B (1952) Measurement of current-voltage relations in the membrane of the giant axon of Loligo. J Physiol (Lond) 116: 424–448. Homma R, Baker BJ, Jin L, Garaschuk O, Konnerth A, Cohen LB, Zecevic D (2009) Wide-field and two-photon imaging of brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Philos Trans R Soc Lond, B, Biol Sci 364: 2453–2467. Hossain MI, Iwasaki H, Okochi Y, Chahine M, Higashijima S, Nagayama K, Okamura Y (2008) Enzyme Domain Affects the Movement of the Voltage Sensor in Ascidian and Zebrafish Voltage-sensing Phosphatases. Journal of Biological Chemistry 283:18248– 18259. Ilagan RP, Rhoades E, Gruber DF, Kao H-T, Pieribone VA, Regan L (2010) A new bright green-emitting fluorescent protein--engineered monomeric and dimeric forms. FEBS J 277:1967–1978. Inouye S, Tsuji FI (1994) Evidence for redox forms of the Aequorea green fluorescent protein. FEBS Lett 351: 211-214. Irwin B. Levitan, Leonard K. Kaczmarek (2001) The Neuron : Cell and Molecular Biology. Oxford University Press, USA. Jin L, Han Z, Platisa J, Wooltorton JRA, Cohen LB, Pieribone VA (2012) Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron 75:779–785. Johnston D, Wu DJSM-S (1995) Foundations of Cellular Neurophysiology. Bradford Book. USA. Kralj JM, Douglass AD, Hochbaum DR, Maclaurin D, Cohen AE (2011) Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nat Meth 9: 90–95. 87 Larsson MC, Domingos AI, Jones WD, Chiappe ME, Amrein H, Vosshall LB (2004) Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron 43: 703–714. Loew LM (2011) Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. In: Membrane Potential Imaging in the Nervous System: Methods and Applications. Canepari M, Zecevic D (eds.), DOI 10.1007/978-1-4419-6558-5_1. Springer Sciencie+Buisness Media. LLC. Looger LL, Griesbeck O (2012) Genetically encoded neural activity indicators. Curr Opin Neurobiol 22:18–23. Lundby A, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W (2008) Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS ONE 3: e2514. Lundby A, Akemann W, Knöpfel T (2010) Biophysical characterization of the fluorescent protein voltage probe VSFP2.3 based on the voltage-sensing domain of Ci-VSP. Eur Biophys J 39: 1625–1635. McCarthy von E, Wu Y, deCarvalho T, Brandt C, Cao G, Nitabach MN (2011) Synchronized bilateral synaptic inputs to Drosophila melanogaster neuropeptidergic rest/arousal neurons. J Neurosci 31: 8181-8193. Miesenböck GG, De Angelis DAD, Rothman JEJ (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature 394:192– 195. Mishina Y, Mutoh H, Knöpfel T (2012) Transfer of Kv3.1 Voltage Sensor Features to the Isolated Ci-VSP Voltage-Sensing Domain. Biophys J 103: 669–676. Miyawaki A, Llopis J, Heim R, McCaffery JM, Adams JA (1997) Fluorescent indicators for Ca2+; based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388: 882-887. 88 Murata Y, Iwasaki H, Sasaki M, Inaba K, Okamura Y (2005) Phosphoinositide phosphatase activity coupled to an intrinsic voltage sensor. Nature 435:1239–1243. Murata Y, Okamura Y (2007) Depolarization activates the phosphoinositide phosphatase Ci-VSP, as detected in Xenopus oocytes coexpressing sensors of PIP2. J Physiol (Lond) 583: 875–889. Mutoh H, Perron A, Dimitrov D, Iwamoto Y, Akemann W, Chudakov DM, Knöpfel T (2009) Spectrally-Resolved Response Properties of the Three Most Advanced FRET Based Fluorescent Protein Voltage Probes. PLoS ONE 4: e4555. Mutoh H, Akemann W, Knöpfel T (2012) Genetically Engineered Fluorescent Voltage Reporters. ACS Chem Neurosci 3: 585–592. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA 98: 3197–3202. Nakai J, Ohkura M, Imoto K (2001) A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol 19:137-141. Nicolelis MA, Wiest M, Thomson E, Meloy J (2008) Multielectrode Recordings in the Somatosensory System. In: Methods for Neural Ensemble Recordings. Nicolelis MAL (ed.) 2nd ed. Boca Raton (FL): CRC Press. Nitabach MN, Blau J, Holmes TC (2002) Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock. Cell 109: 485–495. Nitabach MN, Wu Y, Sheeba V, Lemon WC, Strumbos J, Zelensky PK, White BH, Holmes TC (2006) Electrical hyperexcitation of lateral ventral pacemaker neurons desynchronizes downstream circadian oscillators in the fly circadian circuit and induces multiple behavioral periods. J Neurosci 26: 479–489. Nitabach MN, Taghert PH (2008) Organization of the Drosophila Circadian Control Circuit. Current Biology 18: R84-R93. 89 Okamura Y, Murata Y, Iwasaki H (2009) Voltage-sensing phosphatase: actions and potentials. J Physiol (Lond) 587: 513–520. Perron A, Mutoh H, Launey T (2009) Red-Shifted Voltage-Sensitive Fluorescent Proteins. Chem Biol 16: 1268-1277. Perron A, Akemann W, Mutoh H (2012) Genetically encoded probes for optical imaging of brain electrical activity. In: Progress in Brain Research. Knopfel T, Boyden E (eds.) 196. ISSN: 0079-6123. Elsevier BV. Peterka DS, Takahashi H, Yuste R (2011) Imaging Voltage in Neurons. Neuron 69: 9– 21. Pfeiffer BD, Ngo T-TB, Hibbard KL, Murphy C, Jenett A, Truman JW, Rubin GM (2010) Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics 186: 735–755. Popovic MA, Foust AJ, McCormick DA, Zecevic D (2011) The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J Physiol (Lond) 589: 4167–4187. Prasher DCD, Eckenrode VKV, Ward WWW, Prendergast FGF, Cormier MJM (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111: 229– 233. Renn SC, Park JH, Rosbash M, Hall JC, Taghert PH (1999) A pdf neuropeptide gene mutation and ablation of PDF neurons each cause severe abnormalities of behavioral circadian rhythms in Drosophila. Cell 99: 791–802. Sakai R, Canonigo VR, Raj CD, Knopfel T (2001) Design and characterization of a DNA-encoded, voltage-sensitive fluorescent protein. European Journal of Neuroscience 13: 2314-2318. 90 Sankaranarayanan S, De Angelis D, Rothman JE, Ryan TA (2000) The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J 79: 2199–2208. Scanziani M, Häusser M (2009) Electrophysiology in the age of light. Nature 461: 930– 939. Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59: 223–239. Shinobu A, Palm GJ, Schierbeek AJ, Agmon N (2010) Visualizing Proton Antenna in a High-Resolution Green Fluorescent Protein Structure. J Am Chem Soc 132: 11093– 11102. Siegel MSM, Isacoff EYE (1997) A Genetically Encoded Optical Probe of Membrane Voltage. Neuron 19: 7–7. Silbering AF, Okada R, Ito K, Galizia CG (2008) Olfactory Information Processing in the Drosophila Antennal Lobe: Anything Goes? J Neurosci 28:13075–13087. Sjulson L, Miesenböck G (2008) Rational optimization and Imaging in vivo of a genetically encoded optical voltage reporter. J Neurosci 28: 5582–5593. Stocker RFR, Heimbeck GG, Gendre NN, de Belle JSJ (1997) Neuroblast ablation in Drosophila P[GAL4] lines reveals origins of olfactory interneurons. J Neurobiol 32: 443–456. Tian L, Hires SA, Mao T, Huber D, Chiappe ME, Chalasani SH, Petreanu L, Akerboom J, McKinney SA, Schreiter ER, Bargmann CI, Jayaraman V, Svoboda K, Looger LL (2009) Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Meth 6: 875–881. Topell S, Hennecke J, Glockshuber R (1999) Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Lett 457: 283–289. 91 Tsutsui H, Karasawa S, Okamura Y, Miyawaki A (2008) Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Meth 5: 683–685. Villalba-Galea CA, Sandtner W, Starace DM, Bezanilla F (2008) S4-based voltage sensors have three major conformations. PNAS 105: 17600-17607. Villalba-Galea CA, Sandtner W, Dimitrov D, Mutoh H, Knöpfel T, Bezanilla F (2009) Charge movement of a voltage-sensitive fluorescent protein. Biophys J 96: L19–L21. Wilson RI, Turner GC, Laurent G (2004) Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science 303: 366–370. Wu Y, Cao G, Nitabach MN (2008) Electrical Silencing of PDF Neurons Advances the Phase of non-PDF Clock Neurons in Drosophila. Journal of Biological Rhythms 23:117–128. Zhao YY, Araki SS, Wu JJ, Teramoto TT, Chang Y-FY, Nakano MM, Abdelfattah ASA, Fujiwara MM, Ishihara TT, Nagai TT, Campbell RER (2011) An expanded palette of genetically encoded Ca²⁺ indicators. Science 333:1888–1891. 92 Биографија   Јелена  Ч.  Платиша-­‐Поповић  je  рођена  у  Београду  31.  октобра  1976  године   где  је  завршила  основну  и  средњу  медицинску  школу  “Београд”.  Основне  студије   из  Биологије  је  завршила  на  Биолошком  факултету,  Универзитета  у  Београду.   Докторске  студије  на  Факултету  за  физичку  хемију  је  започела  2009.  године.       Од  марта  2006.  до  марта  2007.  године  је  радила  у  VII  Београдској   гимназији  у  Београду.  Од  априла  2007.  до  јула  2012.  године  је  била  запослена  на   Институту  за  биолошка  истраживања  „Синиша  Станковић“.  На  Одељењу  за   Физиологију  биљака  је  радила  на  пројекту  под  вођством  Др.  Бранке   Винтерхалтер.  Од  јануара  2010.  године  ради  у  Лабораторији  за  ћелијску   неурофизиологију  у  Џон  Б  Пирс  Лабораторији-­‐  Јел  Универзитету  (The  John  B.   Pierce  Laboratory-­‐Yale  University)  под  вођством  Др.  Винсент  Пирбона  (Vincent   Pieribone,  PhD).   Библиографија Guan  Cao,  Jelena Platisa,  Vincent  A  Pieribone,  Davide  Raccuglia,  Michael  Kunst,  Mi-­‐ chael  N  Nitabach  (2013).  Gene€cally  Targeted  Op€cal  Electrophysiology  in  Intact  Neu-­‐ ral  Circuits.  Cell,  154  (4):904-­‐913.   Milan  Dragićević,  Jelena Platiša,  Radomirka  Nikolić,  Slađana  Todorović,  Milica  Bog-­‐ danovć,  Ana  Simonović  (2013):  Herbicide  Phosphinothricin  Causes  Direct  S€mula€on   Hormesis.  Dose-­‐Response  1  (1),  1-­‐17 Lei  Jin,  Zhou  Han,  Jelena Platisa,  Julian  R  Wooltorton,  Lawrence  B  Cohen,  Vincent  A   Pieribone  (2012).  Single  ac€on  poten€als  and  subthreshold  events  imaged  in  neurons   with  a  novel  fluorescent  protein  voltage  probe.  Neuron  75:  779-­‐785. Lauren  Barne’,  Jelena Platisa,  Vincent  A  Pieribone,  Thomas  Hughes  (2012).  A  Fluores-­‐ cent,  Gene€cally-­‐Encoded  Voltage  Probe  Capable  of  Resolving  Ac€on  Poten€als.   PlosOne  Vol.  7(9):  e43454. Bradley  J.  Baker,  Lei  Jin,  Zhou  Han,  Lawrence  B.  Cohen,  Marko  Popovic,  Jelena Platisa,   Vincent  Pieribone.  Gene€cally  encoded  fluorescent  voltage  sensors  using  the  voltage-­‐ 93 sensing  domain  of  Nematostella  and  Danio  phosphatases  exhibit  fast  kine€cs.  Journal   of  Neuroscience  Methods  (2012),  208(2):190-­‐196. Joon  Hyuk  Park,  Jelena Platisa,  Justus  V  Verhagen,  Shree  H  Gautam,  Ahmad  Osman,   Dongsoo  Kim,  Vincent  A  Pieribone,  Eugenio  Culurciello.  Head-­‐mountable  high  speed   camera  for  op€cal  neural  recording.Journal  of  Neuroscience  Methods   (2011),  201(2):290-­‐5.   Savić,  J.,  Platiša, J.,  Dragićević,  M.,  Nikolić,  R.,  Mi€ć,  N.,  Cingel,  A.,  Vinterhalter,  B.  The   ac€vity  of  peroxidases  and  superoxide  dismutases  in  transgenic  phosphinothricin-­‐ resistant  Lotus  corniculatus  shoots.  Archives  of  Biological  Sciences  (2010),  62,  1063-­‐ 1070. B  Vinterhalter,  J  Savić,  J Platiša,  M  Raspor,  S  Ninković,  N  Mi€ć,  D  Vinterhalter  (2008).   Nickel  tolerance  and  hyperaccumula€on  in  shoot  cultures  regenerated  from  hairy  root   cultures  of  Alyssum  murale  Waldst  et  Kit.  Plant  Cell,  Tissue  and  Organ  Culture,  94  (3),   299-­‐303. J. Platisa,  S.  Veljovic-­‐Jovanovic,  B.  Vinterhalter,  A.  Smigocki  and  S.  Ninkovic.  Induc€on   of  peroxidase  and  superoxide  dismutase  in  transformed  embryogenic  calli  of    alfalfa   (Medicago  sa€va  L.),  Journal  of  Plant  Physiology  (2008),  8(165):  895-­‐900.   Зборници са међународних/националних научних скупова DA  Storace,  U  Sung,  J Platisa,  LB  Cohen,  VA  Pieribone  (2013).  In  Vivo  Imaging  of  Odor-­‐ Evoked  Responses  in  the  Olfactory  Bulb  using  Arclight,  a  Novel  Fp  Voltage   Probe.Biophysical  J  (2013),  104  (2,):  679a Zhou  Han,  Lei  Jin,  Jelena Platisa,  Julian  Wooltorton,  Brian  M.  Salzberg,  Lawrence  B.   Cohen,  Vincent  A.  Pieribone.  Improved  Gene€cally  Encoded  Voltage  Sensi€ve  Op€cal   Probes  Detect  Ac€on  Poten€als  and  Subthreshold  Events.  Biophysical  J  (2012),  120(3):   214a. Han  Z,  Jin  L,  Platisa J, Cohen  LB,  Pieribone  VA.  Cri€cal  fluorescent  protein  residues  are   required  for  producing  large  signals  with  the  novel  fluorescent  protein  voltage  sensor   ArcLight.  Optogene€cs  IV.  2012  Neuroscience  Mee€ng  Planner.  New  Orleans,  LA:  Soci-­‐ ety  for  Neuroscience,  2012.  Online. Platisa J, Barne’  L,  Popovic  M,  Hughes  T,  Pieribone  VA.  Superior  response  kine€cs  of   circularly  permuted  fluorescent  proteins  as  reporters  in  CiVSP-­‐based  voltage  sensors.   94 Op€cal  methods.  2012  Neuroscience  Mee€ng  Planner.  New  Orleans,  LA:  Society  for   Neuroscience,  2012.  Online. J. Platisa-Popovic,  M.  Dragicevic,  R.  Nikolic,  N.  Mi€c,  S.  Zdravkovic-­‐Korac,  S.  Ninkovic.   An€oxida€ve  enzymes  analysis  in  bar-­‐gene  transformed  plants  of  Lotus  corniculatus  L.,   Book  of  Abstracts,  5th  Balkan  Botanical  Congress,  Faculty  of  Biology,  University  of  Bel-­‐ grade  and  Serbian  Academy  of  Sciences  and  Arts,  p44. M.  Dragicevic,  J. Platisa-Popovic,  A.  Simonovic,  R.  Nikolic,  N.  Mi€c,  B.  Vinterhalter.   The  effects  of  phosphinothricin  on  glutamine  synthetase  ac€vity  and  mobility  in  Lotus   corniculatus  L.,  Book  of  Abstracts,  5th  Balkan  Botanical  Congress,  Faculty  of  Biology,   University  of  Belgrade  and  Serbian  Academy  of  Sciences  and  Arts,  p45. J. Platisa,  S.  Veljovic-­‐Jovanovic  and  S.  Ninkovic  (2005):  Protein  and  peroxidase  analysis   in  different  transgenic  lines  of  alfalfa  (Medicago  sa€va  L.),  Book  of  Abstracts,  XVI  Sym-­‐ posium,  Society  of  Plant  Physiology  SCG,  p24. 95 96 97 98 99