U N I V E R Z I T E T U B E O G R A D U FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Pavle D. Gavrilovi ISPITIVANJE UTICAJA ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE NA POJAVU PATOMORFOLOŠKIH PROMENA U RESPIRATORNIM ORGANIMA BROJLERSKIH RODITELJA I FAZANA NAKON VEŠTAKE INFEKCIJE doktorska disertacija Beograd, 2013. U N I V E R S I T Y O F B E L G R A D E FACULTY OF VETERINARY MEDICINE Pavle D. Gavrilovi EXAMINATION OF THE INFLUENCE OF ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE ON THE APPEARANCE OF PATHOMORPHOLOGICAL LESIONS IN RESPIRATORY ORGANS OF BROILER BREEDERS AND PHEASANTS AFTER EXPERIMENTAL INFECTION Doctoral Dissertation Belgrade, 2013. Mentor: dr Milijan Jovanovi, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine, Katedra za patološku morfologiju lanovi komisije: dr Milijan Jovanovi, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine, Katedra za patološku morfologiju dr Ružica Ašanin, redovni profesor u penziji, Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine, Katedra za mikrobiologiju sa imunologijom dr Vojin Iveti, viši nauni saradnik, Nauni institut za veterinarstvo Srbije, Beograd, Odeljenje za patološku morfologiju  Datum odbrane:  ISPITIVANJE UTICAJA ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE NA POJAVU PATOMORFOLOŠKIH PROMENA U RESPIRATORNIM ORGANIMA BROJLERSKIH RODITELJA I FAZANA NAKON VEŠTAKE INFEKCIJE REZIME Prvi podaci o oboljenju prouzrokovanom O. rhinotracheale datiraju iz 1991. godine kada je u južnoj Africi, Jan du Preez (Žan di Prez) otkrio novo oboljenje brojlera koje se manifestovalo blagim respiratornim simptomima. Bakteriološkim ispitivanjem organa obolelih brojlera otkrivena je gram-negativna, pleomorfna, štapiasta bakterija, sporog rasta, koja se nije mogla identifikovati kao neka od poznatih bakterijskih vrsta. Današnji naziv Ornithobacterium rhinotracheale prihvaen je 1994. godine, kada je izvršena i klasifikacija uzronika. Prema podacima iz literature infekcija O. rhinotracheale dovodi do znaajnih ekonomskih gubitaka u živinarskoj proizvodnji koji su posledica poveanog mortaliteta, suprimiranog rasta, smanjene proizvodnje jaja i odbacivanja trupova na klanici. U literaturi ima veoma malo podataka o klinikoj slici kod brojlerskih roditelja, dok podaci o patomorfološkim promenama ne postoje. Prema navodima iz literature O. rhinotracheale je izolovan iz nekoliko razliitih vrsta divljih ptica, ali nema podataka o ornitobakteriozi fazana. Zbog toga su sprovedena ispitivanja imala za cilj da se utvrdi uticaj O. rhinotracheale na razvoj patomorfoloških promena u respiratornim organima i zdravstveno stanje kokoši brojlerskih roditelja i fazana iz odgoja. Za eksperiment je odabrano 22 fazana starosti 19 nedelja i 22 kokoši brojlerskih roditelja hibrida „Ross 308“ starosti 15 nedelja. Ptice su podeljene u etiri grupe koje su držane na podnom sistemu, u odvojenim prostorijama. Nakon sedmodnevne aklimatizacije, inficirana je po jedna grupa od 16 fazana i 16 brojlerskih roditelja intratrahealnom aplikacijom suspenzije 48-asovne kulture O. rhinotracheale, soj B3263/91 u sterilnom fiziološkom rastvoru, u koncentraciji od 5 X 1011 CFU/ml. Po jedna grupa od šest fazana i šest brojlerskih roditelja služile su kao kontrolne grupe kojima je intratrahealno aplikovan po 1 ml sterilnog fiziološkog rastvora. Posle inficiranja ptice su svakodnevno opservirane i merena im je telesna masa neposredno pre inficiranja i sedam dana kasnije. Sedmog dana od inficiranja eutanazirano je po šest ptica iz inficiranih i etiri ptice iz kontrolnih grupa, intravenskom aplikacijom preparata „61“ proizvoaa Intervet. Dvanaestog dana od inficiranja eutanazirane su po etiri ptice iz inficiranih i dve ptice iz kontrolnih grupa. Neposredno pre eutanazije uzorkovana je krv za serološki pregled, punkcijom brahijalne vene. Leševi eutanaziranih ptica su obdukovani i uzorkovani su unutrašnji organi za bakteriološko i histopatološko ispitivanje. Od preostalih inficiranih ptica (6 brojlerskih roditelja i 6 fazana) uzorkovana je krv na svake dve nedelje u periodu do 16 nedelja i ispitivana metodom ELISA kako bi se utvrdio serološki odgovor na uzronika. Uzorci organa ptica: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje, plua, srca, slezine, jetre, bubrega i brisevi vazdušnih kesa ispitani su bakteriološki, metodom izolacije i identifikacije uzronika. Za histopatološko ispitivanje uzorkovani su tkivni iseci nosne šupljine, infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje, plua i vazdušnih kesa koji su fiksirani u 10% puferizovanom formalinu. Nakon obrade u automatskom tkivnom procesoru uzorci su kalupljeni u parafinske blokove. Parafinski iseci debljine oko 5 µm bojeni su standardnom hematoksilin-eozin metodom (HE). Kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja nije utvren nepovoljan uticaj uzronika na zdravstveno stanje. Eksperimentom je potvreno da kod kokoši brojlerskih roditelja infekcija O. rhinotracheale protie supkliniki i da nema nepovoljan uticaj na prirast. Patoanatomske promene kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja manifestovale su se u respiratornim organima u vidu blagog kataralnog zapaljenja gornjih disajnih puteva: nosnih šupljina, larinksa, traheje i hiperemijom plua kod 20% inficiranih kokoši. Histopatološke promene kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja naješe su bile zastupljene u pluima (50%), traheji (40%), larinksu (20%), vazdušnim kesama (20%), nosnim šupljinama (10%) i infraorbitalnim sinusima (10%). Manifestovale su se u vidu kataralnog zapaljenja gornjih respiratornih organa i hiperemijom plua. Dominantnu elijsku populaciju u inflamatornom infiltratu predstavljali su heterofili. Ornithobacterium rhinotracheale soj B3263/91 nije bilo mogue reizolovati iz organa kokoši brojlerskih roditelja, komercijalnog hibrida „Ross 308“, sedam do dvanaest dana posle eksperimentalnog inficiranja u starosti od šesnaest nedelja. Veštaka infekcija O. rhinotracheale sojem B3263/91 imala je nepovoljan uticaj na prirast fazana. Patoanatomske promene kod veštaki inficiranih fazana manifestovale su se u respiratornim organima u vidu kataralnog zapaljenja gornjih disajnih puteva: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa i traheje, kao i hiperemijom plua i aerosakulitisom. Histopatološke promene kod veštaki inficiranih fazana naješe su otkrivene u pluima (70%), larinksu (50%), traheji (50%), nosnim šupljinama (40%), infraorbitalnim sinusima (30%) i vazdušnim kesama (30%). Promene su se manifestovale u vidu kataralnog zapaljenja gornjih respiratornih puteva, a dominantnu elijsku populaciju u inflamatornom infiltratu predstavljali su heterofili. Ornithobacterium rhinotracheale soj B3263/91 reizolovan je iz respiratornih organa fazana: infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje i plua, sedam do dvanaest dana posle veštakog inficiranja u starosti od dvadeset nedelja. Iz ostalih unutrašnjih organa uzronik nije izolovan. Serološki odgovor kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja i fazana odlikovao se brzim stvaranjem specifinih antitela za uzronika koja su dostigla maksimalan nivo u krvi, u prvoj nedelji posle veštakog inficiranja. Vrednosti titra antitela su postepeno opadale i održavale se na stabilnom nivou do dvanaeste nedelje od inficiranja, a nakon etrnaest nedelja od inficiranja specifina antitela više se nisu mogla otkriti metodom ELISA. Fazani su se pokazali osetljivijim na veštaku infekciju O. rhinotracheale sojem B3263/91 od kokoši brojlerskih roditelja komercijalnog hibrida „Ross 308“. Kljune rei: Ornithobacterium rhinotracheale, brojlerski roditelji, fazani, patomorfološke promene, respiratorni organi Nauna oblast: Klinika patologija i terapija životinja Uža nauna oblast: Patološka morfologija UDK broj: 619:616 EXAMINATION OF THE INFLUENCE OF ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE ON THE APPEARANCE OF PATHOMORPHOLOGICAL LESIONS IN RESPIRATORY ORGANS OF BROILER BREEDERS AND PHEASANTS AFTER EXPERIMENTAL INFECTION SUMMARY The first data relating to disease caused by O. rhinotracheale originate from 1991, when Jan du Preez discovered a new disease in broiler chickens in South Africa, which manifested itself with mild respiratory symptoms. Bacteriological examination of infected birds’ organs revealed a gram-negative, pleomorphic, slow growing, rod bacterium, which could not be identified as any of the known bacterial species. The present name Ornithobacterium rhinotracheale was accapted and the agent was classified in 1994. The literature states that the O. rhinotracheale infection can cause significant economic losses in the poultry industry as a consequence of increased mortality, suppressed growth, reduced egg production and increased carcase condemnation rate at processing. There are few data about clinical features in broiler breeders nor can data about the gross lesions be found in the literature. According to the literature, O. rhinotracheale has been isolated from several different wild bird species, but there are no data relating to ornithobacteriosis in pheasants. For these reasons investigations were carried out to determine the influence of O. rhinotracheale on the development of pathomorphological lesions in the respiratory organs and on the health status of broiler breeders and pheasants from the rearing stage. A total of 22 pheasants, 19 weeks of age and 22 "Ross 308" broiler breeder hens, 15 weeks of age were used in this study. The birds were divided into four groups which were housed in a floor system, in separate rooms. After seven days of acclimatization, one group of 16 pheasants and 16 broiler breeder hens were infected intratracheally with a suspension of 48-hour culture of O. rhinotracheale strain B3263/91 in sterile saline in concentration of 5 X 1011 CFU/ml. Six pheasants and six broiler breeders served as control groups and were inoculated intratracheally with 1 ml of sterile saline per bird. After infection, the birds were observed daily and weighed at the time of infection and seven days post-inoculation. On the seventh day post-inoculation, 6 birds from infected groups, and 4 birds from control groups were euthanized by intravenous application of the euthanasia drug "T61" produced by Intervet. On the twelfth day post-inoculation, 4 birds from infected groups and two birds from control groups were euthanized. Immediately prior to euthanasia, blood samples were taken for serological examination by a puncture, from the brachial vein. The euthanized birds were autopsied and the internal organs were sampled for bacteriological and histopathological examination. Blood samples from the remaining infected birds (6 broiler breeders and 6 pheasants) were taken every two weeks, for up to 16 weeks, and tested by ELISA to determine the serological response to the agent. Samples of the birds’ organs: nasal cavities, infraorbital sinuses, larynx, trachea, lungs, heart, spleen, liver, kidneys and swabs of the air sacs were processed for bacteriological isolation and identification. For histopathological examination tissue samples of nasal cavities, infraorbital sinuses, larynx, trachea, lungs and air sacs were taken and fixed in 10% buffered formalin. After processing in an automated tissue processor the samples were embedded in paraffin blocks. Approximately 5 µm thick paraffin sections were stained using the standard hematoxylin-eosin method (HE). It was not determined that the agent had a negative effect on the health condition of the experimentally infected broiler breeder hens. The experiment confirmed that O. rhinotracheale infection in broiler breeder hens runs in subclinical form and does not influence the growth rate. In experimentally infected broiler breeder hens, gross lesions were manifested in the respiratory organs in the form of a mild catarrhal inflammation of the upper respiratory tract: nasal cavities, larynx, trachea, and hyperemia of the lungs in 20% of infected hens. Histopathological lesions in experimentally infected broiler breeder hens were most frequently detected in the lungs (50%), trachea (40%), larynx (20%), air sacs (20%), nasal cavities (10%) and infraorbital sinuses (10%). The lesions were manifested in the form of catarrhal inflammation of the upper respiratory tract and lung hyperemia. The predominant cell population in the inflammatory infiltrate were heterophils. Ornithobacterium rhinotracheale strain B3263/91 could not be reisolated from „Ross 308“ broiler breeder hens, 7 to 12 days after experimental infection at the age of 16 weeks. The experimental infection with O. rhinotracheale B3263/91 strain had a negative effect on the growth rate of pheasants. Gross lesions in experimentally infected pheasants were manifested in the respiratory organs in the form of catarrhal inflammation of the upper respiratory tract: nasal cavities, infraorbital sinuses, larynx and trachea, hyperemia of the lungs and aerosacculitis. Histopathological lesions in experimentally infected pheasants were most frequently detected in the lungs (70%), larynx (50%), trachea (50%), nasal cavities (40%), infraorbital sinuses (30%) and air sacs (30%). They were manifested in the form of catarrhal inflammation of the upper respiratory tract, with heterophils as a predominant cell population in the inflammatory infiltrate. Ornithobacterium rhinotracheale strain B3263/91 was reisolated from the following respiratory organs of pheasants: infraorbital sinuses, larynx, trachea and lungs, 7 to 12 days after experimental infection at the age of 20 weeks. The agent could not be isolated from other internal organs. The serological response in experimentally infected broiler breeders and pheasants was characterized by rapid production of specific antibodies that reached a maximum level in the blood in the first week after experimental infection. The antibody titers decreased gradually and were maintained at a stable level until the twelfth week after inoculation. Fourteen weeks post-inoculation specific antibodies could not be detected by ELISA. The investigations was demonstrated that pheasants are more sensitive to experimental infection with O. rhinotracheale B3263/91 strain than broiler breeder hens of commercial hybrid “Ross 308” Key words: Ornithobacterium rhinotracheale, broiler breeders, pheasants, pathomorphological lesions, respiratory organs Scientific field: Clinical Pathology and Therapy of Animals Field of academic expertise: Pathological Morphology UDK number: 619:616 1. UVOD.........................................................................................................................................................1 2. PREGLED LITERATURE......................................................................................................3 2.1. Respiratorne bolesti ptica..........................................................................................................................3 2.2. Istorijat...........................................................................................................................................4 2.3. Etiologija.........................................................................................................................................................7 2.3.1. Klasifikacija.....................................................................................................................................7 2.3.2. Morfološke osobine................................................................................................................................7 2.3.3. Kulturelne osobine................................................................................................................................7 2.3.4. Biohemijske osobine...............................................................................................................................8 2.3.5. Osetljivost na hemijske agense....................................................................................................................9 2.3.6. Serotipovi i sojevi...............................................................................................................................10 2.4. Domaini......................................................................................................................................................10 2.5. Putevi prenošenja...................................................................................................................................10 2.6. Patogeneza..........................................................................................................................................11 2.7. Inkubacioni period..................................................................................................................................14 2.8. Klinika slika.................................................................................................................................................14 2.8.1. Klinika slika kod brojlera................................................................................. 15 2.8.2. Klinika slika kod brojlerskih roditelja....................................................................15 2.8.3. Klinika slika kod komercijalnih nosilja....................................................................16 2.8.4. Klinika slika kod uraka.................................................................................................16 2.8.5. Klinika slika kod roditeljskih uraka.................................................................................................16 2.9. Patoanatomske promene...............................................................................................................................17 2.10. Histopatološke promene.............................................................................................................................19 2.11. Laboratorijska dijagnoza...........................................................................................................................20 2.11.1. Detekcija bakterija..............................................................................................................................21 2.11.2. Izolacija........................................................................................................................................22 2.11.3. Identifikacija...................................................................................................................................22 2.11.4. Tipizacija izolata...............................................................................................................................23 2.11.5. Serološka ispitivanja............................................................................................................................24 2.11.6. Diferencijalna dijagnoza.........................................................................................................................25 2.12. Pojava infekcije u pojedinim zemljama..............................................................................................................26 2.13. Serološka ispitivanja prisustva uzronika u pojedinim zemljama..........................32 2.14. Eksperimentalna infekcija..........................................................................................................................33 2.14.1. Eksperimentalna infekcija pilia.....................................................................................................33 2.14.2. Eksperimentalna infekcija uraka.................................................................................................35 2.14.3. Eksperimentalna infekcija pilia i uraka.................................................................................................37 2.14.4. Eksperimentalna infekcija prepelica (Coturnix coturnix japonica )..................................................38 2.15. Terapija...........................................................................................................................................39 2.16. Vakcinacija........................................................................................................................................40 3. CILJ I ZADACI ISPITIVANJA......................................................................................................42 4. MATERIJAL I METODE ISPITIVANJA......................................................................................................43 SADRŽAJ 4.1. Materijal...........................................................................................................................................43 4.1.1. Ptice u eksperimentu..............................................................................................................................43 4.1.2. Bakterijski soj...................................................................................................................................45 4.1.3. Priprema bakterijske kulture za eksperimentalnu infekciju......................................45 4.1.4. Inokulacija bakterijske kulture...................................................................................................................45 4.1.5. Opservacija.......................................................................................................................................45 4.1.6. Uzorkovanje.......................................................................................................................................46 4.2. Metode..............................................................................................................................................46 4.2.1. Serološko ispitivanje.............................................................................................................................46 4.2.2. Bakteriološko ispitivanje.........................................................................................................................47 4.2.3. Histopatološko ispitivanje........................................................................................................................49 4.2.4. Statistika obrada podataka....................................................................................49 5. REZULTATI.........................................................................................................................................................50 5.1. Rezultati praenja zdravstvenog stanja......................................................................................................50 5.1.1. Klinika slika kod kokoši brojlerskih roditelja.............................................................50 5.1.2. Klinika slika kod fazana................................................................................... 51 5.2. Rezultati patomorfološkog ispitivanja......................................................................................................54 5.2.1. Patomorfološke promene kod brojlerskih roditelja iz inficirane grupe...........................54 5.2.1.1. Makroskopski nalaz..............................................................................................................................54 5.2.1.2. Mikroskopski nalaz..............................................................................................................................57 5.2.2. Patomorfološke promene kod brojlerskih roditelja iz kontrolne grupe............................64 5.2.3. Patomorfološke promene kod fazana iz inficirane grupe..........................................65 5.2.3.1. Makroskopski nalaz..............................................................................................................................65 5.2.3.2. Mikroskopski nalaz..............................................................................................................................69 5.2.4. Patomorfološke promene kod fazana iz kontrolne grupe...........................................80 5.3. Rezultati bakteriološkog ispitivanja......................................................................................................81 5.4. Rezultati serološkog ispitivanja......................................................................................................88 6. DISKUSIJA.........................................................................................................................................................92 7. ZAKLJUCI.........................................................................................................................................................102 8. SPISAK LITERATURE......................................................................................................104 11. UVOD Gajenje živine u industrijskoj proizvodnji stvorilo je uslove za nastanak bolesti infektivne i neinfektivne etiologije koje se do tada nisu javljale u malim ekstenzivnim zapatima. Uzgoj velikog broja ptica na ogranienom prostoru, naroito uz nepoštovanje tehnoloških principa i normativa i veliki proizvodni zahtevi nepovoljno su uticali na zdravstveno stanje, što je omoguilo pojedinim mikroorganizmima, za koje se ranije nije znalo, da ispolje patogeno delovanje. Respiratorne bolesti su veoma este u intenzivnoj živinarskoj proizvodnji zbog bliskog kontakta ptica koji pogoduje aerogenom širenju infekcije. U etiologiji respiratornih bolesti uestvuju mikroorganizmi (virusi, bakterije, gljivice) i faktori sredine. S obzirom da su kliniki manifestne respiratorne infekcije uglavnom multikauzalne etiologije, veoma je bitno poznavati ulogu pojedinih infektivnih agenasa u etiopatogenezi. Uloga nekih relativno skoro otkrivenih agenasa u kompleksu respiratornih bolesti, kao što je Ornithobacterium rhinotracheale, još uvek se istražuje. Ornithobacterium rhinotracheale poznat je od 1991. godine kada je u južnoj Africi, Jan du Preez otkrio novo oboljenje brojlera koje se manifestovalo blagim respiratornim simptomima. Bakteriološkim ispitivanjem organa obolelih brojlera otkrivena je gram-negativna, pleomorfna, štapiasta bakterija, sporog rasta, koja se nije mogla identifikovati kao neka od poznatih bakterijskih vrsta. Današnji naziv Ornithobacterium rhinotracheale prihvaen je 1994. godine, kada je izvršena i klasifikacija uzronika. Od tada je prisustvo ovog agensa otkriveno kod brojnih domaih i divljih vrsta ptica širom sveta. Prema podacima iz literature infekcija O. rhinotracheale dovodi do znaajnih ekonomskih gubitaka u živinarskoj proizvodnji koji su posledica poveanog mortaliteta, suprimiranog rasta, smanjene proizvodnje jaja i odbacivanja trupova na klanici. Ovaj uzronik respiratornih bolesti ptica je jedina vrsta iz roda Ornithobacterium koji pripada familiji Flavobacteriaceae. Može da prouzrokuje akutno, kontagiozno oboljenje kod uria i pilia koje se prenosi direktnim i indirektnim kontaktom, a postoje indicije da je mogua i vertikalna transmisija. Inicijalni simptomi infekcije su nazalni iscedak, kijanje, kašalj i sinuzitis na koje se ponekad nadovezuje težak respiratorni distres, prostracija i uginue. Simptomi su 2praeni i smanjenim konzumiranjem hrane i vode. Od patoanatomskih promena javljaju se traheitis, aerosakulitis, edem plua i pneumonija fibrinoznog do fibrinozno-gnojnog karaktera. Za izolaciju bakterija koristi se agar sa 10% ovije krvi uz inkubaciju pod mikrooaerofilnim uslovima tokom 48 h. Pretpostavlja se da su ovako složeni zahtevi za izolaciju jedan od razloga zbog kojih se O. rhinotracheale retko otkriva u rutinskoj dijagnostici. U terapiji oboljenja najbolje rezultate su dali: ampicilin, amoksicilin i tetraciklini. Postoje komercijalne vakcine, ali se vakcinacija retko primenjuje. Poznato je da je uzronik široko rasprostranjen kod živine u intenzivnoj živinarskoj proizvodnji. Objavljeno je više naunih radova o manifestacijama infekcije kod brojlera i uraka, a mišljenja naunika o patogenosti uzronika za ove dve vrste ptica su podeljena. U literaturi ima veoma malo podataka o klinikoj slici kod brojlerskih roditelja, dok podaci o patomorfološkim promenama ne postoje. Prema navodima iz literature O. rhinotracheale je izolovan iz više razliitih vrsta divljih ptica, ali nema podataka o ornitobakteriozi fazana. Ovo su bili glavni razlozi koji su nas opredelili da u eksperimentalnim uslovima istražimo uticaj uzronika na pojavu patomorfoloških promena i zdravstveno stanje dve srodne vrste ptica iz supfamilije Phasianinae. Ispitivanja su sprovedena na kokošima brojlerskih roditelja (Gallus domesticus) i fazanima (Phasianus colchicus) kako bi se izmeu ostalog utvrdilo, da li se patogeno dejstvo uzronika više ispoljava kod domae visokoselkcionisane kokoši u odnosu na srodnu divlju vrstu. 32. PREGLED LITERATURE 2.1. Respiratorne bolesti ptica U zdravstvenoj problematici intenzivne živinarske proizvodnje znaajno mesto zauzimaju respiratorne bolesti koje mogu da prouzrokuju velike direktne i indirektne gubitke. Njihovom širenju pogoduje blizak kontakt ptica u velikim aglomeratima, na ogranienom prostoru, što omoguava lako aerogeno prenošenje infektivnih agenasa. U etiologiji respiratornih bolesti uestvuju mikroorganizmi: virusi, bakterije, gljivice i faktori sredine. Respiratorne infekcije mogu da izazovu: virus infektivnog bronhitisa, virus infektivnog laringotraheitisa, virus atipine kuge živine i drugi paramiksovirusi, influenca virusi tipa A, pneumovirusi, reovirusi, adenovirusi grupe 1, Bordetella avium, Escherichia coli, Avibacterium paragallinarum, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis, Mycoplasma iowae, Pasteurella multocida, Riemerella anatipestifer, Ornithobacterium rhinotracheale, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus. Od faktora sredine znaajni su koncentracija štetnih gasova, amonijaka i ugljendioksida, vlažnost vazduha, temperatura u objektu, kvalitet i stanje prostirke. Samo neki od navedenih uzronika poput virusa atipine kuge i infektivnog bronhitisa su primarni patogeni. U veini sluajeva respiratorne bolesti su prouzrokovane veim brojem infektivnih agenasa ili kombinovanim uticajem infektivnih agenasa i nepovoljnih uslova sredine (van Empel, 1998a; Chin i saradnici, 2003). 4Shema 1. Etiologija respiratornih oboljenja živine (prema podacima van Empel, 1998a; Chin i saradnici, 2003) 2.2. Istorijat Jan du Preez je 1991. godine, otkrio novo oboljenje kod brojlera u južnoj Africi. Bolest se manifestovala blagim respiratornim simptomima koji su poinjali kijanjem u uzrastu od 28 dana i trajali su do kraja tovnog perioda. Mortalitet je bio povean (preko 3%), a proizvodni rezultati, konverzija hrane i dnevni prirast, slabiji. Patoanatomski nalaz karakterisao se pojavom pneumonije i penušavog beliastog eksudata u vazdušnim kesama koji je opisan kao eksudat slian jogurtu. Bakteriološkim ispitivanjem otkrivena je gram-negativna, pleomorfna, štapiasta bakterija, sporog rasta koja se nije mogla identifikovati kao neka od poznatih bakterijskih vrsta (van Beek i saradnici, 1994). Ubrzo se ispostavilo da su bakterije sline pastereli koje su izolovane 1987. godine iz pataka koje su ispoljavale respiratorne simptome, u Maarskoj, identine ovim izolatima iz južne Afrike. Bakterije opisane kao sline riemereli izolovane iz 5uraka sa respiratornim simptomima u Nemakoj 1991. i 1992. godine, takoe su imale iste morfološke i biohemijske osobine kao izolati iz južne Afrike (Hafez i saradnici, 1993). Meutim, u retrospektivnim istraživanjima došlo se do saznanja da je ornitobakterijum izolovan još 1981. godine u severnoj Nemakoj iz uraka starih pet nedelja koje su ispoljavale respiratorne znake u vidu nazalnog iscetka, facijalnog edema i fibrinozno-gnojnog aerosakulitisa, a 1983. godine izolovan je iz traheje mladih vrana. Uzronik je izolovan 1986. godine u Izraelu iz uraka razliite starosti sa nalazom aerosakulitisa i eksudativne pneumonije (Bock i saradnici, 1995, 1997). U periodu izmeu 1986. i 1988. godine izolovan je iz jata roditeljskih uraka u Engleskoj u kojima su se manifestovali znaci depresije, smanjene nosivosti, kašlja, niskog mortaliteta, fibrinozno-gnojnog aerosakulitisa i pneumonije. Tada su izolovane bakterije opisane kao bakterije sline pastereli (Pasteurella-like bacterium) (Chin i saradnici, 2003). Izolacija ovih bakterija u Kaliforniji datira od 1986. godine, a Charlton je u periodu izmeu 1990. i 1991. godine opisao 14 izolata poreklom od pilia i uria (Charlton i saradnici, 1993). Na nekoliko farmi uraka u Holandiji i Nemakoj, 1992. i 1993. godine, javili su se respiratorni poremeaji sa klinikim znacima suzenja, kijanja, nazalnog eksudata i otoka infraorbitalnih sinusa, praeni usporenim rastom. Na nekim od tih farmi mortalitet je konstantno rastao uprkos primeni medikamenata. Kod brojlera u ovom periodu, javljali su se blagi do srednji respiratorni problemi i akutna uginua. U Holandiji je ova infekcija zapažena kod pilia i uraka u prvim nedeljama života i liila je na pasterelozu. Kliniki znaci su se pojavili kod uraka u starosti od 2-8 nedelja, a kod brojlera u starosti od 2-5 nedelja (van Beek i saradnici, 1994). Gram negativne štapiaste bakterije poput onih izolovanih u južnoj Africi, Nemakoj i Maarskoj izolovane su iz tkiva uginulih ptica i u ovim sluajevima. U Nemakoj se u tom periodu infekcija O. rhinotracheale javljala kod uraka starijih od 14 nedelja (Hafez i saradnici, 1993). Provobitno je novootkrivena bakterija nazivana pleomorfni gram-negativni štapi (pleomorphic gram-negative rod- PGNR) (Charlton i saradnici, 1993), pastereli slina (Hafez i saradnici, 1993) ili kingeli slina bakterija (van Beek i saradnici, 1994). Kasnije je Bisgaard ustanovio da bi ona mogla biti klasifikovana u okviru grupe bakterija koje se oznaavaju kao TAXON 28 (van Empel i Hafez, 1999). Godine 1994. predloženo je ime Ornithobacterium za ovaj novi rod u okviru rRNK superfamilije V, a za vrstu naziv rhinotracheale (Vandamme i saradnici, 1994). 6Postoji mišljenje da su infekcije izazvane ornitobakterijumom kod živine pre 1993. godine pogrešno pripisivane virusima ili bakterijama kao što su: Pasteurella, Riemerella, Flavobacterium/Cytophaga spp. ili NADH nezavisna vrsta Haemophilus paragallinarum (Mouahid i saradnici, 1992; Hafez i saradnici, 1993; Bragg i saradnici, 1997). Kada je promenjen rutinski nain izolacije bakterija, uzronika respiratornih oboljenja živine, što se odnosi na produženje inkubacionog perioda u sredini sa 5-10% CO2, O. rhinotracheale je izolovan u sluajevima aerosakulitisa i pneumonije kod uraka i brojlera širom sveta (van Beek i saradnici, 1994; Ryll i saradnici, 1996; Travers i saradnici, 1996; Odor i saradnici, 1997; Roepke i saradnici, 1998). Ornithobacterium rhinotracheale je izolovan iz mnogih vrsta ptica: kokoši, pataka, gusaka, uraka, fazana, golubova, galebova, jarebica, prepelica, nojeva, biserki i vrana (Charlton i saradnici, 1993; Vandamme i saradnici, 1994; Devriese i saradnici, 1995; van Empel i saradnici, 1997). Široka rasprostranjenost infekcije kod ptica dokazana je i serološki u mnogim zemljama (Hafez i Sting, 1996; Ryll i saradnici, 1997; van Empel i Hafez, 1999; Canal i saradnici, 2003; Chansiripornchai i saradnici, 2007). Istraživanjem kolekcija izolovanih kultura mikroorganizama u Nemakoj otkriveno je da je O. rhinotracheale prvi put izolovan iz respiratornog trakta uraka 1981. godine (Vandamme i saradnici, 1994). U literaturi nema podataka da je pre toga uzronik bio izolovan bilo gde u svetu (Hinz i Hafez, 1997). Na osnovu genetskih ispitivanja naunici smatraju da su ove bakterije relativno skoro prešle sa divljih na domae vrste ptica (Amonsin i saradnici, 1997). Terapija bolesti uobiajenim oralnim antibioticima nije davala zadovoljavajue rezultate. Naroito u sluajevima kliniki izražene pneumonije, primena enrofloksacina ili trimetoprim-sulfametoksazola nije bila efikasna. I pored terapije, gubici su iznosili ak i do 25% u par nedelja. Izolovani sojevi iz ovakvih sluajeva u Holandiji bili su veinom rezistentni na flumekvin, a samo neznatno osetljivi na enrofloksacin i trimetoprim u kombinaciji sa sulfonamidom. Tetraciklin, ampicilin i amoksicilin pokazali su se kao veoma efikasni (Hafez i saradnici, 1993; van Beek i saradnici, 1994; van Empel, 1998a). 72.3. Etiologija 2.3.1. Klasifikacija Ornithobacterium rhinotracheale je jedina vrsta iz roda Ornithobacterium koji pripada familiji Flavobacteriaceae i rRNK superfamiliji V. Rod Ornithobacterium je u bliskom taksonomskom srodstvu sa rodovima: Riemerella, Flavobacterium, Weeksella i Capnocytophaga (Vandamme i saradnici, 1994). Vrsta: Ornithobacterium rhinotracheale Rod: Ornithobacterium Familija: Flavobacteriaceae Red: Flavobacteriales Klasa: Flavobacteria Tip: Bacteroidetes (Euzéby, 1997). 2.3.2. Morfološke osobine Ornithobacterium rhinotracheale je gram-negativna, nepokretna, pleomorfna, štapiasta bakterija. Ne stvara spore ni kapsulu. Sadržaj G+C parova kod ovog uzronika iznosi izmeu 37 i 39 mol%. Bakterijske elije su šljivolikog oblika debljine 0,2 do 0,9 m, a dužina varira od 0,6 do 5 m. Nije utvreno da poseduju posebne strukture kao što su pili, fimbrije, plazmidi niti specifinu toksinu aktivnost (Vandamme i saradnici, 1994; Leroy-Sétrin, 1998). 2.3.3. Kulturelne osobine Ornithobacterium rhinotracheale se ubraja u mezofilne (raste na temperaturi od 30 do 42 C), hemoorganotrofne mikroorganizme. Raste u aerobnoj, anaerobnoj, mikroaerofilnoj i atmosferi obogaenoj ugljendioksidom (Euzéby, 1997). Optimalan rast se postiže inkubiranjem na krvnom agaru sa 5% ovije krvi, tokom 48 h u mikroaerofilnoj sredini (5 do 10% CO2) na temperaturi od 37 C. Pod ovim uslovima kolonije O. rhinotracheale izrastu u vidu takica nakon inkubacije u trajanju od 24 h. Posle 48 h razvijaju se male, cirkularne, konveksne, sive do sivo-bele kolonije, sa kontinuiranim ivicama, ponekad sa crvenim odsjajem. k njih se ne stvara zona hemolize (Chin i saradnici, 2003). 8Iako je O. rhinotracheale prvobitno okarakterisan kao beta nehemolitian, istraživanja sprovedena na severnoamerikim izolatima su pokazala, da pod odreenim uslovima, mogu da daju hemolizu na krvnom agaru. Hemoliza se javlja kada se nakon inicijalne inkubacije u mikroaerofilnoj sredini sa 7,5% CO2, u trajanju od 48 h, hranljive podloge inkubiraju dodatnih 48 h u aerobnoj sredini, na sobnoj temperaturi. Ispitivanjem osobina 23 izolata pod navedenim uslovima, utvreno je da na agaru sa ovijom krvi mogu da daju zonu -hemolize, -hemolize ili ne daju hemolizu (Tabatabai i saradnici, 2010). Kolonije O. rhinotracheale karakteriše intenzivan miris koji podsea na buternu kiselinu. U primarnoj izolaciji veina kolonija pokazuje varijacije u širini od 1 do 3 mm posle inkubacije u trajanju od 48 h. U supkulturi je veliina kolonija uniformnija. Ne raste na „MacConkey“ agaru, „Endo“ agaru, „Simon’s“ citratnom agaru. Rast na tenim podlogama zavisi od soja, a podesni su „Brain-heart infusion broth“, „Pasteurella broth“, „Todd Hewitt broth“ (Chin i saradnici, 2003). Kada raste u tenom medijumu O. rhinotracheale je pleomorfniji nego na vrstim podlogama poput agara. esto formira nestabilne lance koji mogu da sadrže od nekoliko do više hiljada bakterijskih elija i koji se lako raspadaju. Dobra selektivna podloga još uvek nije dostupna ali se rast drugih bakterija može suprimirati dodavanjem gentamicina i polimiksina (oba po 5 g/ml) krvnom agaru sa 5% ovije krvi. Pošto je oko 90% sojeva O. rhinotracheale osetljivo na oba antibiotika, istovremeno treba zasejati i krvni agar sa 5% ovije krvi bez antibiotika (van Empel, 1997; Hafez, 2002). 2.3.4. Biohemijske osobine U mikrobiološkoj dijagnostici rezultati konvencionalnih biohemijskih testova mogu da budu nekonzistentni (Chin i saradnici, 2003). U tabeli 1. navedene su neke od biohemijskih osobina uzronika od znaaja za dijagnostiku. 9Tabela 1. Enzimi koje lui O. rhinotracheale TEST REZULTAT Alkalna fosfataza + Esteraza-lipaza + Leucin aminopeptidaza + Valin aminopeptidaza + Cistin aminopeptidaza + Kisela fosfataza + Fosfohidrolaza + -Galaktozidaza + -Galaktozidaza + -Glukozidaza + N-acetil- -glukozamidaza + Tripsin + -Himotripsin + Lipaza - -Glukuronidaza - -Glukozidaza - -Manozidaza - -Fukozidaza - (Chin i saradnici, 2003) Ispitivanjem 56 sojeva razliitog porekla koji su pripadali razliitim serotipovima utvreno je da kada se ispitivanja izvode pod optimalnim uslovima, O. rhinotracheale proizvodi oksidazu, beta-galaktozidazu, arginin dehidrolazu, alkalnu fosfatazu, esterazu-lipazu, leucin arilamidazu, cistin arilamidazu, kiselu fosfatazu, fosfohidrolazu, alfa-glukozidazu, N-acetil- -glukozamidazu, stvara kiselinu bez gasa iz glukoze, fruktoze, laktoze i galaktoze. Ne proizvodi katalazu, lizin dekarboksilazu, ornitin dekarboksilazu, želatinazu, esterazu (C4), lipazu (C14), himotripsin, beta- glukuronidazu, alfa-manozidazu, alfa-fukozidazu, ne razlaže trostruki šeer sa gvožem, ne redukuje nitrate do nitrita, ne stvara kiselinu iz maltoze, saharoze, fruktoze i riboze (van Empel i Hafez, 1999). 2.3.5. Osetljivost na hemijske agense Sojevi O. rhinotracheale potpuno se inaktivišu 0,5% rastvorom mravlje kiseline i oksal-siretne kiseline i 0,5% rastvorom aldehidnog jedinjenja (20% glutaraldehid) nakon izlaganja u trajanju od 15 minuta (Hafez i Schulze, 1998). 10 2.3.6. Serotipovi i sojevi Primenom seroloških metoda dokazano je postojanje 18 serotipova koji se oznaavaju latininim slovima od A do R. Visok procenat (94%) izolata poreklom od pilia i 57% izolata poreklom od uria pripada serotipu A. Postoji korelacija izmeu geografskog porekla bakterija i pripadnosti odreenom serotipu. Serotip C izoluje se samo iz pilia i uria iz južne Afrike i SAD-a. Nema dokaza za postojanje specifinosti odreenog serotipa prema domainu (van Empel i saradnici, 1997; Hafez, 1998b; van Empel, 1998b). Serotipovi A i C poreklom od pilia i serotipovi B, D i E poreklom od uraka ispoljavaju približnu virulentnost i za pilie i za urke. Objašnjenje za razliitu distribuciju serotipova kod ovih vrsta moglo bi se tražiti u razliitoj industrijskoj praksi u njihovom uzgoju (van den Bosch, 2001). Amonsin i saradnici (1997) su primenom PCR metode (polimerase chain reaction - lanana reakcija polimeraze) ustanovili da veina od 55 ispitanih izolata poreklom od domestifikovanih ptica širom sveta ima ogranienu heterogenost i da pripada maloj grupi blisko udruženih klonova. Zbog toga pretpostavljaju da su ove bakterije u skorije vreme prešle sa divljih na domae vrste ptica. 2.4. Domaini Ornithobacterium rhinotracheale je izolovan širom sveta iz brojnih vrsta ptica: kokošaka, uraka, pataka, gusaka, golubova, galebova, nojeva, fazana, biserki, jarebica, prepelica (Charlton i saradnici, 1993; Vandamme i saradnici, 1994; van Empel i Hafez, 1999). 2.5. Putevi prenošenja Infekcija O. rhinotracheale se prenosi horizontalno, direktnim i indirektnim putem; živina se naješe inficira aerogeno ili peroralno preko vode za pie. Objavljena su istraživanja koja idu u prilog postojanju i vertikalne transmisije (van Empel, 1998a). Na jednom primeru eksperimentalne infekcije roditeljskih uraka starih 55 nedelja potvreno je da O. rhinotracheale može da preživi u jajniku i jajovodu ne dovodei do pojave klinikih simptoma (Back i saradnici, 1997, 1998b; Nagaraja i saradnici, 1998). 11 U drugom eksperimentu korišeni su brojlerski pilii i urii izleženi iz seropozitivnih roditeljskih jata. Ove ptice su bile u potpunoj izolaciji za vreme istraživanja, dobijale su sterilnu hranu i vodu. Nakon inficiranja virusom atipine kuge peradi (Newcastle disease virus - NDV) i virusom rinotraheitisa uraka (turkey rhinotracheitis virus - TRTV) aerosolom, O. rhinotracheale je izolovan iz vazdušnih kesa. Ovo potvruje da se O. rhinotracheale prenosi jajima i to ili transovarijalno ili kontaminacijom prilikom prolaska jajeta kroz kloaku - pseudovertikalni put prenošenja. Ornithobacterium rhinotracheale je izolovan iz ljuski jaja i žumancetne kese jednodnevnih ptica (u manje od 1% sluajeva) (van Empel, 1997). Rezultati ovih istraživanja ukazuju da je vertikalna transmisija mogua, a njome bi se moglo objasniti brzo širenje O. rhinotracheale u komercijalnoj živinarskoj proizvodnji u poslednjih 15 godina (Tanyi, 1995). 2.6. Patogeneza Živina u intenzivnom uzgoju može da se inficira u svim uzrastima, mada je patogenost uzronika za urke izraženija kod starijih jedinki. Zapaženi su brojni sluajevi udruženih infekcija prouzrokovanih O. rhinotracheale i drugim mikroorganizmima, uzronicima respiratornih oboljenja živine: Escherichia coli, Bordetella avium, NDV, virus infektivnog bronhitisa (Infectious bronchitis virus - IBV), TRTV, Mycoplasma synoviae (De Rosa i saradnici, 1997; Odor i saradnici, 1997; Salem i saradnici, 1997; Erbeck i McMurray, 1998; Charlton, 1999; Sakai i saradnici, 2000; Zorman-Rojs i saradnici, 2000). U pogledu patogenosti uzronika u literaturi se istiu dva gledišta. Jedna grupa istraživaa smatra da O. rhinotracheale uzrokuje minimalne patološke promene kod pilia i uria i da se intenzitet ispoljavanja patoloških promena pojaava drugim mikroorganizmima (virusima i bakterijama) uzronicima respiratornih bolesti (van Empel i saradnici, 1996; Back i saradnici, 1997; Droual i Chin, 1997; Franz i saradnici, 1997; van Empel i saradnici, 1999). Nasuprot ovakvom mišljenju, Ryll i saradnici (1996), Travers i saradnici (1996), Sprenger i saradnici (1998) i van Veen i saradnici (2000b) objavljuju radove u kojima se iznosi da se eksperimentalnim inficiranjem samo ornitobakterijumom, bez drugih mikroorganizama mogu izazvati patološke promene sline onima kod prirodne infekcije, što ide u prilog stavu da je uzronik primarni patogen. 12 U eksperimentu koji je izveo Paul van Empel sa grupom istraživaa 1999. godine, pokazano je da O. rhinotracheale uzrokuje zapaljenje plua i vazdušnih kesa, pošto su u prvoj nedelji nakon eksperimentalnog inficiranja aerosolom SPF (specific pathogen freee - slobodni od specifinih patogenih uzronika) leghorn pilia (prethodno inficiranih NDV-om), izolovane samo iste kulture ovih bakterija koje su otkrivene i imunohistohemijski u tkivima. U eksperimentu su bile 4 grupe od po 30 pilia. Prva grupa inficirana je NDV-om 21. dana, a ornitobakterijumom 26. dana. Druga grupa inficirana je samo ornitobakterijumom 26. dana. U prvoj grupi, dva dana nakon inficiranja ornitobakterijumom, epitel vazdušnih kesa infiltruju makrofagi i polimorfonukleari. Vazdušne kese postaju edematozne i dolazi do formiranja granuloma. O. rhinotracheale je imunohistohemijski detektovan u svim delovima vazdušnih kesa, ali je najviše vezan za makrofage. Aerosakulitis je bio najizraženiji 5-9 dana od inficiranja, nakon ega je usledio oporavak. Na delovima BALT-a u pluima javile su se promene posle 4 ili 5 dana od inficiranja ornitobakterijumom, iji su antigeni imunohistohemijski otkriveni u tim lezijama. Ni u jednom drugom organu nisu naeni antigeni O. rhinotracheale. U drugoj grupi pilia zapažena je minimalna infiltracija vazdušnih kesa polimorfonuklearima, jedan dan nakon inficiranja. Imunohistohemijski je detektovan O. rhinotracheale privršen za cilije epitela vazdušnih kesa samo prvog dana posle inficiranja, a kasnije se više nije mogao detektovati u tkivu (van Empel i saradnici, 1999). Ovaj eksperiment u znaajnoj meri rasvetljava patogenezu infekcije O. rhinotracheale. Veoma je važan podatak da inficiranje pilia ornitobakterijumom, aerosolom, bez prethodne virusne infekcije ne dovodi do znaajnih promena na respiratornom traktu. Kod ovih pilia zapažene su samo neznatne promene na vazdušnim kesama koje su ubrzo išezle, a nastale su kao posledica privršivanja bakterija za respiratorni epitel. Ornithobacterium rhinotracheale se posle 2 dana nije mogao detektovati u tkivu ni bakteriološki ni imunohistohemijski. Rezultati opisanog eksperimenta idu u prilog stavu da O. rhinotracheale nije u stanju da samostalno izazove patološke promene i da se promene ispoljavaju u prisustvu drugih mikroorganizama uzronika respiratornih oboljenja, u ovom sluaju NDV-a. Iako opisani eksperiment u znaajnoj meri doprinosi razumevanju infekcije O. rhinotracheale, treba uzeti u obzir i podatke do kojih su došli drugi istraživai, a koji idu u prilog stavu da je uzronik primarni patogen. Ovi podaci izneti su u poglavlju „Eksperimentalna infekcija“. 13 U cilju utvrivanja faktora koji doprinose patogenezi infekcije O. rhinotracheale, istraživana je interakcija O. rhinotracheale i epitelnih elija. Eksperimentalnim inficiranjem u uslovima in vitro, pokazano je da se O. rhinotracheale veoma efikasno atherira za razliite vrste elija iz kultura epitelnih elija, sa nivoom do 80 atherirajuih bakterija po eliji, 3 asa nakon inficiranja. Poreenjem razliitih O. rhinotracheale izolata utvreno je da svi testirani sojevi imaju atherentno svojstvo, ali razliitog intenziteta. Analizom spoljašnje membrane atherentnih sojeva metodom elektroforeze „SDS-PAGE“ utvreno je da postoje razlike meu sojevima u elektroforetskoj pokretljivosti proteinskog i lipopolisaharidnog dela. Analizom infekcije u prisustvu preišenog lipopolisaharida (LPS), dobijenog od O. rhinotracheale, došlo se do saznanja da postoji LPS-dozno zavisna inhibicija athezije ove bakterije. Ustanovljeno je da je ovaj efekat specifian za soj pošto inhibiciju ne prouzrokuje lipopolisaharid iz svih sojeva. Ovaj podatak pokazuje da je athezija O. rhinotracheale za epitelne elije omoguena posredstvom jedinstvenog soj specifinog i LPS osetljivog mehanizma. Kako bi se bolje razumela interakcija O. rhinotracheale i makrofaga, inficirani su HD-11 pilei makrofagi O. rhinotracheale sojem 30. Mikroskopski je utvrena pojava dozno zavisne neopsonizujue atherencije i unošenja O. rhinotracheale u makrofage. Merenjem proizvodnje azotnog oksida (NO) kao markera inflamacije, došlo se do zakljuka da O. rhinotracheale stimuliše njegovu proizvodnju, mada znatno slabije od enterobakterija (E. coli i S. enteritidis). Prethodnim tretiranjem makrofaga rekombinantnim pileim gama interferonom (rChIFN ), neznatno se poveava proizvodnja azot oksida. Lipid A poreklom od polimiksina B ne inhibira proizvodnju azot oksida koju stimuliše O. rhinotracheale. Ovo jedinjenje efikasno blokira proizvodnju koju indukuju enterobakterije. Dodavanjem preišenog LPS-a poreklom od O. rhinotracheale, HD 11 elijama stimulisanim na proizvodnju azot oksida, na polimiksin B osetljiv nain (prethodno tretiranim rChIFN ), pokazalo se da u preišenoj formi LPS poreklom od O. rhinotracheale pokazuje proinflamatornu aktivnost. Eksperimentalnim inficiranjem makrofaga miševa, stimulisanim rMoINF -om pokazano je da ni O. rhinotracheale ni preišeni LPS ne stimulišu prizvodnju azot oksida. Na osnovu ovog eksperimenta može se zakljuiti da se O. rhinotracheale brzo unosi u makrofage i da podstie inflamatorni odgovor u pileim makrofagima posredstvom stimulusa nezavisnog od LPS-a. Lipopolisaharid dobijen od O. 14 rhinotracheale je bioaktivan samo u preišenoj formi. Razliit odgovor pileih i mišijih elija ukazuje na specifinost infekcije za vrstu (Chansiripornchai, 2004). 2.7. Inkubacioni period Eksperimentalnim inficiranjem uraka u starosti od 22 nedelje, intratrahealno, prvi simptomi u vidu depresije, kašlja i smanjenog konzumiranja hrane javljaju se za 24 h. Posle 48 h od inficiranja, bolesne urke iskašljavaju krvavo-sluzav sadržaj, a nakon 5 dana zapažaju se znaci oporavka (Sprenger i saradnici, 1998). Eksperimentalnim inficiranjem pilia u starosti od pet nedelja aerosolom, bakterije dospevaju u respiratorne organe posle 2 dana, a kliniki znaci zapažaju se posle 4 dana (van Empel i saradnici, 1999). 2.8. Klinika slika Ornithobacterium rhinotracheale može da prouzrokuje akutno, visoko kontagiozno oboljenje kod živine, ali izraženost klinikih znakova, trajanje oboljenja i procenat mortaliteta kod potvrenih infekcija veoma se razlikuju (tabela 2). Razlozi leže u uticajima brojnih faktora sredine (nepoštovanje tehnoloških principa i zoohigijenskih normativa), drugih oboljenja i sekundarnih infekcija (van Empel i Hafez, 1999). Tabela 2. Dužina trajanja i procenat mortaliteta potvrenih infekcija O. rhinotracheale starost (u nedeljama) mortalitet (%) trajanje (u danima) urke >2 1-15 7-8 brojleri 3-4 0-10 5-8 brojlerski roditelji 24-52 1-3 >21 (van Empel i Hafez, 1999) 15 2.8.1. Klinika slika kod brojlera Kod brojlera se oboljenje manifestuje na dva naina. Bolest se naješe ispoljava respiratornim poremeajima kada se kliniki znaci javljaju izmeu tree i šeste nedelje života sa mortalitetom od 2 do 10%. Javlja se depresija, nazalni iscedak, kijanje, facijalni edem, smanjeno uzimanje hrane i smanjen prirast (Franz i saradnici, 1997; Odor i saradnici, 1997; van Empel i Hafez, 1999). Ponekad se bolest manifestuje supkutanim edemima glave i iznenadnim uginuima mladih pilia (ak do 20% u nekoliko dana) kao posledica osteitisa, osteomijelitisa i encefalitisa, što može ali i ne mora da bude praeno respiratornim simptomima (Goovaerts i saradnici, 1998). Respiratorni virusi kao što su NDV i IBV pojaavaju ispoljavanje simptoma poremeaja respiratornih organa (Travers, 1996). Travers i saradnici (1996) opisuju tri sindroma vezana za ovu infekciju. Prvi je primarno vezan za respiratorni trakt, drugi se karakteriše slabo izraženim respiratornim znacima uz izrazit peritonitis pri patoanatomskom pregledu, a trei uz respiratorne znake odlikuju artritis i hromost. Sva tri sindroma praena su smanjenim prirastom i poveanom konverzijom hrane. Ornithobacterium rhinotracheale se eše javlja tokom zimskih meseci, verovatno kao posledica lošije ventilacije i višeg nivoa amonijaka i prašine u objektima u ovom periodu godine (Schleifer, 1997). 2.8.2. Klinika slika kod brojlerskih roditelja Kod brojlerskih roditelja oboljenje zahvata ptice u periodu nošenja, uglavnom u špicu nosivosti ili neposredno pre pronošenja. Javlja se neznatno povišenje mortaliteta, smanjeno je uzimanje hrane i prisutni su blagi respiratorni simptomi. Mortalitet je varijabilan ali relativno nizak u nekomplikovanim sluajevima. Može se javiti pad nosivosti, smanjenje veliine jaja i smanjen kvalitet ljuske. Procenat oploenih i izleženih jaja u veini sluajeva nije promenjen (Hafez, 1996). Asadpour i saradnici (2008) sproveli su ispitivanje prisustva O. rhinotracheale u 22 jata brojlerskih roditelja u Iranu. Uzronik je izolovan iz trahealnih briseva, uzorkovanih iz pet jata razliite starosti koja u vreme uzimanja uzoraka nisu ispoljavala bilo kakve simptome. 16 Ornithobacterium rhinotracheale je izolovan iz uginulih embriona kao i jednodnevnih brojlera i uria u inkubatorima u Egiptu, gde je postojao problem poveanog mortaliteta embriona (El-Gohary, 1998). 2.8.3. Klinika slika kod komercijalnih nosilja Kod komercijalnih nosilja bolest se može manifestovati smanjenjem nosivosti, poveanim procentom jaja deformisane ljuske i povišenim mortalitetom (Sprenger i saradnici, 2000). 2.8.4. Klinika slika kod uraka Kod uraka starijih od 8 nedelja kliniki znaci su izraženiji, dok infekcija u mladim jatima (2 do 8 nedelja) obino prolazi asimptomatski (Roepke i saradnici, 1998). Bolest je eše zapažena kod urana u starosti oko 14 nedelja, a mortalitet je naroito visok kod jedinki starijih od 20 nedelja. Infekcija se naješe ispoljava u zimskim mesecima (Hafez i saradnici, 1993; Schleifer, 1997). Mortalitet se kree izmeu 1 i 15% u toku akutne faze bolesti (8 dana), ali su zabeleženi sluajevi sa znatno višim mortalitetom, ak i do 50% (De Rosa i saradnici, 1996; Back i saradnici, 1998a). Poetni kliniki znaci su: kašalj, kijanje i nazalni iscedak, koje u nekim sluajevima prate ozbiljni respiratorni poremeaji: dispnoja, prostracija, sinuzitis. Smanjeno je uzimanje hrane i vode. Bolest traje 7 do 10 dana, a kliniki znaci u nekim sluajevima zapažaju se samo kratko vreme pre smrti. 2.8.5. Klinika slika kod roditeljskih uraka U roditeljskim jatima može se javiti pad nosivosti i poveanje broja neizleženih jaja (Schleifer, 1997; van Empel i Hafez, 1999). U najkraim crtama znaci infekcije mogu se prikazati i na sledei nain: 1. Relativno blagi respiratorni znaci kod mladih ptica koji poinju kijanjem, a udruženi su sa neznatnim povišenjem mortaliteta, ali znaajnim indirektnim gubicima (slabiji prirast, veliki broj škartova). 17 2. Iznenadna uginua mladih ptica usled promena lokalizovanih na glavi u vidu osteitisa, osteomijelitisa i encefalitisa. Ovaj oblik može se javiti sam ili udružen sa respiratornim simptomima. 3. Akutna pneumonija sa povišenim mortalitetom (ak i do 50%), kod uraka starijih od 12 nedelja. 4. Kod starijih uraka pareze i paralize, usled artritisa, osteitisa, osteomijelitisa. 5. Kod roditeljskih uraka, brojlerskih roditelja i komercijalnih nosilja pad nosivosti i smanjen kvalitet ljuske jaja. Ovaj vid infekcije se teško prepoznaje (van den Bosch, 2001). 2.9. Patoanatomske promene Najvažnije promene manifestuju se na respiratornim organima, mada su esto promenjeni i drugi organi. Na osnovu opisanih primera infekcije kod pilia, teško je odvojiti promene specifine za ovu bakteriju pošto su one u veini sluajeva posledica udruženog dejstva O. rhinotracheale i drugih mikroorganizama. Kod uraka postoje primeri eksperimentalne monoinfekcije prouzrokovane ornitobakterijumom koji pružaju mogunost za realnije sagledavanje patogenosti uzronika i patoloških promena koje on može da izazove. Kod brojlerskih pilia inficiranih ornitobakterijumom mogu da se jave: sinuzitis, traheitis, aerosakulitis, hepatomegalija, splenomegalija, perikarditis i pneumonija. Najupeatljivije promene vezane su za respiratorni sistem, a naješe se sreu: aerosakulitis, pleuritis i pneumonija (El-Gohary i saradnici, 1998). Van den Bosch (2001) navodi da se kod inficiranih brojlera u vazdušnim kesama javlja penušav, beo eksudat, slian jogurtu, esto udružen sa unilateralnom pneumonijom. Ove promene obino išezavaju nakon nedelju dana, a mogu da budu maskirane napredovanjem drugih infekcija i kao takve neprepoznatljive u daljem periodu. U literaturi se opisuje više sluajeva udruženih infekcija u kojima uz O. rhinotracheale uestvuju NDV ili IBV (van Empel i saradnici, 1996; Odor i saradnici, 1997). Odor i saradnici (1997) opisuju udružene infekcije izazvane ornitobakterijumom i IBV-om kod brojlera na poluostrvu Delmarva u Americi. Patoanatomski nalaz karakterisao se profuznim žutim ili belim, tenim, penušavim sadržajem sa kazeoznim „ostrvcima“ u vazdušnim kesama. Neki autori ovakav eksudat opisuju kao eksudat slian jogurtu - „yoghurt-like“ (van Empel i saradnici, 1996; Sakai i saradnici, 2000). 18 Nalaz je karakterisalo i prisustvo pleuralnog eksudata ili fibrinoznog pleuritisa, fibrinozne pneumonije, eše unilateralne i formiranje priraslica za zid grudnog koša. Kod nekih pilia bila su zahvaena cela plua, a kod drugih samo deo (Odor i saradnici, 1997). Van Empel i saradnici (1996) opisuju patoanatomske promene kod brojlera nastale kao posledica eksperimentalne infekcije prouzrokovane ornitobakterijumom i NDV-om. Utvren je aerosakulitis koji se manifestovao penušavim eksudatom i nakupljanjem fibrina i pneumonija (u veini sluajeva unilateralna), sa jasnom granicom izmeu zahvaenog i zdravog dela plunog tkiva. U ovakvim sluajevima teško je razgraniiti koje su promene posledica bakterijske, a koje virusne infekcije, pa se može govoriti o udruženom ili sinergistikom delovanju navedenih mikroorganizama u izazivanju patoanatomskih promena (Travers, 1996; Odor i saradnici, 1997). U nekim sluajevima infekcija izazvana O. rhinotracheale kod brojlera se manifestovala supkutanim edemima glave uz prisustvo osteitisa, osteomijelitisa i encefalitisa (Goovaerts i saradnici, 1998; Goovaerts i saradnici, 1999). Opisane su i degenerativne promene na sranoj muskulaturi (Hafez i saradnici, 1993). Patološke promene prouzrokovane ovom bakterijom kod brojlerskih pilia mogle su da budu razlog visokog procenta odbacivanja trupova na klanicama koji je u nekim sluajevima iznosio preko 50% (van Veen i saradnici, 2000a). Ornithobacterium rhinotracheale kod uraka može da izazove sinuzitis, traheitis, aerosakulitis, hepatomegaliju, splenomegaliju, perikarditis i pneumoniju (Hafez i saradnici, 1993; De Rosa i saradnici, 1996; Back i saradnici, 1998b; Roepke i saradnici, 1998; Joubert i saradnici, 1999; Zorman-Rojs i saradnici, 2000). U jednom sluaju oboljenja roditeljskih uraka u Americi obdukovano je 16 uraka starosti 27-42 nedelje kompanije A i 14 uraka starosti 31-32 nedelje kompanije B. Sluznica sinusa bila je hiperemina kod veine obdukovanih uraka. Zidovi vazdušnih kesa bili su jako zadebljali zbog prisustva fibrinoznog eksudata, a kod nekoliko uraka vazdušne kese je ispunjavao kazeozni eksudat. Kod veine uraka jetra je bila uveana, hiperemina sa bledim podrujima po rubovima. Kod pojedinih leševa slezina i bubrezi su bili hiperemini. Kod nekoliko leševa uoen je perikarditis koji se karakterisao prisustvom petehija na epikardu i zamuenog eksudata u osrju. Kod 26 uraka utvrene su promene na pluima u vidu unilateralne ili bilateralne konsolidacije. Plua su bila uveana, vrsta, hiperemina i sa fibrinoznim eksudatom na pleuri. Manje 19 uestao nalaz bio je fibrinozni eksudat u peritonealnoj šupljini i zglobovima (kod nekoloko leševa) i prisustvo askarida u crevima (De Rosa i saradnici, 1996). Najkonzistentnije patoanatomske promene kod inficiranih uraka i kokoši brojlerskih roditelja u Sloveniji inili su: aerosakulitis, unilateralna ili bilateralna pneumonija, i akumulacija fibrina na pluima i pleuri (Zorman-Rojs, 2000). Obdukcijom leševa uginulih i eutanaziranih uraka nakon eksperimentalnog inficiranja ornitobakterijumom intratrahealno, utvren je konjunktivitis (u medijalnom onom uglu nalazio se beliast eksudat). Vazdušne kese bile su zadebljalih zidova i ispunjene belim do žutim kazeoznim sadržajem. Perikardijum je esto bio hiperemian, zadebljao, zamuen, neproziran i ispunjen kazeoznim, žuto-belim eksudatom. Promene na pluima manifestovale su se u vidu hiperemije i pneumonije fibrinoznog do fibrinozno-gnojnog karaktera. Eksperimentalnim inficiranjem uraka aerosolom prouzrokovan je aerosakulitis koji se manifestovao prisustvom penušave mutne tenosti u vazdušnim kesama i edem plua (Sprenger i saradnici, 1998). Ovaj eksperiment je detaljnije opisan u poglavlju „Eksperimentalna infekcija“. 2.10. Histopatološke promene Histopatološke promene naješe se otkrivaju u pluima, pleuri i vazdušnim kesama. U sluajevima infekcije u farmskim uslovima, u pluima se javlja hiperemija i nakupljanje fibrina pomešanog sa makrofagima i heterofilima, koji se mogu videti slobodni u lumenu parabronhija i vazdušnih kapilara. Intersticijum je difuzno infiltrovan makrofagima i u manjem broju heterofilima. Uoavaju se i fokalne koagulacione nekroze, iji je centar smešten u lumenu parabronhija odakle se šire na okolni parenhim. Nekrotina ognjišta ispunjena su gustim nakupinama nekrotizovanog heterofilnog infiltrata ili eksudata u kojima mogu biti rasute i male grupe bakterija. Mnogi kapilarni krvni sudovi su prošireni i ispunjeni fibrinskim trombima. Pleura i vazdušne kese mogu da budu znatno zadebljale, edematozne ili sa intersticijalnim fibrinskim depozitima. Difuzno su infiltrovane heterofilima i prožete malim ognjištima nekrotizovanog heterofilnog infiltrata i fibroze (Chin i saradnici, 2003). Kod oboljenja roditeljskih uraka u Americi prouzrokovanog ornitobakterijumom, histopatološki nalaz u pluima karakterisao se pisustvom fibrinozno-heterofilnog eksudata u lumenu parabronhija i atrija i izmeu vazdušnih kapilara. Bakterije su retko uoavane u eksudatu. Ponegde su se mogla uoiti ognjišta fibrinozno-gnojnog zapaljenja, koja su se sastojala iz infiltrata velikog broja 20 degranulisanih heterofila pomešanih sa nekrotinim detritusom i heterofila raštrkanih u parabronhijama. Pojedina ognjišta bila su okružena višejedarnim džinovskim elijama i sadržavala su gram-negativne bakterije. Pleura je bila zadebljala zbog fibrinozno- heterofilne infiltracije. U veini sluajeva plua su imala izražen perivaskularni i intersticijalni edem uz infiltraciju heterofilima i po nekim limfocitom. Ponegde se u velikim arterijama intersticijuma mogla zapaziti blaga proliferacija endotela, vakuolizacija citoplazme i infiltracija endotelnog sloja heterofilima. Zidovi vazdušnih kesa su bili zadebljali kao posledica fibrinozno-gnojnog zapaljenja. Nalaz u jetri karakterisalo je prisustvo akutne koagulacione nekroze uz trombozu pojedinih krvnih sudova, naroito na periferiji jetrinih lobusa. Na periferiji nekrotinih podruja uoavane su degenerativne promene. Kod nekoliko uraka na periferiji jetre je uoeno multifokalno propadanje hepatocita uz prisustvo serofibrinoznog eksudata u kome se nalazio mali broj heterofila. Kod nekoliko uraka naena je hiperemija nazalnih sinusa, slezine, bubrega i serofibrinozni eksudat u vaskularnim sinusima slezine (De Rosa i saradnici, 1996). Eksperimentalnim inficiranjem uraka ornitobakterijumom intratrahealno, prouzrokovana je izrazita hiperemija plua. Parabronhije i vazdušni kapilari bili su ispunjeni fibrinom, heterofilima, makrofagima i malim brojem gram-negativnih, štapiastih bakterija. Pleura veeg broja uraka bila je prekrivena debelim omotaem koji se sastojao iz fibrina, heterofila i makrofaga. Kod uraka žrtvovanih sedam dana nakon inficiranja u parabronhijama su se nalazile nakupine fibrina, oiviene spljoštenim epitelnim elijama i infiltrovane fibroblastima, makrofagima i heterofilima. U intersticijumu plua naena su multipla ognjišta koja su se sastojala iz nekrotinog detritusa okruženog višejedarnim džinovskim elijama, makrofagima i po nekim heterofilom (Sprenger i saradnici, 1998). 2.11. Laboratorijska dijagnoza Kliniki znaci i patoanatomske promene su od malog znaaja za postavljanje dijagnoze pošto se i kod mnogih drugih infektivnih oboljenja javlja slina klinika slika i sline patoanatomske promene. Dijagnoza se može postaviti primenom direktnih i indirektnih metoda. Direktne metode dokazivanja uzronika su imunohistohemijska metoda, molekularne metode (PCR) i izolacija uzronika, a indirektne metode su serološke metode kojima se dokazuju specifina antitela za uzronika (shema 2) (Hafez, 2002). 21 Shema 2. Laboratorijska dijagnoza O. rhinotracheale (Hafez, 2002) 2.11.1. Detekcija bakterija Za detekciju bakterija mogu se koristiti PCR i imunohistohemijske metode. Metoda PCR može se izvoditi upotrebom kombinacije prajmera OR16S-F1 (5’-GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G) i OR 16S-R1 (5’- TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT). Ova kombinacija umnožava fragment od 784 bazna para na 16S rRNK genu ornitobakterijuma, ali ne i kod srodnih bakterija sa kojima se on može zameniti (Hafez i Beyer, 1997; van Empel, 1998a; Hung i Alvorado, 2001). U budunosti bi PCR mogao biti prilagoen za dokazivanje O. rhinotracheale u trahealnim brisevima, jajima i uzorcima iz ambijenta (Hafez, 2002). Primenom imunohistohemijske metode utvreno je da je O. rhinotracheale prisutan u 70% sluajeva oboljenja sa ispoljenim respiratornim simptomima kod brojlera, dok se bakteriološki i/ili serološki samo 30% sluajeva sa respiratornim simptomima može dovesti u vezu sa O. rhinotracheale (van Empel i saradnici, 1999; van Veen i saradnici, 2000a; Hafez, 2002). 22 2.11.2. Izolacija Uzorke za bakteriološko kultivisanje treba uzeti u ranom stadijumu bolesti. O. rhinotracheale se može izolovati iz traheje, trahealnih briseva, plua i vazdušnih kesa. Pokušaji izolacije uzronika iz krvi, srca i jetre nisu dali rezultate (Hafez i saradnici, 1993). Meutim, izolacija je bila uspešna iz ovih organa, pa ak i iz zglobova, mozga, jajnika i jajovoda eksperimentalno inficiranih ptica (van Beek i saradnici, 1994; Back i saradnici, 1998b). Za primarnu izolaciju obino se koristi krvni agar sa 10% ovije krvi. Ploe se inkubiraju na temperaturi od 37 C tokom 48 asova, pod anaerobnim ili mikroaerofilnim uslovima. O. rhinotracheale dobro raste i na triptoznom-soja agaru kao i u peptonskoj vodi i pasterela bujonu pod aerobnim i anaerobnim uslovima. U uzorcima kontaminiranim brzo-rastuim bakterijama kao što su E. coli, Proteus ili Pseudomonas dešava se da prerastu O. rhinotracheale kolonije, pa one ne bivaju otkrivene u rutinskoj dijagnostici. Pošto je potvreno da je veina izolata O. rhinotracheale rezistentna na gentamicin preporuuje se upotreba 10 g gentamicina po mililitru podloge da bi se spreio rast drugih bakterija iz kontaminiranih uzoraka i omoguila izolacija O. rhinotracheale (Hafez i saradnici, 1993; Back i saradnici, 1998b). Kao efikasna selektivna podloga navodi se krvni agar sa dodatkom 5 g gentamicina i polimiksina po mililitru podloge (van Empel, 1997). 2.11.3. Identifikacija Na krvnom agaru kolonije su male, sivo-bele, neprozirne, nehemolitine i variraju u preniku od 1 do 3 mm. O. rhinotracheale je gram-negativni pleomorfni štapi. Ne raste na „MacConkey“ agaru. Proizvodi oksidazu ali ne i indol. Svi izolati su galaktozidaza (ONPG) pozitivni, katalaza negativni i veina njih daje pozitivnu reakciju u ureaza testu (Hafez, 2002). Meutim, Günther i saradnici (2002) izolovali su i identifikovali citohrom-oksidaza negativan soj O. rhinotracheale iz uraka. Nakon inkubacije u mikroaerofilnim uslovima u trajanju od 48 h ne stvara zonu hemolize. Meutim, oko kolonija izraslih na agaru sa dodatkom ovije, kozje ili konjske krvi, nakon inicijalne inkubacije pod mikroaerofilnim uslovima, na sobnoj temperaturi u aerobnoj sredini može da se razvije zona hemolize (Tabatabai i saradnici, 2010; Gornatti Churria i saradnici, 2011). Na osnovu biohemijske identifikacije upotrebom komercijalnog test-kita (API 20 NE, bioMérieux, Francuska ili API 20 NFT, SAD) utvreno je da 99,5% sojeva 23 poseduje šifre 022 000 4 (61%) ili 002 000 4 (38,5%) (van Empel, 1998a). Dalja identifikacija bi mogla da se sprovede upotrebom „API ZYM“, ili masnokiselinskog profila (Charlton i saradnici, 1993). Drugi komercijalni identifikacioni sistem „RapID NF Plus“ sistem (Innovative Diagnostics, USA), dao je pouzdane rezultatate u identifikaciji (šifre: 4-7-2-2-6-4, 4-7-6-2-6-4, 6-7-6-2-6-4 ili 6-7-2-2-6-4) 110 ispitanih sojeva (Post i saradnici, 1997, 1999). 2.11.4. Tipizacija izolata Serološka tipizacija Potvrda pripadnosti izolata odreenom serološkom tipu može se izvršiti primenom poznatog pozitivnog antiseruma u agar-gel precipitacionom testu (AGP), ELISA testa (van Empel, 1998a; Hafez i Sting, 1999) ili brze aglutinacije (Bock i saradnici, 1997; Back i saradnici, 1998a). Otkriveno je ukupno 18 serotipova koji su oznaeni latininim slovima od A do R (van Empel, 1998a). Veina izolata poreklom od pilia pripada serotipu A, dok su izolati poreklom od uraka hetorogeniji i pripadaju serotipovima A, B i D (van Empel i saradnici, 1996; Hafez, 1998a; van Empel, 1998a). Molekularno-biološka tipizacija Dalju tipizaciju mogue je vršiti pomou PCR metode ili korišenjem RAPD- DNK (random-amplified-polymorphic DNA). Upotrebom prajmera M13 (5’-TAT GTA AAA CGA CGG CCA GT-3) i ERIC 1R (5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C- 3’) naene su varijacije izmeu svih testiranih serotipova, zbog ega se metoda smatra pogodnom za tipizaciju i epizootiološko istraživanje izolata O. rhinotracheale. Upotrebom pulsne elektroforeze (pulsed-field gel electrophoresis - PFGE) mogu se otkriti razlike izmeu 17 standardnih serotipova (A-Q). Meutim, ispitivanjem terenskih izolata serotipa A poreklom od uraka iz Nemake zapažaju se varijacije, dok su izolati B serotipa identini. Poreenjem izolata iz razliitih zemalja uoena je velika slinost izmeu izolata istog serotipa bez obzira da li su poticali od pilia ili uraka. Rezultati ukazuju na postojanje veze izmeu geografskog porekla i serotipa (Popp i Hafez, 2001). 24 2.11.5. Serološka ispitivanja Serološko ispitivanje prisustva antitela može se sprovoditi upotrebom testa brze aglutinacije pripremljenog od razliitih serotipova, ELISA testa ili DIA testa (DOT - immunobinding assay) (Bock i saradnici, 1997; Back i saradnici, 1998a; Hafez, 2002). Specifinost ELISA testa za otkrivanje odreenog serotipa zavisi od primenjenog metoda za ekstrakciju antigena koji se nanosi na ploe. Antigeni koji se ekstrahuju kuvanjem su serotipski specifini (van Empel i saradnici, 1997), dok antigeni dobijeni ekstrakcijom pomou sodium dodecil sulfata (SDS antigeni) daju više unakrsnih reakcija (Hafez i Sting, 1999). Nekomercijalni ELISA test (dobijen SDS ekstrakcijom), kao i dva komercijalna, dostupna ELISA kita (Biocheck i IDEXX) mogu da detektuju antitela protiv svih testiranih serotipova O. rhinotracheale. Ispitivanjem uzoraka seruma prikupljenih od komercijalnih jata dobijeni su slini rezultati primenom sva tri testa (Ballagi i saradnici, 2000; Hafez i saradnici, 2000). Upotrebom ELISA testa, antitela protiv O. rhinotracheale se mogu detektovati u serumu pilia nekoliko dana nakon inficiranja, a vrednosti titra antitela dostižu najviše vrednosti izmeu 1. i 4. nedelje posle inficiranja (van Empel i saradnici, 1996). Pošto titar antitela brzo opada nakon dostizanja maksimalne vrednosti, uzorke seruma za skrining ispitivanja trabalo bi kontrolisati u kraim vremenskim intervalima. Prednost seroloških testova u odnosu na bakteriološka ispitivanja je u tome što antitela perzistiraju nekoliko nedelja nakon infekcije, a bakterije se kratko zadržavaju u organizmu. Meutim, na izluivanje O. rhinotracheale i imunski odgovor mogu da utiu razni faktori, kao što su antibiotska terapija i vakcinacija. Uticaj terapije antibioticima na serološki odgovor protiv O. rhinotracheale nije razjašnjen. Popp i Hafez (2002) su sproveli istraživanje sa ciljem da utvrde efakat medikamentozne terapije amoksicilinom na kinetiku antitela. Amoksicilin je efikasan protiv veine izolata testiranih u uslovima in vitro (Hafez i saradnici, 1993). Tri grupe od po 10 SPF nosilja su inficirane intravenski sojem O. rhinotracheale (5X108 CFU) sa 36 nedelja. Grupa 1 bila je kontrolna, inficirana je ali nije tretirana amoksicilinom. Grupa 2 bila je inficirana i tretirana je odmah, amoksicilinom u dozi od 250 ppm kroz vodu za pie tokom 5 dana. Grupa 3 bila je inficirana i tretirana amoksicilinom 7 dana nakon inficiranja u dozi od 250 ppm kroz vodu za pie tokom 5 dana. Grupa 4 bila je dodatna kontrolna grupa koja nije inficirana niti tretirana antibiotikom. Uzorci krvi prikupljani su u petodnevnim intervalima do 50. dana od inficiranja i ispitani ELISA testom na prisustvo antitela protiv O. rhinotracheale. 25 Rezultati su pokazali da antibiotski tretman neposredno po inficiranju ne utie na imunski odgovor, dok tretman sproveden 7 dana nakon inficiranja ima za posledicu slabiji imunski odgovor, odnosno niži je nivo antitela u odnosu na kontrolnu grupu inficiranih, a neleenih pilia. 2.11.6. Diferencijalna dijagnoza Respiratorna oboljenja živine uzrokuju razne vrste virusa, bakterija i gljivica (shema 1). Za postavljanje laboratorijske dijagnoze, koja podrazumeva izolaciju i identifikaciju O. rhinotracheale, bitno je poznavati osobine i drugih bakterija, koje su znaajne za diferencijalnu dijagnozu (tabela 3). U diferencijalnoj dijagnostici respiratornih oboljenja ptica znaajno je nekoliko bakterijskih vrsta iz roda Pasteurella (P. multocida, P. gallinarum, P. haemolytica), Riemerella anatipestifer, Yersinia pseudotuberculosis (uzronik pseudotuberkuloze koja je ranije pripadala rodu Pasteurella), Bordetella avium i Haemophilus paragallinarum (Hafez, 2002). Tabela 3. Razliite karakteristike nekih bakterija uzronika respiratornih oboljenja živine REZULTAT ZA BAKTERIJSKE VRSTE: TEST O.r P.m R.a P.g P.h Y.p B.a H.p hemoliza - - - - + - MacConkey agar - - - - - +/- + - oksidaza + + + + + - + - galaktozidaza (ONPG) + +/- - +/- - + + indol - + +/- - - - - ureja +/- + +/- + + + - - arginin dihidrolaza -/+ - + - - - redukcija nitrata - + - + + +/- - + katalaza - + + + + + - laktoza -/+ +/- - - +/- - - maltoza -/+ -/+ - + + + + galaktoza -/+ + - + + - fruktoza -/+ + - + + + O.r = Ornithobacterium rhinotracheale; P.m = Pasteurella multocida; R.a = Riemerella anatipestifer; P.g = Pasteurella gallinarum; P.h = Pasteurella haemolytica; Y.p = Yersinia pseudotuberculosis; B.a = Bordetella avium; H.p = Haemophilus paragallinarum (Hafez, 2002) 26 2.12. Pojava infekcije u pojedinim zemljama U Evropi se O. rhinotracheale esto opisuje kao uzronik blagih do srednjih respiratornih problema i iznenadnih, akutnih uginua. Osnovni znaci infekcije su: mukozni iscedak iz nosa, suzenje, otok infraorbitalnih sinusa i smanjen prirast (van Empel i Hafez, 1999). U Holandiji se od novembra 1999. godine javljaju poveani finansijski gubici na nekoliko brojlerskih farmi kao posledica velikog broja odbaenih trupova na klanici, sa najupeatljivijim nalazom gnojnog aerosakulitisa. Procenat gubitaka na klanici iznosio je od 5 do 10%, ali je zabeležen sluaj da je odbaeno ak 90% trupova. Van Veen i saradnici (2000a) opisuju jedan ovakav sluaj sa gubicima na klanici od 60%. Klanici je isporueno 37.110 brojlera, starih 42 dana, od kojih je 265 uginulo ve u toku transporta. Inspekcijskim pregledom pilia po prispeu na klanicu ustanovljeni su znaci bolesti. Od ukupnog broja isporuenih brojlera, 22.101 trup je odbaen zbog ascitesa, poliserozitisa i drugih intraabdominalnih promena. Kod nekoliko pilia uoen je dermatitis, sinovitis, artritis i/ili perikarditis. Sa klanice je upueno 150 živih pilia i 150 trupova na patoanatomsku analizu u Deventer („Animal health servis“). Na živim piliima zapaženi su kliniki simptomi u vidu kijanja, nazalnog iscetka i lakrimacije. Iz anamneze se došlo do saznanja da su pilii ispoljavali blage respiratorne simptome od 28. dana života. Ukupno je useljeno 41.000 brojlera u tri odvojena objekta. Vakcinisani su protiv atipine kuge peradi, infektivnog bronhitisa i Gamboro bolesti. Antibiotici nisu primenjivani uprkos mortalitetu od 3,3% u prvih 10 dana tovnog perioda. Do 28. dana proizvodni rezultati su bili dobri. Prosena telesna masa 28. dana iznosila je 1156 g, a 41. dana 1700 g. Stopa mortaliteta iznosila je 0,12- 0,85% dnevno. Patoanatomskim ispitivanjem utvreno je prisustvo fibrinozno-gnojnog aerosakulitisa kod 84% ispitanih pilia, a kod nekoliko leševa i prisustvo perikarditisa i pneumonije. Serološkim analizama utvren je visok titar antitela na IBV koji se dovodi u vezu sa prirodnom infekcijom, a titar antitela na O. rhinotracheale odgovarao je akutnoj infekciji. Od 24 pileta sa izraženim patoanatomskim promenama uzorkovani su organi (vazdušne kese, plua, kosna srž) za bakteriološka ispitivanja. O. rhinotracheale je izolovan iz 20 uzoraka vazdušnih kesa, a E. coli iz svega 4 uzorka. Histopatološkim ispitivanjem uoena je infiltracija plua i vazdušnih kesa limfocitima i heterofilima i fibrinozno-gnojni eksudat u vazdušnim putevima. U 27 mišiima su zapažene degenerativne promene. Imunohistohemijskim ispitivanjem otkriveno je prisustvo antigena O. rhinotracheale u respiratornim organima, tetivama i aponeurozama (van Veen i saradnici, 2000a). Odor i saradnici (1997) opisali su pojavu oboljenja na poluostrvu Delmarva u 11 brojlerskih jata u starosti od 36 do 66 dana (prosena starost 46 dana). U trenutku ispitivanja iz anamneze je bilo poznato da su tokom tova u ovim jatima bili poveani morbiditet i mortalitet i da je na klanici odbaen vei broj trupova od uobiajenog, mada precizni podaci nisu bili poznati. U obolelim jatima dijagnostikovani su i IBV, lentogeni NDV i virus infektivnog laringotraheitisa (laryngotracheitis virus - LTV). Ispitivanja su preduzeta na zahtev kompanija - vlasnika farmi, zbog kliniki ispoljenog respiratornog oboljenja i poveanog dnevnog mortaliteta. Stopa mortaliteta iznosila je 2-4 pileta na hiljadu (oekivana dnevna stopa mortaliteta je 0,5 na hiljadu u toj fazi uzgoja). Od patoanatomskih promena zapažen je aerosakulitis koji se manifestovao prisustvom tenog, penušavog sadržaja žute do bele boje i kazeoznog sadržaja u vazdušnim kesama. Kod leševa iz nekoliko jata bila je prisutna pneumonija, u veini sluajeva unilateralna, a na leševima iz jednog jata naena je izrazita bilateralna konsolidacija plua. Kod nekih pilia cela plua su bila zahvaena, a kod drugih samo deo organa. Oko plua, uz zid grudnog koša uoene su nakupine fibrina, a opisana je i pojava pleuralnog eksudata. Šest od jedanaest jata ispitano je histopatološki. Od histopatoloških promena utvren je slabo do srednje izražen limfocitni traheitis sa difuznom hiperplazijom epitela, hiperemijom, gubitkom cilija, akutni difuzni gnojni aerosakulitis i akutna fibrinozna pleuropneumonija. Od 11 ispitanih jata u sedam je izolovan virus: u tri jata IBV, u jednom jatu lentogeni NDV, u dva jata LTV i u jednom jatu adenovirus. Izolati IBV-a nisu bili serotipizirani, a poreklo LTV-a nije bilo poznato. Iz svih 11 obolelih jata izolovan je O. rhinotracheale, a iz 7 jata i E. coli. Ni u jednom sluaju antibiotici nisu primenjivani pre laboratorijskih ispitivanja. Antibiogram ukazuje na osetljivost uzronika na tetraciklinine, eritromicin, sarafloksacin, novobiocin, nalidiksinsku kiselinu, linkomicin i bacitracin. Aerosakulitis koji je zapažen u ovim sluajevima infekcije prouzrokovane virusom infektivnog bronhitisa razlikovao se od do tada poznatih sluajeva u kojima je E. coli uzrokovala sekundarnu infekciju. Masivni aerosakulitis sa prisustvom penušavog sadržaja bele do žute boje sa kazeoznim ostrvcima i unilateralna pleuropneumonija 28 odgovarali su nalazu koji su opisali Van Beek i saradnici (1994) kao posledicu infekcije ornitobakterijumom. Nasuprot tome navedeni autori opisuju i enteritis koji se u ovim sluajevima nije javljao (Odor i saradnici, 1997). U martu 1997. godine u SAD-u (na srednjem zapadu) javili su se problemi na farmi koja se sastojala iz osam proizvodnih jedinica od po 127.000 komercijalnih nosilja. Proizvodnja jaja u jatu A u starosti od 34 nedelje, opala je za 10% u sedam dana. Uoena je niska incidencija otoka sinusa (< 0,1%) i otežano disanje kod malog broja kokoši. Beleži se i pojava deformisanih jaja, ali manje od 1% ukupne proizvodnje. Mortalitet koji se kretao od 15 do 20 kokoši dnevno (0,1% nedeljno), poveao se na 30 kokoši dnevno (0,2-0,3% nedeljno). Patoanatomski nalaz karakterisao se prisustvom sinuzitisa i peritonitisa. Iz infraorbitalnih sinusa izolovan je O. rhinotracheale-serotip C. Iz unutrašnjih organa leševa izolovane su i druge bakterije: E. coli, Streptococcus sp. i bakterije opisane kao „sline pastereli“. U narednih šest nedelja došlo je do pada proizvodnje i poveanja mortaliteta i u 5 drugih proizvodnih jedinica (B-F). Nekoliko nedelja od izbijanja oboljenja proizvodnja jaja je bila smanjena i nikada nije dostigla oekivane vrednosti, a stopa mortaliteta bila je poveana duže vreme. U poetnoj fazi oboljenja izolovan je IBV. Meutim autori smatraju da neoekivano dug period smanjene proizvodnje kao i stopa mortaliteta nisu uobiajeni za infekciju prouzrokovanu IBV-om i navode da je u ovom sluaju uloga O. rhinotracheale mogla biti veoma znaajna (Sprenger i saradnici, 2000). El-Gohary i Awaad (1998) izveštavaju o pojavi oboljenja prouzrokovanog ornitobakterijumom u Egiptu, praenog respiratornim znacima uz depresiju, anoreksiju, smanjen prirast i povišen procenat mortaliteta. U južnoj Africi O. rhinotracheale je uzrokovao znaajne ekonomske gubitke koji su posledica odbacivanja trupova na klanicama usled hroninih aerosakulitisa i peritonitisa (Travers i saradnici, 1996). Sakai i saradnici (2000) izveštavaju o pojavi oboljenja u Japanu gde je O. rhinotracheale doveden u vezu sa oboljenjem brojlera u starosti od sedam do devet nedelja koje se manifestovalo blagim kijanjem, dijarejom sa zelenim izmetom i tremorom glave. Mortalitet je bio povean preko 10%. 29 Rahimi i Banani (2007) opisali su pojavu ornitobakterioze kod brojlera na zapadu Irana. Respiratorni simptomi poeli su kijanjem u starosti od 27 dana, a zatim se pojavio nazalni iscedak, suzenje otok infraorbitalnih sinusa i otežano disanje. Bolest je trajala do kraja tovnog perioda, nepovoljno se odrazila na proizvodne rezultate, a mortalitet je iznosio 13,6%. Patoanatomskim pregledom naen je traheitis, aerosakulitis i pneumonija. Najupeatljiviji je bio nalaz, penušavog, belog eksudata u traheji i vazdušnim kesama. Histopatološkim pregledom zapaženo je zadebljanje perikardijuma usled infiltracije makrofagima i heterofilima. Vazdušne kese su bile edematozne i infiltrovane heterofilima. Plua su bila hiperemina i infiltrovana makrofagima i heterofilima, a u lumenu parabronhija nalazila su se nekrotina ognjišta. Traheitis se manifestovao hiperemijom i infiltracijom epitela i lamine proprije heterofilima i makrofagima. Bakteriološkim ispitivanjem izolovan je O. rhinotracheale iz traheje, plua i vazdušnih kesa bolesnih ptica. Na osnovu klinikog pregleda, patomorfološkog i laboratorijskih ispitivanja smatra se da je O. rhinotracheale primarni prouzrokova respiratorne infekcije na ovoj farmi. U dva susedna jata brojlera sa jednog velikog farmskog kompleksa u Buenos Airesu, u Argentini, u starosti od 40 i 46 dana, javili su se simptomi u vidu kijanja, nazalnog iscetka, facijalnog edema, depresije i smanjenog uzimanja hrane i vode. Mortalitet je bio povišen preko 10%. Patoanatomskim pregledom naena je pneumonija i zamuenje zidova torakalnih i abdominalnih vazdušnih kesa u kojima se nalazio penušavi eksudat. Histopatološkim ispitivanjem, kod pilia iz oba jata utvrena je fibrinozno-gnojna pneumonija. Iz uzoraka traheje i plua izolovan je O. rhinotracheale koji je posle inkubacije u mikroaerofilnoj sredini, na sobnoj temperaturi, u aerobnim uslovima ispoljio -hemolitiku aktivnost (Gornatti Churria i saradnici, 2011). Hinz i saradnici (1994) opisuju pojavu ovog oboljenja u Nemakoj, 1992. godine, kod tovnih uraka u starosti od 23 nedelje. urke su bile vakcinisane protiv atipine kuge i pastereloze i bile su serološki negativne na Mycoplasma spp. U ovom sluaju mortalitet je iznosio 5,6%, a morbiditet 16,6%. Kliniki znaci (slabost, dispnoja, zevanje i iskašljavanje krvavo-sluzavog sadržaja) zapaženi su samo kratko vreme (nekoliko sati) pre smrti. Pojavu ove infekcije kod uraka u Maarskoj pratili su razliiti kliniki znaci u razliitim jatima. U etiri jata u starosti od 2 do 3 nedelje javili su se simptomi u vidu 30 rinitisa, traheitisa, konjunktivitisa i povišen mortalitet. U jednom jatu u starosti od 15 do 16 nedelja kod uginulih ptica, patoanatomski nalaz je karakterisala bilateralna kataralno-krupozna pneumonija. U jednom jatu starom pet nedelja i u tri jata u starosti od 16 do 20 nedelja javili su se nervni simptomi (poremeaj motorike, abnormalno držanje glave, ležanje), kao posledica fibrinozno-gnojnog zapaljenja kostiju glave i meningitisa. U svim opisanim sluajevima iz organa obolelih uraka izolovan je O. rhinotracheale (Szalay i saradnici, 2002). U Sloveniji se 1999. godine pojavilo teško respiratorno oboljenje koje se dovodi u v zu sa O. rhinotracheale. Ova bakterija je izolovana iz respiratornih organa tovnih uraka i brojlerskih roditelja. Kliniki znaci i patoanatomske promene bili su slini kao kod drugih virusnih i bakterijskih respiratornih infekcija. Najkonzistentnije patoanatomske promene inili su: unilateralna ili bilateralna pneumonija, aerosakulitis i akumulacija fibrina na pluima. Kod kokoši se javljao i ovoforitis. Kod uraka su kliniki znaci bili izraženiji, a mortalitet je bio viši kod starijih i kod jedinki muškog pola. Kod brojlerskih roditelja infekcija je bila izraženija kod kokoši nego kod petlova. Serološkim ispitivanjem ELISA testom 18 jata tovnih uraka i 22 jata brojlerskih roditelja utvreno je prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale u 77% jata tovnih uraka, odnosno 91% jata brojlerskih roditelja (Zorman-Rojs, 2000). U Americi, na srednjem zapadu, opisano je oboljenje kod urana u jatu starom 22 nedelje, koje je u naredna tri dana trebalo da bude upueno na klanje. Od klinikih znakova zapaženi su depresija, kašalj i prisustvo krvi oko kljuna i nosnih otvora. Od pojave prvih simptoma mortalitet je rastao dostigavši 5,9% u toku nekoliko dana, pre nego što je jato upueno na klanje. U ovom periodu i na drugim okolnim farmama obolela su jata tovnih uraka u starosti od 14 do 22 nedelje i jata urana na tri farme roditeljskih uraka, pri emu je mortalitet bio povišen kao posledica pneumonije. Na farmi su izvršene obdukcije i organi 5 leševa (plua i jetre) prosleeni su na histopatološko i bakteriološko ispitivanje, a krv je uzorkovana za serološki pregled. Patoanatomskim pregledom utvreno je da su mišini i žlezdani želudac prazni, jetre normalnog izgleda, a plua zacrvenjena i vlažna. Obino je jedno pluno krilo bilo više zahvaeno. Pleura je na toj strani prekrivena bistrim, lepljivim eksudatom. Histopatološkim ispitivanjem utvrena je difuzna fibrinozno-gnojna pneumonija i pleuritis u svim pregledanim organima (5 plua). Vazdušni putevi bili su ispunjeni 31 fibrinom, heterofilima i makrofagima. Na tri od pet pregledanih jetri zapažena je multifokalna bilijarna hiperplazija, nekrotina i inflamatorna ognjišta. Iz svih pet uzoraka plua izolovana je ista kultura O. rhinotracheale. Ni iz jednog uzorka jetre nije izolovana ova bakterija. Serološkim ispitivanjem nisu utvrena antitela na mikoplazme, paramiksoviruse tip 2 i tip 3 (paramyxoviruses - PMV) niti na virus avijarne influence (avian influenza virus - AIV) (Roepke i saradnici, 1998). Prvi publikovan sluaj infekcije uraka prouzrokovane O. rhinotracheale u Kanadi datira iz 1998. godine (Ontario). U jatu od 10.000 urana u starosti od 14 nedelja, došlo je do poveanja mortaliteta (u dva dana uginulo je oko 1% urana). Od klinikih znakova opisuje se neveselost i teško disanje. Najkonzistentnije patoanatomske promene zapažene su na pluima u vidu bilateralnog otoka, hiperemije i konsolidacije. Kod mnogih uraka površina plua, naroito dorzalna strana bila je prekrivena žuto-belim fibrinoznim eksudatom. Na pluima pojedinih leševa uoena su žuta nekrotina podruja. Kod oko 30% leševa uoen je fibrinozni perikarditis, a kod nekoliko uraka bio je prisutan aerosakulitis (eše na grudnim vazdušnim kesama). Jetra nekoliko leševa bila je hiperemina. Na osnovu klinikih i patoanatomskih promena postavljena je sumnja na O. rhinotracheale. Organi uginulih uraka poslati su na histopatološko, bakteriološko i virusološko, a krv na serološko ispitivanje. Histopatološkim ispitivanjem plua ustanovljena je difuzna fibrinozno-gnojna pleuropneumonija. Iz plua uginulih uraka izolovan je O. rhinotracheale. Izolat je bio osetljiv na eritromicin i tetraciklin, intermedijarno osetljiv na penicilin, a otporan na trimetoprim-sulfametoksazol. Serološkim ispitivanjem u serumima nije utvreno prisustvo antitela na M. gallisepticum, M. synoviae, M. meleagridis, AIV i PMV (tip 1, 2, 3 i 6), niti su izolovani virusi na pileim embrionima (Abdul-Aziz, 1999). Kasnije je opisana i pojava ovog oboljenja u Kvebeku koje se pojavilo još ranije, u prolee 1997. godine. U tri jata velikih belih hibridnih uraka nosilja, javili su se ozbiljni respiratorni problemi u starosti od 52 nedelje. urke su pokazivale znake depresije, dispnoje, kašlja, nazalnog iscetka, a u nekim sluajevima javljala su se iznenadna uginua. U najkritinijem periodu mortalitet je dostizao 1,4-7% nedeljno. U svim jatima došlo je do pada nosivosti u trajanju od najmanje etiri nedelje (Joubert i saradnici, 1999). 32 De Rosa i saradnici (1996) opisali su pojavu respiratornog oboljenja u Americi na tri susedna rana roditeljskih uraka u intervalima od oko dve nedelje. Poslednja dva zahvaena rana bila su na udaljenosti od 11 km i pripadala su razliitim kompanijama. Mortalitet na poslednjem ranu bio je naroito izražen u pojedinim izdvojenim grupama uraka: kod urana, utovljenih uraka i uraka izloženih stresu (veštako osemenjavanje). Na tom ranu procenat mortaliteta u periodu od 18 dana iznosio je 5,2% kod urana, 2,4% kod uraka, 7,4% kod utovljenih urana i 5,4% kod utovljenih uraka. Tokom trajanja oboljenja ispitane su urke u starosti od 27 do 42 nedelje. Od patoanatomskih promena zapažen je fibrinozni aerosakulitis, uveanje jetre i slezine, petehije na epikardu, prisustvo zamuene tenosti u perikardijumu, konsolidacija plua i fibrinozni eksudat na pleuri. Histopatološki nalaz karakterisalo je fibrinozno-gnojno zapaljenje vazdušnih puteva, pleure, vazdušnih kesa i perivaskularni intersticijalni edem plua. U jetri je utvrena akutna koagulaciona nekroza hepatocita sa mestiminom trombozom na periferiji jetrinih lobusa. Iz respiratornih organa: infraorbitalnih sinusa, traheje, plua i vazdušnih kesa izolovan je O. rhinotracheale. Pokušaj izolacije iz ostalih organa (jetre, slezine i kosne srži) nije dao rezultate. E. coli izolovana je iz respiratornih organa, mada sa manjom uestalošu. 2.13. Serološka ispitivanja prisustva uzronika u pojedinim zemljama Prisustvo uzronika u intenzivnoj brojlerskoj proizvodnji dokazano je indirektno, serološkim metodama u mnogim zemljama. Ovde se navodi samo nekoliko primera dokazivanja uzronika u brojlerskim jatima sa tri razliita kontinenta kako bi se skrenula pažnja na globalni karakter infekcije. Chansiripornchai i saradnici (2007) ispitivali su prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale u 19 brojlerskih jata u starosti od 30 do 45 dana na Tajlandu i utvrdili prisustvo antitela u 12 jata. Od 280 pojedinanih seruma brojlera (iz 19 jata) pozitivno je reagovalo 19,6% uzoraka. Canal i saradnici (2003) ispitivali su prisustvo antitela na uzronika u 50 brojlerskih jata (ukupno 1550 pojedinanih uzoraka) u južnom Brazilu. Prisustvo antitela ustanovljeno je u 63,83% jata, a pozitivno je reagovalo u proseku 6,52% pojedinanih uzoraka po jatu. 33 Hafez i Sting (1996) sproveli su ispitivanje prisustva antitela na uzronika u Nemakoj i ustanovili 26% seropozitivnih jata brojlera. Ryll i saradnici (1997) takoe su ispitivali prisustvo antitela na O. rhinotracheale u Nemakoj. Ispitivanjem 332 pojedinana seruma, sa 22 farme iz 25 brojlerskih jata utvrdili su 9,4% seropozitivnih pojedinanih uzoraka odnosno 13,2% seropozitivnih jata. U Republici Srbiji sprovedeno je ispitivanje rasprostranjenosti infekcije kojim je obuhvaeno 26 jata brojlera sa razliitih farmi iz pet opština. Specifina antitela za uzronika utvrena su u 43 od 430 ispitanih uzoraka krvi brojlera iz 16 jata razliite starosti. Rezultati pokazuju da je infekcija rasprostranjena u veini brojlerskih jata (61,54%) i da je u proseku relativno mali broj pilia po jatu inficiran - 10% (Gavrilovi, 2009). 2.14. Eksperimentalna infekcija Uloga O. rhinotracheale u kompleksnoj patologiji respiratornog sistema živine još uvek nije u potpunosti razjašnjena. Rasvetljavanju te uloge doprinose brojni eksperimenti iji je osnovni cilj da se utvrdi da li je O. rhinotracheale uzronik respiratornog oboljenja živine i da li je sposoban sam da izazove infekciju, odnosno da li je primarni patogen. U poglavlju „Patogeneza“ opisan je eksperiment koji ukazuje da O. rhinotracheale uzrokuje minimalne patološke promene kod pilia nakon inficiranja aerosolom, dok su ovom poglavlju opisani i eksperimenti koji su uporište za tezu da je uzronik primarni patogen. 2.14.1. Eksperimentalna infekcija pilia Jedan od eksperimenata koji potkrepljuju stav da je O. rhinotracheale primarni patogen je eksperiment koji su izveli L. van Veen i saradnici (2000b). Ciljevi ovog eksperimenta bili su da se ispita patogenost, odnosno da li O. rhinotracheale ima ulogu primarnog patogena ili sekundarnog oportunistikog patogena; da li postoji razlika u patogenosti izmeu holandskih izolata od 1994/1995. do 1998/1999. i da li postoji razlika u patogenosti izmeu holandskih, južnoafrikih i amerikih izolata O. rhinotracheale. Ispitivanje je obuhvatalo 6 ogleda u kojima su korišeni komercijalni brojleri, SPF brojleri i SPF pilii rase leghorn koji su inficirani aerosolom ili intravenski 34 holandskim izolatima iz 1994/1995. i 1998/1999. godine, južnoafrikim ili amerikim izolatima. Pojedine grupe 6 dana pre inficiranja O. rhinotracheale inficirane su NDV- om, a pojedine nisu inficirane ni jednim od agenasa (kontrolne grupe). Patoanatomsko ispitivanje vršeno je posle 7 i 14 dana od inficiranja ornitobakterijumom. Promene u traheji utvrene su kod komercijalnih brojlera i SPF brojlera nakon inficiranja samo ornitobakterijumom, ali su bile izraženije kada su pilii prethodno bili inficirani NDV-om. Promene na vazdušnim kesama i pluima naene su posle inficiranja razliitim sojevima O. rhinotracheale aerosolom kod SPF brojlera i komercijalnih brojlera, dok kod SPF leghorn pilia nije bilo lezija na pluima, a promene na vazdušnim kesama su bile manje izražene. Promene su bile jaeg intenziteta u grupama komercijalnih i SPF brojlera koje su prethodno inficirane NDV-om. Infekcija dve grupe SPF brojlera, prouzrokovana intravenskom aplikacijom holandskih izolata iz 1994/1995. i 1998/1999. godine manifestovala se promenama na zglobovima i jetri. Patoanatomske promene posle 14 dana od inficiranja bile su manje izražene nego 7 dana posle inficiranja. Razlike u patogenosti izmeu holandskih sojeva iz 1994/1995. i iz 1998/1999. godine nisu uoene u odnosu na pojavu aerosakulitisa, pneumonije i traheitisa. Pošto je ovim eksperimentom dokazano da O. rhinotracheale nije postao virulentniji u periodu od 1994. do 1999. godine, smatra se da su poveani problemi u vezi sa infekcijom O. rhinotracheale u Holandiji mogli da budu posledica ili poveanog broja infekcija i/ili poveane rezistencije uzronika na antibiotike. Od znaaja je nalaz da O. rhinotracheale može da prouzrokuje promene bez prethodne infekcije virusima, iako je potvreno da NDV pojaava intenzitet promena koje uzrokuje O. rhinotracheale. Promene prouzrokovane eksperimentalnom infekcijom nestaju vrlo brzo što je zapaženo i kod prirodne infekcije. Eksperimentom je pokazano da postoje razlike u virulentnosti sojeva kao i razlike u prijemivosti razliitih provenijencija pilia. Holandski i južnoafriki sojevi su virulentniji od amerikih. Leghorn SPF pilii su manje prijemivi od brojlera, dok su komercijalni brojleri prijemivi kao SPF brojleri. Glavni zakljuak ovog eksperimenta je da postoje razlike u patogenosti razliitih sojeva i da se O. rhinotracheale može smatrati primarnim patogenom (van Veen i saradnici, 2000b). Kilic i saradnici (2009) ispitivali su klinike simptome i patomorfološke promene kod komercijalnih brojlera, starih 14 dana koji su inficirani putem aerosola O. rhinotracheale sojem B3263/91. Od 30 inficiranih pilia kod 3 su se javili kliniki 35 simptomi u vidu otežanog disanja. U poreenju sa piliima iz kontrolne grupe nedeljni prirast je bio niži što je naroito bilo izraženo 2 nedelje od inficiranja. Kod pet pilia izmeu 7. i 14. dana od inficiranja zapaženo je nakupljanje male koliine sluzi u nosu, larinksu i traheji kao i hiperemija sluznice gornjih respiratornih puteva. Kod pojedinih pilia u pluima su makroskopskim pregledom uoena zelenkasto-crvena ognjišta. Histopatološke promene naene su u nosu, larinksu, traheji, pluima i vazdušnim kesama. U posteriornom delu nosne šupljine, larinksu i traheji zapažena su mala ognjišta hiperplazije epitela. U pojedinim delovima mukoze naena je degeneracija, nekroza i deskvamacija epitela. U lamini propriji ustanovljen je edem, hiperemija i krvarenja razliitog intenziteta. elijski infiltrat sastojao se iz limfocita, makrofaga, heterofila i malo plazma elija, a naena su i fokalna ognjišta akumulacije limfocita. U lumenu nosa, larinksa i traheje nalazio se eksudat od degenerisanih i nekrotinih epitelnih elija, heterofila i eritrocita. U pojedinim delovima plua u BALT- u zapažena je infiltracija inflamatornim elijama, krvarenja i nekroza. U primarnim bronhusima uoena je fokalna hiperplazija epitela, blag peribronhijalni edem, hiperemija i infiltracija limfocitima, makrofagima i malim brojem heterofila i plazma elija. Nalaz u vazdušnim kesama karakterisala je fokalna hiperplazija, degeneracija, nekroza i deskvamacija epitela, kao i hiperemija, edem i infiltrat od inflamatornih elija u subepitelu. Histopatološke promene nisu naene u drugim visceralnim organima eksperimentalno inficiranih pilia (Kilic i saradnici, 2009). 2.14.2. Eksperimentalna infekcija uraka Eksperiment koji je izvela grupa istraživaa Fakulteta veterinarske medicine sa univerziteta Minesota (Sprenger i saradnici, 1998) veoma je znaajan jer predstavlja prvi primer eksperimentalne infekcije uraka prouzrokovane samo ornitobakterijumom (monoinfekcija). Eksperimentom je obuhvaeno 25 tovnih urana, starih 22 nedelje, bakteriološki i serološki negativnih na O. rhinotracheale koji su podeljeni u pet grupa. Jedna grupa inficirana je intravenski (I/V) istom kulturom O. rhinotracheale, druga grupa intratrahealno (I/T) istom kulturom O. rhinotracheale, trea grupa inficirana je I/T plunim homogenizatom u kojem se nalazio uzronik. Dve grupe su bile kontrolne, aplikovan im je I/V ili I/T sterilni fiziološki rastvor. urani su posmatrani tokom sedam dana od inficiranja. U tom periodu uginulo je 5 urana iz grupe I/T inficirane plunim homogenizatom, 2 urana iz grupe I/T inficirane istom kulturom i jedan uran iz grupe koja je I/V inficirana istom kulturom. 36 Uzorci krvi uzimani su sedmog dana nakon inficiranja kada su preživele jedinke eutanazirane. Nakon 24 h od inficiranja, kod urana iz grupe inficirane I/T istom kulturom O. rhinotracheale i grupe inficirane I/T plunim homogenizatom ispoljili su se simptomi depresije, kašlja i smanjenog uzimanja hrane. Nakon 48 h od inficiranja, nekoliko urana iz ove dve grupe, iskašljavalo je krvavu sluz i oni su uginjavali nakon 24 h. Pet dana nakon inficiranja kašalj se povlaio i preživeli urani su bili manje depresivni. urani iz kontrolnih grupa nisu ispoljavali klinike simptome. urani inficirani I/T istom kulturom O. rhinotracheale i urani inficirani I/T plunim homogenizatom imali su statistiki znaajan gubitak telesne mase u poreenju sa kontrolnim grupama. Patoanatomskim pregledom leševa uginulih i eutanaziranih urana iz ove dve grupe naen je beliast eksudat u medijalnom onom uglu kod nekoliko leševa. Vazdušne kese su bile zadebljalih zidova i ispunjene belim do žutim kazeoznim sadržajem. Perikard je kod nekoliko leševa bio hiperemian, zadebljao, zamuen (neproziran) i ispunjen kazeoznim žuto-belim eksudatom. Plua su makroskopski opisana kao zacrvenjena, vlažna, teška i prekrivena gustim, beliastim eksudatom. Mikroskopski, plua su bila izrazito hiperemina. Parabronhije i vazdušni kapilari bili su ispunjeni fibrinom, heterofilima, makrofagima i malim brojem gram- negativnih, štapiastih bakterija. Pleura je bila prekrivena naslagama koje su se sastojale iz fibrina, heterofila i makrofaga. Kod urana eutanaziranih sedmog dana u parabronhijama su se nalazile nakupine fibrina, oiviene spoljštenim epitelnim elijama i infiltrovane fibroblastima, makrofagima i heterofilima. U intersticijumu plua naena su multipla ognjišta nekrotinog elijskog detritusa okruženog višejedarnim džinovskim elijama, makrofagima i po nekim heterofilom. Iz obe grupe urana koji su inficirani I/T (kulturom O. rhinotracheale i plunim homogenizatom), O. rhinotracheale je izolovan iz plua etiri od pet urana. Sedmog dana, u serumima inficiranih urana utvreno je prisustvo specifinih antitela protiv O. rhinotracheale, za razliku od kontrolnih grupa. Kliniki znaci koje su ispoljavali eksperimentalno inficirani urani (depresija, kašalj i dr.) bili su slini kao kod prirodne infekcije. Patoanatomske promene (nekrotina, fibrinozno-gnojna pneumonija, perikarditis i pleuritis) uoene kod eksperimentalno inficiranih urana bile su u tipu promena naenih kod uginulih uraka u terenskim uslovima. Nakon sedam dana od inficiranja urani su pokazivali znake oporavka, iako su na obdukciji bili izraženi aerosakulitis i pneumonija. 37 Ovo je prvi sluaj uspešno izazvanog oboljenja uraka u eksperimentalnim uslovima, inficiranjem samo ornitobakterijumom. Autori navode nekoliko faktora koji bi mogli da budu znaajni za uspeh ovog eksperimenta. 1. Prvi je odabir ptica koje su praene tokom odgoja bakteriološki i serološki (ni jedna nije bila u kontaktu sa uzronikom pre eksperimentalne infekcije). 2. Uzrast koji je odgovarao uzrastu u kom su zabeleženi teži sluajevi oboljenja u terenskim uslovima. 3. Intratrahealno inficiranje može se smatrati znaajnim za izazivanje teške pneumonije. Aerosol i inokulacija vazdušnih kesa imali su za posledicu smanjen rast i aerosakulitis (eksperiment koji su izveli van Empel i saradnici, 1996). 4. etvrti faktor koji može da bude znaajan za ispoljavanje bolesti je kultura koja se koristi za izazivanje infekcije (broj pasaža, medijum za rast i doza). Kultivisanje uzronika na vrstom medijumu i upotreba bakterija sa manjim brojem pasaža mogli su da utiu na spreavanje gubitka faktora virulencije. Iako je mogue izazvati bolest manjim brojem bakterija, u opisanom eksperimentu je aplikovano 1010 bakterija u istoj kulturi i 108 bakterija u plunom homogenizatu (Sprenger i saradnici, 1998). 2.14.3. Eksperimentalna infekcija pilia i uraka Van Empel i saradnici (1996) izveli su eksperiment kojim je pokazano da se eksperimentalnim inficiranjem uraka i brojlera može izazvati respiratorno oboljenje sa bar delimino istim karakteristikama koje se sreu u klinikim sluajevima. Nakon inficiranja vazdušnih kesa izolatima O. rhinotracheale i kod uraka i kod brojlera je došlo do usporavanja rasta, bez makroskopskih promena na sekciji. Inficiranje uraka i brojlera razliitog uzrasta, aerosolom, imalo je za posledicu usporen rast i razvoj patoanatomskih promena u traheji, vazdušnim kesama i pluima. Kod uraka je eksperimentalna infekcija (prouzrokovana aerosolom) pojaana prethodnom aplikacijom TRTV-a, a kod brojlera prethodnom aplikacijom NDV-a (slabiji efekat postignut je aplikacijom IBV-a i TRTV-a u odnosu na razvoj aerosakulitisa i pneumonije). Najizraženiji kliniki znak eksperimentalne infekcije bio je usporen rast. Meutim, drugi kliniki znaci (slabost, dispnoja, mukozni iscedak iz nosa) i uginua zapaženi kod prirodne infekcije nisu primeeni kod eksperimentalne infekcije. Ove razlike u eksperimentalnoj i prirodnoj infekciji mogle bi se objasniti razlikama u 38 predisponirajuim faktorima i uticajima drugih infektivnih agenasa. U terenskim uslovima znaajan uticaj mogu da imaju: stres, prenaseljenost, loša ventilacija, prisustvo drugih bakterija i visok nivo amonijaka. Najupeatljivija patoanatomska karakteristika eksperimentalne infekcije prouzrokovane ornitobakterijumom i NDV-om je fibrinozni aerosakulitis koji je ponekad bio udružen sa traheitisom i pneumonijom. Aerosakulitis se manifestovao nalazom penušavog eksudata sa krpicama fibrina u vazdušnim kesama. Pneumonija je obino bila unilateralna sa jasnom granicom izmeu zahvaenih i nezahvaenih delova plua. Ove promene opisane su i u klinikim sluajevima prirodne infekcije u kojima je izolovan O. rhinotracheale. Iako se nisu ispoljili svi kliniki znaci i patoanatomske promene kao kod prirodne infekcije, ovim eksperimentom je potvreno da je O. rhinotracheale infektivni agens patogen za pilie i urke pošto su ispunjena sva tri Kohova postulata: 1. Agens je izolovan iz obolelih ali ne i iz zdravih jedinki; 2. Agens je izolovan u istoj kulturi, kojom je prouzrokovano oboljenje kod uraka i brojlera posle eksperimentalnog inficiranja; 3. Agens je reizolovan iz obolelih jedinki. 2.14.4. Eksperimentalna infekcija prepelica (Coturnix coturnix japonica) Eroksuz i saradnici (2006) ispitivali su patogenost uzronika za japanske prepelice u eksperimentalnim uslovima. Inficirano je 30 mužjaka starih 10 nedelja putem aerosola O. rhinotracheale sojem B3263/91. Tokom šest nedelja, ptice u ogledu nisu ispoljavale klinike simptome. Patoanatomski nalaz karakterisala je hiperemija traheje, hiperemija plua i zadebljanje pleure. Histopatološkim ispitivanjem utvrena je nekroza i deskvamacija trahealnog epitela, subepitelna krvarenja, subserozni edem i hiperemija plua u treoj i šestoj nedelji nakon inficiranja. Uoeno je i zadebljanje pleure kao posledica infiltracije mononuklearnim elijama. 39 2.15. Terapija Teškoe u terapiji bolesti su posledica sposobnosti uzronika za sticanje rezistencije na brojne antibiotike: enrofloksacin, linkomicin, tilozin, doksiciklin, sulfonamide i flumekvin (Devriese i saradnici, 1995; van Empel i Hafez, 1999). Utvreno je da osetljivost ornitobakterijuma na antibiotike varira u zavisnosti od porekla soja. Tako je na primer u Nemakoj 90% sojeva rezistentno na enrofloksacin (Hafez, 1996), dok su izolati iz Francuske i Belgije (gde se jaja uglavnom ne tretiraju antibioticima) gotovo uvek vrlo osetljivi na ovaj antibiotik (Devriese i saradnici, 1995; Dudouyt i saradnici, 1995; Roger i Léorat, 1997). Leenje obolelih uraka konvencionalnim, oralno primenjenim antibioticima davalo je slabe rezultate, naroito u sluajevima kliniki izražene pneumonije. Upotreba enrofloksacina i trimetoprim-sulfametoksazola nije bila efikasna. U nekim sluajevima oboljenja, injekcijama tetraciklina ili sintetskih penicilina (uglavnom dvokratno aplikovanih) postignuti su dobri efekti. Neuspešna terapija imala je za posledicu visok mortalitet koji je iznosio i do 25% u par nedelja (van Beek, 1994). Gotovo svi sojevi izolovani u Holandiji bili su rezistentni na flumekvin, slabo osetljivi na enrofloksacin i trimetoprim-sulfametoksazol, a osetljivi na ampicilin i tetraciklin (van Empel i Hafez, 1999). Istraživanja u Nemakoj pokazala su da je 90-100% ispitanih sojeva O. rhinotracheale poreklom iz Nemake rezistentno na enrofloksacin, neomicin, gentamicin i trimetoprim-sulfametoksazol, dok su svi ispitani sojevi osetljivi na tetraciklin, hloramfenikol i amoksicilin (Hafez, 1996). Primenom tetraciklina, hloramfenikola i amoksicilina u vodi za pie postignuti su dobri rezultati u Nemakoj i Velikoj Britaniji (Chin i Droual, 1997). Pri razmatranju ovih rezultata treba imati u vidu da pozitivni efekti postignuti primenom hloramfenikola nemaju praktian znaaj za živinarstvo zbog zakonske regulative u Republici Srbiji (zabrana korišenja hloramfenikola kod životinja iji se proizvodi koriste za ljudsku ishranu). Svi ispitani sojevi u Francuskoj bili su osetljivi na amoksicilin, spektinomicin i tilozin, a rezistentni na gentamicin i kolistin (Roger i Léorat, 1997). Nagaraja i saradnici (1998) izveštavaju o osetljivosti sojeva O. rhinotracheale u SAD-u. Svi testirani sojevi bili su osetljivi na ampicilin, eritromicin, penicilin, spektinomicin i tilozin. Pedeset etiri od 68 sojeva bila su osetljiva na neomicin, sarafloksacin i tetracikline, a manji broj je bio osetljiv na gentamicin, streptomicin i 40 trimetoprim. Poreenjem osetljivosti amerikih i nemakih izolata na antibiotike utvrene su razlike, pogotovo u odnosu na eritromicin i sarafloksacin na koje su nemaki izolati bili osetljivi u znatno manjem procentu (Nagaraja i saradnici, 1998). Aplikacijom hlortetraciklina kroz vodu za pie u dozi od 500 ppm, tokom 4-5 dana i aplikacijom amoksicilina u dozi od 250 ppm tokom 3-7 dana postignuti su dobri terapeutski efekti (Hafez, 1997). Sojevi O. rhinotracheale su veoma osetljivi na razliite hemijske dezinficijense. Preparati na bazi organskih kiselina (mravlja, oksal-siretna) ili aldehida, inaktivišu O. rhinotracheale u koncentraciji od 0,5% za 15 minuta u uslovima in vitro (Hafez i Schulze, 1998). Danas je poznato da infekcija O. rhinotracheale ima enzootski karakter i da može da se javi u svakom novouseljenom jatu, iako su u objektu prethodno primenjene zoohigijenske mere (išenje i dezinfekcija), a naroito u podrujima sa razvijenom živinarskom proizvodnjom i na farmama sa razliitim starosnim kategorijama. Neadekvatno sprovoenje zootehnikih mera pri pražnjenju objekata, može da ima za posledicu kontaminaciju susednih useljenih objekata i stalno održavanje infekcije na farmi (van Empel i Hafez, 1999). 2.16. Vakcinacija Vakcinacija nije našla širu primenu u spreavanju izbijanja i širenja infekcije prouzrokovane ornitobakterijumom. Na tržištu postoje inaktivisane vakcine proizvedene od O. rhinotracheale, serotipa A, namenjene za vakcinisanje kokoši brojlerskih majki u cilju zaštite podmlatka u prvim nedeljama života. Vakcinacija živim vakcinama bila bi rizina pošto atenuirani sojevi O. rhinotracheale mogu da ispolje patogeno dejstvo kod živine primarno inficirane virusima. Kod pilia je najzastupljeniji O. rhinotracheale, serotip A, pa je zaštita vakcinama na bazi ovog serotipa dovoljna, dok je kod uraka neophodna zaštita protiv više serotipova. Vakcinacijom SPF leghorn pilia bakterinom u uljnom adjuvansu utvreno je da postoje unakrsne reakcije, ali ne izmeu svih serotipova (van Empel i Hafez, 1999). Objavljeni su rezultati brojnih istraživanja koji ukazuju na pozitivne efekte primene inaktivisanih vakcina kod brojlera, tovnih uraka, brojlerskih roditelja i roditeljskih uraka. Vakcinisanjem jednodnevnih uria i brojlera bakterinima u uljnom adjuvansu postignut je zadovoljavajui nivo zaštite od eksperimentalnog inficiranja 41 homolognim sojem. Posle vakcinacije jednodnevnih brojlera bakterinom u uljnom adjuvansu izostajala je pojava aerosakulitisa koja se ispoljavala u kontrolnoj grupi nevakcinisanih jedinki nakon eksperimentalnog inficiranja NDV-om, 19. dana i ornitobakterijumom 26. dana (van Empel i van den Bosch, 1998). Vakcinacijom jednodnevnih uria bakterinom u uljnom adjuvansu postignuti su rezultati u spreavanju redukcije telesne mase, razvoja pneumonije i aerosakulitisa što su bile manifestacije u kontrolnoj grupi nevakcinisanih uria posle eksperimentalnog inficiranja ornitobakterijumom i TRTV-om (van Empel i Hafez, 1999). Meutim, poznato je da vakcinacija jednodnevnih ptica bakterinima u jaem uljnom adjuvansu može da ima negativne efekte na proizvodne rezultate. Eksperimentalna vakcinacija, primenom razliitih adjuvanasa davala je razliite rezultate, a neke vakcine aplikovane jednodnevnim piliima nisu spreavale razvoj aerosakulitisa (van Empel i van den Bosch, 1998). Vakcinacija uraka u starosti od tri i sedam nedelja inaktivisanom vakcinom, imala je za posledicu znatno niži mortalitet (1,79-3,63%) u poreenju sa nevakcinisanim kontrolnim grupama (3,54-7,27%). Procenat škartova u vakcinisanoj grupi iznosio je svega 20% od broja u nevakcinisanoj kontrolnoj grupi (van Empel i Hafez, 1999). Praenjem jata tovnih uraka do devetnaeste nedelje starosti, vakcinisanih bakterinom u drugoj i šestoj nedelji, zabeleženi su dobri rezultati u preveniranju pneumonije i aerosakulitisa (van Empel i Hafez, 1999). S obzirom da je prisustvo maternalnih antitela kod brojlera utvreno širom sveta i da postoji mogunost prenošenja uzronika preko jaja, vršena su ispitivanja uticaja vakcinacije brojlerskih roditelja na zaštitu podmlatka u prvim nedeljama života i spreavanje širenja infekcije. Van Empel i van den Bosch (1998) su utvrdili da kod podmlatka vakcinisanih brojlerskih roditelja izostaje razvoj pneumonije i aerosakulitisa nakon eksperimentalnog inficiranja NDV-om i ornitobakterijumom, za razliku od pilia nevakcinisanih roditelja (kontrolna grupa). Vakcinisanjem brojlerskih roditelja u 9. i 18. nedelji monovalentnim bakterinom (dobijenim od serotipa A) u uljnom adjuvansu postignut je dobar humoralni odgovor, a proizvodni rezultati kod podmlatka bili su bolji u poreenju sa kontrolnim grupama pilia poreklom od nevakcinisanih roditelja (Bisschop i saradnici, 2004). 42 3. CILJ I ZADACI ISPITIVANJA Ispitivanja u ovom radu imala su za cilj da se utvrdi uticaj O. rhinotracheale na razvoj patomorfoloških promena u respiratornim organima i zdravstveno stanje kokoši brojlerskih roditelja i fazana iz odgoja. Postavljeni cilj realizovan je kroz sledee zadatke: 1. Opservacija i merenje telesne mase ptica posle veštakog inficiranja. 2. Serološko ispitivanje krvi na prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale i druge uzronike respiratornih infekcija. 3. Ispitivanje makroskopskih promena u organima veštaki inficiranih ptica. 4. Mikroskopsko ispitivanje respiratornih organa ptica upotrebom standardnih histoloških metoda. 5. Reizolacija i identifikacija uzronika iz organa veštaki inficiranih ptica. 6. Obrada i poreenje rezultata oglednih grupa. 43 4. MATERIJAL I METODE ISPITIVANJA 4.1. terijal 4.1.1. Ptice u eksperimentu Za eksperiment su korišene kokoši brojlerski roditelji hibrida „Ross 308“ i fazani iz završne faze odgoja. Kokoši su tokom odgoja, vakcinisane po etiri puta protiv atipine kuge živine i infektivnog bronhitisa, kao i protiv drugih infektivnih bolesti prema uobiajenom programu vakcinacije za brojlerske roditelje u odgoju. Fazani su tokom odgoja vakcinisani dva puta protiv atipine kuge živine dok vakcinacinacija protiv drugih bolesti nije primenjivana. Iz jata brojlerskih roditelja i fazana iz kojih su odabrane ptice za eksperiment, uzorkovana je krv od po 50 ptica dva puta u razmaku od tri nedelje radi ispitivanja prisustva specifinih antitela protiv . rhinotracheale, kako bi se iskljuila mogunost da su jata bila prirodno inficirana. Pošto su dobijeni negativni rezultati, za eksperiment je odabrano 22 kokoši brojlerskih roditelja, starosti 15 nedelja i 22 fazana starosti 19 nedelja. Ptice su podeljene u etiri grupe koje su držane u podnom sistemu, u odvojenim prostorijama. Hranjene su potpunim krmnim smešama kojima su hranjene pre uvoenja u ogled, sa izbalansiranim sadržajem hranljivih materija prilagoenom uzrasnim potrebama. Fazani su dobijali hranu i vodu ad libitum, a brojlerski roditelji su hranjeni obrono, jednom dnevno, dok im je voda bila stalno dostupna. Na dan uvoenja ptica u ogled, uzorkovana je krv radi serološkog pregleda na prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale i trahealni brisevi za bakteriološki pregled, kako bi se iskljuila mogunost da su ptice bile prirodno inficirane. Nakon sedmodnevne aklimatizacije, inficirana je po jedna grupa od 16 fazana i 16 brojlerskih roditelja, a po jedna grupa od 6 fazana i 6 brojlerskih roditelja služile su kao kontrole. Sedmog dana posle inficiranja, eutanazirano je po 6 ptica iz inficiranih grupa i po 4 ptice iz kontrolnih grupa intravenskom aplikacijom preparata „61“, proizvoaa Intervet. Dvanaestog dana od inficiranja eutanazirane su po 4 ptice iz inficiranih i po 2 ptice iz kontrolnih grupa. Preostale inficirane ptice, 6 brojlerskih roditelja i 6 fazana, držane su u ogledu 16 nedelja posle inficiranja radi ispitivanja serološkog odgovora na O. rhinotracheale (shema 3). 44         ! ""#"$" "% &'() "* ! ""#"*$"  #""#+, ""#-,./01234 """#4"5""# ""#$  ""$$.$ ."2.4 ""#"$ %""# 2""#  ""#+, .$""#-,./01234 """#4"5""# ""#$ 2""#     2""#     2""#          ! ""#"$" "% &'() "* ! ""#"*$"  # ! +,  ! -,./01234 """#4"5""# ""#$  ""$$.$ ."2.4 ""#"$ %!  2!    ! +, .$ ! -,./01234 """#4"5""# ""#$ 2!      2!      2!  Shema 3. Plan eksperimenta 45 4.1.2. Bakterijski soj Za eksperimentalnu infekciju je korišen soj O. rhinotracheale B3263/91, serotip A, koji je jedan od prvih izolata ove bakterije u svetu. Izolovan je iz organa brojlera koji su ispoljavali respiratorne simptome na jednoj farmi u južnoj Africi, 1991. godine, kao do tada nepoznat mikroorganizam jer se nije mogao identifikovati upotrebom poznatih metoda. 4.1.3. Priprema bakterijske kulture za eksperimentalnu infekciju Bakterijski soj je kultivisan na Kolumbija (Columbia) agaru, gotovoj hranljivoj podlozi koja sadrži 10% ovije krvi, proizvoaa „bioMérieux“, Francuska, pod mikroaerofilnim uslovima. Nakon inkubacije u trajanju od 48 h, pikirane su kolonije i suspendovane u sterilnom fiziološkom rastvoru. Od 10 ml polazne suspenzije, napravljena su decimalna razreenja od 10-1 do 10-12 iz kojih su sa po 0,1 ml zasejavane dve ploe Kolumbija krvnog agara. Posle inkubacije u trajanju od 24 h na temperaturi od 37o C, pod mikroaeroflinim uslovima, brojane su izrasle bakterijske kolonije. Množenjem sa odgovarajuim faktorom razreenja poetne suspenzije utvreno je da se u razreenju 10-1 nalazi 5x1011 CFU/ml, te je ovo razreenje odabrano za izazivanje veštake infekcije. 4.1.4. Inokulacija bakterijske kulture Ptice su inficirane intratrahealno, pomou sistema za intravensku aplikaciju. Na plastinu brizgalicu od 3 ml stavljen je sistem za intravensku aplikaciju, odseen je i odbaen vei deo gumene cevice do igle, a preostali deo cevice u dužini od 5 cm korišen je za uvoenje u traheju i aplikaciju bakterijske suspenzije. Grupi fazana i grupi brojlerskih roditelja aplikovan je intratrahealno po 1 ml suspenzije bakterijske kulture u sterilnom fiziološkom rastvoru, a preostalim dvema grupama koje služile kao kontrolne grupe, aplikovan je intratrahealno po 1 ml sterilnog fiziološkog rastvora. 4.1.5. Opservacija Nakon inficiranja, ptice su svakodnevno, dva puta opservirane, a telesna masa merena im je na dan uvoenja u ogled i sedam dana posle inficiranja. 46 4.1.6. Uzorkovanje Za serološko ispitivanje uzimano je po 50 uzoraka krvi iz jata iz kojih su odabrane ptice za ogled, dva puta u razmaku od tri nedelje, a od svih oglednih ptica uzorkovana je krv na dan uvoenja ptica u ogled. Pticama koje su žrtvovane uzorkovana je krv prilikom eutanazije, sedmog i dvanaestog dana posle inficiranja. Dvanaestog dana uzorkovana je i krv od po još dve ptice iz inficiranih grupa koje su ostale u ogledu radi praenja serološkog odgovora. Od preostalih ptica iz inficiranih grupa, 6 fazana i 6 kokoši brojlerskih roditelja, uzorkovana je krv na svake dve nedelje od 28. do 112. dana od inficiranja. Leševi eutanaziranih ptica su obdukovani, a brisevi vazdušnih kesa i organi: nosne šupljine, infraorbitalni sinusi, larinks, traheja, plua, srce, slezina, jetra i bubrezi uzorkovani su za bakteriološko ispitivanje. Za histopatološko ispitivanje uzorkovani su respiratorni organi: nosne šupljine, infraorbitalni sinusi, larinks, traheja, plua i vazdušne kese. 4.2. etode 4.2.1. Serološko ispitivanje Svi uzorci krvi su ispitani serološki na prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale, metodom ELISA, prema uputstvu proizvoaa dijagnostikuma. Uzorci krvi svih ptica koji su uzorkovani na dan uvoenja ptica u ogled i uzorci krvi ptica koji su uzorkovani prilikom žrtvovanja sedmog i dvanaestog dana ispitani su serološki, metodom ELISA, i na prisustvo specifinih antitela za virus atipine kuge živine, virus infektivnog bronhitisa, pneumovirus, virus avijarne influence, kao i dve mikoplazme M. gallisepticum i M. synoviae. Za ispitivanje prisustva specifinih antitela za O. rhinotracheale je korišen dijagnostikum „Flock Chek ORT“, proizvoaa „IDEXX“ koji je dizajniran po principu metoda indirektna ELISA. Ispitivani krvni serumi, razreeni 500 puta, nanošeni su u odgovarajua udubljenja mikrotitracione ploe za koja je vezan bakterijski antigen. Tokom inkubacije od 30 minuta na sobnoj temperaturi, ukoliko su bila prisutna, antitela iz seruma vezala su se za antigene u mikrotitracionoj ploi. Mikrotitracione ploe su ispirane destilovanom vodom, dodavan je konjugat, ponovo su inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, ispirane, a zatim je dodavan supstrat i nakon 15 minuta „stop rastvor“ za zaustavljanje reakcije. Kod pozitivnih uzoraka seruma, za antigen- 47 antitelo komplekse formirane u ploi, nakon dodavanja konjugata vezala su se i anti- antitela obeležena enzimom. Kada je dodat supstrat došlo je do razvoja bojene reakcije što je posledica razlaganja supstrata enzimom. Po nanošenju uzoraka krvnih seruma u kojima nije bilo specifinih antitela, izostalo je formiranje antigen-antitelo kompleksa u ploi, nevezana antitela obeležena enzimom (konjugat) su isprana pa je nakon dodavanja supstrata izostala pojava boje. Reakcija je oitavana ELISA itaem, spektrofotometarskim aparatom tipa „Multiskan RC“ proizvoaa Labsystems, na talasnoj dužini od 650 nm. Iz dobijenih vrednosti optikih gustina vršeni su dalji prorauni i interpretirani rezultati. Rezultati se tumae na osnovu izraunate S/P vrednosti (odnos optike gustine uzorka i pozitivne kontrole) i vrednosti titra prema formulama: ODnegODpos ODnegODuzorka P S − − = ; Log10titar = 1,09(log10S/P)+3,36 Prema uputstvu proizvoaa dijagnostikuma, rezultati se procenjuju na osnovu vrednosti titra antitela. Ukoliko su vrednosti titra antitela vee od 844 uzorci se smatraju pozitivnim. Za ispitivanje prisustva specifinih antitela protiv virusa atipine kuge živine, virusa infektivnog bronhitisa, pneumovirusa, virusa avijarne influence, M. gallisepticum i M. synoviae u krvnom serumu, korišeni su dijagnostikumi proizvoaa IDEXX koji su dizajnirani po principu metoda indirektna ELISA. Nain izvoenja je identian opisanom postupku za utvrivanje prisustva specifinih antitela za O. rhinotracheale. Rezultati za sve navedene testove se interpretiraju na osnovu vrednosti titra specifinih antitela, osim kod testa za utvrivanje specifinih antitela za virus avijarne influence kod kojeg se rezultati interpretiraju na osnovu S/P vrednosti. Ukoliko je titar specifinih antitela za M. gallisepticum i M. synoviae vei od 1076, a za virus atipine kuge živine, virus infektivnog bronhitisa i pneumovirus vei od 396 uzorci se proglašavaju pozitivnim. Specifina antitela za virus avijarne influence u krvnom serumu su prisutna ukoliko je S/P vrednost vea od 0,50. 4.2.2. Bakteriološko ispitivanje Uzorci organa: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje, plua, srca, slezine, jetre, bubrega i brisevi vazdušnih kesa ispitani su bakteriološki. Za primarnu izolaciju uzronika iz organa korišen je Kolumbija krvni agar proizvoaa „bioMérieux“, Francuska i selektivna hranljiva podloga sa gentamicinom koja je 48 pripremana po standardnoj proceduri u laboratoriji Veterinarskog specijalistikog instituta „Panevo“. U bazu za krvni agar, proizvoaa Torlak, dodavano je 10% sveže ovije krvi i gentamicin u koliini od 10 g/ml hranljive podloge. Bakterije koje su na ovim podlogama formirale male, cirkularne, sive do sivo-bele kolonije, prenika oko jedan ili više milimetara oznaavane su kao sumnjive. One su zasejavane na „MacConkey“ agar i na Kliglerov agar sa trostrukim šeerom i gvožem gde nije bilo rasta, odnosno reakcije u vidu promene boje podloge i formiranja gasa. Od sumnjivih kolonija pravljeni su i mikroskopski preparati koji su bojeni po Gramu, a zatim su se od kolonija gram-negativnih pleomorfnih bacila izvodili biohemijski testovi oksidaze i katalaze i konvencionalni biohemijski testovi: reakcija sa metil crvenim (Voges- Proskauer reakcija), dokazivanje stvaranja indola i ONPG test. Gram negativni pleomorfni bacili koji su davali pozitivnu reakciju u oksidaza testu, a negativnu u katalaza testu identifikovani su upotrebom komercijalnog test kita za biohemijsku identifikaciju „API 20 NE“ proizvoaa „bioMérieux“, Francuska. Ovaj komercijalni sistem za biohemijsku identifikaciju zasniva se na ispitivanju veeg broja biohemijskih i fizioloških osobina mikroorganizama. Sastoji se iz 8 konvencionalnih testova i 12 asimilacionih testova koji se izvode u udubljenjima sa kupolom, postavljenim na bliskom odstojanju na tankoj plastinoj traci, u kojima se nalaze dehidrirani supstrati. Od 2-4 sumnjive kolonije pravljena je suspenzija u 5 ml sterilnog fiziološkog rastvora. Pomou automatske mikropipete nanošeno je po 100 µl suspenzije u udubljenja sa oznakom testa od NO3 do PNPG, a zatim su dopunjena sa po 200 µl sterilnog fiziološkog rastvora kako bi se ispunile i kupole. Udubljenja i kupole sa oznakom testa GLU do PAC su ispunjene u potpunosti bakterijskom suspenzijom. U udubljenja 3 testa GLU, ADH i URE dodato je mineralno ulje do formiranja koveksnog meniskusa u kupoli. Radi spreavanja isparavanja vode, u plastinu kutiju za inkubiranje dodato je malo sterilne destilovane vode i sistem je inkubiran tokom 24 h na 37o C pod mikroaeroflinim uslovima. Rezultati su oitavani praenjem tabele za oitavanje. Najpre su oitane spontane reakcije konvencionalnih biohemijskih testova (GLU, ADH, URE, ESC, GEL i PNPG) i zabeležene u odgovarajui obrazac. Zatim su, sledei uputstvo proizvoaa, dodavani reagensi NIT1 i NIT2, a posle 5 minuta Zn, u kupolu sa oznakom testa NO3 i reagens JAMES u kupolu sa oznakom testa TRP, tako da su oitana i preostala dva konvencionalna biohemijska testa. Konano, oitavanjem asimilacionih testova upisane su u obrazac vrednosti svih reakcija na osnovu kojih je dobijena šifra za sumnjivi izolat po kojoj je on identifikovan. Iako uzronik nije unet u 49 bazu podataka mikroorganizama, korišeni su podaci iz literature prema kojima O. rhinotracheale daje šifru 0020004 ili 0220004 u ovom sistemu. 4.2.3. Histopatološko ispitivanje Za histopatološko ispitivanje uzorkovani su tkivni iseci nosne šupljine, infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje, plua, vazdušnih kesa i fiksirani u 10% puferizovanom formalinu u trajanju od 48 do 72 h. Nakon toga tkivo je obraeno u automatskom tkivnom procesoru: dehidratacijom kroz seriju alkohola, prosvetljavanjem u ksilolu, impregnacijom parafinom i uklopljeno u parafinske blokove. Parafinski iseci debljine oko 5 µm obojeni su standardnom hematoksilin-eozin metodom (HE). 4.2.4. Statistika obrada podataka U statistikoj analizi dobijenih rezultata korišeni su deskriptivni statistiki parametri: aritmetika sredina ( X), standardna devijacija (SD), standardna greška (Sx), minimalna vrednost (Xmin), maksimalna vrednost (Xmax) i koeficijent varijacije (CV). Prilikom testiranja i utvrivanja statistiki znaajnih razlika izmeu ispitivanih eksperimentalnih grupa korišen je Studentov t test, pomou kojeg su ustanovljavane statistiki signifikantne razlike izmeu tretmana pojedinano. Signifikantnost razlika ustanovljavana je na nivoima znaajnosti od 5% i 1%. Svi dobijeni rezultati prikazani su tabelarno. 50 5. REZULTATI 5.1. Rezultati praenja zdravstvenog stanja 5.1.1. Klinika slika kod kokoši brojlerskih roditelja Tokom trajanja ogleda ptice su dva puta dnevno opservirane, a neposredno pre i sedam dana posle inficiranja, merena im je i telesna masa. Kod kokoši brojlerskih roditelja iz inficirane i kontrolne grupe nisu zapaženi kliniki simptomi bolesti. Na perju, koži i vidljivim sluznicama nisu utvrene vidljive promene. Apetit je tokom celog trajanja ogleda bio dobar. Prilikom hranjenja sve ptice su se grupisale oko hranilica i ravnomerno uzimale hranu. Dnevni obrok pojele su za oko 5 minuta. Feces je bio uobiajeno formiran. Sedmodnevni prirast iznosio je 127 g kod ptica iz inficirane grupe (tabela 4) i 125 g kod ptica iz kontrolne grupe (tabela 5). Odstupanja telesne mase kod inficiranih brojlerskih roditelja u odnosu na kontrolnu neinficiranu grupu nisu bila statistiki znaajna ni pre, ni sedam dana posle inficiranja (tabela 6). Tabela 4. Rezultati merenja telesne mase inficiranih kokoši N Pre inficiranja Sedam dana posle inficiranja 1 1591 1711 2 1597 1719 3 1617 1740 4 1623 1747 5 1629 1751 6 1631 1755 7 1640 1770 8 1645 1771 9 1649 1778 10 1657 1788 11 1659 1789 12 1700 1830 13 1707 1835 14 1711 1841 15 1719 1850 16 1730 1863 Xmin 1591 1711 Xmax 1730 1863 X 1657 1784 SD 44,05 47,46 Sx 11,01 11,87 CV 2,66% 2,66% 51 Tabela 5. Rezultati merenja telesne mase kokoši iz kontrolne grupe N Pre inficiranja Sedam dana posle inficiranja 1 1599 1725 2 1641 1764 3 1657 1781 4 1663 1780 5 1697 1829 6 1721 1851 Xmin 1599 1725 Xmax 1721 1851 X 1663 1788 SD 42,75 45,40 Sx 17,45 18,54 CV 2,57% 2,54% Tabela 6. Poreenje telesne mase kokoši iz inficirane i kontrolne grupe pre inficiranja i 7 dana posle inficiranja, primenom t testa 5.1.2. Klinika slika kod fazana Drugog dana od inficiranja kod jednog fazana iz inficirane grupe zapaženo je sporije kretanje, neveselost, nakostrešenost perja i pokreti glave kao da pokušava da izbaci sadržaj iz kljuna, slika 1. Kod dva fazana, sedam dana posle inficiranja, pritiskom na nosne otvore isticala je mala koliina mutne sluzi, dok na sluznici usne duplje i konjunktivama nije bilo vidljivih promena. Na perju i koži nisu zapažene vidljive promene. Feces je bio uobiajeno formiran. Konzumiranje hrane u inficiranoj grupi je bilo smanjeno u odnosu na kontrolnu grupu što se vidi iz rezultata merenja telesne mase (tabela 7 i 8). Primenom Studentovog t testa utvreno je da postoji statistika znaajnost (p<0,05) razlike u telesnoj masi izmerenoj sedam dana nakon inficiranja izmeu fazana iz inficirane i kontrolne grupe. Razlika u telesnoj masi izmerenoj pre inficiranja izmeu fazana iz inficirane i kontrolne grupe nije bila statistiki znaajna (tabela 9). Pre inficiranja Posle inficiranja Kontrolna grupa Inficirana grupa Kontrolna grupa Inficirana grupa N 6 16 6 16 Xmin 1599 1591 1725 1711 Xmax 1721 1730 1851 1863 X 1663 1657 1788 1784 SD 42,75 44,05 45,40 47,46 Sx 17,45 11,01 18,54 11,87 CV 2,57% 2,66% 2,54% 2,66%  9978 26505 10730 28538 t t = 0,31 NZ t = 0,21 NZ 52 Slika 1. Kod fazana sa leve strane zapaža se usiljeno držanje tela i nakostrešenost perja Tabela 7. Rezultati merenja telesne mase inficiranih fazana N Pre inficiranja Sedam dana posle inficiranja 1 1194 1169 2 1198 1163 3 1213 1171 4 1218 1179 5 1227 1190 6 1235 1200 7 1243 1199 8 1251 1190 9 1255 1220 10 1261 1200 11 1265 1245 12 1275 1251 13 1280 1230 14 1287 1241 15 1290 1261 16 1299 1269 Xmin 1194 1163 Xmax 1299 1269 X 1249 1211 SD 32,96 34,57 Sx 8,241 8,641 CV 2,64% 2,85% 53 Tabela 8. Rezultati merenja telesne mase fazana iz kontrolne grupe N Pre inficiranja Sedam dana posle inficiranja 1 1199 1210 2 1201 1214 3 1253 1263 4 1261 1275 5 1267 1275 6 1279 1289 Xmin 1199 1210 Xmax 1279 1289 X 1243 1254 SD 34,63 33,83 Sx 14,14 13,81 CV 2,79% 2,70% Tabela 9. Poreenje telesne mase fazana iz inficirane i kontrolne grupe pre inficiranja i 7 dana posle inficiranja, primenom t testa * statistiki znaajna razlika Pre inficiranja Posle inficiranja Kontrolna grupa Inficirana grupa Kontrolna grupa Inficirana grupa N 6 16 6 16 Xmin 1199 1194 1210 1163 Xmax 1279 1299 1289 1269 X 1243 1249 1254 1211 SD 34,63 32,96 33,83 34,57 Sx 14,14 8,241 13,81 8,641 CV 2,79% 2,64% 2,70% 2,85%  7460 19991 7526 19378 t t = 0,38NZ t = 2,63*; p < 0,05 54 5.2. Rezultati patomorfološkog ispitivanja 5.2.1. Patomorfološke promene kod brojlerskih roditelja iz inficirane grupe 5.2.1.1. Makroskopski nalaz Kod veine kokoši brojlerskih roditelja iz inficirane grupe nisu naene vidljive patoanatomske promene na unutrašnjim organima. Promene su otkrivene kod samo dve ptice, a bile su zastupljene u nosnim šupljinama, infraorbitalnim sinusima, larinksu, traheji i pluima. U nosnim šupljinama je zapažena hiperemija sluznice i nakupljanje sluzi, a u infraorbitalnim sinusima samo nakupljanje sluzi (slika 2). Slika 2. Nosne šupljine i sinusi kokoši brojlerskog roditelja 7 dana nakon veštakog inficiranja. Na poprenom preseku nosnih šupljina i infraorbitalnih sinusa zapaža se hiperemija nosne sluznice i sluz u levoj nosnoj šupljini i infraorbitalnom sinusu. Sluznica larinksa i traheje kod veine inficiranih brojlerskih roditelja bila je bledo-ružiasta, glatka i sjajna (slika 3). Kod dve kokoši sluznica larinksa i traheje bila je zacrvenjena, a u lumenu se nalazila mala koliina sluzi (slika 4). 55 Slika 3. Traheja kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Bledo-ružiasta, glatka i sjajna sluznica. Slika 4. Larinks i traheja kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Zacrvenjena sluznica larinksa i traheje (Laryngotracheitis catarrhalis). Kod jedne kokoši, plua su bila uveana, tamno-crvene boje, zaobljenih rubova, vrste konzistencije. Na preseku promenjenih plua isticala je krvavo-penušava tenost 56 što je karakteristian nalaz za hiperemiju i edem plua (slika 5). Kod jednog leša zapažena su ograniena krvarenja u oba pluna krila (slika 6). U vazdušnim kesama makroskopskim pregledom nije utvreno prisustvo sadržaja, a zidovi vazdušnih kesa su bili glatki, vlažni, sjajni i prozirni. Slika 5. Plua kokoši brojlerskog roditelja 7 dana nakon veštakog inficiranja. Plua su uveana, crvene boje, vrste konzistencije (Hyperaemia et oedema pulmonis). Slika 6. Plua kokoši 7 dana posle veštakog inficiranja. Ograniena podruja tamno crvene boje (Haemorrhagiae pulmonis). 57 5.2.1.2. Mikroskopski nalaz Histopatološke promene kod inficiranih kokoši brojlerskih roditelja ustanovljene su u nosnim šupljinama, infraorbitalnim sinusima, larinksu, traheji, pluima i vazdušnim kesama. U jednom uzorku utvrena je hiperemija nosne sluznice i poveano nakupljanje sluzi u nosnim šupljinama i infraorbitalnim sinusima (slika 7). Slika 7. Infraorbitalni sinus kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Nakupljanje sluzi (HE, obj. 20x). U lumenu larinksa kod dve kokoši bio je prisutan sluzav sadržaj sa malim brojem deskvamisanih epitelnih elija, eritrocita i heterofila (slika 8). Nalaz u lamini propriji karakterisalo je prisustvo elijskog infiltrata koji se sastojao iz heterofila i limfocita, kao i injiciranost krvnih sudova (slika 9). 58 Slika 8. Larinks kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. U lumenu se nalazi sluzav sadržaj sa heterofilima i eritrocitima (obj. 20x, HE). Slika 9. Larinks kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. U lumenu se nalazi sluzav sadržaj sa heterofilima i eritrocitima. U lamini propriji vidi se injiciranost krvnih sudova i elijski infiltrat u kojem dominiraju limfociti (HE). 59 Slino larinksu, u lumenu traheje kod nekoliko kokoši bio je prisutan sluzav sadržaj sa deskvamisanim epitelnim elijama, eritrocitima i heterofilima. Kod dve kokoši zapažena je hiperplazija epitela (slika 10) kao i fokalne degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija. Nalaz u lamini propriji karakterisala je injiciranost krvnih sudova i elijski infiltrat u kojem su se nalazili heterofili, limfociti, monociti i po neka plazma elija (slika 11). Slika 10 Traheja kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Proliferacija epitela i limfocitni infiltrat u lamini propriji (HE). 60 Slika 11. Traheja kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Akumulacija limfocita u lamini propriji (HE). Nalaz u pluima tri kokoši bila je hiperemija, u jednim pluima hiperemija i edem i u jednim hemoragije (slika 12). Slika 12. Plua kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. U parabronhijama i atrijama nalaze se eritrociti (HE). 61 Vazdušne kese kod dva leša bile su zadebljale usled infiltracije zida mononuklearima (slika 13). Na epitelu su se mogle videti degenerativno-nekrotine promene, deskvamacija i fokalna hiperplazija (slika 14). Slika 13. Abdominalna vazdušna kesa kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Monunuklearni elijski infiltrat u zidu vazdušne kese (HE). Slika 14. Abdominalna vazdušna kesa kokoši brojlerskog roditelja 7 dana posle veštakog inficiranja. Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija i subepitelni limfocitni infiltrat (HE). 62 Histopatološke promene u respiratornim organima inficiranih kokoši brojlerskih roditelja utvrene su kod 5 ptica (tabela 10). Uestalost histopatoloških promena iznosila je 10-40% za pojedine organe. Rezultati su prikazani u tabelama 11-16. Tabela 10. Zastupljenost histopatoloških promena u respiratornim organima inficiranih kokoši kokoši nosne šupljine sinusi larinks traheja plua vazdušne kese 1 + + - - + - 2 - - + + + + 3 - - - + + + 4 - - - - - - 5 - - + + + - 6 - - - + + - 7 - - - - - - 8 - - - - - - 9 - - - - - - 10 - - - - - - ukupno 1 1 2 4 5 2 % 10 10 20 40 50 20 Tabela 11. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u nosnim šupljinama kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 1/10 (10) Eksudat u lumenu 1/10 (10) Tabela 12. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u infraorbitalnim sinusima kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Eksudat 1/10 (10) 63 Tabela 13. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u larinksu kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 2/10 (20) Hiperplazija epitela 1/10 (10) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 1/10 (10) Deskvamacija epitela 1/10 (10) elijski infiltrat u lamini propriji 2/10 (20) Eksudat u lumenu 2/10 (20) Tabela 14. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u traheji kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 3/10 (30) Hiperplazija epitela 2/10 (20) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 2/10 (20) Deskvamacija epitela 3/10 (30) elijski infiltrat u lamini propriji 3/10 (30) Eksudat u lumenu 4/10 (40) Tabela 15. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u pluima kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 4/10 (40) Edem 1/10 (10) Krvarenja 1/10 (10) Tabela 16. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u vazdušnim kesama kokoši brojlerskih roditelja inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) elijski infiltrat 2/10 (20) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 1/10 (10) 64 5.2.2. Patomorfološke promene kod brojlerskih roditelja iz kontrolne grupe Kod brojlerskih roditelja iz kontrolne grupe nije bilo vidljivih makroskopskih promena, osim umerene hiperemije plua kod pojedinih leševa. U nosnim šupljinama nije bilo sadržaja ili se nalazila mala koliina sluzi dok u infraorbitalnim sinusima nije bilo sadržaja. Sluznica larinksa i traheje je bila bledo-ružiasta, glatka, vlažna i sjajna (slika 15). Mikroskopskim pregledom iseaka tkiva respiratornih organa utvrena je injiciranost krvnih sudova plua etiri kokoši dok u ostalim pregledanim organima nisu utvrene histopatološke promene. Slika 15. Izgled traheje kod kokoši iz kotrolne grupe (levo) i inficirane grupe (desno), 7 dana posle veštakog inficiranja. 65 5.2.3. Patomorfološke promene kod fazana iz inficirane grupe 5.2.3.1. Makroskopski nalaz Patoanatomske promene kod inficiranih fazana utvrene su u nosnim šupljinama, infraorbitalnim sinusima, larinksu, traheji, pluima i vazdušnim kesama. Promene su naene kod sedam ptica. Kod nekoliko fazana nosna sluznica je bila zacrvenjena, a u nosnim šupljinama i infraorbitalnim sinusima nalazila se sluz (slika 16). Slika 16. Nosne šupljine i infraorbitalni sinusi fazana, 7 dana nakon veštakog inficiranja. Na poprenom preseku levog infraorbitalnog sinusa istie sluz. Promene u larinksu i traheji manifestovale su se u vidu crvenila sluznice i poveanog nakupljanja sluzi (slika 17). Kod dva fazana zapaženo je nakupljanje sluzavo-gnojnog sadržaja (slika 18). 66 Slika 17. Larinks i traheja fazana, 7 dana nakon veštakog inficiranja. Sluznica larinksa i traheje je zacrvenjena. Slika 18. Traheja fazana, 7 dana nakon veštakog inficiranja. U proksimalnom segmentu traheje zapaža se zacrvenjenost sluznice i nakupljanje mutne sluzi. Plua veine inficiranih fazana su bila uveana, tamno-crvena, zaobljenih rubova, a sa preseka promenjenih plua isticao je krvavo-penušav sadržaj, što odgovara hiperemiji i edemu (slika 19). U dva uzorka plua zapažena su i hemoragina podruja (slika 20). 67 Slika 19. Plua fazana, 12 dana nakon veštakog inficiranja. Plua su uveana, sjajna, crvene boje, vrste konzistencije (Hyperaemia et oedema pulmonis). Slika 20. Plua fazana, 7 dana nakon veštakog inficiranja. Plua su uveana, crvene boje, vrste konzistencije (Hyperaemia et oedema pulmonis), sa tamno-crvenim podrujima (Haemorrhagiae pulmonis). 68 Na zidovima torakalnih vazdušnih kesa kod dva fazana zapažene su promene u vidu jasno lokalizovanih, malih, žukastih, okruglih zadebljanja prenika oko 2 mm, a kod jedne od ovih ptica sline promene su se javile i na abdominalnim vazdušnim kesama (slika 21 i 22). Slika 21. Abdominalna vazdušna kesa fazana, 12 dana nakon veštakog inficiranja. Fokalno zadebljanje zida, žukaste boje, prenika oko 2 mm. Slika 22. Torakalna vazdušna kesa fazana, 12 dana nakon veštakog inficiranja. Fokalna zadebljanja zida, žukaste boje, prenika oko 2 mm. 69 5.2.3.2. Mikroskopski nalaz Histopatološki nalaz u gornjim respiratornim putevima: nosnim šupljinama, infraorbitalnim sinusima, larinksu i traheji inficiranih fazana je slian. U nosnim šupljinama je zapaženo nakupljanje vee koliine sluzavog sadržaja u kojem su se nalazili eritrociti i heterofili (slika 23 i 24). U infraorbitalnim sinusima dva fazana nalazila se mala koliina sluzi i po neka inflamatorna elija, a kod jednog fazana u infraorbitalnim sinusima se nalazio sluzavo-hemoragian sadržaj i vei broj inflamatornih elija: limfocita i heterofila (slika 25). Slika 23. Nosna šupljina fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. U nosnoj šupljini nalazi se vea koliina sluzi (Rhinitis catarrhalis, HE). 70 Slika 24. Nosna šupljina fazana, 7 dana posle veštakog inficiranja. U nosnoj šupljini nalazi se velika koliina sluzi, eritrociti i heterofili (Rhinitis catarrhalis, HE). Slika 25. Infraorbitalni sinus fazana, 7 dana posle veštakog inficiranja. U sinusu se nalazi velika koliina sluzavog eksudata sa limfocitima, hetrerofilima i velikim brojem eritrocita (HE). 71 Histopatološki nalaz u larinksu i traheji veine uzoraka odgovara kataralnom zapaljenju. U lumenu se nalazila izvesna koliina sluzavog do sluzavo-elijskog eksudata. U nekoliko uzoraka bila je izražena hiperplazija epitela, a na pojedinim delovima sluznice javile su se degenerativno-nekrotine promene i deskvamacija epitela (slika 26). Krvni sudovi lamine proprije mukoze larinksa i traheje bili su injicirani, a elijski infiltrat sastojao se iz heterofila, limfocita, monocita, i malog broja plazmocita (slika 27 i 28). Slika 26. Traheja fazana, 7 dana posle eksperimentalnog inficiranja. Na epitelu su izražene degenerativno nekrotine promene i deskvamacija, a lamina proprija infiltrovana je heterofilima (HE). 72 Slika 27. Traheja fazana, 7 dana posle veštakog inficiranja. Na sluznici traheje nalazi se eksudat bogat heterofilima (HE). Slika 28. Traheja fazana, 7 dana posle veštakog inficiranja. Epitel je zadebljao, a u lumenu traheje nalazi se eksudat bogat heterofilima (HE). U primarnim bronhusima je, takoe, zabeleženo nakupljanje sluzavog sadržaja sa heterofilima (slika 29). Krvni sudovi lamine proprije mukoze su bili injicirani, a bio je prisutan i celularni infiltrat u kojem su se nalazili limfociti i heterofili. Dominantan histopatološki nalaz u pluima bila je hiperemija (slika 30). Krvni sudovi plua bili su 73 prepuni krvi, a u lumenu parabronhija i atrija u dva uzorka zapažen je serozni eksudat sa malim brojem inflamatornih elija (slika 31). Slika 29. Plua fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. U bronhusu se nalazi eksudat bogat heterofilima, a lamina proprija je infiltrovana limfocitima i heterofilima (HE). Slika 30. Plua fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. Hiperemija (HE). 74 Slika 31. Plua fazana, 7 dana posle veštakog inficiranja. U parabronhijama i atrijama nalazi se serozni eksudat sa malim brojem heterofila i eritrocita (HE). U uzorcima plua dva fazana došlo je do formiranja granuloma. Oko nekrotinog centra koncentrino slojevito su rasporeene epiteloidne elije, gigantociti, limfociti i fibroblasti (slika 32). Slika 32. Plua fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. Granulomatozno zapaljenje (HE). 75 Kod dva fazana u pluima se razvila fibrinozna pneumonija. Lumen parabronhija i atrija ispunjen je fibrinoznim eksudatom u kojem se nalazi mali broj heterofila i eritrocita (slika 33). Slika 33. Plua fazana, 7 dana posle eksperimentalnog inficiranja. U parabronhijama i atrijama se nalazi fibrinozni eksudat sa malim brojem eritroca (HE). 76 Kod tri fazana zapažene su promene na vazdušnim kesama. Sa respiratorne strane zida vazdušnih kesa u jednom uzorku nalazio se celularni eksudat koji su inili pretežno monociti i heterofili. Na pojedinim mestima zapažena je degeneracija i nekroza respiratornog epitela. Subepitelno je uoena infiltracija mononuklearima i injiciranost krvnih sudova u tri uzorka. (slika 34 i 35). Slika 34. Torakalna vazdušna kesa fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. Celularni eksudat na respiratornoj površini i infiltracija zida vazdušne kese mononuklearima (HE). 77 Slika 35. Torakalna vazdušna kesa fazana, 12 dana posle veštakog inficiranja. Nekroza epitela, zadebljali zidovi vazdušnih kesa usled infiltracije mononuklearima (HE). Promene u respiratornim organima inficiranih fazana utvrene su kod 7 ptica (tabela 17). Uestalost histopatoloških promena iznosila je 10-70% za pojedine organe. Rezultati su prikazani u tabelama 18-23. Tabela 17. Zastupljenost histopatoloških promena u respiratornim organima inficiranih fazana fazani nos sinusi larinks traheja plua vazdušne kese 1 + + - - + - 2 + - + + + + 3 + + + + + - 4 - - - - - - 5 - - - - - - 6 - - - - - - 7 - + + + + + 8 - - + + + + 9 + - + + + - 10 - - - - + - ukupno 4 3 5 5 7 3 % 40 30 50 50 70 30 78 Tabela 18. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u nosnim šupljinama fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 4/10 (40) Eksudat u lumenu 3/10 (30) Tabela 19. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u infraorbitalnim sinusima fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Eksudat 3/10 (30) Hemoragije 1/10 (10) Tabela 20. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u larinksu fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 4/10 (40) Hiperplazija epitela 4/10 (40) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 4/10 (40) Deskvamacija epitela 3/10 (30) elijski infiltrat u lamini propriji 4/10 (40) Eksudat u lumenu 5/10 (50) Tabela 21. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u traheji fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 5/10 (50) Hiperplazija epitela 3/10 (30) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 3/10 (30) Deskvamacija epitela 3/10 (30) elijski infiltrat u lamini propriji 3/10 (30) Eksudat u lumenu 5/10 (50) 79 Tabela 22. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u pluima fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) Hiperemija 7/10 (70) Edem 2/10 (20) Krvarenja 2/10 (20) Serozni eksudat 2/10 (20) Fibrinozni eksudat 2/10 (20) Granulomatozno zapaljenje 2/10 (20) Tabela 23. Uestalost ustanovljenih histopatoloških promena u vazdušnim kesama fazana inficiranih O. rhinotracheale Tip promene Uestalost promene (%) elijski infiltrat u zidu 3/10 (30) Degenerativno-nekrotine promene epitelnih elija 1/10 (10) Eksudat u vazdušnim kesama 1/10 (10) 80 5.2.4. Patomorfološke promene kod fazana iz kontrolne grupe Kod fazana iz kontrolne grupe utvrena je blaga hiperemija plua kod pojedinih ptica. U ostalim organima nisu utvrene vidljive patoanatomske promene. Mikroskopskim pregledom utvrena je blaga hiperemija plua kod 3 fazana, dok transudata u vazdušnim putevima nije bilo (slika 36). U uzorcima ostalih respiratornih organa nisu utvrene histopatološke promene. Slika 36. Plua fazana iz kontrolne grupe, žrtvovanog 7 dana nakon veštakog inficiranja. U parabronhijama nema inflamatornog eksudata. 81 5.3 Rezultati bakteriološkog ispitivanja Uzorci unutrašnjih organa svake od ptica ispitivani su pojedinano. Paralelno sa uzorcima ispitivan je i referentni bakterijski soj kojim je izazvana infekcija, kako bi mogli da budu uporeivani rezultati. Rast referentnog soja O. rhinotracheale B3263/91 na Kolumbija krvnom agaru i rezultati biohemijskih reakcija u API sistemu prikazani su na slikama 37 i 38. Slika 37. Izgled kolonija referentnog soja O. rhinotracheale B3263/91 na Kolumbija krvnom agaru 82 Slika 38. Rezultati biohemijskih testova u API sistemu za referentni bakterijski soj. Uzorci su zasejavani istovremeno na po dve hranljive podloge: agar sa ovijom krvi i gentamicinom i Kolumbija krvni agar. Nakon inkubacije u trajanju od 48 asova pod mikroaerofilnim uslovima oitavani su rezultati. Kolonije O. rhinotracheale bile su veoma male, prenika oko 1 mm, cirkularne, konveksne i sivkasto-bele boje. Iz pojedinih uzoraka rasle su kolonije prenika manjeg od 1 mm, ije su morfološke karakteristike proveravane pod lupom (slika 39 i 40). 83 Slika 39. Izgled kolonija O. rhinotracheale na Kolumbija krvnom agaru, izraslih iz larinksa veštaki inficiranog fazana. Slika 40. Izgled kolonija O. rhinotracheale na krvnom agaru sa ovijom krvi i gentamicinom, izraslih iz plua veštaki inficiranog fazana. 84 Posle dobijanja iste kulture vršena je primarna identifikacija bakterija tako što su od svih sumnjivih kolonija pravljeni mikroskopski preparati i bojeni po Gramu. Sumnjivi izolati bili su gram-negativni i izrazito pleomorfni. Na preparatu su se mogle videti sitne pojedinane bakterijske elije šljivolikog oblika razliitih dimenzija, kao i nizovi formirani od bakterijskih elija razliite dužine i širine, slika 41. Slika 41. Na mikroskopskom preparatu zapaža se izrazit pleomorfizam gram-negativno obojenih bakterijskih elija. 85 Sumnjive kolonije presejavane su na „MacConkey“ agar i na Kliglerov agar sa trostrukim šeerom i gvožem. Uzronik nije rastao na „MacConkey“ agaru i agaru sa trostrukim šeerom i gvožem. Izvoeni su testovi oksidaze, katalaze i konvencionalni biohemijski testovi: reakcija sa metil crvenim (Voges-Proskauer reakcija), dokazivanje stvaranja indola i ONPG test. Izolati O. rhinotracheale davali su pozitivnu reakciju u oksidaza, a negativnu u katalaza testu, Voges-Proskauer reakcija i ONPG test bili su pozitivni, a reakcija stvaranja indola negativna. Konana identifikacija izvršena je primenom komercijalnog test kita za biohemijsku identifikaciju „API 20 NE“ proizvoaa „bioMérieux“, Francuska. Svi izolati su davali šifru 0020004 (slika 42). U tabeli 24 prikazani su biohemijski testovi koji su korišeni za identifikaciju uzronika. Slika 42. Rezultati biohemijskih reakcija za identifikaciju u API sistemu, za tri izolata O. rhinotracheale iz organa veštaki inficiranih fazana. 86 TABELA 24. Rezultati ispitivanja biohemijskih osobina O. rhinotracheale soj B 3263/91, nakon izolacije iz organa veštaki inficiranih fazana Hranljiva podloga/biohemijski test rezultat „MacConkey“ agar - agar sa trostrukim šeerom i gvožem - oksidaza + katalaza - Voges-Proskauer test + formiranje indola - -Galaktozidaza + redukcija nitrata - fermentacija glukoze - arginin-dihidrolaza - ureaza - -Glukozidaza - razlaganje želatina (proteaza) - D-glukoza (asimilacija) - L-arabinoza (asimilacija) - D-manoza (asimilacija) - D-manitol (asimilacija) - N-acetil-glukozamin (asimilacija) - D-maltoza (asimilacija) - kalijum-glukonat (asimilacija) - kaprinska kiselina (asimilacija) - adipinska kiselina (asimilacija) - jabuna kiselina (asimilacija) - natrijum-citrat (asimilacija) - fenil-siretna kiselina (asimilacija) - Bakteriološkim ispitivanjem obuhvaeni su uzorci organa: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje, plua, srca, slezine, jetre i bubrega, kao i brisevi vazdušnih kesa ptica iz inficiranih i kontrolnih grupa. Uzronik nije reizolovan iz organa inficiranih brojlerskih roditelja niti je izolovan iz brojlerskih roditelja i fazana iz kontrolnih grupa (tabela 25). 87 Tabela 25. Rezultati bakteriološkog ispitivanja organa ptica iz inficiranih i kontrolnih grupa na O. rhinotracheale Broj pregledanih/broj pozitivnih uzoraka Grupe: nosne šupljine sinusi larinks traheja plua v. kese ostali organi* fazani iz inficirane grupe 10/0 10/4 10/3 10/1 10/5 10/0 10/0 fazani iz kontrolne grupe 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 kokoši iz inficirane grupe 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 kokoši iz kontrolne grupe 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 6/0 *srce, slezina, jetra, bubreg Uzronik je reizolovan iz respiratornih, ali ne i iz drugih organa inficiranih fazana. Reizolacija je bila uspešna iz organa osam ptica što ini 80% od ukupnog broja inficiranih ptica. Uzronik je izolovan iz traheje jedne ptice, larinksa tri ptice, infraorbitalnih sinusa etiri ptice i plua pet ptica (tabela 26). Tabela 26. Rezultati bakteriološkog pregleda organa inficiranih fazana na O. rhinotracheale N nosne šupljine sinusi larinks traheja plua v. kese ostali organi* 1 - + - - + - - 2 - - - + - - - 3 - - - - - - - 4 - - + - - - - 5 - - - - - - - 6 - + + - - - - 7 - + - - + - - 8 - + - - + - - 9 - - - - + - - 10 - - + - + - - ukupno 0 4 3 1 5 0 0 *srce, slezina, jetra, bubreg 88 5.4. Rezultati serološkog ispitivanja Pre uvoenja u ogled, ispitani su uzorci krvi svih ptica na prisustvo specifinih antitela za O. rhinotracheale i dobijen je negativan rezultat. Sedmog dana nakon veštakog inficiranja, ispitani su uzorci krvi po 6 žrtvovanih ptica iz inficirane grupe fazana i inficirane grupe kokoši brojlerskih roditelja, i po etiri ptice iz kontrolnih grupa. Kod inficiranih ptica utvrene su visoke vrednosti titra specifinih antitela, dok su uzorci krvi ptica iz kontrolnih grupa reagovali negativno. Vrednosti titra specifinih antitela u krvi kokoši brojlerskih roditelja kretale su se od 5878 do 15431, srednja vrednost iznosila je 11073 (tabela 27). Vrednosti titra specifinih antitela protiv O. rhinotracheale u krvi fazana iznosile su od 3736 do 8587, srednja vrednost iznosila je 6643 (tabela 28). Dvanaestog dana posle inficiranja, ispitani su uzorci krvi po 6 ptica iz inficiranih grupa (4 uzorka od žrtvovanih i po dva od preostalih inficiranih ptica) kao i po dva uzorka ptica iz kontrolnih grupa. Dobijene vrednosti titra specifinih antitela u krvi inficiranih ptica bile su sline kao u prethodnom ispitivanju, a kod ptica iz kontrolnih grupa nije utvreno prisustvo specifinih antitela. Vrednosti titra specifinih antitela u krvi kokoši brojlerskih roditelja kretale su se od 7312 do 10766, srednja vrednost iznosila je 8662. Vrednosti titra specifinih antitela u krvi fazana iznosile su od 3980 do 8685, srednja vrednost iznosila je 6805. U narednom periodu ispitivana je krv od po 6 preostalih inficiranih ptica na svake dve nedelje. Srednja vrednost titra specifinih antitela u krvi kokoši brojlerskih roditelja, 4 nedelje posle eksperimentalnog inficiranja iznosila je 2372, a u periodu vršenja analiza 6 do 12 nedelja od inficiranja dobijene su srednje vrednosti titra specifinih antitela 2333, 2265, 2203, 1564. Nakon 14 i 16 nedelja od inficiranja nivo antitela je bio ispod granine vrednosti primenjenog dijagnostikuma za poglašavanje uzorka pozitivnim. Srednja vrednost titra specifinih antitela u krvi fazana, 4 nedelje posle veštakog inficiranja, iznosila je 2601, a u periodu vršenja analiza 6 do 12 nedelja od inficiranja dobijene su vrednosti 2335, 2205, 2134, 1594. Nakon 14 i 16 nedelja od inficiranja, svi ispitani uzorci su reagovali negativno. 89 Tabela 27. Rezultati ipitivanja prisustva specifinih antitela za O. rhinotracheale kod kokoši brojlerskih roditelja, nakon eksperimentalnog inficiranja (ELISA) Vreme proteklo od eksperimentalnog inficiranja Redni broj uzorka 7 dana 12 dana 4 nedelje 6 nedelja 8 nedelja 10 nedelja 12 nedelja 14 nedelja 16 nedelja 1 9640 10766 2901 1649 2618 1876 1536 622 376 2 15431 9132 2361 1979 2454 1514 1865 748 336 3 13098 7708 2548 2442 2326 2641 1762 833 601 4 5878 9188 2688 2783 2677 2221 1660 653 653 5 11870 7312 2106 2407 1536 2407 1491 477 748 6 10520 7863 1626 2736 1979 2559 1071 447 685 Xmin 5878 7312 1626 1649 1536 1514 1071 447 336 Xmax 15431 10766 2901 2783 2677 2641 1865 833 748 X 11073 8662 2372 2333 2265 2203 1564 630 567 SD 3258 1288 456 442 435 434 279 150 170 Sx 1330 526 186 180 178 177 114 61 70 CV 29% 15% 19% 19% 19% 20% 18% 24% 30% Tabela 28. Rezultati ipitivanja prisustva specifinih antitela za O. rhinotracheale kod fazana, nakon eksperimentalnog inficiranja (ELISA) Vreme proteklo od eksperimentalnog inficiranja Redni broj uzorka 7 dana 12 dana 4 nedelje 6 nedelja 8 nedelja 10 nedelja 12 nedelja 14 nedelja 16 nedelja 1 7652 8573 2877 3594 3378 3402 2419 769 549 2 4633 8685 3282 1739 2442 1751 1739 570 539 3 8148 4442 1739 2442 1536 2198 962 674 336 4 7099 8573 1968 1899 1626 1671 1413 239 239 5 8587 6578 3884 1762 1876 1536 1604 539 336 6 3736 3980 1853 2571 2372 2244 1424 653 570 Xmin 3736 3980 1739 1739 1536 1536 962 239 239 Xmax 8587 8685 3884 3594 3378 3402 2419 769 570 X 6643 6805 2601 2335 2205 2134 1594 574 428 SD 1988 2163 882 711 686 684 482 183 141 Sx 812 883 360 290 280 279 197 75 58 CV 30% 32% 34% 30% 31% 32% 30% 32% 33% Prilikom uvoenja ptica u ogled i prilikom žrtvovanja 7. i 12. dana od inficiranja, ispitani su uzorci krvnog seruma ptica na prisustvo specifinih antitela protiv virusa atipine kuge živine, virusa infektivnog bronhitisa, pneumovirusa, virusa avijarne influence, M. gallisepticum i M. synoviae kako bi se iskljuio uticaj navedenih infektivnih agenasa na pojavu patomorfoloških promena u respiratornim organima. 90 Kod fazana je utvreno prisustvo specifinih antitela za virus atipine kuge živine dok antitela protiv virusa infektivnog bronhitisa, pneumovirusa, virusa avijarne influence, M. gallisepticum i M. synoviae u parnim uzorcima krvnog seruma fazana nisu utvrena. Prilikom uvoenja fazana u ogled dobijene su vrednosti titra specifinih antitela za virus atipine kuge živine: 810, 2579, 4043, 5614, 7192, 2550, 2565, 4058, 1737, 3475, 2885, 4968, 1878, 4984, 6344, 3208, 2565, 4073, 3061, 4694, 1751, 3371; X = 3564; SD = 1589; CV = 45%. Kod fazana iz inficirane grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 929, 2420, 4013, 5753, 7444, 2449; X = 3835; SD = 2412; CV = 63%. Kod fazana iz kontrolne grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 2478, 4163, 1822, 3505; X = 2992 Kod fazana iz inficirane grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 2608, 4678, 1723 i 4709; X = 3429 Kod fazana iz kontrolne grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 6219 i 2914. Kod kokoši je utvreno prisustvo specifinih antitela za virus atipine kuge živine i virus infektivnog bronhitisa, dok prisustvo antitela protiv ostalih ispitivanih uzronika respiratornih infekcija nije ustanovljeno. Prilikom uvoenja u ogled, vrednosti titra specifinih antitela za virus atipine kuge živine kod kokoši iznosile su: 9959, 11968, 7302, 14522, 8414, 12066, 10479, 9458, 7555, 4907, 14088, 11082, 14790, 9474, 5568, 11344, 10919, 15511, 12693, 11229, 8718, 6516; X = 10389; SD = 2958; CV = 28% Kod kokoši iz inficirane grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 13988, 11049, 14622, 9619, 5908, 11049; X = 11039, SD = 3158, CV = 29% Kod kokoši iz kontrolne grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 10690, 14355, 12515, 11017; X = 12143 Kod kokoši iz inficirane grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 7381, 13024, 8590, 12231; X = 10306. Kod kokoši iz kontrolne grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 8494, 5599. Vrednosti titra specifinih antitela za virus infektivnog bronhitisa na dan uvoenja ptica u ogled iznosile su: 9139, 8223, 8916, 4964, 8549, 6290, 7161, 4615, 8811, 7251, 5934, 91 7109, 4059, 8549, 8602, 7328, 6022, 5630, 6775, 6137, 7989, 4256; X = 6923; SD = 1585; CV = 23%. Kod kokoši iz inficirane grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 9271, 8067, 8995, 5139, 8223, 6086; X = 7630; SD = 1655; CV = 22%. Kod kokoši iz kontrolne grupe, žrtvovanih 7. dana dobijene su vrednosti titra: 7367, 4740, 8445, 7071; X = 6906. Kod kokoši iz inficirane grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 6022, 7290, 3887, 8484; X = 6421. Kod kokoši iz kontrolne grupe, žrtvovanih 12. dana dobijene su vrednosti titra: 8471, 7445. 92 6. DISKUSIJA O. rhinotracheale je novootkriveni uzroronik respiratornih infekcija ptica (van Beek i saradnici, 1994), ija je klasifikacija izvršena 1994. godine (Vandamme i saradnici, 1994). Veoma je rasprostranjen kod živine u intenzivnoj proizvodnji širom sveta (Hafez i Sting, 1996; Ryll i saradnici, 1997; Canal i saradnici, 2003; Chansiripornchai i saradnici, 2007) što je potvrreno i u Republici Srbiji (Gavrilovi, 2009). I pored toga, uloga ovog uzronika u patologiji respiratornih bolesti ptica nije dovoljno poznata i još uvek se istražuje. Mišljenja naunika o patogenosti uzronika idu u dva pravca. Jedni smatraju da je O. rhinotracheale primarni patogen (Ryll i saradnici, 1996; Travers i saradnici, 1996; Sprenger i saradnici, 1998; van Veen i saradnici, 2000b), a drugi da je za izbijanje infekcije neophodno dejstvo drugih mikroorganizama (van Empel i saradnici, 1996; Back i saradnici, 1997; Droual i Chin, 1997; Franz i saradnici, 1997; van Empel i saradnici, 1999). S obzirom da uloga O. rhinotracheale u patologiji repiratornih bolesti ptica nije u potpunosti razjašnjena, opredelili smo se da u eksperimentalnim uslovima ispitamo uticaj ove bakterije na pojavu patomorfoloških promena u respiratornim organima kokoši brojlerskih roditelja i fazana. Amonsin i saradnici (1997) su ispitivanjem 55 izolata O. rhinotracheale primenom PCR metode ustanovili da imaju ogranienu heterogenost i da pripadaju maloj grupi blisko udruženih klonova. Na ovakvim saznanjima zasniva se pretpostavka naunika da su ove bakterije u skorije vreme prešle sa divljih na domae vrste ptica (Chin i saradnici, 2003), što je bio jedan od razloga da za eksperiment odaberemo srodnu domau i divlju vrstu ptica. U literaturi ima veoma malo podataka o klinikoj slici kod kokoši brojlerskih roditelja (Hafez, 1996), dok podaci o patomorfološkim promenama ne postoje, kao ni podaci o ornitobakteriozi fazana. Pored navedenih razloga za izbor vrsta ptica koje e se koristiti u ogledu, smatrali smo da je znaajno da se uporedi prijemivost kokoši brojlerskih roditelja kao visoko selekcionisane vrste na odreene osobine, znaajne za komercijalnu proizvodnju i srodne prirodno selekcionisane divlje vrste iz iste supfamilije - Phasianinae. 93 Sprovedena ispitivanja imala su za cilj da se utvrdi uticaj O. rhinotracheale na razvoj patomorfoloških promena u respiratornim organima i zdravstveno stanje kokoši brojlerskih roditelja i fazana iz odgoja. Kod inficarinih ptica praen je i serološki odgovor tokom 16 nedelja nakon veštakog inficiranja. Za eksperiment su odabrane ptice koje nisu bile u kontaktu sa uzronikom što je potvreno serološkim ispitivanjem uzoraka krvi ptica iz jata iz kojih su izdvojene ptice za eksperiment, dva puta u razmaku od 3 nedelje, kao i bakteriološkim ispitivanjem uzoraka trahealnih briseva i serološkim ispitivanjem uzoraka krvi sve 44 odabrane ptice. Soj O. rhinotracheale B3263/91 je jedan od prvih izolovanih sojeva ove bakterije u svetu. Izolovan je iz organa obolelih brojlera, 1991. godine u južnoj Africi. Van Veen i saradnici (2000b) su istraživali virulentnost razliitih sojeva O. rhinotracheale i ustanovili da je južnoafriki soj B3263/91 virulentniji od amerikih sojeva zbog ega smo se opredelili da ovim sojem izazovemo infekciju. Veina naunika koji su istraživali eksperimentalnu infekciju aplikovali su O. rhinotracheale oglednim pticama u koncentraciji 108 do 109 CFU/ml, aerosolom (van Empel i saradnici, 1996; van Veen i saradnici, 2000b; Kilic i saradnici, 2009). Sprenger i saradnici (1998) izazvali su klinike manifestacije i patomorfološke promene u respiratornim organima uraka, intratrahealnom aplikacijom suspenzije O. rhinotracheale u koncentraciji 1010 CFU/ml. Imajui u vidu navedene podatke opredelili smo se da za eksperimentalnu infekciju koristimo suspenziju sa visokom koncentracijom bakterija (1011 CFU/ml) za koju u literaturi nije bilo podataka da je korišena. Pored primene suspenzije sa visokom koncentracijom bakterija, uzronik je favorizovan u odnosu na domaina i intratrahealnim nainom aplikovanja suspenzije bakterijskih kolonija ime je zaobien deo nespecifinih odbrambenih mehanizama nosa, larinksa i traheje. Ovakvim pristupom favorizovanja uzronika i stvaranja što optimalnijih uslova za nastanak infekcije, nastojali smo da utvrdimo da li O. rhinotracheale može kod zdravih ptica, gajenih na uobiajen nain, za odreene namene da prouzrokuje bolest i kakav je serološki odgovor inficiranih ptica. Drugim reima, eksperiment je tako koncipiran da bi u prirodnim uslovima monoinfekcije O. rhinotracheale mogle da se oekuju klinike i patomorfološke promene manjeg intenziteta od promena izazvanih sprovedenim eksperimentom. Suspenzija O. rhinotracheale za eksperimentalnu infekciju, pripremljena je od kolonija izraslih na vrstoj hranljivoj podlozi iz druge pasaže nabavljene liofilizovane kulture koja je pripremljena iz tree pasaže izvornog izolata iz patološkog materijala (organa obolelih brojlera iz južne Afrike). Kultivisanjem uzronika na vrstoj hranljivoj 94 podlozi i malim brojem pasaža nastojalo se da se u što veoj meri ouva virulentnost uzronika. Sprenger i saradnici (1998) kao kljune razloge za uspeh eksperimenta izvedenog na urkama u pogledu ispoljavanja klinikih simptoma i nastanka patomorfoloških promena, navode kultivisanje bakterija za eksperimentalnu infekciju na vrstoj hranljivoj podlozi i mali broj pasaža u in vitro uslovima. Kod inficiranih brojlerskih roditelja nije bilo klinikih znakova infekcije. Primenom Studentovog t testa nije ustanovljeno da infekcija nepovoljno utie na prirast, odnosno nije utvrena statistika znaajnost razlike aritmetikih sredina telesne mase izmeu inficirane i kontrolne grupe 7 dana posle inficiranja. Podaci iz literature o klinikim simptomima razlikuju se kod eksperimentalno i prirodno inficiranih ptica. Chin i saradnici (2003) navode da se kliniki znaci kod prirodno inficiranih pilia javljaju izmeu tree i šeste nedelje života sa mortalitetom od 2 do 10% i da su od simptoma prisutni: depresija, nazalni iscedak, kijanje, facijalni edem, smanjeno uzimanje hrane i smanjen prirast. Sline manifestacije opisali su van Beek i saradnici (1994) u sluaju pojave infekcije kod brojlera u Holandiji kada su se ispoljili kliniki simptomi u vidu kijanja, nazalnog iscetka i lakrimacije. Kod brojlerskih roditelja oboljenje zahvata ptice u periodu nošenja, uglavnom u špicu nosivosti ili neposredno pre pronošenja. Javlja se neznatno povišenje mortaliteta, smanjeno je uzimanje hrane i prisutni su blagi respiratorni simptomi (Hafez, 1996). Najupeatljivija manifestacija infekcije kod veštaki inficiranih pilia je usporen rast. Meutim, drugi kliniki znaci (slabost, dispnoja, mukozni iscedak iz nosa) i uginua zapaženi kod prirodno inficiranih ptica nisu primeeni kod veštaki inficiranih pilia i uria (van Empel i saradnici, 1996). Kilic i saradnici (2009) opisali su klinike simptome u vidu otežanog disanja kod svega 3 od 30 brojlera, inficiranih u uzrastu od 14 nedelja. Razlike u eksperimentalnoj i prirodnoj infekciji u pogledu ispoljavanja klinike slike mogle bi da se objasne uticajem nekih od predisponirajuih faktora. U farmskim uslovima znaajan uticaj na ispoljavanje klinikih simptoma mogu da imaju: stres, prenaseljenost, loša ventilacija, prisustvo drugih bakterija i visok nivo amonijaka. Odsustvo nepovoljnog uticaja veštake infekcije na prirast kokoši iz inficirane grupe, nasuprot rezultatima za brojlere koje su objavili van Empel i saradnici (1996) može da se objasni manjom osetljivošu kokoši brojlerskih roditelja ili uzrasnom otpornošu. Visoka seroprevalencija jata kokoši brojlerskih roditelja starijih od 20 nedelja (Gavrilovi, neobjavljena zapažanja) bez istorije respiratornih simptoma i odstupanja rezultata od tehnoloških normi ide u prilog rezultatima eksperimenta. U 95 eksperimentu koji smo izveli, ak ni visokom koncentracijom klica direktno aplikovanim intratrahealno nije isprovocirana klinika slika, ve je infekcija proticala asimptomatski kao i prirodna infekcija. Ovakvi rezultati podudaraju se sa zakljukom magistarske teze da iako je O. rhinotracheale rasprostranjen u intenzivnoj brojlerskoj proizvodnji u Južnobanatskom okrugu, njegovo prisustvo ne mora da dovede do ispoljavanja klinike slike u vidu poremeaja respiratornog sistema (Gavrilovi, 2009). Do slinih saznanja došli su i Asadpour i saradnici (2008) ispitivanjem prisustva O. rhinotracheale u 22 jata brojlerskih roditelja u Iranu. Serološkim ispitivanjem utvreno je da su jata bila inficirana ali u vreme uzimanja uzoraka nisu ispoljavala bilo kakve simptome. U inficiranoj grupi fazana kliniki simptomi javili su se samo kod jednog fazana, dva dana posle inficiranja. Zapaženo je sporije kretanje, neveselost, nakostrešenost perja i pokreti glave kao da pokušava da izbaci sadržaj iz kljuna. Primenom Studentovog t testa utvreno je da postoji statistika znaajnost (p<0,05) razlike u telesnoj masi izmerenoj sedam dana posle eksperimentalnog inficiranja, izmeu inficirane i kontrolne grupe fazana što dokazuje da se infekcija nepovoljno odrazila na prirast. U literaturi ima podataka o infekciji kod pilia i uria, ali veoma malo se zna o infekciji kod drugih vrsta ptica. Sprenger i saradnici (1998) opisuju simptome depresije, kašlja i smanjenog uzimanja hrane kod tovnih urana iz grupe inficirane I/T istom kulturom O. rhinotracheale i grupe inficirane I/T plunim homogenizatom koji su nastali 24 h posle inficiranja. Nakon 48 h od inficiranja, nekoliko urana iz ove dve grupe, iskašljavalo je krvavu sluz i oni su uginjavali nakon 24 h. urani inficirani I/T istom kulturom O. rhinotracheale i urani inficirani I/T plunim homogenizatom imali su statistiki znaajan gubitak telesne mase u poreenju sa kontrolnim grupama. Ni jednim drugim opisanim eksperimentom nije izazvana klinika slika u vidu teškog respiratornog distresa. U našim ispitivanjima utvren je nepovoljan uticaj infekcije na prirast kod fazana kao u opisanom eksperimentu na urkama, ali ne i drugi kliniki simptomi. Rezultati koje su dobili Eroksuz i saradnici (2006) ispitivanjem patogenosti uzronika za japanske prepelice (Coturnix coturnix japonica) u eksperimentalnim uslovima su slini našim rezultatima za kokoši i fazane u pogledu ispoljavanja klinikih simptoma. Ni jedna od 30 ptica, inficiranih aerosolom, nije ispoljila klinike simptome tokom trajanja eksperimenta. Nepovoljan uticaj infekcije na telesnu masu fazana i odsustvo klinikih manifestacija (simptomi su zapaženi samo kod jedne ptice) podudara se sa podacima do 96 kojih su došli van Empel i saradnici (1996), van Veen i saradnici (2000b) i Kilic i saradnici (2009) ispitivanjem veštake infekcije kod pilia. Jedini sluaj kliniki ispoljene prirodne infekcije kod divljih ptica opisali su Hafez i Lierz (2010) kod mladih sokolova, u farmskom uzgoju, u vidu respiratornog distresa. Patoanatomske promene naene su kod 20% inficiranih kokoši. Manifestovale su se u vidu blage upale gornjih respiratornih puteva: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa i traheje kao i hiperemijom i edemom plua. Kod veine inficiranih kokoši nije bilo vidljivih promena na respiratornim organima. Sline promene opisali su Kilic i saradnici (2009) kod veštaki inficiranih brojlera u starosti od 14 dana putem aerosola. Kod pet pilia izmeu 7. i 14. dana od inficiranja zapaženo je nakupljanje male koliine sluzi u nosu, larinksu i traheji kao i hiperemija sluznice gornjih respiratornih puteva što se podudara sa našim rezultatima patoanatomskog pregleda inficiranih kokoši. Kod pojedinih pilia, navedeni autori opisuju zelenkasto-crvena ognjišta u pluima dok su kod jedne inficirane kokoši u našim ispitivanjima, plua bila crvena, zaobljenih rubova, vrste konzistencije što je karakteristino za hiperemiju i edem. Van Veen i saradnici (2000b) su istraživanjem uticaja veštake infekcije na razliite provenijencije pilia, prouzrokovane aplikacijom uzronika aerosolom, utvrdili patoanatomske promene u traheji kod komercijalnih brojlera i SPF brojlera nakon inficiranja samo ornitobakterijumom, ali su promene bile izraženije kada su pilii prethodno bili inficirani NDV-om. Ovakav nalaz je u saglasnosti sa našim zapažanjem slabo izraženih makroskopskih promena u gornjim respiratornim putevima kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja. Makroskopske promene kod inficiranih fazana utvrene su kod veeg broja ptica i bile su izraženije u odnosu na grupu inficiranih kokoši brojlerskih roditelja. Utvrene su u nosnim šupljinama, infraorbitalnim sinusima, larinksu, traheji, pluima i vazdušnim kesama. Kod inficiranih fazana sluznica gornjih respiratornih puteva: nosnih šupljina, larinksa i traheje je bila zacrvenjena i prekrivena sluzavim sadržajem koji se nakupljao i u infraorbitalnim sinusima. Plua veine inficiranih fazana su bila uveana, crvene boje, zaobljenih rubova, a sa preseka promenjenih plua isticala je krvavo- penušava tenost. Na zidovima torakalnih vazdušnih kesa kod dva fazana zapažene su promene u vidu jasno lokalizovanih, žukastih, okruglih zadebljanja prenika oko 1-2 mm za razliku od negativnog makroskopskog nalaza u vazdušnim kesama kod kokoši brojlerskih roditelja. 97 Eroksuz i saradnici (2006) izazvali su sline promene u pluima i traheji veštakim inficiranjem japanskih prepelica. Makroskopski nalaz odlikovala je blaga hiperemija plua i traheje i zadebljanje pleure. Histopatološke promene ustanovljene u respiratornim organima inficiranih kokoši brojlerskih roditelja i fazana karakterisao je inflamatorni odgovor tipian za bakterijsku infekciju. Kod inficiranih fazana bile su uestalije i jaeg intenziteta u odnosu na inficirane kokoši, mada je i kod njih inflamatorni odgovor bio relativno slabo izražen. U respiratornim organima inficiranih kokoši brojlerskih roditelja histopatološke promene utvrene su kod 5 ptica, a uestalost je iznosila 10-40% za pojedine organe. U nosu i sinusima promene su ustanovljene u 10% uzoraka, u larinksu 20%, u traheji 40%, u pluima 50% i u vazdušnim kesama 20% uzoraka. U lumenu larinksa i traheje inficiranih kokoši bio je prisutan eksudat koji se sastojao iz sluzi, eritrocita i heterofila. U lamini propriji mukoze nalazio se infiltrat od inflamatornih elija u kojem su dominirali heterofili, a krvni sudovi su bili hiperemini. U pluima se nalaz karakterisao hiperemijom, a jedna plua bila su i edematozna. Vazdušne kese kod dva leša bile su zadebljale usled infiltracije mononuklearima. Histopatološke promene u respiratornim organima inficiranih fazana utvrene su kod 7 ptica sa uestalošu promena 10-70% u pojedinim organima. Utvrene su u nosu u 40% uzoraka, sinusima 30%, u larinksu i traheji 50%, u pluima 70% i u vazdušnim kesama 30% uzoraka. U nosnim šupljinama je zapaženo nakupljanje vee koliine sluzavog sadržaja u kojem su se nalazili eritrociti i heterofili. U sinusima se nalazila mala koliina sluzi i po neka inflamatorna elija, a kod jedne ptice i krvarenja. Histopatološki nalaz u larinksu i traheji veine uzoraka odgovarao je kataralnom zapaljenju. U lumenu se nalazila izvesna koliina eksudata. Promene na epitelu manifestovale su se u vidu hiperplazije, degenerativno-nekrotinih promena i deskvamacije. Krvni sudovi lamine proprije larinksa i traheje bili su injicirani, a elijski infiltrat sastojao se iz heterofila, limfocita, monocita i malog broja plazmocita. Slino gornjim respiratornim putevima, u primarnim bronhusima je takoe zabeleženo nakupljanje sluzavog sadržaja sa heterofilima i inflamatorni elijski infiltrat u lamini propriji. Kod sedam fazana histopatološki nalaz u pluima karakterisao se hiperemijom. Krvni sudovi plua bili su prepuni krvi, a u lumenu parabronhija i atrija kod dva fazana zapaženo je nakupljanje serozne tenosti sa malim brojem inflamatornih elija. Kod dva fazana razvila se fibrinozna pneumonija koja se može smatrati posledicom intenzivnijeg inflamatornog 98 procesa, što nije bio sluaj ni kod jedne inficirane kokoši. Granulomi, takoe nisu naeni u pluima kokoši, a ustanovljeni su u pluima dva inficirana fazana. Mnogi autori, slino našim zapažanjima, navode da se kod inficiranih ptica javlja heterofilni infiltrat u respiratornim organima (De Rosa i saradnici, 1996; Sprenger i saradnici, 1998; Chin i saradnici, 2003; Kilic i saradnici, 2009). Promene u respiratornim organima kod kokoši brojlerskih roditelja su manjeg intenziteta od promena koje su opisali pojedini autori kod brojlera (van Veen i saradnici, 2000b; Kilic i saradnici, 2009) što se može objasniti razliitim uzrastom inficiranih kokoši i razliitom osetljivošu razliitih generacija hibrida, odnosno razliitih provenijencija. Ovakvom zakljuku idu u prilog i rezultati do kojih su došli van Veen i saradnici (2000b) istraživanjem eksperimentalne infekcije kod razliitih provenijencija pilia teških linija. Promene na vazdušnim kesama i pluima utvrene su posle inficiranja razliitim sojevima O. rhinotracheale aerosolom kod SPF brojlera i komercijalnih brojlera, dok kod SPF pilia rase leghorn nisu ustanovljene lezije u pluima, a promene na vazdušnim kesama su bile manje izražene. Kod prirodno inficiranih ptica opisane su mnogo izraženije histopatološke promene nego kod ptica koje su veštaki inficirane. De Rosa i saradnici (1996) opisali su promene karakteristine za fibrinozno-gnojnu pneumoniju kod inficiranih uraka, a sline manifestacije utvrdili su Gornatti Churria i saradnici (2011) kod brojlera. Razlike u intenzitetu histopatoloških lezija kod veštaki inficiranih u odnosu na prirodno inficirane ptice najverovatnije su posledica delovanja drugih inilaca, infektivnih agenasa ili ambijentalnih faktora. Analizom histopatoloških promena u sluajevima prirodne infekcije esto se mogu utvrditi i promene koje su karakteristine za virusne infekcije. Tako su, na primer, Odor i saradnici (1997) i Van Veen i saradnici (2000a) opisali mešane infekcije u kojima su pored ornitobakterijuma brojleri bili inficirani NDV-om, odnosno IBV-om. Difuzna limfocitna infiltracija plua i traheje koju opisuju navedeni autori posledica je odgovora organizma na virusnu infekciju, dok su fibrinozne do fibrinozno gnojne promene posledica delovanja ornitobakterijuma. U našim istraživanjima u pluima dva fazana utvren je fibrinozni eksudat. Van Empel i saradnici (1999) utvrdili su granulome u vazdušnim kesama veštaki inficiranih pilia NDV-om i ornitobakterijumom dok su u našim ispitivanjima ustanovljeni granulomi u pluima dva fazana inficiranih samo ornitobakterijumom. Ornithobacterium rhinotracheale se teško kultiviše zbog posebnih kulturelnih zahteva i sporog rasta. Kolonije izrastu obino posle 24-48 h u mikroaerofilnoj sredini zbog ega se dešava da ih u rutinskoj dijagnostici prerastu brzo-rastue bakterije kao što su E. coli, Proteus ili Pseudomonas. Ovo je bio razlog zbog kojeg smo se opredelili da 99 za izolaciju koristimo i jednu selektivnu hranljivu podlogu sa gentamicinom kako bi se suprimirao rast drugih bakterija. Ornithobacterium rhinotracheale je reizolovan iz respiratornih organa 8 od 10 (80%) inficiranih fazana. Najviše izolata je bilo iz plua (5), zatim iz infraorbitalnih sinusa (4), larinksa (3), traheje (1), dok iz ostalih unutrašnjih organa uzronik nije izolovan. O. rhinotracheale nije izolovan iz organa inficiranih kokoši brojlerskih roditelja niti iz organa ptica iz kontrolnih grupa. Ovakvi rezultati mogli bi da se objasne razliitom prijemivošu dve ispitivane vrste ptica ili efikasnijim imunološkim mehanizmima usmerenim prema ovom uzroniku kod kokoši brojlerskih roditelja provenijencije „Ross 308“ u poreenju sa fazanima. Rezultati izolacije uzronika iz organa inficiranih kokoši u saglasnosti su sa rezultatima do kojih su došli van Empel i saradnici (1999) istraživanjem uticaja uzronika na tok bolesti veštaki inficiranih SPF kokoši rase leghorn, starih 26 dana. Ornithobacterium rhinotracheale izolovan je iz traheje inficiranih kokoši dva dana posle veštakog inficiranja, dok u kasnijem periodu uzronika više nije bilo mogue izolovati. Rezultati izolacije kod prirodno inficiranih kokoši brojlerskih roditelja u znaajnoj meri se podudaraju sa rezultatima izolacije kod veštaki inficiranih kokoši. Negativni rezultati izolacije uzronika iz organa veštaki inficiranih kokoši u saglasnosti su sa rezultatima ispitivanja za 5 jata brojlerskih roditelja u južnom Banatu u starosti od 20 i više nedelja u kojima je utvreno prisustvo specifinih antitela, ali se uzronik nije mogao izolovati iz organa (Gavrilovi, neobjavljeni podaci). Asadpour i saradnici (2008) ispitivali su prisustvo uzronika u 22 jata brojlerskih roditelja izolacijom, primenom PCR metode i serološkim ispitivanjem specifinih antitela. Iako su sva ispitana jata bila serološki pozitivna, uzronik je izolovan iz malog broja uzoraka trahealnih briseva iz samo pet jata. Navedeni podaci o izolaciji uzronika iz veštaki i prirodno inficiranih kokoši navode na zakljuak da uzronik teško opstaje u organizmu kokoši brojlerskih roditelja. S obzirom da se kod veštaki inficiranih brojlera uzronik može izolovati iz plua i traheje 30-50% ptica u prve dve nedelje (Kilic i saradnici, 2009), može se pretpostaviti da postoji i rasna predispozicija za prijemivost O. rhinotracheale i nastanak oboljenja. Van Veen i saradnici (2000b) istraživali su patogenost uzronika za brojlere i posle veštakog inficiranja ptica utvrdili da su SPF kokoši rase leghorn manje prijemive na uzronika u poreenju sa SPF brojlerima i komercijalnim brojlerima. 100 Ornithobacterium rhinotracheale se kod prirodno inficiranih ptica izoluje iz respratornih organa, obino iz traheje, trahealnih briseva, plua i vazdušnih kesa. Pokušaji izolacije uzronika iz ostalih unutrašnjih organa koji se koriste u rutinskoj dijagnostici poput srca, jetre i dr. nisu dali rezultate (Hafez i saradnici, 1993). Meutim, kod veštaki inficiranih ptica, intravenskom aplikacijom uzronika, izolacija je bila mogua i iz ovih organa, pa ak i iz zglobova, mozga, jajnika i jajovoda (van Beek i saradnici, 1994; Back i saradnici, 1998b). Sprenger i saradnici (1998) navode da je O. rhinotracheale kod intratrahealno inficiranih uraka izolovan iz plua (40%), vazdušnih kesa (30%), sinusa, traheje, slezine i bubrega 20% ptica. Ovi podaci uporeeni sa rezultatima do kojih smo došli upuuju na razliitu osetljivost razliitih vrsta ptica na O. rhinotracheale. Izolacija uzronika iz unutrašnjih organa u opisanom eksperimentu podudara se sa teškom klinikom slikom i izraženim patomorfološkim promenama u organima. Pored toga postoji i mogunost razliite osetljivosti ptica na uzronika u razliitim uzrastima. Tako na primer, Van Empel i saradnici (1996) navode da je uzronik izolovan samo iz vazdušnih kesa eksperimentalno inficiranih uria starih 31 dan kod kojih nije bilo klinikih simptoma, a patomorfološke promene su se manifestovale samo na vazdušnim kesama. Jedan od zadataka ispitivanja bio je praenje serološkog odgovora. I kod fazana i kod kokoši brojlerskih roditelja utvrene su visoke vrednosti titra specifinih antitela sedmog dana posle inficiranja. Razliite vrednosti titra specifinih antitela u krvi kokoši i fazana, verovatno su posledica intenzivnijeg imunološkog odgovora kokoši brojlerskih roditelja na ovog uzronika. Više autora, slino našim rezultatima, navodi da se sedmog dana nakon veštakog inficiranja kod razliitih vrsta ptica: uraka, kokoši, prepelica mogu da ustanove specifina antitela za uzronika (Sprenger i saradnici, 1998; Van Empel i saradnici, 1999; Eroksuz i saradnici, 2006). Vrednosti titra utvrene za kokoši, sedmog dana posle inficiranja, bile su više od vrednosti koje navode Van Empel i saradnici (1999) najverovatnije zbog razliitog naina inokulacije i razliite koncentracije aplikovanih bakterija. U eksperimentu navedenih autora najviše vrednosti titra specifinih antitela ustanovljene su 9 dana posle aplikacije suspenzije bakterijske kulture u koncentraciji 3,8 x 108 CFU/ml putem aerosola. U našim ispitivanjima, maksimalne vrednosti titra specifinih antitela kod veštaki inficiranih ptica postignute su ve sedmog dana što se može objasniti veom koncentracijom suspenzije bakterijske kulture (1011 CFU/ml) i intratrahealnim nainom aplikacije. Antitela kod inficiranih kokoši i fazana mogla su se registrovati do 12 nedelja posle inficiranja dok su vrednosti 101 sa 14 nedelja bile ispod granice primenjenog testa za proglašavanje uzorka pozitivnim što je u saglasnosti sa rezultatima eksperimenta koji su izveli Van Empel i saradnici (1999). Autori navode niske vrednosti titra specifinih antitela kod veštaki inficiranih pilia, 12 i 14 nedelja posle inficiranja. Kod prirodno inficiranih ptica vrednosti titra specifinih antitela spontano opadaju od 6. do 10. nedelje posle inficiranja (Van Empel i saradnici, 1999). Razliito vreme perzistencije antitela u krvi prirodno i veštaki inficiranih ptica može da se objasni time što je kod veštake infekcije obezbeena viša koncentracija bakterija i njihovo efikasnije prodiranje u organizam ptica. Serološkim ispitivanjem iskljuen je uticaj virusa atipine kuge živine, virusa infektivnog bronhitisa, virusa avijarne influence, pneumovirusa, M. synoviae i M. gallisepticum na pojavu patomorfoloških promena u respiratornim organima veštaki inficiranih ptica. Vrednosti titra specifinih antitela protiv virusa atipine kuge i virusa infektivnog bronhitisa u parnim serumima kokoši, kao i vrednosti titra specifinih antitela protiv virusa atipine kuge u parnim serumima fazana odgovaraju sprovedenoj vakcinaciji protiv ovih bolesti. 102 7. ZAKLJUCI 1. Kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja nije utvren nepovoljan uticaj uzronika na zdravstveno stanje. Eksperimentom je potvreno da kod kokoši brojlerskih roditelja infekcija O. rhinotracheale protie supkliniki i da nema nepovoljan uticaj na prirast. 2. Patoanatomske promene kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja manifestovale su se u respiratornim organima u vidu blagog kataralnog zapaljenja gornjih disajnih puteva: nosnih šupljina, larinksa, traheje i hiperemijom plua kod malog broja inficiranih kokoši. 3. Histopatološke promene kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja naješe su bile zastupljene u pluima (50%), traheji (40%), larinksu (20%), vazdušnim kesama (20%), nosnim šupljinama (10%), infraorbitalnim sinusima (10%). Manifestovale su se u vidu kataralnog zapaljenja gornjih respiratornih organa i hiperemijom plua. Dominantnu elijsku populaciju u inflamatornom infiltratu predstavljali su heterofili. 4. Ornithobacterium rhinotracheale soj B3263/91 nije bilo mogue reizolovati iz organa kokoši brojlerskih roditelja, komercijalnog hibrida „Ross 308“, sedam do dvanaest dana posle eksperimentalnog inficiranja u starosti od šesnaest nedelja. 5. Veštaka infekcija O. rhinotracheale sojem B3263/91 imala je nepovoljan uticaj na prirast fazana. 6. Patoanatomske promene kod veštaki inficiranih fazana manifestovale su se u respiratornim organima u vidu kataralnog zapaljenja gornjih disajnih puteva: nosnih šupljina, infraorbitalnih sinusa, larinksa i traheje, kao i hiperemijom plua i aerosakulitisom. 103 7. Histopatološke promene kod veštaki inficiranih fazana naješe su otkrivene u pluima (70%), larinksu (50%), traheji (50%), nosnim šupljinama (40%), infraorbitalnim sinusima (30%) i vazdušnim kesama (30%). Promene su se manifestovale u vidu kataralnog zapaljenja gornjih respiratornih puteva, a dominantnu elijsku populaciju u inflamatornom infiltratu predstavljali su heterofili. 8. Ornithobacterium rhinotracheale soj B3263/91 reizolovan je iz respiratornih organa fazana: infraorbitalnih sinusa, larinksa, traheje i plua, sedam do dvanaest dana posle veštakog inficiranja u starosti od dvadeset nedelja. Iz ostalih unutrašnjih organa uzronik nije izolovan. 9. Serološki odgovor kod veštaki inficiranih kokoši brojlerskih roditelja i fazana odlikovao se brzim stvaranjem specifinih antitela za uzronika koja su dostigla maksimalan nivo u krvi, u prvoj nedelji posle veštakog inficiranja. Vrednosti titra antitela su postepeno opadale i održavale se na stabilnom nivou do dvanaeste nedelje od inficiranja, a nakon etrnaest nedelja od inficiranja specifina antitela više se nisu mogla otkriti metodom ELISA. 10. Fazani su se pokazali osetljivijim na veštaku infekciju O. rhiotracheale sojem B3263/91 od kokoši brojlerskih roditelja komercijalnog hibrida „Ross 308“. 104 8. SPISAK LITERATURE 1. Abdul-Aziz, T. A., Weber, L. J. 1999. Ornithobacterium rhinotracheale infection in a turkey flock in Ontario. The Canadian Veterinary Journal 40: 349-50. 2. Amonsin, A., Wellehan, J. F. X., Li, L. L., Vandamme, P., Lindeman, C., Edma, M., Robinson, R. A., Kapur, V. 1997. Molecular epidemiology of Ornithobacterium rhinotracheale. Journal of Clinical Microbiology 35: 2894-2898. 3. Asadpour, Y., Bozorgmehrifard, M. H., Pourbakhsh, S. A., Banani, M., Charkhkar, S. 2008. Isolation and identification of Ornithobacterium rhinotracheale in broiler breeder flocks of Guilan Province, north of Iran. Pakistan Journal of Biological Sciences 11: 1487-1491 4. Back, A., Gireesh, R., Halvorson, D., Nagaraja, K. 1997. Experimental studies of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) infection. In: Proceedings of the 46th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 7-8. 5. Back, A., Halvorson, D., Rajashekara, G., Nagaraja, K. V. 1998a. Development of a serum plate agglutination test to detect antibodies to Ornithobacterium rhinotracheale. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 10: 84-86. 6. Back, A., Rajashekara, G., Jeremiah, R., Halvorson, D., Nagaraja, K. 1998b. Tissue distribution of Ornithobacterium rhinotracheale in experimentally infected turkeys. Veterinary Record 143: 52-53. 7. Ballagi, A., Holmquist, G., Odmark, M., Leathers, V. L. 2000. ELISA test for the detection of Ornithobacterium rhinotracheale infection in chickens and turkeys. In: Proceedings of the 49th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 50-51. 8. Bisschop, S. P. R., van Vuuren, M., Gummow, B. 2004. The use of a bacterin vaccine in broiler breeders for the control of Ornithobacterium rhinotracheale in commercial broilers. Journal of the South African Veterinary Association 75: 125-128. 9. Bock, R., Freidlin, P., Manoim, M., Inbar, A., Frommer, A., Vandamme, P., Wilding, P. 1997. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) associated with a new turkey respiratory tract infectious agent in Israel. In: Proceedings of the 11th International Congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest, Hungary, 120. 105 10. Bock, R. R, Freidlin, P. J., Tomer, S., Manoim, M., Inbar, A., Frommer, A., Vandamme, P., Wilding, P., Hickson, D. 1995. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) associated with a new turkey respiratory tract infectious agent. In: Proceedings of the 33rd Annual Convention of the Israel Branch of the World Poultry Science Association (WPSA), Israel, 43-45. 11. Bragg, R., Greyling, J., Verschoor, J. 1997. Isolation and identification of NAD- independent bacteria from chickens with symptoms of infectious coryza. Avian Pathology 26: 595-606. 12. Canal, C. W., Leao, J. A., Ferreira, D. J., Macagnan, M., Salle, C. T. P., Back, A. 2003. Prevalence of antibodies against Ornithobacterium rhinotracheale in broilers and breeders in Southern Brazil. Avian Diseases 47: 731-737 13. Chansiripornchai, N. 2004. Molecular interaction of Ornithobacterium rhinotracheale with eukaryotic cells. PhD thesis. University of Utrecht. 14. Chansiripornchai, N., Wanasawaeng, W., Sasipreeyajan, J. 2007. Seroprevalence and identification of Ornithobacterium rhinotracheale from broiler and broiler breeder flocks in Thailand. Avian Diseases 51: 777-780. 15. Charlton, B. R. 1999. Bordetella avium and Ornithobacterium rhinotracheale from California poultry submissions. In: Proceedings of the 48th Western Poultry Disease Conference, Vancouver, Canada, 80. 16. Charlton, B. R., Channing-Santiago, S. E., Bickford, A. A., Cardona, C. J., Chin, R. P., Cooper, G. L., Droual, R., Jeffrey, J. S., Meteyer, C. U., Shivaprasad, H. L., Walker, R. L. 1993. Preliminary characterization of a pleomorphic gram-negative rod associated with avian respiratory disease. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 5: 47-51. 17. Chin, R., Droual, R. 1997. Ornithobacterium rhinotracheale infection. In Calnek B. W. (Ed.), Diseases of Poultry (10th edn, pp. 1012-1015). Ames: Iowa State University Press. 18. Chin, R. P., van Empel, C. M. P., Hafez, H. M. 2003. Ornithobacterium rhinotracheale infection. In Saif, Y. M. (Ed.), Diseases of Poultry (11th edn, pp. 683- 690). Ames: Iowa State University Press. 19. De Rosa, M., Droual, R., Chin, R. P., Shivaprasad, H. L. 1997. Interaction of Ornithobacterium rhinotracheale and Bordetella avium in turkey poults. In: Proceedings of the 46th Western Poultry Disease Conference, Davis, California, USA, 52-53. 106 20. De Rosa, M., Droual, R., Chin, R. P., Shivaprasad, H. L., Walker, R. L. 1996. Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkey breeders. Avian Diseases 40: 865- 874. 21. Devriese, L. A., Hommez J., Vandamme P., Kersters, K., Haesebrouck, F. 1995. In vitro antibiotic sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale strains from poultry and wild birds. Veterinary Record 137: 435-436. 22. Droual, R., Chin, R. 1997. Interaction of Ornithobacterium rhinotracheale and Escherichia coli O78, H9 when inoculated into the air sac in turkey poults. In: Proceedings of the 46th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 11. 23. Dudouyt, J., Léorat, J., van Empel, P., Gardin, Y., Céline, D. 1995. Isolement d’ un nouvel pathogene chez la dinde: Ornithobacterium rhinotracheale; Conduite a tenir. In: Proceedings of the Journées de la Recherche Avicole, Angers, France, 240-243. 24. El-Gohary, A., Awaad, M. H. H. 1998. Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) and E. coli infection in chicken broilers. Veterinary Medical Journal Giza 46: 67-75. 25. El-Gohary, A. 1998. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) associated with hatching problems in chicken and turkey eggs. Veterinary Medical Journal Giza 46: 183-191. 26. Erbeck, D. H., McMurray, B. L. 1998. Isolation of Georgia variant (Georgia isolate 1992) infectious bronchitis virus but not Ornithobacterium rhinotracheale from a Kentucky broiler complex. Avian Diseases 42: 613-617. 27. Eroksuz, H., Ozbey, G., Cevik, A., Gencer Tarakci, B., Balik, D. T. 2006. Immuno- histochemical, pathological, enzyme linked immunosorbent assay and polymerase chain reaction analysis of experimental Ornithobacterium rhinotracheale infection in quails (Coturnix coturnix japonica). Revue de Médecine Véterinaire 157: 197-202. 28. Euzéby J. P. 1997. List of Bacterial Names with Standing in Nomenclature: a folder available on the Internet. International Journal of Systematic Bacteriology 47: 590-592. (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature. Last full update: March 04, 2012. URL: http://www.bacterio.net). 29. Franz, G., Hein R., Bricker, J., Walls, P., Odor, E., Salem, M., Sample, B. 1997. Experimental studies in broilers with a Delmarva Ornithobacterium rhinotracheale isolate. In Proceedings of the 46th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 46-48. 107 30. Gavrilovi, P. 2009. Ispitivanje prisustva Ornithobacterium rhinotracheale i patomorfoloških promena u respiratornim organima brojlera u intenzivnoj brojlerskoj proizvodnji. Magistarska teza. Univerzitet u Beogradu. 31. Goovaerts, D., Vrijenhoek, M., van Empel, P. 1998. Immuno-histochemical and bacteriological investigation of the pathogenesis of Ornithobacterium rhinotracheale infection in South Africa in chickens with osteitis and encephalitis syndrome. In: Proccedings of the 16th European Society of Veteinary Pathology, Lillehammer, Norway, 81. 32. Goovaerts, D., Vrijenhoek, M., van Empel, P. 1999. Immuno-histochemical and bacteriological investigation of the pathogenesis of Ornithobacterium rhinotracheale infection in chickens with osteitis and encephalitis syndrome. In: Proccedings of the 48th Western Poultry Disease Conference, Vancouver, Canada, 79. 33. Gornatti Churria, C. D., Sansalone, P. L., Vigo, G. B., Sguazza, G. H., Machuca, M. A., Origlia, J. A., Piscopo, M. V., Herrero Loyola, M. A., Petruccelli, M. A. 2011. Pneumonia in Broiler Chicken Flocks Associated with -Hemolitic Ornithobacterium rhinotracheale Infection. Brazilian Journal of Veterinary Pathology 4: 243-246. 34. Günther, R., Ryll, M., Hinz, K. H., Hafez, H. M. 2002. New variety of Ornithobacterium rhinotracheale. In: Proceedings of the 4th international symposium on turkey diseases, Berlin, Germany, 63. 35. Hafez, H. M. 1996. Current status on the role of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) in respiratory disease complexes in poultry. Archiv füer Geflüegelkunde 60: 208-211. 36. Hafez, H. M. 1997. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT). In Hafez H. M. and Jodars S. (Eds), Putenkrankheiten (pp. 62-66). Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart. 37. Hafez, H. M. 1998a. Current status on the Laboratory diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale „ORT“ in poultry. Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 111: 143-145. 38. Hafez, H. M. 1998b. Respiratory diseases in turkey: Serological surveillance for antibodies against Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) and Turkey rhinotracheitis (TRT). In: Proceedings of the 1th International Symposium on Turkey Diseases, Berlin, Germany, 138-145. 39. Hafez, H. M. 2002. Diagnosis of Ornithobacterium rhinotracheale. International Journal of Poultry Science 1: 114-118. 40. Hafez, H. M., Beyer, W. 1997. Preliminary investigation on Ornithobacterium rhinotracheale (ORT) isolates using PCR-fingerprints. In: Proceedings of the 11th 108 International Congress of the World Veterinary Poultry Association, Budapest, Hungary, 51. 41. Hafez, H. M., Kruse, W., Emele, J., Sting, R. 1993. Eine Atemwegsinfektion bei Mastputen durch Pasteurella-ähnliche Erreger: Klinik, Diagnostik und Therapie. In: Proceedings of the International Conference on Poultry Diseases, Potsdam, Germany, 105-112. 42. Hafez, H. M., Lierz, M. 2010. Ornithobacterium rhinotracheale in nestling falcons. Avian diseases 54: 161-163 43. Hafez, H. M., Mazaheri, A., Sting, R. 2000. Efficacy of ELISA for detection of antibodies against several Ornithobacterium rhinotracheale serotypes. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift 107: 142-143. 44. Hafez, H. M., Schulze, D. 1998. Efficacy of clinical disinfectants on Ornithobacterium rhinotracheale in vitro: Short communication. In: Proceedings of the 1st International Symposium on Turkey Diseases, Berlin, Germany, 146-150. 45. Hafez, H. M., Sting, R. 1996. Serological surveillance on Ornithobacterium rhinotracheale „ORT“ in poultry flocks using self-made ELISA. In: Proceedings of the 45th Western Poultry Disease Conference, Cancun, Mexico, 163-164. 46. Hafez, H. M., Sting, R. 1999. Investigations on different Ornithobacterium rhinotracheale „ORT“ isolates. Avian Diseases 43: 1-7. 47. Hinz, K. H., Blome, C., Ryll, M. 1994. Acute exudative pneumonia and airsacculitis associated with Ornithobacterium rhinotracheale in turkeys. Veterinary Record 135: 233-234. 48. Hinz, K. H., Hafez, H. M. 1997. The early history of Ornithobacterium rhinotracheale (ORT). Archiv für Geflügelkunde 61: 95-96. 49. Hung, A. L., Alvarado, A. 2001. Phynotypic and molecular characterization of isolates of Ornithobacterium rhinotracheale from Peru. Avian Diseases 45: 999-1005. 50. Joubert, P., Higgins, R., Laperle, A., Mikaelian, I., Venne, D., Silim, A. 1999. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from turkeys in Quebec, Canada. Avian Diseases 43: 622-626. 51. Kilic, A., Timurkaan, N., Erta, Yilmaz, F. 2009. Pathological examination and bacterial reisolation by culture and PCR of experimental Ornithobacterium rhinotracheale infection in broiler chickens. Revue de Médecine Véterinaire 160: 140- 144. 109 52. Leroy-Sétrin, S., Flaujac, G., Thénaisy, K., Chaslus-Dancla, E. 1998. Genetic diversity of Ornithobacterium rhinotracheale strains isolated from poultry in France. Letters in Applied Microbiology 26: 189-193. 53. Mouahid, M., Engelhard, E., Grebe, M., Kroppenstedt, M., Mutters, R., Mannheim, W. 1992. Characterization of nonpigmented members of the Flavobacterium/Cytophaga complex parasitizing in mammals and birds. In: Proceedings of the 2nd International Symposium on Flavobacterium-Cytophaga and related bacteria, Bloemfontein, South Africa, 26-36. 54. Nagaraja, K., Back, A., Sorenger, S., Rajashekara, G., Halvorson, D. 1998. Tissue distribution post-infection and antimicrobal sensitivity of Ornithobacterium rhinotracheale. In: Proceedings of the 47th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 57-60. 55. Odor, E. M., Salem, M., Pope, C. R., Sample, B., Primm, M., Vance K., Murphy, M. 1997. Isolation and identification of Ornithobacterium rhinotracheale from commercial broiler flocks on the Delmarva Peninsula. Avian Diseases 41: 257-260. 56. Popp, C., Hafez, H. M. 2001. Ornithobacterium rhinotracheale: Comparison between serotypes and puls gel electrophoresis muster isolates of different sources and origin. In: Proceedings of the 12th International Congress of the World Veterinary Poultry Association, Cairo, Egypt, 269. 57. Popp, C., Hafez, H. M. 2002. Investigations on Ornithobacterium rhinotracheale. In: Proceedings of the 4th international symposium on turkey diseases, Berlin, Germany, 245-252. 58. Post, K., Murphy, S., Boyette, J., Resseguie, P. 1997. Evaluation of the rapid NF plus system for the identification of Ornithobacterium rhinotracheale. In: Proceedings of the 40th Annual meeting of the American Association of Veterinary Diagnostics, Louisville, Kentucky, USA, 88. 59. Post, K., Murphy, S., Boyette, J., Resseguie, P. 1999. Evaluation of a commercial system for the identification of Ornithobacterium rhinotracheale. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 11: 97-99. 60. Rahimi, M., Banani, M. 2007. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from the chickens of a broiler farm in Kermanshah province, west of Iran. Iranian Journal of Veterinary Research 8: 355-359. 61. Roepke, D. C., Back, A., Shaw, D. P., Nagaraja, K. V., Sprenger, S. J., Halvorson, D. A. 1998. Isolation and identification of Ornithobacterium rhinotracheale from commercial turkey flocks in the upper Midwest. Avian Diseases 42: 219-221. 110 62. Roger, M. F., Léorat, J. 1997. À l’origine de troubles respiratoires chez la dinde: Ornithobacterium rhinotracheale est mieux maitrisé. Filières Avicoles Juin 1997, 62- 63. 63. Ryll, M., Hinz., K. H., Neumann, U., Löhren, U., Sudbeck, M., Steinhagen, D. 1997. Pilot study on prevalence of the Ornithobacterium rhinotracheale infection in meat-type chickens in Northwest Germany. Berliner und Muenchener Tieräerztlichen Wochenschrift 110: 267-271. 64. Ryll, M., Hinz, K. H., Salisch, H., Kruse, W. 1996. Pathogenicity of Ornithobacterium rhinotracheale for turkey poults under experimental conditions. Veterinary Record 139: 19. 65. Sakai, E., Tokuyama, Y., Nonaka, F., Ohishi, S., Ishikawa, Y., Tanaka, M., Taneno, A. 2000. Ornithobacterium rhinotracheale infection in Japan: preliminary investigations. Veterinary Record 146: 502-503. 66. Salem, M., Odor E. M., Sample, B., Murphy, M., Franz, G. 1997. Ornithobacterium rhinotracheale, update and field survey in the Delmarva Peninsula. In: Proccedings of the 46th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, California, USA, 59-60. 67. Schleifer, J. 1997. IBD and ORT highlight 1997 Western Poultry Disease Meet. Poultry Digest, June 1997: 28-30 68. Sprenger, S. J., Back, A., Shaw, D. P., Nagaraja, K. V., Roepke, D. C., Halvorson, D. A. 1998. Ornithobacterium rhinotracheale infection in turkeys: Experimental reproduction of the disease. Avian Diseases 42: 154-161. 69. Sprenger, S. J., Halvorson, D. A., Nagaraja, K. V., Spasojevic, R., Dutton, R. S., Shaw, D. P. 2000. Ornithobacterium rhinotracheale infection in commercial laying- type chickens. Avian Diseases 44: 725-729. 70. Szalay, D., Glávits, R., Nemes, C., Kósa, A., Fodor, L. 2002. Clinical signs and mortality caused by Ornithobacterium rhinotracheale in turkey flocks. Acta Veterinaria Hungarica 50: 297-305. 71. Tabatabai, L. B., Zimmerli, M. K., Zehr, E. S., Briggs, R. E., Tatum, F. M. 2010. Ornithobacterium rhinotracheale North American field isolates express a hemolysin- like protein. Avian Diseases 54: 994-1001. 72. Tanyi, J., Bistyak A., Kaszanyitzky, E., Vetesi, F., Dobos-Kovacs M. 1995. Isolation of Ornithobacterium rhinotracheale from chickens, hens and turkeys showing respiratory symptoms. Preliminary report. Magyar Allatorvosok Lapja 50: 328-330. 73. Travers, A. F. 1996. Concomitant Ornithobacterium rhinotracheale and Newcastle disease infection in broilers in South Africa. Avian Diseases 40: 488-490. 111 74. Travers, A. F., Coetzee L., Gummow B. 1996. Pathogenicity differences between South African isolates of Ornithobacterium rhinotracheale. Onderstepoort Journal of Veterinary Research 63: 197-207. 75. van den Bosch, G. 2001. Ornithobacterium rhinotracheale: the current status. In: Proceedings of the 24th Technical Turkey Conference, Leyburn, England, 1. 76. van Beek, P. 1994. Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), clinical aspects in broilers and turkeys. Annual Meeting of the Veterinary Study Group of the EU, Amsterdam, The Netherlands, November 1994. 77. van Beek, P. N. G. M., van Empel, P. C. M., van den Bosch, G., Storm, P. K., Bongers, J. H., Du Preez, J. H. 1994. Ademhalingsproblemen, groeivertraging en gewrichtsontsteking bij kalkoenen en vleeskuikens door een Pasteurella-achtige bacterie: Ornithobacterium rhinotracheale or „Taxon 28“. Tijdschrift voor Diergeneeskunde 119: 99-101. 78. van Empel, P. 1997. Ornithobacterium rhinotracheale: An update. In: Proceedings of Fachgruppe „Geflügelkrankheiten“ der Deutsche Veterinärmedizinischen Gesellschaft and German branch of the World’s Veterinary Poultry Association, 52nd Semi-annual Meeting on Poultry Diseases, Hannover, Germany, 418-421. 79. van Empel, P. 1998a. Ornithobacterium rhinotracheale. PhD Thesis. University of Utrecht. 80. van Empel, P. 1998b. Ornithobacterium rhinotracheale: Current status and control. In: Proceedings of the 1st International Symposium on Turkey Diseases, Berlin, Germany, 129-137. 81. van Empel, P., van den Bosch, H. 1998. Vaccination of chickens against Ornithobacterium rhinotracheale infection. Avian Diseases 42: 572-578. 82. van Empel, P., van den Bosch, H., Goovaerts, D., Storm, P. 1996. Experimental infection in turkeys and chickens with Ornithobacterium rhinotracheale. Avian Diseases 40: 858-864. 83. van Empel, P., van den Bosch H., Loeffen P., Storm P. 1997. Identification and serotyping of Ornithobacterium rhinotracheale. Journal of Clinical Microbiology 35: 418-421. 84. van Empel, P., Vrijenhoek M., Goovaerts D., van den Bosch, H. 1999. Immunohistochemical and serological investigation of experimental Ornithobacterium rhinotracheale infection in chickens. Avian Pathology 28: 187-193. 85. van Empel, P. C. M., Hafez, H. M. 1999. Ornithobacterium rhinotracheale: A review. Avian Pathology 28: 217-227. 112 86. van Veen, L., Gruys E., Frik, K., van Empel, P. 2000. Increased condemnation of broilers associated with Ornithobacterium rhinotracheale. Veterinary Record 147: 422- 423. 87. van Veen, L., van Empel, P., Fabri T. 2000. Ornithobacterium rhinotracheale, a primary pathogen in broilers. Avian Diseases 44: 896-900. 88. Vandamme, P., Segers, P., Vancanneyt, M., van Hove, K., Mutters, R., Hommez, J., Dewhirst, F., Paster, B., Kersters, K., Falsen, E., Devrieze, L., Bisgaard, M., Hinz, K. H., Mannheim, W. 1994. Description of Ornithobacterium rhinotracheale gen. nov. sp. nov. isolated from the avian respiratory tract. International Journal of Systematic Bacteriology 44: 24-37. 89. Zorman-Rojs, O. 2000. Countryreports - Slovenia Ornithobacterium rhinotracheale Newsletter of the World Veterinary Poultry Association. In: http://www.wvpa.net/newsletter/reports_slovenia.html. (01.02.2006) 90. Zorman-Rojs, O., Adovc, I., Bencina, D., Mrzel, I. 2000. Infection of turkeys with Ornithobacterium rhinotracheale and Mycoplasma synoviae. Avian Diseases 44: 1017- 1022. Biografija Pavle D. Gavrilovi, roen je 11.10.1976. godine u Panevu. U rodnom gradu završio je osnovnu školu i gimnaziju prirodnomatematikog smera, a prvu godinu studija na Fakultetu veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu upisao je 1995. godine. Diplomirao je u julu 2003. godine sa prosenom ocenom 9,00. Po odsluženju vojnog roka, juna 2004. godine zapošljava se kao veterinar pripravnik u Veterinarskom specijalistikom institutu „Panevo“, a od novembra 2008. godine rasporeen je na radno mesto rukovodioca odeljenja za patologiju i kliniku parazitologiju. Postdiplomske studije, odsek magistratura, nauna oblast patologija i terapija životinja upisao je 2004. godine i završio ih sa prosenom ocenom 9,70. Magistarsku tezu pod naslovom „Ispitivanje prisustva Ornithobacterium rhinotracheale i patomorfoloških promena u respiratornim organima brojlera u intenzivnoj brojlerskoj proizvodnji“ odbranio je marta 2009. godine. Odlukom Naunog vea Naunog instituta za veterinarstvo Srbije od 21.02.2011.godine, izabran je u istraživako zvanje istraživa saradnik. Bio je autor i nosilac dva projekta Ministarstva poljoprivrede iz oblasti „Unapreenje nadzora i kontrole zaraznih bolesti životinja i zoonoza“, a uestvovao je u realizaciji još etiri projekta iz navedene oblasti. Uestvovao je na domaim i meunarodnim veterinarskim simpozijumima na kojima je prezentovao radove i objavio devet strunih i naunih radova. Kao prvi autor objavio je jedan rad u meunarodnom veterinarskom asopisu, a po jedan rad prihvaen je za objavljivanje u medicinskom i veterinarskom meunarodnom asopisu.