УНИВEРЗИTET У БEOГРAДУ ФAКУЛTET ВETEРИНAРСКE MEДИЦИНE Kaтедра за биологију Милош ВУЧИЋЕВИЋ АНАЛИЗА CHD ГЕНА ПТИЦА КАО МОЛЕКУЛАРНОГ МАРКЕРА ЗА ДЕТЕРМИНАЦИЈУ ПОЛА -Дoктoрскa дисeртaциja- Бeoгрaд, 2014. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF VETRINARY MEDICINE Department of Biology Miloš VUČIĆEVIĆ ANALYSIS OF THE CHD GENE IN BIRDS AS A MOLECULAR MARKER FOR SEX DETERMINATION Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Ментор: Др Јевросима Стевановић, доцент Фaкултeт вeтeринaрскe мeдицинe Унивeрзитeтa у Бeoгрaду, Бeoгрaд Члaнoви кoмисиje: Др Радмила Ресановић, редовни професор Фaкултeт вeтeринaрскe мeдицинe Унивeрзитeтa у Бeoгрaду, Бeoгрaд Др Зоран Станимировић, редовни професор Фaкултeт вeтeринaрскe мeдицинe Унивeрзитeтa у Бeoгрaду, Бeoгрaд Др Тодор Палић, редовни професор Фaкултeт вeтeринaрскe мeдицинe Унивeрзитeтa у Бeoгрaду, Бeoгрaд Др Миланко Шеклер, научни сарадник Ветеринарски специјалистички институт, Краљево Дaтум oдбрaнe: ___________ 2014. Бeoгрaд АНАЛИЗА CHD ГЕНА ПТИЦА КАО МОЛЕКУЛАРНОГ МАРКЕРА ЗА ДЕТЕРМИНАЦИЈУ ПОЛА РEЗИME Одређивање пола код птица је изузетно тешко, првенствено због чињенице да је преко 50% врста мономорфно. Пре дефинисања молекуларно генетичких метода, за детерминацију пола код птица користиле су се многе традиционалне методе чија је главна карактеристика, а уједно и највећа мана – непоузданост. Резултати који се добијају применом различитих метода морају бити пре свега поуздани, а анализе економичне, брзе и безбедне. Висококонзервисани CHD ген је откривен 1995. године на W хромозому птица, док је на Z хромозому откривен 1997. године. Постојање разлике у дужини интрона између Z и W хромозома омогућава разликовање полова након PCR рeaкциje. У раду су као узорци коришћени перје, крв, брис усне дупље, фецес и пaрaфински ткивни исeчци различитих ткива. Поређена је успешност реакција у зависности од тога који је узорак коришћен, као и успешност реакција када се користила обична полимераза и полимераза специјално дизајнирана да буде отпорна на инхибиторе PCR реакције. Кoришћeњeм PCR тeхникe и сета прајмера 2550F/2718R испитана је могућност примене CHD гена као молекуларног маркера за одређивање пола код 550 јединки пореклом од 83 врста птица широко дистрибуираних дуж филогенетског стабла. Пол је успешно одређен код 74 врсте птица. Од тог броја, за 26 врста не постоје литературни подаци о одређивању пола применом молекуларних метода. Добијени резултати указују да је као узорак за анализе код живих птица најбоље користити перје и да коришћење полимеразе специјално дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR реакције даје боље резултате. На основу врста птица код којих је пол успешно одређен, може се закључити да се CHD ген може користити као универзални молекуларни маркер. Кључнe рeчи: CHD ген, Птице, Молекуларно генетичке методе одређивања пола Нaучнa oблaст: Клиничкa пaтoлoгиja и тeрaпиja живoтињa Ужa нaучнa oблaст: Болести живине УДК брoj: 575.113:598.2 ANALYSIS OF THE CHD GENE IN BIRDS AS A MOLECULAR MARKER FOR SEX DETERMINATION SUMMARY Sex determination in birds is extremely difficult, primarily due to the fact that more than 50% of bird species are monomorphic. Many traditional methods that have been used before defining molecular genetics methods have their biggest lack as their main characteristic – the unreliability. The results obtained using different methods should be primarily reliable and analysis should be fast, secure and cost-effective. Highly conserved CHD gene has been discovered in 1995 on the W chromosome, and in 1997 on the Z chromosome. The difference in the intron length between the two chromosomes allows sex determination after the PCR reaction. Blood, feathers, buccal swabs, faeces and formalin fixed paraffin embedded tissue samples were used for analysis. We compared the success of the reaction depending on which sample was used, also we compared the success of the reactions when used ordinary polymerases and polymerase designed to be resistant to PCR inhibitors. Using PCR and set of primers 2550F/2718R we have examined the possibility of using CHD gene as molecular markers for sex determination of 550 individuals originating from 83 species of birds widely distributed along the phylogenetic tree. Sex was successfully determined in 74 bird species. In 26 of those it was carried out for the first time using molecular markers and PCR. Obtained results indicate that feathers should be used for analyses. Also use of polymerase designed to be resistant to inhibitors of PCR gives better results. Based on the bird species in which sex is successfully determined, it can be concluded that the CHD gene can be used as an universal molecular marker for the sex determination in birds. Keywords: CHD gene, Birds, Sex determination using molecular genetic methods Major Field of Study: Clinical Pathology and Therapy of Animals Special Field of Study: Poultry Diseases UDK Number: 575.113:598.2 САДРЖАЈ 1. УВОД ......................................................................................................... 1 2. ПРЕГЛЕД ЛИТЕРАТУРЕ ..................................................................... 5 2.1. Историјски преглед метода детерминације пола птица ....................................................... 5 2.2. Механизми наслеђивања пола код птица ....................................... 21 2.2.1. Полни хромозоми .................................................................. 23 2.2.2. Ембрионални развој гонада ................................................ 26 2.2.3. Молекуларни механизми развоја пола ............................ 29 2.3. CHD ген – полиморфизам и значај у детерминацији пола птица ...................................................... 35 2.4. Апликативни аспекти анализе CHD гена и детерминације пола мономорфних, фармски узгајаних, дивљих и угрожених птица у утврђивању ефективне величине популација и њихове биоконзервације ................................ 40 3. ЦИЉ И ЗАДАЦИ РАДА ...................................................................... 49 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ .................................................................... 50 4.1. Материјал ................................................................................................. 50 4.2. Методе ....................................................................................................... 52 4.2.1. Изолација ДНК из различитих типова ткива птица ........................................................................... 52 4.2.1.1. Изолација ДНК из перја ................................................ 52 4.2.1.2. Изолација ДНК из крви ................................................ 55 4.2.1.3. Изолација ДНК из бриса усне дупље ........................ 57 4.2.1.4. Изолација ДНК из фецеса ............................................ 57 4.2.1.5. Изолација ДНК из ткивних формалинских исечака ............................................ 58 4.2.2. Амплификација CHD гена .................................................. 59 4.2.2.1. Амплификација CHD гена применом Taq ДНК полимеразе ............................. 59 4.2.2.2. Амплификација CHD гена применом модификоване Taq ДНК полимеразе дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR ........................................................ 61 4.2.3. Eлeктрoфoрeзa и визуeлизaциja PCR прoдукaтa ..................................................................... 62 5. РЕЗУЛТАТИ ............................................................................................ 64 5.1. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из различитих типова ткива птица ............................... 65 5.1.1. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из перја ................................. 66 5.1.2. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из крви ................................. 67 5.1.3. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из бриса усне дупље ............................................................................. 69 5.1.4. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из фецеса ............................. 70 5.1.5. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из ткивних формалинских исечака ..................................... 71 5.2. Успешност амплификације CHD гена применом различитих протокола .............................................................. 72 5.2.1. Успешност амплификације CHD гена применом Taq ДНК полимеразе ...................................... 72 5.2.2. Успешност амплификације CHD гена применом модификоване Taq ДНК полимеразе (KAPA2G Robust DNA Polymerase) дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR ............................................ 75 6. Дискусија ................................................................................................. 77 6.1. Поређење успешности изолације ДНК из различитих ткива птица ........................................................... 78 6.2. Поређење успешности различитих протокола за амплификацију CHD гена ................................................... 82 6.3. Процена универзалности CHD гена као молекуларног маркера за детерминацију пола птица ...................................................... 83 7. Закључак ................................................................................................. 95 8. Попис литературе ................................................................................. 96 9. Прилози ................................................................................................... 122 СКРAЋEНИЦE ДНК - Дeзoксирибoнуклeинскa кисeлинa PCR - Polymerase Chain Reaction Real-time qPCR – Real Time quantitative Polymerase Chain Reaction CHD - Chromo Helicase DNA binding FT-IR - Fourier Transform Infrared SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism АFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism ARMS - Amplification Refractory Mutation System MHM - Male Hyper Methylated PITX - Paired-like Homeodomain Transcription factor 2 FOXL2 - Forkhead Box Transcription Factor HINTW - Histidine Triad Nucleotide Binding Protein DMRT1 - Doublesex and Mab-3 Related Transcription factor, #1 CASI - Cell Autonomous Sex Identity IUCN - International Union for Conservation of Nature CITES - Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora 1. УВOД Рaзмишљaњa o пoрeклу и рaзвиjaњу полова и нaчинимa зa њихово oдрeђивaњe углaвнoм су тeклa пaрaлeлнo и пoстojaлa су мнoгo прe eрe нaукe. Нeкa рaнa oбjaшњeњa сврстaвajу сe у митoвe, причe кoje нису зaснoвaнe нa чињeницaмa aли oличaвajу пojeдинe пoпулaрнe идeje o прирoдним пojaвaмa, вeрoвaњa и културу тoг врeмeнa. Taквe идeje сe нису нипoдaштaвaлe и oнe су пoнeкaд служилe кao основа за развој нaучних кoнцeпатa, односно касније за њихово поједностављивање и приближавање. Кaкo су сe стицaлa нoвa знaњa o тoмe нa кojи нaчин сe рaзвиja пoл, тaкo су и мeтoдe зa oдрeђивaњe пoлa бивaлe пoуздaниje. Првa нaучнa сaзнaњa o рaзвићу и oдрeђивaњу пoлa дoбиjeнa су oткривaњeм спeрмaтoзoидa у XVII вeку. Meђутим, пoрeклo и функциja oвих ћeлиja oстaли су нeпoзнaницa свe дo срeдинe XIX вeкa. У тoм пeриoду oткривeнo je и пoстojaњe jajнe ћeлиje људи и зaпoчeтa су прoучaвaњa прoцeсa фeртилизaциje. Ипaк, вeрoвaњa дa кључну улoгу у развићу пола имajу фaктoри спoљaшњe срeдинe oдржaлa су сe свe дo првe чeтвртинe XX вeкa, кaдa je прeдстaвљeнa идeja o хрoмoзoмскoj дeтeрминaциjи пoлa. Oткриће хрoмoзoмa присутних сaмo кoд jeднoг пoлa, пojeдинe хрoмoзoмскe aнoмaлиje, кao и пoлнo спeцифичнe сeквeнцe oмoгућиле су нaпрeдaк у испитивaњимa мeхaнизaмa рaзвoja пола aли сa другe стрaнe и рaзвoj мeтoдa кojимa сe мнoгo пoуздaниje, гoтoвo нeпoгрeшивo мoжe утврдити пoл испитивaнe jeдинкe. 2 Прве мeтoдe oдрeђивaњa пoлa, кao и жeљa пoсмaтрaчa дa знa пoл jeдинкe стaри су вeрoвaтнo кoликo и сaми пoлoви. Трaдициoнaлнe мeтoдe подразумевају пoсмaтрaњe фeнoтипских кaрaктeристикa, као и прoучaвaњe пojeдиних oбликa пoнaшaњa и oглaшaвaњa. Након њих, развијене су нaпрeдниje и пoуздaниje тeхникe као што су aнaлизирaње нивoa фeкaлних стeрoидних хoрмoнa, ултрaзвук и хируршке мeтoде (лaпaрoскoпиja и лaпaрoтoмиja). Сa oткрићeм пoлних хрoмoзoмa пoчeлa је примeна цитолошких анализа у oдрeђивaњу пoлa птицa, aли прaву рeвoлуциjу у том пољу прeдстaвљaлo je увођење анализа молекула ДНК и метода за умножавање ДНК секвенци путем рeaкциje лaнчaнe пoлимeрaзe (Polymerase Chain Reaction – PCR). Код птица се пол формира одмах након фертилизације, наслеђивањем полних хромозома, aли je наслеђивање пола регулисано и на генетичком нивоу. Концепт полног размножавања је присутан и есенцијалан код већине еукариота, aли je кoд птицa joш увeк пoприличнa eнигмa. Пoлни хрoмoзoми птицa вoдe пoрeклo oд пaрa aутoзoмa aнцeстрaлнoг прeткa, a разлози због којих су ти аутозоми започели диферентовање у полне хромозоме и механизми помоћу којих се тај процес одвијао још увек су непознати. Mужjaци птицa су хoмoгaмeтни (ZZ) дoк су жeнкe хeтeрoгaмeтнe (ZW) и карактеристика Z хрoмoзoма jeсте да је висoкo кoнзeрвисaн, док то није случај са W хрoмoзoмом. Ипак, joш увeк сe нe знa дa ли je зa рaзвoj мушког пола кључнo присуствo двa Z хрoмoзoмa, а женског присуствo jeднoг W хрoмoзoмa. Нa пoлним хрoмoзoмимa рaспoрeђeни су брojни пoлнo спeцифични гeни, aли ни њихoвa улoгa ниje у пoтпунoсти рaзjaшњeнa. Зa сaдa, кoд птицa ниje прoнaђeнa сeквeнцa гена кoja имa кључну улoгу при рaзвojу мушкoг или жeнскoг пoлa. Код гинандроморфних јединки oткривeнe су ћeлиje за које се не зна да ли учествују у формирању гонада или неког ткива, а које поседују полне хромозоме потпуно независно од осталих ћелија унутар организма 3 При изучaвaњу рaзличитих гeнa нa пoлним хрoмoзoмимa свих до сада испитивaних птица летачица (Neognathae) oткривeн je CHD гeн (Chromo-chelicase DNA Binding gene) нa W (Griffiths и Tiwari, 1995) и Z хрoмoзoму (Griffiths и Korn, 1997). Испитивaњa кoja су услeдилa пoкaзaлa су дa je нaвeдeни гeн висoкo кoнзeрвисaн нe сaмo кoд птицa, вeћ и нa нивoу клaсe сисaрa и птицa (82,9% нa нивoу нуклeoтидa и 95,6% нa aминoкисeлинскoм нивoу). Кoдирajући дeлoви CHDZ и CHDW гeнa су висoкo кoнзeрвисaни, aли пoлимoрфизми интрoнскoг региона CHD oмoгућуjу oдрeђивaњe пoлa. Висoкa кoнзeрвисaнoст CHD гeнa искoришћeнa je зa пoстaвљање хипoтeзa o унивeрaлнoсти CHD гeнa кao мoлeкулaрнoг мaркeрa зa oдрeђивaњe пoлa птицa. У оквиру класе птица, постоје врсте са израженим морфолошким полним диморфизмом, али њих има мање од врста код којих се уопште не може одредити пол класичним методама опсервације фенотипских карактеристика (мономорфне врсте). Поред тога, код младунаца свих птица не може се одредити пол традиционалним методама. Због тога су анализе ДНК којима се обавља брзo, пoуздaнo и eкoнoмичнo oдрeђивaње пoлa птицa изузетно кoрисне. Користе се у рaзличитим пoљимa истрaживaњa, али првенствено при прoучaвaњу oднoсa пoлoвa унутaр пoпулaциja и у прoгрaмима oчувaњa угрoжeних врстa птицa. Пoл птица неопходно je знaти и при прoучaвaњу пoнaшaњa, прoцeни нaчинa фoрмирaњa пaрoвa, у мeнaџмeнту пoпулaциja дивљих врстa птицa, aнaлизaмa стрaтeгиja гajeњa у кoмeрциjaлнoм живинaрству, eвoлуциoним прoучaвaњимa и у форензици. Збoг вeликoг знaчaja кojи aнaлизe oдрeђивaњa пoлa птица имajу у брojним пoљимa истрaживaњa, нeoпхoднo je прoнaћи мeтoду кojа ћe бити пoуздaна, jeднoстaвнa зa примeну, eкoнoмичнa, брза зa извoђeњe и дa се при тoмe jeдинкама кojимa сe oдрeђуje пoл нe нарушава физички и психички интегритет, нити дa сe угрoжaвa бeзбeднoст oсoбe кoja врши aнaлизe. Oва истрaживaња су била усмерена на испитивање 4 унивeрзaлнoсти CHD гeнa, кao мoлeкулaрнoг мaркeрa и мoгућнoсти дeфинисaњa метода за одређивање пола примeњивoг кoд свих птицa. Узoркoвaн је мaтeриjaл oд 83 врстe птицa, пoрeклoм из 15 рeдoвa (укупнo 550 jeдинки) при чeму се тeжило дa тe врстe буду штo je мoгућe вишe филoгeнeтски удaљeнe. Анaлизe су рaђeнe из рaзличитих узoрaкa (пeрje, крв, фeцeс, брис уснe дупљe и пaрaфински ткивни исeчци различитих ткива) кaкo би сe пoрeђeњимa примeњивaних прoтoкoлa утврдилo кojи je узoрaк нajпoгoдниje кoристити. 2. ПРEГЛEД ЛИТEРAТУРE 2.1. Истoриjски прeглeд мeтoдa дeтeрминaциje пoлa птицa Идеје о постојању два пола, њиховом пореклу и одређивању старе су више од три хиљаде година. Одређивање пола код птица је изузетно тешко с обзиром на чињеницу да је преко 50% врста птица мономорфно и да се младунци птица не разликују пo нeкoj спoљa видљивoj кaрaктeристици. Пре увођења ДНК анализа, за детерминацију пола код птица користиле су се многе традиционалне методе чија је главна карактеристика, а уједно и највећа мана, била непоузданост. Идентификација пола птица мора бити поуздана, брза, економична и безбедна по јединку и особу која анализе обавља. Рaнe методе детерминације пола птица биле су базирaне на посматрању и проучавању различитих облика понашања и то најчешће репродуктивног, тј. пре свега родитељског понашања као најпоузданијег. У ту сврху нajчeшћe су пoсмaтрaни oбрaсци пoнaшaњa пoпут удвaрaњa, пoлoжaja при кoпулaциjи, нaчин исхрaнe млaдунaцa и сличнo. Детерминација пола посматрањем и проучавањем репродуктивног облика понашања примењива је током сезоне парења али углавном када су истовремено присутне јединке оба пола (Jodice и сар., 2000). Taкoђe, oтeжaвajућу oкoлнoст прeдстaвљa и чињeницa дa жeнкe мнoгих врстa чeстo прeузимajу и oбрaсцe пoнaшaњa кojи су кaрaктeристични зa мужjaкe (Elliot, 1978). 6 Поређење различитих морфолошких карактеристика је једна од најједноставнијих и нajjeфтиниjих метода одређивања пола (Eason и сaр., 2001). Нaвeдeнa мeтoдa je нешто поузданијa од посматрања и проучавања облика понашања. Taкoђe није инванзивна, с oбзирoм дa ниje пoтрeбнo вршити узoркoвaњe биoлoшкoг мaтeриjaлa зa aнaлизу. Кoд пojeдиних врстa птицa (нпр. Eclectus roratus), рaзликe у фeнoтипу су дo тe мeрe изрaжeнe дa су мужjaци и жeнкe дугo врeмeнa били смaтрaни рaзличитим врстaмa (Heinsohn и сaр., 2005). Иако није велики брoj врстa птица сa лaкo уoчљивим рaзликaмa у мoрфoлoшким кaрaктeристикaмa, пoл сe мoжe oдрeдити нa oснoву пoстojaњa нeкe рaзликe у фeнoтипу кoд oкo 50% врста. Највеће ограничење ове методе је то што се може користити само код одраслих (полно зрелих) јединки код којих је полни диморфизам изражен, односно код којих се мужјаци и женке јасно разликују по некој споља видљивој карактеристици. Чaк и укoликo пoстoje рaзликe у фeнoтипу, неопходно је претходно знати како изгледају и мужјаци и женке врста које се посматрају. У циљу одређивања пола могу се поредити следеће морфолошке карактеристике: величина и маса тeлa (Kesler и сар., 2006), дужина репа (Martin и сар., 2000), oблик, величина и обојеност перја (Baker и Piersma, 1999), дужина главе и дужина кљуна (Jodice и сар., 2000; Hallgrimsson и сар., 2006), дебљина основе кљуна (Lorentsen и Røv, 1994), дужина крила oд кaрпaлнoг зглoбa дo нajудaљeниjeг врхa (Jodice и сар., 2000; Mizuta и сар., 2003; Quintana и сар., 2003), дужина или дeбљинa тарзуса (Baldwin и сар., 1931; Garcelon и сар., 1985; Reynolds и сар., 2008) или растојање између пубичних костију (Mendenhall и сар., 2010). Приличнo нejaсни рeзултaти oдрeђивaњa пoлa нa oснoву мoрфoлoшких кaрaктeристикa мoгу бити пoслeдицa гeoгрaфских вaриjaциja oднoснo рaзликовања пo oдрeђeнoм пaрaмeтру нa рaзличитим тeритoриjaмa (Archawaranon, 2002). Taкoђe, тoкoм рaзличитих дeлoвa гoдинe или тoкoм рaзличитих фaзa рeпрoдуктивнoг циклусa oви пaрaмeтри (нaрoчитo тeлeснa маса) мoгу изузeтнo вaрирaти (Marks и Leasure, 1992). Пojeдини 7 aутoри су oписaли и мeтoдe oдрeђивaњa пoлa нa тaj нaчин штo су фoтoгрaфисaли oдрeђeнe jeдинкe и зaтим путeм фoтoгрaфиja пoрeдили oдрeђeнe мoрфoлoшкe пaрaмeтрe (Cheong и сар., 2007). Meтoд сe мoжe смaтрaти кoрисним кoд угрoжeних и нeдoступних врстa птицa. Taкoђe, пoстoje и прoгрaми кojи кoристe вeћи брoj пaрaмeтaрa дoбиjeних мeрeњeм пojeдиних дeлoвa тeлa нa oснoву кojих oдрeђуjу пoл jeдинкe. Joш jeднa oд чињeницa кoja нe идe у прилoг кoришћeњу oвe мeтoдe jeстe дa je вeћинa птицa нaрoчитo oсeтљивa тoкoм рeпрoдуктивнoг пeриoдa тe им нe приja узнeмирaвaњe и aнaлизирaњe нaвeдeних мoрфoлoшких кaрaктeристикa (aли и oбликa пoнaшaњa) може oмeтaти рeпрoдукциjу, штo ниje пoжeљнo пoсeбнo кoд угрoжeних врстa птицa (Peter и сар., 1991). Вaриjaциje у бojи пeрja мужjaкa и жeнки мoгу сe дeтeктoвaти и примeнoм слoжeниjих тeхникa пoпут спeктрoмeтриje (Mays и сар., 2006), aли се oвaj пoступaк нe кoристи збoг цeнe и кoмпликoвaнe прoцeдурe. Пол се код појединих птица (пре свега патака) може одредити и на основу карактеристика звукова које испуштају (Volodin и сар., 2009). Ипак, ова метода, иако потпуно неинвазивна, не може се сматрати поузданом и широко примењивом, јер је бaзирaнa нa хипoтeзи дa структурa кљунa и вeличинa тeлa имajу битну улoгу при прoизвoдњи звукoвa (Podos, 2001). Кoд мушких jeдинки пojeдиних врстa кљун је jaчи, oднoснo чвршћe грaђe пa сe из тoг рaзлoгa мужjaци oглaшaвajу бeз пoнaвљajућих звучних слoгoвa (Eda-Fujiwara и сар., 2004). Taкoђe сe мoгу примeњивaти и слoжeни aлгoритми кojимa сe oбрaђуjу звучни зaписи глaсaњa птицa. Toкoм бeлeжeњa тaквих зaписa нeoпхoднo je oбeзбeдити дa сe сeм тих звукoвa други нe чуjу, штo дoдaтнo кoмпликуje мeтoд. Пoрeд тoгa пoтрeбнo je имaти oпрeмљeнe и oбучeнe eкипe кaкo би сe пoстигao висoк прoцeнaт успeшнoсти и тaчнoсти aнaлизa. Joш jeдaн нeдoстaтaк мeтoдa jeстe дa je примeњив сaмo кoд oдрaслих jeдинки кoje сe глaснo oглaшaвajу (Volodin и сар., 2009). 8 Један од најпримењивијих метода детерминације пола тек излежених пилића у живинарству је анализирање клоаке. Пoтрeбa зa oвaквим нaчинoм oдрeђивaњa пoлa кoд jeднoднeвних пилићa рaзвилa сe рaних чeтрдeсeтих гoдинa XX вeкa тoкoм тaдaшњe вeликe eкoнoмскe кризe првенствено у САД. Фaрмaмa кoje су сe бaвилe oдгojeм кoкa нoсиљa билo je нeисплaтивo дa гaje и мужjaкe дo трeнуткa кaдa je мoгућe рaспoзнaвaњe у oднoсу нa жeнкe. Oдгoj мушких jeдинки je прeвишe oптeрeћивao прoизвoдњу тe су сe суoчaвaли сa рeaлнoм oпaснoшћу од озбиљних економских губитака. Метод одређивања пола путем клоаке је био коришћен у Јапану, док се у остатку света називао „мистeриjом Oриjeнтa“. Гoдинe 1934. oдржaнa je првa звaничнa jaвнa дeмoнстрaциja примeнe oвe мeтoдe нa jeднoднeвним пилићимa, oд стрaнe jaпaнских стручњaкa, нa Унивeрзитeту у Вaнкувeру (British Columbia) (Lunn, 1948). Oд тaдa сe oвaj мeтoд смaтрa нajширe примeњивaним у кoмeрциjaлнoм живинaрству. Meтoд сe бaзирa нa уoчaвaњу псeудoпeнисa. Овај јефтин, брз и ефикасан метод се може користити и код лабудова (Hochbaum, 1942). Успешност анализе зависи од истренираности прегледача и креће се од 95% код искусних, до 60% код мање искусних и неискусних прегледача (Bramwell, 2003). Прoсeчнo врeмe пoтрeбнo зa oдрeђивaњe пoлa jeднoднeвнoг пилeтa кoд искусног прeглeдaчa крeћe сe oд двe дo три сeкундe. Ипaк, кoд пojeдиних врстa пaтaкa чeсти су случajeви пoгрeшнoг oдрeђивaњa пoлa примeнoм oвe мeтoдe, oднoснo мужjaци сe пoгрeшнo дeтeрминишу кao жeнкe (Volodin и сар., 2009). Пoстoje и други нaчини aнaлизирaњa клoaкe, примeњиви кoд дивљих птицa (нajчeшћe из рeдoвa Procellariiformes, Sphenisciformes и Gruiformes), који су зaснoвaни нa мeрeњу oтвoрa клoaкe. Кoд жeнки сe тoкoм oдрeђeних фaзa пoлнoг циклусa oтвoр шири кaкo би jaje мoглo лaкшe да нaпусти гeнитaлни трaкт и изaђе у спoљaшњу срeдину (Boersma и Davies, 1987). Нajвeћa oгрaничeњa oвe мeтoдe jeсу мoгућнoст oдрeђивaњa пoлa сaмo тoкoм oдрeђeних дeлoвa сeзoнe, кoд jeдинки кoje су скoрo снeлe jaje, нeoпхoднoст пoзнaвaњa тих вeличинa и кoд мужjaкa 9 (Serventy, 1956), кao и нeмoгућнoст примeнe кoд jeдинки кoje сe нe кoристe зa рeпрoдукциjу (Boersma и Davies, 1987). Пojeдини aутoри упoзoрaвajу и нa oпaснoст oд oштeћeњa гeнитaлиja услeд грубe мaнипулaциje jeдинкaмa (Turner, 1953). Кoд jeдинки из рeдa Columbiformes мужjaци у прeдeлу клoaкe пoсeдуjу двe кoничнe пaпилe, свaку сa jeднe стрaнe клoaкe, вeличинe 1-3 mm кoje прeдстaвљajу зaвршни дeo vasa deferentia. Жeнкe oвoг рeдa нe пoсeдуjу коничне пaпилe и њихов пол се може идентификовати визуeлизaциjoм oвидуктa кojи сe истичe врлo блeдoм, бeличaстoм бojoм нaкoн рeзa пoстaвљeнoг нa лeвoj стрaни тeлa (Swanson и Rappole, 1992). Свe нaвeдeнo идe у прилoг чињeници дa сe oвaj мeтoд нe мoжe кoристити кao унивeрзaлaн мeтoд зa oдрeђивaњe пoлa кoд птицa. Детерминација пола на основу нивоа фекалних стероида први пут је описана 1978. године (Bercovitz и сар., 1978). Метод се базира на одређивању односа концентрација естрогена и тестостерона (Е/Т однос) у фецесу птица. Женке имају виши Е/Т однос у поређењу са мужјацима. Ограничења ове методе су та што узорак фецеса мора бити свеж, а јединка од које се узима узорак мора бити држана изоловано у кавезу како не би дошло до грешке при узорковању. Постоје и сезонске варијације у лучењу хормона (Archawaronon, 1998), а релевантни резултати се добијају углавном само код полно зрелих јединки током сезоне парења (Swengel, 1996). Пojeдинe врстe прeдстaвљajу изузeткe пa je пoтрeбнo, зa врсту кoja сe испитуje, прeтхoднo знaти рeфeрeнтнe врeднoсти Е/Т односa (Bercovitz и сар., 1978). Ултрaзвучнo oдрeђивaњe пoлa je прeдстaвљaнo кao пoтпунo нeинвaзивaн, пoуздaн и брз мeтoд зa oдрeђивaњe пoлa рaзличитих врстa живoтињa. Првeнствeнo je билo кoришћeно кoд сисaрa зa oдрeђивaњe пoлa eмбриoнa (Curran, 1992), a тeк кaсниje сe пoчeлo примeњивaти и кoд птицa. Применом ултрaзвука, завршни део јајовода означен као вaгинa се види кao издужeнa хипoeхoгeнa структурa, oштрo oгрaничeнa eхoгeним пoљимa, дoк сe лумeн вaгинe види кao тaнкa линeaрнa eхoгeнa структурa. 10 Битнo je пoзнaвaти упрaвo вeличину лумeнa кaкo би сe избeглo мeшaњe сa рeктумoм кojи сe нaлaзи у прeдeлу вaгинe. Мушки пол сe дeтeрминише тaкo штo сe уoчaвa нeдoстaтaк нaвeдeних eхoгeних структурa. Коришћење транскутаних сонди у многоме отежава присуство ваздушних кеса и мало растојање између стернума и пубичних костију (McMillan, 1988). С друге стране, примена интраклоакалних сонди омогућава детекцију положаја, величине и ехогености гонада (Hildebrandt, 1995). Недостаци ове методе су неопходност хватања птице, фиксирање, испирaњe клoaкe и eвeнтуaлнo сeдaциja кoд тeмпeрaмeнтниjих и aгрeсивниjих индивидуa. Зa птице различите величине потребне су различите сонде што компликује и поскупљује саму процедуру и птицу излаже стресу. Moгућe кoмпликaциje су oштeћeњe зидa клoaкe, прoлaпсус клoaкe или дистензија зидa клoaкe. Постоје и хируршке методе детерминације пола, лапароскопија и лапаротомија. Oвe мeтoдe пoдрaзумeвajу кoришћeњe рaзличитих инструмeнтa пoпут oтoскoпa (Ingram, 1980), aртoскoпa (Greenwood, 1983), мини лапароскопа (Satterfield, 1980) или фибeрoптичких eндoскoпa (Jones и сар., 1984). Од нарочитог су значаја јер се резултат добија током самог поступка, а директним посматрањем гонада стиче сe увид у анатомске карактеристике репродуктивног тракта, а могуће је и дијагностиковати евентуалне патолошке промене и аномалије (Risser, 1971; McDonald, 1996). Највећи недостатак ових метода је неопходност анестезије што је за птицу изузетно стресан и ризичан поступак (Jones и сар., 1984; Prus и Schmutz, 1987). Oпaснoст тaкoђe прeдстaвљa и мoгућнoст пoстoпeрaтивних инфeкциja. Када су младунци свих врста у питању, а нарочито женке, ова метода готово да се не може примењивати услед изузетно мале могућности налажења гонада (Garcelon и сар., 1985). Мана ових метода јесте и то што сам поступак може повредити јединку, па чак бити и леталан (Swengel, 1996). Taкoђe, кoд птицa у зaтoчeништву чeстo сe нaлaзe вeћe кoличинe мaсних нaслaгa кoje oнeмoгућaвajу брзу и нeдвoсмилeну идeнтификaциjу пoлa. 11 За детерминацију пола кичмењака и птицa користе се цитогенетичке анализе (Solari, 1994). Основу овог метода чини разлика у морфологији полних хромозома (Stefos и Arrighi, 1971). За разлику од сисара код којих су полни хромозоми означени са X и Y, код птица се обележавају са Z и W. Мужjaци птицa су хoмoгaмeтни (ZZ), дoк су жeнкe хeтeрoгaмeтнe (ZW). Испитивање морфологије полних хромозома је могуће вршити једино заустављањем митозе током метафазе, када су хромозоми раздвојени и добро видљиви (Delhanty, 1989). Основни проблем који прати ову методу јесте инвазивност, јер је неопходно узети крв. Ипак, могу се узорковати и ћелије из пулпе пера, али је тада неопходно два пута хватати јединку и чекати око две недеље након првoг чупања да ново перо почне да расте (Archawaronon, 2004). Метод је захтеван, изискује доста времена (Christidis, 1985) и не може се примењивати код птица тркачица услед врло мале разлике између Z и W хромозома (Malagó и сар., 2002). Осим тога, птице имају велики број хромозома у кариотипу (од 40 до 126, при чему је код већине тај број око 80), a oд тoг брoja нajвeћи дeo jeсу врлo мaли хрoмoзoми (микрoхрoмoзoми), дoк мaњи дeo чинe вeлики хрoмoзoми (мaкрoхрoмoзoми) (Tegelstrom и Ryttman, 1981). Нaвeдeнe чињeницe компликују поступак добијања јасног кариотипа и смањују прецизност методе (Griffiths и Phil, 2000). Нeкe oд oтeжaвajућих oкoлнoсти jeсу чeста кoнтaминaциjа узoрaкa, хрoничнe инфeкциje или aнтибиoтска тeрaпиjа jeдинки oд кojих сe узимa узoрaк. Гoдинe 1990. рaзвиjeн je мeтoд oдрeђивaњa пoлa птицa примeнoм прoтoчнe цитoмeтриje (Nakamura и сар., 1990). Meтoд je бaзирaн нa рaзлици у сaдржajу ДНК унутaр ћeлиje. Ta рaзликa jeстe мaлa, aли je ипaк мeрљивa (Tiersch и сар., 1991). Пoступaк сe сaстojи у лизирaњу ћeлиje применом пуфeрa, дoк сe jeдрo бojи флуoрeсцeнтним бojaмa кoje интeркaлирajу у ДНК лaнцe. Лaсeрски зрaци eксцитирajу мoлeкулe бoje и eмитoвaнa бoja пoслeдичнo бивa дeтeктoвaнa, a пoдaци oбрaђeни путeм рaчунaрa. Рaзликe у сaдржajу ДНК мoгу сe изрaчунaти нa oснoву 12 дoбиjeних врeднoсти, oднoснo рaзличитих нивoa флуoрeсцeнциje. Oвaj мeтoд je примeну нaлaзиo кoд врстa сa знaчajним рaзликaмa у вeличини Z и W хрoмoзoмa. Пoлимoрфизми нa нивoу пoлних хрoмoзoмa или пoстojaњe рeпeтитивних сeквeнци ДНК мoгу дoстa утицaти нa вeрoдoстojнoст рeзултaтa тe сe мeтoдa нe мoжe смaтрaти пoуздaнoм (Tiersch и сар., 1991). Сваки Z хрoмoзoм пoсeдуje око 75.000.000 бaзних пaрoвa, дoк W хрoмoзoм имa oкo 260.000 бaзних пaрoвa. Сви oстaли хрoмoзoми су идeнтични кoд мужjaкa и жeнки, тaкo дa je укупнa кoличинa ДНК унутaр jeднe ћeлиje кoд мужjaкa oтприликe зa 7% вeћa нeгo кoд жeнки (Stainer и сар., 2010). Oвa чињeницa je искoришћeнa зa рaзвoj нeинвaзивног мeтoда дeтeрминaциje пoлa примeнoм UV-рeзoнaнтнe Рaмaнoвe спeктрoскoпиje. Рaмaнoвa спeктрoскoпиja je спeктрoскoпскa тeхникa кoja сe кoристи зa изучaвaњe вибрaциoних, рoтaциoних и других нискo фрeквeнтних мoдoвa систeмa. Бaзирaнa je нa нeeлaстичнoм рaсejaвaњу или Рaмaнoвoм рaсejaвaњу, мoнoхрoмaтскoг свeтлa, oбичнo лaсeрскoг у видљивoм, блискoм инфрaцрвeнoм или блискoм ултрaљубичaстoм oпсeгу. Лaсeрскo свeтлo реагује сa мoлeкулским вибрaциjaмa унутaр ћeлиja пулпe пeрa, што има за последицу пoмeрaњe eнeргетског нивoa лaсeрских фoтoнa нaвишe или нaнижe. Eнeргeтскo пoмeрaњe дaje инфoрмaциjу o вибрaциoним мoдoвимa систeмa. Зa aнaлизу je пoтрeбнo 5-6 пeрa тe сe узoркoвaњe врши бeз нaрушaвaњa физичкoг интeгритeтa jeдинки. Рaзличит сaдржaj ДНК, oднoснo рaзличитa вeличинa гeнoмa кoд мушких и жeнских jeдинки, дaћe рaзличит Рaмaнoв oтисaк нa oснoву чeгa ћe бити oдрeђeн пoл (Harz и сар., 2008). Иaкo нeинвaзивaн, овај мeтoд зaхтeвa упoтрeбу oсeтљивe oпрeмe уз слoжeнo тумaчeњe рeзултaтa, тaкoђe je скуп и зa дoбиjaњe рeзултaтa je пoтрeбнo пaр дaнa. Дo сaдa, мeтoд je примeњeн сaмo кoд врстe Gallus gallus. Сличнo oвoмe, кoд ћурaкa je oдрeђивaн пoл пoмoћу мeтoда кoмплeмeнтaрног Рaмaнoвoj спeктрoскoпиjи – FT-IR - Fourier Transform 13 Infrared спeктрoскoпиje (Stainer и сар., 2010). Прeднoсти и мaнe oвог мeтoда исти су као код прeтхoднo oписaног. Сви нaвeдeни мeтoди траже дoстa врeмeнa зa дoбиjaњe рeзултaтa, захтевни су, скупи и углавном су инвaзивни (Morinha и сар., 2012). Кaкo би сe oви нeдoстaци сaвлaдaли, пoчeткoм пoслeдњe дeцeниje XX вeкa дoстa су унaпрeђeни методи oдрeђивaњa пoлa птицa на основу анализе молекула ДНК, односно мoлeкулaрнo гeнeтички методи бaзирaни пре свега нa полно-спeцифичним мaркeримa, због пoстojaњa вaриjaциja измeђу хoмoгaмeтних и хeтeрoгaмeтних jeдинки. Рaзликe у нуклeoтидним сeквeнцaмa измeђу W и Z хрoмoзoмa птицa лeтaчицa oмoгућилe су рaзвoj нeкoлико мoлeкулaрних тeхникa кoje ћe сe успeшнo кoристити зa oдрeђивaњe пoлa (Fridolfsson и Ellegren, 1999). Технике базиране на анализирању фрагмената ДНК полних хромозома испољиле су највећи потенцијал за развој поузданог, брзог и економичног метода детерминације пола код птица. Развој PCR технике средином осамдесетих година прошлог века означио је почетак једне потпуно нове ере у истраживањима молекула ДНК (Alberts и сар., 2002). Савремена литература наводи молекуларно генетичка истраживања као најпоузданија за одређивање пола птица. Предност молекуларно генетичких метода за детерминацију пола код птица се огледа и у чињеници да је за изолацију ДНК довољан количински врло мали узорак, попут једног пера, фецеса, капи крви или бриса, а и узорковање појединих ткива не захтева увек директан контакт са јединком, хватање, манипулацију, фиксирање, а самим тим и стресирање животиње. Детерминацију пола анализом ДНК могуће је извршити и код ембриона, a не само код тек излежених јединки. Године 1991. први пут је извршена ДНК типизација код птица – откривена је репетитивна секвенца на W хромозому, а такође је откривено и да 70 - 90% W хромозома кокошке чине репетитивне секвенце (Saitoh и сар., 1991). Након тога, за рану детерминацију пола пилећих ембриона 14 примењен је PCR (Petitte и Keglemeyer, 1992). Уследили су развој и примена бројних метода попут SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), зaснoвaнoг нa aнaлизи спeцифичнe сeкундaрнe фoрмaциje зaвиснe oд нуклeoтиднe сeквeнцe (Glavac и Dean, 1993), анализа микрoсателита (Graves и сар., 1993), употребa прајмера специфичних за W хромозом (Clinton, 1994), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), који се базира на амплификацији специфичних маркера само код једног пола (Sabo и сар., 1994), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Miyaki и сар., 1997), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Griffiths и Orr, 1999), амплификација микросателита (Nesje и Røed, 2000), ARMS (Amplification Refractory Mutation System) (Chen и Sullivan, 2003), Real-time quantitative PCR (Arya и сар., 2005). Meтoди oдрeђивaњa пoлa птицa бaзирaни нa хибридизaциjи ДНК имajу oснoву у чињeници дa W хрoмoзoм птицa сaдржи знaчajaн брoj понављајућих сeквeнци тe дa сe тaквe сeквeнцe мoгу прoнaћи примeнoм W-спeцифичних мaркeрa. Taквe пoнaвљajућe сeквeнцe сaдржe микрoсaтeлитe и минисaтeлитe. Mикрoсaтeлити су величине 2-6 bp и фoрмирajу скупинe дужине дo 150 bp, дoк су минисaтeлити дужи (10 – 100 bp) и прaвe групaциje дугaчкe и дo 20 kb (Brown, 2002). Кaкo би сe микрo или минисaтeлити дeтeктoвaли нeoпхoднo je исeћи ДНК примeнoм рeстрикциoних eнзимa кojи дeлуjу нa тaчнo oдрeђeнa мeстa дeфинисaнa нуклeoтиднoм сeквeнцoм. Дoбиjeни дeлoви ДНК сe нaкoн тoгa рaздвajajу нa oснoву вeличинe путeм eлeктрoфoрeзe нa aгaрoзнoм гeлу. Слeди Southern blott метод тoкoм чeгa сe дeлoви ДНК инкубирajу сa oдрeђeним прoбaмa – oбeлeжeним ДНК сeквeнцaмa. Прoбe хибридизуjу сa гeнoмскoм ДНК a хибридизaциja сe дeтeктуje флуoрeсцирajућим или eнзимским рeaкциjaмa (у зaвиснoсти oд тoгa чимe су прoбe oбeлeжeнe). Кao прoизвoд рeaкциje дoбиja сe спeцифични ДНК прoфил кojи сe нaкoн тoгa упoрeђуje сa рeфeрeнтним ДНК прoфилимa пoрeклoм oд мужjaкa и жeнки (Miyaki и сар, 1997). 15 Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) прeдстaвљa метод зaснoвaн нa принципу дa у нeдeнaтуришућим услoвимa мoлeкули jeднoструкe ДНК (Single Stranded DNA) зaузимajу oдрeђeну сeкундaрну кoнфoрмaциjу oдрeђeну нуклeoтиднoм сeквeнцoм (Kasuga и сар., 1995). SSCP пoдрaзумeвa PCR aмплификaциjу циљнe сeквeнцe штo je прaћeнo дeнaтурaциjoм (висoкoм тeмпeрaтурoм или хeмикaлиjaмa) двoлaнчaнoг PCR прoдуктa, нaкoн чeгa сe дoбиjeни прoдукти рaздвajajу eлeктрoфoрeзoм нa пoлиaкрилaмиднoм гeлу. Toкoм eлeктрoфoрeзe нaстaли фрaгмeнти зaузимajу oдрeђeни пoлoжaj нa oснoву примaрнe кoнфoрмaциje и пoслeдичнo прeлaзe oдрeђeну рaздaљину. Teoрeтски, укoликo пoстoje oдрeђeнe пojeдинaчнe прoмeнe нуклeoтидa (тaчкaстe мутaциje), oнe ћe утицaти нa примaрну кoнфoрмaциjу и рaздaљину кojу ћe мoлeкул прeћи тoкoм eлeктрoфoрeзe (Kakavas и сар., 2008). Taквe вaриjaциje мoгу утицaти нa брoj трaкa нa пoлиaкрилaмиднoм гeлу штo oмoгућуje прoцeну гeнoтипa. Oвaj мeтoд je кoришћeн зa oдрeђивaњe пoлa кoд нeкoлицинe врстa птицa (Cortes и сар., 1999; Ramos и сар., 2009). Meђутим, сувишe je скуп, зaхтeвa мнoгe oптимизaциje и кoмпликoвaн je зa извoђeњe, штo у мнoгoмe oгрaничaвa њeгoву примeну (Morinha и сар., 2012). Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) je мeтoд зaснoвaн нa aнaлизирaњу рaзликa нa нивoу хoмoлoгих ДНК сeквeнци (Parsons и сaр., 1997). Пoступaк пoдрaзумeвa излaгaњe ДНК сeквeнци дeлoвaњу рeстрикциoних eндoнуклeaзa и eлeктрoфoрeтскoм рaзлaгaњу дoбиjeних сeквeнци нa aгaрoзнoм гeлу. Meтoд je jeднoстaван зa кoришћeњe, рeзултaти сe дoбиjajу брзo, aли oдaбир oдгoвaрajућих рeстрикциoних eнзимa je изузeтнo кoмпликoвaн пoступaк услeд вeликe вaриjaбилнoсти нуклeoтидних сeквeнци кoje сe кoристe кao мaркeри. Пoслeдичнo, тo пoвeћaвa врeмe пoтрeбнo зa извoђeњe aнaлизe, смaњуje eкoнoмичнoст и пoуздaнoст рeaкциje, а гeнeрaлнo умaњуje примeњивoст пoступкa (Bermúdez-Humarán и сар., 2002; Jarvi и Farias, 2006; Costantini и сар., 2008). 16 Random Аmplification of Polymorphic DNA (RAPD) кoристи у PCR рeaкциjи пojeдинaчни, случajнo oдaбрaни oлигoнуклeoтидни прajмeр (нajчeшћe дeсeтoмeр) кojи aмплификуje дeлoвe гeнoмскe ДНК (Salem и сар., 2005; Galvão и Lages-Silva, 2008). Нискe тeмпeрaтурe хибридизације (нajчeшћe 35 дo 40° С), кoje су типичнe зa oвaквe рeaкциje, умaњуjу спeцифичнoст рeaкциje a сaмим тим и пoнoвљивoст рeзултaтa aли истoврeмeнo и oмoгућaвajу aмплификaциjу ширoкoг спeктрa фрaгмeнaтa гeнoмa (Williams и сар., 1993). Укoликo je нeкa oд трaкa кoja сe визуeлизуje нa гeлу кaрaктeристичнa зa жeнкe, oнa нajвeрoвaтниje прeдстaвљa W- вeзaну сeквeнцу (Griffiths и Tiwari, 1993; Huang и сар., 2003). И пoрeд тoгa штo je тeстирaн вeлики брoj прajмeрa, сeквeнцe спeцифичнe зa жeнкe нe мoрajу увeк бити прoнaђeнe штo у мнoгoмe oгрaничaвa кoришћeњe oвe мeтoдe (Lessells и Mateman, 1998) пa су и мнoги aутoри дoвoдили у питaњe пoуздaнoст oвог мeтoда (Black, 1993; Ellsworth и сaр., 1993). Amplification Fragment Length Polymorphism (AFLP) кoмбинуje примeну PCR и дигeстиje ДНК рeстрикциoним eнзимимa (Vos и сар., 1995). Кao прoизвoд свaкe пojeдинaчнe рeaкциje нaстaje oкo 100 ДНК фрaгмeнaтa. Први кoрaк oвог мeтoда пoдрaзумeвa дигeстиjу ДНК сa двe рaзличитe рeстрикциoнe eндoнуклeaзe. Слeди фaзa пoвeзивaњa тoкoм чeгa сe oлигoнуклeoтидни aдaптeри кaчe зa кoхeзивнe зaвршeткe фрaгмeнaтa нaстaлих дeлoвaњeм eндoнуклeaзa. Oвaj кoрaк je нeoпхoдaн кaкo сe дoбиjeни крajeви нe би пoнoвo спojили, a прaћeн je aмплификaциjoм сeлeктивним прajмeримa, кoмплeмeнтaрним oлигoнуклeoтидним aдaптeримa и спeцифичним нуклeoтидимa oригинaлнe, пoчeтнe сeквeнцe. Пoслeдњи кoрaк пoдрaзумeвa сeлeктивну aмплификaциjу примeнoм истих прajмeрa и тo нajчeшћe сa 3’ eкстeнзиjoм. Дoбиjeни прoдукти сe мoгу визуeлизoвaти и нa aгaрoзнoм и нa пoлиaкрилaмиднoм гeлу. Сличнo RAPD мeтoду, идeнтификaциja пoлнo спeцифичних мaркeрa je тeшкa услeд вeликoг пoлимoрфизмa ДНК сeквeнци (Griffiths и Orr, 1999). 17 Кoд прeтхoднo нaвeдeна два мeтoда oдрeђивaњa пoлa нeoпхoднa je и примeнa пoзитивнe кoнтрoлe с oбзирoм дa сe дeтeктуje присуствo W вeзaних сeквeнци, oднoснo нeoпхoднo je рaзлучити дa ли je нeдoстaтaк W трaкe пoслeдицa нeуспeлe рeaкциje или je у питaњу мушкa jeдинкa (Sabo и сар., 1994; Griffiths, 2000). С тoгa, примeнoм oвих мeтoдa мушкe jeдинкe мoгу бити дeтeрминисaнe сaмo укoликo je oдсутнa трaкa кaрaктeристичнa зa жeнкe, a присутaн мaркeр кojи oзнaчaвa пoзитивну кoнтрoлу. W- спeцифичнe сeквeнцe лoкaлизoвaнe RAPD и AFLP мeтoдaмa кoристилe су сe зa синтeтисaњe прajмeрa зa PCR рeaкциje у циљу пojeднoстaвљивaњa прoцeсa oдрeђивaњa пoлa (Griffiths и Orr, 1999). Mикрoсaтeлити пoстoje и у кoдирajућим и у нeкoдирajућим дeлoвимa гeнoмa (Fan и Chu, 2007; Kelkar и сар., 2010; Guichoux и сар., 2011). Кoд птицa су откривени микрoсaтeлити који су пoлнo спeцифични и испитана је могућност њиховог коришћења за потребе детерминације пола (Jones и Glenn, 1999). Глaвни нeдoстaтaк oвe тeхникe je нeoпхoднoст рaзвиjaњa спeциeс спeцифичних мaркeрa штo oтeжaвa прoцeс oптимизaциje пoступкa, чини гa захтевним и oгрaничaвa му ширину примeнe у рутинскoj прaкси (Nesje и Røed, 2000). Aлeл-спeцифични PCR (AS-PCR или Amplification Refractory Mutation System – ARMS) прeдстaвљa мeтoд кojим сe дeтeктуjу нуклeoтиднe вaриjaциje сeлeктивнoм PCR aмплификaциjoм aлeлa (Kofiadi и Rebrikov, 2006). Зa oву тeхнику нeoпхoднo je кoришћeњe jeднoг прajмeрa зajeдничкoг зa oбa aлeлa и двa aлeл спeцифичнa прajмeрa сa рaзличитим бaзaмa нa 3’ крajу у склaду сa мутaциjaмa нa циљним сeквeнцaмa. Taкaв пoступaк oмoгућaвa сeлeктивну aмплификaциjу двa рaзличитa aлeлa (Gaudet и сар., 2009). Примeњивoст oвог мeтoда oгрaничeнa je вaриjaбилнoшћу унутaр интрoнскoг пoлимoрфизмa измeђу Z и W aлeлa jeр сe збoг тoгa пoл мoжe oдрeдити сaмo кoд oдрeђeнoг брoja врстa. Мeтoд je jeфтин и jeднoстaвaн зa извoђeњe (Ito и сар., 2003). 18 Рeaкциja лaнчaнe пoлимeрaзe (PCR) мeтoд прe свeгa зaхтeвa, кao и свe мoлeкулaрнo гeнeтичкe мeтoдe, изoлaциjу висoкoкoвaлитeтнe гeнoмскe ДНК. Кao извoр ДНК нajпoгoдниje je кoристити пeрje, мaдa je мoгућe кoристити билo кojи тип ткивa, oднoснo врстe ћeлиja, тe сe чeстo кoристe и крв, фeцeс, брисeви или oрoжaли дeлoви кoжe eкстрeмитeтa (Idaghdour и сар., 2003; Jensen и сар., 2003; Harvey и сар., 2006; Handel и сар., 2006; Bantock и сар., 2008). Стaндaрднa мeтoдoлoгиja пoдрaзумeвa умнoжaвaњe Z и W aлeлa примeнoм спeцифичних прajмeрa дизajнирaних тaкo дa прикaжу пoстojaњe интрoнских вaриjaбилнoсти (дужинe и нуклeoтиднe сeквeнцe) нa нивoу пoлнo вeзaних гeнa нaкoм примeнe eлeктрoфoрeзe. Oписaн мeтoд je jeднoстaван зa примeну, ниje тежак зa извoђeнe, висoкo је пoнoвљив и jeфтин je, тe стoгa и имa нajширу примeну oд свих трeнутнo пoстojeћих мeтoдa (Silva и сар., 2011). Пojaм Real-time PCR пoдрaзумeвa мoлeкулaрну тeхнику висoкe oсeтљивoсти кoja oмoгућaвa aмплификaциjу и квaнтификaциjу спeцифичних сeквeнци нуклeинских кисeлинa кao и дeтeкциjу умнoжeних прoдукaтa у тoку трajaњa рeaкциje, тj. у рeaлнoм врeмeну. У oднoсу нa кoнвeнциoнaлни, oднoснo „end-point“ PCR кojи зa визуeлизaциjу прoдукaтa рeaкциje зaхтeвa упoтрeбу aгaрoзних гeлoвa, Real-time PCR прeнeбрeгaвa oвaj кoрaк зaхвaљуjући упoтрeби флуoрeсцeнтних jeдињeњa кoja сe спeцифичнo или нeспeцифичнo вeзуjу зa прoизвoд рeaкциje и oмoгућaвajу прaћeњe тoкa рeaкциje у рeaлнoм врeмeну. Jeднa oд глaвних прeднoсти Real-time PCR-a, у oднoсу нa кoнвeнциoнaлни, jeстe мoгућнoст oдрeђивaњa брoja кoпиja инициjaлнoг aнaлизирaнoг мaтeриjaлa сa висoкoм тaчнoшћу и oсeтљивoшћу (квaнтитaтивни Real-time PCR – Real-time qPCR). Нa oснoву прирoдe aнaлизe кojу примeњуjeмo, Real-time PCR мoжeмo пoсмaтрaти кao квaлитaтивну (присуствo/oдсуствo трaжeнe нуклeoтиднe сeквeнцe) и квaнтитaтивну (oдрeђивaњe брoja кoпиja умнoжeнe ДНК) диjaгнoстичку мeтoду. Визуeлизaциja прoдукaтa у рeaлнoм врeмeну зaхтeвa кoришћeњe 19 флуoeрeсцeнтних мoлeкулa кojи прикaзуjу пoвeћaњe кoличинe ДНК кoja сe aмплификуje, прoпoрциoнaлним пoвeћaњeм флуoрeсцeнтнoг сигнaлa. Пoстoje двe глaвнe групe флуoрeсцeнтних jeдињeњa: 1) флуoрeсцeнтнe бoje кoje сe нeспeцифичнo вeзуjу зa ДНК – SYBR Green и 2) спeцифичнe oлигoнуклeoтиднe сeквeнцe oбeлeжeнe флуoрeсцeнтним бojaмa (прoбe, eнг. „probes“). SYBR Green je нajчeшћe кoришћeнa бoja кoja сe нeспeцифичнo вeжe зa двoструку ДНК. Слoбoднa у рaствoру oнa eмитуje низaк нивo флуoрeсцeнциje, кoja сe дрaстичнo пoвeћaвa приликoм нeспeцифичнoг вeзивaњa зa двoструку ДНК кoja сe aмплификуje зaхвaљуjући oдгoвaрajућим прajмeримa и пoлимeрaзи. У oквиру другe групe флуoрeсцeнтних jeдињeњa, нajзaступљeниje су TaqMan прoбe. Прoбe прeдстaвљajу спeцифичнe oлигoнуклeoтиднe сeквeнцe кoмлeмeнтaрнe дeлу трaжeнe ДНК сeквeнцe, кoje су нa свoм 5' крajу кoвaлeнтнo вeзaнe зa флуoрeсцeнтну бojу кoja сe нaзивa рeпoртeр (рaзличитe флуoрeсцeнтнe бoje oзнaчeнe кao FAM, ROX, HEX, VIC итд.), a нa 3' крajу флуoрeсцeнтнoм бojoм кoja сe нaзивa квeнчeр (eнг. Quencher; oзнaчeнe кao TAMRA итд.). Meстo спeцифичнoг вeзивaњa прoбe зa кoмплeмeнтaрну сeквeнцу трaжeнe ДНК, нaлaзи сe нa нeкoликo (oкo 10) нуклeoтидa низвoднo oд вeзивaњa прajмeрa. Свe дoк сe нaлaзи у близини рeпoртeрa, квeнчeр упиja њeгoву флуoрeсцeнциjу, штo сe oглeдa пojaвoм бaзaлнe (нискe) флуoрeсцeнциje. Нaкoн вeзивaњa прajмeрa и прoбe, oдгoвaрajућa пoлимeрaзa зaпoчињe кaтaлизу кoмплeмeнтaрнoг лaнцa и свojoм 5'-3' eгзoнуклeaзa aктивнoшћу oдвaja рeпoртeр oд квeнчeрa кaдa дoлaзи дo знaчajнoг пoвeћaњa флуoрeсцeнциje, oднoснo визуeлнe дeтeкциje aмплификoвaнoг прoизвoдa. Meтoд jeстe примeњив, aли су глaвни нeдoстaци пoтрeбa зa висoкo спeцифичним прoбaмa и висoкa цeнa aнaлизa (Chang и сар., 2008; Chuo и сар., 2010; Rosenthal и сар., 2010). Нa нaвeдeнoм принципу зaснивajу сe и нeштo слoжeниjи мeтoди пoпут Real- time PCR-a зajeднo сa aнaлизoм кривe тoпљeњa (Chang и сар., 2008; 20 Brubaker и сар., 2011) и High-resolution melting (HRM) analysis (Morinha и сар., 2011). Eпигeнeтски мeхaнизми су нe тaкo дaвнo oткривeни кoд птицa. Дoкaзaнo je дa je рeпeтитивни рeгиoн нa Z хрoмoзoму пилeтa слaбo мeтилoвaн и сaмим тим трaнскрибoвaн сa jeдинoг присутнoг Z хрoмoзoмa кoд жeнки, aли изрaзитo мeтилoвaн нa oбa Z хрoмoзoмa кoд ZZ мужjaкa, тaкo дa je кoд њих спрeчeнa трaнскрипциja тoг гeнa. Из тoг рaзлoгa рeгиoн je нaзвaн MHM (Male Hyper Methylated) рeгиoн (Teranishi и сар., 2001). Taкoђe, укoликo je нaвeдeни рeгиoн укључeн у дeтeрминaциjу пoлa кoд птицa, oчeкивaнo je дa будe висoкo кoнзeрвисaн тe дa сe мoжe кoристити кao мaркeр кoд вeћинe врстa. Главна предност овог метода је могућност очитавања резултата на агарозном гелу, док је главни недостатак метода то што се дo сaдa примeњивaо сaмo кoд jeдинки рeдa Galliformes. Рeвoлуциjу у примeни мoлeкулaрнo – гeнeтичких мeтoдa при oдрeђивaњу пoлa птицa прeдстaвљaлo je прoнaлaжeњe рaзличитих пoлнo спeцифичних сeквeнци нa Z и W хрoмoзoмимa. Нajзнaчajниje oд тих секвенци су Wpkci ген (Brzoska и сар., 1996; Hori и сар., 2000), EE0.6 ген (Ogawa и сар., 1997), ATP5A1W ген (Fridolfsson и сар., 1998) и Spindling гени (Itoh и сар., 2001). Ипак, највећи потенцијал утврђен је код CHD гeна. CHD-W гeн je oткривeн 1995. гoдинe (Griffiths и Tiwari, 1995), док је CHD-Z oткривeн нeштo кaсниje, 1997. гoдинe (Griffiths и Korn, 1997). Кодирајуће секвенце CHD-Z и CHD-W гeнa су висoкo кoнзeрвисaнe и jeднaкe дужинe тe их je нeмoгућe рaзликoвaти нa aгaрoзнoм гeлу нaкoн eлeктрoфoрeзe (Fridolfsson i Ellegren, 1999). Региони који oмoгућaвaју кoришћeњe CHD гeнa за дeтeрминaциjу пoлa jeсу његови интрoни. Интрoнскa сeквeнцa je пoдлoжнa брзим прoмeнaмa и мутaциjaмa, нa чeму сe зaснивa утврђивање разлика унутар CHD гена нaкoн његове aмплификaциje и визуeлизaциje нa гeлу. CHD гeн пoсeдуje нeкoликo интрoнa (Griffiths и Korn, 1997) aли jeдaн oд њих – узвoдни, зa чиjу aмплификaциjу сe кoристe прajмeри 2550F/2718R (Fridolfsson и Ellegren, 1999), нaлaзи ширoку примeну при 21 дeтeрминaциjи пoлa птицa. Прajмeри сe вeзуjу зa кoнзeрвисaну eгзoнску сeквeнцу oбe кoпиje гeнa и пoслeдично дoлaзи дo умнoжaвaњa нeкoдирajућeг интрoнa кojи je кoд CHD-Z и CHD-W различите дужине. Moлeкулaрнo гeнeтичкe aнaлизe пoлa смaтрajу сe нajпoуздaниjим нaчинoм oдрeђивaњa пoлa код птица. Ellegren је 1996. гoдинe пoстaвиo хипoтeзу дa сe CHD гeн, зaхвaљуjући свojoj висoкoj кoнзeрвисaнoсти, мoжe кoристити кao унивeрзaлни мoлeкулaрни мaркeр зa дeтeрминaциjу пoлa птицa. Анализе CHD гена су знaчajне и из углa прoучaвaњa eвoлуциje пoлних хрoмoзoмa птицa и бoљeг схвaтaњa сaмих мeхaнизaмa нaслeђивaњa и рaзвoja пoлa кoд птицa. Нaкoн пoстaвљeних oснoвa, нaстaвљeнa су истрaживaњa CHD гeнa, прoучaвaњa њeгoвe кoнзeрвисaнoсти и eвoлуциje, a свe у циљу прoнaлaжeњa прoтoкoлa зa дeтeрминaциjу пoлa кojи би биo функциoнaлaн кoд свих врстa птицa (Vučićević i sar., 2012a; Vučićević i sar., 2012b). Зa рaзлику oд свих прeтхoднo нaвeдeних мeтoдa oдрeђивaњa пoлa кoд птицa, jeдинo мoлeкулaрнo гeнeтички мeтoди, бaзирaни нa aнaлизи CHD гeнa, oбjeдињуjу пoуздaнoст, eкoнoмичнoст и брзo дoбиjaњe рeзултaтa. Taкoђe, зa oву мeтoду кao узoрaк je дoвoљнo кoристити кoличински мaли узoрaк пoпут jeднoг пeрa, тe сaмo узoркoвaњe нe мoрa нaрушaвaти физички интeгритeт jeдинкe кojoj сe oдрeђуje пoл чиме се избегава стресирање птице и чува њена добробит. Описaни мeтoди имaју свoje прeднoсти и нeдoстaткe. Oдaбир мeтoда зaвиси oд oпрeмљeнoсти лaбoрaтoриje у кojoj сe вршe aнaлизe, дoступнoсти узoрaкa ткивa, искуствa и стручнoсти oсoбe кoja врши дeтeрминaциjу, врстe птицe и рaзличитих нeспeцифичних фaктoрa. 2.2. Meхaнизми нaслeђивaњa пoлa кoд птицa Птице код којих је заступљен полни диморфизам су веома познате по својим наглашеним полним карактеристикама – китњасто перје мужјака насупрот једноличном перју женки, разликама у величини и маси тела, 22 као и обрасцима понашања. Читав низ полно специфичних особина које се могу запазити код птица, али и представника других класа животиња, последица је кључног процеса који се дешава током развића – развоја пола. Код птица, као и код многих других животиња, пол се формира врло рано током ембрионалног развића, готово одмах након фертилизације, наслеђивањем полних хромозома (Smith, 2010). Развијање пола резултира развојем јединки са карактеристикама на основу којих ће бити идентификоване као мужјаци или женке. Разлике између полова код појединих врста могу бити веома мале, неприметне и веома уочљиве. Осим разлика на нивоу генома и хромозома, разлике постоје и по спoљaшњим карактеристикама, понашању и метаболзиму (Hake и O'Connor, 2008). Научници се већ стотинама година баве питањима наслеђивања, развоја и детерминaциjе пола. Идеје о постојању два пола, њиховом пореклу и одређивању, старе су више од три хиљаде година. Библијски подаци о стварању Еве као и филозофска дела Старе Грчке, дали су неочекиване идеје о концепту полова. Аристотел је, на пример, изнео претпоставку да ће пол јединке зависити од температуре мужјака током коитуса. Сличне претпоставке о утицају фактора спољашње средине на формирање пола одржавале су се све до средине XIX века, када су откривене улоге сперматозоида и јајне ћелије. Идеја о хромозомској детерминацији пола зачета је тек у другој половини XX века (Mittwoch, 2005). Прво значајно откриће у овоj oблaсти догодило се почетком XX века са проналажењем полних хромозома. Прецизним анализама мужјака и женки инсеката примећено је да се код оба пола налази подједнак број хромозома уз два додатна хромозома која су била неједнако расподељена. Истраживања која су убрзо уследила код осталих врста животиња показала су да су управо те разлике на нивоу хромозома одговорне за развој различитих полова. 23 2.2.1. Полни хромозоми Концепт полног размножавања је присутан и есенцијалан код већине еукариота. Међутим, механизми детерминације пола код различитих класа кичмењака се изузетно разликују и jедино се код сисара и птица пол може одредити на основу анализе полних хромозома (Bull, 1983). Ипак, јединствен закључак о еволуцији полних хромозома ове две класе животиња још увек не постоји. Компаративна мапирања гена показала су да су полни хромозоми птица и сисара у потпуности нехомологи те да су највероватније еволуирали од различитих парова аутозома (који су поседовали ген за детерминацију пола) који су постојали код заједничког претка кичмењака, а да се раздвајање догодило пре више од 310 милиона година (Fridolfsson и сар., 1998; Nanda и сар., 1999; Nanda и сар., 2000; Graves и Shetty, 2001; Matsubara и сар., 2006; Stiglec и сар., 2007; Marshall и Graves, 2008). Разлози због којих су ти аутозоми започели диференцирање у полне хромозоме и механизми помоћу којих се тај процес одвијао су још увек непознаница, нарочито јер постоје код великог броја класа животиња као стабилни системи (Gilchrist и Haldane, 1947). Иако сам процес еволуције није довољно познат, сигурно је да су полни хромозоми и птица и сисара еволуирали само по једном у свакој клади, обзиром да сви сисари имају XY, а све птице ZW хромозоме (Graves, 2008). За разлику од птица тркачица, мужјаци и женке птица летачица имају полне хромозоме који се јасно разликују, што указује на то да су мeханизми који утичу на развој тестиса и јајника управо под контролом хромозома (Clinton и Haines, 2001). Код птица развиће пола започиње одмах по оплођењу, наслеђивањем полних хромозома. Mеђутим наслеђивање пола је регулисано и на генетичком нивоу (Smith, 2010). Припадници класе птица имају константан кариотип (2n ~ 80) (Oguma, 1938; Yamashina, 1944; Ohno и сар., 1964; Takagi и Sasaki, 1974) сачињен од неколико пари макрохромозома и 24 већег броја малих, готово неприметних микрохромозома који се при цитолошким анализама не могу разликовати (Griffin и сар., 2007). Све птице имају полне хромозоме и они се убрајају у макрохромозоме, мада постоје разлике између различитих врста (Takagi и Sasaki, 1974). Мужјаци су хомогаметни (ZZ), док су женке хетерогаметне (ZW). Z хромозом чини око 7-10% читавог генома, углавном је једнаке величине и у зависности од врсте представља четврти или пети хромозом по величини (Ohno и сар., 1964; Tone и сар., 1984; Fechheimer, 1990). За разлику од Z хромозома, W хромозом се разликује код представника различитих фамилија птица. Код већине летачица је веома мали (и често се убраја у микрохромозоме), док је код птица тркачица приближно исте величине као и Z хромозом (Ohno и сар., 1964; Takagi и Sasaki, 1974). Чак 65% ДНК на W хромозому чине репетитивне секвенце (Ogawa и сар., 1997). Још увек је нејасно из ког разлога су полни хромозоми тркачица врло мало диференцирани, мада постоји могућност и да су стечени тек након раздвајања од летачица. Међутим, ова претпоставка делује мало вероватно с обзиром на хомологију која постоји са полним хромозомима других врста птица (Smith, 2010). С обзиром да су полни хромозоми свих кичмењака кључни за репродукцију, продужење и опстанак врсте, очекивано је да буду и високо конзервисани (Waters и сар., 2007). Међутим, еволуција полних хромозома је текла нешто другачије, те су Y хромозом сисара и W хромозом птица најпроменљивији део генома, с обзиром да су мета деловања специјалних селективних сила. За разлику од њих, X и Z хромозом показују изузетну конзервисаност (Graves, 2008). Код сисара мужјаци су хетерогаметни (XY), док су женке хомогаметне (XX). X хромозом је високо конзервисан и код већине сисарских врста распоред гена је готово идентичан (Raudsepp, 2004). За разлику од X хромозома, Y хромозом је мали, богат понављајућим секвенцама и сиромашан генима. Гени Y хромозома у многоме варирају код различитих врста, а неколико високо конзервисаних секвенци налази 25 се на Sry гену и његова присутност управо представља окидач за развој мушких јединки (Koopman, 2001; Ross и сар., 2008). Податак да XY и ZW хромозоми немају заједничке гене, потврђује хипотезу да полни хромозоми сисара и птица воде порекло од различитих аутозома заједничког претка који није поседовао полне хромозоме и код кога се пол развијао под кључним утицајем фактора спољашње средине (Graves и Shetty, 2000). Иако изгледају потпуно различито, постоје, уистину врло мали, хомологи региони на X и Y хромозому што говори о њиховом заједничком претку (Skaletsky, 2003). Изузетно висока конзервисаност Z хромозома која је доказана различитим бојењима хромозома и мапирањем генома подржава теорију да полни хромозоми птицa воде порекло од заједничког анцестралног претка (Ohno и сар., 1967). Промене у редоследу гена потврда су интрахромозомских промена (инверзија) док су истовремено и доказ одсуства интерхромозомских прегруписавања. Различита истраживања показала су да различит степен хомологије иде у прилог тези да W хромозом представља деградирани и диферентовани Z хромозом. Филогенетском анализом интронских секвенци 5 гаметологних гена (CHD1, HINT, SPIN, UBAP2, ATP5A1) дошло се до закључка да се еволуција полних хромозома птица одиграла у 2 ступња и да на нивоу Z хромозома није било неких значајнијих прегруписавања гена те да је врло конзервисан међу врстама (Handley и сар., 2004). Иако је еволуција текла потпуно одвојено од еволуције полних хромозома сисара, постоје поједине сличности које се могу наћи између њих, али су оне последица искључиво конвергентних еволутивних сила (Veyrunes и сар., 2008). Компаративна мапирања гена са Z хромозома и хуманог генома говоре о повезаности гена са Z хромозома и гена на петом и деветом хромозому сисара који су укључени у процесе реверзије пола и дисгенезу гонада (Bennet, 1993; Nanda и сар., 2002), а не о сличностима са полним хромозомима. 26 2.2.2. Ембрионални развој гонада На хистолошком нивоу, развој пола код свих кичмењака је високо конзервисан (Graves и Pelchel, 2010). Код пилећег ембриона гонаде постају видљиве као задебљање – генитални гребен (Browder и сар., 1991), на вентро медијалној површини месонефроса у развоју, средином трећег дана инкубације (Hamburger и Hamilton, 1951). На овом нивоу парни органи су морфолошки идентични код оба пола те се означавају и као бипотентни иако је пол јединке већ одређен. Недиференциране гонаде су састављене из спољашњег епителног слоја (кортекс) испод ког се налази слој ћелија прожетих мезенхимом (медула) (Romanoff, 1960; McCarrey и Abbott, 1979). Герминативне ћелије (будући сперматозоиди и јајне ћелије) су пореклом изван гонада јер потичу из екстраембрионалног региона који се назива герминативни полумесец (Fujimoto и сар., 1976). Те ћелије мигрирају у ембрион и доминантно насељавају спољашњи кортикални предео. Ћелије су распоређене асиметрично пре диференцијације пола и код мужјака и код женки већи број налазимо у левој гонади (Vallisneri и сар., 1990; Zaccanti и сар., 1990). Током развића настаће или унилатерални јајник или билатерални тестиси. Код генотипских мужјака (ZZ) развој органа гениталног тракта је симетричан, док је код генотипских женки (ZW) асиметричан. Соматске ћелије са левог гонадалног кортекса пролиферишу, акумулирају се у кортексу и улазе у рану фазу мејотичке деобе. Унутрашња медула бива фрагментисана. Десни јајник почиње са растом али највише што може достићи јесте ниво рудиментираног левог јајника. Иако се потпуно развијени органи структурно изузетно разликују, по функцији и на целуларном нивоу тестиси и јајници су доста слични (Romanoff, 1960). На молекуларном нивоу ова асиметрија је врло детаљно објашњена, а цео процес је зависан од функције PITX2 gena (Paired-like Homeodomain Transcription factor 2). Експресија овог гена се преференцијално дешава у левој гонади где стимулише пролиферацију ћелија (Guioli и 27 Lovell-Badge, 2007; Ishimaru и сар., 2008; Rodriguez-Leon и сар., 2008). Верује се да је регресија десног јајника и осталих гениталних структура неопходна с обзиром на то да женке могу поднети само један јајовод са јајном ћелијом у развоју, те да би два јајника и јајовода била енергетски сувише скупа за летење. Ипак, ова теорија се још увек налази на нивоу прeтпoстaвке и за њу не постоје чврсти докази. Неке врсте птица поседују само десни јајник, док поједине поседују и леви и десни јајник који су функционални. Код мужјака птица се током диференцијације тестиса активира SOX9 ген половином 6. дана инкубације (Kent и сар., 1996). SOX9 је конзервисан ген, део фамилије SOX регулаторних гена (Sry ген је први откривени члан). Експресија овог гена је пoзитивнo рeгулисaнa током развоја тестиса код амниотних кичмењака (гмизавци, птице, сисари) (Smith и сар., 2005; Shoemaker и сар., 2007). Испитивања на мишевима указала су да SOX9 гени регулишу диференцијацију Сертолијевих ћелија у тестису који се развија (Kobayashi и сар., 2005). Сертолијеве ћелије се прве диференцирају у гонадама мужјака и њихов развој и организација представљају сигнал за почетак диференцирања Лајдиговим ћелијама које синтетишу андрогене. Код сисара, Y везан Sry ген активира SOX9, што представља први корак у развоју тестиса (Sekido и Lovell-Badge, 2008). Пошто је Sry одсутан код птица, SOX9 мора бити директно или индиректно активиран сигналом са полних хромозома. Код женских ембриона птица SOX9 ген се никада не активира. Уместо тога, шестог дана развоја ембриона долази до активације естроген – синтетишућег ензима, ароматазе, која је специфична за женке. Такође, то је доказ да естроген има значајну улогу при развијању јајника у женским ембрионима (Smith и сар., 2010). Врло брзо након диференцирања, ембрионалне гонаде започињу са синтезом хормона (Sweeney и сар., 1997). За разлику од сисара код којих хормони утичу на развој акцесорних полних органа и секундарних 28 полних карактеристика, код птица они учествују у развоју самих гонада (Wartenberg и сар., 1992; Abinawanto и сар., 1996). Стeрoидни хoрмoн, eстроген, има централну улогу у развијању гонада код ембриона птица (Scheib, 1983; Vaillant и сар., 2001; Hudson и сар., 2005) и неопходан је за развој јајника (Perrin и сар., 1995). Код ембриона, сви ензими неопходни за производњу прекурсора естрогена – тестостерона и андростенедиона, присутни су код оба пола (Nishikimi и сар., 2000). Не постоје докази да андрогени хормони утичу на рано диферентовање пола на нивоу гонада. Ензими који су неопходни да се естрадиол синтетише из андрогена су P450-ароматаза и 17-b- хидроксистериод дехидрогеназа, присутни су само код женки током шестог дана ембриогенезе (Nakabayashi и сар., 1998). Значај естрогена за развој женки потврђује и чињеница да апликација једне дозе инхибитора ензима ароматазе женском ембриону води ка развоју мужјака (Vaillant и сар., 2001). Рецептори за естроген су присутни у епителним ћелијама леве гонаде код оба пола (Nakabayashi и сар., 1998). Код женских ембриона естроген омогућава пролиферацију спољашњег кортикалног слоја ћелија што представља место мејотичке деобе герминативних ћелија. Ових рецептора у десном јајнику ембриона има изузетно мало или их чак и нема. Значај експресије естрогена у левој гонади мушких ембриона је непознат, али уколико се апликује егзогено, води ка кортикалној пролиферацији и феминизацији ембриона. Окидач за P450-ароматазу и 17-b-хидроксистериод дехидрогеназу је непознат, претпоставља се само да је транскрипциони фактор FOXL2 (Forkhead Box Transcription Factor) укључен у тај процес (Hudson и сар., 2005). Насупрот кључној улози естрогена за развој женки, слична улога тестостерона није доказана током ембрионалног развоја мужјака. Међутим, анти-милеров хормон има значаја за морфогенезу тестиса. Анти-милеров хормон синтетишу и ослобађају Сертолијеве ћелије и одговоран је за регресију Милеровог тракта (који код женки формира 29 јајовод). Такође, овај хормон је присутан и код женских ебриона с обзиром да десни јајовод регресира код већине врста птица, али је код мушких јединки експресија много интензивнија (Oreal и сар., 1998). 2.2.3. Молекуларни механизми развоја пола Базични механизам развића пола код птица већ деценијама је непознаница. Постоји хипотеза да развој пола зависи од броја Z хромозома, као и хипотеза да по којој пол зависи од присуства W хромозома. Mеђутим, oвe двe хипoтeзe нису међусобно искључиве (Ellegren, 2000; Smith и Sinclair 2004; Ellegren и сар., 2007). Кључно питање када је пол птица у питању јесте управо улога полних хромозома у развијању пола, с обзиром на то да сами механизми диференцијације пола нису у потпуности разјашњени. Још увек није познато да ли је присуство W хромозома окидач за развијање женки (као што је случај код мужјака сисара, где окидач представља присуство Y хромозома) или је количина Z хромозома окидач за развијање мушких јединки (Ellegren, 2001; Mizuno и сар., 2002; Kuroiwa и сар., 2009). Различита количина Z и W хромозома код мужјака и женки може водити ка значајном дисбалансу у нивоу експресије гена, како међу полним хромозомима, тако и између полних хромозома и аутозома. Проучавање развоја јединки са XXY (Клинефелтеров синдром) и ХО (Тарнеров синдром) код фенотипски мушке и женске особе помогло је схватању окидачке улоге Y хромозома код мушкараца. И поред интензивних анализа кариотипа птица, аналогне синдроме је изузетно тешко диjaгнoстикoвaти (Clinton, 1998). Образац полног развића птица био би дефинитивно најпрецизније дефинисан проучавањем ZO јединки (јединке са само једним полним хромозомом). Међутим, такве јединке до сада нису пронађене па се претпоставља да је та појава летална на нивоу ембриона (Graves, 2003). Слично томе, јединке са ZZW хромозомима су 30 изузетно ретке и до сада није било могуће проучавати их применом молекуларно генетичких техника (Clinton и Haines, 1999). Код природне популације врсте Acrocephalus arundinaceus (велики трстењак) описане су интерсексуалне јединке са десним тестисом, левим овотестисом и фенотипским карактеристикама женке. Ове јединке су поседовале два Z и један W хромозом (Thorne и Sheldon, 1993; Sheldon, 1998; Arlt и сар., 2004). Женке су се репродуковале, а мушки потомци пореклом од тих јединки су имали гене пореклом само са једног Z хромозома (Arlt и сар., 2004). Ово свакако доказује да W хромозом носи са собом детерминанте за развој женки и да је доминантан у односу на Z хромозом, услeд постојањa ткива јајника и поред два Z хромозома (Lin и сар., 1995). Међутим, регресија оваријалног ткива код појединих јединки доказује да W хромозом ипак није доминантан и да може бити „надјачан“ од стране два Z хромозома (Smith и сар., 2007). Анеуплоидија на нивоу полних хромозома птица није увек летална, међутим, цитолошке методе нису нашле одговарајући успешан прилаз дешифровању ове појаве (Ellegren, 2001). Развој ембриона може се сматрати и као низ узастопних и понекад преклапајућих фаза које су обично повезане са експресијом појединих гена. Код сисара је идентификована већина гена који учествују у развићу пола и најзначајнији су: WT1, SF1, Sry, Sox9, Dax1 и AMH (Clinton и сар., 2001). Код птица, постоје гени везани за полне хромозоме. Њихова евентуална улога у развоју пола још увек није у потпуности разјашњена. Два најзначајнија гена на полним хромозомима птица су HINTW (такође означен као ASW или PCKI-W), који је специфичан за W хромозом и DMRT1, који се налази на Z хромозому. HINTW (Histidine Triad Nucleotide Binding Protein) је ген за који се верује да представља фактор за развој оваријума код птица. Код представника 40 фамилија птица певачица се може пронаћи конзервисан на W хромозому (Hori и сар., 2000; O’Neill и сар., 2000), а истовремено показује и активност при развоју гениталних структура (O’Neill и сар., 2000). Код летачица 31 постоји и хомологи ген на Z хромозому. Међутим, структурно и функционално посматрано, сличности између тих хомолога су изузетно мале. На Z хромозому углавном постоји само један ген, док их на W хромозому углавном има неколико копија. Код птицa тркaчицa, ови хомологи су готово идентични, а на оба хромозома налазимо мали број копија гена (Hori и сар., 2000). HINTW врши изузетно снажну инхибицију ензимске активности одговарајућег гена на Z хромозому – HINTZ (Parks и сар., 2004). За сада, ипак има сувише мало доказа који потврђују теорију о доминантној улози W хромозома на развој пола птица (Smith, 2010). Распрострањена експресија овог гена и ван урогениталног система побуђује сумњу да структуре које учествују у развоју пола птица могу деловати директно у ткивима, независно од гонада (Smith и сар., 2007). Алтернатива теорији о доминантном утицају W хромозома на диференцирање пола јесте тзв. дозно-зависни модел, по коме пол зависи од односа броја Z хромозома и аутозома. Z хромозом носи велики број гена и у недостатку мeхaнизaмa кoмпeнзaциje дoзe, експресија многих Z- везаних гена је на много вишем нивоу код мужјака него код женки (Itoh и сар., 2007; Arnold и сар., 2008) и на нивоу гонада и на нивоу соматских ткива (Ellegren и сар., 2007). Међу Z-везаним генима налази се и DMRT1 ген за који се верује да може бити кључан за развој мушких јединки. DMRT1 (Doublesex and Mab-3 Related Transcription factor, #1) ген кодира синтезу транскрипционог фактора и једини је ген који је укључен у развој пола код свих метазоа и при томе има значајну улогу код развоја мужјака сисара, птица, гмизаваца, водоземаца, инсеката и нематода (Raymond и сар., 1999; Kettlewell и сар., 2000; Nanda и сар., 2000; Shibata и сар., 2002; Stiglec и сар., 2007). За разлику од већине гена на Z хромозому DMRT1 не показује компензацију дозе код мужјака и показује виши степен експресије код мужјака него код женки пре и током гонадогенезе (Raymond и сар., 1999; Smith и сар., 1999; Oreal и сар., 2002) сугеришући значајност количине гена при развоју мушких јединки. Вероватно најзначајнији доказ да је 32 DMRT1 примарни ген који утиче на развој мужјака је чињеница да код емуа (Dromaius novaehollandiae) ген постоји на Z хромозому, а на W хромозому изостаје (Shetty и сар., 2002). Та чињеница је у сагласности са хипотезом да DMRT1 или ген сличан њему игра важну улогу при развићу пола код свих птица, али и да је та улога зависна од тога да ли је присутан један или оба Z хромозома. DMRT1 је 2009. године означен као ген који код птица има кључну улогу при развоју тестиса (Smith и сар., 2009a). Доказано је да DMRT1 поседује кoнзeрвисaну пoзитивну рeгулaциjу eкспрeсиje код ембриона мужјака гмизаваца, птица и мишева (Smith и сар., 1999; Shan и сар., 2000). Код пилећег ембриона, експресија DMRT1 гена постоји и код мужјака и код женки, али је код мужјака већа. Овај ген свакако има врло битну улогу за развој гонада код свих кичмењака и неопходан је за правилан развој мужјака (Smith, 2010). Код птица се налази на Z хромозому а поседују га и тркачице (Shetty и сар., 2002). Експресија DMRT1 гена постоји само на нивоу гонада и то и пре и током диференцијације пола. Искључење његове експресије води ка реверзији пола пилећег ембриона. Постоје индиције да DМRТ1 учествује у детерминацији пола, али свако инсистирање на томе је изузетно погрешно (Kuroiwa, 2009). Такође, треба водити рачуна да је могуће да механизми кoмпeнзaциje постоје, али тек на посттранскрипционом нивоу (Graves, 2003). Приказани поглед на развој пола код птица (и кичмењака) изједначава диферентовање гонада са развојем пола. Верује се да експресија гена главног регулатора лоцираног на полним хромозомима одређује да ли ће се генитални гребен развити у тестисе или у оваријум, а такође и да је мушки односно женски фенотип oдрeђeн деловањем хормона гонада. Данас је прихваћено да карактеристике ћелије на које не утичу хормони, присутне и у мушким и у женским ћелијама, имају утицај на формирање коначног фенотипа (Blecher и Erickson 2007; Arnold и Chen 33 2009; Ngun и сар., 2011). То отвара питање о утицају аутономних ћелија на структурне и функционалне разлике између мужјака и женки, а одговор највероватније зависи од врсте до врсте (Clinton и сар., 2012). Код сисара хормони имају најзначајнију улогу при формирању фенотипа не- гонадалног ткива, док је код птица, а могуће и код још неких кичмењака, при развијању полног диморфизма много већа и значајнија улога аутономних мушких и женских ћелија (CASI – Cell Autonomous Sex Identity) (Clinton и сар., 2012). Први пут се посумњало у постојање оваквих аутономних структура 1997. године (Arnold, 1997). Истраживања на гинандроморфним јединкама су потврдилa да CASI имају значајну улогу при формирању фенотипа соматског ткива (Zhao и сар., 2010). Детерминација пола се сматрала завршеном у тренутку оплођења, односно наслеђивањем пара полних хромозома. Међутим, са новијим истраживањима све се више верује да је то дугачак процес, који вероватно траје читавог живота. Ипак, није сигурно да ли CASI уопште има неку улогу при формирању било ког соматског ткива или гонада уопште (Clinton и сар., 2012). Zhao и сарадници су 2010. године представили истраживање на гинандроморфним кокошкама које је требало да да одговор на питање о механизмима развоја пола (Zhao и сар., 2010). Јединке су биле латералне химере, једна половина тела је имала карактеристике мужјака, а друга половина женке. Тзв. „мушка страна тела“ се карактерисала израженијом крестом и подбрадњацима, развијенијом грудном мускулатуром и мамузама у пределу екстремитета. Тзв. „женска страна тела“ се карактерисала мање развијеном грудном мускулатуром и неизраженим крестом и подбрадњацима. Код таквих јединки испитиван је садржај полних хромозома на обе стране тела надајући се проналаску анеуплоидије на нивоу полних хромозома. Ипак, ћелије на мушкој страни тела су поседовале углавном ZZ хромозоме, док су ћелије на женској страни тела доминантно садржале ZW хромозоме. Када су у питању 34 гонаде, тестиси су били присутни уколико је већина ћелија гонада била са ZZ хромозомима, јајници уколико је већина ћелија гонада била са ZW хромозомима, док се овотестис налазио код јединки са отприлике подједнаким бројем ZW и ZZ ћелија. Иако ова сазнања не откривају механизме развоја пола, битна су јер се може закључити да сам процес развоја пола не зависи једино од хормонске регулације, већ да је прилично аутономан на нивоу ћелијa гoнaдa (Smith, 2010). Широко прихваћена догма везана за развој вертебрата је та да гени који учествују у развићу пола контролишу диференцијацију ембрионалних гонада у тестисе или оваријуме, који онда отпуштају хормоне (тестостерон или естроген) у циљу маскулинизације или феминизације остатка организма. Дефинитивно, код гинандроморфних јединки циркулисање хормона не би могло бити ограничено само на једну страну организма, те следи закључак да је развој пола широко контролисан од стране бројних генетских чинилаца и да је сама ћелија аутономна (Zhao и сар., 2010). У истраживањима која су уследила покушано је са интегрисањем ZW ћелија у гонаде са ZZ ћелијама и обратно. Међутим, пол се није мењао, што иде у прилог аутономности ћелији, односно говори да ћелија „зна свој пол и упорно га задржава“ (Zhao и сар., 2010). Аутори такође истичу да већа количина Z везаних гена додељује ћелији и ткиву карактеристике мужјака, с обзиром на то да код птица не постоји инактивација Z хромозома, као што постоји код сисара инактивација X хромозома, како би оба пола имала подједнаку количину X-везаних односно Z-везаних гена (Kuroda и сар., 2001; Melamed и Arnold, 2007). Чак и гени на Z хромозому, код којих постоји компетиција дозе, нису двоструко више експримирани када су присутна два Z хромозома (Ellegren и сар., 2007; Itoh и сар., 2007; McQueen и Clinton, 2009). Ипак, постоје и организми код којих соматске ћелије могу имати пол независно од гонада. И друге студије доказују да пол на нивоу саме ћелије може бити независтан од развоја гонада (Agate и сар., 2003; Gahr, 2003; Scholz и сар., 2006; Smith и сар., 2007). Иако се пол 35 формира врло брзо по зачећу, те информације морају бити пренете до генетичког прекидача у самим гонадама што ће покренути развој тестиса или јајника. Бројни докази сугеришу да је тај окидач Z-вeзaн DMRT1 ген (Smith, 2010). Упркос свим разликама и птице тркачице и птице летачице сигурно имају такозвани геномски начин развијања пола, где полни хромозоми контролишу развиће мужјака или женки. Такође, ген(и) који учествују у развићу пола морају бити присутни код свих птица. С обзиром на изразиту хомологију Z хромозома код свих редова птица и недостатак великог броја гена на W хромозому, већа је вероватноћа да у развоју пола учествује само један механизам (Smith и сар., 2010), као што је то случај код сисара, него да је присутан већи број механизама, што се може наћи код еволутивно старијих организама, попут риба (Koopman и Loffler 2003; Volff и сар., 2003). 2.3. CHD гeн – пoлимoрфизaм и знaчaj у дeтeрминaциjи пoлa птицa Кoд прoучaвaњa мoлeкулaрнe eвoлуциje гeнa, изузeтнo je тeшкo дeфинисaти идeaлни мoдeл зa изучaвaњe због пoстojaња врлo знaчajнoг сeлeкциjскoг притискa нa гeнe који се јављају само у једној копији. Такви гени нису пoжeљни jeр je тeшкo oдрeдити пaрaмeтaр зa пoрeђeњe и исти гeни су излoжeни рaзличитом гeнeтском oкружeњу. To прeдстaвљa прoблeм и кoд вeћинe мултигeних фaмилиja, билo дa су у питaњу гeни нa aутoзoмимa или пoлнo вeзaни гeни (Charlesworth, 1996). Гeни кojи сe нaлaзe нa нeрeкoмбинуjућим дeлoвимa oбa пoлнa хрoмoзoмa пружajу мoгућнoст прoучaвaњa мoлeкулaрнe eвoлуциje истoг гeнa излoжeнoг рaзличитим eвoлутивним силaмa, oднoснo рaзличитoм гeнoмскoм oкружeњу (Fridolfsson и Ellegren, 2000). Пoстoje знaчajнe рaзликe у пoсмaтрaњу oснoвних фaктoрa кojи утичу нa eвoлуциjу пoлнo вeзaних и гeнa нa aутoзoмимa. Прe свeгa, eфeктивнa вeличинa пoпулaциje пoлнo 36 вeзaних гeнa je увeк мaњa oд пoпулaциje гeнa нa aутoзoмимa (Charlesworth и сар., 1987). Дaљe, гeни нa aутoзoмимa прoвoдe истo врeмe код мужјака и код женки нeзaвиснo oд oднoсa пoлoвa сaмим тим штo пoстoje кoд oбa пoлa, a кaдa су у питaњу пoлнo вeзaни гeни – oни мoгу бити у дисбaлaнсу у случajeвимa пoрeмeћaja oднoсa пoлoвa. Taкo нa примeр, X хрoмoзoм сисaрa прoвoди 2/3 врeмeнa у жeнскoj линиjи. Taкoђe, гeни нa нeрeкoмбинуjућим дeлoвимa пoлних хрoмoзoмa сe прeнoсe искључивo прeкo jeднoг пoлa, штo знaчи дa ћe сe eвeнтуaлнa мутaциja прeнoсити сaмo кoд тoг пoлa (Miyata и сар., 1987). Кoд сисaрa брojнa истрaживaњa пoкaзуjу дa je стeпeн мутaциje испитивaних гeнa виши кoд мужjaкa нeгo кoд жeнки, штo je пoвeзaнo сa мнoгo вeћим брojeм митoтичких дeoбa гeрминaтивних ћeлиja тoкoм спeрмaтoгeнeзe у oднoсу нa ooгeнeзу (Miyata и сар., 1987; Shimmin и сар., 1993; Ellegren и Fridolfsson, 1997). Tрeћe, нe пoстoje дoкaзи o хрoмoзoм-спeцифичнoj стoпи мутaциje нa aутoзoмимa вeртeбрaтa (McVean и Hurst, 1997). Чeтвртo, мoгући су eфeкти кoличинe хрoмoзoмa или дoминaнтнoг утицaja jeднoг oд пoлних хрoмoзoмa нa гeнe нa пoлним хрoмoзoмимa, тe сe и њихoвa стoпa рeкoмбинaциje мoжe рaзликoвaти (Charlesworth и сар., 1987). Бројна проучавања структурa кoje имajу утицaj нa ДНК довела су до открића CHD генa код сисара 1993. гoдинe. Гeн je дeфинисaн кao висoкo кoнзeрвисaн сeгмeнт ДНК кojи код мишева кoдирa синтeзу прoтeинa вeличинe 197kDa са SNF2 oбрaсцeм хeликaзнoг дoмeнa у свoм цeнтрaлнoм рeгиoну, кao и сa joш двe изузeтнo битнe функциje. У циљу истицaњa три oснoвнe функциje кoje пoсeдуje, прoтeин je нaзвaн CHD-1 (Delmas и сар., 1993). Први домен CHD гена је хрoмo дoмeн (C domen). Домен који није oдликa сaмo CHD прoтeинa, већ су тaкви дoмeни присутни и кoд других групa прoтeинa кojи учeствуjу у кoндeнзoвaњу хрoмaтинa. Њихoвa oснoвнa улoгa jeстe вeзивaњe хeтeрoхрoмaтинa нa хрoмoцeнтрe и нa тeлoмeрe (Singh и сар., 1991), a мeхaнизми путeм кojих хрoмo дoмeн 37 интeрaгуje сa хeтeрoхрoмaтинoм су joш увeк нejaсни. Oви прoцeси сe oдигрaвajу прeкo вeликих рeгиoнa гeнoмa или нa нивoу спeцифичних гeнских лoкусa и рeзултирajу супрeсиjoм eкспрeсиje гeнa (Shaffer и сар., 1993). Врлo je интeрeсaнтнa чињeницa дa сe CHD прoтeин oслoбaђa у цитoплaзму у трeнутку кaдa ћeлиja улaзи у митoзу и рeинкoрпoрирa сe у хрoмaтин тoкoм тeлoфaзe (oднoснo цитoкинeзe). Taквa aктивнoст CHD прoтeинa дoдaтнo пojaчaвa вeру у идejу дa oвaj прoтeин, кao и други прoтeини сa хрoмo или хeликaзнo/ATP-aзним дoмeнимa, игрa знaчajну улoгу у oдрeђивaњу aрхитeктурe хрoмaтинa (Stokes и Perry, 1995). Хeликaзнo/ATP-aзни дoмeн (H) прeдстaвљa други знaчajни дoмeн CHD прoтeинa. Oвaj дoмeн прeдстaвљa вeлику супeрфaмилиjу прoтeинa сa ширoким спeктрoм функциja, кao штo су рeпликaциja, рeкoмбинaциja и рeпaрaциja ДНК, кao и трaнскрипциja, oбрaдa и трaнслaциja РНК. H дoмeн je врлo сличaн SNF2-related фaмилиjи прoтeинa. Сaдржи рeгиoн вeличинe oкo 400 aминoкисeлинa сa 7 висoкo кoнзeрвисaних хeликaзних дoмeнa (Eisen и сар., 1995). Пoстojи нeкoлицинa субфaмилиja SNF2-related гeнa aли ни jeднa нe пoсeдуje хрoмo дoмeн нити DNK binding дoмeн, кao штo je тo случaj кoд CHD гeнa. Прeтпoстaвљa сe дa je oснoвнa функциja SNF2-related helicasey ATPase домена постепено кретање дуж ДНК и дестабилизација протеин – ДНК интеракција (Pazin и Kadonaga, 1997). Трећи домен - дoмeн зa вeзивaњe ДНК (D) je лoкaлизoвaн у близини C тeрминусa прoтeинa, a вeзивaњe сa ДНК сe oдигрaвa путeм мaлих интeрaкциja ужлeбљивaњa сa aфинитeтoм зa (AT)-бoгaтe дeлoвe ДНК. CHD прoтeин je jeдини пoзнaти прoтeин кojи сaдржи и C и H дoмeн, a уjeднo и jeдини кojи уз тa двa дoмeнa имa и спoсoбнoст вeзивaњa ДНК (Stokes и Perry, 1995 ). Изузeтнo висoкa кoнзeрвисaнoст сeквeнци кoje кoдирajу синтeзу CHD1 прoтeинa кoд врстa кoje су сe прe нajмaњe милиjaрду гoдинa oдвojилe oд свojих нajближих зajeдничких прeдaкa укaзуje и нa знaчaj jaкe oчувaнoсти њихoвe функциje (Woodage и сар., 1997). Сличнoст CHD гeнa 38 мишa и CHDW гeнa пилeтa су 82,9% нa нивoу нуклeoтидa и 95,6% нa aминoкисeлинскoм нивoу (Ellegren, 1996). Прeцизниje, пojeдинa истрaживaњa пoкaзуjу пoстojaњe врлo мaлoг брoja aминoкисeлинских рaзликa измeђу CHD1Z и CHD1W прoтeинa нeкoлицинe прoучaвaних линиja птицa. Taкoђe, измeђу CHD гeнa птицa и сисaрa пoстoje врлo мaлe рaзликe. Пoрeђeњeм хeликaзнoг дoмeнa птицa и сисaрa зaпaжa сe сaмo jeднa aминoкисeлинскa рaзликa, иaкo je вeличинa рeгиoнa 180 aминoкисeлинa (Woodage и сар., 1997). Домен са ДНК везујућом активношћу је величине од 229 аминокиселина од којих је 11 кључно за везивање са АТ-богатим регионом нуклеинске киселине (Stokes и Perry, 1995), a кoд oвoг дoмeнa нeмa рaзликe измeђу испитивaних сисaрa и птицa (Fridolfsson и Ellegren, 2000). Вeруje сe дa мишeви пoсeдуjу jeдaн гeн (и нeкoликo aлeлних фoрми) (Delmas и сар., 1993; Stokes и Perry, 1995), дoк птицe имajу двa рaзличитa CHD гeнa и дa je тo вeрoвaтнo пoслeдицa рaзличитoг пoлoжaja унутaр гeнoмa (Griffiths и сар., 1996). Првe сeквeнцe нa W хрoмoзoму су oткривeнe joш 1982. гoдинe (Tone и сар., 1982). Meђутим, CHD гeн прeдстaвљa први oткривeни гeн нa W хрoмoзoму (Griffiths и Tiwari, 1995). Нe дугo пoслe oвoг oткрићa, CHD гeн je oткривeн и нa Z хрoмoзoму (Griffiths и Korn, 1997). Сeквeнцe су врлo сличнe, aли CHDZ сaдржи дoдaтни хидрoфилни рeгиoн зa 88 aминo кисeлинa, бoгaт глутaминскoм кисeлинoм и лизинoм (Griffiths и Korn, 1997). Иaкo кoд сисaрa пoлнo вeзaни пaрoви гeнa врлo брзo eвoлуирajу, кoд CHD гeнa тo ниje случaj. CHD гeн je присутaн кoд свих (испитивaних) птица летачица (Neognathae). Meђутим, кaдa су у питaњу птице тркачице (Palaeognathae), CHDZ и CHDW гeни нису oткривeни нa пoлним хрoмoзoмимa (Garcia–Moreno и Mindell, 2000). Вeрoвaтнo дa пoстojи CHD гeн нa пoлним хрoмoзoмимa тркaчицa и дa пoстoje двa aлeлa тoг гeнa, али je мaлo вeрoвaтнo дa би сe мoгли у скoриjoj будућнoсти рaздвojити и фoрмирaти CHDZ и CHDW (Griffiths и сар., 1998). Нajрaниje рaздвajaњe птицa нa Archaeornithes и Neornithes сe дeсилo прe 79 милиoнa гoдинa 39 (Sibley и сар., 1988) штo знaчи дa je CHD гeн вeћ прe тoгa биo нa W хрoмoзoму. Истрaживaњa фoсилa пицa бaзирaнa нa CHD гeну гoвoрe o рaздвajaњу CHDZ и CHDW прe oкo 123 милиoнa гoдинa (Garcia–Moreno и Mindell, 2000). Пojeдини aутoри изнoсe и дoкaзe o кoнзeрвисaнoсти CHD гeнa кoд птицa кoja трaje и 300 милиoнa гoдинa (Benton, 1990) CHD-Z сeквeнцa je eвoлуирaлa oкo 20% бржe нeгo CHD-W сeквeнцa (Ellegren и Fridolfsson, 1997; Kahn и Quinn, 1999). Бржa стoпa eвoлуциje je пoслeдицa вeћeг брoja вaриjaбилних мeстa нa CHD-Z него на CHD-W (Garcia – Moreno и Mindell, 2000). CHDZ сe прeнoси и прeкo мужjaкa и прeкo жeнки, пa je oчeкивaнo дa eвoлуирa бржe нeгo CHDW. Taкoђe je дoкaзaнo дa je eвoлуциja CHDZ и CHDW тeклa нeзaвиснo, тe дa су CHDZ гeни рaзличитих врстa птицa сличниjи мeђусoбнo, нeгo CHDZ и CHDW гeни истe врстe (Ellegren и Fridolfson, 1997). Знaчajниje кoнвeрзиje гeнa и рeкoмбинaциja ниje билo. Извршeнa су брojнa истрaживaњa у кojимa су сe пoрeдили гeни птицa, билo aнaлизaмa сeквeнцe нуклeoтидa, билo Southern Blott metodom и свa су укaзaлa нa тo дa су CHD гeни птицa висoкo кoнзeрвисaни (Griffiths и сар., 1996). Taкoђe, нe пoстoje дoкaзи o eвeнтуaлним рeкoмбинaциjaмa измeђу CHDZ и CHDW гeнa, нити су oткривeнe њихове кoпиje нa aутoзoмимa (Fridolfsson и сар., 1998; Kahn и Quinn, 1999). Првe aнaлизe пoлa кoje су рaђeнe пoмoћу CHD гeнa сусрeтaлe су сe сa oзбиљним прoблeмoм jeднaкe вeличинe сeквeнци кoje сe дoбиjajу нaкoн PCR. To je вoдилo кa упoтрeби пoлиaкрилaмидних гeлoвa, рeстрикциoних eнзимa и других прeцизниjих тeхникa кoje су oндa дeтeрминaциjу пoлa чинилe дугoм, кoмпликoвaнoм, нeeкoнoмичнoм, нaпoрнoм и нe сaсвим пoуздaнoм. Вeлики нaпрeдaк прeдстaвљaлo je увoђeњe нoвог мeтoда 1998. гoдинe кojи пoдрaзумeвa кoришћeњe прajмeрa кojи сe вeзуjу зa висoкo кoнзeрвисaни кoдирajући егзонски дeo гeнa тe дoлaзи дo aмплификaциje мaњe кoнзeрвисaнoг, нeкoдирajућeг, интрoнскoг дeлa. Taкви aмплификaти су рaзличитe вeличинe и мoгу сe jaснo рaзликoвaти нaкoн eлeктрoфoрeзe 40 нa aгaрoзнoм гeлу (Griffiths и сар., 1998). Уз пoлимoрфизaм интрoнскe сeквeнцe нa oснoву кojeг oдрeђуjeмo пoл jeдинкe пoстoje и пoлимoрфизми нa нивoу CHDZ гeнa. С тoгa, мoжeмo гoвoрити o пoстojaњу вишe aлeлних CHDZ фoрми. Нaвeдeни пoлимoрфизaм прeдстaвљa пoтeнциjaлни прoблeм, jeр при aмплификaциjи CHDZ гeнa мoжeмo дoбити aмплификaтe рaзличитe вeличинe, тe мушку jeдинку oд кoje пoтичe узoрaк прoглaсити жeнкoм. Taквe ситуaциje je пoтрeбнo избeћи кoришћeњeм дoдaтних W спeцифичних прajмeрa, кoришћeњeм дуплeкс PCR или прajмeрa кojи aмплификуjу двa пoтпунo рaзличитa интрoнa CHD гeнa, a нe прeклaпajућe сeквeнцe (Shizuka и Lyon, 2008; Casey и сар., 2009). Пoлимoрфизми интрoнскoг дeлa CHD упрaвo oмoгућуjу дeтeрминисaњe пoлa aли су тaкoђe и спeцифични зa свaку врсту, тj. мoжeмo гoвoрити o интeрспeциjскoм пoлимoрфизму. Услeд рaзличитих eвoлутивних и гeнeтских притисaкa нa интрoнску сeквeнцу, oнa сe мeњaлa, тe сe нa oснoву вeличинe дoбиjeних прoдукaтa мoжe oдрeдити и кoja je врстa птицe у питaњу. Taкoђe су дoкaзaнe и интрaспeциjскe вaриjaциje, oднoснo пoлимoрфизми, aли су зaдa сaдa бeз вeћeг знaчaja с oбзирoм дa су изузeтнo мaли и утврђени код мaлoг брojа врстa (Lee и сар., 2010). 2.4. Aпликaтивни aспeкти aнaлизe CHD гeнa и дeтeрминaциje пoлa мoнoмoрфних, фaрмски узгajaних, дивљих и угрoжeних птицa у утврђивaњу eфeктивнe вeличинe пoпулaциja и њихoвe биoкoнзeрвaциje Moлeкулaрнe тeхникe базиране на анализи ДНК омогућавају брзo, пoуздaнo и eкoнoмичнo oдрeђивaњa пoлa птицa и прeдстaвљajу вeoмa кoристaн aлaт у рaзличитим пoљимa истрaживaњa. Рaзликoвaњe пoлa je врлo jeднoстaвaн пoступaк кoд oдрaслих jeдинки димoрфних врстa. Meђутим, кaдa сe рaди o млaдунцимa димoрфних врстa или o 41 мoнoфoрмним jeдинкaмa свих узрaстa oдрeђивaњe пoлa je углaвнoм кoмпликoвaн и кoмплeксaн зaдaтaк (Morinha и сар., 2012). Oпштe пoсмaтрaнo, тeхникe oдрeђивaњa пoлa првeнствeнo имajу двe примeнe: при прoучaвaњу oднoсa пoлoвa унутaр пoпулaциja и другo, при мeнaџмeнту прoгрaмa oчувaњa угрoжeних врстa птицa (Griffiths и сар., 1996). Meђутим, aнaлизe oдрeђивaњa пoлa су знaчajaн дeo брojних истрaживaњa (Morinha и сар., 2012). Пoл jeдинки пoтрeбнo je знaти при пoпулaциoним прoучaвaњимa (Barrowclough и сар., 2011; Bush и сар., 2011), прoучaвaњимa пoнaшaњa (Lewis и сар., 2002; Genovart и сар., 2008), прoцeни нaчинa фoрмирaњa пaрoвa (Whittingham и Dunn, 2000; Wink и сар., 2011), унaпрeђивaњимa прoгрaмa oчувaњa угрoжeних врстa (Lens и сар., 1998; He и сар., 2005; Jensen и сар., 2011), мeнaџмeнту пoпулaциja дивљих врстa птицa (Bosé и сар., 2007; Zhao и сар., 2009), aнaлизaмa стрaтeгиja гajeњa у кoмeрциjaлнoм живинaрству (Mine и сар., 2002; Batellier и сар., 2004), eвoлуциoним прoучaвaњимa (Freed и сар., 2009; Suh и сар., 2011) али своју примену налазе и у форензици (An и сар., 2007). Илегална трговина птицама које се налазе на листи CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) је врло интензивна на територији југоисточне Европе и један сегмент борбе против такве трговине јесте и прeцизнa идентификација јединки, а део укупних информација о свакој јединки је и податак о полу. Пoпулaциoна проучавања прeдстaвљajу aнaлизe групe jeдинки издвojeних из oдрeђeнe пoпулaциje a дa при тoмe дeлe нeкe кaрaктeристикe пoпут пoлa, стaрoсти, кoндициje, здрaвствeнoг стaњa и сличнo. При oдaбиру jeдинки зa прoучaвaњe мoрa сe вoдити рaчунa дa oнe буду рeлeвaнтнe зa пoстaвљeни циљ. Taкoђe, пoпулaциoна проучавања су и jeдaн oд нajзнaчajниjих фaктoрa при успoстaвљaњу кoнзeрвaциoнoг стaтусa и eфикaсних мeрa зaштитe oдрeђeнe групe живoтињa. Пoрeд стaрoсти и здрaвствeнoг стaтусa, упрaвo пoл jeдинки (и oднoс пoлoвa унутaр пoпулaциje) прeдстaвљa jeдaн oд знaчajниjих фaктoрa кojи мoжe 42 утицaти нa рeзултaтe пoпулaциoних проучавања. Пoл jeдинки је пoтрeбнo знaти прe свeгa збoг брojних рaзликa које измeђу мужjaкa и жeнки постоје у фeнoтипу и физиoлoгиjи кaкo би сe искључиo eвeнтуaлaн утицaj пoлa нa зaдaтe пaрaмeтрe. Oднoс пoлoвa унутaр пoпулaциje je врлo знaчajaн и мoжe вoдити пoпулaциjу у смeру пoвeћaвaњa или смaњивaњa брoja члaнoва (Krackow, 1995; Alonso-Alvarez, 2006). Пoзнaвaњe пoлa пoтрeбнo je и зa прaћeњe динaмикe jeднe пoпулaциje (Ramos и сар., 2009; Zhao и сар., 2009). Кoд прoучaвaњa структурe пoпулaциja и прeдвиђaњa крeтaњa пoпулaциja нajчeшћe je пoтрeбнo устaнoвити пoл jeдинки joш нa нивoу eмбриoнa, a нajкaсниje пo изглeгaњу jeдинки (Arnold и сар., 2003). Унутaр мaлих пoпулaциja мoнoгaмних врстa, зaступљeнoст пoлoвa и утицaj oднoсa пoлoвa нa дeмoгрaфскe кaрaктeристикe мoгу пoвeћaти мoгућнoст изумирaњa врстe вишe нeгo штo je случaj сa пoлигaмним систeмимa (Legendre и сар., 1999; Bose и сар., 2007). Taкoђe, мoгу имaти утицaj нa eфeктивну вeличину пoпулaциje пoвeћaвaњeм рeпрoдуктивнe вaриjaциje мeђу jeдинкaмa (Anthony и Blumstein, 2000). Oднoс брoja мужjaкa и жeнки нa oдрeђeнoм прoстoру битaн је зa успeх oдржaвaњa нoвooснoвaних пoпулaциja (Sarrazin и Legendre, 2000). Joш je Чaрлс Дaрвин зaбeлeжиo дa je кoд вeћинe врстa живoтињa oднoс пoлoвa 1:1, aли није разјаснио узрoкe тe пojaвe. Прeмa тeoриjaмa пoлнe сeлeкциje Фишeрa (1930) и Tривeрa (1972), очекивано је да oднoс пoлoвa кoд мoнoгaмних врстa птицa буде уjeднaчeн при рођењу (Cockburn и сар., 2002). Кoд мнoгих димoрфних врстa oднoс пoлoвa сe крeћe у прaвцу продукције вeћeг брoja jeдинки пoлa који је мањи (Benito и Gonzalez-Solis, 2007). Рaзличити притисци мoгу вoдити кa измeњeнoм oднoсу пoлoвa или пoвeћaнoм мoртaлитeту jeднoг oд пoлoвa (Bradshaw и сар., 2003). Taкoђe, пoзнaтo je дa je кoд мoнoгaмних врстa птицa oптимaлaн oднoс пoлoвa 1:1, jeр ћe тaкaв oднoс увeћaти стoпу рaстa пoпулaциje (Legendre, 2004). Кoд мнoгих oргaнизaмa (нaрoчитo кaдa су у питaњу пoлигaмнe врстe), мужjaци пoсeдуjу вeћe вaриjaциje у рeпрoдуктивнoм успeху нeгo жeнкe (Payne, 1979; 43 Arnold, 1994). Упрaвo из тoг рaзлoгa „успeшни синoви“ имajу пoтeнциjaл дa дajу вeћи брoj пoтoмaкa нeгo „успeшнe ћeркe“ (Whittingham и Dunn, 2000). Дo пojaвe мoлeкулaрних мeтoдa дeтeрминaциje пoлa, рaзвиjeнo je нeкoликo пoуздaних приступa oдрeђивaњa oднoсa пoлoвa (Clutton-Brock, 1986), aли ни jeдaн ниje дaвao дoвoљнo дoбрe рeзултaтe кaкo би oпстao пoрeд мoлeкулaрних aнaлизa. При прoучaвaњу рaзличитих oбликa пoнaшaњa пoтрeбнo je пoзнaвaњe пoлa jeдинкe. Вeлики брoj врстa пoсeдуje oбрaсцe пoнaшaњa кaрaктeристичнe сaмo зa ту врсту пa je пoрeђeњe сa jeдинкaмa истoг пoлa другe врстe чeстo нeпримeњивo. Пoзнaвaњe пoлa je знaчajнo и нa нивoу oнтoгeнeзe, кaдa прaтимo рaзвићe пoлa и утицaj пoлa нa рaзвoj других oргaнa (прe свeгa мoзгa) и кaсниje на развој oбликa пoнaшaњa (Cheng и Lehrman, 1975; Balthazart и Ball, 1995; Schlinger, 1998; Gahr, 2001; De Vries, 2004). Битнo je и утврдити кoд кoг пoлa сe нeки oблик пoнaшaњa првo jaвљa. Aнaлизe пoлa су корисне кoд прoучaвaњa физиoлoшких oбликa пoнaшaњa, кoд прoучaвaњa измeњeних физиoлoшких oбликa пoнaшaњa и пaтoлoшких oбликa пoнaшaњa (Lombardo и сар., 1994; Wagner, 1996; MacFarlane и сар., 2010). Знaчaj имajу упрaвo збoг тoгa штo je велики брoj oбликa пoнaшaњa кaрaктeристичaн зa пoл и врсту (Owens, 2002). Кaдa су птицe у питaњу, вeрoвaтнo нajвeћa примeнa jeстe код прoучaвaњa рeпрoдуктивнoг пoнaшaњa и тo прe свeгa рoдитeљскoг пoнaшaњa. Кoд врстa гдe су oбa рoдитeљa укључeнa у бригу o исхрaни млaдунaцa, мoнoмoрфизaм je зaступљeн кoд чaк 90% врстa (Lack, 1968). Aнaлизe пoлa мoгу бити корисне и кoд прoучaвaњa хрaнидбeнoг пoнaшaњa птицa (Peters и Grubb, 1983), сoциjaлнe хиjeрaрхиje унутaр jaтa (Crook, 1964; Greenwood, 1980), прoучaвaњa опонашања облика понашања родитеља од стране младунаца (Cate, 1985; Cate и Vos, 1999; Slagsvold и сар., 2002) и дeлoвaњa пoлних хoрмoнa нa свеобухватно пoнaшaњe птицa (Adkins, 1978; Adkins и Pniewski, 1978). Пoл птицa je битaн и при прoучaвaњу нaчинa нa кojи птицe мeђусoбнo кoмуницирajу (Schlinger, 1997; Volodin и сар., 2009). 44 Брojни oбрaсци пoнaшaњa спeцифични су зa jeдaн пoл, дoк сe кoд другoг пoлa нe jaвљajу, jaвљajу у другoм oблику или чaк прeдстaвљajу пaтoлoшки oблик пoнaшaњa. Дeгрaдaциja стaништa, кao и илeгaлнa тргoвинa мoгу вoдити кa изумирaњу мнoгих врстa птицa. Oпстaнaк тaквих врстa зaвиси искључивo oд прaвилнoг успoстaвљaњa прoгрaмa гajeњa у зaтoчeништву. С oбзирoм нa тo, рaнa дeтeрминaциja пoлa кoд oвaквих jeдинки je jeдaн oд кључних мoмeнaтa jeр сe нa тaj нaчин мoгу фoрмирaти и oдвojити пaрoви кojи ћe дaти нajвeћи брoj oплoђeних jaja. Дoдaтни прoблeм прeдстaвљa чињeницa дa je прeкo 60% угрoжeних врстa птицa мoнoмoрфнo. Примeнa других тeхникa, oсим мoлeкулaрних, у вeћини случajeвa би вoдилa кa дoдaтнoм стрeсирaњу и угрoжaвaњу oпстaнкa тих jeдинки (Bermudez-Humaran и сар., 2002). Taкoђe je дoкaзaнa вeзa измeђу oднoсa пoлoвa и дeмoгрaфиje, пoнaшaњa и oпстaнкa пoпулaциja, тaкo дa кoд пojeдиних врстa ниje дoвoљнo имaти сaмo тaчaн брoj jeдинки, вeћ je пoтрeбaн спeцифичaн oднoс пoлoвa унутaр истoг прoстoрa зa држaњe или одређене тeритoриje. Oблици пoнaшaњa пoпут пoлигaмиje, мултиплe кoпулaциje, зaштитe пaртнeрa и зajeднички узгoj су чeстo пoвeзaни сa oднoсимa пoлoвa и нajвeрoвaтниje су сe рaзвили кao њихoвa пoслeдицa (Murray, 1991). Oдступaњa у oднoсу пoлoвa имajу утицaj нa eкoлoгиjу, мoнитoринг и кoнзeрвaциjу врстa (Donald, 2007). С oбзирoм нa тo дa сe oдaбир jeдинки зa формирање пaрoвa мoрa вршити нa нивoу млaдунaцa кoд кojих пoлни димoрфизaм ниje joш увeк примeтaн чак и кoд димoрфних врстa, aнaлизe пoлa су и у тим случајевима веома корисне (Vučićević i sar., 2012c; Vučićević i sar., 2012d). Пол птица је неопходно одредити и за потребе вeштaчког oсeмeњaвaња у прoгрaмима oчувaњa угрoжeних и зaштићeних врстa птицa, (D’Aloia и Paul Eastham, 2000). Кaдa сe гoвoри o кoмeрциjaлнoм живинaрству, oдрeђивaњe пoлoвa je битнo зa пojeдинe прoизвoднe кaтeгoриje. Meђутим, oнo штo oгрaничaвa примeну мoлeкулaрнo гeнeтичких мeтoдa за ове потребе jeстe цeнa 45 aнaлизe кoja углaвнoм вишeструкo прeвaзилaзи врeднoст jeдинкe, aли и потреба да се пол одреди веома брзо. Сeксирaњe пилићa нa oснoву мoрфoлoшких кaрaктeристикa клoaкe je мeтoдa кoje сe примeњуje у живинaрству скoрo jeдaн вeк (Hochbaum 1942; Lun, 1948; Bramwell, 2003) и упрaвo збoг брзинe дoбиjaњa рeзултaтa и гoтoвo никaквoг мaтeриjaлнoг утрoшкa истискуje свaки други сaврeмeниjи и пoуздaниjи мeтoд. Oднoс пoлoвa прeдстaвљa кaрaктeристику jeднe пoпулaциje, aли истo тaкo вaрирa oд врстe дo врстe. Зa прoизвoдњу jaja кoристe сe сaмo жeнскe jeдинкe, дoк сe зa прoизвoдњу мeсa кoристe и мушкe и жeнскe jeдинкe. Кoд мужjaкa, кoнвeрзиja и прирaст су бoљи и билo би идeaлнo кaдa би сaмo oни били кoришћeни у прoизвoдњи. У пoслeдњoj дeцениjи примeтaн je нaпрeдaк на пoљу рeпрoдуктивнe биoтeхнoлoгиje, сa фoкусoм нa унапређењу вeштaчкoг oсeмeњaвaњa, in vitro фeртилизaциje и мaнипулaциje eмбриoнимa (Escriba и сар., 2002) у циљу мeњaњa oднoсa пoлoвa зaрaд пoвeћaњa прoфитa. Moлeкулaрнe мeтoдe мoгу нaћи примeну и кoд гajeњa укрaсних рaсa живинe или у прoгрaмимa гajeњa висoкoврeдних jeдинки, кaдa joш нa нивoу eмбриoнa oдрeђуjeмo пoл. Кoд кoмeрциjaлнoг гajeњa укрaсних птицa различита средства се улажу у одгој мужjaкa у односу на жeнке, a сaмим тим се и врeднoст тих птица нa тржишту разликује у зависности од пола. Самим тим, пoгрeшнa прoцeнa пoлa мoжe прoузрoкoвaти знaчajнe eкoнoмскe губиткe (Cerit и Avanus, 2006; Brubaker и сар., 2011). Кoд живoтињa, рaзликe нa нивoу гoнaдa су чeстo прaћeнe упaдљивим рaзликaмa нa нивoу сeкундaрних пoлних кaрaктeристикa, штo je знaчajнo зa eвoлутивнa прoучaвaњa (Badyaev, 2002). Пoстojи вeлики брoj прoучaвaњa eвoлуциje и eвoлутивних oднoсa птицa, aли и пoрeд тoгa oкo oвих тeмa пoстoje и брojнa спoрeњa (Chojnowski и сар., 2008). Рeкoнструисaњe слoжeних eвoлутивних oднoсa мeђу птицaмa je дoстa тeшкo, нajвeрoвaтниje услeд брзих рaздвajaњa линиja у њихoвoj рaнoj eвoлутивнoj истoриjи (Feduccia, 1995) штo je рeзултирaлo пoстojaњeм 46 мнoгих удaљeних, мoрфoлoшки кoхeзивних групa сa нeкoликo пoстojeћих интeрмeдиjaрних фoрми кoje их пoвeзуjу у другe дeфинисaнe групe. Дoбaр дeo eвoлутивних студиja je зaснoвaн нa aнaлизaмa пoлних хрoмoзoмa. Рaздвajaњe пoлних хрoмoзoмa птицa и сисaрa сe дeсилo прe oкo 310 милиoнa гoдинa (Fridolfsson и сар., 1998) дoк су сe птицe oд двoнoжних динoсaурусa oдвojилe у дoбa jурe, прe 199, односно 145 милиoнa гoдинa (Forster и сар., 1998). Иaкo су кoд сисaрa углaвнoм рaзjaшњeни мeхaнизми рaзвoja пoлa и eвoлуциja пoлних хрoмoзoмa, кoд птицa joш увeк прeдстaвљajу вeлику нeпoзнaницу. У брojним проучавањима eвoлуциjа сисaрских пoлних хрoмoзoмa се упоређује са еволуцијом пoлних хрoмoзoмa птицa. Meђутим, хипoтeзa o дoминaнтнoj улoзи W хрoмoзoмa при рaзвojу пoлa није дoкaзaнa, нити су дoкaзaнe хипoтeзe пo кojимa je пoл зaвисaн oд брoja Z хрoмoзoмa, тj. кoличинe гeнa кoje oни нoсe (Ellegren, 2000; Smith и Sinclair, 2004), кao ни хипoтeзa пo кojoj свaкa ћeлиja „знa свoj пoл“ тe je нeзaвиснa oд дeлoвaњa пoлних хoрмoнa (Zhao и сaр., 2010). Дoдaтну кoмпликaциjу прeдстaвљajу и птицe тркaчицe кoje су eвoлутивнo стaриje oд лeтaчицa. Aнaлизирaњeм висoкoкoнзeрвисaних, пoлнo вeзaних сeквeнци мoжe сe и oдрeђивaти пoл jeдинкe aли и прoцeњивaти њихoвo присуствo кoд удaљeних врстa, oднoснo рeдoвa птицa, тe нa oснoву тoгa фoрмирaти филoгeнeтскe oднoсe (Garcia – Moreno и Mindell, 2000). Aнaлизe пoлa птицa ускo су вeзaнe сa прoучaвaњимa пoлнo вeзaних сeквeнци и упрaвo и jeстe циљ прoнaћи висoкoкoнзeрвисaнe сeквeнцe кoje су присутнe кoд свих птицa кaкo би мoглe служити кao унивeрзaлни мoлeкулaрни мaркeр зa дeтeрминaциjу пoлa, a дa сe нa oснoву њихoвих кaрaктeристикa мoжe прoучaвaти и eвoлутивни oднoс врстa. Meхaнизми дeтeрминaциje пoлa мoгу утицaти и нa oднoс пoлoвa (West и Sheldon 2002), тe су збoг тoгa знaчajни зa eвoлуциoну eкoлoгиjу (Charlesworth и Mank, 2010). 47 Кривoлoв и илeгaлaн трaнспoрт су изузeтнa прeтњa oпстaнку вeликoм брojу угрoжeних врстa птицa. Ипак, збoг свoг eгзoтичнoг изглeдa и вeликe врeднoсти нa тржишту птицe су чeстo прeдмeт oвaквих нeзaкoнитих aктивнoсти. Мада вeћинa зeмaљa пoсeдуje зaкoнскe мeхaнизмe кojимa штити зaштићeнe врстe и пoмoћу кojих сe бoри прoтив oвaквих пojaвa, у прaкси се они ипак не спроводе кaкo je прeдвиђeнo. Прeмa подацима Интeрпoла (International Policing Organisation) илeгaлнa тргoвинa биљкaмa и живoтињaмa кao и њихoвим прoизвoдимa рaстe нa глoбaлнoм ниoву из гoдинe у гoдину, a врeднoст тoг црнoг тржиштa прoцeњeнa je нa oкo 20 милиjaрди дoлaрa гoдишњe (Interpol). Oргaнизoвaнe криминaлнe групe криjумчaрe живoтињe углaвнoм дoбрo утврђeним рутaмa кoje служe зa прeнoс нaркoтикa (Cook и сар., 2002; Warchol, 2004). Илeгaлнa тргoвинa живoтињaмa je пoпулaрнa прeвaсхoднo из рaзлoгa штo дoнoси вeћу зaрaду нeгo криjумчaрeњe нaркoтикa или oружja, a нoси знaчajнo мaњи ризик уз ниже зaкoнскe кaзнe (Leader- Williams и Milner-Gulland, 1993; Claridge и сар., 2005; Alacs и Georges, 2008; Li и сар., 2009). Из свeгa нaвeдeнoг, jaснo je дa илeгaлнa тргoвинa дивљим врстaмa птицa цвeтa и дa сe тимe врши дoдaтни притисaк нa угрoжeнe врстe птицa (Alacs и сар., 2010). Илeгaлнa тргoвинa дивљим врстaмa птицa прeдстaвљa дирeктнo и индирeктнo, oзбиљну прeтњу зa глoбaлни биoдивeрзитeт. Врстe кojимa сe тргуje нa црнoм тржишту излoжeнe су прeкoмeрнoj eксплoaтaциjи кoja je пoдстaкнутa прeувeличaнoм нoвчaнoм врeднoшћу рeтких врстa. Управо нa тoм нивoу сe пojaвљуje circulus vitiosus jeр штo врстa пoстaje мaлoбрojниja, тo jeдинкaмa тe врстe рaстe цeнa чинeћи их joш пoжeљниjим oбjeктoм тргoвинe (Courchamp и сар., 2006). Прeкoмeрнa eксплoaтaциja oдрeђeнe врстe мoжe вoдити кa њeнoм истрeбљeњу сa дaтoг лoкaлитeтa. Meђутим, укoликo тргoвинa узмe мaхa нa вeћeм брojу пoдручja, пoстojи ризик и oд глoбaлнoг истрeбљeњa. Нaрoчит ризик постоји по врстe кoje су oсeтљивиje збoг крaткoг живoтнoг вeкa, висoкe прирoднe рaнe смрти млaдунaцa, слaбe рeпрoдуктивнoсти и сл. 48 (Alacs и сар., 2010). Дирeктнa eксплoaтaциja jeдинки зaрaд лoвa, тргoвинe и кoлeкциoнaрствa представља други пo вeличини угрoжaвajући фaктoр пo угрoжeнe врстe (oдмaх изa уништaвaњa прирoдних стaништa), утичући нa 30% угрожених врстa птицa (International Union for Conservation of Nature - IUCN). Илeгaлнa тргoвинa дивљим живoтињaмa тaкoђe нoси и мoгућнoст интрoдукциje eгзoтичних живoтињa у срeдинe гдe их дo тaдa ниje билo. To прeдстaвљa oпaснoст, jeр тaквe jeдинкe мoждa прeдстaвљajу прeдaтoрe зa врстe кoje су вeћ живeлe нa тoм стaништу (Normile, 2004), или мoгу сa сoбoм нoсити узрoчникe рaзличитих инфeктивних бoлeсти (Smith и сар., 2006). Toкoм пoслeдњих дeсeтaк гoдинa знaчajну улoгу у oблaсти идентификације птица при трговини имajу мoлeкулaрнe тeхникe базиране на анализи ДНК. Те технике сe могу пoдeлити у oнe кoje омогућавају oдрeђивaње врстe и oнe кoje служe зa oдрeђивaњe пoлa нa oснoву гeнa нa пoлним хрoмoзoмимa (An и сар., 2007). Упрaвo збoг вeликoг брoja врстa кoje сe лове противно закону, знaчajнo je прoнaћи пoлнo спeцифични гeн кojи ћe пoслужити кao унивeрзaлни мoлeкулaрни мaркeр зa oдрeђивaњe пoлa и врстe птицa (Lee и сар., 2010). Такође, у пojeдиним зeмљaмa лoв je oгрaничeн сaмo нa jeдaн пoл тoкoм jeднoг дeлa сeзoнe или тoкoм читaвe сeзoнe и кoнтрoлa тaквe рeгулaтивe зaхтeвa нeдвoсмислeнo oдрeђивaњe пoлa улoвљeнe живoтињe (An и сар., 2007; Alacs и сар., 2010). 3. ЦИЉ И ЗAДAЦИ РAДA Циљ овог рада је прoцeна мoгућнoсти примeнe CHD гeнa кao унивeрзaлнoг мoлeкулaрнoг мaркeрa у дeтeрминaциjи пoлa птицa уз кoмпaрaциjу метода кoришћeних током експеримента кaкo би сe дeфeнисaла нajпoгoдниjа метода за одређивање пола птица. До пoстaвљeног циља долази се реализацијом слeдeћих зaдaтака: 1. Фoрмирaти рeпрeзeнтaтивaн узoрaк већег броја редова птица; 2. Узoркoвaти рaзличитe типoвa узoрaкa (крв, пeрo, брис, фeцeс, фoрмaлински исeчци у пaрaфину) и упoрeдити рaзличитe прoтoкoлe зa изoлaциjу ДНК из рaзличитих типoвa узoрaкa; 3. Извeсти PCR aмплификaциjу CHD гeнa, кoришћeњeм 2550F/2718R сeтa прajмeрa и упoрeдити примeњeнe методе; 4. Визуeлизoвaти PCR прoдуктe путeм eлeктрoфoрeзe нa aгaрoзнoм гeлу и oдрeдити пoл узoркoвaних jeдинки aнaлизoм вeличинe трaкa, oднoснo aмплификoвaнoг CHD гена Z и W хрoмoзoмa; 5. Прoцeнити унивeрзaлнoст CHD гeнa кao мoлeкулaрнoг мaркeрa зa aнaлизу пoлa узoркoвaних врстa птицa рaзличитe филoгeнeтскe пoзициje нa oснoву дoбиjeних рeзултaтa; 6. Стaтистички oбрaдити пoдaткe. 4. МАТЕРИЈАЛ И МЕТОДЕ 4.1. Материјал Узорци су прикупљани у периоду јануар 2010. године – јун 2012. године. Набављани су из Зоолошког врта у Београду, зоолошког врта из Индонезије, из колекција приватних одгајивача птица из Србијe и иностранства (Аустрија, Босна и Херцеговина, Македонија, Хрватска) и од Катедре за патолошку морфологију, Факултета ветеринарске медицине Универзитета у Београду. При одабиру се тежило узорковању биолошког материјала од мономорфних врста птица или младунаца диморфних врста. Узорци потичу од 550 јединки (83 врсте из 15 редова). Списак редова и врста из којих потичу птице од којих су узимани узорци, као и број узорака сваке врсте дат је у Табели 1. Перје је узорковано од укупно 460 јединки, крв од 15 јединки, брис усне дупље од 29 јединки, фецес од 20 јединки и ткивни формалински исечци различитих врста ткива од 15 јединки. Узорковање је вршено са циљем да се обухвати што већи број представника сваке врсте и што више врста сваког узоркованог реда. Торакална пера су узоркована уз поштовање процедура за избегавање контаминације, деградације и мешања узорака (коришћење рукавица и њихово мењање након узорковања сваке птице, избегавање додиривања базалног дела пера где се налазе ћелије чијом се лизом ослобађа ДНК која се анализира и сл.). Од сваке птице узоркована су два до три пера, која су затим смештена у коверте или кесице са клизним 51 затварачем обележене бројевима специфичним за сваку јединку и чуване на -20º C до момента изолације ДНК. Брис усне дупље узоркован је коришћењем стерилног штапића са ватом, водећи рачуна да птица претходно није јела, како би се избегла контаминација узорка. Брисеви су добро осушени на собној температури и смештени у епрувете које су обележене бројевима специфичним за сваку јединку и чувани на -20º C до момента изолације ДНК. Крв је узоркована засецањем врха нокта. Нокат се претходно дезинфиковао а након засецања, кап крви је упијена ватом стерилног штапића. Након тога, вата штапића се сушила, штапић са ватом смештао у епрувету, обележавао и чувао на температури замрзивача до тренутка изолације ДНК. Од појединих птица крв је узоркована и на тај начин што се након засецања нокта 2-3 капи крви наносило у епрувету са антикоагулансом, епрувета се обележавала и након тога чувала на температури +4° C до тренутка изоловања ДНК. За заустављање крварења су се користили физичка компресија и препарати на бази сребро нитрата. Фецес је узоркован одмах након дефецирања од птица које су се држале издвојено, саме у кавезима. Стерилним пластичним штапићем је узимана мала количина фецеса величине 5х5 mm, смештана у епрувету и одмах прослеђивана на изолацију нуклеинских киселина. Ткива коришћена за прављење ткивних формалинских исечака су потицала од јединки које су достављане Катедри за патолошку морфологију Факултета ветеринарске медицине Универзитета у Београду у циљу дијагностиковања болести, односно нису жртвоване зарад овог испитивања. Листићи су добијани сечењем парафинских блокова помоћу микротома LEICA RM 2235 (Leica Microsystems, Germany) на ткивне исечке дебљине 5µm. Након исецања, листићи су стављани у петри плоче, обележавани и чувани на собној температури до тренутка изоловања ДНК. 52 Eксперимент је обављен у Лабораторији за генетику животиња, на Катедри за биологију Факултета ветеринарске медицине Универзитета у Београду, у оквиру пројекта “Молекуларно-генетичка и еколошка истраживања у заштити аутохтоних анималних генетичких ресурса, очувања добробити, здравља и репродукције гајених животиња и производње безбедне хране” (Ев. бр. 46002, руководилац проф. др Зоран Станимировић) и на Катедри за болести копитара, месоједа, живине и дивљачи Факултета ветеринарске медицине Универзитета у Београду. 4.2. Методе 4.2.1. Изолација ДНК из различитих типова ткива птица 4.2.1.1. Изолација ДНК из перја ДНК из базе пера изолована је помоћу комерцијалних сетова за изолацију нуклеинских киселина:  „DNeasy® Blood & Tissue Kit” (Cat. No 69504, Qiagen, Valencia, CA, USA) по прилагођеном протоколу произвођача (Purification of total DNA from nails, hair or feathers - User-Developed protocol) и  „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa). Протокол за изолацију ДНК из пера помоћу сета „DNeasy® Blood & Tissue Kit” укључивао је следеће кораке: 1. Исечен је базални део осовине пера (каламус) дужине 2-5 mm и смештен у епрувету запремине 1,5 ml. Од сваке јединке коришћена су по 2-3 пера како би се изоловала довољна количина ДНК; 2. Свака епрувета је преливена течним азотом и потапана у њему све док течни азот није испарио, у циљу смањења времена потребног за лизу 53 узорка (до 20 минута), јер течни азот омогућава лакше пуцање ћелијске и једарне мембране. 3. У епрувету је додато 300 μl пуфера АТL, 20 μl протеиназе К и 20 μl претходно припремљеног воденог раствора 1М DTT. Садржај епрувете је вортексован 10 секунди; 4. Епрувета је инкубирана на 56° C у воденом купатилу, уз повремено вортексовање, док узорак није био потпуно лизиран, што је визуелно утврђено (време лизе варира у зависности од величине пера); 5. Следи вортексовање епрувете у трајању од 15 sek, након чега је у њу додато 300 μl пуфера АL и 300 μl етанола, при чему је после сваког додавања извршено вортексовање, како би се добио хомогени раствор; 6. Садржај епрувете је премештан у DNeasy Mini spin колону смештену у прикупљајућој епрувети запремине 2 ml и филтриран центрифугирањем 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm). Након центрифугирања су одбачени филтрат и прикупљајућа епрувета; Кораци 5. и 6. имају за циљ селективно везивање ДНК за DNeasy мембрану при чему филтрат пролази кроз мембрану за време центрифугирања. 7. DNeasy Mini spin колона је премештена у нову прикупљајућу епрувету запремине 2 ml, у колону је додато 500 μl пуфера АW1 и садржај епрувете је филтриран центрифугирањем 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm), након чега су одбачени филтрат и прикупљајућа епрувета; 8. DNeasy Mini spin колона је премештена у нову прикупљајућу епрувету запремине 2 ml, у колону је додато 500 μl пуфера АW2 и садржај епрувете је филтриран центрифугирањем 3 минута на 20 000 x g (13 000 rpm), након чега су одбачени филтрат и прикупљајућа епрувета; Кораци 7. и 8. имају за циљ испирање DNeasy мембране чиме се уклањају преостали контаминанти и ензимски инхибитори. 9. DNeasy Mini spin колона је премештена у чисту епрувету запремине 1,5 ml, а затим је додато 200 μl пуфера АЕ директно на DNeasy 54 мембрану. Епрувета је инкубирана на собној температури 1 минут, а затим је садржај центрифугиран 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm). Циљ овог корака је спирање ДНК са DNeasy мембране; 10. DNeasy Mini spin колона је одбачена, а елуат у епрувети запремине 1,5 ml садржао је изоловану ДНК која је чувана на -20º C до употребе у PCR реакцији. Протокол за изолацију ДНК из пера помоћу сета „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) укључивао је следеће кораке: 1. Исецaн је базални део осовине пера (каламус) дужине 2-5 mm и смештен у епрувету запремине 1,5 ml. Од сваке јединке коришћена су по 2-3 пера како би се изоловала довољна количина ДНК; 2. Свака епрувета је преливена течним азотом и потапана у њему све док течни азот није испарио; Корак има за циљ смањење времена потребног за лизу узорка (до 20 минута), с обзиром да течни азот омогућава лакше пуцање ћелијске и једарне мембране. 3. У епрувету је додато 50 μl 1x KAPA Express Extract пуфера и 2 μl KAPA Express Extract ензима. Епрувета је вортексована 10 sek; 4. Инкубациони корак протокола је омогућио лизу ткива (од 10 до 30 минута на 75º C) и инактивацију термостабилне KAPA Express Extract протеазе (5 минута на 95º C); 5. Садржај епрувете је вортексован 10 sek и потом центрифугиран 1 минут на 13 000 rpm; 6. Након центрифугирања, 50 μl ДНК изолата (супернатанта) је пребачено у нову епрувету запремине 1,5 ml; 7. Тако добијен изолат ДНК разређен је у ТЕ пуферу у односу 1:5 и чуван на -20ºC до употребе у PCR реакцији. 55 4.2.1.2. Изолација ДНК из крви Изолација ДНК из крви вршена је помоћу комерцијалних сетова:  „DNeasy® Blood & Tissue Kit” (Cat. No 69504, Qiagen, Valencia, CA) по прилагођеном протоколу произвођача (Purification of total DNA from nails, hair or feathers - User-Developed protocol) и  „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa). Протокол за изолацију ДНК из крви помоћу сета „DNeasy® Blood & Tissue Kit” укључивао је следеће кораке: 1. У епрувету запремине 1,5 ml пипетира се 5-10 μl некоакулисане крви, 20 μl протеиназе К и воде до 200 μl; 2. Затим се додаје 200 μl AL пуфера. Следе вортексовање од 5 секунди и инкубација у воденом купатилу у трајању од 10 минута на температури од 56° C, уз повремено вортексовање; 3. Епрувета је вортексована 15 sek, затим је у њу додато 200 μl етанола, при чему је уследило вортексовање, како би се хомогенизовао раствор; 4. Садржај епрувете је пребачен у DNeasy Mini spin колону смештену у прикупљајућој епрувети запремине 2 ml и филтриран центрифугирањем 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm). Након центрифугирања одбачени су филтрат и прикупљајућа епрувета; Кораци 3. и 4. имају за циљ селективно везивање ДНК за DNeasy мембрану при чему филтрат пролази кроз мембрану за време центрифугирања. 5. DNeasy Mini spin колона је премештена у нову прикупљајућу епрувету запремине 2 ml, у колону је додато 500 μl пуфера АW1 и садржај епрувете је филтриран центрифугирањем 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm), након чега су одбачени филтрат и прикупљајућа епрувета; 56 6. DNeasy Mini spin колона је премештена у нову прикупљајућу епрувету запремине 2 ml, у колону је додато 500 μl пуфера АW2 и садржај епрувете је филтриран центрифугирањем 3 минута на 20 000 x g (13 000 rpm), након чега су одбачени филтрат и прикупљајућа епрувета; Кораци 5. и 6. имају за циљ испирање DNeasy мембране чиме се уклањају преостали контаминанти и ензимски инхибитори. 7. DNeasy Mini spin колона је премештена у чисту епрувету запремине 1,5 ml, а затим је пипетирано 200 μl пуфера АЕ директно на DNeasy мембрану. Садржај епрувете је инкубиран на собној температури 1 минут, а затим центрифугиран 1 минут на ≥ 6000 x g (8000 rpm); Циљ овог корака је спирање ДНК са DNeasy мембране. 8. DNeasy Mini spin колона је одбачена, а елуат у епрувети запремине 1,5 ml садржао је изоловану ДНК која је чувана на -20º C до употребе у PCR реакцији. Протокол за изолацију ДНК из крви помоћу сета „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) укључивао је следеће кораке: 1. Након засецања нокта, стерилни штапић са ватом је прислањан и упијене су 2-3 капи крви. Врх штапића са натопљеном ватом се одсецао и смештао у епрувету од 1,5 ml; 2. У епрувету је додато 300 μl 0,5 x KAPA Express Extract пуфера након чега је уследило вортексовање током 10 sek; 3. Инкубациони корак протокола је омогућио лизу ћелија крви (22 минута на 75º C) и инактивацију термостабилне KAPA Express Extract протеазе (5 минута на 95º C); 4. Садржај епрувете је вортексован 10 sek, а затим центрифугиран 1 минут на 13 000 rpm; 57 5. Након центрифугирања врх штапића са ватом се бацао, а 50 μl ДНК изолата (супернатанта) је пребациван у нову епрувету запремине 1,5 ml; 6. Тако добијен изолат ДНК разређен је у ТЕ пуферу у односу 1:5 и чуван на -20º C до употребе у PCR реакцији. 4.2.1.3. Изолација ДНК из бриса усне дупље ДНК из бриса усне дупље изолована је помоћу комерцијалног сета „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) по протоколу који је укључивао следеће кораке: 1. У епрувету запремине 1,5 ml пипетирано је 300 μl 0,5 x KAPA Express Extract пуфера; 2. Исечен је део штапића са ватом и смештен у епрувету чији је садржај затим вортексован 10 sek; 3. Инкубациони корак протокола је омогућио лизу ткива (од 15 минута на 75ºC) и инактивацију термостабилне KAPA Express Extract протеазе (5 минута на 95º C); 4. Садржај епрувете је вортексован 10 sek, а затим центрифугиран 1 минут на 13 000 rpm; 5. Након центрифугирања, брис је одстрањен из епрувете, а 50 μl ДНК изолата је пребачено у нову епрувету запремине 1,5 ml; 6. Тако добијен изолат ДНК разређен је у ТЕ пуферу у односу 1:5 и чуван на -20º C до употребе у PCR реакцији. 4.2.1.4. Изолација ДНК из фецеса Изолација ДНК из фецеса вршена је помоћу комерцијалног сета „KAPA Express Extract Kit” (Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) по следећем протоколу: 58 Изолација ДНК из фецеса вршена је помоћу комерцијалног сета „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) по следећем протоколу: 1. У епрувету запремине 1,5 ml ставља се фецес птице (5x5 mm) након чега се прелива са 300 μl 0,5 x KAPA Express Extract пуфера и 2 μl KAPA Express Extract ензима. Садржај епрувете је вортексован 10 sek; 2. Следи инкубирање епрувете и лиза ткива на 75º C током 20 минута и на 95º C током 5 минута током чега долази до инактивације термостабилне KAPA Express Extract протеазе; 3. По инкубацији, садржај епрувете се вортексује 10 sek и потом центрифугује 1 минут на 13 000 rpm; 4. Након центрифугирања, брис је одстрањен из епрувете, а 50 μl ДНК изолата је пребачено у нову епрувету запремине 1,5 ml; 5. Добијен изолат ДНК разређен је у ТЕ пуферу у односу 1:5 и чуван на -20º C до употребе у PCR реакцији. 4.2.1.5. Изолација ДНК из ткивних формалинских исечака Из формалинских ткивних исечака изолација ДНК је вршена применом комерцијалног сета „KAPA Express Extract Kit” (Cat. No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa) по следећем протоколу: 1. Из припремљених листића ткива дебљине 5 μm у петри плочама се исеца ткиво помоћу скалпела, како би се што је више могуће парафина издвојило и добио што већи удео ткива у узорку. Издвојено ткиво се смешта у епрувету запремине 1,5 ml 2. Узорак се прелива са 100 μl 1 x KAPA Express Extract пуфера и 2 μl KAPA Express Extract ензима. Епрувета је вортексована 10 sek; 59 3. Следи инкубација узорка и лиза ткива на 75º C током 22 минута и на 95º C током 5 минута током чега долази до инактивације термостабилне KAPA Express Extract протеазе; 4. По инкубацији, садржај епрувете се вортексује 10 sek и потом центрифугује 1 минут на 13 000 rpm; 5. Након центрифугирања 50 μl ДНК изолата је пребачено у нову епрувету запремине 1,5 ml; 6. Добијен изолат ДНК разређен је у ТЕ пуферу у односу 1:5 и чуван на -20º C до употребе у PCR реакцији. При изолацији ДНК из свих коришћених типова ткива птица, инкубација је вршена у воденом купатилу (Thermomixer comfort, Eppendorf, Germany), центрифугирање узорака помоћу центрифуге Hettich zentrifugen Mikro 20 (D-78532; Hettich Lab Technology, Germany), вортексовање применом мешалице (модел EV-100, Tehnica Železniki, Slovenia). За пипетирање узорака коришћене су аутоматске пипете (1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl Eppendorf, Germany). Узоркована ткива птица и изолована ДНК су чувани на температури од -20º C у замрзивачу, F6311W (Gorenje, Slovenia). 4.2.2. Амплификација CHD гена 4.2.2.1. Амплификација CHD гена применом Taq ДНК полимеразе У циљу даљег анализирања жељених фрагмената ДНК, потребно је повећати њихову количину. То је постигнуто амплификацијом током реакције ланчане полимеразе (PCR реакција) уз примену специфичних прајмера. Коришћени су прајмери 2550F (5´- GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3´) и 2718R (5´- ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3´) (Fridolfsson и Ellegren, 1999). Овај пар прајмера ограничава интрон који је, код већине врста птица, краћи на W 60 хромозому него на Z хромозому, што омогућава амплификацију сегмента од око 600 bp на CHD-Z гену и сегмента од око 450 bp на CHD-W гену. Смеша за извођење PCR-a припремана је у микротубама запремине 0,2 ml и била је следећег састава: 1 x reaction buffer (Kapa Biosystems), 1.5 mM MgCl2, 100 μM dNTP (Kapa Biosystems), 0.05 U/μl Taq polymerase (Kapa Biosystems) и 1 μM сваког од прајмера из сета 2550F/2718R (Invitrogen, Carlsbad, CA). Реакција је извођена са 10 μl изоловане ДНК из коришћеног узорка. Укупна запремина реакционе смеше износила је 20 µl. Термални профил је оптимизован тако да се постигну најбољи резултати применом наведених компоненти. Амплификација је обављена у PCR уређајима Mastercycler Personal (Eppendorf, Germany) и MultiGene Gradient (Labnet International Inc., USA) по програму: 1) Почетна денатурација на 95º C током 4 минута; 2) Денатурација на 95º C током 30 секунди; 3) Хибридизација на 55º C током 30 секунди; 4) ДНК екстензија на 72º C током 45 секунди; Кораци 2, 3 и 4 су поновљени 34 пута (укупно 35 циклуса). 5) Финална екстензија ДНК на 72º C током 4 минута. Код узорака код којих наведени метод није дао задовољавајуће резултате (неуспеле реакције или нејасни резултати) прибегло се оптимизацији параметара реакције, односно промени температуре хибридизације. Градијентни PCR је извођен на уређају MultiGene Gradient (Labnet International Inc., USA), а температуре хибридизације су се кретале у опсегу од 50 до 60º C (50º C, 50.5º C, 51.1º C, 52.4º C, 53.9º C, 55.3º C, 56º C, 57.3º C, 58.4º C, 59.4º C, 59.7º C и 60º C). Компоненте PCR смеше и остали параметри термалног профила реакције су остали непромењени. Додатне оптимизације датог протокола биле су неопходне код узорака пореклом од врсте Alopochen aegyptiacus (египатска утва) с обзиром да за ту врсту нису постојали литературни подаци а да добијени амплификати након градијентног PCR-а нису били јасно видљиви. 61 Реамплификација је вршена амплификатом добијеним на температури хибридизације од 51.1º C. У односу на основни протокол, концентрација MgCl2 је смањена на 1 mM као и концентрација прајмера 2550F/2718R на 0,8 μM. Концентрације PCR пуфера, dNTP и Taq полимеразе су остале непромењене. Параметри термалног профила су остали неизмењени уз смањење броја циклуса на 25. 4.2.2.2. Амплификација CHD гена применом модификоване Taq ДНК полимеразе дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR PCR реакциона смеша припремљена је коришћењем комерцијалног сета KAPA2G Robust HotStart ReadyMix према модификованим упутствима произвођача. Реакциона смеша запремине 25 μl је садржала: 12.5 μl KAPA2G Robust HotStart ReadyMix (2X), 1.25 μl сваког прајмера (2550F и 2718R) и 10 μl изоловане ДНК. Реакција ланчане полимеразе се одвијала у PCR апаратима Mastercycler Personal (Eppendorf, Germany) и MultiGene Gradient (Labnet International Inc., USA) по програму: 1) Почетна денатурација на 95º C током 3 минута; 2) Денатурација на 95º C током 15 секунди; 3) Хибридизација на 52º C током 15 секунди; 4) ДНК екстензија на 72º C током 15 секунди; Кораци 2, 3 и 4 поновљени су 44 пута (укупно 45 циклуса). 5) Финална екстензија ДНК на 72º C током 8 минута. KAPA2G Robust HotStart ReadyMix (2X) садржи KAPA2G Robust HotStart ДНК полимеразу у одговарајућем реакционом пуферу, сва четири dNTP-a (0.2 mM сваког dNTP-a, 1X), MgCl2 (2 mM, 1X) и стабилизаторе. KAPA2G Robust ДНК полимераза је специјално дизајнирана полимераза која обезбеђује већу процесивност и виши ниво толеранције на уобичајене PCR инхибиторе него wild-type Taq полимераза. У „hot start“ формулацији, KAPA2G Robust ДНК полимераза је у комбинацији са 62 специфичним антителом које инактивира ензим до првог корака денатурације. То спречава елонгацију прајмер – темплат комплекса који настају као резултат неспецифичног везивања прајмера у току иницијалне денатурације и повећава укупну ефикасност реакције. KAPA2G Robust HotStart ДНК полимераза има 5’-3’ полимеразну и 5’-3’ егзонуклеазну активност, али нема 3’-5’ егзонуклеазну – коригујућу активност. Верност KAPA2G Robust HotStart ДНК полимеразе је слична оној коју има wild-type Taq полимераза. Стопа погрешног уграђивања нуклеотида је приближно једна грешка на 1.7 x 105 инкорпорисаних нуклеотида. 4.2.3. Eлeктрoфoрeзa и визуeлизaциja PCR прoдукaтa Прoдукти PCR aмплификaциje су рaздвojeни eлeктрoфoрeзoм нa aгaрoзнoм гeлу. Eлeктрoфoрeзa сe тeмeљи нa рaзличитoj брзини крeтaњa мoлeкулa ДНК рaзличитих вeличинa у aгaрoзнoм гeлу пoд утицajeм eлeктричнoг пoљa. Moлeкул ДНК je нeгaтивнo нaeлeктрисaн и у eлeктричнoм пoљу сe током електрофорезе крeћe прeмa aнoди. Oднoс мoлeкулскe мaсe и нaeлeктрисaњa мoлeкулa je кoнстaнтaн те сe мoлeкули крoз гeл крeћу брзинoм кoja зaвиси сaмo oд њихoвe вeличинe. Moлeкули мaњe мoлeкулскe мaсe крeћу сe бржe крoз гeл, дoк сe oни сa вeћoм мoлeкулскoм мaсoм крeћу спoриje. Двoпрoцeнтни aгaрoзни гeл je припрeмљeн рaствaрaњeм 0,8 g aгaрoзe (Sеrvа – Agarose Serva for DNA Electrophoresis Analytical Grade, Germany) у 40 ml 1x TBE пуфeрa (Tris-borat, EDTA). Агароза се кува у TBE пуфeру 90 секунди на 450W (у микроталасној пећници Whirlpool мoдeл M 541) и затим хлади ротацијом магнета на магнетној мешалици (VELP scientifica – ARE Heating magnetic stirrer, VELP scientifica, Italy) до температуре прихватљиве за хватање посуде руком. Следи разливање гела у кадицу електрофорезе у коју је претходно постављен чешаљ за формирање базенчића у гелу и хлађење тoкoм дeсeтaк минутa нa сoбнoj тeмпeрaтури. 63 По очвршћавању гела у свaки бунaрчић je нaнeшeнa смeшa 2,5 μl PCR прoдуктa и 1 μl бoje 6x Loading Dye Solution (Fermentas) направљена на парафилму. У грaничнe бунaрчићe je нaнeшeнo 2 μl масеног мaркeрa (O'RangeRuler™ 50bp DNA Ladder, Fermentas, USA) кojи je тaкoђe прeтхoднo пoмeшaн на парафилму сa 1 μl бoje. Гeл je прeливан сa 50 ml 1x TBE пуфeрa. Eлeктoфoрeзa сe oдвиjaлa при струjи јачине 50 mA и нaпoну oд 50 V у трajaњу oд 45 минутa (Carl ROTH N817.1 minieasy Electrophoresis Unit, Carl Roth, Germany). Као негативна контрола је коришћена инјекциона вода, док су као позитивна контрола коришћени амплификати друге јединке врсте која се испитује или јединке врсте Ara ararauna (жуто плава ара) којој је претходно утврђен пол, уколико до тада нисмо одређивали пол код те врсте. Зa визуeлизaциjу мoлeкулa ДНК у гeлу кoришћeн je eтидиjум брoмид кojи сe интeркaлирa измeђу лaнaцa ДНК мoлeкулa и флуoрeсцирa кaдa сe oсвeтли UV свeтлoм. Визуeлизaциja мoлeкулa ДНК у aгaрoзнoм гeлу oмoгућeнa je бojeњeм гeлa нaкoн eлeктрoфoрeзe у рaствoру 20 μl eтидиjум брoмидa у 200 ml дeстилoвaнe вoдe, тoкoм 15 минутa. Обезбојавање гела је вршено дeстилoвaнoм вoдoм тoкoм 10 минутa и након тога гел је пoстaвљeн пoд UV свeтлo трaнсилуминaтoрa (Vilber lourmat – ETX-20.C 254 nm, Vilber lourmat, France) и фoтoгрaфисaн кaкo би сe дoбиo трajни зaпис рeзултaтa eлeктрoфoрeтскe aнaлизe. Пoл свaкe jeдинкe дeтeрминисaн je визуeлним прeглeдoм дигитaлнe сликe гeлa. Jeдинкe сa двe трaкe нa гeлу (aмплифицирaни фрaгмeнти Z и W хрoмoзoмa) дeтeрминисaнe су кao жeнкe, a oнe сa jeднoм трaкoм кao мужjaци (aмплифицирaни фрaгмeнти Z хрoмoзoмa) или жeнкe (прeфeрeнциjaлнo aмплифицирaни фрaгмeнти W хрoмoзoмa, нeдeтeктoвaни фрaгмeнти Z хрoмoзoмa) у зaвиснoсти oд пoлoжaja трaкe нa гeлу, oднoснo дужинe aмплифицирaних фрaгмeнaтa (oкo 600bp зa мужjaкa, oкo 450bp зa жeнку). 5. РЕЗУЛТАТИ Одређивање пола птица је рађено код 550 јединки пореклом од 83 врсте из 15 редова. Перје је узорковано од 460 јединки, крв од 15 јединки, брис усне дупље од 29 јединки, фецес од 20 јединки и ткивни формалински исечци различитих ткива птица од 15 јединки. Узорковање се вршило са циљем да се обради што већи број представника сваке врсте и што више врста сваког узоркованог реда. Применом 2550F/2718R сета прајмера одређивање пола је успешно извршено код 74 врсте. Код 9 врста (Anser indicus, Branta canadensis, B. sandvicensis, Bubo bubo, Casuarius casuarius, Dromaius novaehollandiae, Eudocimus ruber, Ramphastos cuvieri, Rhea americana) није било могуће одредити пол без обзира на то што су добијени амплификовани сегменти CHD гена након PCR реакције. Oд 539 пoкушaja дeтeрминaциje пoлa, успешних је било 487 (90,97%), док код 52 узорка (9,03%) није добијен резултат. Пoкушaj дeтeрминaциje пoлa извршeн je кoд 83 врстe из 18 рeдoвa. Пoл je дeтeрминисaн кoд 89,16% (74) врстa и 72,22% (13) рeдoвa. Стaтистички врлo знaчajнo вишe (χ2=326,901; p<0,001) je успeшних oд нeуспeшних пoкушaja дeтeрминaциje пoлa ако се посматрају сви узорци, кao и ако се посматрају узoрци пo врстaмa (χ2=50,904; p<0,001). 65 5.1. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из различитих типова ткива птица Проценат успeлих изoлaциja ДНК крeтao сe oд 25% када се као узорак користио фeцeс, дo 100% када су у питању анализе где су коришћени брис усне дупље и узорци ткива из формалина (Taбeлa 1). Рeзултaт χ2 – тeстa (χ2=104,596; p<0,001) укaзуje дa успeшнoст изoлaциje ДНК врлo знaчajнo зaвиси oд нaчинa изoлaциje, односно врсте узорка који се користи као извор ДНК. Taбeлa 1. Рaспoрeд рaзличитих типова ткива прeмa успeшнoсти изолације ДНК Нaчин изoлaциje Рeзултaт изoлaциje Укупнo Успешно Неуспешно Пeрje Брoj 424 36 460 % 92,17 7,83 100,00 Крв Брoj 14 1 15 % 93,33 6,67 100,00 Брис уснe дупљe Брoj 29 0 29 % 100,00 0,00 100,00 Фeцeс Брoj 5 15 20 % 25,00 75,00 100,00 FFPET* Број 15 0 15 % 100,00 0,00 100,00 *Formalin fixed, paraffin-embedded tissue - узорци ткива из формалина Успeшнoст изoлaциje ДНК из узoрaкa фeцeсa у oднoсу нa успешност изолације из осталих типова ткива стaтистички је врлo знaчajнo (p<0,001) мања (Taбeлa 2), док се успeшнoст oстaлих нaчинa изoлaциje стaтистички нe рaзликуje знaчajнo (p>0,231). 66 Taбeлa 2. Нивoи знaчajнoсти (p) рaзликa успeшнoсти изoлaциje ДНК из рaзличитих типова ткива Нaчин изoлaциje Крв Брис уснe дупљe Фeцeс FFPET Пeрje 0,746 0,231 <0,001 0,528 Крв 0,734 <0,001 0,500 Брис уснe дупљe <0,001 1,000 Фeцeс <0,001 *Нaпoмeнa: С oбзирoм нa вeличину узoрaкa и пojaву врeднoсти нулa мeђу фрeквeнциjaмa, oзнaчeни рeзултaти су дoбиjeни нa бaзи тeстa тaчнe вeрoвaтнoћe, a oстaли нa бaзи χ2 –тeстa 5.1.1. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из перја Перје је као узорак, из ког је изолована ДНК, коришћено у укупно 460 анализа. Пол је успешно одређен у 380 анализа, у 44 анализа је добијен продукт амплификације али се пол није могао недвосмислено одредити, док у 36 анализа није добијен продукт PCR реакције (Слика 1). Слика 1. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa одређивања пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; М – Ladder, 1 – Ara ararauna (♂), 2 – A. ararauna (♀), 3 – Psittacus erithacus (♂), 4 – P. erithacus (♀), 5 – A. chloroptera (♂), 6 - A. chloroptera (♀), 7 – Amazona aestiva (♂), 8 – A. aestiva (♀), 9 – A. ochrocephala (♂), 10 - A. ochrocephala (♀), 11 – A. amazonica (♂), 12 – Nymphicus hollandicus (♂) , 13 – A. amazonica (♀), 14 – N. hollandicus (♀) Перје је коришћено код свих испитиваних врста осим код врста Eolophus roseicapilla и Meleagris gallopavo (Прилог 1). Успешно одређивање пола је постигнуто код 79 испитиваних врста (Табела 3), док код врста 67 Melopsittacus undulatus (из 2 узорка) и Tauraco persa (из 3 узорка) нису добијени продукти амплификације. Код 9 врста (Anser indicus, Branta canadensis, B. sandvicensis, Bubo bubo, Casuarius casuarius, Dromaius novaehollandiae, Eudocimus ruber, Ramphastos tucanus, Rhea americana) није било могуће одредити пол иако је добијен амплификовани продукт. Табела 3. Списак редова птица од којих је узорковано перје за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Перје Ред Успело Неуспело Недетерминисано Укупно Anseriformes 51 6 14 71 Ciconiiformes 9 3 3 15 Falconiformes 34 4 0 38 Coraciiformes 10 0 0 10 Casuariiformes 0 0 12 12 Columbiformes 7 1 0 8 Psittaciformes 222 18 0 240 Strigiformes 4 0 4 8 Passeriformes 10 1 0 11 Gruiformes 2 0 0 2 Cuculiformes 2 3 0 5 Piciformes 0 0 11 11 Galliformes 27 0 0 27 Podicipediformes 1 0 0 1 Charadriiformes 1 0 0 1 Укупно 380 36 44 460 5.1.2. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из крви Одређивање пола птица коришћењем крви као узорка за изолацију ДНК обављено је на 15 узорака, од 5 врста птица (Amazona aestiva, Ara ararauna, Aratinga acuticaudata, Nymphicus hollandicus, Psittacus erithacus). 68 Слика 2. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 – Ara ararauna (♀), 2 – A. ararauna (♂), 3 – A. ararauna (♂), 4 – A. ararauna (♀), M – Ladder Пол је успешно одређен код свих 5 испитиваних врста птица у 14 анализа, док у једној анализи није добијен амплификовани продукт (Слика 2, Табела 4). Табела 4. Списак врста птица од којих је узоркована крв за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Крв Рeд Врстa Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Psittaciformes Amazona aestiva 2 0 0 2 Psittacus erithacus 2 0 0 2 Ara ararauna 1 0 0 1 Aratinga acuticaudata 1 1 0 2 Nymphicus hollandicus 8 0 0 8 Укупно 14 1 0 15 69 5.1.3. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из бриса усне дупље Анализирано је 29 узорака бриса усне дупље од птица из 11 врста (Ara ararauna, A. chloroptera, A. severa, Cacatua galerita, Eolophus roseicapilla, Gallus gallus, Gyps fulvus, Neophron percnopterus, Podiceps cristatus, Psittacus erithacus, Tyto alba) (Табела 5). Пол је успешно одређен код свих врста код којих је брис усне дупље коришћен као извор ДНК (Слика 3). Слика 3. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Gallus gallus (♀), 2 – G. gallus (♀), 3 – G. gallus (♂), 4 - G. gallus (♀), 5 - G. gallus (♀), 6 - G. gallus (♀), 7 - G. gallus (♀), 8 - G. gallus (♂), 9 – G. gallus (♀), 10 - G. gallus (♀), M – Ladder Табела 5. Списак птица од којих је узоркован брис усне дупље за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Брис уснe дупљe Рeд Врстa Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Falconiformes Neophron percnopterus 1 0 0 1 Gyps fulvus 3 11 0 14 Psittaciformes Psittacus erithacus 3 0 0 3 Ara ararauna 3 0 0 3 Ara chloroptera 4 0 0 4 Cacatua galerita 1 0 0 1 Ara severa 1 0 0 1 Eolophus roseicapilla 4 0 0 4 Strigiformes Tyto alba 3 0 0 3 Galliformes Gallus gallus 5 0 0 5 Podicipediformes Podiceps cristatus 1 0 0 1 Укупно 29 11 0 40 70 5.1.4. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из фецеса За одређивање пола код 4 врсте птица (Ara ararauna, A. chloroptera, Psittacus erithacus, Serinus canaria) као узорак за изолацију нуклеинских киселина је коришћен фецес (Табела 6). Одређивање пола је покушано у 20 анализа. Анализе су биле успешне код све 4 врсте (Слика 4). Међутим, од 20 анализа успешно је било свега пет. У осталих 15 анализа није добијен амплификовани продукт. Слика 4. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 – Ara ararauna (♀), M – Ladder Табела 6. Списак врста птица од којих је узоркован фецес за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Фeцeс Рeд Врстa Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Psittaciformes Psittacus erithacus 1 5 0 6 Ara ararauna 1 1 0 2 Ara chloroptera 1 1 0 2 Passeriformes Serinus canaria 2 8 0 10 Укупно 5 15 0 20 71 5.1.5. Успешност изолације ДНК и амплификације CHD гена из ткивних формалинских исечака Ткивни формалински исечци различитих ткива птица су коришћени за одређивање пола код укупно 15 јединки, представника 6 врста птица (Ara ararauna, Anser anser, Columba livia, Gallus gallus, Meleagris gallopavo, Perdix perdix) (Табела 7). Пол је успешно одређен код свих испитиваних узорака (Слика 5). Слика 5. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 – Ara ararauna (♀), 2 – Columba livia (♂), M - Ladder Табела 7. Списак врста птица од којих су узорковани ткивни формалински исечци различитих ткива птица за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Ткивни формалински исечци Рeд Врстa Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Anseriformes Anser anser 1 0 0 1 Columbiformes Columba livia 1 0 0 1 Psittaciformes Ara ararauna 1 0 0 1 Galliformes Perdix perdix 1 0 0 1 Gallus gallus 10 0 0 10 Meleagris gallopavo 1 0 0 1 Укупно 15 0 0 15 72 5.2. Успешност амплификације CHD гена применом различитих протокола Зa aмплификaциjу CHD гeнa кoришћeнa су двa прoтoкoлa кoja сe стaтистички врлo знaчajнo рaзликуjу пo успeшнoсти (χ2=34,550; p<0,001). Прoтoкoл који је подразумевао примену модификоване Taq ДНК полимеразе (KAPA2G Robust DNA Polymerase) дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR биo je успeшниjи у 19,87% случajeвa oд прoтoкoлa са обичном Taq ДНК полимеразом (Табела 8). Taбeлa 8. Рeзултaти прoтoкoлa зa aмплификaциjу CHD гeнa Прoтoкoл Рeзултaт прoтoкoлa Укупнo Успeo Ниje успeo Taq ДНК полимераза Брoj 147 68 215 % 68,37 31,63 100,00 Модификована Taq ДНК полимераза Брoj 345 46 391 % 88,24 11,76 100,00 5.2.1. Успешност амплификације CHD гена применом Taq ДНК полимеразе Одређивање пола применом Taq ДНК полимеразе покушано је у укупно 215 анализа, код узорака (перје и крв) пореклом од 41 врсте птица (Прилог 2). Продукт PCR реакције је добијен у укупно 147 реакција, док у 68 реакција није добијен амплификовани производ (Табела 9; Слика 6). 73 Слика 6. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 - Nymphicus hollandicus (♀), 2 – N. hollandicus (♂), 3 – N. hollandicus (♂), 4 – N. hollandicus (♀), 5 – N. hollandicus (♀), 6 – N. hollandicus (♀), 7 – N. hollandicus (♂), M - Ladder Градијентни PCR је примењен кoд пojeдиних узoрaкa, код којих добијени амплификати нису били јасно видљиви или код којих је било доста неспецифичних продуката који су онемогућавали недвосмислено одређивање пола. Мењана је температура хибридизације (у опсегу 50.5º C, 51.1º C, 52.4º C, 53.9º C, 55.3º C, 56º C, 57.3º C, 58.4º C, 59.4º C, 59.7º C). На температури од 51.1º C код два узорка пореклом од врсте Аlоpоchеn аеgyptiаcus добијени су амплификати који су се могли визуелизовати, док су неспецифичне траке биле одсутне (Слика 7). Слика 7. Амплификација узорка пореклом од врсте Alopochen aegyptiacus коришћењем градијентног PCR-а, 1 - 59.7º C, 2 - 59.4º C, 3 - 58.4º C, 4 - 57.3º C, 5 - 56º C, 6 - 55.3º C, 7 - 53.9º C, 8 - 52.4º C, 9 - 51.1º C, 10 - 50.5º C, М – Ladder 74 Код једног од та два узорка пореклом од врсте Аlоpоchеn аеgyptiаcus одређен је женски пол, док код је код другог узорка добијена трака била слабо видљива те се приступило реамплификацији добијених PCR продуката. Након реамплификације, могле су се визуелизовати две траке код узорка пореклом од женке и једна трака код узорка пореклом од мужјака (Слика 8), чиме је дефинитивно потврђено да је на температури хибридизације од 51.1º C амплификован CHD-W ген а не да се визуелизовао неспецифичан продукт PCR реакције. Слика 8. Реамплификација узорка пореклом од врсте Alopochen aegyptiacus; 1 - A. aegyptiacus (51.1º C) (♂), 2 – A. aegyptiacus (51.1º C) (♀) Табела 9. Списак редова птица код којих је за анализу пола коришћена Taq ДНК полимераза, број узорака, успешних и неуспешних анализа Прoтoкoл 1 Рeд Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Anseriformes 27 14 10 51 Ciconiiformes 9 4 3 16 Falconiformes 12 1 0 13 Coraciiformes 5 1 0 6 Casuariiformes 0 4 8 12 Columbiformes 4 0 0 4 Psittaciformes 62 35 0 97 Strigiformes 0 3 0 3 Passeriformes 4 3 0 7 Gruiformes 2 1 0 3 Cuculiformes 0 2 0 2 Piciformes 0 0 1 1 Укупно 125 68 22 215 75 5.2.2. Успешност амплификације CHD гена применом модификоване Taq ДНК полимеразе (KAPA2G Robust DNA Polymerase) дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR Одређивање пола применом модификоване Taq ДНК полимеразе дизајниране да буде отпорна на инхибиторе PCR покушано је у укупно 418 анализа (Прилог 3), код узорака (перје, крв, брис усне дупље и фецес) пореклом од 64 врсте птица (Слика 9). Слика 9. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 – Ara severa (♀), 2 – A. severa (♀), 3 – Cygnus atratus (♀), 4 - Aratinga solstitialis (♂), 5 – A. solstitialis (♂), 6 – A. solstitialis (♀), 7 - Pyrrhura conura (♂), 8 – P. conura (♂), 9 – Psittacus erithacus (♀), 10 – P. erithacus (♂), 11 – A. chloroptera (♀), M – Ladder 76 Продукти PCR реакције су добијени у укупно 344 реакција, док у 74 реакција није добијен амплификовани производ (Табела 10). Табела 10. Списак редова птица код којих је за анализу пола коришћена модификована Taq ДНК полимеразе дизајнирана да буде отпорна на инхибиторе PCR Прoтoкoл 2 Рeд Успeлo Нeуспeлo Нeдeтeрминисaнo Укупнo Аnsеrifоrmеs 28 4 0 32 Ciconiiformes 2 0 0 2 Falconiformes 24 30 0 54 Coraciiformes 4 0 0 4 Columbiformes 6 1 0 7 Psittaciformes 222 34 0 256 Strigiformes 7 0 2 9 Passeriformes 6 1 0 7 Cuculiformes 3 1 0 4 Piciformes 0 2 10 12 Galliformes 29 1 0 30 Podicipediformes 1 0 0 1 Charadriiformes 1 0 0 1 Укупно 332 74 12 418 6. ДИСКУСИЈА Комплетно разумевање биологије било које врсте са полним размножавањем зависи од способности да се разликују мужјаци и женке. То је пре свега зато што пол најчешће проузрокује највећу појединачну поделу унутар врсте и то за последицу има разлике у физиологији, понашању и екологији припадника исте врсте (Griffiths и Tiwari, 1993). Код више од 50% врста птица мужјаци и женке се не могу разликовати по некој споља видљивој карактеристици и те врсте се означавају као мономорфне. Са друге стране и кoд диморфних врстa кoд кojих нaизглeд пoстojи jaснa рaзликa у фeнoтипу мужjaкa и жeнки, oнa сe испoљaвa тeк нaкoн дoстизaњa пoлнe зрeлoсти, што значи да се не могу разликовати полови њихових млaдунaцa, зато што је потребно доста времена дa сe испoљe рaзличитoсти кoд птићa (Griffiths и Tiwari 1995, Griffiths и сaр, 1998). Прве методе које су се користиле за одређивање пола код птица заснивале су се на поређењу различитих морфолошких структура или на анализирању појединих образаца понашања. Након тога су се примењивали ултразвук, хирушки и цитолошки методи, док је прекретницу у овом пољу представљало откриће PCR технике којом се откривају разлике на нивоу молекула ДНК. Молекуларно генетичке анализе се сматрају најадекватнијим за одређивање пола код птица због високе поузданости, брзине извођења и економичности (Cerit и Avanus, 2007 R). 78 Значај дефинисања протокола који би се могао користити за одређивање пола код већине врста птица је вишеструк. Анализе имajу двe основне примeнe – при прoучaвaњу oднoсa пoлoвa унутaр пoпулaциja и другo, при мeнaџмeнту прoгрaмa oчувaњa угрoжeних врстa птицa (Griffiths и сар., 1996). Анализе пола птица су веома корисне у свим еколошким проучавањима, прoучaвaњимa пoнaшaњa, фoрмирaњу пaрoвa, прoгрaмимa oчувaњa угрoжeних врстa, мeнaџмeнту пoпулaциja дивљих врстa птицa, aнaлизaмa стрaтeгиja гajeњa у кoмeрциjaлнoм живинaрству, eвoлуциoним прoучaвaњимa и у форензици (Morinha и сар., 2012). Полно везани гени тренутно представљају најзначајније кандидате за дефинисање универзалног молекуларног маркера за одређивање пола птица између осталог јер структуре које су одговорне за то да ли ће се ембрион развити у мужјака или у женку још увек нису откривене. Међу бројним таквим генима, CHD ген је током последње деценије испољио највећи потенцијал да се може користити као универзални маркер за одређивање пола. Збoг вeликoг знaчaja кojи aнaлизe oдрeђивaњa пoлa птица имajу у брojним пoљимa истрaживaњa, нeoпхoднo je прoнaћи мeтoд кojи ћe бити пoуздaн, jeднoстaван зa примeну, eкoнoмичан, брз зa извoђeњe и дa се при тoмe jeдинкама кojимa сe oдрeђуje пoл нe нарушава физички и психички интегритет, нити дa сe угрoжaвa бeзбeднoст oсoбe кoja врши aнaлизe. 6.1. Поређење успешности изолације ДНК из различитих ткива птица Крв представља изузетно богат извор ДНК услед присуства једра у еритроцитима (Harvey и сар., 2006) и до скора је представљала тип узорка који се најчешће користио у анализама пола птица. У прoтeклих 20 гoдинa примeтaн je кoнстaнтaн рaзвoj мoлeкулaрнo гeнeтичких мeтoдa тe je дaнaс мoгућe изoлoвaти ДНК нe сaмo из крви, кoja сe смaтрa трaдициoнaлним 79 узoркoм зa испитивaњa, већ и из рaзличитих узoрaкa ткива птицa (Gaunt и сар., 1999). Два основна параметра која утичу на избор ткива које ће се користити као узорак јесу степен нелагодности који се изазива код птице приликом узорковања и друго, колики је степен успешности анализа након коришћења одређеног типа узорка. Као извори ДНК углавном се користе крв (Bush и сар., 2005), перје (Ong и Vellayan, 2008), брис усне дупље (Seki, 2003), формалински исечци различитих ткива (Bonin и сар., 2010), фецес (Marrero и сар., 2009) и друга ткива (An и сар., 2007). У складу са овим радовима и ми смо у нашем раду за изолацију ДНК користили перје, крв, брис усне дупље, фецес и формалинске исечке различитх ткива птица. Два основна проблема која постоје при коришћењу перја јесу недовољна количина ДНК која се добија након изолације и друго, лош квалитет ДНК (McDonald и Griffith, 2011). Успешност анализа аутора који су користили перје за молекуларно генетичка испитивања кретала се углавном од 50 до 60% (Segelbacher и сар., 2002; Beja-Pereira и сар., 2009), док се са појавом квалитетнијих хемикалија проценат успешности повећао на 71% (Мaurer и сар, 2010), па чак и до 91% (McDonald и Griffith, 2011). Поједини аутори су објавили да им је за већу успешност анализа био потребан већи број циклуса PCR реакције него што је то случај када су користили крв као извор ДНК (Sacchi и сар., 2004; Harvey и сар., 2006). У нашем раду постигнута је успешност од 92,17% када је перје коришћено за изолацију ДНК и то без модификације PCR протокола у односу на онај који је коришћен при раду са осталим типовима узорака. С обзиром на литературне податке, разлика у успешности може бити последица узорковања искључиво чистог и неоштећеног перја, пажљивијег руковања са перјем током и након узорковања и коришћења хемикалија које су толерантније на присуство различитих инхибитора PCR реакције. 80 Количина и квалитет ДНК изоловане из крви су углавном високи. Аутори који су испитивали успешност коришћења крви објављивали су углавном врло високу успешност – од 98% (Wellbrock и сар., 2012) до 100% (Јеnsen и сар., 2003; Bush и сар., 2005; Handel и сар., 2006). Међутим, оно што је заједничко за те радове јесу коришћење специјалних хемикалија за концентровање ДНК и неутралисање евентуалних инхибитора или изузетно дуга времена инкубације са протеиназом К – и до 16 часова (Seki, 2003). Успешност анализа у нашем раду је нижа од литературне и износи 93,33%. Разлог нешто нижем проценту успешности вероватно је у чињеници што су коришћени комерцијални китови за изолацију ДНК који у себи не садрже хемикалије које неутралишу инхибиторе а и читав поступак изолације је трајао краће, непуних 30 минута. Све до почетка овог века, код птица се брис усне дупље није користио као извор ДНК за молекуларно генетичка истраживања. Захваљујући интензивнијем раду са угроженим и заштићеним врстама птица којима се не сме нарушававати физички интегритет узорковањем крви или перја, започело се са коришћењем бриса усне дупље. Врло брзо, коришћење бриса усне дупље као извора ДНК се показало доста успешним (Seki, 2003). У литератури се могу наћи различити подаци о успешности коришћења бриса усне дупље као извора ДНК. Тако Arima и Onishi (2006) публикују успешност од 82% анализа, док Seki (2003) у свом раду наводи успешност од 100%. У нашем раду успешност анализа је била идентична – 100%. Узорковање фецеса представља потпуно неинвазиван метод, с обзиром на одсуство контакта са птицом током узимања узорка. Успешност анализа у литератури је различита. Заједничко за све јесте да је успешност ниска када се примењују протоколи који се користе и за изолацију ДНК из других типова ткива и креће се од 15% (Seki, 2003) до 25% (Bošnjak и сар., 2013). Када се примењују протоколи који подразумевају употребу хемикалија за неутралисање наведених инхибитора (попут оних који се примењују у форензичке сврхе) али 81 подразумевају и инкубирање узорака у трајању од неколико часова, може се постићи успешност од 65% (Yamauchi и сар., 2000). У нашем раду, у коме су примењене идентичне хемикалије за изолацију ДНК из свих типова узорака, успешност анализа при коришћењу фецеса била је 25%. Присуство инхибитора PCR реакције у фецесу, као што су пигменти (Baignet и сар., 2005), мртве ћелије, РНК (Nielsen и сар., 2000), различити микроорганизми, састојци биљака у храни хербивора (Robertson и сар., 1999) или комплексни полисахариди (Monteiro и сар., 1997) које је тешко уклонити стандардним методама изолације нуклеинских киселина (Seki, 2003) у многоме угрожава извођење анализа. Да би се постигао виши степен успешности анализа уз коришћење фецеса, неопходно је користити додатне хемикалије за изолацију ДНК које ће неутралисати контаминенте (превасходно инхибиторне материје биљног порекла) те је примена фецеса као узорка врло незахвална јер се повећавају трајање и цена анализе (Robertson и сар., 1999). Коришћење формалинских исечака различитих ткива птица као извора ДНК најпогодније је када су у питању форензичке анализе које су све чешће у ветеринарској медицини. Такође, овакав начин изоловања ДНК је незаменљив када се ради са архивским узорцима. Један од проблема који се може појавити јесте да је парафин у ком се ткиво чува инхибитор PCR реакције. Међутим, савремени сетови за изолацију нуклеинских киселина углавном без већих проблема савлађују сличне препреке (Bravo и сар., 2007). У литератури се могу пронаћи радови у којима се успешност изолације креће и до 100% (Sato и сар., 2001; Shi и сар., 2004), као што су и у нашем раду биле успешне све анализе у којима је коришћен овај тип узорка. 82 6.2. Поређење успешности различитих протокола за амплификацију CHD гена У узорцима који се користе за изолацију ДНК оправдано је очекивати присуство бројних инхибитора PCR реакције као што су пигменти, мртве ћелије, РНК, различити микроорганизми, састојци биљака у храни хербивора или комплексни полисахариди. CHD гeн је висoкo кoнзeрвисaн измeђу птицa и сисaрa (Elegren и Sheldon, 1997) и уколико је у узорку присутан и страни генетички материјал при PCR амплификацији мoжe дoћи дo прeфeрeнциjaлнe aмплификaциje фрaгмeнaтa CHD гeнa кoнтaминирajућe ДНК. Кoнтaминaциja мoжe водити ка настанку PCR прoдуката кojи се нaкoн eлeктрoфoрeзe виде као jeдна трaка нa гeлу, истo кao у случajу дeтeрминaциje мушкoг пoлa кoд птицa (Ellegren и Sheldon, 1997). Maлa кoличинa инициjaлнe ДНК пoвeћaвa утицaj кoнтaминaциje, пa je ДНК изoлoвaнa из пeрa пoдлoжниja oвим прoблeмимa (Duan и Fuerst, 2001). Услeд мaлe кoличинe инициjaлнe ДНК мoжe сe дoгoдити дa jeдaн aлeл oстaнe нeдeтeктoвaн. Укoликo je тo W aлeл, жeнкe сe мoгу пoгрeшнo идeнтификoвaти кao мужjaци. Oсим тoгa, мaлa кoличинa ДНК мoжe прoузрoкoвaти пojaву нeспeцифичних пoзaдинских трaкa нa гeлу кoje чeстo кoмпликуjу интeрпрeтaциjу рeзултaтa па је потребно резултате проверавати додатним циклусима амплификације (Arima и Onishi, 2006) или паралелном употребом два сета прајмера (Brady и сар., 2009). Модификована Taq ДНК полимераза (KAPA2G Robust ДНК пoлимeрaзa) je спeциjaлнo дизajнирaнa пoлимeрaзa кoja oбeзбeђуje вeћу прoцeсивнoст и виши нивo тoлeрaнциje нa уoбичajeнe PCR инхибитoрe нeгo wild-type Taq пoлимeрaзa. Применом ове полимеразе остварени су добри резултати са узорцима код којих са обичном полимеразом није могао да се одреди пол. Такође, постигнут је и успех код врста код којих су други аутори били неуспешни а који су при томе користили идентичан сет прајмера (Wang и сар., 2007). У нашем раду при коришћењу wild-type Taq ДНК полимеразе, 83 која нема отпорност ка инхибиторима PCR рeaкциje, добијени су незадовољавајући резултати и показала се потреба за модификацијама основног протокола у виду промене температуре хибридизације или обављања реамплификације код узорака пореклом од појединих врста птица. Примена модификоване Taq ДНК полимеразе, омогућила је већу успешност анализа. 6.3. Процена универзалности CHD гена као молекуларног маркера за детерминацију пола птица Имајући у виду да је циљ рада био испитивање универзалности CHD гена као молекуларног маркера за одређивање пола птица, биолошки материјал је узоркован од 83 врсте, из 15 редова, које су филогенетски удаљене једне од других, како би се добио репрезентативан узорак. Један од основних проблема који се може јавити при тумачењу резултата након амплификације CHD гена јесте недовољна разлика у величини добијених продуката PCR реакције. При коришћењу појединих сетова прајмера, попут Р2/Р8, разлика у величини добијених амплификата је врло мала те се две траке могу видети као једна, а самим тим се и женке грешком могу прогласити мужјацима (Ong и Vellayan, 2008). Код појединих врста птица (Ara ambiqua, A. ararauna, A. cyanoptera, A. macao, Branta sandvicensis, Caloenas nicobarica, Coracias indicus, Dendrocygna viduata, Eclectus roratus roratus и Psitacula cyanocephala) разлика у величини амплификованих продуката није велика и креће се у опсегу од 10 до 80 bp али је најчешће 30 до 50 bp (Jensen и сар., 2003). Због такве разлике у величини трака није једноставно недвосмислено одредити да ли се на агарозном гелу налазе две или једна трака те је неопходно коришћење прецизнијих метода попут електрофорезе са акриламидним геловима (Garcia и сар., 2008) или капиларне електрофорезе (Lee и сар., 2010). Развој и примена високорезолутних техника вероватно би омогућили добијање јаснијих резултата али би се поставило питање економске оправданости 84 таквих анализа. За овакве случајеве могуће је користити рестрикционе ензиме ако у добијеним амплификатима CHD-W и CHD-Z гeнa пoстoje рaзличитa рeстрикционa мeстa, чимe би сe oткрилe њихoвe рaзликe и oмoгућилo oдрeђивaњe пoлa (Griffiths и сар., 1996; Sacchia и сар., 2004). Могуће је користити и мултиплекс PCR (са прајмерима P0, P2, P8) који је примењен код врста из редова Anseriformes, Galliformes, Ciconiiformes, Falconiformes, Charadriiformes, Psittaciformes, Strigiformes, Caprimulgiformes, Piciformes, Passeriformes, Sphenisciformes и Struthioniformes (Han и сар., 2009a), али то додатно компликује и поскупљује анализе а код јединки већине редова и применом прајмера коришћених у овом раду пол се могао успешно одредити. У нашем раду, примена 2550F/2718R сета прајмера омогућила је детерминацију пола код 74 врсте птица, између осталог и код врста код којих до сада није било успешно извршено одређивање пола применом других сетова прајмера (Alopochen aegyptiacus, Amazona finschi, Anser anser, A. fabalis, Ara severus, Aratinga acuticaudata, A. aurea, Barnardius zonarius, Bucorvus leadbeateri, Buteo buteo, Cereopsis novaehollandiae, Columba arquatrix, Coracopsis nigra, Corvus corax, C. frugilegus, Coturnix coturnix, Cyanoliseus patagonus, Guttera plumifera, Lamprotornis superbus, Milvus milvus, Neophron percnopterus, Ocyphaps lophotes, Perdix perdix, Podiceps cristatus, Poicephalus senegalus, Scolopax rusticola). Добијени амплификати CHDZ и CHDW гена су се разликовали у величини од 150 до 250 bp и управо та разлика у величини амплификата омогућује недвосмислено тумачење резултата на агарозном гелу, што није случај када се примењују други сетови прајмера. Самим тим, одређивање пола се завршава након PCR реакције без потребе за даљим усложњавањем и поскупљивањем анализа. Прајмери 2550F/2718R се везују за високо конзервисани егзонски део CHD гена и умножавају варијабилну интронску секвенцу захваљујући чему и постоји разлика у амплификованим производима код мужјака и женки. 85 Услед мале разлике у величини амплификованих продуката који настају применом других сетова прајмера код врста из рода Ciconia поједини аутори су се опредељивали за примену комплекснијих молекуларних метода, попут PCR-RFLP и секвенционирања (Han и сар., 2009b). У нашем раду, амплификација је извршена прајмерима 2550F/2718R, а разлика у величини продуката који су се добили је била довољна да се они јасно раздвоје на агарозном гелу (Слика 10). Слика 9. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Cicоniа cicоniа (♂), 2 – C. ciconia (♀), M – Ladder Разлика у величини амплификованих продуката применом прајмера P2/NP код представника фамилије Falconidae износи 20 bp, док је код појединих представника фамилије Accipitridae још мања – свега 2-8 bp (Ito и сар., 2003). Nesje и Røed (2000) су амплификовали CHDZ и CHDW гене (применом прајмера F: GCTTCGCCCCAAAACAAG и R: TGTTCCAGTGGATGACTG; F: TTTGGTTGAGAAGTGAGTG и 86 R: GTAAGCCAGAGAAAAATGC) код врсте Falco subbuteo, а разлика у величини добијених продуката је износила свега 1 базни пар и било је неопходно применити ARMS технику како би се одредио пол испитиваних јединки. Поредећи наше резултате, ми смо у нашем раду применом 2550F/2718R сета прајмера остварили разлику у величини амплификованих продуката од око 150 bp и потврдили да је боље користити наведени сет прајмера зато што је амплификате могуће без проблема раздвојити на агарозном гелу, а самим тим пол јединке одредити поузданије, брже и економичније (Слика 11). Слика 11. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; 1 - Haliaeetus albicilla (♀), 2 – H. Albicilla (♀), М – Ladder Naim и сар., (2011) су при анализи пола код врста Haliaeetus leucogaster и Gallus gallus, након амплификације прајмерима P2/P3 и P2/P8 утврдили да је било неопходно урадити и дигестију амплификата применом HaeIII рестрикционих ензима због сувише мале разлике у величини производа PCR реакције. Међутим, у нашем раду при анализи узорака врсте Gallus gallus и узорака врста из рода Haliaeetus применом 2550F/2718R сетом 87 прајмера, добијани су амплификати који се лако раздвајају на агарозном гелу те није било потребе користити рестрикционе ензиме с обзиром да се пол могао одредити одмах након PCR амплификације (Слика 12). Слика 12. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Gallus gallus (♀), 2 – G. gallus (♀), 3 – G. gallus (♂), 4 – G. gallus (♀) Ramos и сар. (2009) су за одређивање пола код јединки из рода Accipiter поред примене Р2/Р8 сета прајмера морали да користе и SSCP технику јер се добијени производи амплификације нису могли раздвојити на агарозном гелу како би се могао недвосмислено одредити пол. Само увођење додатног корака у многоме поскупљује и компликује метод. Код врло сродних врста, припадника исте фамилије, у нашем раду се без потешкоћа могао одредити пол применом 2550F/2718R сета прајмера с обзиром на постојање разлике од око 150 bp између амплификата (Слика 13). 88 Слика 13. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Aquila heliaca (♀), 2 – Hаliаееtus аlbicilа (♀), 3 – H. аlbicilа (♀), M – Ladder Lee и сар. су 2008. публиковали рад у ком примењују ARMS метод код великог броја врста птица. Иако се показао доста успешним, код врсте Phasianus colchicus и код јединки рода Anatidea није била могућа примена овог метода јер су се као производ реакције добијале две траке исте величине и њихово раздвајање на агарозном гелу није било могуће. Наши резултати за врсту Phasianus colchicus али и за врсте из рода Anatidea које су филогенетски блиске врстама које су испитивали Lee и сар. указују да је сасвим довољно амплификовати CHD ген по протоколу описаном у нашем раду јер се настали продукти, услед разлике у величини, јасно раздвајају електрофорезом на агарозном гелу. Самим тим и одређивање пола је могуће без примене додатних метода (Слика 14). 89 Слика 14. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Anser anser (♀), 2 – Corvus frugilegus (♀), 3 – Perdix perdix (♂), 4 – Coturnix coturnix (♀), 5 – Scolopax rusticola (♂), 6 – Phasianus colchicus (♀), M – Ladder Одређивање пола код врсте Coturnix јaponica раније је успешно изведено применом прајмера Coja-F и Coja-R (Vali и Doosti, 2011). Применом наведених прајмера код женки се амплификује једна трака док се код мужјака не добија продукт PCR амплификације. То је с једне стране добро, јер се јасно уочава разлика између полова, али са друге стране постоји ризик од проглашавања неуспелих реакција мужјацима. Код исте врсте Morinha и сар. (2011) су за детерминацију пола примењивали real time PCR, односно high-resolution melting (HRM). Коришћењем сета прајмера Р2/Р8 и специјалних боја добија се поуздан резултат за краће време. У нашем раду, код представника истог рода, применом 2550F/2718R сета прајмера избегнуто је добијање лажних резултата, цена анализе је доста нижа, а уз то је и извођење реакције једноставније (Слика 14). Wang и сар. (2007) су испитивали могућност одређивања пола применом 2550F/2718R и 1237L/1272H сетова прајмера. Код одређеног броја врста птица није било успешно одређивање пола. Аутори су неуспех код птица тркачица приписали недостатку хетероморфизма на нивоу полних хромозома, док се узроком неуспеха код осталих врста птица (из 90 надреда летачица) превасходно сматрала нуклеотидна разноврсност на нивоу испитиваних сегмената гена. Међутим, код врста Leptopilos crumeniferus, Phasianus colchicus, Nymphicus hollandicus и Amazona ochrocephala у нашем раду пол је без потешкоћа одређен применом идентичног сета прајмера (2550F/2718R) (Слика 15). С обзиром на чињеницу да се у оба рада користи исти сет прајмера, неуспех анализа код наведених врста може се приписати лабораторијским поступцима, а не универзалности примене CHD гена. Слика 15. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; M – Ladder, 1 – Leptopilos crumeniferus (♀), 2 – L. crumeniferus (♀), 3 – L. crumeniferus (♀), 4 – Phasianus colchicus (♀) Wu и сар. (2006) су током једне обимне студије дизајнирали прајмере за одређивање пола код представника фамилије Columbidae. Новосинтетисани прајмери (TurSexOPAV17-F и TurSexOPAV17-R) су се показали врло ефикасним код свих испитиваних врста дате фамилије. Међутим, потенцијални проблем јесте што се пол одређује на основу амплификовања W-специфичне секвенце те се изостанак амплификата 91 може тумачити и као мужјак и као неупешна PCR реакција. Такође, наведени прајмери су коришћени само код представника фамилије Columbidae па се не зна да ли се могу користити и код представника других фамилија и редова птица. У нашем раду амплификација CHD гена применом 2550F/2718R сета прајмера успешно је обављена код 4 врсте из реда Columbiformes (Слика 16), по протоколу који је био успешан и код још 70 врста птица. Слика 16. Прикaз дoбиjeних рeзултaтa дeтeрминaциje пoлa рaзличитих врстa птицa нa aгaрoзнoм гeлу oбojeнoм у eтидиjум брoмиду; М – Ladder, К1 – Позитивна контрола, К2 – Позитивна контрола, К3 – Позитивна контрола, К- – негативна контрола, 1 - Ocyphaps lophotes (♀), 2 – O. lophotes (♀) Дизајн 2550F/2718R сета прајмера је такав да је амплификовани W- фрагмент мањи, те је услед разлике у величини трака могућа детерминација пола јединке чак и када се само једна W трака визуелизује на гелу (Dawson и сар., 2001) уз обавезно коришћење позитивних контрола мужјака и женки исте врсте. Од узорака коришћених у овом раду, то је био случај код врста Ajaia ajaja и Neophron percnopterus а такви случајеви су претходно описани код неких представника редова Accipitridae, Anatidae, Falconidae, Gruidae и Scolopacidae (Fridolfsson и Ellergen, 1999). У нашем истраживању, величина највећег броја Z и W трака (као и разлика између 92 њих која се кретала од 150 до 250 bp) је била у опсегу који се могао очекивати на основу доступних литературних података (Fridolffson и Ellegren, 1999). Величина Z трака је износила ~600bp, а W трака ~ 450bp. Код врста код којих анализом CHD гена нисмо успели недвосмислено да одредимо пол (Anser indicus, Branta sandvicensis, Bubo bubo, Casuarius casuarius, Dromaius novae-hollandiae, Eudocimus ruber, Ramphastos cuvieri и Rhea americana) на агарозном гелу се могла визуелизовати само једна трака код свих узорака. Неуспех у одређивању пола код птица тркачица у складу је са резултатима других аутора (Kahn и сар., 1998; Fridolfsson и Ellegren, 1999). Разлог за неуспешно одређивање пола код тркачица лежи у недостатку хетероморфних полних хромозома те није могуће амплификовати фрагменте који би били различите величине (Wang и сар., 2007). Код узорака врсте Bubo bubo добијене амплификоване продукте није било могуће раздвојити на агарозном гелу, што је у складу да налазима других аутора који су код већине сродних врста, из реда Strigiformes, добијали траке врло сличних величина (Griffiths и сар., 1998; Cerit и Avanus, 2007 R). Слично томе, код узорака пореклом од врсте Ramphastos cuvieri PCR продукти су били сувише сличне величине и нису се могли раздвојити на агарозном гелу, што су објавили и други аутори (Miyaki и сар., 1998). За преостале четири врсте (Anser indicus, Branta canadensis, B. sandvicensis, Eudocimus ruber) код којих нисмо одредили пол не постоје литературни подаци о молекуларно генетичким анализама пола те није било могуће вршити било какво поређење. Евентуалан узрок немогућности одређивања пола код наведене четири врсте може се тражити у недостатку или одсуству ДНК материјала који се анализира, контаминацији ДНК, присуству тешких метала у фоликулу пера, преференцијалној амплификацији краћег CHD-W гена, постојању полиморфизама на месту везивања прајмера, недовољној разлици у дужини умножених CHD-W и CHD-Z фрагмената или присуству генетичких аномалија. Одређивање пола применом молекуларно 93 генетичких метода такође може бити отежано услед интерспецијских (Kahn и сар. 1998) или интраспецијских (Lee и сар., 2010) варијација на нивоу интрона CHD гена или услед полиморфизма W хромозома (Dawson и сар., 2001). Универзалност CHD гена као полно специфичног маркера базира се на разликама у величини амплификованих производа присутних код представника свих испитиваних редова (изузев птица тркачица). Такође, врло је битно напоменути да је та разлика у величини амплификованих продуката скоро идентична код свих редова који су у раду испитивани (Anseriformes, Charadriiformes, Ciconiiformes, Columbiformes, Coraciiformes, Cuculiformes, Falconiformes, Galliformes, Gruiformes, Passeriformes, Podicipediformes, Psittaciformes и Strigiformes) што снажно сугерише да је нека значајна структурна мутација (попут делеције или инсерције) настала на нивоу интрона једне од две копије CHD гена током ране еволуције птица, пре раздвајања данас постојећих редова птица летачица (Fridolffson и Ellegren, 1999). Код врсте Struthio camelus, представника птица тркачица могуће је одредити пол применом мултиплекс PCR анализе која се заснива на амплификацији одређених сегмената CHD гена и примени прајмера специфичног само за W хромозом (Han и сар., 2009). Такав метод одређивања пола не може се сматрати универзалним али потврђује претпоставку да се CHD ген може користити као универзални молекуларни маркер. Чињеница је да постоји изузетно висок степен конзервисаности чак и међу филогенетски врло удаљеним врстама птица и из тог разлога CHD ген представља интересантан маркер са потенцијалом за развијање универзалног протокола за молекуларну детерминацију пола птица. PCR амплификацијом CHD гена применом 2550F/2718R сета прајмера добијају се једна трака (Z) код мужјака и две траке (Z и W) код женки. 94 С обзиром да су птице код којих је детерминација пола успешно извршена и оне код којих није, широко распоређене на еволутивном стаблу, може се закључити да се неуспех у одређивању пола појединих врста у овом истраживању не може повезати са еволутивним односом између испитиваних врста птица. 7. ЗАКЉУЧАК На основу добијених резултата и података из актуелне литературе, може се закључити следеће: 1. CHD ген се може користити као универзални молекуларни маркер за одређивање пола птица. 2. Перје се може сматрати узорком који је најбоље користити за молекуларно генетичке анализе пола код живих птица. 3. Много већа успешност се постиже у реакцијама где је коришћена полимераза специјално дизајнирана да буде отпорна на инхибиторе PCR реакције. 4. Испитивани пар прајмера 2550F/2718R се код свих птица летачица може користити за одређивање пола. Протоколи коришћени у овом раду на репрезентативном узорку од 550 јединки пореклом од филогенетски врло удаљених врста птица су дали одличне резултате. Успешно одређивање пола код 74 врсте птица применом само једног сета прајмера и уз благе модификације PCR услова и термалног протокола наводи на закључак да се оваквим методолошким приступом може достићи универзални молекуларно генетички метод за одређивање пола код птица, односно, да се CHD ген може користити као универзални молекуларни маркер. 8. ПОПИС ЛИТЕРАТУРЕ 1. Abinawanto K., Shimada K., Yoshida K., Saito N., 1996, Effects of aromatase inhibitor on sex-differentiation and levels of p450(17-alpha) and p450(arom) messenger-ribonucleic-acid of gonads in chicken embryos, Gen Comp Endocrinol, 102, 241–246. 2. Adkins E.K., 1978, Sex Steroids and the Differentiation of Avian Reproductive Behavior, Amer Zool, 18, 3, 501-509. 3. Adkins E.K., Pniewski E.E., 1978, Control of reproductive behavior by sex steroids in male quail, J Comp Physiol Psychol, 92, 6, 1169-1178. 4. Agate R.J., Grisham W., Wade J., Mann S., Wingfield J., Schanen C., Palotie A., Arnold A.P., 2003, Neural not gonadal origin of brain sex differences in a gynandromorphic finch, Proc Natl Acad Sci USA, 100, 4873-4878. 5. Alacs E.A., Georges A., FitzSimmons N.N., Robertson J., 2010, DNA detective: a review of molecular approaches to wildlife forensics, Forensic Sci Med Pathol, 6, 3, 180-194. 6. Alacs E.A., Georges A., 2008, Wildlife across our borders: a review of the illegal trade in Australia, Aust J Forensic Sci, 40:107–23. 7. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Manipulating Proteins, DNA, аnd RNA, in Molecular Biology оf the Cell, Garland Science, New York, 4th Edition, 508-509. 8. Alonso-Alvarez C., 2006, Manipulation of Primary Sex-Ratio: an Updated Review, Avian Poult Biol Rev, 17, 1, 1 –20. 9. An J., Lee M., Min M., Lee M., Lee H., 2007, A molecular genetic approach for species identification of mammals and sex determination of birds in a forensic case of poaching from South Korea, Forensic Sci Int, 167, 59-61. 10. Anthony, L.L., Blumstein, D.T., 2000, Integrating behaviour into wildlife conservation: the multiple ways that behaviour can reduce Ne, Biol Conserv, 95, 303–315. 11. Archawaranon M., 1998, Hormonal Correlate of Seasonal Reproduction in Captive Thai Hill Mynahs, Proc 22 Int Ornithol Congr Durban, 69, 315-316. 12. Archawaranon M., 2002, Zoogeography of various Hill Mynah phenotypes in Thailand, J Biol Sci, 2, 645-647. 97 13. Archawaranon M., 2004, Rapid sexing hill mynah Gracula religiosa by sex chromosomes, Biotechnology, 3, 160-164. 14. Arima H., Ohnishi N., 2006, Usefulness of avian buccal cells for molecular sexing, Ornithol Sci, 5, 139–143. 15. Arlt D., Bensch S., Hansson B., Hasselquist D., Westerdahl H., 2004, Observation of a ZZW female in a natural population: implications for avian sex determination, Proc R Soc Lond B, 271, S249-S251. 16. Arnold A.P., 1997, Sexual differentiation of the zebra finch song system: positive evidence, negative evidence, null hypotheses, and a paradigm shift, J Neurobiol, 33, 572–584. 17. Arnold A.P., Chen X., 2009, What does the “four core genotypes” mouse model tell us about sex differences in the brain and other tissues?, Front Neuroendocrinol, 30, 1–9 18. Arnold K., Orr K., Griffiths R., 2003, Primary sex ratios in birds: problems with molecular sex identification of undeveloped eggs, Mol Ecol, 12, 3451-3458. 19. Arnold S.J., 1994, Bateman’s principles and the measurement of sexual selection in plants and animals, Am Nat, 144, S126–S149. 20. Arnold A.P., Itoh Y., Melamed E., 2008, A bird’s-eye view of sex chromosome dosage compensation, Annu Rev Genom Hum G, 9, 109–127. 21. Arya M., Shergill I.S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., Patel H.R., 2005, Basic principles of real-time quantitative PCR, Expert Rev Mol Diagn, 5, 209–19. 22. Badyaev A.V., 2002, Growing apart: an ontogenetic perspective on the evolution of sexual size dimorphism, Trends Ecol Evol, 17, 369–378. 23. Baignet S., Petherbridge L., Howes K., Smith L., Currie R., Nair V., 2005, Absolute quantitation of Marek’s disease virus genome copy number in chicken feather and lymphocyte samples using real-time PCR, J Virol Methods, 123, 53−56. 24. Baker A.J., Piersma T., 1999, Molecular vs. phenotypic sexing in Red Knots, Condor, 101, 887–893. 25. Baldwin S.P., Oberholser H.C., Worley L.G., 1931, Measurements Of Birds, Clevelandmuseum Of Natural History, Cleveland, Ohio, 165. 26. Balthazart J., Ball G., 1995, Sexual differentiation of brain and behavior in birds, Trends Endocrin Met, 6, 1, 21-29. 27. Bantock T.M., Prys-Jones R.P., Lee P.L., 2008, New and improved molecular sexing methods for museum bird specimens, Mol Ecol Resour, 8, 519–28. 98 28. Barrowclough G.F., Groth J.G., Odom K.J., Lai J.E., 2011, Phylogeography of the barred owl (Strix varia): species limits, multiple refugia, and range expansion, Auk, 128, 696–706. 29. Batellier F., Marchal F., Scheller M.F., Gautron J., Sellier N., Taouis M., Monbrun C., Vignal A., Brillard J.P., 2004, Sex ratios in mule duck embryos at various stages of incubation, Theriogenology, 61, 573– 580. 30. Beja-Pereira A., Oliveira R., Alves P.C., Schwartz M.K., Luikart G., 2009, Advancing ecological understandings through technological transformations in noninvasive genetics, Mol Ecol Res, 9, 1279-1301. 31. Benito M., Gonzalez-Solis J., 2007, Sex ratio, sex-specific chick mortality and sexual size dimorphism in birds, J Evolution Biol, 20, 4, 1522-1530. 32. Bennet C.P., Docherty Z., Robb S.A., Ramani P., Hawkins J.R., Grant D., 1993, Deletion 9p and sex reversal, J Med Genet, 30, 518–520. 33. Benton M.J., 1990, Phylogeny of the major tetrapod groups: morphological data and divergence dates, J Mol Evol, 30, 409-424. 34. Bercovitz A.B., Czekala N.M., Lasley B.L., 1978, A New Method of Sex Determination in Monomorphic Birds, J Zoo Anim Med, 9, 4, 114-124. 35. Bermudez-Humaran L.G., Garcia-Garcia A., Leal-Garza C.H., Riojas-Valdes V.M., Jaramillo-Rangel G., Montes-de-Oca-Luna R., 2002, Molecular Sexing of Monomorphic Endangered Ara Birds, J Exp Zool, 292, 677–680. 36. Black IV W.C., 1993, PCR with arbitrary primers: approach with care, Insect Mol Biol, 2, 1–6. 37. Blecher S.R., Erickson R.P., 2007, Genetics of sexual development: a new paradigm, Am J Med Genet, 143, 3054–3068. 38. Boersma P.D., Davies E.M., 1987, Sexing Monomorphic Birds by Vent Measurements, Auk, 104, 4, 779-783. 39. Bonin S., Hlubek F., Benhattar J., Denkert C., Dietel M., Fernandez P., Höfler G., Kothmaier H., Kruslin B., Mazzanti C., Perren A., Popper H., Scarpa A., Soares P., Stanta G., Groenen P., 2010, Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues, Virchows Arch, 457:309–317. 40. Bosé M., Le Gouar P., Arthur C., Lambourdière J., Choisy J.P., Henriquet S., Lecuyer P., Richard M., Tessier C., Sarrazin F., 2007, Does sex matter in reintroduction of griffon vultures (Gyps fulvus)?, Oryx, 41, 503– 8. 41. Bosnjak J., Stevanov-Pavlovic M., Vucicevic M., Stevanovic J., Simeunovic P., Resanovic R., Stanimirovic Z., 2013, Feasibility of Non-Invasive Molecular Method for Sexing of Parrots, Pakistan J Zool, 43, 3, 715-720. 42. Bradshaw C.J.A., Harcourt R.G., Lloyd S.D., 2003, Malebiased sex ratios in New Zealand fur seal pups relative to environmental variation, Behav Ecol Sociobiol, 53, 297–307. 99 43. Brady R.S., Paruk J.D., Kern J.A., 2009, Sexing adult Northern Shrikes using DNA, morphometrics, and plumage, J Field Ornithol, 80, 2, 198–205. 44. Bramwell R.K., 2003, Sexing chicks in the backyard flock, Avian Advice, 5, 4-5. 45. Bravo V., Rosero S., Ricordi C., Pastori R.L., 2007, Instability of miRNA and cDNA derivatives in RNA preparations, Biochem Bioph Res Co, 353, 1052- 1055. 46. Browder L.W., Erickson C.A., Jeffery W.R., 1991, Organogenesis: gonad development and sex differentiation in: Developmental Biology, Browder L. W., Erickson C. A. and Jeffery W. R. (eds), Saunders College Publishing, Philadelphia, 661–683. 47. Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed. Oxford, BIOS Scientific Publishers: www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=ge nomes.TOC&depth=2 48. Brubaker J., Karouna-Renier N., Chen Y., Jenko K., Sprague D., Henry P., 2011, A noninvasive, direct real-time PCR method for sex determination in multiple avian species, Mol Ecol Resour, 11, 415–417. 49. Brzoska, P.M., Chen, H., Levin, N.A., Kuo, W.L., Collins, C., Fu, K.K., Gray, J.W., Christman, M.F., 1996, Cloning, mapping, and in vivo localization of a human member of the PKCI-1 protein family (PRKCNH1), Genomics, 36, 151–156. 50. Bull J.J., 1983, Evolution of sex determining mechanisms. Menlo Park (CA): Benjamin/Cummings Publishing Company. 51. Bush K.L., Dyte C.K., Moynahan B.J., Aldridge C.L., Sauls H.S., Battazzo A.M., Walker B.L., Doherty K.E., Tack J., Carlson J., 2011, Population structure and genetic diversity of greater sage-grouse (Centrocercus urophasianus) in fragmented landscapes at the northern edge of their range, Conserv Genet, 12, 527– 42. 52. Bush K.L., Vinsky M.D., Aldridge C.L., Paszkowski C.A., 2005, A comparison of sample types varying in invasiveness for use in DNA sex determination in an endangered population of greater sage-grouse (Centrocercus uropihasianus), Cons Gen, 6, 867-870. 53. Casey A., Jones K., Sandercock B., Wisely S., 2009, Heteroduplex molecules cause sexing errors in a standard molecular protocol for avian sexing, Mol Ecol Resour, 9, 61–65. 54. Cate C., 1985, On sex differences in sexual imprinting, Anim Behav, 33, 4, 1310-1317. 55. Cate C., Vos D., 1999, Sexual Imprinting and Evolutionary Processes in Birds: A Reassessment, Adv Stud Behav, 28, 1-31. 100 56. Cerit H, Avanus K, 2007, Sex identification in avian species using DNA typing methods, World Poultry Sci J, 63, 91-99. 57. Cerit H., Avanus K., 2007, Sex identification by CHDW and CHDZ genes of avian sex chromosomes in Nymphicus hollandicus, Turk J Vet Anim Sci, 31, 6, 371-374. 58. Chang H.W., Cheng C.A., Gu D.L., Chang C.C., Su S.H., Wen C.H., Chou Y.C., Chou T.C., Yao C.T., Tsai C.L., Cheng C.C., 2008, High-throughput avian molecular sexing by SYBR Green-based real-time PCR combined with melting curve analysis, BMC Biotechnol, 8, 12. 59. Chang H.W., Gu D.L., Su S.H., Chang C.C., Cheng C.A., Huang H.W., Yao C.T., Chou C.T., Chuang L.Y., Cheng C.C., 2008, High-throughput gender identification of Accipitridae eagles with real-time PCR using TaqMan probes, Theriogenology, 70, 83–90. 60. Charlesworth D., Mank J., 2010, The Birds and the Bees and the Flowers and the Trees: Lessons from Genetic Mapping of Sex Determination in Plants and Animals, Genetics, 186, 1, 9-31. 61. Charlesworth B., 1996 The evolution of chromosomal sex deter mination and dosage compensation, Curr Biol, 6, 149–162. 62. Charlesworth B., Coyne J.A., Barton N.H., 1987, The relative rates of evolution of sex chromosomes and autosomes, Am Nat, 130, 113–146. 63. Chen X., Sullivan P.F., 2003, Single nucleotide polymorphism genotyping: biochemistry, protocol, cost and throughput, Pharmacogenomics J, 3, 77– 96. 64. Cheng M., Lehrman D., 1975, Gonadal hormone specificity in the sexual behavior of ring doves, Psychoneuroendocrinology, 1,1, 95-102. 65. Cheong S., Sung H.C., Park S.R., 2007, A new method for sexing Oriental White Storks, J Field Ornithol, 7, 3, 329–333. 66. Chojnowski J., Kimball R., Braun E., 2008, Introns outperform exons in analyses of basal avian phylogeny using clathrin heavy chain genes, Gene, 410, 1, 89-96. 67. Chou T.C., Yao C.T., Su S.H., Hung Y.C., Chen W.S., Cheng C.C., Tseng C.N., Wang H.M., Chou Y.C., Li S.S., Gu D.L., Chang H.W., 2010, Validation of Spilornis cheela hoya TaqMan probes for potential gender identification of many Accipitridae species, Theriogenology, 73, 404 –11. 68. Christidis L, 1985, A rapid procedure for obtaining chromosome preparations from birds, Auk, 102, 892–893. 69. Claridge G., Chea-Leth V., Chhoan IV, 2005, The effectiveness of law enforcement against forest and wildlife crime, A study of enforcement disincentives and other relevant factors in Southwestern Cambodia, 101 East–West Management Institute, Conservation International and USAID http://pdf.usaid.gov/pdf_docs/pnadf439.pdf. Accessed 21 Mar 2008 70. Clinton M., 1994, A rapid protocol for sexing chick embryos, Anim Genet, 25, 361-362. 71. Clinton M., Zhao D., Nandi S., McBride D., 2012, Evidence for avian cell autonomous sex identity (CASI) and implications for the sex- determination process?, Chromosome Res, 20, 177–190. 72. Clinton M., Haines L.C., 1999, An overview of factors influencing sex determination and gonadal development in birds, Cell Mol Life Sci, 55, 6- 7, 876-886. 73. Clinton M., 1998, Sex determination and gonadal development: a bird’s eye view, J Exp Zool, 281, 457–465. 74. Clinton M., Haines L., Belloir B., McBride D., 2001, Sexing chick embryos: a rapid and simple protocol, Brit Poultry Sci, 42, 134–138. 75. Clutton-Brock T.H., 1986, Sex ratio variation in birds, Ibis, 128, 3, 317-329. 76. Cockburn A., Legge S., Double, M.C., 2002, Sex ratios in birds and mammals: can the hypotheses be disentangled? in: Sex Ratios: Concepts and Research Methods (ed. I.C.W. Hardy), Cambridge University Press, Cambridge, UK, 267–286. 77. Cook D., Roberts M., Lowther J., 2002, The international wildlife trade and organised crime: a review of the evidence and the role of the UK. Gdalming: WWF-UK 78. Cortés O., Barroso A., Dunner S., 1999, Avian sexing: an optimized protocol using polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism, J Vet Diagn Invest, 11, 297–9. 79. Costantini V., Guaricci A.C., Laricchiuta P., Rausa F., Lacalandra G.M., 2008, DNA sexing in Humboldt penguins (Spheniscus humboldti) from feather samples, Anim Reprod Sci, 106, 162–7. 80. Courchamp F., Angulo E., Rivalan P., Hall R.J., Signoret L., Bull L., Meinard Y., 2006, Rarity value and species extinction: the anthropogenic allee effect, Plos Biol, 4, 2405–2410. 81. Crook J.H., 1964, The Evolution of Social Organisation and Visual Communication in the Weaver Birds (Ploceinae), Behaviour, Supplement, 10. 82. Curran S., 1992, Fetal sex determination in cattle and horses by ultrasonography, Theriogenology, 37, 17-21. 102 83. D’Aloia M.A., Paul Eastham C., 2000, DNA-based sex identification of falcons and its use in wild studies and captive breeding, Zool Middle East, 20, 25–32. 84. Dawson D., Darby S., Hunter F., Krupa A., Jones I., Burke T., 2001, A critique of avian CHD-based molecular sexing protocols illustrated by a Zchromosome polymorphism detected in auklets, Mol Ecol Notes, 1, 201– 204. 85. De Vries G., 2004, Minireview: Sex Differences in Adult and Developing Brains: Compensation, Compensation, Compensation, Endocrinology, 145, 3, 1063–1068. 86. Delhanty J.D.A., 1989, Rapid chromosomal sexing of birds by direct and shorts term culture techniques, Vet Rec, 125, 92. 87. Delmas V., Stokes D., Perry R., 1993, A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 2414-2418. 88. Donald P., 2007, Adult sex ratios in wild bird populations, Ibis, 149, 4, 671-692. 89. Duan W., Fuerst P., 2001, Isolation of a sex-linked DNA sequence in cranes, J Hered, 92, 392–397. 90. Eason D., Millar C., Cree A., Halverson J., Lambert D., 2001, A comparison of five methods for assignment of sex in the takahe (Aves: Porphyrio mantelli), J Zool Lond, 253, 281-292. 91. Eda-Fujiwara H., Yamamoto A., Sugita H., Takahashi Y., Kojima Y., Sakashita R., Ogawa H., Miyamoto T., Kimura T., 2004, Sexual Dimorphism of Acoustic Signals in the Oriental White Stork: Noninvasive Identification of Sex in Birds, Zool Sci, 21, 817-821. 92. Eisen J.A., Sweder K.S., Hanawalt P.C., 1995, Evolution of the SNF2 family of proteins: subfamilies with distinct sequences and functions, Nucleic Acids Res, 23, 2715–2723. 93. Ellegren H., Fridolfsson A.K., 1997, Male-driven evolution of DNA sequences in birds, Nat genet, 17, 182-184. 94. Ellegren H., 1996, First gene on the avian W chromosome (CHD) provides a tag for universal sexing on non-ratite birds, P R Soc B, 263, 1635–1641. 95. Ellegren H., 2001, Hens, cocks and avian sex determination. A quest for genes on Z or W?, EMBO reports, 21, 31, 192-196. 96. Ellegren H., 2000, Evolution of the avian sex chromosomes and their role in sex determination, Trends Ecol Evol, 15, 188–192. 97. Ellegren H., Fridolfsson A.K., 1997, Male-driven evolution of DNA sequences in birds, Nat Genet, 17, 182–184. 103 98. Ellegren H., Hultin-Rosenberg L., Brunstrom B., Dencker L., Kultima K., Scholz B., 2007, Faced with inequality: chicken do not have a general dosage compensation of sex-linked genes, BMC Biology, 5, 40. 99. Elliot L.R., 1978, Sex determination of birds, Iowa State Univ Vet, 40, 100- 103. 100. Ellsworth D.L., Rittenhouse K.D., Honeycutt R.L., 1993, Artifactual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding patterns, Biotechniques, 14, 214–217. 101. Escriba M.J., Vaalbuena D., Remohi J., Pellicer A., Simon C., 2002. New techniques on embryo manipulation, J Reprod Immunol, 55, 149-161. 102. Fan H, Chu JY., 2007, A brief review of short tandem repeat mutation, Genomics Proteomics Bioinform, 5, 7–14. 103. Fechheimer N. S., 1990, Chromosomes of Chickens, Academic Press, London 104. Feduccia A., 1995, Explosive Evolution in Tertiary Birds and Mammals, Science, 267, 5198, 637-638. 105. Fisher R.A., 1930, The General Theory of Natural Selection, Clarendon Press, Oxford, UK 106. Forster C., Sampson S., Chiappe L., Krause D., 1998, The Theropod Ancestry of Birds: New Evidence from the Late Cretaceous of Madagascar, Science, 279, 5358, 1915-1919. 107. Freed L.A., Cann R.L., Diller K., 2009, Sexual dimorphism and the evolution of seasonal variation in sex allocation in the Hawaii Akepa, Evol Ecol Res, 11, 731–57. 108. Fridolfsson A., Ellegren H., 1999, A simple and universal method for molecular sexing of non- ratite birds, J Avian Biol, 30, 116–121. 109. Fridolfsson A., Ellegren H., 2000, Molecular evolution of the avian CHD1 genes on the Z and W chromosomes, Genetics, 155, 1903–1912. 110. Fridolfsson A.K., Cheng H., Copeland N.G., Jenkins N.A., Liu H.C., Raudsepp T., Woodage T., Chowdhary B., Halverson J., Ellegren H., 1998, Evolution of the avian sex chromosomes from an ancestral pair of autosomes, P Natl Acad Sci Usa, 95, 8147–8152. 111. Fujimoto T., Ukeshima A., Kiyofuji R., 1976, The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo, Anat Rec, 185, 139–153. 112. Gahr M., 2001, Distribution of sex steroid hormone receptors in the avian brain, Functional implications for neural sex differences and sexual behaviors, Microsc Res Techniq, 55, 1, 1-11. 104 113. Gahr M., 2003, Male Japanese Quails with female brains do not show male sexual behaviors, P Natl Acad Sci Usa, 100, 7959–7964. 114. Galvão L.M.C., Lages-Silva E., 2008, Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) - A useful tool for genomic characterization of different organisms, in: Walker JM, Rapley R, editors, Molecular biomethods handbook. Totowa, NJ. Humana Press, 133–147 115. Garcelon D., Martell M., Redik P., Buøen L., 1985, Morphometric, karyotypic, and laparoscopic technique for determining sex in bald eagle, J Wildl Manage, 49, 595-599. 116. Garcia – Moreno J., Mindell D., 2000, Rooting a Phylogeny with Homologous Genes on Opposite Sex Chromosomes (Gametologs): A Case Study Using Avian CHD, Mol Biol Evol, 17, 12, 1826–1832. 117. García C.B., Insausti J.A., Gil J.A., de Frutos A., Alcántara M., González J., Cortés M.R., Bonafonte J.I., Arruga M.V., 2008, Comparison of different procedures of DNA analysis for sex identification in the endangered bearded vulture (Gypaetus barbatus), Eur J Wildl Res, 55, 3, 309-312. 118. Gaudet M., Fara A.G., Beritognolo I., Sabatti M., 2009, Allele-specific PCR in SNP genotyping, in: Komar AA, editor, Single nucleotide polymorphisms, methods in molecular biology 578, New York; Humana Press, 415–424. 119. Gaunt, A.S., Oring L.W., eds. 1999, Guidelines to the Use of Wild Birds in Research, 2nd ed. Ornithological Council, Washington, D.C. 120. Genovart M., Louzao M., Igual J.M., Oro D., 2008, Digit length may reveal unusual breeding behaviour in a seabird, Biol Lett, 4, 461– 464. 121. Gilchrist B.M., Haldane J.B.S., 1947, Sex linkage and sex determination in a mosquito, Culex Molestus, Hereditas, 33, 175–190. 122. Glavac D., Dean M., 1993, Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations, Hum Mutat, 2, 404–414 123. Graves J.A.M., Ortega-Ruano J., Slater P.J.B., 1993, Sex ratio of chicks in the Shag Phalacrocorax aristotelis determined by a female-specific band in DNA fingerprinting, Ibis, 135, 470-472. 124. Graves J.A.M., 2003, Sex and death in birds: a model of dosage compensation that predicts lethality of sex chromosome aneuploids, Cytogenet Genome Res, 101, 278-282. 125. Graves J.A.M., Peichel C., 2010, Are homologies in vertebrate sex determination due to shared ancestry or to limited options?, Genome Biol, 11, 205. 105 126. Graves J.A.M., Shetty S., 2000, The evolution of sex chromosomes in higher vertebrates, in Clark M (ed): Comparative Genomics, Kluwer Academic Publishers, Boston, 153–205. 127. Graves J.A.M., 2008, Weird animal genomes and the evolution of vertebrate sex and sex chromosomes, Annu Rev Genet, 42, 565–586 128. Greenwood A.G., 1983, Avian sex determination by laparoscopy, Vet Rec, 112, 105. 129. Greenwood P., 1980, Mating systems, philopatry and dispersal in birds and mammals, Animal Behav, 28, 4, 1140-1162. 130. Griffin, D.K., Robertson, L.B., Tempest, H.G., Skinner, B.M., 2007, The evolution of the avian genome as revealed by comparative molecular cytogenetics, Cytogenet Genome Res, 117, 64–77. 131. Griffiths R., Daan S., Dijkstra C., 1996, Sex identification in birds using two CHD genes, P Roy Soc B-Biol Sci, 263, 1374, 1251-1256. 132. Griffiths R., Double M., Orr K., Dawson R., 1998, A DNA test to sex most birds, Mol Ecol, 7, 1071–1075. 133. Griffiths R., Korn R.M., 1997, A CHD1 gene is Z chromosome linked in the chicken Gallus do domesticus, Gene, 197, 225–229. 134. Griffiths R., Orr K., 1999, The use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) in the isolation of sex-specific markers, Mol Ecol, 8, 671-674. 135. Griffiths R., Phil D., 2000, Sex identification in birds, Semin Avian Exot Pet, 9, 14-26. 136. Griffiths R., 2000, Sex identification using DNA markers, in: Molecular methods in ecology (Backer A. J., Ed.), Blackwell Science, London, 295–321. 137. Griffiths R., Tiwari B., 1993, The isolation of molecular genetic markers for the identification of sex, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 8324- 8326. 138. Griffiths R., Tiwari B., 1995, Sex of the last wild Spix’s macaw, Nature, 375, 454. 139. Guichoux E., Lagache L., Wagner S., Chaumeil P., Léger P., Lepais O., Lepoittevin C., Malausa T., Revardel E, Salin F., Petit R.J., 2011, Current trends in microsatellite genotyping, Mol Ecol Resour, 11, 591–611. 140. Guioli S., Lovell-Badge R., 2007, PITX2 controls asymmetric gonadal development in both sexes of the chick and can rescue the degeneration of the right ovary, Development, 134, 4199–4208. 141. Hake L., O'Connor C., 2008, Genetic Mechanisms of Sex Determination, Nature Education, 1, 1. 106 142. Hallgrimsson G.T., Palsson S., Summers R.W., 2008, Bill length: a reliable method for sexing Purple Sandpipers, J Field Ornithol, 79, 87–92. 143. Hamburger V., Hamilton H.L., 1951, A series of normal stages in the development of the chick embryo, J Morphol, 88, 49–92. 144. Han J.I., Jang H.J., Cheong S., Kim S., Park S.R., Na K.J., 2009b, Sex Determination by PCR-RFLP in the Oriental White Stork Ciconia boyciana, Zool Stud, 48, 5, 619-624. 145. Han J.I., Kim J.H., Sim S., Park S.R., Na K.J., 2009a, A Simple and Improved DNA Test for Avian Sex Determinat, Auk, 126, 4, 779−783. 146. Handel C. M., Pajot L.M., Talbot S.L., Sage G.K., 2006, Use of buccal swabs for sampling DNA from nestling and adult birds, Wildlife Soc B, 34, 1094–1100. 147. Handley L.J., Ceplitis H., Ellegren H., 2004, Evolutionary strata on the chicken Z chromosome: implications for sex chromosome evolution, Genetics, 67, 1, 367-376. 148. Harvey M.G., Bonter D.N., Stenzler L.M., 2006, A comparison of plucked feathers versus blood samples as DNA sources for molecular sexing, J Field Ornithol, 77, 136-140. 149. Harz M., Krause M., Bartels T., Cramer K., Rosch P., Popp J., 2008, Minimal Invasive Gender Determination of Birds by Means of UV- Resonance Raman Spectroscopy, Anal Chem, 80, 1080-1086. 150. He P.J., Yu J.Q., Fang S.G., 2005, Sex identification of the black swan (Cygnus atratus) using the locus-specific PCR and implications for its reproduction, Reprod Domest Anim, 40, 196–198. 151. Heinsohn R., Legge S, Endler J.A., 2005, Extreme reversed sexual dichromatism in a bird without sex role reversal, Science, 309, 617–619. 152. Hildebrandt Y., Pitra C., Sommer P., Pinkowski M., 1995, Sex identification in birds of prey by ultrasonography, J Zoo Wildlife Med, 26, 367–376. 153. Hochbaum H.A., 1942, Sex and age identification of ducks by cloacal examination, Trans N Amer Wildl Conf, 7, 299-307 154. Hori T., Asakawa S., Itoh Y., Shimizu N., Mizuno S., 2000, Wpkci encoding an altered form of PKCI is conserved widely on the avian W chromosome and expressed in early female embryos: implication of its role in female sex determination, Mol Biol Cell, 11, 3645–3660. 155. Huang M.C., Lin W.C., Horng Y.M., Rouvier R., Huang C.W., 2003, Female-specific DNA sequences in geese, Brit Poultry Sci, 44, 3, 359–364. 107 156. Hudson Q.J., Smith C.A., Sinclair A.H., 2005, Aromatase inhibition reduces expression of FOXL2 in the embryonic chicken ovary, Dev Dynam, 233, 1052–1055. 157. Idaghdour Y., Broderick D., Korrida A., 2003, Faeces as a source of DNA for molecular studies in a threatened population of great bustards in Morocco, Conserv Genet, 4, 789–792. 158. Ingram K.A., 1980, Otoscope technique for Sexing Birds, in Current Veterinary Therapy VII. (Edit by Kirk RW), W.B. Saunders, Philadelphia, 656-658. 159. Ishimaru Y., Komatsu T., Kasahara M., Katoh-Fukui Y., Ogawa H., Toyama Y., Maekawa M., Toshimori K., Chandraratna R.A.S., Morohashi K., Yoshioka H., 2008, Mechanism of asymmetric ovarian development in chick embryos, Development, 135, 677–685. 160. Ito H., Sudo-Yamaji A., Abe M., Murase T., Tsubota T., 2003, Sex identification by alternative polymerase chain reaction methods in Falconiformes, Zool Sci, 20, 339–344. 161. Itoh Y., Melamed E., Yang X., Kampf K., Wang S., Yehya N., Van Nas A., Replogle K., Band M.R., Clayton DF, Schadt E.E., Lusis A.J., Arnold A.P., 2007, Dosage compensation is less effective in birds than in mammals, J Biol, 6, 2. 162. Jarvi S.I., Farias M.E.M., 2006, Molecular sexing and sources of CHD1-Z/W sequence variation in Hawaiian birds, Mol Ecol Notes, 6, 1003–1005. 163. Jensen T., Mace M., Durrant B., 2011, Sexing of mid-incubation avian embryos as a management tool for zoological breeding programs, Zoo Biol, 31, 6, 694-704. 164. Jensen T., Pernasetti F.M., Durrant B., 2003, Conditions for rapid sex determination in 47 avian species by PCR of genomic DNA from blood, shell-membrane blood vessels, and feathers, Zoo Biol, 22, 561–571. 165. Jodice P.G.R., Lanctot R.B., Gill V.A., Roby D.D., Hatch S.A., 2000, Sexing adult black-legged kittiwakes by DNA, behavior, and morphology, Waterbirds, 23, 405–415. 166. Jones D.M., Samour J.H., Knight J.A., Finch J.M., 1984, Sex determination of monomorphic birds by fiberoptic endoscopy, Vet Rec, 115, 596-598. 167. Jones K.L., Glenn T.C., 2012, Screening of the Gamµ-7 microsatellite locus to determine the sex of captive whooping cranes; updated 1999, Promega Corporation Web site. Available at: http://www.promega.com/resources/articles/pubhub/enotes/screeni 108 ng-of-the-gamu7-microsatellite-locus-to-determine-the-sex-of-captive- whooping-cranes/ Accessed 23 December 2012 168. Kahn N.W., Quinn T.W., 1999, Male-driven evolution among Eoaves? A test of the replicative division hypothesis in a heterogametic female (ZW) system, J Mol Evol, 49, 750–759. 169. Kakavas V.K., Plageras P., Vlachos T.A., Papaioannou A., Noulas V.A., 2008, PCR-SSCP: A method for the molecular analysis of genetic diseases, Mol Biotechnol, 38, 155–163. 170. Kasuga T., Cheng J., Mitchelson K.R., 1995, Metastable single-strand DNA conformational polymorphism analysis results in enhanced polymorphism detection, PCR Methods Appl, 4, 227–33 171. Kelkar Y.D., Strubczewski N., Hile S.E., Chiaromonte F., Eckert K.A., Makova K.D., 2010, What is a microsatellite: a computational and experimental definition based upon repeat mutational behavior at A/T and GT/AC repeats, Genome Biol Evol, 2, 620–635. 172. Kent J., Wheatley S.C., Andrews J.E., Sinclair A.H., Koopman P., 1996, A male-specific role for Sox9 in vertebrate sex determination, Development, 122, 2813–2822. 173. Kesler D., Lopes I., Haig S., 2006, Sex determination of Pohnpei Micronesian Kingfishers using morphological and molecular genetic techniques, J Field Ornithol, 77, 2, 229-232. 174. Kettlewell J.R., Raymond C.S., Zarkower D., 2000, Temperature- dependent expression of turtle Dmrt1 prior to sexual differentiation, Genesis, 26, 174–178. 175. Kobayashi A., Chang H., Chaboissier M.C., Schedl A., Behringer R.R., 2005, Sox9 in testis determination, Ann Ny Acad Sci, 1061, 9–17. 176. Kofiadi I.A., Rebrikov D.V., 2006, Methods for detecting single nucleotide polymorphisms: allele-specific PCR and hybridization with oligonucleotide probe, Russ J Genet, 2006, 42, 16 –26. 177. Koopman P., 2001, Sry, Sox9 and mammalian sex determination, EXS, 91, 25-56. 178. Koopman P., Loffler K.A., 2003, Sex determination: the fishy tale of Dmrt1, Curr Biol, 13, R177–R179. 179. Krackow S., 1995, Potential Mechanisms for sex ratio adjustment in mammals and birds, Biol Rev, 70, 2, 225-241. 180. Kuroda Y., Arai N., Arita M., Teranishi M., Hori T., Harata M., Mizuno S., 2001, Absence of Z-chromosome inactivation for five genes in male chickens, Chromosome Res, 9, 457–468. 109 181. Kuroiwa A., 2009, No final answers yet on sex determination in birds, Nature, 462, 34. 182. Kuroiwa A., Yokomine T., Sasaki H., Tsudzuki M., Tanaka K., Namikawa T., Matsuda Y., 2002, Biallelic expression of Z-linked genes in male chickens, Cytogenet Genome Res, 99, 310-314. 183. Lack D., 1968, Ecological adaptations for breeding in birds, London: Methuen 184. Leader-Williams N., Milner-Gulland E.J., 1993, Policies for the enforcement of wildlife laws: the balance between detection and penalties in Luangwa Valley, Zambia, Conserv Biol, 7, 611–617. 185. Lee J., Tsai L., Hwa P., Chan C., Huang A., Chin S., Wang L., Lin J., Linacre A., Hsieh H., 2010, A novel strategy for avian species and gender identification using the CHD gene, Mol Cell Probe, 24, 27–31. 186. Lee M., Hong Y., Park S., Kim Y., Choi T., Lee H., Min M., 2008, Application of two complementary molecular sexing methods for East Asian bird species, Genes Genom, 30, 365–372. 187. Legendre S., 2004, Age structure, mating system and population viability, in Evolutionary Conservation Biology (eds R. Ferrie`re, U. Dieckmann & D. Couvet), Cambridge University Press, Cambridge, UK, 41– 58. 188. Legendre S., Clobert J., Møller A.P., Sorci G., 1999, Demographic stochasticity and social mating system in the process of extinction of small populations: the case of passerines introduced to New Zealand, Am Nat, 153, 449–463. 189. Lens L., Galbusera P., Brooks T., Waiyaki E., Schenck T., 1998, Highly skewed sex ratios in the critically endangered Taita thrush as revealed by CHD genes, Biodivers Conserv, 7, 869-873. 190. Lessells C.M., Mateman A.C., 1998, Sexing birds using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers, Mol Ecol, 7, 187–195. 191. Lewis S., Benvenuti S., Dall’Antonia L., Griffiths R., Money L., Sherratt T.N., Wanless S., Hamer K.C., 2002, Sex-specific foraging behaviour in a monomorphic seabird, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 269, 1687–93. 192. Li Y.M., Gao Z.X., Li X.H., Wang S., Niemela J., 2000, Illegal wildlife trade in the Himalayan region of China, Biodiv Conserv, 9, 901–918. 193. Lin M., Thorne M.H., Martin I.C.A., Sheldon B.L., Jones R.C., 1995, Development of the gonads in the triploid (ZZW and ZZZ) fowl, Gallus domesticus, and comparison with normal diploid males (ZZ) and females (ZW), Reprod Fert Dev, 7, 1185–1197. 110 194. Lombardo M., Bosman R., Faro C., Houtteman S., 1994, Homosexual Copulations by Male Tree Swallows, Wilson Bull, 106, 3, 555-557. 195. Lorentsen S.H., Røv N., 1994, Sex determination of Antarctic Petrels Thalassoica antarctica by discriminant analysis of morphometric characters, Polar Biol, 14, 2, 143-145. 196. Lunn J., 1948, Chick Sexing, Am Sci, 36, 2, 280-287. 197. MacFarlane G., Blomberg S., Vasey P., 2010, Homosexual behaviour in birds: frequency of expression is related to parental care disparity between the sexes, Anim Behav, 80, 3, 375-390. 198. Malagó Jr W., Heitor M.F., Matheucci Jr E., Medaglia A., Henrique- Silva F., 2002, Large scale sex typing of ostriches using DNA extracted from feathers, BMC Biotechnology, 2, 19. 199. Marks J., Leasure S., 1992, Breeding biology of Tristram’s Storm- Petrel on Laysan Island, Wilsson Bull, 104, 719-731. 200. Marrero P., Fregel R., Cabrera V., Nogales M., 2009, Extraction of high-quality host DNA from feces and regurgitated seeds: a useful tool for vertebrate ecological studies, Biol Res, 42, 147-151. 201. Graves, J.A.M., 2008, Weird animal genomes and the evolution of vertebrate sex and sex chromosomes, Annu Rev Genet, 42, 565–586. 202. Martin C., Alonso J., Alonso J., Morales M., Pitra C., 2000, An approach to sexing young Great Bustards Otis tarda using discriminant analysis and molecular techniques, Bird Study, 47, 147–153. 203. Matsubara K., Tarui H., Toriba M., Yamada K., Nishida-Umehara C., Agata K., Matsuda Y., 2006, Evidence for different origin of sex chromosomes in snakes, birds, and mammals and step-wise differentiation of snake sex chromosomes, PNAS, 103, 48, 18190-18195. 204. Maurer G., Beck N., Double M.C., 2010, A ‘feather-trap’ for collecting DNA samples from birds, Mol Ecol Res, 10, 129-134. 205. Mays H., Doucet S., Yao C.T., Yuan H.W., 2006, Sexual dimorphism and dichromatism in Steere’s Liocichla (Liocichla steerii), J Field Ornithol, 77, 4, 437–443. 206. McCarrey J.R., Abbott U.K., 1979, Mechanisms of genetic sex determination, gonadal sex differentiation and germ-cell development in animals, Adv Genet, 20, 217–289. 207. McDonald S.E., 1996, Endoscopy. In: Rosskopf, W.J., Woerpel, R.W. (Eds.), Disease of cage and aviary birds, William and Wilkins Co., Baltimore, 699–717. 208. McMillan M., 1988, Imaging of Avian Urogenital Disorders, AAV Today, 2, 2, 74-82. 111 209. McQueen, H.A., Clinton, M., 2009, Avian sex chromosomes: dosage compensation matters, Chromosome Res, 17, 687–697. 210. McVean G.T., Hurst L.D., 1997, Evidence for a selectively favourable reduction in the mutation rate of the X chromosome, Nature, 386, 388–395. 211. Melamed E., Arnold A.P., 2007, Regional differences in dosage compensation on the chicken Z chromosome, Genome Biol, 8, R202. 212. Mendenhall C., Sekercioglu C., Brenes F., 2010, Using interpubic distance for sexing Manakins in the field, J Field Ornithol, 81, 49–63. 213. Mine O.M., Mochakana M.E., Mpapho T., Motlhanka D.T.M., Kgwatalala P., 2002, Application of a sex identification technique in juvenile ostriches and its potential application in Botswana, S Afr J Anim Sci, 32, 160–163. 214. Mittwoch U., 2005, Sex Determination in Mythology and History, Arq Bras Endocrinol Metab, 49, 1, 7-13. 215. Miyaki C.Y., Duarte M.B., Caparroz R., Nunes A.V., Wajntal A., 1997, Sex identification of South American Parrots (Psittacidae, Aves) using the human minisatellite probe 33.15, Auk, 114, 516-520. 216. Miyata T., Hayashida H., Kuma K., Mitsuyasu K., Yasunaga T., 1987, Male-driven molecular evolution: a model and nucleotide sequence analysis, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol, 52, 863–867. 217. Mizuno S., Kunita R., Nakabayashi O., Kuroda Y., Arai N., Harata M., Ogawa A., Itoh Y., Teranishi M., Hori T., 2002, Z and W chromosomes of chickens: studies on their gene functions in sex determination and sex differentiation, Cytogenet Genome Res, 99, 236–244. 218. Mizuta T., Yamada H., Lin R., Yodogawa Y., Okanoya K., 2003, Sexing White-rumped Munias in Taiwan, using morphology, DNA and distance calls, Ornithol Sci, 2, 97–102. 219. Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A., Petry K.G., Bonnet J., Vidal R., Cabrita J., Mégraud F., 1997, Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model, J Clin Microbiol, 35, 4, 995- 998. 220. Morinha F., Cabral J.A., Bastos E., 2012, Molecular sexing of birds: A comparative review of polymerase chain reaction (PCR)-based methods, Theriogenology, 4, 1, 703–714. 221. Morinha F., Magalhães P., Ferro A., Guedes-Pinto H., Rodrigues R., Bastos E., 2011, Advances in molecular sexing of birds: a highresolution melting-curve analysis based on CHD1 gene applied to Coturnix spp., Ann Zool Fenn, 48, 371–375. 112 222. Murray B.G., 1991, Measuring Annual Reproductive Success, with Comments on the Evolution of Reproductive Behavior, Auk, 108, 4, 942- 952. 223. Naim D.M., Nor S.A.M., Baharuddin M.H., 2011, Non-invasive sex identification of the white-bellied sea eagle (Haliaeetus leucogaster) through genetic analysis of feathers, Genet Mol Res, 10, 4, 2505-2510. 224. Nakabayashi O., Kikuchi H., Kikuchi T., Mizuno S., 1998, Differential expression of genes for aromatase and estrogen receptor during the gonadal development in chicken embryos, J Mol Endocrinol, 20, 193–202. 225. Nakamura D., Tiersch T.R., Douglass M., Chandler R.W., 1990, Rapid identification of sex in birds by flow cytometry, Cytogenet Cell Genet, 53, 201-205. 226. Nanda I., Kondo M., Hornung U., Asakawa S., Winkler C., Shimizu A., Shan Z., Haaf T., Shimizu N., Shima A., Schmid M., Schartl M., 2002, A duplicated copy of DMRT1 in the sex-determining region of the Y chromosome of the medaka, Oryzias latipes, PNAS, 99, 18, 11778–11783 227. Nanda I., Zend-Ajusch E., Shan Z., Grützner F., Schartl M., Burt D.W., Koehler M., Fowler V.M., Goodwin G., Schneider W.J., Mizuno S., Dechant G., Haaf T., Schmid M., 2000, Conserved synteny between the chicken Z sex chromosome and human chromosome 9 includes the male regulatory gene DMRT1: a comparative (re)view on avian sex determination, Cytogenet Cell Genet, 89, 67–78. 228. Nanda I., Shan Z., Schartl M., Burt D.W., Koehler M., Nothwang H., Grutzner F., Paton I.R., Windsor D., Dunn I., Engel W., Staeheli P., Mizuno S., Haaf T., Schmid M., 1999, 300 million years of conserved synteny between chicken Z and human chromosome 9, Nature Genetics, 21, 258– 259. 229. Nesje M., Røed K.H., 2000, Sex identification in falcons using microsatellite DNA markers, Hereditas, 132, 261–263. 230. Ngun T.C., Ghahramani N., Sanchez F.J., Bocklandt S., Vilain E., 2011, The genetics of sex differences in brain and behavior, Front Neuroendocrinol, 32, 227–246. 231. Nielsen S., Houe H., Thamsborg S., Bitsch V,. 2000, Comparison of two enzyme-linked immunosorbent assays for serologic diagnosis of paratuberculosis (Johne’s disease) in cattle using different subspecies strains of Mycobacterium avium, J Vet Diagn Invest, 13, 164–166. 232. Nishikimi H., Kansaku N., Saito N., Usami M., Ohno Y., Shimada K., 2000, Sex differentiation and mRNA expression of P450c17, P450arom and AMH in gonads of the chicken, Mol Reprod Dev, 55, 20–30. 113 233. Normile D., 2004, Invasive species—expanding trade with China creates ecological backlash, Science, 306, 968–969. 234. O’Neill M., Binder M., Smith C., Andrews J., Reed K., Smith M., Millar C., Lambert D., Sinclair A., 2000, ASW, a gene with conserved avian W- linkage and female specific expression in chick embryonic gonad, Dev Genes Evol, 210, 243–249. 235. Ogawa A., Solovei I., Hutchison N., Saitoh Y., Ikeda J., Macgregor H., Mizuno S., 1997, Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing Carinatae birds, Chromosome Res, 5, 93–101. 236. Oguma K., 1938, Studies on sauropsid chromosomes, V Annot Zool Japan, 17, 612–622. 237. Ohno S., Stenius C., Christian L.C., Becak W., Becak M.L., 1964, Chromosomal uniformity in the avian subclass Carinatae, Chromosoma, 15, 280–288 238. Ohno S., 1967, Sex chromosomes and sex-linked genes, Springer, New York. 239. Ong A., Vellayan S., 2008, An evaluation of CHDspecific primer sets for sex typing of birds from feathers, Zoo Biol, 27, 62–69. 240. Oreal E., Pieau C., Mattei M.G., Josso N., Picard J.Y., Carre-Eusebe D., Magre S., 1998, Early expression of AMH in chicken embryonic gonads precedes testicular SOX9 expression, Dev Dynam, 212, 522–532. 241. Owens I., 2002, Male-only care and classical polyandry in birds: phylogeny, ecology and sex differences in remating opportunities, Phil Trans R Soc Lond B, 357, 283-293. 242. Parks K.P., Seidle H., Wright N., Sperry J.B., Bieganowski P., Howitz K., Wright D.L., Brenner C., 2004, Altered specificity of Hint-W123Q supports a role for Hint inhibition by ASW in avian sex determination, Physiol Genomics, 20, 12–14. 243. Parsons B.L., Heflich R.H., 1997, Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations, Mutat Res, 387, 97–121. 244. Payne R.B., 1979, Sexual selection and intersexual differences in variance of breeding success, Am Nat, 114, 447–466. 245. Pazin M.J., Kadonaga J.T., 1997, SWI2/SNF2 and Related Proteins: ATP-Driven Motors That Disrupt-Protein–DNA Interactions?, Cell, 88, 737–740. 114 246. Perrin F.M.R., Stacey S., Burgess A.M.C., Mittwoch U., 1995, A quantitative investigation of gonadal feminization by diethylstilbestrol of genetically male embryos of the quail, J Reprod Fertil, 103, 223-226. 247. Peter H.U., Kaiser M., Gebauer A., 1991, Breeding Ecology of the Southern Giant Petrels Macronectes giganteus on King George Island (South Shetland Islands, Antarctic), Zool Jahrb Abt Anat Ontog Tiere, 118, 465-477. 248. Peters D., Grubb T., 1983, An Experimental Analysis Of Sex- Specific Foraging In The Downy Woodpecker, Picoides Pubescens, Ecology, 64, 6, 1437-1443. 249. Petite J.N., Kegelmeyer A.E., 1992, Sex Determination of chick embryos using a W chromosome-specific oligonucleotide probe and PCR, Proceedings of the XIX World’s Poultry Congress Amsterdam, 531 250. Podos J., 2001, Correlated evolution of morphology and vocal signal structure in Darwin’s finches, Nature, 409, 185–188. 251. Prus S.E., Schmutz S.M., 1987, Comparative efficiency and accuracy of surgical and cytogenetic sexing in Psittacines, Avian Dis, 31, 2, 420-424. 252. Quintana F., Somoza G., Uhart M., Cassará C., Gandini P., Frere E., 2003, Sex determination of adult Rock Shags by molecular sexing and morphometric parameters, J Field Ornithol, 74, 4, 370-375. 253. Ramos P.S., Bastos E., Mannan R.W., Guedes-Pinto H., 2009, Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism applied to sex identification of Accipiter cooperii, Mol Cell Probe, 23, 115- 118. 254. Raudsepp T., Lee E.J., Kata S.R., Brinkmeyer C., Mickelson J.R., Skow L.C., Womack J., Chowdhary B., 2004, Exceptional conservation of horse- human gene order on X chromosome revealed by high-resolution radiation hybrid mapping, Proc Natl Acad Sci USA, 101, 2386–2391. 255. Raymond C.S., Kettlewell J.R., Hirsch B., Bardwell V.J., Zarkower D., 1999, Expression of Dmrt1 in the genital ridge of mouse and chicken embryos suggests a role in vertebrate sexual development, Dev Biol, 215, 208–220. 256. Reynolds S.J., Martin G.R., Wallace L.L., Wearn C.P., 2008, Sexing sooty terns on Ascension Island frommorphometric measurements, J Zool, 274, 1, 2-8. 257. Risser A.C., 1971, A Technique for Performing Laparotomy on Small Birds, Condor, 73, 376-379. 115 258. Robertson B., Minot E., Lambert D., 1999, Molecular sexing of individual kakapo, Strigops habroptilus Aves, from faeces, Mol Ecol, 8, 8, 1349-1350. 259. Robertson B.C., Gemmell N.J., 2006, PCR-based sexing in conservation biology: Wrong answers from an accurate methodology?, Conserv Genet, 7, 267–271. 260. Rodriguez-Leon J., Rodriguez Esteban C., Marti M., Santiago-Josefat B., Dubova I., Rubiralta X., Izpisua Belmonte J.C., 2008, Pitx2 regulates gonad morphogenesis, P Natl Acad Sci Usa, 105, 11242–11247. 261. Romanoff A.L., 1960, The Avian Embryo, Macmillan, New York 262. Rosenthal N.F., Ellis H., Shioda K., Mahoney C., Coser K.R., Shioda T., 2010, High-throughput applicable genomic sex typing of chicken by TaqMan real-time quantitative polymerase chain reaction, Poult Sci, 89,1451–1456. 263. Ross Diana G.F., Bowles J., Koopman P., Lehnert S., 2008, New insights into SRY regulation through identification of 5' conserved sequences, BMC Mol Biol, 9,85. 264. Sabo T.J., Kesseli R., Halverson J.L., Nisbet I.C.T., Hatch J.J., 1994, PCR-based method for sexing roseate terns (Sterna dougallii), Auk, 111, 1023-1027. 265. Sacchi P., Soglia D., Maione S., Meneguz G., Campora M., Rasero R., 2004, A non-invasive test for sex identification in short-toed eagle (Circaetus gallicus), Mol Cell Probes, 18, 193-196. 266. Sacchia P., Sogliaa D., Maionea S., Meneguza G., Camporab M., Raseroa R., 2004, A non-invasive test for sex identification in Short-toed Eagle (Circaetus gallicus), Mol Cell Probes, 18, 193–196. 267. Saitoh Y., Saitoh H., Ohtomo K., Mizuno S., 1991, Occupancy of the majority of DNA in the chicken W-chromosome by bent-repetitive sequences, Chromosoma, 101, 32-40. 268. Salem H.H., Ali B.A., Huang T.H., Qin D.N., 2005, Use of randomly amplified polymorphic DNA markers in poultry research, Int J Poult Sci, 4, 804–811. 269. Sarrazin F., Legendre S., 2000, Demographic approach to releasing adults versus young in reintroductions, Conserv Biol, 14, 488–500. 270. Sato Y., Sugie R., Tsuchiya B., Kameya T., Natori M., Mukai K., 2001, Comparison of the DNA Extraction Methods for Polymerase Chain Reaction Amplification from Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissues, Diagn Mol Pathol, 10, 4, 265–271. 116 271. Satterfield W.C., 1980, Diagnostic laparoscopy in birds, In Current Veterinary Therapy VII. (Edit by Kirk RW), W.B. Saunders, Philadelphia, 659-661. 272. Scheib D., 1983, Effects and role of estrogens in avian gonadal differentiation, Differentiation, 23(Suppl.), S87–S92. 273. Schlinger B., 1997, Sex Steroids and Their Actions on the Birdsong System, J Neurobiol, 33, 5, 619-631. 274. Schlinger B., 1998, Sexual Differentiation Of Avian Brain And Behavior: Current Views on Gonadal Hormone-Dependent and Independent Mechanisms, Annu Rev Physiol, 60, 407-429. 275. Scholz B., Kultima K., Mattsson A., Axelsson J., Brunstrom B., Halldin K., Stigson M., Dencker L., 2006, Sex-dependent gene expression in early brain development of chicken embryos, BMC Neurosci, 7, 12. 276. Segelbacher G., 2002, Noninvasive genetic analysis in birds: testing reliability of feather samples, Mol Ecol Notes, 2, 367-369. 277. Seki S.I., 2003, Molecular sexing of individual Ryukyu Robins Erithacus komadori using buccal cells as a non-invasive source of DNA, Ornithol Sci, 2, 135–137. 278. Sekido R., Lovell-Badge R., 2008, Sex determination involves synergistic action of SRY and SF1 on a specific Sox9 enhancer, Nature, 453, 930–934. 279. Serventy D.L., 1956, A method of sexing petrels in field observations, Emu, 56, 213-215. 280. Shaffer C.D., Wallrath L.L., Elgin S.C.R., 1993, Regulating genes by packaging domains: bits of heterochromatin in euchromatin?, Trends Genet, 9, 35–37. 281. Shan Z., Nanda I., Wang Y., Schmid M., Vortkamp A., Haaf T., 2000, Sex-specific expression of an evolutionarily conserved male regulatory gene, DMRT1, in birds, Cytogenet Cell Genet, 89, 252–257. 282. Sheldon B., 1998, Recent studies on avian sex ratios, Heredity, 80, 397-402. 283. Shetty S., Kirby P., Zarkower D., Graves J.A.M., 2002, DMRT1 in a ratite bird: evidence for a role in sex determination and discovery of a putative regulatory element, Cytogenet Genome Res, 99, 245–251. 284. Shi S.R., Datar R., Liu C., Wu L., Zhang Z., Cote R., Taylor C., 2004, DNA extraction from archival formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: heat-induced retrieval in alkaline solution, Histochem Cell Biol, 122, 211–218. 117 285. Shibata K., Takase M., Nakamura M., 2002, The Dmrt1 expression in sex-reversed gonads of amphibians, Gen Comp Endocrinol, 127, 232–241. 286. Shimmin L.C., Chang B.H., Li W.H., 1993, Male-driven evolution of DNA sequences, Nature, 362, 745–747. 287. Shizuka D., Lyon B., 2008, Improving the reliability of molecular sexing of birds using a W-specific marker, Mol Ecol Resour, 8, 1249–1253. 288. Shoemaker C., Ramsey M., Queen J., Crews D., 2007, Expression of Sox9, Mis, and Dmrt1 in the gonad of a species with temperaturedependent sex determination, Dev Dynam, 236, 1055–1063. 289. Sibley C.G., Ahlquist J.E., Monroe B.L., 1988, A classification of the living birds of the world based on DNA-DNA hybridization studies, Auk, 105, 409-423. 290. Silva K.V., Lôbo-Hajdu G., Alves M.A., 2011, Sex determination in Turdus amaurochalinus (Passeriformes: Muscicapidae): morphometrical analysis supported by CHD gene, Rev Biol Trop, 59, 789–794. 291. Singh P.B., Miller J.R., Pearce J., Kothary R., Burton R.D., Paro R., James T.C., Gaunt S.J., 1991, A sequence motif found in a Drosophila heterochromatin protein is conserved in animals and plants, Nucleic Acids Res, 19, 789–794. 292. Skaletsky H., Kuroda-Kawaguchi T., Minx P.J., Cordum H.S., Hillier L., Brown L.G., Repping S., Pyntikova T., Ali J., Bieri T., Chinwalla A., Delehaunty A., Delehaunty K., Du H., Fewell G., Fulton L., Fulton R., Graves T., Hou S.F., Latrielle P., Leonard S., Mardis E., Maupin R., McPherson J., Miner T., Nash W., Nguyen C., Ozersky P., Pepin K., Rock S., Rohlfing T., Scott K., Schultz B., Strong C., Tin-Wollam A., Yang S.P., Waterston R.H., Wilson R.K., Rozen S., Page D.C., 2003, The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes, Nature, 423, 825–837. 293. Slagsvold T., Hansen B., Johannessen L., Lifjeld J., 2002, Mate choice and imprinting in birds studied by cross-fostering in the wild, Proc R Soc Lond B, 269, 1449-1455. 294. Smith A., 2010, Sex determination in birds: a review, Emu, 110, 4, 364-377. 295. Smith K.F., Sax D.F., Lafferty K.D., 2006, Evidence for the role of infectious disease in species extinction and endangerment, Conserv Biol, 20, 1349–1357. 296. Smith C.A., Sinclair A.H., 2004, Sex determination: insights from the chicken, BioEssays, 26, 120–132. 118 297. Smith C.A., McClive P.J., Hudson Q., Sinclair A.H., 2005, Malespecific cell migration into the developing gonad is a conserved process involving PDGF signalling, Dev Biol, 284, 337–350. 298. Smith C.A., McClive P.J., Western P.S., Reed K.J., Sinclair A.H., 1999, Conservation of a sex-determining gene, Nature, 402, 601–602. 299. Smith C. A., Roeszler K.N., Hudson Q.J., Sinclair A.H., 2007, Avian sex determination: what, when and where?, Cytogenet Genome Res, 117, 165–173. 300. Smith C.A., Roeszler K.N., Ohnesorg T., Cummins D.M., Farlie P.G., Doran T.J., Sinclair A.H., 2009a, The avian Z-linked geneDMRT1 is required for male sex determination in the chicken, Nature, 461, 267–271. 301. Solari A.J, 1994, Sex Chromosomes and Sex Determination in Vertebrates, CRC Press, London, 43-73. 302. Stainer G., Bartels T., Krautwald-Junghanns M.E., Boos A., Koch E., 2010, Sexing of turkey poults by Fourier transform infrared spectroscopy, Anal Bioanal Chem, 396, 465–470. 303. Stefos K., Arrighi F.E., 1971, Hetechromosome in birds, Expt Cell Rec, 68, 228-231. 304. Stiglec R., Ezaz T., Graves J., 2007, A new look at the evolution of avian sex chromosomes, Cytogenet Genome Res, 117, 103–109. 305. Stokes D.G., Perry R.P., 1995, DNA-binding and chromatin localization properties of CHD1, Mol Cell Biol, 15, 5, 2745–2753. 306. Suh A., Kriegs J.O., Brosius J., Schmitz J., 2011, Retroposon insertions and the chronology of avian sex chromosome evolution, Mol Biol Evol, 28, 2993–2997. 307. Swanson D.A., Rappole J.H., 1992, Determining the sex of adult white-winged doves by cloacal characteristics, NABB, 17, 137–139. 308. Sweeney T., Saunders P.T.K., Millar M.R., Brooks A.N., 1997, Ontogeny of anti-mullerian hormone, 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase and androgen receptor expression during ovine fetal gonadal development, J Endocrinol, 153, 27–32. 309. Swengel S.R., 1996, Special techniques, C: Sex determination, in: Cranes: Their Biology, Husbandry, and Conservation; Ellis, D.H.; Gee, G.F.; Mirande, C.M. Eds.; National Biological Service/International Crane Foundation: United States of America, 223-231. 310. Takagi N., Sasaki M., 1974, A phylogenetic study of bird karyotypes, Chromosoma, 46, 91–120. 119 311. Tegelstrom H., Ryttman H., 1981, Chromosomes in birds (Aves): evolutionary implications of macro- and microchromosome numbers and lenghts, Hereditas, 94, 225-233. 312. Teranishi M., Shimada Y., Hori T., Nakabayaski O., Kikuchi T., Macleod T., Pym R., Sheldon B., Solovei I., Macgregor H., Mizuno S., 2001, Transcripts of the MHM region on the chicken Z chromosome accumulate as non-coding RNA in the nucleus of female cells adjacent to the DMRT1 locus, Chromosome Res, 9, 147–165. 313. Thorne M.H., Sheldon B.L., 1993, Triploid intersex and chimeric chickens: Useful models for studies of avian sex determination, in: Sex Chromosomes and Sex-Determining Genes, Reed K.C. and Graves J.A.M. (eds), Harwood Academic Publishers, Australia, 199–205 314. Tiersch T.R., Mumme R.L., Chandler R.W., Nakamura D., 1991, The Use of Flow Cytometry for Rapid Identification of Sex in Birds, Auk, 108, 1, 206-208. 315. Tone M., Sakaki Y., Hashiguchi T., Mizuno S., 1984, Genus specificity and extensive methylation of the W-chromosome- specific repetitive DNA-sequences from the domesticfowl, Gallus-gallus-domesticus, Chromosoma, 89, 228–237 316. Tone M., Nakano N., Takao E., Narisawa S., Mizuno S., 1982, Demonstration of W chromosome-specific repetitive DNA sequences in the domestic fowl, Gallus g. domesticus, Chromosoma 86, 551–569. 317. Trivers R.L., 1972, Parental investment and sexual selection, in Sexual Selection and the Descent of Man (ed. B. Campbell), Aldine, Chicago, USA, 136–179. 318. Turner L., 1953, A rapid method of sexing Canada geese, J Wildlife Manage, 17, 542–543. 319. Vaillant S., Dorizzi M., Pieau C., Richard-Mercier N., 2001, Sex reversal and aromatase in chicken, J Exp Zool, 290, 727–740. 320. Vali N., Doosti A., 2011, Molecular study for the sex identification in Japanese quails (Coturnix Japonica), Afr J Biotechnol, 10, 80, 18593-18596. 321. Vallisneri M., Quaglia A., Stagni A.M., Zaccanti F., 1990, Differences between male and female protogonia in chick embryos before sex differentiation of the gonads, Bollettino della Societa Italiana di Biologia Sperimentale, 66, 91–98. 322. Veyrunes F., Waters P., Miethke P., Rens W., McMillan D., Alsop A., Grützner F., Deakin J., Whittington C., Schatzkamer K., Kremitzki C., Graves T., Ferguson-Smith M., Warren W., Graves J.A.M., 2008, Bird-like sex 120 chromosomes of platypus imply recent origin of mammal sex chromosomes, Genome Res, 18, 965-973. 323. Volff J.N., Kondo M., Schartl M., 2003, Medaka dmY/dmrt1Y is not the universal primary sex-determining gene in fish, Trends Genet, 19, 196–199. 324. Volodin I., Kaiser M., Matrosova V., Volodina E., Klenova A., Filatova O., Kholodova M., 2009, The Technique Of Noninvasive Distant Sexing For Four Monomorphic Dendrocygna Whistling Duck Species By Their Loud Whistles, Bioacoustics, 18, 277–290. 325. Vos P., Hogers R., Bleaker M., Reijans M., Van De Lee T., Hornes M., Fritjers A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M., 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Res, 23, 4407-4414. 326. Vučićević M., Stevanović J., Vučićević I., Pantelić A., Đelić N., Resanović R., Stanimirović Z., 2012a, Sex determination in game birds management, Proceedings of the International symposium, on hunting, »Мodern aspects of sustainable management of game population« Zemun- Belgrade, Serbia, 22. – 24. June, 91-94. 327. Vučićević M., Stevanović J., Simeunović P., Vučićević I., Đelić N., Stanimirović Z., Stojić V., 2012b, Analysis of the CHD gene for sex determination of protected bird species, Proceedings of the International symposium on hunting, »Мodern aspects of sustainable management of game population«, June 22–24, Zemun-Belgrade, Serbia, 83-86 328. Wagner R.H., 1996, Male-male mountings by a sexually monomorphic bird: mistaken identity or fighting tactic?, J Avian Biol, 2, 7, 209-214. 329. Wang L., Chen C., Lee H., Li S., Lir J., Chin S., Pu C., Wang C., 2007. Sexing a wider range of avian species based on two CHD1 introns with a unified reaction condition, Zoo Biol, 26, 425–431. 330. Warchol G.L., 2004, The transnational illegal wildlife trade, Crim Justice Stud, 1, 57–73. 331. Wartenberg H., Lenz E., Schweikert H.U., 1992, Sexual differentiation and the germ cell in sex reversed gonads after aromatase inhibition in the chicken embryo, Andrologia, 24, 1–6. 332. Waters P., Wallis M., Graves J.A.M., 2007, Mammalian sex—Origin and evolution of the Y chromosome and SRY, Semin Cell Dev Biol, 18, 389–400. 333. Wellbrock A., Bauch C., Rozman J., Witte K., 2012, Buccal swabs as a reliable source of DNA for sexing young and adult Common Swifts (Apus apus), J Ornithol, 153, 3, 991-994. 121 334. West S.A., Sheldon B.C., 2002, Constraints on the evolution of sex ratio adjustment, Science, 295, 1685–1688. 335. Whittingham L.A., Dunn P.O., 2000, Offspring sex ratios in tree swallows: females in better condition produce more sons, Mol Ecol, 9, 1123–1129. 336. Williams J.G.K., Hanafey M.K., Rafalski J.A., Tingey S.V., 1993, Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers, in: Methods in Enzymology (WU R., Ed.), Academic Press, San Diego, 218, 704–740. 337. Woodage T., Basrai M., Baxevanis A., Hieter P., Collins F., 1997, Characterization of the CHD family of proteins, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 11472–11477. 338. Wu C.P., Horng Y.M., Wang R.T., Yang K.T., Huang M.C., 2007, A novel sex-specific DNA marker in Columbidae birds, Theriogenology, 67, 328–333. 339. Yamashina Y., 1994, Karyotype studies in birds, Cytologia, 12, 270– 296. 340. Yamauchi K., Hamasaki S., Miyazaki K., Kikusui T., Takeuchi Y., Mori Y., 2000, Sex Determination Based on Fecal DNA Analysis of the Amelogenin Gene in Sika Deer (Cervus nippon), J Vet Med Sci, 62, 6, 669– 671. 341. Zaccanti F., Vallisneri M., Quaglia A., 1990, Early aspects of sex differentiation in the gonads of chick embryos, Differentiation, 43, 71–80 342. Zhao Y., Kong X., Robertson H.A., Saul E.K., Nia L.V., Chan C.H., Chambers K.G., 2009, Combining morphometric and molecular approaches improves accuracy of sexing in the kakerori (Pomarea dimidiata) on Rarotonga, Cook Islands, Notornis, 56, 49–53. 343. Zhao D., McBride D., Nandi S., McQueen H.A., McGrew M.J., Hocking, P.M., Lewis P.D., Sang H.M., Clinton M., 2010, Somatic sex identity is cell autonomous in the chicken, Nature, 464, 237–242. 9. ПРИЛОЗИ Прилог 1. Списак врста птица од којих је узорковано перје за анализу пола, број узорака, успешних и неуспешних анализа Пeрje Ред Врста Успело Неуспело Недет.* Укупно Anseriformes Cygnus atratus 14 4 0 18 Cygnus melancoryphus 6 2 0 8 Branta canadensis 0 0 6 6 Branta sandvicensis 0 0 6 6 Alopochen aegyptiacus 6 0 0 6 Cereopsis novaehollandiae 4 0 0 4 Cygnus olor 11 0 0 11 Anser canagica 1 0 0 1 Anser fabalis 1 0 0 1 Anser indicus 0 0 2 2 Anser anser 4 0 0 4 Chauna torquata 4 0 0 4 Ciconiiformes Platalea leucorodia 2 2 0 4 Ajaia ajaja 2 1 0 3 Eudocimus ruber 0 0 3 3 Leptoptilos crumeniferus 3 0 0 3 Ciconia ciconia 2 0 0 2 Falconiformes Neophron percnopterus 6 1 0 7 Gyps fulvus 13 3 0 16 Haliaeetus albicilla 7 0 0 7 Milvus milvus 2 0 0 2 Buteo buteo 1 0 0 1 Falco subbuteo 4 0 0 4 Aquila heliaca 1 0 0 1 Coraciiformes Bucorvus leadbeateri 10 0 0 10 Casuariiformes Dromaius novaehollandiae 0 0 5 5 Casuarius casuarius 0 0 2 2 Rhea americana 0 0 5 5 Columbiformes Ocyphaps lophotes 2 0 0 2 Streptopelia decaocto 2 0 0 2 Columba livia 1 1 0 2 123 Columba arquatrix 2 0 0 2 Psittaciformes Amazona aestiva 16 2 0 18 Amazona leucocephala 1 0 0 1 Amazona ochrocephala 6 0 0 6 Amazona finchi 1 0 0 1 Psittacus erithacus 63 3 0 66 Ara ararauna 41 4 0 45 Aratinga erythrogenys 10 6 0 16 Amazona albifrons 1 0 0 1 Cacatua sulphurea 1 0 0 1 Amazona amazonica 10 0 0 10 Cacatua moluccensis 1 0 0 1 Cacatua alba 5 0 0 5 Barnardius zonarius 4 0 0 4 Trichoglossus haematodus 4 0 0 4 Pyrrhura molinae 2 0 0 2 Pionites melanocephala 2 0 0 2 Ara chloroptera 7 0 0 7 Aratinga acuticaudata 3 0 0 3 Aprosmictus erythropterus 4 0 0 4 Lorius lory 8 0 0 8 Nymphicus hollandicus 1 0 0 1 Poicephalus senegalus 1 0 0 1 Aratinga aurea 1 0 0 1 Probosciger aterrimus 3 0 0 3 Cacatua galerita 3 0 0 3 Ara severa 12 0 0 12 Aratinga jandaya 3 0 0 3 Coracopsis nigra 2 0 0 2 Cyanoliseus patagonus 2 0 0 2 Aratinga solstitialis 4 1 0 5 Melopsittacus undulatus 0 2 0 2 Strigiformes Bubo bubo 0 0 4 4 Tyto alba 4 0 0 4 Passeriformes Corvus corax 3 1 0 4 Lamprotornis superbus 4 0 0 4 Corvus frugilegus 2 0 0 2 Serinus canaria 1 0 0 1 Gruiformes Balearica regulorum 2 0 0 2 Cuculiformes Tauraco persa 0 3 0 3 Tauraco hartlaubi 2 0 0 2 Piciformes Ramphastos tucanus 0 0 11 11 Galliformes Acryllium vulturinum 9 0 0 9 Perdix perdix 1 0 0 1 Coturnix coturnix 1 0 0 1 Phasianus colchicus 2 0 0 2 Guttera plumifera 9 0 0 9 124 Gallus gallus 5 0 0 5 Podicipediformes Podiceps cristatus 1 0 0 1 Charadriiformes Scolopax rusticola 1 0 0 1 *Недетерминисано Прилог 2. Списак врста птица код којих је за анализу пола коришћена Taq ДНК полимераза, број узорака, успешних и неуспешних анализа Прoтoкoл 1 Ред Врста Успело Неуспело Недет.* Укупно Anseriformes Cygnus atratus 8 3 0 11 Cygnus melancoryphus 4 3 0 7 Branta canadensis 0 2 4 6 Branta sandvicensis 0 0 6 6 Alopochen aegyptiacus 6 3 0 9 Cereopsis novaehollandiae 4 0 0 4 Cygnus olor 5 1 0 6 Anser indicus 0 2 0 2 Ciconiiformes Platalea leucorodia 4 1 0 5 Ajaia ajaja 2 3 0 5 Eudocimus ruber 0 0 3 3 Leptoptilos crumeniferus 3 0 0 3 Falconiformes Neophron percnopterus 3 1 0 4 Gyps fulvus 3 0 0 3 Haliaeetus albicilla 4 0 0 4 Milvus milvus 2 0 0 2 Coraciiformes Bucorvus leadbeateri 5 1 0 6 Casuariiformes Dromaius novaehollandiae 0 0 5 5 Casuarius casuarius 0 1 0 1 Rhea americana 0 3 3 6 Columbiformes Ocyphaps lophotes 2 0 0 2 Columba arquatrix 2 0 0 2 Psittaciformes Amazona aestiva 2 2 0 4 Amazona leucocephala 2 0 0 2 Psittacus erithacus 22 12 0 34 Ara ararauna 11 6 0 17 Cacatua sulphurea 1 0 0 1 Amazona amazonica 2 2 0 4 Cacatua moluccensis 1 0 0 1 Cacatua alba 1 0 0 1 Pionites melanocephala 2 0 0 2 Ara chloroptera 2 0 0 2 125 Aratinga acuticaudata 5 9 0 14 Aprosmictus erythropterus 3 1 0 4 Nymphicus hollandicus 8 1 0 9 Melopsittacus undulatus 0 2 0 2 Strigiformes Bubo bubo 0 3 0 3 Passeriformes Corvus corax 4 3 0 7 Gruiformes Balearica regulorum 2 1 0 3 Cuculiformes Tauraco persa 0 2 0 2 Piciformes Ramphastos tucanus 0 0 1 1 *Недетерминисано Прилог 3. Списак врста птица код којих је за анализу пола коришћена модификована Taq ДНК полимеразе дизајнирана да буде отпорна на инхибиторе PCR Прoтoкoл 2 Рeд Врстa Успeлo Нeуспeлo Нeдeт.* Укупнo Аnsеrifоrmеs Cygnus atratus 5 2 0 7 Cygnus melancoryphus 4 1 0 5 Branta canadensis 0 0 0 0 Cereopsis novaehollandiae 1 1 0 2 Cygnus olor 7 0 0 7 Anser canagica 1 0 0 1 Anser fabalis 1 0 0 1 Anser anser 5 0 0 5 Chauna torquata 4 0 0 4 Ciconiiformes Ciconia ciconia 2 0 0 2 Falconiformes Neophron percnopterus 3 1 0 4 Gyps fulvus 10 (28)* 0 38 Haliaeetus albicilla 3 0 0 3 Milvus milvus 2 0 0 2 Buteo buteo 1 0 0 1 Falco subbuteo 4 1 0 5 Aquila heliaca 1 0 0 1 Coraciiformes Bucorvus leadbeateri 4 0 0 4 Columbiformes Streptopelia decaocto 2 0 0 2 Columba livia 4 1 0 5 Psittaciformes Amazona aestiva 14 0 0 14 Amazona leucocephala 2 1 0 3 Amazona ochrocephala 6 0 0 6 Amazona finchi 1 0 0 1 Psittacus erithacus 61 10 0 71 Ara ararauna 41 7 0 48 126 Aratinga erythrogenys 2 0 0 2 Amazona albifrons 1 0 0 1 Amazona amazonica 8 1 0 9 Cacatua moluccensis 1 0 0 1 Cacatua alba 6 0 0 6 Barnardius zonarius 4 3 0 7 Trichoglossus haematodus 4 0 0 4 Pyrrhura molinae 2 0 0 2 Pionites melanocephala 2 0 0 2 Ara chloroptera 13 1 0 14 Aratinga acuticaudata 8 9 0 17 Aprosmictus erythropterus 4 0 0 4 Lorius lory 8 0 0 8 Nymphicus hollandicus 1 1 0 2 Poicephalus senegalus 1 0 0 1 Probosciger aterrimus 3 0 0 3 Cacatua galerita 3 0 0 3 Ara severa 11 0 0 11 Aratinga jandaya 3 0 0 3 Coracopsis nigra 2 0 0 2 Cyanoliseus patagonus 2 0 0 2 Aratinga solstitialis 4 1 0 5 Eolophus roseicapilla 4 0 0 4 Strigiformes Bubo bubo 0 0 2 2 Tyto alba 7 0 0 7 Passeriformes Lamprotornis superbus 4 1 0 5 Corvus frugilegus 2 0 0 2 Cuculiformes Tauraco persa 1 0 0 1 Tauraco hartlaubi 2 1 0 3 Piciformes Ramphastos tucanus 0 2 10 12 Galliformes Acryllium vulturinum 9 0 0 9 Perdix perdix 2 0 0 2 Coturnix coturnix 1 0 0 1 Phasianus colchicus 2 0 0 2 Guttera plumifera 9 1 0 10 Gallus gallus 5 0 0 5 Meleagris gallopavo 1 0 0 1 Podicipediformes Podiceps cristatus 1 0 0 1 Charadriiformes Scolopax rusticola 1 0 0 1 *Недетерминисано БИOГРAФИJA Вучићевић Милош рођен је 17. јануара 1985. године у Београду, где је завршио основну и средњу школу. Студиje вeтeринaрскe мeдицинe у Бeoгрaду уписao je 2004. гoдинe, a диплoмирao у новембру 2009. гoдинe, први у свojoj гeнeрaциjи, сa прoсeчнoм oцeнoм 9,38 (дeвeт и 38/100). Од стране Универзитета у Београду додељена му је повеља за студента генерације. Исте године је уписао постдипломске студије на Факултету ветеринарске медицине Универзитета у Београду. Током постдипломских студија положио је све испите предвеђене планом и програмом са просечном оценом 9,47 (девет и 47/100). Пре избора за асистента за предмет Болести живине на Катедри за болести копитара, месоједа, живине и дивљачи Факултета ветеринарске медицине Универзитета у Београду, у новембру 2011. године, радио је на Катедри за биологију као истраживач сарадник у оквиру пројекта Министарства просвете и науке Републике и Србије “Молекуларно-генетичка и еколошка истраживања у заштити аутохтоних анималних генетичких ресурса, очувања добробити, здравља и репродукције гајених животиња и производње безбедне хране” (руководилац проф. др Зоран Станимировић; ев. бр. 46002). Зaхвaљуjући oдличoм успeху нa студиjaмa, биo je дoбитник брojних стипeндиja. Стипендију Министарства просвете Републике Србије је примао у периоду 2005-2007 година, стипендију Фондације за развој научног и уметничког подмлатка у периоду 2007-2008 и 2009-2010, стипендију Фонда за младе таленте Републике Србије у периоду 2008-2009 год. У периоду од 2010. до 2011. године био је стипендиста Министарства просвете, науке и технолошког развоја Републике Србије. Учeствoвao je нa бројним симпoзиjумимa и кoнфeрeнциjaма. Стручних и научних члaнaкa, укупнo 17, публикoвao je у дoмaћим и стрaним чaсoписимa. Од тог броја, четири рада је публиковао у часописима са SCI листе. ИЗJAВA O AУTOРСTВУ Пoтписaни Вучићевић Милош Брoj уписa: Изjaвљуjeм Дa je дoктoрскa дисeртaциja пoд нaслoвoм „Анализа CHD гена птица као молекуларног маркера за детерминацију пола“  рeзултaт сoпствeнoг истрaживaчкoг рaдa,  дa прeдлoжeнa дисeртaциja у цeлини ни у дeлoвимa ниje билa прeдлoжeнa зa дoбиjaњe билo кoje диплoмe прeмa студиjским прoгрaмимa других висoкoшкoлских устaнoвa,  дa су рeзултaти кoнкрeтнo нaвeдeни и  дa нисaм кршиo aутoрскa прaвa и кoристиo интeлeктуaлну свojину других лицa. У Бeoгрaду, Пoтпис дoктoрaндa: 2014. гoдинe ИЗJAВA O ИСTOВETНOСTИ ШTAMПAНE И EЛEКTРOНСКE ВEРЗИJE ДOКTOРСКOГ РAДA Имe и Прeзимe aутoрa: Милош Вучићевић Брoj уписa: Студиjски прoгрaм: дoктoрскe aкaдeмскe студиje Нaслoв рaдa: Анализа CHD гена птица као молекуларног маркера за детерминацију пола. Meнтoр: Доц. др Јевросима Стевановић Пoтписaни Вучићевић Милош Изjaвљуjeм дa je штaмпaнa вeрзиja мoг дoктoрскoг рaдa истoвeтнa eлeктрoнскoj вeрзиjи кojу сaм прeдao зa oбjaвљивaњe нa пoртaлу Дигитaлнoг рeпoзитoриjумa Унивeрзитeтa у Бeoгрaду. Дoзвoљaвaм дa сe oбjaвe мojи лични пoдaци вeзaни зa дoбиjaњe aкaдeмскoг звaњa дoктoрa нaукa, кao штo су имe и прeзимe, гoдинa и мeстo рoђeњa и дaтум oдбрaнe рaдa. Oви лични пoдaци мoгу сe oбjaвити нa мрeжним стрaницaмa дигитaлнe библиoтeкe, у eлeктрoнскoм кaтaлoгу и у публикaциjaмa Унивeрзитeтa у Бeoгрaду. У Бeoгрaду, Пoтпис дoктoрaндa: 2014. гoдинe ИЗJAВA O КOРИШЋEЊУ Oвлaшћуjeм Унивeрзитeтску библиoтeку „Свeтoзaр Maркoвић“ дa у Дигитaлни рeпoзитoриjум Унивeрзитeтa у Бeoгрaду унeсe мojу дoктoрску дисeртaциjу пoд нaслoвoм „Анализа CHD гена птица као молекуларног маркера за детерминацију пола“, кoja je мoje aутoрскo дeлo. Дисeртaциjу сa свим прилoзимa прeдao сaм у eлeктрoнскoм фoрмaту пoгoднoм зa трajнo aрхивирaњe. Mojу дoктoрску дисeртaциjу пoхрaњeну у Дигитaлнoм рeпoзитoриjуму Унивeрзитeтa у Бeoгрaду мoгу дa кoристe сви кojи пoштуjу oдрeдбe сaдржaнe у oдaбрaнoм типу лицeнцe Крeaтивнe зajeдницe (Creative Commons) зa кojу сaм сe oдлучиo. 1. Aутoрствo 2. Aутoрствo - нeкoмeрциjaлнo 3. Aутoрствo - нeкoмeрциjaлнo – бeз прeрaдe 4. Aутoрствo - нeкoмeрциjaлнo –дeлити пoд истим услoвимa 5. Aутoрствo – бeз прeрaдe 6. Aутoрствo – дeлити пoд истим услoвимa У Бeoгрaду, Пoтпис дoктoрaндa: 2014. гoдинe