UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET ZA FIZIČKU HEMIJU Leposava A. Pavun SPEKTROFLUORIMETRIJSKO ISPITIVANJE KOMPLEKSNIH JEDINJENJA MORINA, HESPERIDINA I KVERCETINA SA ALUMINIJUMOM doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF PHYSICAL CHEMISTRY Leposava A. Pavun SPECTROFLUORIMETRIC INVESTIGATION OF COMPLEX COMPOUNDS OF MORIN, HESPERIDIN AND QUERCETIN WITH ALUMINIUM Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentori: dr Jasmina Dimitrić Marković, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet za fizičku hemiju dr Milena Jelikić-Stankov, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Farmaceutski fakultet Članovi komisije: dr Miroslav Kuzmanović, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet za fizičku hemiju Datum odbrane: Ova disertacija urađena je u Laboratoriji Odseka za nauku o živim sistemima Instituta za multidisciplinarna istraživanja Univerzteta u Beogradu. Izuzetno mi je zadovoljstvo da izrazim zahvalnost mom mentoru, prof. dr Mileni Jelikić Stankov, redovnom profesoru Farmaceutskog fakulteta Univerzteta u Beogradu, koja mi je pružila nesebičnu pomoć i podršku tokom izrade i pisanja ove disertacije. Iskreno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Jasmini Dimitrić Marković, vanrednom profesoru Fakulteta za fizičku hemiju Univerzteta u Beogradu, na korisnim savetima i sugestijama kao i na pomoći tokom izrade i pisanja disertacije. Zahvaljujem se prof. dr Miroslavu Kuzmanoviću, vanrednom profesoru Fakulteta za fizičku hemiju Univerzteta u Beogradu, na korisnim primedbama i sugestijama. Prof. dr Predragu Đurđeviću, redovnom profesoru Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Kragujevcu veliko hvala na pomoći, savetima i sugestijama tokom izrade teze. Mojoj koleginici dr Danieli Đikanović Golubović iz Instituta za multidisciplinarna istraživanja, i kolegi Andriji Ćiriću sa Prirodno-matematičkog fakulteta Univerziteta u Kragujevcu, zahvaljujem se na ogromnoj pomoći u eksperimentalnom radu. Prof. dr Dušanu Maleševu, redovnom profesoru u penziji Farmaceutskog fakulteta Univerzteta u Beogradu, puno hvala na korisnim primedbama i sugestijama tokom izrade i pisanja teze. Hvala profesorima i saradnicima Katedre za fizičku hemiju i instrumentalne metode Farmaceutskog fakulteta Univerzteta u Beogradu na kolegijalnosti i podršci. Mojoj porodici, Siniši, Sonji i Kseniji beskonačno hvala za nesebičnu podršku, pomoć i razumevanje bez koje ne bih uspela sve što sam postigla u životu. Leposava Pavun Naslov doktorske disertacije: SPEKTROFLUORIMETRIJSKO ISPITIVANJE KOMPLEKSNIH JEDINJENJA MORINA, HESPERIDINA I KVERCETINA SA ALUMINIJUMOM Rezime: Morin, hesperidin i kvercetin pripadaju flavonoidima, koji imaju značajnu biološku i fiziološku aktivnost, zbog čega je bilo potrebno razviti jednostavne, precizne i tačne metode za njihovo određivanje u različitim uzorcima. Predložena je spektrofluorimetijska metoda za određivanje morina u 70 v/v % etanolu i u humanom serumu, zasnovana na fluorescenciji kompleksa aluminijum(III)– morin. Ovaj kompleks ima sastav aluminijum(III) : morin = 1 : 2. Formirani kompleks je stabilan u pH oblasti od 3,0 do 6,0 i pokazuje intenzivnu fluorescenciju na λem = 500 nm pri eksitaciji na λex = 410 nm. Intenzitet fluorescencije nastalog kompleksa zavisi od pH vrednosti rastvora, i najveći je na pH = 4,40, a vrednost konstante stabilnosti na ovoj vrednosti pH iznosi log β2 = 16,96. Dobijena je linearna zavisnost intenziteta emitovanog zračenja od koncentracije morina u oblasti od 1,5 do 30,5 ng cm-3. Granica detekcije je iznosila 0,02 ng cm-3 a granica kvantifikacije 0,06 ng cm-3. Pouzdanost predložene metode proverena je referentnom RP-HPLC/UV metodom. Razvijena je spektrofluorimetijska metoda za određivanje hesperidina u humanoj plazmi i farmaceutskim preparatima koja se zasniva na fluorescenciji kompleksa aluminijum(III)–hesperidin, čiji je sastav aluminijum(III) : hesperidin = 1 : 1. Kompleks pokazuje intenzivnu fluorescenciju u prisustvu surfaktanta SB 12 na λem = 476 nm pri ekscitaciji na λex =390 nm i stabilan je u pH opsegu od 3,0 do 7,0. Konstanta stabilnosti ovog kompleksa na pH = 4,50 je log β1 = 9,20. Linearna zavisnost intenziteta fluorescencije od koncentracije, pri određivanju hesperidina u farmaceutskim preparatima dobijena je u koncentracionom opsegu 0,06–24,4 µg cm-3 sa granicom detekcije od 0,016 µg cm-3 i granicom kvantifikacije od 0,049 µg cm-3. Dobijene „recovery“ vrednosti u intervalu od 99,3–99,7 % pokazuju veliku tačnost metode. Linearna zavisnost intenziteta fluorescencije kompeksa od koncentacije hesperidina pri određivanju u uzorcima humane plazme dobijena je u koncentracionom opsegu od 0,1–12,2 µg cm-3 sa granicom detekcije od 0,032 µg cm-3 i granicom kvantifikacije od 0,096 µg cm-3. „Recovery“ vrednosti su dobijene u opsegu 98,4 do 99,8 %. Pouzdanost metode proverena je LC–MS/MS metodom za određivanje hesperidina u humanoj plazmi, a HPLC/UV metodom prilikom određivanja hesperidina u farmaceutskim preparatima. Linearna zavisnost pri određivanju hesperidina u farmaceutskim preparatima dobijena je u intervalu od 0,05–10,00 µg cm-3. Granica detekcije, LOD je iznosila 0,01 µg cm-3, granica kvantifikacije, LOQ 0,03 µg cm-3. Linearna zavisnost pri određivanju hesperidina u humanoj plazmi je dobijena u intervalu 0,02–10,00 µg cm-3 sa granicom detekcije od 0,005 µg cm-3 i granicom kvantifikacije od 0,015 µg cm-3. Dobro slaganje između ove dve metode pokazuje primenljivost spektrofluorimetrijske metode u kliničkim laboratorijama i laboratorijama za kontrolu kvaliteta. Predložena fluorimetrijska metoda je jednostavna, pouzdana i precizna za određivanje hesperidina u humanom serumu i farmaceutskim preparatima. Predložena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje sadržaja hesperidina u sokovima od pomorandže zasnovana na fluorescenciji kompleksa aluminijum– hesperidin. Linearna zavisnost za određivanje hesperidina u rastvorima metanol-voda dobijena je u koncentracionom intervalu od 0,08 do 18,0 µg cm-3, pri čemu je granica detekcije iznosila LOD = 0,023 µg cm-3, a granica kvantifikacije LOQ = 0,070 µg cm-3. Predložena metoda je pojednostavljena izostavljanjem površinski aktivnih materija koje se koriste u sličnim procedurama i uspešno je primenjena za određivanje sadržaja hesperidina u sokovima od pomorandže prisutnim na tržištu Srbije. Predložena je spektrofluorimetijska metoda za određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima, koja je zasnovana na fluorescenciji kompleksa aluminijum(III)–kvercetin, sastava aluminijum(III) : kvercetin = 2 : 1. Kompleks aluminijum(III)–kvercetin pokazuje intenzivnu fluorescenciju na λem = 480 nm pri eksitaciji na λex = 420 nm, i stabilan je u pH oblasti od 2,0 do 5,5. Intenzitet fluorescencije nastalog kompleksa zavisi od pH vrednosti rastvora, i najveći je na pH = 3,33. Konstanta stabilnosti ovog kompleksa na pH = 3,20 iznosi log β = 27,79. Linearnost je dobijena u koncentracionom opsegu od 1,5 do 60,5 ng cm-3 kvercetina. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,09 ng cm-3, a granica kvantifikacije LOQ = 0,27 ng cm-3. Pouzdanost predložene metode proverena je referentnom RP-HPLC/UV metodom. Linearnost je dobijena u koncentracionom opsegu od 1,0 do 200,0 µg cm-3 Granica detekcije kvercetina RP- HPLC/UV metodom je iznosila 0,066 µg cm-3 a granica kvantifikacije 0,200 µg cm-3 kvrercetina. Predložena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje ukupnog sadržaja polifenola u soku od jabuka pri čemu je sadržaj ukupnih polifenola izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE), koji je određivan spektrofluorimetrijski Ključne reči: morin, hesperidin, kvercetin, aluminijum(III), spektrofluorimetrijsko određivanje, konstanta stabilnosti kompleksa Naučna oblast: Fizička hemija Uža naučna oblast: Spektrohemija TITLE: SPECTROFFLUORIMETRIC INVESTIGATION OF COMPLEX COMPOUNDS OF MORIN, HESPERIDIN AND QUERCETIN WITH ALUMINIUM Abstract: Morin, hesperidin and quercetin belong to flavonoids, a large class of compounds. Flavonoids have important biological and physiological activity. Thus, it is of interest to develop simple, accurate and precise method for the determination of morin, hesperidin and quercetin in different samples. Morin is a flavonol antioxidant. In ethanol–water mixtures (70 v/v % of ethanol) it reacts with aluminium (III) ion to give Al(Mor)2 in the pH range 3–6. The complex shows strong fluorescence emission at 500 nm upon excitation at 410 nm. The fluorescence intensity is pH dependent with maximum emission at pH 4,40. The conditional stability constant of this complex at 298 K was found to be log β2 = 16,96 at pH 4,40. Since the complexation reaction enhances the fluorescence of morin, this property was used for the determination of morin in human serum. A linear dependence of the intensity of fluorescence of the complex on the concentration of morin was obtained in morin concentration range from 1,5–30,5 ng cm-3. The limit of detection, LOD was 0,02 ng cm-3 while limit of quantification, LOQ was 1,0 ng cm-3. Serum concentration of morin was also determined using RP-HPLC as a reference method. A spectrofluorometric method, based on the fluorescence properties of the aluminium(III)–hesperidin complex, AlHesp2+, for the determination of hesperidin in human plasma and pharmaceutical forms has been developed and validated. The complex shows a strong emission in the presence of the surfactant betain sulphonate SB 12 at 476 nm with excitation at 390 nm. The conditional stability constant of this complex at 298 K was found to be log β1 = 9,20 at pH 4,50. The linearity range for pharmaceutical forms of hesperidin was 0,06–24,4 µg cm-3 with a limit of detection, LOD, of 0,016 µg cm-3 and a limit of quantification, LOQ, of 0,049 µg cm-3. Recovery values in the range 99,3–99,7 % indicate good accuracy of the method. A linear dependence of the intensity of fluorescence of the complex on the concentration of hesperidin in plasma was obtained in concentration range from 0,1–12,2 µg cm-3. The LOD was 0,032 µg cm-3 while LOQ was 0,096 µg cm-3. Recovery values were in the range 98,4–99,8 %. The reliability of the method was checked by an LC–MS/MS method for plasma samples and an HPLC/UV method for tablets with direct determination of hesperidin after separation. Linearity range in determination of hesperidin in pharmaceutical forms was obtained in the range from 0,05 to 10,00 µg cm-3. The LOD was 0,01 µg cm-3 and the LOQ was 0,03 µg cm-3. The linearity range for the determination of hesperidin in human plasma was 0,02–10,00 µg cm-3 with an LOD 0,005 µg cm-3 and an LOQ of 0,015 µg cm-3. The good agreement between the two methods indicates the usability of the proposed fluorometric method for the simple, precise and accurate determination of hesperidin in clinical and quality control laboratories. The spectrofluorometric method based on fluorescence ability of aluminium – hesperidin complex for the determination of hesperidin in orange juice is proposed. The linearity range of hesperidin in methanolic-aqueous solution was 0,08 – 18,0 µg cm-3 with LOD and LOQ values as 0,023 µg cm-3 and 0,070 µg cm-3, respectively. Method was simplified by omitting any of surphactant agents usually applied in similar procedures, and successfully applied for the determination of hesperidin in orange juices commercially available on the Serbian market. Quercetin is a flavonol antioxidant. IIn methanol – water mixtures (70 v/v % of ethanol) it reacts with aluminium (III) ion to give Al2Querc+4 in the pH range 2,0–5,5. The complex shows strong fluorescence emission at 480 nm upon excitation at 420 nm. The fluorescence intensity is pH dependent with maximum emission at pH 3,33. The conditional stability constant of this complex at 298 K was found to be log β = 27,79 at pH 3,20. Since the complexation reaction enhances the fluorescence of quercetin, this property was used for the determination of quercetin in dosage forms. A linear dependence of the intensity of fluorescence of the complex on the concentration of quercetin was obtained in quercetin concentration range from 1,5 to 60,5 ng cm-3. The LOD was 0,09 ng cm-3 while LOQ was 0,27 ng cm-3. Concentration of quercetin was also determined using RP-HPLC as a reference method. Quercetin and aluminium(III)-ion form a stable complex and the resulted emission at 480 nm can be used for the determination of the total phenols concentration expressed in terms of “quercetin equivalent” (QE). Keywords: Morin, hesperidin, quercetin, aluminium (III), determination, spectrofluorimetry, costant stability of complex Scientific Field: Physical Chemistry Field of Academic Expertise: Spectrochemistry SADRŽAJ: 1. UVODNI DEO 1 1.1. Uvod 1 1.2. Cilj rada 2 2. OPŠTI DEO 3 2.1. Flavonoidi 3 2.1.1. Hemijska struktura flavonoida 3 2.1.2. Kompleksna jedinjenja flavonoida sa jonima metala 5 2.1.2.1. Kompleksna jedinjenja morina 6 2.1.2.2. Kompleksna jedinjenja hesperidina 9 2.1.2.3. Kompleksna jedinjenja kvercetina 10 2.1.3. Farmakološka svojstva flavonoida 12 2.1.3.1. Farmakološka svojstva morina 14 2.1.3. 2. Farmakološka svojstva hesperidina 15 2.1.3.3. Farmakološka svojstva kvercetina 17 2.2. Aluminijum(III)-jon kao izabrani centralni metalni jon i njegova svojstva 19 3. EKSPERIMENTALNI DEO 22 3.1. Metode 22 3.1.1. Spektrofluorimetrija 22 3.1.2. Tečna hromatografija 25 3.1.3. Ekstrakcija na čvrstoj fazi 27 3.2. Instrumenti i reagensi 30 3.2.1. Instrumenti 30 3.2.1.1. Spektrofluorimetar 30 3.2.1.2. Hromatografski sistemi 31 3.2.1.3. Uslovi za LC-MS/MS određivanje hesperidina 32 3.2.1.4. pH-metar 32 3.2.1.5. Ultrazvučno kupatilo 33 3.2.2. Reagensi i hemikalije 33 3.3. Generalna procedura 34 3.3.1. Osnovni rastvori 34 3.3.1.1. Osnovni rastvor aluminijum(III)-nitrata 34 3.3.1.2. Osnovni rastvori flavonoida 35 3.3.1.3. Osnovni rastvori površinski aktivnih materija 35 3.3.2. Ispitivanje kompleksa 36 3.3.2.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa 36 3.3.2.2. Određivanje sastava kompleksa 36 3.3.3. Reakcija formiranja kompleksa 38 3.3.4. Izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa 39 3.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje flavonoida u alkoholno-vodenim rastvorima 42 3.4.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u 70 % v/v etanolu 44 3.4.2. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u70 % v/v metanolu 44 3.4.3. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 % v/v metanolu u prisustvu površinski aktivne materije SB 12 (n-dodecil sulfobetaina) 45 3.4.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u 70 % v/v metanolu 45 3.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje flavonoida u različitim uzorcima 46 3.5.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u uzorcima humanog seruma 46 3.5.2. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme 46 3.5.3. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u tabletama 47 3.5.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u soku od pomorandže 48 3.5.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u kapsulama 48 3.5.6. Spektrofluorimetrijsko određivanje polifenola u soku od jabuke 49 3.6. Procedure za određivanje flavonoida referentnim metodama 50 3.6.1. HPLC određivanje morina 50 3.6.2. HPLC i maseno - spektrometrijsko određivanje hesperidina 50 3.6.3. HPLC određivanje kvercetina 52 4. REZULTATI I DISKUSIJA 53 4.1. Kompleks aluminijum(III)-morin 53 4.1.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)-morin 53 4.1.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-morin 55 4.1.3. Reakcija formiranja kompleksa 59 4.1.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum (III)-morin 60 4.1.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u 70 %v/v etanolu 63 4.1.6. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u uzorcima humanog seruma 64 4.1.7. HPLC određivanje morina 65 4.2. Kompleks aluminijum(III)-hesperidin 68 4.2.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)-hesperidin 68 4.2.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-hesperidin 69 4.2.3. Reakcija formiranja kompleksa 72 4.2.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-hesperidin 73 4.2.5. Uticaj prisustva cviterjonske površinski aktivne materije SB 12 na intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin 76 4.2.6. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu SB 12 79 4.2.7. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu 82 4.2.7.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u sokovima od pomorandže 83 4.2.8. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu u prisustvu SB 12 85 4.2.8.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje sadržaja hesperidina u farmaceutskim preparatima 87 4.2.9. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme u prisustvu SB 12 89 4.2.10.Uticaj surfaktanta SB 12 na spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu 90 4.2.11. HPLC određivanje hesperidina u farmaceutskim preparatima 91 4.2.12. LC-MS/MS određivanje sadržaja hesperidina u uzorcima humane plazme 93 4.3. Kompleks aluminijum(III)- kvercetin 96 4.3.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)-kvercetin 96 4.3.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-kvercetin 97 4.3.3. Reakcija formiranja kompleksa 101 4.3.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-kvercetin 103 4.3.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u 70 %v/v metanolu 106 4.3.5.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima 107 4.3.4.2.Spektrofluorimetrijsko određivanje polifenola u sokovima od jabuke 109 4.3.6. HPLC određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima 110 5. ZAKLJUČAK 115 6. LITERATURA 120 1 1. UVODNI DEO 1.1. Uvod Flavonoidi su sekundarni ćelijski metaboliti koji, pored karotenoida i hlorofila, predstavljaju najveću klasu biljnih pigmenata u prirodi. Učestvujući u procesima fotosinteze, rasta, reprodukcije, fosforilacije i pigmentacije, flavonoidi ispoljavaju veoma važnu ulogu u fiziologiji biljaka. Oni takođe doprinose rezistenciji prema patogenim mikroorganizmima i štite biljke od negativnog dejstva ultraljubičastog zračenja. Veliki broj radova pokazuje da flavonoidi preventivno deluju na razvoj oksidativnog stresa koji se, kao jedan od uzročnika nastajanja slobodnih radikalskih vrsta (prvenstveno reaktivnih kiseoničnih vrsta (reactive oxygen species) - ROS), nalazi u osnovi većine, ako ne i svih, patoloških stanja u organizmima kao i samog procesa starenja. Predpostavlja se da je biološka i fiziološka aktivnost flavonoida, pre svega, zasnovana na njihovom antioksidativnom dejstvu koje se ispoljava i kroz antimutageno, antibakterijsko, antiinflamatorno, antialergijsko, antivirusno, antitrombolitično, vazodilatorno i antikancerogeno delovanje. Flavonoidi imaju izraženu sposobnost kompleksiranja jona prelaznih metala. Pored toga što ove reakcije predstavljaju veoma važan faktor stabilizacije obojenja, strukture, u prirodnom medijumu one su takođe i jedan od mehanizama kojim se postiže akumulacija metala u perifernim tkivima čime se smanjuje njihov štetni efekat i mogućnost njihove mobilizacije u ekosisteme. Građenjem kompleksa sa metalnim jonima se pospešuje odbrambeni mehanizam biljaka od patogena i biljojeda. Sposobnost kompleksiranja flavonoida sa metalnim jonima služi i kao kvalitativni test njihovog prisustva u biljnim ekstraktima, biološkim i drugim uzorcima, a takođe se ova osobina često koristi i u kolorimetrijske svrhe za detekciju metala u tragovima. Zbog svega navedenog, postoji potreba za razvojem i validiranjem odgovarajućih metoda koje se zasnivaju na analizi flavonoid-metal kompleksa, a u cilju ispitivanja kvaliteta proizvoda koji sadrže flavonoide (farmaceutski preparati, uzorci hrane) i određivanja njihovog sadržaja u biološkim uzorcima. Činjenica je da flavonoidi imaju strukturne karakteristike koje omogućavaju fluorescenciju molekula, što pruža 2 mogućnost primene spektrfluorimetrije kao metode u njihovoj analizi. Izuzetno velika osetljivost spektrofluorimetrijske metode daje prednost ovoj metodi u odnosu na druge i svrstava je u jednu od veoma primenjivanih metoda u savremenim istraživanjima flavonoida. 1.2. Cilj rada Cilj ove disertacije je da se ispitaju kompleksna jedinjenja flavonoida: morina, hesperidina i kvercetina sa aluminijum(III)-jonom, da se odredi sastav i izračunaju konstante stabilnosti nastalih kompleksnih jedinjenja aluminijuma i navedenih flavonoida. Formiranje navedenih kompleksa biće primenjeno za određivanje flavonoida - morina, hesperidina i kvercetina u farmaceutskim preparatima, uzorcima hrane, humanog seruma i plazme. Biće određeni optimalni uslovi za kvantitativnu analizu navedenih flavonoida, a zatim razvijena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje morina, hesperidina i kvercetina u različitim uzorcima. Ispitivaće se parametri za validaciju datih metoda sa posebnim osvrtom na validaciju metoda koje se primenjuju u analizi bioloških uzoraka i definišu optimalni uslovi za određivanje njihovog sadržaja u različitim uzorcima. Predložene spektrofluorimetrijske metode treba da omoguće brzo i jednostavno određivanje ispitivanih flavonoida sa velikom osetljivošću i u širem opsegu koncentracija u odnosu na postojeće metode. Tako razvijene i validirane spektrofluorimetrijske metode omogućile bi određivanje ispitivanih flavonoida – morina, hesperidina i kvercetina u kliničkim laboratorijama i laboratorijama za kontrolu kvaliteta farmaceutskih preparata i hrane. 3 2. OPŠTI DEO 2.1. Flavonoidi 2.1.1. Hemijska struktura flavonoida Flavonoidi ili bioflavonoidi su velika grupa biljnih jedinjenja koji predstavljaju slobodne ili glikozidno vezane žute ćelijske pigmente. Ova grupa jedinjenja se sintetiše u biljkama. Najčešće se mogu naći u korenju, lišću, semenkama, cvetu viših biljaka, zatim u povrću, voću i napicima kao što su čaj, vino, kafa i voćni sokovi. Oni predstavljaju najveću grupu polifenolnih jedinjenja i imaju prepoznatljivu hemijsku strukturu. Ime su dobili po flavonu (lat. flavus- žut), koji predstavlja osnovnu stukturnu jedinicu. Ova grupa jedinjenja predstavlja derivate γ-pirona, to jest benzo γ- pirona, za koji je vezan jedan fenilni prsten. Osnovnu strukturu flavonoida čini difenilpropan: C6H5(A)-C3-C6H5 (B) odnosno 1-fenil-3-(2- hidroksifenil) propan-1-ol iz kojeg se gubitkom vode i zatvaranjem C-prstena dobija flavan od kog se izvodi određeni broj osnovnih struktura. Oznake A i B odnose se na benzenske prstenove, a oznaka C3 na prsten γ-pirona. Različite klase jedinjenja u okviru ove grupe, sa istom osnovnom strukturom, nastaju promenom oksidacionog stanja alifatičnog niza, odnosno heterocikličnog prstena C. U zavisnosti od stepena oksidovanosti prstena C, može se izvršiti podela flavonoida na: flavanone, flavan-3-ole (katehine), flavone, flavon-3-ole, antocijanidine i izoflavone. Svi oni mogu biti hidroksilovani, metoksilovani i glikozidirani s monosaharidima ili oligosaharidima, a često sadrže i acilne grupe u različitim položajima osnovne flavonoidne strukture ili glikozidnog dela.1 Osim toga, kod flavonoida je izražena i velika sklonost ka umrežavanju i polimerizaciji. Zahvaljujući ovoj činjenici, može se 4 zaključiti da su flavonoidi polifenoli široke rasprostranjenosti u biljnom svetu (poznato je preko 6000 jedinjenja koja pripadaju flavonoidima).1 Predmet ove disertacije je proučavanje kompleksnih jedinjenja flavonoida- morina, hesperidina i kvercetina sa aluminijum(III)–jonima. Strukture ovih jedinjenja su prikazane Shemama 1a, 1b, 1c : Morin, C15H10O7, iz grupe flavonola (2',3,4',5,7-pentahidroksiflavon) Shema 1a. Struktura morina Hesperidin, C28H34O15, iz grupe flavanona (hesperitin-7-rutinozid) Shema 1b. Struktura hesperidina 5 kvercetin C15H10O7, iz grupe flavonola (3',3,4',5,7-pentahidroksiflavon) Shema 1c. Struktura kvercetina Morin i kvercetin pripadaju flavonolima,2 koji su zastupljeni u povrću kao što je luk, kelj, brokoli, zelena salata, paradajz, a manje ih ima u voću (nalaze se u jabukama, grožđu, bobičastom voću). Ranija istraživanja su pokazala da se flavonoidi,3 a naročito kvercetin, nalaze u vinu i da od njih potiče gorak i opor ukus vina. Takođe ih ima u zelenom i crnom čaju. Hesperidin pripada flavanonima, i u velikoj meri se nalazi u unutrašnjoj kori ploda citrusa, takozvanom albedo delu, nešto manje ga ima u unutrašnjem, sočnom delu ploda, dok se u spoljašnjoj kori ploda (flavedo deo) uglavnom nalaze polimetoksilovani flavonoidi.4,5 2.1.2. Kompleksna jedinjenja flavonoida sa jonima metala Zahvaljujući svojoj specifičnoj strukturi, flavonoidi grade obojena kompleksna jedinjenja sa velikim brojem jona metala. Reakcije kompleksiranja flavonoida u velikoj meri su ispitivane tokom šezdesetih i početkom sedamdesetih godina prošlog veka (najviše flavona i flavonola). Pregledom literaturnih podataka uočava se da su se u ovom periodu kompleksnim jedinjenjima flavonoida najviše bavili ruski naučnici, u čijim se radovima mogu naći podaci o stehiometrijskom sastavu kompleksa, uslovima pod kojima su ispitivanja vršena (pH, jonska jačina), kao i optimizacija reakcija za kvantitativnu analizu jona metala.6-9 Tokom osamdesetih, interes za ovu problematiku opada, pa se stoga javlja srazmerno manji broj radova koji se odnose na kompleksna 6 jedinjenja flavonoida sa jonima metala. Međutim, početkom devedesetih godina, flavonoidi ponovo ulaze u središte pažnje, zato što se sve više ljudi okreću zdravom načinu življenja, što između ostalog uključuje i zdravu ishranu. U tom periodu nastupa i trend povratka lečenju prirodnim proizvodima, što dovodi do sve intenzivnijih istraživanja biološki i farmakološki aktivnih flavonoida.10-13 S hemijskog aspekta, razvojem savremenih hromatografskih tehnika, radovi iz ovog perioda, su uglavnom posvećeni izolovanju flavonoida iz biljaka, zatim identifikaciji novootkrivenih flavonoidnih jedinjenja.14-17 Flavonoidi su se pokazali kao efikasni helatni reagensi za metalne jone koji formiraju stabilna kompleksna jedinjenja koja intenzivno fluoresciraju. Ova njihova osobina se koristi u analitičkim metodama za određivanje metala u tragovima, kao i za određivanje samih flavonoida. Dobro je poznato da flavonoidi mogu da heliraju metalne jone kao što su berilijum(II), aluminijum(III), gvožđe(III) i cink(II).18-20 Za naša ispitivanja od posebnog značaja bila su kompleksna jedinjenja morina, hesperidina i kvercetina sa aluminijumom, jer su se u sva tri slučaja dobijala kompleksna jedinjenja koja su pokazivala veliki intenzitet fluorescencije, što je omogućilo uvođenje metoda za spektrofluorimetrijsko određivanje sadržaja ovih flavonoida u farmaceutskim preparatima, humanom serumu i plazmi, kao i u prehrambenim proizvodima. 2.1.2.1. Kompleksna jedinjenja morina Morin je flavonol koji relativno lako stupa u reakciju sa metalnim jonima, pri čemu najčešće formira komplekse sastava MMor i MMor2. U relativno starijoj literaturi21 nalaze se podaci da morin u prisustvu različitih surfaktanata formira kompleks sa gvožđe(III)-jonom sastava 1:4 na pH = 4,0. Dobija se kompleks koji ima visoku vrednost koncentracione konstante stabilnosti (k = 3,90 ×1022), što je iskorišćeno za definisanje uslova za određivanje gvožđe(III)-jona. Reakcija nastajanja kompleksa gvožđe(III)-morin je primenjena za određivanje gvožđe(III)-jona u farmaceutskim preparatima koji pored ovog jona sadrže i gvožđe(II)-jon.22 U ovom radu pokazano je da je reakcija morina sa gvožđe(III)-jonom selektivna, odnosno da ne dolazi do interferencije gvožđe(II)-jona sa morinom. 7 S. Blagojević23 i saradnici su ispitivali kompleks paladijum(II)-morin u 70 % v/v etanolu. U etanolnoj sredini nastaje kompleks sastava paladijum(II): morin = 1:1. kome su određene koncentracione konstante stabilnosti na nekoliko različitih pH vrednosti: log β1 = 4,55 (pH = 4,0), log β2 = 4,01 (pH = 5,0) i log β2 = 4,17 (pH = 6,0). Određeni su uslovi za spektrofotometrijsko određivanje morina u koncentracionom opsegu od 1× 10-5 - 1× 10-3 mol dm-3. Za određivanje koncentacije antimona u bronzi adsorptivnom striping voltametrijom24 primenjena je reakcija formiranja kompleksa antimon(III)-morin (sastav kompleksa 1:3, na pH = 2,3). Spektrofotometrijski je ispitivan titanil oksalat-morin kompleks u 50% v/v etanolu.25 U etanolnoj sredini formira se kompleks TiO(C2O4)22-: morin = 1:2. kome su određene koncentracione konstante stabilnosti na nekoliko različitih pH vrednosti: log β2 = 5,83 (pH = 6,0), log β2 = 6,40 (pH = 7,0) i log β2 = 7,35 (pH = 8,0). Dobijena je linearna zavisnost apsorbancije kompleksa od koncentracije morina, i na osnovu toga je razvijena metoda za kvantitativno određivanje morina. Studija Q. K. Panhwara26 i autora se odnosi na sintezu, karakterizaciju kompleksa bakar(II)-morin na osnovu spektroskopskih ispitivanja. Zbog velike biološke aktivnosti morina kao i njegovih kompleksa, u ovom radu je ispitivan i antioksidacioni potencijal nastalog kompleksa. Pokazano je da morin gradi kompleks sa bakar(II)- jonom sastava 1:1, koji ima jače antioksidativno dejstvo u odnosu na čist morin. Razvijena je metoda za simultano određivanje sadržaja olova i kadmijuma u vodi27 na pH vrednosti koja iznosi 2,9 adsorptivnom striping-voltametrijom. Metoda je zasnovana na formiranju kompleksa olovo(II)-morin sastava 1:1 i kadmijum(II)-morin kompleksa sastava 1:2. Kompleksi morina koji fluoresciraju dobijeni su u reakciji morina sa cirkonijum (IV)-jonom28 (nastaje kompleks sastava 1:1 u prisustvu surfaktanta CTABa- cetiltrimetilamonijum bromida, i sulfatne kiseline), zink(II)-jonom29 (formira se kompleks koji intenzivno fluorescira na pH = 4,7), berilijum(II)-jonom30 (dobija se kompleks sastava 1:1, stabilan u pH oblasti od 5,8 do 6,2, u heksaamin puferu u prisustvu surfaktanta Triton X-100, odnosno polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)- fenil etra). Formiranje kompleksa morina sa navedenim jonima metala uglavnom je iskorišćeno za određivanje prisustva ovih jona u tragovima u različitim uzorcima. 8 Nukleinske kiseline interaguju sa velikim brojem hemijskih vrsta kao što su mali organski katjoni, molekuli aktivnih principa farmaceutskih preparata, joni i njihovi kompleksi, od kojih većina pokazuje specifične interakcije sa nukleinskim kiselinama. Ispitivanjem ovih interakcija dobijaju se značajne informacije o specifičnom načinu vezivanja ovih vrsta sa nukleinskim kiselinama, kao i mestima u molekulu nukleinskih kiselina gde se ostvaruju veze. Ispitivan je kompleks morina sa lantan(III)-jonom u prisustvu molekula DNK31 (nastaje 1:1 kompleks u pH opsegu od 4,5 – 6,5) Korišćenjem lantan(III)-morin kompleksa kao fluorescentnog reagensa, razvijena je metoda za kvantitativnu analizu DNK na pH vrednosti od 5,5. Ispitivanje interakcija DNK i molekula aktivnih principa lekova je od opšteg značaja posebno za dizajniranje novih lekova sa DNK kao ciljnim mestom delovanja. Morin je flavonoid koji pokazuje veliku biološku aktivnost, pa je interakcija morina i molekula DNK bila predmet ispitivanja Ensafija i grupe autora.32. Ispitivana je interakcija morina i DNK, kao i interakcija kompleksa bizmut(III)-morin (sastava 1:2) i DNK. Utvrđeno je da u prisustvu DNK intenzitet fluorescencije kompleksa raste, dok prisustvo DNK gasi fluorescenciju čistog morina. Jedan od najpoznatijih kompleksa koji pokazuje intenzivnu fluorescenciju je aluminijum(III)-morin kompleks koji je izučavan od strane većeg broja autora. A. Gutierez i M. H. Gehlen33 ispitivali su ovaj kompleks u metanolu i utvrdili da je sastav kompleksa aluminijum(III) : morin = 1 : 2 u metanolu, i 1 : 1, u kiseloj sredini. Dati kompleks pokazuje intenzivnu fluorescenciju, pa su zahvaljujući toj činjenici, uvedene metode za određivanje, najčešće, aluminijuma u različitim uzorcima. Tako je formiranje ovog kompleksa primenjeno za određivanje sadržaja aluminijum(III)- jona u kulturi Nicotiana tabacum. 34 U nekim od ovih radova, reakcija kompleksiranja aluminijum(III)-jona i morina bila je primenjena za određivanje aluminijuma u tragovima u različitim uzorcima vode35-37 i u tečnosti za hemodijalizu.38 9 2.1.2.2. Kompleksna jedinjenja hesperidina U literaturi ima malo podataka o kompleksnim jedinjenjima hesperidina, što je verovatno posledica slabe rastvorljivosti hesperidina u relativno ograničenom broju rastvarača. Hesperidin formira nekoliko kompleksnih vrsta sa gvožđe(III)-jonom9 u zavisnosti od pH vrednosti (u pH intervalu od 1,2- 2,2 nastaje kompleks sastava 1:1, kompleks sastava 1:2 nastaje u oblasti pH od 3,5- 4,0, a u intervalu pH od 6,5- 7,0 nastaje 1:3 kompleks). Sa cirkonijum(IV)-jonom nastaje kompleks sastava 1:1, na pH = 3,6.39 Spektrofotometrijski je ispitivan aluminijum(III)-hesperidin kompleks koji nastaje u 70% v/v metanolu.40 Utvrđeno je da nastaje kompleks sastava 1:1, određene su koncentracione konstante stabilnosti na različitim pH vrednostima ( log β1= 3,46 na pH = 4,0 a na pH = 5,0 log β1= 4,54). Spektrofotometrijski, hesperidin se može odrediti na osnovu linearne zavisnosti apsorbancije kompleksa od koncentracije hesperidina u koncentracionom opsegu od 2,50 × 10−5 mol dm-3 -1,75 × 10−4 mol dm-3 hesperidina. Uranil(II)-hesperidin kompleks je ispitivan spektrofotometrjiski.41 Određeni su sastav i koncentraciona konstanta stabilnosti kompleksa. Utvrđeno je da uranil(II)-jon i hesperidin formiraju 1:2 kompleks u kome je uranil(II)-jon vezan za molekul hesperidina preko karbonilne i 5-hidroksilne grupe. Relativna konstanta stabilnosti datog kompleksa iznosi log β2 = 5,77 na pH = 4,0 log β2 = 7,00 na pH = 6,0. Ispitani su uslovi za spektrofotometrijsko određivanje hesperidina na osnovu optimalnih uslova formiranja ovog kompleksa. Dobijena je linearna zavisnost apsorbancije kompleksa od koncentracije hesperidina u koncentracionom opsegu od 2,0 × 10-5 mol L-1 do 2,0 × 10-4 mol dm-3 hesperidina. Sintetisan je vanadil(IV)–hesperidin kompleks i okarakterisan fizičkohemijskim metodama.42 Određen je sastav ovog kompleksa (nastaje 1:1 kompleks) i ispitani njegovi antioksidativni efekti. Kompleks je ispitan na dve kulture tumorskih ćelija, pri čemu je pokazano da ovaj kompleks poboljšava proliferativne efekte samog liganda- hesperidina. Literaturni podaci za komplekse hesperidina koji pokazuju fluorescenciju odnose se na komplekse aluminijum(III)–hesperidin (nastaje 1:1 kompleks, optimalan opseg pH vrednosti je od 5,4- 5,6)43 i kompleks hesperidina sa terbijum(III)-jonom (fornira se TbHesp3 kompleks sa intenzivnom fluorescencijom na pH = 8,0).44 Reakcija 10 kompleksiranja hesperidina primenjena je za određivanje hesperidina u kori od pomorandže i soku od pomorandže,43 farmaceutskim preparatima i humanoj plazmi.44 Navedeni kompleksi pokazuju intenzivnu fluorescenciju. Intenzitet fluorescencije se povećava sa porastom koncentracije metala. 2.1.2.3. Kompleksna jedinjenja kvercetina Kvercetin pripada flavonolima, i slično morinu formira veći broj kompleksa sa jonima metala. U literaturi koja je publikovana osamdesetih i devedesetih godina dvadesetog veka ispitivani su (najčešće spektrofotometrijski) kompleksi kvercetina sa različitim jonima metala pri čemu su definisani uslovi za određivanje kvercetina ili jona metala u različitim uzorcima na osnovu zavisnosti apsorbancije kompleksa od koncentracije kvercetina ili jona metala. Tako je ispitan kompleks nikl(II)–kvercetin u etanolnoj sredini.45 Utvrđeno je da se formira kompleks sastava nikl(II) : kvercetin = 1:1. Određena je koncentraciona konstanta stabilnosti kompleksa logβ1 = 3,1 i uslovi za odrđivanje nikla na osnovu zavisnosti apsorbancije formiranog kompleksa od koncentracije nikl(II)-jona. Sastav i koncentracione konstante stabilnosti paladijum(II)-kvercetin kompleksa u 50 v/v% etanolu određene su odgovarajućim spektrofotometrijskim metodama i pH- metrijskim merenjima.46 Utvrđeno je da paladijum (II)-jon i kvercetin grade kompleks sastava 1:1 u kome je paladijum(II)-jon ostvaruje koordinativnu vezu u sa molekulom kvercetina preko karbonilne i 3-hidroksilne grupe. Koncentracione konstante stabilnosti iznosile su logβ1 = 6,05 na pH = 5,00 i logβ1 = 4,96 na pH = 6,50. Ispitani su uslovi za spektrofotometrijsko određivanje kvercetina i utvrđeno je da Beerov zakon važi u koncentracionom opsegu kvercetina od 5,0 × 10-5 -1,0 × 10-3 mol dm-3. Spektrofotometrijski je ispitivan kompleks koji nastaje u reakciji kvercetina i kalijum titaniloksalata u 50 v/v% etanolu.47 Određene su konstante stabilnosti kvercetin- titaniloksalatnog kompleksa potenciometrijski i spektrofotometrijski na različitim temperaturama (T = 26,0 0C, 34 0C i 39,0 0C) i različitim jonskim jačinama (I = 5,0 × 10-4 mol dm-3, 3,0 × 10-2 mol dm-3 i 6,0×10-2 mol dm-3) i izračunati termodinamički parametri. Predložena je brza, jednostavana i tačna metoda za određivanje kvercetina u farmaceutskim sirovinama i doziranim oblicima. Metoda je bazirana na 11 spektrofotometrijskom određivanju kvercetina na osnovu formiranja kompleksa kvercetina sa kalijum-titaniloksalatom. Kako se kvercetin uobičajeno nalazi zajedno sa vitaminom C u doziranim oblicima, predložene su dve procedure za određivanje kvercetina: bez i u prisustvu askorbinske kiseline. U obe predložene procedure, Beer-ov zakon važi u opsegu koncentracija od 0,85 µg cm-3 – 16,9 µg cm-3 kvercetina. Interakcije olovo(II)-jona sa kvercetinom su ispitivane u metanolnim rastvorima.48 Stehiometrijski odnos kvercetina i metalnog jona u kompleksu, kao i ravnotežne konstante stabilnosti kompleksa određene su UV-Vis spektroskopskim metodom u kombinaciji sa hemometrijskim metodama. U rastvoru nastaju tri kompleksne vrste u kojima je odnos metal : ligand 2:1, 1:2, i 1:1. Dominantna vrsta koja nastaje u metanolnom rastvoru je kompleks sastava olovo(II): kvercetin = 1:1. D. A. Kostić49 i saradnici su ispitivali spektrofotometrijski kompleks kvercetina sa bakar(II)-jonima u etanolu. Određen je sastav bakar(II)-kvercetin kompleksa (1:1). Koncentraciona konstanta stabilnosti kompleksa je izračunata iz Žobove krive i iznosila je log β1= 7,53 ± 0,25. Razvijena je nova metoda za kvantitativno određivanje sadržaja kvercetina u etanolnoj sredini. U optimalnim uslovima kvercetin se može odrediti u koncentracionom opsegu od 0,202 do 1,006 mg cm-3 sa relativnom standardnom greškom od 2,5% do 5,5%. Granica detekcije je iznosila 0,067 mg cm-3. Predložena metoda je veoma precizna, reproduktivna i osetljiva, i njom se mogu određivati mikrokoličine kvercetina u farmaceutskim preparatima. Kompleks kobalt(II)-kvercetin ispitivan je u metanolnoj sredini.50 Spektroskopskim metodama (UV-Vis, 1H NMR i IR) i TGA, DSC analizom ispitivane su osobine ovog kompleksa. Utvrđeno je da se formira kompleks stehiometrijskog sastava 2:1 (metal / ligand). Antioksidativna aktivnost kompleksa dređivana je spektrofotometrijski na osnovu njihovog delovanja na stabilni 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH) radikal. U ovom radu je pokazano da nastali kompleks ima veću antioksidativnu sposobnost u odnosu na čist kvercetin. Kvercetin kao jedan od najzastupljenijih flavonoida u prehrambenim namirnicama, ispitivan je u prisustvu bakar(II)-jona u metanolu.51 Spektroskopskim ispitivanjima (UV-Vis, 1H NMR i IR) ispitivane su interakcije kvercetina sa bakar(II)- jonima kao i mesta u molekulu kvercetina gde dolazi do nastajanja koordinativne veze između kvercetina i bakar(II)-jona. Određen je stehiometrijski sastav kompleksa, metal : 12 ligand = 2:1. Antioksidativne osobine kompleksa i kvercetina ispitivane su spektrofotometrijski na osnovu njihovog delovanja na stabilni 1,1-difenil-2-pikril hidrazil (DPPH) radikal. Utvrđeno je da kompleks bakar(II)-kvercetin pokazuje mnogo veću antioksidativnu sposobnost u odnosu na čist kvercetin. Kompleks aluminijum(III)-kvercetin ispitivan je spektrofluorimetrijski u metanolu sa i bez prisustvu surfaktanata, a podaci koji su dobijeni ukazuju da u metanolu nastaje kompleks aluminijum(III): kvercetin = 2:1, a u metanolu kome je dodata 0,1 mol dm-3 nitratna kiselina, nastaje kompleks sastava 1:1:33 Nastajanje ove dve kompleksne vrste takođe je potvrđeno i u prisustvu koloidne silikatne matrice.52 Spektoskopska studija53 ovog sistema iz 2002. godine, takođe potvrđuje prisustvo ove dve kompleksne vrste. Pored ovog kompleksa, kvercetin formira fluorescentne komplekse sa bakar(II)- jonom (formira se kompleks CuKverc2 ),54 zatim sa terbijum(III)-jonom (na pH = 7,0 formira se stabilan 1:1 kompleks,55 a sa germanijum(IV)-jonom nastaje 1:1 kompleks na pH = 8,15 u 90% metanolu u prisustvu površinski aktivne materije Brij-35 (polietilen glikol lauril etar).56 Formiranje ovih kompleksa je iskorišćeno za određivanje kvercetina ili jona metala u različitim uzorcima, a formiranje terbijum(III)- kvercetin kompleksa je primenjeno za određivanje ukupnih fenola u čajevima i sokovima.55 2.1.3. Farmakološka svojstva flavonoida Zbog velike biološke i farmakološke aktivnosti flavonoidi su, posebno u poslednje dve decenije, na samom vrhu naučnih i stručnih istraživanja. Proučavanjem njihovog mehanizma delovanja u in vitro i in vivo eksperimentima, pokazano je da flavonoidi poseduju antialergijske, antiinflamatorne, antiviralne i antioksidativne osobine. Ova jedinjenja imaju važnu ulogu u održavanju i zaštiti životnih funkcija biljaka, a sličnu ulogu imaju i kod drugih živih bića koja flavonoide u svoj organizam unose kao hranu. Zaštitna uloga flavonoida u biološkim sistemima pripisuje se njihovoj sposobnosti sparivanja (“hvatanja”) elektrona slobodnog radikala, helatnog vezivanja jona prelaznih metala (Fe2+, Cu2+, Zn2+ i Mg2+),57 aktiviranja antioksidativnih enzima58 i inhibiranja oksidaza.59 13 Jedinjenja iz ove grupe su do 1962. bila svrstavana u vitamine (vitamin P), koji su neophodni za pravilno delovanje i apsorbovanje vitamina C. Najaktivniji su flavonoidi iz citrusnih jedinjenja. Nalaze se u kori, belom sunđerastom sloju ispod kore i u membranama između segmenata ploda. Pokazalo se da su flavonoidi korisni u prevenciji pucanja kapilara naročito kod osoba koje su prisiljene da svakodnevno uzimaju aspirin, protiv hronične venske insuficijencije, kod manjih sportskih povreda gde je nužna brza rehabilitacija, kod manjih ili većih modrica nastalih zbog udaraca tupim predmetima, zatim kod šećerne bolesti, katarakte, retinopatije, otoka i upale desni itd. Takođe, osobe koje u ishrani kontinuirano imaju visok nivo bioflavonoida, imaju značajno manji rizik od pojave malignih bolesti. Antikancerogena aktivnost flavonoida izražena je preko njihovog agonizma i / ili antagonizma na karcinogenetski povezane receptore, kao što su receptori za epidermalni faktor rasta,60 arilhidroksikarbonilni receptori61 i estrogen-receptori,62 odnosno mogu uticati na pojačanje delovanja antikancerogenih enzima,63 ili pak inhibirati uticaj kancer-promotorskih enzima.64-66 Smatra se da utiču i na smanjenje smrtnosti kod koronarnih srčanih oboljenja.67 Određeni flavonoidi imaju mogućnost inhibicije većeg broja enzima, ali se posebno ispoljava njihova inhibitorna aktivnost na nekoliko enzimskih sistema, koji su povezani sa aktivacionim procesima u ćeliji, kao što su: protein kinaze, protein tirozin kinaze i fosfolipaze.68 Zbog njihove mogućnosti inhibicije oksidacije LDL (low density lipoprotein) proteina, flavonoidi ispoljavaju jedinstveni efekat zaštite od kardiovaskularnih oboljenja i infarkta miokarda.69-70 Antiinflamatorna aktivnost se manifestuje mogućnošću inhibicije nekih enzima kao što su ciklo-oksigenaze i 5–lipooksigenaze, koji u svojim metaboličkim ciklusima izazivaju edeme, artritis, dermatitis i druga patološka stanja.71 Antioksidativna svojstva flavonoida. Antioksidativne karakteristike pokazuju mnogi prirodni proizvodi, koji u svojoj strukturi poseduju fenolnu ili kateholnu funkcionalnu grupu. Ova jedinjenja pokazuju veliku aktivnost u oksidacionim procesima u kojima učestvuje atmosferski kiseonik, čijom redukcijom nastaju slobodni radikali ( superoksid- anjon, hidroksi-, peroksi- i alkoksi-radikali) koji predstavljaju izuzetno reaktivne oksidativne vrste. Kao posledica lančanih i slobodnoradikalskih reakcija u kojima učestvuju gore navedeni slobodni radikali javlja se veći broj 14 patoloških stanja u organizmu, pri čemu dolazi do oštećenja zdravih ćelija, ubrzavanja procesa starenja, destrukcije tkiva, i pojave mutagenih i kancerogenih procesa. Jedinjenja kao što su vitamin C, E, karoten, fenolna jedinjenja, flavonoidi, estrogeni biljnog porekla imaju antioksidativnu sposobnost,72, 73 tako što vezuju kiseonik iz vazduha, i na taj način sprečavaju njegovo štetno delovanje. Smatra se da flavonoidi u organizmu deluju kao antioksidansi i hvatači slobodnih radikala i na taj način imaju važnu ulogu u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji kao lekovi i antioksidansi.74 Predpostavlja se da se antioksidativno delovanje flavonoida zasniva na njihovoj sposobnosti doniranja vodonikovog atoma ili jednog elektrona nekom reaktivnom, slobodnom radikalu i na taj način dolazi do ″hvatanja″ slobodnih radikala dobijenih u reakciji peroksidacije lipida. Na ovaj način, ova jedinjenja štite ljudski organizam od mogućih bolesti, i usporavaju kvarenje hrane bogate lipidima.75, 76 2.1.3.1. Farmakološka svojstva morina Morin (3,5,7,2’,4’-pentahidroksiflavon, žuti pigment) je tipičan predstavnik flavonoida, pripada grupi flavonola, i pokazuje značajna farmakolška svojstva. On je vrlo značajno bioaktivno jedinjenje, koje interaguje sa nukleinskim kiselinama, enzimima i proteinima.77 Poznato je da morin može modulirati aktivnost metaboličkih enzima, između ostalog citohroma P450,78 a takođe ima izražena antioksidativna svojstva, te štiti različite vrste ćelija u ljudskom organizmu, kao što su miociti, ćelije endotela, hepatocita, ereitrocita, od različitih oksidativnih oštećenja.79 U novijoj literaturi pokazano je da morin štiti celovitost lizozomalne membrane, održavajući aktivnost lizozomalnih enzima u serumu i srcu.80. Morin hidrat se često koristi kao konzervans, jer sprečava oksidaciju lipida. Antioksidativno delovanje ispitivano je kod kompleksa morina sa lantan(III), gadolinijum(III) i luterijum(III)-jonima. Utvrđeno je da ovi kompleksi pokazuju inhibitorno delovanje na tri bakterijska soja: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae i StapHylococcus aureus.81 15 Zbog značajnih farmakoloških svojstava koje pokazuje morin, postoji potreba za njegovom kvantitativnom analizom u različitim uzorcima. U literaturi postoji nekoliko navedenih metoda koje se koriste za određivanje morina. Grupa autora82 predložila je HPLC metodu za simultano određivanje morina, kvercetina i njihovih metabolita u uzorcima seruma. Ovom metodom, morin je bilo moguće odrediti u koncentracionom opsegu od 1,6 do 200 µg cm-3, a granica detekcije LOD (limit of detection), za određivanje morina ovom metodom iznosila je 1,6 µg cm-3. Razvijena je kinetičko-spektrofotometrijska metoda za određivanje morina.83 Koncentracioni opseg za određivanje morina ovom metodom je iznosio 2,255 – 22,55 ng cm-3, sa relativnom greškom metode od 1,42–5,1 %. Granica detekcije, LOD, iznosila je 0,28 ng cm-3. P. Xiao i saradnici84 su predložili metodu za voltametrijsko određivanje morina u biljnoj drogi Glycyrrhiza, (sladić), koja se koristi u kineskoj tradicionalnoj medicini. Prema predloženoj metodi, morin je bilo moguće odrediti u koncentracionom opsegu od 5,0 × 10-9 do 1,0 × 10-7 mol dm-3 sa granicom detekcije, LOD od 1,0 × 10-7 mol dm-3. Dobijene ″recovery″ vrednosti nalazile su se u opsegu od 97,0 do100,5%. Predložena je HPLC metoda za određivanje dvanaest flavonoida (deset flavonola i dva flavonona) koji se nalaze u crvenom vinu.3 Ovom metodom morin se može odrediti u koncentracionom opsegu od 7,12–114 mg dm-3, a granica detekcije, LOD je iznosila 0,023 mg dm-3. 2.1.3. 2. Farmakološka svojstva hesperidina Hesperidin (hesperitin-7-rutinozid), spada u grupu flavanona, i takođe, ima veliku farmakološku aktivnost. Između ostalog, potpomaže efikasnost vitamina C i sprečava njegovu degradaciju i potpunu razgradnju u prisustvu vazduha. Stoga i ne čudi da se ovaj bioflavonoid u kombinaciji sa rutinom i vitaminom C vrlo često nalazi na tržištu u obliku različitih proizvoda koji se koriste kao dodaci ishrani. Hesperidin pokazuje antiinflamatorne, antialergijske osobine, doprinosi jačanju zidova kapilara, čime sprečava pojavu modrica. Takođe su poznata njegova vazodilatatorska svojstva, kao i uticaj na smanjenje gubitka gustine kostiju.85-87 16 Uzimajući u obzir biološke efekte hesperidina, značajno je da se razviju jednostavne, precizne i tačne metode za određivanje hesperidina u različitim uzorcima. U literaturi se nalazi nekoliko predloženih metoda koje se koriste za određivanje hesperidina u uzorcima soka od pomorandže, serumu i farmaceutskim preparatima. Za određivanje hesperidina u preparatima koji se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini, razvijena je HPLC metoda sa UV-Vis detektcijom.88 Hesperidin je ovom metodom određivan u koncentracionom opsegu od 15,36 do 122,88 µg cm-3. X. Li i saradnici89 predložili su LC-MS/MS metodu za određivanje hesperidina, narginina i neohesperidina u serumu pacova nakon oralne upotrebe preparata koji se koriste u tradicionalnoj kineskoj medicini: Bulpleurum falcatum L. i Fractus aurantii. Hesperidin se ovom metodom mogao odrediti u koncentracionom opsegu od 2,0 do 50,0 µg dm-3. Adsorptivnom striping voltametrijom90 određivani su rutin i grupa flavonoida među kojima je i hesperidin. Koncentracioni opseg u kom su određivani ovi flavonoidi iznosio je od 1,0 × 10-8 do 1,0 ×10-5 mol dm-3. D. Obendorf i E. Reichart91 razvili su metodu katodne striping voltametrije za određivanje hesperidina. Koncentracioni opseg u kom je bilo moguće odrediti hesperidin iznosio je od 1,64 × 10-7 do 4,1 × 10-5 mol dm-3. Ovom metodom bio je određivan sadržaj hesperidina u fitofarmaceutskom preparatu Helopyrin tablete, proizvođača Rosh & Handel, (Beč, Austrija) i soku od pomorandže. Sadržaj hesperidina u fitofarmaceutskom preparatu Helopyrin tablete, određen je metodom internog standarda i iznosio je 13,6 mg po jednoj tableti, a standardna devijacija ovog određivanja iznosila je 2,96 %. Sadržaj hesperidina u ispitivanim sokovima (analizirane su tri vrste soka) se kretao od 340,3 do 555,3 mg dm-3. Metodom pulsne pertubacije u oscilatornim sistemima, koju su ustanovili N. Pejić i grupa autora92 bilo je moguće odrediti hesperidin u širokom koncentracionom intervalu 7,5 do 599,4 µg cm-3 (odnosno 1,2 × 10-5 do 9,8 × 10-4 mol dm-3). D. Malešev i saradnici40 su spektrofotometrijski ispitivali kompleks aluminijum(III)-hesperidin i predložili jednostavnu spektrofotometrijsku metodu za određivanje hesperidina u sokovima od pomorandže, zasnovanu na merenju apsorbancije ovog kompleksa na λ = 410 nm. Hesperidin se ovom metodom mogao 17 odrediti u koncentracionom opsegu od 2,50 × 10−5 mol dm-3 do 1,75 × 10−4 mol dm-3 (odnosno od 15 do 10,6 mg dm-3). T. Perez-Ruiz i saradnici43 su razvili i validirali spektrofluorimetrijsku metodu za određivanje hesperidina u kori i soku pomorandže koja se zasniva na kompleksiranju hesperidina i aluminijum(III)-jona u micelarnom medijumu (u prisustvu SDSa, odnosno natrijum-dodecilsulfata). Za određivanje sadržaja hesperidina u uzorcima su korišćene manuelne i flow injection procedure, pri čemu je korišćena talasna dužina ekscitacije na 391 nm i emisije na 496 nm. Opseg koncentracija u kom se hesperidin ovom metodom mogao odrediti, je bio između 5,0 × 10-7 i 2,0 × 10-5 mol dm-3 sa granicom detekcije od 79 µg dm-3. 2.1.3.3. Farmakološka svojstva kvercetina Kvercetin (3',3,4',5,7-pentahidroksiflavon), još jedan flavonoid iz grupe flavonola, po strukturi vrlo sličan morinu, pokazuje jaku antioksidativnu i antiinflamatornu aktivnost.93, 94 Upotreba kvercetina u tradicionalnoj medicini u lečenju dijareje i dizenterije poznata je godinama unazad. Antiinflamatorno delovanje postiže se inhibicijom biosinteze metabolita koji nastaju iz proinflamatorne arahidonske kiseline (leukotrieni LT4 i grupa proinflamatornih prostaglandina PG2), ali i u inhibicijom proinflamatornih enzima ciklooksigenaze i lipooksigenaze. Inhibicija oslobađanja histamina uz antialergijsko delovanje ima i antiinflamatorni efekat. Kvercetin je vrlo jak antioksidans, i pokazao je raznovrsno pozitivno delovanje na ljudski organizam, naročito na nivou zaštite ćelijske strukture i krvnih sudova od razornog dejstva slobodnih radikala. Kao i većina bioflavonoida, kvercetin ima i vazodilatatorsku ulogu,95 čime utiče na zaštitu krvnih sudova, jer povećava njihovu elastičnost i samim tim utiče na normalizaciju povišenog krvnog pritiska. Kvercitin smanjuje agregaciju trombocita, smanjuje štetni LDL holesterol tj. njegovu oksidaciju i izaziva širenje krvnih sudova a pokazuje i antioksidativni i antiagregacijski efekat. Kvercetrin inhibira enzim aldoza-reduktazu i zaustavlja napredovanje katarakte kod dijabetičara. Smatra se da je kvercetin najaktivniji od svih flavonoida. Istraživanja ukazuju i na njegovu antiviralnu i antitumorsku aktivnost.96 18 S obzirom da kvercetin predstavlja jedan od najzastupljenijih flavonola i jedan od najsnažnijih antioksidanasa, bilo je važno da se razviju jednostavne, precizne i tačne metode za određivanje kvercetina u različitim uzorcima. U literaturi se nalazi nekoliko predloženih metoda koje se koriste za određivanje kvercetina u uzorcima sokova i plodova od jabuke i paradajza, vinima, čajevima, serumu i farmaceutskim preparatima. N. Pejić i grupa autora97 razvili su jednostavnu spektrofotometrijsku metodu za određivanje kvercetina u prisustvu vitamina C u doziranim oblicima. Beerov zakon se mogao primeniti na koncentracioni opseg od 1,0–12,0 µg cm-3, a granica detekcije kvercetina ovom metodom iznosila je 0,76 µg cm-3. V. Kuntić i saradnici47 predložili su brzu, jednostavnu i tačnu metodu za određivanje kvercetina u farmaceutskim sirovinama i doziranim oblicima. Metoda je bazirana na spektrofotometrijskom određivanju kompleksa formiranog između kvercetina i kalijum-titaniloksalata u 50 % etanolu. Kako se kvercetin uobičajeno nalazi zajedno sa vitaminom C u doziranim oblicima, predložene su dve procedure za određivanje kvercetina: bez i u prisustvu askorbinske kiseline. U obe predložene procedure, Beerov zakon važi u opsegu koncentracija od 0,85 – 16,9 µg cm-3. Granica detekcije, LOD, kvercetina u prisustvu vitamina C je iznosila 0,72 µg cm-3, a bez njegovog prisustva 0,67 µg cm-3. Predložena je HPLC metoda98 za simultano određivanje kvercetina i luteolina u kapsulama, LamiopHlomis rotata (Benth.) Kudo. Granica detekcije luteolina i kvercetina ovom metodom iznosila je 7,5 ng i 16,0 ng respektivno, dok ″recovery″ vrednosti za određivanje luteolina i kvercetina iznose 96,8 % i 92,6 %, respektivno. Za određivanje ukupnog sadržaja polifenola, razvijena je fluorimetrijska metoda koja je zasnovana na senzibilisanoj fluorescenciji kompleksnog jedinjenja koje nastaje u reakciji terbijum(III)-jona i flavonola.55 Predložena metoda za određivanje ukupnog sadržaja polifenola je primenjena za određivanje sadržaja ukupnih polifenola u soku od jabuka, a sadržaj ukupnih polifenola je izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE). Ovaj postupak je opravdan činjenicom da je kvercetin jedan od najzastupljenijih flavonola i jedan od najsnažnijih antioksidanasa, i koji se nalazi u voćnom soku od jabuke. Metoda je pokazala odličnu saglasnost određivanja ukupnog sadržaja polifenola, koji su određivani u odnosu ekvivalent kvercetina (QE), u odnosu na određivanje ukupnog sadržaja polifenola referentnom Folin–Ciocalteu 19 spektrofotometrijskom metodom. Koncentracioni opseg u kom se može odrediti sadržaj polifenola ovom metodom nalazi se u oblasti od 0,01 do 2l µg cm-3, a granica detekcije ovom metodom 0,002 µg cm-3. G. J. Volikakis, C. E. Efstathiou99 razvili su metodu adorptivne striping voltametrije za određivanje sadržaja flavonola (kvercetina, kaempferola, miricetina) u soku od paradajza, vinu i čajevima. Za određivanje sadržaja flavonola u navedenim uzorcima korišćena je flow injection procedura. Linearnost postignuta ovom metodom je iznosila od 3 do 60 µg cm-3, i u ovom slučaju sadržaj flavonola u uzorcima čajeva, sokova i vina izražen je u odnosu ekvivalent kvercetina (QE). 2.2. Aluminijum(III)-jon kao izabrani centralni metalni jon i njegova svojstva Aluminijum se nalazi u IIIa grupi periodnog sistema elemenata. Redni broj aluminijuma je 13, a atomska masa 26,98 g mol-1. Ima mali atomski radijus (57 pm) koji omogućava stabilnost njegovih jedinjenja. Elektronska konfiguracija aluminijuma je 3s2 3p1. Dovođenjem energije dolazi do prelaska jednog s-elektrona u slobodnu p- orbitalu, pri čemu nastaju tri sp2-hibridne orbitale. Zbog toga je aluminijum u svim jedinjenjima u oksidacionom stanju +3, a u vodenim rastvorima ovaj jon postoji kao hidratisan sa šest molekula vode. Sa oksidacionim brojem +3, aluminijum gradi veliki broj jedinjenja jonskog i kovalentnog karaktera. Aluminijum gradi kompleksna jedinjenja sa koordinacionim brojevima +4 i +6 koja sadrže sledeće kompleksne jone: [Al(H 2 O) 3 ]3+, [Al(OH) 6 ]3-, [AlF 6 ]3-, [AlCl 4 ]-, [AlBr 4 ].- i dr. Sa flavonoidima formira kompleksna jedinjenja od kojih neka pokazuju fluorescentna svojstva. Aluminum(III)-jon je još pedesetih godina prošlog veka prepoznat kao kompleksirajući reagens za flavonoide. Poređenjem UV spektara samog flavonoida i kompleksa aluminijum(III)-flavonoid, uočava se da reakcijom aluminijum(III)-jona sa molekulom flavonoida dolazi do pomeranja traka u UV spektrima flavonoida. 20 Utvrđeno je da najčešće nastaju kompleksi sastava AlFlav, AlFlav2 ili Al2Flav, ali mogu se formirati i kompleksi sastava AlFlav3 i Al2Flav3.7, 9, 100 Generalno, najzastupljeniji je tip kompleksa stehiometrijskog sastava aluminijum(III): flavonoid = 1 : 2, odnosno nastajanje kompleksa koji ima opštu formulu [Al(flavonoid-H)2]+, i koji nastaje kod flavonoida koji imaju bar jednu hidroksilnu grupu (C3-OH, C5-OH ili obe) u blizini karbonilne grupe u položaju C4.101 Aluminijum(III)-jon, pored već pomenutih kompleksa aluminijum(III)-morin, aluminijum(III)-hesperidin i aluminijum (III)-kvercetin, gradi komplekse i sa drugim flavonoidima. Spektroskopskom i strukturnom analizom izučavan je aluminijum (III)-5 hidroksiflavon kompleks,102. 103 pri čemu je utvrđeno da nastaje 1:1 kompleks. Sa izokvercetinom, aluminijum(III)-jon formira nekoliko kompleksnih vrsta Al(Iso)2+, Al(Iso)2+, i Al2(Iso)3+.104 Takođe je spektroskopski ispitivan kompleks aluminijum(III)- 3 hidroksiflavon, i utvrđeno da nastaje kompleks sastava Al(3HF)2.105 Sa 5,7- dihidroksi-flavonom gradi se kompleks aluminijum(III)-5,7-dihidroksi-flavon je sastava 1:2.106 Od navedenih aluminijum(III)-flavonoid kompleksa, fluorescenciju pokazuju aluminijum(III)-morin, aluminijum(III)-hesperidin, aluminijum(III)-kvercetin i aluminijum(III)-5 hidroksiflavon kompleksi. Međutim, aluminijum(III)-jon i sa nekim organskim molekulima daje fluorescirajuće komplekse, čime je omogućena detekcija i određivanje datih molekula. Tako aluminijum sa pioverdinom (siderofora koju stvara gram negativna bakterija Pseudomonas fluorescens), formira 1:1 kompleks, koji se može primeniti u toksikološke i analitičke svrhe.107 Reakcija aluminijuma i norfloksacina (antibiotik iz grupe hinolona) u prisustvu SDSa (natrijum dodecilsulfata), u kojoj se formira 1:1 kompleks, iskorišćena je za određivanje norfloksacina u humanom serumu.108 Metoda koja je predložena za određivanje aluminijuma u tragovima (koncentracije reda veličine ng cm-3) u pijaćoj, rečnoj i morskoj vodi zasnovana je na formiranju 1:1 kompleksa aluminijuma i hromotropne kiseline (1,8- dihidroksinaftlen-3,6-disulfonska kiselina).109 Flurescencija kompleksa aluminijum(III)-N,N′-disalicilidene-1,3-diamino-2- hidrooksipropan (sastav 1:2) primenjena je za određivanje aluminijuma u rastvorima za hemodijalizu.110 Spektrofluorimetrijsko određivanje nukleinskih kiselina zasnovano je na njihovom uticaju na intenzitet fluorescencije aluminijum(III)-8-hidroksihinolin 21 kompleksa.111 Za aluminijum se dugo smatralo da je biološki neaktivan, i da se ne apsorbuje iz gastrointestinalnog trakta. Međutim, rezultati studija koje su rađene devedesetih godina dvadesetog veka su pokazali da akumulacija aluminijuma u organizmu može da dovede do patoloških stanja,112, 113 zbog deponovanja u mozgu, pri čemu dolazi do oštećenja funkcije pamćenja, pojave konvulzija, karakteristične promene u EEG-u, pojavu uremije a povezuju ga sa i sa nastankom Alchajmerove bolesti114 i nekih drugih neuroloških oboljenja. Poremećaj u rastu skeleta izazvan je deponovanjem aluminijuma u kostima. Smatra se da prisustvo aluminijuma u organizmu povećava rizik od oboljevanja od raka pluća i pankreasa115 kao i da povećava rizik za pojavu leukemije. Kao posledica dejstva aluminijuma kod radnika koji su u dužem vremenskom periodu bili izloženi ovom dejstvu, uočene su fibroza pluća, odnosno takozvana Šejverova bolest pluća116 i aluminoze praćene pneumotoraksom kod radnika u proizvodnji pirotehničkih sredstava. U drugoj polovini prošlog veka, sprovedena je studija nad pacijentima koji su bili oko tri godine na dijalizi. Uočeno je da kod jednog dela ovih pacijenata dolazi do demineralizacije kostiju. Epidemiološke studije su pokazale da postoji veza između koncentracije aluminijuma u tečnosti za hemodijalizu i njegovog povećanog sadržaja u kostima i mozgu (uočene su pojave encefalopatije ili dijalizne demencije), a smatra se da može biti i uzrok nastanka anemije.117 Prisustvo aluminijum(IIII)-jona u kostima otežava razmenu katjona i anjona koštanog tkiva sa drugim tkivima, što dovodi do usporenog rasta skeleta, a kao posledica nastaju i osteoporoza i osteomalacija. Zbog njegovih toksičnih svojstava, od izuzetnog značaja je kontrolisati kvalitet vode, hrane, farmaceutskih preparata, te su stoga razvijene metode kojima se ovaj metal može odrediti u tragovima u uzorcima hrane, vode, rastvorima koji se koriste za hemodijalizu, peritonalnu dijalizu, rastvorima za hemofiltraciju, rastvorima za totalnu parenteralnu ishranu kao i u biološkim fluidima (humani serum, humana plazma, urin). 22 3. Eksperimentalni deo 3.1. Metode 3.1.1. Spektrofluorimetrija Spektrofluorimetrijska metoda je zasnovana na merenju intenziteta fluorescencije analita u funkciji talasne dužine emitovanog zračenja. Fluorescencija spada u luminiscentne odnosno fotoluminiscentne pojave. Luminiscencija je zajednički naziv za niz fizičkih, hemijskih i biohemijskih procesa koji imaju za posledicu zračenje svetlosti. Luminiscentne pojave su posledica elektronskih prelaza molekula, tako da se pod pojmom luminiscentnog zračenja podrazumeva svetlost koja se emituje u ULJ i VID oblasti spektra. Fluorescencija zajedno sa fosforescencijom predstavlja jednu od najstarijih ustanovljenih spektroskopskih metoda. Može se definisati kao radijacioni prelaz između elektronskih stanja iste multipletnosti. Fluorescentna emisija nastaje prelazom sa osnovnog vibracionog nivoa prvog pobuđenog singletnog stanja molekula na neki (bilo koji) od vibracionih nivoa osnovnog elektronskog stanja, S1(v′ = 0)→ S0 ( v" = 0, 1, 2, 3, ....). Posle akta apsorpcije molekuli se prevode na različite vibracione nivoe nekog od pobuđenih elektronskih stanja što zavisi od vrednosti apsorbovane energije. Veoma brzo posle apsorpcije molekul se “oslobađa” viška vibracione energije nekim od procesa neradijacione dezaktivacije (relaksacije) koji su znatno brži od radijacionih procesa kao što su fluorescencija ili fosforescencija. Koji će proces biti dominantan zavisi od strukture i simetrije molekula kao i spoljašnjih faktora: temperature, agregatnog stanja, prisustva drugih molekula u sistemu i dr. Na slici 3.1. prikazan je dijagram Jablonskog sa svim karakterističnim radijacionim i neradijacionim prelazima između dva elektronska stanja. 23 Slika 3.1. Dijagram Jablonskog U zavisnosti od toga koji fenomen se prati, razlikuju se emisioni i ekscitacioni fotoluminescentni spektri (slika 3.2.). Emisioni spektar predstavlja zavisnost intenziteta fotoluminescentne emisije u funkciji talasne dužine ili frekvencije pri fiksnoj ekscitacionoj talasnoj dužini. Prikazivanjem spektra u zavisnosti od talasne dužine ili frekvencije na istom dijagramu dobiće se dva različita fotoluminescentna profila. Escitacioni spektar predstavlja zavisnost intenziteta fotoluminescentne emisije na konstantnoj talasnoj dužini (obično maksimumu fluorescencije ili fosforescencije) na različitim talasnim dužinama pobuđivačkog zračenja. Spektrofluorimetrijska metoda je zasnovana na fluorescenciji, odnosno pojavi da pri delovanju ultraljubičaste ili vidljive svetlosti na neke molekule dolazi do sekundarne emisije svetlosti veće talasne dužine od pobudne. Emitovana svetlost je karakteristična za supstanciju koja je emituje. Osnovna karakteristika fluorescentnog zračenja je niža frekvencija (manja energija) od frekvencije apsorbovanog zračenja, odnosno veća talasna dužina 24 fluorescentnog zračenja od talasne dužine apsorbovanog zračenja. Struktura i izgled fluorescentnog spektra može da pruži informacije o stanju, jačini veze i stabilnosti molekula u osnovnom stanju. Ekscitacioni i emisioni spektri (prikazani na slici 3.2) su obično takvog izgleda da imaju "ogledalsku simetriju" jedan u odnosu na drugi. Na karakteristike fluorescentnih spektara utiče struktura molekula, koncentracija, efekti okoline (rastvarač, prisustvo molekula drugih rastvoraka, metalnih jona ili kiseonika, pH vrednost sredine, temperatura). Slika 3.2. Shematski prikaz ekscitacionog i emisionog spektra Spektrofluorimetrija se koristi za kvalitativnu analizu, kao i za određivanje supstancija. Prema talasnoj dužini emitovanog talasa, može se izvršiti kvalitativna analiza, dok se kvantitativna analiza zasniva se na linearnoj zavisnosti intenziteta fluorescentne emisije ispitivane supstancije od koncentracije koji je predstavljen jednačinom:118 [ ]LcF fQII τφ−−= 1010 (3.1.) 25 gde IF predstavlja intenzitet fluorescencije, Io intenzitet upadne, ekscitacione, svetlosti, proizvod predstavlja ε Фf senzitivnost fluorofore, sa L je označena debljina sloja supstancije, odnosno dužina optičkog puta svetlosti, a c je koncentracija ispitivane supstancije. U slučaju vrlo razblaženih rastvora, kod kojih je deo apsorbovane svetlosti mali, izraz (3.1.) se može transformisati u izraz: kccLII f =Φ= ε0303,2 (3. 2.) te se može primeniti metoda kalibracione krive. Spektrofluorimetrija je osetljiva metoda jer se fluorescencija manifestuje i pri vrlo niskim koncentracijama, tako da se mogu određivati koncentracije i do 103 puta manje nego spektrofotometrijskim metodama. Ovom metodom se mogu detektovati vrlo niske koncentracije supstancija (∼10−12 mol dm-3), te je ova metoda našla značajnu primenu u biohemijskim, medicinskim i hemijskim istraživanjima. 3.1.2. Tečna hromatografija Tečna hromatografija (LC - liquid chromatography) je osnovna višenamenska separaciona tehnika koja se primenjuje u savremenim istraživanjima. Za razliku od mnogih drugih separacionih tehnika koje nisu pogodne za razdvajanje termički nestabilnih molekula, tečna hromatografija se može uspešno primenitii za razdvajanje većeg broja molekula kao što su polimeri, mali molekuli farmaceutika ili njihovih metabolita, kao i peptida i proteina. Tečna hromatografija je tehnika koja se koristi za separaciju hemijskih vrsta iz rastvora. Komponente rastvora u različitoj meri stupaju u interakciju sa stacionarnom i tečnom mobilnom fazom, te imaju različita vremena zadržavanja na hromatografskoj koloni. Razdvajanje je zasnovano na raspodeli ispitivanih supstanci između dve faze koje se međusobno ne mešaju, od kojih je jedna stacionarna, dok je druga mobilna faza. Ispitivana smeša komponenata je rastvorena u mobilnoj fazi i propušta se kroz kolonu u kojoj se nalazi stacionarna faza. U koloni dolazi do raspodele komponenata smeše između dve faze usled procesa adsorpcije ili procesa raspodele komponenata smeše između dve tečne faze. 26 U zavisnosti od polarnosti stacionarne i mobilne faze, tečna hromatografija se deli na tečnu hromatografiju normalnih faza (stacionarna faza je polarna, a mobilna faza nepolarna, koristi se za analizu polarnih analita) i reverznofaznu tečnu hromatografiju (tečnu hromatografiju reverznih faza kod koje je stacionarna faza je nepolarna, dok je mobilna faza polarna, i koristi se za analizu nepolarnih analita). . Reverznofazna tečna hromatografija (RP-HPLC, Reverse-pHase-high performance liquid chromatography) je razvijena osamdesetih godina dvadesetog veka, i danas predstavlja jednu od najznačajnijih tehnika koja se koristi u modernoj analitičkoj hemiji. Princip razdvajanja ovom tehnikom se zasniva na interakcijama, koje su rezultat odbijajućih sila između polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne faze. Najpolarniji molekuli smeše se eluiraju na početku, odnosno imaju najkraća vremena zadržavanja (retenciona vremena), dok se najmanje polarni molekuli, eluiraju na kraju, odnosno, ostaju najduže zadržani na koloni te stoga imaju velike vrednosti retencionih vremena. Ova tehnika koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu fazu. Stacionarnu fazu predstavlja silikatna porozna površina tretirana sa RMe2SiCl, gdje je R alkilna grupa ugljovodoničnog lanca (npr. C18H37 ili C8H17), te se u praksi upotrebljavaju C4, C8, C18 i C30 kolone. Kao mobilna faza se koriste rastvarači ili smeše rastvarača koji su veoma polarni i najčešće su to vodeni rastvori metanola, acetonitrila i tetrahidrofurana. Vreme zadržavanja (retenciono vreme) komponente analizirane smeše na koloni zavisi, pre svega, od polarnosti same komponente, ali i od eksperimentalnih uslova: sastava mobilne faze, tipa kolone i temperature.119 U RP-HPLC tehnici posebno se mora voditi računa o pH vrednosti mobilne faze, jer ako je pH vrednost preko 7,5, može doći do razgradnje silikatnih čestica stacionarne faze.120 Promenom pH mobilne faze utiče se na brzinu eluiranja komponenti analizirane smeše, jer se na taj način može promeniti polarnost analiziranih hemijskih vrsta. Retenciono vreme komponente smeše je duže za manje polarne supstance, i može se povećati dodatkom polarnih rastvarača u mobilnu fazu, odnosno smanjiti dodatkom 27 hidrofobnih rastvarača. Povećanje temperature dovodi do smanjenja retencionih vremena analiziranih vrsta. Tečna hromatografija povezana s tandemnom spektrometrijom masa, (Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry LC-MS/MS), predstavlja sistem koji omogućava razdvajanje komponenata smeše i njihovu detekciju na osnovu odnosa mase i naelektrisanja (m/z) jona koji nastaju u MS/MS analizatoru. Usled velike moći razdvajanja masa, postiže se velika selektivnost. LC-MS/MS tehnika omogućava brzo i selektivno određivanje velikog broja jedinjenja u biološkim uzorcima. 3.1.3. Ekstrakcija na čvrstoj fazi Ekstrakcija na čvrstoj fazi (Solid-phase extraction- SPE) je separaciona tehnika koja se koristi za izolovanje ispitivanog jedinjenja ili jona, što je potrebno za kvalitativnu i kvantitativnu analizu ciljnog analita. Ovaj tip ekstrakcije omogućava izolovanje analita iz različitih uzoraka čak i veoma složenih matriksa kao što su voda, mleko, urin, krv, tkiva i drugi.120 Ekstrakcija na čvrstoj fazi se danas primenjuje najčešće u pripremi uzoraka radi dalje analize pogodnom analitičkom metodom, što je često HPLC metoda. S obzirom na to da su uzorci iz životne sredine veoma složeni po sastavu i sadrže analite u niskim koncentracijama, nije moguće direktno injektovanje uzorka u hromatografski sistem. Neophodno je takav uzorak pripremiti, tj. izolovati, koncentrovati i prečistiti analit, te je stoga ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE) separaciona tehnika od velikog značaja koja ima za cilj da kvantitativno izoluje analite od kontaminenata, da se analiti koncentrišu u mernom opsegu i da se odredi odgovarajuća forma za analizu. Ekstrakcija na čvrstoj fazi se primenjuje u postupku:  uklanjanja interferirajućih (ometajućih) supstanci i precišćavanja uzoraka,  koncentrisanja analita,  selektivnog razdvajanja jona i  promena matriksa analita uz primenu drugog rastvarača, ako je to potrebno u daljim analizama. Za efikasnu ekstrakciju na čvrstoj fazi od posebnog značaja je definisati uzorak: matriks (medijum iz koga se izvodi ekstrakcija) analit (ispitivani joni ili jedinjenje) 28 interferencije (ometajuća jedinjenja ili joni koji se uklanjaju). Ekstrakcija na čvrstoj fazi zasniva se na izolovanju analita-ispitivanog jedinjenja iz smeše sa drugim komponentama. To se postiže prolaskom uzorka kroz kratku kolonu sa odgovarajućim sorbentom, korišćenjem pritiska ili vakuuma. Postoje dva tipa ekstrakcije, u zavisnosti od namene SPE analize: • uz retenciju ciljnog analita • bez retencije ciljnog analita. Procedura ekstrakcije na čvrstoj fazi prikazana je na slici 3.3. Nakon izbora odgovarajuće SPE kolone, eksperimentalna procedura sastoji se iz četiri faze: 1. kondicioniranje kolone - propuštanje male zapremine odgovarajućeg rastvarača kroz pakovanje kolone u cilju pripreme adsorbensa za adsorpciju analita; 2. nanošenje uzorka - propuštanje uzorka vode kroz kolonu, pri čemu se analit adsorbuje na pakovanju kolone; 3. ispiranje kolone - propuštanje minimalne zapremine odgovarajućeg rastvarača (obično dejonizovane vode sa malim sadržajem organskog rastvarača) kroz kolonu radi uklanjanja polarnih nečistoća i soli iz uzorka vode koja su se zadržala na adsorbensu; 4. eluiranje - propuštanje odgovarajućeg rastvarača u kojem se analit dobro rastvara i desopcija analita sa kolone. Slika 3.3. Procedura ekstrakcije na čvrstoj fazi. Na slici 3.4. je prikazana aparatura potrebna za izvođenje ekstrakcije na čvrstoj fazi koja omogućava istovremenu ekstrakciju iz većeg broja uzoraka. Aparatura se 29 sastoji od staklene kade na kojoj se nalazi izvod sa manometrom za vezivanje vakuum pumpe, koja je često neophodna. Staklena kada se zatvara perforiranim poklopcem na koji se postavljaju kertridži, tj. SPE kolone sa adsorbensima. U kadu se stavlja stalak sa kivetama, koje se nalaze neposredno ispod svakog kertridža i služe za sakupljanje ekstrakta prilikom eluiranja kolona rastvaračem. Slika 3.4. Aparatura za ekstrakciju na čvrstoj fazi. Zahvaljujući jednostavnosti, brzini, efikasnosti i manjoj potrošnji organskih rastvarača, ova tehnika je uzela primat nad klasičnom tečno-tečnom ekstrakcijom. Do zadržavanja analita dolazi tako što se uzorak propušta kroz poroznu čvrstu fazu sa velikim afinitetom prema analitu. Izborom odgovarajućeg rastvarača, analit se kasnije eluira sa čvrste faze. Ograničenja SPE tehnike su unošenje sastojaka matrice uzorka u ekstrakt i upotreba skupih kolona pakovanih čvrstom fazom koje se obično bacaju nakon jedne upotrebe. 30 3.2. Instrumenti i reagensi 3.2.1. Instrumenti 3.2.1.1. Spektrofluorimetar Kao i kod većine instrumenata koji se koriste u drugim spektrofotometrijskim metodama, osnovne komponente spektrofluorimetara su: izvor zračenja, monohromatori, ćelija za uzorak i detektori. U sastav instrumenta koji je prikazan na slici.3.5. ulaze i jedan ekscitacioni i dva emisiona spektrometra. Kao izvor zračenja se koristi ksenonska lampa koja emituje zračenje u relativno širokom opsegu talasnih dužina (i do ultraljubičaste oblasti spektra). Uređaj Fluorolog-3 Model FL3-221 (slika 3.5.) je opremljen sa dve ksenonske lampe – kontinualnom, koja se koristi kod snimanja luminiscentnih spektara u statičkom režimu, i pulsnom, koja se koristi za merenja vremenski razloženih luminescentnih spektara i vremena života radijacionih prelaza. Slika 3.5. Optička shema spektrofluorimetra Fluorolog-3 Model FL3-221 (HORIBA Jobin-Yvon) Zračenje iz izvora se usmerava sistemom sočiva na ekscitacioni filter, koji izdvaja monohromatsko ili zračenje veoma uskog opsega talasnih dužina za pobuđivanje 31 analita. Iz izvora zračenje dospeva u ekscitacioni spektrometar koji ima dva monohromatora vezana u red u cilju dobijanja što kvalitetnijeg pobuđivačkog zračenja. Iz emisionog spektrometra zračenje se usmerava na ćeliju sa uzorkom, koji je u vidu praha presovanog u tabletu. Nosač za uzorak može da se modifikuje i prilagođava tipu uzorka. Fluorescentni spektri dobijeni su merenjem na uređaju Fluorog-3 spektrofluorimetar ( Jobin Yvon Horiba, Paris, France) koji kao izvor polihromatskog zračenja sadrži ksenonsku lampu snage 450 W, a kao fotodetektori emitovanog zračenja se koriste fotomultiplikatorske tube. U zavisnosti od ispitivanog kompleksa, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove podešavne su na 3 nm, i 4nm, ili 5nm i 5nm. Spektri su korigovani na tamnu struju. Pri svakom merenju, usrednjeno je deset prolaza. Sva merenja su obavljena na temperaturi od 25 0C , kontrolisanoj pomoću Peltierovog instrumenta. Korišćene su kvarcne kivete optičkog puta 1,00 cm. 3.2.1.2. Hromatografski sistemi Hromatografska merenja za određivanje morina i kvercetina urađena su na HPLC sistemu (Shimadzu, Japan) koji se satojao od analitičke pumpe LC-20AT, degazera DGU-20A3, injektora 7125 (2 × 10-5 dm3), termostata kolone CTO-20A i foto diodnog detektora SPD-M20A i CBM-20A kontrolora sistema. Analiza dobijenih podataka vršena je softverom LC Solution (Shimadzu). Za određivanje morina korišćena je reverzno fazna kolona RP-18 Thermo-Fisher (USA) Hypersil Gold AQ, dimenzija 150 × 4,6 mm, i prečnikom zrna punila 5,0 µm. Mobilna faza, protoka od 1 cm3 min-1, sadržavala je acetonitril i 0,1% fosfornu kiselinu u odnosu 30:70 v/v %. Zapremina od 2 × 10-5 dm3 uzorka injektovana je u HPLC sistem. Detekcija je vršena na talasnoj dužini od 250 nm. Za određivanje kvercetina korišćena je reverzno fazna AquaGold aQ (150 × 4,6 mm, velicina čestica 5µm) (Thermo, USA) kolona. Mobilna faza je sadržavala vodu (+2% sirćetna kiselina) i acetonitril u odnosu 95:5 (v/v%); protok mobilne faze od 1 cm-3 min-1 na temperaturi od 30 0C. Zapremina od 2 × 10-5 dm3 uzorka je injektovana u HPLC sistem. Detekcija je vršena na talasnoj dužini od 254 nm. Hromatografska merenja za određivanje hesperidina u tabletama vršena su na HPLC sistemu Perkin Elmer PE200 (Norwalk, CT, USA), koji se sastojao od binarne 32 pumpe, autosamplera (injekcione zapremine od 2 × 10-5 dm3), uz korišćenje kolone Gemini C18 (150 × 4,6 mm, 3 µm, Phenomenex, California, USA), sa termostatom kolone i ULJ-VID detektorom. Detekcija je vršena na talasnoj dužini od 280 nm. Eksperimentalni uslovi su bili sledeći: mobilna faza A sastojala se od: 2% sirćetne kiseline, mobilna faza B sadržavala je acetonitril; mešanje ovih faza je vršeno u linearnom gradientu: 0 - 5 min: 85% A, 15% B; 25 - 30 min: 10% A, 90% B; 35 - 40 min: 85% A, 15% B; protok: 0,7 cm3 min-1; injektirana zapremina je iznosila 2 × 10-5 dm3. 3.2.1.3. Uslovi za LC-MS/MS određivanje hesperidina Za određivanje hesperidina LC-MS/MS metodom korišćen je maseni spektrometar 3200 QTRAP MS/MS (Applied Biosystems / MDS Sciex, Foster City, USA) sa sa elektro-sprej i turbo-jon-sprej jonizacijom (ESI - electro spray ionization; TIS - turbo-ion spray). Analiza dobijenih podataka vršena je softverom Analyst TM (PE Sciex). Vrednosti negativne jonizacije su odabrane tako da se prati samo jedan proizvod fragmentacije, tj. vrši se praćenje odabrane reakcije (engl. selected reaction monitoring, SRM) u LC-MS/MS analizi sa periodom prekida od 50 ms. Parametri masenospektrometijskog određivanja su optimizovani tako se postigne najveća SRM osetljivost injektiranjem 100 µg cm-3 standardnih rastvora hesperidina u metanolu upotrebom brizgalica. Optimizirani uslovi pri kojima je vršeno određivanje bili su: temperatura interfejsa 500 0C; TIS napon, -4500 V; curtain gas (He), 10 psi; gas raspršivač (nebulizer) (N2), 40 psi; TIS gas (He), 60 psi; declustering potencjial (DP), - 57 V; ulazni potencijal (EP), -5 V; koliziona energija (CE) -34 eV; izlazni potencijal kolizione ćelije (CXP) -9 V. Korišćeni signal za detekciju i kvantifikaciju hesperidina je bio SRM signal na m/z 609 →325. Maseni spektrometar je bio podešen na jediničnu rezoluciju za oba kvadrupola, Q1 i Q3. 3.2.1.4. pH-metar Za pH-metrijska merenja korišćen je Metler Toledo mp 120 pH-metar sa kombinovanom elektrodom (osetljivosti ±0.01 pH jedinica). Ovaj pH-metar ima radni opseg pH od 0 do 14 pH jedinica. 33 3.2.1.5. Ultrazvučno kupatilo Za ubrzavanje rastvaranja odmerenih masa flavonoida, uzoraka tableta i kapsula korišćeno je ultrazvučno kupatilo Bandelin Sonorex Super, Model RK 512H. 3.2.2. Reagensi i hemikalije Za ispitivanje kompleksa aluminijum(III)–flavonoid (morin, hesperidin ili kvercetin), korišćene su sledeće hemikalije:  Aluminium(III)-nitrat, Fluka AG, Buchs, Nemačka  morin (C15H10O7 Mr = 302,24 g mol−1; CAS number 6472-38-4), Fluka AG, Buchs, Nemačka  hesperidin (C28H34O15; Mr = 610,56 g mol−1; CAS number 520-26-3), Fluka AG, Buchs, Nemačka  kvercetin-dihidrat (C15H10O7 · 2H2O, Mr = 338,27 g mol−1 ; CAS number 6151- 25-3), Fluka AG, Buchs, Nemačka  metanol, Merck, Darmstadt, Nemačka  etanol, Merck, Darmstadt, Nemačka  Natrijum- hidroksid, Merck, Darmstadt, Nemačka  Natrijum-acetat, Merck, Darmstadt, Nemačka  sirćetna kiselina, Merck, Darmstadt, Nemačka  Acetonitril J.T. Baker (Deventer, Holandija) Kao površinski aktivne supstance za proučavanje kompleksa aluminijum(III)- hesperidin korišćene su:  SB 12, n-dodecil sulfobetain (n-dodecyl sulpHobetaine ili 3-(N-hexadecyl-N,N- dimethylammonio)propane sulpHonate), Serva, Nemačka i  SDS, natrijum-dodecilsufat (sodium dodecylsupHate), Sigma Aldrich, Poole, UK Svi upotrebljavani reagensi su bili p.a. čistoće, i korišćeni su bez prečišćavanja. Od komercijalnih preparata korišćeni su: 34  Helopyrin tablete, proizvođača Rosh & Handel, (Beč, Austrija) (jedna tableta sadrži: vitamin C 120 mg, bioflavonoide 20 mg, rutin 15 mg, ekscipiente: mikrokristalna celuloza, metilhidroksipropil celuloza, magnezijum(II)- stearat, skrob). U ovim tabletama je određivan sadržaj hesperidina.  Vitamin C 1500 tablete sa bioflavonoidima (sa rutinom i hesperidinom) proizvođača American Nutrition Products, u kojima je, takođe, određivan sadržaj hesperidina (sadržaj vitamina C u jednoj tableti iznosi 1500 mg, a proizvođač u deklaraciji preparata ne navodi sadržaj bioflavonoida- rutina i hesperidina)  Quercetin + C kapsule proizvođača Twinlab, USA (sadržaj vitamina C i kvercetin-dihidrata standardizovan je za dve kapsule i on iznosi: vitamin C 1400 mg, kvercetin-dihidrat 500 mg, a ekscipienti su: želatin, biljna stearinska kiselina i silicijum-dioksid). U ovim kapsulama je određivan sadržaj kvercetina. Humana plazma i humani serum koji su korišćeni u ovim eksperimentima su dobijeni u laboratoriji Službe za transfuziju Kliničko-bolničkog centra »Dr Dragiša Mišović«, Beograd, Srbija. Sadržaj hesperidina određivan je u sokovima od pomorandže, dok je sadržaj polifenola u odnosu ekvivalent kvercetina (QE) određivan u sokovima od jabuke koji se nalaze na tržištu u Srbiji. 3.3. Generalna procedura 3.3.1. Osnovni rastvori 3.3.1.1. Osnovni rastvor aluminijum(III)-nitrata Osnovni rastvor aluminijum(III)-nitrata (koncentracije 1,0 × 10-3 mol dm-3) je pripremljen rastvaranjem odgovarajuće mase aluminijum(III)-nitrata u bidestilovanoj vodi, uz dodatak odgovarajuće količine nitratne kiseline, kako bi se sprečila hidroliza aluminijum(IIII)-jona. Sadržaj aluminijum(III)-nitrata određivan je gravimetrijski, taloženjem sa amonijakom. 35 3.3.1.2. Osnovni rastvori flavonoida Ispitivani flavonoidi se slabo rastvaraju u vodi (rastvorljivost morina je 1 g u 4 dm3 vode, hesperidina 1 g u 50 dm3 vode, a prema Merck-ovom indeksu kvercetin je praktično nerastvoran u vodi). Kvercetin i morin su rastvorljivi u etanolu i metanolu, dok se hesperidin rastvara u metanolu. Jedan od značajnih parametara jeste sastav rastvarača alkohol-voda, zato što on utiče na intenzitet fluorescencije i rastvorljivost samog liganda, a samim tim i kompleksa. Optimalna vrednost odnosa vode i alkohola je utvrđena u cilju postizanja najpovoljnijih uslova za formiranje kompleksa, ali se moralo voditi računa i o potrebi da takav sastav rastvarača omogući i dobijanje maksimalnih intenziteta fluorescencije. U tu svrhu je određivan sastav rastvarača za svaki od ispitivanih kompleksa. Sastavi rastvarača koji su bili ispitivani za svaki kompleks sadržavali su 30, 50, 70 i 90 (v/v%) metanola, odnosno etanola za kompleks aluminijum(III)–morin. Najpovoljniji odnosi alkohola i vode koji su dobijeni za svaki od kompleksa bili su 70 v/v% metanol za komplekse aluminijum(III)-hesperidin i aluminijum(III)-kvercetin, i 70 v/v% etanol za kompleks aluminijum(III)-morin. Osnovni rastvor morina (koncentracija 1,0 × 10-4 mol dm-3) je pripremljen rastvaranjem odgovarajuće mase morina u 70 % etanolu. Osnovni rastvori hesperidina i kvercetin-dihidrata (koncentracije su iznosile 1,0 × 10-4 mol dm-3) su pripremani rastvaranjem odgovarajuće mase hesperidina, odnosno kvercetin- dihidrata u 70 v/v% metanolu. 3.3.1.3. Osnovni rastvori površinski aktivnih materija Rastvor n-dodecil sulfobetaina odnosno SB 12, koncentracije 0,5 mol dm-3, napravljen je rastvaranjem odmerene mase SB 12 u dejonizovanoj vodi. Takođe, rastvor natrijum-dodecilsulfata (SDS) koncentracije 0,5 mol dm-3 napravljen je rastvaranjem odmerene mase SDS u dejonizovanoj vodi. Svi rastvori su čuvani u frižideru do korišćenja. Sva spektrofluorimetrijska merenja su izvođena u acetatnim puferima odgovarajućih pH vrednosti, koji su bili napravljeni 70 v/v % etanolu, odnosno 70 v/v % metanolu, a u saglasnosti sa procedurama iz literature.122 36 3.3.2. Ispitivanje kompleksa 3.3.2.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa Izmereni su ekscitacioni i emisioni spektri smeše rastvora aluminijum (III)- nitrata i rastvora flavonoida: morina, hesperidina ili kvercetina, a zatim su izmereni ekscitacioni i emisioni spektri rastvora flavonoida. Odnos koncentracija aluminijum(III)-jona i flavonoida u smeši iznosio je 1:50. Ova smeša je pripremana tako da je koncentracija flavonoida bila u velikom višku, odnosno, 50 puta je bila veća od koncentracije aluminijum(III)-jona, da bi se ravnoteža u reakciji nastajanja kompleksa: nm FlMnFlmM ⇔+ (3.3.) maksimalno pomerila udesno, odnosno u smeru nastajanja kompleksa. Koncentracije rastvora flavonoida za koje su snimani ekscitacioni i emisioni spektri bile su iste kao odgovarajuće koncentracije ovih jedinjenja u ispitivanoj smeši aluminijum(III)-nitrata i rastvora flavonoida. Eksperimentalno je utvrđeno da aluminijum(III)-nitrat u opsegu talasnih dužina u kom su ispitivanja vršena (350-650 nm) ne pokazuje fluorescenciju. Kao slepa proba korišćen je 70 v/v % metanol, odnosno 70 v/v % etanol u zavisnosti od kompleksa koji je ispitivan. Kod sva tri flavonoida uočeno je da njihovi alkoholni rastvori pokazuju slabu fluorescenciju. Dodatkom odgovarajuće zapremine rastvora aluminijum(III)-nitrata u rastvore flavonoida, dolazi do intenzivnog porasta intenziteta fluorescencije, što je i očekivano, obzirom da nastaju kompleksi, koji pokazuju intenzivnu fluorescenciju. 3.3.2.2. Određivanje sastava kompleksa Definisanje sastava kompleksnog jedinjenja odnosi se na određivanje broja jona metala i broja molekula liganda u kompleksu. Za određivanje sastava formiranih kompleksa korišćene su metoda molarnih odnosa123 i metoda varijacija ekvimolarnih rastvora, odnosno Žobova metoda.124, 125 37 Metoda molarnih odnosa Ova metoda predstavlja jednu od najjednostavnijih metoda za određivanje sastava kompleksnih jedinjenja. Primenjuje se za određivanje sastava relativno stabilnih kompleksa. Tokom eksperimenta meren je intenzitet fluorescencije serije smeša rastvora u kojima je koncentracija jedne od komponenata konstantna (obično je to koncentracija metala), a koncentracije liganda su manje, jednake i veće od koncentracije jona metala. Slika 3.6. Metoda molarnih odnosa. Krive mogućih zavisnosti promena intenziteta fluorescencije kompleksa različitih stabilnosti od stehiometrijskog odnosa komponenata Merenja su vršena na određenim vrednostima talasnih dužina λex i λem, i odgovarajućih širina otvora za ekscitacione i emisione snopove, a rezultati su prikazani u obliku dijagrama zavisnosti IF = f (cFl /cM), gde je IF- intenzitet fluorescencije smeše (dat u arbitrarnim jedinicama) a cFl /cM predstavlja odnos stehiometrijskih koncentracija liganda (odgovarajućeg flavonoida) i metala (slika 3.6.). U idealnom slučaju, ako se formira samo jedan stabilan kompleks, dobijaju se dve prave sa različitim koeficijentima pravca. Tačka preseka ovih prava, pri interpolaciji na apscisu daje stehiometrijski odnos koncentracija liganda- odgovarajućeg flavonoida i metala u kompleksu. 38 Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora (Žobova metoda) Metoda se zasniva na merenju bilo kog svojstva rastvora, koje linearno zavisi od ravnotežne koncentracije kompleksa u rastvoru, pa su stoga mereni intenziteti fluorescencije serije takvih rastvora, kod kojih je suma stehiometrijskih molarnih koncentracija aluminijuma i flavonoida konstantna. Predstavljanjem zavisnosti intenziteta fluorescencije rastvora (koja linearno zavisi od ravnotežne koncentracije kompleksa) u funkciji od molskog udela liganda- odgovarajućeg flavonoida (ili metala), može se naći odnos stehiometrijskih koncentracija metala i flavonoida u kompleksu. Slika 3.7. Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora (Žobova metoda) Kriva zavisnosti intenziteta fluorescencije kompleksa od molske frakcije liganda Maksimalna koncentracija kompleksa u seriji rastvora dostiže se pri određenoj vrednosti molskog udela liganda (ili metala), xmax , i odgovara maksimumu na krivoj zavisnosti intenziteta fluorescencije rastvora u funkciji molskog udela flavonoida (ili metala), koja je prikazana na slici 3.7. 3.3.3. Reakcija formiranja kompleksa Flavonoidi u kompleksu se mogu naći u molekulskom ili anjonskom obliku. U cilju utvrđivanja oblika flavonoida (jonski ili molekulski) koji je zastupljen u ispitivanom kompleksu primenjen je sledeći postupak: 39 Pripreme se sledeća tri rastvora: rastvor flavonoida u 70 v/v% metanolu, odnosno 70 v/v % etanolu, zatim se pripremi rastvor aluminijum(III)-nitrata u 70 v/v% metanolu, odnosno 70 v/v% etanolu koji ima istu koncentraciju kao i prethodno napravljeni rastvor flavonoida, i na kraju se napravi smeša flavonoida i aluminijum(III)- nitrata u 70 v/v% metanolu, odnosno etanolu, u kojoj su koncentracije flavonoida i aluminijum(III)- jona iste kao i u rastvorima koji sadrže samo flavonoid odnosno aluminijum(III)- nitrat. Merenjem i upoređivanjem pH vrednosti ovih rastvora može se zaključiti da li se reakcija nastajanja kompleksa odvija uz oslobađanje vodonikovog jona, odnosno da li se flavonoid u molekulu kompleksnog jedinjenja nalazi u anjonskom obliku. Za sva tri ispitivana kompleksa izmerena pH vrednost smeše bila je niža od pH vrednosti koje su izmerene za rastvore flavonoida i rastvor aluminijum(III)-nitrata, što je ukazivalo da se flavonoid u molekulu kompleksnog jedinjenja nalazi u anjonskom obliku. 3.3.4.Izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa Za izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti korišćena je Bjerumova metoda126 i jednačine izvedene iz reakcija formiranja kompleksa.41, 127, 128 Na različitim pH vrednostima mereni su intenziteti fluorescencije smeše rastvora aluminijuma i flavonoida u 70 v/v% metanolu (odnosno 70 v/v% etanolu, za kompleks aluminijum (III) –morin) a odnos koncentracija bio je 20:1:3 =+ FlAl cc . Kao slepa proba je korišćen je rastvor flavonoida čija je koncentracija u 70 v/v% metanolu (odnosno 70 v/v% etanolu, za kompleks aluminijum(III)–morin) bila ista kao u smeši. Obzirom da je eksperimentalno utvrđeno da aluminijum u datom opsegu talasnih dužina, u kom su ispitivanja vršena (350-650 nm), ne pokazuje fluorescenciju, korekcija intenziteta flurescencije smeše u odnosu na aluminijum nije bila potrebna. Dobijene su krive zavisnosti If = f (pH), gde vrednosti If odgovaraju intenzitetu fluorescencije kompleksa. Najveća koncentracija kompleksa postoji na maksimumu krive If = f (pH), na kome se može uzeti da je koncentracija kompleksa približno jednaka ukupnoj 40 koncentraciji aluminijuma u smeši, zbog velikog viška liganda- flavonoida, pa je konstanta k* izračunata preko relacije: [ ]03 max + = Al I k f (3.4.) gde If max predstavlja intenzitet fluorescencije kompleksa očitanu sa maksimuma krive If max = f(pH). Reakcija nastajanja kompleksa predstavljena je opštom jednačinom: n nm FlAlnFlmAl −−+ ⇔+ 33 (3.5.), a opšta koncentraciona konstanta stabilnosti kompleksa, koga određuje ravnoteža data relacijom (3.5.), se izračunava prema sledećoj jednačini: β n= [ ] nm n nm FlAl FlAl ][][ 3 − − (3.6.) gde su: ][],[],[ 33 nnAlFlFlAl −−+ ravnotežne koncentracije centralnog jona, disosovanog oblika flavonoida i kompleksa, a βn predstavlja opštu koncentracionu konstantu stabilnosti kompleksa. Na bilo kojoj vrednosti pH određuje se koncetracija kompleksa iz krive If = f(pH), prema sledećoj jednačini: [ ] , 3 k I FlAl fnnm = − (3.7.) gde je If intenzitet flurescencije kompleksa aluminijum(III)-flavonoid na određenoj vrednosti pH, pri čemu If ≠ If max. Ukupne (analitičke) koncentracije flavonoida i aluminijuma predstavljene su sledećim jednačinama: [ ] ][][][ 30 nnm FlAlnFlHFlHFl −− ++= (3.8.) [ ] ][][ 3303 nnm FlAlmAlAl −++ += (3.9.) * kccLII f =Φ= ε0303,2 , gde je I intenzitet fluorescencije, I0 je intenzitet upadne ekscitacione svetlosti, a proizvod ε Фf je senzitivnost fluorofore, i L predstavlja dužinu optičkog puta svetlosti.118 41 gde je sa [HFl]0 prikazana ukupna koncentracija flavonoida a sa 033 ][],[ ++ AlAl date su koncentracije slobodnih jona aluminijuma u rastvoru i ukupna koncentracija aluminijuma, a [HFl] predstavlja ravnotežnu koncentraciju molekulskog oblika flavonoida u smeši. Jednačinom (3.10.) definisana je prva konstanta disocijacije, kd1, flavonoida, koja je potrebna da bi se odredila ravnotežna koncentracija liganda, tj. flavonoida, pri čemu ][HFl predstavlja koncentraciju nedisosovanog oblika flavonoida, a ][ +H predstavlja koncentraciju vodoničnih jona. ][ ]][[ 1 HFl FlHkd −+ = (3.10.) Ukoliko nastaje polidentatni ligand129 (u molekulu kompleksa se nalaze dva ili više centralnih jona metala), pri izračunavanju koncentracije anjonskog oblika moraju se uzeti u obzir i vrednosti viših konstanti disocijacije (druge, treće, itd). Ukupna konstanta disocijacije flavonoida predstavljena je sledećom jednačinom: nN kkkkk ...321 ⋅⋅= (3.11.) Kombinovanjem Bjerumove metode, izraza (3.6.) za opštu koncentracionu konstantu stabilnosti kompleksa, koga određuje ravnoteža data relacijom (3.5.) i jednačina (3.4.)-(3.11.), izračunava se opšta koncentraciona konstanta stabilnosti kompleksa βn. 42 3.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje flavonoida u alkoholno-vodenim rastvorima Za kvantitativno određivanje flavonoida primenjena je metoda kalibracione krive koja je zasnovana na zavisnosti relativnog intenziteta fluorescencije od koncentracije ispitivanih flavonoida. Pripremljena je serija standardnih rastvora koji su sadržavali konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata i koja je u odnosu na koncentracije ispitivanih flavonoida bila u velikom višku (u odnosu na standardni rastvor koji je sadržavao najveću koncentraciju flavonoida, koncentracija aluminijum(III)–jona bila je pet puta veća od koncentracije ispitivanog flavonoida). U standardnim rastvorima varirana je koncentacija flavonoida. Sva spektrofluorimetrijska merenja izvođena su u acetatnim puferima pH vrednosti na kojima je ispitivani kompleks aluminijum(III)-flavonoid (morin, hesperidin, kvercetin) pokazivao maksimalan intenzitet fluorescencije. Puferi su bili pripremljeni u 70 v/v% etanolu odnosno 70 v/v% metanolu, a prema sa procedurama koje se navode u literaturi.122 Kalibracione krive bile su prikazane na talasnim dužinama, λem, gde ispitivani kompleks pokazuje maksimum intenziteta fluorescencije. Kao slepa proba korišćeni su rastvori flavonoida u acetatnim puferima, a koji su sadržavali ekvivalentne koncentracije flavonoida kao i ispitivani standardni rastvor. U oblasti koncentracija flavonoida u kojoj važi relacija (3.2.) bilo je moguće odrediti koncentraciju ispitivanog flavonoida sa odgovarajućom tačnošću. Za svaku kalibracionu krivu određeni su linearnost, opseg, granica detekcije ( limit of detection, LOD) granica kvantifikacije (limit of quantification, LOQ), tačnost i preciznost.130, 131 Linearnost predstavlja mogućnost metode da da rezultate koji su direktno proporcionalni koncentraciji analita u datom opsegu. Linearnost je utvrđivana merenjem zavisnosti intenziteta fluorescencije od koncentracije i procenjivana je na osnovu vrednosti korelacionog koeficijenta, r2. Linearnost je utoliko bolja, ukoliko je vrednost korelacionog koeficijenta, r2, bliži 1. Analitički opseg predstavlja interval između najviše i najniže koncentracije analita, u kome je pokazana preciznost, tačnost i linearnost metode. 43 Granica detekcije (dokazivanja) se definiše kao najmanja koncentracija ispitivanog analita koja se može detektovati određenom metodom pod optimalnim uslovima i izračunava se na osnovu sledećeg izraza: a s LOD b3,3= (3.12.) Granica kvantifikacije (određivanja) je najniža koncentracija analita koja se može meriti u uzorku određenom metodom pod optimalnim uslovima sa prihvatljivom preciznošću i tačnošću, i može se dobiti iz sledeće relacije: a s LOQ b10= (3.13.) U jednačinama 3.12. i 3.13. a je vrednost koeficijenta pravca kalibracione prave, a sb predstavlja vrednost standardne devijacije odsečka. Tačnost je mera egzaktnosti analitičke metode, ili bliskost slaganja između tačne vrednosti ili prihvaćene referentne vrednosti i nađene vrednosti. Dobijeni podaci se prikazuju kao ″recovery″ vrdnosti date u procentima. Preciznost označava bliskost ili slaganje između serije ponovljenih merenja iste veličine uzorka Preciznost analitičke procedure se obično izražava (procenjuje) preko vrednosti S2 ( varijansa ili srenje kvadratno odstupanje), SD (standardna devijacija), KV ili RSD (relativna standardna devijacija izražena u %) u seriji od najmanje 5 ponovljenih merenja. Za svaku kalibracionu pravu prikazana je njena jednačina, koeficijent korelacije, granica detekcije, granica kvantifikacije i analitički opseg. Proveravana je tačnost i preciznost metode tako što su u ispitivanom opsegu koncentracija flavonoida bile izabrane tri različite koncentracije za koje je pripremljeno po pet rastvora. Zatim je svakom rastvoru meren intenzitet fluorescencije i iz jednačine kalibracione prave određena koncentracija. Tako dobijeni rezultati su statistički obrađeni, odnosno za svaku izabranu koncentraciju izračunata je standardna devijacija određivanja koncentracije i određene su ″recovery″ vrednosti. 44 3.4.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u 70 % v/v etanolu Pripremljeni su standardni rastvori za određivanje koncentracije morina primenom metode kalibracione krive. Ovi rastvori su sadržavali konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata koja je iznosila 5,0 × 10-7 mol dm-3, a interval radnih koncentracija morina bio je 5,0 × 10-9- 1,0 ×10-7 mol dm-3 (odnosno 1,5 – 30,2 ng cm-3). Rastvori su bili pripremljeni u acetatnom puferu u 70 % v/v rastvoru etanol-voda, pH = 4,40. Mereni su intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex= 410 nm i λem = 500 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 3 nm i 4 nm, respektivno). Kao slepa proba korišćeni su rastvori morina u acetatnim puferima u 70 % v/v etanolu, a koji su sadržavali ekvivalentne koncentracije morina kao i ispitivani standardni rastvor. 3.4.2. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 % v/v metanolu Pripremljeni su standardni rastvori za određivanje koncentracije hesperidina primenom metode kalibracione krive. Ovi rastvori su sadržavali konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata koja je iznosila 5,0 × 10-7 mol dm-3, a interval radnih koncentracija morina bio je 1,0 × 10-7- 3,0 × 10-5 mol dm-3 (odnosno 0,06 – 18,00 µg cm-3). Rastvori su bili napravljeni u acetatnom puferu u 70% v/v rastvoru metanol- voda, pH = 5,50. Mereni su intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex = 390 nm i λem = 490 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Kao slepa proba korišćeni su rastvori hesperidina u acetatnim puferima u 70 % v/v metanola, a koji su sadržavali ekvivalentne koncentracije hesperidina kao i ispitivani standardni rastvor. 45 3.4.3. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 % v/v metanolu u prisustvu površinski aktivne materije SB 12 (n- dodecil sulfobetaina) Za određivanje hesperidina u prisustvu površinski aktivnog SB 12 (n-dodecil sulfobetaina), takođe su pripremljeni standardni rastvori i primenjena metoda kalibracione krive. Ovi rastvori su sadržavali konstantnu koncentraciju aluminijum(III)- nitrata koja je iznosila 5,0 × 10-7 mol dm-3, a interval radnih koncentracija hesperidina bio je 1,0 × 10-7- 4,0 × 10-5 mol dm-3 (odnosno 0,06 – 24,00 µg cm-3). Rastvori su bili pripremljeni u acetatnom puferu u 70% v/v metanolu, pH = 4,58. Svi standardni rastvori su sadržavali konstantnu koncentraciju SB 12, c = 7,5 ×10-3 mol dm-3. Mereni su intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex = 390 nm i λem = 476 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Kao slepa proba korišćeni su rastvori hesperidina u prisustvu SB 12 u acetatnim puferima 70% v/v metanolu, a koji su sadržavali ekvivalentne koncentracije hesperidina kao i ispitivani standardni rastvor. 3.4.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u 70 % v/v metanolu Kvercetin je određivan spektrofluorimetrijski primenom metode kalibracione krive. Pripremljeni standardni rastvori sadržavali su konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata od iznosila 5,0×10-7 mol dm-3, a opseg radnih koncentracija kvercetina bio je 5,0× 10-9- 2×10-7 mol dm-3 (odnosno 1,5 – 30,2 ng cm-3). Rastvori su bili pripremljeni u acetatnom puferu u 70% v/v metanolu, pH = 3,30. Mereni su intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex= 420 nm i λem = 480 nm, otvori za ekscitacione i emisione snopove su bili 5 nm i 5 nm, respektivno). Kao slepa proba korišćeni su rastvori kvercetina u acetatnim puferima u 70% v/v metanolu, a koji su sadržavali ekvivalentne koncentracije kvercetina kao i ispitivani standardni rastvor. 46 3.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje flavonoida u različitim uzorcima 3.5.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u uzorcima humanog seruma Za određivanje morina u uzorcima humanog seruma primenjena je metoda kalibracione krive zasnovana na zavisnosti relativnog intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od koncentracije morina. Standardni rastvori za ovu kalibracionu pravu prripremljeni su tako što je napravljena smeša od 0,2 cm3 humanog seruma i 8,8 cm3 acetatnog pufera (pripremljenog u 70 v/v % etanolu) pH = 4,40, u odmernom sudu od 10 cm3. Ovako napravljenom rastvoru dodate su odgovarajuće zapremine osnovnog rastvora morina tako da se dobije serija standardnih rastvora morina u opsegu koncentracija 1,5–30,5 ng cm-3. Posle inkubacije na 37 0C u trajanju od 30 min, u ovu smešu se doda 0,5 cm3 rastvora aluminijum(III)-nitrata koncentracije 1×10–3 mol dm-3. Mereni su intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex= 410 nm i λem = 500 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 3 nm i 4 nm, respektivno). Slepa proba je pripremljena prema prethodno datoj proceduri za pripremu standardnih rastvora. Ovaj rastvor je sadržavao odgovarajuću zapreminu humanog seruma u acetatnom puferu pH = 4,40. Za kalibracionu krivu za određivanje morina u humanom serumu, data je njena jednačina, koeficijent korelacije, granica detekcije, granica kvantifikacije i analitički opseg koncentracija. Proveravana je tačnost i preciznost metode u ispitivanom opsegu koncentracija morina za tri različite koncentracije. 3.5.2. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme Za određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme primenjena je metoda kalibracione krive zasnovana na zavisnosti relativnog intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od koncentracije hesperidina. Standardni rastvori za ovu kalibracionu pravu pripremljeni su tako što je uzeto 0,2 cm3 humane plazme 0,35 cm3 rastvora SB 12 koncentracije 0,5 mol dm-3 i različite zapremine osnovnog rastvora 47 hesperidina, tako da se mešanjem sa odgovarajućom zapreminom acetatnog pufera pH= 4,58 (pripremljenog u 70 v/v % metanolu) u odmernom sudu zapremine 10 cm3 dobiju koncentracije hesperidina u opsegu od 0,1–12,2 µg cm-3. Posle inkubacije na 37 0C (30 min), u ovu smešu se doda 0,5 cm3 rasatvora aluminijum(III)-nitrata koncentracije 1×10–3 mol dm-3. Potom su mereni intenziteti fluorescencije ovako pripremljenih rastvora (λex = 390 nm i λem = 476 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Rastvor koji je korišćen kao slepa proba pripremljen je prema prethodno datoj proceduri. Slepa proba je sadržavala odgovarajuću zapreminu humane plazme sa dodatkom SB 12 u acetatnom puferu pH = 4,58. Za kalibracionu krivu za određivanje hesperidina u humanoj plazmi, prikazana je njena jednačina, koeficijent korelacije, granica detekcije, granica kvantifikacije i analitički opseg koncentracija. Proveravana je tačnost i preciznost metode u ispitivanom opsegu koncentracija hesperidina za tri različite koncentracije. 3.5.3. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u tabletama Za određivanje hesperidina u tabletama primenjena je sledeća procedura: na analitičkoj vagi je izmereno pojedinačno 10 tableta i izračunata je srednja vrednost mase tablete. Zatim su tablete sprašene u tarioniku do praškaste usitnjenosti. Odmerena je količina koja odgovara srednjoj vrednosti mase jedne tablete, i rastvorena u 100 cm3 70 v/v % metanola, a rastvor je mešan 15 minuta u ultrazvučnom kupatilu na temperaturi 25 0C i filtriran kroz Millipore membrane filter sa veličinom pora 0,45 µm. Od ovako pripremljenog rastvora u odmerni sud od 10 cm3 odmereno je 0,25 cm3, kome je dodato 0,35 cm3 0,5 mol dm-3 rastvora SB 12, i 0,5 cm3 rastvora aluminijum(III)-nitrata koncentracije1×10–3 mol dm-3. Odmerni sud je dopunjen do marke acetatnim puferom pH = 4,58, koji je pripremljen u 70 % v/v metanolu. Ovako pripremljenom rastvoru izmeren je intenzitet fluorescencije pri odgovarajućim eksperimentalnim uslovima (λex = 390 nm i λem = 476 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su 5 nm). Iz jednačine kalibracione prave određena je koncentracija hesperidina u tabletama. Za statističku obradu dobijenih rezultata, bilo je potrebno uraditi 10 merenja. Tačnost metode data je preko ″recovery″ vrednosti, izražene u %, koja predstavlja odnos nađene i deklarisane mase aktivne supstance (hesperidina) pomnožene sa 100. 48 3.5.4. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u soku od pomorandže Za određivanje sadržaja hesperidina u soku od pomorandže primenjen je sledeći postupak: zapremini od 2 cm3 ispitivanog soka od pomorandže dodato je 5,5 cm3 acetatnog pufera pripremljenog u 70 % v/v metanolu, pH = 5,40, a potom je rastvor centrifugiran 10 minuta na 900 obrtaja. Supernatant* se filtrira kroz filter papir Whatman No. 1. Zapremini od 5 cm3 supernatanta je dodato 0,25 cm3 rastvora aluminijum (III)-nitrata koncentracije 1×10–3 mol dm-3 a zatim je 1 cm3 ove smeše razblažen sa 9 cm3 acetatnog pufera pH = 5,40. Ovako pripremljenom rastvoru izmeren je intenzitet fluorescencije pri odgovarajućim eksperimentalnim uslovima (λex = 390 nm i λem = 490 nm i otvori za ekscitacione i emisione snopove su bili 5 nm). Iz jednačine kalibracione prave (bez prisustva površinski aktivnog SB 12) određen je sadržaj hesperidina u soku.** 3.5.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u kapsulama Za određivanje kvercetina u kapsulama primenjen je sličan postupak kao kod određivanja hesperidina u tabletama. Na analitičkoj vagi je izmeren pojedinačno sadržaj 10 kapsula i izračunata srednja vrednost mase sadržaja kapsule. Zatim je sadržaj kapsula sprašen u tarioniku do praškaste usitnjenosti. Potom je odmerena količina koja odgovara srednjoj vrednosti mase sadržaja jedne kapsule, i rastvorena u 100 cm3 70 v/v % metanola i mešana 15 minuta u ultrazvučnom kupatilu na temperaturi 25 0C. Dobijeni rastvor je filtriran kroz Millipore membrane filter sa veličinom pora od 0,45 µm. Od ovako pripremljenog rastvora u odmerni sud od 10 cm3 odmereno je 0,25 cm3, kome je dodato 0,5 cm3 rastvora aluminijum(III)-nitrata koncentracije1×10–3 mol dm-3. * Supernatant predstavlja tečnost koja se nalazi iznad taloga nakon centrifugiranja ** Određivanje sadržaja flavonona koristi se za kontrolisanje kvaliteta u proizvodnji sokova. Tako, visoke vrednosti koncentracije hesperidina u soku navode na zaključak da se tokom procesa proizvodnje sokova koristio ceo plod, bez odstranjivanja kore, dok znatno manji sadržaj hesperidina ukazuju da je za dobijanje soka korišćen samo unutrašnji deo ploda, što je u skladu sa propisima. Sadržaj hesperidina u soku od pomorandže, određen je prema posebnim Zahtevima koji definišu kvalitet citrusnih sokova- dati u Code of Practice for evaluation of quality and authenticity of fruit and vegetable juices, od strane AIJN - European Fruit Juice Association.132 49 Odmerni sud je dopunjen do marke acetatnim puferom pH = 3,30 koji je pripremljen u 70 % v/v metanolu. Ovako pripremljenom rastvoru izmeren je intenzitet fluorescencije pri odgovarajućim eksperimentalnim uslovima (λex = 420 nm i λem = 480 nm i širina otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Iz jednačine kalibracione prave određena je koncentracija kvercetina u kapsulama. Za statističku obradu dobijenih rezultata, bilo je potrebno uraditi 10 merenja. Tačnost metode data je preko ″recovery″ vrednosti, izražene u %. 3.5.6. Spektrofluorimetrijsko određivanje polifenola u soku od jabuke Ukupni sadržaj polifenola u različitim uzorcima sokova od jabuke, koji se nalaze na tržištu u Srbiji, je izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE- quercetin equivalent).133 Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje ukupnog sadržaja polifenola bazirana na fluorescenciji kompleksa aluminijum(III)-kvercetin, je primenjena za određivanje sadržaja ukupnih polifenola u soku od jabuka, a sadržaj ukupnih polifenola je izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE). Ovaj postupak je opravdan činjenicom da je kvercetin jedan od najzastupljenijih flavonola i jedan od najsnažnijih antioksidanasa, koji se nalazi u voćnom soku od jabuke. Osim toga što je najzastupljeniji flavonol u sokovima od jabuke, kvercetin predstavlja i najzastupljeniji flavonol u napicima kao što su vina, čajevi, sokovi od paradajza.3 Za određivanje sadržaja polifenola u soku od jabuke primenjen je sledeći postupak: u odmerni sud od 10 cm3 je odmerena zapremina od 0,05 cm3 ispitivanog soka od jabuke, kojoj je dodato 0,1 cm3 rastvora aluminijum(III)-nitrata koncentracije 1×10–5 mol dm-3 a zatim je odmerni sud dopunjen acetatnim puferom pH = 3,30, pripremljenim u 70 % v/v metanolu. Ovako pripremljenom rastvoru izmeren je intenzitet fluorescencije pri odgovarajućim eksperimentalnim uslovima (λex = 420 nm i λem = 480 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Iz jednačine kalibracione krive određen je sadržaj kvercetina, a sadržaj polifenola u soku je izražen preko vrednosti ekvivalenta kvercetina (QE). 50 3.6. Procedure za određivanje flavonoida referentnim metodama 3.6.1. HPLC određivanje morina Da bi se proverila pouzdanost predložene spektrofluorimetrijske metode za određivanje morina u humanom serumu, kao referentna metoda razvijena je i modifikovana HPLC metoda za njegovo određivanje.134 Za određivanje sadržaja morina u rastvorima etanol-voda i humanom serumu, korišćena je metoda kalibracione krive, pri čemu su dobijene dve kalibracione krive, po jedna kriva za svaku sredinu. Procedura za pripremu standardnih rastvora za određivanje morina u rastvorima etanol-voda metodom kalibracione krive Od osnovnog rastvora morina u 70 v/v% etanolu pripremljeni su standardni rastvori za kalibracionu krivu koncentracija 1,6; 6,4; 25,0; 50,0; 100,0 i 200,0 µg cm-3. Standardni rastvori su bez prethodne pripreme injektirani u kolonu. Procedura za pripremu rastvora za određivanje morina u humanom serumu Pripremljeno je šest standardnih rastvora za kalibracionu krivu koji su sadržavali 2 × 10-4 dm3 čistog seruma, 1 × 10-4 dm3 acetatnog pufera (pH = 4,50) i morin u koncentraciomom opsegu od 1,0 do 200 µg cm-3. Rastvori su inkubirani na temperaturi od 37 0C u trajanju od 30 minuta, intenzivno su mućkani i zatim je svakom od njih dodata smeša etra i acetona (90:10 v/v %). Tako dobijeni rastvori su ponovo mešani u šejkeru. Etarski sloj je isparen u atmosferi azota, a ostatak je rastvoren u mobilnoj fazi. 3.6.2. HPLC i maseno - spektrometrijsko određivanje hesperidina Da bi se proverila pouzdanost predložene spektrofluorimetrijske metode, kao referentna metoda je razvijena je i modifikovana direktna HPLC metoda135 za određivanje hesperidina i to u uzorcima humane plazme LC–MS/MS metoda i HPLC/UV metoda za određivanje sadržaja hesperidina u tabletama. 51 Za određivanje sadržaja hesperidina u metanolno-vodenim rastvorima i u humanoj plazmi, korišćena je metoda kalibracione krive, pri čemu su dobijene dve kalibracione krive, po jedna kriva za svaku sredinu (u metanolno-vodenim rastvorima, i u metanolno-vodenoj sredini u prisustvu humane plazme). Priprema rastvora za HPLC i maseno - spektrometrijsko određivanje hesperidina Osnovni rastvor hesperidina (koncentracije 1,0226 mg cm-3) pripremljen je u metanolu. Serija standardnih rastvora hesperidina u koncentracionom opsegu: 0,02– 12,2 µg cm-3 je pripremljena razblaživanjem osnovnog rastvora hesperidina metanolom. Ekstrakcija hesperidina iz uzoraka humane plazme na čvrstoj fazi (SPE) Hesperidin je ekstrahovan iz uzoraka humane plazme upotrebom LC-18 (500 mg) Supelco kertridža. Kertridži su bili prekondicionirani sa 5 cm3 metanola a zatim 5 cm3 ultračiste vode ( Milli-Q). Nakon toga je 5 cm3 uzorka propušteno kroz kertridž sa protokom od 0,5 cm3 min–1. Nakon propuštanja uzorka, SPE kertridž je ispran sa 5 cm3 ultračiste vode (Milli-Q ), a zatim je sušen na vakuumu 10 minuta. Na kraju, uzorak je eluiran sa 2,5 cm3 metanola. Uzorci humane plazme su termostatirani na 25 0C, i nakon opterećivanja sa hesperidinom bili su podvrgnuti precipitaciji proteina i tečno–tečnoj ekstrakciji. U levak za odvajanje unet je 1,0 cm3 humane plazme kojoj je dodato 0,5 cm3 metanola ili standardnog rastvora hesperidina. Zatim je dodat 1,0 cm3 2-propanola da bi se istaložili proteini. Ova smeša, nakon intenzivnog mešanja koje je trajalo 1 minut, centrifugirana je na 10000 obrtaja, u trajanju od 10 minuta. Gornji bistri sloj rastvora je odvojen i dodato mu je 0,5 cm3 vode i 0,5 cm3 zasićenog rastvora kalijum hlorida. Nakon mešanja u trajanju 15 s, dodato je 5 cm3 etil-acetata i uzorak je intenzivno mešan 1 minut, a zatim mućkan 10 minuta. Nakon centrifugiranja na 3500 obrtaja koje je trajalo 5 minuta, gornji, organski sloj je prebačen u drugi levak za odvajanje i isparen u atmosferi azota na 40 0C. Ostatak je rastvoren u 1 cm3 metanola, a potom je 20 × 10-6 dm3 ovog rastvora injektirano je u HPLC – MS/MS sistem.136 Ekstrakt je prvo injektovan u Gemini kolonu u HPLC/UV sistem sa gradijentnim eluiranjem i UV detekcijom. Dobijeni rezultati potvrdili su da se u ovako pripremljenom uzorku nalazi 52 isključivo hesperidin bez drugih, interferirajućih supstanci u ekstraktu. Kvantitativno određivanje se vrši injektiranjem 20 × 10-6 dm3 ekstrata u MS sistem upotrebom autosamplera HPLC sistema koji je povezan sa hromatografskom kolonom. 3.6.3. HPLC određivanje kvercetina Da bi se proverila pouzdanost predložene spektrofluorimetrijske metode, kao referentna metoda razvijena je RP-HPLC/UV metoda za određivanje sadržaja kvercetina u tabletama. Za pripremanje osnovnog rastvora kvercetina na analitickoj vagi je odmereno 13,9 mg standarda kvercetin dihidrata, a zatim je odmerena količina preneta u odmerni sud od 25 cm3 kojoj je dodata zapremina od 10 cm3 metanola. Ova smeša je ostavljena u ultrazvučnom kupatilu 15 min, nakon čega je odmerni sud dopunjen metanolom do 25 cm3. Koncentracija kvercetina u pripremljenom rastvoru je iznosila 0,5560 mg cm-3. Od osnovnog metanolnog rastvora kvercetina pripremljeni su standardni rastvori za kalibracionu krivu koncentracije 1,6; 6,4; 25,0; 50,0; 100,0 i 200,0 µg cm-3. Standardni rastvori su bez prethodne pripreme injektirani u kolonu. Priprema uzorka kapsula Deset kapsula je izmereno na analitičkoj vagi, a zatim je određena prosečna masa kapsule koja je iznosila 1,1365 g. Kapsule su zatim fino sprašene u avanu sa tučkom. Nakon homogenizovanja, odmerena je masa od 1,1365 g, koja je preneta u odmerni sud od 50 cm3. Ovoj količini uzorka je dodata zapremina od 30 cm3 metanola. Rastvaranje uzorka je vršeno u ultrazvučnom kupatilu 15 min. Od ovako pripremljenog rastvora odmerena je zapremina od 1 cm3 i preneta u odmerni sud od 10 cm3, pri čemu je sud dopunjen metanolom do crte. Od ovako pripremljenog rastvora injektirana je zapremina od 20 × 10-6 dm3 uzorka u kolonu. 53 4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1. Kompleks aluminijum(III)- morin 4.1.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- morin Aluminijum(III)-jon i morin grade kompleks intenzivne žuto-zelene boje u rastvoru etanol-voda, koji je stabilan u pH oblasti od 3,0 do 6,0. Na slici 4.1.1. prikazani su ekscitacioni spektri morina (kriva 2′), kompleksa aluminijum(III)–morin (kriva 1′) i emisioni spektri morina (kriva 2), kompleksa aluminijum(III)–morin (kriva 1). Ekscitacioni maksimum kompleksa nalazi se na λex = 410 nm, a emisioni maksimum na λem = 500 nm. Fluorescencija rastvora morina (c = 2,0 ×10–7mol dm-3), koji sam pokazuje relativno nizak intenzitet fluorescencije na λem = 490 nm, intenzivno raste postepenim dodavanjem rastvora aluminijum(III)-nitrata. 300 350 400 450 500 550 600 0 200000 400000 22' 11' In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . λ / nm Slika 4.1.1. Eksitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- morin (1, 1′) i morina (2, 2′) 54 To je očekivano, s obzirom da dolazi do formiranja kompleksa aluminijum(III) –morin, koji pokazuje intenzivnu fluorescenciju na λem = 500 nm, i čiji se emisioni maksimum batohromno pomera za 10 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog morina. Na slici 4.1.2. prikazani su emisioni spektri rastvora morina koncentracije c = 2,0×10–7mol dm-3, izmereni na λex = 410 nm, koji sadrže različite koncentracije aluminijum(III)-nitrata u koncentracionom opsegu 5,0×10–9 mol dm-3 do 1,0×10–7mol dm-3. Slika 4.1.2. Eemisioni spektri kompleksa aluminijum(III)–morin (cmor = const = 2,0× 10–7mol dm-3 i cAl (III) = 5,0× 10–9 mol dm-3 do 1,0 × 10–7 mol dm-3; λex = 410 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 3 nm i 4 nm, respektivno) 55 4.1.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-morin Aluminijum(III)-jon i morin grade kompleks sastava Aluminijum(III): morin = 1 : 2. Sastav kompleksa je određen metodom molarnih odnosa, merenjem intenziteta fluorescencije rastvora koji sadrže konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata (c = 1,0 × 10-8 mol dm-3) i različite koncentracije morina (5,0 × 10–9 do 2,0 × 10–7 mol dm-3). Merenja su izvršena na λex = 410 nm i λem= 500 nm u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v% etanolu, na pH = 4,40. Širine otvora za ekscitacione i emisione snopove podešene su na 4 nm i 3 nm, respektivno. Kao slepa proba korišćen je rastvor aluminijum(III)-nitrata koncentracije 1,0 × 10-8 mol dm-3, pripremljen u acetatnom puferu (u 70 v/v% etanolu) pH = 4,40. Predstavljanjem zavisnosti intenziteta fluorescencije ovih rastvora u funkciji odnosa koncentracija morina i aluminijum(III)- jona, dobija se eksponencijalna zavisnost koju karakteriše prelomna tačka na određenoj vrednosti molskih odnosa komponenata (slika 4.1.3.). Presek tangenti, koje se povlače na pravolinijske delove krive, daje odnos koncentacija morina i aluminijum(III)-jona u formiranom kompleksu. Sa slike 4.1.3. dobija se odnos =+3/ Almorc 2, što ukazuje da se gradi kompleks sastava aluminijum(III):morin =1:2. 56 0 5 10 15 20 0 2000 4000 6000 8000 10000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . cmor/cAl3+ Slika 4.1.3. Metoda molarnih odnosa. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od odnosa koncentracija morina i aluminijum(III)-jona, +3/ Almor cc ; λex = 410 nm i λem= 500 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su iznosile 3 nm i 4 nm, respektivno Metodom varijacija ekvimolarnih rastvora takođe je određen sastav ovog kompleksa. Izmereni su intenziteti fluorescencije serije rastvora, koja je dobijena mešanjem ekvimolarnih rastvora aluminijum(III)-nitrata i morina, čije su koncentracije iznosile 1,0 × 10-7 mol dm-3. Sva merenja su izvršena na λex = 410 nm i λem= 500 nm u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v% etanolu čija je pH vrednost iznosila 4,40. Otvori za ekscitacione i emisione snopove podešeni su na 4 nm i 3 nm, respektivno. Slepa proba za svaki rastvor ove serije bila je različita, i sadržavala je ekvimolarnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v% etanolu, pH = 4,40 za svaki rastvor pojedinačno. Molski udeo aluminijum(III)-jona kretao se od 0,2 do 0,8; koncentracija aluminijum(III)-jona se nalazila u opsegu od 2,0 × 10-8 mol dm-3 do 8,0 × 10-8 mol dm-3. Zavisnost intenziteta 57 fluorescencije rastvora od molskog udela aluminijum(III)-jona prikazana je krivom na slici 4.1.4. 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 0 1000 2000 3000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . xmor 4.1.4. Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od molske frakcije morina, morx . (λex = 410 nm i λem= 500 nm širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su 3 nm i 4 nm, respektivno) Dobijena kriva ima maksimum na =Morx 0,67 što potvrđuje formiranje kompleksa sastava aluminijum(III): morin =1:2. Obe metode kojima je određivan sastav kompleksa aluminijum(III)-morin potvrdile su da nastaje kompleks sastava AlMor2+. Na dijagramu zavisnosti intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od molske frakcije morina (metoda varijacija ekvimolarnih rastvora) pored maksimuma na =Alx 0,33, uočava se prevoj (″rame″) na =Alx 0,5, što ukazuje na to, da pored preovlađujuće kompleksne vrste 58 AlMor2+, nastaje i kompleks AlMor2+. Može se zaključiti da se formiranje kompleksa sastava AlMor2+ odvija u dva stupnja, odnosno preko nastajanja AlMor2+: +−+ +−+ ⇔+ ⇔+ 2 2 23 AlMorMorAlMor AlMorMorAl (4.1) Postojanje male koncentracije kompleksne vrste AlMor2+ moguće je objasniti na taj način što je koncentracija anjonskog oblika liganda, kao slabe kiseline, na pH vrednosti na kojoj su vršena merenja, mala.129 Verovatno je da bi postojala samo jedna kompleksna vrsta sastava AlMor2+ da su ispitivanja vršena na većim pH vrednostima (pH > 5), ali s obzirom da je intenzitet fluorscencije kompleksa najveći oko pH vrednosti na kojoj su vršena ispitivanja, rad na višim pH-vrednostima nije svrsishodan. Prema podacima dostupnim iz literature, uočava se da stehiometrijski sastav aluminijum(III)-morin kompleksa zavisi od sredine u kojoj se formira kompleks, odnosno od pH vrednosti i vrste rastvarača. B. A. Browne i saradnici137 ispitivali su aluminijum(III)-morin kompleks u vodenim rastvorima i utvrdili su da nastaju tri kompleksne vrste: Al(III) : morin = 1:1; 1:2 i/ili 1:3. Pokazano je da se u kiselim rastvorima u kojima koncentracija morina ne prelazi vrednost od 1 µmol dm-3, formira kompleks sastava1:1. Porastom pH vrednosti rastvora kao i koncentracije morina, u rastvoru će nastati i druge dve kompleksne vrste: AlMor2+ i AlMor3. A. Gutierrez i M. Gehlen,33 su utvrdili metodom molarnih odnosa, da u reakciji morina sa aluminijum(III)-jonom nastaju dve kompleksne vrste: u metanolu nastaje kompleks sastava Al(III) : morin = 1 : 1, a u metanolu kome je dodata nitratna kiselina nastaje kompleks Al(III) : morin = 1 : 2. Septhum i saradnici138 su utvrdili metodom molarnih odnosa da u vodenim rastvorima, bez podešavanja pH, nastaje kompleksna vrsta Al3Mor2, a u acetatnom puferu, u vodenoj sredini nastaje kompleks sastava AlMor2+. 59 4.1.3. Reakcija formiranja kompleksa Izvršena su merenja pH ekvimolarnih rastvora morina i aluminijum(III)-nitrata u 70% v/v etanolu, a zatim je meren i pH rastvora koji je sadržavao aluminijum(III)-jon i morin u koncentaciji koja je bila ista kao i njihova koncentracija u posebnim rastvorima. Rezultati su prikazani u Tabeli 4.1.1. Tabela 4.1.1. Rezultati pH-metrijskih merenja ekvimolarnih rastvora morina, Al(NO3)3 i njihove smeše u 70% v/v etanolu Morin, c= 1×10-7mol dm-3 Al(NO3)3, c= 1×10-7 mol dm-3 Smeša pH 6,35 6,72 4,16 +Hc 4,47×10-7 mol dm-3 1,91×10-7 mol dm-3 6,92×10-5 mol dm-3 +Σ Hc smc 6,38 × 10 -7 mol dm-3 6,92 ×10-5 mol dm-3 ++ Σ−=∆ HsmH ccc 6,856×10 -5 mol dm-3 Niže vrednosti pH smeše pokazuju da se reakcija odvija uz oslobađanje vodonikovih jona, odnosno da morin učestvuje u reakciji građenja kompleksa u anjonskom obliku. Na višim pH vrednostima (pH >5,0), smanjuje se koncentracija kompleksne vrste u rastvoru, što može biti posledica hidrolize kompleksa. Reakcija formiranja kompleksa morina i aluminijum(III)-jona može se prikazati jednačinom (4.2.) a struktura kompleksa Shemom 2: [ ] +++ +→+ HOHCAlHOHCAl 2)(2 2791579153 (4.2) Porast intenziteta fluorescencije, nakon heliranja morina sa aluminijum(III)- jonom pripisuje se povezanosti dva važna efekta: (a) inhibicji ekscitovanog stanja intramolekulskog protonskog transfera između C3- hidroksilne i C4-karbonilne grupe na A i C prstenu, i (b) opadanju sposobnosti formiranja vodoničnih veza molekula morina sa molekulima rastvarača koja se javlja kao posledica reakcije kompleksiranja 60 OHO OH O O HO OH Al O OH OH O O OH HO Shema 2: Pretpostavljena struktura kompleksa aluminijum(III)-morin U ispitivanom kompleksu aluminijum(III)-morin dolazi do intenzivne emisije koja je posledica pi*→pi singletnog prelaza, pri čemu je emisija formiranog kompleksa značajno veća u odnosu na slabu emisiju samog morina. Intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa veoma zavisi od pH sredine zbog inter- i intra- molekulskog transfera protona. Na to ukazuje i oblik krive zavisnisti intenziteta fluorescencije kompleksa od pH sredine, prikazan na slici 4.1.5. 4.1.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum (III)- morin Izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- morin vršeno je prema jednačinama datim u poglavlju 3.3. Za smešu rastvora aluminijum(III)-nitrata i morina izmereni su intenziteti fluorescencije na različitim vrednostima pH (eksperimentalni uslovi λex = 410 nm i λem= 500 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bili 3 nm i 4 nm, respektivno). Zavisnost intenziteta fluorescencije od pH vrednosti smeše predstavljena je na slici 4.1.5. Koncentracija aluminijum(III)-nitrata u smeši bila je 1,0×10-8 mol dm-3, a koncentracija morina je iznosila 2,0 × 10-7 mol dm-3. Slepa proba je bio rastvor morina u acetatnom puferu u 61 70% v/v etanolu, odgovarajuće pH vrednosti i koncentracije kao u ispitivanoj smeši (2,0 ×10-7 mol dm-3). 4 5 6 0 100000 200000 300000 400000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je , a. u . pH Slika 4.1.5. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- morin od pH. (λex = 410 nm i λem= 500 nm; širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su 3 nm i 4 nm, respektivno) Iz maksimalne vrednosti intenziteta fluorescencije, IFmax, sa krive IF = f (pH) (slika 4.1.5.), a koja se nalazi na pH = 4,40, izračunata je, prema jednačini (3.4.), konstanta k = 4,26×1013. Iz podataka za intenzitet fluorescencije na različitim vrednostima pH, dobijenih sa krive na slici 4.1.5, jednačina izvedenih iz reakcije formiranja kompleksa (jednačina 3.5.2.) i konstante disocijacije morina139 (kd = 3,55 × 10-6), izračunate su opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β2: [ ] [ ][ ]23 2 2 −+ + = MorAl AlMorβ (4.3.) 62 gde su sa [AlMor2+], [Al3+], [Mor-] označene koncentracije kompleksa aluminijum(III)- morin, aluminijum(III)-jona i morina u anjonskom obliku. Vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β2 na različitim vrednostima pH, date su u tabeli 4.1.2. Tabela 4.1.2. Vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti β2 kompleksa aluminijum(III)-morin U literaturi nema mnogo podataka za vrednosti opštih koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-morin. Prema podacima M. S. Shumana140, konstanta stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-morin sastava 1:1, koji je ispitivan u pH oblasti od 2 do 5 pH jedinica, iznosi log k =6,47 pri čemu se ne navodi pH vrednost na kojoj je određena ova konstanta. Iz podataka prikazanih u tabeli 4.1.2. može se zaključiti da pH vrednost značajno utiče na formiranje, a samim tim i na vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti. Iz tabele 4.1.2. jasno se vidi da su najveće vrednosti konstante stabilnosti za ispitivani kompleks dobijene u oblasti između 4,00-4,50 pH jedinica. Očekivano bi bilo da vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa raste pri povećanju pH, jer se povećanjem pH favorizuje disocijacija morina, što povećava mogućnost ugradnje anjonskog oblika morina u kompleks. Iz tabele 4.1.2. se takođe uočava da sa porastom pH vrednosti raste koncentracija anjonskog oblika morina. Međutim, sa porastom pH vrednosti opada koncentracija slobodnog aluminijum(III)-jona, što je očekivana posledica njegove hidrolize, te otuda jasno sledi da vrednost konstante stabilnosti neće bezuslovno rasti sa porastom pH vrednosti, već to zavisi od pH ckompl cAl cmor ß2 log ß2 4,00 6,08×10-9 3,92×10-9 6,44×10-9 3,74×1016 16,57 4,40 9,57×10-9 4,32×10-10 1,57×10-8 8,98×1016 16,96 4,75 8,73×10-9 1,27×10-9 3,04×10-8 7,44×1015 15,87 5,00 8,25×10-9 1,75×10-9 4,81×10-8 2,04×1015 15,31 5,25 8,20×10-9 1,80×10-9 7,11×10-8 9,01×1014 14,95 5,50 8,08×10-9 1,92×10-9 9,72×10-8 4,45×1014 14,65 63 koncentracija svih učesnika u reakciji kompleksiranja: koncentacije kompleksa i ravnotežnih koncentracija aluminijum(III)-jona i morina. 4.1.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u 70 %v/v etanolu Dobijena vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti aluminijum(III)- morin kompleksa je velika, što ukazuje da se u datim eksperimentalnim uslovima ( pH 4,40, u 70 v/v% etanolu) formira stabilan kompleks. Morin je određivan spektrofluorimetrijski na osnovu kalibracionog dijagrama koji predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od koncentracije morina. Koncentracija aluminijum(III)-jona je uzeta u višku, pa se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji morina. Dobijena je linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije morina, koja se može predstaviti regresionom jednačinom: )04,081,0()07,019,3( ±+±= MorF cI (4.4) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije izražen u %, (meren na λex= 410 nm i λem = 500 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su iznosile 3 nm i 4 nm, respektivno), a cMor je koncentracija morina. Koeficijent korelacije iznosi r = 0,99874. Linearnost je dobijena u koncentracionom intervalu od 1,5–30,5 ng cm-3 morina. Vrednosti granice detekcije LOD i granice kvantifikacije LOQ računate su prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,015 ng cm-3, a granica kvantifikacije je LOQ = 0,045 ng cm-3. Tačnost i preciznost metode je proverena na tri različite koncentracije morina i predstavljena je u Tabeli 4.1.3. 64 Tabela 4.1.3. Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanja morina Odmereno (ng cm-3) Nađeno (ng cm-3) ″Recovery″ (%) SD KV(%) 3,03 2,95 97,4 2.5×10-2 0,84 6,06 6,08 100,4 2,9×10-2 0,47 9,09 9,14 100,6 2,8×10-2 0,31 n=5 ″Recovery″ vrednosti koje se nalaze između 97,4 i 100,6 % i niske vrednosti standardne devijacije ukazuju na veoma dobru reproduktivnost merenja. 4.1.6. Spektrofluorimetrijsko određivanje morina u uzorcima humanog seruma Morin je, takođe, određivan spektrofluorimetrijski u rastvorima humanog seruma metodom kalibracione krive koja predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-morin od koncentracije morina. Koncentracija aluminijum(III)-jona je u višku, pa se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji morina. Dobijena je linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije morina u rastvorima humanog seruma, koja se može predstaviti regresionom jednačinom: )03,076,0()05,030,3( ±+±= MorF cI (4.5) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije izražen u %, (meren na λex= 410 nm i λem = 500 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 3 nm i 4 nm, respektivno), a sa cMor je predstavljena koncentracija morina. Koeficijent korelacije je iznosio r = 0,99944. Linearnost je dobijena u koncentracionom opsegu od 1,5–30,5 ng cm-3 morina. Vrednosti granice detekcije LOD i granice kvantifikacije LOQ, izračunate su prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,02 ng cm-3, a granica kvantifikacije je LOQ = 0,06 ng cm-3. 65 Tačnost i preciznost metode je proverena na tri različite koncentracije morina u uzorcima humanog seruma (predstavljena u Tabeli 4.1.3.). I u ovom slučaju dobijene visoke ″recovery″ vrednosti koje se nalaze između 100,00 i 100,15 % i niske vrednosti standardne devijacije ukazuju na vema dobru reproduktivnost merenja. Tabela 4.1.3. Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanja morina¤ u uzorcima humanog seruma Dodato (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) ″Recovery″ (%) SD KV(%) 0,1515 0,1515 100,00 2,1×10-3 1,40 0,3030 0,3036 100,15 3,5×10-3 1,15 0,4545 0,4551 100,11 3,5×⋅10-3 0,77 n=5 4.1.7. HPLC određivanje morina RP-HPLC metoda je već primenjena za određivanje morina u smeši morina i kvercetina i njihovih konjugovanih metabolita u serumu.82 Za proveru pouzdanosti predložene spektrofluorimetrijske metode za određivanje morina u rastvorima voda- etanol, kao i u uzorcima humanog seruma koji sadrže morin, razvijena je i modifikovana navedena RP-HPLC metoda Dobijene su dve kalibracione krive za određivanje morina, jedna za vodeno- etanolnu sredinu, a druga za određivanje morina u uzorcima humanog seruma. Dobijeni validacioni parametri za određivanje morina u 70 v/v% etanolu i u humanom serumu. Dobijeni validacioni parametri za navedeno određivanje morina prikazani su u Tabeli 4.1.4. ″Recovery″ vrednost je izračunata kao odnos između nagiba kalibracionih krivih u70 v/v% etanolu i u humanom serumu. Dobijena vrednost od 86% je u prihvatljivom opsegu. ¤ U koloni 1 ove tabele prikazane su koncentracije morina u humanom serumu. Serum je zatim, prema proceduri za pripremu standardnih rastvora za serumsku kalibracionu krivu, opisanoj u poglavlju 3, dalje tretiran i razblaživan. Usled razblaživanja, koncentracije morina koje su određivane u humanom serumu spektrofluorimetrijski, ulaze u opseg linearnosti, koji je 1000 puta manji od stvarnih koncentracija morina u humanom serumu. 66 Spektrofluorimetrijska metoda omogućuje direktno i jednostavno određivanje morina bez estrakcije morina iz uzorka, koja se primenjuje kod HPLC metode sa UV- Vis detekcijom. Spektrofluorimetrijski se takođe, dobijaju mnogo niže vednosti za granicu detekcije, LOD, i granicu kvantifikacije, LOQ, od vrednosti dobijenih HPLC metodom, što nesumnjivo predstavlja prednost. Dobijene ″recovery″ vrednosti HPLC metodom su niže u odnosu na ″recovery″ vrednosti koje se dobijaju spektrofluorimetrijski. To se može objasniti činjenicom da je prilikom pripreme uzoraka humanog seruma za HPLC analizu, korišćeno duže vreme inkubacije uzoraka na temperaturi 37 0C, što može dovesti do transformacije molekula morina. Tabela 4.1.4. Validacioni parametri za određivanje morina u uzorcima humanog seruma i u rastvorima etanol-voda Kod spektrofluorimetrijskog određivanja morina u uzorcima humanog seruma, nespecifična emisija komponenata seruma je izbegnuta velikim razblaženjem uzoraka prilikom pripreme rastvora za spektrofluorimetrijsku analizu. Osim toga, RP-HPLC metodom morin se razdvaja od proteina i drugih interferirajućih komponenti koje se nalaze u serumu, čime se omogućuje dobijanje tačnih i preciznih rezultata. Na slici 4.1.6. prikazan je hromatogram uzorka seruma koji sadrži morin. Validacioni parametri Serum rastvori etanol-voda (v/v 70: 30) regresiona jednačina (n=6) Y( površina pika), X (cMor u µg cm-3) Y = (4,29 ± 0,08)×103 X + (5,56± 0,08)×103 Y = (5,0 ± 0,1)×103 X +(10,9 ± 0,1)×103 Linearnost dobijena u opsegu koncentracija (µg cm-3) 1,0 -200,0 1,6 -200,0 Koeficient korelacije (r) 0,9987 0,9988 LOD (µg cm-3) 0,056 0,055 LOQ (µg cm-3) 0,169 0,166 67 Slika 4.1.6. Hromatogram uzorka humanog seruma koji sadrži morin U poređenju sa postojećim metodama za određivanje morina u različitim uzorcima,3, 82, 84 predložena spektrofluorimetrijska metoda je jednostavna, brza, pokazuje visoku osetljivost, u širokom koncentracionom opsegu gde je dobijena linearna zavisnost. 68 4.2. Kompleks aluminijum(III)- hesperidin 4.2.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- hesperidin U reakciji aluminijum(III)-jona i hesperidina u 70 % v/v metanolu nastaje kompleks žute boje, koji je stabilan u pH oblasti od 3,0 do 7,0. Na slici 4.2.1. prikazani su ekscitacioni spektri kompleksa aluminijum(III)–hesperidin (kriva 1′), hesperidina (kriva 2′), i emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)–hesperidin (kriva 1) i hesperidina (kriva 2). Ekscitacioni maksimum kompleksa se nalazi na λex = 390 nm, a emisioni maksimum je na λem = 490 nm. Sam rastvor hesperidina pokazuje vrlo slabu fluorescenciju na λem = 420 nm. Fluorescencija rastvora hesperidina u 70 %v/v metanolu (c = 5,0 ×10–5mol dm-3), intenzivno raste postepenim dodavanjem rastvora aluminijum(III)-nitrata. 250 300 350 400 450 500 550 600 0 100000 200000 300000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . λ/ nm 1, 1 2, 2 Slika 4.2.1. Eksitaciono- emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- hesperidin (1, 1′) i hesperidina (2, 2′) 69 Porast intenziteta fluorescencije je očekivana posledica reakcije kompleksiranja do koje dolazi u rastvoru, pri čemu se gradi kompleks aluminijum(III)–hesperidin, koji pokazuje značajnu fluorescenciju na λem = 490 nm, i čiji je emisioni maksimum batohromno pomeren za 70 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog hesperidina. 4.2.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-hesperidin Aluminijum(III)-jon i hesperidin grade kompleks sastava Aluminijum(III): hesperidin =1:1. Sastav kompleksa je određen metodom molarnih odnosa, prema kojoj su izmereni intenziteti fluorescencije rastvora koji sadrže konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata, koja je iznosila 1,0×10-6 mol dm-3 i različite koncentracije hesperidina, koje su se kretale od 5,0 × 10–7 do 2,0 ×10–5 mol dm-3. Merenja su izvršena na λex = 390 nm i λem= 490 nm u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v % metanolu, čija je vrednosti pH iznosila 4,58. Širine otvora za ekscitacione i emisione snopove podešene su na vrednosti od 5 nm za oba otvora. Kao slepa proba korišćen je 1,0 ×10-6 mol dm-3 rastvor aluminijum(III)-nitrata u acetatnom puferu pH = 4,58 a koji je pripremljen u 70% v/v metanolu. Dijagram zavisnosti intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od odnosa koncentracija hesperidina i aluminijum(III)-jona prikazan je na slici 4.2.2. Presek tangenti koje se povlače na krivu koja predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanih rastvora u funkciji odnosa koncentracija hesperidina i aluminijum(III)-jona, se nalazi u tački Alhesp cc / =1 što ukazuje na nastajanje kompleksa sastava aluminijum(III) : hesperidin =1:1. 70 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 In te n zi te t flu o re sc en ci je, a. u . chesp/cAl3+ Slika 4.2.2. Metoda molarnih odnosa. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od odnosa koncentracija hesperidina i aluminijum(III)-jona, +3/ AlHesp cc ; (λex = 390 nm i λem= 490 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm) Kao uporedna metoda kojom je određivan sastav nastalog kompleksa korišćena je metoda varijacija ekvimolarnih rastvora. Izmereni su intenziteti fluorescencije serije rastvora, koja je dobijena mešanjem ekvimolarnih rastvora aluminijum(III)-nitrata i hesperidina u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v % metanolu, na pH vrednosti 4,58, čije su koncentracije iznosile 1,0 ×10–5 mol dm-3. Slepa proba svakog rastvora u seriji sadržavala je ekvimolarnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata u acetatnom puferu na pH vrednosti 4,58. Sva merenja su vršena na λex = 390 nm i λem= 490 nm. Širine otvora za ekscitacione i emisione snopove podešene su na vrednosti od 5 nm za oba otvora. Molski udeo aluminijum(III)-jona u rastvorima iznosio je od 0,2 do 0,8, a odgovarajuće koncentracije aluminijum(III)–jona su se nalazile u opsegu od 2,0 × 10–6 mol dm-3 do 8,0 × 10–6 mol dm-3. Zavisnost intenziteta fluorescencije rastvora od molskog udela aluminijuma (III), prikazana je na slici 4.2.3. Na dobijenoj krivoj uočava 71 se maksimum na 5,0=Alx , što pokazuje da se gradi kompleks sastava aluminijum(III) : hesperidin =1:1. 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . xHesp 4.2.3. Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od molske frakcije hesperidina, Hespx . (λex = 390 nm i λem= 490 nm širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su 5 nm) Obe metode kojima je određivan sastav kompleksa, su potvrdile da nastaje jedna kompleksna vrsta sastava AlHesp2+. Literaturni podaci pokazuju, pre svega, da kompleksna jedinjenja hesperidina sa jonima metala nisu mnogo istraživana, što je verovatno posledica slabe rastvorljivosti samog hesperidina u relativno velikom broju rastvarača. Kompleks aluminijum(III)-hesperidin ispitivan je u 70 v/v% metanolu spektrofotometrijski,40 i utvrđeno je da nastaje kompleks sastava 1:1. T. Perez-Ruiz i grupa autora43 su takođe ispitivali ovaj kompleks u rastvorima metanol-voda, a zatim su ispitivali kompleks u prisustvu većeg broja anjonskih, katjonskih i nejonskih surfaktanata u takođe u rastvorima metanol-voda. Ova grupa autora je utvrdila da u 72 svim slučajevima (u prisustvu i bez prisustva surfaktanata) nastaje kompleks sastava 1:1. 4.2.3. Reakcija formiranja kompleksa Izvršena su merenja pH ekvimolarnih rastvora hesperidina i aluminijum(III)- nitrata u 70% v/v metanolu, a zatim je meren i pH rastvora koji je sadržavao aluminijum(III)-jon i hesperidin u koncentaciji koja je bila ista kao i njihova koncentracija u posebnim rastvorima. Rezultati su prikazani u Tabeli 4.2.1. Tabela 4.2.1. Rezultati pH-metrijskih merenja ekvimolarnih rastvora hesperidina, Al(NO3)3 i njihove smeše u 70% v/v metanolu hesperidin, c= 5×10-5 mol dm-3 Al(NO3)3, c= 5×10-5 mol dm-3 Smeša pH 7,57 6,72 3,80 +Hc 2,69×10-8 mol dm-3 1,91×10-7 mol dm-3 6,92×10-5 mol dm-3 +Σ Hc smc 2,18×10 -7 mol dm-3 1,58×10-4 mol dm-3 ++ Σ−=∆ HsmH ccc 1,578×10 -4 mol dm-3 Niže pH vrednosti smeše u odnosu na pojedinačne rastvore hesperidina i aluminijum(III)-jona pokazuju da se reakcija formiranja kompleksa odvija uz oslobađanje vodonikovih jona, odnosno da hesperidin učestvuje u građenju kompleksa u anjonskom obliku. Na višim pH vrednostima (pH >5,0), smanjuje se koncentracija kompleksne vrste u rastvoru, što može biti posledica hidrolize kompleksa. Reakcija formiranja kompleksa između hesperidina i aluminijum(III)-jona može se prikazati jednačinom: [ ] +++ +→+ HOHAlCHOHCAl 21533281533283 (4.6.) Predpostavlja se da formirani kompleks ima stukturu prikazanu Shemom 3: 73 OMe O O OH21C12O OH Al 3+ Shema 3: Predpostavljena struktura kompleksa aluminijum(III)-hesperidin 4.2.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- hesperidin Za izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-hesperidin korišćen je postupak opisan u poglavlju 3.3. Izmereni su intenziteti fluorescencije smeše rastvora aluminijum(III)-nitrata i hesperidina na različitim pH vrednostima, (eksperimentalni uslovi λex = 390 nm and λem = 490 nm i širine otvora za ekscitacione i emisione snopove bile su 5 nm). Zavisnost intenziteta fluorescencije od pH smeše predstavljena je krivom na slici 4.2.4. Koncentracija aluminijum(III)-nitrata u smeši je bila 2,5 ×10-7 mol dm-3, a koncentracija hesperidina je iznosila 5,0 ×10-6 mol dm-3. Slepa proba je bio rastvor hesperidina koncentracije 5,0×10-6 mol dm-3 u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70%v/v metanolu, odgovarajuće pH vrednosti. 74 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 200000 250000 300000 350000 In te n zi te t flu o re sc en ci je, a. u . pH Slika 4.2.4. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- hesperidin od pH. (λex = 410 nm i λem= 500 nm; širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su iznosile 5 nm) Iz maksimalne vrednosti intenziteta fluorescencije, dobijene sa krive IF = f (pH) (slika 4.2.4.), za pH = 5,50, izračunata je prema jednačini 3.4. konstanta k=1,41×1012. Iz podataka dobijenih sa krive, slika (4.2.4.), jednačina izvedenih iz reakcije obrazovanja kompleksa i konstante disocijacije hesperidina,141 koja iznosi kd = 3,00 × 10-7, izračunate su opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β1: β1= ]][[ ][ 3 2 −+ + HespAl AlHesp (4.7) gde su sa [AlHesp2+], [Al3+], [Hesp-] označene koncentracije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin, aluminijum(III)-jona i hesperidina u anjonskom obliku. Vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β1 na različitim vrednostima pH, date su u tabeli 4.2.2. 75 Tabela 4.2.2. Vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti β1 kompleksa aluminijum(III)-hesperidin pH IF ckompl cAl cHesp ß1 log ß1 4,00 210900 1,50×10-7 1,00×10-7 1,45×10-8 1,03×108 8,01 4,25 205000 1,45×10-7 1,45×10-7 2,56×10-8 5,36×107 7,73 4,50 208900 1,48×10-7 1,02×·10-7 4,56×10-8 3,18·107 7,50 5,00 287700 2,04×10-7 4,6×10-8 1,40×10-7 3,60×107 7,56 5,25 332000 2,35×10-7 1,5×10-8 2,41×10-7 6,49×107 7,81 6,00 295000 2,09×10-7 4,6×·10-8 1,11×10-6 5,61×106 6,75 T. Perez-Ruiz i grupa autora43 su u izučavali kompleks aluminijum(III)- hesperidin i dobili vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti ovog kompleksa koja iznosi log K = 5,73 ± 0,02. Treba napomenuti da se u radu ne navode eksperimentalni uslovi pri kojima je vrednost konstante stabilnosti izračunata (pH vrednost, prisustvo surfaktanata). Ovaj kompleks je ispitivan u 70 v/v% metanolu spektrofotometrijski, od strane D. Maleševa i grupe autora.40 Na pH = 5,00 i jonskoj jačini rastvora I = 0,01 mol dm-3 dobijena je vrednost relativne koncentracione konstante stabilnosti kompleksa log K = 4,54. Podaci prikazani u tabeli 4.2.2. ukazuju da pH vrednost utiče na formiranje, a samim tim i na vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa. Iz tabele 4.2.2. jasno se vidi da su najveće vrednosti konstante stabilnosti za ispitivani kompleks dobijene na pH = 4,00. Očekivano bi bilo, kao i u slučaju morina, da vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa raste pri povećanju pH, jer se povećanjem pH favorizuje disocijacija hesperidina, kao slabe kiseline, odnosno sa povećanjem pH raste koncentracija anjonskog oblika hesperidina. Osim toga, porast pH vrednosti dovodi do hidrolize aluminijum(III)-jona, pa njegova koncentracija opada, što dovodi do smanjenja vrednosti opšte konstante stabilnosti kompleksa na višim pH vrednostima. 76 4.2.5. Uticaj prisustva cviterjonske površinski aktivne materije SB 12 na intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin U radu T. Perez-Ruiz i saradnika,43 pokazano je da prisustvo površinski aktivnih materija u reakcionom sistemu u kom nastaje ispitivani aluminijum(III)-hesperidin kompleks ima značajan uticaj na intenzitet fluorescencije ovog kompleksa. Ova grupa autora je ispitivala kompleks aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu većeg broja anjonskih, katjonskih i nejonskih surfaktanata u rastvorima metanol-voda. U literaturi nije bilo podataka o uticaju cviterjonskih surfaktanta na fluorescenciju aluminijum(III)- hesperidin kompleksa, što nas je opredelilo za izbor SB 12, kao cviterjonskog surfaktanta u čijem prisustvu je bila izučavana fluorescencija kompleksa aluminijum(III)-hesperidin. Prema ovoj grupi autora, surfaktant koji je pokazao najveći uticaj na intenzitet fluorescencije kompleksa je SDS (natrijum-dodecilsulfat). Da bi se ispitao i uporedio uticaj SDS-a i SB 12 na intenzitet fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin snimljeni su emisioni spektri ovog kompleksa u: 70 v/v% metanolu bez prisustva površinski aktivnih materija (kriva 1, slika 4.2.5); u 70 v/v% metanolu u prisustvu SDS-a (kriva 2, slika 4.2.5) i u 70 v/v% metanolu u prisustvu SB 12 (kriva 3, slika 4.2.5). Emisioni spektri ispitivanog kompleksa su izmereni za onaj odnos koncentracija aluminijum(III)-jona i hesperidina u smeši, koji je naveden u radu T. Perez-Ruiz i saradnika (koncentracija aluminijum(III)-jona je 1×10-5 mol dm-3 a hesperidina 1×10-5 mol dm-3). Koncentracija površinski aktivnih materija bila je oko tri puta veća od njihove kritične micelarne koncentracije.* Prema dobijenim rezultatima, koji su prikazani na slici 4.2.5., nedvosmisleno je potvrđeno da SB 12 ima mnogo veći uticaj na intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa u odnosu na SDS. * Sa povećanjem koncentracije molekuli površinski aktivnih materija se grupišu u veće agregate (micele). Područje koncentracije površinski aktivnih materija u kojem se stvaraju micele relativno je usko, ali se može odrediti sa priličnom tačnošću. Ova karakteristična koncentracija površinski aktivnih materija pri kojoj se micele mogu smatrati formiranim naziva se kritična micelarna koncentracija ( KMK ). U području koncentracija pri kojima dolazi do formiranja micela, dolazi i do naglih promjena različitih osobina rastvora površinski aktivnih materija kao što su npr. osmotski pritisak, površinski napon, električna provodljivost, rasipanje svetlosti... 77 450 500 550 600 0 50000 100000 150000 In te zi te t flu o re sc en ci je, a. u . λ/ nm 3- Al-hesp u prisustvu SB 12 2- Al-hesp u prisustvu SDS 1- Al-hesp u 70% metanolu 1 2 3 Slika 4.2.5. Uticaj surfaktanata na intenzitet fluorescencije kompleksa aluminium(III)–hesperidin: emisioni spektar kompleksa bez prisustva surfaktanata (kriva 1), emisioni spektri kompleksa u prisustvu SDS (kriva 2) i SB 12 (kriva 3). U 70 v/v% metanolu, u kome su ispitivanja vršena, koncentracija surfaktanta SB 12 bila je oko tri puta veća od njegove kritične micelarne koncentracije.142 Intenzitet fluorescencije formiranog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu surfaktanta SB 12 intenzivno raste u odnosu na intenzitet fluorescencije aluminijum(III)-hesperidin kompleksa u 70 v/v% metanolu bez prisustva SB 12, što je prikazano na slici 4.2.6. Uočava da se talasna dužina maksimuma u emisonom spektru kompleksa u prisustvu površinski aktivnog SB 12 hipsohromno pomera sa λem= 490 nm na λem= 476 nm i da je intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa između četiri do pet puta veći u odnosu na intenziet fluorescencije kompleksa u 70 v/v% metanolu bez prisustva SB 12. U skladu sa dobijenim rezultatima, naredna ispitivanja kompleksa su urađena u 70 v/v% metanolu u prisustvu SB 12. 78 . 45 0 50 0 55 0 60 0 0 20 00 0 40 00 0 60 00 0 80 00 0 10 00 00 Intenzitet fluorescencije, a. u. λ λ λ λ / n m 1- ko m pl ek s 1, - he sp er id in 1 1, 45 0 50 0 55 0 60 0 0 20 00 0 40 00 0 60 00 0 80 00 0 10 00 00 Intenzitet fluorescencije, a. u. λ / λ / λ / λ / n m 2- ko m pl e ks Al - he sp . SB 12 2, - he sp e rid in , SB 12 2, 2 (a) (b) Sl ik a 4. 2. 6. Em isi o n i sp ek tr i ko m pl ek sa al u m in iju m (II I)- he sp er id in iz m er en i n a λ e x = 39 0 n m ; šir in e o tv o ra z a ek sc ita ci o n e i em isi o n e sn o po v e su 5 n m (a) be z pr isu st v a SB 12 (b) u pr isu st v u SB 12 kr iv a 1- em isi o n i s pe kt ar ko m pl ek sa al u m in iju m (II I)- he sp er id in , kr iv a 2- em isi o n i s pe kt ar ko m pl ek sa al u m in iju m (II I)- he sp er id in kr iv a 1′ em isi o n i s pe kt ar he sp er id in a kr iv a 2′ em isi o n i s pe kt ar he sp er id in a 4.2.6. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- hesperidin u prisustvu SB 12 Da bi se odredile opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu SB 12 prema postupku koji je opisan u poglavlju 3.3., bilo je potrbno ispitati uticaj pH na intenzitet fluorescencije kompleksa u prisustvu SB 12. Uticaj pH vrednosti na intenzitet fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- hesperidin je ispitivan u pH oblasti 3,0–7,0. Izmereni su intenziteti fluorescencije smeše rastvora aluminijum(III)-nitrata i hesperidina na različitim vrednostima pH, (eksperimentalni uslovi: λex = 390 nm i λem = 476 nm; širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Zavisnost intenziteta fluorescencije od pH smeše predstavljena je na slici 4.2.7. Korišćena koncentracija aluminijum(III)-nitrata u smeši bila je 2,5 ×10-7 mol dm-3, dok je koncentracija hesperidina iznosila 5,0 ×10-6 mol dm-3. Slepa proba je bio rastvor hesperidina koncentracije 5×10-6 mol dm-3 u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70% metanolu u prisustvu SB 12. Vrednosti pH slepe probe su odgovarale pH vrednostima svakog pojedinačnog rastvora za koji su ispitivanja vršena. Na slici 4.2.7. se uočava da je intenzitet fluorescencije kompleksa na nižim pH vrednostima mnogo manji u odnosu na maksimalnu vrednost na pH = 4,58, što je posledica težnje protona da istisne aluminijum(III)-jon iz kompleksa, a što dovodi do razgradnje kompleksa. Međutim, intenzitet fluorescencije kompleksa na pH vrednostima većim od 4,58 veoma brzo opada, što se može pripisati nastajanju aluminijum(III)-hidrokso kompleksa. Optimalna pH vrednost za nastajanje kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu SB 12 je oko 4,5 pH jedinica. 80 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 50 60 70 80 90 100 In te n zi te t flu o re sc en ci je , % pH Slika 4.2.7. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- hesperidin u prisustvu SB 12 od pH. (λex = 390 nm i λem= 476 nm; širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm) Iz maksimalne vrednosti intenziteta fluorescencije, očitane sa krive IF = f (pH) (slika 4.2.7.), koja se nalazi na pH = 4,58, izračunata je prema jednačini (3.4.) konstanta k=1,41×1012 Iz podataka dobijenih sa krive prikazane na slici (4.2.7.), jednačina izvedenih iz reakcije stvaranja kompleksa i konstante disocijacije hesperidina koja iznosi kd = 3,00 × 10-7 izračunate su opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β1: β1= ]][[ ][ 3 2 −+ + HespAl AlHesp (4.8.) gde su sa [AlHesp2+], [Al3+], [Hesp-] označene koncentracije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin, aluminijum(III)-jona i hesperidina u anjonskom obliku. Vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa β1 na različitim pH vrednostima, date su u tabeli 4.2.3.: 81 Tabela 4.2.3. Vrednosti opštih koncentracionih konstanti stabilnosti β1 kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u prisustvu površinski aktivne materije SB 12 Poređenjem vrednosti konstanti stabilnosti ovog kompleksa koje su izračunate u prvom slučaju za rastvore u kompleksa u 70 v/v% metanolu, u acetatnom puferu bez prisustva SB 12 (Tabela 4.2.2.) i u drugom slučaju za za rastvore u kompleksa u 70 v/v% metanolu, u acetatnom puferu u prisustvu SB 12 (Tabela 4.2.3.), uočava se da se u prisustvu surfaktanta povećava stabilnost kompleksa, konstanta stabilnosti na svim poređenim pH vrednostima je veća u prisustvu SB 12. Takođe, poređenjem podataka koji su prikazani u ove dve tabele, uočava se da na višim pH vrednostima, porast konstante stabilnosti za rastvore u kompleksa u 70 v/v% metanolu, u acetatnom puferu u prisustvu SB 12 nije tako značajan u odnosu na vrednosti konstante stabilnosti kompleksa na odgovarajućim pH vrednostima (pH > 5,0) bez prisustva surfaktanta. Vrednosti konstanti stabilnosti kompleksa u prisustvu SB 12 značajno rastu na nižim pH vrednostima ( oko pH 4,0) u odnosu na vrednosti konstante stabilnosti kompleksa u 70 v/v% metanolu u acetatnom puferu bez prisustva surfaktanta. Ova pojava može se objasniti činjenicom da porast pH vrednosti dovodi do hidrolize aluminijum(III)-jona, pa njegova koncentracija opada, a samim tim dolazi do smanjenja vrednosti opšte konstante stabilnosti kompleksa na višim pH vrednostima. Međutim, ako se uporede vrednosti konstante k, koja je izračunata prema jednačini (3.4.) koje samo zavise od karakteristika molekula koji pokazuje fluorescenciju (te je stoga ova vrednost karakteristična za dati molekul), dobijaju se gotovo identične vrednosti: vrednost ove konstante računate za kompleks koji je pH IF ckompl cAl chesp ß1 log ß1 4,25 49000 3,47×10-8 1,53×10-8 5,12×10-9 4,40×108 8,62 4,5 65000 4,61×10-8 3,9×10-9 8,90×10-9 1,32×109 9,20 5,0 53700 3,81×10-8 1,29×10-8 2,8×10-8 1,05×108 8,02 5,25 43400 3,08×10-8 1,92×10-8 4,91×10-8 3,27×107 7,51 5,50 43000 3,05×·10-8 1,95×10-8 8,40×10-8 1,86×107 7,27 6,0 44700 3,17×10-8 1,83×10-8 2,23×10-7 7,75×106 6,89 82 formiran u 70 %v/v metanolu iznosi k = 1,41 × 1012, a njena vrednost za kompleks u 70 %v/v metanolu u prisustvu surfaktanta, iznosi k = 1,40 × 1012. Saglasnost ovih podataka pokazuje da prisustvo SB 12 ne utiče na prirodu formiranog kompleksa, ali povećava intenzitet fluorescencije nastalog kompleksa četiri do pet puta, što omogućava njegovu analizu pri nižim vrednostima koncentracija u prisustvu SB 12, kao i određivanje sadržaja hesperidina u različitim uzorcima. 4.2.7. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu Hesperidin i aluminijum(III)-jon formiraju stabilan kompleks sastava 1 : 1, na šta ukazuju i dobijene vrednosti opšte koncentracione konstante stabilnosti ovog kompleksa, pa se u datim eksperimentalnim uslovima (acetatni pufer pH = 5,40, pripremljen u 70 v/v% metanolu) hesperidin može spektrofluorimetrijski odrediti na osnovu kalibracionog dijagrama koji predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od koncentracije hesperidina. Koncentracija aluminijum(III)-jona je uzeta u višku, te se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji hesperidina. Dobijena linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije hesperidina, predstavljena je regresionom jednačinom: )02,006,0()05,013,3( ±+±= HespF cI (4.9) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije izražen u % (meren na λex= 390 nm i λem = 490 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznose 5 nm), a cHesp je koncentracija hesperidina data u µg cm-3. Koeficijent korelacije iznosi r = 0,99845. Linearnost je dobijena u koncentracionom intervalu od 0,08 – 18,0 µg cm-3 hesperidina. Vrednosti granice detekcije, LOD i granice kvantifikacije, LOQ, računate su prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,023 µg cm-3, a granica kvantifikacije je LOQ = 0,070 µg cm-3. Tačnost i preciznost metode su proverene na četiri različite koncentracije hesperidina (predstavljena u Tabeli 4.2.4.). 83 Tabela 4.2.4. Rezultati dobijeni spektrofluorimetrijskim određivanjem hesperidina u 70% v/v metanolu Odmereno (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) ″Recovery″ (%) SD KV(%) 1.83 1.79 97.8 2.3⋅10-2 1.31 3.05 2.99 98.0 1.7⋅10-2 0.57 6.10 6.08 99.6 2.2⋅10-2 0.36 12.21 12.18 99.8 2.8⋅10-2 0.23 n=5 Tačnost i reproduktivnost metode je veoma dobra, na šta ukazuju visoke ″recovery″ vrednosti i niske vrednosti standardne devijacije. 4.2.7.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u sokovima od pomorandže Koncentracija hesperidina određivana je u različitim sokovima od pomorandže, koji se nalaze na tržištu u Srbiji. Uzorci za određivanje hesperidina u soku od pomorandže pripremljeni su prema proceduri opisanoj u poglavlju 3.5, a rezultati ovog određivanja prikazani su u tabeli 4.2.5. Tabela 4.2.5. Rezultati dobijeni spektrofluorimetrijskim određivanjem sadržaja hesperidina u soku od pomorandže Vrsta soka Sadržaj hesperidina, g dm-3 SD Life (Nectar) 0,308 0,0042 Happy day 0,350 0,0050 Next (100%) 0,317 0,0046 Pago 0,573 0,0067 Bravo 0,477 0,0042 n=5 84 Sadržaj hesperidina u soku od pomorandže, određen je prema posebnim Zahtevima koji definišu kvalitet citrusnih sokova ( od limuna, pomorandže, grejpfruta), a koji su dati u dokumentu Code of Practice for evaluation of quality and authenticity of fruit and vegetable juices, od strane AIJN - European Fruit Juice Association.132 Prema ovom dokumentu, koncentracija hesperidina u citrusnim sokovima treba da se nalazi u koncentracionom opsegu od 250 do 700 mg dm-3. Količina bioaktivnih jedinjenja u voću, uključujući citrusne flavonoide u koje spada i hesperidin, je veličina koja zavisi od mnogo faktora: geografske regije u kojoj je voće proizvedeno, klime, svojstava tla, vrste i sorte voća, sezone (godine u kojoj je korišćeno voće proizvedeno), načina skladištenja, broja sunčanih dana, i drugih uvslova. Dobijene vrednosti sadržaja hesperidina u ispitivanim sokovima od pomorandže, prikazane u Tabeli 4.2.5., nalaze se u okvirima dozvoljenih vrednosti koje propisuje AIJN (European Fruit Juice Association). Imajući u vidu da su za sve vrste sokova koje su bile ispitivane, dobijene vrednosti koje se nalaze ispod 700 mg dm-3, potvrđeno je da je poštovana procedura o upotrebi očišćenog ploda za dobijanje soka. S obzirom da ispitivani sokovi nemaju deklarisani sadržaj hesperidina, nije bilo moguće odrediti ″Recovery″ vrednosti. Pregledom literature ustanovljeno je da je sadržaj hesperidina u sokovima određivan metodom katodne striping voltametrije, spektrofotometrijskom metodom i spektofluorimetrijskom metodom gde su za određivanje analita korišćene manuelne i flow injection procedure. Metoda katodne striping voltametrije, predložena od strane D. Obendorfa i E. Reicharta,91 bila je primenjena za određivanje sadržaja hesperidina u tri komercijalne vrste soka. Sadržaj hesperidina u ispitivanim sokovima kretao se od 340,3 do 555,3 mg dm-3. Određivanje sadržaja hesperidina bilo je otežano usled pojave značajnog pada intenziteta analitičkog signala (jačine struje koja se meri) u toku vremena nakon pripreme uzorka. Autori smatraju da do ove pojave najverovatnije dolazi usled procesa oksidacije u ispitivanim rastvorima. Oni predlažu da navedenu analitičku proceduru za određivanje treba izvesti što je moguće brže nakon pripreme uzorka, kako bi se izbegao gubitak hesperidina u ispitivanom rastvoru usled procesa oksidacije, i samim tim bi i određivanje sadržaja hesperidina u uzorcima soka bilo tačnije. 85 Tokom spektrofluorimetrijskog ispitivanja kompleksa aluminijum(III)- hesperidin i pripreme uzoraka za kvantitativnu analizu hesperidina u sokovima od pomorandže, procedurom koju smo predložili, nije primećena zavisnost analitičkog signala (intenziteta fluorescencije kompleksa) od vremena. Na osnovu ove činjenice, kao i činjenice da je predložena priprema uzoraka soka za spektofluorimetrijsku analizu jednostavnija, može se smatrati da je određivanje sadržaja hesperidina u soku predloženom spektrofluorimetrijskom metodom jednostavnije i pouzdanije. U odnosu na spektrofotometrijsku metodu za određivanje hesperidina koja je predložena od strane D. Maleševa i saradnika,40 i primenjena za određivanje sadržaja hesperidina u komercijalnim sokovima od pomorandže (koncentracioni opseg od 2,50 ×10−5 mol dm-3 -1,75×10−4 mol dm-3), spektrofluorimetrijska metoda koju smo razvili ima veću osetljivost, odnosno ovom metodom se mogu uspešno odrediti niže koncentracije hesperidina u rastvorima (koncentracioni opseg od 1,3 ×10−7 mol dm-3 - 3,0×10−6 mol dm-3). U poređenju sa metodom za određivanje hesperidina u kori i soku pomorandže koja se zasniva na kompleksiranju hesperidina i aluminijum(III)-jona u micelarnom medijumu-SDS, koju predlažu T. Perez-Ruiz i autori43 (koncentracioni opseg od 5×10-7 do 2 ×10-5 mol dm-3 sa granicom detekcije LOD = 79 µg dm-3), našom metodom postignuta je nešto veća osetljivost, a granica detekcije LOD, je smanjena oko 3,5 puta. 4.2.8. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu u prisustvu SB 12 Reakcija dobijanja stabilnog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin sastava 1 : 1, u prisustvu surfaktanta SB 12, upotrebljena je za postavljanje spektrofluorimetrijske metode za određivanje hesperidina metodom kalibracione krive. Dobijeni kalibracioni dijagram predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije formiranog kompleksa u prisustvu SB 12, od koncentracije hesperidina. Aluminijum(III)-jon se nalazi u višku, te se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji hesperidina. 86 Dobijena linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije hesperidina, predstavljena je regresionom jednačinom: )02,027,1()01,006,4( ±+±= HespF cI (4.10.) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije kompleksa u prisustvu SB 12 na pH vrednosti 4,58, izražen u % (meren na λex= 390 nm i λem = 476 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznose 5 nm), a cHesp je koncentracija hesperidina data u µg cm-3. Dobijeni koeficijent korelacije iznosi r = 0,99999. Linearna zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa od koncentracije hesperidina dobijena je u opsegu od 0,06–22,4 µg cm-3. Vrednosti granice detekcije, LOD i granice kvantifikacije LOQ, su izračunate prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,016 µg cm-3, a granica kvantifikacije LOQ = 0,049 µg cm-3. Tačnost i preciznost metode su proverene na četiri različite koncentracije hesperidina (Tabela 4.2.6.). Tabela 4.2.6. Rezultati dobijeni spektrofluorimetrijskim određivanjem hesperidina u 70% v/v metanolu u prisustvu SB 12 Odmereno (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) ″Recovery″(%) SD KV(%) 0,305 0,303 99,3 2,45⋅10-3 0,81 0,611 0,609 99, 7 1,71⋅10-3 0,28 1,222 1,218 99, 7 2,92⋅10-3 0,24 6,110 6,085 99,6 7,8⋅10-3 0,13 n=5 Tačnost i reproduktivnost metode je veoma dobra, na šta ukazuju vrlo visoke ″recovery″ vrednosti ( od 99,3 do 99,7 %) i niske vrednosti standardne devijacije. 87 4.2.8.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje sadržaja hesperidina u farmaceutskim preparatima Koncentracija hesperidina određivana je u dva farmaceutska oblika: Helopyrin tabletama, proizvođača Rosh & Handel, (Beč, Austrija) (jedna tableta sadrži: vitamin C 120 mg, bioflavonoide 20 mg, rutin 15 mg, ekscipiente: mikrokristalna celuloza, metilhidroksipropil celuloza, magnezijum(II)- stearat, skrob) i u Vitamin C 1500 tabletama sa bioflavonoidima (sa rutinom i hesperidinom) proizvođača American Nutrition Products, (sadržaj vitamina C u jednoj tableti iznosi 1500 mg, a proizvođač u deklaraciji preparata ne navodi sadržaj bioflavonoida- rutina i hesperidina) . Uzorci za određivanje hesperidina u tabletama pripremljeni su prema proceduri opisanoj u poglavlju 3, a rezultati ovog određivanja prikazani su u tabeli 4.2.7. Tabela 4.2.7. Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanja sadržaja hesperidina u farmaceutskim preparatima Određen sadržaj hesperidina, mg „Recovery“ ( %) SD ( %) KV (%) Helopyrin tabl. sadržaj bioflavonoida deklarisan na 20 mg 18,06 90,3 0,12 0,66 Vitamin C, tabl. sadržaj hesperidina i rutina nije deklarisan 117,38 0,81 0,69 n=5 Da bi predložena spektrofluorimetrijska metoda mogla biti uspešno primenjena za određivanje sadržaja hesperidina u fitofarmaceutskom preparatu Helopyrin tablete, kod kojih je sadržaj bioflavonoida (od kojih je najzastupljeniji hesperidin) deklarisan na 20 mg, bilo je potrebno utvrditi uticaj prisutnog vitamina C, rutina i ekscipijenata na intenzitet fluorescencije rastvora koji je dobijen od pripremljenog uzorka tableta Helopyrin prema proceduri opisanoj u poglavlju 3. U tu svrhu napravljena je smeša koja je sadržavala vitamin C, rutin i navedene eksipijente u odnosu u kome se oni nalaze u preparatu Helopyrin tablete. Ova smeša je tretirana na isti način, odnosno prema predloženoj proceduri za analizu hesperidina u preparatu Helopyrin tablete. Izmeren je 88 emisioni spektar dobijenog rastvora koji je sadržavao ekscipijente i vitamin C. Uslovi u kojima je snimljen ovaj spektar bili su λex= 390 nm i λem = 476 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm. Emisioni spektar je prikazan na slici 4.2.8. 450 500 550 600 0 20 40 60 80 100 In te n zi te t flu o re s ce n c ije , % λ / nm 1 2 Slika 4.2.8. Emisioni spektar aluminijum(III)–hesperidin kompleksa u preparatu Helopyrin tablete (1) i smeše ekscipijenata (2). Iz emisionog spektra rastvora koji je pripremljen u 70 %v/v metanolu i koji je sadržavao ekscipijente, rutin i vitamin C, prikazanog krivom 1 na slici 4.2.8., uočava se da ekscipijenti ne pokazuju interferenciju pri određivanju hesperidina. U okviru izabranih eksperimentalnih uslova, utvrđeno je da kompleksi koje aluminijum(III)-jon formira sa rutinom i drugim citrusnim flavonoidima takođe, ne dovode do interferencija, pa se predložena spektrofluorimetrijska metoda može uspešno koristiti za određivanje hesperidina u preparatu Helopyrin tablete. Sadržaj hesperidina u Helopyrin tabletama određen predloženom spektrofluorimetrijskom metodom je u dobroj saglasnosti sa rezultatima određivanja 89 sadržaja hesperidina u istom preparatu metodom adsorptivne katodne voltametije predložene od strane autora D. Obendorfa i E. Reicharta.43 Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje hesperidina u prisustvu SB 12, u poređenju sa metodama za određivanje hesperidina koje su navedene u pregledu literature (u poglavlju 2), pokazuje veću osetljivost, preciznost, nižu granicu detekcije, LOD u odnosu na metode za koje je vrednost LOD navedena. Takođe, priprema uzoraka za spektrofluorimetrijsku analizu je, u odnosu na većinu navedenih metoda, jednostavnija. 4.2.9. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme u prisustvu SB 12 Hesperidin je, takođe, određivan spektrofluorimetrijski u uzorcima humane plazme metodom kalibracione krive koja predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-hesperidin od koncentracije hesperidina u prisustvu SB 12. Koncentracija aluminijum(III)-jona je u višku, pa se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji hesperidina. Dobijena je linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije hesperidina u rastvorima humane plazme, koja se može predstaviti regresionom jednačinom: )04,013,2()02,012,4( ±+±= HespF cI (4.11.) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije kompleksa u prisustvu SB 12 na pH vrednosti 4,58, izražen u % (meren na λex= 390 nm i λem = 476 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznose 5 nm), a cHesp je koncentracija hesperidina data u µg cm-3 . Dobijeni koeficijent korelacije iznosi r = 0,99998. Linearna zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa od koncentracije hesperidina u uzorcima humane plazme dobijena je u opsegu od 0,1 – 12,2 µg cm-3. Vrednosti granice detekcije, LOD i granice kvantifikacije LOQ, su izračunate prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,032 µg cm-3, a granica kvantifikacije LOQ = 0,096 µg cm-3. Tačnost i preciznost metode su proverene na tri različite koncentracije hesperidina (predstavljena u Tabeli 4.2.8.). 90 Tabela 4.2.8. Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanja hesperidina u uzorcima humane plazme u prisustvu SB 12 Dodato (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) „Recovery“(%) SD KV(%) 0,122 0,120 98,4 1,08×10-3 0,86 0,611 0,610 99, 8 1,22×10-3 0,20 6,110 6,091 99,7 1,3×10-3 0,21 n=5 Visoke ″recovery″ vrednosti ( od 98,3 do 99,8 %) i niske vrednosti standardne devijacije, pokazuju veliku tačnost i reproduktivnost metode. 4.2.10 Uticaj surfaktanta SB 12 na spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu Poređenjem analitičkih parametara za spektofluorimetrijsko određivanje hesperidina u prisustvu surfaktanta SB 12 i analitičkih parametara za određivanje hesperidina bez surfaktanta, uočava se da se spektrofluorimetrijskim određivanjem hesperidina u prisustvu SB 12 postiže veća osetljivost i preciznost određivanja, koja je i neophodna za njegovo određivanje u biološkim tečnostima i doziranim oblicima. Međutim, imajući u vidu očekivani opseg koncentracija hesperidina u voćnim sokovima, jasno je da dobijene vrednosti sadržaja hesperidina, predloženom procedurom za njegovo spektrofluorimetrijsko određivanje bez prisustva surfaktanta SB 12, pokazuju zadovoljavajuću tačnost. Predložena procedura za pripremu uzoraka bez prisustva surfaktanta SB 12, za spektrofluorimetrijsko određivanje sadržaja hesperidina, može se uspešno primeniti za analizu uzoraka koji imaju povećan sadržaj hesperidina kao što su na primer voćni sokovi citrusa (pomorandže, limuna, grejpfruta). U Tabeli 4.2.9. je prikazano kako prisustvo surfaktanta SB 12 u ispitivanim rastvorima utiče na analitičke parametre za spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina. 91 Tabela 4.2.9. Uticaj surfaktanta SB 12 na analitičke parametre za spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina 4.2.11. HPLC određivanje hesperidina u farmaceutskim preparatima Sadržaj hesperidina u fitopreparatu Helopyrin tablete, proizvođača Rosh & Handel, (Beč, Austrija), određivan je i RP-HPLC metodom sa UV-Vis detekcjom. Uzorci tableta za RP-HPLC analizu pripremljeni su na isti način kako to propisuje procedura za pripremu uzoraka tableta za spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina, tako da u ovom slučaju nije korišćena nijedna ekstrakciona procedura. Različiti alikvoti ovako pripremljenog rastvora tableta analizirani su u HPLC sistemu sa Gemini kolonom, gradijentnim eluiranjem i UV detektorom. Hromatogram dobijen analizom fitopreparata Helopyrin tableta, prikazan je na slici 4.2.9. Pik hesperidina na ovom hromatogramu se pojavljuje na vrednosti retencionog vremena od 13,74 minuta (ova vrednost retencionog vremena za hesperidin potvrđena je hromatogramom standardne supstance- hesperidina i proverom UV i masenih spektara odgovarajućeg pika). U prisustvu SB 12 Bez SB 12 Talasna dužina ekscitacije 390 nm 390 nm Talasna dužina emisije 476 nm 490 nm Regresiona jednačina IF=(4,06±0,01)c + (1,27±0,02) IF=(3,13±0,05)c +(0,06±0,02) Linearni opseg 0,06 – 24,4 µg cm-3 0,08 – 18,0 µg cm-3 LOD 0,016 µg cm-3 0,023 µg cm-3 LOQ 0,049 µg cm-3 0,070 µg cm-3 „Recovery“ 99,3 – 99,7 % 97,8-99,8 % KV 0,13-0,81% 0,23-1,31% 92 Slika 4.2.9. Hromatogram dobijen analizom fitopreparata Helopyrin tableta; pik hesperidina dobijen na retencionom vremenu tr = 13,74 min Regresiona jednačina kalibracione prave za RP-HPLC određivanje hesperidina ima oblik: 34 10)2,01,2(10)05,083,4( ⋅±+⋅±= HespcA (N = 10, r2 = 0,9998) (4.12.) Gde A predstavlja površinu pika i cHesp je koncentracija uzorka data µg cm-3. Linearnost je postignuta u koncentracionom opsegu hesperidina od 0,05–10,0 µg cm-3. Vrednost granice detekcije, LOD, računata iz parametara kalibracione prave, iznosi 0,01 µg cm-3, a vrednost granice kvantifikacije, LOQ, iznosi 0,03 µg cm-3. Sadržaj hesperidina određivan je u fitopreparatu Helopyrin tablete, proizvođača Rosh & Handel, (Beč, Austrija) i u preparatu Vitamin C 1500 tablete sa bioflavonoidima (sa rutinom i hesperidinom) proizvođača American Nutrition Products. Rezultati dobijeni RP-HPLC analizom Helopyrin tableta i Vitamin C 1500 tableta sa bioflavonoidima prikazani su u tabelama 4.2.10. i 4.2.11. respektivno. 93 Tabela 4.2.10. Rezultati određivanja sadržaja hesperidina u Helopyrin tabletama HPLC/UV metodom Dodato (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) „Recovery“, % SD KV(%) 1,5 1,26 84,00 0,25 0,17 3,0 2,84 94,66 0,36 0,12 6,0 5,75 95,83 0,39 0,07 n=5 Tabela 4.2.11. Rezultati određivanja sadržaja hesperidina u Vitamin C 1500 tabletama sa bioflavonoidima HPLC/UV metodom Dodato (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) „Recovery“, % SD (%) KV (%) 0,1 0,075 75,00 0,3 8,3 0,2 0,176 88,00 0,7 3,65 0,3 0,286 95,33 0,2 0,76 n=5 Niže ″recovery″ vrednosti dobijene za određivanje hesperidina u Vitamin C 1500 tabletama sa bioflavonoidima, mogu se objasniti apsorpcijom drugih supstancija koje se nalaze u ovim tabletama, na istoj talasnoj dužini na kojoj i sam hesperidin apsorbuje. Ove komponente i njihov uticaj nisu mogli biti uklonjeni SPE ekstrakcijom. 4.2.12. LC-MS/MS određivanje sadržaja hesperidina u uzorcima humane plazme Sadržaj hesperidina u uzorcima humane plazme određivan je LC-MS/MS metodom. U dobijenim masenim spektrima uočeno je šest signala (pikova) različitog intenziteta što je prikazano u tabeli 4.2.12. 94 Tabela 4.2.12. Maseni spektar hesperidina m/z Zastupljenost, % 609/343 31 609/325 72 609/301 100 609/265 16 609/253 12 609/174 24 609/151 32 Praćene su promene intenziteta pika na vrednosti m/z: 609→325. Dobijena kalibraciona kriva predstavljena je jednačinom: 34 10)09,075,1(10)02,083,4( ⋅±+⋅±= HespcA (N = 10, r2 = 0.9998) (4.13.) Gde A predstavlja površinu pika i cHesp je koncentracija analita data u µg cm-3. Linearnost je postignuta u koncentracionom opsegu hesperidina od 0,02–10,0 µg cm-3. Vrednost granice detekcije, LOD, računata je iz sedam ponovljenih merenja u koncentracionom opsegu od 0,002–0,05 µg cm-3, u odnosu na metanol kao slepu probu. Dobijena je vrednost granice detekcije, LOD od 5 ng cm-3, a vrednost granice kvantifikacije, LOQ, iznosila je 15 ng cm-3. Tačnost i preciznost metode suproverene na četiri različite koncentracije hesperidina. Rezultati analize hesperidina u uzorcima humane plazme prikazani su u tabeli 4.2.13. Tabela 4.2.13. Rezultati određivanja hesperidina u uzorcima humane plazme LC-MS/MS metodom Dodato (µg cm-3) Nađeno (µg cm-3) „Recovery“, % SD KV(%) 0,5 0,497 99,4 0,006 1,21 1,0 1,02 102,0 0,06 5,88 2,5 2,48 99,2 0,05 2,02 5,0 5,19 102,0 0,03 0,58 n=5 95 Dobijene su veoma visoke ″recovery″ vrednosti u opsegu od 99,2 do 102,0 %, i niske vrednosti standardne devijacije, što ukazuje da je tačnost i reproduktivnost metode je veoma dobra, i da se metoda može uspešno primeniti za određivanje hesperidina u biološkim tečnostima kao što su humani serum i humana plazma. Dobijene veoma visoke ″recovery″ vrednosti objašnjavaju se činjenicom da je detekcija komponenata analiziranog uzorka LC-MS/MS metodom znatno osetljivija i specifičnija u poređenju sa drugim metodama, tako da je i opseg koncentracija koje se ovom metodom mogu određivati od 10 do 100 puta niži nego u slučaju kada se određivanje vrši HPLC/UV metodom. Ovaj opseg koncentracija je optimalan, zato što se koncentracija hesperidina u uzorcima humane plazme, posle oralne upotrebe tableta koje sadrže hesperidin, upravo nalazi u ovom koncentracionom opsegu. Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje hesperidina u farmaceutskim preparatima i uzorcima humane plazme je jednostavna, tačna, precizna i reproduktivna, i omogućuje direktno i jednostavno određivanje hesperidina bez njegove estrakcije iz uzorka. Određivanje hesperidina u doziranim oblicima je uspešno, pod uslovom da analizirani preparati ne sadrže flavonoide koji bi kompleksiranjem sa aluminijum(III)-jonom dali specifičnu fluorescenciju na λex = 390 nm i λem = 476 nm u prisustvu SB 12. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima humane plazme, nakon kompleksiranja sa aluminijum(III)-jonom, pokazuje visoku preciznost i tačnost, pa se metoda može primeniti za rutinsku analizu hesperidina u kliničkim laboratorijama. Takođe, spektrofluorimetrijska metoda je jednostavnija i brža u odnosu na LC-MS/MS metodu. 96 4.3. Kompleks aluminijum(III)- kvercetin 4.3.1. Ekscitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- kvercetin Aluminijum(III)-jon i kvercetin formiraju kompleks u 70 %v/v metanolu intenzivne žuto-narandžaste boje, koji je stabilan u pH oblasti 2,0–5,5. Na slici 4.3.1. prikazani su ekscitacioni spektri metanolnih rastvora aluminijum(III)–kvercetin kompleksa (kriva 1′), kvercetina (kriva 2′) i emisioni spektri aluminijum(III)–kvercetin kompleksa (kriva 1) i kvercetina (kriva 2). Ekscitacioni maksimum kompleksa nalazi se na λex = 420 nm, a emisioni maksimum na λem = 480 nm. Fluorescencija rastvora kvercetina (c = 2,0 ×10–7mol dm-3) koji pokazuje slabu fluorescenciju na λem = 500 nm, intenzivno raste postepenim dodavanjem rastvora aluminijum(III)- nitrata. To je očekivano, s obzirom da dolazi do formiranja kompleksa aluminijum(III)–kvercetin, koji pokazuje intenzivnu fluorescenciju na λem = 480 nm. 300 350 400 450 500 550 600 0 200000 400000 600000 800000 1000000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . λ / nm 1, 1 2, 2 Slika 4.3.1. Eksitaciono-emisioni spektri kompleksa aluminijum(III)- kvercetin (1, 1′) i kvercetina (2, 2′) 97 Formirani kompleks aluminijum(III)–kvercetin pokazuje značajnu fluorescenciju na λem = 480 nm. Emisioni maksimum ovog kompleksa hipsohromno je pomeren za 20 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog kvercetina. 4.3.2. Određivanje sastava kompleksa aluminijum(III)-kvercetin Aluminijum(III)-jon i kvercetin reakcijom kompleksiranja grade kompleks sastava Aluminijum(III): kvercetin =2:1. Sastav kompleksa je određen metodom molskih odnosa, merenjem intenziteta fluorescencije rastvora koji sadrže konstantnu koncentraciju aluminijum(III)-nitrata koja je iznosila 1,0 ×10-8 mol dm-3 i različite koncentracije kvercetina (od 5,0 × 10–9 do 2,0 ×10–7 mol dm-3). Merenja su izvršena na λex = 420 nm i λem= 480 nm u acetatnom puferu pripremljenom u 70 %v/v metanolu, kome je vrednost iznosila pH = 3,30. Širine otvora za ekscitacione i emisione snopove podešene su na 5 nm. Predstavljanjem intenziteta fluorescencije ispitivanih rastvora u funkciji odnosa koncentracija kvercetina i aluminijum(III)-jona dobija se eksponencijalna zavisnost. Presek tangenti na pravolinijske delove krive javlja se na vrednosti AlKverc cc / = 0,5, što pokazuje da nastaje kompleks sastava Al(III): kvercetin =2:1. Kao slepa proba korišćen je 1,0 ×10-8 mol dm-3 rastvor aluminijum(III)-nitrata u acetatnom puferu pH =3,30 u 70% v/v metanolu. Dijagram zavisnosti intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- kvercetin od odnosa koncentracija kvercetina i aluminijum(III)-jona prikazan je na slici 4.3.2. 98 0 2 4 6 8 10 0 50000 100000 150000 In te n zi te t flu o re sc en ci je, a. u . cKverc/cAl3+ Slika 4.3.2. Metoda molarnih odnosa. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-kvercetin od odnosa koncentracija kvercetina i aluminijum(III)-jona, +3/ AlKverc cc . (λex = 420 nm i λem= 480 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm ) Metodom varijacija ekvimolarnih rastvora takođe je određen sastav ovog kompleksa. Izmereni su intenziteti fluorescencije serije rastvora, koja je dobijena mešanjem ekvimolarnih rastvora aluminijum(III)-nitrata i kvercetina, čije su koncentracije iznosile 1,0 ×10-6 mol dm-3. Sva merenja su izvršena na λex = 420 nm i λem= 480 nm u metanolnom acetatnom puferu pH = 3,30. Slepa proba za svaki rastvor ove serije bila je različita, i sadržavala je ekvimolarnu koncentraciju aluminijum(III)- nitrata. Molski udeo aluminijum(III)-jona iznosio je od 0,2 do 0,8; koncentracija aluminijum(III)-jona se nalazila u opsegu od 2,0 × 10-7 mol dm-3 do 8,0 × 10-7 mol dm-3. Zavisnost intenziteta fluorescencije rastvora od molskog udela aluminijum(III)-jona predstavljena je krivom prikazanom na slici 4.3.3. Prikazana kriva ima maksimum na 67,0=Alx , što potvrđuje sastav kompleksa Al(III): kvercetin =2:1 99 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 150000 200000 250000 300000 350000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . xAl3+ 4.3.3. Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-kvercetin od molske frakcije aluminijum(III)-jona, +3Alx na pH = 3,30. (λex = 420 nm i λem= 480 nm širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm ) Sastav kompleksa aluminijum(III)-kvercetin određivan je metodom molarnih odnosa i metodom varijacija ekvimolarnih rastvora. Obe metode su potvrdile da na pH vrednosti pH = 3,30 nastaje samo jedna kompleksna vrsta sastava Al2Querc4+. Sastav ovog kompleksa je određivan i na višim pH vrednostima (4,00; 4,50) i na obe pH vrednosti pored kompleksne vrste Al2Querc4+ nastajala je i izvesna količina kompleksa sastava aluminijum(III): kvercetin = 1:1. Određivanje sastava kompleksa metodom varijacija ekvimolarnih rastvora (Žobova metoda) na vrednosti pH = 4,50 prikazano je na slici 4.3.4. Izmereni su intenziteti fluorescencije serije rastvora, koja je dobijena mešanjem ekvimolarnih rastvora aluminijum(III)-nitrata i kvercetina, čije su koncentracije iznosile 1,0 ×10-6 mol dm-3. Sva merenja su izvršena na λex = 420 nm i λem= 480 nm u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v% metanolu, na pH = 4,50. Slepa proba za svaki rastvor ove serije bila je različita, i sadržavala je ekvimolarnu 100 koncentraciju aluminijum(III)-nitrata. Molski udeo aluminijum(III)-jona iznosio je od 0,2 do 0,8; koncentracija aluminijum(III)-jona se nalazila u opsegu od 2,0 ×10-7 mol dm-3 do 8,0 ×10-7 mol dm-3. 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 10000 15000 20000 25000 30000 In te n zi te t flu o re sc en ci je, a. u . xKverc 4.3.4. Metoda varijacija ekvimolarnih rastvora. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-kvercetin od molske frakcije kvercetina, Kvercx na pH vrednosti 4,50. (λex = 420 nm i λem= 480 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm ) Nastajanje kompleksne vrste AlKverc2+ je očekivano, jer porastom pH, dolazi do disocijacije kvercetina. Kako kvercetin u reakciji kompleksiranja učestvuje u anjonskom obliku, raste verovatnoća da će pored kompleksne vrste Al2Kverc4+, doći i do građenja kompleksa sastava AlKverc2+. Prema podacima dostupnim iz literature, uočava se da u reakciji kompleksiranja aluminijum(III)-jona i kvercetina nastaju kompleksne čestice različitog stehiometrijskog sastava. 101 A. Gutierrez i M. Gehlen,33 su utvrdili metodom molarnih odnosa, da u reakciji kompleksiranja kvercetina sa aluminijum(III)-jonom nastaju tri kompleksne vrste: u metanolu nastaju kompleksi sastava Al2Kverc33+, Al2Kverc4+ i AlKverc2+ a u metanolu kome je dodata nitratna kiselina nastaje kompleks aluminijum(III) : kvercetin = 1 : 1. Ovaj kompleks je ispitivan spektrofluorimetrijski u rastvorima metanol-voda sa i bez prisustva surfaktanata. Podaci koji su dobijeni ukazuju da u rastvoru metanol-voda nastaje kompleks aluminijum(III): kvercetin = 2:1, a u rastvorima metanol-voda u koji je dodata 0,1 mol dm-3 nitratna kiselina, nastaje kompleks sastava 1:1.33 Takođe je potvrđeno nastajanje ove dve kompleksne vrste u prisustvu koloidne silikatne matrice.52 Spektoskopska studija ovog sistema iz 2002. godine,53 takođe potvrđuje prisustvo dve kompleksne vrste u 90 % v/v metanolu: Al2Kverc AlKverc2 u rastvoru metanol-voda, a uz dodatak 0,01 mol dm-3 hloridne kiseline, formira se kompleksna vrsta AlKverc, dok su u alkalnoj sredini prisutne sve tri kompleksne vrste. Septhum i grupa autora138 su utvrdili metodom molarnih odnosa da u vodenim rastvorima, bez podešavanja pH, nastaje kompleksna vrsta AlKverc, a u acetatnom puferu na pH vrednosti pH = 4,50, u vodenoj sredini, nastaje takođe kompleks sastava AlKverc. E.A. Saad i autori143 su pokazali da aluminijum(III)-jon i kvercetin u prisustvu površinski aktivne materije PVPa (polivinilpirolidon) nastaje kompleks sastava aluminijum(III): kvercetin = 1:3. Na osnovu iznetih činjenica do kojih smo došli pregledom literature, može se zaključiti da u reakciji kompleksiranja aluminijum(III)-jona i kvercetina ne nastaje samo jedna kompleksna vrsta, već da na stehiometrijski sastav značajno utiču osobine sredine u kojoj nastaje kompleks ( pH vrednost i vrsta rastvarača). 4.3.3. Reakcija formiranja kompleksa Izvršena su merenja pH ekvimolarnih rastvora kvercetina i aluminijum(III)- nitrata u 70% v/v metanolu, a zatim je meren i pH rastvora koji je sadržavao aluminijum(III)-jon i kvercetin u koncentaciji koja je bila ista kao i njihova koncentracija u posebnim rastvorima. Rezultati su prikazani u Tabeli 4.3.1. 102 Tabela 4.3.1. Rezultati dobijeni pH-metrijskim merenjima ekvimolarnih rastvora kvercetina, aluminijum(III)-nitrata i njihove smeše u 70% v/v metanolu Kvercetin, c= 1×10-7 mol dm-3 Al(NO3)3, c= 1×10-7 mol dm-3 Smeša pH 8,05 6,72 3,97 +Hc 8,91×10-9 mol dm-3 1,91×10-7 mol dm-3 1,07×10-4 mol dm-3 +Σ Hc smc 2,00×10 -7 mol dm-3 1,07×10-4 mol dm-3 ++ Σ−=∆ HsmH ccc 1,070×10 -4 mol dm-3 Niže vrednosti pH smeše pokazuju da se reakcija odvija uz oslobađanje vodonikovih jona, odnosno, da kvercetin učestvuje u reakciji građenja kompleksa u anjonskom obliku. Na višim pH vrednostima (pH >4,0), smanjuje se koncentracija kompleksne vrste u rastvoru, što može biti posledica hidrolize kompleksa. Reakcija formiranja kompleksa kvercetina i aluminijum(III)-jona može se prikazati na sledeći način: [ ] +++ +→+ HOHCAlHOHCAl 22 478152278153 (4.14) Predpostavlja se da nastaje kompleks koji ima stukturu prikazanu Shemom 4: O -O OH OH OH O O Al 3+ Al 3+ Shema 4: Predpostavljena struktura kompleksa aluminijum(III)-kvercetin 103 Porast intenziteta fluorescencije nakon heliranja kvercetina sa aluminijum(III)-jonom, slično kao i kod formiranja kompleksa aluminijum(III)-morin, pripisuje se povezanosti dva važna efekta: (a) inhibicji ekscitovanog stanja intramolekularnog transfera protona između C3- hidroksilne i C4-karbonilne grupe na A i C prstenu, i (b) opadanju sposobnosti formiranja vodoničnih veza molekula morina sa molekulima rastvarača usled kompleksiranja. U ispitivanom kompleksu aluminijum(III)-kvercetin dolazi do intenzivne emisije koja je posledica pi*→pi singletnog prelaza. Emisija formiranog kompleksa je značajno veća u osnosu na slabu emisiju čistog kvercetina. Intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa veoma zavisi od pH sredine zbog inter i intramolekulskog transfera protona. Na to ukazuje i oblik krive zavisnosti intenziteta fluorescencije kompleksa od pH sredine, prikazan na slici 4.3.5. 4.3.4. Određivanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- kvercetin Izračunavanje koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- kvercetin izvršeno je prema jednačinama datim u poglavlju 3.3. Za smešu rastvora aluminijum(III)-nitrata i kvercetina izmereni su intenziteti fluorescencije na različitim vrednostima pH (eksperimentalni uslovi: λex = 420 nm i λem= 480 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm). Zavisnost intenziteta fluorescencije od pH vrednosti smeše predstavljena je na slici 4.3.5. Koncentracija aluminijum(III)-nitrata u smeši bila je 1,0 ×10-8 mol dm-3, a koncentracija kvercetina je iznosila 2,0 ×10-7 mol dm-3. Slepa proba je bio rastvor kvercetina u acetatnom puferu koji je pripremljen u 70 v/v% metanolu, odgovarajuće pH vrednosti, i čija je koncentracija bila kao u ispitivanoj smeši (2,0×10-7 mol dm-3). 104 2 3 4 5 6 150000 200000 250000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . pH Slika 4.3.5. Zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)- kvercetin od pH vrednosti. (λex = 420 nm i λem= 480 nm; širine otvora za ekscitacione i emisione snopove su bile 5 nm) Iz maksimalne vrednosti intenziteta fluorescencije, očitane sa krive IF = f (pH) (slika 4.3.5.), koja se nalazi na pH vrednosti 3,33, izračunata je prema jednačini (3.4.) konstanta k koja iznosi k= 4,24×1013. Iz podataka za intenzitete fluorescencije na različitim vrednostima pH, dobijenih sa krive prikazane na slici 4.3.5. i jednačina izvedenih iz reakcije formiranja kompleksa datih u poglavlju 3.4. i konstanti disocijacije kvercetina,144 kd1 = 3,02 ×10-4 i kd2 = 4,37 ×10-10 izračunate su opšte koncentracione konstante stabilnosti formiranog kompleksa β: β = ][][ ][ 23 4 2 −+ + KvercAl KvercAl (4.15.) gde su sa [Al2Kverc4+], [Al3+], [Kverc-] označene koncentracije kompleksa aluminijum(III) -kvercetin, aluminijum(III)-jona i kvercetina u anjonskom obliku. Vrednosti koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa β na različitim pH vrednostima, date su u tabeli 4.3.2. 105 Tabela 4.3.2. Vrednosti opštih koncentracionih konstanti stabilnosti β kompleksa aluminijum(III)-kvercetin U literaturi nema mnogo podataka za vrednosti opštih koncentracionih konstanti stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-kvercetin. G. Erdogan i grupa autora145 u svom radu iz 1981. godine, su spektrofotometrijski i potenciometrijski određivali konstante stabilnosti kompleksa aluminijum(III)-kvercetin sastava 1:1, i dobili da vrednost ove konstante iznosi log K = 14,05. Prema E.A. Saadu i autorima143 koji su ispitivali aluminijum(III)-kvercetin kompleks sastava AlKverc3, u prisustvu površinski aktivne materije PVPa, konstanta stabilnosti ovog kompleksa iznosi log K = 13,42 (ne navodi se pH vrednost na kojoj je konstanta stabilnosti izračunata). Prema izračunatim vrednostima konstanti stabilnosti ispitivanog kompleksa Al2Kverc4+ koje su prikazane u tabeli 4.3.2. može se zaključiti da pH vrednost značajno utiče na reakciju formiranja kompleksa, a samim tim i na vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti. S obzirom da nastaje kompleks sastava Al2Kverc4+ dobijaju se vrlo velike vrednosti za konstantu stabilnosti kompleksa. Iz tabele 4.3.2. jasno se vidi da su najveće vrednosti konstante stabilnosti dobijene u opsegu između 3,00-4,00 pH jedinica. U ovoj oblasti najveće su i vrednosti intenziteta fluorescencije kompleksa, što je i prikazano na slici 4.3.5. Očekivano bi bilo da vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa raste pri povećanju pH preko 4,00, jer pH IF ckompl cAl cKverc ß log ß 3,00 199000 4,68×10-9 6,1×⋅10-10 2,58×10-17 4,88×1026 26,69 3,20 209000 4,93×10-9 1,4×10-10 4,08×10-17 6,16×1027 27,79 3,50 203000 4,79×⋅10-9 4,2×⋅10-10 8,15×10-17 3,33×1026 26,52 3,75 192000 4,48×10-9 9,4×⋅10-10 1,45×10-16 3,49×1025 25,54 4,00 187500 4,42×⋅10-9 1,16×10-9 2,58×10-16 1,27×1025 25,10 4,50 188700 4,45×10-9 1,10×⋅10-9 8,16×10-16 4,51×1024 24,65 4,75 183000 4,32×10-9 1,37×⋅10-9 1,45×10-15 1,59×1024 24,20 5,00 168000 3,96×10-9 2,08×10-9 2,59×10-15 3,54×1023 23,55 106 se povećanjem pH vrednosti favorizuje disocijacija kvercetina, (porastom pH vrednosti dolazi do porasta koncentracije anjonskog oblika kvercetina, što i sledi iz tabele 4.3.2.), čime se povećava mogućnost njegove ugradnje u kompleks. Međutim, sa porastom pH vrednosti opada koncentracija slobodnog aluminijum(III)-jona, što je očekivana posledica njegove hidrolize, pa kao rezultat ove pojave, dolazi do smanjenja vrednosti konstante stabilnosti kompleksa na pH vrednostima preko 3,50. 4.3.5. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u 70 %v/v metanolu Dobijena vrednost opšte koncentracione konstante stabilnosti aluminijum(III)- kvercetin kompleksa ima veliku vrednost, što ukazuje da se u datim eksperimentalnim uslovima ( pH = 3,30, u 70 %v/v metanolu) formira stabilan kompleks. Kvercetin je određivan spektrofluorimetrijski na osnovu kalibracionog dijagrama koji predstavlja zavisnost intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-kvercetin od koncentracije kvercetina. Koncentracija aluminijum(III)-jona je uzeta u višku, te se može smatrati da je koncentracija kompleksa proporcionalna koncentaciji kvercetina. Dobijena je linearna zavisnost intenziteta fluorescencije ispitivanog kompleksa od koncentracije kvercetina, koja se može predstaviti regresionom jednačinom: )04,056,0()01,047,1( ±+±= KvercF cI (4.16.) gde IF predstavlja relativni intenzitet fluorescencije izražen u % (meren na λex= 420 nm i λem = 480 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm), a cKverc je koncentracija kvercetina izražena u ng cm-3. Koeficijent korelacije iznosi r = 0,9998. Linearnost je dobijena u koncentracionom opsegu od 1,5 do 60,5 ng cm-3 kvercetina. Vrednosti granice detekcije, LOD i granice kvantifikacije, LOQ računate su prema jednačinama (3.12.) i (3.13.) koje su date u poglavlju 3.4. Granica detekcije je iznosila LOD = 0,09 ng cm-3, a granica kvantifikacije LOQ = 0,27 ng cm-3. Tačnost i preciznost metode proverene su na tri različite koncentracije kvercetina. Rezultati određivanja su predstavljeni u Tabeli 4.3.3. 107 Tabela 4.3.3. Rezultati dobijeni spektrofluorimetrijskim određivanjem kvercetina Odmereno (ng cm-3) Nađeno (ng cm-3) „Recovery“(%) SD KV(%) 6,06 6,07 100,17 2,1⋅10-2 0,35 12,12 12,11 99,92 2,0⋅10-2 0,17 24,24 24,23 99,96 1,8⋅10-2 0,08 n=5 ″Recovery″ vrednosti koje se nalaze između 99,92 i 100,17 % i niske vrednosti standardne devijacije ukazuju na veoma dobru reproduktivnost merenja. 4.3.5.1. Spektrofluorimetrijsko određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima Sadržaj kvercetina određivan je u preparatu Quercetin + C kapsule (nominalni sadržaj jedne kapsule iznosi: 700 mg vitamina C, 250 mg kvercetin-dihidrata, ekscipienti: želatin, biljna stearinska kiselina i silicijum-dioksid), proizvođača Twinlab, USA u kojima je određivan sadržaj kvercetina. Uzorci za određivanje kvercetina u tabletama pripremljeni su prema proceduri opisanoj u poglavlju 3, a rezultati ovog određivanja prikazani su u tabeli 4.3.4. Tabela 4.3.4. Rezultati dobijeni spektrofluorimetrijskim određivanjem kvercetina u farmaceutskim preparatima Određen sadržaj kvercetin- dihidrata, mg „Recovery“ ( %) SD ( %) KV (%) Quercetin + C kapsule sadržaj kvercetin dihidrata deklarisan na 500 mg u dve kapsule 245,7 98,28 0,22 0,09 n=5 Da bi predložena spektrofluorimetrijska metoda mogla biti uspešno primenjena na određivanje sadržaja kvercetina u farmaceutskim preparatima koji ga sadrže, mora se utvrditi uticaj ekscipijenata i drugih prisutnih materija na intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa aluminijum(III)-kvercetin. Pri određivanju sadržaja kvercetina u 108 preparatu Quercetin + C kapsule, bilo je potrebno utvrditi uticaj prisutnog vitamina C i ekscipijenata na intenzitet fluorescencije rastvora koji je dobijen od pripremljenog uzorka Quercetin + C kapsula prema proceduri opisanoj u poglavlju 3. Zbog toga je napravljena smeša koja je sadržavala vitamin C, i navedene eksipijente u odnosu u kome se oni nalaze u preparatu. Ova smeša je tretirana na isti način, odnosno prema predloženoj proceduri za analizu kvercetina u preparatu. Izmeren je emisioni spektar dobijenog rastvora koji je sadržavao ekscipijente i vitamin C. Uslovi u kojima je snimljen ovaj spektar bili su λex= 420 nm i λem = 480 nm, širine otvora za ekscitacione i emisione snopove iznosile su 5 nm. Emisioni spektar uzorka kapsula prikazan je krivom 1 na slici 4.3.6., a kriva 2 predstavlja emisioni spektar uzorka koji je sadržavao samo vitamin C i ekscipijente. 450 500 550 600 0 20000 40000 60000 In te n zi te t f lu o re sc en ci je, a. u . λ / nm 1 2 Slika 4.3.6. Emisioni spektar aluminijum(III)–kvercetin kompleksa u preparatu Quercetin + C kapsule (1) i smeše ekscipijenata (2). Iz emisionog spektra rastvora koji je sadržavao ekscipijente i vitamin C u 70 v/v% metanolu, prikazanog krivom 2 na slici 4.3.6., uočava se da ekscipijenti ne 109 pokazuju značajnu interferenciju pri određivanju kvercetina. U okviru izabranih eksperimentalnih uslova, utvrđeno je da se predložena spektrofluorimetrijska metoda može uspešno koristiti za određivanje kvercetina u preparatu Quercetin + C kapsule. U odnosu na metode koje su razvijene za određivanje sadržaja kvercetina u farmaceutskim preparatima i sirovinama, a koje su zasnovane na spektrofotometrijskim merenjima,47, 97 kao i u odnosu na HPLC metodu98 koja je razvijena za simultano određivanje kvercetina i luteolina u kapsulama, predložena spektrofluorimetrijska metoda pokazuje veću osetljivost, preciznost, ima niže vrednosti granice detekcije LOD i granice kvantifikacije LOQ oko 1000 puta. 4.3.5.2. Spektrofluorimetrijsko određivanje polifenola u sokovima od jabuke Spektrofluorimetrijski je određivan ukupni sadržaj polifenola u različitim uzorcima sokova od jabuke, koji se nalaze na tržištu u Srbiji. Sadržaj polifenola u uzorcima je izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE- quercetin equivalent). Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje ukupnog sadržaja polifenola bazirana je na merenju intenziteta fluorescencije kompleksa aluminijum(III)-kvercetin i izražavanju sadržaja ukupnih polifenola preko ekvivalent kvercetina (QE). Uzorci za određivanje sadržaja polifenola u soku od jabuke pripremljeni su prema proceduri opisanoj u poglavlju 3, a rezultati određivanja prikazani su u tabeli 4.3.5. U drugoj koloni ove tabele prikazan je sadržaj polifenola izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE). 110 Tabela 4.3.5.: Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanjae sadržaja ukupnih polifenola u soku od jabuke Vrsta soka Sadržaj polifenola, mg dm-3 SD Life (Nectar) 3,90 3,2×10-3 Happy day 4,52 3,4×10-3 Next (100%) 9,77 2,9×⋅10-3 Next 5,64 3,2×10-3 Nectar 8,76 2,6×10-3 Golf 9,70 2,7×10-3 Bravo 5,59 3,0×10-3 n=5 Kako se iz tabele vidi, ukupan sadržaj polifenola u voćnim sokovima varira u zavisnosti od vrste i sorte jabuka od koje je sok proizveden, od geografske regije u kojoj je voće proizvedeno, klime, svojstava tla, sezone, načina skladištenja, broja sunčanih dana, i drugih uslova. S obzirom da ukupan sadržaj polifenola u voću nije deklarisan, nije bilo moguće odrediti ″recovery″ vrednosti. U odnosu na metodu za određivanje sadržaja polifenola u sokovima od jabuke, paradajza, i u čajevima, a koja je zasnovana na senzibilisanoj fluorescenciji kompleksnog jedinjenja koje nastaje u reakciji terbijum(III)-jona i flavonola,133 predloženom spektrofluorimetrijskom metodom se mogu određivati niže koncentracije polifenola u uzorcima (linearnost se postiže u opsegu koncentracija od od 1,5 do 60,5 ng cm-3 kvercetina). Postignute vrednosti granice detekcije spektrofluorimetrijskom metodom (LOD = 0,09 ng cm-3) su oko dvadeset puta niže u odnosu na metodu koju su razvili M. Shaghaghia i saradnici.133 43.6. HPLC određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima Za proveru pouzdanosti predložene spektrofluorimetrijske metode za određivanje kvercetina u rastvorima metanol-voda razvijena je RP-HPLC metoda sa 111 UV-Vis detekcijom za određivanje kvercetina. Na slici 4.3.7. prikazan je hromatogram standardnog rastvora kvercetina pod optimalnim uslovima. Uzorci kapsula preparata Quercetin + C kapsula za RP-HPLC analizu pripremljeni su na način kako to propisuje procedura za pripremu uzorka kapsula koja je opisana u poglavlju 3. Različiti alikvoti ovako pripremljenog rastvora kapsula analizirani su u HPLC sistemu sa AquaGold aQ kolonom i UV detekcijom. Slika 4.3.7. Hromatogram kvercetina pod optimalnim uslovima Hromatogram dobijen analizom preparata Quercetin + C kapsula prikazan je na slici 4.3.8. Pik kvercetina na ovom hromatogramu se pojavljuje na vrednosti retencionog vremena od 6,18 minuta (ova vrednost retencionog vremena za kvercetin potvrđena je hromatogramom standardne supstance- kvercetina i proverom UV i masenih spektara odgovarajućeg pika- slika 4.3.7.). 112 Slika 4.3.8. Hromatogram dobijen analizom preparata Quercetin + C kapsule; pik kvercetina dobijen na retencionom vremenu tr = 6,18 min Regresiona jednačina kalibracione prave za određivanje kvercetina RP-HPLC metodom, ima oblik: 33 10)002,005,0(10)05,038,4( ×±+×±= KverccA (N = 7, r = 1,0000) (4.17.) gde A predstavlja površinu pika a cKverc predstavlja koncentraciju kvercetina izraženu u µg cm-3. Linearnost je postignuta u koncentracionom opsegu hesperidina od 0,05–200,0 µg cm-3. Vrednost granice detekcije, LOD, izračunata iz parametara kalibracione prave, iznosila je 0,066 µg cm-3, a vrednost granice kvantifikacije, LOQ, 0,02 µg cm-3. Tačnost metode je proverena za tri nivoa različitih koncentracija kvercetina i to za nivoe: 80%, 100% i 120%, tehnikom standardnog dodatka. Sve analize su urađene tri puta i izračunata je standardna devijacija i ″recovery″ vrednosti. Iz tabele 4.3.6. se učava da su ″recovery″ vrednosti u opsegu od 99,12 – 103,37 %, što potrvđuje da je metoda tačna i prezina za određivanje kvercetina. 113 Tabela 4.3.6. Rezultati određivanje sadržaja kvercetina RP-HPLC/UV metodom Kvercetin 80% Dodato (µg cm-3) 73,00 Nađeno (µg cm-3) 75,4 ± 0,8 „Recovery“ (%) 103,37 100% Dodato (µg cm-3) 91,26 Nađeno (µg cm-3) 90,46 ± 0,7 „Recovery“ (%) 99,12 120% Dodato (µg cm-3) 109,51 Nađeno (µg cm-3) 108,77 ± 0,6 „Recovery“ (%) 99,32 n=3 Sadrzaj kvercetina u kapsulama određen je RP-HPLC/UV metodom, a rezultati određivanja su prikazani u tabeli 4.3.7. Tabela 4.3.7. Rezultati spektrofluorimetrijskog određivanja kvercetina u preparatu Quercetin + C kapsula Određen sadržaj kvercetin-dihidrata, mg Recovery ( %) SD ( %) KV (%) Quercetin + C kapsule sadržaj kvercetin dihidrata deklarisan na 500 mg u dve kapsule 243,0 97,2 0,31 0,15 n=5 Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima je jednostavna, tačna, precizna i reproduktivna, i omogućava direktno i jednostavno određivanje kvercetina bez njegove estrakcije iz uzorka. Spektrofluorimetrijski se i u ovom slučaju dobijaju mnogo niže vednosti za granicu detekcije, LOD, i granicu kvantifikacije, LOQ, od vrednosti dobijenih RP- HPLC/UV metodom. Određivanje kvercetina u doziranim oblicima je uspešno, pod 114 uslovom da analizirani preparati ne sadrže flavonoide koji bi kompleksiranjem sa aluminijum(III)-jonom dali specifičnu fluorescenciju na λem = 480 nm uz ekscitaciju molekula na λex = 420 nm. 115 5. ZAKLJUČAK Na osnovu prikazanih eksperimentalnih rezultata može se zaključiti sledeće: Aluminijum(III)-jon i morin grade kompleks intenzivno žuto-zelene boje u 70 % v/v etanolu, koji je stabilan u pH oblasti od 3,0 do 6,0. Formirani kompleks ima sastav aluminijum(III) : morin = 1:2. Aluminijum(III)-morin kompleks pokazuje intenzivnu fluorescenciju na λem = 500 nm, pri ekscitaciji na λex=410 nm, a emisioni maksimum formiranog kompleksa se batohromno pomera za 10 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog morina. U reakciji aluminijum(III)-jona i hesperidina u 70 % v/v metanolu nastaje kompleks žute boje, koji je stabilan u pH oblasti od 3,0 do 7,0. U reakciji kompleksiranja gradi se kompleks koji ima sastav aluminijum(III) : hesperidin = 1:1. Formirani kompleks aluminijum(III)–hesperidin, pokazuje značajnu fluorescenciju na λem = 490 nm pri ekscitaciji na λex = 390 nm, a emisioni maksimum kompleksa je batohromno pomeren za 70 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog hesperidina. Utvrđeno je da se intenzitet fluorescencije formiranog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin u 70 % v/v metanolu u prisustvu surfaktanta SB 12 značajno povećava u odnosu na intenzitet fluorescencije ovog kompleksa u 70 % v/v metanolu bez prisustva SB 12. Uočeno je da se talasna dužina maksimuma u emisonom spektru kompleksa, u prisustvu površinski aktivne materije SB 12, hipsohromno pomera sa λem= 490 nm na λem= 476 nm i da je intenzitet fluorescencije ispitivanog kompleksa oko četiri do pet puta veći u odnosu na intenziet fluorescencije kompleksa u metanolno-vodenim rastvorima bez prisustva SB 12. Aluminijum(III)-jon i kvercetin formiraju kompleks u 70 % v/v metanolu intenzivne žuto-narandžaste boje, koji je stabilan u pH oblasti od 2,0 do 5,5 pH jedinica. U reakciji kompleksiranja u 70 % v/v metanolu nastaje kompleks sastava aluminijum(III) : kvercetin = 2:1. Ekscitacioni 116 maksimum kompleksa nalazi se na λex = 420 nm, a emisioni maksimum na λem= 480 nm. Formirani kompleks aluminijum(III)–kvercetin pokazuje značajnu fluorescenciju na λem = 480 nm. Emisioni maksimum ovog kompleksa hipsohromno je pomeren za 20 nm u odnosu na emisioni maksimum čistog kvercetina. Reakcija kompleksiranja u kojoj učestvuju aluminijum(III)-jon i ispitivani flavonoidi (morin, hesperidin i kvercetin) odvija se uz oslobađanje vodonikovih jona, što potvrđuje da ispitivani flavonoidi učestvuju u reakciji građenja kompleksa u anjonskom obliku. Formirani kompleksi imaju veoma visoke vrednosti konstanti stabilnosti kompleksa. Konstanta stabinosti kompleksa aluminijum(III)–morin na pH vrednosti pH = 4,40 iznosi log ß2=16,96. Za kompleks aluminijum(III)– hesperidin izračunata konstanta stabilnosti na pH =4,50 ima vrednost log ß1 = 7,50, dok konstanta stabilnosti ovog kompleksa u prisustvu površinski aktivne materije, SB 12, na istoj vrednosti pH iznosi log ß1 = 9,20. Poređenjem vrednosti konstanti stabilnosti ovog kompleksa koje su izračunate u jednom slučaju za rastvore kompleksa u 70 % v/v metanolu bez prisustva SB 12 a u drugom za rastvore kompleksa u 70 % v/v metanolu u prisustvu SB 12, uočava se da se u prisustvu surfaktanta povećava stabilnost kompleksa, odnosno da su konstante stabilnosti formiranog kompleksa veće u prisustvu SB 12 na svim poređenim pH vrednostima. Vrednost konstante stabilnosti kompleksa aluminijum(III)– kvercetin iznosi log ß=27,79 na pH vrednosti pH =3,20. Opšte koncentracione konstante stabilnosti kompleksa aluminijum(III)- flavonoid (morin, hesperidin, kvercetin) imaju velike vrednosti, što ukazuje da se u datim eksperimentalnim uslovima (odgovarajuća vrednost pH, u smešama etanol-voda odnosno metanol-voda) formiraju stabilni kompleksi. Stoga je bilo moguće razviti metode za spektrofluorimetrijsko određivanje ovih flavonoida u različitim uzorcima. 117 Razvijena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje morina u 70 %v/v etanolu i u uzorcima humanog seruma primenom metode kalibracione krive. Za proveru pouzdanosti predložene spektrofluorimetrijske metode za određivanje morina, razvijena RP- HPLC/UV metoda za njegovo određivanje. Spektrofluorimetrijska metoda omogućava direktno i jednostavno određivanje morina bez njegove estrakcije iz uzorka, koja se primenjuje kod HPLC metode sa UV-Vis detekcijom. Spektrofluorimetrijski se takođe, dobijaju mnogo niže vednosti za granicu detekcije, LOD, i granicu kvantifikacije, LOQ, od vrednosti dobijenih HPLC metodom, što nesumnjivo predstavlja prednost pri primeni ove metode. Razvijena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje hesperidina u 70 %v/v metanolu primenom kalibracionog dijagrama. Predloženu spektrofluorimetrijsku metodu bilo je moguće primeniti za određivanje sadržaja hesperidina u različitim sokovima od pomorandže, koji se nalaze na tržištu u Srbiji. Reakcija dobijanja stabilnog kompleksa aluminijum(III)-hesperidin, u prisustvu surfaktanta SB 12, upotrebljena je za postavljanje spektrofluorimetrijske metode za određivanje sadržaja hesperidina u farmaceutskim preparatima i uzorcima humane plazme. Da bi se proverila pouzdanost predložene spektrofluorimetrijske metode, kao referentna metoda je razvijena je i modifikovana HPLC metoda za određivanje hesperidina. U uzorcima humane plazme korišćena je LC–MS/MS metoda, a HPLC/UV metoda je upotrebljena za određivanje sadržaja hesperidina u tabletama. Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje hesperidina u farmaceutskim preparatima i uzorcima humane plazme je jednostavna, tačna, precizna i reproduktivna, i omogućuje direktno i jednostavno određivanje hesperidina bez njegove estrakcije iz uzorka. Određivanje hesperidina u doziranim oblicima je uspešno, pod uslovom da analizirani preparati ne sadrže flavonoide koji bi kompleksiranjem sa aluminijum(III)-jonom dali specifičnu fluorescenciju na λex = 390 nm i λem = 476 nm. Spektrofluorimetrijsko određivanje hesperidina u uzorcima 118 humane plazme, nakon kompleksiranja sa aluminijum(III)-jonom, pokazuje visoku preciznost i tačnost, pa se metoda može primeniti za rutinsku analizu hesperidina u kliničkim laboratorijama. a u odnosu na LC-MS/MS metodu, spektrofluorimetrijska metoda je jednostavnija i brža. Poređenjem analitičkih parametara za spektofluorimetrijsko određivanje hesperidina u prisustvu surfaktanta SB 12 i analitičkih parametara za određivanje hesperidina u ispitivanim rastvorima bez prisustva surfaktanta, uočava se da se spektrofluorimetrijskim određivanjem hesperidina u prisustvu SB 12 postiže veća osetljivost i preciznost određivanja, koja je i neophodna za određivanje hesperidina u biološkim tečnostima i doziranim oblicima. Međutim, imajući u vidu očekivani opseg koncentracija hesperidina u voćnim sokovima, jasno je da dobijene vrednosti sadržaja hesperidina predloženom procedurom za njegovo spektrofluorimetrijsko određivanje bez prisustva surfaktanta SB 12, pokazuju zadovoljavajuću osetljivost i tačnost. Postavljena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje kvercetina u 70 %v/v metanolu primenom kalibracionog dijagrama. Da bi se proverila pouzdanost predložene spektrofluorimetrijske metode, kao referentna metoda razvijena je RP-HPLC/UV metoda za određivanje sadržaja kvercetina u tabletama. Predložena spektrofluorimetrijska metoda je primenjena za određivanje sadržaja kvercetina u farmaceutskim preparatima. Predložena spektrofluorimetrijska metoda za određivanje kvercetina u farmaceutskim preparatima je jednostavna, tačna, precizna i reproduktivna, i omogućava direktno i jednostavno određivanje kvercetina bez njegove estrakcije iz uzorka. Spektrofluorimetrijski se i u ovom slučaju dobijaju mnogo niže vrednosti za granicu detekcije, LOD, i granicu kvantifikacije, LOQ, od vrednosti dobijenih RP-HPLC/UV metodom. Određivanje kvercetina u doziranim oblicima je uspešno, pod uslovom da analizirani preparati ne sadrže flavonoide koji bi kompleksiranjem sa aluminijum(III)-jonom dali specifičnu fluorescenciju na λem = 480 nm uz ekscitaciju molekula na λex = 420 nm. 119 Predložena je spektrofluorimetrijska metoda za određivanje ukupnog sadržaja polifenola u soku od jabuka pri čemu je sadržaj ukupnih polifenola izražen u odnosu ekvivalent kvercetina (QE), koji je određivan spektrofluorimetrijski. 120 6. LITERATURA 1. J. B. Harborne, H. Baxter (Ed.). Handbook of Natural flavonoids. Vol 2. Chichester (UK): Wiley & Sons; (1999) 2. S.B. Lotito, B. Frei: ″Consumption of flavonoid rich foods and increased plasma antioxidant capacity in humans: cause, consequence, or epipHenomenon″. Free Radic Biol Med. 41 (2006) 1727-1746 3. Fang Fang, Jing-Ming Li, Qiu-Hong Pan, Wei-Dong Huang: ″Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging″. Food Chem. 101 (2007) 428–433 4. R. Omidbaigi, M. Faghih Nasiri: ″Quantitative distribution of hesperidin in Citrus species, during fruit maturation and optimal harvest time″. Natural Product Radiance 3 (2004) 1: 12-15); 5. Y. Nogata, K. Sakamoto, H. Shiratsuchi, T. Ishii, M. Yano, H. Ohta: “Flavonoid composition of fruit tissues of citrus species”. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 70 (2006) 1: 178–192 6. N. A. Tykavina, N. N. Pogodaeva, E. I. Brodskaya, Yu. M. Sapozhnikov: ″Ultraviolet absorption of flavonoids. V. The structure of 3- and 5- hydroxyflavones.″ Chemistry of Natural Compounds 11 (1975) 5: 613-616 7. M. Katyal: ″Flavones as analytical reagents″. Talanta 15 (1968) 95-106 8. E.M. Nevskaya, V.A. Nazarenko: ″Hydroxyflavones in analytical chemistry″. Zh. Analit. Khim. 27 (1972) 1699-1714 9. M. Katyal, S. Prakash: ″Analytical reactions of hydroxyflavones″. Talanta, 24 (1977) 367-375 10. G. Cao, E. Sofic, R.L. Prior: ″Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids: structure-activity relationships″. Free Radic. Biol. Med. 5 (1997) 749–760 11. J. E. Middleton, C. Kandaswami, T. C. Theoharides: ″The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer″. PHarmacol. Rev. 52 (2000) 4: 673-751 121 12. E. Jr. Middleton, C. Kandaswami: ″Effects of flavonoids on immune and inflammatory cell functions″. Biochem. PHarmacol. 43 (1992) 1167-1179 13. R. J. Williams, J. P. Spencer, C. Rice-Evans: ″Flavonoids: antioxidants or signalling molecules?″ Free Radic. Biol. Med. 36(2004) 7: 838-849 14. G. Weber: ″HPLC with electrochemical detection of metal-flavonoid- complexes isolated from food″. ChromatograpHia, 26 (1988) 133 -138 15. Y. C. Lee, C. Y. Huang, T. T. Wen, K. C. Suen: ″Determination of liquiritin, glycyrrhizin, hesperidin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, honokiol and magnolol in the traditional Chinese medicinal preparation Wuu-Ji-San by high-performance liquid chromatograpHy″ J. Chromatogr. A 692 (1995) 137- 145 16. U. Justesen, P. Knuthsen, T. Leth: ″Quantitative analysis offlavonols, flavones, and flavanones in fruits, vegetables and bever-ages by high- performance liquid chromatograpHy with pHoto-diode array and mass spectrometric detection″. J. Chromatogr. A, 79 (1998) 101-110 17. B. Liu, D. Anderson, D.R. Ferry, L.W. Seymour, P.G. de Takats, D.J. Kerr: ″Determination of quercetin in human plasma using reversed- pHase high-performance liquid chromatograpHy″. J. Chromatogr. B, 666 (1995) 149-155 18. S. G. Schulman (Ed.): Molecular Luminescence Spectroscopy: Methods and applications. Part I, Wiley, New York, (1985) 371-546 19. X. F. Long, S. P. Bi, H. Y. Ni, X. C. Tao, N. Gan: ″Resonance Rayleigh scattering determination of trace amounts of Al in natural waters and biological samples based on the formation of an Al(III)-morin-surfactant complex″. Anal. Chim. Acta 501 (2004) 89-97 20. R. Ghavami, A. Najafi, B. Hemmateenejad: ″Chemometrics-assisted spectropHotometric methods for simultaneous determination and complexation study of Fe(III), Al(III) and V(V) with morin in micellar media″. Spectrochim. Acta Part A, 70 (2008) 824–834 122 21. F. Hernandez Hernandez, J. Medina Escriche, R. Marin Saez, M. C. Roig Barreda: ″SpectropHotometric study of the iron(III)-morin complex in a micellar medium″. Analyst, 111 (1986), 1045-1049 22. M. Balcerzak, A. Tyburska, E. Swiecicka- Fűchsel: ″Selective determination of Fe(III) in Fe(II) samples by UV-spectropHotometry with the aid of quercetin and morin″. Acta PHarm. 58 (2008) 327–334). 23. S. Blagojević, D. Malešev, Z. Radović: ″SpectropHotometric and pH−matric investigation of Pd(II)−morin complex in 70% ethanolic solution″. Arh. farm. (1999) 5-6: 387-396. 24. Chang-li Zhou, Yan Lu, Xiu-ling Li, Chuan-Nan Luo, Zhen-wei Zhang, Jin- mao You: ″Adsorptive stripping voltammetric determination of antimony″. Talanta, 46 (1998) 1531 – 1536 25. S. Blagojević, M. Aleksić, D. Malešev, Z. Radović: ″Spektrofotometrijsko ispitivanje kompleksa titanil oksalat–morin u 50% V/V etanolu″, Arh. farm. 53 (2003) 1-2: 17-26 26. Q. K. Panhwar, S. Memon, M. I. Bhanger: ″Synthesis, characterization, spectroscopic and antioxidation studies of Cu(II)–morin complex″. J. Molec. Struct. 967 (2010) 47–53 27. E. Nagles, V. Arancibia, R. Ríos, C. Rojas: ″Simultaneous Determination of Lead and Cadmium in the Presence of Morin by Adsorptive Stripping Voltammetry with a Nafion–Ionic Liquid–coated Mercury Film Electrode″. Int. J. Electrochem. Sci., 7 (2012) 5521 – 5533 28. Zing-Xin Fan, Yong-Xi Zheng: ″Effect of cationic micelles on the fluorescence of the zirconium-morin complex″. Analyt. Chim. Acta, 281 (1993) 2: 353-360 29. F. Hernandez Hernandez, J. Medina Escriche, M.T. Gasco Andreu: ″Enhancement of the fluorescence of the zinc-morin complex by a non-ionic surfactant″. Talanta, 33 (1986) 6: 537–540 30. F. Wei, E. Ten, Z. Wu: ″Enhancement of the fluorescence of the beryllium- morin complex by non-ionic surfactants″. Talanta 37 (1990) 9: 947-950 123 31. Xiao-jing Liu , Yuan-zong Li, Yun-xiang Ci: ″Interaction of the La3+-Morin Complex with DNA″. Analytical Sciences, 13 (1997) 939-944 32. A. A. Ensafi, R. Hajian, S. Ebrahimi: ″Study on the interaction between Morin-Bi(III) complex and DNA with the use of methylene blue dye as a fluoropHor probe″. J. Braz. Chem. Soc., 20 (2009) 2: 266-276 33. A. C. Gutierrez, M.H. Gehlen: ″Time resolved fluorescence spectroscopy of quercetin andmorin complexes with Al3+″. Spectrochim. Acta Part A, 58 (2002) 83-89 34. V. A. Vitorello, A. Haug: ″An aluminum-morin fluorescence assay for the visualization and determination of aluminum in cultured cells of Nicotiana tabacum L. cv. BY-2″. Plant Science, 122 (1997) 35-42 35. H. Z. Lian, Y. F. Kang, S. P. Bi, A. Yasin, D. L. Shao, Y. J. Chen, L. M. Dai, L. C. Tian: ″Morin applied in speciation of aluminium in natural waters and biological samples by reversed-pHase high-performance liquid chromatograpHy with fluorescence detection″. Anal. Bioanal. Chem., 376 (2003) 4:542-548 36. J. Tria, E. C. V. Butler, P. R. Haddad, A. R. Bowie: ″Determination of aluminium in natural water samples″. Analyt. Chim. Acta 588 (2007) 153–165 37. S. M. Z. Al-Kindy, F. O. Suliman, S. B. Salama: ″A sequential injection method for the determination of aluminum in drinking water using fluorescence enhancement of the aluminum–morin complex in micellar media″. Microchem. J., 74 (2003) 173-179 38. M. A. Raggi, G. Varan, V. Cavrini, D. Lacche, L. Nobile: ″Fluorimetric Determination of Aluminium Traces (ppb) in Hemodialysis Solutions Using Morin and Pontachrome Blue Black″. Analyt. Lett., 19 (1986) 13-14: 1435- 1441 39. Z. Radović, D. Malešev, M. Jelikić-Stankov: ″SpectropHotometric determination of hesperidin by Zr(IV)-hesperidin complexation″. PHarmazie, 51 (1996) 8: 604-604 124 40. D. Malešev, Z. Radović, V. Kuntić, M. Kosanić: ″SpectropHotometric determination of hesperidin by Al(III)-hesperidin complex in water-methanol solution″. Analyt. Lett. 30 (1997) 5: 917-926 41. V. Kuntić, M. Kosanić, D. Malešev, Z. Radović U. Mioč: ″SpectropHotometric investigation of the uranyl(II)-hesperidin complex in 70% methanol″. J. Serb. Chem. Soc. 63 (1998) 7: 565-572 42. S. B. Etcheverry, E. G. Ferrer, L. Naso, J. V. Salinas, P. A. M. Williams: ″Antioxidant effects of the VO(IV) hesperidin complex and its role in cancer chemoprevention″ J. Biol. Inorg. Chem. 13 (2008) 435–447 43. T. Perez-Ruiz, C. Martinez-Lozano, V. Tomas, J. Fenoll ″Spectrofluorometric determination of hesperidin by manual and flow-injection methods″. Fresenius J. Anal. Chem. 364 (1999) 279-283 44. D. Mohamed, S. M. Tawakkol: ″Fluorimetric determination of diosmin and hesperidin in combined dosage forms and in plasma through complex formation with terbium″. Bulletin of Faculty of PHarmacy, Cairo University http://dx.doi.org/10.1016/j.bfopcu.2012.12.001. 45. Z. Radović, D. Malešev: ″Untersuchungen des Ni(II)-Quercetin-Komplexes Investigation of the Complex of Ni(II) and Quercetin″. Arch. PHarm 320 (1987), 188-189 46. V. Kuntić, S. Blagojević, V. Vukojević, D. Malešev, Z. Radović: ″SpectropHotometric investigation of the Pd(II)-quercetin complex in 50% ethanol″. Monatshefte fűr Chemie 129, (1998) 41-48. 47. V. Kuntić, N. Pejić, S. Mićić, V. Vukojević, Z. Vujić, D. Malešev: ″Determination of quercetin in pHarmaceutical formulations via its reaction with potassium-titanyloxalate: Determination of the stability constants of the quercetin-titanyloxalato complex″. J. Serb. Chem. Soc. 70 (2005) 5: 753–763 48. J. P. Cornard, L. Dangleterre, C. Lapouge: ″Spectroscopic and structural study of complexes of quercetin with Al(III)″. J. PHys. Chem. A 109 (2005) 10044- 10051 125 49. D. A. Kostić, G. Ž. Miletić, S. S. Mitić, I. D. Rašić, V. V. Živanović: ″SpectropHotometric determination of microamounts of quercetin based on its complexation with copper(II)″. Chemical Papers, 61 (2007) 2: 73-76 50. S. Birjees Bukhari, S. Memon, M. Mahroof-Tahir, M. I. Bhanger: ″Synthesis, characterization and investigation of antioxidant activity of cobalt–quercetin complex″. J. Molec. Struct. 892 (2008) 39–46 51. S. Birjees Bukhari, S. Memon, M. Mahroof-Tahir, M. I. Bhanger: ″Synthesis, characterization and antioxidant activity copper–quercetin complex″. Spectrochim. Acta Part A, 71 (2009) 1901–1906 52. R. Frederice, A. P. G. Ferreira, M. H. Gehlen: ″Molecular fluorescence in silica particles doped with quercetin-Al3+ complexes″. J. Braz. Chem. Soc. 21, (2010) 7: 1213-1217 53. J. P. Cornard, J. C. Merlin: ″Spectroscopic and structural study of complexes of quercetin with Al(III)″. J. Inorg. Biochem. 92 (2002) 19–27 54. Y. Ni, S. Du, S. Kokot: ″Interaction between quercetin-copper(II) complex and DNA with the use of the Neutral Red dye fluoropHor probe″ Analyt. Chim. Acta, 584 (2007) 1: 19–27 55. M. Shaghaghi, J.L. Manzoori, A. Jouyban: ″Determination of total pHenols in tea infusions, tomato and apple juice by terbium sensitized fluorescence method as an alternative approach to the Folin–Ciocalteu spectropHotometric method″. Food Chem. 108 (2008) 695–701 56. A. M. Garcıa-Campaña, F. Alés Barrero, A. Lupiáñez González, M. Román Ceba: ″Non-ionic micellar solubilization — spectrofluorimetric determination of trace of germanium(IV) with quercetin in real samples″. Analyt. Chim. Acta 447 (2001) 219–228 57. M. Ferrali, C. Signorini, B. Caciotti, L. Sugherini, L. Ciccoli, D. Giachetti, M. Comporti: ″Protection against oxidative damage of erythrocyte membranes by the flavonoid quercetin and its relation to iron chelating activity″. FEBS Lett. 416 (1997) 123-129 126 58. A. J. Elliott, S. A. Scheiber, C. Thomas, R. S. Pardini: ″Inhibition of glutathione reductase by flavonoids″. Biochem. PHarmacol. 44 (1992)1603- 1608 59. P. Cos, L. Ying, M. Calomme, Jp. Hu, K. Cimanga, B. Van Poel, L. Pieters, A. J. Vlietinck, V. Vander-Berghe: ″Structure-activity relationship and classification of flavonoids as inhibitors of xanthine oxidase and superoxide scavengers″. J. Nat Prod. 61 (1998) 71-76 60. G. Agullo, L. Gamet-Payrastre, S. Manenti, C. Viala, C. Remesy, H. Chap, B. Payrastre: ″Relationship between flavonoid structure and inhibition of pHospHatidylinositol 3-kinase: A comparison with tyrosine kinase and protein kinase C inhibition″. Biochem. PHarmacol. 53 (1997) 1649–1657 61. H. Ashida, I. Fukuda, T. Yamashita, K. Kanazawa: ″Flavones and flavonols at dietary levels inhibit a transformation of aryl hydrocarbon receptor induced by dioxin″. FEBS Lett. 476 (2000) 213–217 62. J. An, C. Tzagarakis-Foster, T. C. Scharschmidt, N. Lomri, D. C. Leitman: ″Estrogen receptor beta-selective transcriptional activity and recruitment of coregulators by pHytoestrogens″. J. Biol. Chem. 276 (2001) 17808–17814 63. G. Williamson, G. W Plumb, Y. Uda, K. R. Price, M. J. C. Rhodes: ″Dietary quercetin glycosides: antioxidant activity and induction of the anticarcinogenic pHase II marker enzyme quinone reductase in Hepa1c1c7 cells″. Carcinogenesis, 17 (1996) 2385-2387 64. M. Soriani, C. Rice-Evans, R. M. Tyrrell: ″Modulation of the UVA activation of haem oxygenase, collagenase and cyclooxygenase gene expression by epigallocatechin in human skin cells″. FEBS Lett. 439 (1998) 253-257. 65. T. L.Wadsworth, D. R. Koop: ″Effects of the wine polypHenolics quercetin and resveratrol on pro-inflammatory cytokine expression in RAW 264.7 macropHages″. Biochem. PHarmacol. 57 (1999) 941-949 66. Y.-C. Liang, S.-H. Tsai, D.-C. Tsai, S.-Y. Lin-Shiau, J.-K. Lin: ″Suppression of inducible cyclooxygenase and nitric oxide synthase through activation of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma by flavonoids in mouse macropHages″. FEBS Lett. 496 (2001)12-18. 127 67. M. G. L. Hertog, D. Kromhout, C. Aravanis, H. Blackburn, R. Buzina, F. Fidanza, S. Giampaoli, A. Jansen, A. Menotti, S. Nedeljković, M. Pekkarinen, B. S. Simic, H. Toshima, E. J. M. Feskens, P. C. H. Hollman, M. B. Katan: ″Flavonoid Intake and Long-term Risk of Coronary Heart Disease and Cancer in the Seven Countries Study″. Arch. Intern. Med. 155 (1995) 381–386 68. E. Middleton: ″Biological Properties of Plant Flavonoids: An Overview″. PHarmaceutical Biology, 34 (1996) 5: 344 – 348 69. A. Mazur, D. Bayle, C. Lab, E. Rock, Y.Rayssiguier: ″Inhibitory effect of procyanidin-rich extracts on LDL oxidation in vitro″. Atherosclerosis, 145 (1999) 421–422 70. M. G. L. Hertog, E. J. M. Feskens, P. C. H. Hollman, M. B. Katan, D. Kromhout: ″Dietary antioxidantflavonoids and risk of coronary heart disease: the ZutpHen elderly study″. Lancet, 342 (1993) 1007–1011 71. H. Wang, M. G. Nair, G. M. Strasburg, Y. C. Chang, A. M. Booren, J. I. Gray, D. L. Dewitt: ″Antioxidant and Antiinflammatory Activities of Anthocyanins and Their Aglycon, Cyanidin from Tart Cherries″. J. Natural Products, 62 (1999) 294 – 301 72. J. M. Gaziano, J. E. Manson, J. E. Buring, C. H. Henneksen: ″Dietary antioxidants and cardiovascular disease″. Ann. New York Acad Sci. 669 (1992) 249-259 73. K. F. Gey, P. Puska, P. Jordan, U. K. Moser: ″Inverse correlation between plasma Vitamin E and mortality from ischemic-heart-disease in cross cultural epidemiology″. Am. J. Clin. Nutr. 53 (1991) 326–334 74. S. A. B. E. Van Acker, D. J. Van Den Berg, M. N. J. L. Tromp, D. H. Griffioen, W. P. Van Bennekom, W. J. F. Van Der Vijgh, A. Bast: ″Structural aspect of antioxidant activity of flavonoids″. Free Radical Biology & Medicine, 20 (1996) 3: 331-342 75. J. E. Kinsella, E. Frankel, B .German, J. Kanner: ″Possible mechanisms for the protective role of antioxidants in wine and plant foods″. Food Technol. 47 (1993) 4: 85–89 128 76. W. A. Pryor: ″The antioxidant nutrients and disease prevention - what do we know and what do we need to find out?″. Am. J. Clin. Nutr. 53 (1991) 391– 393 77. S. Subash, P Subramanian: ″Morin a flavonoid exerts antioxidant potential in chronic hyperammonemic rats: a biochemical and histopathological study″. Mol. Cell Biochem. 327 (2009) 1-2:153-61 78. P. Hodek, P. Trefil, M. Stiborova: ″Flavonoids-potent and versaltile biologically active compounds interacting with cytochromes P450″. Chem. Biol. Interact. 139 (2002) 1-21 79. S. Kitagawa, H. Sakamoto, H. Tano: ″Inhibitory effects of flavonoids on free radical-induced hemolysis and their oxidative effects on hemoglobin″. Chem. PHarm. Bull. 52 (2004) 999-1001 80. K. S. Al-Numair, G. Chandramohan, C. Veeramani, M. A. Alsaif: ″Morin, a flavonoid, prevents lysosomal damage in experimental myocardial ischemic rats″. J. Medicinal Plants Research, 6 (2012) 18: 3445-3449 81. M. Kopacz, E. Woznicka, J. Gruszecka: ″Antibacterial activity of morin and its complexes with La(III), Gd(III) and Lu(III) ions″. Acta Pol. PHarm. 62 (2005) 65-67 82. S. L. Hsiu, C. W. Tsao, Y. C. Tsai, H. J. Ho, P. D. L. Chao: ″Determination of Morin, Quercetin and Their Conjugate Metabolites in Serum″ Biol. PHarm. Bull. 24 (2001) 8: 967–969 83. D. A. Kostić, S. S. Mitić, G. Ž. Miletić: ″Kinetic determination of morin nanoamounts″. J. Serb. Chem. Soc. 69 (2004) 6: 477–483 84. P. Xiao, Q. Zhou, F. Xiao, F. Zhao, B. Zeng: ″Sensitive voltammetric determination of morin on multi-walled carbon nanotubes-paraffin oil paste electrode″. Int. J. Electroc-hem. Sci.1 (2006) 228–237 85. J. B. Harborne, C. A. Williams: ″Advances in flavonoid research since 1992″. PHytochemistry 55 (2000) 481-454 86. A. Garg, S. Garg, L. J. Zaneveld, A. K. Singla: ″Chemistry and pHarmacology of the Citrus bioflavonoid hesperidin″. PHytother. Res. 15 (2001) 655-669 129 87. H. Chiba, M. Uehara, J. Wu, X. Wang, R. Masuyama, K. Suzuki, K. Kanazawa, Y. Ishimi: ″Hesperidin, a citrus flavonoid, inhibits bone loss and decreases serum and hepatic lipids in ovariectomized mice″. J. Nutr. 133 (2003) 1892-1897 88. Y. C. Lee, C. Y. Huang, T. T. Wen, K. C. Suen: ″Determination of liquiritin, glycyrrhizin, hesperidin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, honokiol and magnolol in the traditional Chinese medicinal preparation Wuu-Ji-San by high-performance liquid chromatograpHy″. J. Chromatogr. A, 692 (1995) 137-145 89. X. Li, H. Xiao, X. Liang, D. Shi, J. Liu: ″LC-MS/MS determination of naringin, hesperidin and neohesperidin in rat serum after orally administrating the decoction of Bulpleurum falcatum L. and Fractus aurantii″. J. PHarm. Biomed. Anal. 34 (2004) 159-166 90. G. J. Volikakis, C. E. Efstathiou: ″Determination of rutin and other flavonoids by flow-injection/adsorptive stripping voltammetry using nujol-grapHite and dipHenylether-grapHite paste electrodes″. Talanta 51 (2000) 775-785 91. D. Obendorf , E. Reichart: ″Determination of hesperidin by catholic stripping voltammetry in orange juice and helopyrin, a pHytopHarmaceutical preparation″, Electroanalysis 7 (1995) 11: 1075-1081 92. N. Pejić, S. Blagojević, S. Anić, V.Vukojević, Lj. Kolar-Anić: ″Microquantitative determination of hesperidin by pulse perturbation of the oscillatory reaction system″. Anal. Bioanal. Chem. 381 (2005) 775-780 93. T. Guardia, A. E. Rotelli, A. O. Juarez, L. E. Pelzer: Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. ″Effects of rutin, quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat″. Il Farmaco, 56 (2001) 9: 683 – 687 94. M. Comalada, D. Camuesco, S. Sierra, I. Ballester, J. Xaus, J. Galvez, A. Zarzuelo: ″In vivo quercitrin anti-inflammatory effect involves release of quercetin, which inhibits inflammation through down-regulation of the NF- kappaB pathway″. Eur. J. Immunol. 35 (2005).584–592 95. M. Ibarra, L. Moreno, R. Vera, A. Cogolludo, J. Duarte, J. Tamargo, F. Perez- Vizcaino: ″ Effects of the Flavonoid Quercetin and its Methylated Metabolite 130 Isorhamnetin in Isolated Arteries from Spontaneously Hypertensive Rats″. Planta Med. 69 (2003) 11: 995-1000. 96. M. P.N. Naira, C. Kandaswami, S. Mahajan, K. C. Chadha, R. Chawda, H. Nair, N. Kumar, R.E. Nair, S. A. Schwartz: ″The flavonoid, quercetin, differentially regulates Th-1 (IFNg) and Th-2 (IL4) cytokine gene expression by normal peripHeral blood mononuclear cells″. Biochimica et BiopHysica Acta, 1593 (2002) 29–36 97. N. Pejić, V. Kuntić, Z. Vujić, S. Mićić: ″Direct spectropHotometric determination of quercetin in the presence of ascorbic acid″. Il Farmaco, 59 (2004) 21–24 98. S. Wang, D. Di, X. Liu, S. Jiang: ″Determination of Luteolin and Quercetin in the Capsule of LamiopHlomis Rotata (Benth.) Kudo by HPLC Coupled with Weighted Least Squares Linear Regression″. J. Liquid ChromatograpHy & Related Technologies 30(2007) 13:1991-1999 99. G. J. Volikakis, C. E. Efstathiou: ″Fast screening of total flavonols in wines, tea-infusions and tomato juice by flow injection/adsorptive stripping voltammetry″. Analyt. Chim. Acta, 551 (2005) 124–131 100. M. J. Ahmed, J. Hossan: ″SpectropHotometric determination of aluminium by morin″. Talanta, 42 (1995) 1135-1142 101. J. Zhang, J. Wang, J. S. Brodbelt: ″Characterization of flavonoids by aluminum complexation and collisionally activated dissociation″. J. Mass Spectrom. 40 (2005) 350 – 363 102. J.P. Cornard, J.C. Merlin: ″Structural and spectroscopic investigation of 5- ydroxyflavone and its complex with aluminium″. J. Molec. Struc, 569 (2001) 129-138 103. R. Sai Sathish, A. Goutam Raju, G. Nageswara Rao, C. Janardhana: ″A fluorescent fluoride ion probe based on a self-organized ensemble of 5- hydroxyflavone–Al(III) complex″. Spectrochim. Acta Part A, 69 (2008) 282– 285 131 104. J.P. Cornard, J.C. Merlin: ″Complex of aluminium (III) with isoquercitrin : spectroscopic characterization and quantum chemical calculations″. Polyhedron 21 (2002) 2801-2810 105. A.C. Boudet, J. Cornard, J.C. Merlin: ″Conformational and spectroscopic investigation of 3-hydroxyflavone-aluminium chelates″. Spectrochim. Acta Part A, 56 (2000) 829 – 839 106. G. T. Castro, S. E. Blanco: ″Structural and spectroscopic study of 5,7- dihydroxyflavone and its complex with aluminum.″ Spectrochim. Acta Part A, 60 (2004) 2235–2241 107. A. del Olmo, C. Caramelo, C. SanJose: ″Fluorescent complex of pyoverdin with aluminum″ J. Inorg. Biochem. 97 (2003) 384–387 108. P. Đurđević, M. Jelikić-Stankov, D. Stankov: ″Fluorescence reaction and complexation equilibria between norfloxacin and aluminium(III) ion in chloride medium″. Analyt. Chim. Acta 300 (1995) 253-259 109. Chan-Il Park, Ki-Won Cha: ″Spectrofluorimetric method for determination of aluminium with chromotropic acid and its application to water samples″. Talanta 51 (2000) 769 – 774 110. S. Beniz Gűndűz, S. Kűçűkkolbaşy, O. Atakol, E. Kylyç: ″Spectrofluorimetric determination of trace aluminum in diluted hemodialysis solutions″. Spectrochim. Acta Part A, 61 (2005) 913–921 111. Cheng Zhi Huang, Yuan Fang Li, Shen Yang Tong: ″Spectrofluorimetric Determination of Nucleic Acids with Aluminum(III)/8-Hydroxyquinoline Complex″. Analyt. Lett. 30 (1997) 7: 1305-1319 112. L. Friberg, G.F. Nordberg V.B. Vouk (Eds.): Handbook on the Toxicology of Metals, 2nd edn., Vol. 2, (1986), Chapter 1, Elsevier, Amsterdam, 1-209 113. C.G. Elinder L. Ahrengart, V. Lidums, E. Petterson B. Sjogren: ″ Evidence of aluminium accumulation in aluminium welders″. Br. J. Ind. Med. 48 (1991) 11: 735–738 114. D. R. Craper, S. S. Krishnan, A. J. Dalton: ″Brain aluminium distribution in Alzheimer's disease and experimental neurofibrillary degeneration″. Science, 108 (1973) 511-513 132 115. R. K. Iyer, S. G. Jadhav, Science Today, 24 (1990) 9 116. B. Venugopal, T. D. Luckey: ″Aluminium, in Metal Toxicity in Mammals-2″. Plenum Press, New York, (1979), 104, 112 117. A. K. De: Chemical Toxicology in Environmental Chemistry, Wiley Eastern Limited, New Delhi, (1989) p. 66 118. J.R. Albani: ″Structure and dynamics of macromolecules: Absorption and fluorescence studies″, Elsevier, (2004) p. 61 119. J. E. Haky: ″Resolution in HPLC: Selectivity, Efficiency, and Capacity; Encyclopedia of ChromatograpHy″. Marcel Dekkler, INC, New York (2001) 120. D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, S.R.Crouch: ″Fundamentals of Analytical Chemistry″. 8. ed. Belmont: Brooks / Cole (2004) 121. J. D. Winefordner: ″Sample preparation techniques in analytical chemistry″. Institute of Technology, New Jersey (2003) 122. D. D. Perrin, B. Dempsey: ″Buffers for pH and Metal Ion Control″. Chapman and Hall, London, (1974) p. 77–94 123. J. Yoe, A. Jones: ″Colorimetric determination of iron with disodium-1,2- dihydroxybenzene-3,5-disulfonate″. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 16 (1944) 111- 115 124. H. Irving, T. Pierce: ″Observations on Job's method of continuous variations and its extension to two-pHase systems″. J. Chem. Soc. (1959) 2565-2574 125. P. Job: ″Formation and stability of inorganic complexes in solution″. Annali di Chimica Applicata, 9, (1928) 113–203 126. J. Inczédy: Analytical Applications of Complex Equilibria, Horword and Willy, New York, (1976) p. 137 127. D. Malešev, Z. Radović, M. Jelikić-Stankov: ″Investigation of the molybdate(II)-3-hydroxyflavone complex″. Monatsh. Chem. 122 (1991) 429- 434 128. D. Malešev, Z. Radović, M. Jelikić-Stankov, ″Investigation of europium(III)- rutin complex in water-ethanolic solution″. Spectrosc. Lett. 26 (1993) 1985- 1995 133 129. M. Obradović, D. Veselinović, P. Đurđević: ″Fizičkohemijske metode ispitivanja ravnoteža u komplrksirajućim sredinama″. Filozofski fakultet, Niš, Fakultet za fizičku hemiju, Beograd, (1996) 130. J. N. Miller, J. C. Miller: In Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 5th ed. Pearson Education, London, (2005), p. 121; 131. Validation of analytical procedures: Methodology, ICH Guideline Q2B. (1997), Federal Register 62, No. 96, p. 27463–27467 132. http://www.aijn.org/pages/cop/cop.html 133. M. Shaghaghia, J. L. Manzooria, A. Jouyban: ″Determination of total pHenols in tea infusions, tomato and apple juice by terbium sensitized fluorescence method as an alternative approach to the Folin–Ciocalteu spectropHotometric method″. Food Chemistry 108 (2008) 695–701 134. S. L. Hsiu, C. W. Tsao, Y. C. Tsai, H. J. Ho, P. D. L. Chao: ″Determinations of Morin, Quercetin and Their Conjugate Metabolites in Serum″. Biol. PHarm. Bull. 24 (2001) 8: 967–969 135. A. Ćirić, H. Prosen, M. Jelikić-Stankov, P. Đurđević: ″Evaluation of matrix effect in determination of some bioflavonoids in food samples by LC-MS/MS method″. Talanta, 99 (2012) 780-790 136. Y. Yang, H. Li, K Gao, M. Liu, Y. Sun, T. Yan, J. P. Fawcett, Y. Cui, J. Gu: ″Simultaneous quantitation of dexamethasone palmitate and dexamethasone in human plasma by liquid chromatograpHy/tandem mass spectrometry″. J. Chromatogr. B 862 (2008) 119-124 137. A. Browne, J. G. McColl, C. T. Driscoll: Aluminum speciation using morin. I, Morin and its complexes with aluminum II.. J. Environ. Qual. 19,(1990) 1: 65- 72, 73-82 138. C. Septhum, V. RattanapHani, S. RattanapHani: UV-Vis spectroscopic study of natural dyes with alum as a mordant. Suranaree J. Sci. Technol. 14, (2007) 1: 91-97 139. K. Jagasia, B. Haldar, Acid dissociation constants of morin in ethanol-water mixture J. Ind. Chem. Soc. 40 (1963) 287-292 134 140. M. S. Shuman: Dissociation pathways and species distribution of aluminum bound to an aquatic fluvic acid. Environmental Science and Technology. 26 (1992) 593–598 141. S. V. Jovanović, S. Steeden, M. Tošić, B. Marjanović, M. G. Simić: ″Flavonoids as Antioxidants″, J. Am. Chem. Soc.,116 (1994) 4846-4851 142. K. Behera, S. Pandey, ″Interaction between ionic liquid and zwitterionic surfactant: A comparative study of two ionic liquids with different anions″. J. Colloid and Interface Sci. 331 (2009) 196–205 143. E. A. Saad, L. H. Khalil, M.T. M. Zaki, A. A. Abu El-Ella: ″Determination of Zirconium (IV) and Aluminium (III) in Waste Water″. Microchim. Acta, 140 (2002)1-2: 87-91 144. V. Kuntić, N. Pejić, S. Mićić, D. Malešev, Z. Vujić: ″Determination of dissociation constants of quercetin″. PHarmazie, 58 (2003) 6: 439-440 145. G. Erdogan, R. Karadag, E. Dolen: ″Potentiometric and SpectropHotometric Determination of the Stability Constants of Quercetin Complexes with Aluminium(III) and Iron(II)″. Reviews in Analytical Chemistry, 24 (1981) 4: 247–262 BIOGRAFIJA AUTORA Leposava Pavun (rođ. Popović), rođena je 20. 05. 1966. godine u Užicu, gde je završila osnovnu i srednju školu prirodno-tehničke struke. Prirodno-matematički fakultet Univerziteta u Beogradu, studijska grupa fizička hemija, upisala je školske 1984/85. gde je 09. 07. 1990. godine diplomirala sa srednjom ocenom 8,08 u toku studija i ocenom 10 na diplomskom radu. Tema diplomskog rada bila je “Sorpcija n- heksana na LiX iLiY zeolitima: Izosterne toplote sorpcije”. Magistarsku tezu pod nazivom ”Ispitivanje kompleksa gvožđe (III) i uranil-jona sa fenilefrinom i orciprenalinom” odbranila je 17. 11. 1998. na Fakultetu za fizičku hemiju Univerziteta u Beogradu. Od oktobra 1990. do 01. aprila 1991. Leposava Pavun je radila kao honorarni saradnik u praktičnoj nastavi u Zavodu za fizičku hemiju Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Aprila 1991. god. izabrana je u zvanje asistenta-pripravnika na predmetu Fizička hemija i instumentalne metode na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Beogradu. Od 01. januara 1997. do 24. januara 1999. radila je kao stručni saradnik u Institutu za fizičku hemiju Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. U januaru 1999. god. izabrana je u zvanje asistenta za premet Fizička hemija i instumentalne metode na Farmaceutskom fakultetu Univerziteta u Beogradu. U januaru 2003. god. i septembru 2007. god. izabrana je u zvanje asistenta za užu naučnu oblast Fizička hemija na istom fakultetu. U isto zvanje je reizabrana 01. oktobra 2010. god. Leposava Pavun je objavila 8 naučnih radova u domaćim i međunarodnim časopisima, a na domaćim i inostranim naučnim skupovima je učestvovala sa 7 radova. BIBLIOGRAFIJA OBJAVLJENI NAUČNI RADOVI I SAOPŠTENJA PROISTEKLI IZ DOKTORSKE DISERTACIJE Radovi u istaknutim međunarodnim časopisima (M 22): 1. Leposava Pavun, Daniela Ðikanović, Predrag Ðurđević, Milena Jelikić -Stankov, Dušan Malešev, Andrija Ćirić; Spectrofluorimetric and HPLC Determination of Morin in Human Serum, Acta Chim. Slov. (2009), (56): 967–972. IF 2007 = 1,039 (59/127) Radovi u međunarodnim časopisima (M 23): 1. Leposava A. Pavun, Jasmina M. Dimitrić- Marković, Predrag T. Ðurđević, Milena D. Jelikić-Stankov, Daniela B. Ðikanović, Andrija R. Ćirić, Dušan L. Malešev; Development and validation of a fluorometric method for the determination of hesperidin in human plasma and pharmaceutical forms, J. Serb. Chem. Soc. (2012), 77 (11): 1625–1640. IF 2011 = 0,879 (103/154) Radovi u časopisima nacionalnog značaja (M 52) 1. Leposava Pavun, Jasmina Dimitrić Marković, Predrag Đurđević, Milena Jelikić Stankov, Daniela Đikanović, Dušan Malešev, Snežana Uskoković-Marković; Fluorometric determination of hesperidin in orange juices available on Serbian market, Acta Agriculturae Serbica (2012), 17(34): 93-103. OBJAVLJENI NAUČNI RADOVI I SAOPŠTENJA KOJI NISU PROISTEKLI IZ DOKTORSKE DISERTACIJE Radovi u međunarodnim časopisima (M 23): 1. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Dragan Veselinović; Spectrophotometric investigation of the uranyl-phenylephrine system, J. Serb. Chem. Soc. (2007), 72 (8-9): 799-807. IF 2007 = 0,536 (95/127) Radovi u međunarodnim časopisima koji nisu na SCI listi 1. Leposava Pavun, Snežana Uskoković-Marković, Dušan Malešev; Spectrophotometric Study of Uranyl - Orciprenaline Complex and its Application for Orciprenaline Determination in Pharmaceutical Preparations, Technologica Acta (2011), 4(2): 19-26. Radovi u časopisima nacionalnog značaja (M 52) 1. Dušan Malešev, Dragan Veselinović, Zorica Radović, Leposava Pavun; Određivanje fenilefrina pomoću kompleksa Fe (III) - fenilefrin, Arh. Farm. (1995), (1- 2): 9-13. 2. Dušan Malešev, Dragan Veselinović, Zorica Radović, Leposava Pavun; Spektrofotometrijsko ispitivanje kompleksa Fe (III) -orciprenalin, Arh. Farm. (1995), (3-4): 85-88. 3. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Dragan Veselinović; Termodinamičke konstante stabilnosti kompleksa Fe (III) -jona sa fenilefrinom i orciprenalinom, Arh. Farm. (2003), 27-36. Radovi sopšteni na međunarodnim skupovima štampani u celini (M 33): 1. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Zorica Radović, Dragan Veselinović; The Determination of Thermodynamic Stability Constants of Complexes of Fe (III)- ion with Orciprenaline and Phenylephrine, Physical Chemistry ’98, 4th International Conference on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 23-25. September 1998. Belgrade, p. 588-590. 2. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Milica Bogavac, Dragan Veselinović; Spectrophotometric Investigation of Uranil- orciprenaline Complex; Physical Chemistry ’98, 4th International Conference on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 23-25. September 1998. Belgrade, p. 615-617. 3. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Zorica Radović, Dragan Veselinović; The Determination of Thermodynamic Stability Constant of the Complex of Uranil Ion with Phenylephrine, Physical Chemistry 2000 5th International Conference on Fundamental and Applied Aspects of Physical Chemistry, 27-29. September 2000, Belgrade, p. 625- 627. Radovi sopšteni na međunarodnim skupovima štampani u izvodu (M 34): 1. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Ankica Jovanović, Milica Bogavac, Vesna Kuntić; Spectrophotometric Determination of Phenylephrine by Uranil-ion, Pharmacy World Congress ‘98, 58th International Congress of FIP; Hague, Netherlands 30. August - 4. September 1998, Abstracts FIP ’98. p. 183 Radovi sopšteni na domaćim skupovima štampani u izvodu (M 64): 1. Leposava A. Pavun, Radmila V. Hercigonja, Vukosava M. Radak; Izosterne toplote sorpcije n-heksana na LiX i LiY zeolitima, I savetovanje Društva fizikohemičara “Fizička hemija 92”, Beograd, knjiga izvoda str. 260. 2. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Zorica Radović; Spektrofotometrijsko određivanje fenilefrina pomoću Fe3+ jona, I kongres farmaceuta SRJ, Vrnjačka Banja, 17-20. april 1994., knjiga izvoda str. 122-123. 3. Leposava Pavun, Dušan Malešev, Dragan Veselinović, Zorica Radović; Spektrofotometrijsko određivanje alupenta pomoću Fe(III) jona, II savetovanje Društva fizikohemičara “Fizička hemija 94”, 26-28. septembar 1994. Beograd, knjiga izvoda str. 26-28. Odbranjena magistarska teza (M 72) 1. Leposava Pavun ”Ispitivanje kompleksa gvožđe (III) i uranil-jona sa fenilefrinom i orciprenalinom”, Magistarski rad, Fakultet za fizičku hemiju, Univerzitet u Beogradu, (1998). Dodatne aktivnosti: 1.Vesna Kuntić, Mara Aleksić, Leposava Pavun i Nataša Pejić; Zbirka zadataka iz fizičke hemije, Ed: mr Leposava Pavun, Beograd 2003. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписанa: Лепосава А. Павун број уписа Изјављујем да је докторска дисертација под насловом: СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЈСКО ИСПИТИВАЊЕ КОМПЛЕКСНИХ ЈЕДИЊЕЊА МОРИНА, ХЕСПЕРИДИНА И КВЕРЦЕТИНА СА АЛУМИНИЈУМОМ • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда Лепосава Павун У Београду, 20. 05. 2013. Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора: Лепосава А. Павун Број уписа Студијски програм Наслов рада: СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЈСКО ИСПИТИВАЊЕ КОМПЛЕКСНИХ ЈЕДИЊЕЊА МОРИНА, ХЕСПЕРИДИНА И КВЕРЦЕТИНА СА АЛУМИНИЈУМОМ Ментори: др Јасмина Димитрић Марковић, ванредни професор др Милена Јеликић – Станков, редовни професор Потписани: Лепосава А. Павун изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда Лепосава Павун У Београду, 20.05. 2013. Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: СПЕКТРОФЛУОРИМЕТРИЈСКО ИСПИТИВАЊЕ КОМПЛЕКСНИХ ЈЕДИЊЕЊА МОРИНА, ХЕСПЕРИДИНА И КВЕРЦЕТИНА СА АЛУМИНИЈУМОМ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда Лепосава Павун У Београду, 20. 05. 2013. 3 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.