UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Milena Đorđević MORFOLOŠKE, IMUNOFENOTIPSKE I KLINIČKE KARAKTERISTIKE LIMFOCITNO – PLAZMOCITNOG DUODENITISA PASA Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF VETERINARY MEDICINE Milena Đorđević MORPHOLOGICAL, IMMUNOPHENOTYPIC AND CLINICAL CHARACTERISTICS OF DOGS WITH LYMPHOCYTIC - PLASMACYTIC DUODENITIS Doctoral Dissertation Belgrade, 2013. Mentor: dr Vanja Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine Katedra za bolesti kopitara, mesojeda, živine i divljači Članovi komisije: dr Vanja Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine Katedra za bolesti kopitara, mesojeda, živine i divljači dr Sanja Aleksić-Kovačević, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine Katedra za patološku morfologiju dr Olivera Lozanče, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine Katedra za anatomiju domaćih životinja dr Nikola Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine Katedra za radiologiju i radijacionu higijenu dr Milenko Uglješić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Katedra za internu medicinu Datum odbrane:__________________________ Veliku zahvalnost za pomoć u izradi ove disertacije dugujem:  svom mentoru profesoru dr Vanji Krstić, na bezgranično dobroj volji, znanju i iskustvu koje mi je preneo i nesebičnoj podršci koju mi je pružio u izradi ove disertacije  profesorki dr Sanji Kovačević, na ogromnoj pomoći koju mi je pružila u izradi ove disertacije, na strpljenju, razumevanju, kao i na velikom broju stručnih i korisnih saveta  profesoru dr Miodragu Miriloviću na pomoći u izradi ove disertacije  kolektivu Katedre za patološku morfologiju Fakulteta veterinarske medicine koja je pomogla realizaciju ove disertacije  kolektivu Katedre za bolesti kopitara, mesojeda, živine i divljači Fakulteta veterinarske medicine koja je pomogla realizaciju ove disertacije  kolektivu Katedre za anatomiju Fakulteta veterinarske medicine na interesovanju sa kojim su pratili moj rad i brojnim dragocenim uslugama . MORFOLOŠKE, IMUNOFENOTIPSKE I KLINIČKE KARAKTERISTIKE LIMFOCITNO – PLAZMOCITNOG DUODENITISA PASA REZIME Limfocitno – plazmocitni duodenitis (LPD) pasa je oblik inflamatorne bolesti creva. LPD predstavlja enteropatiju hroničnog toka i praćen je nespecifičnim kliničkim simptomima, od kojih su najvažniji dijareja i povraćanje. Najvažnija morfološka karakteristika imunološkog odgovora kod limfocitno - plazmocitnog duodenitisa (LPD) pasa je nalaz mononuklearnog ćelijskog infiltrata u sluznici duodenuma. Nakon dobro obavljenog kliničkog pregleda i detaljne anamneze, može se pretpostaviti moguće mesto inflamacije. Prikupljanje preciznih podataka, uzimanje sveobuhvatne anamneze i vršenje detaljnog kliničkog pregleda pasa je od neprocenjivog značaja za pravilno postavljanje dijagnoze. Klinički znaci vezani za LPD nisu specifični. Imaju cikličan karakter, reĎe progresivan klinički tok. Najčešći simptomi uključuju hroničnu ili rekurentnu dijareju, povraćanje, gubitak težine i promenu apetita. Ispitivanjem je obuhvaćeno ukupno 60 odraslih pasa, različite rase i oba pola: 54 psa sa simptomima dijareje i povraćanja, koje je trajalo duže od tri nedelje, kao i šest klinički zdravih pasa koji su služili kao kontrolna grupa. Ispitivanja su obuhvatila pse koji su bili pacijenti ambulantne klinike Fakulteta veterinarske medicine (FVM) u Beogradu. Prema anamnestičkim podacima, svi psi su pre dolaska u ambulantu FVM bili neuspešno lečeni antibioticima i svi su bili slobodni od crevnih parazita. UraĎene su hematološke i biohemijske analize krvi, zatim radiološka, ultrazvučna i endoskopska dijagnostika. Uzorci mukoze duodenuma, uzeti biopsijom, ispitani su patohistološkim i imunohistohemijskim metodama. Analizom rezultata dobijenih u ovom istraživanju, ustanovljeno je da oboleli psi, koji su u kliničkoj slici imali hroničnu dijareju, hronično povraćanje, izmenjeno ponašanje i promenjen apetit, boluju od sledećih enteropatija: kataralni duodenitis je utvrĎen kod 5 pasa, kod 3 psa je postavljena dijagnoza eozinofilnog duodenitisa dok je kod 46 pasa dijagnostikovan limfocitno – plazmocitni duodenitis (LPD). Detaljnim opisom morfoloških promena na biopsijskim uzorcima sluznice duodenuma pasa obolelih od LPD (promene na crevnim resicama, stepen oštećenja crevnog epitela, postojanje proširenja kripti, prisustvo dilatiranih limfnih sudova i fibroze) kao i praćenjem zastupljenosti intraepitelnih limfocita (IEL), limfocita, plazma ćelija, eozinofilnih granulocita i neutrofilnih granulocita u infiltratu sluznice, formirane su različite morfološke grupe. U uzorcima duodenuma u kojima dominiraju limfociti i plazma ćelije, uočeno je skraćenje crevnih resica na 75 - 50% normalne dužine, a same promene su okarakterisane kao blage do umerene. Crevne resice su zadebljale, a neke su fuzionisane. Na epitelnim ćelijama zapažaju se degenerativne promene, kao i deskvamacija epitelnih ćelija. Zapaženo je blago do umereno proširenje kripti (10 - 25% kripti je prošireno). Lamina propria je edematozna zbog prisustva obilnog ćelijskog infiltrata velikim brojem mononuklearnih ćelija, meĎu kojima dominiraju limfociti i plazma ćelije. Plazma ćelije sa ekscentrično postavljenim jedrima obično u grupama ispunjavaju laminu propriju crevnih resica. Kripte su razdvojene sa 10 – 20 limfocita i plazma ćelija. Pojedinačni limfociti, smešteni intaepitelno, zapažaju se na epitelu crevnih resica, i to kao individualne ćelije, a retko u grupama (grozdovima). Imunohistohemijskim ispitivanjem uzoraka sluznice duodenuma obolelih pasa u našem materijalu, uočena je ekspresija CD3+ (T limfocita) i CD79+ (B limfocita). Kod ispitanih uzoraka, kod 31 psa u inflamatornom infiltratu dominiraju ćelije CD3+ imunofenotipa. Pozitivna imunohemijska reakcija je ispoljena nalazom precipitata tamnosmeĎe boje u predelu ćelijske membrane T limfocita, tako da je prisutan tzv. membranski precipitat. Reakcija reĎe zastupljenih B limfocita, više je difuznog karaktera. B limfociti dominiraju u 2 slučaja. U 13 slučajeva postoji ravnomerno mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat. Analizom statističkih pokazatelja za CIBDAI (engl. canine inflamatory bowel disease activity index) i CCECAI (engl. canine chronic enteropathy clinical activity index) unutar grupe pasa obolelih od LPD, ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĎu prosečne vrednosti za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom i prosečne vrednosti kod pasa sa pretežno plazmocitnim infiltratom. Statistički vrlo značajno (p≤0,01) je veća prosečna vrednost za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom u odnosu na prosečnu vrednost za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa pretežno limfocitnim infiltratom. Ključne reči: pas, endoskopija, limfocitno - plazmocitni duodenitis (LPD) Naučna oblast: Veterinarska medicina Uža naučna oblast: Klinička dijagnostika, patologija i terapija životinja UDK broj: 636.7:616 MORPHOLOGICAL, IMMUNOPHENOTYPIC AND CLINICAL FEATURES OF LYMPHOCYTIC – PLASMOCYTIC DUODENITIS IN DOGS SUMMARY Lymphocytic - plasmocytic duodenitis (LPD) in dogs is a form of chronic inflammatory bowel disease. LPD is a chronic enteropahty accompanied with non specific clinical symptoms out of which diarrhea and vomiting are the most significant. The most important morphological feature of the immune response in this type of inflammatory bowel disease is the finding of mononuclear infiltrates in the mucosa of the duodenum. After thorough clinical examination and detailed patient’s history the inflammation site can be described. Gathering of precise data, history, and a detailed clinical examination are of the upmost importance for the diagnosis. Clinical signs of LPD are not specific. They have a cyclic character and a seldom progressive clinical course. The most common symptoms include chronic or recurrent diarrhea, vomiting, weight loss, and changes in appetite. The study involved 60 adult dogs of different breeds and both sexes: 54 dogs with symptoms of diarrhea and vomiting that persisted longer than three weeks and six clinically healthy dogs that served as controls. The investigation included dogs which were patients at the ambulatory clinic at the Faculty of Veterinary Medicine, Belgrade (Serbia). According to anamnestic data all dogs were previously unsuccessfully treated with antibiotics and were free of intestinal parasites. Hematological and biochemical blood tests, radiology, ultrasonography and endoscopy tests were carried out. Biopsy samples of the duodenal mucosa were investigated with pathohistological and immunohistochemical methods. By analysis of the results obtained in this study it was shown that dogs, which in the clinical picture had chronic diarrhea, chronic vomiting, abnormal behavior and altered appetite, suffered from the following enteropathies: catarrhal duodenitis was found in 5 dogs, 3 dogs were diagnosed with eosinophilic duodenitis and 46 dogs were diagnosed with lymphocytic - plasmocytic duodenitis (LPD). Different morphological groups were formed according to detailed description of morphological changes of the duodenal mucosa biopsy samples of LPD affected dogs (changes of the villi, degree of intestinal epithelium damage, expansion of crypts, dilated lymph vessels and fibrosis). Relevant factors were as well: incidence of intraepithelial lymphocytes (IEL), lymphocytes, plasma cells, eosinophilic and neutrophilic granulocytes in the mucosa infiltrate. The duodenal samples were dominated by lymphocytes and plasma cells and shortening of the villi at 75 - 50% of the normal length were observed. The observed changes were characterized as mild to moderate. The villi were thickened, and some have merged. On epithelial cells degenerative changes and desquamation of epithelial cells were observed. A mild to moderate enlargement of crypts (10 - 25% crypts were extended) was recorded. The lamina propria was edematous due to the presence of an abundant cellular infiltrate of a large number of mononuclear cells, predominantly lymphocytes and plasma cells. Plasma cells with eccentrically placed nuclei in groups usually fill the lamina propria of the villi. Crypts were separated by 10 - 20 lymphocytes and plasma cells. Individual lymphocytes, located in the epithelium (IEL), can be observed in the epithelium of the villi, as individual cells, and rarely in groups (clusters). Immunohistochemical examination of duodenal mucosa samples revealed expression of CD3+ (T lymphocytes) and CD79+ (B lymphocytes). In the investigated samples, in 31 dogs in the inflammatory infiltrate CD3+ cells were the dominant cell type. Positive immunochemical reaction was exhibited by a dark brown precipitate in the area of the cell membrane of T lymphocytes, i.e. so-called membranous precipitate. The reaction of the few B lymphocytes was of a more diffuse character. B lymphocytes dominated in 2 cases. In 13 cases there was an evenly mixed lymphocytic - plasmocytic infiltrate. The analysis of statistical indicators for CIBDAI (engl. canine inflamatory bowel disease activity index) and CCECAI (engl. canine chronic enteropathy clinical activity index) within the group of dogs affected by LPD, determined a significant difference (p≤0.05) between the mean values for CIBDAI and CCECAI in dogs with mixed infiltrate and the average values for dogs with a mainly plasmocytic infiltration. The average value for the CIBDAI CCECAI in dogs with a mixed infiltrate was statistically highly significant (p≤0.01) compared to the average value for CIBDAI and CCECAI in dogs with a predominantly lymphocytic infiltrate. Key words: dog, endoscopy, lymphocytic - plasmacytic duodenitis (LPD) Scientific field: Veterinary medicine Field of academic expertise: Clinical diagnostics, pathology and therapy of animals UDK number: 636.7:616 Spisak skraćenica koje su korišćene u ovoj doktorskoj disertaciji: Ag antigen ALT alanin transaminaza AP alkalna fosfataza APC antigen prezentujude delije AST aspartat aminotransferaza At antitelo CCECAI engl. canine chronic enteropathy clinical activity index CCL25 engl. C-chemokine ligand 25 CCR9 engl. C-chemokine receptor 9 CD25 marker CIBD engl. cryptogenic inflamatory bowel disease CIBD engl. cryptogenic inflamatory bowel disease“ CIBDAI engl. canine inflamatory bowel disease activity index EGE eozinofilni gastroenteritis ENS enterički nervni system FAE engl. folicule associated epithelium Fc engl. fragment crystalline GALT engl. gut - associated lymphoid tissue (crevu pridruženo limfno tkivo) GALT engl. gut associated lymphoid tissue GI gastrointestinalni HE hematoksilin-eozin HEV engl. high endothelial vessels HUC histiocitni ulcerativni colitis i.v. intravenska IBC inflamatorna bolest creva IBD engl. inflamatory bowel disease IEL intraepitelni limfociti IFNγ interferon γ IgA imunoglobulin A IgM, IgG, IgE imunoglobulini IL interleukin iTreg indukovane Treg (regulatorne T delije) LL latero – lateralna projekcija lnn. lymphonodi LPD limfocitno – plazmocitni duodenitis LPE limfocitno-plazmocitni enteritis LPL lamina propria limfociti LPM lamina proprija mukoze (lamina propria mucosae) LSAB2 streptavidin-biotin imunohistohemijska metoda MAdCAM – 1 engl. mucosal addressin cell-adhesion molecule – 1 MALT engl. mucosa - associated lymphoid tissue (mukozi pridruženo limfno tkivo) MHC engl. major histocompatibility complex MLN engl. mesenterial lymph nodes (mezenterijalni limfni čvorovi) N.A.V. nomina anatomica veterinaria nTreg postojede (natural) Treg (regulatorne T delije) PAMP engl. pathogen associated molecular patterns pIgR polimerni imunoglobulinski receptor PLE engl. protein losing enteropathy PP Pejerove ploče (noduli lymphatici aggregati) ROS engl. reactive oxygen species SC sekretorna komponenta SigA sekretorni IgA TCR engl. T-cell receptor TGFβ engl. tumor growth factor β Th3 regulatorne T delije TLR engl. toll like receptors Tr1 regulatorne T delije VD ventro – dorzalna projekcija WSAVA engl. World Small Animal Veterinary association SADRŽAJ 1. UVOD 1 2. PREGLED LITERATURE 4 2.1. Morfološko-fiziološke osobenosti duodenuma pasa 4 2.2. Imunološki sistem mukoze creva 12 2.3. Inflamatorne bolesti creva pasa 21 3. CILJ I ZADACI 42 4. MATERIJAL I METODE 43 4.1. Materijal 43 4.2. Metode 43 5. REZULTATI ISTRAŽIVANJA 51 5.1. Klinički nalaz 51 5.2. Hematološki nalaz 55 5.3. Biohemijski nalaz 57 5.4. Koprološki nalaz 61 5.5. Ultrazvučni nalaz 62 5.5.1. Kontrolna grupa 62 5.5.2. Oboleli psi 62 5.6. Radiološki nalaz 64 5.6.1. Kontrolna grupa 64 5.6.2. Oboleli psi 64 5.7. Endoskopski nalaz 65 5.7.1. Kontrolna grupa 65 5.7.2. Oboleli psi 65 5.8. Patohistološki nalaz 67 5.8.1. Kontrolna grupa 67 5.8.2. Oboleli psi 67 5.9. Imunohistohemijski nalaz 72 5.9.1. Kontrolna grupa 72 5.9.2. Oboleli psi 73 5.10. Odnos hematoloških i biohemijskih parametara izmeĎu obolelih pasa i kontrolne grupe pasa 74 5.11. Odnos pojedinih hematoloških i biohemijskih parametara i tipa infiltrata kod pasa obolelih od LPD 85 5.12. Odnos indeksa CIBDAI i CCECAI pasa obolelih od različitih tipova duodenitisa: limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa 93 5.13. Odnos indeksa CIBDAI i CCECAI i tipa infiltrata pasa obolelih od LPD 97 6. DISKUSIJA 101 7. ZAKLJUČCI 110 8. LITERATURA 112 1 1. UVOD Hroniĉne enteropatije ĉine više od polovine svih digestivnih poremećaja kod pasa. Inflamatorna bolest creva – IBC (engl. inflamatory bowel disease - IBD) pasa je zajedniĉki naziv za niz hroniĉnih enteropatija koje se primarno odlikuju zapaljenjem sluznice gastrointestinalnog sistema i nespecifiĉnim simptomima. Limfocitno – plazmocitni duodenitis (LPD) pasa je oblik inflamatorne bolesti duodenuma. LPD predstavlja enteropatiju hroniĉnog toka i praćen je nespecifiĉnim kliniĉkim simptomima, od kojih su najvaţniji dijareja i povraćanje. Najvaţnija morfološka karakteristika imunološkog odgovora, u ovom tipu inflamatorne bolesti creva, je nalaz mononuklearnog infiltrata u sluznici duodenuma. Klasifikacija IBC-a, izvršena je upravo na osnovu dominantne populacije ćelija u infiltratu zida creva, kao i na osnovu mesta gde se infiltracija odigrala. U infiltratu se mogu naći limfociti, plazma ćelije, eozinofilni granulociti, makrofagi, a reĊe neutrofilni granulociti. Vrlo je ĉest i mešoviti infiltrat kada su ćelijske populacije izmešane i preklapaju se u razliĉitim kombinacijama. Limfocitno- plazmocitni enteritis je najĉešći oblik IBC tankih creva pasa. Inflamatorna bolest creva je dobro poznata i kod ljudi. Vaţno je navesti da skraćenica CIBD (engl. cryptogenic inflamatory bowel disease) kod ljudi objedinjuje dva oboljenja i to su ulcerativni kolitis i Kronova bolest, a koje pokazuju izvesne sliĉnosti sa odreĊenim oblicima IBC pasa. Patogeneza IBC je vrlo kompleksna (Whitley i sar., 2010). Ona je primer izmenjenog imunološkog odgovora na velikoj mukoznoj površini gde egzogeni antigeni (iz lumena creva) imaju znaĉaja u nastanku bolesti i odrţavanju tako promenjenog stanja (Whitley i sar., 2010). Mehanizmi koji stoje u pozadini nastanka IBC pasa nisu još uvek razjašnjeni (Allenspach, 2003). Iako uzrok nastanka IBC kod ţivotinja i ljudi nije jasan, i histološki i kliniĉki podaci ukazuju na imunološku podlogu razvoja bolesti (German i sar., 2008). Umešanost imunoloških mehanizama u nastanak bolesti potvrĊuje povećan broj ćelija zapaljenja u gastrointestinalnoj mukozi kod pacijenata obolelih od IBC, zatim uspeh tradicionalne terapije IBC-a koja podrazumeva posebnu ishranu u kojoj su zastupljeni 2 „novi“ proteini koji ranije nisu korišćeni u ishrani (engl. novel proteins) kao i upotreba lekova za koje se zna da menjaju imunološki odgovor (napr. kortikosteroidi, azatiopirin, sulfasalazin). Ove ĉinjenice ipak nisu dovoljne da se IBC svrsta u primarno imunološka obolenja (Jergens i sar., 1996). U pogledu etiopatogeneze IBC, u literaturi se iznose dve osnovne hipoteze. Prema prvoj hipotezi, inflamacija u crevima nastaje kao posledica poremećenog imunološkog odgovora. Poremećen imunološki odgovor moţe biti posledica defektne supresorske funkcije GALT-a (engl. gut associated lymphoid tissue) ili, pak, poremećeni imunološki odgovor moţe predstavljati primarno imunološki poremećaj. Druga hipoteza podrazumeva da inflamacija zapoĉinje kao posledica imunološkog odgovora, ali na antigene na koje ne bi trebao da se razvija imunološki odgovor, tj. na normalne sastojke lumena creva (antigeni hrane ili rezidentna crevna flora). U svakom sluĉaju, i ćelijska komponenta (aktivirani intestinalni T i B limfociti, plazma ćelije, dendritske ćelije, makrofagi) i molekulski elementi (sistem komplementa, prostaglandini, leukotrijeni, proinflamatorni citokini, interleukini, proteaze, azot oksid, slobodni kiseonikovi radikali) uĉestvuju skupa u nastanku i odrţavanju zapaljenja mukoze (Jergens, 2008). Kliniĉki simptomi reflektuju lokalizaciju oštećenja tkiva (Jergens i sar., 1996). Nakon dobro obavljenog kliniĉkog pregleda i detaljne anamneze, moţe se pretpostaviti moguće mesto inflamacije. Prikupljanje preciznih podataka, uzimanje sveobuhvatne anamneze i vršenje detaljnog kliniĉkog pregleda pasa je od neprocenjivog znaĉaja za pravilno postavljanje dijagnoze (Gaschen i sar., 2011). Kliniĉki simptomi IBC se pripisuju ćelijskom infiltratu i medijatorima inflamacije (The WSAVA International Standardization Group, 2010). Kliniĉki simptomi su direktna posledica gastrointestinalnog zapaljenja i njegovog uticaja na gastrointestinalnu permeabilnost, motilitet, apsorpciju hranljivih sastojaka i na centar za povraćanje (Jergens i sar., 1996). Kliniĉki znaci vezani za IBC nisu specifiĉni. Imaju cikliĉan karakter, reĊe progresivan kliniĉki tok. Najĉešći simptomi ukljuĉuju hroniĉnu ili rekurentnu dijareju, povraćanje, gubitak teţine i promenu apetita (Gaschen i sar., 2011; Kobayashi i sar., 2007; Lecoindre i sar., 2006; Jergens, 2004; Craven i sar., 2004; Jergens i sar., 1996). 3 Definitivna dijagnoza IBC zahteva mikroskopski pregled uzoraka sluznice gastrointestinalnog sistema koji su dobijeni biopsijom. IzvoĊenje biopsije mukoze je zapravo, jedini dijagnostiĉki postupak kojim se moţe obezbediti uzorak tkiva potreban za sigurno postavljanje dijagnoze IBC i za pruţanje informacija za prognozu kao i za individualizaciju terapije. Endoskopija je metoda izbora pošto je minimalno invazivna, nije skupa, a i brza je. Uz to, ovom metodom je moguće dobiti veći broj uzoraka koji se mogu koristiti za citološka i histološka ispitivanja kao i za imunohistohemijske analize. Ipak, do danas, etiopatogeneza ove bolesti pasa nije u svemu poznata, a nisu poznate ni sve imunofenotipske karakteristike ćelija u infiltratu, koje bi bile znaĉajne za razumevanje etipatogeneze. Bliţe definisanje ćelijskih populacija sa morfološkog i imunofenotipskog aspekta, doprineće boljem razumevanju patogeneze limfocitno – plazmocitnog duodenitisa pasa, što će u korelaciji sa kliniĉkim nalazom omogućiti postavljanje precizne dijagnoze i primenu adekvatne terapije. Stoga su ispitivanja u ovoj disertaciji bila usmerena u tom pravcu. 4 2. PREGLED LITERATURE 2.1. MORFOLOŠKO - FIZIOLOŠKE OSOBENOSTI DUODENUMA PASA Digestivni sistem psa (apparatus digestorius s. systema digestorium) se sastoji od digestivnog tubusa i pomoćnih organa (Evans, 1993; Miller, 1964). Prema Konigu i saradnicima (2009) delovi digestivnog tubusa su: usna duplja (cavum oris), ţdrelo (pharynx), jednjak (esophagus s. oesophagus), ţeludac (ventriculus s. gaster), tanko crevo (intestinum tenue), debelo crevo (intestinum crassum) i analni kanal (canalis analis). Deo digestivnog tubusa kaudalno od ţdrela, ukljuĉujući sve strukture od jednjaka do rectuma i analnog kanala predstavlja canalis alimentarius, tj. alimentarni kanal (Konig i sar., 2009; Evans, 1993). Isti autori navode da u pomoćne organe sistema za varenje spadaju: zubi (dentes), jezik (lingua), pljuvaĉne ţlezde (glandulae salivales), jetra (hepar), ţuĉna kesica (vesica fellea), gušteraĉa (pancreas), a po Evansu (1993) i analna kesica (sinus paranalis). Tanko crevo psa (intestinum tenue) se proteţe od pilorusa ţeluca do ušća ileuma u debelo crevo koje se oznaĉava kao ostium ileale (N.A.V., 2005) seu ostium ileocolicum. Tanko crevo predstavlja najduţi deo alimentarnog kanala. Duţina creva varira kod razliĉitih rasa i individua u okviru iste rase. Vrlo je teško odrediti duţinu creva ţivih ţivotinja. Post mortem, kada nema peristaltiĉkih kontrakcija, duţina creva se povećava. Kao rezultat gastrointestinalne adaptacije na odreĊenu vrstu hrane i navike hranjenja, moţe se reći da je duţina creva mesojeda manja u odnosu na duţinu creva herbivora. Generalno, kod pasa je duţina creva pet puta veća od duţine tela, dok je kod herbivora taj odnos 25:1 (Konig i sar., 2009). Prema Evansu (1993), duţina creva ţivog psa je 3,5 puta veća od duţine njegovog tela. Zapremina creva psa iznosi oko 37% od ukupne zapremine digestivnog sistema (Evans, 1993; Banks, 1986). Duodenum psa je dugaĉak od 20 cm do 60 cm, zavisno od veliĉine ţivotinje (Simić i Janković, 1997). Anatomi dele tanko crevo na tri dela: duodenum, jejunum i ileum (Konig i sar., 2009; Budras i sar., 2002; Simić i Janković, 1997; Ellenberger i sar., 1977). Autori navode da je duodenum relativno kratak (u psa teškog 20 kg duţina duodenuma grubo iznosi oko 5 25 cm), jejunum je najduţi (blizu 90% duţine tankog creva), a ileum najkraći, tj. predstavlja samo kratak završni deo tankog creva psa. Iako precizne granice izmedju ova tri segmenta ne mogu da se opserviraju ni makroskopski, a ni mikroskopski, histološke razlike izmedju duodenuma, jejunuma i ileuma ipak postoje. Duodenum (duodenum) poĉinje od pilorusa (pylorus) te se pruţa od ţeluca ka desnom trbušnom zidu po visceralnoj površini jetre. Ovaj poĉetni, gornji deo naziva se pars cranialis duodeni. On je dorzalno i lateralno u kontaktu sa jetrom, a medijalno sa pankreasom. U visini devetog meĊurebarnog prostora, duodenum obrazuje prvu krivinu (flexura duodeni cranialis s. prima), zatim savija kaudalno i dodirujući parijetalni peritoneum (peritoneum parietale) desnog trbušnog zida, nešto ventralnije od desnog bubrega, pruţa se kao njegov nishodni deo, oznacen kao pars descendens duodeni. Njegova lateralna površina je u kontaktu sa parijetalnim peritoneumom kao i sa desnim lateralnim i desnim medijalnim lobusom jetre. Dorzalno je u kontaktu sa pankreasom. Medijalno je u vezi sa slepim crevom (cecum s. caecum) i ascendentnim kolonom (colon ascendens), a od kojih je odvojen velikim omentumom (omentum majus). U predelu šestog slabinskog pršljena, duodenum ponovo savija i to ulevo obrazujući drugu krivinu (flexura duodeni caudalis s. secunda), pruţajuci se transverzalno u levu polovinu trbušne duplje. Flexura duodeni caudalis leţi u horizontalnoj ravni. Od ove krivine duodenum ide ushodno, tj. nastavlja put kranijalno ka jetri i ţelucu gradeci pars ascendens duodeni. Ascendentni deo duodenuma se nastavlja u jejunum, ĉineći pri tome krivinu nazvanu - flexura duodenojejunalis. Kranijalna ivica nabora, tj. veze – plica duodenocolica s. lig. duodenocolicum oznaĉava prelaz duodenuma u jejunum (N.A.V., 2005; Simić i Janković, 1997; Evans, 1993). U descendentnom delu duodenuma uoĉavaju se dva ispupĉenja, a to su velika i mala duodenalna papila. Velika duodenalna papila (papilla duodeni major) nalazi se 2,6 - 6 cm kaudalno od pilorusa, a preko nje se u pars descendens zajedno otvaraju dva kanala, i to: ţuĉovod (ductus choledochus) koji dovodi ţuĉ iz jetre i ţuĉne kese, i glavni izvodni kanal pankreasa (ductus pancreaticus). Mala duodenalna papila (papilla duodeni minor) nalazi se nekoliko santimetara kaudalno od papillae duodeni major, i tu se otvara akcesorni kanal pankreasa - ductus pancreaticus accessorius (Budras i sar., 2002; Ellenberger i sar., 1977). 6 Duodenum je priĉvršćen za dorzalni trbušni zid pomoću duplikature peritoneuma, u kojoj se nalaze krvni sudovi, nervi, limfni sudovi, limfni ĉvorovi i masno tkivo (Ellenberger i sar., 1977). Deo duplikature peritoneuma na kojoj visi duodenum oznaĉava se kao mesoduodenum (Evans, 1993). Duodenum je odgovarajućim ligamentima povezan sa organima i to sa jetrom, ţelucem i nishodnim delom kolona (Simić i Janković, 1997). U veze duodenuma se ubrajaju: ligamentum hepatoduodenale, ligamentum gastroduodenale i plica duodenocolica s. ligamentum duodenocolicum. Kroz ligamentum hepatoduodenale prolazi ductus choledochus, vena portae i arteria hepatica (Konig i sar., 2009). Osnovne histološke karakteristike duodenuma su u osnovi zajedniĉke za sve delove alimentarnog kanala (Trpinac, 1994). Alimentarni kanal predstavlja cev sa centralnom šupljinom oznaĉenom kao lumen. Zid digestivne cevi se sastoji od ĉetiri osnovna sloja (Junqueira i sar., 1998; Stojić, 1996; Trpinac, 1994; Banks, 1986). Ovi slojevi, od lumena ka periferiji, imaju sledeći raspored: sluznica (tunica mucosa), podsluznica (tela submucosa), mišićni sloj (tunica muscularis) i seroza (tunica serosa). Sluznicu duodenuma grade tri lamine. Lamina epithelialis mucosae je predstavljena epitelom na bazalnoj memebrani, lamina propria mucosae je saĉinjena od rastresitog vezivnog tkiva, a lamina muscularis mucosae je izgraĊena od glatkih mišićnih ćelija. Lamina epithelialis mucosae sastoji se od više vrsta cilindriĉnih ćelija poreĊanih u jednom redu. To su: enterociti ili apsorptivne ćelije, peharaste ćelije koje luĉe sluz (mukus), Panetove ćelije koje sekretornom aktivnošću i sposobnošću fagocitoze uĉestvuju u regulaciji crevne bakterijske flore, M ćelije koje predstavljaju specijalizovane epitelne ćelije, a nalaze se iznad limfnih folikula i Pejerovih ploĉa, endokrine ćelije i matiĉne ćelije ĉijom deobom nastaju ostale ćelije epitela (Junqueira i sar., 1998; Trpinac, 1994). Lamina propria mucosae se odlikuje bogatom mreţom krvnih i limfnih sudova, kao i difuznim limfatiĉnim tkivom. U ovom sloju sluznice su smešteni i limfni ćvorići, tj. folikuli koji mogu biti pojedinaĉni (noduli lymphatici solitarii) i udruţeni (noduli lymphatici aggregati). Udruţeni limfni ćvorići u sluznici creva obrazuju Pejerove ploĉe – PP (Evans, 1993; Junqueira i sar., 1998; Stojić, 1996; Trpinac, 1994). 7 Lamina muscularis mucosae je sloj sluznice koji je tri puta deblji kod psa nego kod ostalih domaćih ţivotinja. Predstavljen je sa dva sloja: unutrašnjim - cirkularnim i spoljašnjim - longitudinalnim mišićnim slojem (Evans, 1993). Na sluznici duodenuma postoje strukturne tvorevine koje povećavaju ukupnu površinu mukoze (Junqueira i sar., 1998; Trpinac, 1994; Pantić, 1987). Za razliku od ostalih sisara, psi nemaju makroskopski uoĉljive kruţne, prstenaste nabore - plicae circulares (Evans, 1993). Mikroskopski se uoĉavaju prstasti izvrati mukoze, tj. crevne resice (villi intestinales) i uvrati mukoze - Liberkinijeve kripte (neodgovarajući, ali opšte prihvaćen naziv) odnosno glandulae intestinales, tj. intestinalne ţlezde (Junqueira i sar., 1998; Trpinac, 1994). Smatra se da pas ima oko 4 miliona crevnih resica na 1 cm 2 površine duodenuma (Evans, 1993), a od 600 do 3000 resica na svakoj ćeliji (Stevanović, 2004; Trpinac, 1994). Crevne resice daju somotast izgled površini sluzokoţe tankog creva. Svaka resica ima svoju arteriolu koja se grana u kapilarnu mreţu na slobodnom kraju resice. Drenaţa se vrši venulama na bazi resice. Svaka resica ima i svoje limfne kapilare, lakteale, kao i glatke mišiće koji omogućavaju njenu kontrakciju (Junqueira i sar., 1998). Podsluznica (tela submucosa), sastoji se iz rastresitog vezivnog tkiva koje labavo povezuje sluznicu za mišićni sloj crevnog zida pa, stoga, pri kontrakciji mišićnog sloja crevnog zida sluznica obrazuje mnogobrojne nabore. Vezivno tkivo je dobro vaskularizovano i sadrţi brojne limfne sudove. U podsluznici zida, kako duodenuma tako i ostalih delova tankog creva (jejunum i ileum), nalazi se Meissner-ov submukozni nervni splet. U vezivnom tkivu sluznice i podsluznice duodenuma se nalaze i klupĉaste, tubulo- alveolarne duodenalne ţlezde - glandulae duodenales, koje se razlikuju od intestinalnih ţlezda pošto liĉe na pilorusne ţlezde ţeluca. Glandulae duodenales se nalaze samo u delu duodenuma koji je u blizini pilorusa (Evans, 1993; Banks, 1986). Te tubularne ţlezde se otvaraju u Liberkinijeve kripte. Ţlezdane ćelije su mukoznog tipa i uĉestvuju u stvaranju crevnog soka. Produkt njihove sekrecije je alkalan i sluţi da štiti mukoznu membranu od kiselog ţeludaĉnog soka i da omogući optimalan pH za delovanje pankreasnih enzima (Stevanović, 2004). 8 Mišićni sloj (tunica muscularis), sastoji se od spoljašnjeg, tankog, uzduţnog sloja (stratum longitudinale) i unutrašnjeg, jaĉeg, kruţnog sloja (stratum circulare) glatkih mišićnih vlakana. IzmeĊu ova dva sloja nalazi se tanak sloj vezivnog tkiva i Auerbach-ov mienteriĉni nervni splet (Junqueira i sar., 1998, Trpinac, 1994). Seroza (tunica serosa) predstavlja visceralni list peritoneuma (peritoneum viscerale) ĉije su glavne karakteristike da je sjajan, gladak, vlaţan, elastiĉan i providan (Sisson, 1953). Vaskularizacija duodenuma psa ima svoje osobenosti. Deo aorte koji leţi u trbušnoj duplji je aorta abdominalis. Dve njene grane koje dovode krv u tanko crevo su arteria celiaca s. coeliaca i arteria mesenterica cranialis (Janković i sar., 1996). Arteria celiaca je neparan krvni sud koji se odvaja od ventralne strane trbušne aorte u predelu prvog lumbalnog pršljena. Kod psa ona ima tri grane (od kojih samo jedna grana dovodi krv u duodenum), a to su: arteria gastrica sinistra, arteria lienalis i arteria hepatica. Završni deo arteriae hepaticae je arteria gastroduodenalis koja se pruţa do kranijalnog dela duodenuma gde se deli na dve grane, a to su: arteria gastroepiploica dextra i arteria pancreaticoduodenalis cranialis. Ova poslednja se pruţa kroz mezoduodenum uz pars cranialis i pars descendens duodeni i daje grane za duodenum - rami duodenales (Janković i sar., 1996). U predelu kaudalne krivine duodenuma (flexura duodeni caudalis) ona se anastomozira sa kaudalnom pankreatikoduodenalnom arterijom (arteria pancreaticoduodenalis caudalis), granom arteriae mesentericae cranialis. Arteria mesenterica cranialis kao najveća visceralna grana aorte odvaja se, takodje, od ventralnog zida trbušne aorte, ali kaudalno od mesta nastanka arteriae celiacae, tj. u predelu drugog lumbalnog pršljena. Kranijalna mezenteriĉna arterija sluţi kao osovina oko koje rotiraju tanko i debelo crevo tokom embrionalnog razvoja. Labavo je vezana za duodenum sa desne strane i kaudalno. Ona se grana u mezenterijumu i dovodi krv u sve delove tankog creva izuzev kranijalnog dela duodenuma. Jedna od njenih grana je arteria pancreaticoduodenalis caudalis koja se od mesta nastanka pruţa udesno kroz mezoduodenum do pars descendens duodeni. U blizini flexurae duodeni caudalis ona se anastomozira sa kranijalnom pankreatikoduodenalnom arterijom (arteria pancreaticoduodenalis cranialis), granom arteriae celiacae. Kaudalna 9 pankreatikoduodenalna arterija dovodi krv u kaudalni deo duodenuma granama - rami duodenales. Vene tankog creva se sve ulivaju u portnu venu (vena portae), a venska krv portnom venom odlazi u jetru (Janković i sar., 1996). Limfotok trbušnog zida i trbušnih organa se karakteriše prisustvom ĉetiri limfna centra (lymphocentrum). To su: slabinski (lymphocentrum lumbale), celijaĉni (lymphocentrum celiacum), kranijalni mezenteriĉni (lymphocentrum mesentericum craniale) i kaudalni mezenteriĉni (lymphocentrum mesentericum caudale) limfni centar (N.A.V. 2005; Janković i sar., 1996). U poreĊenju sa drugim ţivotinjama, pas ima malo limfnih ĉvorova (lymphonodi – lnn.) trušnih organa (Budras i sar., 2002). U limfne ĉvorove trušnih organa pasa se ubrajaju: lnn. lumbales aortici, lnn. hepatici, lnn. lienales, ln. gastricus, lnn. pancreaticoduodenales, lnn. jejunales, lnn. colici i lnn. mesenterici caudales. Lnn. lumbales aortici pripadaju slabinskom limfnom centru (lymphocentrum lumbale). Lnn. hepatici, lnn. lienales, ln. gastricus i lnn. pancreaticoduodenales Budras i saradnici (2002) svrstavaju u celijaĉni limfni centar (lymphocentrum celiacum), dok Ellenberger i saradnici (1977) lnn. duodenales svrstavaju u kranijalni mezenterĉni limfni centar (lymphocentrum mesentericum craniale). U N.A.V. (2005), lnn. duodenales i lnn. omentales kod pasa su oznaĉeni kao lnn. pancreaticoduodenales, nalaze se izmeĊu zida creva i pankreasa i pripadaju celijaĉnom limfnom centru (lymphocentrum celiacum). Lnn. colici i lnn. jejunales pripadaju kranijalnom mezenteriĉnom limfnom centru dok lnn. mesenterici caudales pripadaju kaudalnom mezenteriĉnom limfnom centru. Aferentni limfni sudovi koji nose limfu iz duodenuma ulivaju se u lnn. hepatici i u lnn. duodenales odnosno lnn. pancreaticoduodenales. U hepatiĉne limfne ĉvorove (lnn. hepatici) stiţe i limfa iz ţeluca, pankreasa i jetre, a obiĉno ih ima dva, levi i desni. Lnn. duodenales odnosno lnn. pancreaticoduodenales leţe izmeĊu poĉetnog dela duodenuma i desnog dela pankreasa, a moţe ih biti jedan ili dva (Budras i sar., 2002; Evans, 1993). Eferentni limfni sudovi iz lymphocentrum celiacum i lymphocentrum mesentericum craniale grade mreţu vasa efferentia od koje nastaje truncus visceralis. Njime limfa otiĉe iz trbušnih organa u proširenje nazvano cisterna chyli pa dalje u ductus thoracicus koji 10 predstavlja glavni limfovod. Limfa iz lymphocentrum mesentericum caudale otiĉe jednim delom preko truncus visceralis-a, a drugim delom preko truncus lumbalis-a u cisterna-u chyli. Ductus thoracicus, kao najveći limfni sud tela, uliva se u kranijalnu šuplju venu - vena cava cranialis (Janković i sar., 1996; Miller i sar., 1969). Nervna kontrola funkcije duodenuma odvija se kao spoljašnja i unutrašnja (Stevanović, 2004). Nervni, kao i humoralni mehanizmi, samo menjaju, smanjuju ili pojaĉavaju, postojeću spontanu kontraktilnost tankog creva. Naime, crevo ima sopstveni automatizam. Postoje specijalizovane pejsmejkerske ćelije koje spontano stvaraju akcione potencijale za motornu aktivnost digestivnog sistema. To su Kajalove ćelije koje pripadaju enteriĉkom nervnom sistemu (ENS) kao i glatkomišićne ćelije u zidu creva (Stevanović, 2004). U njima nastaju spori talasi (hipopolarizacije) koji kada dostignu jaĉinu praga prerastaju u akcione potencijale. Zato kaţemo da crevo ima sopstveni automatizam. Frekvenca akcionih potencijala varira u razliĉitim delovima digestivnog trakta. U duodenumu ih ima do 12 u minuti (Stevanović, 2004). Spoljašnja nervna kontrola duodenuma se ostvaruje posredstvom vegetativnog nervnog sistema, simpatikusa i parasimpatikusa. Parasimpatikusna vlakna potiĉu od nervus vagus-a. Simpatikusna nervna vlakna potiĉu od nn. splanhnici i to iz celijaĉnog i kranijalnog mezenteriĉnog gangliona - ganglion celiacum i ganglion mesentericum craniale (Konig i sar., 2009). Unutrašnja nervna kontrola se ostvaruje posredstvom enteriĉkog nervnog sistema (ENS). U duodenumu postoje intramuralne grupe neurona ozanĉene kao mienteriĉni Auerbahov splet (plexus myentericus Auerbachi) i kao submukozni Majsnerov splet (plexus submucosis Meissneri). Oba pleksusa su povezana sa prevertebralnim ganglijama abdominalne duplje mreţom subseroznih nervnih vlakana. Ovi pleksusi su pod kontrolom simpatikusnog i parasimpatikusnog sistema, ali su odgovorni i za spontanu mišićnu i sekretornu aktivnost. Auerbahov splet je postavljen izmeĊu longitudinalnog i cirkularnog mišićnog sloja (Stojić, 1996) i on koordinira kontrakcije creva jer programira peristaltiku, pokrete mešanja i fiziološki ileus. Majsnerov splet je smešten u vezivnom tkivu submukoze (Stojić, 1996). Neuroni ovog pleksusa inervišu kripte i crevne resice te tako kontrolišu endokrinu i sekretornu aktivnost digestivnog trakta, lokalni protok krvi, a podstiĉu i 11 nabiranje crevne sluznice. Majsnerov pleksus ima i receptorsku ulogu jer primljene informacije sa receptora šalje u Auerbahov pleksus. Nervni i humoralni faktori samo prilagoĊavaju spontanu aktivnost trenutnim potrebama. Glavni stimulus za pokretanje motorne aktivnosti celog glatkomišićnog dela digestivnog trakta je istezanje zida creva (Stevanović, 2004). Parasimpatikusna stimulacija i odreĊeni hormoni (holecistokinin, gastrin, histamin, insulin, motilin itd.) pojaĉavaju motornu aktivnost, dok simpatikusna stimulacija i pojedini hormoni (adrenalin, noradrenalin, sekretin, glucagon itd.) smanjuju ekscitabilnost glatkomišićnih ćelija. Osnovne funkcije tankog creva te i duodenuma kao njegovog sastavnog dela su varenje hrane, apsorpcija hranljivih materija kao i sekrecija crevnog soka. Mesojedima je tanko crevo glavni organ za razgradnju i apsorpciju hranljivih materija. Varenje hrane kod psa se najvećim delom odvija u tankom crevu te u debelo crevo prelazi samo mali deo nesvarene hrane. U duodenum dospeva sadrţaj iz ţeluca koji je u poluteĉnom, rastvorenom i delom razgraĊenom obliku (himus). Uz pomoć brojnih enzima pankreasnog i crevnog soka i aktivnih materija iz ţuĉi, u duodenumu se nastavlja proces varenja hrane koji je zapoĉet u ţelucu. Himus u malim porcijama iz ţeluca ulazi kroz pilorus u poĉetni deo tankog creva, tj. duodenum, gde podleţe temeljnoj mehaniĉkoj i hemijskoj obradi. To je moguće zato što tanko crevo psa ima dobru motoriĉku aktivnost, a u duodenum se ulivaju ţuĉ i pankreasni sok ĉiji enzimi zajedno sa enzimima iz crevnog soka omogućavaju veoma intenzivnu hidrolizu hranljivih materija. Crevni sok nastaje sekretornom aktivnošću duodenuma (kao i ostalog dela tankog creva). Crevni sok luĉe ćelije Brunerovih (glandulae duodenales) i Liberkinijevih (glandulae intestinales) ţlezda (Stojić, 1996). Resorpcija koja se obavlja u duodenumu je vrlo intenzivna. Razlozi za takav intenzitet resorpcije su višestruki. Najvaţniji su velika apsorptivna površina zbog crevnih resica na sluznici i mikroresica na enterocitima, kao i odliĉna prokrvljenost crevnih resica kroz koje teĉe 60 - 70% ukupne krvi tankog creva (Stevanović, 2004). Preko 90% resorptivnih oblika hranljivih materija (voda, mineralne materije, monosaharidi, disaharidi, aminokiseline, dipeptidi i tripeptidi, nukleozidi, slobodne masne kiseline, glicerol, 12 monogliceridi, holesterol, fosfolipidi i vitamini) resorbuje se tokom prolaska kroz tanko crevo, potom resorptivni oblici hranljivih materija prelaze iz enterocita u portni krvotok, a preko meĊućelijske teĉnosti u limfotok. 2.2. IMUNOLOŠKI SISTEM MUKOZE CREVA Primarne funkcije gastrointestinalnog sistema su digestija i apsorpcija hranljivih materija. Osim navedenih funkcija, gastrointestinalni sistem, predstavlja i najveći imunološki organ u telu, sa funkcijom barijere i odbrane od potencijalnih patogena, kao i istovremene tolerancije prema bezopasnim agensima i sastojcima hrane (Untersmayr i sar., 2006). Delikatna homeostaza izmeĊu imunoloških reakcija i indukcije tolerancije na bezopasne agense i nutritivne komponente je kljuĉna za pravilno funkcionisanje digestivnog sistema (Untersmayr i sar., 2006). Da bi poboljšao efikasnost, digestivni sistem se razvijao u pravcu povećanja svoje površine. Površina gastrointestinalnog sistema ĉoveka je oko 200 puta veća od površine cele koţe i iznosi 400 m2 (Untersmayr i sar., 2006; Roitt i sar., 2001). Pošto je tako velika površina u stalnom kontaktu sa antigenima spoljašnje sredine, neophodna je dobra imunološka zaštita unutar ovog sistema. Tu se nalaze brojne resice i kripte creva obloţene mukusom koji štiti crevne ćelije, zatim u dnu kripti leţe specijalizovane Panetove ćelije sa sposobnošću otpuštanja antimikrobnih supstanci u lumen creva, intestinalna flora (uglavnom prisutna u kolonu) stvara prirodnu barijeru za patogene dok su brojne ćelije imunološkog sistema smeštene u mukozi creva. Visoko specijalizovani imunološki sistem mukoza štiti mukozne površine. GALT (engl. gut - associated lymphoid tissue, ili crevu pridruţeno limfno tkivo) koji ĉini sastavnu komponentu MALT-a (engl. mucosa - associated lymphoid tissue, ili mukozi pridruţeno limfno tkivo), predstavlja najveći rezervoar imunoloških ćelija u telu. Imunološki sistem mukoze creva u mnogo ĉemu se razlikuje od sistemskog imunološkog sistema. Smatra se da ova razlika reflektuje razliĉite izazove sa kojima se sreće svaki sistem ponaosob. Mukoza creva je direktno izloţena antigenima iz hrane, 13 virusima, razliĉitim bakterijama i sliĉno. Koliĉina antigena kojima je mukoza izloţena tokom jednog dana je veća nego ona kojoj je sistemski imunitet izloţen tokom celog ţivota (Mayer, 2003). Imunološki sistem mukoze creva raĊe suprimira imunološki odgovor nego što ga aktivira, koristeći više mehanizama da zaštiti domaćina od agresivnog imunološkog odgovora na sastojke iz lumena creva. To podrazumeva: pouzdanu fiziĉku barijeru, prisustvo enzima u lumenu creva koji menjaju prirodu samih antigena, prisustvo specifiĉnih regulatornih T ćelija, kako u difuznom, tako i u organizovanom limfnom tkivu creva, kao i produkciju antitela, i to najvećim delom sekretornog imunoglobulina A klase. Svi ovi mehanizmi daju imunosupresivni ton gastrointestinalnom imunološkom sistemu mukoza, a poremećaj na bilo kom nivou moţe dovesti do zapaljenja creva ili alergije na hranu (Mayer, 2003). Mukozna barijera je kompleksna struktura saĉinjena od ćelijske i nećelijske komponente (Nagler-Anderson, 2001). Peharaste ćelije neprekidno stvaraju mukusni sloj koji je debeo i pokriva susedni epitel. Partikule, bakterije i virusi, „uhvate“ se u sloj mukusa, te bivaju izbaĉeni u spoljašnju sredinu peristaltiĉkim pokretima creva. Ovaj sloj spreĉava potencijalne patogene i antigene da prodru do epitelnih ćelija. Mukus predstavlja i rezervoar sekretornog imunoglobulina A (IgA) koji vezuje bakterije i viruse te tako spreĉava njihov kontakt i vezivanje za epitel. Epitelne ćelije su meĊusobno spojene jakim vezama, kako apikalno tako i bazalno, te su paracelularni prostori, kao i ćelijska membrana, praktiĉno nepropustljivi za makromolekule i peptide (Mayer, 2003). Samo joni mogu da cirkulišu. Tokom zapaljenja, meĊućelijske veze oslabe omogućavajući prolaz makromolekulima sve do laminae propriae mucosae. U takvoj situaciji moţe se javiti imunološka reakcija na sastojke hrane i na mikroorganizme iz lumena creva. Pretpostavlja se da povećana crevna propustljivost igra ulogu u nastanku i razvoju inflamatorne bolesti creva (Kobayashi i sar., 2007). Prisustvo enzima u lumenu creva je moţda najbitniji mehanizam kojim se spreĉava ulazak antigena u GALT. Proteolitiĉki enzimi u ţelucu i tankim crevima vrše svoju primarnu funkciju, tj. digestiju. MeĊutim, razlaganje velikih polipeptida na male dipeptide i tripeptide, zapravo, ispunjava još jedan zadatak, a to je stvaranje bezopasnih peptida od 14 potencijalno imunogenih proteina. Peptidi sa manje od 8 - 10 amino-kiselina u lancu su slabi imunogeni (Untersmayr i sar., 2006; Mayer, 2003; York i sar., 1999). Regulatorne T ćelije (Treg) igraju neizmerno vaţnu ulogu u odrţavanju imunološke nereaktivnosti na sopstvene antigene i u suprimiranju prejakog imunološkog odgovora koji šteti domaćinu (Sakaguchi i sar., 2008). Regulatorne T ćelije su identifikovane i kod pasa i kod maĉaka (Biller i sar., 2007). Tokom proteklih godina je definisano nekoliko vrsta regulatornih T ćelija, a sve su povezane sa imunološkim odgovorom na mukozi (Mayer, 2003). Treg ćelije se stvaraju ili u timusu kao funkcionalno zrela subpopulacija T ćelija, ili mogu nastati od naivnih CD4+ pomoćniĉkih T limfocita, na periferiji, u MALT-u, za šta je neophodan uticaj interleukina - IL-10 i drugih inhibitornih citokina (Nandakumar i sar., 2009; Sakaguchi i sar., 2008). Osnovna podela regulatornih T ćelija je izvršena na osnovu naĉina njihovog nastanka, i to na već postojeće (natural) Treg – nTreg, i indukovane Treg - iTreg (Nandakumar i sar., 2009). Natural Treg su konstantno prisutne i spreĉavaju aktivaciju potencijalno štetnih ili alergen - reaktivnih T ćelija (O,Garra i sar., 2004). Ove ćelije luĉe IL-10 i eksprimiraju markere kao što su CD25 i Foxp3. U regulatorne T ćelije koje su od velikog znaĉaja u imunološkom sistemu mukoze creva, spadaju Tr1 i Th3 ćelije. Glavna funkcija im je da suprimiraju imunološki odgovor u crevima, tj. da omoguće toleranciju na antigene iz hrane (Biology pages, 2011). Th3 nastaju u Pejerovim ploĉama i sekretuju TGFβ (engl. tumor growth factor β), imunosupresivni citokin. Interesantno je da je TGFβ faktor koji potencira zamenu klase u IgA, u B limfocitima. To vrlo pogoduje imunološkom odgovoru mukoze creva (Mayer, 2003). Ciljane ćelije Treg ćelija, koje su za sada utvrĊene, su APC (antigen prezentujuće ćelije) i efektorske T ćelije, a supresija se ostvaruje posredstvom IL-10, TGFβ, kontaktom, granzimima i perforinima (eBioscience, 2011). Najvaţniji vid supresije je prema dendritskim APC, kojima Treg onemogućavaju da izvrše aktivaciju efektorskih T ćelija pošto blokiraju tzv. „drugi“ signal na dendritskim ćelijama (Biology pages, 2011). Po definiciji, svaka T ćelija koja ima sposobnost da suprimira imunološki odgovor je regulatorna T ćelija (Nandakumar i sar., 2009). Moţe se onda zakljuĉiti da i intraepitelni limfociti (IEL), spadaju u regulatorne ćelije, pošto su prema nekim autorima ukljuĉeni u oralnu toleranciju (Untersmayr i sar., 2006). Neki tipovi CD8+T ćelija, takoĊe, mogu biti 15 regulatorne ćelije pod odreĊenim okolnostima (Rouse, 2007). Kao i Tr1, supresorne CD8+T ćelije funkcionišu stvaranjem IL-10 (Rouse, 2007). Antitelo IgA igra glavnu ulogu u imunološkom odgovoru na mukoznim membranama. Svakodnevno, intestinalne plazma ćelije produkuju više antitela od svih ostalih limfnih organa zajedno (slezine, limfnih ĉvorova, kostne srţi). IgA ĉini 70% svih antitela sisara (Macpherson i sar., 2008). Iako se se odavno zna za dominaciju IgA u crevima, fini detalji se i danas otkrivaju, a vezani su za migraciju, diferencijaciju prekursora IgA plazma ćelija, “homing“, kao i za mehanizme selektivnog transcelularnog transporta IgA. IgA je najheterogeniji imunoglobulin, moţe se javiti u više molekulskih formi: kao monomer, dimer i polimer. Postoji i sekretorni IgA (sIgA). Razlikuju se dve subklase: IgA1 i IgA2. IgA1 je naĊen u serumu i stvaraju ga B ćelije kostne srţi. IgA2 luĉe B ćelije koje se nalaze u mukozi. U IgA2, teški i laki lanci imunoglobulina nisu povezani disulfidnim već nekovalentnim vezama. IgA antitela imaju razliĉitu funkciju u zavisnosti od forme u kojoj se nalaze, kao i od lokacije na kojoj su. U svojoj sekretornoj formi, IgA je dominantni imunoglobulin u sekretima mukoze. Sekretorni IgA (sIgA) ima formu dimera u kojoj su dva monomera povezana dodatnim lancima. Jedan od dodatnih lanaca je J lanac (engl. joining chain – povezujući lanac), bogat cisteinom i strukturno potpuno razliĉit od ostalih imunoglobulinskih lanaca. Ovaj lanac se sintetiše u ćelijama koje produkuju IgA. Pošto bude izluĉen od strane plazma ćelija koje se nalaze u lamini propriji mukoze (lamina propria mucosae), IgA se vezuje za polimerni imunoglobulinski receptor (pIgR) na bazolateralnoj strani epitelnih ćelija, koje ga preuzimaju endocitozom. Kompleks pIgR - IgA putuje kroz epitelnu ćeliju prema lumenu creva, dolazi do proteolize receptora, mada deo receptora, koji se naziva sekretorna komponenta (SC), ostaje vezan za antitelo. sIgA se oslobaĊa u lumen gde mu je zadatak da prepozna mikroorganizme i blokira njihovo vezivanje za epitelne ćelije. Sekretorna komponenta daje otpornost sekretornom antitelu na proteaze iz lumena. Glikoprotein iz sekretorne komponente obavija Fc deo dimernog antitela (engl. fragment crystalline) i zaklanja mesta potencijalnog proteolitiĉkog cepanja. Od svih antitela, jedino još IgM moţe da vezuje SC (Mayer, 2003). Funkcionalna prednost sIgA ukljuĉuje multivalentnost (ĉetiri antigen vezujuća mesta) i otpornost na dejstvo proteolitiĉkih enzima, a zahvaljujući 16 jedinstvenoj primarnoj strukturi alfa lanca kao i sekretornoj komponenti receptora koja ostaje kovalentno vezana za IgA posle njegove transcitoze kroz epitelne ćelije. Sekretorni IgA ispoljava antiinflamatorne osobine. Intaktna, nativna sIgA antitela ne mogu da aktiviraju komplement kada su u kompleksu sa antigenom, a takoĊe ometaju aktivaciju komplementa pokrenutu IgM i IgG antitelima. Sekretorni IgA slabo vrši opsonizaciju i uglavnom funkcioniše kao inhibitor bakterijskog/virusnog vezivanja za epitel (Macpherson i sar., 2001; Cunningham-Rundles, 2001), a moţe, takoĊe, da izvrši aglutinaciju antigena i da ih „ubaci“ u sloj mukusa odakle će, zahvaljujući pokretima creva, biti izbaĉeni u spoljašnju sredinu (Mayer, 2003). Imunološke ćelije gastrointestinalnog sistema su organizovane, anatomski i funkcionalno, u dva odvojena odeljka: imunološko - induktivni i imunološko - efektorski odeljak. U imunološko - induktivnom odeljku dolazi do prepoznavanja antigena od strane naivnih limfocita što je uslov za kasnije diferenciranje limfocita iz naivnih u efektorske ćelije koje su sposobne za obavljanje efektorkih funkcija. Ovaj odeljak ĉini regionalni GALT (pojedinaĉni limfni folikuli i udruţeni limfni folikuli koji su oznaĉeni kao Pejerove ploĉe - PP) i mezenterijalni limfni ĉvorovi - MLN (engl. mesenterial lymph nodes) – Brandtzaeg i sar., 2008. Pejerove ploĉe predstavljaju vaţnu komponentu GALT-a (engl. gut-associated lymphoid tissue). Nalaze se u vezivnom tkivu mukoze (lamina propria mucosae) i podsluznici (tela submucosa) duodenuma. Mogu se naći i u drugim delovima tankog creva. Svaka Pejerova ploĉa sadrţi 10 - 100 limfnih folikula i vidljiva je golim okom kao ovalna površina na antimezenterijalnoj strani duodenuma (Evans, 1993). Epitel koji pokriva Pejerove ploĉe ne formira crevne resice, već su umesto enterocita prisutne M ćelije. Pas ima 12 do 25 Pejerovih ploĉa u celom tankom crevu, a najviše ih ima u duodenumu (Simić i Janković, 1997). Pejerove ploĉe su duge od 7 mm do 85 mm, a široke od 4 mm do 15 mm. Pejerove ploĉe koje se nalaze kranijalno su uglavnom okrugle i leţe u udubljenjima u sluznici tankog creva, dok su one kaudalnije ovalne ili u vidu traka (Sisson, 1953), i štrĉe iznad crevne sluznice (Evans, 1993). Pejerove ploĉe su brojnije i veće kod mlaĊih ţivotinja. Kod starijih ţivotinja atrofiraju (Simić i Janković, 1997). Pejerove ploĉe imaju anatomsku organizaciju sekundarnih limfnih organa. B limfociti su koncentrisani u 17 diskretnim strukturama nazvanim folikuli. U sluĉajevima kad su B limfociti u folikulu nedavno odgovorili na antigen, ovi folikuli imaju centralnu zonu nazvanu germinativni centar. T limfociti se nalaze na periferiji folikula. Prodiranje antigena kroz epitelnu barijeru mukoze creva je prvi, kritiĉan korak u ostvarivanju imunološkog odgovora. Sposobnost intestinalnog epitela da prihvata i transportuje antigene je strateški ograniĉena jedino na epitel vezan za folikule - FAE (engl. folicule associated epithelium). Samo jedan sloj ćelija odvaja PP od intestinalnog lumena. Adaptacija ovog sloja ćelija za uspešno obavljanje svog zadatka se ogleda u prisustvu ćelija koje su specijalizovane za prihvatanje antigena, tj. M ćelija, kao i u odsustvu mukusa na epitelu vezanom za folikule (nema peharastih ćelija koje sekretuju mukus). M ćelije igraju glavnu ulogu u inicijaciji imunološkog odgovora pošto preuzimaju i transportuju antigene da bi ih potom predale antigen prezentujućim ćelijama (Neutra i sar, 2001). Smatra se da M ćelije predstavljaju ulazna vrata za antigene direktno u imunološko - induktivni odeljak (Brandtzaeg i sar., 2008; Untersmayr i sar., 2006; Nicoletti, 2000). M ćelije se znaĉajno razlikuju od okolnih enterocita: ĉetkasta ivica saĉinjena od mikroresica, karakteristiĉna za enterocite, maltene je neprimetna, a i glikokaliks nedostaje. To ĉini da je apikalni deo M ćelija dostupan makromolekulima i mikroorganizmima koji se nalaze u sadrţaju creva te dolazi do njihove internalizacije od strane M ćelija. U zavisnosti od prirode makromolekula i mikroorganizama, mehanizam internalizacije pokazuje tri varijante (Nicoletti, 2000): - velike ĉestice i bakterije se fagocituju, - u sluĉaju virusa odvija se endocitoza posredovana klatrinskim vezikulama, - u sluĉaju da partikule ne adheriraju na M ćelije odvija se pinocitoza. Prema nekim autorima nije definitivno potvrĊen poslednji navedeni naĉin preuzimanja antigena (Untersmayr i sar., 2006, Chehade i sar., 2005). Internalizovani materijal se transportuje vezikulama do bazolateralne membrane M ćelija gde se vrši njegova egzocitoza. Jedna od vaţnih karakteristika M ćelija je da njihova bazolateralna strana formira veliki dţep invaginacijom membrane, što omogućava prisan kontakt sa okolnim limfocitima i antigen - prezentujućim ćelijama (dendritskim ćelijama, makrofagama, B ćelijama i folikulo dendritskim ćelijama), a i skraćuje put koji vezikula sa potencijalnim antigenom treba da preĊe (Brandtzaeg i sar., 2008). Dendritske ćelije koje se nalaze ispod M ćelija su pozicionirane tako da od M ćelija prihvataju antigene. Po 18 fenotipskim karakteristikama razlikujemo nezrele i zrele, tj. aktivirane dendritske ćelije (Brandtzaeg i sar., 2008; Delves i sar., 2000). Nezrele dendritske ćelije su opremljene mehanizmima za fagocitozu antigena i bakterija. One ne eksprimiraju ni kostimulatorne ni adhezivne molekule koji su neophodni za stimulaciju T ćelija. Po preuzimanju antigena i primanju aktivacionih signala, one se sele u parakorteks regionalnih mezenterijalnih limfnih ĉvorova. Tokom migracije sazrevaju, gube sposobnost fagocitoze, a antigen koji su preuzele od M ćelija prezentuju u stabilnoj formi u kompleksu sa MHC (engl. major histocompatibility complex) proteinima na svojoj površini. TakoĊe, na njihovoj površini se pojavljuju kostimulatorni i adhezivni molekuli (CD40, CD80, CD86, CD54 i drugi). Ovakva dendritska ćelija je aktivirana i spremna za interakciju sa T limfocitnim receptorima odnosno za stimulaciju T limfocita (Brandtzaeg i sar., 2008). Sposobnost patogenih bakterija da izazovu imunološki odgovor, nasuprot toleranciji, zavisi od ekspresije molekularnih šablona vezanih za patogene – PAMP (engl. pathogen associated molecular patterns) na njihovoj površini. Ove šablone prepoznaju visoko konzervisani „Toll like“ receptori (engl. toll like receptors - TLR) na dendritskim ćelijama. Aktivacija TLR izaziva maturaciju dendritskih ćelija: ekspresiju kostimulatornih molekula neophodnih za aktivaciju T limfocita i luĉenje citokina koji se vezuju za receptore na T ćelijama (Whitley i sar., 2011). Nepatogene, komensalne bakterije ne eksprimiraju pomenute šablone te nisu u stanju da aktiviraju dendritske ćelije te, stoga, ne dovode ni do aktivacije T limfocita. Alternativno, osim M ćelija, antigene iz crevnog sadrţaja mogu da „preuzmu“ i intra i subepitelne dendritske antigen prezentujuće ćelije koje „hvataju“ antigen sopstvenim transepitelnim projekcijama u lumen creva, nose ga do MLN, sazrevaju u zrele APC i stimulišu T ćelije na produktivni ili supresorski imunološki odgovor. Enterociti mogu da se ponašaju kao lokalne, neprofesionalne APC koje imaju MHC (engl. major histocompatibility complex) molekule II klase na svojoj površini, ali nemaju kostimulatorne molekule (Hershberg i sar., 2000; Blumberg i sar., 1999; Mayer, 1998). Enterociti prezentuju antigen T limfocitima u lamini propriji mukoze. U normalnoj situaciji, ovakva interakcija rezultuje selektivnoj aktivaciji regulatorne T ćelije. U 19 odreĊenim stanjima, kao što je na primer, inflamatorna bolest creva, aktivacija supresorske T ćelije je neuspešna što moţda objašnjava perzistentnu inflamaciju. Pošto se u MLN ili PP odigra aktivacija i proliferacija limfocita, limfociti eferentnim limfnim sudovima ulaze u limfu, a preko grudnog limfnog kanala (ductus thoracicus) ulaze u sistemsku cirkulaciju. Krvnim sudovima limfociti stiţu do mukoze, izlaze u tkivo ekstravazacijom kroz endotelne venule i naseljavaju imunološko - efektorska mesta (takozvani „homing“). Imunološko - efektorski odeljak histološki obuhvata dve lamine, i to su: lamina propria mucosae i lamina epithelialis mucosae. U ovom odeljku limfociti nakon ekstravazacije i diferencijacije vrše svoju efektorsku ulogu. Proces ekstravazacije je diktiran lokalnim profilom vaskularnih adhezionih molekula i hemokina, te na taj naĉin endotelne ćelije imaju ulogu „kontrolora“ ulaska u efektorski odeljak. Na T i B limfocitima postoje receptori za adhezivne molekule i hemokine koji ih navode u mesta bogata ligandima za te receptore (Brandtzaeg i sar., 2005). Vaţno je napomenuti da aktivacija B limfocita i diferencijacija u mukozni IgA sekretujući plazmablast i plazma ćeliju, povlaĉi za sobom i povećanje broja receptora za hemokine koji se nalaze u odreĊenim imunološko - efektorskim mestima mukoze. I aktivacija i diferencijacija T limfocita, takoĊe, povlaĉi za sobom povećanje broja receptora za hemokine koji se nalaze u odreĊenim imunološko - efektorskim mestima mukoze. U sluznici tankih creva, naivni limfociti, aktivirani u PP i MLN, povećavaju ekspresiju α4β7 integrina (Guy-Grand i sar., 2002) koji interaguje sa MAdCAM – 1 (engl. mucosal addressin cell-adhesion molecule - 1) koji je eksprimiran na endotelnim HEV (engl. high endothelial vessels) intestinuma (German i sar., 1999) obezbeĊujući tako „homing“ (samonavoĊenje) u imunološko - efektorska mesta. Hemokin ligand 25 (CCL25; engl. C-chemokine ligand 25) koga stvaraju epitelne ćelije tankog creva, takoĊe je umešan u migraciju limfocita u intestinalnu mukozu. Njegov receptor CCR9 (engl. C-chemokine receptor) je eksprimiran na skoro svim limfocitima tankog creva (Brandtzaeg i sar., 2008). Integrin αEβ7 se nalazi na IEL i reaguje sa E-kadherinom na epitelnim ćelijama (Brandtzaeg i sar., 2008). Sa druge strane, IgA plazmablasti debelog creva eksprimiraju CCR10 koji bivaju privuĉeni ligandom CCL28 koji je eksprimiran upravo u sluznici debelog creva. 20 Limfociti nastanjuju efektorski odeljak intestinalne mukoze: laminu epitelijalis mukoze nastanjuju intraepitelni limfociti oznaĉeni kao IEL, dok laminu propriju mukoze nastanjuju lamina propria limfociti oznaĉeni kao LPL (Guy-Grand i sar., 2005). LPL su predstavljeni T limfocima (CD4+ i CD8+ T limfociti) i B limfocitima. Lamina propria T limfociti imaju jedinstven fenotip. Ove ćelije predstavljaju finalno diferencirane efektorske T ćelije ĉiji su putevi stimulacije razliĉiti od onih za T limfocite periferne krvi. Sekretuju velike koliĉine citokina kao što je IFNγ, IL4, IL5. To su najvećim delom CD4+ T limfociti. Lamina propria B limfociti su aktivirane B ćelije i plazma ćelije koje sekretuju najvećim delom IgA. IEL su jedinstvena populacija limfocita u telu razliĉita od LPL. IEL su predstavljeni T limfocitima sa znaĉajnom citolitiĉkom i imunoregulatornom aktivnošću. T - ćelijski receptor - TCR (engl. T-cell receptor), prepoznaje peptidne antigene prezentovane u sklopu MHC molekula i predstavlja heterodimer koji se sastoji od α i β lanca. Pet do deset procenata T ćelija u organizmu eksprimira receptore sastavljene od γ i δ lanaca, koji po strukturi liĉe na αβTCR, ali pokazuju potpuno drugaĉiju specifiĉnost. T ćelije koje eksprimiraju γδTCR najviše su zastupljene u epitelnim tkivima (Abbas i sar., 2006). Ĉak 10-40% IEL pripada γδT limfocitima (Roitt i sar., 2001). Prema nekim autorima (Untersmayr i sar., 2006), oko 50 % IEL u crevima su γδT limfociti. γδT limfociti su slabo definisanog porekla i uloge. Po svojim karakteristikama nalaze se na granici izmeĊu uroĊenog i steĉenog imuniteta. Nekada se smatralo da su IEL zaduţeni za prvi kontakt sa antigenom (Ferguson, 1977). Danas se zna da je to zadatak M ćelija. IEL luĉe u velikoj koliĉini IFNγ i IL5. Moguća funkcija je imunološki nadzor nad mutiranim ili virusom inficiranim ćelijama (Roitt i sar., 2001) kao i eliminacija oštećenih i inficiranih ćelija intestinalnog epitela (Fogle, 2007). Neki autori (Untersmayr i sar., 2006) ukazuju da je moguće da su zaduţeni za oralnu toleranciju. MeĊutim, IEL su izvor citokina Th2 tipa - IL13, koji podrţava produkciju IgE i alergijsku reakciju. γδTCR molekuli prepoznaju proteinske i neproteinske antigene koje uglavnom ne prezentuju klasiĉni MHC molekuli (Untersmayr i sar., 2006, Allison i sar., 2001), što ukazuje da prepoznaju konformaciju, a to je tipiĉna odlika alergena hrane, te je moguće da uĉestvuju u odgovoru na alergene hrane. 21 2.3. INFLAMATORNE BOLESTI CREVA PASA Termin „hroniĉne enteropatije“ pasa se koristi da objedini grupu hroniĉnih intestinalnih obolenja razliĉite etiologije i razliĉitog patološkog mehanizma nastanka poremećaja, ali sa sliĉnim kliniĉkim manifestacijama. Osnovne karakteristike hroniĉnih enteropatija su hroniĉna dijareja i povraćanje (Gaschen i sar., 2011). U hroniĉne enteropatije pasa spada niz bolesti koje zahvataju tanko i debelo crevo. Većina hroniĉnih enteropatija su primarno obolenja creva. Ipak, kod nekih bolesti ove grupe kod kojih je ţarište van gastrointestinalnog trakta, odraz obolenja je kliniĉki fenotip sliĉan primarnim enteropatijama (Gaschen i sar., 2011). U tabeli 1 su navedeni najĉešći uzroci hroniĉnih enteropatija pasa, ukljuĉujući parazitske, bakterijske i gljiviĉne infekcije, neodgovarajuću reakciju na hranu, poremećaje intestinalne mikroflore i idiopatsku inflamatornu bolest creva. Hroniĉne enteropatije su ĉeste kod pasa i ĉine više od 50% digestivnih poremećaja kod ove vrste (Lecoindre i sar., 2006). Tabela 1. Najĉešći uzroci hroniĉnih enteropatija pasa Parazitska infekcija Nematode, Protozoe (Giardia) Bakterijska infekcija kampilobakterijska, klostridijalna infekcija Disbakterioza antibiotic responsive diarrhea (ARD) Gjiviĉna infekcija histoplazmoza Neodgovarajuća reakcija na hranu intolerancija ili alergija na hranu Idiopatska inflamacija inflamatorna bolest creva (IBC) sa limfocitno- plazmocitnom, eozinofilnom, neutrofilnom ili granulomatoznom infiltracijom rasno specifiĉna: -ulcerativni kolitis boksera -enteropatija sa gubitkom proteina kod svilenog „Wheaten“ terijera -Basenji enteropatija 22 Inflamatorna bolest creva (IBC) je zajedniĉki naziv za grupu hroniĉnih enteropatija koje se odlikuju zapaljenjem gastrointestinalnog sistema (Simpson i sar., 2011) i poslediĉno nespecifiĉnim simptomima, koji mogu biti postojani ili rekurentni. Kod IBC pasa, u zidu creva, u lamini propriji mukoze (lamina propria mucosae), nagomilavaju se ćelije zapaljenja, a na zidu creva dolazi i do drugih morfoloških promena (Gaschen i sar., 2011). Ćelijski infiltrat ukljuĉuje razliĉite populacije ćelija: limfocite, plazma ćelije, eozinofilne granulocite, makrofage i neutrofilne granulocite koji naseljavaju sluznicu creva. IBC je dobro poznata i kod ljudi (Cerquetella i sar., 2010). Vaţno je navesti da skraćenica CIBD koja potiĉe od engleskog naziva „cryptogenic inflamatory bowel disease“, oznaĉava, ustvari, IBC ljudi, a tu spadaju ulcerativni kolitis i Kronova bolest (Harvey i sar., 1980) koje pokazuju izvesne sliĉnosti sa odreĊenim oblicima IBC pasa (Lecoindre i sar., 2006). Pseći granulomatozni enterokolitis podseća na Kronovu bolest kod ljudi (Eldredge i sar., 2007), dok hroniĉni kolitis (limfocitno - plazmocitni kolitis) ima sliĉnosti sa ulcerativnim kolitisom kod ljudi (Jergens i sar., 1996). Sadašnji podaci navode da su ulcerativni kolitis i Kronova bolest dva razliĉita kraja spektra humanih idiopatskih inflamatornih bolesti creva. Ipak, ove bolesti se svrstavaju u zajedniĉku grupu IBC, pošto imaju preklapajuće kliniĉko-patološke osobenosti, dele odreĊene zajedniĉke imunološke poremećaje i idiopatske su (Jergens i sar., 1996). Klasifikacija IBC je izvršena na osnovu dominantne populacije ćelija u infiltratu zida creva kao i na osnovu toga gde se infiltracija odigrala (Jergens, 2008; German i sar., 2003). U infiltratu lamine proprije mukoze mogu se naći limfociti, plazma ćelije, eozinofilni granulociti, makrofagi i neutrofilni granulociti (Marks i sar., 2011). Vrlo je ĉest i mešoviti infiltrat u lamini propriji mukoze zida creva - ćelijske populacije su izmešane i preklapaju se u razliĉitim kombinacijama (Washabau i sar., 2010). U okviru inflamatornih bolesti tankih creva razlikujemo limfocitno - plazmocitni enteritis (LPE), eozinofilni enteritis i eozinofilni gastroenteritis (EGE). U debelom crevu, prepoznati su limfocitno - plazmocitni kolitis, eozinofilni kolitis, histiocitni ulcerativni kolitis (HUC) i granulomatozni kolitis (Nelson i sar., 2003). Ovakva podela zapravo nema mnogo smisla pošto se zna da istovremeno moţe biti zahvaćeno i tanko i debelo crevo, a ĉak moţe biti 23 istovremeno zahvaćen i ţeludac, na primer limfocitno - plazmocitni enterokolitis ili eozinofilni gastroenterokolitis (Hall i sar., 2009; Nelson i sar., 2003). Limfocitno - plazmocitni enteritis pasa (LPE) je tip inflamatorne bolesti tankih creva, hroniĉnog karaktera, koga karakteriše ćelijski infiltrat u kome dominiraju limfociti i plazma ćelije. LPE je najĉešći oblik IBC tankih creva pasa (Jergens, 2008; Eldredge i sar., 2007; Cowell, 2004; Jergens i sar., 1996). Eozinofilni enterokolitis je tip IBC pasa. Na biopsijama, povećan broj eozinofila moţe biti uoĉen u ţelucu, tankim crevima ili kolonu. Granulomatozni enteritis je sliĉan humanoj Kronovoj bolesti. Stvara se zadebljanje zida creva te poslediĉno suţenje tog dela tankog creva zbog inflamacije okolnog tkiva i limfnih ĉvorova. Na biopsijama su naĊeni makrofagi (Eldredge i sar., 2007). Neutrofilni enterokolitis se odlikuje ćelijskim infiltratom sastavljenim preteţno od neutrofilnih granulocita. Ovaj oblik enterokolitisa naziva i piogranulomatozni enterokolitis. Histiocitni ulcerativni kolitis se javlja skoro iskljuĉivo kod boksera. Simptomi se javljaju pre nego što pas napuni 2 godine. Ćelijski infiltrat je predstavljen makrofagima (Eldredge i sar., 2007). Patogeneza IBC je vrlo kompleksna (Whitley i sar., 2010). Ona je primer izmenjenog imunološkog odgovora na velikoj mukoznoj površini gde egzogeni antigeni (iz lumena creva) imaju znaĉaja u nastanku bolesti i odrţavanju tako promenjenog stanja (Whitley i sar., 2010). Mehanizmi koji stoje u pozadini nastanka IBC pasa nisu još uvek razjašnjeni (Allenspach, 2003). Iako uzrok nastanka IBC kod ţivotinja i ljudi nije jasan, ipak podaci, kako histološki tako i kliniĉki, ukazuju na imunološku podlogu razvoja ove bolesti (German i sar., 2008). Umešanost imunoloških mehanizama u nastanak bolesti potvrĊuje povećan broj ćelija zapaljenja u gastrointestinalnoj mukozi kod pacijenata, uspeh tradicionalne terapije IBC-a koja podrazumeva posebnu ishranu u kojoj su zastupljeni proteini koji ranije nisu korišćeni u ishrani (engl. novel proteins) kao i upotreba lekova za koje se zna da menjaju imunološki odgovor (napr. kortikosteroidi, azatiopirin, sulfasalazin). Ove ĉinjenice ipak nisu dovoljne da se IBC svrsta u primarno imunološka obolenja (Jergens i sar., 1996). U pogledu etiopatogeneze IBC, u literaturi se iznose dve osnovne hipoteze. 24 Prema prvoj hipotezi, inflamacija nastaje kao posledica poremećenog imunološkog odgovora. Poremećen imunološki odgovor moţe biti posledica defektne supresorske funkcije GALT-a (engl. gut associated lymphoid tissue), ili pak, poremećeni imunološki odgovor moţe predstavljati primarno imunološki poremećaj. Poremećaji u supresorskoj funkciji GALT-a se smatraju razlogom hipersenzitivnog odgovora karakteristiĉnog za IBC (Lecoindre i sar., 2006). Po ovoj teoriji, supresija je poremećena te klonovi limfocita izmiĉu kontroli i pokreću imunološki odgovor na razliĉite crevne antigene (Jergens i sar., 1996). Takav imunološki odgovor izaziva znaĉajno gastrointestinalno zapaljenje, što za uzvrat povećava propustljivost crevnog zida te omogućava priliv raznovrsnih antigena. Rezultat je sve više ugroţena supresorska funkcija GALT-a, novi ciklusi inflamacije, propustljivost se još više povećava i dolazi do sve većeg oštećenja tkiva (Jergens i sar., 1996). Druga hipoteza podrazumeva da inflamacija zapoĉinje kao posledica imunološkog odgovora, ali na antigene na koje ne bi trebao da se razvija imunološki odgovor: na normalne sastojke lumena creva (antigeni hrane ili rezidentna crevna flora). U svakom sluĉaju, i ćelijska komponenta (aktivirani intestinalni T i B limfociti, plazma ćelije, dendritske ćelije, makrofagi) i molekulski elementi (sistem komplementa, prostaglandini, leukotrijeni, proinflamatorni citokini, interleukini, proteaze, azot oksid, slobodni kiseonikovi radikali) uĉestvuju skupa u nastanku i odrţavanju zapaljenja mukoze (Jergens, 2008). Jedno od objašnjenja je postojanje primarne lezije na mukoznoj propustljivoj membrani (Kobayashi i sar., 2007). Hroniĉno povećanje propustljivosti crevne epitelne barijere, to jest njena disfunkcija, dovodi do povećanog kretanja antigena kroz intestinalni epitel i poslediĉno do povećane izloţenosti imunološkog sistema antigenima (Korzenik, 2005). Povećana crevna propustljivost je uoĉena kod ljudi obolelih od Kronove bolesti i još zanimljivije je što je navedeni poremećaj ustanovljen i kod roĊaka pacijenata, a koji nemaju nikakve simptome bolesti (Kobayashi i sar., 2007). To navodi na razmišljanje o postojanju genetiĉke predispozicije i umešanosti genetiĉkih faktora (Whitley i sar., 2010; Lecoindre i sar., 2006). Kod pasa sa IBC, propustljivost mukoze, merena kroz administraciju laktuloze i 25 ramnoze, bila je u korelaciji sa stepenom histološkog oštećenja (Cerquetella i sar., 2010; Kobayashi i sar., 2007). Malo je podataka da je IBC autoimuna bolest (Whitley i sar., 2010) mada neki autori podrţavaju tu hipotezu (Snook, 1990). Dalja istraţivanja u ovom smeru će sigurno pokazati ulogu fenomena autoimunosti u patogenezi IBC kod pasa. Brojna istraţivanja ukazuju na izuzetan znaĉaj intestinalne mikroflore u imunološkom odgovoru (Lecoindre i sar., 2006). IBC se danas sve više posmatra kao posledica nekontrolisanog zapaljenja creva koje je rezultat kombinacije spoljašnjih faktora (od kojih su najvaţniji sastojci hrane i mikrobi koji se nalaze u lumenu creva) i faktora imunoregulacije kod genetski prijemĉivih jedinki (Simpson i sar., 2011; Chichkowski i sar., 2008; Sartor, 2006). Komensalna mikroflora predstavlja glavni faktor sredine koji igra ulogu u nastanku i odrţavanju IBC (Lecoindre i sar., 2006; Rutgers i sar., 1998). Antigeni koji imaju odluĉujuću ulogu u poremećenom imunološkom odgovoru su poreklom od bakterija (Hendrickson i sar., 2002) i to su uglavnom antigeni rezidentne mikroflore (Simpson i sar., 1994). U svakom sluĉaju, mnogi istraţivaĉi danas prouĉavaju interakciju izmeĊu genetske prijemĉivosti jedinki i mikrosredine creva – napr. bakterije i sastojci hrane (Simpson i sar., 2011; Allenspach, 2011). Genetski uticaj još nije definitivno potvrĊen u IBC pasa, ali su izvesne pasmine, poput nemaĉkog ovĉara, boksera, rotvajlera, pod povećanim rizikom od ovog obolenja (Allenspach, 2011; Washabau i sar., 2010; Fogle, 2007). Genetski uticaj, tj. rasna predispozicija je prihvaćena kod boksera kod kojih se razvija histiocitni ulcerativni kolitis (Cerquetella i sar., 2010). Nasledni poremećaji sluznice kolona se povezuju sa poremećajem brzine regeneracije ćelija i poremećajem u fiziohemijskoj barijeri površine sluznice, što favorizuje nespecifiĉni atak mikroorganizama komensalne flore kolona na sluznicu. Radovi Gomeza (1977) su nagovestili mogućnost postojanja poremećaja enzima histiocita što oteţava hidrolizu lizozoma i poslediĉno dovodi do nemogućnosti uništavanja bakterija. Glutenom indukovana enteropatija kod setera je verovatno nasledna i ima mnogo sliĉnosti sa celijaĉnom bolesti ljudi (Strombeck i sar., 1996). Imunoproliferativna enteropatija kod Basenji pasa je nasledna IBC, limfocitno - plazmocitnog tipa (Gaschen i sar., 2011; Cerquetella i sar., 2010). Odlikuje se hipergamaglobulinemijom povezanom sa 26 porastom koncentracije IgA u krvi (Breitschwerdt i sar., 1980). Ova IBC je analog imunoproliferativnom enteritisu kod ljudi. Mekodlaki „Wheaten“ terijer i „lundehund“ rase pasa takoĊe obolevaju od ozbiljnog PLE (engl. protein losing enteropathy) pri ĉemu postoje indikacije da je u pitanju nasledni faktor . Kod nemaĉkih ovĉara i šar-pej-a postoji visoka uĉestalost imunodeficijencije IgA u krvi i u sluznici, što moţda objašnjava predispoziciju ovih rasa za nastanak IBC-a (German i sar., 2000). Nije utvrĊeno da pol i starost utiĉu na nastanak IBC kod pasa. Istraţivanja Jergens-a i saradnika (1996) su ukazala da 27% obolelih pasa ima dve godine i manje. Ipak, najviše sluĉajeva je ustanovljeno kod pasa srednjih godina i starijih. Kliniĉki simptomi reflektuju lokalizaciju oštećenja tkiva (Jergens i sar., 1996), nakon dobro obavljenog kliniĉkog pregleda i detaljne anamneze, moţe se pretpostaviti moguće mesto inflamacije, to jest da li je zahvaćeno tanko ili debelo crevo, ili oba (Gaschen i sar., 2011). Obiĉno su simptomi jaĉe izraţeni ako je u pitanju tanko crevo (Gaschen i sar., 2011). Sa napretkom dijagnostiĉkih testova i veće dostupnosti abdominalne imidţing dijagnostike, ĉesto se previdi vaţnost utvrĊivanja detaljnog kliniĉkog fenotipa pasa koji boluju od hroniĉnih enteropatija (Gaschen i sar., 2011). Prikupljanje preciznih podataka, uzimanje sveobuhvatne anamneze i vršenje detaljnog kliniĉkog pregleda pasa je od neprocenjivog znaĉaja za pravilno postavljanje dijagnoze. Kliniĉki simptomi IBC se pripisuju ćelijskom infiltratu i medijatorima inflamacije (Washabau i sar., 2010). Kliniĉki simptomi su direktna posledica gastrointestinalnog zapaljenja i njegovog uticaja na gastrointestinalnu permeabilnost i motilitet, na apsorpciju hranljivih sastojaka i na centar za povraćanje (Jergens i sar., 1996). Kliniĉki znaci vezani za IBC nisu specifiĉni. Imaju cikliĉan karakter, reĊe progresivan kliniĉki tok. Najĉešći simptomi ukljuĉuju hroniĉnu ili rekurentnu dijareju, povraćanje, gubitak teţine i promenu apetita (Gaschen i sar., 2011; Kobayashi i sar., 2007; Lecoindre i sar., 2006; Jergens, 2004; Craven i sar., 2004; Jergens i sar., 1996). Mogu se javiti i tenezmi, hematohezija, mukozna stolica, bol u stomaku (Jergens i sar., 1996). Dijareja je najĉešći simptom kod pasa. Kod pasa kod kojih je IBC zahvatila tanko crevo, dijareja ima odlike dijareje tankog creva: stolica je profuzna, teĉna, normalne ili povećane uĉestalosti, prisutna je hitnost. IBC kolona dovodi do nastanka tradicionalnog „kolon sindroma" (Lecoindre i sar., 2006): povećana je frekvenca 27 defekacije, karakter stolice je sluzav, postoje tenezmi. Hematohezija se takoĊe moţe uoĉiti (Hall i sar., 1994). Povraćanje je vaţan simptom IBC. Sadrţaj je obiĉno vodenast, retko hrana, a moţe biti i krvav ukoliko postoje ulceracije, pogotovo duodenuma (Jergens i sar., 1992). IBC je najĉešĉi uzrok hroniĉnog povraćanja i proliva kod pasa (Marks i sar., 2011; Cowell, 2004). Postoji pozitivna korelacija izmeĊu stepena oštećenja tkiva kod IBC i gubitka teţine (Jergens i sar., 1992). To je najverovatnije posledica gubljenja integriteta mukoze tankih creva što dovodi do malasimilacije (smanjene apsorpcije hranljivih sastojaka hrane). Promena apetita uoĉena kod pasa obolelih od IBC, varira od bulimije do anoreksije. Teški sluĉajevi IBC se mogu zakomplikovati gubitkom proteina što se oznaĉava kao enteropatija sa gubitkom proteina (PLE - engl. protein losing enteropathy). U poslednjih 8 godina su se razvila dva sistema koja utvrĊuju intenzitet bolesti na osnovu kliniĉkih simptoma. To su CIBDAI (engl. canine inflamatory bowel disease activity index) i CCECAI (engl. canine chronic enteropathy clinical activity index). Parametri uzeti u obzir su dobijeni anamnezom i kliniĉkim pregledom, što je prikazano u tabeli 2 i tabeli 3. Oba indeksa su se pokazala kao vrlo uspešna da se sa izvesnom dozom sigurnosti odredi ozbiljnost bolesti, da se odredi terapija (Malewska i sar., 2011) i da se prati odgovor na terapiju (Jergens i sar., 2010; Munster i sar., 2010; Garcia-Sancho i sar., 2007; Allenspach i sar., 2007; Luckschander i sar., 2006; Jergens i sar., 2003). Jedna studija je pokazala da indeksi koreliraju sa ishodom bolesti (Allenspach i sar., 2007), ali to nije potvrĊeno u drugim studijama (Jergens i sar., 2010; Munster i sar., 2010). Za sada nije utvrĊena korelacija ni CIBDAI ni CCECAI sa patohistološkim nalazom (Allenspach i sar., 2007). 28 Tabela 2. Indeks aktivnosti (CIBDAI) koji se koristi kod pasa koji boluju od IBC (Jergens, 2003) A-Ponašanje / aktivnost 0 = normalna 1 = blago smanjena 2 = srednje smanjena 3 = jako smanjena B-Apetit 0 = normalan 1 = blago smanjen 2 = srednje smanjen 3 = jako smanjen C-Povraćanje 0 = nema 1 = blago (1 epizoda nedeljno) 2 = srednje (2-3 epizode nedeljno) 3 = jako (više od 3 epizode nedeljno) D-Konzistencija stolice 0 = normalna 1 = blago mekan feces 2 = veoma mekan feces 3 = vodenast proliv E-Učestalost defekacije 0 = normalna 1 = blago povećana (2-3 puta dnevno) ili krv i / ili mukus u stolici 2 = srednje povećana (4-5 puta dnevno) 3 = jako povećana (više od 5 puta dnevno F-Gubitak teţine 0 = nema 1 = blago (manje od 5% telesne teţine) 2 = srednje (5-10% telesne teţine) 3 = jako (više od 10% telesne teţine) Procena rezultata: CIBDAI = A + B + C + D + E + F CIBDAI 0-3: nema kliniĉki znaĉaj 29 CIBDAI 4-5: blaga IBC CIBDAI 6-8: IBC srednjeg intenziteta CIBDAI 9 i više: intenzivna IBC Tabela 3. Indeks aktivnosti (CCECAI) koji se koristi kod pasa koji boluju od hroniĉne enteropatije (Allenspach, 2007) CCECAI = A + B + C + D + E + F + G + H + I G-Koncentracija serum albumina 0≥20 g/l 1 = 15-19,9 g/l 2 = 12-14,9 g/l 3<12 g/l H- Ascites i periferni edem 0 = nema 1 = blagi ascites ili periferni edem 2 = srednji ascites ili periferni edem 3 = ozbiljan ascites / pleuralna efuzija i periferni edem I- Pruritus 0 = nema 1 = poneka epozoda ĉešanja 2 = regularne epizode koje prestaju kada pas spava 3 = pas se redovno budi iz sna da bi se ĉešao Procena rezultata: CCECAI 0-3: nema kliniĉki znaĉaj CCECAI 4-5: blaga enteropatija CCECAI 6-8: enteropatija srednjeg intenziteta CCECAI 9-11: intenzivna enteropatija CCECAI 12: vrlo intenzivna enteropatija 30 Postavljanje dijagnoze IBC bi za kliniĉare trebalo da podrazumeva integraciju i kliniĉkih i patohistoloških kriterijuma. IBC nije samo mikroskopskim pregledom uoĉljiv problem (Washabau i sar., 2010). Postavljanje dijagnoze IBC vrši se putem eliminacije jer podrazumeva iskljuĉivanje svih drugih bolesti koje imaju sliĉnu simptomatologiju i, takoĊe, izazivaju gastrointestinalnu inflamaciju. Bolesti koje bi diferencijalno dijagnostiĉki došle u obzir navedene su u tabeli 4. Tabela 4. Diferencijalna dijagnoza IBC kod pasa (Lecoindre, 2006; Tams, 2003) Intolerancija na hranu, alergija na hranu Limfangiektazija Đardijaza, trihuroza Iritabilni sindrom creva Metaboliĉke bolesti, bolesti jetre Pankreatitis Intestinalni tumori (limfom, adenokarcinom, mastocitom) Tumori APUD sistema Neuromišićna obolenja Cekokoliĉna intususcepcija Sindrom bakterijskog preumnoţavanja Hiperkalcemija Dijabetska ketoacidoza 31 Kriterijumi koji moraju biti zadovoljeni da bi se postavila dijagnoza inflamatorne bolesti creva pasa (Washabau i sar., 2010) dati su u tabeli 5. Tabela 5. Kriterijumi koji moraju biti zadovoljeni da bi se postavila dijagnoza IBC  kliniĉki simptomi traju najmanje 3 nedelje ( dijareja, povraćanje)  postojanje neadekvatanog kliniĉkog odgovora na promenu ishrane (koja podrazumeva primenu hipoalergijske strogo kontrolisane dijete), na primenu antibiotika i na primenu antihelmintske terapije  iskljuĉenje metaboliĉkih poremećaja i drugih primarno gastrointestinalnih poremećaja  mikroskopskim pregledom postavljena dijagnoza na osnovu nalaza inflamatornog celularnog infiltrata  postojanje kliniĉkog odgovora na antiinflamatorne i imunosupresivne lekove Definitivna dijagnoza IBC zahteva mikroskopski pregled uzorka sluznice gastrointestinalnog sistema koji je dobijen biopsijom. Biopsijski uzorak neophodan za definitivnu dijagnozu IBC moţe se dobiti ili putem endoskopije ili hirurškim putem - laparatomijom. IzvoĊenje biopsije mukoze je jedini dijagnostiĉki postupak kojim se moţe obezbediti uzorak tkiva potreban za sigurno postavljanje dijagnoze IBD i za pruţanje informacija za prognozu i individualizaciju terapije. Endoskopija je metoda izbora pošto je minimalno invazivna (Krstić i sar., 2007), brzo se obavlja i od znaĉaja je da nije skupa. Ovom metodom moguće je dobiti veći broj uzoraka koji se mogu koristiti kako za citološka 32 i histološka ispitivanja tako i za imunohistohemijske analize. Veliĉina biopsijskih uzoraka kao i subjektivnost u interpretaciji rezultata su odluĉujući faktori pri postavljanju dijagnoze IBC. Prepoznavanje i interpretacija zapaljenjskih promena iz uzoraka dobijenih endoskopskom biopsijom mukoze gastrointestinalnog sistema, stavili su veterinarske patologe pred veliki izazov. Fundamentalna pitanja u ovom dijagnostiĉkom procesu jesu: - da li je biopsijski uzorak kvantitativno i kvalitativno odgovarajući za postavljanje dijagnoze, - šta je priroda zapaljenjske reakcije (limfocitno - plazmocitna, neutrofilna, eozinofilna, granulomatozna ili piogranulomatozna), - koje jaĉine je zapaljenjska reakcija, kao i - kada zapaljenjski odgovor moţe biti prethodnica limfoidnih neoplazmi? Kada se imaju u vidu ograniĉenja mikroskopskog istraţivanja delova tkiva obojenih hematoksilin-eozin metodom, jasno je da bolju procenu pruţa imunohistohemijski pregled dopunjen rezultatima morfometrije. Danas su na raspolaganju softveri za morfometriju koji na osnovu broja ćelija specifiĉnih fenotipova po jedinici površine u lamini propriji (lamina propria mucosae) ili u lamini epitelijalis mukoze (lamina epithelialis mucosae) mogu ustanoviti suptilne promene ćelijskog sadrţaja u tkivu (Jergens, 1996). MeĊutim, malo je verovatno da će ovako dugotrajne i skupe procedure postati rutinska kliniĉka dijagnostika. Patohitologija IBC pasa, tj. patohistološko ispitivanje radi se zbog potrebe razlikovanja normalnog od obolelog tkiva, da bi se opisala priroda i teţina promena na tkivu i da bi se obezbedila taĉna morfološka i etiološka dijagnoza, ĉime se poboljšava formulacija odgovarajuće terapije i prognoza leĉenja (Washabau i sar., 2010). Neke patohistološke dijagnoze na tkivnim uzorcima creva se relativno lako postave (napr. adenocarcinoma). Nasuprot tome, interpretacija zapaljenskih promena na sluznici creva i razlikovanje tih promena od alimentarnog limfoma, znatno je kompleksnija. Karakterizacija gastrointestinalnog zapaljenja do nedavno je bila oteţana zbog nedostatka prihvaćenih, standardnih kriterijuma za procenu histopatoloških promena u tkivnom uzorku. U toku proteklih 20 godina, više nezavisnih grupa razvilo je i primenilo sisteme klasifikacije koji definišu prirodu i teţinu gastrointestinalnih inflamatornih promena (Münster i sar., 2006; Zentek i sar., 2002; Kull i sar., 2001; Baez i sar., 1999; Jergens i sar., 33 1999; Stonehewer i sar., 1998; Yamasaki i sar., 1996; Spinato i sar., 1990; Roth i sar., 1990). U većini ovih studija, priroda gastrointestinalnih zapaljenja odreĊivana je primarno, nekada i jedino, na osnovu dominantne populacije ćelija zapaljenja (na primer: limfocita, plazma ćelija, eozinofilnih granulocita, neutrofilnih granulocita, makrofaga) u lamini propriji mukoze. U mnogo sluĉajeva morfološke i citoarhitektonske promene epitela i mukoze bile su potcenjene. Teţina gastrointestinalnog zapaljenja obiĉno je gradirana ĉetvorostepeno (normalno, blago, umereno i znaĉajno). Iako ovaj pristup izgleda logiĉan, specifiĉni kriterijumi definisani od strane razliĉitih grupa znaĉajno se razlikuju, tako da je bilo nemoguće uporediti patohistološke promene u razliĉitim studijama (zbog razliĉitih kriterijuma). Ĉak i kada su primenjeni specifiĉni kriterijumi javljaju se suštinske varijacije u patohistološkim interpretacijama promena na uzorcima tkiva. Willard i saradnici (2002) izveštavaju u svom ĉlanku o nedostatku uniformnog nalaza u 50% uzoraka dobijenih biopsijom, a ispitanih od strane pet razliĉitih patologa. Ovakve interpretativne varijacije predstavljale su problem za rutinsku dijagnozu IBC i drugih gastrointestinalnih obolenja kao i za praćenje procesa bolesti kod pacijenata koji su podvrgnuti endoskopiji nakon primenjene terapije. Štaviše, multicentriĉni dijagnostiĉki i terapeutski kliniĉki ogledi nisu bili mogući sa ovakvom varijabilnošću histopatoloških interpretacija (Washabau i sar., 2010). Zbog toga je grupa za gastrointestinalnu (GI) standardizaciju, uz podršku WSAVA (engl. World Small Animal Veterinary Association), razvila dijagnostiĉke i terapeutske standarde gastrointestinalnih bolesti kod pasa i maĉaka. WSAVA i Grupa za GI standardizaciju razvili su model u nadi da će on biti kritiĉki procenjen u profesionalnim krugovima i, nakon toga, biti prihvaćen kao meĊunarodni standard za definiciju inflamatornih promena u gastrointestinalnom sistemu pasa i maĉaka. Jedan od prvih zadataka ove grupe bio je uspostavljanje konsenzusa o normalnoj histološkoj morfologiji gastrointestinalnog sistema, sa namerom daljeg razvijanja patohistoloških standarda koji opisuju prirodu i teţinu zapaljenja sluznice creva uz prateće morfološke promene. Normalna histološka morfologija gastrointestinalnog sistema pasa moţe donekle varirati pod uticajem ţivotnog doba i zrelosti tkiva (Baum i sar., 2007; Paulsen i sar., 2003), zatim naĉina ishrane i toka leĉenja. Usled toga ceo problem se moţe smatrati priliĉno kontraverznim. Nedostatak saglasnosti o normalnoj histološkoj morfologiji bio je jedan od 34 razloga za pogrešne dijagnoze gastrointestinalnog zapaljenja kod mnogih pasa. Grupa za GI standardizaciju koristila je pristup koji se zasniva na ĉvrstim medicinskim dokazima da bi uspostavila referentne okvire za normalan histološki nalaz u gastrointestinalnom sistemu pasa i maĉaka. Sluznica duodenuma pasa je bila predmet pruĉavanja brojnih studija. Osobine sluznice duodenuma pasa su procenjivane morfometrijskim i imunohistohemijskim metodama (Janeczko i sar., 2008; Waly i sar., 2001; German i sar., 1999; Hart i sar., 1978). Normalna duţina resica kod odraslog psa iznosi 722 ± 170 µm, normalna dubina kripte iznosi 1279 ± 203 µm, a normalni odnos duţine resica prema kripti iznosi 0,68 ± 0,30 (Janeczko, 2008; Paulsen i sar., 2003; Hart i sar., 1978). Kod zdravih pasa srednji broj peharastih ćelija je 3,6 ± 3,56 po duţini od 100 vilusnih enterocita, i 9,3 ± 3,09 peharastih ćelija po 100 kriptalnih enterocita (German i sar., 1999). Intraepitelnih limfocita (IEL) u resicama kod pasa brojĉano je manje nego kod maĉaka. Taj odnos kod pasa iznosi 20,6 ± 9,5 na 100 enterocita, a kod maĉaka 47,8 ± 11,7 na 100 enterocita. Ali, broj kriptalnih IEL kod pasa (5,2 ± 2,3 na 100 enterocita), sliĉan je onom kod maĉaka (4,6 ± 1,7 na 100 enterocita) - Waly i sar., 2001. Kod pasa, ukupan broj leukocita veći je u kriptalnoj lamini propriji (156,3 ± 24,9 na 10.000 µm2 ) nego u lamini propriji na bazi resice (128,3 ± 26,6 na 10.000 µm2 ) ili u lamini propriji na vrhu resice (100,7 ± 43,89 na 10.000 µm2) - Gomez i sar., 1977. Sliĉno tome, u predelu laminae propriae kripte, kod pasa, ima više eozinofilnih granulocita (9,8 ± 7,51 na 10.000 µm2) nego u lamini propriji na bazi resice (3,7 ± 3,52 na 10.000 µm2 ) ili na vrhu resice (3,8 + 6,06 na 10.000 µm2 ) - German i sar., 1999. 35 Morfološki kriterijumi uspostavljeni su u cilju bolje procene prirode i teţine zapaljenja sluznice duodenuma. Patohistološki standardi koji opisuju prirodu i teţinu zapaljenja sluznice duodenuma, a baziraju se na morfološkim i zapaljenskim kriterijumima navedeni su u tabeli 6. Tabela 6. Morfološke i zapaljenjske promene tipiĉne za sluznicu duodenuma pasa Morfološki kriterijumi Zapaljenjski kriterijumi Promene na crevnim resicama Intraepitelni limfociti u lamini epitelijalis mukoze Oštećenje epitela Limfociti i plazma ćelije u LPM Proširenje kripti Eozinofilni granulociti u LPM Dilatacija glavnog limfnog suda - lakteala Neutrofilni granulociti u LPM Fibroza mukoze Legenda: LPM – lamina proprija mukoze (lamina propria mucosae) Day i saradnici su 2008 godine predloţili patohistološke standarde koji bi olakšali postavljanje dijagnoze IBC kod pasa u biopsijskim uzorcima creva. Posmatrane su promene na crevnim resicama, na epitelu, na kriptama, na limfnim sudovima resica (laktealima) kao i fibrozne promene na sluznici. Navedene promene su standardizovane odredjenim parametrima, a to je prikazano na sledećim tabelama: tabela 7, tabela 8, tabela 9, tabela 10 i tabela 11. 36 Tabela 7. Promene na crevnim resicama Normalna sluznica Dugaĉke, tanke, uniformne resice kada je presek longitudinalan. Procena duţine resica je moguća samo kod pravilne orjentacije uzorka tkiva dobijenog biopsijom. Blage promene na resicama Duţina resica je redukovana na 75% normalne duţine. Neke resice su povećane debljine. Nisu uniformne. Umerene promene na resicama Duţina resica je redukovana na 50% normalne duţine. Neke resice su povećane debljine, a neke su se spojile meĊusobno (fuzionisale su se). Znaĉajne promene na resicama Duţina resica je redukovana na < 25% normalne duţine. Intenzivno fuzionisanje resica. Površina sluznice moţe u teškim sluĉajevima biti sravnjena. Tabela 8. Promene na epitelu Normalna sluznica Jednoslojan cilindriĉan epitel. Kod pasa normalan broj peharastih ćelija je u proseku 3 na 100 enterocita. Blago oštećenje epitela ProreĊenost ćelija, degeneracija, vakuolizacija u fokalnim ţarištima površinskog epitela. Umereno oštećenje epitela Uoĉljivije degenerativne promene sa fokalnim gubitkom epitela. Znaĉajno oštećenje epitela Raširene ulceracije epitela. 37 Tabela 9. Promene na kriptama Normalna sluznica Uniformne, uzane kripte orjentisane perpendikularno na površinu. Cilindriĉan epitel sa ponekom peharastom ćelijom (kod psa otprilike 9 na 100 enterocita). Dilatacija kripti je u granicama normale. Blago proširenje kripti Preko 10% kripti na preseku je prošireno, nepravilnog oblika ili sadrţi u lumenu eozinifilni materijal ili degenerisane neutrofilne granulocite (ova pojava se oznaĉava kao apsces kripte). Umereno proširenje kripti Preko 25% kripti na preseku je prošireno, iskrivljeno ili su prisutni apscesi. Znaĉajno proširenje kripti Preko 50% kripti na preseku je prošireno, iskrivljeno ili su prisutni apscesi. Tabela 10. Promene na limfnim sudovima resica – laktealima Normalna sluznica Centralni lakteal, zahvata oko 25% laminae propriae crevne resice po širini, na uzduţnom preseku. Blaga laktealna dilatacija Centralni lakteal je proširen, zahvata oko 50% laminae propriae crevne resice po širini, na uzduţnom preseku. Resice uglavnom šire nego normalno. Umerena laktealna dilatacija Centralni lakteal je proširen, zahvata oko 75% laminae propriae crevne resice po širini, na uzduţnom preseku. Resice uglavnom šire nego normalno. Znaĉajna laktealna dilatacija Centralni lakteal je znaĉajno uvećan i zahvata skoro 100% laminae propriae resice. Preostala lamina propria, gde se uoĉava, je edematozna. Resice su znaĉajno proširene, posebno na vrhovima, dajući vrećast izgled. 38 Tabela 11. Fibrozne promene na sluznici Normalna sluznica Uzane trake strome, od 1 do 2 fibroblasta u širinu, razdvajaju kripte. Blaga fibroza sluznice Kripte razdvojene trakama strome, do 5 fibroblasta u širinu. Umerena fibroza sluznice Kripte razdvojene trakama strome, do 10 fibroblasta u širinu. Kripte variraju u širini, neke su atrofiĉne. Znaĉajna fibroza sluznice Kripte razdvaja matriks kolagena, > 10 fibroblasta u širinu. Kripte mogu biti atrofiĉne ili potpuno nestale i zamenjene fibrotiĉnim matriksom. Kriterijumi za procenu inflamacije uspostavljeni su u cilju boljeg razumevanja stepena oštećenja zida duodenuma. Day i saradnici su 2008 godine prouĉavali zastupljenost: intraepitelnih limfocita u lamini epitelijalis mukoze (lamina epithelialis mucosae) crevnih resica, limfocita i plazma ćelija u lamini propriji mukoze (lamina propria mucosae), eozinofilnih granulocita u lamini propriji mukoze (lamina propria mucosae) kao i neutrofilnih granulocita u lamini propriji mukoze (lamina propria mucosae). Isti autori su predloţili patohistološke standarde, a koji su prikazani na sledecim tabelama: tabela 12, tabela 13, tabela 14 i tabela 15. 39 Tabela 12. Prisustvo intraepitelnih limfocita - IEL u epitelu crevnih resica Normalna sluznica Normalan broj IELje oko 5-10 IEL, na posmatranim poljima uniformne veliĉine na epitelu crevnih resica. Blag porast u broju intraepitelnih limfocita Blagi porast u broju na 20-30 IEL na posmatranim poljima uniformne veliĉine na epitelu crevnih resica. Uglavnom se uoĉavaju individualne ćelije. Umeren porast u broju intraepitelnih limfocita Otprilike 30-50 IEL na posmatranim poljima uniformne veliĉine na epitelu crevnih resica. Ćelije se mogu naći i fokalno u grupama. Znaĉajan porast u broju intraepitelnih limfocita Oko 50-100 IEL na posmatranim poljima uniformne veliĉine na epitelu crevnih resica. Ćelije se nalaze u grupama (grozdovima). Tabela 13. Prisustvo limfocita i plazma ćelija u lamini propriji (lamina propria mucosae) Normalna sluznica U LPM resice oko 25% podruĉja u posmatranim poljima moţe biti zauzeto limfocitima i plazma ćelijama. IzmeĊu kripti se mogu naći 1-2 limfocita i plazma ćelije. Blag porast broja limfocita i plazma ćelija u LPM Limfociti i plazma ćelije mogu da okupiraju 25-50% podruĉja lamine proprije resice u posmatranim poljima. Kripte mogu biti razdvojene sa do 5 limfocita i plazma ćelija. Umeren porast broja limfocita i plazma ćelija u LPM Limfociti i plazma ćelije mogu da okupiraju 50-75% podruĉja lamine proprije resice u posmatranim poljima. Kripte mogu biti razdvojene sa do 10 limfocita i plazma ćelija. Znaĉajan porast broja limfocita i plazma ćelija u LPM Limfociti i plazma ćelije mogu da okupiraju 75-100% podruĉja lamine proprije resice u posmatranim poljima. Kripte mogu biti razdvojene sa do 20 limfocita i plazma ćelija. Legenda: LPM – lamina proprija mukoze (lamina propria mucosae) 40 Tabela 14. Prisustvo eozinofilnih granulocita u u lamini propriji (lamina propria mucosae) Normalna sluznica Normalan broj eozinofilnih granulocita je oko 2-3 ćelije u posmatranim poljima. Eozonofilni granulociti mogu biti brojniji kod mladih ţivotinja. Blag porast broja eozinofilnih granulocita u LPM Blago povećanje broja eozonofilnih granulocita je do oko 5-10 ćelija u posmatranim poljima. Mononuklearne ćelije su dominantna populacija ćelija. Umeren porast broja eozinofilnih granulocita u LPM Umereno povećanje broja eozonofilnih granulocita do oko 10-20 u posmatranim poljima. Mononuklearne ćelije ipak dominiraju u tkivnoj populaciji leukocita ili im broj moţe biti sliĉan. Znaĉajan porast broja eozinofilnih granulocita u LPM Eozonofilni granulociti dominiraju u tkivnoj populaciji leukocita. Legenda: LPM – lamina proprija mukoze (lamina propria mucosae) Tabela 15. Prisustvo neutrofilnih granulocita u u lamini propriji (lamina propria mucosae) Normalna sluznica Neutrofilni granulociti nisu prisutni. Blago povećanje broja neutrofilnih granulocita u LPM Blagi infiltrat (5-10 neutrofilnih granulocita po vidnom polju) u lamini propriji. Mononuklearne ćelije dominaniraju. Umereno povećanje broja neutrofilnih granulocita u LPM Blagi infiltrat (20-30 neutrofilnih granulocita po vidnom polju) u lamini propriji gde mogu da im se pridruţe makrofagi. Neutrofilni granulociti i mononuklearne ćelije prisutne u istom broju. Znaĉajno povećanje broja neutrofilnih granulocita u LPM Neutrofilni granulociti su dominantna populacija u vidnom polju i nije ih lako izbrojati. Mogu im se pridruţiti makrofagi. Legenda: LPM – lamina proprija mukoze (lamina propria mucosae) 41 Na tabelama, i to od tabele 7 do tabele 15, sve promene su definisane na nivou uvećanja mikroskopom od 40 puta. Korišćeno je prosto numeriĉko oznaĉavanje stepena patohistoloških promena gde je normalno = 0; blago = 1; umereno = 2; znaĉajno = 3. Na ovaj naĉin je omogućeno dobijanje opšteg histološkog rezultata za tkivo od interesa. 42 3. CILJEVI I ZADACI Cilj ove disertacije je ispitivanje i korelacija kliniĉkih manifestacija, morfoloških i imunofenotipskih karakteristika limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa. U cilju izuĉavanja kliniĉkih manifestacija, postavljeni su sledeći zadaci:  Ispitivanje vrednosti kliniĉkih, hematoloških i biohemijskih parametara koji omogućavaju izraĉunavanje vrednosti kliniĉkih indeksa: CIBDAI i CCECAI  Radiološka i ultrazvuĉna dijagnostika  Endoskopska ispitivanja duodenuma i izvoĊenje endoskopske biopsije U cilju razjašnjenja morfogeneze limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa, postavljeni su sledeći zadaci:  Patohistološka ispitivanja tkivnih uzoraka duodenuma uzetih endoskopskom biopsijom  OdreĊivanje distribucije CD3+ (T) i CD79+ (B) limfocita u sluznici duodenuma pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa  Statistiĉka korelacija kliniĉkih i morfoloških manifestacija bolesti 43 4. MATERIJAL I METODE 4.1. MATERIJAL Ispitivanja su obuhvatila 54 obolela psa, oba pola, uzrasta od 5 meseci do 14 godina, razliĉitih rasa, koji su bili pacijenti ambulantne klinike Fakulteta veterinarske medicine (FVM). U ispitivanje je ukljuĉeno i 6 zdravih pasa koji su sluţili kao kontrola. Prema anamnestiĉkim podacima, svi oboleli psi su duţe od tri nedelje ispoljavali simptome dijareje i/ili povraćanja, neuspešno su leĉeni antibioticima i bili su slobodni od crevnih parazita. Nakon kliniĉkog pregleda ţivotinje, uzorkovanja krvi za hematološke i biohemijske analize, uzorkovanja fecesa za koprološko ispitivanje, raĊen je ultrazvuĉni pregled ţivotinje, radiološka ispitivanja digestivnog sistema, kao i endoskopski pregled tokom koga su uzimani uzorci tkiva zida duodenuma endoskopski voĊenom biopsijom. Uzorci krvi i fecesa za hematološka, biohemijska i koprološka ispitivanja slati su odmah u laboratoriju klinike FVM. Biopsijski uzorci duodenuma (8 – 10 uzoraka po ţivotinji) odlagani su u boĉice sa 10% formalinom i tako prosleĊivani u laboratoriju za patologiju FVM. 4.2. METODE Materijal je obraĊen odgovarajućim metodama u okviru:  Kliniĉke dijagnostke  Hematoloških ispitivanja  Biohemijskih ispitivanja  Koprološkog ispitivanja  Ultrazvuĉne dijagnostike 44  Radiološkog ispitivanja  Endoskopskog ispitivanja uz izvoĊenje endoskopske biopsije  Patohistoloških ispitivanja  Imunohistohemijskih ispitivanja  Statistiĉke analize KLINIĈKA ISPITIVANJA. Korišćeni su metodi adspekcije, palpacije, auskultacije i termometriranje. Habitus ţivotinje je konstatovan korišćenjem metode adspekcije. Trijas (pokazatelj vitalnih funkcija organizma) je odreĊivan korišćenjem svih navedenih metoda. Termometriranjem je konstatovana telesna temperatura ţivotinja. HEMATOLOŠKA ISPITIVANJA. Nakon pripreme koţe, uzorkovanje krvi vršeno je iz cefaliĉne (vena cephalica) ili jugularne vene (vena jugularis) u vacutainer posude sa antikoagulansom (EDTA). Hematološke analize uraĊene su uz pomoć automatskog hematološkog analizatora (Abacus Junior Vet Hematology Analyzer SN130612, Hungary) u modu predviĊenom za pse. BIOHEMIJSKA ISPITIVANJA. Krv namenjena za biohemijska ispitivanja, takoĊe, je uzorkovana iz cefaliĉne (vena cephalica) ili jugularne vene (vena jugularis) u vacutainer posude bez antikoagulansa. Nakon koagulisanja krvi, izvršeno je centrifugovanje i izdvajanje seruma, u kome su uz pomoć poluautomatskog biohemijskog spektrofotometra (Vet evolution - Biochemical System International VT00300, Italy) odreĊeni sledeći parametri: aspartat aminotransferaza (AST), alanin transaminaza (ALT), alkalna fosfataza (AP), ukupni proteini i albumini. KOPROLOŠKA ISPITIVANJA - KOPROSKOPIJA. Izmet namenjen kako makroskopskom tako i mikroskopskom pregledu, sakupljan je 72 sata i drţan u friţideru do ispitivanja. 45 Makroskopski su posmatrani: konzistencija, boja, miris fecesa kao i prisustvo stranih primesa - krvi, sluzi, gnoja, ĉitavih helminata ili njihovih delova. Mikroskopska ispitivanja bazirala su se na kvalitativnoj metodi flotacije. Flotacijom, rastvorima velike gustine, postiţe se izdvajanje parazitskih elemenata iz izmeta i njihovo koncentrisanje u veoma maloj zapremini. Kao rastvori za flotaciju u rutinskoj dijagnostici koriste se zasićeni vodeni rastvor natrijum-hlorida i zasićeni vodeni rastvor cink-sulfata. Prvi rastvor je manje gustine (1180 – 1200 g/l) i u stanju je da isflotira tzv. laka jaja helminata i većinu oocista kokcidija. Rastvor cink-sulfata (gustina 1400 g/l) primenjuje se za flotiranje tzv. teških jaja helminata. Jaja parazita Toxocara canis spadaju u laka jaja. Jaja parazita Trichuris vulpis spadaju u teška jaja. Za izvoĊenje metode flotacije koristi se sledeći pribor: rastvor za flotaciju, posude za rastvaranje izmeta, cediljka, epruvete sa stalkom, predmetnice i pokrovnice. Postupak rada je sledeći: 5 – 10 g izmeta se isitni i homogenizuje u rastvoru za flotaciju, procedi kroz cediljku i sadrţaj prespe u epruvete, formira se konveksan nivo teĉnosti tako da pokrovnica koja se odmah postavi u potpunosti naleţe na površinu suspenzije. Po isteku 20 – 30 minuta oĉitavaju se rezultati. „SensPERT Giardia Test Kit“ (IDEXX laboratories, USA), funkcioniše na principima imunohromatografije, a namenjen je za detektovanje antigena Giardia lamblia u fecesu. Dva antitela (At) u kitu se specifiĉno vezuju za razliĉite epitope antigena (Ag) Giardia lamblia. Pošto celulozna podloga upije antigene Giardia lamblia, oni migriraju dok se ne veţu za antitelo koje se već nalazi u podlozi te tako nastaje kompleks antitelo – antigen (At - Ag). Za taj kompleks se sada vezuje drugo antitelo iz podloge formirajući sendviĉ At - Ag - At što se moţe oĉitati kao crtica na podlozi od celuloze na kojoj se izvodi test. ULTRAZVUĈNA ISPITIVANJA. Za ultrazvuĉni pregled korišćen je ultrazvuĉni aparat ALOCA 2000 i sonda od 5MHz. Da bi se izveo ultrazvuĉni pregled, neophodna je prethodna priprema pacijenta koja podrazumeva uskraćivanje hrane od 12 do 24 sata pre pregleda. Pas se postavlja u leĊni poloţaj sa maksimalno ispruţenim zadnjim ekstremitetima. Polje pregleda je prethodno 46 pripremljeno brijanjem dlake. Po stavljanju gela na pripremljeno polje moţe se pristupiti ultrazvuĉnom pregledu. RADIOLOŠKA ISPITIVANJA. Za radiološki pregled je korišćen aparat SELENOS 4, EI Niš. Radiološka ispitivanja su ukljuĉila nativni rendgenski pregled abdomena i specijalni rendgenski pregled duodenuma sa pozitivnim kontrastnim sredstvom (60% vodena suspenzija barijum-sulfata). Priprema pacijenta za pregled se sastojala u jednodnevnom gladovanju, bez ograniĉavanja unošenja teĉnosti. Aplikovana je klizma od 2 do 4 ĉasa pre pregleda, u cilju evakuacije crevnog sadrţaja. Aplikacija pozitivnog kontrasta se moţe izvršiti ako je, neposredno pre aplikacije kontrasta, ţivotinji stavljen u usta „drveni zalogaj“. „Drveni zalogaj“ se fiksira za donju i gornju vilicu, a prilagoĊen je izgledu tvrdog nepca i veliĉini usne duplje pacijenta. Kroz fiksirani „zalogaj“ se plasira gumena sonda u visini farinksa. Pomeranjem sonde napred - nazad, nadraţi se sluzokoţa, što dovodi do akta gutanja i prolaska sonde u jednjak. Sonda se zatim lagano potisne u ţeludac. Po izvršenoj kontroli da li je sonda u ţelucu, tj.da nije eventualno u traheji, lagano se aplicira kontrastno mleko. Koliĉina aplicirane kaše barijum - sulfata iznosi 6 - 10 ml/kg telesne mase. Aplikacija se vrši pomoću brizgalice koja je fiksirana za kraj sonde u porcijama 10 - 20 ml. Po završenoj aplikaciji, sonda se izvlaĉi iz jednjaka, skida se „zalogaj“ i nastavlja pregled. Tehniĉki uslovi za rendgenografiju podrazumevaju taĉno odreĊenu kondiciju za snimanje i definisane projekcije u kojima se snimanje vrši. Kondicije za snimanje (KV i mAs) su prilikom snimanja bile prilagoĊene veliĉini svake ţivotinje. Projekcije za snimanje su standardna LL (latero – lateralna) i VD (ventro – dorzalna) projekcija. Koristili smo sledeći vremenski program :  Prvi rendgenogram – nativni snimak, tj. pre davanja kontrasta  Drugi rendgenogram – neposredno po aplikaciji kontrasta  Treći rendgenogram – 1 sat posle aplikacije kontrasta  Ĉetvrti rendgenogram – 3 - 4 sata posle aplikacije kontrasta 47  Peti rendgenogram – 5 - 6 sati posle aplikacije kontrasta  Šesti rendgenogram – 24 sata posle aplikacije kontrasta Ovaj vremenski program rendgenografije predstavlja naĉelnu šemu za snimanje kod pregleda digestivnog sistema pasa kao i drugih domaćih karnivora. Nije uvek potrebno da se naĉini svih šest rendgenograma. ENDOSKOPSKA ISPITIVANJA. Za endoskopski pregled korišćen je endoskop sa video kamerom STORC, koji se sastoji od endoskopa (preĉnika 9 mm), radnog kanala (preĉnika 2,2 mm i duţine 140 cm) i izvora svetla. Za izvoĊenje endoskopske biopsije je korišćen biopser „aligator“. Pre ovog zahvata obavezna je priprema pacijenta koja podrazumeva uskraćivanje hrane u periodu od 12 do 24 sata pre pregleda, kao i uskraćivanje vode 4 sata pre pregleda. Endoskopski pregled se izvodi u opštoj inhalacionoj anesteziji. Premedikacija se postiţe intravenskom (i.v.) aplikacijom diazepama (u dozi od 0,5 mg/kg) ili i.v. aplikacijom kombinacije midazolama (u dozi od 0,4 mg/kg) i butorfanola (u dozi od 0,2 mg/kg). Indukcija se vrši i.v. aplikacijom propofola (u dozi od 4 mg/kg), a nakon intubacije odrţavanje opšte inhalacione anestezije se sprovodi izofluranom (u koncentraciji od 1,5% do 2%). Nakon uvoĊenja u anesteziju, ţivotinja se postavlja u levi boĉni poloţaj, postavlja se otvaraĉ za usta i pristupa se pregledu. Glava i vrat pacijenta su maksimalno ispruţeni, endoskop je usmeren centralno kroz orofarinks i ide dorzalno do larinksa tako da se dobro uoĉava kranijalni ezofagealni sfinkter. Ovaj sfinkter predstavlja ulaz u ezofagus, normalno je zatvoren i vidi se kao naborana mukoza zvezdastog oblika. Insuflacijom vazduha i blagim pritiskom vrha endoskopa na kranijalni ezofagealni sfinkter, vrh endoskopa lako napreduje u vratni deo jednjaka. Po pregledu jednjaka i ţeluca, endoskop se uvodi u duodenum. Da bi se ušlo u duodenum, vrh endoskopa treba dovesti do pilorusa. Pilorus se otvara lakim pritiskom endoskopa uz povremenu insuflaciju vazduha i/ili ispiranje vodom, što olakšava prolaz endoskopa u duodenum. Vrh endoskopa obiĉno izaziva prolazno „crvenilo“ zida pilorusa ili duodenuma pri prolasku kroz njih. Da bi se video lumen duodenuma, insuflira se mala koliĉina vazduha i vrh endoskopa se povuĉe za nekoliko 48 milimetara unazad. Sluznica duodenuma tada postaje lako vidljiva pri ĉemu intestinalne resice dobijaju izgled somota. Svetlost sa vrha endoskopa odbija se od vrhova resica, ĉesto dajući odsjaj. Pod blagim pritiskom, vrh endoskopa prolazi kroz lumen duodenuma koliko je god moguće, uz minimalnu insuflaciju vazduha. Normalna peristaltika tankih creva obiĉno olakšava dalji prolaz vrha endoskopa, a ĉesto je potrebno 2 - 3 minuta da bi endoskop stigao na ţeljeno mesto. Ponekad endoskop zastane dok prolazi iz proksimalnog duodenalnog segmenta u descendentni deo duodenuma. Tkivni uzorci sluznice duodenuma uzimaju se endoskopski voĊenom biopsijom. Mukoza tankih creva nije kompaktna, te se uzorci uzimaju forcepsom koji na vrhu ima šolje. Koristi se tehnika biopsije koja se vrši tako što se šolje forcepsa mogu otvoriti ĉim proĊu vrh endoskopa. Forceps se gura napred dok se ne naiĊe na otpor. Krvarenja su obiĉno minimalna. Biopsijski uzorci se, u odnosu na kvalitet uzorka, mogu klasifikovati na adekvatne, marginalne i neadekvatne. Biopsijom je uzimano 8 - 10 uzoraka tkiva od svakog psa. Uzorci tkiva su paţljivo skidani sa biopsijskog forcepsa i pripremani na naĉin kojim se izbegavaju artefakti. Uzorak je skidan sa forcepsa korišćenjem hipodermalne igle, pri ĉemu se vodilo raĉuna da se ne stvori artefakt istezanjem ili kidanjem mukoze. Uzorci su fiksirani u puferisanom formalinu. PATOHISTOLOŠKA ISPITIVANJA. Uzorci duodenuma (8 - 10 tkivnih iseĉaka od svakog psa) koji su dobijeni endoskopskom biopsijom, a odreĊeni za patohistološka i imunohistohemijska ispitivanja, fiksirani su u 10% neutralnom formalinu u trajanju od 48 sati do 72 sata. Posle fiksiranja tkivo je procesovano u automatskom tkivnom procesoru (dehidratacija kroz seriju alkohola, prosvetljavanje u ksilolu, impregnacija parafinom) i zatim uklopljeno u parafinske blokove sa mreţicom za biopsijske uzorke. Parafinski iseĉci debljine od 3 μm do 5 μm bojeni su rutinskom hematoksilin - eozin (HE) metodom. Patohistološka ispitivanja su ukljuĉila detaljan opis morfoloških promena na biopsiranim uzorcima sluznice duodenuma (promene na crevnim resicama, stepen oštećenja crevnog epitela, postojanje proširenja kripti, prisustvo dilatiranih limfnih sudova i fibroze) 49 kao i praćenje zastupljenosti intraepitelnih limfocita (IEL), limfocita, plazma ćelija, eozinofilnih granulocita i neutrofilnih granulocita u infiltratu sluznice. IMUNOHISTOHEMIJSKA ISPITIVANJA. Imunohistohemijska ispitivanja su vršena na parafinskim iseĉcima zida duodenuma, prethodno fiksiranim u formalinu. Korišćena je streptavidin - biotin imunohistohemijska metoda (LSAB2) u cilju izuĉavanja ekspresije ćelija pozitivnih na CD3+ (T limfocita) i CD79+ (B limfocita). Podaci o razreĊenju primarnih antitela, inkubaciji i metodi demaskiranja antigena prikazani su u tabeli 16. Tabela 16. Primarna antitela korišćena za imunohistohemijske analize Primarno antitelo RazreĊenje Inkubacija Demaskiranje antigena Monoclonal rabbit - antihuman CD3 (DAKO A 0452) 1:50 60 minuta/18 C Citratni pufer pH = 6 560W/21minut Monoclonal mouse - antihuman CD79 (DAKO M 7051) 1:50 60 minuta/18 C Citratni pufer pH = 6 560W/21minut U deparafinisanim i prosvetljenim tkivnim iseĉcima je najpre izvršeno demaskiranje antigena, maskiranih fiksiranjem u formalinu. Demaskiranje CD3 i CD79 antigena vršeno je zagrevanjem u mikrotalasnoj peći na 560W u trajanju od 21 minut, u citratnom puferu pH = 6. Endogena peroksidaza blokirana je u 0,3% H2O2 u metanolu, na temperaturi od 18 0 C u trajanju od 15 minuta. Sva ispiranja i razblaţenja tokom reakcije raĊena su u PBS-u pH = 7,2 - 7,4. Preinkubacija je vršena u 10% normalnom kozjem serumu u PBS-u, u trajanju od 20 minuta. Odmah zatim iseĉci su inkubirani primarnim antitelima i 50 odgovarajućim kitom za vizuelizaciju. Za detekciju je korišćen kit: DAKO Cytomation LSAB2 System-HRP (DAKO, K 0675). Antigen - antitelo kompleks koji je nastao u tkivu postao je vidljiv primenom hromogena diaminobenzidina (DAB+, Dako, K3468) u trajanju od 10 do 15 minuta. Na mestu pozitivne reakcije javlja se precipitat smeĊe boje. Kontrastiranje iseĉaka izvršeno je u hematoksilinu (Mayer-ov hematoksilin) u trajanju od nekoliko sekundi. Nakon bojenja iseĉci su montirani pomoću vodenog medijuma za montiranje Glycergel (Dako, C563). Kao negativna kontrola korišćeni su istovetni tkivni iseĉci koji nisu tretirani primarnim antitelima. Kao pozitivna kontrola korišćeni su tkivni iseĉci kod kojih je prethodno imunohistohemijski potvrĊeno prisustvo ispitivanih antigena. STATISTIĈKA ANALIZA. U statistiĉkoj analizi dobijenih rezultata izvedenog istraţivanja kao osnovne statistiĉke metode koristili smo deskriptivne statistiĉke parametre. Ovi parametri su nam omogućili opisivanje dobijenih rezultata i njihovo tumaĉenje. Od deskriptivnih statistiĉkih parametara koristili smo: aritmetiĉku sredinu, standardnu devijaciju, standardnu grešku, interval varijacije i koeficijent varijacije. Prilikom testiranja i utvrĊivanja statistiĉki znaĉajnih razlika izmeĊu ispitivanih grupa koristili smo dva testa. Prvi test koji smo korisrili, potpuno sluĉajan plan (ANOVA), je grupni test i na osnovu njega smo ustanovljavali postojanje signifikantnih razlika izmeĊu posmatranih grupa ukupno. Drugi test koji je korišćen je pojedinaĉni, Tukey test ili t-test, pomoću kojih su ustanovljavane statistiĉki signifikantne razlike izmeĊu grupa pojedinaĉno. Signifikantnost razlika ustanovljavana je na nivoima znaĉajnosti od 5% i od 1%. Svi dobijeni rezultati prikazani su tabelarno i grafiĉki. Statistiĉka analiza dobijenih rezultata uraĊena je u statistiĉkom paketu PrismaPad 4.00. 51 5. REZULTATI ISTRAŢIVANJA 5.1. KLINIČKI NALAZ OPŠTI PREGLED Anamneza Uzeta je anamneza za svakog od 54 obolela psa. Ovako dobijeni podaci bili su iskorišćeni za izraĉunavanje kliniĉkih indeksa CIBDAI i CCECAI. Podaci su navedeni u tabelama 17, 18, 19 i 20. Tabela 17. Podaci dobijeni anamnezom potrebni za izraĉunavanje indeksa CIBDAI Anamnestiĉki podaci Skala promena Broj ţivotinja A Ponašanje 0 4 1 33 2 17 3 0 B Apetit 0 4 1 36 2 14 3 0 Anamnestiĉki podaci Skala promena Broj ţivotinja C Povraćanje 0 19 1 35 2 0 3 0 D Konzistencija stolice 0 0 1 41 2 13 3 0 52 Anamnestiĉki podaci Skala promena Broj ţivotinja E Uĉestalost defekacije 0 4 1 24 2 26 3 0 Anamnestiĉki podaci Skala promena Broj F Gubitak teţine 0 3 1 36 2 15 3 0 Tabela 18. Izraĉunate vrednosti indeksa CIBDAI Vrednost indeksa CIBDAI Broj pasa 0 - 3 3 4 - 5 11 6 - 8 29 ≥ 9 11 Za izraĉunavanje indeksa CCECAI, osim anamnestiĉkih podataka navedenih u tabeli 17, korišćeni su i anamnestiĉki podaci navedeni u tabeli 19, kao i rezultati biohemijske analize krvi (koncentracija serumskih albumina) koji su navedeni u tabeli 22. 53 Tabela 19. Dodatni anamnestiĉki podaci potrebni za izraĉunavanje indeksa CCECAI Anamnestiĉki podaci Skala promena Broj ţivotinja G Koncentracija serumskih albumina 0 49 1 5 2 0 3 0 H Ascites i periferni edemi 0 54 1 0 2 0 3 0 I Pruritus 0 51 1 3 2 0 3 0 Pošto je CCECAI izraĉunat kao zbir, tj. CCECAI = A + B + C + D + E + F + G + H + I, uoĉava se da se vrednost CCECAI poklapa sa vrednošću CIBDAI, kod svih osim kod 8 pasa. Od toga, kod 5 pasa je koncentracija serum albumina izmeĊu 15 g/l i 19,9 g/l, te im je vrednost parametra G jednaka jedinici. Kod 3 psa je uoĉena poneka epizoda ĉešanja te im je vrednost parametra I jednaka jedinici. Takav rezultat i kod ovih osam pasa dovodi do uvećanja njihovog indeksa CCECAI za 1 poen. 54 Tabela 20. Izraĉunate vrednosti indeksa CCECAI Vrednost indeksa CCECAI Broj pasa 0 - 3 3 4 - 5 9 6 - 8 31 9 - 11 10 ≥ 12 1 Habitus Kliniĉkim pregledom je ustanovljena loša kondicija pasa kao i stanje loše uhranjenosti. Kod 51 od 54 ispitivana psa, konstatovan je gubitak teţine (tabela 17). Konstitucija, telesna graĊa i poloţaj tela u prostoru su bez osobenosti. Temperament je izmenjen kod 50 od 54 ţivotinja što je prikazano u tabeli 17. Trijas Trijas je odreĊen na osnovu vrednosti za telesnu temperaturu, puls i disanje. Trijas je bio u granicama normale kod svih ţivotinja. SPECIJALNI PREGLED Nakon opšteg pregleda ţivotinje, pristupilo se specijalnom pregledu, odnosno detaljnom ispitivanju pojedinih organa i organskih sistema. Pri pregledu koţe i dlaĉnog pokrivaĉa uoĉena su odreĊena odstupanja. Kod 47 pasa uoĉena je promena u elastiĉnosti koţe (proba se izvodi na leĊima) i procenjena je dehidratacija od 5% do 10%. Pri pregledu dlaĉnog pokrivaĉa kod 48 pasa ustanovljeno je lakše ĉupanje dlake. Pri pregledu ostalih organa i organskih sistema nisu uoĉene promene. 55 5.2. HEMATOLOŠKI NALAZ Vrednosti hematoloških parametara kod ispitivanih pasa, kao i referentne vrednosti za zdrave pse prikazani su u tabeli 21. Tabela 21. Vrednosti hematoloških parametara kod ispitivanih pasa kao i referentne vrednosti za zdrave pse Psi su, radi bolje preglednosti, razvrstani na osnovu kasnije postavljene patohistološke dijagnoze. Za prva 3 psa (sa brojevima 1-3) postavljena je dijagnoza eozinofilnog duodenitisa, za narednih 46 je postavljena dijagnoza limfocitno - plazmocitnog duodenitisa (od toga kod 2 psa sa rednim brojevima 4 i 5 dominiraju plazma ćelije, kod pasa sa brojevima od 6 do 36 dominiraju limfociti, kod 13 pasa obeleţenih brojevima od 37 do 49 uoĉen je mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat), dok je kod 5 pasa sa brojevima od 50 do 54, postavljena dijagnoza kataralnog duodenitisa. Šest pasa sa brojevima od 55 do 60 predstavljaju kontrolnu grupu. Leukociti x 10 9 /l Limfociti x 10 9 /l Eozinofili % Eritrociti x 10 12 /l Referentne vrednosti 6-17 1-4,8 0-2 5,5-8,5 Pas 1 10,95 2,9 3,5 6,62 2 16,81 4,1 4,9 6,85 3 12,02 3,8 4,2 5,98 4 17,10 5,2 2,2 6,23 5 18,95 5,6 2,1 6,12 6 17,95 5,4 0,1 7,59 7 17,98 5,5 0,3 7,20 8 19,75 5,9 0,2 6,90 9 20,12 7,2 0,2 6,79 10 18,72 6,1 0,1 6,95 11 18,95 6,2 0,1 6,02 56 12 19,02 7,1 0,9 6,75 13 17,68 5,3 0,5 7,20 14 19,21 6,1 0,2 7,15 15 18,05 6,0 0,1 7,12 16 19,63 6,9 0,5 6,73 17 19,82 6,9 0,7 6,09 18 18,51 6,5 0.2 7,90 19 20,02 7,5 0,3 7,15 20 19,03 7,1 0,1 7,70 21 19,59 6,9 0,1 6,72 22 18,95 6,1 0,5 6,49 23 18,35 7,5 0,5 6,98 24 18,21 6,9 0,1 7,02 25 17,95 7,2 0,3 7,65 26 19,97 7,3 0,2 7,01 27 19,64 7,2 0,1 6,20 28 18,95 6,8 0,2 6,63 29 18,75 6,6 0,4 6,72 30 17,52 4,9 0,1 7,18 31 18,12 5,4 0,5 6,95 32 18,53 5,5 0,3 7,74 33 18,02 5,3 0,2 7,95 34 18,21 5,9 0,1 8,05 35 19,50 6,8 1,2 6,96 36 20,72 7,1 1,5 5,65 37 21,65 8,5 0,1 5,70 38 22,05 9,1 0,9 6,12 39 19,73 6,8 0,1 6,05 40 23,05 8,1 0,2 5,95 41 21,92 6,8 0,5 6,28 42 19,01 6,9 0,1 6,33 43 22,12 6,7 0,5 5,92 44 21,15 8,1 0,6 5,80 45 18,03 6,9 0,1 5,75 57 46 21,12 7,8 0,7 6,51 47 20,25 6,9 0,2 7,21 48 17,95 5,8 0,3 6,98 49 19,25 7,8 0,2 6,12 50 16,90 4,5 0,1 7,29 51 17,95 3,9 0,2 8,10 52 18,12 4,2 0,1 7,65 53 18,15 4,9 0,1 7,35 54 19,02 3,8 0,1 6,08 55 9,05 3,5 0,2 6,95 56 12,01 2,7 0,4 7,67 57 6,52 4,7 0,2 5,70 58 18,12 2,5 1,1 8,20 59 10,70 1,5 0,5 7,53 60 12,98 4,0 0,2 6,82 5.3. BIOHEMIJSKI NALAZ Rezultati biohemijskih analiza prikazani su u tabeli 22. Tabela 22. Rezultati biohemijske analize krvi ispitivanih pasa, kao i referentne vrednosti za zdrave pse Psi su, radi bolje preglednosti, razvrstani na osnovu kasnije postavljene patohistološke dijagnoze. Za prva 3 psa (sa brojevima 1-3) postavljena je dijagnoza eozinofilnog duodenitisa, za narednih 46 je postavljena dijagnoza limfocitno - plazmocitnog duodenitisa (od toga kod 2 psa sa rednim brojevima 4 i 5 dominiraju plazma ćelije, kod pasa sa brojevima od 6 do 36 dominiraju limfociti, kod 13 pasa obeleţenih brojevima od 37 do 49 uoĉen je mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat), dok je kod 5 pasa sa brojevima od 50 do 54, postavljena dijagnoza kataralnog duodenitisa. Šest pasa sa brojevima od 55 do 60 predstavljaju kontrolnu grupu. 58 ALT AST AP Ukupni proteini Albumini Referentne vrednosti 10-50 U/L 10-58 U/L do190 U/L 50-80 g/L 28-40 g//L 1 38 18 90 55 35 2 12 26 78 55 32 3 25 47 85 53 32 4 42 50 146 52 29 5 49 55 164 53 29 6 39 49 50 50 29 7 16 27 83 51 29 8 27 21 25 47 26 9 38 40 158 39 19 10 48 50 91 45 26 11 37 36 95 46 26 12 23 30 109 45 26 13 12 21 99 52 29 14 21 15 41 51 27 15 29 31 23 51 30 16 34 20 25 51 27 17 42 45 115 45 25 18 25 29 150 50 29 19 38 40 132 45 24 20 15 20 90 42 25 21 18 21 89 42 25 22 26 24 70 45 26 23 42 49 56 40 26 24 36 45 120 39 25 59 25 12 21 96 41 27 26 45 30 112 39 23 27 38 41 65 40 25 28 27 29 48 41 25 29 22 29 93 48 27 30 35 41 132 53 30 31 39 38 21 45 27 32 38 35 48 52 27 33 15 12 95 55 29 34 38 21 74 56 31 35 22 29 67 40 26 36 12 41 80 41 24 37 27 20 120 38 18 38 49 40 75 40 21 39 36 31 112 38 26 40 37 24 130 37 18 41 16 25 96 39 19 42 42 29 78 50 29 43 15 21 115 39 19 44 21 12 56 41 22 45 45 28 81 50 27 46 23 45 57 40 21 47 18 36 48 43 26 48 19 25 105 54 29 49 26 18 98 51 29 50 39 29 80 55 31 51 23 50 95 52 30 52 27 24 47 56 32 60 53 48 41 78 65 32 54 26 12 96 70 35 55 37 23 121 65 31 56 27 39 73 72 38 57 39 45 96 55 30 58 22 12 118 76 37 59 12 38 54 58 33 60 42 39 38 69 36 Rezultate ispitivanja biohemijskih parametara krvi pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa moţemo predstaviti i na naĉin prikazan u tabeli 23. Tabela 23. Rezultati ispitivanja biohemijskih parametara krvi pasa obolelih od LPD (obeleţeni kao LPD psi) i kontrolne grupe pasa ALT (IU/l) AST (IU/l) AP (IU/l) Ukupni proteini (g/L) Albumini (g/L) X LPD psi 29.87 31.28 87.67 45.48 a 25.70 a Kontrolna grupa 29.83 32.67 83.33 65.83 a 32.50 a SD LPD psi 11.24 11.07 36.33 5.605 3.379 Kontrolna grupa 11.58 12.50 34.07 8.134 3.507 SE LPD psi 1.657 1.632 5.357 0.8263 0.4982 Kontrolna grupa 4.729 5.103 13.91 3.321 1.432 CV (%) LPD psi 37.63 35.39 41.44 12.32 13.15 61 Kontrolna grupa 38.83 38.27 40.88 12.36 10.79 Xmin LPD psi 12 12 21 37 18 Kontrolna grupa 12 12 38 55 28 Xmax LPD psi 49 55 164 56 31 Kontrolna grupa 42 45 121 76 37 Ista slova pokazuju statistički značajnu razliku između obolelih pasa i pasa iz kontrolne grupe za ukupne proteine i albumine. Slovo a = p ≤ 0,01. 5.4. KOPROLOŠKI NALAZ Iako je jedan od kriterijuma pri odabiru pasa, za potrebe ovog istraţivanja, bio negativan test na prisustvo crevnih parazita, uraĊene su ponovne analize na prisustvo parazita Toxocara canis, Trichuris vulpis i Giardia lamblia. Rezultati su prikazani u tabeli 24. Tabela 24. Rezultati koprološkog istraţivanja Broj ţivotinja kod kojih su u fecesu naĊena jaja Trichuris vulpis / Broj ţivotinja kod kojih je u fecesu potvrĊeno prisustvo antigena Giardia lamblia / Broj ţivotinja kod kojih su u fecesu naĊena jaja Toxocara canis / Broj ţivotinja kod kojih nisu pronaĊeni paraziti 60 62 5.5. ULTRAZVUČNI NALAZ 5.5.1. Kontrolna grupa Ultrazvuĉni nalaz kod pasa kontrolne grupe je bio bez osobenosti. 5.5.2. Oboleli psi Ultrazvuĉni pregled abdomena je obavljen kod 54 obolela psa. Ultrazvuĉnim pregledom creva, kod obolelih pasa zapaţen je valovit izgled zida duodenuma (slika 1). Kod 40 pasa mukoza je izrazito hipoehogena i debljina zida je oko 6 mm. Kod 5 pasa je debljina zida tankih creva u granicama normale (oko 3 mm). Kod 3 psa se zapaţaju sitna zrnasta beliĉasta polja na zadebljalom zidu creva, a debljina zida creva je oko 6 mm (slika 2). Slika 1. Uvećana debljina zida creva 63 Slika 2. Valovit izgled zida duodenuma 64 5.6. RADIOLOŠKI NALAZ 5.6.1. Kontrolna grupa Rendgenski nalaz kod pasa kontrolne grupe je bio bez osobenosti. 5.6.2. Oboleli psi Na rendgenskim snimcima duodenuma uraĊenim u VD i LL projekciji uz upotrebu pozitivnog kontrasnog sredstva ustanovili smo spastiĉnost i neujednaĉenost lumena creva kod svih ispitivanih jedinki, a naroĉito kod 46 sluĉajeva. U najvećem broju sluĉajeva promene su dijagnostikovane bulbarno, granica metalne senke barijum sulfata sa okolnim senkama mekog tkiva je narezuckana, diskontinuirana i magliĉasta. Reljef sluzokoţe je deformisan zbog postojanja spazma i edema, pa ona dobija mramorisan izgled usled barijumskih depozita prilepljenih uz hipertrofiĉne nabore mukoze. Zbog prisustva sluzi, krvi i deskvamiranog epitela, zapaţena je pahuljasta flokulacija (fragmentacija) kontrastne smeše na sloj sluznog pokrivaĉa, sa duplom konturom zida duodenuma. Kod 3 psa kod kojih je postojala osnovana sumnja na limfangiektaziju, ustanovljene su sledeće promene: laka dilatacija lumena, minimalna segmentacija, a uvećani folikuli su davali utisak da je sluzokoţa pseudo-polipoidnog ili nodularnog izgleda. Akumulacija gasa u vidu transparentnih polja, bila je redovan pratlac ovih zapaljenskih promena. Osim morfoloških, rendgenskom dijagnostikom su ustanovljeni i motorni i sekretorni poremećaji dvanaestopalaĉnog creva. Oni su se manifestovali njegovom hiperperistaltikom i ubrzanom pasaţom kontrasta prema kaudalnim partijama tankih creva, tako da se kod 39 pasa duodenum u rendgenskoj slici pojavljivao već nekoliko minuta nakon administracije barijuma, umesto posle 20 do 30 minuta. 65 5.7. ENDOSKOPSKI NALAZ 5.7.1. Kontrolna grupa Pri endoskopskom pregledu kontrolne grupe pasa zapaţa se crvenkasta do ţutocrvena ravnomerna obojenost mukoze. Nema prisustva ni pene niti sluzi. 5.7.2. Oboleli psi Pri endoskopskom pregledu obolelih pasa (slika 3), u lumenu se uoĉava dosta ţućkasto-beliĉaste pene (slika 4). Kod obolelih pasa, zapaţena je hiperemiĉnost i edem sluznice duodenuma (slika 5). Zbog toga je sluznica izgledala somotasto i to ili celom duţinom ili, pak, parcijalno. Pri biopsiji sluznica je lako krvarila. Kod 18 pasa je sluznica duodenuma bila manje hiperemiĉna, ali sa edematoznim poljima. Kod 3 psa se mogla uoĉiti jaka hiperemija i edem sluznice duodenuma, a na njenoj površini su se zapaţala sitno zrnasta polja, bele boje, posuta po sluznici i veliĉine zrna pirinĉa (slika 6). Sa ovako promenjenih mesta su uzeti biopsijski uzorci. Slika 3. IzvoĊenje endoskopije psa 66 Slika 4. Ţućkasto beliĉasta pena u lumenu duodenuma Slika 5. Hiperemija i edem sluznice duodenuma 67 Slika 6. Sitno zrnasta polja na površini sluznice duodenuma 5.8. PATOHISTOLOŠKI NALAZ 5.8.1. Kontrolna grupa Histološkim pregledom zida duodenuma zdravih pasa uoĉavaju se uniformne crevne resice, sa oĉuvanim crevnim epitelom. Kripte su uglavnom malog lumena, osim pojedinaĉnih kripti koje su umereno dilatirane. Centralni lakteal zauzima do 25% širine lamine proprije resice, na uzduţnom preseku. U lamini propriji se zapaţa mali broj pojedinaĉnih limfocita, plazma ćelija i po koji eozinofil. IzmeĊu kripti nalaze se 1-2 limfocita ili plazma ćelije. U epitelnom sloju se mogu naći pojedinaĉni intraepitelni limfociti. 5.8.2. Oboleli psi Patohistološkim pregledom tkivnih uzoraka sluznice duodenuma obolelih pasa, izdvojile su se tri grupe patomorfoloških promena: prva grupa uzoraka su uzorci u kojima 68 postoji infiltrat u lamini propriji sluznice duodenuma u kome dominiraju limfociti i plazma ćelije (46 sluĉajava); u drugoj grupi uzoraka, takoĊe postoji infiltrat, ali sastavljen preteţno od eozinofilnih granulocita (3 sluĉaja), dok u trećoj grupi uzoraka nema ćelijskog infiltrata u sluznici duodenuma (5 sluĉajeva). Detaljnim opisom morfoloških promena na biopsijskim uzorcima sluznice duodenuma (promene na crevnim resicama, stepen oštećenja crevnog epitela, postojanje proširenja kripti, prisustvo dilatiranih limfnih sudova i fibroze) kao i praćenjem zastupljenosti intraepitelnih limfocita (IEL), limfocita, plazma ćelija, eozinofilnih granulocita i neutrofilnih granulocita u infiltratu sluznice, došlo se do dole opisanih rezultata. U prvoj grupi uzoraka u kojoj dominiraju limfociti i plazma ćelije, uoĉene su promene na crevnim resicama koje su okarakterisane kao blage do umerene. Duţina crevnih resica je redukovana na 75-50% njihove normalne duţine. Crevne resice su zadebljale, a neke su fuzionisane - meĊusobno spojene (slika 7). Promene na crevnom epitelu su okarakterisane kao blago do umereno oštećenje epitela. Na enterocitima i epitelnim ćelijama crevnih kripti zapaţaju se degenerativne promene (slika 8), kao i deskvamacija epitelnih ćelija (slika 9). Zapaţeno je blago do umereno proširenje kripti (10% do 25% kripti je prošireno). Kripte su izmenjenog, nepravilnog oblika i ispunjene su detritusom (slika 10). Limfni sudovi resica su prošireni, i to od blago do umereno proširenih (centralni lakteal zahvata 50% do 75% crevne resice po širini, na uzduţnom preseku). Lamina propria mucosae je edematozna zbog prisustva obilnog ćelijskog infiltrata. U lamini propriji duodenuma, kod 46 pasa, uoĉena je infiltracija velikim brojem mononuklearnih ćelija, u kojima dominiraju limfociti i plazma ćelije. Limfociti su uglavnom difuzno rasuti u lamini propriji, dok plazma ćelije, sa ekscentriĉno postavljenim jedrima, obiĉno u grupama ispunjavaju laminu propriju crevnih resica (slika 11). Kripte su razdvojene sa 10 – 20 limfocita i plazma ćelija. Pojedinaĉni limfociti, smešteni intaepitelno (intraepitelni limfociti – IEL), zapaţaju se na epitelu crevnih resica, i to kao individualne ćelije, a retko i u grupama – grozdovima (slika 12). 69 Slika 7. Crevne resice su zadebljale i fuzionisane, HE Slika 8. Degenerativne promene na epitelnim ćelijama, HE 70 Slika 9. Deskvamacija epitelnih ćelija, HE Slika 10. Kripte nepravilnog oblika ispunjene detritusom, HE 71 Slika 11.Grupe plazma ćelija ispunjavaju laminu propriju, HE Slika 12. Intraepitelni limfociti nalaze se pojedinaĉno ili u grupama, HE 72 U drugoj grupi uzoraka u kojoj dominiraju eozinofilni granulociti, promene na crevnim resicama su okarakterisane kao blage. Zapaţa se blagi stepen oštećenja crevnog epitela kao i proširenja kripti (do 10% kripti je prošireno). Centralni lakteal ne zauzima više od polovine crevne resice na uzduţnom preseku. U lamini propriji duodenuma kod ova 3 psa uoĉena je infiltracija velikim brojem eozinofilnih granulocita mada je zapaţeno i prisustvo mononukleara u infiltratu. Koprološki nalaz kod pasa iz ove grupe bio je negativan. U trećoj grupi uzoraka u kojoj nije zapaţena ćelijska infiltracija u sluznici duodenuma, promene se svode na kataralno – mucinozni enteritis. Opisane patohistološke promene kod prve dve grupe uzoraka upućuju na inflamatornu bolest creva, a kod treće grupe na kataralni duodenitis (tabela 25). Tabela 25. Postavljena patohistološka dijagnoza Postavljena patohistološka dijagnoza Broj pasa Limfocitno - plazmocitni duodenitis 46 Eozinofilni duodenitis 3 Kataralni duodenitis 5 5.9. IMUNOHISTOHEMIJSKI NALAZ 5.9.1. Kontrolna grupa U uzorcima sluznice duodenuma zdravih pasa, CD3 eksprimiraju pojedinaĉni T limfociti u lamini propriji mukoze i u lamini epitelialis mukoze. Isto tako, u uzorcima sluznice duodenuma ovih pasa, CD79 eksprimiraju pojedinaĉni B limfociti smešteni uglavnom u lamini propriji (lamina propria mucosae). 73 5.9.2. Oboleli psi Imunohistohemijskim ispitivanjem uzoraka sluznice duodenuma obolelih pasa, na preparatima bojenim LSAB2 tehnikom uoĉena je ekspresija CD3+ (T limfocita) i CD79+ (B limfocita). Kod ispitanih uzoraka, kod 31 psa, u inflamatornom infiltratu dominiraju ćelije CD3+ imunofenotipa (slika 13). Pozitivna imunohemijska reakcija je ispoljena nalazom precipitata tamnosmeĊe boje u predelu ćelijske membrane T limfocita, tako da je prisutan tzv. membranski precipitat. Reakcija reĊe zastupljenih B limfocita, više je difuznog karaktera. B limfociti dominiraju u 2 sluĉaja. U 13 sluĉajeva postoji ravnomerno mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat. Slika 13. U infiltratu dominiraju CD3+ T limfociti, IHC – LSAB 74 5.10. ODNOS HEMATOLOŠKIH I BIOHEMIJSKIH PARAMETARA IZMEĐU OBOLELIH PASA I KONTROLNE GRUPE PASA Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na broj leukocita kod pasa obolelih od LPD kao i kontrolne grupe pasa, prikazani su u tabeli 26. Tabela 26. Deskriptivni statistiĉki parametri broja leukocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa x 10 9 /L X SD Sx Minimum Maximum CV Kontrola 9,90 x 2,45 0,9982 6,52 12,98 24,71 Bolesni 19,32 x 1,37 0,2016 17,10 23,05 7,08 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizirajući deskriptivne statistiĉke parametre koji se odnose na broj leukocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (tabela 26), ustanovljeno je da je u kontrolnoj grupi on iznosio proseĉno (9,90 ± 2,45) i bio statistiĉki signifikantno manji (p≤0,01) od proseĉnog broja leukocita kod bolesnih pasa (19,32 ± 1,37), što je prikazano i na grafikonu 1. Izraĉunati koeficijent korelacije kod kontrolne grupe pasa bio je relativno visok (24,71%) što ukazuje na veće variranje broja leukocita kod kontrolne grupe pasa, dok je koeficijent korelacije bolesnih pasa bio vrlo nizak (7,08%) što nas navodi na zakljuĉak da je broj leukocita kod ove grupe pasa bio visok, ali pribliţno isti kod svih pasa. 75 K o ntro lna grup a B o le sni p s i 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 B r o j le u k o c it a Grafikon 1. Proseĉne vrednosti broja leukocita (x 109/L) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 76 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na broj limfocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa, prikazani su u tabeli 27. Tabela 27. Deskriptivni statistiĉki parametri broja limfocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa x 10 9 /L X SD Sx Minimum Maximum CV Kontrola 3,15 x 1,15 0,4689 1,50 4,70 36,46 Bolesni 6,65 x 0,93 0,1377 4,90 9,10 14,04 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizirajući deskriptivne statistiĉke parametre koji se odnose na broj limfocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (tabela 27), ustanovljeno je da je u kontrolnoj grupi on iznosio proseĉno (3,15 ± 1,15) i bio statistiĉki signifikantno manji (p≤0,01) od proseĉnog broja limfocita kod bolesnih pasa (6,65 ± 0,93), što je prikazano i na grafikonu 2. Izraĉunati koeficijent korelacije kod kontrolne grupe pasa bio je vrlo visok (36,46%) što ukazuje na veće variranje broja limfocita kod kontrolne grupe pasa i nehomogenost ovog parametra, dok je koeficijent korelacije bolesnih pasa bio nizak (14,04%) što nas navodi na zakljuĉak da je broj limfocita kod ove grupe pasa bio visok, ali sa malim odstupanjem od aritmetiĉke sredine. 77 K o ntro lna grup a B o le sni p s i 0 2 4 6 8 B r o j li m f o c it a Grafikon 2. Proseĉne vrednosti broja limfocita (x 109/L) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 78 Rezultati dobijeni analizom procentualne zastupljenosti eozinofilnih granulocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa prikazani su na grafikonu 3. Analizirajući kretanje procenta pojave eozinofilnih granulocita u ispitivanim grupama (kontrolna grupa i bolesni psi), ustanovili smo da je on proseĉno iznosio 0,43%. Na osnovu toga ustanovljeno je da ne postoji statistiĉki signifikantna razlika kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. Kontrolna grupa Bolesni psi 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 P ro c e n a t e o z in o fi ln ih g ra n u lo c it a Grafikon 3. Proseĉne vrednosti broja eozinofilnih granulocita (procentualno izraţeno) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 79 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na broj eritrocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa prikazani su u tabeli 28. Tabela 28. Deskriptivni statistiĉki parametri broja eritrocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa x 10 12 /L X SD Sx Minimum Maximum CV Kontrola 7,15 0,87 0,3544 5,70 8,20 12,15 Bolesni 6,74 0,65 0,0953 5,65 8,05 9,59 Analizirajući deskriptivne statistiĉke parametre koji se odnose na broj eritrocita kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (tabela 28), ustanovljeno je da je proseĉan broj eritrocita u ispitivanim grupama (kontrolna grupa i bolesni psi) bio vrlo sliĉan (7,15 ± 0,87 i 6,74 ± 0,65) tako da nije ustanovljena statistiĉki signifikantna razlika (p≥0,05) što je prikazano i na grafikonu 4. Izraĉunati koeficijenti korelacije kod obe grupe ispitivanih ţivotinja su niski i vrlo sliĉni (12,15% kod kontrolne grupe i 9,59% kod bolesnih pasa) što ukazuje na homogenost ispitivanog parametra. 80 K o ntro lna grup a B o le sni p s i 0 2 4 6 8 1 0 B r o j e r it r o c it a Grafikon 4. Proseĉne vrednosti broja eritrocita (x 1012/L) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 81 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na koncentraciju ukupnih proteina kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa, prikazani su u tabeli 29. Tabela 29. Deskriptivni statistiĉki parametri za ukupne proteine kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa g/L X SD Sx Minimum Maximum CV Kontrola 65,83 x 8,13 3,3210 55,00 76,00 12,36 Bolesni 45,48 x 5,61 0,8263 37,00 56,00 12,32 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizirajući deskriptivne statistiĉke parametre koji se odnose na koncentraciju ukupnih proteina kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (tabela 29), ustanovljeno je da je proseĉna koncentracija ukupnih proteina u kontrolnoj grupi (65,83 ± 8,13) bila statistiĉki signifikantno veća (p≤0,01) od proseĉne koncentracije ukupnih proteina kod bolesnih pasa (45,48 ± 5,61), što je prikazano i na grafikonu 5. Izraĉunati koeficijenti korelacije kod obe grupe ispitivanih ţivotinja su niski i vrlo sliĉni (12,36% kod kontrolne grupe i 12,32% kod bolesnih pasa) što ukazuje na homogenost ispitivanog parametra. 82 K o ntro lna grup a B o le sni p s i 0 2 0 4 0 6 0 8 0 K o n c e n tr a c ij a u k u p n ih p ro te in a Grafikon 5. Proseĉne vrednosti koncentracije ukupnih proteina (g/L) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 83 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na koncentraciju serumskih albumina kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa, prikazani su u tabeli 30. Tabela 30. Deskriptivni statistiĉki parametri za albumine kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa g/L X SD Sx Minimum Maximum CV Kontrola 34,17 x 3,31 1,3520 30,00 38,00 9,69 Bolesni 25,70 x 3,40 0,4982 18,00 31,99 13,15 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizirajući deskriptivne statistiĉke parametre koji se odnose na koncentraciju serumskih albumina kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (tabela 30), ustanovljeno je da je u kontrolnoj grupi ona iznosila proseĉno (34,17 ± 3,31) i bila statistiĉki signifikantno veća (p≤0,01) od proseĉne koncentracije albumina kod bolesnih pasa (25,70 ± 3,40) što je prikazano i na grafikonu 6. Izraĉunati koeficijenti korelacije kod obe grupe ispitivanih ţivotinja su niski (9,69% kod kontrolne grupe i 13,15% kod bolesnih pasa) što ukazuje na homogenost ispitivanog parametra. 84 K o ntro lna grup a B o le sni p s i 0 1 0 2 0 3 0 4 0 K o n c e n tr a c ij a s e ru m s k ih a lb u m in a Grafikon 6. Proseĉne vrednosti koncentracije serumskih albumina (g/L) kod pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa. 85 5.11. ODNOS POJEDINIH HEMATOLOŠKIH I BIOHEMIJSKIH PARAMETARA I TIPA INFILTRATA KOD PASA OBOLELIH OD LPD Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na broj leukocita kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 31. Tabela 31. Deskriptivni statistiĉki parametri broja leukocita pasa obolelih od LPD, sa dominacijom razliĉitih vrsta ćelija u infiltratu x 10 9 /L X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 18,03 a 1,31 0,9250 17,10 18,95 7,26 Dominantno limfocitni infiltrat 18,88 x 0,83 0,1487 17,52 20,72 4,38 Ravnomerno mešoviti infiltrat 20,56 ax 1,65 0,4576 17,95 23,05 8,03 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja broja leukocita unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 31), ustanovljeno je da je najveći proseĉni broj leukocita bio kod pasa koji su imali mešoviti infiltrat (20,56 ± 1,65), a najmanji proseĉni broj leukocita bio je kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (18,03 ± 1,31). Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 11,44 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike u broju leukocita ukupno kod pasa 86 obolelih od LPD (p≤0,01). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĊu proseĉnog broja leukocita kod pasa sa mešovitim infiltratom (20,56 ± 1,65) i proseĉnog broja leukocita pasa sa preteţno plazmocitnim infiltratom (18,03 ± 1,31). Statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) je veći proseĉni broj leukocita kod pasa sa mešovitim infiltratom (20,56 ± 1,65) u odnosu na proseĉni broj leukocita kod pasa sa preteţno limfocitnim infiltratom (18,88 ± 0,83) što je prikazano i na grafikonu 7. Izraĉunati koeficijenti korelacije su na niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. P D L D M 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 B r o j le u k o c it a Grafikon 7. Proseĉne vrednosti broja leukocita (x 109/L) kod pasa obolelih od LPD, sa razliĉitim tipom infiltrata (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD - preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 87 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na broj limfocita kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 32. Tabela 32. Deskriptivni statistiĉki parametri broja limfocita kod pasa obolelih od LPD, sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu x 10 9 /L X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 5,40 x 0,28 0,2000 5,20 5,60 5,24 Dominantno limfocitni infiltrat 6,42 y 0,76 0,1361 4,90 7,50 11,80 Ravnomerno mešoviti infiltrat 7,40 xy 0,90 0,2522 5,80 9,10 12,29 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja broja limfocita unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 32), ustanovljeno je da je najveći proseĉni broj limfocita bio kod pasa koji su imali mešoviti infiltrat (7,40 ± 0,90), a najmanji proseĉni broj limfocita bio je kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (5,40 ± 0,28). Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 9,51 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike u broju leukocita ukupno kod pasa obolelih od LPD (p≤0,01). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je da je proseĉni broj limfocita kod pasa sa mešovitim infiltratom (7,40 ± 0,90) vrlo znaĉajno veći (p≤0,01) i od proseĉnog broja limfocita kod pasa sa preteţno limfocitnim infiltratom (6,42 ± 0,76) kao i od proseĉnog 88 broja limfocita kod pasa sa preteţno plazmocitnim infiltratom (5,40 ± 0,28) što je prikazano i na grafikonu 8. Nisu ustanovljene statistiĉki signifikantne razlike (p≥0,05) izmeĊu ostalih vidova promena kod pasa. Izraĉunati koeficijenti korelacije su na niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. PD LD M 0 2 4 6 8 B ro j li m fo c it a Grafikon 8. Proseĉne vrednosti broja limfocita (x 109/L) kod pasa obolelih od LPD sa razliĉitim tipom infiltrata (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD - preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 89 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na koncentraciju ukupnih proteina kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 33. Tabela 33. Deskriptivni statistiĉki parametri ukupnih proteina pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu g/L X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 52,50 0,71 0,50 52,00 53,00 1,35 Dominantno limfocitni infiltrat 46,30 5,19 0,9315 39,00 56,00 11,27 Ravnomerno mešoviti infiltrat 43,08 5,94 1,6470 37,00 54,00 13,78 Analizom statistiĉkih pokazatelja ukupnih proteina unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela33), ustanovljeno je da je najveća proseĉna koncentracija ukupnih proteina bila kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (52,50 ± 0,71), a najmanja proseĉna koncentracija bila je kod pasa kod kojih je ustanovljen mešoviti infiltrat (43,08 ± 5,94), što je prikazano i na grafikonu 9. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 3,19 što ukazuje da nije ustanovljena signifikantna razlika u ukupnim proteinima kod pasa obolelih od LPD (p≥0,05). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. 90 P D L D M 0 2 0 4 0 6 0 K o n c e n tr a c ij a u k u p n ih p ro te in a Grafikon 9. Proseĉne vrednosti koncentracije ukupnih proteina (g/L) kod pasa obolelih od razliĉitih tipova LPD (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD - preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 91 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na koncentraciju albumina kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 34. Tabela 34. Deskriptivni statistiĉki parametri albumina pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu g/L X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 28,50 0,71 0,500 28,00 29,00 2,48 Dominantno limfocitni infiltrat 26,45 a 2,41 0,4321 19,00 31,00 9,10 Ravnomerno mešoviti infiltrat 23,38 a 4,39 1,2170 18,00 29,00 18,77 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja albumina unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 34), ustanovljeno je da je najveća proseĉna koncentracija albumina bila kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (28,50 ± 0,71), a najmanja proseĉna koncentracija bila je kod pasa koji su imali mešovite infiltrate (23,38 ± 4,39) što je prikazano i na grafikonu 10. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 5,46 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike u koncentraciji 92 albumina ukupno kod pasa obolelih od LPD (p≤0,05). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĊu proseĉne koncentracije albumina kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno limfocitni infiltrat (26,45 ± 2,41) i proseĉne koncentracije albumina kod pasa sa mešovitim infiltratom (23,38 ± 4,39). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. P D L D M 0 1 0 2 0 3 0 K o n c e n tr a c ij a s e ru m s k ih a lb u m in a Grafikon 10. Proseĉne vrednosti koncentracije serumskih albumina (g/L) kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD - preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 93 5.12. ODNOS INDEKSA CIBDAI I CCECAI PASA OBOLELIH OD RAZLIČITIH TIPOVA DUODENITISA: LIMFOCITNO - PLAZMOCITNOG DUODENITISA, EOZINOFILNOG DUODENITISA I KATARALNOG DUODENITISA Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na CIBDAI pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa, prikazani su u tabeli 35. Tabela 35. Deskriptivni statistiĉki parametri za CIBDAI kod pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa X SD Sx Minimum Maximum CV LPD 7,48 x 1,59 0,2341 5,00 11,00 21,23 Eozinofilni duodenitis 5,33 0,58 0,3333 5,00 6,00 10,83 Kataralni duodenitis 3,40 x 0,55 0,25 3,00 4,00 16,11 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CIBDAI unutar grupe pasa obolelih od LPD i pasa sa eozinofilnim duodenitisom i pasa sa kataralnim duodenitisom (tabela 35), ustanovljeno je da je najviša proseĉna vrednost za CIBDAI bila kod pasa koji su imali LPD (7,8 ± 1,59), a najmanja proseĉna vrednost za CIBDAI bila je kod pasa sa kataralnim promenama (3,40 ± 0,55) što je prikazano i na grafikonu 11. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 18,49 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike za vrednosti CIBDAI ukupno kod pasa obolelih od razliĉitih tipova duodenitisa (p≤0,01). 94 Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljeno je da je statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) veća proseĉna vrednost za CIBDAI kod pasa obolelih od LPD (7,8 ± 1,59) u odnosu na proseĉnu vrednost za CIBDAI kod pasa sa kataralnim promenama (3,40 ± 0,55). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na relativno niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. L P D E D K D 0 2 4 6 8 V re d n o s t C IB D A I Grafikon 11. Proseĉne vrednosti CIBDAI kod bolesnih pasa (LPD – limfocitno - plazmocitni duodenitis, ED - eozinofilni duodenitis, KD - kataralni duodenitis). 95 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na CCECAI pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa, prikazani su u tabeli 36. Tabela 36. Deskriptivni statistiĉki parametri za CCECAI kod pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa X SD Sx Minimum Maximum CV LPD 7,59 x 1,80 0,2648 5,00 12,00 23,67 Eozinofilni duodenitis 6,00 a 1,00 0,5774 5,00 7,00 16,67 Kataralni duodenitis 3,40 xa 0,55 0,2449 3,00 4,00 16,11 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CCECAI unutar grupe pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa pasa (tabela 36), ustanovljeno je da je najviša proseĉna vrednost za CCECAI bila kod pasa sa LPD-om (7,59 ± 1,80), a najmanja proseĉna vrednost za CCECAI bila je kod pasa sa kataralnim promenama (3,40 ± 0,55) što je prikazano i na grafikonu 12. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 14,26 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike za vrednosti CCECAI ukupno kod pasa obolelih od razliĉitih tipova duodenitisa (p≤0,01). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je signifikantna veća proseĉna vrednost (p≤0,05) za CCECAI pasa sa eozinofilnim duodenitisom (6,00 ± 1,00) u odnosu na proseĉnu vrednost za pse sa kataralnim promenama (3,40 ± 0,55). Statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) je veća proseĉna vrednost za CCECAI kod pasa obolelih od LPD (7,59 ± 1,80) u odnosu na 96 proseĉnu vrednos za CCECAI kod pasa sa kataralnim promenama (3,40 ± 0,55). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na relativno niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. L P D E D K D 0 2 4 6 8 V re d n o s t C C E C A I Grafikon 12. Proseĉne vrednosti CCECAI kod bolesnih pasa (LPD – limfocitno - plazmocitni duodenitis, ED - eozinofilni duodenitis, KD - kataralni duodenitis). 97 5.13. ODNOS INDEKSA CIBDAI I CCECAI I TIPA INFILTRATA PASA OBOLELIH OD LPD Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na CIBDAI kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 37. Tabela 37. Deskriptivni statistiĉki parametri za CIBDAI kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 4,50 x 0,71 0,5000 4,00 5,00 15,71 Dominantno limfocitni infiltrat 7,26 a 1,33 0,2397 5,00 10,00 18,74 Ravnomerno mešoviti infiltrat 8,46 xa 1,66 0,4615 5,00 11,00 19,76 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CIBDAI unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 37), ustanovljeno je da je najviša proseĉna vrednost za CIBDAI bila kod pasa koji su imali mešoviti infiltrat (8,46 ± 1,66), a najmanja proseĉna vrednost za CIBDAI bila je kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (4,50 ± 0,71) što je prikazano i na grafikonu 13. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 7,96 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike za 98 vrednosti CIBDAI ukupno kod pasa obolelih od LPD (p≤0,01). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĊu proseĉne vrednosti za CIBDAI kod pasa sa mešovitim infiltratom (8,46 ± 1,66) i proseĉne vrednosti pasa sa preteţno plazmocitnim infiltratom (4,50 ± 0,71). Statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) je veća proseĉna vrednost za CIBDAI kod pasa sa mešovitim infiltratom (8,46 ± 1,66) u odnosu na proseĉnu vrednost za CIBDAI kod pasa sa preteţno limfocitnim infiltratom (7,26 ± 1,33). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na relativno niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. P D L D M 0 2 4 6 8 1 0 V re d n o s t C IB D A I Grafikon 13. Proseĉne vrednosti CIBDAI kod pasa obolelih od LPD sa razliĉitim tipom infiltrata (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD - preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 99 Rezultati dobijeni analizom deskriptivnih statistiĉkih parametara koji se odnose na CCECAI kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu, prikazani su u tabeli 38. Tabela 38. Deskriptivni statistiĉki parametri za CCECAI kod pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu X SD Sx Minimum Maximum CV Dominantno plazmocitni infiltrat 4,50 x 0,71 0,5000 4,00 5,00 15,71 Dominantno limfocitni infiltrat 7,26 a 1,41 0,2539 5,00 11,00 19,47 Ravnomerno mešoviti infiltrat 8,77 xa 2,05 0,5679 5,00 12,00 23,35 Ista slova označavaju statistički signifikantnu razliku. Slova a, b, c= p≤0,05; x, y, z = p≤0,01. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CCECAI unutar grupe pasa obolelih od LPD sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 38), ustanovljeno je da je najviša proseĉna vrednost za CCECAI bila kod pasa koji su imali mešoviti infiltrat (8,77 ± 2,05), a najmanja proseĉna vrednost za CCECAI bila je kod pasa kod kojih je ustanovljen preteţno plazmocitni infiltrat (4,50 ± 0,71), što je prikazano i na grafikonu 14. Analizom varijanse ustanovljeno je da je F vrednost 7,88 što ukazuje na postojanje signifikantne razlike za vrednosti CCECAI ukupno kod pasa obolelih od LPD (p≤0,01). Pojedinaĉnim Tukey testom ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĊu proseĉne vrednosti za 100 CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom (8,77 ± 2,05) i proseĉne vrednosti kod pasa sa preteţno plazmocitnim infiltratom (4,50 ± 0,71). Statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) je veća proseĉna vrednost za CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom (8,77 ± 2,05) u odnosu na proseĉne vrednosti za CCECAI kod pasa sa preteţno limfocitnim infiltratom (7,26 ± 1,41). Izraĉunati koeficijenti korelacije su na relativno niskom nivou što ukazuje na homogenost ispitivanih serija podataka. P D L D M 0 2 4 6 8 1 0 V re d n o s t C C E C A I Grafikon 14. Proseĉne vrednosti CCECAI kod pasa obolelih od LPD sa razliĉitim tipom infiltrata (PD – preteţno plazmocitni infiltrat, LD – preteţno limfocitni infiltrat, M - ravnomerno mešoviti infiltrat) 101 6. DISKUSIJA Inflamatorna bolest creva (IBC) pasa je zajedniĉki naziv za niz hroniĉnih enteropatija koje se primarno odlikuju zapaljenjem sluznice gastrointestinalnog sistema i nespecifiĉnim simptomima. Limfocitno – plazmocitni duodenitis (LPD) pasa je oblik inflamatorne bolesti duodenuma i predstavlja enteropatiju hroniĉnog toka sa nespecifiĉnim kliniĉkim simptomima, od kojih su najvaţniji dijareja i povraćanje. Najvaţnija morfološka karakteristika imunološkog odgovora, u ovom tipu inflamatorne bolesti creva je nalaz mononuklearnog ćelijskog infiltrata u sluznici duodenuma. Analizom rezultata dobijenih u ovom istraţivanju, ustanovljeno je da oboleli psi, koji su u kliniĉkoj slici imali hroniĉnu dijareju, hroniĉno povraćanje, izmenjeno ponašanje i promenjen apetit, boluju od sledećih enteropatija: kataralni duodenitis je utvrĊen kod 5 pasa, kod 3 psa je postavljena dijagnoza eozinofilnog duodenitisa dok je kod 46 pasa dijagnostikovan limfocitno – plazmocitni duodenitis (LPD). Ispitivanja su obuhvatila pse koji su bili pacijenti ambulantne klinike Fakulteta veterinarske medicine (FVM) u Beogradu. Prema anamnestiĉkim podacima, svi psi su pre dolaska u ambulantu FVM bili neuspešno leĉeni antibioticima i svi su bili slobodni od crevnih parazita. U ispitivanje je ukljuĉeno i 6 zdravih pasa koji su sluţili kao kontrolna grupa. Na osnovu podataka iz literature, moţe se zakljuĉiti da je patogeneza inflamatorne bolesti creva pasa, pa samim tim i limfocitno – plazmocitnog duodenitisa pasa, vrlo kompleksna i nedovoljno razjašnjena (Whitley i sar., 2010; Allenspach i sar., 2003). Iako uzrok nastanka IBC kod ţivotinja i ljudi nije jasan, i histološki i kliniĉki podaci ukazuju na imunološku podlogu razvoja bolesti (German i sar., 2008). Glavni dogaĊaj u patogenezi IBC je gubitak imunološke tolerancije na normalnu bakterijsku floru i antigene hrane, što prouzrokuje poremećaj imunološkog odgovora (Cerquetella, 2010). Pretpostavlja se da patogeneza IBC ukljuĉuje aktivaciju subseta CD4+ T ćelija koje stvaraju inflamatorne citokine, sa istovremenim gubitkom subseta T ćelija i citokina koji koĉe imunološki odgovor te tako štite tkivo creva od oštećenja (Washabau, 2010). Patofiziološki, LPD se 102 definiše kao niz promena vezanih za transport, protok krvi i motilitet creva, dok je histološki kriterijum za definisanje LPD postojanje limfocitno – plazmocitnog infiltrata u sluznici duodenuma. Kliniĉki simptomi pasa sa LPD se pripisuju ćelijskom infiltratu, medijatorima inflamacije, disfunkciji enterocita vezanoj za inflamaciju i promeni motiliteta creva (Washabau i sar., 2010). Grupa od 46 pasa obolelih od LPD je brojala 15 ţenskih i 31 mušku ţivotinju, uzrasta od 5 meseci do 14 godina. Deset pasa je bilo mešane rase, a 36 pasa je bilo u ĉistoj rasi. Po podacima iz literature, ni rasna, ni starosna niti polna predispozicija za nastanak ove bolesti se ne moţe ustanoviti (van der Gaag i sar., 1990), a što je u saglasnosti sa našim nalazima. Postoje podaci da odreĊene rase, kao što je nemaĉki ovĉar, imaju sklonost ka razvoju IBC (Washabau i sar., 2010; Allenspach, 2009; Fogle, 2007). U našem ispitivanju 5 od 46 (10,87%) pasa obolelih od LPD bili su nemaĉki ovĉari, što ide u prilog hipotezi o rasnoj predispoziciji. Od kliniĉkih simptoma, dijareja je bila prisutna kod svih ispitivanih pasa, s obzirom da je bila jedan od preduslova za njihov izbor. Povraćanje se u našem uzorku od 46 pasa javlja sa uĉestalošću od 76,09% (35/46). U literaturi se mogu naći potvrde da su hroniĉna dijareja i povraćanje najĉešći simptomi IBC (Gaschen i sar., 2011; Marks i sar., 2011; Kobayashi i sar., 2007; Lecoindre, 2006; Jergens, 2004; Cowel, 2004; Jergens, 1992) Pojedini autori iznose podatke da je dijareja jedan od najĉešćih simptoma IBC sa uĉestalošću od 91% (Lecoindre i sar., 2010). Drugi autori su ustanovili da postoji pozitivna korelacija izmeĊu stepena oštećenja tkiva kod IBC i gubitka telesne mase (Jergens i sar., 1992). U našem istraţivanju se gubitak telesne mase javlja u 95,65% sluĉajeva (44/46). Broj pasa sa izmenjenim temperamentom je 93,48% (43/46). Do sliĉnih rezultata došli su i drugi autori (Lecoindre i sar., 2010): gubitak telesne mase u 74% dok su anoreksija i letargija izraţene u 56%, odnosno u 51% sluĉajeva. Kod ispitivanih pasa nismo uoĉili ascites dok drugi autori ukazuju na njegovu uĉestalost od 18% (Lecoindre i sar., 2010). U literaturi se mogu naći podaci o psima obolelim od IBC, a bez drugih kliniĉkih simptoma osim povremenog povraćanja (McTavish, 2002) kao i o psima bez proliva, a sa izraţenim povraćanjem (Rousseau, 2005). 103 Hematološkim analizama utvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika za vrednosti broja leukocita i limfocita izmeĊu obolelih pasa i kontrolne grupe pasa (p≤0,01) što je prikazano i u tabeli 26 i tabeli 27. Srednja vrednost leukocita iznosila je 19,32 x 10 9 /l, dok je procentualna zastupljenost broja limfocita iznosila 69,48%. Rezultati ispitivanja hematoloških parametara kod ispitivanih pasa kao i referentne vrednosti za zdrave pse prikazani su u tabeli 12. U literaturi se mogu naći tvrdnje pojedinih autora da je limfopenija jedna od promena hematoloških parametara (Jacobs i sar., 1990). Pojedini autori su zapazili da broj leukocita moţe biti i smanjen i uvećan kod pasa obolelih od LPD, te se ne moţe tvrditi da je za ovu bolest karakteristiĉna promena broja leukocita samo u jednom pravcu (Craven i sar., 2004). Isti autor navodi da se povećan broj eozinofilnih granulocita moţe naći i u biopsijskom uzorku zida creva ţivotinje koja je obolela od LPD, a ne iskljuĉivo od eozinofilnog enteritisa. Periferna eozinofilija nije karakteristiĉna za pse obolele od limfocitno – plazmocitnog duodenitisa pasa, ali moţe biti prisutna kod pasa obolelih od eozinofilnog duodenitisa. Takav je sluĉaj kod 3 psa iz našeg istraţivanja za koje je utvrĊeno da boluju od ove bolesti, a isto potvrĊuju i drugi autori (Fonseca-Alves i sar., 2012; Fogle, 2007; Rousseau, 2005; McTavish, 2002). Pojedini autori navode nalaz eozinopenije kod pasa obolelih od limfocitno – plazmocitnog duodenitisa pasa (Jacobs i sar., 1990). U našem istraţivanju nije utvrĊena statistiĉki signifikantna razlika za vrednosti broja eozinofila (u procentima) izmeĊu obolelih pasa i kontrolne grupe što je prikazano na grafikonu 3. U našem istraţivanju nije utvrĊena ni statistiĉki znaĉajna razlika za vrednosti broja eritrocita obolelih pasa i kontrolne grupe pasa (tabela 28), dok se u literaturi mogu naći podaci koji ukazuju na umerenu anemiju pasa obolelih od IBC (Fonseca-Alves i sar., 2012; Marchetti i sar., 2010; Rousseau, 2005). Biohemijski parametri su bili u granicama normale izuzev vrednosti ukupnih proteina i serumskih albumina koje su kod pojedinih ţivotinja bile ispod normalnih vrednosti. Smanjena koncentracija proteina (<50 g/l) je naĊena kod 63,04% pasa (29/46). Srednja koncentracija proteina iznosila je 45,48 g/l (tabela 29). Smanjena koncentracija serumskih albumina je ustanovljena kod 71,74% pasa (33/46). Srednja koncentracija serumskih albumina je 25,70 g/l (tabela 30). Rezultati ispitivanja biohemijskih parametara krvi pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa prikazani su u tabeli 14. Dobijeni rezultati 104 su u saglasnosti sa nalazima drugih autora (Fonseca-Alves i sar., 2012; Lecoindre i sar., 2010; Craven i sar., 2004; Rousseau, 2005; McTavish, 2002; Jacobs i sar., 1990). Pojedini autori navode da je hipoalbuminemija ĉest nalaz kod pasa obolelih od LPD, ali je prognostiĉki loš znak (Gaschen i sar., 2011; Allenspach*, 2009; Craven i sar., 2004) i da, ukoliko se ustanovi, svrstava LPD u grupu enteropatija sa gubitkom proteina (engl. protein - losing enteropathies – PLE). Ovakva situacija nije karakteristiĉna samo za LPD već se sreće i kod drugih enteropatija. Pošto su paţljivo sistematizovani podaci o ponašanju, apetitu, povraćanju, gubitku telesne mase, kvalitetu i kvantitetu stolice, koncentraciji serumskih albumina, prisustvu ascitesa i pruritusa, a prema preporukama WSAVA (Washabau i sar., 2010), na osnovu nabrojanih rezultata izraĉunati su kliniĉki indeksi CIBDAI (engl. canine inflamatory bowel disease activity index) i CCECAI (engl. canine chronic enteropathy clinical activity index). Ukupna srednja vrednost CIBDAI kod pasa obolelih od LPD je 7,48. Vrednost CCECAI se poklapa sa vrednošću CIBDAI, osim kod 5 pasa, kod kojih je koncentracija serumskih albumina izmeĊu 15 i 19,9 g/l. što dovodi do uvećanja njihovog CCECAI za 1 poen. Ukupna srednja vrednost CCECAI kod pasa obolelih od LPD je 7,59. Dobijeni rezultati su u skladu sa nalazima drugih autora koji su pratili parametre potrebne za izuĉavanje indeksa CIBDAI i CCECAI (Garcia–Sancho et al. 2010, Allenspach 2009, Jergens 2008, Garcia- Sancho et al. 2007, Kobayashi et al. 2007, Lecoindre 2007). Na osnovu vrednosti CIBDAI dobili smo 3 grupe pacijenata: prva grupa sa blagim oblikom LPD broji 7 pasa (CIBDAI ≤5), druga grupa od 28 pasa ima LPD srednjeg intenziteta (6≤ CIBDAI ≤8) i treća grupa sa intenzivnim LPD broji 11 pasa (CIBDAI ≥9). U našim morfološkim nalazima, s druge strane, izdvojile su se takoĊe 3 grupe pasa: kod 31 psa dominantnu ćelijsku populaciju ĉine T limfociti, u 2 sluĉaja dominiraju plazma ćelije dok je kod 13 pasa ustanovljen ravnomerno mešoviti infiltrat limfocita i plazma ćilija. U grupi blagih LPD su 2 psa sa dominantno plazmocitnim infiltratom, 4 psa sa dominantno limfocitnim infiltratom i 1 pas sa limfocitno - plazmocitnim infiltratom. U grupi srednje jakih LPD su 23 psa sa dominmantno limfocitnim infiltratom i 5 pasa sa limfocitno - plazmocitnim infiltratom. U grupi znaĉajnih LPD su 4 psa sa dominantno limfocitnim infiltratom i 7 pasa sa limfocitno - plazmocitnim infiltratom. Vrednost CCECAI se poklapa sa vrednošću CIBDAI, osim kod 1 105 psa iz II grupe i 4 psa iz III grupe, kod kojih je koncentracija serumskih albumina izmeĊu 15 i 19,9 g/l. Takav rezultat kod ovih pasa dovodi do uvećanja njihovog CCECAI za 1 poen. Na osnovu vrednosti indeksa CCECAI, koji govori o jaĉini enteropatija, mogli smo svrstati pacijente na sledeći naĉin: blagu enteropatiju ima 7 pasa (CCECAI ≤5), enteropatiju srednjeg intenziteta ima 28 pasa (6≤ CCECAI ≤8), od intenzivne enteropatije boluje 10 pasa (9 ≤ CCECAI ≤ 11) dok od vrlo intenzivne enteropatije boluje 1 pas (CCECAI ≥12). U prve tri grupe poklapaju se pacijenti sa podelom na osnovu vrednosti CIBDAI, dok je u grupi vrlo intenzivnih enteropatija pas kod koga dominira mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat. Ultrazvuĉni pregled nam je ukazao na promene koje nisu specifiĉne za LPD već se javljaju kod većine duodenopatija. Zapaţen je valovit izgled zida duodenuma, zadebljala i hipoehogena mukoza (debljina zida je oko 6 mm). U literaturi se mogu naći sliĉni podaci (Fonseca-Alves i sar., 2012; Rousseau, 2005; Spohr i sar., 1995). Pojedini autori navode da se zadebljanje zida creva moţe uoĉiti u 71% sluĉajeva (Lecoindre i sar., 2010). Radiološkim ispitivanjem, na nativnim snimcima se najĉešće ne zapaţaju specifiĉne promene. Uz upotrebu kontrastnog sredstva uoĉava se neujednaĉenost lumena creva i spastiĉnost, dok je reljef sluzokoţe narezuckan, diskontinuiran i magliĉast, što se slaţe sa tvrdnjama drugih autora (Fonseca-Alves i sar., 2012; McTavish, 2002). Potreba za endoskopskim ispitivanjem radi postavljanja dijagnoze LPD je zajedniĉka svim istraţivaĉima (Lecoindre i sar., 2010; Tischendorf i sar., 2008; Rychlik i sar., 2007; Serra i sar., 2006). U našem ispitivanju, kod obolelih pasa je zapaţena hiperemiĉnost i edem sluznice duodenuma. Sluznica je izgledala somotasto i lako je krvarila. Kod 3 psa su se mogla uoĉiti na površini sluznice sitno zrnasta polja bele boje, posuta po sluznici, veliĉine zrna pirinĉa. Ovaj nalaz je interesantan pošto se do skora smatralo da su ovakve promene karakteristiĉne samo za limfangiektaziju (Jergens, 2008). MeĊutim, grupa autora (Garcia-Sancho i sar., 2010) ispitujući pse obolele od limfocitno – plazmocitnog enteritisa, dobila je rezultate sliĉne našima. Naime, njihova studija je obuhvatala 50 pasa obolelih od limfocitno – plazmocitnog enteritisa, a kod 22 psa, tokom endoskopije su na površini sluznice uoĉena sitno zrnasta polja bele boje, veliĉine zrna pirinĉa. Ova grupa autora je pokazala da ovakav nalaz nije specifiĉan samo za 106 limfangiektaziju. Dalje studije bi trebalo da pokaţu znaĉaj ovakvog nalaza kod pasa obolelih od LPD, posebno u prognostiĉkom smislu. U izvedenim ispitivanjima, histološkim pregledom zida duodenuma zdravih pasa uoĉavaju se uniformne crevne resice, sa oĉuvanim crevnim epitelom. U lamini propriji se zapaţa mali broj pojedinaĉnih limfocita, plazma ćelija i po koji eozinofilni granulocit. Kripte su razdvojene sa 1-2 limfocita ili plazma ćelije. U epitelnom sloju se mogu naći pojedinaĉni intraepitelni limfociti. Histopatološkim pregledom tkivnih uzoraka sluznice duodenuma svih obolelih pasa, izdvojile su se tri grupe uzoraka: prva grupa uzoraka su uzorci u kojima postoji infiltrat u krznu sluznice duodenuma u kome dominiraju limfociti i plazma ćelije (kod 46 sluĉajeva); u drugoj grupi uzoraka, takoĊe postoji infiltrat, ali sastavljen preteţno od eozinofilnih granulocita (3 sluĉaja), dok u trećoj grupi uzoraka nema ćelijskog infiltrata u sluznici duodenuma (5 sluĉajeva). Detaljnim opisom morfoloških promena na biopsijskim uzorcima sluznice duodenuma pasa obolelih od LPD (promene na crevnim resicama, stepen oštećenja crevnog epitela, postojanje proširenja kripti, prisustvo dilatiranih limfnih sudova i fibroze) kao i praćenjem zastupljenosti intraepitelnih limfocita (IEL), limfocita, plazma ćelija, eozinofilnih granulocita i neutrofilnih granulocita u infiltratu sluznice, formirane su razliĉite morfološke grupe. Poznato je da limfociti nastanjuju efektorski odeljak intestinalne mukoze. Laminu epitelijalis mukoze nastanjuju intraepitelni limfociti oznaĉeni kao IEL, dok laminu propriju mukoze nastanjuju lamina propria limfociti oznaĉeni kao LPL (Guy- Grand i sar., 2005). LPL su predstavljeni T limfocima (CD4+ i CD8+ T limfociti) i B limfocitima. T limfociti predstavljaju finalno diferencirane efektorske T ćelije ĉiji su putevi stimulacije razliĉiti od onih za T limfocite periferne krvi. Sekretuju velike koliĉine citokina kao što je IFNγ, IL4, IL5. To su najvećim delom CD4+ T limfociti. B limfociti su aktivirane B ćelije i plazma ćelije koje sekretuju najvećim delom IgA. Intraepitelni limfociti su takoĊe jedinstvena populacija limfocita razliĉita od LPL. U grupi uzoraka u kojoj dominiraju limfociti i plazma ćelije, uoĉeno je skraćenje crevnih resica na 75-50% normalne duţine, a same promene su okarakterisane kao blage do umerene. Crevne resice su zadebljale, a neke su fuzionisane. Na epitelnim ćelijama zapaţaju se degenerativne promene, kao i deskvamacija epitelnih ćelija. Zapaţeno je blago do umereno proširenje 107 kripti (10 - 25% kripti je prošireno). Lamina propria je edematozna zbog prisustva obilnog ćelijskog infiltrata velikim brojem mononuklearnih ćelija, meĊu kojima dominiraju limfociti i plazma ćelije. Plazma ćelije, sa ekscentriĉno postavljenim jedrima, obiĉno u grupama ispunjavaju laminu propriju crevnih resica. Kripte su razdvojene sa 10 – 20 limfocita i plazma ćelija. Pojedinaĉni limfociti, smešteni intaepitelno (intraepitelni limfociti – IEL), zapaţaju se na epitelu crevnih resica, i to kao individualne ćelije, a retko u grupama (grozdovima). IEL su predstavljeni T limfocitima sa znaĉajnom citolitiĉkom i imunoregulatornom aktivnošću. (Abbas i sar., 2006). Rezultati dosadašnjih izuĉavanja imunološkog sistema ukuzuju da intraepitelni limfociti ĉine jedinstvenu populaciju limfocita predstavljenu T limfocitima sa znaĉajnom citolitiĉkom i imunoregulatornom aktivnošću. T - ćelijski receptor (TCR), prepoznaje peptidne antigene prezentovane u sklopu MHC molekula i predstavlja heterodimer koji se sastoji od α i β lanaca, dok manji procenat T ćelija u organizmu eksprimira receptore sastavljene od γ i δ lanaca. (Abbas i sar., 2006). Prema nekim autorima (Untersmayr i sar., 2006), ĉak 50% IEL u crevima su γδT limfociti. γδT limfociti su slabo definisanog porekla i uloge. Nekada se smatralo da su IEL zaduţeni za prvi kontakt sa antigenom (Ferguson 1977). Danas se zna da je to zadatak M ćelija. IEL luĉe u velikoj koliĉini IFNγ i IL5. Moguća funkcija je imunološki nadzor nad mutiranim ili virusom inficiranim ćelijama (Roitt i sar. 2001). IEL su izvor citokina Th2 tipa - IL13, koji podrţava produkciju IgE i alergijsku reakciju. γδTCR molekuli prepoznaju proteinske i neproteinske antigene koje uglavnom ne prezentuju klasiĉni MHC molekuli (Untersmayr i sar., 2006; Allison i sar., 2001), što ukazuje da prepoznaju konformaciju, a to je tipiĉna odlika alergena hrane, te je moguće da uĉestvuju u odgovoru na alergene hrane. Iz rezultata drugih istraţivaĉa koji su se bavili ispitivanjem imunofenotipskih karakteristika ćelija u uzorcima sluznice duodenuma zdravih pasa, poznato je da na CD3 antitelo pozitivno reaguju pojedinaĉni limfociti u lamini propriji mukoze i u lamini epitelijalis mukoze. Istovremeno je ustanovljeno da na CD79 antitelo pozitivno reaguju pojedinaĉni limfociti u lamini propriji mukoze (Day i sar., 2008). Imunohistohemijskim ispitivanjem uzoraka sluznice duodenuma obolelih pasa u našem materijalu, uoĉena je ekspresija CD3+ (T limfocita) i CD79+ (B limfocita). Kod ispitanih uzoraka, kod 31 psa u inflamatornom infiltratu dominiraju ćelije CD3+ 108 imunofenotipa. Pozitivna imunohemijska reakcija je ispoljena nalazom precipitata tamnosmeĊe boje u predelu ćelijske membrane T limfocita, tako da je prisutan tzv. membranski precipitat. Reakcija reĊe zastupljenih B limfocita, više je difuznog karaktera. B limfociti dominiraju u 2 sluĉaja. U 13 sluĉaja postoji ravnomerno mešoviti limfocitno - plazmocitni infiltrat. U literaturi se moţe naći mnoštvo podataka o psima obolelim od limfocitno – plazmocitnog duodenitisa. MeĊutim, o psima kod kojih se u biopsijskom uzorku duodenuma uoĉava dominacija plazmocita, dominacija limfocita ili mešoviti infiltrat plazmocita i limfocita, podaci su veoma oskudni. U našem istraţivanju smo uporeĊivali broj leukocita, limfocita, koncentraciju ukupnih proteina, koncentraciju serumskih albumina kao i vrednosti indeksa CIBDAI i CCECAI kod pasa obolelih od LPD, ali sa dominacijom razliĉitih ćelija u infiltratu (tabela 32, tabela 33, tabela 34, tabela 35, tabela 38 i tabela 39). Psi sa ravnomerno mešovitim infiltratom su pokazali najveće srednje vrednosti za broj leukocita i limfocita, kao i najniţe srednje vrednosti za koncentraciju ukupnih proteina i koncentraciju serumskih albumina. Kod ovih pasa ustanovljene su najveće srednje vrednosti kliniĉkih indeksa CIBDAI i CCECAI. Promene uoĉene patohistološkim ispitivanjem su okarakterisane kao blage do umerene. MeĊutim, kod pasa sa dominacijom plazmocita u infiltratu, koji su imali najniţe srednje vrednosti broja leukocita i limfocita, najveće srednje vrednosti koncentracije ukupnih proteina i serumskih albumina kao i najniţe srednje vrednosti kliniĉkih indeksa CIBDAI i CCECAI, patohistološke promene na biopsijskim uzorcima okarakterisane su kao umerene. Iz navedenog se moţe zakljuĉiti da kliniĉka manifestacija LPD ne odraţava uvek patohistološku sliku. Ukoliko odreĊenom psu na osnovu kliniĉkih ispitivanja budu izraĉunati indeksi CIBDAI i CCECAI koji bi ga svrstali u grupu pasa obolelih od blagih enteropatija, to ne mora da podrazumeva blage promene u patohitološkom nalazu, ili pak ukoliko odreĊenom psu na osnovu kliniĉkih ispitivanja budu izraĉunati indeksi CIBDAI i CCECAI koji bi ga svrstali u grupu pasa obolelih od srednjih ili intenzivnih enteropatija, to ne mora da podrazumeva uvek intenzivne promene u patohitološkom nalazu, već promene mogu biti i blage ili umerene. Do sliĉnih rezultata došli su i Allenspach* i saradnici (2009) koji navode da u svojim istraţivanjima nisu mogli da uspostave korelaciju kliniĉke aktivnosti (kliniĉkih indeksa) sa 109 patohistološkim nalazom. Ovi autori sugerišu da su pri oceni intenziteta bolesti promene u mikroarhitekturi crevnih resica od većeg znaĉaja nego sam ćelijski infiltrat. Na ovaj naĉin bi se moţda moglo objasniti zašto naki psi oboleli od LPD, u našem istraţivanju, imaju visoke indekse CIBDAI i CCECAI, a blage patohistološke promene na biopsijskim uzorcima, dok pojedini psi imaju niske kliniĉke indekse, a promene na biopsijskim uzorcima su okarakterisane kao umerene ili znaĉajne. Na osnovu do sada iznetih rezultata je oĉigledno da se na osnovu kliniĉke dijagnostike, ultrazvuĉnog, rendgenskog i endoskopskog nalaza ne moţe sa sigurnošću tvrditi o kom tipu zapaljenja creva se radi. Ne postoje jasne razlike u rezultatima kliniĉkih ispitivanja kod pasa obolelih od razliĉitih vrsta enteropatija. Jedino se patohistološkom analizom uz opis pratećih morfoloških promena i opis ćelija koje se nalaze u infiltratu moţe postaviti definitivna dijagnoza. Ipak, naši rezultati, kao i podaci iz literature, ukazuju da postoji potreba za daljim istraţivanjima u smeru utvrĊivanja u kojoj meri promene mikroarhitekture crevnih resica, a u kojoj meri sam ćelijski infiltrat utiĉu na kliniĉku manifestaciju limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa.. 110 7. ZAKLJUČCI Na osnovu sprovedenih istraţivanja, doneti su sledeći zakljuĉci: 1. Vrednost kliniĉkih indeksa CIBDAI i CCECAI kod obolelih pasa, koji se izraĉunavaju na osnovu podataka dobijenih kliniĉkim pregledom, ukazuju na intenzitet kliniĉke manifestacije duodenitisa. Kliniĉke manifestacije limfocitno – plazmocitnog duodenitisa (LPD) mogu da variraju od blage do vrlo intenzivne, što nije odreĊeno tipom infiltrata. 2. UtvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika za vrednosti broja leukocita i limfocita izmeĊu pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (p≤0,01). Nije utvrĊena statistiĉka znaĉajnost razlike za vrednosti eozinofilnih granulocita i eritrocita. 3. UtvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika za vrednosti koncentracije ukupnih proteina i koncentracije serumskih albumina izmeĊu pasa obolelih od LPD i kontrolne grupe pasa (p≤0,01). Nije utvrĊena statistiĉka znaĉajnost razlike za vrednosti ALT, AST i AP. 4. Ultrazvuĉnom, radiološkom i endoskopskom dijagnostikom nije moguće napraviti razliku izmeĊu razliĉitih tipova inflamatorne bolesti creva. 5. Patohistološkom analizom biopsijskih uzoraka duodenuma pasa obolelih od LPD, kod 46 pasa je utvrĊen limfocitno - plazmocitni infiltrat u sluznici creva. 6. Imunohistohemijskom analizom 46 biopsijskih uzoraka duodenuma, kod kojih je patohistološkom analizom uoĉen limfocitno - plazmocitni infiltrat u sluznici creva, ustanovljeno je da u 2 uzorka postoji dominacija plazma ćelija, u 31 uzorku dominiraju 111 CD3+ T limfociti, dok je u 13 uzoraka ustanovljen ravnomerno mešoviti infiltrat limfocita i plazma ćelija. 7. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CIBDAI i CCECAI unutar grupe pasa obolelih od limfocitno - plazmocitnog duodenitisa, eozinofilnog duodenitisa i kataralnog duodenitisa pasa, ustanovljeno je da su najviše proseĉne vrednosti za CIBDAI i za CCECAI bile kod pasa sa LPD, a najmanje proseĉne vrednosti za CIBDAI i CCECAI su bile kod pasa sa kataralnim duodenitisom. Analizom statistiĉkih pokazatelja za CIBDAI i CCECAI unutar grupe pasa obolelih od LPD, ustanovljena je signifikantna razlika (p≤0,05) izmeĊu proseĉne vrednosti za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom i proseĉne vrednosti pasa sa preteţno plazmocitnim infiltratom. Statistiĉki vrlo znaĉajno (p≤0,01) je veća proseĉna vrednost za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa mešovitim infiltratom u odnosu na proseĉnu vrednost za CIBDAI i CCECAI kod pasa sa preteţno limfocitnim infiltratom. 112 8. LITERATURA 1. Abbas A.K., Andrew A.H., Basic immunology., 2006-2007, 2 nd edition; Elsevier Inc, New York, USA 2. Allenspach K., 2011, Clinical immunology and immunopathology of the canine and feline intestine, Vet. Clin. North. Am. Small. Anim. Pract., 41(2): 345-60 3. Allenspach K * ., 2009, IBD nel cane:nuove possibilita diagnostiche, 62 o Congresso Internazionale Multisala SCIVAC, Rimini, Italy, Proceedings of the Internacional SCIVAC Congress, pp: 25-26 4. Allenspach K., 2009, Patogenesi dell , IBD nel cane, 62 o Congresso Internazionale Multisala SCIVAC, Rimini, Italy, Proceedings of the Internacional SCIVAC Congress, pp: 21-22 5. Allenspach K., Wieland B., Grone A., Gaschen F., 2007, Chronic enteropathies in dogs:evaluation of risk factors for negative outcome, J. Vet. Intern. Med., 21(4): 700-708 6. Allenspach K.,Gaschen F., 2003, Chronic intestinal diseases in the dog: a review, Schweiz. Arch. Tierheilkd, 145(5): 209-219, 221-222 7. Allison T.J., Winter C.C., Fournie J.J., Bonneville M., Garboczi D.N., 2001, Structure of human gammadelta T cell antigen receptor, Nature., 411: 820-824 8. Baez J.L., Hendrick M.J., Walker L.M., Washabau R.J., 1999, Radiographic, ultrasonographic, and endoscopic findings in cats with inflammatory bowel disease of the stomach and small intestine: 33 cases (1990–1997), J. Am. Vet. Med. Assoc., 215: 349–354 113 9. Banks W. J., 1986, Applied veterinary histology, 1 st edition, Williams and Wilkins, Baltimore 10. Baum B., Meneses F., Kleinschmidt S., Nolte I., Hewicker-Trautwein M., 2007, Age- related histomorphologic changes in the canine gastrointestinal tract: A histologic and immunohistologic study, World J. Gastro., 13: 152–157 11. Biller B.J., Elmslie R.E., Burnett R.C., Avery A.C., Dow S.W., 2007, Use of FoxP3 expression to identify regulatory T cells in healthy dogs and dogs with cancer, Vet. Immunology and Immunopathology, 116: 69-78 12. Brandtzaeg P., Johansen F-E., 2005, Mucosal B cells: phenotypic characteristics, transcriptional regulation, and homing properties, Immunol. Rev., 206: 32-63 13. Brandtzaeg P., Kiyono H., Pabst R., Russell M.W., 2008, Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue, Mucos. Immunol. 1: 31–37 14. Breitschwerdt E.B., Halliwel W.H., Foley C.W., Stark D.R., Corwin L.A., 1980, A hereditary diarrhetic syndrome in the Basenji characterized by malabsorption protein losing enteropathy and hypergammaglobulinemia, J. Am. Anim. Hosp. Assoc., 16: 551-560 15. Budras K. D., M c Carthy P. H., Fricke W., Richter R., 2002, Anatomy of the dog, 4 th edition, Schlutersche GmbH&Co. KG, Verlag und Druckerei 16. Cave N.J., 2003, Chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract of companion animals, N. Z.Vet.J., 51(6): 262-274 17. Cerquetella M., Spaterna A., Laus F., Tesei B., Rossi G., Antonelli E., Villanacci V., Bassotti G., 2010, Inflammatory bowel disease in the dog: Differences and similarities with humans, World J. Gastroenterol., 16(9): 1050-1056 114 18. Chehade M., Mayer L., 2005, Oral tolerance and its relation to food hypersensitivities, J. Allergy Clin. Immunol., 115: 3-12 19. Chichlowski M., Hale L.P., 2008, Bacterial-mucosal interactions in inflammatory bowel disease, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 295(6): G1139–G1149 20. Craven M., Simpson J.W., Ridyard A.E., Chandler M.L., 2004, Canine inflammatory bowel disease: retrospective analysis of diagnosis and outcome in 80 cases ( 1995-2002), The Journal of Small Animal Practice, 45: 336-342 21. Cunningham-Rundles C., 2001, Physiology of IgA and IgA deficiency, J. Clin. Immunol., 21: 303-309 22. Day M.J., Bilzer T., Mansell J., Wilcock B., Hall E.J., Jergens A., Minami T., Willard M., Washabau R., 2008, Histopathological standards for the diagnosis of gastrointestinal inflammation in endoscopic biopsy samples from the dog and cat: A report from the World Small Animal Veterinary Association Gastrointestinal Standardization Group, J. Comp. Path., 137: S1–S43 23. Delves P.J., Roitt I.M.: 2000. The immune system: First of two parts; Review article, Advances in Immunol., 343(1): 37-49 24. Desnoyers M., 2004, Gastrointestinal tract and pancreas in Cowell R.L.: Veterinary clinical pathology secrets, first edition, Elsevier Inc. Mosby, USA 25. Eldredge D.M., Carlson L.D., Carlson D.G., Giffin J.M., Adelman B., 2007, Dog owner's home veterinary handbook, 4 th edition, Wiley publishing, Howell Book House, New Jersey; pp: 283-284 115 26. Ellenberger Y., Baum H., 1977, Handbuch der vergleichenden anatomie der haustiere, 18. auflage, Springer - Verlag Berlin, Heidelberg, New York 27. Evans H. E., 1993, Miller , s anatomy of the dog, 3 rd edition, Saunders, An Imprint of Elsevier, Philadelphia 28. Ferguson A., 1977, Intraepithelial lymphocytes of the small intestine, Gut, 18: 921-937 29. Fogle J.E., Bissett S.A., 2007, Mucosal immunity and chronic idiopathic enteropathies in dogs, Compendium Vet.com., pp: 290-302 30. Foneseca-Alves C.E., Correa A.G., Elias F., 2012, Eosinophilic gastroenteritis in basset hound dog, J. Anim. Sci., 2(2): 110-112 31. Garcia-Sancho M., Rodriguez-Franco F., Sainz A., Mancho C., Rodriguez A., 2007, Evaluation of clinical, macroscopic, and histopathologic response to treatment in nonhypoproteinemic dogs with lymphocytic - plasmacytic enteritis, J. Vet. Intern. Med., 21(1): 11-17 32. Garcia-Sancho M., Sainz A., Villaescusa A., Rodriguez A., Rodriguez-Franco F., 2011, White spots on the mucosal surface of the duodenum in dogs with lymphocytic plasmacytic enteritis, J. Vet. Sci., 12(2): 165-169 33. Gaschen F.P., Martin M.L., 2011, Clinical phenopype of chronic enteropathies in the dog, “Nestle Purina Nutrition Symposium: Gastrointestinal Immunopathology“, Lausanne. Switzerland, pp: 15-24 34. German A.J., Hall E.J., Day M.J., 1999, Analysis of leucocyte subsets in the canine intestine, J. Comp. Path., 120: 129–145 116 35. German A.J., Hall E.J., Day M.J., 2000, Relative deficiency in IgA production by duodenal explants from German shepherd dogs with small intestinal disease, Vet. Immunol. Immunopathol, 76: 25-43 36. German A.J., Hall E.J., Day M.J., 2001, Immune cell populations within the duodenal mucosa of dogs with enteropathies, J. Vet. Intern. Med, 15(1): 14-25 37. German A.J., Hall E.J., Day M.J., 2003, Chronic intestinal inflammation and intestinal disease in dogs, J. Vet. Intern. Med., 17: 8-20 38. German A.J., Hall E.J., Moore P.F., Ringler D.J., Newman J., Day M.J., 1999, The distribution of lymphocytes expressing alphabeta and gammadelta T-cell receptors, and the expression of mucosal addressin cell adhesion molecule-1 in the canine intestine, J. Comp. Pathol., 121(3): 249-63 39. Gomez J.A., Russell S.W., Trowbridge J.O., Lee J., 1977, Canine histiocytic ulcerative colitis. An ultrastructural study of the early mucosal lesion, Dig. Dis. Sci., 22(6): 485-496 40. Guy-Grand D., Griscelli C., Vassali P., 1974, The gut-associated lymphoid system: nature and properties of the large dividing cells, European J. Immunol., [2005, onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/eji.1830040610] 4(6): 435-443 41. Guy-Grand D., Vassalli P., 2002, Gut intraepithelial lymphocyte development, Curr. Opin. Immunol., 14(2): 255-9 42. Hall E.J., Rutgers H.C., Scholes S.F.E., Middleton D. J., Tennant B.J., King N.M., Kelly D.F., 1994, Histiocytic ulcerative colitis in boxer dogs in the UK, J. Small. Anim. Pract., 35(10): 509-515 117 43. Hart J.R., Shaker E., Patnaik A.K., Garvey M.S., 1994, Lymphocytic - plasmacytic enterocolitis in cats: 60 cases (1988–1990), J. Am. Anim. Hosp. Assoc., 30: 505–514 44. Harvey R.F., Bradshaw J.M., 1980, A simple index of Crohn , s-disease activity, Lancet, 315(8167): 1-514 45. Hendrickson B.A., Gokhale R., Cho J.H., 2002, Clinical aspect and patophysiology of inflammatory bowel disease, Clin. Microbiol. Rev., 15(1): 79-94 46. Hershberg R.M., Mayer L.F., 2000, Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells - polarity and complexity, Immunol. Today, 21(3): 123-128 47. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/Treg.html 48. http://www.ebioscience.com/knowledge-center/cell-type/t-regulatory-cells 49. Jacobs G., Collins-Kelly L., Lappin M., Tyler D., 1990, Lymphocytic - plasmacytic enteritis in 24 dogs, J. Vet. Intern. Med, 4(2): 45-53 50. Janeczko S., Atwater D., Bogel E., Greiter-Wilke A., Gerold A., Baumgart M., Bender H., McDonough P.L., McDonough S.P., Goldstein R.E., Simpson K.W., 2008, The relationship of mucosal bacteria to duodenal histopathology, cytokine mRNA, and clinical disease activity in cats with inflammatory bowel disease, Vet. Microbiol., 128(1-2): 178– 193 51. Janković Ţ., Stanojević D., Miladinović Ţ., 1991, Anatomija domaćih ţivotinja sisara – Angiologija, 1. izdanje, Veterinarski fakultet u Beogradu, Savez veterinara i veterinarskih tehniĉara Jugoslavije, Odbor za izdavaĉku delatnost, Beograd 118 52. Jergens A.E., Crandell J., Morrison J.A., Deitz K., Pressel M., Ackermann M., Suchodolski J.S., Steiner J.M., Evans R., 2010, Comparison of oral prednisone and prednisone combined with metronidazole for induction therapy of canine inflammatory bowel disease: a randomized-controlled trial, J. Vet. Intern. Med, 24(2): 269-277 53. Jergens A.E., Gamet Y., Moore F.M., Niyo Y., Tsao C., Smith B., 1999, Colonic lymphocyte and plasma cell populations in dogs with lymphocytic - plasmacytic colitis. An immunohistochemical and morphometric study, Am. J. Vet. Res., 60(4): 515–520 54. Jergens A.E., Moore F.M., Heynes J.S., Miles K.G., 1992, Idiopathic inflammatory bowel disease in dogs and cats. 84 cases (1987-1990), J. Am. Vet. Med. Assoc., 201(10): 1603-1608 55. Jergens A.E., Moore F.M., Kaiser M.S., Haynes J.S., Kinyon J.M., 1996, Morphometric evaluation of immunoglobulin A-containing and immunoglobulin G-containing cells and T cells in duodenal mucosa from healthy dogs and from dogs with inflammatory bowel disease or nonspecific gastroenteritis, Am. J. Vet. Res., 57(5): 697-704 56. Jergens A.E., Moore F.M., March P., Miles K.G., 1992, Idiopathic inflammatory bowel disease associated with gastroduodenal ulceration-erosion: a report of nine cases in the dog and cat, J. Am. Anim. Hosp. Assoc., 28(1): 21-26 57. Jergens A.E., Schreiner C.A., Frank D.E., Niyo Y., Ahrens F.E., Eckersall P.D., Benson T.J., 2003, A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease, J. Vet. Intern. Med., 17(3): 291-297 58. Jergens A.E., 2004, Clinical assessment of disease activity for canine inflammatory bowel disease, J. Am. Anim. Hosp. Assoc., 40(6): 437-445 119 59. Jergens A.E., 2008, Inflammatory bowel disease in the dog (IBD). Dog Health by Lowchens Australia.com; http://www.lowchenaustralia.com./health/boweldisease.htm 60. Junqueira L. C.,Carneiro J., Kelley O. R., 1995, Basic histology, 8 th edition, Guanabara Koogan S.A., Rio de Janeiro, Brasil 61. Kleinschmidt S., Meneses F., Nolte I., Hewicker-Trautetwein M., 2008, Distribution of mast cell subtypes and immune cell populations in canine intestines: evidence for age- related decline in T cells and macrophages and increase of IgA-positive plasma cells, Res. Vet. Sci., 84(1): 41-48 62. Kobayashi S., Ohno K., Uetsuka K., Nakashima K., Setoguchi A., Fujino Y., Tsujimoto H., 2007, Measurement of intestinal mucosal permeability in dogs with lymphocytic- plasmacytic enteritis, J. Vet. Med. Sci., 69(7): 745-749 63. Konig H. E., Liebich H. G., 2009, Veterinary anatomy of domestic mammals, Textbook and colour atlas, 4 th edition, Schattauer GmbH Stuttgart 64. Korzenik J.R., 2005, Past and current theories of etiology of IBD. - Toothpaste, worms and refrigerators, J. Clin. Gastroenterol., 39(2): 59-65 65. Krstić N., Krstić V., 2007, Rendgenološka i endoskopska dijagnostika oboljenja digestivnog i respiratornog sistema pasa i maĉaka, 1. izdanje, Fakultet veterinarske medicine u Beogradu, Nauĉna KMD 66. Kull P.A., Hess R.S., Craig L.E., Saunders H.M., Washabau R.J., 2001, Clinical, clinicopathologic, radiographic, and ultrasonographic characteristics of intestinal lymphangiectasia in dogs: 17 cases (1996–1998), J. Am. Vet. Med. Assoc., 219(2): 197– 202 120 67. Lecoindre P., Chevallier M., Guerret S., 2010, Les entereropathies exsudatives d`origine non neoplastique du chien: etude retrospective de 34 cas, Schweizer Archiv fuer Tierheilkunde, 152(3): 141-146 68. Lecoindre P., 2006, Chronic inflammatory bowel diseases, etiopathogeny, diagnosis, Bull. Acad. Vet. France, Tome 159(N o 4): 333-342 69. Luckschander N., Allenspach K., Hall J., Seibold F., Grone A., Doherr M.G., Gaschen F., 2006, Perinuclear antineutrophilic cytoplasmic antibody and response to treatment in diarrheic dogs with food responsive disease or inflammatory bowel disease, J. Vet. Intern. Med., 20(2): 221-227 70. Macpherson A.J., Hunziker L., McCoy K., Lamarre A., 2001, IgA responses in the intestinal mucosa against pathogenic and non-pathogenic microorganisms, Microbes Infection., 3: 1021-1035 71. Malewska K., Rychlik A., Nieradka R., Kander M., 2011, Treatment of inflammatory bowel disease (IBD) in dogs and cats, Pol. J. Vet. Sci., 14(1): 165-171 72. Marchetti V., Lubas G., Lombardo A., Corazza M., Guidi G., Cardini G., 2010, Evaluation of erytrocytes, platelets, and serum iron profile in dogs with chronic enteropathy, Vet. Med. Int., pp: 1-8 (PubMed – published online 2010 july) 73. Marks S.L., Cave N., 2011, Dietary modulation of intestinal mucosa integrity, “Nestle Purina Nutrition Symposium: Gastrointestinal Immunopathology“, Lausanne. Switzerland, pp: 7-14 74. Mayer L., 1998, Current concepts in mucosal immunity. I. Antigen presentation in the intestine: new rules and regulations, Am. J. Physiol., 274(1): G7-9 121 75. Mayer L., 2000, Mucosal immunity and gastrointestinal antigen processing, J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 30(1): S4-12 76. Mayer L., 2003, Mucosal immunity, Pediatrics, 111(6): 1595-1600 77. McTavish S., 2002, Eosinophilic gastroenteritis in a dog, Can. Vet. J., 43: 463-465 78. Miller M. E., Christensen J.C., Evans H.E., 1964, Anatomy of the dog, 1 st edition, W. B. Saunders Company Philadelphia - London 79. Münster M., Hörauf A., Bilzer T., 2006, Assessment of disease severity and outcome of dietary, antibiotic, and immunosuppressive interventions by use of the canine IBD activity index in 21 dogs with inflammatory bowel disease, Berl. Münch. Tierärztl. Wochenschr., 119(11-12): 493–505 80. Munster M., Suchodolski J.S., Bilzer T., Bilzer T., Horauf A., Steiner J.M., 2010, Influence of physiological disturbances on treatment success of dietary therapy in dogs with chronic enteropathies, Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr, 123(1-2): 74-82 81. Nagler-Anderson C., 2001, Strategic defences in the intestinal mucosa, Nat. Rev. Immunol, 1(1): 59-67 82. Nandakumar S., Miller C.W.T., Kumarguru U., 2009, T regulatory cells: an overview and intervention techniques to modulate allergy outcome, Clinical Molecular Allergy, 7: 5- 13 83. Nelson R.W., Cuoto C.G., 2003, Disorders of the intestinal tract in Small animal internal medicine, 3 rd edition Mosby, Inc Elsevier, S th Louis, Missouri, pp: 431-463 122 84. Neutra M.R., Mantis N.J., Kraehenbuhl J.P., 2001, Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues, Nat. Immunol., 2: 1004-1009 85. Nicoletti C., 2000, Unsolved mysteries of intestinal M cells, Gut, 47: 735-739 86. Nomina anatomica veterinaria, 2005, 5 th edition, Editorial Committee, Hannover, Columbia, Gent, Sapporo 87. O , Garra A., Vieira P., 2004, Regulatory T cells and mechanisms of immune system control, Nature Medicine, 10(8): 801-805 88. Pantić V., 1987, Histologija, 2. izdanje, IRO „Nauĉna knjiga“, Beograd 89. Paulsen D.B., Buddington K.K., Buddington R.K., 2003, Dimensions and histologic characteristics of the small intestine of dogs during postnatal development, Am. J. Vet. Res., 64(5): 618–626 90. Roitt I., Brostoff J., Male D., 2001, Immunology, 6 th edition, Mosby, Harcuort Publishers Limited 91. Roth L., Walton A.M., Leib M.S., Burrows C.F., 1990, A grading system for lymphocytic plasmacytic colitis in dogs, J. Vet. Diagn. Investig., 2(4): 257–262 92. Rouse B.T., 2007, Regulatory T cells in health and disease, J. Int. Med., 262: 78-95 93. Rousseau M., 2005, Severe lymphocytic - plasmacytic and atrophic gastritis, as well as, predominantly eosinophilic severe enteritis, in a 19-month-old Labrador retriever, Can. Vet. J., 46(3): 264-267 123 94. Rutgers H.C., Batt R.M., Kelly D.F., 1988, Lymphocytic - plasmacytic enteritis associated with bacterial overgrowth in a dog, J. Am. Vet. Med. Assoc., 192(12): 1739- 1742 95. Rychlik A., Nieradka R., Kander M., Depta A., Nowicki M., Sarti K., 2007, Usefulness of endoscopic examination for the diagnosis of inflammatory bowel disease in the dog, 10(2): 113-118 96. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Masahiro O., 2008, Regulatory T cells and immune tolerance, Cell. 133(5): 775-787 97. Sartor R.B., 2006, Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn's disease and ulcerative colitis, Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol., 3(7): 390–407 89. Serra S., Jani P.A., 2006, An approach to duodenal biopsies, J. Clin. Pathol., 59(11): 1133-1150 99. Simić V., Janković Ţ.,1997, Anatomija domaćih ţivotinja – Splanchnologija, 4. izdanje, Veterinarski fakultet u Beogradu, Veterinarska komora Srbije, Beograd 100. Sisson S., 1953, Anatomija domaćih ţivotinja, Poljoprivredni nakladni zavod, Zagreb 101. Simpson K.W., Jergens A.E., 2011, Pitfalls and progress in the diagnosis and management of canine inflammatory bowel disease, Vet. Clin. North. Am. Small. Anim. Pract., 41(2): 381-398 102. Simpson K.W., 2011, The relationship between mucosal bacteria and IBD in dogs and cats, “Nestle Purina Nutrition Symposium: Gastrointestinal Immunopathology“, Lausanne, Switzerland, pp: 25-30 124 103. Simpson K.W., 1994, Small intestinal bacterial overgrowth, J. Am. Vet. Med. Assoc., 205(3): 405-407 104. Snook J., 1990, Are the inflammatory bowel diseases autoimmune disorders? Gut, 31: 961-963 105. Spinato M.T., Barker I.K., Houston D.M., 1990, A morphometric study of the canine colon: comparison of control dogs and cases of colonic disease, Can. J. Vet. Res., 54(4): 477-486 106. Spohr A., Koch J., Jensen A.L., 1995, Ultrasonographic findings in a basenji with immunoproliferative enteropathy, J. Small Anim. Pract., 36(2): 79-82 107. Stevanović J., 2004, Fiziologija organa za varenje kod domaćih ţivotinja, 1. izdanje, Fakultet vetrinarske medicine u Beogradu, Mladost biro šped, Beograd 108. Stojić V., 1996, Veterinarska fiziologija, IP „Nauĉna knjiga“, Beograd 109. Stonehewer J., Simpson J.W., Else R.W., Macintyre N., 1998, Evaluation of B and T lymphocytes and plasma cells in colonic mucosa from healthy dogs and from dogs with inflammatory bowel disease, Res. Vet. Sci., 65(1): 59–63 110. Strombeck D.R., Guilford W.G.,1996, Idiopathic inflammatory bowel disease, Small Anim Gastroenterology, 3 th edition, Saunders; pp: 451-486 111. Tams T. R., 2003, Handbook of small animal gastroenterology, 2 nd edition, Saunders, Elsevier Science, USA 125 112. Tischendorf J.J., Wopp K., Streetz K.L., Bach J., Meyer M., Tischendorf S., Gassier N., Wasmuth H.E., Trautwein C., Winograd R., 2008, The value of duodenal biopsy within routine endoscopy: a prospective study in 1000 patients, Z. Gastroenterol., 46(8): 771-775 113. Trpinac D., 1994., Histologija za studente farmacije, 2. izdanje, Ecolibri, Beograd 114. Untersmayr E., Jensen-Jarolim E., 2006, Mechanisms of type I food allergy, Pharmacology & Therapeutics, 112: 787-798 115. van der Gaag I., Happe R.P., 1990, The histological appearance of peroral small intestinal biopses in clinically healthy dogs and dogs with chronic diarrhea, Zentralbl. Veterinarmed. A., 37(6): 401-416 116. Waly N., Gruffydd-Jones T.J., Stokes C.R., Day M.J., 2001, The distribution of leucocyte subsets in the small intestine of healthy cats, J. Comp. Pathol., 124(2-3): 172–182 117. Waly N.E., Stokes C.R., Gruffydd-Jones T.J., Day M.J., 2004, Immune cell populations in the duodenal mucosa of cats with inflammatory bowel disease, J. Vet. Intern. Med., 18(6): 816–825 118. Washabau R.J., Day M.J., Willard M.D., Hall E.J., Jergens A.E., Mansell J., Minami T., Bilzer T.W., 2010, Endoscopic, biopsy, and histopathologic guidelines for the evaluation of gastrointestinal inflammation in companion animals, J. Vet. Intern. Med., 24: 10–26 119. Washabay R.J., 2010, Canine inflammatory bowel disease: diagnosis and therapy, „110th Pen Annual Conference“. Companion Animal – Gastrointestinal issues. pp: 98-105 126 120. Whitley N.T., Day M.J., 2011, Immunomodulatory drugs and their application to the management of canine immune-mediated disease, J. Small Anim. Pract., 52: 70-85 121. Willard M.D., Jergens A.E., Duncan R.B., Leib M.S., McCracken M.D., DeNovo R.C., Helman R.G., Slater R.G., Harbison J.L., 2002, Interobserver variation among histopathologic evaluations of intestinal tissues from dogs and cats, J. Am. Vet. Med. Assoc., 220(8): 1177–1182 122. Yamasaki K., Suematsu H., Takahashi T., 1996, Comparison of gastric and duodenal lesions in dogs and cats with and without lymphocytic - plasmacytic enteritis, J. Am. Vet. Med. Assoc., 209(1): 95–97 123. York I.A., Goldberg A.L., Mo X.Y., Rock K.L., 1999, Proteolysis and class I major histocompatibility complex antigen presentation, Immunol. Rev., 172: 49-66 124. Zentek J., Hall E.J., German A.J., Haverson K., Bailey M., Rolfe V., Butterwick R., Day M.J., 2002, Morphology and immunopathology of the small and large intestine in dogs with nonspecific dietary sensitivity, J. Nutr., 132(6 Suppl 2): 1652S–1654S BIOGRAFIJA Milena M. Đorđević, po zanimanju diplomirani veterinar i molekularni biolog, rođena je 19.03.1972. u Beogradu. 1990. je upisala Biološki fakultet na PMF-u Beogradu, - studijska grupa: Molekularna biologija i fiziologija. Diplomirala je 1998. sa srednjom ocenom 9,56. Godine 1999. upisala se na Fakultet veterinarske medicine u Beogradu, a diplomirala je 2005. sa srednjom ocenom 9,05. Tokom studiranja ova dva fakulteta bila je stipendista Republike Srbije, i Biološkog fakulteta (1992.), a i Fakulteta veterinarske medicine (2001.). 1993. boravila je tri meseca u dve istraživačke laboratorije za genetiku – u Rimu i u Pizi. Boravila je 2005. tri meseca u Veterinarskoj klinici za lečenje malih životinja u Parizu kao i mesec dana (2008.) na Fakultetu veterinarske medicine Univerziteta u Bolonji. Volonterski je radila u privatnoj veterinarskoj ambulanti u Beogradu (2003. – 2008.). Doktorske akademske studije upisala je školske 2006./07. iz oblasti „Klinička patologija i terapija životinja“ na Fakultetu veterinarske medicine u Beogradu, te položila sve ispite predviđene planom i programom nastave. Učestvovala je 2007. i 2012. na Seminaru za inovacije znanja veterinara (FVM Beograd). Tokom 2008. učestvovala je na edukaciji iz anesteziologije i reanimacije pasa i mačaka (FVM, Beograd), zatim u WSAVA Continuing Education Course: Feline medicine. (Beograd), a i na praktičnoj obuci iz ultrazvučne dijagnostike u veterini (Niš). Od 01.11.2010. je zaposlena na Fakultetu veterinarske medicine, a u svojstvu asistenta za predmet Anatomija. U okviru svog istraživačkog rada objavila je 11 naučnih i stručnih radova. 2011. i 2012. odrzala je predavanja na sajmu konjarstva „Horseville“ u Novom Sadu. Aktivno se bavi konjičkim sportom. Osnivač je i predsednik KK „Favorit“ a predsednik je i Konjičkog saveza Beograda. Prilog 1. Izjava o autorstvu Potpisana ___________________________________________________________________ broj upisa____________________________________________________________________ Izjavljujem da je doktorska disertacija po naslovom Morfološke, imunofenotipske i kliničke karakteristike limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa  rezultat sopstvenog istraživačkog rada,  da predložena disertacija u celini ni u delovima nije bila predložena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visokoškolskih ustanova,  da su rezultati korektno navedeni  da nisam kršio/la autorska prava i koristio/la intelektualnu svojinu drugih lica. U Beogradu, ______________ Potpis doktoranda ________________________ Prilog 2. Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Ime i prezime autora: Milena Đorđević Broj upisa_____________________________________________________________ Studijski program: doktorske akademske studije Naslov rada: Morfološke, imunofenotipske i kliničke karakteristike limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa Mentor: Prof. Dr Vanja Krstić Potpisana Milena Đorđević izjavljujem da je štampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao što su ime i prezime, godina i mesto rođenja i datum odbrane rada. Ovi lični podaci mogu se objaviti na mrežnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. U Beogradu, ___________________ Potpis doktoranda _____________________ Prilog 3. Izjava o korišćenju Ovlašćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: Morfološke, imunofenotipske i kliničke karakteristike limfocitno - plazmocitnog duodenitisa pasa koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji poštuju odredbe sadržane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio/la. 1. Autorstvo 2. Autorstvo – nekomercijalno 3. Autorstvo – nekomercijalno – bez prerade 4. Autorstvo – nekomercijalno – deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo – bez prerade 6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima (Molimo da zaokružite samo jednu od šest ponuđenih licenci, kratak opis licenci dat je na poleđini lista) U Beogradu,____________________ Potpis doktoranda ______________________