"' UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET ZA FIZICKU HEMIJU Milan А. Markicevic ZNACAJ EKSPRESIJE, REGULISANE ESTROGENOM, PROTEINA PS2 1 КATEPSINA D U PRIMARNOM OPERAВILNOM КARCINOMU DОЈКЕ - Doktorska disertacija - Beograd, 2011. УН~F.РЗМТЕТСКА lilff>ЛИOTEKA •св ~ - :· · .. : ·~<':·:;·.:;eori'AД Lи.Бр/6'f-Џ,? ZAINALNICA Veliku zahvalnost dugujem dr Dragici Nikolic-Vukosavljevic, N. Sav. na svesrdnoj strucnoj i licnoj pomoCi, kak:o pri izboru teme tako i u svim fazama izrade ovog rada. Mentoru prof. dr Goranu Bacicu se zahvaljujem na strpljenju prilikom pregledanja ovog rada i sugestijama vezanim za ovu tezu. Zahvaljujem se doc. dr Milosu Mojovicu na sugestijama prilikom pregledanja ovog rada. Zahvaljujem se Dr Zori Neskovic-Konstantinovic na doprinosu vezanom za pracenje toka bolesti ispitivanih pacijenata kao i na sugestijama prilikom pregledanja ovog rada. Zahvaljujem se Dr Kseniji Kanjer na reviziji histopatoloskih nalaza ispitivanih pacijenata. Zahvalnost dugujem i saradnicima i laboratorijskim tehnicarima Laboratorije za receptore i Ьiologiju malignih tumora koji su doprineli realizaciji ove teze. Na kraju, zahvaljujem se i clanovima moje porodice na razumevanju i podrsci tokom izrade ove teze. Ova doktorska disertacija је u celosti uradena u Laboratoriji za receptore i Ьiologiju malignih tumora Instituta za onkologiju i radiologiju Srblje u Beogradu, u okviru projekta Ministarstva za nauku i tehnoloski razvoj Srblje pod nazivom: "Molekularni Ьiomarkeri rasta, invazivnosti i metastaticnosti karcinoma dojke: Ьioloski i klinicki aspekti". Znacaj ekspresije, regulisane estrogenom, proteina pS2 i katepsina D u primarnom operabllnom karcinomu dojke Apstrakt Karcinom dojke је najzastupljenije maligno oboljenje i jedan od vodecih uzroka smrtnosti od malignih oboljenja medu zenama u industrijski-razvijenim zemljama, u najvecoj meri zbog sklonosti primarnih karcinoma dojke da metastaziraju do limfuih cvorova u pazusnoj jami i udaljenih mesta u organizmu. Tok bolesti ranog karcinoma dojke u prve 3 godine pracenja toka bolesti se karakterise pojavom maksimalnog broja udaljenih metastaza koji је nezavisan od primenjene terapije (hirшska, hirшska i hemio-, hirшska i hormonska terapija). Identiflkacija karakteristika tumora/domacina tumora (bioloska ili klinicka) koje Ьi preciznije ukazale na pacijente sa niskim/visokim rizikom za pojavu metastatske bolesti predstavlja va2an predmet istra2ivanja. Као potencijalni faktori prognoze/predikcije toka bolesti su predlozeni brojni molekularni Ьiomarkeri ili zato sto su direktna meta terapije ili zato sto njihova ekspresija predstavlja sekundarni fenomen u mehanizmu delovanja terapije. Studije su pokazale da је visoka koncentracija katepsina D nezavisan pokazatelj lose prognoze za pacijentkinje obolele od karcinoma dojke, kao i da је visoka koncentracija pS2 u karcinomu dojke povezana sa povoljnijim tokom bolesti i da predstavlja koristan faktor za predvidanje odgovora pacijentkinja na delovanje adjuvantne hormonske terapije. U ovom istra2ivanju su ispitivani estrogenom-indukovani molekulski Ьiomarkeri, pS2 i katepsin D, sa ciljem odredivanja granicne vrednosti za defmisanje povisenih vs. bazicnih koncentracija, odnosno za defmisanje "statusa" Ьiomarkera u karcinomu dojke. Cilj istra2ivanja је Ьiо i da se identiflkuju grupe pacijentkinja sa niskim/visokim rizikom za relaps, u zavisnosti od statusa pS2, odnosno katepsina D koji Ьi Ьili defmisani na osnovu prethodno odredenih granicnih vrednosti za njihove ekspresije u karcinomu dojke. Analiza povezanosti klasicnih i Ьiohemijskih faktora prognoze/predikcije toka bolesti sa koncentracijama pS2 i katepsina D је omoguCila defmisanje granicnih vrednosti, za ekspresiju pS2 (15 ng/mg) i za ekspresiju katepsina D (39 pmol/mg) u karcinomu dojke, koje imaju ne samo statisticki, vec i bioloski znacaj, u srnislu defmisanja estrogen-zavisne vs. estrogen-nezavisne ekspresije. Pregled literatшe pokazuje da granicne vrednosti za ekspresye pS2 i katepsina D, do sada, nisu odredivane na nacin predstavljen u ovom istra2ivanju. Analiza toka bolesti pacijentkinja na osnovu statusa katepsina D, u periodu od 3 godine nakon hirurske terapije, је ukazala na Ьioloski znacaj proteina u karcinomu dojke, tj . na ulogu proteina u procesima proliferacije i apoptoze, i omogucila da se odredi njegov klinicki znacaj, tj. da se defmisu visoko-rizicne grupe (pN+ рТ2 CD-, pN+ III CD-, I CD+), kao i nisko-rizicna grupa pacijentkinja (I CD-), bez obzira na primenjenu terapiju. Analiza toka bolesti pacijentkinja na osnovu statusa pS2, u periodu od 3 godine nakon hirшske terapije, је ukazala na bioloski znacaj proteina u karcinomu dojke, tj. na anti-proliferativnu i anti-apoptotsku, kao i ulogu ovog proteina u rasejavanju malignih celija, i omoguCila da se odredi njegov klinicki znacaj, tj. da se definisu visoko-rizicne (post pN+ pS2-, рТ2 ПI pS2-, pre П ER+ PR+ pS2+) i nisko-rizicne grupe pacijentkinja (post П ER+ PR+ pS2+, pre П ER+ PR+ pS2-), bez obzira na primenjenu terapiju. Кljucne reci: karcinom dojke, estrogenom-regulisani proteini, pS2, katepsin D, granicna vrednost, nisko-rizicne grupe pacijentkinja, visoko-rizicne grupe pacijentkinja; The relevance of estrogen-regulated expression of pS2 and cathepsin D proteins in primary operaЬie breast carcinoma Abstract Breast carcinoma is the most common malignancy and one of the leading causes of death ftom cancer among women in industrial countries, mainly due to the propensity of the primary breast carcinoma to metastasize to lymph nodes in the armpit and remote places in the body. Dшing the fust З years of follow-up, early breast carcinoma is characterized Ьу the maximum number of distant metastases, independent of applied therapy (sшgery, sшgery and chemothetapy, sшgery and hormonal therapy) . Identification ofthe tumor/tumor-host characteristics (clinical or biological) that would specifically indicate patients with low/high risk for metastatic disease represents an important research goal. Numerous molecular biomarkers have been suggested as potential prognostic/predictive factors for breast carcinoma either because they are direct targets of therapy or because their expression is а secondary phenomenon in the mechanism of therapy. Studies have shown that high concentrations of cathepsin D represent an independent indicator of poor prognosis for breast carcinoma patients as well as high concentrations of pS2 in breast carcinoma are associated with а favoraЬle сошsе of the disease and represent а useful predictive factor for patients' response to adjuvant hormonal therapy. Estrogen-induced molecular biomarkers, pS2 and cathepsin D, were investigated in order to determine the cut-off values for defming elevated vs. basic concentrations, i.e. to defme the status of biomarkers in breast carcinoma. The aim of this study was to identi:fy the groups of patients with lowlhigh risk for relapse, on the basis of pS2 and cathepsin D status that would Ье defmed according to the cut-off values for their expression in breast carcinoma. Analysis of the relationship of classical and biochemical prognostic/predictive factors with concentrations of pS2 and cathepsin D allowed us to defme the cut-off values for the expression of pS2 (15 ng/mg) and cathepsin D (З9 pmoVmg) in breast carcinoma that have not only statistical but also biological relevance, in terms of defming the estrogen-dependent vs. estrogen-independent expression. Literatшe review shows that the cut-off values for the expression of pS2 and cathepsin D, so far, have not been determined in the manner done in this study. Analysis of the patients' fo llow-up on the basis of cathepsin D status, dшing а period of З years after sшgical treatment, indicated the biological relevance of the protein in breast carcinoma, i.e. the role of the protein within the processes of proliferation and apoptosis, and allowed us to determine its clinical significance, i.e. to define high-risk groups (pN + рТ2 CD-, pN + III CD-, I CD +) and low-risk group of patients (I CD-), regardless of applied therapy. Analysis of the patients' follow-up on the basis of pS2 status, dшing а period of З years after sшgical treatment, indicated the biological relevance of pS2 protein in breast carcinorna, i.e. the anti-proliferative and anti-apoptotic as well as the role ofthis protein in dissemination ofmalignant cells, and allowed us to determine its clinical significance, i.e. to defrne high-risk (post pN + pS2-, рТ2 ПI pS2-, pre П ER+ PR+ pS2+) and low- risk groups of patients (post П ER+ PR+ pS2+, pre П ER+ PR+ pS2-), regardless of applied therapy. Кеу words: breast carcinoma, estrogen-regulated proteins, pS2, cathepsin D, cut-offvalue, low-risk groups of patients, high-risk group of patients; SADRZAJ Ј. UVOD ..............................................................................•................................................... ............................. l 1. 1. Nastanak malignog tumora dojke ........................................................................................................... 3 1. 1. 1. Model klonske selekcije ........... ... ....... ... .... .................. ........................................ .. .............................. З 1. 1. 2. Model "stem" celije kancera ...... .. .... ... ... .... .................... ... ...... .. ........................................... ...... ..... ..... 5 1. 2. Nastanak metastaza - metastatska kaskada ........................................................................................... 5 1. 2. 1. Uspavanost tumora .. .. ... .... ... ... ... .............. ........... ......... ................... ............ ................. ......... .......... ... .. 8 1. 2. 2. Epitelno-mezenhimalni prelaz ...... .. .... .......... ............. ... ..... ... ............... ... ..... ..... ... ................. ............. . 11 1. 3. Faktori prognoze/predikcije toka bolesti za primarni karcinom dojke ................................................ 12 Ј. З. 1. Кlasicni faktori prognoze/predikcije toka bolesti .......... ..... .. .. ......... ..... .. ........ .... ........ .... .. ...... ... .... ... .... 14 1.3.1.1. Parametri domacina tumora- godine i status menopauze ............... .. ..... .. .... .......... ....... ... ......... .. ... . 14 1 . З . 1 .2 . Parametri tumora ..................................................................... ............... ... ........ ..... .... .... ....... ....... 15 1.З.1.2.1 . Status limfuih cvorova pazusne јате ....... ... ... ............ .... ..... ................. ................... ............... 15 1.З.1.2.2. Velicina tumora ............................................................. ................... ......... .. .... ..................... 15 1.З.1.2.З. Нistoloski tip tumora ............... .. ........... ......... .. .................. .................... .... ...... ...... .. ......... .... 16 1.З.1.2.4. Нistoloski gradus tumora ......... ... ....... .................. ............ ... ..... ...................... .... ............ .. .... . 17 1. З. 2. Biohemijski faktori prognoze/predikcije toka bolesti - status receptora za estrogen i receptora za progesteron ........................ ................... ,· .......... ...... ..... ............. .. ........ .. .......... ..... .............. .. ............... 19 1. 4. Katepsin D .............................................................................................................................................. 20 1. 4. 1. Osnovne informacije о katepsinu D ........ ... ..... ........ ..... .......... ........................... .. ... ... ...... ........ .... ..... ... 20 1. 4. 2. Gen za katepsin D .................................................. ..... .. ......... ....... .. .. ... .... ...................................... .... 21 1. 4. З. Sinteza i post-translaciona obrada katepsina D .................................................................... ..... .... ... .. .. 22 1. 4. 4. Ekspresija katepsina D .................... ... .. .... ...... .... .. ....... ..... .. ... ......................... ..... .... ........ ............ .... ... 25 1. 4. 5. Funkcija katepsina D .......................................................................................................................... 25 1.4.5.1. Fizioloska funkcija katepsina D .. ..................... .. ......... ................ .... .............................. .... ............ 25 1.4.5.2. Patoloska funkcija katepsina D- funkcija u progresiji kancera ...... .... .... .. ...................... .. .. .......... ... 26 1.4.5.2.1. Funkcija katepsina D u proliferaciji celija kancera .... .............. ...................... .. ....................... 27 1.4.5.2.2. Funkcija katepsina D u invaziji celija kancera i nastanku metastaza ........................ .... ........... 28 1.4 . 5.2.З . Funkcija katepsina D u angiogenezi ...................................................................................... 29 1.4.5.2.4. Funkcija katepsina D u apoptozi ...... .. ........ .... .......... .. .......... .. ...... .... ...... .... .... .... ...... .. ........... ЗО 1.4.5.2.4.1 . Funkcija katepsina D u stimulisanju apoptoze ................................................................. ЗO 1.4.5.2.4.2. Funkcija katepsina D u sprecavanuju apoptoze ............................................................... З1 1. 4. 6. Katepsin D kao faktor prognoze/predikcije toka bolesti ................ ........ .. .... ........ .. .................... .... .. ..... З2 1. 5. pS2 .......................................................................................................................................................... 34 1. 5. 1. Osnovne informacije о pS2 .............. ...... ................................................ ................ .... ........................ З4 1. 5. 2. Gen za pS2 ........................................................................................................................................ З5 1.5.2.1. Struktura gena za pS2 .............. ...... ............................ ...... .. ........................ ...... ........ ................ ..... З5 1.5.2.2. Regulacija transkripcije gena za pS2 .. .................... .... .............................. .. .......... .. ...................... . З6 1. 5. З .. Struktura proteina рS2 ........................................................................................................................ З7 1. 5. 4. Ekspresija pS2 ..... ........ .. ....... ..... ...... .... ... ........ .... .............. .. ................ ... ........ ..... .............. ..... ......... ... З9 1.5.4.1. Ekspresija pS2 u normalnim tkivima .... .................. .............. .. .......... .. ........ ........ .... .................... ... З9 1.5.4.2. Ekspresija pS2 u patoloskim tkivima ....... ................ ............ .... .................. ....... ....... .................. .... З9 1. 5. 5. Funkcija pS2 .......... ..... ............ ............ ....... .......................... .... ... ............ .. ..... .... ...... ........ ..... ....... ... .. .40 1.5.5.1. Funkcija pS2 vezana za celijsku pokretljivost ............................................................................ .. . .40 1.5.5.2. Funkcija pS2 u polimerizaciji s1uzokoze .............................................................. .. ...................... . .40 1.5 . 5.З. Funkcija pS2 u proliferaciji/diferencijaciji celije .......................................... .. ................................ 40 1.5.5.4. Funkcija pS2 kao neuropeptida .................................................................................................... .41 1. 5. 6. pS2 kao faktor prognoze/predikcije toka bolesti .................... .. .......................................... .. .............. .41 2. CILJ RADA ...................................................................................................................................................... 43 З. MATERIJAL I МЕТОDЕ ................................................................................................................................ 44 3. 1. Pacijentkinje sa primarnim operaЬilnim karcinomom dojke ............................................................... 44 3. 2. Odredivanje koncentracija ER i PR- Ьiohemijska metoda ................................................................. .45 3. 3. Odredivanje koncentracija pS2 i katepsina D- imunoradiometrijski esej (IRМA) ............................. 49 3. 4. Statisticke metode za obradu rezultata .................................................................................................. 51 4. REZULTAT/ ....................................................... ............................................................................................. 52 4. 1. Raspodela koncentracija ........................................................................................................................ 52 SADRZAJ 4. 1. 1. Raspodela koncentracija katepsina D .... ... ..... ... ... ...... ..... ..... .. ... .. .... ............................................. ........ 52 4.1 .1.1. Raspodela ucestalosti koncentracija katepsina D ........................... ..... ...... ........ ..... ... ...................... 52 4.1.1.2. Raspodela koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja definisanim parametrima domacina 4. 1.1.3. 4.1 .1.4. 4.1.1.5. 4.1.1 .6. tumora ... ... .... .. ....... .. .. .... ... ...... ... .... ...... ... ............................... .... ........ ...... .. ............ ...... .. ........... .. .. 53 Raspodela koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja definisanim parametrima tumora .... 54 Raspodela koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja definisanim statusom ER i!ili PR .... 56 Raspodela koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja definisanim kombinovanjem parametara domacina tumora, tumora i statusa ER i!ili PR .... .... ... .. ... ...... ............ ... ....................... . 57 Raspodela statusa katepsina D u grupama pacijentkinja definisanim parametrima domacina tumora, tumora ili statusima ER i!ili PR ...... ..... ...... .... ... ........ ......... .. ..... ....... ........ .... .... .................. .. .......... 60 4. 1. 2. Raspodela koncentracija pS2 .................. ..... ........ ... ..... .. ........ ....... ... ... ..... ... .......................... .... .... ...... 61 4.1.2.1 . Raspodela ucestalosti koncentracija pS2 .... ... .. .... .. .. .............. .... .... ...... ... ...... ..... ....... ...................... 61 4.1.2.2. Raspode1a koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja definisanim parametrima domacina tumora .62 4.1.2.3. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja definisanim parametrima tumora ............ .... 63 4.1.2.4. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja definisanim statusima ER i!ili PR ............ .. . 65 4.1.2.5. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja definisanim kombinovanjem parametara domacina tumora, tumora i statusa ER i!ili PR .. ... .. ... ... .. .. ........... ........... .. .... .. .. ... .. .. .... ... ......... .... ... 66 4.1.2.6. Raspodela statusa pS2 u grupama pacijentkinja definisanim parametrima domacina tumora, tumora i statusima ER i/i1i PR .... ... ... .... .... ... ........ .................... ...... .. .. ..... .... .... ..... ....... ... .... ..... .... ... .. ....... .... . 68 4. 2. Verovatnoca za DFI ................................................................ ............................................................... 69 4. 2. 1. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa katepsina D .. .... .... ...... ... .... ............ .. ..... ... ........... .... ... . ..... ...... .. 72 4.2.1.1. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa katepsina D - u grupama pacijentkinja definisanim statusom limfuih cvorova ............... ... ...... .. ...... ... .... ....... ...... .... ....... ... ....... .. .. ....................................... ..... ... 72 4.2.1 .2. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa katepsina D - u grupama pacijentkinja definisanim histoloskim gradusom tumora .... .. ... .. .... .. .......... ......... .. ....... ....... ....... .. .... ....... ... ... ........ .... ........... .. 75 4. 2. 2. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa pS2 .. .... .... .......... .......... ... .............. .... .. .. .. ... ... ........... .... .......... . 77 4.2.2.1. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa pS2 - u grupama pacijentkinja definisanih statusom limfuih cvorova .. .... .......... .. ..... ........ ..... .. ..... ........ ... ... ....... ........ .. .... ... .. ... .. .. ... .... .. ....... .. .... ... ... .. ............... . 77 4.2.2.2. Verovatnoca za DFI na osnovu statusa pS2 - u grupama pacijentkinja definisanim histo1oskim gradusom tumora .... ....... .. ......... .. ....... ... ..... .... ...... .... ... ...... ........ ... ......... ... .. ..... ..... ...... .......... ...... ... 78 5. DISKUSIJA ................................ ..................................................................................................................... 82 5. 1. Raspodela koncentracija ........................................................................................................................ 86 5. 2. Raspodela koncentracija katepsina 0 .................................................................................................... 87 5. 3. Raspodela koncentracija pS2 ................................................................................................................. 90 5. 4. Verovatnoce za DFI. ............................................................................................................................... 91 5. 4. 1. Verovatnoce za DFI na osnovu statusa katepsina D - u grupama pacijentkinja de:finisanim statusom limfuih cvorova ............ ........ .... ... ... ..... ....... ...... ..... ... ... ...... ...... ........ .... ............... ..... ... .... ..... .. ... ... ..... .. 95 5. 4. 2. Verovatnoce za DFI na osnovu statusa katepsina D - u grupama pacijentkinja definisanim histo1oskim gradusom .. ............ ... ............. ..... .... .......... ...... .. .... .. ..... .... ... ... ..... ... .............. .. ... ... ..................... ........ .. 96 5. 4. З . Verovatnoce za DFI na osnovu statusa pS2 - u grupama pacijentkinja definisanim statusom limfuih cvorova ......... ..... ... .. .......... ... .. ........ .... ... .... .... .. ... .. ... ..... ....... .. .. ....... .. ... .............. ................................. 97 5. 4. 4. Verovatnoce za DFI na osnovu statusa pS2- u grupama pacijentkinja definisanim histo1oskim gradusom .. ... ...... .... ... ...... ... ............... .... .. ... .. ..... ..... ................... ......................... ........ ..... .. ................... .. .... ....... 98 6. ZAКLJUCCI ................................ .................................................................................................................. JOJ 7. LITERA TURA ............................................................................................................................................... 1 03 8. SPISAK SКRACENICA ................................................................ ................................................................. 118 9. SPISAK PRILOGA ........................................................................................................................................ 120 9. 1. Spisak slika .......................................................................................................................... ; ................ 120 9. 2. Spisak tabela ........................................................................................................................................ 121 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod 1. UVOD Кancer predstavlja vrstu oboljenja u kome se grupa celija karakterise nekontrolisanim rastom, sposobnoscu invazije u okolna tkiva i potencijalom za metastaziranje, odnosno za rasejavanje do udaljenih tkiva i organa putem limfe ili krvi i stvaranja depozita metastatskih celija (metastaza). NajveCi deo humanih kancera nastaje kao rezultat akumulacije genetskih i epigenetskih promena. Ove promene mogu da se ispolje u vidu velikog broja promena celijske morfologije, struktшe i funkcije sto uslovljava: а) da је kancer dovoljan sam seЬi u pogledu stvaranja signala za rast, Ь) neosetljivosti na signale inhiЬitora rasta, с) izbegavanja apoptoze, d) neogranicen potencijal za reprodukovanje, е) aktiviranje signalnih puteva koji dovode do neo- angiogeneze, invazije i nastanka metastaza (1 ). Karcinom predstavlja medicinski termin koji se odnosi na maligni tumor, sastavljen od transformisanih epitelnih celija. Karcinom dojke је najzastupljenije maligno oboljenje i jedan od vodecih uzroka smrtnosti od malignih oboljenja medu zenama u industrijski-razvijenim zernljama (2), u najvecoj meri zbog sklonosti primarnih karcinoma dojke da metastaziraju do limfnih cvorova u pazusnoj jami i udaljenih mesta u organizmu, kao sto su pluca, jetra, kosti i centralni nervni sistem (3). Procena Americkog drustva za kancer је da se, godisnje, ocekuje oko 1 milion novih slucajeva karcinoma dojke u svetu (2). Ukoliko, prilikom dijagnostikovanja karcinoma dojke, nema uocljivih znakova prisustva udaljenih metastaza u organizmu, smatra se da је bolest u ranoj ili pocetnoj fazi (tzv. rani karcinom dojke) i vise od 90 % novih slucajeva karcinoma dojke se dijagnostikuje u ovoj fazi bolesti (4) . Pretpostavljeno је da prirnarni maligni tumori dojke, vec u ranoj fazi bolesti, rasejavaju maligne сеЩе u krvotok (5) tako da u trenutku detekcije bolesti, osirn primarnog tumora, mogu da postoje i udaljene pojedinacne maligne celije i udaljeni depoziti malignih celija (6). Uprkos znacajnom napretku u dijagnostici i klinickom lecenju, kao i razumevanju molekulske osnove biologije karcinoma dojke, oko 30 % pacijenata obolelih od karcinoma dojke u ranoj fazi, koji nisu leceni adjuvantnom sisternskom terapijom, se suoCi sa ponovnom pojavom sirnptoma bolesti, odnosno dozivi relaps u toku dU.Zeg perioda pracenja toka bolesti с~ 10 god.) (2). Ukoliko se, prilikom postavljanja dijagnoze, utvrdi prisustvo udaljenih metastaza u organizmu, smatra se da је bolest u kasnoj ili uznapredovaloj fazi (tzv. uznapredovali kancer dojke). Prisustvo rasejanih celija malignog tumora na udaljenim mestirna u organizmu је povezano sa kracirn periodom bez ponovne pojave bolesti (DFI) i sa kracirn periodom ukup prezivljavanja (OS) pacijenata obolelih od malignog tumora dojke (7). Ako se prirnarni t DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod detektuje i ukloni u ranoj fazi bolesti, pre nego sto nastanu metastaze, prognoza toka bolesti pacijenta moze da bude povoljna i verovatnoca za prezivljavanje bez ponovne pojave bolesti је velika. Sto је duzi vremenski period u kome pacijent nema simptome ponovne pojave bolesti, to Ьi i ukupan vremenski period do smrtnog ishoda, usled kancera, trebalo da bude dиZi. Iako pacijenti sa rasejanim tumorskim celijama imaju veCi rizik za ponovnu pojavu bolesti, nece se, tokom perioda pracenja toka bolesti, kod svih tih pacijenata stvoriti udaljene metastaze, odnosno razviti metastatska bolest (8). Naime, posle hirurske terapije se, uglavnom, primenjuje adjuvantna sistemska terapija (citotoksicna hemioterapija ili manje toksicna hormonska terapija), da Ьi se spreCilo ili odlozilo moguce nastajanje udaljenih metastaza. Medutim, i nakon primljene adjuvantne sistemske terapije, oko 15-20 % pacijenata sa primarnim karcinom dojke, i dalje, u seЬi nosi rasejane maligne celije (9), koje imaju nisku ili uopste nemajи proliferativnи aktivnost (1 0). Deo ovih rasejanih malignih celija moze da nastavi da postoji u stanjи tzv. "иspavanosti", sve dok se ne vrate и aktivnи fazu i iniciraju nastanak metastaza. Na aktiviranje malignih celija иtiси razliciti faktori koji obиhvatajи genetske predispozicije "иspavanih" celija, kao i imиnoloski i angiogeni иticaj okrиzenja. Lecenje karcinoma dojke и ranoj fazi cesto Ьiva neиspesno zbog toga sto и toku 15-20 godina, а najcesce u toku prvih 5 godina nakon hirurske terapije, dolazi do ponovne pojave simptoma bolesti, odnosno relapsa, иsled razvoja metastatske bolesti ( 4). Analiza zavisnosti pojave relapsa od vremenskog perioda koji је protekao od uklanjanja primarnog tumora (hirurska terapija) do pojave relapsa, и okviru tzv. "prirodnog" toka bolesti pacijenata obolelih od karcinoma dojke, је pokazala da se na krivoj koja odgovara funkciji rizika za ponovnи pojavu bolesti mogи razlikovati 2 pika, pri сети se prvi pik uocava и sirokom vremenskom opsegи do 3 godine, adrиgi, иglavnom, izmedи 3. i 5. godine nakon hirurske terapije (7, 11-12). Postojanje 2 pika na krivoj funkcije rizika је иосеnо za razliCite podgrиpe pacijenata, bez obzira na faktore prognoze/predikcije toka bolesti (statиs menopauze, statиs limfnih cvorova pazusne jame, velicinu tumora, status receptora za estrogen) sto upиcuje na Ьioloski fenomen. Jednom od hipoteza, kojom Ьi se mogao objasniti uoceni oЬlik funkcija rizika za ponovnи pojavu bolesti, se pretpostavlja da uklanjanje primarnog tumora hirurskom terapijom moze da indukuje promene unutar mikro-metastatskih zarista, odnosno da stimulise proliferacijи ilili angiogenezu celija tumora (13-14). Transformacija malignih celija iz stanja bez deobe celija u stanje rasta bez krvnih sudova, kao i iz posledenjeg stanja u fazu stvaranja kapilara i daljeg rasta predstavlja transformacijи mikrometastatskih zarista u angiogenezni fenotip sto rezultиje iznenadnim иbrzanjem metastatskog procesa i odgovara prvom piku na krivoj rizika za ponovnu pojavu bolesti. Drиgi pik na krivoj је pripisan aktiviranjи mikrometastatskih depozita koje se, иsled "иspavanosti" tиmora, moze desiti neko liko godina nakon hirurske terapije ( 15). Lecenje 2 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod metastatske bolesti se, jos иvek, svodi na иЬla.Zivanje tegoba (palijativno lecenje), sa obzirom na to da је mogиcnost izlecenja veoma ogranicena ili prakticno ne postoji (16). Klinicko lecenje karcinoma dojke se, dodatno, komplikиje cinjenicom da invazivni karcinomi dojke pokazujи sirok opseg molekиlskih profila, morfoloskih tipova i klinickog ponasanja. Ne samo da postoji velika heterogenost и prirodi tipova celija izmed:и razliCitih tumora, vec se и okviru jednog tumora moze иoCiti znacajna heterogenost feno- i geno-tipova (1 7). Stoga је glavni izazov, za istra.Zivace и translacionim stиdijama, иnapred:enje znanja о molekulskim иzrocirna takve heterogenosti. Nova saznanja о иzrocirna heterogenosti tumora dojke sи od velike va.Znosti ne samo za bolje razиmevanje bioloske osnove nastanka malignog tumora dojke i rasejavanja metastaza, vec i za razvoj novih terapeиtskih pristиpa, а sve и ciljи poboljsanja ishoda bolesti pacijenata. 1. 1. Nastanak malignog tumora dojke Maligni tиmor dojke је, cak i и ranoj fazi, heterogena bolest и kojoj, pored genetskih i epigenetskih mиtacija, interakcije izmed:и tиmorskih celija i njihovog mikrookru:Zenja (stroma, inflamatome celije i krvni sиdovi) irnajи znacajan иticaj na proces tumorigeneze, и smislи da иtiси na rast, progresijи i metastatski potencijal tumora (6, 18). Pored postojanja razliCitih podtipova tиmora, celije и okvirи jedne tиmorske popиlacije, cesto, ispoljavajи funkcionalnи heterogenost, pri сети celije ispoljavajи razliCite kapacitete za proliferacijи i diferencijacijи (18). Da bi se objasnilo zasto svaka celija иnиtar tumora nije sposobna da inicira i!ili odrzi rast tumora, predlozena sи dva modela za heterogenost celija tumora, kojima se objasnjava i nastanak kancera (19-20): • model klonske selekcije i • model "stem" celije kancera. 1. 1. 1. Model klonske selekcije Dva aspekta modela klonske selekcije (slika 1.1. А) , koji је 1976. godine prvi predlozio Nowell (19), јеsи : а) heterogenost и okvirи tumora, иsled genetske nestabilnosti i Ь) postepena prirodna selekcija celija koje imajи najpodesniji (najagresivniji) fenotip. Model klonske selekcije pretpostavlja da svaka celija и tumorи irna potencijal da inicira tиmor. Genetske mutacije obezbed:uju datirn celijama selektivnи prednost pri rastu, u odnosu na okolne normalne celije, з DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod tako da се сеЩе sa mutacijama biti dominantne u odnosu na sve druge celije u tumoru i stvorice novi klon. Celije-potomci novo-stvorenog klona се biti okarakterisane novim karakteristikama, izmedu ostalog i razlicitim potencijalom za diferencijaciju, u odnosu na druge celije tumora, а slicnim potencijalima za inicijaciju rasta tumora, u okviru novo-stvorene populacije (20). Sa jedne strane, ove celije mogu da stvore veliki broj potomaka, а sa druge, nove mutacije mogu da omoguce prednost pri rastu, u odnosu na druge tumorske celije, kao sto је otpornost na apoptozu. Prema modelu, svaka celija kancera, potencijalno, moze da postane invazivna i da lZazove nastanak metastaze ili da postane otporna na terapije i izazove ponovnu pojavu bolesti. А) Model klonske selekcije normalna eelija cf m•llgo. ""'"' Jr 1 \ 0 noviklon с В) Model "stem" celije kancera normalna "stem" eelija celija-prekurzor с \ 1 "stem" eelija kancera с /l\ ~ ... .... ~ ~ eelije-potomci Slika 1.1. - Dva predloiena modela za inicijacijи i progresijи tитша, odnosno heterogenost tиmora. А) Ро modelи klonske selekcije, svaka normalna celija, potencijalno, moie da pretrpi transformacijи. Nastala maligna celija (Ьеlа Ьоја) moie da stekne dodatnи mиtacijи i stvori novi klon celija (siva Ьоја), dok drиge maligne celije ostajи bez dodatne mиtacije. Ovaj proces moie da se ponavlja beskonacno i neke mиtacije тоgи da dovedи do novih osoЫna, kao sto sи difaencijacija i sposobnost za samo-obnavljanje. Celije sa mиtacijama се imati pт·ednosti и tokи rasta i Ысе dominantne и tитоrи. В) Р о modelи "stem" celije kancaa, mиtacije koje izazivajи kancer se, verovatno, dogadajи и normalnim "stem" celijama (siva Ьоја), koje se samo- obnavljajи, ili и celijama-prekиrzoт·ima (siva Ьоја) . Od ovih celija poticи tzv. " stem" celija kanceт·a (siva Ьоја) koje mogu da se samo-obnavljajи i diferentиjи tako da stvoт·e sve drиge celiJe tитша, ali isto tako mogu i dodatno da тиtiт·аји. celiJe-potomci (sт·afiraпoJ sи geпetski identicne " stem" celijama kancaa, ali nisи sposobne da se samo-obnavljajи. И А) i В) - krиgovi pгedstavljajи celije, типја pт·edstavlja mиtagenezи, zvezdice pгedstavljajи mиtacije, ргi сети рт-vа zvezvica и svakom krиgu pгedstavlja visestт·иke mиtacije koje sи neophodne da Ы se normalna celija tт·ansfшmisala и malignи. 4 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod 1. 1. 2. Model "stem" celije kancera Model "stem" celije kancera је, kao model karcinogeneze, bio opisan jos 30-ih godina proslog veka, ali је tek nedavno prosiren na solidne tumore, pri cemu је dokazano da "stem" celije kancera mogu da postoje i u tumorima dojke (21). Prema modelu (slika 1.1. В), odred:ena populacija celija kancera, nazvanih "stem" celije kancera1' regulise inicijaciju, progresiju i ponovnu pojavu tumora (22). Ove celije su nazvane "stem" celijama kancera kako Ьi se naglasile njihove osobine, slicne osobinama "stem" celije norrnalnog tkiva, i sposobnost da kontinualno odrze proces tumorigeneze. Ро defmiciji, "stem" celije kancera su sposobne da se neograniceno samo-obnavljaju i da diferentuju, sto dovodi do stvaranja svih (tumorigenih i ne-tumorigenih) tipovq celija koje sacinjavaju ostatak tuтora. Pretpostavlja se da se ucestalost "stem" celije kancera razlikuje izmed:u pojedinacnih tumora istog podtipa i da је potencijalno veca u agresivnijim tumorima. Jos uvek nisu obezbed:eni defmitivni eksperimentalni dokazi koji pokazuju da "stem" celije kancera poticu od norrnalnih "stem" celija tkiva sa kancerskim fenotipom ili od celija-prekurzora, koje su diferentovanjem stekle kapacitet za samo-obnavljanje, ili, pak, od spajanja "stem" i mutiranih celija sto Ьi, teorijski, omoguCilo dalju akumulaciju mutacija. Modeli selekcije klonova i "stem" celija kancera imaju zajednicko to da tumor nastaje od pojedinacne celije koja је akumulirala visestruke mutacije i koja је stekla neogranicen potencUal za proliferaciju. VaZno је napomenuti da dva modela nastanka kancera nisu med:usobno iskljuciva jer same "stem" celije kancera podlefu klonskoj selekciji (23). Stoga se karakteristike "stem" celije kancera mogu promeniti tokom tumorigeneze i, eventualno, moze nastati posebna, dominatnija "stem" ~elija kancera. 1. 2. Nastanak metastaza- metastatska kaskada Metastatska bolest, kao posledica nastanka udaljenih metastaza, је uzrok preko 90 % smrtnih ishoda med:u pacijentima obolelim od kancera (24). Metastaze predstavljaju depozite malignih celija koji nastaju kao posledica rasejavanja celija tumora sa mesta nastanka primarnog tumora do udaljenih mesta u tkivima/organima, odnosno do sekundarnih tumora (3). Metastaziranje tumora је veoma slozen i dinamican Ьioloski proces tokom koga se desavaju brojne interakcije izmed:u samih celija tumora, kao i izmed:u celija tumora i tkiva koje okrufuje 1 Mezenhimalne stem celije su multipotentne stem celije koje imaju visok kapacitet za samo-obnavljanje i koje mogu da diferentuju u mnostvo specijalizovanih tipova celija. 5 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod tumor. Pri tome је nastanak metastaza "pritajeni" proces koji se desava unutar organizma i kao takvog ga је tesko detektovati. Trajanje bolesti na niskom, odnosno klinicki-nedetektabilnom nivou (tzv. "minimalna rezidualna bolest") је cesta osobina karcinoma dojke, sto је potvrdeno sve veCim brojem pacijenata sa karcinomom dojke, cak i bez indikacija о metastatskom sirenju, koji imaju pojedinacne maligne celije u krvi (25). primarni tumor angiogeneza disocijacija invazija i ntravazacija rasejavanje vezivanje ekstravazacij metastaza 1 1 smrt 6elije Slika 1.2. - Razliciti koraci и okviru metastatske kaskade. Suiavanje figuт-e ukazuje па sve veCi gubltak tumorskih celija tokom metastatske kaskade. Uprkos svom klinickom znacaju, celijski i molekulski mehanizmi kojima nastaju metastaze u kanceru jos nisu dovoljno poznati. Utvrdeno је da proces nastanka metastaza, tzv. metastatska kaskada (slika 1.2.), obuhvata nekoliko uzastopnih bioloskih procesa (3, 26). Tokom rasta, primarni tumor mora da razvije sistem za dovod krvi koji се da zadovolji njegove metabolicke potrebe - proces koji se naziva angiogeneza. Kljucni dogadaj u formiranju metastaza је proces invazije malignih celija u okolno tkivo. Da bi doslo do invazije, neophodno је odvajanje pojedinacne maligne celije od primarnog tumora (disocijacija), kao i slozena i pravovremeno-regulisana interakcija sa tkivom koje okrufuje datu celiju. Preduslov za prodiranje odvojenih malignih celija u vancelijski matriks i okolno tkivo је njihova sposobnost tzv. "aktivne promene mesta" sto, takode, predstavlja visestepeni proces. Da bi migrirale kroz vancelijski matriks, maligne celije moraju da se privremeno vefu za pojedine komponente tog 6 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod matriksa, uz posredstvo receptora na povrsini celije koji sи specificni za odgovarajиce sиbstrate. Potom, maligne celije morajи da prodи kroz intersticijalni2 matriks, sto se desava posredstvom proteolize. Utvrdeno је da mnogi maligni tumori pokazujи povisene nivoe proteoliticke aktivnosti i smatra se da је proteoliticka degradacija vancelijskog matriksa predиslov da Ьi maligne celije mogle иspesno da prodrи и ciljno tkivo (27). Nakon sto иspesno prodи kroz vancelijski matriks, maligne celije иlaze и krvotok ilili и limfni sistem - proces koji se naziva intravazacija3. Ovaj proces, takode, zahteva dobro koordinisanи sekvencи proteolize i "aktivne promene mesta". Ро иlaskи и krvotok, maligne celije se rasejavajи do sekundarnih mesta и иdaljenim tkivima/organima, gde Ьivаји vezane и kapilarima, na osnovu ogranicenja velicinom celije (28). Potom, maligne celije aktivno napиstajи sistem krvnih sиdova (ekstravazacija4) pиtem иzastopnih procesa proteolize, adhezije izmedи celija i sиbstrata, kao i "aktivne promene mesta" i prodirи и ciljna tkiva/organe (invazija). Prodiranje malignih celija и ciljni organ/tkivo ne rezultиje, obavezno, razvojem klinicki-ocigledne metastaze jer invazivne maligne celije mogи da Ьиdи иЬiјеnе od strane imиnog sistema (slika 1.3.). Takode, ove celije mogи ostati "иgasene", иsled fenomena "иspavanosti" tиmora. ekstravazacija 1 klinicki nedetektabilno proliferacija ~: uspavanost 1 1 smrt •-- Ј proliferacija ... 1 1 uspavanost 1 1 smrt •-- Ј klinicki detektaЬilno Slika 1.3. - Moguce sиdЫпе malignih celija па sekиndarnom mestи. Maligne celije тоgи da postoje kao pojedinacne celije, kao male pre-angiogene metastaze ili kao velike metastaze sa krvnim sиdovima. Ргi svakom km-akи, samo mali deo celija се nastaviti proces, pri сети preostale celije ili mikm-metastaze mogu Ш da ш1и и stanje иspavanosti ili da doiive smrt. Samo deo metastaza sa la-vnim sиdovima је klinicki detektaЫlan dok sи pojedinacne celije i mikro-metastaze klinicki nedetektaЫlne. Smatra se da sи procesi proliferacije i apoptoze Ыokiт-ani и " иspavanim " pojedinacnim celijama, dok sи и" иspavanim "pт-e-angiogenim тikт-o­ metastazama ovi pт'ocesi игavnoteieni, sto rezиltиje ogгanicenom veliCinom ovih mikro- metastaza. 2 Intersticijalni matrik:s- prazan prostor ili supljina, koji se nalaze izmedu pюstora popunjenih strukturom ili materijom. 3 lntravazacija- proces ulaska molekula u krvni sud. 4 Ekstravazacija- proces izlaska molekula iz krvnog suda u okolno tkivo. DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod Kada se nalaze na novom, sekundarnom mestu, maligne celije moraju da ponovo zapocnu i da odrze svoj rast, da bi formirale pre-angiogene mikrometastaze. Prema tzv. hipotezi "semena i podloge" (eng. "seed and soil"), koju је prvi put predlozio Paget 1889. godine (29), maligne celije mogu da prezive i kolonizuju samo ona sekundarna mesta na kojima mikro-okrиZenje moze da promeni ekspresije gena u tumorskim celijama u znacajnoj meri i da time utice na stvaranje novih krvnih sudova u mikro-metastazama. Ovaj proces neovaskularizacije mikro- metastaza omogucava njihov dalji rast i nastanak makroskopskog tumora. No, nemaju ni sve celije u tumoru sposobnost da metastaziraju. Metastatski potencijal zavisi od vise faktora koji odreduju ukupan rast, prezivljavanje, angiogenezu i invaziju tumorskih celija. Smatra se da bi samo visoko-maligne celije, tj, celije sa visokim proliferativnim indeksom i sa skoro potpuno izostalom celijskom adhezijom, ttebalo da budu sposobne da napuste primami tumor i da metastaziraju, odnosno dovedu do nastanka metastaza (30). Stvaranje metastaza се biti uspesno samo ako је pojedinacna maligna celija sposobna da prezivi svaki pojedinacan korak metastatske kaskade (28). Iako se u krvotoku pacijenata obolelih od karcinoma dojke mogu detektovati stotine ili hiljade pojedinacnih, rasejanih malignih celija, uocena frekvenca metastaza ostaje znacajno manja od ocekivane jer manje od 0,05 % malignih celija u cirkulaciji uspeva da prezivi sve korake metastatske kaskade (31) . Na osnovu ove cinjenice se moze smatrati da је nastanak metastaza veoma neeftkasan proces. Sa obzirom na to da је, na osnovu studija, zakljuceno da su rani koraci u metastatskom procesu - od trenutka kada maligne celije udu u krvotok ра dok ne napuste krvotok i udu u sekundarne organe - potpuno eflk:asni (5, 32), razlog za neeflk:asnost metastaziranja moze da bude regulacija rasta malignih celija na sekundarnom mestu, odnosno rast mikro-metastaza i njihovo odrzavanje/rast do makro- metastaza (33-34). Ipak, neprekidno ponavljanje metastatke kaskade се, u jednom trenutku, obezbediti dovoljan broj malignih celija koje su sposobne da prevazidu sve prepreke i da uspesno dovedu do nastanka klinicki-detektabilnih metastaza, odnosno detektabilnog metastatsko g tumora . 1. 2. 1. Uspavanost tumora Studije ukazuju da model usporenog rasta malignih celija nije verovatan, kada se govori о stanju uspavanosti tumora, i radije se favorizuje model diskontinualnog rasta, koji podrazumeva postojanje perioda mirovanja malignih celija (33, 35). Trenutno postoje 2 hipoteze kojima se objasnjava uzrok uspavanosti malignih celija: 8 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod I - uspavanost rasejanih malignih 6elija predstavlja njihov odgovor na nepovoljno mikro- okruzenje, П- uspavane raseJane maligne 6elije predstavljaju "stem" 6elije kancera koje su pronasle/stvorile novo specificno mikro-okruzenje, tzv. "tumorsko utociste", gde se ove 6elije sklanjaju da ne Ьi proliferisale (36). Na osnovu eksperimentalnih modela sa 6elijskim kultшama i sa zivotinjama, hipotetise se о postojanju dva stanja uspavanosti tumora: I - Stanje uspavanosti pojedinacne 6elije - Pojedinacne uspavane 6elije su defmisane kao 6elije koje ne podlefu deoЬi (37). Ove 6elije su okarakterisane produzenom GO-fazom 6elijskog ciklusa, u kojoj su i proliferacija i apoptoza Ьlokirane, i ovo stanje mirovanja, verovatno, prU.Za 6elijama zastitu od mnogih konvencionalnih citotoksicnih lekova koji ciljaju samo 6elije sa aktivnim 6elijskim ciklusom (37-38). П- Stanje uspavanosti mikrometastaza Dokazano Је da postoje pre-angюgene mikrometastaze koje ne mogu da narastu vise od 1-2 mm u precniku (34). U ovim mikro- metastazama је potencijalno visoka proliferativna aktivnost malignih 6elija шavnotezena pove6anom brzinom apoptoze, tako da nema ukupnog pove6anja velicine mikro- metastaza. Ravnoteza је regulisana faktorima stimulacije i inhiЬicije koji se luce od strane mikrookruzenja, imunih 6elija i samih tumorskih 6elija. Smatra se da su uspavanost pojedinacnih malignih 6elija uspa vano st mikro-metastaze prekшzori metastatske bolesti, ali da su to razlicite vrste uspavanosti. Maligne 6elije se, na sekundarnom mestu, prilagodavaju novom tkivu/organu i Ьivaju organizovane kao pojedinacne 6elije ili kao grupe 6elija (mikro-metastaze) i to је prvo Ьiolosko stanje, koje se moze oznaCiti kao S1 (39). Sa obzirom na to da ve6ina malignih 6elija u stanju S1 mogu da budu 6elije koje ne pro1iferisu, ovo stanje mirovanja odgovara prvom uspavanom stanju. Faza rasta, koja sledi nakon stanja S 1, moze da bude indukovana kako genetskim promenama u 6eliji tako i promenama u mikro-okrU.Zenju i moze da ima razlicite ishode, u zavisnosti od sposobnosti mikro-metastaza da indukuju angiogenezu. Smatra se da promene u regulaciji angiogeneze imaju najvainiju ulogu u molekulskim mehanizmima koji indukuju prelaz iz stanja uspavane mikro-metastaze u klinicki-detektaЬilnu metastazu (slika 1.3.). Izostanak angюgeneze sprecava rast ne-angiogenih mikro-metastaza preko odredene, mikroskopske velicine (tzv. "kancer bez bolesti") ( 40), te nastaju "zarista" mikro-metastaza bez krvnih sudova, sto predstavlja drugo uspavano stanje - S2. Mikro-metastaze mogu da izadu iz stanja uspavanosti preko bar 2 mehanizma (30): I- uklanjanje inhiЬitora angiogeneze moze da oslobodi one mikro-metastaze koje su ve6 sposobne da indukuju stvaranje novih krvnih sudova (tzv. Folkman-ov efekat), 9 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod П- subpopulacija malignih celija unutar mikro-metastaza moze da se transformise IZ ne- angiogenog u angiogeni fenotip; Ova faza rasta moze da se oznaCi kao SЗ. Pretpostavlja se da uklanjanje primarnog tumora hirшskom terapijom moze da ima nezeljeni efekat u vidu iznenadnog ubrzavanja metastatskog procesa na taj nacin sto се se znacajno povecati verovatnoca prelaza iz stanja S 1 u stanje S2 (tzv. Fisher-ov efekat) (41) i iz stanja S2 u stanje SЗ, sto umanjuje znacaj ranog otkrivanja bolesti (6). uspavanost /,---m_i_k_ro--m-et_a_s-ta_z_e---, / 1 imunoloski odgovor (epi-) genetske promene е anti-angiogeneza \ г--mik-ro-o-kru-zen-ife ---, uspavanost pojedinacne celije 111 111 Slika 1.4. - SиdЫпа rasejanih tиmoгskih celija. Титот-skе celije se т-аsејаvаји па sekиndarno mesto i mogи da do:iive jednи od tri moguce sиdЫne: Ј) тоgи da proliferisи, sto т-еzиltије ranim relapsom, II) mogи da podlegnи apoptozi, tj pmgramiranoj celijskoj smгti i III) тоgи da ostanи " иspavane ". Moguca sи dva stanja иspavanosti tитот-а: а) иspavanost pojedinacne celije - tиmorske celije sи и stanjи mirovanja (zaиstavljene и GO-fazi celijskog ciklиsa) i тоgи da Ьиdи reaktiviт-ane иsled (epi-)genetskih ili promena и тikго-оkги:iепји; Ь) иspavanost mikгo­ metastaze - tиmorske celije pгoliferisи i rastи kao mikгo-metastaze, do odreaene veliCine, иsled toga sto је njihov rast regиlisan delovanjem angiogenih i imиnoloskihfaktora. Obelezje uspavanosti tumora је reverziЬilna promena, tzv. epitelno-mezenhimalni prelaz, kojim se maligne celije, koje ne_proliferisu, transformisu u celije koje aktivno proliferisu (42). Stoga, bez obzira na uspavanost tumora, maligne celije su sposobne da nastave celijski ciklus, u bilo kom trenutku, i da dovedu do stvaranja klinicki-detektabilnih udaljenih metastaza. Као posledica uspavanosti tumora, udaljene metastaze se mogu razviti decenijama nakon primarnog lecenja (43-44). 10 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod 1. 2. 2. Epitelno-mezenhimalni prelaz Sa obzirom na to da "stem" 6elije kancera, jos uvek, nisu potpuno defmisane, ne moze se defmitivno proveriti prisustvo ovih 6elija u karcinomu dojke. Zbog toga se u obzir moraju uzeti druge, alternativne hipoteze kojima se mogu objasniti neke od zbunjujucih karakteristika odredenih populacija malignih 6elija. Jedna od tih alternativnih hipoteza је ona kojom је obuhvacen reverziЬilni epitelno-mezenhimalni prelaz (ЕМТ) . Epitelno-mezenhimalni prelaz predstavlja regulisan niz dogadaja u kojima se: а) menjaju interakcije 6elija-6elija i 6elija- van6elijski matriks, da bi se epitelne 6elije oslobodile iz tkiva koje ih okrufuje, Ь) preureduje citoskeleton, da Ьi se povecala 6elijska pokretljivost i omogu6ilo kretanje 6elije kroz trodirnenzionalni vancelijski matriks, i с) indukuje novi program transkripcije, da Ьi se odrfuo mezenhimalni fenotip "stem" 6elije ( 45). Smatra se da је, za maligne tumore koji poticu od epitelnih 6elija, epitelno-mezenhimalni prelaz jedan od kljucnih dogadaja u metastatskom procesu ( 42). Pretpostavka је da Ьi indukcija epitelno-mezenhimalnog prelaza mogla da stirnulise epitelne celije karcinoma dojke da steknu karakteristike "stem" 6elija ( 46), sto sugerise da "stem" 6elije kancera nisu razliCiti entiteti, ve6 da su to epitelne 6elije tumora koje, privremeno, sticu osobine "stem" 6elije, sto irn povecava potencijal za nastanak metastaza. Pretpostavljeno је i da је sposobnost tumora da metastazira karakteristika koja је svojstvena jednoj podpopulaciji "stem" 6elija kancera. Tokom progresije tumora, "stem" 6elije kancera koje podlefu epitelno-mezenhirnalnom prelazu mogu dovesti do pojave metastatskih "stem" 6elije kancera, koje imaju sposobnost samo-obnavljanja i koja eksprimiraju razliCite povrsinske markere, u odnosu na "stem" 6elije kancera ( 4 7). Metastatske "stem" 6elije kancera mogu ili da udu u u krvotok, kolonizuju udaljena tkiva/organe i iniciraju sekundarni tumor, ili da ostanu "uspavane". Ove 6elije zadrfuvaju vecinu genetskih programa koje su stekle na mestu pпmarnog tumora putem samo-obnavljanja, sto objasnjava fenotipske slicnosti izmedu prirnarnih i me'tastatskih kancera. Medutirn, metastatske "stem" 6elije kancera su, na sekundarnom mestu rasta, sposobne da nezavisno evoluiraju putem akumulacije dodatnih genetskih promena, koje ih cine otpornirn na terapije koje su eflkasne protiv primarnih tumora (48). 11 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod 1. 3. Faktori prognoze/predikcije toka bolesti za primarni karcinom dojke U trenutku postavljanja dijagnoze, kod mnogih pacijenata obolelih od pпmarnog karcinorna dojke u ranoj fazi su prisutne mikro-metastaze u organizmu zbog cega postoji odredena verovatnoca za nastanak udaljenih metastaza, а sarnim tim i za razvoj metastatske bolesti i smrtni ishod ( 49). Stoga је sustinski vafuo da se, za svakog pojedinacnog pacijenta, predvidi rizik za pojavu udaljenih metastaza. Nakon primarne hirurske terapije, mnogi pacijenti oboleli od primarnog karcinorna dojke Ьivaju leceni adjuvantnom sistemskom terapijom, sa ciljem da se uniste udaljene metastaze. Medutirn, adjuvantna sistemska terapija sa sobom nosi i prateci rizik i zato Ьi Ьilo korisno da se optimalno odaberu pacijenti koji се, najverovatnije, imati koristi od iste, odnosno da se odabere optimalna adjuvantna terapija za pojedinacnog pacijenta (50). U tom smislu se Ьilo koja merljiva karakteristika tumora/dornacina tumora (Ьioloska ili klinicka), ili njihova kombinacija, koja Ьi preciznije ukazala na pacijente sa visokim/niskim rizikom za ponovnu pojavu bolesti, smatra znacajnom. Stoga, identifikacija klinicki-korisnih faktora prognoze/predikcije toka bolesti za primarni karcinom dojke predstavlja vazan predmet istra:Zivanj а. Faktor prognoze toka bolesti је Ьilo koji merljivi parametar, dostupan u trenutku hirurske terapije, koji је povezan sa tokom bolesti pacijenta kada nije primenjena adjuvantna terapija, u u:Zem smislu, odnosno ne uzimajuCi u obzir primenjenu adjuvatnu terapUu, u sirem smislu. Faktori prognoze su povezani sa metastatskim i/ili potencijalom brzine rasta primarnog tumora i, stoga, odra:Zavaju sposobnost tumora da proliferise, izvrsi invaziju tkiva i metastazira (51). V afuo је razlikovati faktore prognoze od faktora predikcije toka bolesti. Faktor pre?ikcije toka bolesti је Ьili koje merljiv parametar, dostupan u trenutku hirurske terapije, koji је povezan sa odgovorom, odnosno relativnom osetljivoscu i/ili rezistencijom pacijenta na odredenu vrstu terapije (51). u sirem smislч, faktor predikcije moze da opisuje Ьilo sta sto utice na rizik pacijenta za razvoj bolesti. Brojni su teorijski i prakticni razlozi koji opravdavaju ispitivanje upotrebu faktora prognoze/predikcije toka bolesti: • Prognoza/predikcija toka bolesti Analiza faktora prognoze toka bolesti, u odnosu na parametre toka bolesti, omogucava da se odredi tzv. "prirodan" tok bolesti pacijenata. Ukoliko izmedu dve grupe pacijenata, defmisanih prema statusu faktora prognoze, postoji znacajna razlika u toku bolesti, bez obzira na to da li su pacijenti leceni ili ne nekom dodatnom terapijom, faktori prognoze toka 12 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod bolesti omogucavaju da se identifikuju pacijenti sa povoljnim od onih sa nepovoljnim tokom bolesti (52). Analiza faktora predikcije toka bolesti, u odnosu na parametre toka bolesti, omogucava da se odredi tzv. "klinicki" tok bolesti pacijenata. Ukoliko izmedu dve grupe pacijenata postoji znacajna razlika u toku bolesti, usled primene odredene terapije za koju dati faktor predvida osetljivost ili rezistenciju, faktori predikcije toka bolesti omogucavaju da se identifikuju pacijenti sa povoljnim od onih sa nepovoljnim tokom bolesti (51). • Defmisanje podgrupa pacijenata sa razlicitim rizicima Moguce је defmisati podgrupe pacijenata (tzv. "grupe rizika") koje се imati uporedive verovatnoce za ponovnu pojavu bolesti, odnosno za efikasnost odredene vrste terapije (6). Pri tome, treba imati na umu studije u kojima је, na osnovu unapredenih statistickih modela, ustanovljeno da prognostickaJprediktivna vrednost prihvacenih i predlozenih faktora nije konstantna tokom perioda pracenja toka bolesti i da se menja u zavisnost od duzine perioda pracenja toka bolesti pacijenata (53). • Odabir terapije Faktori prognoze/predikcije mogu da stvore osnovu za odabir izmedu alternativnih terapija za pojedinacnog pacijenta ili za podgrupe pacijenata (50). Sledstveno, faktori predikcije toka bolesti mogu poboljsati klinicko ispitivanje i ukazati na faktore kojima se moze meriti uspeh ili neuspeh odredenih terapija. Pored toga, moguce је identifikovati podgrupe pacijenata za koje је potrebno primeniti agresivnije modalitete terapije ( 49). • Razumevanje bolesti Studije о faktorima prognoze/predikcije toka bolesti imaju za cilj da, direktno ili indirektno, objasne znacajnu heterogenosti koja је uocena izmedu karakteristika pacijenata i tumora, sa jedne, i ishoda bolesti pacijenata, sa druge strane. Faktori prognoze/predikcije toka bolesti su promenljive koje se odreduju za pojedinacne pacijente i koje, samostalno ili u medusobnoj kombinaciji, objasnjavaju deo ove hetrogenosti. Stoga, oni faktori prognoze/predikcije za koje se ustanovi da su znacajni, eventualno, mogu da obezbede uvid u proces bolesti. • Dizajn ispitivanja (studija) Faktori prognoze/predikcije toka bolesti mogu biti upotreЬljeni u dizajniranju klinickih trajala ili drugih studija na nacin da defmisu kriterijum izbora, odnosno podesnost pacijenata ili da razdvoje pacijente prema grupama rizika na nacin da neravnote:Zna raspodela ne utice na primarnu terapiju, kao i da obezbede smernice za buduce studije (6). Кlasicni prognosticki faktor~ koji se trenutno koriste u klinickoj praksi, obuhvataju parametre (godine i status menopauze) domacina tumora i parametre ( status limfnih cvorova, velicina 13 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod turnora, histoloski tip i histoloski gradus) tumora. Standardni prediktivni faktori, pored statusa receptora za estrogen (ER) i receptora za progesteron (PR), koji se koriste u svrhu odabira endokrine terapije, obuhvataju i umnozavanje gena ilili prekomernu ekspresiju HER2/neu, koji se koriste za klinicke trajale u adjuvantnom lecenju, kao i za odabir pacijenata za primenu leka Trastuzurnab u lecenju metastatske bolesti (50). 1. 3. 1. Klasicni faktori prognoze/predikcije toka bolesti 1.3 .1.1. Parametri domacina tumora - godine i status menopauze Analiza parametara domacina tumora, kao prognostickih parametara primarnog karcinoma dojke, је pokazala znacajnu neusaglasenost rezultata (52, 54-55). Istaknuta је potreba za defmisanjem medusobnog odnosa godina i statusa menopauze domacina tumora, kao i potreba za napustanjem pojednostavljenih analiza godina i statusa menopauze domacina tumora koja se ogledaju u podeli pacijentkinja na mlade, odnosno starije od 50 godina, kao i na pre-, odnosno post-menopauzne (52). Starost pacijentkinja је direktno povezana sa statusom menopauze pacijentkinja. Tako su pacijentkinje mlade od 45 godina uglavnom premenopauzne, а one starije od 59 godina postmenopauzne, dok pacijentkinje starosne dobi izmedu 45 i 59 godina mogu biti i premenopauzne i postmenopauzne. Pretpostavlja se da su karcinomi dojke, koji se pojavljuju u mladoj i starijoj zivotnoj doЬi, Ьioloski razliCiti entiteti, i da se, stoga, i "prirodan" tok bolesti kod mladih i starijih pacUentkinja znacajno razlikuj~ (56) . Odredeni rezultati ukazuju na pacijentkinje mlade od 35 godina, kao poseban entitet, za koje је ustanovljeno da imaju izrazito nepovoljniju prognozu toka bolesti (57). Uzrok za neusaglasenost rezultata koja se odnosi na prognosticku vrednost parametara domacina tumora је, jednim delom, u cinjenici da su parametri domacina tumora ispitivani kao nezavisni parametri prognoze, odnosno da su zanemarivani rezultati koji pokazuju medusobnu zavisnost parametara domacina tumora i parametara turnora (58) . 14 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod 1.3.1.2. Parametri tumora 1.3.1.2.1. Status lim(nih cvшova pazusne јате Prilik:om histo-patoloskog pregleda, prisustvo malignih celija u limfuim cvorovima pazusne jame pruza dokaz о tome da su se maligne celije rasejale do udaljenih mesta u organizmu i, stoga, ima odreden prognosticki znacaj (59). Medutim, znacajnija prognosticka informacija se dobija na osnovu broja limfnih cvorova u kojima su detektovane maligne celije nego na osnovu samog prisustva/odsustva metastaza u regionalnim lirnfnim cvorovima. Naime, u vecini sprovedenih studija је pokazano da postoji povezanost izmedu broja limfuih cvorova u kojima su detektovane maligne celije i verovatnoce za ponovnu pojavu bolesti, kao i izmedu ovog broja i verovatnoce za prezivljavanje, odnosno smrtni ishod (60-62). u vecini klinickih istra2ivanja, pacijenti se, prema broju limfuih cvorova u kojima su detektovane maligne celije, razvrstavaju u 4 nodalne grupe, koje su defmisane na osnovu podataka NSAВP studije (skr. od eng. The National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project): О cvorova, 1-3 pozitivna cvora, 4-9 pozitivnih cvorova, 10 i vise pozitivnih cvorova (50, 61). Status limfnih cvorova (pN) se defmise prema tome da li su u limfnim cvorovima detektovane maligne celije (pN+, pozitivan status, bez obzira na broj limfnih cvorova) ili ne (pNO, negativan status). Ovaj parametar predstavlja najuticajniji pojedinacni indik:ator za pono\тnu pojavu bolesti i smrtni ishod i koristi se pri odlucivanju о primeni adjuvantne sistemske terapije (63). I dok su, u slucaju operabilnih pacijenata, metastaze u pazusnoJ Jami najvaznija determinanta prognoze toka bolesti, cinjenica da priЬlizno 25 % pacijenata bez metastaza u regionalnim limfnim cvorovima ne bude izlecena lokalno-regionalnom terapijom, kao i cinjenica da su brojni pacijenti sa metastazama zivi i da su dobro, nekoliko godina nakon hirшske terapije, ukazuju na to daje status limfnih cvorova nepotpun pokazatelj sistemske bolesti (64-65). 1.3.1.2.2. VeliCina tumora Histopatoloska velicina tumora (рТ) predstavlja naj\тecu dimenziju tumora, izmerenog dиZ tri ose, i na osnovu nje se tumori mogu svrstati u рТ1 (Т:::; 2 cm), рТ2 (2 <Т:::; 5 cm) i рТ3 (Т> 5 cm) tumore (66). Velicina tumora је direktno povezana sa prisustvom i sa povecanim prosecnim brojem limfnih cvorova u kojima su detektovane maligne celije, odnosno sa povecanom verovatnocom za nastanak regionalnih metastaza (59, 62). Pri tome, i broj udaljenih 15 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod metastaza raste sa povecanjem velicine tumora, te је velicina tumora u direktnoj korelaciji sa povecanom verovatnocom za ponovnu pojavu bolesti i smrtni ishod (67). Na osnovu toga se moze pretpostaviti da velicina tumora predstavlja funkciju vremena tokom koga tumor raste, odnosno funkciju brzine rasta tumora. Tumori koji su velicine 1 cm ili manji imaju izrazito nizak rizik, odnosno malu verovatnocu za ponovnu pojavu bolesti i smrtni ishod (59) . Medutim, tumori iste v~licine ne moraju imati istu agresivnost, brzinu rasta i proliferativne karakteristike malignih celija (55) . Velicina tumora је od posebnog interesa u grupi pacijentkinja sa negativnim statusom limfnih cvorova. Na osnovu baze podataka SEER (skr. od eng. Surveillance, Epidemiology and End Results) studije, za vise od 13 000 pacijentkinja sa negativnim statusom limfnih cvorova, ustanovljeno је da su pacijentkinje sa tumorima manjim od 1 cm imale ukupno prezivljavanje (OS) od skoro 99 %, u periodu od 5 godina, u poredenju sa 89 %, za one sa tumorima izmedu 1 i З cm, i 86 %, za one sa tumorima izmedu З i 5 cm (60). Za pacijente sa negativnim statusom limfnih cvorova, velicina tumoraje najmocniji, nezavisan faktor prognoze i rutinski se koristi pri odluCivanju о primeni adjuvantne sistemske terapije. Studije podrzavaju hipotezu da pacijenti koji imaju negativan status liшfnih cvorova i precnik tumora 1 cm ili manji predstavljaju grupu pacijenata sa najpovoljnijom prognozom toka bolesti, koji ne bi imali znacajne koristi od primene adjuvantne sistemske terapije (54). Generalno, pacijenti sa tumorima veCim od 1-2 cm se uzimaju u · obzir za primenu adjuvantne terapije jer se kod vise od 20 % ovih pacijenata razvijaju udaljene metastaze (50). Кlinicke studije su pokazale da u slucaju kada su maligne celije prisutne u limfnim cvorovima, velicina tumora nije nezavisan parametar prognoze (68). Ј . 3.1. 2. З. Histoloski tip tum01'a U skladu sa preporukama eksperata Svetske zdravstvene orgamzaclJe u oЬlasti histopatologije malignih tшnora dojke (69), invazivni karcinorni se, na osnovu porekla malignih celija, mogu podeliti na: - invazivne duktalne (IDC) i - invazivne lo bularne (ILC) karcinome; Treba napomenuti da uprkos sugestiji koju namece podela tumora na histoloske tipove, rnaligni tumori оЬа tipa nastaju iz iste regije dojke- terrninalne duktalno-lobularne jedinice (70). Brojne studije о prognostickom znacaju histoloskog tipa karcinoma dojke su dale kontradiktome rezultate (71-72). Za uobicajene tipove karcinorna dojke, kao sto su IDC i ILC, upotreba histoloskog gradusa kao faktora prognoze toka bolesti је bila ogranicena zbog 16 DOKTORSКA DISERTACIJA Uvod sиbjektivnog иticaja histopatologa и klasifikaciji tиmora (7З) . Dok za karcinome dojke, koji sи bili okarakterisani kao IDC ili ILC, nije nadena korelacija sa pojavom иdaljenih metastaza, za nekoliko specificnih histoloskih tipova karcinoma dojke (mиcinozni, tиbиlarni, medиlarni i papilarni) је pokazano da иslovljavajи manji rizik za rasejavanje malignih celija i za izazivanje smrtnog ishoda, te da imajи povoljnijи prognozu toka bolesti (74-77). Ovi specificni tipovi karcinoma predstavljajи malи grири karcinoma koja obиhvata manje od 6 % svih invazivnih karcinoma (78). 1.3.1.2.4. Histoloski gradus tumora Usled nesavrsenosti dostиpnih faktora prognoze/predikcije toka bolesti, postalo је evidentno da је neophodno иvodenje nekih ne-anatomskih faktora da bi se optiшalno procenila prognoza toka bolesti i planiralo lecenje pacijenata. Histoloski gradиs tuшora је иveden u klinickи ироtrеЬи sa ciljem da se poboljsa prognoziranje toka bolesti pacijenata koje је, prvenstveno, bilo zasnovano na statиsи limfnih cvorova i velicini tиmora (79). Histoloski gradиs tиmora obиhvata dve, medиsobno nezavisne osobenosti malignih celija- proliferativnost i diferentovanost (7З , 80). Proliferativnost је izr59 91 40,4 Status menopauze Pre-menopauza 77 34,1 Post-menopauza 144 63,7 Nepoznato 5 2,2 Status limnih cvorova NO 92 40,7 N+ 112 49,6 Nepoznato 22 9,7 Velicina tumora п 100 44,2 Т2 122 54 Nepoznato 4 1,8 Histoloski gradus I 33 14,6 п 146 64,6 ш 43 19 Nepoznato 4 1,8 Histoloski tip IDC 112 49,6 ILC 80 35,4 Ostali 34 15 Status ER ER+ 153 67,7 ER- 73 32,3 Status PR PR+ 102 45,1 PR- 124 54,9 Komblnovani status ER i PR ER+PR+ 92 40,7 ER+ PR- 61 27 ER-PR+ 10 4,4 ER- PR- 73 32,3 44 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode odredivani od strane histopatologa, dok sи podaci о domacinи tиmora Ьili dostиpni na osnovu istorija bolesti pacijentkinja. U tabeli 3.1. је prikazan broj pacijentkinja и grиpama koje sи Ьile defmisane na osnovu parametara domacina tиmora, tиmora, statиsa ER ilili statиsa PR. Treba napomenиti da sи godine i statиs menopauze domacina tиmora Ьili medиsobno povezani (x2-test, р<О,ОО 1) иsled toga sto sи sve pacijentkinje mlade od 45 godina Ьile premenopauzne, sve starije od 59 godina sи Ьile postmenopauzne, dok sи pacijentkinje srednje doЬi Ьile pre- i postmenopauzne. Pored toga, velicina tиmora је Ьila direktno povezana sa statиsom limfnih cvorova (x2-test, р=О,О4) jer је vecina pacijentkinja sa рТ1 tumorima imala negativan, а vecina pacijentkinja sa рТ2 tumorima pozitivan statиs limfnih cvorova. Podaci vezani za tok bolesti pacijentkinja, и okvirи perioda pracenja toka bolesti od 36 meseci, sи Ьili dostиpni za 201 pacijentkinjи, medи kojima је Ьila 41 pacijentkinja (20%) kod koje је potvrdeno prisиstvo иdaljenih metastaza, odnosno 140 pacijentkinja koje nisи imale иdaljene metastaze и periodи pracenja toka bolesti. Pri tome, 20 pacijentkinja nije ispиnjavalo kriterijиme vezane za pracenje toka bolesti и periodи od 36 meseci, tako da ove pacijentkinje nisи uzete и obzir pri analizi verovatnoca za DFI. 3. 2. Odredivanje koncentracija ER i PR- Ьiohemijska metoda Koncentracije steroidnih receptora, ER i PR, и tkivu karcinoma dojke sи odredivane Ьiohernijskom metodom na osnovu stavova i preporuka EORTC (skr. od eng. Еш-ореап Organization for Research and Treatment of Cancer) (301). Metoda se bazira na vezivanjи molekula estrogena i progesterona, obelezenih tricijиmom ен), za molekule odgovarajиcih receptora koji sи prisиtni и citosolnom ekstraktи tkiva karcinoma dojke. Ovom metodom mogи se detektovati samo slobodni receptori, tj. oni receptori za koje nisи vezani endogeni hormon. Biohemijska metoda za odredivanje koncentracija steroidnih receptora obuhvata sledece postиpke: 1.) uzimanje i cиvanje иzoraka karcinoma dojke, 2.) homogenizacijи tkiva i izdvajanje frakcije citosola malignih celija, 3.) izbor hormona i izbor opsega koncentracije hormona, 4.) vezivanje hormona za receptore prisиtne и citosolnom ekstraktи malignih celija, 5.) odvajanje viska nevezanog hormona, 6.) odredivanje radioaktivnosti и ~-scintilacionom Ьrојаси, 7.) odredivanje koncentracije proteina и uzorku, 8.) izracиnavanje koncentracije ER i PR; 45 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode Pravilno uzimanje uzorka tumorskog tkiva, kao i nJegovo cuvanje (302), је vazno sa stanovista istovremenog odredivanja koncentracUa razlicitih biomarkera u citosolnom ekstraktu tkiva karcinoma dojke. Neposredno ро hirurskom odstranjenju tumora iz dojke, histopatolog izdvaja reprezentativni uzorak rnalignog tkiva, rnase od 200 mg do 1 g, za odredivanje koncentracije steroidnih receptora. Tkivo karcinoma dojke se cuva u tecnom azotu (-196 °С) do trenutka odredivanja koncentracije steroidnih receptora, sa obzirom da је utvrdeno da se u uzorcima tumora, koji su cuvani na ovaj nacin, kvantitativni sadrzaj receptora za estrogen ne menja tokom vremena (303). Pokazano је da је najeflkasniji nacin za homogenizaciju uzorka tkiva karcinoma dojke sprasivanje uzorka, zaledenog u tecnom azotu, koje se izvodi na temperaturi ledenog kupatila (0- 4 °С) (13). Spraseni uzorak se homogenizuje u puferu, na temperaturi ledenog kupatila, u cilju dobijanja suspenzije. Prilikom odredivanja koncentracija steroidnih receptora, preporucuje se koriscenje fosfatnog pufer sledeceg sastava: 5 mМ fosfatni pufer, 10 % (v/v) glicerol, 1 mМ monotioglicerol, 1,18 mМ EDTA, pri рН = 7,4 - 7,7 (13 , 301). Suspenzija se centrifugira na 800-1000 g (oko З 500 obr/min), u toku 30 rnin, na temperaturi ledenog kupatila. Dobijeni supematant predstavUa nepreCiscenu frakciju citoso1a celija tumora. Nakon u1tracentrifugiranja supematanta na 100 000 g (37 000 obr/min, ultracentrifuga Beckman L5-50) , u toku 60 min, na temperaturi ledenog kupatila, u supematantu se izdvaja citosolna :frakcija celija tumora. U svrhu odredivanja koncentracije ER koriscen је 17-~-estradiol (Amersham, Eng1eska), obe1ezen tricijumom, speciflcne aktivnosti 90 Cilmmol (3 ,5 TBq/mmol). Као kompetiti\mi hormon koriscen је sinteticki estrogen, dietilstilЬestrol. Pri odredivanju koncentracije ER је potrebno da koncentracije "obelezenog" estrogena u ispitivanom uzorku budu u opsegu 2-32 х 10-10 М, odnosno da koncentracije "neobelezenog" estrogena budu u opsegu 2-32 х 10-8 М (302). Koncentracija PR је odredivana u prisustvu sintetickog progesterona ORG 2058 (Amersham, Eng1eska), obe1ezenog tricijumom, speciflcne aktivnosti 40 Cilmmol (1 ,5 TBq/mmol). ' 'Neobe1ezeni" progesteron, ORG 2058, је koriscen kao konkurentni hormon. Pri odredivanju koncentracije PR је potrebno da koncentracije "obelezenog" progesterona u ispitivanom uzorku budu u opseg 4-64 х 1 о-10 М, odnosno da koncentracije "neobelezenog" progesterona budu u opsegu 8-128 х 10-8 М u ispitivanom uzorku (302). Izbor hormona-liganda mora da zadovolji dva neophodna uslova za odredivanje koncentracija receptora za estrogen i receptora za progesteron. Prvi uslov је da hormon ima ma1u vrednost konstante disocijacije za reakciju hormona sa odgovarajuCim receptorom, а drugi uslov је da hormon pokazuje speciflcnost u pogledu biofunkcionalnosti. Navedeni opseg koncentracija hormona-liganda, u okviru konstanti disocijacija kompleksa hormona i njegovog receptora, omogucava odredivanje koncentracije receptora u citosolnom ekstraktu celija malignog tumora dojke. 46 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode Citosolcelija tumora dojke sadrzi proteine sa visokim afmitetom vezivanja (ER i PR, Kd < 1 nМ) i proteine sa niskim afmitetom vezivanja (Kd > 30 nМ) za steroidne hormone (304-305). Ukupno vezivanje hormona (Вт) predstavlja vezivanje hormona kako za proteine sa visokim, tako i za proteine sa niskim afinitetom vezivanja. Nespecificno vezivanje hormona predstavlja vezivanje hormona za proteine koji imaju nizak afmitet vezivanja. Odredivanje ukupnog i nespecificnog vezivanja hormona zasniva se na kompetitivnoj inhiЬiciji, odnosno na medusobno iskljuCivom vezivanju "obelezenog" ili "neobelezenog" hormona za molekule receptora. Razlika izmedu ukupnog i nespecificnog vezivanja hormona predstavlja specificno vezivanje hormona za odgovarajuci receptor (Bs). Koncentracija "obelezenog" hormona, koji је nakon uspostavljanja ravnoteze ostao slobodan u rastvoru (F), moze se odrediti jednostavnim oduzimanjem koncentracije ukupno-vezanog "obelezenog" hormona (Вт) od pocetne koncentracije "obelezenog" hormona (Т) . Uslovi koji moraju da budu zadovoljeni pri interakciji hormona i proteina u citosolu celija malignog tumora dojke se odnose na ocuvanje biofunkcionalnosti receptora i omogucavanje uspostavljanja dinamicke ravnoteze izmedu hormona, receptora i kompleksa hormon-receptor (302). Reakcija izmedu ER, odnosno PR, i odgovarajuceg steroidnog hormona se izvodi na temperaturi ledenog kupatila, а vreme interakcije obuhvata interval od 18 do 24 sata jer је pokazano da је reakcija izmedu estradiola i njegovog receptora zavisna od temperature i vremena (302). Za razdvajanje molekula hormona vezanih za receptore od slobodnih molekula hormona se, ро uspostavljanju ravnoteze izmedu reaktanata i nastalih proizvoda, koristi aktivni ugalj (0,25 % norit А, Sigma, Nemacka) koji se oЬla:le secerom (0,0025 % dekstran Т-70, Pharmacia, Svedska) (306). Razdvajanje se zasniva na fizicko-hernijskoj adsorpciji slobodnih molekula hormona na cvrstoj fazi uglja. Aktivni ugalj se oЬla:le dekstranom da bi se spreCio pristup velikih molekula povrsini aktivnog uglja, odnosno da Ьi se dozvolilo samo malim molekulima da se adsorbuju. Adsorpcija slobodnih molekula hormona se desava na temperaturi ledenog kupatila, u trajanju od 30 minuta, u 0,01 М TRIS puferu, pri рН 8, uz povremeno mesanje (13 , 305). Talozenje aktivnog uglja, na kome је adsorbovan nevezani hormon, se posti:le centrifugiranjem na 2000-3000 g (oko З 500 obr/min), u toku 30 min, na temperaturi ledenog kupatila (302). U supematantu ostaje hormon vezan za odgovarajuci receptor. Radioaktivnost uzorka se meri u alikvotu supematanta, u scintilacionoj tecnosti (0,4 % РРО i 0,005 % РОРОР rastvoreni u toluolu), pomocu ~-scintilacionog brojaca (Beckman LS 7000). Istovremeno se meri i pocetna radioaktivnost dodatog "obelezenog" hormona (Т). Izmerenu relativnu aktivnost uzorka, izra:lenu kao broj detektovanih raspada u minuti (cpm- skr. od eng. counts per minute), је potrebno podeliti sa efikasnoscu ~-scintilacionog brojaca, koja је Ьila izmedu 0,45 i 0,6, da Ьi se odredila apsolutna aktivnost, izra:lena kao broj raspada u minuti 47 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode (dpm- sk:r. od eng. desinteg~-ations per minute). Eflkasnost brojaca, tj. odnos broja raspada koje sи detektovani роmоси brojaca i broja raspada koji sи se stvarno dogodili, se odredиje na osnovu kaliЬracione krive za brojac koja se periodocno odredиje, koriscenjem radioaktivnih standarda koje isporиcиje proizvodac ~-scintilacionog brojaca. Koncentracija ukupnih proteina и citosolnom ekstraktи је odredivana metodom ро Lowry- и (307). Ova mikrometoda se bazira na dve hemijske reakcije: Ьiuretskoj reakciji proteina sa jonom bakra и baznoj sredini i redиkciji fosfo-molibdenskog-fosfo-volframovog reagensa (Folin-Ciocalteи-ev fenolni reagens) tirozinom i triptofanom prisиtnim и citosolnom ekstraktи. Apsorbancija је merena spektrofotometrom (Boewe, Nernacka) na talalasnoj dиZini od 660 nm. Prilikom svakog merenja koncentracije иkиpnih proteina и uzorcima, konstrиisana Је kaliЬraciona kriva za odredivanje koncentracije proteina koriscenjem vodenih rastvora sa razliCitim koncentracijama govedeg serиma alЬиmina (BSA). Vrednosti koncentracije proteina и иzorcima, koje sи Ьile ocitane sa kaliЬracione krive, na osnovu izmerenih vrednosti apsorbancije, sи Ьile korigovane za koriscena razЬlaienja i izraiene и mg/ml. Kada sи poznate ravnotefue koncentracije slobodnog "obelezenog" (F) speciflcno- vezanog "obelezenog" (Bs) hormona, роmоси Scatchard-ove jednacine (308): Bs =--~-Bs + Ro F Kd Kd se moze odrediti koncentracija receptora za steroidni hormon (RO) i konstanta disocijacije (Kd). Graflckim predstavljanjem Scatchard-ove jednacine do Ьiја se linearna zavisnost ( slika 3 .1. ). о Slika З . Ј . - Graficki prikaz Scatchшd-ove jednaCine 48 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode Ekstrapolacijom dobUene prave za uslov BS/F=O, odnosno iz preseka prave sa apscisorn, moze se odrediti ukupna koncentracija steroidnih receptora RO, dok se konstanta disocijacije Kd mozeodrediti iz nagiЬa prave kao negativna reciprocna vrednost nagiЬa prave. Relativna greska odredivanja је Ьila manja od 5% (8<0,05). Koncentracija steroidnog receptora, odredena na opisani nacin, је izra:Zena u fmol/ml i potrebno је doЬijenu vrednost podeliti sa koncentracijom ukupnih proteina da Ьi se doЬila koncentracija steroidnog receptor izrazena u fmol/mg ukupnih proteina. Pokazano је da se, umesto Ьiohemijske metode sa 5 koncentracija hormona, pouzdano moze upotreЬiti metoda sa jednorn, maksimalnom koncentracijom hormona (309). Stoga su, za odredivanje koncentracija steroidnih receptora Ьiohemijskom metodom sa jednom koncentracijom steroidnog hormona, koriscene maksimalne koncentracije steroidnih hormona koje su navedene u odeUku 3.2., а u skladu sa preporukama EORTC-a. Upotreba samo jedne koncentracije hormona је omoguCila da se u citosolnom ekstraktu, istovremeno, odrede i kvantitativni sadrzaji katepsina D i pS2. 3. 3. Odredivanje koncentracija pS2 1 katepsina D - imunoradiometrijski esej (IRМA) Citosolni ekstrakt, koji је Ьiо koriscen za odredivanje koncentracija steroidnih receptora Ьiohemijskom metodorn, је koriscen i za odredivanje koncentracija pS2 i katepsina D. Koncentracije pS2 i katepsina D su odredivane IRМA metodorn, tacnije koriscena је jedna varijanta ove metode, tzv. "sendvic" imunoradiometrijski esej na cvrstoj fazi. Za odredivanje koncentracija pS2 1 katepsina D su korisceni komercijalni kompleti za kvantitativno odredivanje pS2, odnosno katepsina D (ELSA-pS2, odnosno ELSA-CATH-D, CIS Biolntemational, Francuska). Upotrebom navedenog komercijalnog kompleta za katepsin D је Ьilo moguce detektovati sve tri izoforme katepsina D (34 kDa, 48 kDa i 52 kDa). Granica detekcije, odnosno najmanja koncentracija razliCita od nule koju је Ьilo moguce odrediti sa verovatnocom 0,95, је Ьila 20 fmol/ml za katepsin D, odnosno 40 pg/ml za pS2. "Sendvic" imunoradiometrijski esej na cvrstoj fazi se zaniva na upotreЬi dva monoklonska antitela koja se specificno vezuju za prostomo udaljene regione ( epitope) na ispitivanom antigenu (molekul pS2 ili katepsina D). Antitelo za vezivanje predstavlja primarno antitelo, koje је vec vezano za dno epruvete (cvrsta faza) , i slu:Zi da se ispitivani antigen, prisutan u citosolnom ekstraktu, veze za antitelo i, samim tim, za cvrstu fazu. Sekundarno antitelo, tj. antitelo za obelezavanje, је obelezeno radioaktivnim jodom 125 С25Ј) i specificno se vezuje za ispitivani 49 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode antigen, koji је vec vezan za cvrstи fazu. Na taj nacin se antigen nalazi и "sendvicи" izmedи primarnog i sekundarnog antitela (slika 3.2.). Nakon ispiranja viska nevezanog sekundarnog antitela, radioaktivnost, koja potice od 125 Ј vezanog za antigen, se meri роmоси y-scintilacionog brojaca i proporcionalna је koncentraciji antigena vezanog izmedи dva antitela и eprиveti. Preporuka proizvodaca navedenih kompleta za IRМA esej је da koncentracija ukupnih proteina и citosolnom ekstraktи Ьиdе podesena na vrednost izmedи 1 i 2 mg/ml pre izvodenja eseja. Za potrebe eseja, koji se izvodi na sobnoj temperatшi, kontrolni i ispitivane иzorke za analizu pS2 је potrebno razЬlaZiti sa odgovarajиcim rastvaracem и odnosи 1/20, а и slисаји katepsina D је potrebno razЬlaZiti samo ispitivane иzorke и odnosи 1/40 i 1/80. U svaki eprиvetи iz komercijalnog kompleta za odredivanje је potrebno dodati ро 200 IJ.l monoklonskog antitela za pS2 obelezenog sa 1 25Ј, odnosno ро 300 IJ.l monoklonskog antitela za katepsin D obelezenog ......--+--- 12s Ј ....---1--- Antitelo za obelezavanje (sekundarno antitelo) .-.-+---- Antigen (pS2 ili katepsin D) lo za vezivanje (primarno antitelo) Slika З. 2. - Sematski pl'ikaz priпcipa па kome se zasпiva tzv. " seпdvic " imuпшadiomen-ijski esej па cvrstoj fazi. Aпtitelo za vezivaпje (primarno aпtitelo) је, prethodпo, vezaпo za cvrstu fazu i опо, ргеkо odgovarajuceg геgiопа (epitopa) , specificпo vezuje aпtigen. Aпtitelo za vezivaпje (sekuпdarno aпtitelo), koje је obeleieпo molekulom l'adioaktivпogjoda 125, se specificпo vezuje za aпtigeп ргеkо drugog, pl'OStorno udaljeпog epitopa. sa 125 Ј. Zatim је, и odgovarajиce eprиvete, potrebno dodati ро 200 IJ.l standarda, razЬlaZenog kontrolnog ili razЬlazenog ispitivanog иzorka, za analizu pS2, odnosno ро 50 IJ.l za analizи katepsina D. Nakon inkubacije na sobnoj temperatшi, и trajanjи od 1 sata za analizu pS2, odnosno 3 sata za analizu katepsina D, potrebno је ukloniti visak nevezanog sekundarnog antitela pиtem nekoliko uzastopnih ispiranja, sto predstavlja jedan od kriticnih koraka Na osnovu izmerenih radioaktivnosti za standarde, mogиce је konstrиisati standardnи krivu sa koje se mogи odrediti nepoznate koncentracije antigena koje odgovarajи izmerenim aktivnostima иzoraka. Kolicnik nepoznate koncentracije antigena, izraZene и ng/ml za pS2, odnosno и pmollml za katepsina D, koje sи korigovane za odgovarajиca razЬlaZenj a, i ukupne 50 DOKTORSКA DISERTACIJA Materijal i metode koncentracije proteina u uzorku, izra.Zene u mg/ml ukupnih proteina, predstavlja koncentraciju antigena izra.Zenu u ng/mg za pS2, odnosno u pmol/mg za katepsina D. 3. 4. Statisticke metode za obradu rezultata Sa obzirom da su vrednosti koncentracija i pS2 i katepsina D bile u sirokom opsegu vrednosti, pomocu Kolmogorov-Smirnov testa (31 О) su analizirane raspodele vrednosti koncentracija ova dva molekularna biomarkera da bi se utvrdilo da li one odstupaju, ili ne, od normalne raspodele. Kako је utvrdeno da raspodele vrednosti koncentracija оЬа molekularna biomarkera statisticki znacajno odstupaju od normalne raspodele, za obradu rezultata su korisceni neparametrijski statisticki testovi: • Za uporedivanje vrednosti koncentracija pS2, odnosno katepsina D, u grupaшa pacijentkinja definisanim parametrirna domacina tumora, tumora, statusom ER ilili statusom PR је koriScen Mann-J!Vhitney-ev U-test (311) ili Kruskal-Wallis-ov test (312). • Upotrebom Spearman-ovog testa је odredivan rang korelacije kao priЬliZna indikacija povezanosti izmedu koncentracija ispitivanih proteina (313). • Za uporedivanje ucestalosti pacijenata sa pozitivnirn/negativnim statusom pS2, odnosno katepsina D, u grupama pacijentkinja defmisanirn parametrirna domacina tumora, tumora, statusom ER ilili statusom PR, upotrebljenje x2-test (314). • Verovatnoce za interval bez ponovne pojave bolesti u grupama pacijentkinja defmisanim parametrirna domacina tumora, tumora, statusom ER ilili statusom PR su odredivane metodom Kaplan-a i _Meier-a (315), na osnovu poznatog broja pacijentkinja kod kojih је potvrdeno prisustvo udaljenih metastaza, broja meseci nakon hirurske intervencije, za svaku od tih pacijentkinja, posle kojih је doslo do pojave udaljene metastaze, kao i broja pacijentkinja koje nisu imale metastaze, u periodu ukupnog pracenja toka bolesti od 36 mesec1. • Upotrebom tzv. "log-rank" testa (316), koji је poznat i kao Mantel-Cox-ov test, ispitivano је da li se verovatnoce za interval bez ponovnog javljanja bolesti statisticki znacajno razlikuju izmedu odredenih grupa pacijentkinja u datom periodu pracenja toka bolesti. 51 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati 4. REZULTATI 4. 1. Raspodela koncentracija 4. 1. 1. Raspodela koncentracija katepsina D ' 4. 1.1.1. Raspodela ucestalosti koncentracija katepsina D U celoj grupi od 226 pacijentkinjica sa primarnim operabilnim karcinomom dojke, vrednosti koncentracija katepsina D su bile u opsegu od 8,3 do 237,8 pmol/mg, sa medijanom od 37,7 pmol/mg. Raspodela ucestalosti koncentracija katepsina D, za 226 pacijentkinja sa primarnim operabilnim karcinomom dojke, је prikazana na slici 4.1 .. 60 50 40 ~ 30 20 10 о о 40 во 120 160 200 240 katepsin D (pmol/mg) Slika 4.1. - Raspodela ucestalosti koncentracija katepsina D, za 226 pacijentkinja sa primarnim operahilnim karcinomom dojke (Kolmogoгov-Smirnov test, р< О, ООЈ), и intavalimд od 20140 p mol/mg. Sa slike 4.1. se moze videti da raspodela ucestalosti koncentracija katepsina D u tumorima znacajno odstupa od normalne raspodele, sto to је potvrdeno i pomocu Kolmogorov-Smirnov testa (p59 Status me по pauze Pre-menopauza Post-menopauza Nepomato Broj pacijenata 39 96 91 77 144 5 * Mann-Whitney ili Kгuskal-Wallis test (%) 17,2 42,5 40,3 34,1 63,7 2,2 Ко псе ntracija kate ps ina D (pmol!mg) Opseg 15,4- 143,2 12,1 - 237,8 8,3- 167,8 12,1 - 237,8 8,3- 207,2 11 - 73,8 50% - vrednost 31 ,6 " 39,4 38,7 35,9 " 38,8 26,5 р vrednost* 0,3 0,9 Od ukupnog broja pacijentkinja, njih 77 је bilo defrnisano kao premenopauzne, а 144 kao postmenopauzne, dok za 5 pacijentkinja nije bio poznat status menopauze. U grupi premenopauznih pacijentkinja, koncentracije katepsina D su bile u opsegu od 12,1 do 237,8 pmollmg, pri cemu је medijana bila 35,9 pmol/mg. Za postmenopauzne pacijentkinje, koncentracije katepsina D su imale 53 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati vrednosti izmedи 8,3 i 207,2 pmollmg. Medijana koncentracija katepsina D, и ovoj grиpi, је bila 38,8 pmollmg. Koncentracije katepsina D, и dve grиpe defшisane statиsom menopauze domacina tumora, se nisи znacajno razlikovale. 4.1. 1.3. Raspodela koncentracija katepsina D и grиpama pacUentkinja defшisanim parametrima tиmora U tabeli 4.2. sи prikazane karakteristike raspodele koncentracija katepsina D и grиpama pacijentkinja defшisanim parametrima tumora. Pacijentkinje sи, prema statиsи limfnih cvorova, bile svrstane и dve grиpe pacijentkinja: а) sa negativnim statиsom limfnih cvorova, odnosno bez malignih celija и limfnim cvorovima (pNO) i Ь) sa pozitivnim statиsom limfnih cvorova, odnosno sa malignim celijama и limfnim cvorovima (pN+). Za 22 pacijentkinje nije Ьiо poznat statиs limfnih cvorova. Pacijentkinje sa negativnim statиsom limfnih cvorova (n=92) sи imale koncentracije katepsina D и intervalи od 8,3 do 132,7 pmollmg, sa medijanom od 20,3 pmol/mg, dok sи one sa pozitivnim statиsom limfnih cvorova (n=112) imale koncentracije katepsina D и intervalи od 12,2 do 237,8 pmollmg, sa medijanom od 43 ,2 pmollmg. Analizom vrednosti koncentracija katepsina D ustanovljeno је da sи se one statisticki znacajno razlikovale (Mann-Whitney test, р<О ,ОО1) и dve grиpe, pri сети sи koncentracije katepsina D и grиpi pacijentkinja sa pozitivnim statиsom limfnih cvorova imale vece vrednosti. Na osnovu velicine tиmora, pacijentkinje sи Ьile svrstane ili и grupи pacijentkinja sa tumorima koji sи manji od 2 cm (рТ1, n=100) i и grupи pacijentkinja sa tиmorima koji sиjednaki ili veCi od 2 cm (рТ2, n=122). Velicina tиmora је Ьila nepoznata za 4 pacijentkinje. Koncentracije katepsina D sи Ьile izmedи 8,3 i 237,8 pmollmg, и grиpi pacijentkinja sa tumorima manjim od 2 cm, odnosno, izmedи 12,2 i 189,3 pmollmg, и grиpi pacijentkinja sa tumorima jednakim ili veCim od 2 cm. Odgovarajиce medijane koncentracija sи Ьile 35 i 39,2 pmollmg, respektivno. Vrednosti koncentracija katepsina D, и grиpama pacijentkinja defшisanih prema velicini tиmora, se nisи znacajno razlikovale. Histoloski gradиs tumora је Ьiо nepoznat za 4 pacijentkinje. Tиmori pacijentkinja sи Ьili karakterisani koncentracijama katepsina D и rasponи od 8,3 do 132,7 pmollmg (medijana 27,7 pmollmg), za tumore histoloskog gradиsa I (n=33) , и rasponи od 10,4 do 237,8 pmollmg (medijana 38,3 pmollmg), za tumore histoloskog gradиsa П (n=146), i и rasponи od 12,2 do 167,8 pmollmg (medijana 43 ,5 pmollmg), za tиmore histoloskog gradиsa III (n=43). Vrednosti koncentracija katepsina D, и grиpama pacijentkinja defшisanih prema histoloskom gradиsи tumora, se nisu znacajno razlikovale. 54 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati Tabela 4. 2. - Karakteristike raspodele koncentracija katepsina D и gl'Иpama pacijentkinja definisanim parametrima tumora (Ьт-ој pacijenata, opseg vrednosti i medijana koncentracije, р vrednost). Koncentracija katepsina D Broj (pmollmg) р pacijenata (%) vrednost* 50%-O pseg vrednost Status limnih cvo rova pNO 92 40,7 8,3- 132,7 30,4 < 0,001 pN+ 112 49,6 12,2 - 237,8 43,2 Nepomato 22 9,7 10,4 - 131,5 42,2 Velicina tumora р П 100 44,2 8,3-237,8 35 0,4 рТ2 122 54 12,2- 189,3 39,2 Nepomato 4 1,8 11 - 78,4 47,2 Нistoloski gradus I 33 14,6 8,3 - 132,7 27,7 п 146 64,6 10,4- 237,8 38,3 0,2 ш 43 19 12,2- 167,8 43,5 Nepomato 4 1,8 16,7- 27,5 24 Нis tolo s ki tip IDC 112 49,6 10,4- 237,8 39,6 0,3 ILC 80 35,4 12,8 - 120,3 37,7 Ostali 34 15 8,3 - 110,8 29,3 * Mann-Whitney ili Kгuskal- Wallis test U zavisnosti od histoloskog tipa tumora, pacijentkinje su razvrstane u grupe sa: а) invazivnim duktalnim karcinomima (IDC), Ь) invazivnim lobularnim karcinomima (ILC) i с) ostalim tipovima karcinoma dojke. U grupi pacijentkinja sa IDC karcinomima dojke (n=112), koncentracije katepsina D su bile u opsegu od 10,4 do 237,8 pmol/mg, sa medijanom od 39,6 pmol/mg, dok su, u grupi pacijentkinja sa ILC karcinomima dojke (n=80), bile u opsegu od 12,8 do 120,3 pmol/mg, sa medijanom od 37,7 pmol/mg. U celoj grupi ispitivanih pacijentkinja, 34 pacijentkinje su imale retke tipove karcinoma dojke, koji nisu bili IDC ili ILC. Ustanovljeno је da se koncentracije katepsina D nisu znacajno razlikovale izmed:u grupa pacijentkinja sa IDC i ILC karcinomima. 55 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati 4.1.1 .4. Raspodela koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja defmisanim statusom ER i/ili PR Karakteristike raspodele koncentracija katepsina D u grupama pacijentkinja defmisanim statusom ER i/ili PR su prikazane u tabeli 4.3. U tumorima pacijentkinja sa pozitivnim statusom ER (n=153), koncentracije katepsina D su bile u opsegu od 10,4 do 237,8 pmol/mg, pri cemu је medijana Ьila 42,9 pmollmg, i one su se statisticki znacajno razlikovale od koncentracija katepsina D u tumorima pacijentkinja sa negativnim statusom ER (n=73), koje su Ьile u opsegu od 8,3 do 107,9 pmollmg, sa medijanom od 26,9 pmollmg (Mann- Whitney test, р<О,ОО 1 ). Koncentracije katepsina D su Ьile vece u grupi pacijentkinja sa pozitivnim statusom ER. Koncentracije katepsina D su se statisticki znacajno razlikovale izmedu grupa pacijentkinja sa pozitivnim (n=102, opseg=10,4-207,2 pmol/mg, medijana=39,8 pmol/mg) i negativnim (n=124, opseg=8,3-237,8 pmollmg, medijana=33 ,4 pmollmg) statusom PR (Mann-Whitney test, р=О,О2). Koncentracije katepsina D su Ьile vece u grupi pacijentkinja sa pozitivnim statusom PR. Tabela 4.3. - Karakteristike raspodele koncentracija katepsina D и grupama pacijentkinja definisanim statusom ER i/ili PR (Ьrој pacijenata, opseg vrednosti i medijana koncentl'acije, р vrednost) Ко псе ntracija kate ps ina Broj D (pmollmg) р pacijenata (%) vrednost* 50%-Opseg vrednost Status ER ER+ 153 67,7 10,4- 237,8 42,9 < 0,001 ER- 73 32,3 8,3 - 107,9 26,9 Status PR PR+ 102 45,1 10,4- 207;2 39,8 0,02 PR- 124 54,9 8,3-237,8 33,4 KomЬinovani. status ER i PR ER+PR+ 92 40,7 10,4- 207;2. 40,1 ER+ PR- 61 27 12,1 - 237,8 45,8 <0,001 ER- PR+ 10 4,4 11 - 93,4 39;2. ER- PR- 73 32,3 8,3- 107,9 26,9 * Mann-Whitney ili Kruskal-Wallis test 56 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati Kada su analizirane koncentracije katepsina D u grupama pacijentkinja koje su bile defmisane na osnovu kombinovanog stausa ER i PR, utvrdeno је da se koncentracije katepsina D statisticki znacajno razlikuju (Kruskal-Wallis test, p59 Status menopauze Р re-menopauza Post-menopauza Status Iimnih cvorova pNO pN+ Velicina tumora р ТЈ рТ2 Histoloski oradus I п ш Histoloski tip шс ILC Status ER ER+ ER- Status PR PR+ PR- Komblnovani status ER i PR ER+PR+ ER+PR- ER-PR+ ER-PR- * Hi-kvadrat test В roj pacije nata Status kate ps ina D + 23 16 47 49 46 44 40 37 73 71 59 33 47 65 55 45 60 62 19 14 75 71 19 24 54 58 41 39 64 89 53 20 44 58 73 51 40 52 24 37 4 6 49 14 р v rednost* 0,6 0,003 0,5 0,5 0,8 < 0,001 0,03 < 0,001 60 DOKTORSКA DISERTACJJA Rezultati U grupi pacijentkinja sa pozitivnim statusom limfnih cvorova, broj pacijentkinja sa pozitivnim statusom katepsina D је bio veCi od broja pacijentkinja sa negativnim statusom katepsina D, dok su u grupi pacijentkinja sa negativnim statusom limfnih cvorova, pacijentkinje sa negativnim statusom katepsina D bile brojnije od onih sa pozitivnim statusom katepsina D. Pri tome, frekvencije pacijentkinja u navedenim grupama su se statisticki znacajno razlikovale od :frekvencija koje bi se ocekivale pod nultom hipotezom, prema kojoj nema razlike izmedu doЬijenih i slucajno rasporedenih frekvencija pacijentkinja u grupama defmisanim statusom limfnih cvorova i statusom katepsina D (х2 -test, р=О,ООЗ). U grupi pacijentkinja koje su imale tumore sa pozitivnim statusom ER, veCi broj pacijentkinja Је imao pozitivan status katepsina D, dok је u grupi pacijentkinja sa tumorima koji su imali negativan status ER, veCi broj pacijentkinja imao negativan status katepsina D. Frekvencije koje se odnose na pacijentkinje u gruparna sa razlicitim statusima ER i katepsina D su se statisticki znacajno razlikovale od frekvencija koje Ьi se ocekivale pod nultom hipotezom (x2-test, р<О,ОО1). Frekvencije pacijentkinja u grupama defmisanim statusom PR su Ьile rasporedene tako da su se statisticki znacajno razlikovale od frekvencija pacijentkinja koje Ьi se ocekivale pod nultom hipotezom (Hi-kvadrat test, р=О,ОЗ). Sto se tice grupa pacijentkinja defmisanih kombinovanim statusom ER i PR, frekvencije vezane za pacijentkinje sa razlicitim statusom katepsina D, u grupama defmisanim statusom ER i PR, su Ьile statisticki znacajno razliCite od frekvencija koje Ьi se ocekivale pod nultom hipotezom, prema kojoj nema razlike izmedu doЬijenih i slucajno rasporedenih frekvencija (Hi-kvadrat test, р<О,ОО1). Ustanovljeno је da је ova razlika Ьila uslovljena razlikom u broju pacijentkinja sa pozitivnim i negativnim statusom katepsina D samo izmedu fenotipova ER+PR+ i ER-PR- (p<0,001), pri cemu је veCi broj pacijentkinja, u okviru fenotipa ER+PR+, imao pozitivan status katepsina D, dok је u okviru fenotipa ER-PR-, veCi broj pacijentkinja imao negativan status katepsina D. 4. 1. 2. Raspodela koncentracija pS2 4.1.2.1. Raspodela ucestalosti koncentracija pS2 Na slici 4.4 је predstavljena raspodela ucestalosti koncentracija pS2, za 226 pacijentkinja sa primamim operaЬilnim malignim karcinomom dojke. Vrednosti koncentracija pS2 su Ьile u opsegu od 1,5 do 137,4 ng/mg, sa medijanom od 9 ng/mg. Pomocu Kolmogorov-Smirnov testa је ustanovljeno da raspodela ucestalosti koncentracija pS2 u tumorima pacijentkinja statisticki 61 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati znacajno odstupa od normalne raspodele (р<О,ОО1 ) te su, u toku dalje analize, korisceni neparametrijski testovi statisticke analize. 60 50 40 ~ 30 20 10 о о 20 40 60 80 100 120 140 pS2 (ng/mg) Slika 4. 4. - Raspodela ucestalosti koncentracija pS2, za 226 pacijentkinja sa primarnim оретаЫ!пiт karcinomom dojke (Kolmogorov-Smirnov test, р< О, 001), и intervalima od Ј 0/20 nglmg. 4.1 .2.2. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim parametrima domacina tumora U tabeli 4.5 su prikazane karakteristike raspodele koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja definisanim parametrima domacina tumora. Tumori pacijentkinja mladih od 45 godina su bili okarakterisani vrednostima koncentracija pS2 izmedu 2 i 82,9 ng/mg, sa medijanom od 17,7 ng/mg, tumori pacijentkinja starosti izmedu 45 i 59 godina su sadrzavali izmedu 1,5 i 124,1 ng/mg pS2, sa medijanom od 7,9 ng/mg, dok su u tumorima pacijentkinja starijih od 59 godina, koncentracije pS2 bile izmedu 1,8 i 137,4 ng/mg, pri cemu је medijana bila 9,4 ng/mg. Koncentracije pS2 se nisu razlikovale izmedu grupa pacijentkinja defmisanih na osnovu godina pacijentkinja. Vrednosti koncentracija pS2 su Ьile u intervalu od 2 do 124,1 ng/mg, sa medijanom od 13,6 ng/mg, u grupi premenopauznih pac~entkinja, i u intervalu od 1,5 do 137,4 ng/mg, sa medijanom od 8 ng/mg, u grupi postmenopauznih pacijentkinja. Analiza је pokazala da su vrednosti koncentracija pS2 Ьile statisticki znacajno vece u grupi premenopauznih, u odnosu na grupu postmenopauznih pacijentkinja (Mann- Whitney test, р=О ,О2). 62 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati Tabela 4.5. - Karakteristike raspodele koncentracija pS2 и grupama pacijentkinja definisanim parametl'ima domatina tитот-а (Ьгој pacijentkinja, opseg vrednosti i medijana koncentracije, р vгednost) Koncentracija pS2 (ng/mg) Broj (%) р pacijenata 50%- vrednost* Opseg vrednost Godine < 45 39 17,2 2,0- 82,9 17,7 45- 59 96 42,5 1,5 - 124,1 7,9 0,1 >59 91 40,3 1,8- 137,4 9,4 Status menopauze Pre-menopauza 77 34,1 2,0- 124,1 13,6 0,02 Post-menopauza 144 63,7 1,5- 137,4 8 Nepomato 5 2,2 2,2- 19,4 3,7 * Mann-Whitney ili Kгuskal-Wallis test 4. 1.2.3 . Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim parametrima tumora Karakteristicne vrednosti raspodele koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim parametrima tumora, sa odgovarajuCim р vrednostima, su prikazane u tabeli 4.6 .. Status limfnih cvorova u tumorima pacijentkinja је uslovio da su koncentracije pS2, u grupi pacijentkinja sa negativnim statusorn, bile u opsegu od 1,5 do 137,4 ng/mg, sa medijanom od 7,4 ng/mg, dok su, u grupi pacijentkinja sa pozitivnim statusorn, bile u opsegu od 2 do 124,1 ng/mg, sa medijanom od 11,2 ng/mg. Koncentracije pS2 su bile u intervalu od 1,5 do 137,4 ng/mg, u tumorima manjim od 2 crn, odnosno u intervalu od 1,9 do 124,6 ng/mg, u tumorima jednakim ili vecim od 2 crn, uz medijane od 10,6 i 8,8 ng/mg, respetktivno. U grupi pacijentkinja koje su imale tumore histoloskog gradusa I, pS2 је bio eksprimiran u koncentracijama izmedu 1,9 i 56,2 ng/mg, sa medijanom od 7,3 ng/mg, u grupi pacijentkinja koje su imale tumore histoloskog gradusa П, pS2 је bio eksprimiran u koncentracijama izmedu 1,6 i 124,6 ng/mg, sa medijanom od 12,1 ng/mg, dokje, u grupi pacijentkinja koje su imale tumore liistoloskog gradusa III, pS2 bio eksprimiran u koncentracijama izmedu 1,5 i 137,4 ng/mg, sa medijanom od 3,1 ng/mg. U grupi pacijentkinja sa invazivnim duktalnim karcinomima dojke, koncentracije pS2 su bile u opsegu od 1,5 do 137,4 ng/mg, а u grupi pacijentkinja sa invazivnim lobularnim karcinomima, 63 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati koncentracije pS2 su bile u opsegu od 2 do 124,1 ng/mg. Odgovarajuce medijane za koncentraciju pS2 su bile 6,4 i 12 ng/mg, respektivno. U celoj grupi ispitivanih pacijentkinja, 34 pacijentkinje nisu imale invazivne karcinome dojke. Tabela 4. 6. - Kш-akteristike raspodele koncentracija pS2 и grupama pacijentkinja dejinisanim parametrima tumora (Ьrој pacijentkinja, opseg vrednosti i medijana koncentт-acije, р vrednost) Koncentracija pS2 (ng/mg) Karakte ris tika В го ј (%) р pacijenata 50%- vrednost* Opseg vrednos t Status limfuih cvorova pNO 92 40,7 1,5 - 137,4 7,4 0,1 pN+ 112 49,6 2,0- 124,1 11,2 Nepomato 22 9,7 1,6 - 58,1 7 Ve licina tumora р П 100 44,3 1,5- 137,4 10,6 0,5 рТ2 122 54 1,9 - 124,6 8,8 Nepomato 4 1,8 2,2- 19,4 6,4 Histo loski gradus 1 .,., 14,6 1,9 - 56,2 7,3 .).) 1 1 146 64,6 1,6 - 124,6 12,1 < 0,001 1 1 1 43 19 1,5 - 137,4 3,1 Nepomato 4 1,8 з- 42,3 15,1 Histo loski tip IDC 112 49,6 1,5 - 137,4 6,4 0,07 ILC 80 35,4 2,0- 124,1 12 ostali 34 15 1,6- 54,4 13,7 * Mann-Whitney ili Kruskal-Wallis test Statisticka analiza је pokazala da se vrednosti koncentracija pS2 nisu znacajno razlikovale izmedu grupa pacijentkinja defmisanih statusom limfnih cvorova, velicinom ili histoloskim tipom tumora, dok su se statisticki znacajno razlikovale izmedu grupa pacijentkinja defmisanih histoloskim gradusom tumora (Kruskal-Wallis test, р<О ,ОО1). Tumori histoloskog gradusa П su imali vece vrednosti koncentracija pS2 u odnosu na tumore histoloskog gradusa I, koji su, sa druge strane, imali vece vrednosti koncentracija pS2 u odnosu na tumore histoloskog gradusa III. 64 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati 4.1.2.4. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim statusima ER i/ili PR U tabeli 4. 7. su predstavljene karakteristik:e raspodele koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim statusoш ER i/ili PR. Koncentracije pS2 su, u tuшorima pacijentkinja sa pozitivniш statusoш ER, Ьile izшedu 1,6 i 137,4 ng/шg, а u tuшorima pacijentkinja sa negativniш statusoш ER, izшedu 1,5 i 66 ng/шg, pri сешu su odgovarajuce шedijane Ьile jednake 15,9 i 3,7 ng/шg, respektivno. Koncentracije pS2 su Ьile statisticki znacajno vece u tuшoriшa pacijentkinja sa pozitivniш statusoш ER (Mann-Whitney test, р<О,ОО1). Tabela 4. 7. - Karakteristike т-aspodele koncentracija pS2 и grupama pacijentkinja definisanim statusom ER il ili Р R (Ьrој pacijentkinja, opseg vrednosti i medijana koncentracije, р vrednost) Broj Koncentracija pS2 (ng/mg) Karakte ris tika (%) р pacijenata 50%- vrednost* Opseg vrednost Status ER ER+ 153 67,7 1,6- 137,4 15,9 < 0,001 ER- 73 32,3 1,5-66 3,7 Status PR PR+ 102 45,1 1,6- 137,4 15,4 < 0,001 PR- 124 54,9 1,5- 124,6 5,2 Kombinovani status ER i PR ER+PR+ 92 40,7 1,6 - 137,4 16,4 ER+ PR- 61 27 1,9- 124,6 15 <0,001 ER-PR+ 10 4,4 2,2- 56,2 12,7 ER- PR- 73 32,3 1,5 - 66 3,3 * Mann-Whitney ili Kmskal-Wallis test Sto se tice raspodele koncentracija pS2 u grupaшa pacijentkinja defmisaniш statusom PR, analiza је pokazala da su koncentracije pS2 Ьile statisticki znacajno vece za pacijentkinje sa pozitivnim statusom PR, jer su Ьile u opsegu od 1,6 do 137,4 ng/шg i sa medijanom od 15,4 ng/mg, nego za pacijentkinje sa negativniш statusom PR, za koje su koncentracije pS2 Ьile u opsegu od 1,5 do 124,6 ng/mg i sa medijanom od 5,2 ng/mg (Mann-Whitney test, р<О,ОО1). Analiza vrednosti koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanim kombinovanjem statusa ER i PR је pokazala da su koncentracije pS2 statisticki znacajno razlik:ovale izmedu grupa pacijentkinja (Kruskal-Wallis test, р<О,ОО1). Dodatnom analizom је ustanovljeno da su koncentracije pS2, u okviru grupe pacijentkinja sa fenotipom ER-PR-, Ьile statisticki znacajno 65 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati manje u odnosu na koncentracije pS2 u grupama pacijentkinja koje su pripadale fenotipovirna ER+PR+ (р<О,ОО1 ), ER+PR- (р<О ,ОО1) i ER-PR+ (р=О,ОО6). 4. 1.2.5. Raspodela koncentracija pS2 u grupama pacijentkinja defmisanirn kombinovanjem parametara dornacina tumora, tumora i statusa ER i/ili PR U cilju odredivanja granicne vrednosti za ekspresiju pS2, raspodela koncentracija pS2 је analizirana u grupama pacijentkinja koje su definisane kombinovanjem razliCitih parametara. Sa obzirom na to da su nadene statisticki znacajne razlike u koncentracijama pS2 izmedu grupa pacijentkinja defmisanih pojedinim parametrirna (status menopauze, histoloski gradus tumora, status ER, status PR ili kombinovani status ER i PR), painja је bila usmerena na grupe pacijentkinja defmisane kombinovanjem, prvenstveno, ali ne i iskljuCivo, navedenih parametara. Analizirane su koncentracije pS2 u grupama pacijentkinja sa negativnim pozitivnim statusom ER, u okviru fenotipova defmisanih statusom menopauze i histoloskirn gradusom tumora (slika 4.5.). U okviru grupe postmenopauznih pacijentkinja, sa tumorirna histoloskog gradusa П, nj ih 74 su irnale tumore sa pozitivnirn statusom ER i sa koncentracijama pS2 izmedu 1,6 i 124,7 ng/mg (medijana је bila 13,3 ng/mg), dok је 14 pacijentkinja imalo tumore sa negativnim statusom ER i sa koncentracijama pS2 izmedu 2 i 12,9 ng/mg (medijana је bila 3,3 ng/mg). Pri tome su koncentracije pS2 bile statisticki znacajno vece u tumorirna pacijentkinja sa pozitivnim statusom ER (Mann-Whitney test, р<О,ОО1) . U okviru grupe postmenopauznih pacijentkinja, ali sa tumorirna histoloskog gradusa IП, njih 16 је irnalo tumore sa pozitivnim statusom ER, pri cemu su koncentracije pS2 bile u opsegu od 1,9 i 137,4 ng/mg, sa medijanom od 3,4 ng/mg, dok је 12 pacijentkinja irnalo tumore sa negativnim statusom ER, а koncentracije pS2 su bile u opsegu od 1,5 do 9,6 ng/mg, sa medijanom od 2,6 ng/mg. Kada su analizirane koncentracije pS2 za premenopaume pacijentkinje koje su irnale tumore histoloskog gradusa П, u grupama pacijentkinja sa pozitivnim (n=5) i negativnim (n=9) statusom ER, ustanovljeno је da se koncentracije pS2 u prvoj grupi pacijentkinja ( opseg od 17,7 do 48,3 ng/mg) statisticki znacajno razlikuju od koncentracija pS2 u drugoj grupi pacijentkinja ( opseg od 2 do 14,9 ng/mg) i da su vece u prvoj grupi pacijentkinja, sa obzirom na odgovarajuce medijane koncentracija pS2 u dvema grupama koje bile 18,1 i З ng/mg, respektivno (Mann- Whitney test, р=О,ООЗ) . 66 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezиltati 160 р= 0 ,003 р< 0,001 г------1 г------1 140 • 120 • О> 100 Е -- ОЈ .s во • N U) Q_ 60 • • • • 40 1 • • 20 • ехз • x 2l x2 • хзl х2 х2 о X 5l x5 l хЗ ER+ ER- ER+ ER- POST 11 PRE 11 POST 111 n 74 14 5 9 16 12 Medijana (pmol/mg) 13,3 3,3 18,1 з 3 ,4 2 ,6 Opseg (pmol/mg) 1,6-124,7 2-12,9 17,7-48 ,3 2-14,9 1,9-137,4 1,5-9,6 Slika 4. 5. - Raspodela vrednosti koncentracija pS2 и grиpama pacijentkinja definisanim statиsom ER, и okvirи fenotipova definisanih statиsom тепораиzе i histololoskim gradиsom tиmora. Prikazane sи medijane i opsezi koncenfl'acija pS2 i broj pacijentkinja и analiziгanim grиpam, kao i odgovшajиce р Vl'ednosti za Mann-Whitney test. Analiza је pokazala da negativan status ER uslovljava da koncentracije pS2 budu statisticki znacajno manje, u poredenju sa koncentracijama koje odgovaraju pozitivnom statusu ER, za tumore histoloskog gradusa П, kako pre- tako i postmenopauznih pacijentkinja. Dodatno, moze se smatrati da se, u okviru sva tri fenotipa sa slike 4.5 . koji su defшisani statusom menopauze i histoloskim gradusom tumora, opsezi koncentracija pS2 razlikuju u tumorirna pacijentkinja sa razlicitirn statusom ER, sto ukazuje da, pored statisticki znacajne, postoji i Ьioloski znacajna razlika izmedu tumora okarakterisanih razliCitim statusirna ER. U analiziranim grupama pacijentkinja koje su irnale negativan status ER, vrednosti koncentracija pS2 su Ьile manje od 15 ng/mg. Ova vrednost је usvojena kao granicna vrednost za ekspresiju pS2 i koriscena је za defшisanje statusa pS2 u tumorirna pacijentkinja. Pacijentkinje koje su imale tumore sa koncentracijama pS2 manjim od 15 ng/mg su Ьile defшisane kao pacijentkinje sa negativnim statusom pS2 (pS2-), dok su one sa koncentracijama pS2 jednakim ili veCim od 15 ng/mg Ьile defшisane kao pacijentkinje sa pozitivnim statusom pS2 (pS2+). 67 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati 4.1.2.6. Raspodela statusa pS2 u grupama pacijentkinja defшisanim parametrima doma6ina tumora, tumora i statusima ER i/ili PR Na osnovu granicne vrednosti za ekspresiju pS2 od 15 ng/mg, analizirana је raspodela koncentracija pS2, u grupama pacijentkinja defшisanim parametrima doma6ina tumora, tumora ili statusima ER i/ili PR, koje su bile manje, odnosno ve6e od granicne vrednosti. U tabeli 4.8 su Tabela 4. 8. - Broj pacijentkinja, па osnovu statusa pS2, и grupama pacijentkinja definisanim parametrima domaf:ina tumora, tumora ili statusima ER i/ili Р R i odgovarajuce р vrednosti Godine <45 45-59 >59 Status menopauze Pre-menopauza Р ost-menopauza Status limfnih cvorova pNO pN+ Velicina tumora рТl рТ2 Histoloski gradus I I I I I I Histoloski tip IDC ILC Status ER ER+ ER- Status PR PR+ PR- KomЬinovani status ER i PR ER+PR+ ER+PR- ER-PR+ ER-PR- * Hi-kvadrat test Broj pacijenata Status pS2 + 19 20 65 31 57 34 43 34 94 50 61 31 66 46 62 38 76 46 22 11 85 61 32 11 75 37 48 32 75 78 66 7 51 51 90 34 45 47 30 31 6 4 60 з р vrednost* 0,2 0,3 0,4 0,2 0,4 < 0,001 <0,001 < 0,001 prikazane frekvencije koje se odnose na pacijentkinje sa negativnim i pozitivnim statusom pS2, u grupama pacijentkinja defшisanim parametrima domacina tumora, tumora ili statusima ER i/ili PR. Analizom је utvrdeno da је status pS2 је bio statisticki znacajno povezan sa statusom ER, statusom PR, kao i kombinovanim statusima ER i PR. U grupi pacijentkinja sa tumorima koji su 68 DOKTORSКA DISERTACIJA Rezultati imali pozitivan status ER, veci broj pacijentkinja је imao pozit ivan status pS2, dok ј е u grupi pacijentkinja sa tumorima koj i su imali negativan status ER, ve6i broj pacijentkinja imao negativan status pS2 (x2-test, p