UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Katedrа zа pаtološku morfologiju mr Ivana VUČIĆEVIĆ EKSPRESIJA ANTIGENA ĆELIJSKE PROLIFERACIJE NA MASTOCITIMA I NJIHOV ZNAČAJ ZA GRADACIJU MASTOCITOMA PASA doktorska disertacija Beograd, 2014. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF VETRINARY MEDICINE Department of Pathology mr Ivana VUČIĆEVIĆ EXPRESSION OF PROLIFERATING CELL ANTIGENS ON MAST CELLS AND THEIR SIGNIFICANCE FOR MAST CELL TUMOR CLASSIFICATION Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Mentor: Dr Sanja Aleksić-Kovačević, redovni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu, Beograd Članovi komisije: Dr Milijan Jovanović, redovni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu, Beograd Dr Nikola Popović, redovni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu, Beograd Dr Zorаn Stаnimirović, redovni profesor Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu, Beograd Dr Svetislav Tatić, redovni profesor Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu, Beograd Datum odbrane: ___________ Beograd REZIME Kutani mastocitomi su jedna od najčešći neoplazmi pasa. Vode poreklo iz kostne srži, iz linije opredeljene za mastocite i pokazuju vrlo promenljivo ponašanje, te je predloženo nekoliko kriterijuma za nji ovu klasifikaciju, uključujući istološku gradaciju i markere proliferacije ćelija Citoplazmatska ekspresija CD117 ili KIT proteina (tirozin kinaza receptor) dovodi se u vezu sa višim stepenima maligniteta mastocitoma i lošijom prognozom Dokazano je da postoji veza između aberantne ekspresije CD117 i postojanja c-kit mutacija, iako mutacije često nisu prisutne kod svih mastocitoma sa aberantnom ekspresijom KIT proteina. Ispitivanjima su obu vaćena 24 kutana mastocitoma i 6 kontrolni uzoraka kože od 30 pasa različitog uzrasta, rase i pola. Kao pozitivna kontrola za c-kit mutaciju korišćen je izolat DNK psa sa mastocitomom za koga je ranije utvrđeno da poseduje navedenu mutaciju Uzorci tkiva fiksiranog u formalinu i ukalupljenog u parafinske blokove, bojeni su hematoksilin-eozinom i toluidin blue metodom, a imunohistohemijski na CD117, Ki-67, PCNA i CD45RA. DNK je izolovana iz istih parafinskih blokova, a primenom PCR metode i korišćenjem specifični prajmera PE1 i PE2 amplifikovan je željeni fragment DNK. Četrnaest od 24 mastocitoma su prema istološkim osobinama svrstana u mastocitome visokog stepena maligniteta, dok su preostalih deset, mastocitomi niskog stepena maligniteta. Kod 7 mastocitoma prisutno je više od šest mitotskih figura na 10 polja velikog uvećanja Prisustvo više od dve multinuklearne ćelije na 10 polja velikog uvećanja uočeno je kod 11 mastocitoma, dok su više od dve ćelije sa bizarnim jedrom na 10 polja velikog uvećanja uočene kod 10 mastocitoma. Osam mastocitoma sadrži više od 10% anaplastični mastocita sa jedrima promera oko 8-10 mikrometara. Od ukupno 24 mastocitoma, devet je Ki-67 pozitivno (7 mastocitomima višeg i 2 mastocitomima nižeg stepena maligniteta), dok se ekspresija PCNA i CD45RA uočava kod svih mastocitoma. Devet mastocitoma višeg stepena maligniteta ispoljava aberantnu citoplazmatsku ekspresiju CD117 Ni kod jednog od ispitanih uzoraka mastocitoma nije detektovano prisustvo c-kit mutacije. Prisustvo mitotskih figura, višejedarni ćelija, bizarnih jedara i kariomegalije, kao i tip ekspresije CD117 predstavljaju preduslov za novu klasifikaciju i ključne prognostičke parametre kod pasa sa mastocitomima. Ključne reči: psi, mastocitom, morfologija, klasifikacija, CD 117, c-kit mutacija Naučna oblast: Veterinarska medicina Uža naučna oblast: Patologija UDK broj: 616-097:599.735.1 SUMMARY Cutaneous mast cell tumours (MCTs) are one of the most common neoplasm in dogs. Originate from the bone marrow, from the mast cells line, but because of its location are being studied within skin tumors. MCTs show a highly variable biologic behavior and therefore several criteria have been proposed for their classification, including histological grading and cell proliferation markers. Cytoplasmic expression of CD117 or KIT protein (tyrosine kinasa receptor) has been found to correlate with higher histological grade and with a worsened prognosis. It has been revealed that there is a conection between the aberrant expression of CD117 and presence of c-kit mutations, although mutations were not present in all mast cell tumors with aberrant expression of KIT protein. Twenty four MCTs and 6 control specimens from 30 dogs of different age, breed and sex were included in this study. DNA isolated from the dog with mast cell tumor which had previously found to has specified mutation was used as a positive control for c-kit mutation. Formalin fixed and paraffin embedded tissue samples were stained with hematoxylin-eosin and toluidin blue and immunohistochemically tested for CD117, Ki-67, PCNA i CD45RA expression. DNA had been extracted from the same paraffin blocks and subsequent polymerase chain reaction amplification was performed using PE1 and PE2 primers. Fourteen of 24 MCTs were histologically high-grade, while ten were classified as a low-grade malignancy. Seven MCTs have more than six mitotic figures in 10 high-power fields. The presence of more than two multinucleated cells in 10 high-power fields was observed in 11 MCTs, while more than two cells with bizarre nuclei in 10 hpf were observed in 10 MCTs. Eight MCTs have more than 10% of neoplastic mast cells with nuclei about 8-10 microns in diameter. Of the total MCTs, 9 tumors are Ki-67 positive (7 mastocytomas of high and 2 mastocytomas of low-grade malignancy), while the expression of PCNA and CD45RA was observed in all 24 MCTs. Nine MCTs of high-grade malignancy showed aberrant cytoplasm labeling for CD117. Mutations of c-kit proto-oncogene were not detected in any of the tested MCTs. The presence of mitotic figures, multinucleated cells, bizarre nuclei and karyomegaly in 10 high-power fields, as well as the pattern of CD117 expression are prerequisite for the new classification and most important prognostic factor in dogs with mast cell tumor. Key Words: dogs, mast cell tumor, morphology, classification, CD117, c-kit mutation Major Field of Study: Veterinary Medicine Special Field of Study: Pathology UDK Number: 616-097:599.735.1 SADRŽAJ 1. UVОD ......................................................................................................... 1 2. PRЕGLЕD LIТЕRАТURЕ ...................................................................... 4 2.1. Mastociti ..................................................................................................... 4 2.1.1. Vrste mastocita............................................................................ 5 2.1.2. Mastocitoza i mastocitomi .......................................................... 8 2.2. Kutani mastocitom pasa ............................................................................. 9 2.2.1. Etiologija ..................................................................................... 9 2.2.2. Incidenca i faktori rizika ............................................................. 10 2.2.3. Patogeneza .................................................................................. 10 2.2.4. Klinička slika .............................................................................. 14 2.2.5. Klasifikacija mastocitoma ........................................................... 17 2.2.6. Nova klasifikacija ....................................................................... 25 2.2.7. Terapija ....................................................................................... 26 2.2.8. Novi pristupi u terapiji ................................................................ 27 3. CILj I ZАDАCI ......................................................................................... 29 4. МАТЕRIЈАL I МЕТОDЕ ........................................................................ 30 4.1. Маtеriјаl ..................................................................................................... 30 4.1.1. Tkivni uzorci ............................................................................... 30 4.1.2. Izolat DNK .................................................................................. 30 4.2. Меtоdе ......................................................................................................... 31 4.2.1. Histološka obrada uzoraka tumora kože .................................... 31 4.2.2. Histološka analiza uzoraka tumora kože ..................................... 31 4.2.3. Imunohistohemijska metoda ....................................................... 33 4.2.4. Morfometrijska analiza ............................................................... 36 4.2.5. Metode molekularne detekcije mutacija ..................................... 37 4.2.6. Statistička obrada podataka ......................................................... 39 5. RЕZULТАТI.............................................................................................. 41 5.1. Određivanje polne, starosne, rasne i topografske distribucije kutanog mastocitoma kod ispitanih pasa ......................................... 41 5.1.1. Polna distribucija mastocitoma ................................................... 41 5.1.2. Zastupljenost kutanog mastocitoma u odnosu na starost pasa ........................................................... 42 5.1.3. Rasna distribucija kutanog mastocitoma .................................... 42 5.1.4. Topografska distribucija kutanog mastocitoma .......................... 43 5.2. Morfološke karakteristike mastocitoma ...................................................... 45 5.2.1. Mikroskopski nalaz na preparatima bojenim hematoksilin – eozinom (HE) ................................................... 45 5.2.2. Mikroskopski nalaz na preparaima bojenim toluidine blue metodom ............................................................ 52 5.3. Klasifikacija mastocitoma ........................................................................... 53 5.4. Imuno isto emijski parametri značajni za klasifikaciju mastocitoma ........ 54 5.4.1. Imunohistohemijska ekspresija KIT receptora (CD117) u mastocitomima ................................ 54 5.4.2. Imunohistohemijska ekspresija Ki-67 u mastocitomima ............ 57 5.4.3. Imunohistohemijska ekspresija PCNA u mastocitomima........... 60 5.4.4. Imunohistohemijska ekspresija CD45RA u mastocitomima ...... 61 5.5. Prisustvo mutacija ....................................................................................... 62 6. Diskusiја ..................................................................................................... 64 7. Zаklјučаk.................................................................................................... 78 8. Pоpis litеrаturе........................................................................................... 80 SKRAĆENICE MCT - Mast Cell Tumor KIT – Tyrosine Kinase Receptor CD117 – Cluster of Differentiation 117 ATP – Adenozin - trifosfat IL – Interleukin SCF – Stem cell factor NK cells – Natural killer cells TNF-α – Tumor necrosis factors alpha LT – Leukotriene PAF – Platelate Activating Factor TGF-β – Transforming growth factor beta ITD – Internal Tandem Duplication AgNOR – Nucleolar Organiser Region VEGF – Vascular endothelial growth factor TSLC1 – Tumor Suppressor in Lung Cancer 1 PlGF – Placental Growth Factor VEGFR – Vascular endothelial growth factor receptor WHO – The World Health Organization MI – Mitotic Index PCNA – Proliferating Cell Nuclear Antigen NOR – Nucleolar Organiser Region CD45RA – Cluster of Differentiation 45 Ready to Use HPF – High-power Fields PDGF – Platelet-derived Growth Factor EGF – Epidermal Growth Factor FGF – Fibroblast Growth Factors PCR - Polymerase Chain Reaction 1 1. UVOD Kutani mastocitomi (Mast Cell Tumor – MCT, eng) čine 7% do 21% svi tumora kože pasa i spadaju među najučestalije tumore kože kod ove vrste životinja (Welle i sar., 2008). Prema poreklu, mastocitomi pripadaju grupi mezenhimski tumora kože i meki tkiva (Hendrick i sar., 1998). Vode poreklo iz kostne srži i pokazuju vrlo promenljivo ponašanje, pa se za nji ovu klasifikaciju uzima nekoliko kriterijuma, uključujući istološku gradaciju i markere proliferacije ćelija Tirozin kinaza receptor (Tyrosine Kinase Receptor – KIT, eng) ili CD117 (Cluster of Differentiation 117 – CD117, eng) je tirozin kinaza receptor za koji se smatra da ima ključnu ulogu kod mastocitoma pasa i dokazano je da postoji veza između aberantne ekspresije CD117 i postojanja c-KIT mutacija, iako mutacije nisu prisutne kod svih mastocitoma sa aberantnom ekspresijom KIT proteina. Klasifikacija mastocitoma je od velikog prognostičkog i terapijskog značaja i može se izvršiti na osnovu različiti parametara Najviše su zastupljeni histološki sistemi klasifikacije, od kojih je najpoznatiji Patnaikov sistem, prema kome su tumori podeljeni na tri stepena maligniteta na osnovu stepena diferentovanosti, celularnosti, ćelijske morfologije, mitotskog indeksa i reakcije tkiva (Patnaik i sar., 1984). Histološka građa mastocitoma je u korelaciji sa krajnjim ishodom bolesti (Patnaik i sar., 1984), mada postoji značajna dvosmislenost kada su u pitanju srednje diferentovani tumori (Weisse i sar., 1984), kao i znatne varijacije vezane za subjektivnost istraživača, što je uticalo na uvođenje dvostepenog sistema klasifikacije, na mastocitome visokog i niskog stepena maligniteta (Kiupel i sar., 2004a). Na osnovu ove podele, mastocitomi visokog stepena maligniteta imaju ispunjen najmanje jedan od sledeći kriterijuma: najmanje 7 mitotskih figura, najmanje 3 multinuklearne ćelije, najmanje 3 bizarna jedra na 10 polja velikog uvećanja ili prisustvo kariomegalije kod najmanje 10% neoplastični ćelija (Kiupel i sar., 2011). 2 Iako etiologija MCT pasa još uvek nije u potpunosti razjašnjena, nekoliko studija ukazuje da oko 15-40% mastocitoma pasa sadrži mutaciju c-KIT protoonkogena (Letard i sar, 2008; Takeuchi i sar., 2011). C-KIT protoonkogen kodira receptor tirozin kinazu, te mutacije ovog gena mogu dovesti do aktivacije KIT receptora u odsustvu liganda (Longley i sar., 2001; Webster i sar., 2006) KIT receptor ima bitnu ulogu u opstanku ćelija na kojima se nalazi, zatim u njihovoj proliferaciji i diferencijaciji (Webster i sar., 2006; Takeuchi i sar., 2011). Mutacije koje dovode do aktivacije KIT receptora u odsustvu liganda identifikovane su kod mastocitoma pasa, pre svega na eksonu 11 (nešto ređe na eksonu 8, 9 i 12) i sastoje se od interni tandem duplikacija, delecija i tačkasti mutacija. Prisustvo mutacija c-KIT protoonkogena se pre svega dovodi u vezu sa mastocitomima visokog stepena maligniteta (Webster i sar., 2006; London i sar., 2009; Kiupel i sar., 2011). Mada postoji veza između postojanja c-KIT mutacija i aberantne ekspresije CD117, mutacije nisu prisutne kod svih mastocitoma sa aberantnom ekspresijom KIT proteina (London i sar., 1996; Morini i sar., 2004; Webster i sar., 2006). Pod aberantnom ekspresijom smatra se ekspresija KIT proteina fokalno i difuzno u citoplazmi mastocita. Povećano prisustvo KIT receptora u citoplazmi (fokalno ili difuzno) je u korelaciji sa kraćim preživljavanjem pasa sa mastocitomom, kao i sa kraćim intervalom do remisije bolesti u odnosu na mastocitome kod koji je povećana ekspresija membranskih KIT receptora (Kiupel i sar., 2004b; Webster i sar., 2004). Ispitivanja vezana za aberantnu ekspresiju KIT proteina i postojanje c-KIT mutacija, uslovila su da se protein kinaze smatraju važnim „metama“ u terapiji mastocitoma (London, 2004). Inhibitori tirozin kinaza su mali molekuli koji blokiraju adenozin-trifosfat (Adenosine triphosphate – ATP, eng) vezujuća mesta na kinaza receptorima (Bennasroune i sar., 2004; Takeuchi i sar., 2011) Dosadašnja ispitivanja su pokazala pozitivan odgovor na terapiju inhibitorima tirozin kinaza, kako kod pasa koji imaju mastocitome kod kojih nije detektovana c- KIT mutacija (Isotani i sar., 2008; Takeuchi i sar., 2011), tako i kod pasa sa mastocitomima koji imaju c-KIT mutaciju (Hahn i sar., 2008; London i sar., 2009; Takeuchi i sar., 2011). Sa uvođenjem dvostepenog sistema klasifikacije po Kiupelu otvorena je mogućnost za detaljnije i pouzdanije razdvajanje mastocitoma različiti po stepenu agresivnosti Međutim, bez obzira na mane Patnaikovog sistema klasifikacije, on predstavlja dobar osnov za klasifikaciju mastocitoma, tako da se u većini slučajeva preporučuje kombinovanje ova dva sistema 3 klasifikacije pri određivanju terapije i prognoze (Stern, 2012) Pored klasifikacije mastocitoma, prilikom određivanja terapije i prognoze u obzir treba uzeti i prisustvo aberantne ekspresije KIT proteina, kao i postojanje c-KIT mutacija (Thompson i sar., 2010) Većina autora smatra da iako sve navedene parametre treba uzeti u obzir, prisustvo mitoza (mitotski indeks) ipak predstavlja najbitniji pokazatelj biološkog ponašanja tumora (Romansik i sar., 2007; Elston i sar., 2009; Scarpa i sar., 2013). Uzimajući u obzir sve navedeno, usmerili smo cilj ispitivanja ka izučavanju morfološki karakteristika, prisustva c-KIT mutacija i ekspresije molekulа znаčаjni zа proliferаciju i kontrolu rаstа tumora, na osnovu čega bi se mogao primeniti novi sistem klasifikacije mastocitoma pasa, kao preduslov za odgovarajuću terapiju 4 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Mastociti Mastocite je prvi put opisao Paul Ehrlich 1879. godine, u svojoj doktorskoj disertaciji, kao ćelije koje u svojoj citoplazmi imaju krupne granule koje se karakteristično boje (Vyas i sar., 2006) U mastocitima, velikim ovoidnim ćelijama sa centralno postavljenim jedrom i različitom količinom citoplazme, nalaze se brojne bazofilne granule koje se mogu identifikovati upotrebom specijalnih bojenja (Romanowsky, May-Griinwald Giemsa i toluidine blue). Mastociti, kao i bazofilni granulociti, vode poreklo od pluripotentne stem ćelije (CD34+) kostne srži, odakle putem cirkulacije dolaze do vezivnog tkiva ili sluznica i tu dovršavaju sazrevanje (Welle i sar., 2008). Progenitori mastocita pod dejstvom interleukina 4 (Interleukin - IL, eng ) sazrevaju u zrele mastocite u sluznici, a pod dejstvom faktora rasta matične ćelije (Stem cell factor – SCF, eng.) u tkivu nastaju zreli vezivno-tkivni mastociti (Kosjerina, 1999). SCF je ligand koji se vezuje za tirozin kinaza receptore (Tyrosine Kinase Receptor – KIT, eng.) koji se nalaze na površini mastocita, a bitan je i za kasniji razvoj, funkciju i opstanak mastocita (Wedemeyer i sar., 2000). Glavni je faktor rasta za mastocite, a sekretuju ga stromalne i endotelne ćelije i predstavlja ključni citokin koji reguliše diferencijaciju i sazrevanje mastocita (Galli i sar., 1995; Hundley i sar., 2004) SCF je, takođe, neop odan za održavanje zreli mastocita, obzirom da indukuje proliferaciju, sprečava apoptozu mastocita i stimuliše nji ovu degranulaciju (Mekori i sar., 1995; Jensen i sar., 2008; El-Agamy, 2012) Novija istraživanja, vezana za sazrevanje mastocita, pokazala su da su faktor rasta matične ćelije, IL – 3 i IL – 9 najbitniji citokini za regulaciju rasta i diferentovanje mastocita (Jamur i sar., 2011). Zreli mastociti su, za razliku od bazofilni granulocita, dugovečni i zadržavaju sposobnost umnožavanja pod određenim uslovima (Wedemeyer i sar., 2000). 5 Granule mastocita sadrže eparin, istamin i mnoge proteaze, kao što su triptaze Ekstracelularno oslobađanje medijatora, predstavlja degranulaciju, koja može biti uzrokovana fizičkim faktorima (me anička trauma, visoka temperatura), toksinima, endogenim posrednicima (proteini, tkivne proteaze) i imunološkim me anizmima (Payne i Kam, 2004) Mastociti se nalaze u većini organa i tkiva u organizmu a u najvećem broju su prisutni na mestima, kao što su koža i organi respiratornog i digestivnog sistema, koja su neprekidno u kontaktu sa materijama iz spoljne sredine (Kosjerina, 1999). Mastociti učestvuju u odbrani organizma putem fagocitoze, stvaranjem slobodni radikala kiseonika (Malaviya i sar., 1994) ili stvaranjem antimikrobni peptida, kao što su katelicidin (Di Nardo i sar., 2003) ili himaze (Metz i sar., 2008) Takođe, mogu da menjaju imunski odgovor domaćina putem degranulacije i sekrecije medijatora Tako na primer, oslobađanjem istamina i drugi vazoaktivni medijatora utiču na povećanje vaskularne propustljivosti a mogu delovati i na glatke mišiće Osim navedenog, istamin povećava stvaranje sluzi, što pomaže eliminaciju patogena i omogućava bolju zaštitu ćelija Lučenjem emoatraktanata, mastociti mogu uticati na efikasnost eozinofilni granulocita, NK ćelija (Natural killer cells - NK cells, eng.), IL-8 i neutrofilnih granulocita (Urb i sar., 2012). 2.1.1. Vrste mastocita Mastociti se normalno mogu naći u mnogim tkivima, uključujući kostnu srž i limfne čvorove (Bookbinder i sar., 1992) Migracija mastocita u tkiva u početku zavisi od interakcije mastocita i endotelni ćelija, a zatim, različiti medijatori, kao što su ad ezivni molekuli, hemokini, citokini, integrini i faktori rasta igraju bitnu ulogu u procesu migracije (Nilsson i sar., 1994). Na osnovu izučavanja mastocita kod miševa, uobičajeno je da se ove ćelije grupišu na osnovu lokalizacije u tkivima, morfološkim svojstvima i sadržaju granula na vezivno-tkivne i mastocite sluznice Obe vrste mastocita imaju brojne receptore u ćelijskoj membrani Mastociti su eterogena grupa ćelija Vezivno-tkivni mastociti se nalaze u koži, peritonealnoj šupljini i zidu creva Nji ove granule sadrže eparin, velike količine istamina i faktor nekroze tumora-α (Tumor necrosis factors alpha - TNF-α, eng ) Nasuprot tome, mastociti sluznice se prvenstveno nalaze u plućima i crevima Od proteoglikana mnogo češće sadrže ondroitin-sulfat nego 6 eparin, a takođe sadrže mnogo niže koncentracije istamina i TNF-α od vezivno-tkivnih mastocita (Sur i sar., 2007) Prema drugim istraživanjima, mastociti sluznice sekretuju prostanoide (prostaglandine, tromboksane i prostacikline) i cisteinil leukotriene LTC4, LTD4 i LTE4 (Leukotriene – LT, eng.), dok vezivno-tkivni mastociti uglavnom sekretuju samo prostanoide (Schwartz, 1994). U granulama obe grupe mastocita se nalazi triptaza, dok se himaza i karboksipeptidaza nalaze isključivo u vezivno-tkivnim mastocitima Triptaza utiče na bron okonstrikciju, imaza pretvara angiotenzin I u angiotenzin II i razgrađuje bradikinin, dok uloga karboksipeptidaze nije u potpunosti razjašnjena (Kosjerina, 1999). Pojedini autori smatraju da se mastociti pasa ne mogu deliti prema lokalizaciji u tkivima, već na osnovu nji ove osetljivosti na formalin i prisustva proteaza (Gross i sar., 2005). Mastociti koji se boje primenom metahromatskih bojenja preparata tkiva fiksiranog u formalinu, predstavljaju samo deo ukupne populacije mastocita Ovakvi mastociti se označavaju kao „tipični“ ili mastociti vezivnog tkiva S druge strane, mastociti osetljivi na formalin, koji se metahromatskim bojama boje jedino ukoliko je tkivo fiksirano u Karnoa fiksativu (Carnoy, eng.) su „atipični“ ili mastociti sluznica Mastociti osetljivi na formalin su dominantni u sluznicama, dok se formalin rezistentni mastociti prevashodno nalaze u submukozi gastrointestinalnog trakta i koži pasa (Becker i sar., 1985; De Mora i sar., 2006). Na osnovu rani istraživanja, kod ljudi su opisane dve vrste mastocita na osnovu razlike u sadržaju neutralni proteaza, odgovora na stimuluse i ekspresije površinski antigena (Sc wartz i sar., 1987; Irani i sar., 1989; Schwartz, 2006). Kod pasa, mastociti se mogu podeliti na himaza, triptaza i himaza i triptaza pozitivne mastocite (Irani i sar., 1989; Noviana i sar., 2004). U novije vreme, naučnici smatraju da kod zreli mastocita postoji mogućnost promene sadržaja medijatora, površinski antigena ćelije, kao i ekspresije receptora na bazi sazrevanja, statusa aktivacije i interakcije sa mikrookolinom (Valent i sar., 2010; Galli i sar., 2011). Na osnovu toluidin blue bojenja, mastociti se mogu podeliti na aktivirane mastocite koji imaju mali broj granula ili uopšte nemaju granule i mastocite u stanju mirovanja sa velikim granulama u citoplazmi (Schulman i sar., 1983). Mastociti imaju važnu ulogu u urođenom i stečenom imunitetu, bakterijskim infekcijama, kao i u alergijskim i autoimunim reakcijama (Theoharides i sar., 2010). Prilikom prvog kontakta sa antigenom, u orgamizmu dolazi do stvaranja antitela (IgE), koja se se preko Fc fragmenta vezuju za receptore na membrani mastocita, bazofilnih granulocita i trombocita. Ponovno 7 unošenje antigena u senzibilisani organizam indukuje, između ostalog, degranulaciju mastocita, pri čemu se oslobađaju brojni medijatori (primarni efektorni medijatori, proteoglikani, neutralne proteaze, triptaza, himaza, karboksipeptidaza i kisele idrolaze) Najvažniji su primarni efektorni medijatori, kao što su istamin, prostaglandin D2, leukotrijeni i faktor aktivacije trombocita (Platelate Activating Factor – PAF, eng.) Pored započinjanja akutne alergijske reakcije, mastociti su odgovorni i za otpočinjanje ronične alergijske reakcije preko svoji medijatora IL- 3, IL-4, IL -5, IL-6, i TNF- α (Kosjerina, 1999). Medijatori koje sintetišu mastociti mogu se podeliti na 3 grupe: izmenjene, novosintetisane lipidne medijatore i citokine i hemokine. U izmenjene medijatore spadaju istamin, serotonin, neutralne proteaze, triptaze, proteoglikani i neki citokini, kao što je TNF-α (Caug ey, 2007; S a id, 2009) Ovi medijatori se brzo izlučuju i utiču na pojavu edema, bron okonstrikciju, povećanje vaskularne propustljivosti i drugih promena koje prate alergijsku reakciju. Novosintetisani lipidni medijatori obuhvataju prostaglandine, leukotriene, faktor aktivacije trombocita i nervni faktor rasta (Freeman i sar., 2004; Boyce i sar., 2007; Tsuda i sar., 2011) Ovi medijatori se oslobađaju 15 minuta do jedan sat nakon aktivacije ćelije i uglavnom izazivaju simptome alergije (Harizi i sar., 2008). Od citokina, najbitniji su IL-4, IL-5, transformišući faktor rasta beta (Transforming growth factor beta - TGF-β, eng.) i TNF- α (Bloemen i sar., 2007). Za razliku od dobro poznate aktivacije mastocita preko receptora za IgE tokom alergijske reakcije, istraživanja pokazuju da mastociti mogu delovati kao efektorske ćelije u oba oblika odbrane oragnizma preko direktne aktivacije toll-like receptora na mastocitima od strane mikroorganizama (Supajatura i sar., 2002) Međutim, tokom inflamatorni procesa retko dolazi do degranulacije mastocita. Smatra se da mastociti u nealergijskim procesima deluju stvaranjem medijatora, ali uz izostanak degranulacije (Theoharides i sar., 2007) U ovim slučajevima mastociti direktno deluju na patogen putem fagocitoze i stvaranjem slobodnih radikala kiseonika (Malaviya i sar., 1994) ili stvaranjem antimikrobni peptida, kao što su katelicidin (Di Nardo i sar., 2003) ili himaze (Metz i sar., 2008) Takođe, mastociti mogu da oslobađaju proteaze koje razgrađuju toksične peptide nastale tokom bakterijske infekcije (Maurer, 2004) Mastociti stvaraju citokine i emokine koji obu vataju klasične proinflamatorne medijatore, kao što su tumor nekrotični faktor i IL-1β, ali i citokine koji su povezani sa antiinflamatornim ili imunomodulatornim efektima, kao što su IL-10 i TFG-β (Mars all i sar., 2004). 8 Pored direktne, moguća je i indirektna aktivacija mastocita, koja se uglavnom ispoljava tokom sekundarni i ponovljeni infekcija Mastociti takođe imaju receptore za IgG i različite komponente komplementa (C3a i C5a), te stoga potencijalno mogu odgovoriti i na unošenje opsonizovanih patogena. Uloga pomenuti receptora u aktivaciji mastocita tokom infekcije je još uvek nedovoljno definisana (Urb i sar , 2012), ali se smatra da putem ovog načina aktivacije dolazi do degranulacije mastocita, proizvodnje lipidni medijatora i stvaranja različiti citokina i hemokina (Marshall i sar., 2004). S druge strane, C3a komponenta komplementa, ali ne i C5a, inhibira degranulaciju mukoznih mastocita (Erdei i sar., 2004). Nadalje, uloga mastocita u urođenom imunitetu nije ograničena na delovanje protiv bakterija, već je opisano i delovanje mastocita u toku virusnih i parazitskih infekcija. (Marshall i sar., 2004). 2.1.2. Mastocitoza i mastocitomi Povećanje broja mastocita u tkivima (mastocitoza) može nastati kao posledica pojačanog dotoka progenitorni ćelija iz kostne srži ili zbog proliferacije mastocita u samim tkivima. Mastocitoza može nastati kao posledica reaktivne mastocitoze kod različiti oboljenja i maligni neoplazmi (različiti od mastocitoma), kao i kod sistemske mastocitoze i drugi neoplastični procesa. Reaktivna mastocitoza se najčešće sreće kod bron ijalne astme i urtikarija (Dunphy, 2005; Božić, 2007; Po lman, 2010). Neoplastična proliferacija mastocita javlja se u formi mastocitoma (Mast Cell Tumor – MCT, eng ), koji je najčešći tumor kože kod pasa i drugi po učestalosti kod mačaka (Thamm i sar., 2007) Mastocitna leukoza se retko sreće kod pasa (McGavin i sar., 2001). Sistemska mastocitoza se ne može razlikovati od reaktivne mastocitoze na osnovu određivanja mastocita u krvnom razmazu, ali postoje mišljenja da se mastociti kod sistemske mastocitoze morfološki razlikuju od onih koji se javljaju kod reaktivne mastocitoze. Sistemska mastocita je redak poremećaj koji se karakteriše nakupljanjem mastocita u različitim organima, kao što su kostna srž, slezina i jetra, uz moguće prisustvo promena na koži (urticaria pigmentosa) (Stevens i sar., 2001) Naziva se još i visceralna forma mastocitoma ili diseminovana mastocitoza (Thamm i sar., 2007) Mnogo češće se sreće kod mačaka nego kod pasa (Da m i sar., 2001). Kod pasa, sistemskoj mastocitozi gotovo uvek pret odi nediferentovana primarna kožna lezija Zabeleženi su i slučajevi primarnog mastocitoma u gastrointestinalnom traktu pasa (Thamm i sar., 2007). 9 Pored pasa, tumori mastocita su opisani i kod mačaka (Lamm i sar., 2009) i konja (Leadbeater i sar., 2010) Ređe se javljaju kod goveda (Palyada i sar., 2008), ovaca (Johnstone, 1972), koza (Allison i Fritz, 2001) i svinja (Migaki i Langheinrich, 1970). U umanoj medicini povećan broj mastocita opisan je kod oboljenja kao što su reumatoidni artritis, psorijaza, astma, fibroza pluća, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, kardiovaskularne bolesti i drugih (Harvima i sar., 2008; Chichlowski i sar., 2010). 2.2. Kutani mastocitom pasa Mastocitomi vode poreklo iz kostne srži, iz linije opredeljene za mastocite, ali se zbog svoje lokalizacije izučavaju u okviru tumora kože Sastavljeni su od različito diferentovani mastocita (Aleksić-Kovačević i sar., 2005) koji se uočavaju kao okrugle ćelije sa različitom količinom granula u citoplazmi, poređane u redove ili grupe (Strefezzi i sar., 2009; Jovanović i sar., 2012). Pripadaju grupi okruglo-ćelijski tumora, zajedno sa limfomom, plazmocitomom, istiocitomom i transmisivnim veneričnim tumorom (London i sar., 2003; Strefezzi i sar., 2009). Pojedinačne ili multiple nodularne proliferacije mastocita javljaju se kod svi vrsta domaći životinja, ali su najčešće kod pasa (Jubb i sar., 2007; Jovanović i sar., 2012). Mastocitomi pasa pokazuju ogromnu raznolikost u izgledu, kliničkoj slici, pojavi metastaza i odgovoru na terapiju, tako da predstavljaju značajan problem u pogledu terapije i prognoze (Morris i sar., 2001). 2.2.1. Etiologija Etiologija mastocitoma je nepoznata, ali se smatra da je, kao i kod većine neoplazmi, multifaktorijalna. Predispozicija pojedini rasa govori u prilog značaja genetske kompmonente u nastanku mastocitoma (Welle i sar., 2008) Pojedina istraživanja navode virusnu etiologiju mastocitoma, s obzirom da je uspelo prenošenje ove neoplazme korišćenjem ekstrakta tumora, a daljim ispitivanjima materijala nisu uočene virusne partikule (Misdorp, 2004). Veza između mastocitoma i ormona je još uvek sporna Receptori za estrogen su uočeni u citosolu malog broja ćelija mastocitoma, dok je jedan od ispitanih tumora imao i receptore za progesteron (Elting i sar., 1982; Misdorp, 2004). U drugom ispitivanju, kod 6 od 9 mastocitoma 10 je utvrđeno da ne sadrže receptore za estrogen, dok je za 3 tumora bilo sporno (Larsen i sar., 1989; Misdorp, 2004). Noviji radovi ističu ulogu površinskog receptora tirozin kinaze u etiologiji mastocitoma (London i sar., 2005). Smatra se da su mutacije c-KIT protoonkogena, koji kodira receptor faktora rasta matične ćelije, bitne za nastanak i razvoj mastocitoma (Strefezzi i sar., 2009). Osim genetskih mutacija, neki autori navode da hronična inflamacija kože može imati ulogu u nastanku mastocitoma (Govier, 2003). Međutim, dokumentovano je samo nekoliko slučajeva mastocitoma, čiji se nastanak povezuje sa hroničnim dermatitisom, ožiljkom ili primenom iritantnih sredstava (Welle i sar., 2008). 2.2.2. Incidenca i faktori rizika Tumori mastocita su veoma retki u humanoj populaciji i uglavnom su uvek benigni, dok kod pasa oni čine 7 – 21% ukupnog broja tumora kože i mogu imati vrlo agresivan klinički tok sa metastazama u limfnim čvorovima, jetri, slezini i kostnoj srži (Fulciniti i sar., 2007). U većini radova se navodi da ne postoji predispozicija mastocitoma vezana za pol, niti da pol ima ulogu u dužini preživljavanja pasa kod kojih je dijagnostikovan mastocitom (Baker- Gabb i sar., 2003), dok se kao rase kod kojih se češće javlja mastocitom navode bokser, bostonski terijer, bul terijer, bul mastif, koker španijel, staford terijer, foks terijer, engleski buldog, labrador-retriver, zlatni retriver, bigl, šnaucer, šar-pej, ridžbek (Welle i sar., 2008). Iako se navodi da su bokseri rasa kod koje se najčešće javlja mastocitom, oni uglavnom imaju mastocitome nižeg stepena maligniteta, koji imaju povoljniju prognozu (Thamm i sar., 2007). Nalaz mastocitoma je najčešći kod pasa starosti 7,5 – 9 godina (Scott i sar., 2001), mada postoje opisani slučajevi mastocitoma kod pasa starosti 4 – 6 meseci (Mukaratirwa i sar., 2005). 2.2.3. Patogeneza Iako je etiologija mastocitoma još uvek nedovoljno razjašnjenja, u novijim radovima se sve više ističe značaj genetske komponente. U proseku, 50% od slabije diferentovanih/nediferentovanih mastocitoma pasa ima mutacije c-KIT protoonkogena, odnosno 15% od ukupnog broja mastocitoma (Zemke i sar., 2002; Jones i sar., 2004; Webster i sar., 11 2006). Prisustvo mutacija c-KIT protoonkogena i aberantna lokalizacija KIT proteina smatraju se bitnim činiocima za prognozu razvoja mastocitoma (Jones i sar., 2004; Webster i sar., 2004). Receptor za faktor rasta matične ćelije (KIT protein), koji se normalno nalazi na površini ematopoetski ćelija i mastocita, igra značajnu ulogu u rastu i diferencijaciji ovi ćelija KIT receptor je transmembranski receptor kinaza tip III koga kodira c-KIT protoonkogen koji se kod pasa nalazi na 13 romozomu Poremećaji u ekspresiji mogu doprineti neoplastičnoj transformaciji (Misdorp, 2004; Takeuchi i sar., 2010). KIT receptor se sastoji od ekstracelularnog ligand-vezujućeg domena, transmembranskog dela i citoplazmatskog „repa“ Aktiviran KIT receptor vezuje i fosforiliše intracelularne proteine, otpočinjući kaskadnu reakciju, koja za rezultat ima niz biološki aktivnosti, kao što su proliferacija, migracija, sazrevanje i opstanak ematopoetski matični ćelija, mastocita, melanocita i drugi Ekspresija KIT receptora dokazana je imuno isto emijskim bojenjem, kako na površini normalnih, tako i na površini neoplastično transformisani mastocita pasa Povećana ekspresija zabeležena je kod slabo diferentovanih i nediferentovanih mastocitoma (Welle i sar., 2008; El-Agamy, 2012). Izuzev membranske ekspresije, opisana je ekspresija KIT proteina fokalno i difuzno u citoplazmi Kod neoplastični mastocita, KIT protein se akumulira u citoplazmi, prvenstveno u blizini jedra (Reguera i sar., 2000; Kiupel i sar., 2004b) Povećano prisustvo KIT receptora u citoplazmi (fokalno ili difuzno) je u korelaciji sa kraćim preživljavanjem pasa sa mastocitomom, kao i sa kraćim intervalom do remisije bolesti u odnosu na mastocitome kod koji je povećana ekspresija membranskih KIT receptora (Webster i sar., 2004). KIT receptor se može aktivirati putem 2 mehanizma: ligand zavisnim i ligand nezavisnim mehanizmom. Ligand zavisni mehanizam je kod pasa slabo ispitan, ali su brojni radovi vezani za ispitivanja u humanoj medicini koji navode da se aktivacija odvija vezivanjem SCF za KIT receptor. Ligand nezavisni mehanizam aktivacije, iako ne u potpunosti poznat, povezuje se sa najmanje dve promene Prva se odnosi na prekomernu ekspresiju KIT proteina, što dovodi do konstantno visokog nivoa njihove aktivacije, dok se druga vezuje za mutacije c-KIT protoonkogena koje uzrokuju fosforilaciju KIT receptora (Kitayama et al., 1995; London i sar. 1996; Turin i sar., 2006). S obzirom da c-KIT protoonkogen kodira KIT receptor, mutacije ovog gena mogu dovesti do aktivacije KIT receptora u odsustvu liganda (SCF). Mutacije koje dovode do ovakvih promena identifikovane su kod mastocitoma pasa, pre svega na eksonu 11 (nešto ređe na eksonu 12 8, 9 i 12) i sastoje od internih tandem duplikacija (Internal Tandem Duplication – ITD, eng.), delecija i tačkasti mutacija Eksoni 8 i 9 pripadaju ekstracelularnom domenu, ekson 10 transmembranskom, dok 11 i 12 pripadaju intracelularnom domenu i to negativnom regulatornom jukstamembranskom domenu (Letard i sar., 2008; Takeuchi i sar., 2010). Istraživanja pokazuju da su c-KIT mutacije u značajnoj vezi sa istološkom gradacijom mastocitoma, odnosno da su u većem stepenu prisutne kod slabo diferentovanih i nediferentovanih mastocitoma, tj. kod mastocitoma II i III stepena maligniteta prema Patnaikovoj gradaciji mastocitoma (Patnaik i sar., 1984; Zemke i sar., 2002; Webster i sar., 2006; Letard i sar., 2008). Istraživanja pokazuju da je kod tumora kod koji su izraženije mutacije veća mogućnost pojave metastaza i remisije Osim toga, urađene su dve velike studije po pitanju povezanosti prisustva mutacije i istološke gradacije tumora, koje su za rezultate imale odsustvo mutacija kod svih 24 mastocitoma, odnosno kod 12 dobro diferentovanih mastocitoma, zatim prisustvo mutacije kod 8 od 58 i kod 42 od 119 srednje diferentovanih mastocitoma i prisustvo mutacije kod 4 od 6, odnosno kod 9 od 26 slabo diferentivanih/nediferentovanih mastocitoma (Downing i sar., 2002; Zemke i sar., 2002). London i sar. (1996) su ukazali na ekspresiju KIT receptora na malignim mastocitima, a nekoliko godina kasnije su dokazali i prisustvo internih tandem duplikacija na eksonu 11 c-KIT protoonkogena kod približno 30% mastocitoma pasa (London i sar., 1999). Interne tandem duplikacije su najčešći vid mutacija c-KIT protoonkogena kod mastocitoma pasa (Zemke i sar., 2002; Jones i sar., 2004). Pokazalo se da tandem duplikacije u jukstamembranskom domenu mogu aktivirati KIT receptor bez prisustva liganda SCF (London i sar.,1999; Ma i sar., 1999). C-KIT mutacije i aberantna lokalizacija KIT proteina su povezani sa lošijom prognozom is oda mastocitoma Takođe se smatra da su u vezi sa povećanom ekspresijom Ki-67 i argirofilnim nukleolarnim organizacionim regionima (Agyrophilic Nucleolar Organiser Region – AgNOR, eng.), koji predstavljaju markere ćelijske proliferacije (Webster i sar., 2007). Drugi autori navode da c-KIT mutacije i promene u lokalizaciji KIT proteina mogu biti sasvim odvojeni, odnosno da se javljaju nezavisno jedan od drugog (Webster i sar., 2006). Ova hipoteza je podržana činjenicom da je 28 ispitani mastocitoma imalo promenjenu KIT lokalizaciju bez prisustva c-KIT mutacije (internih tandem duplikacija). Stoga se smatra da za aberantnu KIT lokalizaciju mogu biti odgovorne i mutacije u drugim domenima c-KIT protoonkogena, zatim 13 promene u ćeliji, kao što su poremećaji intracelularnog transporta, poremećaji funkcije Goldži kompleksa, kao i uticaj različiti faktora (Webster i sar., 2006). S druge strane, premda mutacije protoonkogena c-KIT nisu detektovane u oko 60% slučajeva mastocitoma, postoje mišljenja da mutacije ovog gena najviše utiču na razvoj i progresivan tok pojedinih mastocitoma (prevashodno malignih mastocitoma, odnosno slabo diferentovanih i nediferentovanih), dok je sama inicijacija nastanka mastocitoma mnogo kompleksnija (Welle i sar., 2008). Osim ekspresije KIT receptora i mutacija c-KIT gena, u patogenezi mastocitoma, proučavani su i ekspresija vaskularnog endotelnog faktora rasta (Vascular endothelial growth factor –VEGF, eng.), uloga prostaglandina E2, supresora karcinoma pluća 1 (Tumor Suppressor in Lung Cancer 1 –TSLC1, eng.) i serotonina i njegovog receptora (Froberg i sar., 2009; Amorim i sar., 2010; Taylor i sar., 2010). Drugi autori navode da su od pomenutih faktora, TSLC1 i receptori za serotonin imali manju ekspresiju kod mastocitoma višeg stepena maligniteta, što ukazuje na nji ov gubitak funkcije tokom karcinogeneze, međutim, nji ova uloga u razvoju mastocitoma je ipak nejasna (Sc lieben i sar., 2012). Vaskularni endotelni faktor rasta je bitan u progresiji tumora sa dva aspekta. Pre svega, kao ključni regulator neovaskularizacije tumora (Sc mid i sar., 2010), a s druge strane mnoge neoplastične ćelije koriste VEGF signalizaciju kao me anizam opstanka (Roskoski, 2007; Ellis i Hicklin, 2008). Familija VEGF obuhvata pet izoformi VEGF (A - D), faktore rasta placente (Placental Growth Factor - PlGF1 i PlGF2, eng.), kao i izoforme koje se javljaju zbog različitog uplitanja mRNK. VEGF (A - D) i PlGF1 su ligandi za receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta (Vascular endothelial growth factor receptor –VEGFR, eng.) koji obuhvata RTK VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 i koreceptore neuropiline 1 i 2 (Ferrara i sar., 2003; Roskoski, 2007). 14 Uloga VEGF kod mastocitoma nije u potpunosti razjašnjena Dve studije su pokazale da na malignim mastocitima mogu biti eksprimirani i VEGFR1 i VEGFR2, ali nji ov značaj nije sasvim ispitan (Rebuzzi i sar., 2007; Sekis i sar., 2009) Jedno od pomenuti istraživanja navodi i da je ekspresija VEGF intenzivnija kod neoplastični ćelija mastocitoma višeg stepena maligniteta, međutim smatra se da su ovakvi nalazi subjektivni i da nije utvrđena ni gustina mikrocirkulacije, niti vreme preživljavanja pasa sa ovakvim mastocitomima (Rebuzzi i sar., 2007; Thompson i sar., 2010). 2.2.4. Morfološke osobine mastocitoma Mastocitomi se kod pasa najčešće sreću na trupu (50-60%), ekstremitetima (25 - 40%), glavi i vratu (10%). Na skrotumu, međici, leđima i repu tumor se ređe sreće (Welle i sar., 2008). Makroskopski izgled mastocitoma varira u zavisnosti od progresije i stepena istološke diferencijacije. Dobro diferentovani mastocitomi se najčešće pojavljuju kao nodularnе, nekapsulirane mase gumaste konzistencije, iznad koji su polja kože bez dlake Veličina varira od 1 do 4 cm u prečniku a klinički podsećaju na lipom Slabije diferentovani mastocitomi imaju tendenciju bržeg rasta, manje su ograničeni i često praćeni inflamacijom i edemom okolnog tkiva (Jubb i sar., 2007) Na nji ovoj površini mogu nastati ulceracije, dok se u blizini mogu razviti manji čvorići, tzv satelitski noduli Većina mastocitoma nije pigmentisana, ali se kao povremen nalaz mogu uočiti eritematozni i hiperpigmentisani noduli (Welle i sar., 2008). Lezije na distalnim delovima ekstremiteta, usnama i u području prepona mogu biti u vidu slabo definisani otoka ili nalik dermatitisu uzrokovanom lizanjem (acral lick dermatitis, eng.) (Gross i sar., 2005; Welle i sar., 2008). Klinički znaci kod pasa sa mastocitomom se mogu komplikovati oslobađanjem istamina, eparina i drugi vazoaktivni amina iz degranulisani mastocita Me anička manipulacija tokom ispitivanja ili uklanjanja tumora može rezultirati u degranulaciji mastocita, sa posledičnim eritemom i urtikarijama na okolnom tkivu, a trljanjem pomenjenih mesta, one dobijaju jako crvenu, nekada i modru boju i može se stvoriti otok (tzv Darieov znak) (Morris i sar., 2001; Govier 2003) Histamin stimuliše H2 receptore na parijetalnim ćelijama želuca povećavajući lučenje želudačne kiseline, što može dovesti do pojave ulceracija, sa posledičnim povraćanjem, anoreksijom, melenom i bolom u abdomenu (Wallace, 2002; Thamm i sar., 2007). 15 Maligni mastocitomi mogu metastazirati putem limfe ili krvi i u većini slučajeva, prvi znak metastaze je uvećanje regionalnog limfnog čvora Metastaze mastocitoma na plućima su retke, dok se uglavnom javljaju na slezini, jetri i bubrezima. Koža je takođe često mesto za razvoj metastaza (Morris i sar., 2001). Dijagnoza mastocitoma postavlja se na osnovu citološki bojenja preparata dobijeni pravljenjem razmaza dobijenog biopsijom tumora iglom (fine needle aspiration) ili pravljenja otisak preparata tkiva tumora. Od metoda bojenja, najčešće se koriste Romanowsky tip bojenja (npr. Diff-Quik, Giemsa, Wright’s) ili New Methylene Blue (London i sar., 2003; Strefezzi i sar., 2009) Ćelije su okrugle sa okruglim do ovalnim jedrom koje je uglavnom centralno postavljeno, ali često može biti maskirano intenzivno obojenim citoplazmatskim granulama Od ostali ćelija može se videti različit broj eozinofilni granulocita i/ili vretenasti ćelija, najverovatnije fibroblasta (Scott i sar., 2000; Welle i sar., 2008). Zbog svog jedinstvenog bojenja, mastociti se mogu uočiti pomoću mikroskopa u obojenim preparatima, već pri uvećanju 40 puta Kod pojedini životinjski vrsta visoko granulisani bazofilni granulociti se mogu pogrešno protumačiti kao mastociti (Feldman i sar., 2006). Na osnovu citologije postavlja se tačna dijagnoza kod 92% do 96% mastocitoma (Thamm i sar., 2007; Welle i sar., 2008) Pojedini autori navode da se slabo granulisane ćelije bolje mogu uočiti citološki nego istopatološki zbog citoplazmatski granula (Duncan i sar., 1979; Strefezzi i sar., 2009) Kod slabo diferentovani tumora količina granula u neoplastičnim mastocitima je često nedovoljna da bi bile dobro vidljive, stoga se preporučuje da se za vizuelizaciju citoplazmatskih granula koriste Giemsa i toluidin blue bojenja (London i sar., 2003; Strefezzi i sar., 2009). Dok se na osnovu citološki bojenja može utvrditi da li je u pitanju mastocitom, za klasifikaciju tumora je neop odan istopatološki pregled biopsiranog tkiva (Bostock, 1973; Patnaik i sar., 1984). Citoplazmatske granule boje se svetlo sivo-plavo hematoksilinom-eozinom ili ljubičasto, upotrebom toluidine blue bojenja Stromu uglavnom čini kolagen i varira od oskudne do veoma zastupljene, a može izgledati i edematozno ili se uočava prisustvo ijalina (Welle i sar., 2008). 16 Bojenje srebrom omogućava određivanje prisustva argirofilnog organizatora nukleolusa koji je bitan prognostički pokazatelj Takođe se koristi i niz imuno isto emijski bojenja kojima se vizuelizuju markeri proliferacije (Newman i sar., 2007; Webster i sar., 2007). Diferencijalno dijagnostički, mastocitomi (naročito slabo diferentovani) se mogu zameniti sa drugim okruglo-ćelijskim tumorima (limfomom, plazmocitomom, istiocitomom i transmisivnim veneričnim tumorom) (Welle i sar., 2008; Oliveira i sar., 2012). Prisustvo eozinofilni granulocita ne može se striktno vezati za mastocitome, iz razloga što oni mogu biti prisutni i kod kutani limfoma Neepitelioptropni kutani limfomi uglavnom imaju ćelije sa manje citoplazme i okruglim jedrom. Plazmocitomi se sastoje iz grupa tumorski ćelija, umerenog polimorfizma, često sa dva ili više jedra Generalno, mastocitomi pasa su nekapsulirane mase u koži ili potkožju, sastavljene od okrugli ćelija poređani u redove Iznad manji mastocitoma, epidermis je intaktan, dok je iznad veći uglavnom ulcerisan Kolagena stroma varira od oskudne do veoma razvijene, sa prisustvom hijalina, edema i nekroze. Pojedini mastocitomi su veoma kompaktni i pokazuju nisku celularnost. Kolageni snopovi mogu izgledati nalik keloidu i podsećati na fibrom pasa (Gross i sar., 2005; Welle i sar., 2008). Histopatološke analize mastocitoma ukazuju na čestu difuznu ili fokalnu infiltraciju eozinofilnim granulocitima različitog intenziteta (Scott i sar., 2000; Goldschmidt i Hendrick, 2002; Gross i sar., 2005). Prisustvo eozinofilnih granulocita u vezi sa tumorima, opisano je u umanoj medicini kod različiti tipova karcinoma, zatim kod adenokarcinoma i ređe kod sarkoma Pojedini autori smatraju da prisustvo eozinofilni granulocita ima zaštitnu ulogu i da sprečava progresiju tumora, budući da su eozinofilni granulociti uključeni u imunološki odgovor i da učestvuju u sintezi i oslobađanju citokina Ne samo da mogu biti uključeni u inflamatorni proces koji obično prati tumor, već deluju sinergistički sa makrofagima pojačavajući nji ovu antitumorsku aktivnost (Navega, 2011). 17 2.2.5. Klasifikacija mastocitoma Histopatološki nalaz je jedan od glavni parametara za klasifikaciju mastocitoma (Patnaik, 1984). Prema klasifikaciji Svetske zdravstvene organizacije (The World Health Organization – WHO, eng ) mastocitomi pasa se svrstavaju u četiri stepena na osnovu kliničke manifestacije. I stepen - solitarni tumor ograničen na dermis, pri čemu nije za vaćen regionalni limfni čvor Može se podeliti na Ia stepen kada ne postoje sistemski znaci i Ib stepen kada su ispoljeni sistemski znaci. II stepen - solitarni tumor ograničen na dermis, pri čemu je za vaćen regionalni limfni čvor Razlikuju se IIa stepen bez sistemski znakova kod oboleli pasa i IIb stepen kada postoje sistemski znaci. III stepen - multipli tumori kože ili jedan veliki infiltrirajući tumor sa ili bez za vaćenosti regionalnog limfnog čvora Takođe se može podeliti na IIIa i IIIb stepen u zavisnosti da li postoje ili ne sistemski znaci bolesti. IV stepen - svaki tumor sa udaljenim metastazama ili recidivi sa metastazama (uključujući prisustvo neoplastični mastocita u krvi i/ili koštanoj srži) Prisustvo metastaza, pre svega na slezeni i jetri, je najvažnije za procenu stepena MCT (Strefezzi i sar., 2009). Klasifikacija mastocitoma je veoma bitna sa prognostičkog aspekta i izbora terapije Primarna klasifikaciona determinanta je istološka građa mastocitoma kože Postoje tri histopatološke klasifikacije (Hottendorf i Neilsen 1967; Bostock, 1973; Patnaik i sar., 1984). Hottendorf i Nielsen nisu gradirali klasifikovane tumore, dok prema Bostock-u, dobro diferentovani mastocitomi pripadaju mastocitomima III stepena maligniteta, a po Patnaik-u su to mastocitomi I stepena maligniteta (Hottendorf i sar., 1967; Patnaik, 1984; Bostock i sar., 1989; Welle i sar., 2008). Najčešći istopatološki sistem klasifikacije je Patnaikov sistem prema kome su tumori podeljeni na tri stepena maligniteta na osnovu stepena diferentovanosti, celularnosti, ćelijske morfologije, mitotskog indeksa i reakcije tkiva. Na primer, na osnovu stepena diferentovanosti, mastocitomi I stepena maligniteta predstavljaju dobro diferentovane tumore koji imaju dobru prognozu, mastocitomi II stepena maligniteta, umereno diferentovane sa upozoravajućom prognozom i mastocitomi III stepena maligniteta su nediferentovani sa lošom prognozom (Tabela 1) (Patnaik, 1984). Dobro diferentovani mastocitomi sastoje se od okrugle, prilično dobro ograničene, ali neinkapsulirane mase sastavljene od okrugli ćelija sa centralno postavljenim malim jedrom, skoro neprimetnim jedarcetom i obilnom, vrlo granulisanom citoplazmom. Granice citoplazme 18 su jasno uočljive, ćelije su uniformnog oblika, a mitotske figure gotovo nikad nisu prisutne Tumorske ćelije su poređane u redove ili rastresite ploče odvojene kolagenom Epidermis je obično intaktan Prema Patnaik i sar. (1984) ovi tumori su ograničeni na interfolikularni dermis, dok drugi autori navode da dobro diferentovani mastocitomi mogu za vatiti čak i subkutis (Bostock i sar., 1989; Gross i sar., 2005; Welle i sar., 2008). Granice ćelija i citoplazmatske granule prilikom bojenja hematoksilin-eozinom vide se kao sivo-plave linije, odnosno mrlje. Većina mastocitoma I stepena maligniteta se odlikuje prisustvom umerenog do velikog broja eozinofilni granulocita raspršeni po neoplastičnom tkivu Nekroza nije uobičajena kod ovog stepena maligniteta tumora (Gross i sar., 2005). Srednje diferentovani mastocitomi su obično veći dimenzija, prodiru u dublje slojeve tkiva i nisu jasno ograničeni kao pret odni, a sastoje se od relativno zbijeni ćelija sa jasno vidljivim granicama, dok je broj citoplazmatski granula smanjen na račun jedra ili citoplazme Maligne ćelije su veće, sa više zastupljenim pleomorfizmom Mogu biti prisutne džinovske, višejedarne ili vretenaste ćelije, kao i mali broj mitotski figura Tumorske ćelije su raspoređene u grupe odvojene stromom građenom od kolagena Stroma može biti izražena, sa prisustvom ijalina i područjima edema i nekroze Mitotska aktivnost varira i može potpuno izostati ili biti umereno prisutna. Citoplazma je umereno zastupljena i varijabilno granulisana (Patnaik i sar., 1984; Hahn 2002; Gross i sar., 2005; Welle i sar., 2008). Prema Patnaik i sar. (1984), mastocitomi II stepena maligniteta zahvataju dublje slojeve dermisa, a mogu zahvatiti i subkutis. Prisustvo eozinofilni granulocita varira od nekoliko do većeg broja (Gross i sar., 2005). Slabo diferentovani i nediferentovani (anaplastični) mastocitomi su slabo ograničeni i većinom se sastoje od slabo granuslisani , okrugli do poligonalni visoko pleomorfni ćelija svetle citoplazme Ćelije su većinom grupisane u vidu listova ili gnezda Granice ćelija često nisu jasno izražene, a jedro je veliko, nepravilnog oblika i ima nekoliko jedaraca Prisutne su višejedarne ćelije, a mitotske figure su brojne Tumorske ćelije duboko infiltruju subkutis. Nekroze i ulceracije su takođe prisutne (Patnaik i sar., 1984; Gross i sar., 2005; Ginn i sar., 2007; Welle i sar., 2008). Bojenjem Giemsa-om i toluidin blue metodom postaje vidljiv mali broj citoplazmatskih metahromatskih granula u maloj subpopulaciji maligni ćelija Granule u citoplazmi mogu biti vrlo male, toliko da je nekada potrebno koristiti imerzioni objektiv za njihovu detekciju. Imunohistohemijska bojenja su ponekad potrebna za potvrdu dijagnoze. Kod 19 anaplastični mastocitoma nalazi se manji broj eozinofilni granulocita ili su ove ćelije prisutne u vidu manjih grupa (Gross i sar., 2005). Tabela 1. Klasifikacija kutani mastocitoma pasa na osnovu istološki osobina (Patnaik, 1984; Thamm i sar., 2007) Stepen maligniteta mastocitoma Patnaikova podela Mikroskopski opis Slabo diferentovani 3 Visoko pleomorfne ćelije; tumor slabo ograničen; jedra nepravilnog oblika i veličine; česte mitoze; raspršene citoplazmatske granule Srednje diferentovani 2 Ćelije su gusto zbijene sa nejasnim citoplazmatskim granicama; odnos jedra i citoplazme je manji nego kod slabo diferentovanih; retke mitoze; više granula nego kod slabo diferentovanih mastocitoma Dobro diferentovani 1 Ćelije sa jasno definisanom granicom citoplazme imaju pravilno, okruglo ili ovoidno jedro; retke mitoze ili odsudstvo mitoza; velika zastupljenost citoplazmatskih granula Brojna istraživanja su pokazala značajne razlike između dobro diferentovanih i slabo diferentovani mastocitoma i vremena preživljavanja pacijenta (Tabela 2) (Bostock, 1973; Patnaik, 1984; Bostock i sar., 1989; Simoes i sar., 1994; Murphy i sar., 2004; Thamm i sar., 2007; Romansik i sar., 2007). Sa prognostičkog aspekta, najveći problem su srednje diferentovani mastocitomi, naročito ako se uzme u obzir da su studije pokazale varijacije u klasifikaciji mastocitoma između patologa koji koriste identične sisteme klasifikovanja Većina neslaganja bila je između mastocitoma I i II stepena maligniteta, odnosno mastocitoma II i III stepena maligniteta (Northrup i sar., 2005; Strefezzi i sar., 2010) Međutim, mnogi autori smatraju da je istološka građa mastocitoma najdosledniji prognostički pokazatelj (T amm i sar., 2006). 20 Tabela 2. Vreme preživljavanja pasa nakon iruškog odstranjivanja mastocitoma u odnosu na na istološku građu tumora Autor/stepen maligniteta Broj pasa Procenat preživeli /br meseci nakon operacije Bostock, 1973/ Dobro diferentovani Srednje diferentovani Slabo diferentovani 39 30 45 79/7 37/7 15/7 Patnaik, 1984/ Dobro diferentovani Srednje diferentovani Slabo diferentovani 30 36 17 83/48 44/48 6/48 Bostock, 1989/ Dobro diferentovani Srednje diferentovani Slabo diferentovani 19 16 15 90/nema podataka 75/nema podataka 27/nema podataka Murphy, 2004/ Dobro diferentovani Srednje diferentovani Slabo diferentovani 87 199 54 100/12 92/12 46/12 Simoes, 1994/ Dobro diferentovani Srednje diferentovani Slabo diferentovani 33 35 19 91/20 35/20 42/20 S druge strane, u literaturi se navodi i sledeći sistem klasifikacije mastocitoma: Mastocitomi I stepena - 83% pasa preživljava 4 godine; kompaktan rast tumora, monomorfan izgled, dobro granulisani, nema mitotskih figura. Mastocitomi II stepena - 44% pasa preživljava 4 godine; umereno prisutne citoplazmatske granule, malo mitotskih figura, umerena anizokarioza, povremeno prisutne binuklearne ćelije Mastocitomi III stepena - < 10% pasa preživljava 1 godinu; izražene anizocitoza i anizokarioza, slabo granulisana citoplazma, 36 mitotskih figura u polju od 40x, infiltrativni rast (Cheville, 2006). Brojni su pokušaji da se odrede objektivnije metode za klasifikaciju mastocitoma Pokazalo se da je morfometrija jedra značajno povezana sa istološkim gradiranjem razni tumora kod ljudi i životinja (Maiolino i sar., 2002; Simeonov i sar., 2007). U okviru morfometrijski parametara jedra proučavani su, srednji prečnik, obim, faktor pravilnosti i faktor eliptičnosti Vrednosti prečnika i obima jedra su se povećavale sa povećanjem stepena maligniteta mastocitoma određenog na osnovu istopatološke građe, ali su statistički značajne vrednosti bile samo između II i III stepena maligniteta i I i III stepena maligniteta. Faktor 21 pravilnosti i faktor eliptičnosti se nisu značajno menjali u zavisnosti od istopatološkog stepena tumora Druga ispitivanja ukazuju na kraće vreme preživljavanja što su veće vrednosti morfometrijskih parametara jedra (Strefezzi i sar., 2003; Strefezzi i sar., 2009). Inflitrativni rast tumora se posmatra kao istološka invazivnost tumora i predstavlja najvažniji prognostički činilac i trebalo bi ga određivati u rutinskoj dijagnostici kako bi se predvideo postoperativni is od i preživljavanje psa Pacijenti sa sporo rastućim, lokalizovanim tumorom imaju bolju prognozu (Preziosi i sar., 2007). Mitotski indeks (Mitotic Index – MI, eng ) se pokazao kao bitan prognostički faktor is oda bolesti za različite oblike tumora kod ljudi i životinja Nekoliko studija je pokazalo prognostički značaj MI kod kutanog mastocitoma pasa (Bostock i sar., 1989; Strefezzi i sar., 2003; Romansik i sar., 2007; Welle i sar., 2008) Srednje vreme preživljavanja pasa sa MI ≤ 5 bilo je značajno duže (70 meseci), nego pasa sa MI ≥ 5 (2 meseca), bez obzira na stepen maligniteta tumora, određen na osnovu istopatološki osobina (Romansik i sar., 2007). Međutim, smatra se da mitotski indeks ne može biti odlučujući za ocenjivanje, već da ga treba smatrati dodatnim parametarom pri klasifikaciji mastocitoma (Strefezzi i sar., 2003). Kao bitni prognostički faktori navode se i markeri proliferacije, od koji se najčešće određuju isto emijski marker arigrofilni organizator nukleolusa i imunohistohemijski markeri Ki-67 i nuklearni antigen proliferacije ćelija (Proliferating Cell Nuclear Antigen – PCNA, eng.) (Madewell, 2001). Novija istraživanja, kao negativne prognostičke faktore, navode povećano prisustvo AgNOR, povećanu imunohistohemijsku ekspresiju PCNA/Ki-67 i CD117, kao i povećanu vaskularizaciju i/ili mitotski indeks (Bergman, 2010). Argirofilni organizator nukleolusa (AgNOR) je subjedinica jedra uključena u transkripciju RNK (Derenzini, 2000). Proteini AgNOR-a su skup nuklearnih proteina koji su prisutni u jedrima svi ćelija a akumuliraju se u visoko proliferišućim ćelijama (Mukaratirwa, 2005a). Bojenje organizatora nukleolusa (Nucleolar Organiser Region – NOR, eng.) srebrnim koloidom je u literaturi označeno kao vrlo pouzdan isto emijski prognostički metod Organizatori nukleolusa koji se aktivno transkribuju su argirofilni i mogu se vizuelizovati primenom srebrnog koloida (Kiupel i sar., 1998; Jelesijević i sar., 2003). Ova relativno jednostavna metoda može se izvesti i na citološkim i na istološkim preparatima (T amm i sar., 2007) Služe kao markeri brzine razvoja i napredovanja tumora i metaboličke aktivnosti tumora (Welle i sar., 2008) Pojedini autori navode da je količina AgNOR po jedru proporcionalna 22 stepenu ćelijske proliferacije i vremenu deobe ćelije in vitro, odnosno rastu tumora in vivo (Ofner i sar., 1992; Trere i sar., 1996; Webster i sar., 2007; Welle i sar., 2008). Ispitivanje sprovedeno na 50 pasa sa mastocitomom pokazalo je da je učestalost prisustva AgNOR odličan prognostički pokazatelj (čak bolji od istološkog gradiranja) biološkog ponašanja tumora (Bostock i sar., 1989; Thamm i sar., 2007). Brojne studije su pokazale da je veći broj AgNOR u mastocitomu povezan sa povećanim mortalitetom, lokalnim recidivima i metastazama (Scase i sar., 2006; Webster i sar., 2007). Ki-67 monoklonsko antitelo može se detektovati pomoću imuno isto emijski bojenja tkiva fiksiranih u formalinu i kalupljenih u parafinu. Ki-67 protein je prisutan u svim aktivnim fazama ćelijskog ciklusa (G1, S, G2 i mitoza), ali ga nema u fazi mirovanja ćelije (G0) Za razliku od antigena ćelijske proliferacije (PCNA), koji je pored uloge u replikaciji DNK, bitan i u popravci DNK, Ki-67 je samo marker proliferacije, što ga čini specifičnijom determinantom frakcije rasta tumora. Zbog ovih osobina, Ki-67 je odličan marker za određivanje proliferišući ćelija u neoplazmama ljudi i životinja (Abadie i sar., 1999; Mukaratirwa, 2005a; Ozaki i sar., 2007). Određivanje proliferativnog potencijala tumorski ćelija na osnovu Ki-67 koristi se pri gradiranju pojedinih tumora u humanoj populaciji, kao što su karcinom dojke, karcinom mokraćne bešike, tumori mozga i drugi (Terzić, 2010) Ispitivanja su pokazala da su prisutne značajne razlike u ekspresiji Ki-67 kod mastocitoma I i II stepena maligniteta, odnosno II i III stepena maligniteta, čak i u slučajevima kada nije bilo značajni razlika u MI između mastocitoma pomenutih stepena maligniteta (Sakai i sar., 2002). Prema Patnaikovoj podeli, mastocitomi gradusa I imaju prosečnu vrednost Ki-67 indeksa 2,5, dok mastocitomi gradusa II i III imaju vrednost Ki-67 indeksa 6,0 i 20,6 (Vascellari i sar., 2012). Kako bi se u potpunosti procenila proliferacija ćelija, potrebno je odrediti kako Ki-67, tako i AgNOR Vreme koje protekne do deobe ćelije, a koje se određuje na osnovu broja AgNOR, kao i broj ćelija aktivno uključeni u ćelijski ciklus, meren pomoću Ki-67, blisko je povezano sa progresijom mastocitoma kod pasa S obzirom na pomenute rezultate, preporučeno je da se određivanje AgNOR i Ki-67 primenjuje kao deo rutinske procene osobina tumora zajedno sa drugim parametrima, kao što su istološka procena, postojanje c-KIT mutacije, ekspresija KIT receptora i drugi (Webster i sar., 2007). 23 Antigen ćelijske proliferacije (PCNA) kodira protein koji se nalazi u jedru i kofaktor je DNK polimeraze delta (Bravo, 1987) Uključen je i u mnoge druge procese u jedru, od koji naročito treba pomenuti reparaciju DNK (Maga, 2003). PCNA se sintetiše od sredine G1 faze ćelijskog ciklusa i tokom S faze, ali se može detektovati tokom celog ćelijskog ciklusa zbog dugog vremena polu-života (Mukaratirwa, 2005a) Imuno isto emijskim bojenjem na PCNA označavaju se ćelije koje su u deobi ili kod koji je došlo do reparacije DNK (Simoes i sar., 1994) Pojedine studije su pokazale vezu između PCNA ekspresije s jedne strane i povećanog broja uginuća pasa i vremena koje protekne do ponovne pojave bolesti (Simoes i sar., 1994; Abadie i sar., 1999), dok neki autori smatraju da određivanje samo ekspresije PCNA nema nikakav prognostički značaj kada je u pitanju preživljavanje psa (Scase i sar., 2006; Webster i sar., 2007) Međutim, svi autori se slažu da procenu ekspresije AgNOR i PCNA i istološku procenu treba kombinovati kako bi se dobio najbolji prognostički pokazatelj (Simoes i sar., 1994; Webster i sar., 2007; Welle i sar., 2008). CD45RA antigen (Cluster of Differentiation 45 Ready to Use – CD45RA, eng.) je izoforma antigena CD45 (Cluster of Differentiation 45– CD45, eng.) koji pripada familiji protein tirozin fosfataza, a kodira ga tirozin fosfataza receptor tip C gen. CD45 je membranski glikoprotein sa aktivnošću tirozin fosfataze Eksprimira se na prekursorima i zrelim B i T- limfocitima, granulocitima, istiocitima, mastocitima, folikularnim i dendritičnim ćelijama CD45 se jako eksprimira na membrani limfocita, dok je njegova ekspresija znatno slabija na membrani histiocita. Ovi receptori se gube na zrelim eritrocitima, megakariocitima i plazma ćelijama (Nakano i sar., 1990). CD45RA se nalazi na T i B – limfocitma, mastocitima, NK ćelijama i mnogim drugim ćelijama Ne nalazi se na površini eritrocita i trombocita (Terzić, 2010). Stepen njegove ekspresije na mastocitima može takođe biti bitan prognostički parametar (Welle i sar., 2008). KIT protein, odnosno CD117 pripada porodici tirozin kinaza receptora i veoma je važan za eritropoezu, limfopoezu, razvoj i funkciju mastocita, megakariopoezu, gametogenezu i melanogenezu. Strukturno i funkcionalno je blizak receptoru za faktor rasta trombocita (Platelet- Derived Growth Factor – PDGF, eng.) i faktoru stimulacije rasta kolonija (Roskoski, 2005; Masson i sar., 2009). KIT receptor se nalazi i na normalnim i na neoplastično transformisanim mastocitima (London i sar., 1996; Klopfleisch i sar., 2012). Sastoji se od ekstracelularnog, 24 transmembranskog, negativnog regularnog jukstamembranskog i podeljenog kinaza domena (Slika 1) (Chan i sar., 2003; Webster i sar., 2006). Slika 1. Shematski prikaz tirozin kinaza receptora (KIT) (Webster i sar., 2006b) Nedavna istraživanja su ukazala na postojanje kako normalnih (membranskih), tako i aberantnih citoplazmatskih (fokalnih i difuznih) CD117 receptora na mastocitima pasa (Morini i sar., 2004; Gil da Costa i sar., 2007). Ekspresija Ki-67 i broj AgNOR su u korelaciji sa distribucijom CD117 receptora Broj AgNOR je značajno viši kod mastocitoma sa povećanom ekspresijom citoplazmatski CD117 receptora Značajna veza je uočena i između povećane ekspresije citoplazmatski CD117 receptora i pojave ulceracija, što najverovatnije nastaje kao posledica CD117 posredovanog oslobađanja istamina i serotonina sa posledičniom pojavom svraba i povreda naneti češanjem (Gil da Costa i sar., 2007). Analiza podataka pokazuje manje povoljnu prognozu u slučajevima veće ekspresije fokalni citoplazmatski KIT receptora, nego kada su u pitanju mastocitomi kod koji je uočena povećana ekspresija difuzni citoplazmatski receptora, što ukazuje na vezu između ove vrste KIT receptora i agresivnosti tumora (Preziosi i sar., 2004). Mutacije c-KIT gena koji kodira tirozin kinaza receptor navode se kao bitan faktor za progresiju pojedinih mastocitoma (Downing i sar., 2002; Gleixner i sar., 2007). Prisustvo ovih mutacija se pre svega vezuje za jukstamembranski domen i dovodi se u vezu sa mastocitomima 25 viši stepena maligniteta prema klasifikaciji izvršenoj na osnovu istopatološki osobina tumora (Zemke i sar., 2002; Pryer i sar., 2003; London i sar., 2009). Pojedina ispitivanja ukazuju na vezu između postojanja ITD c-KIT gena ili aberantne lokalizacije KIT receptora i povećani vrednosti ekspresije Ki-67, kao i na značajno povećan indeks proliferacije kod mastocitoma sa ITD (Webster i sar., 2007; Thompson i sar., 2010). C-KIT mutacije su povezane sa višim stepenom istolopatološke klasifikacije MCT (Zemke i sar., 2002; Webster i sar., 2006a). Pacijenti sa mastocitomom koji ima ITD, imaju značajno lošiju prognozu u odnosu na pacijente sa mastocitomima bez pomenute mutacije (Webster i sar., 2006a). 2.2.6. Nova klasifikacija Iako je potvrđeno da je istološka građa mastocitoma u značajnoj korelaciji sa krajnjim ishodom bolesti (Patnaik, 1984), postoji značajna dvosmislenost kada su u pitanju srednje diferentovani tumori (Weisse i sar., 1984), kao i znatne varijacije vezane za subjektivnost istraživača, što je sve skupa uticalo da se dovede u pitanje relevantnost pomenute klasifikacije mastocitoma (Kiupel i sar., 2004a). Stoga je predložen dvostepeni sistem klasifikacije na mastocitome visokog i niskog stepena maligniteta. Na osnovu ove podele, mastocitomi visokog stepena maligniteta moraju imati ispunjen najmanje jedan od sledeći kriterijuma: najmanje 7 mitotskih figura na 10 hpf (High-power Fields – hpf, eng.), najmanje 3 multinuklearne ćelije na 10 hpf, najmanje 3 bizarna jedra na 10 hpf ili prisustvo kariomegalije kod najmanje 10% neoplastični ćelija (Kiupel i sar., 2011). Predloženi dvostepeni sistem gradiranja trebao bi da se koristi pri svakom rutinskom istološkom ispitivanju i dijagnostikovanju mastocitoma. Za mastocitome visokog stepena maligniteta treba primeniti dodatna ispitivanja, kao što su određivanje ekspresije KIT receptora i skrining na c-KIT mutacije, kako bi se odredila adekvatna terapija Životinje sa mastocitomima niskog stepena maligniteta treba klinički pratiti, a dalje prognoze davati na osnovu ekspresije markera proliferacije, KIT ekspresije, postojanja c-KIT mutacija i drugih parametara, kako bi se odredio rizik od nastanka metastaza i odabrao odgovarajući vid terapije (Kiupel i sar., 2011). 26 Webster i sar. (2007) i Kiupel i sar. (2011) su predložili da prognozu za MCT treba određivati na osnovu istološke građe tumora, kao i korišćenjem panel markera, što uključuje određivanje lokalizacije KIT receptora, ekspresije Ki-67 i prisustva mutacija c-KIT protoonkogena. Većina autora smatra da iako sve navedene parametre treba uzeti u obzir, prisustvo mitoza (mitotski indeks) ipak predstavlja najbitniji pokazatelj biološkog ponašanja tumora (Romansik i sar., 2007; Elston i sar., 2009; Scarpa i sar., 2013). 2.2.7. Terapija Izbor terapije zavisi od kliničke slike bolesti, kao i od prisustva, odnosno odsustva bitni prognostički faktora Za tumore različitog stepena klasifikacije, primenjivaće se različite metode lečenja (Welle i sar., 2008). Terapija dobro i srednje diferentovani mastocitoma, sa većine anatomski lokacija na telu psa, podrazumeva potpuno irurško uklanjanje tumora Različiti autori opisuju efikasnu kontrolu tumora nakon irurške ekscizije u oko 84% do 89% slučajeva kod mastocitoma II stepena maligniteta Pored neuspeli rezultata u oko 11%, zabeležene su i udaljene metastaze u 5% do 22% slučajeva Međutim, mnoge studije su pokazale razvoj novi mastocitoma u oko 44% slučajeva (Sfiligoi i sar., 2005; Mullins i sar., 2006; Poirier i sar., 2006). Terapija lekovima na bazi kortikosteroida (Prednizolon) u velikom broju slučajeva dovodi do konsolidacije i smanjenja tumora, što znatno olakšava irurško uklanjanje (Dobson i Co en, 2004; Stanclift i Gilson, 2008) Kod irurškog odstranjivanja tumora, potrebno je da rez bude udaljen oko 3cm od ivice mastocitoma, kako bi se izvela opsežna ekscizija i izbeglo zasecanje tumorske mase Međutim, široke irurške margine nisu preduslov za dugoročno preživljavanje pasa sa dobro diferentovanim mastocitomima (Murphy i sar., 2004; Dobson i Scase, 2007). Ukoliko su promenama za vaćeni i limfni čvorovi, preporučuje se terapija koja obu vata iruršku eksciziju i radioterapiju (Chaffin i Thrall, 2002). Srednje vreme preživljavanja za većinu pasa sa mastocitomom III stepena maligniteta kreće se između 3,5 meseca, ukoliko se primenjuje samo irurški za vat, odnosno 20 meseci, ukoliko se kombinuju operacija i zračenje (Ha n i sar., 2004; Murphy i sar., 2004). Uprkos prihvatljivim rezultatima nakon irurške intervencije i radioterapije, većina veterinarski onkologa smatra da sama lokalna terapija nije dovoljna za optimalnu kontrolu mastocitoma III 27 stepena maligniteta (Hahn i sar., 2004; Thamm i sar., 2006) Većina autora preporučuje i primenu emoterapije, naročito što mastocitomi III stepena maligniteta često daju metastaze (Cooper i sar., 2009). Zračenje je uglavnom korišćeno u okviru post irurške terapije mastocitoma II stepena maligniteta, kod kojih nije bila izvodljiva kompletna ekscizija (npr. na distalnom delu ekstremiteta) Ovakav vid kombinovane terapije je uspešan u 94-97% slučajeva, sa stepenom preživljavanja od 12 meseci (Al-Sarraf i sar., 1996; Frimberger i sar., 1997) Međutim, nijedna od ovih studija nema kontrolnu grupu životinja sa mastocitomima koji su tretirani samo irurški Nekoliko radova navodi isključivo korišćenje radioterapije u lečenju MCT bez pret odnog irurškog otklanjanja tumora (Turrel i sar., 1988; LaDue i sar., 1998). Potencijalna opasnost od zračenja mastocitoma in situ je oslobađanje istamina iz neoplastični mastocita Iz tog razloga, neki autori smatraju da psima sa neoperabilnim MCT treba davati prednizolon 10-14 dana pre zračenja (Dobson i sar., 2004) Radioterapija se takođe može primeniti i preoperativno kako bi se smanjila veličina tumora (LaRue i sar., 2007). Kombinovana terapija koja uključuje zračenje i irurško uklanjanje tumora, u znatnoj meri poboljšava kontrolu tumora, posebno u slučajevima kada je operacija delimično izvodljiva zbog funkcionalni ili kozmetički ograničenja i kao takva nedovoljna za kontrolu bolesti (LaRue i sar., 2007). Primena hemoterapije u terapiji MCT se primarno koristi kod diseminovanih, neoperabilnih mastocitoma ili mastocitoma III stepena maligniteta, kao i kod postojanja metastaza (Camps-Palau i sar., 2007; Welle i sar., 2008). Generalno, postoji vrlo malo podataka iz literature o odgovoru na hemoterapiju kod pasa sa MCT Studije koje su objavljene, uglavnom su rađene na malom broju slučajeva i često su posmatrani MCT različititog stepena maligniteta u različitim kliničkim fazama (Dobson i Scase, 2007). 2.2.8. Novi pristupi u terapiji Poslednji nekoliko godina, protein kinaze se smatraju važnim „metama“ u terapiji mastocitoma (London, 2004). Ovaj vid terapije je već dao povoljne rezultate u umanoj medicini u lečenju tumora Publikovani su radovi u kojima su kao in ibitori tirozin kinaze korišćeni 28 preparati kao što su Gleevec (Imatinib mesilat; Novartis) i Iressa (Gefatinib; Astra-Zeneca). Farmaceutska industrija ubrzano ispituje različite in ibitore protein kinaza receptora, uključujući i molekule koji selektivno deluju kao inhibitori tirozin kinaza receptora (Dobson i Scase, 2007). U okviru ispitivanja u veterinarskoj medicini, najviše je proučavan jedan takav molekul, toceranib phosphate (SU11654), kojim je tretirano 57 pasa sa neoplazmama, a najviša stopa uspešnog odgovora zabeležena je kod pasa sa mastocitomima (London i sar., 2003a; London i sar., 2009) Nakon toga, dodatna istraživanja na psima sa mastocitomima su pokazala vezu između koncentracije SU11654 u plazmi i in ibicije target molekula u biopsijama tumora (Pryer i sar., 2003) U novije vreme se ispituju in ibitori KIT receptora, kao što su axitinib, imatinib, masitinib i vatalanib (Takeuchi i sar., 2012). Osim ciljanog delovanja na neoplastične ćelije, in ibitori KIT receptora mogu delovati i na krvne sudove tumora (Joyce, 2005; Ellis i Hicklin, 2008; Carmeliet i Jain, 2011; Takahashi, 2011). Od ranije je poznato da angiogeneza ima centralnu ulogu u tumorskom rastu (Folkman, 1971) te je atraktivna terapijski meta. Inhibicija angiogeneze se zasniva na vezivanju inhibitora KIT receptora za ATP-vezujuću stranu VEGFR1 i VEGFR2, koji predstavljaju receptore za vaskularni endotelni faktor rasta. Deluju inhibitorno i na tirozin kinaza receptore za faktor rasta poreklom iz trombocita (Platelet-derived Growth Factor – PDGF, eng), epidermalni faktor rasta (Epidermal Growth Factor – EGF, eng.), faktor rasta fibroblasta (Fibroblast Growth Factors – FGF, eng.) (Ellis i Hicklin, 2008; Backer i sar., 2009; Carmeliet i Jain, 2011). Pomenuti receptori, osim što se nalaze na ćelijama krvi, nalaze se i na samim malignim ćelijama, tako da delovanje na ove receptore može imati kako direktan, tako i indirektan efekat na sam tumor Stoga je važno utvrditi da li su ovi receptori prisutni na ćelijama tumora, kako bi se odredila ciljana terapija (Millanta i sar., 2006; Al-Dissi i sar., 2011). Prema pojedinim autorima, na neoplastičnim mastocitima postoji ekspresija VEGF receptora VEGFR1 i VEGFR2, međutim, za razliku od drugi neoplazmi, mastocitomi ne koriste VEGF kao autokrini regulator rasta (Rebuzzi i sar., 2007). Dok se u humanoj medicini navodi 11 registrovanih inhibitora tirozin kinaza receptora i preko 130 koji se nalaze u fazi kliničkog testiranja, u veterinarskoj medicini su zvanično odobreni samo toceranib (Palladia™) u Severnoj Americi (London i sar., 2009) i masitinib (Kinavet™) u Evropi za lečenje pasa, dok je u Severnoj Americi u fazi ispitivanja (Ha n i sar., 2008; Hahn i sar., 2010). 29 3. CILJ I ZADACI Cilj istrаživаnjа u ovoj doktorskoj disertaciji je dа se na osnovu morfološki karakteristika, ekspresije molekulа znаčаjni zа proliferаciju i kontrolu rаstа tumora i prisustva c-KIT mutacija, primeni novi sistem klasifikacije mastocitoma pasa. U cilju određivanja distribucije i morfoloških karakteristika mastocitoma postavljeni su sledeći zadaci:  Određivanje polne, starosne, rasne i topografske distribucije mastocitoma  Ispitivanje prisustva mitotskih deoba, multinuklearni ćelija, bizarni jedara i kariomegalije, mikroskopskom analizom preparata bojenih hematoksilin-eozinom  Ispitivanje prisustva granula i stepena degranulacije mastocita mikroskopskom analizom preparata bojenih toluidine blue metodom U cilju određivanja ekspresije u mastocitomima, molekulа znаčаjnih zа proliferаciju i kontrolu rаstа, postavljeni su sledeći zadaci:  Imunohistohemijsko dokazivanje ekspresije KIT receptora (CD117),  Imunohistohemijsko dokazivanje ekspresije Ki-67 antigena,  Imunohistohemijsko dokazivanje ekspresije PCNA i  Imunohistohemijsko dokazivanje ekspresije CD45RA. U cilju određivanja prisustva mutacija na c-KIT protoonkogenu, postavljen je zadatak:  Ispitivanje prisustva c-KIT mutacija kod mastocitoma oba istološka gradusa, primenom molekularne metode PCR (Polymerase Chain Reaction - PCR, eng). 30 4. MATERIJAL I METODE 4.1. Materijal 4.1.1. Tkivni uzorci Ispitivanjima su obu vaćeni isečci kože 24 psa kod koji je kliničkim pregledom postavljena sumnja na mastocitom Isečci nepromenjene kože 6 odrasli pаsа, uzorkovаni nа obdukciji, služili su kаo kontrolа Psi različite rase i pola (7 ženki i 17 mužjaka), uzrasta od 3 do 11 godina, poticali su sa teritorije Republike Srbije Histopatološka dijagnoza kod ovi pasa postavljena je na Kаtedri zа pаtološku morfologiju, Fаkultetа veterinаrske medicine u Beogrаdu, u prethodne tri godine. Svi ispitani MCT potiču od pasa koji su klinički pregledani, a podaci o rasi, polu, starosti i lokalizaciji odstranjenog tumora, navedeni su u uputu za istopatološki pregled 4.1.2. Izolat DNK Kao pozitivna kontrola za c-KIT mutaciju (prisustvo ITD na egzonu 11) korišćen je izolat DNK psa sa mastocitomom za koga je utvrđeno da poseduje navedenu mutaciju Izolat potiče sa Koledža veterinarske medicine, Odeljenja za patobiologiju i dijagnostička ispitivanja iz Mičigena, SAD (T e Department of Pat obiology and Diagnostic Investigation in the College of Veterinary Medicine at Michigan State University, USA). 31 4.2. Metode U toku ispitivanja primenjene su sledeće metode: 1 Histološka obrada uzoraka tumora kože 2 Histološka analiza uzoraka tumora kože 3. Imunohistohemijska metoda 4. Morfometrijska analiza 5. Metode molekularne detekcije mutacija 6 Statistička obrada 4.2.1. Histološka obrada uzoraka tumora kože Neposredno nаkon biopsije tumorа kože pаsа, uzorci su fiksirаni u 10% neutrаlnom puferizovаnom formаlinu ne duže od 48 sаti, posle čegа su procesovаni u аutomаtskom tkivnom procesoru LEICA TP1020, gde su isprаni vodom i dаlje de idrirаni u аlko olimа rаstuće koncentrаcije, dа bi zаtim bili prosvetljeni u ksilolu i ukаlupljeni u pаrаfinske kаlupe Pаrаfinski blokovi su sečeni pomoću mikrotomа LEICA RM 2235 nа tkivne isečke debljine 3-5 µm Dobijeni prepаrаti su bojeni emаtoksilin-eozin (HE) metodom. 4.2.2. Histološka analiza uzoraka tumora kože Nа prepаrаtimа bojenim emаtoksilin-eozinom postаvljenа je preliminarna pаto istološkа dijаgnozа mаstocitomа, a zа njenu potvrdu, prepаrаti su dаlje bojeni toluidin blue (TB) metodom, čime je omogućena vizuelizacija istaminski granula u mastocitima Pаto istološke osobine tumorа, kаo što su prisustvo mitozа, multijedаrni ćelijа, bizаrni jedаrа i kariomegalije, analizirani su nа prepаrаtimа bojenim emаtoksilin-eozinom. Broj nаvedeni pаrаmetаrа određivаn je nа deset vidni poljа svаkog tumorа, pri uveličаnju 400 putа (10 high-power fields - 10 hpf, eng). Na osnovu navedenih parametara, tumori su razvrstani u dva stepena diferentovanosti – tumore visokog stepena maligniteta koji imaju najmanje 7 mitotskih figura, najmanje 3 multinuklearne ćelije, najmanje 3 bizarna jedra na 10 polja velikog uvećanja (400x) ili je prisutna kariomegalija kod 10% anaplastični ćelija i na tumore niskog 32 stepena maligniteta, koji ne ispunjavaju navedene uslove. Mitotski indeks je definisan kao broj mitotskih figura na 10 polja velikog uvećanja (400x) i beležen je za svaki tumor posebno primenom metode opisane od strane Romansik i sar. (2007). Nа prepаrаtimа bojenim toluidin blue metodom аnаlizirаno je prisustvo grаnulа u mаstocitimа, odnosno pericelularna degranulacija, tаkođe nа deset poljа pri istom uvećаnju  Mitotske figure Pod mitotskim figurama se podrazumevaju romozomi ćelija u deobi koji se uočavaju umesto samog jedra i vidljivi su kao upletene, tamnije obojene niti. To su hiperhromatske figure čije jedarne membrane nisu jasno uočljive Veliki broj umnoženi romozoma često ćeliji daje "čupav" izgled Citoplazma ovi ćelija je boje slabijeg inteziteta u odnosu na ćelije u interfazi Tokom profaze romozomi su prvo končasti, a zatim se kondezuju tako da se mogu uočiti sestrinske romatide spojene centromerom Kod određenog broja ćelija romozomi su uočljivi samo u jednoj ravni, tzv ekvatorijalnoj ravni i tada se ćelija nalazi u metafazi u kojoj se romozomi najbolje uočavaju jer su maksimalno kondezovani U ranoj anafazi većina romozoma počinje da se razdvaja na po dve romatide koje se dekondezuju, tako da se pri kraju anafaze i tokom telofaze uočavaju dve grupe romatida na oba pola ćelije  Multinuklearne ćelije Multinuklearnim ćelijama smatrani su svi mastociti sa više od jednog jedra Ove ćelije su uglavnom krupne, okruglog oblika, sa jasno vidljivim granicama između jedara i citoplazme Karakteristike jedra i citoplazme multinuklearni ćelija su iste kao i kod ćelija sa jednim jedrom  Bizarna jedra Pod bizarnim jedrima podrazumevana su sva jedra koja odstupaju od normalnog (okruglog) oblika, tipičnog za jedra mastocita Ovakva jedra mogu biti režnjevita, elipsoidnog ili nepravilnog oblika i iper romatična 33  Kariomegalija Kariomegalija podrazumeva patološko uvećanje jedra ćelije Većina ćelija sa kariomegalijom sadrži veliki broj meta romatski ćelija u svojoj citoplazmi Povećana jedra su iper romatična sa prominentnim jedarcetom 4.2.3. Imunohistohemijska metoda Imuno isto emijskа obrаdа je obаvljenа u Lаborаtoriji zа pаto istologiju Kаtedre zа pаtološku morfologiju, Fаkultetа veterinаrske medicine u Beogrаdu Imuno isto emijskа te nikа na uzorcima fiksiranim u formаlinu i ukalupljenim u pаrаfinu predstаvljа višestepenu proceduru kojа obu vаtа sledeće postupke: - deparafinizacija - demaskiranje antigena - blokirаnje endogene peroksidаze - preinkubacija sa normalnim kozjim serumom - imuno isto emijsko bojenje primenom streptаvidin-biotin tehnike Deparafinizacija Isečci debljine 4µm, dobijeni sečenjem pаrаfinski kаlupа tumora pomoću mikrotomа, nаkon sušenjа na 56°C – 12 , depаrаfinisаni su po sledećoj proceduri: I ksilol ........................................................................ 10 minuta II ksilol ....................................................................... 10 minuta 100% alkohol .............................................................. 3 – 5 minuta 100% alkohol .............................................................. 3 – 5 minuta 96% alkohol ................................................................ 3 minuta 70% alkohol ................................................................ 3 minuta tekuća voda ispiranje 34 Demaskiranje antigena Depаrаfinisаni preseci su preneti u plаstičnu kivetu sа oko 250 ml rаdnog rаstvorа citrаtnog puferа (pH=6) i termički obrađeni u mikrotаlаsnoj pećnici 21 minut pri snаzi od 560W, а zаtim lađeni dodavanjem destilovane vode 20 minutа nа sobnoj temperаturi Nаkon lаđenjа, isprani su nаjpre u vodi iz česme, а zаtim u destilovаnoj vodi Blokirаnje endogene peroksidаze Preparati su potopljeni 15 minuta u smešu 3% vodonik – proksida (3 ml) i metanola (177 ml), a zatim isprani u fosfatnom puferu (phosphate-buffered-saline – PBS, eng.). Nakon odlivanja viška pufera, preostala tečnost oko isečka pažljivo je obrisana. Preinkubacija sa normalnim kozjim serumom Svaki isečak prekriven je 20% kozjim serumom i inkubiran 20 minuta na sobnoj temperaturi. Imunohistohemijsko bojenje primenom streptavidin-biotin tehnike Za imuno isto emijsko bojenje korišćen je komercijalni kit (Labelled streptavidin-biotin LSAB+ metoda, DAKO, Danska) Bojenje se obavlja po sledećoj proceduri: FAZA I (primarno antitelo razblaženo po uputstvu proizvođača) 1. odliti višak seruma, obrisati višak tečnosti oko isečka 2. pokriti isečak sa minimalnom količinom (50-150 µL) primarnog antitela 3. inkubirati 60 minuta na sobnoj temperaturi 4. pažljivo isprati PBS iz špric boce (3 puta po 5 minuta) 5. preliti svežim puferom 35 FAZA II (biotinilizovano vezno antitelo) 1. odliti višak pufera, obrisati višak tečnosti oko isečka 2. pokriti isečak sa minimalnom količinom (50-150 µL) LINK antitela 3. inkubirati 20 minuta na sobnoj temperaturi 4. pažljivo isprati PBS iz špric boce (3 puta po 5 minuta) 5. preliti svežim puferom FAZA III (streptavidin-peroksidaza) 1. odliti višak pufera, obrisati višak tečnosti oko isečka 2. pokriti isečak sa minimalnom količinom (50-150 µL) streptavidin-peroksidaze 3. inkubirati 20 minuta na sobnoj temperaturi 4. pažljivo isprati PBS iz špric boce (3 puta po 5 minuta) 5. preliti svežim puferom FAZA IV (supstrat hromogen) 1. odliti višak pufera, obrisati višak tečnosti oko isečka 2. pokriti isečak sa minimalnom količinom (50-150 µL) romogena diaminobenzidina (DAB) 3. inkubirati 10 minuta na sobnoj temperaturi 4. isprati destilovanom vodom FAZA V (kontrastiranje) 1. staviti u Mayer-ov hematoksilin 1 sekundu 2. isprati prvo vodom iz česme, a zatim destilovanom vodom 3. pokriti vodenim medijumom za montiranje (Aquatex, Merck) Mesta specifičnog vezivanja antitela su smeđe boje, dok ematoksilin boji plavo jedra svi ćelija za koje se nespecifično veže Celokupna procedura je korišćena za sledeća antitela, u odgovarajućim razblaženjima: - CD117 (A4502, Polyclonal Rabbit Anti-Human, DakoCytomation, Danska), 1:400 - Ki-67 (M7240, Klon MIB-1, DakoCytomation, Danska), 1:50 - PCNA (M0879, Monoclonal Mouse Anti-, DakoCytomation, Danska), 1:200 - CD45RA (M0754, Monoclonal Mouse Anti-Human, DakoCytomation, Danska), Ready to use 36 Za svako primenjeno antitelo postojala je pozitivna i negativna kontrola. Kao pozitivne kontrole korišćeni su tkivni uzorci kod koji je pret odno već postavljena dijagnoza mastocitoma Kontrolni uzorci su tretirani jednako kao i ispitujući mastocitomi, s tim što je kod negativne kontrole tridesetominutna inkubacije sa primarnim antitelom zamenjena inkubacijom sa puferom. Rezultati imunohistohemijskog bojenja su analizirani na svetlosnom mikroskopu (BX51, Olympus Optical, Japan). 4.2.4. Morfometrijska analiza Za morfometrijska ispitivanja korišćen je morfometrijski softver Olympus Cell B, uz upotrebu kamere Olympus Color View III. Lokalizacija KIT proteina je određena na način opisan u istraživanju Webster i sar. (2007), s obzirom da se razlikuju membranski KIT proteini i dve vrste citoplazmatskih KIT proteina - fokalno i difuzno raspoređeni u citoplazmi Koji od KIT proteina preovlađuje, određivano je na osnovu prisustva u najmanje 10% neoplastični ćelija tumora Ćelije na ivici tumora nisu uzimane u razmatranje Za Ki-67 antitelo i PCNA, najpre su pomoću svetlosnog mikroskopa, pri uvećanju 1000x, određena područja sa najvećom koncentracijom neoplastički mastocita Nakon identifikacije visoko proliferativni područja, broj imunopozitivni ćelija je određivan pomoću mrežice za morfometriju, čija su polja površine 1 cm2 pri uvećanju 400X Broj imunopozitivni ćelija je određen u 10 polja, a zatim je izračunata prosečna vrednost Za CD45RA antitelo određivano je da li su tumori imuno isto emijski pozitivni ili negativni na CD45 receptore, bez određivanja broja imunopozitivni ćelija po jedinici površine Digitalne fotografije su napravljene pomoću optičkog mikroskopa Olympus BX51 sa digitalnom kamerom Olympus Color View III. 37 4.2.5. Metode molekularne detekcije mutacija Izolacija DNK DNK iz parafinski isečaka mastocitoma debljine 5µm, izolovana je pomoću komercijalnog seta „KAPA Express Extract Kit” (Cat No KK7152, Kapa Biosystems, Cape Town, South Africa). Protokol za izolaciju DNK korišćenjem navedenog seta uključivao je sledeće korake: 1. Parafinski isečci tumora debljine 5 µm i veličine 2x3mm stavljani su u epruvetu zapremine 1,5 ml. 2. U svaku epruvetu je dodato po 88 μl vode, 10 μl 10x KAPA Express Extract pufera i 2 μl KAPA Express Extract enzima Sadržaj epruvete je vorteksovan 10s 3. Inkubacioni korak protokola je omogućio lizu tkiva (20 min na 75ºC) i inaktivaciju termostabilne KAPA Express Extract proteaze (5 min na 95ºC) 4. Sadržaj epruvete je vorteksovan 10s, a zatim centrifugiran 1 minut na 130k rpm 5. Nakon centrifugiranja, 50 μl DNK izolata (supernatanta) je prebačeno u novu epruvetu zapremine 1,5 ml. 6. Tako dobijen izolat DNK razređen je u TE puferu u odnosu 1:5 i čuvan na -20ºC do upotrebe u PCR reakciji. Lančana reakcija polimeraze (PCR) Kako bi se željeni fragment DNK mogao analizirati, neop odno je da se poveća njegova količina, što se postiže PCR amplifikacijom uz primenu specifični prajmera U ovom radu korišćeni su prajmeri PE1 (CCA TGT ATG AAG TAC AGT GGA AG) i PE2 (GTT CCC TAA AGT CAT TGT TAC ACG) (Jones i sar., 2004) koji omogućavaju amplifikaciju c-KIT jukstamembraznog domena PE1 je smešten na 5’ kraju egzona 11, dok se PE2 nalazi u sredini introna 11 Navedeni prajmeri bi trebalo da generišu PCR produkt veličine ~191 bazni parova i drugi, veličine ~250 bazni parova 38 PCR reakciona smeša je pripremljena upotrebom komercijalnog seta KAPA2G Robust HotStart ReadyMix prema uputstvima proizvođača Reakciona smeša ukupne zapremine 25 μl sadržala je 12,5 μl KAPA2G Robust HotStart ReadyMix (2X), 1,25 μl svakog prajmera (PE1 i PE2) i 10 μl izolovane DNK PCR reakcija se odvijala u PCR aparatu – MultiGene Gradient (Labnet International Inc.) po programu: 1) Početna denaturacija na 95ºC tokom 3 minuta; 2) Denaturacija na 94ºC tokom 15 sekundi; 3) Hibridizacija na 59ºC tokom 15 sekundi; 4) DNK ekstenzija na 72ºC tokom 15 sekundi; Koraci 2, 3 i 4 ponovljeni su u 40 ciklusa. 5) Finalna ekstenzija DNK na 72ºC tokom 5 minuta. KAPA2G Robust HotStart ReadyMix (2X) sadrži KAPA2G Robust HotStart DNK polimerazu u odgovarajućem reakcionom puferu, sva četiri dNTP-a (0,2 mM svakog dNTP-a, 1X), MgCl 2 (2 mM, 1X) i stabilizatore. KAPA2G Robust DNK polimeraza je specijalno dizajnirana polimeraza koja obezbeđuje veću procesivnost i viši nivo tolerancije na uobičajene PCR in ibitore nego wild-type Taq polimeraza U „ ot start“ formulaciji, KAPA2G Robust DNK polimeraza je u kombinaciji sa specifičnim antitelom koje inaktivira enzim do prvog koraka denaturacije To sprečava elongaciju prajmer–templat kompleksa koji nastaju kao rezultat nespecifičnog vezivanja prajmera u toku inicijalne denaturacije i povećava ukupnu efikasnost reakcije KAPA2G Robust HotStart DNK polimeraza ima 5’-3’ polimeraznu i 5’-3’ egzonukleaznu aktivnost, ali nema 3’-5’ egzonukleaznu (korigujuću) aktivnost Vernost KAPA2G Robust HotStart DNK polimeraze je slična onoj koju ima wild-type Taq polimeraza; stopa pogrešnog ugrađivanja nukleotida je približno jedna greška na 1 7 x 105 inkorporiranih nukleotida. A 39 Elektroforeza i vizuelizacija PCR produkata Produkti PCR amplifikacije su razdvojeni elektroforezom na agaroznom gelu. Elektroforeza se temelji na različitoj brzini kretanja molekula DNK različiti veličina u agaroznom gelu pod uticajem električnog polja Molekul DNK je negativno naelektrisan i u električnom polju se kreće prema pozitivnoj elektrodi (anodi) Odnos molekulske mase i naelektrisanja molekula je konstantan, pa se molekuli kroz gel kreću brzinom koja zavisi samo od nji ove veličine Molekuli manje molekulske mase kreću se brže kroz gel, dok se oni sa većom molekulskom masom kreću sporije Dvoprocentni agarozni gel pripremljen je rastvaranjem 0,8 g agaroze u 40 ml 1x TBE pufera (Tris-borat, EDTA) Nakon što je gel naliven u kalup i o lađen tokom desetak minuta na sobnoj temperaturi, u svaki bunarčić gela nanešena je smeša 2,5 μl PCR produkta i 1,5 μl boje 6x Loading Dye Solution (Fermentas) U granične bunarčiće je nanešeno 2 μl markera (O'RangeRuler™ 50bp DNA Ladder, Fermentas) koji je takođe pret odno pomešan sa 1,5 μl boje. Gel je preliven sa 50 ml 1x TBE pufera. Elektoforeza se odvijala pri struji od 50 mA i naponu od 50 V u trajanju od 46 minuta. Za vizuelizaciju molekula DNK u gelu korišćen je etidijum bromid koji se interkalira između lanaca DNK molekula i fluorescira kada se osvetli UV svetlom Vizuelizacija molekula DNK u agaroznom gelu omogućena je bojenjem gela nakon elektroforeze u rastvoru od 20 μl etidijum bromida u 200 ml destilovane vode tokom 15 minuta. Gel je zatim ispran destilovanom vodom tokom 15 minuta, postavljen pod UV svetlo transiluminatora i fotografisan kako bi se dobio trajni zapis rezultata elektroforetske analize Prisustvo mutacija određivano je vizuelnim pregledom slike gela. 4.2.6. Statistička obrada podataka U statističkoj analizi dobijeni rezultata, kao osnovne statističke metode, korišćeni su deskriptivni parametri Ovi parametri su omogućili opisivanje dobijeni rezultata i nji ovo tumačenje Od deskriptivni aritmetički parametara korišćene su aritmetička sredina i standardna devijacija. 40 Prilikom testiranja i utvrđivanja statistički značajni razlika korišćena su dva testa: t - test proporcije i χ2 test Pomoću ovi testova utvrđivano je postojanje statistički signifikantne razlike između ispitivani parametara Statistički signifikantna razlika utvrđena je na nivou značajnosti od 5% i 1% Dobijeni rezultati su prikazani tabelarno i grafički Statistička analiza dobijeni rezultata izvedena je u statističkom paketu SPSS i MS Excel. 41 5. REZULTATI 5.1. Određivanje polne, starosne, rasne i topografske distribucije kutanog mastocitoma kod ispitanih pasa 5.1.1. Polna distribucija mastocitoma Kutani mastocitom je dijagnostikovan kod 24 psa, i to kod 7 ženki (29,17%) i 17 mužjaka (70,83%) (Grafikon 1) Podaci pokazuju da u ispitanoj grupi postoji statistički signifikantna razlika između pola pasa i pojave mastocitoma (p<0,01) Pse iz kontrolne gupe činili su tri mužjaka i tri ženke Grafikon 1. Zastupljenost kutanog mastocitoma u odnosu na polnu distribuciju 42 5.1.2. Zastupljenost kutanog mastocitoma u odnosu na starost pasa Starost pasa kod kojih je dijagnostikovan mastocitom je od 3 do 11 godina, dok je prosečna starost oboleli pasa 7,56±2,45 godina Obolele ženke su prosečne starosti 7,43±2,52 godina, dok je prosečna starost oboleli mužjaka 7,62±2,48 godina (Grafikon 2) Podaci pokazuju da ne postoji statistički značajna razlika između starosti pasa i pojave mastocitoma (p>0,05). U kontrolnoj grupi bili su psi prosečne starosti 7,0±4,15 godina Grafikon 2. Zastupljenost kutanog mastocitoma u odnosu na starosnu distribuciju 5.1.3. Rasna distribucija kutanog mastocitoma Ispitanu grupu oboleli pasa čine po jedan (4,2%) foks terijer, dogo argentino, maltezer i američki staford terijer, po dva (8,3%) mešanca, labradora i američka buldoga, pet boksera (20,7%) i devet zlatnih retrivera (37,5%). Za jednog (4,2%) psa ne postoje podaci o rasi (Grafikon 3) Iz navedeni podataka se može uočiti da su mastocitomi više zastupljeni kod rasni pasa u odnosu na mešance Podaci pokazuju da postoji statistički značajna razlika u pojavi mastocitoma između različiti rasa pasa (p=0,005401) U kontrolnoj grupi su se nalazile dve pudle i po jedan veliki šnaucer, nemački lovni terijer, maltezer i mešanac 43 *foks terijer, dogo argentino, maltezer i američki staford terijer ** mešanac, labrador i američki buldog Grafikon 3. Zastupljenost kutanog mastocitoma u odnosu na rasnu distribuciju 5.1.4. Topografska distribucija kutanog mastocitoma Najčešća lokalizacija mastocitoma kod pasa je uočena na ekstremitetima (Slika 2), i to kod 8 pasa (33,3%), zatim na trupu kod 7 pasa (29,2%) i na abdomenu kod 3 psa (12,5%). Dva mastocitoma (8,3%) su odstranjena sa različiti mesta na glavi oboleli pasa Za četiri tumora (16,6%) nije poznata lokalizacija (Grafikon 4) Podaci pokazuju da ne postoji statistički značajna razlika u pogledu lokalizacije mastocitoma na različitim anatomskim regijama tela psa (p=0,232501). 44 Slika 2. Kutani mastocitom na ekstremitetu psa Grafikon 4. Zastupljenost mastocitoma u odnosu na topografsku distribuciju 45 5.2. Morfološke karakteristike mastocitoma 5.2.1. Mikroskopski nalaz na preparatima bojenim hematoksilin – eozinom (HE) Od 24 dijagnostikovana mastocitoma (Grafikon 5), ustanovljeno je 10 dobro diferentovanih mastocitoma. U ovim tumorima se uočavaju ćelije uniformnog oblika sa centralno postavljenim jedrom i granulisanom citoplazmom Tumorske ćelije su poređane u umereno zbijene redove odvojene kolagenom (Slika 3). Slika 3. Ćelije dobro diferentovanog mastocitoma, HE, x400 Grafikon 5. Broj mastocitoma visokog i niskog stepena maigniteta 46 Mikroskopskim pregledom pato istološki preparata, kod 14 slabo diferentovani mastocitoma uočavaju se ćelije sa jasno izraženim granicama, jedra su velika, nepravilnog oblika (Slika 4), dok pojedine ćelije imaju više jedaraca Prisutne su višejedarne ćelije, a mitotske figure su brojne Kod 5 mastocitoma ćelije su poređane u redove, dok su kod ostali mastocitoma nepravilno raspoređene Tumorske ćelije duboko infiltruju subkutis Uočavaju se i nekrotična polja. Na istopatološkim preparatima 6 uzoraka kože uzeti od pasa iz kontrolne grupe nisu uočene promene Slika 4. Ćelije slabo diferentovanog mastocitoma, HE, x 400 Većina tumora oba gradusa je infiltrovana različitim ćelijama zapaljenja, uglavnom limfocitima i plazma ćelijama i u različitoj meri eozinofilnim granulocitima Prisustvo mitotskih figura Histološkom analizom isečaka mastocitoma bojeni ematoksilin-eozinom ćelije u mitozi se uočavaju kao iper romatske figure Osim toga, kod nji se ne zapažaju jasno jedarne membrane, a umesto samog jedra vidljivi su hromozomi nalik tamnim nitima. Veliki broj umnoženi romozoma često ćeliji daje "čupav" izgled Boja citoplazme ćelija u mitozi je slabijeg inteziteta, dok su jedra ovi ćelija intenzivnije boje u odnosu na ćelije u interfazi Kod 7 mastocitoma prisutno je više od šest mitotskih figura na 10 hpf (High-power Fields – hpf, eng.) (Slika 5), dok se 17 mastocitoma odlikuje slabijom mitotskom aktivnošću (Slika 6). Svih sedam mastocitoma sa povećanim brojem mitotskih figura pripada 47 mastocitomima višeg stepena maligniteta (Grafikon 6) S obzirom da su mitotske figure prisutne kod 7 (50%) mastocitoma visokog stepena maligniteta, nji ovo prisustvo u ovom istraživanju nije statistički značajno (p > 0,05) za klasifikaciju mastocitoma po Kiupel-u. Slika 5. Mitotske figure kod mastocitoma visokog stepena maligniteta, HE, x 400 Slika 6. Odsustvo mitotskih figura kod mastocitoma niskog stepena maligniteta, HE, x 400 Grafikon 6. Prisustvo mitotskih figura kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta 48 Prisustvo multinuklearnih ćelija Mikroskopski je utvrđeno prisustvo multinuklearni ćelija u preparatima bojenim HE Većina multinuklearni ćelija ima dva jedra, dok su ćelije sa većim brojem jedara znatno ređe Histološkim pregledom uzoraka, kod 11 mastocitoma je uočeno prisustvo više od dve multinuklearne ćelije na 10 pf (Slika 7) Kod 5 mastocitoma su prisutne po dve multinuklearne ćelije, dok je kod 6 mastocitoma uočena po jedna multinuklearna ćelija na istom broju vidni polja Multinuklearne ćelije nisu uočene kod 2 mastocitoma (Slika 8, Grafikon 7) Iz napred navedenog se uočava da su kod 78,57% mastocitoma visokog stepena prisutne više od dve multinuklearne ćelije na 10 pf, što ukazuje da je ovaj parametar statistički značajan (p < 0,01) za klasifikaciju mastocitoma po Kiupelu. Slika 7. Multinuklearne ćelije kod mastocitoma visokog stepena maligniteta, HE, x 400 Slika 8. Odsustvo multinuklearni ćelijija kod mastocitoma niskog stepena maligniteta, HE, x 400 49 Grafikon 7. Prisustvo multinuklearni ćelija kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta Prisustvo bizarnih jedara U pato istološkim preparatima mastocitoma uočavaju se tumorske ćelija bogate citoplazmom, sa jedrima koja odstupaju od okruglog oblika. Više od dve ćelije sa bizarnim jedrom na 10 hpf prisutne su kod 10 mastocitoma (Slika 9). Svih deset mastocitoma su mastocitomi visokog stepena maligniteta. Dve ćelije sa bizarnim jedrom na istom broju vidni polja uočene su kod jednog mastocitoma, dok je po jedna ćelija sa bizarnim jedrom prisutna kod 10 mastocitoma Kod 3 mastocitoma nisu uočene ćelije sa bizarnim jedrima (Slika 10, Grafikon 8) S obzirom da se bizarna jedra uočavaju kod 71,43% mastocitoma visokog stepena maligniteta, nji ovo prisustvo se može smatrati statistički značajnim parametrom (p < 0,05) za klasifikaciju mastocitoma po Kiupelu,. 50 Slika 9. Bizarna jedra kod mastocitoma visokog stepena maligniteta, HE, x 400 Slika 10. Odsustvo bizarnih jedara kod mastocitoma niskog stepena maligniteta, HE, x 400 Grafikon 8. Prisustvo bizarnih jedara kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta Prisustvo kariomegalije Osam mastocitoma sadrži više od 10% anaplastični mastocita sa jedrima promera oko 8- 10 mikrometara (Slika 11 i 12), dok 5 mastocitoma sadrže manje od 10% ćelija sa povećanim jedrom. Kod 11 mastocitoma nije prisutna kariomegalija (Grafikon 9). Prisustvo kariomegalije je uočeno kod 57,14% mastocitoma visokog stepena maligniteta i ne može se smatrati statistički značajnim (p > 0,05) parametrom za klasifikaciju mastocitoma po Kiupel-u. 51 Slika 11. Kariomegalija kod mastocitoma visokog stepena maligniteta, HE, x 400 Slika 12. Kariomegalija kod mastocitoma visokog stepena maligniteta, TB, x 600 Grafikon 9. Prisustvo kariomegalije kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta Na histopatološkim preparatima 6 uzoraka kože uzeti od pasa iz kontrolne grupe nije uočeno prisustvo mitotski figura, multinuklearni ćelija, bizarni jedara i kariomegalije 52 5.2.2. Mikroskopski nalaz na preparaima bojenim toluidine blue metodom Radi potvrđivanja dijagnoze, preparati su obojeni toluidin blue metodom radi vizuelizacije granula. Kod svih 24 uzoraka tumora citoplazmatske granule su pokazale meta romaziju, čime je potvrđena dijagnoza mastocitoma (Slika 12 i 13) Kod 13 tumora (jedanaest mastocitoma visokog stepena maligniteta i dva mastocitoma niskog stepena maligniteta) granule su bile prisutne u malom broju, dok su kod preostalih 11 mastocitoma one bile zastupljene u većem broju (3 mastocitoma visokog i 8 mastocitoma niskog stepena maligniteta) (Grafikon 10). Slika 13. Prisustvo velikog broja citoplazmatskih granula kod mastocitoma, TB, x 400 Slika 14. Prisustvo malog broja citoplazmatskih granula kod mastocitoma, TB, x 400 Grafikon 10. Stepen degranulacije mastocita kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta 53 Intenzivna degranulacija mastocita uočena je kod 12 tumora, od koji je jedan niskog stepena maligniteta, a 11 visokog stepena maligniteta (Slika 15). Slika 15. Degranulacija mastocita u mastocitomima visokog stepena maligniteta, TB, x 600 5.3. Klasifikacija mastocitoma Na osnovu: 1. prisustva mitotskih figura 2. prisustva multinuklearnih ćelija 3. prisustva bizarnih jedara 4. prisustva kariomegalije svi mastocitomi su klasifikovani prema Kiupel-ovom predlogu dvostepene gradacije (Kiupel i sar., 2011). U ispitanom materijalu 14 od 24 mastocitoma ima ili najmanje 7 mitotskih figura ili najmanje 3 multinuklearne ćelije ili najmanje 3 bizarna jedra na 10 pf ili prisustvo kariomegalije kod minimum 10% anaplastični mastocita, te su svrstani u visoki stepen maligniteta, dok je 10 mastocitoma niskog stepena maligniteta (Tabela 3). 54 Tabela 3 Histopatološke karakteristike mastocima visokog i niskog gradusa Karakteristika tumora >6 MF ≤6 MF >2 MĆ ≤2 MĆ >2 BJ ≤2BJ >10% KM Broj tumora 7 17 11 13 10 14 8 Ukupan broj mastocitoma visokog stepen maligniteta 14 Ukupan broj mastocitoma niskog stepen maligniteta 10 Histopatološke osobine tumora: MF=broj mitotskih figura, MĆ=broj multinuklearni ćelija, BJ=broj bizarnih jedara, KM=kariomegalija 5.4. Imunohistohemijski parametri značajni za klasifikaciju mastocitoma 5.4.1. Imunohistohemijska ekspresija KIT receptora (CD117) u mastocitomima Imuno isto emijskim bojenjem potvrđeno je prisustvo CD117 receptora u isečcima tkiva kože pasa sa mastocitomom Mikroskopskim pregledom preparata uočavaju se tri tipa imuno isto emijskog bojenja mastocita pozitivni na CD117 Tip I se karakteriše prebojavanjem membrane mastocita usled lokalizacije KIT proteina u membrani ćelija, dok je prebojavanje citoplazme prisutno u maloj meri ili potpuno izostaje (Slika 16) Tip II se karakteriše difuznim prebojavanjem citoplazme (Slika 17) Tip III je takođe vezan za prisustvo KIT proteina u citoplazmi naoplastični mastocita i karakteriše se intenzivnim fokalnim prebojavanjem citoplazme neoplastični mastocita 55 Slika 16. Ekspresija CD117, tip I – intenzivna membranska reakcija mastocita, citoplazmatska reakcija prisutna u maloj meri ili potpuno izostaje, CD117, LSAB2, x 400 Slika 17. Ekspresija CD117, tip II – difuzna citoplazmatska reakcija mastocita, CD117, LSAB2, x 400 Membransku ekspresiju CD117 ima 62,5% (15 od 24) mastocitoma i to svih 10 mastocitoma niskog stepena maligniteta i 5 mastocitoma visokog stepena maligniteta. Od ukupnog broja mastocitoma, 20,8% (5 od 24) ispoljava difuznu citoplazmatsku ekspresiju CD117, dok nijedan mastocitom ne pokazuje samo fokalnu citoplazmatsku reakciju mastocita na CD117 Mešovit tip ekspresije KIT proteina takođe se uočava kod pojedini tumora gde postoji varijabilan odnos mastocitoma sa različitim tipom ekspresije: 12,5% od ukupnog broja tumora (3 od 24) pokazuje i fokalnu citoplazmatsku i membransku ekspresiju (Slika 18), dok 4,2% (1 od 24) mastocitoma ima membransku i difuznu citoplazmatsku ekspresiju KIT proteina (Slika 19). Dobijeni rezultati pokazuju da ne postoji statistički signifikanta razlika između različiti tipova citoplazmatske ekspresije CD117 kod mastocitoma visokog stepena maligniteta (p=0, 285049). 56 Slika 18. Ekspresija CD117, mešoviti tip – membranska i fokalna citoplazmatska reakcija mastocita, CD117, LSAB2, x 400 Slika 19. Ekspresija CD117, mešoviti tip – membranska i difuzna citoplazmatska reakcija mastocita, CD117, LSAB2, x 400 Odnos između različiti tipova ekspresije KIT proteina i istološkog stepena maligniteta prikazan je na Grafikonu 11 Od mastocitoma višeg stepena maligniteta 5 mastocitoma ispoljava membranski tip ekspresije Svi mastocitomi nižeg stepena maligniteta ispoljavaju samo membransku ekspresiju CD117. Nijedan od navedeni tipova ekspresije KIT proteina nije uočen na preparatima kože pasa iz kontrolne grupe nakon imunohistohemijskog bojenja na CD117. 57 Grafikon 11. Ekspresija CD117 (KIT) u mastocitomima visokog i niskog stepena maligniteta: M- membranska, CD- difuzna citoplazmatska, CP- fokalna citoplazmatska, CMP- fokalna citoplazmatska i membranska, MDC- membranska i difuzna citoplazmatska 5.4.2. Imunohistohemijska ekspresija Ki-67 u mastocitomima Ki-67 protein je prisutan u svim aktivnim fazama ćelijskog ciklusa (G1, S, G2 i mitoza), ali ga nema u fazi mirovanja ćelije (G0) Jedra mastocita imuno isto emijski pozitivni na Ki-67 obojena su smedje, imajući u vidu da je DAB korišćen kao romogen (Slika 20), dok se u citoplazmi ne uočavaju obojena područja Pozitivne ćelije su ravnomerno raspoređene u neoplastičnom tkivu mastocitoma Od ukupno 24 mastocitoma, 9 mastocitoma je Ki-67 pozitivno, od čega 7 pripada mastocitomima višeg stepena maligniteta, a dva, mastocitomima nižeg stepena maligniteta. Petnaest mastocitoma je Ki-67 negativno (Slika 21, Grafikon 12). 58 Slika 20. Mastocitomi visokog stepena maligniteta - ekspresija Ki-67 u jedrima mastocitima, Ki-67, LSAB2, x 400 Slika 21. Mastocitom niskog stepena maligniteta - ne uočava se ekspresija Ki-67, Ki-67, LSAB2, x 400 Prosečna vrednost broja Ki-67 pozitivni ćelija na 10 polja velikog uvećanja (10 pf) kod mastocitoma visokog stepena maligniteta iznosi 22,19±4,75, dok je za mastocitome niskog stepena maligniteta pomenuta vrednost 4,75±2,13 (Grafikon 13) Na osnovu dobijenih vrednosti uočavamo da postoji statistički značajna razlika u broju Ki-67 pozitivni ćelija kod mastocitoma visokog i mastocitoma niskog stepena maligniteta (t=10,80). Imuno isto emijskim bojenjem isečaka kože pasa iz kontrolne grupe na Ki-67 nije uočena ekspresija Ki-67 pozitivni ćelija 59 Grafikon 12. Broj Ki-67 pozitivnih mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta Grafikon 13. Prosečan broj Ki-67 pozitivni ćelija kod mastocitoma u odnosu na stepen maligniteta 60 5.4.3. Imunohistohemijska ekspresija PCNA u mastocitomima Imuno isto emijskim bojenjem na PCNA označavaju se ćelije koje su u deobi ili kod koji je došlo do reparacije DNK Jedra mastocita pozitivni na PCNA su narandžaste do crvene boje, uglavnom granularne strukture (Slika 22 i 23) Pozitivne ćelije se nalaze u manjim grupama, a intenzitet boje varira. Slika 22. Mastocitomi visokog stepena maligniteta - ekspresija PCNA na mastocitima, PCNA, LSAB2, x 400 Slika 23. Mastocitomi niskog stepena maligniteta - ekspresija PCNA na mastocitima, PCNA, LSAB2, x 400 Svi ispitani mastocitomi su PCNA pozitivni mastocitomi. Razlika postoji u intenzitetu ekspresije PCNA Kod mastocitoma visokog stepena maligniteta uočava se veliki broj PCNA pozitivni ćelija koje su intenzivno obojene (Slika 22), dok su PCNA pozitivne ćelije kod mastocitoma niskog stepena maligniteta malobrojnije i intenzitet prebojavanja je znatno slabiji (Slika 23) Uočena razlika u intenzitetu ekspresije PCNA kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta nije statistički značajna Prosečna vrednost broja PCNA pozitivni ćelija na 10 polja velikog uvećanja (10 pf) kod mastocitoma visokog stepena maligniteta iznosi 29,22±7,79, a kod mastocitoma niskog stepena maligniteta 28,81±8,09 Na osnovu dobijeni vrednosti uočavamo da ne postoji statistički značajna razlika u broju PCNA pozitivni ćelija kod mastocitoma visokog i mastocitoma niskog stepena maligniteta (t=0,22). 61 Isečci kože pasa iz kontrolne grupe, nakon imunohistohemijskog bojenja na PCNA, u dva slučaja pokazuju umerenu ekspresiju PCNA pozitivni ćelija 5.4.4. Imunohistohemijska ekspresija CD45RA u mastocitomima CD45RA je izoforma CD45 i predstavlja receptorski molekul koji se osim na mastocitima, eksprimira i na B-limfocitima, CD4+ i CD8+ T-limfocitima. Ekpspresija CD45RA se uočava kako na mastocitima visokog stepena maligniteta (Slika 24), tako i na mastocitima niskog stepena maligniteta (Slika 25). Imuno isto emijskim bojenjem isečaka kože pasa iz kontrolne grupe na CD45RA uočena je slaba ekspresija CD45RA pozitivni ćelija Slika 25. Mastocitomi niskog stepena maligniteta - ekspresija CD45RA na mastocitima, CD45RA, LSAB2, x 400 Slika 24. Mastocitomi visokog stepena maligniteta - ekspresija CD45RA na mastocitima, CD45RA, LSAB2, x 400 62 5.5. Prisustvo mutacija Određivanje prisustva c-KIT mutacija na parafinskim isečcima uzoraka mastocitoma fiksirani u formalinu je vršeno kod 24 psa, kao i na uzorcima zdrave kože 6 pasa iz kontrolne grupe. Ni kod jednog od ispitivanih uzoraka nije detektovano prisustvo c-KIT mutacije (prisustvo ITD na egzonu 11), odnosno na svim uzorcima izostaje prisustvo dve trake veličine ~150bp i ~250bp koje se mogu zapaziti kod pozitivne kontrole za koju je korišćen uzorak mastocitoma sa c-KIT mutacijom (Slika 26). Kod svih ispitivanih mastocitoma je detektovan normalan c-KIT protoonkogen, tj vizuelizovana je jedna traka veličine ~150bp (Slika 27) Slika 26. PCR amplifikacija egzona 11 c-KIT protoonkogena mastocitoma pasa; M – Marker, 1 – Pozitivna kontrola (interna tandem duplikacija), 2 – Pozitivna kontrola (interna tandem duplikacija), 3 – Normalni c-KIT protoonkogen, 4 – Normalni c-KIT protoonkogen 63 Slika 27. PCR amplifikacija egzona 11 c-KIT protoonkogena mastocitoma pasa; M – Marker, 1 – Normalni c-KIT protoonkogen, 2 – Normalni c-KIT protoonkogen, 3 – Normalni c-KIT protoonkogen, 4 – Normalni c-KIT protoonkogen, 5 – Normalni c-KIT protoonkogen, 6 – Normalni c- KIT protoonkogen, 7 – Normalni c-KIT protoonkogen, M – Marker 64 6. DISKUSIJA Prema klasifikaciji Svetske zdravstvene organizacije (The World Health Organization – WHO, eng.) tumora kod domaći životinja, mastocitomi pripadaju grupi mezen imski tumora kože i meki tkiva Pored kože, mastocitomi se mogu javiti i na crevima, jetri, slezini i drugim organima (Hendrick i sar., 1998) Biološko ponašanje mastocitoma je vrlo različito, neki tumori su benignog karaktera, dok drugi pokazuju agresivan rast i sklonost ka metastaziranju (Preziosi i sar., 2007) Kutani mastocitomi čine 7% do 21% svi tumora kože pasa i stoga su jedan od najučestaliji tumora kože Oni predstavljaju 11% do 27% svi zloćudni tumora kože pasa Obično se javljaju pojedinačno, mada su zabeleženi i multipli kožni mastocitomi. Nejasno je da li su multipli mastocitomi posledica metastaza primarnog mastocitoma ili svaki tumor ima odvojeno poreklo (Turin i sar., 2006; Thamm i sar., 2007). Na osnovu rezultata dobijeni u našem istraživanju najveća učestalost mastocitoma uočena je kod pasa rase zlatni retriver (37,5%), a zatim kod pasa rase bokser (20,7%) Većina autora navodi da su mastocitome najčešće dijagnostikovali kod pasa rase bokser (London i sar., 2003; Webster i sar., 2006a; Gil da Costa i sar., 2007; Welle i sar., 2008). Drugi smatraju da iako bokseri imaju povećan rizik od nastanka mastocitoma, kod nji se uglavnom javljaju mastocitomi niskog stepena maligniteta koji imaju povoljniju prognozu (Thamm i sar., 2007). Za razliku od prethodnih autora, drugi autori su najveći broj mastocitoma dijagnostikovali kod pasa rase labrador retriver (Romansik i sar., 2007) Poređenjem naši rezultata sa navedenim nalazima drugi istraživača, jasno je da se može govoriti o rasnoj predispoziciji za mastocitome kod pasa rase bokser i labrador retriver. Praćenjem pojave mastocitoma u pojedinim starosnim kategorijama, ustanovili smo da prosečna starost pasa sa mastocitomima u našem materijalu iznosi 7,6 godina, što je u korelaciji sa starošću pasa koji su obu vaćeni sličnim ispitivanjima Tako na primer, pojedini autori navode prosečnu starost pasa sa mastocitomom od 7,7 godina (Simoes i sar., 1994), kod drugih ta starost iznosi 7 godina (Fulcher i sar., 2006), odnosno 7,3 godine (Ginn i sar., 2007). 65 Dok usaglašenost postoji sa drugim autorima po pitanju starosti i rasne pripadnosti oboleli pasa, naši rezultati vezani za pol pasa sa mastocitomima, znatno se razlikuju Mastocitomi su kod pasa sa teritorije Republike Srbije u većem broju dijagnostikovani kod mužjaka nego kod ženki, tako da približan odnos iznosi 2:1 u korist mužjaka Za razliku od naši nalaza, većina autora (Simoes i sar., 1994; Fulcher i sar., 2006; Ginn i sar., 2007) navodi da su mastocitomi češće prisutni kod ženki (približno 1:1,3) Drugi autori iznose podatke po kojima ne postoji predispozicija vezana za pol (Thamm i sar., 2007). Kod najvećeg broja pasa kod koji smo dijagnostikovali mastocitom, pomenuti tumor je bio lokalizovan na ekstremitetima (33,3%) Prema jednom istraživanju, ekstremiteti se takođe opisuju kao najčešća lokalizacija mastocitoma, dok su u jednoj grupi pasa ovi tumori najčešće bili lokalizovani na trupu životinje (T ompson, 2012) Prema ranijim ispitivanjima na našoj teritoriji, takođe je zabeležena najveća zastupljenost mastocitoma na ekstremitetima pasa (Kovacevic i sar., 2005) Međutim, u zemljama u okruženju navodi se da su mastocitomi kod pasa najčešće bili lokalizovani na trupu (50-60%), ekstremitetima (25 - 40%), glavi i vratu (10%), dok se na skrotumu, međici, leđima i repu tumor ređe sreće (Welle i sar., 2008). Lokalizacija mastocitoma prema nekim autorima veoma je bitna sa prognostičkog aspekta (Turrel i sar., 1988; Thamm i sar., 2006). Prema njihovim ispitivanjima, psi sa mastocitomima na trupu imaju lošiju prognozu, dok drugi smatraju da ne postoji takva korelacija, već da se tumori na ekstremitetima lakše uoče dok su još manji dimenzija, odnosno u ranijem stadijumu (O’Connell i sar., 2011). Objektivni prediktivni parametri kod mastocitoma ipak su uslovljeni mikroskopskim pregledom. U našem materijalu na tkivnim isečcima bojenim ematoksilin-eozinom, mikroskopskim pregledom kod dobro diferentovani mastocitoma, uočavaju se ćelije uniformnog oblika sa obilnom citoplazmom i okruglim jedrom. Brojne metahromatske granule, dokazane toluidin blue metodom, ispunjavaju citoplazmu tumorski ćelija Drugi autori opisuju postojanje uniformni ćelija kod dobro diferentovani mastocitoma One su poređane u redove ili su u vidu rastresiti ploča Granice ćelija su jasno vidljive, a u citoplazmi su prisutne sivkasto- plave granule (Gross i sar., 2005) Većina neoplastični mastocita sadrži citoplazmatske granule koje se sasvim diskretno boje sivo-plavo pri bojenju uzorka hematoksilin-eozinom, odnosno intenzivno plavo-ljubičasto ukoliko se preparat boji toluidin blue bojenjem (Hendrick i sar., 1998) Granule mastocita, između ostalog, sadrže i istamin, tako da prilikom degranulacije 66 mastocita dolazi do oslobađanja istamina sa posledičnom pojavom svraba Upravo zbog mogućnosti oslobađanja istamina prilikom ekscizije tumora, mora se voditi računa o širini irurški margina kako ne bi došlo do oštećenja tumorski ćelija Kod slabo diferentovani mastocitoma uočili smo ćelije sa jasno izraženim granicama, čija su jedra velika i nepravilnog oblika, dok pojedine ćelije imaju više jedaraca Kod manjeg broja slabo diferentovani mastocitoma ćelije su poređane u redove, dok su kod ostali mastocitoma one nepravilno raspoređene Tumorske ćelije duboko infiltruju subkutis i mogu se uočiti brojne mitotske figure Na preparatima se zapažaju i nekrotična polja Značajan broj mastocitocita je degranulisan, tako da se citoplazmatske granule uglavnom uočavaju i izvan ćelija, a u malom broju u citoplazmi sami mastocita Sličan istopatološki nalaz za slabo diferentovane mastocitome sreće se i kod drugi autora koji i opisuju kao nedovoljno diferentovane, slabo ograničene sa prodiranjem duboko u subkutis Veoma se često zapažaju ulceracije i nekroza Ćelije ovakvi tumora su okrugle do poligonalne, često i izrazito polimorfne. Uglavnom su tumorske ćelije poređane u redove ili obrazuju gnezda Granice ćelija su slabo definisane, jedra su krupna sa prominentnim jedarcetom, dok je citoplazma svetla sa oskudnim brojem granula (Gross i sar., 2005). Pored stepena diferencijacije na osnovu mikroskopskog nalaza, u cilju predviđanja biološkog ponašanja tumora, koriste se i različiti drugi kriterijumi, kao što su klinička slika, stepen rasta i proliferativna aktivnost mastocitoma Histološka građa se čini najdosljednijim prediktivnim parametrom i u bliskoj je vezi sa sistemom klasifikacije mastocitoma koji je predložio Patnaik (Patnaik i sar., 1984; Preziosi i sar., 2007). Najčešće korišćeni istopatološki sistemi klasifikacije mastocitoma su Bostock-ov sistem klasifikacije iz 1973. godine i Patnaik-ov sistem klasifikacije iz 1984. godine. Oba sistema podrazumevaju klasifikaciju mastocitoma u tri stepena, s tim što klasifikaciju vrše obrnutim redosledom, pa se tako dobro diferentovani mastocitomi prema Bostock-u svrstavaju u mastocitome III stepena, dok prema Patnaik-u oni pripadaju mastocitomima I stepena. Na osnovu oba sistema klasifikacije, slabo diferentovani mastocitomi uzrokuju kraće vreme preživljavanja pacijenta, u poređenju sa srednje i dobro diferentovanim mastocitomima (Bostock, 1973; Patnaik i sar., 1984) Histološki kriterijumi ocenjivanja mastocitoma koji se koriste prilikom Bostock-ove klasifikacije obuhvataju: odnos citoplazme i jedra, mitotske figure, pleomorfnost ćelija, tumorsku celularnost i prisustvo metahromatskih granula (Bostock, 1973). Prema Patnaik-u mastocitomi se dele na tri stepena 67 maligniteta na osnovu stepena diferentovanosti, celularnosti, ćelijske morfologije, mitotskog indeksa, reakcije tkiva i stromalne reakcije (Patnaik i sar., 1984). Mitotski indeks je veoma pouzdan pokazatelj ćelijske proliferacije kao i AgNOR i Ki-67. Dok je za dokazivanje AgNOR i Ki-67 potrebno uraditi imunuhistohemijsko bojenje preparata, procena mitotskog indeksa ne za teva posebne metode bojenja i može se vršiti u rutinskoj dijagnostici na preparatima isečaka tkiva bojeni ematoksilin-eozinom. U humanoj medicini, mitotski indeks je veoma bitan prognostički faktor za slabo diferentovani karcinom tiroidee, a pokazao se i kao najbolji parametar za procenu is oda nakon irurške terapije gastrointestinalnog stromalnog tumora (Wong i sar., 2003; Volante i sar., 2004) Nekoliko istraživanja ukazuje na značaj mitotskog indeksa u prognozi is oda kod pacijenata koji boluju od kancera dojke, te je, stoga, često uključen u određivanje gradusa tumora (Biesterfeld i sar., 2001). Prema Patnaik-u kod mastocitoma I stepena ne uočavaju se mitotske figure, kod mastocitoma II stepena mitotski indeks iznosi 0 - 2 mitotske figure po vidnom polju velikog uvećanja (High-power Fields – hpf, eng.), dok se kod mastocitoma III stepena taj broj kreće od 3 do 6 mitotski figura po pf (Patnaik i sar., 1984). Klasifikacija mastocitoma prema Patnaik-ovom sistemu na mastocitome niskog (stepen I), srednjeg (stepen II) i visokog (stepen III) stepena maligniteta uglavnom se vrši na osnovu subjektivni parametara (T omson, 2012) Iako se istološka građa mastocitoma smatra zlatnim standardom za njihovu klasifikaciju, dominacija mastocitoma II stepena i subjektivnost ocenjivača su karakteristike koje se često navode kao slabosti Patnaik-ove klasifikacije mastocitoma (Northrup i sar., 2005; Kiupel i sar., 2011). Kao dodatni nedostatak Patnaik-ovog sistema klasifikacije smatra se kriterijum po kome mastocitomi III stepena imaju 3-6 mitotskih figura na jednom polju velikog uvećanja (400x), čime se isključuje jedan broj tumora sa niskim mitotskim indeksom za koje se smatra da takođe mogu biti biološki agresivni (Kiupel i sar., 2011; Stern 2012) Procenat recidiva kod nepotpuno irurški odstranjeni mastocitoma iznosio je 50% (Ozaki i sar., 2007), što ukazuje na potrebu postojanja preciznijeg sistema klasifikacije mastocitoma (Stern, 2012). Zbog navedeni nedostataka dosadašnji istopatološki sistema klasifikacije, Kiupel 2011. godine predlaže dvostepeni sistem klasifikacije mastocitoma na mastocitome visokog i niskog stepena maligniteta. Prema novom, dvostepenom sistemu klasifikacije mastocitoma, postoji značajna korelacija između mastocitoma visokog stepena maligniteta i bržeg javljanja 68 metastaza, kao i kraćeg vremena preživljavanja pacijenata (Kiupel i sar., 2011; Stern, 2012). Predloženi dvostepeni sistem gradiranja trebao bi da se koristi pri svakom rutinskom istološkom ispitivanju i dijagnostikovanju mastocitoma. Za mastocitome visokog stepena maligniteta treba primeniti dodatna ispitivanja, kao što su određivanje ekspresije KIT receptora i skrining na c- KIT mutacije, kako bi se odredila adekvatna terapija Životinje sa mastocitomima niskog stepena maligniteta treba klinički pratiti, a dalje prognoze davati na osnovu ekspresije markera proliferacije (Ki-67 i PCNA), KIT ekspresije, postojanja c-KIT mutacija i drugih parametara, kako bi se odredio rizik nastanka metastaza i odabrao odgovarajući vid terapije (Kiupel i sar., 2011). Prema kriterijumima dvostepene klasifikacije, mastocitomi pregledani u okviru našeg istraživanja klasifikovani su u mastocitome visokog i mastocitome niskog stepena maligniteta Od ukupno 24 mastocitoma pasa, četrnaest pripada mastocitomima visokog stepena maligniteta, dok deset mastocitoma ima morfološke karakteristike koje ukazuju na nizak stepen maligniteta. Na osnovu dvostepene podele, mastocitomi visokog stepena maligniteta ispunjavaju bar jedan od navedenih kriterijuma: prisustvo najmanje 7 mitotskih figura na 10 hpf, najmanje 3 multinuklearne ćelije na 10 hpf, najmanje 3 bizarna jedra na 10 hpf ili prisustvo kariomegalije kod najmanje 10% neoplastični ćelija (Kiupel i sar., 2011). Od 14 mastocitoma visokog stepena maligniteta u ispitanom materijalu, kod 7 je uočeno više od šest mitotski figura na 10 pf Dok pojedini autori smatraju da i mastocitomi nižeg stepena maligniteta, I i II stepena prema Patnaikovoj podeli, mogu da metastaziraju, te da određivanje samo mitotskog indeksa nije pouzdan način predviđanja ponašanja tumora (Patnaik i sar., 1984; Weisse i sar., 2002; Séguin i sar., 2006; Webster i sar., 2007), drugi autori smatraju da je mitotska aktivnost ključna osobina za prognozu ponašanja mastocitoma (Romansik i sar., 2007; Kiupel i sar., 2011). Neki autori u svojim radovima nisu zabeležili značajne razlike u vremenu preživljavanja pasa sa tumorima čiji je mitotski indeks 0-4/10 hpf i oni čiji je mitotski indeks 5-10/10 hpf. Međutim, stopa smrtnosti je znatno viša kod pasa sa tumorima čiji je mitotski indeks veći od 10/10 hpf (Bostock i sar., 1989; Scarpa i sar., 2013). Pojedini autori smatraju da se smrtnost povećava već u slučajevima kada je mitotski indeks veći od 5/10 pf (O’Connell i T omson, 2011). Drugi smatraju da je mitotski indeks bitan parametar za predviđanje biološkog ponašanja kutanog mastocitoma i ukazuju na značajnu 69 povezanost mitotskog indeksa i pojave metastaza poreklom od mastocitoma. Ovim ujedno ukazuju i na vreme preživljavanja (Romansik i sar., 2007). Mikroskopskim pregledom materijala kod 11 mastocitoma visokog stepena maligniteta u našem ispitanom materijalu, uočeno je prisustvo više od dve multinuklearne ćelije na 10 pf, dok kod mastocitoma niskog stepena maligniteta nije zabeleženo prisustvo multinuklearni ćelija Činjenica da su više od dve multinuklearne ćelije prisutne kod 78,57% ispitanih uzoraka mastocitoma visokog stepena maligniteta ukazuje na značajnu povezanost prisustva multinuklearni ćelija i većeg maligniteta mastocitoma Neka ispitivanja ukazuju da postoji značajna povezanost između broja multinuklearni ćelija u mastocitomu i vremena preživljavanja pasa, tako da se vreme preživljavanja pasa smanjivalo sa povećanjem broja multinuklearni ćelija (T ompson, 2012) Tako, na primer pretpostavljeno vreme preživljavanja za psa sa mastocitomom, kod koga je mitotski indeks veći od 4 uz prisustvo multinuklearni ćelija, iznosilo je 140 dana, dok kod oni sa mitotskim indeksom manjim od 4, ali bez multinuklearni ćelija, vreme preživljavanja je iznosilo 950 dana Uz pomenute istološke parametre, našom analizom istološki uzoraka mastocitoma uočeno je 10 mastocitoma sa više od dve ćelije sa bizarnim jedrom na 10 pf, pri čemu svi 10 mastocitoma pripada mastocitomima visokog stepena maligniteta. Takođe, je uočeno da osam mastocitoma sadrži više od 10% anaplastični mastocita sa jedrima promera oko 8-10 mikrona Jedarna atipija je opšta karakteristika maligni tumora i u vezi je sa brzinom deobe ćelije Kao posledica oštećenja genoma, često dolazi do nepravilnog reasortiranja romozoma tokom mitoze Usled povećanog broja romozoma dolazi do pojave veliki jedara, jedara nepravilnog oblika ili jedara čija je membrana naborana Takođe, ovakva jedra imaju višak gena koji nema nikakvu funkciju, tako da dolazi do formiranja kompaktni masa etero romatina Što je prisutan veći broj bizarnih jedara, to je tumor agresivniji. Posle deobe maligne ćelije, novostvorene ćelije ostaju nezrele jer je nji ova diferencijacija prekinuta i one pokazuju znake anaplazije (Knežević i sar., 2008) Većina anplastični mastocita uz bizarna jedra pokazuje slabu granulaciju citoplazme (Meuten, 2008). U cilju daljeg određivanja stepena maligniteta tumora potrebno je precizno proceniti koliko je ćelija u fazi deobe Neki autori smatraju da mitotske figure koje se uočavaju na isečcima tumorskog tkiva bojenog HE u manjoj meri ukazuju na stvarni broj ćelija koje su u deobi, jer ćelijski ciklus kratko traje i da su bolji pokazatelji mitotske aktivnosti ćelija markeri 70 proliferacije, kao što su AgNOR, Ki-67 i PCNA (Ishikawa i sar., 2006). Drugi smatraju da je stepen ekspresije Ki67/PCNA/AgNOR u ćelijama mastocitoma u direktnoj korelaciji sa stepenom maligniteta mastocitoma (Bergman i sar., 2004) Pojedini autori navode da je količina AgNOR po jedru proporcionalna stepenu ćelijske proliferacije i vremenu deobe ćelije in vitro, odnosno rastu tumora in vivo (Ofner i sar., 1992; Trere i sar., 1996; Webster i sar., 2007; Welle i sar., 2008), te služe kao markeri brzine razvoja i napredovanja tumora i metaboličke aktivnosti tumora (Welle i sar., 2008). Ki-67 je nuklearni protein čija se ekspresija uočava u svim aktivnim fazama ćelijskog ciklusa, ali nije prisutan u fazi mirovanja ćelije (Sc olzen i sar., 2000) Stoga je odličan marker za određivanje ćelija u fazi proliferacije u neoplazmama ljudi i životinja (Abadie i sar., 1999; Mukaratirwa, 2005a; Ozaki i sar., 2007) Određivanje indeksa Ki-67 u tumorskom tkivu, primenom imuno isto emijskog boljenja, koristi se kao dijagnostički marker kod nekoliko tumora pasa: u diferencijalnoj dijagnostici tumora aorte i karotidnih tumora pasa, kutanog istiocitoma i transmisivnog veneričnog tumora, keratinizujućeg akantoma i dobro diferentovanog skvamoznog karcinoma kože, kao i za klasifikaciju epitelijalni tumora pluća na adenoskvamozne i skvamozne karcinome (Mukaratirwa, 2011). Na 24 tkivna isečka mastocitoma koji su imunohistohemijski bojeni na Ki-67, ekspresija ovog markera proliferacije uočena je kod 9 mastocitoma. Od devet Ki-67 pozitivnih mastocitoma, sedam je iz grupe mastocitoma visokog stepena maligniteta, što odgovara broju mastocitoma visokog stepena maligniteta kod kojih su uočene mitotske figure Mastocitomi niskog stepena maligniteta koji su Ki-67 pozitivni pokazuju ekspresiju ovog markera proliferacije znatno slabijeg inteziteta nego mastocitomi visokog stepena. Prosečna vrednost broja Ki-67 pozitivni ćelija u našem materijalu, prema dvostepenoj Kiupel-ovoj klasifikaciji, kod mastocitoma visokog stepena maligniteta iznosi 22,19±4,75, dok je za mastocitome niskog stepena 4,75±2,13 Naši nalazi su sa navedenim vrednostima u saglasnosti sa Patnaik-ovim sistemom klasifikacije, prema kome srednja vrednost Ki-67 indeksa iznosi za mastocitome I stepena 2,5, za mastocitome II stepena 6,0 i za mastocitome III stepena maligniteta 20,6 Takođe, jasno je uočljivo i postojanje statistički značajne razlike u ekspresiji Ki-67 kod mastocitoma višeg i mastocitoma nižeg stepena maligniteta Ispitivanja ukazuju da je 8 puta veća stopa smrtnosti pasa sa mastocitomom u slučajevima kada je indeks Ki-67 ≥10,6 (Vascellari i sar., 2012). Drugi navode rezultate ispitivanja prema kojima postoji statistički 71 značajna razlika u ekspresiji Ki-67 kod mastocitoma I i II stepena maligniteta, kao i između mastocitoma II i III stepena maligniteta (Sakai i sar., 2002). PCNA se sintetiše od sredine G1 faze ćelijskog ciklusa i tokom S faze, ali se može detektovati tokom celog ćelijskog ciklusa zbog dugog vremena polu-života (Mukaratirwa, 2005a) Imuno isto emijskim bojenjem na PCNA označavaju se ćelije koje su u deobi ili kod koji je došlo do reparacije DNK (Simoes i sar., 1994). Iako postoje podaci u literaturi da je vrednost PCNA indeksa bitna za prognozu ponašanja MCT pasa (Simoes i sar., 1994), rezultati našeg istraživanja pokazuju da su svi ispitani mastocitomi PCNA pozitivni, s tim da se kod mastocitoma visokog stepena maligniteta uočava veliki broj PCNA pozitivni ćelija koje su intenzivno obojene, dok su PCNA pozitivne ćelije kod mastocitoma niskog stepena maligniteta malobrojnije i intenzitet prebojavanja je znatno slabiji. Pojedini autori smatraju da ne postoji značajna veza između vremena preživljavanja pasa sa mastocitomom i ekspresije PCNA u ćelijama ti mastocitoma (Scase i sar., 2006) Sličnog mišljenja su i drugi autori, s tim što smatraju da iako ne postoji statistički značajna veza između PCNA ekspresije s jedne strane i stope smrtnosti i vremena preživljavanja oboleli pasa s druge strane, ipak postoji korelacija između PCNA i Ki-67 ekspresije (Strefezzi i sar., 2010). Interesantan nalaz u našem materijalu čini ekspresija PCNA u nekim uzorcima kože pasa iz kontrolne grupe koji nisu imali neoplastične lezije Povećana PCNA aktivnost u ćelijama epidermisa ukazuje prema nekim istraživanjima, na aktiviranje keratinocita (Groneberg i sar., 2005) Poznato je takođe, da kod različiti oblika dermatitisa dolazi do migracije mastocita u epidermis. Negativnim prognostičkim faktorima smatraju se povećanje ekspresije AgNOR, povećanje ekspresije PCNA/Ki-67, povećana prokrvljenost i/ili mitotski indeks, a u poslednje vreme sve veći značaj se pridaje i povećanju ekspresije KIT proteina (CD117) (Bergman i sar., 2010). Novija istraživanja ukazuju na postojanje, kako normalnih (membranskih), tako i aberantnih citoplazmatskih (fokalnih i difuznih) KIT receptora na mastocitima pasa (Morini i sar., 2004; Gil da Costa i sar., 2007) Za razliku od raniji istraživanja (Reguera i sar., 2000) koja proučavaju odnos između intenziteta imuno isto emijskog bojenja koji ukazuje na stepen ekspresije KIT proteina i stepena maligniteta tumora, naša studija istražuje povezanost ekspresije aberantni tipova KIT proteina i istopatološkog stepena mastocitoma U ispitivanju koje smo 72 sproveli, uočava se da kod svi mastocitoma niskog stepena maligniteta postoji isključivo membranski tip ekspresije CD117 receptora, dok se kod mastocitoma visokog stepena maligniteta pored membranskog tipa ekspresije, javljaju i aberantni tipovi ekspresije KIT proteina Iz naši rezultata se uočava da kod mastocitoma niskog stepena maligniteta nema aberantne ekspresije CD117 receptora. Naime, nijedan od aberantnih tipova ekspresije se ne izdvaja kao statistički značajan u odnosu na ostale aberantne tipove ekspresije KIT proteina Međutim, jasna je povezanost aberantni tipova ekspresije CD117 receptora i stepena maligniteta tumora. Pojedini autori navode da je KIT receptor transmembranski protein, i kao takav, imunoreaktivnost ovog proteina je lokalizovana na citoplazmatskoj membrani nepromenjenih mastocita (Kiupel i sar., 2004b) S druge strane, neoplastični mastociti mastocitoma II i III stepena maligniteta (prema Patnaik-u) pokazuju ekspresiju KIT proteina kako na membrani, tako i u citoplazmi Rezultati ispitivanja potvrđuju da što mastocitomi pasa imaju agresivnije biološko ponašanje, to imaju i veću ekspresiju KIT proteina u citoplazmi mastocita (Kiupel i sar., 2004b) Takođe, isti autori smatraju da kutani mastocitomi pasa sa povećanom ekspresijom KIT proteina u citoplazmi neoplastični mastocita, imaju povećan rizik od lokalnog recidiva i kraće vreme preživljavanja S druge strane, prema nekim autorima difuzni citoplazmatki tip ekspresije sreće kod klinički benigni tumora, odnosno kod tumora I stepena maligniteta prema Patnaik-u, a da je samo citoplazmatski perinuklearni tip ekspresije KIT proteina karakterističan za slabo diferentovane mastocitome III stepena maligniteta (Preziosi i sar., 2004) Mastocitomi II stepena maligniteta pokazuju veći stepen eterogenosti u ekspresiji CD117 receptora, pa pored toga što se kod većine mastocitoma ovog stepena maligniteta uočava samo membranski tip ekspresije, kod pojedini se mogu uočiti i difuzni citoplazmatski i mešoviti membransko/perinuklearni tip ekspresije KIT proteina (Preziosi i sar., 2004). Neki autori naglašavaju da postoji jaka korelacija između citoplazmatske (aberantne) CD117 imunoekspresije i povećane ćelijske proliferacije, a samim tim i višeg stepena maligniteta, ali da nisu uočili značajne razlike između fokalne i difuzne citoplazmatske ekspresije CD117 receptora (Gil da Costa i sar., 2007). Ovo sugeriše da fokalna i difuzna citoplazmatska ekspresija KIT proteina možda odražavaju slične ćelijske promene Poznato je da se citoplazmatska ekspresija CD117 receptora dovodi u vezu i sa nekrotičnim i ulceroznim promenama Naime, citoplazmatska ekspresija CD117 receptora je u vezi sa povećanom proliferacijom mastocita, a pojava nekroza u mastocitomu može biti odraz povećane ćelijske proliferacije koju nije u 73 mogućnosti da isprati odgovarajuća angiogeneza S druge strane, korelacija između citoplazmatska ekspresije CD117 receptora i pojave epidermalni ulceracija može biti posledica CD117 – posredovanog oslobađanja istamina i serotonina, što uzrokuje intenzivan svrab (Gil da Costa i sar., 2007). Mastociti različiti životinjski vrsta sadrže serotonin, monoamin koji je sposoban da uzrokuje brojne složene radnje u organizmu, između ostali i da utiče na rast tumora (Froberg i sar., 2009). Za razliku od ranijih radova u kojima nije dokazan serotonin u mastocitomima pasa (Parratt i West, 1957; Meier, 1959; Beaven i sar., 1982; Fernandez i sar., 2005), u ispitivanju izvršenom na isečcima nepromenjene kože i na 24 isečka mastocitoma sva tri stepena maligniteta, serotonin je dokazan i kod normalni i kod neoplastični mastocita, i to kod 8/8 mastocitoma I stepena maligniteta, kod 7/8 mastocitoma II stepena maligniteta i kod 6/8 mastocitoma III stepena maligniteta (Froberg i sar., 2009). Za razliku od pasa, kod normalni i iperplastični mastocita mačaka nije dokazan serotonin (Mallett i sar,. 2012), što nije u skladu sa ranijim istraživanjima prema kojima je serotonin smatran glavnim biogenim aminom granula u mastocitima mačaka (Moore i Ogilvie, 2001). Ukoliko je u mastocitima prisutna aberantna ekspresija KIT proteina, prognoza za oporavak pasa sa ovakvim mastocitomom je znatno lošija jer je smanjen period preživljavanja pacijenta, a vreme do remisije bolesti je skraćeno u odnosu na pacijente sa mastocitomima u čijim mastocitima je prisutna samo membranska ekspresija KIT proteina (Webster i sar., 2004; Webster i sar., 2006). Dokazano je da postoji veza između postojanja c-KIT mutacija i aberantne ekspresije CD117, iako mutacije nisu bile prisutne kod svih mastocitoma sa aberantnom ekspresijom KIT proteina (London i sar., 1996; Morini i sar., 2004; Webster i sar., 2006). Pojedini autori su u svojim rezultatima dobili da sedam od devet mastocitoma sa c-KIT mutacijom ima aberantnu ekspresiju KIT proteina (Webster i sar., 2006). Tačan me anizam kojim povećana ekspresija KIT proteina izaziva malignu transformaciju mastocita je nepoznat (Kiupel i sar., 2004b). Prema jednoj hipotezi, citoplazmatsku izoformu KIT proteina verovatno aktivira rastvorljivi faktor rasta matične ćelije (Stem cell factor – SCF, eng.) ili postojanje mutacije c-KIT protoonkogena koja dovodi do inhibicije apoptoze, adhezije, migracije i proliferacije mastocita (Reguera i sar., 2000). C-KIT protoonkogen kodira receptor tirozin kinazu KIT, te mutacije ovog gena mogu 74 dovesti do aktivacije KIT receptora u odsustvu liganda (Longley i sar., 2001; Webster i sar., 2006). Prisustvo mutacija c-KIT protoonkogena se pre svega vezuje za jukstamembranski domen, i to prvenstveno za egzon 11, i dovodi se u vezu sa mastocitomima visokog stepena maligniteta (Zemke i sar., 2002; Pryer i sar., 2003; Webster i sar., 2006; London i sar., 2009; Kiupel i sar., 2011). Kada su mastocitomi pasa u pitanju, mutacije c-KIT protoonkogena u jukstamembranskom domenu se prvenstveno javljaju u vidu internih tandem duplikacija i delecija (Downing i sar., 2002; Zemke i sar., 2002). a[im ispitivanjima ni kod jednog od 24 pregledana mastocitoma nisu detektovane mutacije na egzonu 11 jukstamembranskog domena. Odsustvo mutacija eventualno bi se moglo objasniti relativno malim brojem ispitanih mastocitoma. Naime, pojedini autori navode da se mutacije c-KIT protoonkogena kod mastocitoma pasa sreću kod svega 15% uzoraka (Zemke i sar., 2002; Webster i sar., 2006), odnosno 16% mastocitoma (Webster i sar., 2007). Sa druge strane, postoje podaci da se mutacije javljaju kod 50% mastocitoma (Downing i sar., 2002), dok se kod drugih autora procenat učestalosti pojave mutacija c-KIT protoonkogena kreće od 3 do 33% (Downing i sar., 2002; Webster i sar., 2006; Webster i sar., 2007). Odsustvo mutacija na 11 egzonu jukstamembranskog domena zabeleženo je čak i kod pojedini mastocitoma kod koji je potvrđena autofosforilacija KIT proteina (Gleixner i sar., 2007). Prisustvo mutacija c-KIT protoonkogena vezuje se za mastocitome II i III stepena maligniteta prema Patnaik-ovoj klasifikaciji mastocitoma (Zemke i sar., 2002; Pryer i sar., 2003; London i sar., 2009; Thompson i sar., 2010), u prilog čemu govore i rezultati koji ukazuju da postoji veza između prisustva ITD mutacija c-KIT protoonkogena i povećanog indeksa proliferacije, merenog na osnovu imunohistohemijske ekspresije Ki-67 (Webster i sar., 2007). Prisustvo ITD mutacija c-KIT protoonkogena na egzonu 11 smanjuje vreme preživljavanja pasa sa mastocitomom (Webster i sar., 2006a), dok kod mnogih drugih tipova mutacija c-KIT protoonkogena koje dovode do ligand nezavisne aktivacije KIT receptora, nije uočena ovakva veza (Takeuchi i sar., 2013). Mutacije c-KIT protoonkogena uzrokuju ligand nezavisnu fosforilaciju, a time i aktivaciju CD117 receptora u neoplazmatskim ćelijama tumora kod ljudi (Longley i sar., 2001; Gil da Costa i sar., 2007). Ovakve mutacije su verovatno uzrok povećane proliferacije ćelija mastocitoma i dovode do ekspresije CD117 i u citoplazmi mastocita. Postoji mišljenje da mutacije koje izazivaju ligand nezavisnu fosforilaciju CD117 receptora, mogu takođe da utiču i 75 na intracelularni transport CD117 i time dovedu do akumulacije ovog proteina u ćelijskim organelama, kao što su Goldžijev aparat ili endoplazmatski retikulum (Gil da Costa i sar., 2007). Određivanje učestalosti i tipa ekspresije KIT proteina, kao i skrining na c-KIT mutacije su značajni i sa aspekta određivanja terapije (Kiupel i sar., 2011). Svi navedeni prognostički parametri značajno utiču na izbor terapije Poslednji nekoliko godina, protein kinaze se smatraju važnim „metama“ u terapiji lečenja mastocitoma (London, 2004; Takeuchi i sar., 2012). Novija ispitivanja ukazuju da je u terapiji mastocitoma visokog stepena maligniteta potrebno koristiti i inhibitore tirozin kinaza receptora (Liao i sar., 2002; Pryer i sar., 2003; Gleixner i sar., 2007; Kobie i sar., 2007; Lin i sar., 2010; Takeuchi i sar., 2010; Gleixner i sar., 2011) U veterinarskoj medicini najviše proučavani inhibitori tirozin kinaza receptora su toceranib phosphate i masitinib (Waltman, 2012). Toceranib phosphate dovodi do reakcije i kod mastocitoma sa c-KIT aktivirajućom mutacijom, ali i kod mastocitoma bez mutacija, s tim, da je stopa odgovora veća kod tumora sa c-KIT mutacijom nego u onima bez nje (London i sar., 2009; Waltman, 2012). U novije vreme se ispituju inhibitori KIT receptora, kao što su axitinib, imatinib, masitinib i vatalanib (Takeuchi i sar., 2012). Za tumore različitog stepena klasifikacije, primenjivaće se različite metode lečenja, pa su u tu svr u izrađeni posebni dijagnostički paneli (Slika 28) (Welle i sar., 2008; Waltman, 2012). 76 Prognostička evaluacija kutanog mastocitoma pasa Evaluacija margina Klasifikacija na osnovu histološke građe Kliničko stanje Procena zahvaćenosti RLČ, jetre i slezine Potpuna ekscizija Nepotpuna ekscizija Bez dodatne terapije Moguće široke margine pri lokalnoj eksciziji Nisu moguće široke margine pri lokalnoj eksciziji Široke margine pri eksciziji ili lokalna radioterapija Radioterapija Niski stepen maligniteta Visoki stepen maligniteta Analiza proliferacije Niska ekspresija Ki67, AgNOR, Ag67 Visoka ekspresija Ki67, AgNOR, Ag67 Sistemska hemoterapija c-Kit Analiza PCR na c-Kit mutacije c-Kit mutacije Nema c-Kit mutacija Kandidat za terapiju inhibitorima tirozin kinaza KIT IHC KIT IHC Obrazac II ili III KIT IHC Obrazac I Nije kandidat za terapiju inhibitorima tirozin kinaza Dokazi o zahvaćenosti RLČ ili sistemske bolesti Nema dokaza o zahvaćenosti RLČ ili sistemske bolesti Sistemska hemoterapija Bez dodatne terapije Slika 28. Dijagnostički paneli za određivanje terapije kod kutanog mastocitoma pasa (Waltman, 2012) Sa aspekta određivanja adekvatne terapije kod pasa oboleli od mastocitoma veoma je bitno odrediti stepen maligniteta mastocitoma, što podrazumeva odabir odgovarajuće metode i parametara klasifikacije mastocitoma. Pojedini autori smatraju da je Kiupel-ova klasifikacija mastocitoma superiornija, kada je u pitanju prognostička ocena, u odnosu na Patnaik-ovu klasifikaciju (Takeuchi i sar., 2013). Međutim, postavlja se niz pitanja vezani za adekvatnost nove, Kiupel-ove klasifikacije Potrebno je ispitati da li dvostepeni sistem klasifikacije tačno identifikuje agresivne mastocitome sa niskim stepenom mitotskog indeksa, kao i da li postoje varijacije usled subjektivnosti ispitivača kod određivanja pojedini parametara bitni za klasifikaciju, kao što su prisustvo kariomegalije i bizarni jedara Sa kliničkog aspekta, potrebno je utvrditi koja klasifikacija mastocitoma zajedno sa dodatnim testiranjima (npr određivanje ekspresije KIT proteina) omogućava najbolji izbor terapije Dok se ne obave dalje studije 77 poređenja Patnaik-ovog i dvostepenog sistema klasifikacije mastocitoma, najprikladnije je za klasifikaciju mastocitoma koristiti kombinovano oba sistema ocenjivanja (Stern, 2012). 78 7. ZAKLJUČAK 1. Ispitanoj grupi od 24 psa sa kutanim mastocitomom pripada 29,17% ženki i 70,83% mužjaka Razlika u polnoj distribuciji mastocitoma statistički je značajna (p < 0,01). Starost 24 psa sa kutanim mastocitomom iznosi 3 do 11 godina. Ne postoji statistički značajna razlika (p > 0,05) između starosti pasa i pojave mastocitoma. Statistički je značajna razlika (p < 0,01) između ispitani rasa pasa i pojave mastocitoma. Ne postoji statistički značajna razlika (p > 0,05) za topografsku distribuciju mastocitoma. 2. Mikroskopskom analizom 24 mastocitoma 41,67% je klasifikovano u mastocitome niskog stepena maligniteta (gradus I), a 58,33% u mastocitome visokog stepena maligniteta (gradus II). Prisustvo bizarnih jedara i multinuklearni ćelija na 10 polja velikog uvećanja (hpf) su statistički značajni (p < 0,01) morfološki kriterijumi za klasifikaciju mastocitoma. 3. Intenzivna degranulacija mastocita uočena je kod 50% mastocitoma, i to kod 10% mastocitoma niskog stepena maligniteta i 78,57% mastocitoma visokog stepena maligniteta. Intenzivna degranulacija je karakteristika mastocitoma visokog stepena maligniteta. 4. Citoplazmatska ekspresija tirozin kinaza receptora (CD117), uočena je kod 64,28% mastocitoma visokog stepena maligniteta. Kod svih mastocitoma niskog stepena maligniteta i kod 35,72% mastocitoma visokog stepena maligniteta prisutan je isključivo membranski tip CD117 ekspresije. 79 5. Ekspresija antigena ćelijske proliferacije (Ki-67 i PCNA) uočava se kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta Prosečan broj Ki-67 pozitivni ćelija kod mastocitoma visokog stepena maligniteta statistički je značajno veći (p < 0,01) nego kod mastocitoma niskog stepena maligniteta Razlika između prosečnog broja PCNA pozitivni ćelija kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta nije statistički značajna (p > 0,05). Ekspresija receptorskog molekula CD45RA uočava se kod mastocitoma visokog i niskog stepena maligniteta. 6. Primenom PCR reakcije ni u jednom od 24 uzorka mastocitoma nije detektovano prisustvo c-KIT mutacije (prisustvo internih tandem duplikacija na egzonu 11). Kod svih ispitanih mastocitoma je detektovan normalan c-KIT protoonkogen (vizuelizovana je jedna traka veličine ~150 bp) Mutacija c-KIT protoonkogena nije neophodna za nastanak mastocitoma. 80 8. POPIS LITERATURE 1. Abadie J.J., Amardeilh M.A., Delverdier M.E., 1999, Immunohistochemical detection of proliferating cell nuclear antigen and ki67 in mast cell tumors from dogs, J Am Vet Med Assoc, 215(11):1629-34. 2. Aleksić-Kovačević S, Kukolj V, Marinković D, Knežević M, 2005, Retrospective study of canine epithelial and melanocytic tumors, Acta Veterinaria, 55(4):319-26. 3. Aleksic-Kovacevic S, Kukolj V, Jelesijevic T, Jovanovic M, 2005, Retrospective analysis of canine mesenchymal tumors of skin and soft tissues, Acta Veterinaria, 55(5-6):521-29. 4. Allison N, Fritz DL, 2001, Cutaneous mast cell tumor in a kid goat, Vet Rec, 149(18):560-61. 5. Al-Dissi AN, Haines DM, Singh B, Kidney BA, 2011, Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 in canine simple mammary gland adenocarcinomas, Can Vet J, 51(10):1109–14. 6. Al-Sarraf R, Maudlin GN, Patnaik AK, Meleo KA, 1996, A prospective study of radiation therapy for the treatment of grade 2 mast cell tumours in 32 dogs, Journal of Veterinary Internal Medicine, 10(6):376-78. 7. Amorim RL, Pinczowski P, Neto RT, Rahal SC, 2010, Immunohistochemical evaluation of prostaglandin E2 and vascular endothelial growth factor in canine cutaneous mast cell tumours, Veterinary Comparative Oncology, 8(1):23-7. 8. Backer MV, Hamby CV, Backer JM, 2009, Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signaling in angiogenic tumor vasculature, Adv Genet, 67:1-27. 9. Baker-Gabb M, Hunt GB, France MP, 2003, Soft tissue sarcomas and mast cell tumours in dogs; clinical behaviour and response to surgery, Australian Veterinary Journal, 81(12):732-38. 81 10. Bar-Sela G, Kuten A, Ben-Eliezer S, Gov-Ari E, Ben-Izhak, 2003, Expression of HER2 and C-KIT in nasopharyngeal carcinoma: implications for a new therapeutic approach, Mod Pathol, 16(10):1035-40. 11. Beaven MA, Soll AH, Lewin KJ, 1982, Histamine synthesis by intact mast cells from canine fundic mucosa and liver, Gastroenterology, 82(2):254-62. 12. Becker AB, Chung KF, McDonald DM i sar., 1985, Mast cell heterogeneity in dog skin,. Anat Rec, 213(4):477-80, 530-31. 13. Bergman PJ, Craft DM, Newman SJ, Baer K, Camps-Palau MA, McKnight JA, Leibman NF, Brenn S, Finora K, Hohenhaus AE, Bartick T, Patnaik AK, Scase T, 2004, Correlation of histologic grading of canine mast cell tumors with Ki67/PCNA/AgNOR/c- KIT scores: 38 cases (2002–2003), Veterinary and Comparative Oncology, 2(2):98. 14. Bergman P, 2010, Mast cell tumors: Margins, markers and prognostic factors, CVC in Kansas City proceedings. 15. Biesterfeld S, Reitmaier M, 2001, Re-evaluation of prognostic mitotic figure counting in breast cancer: results of a prospective clinical follow-up study, Anticancer Res, 21(1B):589-94. 16. Bloemen K, Verstraelen S, Van Den Heuvel R, Witters H, Nelissen I, Schoeters G, 2007, The allergic cascade: review of the most important molecules in the asthmatic lung, Immunol. Lett., 113(1):6-18. 17. Bookbinder PF, Butt MT, Harvey HJ, 1992, Determination of the number of mast cells in lymph node, bone marrow, and buffy coat cytologic specimens from dogs. J Am Vet Med Assoc., 200(11):1648-50. 18. Bostock DE, 1973, The prognosis following surgical removal of mastocytomas in dogs, Journal of Small Animal Practice, 14(1):27-40. 19. Bostock DE, Crocker J, Harris K, Smith P, 1989, Nucleolar organiser regions as indicators of post-surgical prognosis in canine spontaneous mast cell tumours, British Journal of Cancer, 59(6):915–18. 20. Boyce JA, 2007, Mast cells and eicosanoid mediators: a system of reciprocal paracrine and autocrine regulation, Immunol Rev, 217:168-85. 82 21. Božić T, 2007, Patološka fiziologija domaćih životinja, Mladost biro d.o.o., Beograd. 22. Bravo R, Frank R, Blundell PA, Macdonald-Bravo H, 1987, Cyclin/PCNA is the auxiliary protein of DNK polymerase-delta, Nature, 326(6112):515-17. 23. Camps-Palau MA, Leibmann NF, Elmslie R i sar., 2007, Treatment of canine mast cell tumours with vinblastine, cyclophosphamide and prednisone: 35 cases (1997–2004), Veterinary and Comparative Oncology, 5(3):156-67. 24. Carmeliet P, Jain RK, 2011, Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis, Nature, 473(7347):298-307. 25. Caughey GH, 2007, Mast cell tryptases and chymases in inflammation and host defense, Immunol Rev, 217:141-54. 26. Chan PM, Ilangumaran S, La Rose J, Chakrabartly A, Rottapel R, 2003, Autoinhibition of the KIT receptor tyrosine kinase by cystolic juxtamembrane region, Mol Cel Biol 23(9):3067-78. 27. Cheville NF, 2006, Introduction to Veterinary Pathology, Blackwell Publishing, 3rd edition, 170. 28. Chichlowski M, Westwood GS, Abraham SN, Hale LP, 2010, Role of mast cells in inflammatory bowel disease and inflammation-associated colorectal neoplasia in IL-10- deficient mice, PLoS ONE, 5, 8. 29. De Mora F, Puigdemont A, Torres R, 2006, The role of mast cells in atopy: what can we learn from canine models? A thorough review of the biology of mast cells in canine and human systems, Br. J. Dermatol., 155(6):1109-23. 30. Derenzini M, 2000, The AgNORs. Micron, 31(2):117-20. 31. Di Nardo A, Vitiello A, Gallo RL, 2003, Cutting edge: mast cell antimicrobial activity is mediated by expression of cathelicidin antimicrobial peptide, J Immunol 170(5):2274-8. 32. Dobson i Cohen, 2004, Treatment of canine mast cell tumours with prednisolone and radiotherapy, Veterinary and Comparative Oncology, 2(3):132-41. 33. Dobson JM, Scase TJ, 2007, Advances in the diagnosis and management of cutaneous mast cell tumours in dogs, J Small Anim Pract, 48(8):424-31. 34. Downing S, Chien MB, Kass PH, Moore PE, London CA, 2002, Prevalence and importance of internal tandem duplications in exons 11 and 12 of c-KIT in mast cell tumors of dogs, American Journal of Veterinary Research, 63(12):1718-23. 83 35. Duncan R, Prasse W, 1979, Cytology of canine cutaneous round cell tumours, Vet. Pathol., 16(6):673-79. 36. Dunphy CH, 2005, Evaluation of mast cells in myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes, Arch Pathol Lab Med, 129(2):219-22. 37. El-Agamy DS, 2012, Targeting c-KIT in the therapy of mast cell disorders: current update, European Journal of Pharmacology, 690(1-3):1-3. 38. Ellis LM, Hicklin DJ, 2008, VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity, Nat Rev Cancer, 8(8):579-91. 39. Elston LB, Sueiro FA, Cavalcanti JN, Metze K, 2009, The importance of the mitotic index as a prognostic factor for survival of canine cutaneous mast cell tumors: a validation study, Vet Pathol, 46(2):362-64 40. Elting H i Ungemach FR, 1982, Sexual hormone receptors in canine mast cell tumour cytosol, Journal of Comparative Pathology, 92(4):629-30. 41. Erdei A, Andrasfalvy M, Peterfy H, Toth G, Pecht I, 2004, Regulation of mast cell activation by complement-derived peptides, Immunol Lett, 92(1-2):39-42. 42. Feldman BF, Zinkl JG, Jain NC, 2006, Schalm's Veterinary Hematology 5th edition, Blackwell Publishing, 314–18. 43. Fernandez NJ, West KH, Jackson ML, Kidnet BA, 2005, Immunohistochemical and histochemical stains for differentiating canine cutaneous round cell tumors. Veterinary Pathology, 42(4):437-45. 44. Folkman J, 1971, Tumor angiogenesis: therapeutic implications, N Engl J Med, 285(21):1182-86. 45. Frimberger AE, Moore AS, Larue SM, Gliatto JM i Bengtson AE, 1997, Radiotherapy of incompletely resected, moderately differentiated mast cell tumours in the dog: 37 cases (1989 – 1993), Journal of the American Hospital Association, 33(4):320-4. 46. Freeman RS, i sar., 2004, NGF deprivation-induced gene expression: after ten years, where do we stand?, Progress in Brain Research, 146:111-26. 47. Froberg GK, Lindberg R, Ritter M, Nordlind K, 2009, Expression of serotonin and its 5- HT1A receptor in canine cutaneous mast cell tumours, Journal of Comparative Pathology, 141(2-3):89-97. 84 48. Fulcher RP, Ludwig LL, Bergman PJ, Newman SJ, Simpson AM, Patnaik AK, 2006, Evaluation of a two-centimeter lateral surgical margin for excision of grade I and grade II cutaneous mast cell tumors in dogs, Journal of the American Veterinary Medical Association, 228(2):210-5. 49. Fulciniti F, Di Mattia D, Curcio MP, Bove P, Rota AM, Botti G, 2007, Canine mastocytoma: Report of 8 cases diagnosed by fine needle cytology and clinicopathologic correlations, Acta Cytol, 51(4):616-20. 50. Galli SJ, Tsai M, Wershil PK, Tam SY, Costa JJ, 1995, Regulation of mouse and human mast cell development, survival and function by stem cell factor, the ligand for the c-KIT receptor, Int. Arch. Allergy Immunol., 107(1-3):51-3. 51. Galli SJ, Borregaard N, Wynn TA, 2011, Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils, Nat Immunol 12(11):1035- 44. 52. Gil da Costa RM, Matos E, Rema A, Lopes C, Pires MA, Gartner F, 2007, CD117 immunoexpression in canine mast cell tumours: correlations with pathological variables and proliferation markers, BMC Veterinary Research, 21(3):19. 53. Ginn PE, Mansell JE, Rakich PM, 2007, Mast cell tumours. In: Jubb, Kennedy, and Palmer’s Pathology of Domestic Animals, 5th edn., Philadelphia, PA, Saunders Elsevier, 771–73. 54. Gleixner KV, Rebuzzi L, Mayerhofer M, Gruze A, Hadzijusufovic E, i sar., 2007, Synergistic antiproliferative effects of KIT tyrosine kinase inhibitors on neoplastic canine mast cells, Exp Hematol, 35(10):1510-21. 55. Gleixner KV, Mayerhofer M, Cerny-Reiterer S, Hörmann G, Rix U, Bennett KL, Hadzijusufovic E, Meyer RA, Pickl WF, Gotlib J, Horny HP, Reiter A, Mitterbauer- Hohendanner G, Superti-Furga G, Valent P, 2011, KIT-D816V-independent oncogenic signaling in neoplastic cells in systemic mastocytosis: role of Lyn and Btk activation and disruption by dasatinib and bosutinib, Blood, 118(7):1885-98. 56. Goldschmidt MH i Hendrick MJ, 2002, Tumour of the skin and soft tissues. In D. J.Meuten, Tumours in domestic animals, Iowa State Press, 45-118. 57. Govier SM, 2003, Principles of treatment for mast cell tumors, Clinical Techniques in Small Animal Practice, 18(2):103-6. 85 58. Grabarević Ž, 2002, Biologija i morfologija tumora, In: Grabarević Ž (Ed) Veterinarska onkologija, DSK-FALCO, Zagreb. 59. Groneberg DA, Bester C, Grützkau A, Serowka F, Fisc er A, Henz BM, Welker P , 2005, Mast cells and vasculature in atopic dermatitis--potential stimulus of neoangiogenesis, Allergy, 60, 1, 90-97. 60. Gross TL, Ihrke P, Walder EJ, Affolter VK., 2005, Mast cell tumors. Skin Diseases of the Dog and Cat Clinical and Histopathologic Diagnosis, 2nd edn. Oxford, UK: Blackwell Science Ltd, 853–65. 61. Hahn KA, 2002, Veterinary oncology, 4th edn., Butterworth-Heinemann, 21-23. 62. Hahn KA, Ogilvie G, Rusk T, Devauchelle P, Leblanc A, Legendre A, Powers B, Leventhal PS, Kinet JP, Palmerini F, Dubreuil P, Moussy A, Hermine O, 2008, Masitinib is safe and effective for the treatment of canine mast cell tumors, J Vet Intern Med, 22 1301-09. 63. Hahn KA, Legendre AM, Shaw NG, Phillips B, Ogilvie GK, Prescott DM, Atwater SW, Carreras JK, Lana SE, Ladue T, Rusk A, Kinet JP, Dubreuil P, Moussy A, Hermine O, 2010, Evaluation of 12- and 24-month survival rates after treatment with masitinib in dogs with nonresectable mast cell tumors, Am J Vet Res, 71, 1354-61. 64. Harizi H, Corcuff JB i Gualde N, 2008, Arachidonic-acid-derived eicosanoids: roles in biology and immunopathology, Trends in Molecular Medicine, 14, 461-69 65. Harvima IT i sar., 2008, Is there a role for mast cells in psoriasis? Archives of Dermatological Research, 300(9), 461 – 78. 66. Hauswirth AW, Florian S, Schernthaner GH, Krauth MT, Sonneck K, Sperr WR i sar., 2005, Expression of cell surface antigens on mast cells: mast cell phenotyping, Methods Mol Biol, 315, 77–90. 67. Hendrick MJ, Mahaffey EA, Moore FM, Vos JH, Walder EJ, 1998, Mast cell tumors. In: World Health Organization International Histological Classification of Tumors of Domestic Animals, Histological Classification of Mesenchymal Tumors of the Skin and Soft Tissues of Domestic Animals, 2nd series, ed. Schulman FY, 28–29. Armed Forces Institute of Pathology, Washington, DC. 68. Hottendorf GH, Nielsen SW, 1967, Pathologic survey of 300 extirpated canine mastocytomas, Zentralblatt Veterinarmedizin A, 14, 272–81. 86 69. Hundley TR i sar., 2004, Kit and Fc1RI mediate unique and convergent signals for release of inflammatory mediators from human mast cells, Blood, 104, 2403–17. 70. Irani AM, Bradford TR, Kepley CL, Schechter NM, Schwartz LB., 1989, Detection of MCT and MCTC types of human mast cells by immunohistochemistry using new monoclonal anti-tryptase and anti-chymase antibodies, J Histochem Cytochem., 37, 1509–15. 71. Ishikawa K, Sakai H, Hosoi M, Yanai T, Masegi T, 2006, Evaluation of Cell Proliferation in Canine Tumors by the Bromodeoxyuridine Labeling Method, Immunostaining of Ki-67 Antigen and Proliferating Cell Nuclear Antigen, J Toxicol Pathol, 19, 123–27. 72. Jamur MC i Oliver C, 2011, Origin, maturation and recruitment of mast cell precursors. Front Biosci, 3, 1390-406. 73. Jelesijević T, Jovanović M, Knežević M and Aleksić-Kovačević S, 2003, Quantitative and qualitative analysis of AgNOR in benign and malignant canine mammary gland tumors, Acta Veterinaria, 53, 5-6, 353-60. 74. Jensen BM, Akin C, Gilfillan AM, 2008, Pharmacological targeting of the KIT growth factor receptor: a therapeutic consideration for mast cell disorders, Br J Pharmacol, 154, 1572-82. 75. Johnstone AC, 1972, Two cases of hepatic mastocytoma in sheep, Vet Pathol 9, 159-63 76. Jones CL, Grahn RA, Chien MB, Lyons LA, London CA, 2004, Detection of c-KIT mutations in canine mast cell tumors using fluorescent polyacrylamide gel electrophoresis, J Vet Diagn Invest, 16, 95–100. 77. Jovanović M, Aleksić-Kovačević S, Knežević M, 2012, Specijalna veterinarska patologija, Makarije d.o.o., 129, 404. 78. Joyce JA, 2005, Therapeutic targeting of the tumor microenvironment, Cancer Cell, 7, 513-20. 79. Jubb, Kennedy, Palmer, 2007, Pathology of Domestic Animals, Saunders Elsevier, 5th edition, 771-73. 80. Kitayama H, Kanakura Y, Furitsu T, i sar., 1995, Constitutively activating mutations of c-KIT receptor tyrosine kinase confer factor-independent growth and tumorigenicity of factor-dependent hematopoietic cell lines, Blood, 85, 790–98. 87 81. Kiupel M, Webster JD, Bailey KL, Best S, DeLay J, Detrisac CJ, Gamble D, Ginn PE, Goldschmidt MH, Hendrick MJ I sar., 2004a, Microscopic grading of canine cutaneous mast cell tumors: a multiinstitutional review, Vet Pathol 41, 576. 82. Kiupel M, Webster JD, Kaneene JB, Miller R i Yuzbasiyan-Gurkan V., 2004b, The use of kit and tryptase expression patterns as prognostic tools for canine cutaneous mast cell tumors, Vet Pathol, 41, 371–77. 83. Kiupel M, Webster JD, Bailey KL, Best S, DeLay J, Detrisac CJ i sar., 2011, Proposal of a 2-Tier Histologic Grading System for Canine Cutaneous Mast Cell Tumors to More Accurately Predict Biological Behavior, Veterinary Pathology , 48, 147-55. 84. Klopfleisch R, Meyer A, Schlieben P, Weise C, Bondzio A i sar., 2012, Transcriptome and proteome analysis of tyrosine kinase inhibitor treated canine mast cell tumour cells identifies potentially kit signaling-dependent genes, BMC Veterinary Research, 8, 96. 85. Knežević M, Jovanović M, 2008, Opšta patologija za studente veterinarske medicine, Makarije, Beograd. 86. Kosjerina Z, 1999, Građa i funkcije mastocita i bazofilnih granulocita, Pneumon, 37, 69- 71. 87. Ladue T, Price GS, Dodge R, Page RL i Thrall DE, 1998, Radiation therapy for incompletely resected canine mast cell tumours, Veterinary Radiology & Ultrasound, 39, 57-62. 88. Lamm CG, Stern AW, Smith AJ, Cooper EJ, Ullom SW, Campbell GA, 2009, Disseminated cutaneous mast cell tumors with epitheliotropism and systemic mastocytosis in a domestic cat, J Vet Diagn Invest, 21, 710-15 89. Larsen AE i Grier RL, 1989, Evaluation of canine mast cell tumors for presence of estrogen receptors, American Journal of Veterinary Research, 50, 1779-80. 90. LaRue SM, Gillette EL, 2007, Radiation therapy, In: Withrow SJ, Vail DM, eds. Small Animal Clinical Oncology, 4th edn. Philadelphia, PA, Saunders, 193–210. 91. Leadbeater JC, Gutierrez-Nibeyro SD, Brown JA, 2010, Mastocytoma in the common carpal sheath of the digital flexor tendons of a horse, Aust Vet J, 88, 20-24. 92. Letard S, Yang Y, Hanssens K, Palmerini F, Leventhal PS, Guery S, Moussy A, Kinet JP, Hermine O, Dubreuil P, 2008, Gain-of-function mutations in the extracellular domain of KIT are common in canine mast cell tumors, Mol. Cancer Res., 6, 1137–45. 88 93. Li L, Yao Z, 2004, Mast cell and immune inhibitory receptors, Cell Mol. Immunol., 1, 408–15 94. Liao AT, Chien MB, Shenoy N, Mendel DB, McMahon G, Cherrington JM, London CA, 2002, Inhibition of constitutively active forms of mutant kit by multitargeted indolinone tyrosine kinase inhibitors, Blood, 100, 585-93. 95. Lin TY, Fenger J, Murahari S, Bear MD, Kulp SK, Wang D, Chen CS, Kisseberth WC, London CA, 2010, AR-42, a novel HDAC inhibitor, exhibits biologic activity against malignant mast cell lines via down-regulation of constitutively activated KIT, Blood, 115, 4217-25. 96. London CA, Kisseberth WC, Galli SJ, Geissler EN, Helfand SC, 1996, Expression of stem cell factor receptor (c-KIT) by the malignant mast cells from spontaneous canine mast cell tumours, Journal of Comparative Pathology, 115: 399–414. 97. London CA, Galli SJ, Yuuki T, Hu ZQ, Helfand SC, Geissler EN, 1999, Spontaneous canine mast cell tumors express tandem duplications in the proto-oncogene c-KIT, Exp Hematol, 27, 689–97. 98. London CA i Seguin B, 2003, Mast cell tumors in the dog, Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice, 33, 473-89. 99. London C, Hannah AL, Zadovoskaya R, Chien MB, Kollias-Baker C, Rosenberg M, Downing S, Post G, Boucher J, Shenoy N, Mendel DB i Cherrington JM, 2003a, Phase I dose escalating study of SU11654, a small molecule receptor tyrosine kinase inhibitor, in dogs with spontaneous malignancies, Clinical Cancer Research, 9, 2755-68. 100. London C, 2004, Kinase inhibitors in cancer therapy, Veterinary and Comparative Oncology, 2, 177-93. 101. London CA, Malpas PB, Wood-Follis SL, i sar., 2009, Multi-center, placebo- controlled, double-blind, randomized study of oral toceranib phosphate (SU11654), a receptor tyrosine kinase inhibitor for the treatment of dogs with recurrent (either local or distant) mast cell tumor following surgical excision, Clin Cancer Res,15, 3856–65. 102. Longley BJ, Reguera MJ, Ma Y: Classes of c-KIT activating mutations, 2001, Proposed mechanisms of action and implications in disease classification and therapy, Leuk Res, 25, 571-76. 89 103. Ma Y, Longley BJ, Wang X, Blount JL, Langley K, Caughey GH, 1999, Clustering of activating mutations in c-KIT’s juxtamembrane coding region in canine mast cell neoplasms, J Invest Dermatol 112,165–70. 104. Madewell BR, 2001, Cellular proliferation in tumors: a review of methods, interpretation, and clinical applications, J Vet Intern Med, 15:334–40 105. Maga G, Hubscher U, 2003, Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partner,. J Cell Sci 116:3051–60. 106. Maiolino P, Restucci B, Papparella S, De Vico G, 2002, Nuclear morphometry in squamous cell carcinomas of canine skin, Journal of Comparative Pathology, 127, 114– 17. 107. Malaviya R, Ross EA, MacGregor JI, Ikeda T, Little JR, i sar., 1994, Mast cell phagocytosis of FimH-expressing enterobacteria, J Immunol 152, 1907–14. 108. Mallett CL, Northrup NC, Saba CF, Rodriguez CO, Rassnick KM, Gieger TL, Childress MO, Howerth EW, 2012, Immunohistochemical Characterization of Feline Mast Cell Tumors, Veterinary Pathology, 50, 1, 106-09. 109. Marshall JS, 2004, Mast-cell responses to pathogens, Nat. Rev. Immunol. 4, 787–99. 110. Masson K, Ronnstrand L, 2009, Oncogenicsignaling from the hematopoetic growth factor receptors c-KIT and Flt3, Cellular Signalling, 21, 1717-26. 111. Maurer M, Wedemeyer J, Metz M, Piliponsky AM, Weller K, Chatterjea D, Clouthier DE, Yanagisawa MM, Tsai M, Galli SJ, 2004, Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity, Nature, 432, 512–16. 112. McGavin MD, William WC, Zachary FJ, 2001, Thomson's Special Veterinary Pathology, Mosby, 3rd edition, 354-55. 113. Meininger CJ, Yano H, Rottapel R, Bernstein A, Zsebo KM, Zetter BR, 1992, The c- KIT receptor ligand functions as a mast cell chemoattractant, Blood, 79, 958–63. 114. Meier H, 1959, Serotonin (5-hydroxytryptamine) content of canine mastocytoma. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 100, 815-17. 115. Mekori YA, Oh CK, Metcalfe DD, 1995, The role of c-KIT and its ligand, stem cell factor, in mast cell apoptosis, Int Arch Allergy Immunol, 107, 136–38. 116. Metz M, Siebenhaar F, Maurer M, 2008, Mast cell functions in the innate skin immune system. Immunobiology, 213, 251-60. 90 117. Meuten DJ, 2008, Tumors in Domestic Animals, John Wiley & Sons, 4th ed.. 118. Migaki G, Langheinrich KA, 1970, Mastocytoma in a pig, Pathol Vet, 7, 353-55. 119. Millanta F, Silvestri G, Vaselli C, Citi S, Pisani G, Lorenzi D, Poli A, 2006, The role of vascular endothelial growth factor and its receptor Flk-1/KDR in promoting tumour angiogenesis in feline and canine mammary carcinomas: a preliminary study of autocrine and paracrine loops, Res Vet Sci, 81, 350-57. 120. Misdorp W, 2004, Mast cells and canine mast cell tumours: a review, Veterinary Quarterly, 26, 156 – 69. 121. Moore AS, Ogilvie GK, 2001 Splenic, hepatic, and pancreatic tumors, In: Ogilvie GK, Moore AS, eds. Feline Oncology: A Comprehensive Guide to Compassionate Care, Trenton, NJ: Veterinary Learning Systems, 298. 122. Morini M, Bettini G, Preziosi R, Mandrioli L, 2004, C-KIT gene product (CD117) immunoreactivity in canine and feline paraffin sections, J Histochem Cytochem, 52, 705- 08. 123. Morris J, Dobson J, 2001, Small Animal Oncology, Blackwell Science, 59-62. 124. Mukaratirwa S, Chipunza J, Chitanga S, Chimonyo M, Bhebhe E, 2005, Canine cutaneous neoplasms: prevalence and influence of age, sex and site on the presence and potential malignancy of cutaneous neoplasms in dogs from Zimbabwe, Journal of the South African Veterinary Association, 76, 59–62. 125. Mukaratirwa S, 2005a, Prognostic and predictive markers in canine tumours. rationale and relevance, A Review of Veterinary Quarterly, 27, 52–64. 126. Mullins MN, Dernell WS, Withrow SJ, Ehrhart EJ, Thamm DH, Lana SE, 2006, Evaluation of prognostic factors associated with outcome in dogs with multiple cutaneous mast cell tumors treated with surgery with and without adjuvant treatment: 54 cases (1998–2004), Journal of the American Veterinary Medical Association, 228, 91– 95. 127. Murphy S, Sparkes AH, Smith KC, Blunden AS i Brearley MJ, 2004, Relationships between the histological grade of cutaneous mast cell tumours in dogs, their survival and effi cacy of surgical resection, Veterinary Record, 154, 743-46. 91 128. Nakano A, Harada T, Morikawa S, Kato Y, 1990, Expression of leukocyte common antigen (CD45) on various human leukemia/lymphoma cell lines, Acta Pathol Jpn., 40, 2, 107-15. 129. Navega PR, 2011, Mastocitomas em canídeos: estudo retrospectivo, Universidade técnica de Lisboa 130. Newman SJ, Mrkonjich L, Walker KK, Rohrbach BW, 2007, Canine Subcutaneous Mast Cell Tumour: Diagnosis and Prognosis, Journal of Comparative Pathology, 136, 231-39. 131. Nilsson G i sar., 1994, Stem cell factor is a chemotactic factor for human mast cells, The Journal of Immunology, 153, 8, 3717-23. 132. Northrup NC, Harmon BG, Gieger TL, Brown CA, Carmichael KP, Garcia A, Latimer KS, Munday JS, Rakich PM, Richey LJ, Stedman NL, Cheng AL i Howerth EW, 2005, Variation among pathologists in histologic grading of canine cutaneous mast cell tumors, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 17, 245-48. 133. Noviana D, Mamba K, Makimura S, Horii Y, 2004, Distribution, histochemical and enzyme histochemical characterization of mast cells in dogs, J Mol Histol, 35, 123-32. 134. O’Connell K, T omson M, 2011, Evaluation of prognostic indicators in dogs with multiple, simultaneously occurring cutaneous mast cell tumours: 63 cases, Veterinary and Comparative Oncology, 11, 1, 51–62. 135. Ofner D, Hittmair A, Marth C i sar., 1992, Relationship between quantity of silver stained nucleolar organizer regions associated proteins (Ag-NORs) and population doubling time in ten breast cancer cell lines, Pathology, Research and Practice, 188, 742– 46. 136. Oliveira FN, Elliott JW, Lewis BC, Mathews GG, Brown RM, Treadway CM, Langohr IM, 2013, Cutaneous Mast Cell Tumor With Epitheliotropism in 3 Dogs, Veterinary Pathology, 50(2):234-37. 137. Ozaki K, Yamagami T, Nomura K, Narama I, 2007, Prognostic significance of surgical margin, Ki-67 and cyclin D1 protein expression in grade II canine cutaneous mast cell tumor, J Vet Med Sci, 69, 1117-21 138. Palyada KS, Scott DW, Schlafer DH, Czajkowski M, 2008, Diffuse cutaneous mastocytosis in a newborn calf, Vet Dermatol, 19, 184-86 92 139. Patnaik AK, Ehler WJ i MacEwen EG, 1984, Canine cutaneous mast cell tumor: morphologic grading and survival time in 83 dogs, Veterinary Pathology, 21, 469-74 140. Parratt JR, West GB, 1957, 5-Hydroxytryptamine and tissue mast cells. Journal of Physiology, 137, 169-178 141. Payne V i Kam PC, 2004, Mast cell tryptase: a review of its physiology and clinical significance, Anaesthesia, 59, 695–703 142. Pohlman ML, Basophils, Mast Cells, and Their Disorders, In: Sc alm’s Veterinary Hematology, 2010, Wiley-Blackwell, New York, 6th edition, 290-97 143. Poirier VJ, Adams WM, Forrest LJ, Green EM, Dubielzig RR, Vail DM., 2006, Radiation therapy for incompletely excised grade II canine mast cell tumors. Journal of the American Animal Hospital Association, 42, 430–34 144. Preziosi R, Sarli G, Paltrinieri M, 2007, Multivariate survival analysis of histologic parameters and clinical presentation in canine cutaneous mast cell tumours, Vet Res Commun, 31, 287–96 145. Preziosi R, Morini M, Sarli G, 2004, Expression of the kit protein (CD117) in primary cutaneous cell tumors of the dog, J Vet Diagn Invest, 16:554–561 146. Pryer NK, Lee LB, Zadovaskaya R, Yu X, Sukbuntherng J, Cherrington JM, London CA, 2003, Proof of target for su11654: inhibition of KIT phosphorylation in canine mast cell tumors, Clin Cancer Res, 9, 5729–34 147. Dahm RL i Latimer KS, 2001, Mast Cell Disease in Dogs and Cats: An Overview, Veterinary Clinical Pathology Clerkship Program 148. Rebuzzi L, Willmann M, Sonneck K, Gleixner KV, Florian S, Kondo R,MayerhoferM, Vales A, Gruze A, PicklWF, Thalhammer JG, Valent P, 2007, Detection of vascular endothelial growth factor (VEGF) and VEGF receptors Flt-1 and KDR in canine mastocytoma cells, Vet Immunol Immunopathol 115, 320-333 149. Reguera MJ, Rabanal RM, Puigdemont A, Ferrer L, 2000, Canine mast cell tumors express stem cell factor receptor, Am J Dermatopathol, 22, 49–54 150. Riva F, Brizzola S, Stefanello D, Crema S, Turin L, 2005, A study of mutations in the c- KIT gene of 32 dogs with mastocytoma, J Vet Diagn Invest, 17, 385–88 151. Romansik EM, Reilly CM, Kass PH, Moore PF, London CA, 2007, Mitotic index is predictive for survival for canine cutaneous mast cell tumors, Vet Pathol, 44, 335–41 93 152. Roskoski JR, 2005, Structure and regulation of Kit protein-tyrosine kinase – the stem cell factor receptor, Biochem. Biophys. Res. Commun., 338, 1307–15 153. Roskoski RJ, 2007, Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression, Crit Rev Oncol Hematol, 62, 179-213 154. Sakai H, Noda A, Shirai N, Iidaka T, Yanai T, Masegi T, 2002, Proliferative activity of canine mast cell tumours evaluated by bromodeoxyuridine incorporation and ki67 expression, J Comp Pathol, 127:233-8. 155. Saleem TB i Ahmed I, 2009, Gastrointenstinal stromal tumour-evolving concepts, Surgeon, 7:36-41 156. Scarpa F, Sabattini S, Berlato D, Bettini G, 2013, Histological grading of canine mast cell tumors: Is two better than three, The 31st meeting of the European Society and College of Veterinary Pathologists, London 157. Scase TJ, Edwards D, Miller J i sar., 2006, Canine mast cell tumors: correlation of apoptosis and proliferation markers with prognosis, Journal of Veterinary Internal Medicine, 20, 151–58 158. Scase TJ, Edwards D, Miller J, Henley W, Smith K, Blunden A, Murphy S., 2006, Canine mast cell tumors: correlation of apoptosis and proliferation markers with prognosis, Journal of Veterinary Internal medicine, 20, 1, 151-8 159. Schmid S, Aboul-Enein F, Pfisterer W, Birkner T, Stadek C, Knosp E., 2010, Vascular endothelial growth factor: the major factor for tumor neovascularization and edema formation in meningioma patients, Neurosurgery, 67, 1703–08 160. Schlieben P, Meyer A, Weise C, Bondzio A, Einspanier R i sar., 2012, Differences in the proteome of high-grade versus low-grade canine cutaneous mast cell tumours, Veterinary Journal, 194, 2, 210-14 161. Schulman ES i sar., 1983, Heterogeneity of human mast cells, Journal of Immunology, 131(4), 1936-41 162. Schwartz LB, Irani AA, Roller K, Castells MC, Schechter NM, 1987, Quantitation of histamine, tryptase and chymase in dispersed human T and it mast cells. J Immunol 138, 2611 163. Schwartz LB, 1994, Mast cells: function and contents. Current Opinion in Immunology, 6(1), 91-97 94 164. Schwartz LB, 2006, Analysis of MCT and MCTC mast cells in tissue. The human mast cell. In: Mast Cells: Methods and Protocols, ed. Krischnaswamy G, Chi DS, p. 53-62. New Jersey, USA, Humana Press Inc. 165. Scott DW, Miller WH, Griffin CG, 2001, Mast cell tumor. In: Small Animal Dermatology, ed. Scott DW, Miller WH, Griffin CG, 6th edn. St Louis, MO: W.B. Saunders, 1320–30 166. Scott MA, Stockham SL, 2000, Basophils and Mast Cells, 5th edn. Philadelphia, PA, Lippincott Williams & Wilkins, 308–15 167. Sekis I, Gerner W, Willmann M, Rebuzzi L, Tichy A, Patzl M, Thalhammer JG, Saalmüller A, Kleiter MM, 2009, Effect of radiation on vascular endothelial growth factor expression in the C2 canine mastocytoma cell line, Am J Vet Res, 70, 1141-50 168. Sfiligoi G, Rassnick KM, Scarlett JM, Northrup NC, Gieger TL., 2005, Outcome of dogs with mast cell tumors in the inguinal or perineal region versus other cutaneous locations: 124 cases (1990–2001), Journal of the American Veterinary Medical Association, 226, 1368–74 169. Shahid M, 2009, Histamine, Histamine Receptors, and their Role in Immunomodulation: An Updated Systematic Review. The Open Immunology Journal, 9- 41 170. Simeonov R, Simeonova G, 2007, Nucleomorphometric analysis of feline basal cell carcinomas, Research in Veterinary Science 171. Simoes JP, Schoning P, 1994, Canine mast cell tumors: a comparison of staining techniques, Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 6,458–65 172. Stanclift RM, Gilson S, 2008, Evaluation of neoadjuvant prednisolone administration and surgical excision in treatment of cutaneous mast cell tumours in dogs, Journal of American Veterinary Medical Association, 232, 53-62 173. Stern WA, 2012, Histologic Grading of Canine Cutaneous Mast Cell Tumors: Is There a Good System?, J Vet Sci Med Diagn, 1, 1 174. Stevens EC, Rosenthal NS, 2001, Bone marrow mast cell morphologic features and hematopoietic dyspoiesis in systemic mast cell disease, Am J Clin Pathol, 116, 177–182 95 175. Strefezzi RD, Kleeb SR, Xavier JG, Dias JL, 2010, Avaliação da proliferação celular como indicador prognóstico para mastocitomas cutâneos caninos, Pesquisa Veterinária Brasileira, 30, 559-65 176. Strefezzi RF, Xavier JG, Catao-Dias JL, 2003, Morphometry of canine cutaneous mast cell tumors, Vet Pathol, 40, 268–75 177. Strefezzi RF, Kleeb SR, Xavier JG, Catao-Dias JL, 2009, Prognostic indicators for mast cell tumors, Bray J Vet Pathol, 2, 110-21 178. Supajatura V i sar., 2002, Differential responses of mast cell Toll-like receptors 2 and 4 in allergy and innate immunity, J. Clin. Invest. 109, 1351–9 179. Sur R, Cavender D, Malaviya R, 2007, Different approaches to study mast cell functions, International Immunopharmacology 7, 555–67 180. Takahashi S, Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy, Biol Pharm Bull, 34, 1785-88 181. Takeuchi Y, Fujino Y, Watanabe M, Nakagawa T, Ohno K, Sasaki N, Sugano S, Tsujimoto H, 2010, Aberrant autophosphorylation of c-KIT receptor in canine mast cell tumor cell lines, Vet. Immunol. Immunopathol., 137, 208–16 182. Takeuchi Y, Fujino Y, Watanabe M, Takahashi M, Nakagawa T, Takeuchi A, Bonkobara M, Kobayashi T, Ohno K, Uchida K, Asano K, Nishimura R, Nakayama H, Sugano S, Ohashi Y, Tsujimoto H, 2013, Validation of the prognostic value of histopathological grading or c-KIT mutation in canine cutaneous mast cell tumours: A retrospective cohort study, Veterinary Journal, 196, 492–8 183. Taylor F, Murphy S, Hoather T, Dobson J, Scase T, 2010, TSLC1 tumoursuppressor gene expression in canine mast cell tumours, Veterinary Comparative Oncology 8, 263– 272 184. Terzić T, 2010, Patohistološki i imunohistohemijski parametri značajni za prognozu i terapiju nediferentovanog karcinoma nazofarinksa, Doktorska disertacija 185. Thamm DH, Turek MM, Vail DM: Outcome and prognostic factors following adjuvant prednisone/vinblastine chemotherapy or high-risk canine mast cell tumor: 61 cases, J Vet Med Sci 68:581-587, 2006 186. Thamm DH, Vail DM., Mast cell tumors, In: Withrow SJ, MacEwen EG, editors, 2007, Small Animal Clinical Oncology, Philadelphia, Saunders, 402-24 96 187. Theoharides TC, Kempuraj D, Tagen M, Conti P, Kalogeromitros D, 2007, Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation, Immunol. Rev. 217, 65–78 188. Theoharides TC, Alysandratos KD, Angelidou A, Delivanis DA, Sismanopoulos N, Zhang B, Asadi S, Vasiadi M, Weng Z, Miniati A,Kalogeromitros D, 2010, Mast cells and inflammation, Biochim Biophys Acta, 1822, 21–33 189. Thompson JJ, Yager JA, Best SJ., Pearl DL, Coomber BL, Torres RN, Kiupel M and Foster RA, 2010, Canine Subcutaneous Mast Cell Tumors: Cellular Proliferation and KIT Expression as Prognostic Indices, Veterinary Pathology, 48(1), 169-81 190. Thompson JJ, 2012, Canine Mast Cell Tumours: Characterization of Subcutaneous Tumours and Receptor Tyrosine Kinase Profiling, PhD Thesis, Guelph, Ontario, Canada 191. Trere D, Gramantieri L, Siringo S i sar., 1996, In hepatocellular carcinoma AgNOR protein expression correlates with tumour mass doubling time, Journal of Hepatology, 24, 60–65 192. Tsai M, Takeishi T, Thompson H, Langley KE, Zsebo KM, Metcalfe DD, Geissler EN, Galli SJ, 1991, Induction of mast cell proliferation, maturation and heparin synthesis by the rat c-KIT ligand, stem cell factor., Proc Natl Acad Sci USA, 88, 6382–86 193. Tsuda M, Tozaki-Saitoh H, Inoue K, 2011, Platelet-activating factor and pain, Biological & Pharmaceutical Bulletin, 34(8), 1159-62 194. Turrel JM, Kitchell BE, Miller LM, Theon A, 1988, Prognostic factors for radiation treatment of mast cell tumor in 85 dogs, Journal of the American Veterinary Medical Association, 193, 936-940 195. Turin L, Acocella F, Stefanello D, Oseliero A i sar., 2006, Expression of c-KIT proto- oncogene in canine mastocytoma: a kinetic study using real-time polymerase chain reaction, J. Vet. Diagn. Invest, 18, 343–49 196. Urb M, Sheppard DC, 2012, The Role of Mast Cells in the Defence against Pathogens, PLoS Pathog, 8(4) 197. Valent P, Cerny-Reiterer S, Herrmann H, Mirkina I, George TI, Sotlar K, Sperr WR, Horny HP, 2010, Phenotypic heterogeneity, novel diagnostic markers, and target expression profiles in normal and neoplastic human mast cells, Best Pract Res Clin Haematol, 23, 369-78 97 198. Volante M, Cavallo GP, Papotti M, 2004, Prognostic factors of clinical interest in poorly differentiated carcinomas of the thyroid. Endocr Pathol, 15, 313–317 199. Vyas H, Krishnaswamy G, 2006, Paul Ehrlich's "Mastzellen"--from aniline dyes to DNK chip arrays: a historical review of developments in mast cell research, Methods Mol Biol, 315, 3-11 200. Wallace B. Morrison, 2002, Cancer in Dogs and Cats: Medical and Surgical Management, 2nd edn. Teton NewMedia, 30, 451-59 201. Waltman SS, 2012, Mast Cell Tumor Diagnostic Panels, Southwest Veterinary Oncology, PLLC 202. Vascellari M, Giantin M, Capello K, Carminato A, Morello EM, Vercelli A, Granato A, Buracco P, Dacasto M, Mutinelli F, 2012, Expression of Ki67, BCL-2, and COX-2 in Canine Cutaneous Mast Cell Tumors : Association With Grading and Prognosis, Veterinary Pathology 00(0), 1-12 203. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kaneene JB, Miller R, Resau JH, Kiupel M, 2006a, The role of c-KIT in tumorigenesis: evaluation in canine cutaneous mast cell tumors, Neoplasia, 8, 104-11 204. Webster JD, Kiupel M, Kaneene JB, Miller R, and Yuzbasiyan-Gurkan V, 2004, The use of KIT and tryptase expression patterns as prognostic tools for canine cutaneous mast cell tumors, Vet Pathol 41,371 – 77 205. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Kaneene JB, Miller R, Resau JH, Kiupel M, 2006a, The role of c-KIT in tumorigenesis:evaluation in canine cutaneous mast cell tumors, Neoplasia, 8, 2, 104 – 11 206. Webster JD, Kiupel M, Yuzbasiyan-Gurkan V, 2006b, Evaluation of the kinase domain of c-KIT in canine cutaneous mast cell tumors, BMC Cancer, 6, 85 207. Webster JD, Yuzbasiyan-Gurkan V, Miller RA, Kaneene JB, Kiupel M., 2007, Cellular proliferation in canine cutaneous mast cell tumors: associations with c-KIT and its role in prognostication, Veterinary Pathology 2007; 44: 298–308 208. Wedemeyer J, Galli SJ, 2000, Mast cells and basophils in acquired immunity, Br.Med. Bull, 56, 936–55 98 209. Weisse C, Shofer FS, Sorenmo K, 2002, Recurrence rates and sites for grade II canine cutaneous mast cell tumors following complete surgical excision, J Am Anim Hosp Assoc 38:71–3 210. Welle MM, Ro rer CB, Howard J, Rüfenac t S, 2008, Canine mast cell tumours: a review of the pathogenesis, clinical features, pathology and treatment, Veterinary Dermatology, Vol. 19(6), 321-339 211. Wong NA, Young R, Malcomson RD, Nayar AG, Jamieson LA, Save VE, Carey FA, Brewster DH, Han C, Al-Nafussi A, 2003, Prognostic indicators for gastrointestinal stromal tumours: a clinicopathological and immunohistochemical study of 108 resected cases of the stomach. Histopathology, 43, 118–126 212. Wu H, Hayashi T, Inoue M, 2004, Immunohistochemical expression of p27 and p21 in canine cutaneous mast cell tumors and histiocytomas, Veterinary Pathology, 41, 296-9 213. Zemke D, Yamini B and Yuzbasiyan-Gurkan V, 2002, Mutations in the juxtamembrane domain of c-KIT are associated with higher grade mast cell tumors in dogs, Vet Pathol 39, 529 – 35 BIOGRAFIJA Vučićеvić Ivаnа rоđеnа је 19 fеbruаrа 1978 gоdinе u Bеоgrаdu, gdе је zаvršilа оsnоvnu i srеdnju škоlu Studije veterinarske medicine u Beogradu upisalа je 1997 godine, a diplomiralа је u mаrtu 2004 godine, sa prosečnom ocenom 9,64 (devet i 64/100) Istе gоdinе је upisаlа pоstdiplоmskе studiје nа Fаkultеtu vеtеrinаrskе mеdicinе Univеrzitеtа u Bеоgrаdu Тоkоm pоstdiplоmski studiја bilа је učеsnik projekta na Fakultetu veterinarske medicine „Razvoj i primena novi proizvoda na bazi modifikovani i oplemenjeni minerala u proizvodnji rane“ Pоlоžilа је svе ispitе prеdvеđеnе plаnоm i prоgrаmоm i 2007 gоdinе magistrirala na temu: „Uticaj peroralnog tretmana mineralnim adsorbentom na bazi zeolita na koncentraciju olesterola i žučni kiselina u perifernoj krvi pasa“ Prе izbоrа zа аsistеntа nа kаtеdri zа Pаtоlоšku mоrfоlоgiјu Fаkultеtа vеtеrinаrskе mеdicinе Univеrzitеtа u Bеоgrаdu, rаdilа је dо 2008 gоdinе u Мinistаrstvu pоlјоprivrеdе, šumаrstvа i vоdоprivrеdе Republike Srbije u Uprаvi zа vеtеrinu Тоkоm 2008 gоdinе bilа је zаpоslеnа na Naučnom Institutu za veterinarstvo Srbije u Beogradu, u оkviru Odeljenjа za epizootiologiju i zdravstvenu zaštitu živine i drugi ptica, а оd 2009 dо 2011 gоdinе na projektu Svetske banke „Serbia Transitional Agriculture Reform Project (STAR)“ u okviru Sektora za ruralni razvoj Мinistаrstvа pоlјоprivrеdе, šumаrstvа i vоdоprivrеdе Republike Srbije. Za valјujući odličom uspe u na studijama bilа je dobitnik brojni stipendija, kао štо su Stipendija Kraljevine Norveške, Stipendija Republičke fondacije za razvoj naučnog i umetničkog podmlatka, а Stipendiju Ministarstva nauke i zaštite životne sredine Republike Srbije је primаlа tоkоm pоstdiplоmski studiја Učestvovalа je na brојnim simpozijumima i konferencijamа Stručni i nаučni članaka, ukupno 17, publikovala je u domaćim i stranim časopisima Оd tоg brоја, јеdаn rаd је publikоvаn u čаsоpisu sа SCI listе IZJAVA O AUTORSTVU Potpisana Vučićеvić Ivana Broj upisa: Izjavlјujem Da je doktorska disertacija pod naslovom „EKSPRESIJA ANTIGENA ĆELIJSKE PROLIFERACIJE NA MASTOCITIMA I NJIHOV ZNAČAJ ZA GRADACIJU MASTOCITOMA PASA“  rezultat sopstvenog istraživačkog rada,  da predložena disertacija u celini ni u delovima nije bila predložena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugi visokoškolski ustanova,  da su rezultati konkretno navedeni i  da nisam kršio autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugi lica U Beogradu, Potpis doktoranda: 2014. godine IZJAVA O ISTOVETNOSTI ŠTAMPANE I ELEKTRONSKE VERZIJE DOKTORSKOG RADA Ime i Prezime autora: Ivana Vučićеvić Broj upisa: Studijski program: doktorske akademske studije Naslov rada: EKSPRESIJA ANTIGENA ĆELIJSKE PROLIFERACIJE NA MASTOCITIMA I NJIHOV ZNAČAJ ZA GRADACIJU MASTOCITOMA PASA Mentor: Dr Sanja Aleksić-Kovačević, redovni profesor Potpisana Vučićеvić Ivana Izjavlјujem da je štampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predala za objavlјivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvolјavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao što su ime i prezime, godina i mesto rođenja i datum odbrane rada. Ovi lični podaci mogu se objaviti na mrežnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. U Beogradu, Potpis doktoranda: 2014. godine IZJAVA O KORIŠĆENјU Ovlašćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom „EKSPRESIJA ANTIGENA ĆELIJSKE PROLIFERACIJE NA MASTOCITIMA I NJIHOV ZNAČAJ ZA GRADACIJU MASTOCITOMA PASA“, koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predala sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalnom repozitorijumu Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji poštuju odredbe sadržane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio 1. Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno 3. Autorstvo - nekomercijalno – bez prerade 4. Autorstvo - nekomercijalno – deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo – bez prerade 6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima U Beogradu, Potpis doktoranda: 2014. godine