UNIVERZITET U BEOGRADU FAKULTET VETERINARSKE MEDICINE Katedra za fiziologiju i biohemiju Mr Svetlana Milanović UTICAJ PROPILTIOURACILA I JOPANOIČNE KISELINE NA FUNKCIJU TIREOIDNE OSOVINE I AKTIVNOST GLUTATION PEROKSIDAZA KOD SELEN-DEFICIJENTNIH I SELEN-ADEKVATNIH JUVENILNIH PACOVA Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF VETERINARY MEDICINE Department of physiology and biochemistry Mr Svetlana Milanović THE INFLUENCE OF PROPYLTHIOURACIL AND IOPANOIC ACID ON THYROID AXIS AND GLUTATHIONE PEROXIDASES ACTIVITIES IN SELENIUM ADEQUATE AND SELENIUM DEFICIENT JUVENILE RATS PhD thesis Belgrade, 2012. Mentor: Dr Ivan Jovanović, redovni profesor, Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Komisija: Dr Dušan Gledić, redovni profesor, Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Dr Olivera Valčić, vanredni profesor, Fakultet veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Dr Mirjana Joksimović Todorović, redovni profesor, Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu Datum odbrane: __________________ Bez podrške i pomoći velikog broja ljudi, ovaj ogroman posao nikada ne bi bio završen. Iza ove doktorske teze stoji rad i trud neverovatnih ljudi koji su mi svojim znanjem, voljom i nesebičnošću dali potrebnu energiju da ceo projekat dovedemo do kraja. Pre svega mislim na svog mentora, Prof. dr Ivana Jovanovića koji je imao veliko strpljenje u kritičnim situacijama i koji je svojom smirenošću i znanjem otkalanjao za mene nepremostive prepreke. Zahvaljujem se svim članovima komisije na vrednim sugestijama. Zahvaljujem se ljudima iz Agencije za lekove, posebno mr Srđanu Joksimoviću i Goranu Rosiću. Zahvaljujem se dr Sanji Vranješ-Đurić, višem naučnom saradniku Instituta za nuklearne nauke Vinča na stručnim savetima i praktičnoj pomoći pri izvođenju analiza i neverovatnoj pozitivnoj energiji. Zahvaljujem se i Srđanu Stefanoviću, istraživaču saradniku na Institutu za higijenu i tehnologiju mesa, na svim radnim subotama i nedeljama. Zahvalnost dugujem kolegama i prijateljima sa Fakulteta veterinarske medicine, posebno Prof dr Danijeli Kirovski i Doc dr Darku Marinkoviću, koji su mi svesrdno pomagali na svakom koraku tokom izvođenja ogleda i analiza. Na kraju, veliko hvala mojim roditeljima i mojoj muškoj ekipi. Najviše vas volim! Uticaj propiltiouracila i jopanoične kiseline na funkciju tireoidne osovine i aktivnost glutation peroksidaza kod selen-deficijentnih i selen-adekvatnih juvenilnih pacova Kratak sadržaj U okviru ove doktorske disertacije, ispitivan je uticaj primene blokatora dejodinaza na tireoidni status selenadekvatnih i selendeficitnih juvenilnih pacova. Ogled je izveden na ukupno 128 Wistar pacova muškog pola, podeljenih u osam grupa od po 16 jedinki. Formirane su sledeće grupe: 1. Se+PTU-IA- (kontrolna grupa), 2. Se+PTU+IA+, 3. Se+PTU+IA-, 4. Se+PTU- IA+, 5. Se-PTU-IA-, 6. Se-PTU+IA+, 7. Se-PTU+IA- i 8. Se-PTU-IA+. Prve četiri grupe su bile selenadekvatne (Se+) i dobijale su hranu koja je sadržala 0.334 mg selena po kilogramu hrane. Grupe pet, šest, sedam i osam su bile selendeficitne (Se-) i dobijale su 0.031 mg selena po kilogramu hrane. Kao blokatori dejodinaza su korišćeni propiltiouracil (PTU+) u dozi od 150 mg/L vode za piće i jopanoična kiselina (IA+) u dozi od 6 mg/100g TM intraperitonealno. Nakon tri i sedam nedelja tretmana žrtvovano je po 8 jedinki iz svake grupe i određivani su sledeći parametri: tiroksin (T4), trijodtironin (T3), tireostimulirajući hormon (TSH), koncentracija selena u krvi, aktivnost citosolne glutation peroksidaze eritrocita (GPx1) i aktivnost glutation peroksidaze u krvnoj plazmi (GPx3). Deficit selena doveo je do blagog pada telesne mase jedinki. Primena propiltiouracila (PTU) dovela je do značajnog pada telesne mase od 19% kod selenadekvatnih jedinki i 59% kod selendeficitnih jedinki. Pad koncentracije T4 i T3 i porast koncentracije TSH u krvnoj plazmi zabeležen je kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU, nakon tri nedelje tretmana. Nakon sedam nedelja, koncentracije T3 u krvi svih selenadekvatnih jedinki su bile ujednačene, a kod selendeficitnih jedinki je pri upotrebi PTU bila smanjena koncentracija T3 u krvi. Istovremena upotreba jopanoične kiseline i propiltiouracila kod selendeficitnih jedinki dovela je do rasta aktivnosti GPx1 nakon tri nedelje i GPx3 nakon sedam nedelja tretmana. Upotreba PTU je dovela do gubitka korelacione zavisnosti između koncentracije selena u krvi i aktivnosti GPx1 kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki nakon tri nedelje tretmana, a nakon sedam nedelja tretmana, upotreba PTU sa ili bez jopanoične kiseline je dovela do gubitka korelacione zavisnosti između koncentracije selena u krvi i aktivnosti GPx3. Negativna korelaciona zavisnost između koncentracije T3 i aktivnosti GPx1 kod selendeficitnih jedinki uočena je nakon tri nedelje tretmana, a nakon sedam nedelja između koncentracije T3 i aktivnosti GPx3. Ključne reči: selen, propiltiouracil, jopanoična kiselina, T4, T3, TSH, glutation peroksidaza Naučna oblast: VETERINARSKA MEDICINA Uža naučna oblast: BIOHEMIJA, ENDOKRINOLOGIJA UDK: 619..577.1 The influence of propylthiouracil and iopanoic acid on thyroid axis and glutathione peroxidases activities in selenium adequate and selenium deficient juvenile rats Summary The effects of the applied deiodinase blockers on the thyroid status of selenium adequate and selenium deficient juvenile rats were studied. The experiment was carried out on 128 male Wistar rats randomly allotted to 8 groups, 16 rats each. The following groups were formed: Se+PTU-IA- (control group), 2. Se+PTU+IA+, 3. Se+PTU+IA-, 4. Se+PTU-IA+, 5. Se-PTU-IA- , 6. Se-PTU+IA+, 7. Se-PTU+IA- i 8. Se-PTU-IA+. The first four groups were selenium adequate (Se+) and were fed a diet containing 0.334 mg/Se kg feed. Groups five, six, seven and eight were selenium deficient and fed 0.031 mgSe/ kg feed. As deiodinase blockers were used propylthiouracil (PTU+) in a dose of 150 mg/L potable water and iopanoic acid (IA+) in a dose of 6 mg/kg body mass applied intraperitoneally. After 3 and 7 weeks of treatment eight rats from each group were sacrificed and the following parameters were determined: thyroxine (T4), triiodothyronine (T3), Thyroid stimulating hormone (TSH), blood selenium concentration, erythrocyte cytosolic glutathione peroxidase activity (GPx1) and blood plasma glutathione peroxidase activity (GPx3). Selenium deficiency resulted in decreased body mass. Application of propylthiouracil resulted in decreased body mass by 19% in selenium adequate and by 59% in selenium deficient rats. A decrease in T4 and T3 concentration and increased TSH concentration in the blood plasma was recorded in both selenium adequate and selenium deficient groups treated with PTU after three weeks of treatment. After seven weeks T3 concentration in all selenium adequate rats was uniform, and selenium deficient PTU treated rats had decreased blood T3 concentrations. Concurrent use of IA and PTU in selenium deficient animals resulted in increased GPx1 activity after 3 weeks and GPx3 after 7 weeks of treatment. The use of PTU led to the loss of correlation between blood selenium and GPx1 treatment in both selenium adequate and deficient rats after three weeks of treatment. After seven weeks of treatment PTU (with or without the concurrent application of IA) resulted in the loss of correlation between blood selenium concentration and GPx3 activity. A negative correlation between T3 concentration and GPx1 activity in selenium deficient rats was recorded after three weeks of treatment, and between T3 concentration and GPx3 activity after seven weeks. Key words: selenium, propylthiouracil, iopanoic acid, T4, T3, TSH, glutathione peroxidase. Science: veterinary medicine Specific science: BIOCHEMISTRY, ENDOCRINOLOGY UDK: 619..577.1 SADRŽAJ 1. UVOD 1 2. PREGLED LITERATURE 4 2.1. Metabolizam selena 4 2.1.1. Resorpcija 4 2.1.2. Transport 5 2.2. Selenoproteini 6 2.2.1. Glutation peroksidaze 7 2.2.2. Tioredoksin reduktaze 11 2.2.3. Jodotironin dejodinaze 13 2.2.4. Ostali selenoproteini 13 2.3. Sinteza selenoproteina 16 2.3.1. Mehanizam biosinteze selenocisteina 16 2.3.2. Mehanizam ugradnje selenocisteina u polipeptidni lanac selenoproteina 18 2.3.3. Regulacija sinteze selenoproteina 20 2.3.4. Uticaj selena na sintezu selenoproteina 22 2.4. Tireoidna osovina, sinteza tireoidnih hormona i regulacija 24 2.4.1. Selen i funkcija tireoideje 25 2.4.2. Transport tireoidnih hormona 26 2.4.3. Dejodinaze 26 2.4.4. Uloga dejodinaza u regulaciji tireoidne osovine 31 2.4.5. Homeostaza T3 33 2.4.6. Intracelularna homeostaza T3 33 2.4.7. Uticaj selena na sintezu T3 i T4 36 3. CILJEVI I ZADACI 39 4. MATERIJAL I METODE 40 4.1.1. Izbor materijala 40 4.1.2. Eksperimentalni protokol 40 4.1.3. Ishrana pacova 41 4.2. Metode 42 4.2.1. Određivanje parametara tireoidne osovine 42 4.2.1.1. Određivanje koncentracije T3 i T4 42 4.2.1.2. Određivanje koncentracije TSH 43 4.2.2. Određivanje parametara statusa selena 43 4.2.2.1. Određivanje koncentracije selena u punoj krvi 44 4.2.2.2. Određivanje aktivnosti glutation peroksidaze u punoj krvi (GPx1) i plazmi (GPx3) 44 4.3. Statistička obrada podataka 46 5. REZULTATI 47 6. DISKUSIJA 86 7. ZAKLJUČCI 103 8. SPISAK LITERATURE 105 9. SKRAĆENICE 126 BIOGRAFIJA 11. Uvod Nakon otkrića da jodotironin dejodinaze pripadaju superfamiliji selenoenzima (Behne i sar., 1990; Arthur i sar., 1990; Berry i sar., 1991) razvila se snažna istraživačka aktivnost sa ciljem da se objasni povezanost funkcija tireoidne osovine i statusa joda sa jedne i statusa selena sa druge strane. Na činjenicu da su ove dve pojave međusobno povezane, ukazala su i istraživanja endemskog kretenizma u Zairu (Vanderpas i sar., 1990). Pokazalo se da na područjima ekstremno deficitnim jodom i selenom, uobičajeno lečenje hipotireoidnih pacijenata nadoknadom joda dovodi do degenerativnih promena na štitastoj žlezdi i da tek zajedničko dodavanje ova dva elementa vodi ka ozdravljenju. Istraživanja o složenoj međuzavisnosti funkcije tireoidne osovine i statusa selena odvijaju se na više planova. Metodama molekularne biologije rasvetljena je ultrastruktura većeg broja selenoenzima i jedinstveni način njihove sinteze. Istraživanja u oblasti biohemije i fiziologije usmerena su na definisanje međuzavisnosti, hijerarhije i mehanizama regulacije funkcija bioloških sistema u koje su uključeni selenoenzimi. Selen je esencijalni mikroelement sa mnogostrukim i vrlo važnim ulogama u organizmu. Za razliku od ostalih mikroelemenata koji figuriraju kao kofaktori pojedinih enzima, njegove fiziološke uloge direktno su povezane sa funkcijama proteina u čiji sastav se kotranslatorno ugrađuje putem netipične aminokiseline selenocisteina. Do sada je otkriveno oko 30 selenoproteina, a samo za neke od njih je poznata fiziološka uloga. Prvi enzim za koji je dokazano da u svom sastavu ima ugrađen selenocistein je glutation peroksidaza GPx (Rotruck i sar., 1973; Flohe i sar., 1973). Do sada je identifikovano 5 izoenzimskih formi GPx koje redukuju vodonik peroksid i organske hidroperokside, štiteći ćelije od oksidativnog oštećenja. Ova grupa selenoenzima obuhvata citosolnu glutation peroksidazu (GPx1), gastrointestinalnu glutation peroksidazu (GPx2), plazmatsku (ekstracelularnu) glutation peroksidazu (GPx3), fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidazu (GPx4) i novootkrivenu glutation peroksidazu 6 iz olfaktornog epitela i embrionalnog tkiva. S obzirom na to da je glutation peroksidaza selenoenzim i da njena aktivnost do izvesne granice linearno zavisi od količine selena u hrani, aktivnost ovog enzima može biti dobar pokazatelj statusa selena u organizmu. Sasvim novo polje u istraživanjima je donelo otkriće da su i jodotironin dejodinaze (ID) selenoenzimi, odgovorni za aktivaciju i deaktivaciju tireoidnih hormona 2(Behne i sar., 1990; Arthur i sar., 1990; Berry i sar., 1991). Do sada je identifikovano 3 tipa dejodinaza. Tip 1 (ID1) vrši dejodinaciju spoljnog prstena tiroksina (T4) u položaju 5' i time aktivira prohormon T4 u aktivni T3. Takođe inaktivira T4 u reverzni T3 (rT3) dejodinacijom unutrašnjeg prstena u položaju 5. Zastupljena je u jetri, bubrezima, centralnom nervnom sistemu, hipofizi, crevima i placenti. Dejodinaza tipa 1 je vrlo osetljiva na inhibiciju sa propiltiouracilom, za razliku od dejodinaza tipa 2 i 3. Dejodinaza tipa 2 (ID2) aktivira T4 u T3 dejodinacijom spoljnog prstena u položaju 5', a takođe prevodi reverzni T3 u 3,3' T2. Nalazi se u hipofizi, mozgu i mrkom masnom tkivu, a osetljiva je na dejstvo jopanoične kiseline (Germain DL, 1988a). Dejodinaza tipa 3 (ID3) katalizuje dejodinaciju unutrašnjeg prstena tireoidnih hormona pri čemu nastaju neaktivni rT3 od T4, odnosno 3,3’-T2 od T3. Prisustvo selenocisteina u katalitičkom centru ovih enzima ima presudnu ulogu u njihovoj katalitičkoj aktivnosti. Veoma je značajno da je pri deficitu selena održavanje aktivnosti ovih enzima prioritet u odnosu na druge selenoenzime, te je ekspresija ID1 u štitastoj žlezdi nepromenjena ili čak blago povećana (Bates i sar., 2000), ali je smanjena u jetri i bubrezima. Promena koncentracije serumskog T3 je mala i pored povećanja serumskog T4 i opšteg povišenja serumskog rT3 (DePalo i sar., 1994). Ovi rezultati su ukazali da ID1 jetre i bubrega minimalno doprinosi koncentraciji serumskog T3 te da je glavni izvor cirkulišućeg T3 štitasta žlezda (Chanoine i sar., 1993). Da bi se otklonio ovaj problem, efekat deficita selena je izučavan na tireoidektomisanim pacovima kojima je davan T4. Ova proučavanja su analogna onima izvedenim uz upotrebu propiltiouracila (PTU) u kojima je pronađena inhibicija ekstratireoidne konverzije T4 u T3 za oko 50% (Frumess i Larsen, 1975). Sva ova istraživanja nisu uzela u obzir uticaj ID2 koja takođe aktivira T4 u T3. Ekspresija ID2 i ID3 u uslovima deficita selena u mozgu i placenti je takođe očuvana jer su ova tkiva otporna na pražnjenje selena. Ovakvi rezultati navode na postojanje lokalnih mehanizama za čuvanje selena u tkivu mozga i štitaste kao i na to da su prilikom ekstratireoidnog aktiviranja T4 u T3 podjednako aktivne i ID1 i ID2. Do danas nisu u potpunosti razjašnjeni mehanizmi regulacije sinteze, aktivacije i inaktivacije tireoidnih hormona i njihova zavisnost od prisustva selena. S obzirom na to da su dejodinaze selenoenzimi i da je održavanje nivoa njihove ekspresije prioritet u odnosu na druge selenoenzime, ispitivanje uticaja specifičnih blokatora za dejodinazu tipa 1 i dejodinazu tipa 2 u kombinaciji sa deficitom selena in vivo na proizvodnju T4, 3T3 i TSH mogao bi ukazati na mehanizam regulisanja proizvodnje ovih hormona odnosno aktivnosti dejodinaze 1 i 2 kao i povratni uticaj na aktivnost ostalih selenoenzima. 42. Pregled literature 2.1. Metabolizam selena Gotovo 200 godina nakon otkrića selena može se reći da ovaj esencijalni mikroelement ima neprocenljivu važnost za živi svet jer ulazi u sastav moćnih antioksidativnih enzima kao što su glutation peroksidaza i tioredoksin reduktaza, prevenira pojavu kancera (Combs i Lu, 2001), kardiovaskularnih bolesti (Rayman, 2002; Mihajlović i sar., 2003; Beckett i sar., 2004), a takođe je neophodan za optimalno funkcionisanje endokrinog i imunskog sistema (McKenzie i sar., 2002; Arthur i sar., 2003). 2.1.1. Selen u hrani i njegova resorpcija Glavni izvor selena za životinje predstavljaju biljna hraniva u kojima se ovaj mikroelement najčešće nalazi u obliku selenometionina i selenocisteina. Nivo selena u biljkama zavisi od količine selena u zemljištu u kojem je zastupljen u vidu neorganskih soli i to selenita, selenata i selenida (Whanger, 2002). S obzirom na to da su pojedina područja izrazito deficitna selenom i da hrana poreklom iz tih područja sadrži nedovoljne količine selena, on se u hranu može dodavati u vidu suplemenata kao što su natrijum selenit, selenizirani kvasac i selenometionin. Selen se ne resorbuje u želucu viših kičmenjaka (Whanger i sar., 1976). Selenit i selenometionin se resorbuju u tankom crevu pri čemu je resorpcija nešto intenzivnija u duodenumu. Pri resorpciji selenita, redukovani glutation (GSH) iz lumena creva neenzimski reaguje sa selenom formirajući selenodiglutation. Nastalo jedinjenje u enterocite unosi γ-glutamil transferaza (Anundi i sar,, 1984). Selenat se resorbuje u ileumu aktivnim kotransportom zajedno sa jonima natrijuma (Wolfram, 1999). Povećanje količine selenita ne utiče na resorpciju selenata što ukazuje na postojanje posebnih transportnih mehanizma za ova dva oblika selena (Wolfram i sar., 1985). McConnell i Cho (1965) su koristeći izvrnute crevne kese hrčka utvrdili da se selenometionin resorbuje suprotno svom gradijentu i da se ovaj proces inhibira povećanjem koncentracije L-metionina. Na osnovu svojih nalaza su zaključili da je 5transportni mehanizam za ove dve aminokiseline isti, odnosno da se one resorbuju mehanizmom aktivnog transporta preko istih nosača. Whanger i saradnici (1996) su koristeći model perfuzije kroz tanka creva pacova proučavali transfer selenita, selenata i selenometionina do vaskularne strane enterocita. Selenometionin je 2,4, a selenat 1,5 puta brže transportovan u odnosu na selenit. Osim toga, postojale su značajne razlike u metabolitima pronađenim na vaskularnoj strani enterocita. Kada je davan selen u obliku selenita, na vaskularnoj strani enterocita se našlo svega 14% selenita. Pronađeni su još i selenodicistein (10%), selenotrisulfid (14%), selenodiglutation (8%) i neidentifikovane komponente (14%) od ukupno resorbovanog selenita. Selenat je gotovo nepromenjen transportovan do bazalne membrane (89%), a slično njemu i selenometionin. Ovo je ukazalo na vrlo izražen metabolizam selenita u samim enterocitima, a samim tim je postalo diskutabilno koliko je efikasno njegovo dodavanje u hranu (Surai, 2006). 2.1.2. Transport selena Postoje bitne razlike u metabolizmu neorganskog (natrijum selenit, selenat i selenid) i organskog (selenometionin i selenocistein) selena. Još davne 1976. godine su Gasiewicz i Smith uočili da proteini krvne plazme ne vezuju selenit ukoliko se u medijum ne dodaju eritrociti. Ovaj efekat su potvrdili i mnogi drugi autori (Jenkins i Hidiroglou, 1972; Sandholm, 1975). Nakon resorpcije, selenit preuzimaju eritrociti preko band-3 proteina (Yang i sar., 1996), a zatim redukuju u selenid pomoću glutationa. Po izlasku iz eritrocita, selenid se vezuje za albumine (Shiobara i sar., 1998) i transportuje do jetre. Shigeta i saradnici (2008) su ispitujući distribuciju i raspodelu radioaktivnog selenita (82SeO32-) otkrili vrh Se-albumina i citosolne glutation peroksidaze već nakon 1 sata od aplikacije dok je najveća koncentracija selenoproteina P uočena 6 sati nakon aplikacije. Pomenuti selenoprotein P je protein krvne plazme koji je zadužen za transport selena od jetre do ostalih tkiva, a u zavisnosti od životinjske vrste sadrži 8-17 rezidua selenocisteina (Burk i Hill, 2005). Ostaje nejasno koje su njegove rezidue selenocisteina funkcionalne, a koje predaje tkivima. 6Za razliku od selenita, selenat ne ulazi u eritrocite već preko transportnog sistema za fosfat ulazi u hepatocite gde se redukuje u selenit, a zatim u selenid i ugrađuje u selenoprotein P (Kobayashi i sar., 2001). Veći deo neorganskog selena biva eliminisan fecesom kod preživara, a urinom kod nepreživara (Wolfram, 1999). Organski selen, najčešće zastupljen kao selenometionin (SeMet), metaboliše se kao i metionin (Wolfram, 1999). Nakon resorpcije on ulazi u aminokiselinski pul jer se nespecifično, umesto metionina, može ugrađivati u različite proteine. 2.2. Selenoproteini Za razliku od drugih proteina u čiji sastav metali ulaze kao kofaktori, selen se u proteine ugrađuje kao selenocistein. Grupa proteina koja u svom sastavu ima selenocistein kao integralni funkcionalni deo polipeptida nazivaju se selenoproteini. Pored selenoproteina postoje i proteini koji sadrže nespecifično ugrađen selen, kao i selen-vezujući proteini gde je on kofaktor. Nespecifično vezivanje selena u polipeptid je posledica nemogućnosti razlikovanja tRNK za metionin i selenometionin te se praktično selenometionin ugrađuje u polipeptid umesto metionina. Nije jasna fiziološka uloga ovakve ugradnje selenometionina u proteine (Papp i sar., 2007). Do sada su identifikovana dva selen vezujuća proteina: SLP-14 i SLP-56. Njihove funkcije se povezuju sa regulacijom ćelijskog rasta (Giometti i sar., 2000), detoksikacionim procesima (Pumford i sar., 1992), transportom proteina unutar Goldži kompleksa (Porat i sar., 2000), starenjem (Cho i sar., 2003) i metabolizmom lipida (Park i sar., 2004). Kod ljudi i glodara je identifikovano preko 20 vrsta selenoproteina. Neki od njih imaju slične funkcije u organizmu, ali su kodirani sa nekoliko različitih gena kao što su glutation peroksidaze (5), tioredoksin reduktaze (3), jodotironin dejodinaze (3), selenofosfat sintetaze (2), Sep15, SelH, SelI, SelK, SelM, SelN, SelO, SelP, SelR, SelS, SelT, SelV i SelW. Samo nekolicini od ovih proteina je poznata fiziološka uloga i to tioredoksin reduktazama, glutation peroksidazama, dejodinazama i SPS2 i sve su vezane za procese oksidoredukcije. Svi do sad identifikovani selenoproteini prikazani su u tabeli 2.1. 7Tabela 2.1. Selenoproteini, njihova distribucija u organizmu i funkcije (Pappas i sar., 2008) 2.2.1. Glutation peroksidaze Glutation peroksidaza je prvi protein sisara za koji je pokazano da u katalitičkom centru ima ugrađen selen u obliku selenocisteina (Forstrom i sar., 1978). Ovaj enzim katalizuje redukciju vodonik peroksida i organskih hidroperoksida štiteći ćeliju od oksidativih oštećenja. Kod ljudi je identifikovano sedam glutation peroksidaza od čega su pet selenoenzimi, a dve umesto selenocisteina imaju cistein. Familiji glutation Enzim/protein Skraćenica Funkcija u organizmu Tkivo, ćelija Glutation peroksidaze Citosolna cGPx, GPx-1 Antioksidativna zaštita Gotovo sva tkiva i ćelije Plazmatska pGPx, GPx-3 Antioksidativna zaštita Ekstracelularni prostor, plazma Gastrointestinalna GI-GPx,GPx-2 Antioksidativna zaštita GIT Fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidaza GPx-4 Antioksidativna zaštita Ćel. membrana, razna tkiva Glutation peroksidaza GPx-6 Antioksidativna zaštita Olfaktorna sluzokoža, embrionska tkiva Tioredoksin reduktaze Tioredoksin reduktaza 1 TRxR1 Deo tioredoksin sistema, antioksidativna zaštita, redoks regulacija, ćelijska signalizacija Citoplazma, jetra, srce, bubrezi Tioredoksin reduktaza 2 TRxR2 Deo tioredoksin sistema, antioksidativna zaštita, redoks regulacija, ćelijska signalizacija Mitohondrije, jetra, bubrezi Tioredoksin reduktaza 3 TRxR3 Deo tioredoksin sistema, antioksidativna zaštita, redoks regulacija, ćelijska signalizacija Testisi Jodotironin dejodinaze Dejodinaza 1 ID1 Konverzija T4 u T3 i T4 u rT3 Jetra, bubrezi, štitasta žlezda Dejodinaza 2 ID2 Konverzija T4 u T3 Jetra, bubrezi, štitasta žlezda, mrko masno tkivo Dejodinaza 3 ID3 Konverzija T4 u rT3 Placenta, mozak, koža Selenofosfat sintetaza SPS2 Sinteza selenofosfata Testisi, razna tkiva 15-kDa selenoprotein Sel 15 Ćelijska apoptoza ER,T limfociti, razna tkiva Selenoprotein H Sel H Nepoznata, verovatno u regulaciji gena odgovornih za sintezu glutationa Selenoprotein I Sel I Etanolaminfosfotransferazna aktivnost Selenoprotein K Sel K Antioksidativna zaštita Kardiomiociti Selenoprotein M Sel M Vezana za Sel 15, moguća uloga u etiologiji kancera Mozak, razna tkiva Selenoprotein N Sel N ????? ER Selenoprotein O Sel O Nepoznata Široko rasprostranjen Selenoprotein P Sel P Transport selena, antioksidativna zaštita Plazma, mnoga tkiva Selenoprotein R Sel R Redukcija oksidovanog metionina u oštećenim proteinima Citosol, jedro Selenoprotein S Sel S Ćelijska redoks ravnoteža, moguća uloga u imunskom odgovoru ER Selenoprotein T Sel T Homeostaza Ca2+, neuroendokrina sekrecija Ubikvitaran Selenoprotein V Sel V Nepoznata, moguća u redoks regulaciji Testisi Selenoprotein W Sel W Antioksidativna zaštita Srce i druga tkiva 8peroksidaza pripadaju: citosolna glutation peroksidaza (cGPx ili GPx1) za koju je Flohe sa saradnicima (1973) utvrdio da ne sadrži hem niti bilo koji drugi metal osim selena; gastrointestinalna GPx (GI-GPx ili GPx2) koju su opisali Wingler i Brigelius-Flohe (1999); glutation peroksidaza krvne plazme (pGPx ili GPx3) čiju su primarnu strukturu opisali Takahashi i saradnici 1990. godine; fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidaza (PHGPx ili GPx4) (Thomas i Girotti, 1988) i glutation peroksidaza 6 (GPx6) koja je pronađena u olfaktornom epitelu i u tkivima embriona (Kryukov i sar., 2003). Relativne molekulske mase su im prilično ujednačene. U sastav enzima ulaze četiri identične subjedinice, a svaka od njih u katalitičkom centru sadrži atom selena ugrađen u selenocistein. Subjedinica GPx se sastoji od 198 aminokiselina, a selenocistein je po redosledu 45. aminokiselina (Günzler i sar., 1984). Mehanizam redukcije uz pomoć GPx je prikazan na slici 2.1. Slika 2.1. Mehanizam redukcije uz pomoć GPx. Glutation peroksidaza 1 (GPx1) je enzim citoplazme koji redukuje vodonik peroksid i perokside slobodnih masnih kiselina. Gen GPx1 je prvi gen sisara za koji je pokazano da položaj UGA odgovara mestu selenocisteina u katalitičkom centru proteina (Chambers i sar., 1986). Nedugo zatim je utvrđeno da tRNK koja ugrađuje Sec ima anti- kodon komplementaran sa UGA (Leinfelder i sar., 1988). Genetski modifikovani miševi koji nemaju ovaj enzim su zdravi i plodni i u odnosu na divlje sorte ne pokazuju povećanu senzitivnost na hiperoksiju, što znači da je uloga ovog enzima u fiziološkim uslovima i normalnom razviću ograničena (Ho i sar., 1997). Ipak, kada su ovi miševi bili izloženi agensima koji izazivaju oksidativni stres kao što su vodonik peroksid i parakvat, bili su povećani i morbiditet i mortalitet (de Haan i sar., 1998). Cheng i saradnici (1998, 1999, 2003) smatraju da GPx1 ima veliku ulogu pri oksidativnom stresu izazvanom vodonik peroksidom i da ovaj efekat postiže sprečavanjem oksidacije NADPH, NADH, lipida i proteina. Dokazano je da je ova peroksidaza vrlo važna u 9zaštiti od virusne infekcije što je uočeno kod knockout miševa kod kojih se razvila kardiomiopatija slična Kešanskoj bolesti kod ljudi zaraženih Coxsackie virusom (Beck i sar., 1998). Ova peroksidaza je vrlo osetljiva na promene statusa selena pri čemu kod selendeficitnih jedinki pada nivo iRNK i samog proteina. Regulacija transkripcije GPx1 nije u potpunosti rasvetljena. Promoter gena sadrži element za odgovor na kiseonik (oxygen responsive element-ORE) i neki tipovi ćelija povećavaju transkripciju iRNK za GPx1 kao odgovor na hiperoksiju. Izolovan je i ORE vezujući protein (ORE binding protein-OREBP) koji je i sam regulisan parcijalnim pritiskom kiseonika. Iako je pozitivna regulacija GPx1 uočena i sa estrogenima, na samom genu nije dokazano prisustvo elementa za odgovor na estrogen. Pretpostavlja se da je dejstvo estradiola posredno, preko aktivacije jedarnog faktora kapa B (NFκB). Neka izučavanja su potvrdila da se u uslovima stresa kao što su hipoksija, oštećenje DNK izazvano radijacijom ili adriamicinom, za promotor GPx1 gena vezuje protein 53 (p53) (Habeos i sar., 2008). Glutation peroksidaza 2 (GPx2) je pronađena u epitelu gastrointestinalnog trakta, a struktura joj je slična sa GPx1 (Wingler i Brigelius-Flohe, 1999). Iako se nalazi u svim ćelijama epitela creva, najviše je zastupljena u kriptama te su Florian i sar. (2001) ukazali na moguću ulogu ovog enzima kod ćelija koje su u proliferaciji. Miševi kod kojih je genskom modifikacijom sprečena sinteza GPx2 su normalno razvijeni, ali kombinacija nedostatka i GPx1 i GPx2 dovodi do zaostajanja u razvoju kao i bakterijskih infekcija creva što dovodi do razvoja tumora ileuma (Esworthy i sar., 2001; Chu i sar., 2004). Smatra se da je antikancerogena uloga GPx2 vezana za metabolisanje vodonik peroksida nastalog usled inflamacije (Esworthy i sar., 2005). Koliko je GPx2 važan može se zaključiti i iz činjenice da pri deficitu selena količina njene iRNK ne opada, a da se pri repleciji selenom ovaj enzim mnogo brže sintetiše u odnosu na ostale selenoproteine. Na promoteru GPx2 gena se nalazi element za odgovor na antioksidante i elektrofile (antioxidant/electrophile responce element-ARE/EpRE), a takođe se može vezati i Nrf2/Keap1 sistem (nuclear factor E2-related factor2/ Klech-like ECH associating protein 1) koji kontroliše ekspresiju nekoliko gena kao odgovor na oksidativni stres. Glutation peroksidaza 3 (GPx3) je jedini enzim iz familije glutation peroksidaza koji se luči u međućelijski prostor. Supstrat za ovaj enzim su vodonik peroksid, 10 hidroperoksidi masnih kiselina, fosfolipidni hidroperoksidi, a ima značajnu ulogu u antioksidativnim procesima u krvnoj plazmi (Brigelius-Flohe, 1999). Kako aktivnost ovog enzima opada i do 99% u slučaju deficita selena, GPx3 se široko koristi u proceni statusa selena. Takođe, pošto se povećana aktivnost javlja kod nekih subtipova tumora jajnika (Hough i sar., 2001), može se koristiti kao biomarker. Glavni izvor ekstracelularne GPx su bubrezi, a sintetišu je epitelne ćelije proksimalnih tubula nefrona i parietalne ćelije Boumanove kapsule (Yoshimura i sar., 1991). Informaciona RNK ovog enzima je nađena i u srcu (Hoffmann i sar., 2007), štitastoj žlezdi (Schmutzler i sar., 2007), a smatra se da GPx3 služi kao lokalni ekstracelularni antioksidans. Iako reakcije koje katalizuje ovaj enzim u in vivo uslovima nisu sasvim rasvetljene, studije u in vitro uslovima ukazuju da pri dodavanju glutationa, tioredoksina ili glutaredoksina dolazi do redukcije vodonik peroksida (Björnstedt i sar., 1994). Freedman i sar. (1996) su uočili važnu ulogu GPx3 u regulisanju bioraspoloživosti azot oksida (NO) kojeg proizvode trombociti i endotelne ćelije. Azot oksid aktivira gvanilil ciklazu, inhibira fosfoinozitol 3 kinazu i inhibira ciklooksigenazu 1 te ima važnu ulogu u ograničavanju aktivacije, adhezije i agregacije trombocita. U uslovima smanjene aktivnosti glutation peroksidaze, lipidni hidroperoksidi se ne redukuju u odgovarajuće alkohole već reaguju sa azot oksidom (NO) i smanjuju njegovu koncentraciju. Smanjena koncentracija NO dovodi do hiperreaktivnosti trombocita i povećava mogućnost nastanka trombocitoze. U in vitro uslovima hipoksija predstavlja snažan regulator transkripcije GPx3. Nedavna istraživanja su pokazala da ekspresija GPx3 gena u hipotalamusu miševa zavisi od stimulacije receptora za estrogen α u masnom tkivu (Lundholm i sar., 2008). Glutation peroksidaza 4 (GPx4) za razliku od ostalih GPx, može direktno da redukuje fosfolipidne i holesterol hidroperokside koristeći elektrone iz tiolnih grupa samog proteina kao i od glutationa (Imai i Nakagawa, 2003). Ova peroksidaza je zastupljena u citosolu, mitohondrijama, čak i u jedru ćelija različitih tkiva. Nedostatak enzima dovodi do smrti embriona (Imai i sar., 2003), a smanjena aktivnost uzrokuje povećanu osetljivost na oksidativni stres izazvan γ zračenjem, parakvatom, tercijalnim butilhidroperoksidom i vodonik peroksidom (Yant i sar., 2003). Ovaj enzim takođe učestvuje u sazrevanju spermatozoida. U spermatidama se nalazi kao solubilni enzim koji prolazi oksidativnu polimerizaciju formirajući strukturnu osnovu mitohondrijalne kapsule zrelih spermatozoida (Ursini i sar., 1999). Jedarna izoforma GPx4 deluje kao 11 protein tiol peroksidaza te ima ulogu u kondenzaciji hromatina i njegovoj strukturnoj stabilnosti u spermatozoidima (Conrad i sar., 2005). Izučavanja vršena na pacovima su ukazala na povezanost nivoa selena i plodnosti mužijaka (Olson i sar, 2004). Petrujkić (2010), na osnovu rezultata istraživanja izvedenih na nerastovima, takođe zaključuje da selen ima pozitivan efekat na koncentraciju i pokretljivost spermatozoida. Smanjena aktivnost ovog enzima snizila je motilitet i vijabilnost spermatozoida ljudi (Foresta i sar, 2002). 2.2.2. Tioredoksin reduktaze Enzimi tioredoksin reduktaze (TrxR) zajedno sa tioredoksinom i NADPH čine tioredoksin sistem koji je najveći ćelijski redoks sistem zastupljen kod svih organizama. Tioredoksin reduktaze kod sisara imaju razne uloge, a između ostalog, kontrolišu funkciju centralnog redoks molekula tioredoksina, a mogu i sami direktno da redukuju nekoliko substrata. Sadrže FAD domen, domen za vezivanje NADPH, međufazni domen, a pretposlednji domen je neophodan za enzimsku aktivnost i sadrži reziduu selenocisteina (Zhong i Holmgren, 2000). Aktivni centar na N-terminalnom kraju je identičan aktivnom centru glutation reduktaze. On poseduje Cis-x-x-x-x-Cis motiv koji vrši transfer elektrona na aktivno mesto C-terminalnog kraja (Zhong i sar., 2000). Redukcija substrata se odigrava transferom elektrona sa NADPH na FAD pri čemu se koriste aktivno mesto N-terminalnog kraja i aktivno mesto na C-terminalnom kraju naspramne subjedinice u kojoj se nalazi selenocistein (Biterova i sar., 2005). Makromolekuli -Proteini sa tioredoksin suprasekundarnim sklopom: Trx, PDI, CaBP1, CaBP2, ostali članovi familije PDI - Proteini sa glutaredoksin suprasekundarnim sklopom: hGrx2 -Ostali proteini: NK lizin Mali molekuli -Jedinjenja sa sumporom: lipoična kiselina, DTNB, GSNO… -Jedinjenja sa selenom: selenit, selendiglutation, ebselen, metilseleninat, selenocistein -Jedinjenja povezana sa semihinonom: vitamin K, dehidroaskorbat, miricetin, hinon… Slika 2.2. Redukcija različitih molekula pomoću tioredoksin reduktaze. 12 Do sada je identifikovano 3 tioredoksin reduktaze i to citosolna TrxR1 (Tamura i Stadtman, 1996), mitohondrijalna TrxR2 (Miranda-Vizuete i sar., 1999; Lee i sar., 1999) i TrxR3 iz testisa (Sun i sar., 2001). Ovo je za sada jedina poznata grupa enzima koja katalizuje NADPH zavisnu redukciju oksidovanog tioredoksina, te su mnogi ćelijski procesi vezani za aktivnost ovog enzima (Slika 2.2.). Tioredoksin sistem katalizuje redukciju disulfida u proteinima kao što su ribonukleotid reduktaza koja je neophodna za sintezu dezoksiribonukleotida (Holmgren, 1989); tioredoksin peroksidaza koja je važna u odbrani ćelija od oksidativnog stresa (Rhee i sar., 2005); protein disulfid izomeraza-PDI koja katalizije formiranje disulfida proteina u endoplazmatskom retikulumu (Lundström i Holmgren, 1990); NK-lizin koji je antibakterijski polipeptid T limfocita (Andersson i sar., 1996). Tioredoksin sistem ima centralnu ulogu u regulaciji ekspresije gena putem redoks kontrole transkripcionih faktora NF-kB, Ref-1, AP-1, p53, glukokortikoidnih receptora i enzima apoptoza regulatorne kinaze te indirektno utiče na proliferaciju ćelija, ćelijsku smrt i aktivaciju imunskog odgovora (Rundlof i Arner, 2004). Pored makromolekula, TrxR može redukovati i male molekule kao što su DTNB (5,5’ ditionitrobenzoeva kiselina) što se i koristi prilikom utvrđivanja aktivnosti ovog enzima, zatim vitamin K, aloksan (Holmgren i Lyckeborg, 1980), dehidroaskorbat (May i sar., 1998). Tioredoksin reduktaza može redukovati i S-nitrozoglutation koji nastaje od azot(II)oksida, važnog molekula za redoks signalizaciju, i glutationa pri čemu se oslobađa NO· koji može inaktivirati redukciju disulfida (Nikitović i Holmgren, 1996). Substrati za ovaj enzim takođe mogu biti selenit (Kumar i sar., 1992), selenodiglutation (Björnstedt i sar., 1992), metilseleninat, selenocistein i ebselen (Zhao i sar., 2002). Selenodiglutation i selenit se metabolišu u vodonik selenid koji je donor selena prilikom sinteze selenocisteina te ovaj enzim ima važnu ulogu u kontroli sinteze selenoproteina (Ganther, 1999). TrxR može i direktno da redukuje lipidne hidroperokside (Björnstedt i sar., 1995) i vodonik peroksid, a prisustvo selenocisteina i ebselena ima pozitivan uticaj na ovaj proces (Zhao i sar., 2002). Veza između suplementacije selena i ekspresije TrxR je kompleksna i zavisi od izvora selena kao i od tipa ćelija odnosno tkiva (Arner, 2009). Deficit selena smanjuje aktivnost TrxR u jetri i bubrezima dok je u mozgu ona očuvana (Hill i sar., 1997). 13 2.2.3. Jodotironin dejodinaze Dejodinaze učestvuju u aktivaciji ili deaktivaciji tireoidnih hormona. Enzimska familija jodotironin dejodinaza obuhvata tri enzima. Jodotironin dejodinaza tip 1 (ID1) aktivira prohormon T4 u aktivni T3 dejodinacijom spoljnog prstena tiroksina. Ovaj proces može katalizovati i dejodinaza tipa 2 (ID2). Deaktivaciju tiroksina i trijodtironina katalizuje dejodinaza 3 (ID3), dejodinacijom unutrašnjeg prstena. Detaljniji prikaz građe i funkcije ovih enzima i uloge u homeostazi tireoidnih hormona dat je u podpoglavlju 2.4.2. 2.2.4. Ostali selenoproteini Selenoprotein H ima relativnu molekulsku masu od 14 000. Katalitički centar sadrži Cis-x-x-Sec motiv pri čemu je sa X označena bilo koja aminokiselina. Nalazi se u mnogim tkivima. Tokom deficita selena drastično opada nivo iRNK ovog proteina (Sunde i sar., 2008). Selenoprotein H je lokalizovan u jedru, a studije pokazuju da se on može vezati za DNK kao odgovor na redoks status, da reguliše ekspresiju gena enzima koji učestvuju u de novo sintezi glutationa i da učestvuje u drugoj fazi detoksikacije kao odgovor na redoks status (Panee i sar., 2007). Selenoprotein I je kod ljudi zastupljen u raznim tkivima. Za ovaj protein se do skora nije znala funkcija sve dok nije utvrđeno da poseduje sekvencu homolognu sekvenci enzima koji učestvuju u sintezi fosfolipida (Horibata i Hirabayashi, 2007). Selenoprotein K je mali protein sa relativnom molekulskom masom od 16 000. Smešten je u membrani endoplazmatskog retikuluma (Lu i sar., 2006). Kod miševa se u većoj meri nalazi u slezini i testisima (Hoffmann i sar., 2007), a kod ljudi u srcu (Lu i sar., 2006). Prekomerna ekspresija u kardiomiocitima smanjuje nivo slobodnih radikala, ali se ne zna tačan mehanizam ovog procesa. Selenoprotein M i Sep 15 su smešteni u endoplazmatskom retikulumu, a imaju oko 30% identičnu sekvencu (Labunskyy i sar., 2007). S obzirom na to da imaju sekvence 14 homologne sekvencama disulfid izomeraza, Ferguson i saradnici (2006) pretpostavljaju da ova dva proteina imaju funkcije tiol-disulfid oksidoreduktaza. Selenoprotein N je transmembranski protein sa relativnom molekulskom masom od 70 000 (Petit i sar., 2003). Postoje dve izoforme i obe su zastupljene u skeletnim mišićima, mozgu, plućima i placenti (Moghadaszadeh i sar., 2001). Mutacije gena za selenoprotein N dovode do nekoliko poremećaja u mišićima zajednički označenih kao SEPN1 miopatije. Selenoprotein O je identifikovan pre nekoliko godina (Kryukov i sar., 2003), ali se još uvek pouzdano ne zna ni distribucija u tkivima, ni subcelularna lokalizacija kao ni fiziološka uloga. Selenoprotein P za razliku od ostalih selenoproteina, sadrži u polipeptidnom lancu nekoliko rezidua selenocisteina. Iako DNK za selP sadrži 10 UGA kodona, sam peptidni lanac u cirkulaciji ima manje od 10 rezidua Sec (Burk i Hill, 2005). Visok sadržaj selena u selenoproteinu P ukazuje na njegovu ulogu u transportu selena. Za ovaj protein je vezano 40-50% selena krvne plazme, a Schomburg i saradnici (2003) i Schweizer i saradnici (2005) na miševima dokazuju esencijalnu ulogu selenoproteina P u transportu selena. Tkiva koja su najviše pogođena usled nedostatka ovog proteina su mozak i testisi što su Hill i sar. (2003) i Renko i sar. (2008) potvrdili na knockout miševima. Kada je SelP knockout miševima injekciono dodavan obeleženi selen, zapažen je smanjeni nivo selena u mozgu i testisima, a povećan u jetri, na osnovu čega je zaključeno da se selen vezuje za selenoprotein P u jetri, sekretuje i dalje distribuira tkivima. Novija istraživanja sa intravenskom aplikacijom obeleženog selena su pokazala da se 1-6 sati nakon ubrizgavanja selena povećavaju koncentracije albumina i GPx3, a da je 6-72 časa nakon aplikacije selen vezan za selenoprotein P (Shigeta i sar., 2008). Iako venska aplikacija ne ocrtava u pravoj meri unos selena hranom, ovi rezultati idu u prilog teoriji da je transport selena između tkiva u najvećoj meri zavistan od ovog selenoproteina. Pored ovoga, i prisustvo receptora ApoER2 za unos Sel P u ćelije mozga (Valentine i sar., 2008) i testisa (Olson i sar., 2007) potvrđuje ulogu ovog 15 proteina kao transportera. Megalin, lipoproteinski receptor lokalizovan u epitelu proksimalnih tubula bubrega, odgovoran je za reapsorpciju Sel P iz primarne mokraće (Olson i sar., 2008). Selenoprotein P nema samo ulogu transportera selena, a na to ukazuje prisustvo različitih domena sa aktivnošću glutation peroksidaze, kao i za vezivanje heparina i kompleksiranje teških metala (Burk i Hill, 2005). Selenoprotein R je jedini enzim iz familije sulfoksid reduktaza koji ima selenocistein u aktivnom mestu-ostali imaju cistein. Nalazi se u mnogim tkivima, a najviše je zastupljen u jetri i bubrezima (Fomenko i sar., 2008). Smatra se da kod ljudi ovaj protein štiti od neurodegenerativnih procesa (Hansel i sar., 2005) i oksidativnih oštećenja tokom starenja (Stadtman, 2006). Selenoprotein S je transmembranski protein lokalizovan u endoplazmatskom retikulumu u raznim tkivima (Ye i sar., 2004). Smatra se da ima ulogu u uklanjanju proteina iz lumena ER radi njihove razgradnje (Gao i sar., 2004) kao i u zaštiti ćelije od oksidativnih oštećenja (Gao i sar., 2007). Ekspresija ovog proteina je modulirana metabolizmom glukoze (Gao i sar., 2004). Selenoprotein T je eksprimiran i tokom embrionalnog razvića i kod adultnih pacova u mnogim tkivima, verovatno u endoplazmatskom retikulumu (Grumolato i sar., 2008). Pripada subfamiliji selenoproteina koji imaju sekvencu sličnu tioredoksinu i Cis-x-x- Sec motiv. Selenoprotein V je eksprimiran u testisima, a funkcija je još uvek nepoznata. S obzirom na postojanje sekvence slične sekvenci tioredoksina kao i prosustvo Cis-x-x-Sec motiva, pretpostavlja se da ima ulogu u redoks reakcijama (Dikiy i sar., 2007). Selenoprotein W takođe pripada subfamiliji selenoproteina koji imaju sekvencu sličnu tioredoksinu i Cis-x-x-Sec motiv, zajedno sa Sel T, Sel H i Sel V. Ima malu relativnu molekulsku masu od 9 500, a zastupljen je u različitim tkivima (Gu i sar., 2000). Reaguje sa glutationom te se smatra da ima antioksidativnu ulogu u ćelijama (Beilstein i 16 sar., 1996). Nivo iRNK ovog proteina u velikoj meri zavisi od nivoa selena kao i od nivoa selenoproteina P (Sunde i sar., 2008; Hoffmann i sar., 2007). Selenofosfat sintetaza 2 (SPS2) učestvuje u biosintezi selenoproteina jer katalizuje prenos i ugradnju monoselenofosfata u sec-tRNK (detaljnije objašnjenje je dato u sledećem poglavlju). Na taj način ovaj selenoprotein vrši autoregulaciju sopstvene sinteze kao i regulaciju svih ostalih selenoproteina (Guimares i sar., 1996). Na ćelijskim linijama fibroblasta miševa je dokazano da je ovaj protein neophodan za sintezu selenoproteina (Xu i sar., 2007a). Kod miševa deficitnih u selenoproteinu P uočen je povećan nivo SPS2 iRNK dok je nivo svih ostalih iRNK selenoproteina u mozgu i testisima bio smanjen te su Hoffmann i saradnici (2007) zaključili da bi ovo mogao biti kompenzatorni mehanizam koji se javlja usled deficita selena u tkivima. 2.3. Sinteza selenoproteina Sinteza selenoproteina je evolucijski konzerviran proces. Pronađene su velike razlike u mehanizmu sinteze selenoproteina između prokariota i eukariota, ali su za sve zajednički UGA-Sec kodon, specifična tRNK, SECIS element i nekoliko drugih faktora. Selenocistein je dvadesetprva genetski kodirana aminokiselina, pri čemu se UGA kodon, inače definisan kao STOP kodon i odgovoran za terminaciju translacije, očitava kao kodon za ugradnju selenocisteina. 2.3.1. Mehanizam biosinteze selenocisteina Selenocistein (Sec) je aminokiselina koja se kotranslatorno ugrađuje u protein, a za razliku od ostalih aminokiselina, njegova sinteza se odvija na samoj tRNK (Lee i sar., 1989). Genom sisara sadrži samo jednu kopiju gena koji kodira dve Sec tRNK izoforme. Molekul sadrži 90 nukleotida sa 4 modifikovane baze (Itoh i sar., 2009). Ova dva tipa sekundarne strukture tRNK se označavaju kao 7/5 (7 parova baza na akceptorskom kraku i 5 parova baza na T kraku) i 9/4. Prilikom aminoacilacije, tj. vezivanja aminokiseline, za ovu tRNK se primarno vezuje serin uz katalitičku aktivnost seril-tRNK sintetaze (Slika 2.3.). Nastali seril-tRNK je prekursor za sintezu selenocisteil-tRNK. Seril-tRNK se aktivira pomoću fosfoseril tRNK kinaze (PSTK) u 17 fosfoseril-tRNK. Fosfoseril-tRNK je substrat za selenocistein sintazu (SecS). Ovaj enzim pripada superfamiliji piridoksal-fosfat zavisnih transferaza (Jeffrey i Berry, 2008) i defosforiliše O-fosfoseril-tRNK uz prenos monoselenofosfata na tRNK pri čemu se formira selenocisteil-tRNK (Sec-tRNK). Nedavno je otkriveno da i SLA protein (solubile liver antigen) ima ulogu u sintezi selenocisteina i da se vezuje zajedno sa SECp43 za Sec-tRNK formirajući kompleks. SECp43 je neophodan za metilaciju 2'- hidroksiribozila na wobble poziciji tRNK. Na osnovu subcelularne lokalizacije ovog molekula pretpostavlja se da ima ulogu u kretanju Sec-tRNK između jedra i citoplazme (Xu i sar., 2005, 2007b). Monoselenofosfat je aktivna forma selena koji nastaje od selenida uz učešće ATP-a (Glass i sar., 1993). Enzim koji katalizuje ovu reakciju kod sisara je selenofosfat sintetaza 2 (SPS2) koja je i sama selenoprotein te se pretpostavlja da autoregulacijom sopstvene sinteze reguliše i sintezu ostalih selenoproteina (Guimaraes i sar., 1996). Slika 2.3. Sinteza selenocisteina na samoj tRNK (objašnjenje dato u tekstu). Pser Ser Ser SecSPS2 SecS HSe- SeP tRNK S r 18 2.3.2. Mehanizam ugradnje selenocisteina u polipeptidni lanac selenoproteina Da bi se UGA kodon ’pročitao’ kao kodon za ugradnju selenocisteina, pored specifične tRNK neophodan je i takozvani SECIS element. On se nalazi na 3’ netranslatornom regionu (UTR) iRNK za odgovarajući selenoprotein i po nekoliko hiljada nukleotida udaljen od UGA kodona, (Berry i sar., 1991). SECIS element ima oblik ukosnice i mogu ga sačinjavati različiti nukleotidi, ali postoje visoko-konzervirani delovi kao što su dve nesparene AA rezidue na apikalnoj petlji ukosnice (ili CC na SECIS elementu za selenoprotein M i selenoprotein O), AGUA(G) na 5’ i GA na 3’ kraju u bazi formacije. Između ovih nukleotida je uočeno nestandardno A-G i G-A sparivanje (Walczak i sar, 1998). Slično nestandardno sparivanje baza uočeno je na mestima RNK koja služe za vezivanje odgovarajućih RNK-vezujućih proteina. Ova forma SECIS elementa je zapažena kod glutation peroksidaza (GPx) i dejodinaze tipa 1 (ID1). Kod dejodinaza tipa 2 i 3 (ID2 i ID3), SECIS element ima dodatnu petlju (Slika 2.4.B). Slika 2.4. Tipovi građe SECIS elementa. Osim ovih elemenata, za ugradnju selenocisteina je neophodno prisustvo još nekih proteina kao što su SECIS vezujući protein 2 (SBP2), Sec specifični faktor elongacije (eEFSec), ribozomski L30 protein, Secp43 i SLA protein faktor. 19 SECIS vezujući protein 2 (SBP2) je sastavljen od 854 aminokiseline pri čemu gotovo 400 aminokiselina na N terminalnom kraju nema ulogu u inkorporaciji selenocisteina (Copeland i sar., 2001). Uloga ovog proteina je prvo dokazana u in vitro uslovima kada je obustavljena sinteza selenoproteina u lizatima ćelija bez SBP2, a ponovo uspostavljena nakon njegovog dodavanja (Copeland i sar, 2000). Papp i sar (2006) su na ćelijskim linijama utvrdili isti efekat prisustva ovog proteina (in vitro). Definisano je nekoliko funkcionalnih motiva: N i C terminalni, NLS (nuclear localization signal), NES (nuclear export signals), domen nepotreban za vezivanje za SECIS, ali neophodan za ugradnju selenocisteina. Međutim, još uvek nije tačno definisan domen za vezivanje za ribozom. SBP2 se preko svog RNK vezujućeg domena (RBD) vezuje za AUGA sekvencu SECIS elementa, a zatim raguje sa 28S ribozomskom RNK (28S rRNK) (Fletcher i sar, 2001). Sec specifični faktor elongacije (eEFSec) se može vezati za obe izoforme Sec- tRNK, a formira i komplekse sa SBP2 (Fagegaltier i sar, 2000). Nije utvrđeno gde se tačno formiraju kompleksi između eEFSec i SBP2. Ako se formiraju u jedru, pretpostavka je da u tom slučaju SBP2 olakšava kretanje eEFSec od jedra do ribozoma u citoplazmi. Ukoliko se kompleksi formiraju na ribozomima, vezivanje SBP2 bi dovelo do odvajanja eEFSec na ribozomima i olakšalo prenos Sec tRNK na UGA kodon. Uloga faktora elongacije je kompleksna, a po svemu sudeći, osim u ugradnji selenocisteina u proteine, učestvuje i u samoj sintezi selenocisteina (Small-Howard i sar., 2006). Ribozomski L30 protein pripada familiji ribozomskih protein, a kao i SBP2, ima RNK vezujući domen (Moore i sar., 2004) i vezuje se za SECIS element (Chavatte i sar., 2005). Izgleda da se L30 i SBP2 za SECIS element ne vezuju istovremeno. Vezivanjem L30 menja se struktura SECIS elementa i na taj način izaziva oslobađanje SBP2 što kao posledicu ima olakšano prebacivanje Sec-tRNK na aminoacil mesto ribozoma (Chavatte i sar., 2005). 20 P Fosfoseril kinaza ACU ACU ACUACU SerSer Sec sintaza Se ATP AMP+Pi SPS2 SPS2 Se P PPi EFSec SECp43 SBP2 AAAA AUG UGA UAA UGAUGAACU AAAA UAA UAG Slika 2.5. Shema sinteze selenoproteina. 2.3.3. Regulacija sinteze selenoproteina Metabolizam selena je vrlo kompleksan jer je ovaj mikroelement za organizam esencijalan, ali i potencijalno vrlo toksičan. Stoga su neophodni strogi mehanizmi regulacije nivoa selena neophodnog za optimalnu ekspresiju svih selenoproteina. Iako se o sintezi selenoproteina dosta zna, sama regulacija njihove sinteze je nepoznanica. Sinteza selenoproteina je regulisana nivoom selena u hrani, ali zavisi i od tkiva i od toga koji je selenoprotein u pitanju. Zna se da je sinteza svih dvadesetak selenoproteina zavisna od trans-faktora (SBP2, L30), ali nije jasno na koji način ćelije daju prioritet za njihovo iskorišćavanje. Protein koji povezuje status selena sa različitim ekspresijama 21 selenoproteina je eukariotski faktor inicijacije 4a izoforma 3 (eIF4a3) za koji je u in vitro uslovima pokazano da sprečava vezivanje SBP2 za SECIS element iRNK glutation peroksidaze 1 i na taj način inhibira ugradnju selenocisteina u enzim (Budiman i sar., 2009). Novija istraživanja ukazuju na regulaciju sinteze selenoproteina i na nivou trankripcije, translacije i stabilnosti iRNK. Regulacija na nivou transkripcije je nedovoljno proučena. Brigelius-Flohe i Banning (2006) su nedavno utvrdili da se sinteza GPx2 može regulisati Nrf2/Keap1 (NF-E2-related factor 2/Klech-like ECH- associated protein 1) sistemom koji reguliše i sintezu proteina zaduženih za detoksikaciju i oksidativnu odbranu, a kojima pripada i tioredoksin reduktaza 1 (TrxR 1). Nrf2/Keap1 sistem je jedan od ćelijskih mehanizama za odbranu od oksidativnog stresa (Motohashi i Yamamoto, 2004), a aktiviraju ga elektrofilna jedinjenja, metali, tiolni modifikatori i ostala potencijalno antikancerogena jedinjenja iz hrane (Brigelius- Flohe i Banning, 2006). Moguće je da selen ili njegovi metaboliti aktiviraju ovaj sistem i na taj način utiču na sintezu specifičnih selenoproteina. Postavlja se pitanje da li u DNK uopšte postoji selen regulatorni element koji bi efikasno regulisao transkripciju u odnosu na promenu nivoa selena. Regulacija sinteze na nivou translacije je komplikovana koliko i sama ugradnja selenocisteina. Naime, poznati su efekti nedostatka nekog od regulacionih proteina koji se vezuju za specifične sekvence u sastavu RNK (Ottaviano i sar., 2009), takozvanih trans-reagujućih faktora (SBP2 i L30) kao i efekti promena specifičnih sekvenci na RNK, takozvanih cis-elemenata (promene SECIS elementa, sec-tRNK), ali tačan mehanizam nije poznat. Ogled Jamesona i Diamonda (2004) je pokazao da je metilovana forma Sec- tRNK aktivna prilikom translacije te da je metilacija Sec-tRNK jedan od mehanizama kontrole sinteze selenoproteina. Utvrđeno je da metilovana forma Sec-tRNK učestvuje u sintezi selenoenzima uključenih u odgovor na oksidativni stres kao što su GPx1 i GPx3, a nemetilovana izoforma učestvuje u sintezi TrxR1 i TrxR2. Nedavno je uočeno (Dumitrescu i sar., 2005) da promene na genu za SBP2 kod ljudi dovode do poremećaja aktivnosti ID2. Takođe su bile smanjene i aktivnosti GPx i nivo SelP u plazmi. Ekperimentišući na ćelijama bubrega embriona deJesus i saradnici (2006) su uočili značajno povećanje sinteze selenoenzima kada je bila izražena 22 prekomerna ekspresija SBP2. Iste godine su Papp i saradnici dokazali da smanjenje količine SBP2 izaziva opšti pad sinteze selenoproteina. Takođe, smanjenje nivoa SBP2 sa ili bez SECp43 i SLA dovodi do opšteg pada sinteze selenoproteina (Xu i sar., 2005). 2.3.4. Uticaj Se na sintezu selenoproteina Weiss Sachdev i Sunde su 2001. godine uočili da selen utiče na stabilnost iRNK glutation peroksidaze te da se u slučaju njegovog deficita javlja raspad informacione RNK. Takođe, selen utiče na efikasno očitavanje UGA kodona za ugradnju selenocisteina (Fletcher i sar., 2001; Martin i Berry, 2001), reguliše ukupni nivo Sec- tRNK kao i odnos između količine metilovane i nemetilovane Sec-tRNK (Jameson i sar., 2002; Carlson i sar., 2005). Hatfield (2001) navodi nekoliko nivoa uticaja selena na ekspresiju selenoproteina: transkripcija, obrada u jedru, prelaz transkripta iz jedra do ribozoma, translacija, stabilnost iRNK i promet selenoproteina. Proučavajući uticaj selena na regulaciju GPx1, Knight i Sunde (1987) su prilikom izlaganja mladih pacova deficitu selena i korišćenjem anti-GPx1 antitela uočili eksponencijalni pad koncentracije GPx1 kao i njene aktivnosti i zaključili da za ovakav pad aktivnosti mora postojati još najmanje jedan faktor osim selena. Prilikom dodavanja selena nakon izazvanog deficita, bilo je potrebno duže vreme kao i veće doze Se da bi se uspostavila puna aktivnost ovog enzima. Deficit selena takođe izaziva pad koncentracije informacione RNK GPx1 u jetri za 90% u odnosu na selenadekvatne jedinke (Saedi i sar., 1988). Kada je posmatrano pri kojim dozama se nakon izazvanog deficita selena javlja puna aktivnost ili koncentracija posmatranog enzima, plato za iRNK GPx1 je dostignut sa 0.05 μg selena/g hrane, a za aktivnost GPx1 sa 0.1 μg selena/g hrane. Treba napomenuti da prilikom nadoknade selena prvo dolazi do povećanja količine iRNK, a zatim do povećanja aktivnosti GPx1. Povećanje koncentracije selena u hrani preko 0.1 μg selena/g ne utiče na regulaciju iRNK i aktivnosti GPx1 (Weiss i sar., 1996). Aktivnost glutation peroksidaze eritrocita je kod selendeficitnih jedinki za 60% niža u odnosu na selenadekvatne jedinke, a plato aktivnosti prilikom nadoknade selena nakon izazvanog deficita se takođe dostiže sa 0.1 μg selena/g u hrani. 23 Prilikom deficita selena aktivnost GPx3 plazme iznosi svega 7-8% aktivnosti enzima kod selenadekvatnih jedinki, a plato nakon nadoknade se postiže sa 0.07 μg selena/g u hrani. Lei i saradnici (1995) su uočili da prilikom ishrane pacova veoma niskim količinama selena (0.002 μg selena/g hrane), aktivnost GPx1 jetre opada za 99% u odnosu na selenadekvatne jedinke, a da aktivnost GPx4 (fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidaza) opada za 59% u odnosu na selenadekvatne jedinke. Plato koji je postignut kod GPx1 sa 0.1 μg selena/g u hrani, kod GPx4 se javio već sa 0.065 μg selena/g u hrani. Takođe, mereći nivo iRNK za ova dva enzima uočeno je da koncentracija selena nije uticala na nivo iRNK GPx4 te se plato za iRNK GPx4 javio već na 0.013 μg selena/g u hrani. Ovakav odgovor na deficit i nadoknadu selena nakon izazvanog deficita ukazao je na različite mehanizme regulacije ekspresije ova dva enzima u istom tkivu. Slični eksperimenti su vršeni i radi utvrđivanja efekta deficita selena na nivo iRNK jodotironin dejodinaze 1 (ID1) kao i na njenu aktivnost u jetri. Bermano i saradnici (1995) su kod selendeficitnih pacova uočili pad aktivnosti ID1 u jetri za 95% pri čemu je nivo iRNK ID1 opao za 50%. Nivo iRNK ID1 u štitastoj žlezdi je prilikom deficita selena porastao za 40%. Kako transkripciju ID1 modulira TSH kao odgovor na nivo T3, smatra se da je povećanje nivoa iRNK ID1 u štitastoj žlezdi posledica stimulacije sa TSH. Pri izlaganju jedinki deficitu selena, zapaža se pad koncentracije selenoproteina P (SelP) i to za 90% (Burk i Hill, 1994) i njegove iRNK za 33% u odnosu na selenadekvatne jedinke. Koristeći RPA metodu (ribonuclease protection analysis), Sunde i saradnici (1998) su uočili da koncentracija iRNK ovog proteina ne opada dok iRNK GPx1 opada za 85-90% te je zaključeno da regulacija SelP ne zavisi značajno od promene koncentracije iRNK. Prilikom suplementacije selendeficitnih pacova dolazi do porasta koncentracije SelP i to pre nego što dođe do porasta aktivnosti plazmatske GPx3 i GPx1 u jetri. Aktivnost tioredoksin reduktaze (TR) kod selendeficitnih jedinki pada na 15% u odnosu na selenadekvatne jedinke pri čemu nivo iRNK TR opada za oko 30% (Hadley i Sunde, 2001). Autori su zaključili da se regulacija ovog enzima odvija po drugačijem 24 obrascu u odnosu na GPx1 i GPx4 jer pri deficitu selena dramatično opadaju i aktivnost i iRNK GPx1, a kod GPx4 aktivnost opada za 60%, ali nivo iRNK opada za svega 30%. 2.4. Tireoidna osovina, sinteza tireoidnih hormona i regulacija Sinteza tireoidnih hormona je složen proces koji se odvija delom u štitastoj žlezdi, a delom u ekstratireoidnim tkivima. Kako je jod osnovni mikroelement koji ulazi u sastav tireodnih hormona - jodotironina, adekvatano snabdevanje štitaste žlezde jodom je preduslov za normalnu sintezu samih hormona. Jodid (J-) se u ćelije štitaste žlezde unosi pomoću transmembranskog proteina označenog kao Na+/I- simporter (NIS) (Dai i sar., 1996). Ceo proces stimuliše tireotropin (TSH), a inhibiraju tiocianat i perhlorat (Kogai i sar., 1997). Interakcija TSH i njegovog receptora dovodi do aktiviranja adenilat ciklaze preko Gα-proteina. Sintetisani ciklični AMP utiče na povećanje sinteze NIS-a (Kaminsky i sar., 1994). I sam jodid utiče na sintezu transportera. Smanjene količine jodida inhibiraju ekspresiju iRNK za Na+/I- simporter kod pasa (Uyttersprot i sar., 1997). Nakon unosa u tireocite, jod se transformiše iz neorganske forme u organski vezan jod kao sastavni deo tireoidnih hormona. Prvi korak u ovoj transformaciji podrazumeva oksidaciju joda pomoću tireoidne peroksidaze (Magnusson, 1990). Tireoidna peroksidaza (TPO) je glikolizovani hemoprotein vezan za membranu koji oksidovani jod ugrađuje u tirozil ostatke i vrši spajanje dijodotirozil rezidua tireoglobulina u matriksu od kojih se posle formiraju tiroksin i trijodtironin. Da bi se sintetisani tireoidni hormoni sekretovali, prvo se moraju odvojiti od tireoglobulina. Pod uticajem tireotropina (TSH), formiraju se mikrovili na apikalnoj strani tireocita i tireoglobulin se unosi iz lumena u tireocit, spaja sa lizozomima pri čemu dolazi do njegove proteolize. TSH stimuliše i povećanje aktivnosti lizozomalnih enzima kao što su N-acetil-β-glukozaminidaza, β-galaktozidaza, leucil-β- naftilaminidaza. Takođe, TSH utiče na povećanje količine iRNK proteaza katepsina B (Phillips i sar., 1989) i katepsina S (Petanceska i Devi, 1992). Nakon proteolize tireoglobulina, tiroksin se delom sekretuje, a delom prevodi u trijodtironin procesom dejodinacije, a hormonski neaktivni mono i dijodtironin se dejodinacijom oslobađaju joda koji se vraća u pul joda tireocita i ponovo se ugrađuje u tireoglobulin u lumenu folikula. 25 Sinteza hormona štitne žlezde odvija se pod uticajem TSH. TSH se sintetiše u prednjem režnju hipofize ili u placenti. Ovaj hormon je glikolizovani protein sastavljen iz nekovalentno vezanih α i β subjedinica. Alfa subjedinica ulazi u sastav još nekih hormona kao što su luteinizirajući (LH), folikulostimulirajući (FSH) hormona kao i horionskog gonadotropina (CG), dok je β subjedinica sa karakterističnom aminosekvencom za svaki od četiri pomenuta hormona. Sama β subjedinica se ne može vezivati za receptore već se mora prvo nekovalentno vezati za α subjedinicu. Sinteza TSH je regulisana klasičnom negativnom povratnom spregom gde tireoidni hormoni direktno inhibiraju sintezu ovog hormona u hipofizi, a indirektno deluju na nivou hipotalamusa gde redukuju sekreciju tireotropnog oslobađajućeg hormona (TRH). 2.4.1. Selen i funkcija štitaste žlezde Dickson i Tomlison (1967) su uočili da štitasta žlezda sadrži više selena po gramu tkiva od bilo kog drugog organa, te da je selen esencijalni element važan za njeno normalno funkcionisanje i homeostazu tireoidnih hormona. Sinteza tireoidnih hormona podrazumeva jodinaciju tirozil rezidua tireoglobulina koji se nalazi u lumenu folikula štitaste žlezde. Tireoidna peroksidaza (TPO) katalizuje ovu reakciju za koju je potrebna visoka koncentracija vodonik peroksida, a koji je potencijalno veoma štetan za tireocite. Generisanje vodonik peroksida je limitirajući korak u sintezi hormona i regulisan je dejstvom TSH, (Kimura i sar, 1995). Jodinacija tireoglobulina i generisanje vodonik peroksida se odvija na apikalnoj površini membrane tireocita. Ovakva organizacija omogućava da nastali vodonik peroksid bude visoko dostupan u reakciji jodinacije. Određena količina peroksida koja difunduje u same tireocite biva neutralisana od strane glutation peroksidaze, tioredoksin reduktaze i katalaze (Ekholm i Björkman, 1997). Tireociti sintetišu i sekretuju GPx3. Postoji mogućnost da GPx3 učestvuje u kontroli sinteze tireoidnih hormona regulišući koncentraciju vodonik peroksida. Kada je povećana sinteza tireoidnih hormona signalizirana od strane TSH receptora, porast sinteze vodonik peroksida na apikalnoj membrani tireocita je povezan sa smanjenom 26 sekrecijom GPx3, te smanjenom degradacijom samog vodonik peroksida (Howie i sar., 1995). Kada proizvodnja tireoidnih hormona opada, opada i sinteza vodonik peroksida, ali raste sekrecija GPx3 koji dodatno smanjuje nivo vodonik peroksida. Tireociti su konstantno izloženi potencijalno toksičnom efektu vodonik peroksida i lipidnih hidroperoksida. Prilikom deficita selena, smanjuje se količina GPx1 i TR1 u ćeliji te je smanjena mogućnost odbrane ćelija od peroksida, a to za posledicu ima oštećenje ćelija (Demelash i sar., 2004). 2.4.2. Transport tireoidnih hormona U krvi je za proteine krvne plazme vezano više od 99% tireoidnih hormona. Proteini za koje se vezuju T4 i T3 su tiroksin vezujući globulin (thyroxine-binding globulin-TBG), transtiretin (tiroksin-vezujući prealbumin), serum albumin i lipoproteini. Vezivanje za ove proteine omogućava konstantno snabdevanje ćelija i tkiva i sprečava se gubitak ovih hormona putem mokraće (Rasmussen i Rasmussen, 2007). Tiroksin vezujući globulin (TBG) ima veliki afinitet ka T4 te je 75% tiroksina vezano za TBG. Za transtiretin je vezano 20%, a za serum albumin 5% tiroksina. Trijodtironin se takođe u velikom procentu vezuje za TBG (75%), ali je za transtiretin vezano manje od 5%, a za serum albumin oko 20%. 2.4.3. Dejodinaze Gross i Pitt-Rivers (1951) su utvrdili da se za receptore tireoidnih hormona vezuje T3. Dejodinacija T4 u T3 se smatra prvim korakom u aktivaciji tireoidnog prohormona T4. Dva različita enzima prevode T4 u T3 i to su dejodinaza tipa 1 (jodotironin dejodinaza 1-ID1) i dejodinaza tipa 2 (jodotironin dejodinaza 2 - ID2) koje vrše dejodinaciju spoljnog prstena tiroksina. Dejodinacijom unutrašnjeg prstena inaktivira se T4 pri čemu nastaje reverzni T3 (rT3), a ovaj proces mogu katalizovati ID1 kao i ID3 (Slika 2.6.). Jodotironin dejodinaza tipa 1 (ID1) obezbeđuje gotovo 80% T3 plazme kod ljudi. Za razliku od ID2, vrlo je osetljiva na dejstvo propiltiouracila (PTU) što je i dokazano u nekoliko eksperimenata (Leonard i Rosenberg, 1978; Visser i sar., 1976; Chopra, 1977). ID1 se nalazi u mnogim tkivima pacova kao što su jetra, bubrezi, 27 centralni nervni sistem, hipofiza, štitasta žlezda, creva i placenta (Bianco i sar, 2002). Kod ljudi je nema u CNS-u (Campos-Barros i sar., 1996). Dejodinaza 1 je monomerni integralni membranski protein tipa 1. Dvanaest aminokiselina na N terminalnom kraju je u lumenu endoplazmatskog retikuluma, transmembranski deo se završava sa 36-om aminokiselinom, a ostatak molekula je u citoplazmi (Toyoda i sar., 1995a). Novija istraživanja potvrđuju njegovu lokalizaciju u plazma membrani (Baqui i sar., 2000) ćelija bubrega i tireocita. S obzirom na položaj katalitičkog centra u citoplazmi i položaj samog molekula u plazma membrani, smatra se da je na ovaj način olakšan pristup cirkulišućem T4 kao i rT3 koji su supstrati za ovaj enzim. Smatra se da je zahvaljujući svojoj lokalizaciji, ID1 glavni proizvođač T3 plazme, a da je ID2 koji je lokalizovan u ER odgovoran za generisanje intracelularnog T3 (Larsen i sar., 1981). ID1 ID1 ID2ID2 ID1 ID3 ID3 Slika 2.6. Shema aktivacije i deaktivacije tireoidnih hormona pomoću ID1, ID2 i ID3. Izučavanja su pokazala da dejodinacija katalizovana uz pomoć ID1 ima kinetiku ’ping-pong’ reakcija sa dva substrata od kojih je prvi jodotironin, a drugi endogeni intracelularni tiolni kofaktor čija hemijska priroda još nije utvrđena (Leonard i Rosenberg, 1980). Propiltiouracil inhibira enzim takmičeći se sa ovim tiolnim kosupstratom i formirajući reverzibilni enzim-Se-S-PTU kompleks (Slika 2.7.). 28 Slika 2.7. Shema mehanizma reakcije katalize aktivacije T4 uz pomoć ID1. Primarnu ulogu u regulaciji aktivnosti ID1 ima nivo tireoidnih hormona koji povećavaju i aktivnost jodotironin dejodinaze 1 i sintezu njene iRNK (Kaplan i Utiger, 1978; Harris i sar., 1978; Berry i sar., 1990). Toyoda i saradnici (1995b) su utvrdili postojanje TRE (thyroid response element) na bočnom regionu ID1 gena, a Jakobs i saradnici (1997) su uočili postojanje još jednog TR elementa (TRE-2). Retinoična kiselina, derivat vitamina A, povećava ekspresiju ovog proteina verovatno vezivanjem za TRE (Schmutzler i Kohrle 2000). Analizom promotera ID1 gena utvrđena je ključna uloga hepatocitnog jedarnog faktora 4 α (HNF4 α) u njegovoj aktivaciji, a postojanje proksimalnog HNF4 α elementa za odgovor potvrdilo je ovaj nalaz (Stoycheva i Berry, 2009). Toyoda i saradnici (1992) na tireoidnim ćelijskim linijama pacova pokazuju da TSH izaziva trostruko povećanje koncentracije iRNK ID1. TNFα, IL-1β i interferon γ snižavaju nivo iRNK ID1 kao i njegovu aktivnost (Pekary i sar., 1994). Jodotironin dejodinaza tipa 2 katalizuje dejodinaciju spoljnog prstena tiroksina te konverziju T4 u T3 ili rT3 u 3,3’-T2. Kod pacova je zastupljena u hipofizi (Cheron i sar., 1979), mozgu (Crantz i Larsen, 1980; Leonard, 1988) i mrkom masnom tkivu (Silva i Larsen, 1983). Aktivnost ovog enzima je takođe uočena i u gonadama pacova, epifizi (Kamiya i sar., 1999), timusu (Molinero i sar., 1995), mlečnoj žlezdi kod miševa (Song i sar., 2000), materici skotnih ženki pacova (Galton i sar., 2001), koronarnim arterijama ljudi, glatkim mišićnim ćelijama aorte (Mizuma i sar., 2001). Kod ljudi je eksprimirana u štitastoj žlezdi (Murakami i sar., 2001; Imai i sar., 2001), srcu, mozgu, 29 kičmenoj moždini, skeletnim mišićima i placenti. Kod pacova je nema u srcu i skeletnim mišićima, a ekspresija u tireoideji adultnih pacova je jako mala (Gereben i sar., 2001). Dejodinaza 2 je integralni membranski protein čiji je amino-terminalni kraj u lumenu endoplazmatskog retikuluma, a karboksi-terminalni kraj u citoplazmi (Baqui i sar., 2000). Za razliku od ID1, neosetljiva je na dejstvo PTU (Salvatore i sar., 1996), ali se, kao i ID1 i ID3, kompetitivno inhibira sa jopanoičnom kiselinom (Germain, 1988a,1988b). U sličnim in vitro uslovima, pokazalo se da ID2 ima manju Km za T4 u odnosu na ID1 (Visser i sar., 1982). Dejodinacija pomoću ovog enzima in vivo zahteva postojanje redukcionog kofaktora čiji identitet nije utvrđen (Bianco i sar., 2002). Izlaganje hladnoći povećava količinu iRNK za ID2 i aktivnost enzima u mrkom masnom tkivu, a α1 i β adrenergički antagonisti sprečavaju ovaj efekat (Silva i Larsen, 1983; Salvatore i sar., 1998). U izolovanim adipocitima mrkog masnog tkiva, porast aktivnosti ID2 je zabeležen pri upotrebi norepinefrina, insulina i glukagona, a pad pri upotrebi hormona rasta (Silva i Larsen, 1986a). Ciklični adenozin monofosfat (cAMP) povećava aktivnost ID2 u astroglijalnim ćelijama pacova (Pallud i sar., 1997) kao i nikotin i ciklični gvanozin monofosfat (Gondou i sar., 1999), tako da ne iznenađuje otkriće CRE (cAMP response element) na bočnom regionu ID2 gena kod ljudi, pacova i miševa (Canettieri i sar., 2000). Tireoidni status utiče na ekspresiju ID2 i na pretranslacionom nivou i posttranslacionom nivou (Silva i Larsen, 1986b; Germain, 1985). Viši nivo dejodinacije T4 je zabeležen u kori velikog mozga hipotireoidnih pacova, a povećava se i koncentracija iRNK za ID2 u mozgu (Burmeister i sar., 1997). Dodavanje T3 je dovelo do opadanja nivoa iRNK za ID2 kod hipotireoidnih pacova dok je T4 primarno smanjivao aktivnost ID2. Kim i saradnici (1998) smatraju da je supresija iRNK za ID2 koju izaziva T3 na nivou transkripcije jer T3 nije uticao na smanjenje poluživota (~2h) iRNK za ID2. U istom istraživanju je u prisustvu reverznog T3 (rT3) uočena smanjena aktivnost ovog enzima, ali ne i smanjen nivo iRNK za ID2. Poluživot ovog enzima je kratak (50 min), a dodatak nekog od supstrata kao što su T4 i rT3 ga još više skraćuje (Koenig i sar., 1984; Leonard i sar., 1984; Silva i Leonard, 1985; Obregon i sar., 1986; Halperin i sar., 1994). Gereben i sar. (2000) navode da se regulacija aktivnosti ovog enzima pomoću T4 i T3 odvija posttranslaciono i da se za ID2 vezuje ubikvitin nakon 30 čega tako obeležen enzim podleže proteolizi. Količina ID2 vezana za ubikvitin raste sa količinom prisutnog T4. Uticaj selena na aktivnost ID2 je proučavan devedesetih godina. U početku nije bio svrstan u selenoenzime da bi se u radu Buettnera i saradnika (1999) utvrdilo postojanje SECIS elementa na genu za ovaj enzim. Beckett i saradnici (1989) 5 nedelja nakon izlaganja pacova deficitu selena zaključuju da se aktivnost ovog enzima smanjuje i da je to uzrok povećanja koncentracije T4 u krvnoj plazmi. Nivo cirkulišućeg T4 je kontrolisan negativnom povratnom spregom vezanom za sintezu i oslobađanje TSH u hipofizi. Ovakav vid kontrole podrazumeva dejodinaciju T4 u samoj hipofizi pomoću ID2. Iako čak i subkliničko povećanje T4 kod hipertireoidizma suprimira TSH, autori nisu uočili pad koncentracije TSH i pored toga što je povećanje nivoa T4 bilo 70-80%. Na osnovu svojih rezultata su zaključili da je mehanizam homeostaze narušen zbog pada aktivnosti ID2 usled nedostatka selena. Jodotironin dejodinaza tipa 3 je selenoenzim koji katalizuje dejodinaciju unutrašnjeg prstena tireoidnih hormona pri čemu nastaju neaktivni rT3 od T4, odnosno 3,3’-T2 od T3. Prekomerna ekspresija je zapažena u hepatičnim hemangiomima, a dovela je do izraženog hipotireoidizma (Huang i sar., 2000). Ovaj enzim štiti tkiva od prekomerne količine tireoidnih hormona i na taj način učestvuje u homeostazi. Prve fiziološke uloge ovog enzima su proučavane u CNS-u pacova (Kaplan i sar., 1981). Osim u centralnom nervnom sistemu, ID3 je zastupljena i u koži, placenti i gravidnom uterusu pacova. Kod neonatalnih pacova, ID3 je zastupljena u skeletnoj muskulaturi, jetri i crevima (Bates i sar., 2000). Tokom embriogeneze ovaj enzim ima veliku ulogu u homeostazi tireoidnih hormona jer izlaganje embriona visokom nivou tireoidnih hormona majke može dovesti do malformacija, poremećenog rasta, mentalne retardacije, pa čak i smrti ploda. Pošto koža adultnih pacova sadrži najveću količinu rT3, smatra se da ID3 aktivnost u homogenatima kože može biti dobar pokazatelj aktivnosti ovog enzima in vivo (Huang i sar., 1985). Dejodinaza 3 je takođe integralni membranski protein (Schoenmakers i sar., 1995). Aktivnost dejodinaze 3 raste kod hipertireoidizma, a opada u CNS-u pacova tokom hipotireoidizma (Kaplan i Yaskoski, 1980). U svim regijama CNS-a u kojima je zastupljena iRNK za ID3, u zavisnosti od stepena hipertireoidizma, nivo se povećava i 31 do 50 puta u odnosu na eutireoidne jedinke, a najizraženije povećanje je u cerebelumu. Još uvek nije jasno da li je ovo povećanje nakon kratkog izlaganja T3 posledica povećane transkripcije gena za ID3, povećane stabilnosti iRNK za ID3 ili kombinacija ova dva faktora. Na kulturama astroglijalnih ćelija je takođe potvrđeno povećanje aktivnosti ID3 nakon dodavanja i T4 i T3 u medijum (Esfandiari i sar., 1992). Međutim, aktivnost ID3 nije povećana u placenti hipertireoidnih pacova što ukazuje na različit odgovor gena na povišenje T3 u različitim tkivima (Emerson i sar., 1988). 2.4.4. Uloga dejodinaza u regulaciji tireoidne osovine Štitasta žlezda oslobađa T4 i T3 pod uticajem tireostimulirajućeg hormona (TSH) iz prednjeg režnja hipofize. Proces je regulisan negativnom povratnom spregom jer povišenje nivoa T4 vrlo brzo dovodi do smanjenog oslobađanja TSH kod hipotireoidnih pacova. Smanjeno oslobađanje TSH počinje 15-30 minuta nakon davanja radioaktivnih T3 ili T4 pri čemu je već 15 minuta nakon aplikacije radioaktivnog T4 uočen radioaktivni T3 vezan za receptore unutar ćelija hipofize. Kako se ceo proces nije inhibirao sa PTU (inhibitor ID1), a nije se mogao objasniti ni količinom radioaktivnog T3 u plazmi, Silva i Larsen (1978) su pretpostavili da postoji neki drugi mehanizam regulacije nivoa TSH. Pretretman jopanoičnom kiselinom (inhibitor ID2), blokirao je generisanje T3 u ćelijama hipofize i biološki efekat T4 na oslobađanje TSH (Larsen i sar., 1979). Kasnija istraživanja su pokazala da je ovakav mehanizam intracelularnog prevođenja T4 u T3 zastupljen u CNS-u i mrkom masnom tkivu (Bianco i Silva, 1987). 32 Unutarćelijska dejodinacija T4 se odvija zahvaljujući ID2 te je ovaj enzim neophodan za regulisanje fizioloških nivoa T4 i T3 kao i lučenje TSH. Kasnija istraživanja su pokazala da normalizacija nivoa T4 i T3 u plazmi suprimira iRNK tireotropnog oslobađajućeg faktora (TRH) u paraventrikularnim jedrima hipotalamusa. Kako TRH stimuliše sintezu i oslobađanje TSH, na taj način se normalizuje i nivo TSH kod tireoidektomisanih pacova (Segerson i sar., 1987). ID2 je zapažena i u tanicitima (Guadano-Ferraz i sar., 1997), ependimskim ćelijama koje se nalaze u bazi treće moždane komore, a čiji produžeci prodiru duboko u hipotalamus. Iako nije potvrđeno, izgleda da ove ćelije učestvuju u prenošenju signala do tireotropnih ćelija prevodeći T4 u T3. ID1 Hipotalamus Hipofiza TSH TRH CNS ID2 ID2 ID2 ID3 ID2 T4 T4 T3 T3 - - - ID1 Brzi pul Jetra Bubrezi Ostali CNS, oK ža ? Ostali ID3 ID2 Spori pul CNS, BAT Skeletni mišići T2rT3 Slika 2.8. Shema regulacije lučenja tireoidnih hormona. 33 2.4.5. Homeostaza T3 Smatra se da štitasta žlezda ljudi luči T4 i T3 u odnosu 15:1, a da je ova proporcija određena odnosom T4/T3 u tireoglobulinu (Larsen, 1975). Proizvodnja T3 se odvija u dva nezavisna procesa, sekrecijom štitaste žlezde i dejodinacijom u mnogim ekstratireoidnim tkivima koju katalizuju jodotironin dejodinaze 1 i 2. Relativno učešće ekstratireoidnih tkiva u proizvodnji T3 određivano je kod eutireoidnih pacova primenom propiltiouracila (PTU), pri čemu je konverzija T4 u T3 opala za 50% (Oppenheimer i sar., 1972). Kod tireoidektomisanih pacova kojima je dat T4, primena PTU koji blokira ID1, ali ne i ID2, je dovela do pada koncentracije T3 za 50% (Larsen i Frumess 1977) te je zaključeno da ova dva puta podjednako učestvuju u proizvodnji ekstratireoidalnog T3. U krvnoj plazmi pacova je 40% T3 tireoidnog, a 60% T3 ekstratireoidnog porekla. Koncentracija T3 i T4 u krvnoj plazmi je konstantna te su sva tkiva izložena istim koncentracijama T3 i T4. Prema tome, razlika u koncentracijama T3 u različitim tkivima je posledica aktivnosti dejodinaza u njima. Povećanje odnosno smanjenje intracelularne koncentracije T3, a posledično tome i formiranje kompleksa T3 sa receptorima u jedru, odvija se relativno nezavisno od nivoa hormona u plazmi te uticaj hormona plazme na ciljno tkivo nije uvek isti. Zasićenost receptora u jedru sa T3 u jetri i bubrezima je oko 50%, a u centralnom nervnom sistemu 95% (Crantz i sar., 1982). Kasnije je ova pojava povezana sa aktivnošću ID2 kao glavnog generatora intracelularnog T3. U tkivima hipofize, mozga i mrkog masnog tkiva, u kojima je zastupljena ID2, T3 potiče od intracelularne konverzije T4 u T3. U navedenim tkivima je znatno veća zasićenost receptora (70-90%) pri čemu je čak do 80% vezanog T3 nastalo dejodinacijom T4 unutar ćelija. U tkivu jetre i bubrega u kojima je zastupljena ID1, T3 vezan za receptore je uglavnom poreklom iz krvne plazme (Silva i sar., 1978). 2.4.6. Intracelularna homeostaza T3 Količina T3 u plazmi se brzo uravnotežuje sa većinom ostalih tkiva jer tireoidni hormoni spadaju u relativno male hidrofobne molekule koji lako prolaze kroz ćelijsku membranu putem energetski zavisnih stereospecifičnih procesa (Hennemann i sar., 2001) zavisnih od nekoliko transportera kao što su MCT8 (monocarboxylate transporter 8) i MCT10 (monocarboxylate transporter 10) (Friesema i sar., 1999, 2003. i 2008.), 34 transportera aminokiselina, klasičnih multispecifičnih katjon/anjon organskih transportera (Friesema i sar., 1999) i translokaza masnih kiselina (Van der Putten i sar., 2003). Od transportera aminokiselina koji prenose i tireoidne hormone, spominju se sistem L (leucin) i sistem T (triptofan). Tabela 2.2. Transportni proteini tireoidnih hormona kod pacova (Rasmussen, 2007). Protein transporter Tkivo Hormon NTCP jetra, bubrezi T4, rT3, T3, T2 OATP1A1 OATP1A4 jetra, bubrezi, retina T4, T2, T3, rT3 OATP1A5 bubrezi, retina, jetra T3, T4 OATP1B2 jetra T3, T4 OATP1C1 mozak T4, rT3, T3 OATP4A1 mnoga tkiva T3 (T4, rT3) OATP4C1 T3 (T4) OATP6B1 testis T4, T3 OATP6C1 testis T4, T3 LAT1 tumori T2, rT3, T3, T4 LAT2 tumori T2, rT3, T3, T4 MCT8 oko, hipofiza, druga tkiva T3, T2, T4, rT3 MCT-monokarboksilatni transporter, OAT-organski anjonski transporteri, NTCP- natrijum tauroholat kotransportni polipeptid. Sistem L je nezavisan transporter za velike neutralne aminokiseline. U tkivima sisara je veoma zastupljen, a karakterističan je po tome što prenosi i aromatične aminokiseline kao što je triptofan. Postoje L1 i L2 transportni sistemi. Trijodtironin kompetitivno inhibira L1 transportni sistem u kultivisanim astrocitima pacova (Blondeau i sar., 1993). Sistem T je jonski nezavistan transporter koji prenosi aromatične aminokiseline, a da je on odgovoran i za transport tireoidnih hormona pokazano je na eritrocitima (Zhou i sar., 1990). Nakon ulaska u ciljne ćelije, tireoidni hormoni se vezuju za svoje receptore koji se nalaze u jedru. Regulacija ekspresije različitih gena pomoću tireoidnih hormona odvija se preko receptora tireodnih hormona (TR). Receptori tireoidnih hormona pripadaju superfamiliji jedarnih receptora, a do sada je pronađeno nekoliko formi ovih 35 proteinskih molekula, TRα, TRβ1 i TRβ2. Efekti aktiviranja receptora na regulaciju genske aktivnosti se postižu vezivanjem za specifične sekvence DNK definisane kao elementi za odgovor na tireoidni hormon (thyroid hormone response elements-TRE) u regulatornim regijama ciljnih gena. U odsustvu T3, receptori su vezani za TRE kao monomeri ili kao homodimeri, a najčešće kao heterodimeri sa retinoid X receptorom koji je takođe jedarni receptor. U zavisnosti od prirode TRE, receptor može inhibirati ili aktivirati ekspresiju gena. Receptori imaju 3 domena. Prvi, N-terminalni A/B domen je aktivacioni domen (AF1); drugi, centralno postavljen domen se vezuje za DNK (DNA binding domain-DBD); treći domen vezuje ligand (ligand binding domain-LBD) i poseduje aktivacioni ligand zavisni domen (AF2). Pomenute forme tireoidnih receptora imaju slične domene za vezivanje DNK i liganda, ali su velike razlike u A/B domenima. Različite forme receptora imaju posebne funkcije. Sindrom rezistencije na tireoidne hormone je izazavan mutacijom na LBD domenu TRβ pri čemu je TRα nepromenjen. U većini slučajeva, vezivanje ili otpuštanje liganda ne menja afinitet receptora za vezivanje na DNK već za vezivanje posredničkih molekula. Ovi posrednički molekuli mogu biti koaktivatori ili korepresori. Od koaktivatora TR receptora treba spomenuti nekoliko proteina iz familije p160 (steroidni receptor koaktivator 1 (SRC), transkripcioni intermedijarni faktor 2); familije p300 (CREB vezujući protein-cAMP response element binding protein-binding protein, p/CAF-CBP associated factor); TRAP (TR associated protein). Korepresori su Ncor (nuclear corepressor) i SMRT (silencing mediator for RXR and TR). U odsustvu liganda, TR se vezuje za korepresor kompleks koji inhibira transkripciju tako što blokira deacetilaciju histona. Vezivanje liganda izaziva konformacione promene u samom receptoru koji za posledicu ima zamenu korepresor kompleksa koaktivator kompleksom pri čemu neki od njih (p160, CBP/p300i P/CAF) deluju na histon kao acetiltransferaza što dovodi do remodeliranja samog histona koji aktivira transkripciju (Wu i Koenig, 2000). Multiproteinski kompleks TRAP, koji se vezuje za T receptore kada je vezan T3, ne deluje na ’remodeliranje’ histonskog proteina već reaguje direktno sa TBP (TATA box binding protein) i na taj način pojačava aktivaciju gena (Yuan i sar., 1998). Za razliku od prethodno navedenih koaktivatora koji su nespecifični, protein NRIF3 (nuclear receptor-interacting factor 3) je specifični koaktivator TR (Li i sar, 1999). 36 Normalna zasićenost T receptora je u većini tkiva 40-50% (Oppenheimer, 1979) te se nivo T3 u plazmi tokom hipo- i hipertireoidizma ogleda u promeni zasićenosti receptora u tkivima, a to determiniše biološki efekat tireoidnih hormona na ta tkiva. U ovim tkivima je pretežno eksprimirana ID1. Međutim, u hipofizi, mozgu, mrkom masnom tkivu u kojima je glavni izvor T3 unutarćelijska konverzija T4 pomoću ID2, zasićenost receptora je znatno veća i iznosi 70-90% pri čemu je 50-80% vezanog T3 nastalo ovim procesom, a ostatak je poreklom iz plazme (Bianco i Silva, 1987). Položaj jedne i druge dejodinaze može objasniti ovu razliku. ID1 nema značajnu ulogu u unutarćelijskoj homeostazi T3 pošto je protein plazma membrane te nastali T3 vrlo brzo napušta ćelije u kojima je zastupljen ovaj enzim. Međutim, ako je u tkivima zastupljena ID2, nastali T3 ne napušta ćeliju. Uloga ID2 u unutarćelijskoj homeostazi je dobro proučena u mrkom masnom tkivu, hipofizi i mozgu. Poznati su još neki biološki efekti unutarćelijske konverzije pomoću ovog enzima kao što su povratna regulacija lučenja TSH, sinteza hormona rasta kod pacova, uticaj na gene uključene u adaptivnu termogenezu u mrkom masnom tkivu. 2.4.7. Uticaj Se na sintezu T3 i T4 Deficit selena ima komplekan uticaj na sintezu tireoidnih hormona. Tkiva različito reaguju na nedostatak ovog elementa. Tako mozak, hipofiza, štitasta žlezda, nadbubreg i gonade zadržavaju selen i pored smanjenog unosa, dok u krvnoj plazmi, jetri, skeletnim mišićima i srcu njegova količina dramatično opada (Bates i sar., 2000). Prema tome, uticaj deficita selena na sintezu selenoproteina kao što su selenodejodinaze i glutation peroksidaze, zavisi od tkiva u kojem se nalaze. Meinhold i sar. (1992) su uočili da je aktivnost ID1 u štitastoj žlezdi očuvana, a u jetri opada prilikom nedostatka selena. Kod intaktnih pacova deficit selena je povezan sa porastom koncentracije T4, ali malom promenom koncentracije T3 u serumu, pri čemu je koncentracija TSH nepromenjena (Meinhold i sar., 1993; Veronikis i sar., 1996). Takođe, opada aktivnost ID1 u bubrezima što je povezano sa padom nivoa iRNK za ID1. Ovo se međutim ne događa u jetri gde je zapažen pad u aktivnosti ID1, ali ne i pad koncentracije iRNK za ID1 (DePalo i sar., 1994). Kod ljudi sa deficitom selena je zapaženo blago povišenje T4 i odnosa T3/T4, ali bez porasta nivoa TSH. Pogoršanje tireoidnog statusa nakon dodavanja selena kod ljudi koji su imali udruženi nedostatak joda i selena, a koji se 37 očitovao u vidu porasta TSH i pada serumskog T3, ukazao je na protektivnu ulogu pada aktivnosti ID1 (Contempre i sar., 1992). Nekoliko grupa autora je proučavalo uticaj selena na tireoidni status pacova kao i ulogu ID1 jetre i bubrega na produkciju T3 plazme. U svim ovim eksperimentima je pri deficitu selena uočen pad aktivnosti ID1 u jetri i očuvanje aktivnosti ovog enzima u štitastoj žlezdi i hipofizi. Neočekivao su dobijene male promene nivoa serumskog T3 iako je došlo do blagog povećanja T4 i reverznog T3 (Chanoine i sar., 1992). Ovakav nalaz bio je u neskladu sa procenom da je oko 60% cirkulišućeg T3 poreklom iz jetre i bubrega. Kasnija istraživanja su pokušala da eliminišu ovaj problem te su eksperimenti rađeni na tireoidektomisanim životinjama kojima je dodavan T4. Ovakva proučavanja su analogna eksperimentima sa PTU kod kojih je smanjena ekstratireoidalna konverzija T4 u T3 za 50% (Frumes i Larsen, 1975; van Doorn i sar., 1983). Chanoine i saradnici (1993) su prilikom izazvanog deficita selena smanjili aktivnost ID1 u jetri za 93%, ali i pored toga je bio relativno očuvan nivo T3 u krvnoj plazmi te su na osnovu svojih nalaza zaključili da štitasta žlezda proizvodi najveći deo cirkulišućeg T3. U kasnijim istraživanjima, Veronikis i sar. (1996) su uočili da je prilikom dodavanja T4 tireoidektomisanim pacovima, koncentracija T3 u serumu pala za oko 25%, a pad ukupne proizvodnje T3 je iznosio 32% što je bilo slično efektu propiltiouracila u istom eksperimentu. Manji pad T3 u odnosu na uobičajenih 60% ostao je nerazjašnjen. Nijedan od gore pomenutih eksperimenata nije uzeo u obzir konverziju T4 u T3 pomoću enzima ID2 u tkivima otpornim na deficit selena. Nguyen i saradnici (1998) su tireoidektomisanim pacovima dodavali obeležene T4 i T3 i na osnovu složenih kinetičkih merenja zaključili da je udeo ID1 i ID2 u produkciji ekstratireoidalnog T3 podjednak. Mittag i sar. (2010) su u svom eksperimentu na miševima sa mutacijom TRα 1 i time izazavanom hipotireozom, proučavali uticaj tireoidnih hormona na metabolizam selena. Kod ovih jedinki se javlja statistički značajno niža koncentracija selena u cirkulaciji u odnosu na kontrolu s tim što se nakon aplikacije T3 i kod mutanta i kod kontrole nivo serumskog selena povećava za 20%. Osim toga, nakon tretmana sa T3, došlo je do smanjenja aktivnosti GPx1 u jetri mutanata i kontrolnih životinja. Aktivnost GPx3 oglednih jedinki se nije menjala dodavanjem T3 dok je količina sep P statistički značajno porasla. 38 3. Cilj i zadaci istraživanja Imajući u vidu navedene činjenice, istraživanje je bilo usmereno ka sledećim ciljevima i zadacima: 1. Da se prati uticaj deficita selena i blokatora dejodinaza na telesnu masu juvenilnih pacova. 2. Da se utvrdi uticaj deficita selena i blokatora dejodinaza na funkciju tireoidne osovine, odnosno nivo ТSН, Т3 i Т4 u krvi pacova. 3. Da se utvrdi status selena kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki određivanjem koncentracije selena u krvi pacova. 4. Da se utvrdi status selena kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki uz primenu blokatora dejodinaza (PTU i jopanoične kiseline) određivanjem koncentracije selena u krvi pacova. 5. Da se utvrdi aktivnost selenoenzima glutation peroksidaze 1 u eritrocitima i glutation peroksidaze 3 u krvnoj plazmi selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki. 6. Da se utvrdi aktivnost selenoenzima glutation peroksidaze 1 u eritrocitima i glutation peroksidaze 3 u krvnoj plazmi selenadekvatnih i selendeficitnih pacova uz primenu blokatora dejodinaza. 7. Da se dobijeni rezultati statistički obrade. 39 4. Materijal i metode rada Pri izradi plana ogleda i izbora metoda uzeti su u obzir ciljevi i zadaci rada, kao i odgovarajući podaci iz literature. 4.1. Materijal 4.1.1. Izbor materijala U cilju ispitivanja uticaja blokatora dejodinaza na parametre tireoidne osovine kod selen-adekvatnih i selendeficitnih juvenilnih pacova, organizovan je ogled po grupno-kontrolnom sistemu u Agenciji za lekove u Beogradu. Za ogled su korišćeni Wistar pacovi stari 21 dan, prosečne telesne mase 48.6±7.8 g, poreklom od “Charles- River”, Mađarska. Ispitivanja su izvedena na jedinkama muškog pola. U metalne kaveze su smeštene po 4 životinje, pri čemu je prostorija imala dvanaestočasovni svetlosni režim sa prosečnom temperaturom vazduha 24±1 0C. Hranjenje i napajanje su bili ad libitum. 4.1.2. Eksperimentalni protokol Ogled je izveden na ukupno 128 pacova podeljenih u osam jednakih grupa od po 16 jedinki. Pola oglednih životinja (8 jedinki po grupi) je u eksperimentu bilo 3 nedelje, a druga polovina 7 nedelja. Formirane su sledeće ogledne grupe: Grupa 1 2 3 4 5 6 7 8 Tretman Se+ PTU- IA- Se+ PTU+ IA+ Se+ PTU+ IA- Se+ PTU- IA+ Se- PTU- IA- Se- PTU+ IA+ Se- PTU+ IA- Se- PTU- IA+ Selenadekvatna grupa, netretirana blokatorima (Se+PTU-IA-), tokom ogleda je posmatrana kao kontrolna grupa. Grupe sa oznakom Se+ (1, 2, 3 i 4) su dobijale hranu za pacove koja je sadržala 0.334 mg selena po kilogramu hrane, a grupe sa oznakom Se- (5, 6, 7 i 8) su hranjene selendeficitnom hranom (0.031 mg selena/kg hrane). Sastav kontrolne i selendeficitne hrane su prikazani u tabeli 4.1.1. 40 Grupe 2,3,6 i 7 (PTU+) su preko vode za piće dobijale propiltiouracil (PTU). Koncentracija PTU u vodi za piće je bila 150 mg/l, pri čemu je svaki dan pravljen svež rastvor. Zbog gorkog ukusa PTU u vodu je dodavan veštački zaslađivač. Grupe sa oznakom PTU- su napajane normalnom vodom za piće. Jedinkama iz grupa 2, 4, 6 i 8 (IA+) je svakih sedam dana intraperitonealno aplikovana jopanoična kiselina u dozi 6 mg/100 g TM. Tokom ogleda su svakih sedam dana vršena kontrolna merenja telesne mase pacova. Na kraju ogleda jedinke su uvedene u etarsku anesteziju, a zatim je kardijalnom punkcijom uzeto 3-5 ml krvi. Deo krvi je korišćen za određivanje koncentracije selena i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze (GPx1), a deo za dobijanje plazme nakon centrifugovanja u epruvetama na 3000 obrtaja/min tokom 20 minuta. Kao antikoagulaciono sredstvo je korišćen heparin (15 IJ heparina po ml krvi). Iz plazme je odmah određivana aktivnost glutation peroksidaze (GPx3), a ostatak plazme je zamrznut na -200C da bi se kasnije odredile koncentracije hormona T3, T4 i TSH. 4.1.3. Ishrana pacova Pacovi su hranjeni specijalnim gotovim smešama za ishranu pacova proizvođača Altromin (Nemačka) i to kontrolnom C-1000 (grupe 1,2,3 i 4) i selendeficitnom C-1045 (grupe 5,6,7 i 8) čiji je hemijski sastav prikazan u tabelama 4.1.1. i 4.1.2. Tabela 4.1.1. Hemijski sastav hrane za pacove (Altromin) Hemijski sastav Kontrolna hrana (C-1000) Selendeficitna hrana (C-1045) Metabolička energija (kcal/kg) 3518.1 3502.9 Sirovi proteini (%) 17.61 17.33 Sirova mast (%) 5.08 6.02 Sirova vlakna (%) 4.04 3.53 Sirov pepeo (%) 5.49 5.52 Kalcijum g/kg 9.53 9.25 Fosfor g/kg 14.74 14.7 Lizin g/kg 17.4 11.5 Metionin + Cistin g/kg 13.89 13.8 41 Tabela 4.1.2. Količina vitamina i mikroelemenata mg/kg (Altromin) Ingredijent C-1000 C-1045 Ingredijent C-1000 C-1045 Vitamin A IU./kg 15 000 16 500 Magnezijum mg/kg 739.8 769.27 Vitamin D3 IU/kg 500 550 Natrijum mg/kg 2500.16 2466.2 Vitamin E mg/kg 163.9 165.0 Kalijum mg/kg 7171.34 9202.9 Vitamin K3 mg/kg 10.00 11.00 Bakar mg/kg 5.641 8.426 Vitamin B1 mg/kg 20.04 22.00 Gvožđe mg/kg 178.58 174.31 Vitamin B2 mg/kg 20.32 22.00 Cink mg/kg 29.30 46.73 Vitamin B6 mg/kg 15.03 16.50 Mangan mg/kg 100.89 98.99 Vitamin B12 mg/kg 0.04 0.033 Jod mg/kg 0.450 0.410 Nikotinska kis. mg/kg 50.17 55.00 Kobalt mg/kg 0.147 0.147 Pantotenska kis. mg/kg 50.11 55.00 Selen mg/kg 0.334 0.031 Folna kiselina mg/kg 10.01 11.00 Holin hlorid mg/kg 1 011.5 1 100.0 Biotin mg/kg 0.2 0.4 Vitamin C mg/kg 20.00 22.00 4.2. Metode 4.2.1. Određivanje parametara tireoidne osovine Procena tireoidnog statusa ispitivanih jedinki vršena je na osnovu vrednosti koncentracija trijodtironina (T3), tiroksina (T4) i tireostimulirajućeg hormona (TSH). 4.2.1.1. Određivanje koncentracije T3 i T4 Za određivanje koncentracija slobodnog i vezanog trijodtironina (T3) i tiroksina (T4) korišćeni su komercijalni RIA kitovi (INEP, Zemun). Test se zasniva na kompetitivnom vezivanju serumskog T3 i T4 i radioaktivno obeleženih T3 i T4 za mali, ali određeni broj epitopa na specifičnim anti-T3 i anti-T4 antitelima, pri čemu nastaju obeleženi i neobeleženi imunokompleksi. Ukoliko ima više serumskog T3 i T4, formira 42 se manje obeleženog kompleksa. Posle završene reakcije svi nastali kompleksi su taloženi polietilenglikolom (PEG) dok su slobodni obeleženi i neobeleženi T3 i T4 kao i slobodna antitela zaostala u tečnoj fazi. Radioaktivnost taloga merila se gamascintilacionim brojačem CompuGamma LKB, Belgija. Istovremeno sa uzorcima seruma su tretirani i standardi koji sadrže različite, ali tačno definisane koncentracije T3 i T4. Na osnovu očitanih vrednosti standarda je formirana standardna kriva pomoću koje su određivane koncentracije T3 i T4 u uzorcima. 4.2.1.2. Određivanje koncentracije TSH Za određivanje koncentracija tireotropnog hormona (TSH) u plazmi oglednih životinja korišćen je RIA kit (MP Biomedicals, Belgija). Test se zasniva na kompetitivnom vezivanju TSH i radioaktivno obeleženog 125I-TSH za epitope visokospecifičnih poliklonskih zečijih antiTSH antitela. Zbog konstantnih koncentracija obeleženog TSH i anti-TSH antitela, količina nagrađenih imunokompleksa je zavisila od koncentracije TSH u uzorku plazme. Nakon inkubacije su se odvajali slobodni i vezani TSH dodavanjem sekundarnog antitela (mišije monoklonsko anti zečije IgG antitelo). Radioaktivni imunokompleksi su precipitovani centrifugiranjem nakon čega je očitavana radioaktivnost gamascintilacionim brojačem CompuGamma LKB, Belgija. Istovremeno sa uzorcima seruma su tretirani i standardi koji sadrže različite, ali tačno definisane koncentracije TSH. Na osnovu očitanih vrednosti standarda je formirana standardna kriva pomoću koje su određivane koncentracije TSH u uzorcima. 4.2.2. Određivanje parametara statusa selena Status selena eksperimentalnih jedinki procenjivan je na osnovu količine selena u punoj krvi i na osnovu aktivnosti glutation peroksidaze u plazmi (GPx3) i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze (GPx1) u eritrocitima. 4.2.2.1. Određivanje koncentracije selena u punoj krvi Koncentracija selena u punoj krvi pacova je određivana hidridnom tehnikom na atomskom absorpcionom spektrofotometru. Selen je iz organske materije preveden u 43 neorgansko stanje mikrotalasnom digestijom u mikrotalasnoj peći Milestone, model Touch Control. Svaki uzorak je izmeren i preliven sa 8 mL koncentrovane azotne kiseline i 2 mL 30% vodonik peroksida. Smesa je u teflonskoj kiveti izlagana temperaturi od 1800C tokom 15 minuta po predefinisanom temperaturnom programu. Nakon destrukcije organske materije, sadržaj kivete je prenesen u normalni sud od 25 mL i dopunjen sa 5M hlorovodoničnom kiselinom. U ovako pripremljenom uzorku selen je bio u obliku Se(VI). Zagrevanjem sa 5M HCL došlo je do redukcije Se (VI) u Se(IV) koji sa NaBH4 stvara SeH4. Koncentracija nastalog SeH4 se određuje atomskom apsorpcijom. Analiza je izvedena na uređaju Thermo electron Solaar AA, Series 4, sa VP70 hidridnim modulom i električnim zagrevanjem kvarcne kivete pomoću EC 90 peći. Uzorci su u hidridni modul unošeni pomoću AS 2000 autosamplera. Noseći gas za SeH4 bio je argon čistoće 4.8 sa protokom od 250 mL/min. Stabilizaciono vreme hidridnog modula tokom građenja hidrida bilo je 50 sekundi po uzorku, merenje apsorpcije je vršeno u tri replikata po 4 sekunde, a čišćenje sistema i priprema za sledeći uzorak je trajalo 60 sekundi. Kvarcna kiveta je zagrevana na 9000C. Apsorpcija je merena na 196 nm. Merenje apsorpcije je izvedeno uz pozadinsku korekciju sa deuterijumovom lampom. Kontrola kvaliteta je izvedena merenjem 3 standardna rastvora selena (5, 10 i 20 ug/L), izradom kalibracione prave i jednačine prave. Korelacioni koeficijent standardne prave je bio 0.998. Standardni rastvori su injektovani na početku i na kraju svakog analitičkog lota. Kontrola kvaliteta je takodje izvođena analiziranjem sertifikovanog referentnog materijala BCR 185 (IRMM, Belgija). Dobijene vrednosti za replikate su bile u okvirima sertifikovane vrednosti. 4.2.2.2. Određivanje aktivnosti glutation peroksidaze u punoj krvi i plazmi Aktivnost citosolne glutation peroksidaze (GPx1) i glutation peroksidaze krvne plazme (GPx3) određivana je metodom po Günzler i sar. (1974) na spektrofotometru Cecil 2000, sa vodenim kupatilom i termostatom sa stalnom temperaturom pri merenju od 37C. Princip merenja je baziran na spektrofotometrijskom registrovanju potrošnje NADPH u kuplovanom enzimskom sistemu. U ovom nizu reakcija GPx prisutna u uzorku pune krvi vrši redukciju tercijarnog butil hidroperoksida (TBH). Glutation se, kao neposredni davalac vodonika, oksiduje u GS-SG. U drugoj fazi oksidovani glutation 44 (GS-SG) se regeneriše u redukovani oblik pomoću NADPH. Stabilnost koncentracije redukovanog glutationa (GSH) održava se tako što se sistemu dodaje enzim glutation reduktaza (GR) (E.C.1.6.4.2.). Dva minuta pošto reakcija počne dodavanjem TBH, brzina potrošnje NADPH se registruje u intervalima po 60 sekundi tokom 3 minuta na talasnoj dužini od 366 nm. Razlika u brzini potrošnje NADPH između uzorka i slepe probe predstavlja aktivnost GPx. Slepa proba sadrži date reagense u istim količinama, ali bez prisustva uzorka. Rastvori GR, GSH i NADPH (Sigma-Aldrich) uvek su sveže pripremani uz korišćenje redestilovane vode kao rastvarača za GR i GSH, odnosno 0.1% NaHCO3 za NADPH. Sastav neophodnih reagenasa i njihove koncentracije prikazani su u tabeli 4.3. U epruvetu je sipano 500 l kalijum fosfatnog pufera koji obezbeđuje optimalni pH sredine (pH=7) za delovanje GPx. Zatim je dodato 200 l glutationa (GSH), 50 l glutation reduktaze (GR), 20 l pune krvi hemolizovane Drapkinovim reagensom (razblaženje 11 puta) i 480 l redestilovane vode. Rastvor je preinkubiran u vodenom kupatilu 10 minuta na 37C nakon čega je dodato 200 l redukovanog koenzima (NADPH) i 550 l TBH. Nakon 2 minuta od početka reakcije vršeno je merenje potrošnje NADPH u intervalima od 30 sekundi. Aktivnost plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) određivana je istom postupkom pri čemu je količina uzorka plazme bila 5 l. Niska koncentracija TBH (< 2,32 mmol) koja je korišćena u ovoj metodi omogućava da se meri samo aktivnost selenzavisne glutation peroksidaze (Burk i sar., 1978). 45 Tabela 4.3. Sastav reagenasa koji su korišćeni za spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti GPx. Reagensi Zapremina (μl) Konačna koncentracija Kalijum fosfatni pufer (400 mmol/L, pH 7,0) 500 100 mmol/L EDTA (16 mmol/L) 4 mmol/L GSH (604 mmol/L) 200 6 mmol/L Glutation reduktaza (GR) 50 0,375 IJ/ml Puna krv (razbl. 11x); plazma 20;5 Redestilovana voda 480; 495 10 minuta preinkubacija na 37oC NADPH (3 mmol/L u 0,1% NaHCO3) 200 0,3 mmol/L Tercijarni butil-hidroperoksid (6,3 nmol/L) 500 1,575 mmol/L Start reakcije Posle 2 minuta, registrovanje potrošnje NADPH na 366 nm 4.3. Statistička obrada podataka Rezultati dobijeni u ovom ogledu su grupisani u odgovarajuće statističke serije i obrađeni uz primenu nekoliko matematičko-statističkih metoda korišćenjem programa MS Excel 2007 i GraphPadPrism5. U radu su primenjene sledeće metode: mere varijacije i metod dvofaktorske analize varijanse sa Bonferoni testom. Mere varijacije su omogućile da se prati varijabilitet unutar svakog obeležja, kako apsolutno, tako i relativno, a preko koeficijenta varijacije i poređenja varijacija između obeležja. Analize značajnosti statističkih razlika između pojedinih tretmana izvršene su Student t-testom na nivou rizika od 5%, 1% i 0,1%, pa su i zaključci dati sa odgovarajućom verovatnoćom (95%, 99% i 99.9%). Dobijeni i obrađeni rezultati su prikazani numerički u vidu tabela, a u cilju vizuelne komparacije eksperimentalno utvrđenih numeričkih vrednosti korišćeni su histogrami. Za ocenu korelacionih parametara korišćena je Pearson-ova tablica koeficijenata korelacije. 46 5. Rezultati 5.1. Telesne mase pacova Merenje telesne mase oglednih životinja vršeno je svakih sedam dana od ulaska jedinki u ogled. Na početku eksperimenta (0 dan) izmerena je masa svih oglednih životinja i u proseku je iznosila 48,6±7,8 g. Zatim su formirane grupe sa ujednačenim telesnim masama. Već nakon nedelju dana selendeficitne jedinke tretirane propiltiouracilom (ogledna grupa 7) su imale statistički značajno nižu telesnu masu (p<0,01) u odnosu na kontrolnu grupu (Tabela 5.1.1.). Ovakav trend se nastavio druge i treće nedelje pri čemu su razlike u telesnoj masi između ovih grupa postale statistički još značajnije (p<0,001). Nakon tri nedelje su sve selendeficitne grupe imale statistički značajno manju prosečnu telesnu masu od kontrolne grupe. Posle pet nedelja tretmana, grupe koje su preko vode dobijale PTU (2, 3, 6 i 7) su imale statistički značano niže telesne mase od kontrolne grupe pri čemu su selendeficitni pacovi (6 i 7) imali duplo manje telesne mase u odnosu na kontrolnu grupu. Nakon sedam nedelja tretmana, grupe tretirane sa PTU su imale statistički značajno niže telesne mase u odnosu na kontrolnu grupu na nivou značajnosti p<0,001. Selendeficitne jedinke tretirane sa jopanoičnom kiselinom (IA) su imale prosečno istu telesnu masu kao i selendeficitne jedinke koje nisu dobijale blokator. Takođe, selenadekvatne jedinke tretirane sa IA su imale slične telesne mase kao i kontrolna grupa. Tabela 5.1.1. Prosečna telesna masa (Xsr±SD) pacova tokom trajanja ogleda 7 nedelja (g). Grupa Nedelja 0 1 2 3 4 5 6 7 Se+ PTU- IA- 49,2±8,7 82,1±12,0 125,0±14,3 176,1±19,2 197,2±19,4 218,5±18,5 253,6±22,0 289,8±26,5 PTU+ IA+ 51,0±8,0 83,1±10,6 117,5±12,5 156,6±13,6 183,4±18,1 189,0±13,5b 206,1±12,9c 220,6±11,0c PTU+ IA- 52,4±10,3 85,6±9,7 125,0±12,5 160,0±17,8 193,0±16,6 194,8±19,1a 209,2±22,8c 233,9±27,9c PTU- IA+ 48,2±8,2 81,7±12,2 127,0±16,3 177,6±17,5 202,8±28,8 215,6±25,8 239,1±21,8 288,6±26,5 Se- PTU- IA- 53,6±6,0 75,8±7,2 108,9±9,8 b 154,5±14,2 b 187,1±15,0 197,5±14,7a 234,7±16,2a 267,0±17,4a PTU+ IA+ 54,7±7,0 75,3±9,1 99,9±10,7 c 119,1±12,6 c 133,5±10,1c 124,8±8,9c 124,5±9,3c 128,7±7,7c PTU+ IA- 48,5±6,1 68,5±8,1b 92,5±9,3 c 112,9±12,2 c 121,0±10,5c 111,3±9,0c 116,1±13,2c 119,7±14,4c PTU- IA+ 53,0±6,7 74,4±6,5 107,2±9,1 b 152,2±11,7 c 188,5±20,9 199,6±19,5a 223,1±19,7b 267,8±26,6 a-p<0,05 b-p<0,01 c-p<0,001 47 Analizirajući uticaj selena i blokatora na telesne mase metodom dvofaktorske analize varijanse, uočen je značajan uticaj oba faktora samostalno i u interakciji, nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana (Tabela 5.1.2.). Tabela 5.1.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na telesne mase pacova (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 4,58 (p<0,001) 124,5 (p<0,001) Status selena 146,30 (p<0,001) 138,3 (p<0,001) Blokatori x Se 35,25 (p<0,01) 20,26 (p<0,001) 48 5.2. Koncentracija tiroksina (T4) Nivo tiroksina u krvnoj plazmi ispitivanih grupa se nakon tronedeljnog tretmana kretao od 18,46±8,74 nmol/L do 94,48±15,89 nmol/L (Tabela 5.2.1., Grafikon 5.2.1.). Grupe koje su dobijale propiltiouracil (Se+PTU+IA+, Se+PTU+IA-, Se-PTU+IA+ i Se- PTU+IA-) su imale izrazito niže koncentracije T4 u odnosu na grupe koje su napajane vodom bez PTU. Tabela 5.2.1. Koncentracija tiroksina (T4) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja (nmol/L). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 7 85,94 23,689 10,594 27,56 51,26-115,16 PTU+ IA+ 7 33,21 6,977 2,848 21,01 23,97-43,85 PTU+ IA- 7 27,17 6,072 2,146 22,35 17,51-32,75 PTU- IA+ 7 93,28 12,513 4,729 13,41 76,91-112,68 Se- PTU- IA- 7 85,66 11,053 4,512 12,90 73,09-103,25 PTU+ IA+ 8 24,82 11,601 4,385 46,75 11,13-41,98 PTU+ IA- 7 18,46 8,736 3,907 47,32 10,67-28,12 PTU- IA+ 8 94,48 15,892 5,616 16,82 66,51-114,55 7 nedelja Se+ PTU- IA- 8 64,65 9,067 3,204 14,03 52,05-75,57 PTU+ IA+ 8 29,98 5,141 2,571 17,15 23,25-38,93 PTU+ IA- 8 14,78 6,477 2,896 43,81 6,20-27,27 PTU- IA+ 7 84,44 21,582 10,791 25,56 55,56-109,53 Se- PTU- IA- 8 82,56 8,542 3,487 10,35 68,22-99,85 PTU+ IA+ 5 3,69 2,095 1,048 56,77 1,65-6,98 PTU+ IA- 8 <5 / / / / PTU- IA+ 8 96,83 20,065 7,584 20,72 82,16-136,50 Slična situacija je zabeležena i sedme nedelje, kada su koncentracije T4 selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU bile toliko niske da su izašle iz opsega merljivosti korišćenih RIA kitova (Grafikon 5.2.2.). Nakon sedam nedelja tretmana 49 najviša prosečna koncentracija tiroksina je zabeležena u oglednoj grupi Se-PTU-IA+ i iznosila je 96,83±20,06 nmol/L. Grafikon 5.2.1. Koncentracija tiroksina (T4) u krvnoj plazmi oglednih pacova nakon 3 nedelje tretmana (nmol/L). Grafikon 5.2.2. Koncentracija tiroksina (T4) u krvnoj plazmi oglednih pacova nakon 7 nedelja tretmana (nmol/L). 50 Analizirajući uticaj selena i blokatora dejodinaza na koncentraciju tiroksina u krvi metodom dvofaktorske analize varijanse, uočen je snažan uticaj blokatora nakon tri nedelje tretmana (p<0,001), a nakon sedam nedelja, blokatori su samostalno i u interakciji sa selenom uticali na koncentraciju T4 (Tabela 5.2.2.). Tabela 5.2.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na koncentraciju tiroksina (T4) u krvnoj plazmi pacova (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 114,3 (p<0,001) 175,2 (p<0,001) Status selena 1,357 (p>0,05) 0,399 (p>0,05) Blokatori x Se 0,568 (p>0,05) 11,36 (p<0,001) Statistički značajno niže koncentracije T4 (p<0,001) nakon tronedeljnog i sedmonedeljnog tretmana zabeležene su u selenadekvatnim grupama kao i selendeficitnim grupama, tretiranim sa PTU. Kod jedinki koje su u eksperimentu bile sedam nedelja, statistički značajno povećanje koncentracije T4 u odnosu na kontrolnu grupu je zabeleženo kod selenadekvatnih i selendeficitnih grupa tretiranih jopanoičnom kiselinom (Tabela 5.2.3.) 51 Tabela 5.2.3. Značajnost razlika u vrednostima koncentracija tiroksina (T4) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja, Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001) 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** nsz nsz *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** *** nsz ** *** PTU+ IA- *** *** nsz nsz *** PTU- IA+ nsz *** *** nsz Se- PTU- IA- *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** PTU+ IA- *** PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** nsz nsz *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** *** nsz ** *** PTU+ IA- *** *** nsz nsz *** PTU- IA+ nsz *** *** nsz Se- PTU- IA- *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** PTU+ IA- *** PTU- IA+ Značajnost razlika u koncentracijama T4 u krvnoj plazmi pacova između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja prikazana je u tabeli 5.2.4. Dužina tretmana je uticala na pad koncentracije T4 pri čemu je statistički značajan pad uočen u kontrolnoj grupi kao i u oglednim grupama 3, 6 i 7. Statistički najznačajniji pad koncentracije T4 je zabeležen u selendeficitnoj grupi tretiranoj propiltiouracilom. Tabela 5.2.4. Značajnost razlika u koncentracijama tiroksina (T4) u krvnoj plazmi pacova između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ p<0,05 nsz p<0,01 nsz nsz p<0,01 p<0,001 nsz 52 5.3. Koncentracija trijodtironina (T3) Prosečne vrednosti koncentracije trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi pacova ispitivanih grupa kao i mere varijacije ovog parametra prikazane su u tabeli 5.3.1. Tabela 5.3.1. Koncentracija trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja (nmol/L). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 7 2,23 0,318 0,120 14,288 1,71-2,61 PTU+ IA+ 7 0,94 0,630 0,238 66,930 0,15-1,61 PTU+ IA- 8 1,20 0,405 0,143 33,727 0,62-1,57 PTU- IA+ 7 2,31 0,190 0,072 8,204 2,02-2,57 Se- PTU- IA- 7 1,92 0,291 0,110 15,152 1,53-2,29 PTU+ IA+ 8 1,03 0,573 0,202 55,825 0,35-1,77 PTU+ IA- 7 1,61 0,431 0,163 26,743 0,78-2,07 PTU- IA+ 6 2,21 0,315 0,129 14,275 1,81-2,73 7 nedelja Se+ PTU- IA- 8 1,74 0,173 0,061 9,946 1,33-1,90 PTU+ IA+ 8 1,92 0,127 0,045 6,607 1,79-2,10 PTU+ IA- 8 1,91 0,195 0,069 10,194 2 1,61-2,12 PTU- IA+ 8 1,73 0,218 0,080 12,202 1 1,45-2,02 Se- PTU- IA- 8 2,07 0,246 0,087 11,873 0 1,70-2,53 PTU+ IA+ 8 1,66 0,445 0,168 26,891 45 1,05-2,35 PTU+ IA- 8 1,12 0,540 0,191 48,127 24 0,21-1,63 PTU- IA+ 8 2,16 0,273 0,096 12,612 2 1,64-2,51 Najniža prosečna vrednost T3 nakon tri nedelje tretmana je zabeležena u oglednoj grupi 2 (Se+PTU+IA+) i iznosila je 0,94±0,63 nmol/L, a najviša u oglednoj grupi 4 (Se+PTU-IA+), 2,31±0,19 nmol/L. Niže vrednosti su bile izražene kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih propiltiouracilom (Grafikon 5.3.1.). Nakon sedam nedelja tretmana došlo je do izjednačavanja koncentracije T3 kod selenadekvatnih jedinki i vrednosti su se kretale od 1,73±0,22 nmol/L (ogledna grupa 4) do 1,92±0,13 nmol/L (ogledna grupa 2) (Grafikon 5.3.2.). Najniža vrednost ovog 53 parametra je zabeležena u selendeficitnoj grupi tretiranoj propiltiouracilom (ogledna grupa 7). Grafikon 5.3.1. Koncentracija trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi oglednih pacova nakon 3 nedelje tretmana (nmol/L). Grafikon 5.3.2. Koncentracija trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi oglednih pacova nakon 7 nedelja tretmana (nmol/L). 54 Metodom dvofaktorske analize varijanse, uočeno je da je tretman sa blokatorima uticao na vrednosti T3 u krvi i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana. Nakon sedam nedelja tretmana, i interakcija između selena i blokatora dejodinaza je takođe uticala na vrednosti T3 (Tabela 5.3.2.). Tabela 5.3.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na koncentraciju T3 u krvnoj plazmi pacova (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 27,74 (p<0,001) 6,339 (p<0,001) Status selena 0,034 (p>0,05) 0,898 (p>0,05) Blokatori x Se 1,843 (p>0,05) 13,68 (p<0,001) Selenadekvatne i selendeficitne ogledne životinje tretirane propiltiouracilom sa ili bez jopanoične kiseline su nakon tri nedelje imale statistički značajno niže vrednosti T3 (Tabela 5.3.3.). Nakon 7 nedelja tretmana, nisu postojale statistički značajne razlike između koncentracija T3 selenadekvatnih jedinki. Selendeficitna grupa tretirana sa PTU je imala statistički značajno nižu koncentraciju T3 u krvi u odnosu na kontrolnu grupu kao i u odnosu na selendeficitnu grupu netretiranu sa blokatorima (Se-PTU-IA-). 55 Tabela 5.3.3. Značajnost razlika u vrednostima koncentracija trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja, Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** nsz nsz *** * nsz PTU+ IA+ nsz *** ** nsz * ** PTU+ IA- *** ** nsz nsz *** PTU- IA+ * *** ** nsz Se- PTU- IA- ** nsz nsz PTU+ IA+ * *** PTU+ IA- * PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz ** nsz * ** PTU+ IA+ nsz nsz nsz nsz ** * PTU+ IA- nsz nsz nsz ** nsz PTU- IA+ * nsz * ** Se- PTU- IA- nsz ** nsz PTU+ IA+ nsz * PTU+ IA- *** PTU- IA+ Značajnost razlika u koncentracijama T3 u krvnoj plazmi pacova između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja prikazana je u tabeli 5.3.4. Kod selenadekvatnih jedinki tretiranih sa PTU (ogledne grupe 2 i 3), došlo je do statistički značajnog povećanja koncentracije T3 u krvi u periodu od treće do sedme nedelje tratmana. Kod selendeficitnih jedinki tretiranih i sa PTU i sa jopanoičnom kiselinom, došlo je do statistički značajnog porasta koncentracije T3, dok je tretman samo sa PTU doveo do pada koncentracije T3 u krvi. Tabela 5.3.4. Značajnost razlika u koncentracijama trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi pacova između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ p<0,01 p<0,001 p<0,001 p<0,001 nsz p<0,05 p<0,05 nsz 56 5.4. Koncentracija tireostimulirajućeg hormona (TSH) Nivo tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnoj plazmi oglednih životinja, nakon tri nedelje tretmana, bio je najniži u kontrolnoj grupi (Se+PTU-IA-) i iznosio je 2,947±0,825 ng/mL (Tabela 5.4.1., Grafikon 5.4.1.). Ogledne grupe tretirane propiltiouracilom su imale nekoliko puta veću koncentraciju TSH, i to 71,186±9,275 ng/mL grupa tretirana sa PTU i jopanoičnom kiselinom (Se+PTU+IA+), odnosno 87,827±10,339 ng/mL grupa tretirana samo sa PTU (Se+PTU+IA-). Tabela 5.4.1. Koncentracija tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja (ng/mL). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 5 2,98 0,825 0,369 27,750 2,45-4,17 PTU+ IA+ 5 71,19 9,275 4,148 13,029 60,43-86,02 PTU+ IA- 6 87,83 10,339 4,221 11,772 74,57-100,61 PTU- IA+ 6 6,02 2,779 1,134 46,185 2,84-9,29 Se- PTU- IA- 6 6,57 3,026 1,236 46,077 2,15-9,02 PTU+ IA+ 6 83,03 12,707 5,188 15,305 63,80-96,94 PTU+ IA- 6 85,43 15,639 6,385 18,306 60,72-108,16 PTU- IA+ 6 4,54 2,630 1,074 57,930 2,35-8,87 7 nedelja Se+ PTU- IA- 6 5,04 3,276 1,337 64,976 1,14-9,45 PTU+ IA+ 6 74,07 8,471 3,458 11,436 61,56-84,35 PTU+ IA- 5 73,70 13,203 5,905 17,915 50,81-83,05 PTU- IA+ 5 9,05 0,442 0,198 4,879 8,64-9,68 Se- PTU- IA- 5 8,91 0,635 0,284 7,126 8,01-9,67 PTU+ IA+ 5 91,38 13,049 5,836 14,280 75,45-106,28 PTU+ IA- 5 99,94 5,359 2,397 5,362 93,03-107,53 PTU- IA+ 4 7,57 2,234 1,117 29,506 4,30-9,34 Kod jedinki koje su u eksperimentu bile sedam nedelja (Tabela 5.4.1., Grafikon 5.4.2.), najniža srednja vrednost TSH je takođe zabeležena kod kontrolne grupe (5,04±3,28 ng/mL), a najviša kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU (99,94±5,36 ng/mL). 57 Grafikon 5.4.1. Koncentracija TSH u krvnoj plazmi pacova nakon 3 nedelje ogleda, (ng/mL). Grafikon 5.4.2. Koncentracija TSH u krvnoj plazmi pacova nakon 7 nedelja ogleda, (ng/mL). 58 Analizirajući uticaj selena i blokatora na koncentraciju TSH u krvi metodom dvofaktorske analize varijanse, uočen je veliki uticaj blokatora nakon tri nedelje tretmana (p<0,001), a nakon sedam nedelja, na nivo TSH u krvi su uticali i blokatori i status selena samostalno i u interakciji (Tabela 5.4.2.). Tabela 5.4.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na koncentraciju TSH u krvnoj plazmi pacova, (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 284,2 (p<0,001) 344,4 (p<0,001) Status selena 1,197 (p>0,05) 22,87 (p<0,001) Blokatori x Se 1,525 (p>0,05) 6,903 (p<0,001) Ogledne grupe koje su dobijale propiltiouracil (2, 3, 6 i 7) su imale statistički značajno viši nivo TSH u krvi od kontrolne grupe i nakon tri nedelje i nakon sedam nedelja tretmana (Tabela 5.4.3.). Selendeficitne jedinke su imale viši nivo TSH u odnosu na kontrolnu selenadekvatnu grupu i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana. 59 Tabela 5.4.3. Značajnost razlika u vrednostima koncentracija tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnoj plazmi pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja, Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** * * *** *** nsz PTU+ IA+ * *** *** nsz nsz *** PTU+ IA- *** *** nsz nsz *** PTU- IA+ nsz *** *** nsz Se- PTU- IA- *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** PTU+ IA- *** PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** * * *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** *** * *** *** PTU+ IA- *** *** nsz ** *** PTU- IA+ nsz *** *** nsz Se- PTU- IA- *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** PTU+ IA- *** PTU- IA+ U tabeli 5.4.4. su prikazane statističke značajnosti razlika koncentracija TSH između oglednih grupa nakon 3 i 7 nedelja tretmana. Nivo hormona je u gotovo svim grupama bio viši nakon tretmana od 7 nedelja. Međutim, kod kontrolne grupe (Se+PTU- IA-) i selenadekvatne grupe tretirane sa oba blokatora istovremeno (Se+PTU+IA+), kao i kod selendeficitnih grupa 5 i 6, ovo povećanje nije bio statistički značajno. Tabela 5.4.4. Značajnost razlika u koncentracijama tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnoj plazmi pacova između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t- test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ nsz nsz p<0,05 p<0,05 nsz nsz p<0,05 p<0,05 60 5.5. Procentualni odnos T3/T4 (procenat konverzije T4 u T3) Najniža procentualna zastupljenost T3 u odnosu na T4 treće nedelje ogleda je zabeležena u oglednoj grupi 8 (Se-PTU-IA+) i iznosila je 2,20%. Najviša vrednost je zabeležena u oglednoj grupi 7 (Se-PTU+IA-), a bila je 10,03%. Najviši procenat konverzije T4 u T3 je bio u grupama tretiranim propiltiouracilom i iznosio je 4,47% kod selenadekvatnih jedinki i 10,03% kod selendeficitnih jedinki (Tabela 5.5.1., Grafikon 5.5.1.). Tabela 5.5.1. Konverzija tiroksina u trijodtironin (T3/T4x100) kod pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja (%). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 7 2,71 0,608 0,230 22,37 2,09-3,94 PTU+ IA+ 7 2,65 1,50 0,565 56,37 0,57-4,40 PTU+ IA- 7 4,47 1,580 0,596 35,27 1,88-6,50 PTU- IA+ 7 2,51 0,307 0,116 12,24 2,16-2,96 Se- PTU- IA- 7 2,24 0,205 0,078 9,15 1,95-2,49 PTU+ IA+ 8 4,11 1,477 0,522 35,98 2,32-6,73 PTU+ IA- 7 10,03 4,483 1,694 44,71 6,16-16,54 PTU- IA+ 6 2,20 0,411 0,168 18,62 1,58-2,60 7 nedelja Se+ PTU- IA- 8 2,72 0,426 0,151 15,65 2,16-3,36 PTU+ IA+ 8 6,53 0,868 0,307 13,31 5,40-7,78 PTU+ IA- 8 15,19 6,497 2,297 42,77 7,78-27,51 PTU- IA+ 7 2,14 0,459 0,174 21,46 1,72-2,88 Se- PTU- IA- 8 2,51 0,135 0,048 5,38 2,30-2,70 PTU+ IA+ 5 62,06 31,330 14,040 50,49 32,34-100,0 PTU+ IA- / / / / / / PTU- IA+ 8 2,28 0,374 0,132 16,38 1,79-2,75 Nakon sedam nedelja tretmana, konverzija T4 u T3 u kontrolnoj grupi je ostala ista, a u grupama tretiranim propiltiouracilom je došlo do višestrukog povećanja procenta konverzije koji je kod ogledne grupe 2 (Se+PTU+IA+) iznosio 6,53% što je 2,46 puta više u odnosu na istovetno tretirane jedinke nakon 3 nedelje ogleda, a u 61 oglednoj grupi 3 (Se+PTU+IA-) 15,19%, što je 3,4 puta više u odnosu na istovetno tretirane jedinke nakon 3 nedelje ogleda. Kod selendeficitnih jedinki procentualno povećanje konverzije je bilo još izraženije te je u oglednoj grupi 6 (Se-PTU+IA+) iznosilo 62,06%, što je 15,1 puta veća konverzija u odnosu na konverziju kod istovetno tretiranih jedinki nakon 3 nedelje ogleda. Zbog niskih vrednosti tiroksina kod jedinki ogledne grupe 7 (Se-PTU+IA-), nije bilo moguće utvrditi tačan procenat konverzije T4 u T3, ali se, sudeći po vrednostima T3, približio vrednosti od 100% (Tabela 5.5.1., Grafikon 5.5.2.). Grafikon 5.5.1. Procenat konverzije T4 u T3 nakon 3 nedelje tretmana. 62 Grafikon 5.5.2. Procenat konverzije T4 u T3 nakon 7 nedelja tretmana. Nakon tri i nakon sedam nedelja, status selena i primena blokatora su značajno uticali na procenat konverzije tiroksina u trijodtironin (Tabela 5.5.2.), a što je pokazala analiza varijanse. Tabela 5.3.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na procenat konverzije T4 u T3, (dvofaktorska analiza varijanse- two- way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 21,07 (p<0,001) 32,12 (p<0,001) Status selena 9,672 (p<0,01) 54,93 (p<0,001) Blokatori x Se 7,825 (p<0,001) 18,37 (p<0,001) Nakon tri nedelje eksperimenta, statistički značajno veći procenat konverzije izračunat je u selenadekvatnim i selendeficitnim grupama tretiranim sa PTU. Ogledna grupa 6, koja je dobijala PTU i jopanoičnu kiselinu zajedno, imala je povećan procenat konverzije T4 u T3, ali ovo povećanje nije bilo statistički značajno. Nakon sedam 63 nedelja tretmana, statistički značajno povećanje procenta konverzije T4 u T3 je zabeleženo kod selendeficitnih jedinki kojima je aplikovana i jopanoična kiselina i PTU i to na nivou p<0,001. Selendeficitne jedinke tretirane PTU su imale visok nivo konverzije, ali tačan procenat kao i statističku značajnost nije bilo moguće odrediti zbog izrazito niskih vrednosti tiroksina u krvnoj plazmi oglednih životinja (Tabela 5.5.3.). Tabela 5.5.3. Značajnost razlika u konverziji T4 u T3 kod pacova nakon tretmana 3 i 7 nedelja, Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz * nsz nsz * ** nsz PTU+ IA+ * nsz nsz nsz ** nsz PTU+ IA- * ** nsz * ** PTU- IA+ nsz * ** nsz Se- PTU- IA- * ** nsz PTU+ IA+ * * PTU+ IA- ** PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- *** *** * nsz * / nsz PTU+ IA+ ** *** *** * / *** PTU+ IA- *** *** * / *** PTU- IA+ nsz * / nsz Se- PTU- IA- * / nsz PTU+ IA+ / * PTU+ IA- / PTU- IA+ Status selena i primena jopanoične kiseline nije dovela do promene konverzije T4 u T3 u periodu između treće i sedme nedelje tretmana, ali je primena PTU izazvala značajno povećanje stepena konverzije T4 u T3 (Tabela 5.5.4.). 64 Tabela 5.5.4. Značajnost razlika u konverziji T4 u T3 između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ nsz p<0,001 p<0,01 nsz p<0,05 p<0,05 p<0,001(?) nsz 5.6. Koncentracija selena u punoj krvi Prosečna koncentracija selena u punoj krvi eksperimentalnih životinja nakon tri nedelje tretmana je bila najniža u grupi sa selendeficitnom ishranom (Se-PTU-IA-) i iznosila je 58,17±8,26 μg/L. Najviša prosečna vrednost ovog parametra bila je zabeležena kod selenadekvatnih jedinki koje su dobijale jopanoičnu kiselinu i iznosila je 485,5±105,8 μg/L (Grafikon 5.6.1., Tabela 5.6.1.). Tabela. 5.6.1. Koncentracija selena u krvi pacova tokom ogleda, (μg/L). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 5 364,8 98,06 43,85 26,88 280,0-526,0 PTU+ IA+ 6 269,5 85,10 34,74 31,58 123,0-363,0 PTU+ IA- 6 477,7 105,41 43,03 22,06 291,0-586,0 PTU- IA+ 6 485,5 105,79 39,98 21,79 287,0-630,0 Se- PTU- IA- 6 58,17 8,26 3,37 14,19 47,0-70,0 PTU+ IA+ 4 67,25 4,50 2,25 6,69 62,0-71,0 PTU+ IA- 5 66,60 16,62 7,43 24,96 51,0-90,0 PTU- IA+ 8 63,50 13,88 4,91 21,85 41,0-86,0 7 nedelja Se+ PTU- IA- 7 514,0 125,1 47,27 24,33 308,0-665,0 PTU+ IA+ 5 315,6 168,6 75,40 53,43 189,0-566,0 PTU+ IA- 5 427,4 145,7 65,15 34,08 331,0-682,0 PTU- IA+ 6 493,8 171,5 70,03 34,74 287,0-785,0 Se- PTU- IA- 6 84,17 44,43 18,14 52,79 53,0-171,0 PTU+ IA+ 6 83,67 28,20 11,51 33,71 50,0-112,0 PTU+ IA- 5 94,20 41,54 18,58 44,10 73,0-164,0 PTU- IA+ 6 68,83 10,76 4,39 15,63 47,0-75,0 65 Nakon sedam nedelja tretmana, prosečna koncentracija selena je bila najviša u kontrolnoj grupi (Se+PTU-IA-) i iznosila je 514,0±125,1 μg/L, a najniža u selendeficitnoj grupi tretiranoj sa jopanoičnom kiselinom (Se-PTU-IA+) i iznosila je 68,83±10,76 μg/L, (Grafikon 5.6.2.). Grafikon 5.6.1. Koncentracija selena u punoj krvi pacova nakon 3 nedelje ogleda (μg/L). 66 Grafikon 5.6.2. Koncentracija selena u punoj krvi pacova nakon 7 nedelja ogleda (μg/L). Nakon tri nedelje tretmana, upotreba blokatora, kao i količina selena u ishrani su imali značajan uticaj na koncentraciju selena u krvi ispitivanih jedinki (Tabela 5.6.2.). Nakon sedam nedelja tretmana na ovaj parametar je uticao samo nivo selena u hrani. Tabela 5.6.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na koncentraciju selena u krvi pacova, (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 9,301 (p<0,001) 1,755 (p>0,05) Status selena 315,0 (p<0,001) 117,9 (p<0,001) Blokatori x Se 9,282 (p<0,001) 2,037 (p>0,05) Iako su razlike u koncentraciji selena u krvi selenadekvatnih jedinki bile očigledne, t-test nije pokazao statističke značajnosti između ovih grupa nakon tri nedelje tretmana. Selendeficitne grupe su u ovom periodu imale statistički značajno niže koncentracije selena u odnosu na kontrolnu grupu i to na nivou značajnosti p<0,001 (Tabela 5.6.3.). 67 Nakon sedam nedelja tretmana između koncentracija selena u krvi selenadekvatnih jedinki nisu postojale statistički značajne razlike, iako je grupa tretirana sa oba blokatora imala izrazito nižu koncentraciju. Selendeficitne jedinke su u istom periodu imale statistički značajno nižu koncentraciju selena u krvi u odnosu na kontrolnu grupu. Tabela 5.6.3. Značajnost razlika u koncentraciji selena kod jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz ** ** ** ** PTU+ IA+ ** ** ** ** ** ** PTU+ IA- nsz *** *** *** *** PTU- IA+ *** *** *** *** Se- PTU- IA- nsz nsz nsz PTU+ IA+ nsz nsz PTU+ IA- nsz PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz *** *** *** *** PTU+ IA+ nsz nsz * * * * PTU+ IA- nsz ** ** ** ** PTU- IA+ ** ** ** ** Se- PTU- IA- nsz nsz nsz PTU+ IA+ nsz nsz PTU+ IA- nsz PTU- IA+ Prilikom posmatranja razlika između jedinki tretiranih 3 nedelje i 7 nedelja, do statistički značajnog povećanja koncentracije selena u krvi je došlo samo u kontrolnoj grupi pri čemu kod ostalih grupa nisu utvrđene statistički značajne razlike (Tabela 5.6.4.). 68 Tabela 5.6.4. Značajnost razlika u koncentraciji selena između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ p<0,05 nsz nsz nsz nsz nsz nsz nsz 5.7. Aktivnost citosolne glutation peroksidaze (GPx1) Srednje vrednosti aktivnosti GPx1 posle tri nedelje tretmana su se kretale od 48,50±12,68 μkat/L (Se-PTU-IA+) do 175,5±51,73 μkat/L u grupi selenadekvatnih jedinki tretiranih jopanoičnom kiselinom (Se+PTU-IA+). Jedinke iz grupa hranjenih selendeficitnom hranom (5, 6, 7 i 8) su imale manju aktivnost ovog enzima (Tabela 5.7.1., Grafikon 5.7.1.). Tabela 5.7.1. Aktivnost citosolne glutation peroksidaze (GPx1) pacova, (μkat/L). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 8 153,3 28,55 12,77 18,62 114,2-186,3 PTU+ IA+ 4 141,1 39,53 16,14 28,02 71,5-176,9 PTU+ IA- 5 150,1 46,09 18,82 30,71 71,15-197,4 PTU- IA+ 4 175,5 51,73 19,55 29,48 76,21-238,0 Se- PTU- IA- 6 73,7 17,67 7,23 24,00 57,46-101,4 PTU+ IA+ 4 132,1 35,91 13,57 27,18 73,15-180,9 PTU+ IA- 5 67,0 12,62 5,64 18,82 46,11-78,91 PTU- IA+ 7 48,5 12,68 4,48 26,15 16,92-64,05 7 nedelja Se+ PTU- IA- 5 301,5 103,31 36,52 34,27 152,4-469,3 PTU+ IA+ 6 389,8 152,78 76,39 39,20 248,3-581,1 PTU+ IA- 6 373,0 78,55 35,13 21,06 297,6-505,2 PTU- IA+ 7 354,8 144,05 72,02 40,61 184,2-529,2 Se- PTU- IA- 6 88,6 23,89 9,76 26,96 55,35-115,4 PTU+ IA+ 7 125,7 34,46 17,23 27,41 96,38-175,5 PTU+ IA- 5 66,3 15,50 6,93 23,38 45,98-89,31 PTU- IA+ 8 78,4 14,18 5,36 18,09 58,00-94,23 69 Grafikon 5.7.1. Aktivnost glutation peroksidaze 1 (GPx1) u krvnoj plazmi pacova nakon 3 nedelje ogleda (μg/L). Nakon sedam nedelja tretmana, aktivnost GPx1 se kretala od 301,5±103,3 μkat/L u kontrolnoj grupi do 389,8±152,8 μkat/L u selenadekvatnoj grupi tretiranoj propiltiouracilom i jopanoičnom kiselinom (Se+PTU+IA+) (Grafikon 5.7.1.).. Kod selendeficitnih jedinki nije došlo do značajnog povećanja aktivnosti ovog enzima u odnosu na životinje tretirane 3 nedelje i ona je iznosila od 66,3±15,5 μkat/L kod ogledne grupe 7 (Se-PTU+IA-) do 125,7±34,5 μkat/L kod ogledne grupe 6 (Se- PTU+IA+). Selendeficitna ogledna grupa tretirana sa oba blokatora (Se-PTU+IA+) je i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana imala višu aktivnost ovog enzima u odnosu na selendeficitne jedinke netretirane blokatorima. 70 Grafikon 5.7.2. Aktivnost glutation peroksidaze 1 (GPx1) u krvnoj plazmi pacova nakon 7 nedelja ogleda (μg/L). Posle tri nedelje tretmana, na aktivnost GPx1 su uticali količina selena u hrani (Tabela 5.7.2.) samostalno ili u interakciji sa blokatorima. Nakon sedam nedelja tretmana, aktivnost GPx1 je zavisila isključivo od količine selena u hrani. Tabela 5.7.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na aktivnost GPx1 u krvnoj plazmi pacova, (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 1,704 (p>0,05) 1,065 (p>0,05) Status selena 58,05 (p<0,001) 110,1 (p<0,001) Blokatori x Se 6,199 (p<0,01) 1,065 (p>0,05) Značajnosti razlika u aktivnosti citosolne glutation peroksidaze eritrocita su prikazane u tabeli 5.7.3. Nakon tri nedelje od početka ogleda nisu zabeležene statistički značajne razlike između jedinki koje su hranom dobijale adekvatne količine selena. Grupe hranjene hranom deficitnom u selenu su imale statistički značajno manju 71 aktivnost GPx1, osim ogledne grupe Se-PTU+IA+ koja je imala nižu aktivnost ovog enzima, ali ova razlika nije bila statistički značajna. U odnosu na selendeficitne jedinke (Se-PTU-IA-), ova grupa je imala statistički značajno višu aktivnost GPx1, što je utvrđeno t-testom. Prilikom analiziranja ovog parametra sedme nedelje, uočeni su slični rezultati. Sve selendeficitne ogledne grupe su imale statistički značajno niže aktivnosti ovog enzima (p<0,001), osim selendeficitne grupe tretirane sa oba blokatora (p<0,01). Tretman sa PTU i IA kod selendeficitnih jedinki je doveo do izvesnog povećanja aktivnosti GPx1, ali nije dokazana statistička značajnost u odnosu na selendeficitne jedinke netretirane blokatorima. Tabela 5.7.3. Značajnost razlika u vrednostima aktivnosti citosolne glutation peroksidaze (GPx1), Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz ** nsz ** ** PTU+ IA+ nsz nsz ** nsz ** ** PTU+ IA- nsz ** nsz ** ** PTU- IA+ ** nsz ** *** Se- PTU- IA- ** nsz nsz PTU+ IA+ ** *** PTU+ IA- * PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz *** ** *** *** PTU+ IA+ nsz nsz * * * * PTU+ IA- nsz *** *** *** *** PTU- IA+ nsz nsz nsz nsz Se- PTU- IA- nsz nsz nsz PTU+ IA+ * nsz PTU+ IA- nsz PTU- IA+ 72 Značajnost razlika u aktivnosti citosolne glutation peroksidaze (GPx1) između jedinki tretiranih tri i sedam nedelja prikazana je u tabeli 5.7.4. Kod selenadekvatnih jedinki se aktivnost GPx1 nakon 7 nedelja udvostručila u odnosu na 3 nedelje tretmana. Kod selendeficitnih jedinki ne postoji statistički značajna razlika u aktivnosti enzima u zavisnosti od dužine tretmana, osim kod jedinki deficitnih u selenu, a tretiranih jopanoičnom kiselinom (ogledna grupa 8), kod kojih je tokom vremena došlo do povećanja aktivnosti GPx1 na nivou značajnosti p<0,01. Tabela 5.7.4. Značajnost razlika u aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze (GPx1) između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ p<0,01 p<0,05 p<0,01 nsz nsz nsz nsz p<0,01 5.8. Aktivnost plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) Osnovni statistički parametri vezani za aktivnost glutation peroksidaze krvne plazme (GPx3) nakon tri i sedam nedelja tretmana prikazani su u tabeli 5.8.1. Najmanja srednja vrednost aktivnosti GPx3 nakon tri nedelje tretmana je zabeležena u selendeficitnoj oglednoj grupi (Se-PTU-IA-) i bila je 32,08±14,87 μkat/L. Najveću aktivnost GPx3 u tom periodu su imale selenadekvatne jedinke tretirane sa PTU (Se+PTU+IA-) i to u proseku 91,38±20,42 μkat/L. Sve jedinke grupa hranjenih selendeficitnom hranom imale su nešto niže aktivnosti GPx3 u odnosu na selenadekvatne jedinke (Grafikon 5.8.3.). 73 Tabela 5.8.1. Aktivnost glutation peroksidaze 3 (GPx3) u krvnoj plazmi pacova, (μkat/L). Grupa n Xsr SD SE Cv (%) Iv 3 nedelje Se+ PTU- IA- 7 55,27 17,847 6,745 32,291 27,27-73,06 PTU+ IA+ 7 67,00 16,561 6,259 24,716 37,71-90,91 PTU+ IA- 8 91,38 20,421 7,220 22,347 64,65-125,66 PTU- IA+ 7 65,66 10,952 4,140 16,682 54,88-86,20 Se- PTU- IA- 7 32,08 14,873 5,622 46,363 12,79-51,52 PTU+ IA+ 6 38,50 11,814 4,824 30,694 29,29-59,60 PTU+ IA- 7 37,62 14,809 5,597 39,369 23,57-61,28 PTU- IA+ 8 42,17 23,169 8,198 55,036 20,88-82,15 7 nedelja Se+ PTU- IA- 8 119,40 37,001 13,082 30,988 89,23-186,5 PTU+ IA+ 6 99,16 27,978 9,892 28,216 60,61-139,7 PTU+ IA- 5 105,22 21,081 7,453 20,035 82,49-140,7 PTU- IA+ 4 90,24 16,354 6,181 18,123 71,72-121,2 Se- PTU- IA- 6 23,48 4,318 1,527 18,388 16,16-29,63 PTU+ IA+ 6 47,65 7,296 2,758 15,313 38,25-56,57 PTU+ IA- 5 50,57 7,353 2,600 14,540 42,76-65,32 PTU- IA+ 6 27,20 3,347 1,183 12,303 22,9-31,65 Kod selenadekvatnih jedinki, nakon sedam nedelja je uočen porast aktivnosti GPx3 u odnosu na tronedeljni tretman. Najveća aktivnost je zabeležena u kontrolnoj grupi (Se+PTU-IA-) i bila je 119,4±37,0 μkat/L, a najmanja u oglednoj grupi 5 (Se-PTU- IA-) - 23,48±4,32 μkat/L. I nakon sedam nedelja tretmana uočene su značajno niže vrednosti ovog parametra kod selendeficitnih jedinki u odnosu na selenadekvatne jedinke (Tabela 5.8.1., Grafikon 5.8.2.) 74 Grafikon 5.8.1. Aktivnost glutation peroksidaze 3 (GPx3) u krvnoj plazmi pacova nakon 3 nedelje ogleda (μg/L). Grafikon 5.8.2. Aktivnost glutation peroksidaze 3 (GPx3) u krvnoj plazmi pacova nakon 7 nedelja ogleda (μg/L). 75 Analizirajući uticaj selena i blokatora na aktivnost GPx3 metodom dvofaktorske analize varijanse, uočen je snažan uticaj selena (p<0,001) i nešto slabiji uticaj blokatora (p<0,05) nakon tri nedelje tretmana, a nakon sedam nedelja, na aktivnost GPx3 je uticala samo količina selena u hrani (Tabela 5.4.2.). Tabela 5.8.2. F vrednosti i značajnost uticaja selena i blokatora dejodinaza na aktivnost GPx3 (dvofaktorska analiza varijanse- two-way ANOVA). 3 nedelje 7 nedelja Blokatori 3,526 (p<0,05) 1,705 (p>0,05) Status selena 50,39 (p<0,001) 110,9 (p<0,001) Blokatori x Se 2,569 (p>0,05) 2,613 (p>0,05) Rezultati ispitivanja statističke značajnosti između srednjih vrednosti aktivnosti GPx3 oglednih grupa prikazane su u tabeli 5.8.3. Nakon tronedeljnog tretmana, jedinke iz selenadekvatne ogledne grupe tretirane sa PTU su imale statistički značajno višu aktivnost GPx3 u odnosu na jedinke kontrolne grupe (Se+PTU-IA-) i to na nivou značajnosti p<0,01. Selendeficitne grupe (5, 6, 7 i 8) su imale niže srednje vrednosti aktivnosti ovog enzima u krvnoj plazmi u odnosu na kontrolnu grupu, ali ova razlika nije bila statistički značajna. Statistički značajno nižu aktivnost GPx3, nakon sedam nedelja tretmana, imale su selendeficitne jedinke (grupe 5, 6, 7 i 8) u odnosu na kontrolnu grupu. Selendeficitne grupe tretirane sa PTU su imale statistički značajno više vrednosti ovog parametra u odnosu na selendeficitne jedinke (Se-PTU-IA-), što je pokazano t-testom. 76 Tabela 5.8.3. Značajnost razlika u vrednostima aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze (GPx3), Studentov t-test (nsz-nije statistički značajno, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001). 3 nedelje Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz ** nsz * nsz nsz nsz PTU+ IA+ * nsz ** ** ** * PTU+ IA- ** *** *** *** *** PTU- IA+ *** ** ** * Se- PTU- IA- nsz nsz nsz PTU+ IA+ nsz nsz PTU+ IA- nsz PTU- IA+ 7 nedelja Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ Se+ PTU- IA- nsz nsz nsz *** *** *** *** PTU+ IA+ nsz nsz *** *** ** *** PTU+ IA- nsz *** *** *** *** PTU- IA+ *** ** ** *** Se- PTU- IA- *** *** nsz PTU+ IA+ nsz *** PTU+ IA- *** PTU- IA+ U tabeli 5.8.4. je prikazana značajnost razlika u aktivnosti GPx3 između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja. Osim kod ogledne grupe 3 (Se+PTU+IA-), u svim selenadekvatnim grupama (1, 2 i 4) je statistički značajno porasla aktivnost GPx3 tokom vremena. Kod selendeficitnih jedinki, aktivnost ove peroksidaze je ostala na istom nivou kod grupa 5, 6 i 8. Kod ogledne grupe 7 (Se-PTU+IA-), došlo je do statistički značajnog porasta aktivnosti GPx3. Tabela 5.8.4. Značajnost razlika u aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) između jedinki tretiranih 3 i 7 nedelja, Studentov t-test. Se+ Se- PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ PTU- IA- PTU+ IA+ PTU+ IA- PTU- IA+ p<0,01 p<0,05 nsz p<0,01 nsz nsz p<0,05 nsz 77 5.9. Korelaciona zavisnost između koncentracije selena u punoj krvi pacova i aktivnosti glutation peroksidaze 1 (GPx1) Visok koeficijent korelacije (r=0,66, p<0,01) uočen je između nivoa selena u krvi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze (GPx1) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki već nakon tri nedelje tretmana (Grafikon 5.9.1.). Grafikon 5.9.1. Korelaciona zavisnost koncentracije selena u krvi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze 1 (GPx1) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki nakon tri nedelje tretmana (***p˂0.01). Izvodeći korelacionu zavisnost pojedinačno po tretmanima, nakon tri nedelje tretmana je postojala korelaciona zavisnost između ova dva parametra kod svih tretmana osim pri istovremenoj upotrebi oba blokatora. Koeficijenti korelacije su iznosili r=0,81 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke); r=0,83 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke tretirane sa PTU); r=0,78 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke tretirane sa IA). U grupi tretiranoj istovremeno sa oba blokatora (PTU i IA), koeficijent korelacije je bio izrazito nizak (r=0,35) i nije bio statistički značajan (Grafikon 5.9.2.) 78 Grafikon 5.9.2. Korelaciona zavisnost koncentracije selena u krvi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze 1 (GPx1) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki istovremeno tretiranih sa PTU i IA, nakon tri nedelje tretmana (grupe 2 i 6) (nsz-nije statistički značajno). Nakon sedam nedelja tretmana je uočena visoka korelaciona zavisnost između ova dva parametra, sa koeficijentom korelacije 0,7 (p˂0,01) (Grafikon 5.9.3.). Posmatrajući pojedinačne tretmane, uočena je korelaciona zavisnost kod svih tretmana, a koeficijenti korelacije su iznosili r=0,83 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke, p˂0,01); r=0,79 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke tretirane sa PTU, p˂0,01); r=0,89 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke tretirane sa IA, p˂0,01) i r=0,84 (selenadekvatne i selendeficitne jedinke tretirane sa PTU i IA, p˂0,02). 79 Grafikon 5.9.3. Korelaciona zavisnost koncentracije selena u krvi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze 1 (GPx1) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki nakon sedam nedelja tretmana (***p˂0,01). 80 5.10. Korelaciona zavisnost između koncentracije selena i aktivnosti glutation peroksidaze 3 (GPx3) u krvnoj plazmi pacova Korelaciona zavisnost je uočena između nivoa selena u krvi i aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki već nakon tri nedelje tretmana (Grafikon 5.10.1.) pri čemu je koeficijent korelacije iznosio r=0,55, (p<0,01). Grafikon 5.10.1. Korelaciona zavisnost koncentracije selena u krvi i aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze 3 (GPx3) kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki nakon tri nedelje ekperimenta (svi tretmani) (***p˂0.01) Posmatrajući pojedinačne tretmane, kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki netretiranih sa blokatorima, koeficijent korelacije je iznosio r=0,81 (p<0,01); kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa propiltiouracilom r=0,78 (p<0,05); kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa jopanoičnom kiselinom r=0,92 81 (p<0,01), a kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa oba blokatora (PTU i IA) r=0,82 (p<0,05). Nakon sedam nedelja eksperimenta, koeficijent korelacije između ovih parametara je bio značajno visok i iznosio je 0,75 (p<0,01), (Grafikon 5.10.2.). Grafikon 5.10.2. Korelaciona zavisnost koncentracije selena u krvi i aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze 3 (GPx3) kod selendeficitnih i selenadekvatnih jedinki nakon 7 nedelja tretmana (***p˂0,01). Izvodeći korelacionu zavisnost pojedinačno po tretmanima, nakon sedam nedelja tretmana, utvrđena je korelaciona zavisnost između ova dva parametra kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki, r=0,92 (p<0,05) i kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa jopanoičnom kiselinom, r=0,98 (p<0,05) (Grafikon 5.10.3.). Pri upotrebi propiltiouracila kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki, koeficijent korelacije je iznosio r=0,62 i nije bio statistički značajan kao ni pri istovremenoj upotrebi oba blokatora (PTU i IA) kada je koeficijent korelacije iznosio r=0,60 i takođe nije bio statistički značajan. 82 5.11. Korelaciona zavisnost između koncentracije tireoidnih hormona i aktivnosti glutation peroksidaza 1 i 3 Negativna korelaciona zavisnost između koncentracije T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti GPx1 se javila kod selendeficitnih jedinki već nakon tri nedelje tretmana, sa koeficijentom korelacije r=0,55, p<0,01 (Grafikon 5.11.1.). U istom periodu postojala je i negativna korelaciona zavisnost između koncentracije tiroksina (T4) i aktivnosti ovog enzima kod selendeficitnih jedinki sa vrednošću koeficijenta korelacije od r=0,58 (y=- 0.538x+147,9; R2=0.338; p<0,05). Kod selenadekvatnih jedinki nakon tri nedelje tretmana nije postojala korelaciona zavisnost između T3 i GPx1 (Grafikon 5.11.2.) ni između T4 i GPx1 (r=0,13). Nakon sedam nedelja tretmana, nije uočena korelaciona zavisnost između T3 i GPx1 ni kod selenadekvatnih niti kod selendeficitnih jedinki. U istom periodu, nije zabeležena ni korelaciona zavisnost između T4 i GPx1 kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki. Grafikon 5.11.1. Korelaciona zavisnost T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze 1 (GPx1) kod selendeficitnih jedinki nakon 3 nedelje tretmana (***p˂0,01). 83 Grafikon 5.11.2. Korelaciona zavisnost T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti citosolne glutation peroksidaze 1 (GPx1) kod selenadekvatnih jedinki nakon 3 nedelje tretmana, (nsz-nije statistički značajno). Nakon tri nedelje tretmana nije uočena korelaciona zavisnost između koncentracije T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti GPx3 ni kod selenadekvatnih niti kod selendeficitnih jedinki. Takođe, nije uočena korelaciona zavisnost između T4 i GPx3 kod selenadekvatnih niti kod selendeficitnih jedinki. Nakon sedam nedelja tretmana, kod selendeficitnih jedinki je uočena negativna korelacija između T3 i GPx3 sa visokim koeficijentom korelacije, r=0,61 (p<0.01) (Grafikon 5.11.3.). Između T4 i GPx3 je takođe postojala negativna korelaciona zavisnost kod selendeficitnih jedinki (y=-0,256x+49,37; R2=0,731; r=0,86; p<0,01). Kod selenadekvatnih jedinki, nakon sedam nedelja tretmana, nije postojala korelaciona zavisnost T3 i GPx3 (Grafikon 5.11.4.). U istom periodu nije zabeležena ni korelaciona zavisnost između T4 i GPx3 kod selenadekvatnih jedinki. 84 Grafikon 5.11.3. Korelaciona zavisnost T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze 3 (GPx3) kod selendeficitnih jedinki nakon 7 nedelja tretmana (***p<0,01). Grafikon 5.11.4. Korelaciona zavisnost T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze 3 (GPx3) kod selenadekvatnih jedinki nakon 7 nedelja tretmana, (nsz-nije statistički značajno). 85 6. Diskusija 6.1. Telesne mase pacova Merenje telese mase oglednih životinja vršeno je svakih sedam dana od ulaska jedinki u ogled. Na početku eksperimenta (0 dan) izmerena je masa svih oglednih životinja i u proseku je iznosila 48,6±7,8 g. Nakon dve nedelje eksperimenta, selendeficitne jedinke su imale nižu prosečnu telesnu masu za 13%, a na kraju eksperimenta za 8%. U eksperimentima Beckett-a i sar. (1989), Bates-a i sar. (2000), Barnes-a i sar. (2009) deficit selena nije uticao na telesne mase ispitivanih jedinki. Međutim, Hurt (1971), navodi u svom radu da su selendeficitne jedinke imale niže telesne mase u odnosu na selenadekvatne i to za oko 13%. Već nakon nedelju dana selendeficitne jedinke tretirane propiltiouracilom (PTU) su imale niže telesne mase u odnosu na kontrolnu grupu za 17%, što je bilo statistički značajno (p<0,05). Ovakav trend se nastavio i druge nedelje pri čemu je razlika u telesnim masama između ovih grupa bila još izraženija, kada su selendeficitne jedinke imale za 26% nižu telesnu masu (p<0,001). Tek pete nedelje tretmana, selenadekvatna grupa tretirana sa PTU je imala statistički značajno niže telesne mase od kontrolne grupe (za 11%). U istom periodu je selendeficitna grupa tretirana sa PTU imala za 49% niže telesne mase. Nakon sedam nedelja tretmana, selenadekvatna grupa tretirana sa PTU je imala za 19%, a selendeficitna grupa tretirana sa PTU za 59% niže telesne mase u odnosu na kontrolnu grupu. U radu Yoshide i Nakazona (1995) jedinke tretirane sa PTU imaju oko 2,5 puta nižu telesnu masu od jedinki iz kontrolne grupe. Kod grupa tretiranih sa PTU je ustanovljena hipotireoza sa izrazito niskim koncentracijama T4 u krvi. Pored toga, poznato je da PTU blokira dejodinazu 1 i smanjuje koncentraciju T3. Kako je poznato da tireoidni hormoni imaju veliki uticaj na metaboličke procese u toku rasta i diferencijacije, zaostajanje u rastu jedinki tretiranih sa PTU je bilo očekivano. Na osnovu naših rezultata možemo zaključiti da hipotireoza udružena sa deficitom selena izaziva usporeniji rast jedinki nego kada je u pitanju samo hipotireoza ili samo deficit selena. Selendeficitna grupa tretirana sa jopanoičnom kiselinom (IA) je imala prosečno istu telesnu masu kao i selendeficitne jedinke koje nisu dobijale blokator. Takođe, 86 selenadekvatne jedinke tretirane sa IA su imale slične telesne mase kao i kontrolna grupa. U ovim grupama nije ustanovljena sistemska hipotireoza te nisu bile očekivane promene telesnih masa tretiranih jedinki. 6.2. T4 Radi utvrđivanja uticaja blokatora dejodinaza na tireoidnu osovinu selendeficitnih i selenadekvatnih juvenilnih pacova, korišćeni su propiltiouracil i jopanoična kiselina. Jopanoična kiselina ima benzenov prsten sa 3 atoma joda i aminogrupom i pokazuje visok stepen rastvorljivosti u mastima (Braga i Cooper, 2001). Od 1951. godine se upotrebljava kao sredstvo za holecistografiju. Nakon što su Bürgi i saradnici (1976) uočili smanjenje koncentracije T3 u krvi i povećanje T4 i TSH kod pacijenata koji su dobili IA kao sredstvo za holecistografiju, počela su istraživanja vezana za mehanizam dejstva i eventualnu upotrebu kod hipertireoza. Utvrđeno je da jopanoična kiselina blokira dejodinaciju T4 u T3 i u homogenatima jetre (Kaplan i Utiger, 1978) i u homogenatima bubrega (Silva i sar., 1978) što je kasnije (Germain, 1988b) ukazalo na inhibiciju dejodinaze 1 (ID1). Ovaj blokator inhibira i dejodinaciju u hipofizi i masnom tkivu (Courtin i sar., 1985), a u radu Germaina (1988a) je pokazano da inhibira dejodinazu 2 (ID2). U in vitro uslovima je dokazana kompetitivna inhibicija konverzije T4 u T3 u homogenatima jetre kao i inhibicija degradacije rT3 (Chopra, 1977) sa jopanoičnom kiselinom. Međutim, kod pacova in vivo je utvrđena nekompetitivna inhibicija (Germain, 1988a). Ovaj autor je pokazao da se sa intravenskom aplikacijom jopanoične kiseline u dozi od 4 mg/100g TM pacova, može izazavati pad maksimalne brzine enzimske reakcije za 66%, a da Km ostaje nepromenjena. Inhibicija je zabeležena neposredno nakon aplikacije, bila je maksimalna nakon 5 sati, a trajala je više od 60 sati. Zabeležena je i in vivo ireverzibilna inhibicija konverzije T4 u T3 u hipofizi pacova sa dozom od 5 mg/100g TM pacova i na taj način potvrđena inhibicija dejodinaze 2 (ID2). Isti autor navodi da je ID2 osetljivija na dejstvo jopanoične kiseline od ID1 i da se sa dozom od svega 0.04 mg/100g TM inaktivira 80% ID2 u hipofizi i korteksu velikog mozga. Osim inhibicije ID2, jopanoična kiselina bi mogla inhibirati i 87 sam unos T4 u ćelije. Westholm (2009) dokazuje inhibitorni efekat jopanoične kiseline na unos T4 pomoću polipeptidnih transportera organskih anjona u kulturama hepatocita. Drugi blokator koji smo koristili u radu, propiltiouracil, pripada tioamidnim lekovima koji se koriste u lečenju hipertireoidizma. Pominju se dva mehanizma kojima PTU smanjuje proizvodnju tireoidnih hormona. Prvi podrazumeva blokadu tireocitne peroksidaze koja oksiduje jod (I-1→I0) i ugrađuje ga u tirozil ostatke tireoglobulina (Engler i sar., 1983). Drugi mehanizam je inhibicija ID1 koja je odgovorna za konverziju T4 u T3. Veronikis i saradnici (1996) su ispitivali uticaj različitih koncentracija PTU na inhibiciju ID1 u homogenatima jetre pri čemu je sa sve tri doze, 0,01%, 0,05 ili 0,1% PTU u hrani, procenat inhibicije ID1 bio preko 90%. Shang i sar. (2010) pri upotrebi PTU beleže pad iRNK za tireoglobulin pa bi ovo bio možda i treći mehanizam kojim se utiče na proizvodnju tireoidnih hormona. Preporučene doze PTU za izazivanje hipotireoze kod pacova su 0,01%-0,1% (Veronikis i sar., 1996) pa je sa dozom od 150 mg/L vode za piće (0,015%) u našem eksperimentu sigurno postignut ovaj efekat. Radovanović (2003) izaziva hipotireozu kod mladunaca pacova sa dozom koja je čak 100 puta niža od doze upotrebljene u našem eksperimentu (0,00015%). Prosečna koncentracija tiroksina T4 u krvi kontrolne grupe (Se+PTU-IA-) je nakon tri nedelje bila u fiziološkim granicama i iznosila je 85,94±23,69 nmol/L. Kod selendeficitnih jedinki (Se-PTU-IA-) nivo T4 je bio kao kod kontrolne grupe i iznosio je 85,65±11,05 nmol/L. Iako se pri deficitu selena javlja povišen nivo T4 u krvi oglednih jedinki (Beckett i sar., 1989), tretman od tri nedelje nije bio dovoljan za razvoj deficita. Kako navode Hill i sar. (1987), za razvoj deficita je potrebno 6 nedelja. Nakon sedam nedelja tretmana je u grupi sa deficitom selena registrovana povišena koncentracija T4 u odnosu na selenadekvatnu grupu, što je u skladu sa radom Becketta i sar. (1989) i Yoshide i Nakazona (1995). Pojava više koncentracije T4 kod selendeficitnih jedinki se objašnjava smanjenom ekstratireoidalnom konverzijom T4 u T3 kao posledica smanjene aktivnosti ID1 (Bermano i sar., 1995). Upotreba PTU dovodi do statistički značajnog sniženja koncentracije T4 kod selenadekvatnih jedinki. Nakon tri nedelje zabeležen nivo T4 u Se+PTU+IA- grupi je iznosio 27,17±6,07 nmol/L, a nakon sedam nedelja je bio 14,78 ±6,48 nmol/ što je u potpunosti u skladu sa rezultatima Cettour-Rose i sar. (2005). PTU dovodi do smanjenja T4 u krvi prvenstveno blokirajući sintezu samog T4 u štitastoj žlezdi (inhibira tireocitnu 88 peroksidazu) što potvrđuje rad navedenih autora kada je nakon dodavanja T4 pacovima tretiranim sa PTU, njegova koncentracija u krvi ostala ista. Kod selendeficitnih (Se-PTU+IA-) jedinki upotreba PTU je dovela do još izraženijeg pada koncentracije T4 koja je nakon tri nedelje iznosila 18,46±8,74 nmmol/L, a nakon sedam nedelja je bila ispod granica detekcije upotrebljenog RIA kita. Da blokator i selen u interakciji utiču na nivo T4, pokazala je i dvofaktorska analiza varijanse (Tabela 5.2.3.). Niže vrednosti T4 kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU su zabeležili i Chanoine i sar. (1992) i Yoshida i Nakazono (1995), ali ova pojava nije objašnjena. Beckett i sar. (1993) navode da se prilikom deficita selena u štitastoj žlezdi smanjuje količina joda kao i ukupna količina T4 smatrajući ovaj efekat selena protektivnim. Ukoliko bi proizvodnja tireodnih hormona bila očuvana, to bi podrazumevalo i proizvodnju peroksida, a kako je zbog deficita selena narušena aktivnost GPx3 koja uklanja višak peroksida (Howie i sar., 1995), peroksid bi doveo do lokalnog oštećenja tkiva tireoideje. Nije poznato na koji način deficit selena dovodi do smanjenja količine joda u štitastoj žlezdi jer do sada nije utvrđeno da bilo koji selenoenzim učestvuje u transportu joda i sintezi tiroksina. Tretman selenadekvatnih jedinki sa jopanoičnom kiselinom je doveo do povećanja koncentracije T4 u krvi, a statistički značajno povećanje u odnosu na kontrolnu grupu je bilo zabeleženo nakon sedam nedelja kada je koncentracija T4 iznosila 84,44±21,58 nmol/L (64,65±9,07 nmol/L u kontrolnoj grupi). Isti efekat je uočen i kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa IA (Se-PTU-IA+). Kako jopanoična kiselina blokira sve tri dejodinaze pri čemu je ID2 najosetljivija, smanjena tkivna konverzija T4 u T3 mogla bi biti uzrok povećanja T4 u krvi. Takođe, povišenje koncentracije T4 moglo bi biti posledica dejstva jopanoične kiseline na centralnu tireoidnu osovinu, odnosno na aktivnost ID2 u hipotalamusu i hipofizi. Kako je pri upotrebi jopanoične kiseline inhibirana aktivnost ID2, manja je koncentracija T3 u ćelijama hipotalamusa i hipofize. Niska koncentracija T3 u ovim ćelijama utiče na pojačanu sintezu TRH i TSH. Viša koncentracija TSH (Grafikoni 5.4.1 i 5.4.2) je impuls za pojačanu sintezu tireoidnih hormona. Treći mehanizam koji bi mogao uticati na povećanje nivoa T4 je inhibicija transportera odgovornih za unos T4 u ćelije (Westholm i sar., 2009). Ovo bi moglo biti objašnjenje i za nešto višu koncentraciju T4 89 kod jedinki koje su istovremeno dobijale i PTU i IA u odnosu na jedinke koje su dobijale samo PTU. 6.3. T3 U kontrolnoj grupi (Se+PTU-IA-) je zabeležena prosečna koncentracija T3 od 2,23±0,32 nmol/L nakon tri nedelje tretmana. Fiziološke vrednosti trijodtironina u krvi pacova kreću se od 1,55 nmol/L (Cettour-Rose i sar., 2005) do 3,29 nmol/L (Chunxiang i sar., 2008) te su vrednosti T3 u krvi oglednih jedinki kontrolne grupe bile u fiziološkim granicama. Kod grupe sa deficitom selena (Se-PTU-IA), zabeležena je svega 14% manja prosečna koncentracija T3 (1,92±0,29 nmol/L). U ovoj grupi je očekivana znatno niža vrednost T3 imajući u vidu to da je za proizvodnju ovog hormona odgovorna ID1 koja je selenoenzim. U radu Beckett-a i saradnika (1989) pri korišćenju hrane sa 0,005 mg/kg selena (0,03 mg/kg selena našem eksperimentu), zabeležen je pad koncenracije T3 od 22% u odnosu na kontrolnu selenadekvatnu grupu, ali ovo smanjenje nije bilo statistički značajno. Razlika u procentima može se objasniti različitom koncentracijom selena u hrani (u našem eksperimentu je korišćena hrana deficitarna u selenu koja ima 6 puta veću koncentraciju selena u odnosu na hranu korišćenu u radu Beckett-a). Iako je dejodinaza osetljiva na deficit selena, ovo se prevashodno odnosi na dejodinazu u hepatocitima i bubrezima (Beckett i sar., 1989; Chanoine i sar., 1992) jer se u ovim organima drastično smanjuje količina selena. Međutim, ovo nije slučaj i sa štitastom žlezdom koja je prilično otporna na deficit selena pa je izvesno da ID1 tireoideje nadoknađuje pad aktivnosti ID1 u jetri. U prilog ovoj tvrdnji ide ujednačen stepen konverzije tiroksina u T3 (T3/T4x100) i kod selendeficitne (Se-PTU-IA-) i kod selenadekvatne (Se+PTU-IA-) grupe nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana (Tabela 5.5.1.). Statistički značajno smanjenje koncentracije T3 je zabeleženo u selenadekvatnoj grupi tretiranoj sa propiltiouracilom (PTU), a koncentracija je bila 1,2±0,40 nmol/L. Ovaj blokator ne samo da snažnije blokira konverziju T4 u T3 već inhibira sintezu i samog T4 delujući na tireoidnu peroksidazu, što je dovelo do statistički značajnog pada i koncentracije T3 i koncentracije T4 (grafikon 5.2.2.1). Cettour-Rose i sar. (2005) takođe beleže značajan pad koncentracije T3 u krvi jedinki tretiranih sa PTU. Pri 90 upotrebi ovog blokatora zajedno sa T4 uspostavljena je normalna koncentracija T4 u krvi, ali je bio evidentan pad T3. U odnosu na kontrolnu grupu, izmerena aktivnost ID2 je bila nepromenjena, ali je i pored toga zabeležen visok nivo TSH. Ovo je ukazalo na regulaciju lučenja TSH ne samo pomoću intracelularne konverzije T4 u T3 u ćelijama hipofize već i u zavisnosti od nivoa serumskog T3. Jopanoična kiselina u ovom periodu nije imala uticaj na koncentraciju T3 u krvi selenadekvatnih jedinki koja je u ovoj eksperimentalnoj grupi iznosila 2,31±0,19 nmol/L. Po protokolu koji su predložili Lanni i saradnici (1996), jopanoična kiselina se aplikuje pacovima intraperitonealno jednom nedeljno u dozi od 6 mg/100g telesne mase, pri čemu izaziva pad koncentracije T3 za 20-30% nakon tri nedelje tretmana. Životinje su bile žrtvovane 12h nakon poslednje aplikacije IA. Ovaj protokol je bio primenjen u našem eksperimentu s tom razlikom što su životinje bile žrtvovane 24 i 48h nakon poslednje aplikacije IA. Kako se efekat jopanoične kiseline zadržava i preko 60h nakon aplikacije (Germain, 1988b), smatrali smo da ovo neće uticati na rezultate, odnosno, da će pad koncentracije T3 biti izražen. Larsen i saradnici (1979) radeći sa tireoidektomisanim pacovima, nakon aplikacije T3 i T4 uočavaju viši nivo T3 kod jedinki kojima je aplikovana IA, smatrajući da je ovo posledica inhibicije enzima odgovornih za klirens T3 (dejodinaze 1 i 3). Delimično bi ovu dilemu mogli otkloniti rezultati koncentracije rT3 koju nismo bili u mogućnosti da određujemo. Kod grupe kojoj je aplikovana i IA i PTU nivo T3 je bio niži nego u grupi kojoj je dat samo PTU što je u skladu sa podacima navedenih autora (Lanni i sar., 1996). Nakon sedam nedelja tretmana, prosečna koncentracija T3 u krvi jedinki kontrolne grupe je iznosila 1,74±0,17 nmol/L i možemo reći da je bila u fiziološkim granicama. Bez obzira na tretman (PTU+ ili IA+), sve selenadekvatne jedinke su imale ujednačene prosečne koncentracije T3. Zapaženo je i da je pad koncentracije T3 manji u odnosu pad koncentracije T4 koja je u ovom periodu bila izrazito niska. U literaturi su zastupljene studije u kojima se vrše analize tireoidnog statusa jedinki nakon tronedeljne upotrebe propiltiouracila. Međutim, Li Sui i Gilbert (2003) u eksperimentu na skotnim ženkama pacova sa produžetkom tretmana i 30 dana nakon partusa, takođe ne uočavaju razliku u koncentraciji T3 (kod mladunaca je izražena hipotireoza kao i u našem eksperimentu nakon 3 nedelje). Takođe, Hood i sar. (1999) tretirajući pacove sa različitim dozama PTU, beleže dramatičan pad T3 nakon nedelju dana od početka 91 aplikovanja blokatora, a zatim porast T3 u narednih 3 nedelje pri čemu jedinke tretirane nižim dozama za tri nedelje imaju isti nivo T3 kao i kontrolna grupa. Na osnovu naših rezultata možemo reći da se zahvaljujući homeostatskim mehanizmima nakon sedam nedelja reguliše nivo T3 u krvi eksperimentalnih jedinki. Silva i sar. (1984) napominju da se u slučaju hipotireoze aktivira dejodinacija pomoću dejodinaze 2 i da se zahvaljujući višestrukom povećanju njene aktivnosti uspeva nadomestiti nedostatak T3. Ostali homeostatski mehanizmi su detaljnije opisani u podpoglavlju o TSH. Kod selendeficitnih jedinki se, sudeći prema vrednostima T3, uspostavlja homeostaza. Jedino u selendeficitnoj grupi tretiranoj sa PTU (Se-PTU+IA-) je evidentan pad T3 (1,123±0,54 mmol/L). Nekoliko je razloga za ovakav rezultat. Kod pacova se u uslovima hipotireoze smanjuje za 50% aktivnost ID1. Na pad njene aktivnosti dodatno utiče deficit selena. Iako se u uslovima hipotireoze aktivnost ID2 povećava nekoliko puta, kako je i ona sama selenoenzim, njena aktivnost se ne povećava u toj meri i ne uspeva da nadomesti T3 kao kod selenadekvatnih jedinki. 6.4. TSH Koncentracija tireostimulirajućeg hormona u kontrolnoj grupi (Se+PTU-IA-) je nakon tri nedelje tretmana iznosila u proseku 2,97±0,83 ng/mL i bila je u fiziološkim granicama. Kod jedinki sa deficitom selena (Se-PTU-IA-) izmerena je nešto viša koncentracija TSH (6,57±3,03 ng/mL), ali ova razlika nije bila statistički značajna. Iako je u nekim studijama nivo TSH kod selendeficitnih jedinki isti kao i kod selenadekvatnih jedinki (Veronikis i sar., 1996), Ruz i sar. (1999) i Chanoine i sar. (1992) takođe beleže povišenje nivoa TSH i T4 sa nepromenjenom ili malo nižom koncentracijom T3 kod selendeficitnih u odnosu na selenadekvatne jedinke. Ono što zbunjuje jeste da i malo povišenje nivoa T4 obično dovodi do smanjenja nivoa TSH, a što se kod selendeficitnih jedinki ne dešava. Nivo TSH je povezan sa intracelularnom konverzijom T4 u T3 u hipofizi pomoću ID2. Ukoliko je ova konverzija očuvana, viši nivo T4 izazvao bi viši nivo unutarćelijskog T3 koji se vezuje za receptore TSH na DNK, a čije vezivanje izaziva inhibiciju sinteze iRNK za TSH. Bates i sar. (2000) navode kako konverzija T4 u T3 u hipofizi kod selendeficitnih jedinki raste što znači da se produkuje veća količina T3 koji prouzrokuje smanjenje nivoa TSH. Sa druge strane, 92 viši nivo T3 u hipofizi deluje na nivou transkripcije gena ID2 pri čemu se smanjuje količina iRNK za ID2, a to za posledicu ima smanjenu konverziju T4 u T3 pri čemu bi to bio impuls za povećanu sintezu TSH. Dakle, uzrok povećanja TSH kod selendeficitnih jedinki mogao bi biti prevaga drugog mehanizma. Iako mnogi autori kao jedini mehanizam regulacije lučenja TSH navode intracelularnu konverziju T4 u T3 u hipofizi, postoji mogućnost da u regulaciji učestvuje i serumski T3 (Cettour-Rose i sar., 2005), što je detaljnije opisano u prethodnom podpoglavlju (6.3.). Smatra se da je povišenje TSH signal za porast de novo sinteze T3 na tireoglobulinu čime se normalizuje koncentracija T3 u krvi. Takođe, TSH utiče na povećanje ekspresije ID1 u štitastoj žlezdi koja omogućava viši nivo konverzije T4 u T3. Svi pomenuti kompenzatorni mehanizmi su uticali na rast koncentracije T3 kod selendeficitnih jedinki nakon sedam nedelja tretmana pri čemu se koncentracija T3 u krvi selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki nisu razlikovale. Pri upotrebi PTU kod selenadekvatnih (Se+PTU+IA-) i selendeficitnih (Se- PTU+IA-) jedinki zabeležen je višestruki porast TSH u odnosu na kontrolnu grupu i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana (tabela 5.2.4.1., grafikon 5.2.4.1. i 5.2.4.2.). Cettour-Rose i sar. (2005) pri upotrebi propiltiouracila takođe beleže drastično povećanje koncentracije TSH u krvi ispitivanih jedinki. U navedenim grupama je bila zastupljena izrazito niska koncentracija T4, a poznato je da se prilikom hipotireoze javlja povišen nivo TSH kao rezultat negativne povratne sprege koji je već opisan. Statistički značajna razlika u koncentraciji TSH je zapažena između selenadekvatne i selendeficitne grupe tretirane sa PTU pri čemu je nakon sedam nedelja tretmana u selendeficitnoj grupi nivo TSH bio viši nego kod selenadekvatnih jedinki tretiranih sa PTU. Ovaj nalaz je takođe u skladu sa koncentracijom T4 koja je kod selendeficitnih jedinki bila niža nego kod selenadekvatnih jedinki. Jopanoična kiselina je dovela do blagog povećanja nivoa TSH, a koje je, kako je pokazao t-test, bilo statistički značajno i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana. Kako je u navedenim grupama nivo T3 bio kao i u kontrolnoj grupi, a nivo T4 statistički značajno viši u odnosu na kontrolnu grupu, bilo je očekivano smanjenje nivoa TSH. Pošto jopanoična kiselina blokira konverziju T4 u T3 pomoću ID2 u hipofizi, verovatno je da povišenje serumskog T4 nije mogao biti impuls za sniženje TSH u toj meri. 93 6.5. Procentualni odnos T3/T4 Odnos T3/T4 je kod eutireoidnih pacova oko 2% (Thompson i sar.,1995). Prema istom autoru se kod selendeficitnih jedinki (0,007 mg Se/kg hrane) ovaj odnos menja i dvostruko je manji. U našem eksperimentu ovaj odnos kod selendeficitnih jedinki je nakon tri i sedam nedelja tretmana bio nešto niži kao posledica blagog povećanja koncentracije T4 u krvi, a bez pada koncentracije T3. Kako su selendeficitne životinje u našem eksperimentu hranjene hranom koja je sadržala 0,03 mg Se/kg hrane, nije bio očekivan značajniji pad odnosa T3/T4. Hood i sar. (1999) tretirajući pacove sa različitim dozama PTU, beleže dramatičan pad T3 nakon nedelju dana od početka aplikovanja blokatora, a zatim porast T3 u narednih 3 nedelje pri čemu jedinke tretirane nižim dozama za tri nedelje imaju isti nivo T3 kao i kontrolna grupa. Kako je u grupama tretiranim sa PTU u našem eksperimentu niža koncentracija T4 u odnosu na kontrolnu grupu, odnos T3/T4 raste te nakon tri nedelje iznosi 4,47% kod selenadekvatnih i 10,03% kod selendeficitnih jedinki. Nakon sedam nedelja, kada se u ovim grupama beleži još veći pad T4, a normalizuje nivo T3, odnos T3/T4 raste i iznosi 15,19% kod selenadekvatnih jedinki. Kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU ovaj odnos nije bilo moguće izračunati zbog niskog nivoa T4, ali je očigledno bio visok, uzimajući u obzir vrednosti T3. Povećan procenat konverzije kod jedinki tretiranih sa PTU može se objasniti efikasnijom ekstratireoidnom dejodinacijom T4 u T3 pomoću dejodinaze 2, koja je svakako sve efikasnija što je tretman duži, a još je efikasnija u uslovima deficita selena, kada se njena aktivnost takođe povećava (Bates i sar., 2000). Kod jedinki tretiranih sa jopanoičnom kiselinom, zabeležen je nešto niži odnos T3/T4 koji je bio posledica povišenja nivoa T4. Isti efekat je zabeležen i kod selendeficitnih i kod selenadekvatnih jedinki i nakon tri i nakon sedam nedelja tretmana. Upotreba oba blokatora (PTU i IA), nakon tri nedelje tretmana nije dovela do narušavanja odnosa T3/T4 koji je iznosio 2,65% kod selenadekvatnih jedinki. U ovom periodu je kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa oba blokatora uočena povećana konverzija T4 u T3 zbog većeg pada koncentracije T4 u odnosu na pad koncentracije T3, a procenat konverzije je iznosio 4,11%. Ovaj nalaz bi mogla objasniti već pomenuta povećana aktivnost ID2 u uslovima deficita selena. Nakon sedam nedelja tretmana sa oba blokatora, odnos T3/T4 je bio povećan u odnosu na kontrolnu grupu, ali je bio nešto 94 niži u odnosu na grupe koje su dobijale samo PTU (Tabela 5.5.1.). Kako je u grupama koje su dobijale oba blokatora bio zabeležen blago povišen nivo T4 u odnosu na grupe tretirane samo sa PTU, ovakav odnos konverzije T4 u T3 je bio očekivan. 6.6. Status selena Proučavajući potrebe za selenom u ishrani životinja, bilo je važno znati njegovu biološku raspoloživost. Mnoga istraživanja su pokazala da od oblika selena u hranivima zavisi biološka raspoloživost kao i deponovanje u tkivima (Whanger i Butler, 1988). Nakon otkrića selenoenzima, potrebe u selenu su počele da se definišu prema količini selena neophodnog za punu aktivnost ovih enzima. U novije vreme se kao konvencionalni parametri za određivanje potrebnih količina selena u hrani koriste sledeći biomarkeri: aktivnost mišićne GPx4, plazmatske GPx3, GPx4 jetre, TrxR jetre, koncentracija Se u jetri, GPx1 eritrocita i jetre, koncentracija Se i aktivnost GPx1 u bubrezima kao i aktivnost GPx1 u mišićima (Barnes i sar., 2009). Aktivnost plazmatske GPx3 i GPx1 eritrocita predstavljaju odlične biomarkere za procenu statusa selena jer u visokom stepenu koreliraju sa količinom selena u hrani. Na osnovu vrednosti ovih biomarkera, procenjene su minimalne potrebe u selenu od 0,06 mg Se/kg hrane (plazmatska GPx3) odnosno 0,08 mg Se/kg hrane (GPx1 eritrocita), tako da je ishrana pacova u našem eksperimentu sa 0,3 mg Se/kg hrane u potpunosti obezbeđivala maksimalnu aktivnost ovih enzima kod selenadekvatnih jedinki. 6.6.1. Koncentracija selena u punoj krvi Različite koncentracije selena u hrani kao i različiti oblici selena dovode do njegovog različitog deponovanja u tkivima kao što su jetra, mišići, testisi, mozak, bubrezi, pluća, srce, slezina i krv (Whanger i Butler, 1988). Proučavajući deponovanje selena u navedenim tkivima prilikom davanja pacovima 0,02, 0,2, 1,0 i 4 mg Se/kg hrane, ovi autori su nakon devet nedelja uočili višestruko povećanje količine selena u krvi kod grupa kojima je data količina 0,2 i 1 mg Se/kg hrane (0,5±0,06 i 0,6±0,06 μg/ml selena u krvi) u odnosu na grupu koja je hranom dobijala 0,02 mg Se/kg hrane 95 (0,03±0,01 μg/ml selena u krvi). Grupe koje su dobijale 2,0 i 4,0 mg Se/kg hrane, nisu imale značajno veće vrednosti koncentracije selena u krvi u odnosu na grupu koja je dobijala 0,2 mg Se/kg hrane. Ogledne jedinke u našem eksperimentu su hranom dobijale 0,031 mg Se/kg hrane (selendeficitna ishrana) odnosno 0,334 mg Se/kg hrane (selenadekvatna ishrana), te je razlika u koncentraciji selena u krvi eksperimentalnih jedinki bila očekivana. Nakon tri nedelje eksperimenta, selendeficitne jedinke su imale nižu koncentraciju selena u krvi (58,17±8,26 μg/L) u odnosu na kontrolnu grupu - 364,8±98,06 μg/L, sa utvrđenom statistički značajnom razlikom na nivou p<0,001. Zapaženo je takođe da su selenadekvatne jedinke tretirane propiltiouracilom ili jopanoičnom kiselinom imale više koncentracije selena u krvi (477,7±105,4 i 458,5±105,8 μg/L) u odnosu na kontrolnu grupu (Tabela 5.1.1.1), iako t-test nije pokazao statističku značajnost. Međutim, dvofaktorska analiza varijanse je pokazala da su u ovom periodu na koncentraciju selena u krvi uticali i količina selena u hrani i primena blokatora (samostalno ili u kombinaciji sa selenom, Tabela 5.6.3.). Kako u dostupnoj literaturi nismo našli objašnjenje za ovu pojavu, pretpostavili smo da ova dva blokatora dejodinaza mogu imati posredan uticaj na metabolizam selena (resorpciju, vezivanje ili ugradnju u odgovarajuće selenoproteine krvi, izlučivanje putem bubrega) preko tireoidne osovine, odnosno da promena parametara tireoidne osovine (T4 ili T3) ima uticaj na metabolizam selena. Naime, kod grupe tretirane sa PTU ustanovljena je hipotireoza (niže vrednosti i tiroksina i trijodtironina). Moguće je da je ovakav tireoidni status okidač za pokretanje bolje resorpcije selena i njegovog transporta do tkiva bitnih za proizvodnju navedenih hormona (štitaste žlezde i jetre), jer su dejodinaze, odgovorne za konverziju T4 u T3, upravo selenoenzimi. Yoshida i Nakazono (1995), koristeći propiltiouracil kao sredstvo za izazivanje hipotireoizma kod pacova, proučavaju uticaj promenjene tireoidne osovine na status selena u jetri. Hrana deficitna u selenu je bila sa 0,01 mg Se/kg hrane što je 3 puta manje nego u našem eksperimentu, a aplikovana doza PTU je 0,05% (naspram naših 0,015%). Ovi autori su određivali količinu selena u jetri kao i aktivnost GPx1 jetre i nakon 6 nedelja eksperimenta su uočili povećanje koncentracije selena u jetri kod Se+PTU+ jedinki u odnosu na Se+PTU- jedinke. Kod nas je sličan efekat uočen u krvi, ali 3 nedelje nakon početka tretmana pri čemu je selen određivan u punoj krvi. Po Beilsteinu i Whangeru (1988) je 80,5% selena u eritrocitima ugrađeno u glutation 96 peroksidazu (GPx1), te smo očekivali promene i u aktivnosti ovog enzima. Međutim, nije zabeležena značajno veća aktivnost glutation peroksidaze u eritrocitima (GPx1) kod ovih jedinki (grupa Se+PTU+IA-) pa se može zaključiti da selen nije bio ugrađivan u ovaj selenoprotein već je transportovan do drugih tkiva. Ono što čudi jeste pojava niske koncentracije selena u krvi (269,5±85,1 μg/L) selenadekvatnih jedinki koje su dobijale oba blokatora (PTU+IA+), iako su imale sličan profil tireoidnih hormona kao i jedinke tretirane samo sa PTU. Sličan efekat je zapažen i nakon sedam nedelja tretmana iako nije postojala statistički značajna razlika u koncentraciji selena između kontrolne grupe (514,0±125,1 μg/L) i grupe tretirane sa PTU i IA (315,6±168,6 μg/L). Prema Bermano i sar. (1995) i Bates i sar. (2000) aktivnost ID1 u štitastoj žlezdi se prilikom deficita selena povećava te je moguće da se usled preraspodele selena u tkivima, više selena zadržava u tireoideji i mozgu, (Yoshida i Nakazono, 1995), a samim tim ga ima manje u krvi. Na ovo upućuju i podaci vezani za nivo trijodtironina koji je u tom periodu (nakon sedam nedelja tretmana) kod svih selenadekvatnih jedinki bio približno isti iako je količina selena u krvi jedinki tretiranih blokatorima bila smanjena. Vrednosti koncentracije selena u krvi nakon sedam nedelja su kod selenadekvatnih jedinki koje nisu bile tretirane sa propiltiouracilom niti sa IA iznosile u proseku 514,0±125,1 μg/L selena u krvi, što je u skladu sa navodima Hurta i sar. (1971). Koncentracije selena u krvi selendeficitnih jedinki su bile značajno niže (84,2±44,4 μg/L), a utvrđen stepen statističke značajnosti je na nivou p<0,001. U ostalim selendeficitnim (PTU+ i IA+) oglednim grupama je zabeležena statistički značajno niža koncentracija selena u krvi u odnosu na kontrolnu grupu (grupa Se-PTU+IA+ -83,67±28,20 μg/L; grupa Se-PTU+IA- - 94,20±41,54 μg/L; grupa Se-PTU- IA+ - 68,83±10,76 μg/L). 6.6.2. Aktivnost citosolne glutation peroksidaze (GPx1) Glutation peroksidaza 1 (GPx1) ima u odnosu na druge selenoproteine jedinstven način regulacije ekspresije. Naime, jedino aktivnost ovog selenoenzima u tolikoj meri zavisi od količine raspoloživog selena, pri čemu kod jedinki sa deficitom selena opada i količina iRNK u jetri za 90% (Saedi i sar., 1988), i aktivnost samog 97 enzima (Knight i Sunde, 1987). Weiss Sachdev i Sunde su 2001. godine uočili da selen utiče na stabilnost iRNK glutation peroksidaze 1 te da se u slučaju njegovog deficita javlja raspad informacione RNK. Ova dva autora predlažu postojanje „prekidača“ koji je zavisan od selena i da u slučaju deficita selena, iRNK citosolne glutation peroksidaze podleže raspadu zbog prisustva STOP kodona (nonsense-mediated decay). Isti autori navode da se ovo ne dešava sa iRNK za GPx4. Prateći efikasnost translacije putem ugradnje selena u selenoprotein, uočili su da se kod selenadekvatnih jedinki ona povećava 17-24 puta u odnosu na jedinke sa deficitom selena. Kako navode autori, povećanje količine iRNK u kombinaciji sa povećanom efikasnošću translacije kod selenadekvatnih jedinki moglo bi objasniti sto puta veću aktivnost ovog enzima u odnosu na jedinke sa deficitom selena. Kako povećanje koncentracije selena u hrani preko 0,1 μg selena/g ne utiče na regulaciju iRNK i aktivnosti GPx1 (Weiss i sar., 1996), odabrana količina selena u hrani za pacove u našem ekperimentu od 0,3 μg selena/g svakako je obezbedila punu aktivnost citosolne glutation peroksidaze kod selenadekvatnih jedinki. Whanger i Butler (1988) nakon šest nedelja eksperimenta na pacovima beleže aktivnost GPx1 eritrocita od 435±19 μkat/L kod selenadekvatnih jedinki (0,2 mg Se/kg hrane u obliku natrijum selenita). U našem eksperimentu, kod selenadekvatnih jedinki, aktivnost ovog enzima nakon tri nedelje tretmana iznosi 153,3±28,5 μkat/L, a nakon sedam nedelja je dva puta veća i iznosi 342,1±103,3 μkat/L. Aktivnost glutation peroksidaze eritrocita je kod selendeficitnih jedinki (0,02 mg Se/kg hrane) u eksperimentu navedenih autora za 90% niža u odnosu na selenadekvatne jedinke. Kod jedinki sa deficitom selena (Se-PTU-IA-) u našem eksperimentu, zabeležena aktivnost glutation peroksidaze u krvi je, nakon tri nedelje, iznosila 73,65±17,67 μkat/L što je za 52% niža aktivnost u odnosu na kontrolnu grupu, a nakon sedam nedelja je na istom nivou kao i treće nedelje, iznosi 88,6±23,9 μkat/L, što je za 74% niža vrednost u odnosu na selenadekvatne jedinke. Razlika u procentima se, kao i u slučaju GPx3, može objasniti upotrebom selendeficitne hrane sa većom količinom selena u odnosu na navedene autore. Zabeležene prosečne aktivnosti GPx1 kod selenadekvatnih jedinki tretiranih sa jopanoičnom kiselinom (Se+PTU-IA+) i propiltiouracilom (Se+PTU+IA-) nakon 3 nedelje tretmana su iznosile 175,5±51,73 i 150,1±46,09 μkat/L i nije zabeležena statistički 98 značajna razlika u odnosu na kontrolnu grupu (Se+PTU-IA-). Istovremena aplikacija oba blokatora takođe nije imala značajan uticaj na aktivnost ovog enzima. Selendeficitne jedinke su imale statistički značajno niže aktivnosti GPx1 u odnosu na kontrolnu grupu, osim ogledne grupe koja je istovremeno dobijala oba blokatora (i PTU i IA). Prosečna aktivnost GPx1 u ovoj grupi (Se-PTU+IA+) je iznosila 132,13±35,91 μkat/L i bila je statistički značajno viša u odnosu na aktivnost GPx1 kod selendeficitnih jedinki koje nisu dobijale blokatore. U dostupnoj literaturi nismo pronašli objašnjenje za ovu pojavu. Kako je kod tih jedinki ustanovljena hipotireoza, a kako je postojala i negativna korelaciona zavisnost sa koncentracijom T3 i T4 (Grafikon 5.11.1), pretpostavili smo da je pad koncentracije tireoidnih hormona mogao uticati na povećanu sintezu ovog selenoproteina, odnosno da bi tireoidni hormoni mogli da imaju supresivno dejstvo na sintezu nekih selenoproteina te da pad njihove koncentracije dovodi do smanjenja supresije i da se posledično tome povećava njegova aktivnost. Nakon sedam nedelja tretmana, prosečna aktivnost GPx1 je bila ujednačena u svim selenadekvatnim grupama. Kod selendeficitnih jedinki aktivnost ovog enzima je bila nekoliko puta niža. Selendeficitna grupa tretirana sa oba blokatora je imala nešto višu aktivnost ovog enzima u odnosu na ostale selendeficitne grupe, ali ova razlika nije bila statistički značajna. 6.6.3. Aktivnost plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) Izmerene aktivnosti plazmatske glutation peroksidaze (GPx3) su nakon tri nedelje eksperimenta kod selenadekvatnih jedinki (Se+PTU-IA-) u proseku iznosile 55,27±17,85 μkat/L, a kod jedinki sa deficitom selena (Se-PTU-IA-) 32,08±14,87 μkat/L, pri čemu je izračunati pad aktivnosti ovog enzima u plazmi iznosio 42%. Hill i sar. (1987) navode da kod seledeficitnih jedinki brže opada aktivnost GPx1 nego GPx3 te su naši rezultati u skladu sa navedenim autorima pošto je u posmatranom periodu aktivnost GPx1 opala u većem procentu (52%) nego aktivnost GPx3. Isti autori navode da je za maksimalni pad aktivnosti GPx3 prilikom deficita selena kod pacova potrebno 6 nedelja. Nakon sedam nedelja, aktivnost GPx3 je u kontrolnoj grupi bila 119,40±37,00 μkat/L, a kod jedinki sa deficitom selena (Se-PTU-IA-) je bila 23,48±4,32 μkat/L te možemo reći da je tokom vremena aktivnost GPx3 kod selenadekvatnih 99 jedinki porasla dva puta, a da je kod selendeficitnih jedinki stagnirala. Bates i sar. (2000) takođe navode da aktivnost GPx3 raste sa starošću pacova, a slični rezultati su dobijeni i kod nekih drugih životinjskih vrsta: goveda (Jovanović i sar., 2004.), pilića (Valčić i sar., 2011.). Hill i sar. (1987) su za izazivanje deficita selena koristili hranu sa 0,008 mg Se/kg hrane, a zabeleženi pad aktivnosti GPx3 je bio 99%. U našem eksperimentu je nakon tri nedelje aktivnost GPx3 pala za 42% kod selendeficitnih jedinki u odnosu na selenadekvatne. Pad aktivnosti ovog enzima nakon 7 nedelja tretmana od 78,64% u našem eksperimentu može se objasniti upotrebom selendeficitne hrane sa većom količinom selena (0,03 mg Se/kg hrane) u odnosu na navedene autore. Prilikom upotrebe propiltiouracila (grupa Se+PTU+IA-), nakon tri nedelje je zabeležena statistički značajno veća aktivnost GPx3 u odnosu na kontrolnu grupu i ona je u proseku iznosila 91,38±20,42 μkat/L. Kako je u istoj grupi izmerena i veća koncentracija selena u krvi moguće je da je ovo uzrok povećanja aktivnosti GPx3. Nakon sedam nedelja tretmana aktivnost GPx3 je u svim selenadekvatnim grupama bila ujednačena dok je kod svih selendeficitnih jedinki zabeležena statistički značajno niža aktivnost GPx3. Selendeficitne grupe tretirane sa PTU su imale nešto više aktivnosti GPx3 u odnosu na ostale selendeficitne grupe, a t-testom je zabeležena statistička značajnost. U istim grupama je zabeležena i dramatično niža koncentracija T3 i T4. Nakon obrade podataka, utvđena je negativna korelaciona zavisnost između nivoa tireoidnih hormona i aktivnosti ovog enzima i to samo kod selendeficitnih jedinki. Pojava negativne korelacione zavisnosti između T3 i aktivnosti GPx3 i T4 i aktivnosti GPx3 mogla bi biti posledica prioriteta sinteze određenih selenoproteina pri deficitu selena, koji se ostvaruje preko supresivnog dejstva tireoidnih hormona na sintezu ovih selenoproteina. Howie i sar. (1995) navode da kada opada proizvodnja tireoidnih hormona u štitastoj žlezdi, raste sekrecija GPx3. 100 6.7. Korelacije 6.7.1. Korelaciona zavisnost između koncentracije selena i aktivnosti GPx1 i GPx3 Nakon analize korelacione zavisnosti između koncentracije selena u krvi i aktivnosti GPx1 eritrocita, nakon tri nedelje tretmana, utvrđeni koeficijent korelacije je iznosio 0,66 (p<0,01), a uzete su u obzir vrednosti za ova dva parametra kod svih ispivanih jedinki. Izvodeći korelacionu zavisnost pojedinačno po tretmanima, uočena je visoka korelaciona zavisnost između ova dva parametra kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki r=0,81. Kod drugih životinjskih vrsta vrednosti koeficijenta korelacije se kreću od r=0,78 kod ovaca (Pešut, 1996), r=0,59 kod goveda, r=0,27 kod svinja (McMurray i Blanchflover, 1976). Aplikacija blokatora dejodinaza pojedinačno, u ovom periodu, nije bitno uticala na vrednosti koeficijenta korelacije koji su iznosili r=0,83 kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa PTU i r=0,78 kod selenadekvatnih i selendeficitnih jedinki tretiranih sa IA. Yoshida i Nakazono (1995), pri primeni PTU, takođe ne uočavaju narušavanje korelacione zavisnosti između količine selena i aktivnosti GPx1 u jetri. Međutim, istovremeni tretman sa oba blokatora (PTU i IA) je doveo do gubitka korelacione zavisnosti između ova dva parametra. Kod ovih selenadekvatnih jedinki nižu koncentraciju selena u krvi nije pratila niža aktivnost GPx1, a selendeficitne jedinke su imale višu aktivnost ovog enzima u odnosu na selendeficitne jedinke koje nisu dobijale blokatore. Narušavanje korelacije kod ovih jedinki moglo bi biti posledica preusmeravanja selena u sintezu GPx u uslovima hipotireoze. Ista pojava je zapažena i kod korelacione zavisnosti između koncentracije selena u krvi i aktivnosti GPx3 nakon sedam nedelja kada je tretman sa oba blokatora (PTU i IA) ili samo sa PTU, doveo do gubitka korelacione zavisnosti između selena i GPx3. Posmatrajući oba ova tretmana zajedno (sve jedinke tretirane sa PTU), koeficijent korelacije je iznosio r=0,55 (Grafikon 5.10.4.) i bio je značajno manji od koeficijenta korelacije kod jedinki netretiranih sa PTU kod kojih je iznosio r=0,94 (Grafikon 5.10.3.). U selenadekvatnim grupama tretiranim sa PTU, nivo selena u krvi je bio niži u odnosu na kontrolnu grupu i grupu tretiranu sa IA, pri čemu su aktivnosti GPx3 bile ujednačene. Kod selendeficitnih jedinki, aktivnost GPx3 je kod jedinki tretiranih sa PTU bila značajno viša u odnosu na selendeficitne jedinke koje nisu 101 dobijale PTU (Grafikon 5.8.2). Zaključak bi mogao biti isti, a to je da se u uslovima hipotireoze, selen usmerava u sintezu GPx. 6.7.2. Korelaciona zavisnost između koncentracije tireoidnih hormona i aktivnosti GPx1 i GPx3 Nakon tri nedelje tretmana je uočena negativna korelaciona zavisnost između T3 i aktivnosti glutation peroksidaze 1 kod selendeficitnih jedinki (Grafikon 5.11.1). Isti efekat je zapažen i kod korelacione zavisnosti između T3 i GPx3, nakon sedam nedelja tretmana, kada je uočena negativna korelacija između ova dva parametra kod selendeficitnih jedinki. Zabeležene promene aktivnosti glutation peroksidaza i negativna korelaciona zavisnost između aktivnosti GPx i koncentracije tireoidnih hormona, mogle bi ukazati na inhibitorni uticaj tireoidnih hormona na ekspresiju i/ili aktivnost glutation peroksidaza u odnosu na raspoloživi selen, u uslovima hipotireoze izazvane sistemskim padom koncentracije T4. Ovaj efekat je naročito izražen kod selendeficitnih životinja. U opisanim uslovima potrebna je povišena konverzija T4 u T3 kako bi se održala fiziološka koncentracija aktivnog hormona T3, pa se raspoloživi selen preusmerava od sinteze peroksidaza ka sintezi dejodinaza, pre svega ID2. 102 7. Zaključci Na osnovu dobijenih rezultata izvedeni su sledeći zaključci: 1. Telesna masa juvenilnih pacova značajno se smanjivala tokom celog eksperimentalnog perioda usled blokade tireoidne osovine propiltiouracilom (PTU), i kao posledica niskog statusa selena. Najveće smanjenje telesne mase je uočeno kod selendeficitnih jedinki tretiranih sa (PTU). 2. Koncentracija tiroksina (T4) u krvnoj plazmi juvenilnih pacova je sve vreme značajno opadala u eksperimentalnim grupama tretiranim sa PTU. Kod selendeficitnih životinja ovaj pad je bio izrazitiji u odnosu na selenadekvatne jedinke. 3. Koncentracija trijodtironina (T3) u krvnoj plazmi juvenilnih pacova opala je posle tri nedelje u svim grupama tretiranim sa PTU, bez obzira na status selena. Posle sedam nedelja tretmana, koncentracija T3 se ujednačila na normalnom nivou kod selenadekvatnih pacova, dok su vrednosti ostale niže kod selendeficitnih pacova tretiranih sa PTU. 4. Koncentracija tireostimulirajućeg hormona (TSH) u krvnoj plazmi pacova višestruko je porasla u svim grupama tretiranim sa PTU tokom celog ekperimentalnog perioda. Istovremeno, koncentracija TSH je blago porasla kod životinja tretiranih jopanoičnom kiselinom (IA). I kod selendeficitnih jedinki je tokom eksperimenta ustanovljena blago povišena koncentracija TSH. 5. Procenat konverzije T4 u T3 rastao je celim tokom eksperimenta kod grupa pacova tretiranih sa PTU, da bi kod selendeficitnih životinja posle sedam nedelja dostigao vrednosti bliske stopostotnoj aktivaciji. 6. Koncentracija selena u punoj krvi juvenilnih pacova bila je višestruko (5-7 puta) niža kod svih selendeficitnih grupa u poređenju sa selenadekvatnim. Kod selenadekvatnih životinja blokada tireoidne osovine izazvana sa PTU+IA dovela je do značajnog smanjenja koncentracije selena u odnosu na kontrolu. 7. Aktivnost selenoenzima glutation peroksidaze 1 (GPx1) eritrocita i glutation peroksidaze 3 (GPx3) u krvnoj plazmi je kod selenadekvatnih jedinki porasla 2 – 2,5 puta u sedmoj u odnosu na treću nedelju eksperimenta, dok kod selendeficitnih pacova porast tokom vremena nije zabeležen. Kod selendeficitnih grupa 103 istovremeno tretiranih sa PTU+IA aktivnost GPx1 bila je viša u poređenju sa selendeficitnom grupom netretiranom blokatorima dejodinaza nekon tri nedelje, a selendeficitne grupe tretirane sa PTU su imale dvostruko višu aktivnost GPx3 u odnosu na selendeficitnu grupu netretiranu blokatorima dejodinaza nakon sedam nedelja. 8. Visoka pozitivna korelaciona zavisnost utvrđena je između koncentracije selena u krvi i aktivnosti selenoenzima GPx1 i GPx3 tokom celokupnog trajanja eksperimenta u svim oglednim grupama zajedno. Međutim, korelaciona zavisnost bila je raskinuta za GPx1 posle tri nedelje u grupama tretiranim sa PTU+IA, kao i za GPx3 u sedmoj nedelji kod životinja tretiranih sa PTU. 9. Negativna korelaciona zavisnost (r=-0,55, p<0,01) utvrđena je između koncentracije T3 u krvnoj plazmi i aktivnosti eritrocitne GPx1 u trećoj nedelji eksperimenta na nivou celokupne selendeficitne populacije; negativna korelacija (r=-0,63, p<0,01) utvrđena je između nivoa T3 i aktivnosti GPx3 u krvnoj plazmi selendeficitnih pacova u sedmoj nedelji eksperimenta. 104 8. Spisak literature 1. Andersson M, Holmgren A, Spyrou G, 1996, NK-lysin, a disulfide- containing effector peptide of T-lymphocytes, is reduced and inactivated by human thioredoxin reductase: implication for a protective mechanism against NK-lysin cytotoxicity, J Biol Chem, 271, 10116–10120. 2. Anundi I, Hogberg J, Stahl A, 1984, Absorption of selenite in the rat small intestine: interactions with glutathione, Acta Pharmacol Toxicol, 54, 273. 3. Arner ES, 2009, Focus on mammalian thioredoxin reductases- Important selenoproteins with versatile functions, Biochim Biophys Acta, 1790, 495-526. 4. Arthur JR, Nicol F, Beckett GJ, 1990, Hepatic iodothyronine 5' deiodinase. The role of selenium, Biochem J, 272, 537-540. 5. Arthur JR, McKenzie RC, Beckett GJ, 2003, Selenium in the immune system, J Nutr, 133, 1457S-9S. 6. Baqui MM, Gereben B, Harney JW, Larsen PR, Bianco AC, 2000, Distinct subcellular localization of transiently expressed types 1 and 2 iodothyronine deiodinases as determined by immunofluorescence confocal microscopy, Endocrinology 141, 4309–4312. 7. Barnes KM, Evenson JK, Raines AM, Sunde RA, 2009, Transcript analysis of the selenoproteome indicates tbat dietary selenium requirements of rats based on selenium-regulated selenoprotein mRNA levels are uniformly less than those based on glutathione peroxidase activity 1-3 , J Nutr, 139, 199-206. 8. Bates JM, Spate VL, Morris JS, St. Germain DL, Galton VA, 2000, Effects of selenium deficiency on tissue selenium content, deiodinase activity, and thyroid hormone economy in the rat during development, Endocrinology, 141, 2490– 2500. 9. Beck MA, Esworthy RS, Ho YS, Chu FF, 1998, Glutathione peroxidase protects mice from viral-induced myocarditis, FASEB J 12, 1143–1149. 10. Beckett GJ, Arthur JR, Miller SM, McKenzie RC, 2004, Minerals and Immune responses-selenium, Diet and Human Immune Function, pp 217-240, Eds da Hughes, LG Darlington, A Bendich, WR Beisel, Totowa, NJ: Humana Press. 11. Beckett GJ, MacDougal DA, Nicol F, Arthur JR, 1989, Inhibition of type I and II iodothyronine deiodinase activity in rat liver, kidney and brain produced by selenium deficiency, Biochem J, 259, 887–89. 12. Beckett GJ, Nicol F, Rae P, Beech S, Guo Y, Arthur JR, 1993, Effects of combined iodine and selenium deficiency on thyroid hormone metabolism in rats, Am J Clin Nutr Suppl, 57, 240-243. 13. Behne D, Kyriakopoulos A, Meinhold H, Köhrle J, 1990, Identification of type I iodothyronine 5'-deiodinase as a selenoenzyme, Biochem Biophys Res Commun, 31, 173(3), 1143-9. 105 14. Beilstein MA, Vendeland SC, Barofsky E, Jensen ON, Whanger PD, 1996, Selenoprotein W of rat muscle binds glutathione and an unknown small molecular weight moiety, J Inorg Biochem, 61, 117– 124. 15. Beilstein MA, Whanger PD, 1988, Glutathione peroxidase activity and chemical forms of selenium in tissues of rats given selenite or selenomethionine, J Inorgan Biochem, 33, 31-46. 16. Bermano G, Nicol F, Dyer JA, Sunde RA, Beckett GJ, Arthur JR, Hesketh JE, 1995, Tissue-specific regulation of selenoenzyme gene expression during selenium deficiency in rats, Biochem J, 15,311, 425-30. 17. Berry MJ, Banu L, Chen YY, Mandel SJ, Kieffer JD, Harney JW, Larsen PR, 1991, Recognition of UGA as a selenocysteine codon in type I deiodinase requires sequnces in the 3’ untransllated region, Nature, 353, 273-276. 18. Berry MJ, Kates AL, Larsen PR, 1990, Thyroid hormone regulates type I deiodinase messenger RNA in rat liver, Mol Endocrinol, 4, 743–748. 19. Bianco AC, Salvatore D, Gereben B, Berry MJ, Larsen PR, 2002, Biochemistry, cellular and molecular biology, and physiological roles of the iodothyronine selenodeiodinases, Endocr Rev, 23, 38-89. 20. Bianco AC, Silva JE, 1987, Nuclear 3,5,3'-triiodothyronine (T3) in brown adipose tissue: receptor occupancy and sources of T3 as determined by in vivo techniques, Endocrinology, 120, 55–62. 21. Biterova EI, Turanov AA, Gladyshev VN, Barycki JJ, 2005, Crystal structures of oxidized and reduced mitochondrial thioredoxin reductase provide molecular details of the reaction mechanism, Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 15018– 15023. 22. Björnstedt M, Xue J, Huang W, Akesson B, Holmgren A, 1994, The thioredoxin and glutaredoxin systems are efficient electron donors to human plasma glutathione peroxidase, J Biol Chem, 25, 269(47), 29382-4. 23. Björnstedt M, Hamberg M, Kumar S, Xue J, Holmgren A, 1995, Human thioredoxin reductase directly reduces lipid hydroperoxides by NADPH and selenocystine strongly stimulates the reaction via catalytically generated selenols, J Biol Chem, 270, 11761–11764. 24. Björnstedt M, Kumar S, Holmgren A, 1992, Selenodiglutathione is a highly efficient oxidant of reduced thioredoxin and a substrate for mammalian thioredoxin reductase, J Biol Chem, 25, 267(12), 8030-4. 25. Blondeau JP, Beslin A, Chantoux F et al, 1993, Triiodothyronine is a high affinity inhibitor of amonoacid transport system LI in cultured astrocytes, Journal of Neurochemistry, 60, 1407-1413. 26. Braga M, Cooper D, 2001, Oral cholecystographic agent and the thyroid, J Clin Endocrin, 86, 1853-1860. 27. Brigelius-Flohe R, 1999, Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases, Free Radic Biol Med 27, 951–965. 106 28. Brigelius-Flohe R, Banning A, 2006, Part of the series: from dietary antioxidans to regulators in cellular signaling and gene regulation: sulforaphane and selenium, partners in adaptive response and prevention of cancer, Free Radic Res, 40, 775-787. 29. Budiman ME, Bubenik J., Miniard AC, Middleton LM, Gerber CA, Cash A, Driscoll DM, 2009, Eukaryotic initiation factor 4a3 is a selenium-regulated RNA-binding protein that selectively inhibits selenocysteine incorporation, Mol Cell, 35, 479-489. 30. Buettner C, Harney JW, Larsen PR, 1999, The 3'-untranslated region of human type 2 iodothyronine deiodinase mRNA contains a functional selenocysteine insertion sequence element, J Biol Chem, 273 (50), 33374–8. 31. Bürgi H, Wimpfheimer A, Burger W, Zaunbauer H, Rösler, Lemachand, 1976, Changes of circulating rhyroxine, triiodothyronine and reverse triiodothyronine after radiographic contrast agens, J Clin Endocrin, 43, 1203-1210. 32. Burk RF, Nishiki K, Lawrence RA, Chance B, 1978, Peroxide removal by selenium-dependent and selenium-independentglutathione peroxidases in hemoglobin-free purified rat liver, J Biol Chem, 253, 43-46. 33. Burk RF, Hill KE, 1994, Selenoprotein P. A selenium-rich extracellular glycoprotein, J Nutr, 124, 1891-1897. 34. Burk RF, Hill KE, 2005, Selenoprotein P: an extracellular protein with unique physical characteristics and a role in selenium homeostasis, Annu Rev Nutr 25, 215–235. 35. Burmeister LA, Pachucki J, St. Germain DL, 1997, Thyroid hormones inhibit type 2 iodothyronine deiodinase in the rat cerebral cortex by both pre- and posttranslational mechanisms, Endocrinology, 138, 5231–5237. 36. Campos-Barros A, Hoell T, Musa A, Sampaolo S, Stoltenburg G, Pinna G, Eravci M, Meinhold H, Baumgartner A, 1996, Phenolic and tyrosyl ring iodothyronine deiodination and thyroid hormone concentrations in the human central nervous system, J Clin Endocrinol Metab 81, 2179–2185. 37. Canettieri G, Celi FS, Baccheschi G, Salvatori L, Andreoli M, Centanni M, 2000, Isolation of human type 2 deiodinase gene promoter and characterization of a functional cyclic adenosine monophosphate response element, Endocrinology, 141, 1804–1813. 38. Carlson BA, Xu XM, Gladyshev VN, Hatfield DL, 2005, Selective rescue of selenoprotein expression in mice lacking a highly specialized methyl group in selenocysteine tRNA, J Biol Chem, 280, 5542-5548. 39. Cettour-Rose P, Visser1 TJ, Burger AG, Rohner-Jeanrenaud F, 2005, Inhibition of pituitary type 2 deiodinase by reverse triiodothyronine does not alter thyroxine-induced inhibition of thyrotropin secretion in hypothyroid rats, European Journal of Endocrinology, 153, 429–434. 40. Chambers I, Frampton J, Goldfarb P, Affara N, McBain W, Harrison PR, 1986, The structure of the mouse glutathione peroxidase gene: the selenocysteine in 107 the active site is encoded by the termination codon, TGA, EMBO J, 5, 1221- 1227. 41. Chanoine JP, Braverman LE, Farwell AP, Safran M, Alex S, Dubord S, Leonard JL, 1993, The thyroid gland is a major source of circulating T3 in the rat, J Clin Invest, 91, 2709–2713. 42. Chanoine JP, Safran M, Farwell AP, Dubord S, Alex S, Stone S, Arthur JR, Braverman LE, Leonard JL, 1992, Effects of selenium deficiency on thyroid hormone economy in rats, Endocrinology, 131, 1787–1792. 43. Chavatte L, Brown BA, Driscoll DM, 2005, Ribosomal protein L30 is a component of the UGA-selenocysteina recording machinery in eukaryotes, Nat Struct Mol Biol, 12, 408-416. 44. Cheng W, Fu YX, Porres JM, Ross DA, Lei XG, 1999, Seleniumdependent cellular glutathione peroxidase protects mice against a pro-oxidant-induced oxidation of NADPH, NADH, lipids and protein, FASEB J 13, 1467–1475. 45. Cheng WH, Ho YS, Valentine BA, Ross DA, Combs GF Jr, Lei XG, 1998, Cellular glutathione peroxidase is the mediator of body selenium to protect against paraquat lethality in transgenic mice, J Nutr, 128, 1070–1076. 46. Cheng WH, Quimby FW, Lei XG, 2003, Impacts of glutathione peroxidase- 1 knockout on the protection by injected selenium against the pro-oxidant-induced liver aponecrosis and signaling in selenium- deficient mice, Free Radic Biol Med, 34, 918–927. 47. Cheron RG, Kaplan MM, Larsen PR, 1979, Physiological and pharmacological influences on thyroxine to 3,5,3'-triiodothyronine conversion and nuclear 3,5,3'- triiodothyronine binding in rat anterior pituitary, J Clin Invest, 64, 1402–1414. 48. Cho YM, Bae SH, Choi BK, Cho SY, Song CW, Yoo JK, Paik YK, 2003, Differential expression of the liver proteome in senescence accelerated mice, Proteomics, 3, 1883-1894 . 49. Chopra IJ, 1977, A study of extrathyroidal conversion of thyroxine (T4) to 3,3',5- trioodothyronine (T3) in vitro. Endocrinology, 101, 453–463. 50. Chu FF, Esworthy RS, Chu PG, Longmate JA, Huycke MM, Wilczynski S, Doroshow JH, Aranda R, Martin MG, Binder SW, 2004, Bacteria-induced intestinal cancer in mice with disrupted Gpx1 and Gpx2 genes, mice with combined disruption of Gpx1 and Gpx2 genes have colitis, Cancer Res 64, 962– 968. 51. Chunxiang Wu, Xinli Gu, Yuxiang Wu, Jundong Wang, 2008, Effect of fluoride and arseni on serum thyroid hormone in rats, J Herbal Med Tox 2, 39- 43. 52. Combs and Lu, 2001, Selenium as a cancer preventative agent, In Selenium, Its Molecular Biology and Role in Human Health, pp 205-219, Ed DL Hatfield. Boston Kluwer Academic Publishers. 53. Conrad M, Moreno SG, Sinowatz F, Ursini F, Kolle S, Roveri A, Brielmeier M, Wurst W, Maiorino M, Bornkamm GW, 2005, The nuclear form of phospholipid 108 hydroperoxide glutathione peroxidase is a protein thiol peroxidase contributing to sperm chromatin stability, Mol Cell Biol, 25, 7637–7644. 54. Contempre B, Duale NL, Dumont JE, Ngo B, Diplock AT, Vanderpas J, 1992, Effect of selenium supplementation on thyroid hormone metabolism in an iodine and selenium deficient population, Clin Endocrinol (Oxf), 36, 579–583. 55. Copeland PR, Fletcher JE, Carlson BA, Hatfield DL, Driscol DM, 2000, A novel RNA binding protein, SBP2, is required for the translation of mammalian selenoprotein mRNAs, EMBO J, 19, 306-314. 56. Copeland PR, Stepanik VA, Driscoll DM, 2001, Insight into mammalian selenocysteine insertion: domain structure and ribosome binding properties of Sec sequence binding protein 2, Mol Cell Biol, 21, 1491-1498. 57. Courtin F, Pelletier G, WalkerP, 1985, Subcellular localization of thyroxine 5’deiodinase activity in bovine anterior pituitary, Endocrinology, 107, 1376- 1383. 58. Crantz FR, Larsen PR, 1980, Rapid thyroxine to 3,5,3'-triiodothyronine conversion and nuclear 3,5,3'-triiodothyronine binding in rat cerebral cortex and cerebellum, J Clin Invest, 65, 935–938. 59. Crantz FR, Silva JE, Larsen PR, 1982, An analysis of the sources and quantity of 3,5,3'-triiodothyronine specifically bound to nuclear receptors in rat cerebral cortex and cerebellum, Endocrinology, 110, 367–375. 60. Dai G, Levy O, Amzel LM et al, 1996, Cloning and characterization thyroid iodide transporter, Nature, 379, 458-460. 61. de Jesus LA, Hoffman PR, Michaud T, Forry EP, Small-Howard A, Stillwell RJ, Morozova N, Harney JW, Berry MJ, 2006, Nuclear assembly of UGA decoding complexes on selenoprotein mRNA: a mechanism for eluding nonsense- mediated decay?, Mol Cell Biol, 26, 1795-1805. 62. de Haan JB, Bladier C, Griffiths P, Kelner M, O'Shea RD, Cheung NS, Bronson RT, Silvestro MJ, Wild S, Zheng SS, Beart PM, Hertzog PJ, Kola I, 1998, Mice with a homozygous null mutation for the most abundant glutathione peroxidase, Gpx1, show increased susceptibility to the oxidative stress-inducing agents paraquat and hydrogen peroxide, J Biol Chem, 28, 273(35), 22528-36. 63. Demelash A, Karlsson JO, Nilsson M, Björkman U, 2004, Selenium has a protective role in caspase-3-dependent apoptosis induced by H2O2 in primary cultured pig thyrocytes, Eur J Endocrinol, 150, 841-849. 64. DePalo D, Kinlaw WB, Zhao C, Engelberg-Kulka H, St. Germain DL, 1994, Effect of selenium deficiency on type I 5'-deiodinase, J Biol Chem, 269, 16223– 16228. 65. Dickson RC, Tomlison RH, 1967, Selenium in blood and human tissues, Clinica Chimica Acta, 16, 311-321. 66. Dikiy A, Novoselov SV, Fomenko DE, Sengupta A, Carlson BA, Cerny RL, Ginalski K, Grishin NV, Hatfield DL, Gladyshev VN, 2007, SelT, SelW, SelH, and Rdx12: Genomics and Molecular Insights into the Functions of 109 Selenoproteins of a Novel Thioredoxin-like Family, Biochemistry, 46, 6871– 6882. 67. Dumitrescu M, Liao H, Abdullah MS, Lado-Abeal J, Majed FA, Moeller LC, Boran G, Schomburg L, Weiss RE, Reffetof S, 2005, Mutations in SECISBP2 resuld in abnormal thyroid hormone metabolism, Nat Genet, 37, 1247-1252. 68. Ekholm R, Björkman U, 1997, Glutathione peroxidase degrades intracellular hydrogen peroxide and thereby inhibits intracellular protein iodination in thyroid epithelium, Endocrinology, 138, 2871-2878. 69. Emerson CH, Bambini G, Alex S, Castro MI, Roti E, Braverman LE, 1988, The effect of thyroid dysfunction and fasting on placenta inner ring deiodinase activity in the rat, Endocrinology, 122, 809–816. 70. Engler H, Taurog A, Luthy C, Dorris ML, 1983, Reversible and irreversibible inhibition of thyroid peroxidase-catalyzed iodination by thioureylene drugs, Endocrinology, 112, 86. 71. Esfandiari A, Courtin F, Lennon AM, Gavaret JM, Pierre M, 1992, Induction of type III deiodinase activity in astroglial cells by thyroid hormones, Endocrinology, 131, 1682–1688. 72. Esworthy RS, Aranda R, Martin MG, Doroshow JH, Binder SW, Chu FF, 2001, Mice with combined disruption of Gpx1 and Gpx2 genes have colitis, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 281, G848–G855. 73. Esworthy RS, Yang L, Frankel PH, Chu FF, Aranda R, Martin MG, Doroshow JH, Binder SW, 2005, Epithelium-specific glutathione peroxidase, Gpx2, is involved in the prevention of intestinal inflammation in selenium-deficient mice: mice with combined disruption of Gpx1 and Gpx2 genes have colitis, J Nutr 135, 740–745. 74. Fagegaltier D, Hubert N, Yamada K, Mizutani T, Carbon P, Krol A, 2000, Caracterization of mSelB, a novel mammalian elongation factor for selenoprotein translation, EMBO J, 19, 4796-4805. 75. Ferguson AD, Labunskyy VM, Fomenko DE, Arac D, Chelliah Y, Amezcua CA, Rizo J, Gladyshev VN, Deisenhofer J, 2006, NMR structures of the selenoproteins Sep15 and SelM reveal redox activity of a new thioredoxin-like family, J Biol Chem, 281, 3536–3543. 76. Fletcher JE, Copeland PR, Driscoll DM, Krol A, 2001, The selenocysteine incorporation machinery: interactions between the SECIS RNA and the SECIS- binding protein SBP2, RNA, 7, 1442-1453. 77. Flohe L, Gunzler WA, Schock HH, 1973, Glutathione peroxidase: a selenoenzyme. FEBS Lett 32: 132–134. 78. Florian S, Wingler K, Schmehl K, Jacobasch G, Kreuzer OJ, Meyerhof W, Brigelius-Flohe R, 2001, Cellular and subcellular localization of gastrointestinal glutathione peroxidase in a normal and malignant human intestinal tissue, Free Radic Res, 35, 655-663. 79. Fomenko DE, Novoselov SV, Natarajan SK, Lee BC, Koc A, Carlson BA, Lee TH, Kim HY, Hatfield DL, Gladyshev VN, 2008, Methionine-R-sulfoxide 110 reductase 1 (MsrB1) knockout Mmice: Roles of MsrB1 in redox regulation and identification of a novel selenoprotein form, J Biol Chem, 284, 5986–5993. 80. Foresta C, Flohe L, Garolla A, Roveri A, Ursini F, Maiorino M, 2002, Male fertility is linked to the selenoprotein phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, Biol Reprod, 67, 967–971. 81. Forstrom JW, Zakowski JJ, Tappel AL, 1978, Identification of the catalytic site of rat liver glutathione peroxidase as selenocysteine, Biochemistry, 17, 2639– 2644. 82. Freedman JE, Loscalzo J, Benoit SE, Valeri CR, Barnard MR, Michelson AD, 1996, Decreased platelet inhibition by nitric oxide in two brothers with a history of arterial thrombosis, J Clin Invest, 97, 979–987. 83. Friesema EC, Docter R, Moerings EP, Stieger B, Hagenbuch B, Meier PJ, Krenning EP, Hennemann G, Visser TJ, 1999, Identification of thyroid hormone transporters. Biochem Biophys Res Commun, 254, 497–501. 84. Friesema EC, Ganguly S, Abdalla A, Manning Fox JE, Halestrap AP, Visser TJ, 2003, Identification of monocarboxylate transporter 8 as a specific thyroid hormone transporter. J Biol Chem 278:40128–40135. 85. Friesema EC, Jansen J, Jachtenberg JW, Visser WE, Kester MH, Visser TJ, 2008, Effective cellular uptake and efflux of thyroid hormone by human monocarboxylate transporter 10. Mol Endocrinol 22:1357–1369. 86. Frumess RD, Larsen PR, 1975, Correlation of serum triiodothyronine (T3) and thyroxine (T4) with biologic effects of thyroid hormone replacement in propylthiouracil-treated rats, Metabolism, 24, 547–554. 87. Galton VA, Martinez E, Hernandez A, St. Germain EA, Bates JM, St. Germain DL, 2001, The type 2 iodothyronine deiodinase is expressed in the rat uterus and induced during pregnancy, Endocrinology, 142, 2123–2128. 88. Ganther HE. 1999, Selenium metabolism, selenoproteins and mechanisms of cancer prevention: complexities with thioredoxin reductase, Carcinogenesis, 20, 1657–1666. 89. Gao Y, Feng HC, Walder K, Bolton K, Sunderland T, Bishara N, Quick M, Kantham L, Collier GR, 2004, Regulation of the selenoprotein SelS by glucose deprivation and endoplasmic reticulum stress - SelS is a novel glucose-regulated protein, FEBS Lett, 563, 185–190. 90. Gao Y, Pagnon J, Feng HC, Konstantopolous N, Jowett JB, Walder K, Collier GR, 2007, Secretion of the glucose-regulated selenoprotein SEPS1 from hepatoma cells, Biochem Biophys Res Commun, 356, 636–641. 91. Gasiewicz TA, Smith JC, 1976, Interaction of cadmium and selenium in rat plasma in vivo and in vitro, Biochim Biophys Acta, 428, 113. 92. Gereben B, Goncalves C, Harney JW, Larsen PR, Bianco AC, 2000, Selective proteolysis of human type 2 deiodinase: a novel ubiquitin-proteasomal mediated mechanism for regulation of hormone activation, Mol Endocrinol, 14, 1697-708. 111 93. Gereben B, Salvatore D, Harney JW, Tu HM, Larsen PR, 2001, The human, but not rat, dio2 gene is stimulated by thyroid transcription factor-1 (TTF-1), Mol Endocrinol, 15, 112–124. 94. Germain DL, 1985, Metabolic effect of 3,3',5'-triiodothyronine in cultured growth hormone-producing rat pituitary tumor cells. Evidence for a unique mechanism of thyroid hormone action, J Clin Invest, 76, 890–893. 95. Germain DL, 1988a, The effects and interactions of substrates, inhibitors, and the cellular thiol-disulfide balance on the regulation of type II iodothyronine 5'- deiodinase, Endocrinology, 122, 1860–1868. 96. Germain DL, 1988b, Dual Mechanisms of Regulation of Type I lodothyronine 5'-Deiodinase in the Rat Kidney, Liver, and Thyroid Gland Implications for the Treatment of Hyperthyroidism with Radiographic Contrast Agents, J Clin Invest, 81, 1476-1484. 97. Giometti, CS, Liang X, Tolladsen Sl, Wall DB, Lubman DM, Subbarao V, Rao MS, 2000, Mous liver seleniun-binding protein decreased in abundance by peroxisome proliferators, Electrophoresis, 21, 2162-2169. 98. Glass R, Singh W, Jung, W, Veres Z, Scholz T, Stadtman T, 1993, Monoselenophosphate: Synthesis, characterization and identity with the procariotic biological selenium donor, compound SePX, Biochemistry, 12555- 12559. 99. Gondou A, Toyoda N, Nishikawa M, Yonemoto T, Sakaguchi N, Tokoro T, Inada M, 1999, Effect of nicotine on type 2 deiodinase activity in cultured rat glial cells, Endocr J, 46, 107–112. 100. Gross J, Pitt-Riveers R, 1951, Unidentified iodine compounds in human plasma in addition to thyroxine and iodide, Lancet 2, 766-769. 101. Grumolato L, Ghzili H, Montero-Hadjadje M, Gasman S, Lesage J, Tanguy Y, Galas L, Ait-Ali D, Leprince J, Guerineau NC, Elkahloun AG, Fournier A, Vieau D, Vaudry H, Anouar Y, 2008, Selenoprotein T is a PACAP-regulated gene involved in intracellular Ca2+ mobilization and neuroendocrine secretion, FASEB J, 22, 1756–1768. 102. Gu QP, Sun Y, Ream LW, Whanger PD, 2000, Selenoprotein W accumulates primarily in primate skeletal muscle, heart, brain and tongue, Mol Cell Biochem, 204, 49–56. 103. Guadano-Ferraz A, Obregon MJ, St. Germain DL, Bernal J, 1997, The type 2 iodothyronine deiodinase is expressed primarily in glial cells in the neonatal rat brain, Proc Natl Acad Sci, USA 94, 10391–10396. 104. Guimaraes, MJ, Peterson D, Vicari A, Cocks BG, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Ferrick DA, Kastelein RA, Bazan JF, Zlotnik A, 1996, Identification of a novel selD homolog from eukaryotes, bacteria, and archaea: Is there an autoregulatory mechanism in selenocysteine metabolism? Proc Natl Acad Sci USA, 93, 15086–15091. 112 105. Günzler WA, Steffens GJ, Grossman A, Kim SMA, Otting F, Wendel A, Flohe L, 1974, The aminoacid sequence of a bovine glutathione peroxidase, Hoppe- Seyler’s Z Physiol Chem, 365, 195. 106. Habeos IG, Ziros PG, Chartoumpekis D, Psyrogiannis A, Kyriazopoulou V, Papavassiliou AG, 2008, Simvastatin activates Keap1/Nrf2 signaling in rat liver, J Mol Med, 86, 1279-85. 107. Hadley KB, Sunde RA, 2001, Selenium regulation of thioredoxin reductase activity and mRNA levels in rat liver, J Nutr Biochem 12, 693-702. 108. Halperin Y, Shapiro LE, Surks MI, 1994, Down-regulation of type II L- thyroxine, 5'-monodeiodinase in cultured GC cells: different pathways of regulation by L-triiodothyronine and 3,3',5'-triiodo-L-thyronine, Endocrinology, 135, 1464–1469. 109. Hansel A, Heinemann SH, Hoshi T, 2005, Heterogeneity and function of mammalian MSRs: enzymes for repair, protection and regulation, Biochim Biophys Acta, 1703, 239–247. 110. Harris ARC, Fang SL, Vagenakis AG, Braverman LE, 1978, Effect of starvation, nutrient replacement, and hypothyroidism on in vitro hepatic T4 to T3 conversion in the rat, Metabolism, 27, 1680–1690. 111. Hatfield DL, 2001, Selenium: Its molecular biology and role in human health, Kluver academic publishers. 112. Hennemann G, Docter R, Friesema ECH, de Jong M, Krenning EP, Visser TJ, 2001, Plasma membrane transport of thyroid hormones and its role in thyroid hormone metabolism and bioavailability, Endocr Rev, 22, 451–476. 113. Hill K, Burk R, Lane J, 1987, Effect of selenium depletion and repletion on plasma glutathione and glutathione dependent enzymes in rat, J Nutr, 117, 99- 104. 114. Hill KE, McCollum WG, Boeglin ME, Burk RF, 1997, Thioredoxin reductase activity is decreased by selenium deficiency, Biochem Biophys Acta, 234, 293- 295. 115. Hill KE, Zhou J, McMahan WJ, Motley AK, Atkins JF, Gesteland RF, Burk RF, 2003, Deletion of selenoprotein P alters distribution of selenium in the mouse, J Biol Chem, 278, 13640–13646. 116. Ho YS, Magnenat JL, Bronson RT, Cao J, Gargano M, Sugawara M, Funk CD, 1997, Mice deficient in cellular glutathione peroxidase develop normally and show no increased sensitivity to hyperoxia, J Biol Chem, 272, 16644–16651. 117. Hoffmann PR, Hoge SC, Li PA, Hoffman FV, Hashimoto AC, Berry MJ, 2007, The selenoproteome exhibits widely varying, tissue-specific dependence on selenoprotein P for selenium supply, Nucleic Acids Res, 35, 3963-3973. 118. Holmgren A, Lyckeborg C, 1980, Enzymatic reduction of alloxan by thioredoxin and NADPH-thioredoxin reductase, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 5149–5152. 113 119. Holmgren A, Thioredoxin and glutaredoxin systems, 1989, J Biol Chem 264: 13963–13966. 120. Hood A, Liu YP, Gattone V, Klaassen C, 1999, Sensitivity of thyroid gland growth to thyroid stimulating hormone (TSH) in rat treated with antithyroid drugs, Toxicological sciences, 49, 263-271. 121. Horibata Y, Hirabayashi Y, 2007, Identification and characterization of human ethanolamine phosphotransferase 1, J Lipid Res, 48, 503–508. 122. Hough CD, Cho KR, Zonderman AB, Schwartz DR, Morin PJ, 2001, Coordinately up-regulated genes in ovarian cancer, Cancer Res, 61, 3869–3876. 123. Howie AF, Walker SW, Akesson B, Arthur JR, Beckett GJ, 1995, Thyroidal extracellular glutathione peroxidase: a potential regulator of thyroid-hormone synthesis, Biochem J 15, 713-717. 124. Huang SA, Tu HM, Harney JW, Venihaki M, Butte AJ, Kozakewich HP, Fishman SJ, Larsen PR, 2000, Severe hypothyroidism caused by type 3 iodothyronine deiodinase in infantile hemangiomas, N Engl J Med, 343, 185– 189. 125. Huang TS, Chopra IJ, Beredo A, Solomon DH, Chua Teco GN, 1985, Skin is an active site for the inner ring monodeiodination of thyroxine to 3,3',5'- triiodothyronine, Endocrinology 117, 2106–2113. 126. Hurt HD, Cary EE, Visek WJ, 1971, Growth, reproduction and tissue concentration of selenium in the selenium depleted rat, J Nutr, 101, 761-766. 127. Imai H, Hirao F, Sakamoto T, Sekine K, Mizukura Y, Saito M, Kitamoto T, Hayasaka M, Hanaoka K, Nakagawa Y, 2003, Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene, Biochem Biophys Res Commun, 305, 278–286. 128. Imai H, Nakagawa Y, 2003, Biological significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells, Free Radic Biol Med, 34, 145–169. 129. Imai Y, Toyoda N, Maeda A, Kadobayashi T, Wang F, Kuma K, Mitsushige N, Iwasaka T, 2001, Type 2 iodothyronine deiodinase expression is upregulated by protein kinase A-dependent pathway and is downregulated by the protein kinase C-dependent pathway in cultured human thyroid cells, Thyroid, 11, 899–907. 130. Itoh Y, Chiba S, Sekine S, Yokoyama S, 2009, Crystal structure of human selenocysteine tRNA, Nucleic Acids Research, Vol. 37, No. 18 6259-6268. 131. Jakobs TC, Schmutzler C, Meissner J, Kohrle J, 1997, The promoter of the human type I 5'-deiodinase gene-mapping of the transcription start site and identification of a DR+4 thyroid-hormone- responsive element, Eur J Biochem, 247, 288–297. 132. Jameson RR, Carlson BA, Butz M, Esser K, Hatfield DL, Diamond AM, 2002, Selenium influences the turnover on selenocysteine tRNA in Chinese hamster ovary cells, J Nutr, 132, 1830-1835. 114 133. Jameson RR, Diamond AM, 2004, A regulatory role for Sec tRNA in selenoprotein synthesis, RNA, 10, 1142-1152. 134. Jeffrey E, Berry Marla, 2008, Eukaryotic selenoprotein synthesis: mechanistic insight incorporating new factors and new functions for old factors, Life, 60, 232-235. 135. Jenkins KJ, Hidiroglou M, 1972, Comparative metabolism of 75Se-selenite, 75Se-selenate and 75Se-selenomethionine in bovine erythrocytes, Can J Physiol Pharmacol, 50, 972. 136. Jovanović I, Pešut O, Gvozdić D, Stojić V, 2004, Selenium and iodine status relationship in calves and heifers from selenium and iodine deficient areas in Serbia, Acta Veterinaria, 54, 3-11. 137. Kaminsky SM, Levy O, Salvador C, Dai G, Carrasco N, 1994, Na+-IL symport activity is present in membrane vesicles from thyrotropin-deprived non-1-- transporting cultured thyroid cells, Proc Nati Acad Sci USA, 91, 3789-3793. 138. Kamiya Y, Murakami M, Araki O, Hosoi Y, Ogiwara T, Mizuma H, Mori M, 1999, Pretranslational regulation of rhythmic type II iodothyronine deiodinase expression by ß-adrenergic mechanism in the rat pineal gland, Endocrinology, 140, 1272–1278. 139. Kaplan MM, Utiger RD, 1978, Iodothyronine metabolism in liver and kidney homogenates from hypothyroid and hyperthyroid rats, Endocrinology, 103, 156– 161. 140. Kaplan MM, Yaskoski KA, 1980, Phenolic and tyrosyl ring deiodination of iodothyronines in rat brain homogenates, J Clin Invest, 66, 551–552. 141. Kaplan MM, Yaskoski KA, 1981, Maturational patterns of iodothyronine phenolic tyrosyl ring deiodinase activities in rat cerebrum, cerebellum and hypothalamus, J Clin Invest, 67, 1208–1214. 142. Kim SW, Harney JW, Larsen PR, 1998, Studies of the hormonal regulation of type 2 5'-iodothyronine deiodinase messenger ribonucleic acid in pituitary tumor cells using semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, Endocrinology, 139, 4895–4905. 143. Kimura T, Okajima F, Sho K, Kobayashi I, Kondo Y, 1995, Thyrotropin- induced hydrogen peroxide production in FRTL-5 thyroid cells is mediated not by adenosine 3',5'-monophosphate, but by Ca2+ signaling followed by phospholipase-A2 activation and potentiated by an adenosine derivative, Endocrinology, 136, 116-23. 144. Knight SA, Sunde RA, 1987, The effect of progressive selenium deficiency on anti-glutathione peroxidase antibody reactive protein in rat liver, J Nutr 117(4), 732-8. 145. Kobayashi Y, Ogra Y, Suzuki KT, 2001, Speciation and metabolism of selenium in rats injected with 82Se-enriched selenate and selenite, J Chromatogr, 760, 73- 81. 115 146. Koenig RJ, Leonard JL, Senator D, Rappaport N, Watson AY, Larsen PR, 1984, Regulation of thyroxine 5'-deiodinase activity by 3,5,3'-triiodothyronine in cultured rat anterior pituitary cells, Endocrinology, 115, 324–329. 147. Kogai T, Endo T, Saito T, Miyazaki A, Kawaguchi A, Onaya T, 1997, Regulation by thyroid-stimulating hormone of sodium/iodide symporter gene expression and protein levels in FRTL-5 cells, Endocrinology, 138, 2227-2232. 148. Kryukov GV, Castellano S, Novoselov SV, Lobanov AV, Zehtab O, Guigo R, Gladyshev VN, 2003, Characterization of mammalian selenoproteomes, Science, 300, 1439–1443. 149. Kumar S, Bjornstedt M, Holmgren A, 1992, Selenite is a substrate for calf thymus thioredoxin reductase and thioredoxin and elicits a large non- stoichiometric oxidation of NADPH in the presence of oxygen, Eur J Biochem, 207, 435–439. 150. Labunskyy VM, Hatfield DL, Gladyshev VN, 2007, The Sep15 protein family: roles in disulfide bond formation and quality control in the endoplasmic reticulum, IUBMB Life, 59, 1–5. 151. Lanni A, Moreno M, Lombardi A, Goglia F, 1996, Calorigenic effect of diiodothyronines in the rat, Journal of Physiology, 494, 831-837. 152. Larsen PR, 1975, Thyroidal triiodothyronine and thyroxine in Graves’ disease: correlation with presurgical treatment, thyroid status, and iodine content, J Clin Endocrinol Metab, 41, 1098–104. 153. Larsen PR, Dick TE, Markovitz BP, Kaplan MM, Gard TG, 1979, Inhibition of intrapituitary thyroxine to 3.5.3'-triiodothyronine conversion prevents the acute suppression of thyrotropin release by thyroxine in hypothyroid rats, J Clin Invest, 64, 117–128. 154. Larsen PR, Frumess RD, 1977, Comparison of the biological effects of thyroxine and triiodothyronine in the rat, Endocrinology, 100, 980–988. 155. Larsen PR, Silva JE, Kaplan MM, 1981, Relationships between circulating and intracellular thyroid hormones: physiological and clinical implications, Endocr Rev 2, 87–102. 156. Lee BJ, Worland PJ, Davis JN, Stadtman TC, Harfield DI, 1989, Identification of a selenocysteil-tRNA(Ser) in mammalian cells that recognizes the nonsense codon UGA, J Biol Chem, 264, 9724-9727. 157. Lee SR, Kim JR, Kwon KS, Yoon HW, Levine RL, Ginsburg A, Rhee SG, 1999, Molecular cloning and characterization of a mitochondrial selenocysteine- containing thioredoxin reductase from rat liver, J Biol Chem 274, 4722–4734. 158. Lei XG, Evenson JK, Thompson KM, Sunde RA, 1995, Glutathione peroxidase and phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase are differentially regulated in rats by dietary selenium, J Nutr, 125(6), 1438-46. 159. Leinfelder W, Zehelein E, Mandrad-Berthelot MA, Bock A, 1988, Gene for a novel tRNA species that accepts L-serine and cotranslatoryinserts selenocysteine, Nature, 331, 723-725. 116 160. Leonard JL, 1988, Dibutyryl cAMP induction of Type II 5'deiodinase activity in rat brain astrocytes in culture, Biochem Biophys Res Commun, 151, 1164–1172. 161. Leonard JL, Rosenberg IN, 1978, Thyroxine 5'-deiodinase activity of rat kidney: observations on activation by thiols and inhibition by propylthiouracil, Endocrinology 103, 2137–2144. 162. Leonard JL, Rosenberg IN, 1980, Characterization of essential enzyme sulfhydryl groups on thyroxine 5'-deiodinase from rat kidney, Endocrinology, 106, 444–451. 163. Leonard JL, Silva JE, Kaplan MM, Mellen SA, Visser TJ, Larsen PR, 1984, Acute posttranscriptional regulation of cerebrocortical and pituitary iodothyronine 5'-deiodinases by thyroid hormone, Endocrinology, 114, 998– 1004. 164. Li D, Desai-Yajnik V, Lo E, Schapira M, Abagyan R, Samuels HH, 1999, NRIF3 is a novel coactivator mediating functional specificity of nuclear hormone receptors, Mol Cell Biol, 19, 7191-7202. 165. Li Sui, Gilbert ME, 2003, Pre- and postnatal propylthiouracil-induced hypothyroidism impairs synaptic transmission and plasticity in Area CA1 of the neonatal rat hippocampus, Endocrinology, 144, 4195–4203. 166. Lu C, Qiu F, Zhou H, Peng Y, Hao W, Xu J, Yuan J, Wang S, Qiang B, Xu C, Peng X, 2006, Identification and characterization of selenoprotein K: an antioxidant in cardiomyocytes, FEBS Lett, 580, 5189–5197. 167. Lu J, Holmgren A, 2009, Selenoproteins, J Biol Chem, 284, 723-727. 168. Lundholm L, Putnik M, Otsuki M, Andersson S, Ohlsson C, Gustafsson JA, Dahlman-Wright K, 2008, Effects of estrogen on gene expression profiles in mouse hypothalamus and white adipose tissue: target genes include glutathione peroxidase 3 and cell death-inducing DNA fragmentation factor, alpha-subunit- like effector, A J Endocrinol, 196, 547–557. 169. Lundström J, Holmgren A, 1990, Protein disulfide-isomerase is a substrate for thioredoxin reductase and has thioredoxin-like activity, J Biol Chem, 265, 9114– 9120. 170. Magnusson RP, 1990, Thyroid peroxidase, In: Everse J, Grisham MB, eds, Peroxidases on chemistry and biology, Vol I, Boca Raton, CRC Press, 199. 171. Martin GW 3rd, Berry MJ, 2001, Selenocysteine codons decrease polysome association on endogenous selenoprotein mRNAs, Genes Cells, 6(2), 121-9. 172. May JM, Cobb CE, Mendiratta S, Hill KE, Burk RF, 1998, Reduction of the ascorbyl free radical to ascorbate by thioredoxin reductase, J Biol Chem, 273, 23039–23045. 173. McConnell JW, Cho GJ, 1965, Transmucosal movement of selenium, Am Psysiol, 208, 1191. 174. McKenzie RC, Arthur JR, Miller SM, Rafferty TS, Beckett GJ, 2002, Sellenium and Immune function, In Nutrition and Immune function, pp 229-250, Eds PC Calder, CJ Field, HS Gill, Wallingford: CABI Publishing. 117 175. McMurray CH, Blanchflower WJ, 1976, The levels of selenium and glutathione peroxidase activity in blood of sheep, cowes and pigs, Res Vet Sci, 20, 229-231. 176. Meinhold H, Campos-Barros A, Behne D, 1992, Effects of selenium and iodine deficiency on iodothyronine deiodinases in brain, thyroid and peripheral tissue, Acta Med Austriaca, 19, 8–12. 177. Meinhold H, Campos-Barros A, Walzog B, Kohler R, Muller F, Behne D, 1993, Effects of selenium and iodine deficiency on type I, type II and type III iodothyronine deiodinases and circulating thyroid hormones in the rat, Exp Clin Endocrinol, 101, 87–93. 178. Mihajlović M, Vasiljević Z, Šobajić S, Jovanović I, Pešut O, Matić G, 2003, Antioxidant status of patiens with acute myocardial infarction, Trace Element and Electrolytes, 20, 5-7. 179. Miranda-Vizuete A, Damdimopoulos AE, Pedrajas JR, Gustafsson JA, Spyrou G, 1999, Human mitochondrial thioredoxin reductase cDNA cloning, expression and genomic organization, Eur J Biochem, 261, 405–412. 180. Mittag J, Behrends T, Hoefig CS, Vennström B, Schomburg L, 2010, Thyroid hormones regulate selenoprotein expression and selenium status in mice, PLoS One, 22, 5(9), e12931. 181. Mizuma H, Murakami M, Mori M, 2001, Thyroid hormone activation in human vascular smooth muscle cells: expression of type II iodothyronine deiodinase, Circ Res, 88, 313–318. 182. Moghadaszadeh B, Petit N, Jaillard C, Brockington M, Roy SQ, Merlini L, Romero N, Estournet B, Desguerre I, Chaigne D, Muntoni F, Topaloglu H, Guicheney P, 2001, Mutations in SEPN1 cause congenital muscular dystrophy with spinal rigidity and restrictive respiratory syndrome, Nat Genet, 29, 17–18. 183. Molinero P, Osuna C, Guerrero JM, 1995, Type II thyroxine 5'-deiodinase in the rat thymus, J Endocrinol, 146, 105–111. 184. Moore T, Zhang Y, Fenley MO, Li H, 2004, Molecular basis of box C/D RNA- protein interactions: cocrystal structure of archaeal L7Ae and a box C/Drna, Structure, 12, 807-817. 185. Motohashi H, Yamamoto M, 2004, Nrf2-Keap1 defines a physiologically important stress response mechanism, Trend Mol Med, 10, 549-557. 186. Murakami M, Araki O, Hosoi Y, Kamiya Y, Morimura T, Ogiwara T, Mizuma H, Mori M, 2001, Expression and regulation of type II iodothyronine deiodinase in human thyroid gland, Endocrinology, 142, 2961–2967. 187. Nguyen TT, Chapa F, DiStefano III JJ, 1998, Direct measurement of the contributions of type I and type II 5'-deiodinases to whole body steady state 3,5,3'-triiodothyronine production from thyroxine in the rat, Endocrinology, 139, 4626–4633. 188. Nikitović D, Holmgren A, 1996, S-nitrosoglutathione is cleaved by the thioredoxin system with liberation of glutathione and redox regulating nitric oxide, J Biol Chem, 271, 19180–19185. 118 189. Obregon MJ, Larsen PR, Silva JE, 1986, The role of 3,3',5'-triiodothyronine in the regulation of type II iodothyronine 5'-deiodinase in the rat cerebral cortex, Endocrinology, 119, 2186–2192. 190. Olson GE, Winfrey VP, Hill KE, Burk RF, 2004, Sequential development of flagellar defects in spermatids and epididymal spermatozoa of selenium- deficient rats, Reproduction, 127, 335–342. 191. Olson GE, Winfrey VP, Hill KE, Burk RF, 2008, Megalin mediates selenoprotein P uptake by kidney proximal tubule epithelial cells, J Biol Chem, 283, 6854–6860. 192. Olson GE, Winfrey VP, Nagdas SK, Hill KE, Burk RF, 2007, Apolipoprotein E receptor-2 (ApoER2) mediates selenium uptake from selenoprotein P by the mouse testis, J Biol Chem, 282, 12290– 12297. 193. Oppenheimer JH, 1979, Thyroid hormone action at the cellular level, Science, 203, 971–979. 194. Oppenheimer JH, Schwartz HL, Surks MI, 1972, Propylthiouracil inhibits the conversion of L-thyroxine to L-triiodothyronine: an explanation of the antithyroxine effect of propylthiouracil and evidence supporting the concept that triiodothyronine is the active thyroid hormone, J Clin Invest, 51, 2493–2497. 195. Ottavioano F, Tang S, Handy D, Loscalzo J, 2009, Regulation of the extracellular antioxidant selenoprotein plasma glutathione peoxidase (GPx-3) in mammalian cells, Mol Cell Biochem, 327, 111-126. 196. Pallud S, Lennon AM, Ramauge M, Gavaret JM, Croteau W, Pierre M, Courtin F, St. Germain DL, 1997, Expression of the type II iodothyronine deiodinase in cultured rat astrocytes is selenium-dependent, J Biol Chem, 272, 18104–18110. 197. Panee J, Stoytcheva ZR, Liu W, Berry MJ, 2007, Selenoprotein H is a redox- sensing high mobility group family DNA-binding protein that up-regulates genes involved in glutathione synthesis and phase II detoxification, J Biol Chem, 282, 23759–23765. 198. Papp LV, Lu J, Holmgren A, Khanna K, 2007, From selenium to selenoproteins: synthesis, identity and their role in human health, Antioxidans and Redox Signaling, Vol 9, 7, 775-806. 199. Papp LV, Lu J, Striebel F, Kennedy D, Holmgren A, Khanna K, 2006, The redox state of SECIS binding protein 2 controles its localization and selenocysteine incorporation function, Mol Cell Biol, 26, 4895-4910. 200. Pappas AC, Zoidis E, Surai PF, Zervas G, 2008, Selenoproteins and maternal nutrition, Comparativ Biochem Physiol, 151, 361-372. 201. Park JY, Seong Jk, Paik JK, 2004, Proteomic analysis of diet-induced hypercholesterolemic mice, Proteomics, 514-523. 202. Pekary AE, Berg L, Santini F, Chopra I, Hershman JM, 1994, Cytokines modulate Type I iodothyronine deiodinase mRNA levels and enzyme activity in FRTL-5 rat thyroid cells, Mol Cell Endocrinol, 102, R31-R35. 119 203. Pešut Olivera, 1996, Sadržaj selena u hranivima i status selena ovaca na području Bačke, magistarska teza, Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu. 204. Petanceska S, Devi L, 1992, Sequence analysis, tissue distribution and expression of rat cathepsin S, J Biol Chem, 267, 26038. 205. Petit N, Lescure A, Rederstorff M, Krol A, Moghadaszadeh B, Wewer UM, Guicheney P, 2003, Selenoprotein N: an endoplasmic reticulum glycoprotein with an early developmental expression pattern, Hum Mol Genet, 12, 1045– 1053. 206. Petrujkić B, 2010, Uticaj selena organskog i neorganskog porekla dodatog u hranu na kvalitet sperme nerastova, doktorska disartacija, Fakultet veterinarske medicine, Univerzitet u Beogradu. 207. Philips ID, Black EG, Sheppard MC et al, 1989, Thyrotrophin, forskolin and ionomycin increase cathepsin B mRNA contrentration in rat thyroid cells in culture, J Mol Endocrinol, 2, 207. 208. Porat A, Sagiv Y, Elazar Z, 2000, A 56-kDa selenium-binding protein participates in intra-Golgi protein transport, J Biol Chem, 275, 14457-14465. 209. Pumford NR, Martin BM, Hinson JA, 1992, A metabolite of acetaminophen covalently binds to the 56 kDa selenium binding protein, Biochem Biophys Res Commun, 182, 1348-1355. 210. Radovanović A, 2003, Uticaj smanjene funkcije štitaste žlezde na jajnike pacova tokom polnog sazrevanja, Doktorska disertacija, Fakultet veterinarske medicine, Beograd. 211. Rasmussen U, Rasmussen A, 2007, Thyroid hormone transport and actions, in Diseases of the thyroid in childhood and adolescence, Krassas GE, Rivkees SA, Kiess W (eds), Pediatr adolesc med Basel, 11, 80-103. 212. Rayman MP, 2002, The argument for increasing selenium intake, Proceeding of the Nutrition Society, 61, 203-215. 213. Renko K, Werner M, Renner-Muller I, Coopers T, Yeungs C, 2008, Hepatic selenoprotein P (SePP) expression restores selenium transport and prevents infertility and motor-incoordination in Sepp-knockout mice, Biochem J 409, 741–749. 214. Rhee SG, Chae HZ, Kim K, 2005, Peroxiredoxins: a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling, Free Radic Biol Med, 38, 1543–1552. 215. Rotruck JT, Pope AL, Ganther HE, Swason AB, Hafeman DG, Heekstra WG, 1973, Selenium biochemical role as a component of glutathione peroxidase, Science, 179, 1957-1963. 216. Rundlof AK, Arner ES, 2004, Regulation of the mammalian selenoprotein thioredoxin reductase 1 in relation to cellular phenotype, growth, and signaling events, Antioxid Redox Signal 6, 41–52. 120 217. Ruz M, Codoceo J, Galgani J, Munoz L, Gras N, Muzzo S, Leiva L, Bosco C, 1999, Single and multiple selenium-zinc-iodine deficiencies affect rat thyroid metabolism and ultrastructure, J Nutr, 129, 174-180. 218. Saedi MS, Smith CG, Frampton J, Chambers I, Harrison PR, Sunde RA, 1988, Effect of selenium status on mRNA levels for glutathione peroxidase in rat liver, Biochem Biophys Res Commun 16, 153(2), 855-61. 219. Salvatore D, Bartha T, Harney JW, Larsen PR, 1996, Molecular biological and biochemical characterization of the human type 2 selenodeiodinase, Endocrinology, 137, 3308–3315. 220. Salvatore D, Bartha T, Larsen PR, 1998, The guanosine monophosphate reductase gene is conserved in rats and its expression increases rapidly in brown adipose tissue during cold exposure, J Biol Chem, 273, 31092–31096. 221. Sandholm M, 1975, Function of erythrocytes in attaching selenite Se onto specific plasma proteins, Acta Pharmacol Toxicol, 36, 321. 222. Schmutzler C, Kohrle J, 2000, Retinoic acid redifferentiation therapy for thyroid cancer, Thyroid, 10, 393-406. 223. Schoenmakers CHH, Pigmans IGAJ, Visser TJ, 1995, Investigation of type I and type III iodothyronine deiodinases in rat tissues using N-bromoacetyl- iodothyronine affinity labels, Mol Cell Endocrinol, 107:173–180. 224. Schmutzler C, Mentrup B, Schomburg L, Hoang-Vu C, Herzog V, Kohrle J, 2007, Selenoproteins of the thyroid gland: expression, localization and possible function of glutathione peroxidase 3, Biol Chem, 388, 1053–1059. 225. Schomburg L, Schweizer U, Holtmann B, Flohe L, Sendtner M, Kohrle J, 2003, Gene disruption discloses role of selenoprotein P in selenium delivery to target tissues, Biochem J, 370, 397–402. 226. Schweizer U, Streckfuss F, Pelt P, Carlson BA, Hatfield DL, Kohrle J, Schomburg L, 2005, Hepatically derived selenoprotein P is a key factor for kidney but not for brain selenium supply, Biochem J, 386, 221–226. 227. Segerson TP, Kauer J, Wolfe H, Mobitker H, Wu P, Jackson IMD, Lechan RM, 1987, Thyroid hormone regulates TRH biosynthesis in the paraventricular nucleus of the rat hypothalamus, Science, 238, 78–80. 228. Shang WW, Luo J, Cheng WB, Huang Q, Wang WD, 2010, Effect of PTU on the expression of thyroid TPO, Tg mRNA in rats, Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 41, 428-431. 229. Shigeta K, Matsumura K, Suzuki Y, Shinohara A, Furuta N, 2008, Distribution and dynamic pathway of selenium species in selenium deficient mice injected with 82Se-enriched selenite, Anal Sci, 24, 1117-22. 230. Shiobara Y, Suzuki KT, 1998, Binding of selenium (administreted as selenite) to albumin after efflux from red blood cells, J Chromatogr B, 710, 49-56. 231. Silva JE, Dick TE, Larsen PR, 1978, The contribution of local tissue thyroxine monodeiodination to the nuclear 3,5,3'-triiodothyronine in pituitary, liver, and kidney of euthyroid rats, Endocrinology, 103, 1196–1207. 121 232. Silva JE, Gordon MB, Crantz FR, Leonard JL, Larsen PR, 1984, Qualitative and quantitative differences in pathways of extrathyroidal triiodothyronine generation between euthyroid and hypothyroid rats, J Clin Inv, 73, 898-907. 233. Silva JE, Larsen PR 1983 Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature, 305:712–713. 234. Silva JE, Larsen PR, 1978, Contributions of plasma triiodothyronine and local thyroxine monodeiodination to triiodothyronine to nuclear triiodothyronine receptor saturation in pituitary, liver, and kidney of hypothyroid rats: further evidence relating saturation of pituitary nuclear triiodothyronine receptors and the acute inhibition of thyroid-stimulating hormone release, J Clin Invest, 61, 1247–125. 235. Silva JE, Larsen PR, 1986b, Hormonal regulation of iodothyronine 5'-deiodinase in rat brown adipose tissue, Am J Physiol, 251, E639–E643. 236. Silva JE, Larsen PR, 1986a, Interrelationships among thyroxine, growth hormone, and the sympathetic nervous system in the regulation of 5'- iodothyronine deiodinase in rat brown adipose tissue, J Clin Invest, 77, 1214– 1223. 237. Silva JE, Leonard JL, 1985, Regulation of rat cerebrocortical and adenohypophyseal type II 5'-deiodinase by thyroxine, triiodothyronine, and reverse triiodothyronine, Endocrinology, 116, 1627–1635. 238. Small-Howard A, Morozova N, Stoytcheva Z, Forry EP, Mansell JB, Harney JW, Carlson BA, Xu XM, Hatfield DL, Berry MJ, 2006, Supramolecular complexes mediate selenocysteine incorporation in vivo, Mol Cell Biol, 26, 2337-46. 239. Song S, Sorimachi K, Adachi K, Oka T, 2000, Biochemical and molecular biological evidence for the presence of type II iodothyronine deiodinase in mouse mammary gland, Mol Cell Endocrinol, 160, 173–181. 240. Stadtman ER, 2006, Protein oxidation and aging, Free Radic Res, 40, 1250– 1258. 241. Stoytcheva Z, Berry M, 2009, Trancriptional regulation of mammalian selenoprotein expression, Biochim Biophys Acta, 1790,1429-1440. 242. Sun QA, Kirnarsky L, Sherman S, Gladyshev VN, 2001, Selenoprotein oxidoreductase with specificity for thioredoxin and glutathione systems, Proc Natl Acad Sci USA, 98, 3673–3678. 243. Sunde RA, Raines AM, Barnes KM, Evenson JK, 2008, Selenium status highly- regulates selenoprotein mRNA levels for only a subset of the selenoproteins in the selenoproteome, Biosci Rep, doi: 10.1042/BSR20080146 244. Sunde RA, Thompson KM, Evenson JK, Weiss Sl, 1998, Proc Nutr Soc, 57, 155A. 245. Surai PF, 2006, Selenium in nutrition and health, Nottingham University Press, Nottingham. 122 246. Takahashi K, Akasaka M, Yamamoto Y, Kobayashi C, Mizoguchi J, Koyama J, 1990, Primary structure of human plasma glutathione peroxidase deduced from cDNA sequences, J Biochem (Tokyo), 108, 145–148. 247. Tamura T and Stadtman TC, 1996, A new selenoprotein from human lung adenocarcinoma cells: purification, properties, and thioredoxin reductase activity, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 1006–1011. 248. Thomas JP, Girotti AW, 1988, Photooxidation of cell membranes in the presence of hematoporphyrin derivative: reactivity of phospholipid and cholesterol hydroperoxides with glutathione peroxidase, Biochim Biophys Acta, 962, 297–307. 249. Thompson K, Haibach H, Sunde R, 1995, Growth and plasma triiodothyronine concentrations are modified by selenium deficiency and repletion in second- generation selenium-deficient rats, J Nutr 125, 864-873. 250. Toyoda N, Berry MJ, Harney JW, Larsen PR, 1995a, Topological analysis of the integral membrane protein, type 1 iodothyronine deiodinase (D1), J Biol Chem 270, 12310–12318. 251. Toyoda N, Nishikawa M, Mori Y, Gondou A, Ogawa Y, Yonemoto T, Yoshimura M, Masaki H, Inada M, 1992, Thyrotropin and triiodothyronine regulate iodothyronine 5'-deiodinase messenger ribonucleic acid levels in FRTL- 5 rat thyroid cells, Endocrinology, 131, 389-94. 252. Toyoda N, Zavacki AM, Maia AL, Harney JW, Larsen PR, 1995b, A novel retinoid X receptor-independent thyroid hormone response element is present in the human type 1 deiodinase gene, Mol Cell Biol, 15, 5100–5112. 253. Ursini F, Heim S, Kiess M, Maiorino M, Roveri A, Wissing J, Flohe L, 1999, Dual function of the selenoprotein PHGPx during sperm maturation, Science, 285, 1393–1396. 254. Uyttersprot N, Pelgrims N, Carrasco N, Gervy C, Maenhaut C, Dumont JE, Miot F, 1997, Moderate doses of iodide in vivo inhibit cell proliferation and the expression of thyroperoxidase and Na+/I- symporter mRNAs in dog thyroid, Mol Cell Endocrinol, 131,195–203. 255. Valčić O, Jovanović I, Milanović S, 2011, Selenium, thiobarbituric acid reactive substances and thyroid hormone activation in broilers supplemented with selenium as selenized yeast or sodium selenite, Japanese Journal of Veterinary Research, 59, 69-77. 256. Valentine WM, Abel TW, Hill KE, Austin LM, Burk RF, 2008, Neurodegeneration in mice resulting from loss of functional selenoprotein P or its receptor apolipoprotein E receptor 2. J Neuropathol Exp Neurol, 67, 68–77. 257. Vanderpas JB, Contempré B, Duale NL, Goossens W, Bebe N, Thorpe R, Ntambue K, Dumont J, Thilly CH, Diplock AT, 1990, Iodine and selenium deficiency associated with cretinism in northern Zaire, Am J Clin Nutr 52, 1087- 93. 258. Van der Puten HH, Friesema EC, Abumrad NA et al, 2003, Thyroid hormone transport by the rat fatty acid translocase, Endocrinology, 144, 1315-1323. 123 259. van Doorn JD, Roelfsema F, van der Heide D, 1983, The effect of propylthiouracil and methimazole on the peripheral conversion of thyroxine to 3,5,3'-triiodothyronine in athyreotic thyroxine-maintained rats, Acta Endocrinol (Copenh), 103, 509–520. 260. Vendeland SC, Deagen JT, Butler JA, Whanger PD, 1994, Uptake of selenite, selenomethionine and selenate by brush border membrane vesicles isolated from rat small intestine, Biometals, 7(4), 305-12 . 261. Venditti P, Balestrieri M, Di Meo S, De Leo T, 1997, Effect of thyroid state on lipid peroxidation, antioxidant defences and susceptibility o oxidative stress in rat tissue, J Endocrinology, 155, 151-157. 262. Veronikis IE, Braverman LE, Alex S, Fang SL, Norvell B, Emerson CH, 1996, Comparison of the effects of propylthiouracil and selenium deficiency on T3 production in the rat, Endocrinology, 137, 2580–2585. 263. Visser TJ, Leonard JL, Kaplan MM, Larsen PR, 1982, Kinetic evidence suggesting two mechanisms for iodothyronine 5'-deiodination in rat cerebral cortex, Proc Natl Acad Sci USA, 79, 5080–5084. 264. Visser TJ, van der Does-Tobe I, Docter R, Hennemann G, 1976, Subcellular localization of a rat liver enzyme converting thyroxine into triiodothyronine and possible involvement of essential thiol groups, Biochem J, 157, 479–482. 265. Walczak R, Carbon P, Krol A, 1998, An esseltial non-Watson-Crick base pair motif in 3’UTR to mediate selenoprotein translation, RNA, 4, 74-84. 266. Weiss Sachdev S, Sunde R, 2001, Selenium regulation of transcript abundance and translational efficiency of glutathione peroxidase- 1and -4 in rat liver, J Biochem, 357, 851-858. 267. Weiss SL, Evenson JK, Thompson KM, Sunde RA, 1996, The selenium requirement for glutathione peroxidase mRNA level is half of the selenium requirement for glutathione peroxidase activity in female rats, J Nutr, 126(9), 2260-7. 268. Westholm DE, Stenehjem DD, Rumbley JN, Drewes LR, Anderson GW, 2009, Competitive inhibition of organic anion transporting polypeptide 1c1-mediated thyroxine transport by the fenamate class of nonsteroidal antiinflammatory drugs, Endocrinology, 150, 1025–1032. 269. Whanger PD, 2002, Selenocompounds in plants and animals and their biological significance, J Am Coll Nutr, 21,3,223-232. 270. Whanger PD, Butler JA, 1988, Effects of various dietary levels of selenium as selenite or selenomethionine on tissue selenium levels and glutathione peroxidase activity in rats, J Nutr, 118, 846-852. 271. Whanger PD, Pedersen ND, Hatfield J, Weswig PH, 1976, Absorption of selenite and selenomethionine from ligated digestive tract segments in rats, Proc Soc Exper Biol Med 153,295. 272. Whanger PD, Vendeland SC, Park YC, Xia Y, 1996, Metabolism of subtoxic levels of selenium in animals and humans, Ann Clin Lab Sci, 26, 99-113. 124 273. Wingler K, Brigelius-Flohe R, 1999, Gastrointestinal glutathione peroxidase, Biofactors, 10, 245–249. 274. Wolfram S, 1999, Absorption and metabolism of selenium: difference between inorganic and organic sources. In: Biotechnology in the Feed Idustry, Proceedings of 15th Alltech’s Annual Symposium, Ed Lyons TP and Jacques KA, Nottingham Univesity Press, Nottingham, UK, pp 547-566. 275. Wolfram S, Arduser F, Scharrer E, 1985, In vivo intestinal absorption of selenate and selenite in rats, J Nutr, 115, 454. 276. Wu Y, Koenig R, 2000, Gene regulation by thyroid hormone, TEM, 11, 6, 207- 211. 277. Xu XM, Carlson BA, Irons R, Mix H, Zhong N, Gladyshev VN, Hatfield DL, 2007a, Selenophosphate synthetase 2 is essential for selenoprotein biosynthesis, Biochem J 404, 115–120. 278. Xu XM, Carlson BA, Mix H, Zhang Y, Saira K, Glass RS, Berry MJ, Gladyshev VN, Hatfield DL, 2007b, Biosynthesis of selenocysteine on its tRNA in eukaryotes, PLoS Biol. 5(1):e4. 279. Xu XM, Mix H, Carlson BA, Grabowski PJ, Gladyshev VN, Berry MJ, Hatfield DL, 2005, Evidence for direct roles of two additional factors, SECp43 and SLA, in the selenoprotein synthesis machinery, J Biol Chem, 280, 41568-41575. 280. Yang FY, Fen C, Tu YP, 1996, Se-mediated domain-domain communication in band 3 of human erythrocytes, Biol Trace Elem Res 55(3), 279-95. 281. Yant LJ, Ran Q, Rao L, Van Remmen H, Shibatani T, Belter JG, Motta L, Richardson A, Prolla TA, 2003, The selenoprotein GPX4 is essential for mouse development and protects from radiation and oxidative damage insults, Free Radic Biol Med, 34, 496–502. 282. Ye Y, Shibata Y, Yun C, Ron D, Rapoport TA, 2004, A membrane protein complex mediates retrotranslocation from the ER lumen into the cytosol, Nature, 429, 841–847. 283. Yoshida M, Nakazono N, 1995, Effect of ingestion of 6-propyl-2-thiouracil on biochemical indices of selenium status in rats, J Toxicol Sci, 20, 23-28. 284. Yoshimura S, Wantanabe K, Suemizu H, Onozawa T, Mizoguchi J, Tsuda K, Hatta H, Moriuchi T, 1991, Tissue specific expression of the plasma glutathione peroxidase gene in rat kidney, J Biochem, 109, 918-923. 285. Yuan CX, Ito M, Fondell JD, Fu ZY, Roeder RG, 1998, The TRAP220 component of a thyroid hormone receptor- associated protein (TRAP) coactivator complex interacts directly with nuclear receptors in a ligand- dependent fashion, Proc Natl Acad Sci USA, 95, 7939-7944. 286. Zhao R, Masayasu H, and Holmgren A, 2002, Ebselen, a substrate for human thioredoxin reductase strongly stimulating its hydroperoxide reductase activity and a superfast thioredoxin oxidant, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 8579–8584. 287. Zhong L, Arner ES, Holmgren A, 2000, Structure and mechanism of mammalian thioredoxin reductase: the active site is a redoxactive 125 selenolthiol/selenenylsulfide formed from the conserved cysteine-selenocysteine sequence, Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5854–5859. 288. Zhong L, Holmgren A, 2000, Essential role of selenium in the catalytic activities of mammalian thioredoxin reductase revealed by characterization of recombinant enzymes with selenocysteine mutations, J Biol Chem, 275, 18121– 18128. 289. Zhou Y, Samson M, Osty J, Francon J, Blondeau JP, 1990, evidence for a clise link between the thyroid hormone transport system and the aromatic aminoacid transport system in erythrocytes, Jour of endocrinology, 265, 17000-17004. 126 9. Skraćenice T4- tiroksin T3- trijodtironin TSH- tireostimulirajući hormon PTU- propiltiouracil IA- jopanoična kiselina GPx1- citosolna glutation peroksidaza ID1- jodotironin dejodinaza 1 ID2- jodotironin dejodinaza 2 SPS2- selenofosfat sintetaza 2 Sec- selenocistein Biografija autora Mr Svetlana Milanović rođena je 14.05.1973. godine u Beogradu. Nakon završene srednje škole (Peta beogradska gimnazija) upisala je 1992. god. studije na Fakultetu veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu, smer Veterinarska medicina. Diplomirala je 8.07.1998. godine sa prosečnom ocenom 9,21. Školske 1998/99. godine upisala je poslediplomske magistarske studije, smer Patologija i terapija domaćih životinja na Fakultetu veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu i u roku položila sve ispite predviđene planom i programom, sa prosečnom ocenom 9,00. Na radno mesto asistenta pripravnika za predmet Biohemija na Katedri za fiziologiju i biohemiju Veterinarskog fakulteta u Beogradu primljena je u martu 2001. godine. Magistarsku tezu pod naslovom: Uporedno ispitivanje uticaja organski i neorganski vezanog gvožđa na hematološke parametre, imunski odgovor, količinu u organima i proizvodne rezultate pilića u tovu odbranila je 15. 12. 2005. god. na Veterinarskom fakultetu u Beogradu. Mr Svetlana Milanović je od 1998 do 2001. godine bila stipendista Ministarstva za nauku i tehnologiju i angažovana na projektu: 'Izučavanje etiopatogeneze, genetičkih i ekoloških faktora u cilju unapređenja zaštite zdravlja, povećanja proizvodno reproduktivnih karakteristika životinja i zdravstvene ispravnosti namirnica animalnog porekla’ (12M18). Od 2002. do 2006. godine je bila angažovana na projektima:  Ispitivanje lokalne i sistemske imunološke reaktivnosti junica i krava na antigene spermatozoida i razređivača za spermu bika (OI 1998)  Zajednički deficit joda i selena u Srbiji kao faktor rizika za zdravlje i proizvodne osobine domaćih životinja (OI 1881) Od 2006. do 2010. godine je bila angažovana na projektu: 'Ekofiziološka i genetička istraživanja domaćih životinja i pčela u funkciji povećanja reproduktivnih svojstava i otpornosti na bolesti' (OI 1870). Od 2011. godine je angažovana na projektu: 'Biotehnologija u regulaciji proizvodnog i reproduktivnog statusa i zdravstvenog stanja kod visoko-mlečnih krava' (TP 31050) Tokom dosadašnje karijere objavila je preko dvadeset naučnih radova u međunarodnim i domaćim naučnim časopisima, ili saopštila na naučnim skupovima. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-а Милановић Светлана број уписа 0112/20 Изјављујем да је докторска дисертација под насловом „Утицај пропилтиоурацила и јопаноичне киселине на функцију тиреоиднe осовине и активност глутатион пероксидаза код селен-дефицијентних и селен-адекватних јувенилних пацова“  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, 22.6.2012. _________________________ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора: Милановић Светлана Број уписа 0112/20 Студијски програм: докторске студије Наслов рада: „Утицај пропилтиоурацила и јопаноичне киселине на функцију тиреоиднe осовине и активност глутатион пероксидаза код селен- дефицијентних и селен-адекватних јувенилних пацова“ Ментор: Проф. др Иван Б. Јовановић Потписана Милановић Светлана изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, 22.6.2012. _________________________