U N I V E R Z I T E T U B E O G R A D U T E H N O L O Š K O - M E T A L U R Š K I F A K U L T E T ISPITIVANJE UTICAJA PARAMETARA PROCESIRANJA NA SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA NA BAZI KALCIJUM-HIDROKSIAPATITA I KALCIJUM-FOSFATA DOBIJENIH RAZLIČITIM TEHNIKAMA SINTEROVANJA Doktorska disertacija Mr ðorñe N. Veljović Beograd, 2010 U N I V E R Z I T E T U B E O G R A D U T E H N O L O Š K O - M E T A L U R Š K I F A K U L T E T ISPITIVANJE UTICAJA PARAMETARA PROCESIRANJA NA SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA NA BAZI KALCIJUM-HIDROKSIAPATITA I KALCIJUM-FOSFATA DOBIJENIH RAZLIČITIM TEHNIKAMA SINTEROVANJA Doktorska disertacija Mr ðorñe N. Veljović Beograd, 2010 Mentor i članovi komisije za odbranu doktorske disertacije mr ðorña Veljovića, pod nazivom “ISPITIVANJE UTICAJA PARAMETARA PROCESIRANJA NA SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA NA BAZI KALCIJUM-HIDROKSIAPATITA I KALCIJUM-FOSFATA DOBIJENIH RAZLIČITIM TEHNIKAMA SINTEROVANJA“: Mentor Dr ðorñe Janaćković, redovni profesor Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd Članovi komisije Dr Rada Petrović, vanredni profesor Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd Dr Petar Uskoković, redovni profesor Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd Dr Zvezdana Kojić, vanredni profesor Medicinski fakultet, Beograd Datum odbrane: __________________ Beograd, 2010 Ova doktorska disertacija je urañena na katedri za Neorgansku hemijsku tehnologiju, Tehnološko-metalurškog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, u okviru projekata 142070B i E!3303, pod mentorstvom Prof. dr ðorña Janaćkovića, kome se ovom prilikom zahvaljujem na idejama, strpljenju, korisnim sugestijama i savetima tokom celokupnog eksperimentalnog rada i pisanja disertacije. Prof. dr Radi Petrović se zahvaljujem na velikoj pomoći pri formulisanju i izradi disertacije, višegodišnjoj podršci, korisnim sugestijama i vremenu koje mi je posvetila. Prof. dr Petru Uskokoviću se zahvaljujem na interesovanju za ovu problematiku, velikoj podršci, velikoj pomoći i savetima u oblasti mehanike i nanomehanike materijala. Prof. dr Zvezdani Kojić se zahvaljujem na posvećenom vremenu, korisnim savetima, velikoj pomoći tokom ispitivanja biokompatibilnosti materijala. Dr Eriksu Palcevskisu i kolegama sa Tehničkog univerziteta u Rigi se zahvaljujem na posvećenom vremenu, korisnim savetima i velikoj pomoći prilikom mikrotalasnog sinterovanja, spark plazma sinterovanja i XRD analiza. Prof. dr Chak-Yin Tangu i njegovom timu sa Politehničkog Univerziteta u Hong Kongu se zahvaljujem na pomoći prilikom odreñivanja nanomehaničkih svojstava materijala nanoindentacijom. Prof. dr Yuri Dekhtyaru sa Tehničkog univerziteta u Rigi i Prof. dr Rachel Sammons sa Univerziteta u Birmingemu se zahvaljujem na savetima i pomoći prilikom ispitivanja uticaja naelektrisanja površine na atheziju osteoblasta. Akademiku Prof. dr Miodragu Čoliću sa Vojno-medicinske akademije, dr Gordani Bogdanović i mr Vesni Kojić sa Instituta za onkologiju u Sremskoj Kamenici se zahvaljujem na pomoći i savetima tokom in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala. Dr Branku Matoviću naučnom savetniku i kolegama iz Laboratorije za materijale, Instituta ”Vinča”, hvala na pomoći prilikom pripeme uzoraka, toplog presovanja, ispitivanja mehaničkih svojstava i XRD analiza. Prof. dr Draganu Uskokoviću i svim članovima njegovog tima iz Instituta tehničkih nauka SANU se zahvaljujem na pomoći prilikom pripreme uzoraka i odreñivanja raspodele veličina čestica. Mr Jugoslavu Krstiću sa IHTM-a se zahvaljujem na pomoći prilikom odreñivanja raspodele veličina pora i specifične površine, dr Ivani Smičiklas iz Instituta ”Vinča” se zahvaljujem na pomoći prilikom sintetisanja praha HAP, docentu dr Igoru Balaću sa Mašinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, se zahvaljujem na pomoći prilikom modelovanja metodom konačnih elemenata, dr Miodragu Mitriću iz Instituta ”Vinča” hvala na pomoći prilikom XRD analiza, docentu dr Saši Drmaniću hvala na pomoći prilikom FTIR analiza, docentu dr Radmili Jančić-Hajneman se zahvaljujem na pomoći prilikom analize slika, mr Milošu Bokorovu sa Biološkog fakulteta u Novom Sadu hvala na pomoći prilikom SEM analiza. Hvala svim kolegama sa Katedre za neorgansku hemijsku tehnologiju koji su na bilo koji način pomogli izradu moje doktorske disertacije. Sve ovo bi bilo mnogo teže bez neizmerne podrške i razumevanja moje porodice i svih mojih prijatelja, kojima se od srca zahvaljujem na svemu! IZVOD ISPITIVANJE UTICAJA PARAMETARA PROCESIRANJA NA SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA NA BAZI KALCIJUM-HIDROKSIAPATITA I KALCIJUM-FOSFATA DOBIJENIH RAZLIČITIM TEHNIKAMA SINTEROVANJA Kalcijum-fosfatni biokeramički materiali na bazi kalcijum-hidroksiapatita (HAP) i trikalcijum-fosfata (TCP), zahvaljujući hemijskom sastavu, biokompatibilnosti, bioaktivnosti i osteokonduktivnosti imaju značajnu ulogu pri izradi koštanih implanta. Guste nanostrukturne i kontrolisano porozne forme biokeramičkih materijala na bazi hidroksiapatita i kalcijum-fosfata imaju veliku primenu u maksiofacialnoj, dentalnoj i ortopedskoj praksi. Pažljiva kontrola faznog sastava, veličine zrna, oblika i dimenzija pora, kao i mehaničkih svojstava sinterovanih biokeramičkih materijala jesu ključni faktori za dobijanje implanata optimalnih svojstava. Danas je ogroman broj istraživanja baziran upravo na definisanju optimalnih uslova procesiranja sa ciljem da se dobiju gusti i kontrolisano porozni biokeramički monofazni kalcijum- hidroksiapatitni i bifazni materijali na bazi HAP i TCP, pogodni za ugradnju u ljudski organizam. Cilj ove doktorske disertacije bio je proučavanje procesa formiranja gustih nanostrukturnih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata mikrotalasnim sinterovanjem, spark plazma sinterovanjem i toplim presovanjem, polazeći od stehiometrijskih i kalcijum deficitarnih nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita dobijenih modifikovanim precipitacionim sintezama. Ispitan je uticaj svojstava polaznih prahova HAP i parametara procesiranja na mikrostukturne i fazne karakteristike, kao i na mehanička svojstva dobijenih gustih sinterovanih biokeramičkih materijala. Definisan je uticaj mikrostrukturnih parametara na žilavost i tvrdoću dobijenih monofaznih i bifaznih biokeramičkih materijala. Nanoindentacijom je utvrñen uticaj veličine zrna i faznog sastava na nanomehaničke karakteristike gustih mikro i nanostrukturnih materijala na bazi HAP i HAP/β-TCP. Svojstva materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem, spark plazma sinterovanjem i toplim presovanjem uporeñeni su sa svojstvima materijala dobijenih konvencionalnim sinterovanjem. Mikrotalasnim sinterovanjem, spark plazma sinterovanjem i toplim presovanjem stehiometrijskog i kalcijum deficitarnog nanočestičnog praha hidroksiapatita, dobijeni su monofazni i bifazni nanostrukturni biokermički materijali velikih gustina. Monofazni materijali na bazi HAP, dobijeni mikrotalasnim sinterovanjem na 900 ºC tokom 15 min, sa prosečnom veličinom zrna od 130 nm, imaju znatno veće gustine, uniformnije mikrostrukture i superiornije mehaničke karakteristike u odnosu na uzorake konvencionalno sinterovane na istoj temperaturi tokom 2 h. Uporednom analizom svojstava monofaznih biokermičkih materijala na bazi HAP i bifaznih HAP/TCP materijala, zaključeno je da monofazni materijali imaju superiorna mehanička i nanomehanička svojstva. Smanjenje veličine zrna u slučaju mikrotalasno sinterovane monofazne biokeramike na bazi HAP sa mikro na nano nivo, preciznije sa 1,59 µm na 130 nm, rezultiralo je povećanjem žilavosti sa 0,85 MPa m1/2 na 1,34 MPa m1/2. Spark plazma sinterovanjem na 900 ºC tokom 5 min dobijeni su monofazni HAP materijali sa prosečnom veličinom zrna od 100 nm i gustinom bliskoj teorijskoj. Toplim presovanjem stehimetrijskog praha kalcijum-hidroksiapatita dobijeni su translucentni monofazni biokeramički materijali na bazi HAP sa prosečnom veličinom zrna od 50 nm i žilavošću od 1.52 MPa m1/2. Cilj ove doktorske disertacije bio je i procesiranje materijala kontrolisane poroznosti na bazi HAP i TCP, polazeći od dva različita praha HAP sa sferičnim česticama dobijena hidrotermalnom dekompozicijom uree i EDTA kompleksa. Ispitan je uticaj parametara procesiranja, mikrostrukture i faznog sastava na mehanička svojstva biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. Definisan je i uticaj oblika, sferičnosti i veličine pora na mehanička svojstva, pre svega na žilavost biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. Biokeramički materijali kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, dobijeni su mikrotalasnim sinterovanjem polazaći od dva hidrotemalno dobijena mikrosferična praha sa različitim stepenom kalcijum deficitarnosti. Mikrotalasno sinterovani uzorci kontrolisane poroznosti na 1200 ºC tokom 15 min, u slučaju oba mikrosferična praha karakterišu se koeficijentom žilavosti od 1,25 MPa m1/2. Pokazano je da fazni sastav, tj. udeo TCP u kalcijum-hidroksiapatitnom matriksu, u slučaju materijala kontrolisane poroznosti ima inferioran uticaj na žilavost u odnosu na njihovu specifičnu mikrostrukturu koja se odlikuje prisustvom sfernh intraaglomeratnih pora i uspostavljenih snažnih kontinualnih vratova izmeñu vrlo postojanih sfernih čestica. Primena izostatskog pritiska od 400 MPa pri presovanju mikrosferičnih prahova, uticala je povećanje žilavosti biokeramičkog materijala u kome je dominantna kristalna faza α-TCP do vrednosti 1,35 MPa m1/2, što je izuzetno visoka vrednost za ovaj tip biokeramičkih materijala. Metodom konačnih elemenata je pokazano da materijali kontrolisane poroznosti na bazi HAP, sa porama sfernog oblika imaju bolja mehanička svojstva u poreñenju sa materijalima čije su pore nepravilnog oblika. Uticaj mikrostrukturnih parametara sinterovanih biokeramičkih materijala na bioaktivnost i biokompatibilnost ispitan je u in vitro i in vivo uslovima. In vitro ispitivanja nano- i mikrostrukturnih gustih sinterovanih monofaznih materijala na bazi HAP u simuliranom telesnom fluidu potvrñena je njihova bioaktivnost. Na osnovu rezultata in vitro testova sa L929 fibroblastima i humanim fibroblastnim ćelijama zaključeno je da mikrotalasno sinterovani mikro- i nanostrukturnih monofazni hidroksiapatitni materijali ne pokazuju citotoksični efekat, već izazivaju stimulaciju metaboličke aktivnosti utičući na proliferacije fibroblastnih ćelija na ispitivanim materijalima. Ispitivanjem biokompatibilnosti mikrotalasno sinterovanog monofaznog hidroksiapatitnog materijala HAP1 in vitro, odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1, utvrñeno je da su ćelije sa površinom ispitivanog potencijalno implantnog materijala uspostavile čvrstu vezu. Prilikom in vivo ispitivanja biokompatibilnosti, testom primarne kutane iritacije, za oba ispitivana materijala (monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min i monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min) srednja vrednost indeksa primarne kutane iritacije je bila nula, tj. ni jedan od dva ispitivana materijala nije ispoljio iritirajuća svojstva. Ključne reči: Biokeramika, hidroksiapatit, nanostruktura, sinterovanje, mehanička svojstva, biokompatibilnost. ABSTRACT THE INFLUENCE OF PROCESSING CONDITIONS ON THE PROPERTIES OF BICERAMICS MATERIALS BASED ON CALCIUM HYDROXYAPATITE AND CALCIUM PHOSPHATE OBTAINED BY DIFFERENT SINTERING METHODS Calcium phosphate bioceramics materials based on hydroxyapatite (HAP) and tricalcium phosphate (TCP), due to their chemical composition, excellent biocompatibility, bioactivity and osteoconduction have received considerable attention as suitable bioceramics for the manufacture of osseous implants. Dense nanostructured and controlled porous forms of hydroxyapatite and calcium phosphate are often used as reparation material in maxillofacial, dental and orthopedic surgery. Careful control of phase composition, grain size and shape and size of pores of sintered bioceramic materials in accordance with good mechanical properties can be key issue for a successful implant. A large number of studies were focused on determining the optimal conditions required to obtain dense or controlled porous HAP and HAP/TCP form suitable for incorporation in living bone. The aim of this PhD thesis was to investigate the processing of dense nanostructured pure hydroxyapatite and biphasic HAP/TCP bioceramics by microwave sintering, spark plasma sintering and hot pressing, starting from stoichiometric and calcium deficient nanosized HAP powders, obtained by two modified chemical precipitation syntheses. The effects of the processing conditions on the microstructure, phase composition and mechanical properties of the obtained materials based on HAP and TCP were investigated. The influence of microstructure and phase composition on the fracture toughness and hardness of sintered HAP and HAP/TCP bioceramics was also defined. The influence of the grain size and phase composition on the nanomechanical behaviour of dense nano and microstructured HAP and biphasic HAP/β-TCP bioceramic materials by nanoindentation was also investigated. The results obtained by microwave sintering, spark plasma sintering and hot pressing were compared with those obtained by conventional sintering methods. A nanostructured dense monophase HAP and biphasic HAP/TCP biomaterials were processed starting from stoichiometric and calcium deficient nanosized HAP powders by microwave sintering, spark plasma sintering and hot pressing. The HAP samples microwave sintered for 15 min at 900 ºC, with average grain size of 130 nm, showed better densification, higher density and certainly higher hardness and fracture toughness than samples conventionally sintered for 8 times longer time at the same temperature. By comparing sintered HAP and HAP/TCP samples, it was concluded that pure HAP ceramics have superior mechanical and nanomechanical properties. For monophase MW sintered HAP samples, the decrease in the grain size from micro to nano level, precisely from 1.59 µm to 130 nm led to an increase in the fracture toughness from 0.85 MPa m1/2 to 1.34 MPa m1/2. The monophasic HAP materials with a grain size of 100 nm and density near theoretical were obtained by spark plasma sintering at 900 ºC for 5 min. In the case of hot pressed monophase HAP compacts, full dense, translucent nanostructured biceramic materials were obtained having mean grain size of 50 nm and the fracture toughness of 1.52 MPa m1/2. The processing and characterization of controlled porous HAP/TCP bioceramics obtained by microwave sintering of two different spherical agglomerated nano-sized HAP powders synthesized by hydrothermal decomposition of urea and calcium-EDTA chelates was the next aim of this thesis. The effects of microstructures parameters, processing conditions of the microwave sintering and phase composition on the mechanical properties of controlled porous biomaterials based on HAP and TCP were investigated. The influence of shape, roundness and size of pores on the mechanical properties, mainly fracture toughness, of porous bioceramics based on HAP was also investigated. Starting from two microspherical agglomerated HAP powders, porous biphasic HAP/TCP bioceramics were obtained by microwave sintering. The fracture toughness of the controlled porous samples microwave sintered at 1200 ºC for 15 min were 1.25 MPa m1/2. The phase composition of the obtained bioceramics only had a minor effect on the indentation fracture toughness compared to a microstructure consisting of spherical intra-agglomerate pores with strong bonds between the spherical agglomerates. Cold isostatic pressing at 400 MPa before microwave sintering led to an increase in the fracture toughness of the biphasic HAP/TCP bioceramics to 1.35 MPa m1/2. A three-dimensional, finite element unit cell model confirmed that porous HAP with sphere-like pores have better strength properties compared to non-spherical pore shapes. The influence of microstructures parameters of the sintered bioceramic materials on the bioactivity and biocompability was investigated in vitro and in vivo. The bioactivity of nano- and microstructured monophasic materials based on HAP was confirmed by in vitro investigation in SBF. According to the results of in vitro tests with L929 fibroblasts and human fibroblast cells, it was concluded that microwave sintering of micro-and nanostructured monophase hydroxyapatite materials do not show a cytotoxic effect, but initiated stimulation of metabolic activity, affecting cell proliferation of the fibroblast cells on the materials. Investigation of biocompability of microwave sintered HAP1 materials in vitro, by determinated of adhesion of osteoblast cells MC3T3-E1, confirmed that the cells and investigated materials were constituted a good atachment. During the in vivo investigation of biocompatibility with primary cutaneous irritation test, for both investigated materials (monophase HAP1 microwave sintered at 900 º C for 15 min and monophase HAP1 microwave sintered at 900 º C for 15 min) the mean value of primary cutaneous irritation index was zero, ie. neither of the two tested materials showed no irritating properties. Keywords: Bioceramics, hydroxyapatite, nanostructured, sintering, mechanical properties, biocompability. SADRŽAJ I. UVOD 1 II. TEORIJSKI DEO 3 1. BIOMATERIJALI 3 1.1. Podela i primena biomaterijala 3 1.2. Biokeramički materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita 7 2. KALCIJUM-HIDROKSIAPATIT 11 2.1. Kalcijum-hidroksiapatit u prirodi 13 2.2.Kalcijum-hidroksiapatit u biologiji i medicini 14 2.3. Svojstva kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata 19 2.4. Sintetisanje prahova kalcijum-hidroksiapatita 22 3. PROCESIRANJE I SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA 25 3.1. Oblikovanje keramičkih materijala presovanjem prahova 25 3.2. Konvencionalno sinterovanje 27 3.3. Dobijanje i svojstva sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata 35 3.4. Dobijanje i svojstva mikrotalasno sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata 45 3.5. Metode sinterovanja uz pomoć pritiska 49 3.5.1. Dobijanje i svojstva toplo presovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata 50 3.5.2. Dobijanje i svojstva spark plazma sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata 53 III. EKSPERIMENTALNA PROCEDURA -MATERIJALI I METODE 58 4. Sinteza prahova kalcijum-hidroksiapatita 58 4.1. Sinteza stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita modifikovanom precipitacionom metodom 58 4.2. Sinteza kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita modifikovanom precipitacionom metodom 58 4.3. Sinteza kalcijum-hidroksiapatita hidrotermalnom metodom 59 5. Karakterizacija prahova kalcijum-hidroksiapatita 60 5.1. Odreñivanje raspodele veličina čestica prahova kalcijum-hidroksiapatita 60 5.2. Odreñivanje morfologije prahova kalcijum-hidroksiapatita skenirajućom elektronskom mikroskopijom 60 5.3. Odreñivanje morfologije primarnih čestica kalcijum-hidroksiapatita transmisionom elektronskom mikroskopijom 60 5.4. Rendgenska difrakciona analiza prahova kalcijum-hidroksiapatita 61 5.5. Infracrvena spektroskopska analiza prahova kalcijum-hidroksiapatita 61 5.6. Odreñivanje odnosa Ca/P prahova kalcijum-hidroksiapatita 61 5.7. Odreñivanje specifične površine prahova kalcijum-hidroksiapatita 61 6. Kompaktiranje prahova kalcijum-hidroksiapatita presovanjem 62 6.1. Uniaksijalno presovanje 62 6.2. Izostatsko presovanje 62 6.2.1. Ispitivanje uticaja veličine izostatskog pritiska na raspodelu pora i specifičnu površinu ispresovanog kompakta 62 6.2.2. Ispitivanje uticaja pritiska na sinterovanje kalcijum-hidroksiapatita 62 6.3. Odreñivanje gustine ispresovanih kompakata 63 6.4. Uniaksijalno presovanje na ekstremno visokim pritiscima 63 7. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala mikrotalasnim sinterovanjem 63 8. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala spark plazma sinterovanjem 64 9. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala toplim presovanje 64 10. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala konvencionalnim postupkom sinterovanja 65 11. Dobijanje poroznih biokeramičkih materijala mikrotalasnim i konvencionalnim sinterovanjem 65 12. Karakterizacija mikrotalasno sinterovanih, spark plazma sinterovanih, toplo presovanih i konvencionalno sinterovanih biokeramičkih materijala 66 12.1. Odreñivanje gustine i relativnog linearnog skupljanja dobijenih biokeramičkih materijala 66 12.2. Analiza mikrostrukture biokeramičkih materijala skenirajućom elektronskom mikroskopijom 66 12.3. Odreñivanje prosečne veličine zrna gustih i prosečne veličine pora poroznih biokeramičkih materijala analizom SEM mikrografija 67 12.4. Rendgenska difrakciona analiza biokeramičkih materijala 67 13. Odreñivanje mehaničkih karakteristika dobijenih biokeramičkih materijala 67 13.1. Odreñivanje mikrotvrdoće 67 13.2. Odreñivanje žilavosti 68 13.3. Nanoindentacija nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala 68 14. 3D modelovanje materijala kontrolisane poroznosti metodom konačnih elemenata 69 15. In vitro i in vivo ispitivanja bioaktivnosti i biokompatibilnosti nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala 71 15.1. In vitro ispitivanja bioaktivnosti materijala u simuliranom telesnom fluidu 71 15.2. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi L929 fibroblasta 72 15.3. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi humanih fibroblasta 74 15.4. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1 77 15.5. SEM histološka analiza u okviru in vitro ispitivanja 78 15.6. In vivo ispitivanja biokompatibilnosti materijala metodom primarne kutane iritacije 78 IV. REZULTATI I DISKUSIJA 82 16. Rezultati karakterizacije polaznih prahova kalcijum-hidroksiapatita 82 16.1. Rezultati odreñivanja raspodele veličina čestica kalcijum-hidroksiapatita 82 16.2. Rezultati odreñivanja morfologije prahova kalcijum-hidroksiapatita skenirajućom elektronskom mikroskopijom 84 16.3. Rezultati odreñivanja morfologije primarnih čestica kalcijum-hidroksiapatita transmisionom elektronskom mikroskopijom 88 16.4. Rezultati rendgenske difrakcione analize prahova kalcijum-hidroksiapatita 89 16.5. Rezultati infracrvene spektroskopske analize prahova kalcijum-hidroksiapatita 91 16.6. Rezultati odreñivanje odnosa Ca/P i specifične površine prahova kalcijum-hidroksiapatita 92 17. Karakterizacija uniaksijalno i izostatski ispresovanih kompakata kalcijum-hidroksiapatita 94 17.1. Rezultati ispitivanja uticaja veličine izostatskog pritiska na raspodelu pora i specifičnu površinu ispresovanih kompakata 96 17.2. Rezultati ispitivanja uticaja pritiska na sinterovanje kalcijum-hidroksiapatita 102 17.3. Rezultati uniaksijalnog presovanja i sinterovanja kalcijum-hidroksiapatita na ekstremno visokim pritiscima 104 18. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem 105 18.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom 105 18.2. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom 107 18.3. Rezultati odreñivanja gustine i relativnog linearnog skupljanja 112 18.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem 114 18.5. Uporedna analiza karakteristika gustih biokeramikih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem 118 18.6. Rezultati karakterizacije gustih biokeramičkih materijala izostatski ispresovanih i mikrotalasno sinterovanih 120 19. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem 123 19.1. Rezultati odreñivanja gustine i skupljanja 123 19.2. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom 126 19.3. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom 127 19.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem 132 20. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem 134 20.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava i mikrostrukturnih karakteristika biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem 134 20.2. Rezultati odreñivanja faznog sastava i mikrostrukturnih karakteristika biokeramičkih materijala dobijenih konvencionalnim sinterovanjem 141 20.3. Rezultati ispitivanja uticaja veličine zrna na mehaničke karakteristike gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem mikroindentacijom 144 20.4. Rezultati ispitivanja nanomehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem nanoindentacijom 146 21. Procesiranje i svojstva poroznih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem 150 21.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom 150 21.2. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom 152 21.3. Rezultati odreñivanja gustine i relativnog linearnog skupljanja 156 21.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika poroznih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem 158 21.5. Uporedna analiza karakteristika poroznih biokeramikih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem 160 21.6. Rezultati ispitivanja uticaja oblika, veličine i broja pora na mehaničke karakteristike poroznih biokeramikih materijala 164 21.7. Analiza rezultata 3D modeliranja metodom konačnih elemenata 173 22. Uporedna analiza svojstava biokeramičkih materijala dobijenih različitim tehnikama sinterovanja 175 23. Rezultati in vitro i in vivo ispitivanja bioaktivnosti i biokompatibilnosti nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala 180 23.1. Rezultati in vitro ispitivanja bioaktivnosti materijala u simuliranom telesnom fluidu 180 23.2. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi L929 fibroblasta 183 23.3. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi humanih fibroblasta 191 23.4. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1 199 23.5. Rezultati in vivo ispitivanja biokompatibilnosti materijala metodom primarne kutane iritacije 202 V. ZAKLJUČCI I DALJI PRAVCI 207 VI. LITERATURA 212 LISTA TABELA: Tabela 1.1. Podela biomaterijala na osnovu interakcije živog tkiva i implantiranog materijala Tabela 1.2. Podela biomaterijala prema poreklu Tabela 2.1. Uporedni prikaz sastava, kristalografskih i mehaničkih karakteristika humane gleñi, kostiju i sintetisanog hidroksiapatita Tabela 2.2. Uporedni prikaz sastava neorganskog dela zuba i kosti Tabela 2.3. Fizičko-hemijske i strukturne karakteristike hidroksiapatita Tabela 4.1. Parametri i količine reaktanata pri hirotermalnoj sintezi kalcijum-hidroksiapatita Tabela 15.1. Sastav simuliranog telesnog fluida Tabela 15.2. Kvalitativno morfološko stepenovanje citotoksičnosti Tabela 15.3. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija eritema Tabela 15.4. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija edema Tabela 15.5. Ocena test materijala na osnovu indeksa primarne kutane iritacije (PII) Tabela 16.1. Vrednosti odnosa Ca/P prahova HAP1 i HAP2 Tabela 16.2. Vrednosti odnosa Ca/P u polaznom rastvoru prahova HAP3 i HAP4 Tabela 16.3. Vrednosti specifičnih površina prahova HAP1 – HAP4 Tabela 17.1. Vrednosti gustina uniaksijalno presovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 400Mpa Tabela 17.2. Vrednosti gustina izostatski presovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 400 MPa Tabela 17.3. Vrednosti gustina izostatski presovanih kompakata HAP1 na 100 - 400 Mpa Tabela 18.1. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP1 na 900 - 1200 ºC Tabela 18.2. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP2 na 900 - 1200 ºC Tabela 18.3. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih konvencionalnim i mikrotalasnim sinterovanjem Tabela 18.4. Uslovi procesiranja i mehanička svojstva monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem Tabela 19.1. Vrednosti gustina spark plazma sinterovanih kompakata HAP1 na 900 - 1200 ºC Tabela 19.2. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem Tabela 20.1. Veličina zrna i gustina presovanih uzoraka HAP1 and HAP2 Tabela 21.1. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike uzoraka HAP4 dobijenih konvencionalnim i mikrotalasnim sinterovanjem Tabela 21.2. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP3 na 1100 - 1250 ºC Tabela 23. 1. Skor eritema i edema posle primene HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC Tabela 23. 2. Skor eritema i edema posle primene HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC Tabela 23. 3. Skor eritema i edema posle primene mlečne kiseline 98% (pozitivna kontrola) LISTA SLIKA: Slika 1.1. Klinička upotreba biokeramičkih materijala Slika 2.1. Kristalna struktura kalcijum-hidroksiapatita: 3D pozicija atoma, (b) projekcija u pravcu c-ose Slika 2.2. Primeri polikristalnog (levo) i monokristalnog (desno) prirodnog apatita Slika 2.3. Mikro i makro struktura kosti Slika 2.4. Struktura zuba Slika 3.1. Šema aglomerisanog praha Slika 3.2. Dijagram raspodele pora: a) neaglomerisanog praha, b) praha sa aglomeratima iste veličine i c) praha se aglomeratima različitih veličina Slika 3.3. Promena gustine i strukture keramičkog kompakta sa vremenom sinterovanja (TD-teorijska gustina) Slika 3.4. Mehanizmi sinterovanja Slika 3.6. Ravnotežni oblik zrna i pravac pomeranja granice zrna Slika 3.7. Transgranularni i intergranularni mehanizam prostiranja pukotine Slika 3.8. Šema uredjaja za toplo uniaksijalno presovanje Slika 3.9. Šema peći za spark plazma sinterovanje Slika 14.1. Šematski prikaz idealizacije rasporeda i oblika pora prilikom modelovanja Slika 14.2. Koordinatne mreže konačnih elemenata za sferne i nepravilne pore kod hidroksiapatitne keramike Slika 16.1. Raspodela veličina čestica prahova HAP1 i HAP2 Slika 16.2. Raspodela veličina čestica prahova HAP3 i HAP4 Slika 16.3. SEM mikrografija praha HAP1 Slika 16.4. SEM mikrografija praha HAP1 nakon tretiranja ultrazvukom Slika 16.5. SEM mikrografija praha HAP2 Slika 16.6. SEM mikrografija praha HAP2 nakon tretiranja ultrazvukom Slika 16.7. SEM mikrografija praha HAP3 Slika 16.8. SEM mikrografija preseka sferne čestice praha HAP3 Slika 16.9. SEM mikrografija praha HAP4 Slika 16.10. TEM snimak primarnih čestica praha HAP1 Slika 16.11. TEM snimak primarnih čestica praha HAP2 Slika 16.12. Rendgenska difrakciona analiza prahaova HAP1 i HAP2 Slika 16.13. Rendgenska difrakciona analiza prahaova HAP3 i HAP4 Slika 16.14. Infracrvena spektroskopska analiza prahova HAP1 i HAP2 Slika 16.15. Infracrvena spektroskopska analiza prahova HAP3 i HAP4 Slika 17.1. SEM mikrografije izostatski ispresovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 400 MPa Slika 17.2. Ukupna zapremina pora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Slika 17.3. Raspodela veličina mezopora praha HAP1 Slika 17.4. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 100MPa Slika 17.5. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 200MPa Slika 17.6. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 300MPa Slika 17.7. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 400MPa Slika 17.8. Zapremina mezopora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Slika 17.9. Zapremina mikropora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Slika 17.10. Specifična površina kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Slika 17.11. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 100 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 17.12. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 200 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 17.13. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 300 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 17.14. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 17.15. SEM mikrografija kompakta HAP1:a) uniaksijalno ispresovanog na 2.5 GPa, b) isostatski ispresovanog na 400MPa, a nakon toga sinterovanih na 900ºC tokom 2h Slika 18.1. Rendgenska difrakciona analiza uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP1 na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.2. Rendgenska difrakciona analiza uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP2 na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.3. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 18.4. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Slika 18.5. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 18.6. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.7. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 18.8. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Slika 18.9. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 18.10.SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.11. Veličina zrna HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 18.12. Relativno linearno skupljanje HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 18.13.Tvrdoća uzoraka HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 18.14.Žilavost uzoraka HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 18.15. Žilavost uzoraka HAP1 u funkciji veličine zrna Slika 18.16. Mikrografije ispoliranih površina monofaznih HAP1 kompakata nakon Vikersovog testa, mikrotalasno sinterovanih na: a) 1200 ºC b) 1100 ºC i c) 900 ºC Slika 18.17. SEM mikrografije uzoraka HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovanih na 900 ºC tokom 2 h Slika 18.18. SEM mikrografije uzoraka HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovanih na 1000 ºC tokom 2 h Slika 18.19. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.20. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 18.21. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 850 ºC tokom 15 min Slika 19.1. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 900 ºC tokom 10 min Slika 19.2. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 1000 ºC tokom 10 min Slika 19.3. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 1200 ºC tokom 10 min Slika 19.4. Rendgenska difrakciona analiza materijala dobijenih spark plazma simterovanjem HAP1 na 900 ºC, 1000 ºC i 1200 ºC tokom 10 min Slika 19.5. Rendgenska difrakciona analiza materijala dobijenog spark plazma simterovanjem HAP2 na 900 ºC tokom 10 min Slika 19.6. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1200 ºC tokom 10 min Slika 19.7. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1200 ºC tokom 5 min Slika 19.8. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1000 ºC tokom 10 min Slika 19.9. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 10 min Slika 19.10. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 5 min Slika 19.11. Veličina zrna HAP1 u funkciji temperature spark plazma sinterovanja Slika 19.12. SEM mikrografija uzorka HAP2 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 10 min Slika 20.1. XRD dijagram uzoraka HAP1 toplo presovanog 2 h na 1000 ºC u struji argona Slika 20.2. XRD dijagram uzoraka HAP2 toplo presovanog 2 h na 1000 ºC u struji argona Slika 20.3. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 2 h Slika 20.4. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 1 h Slika 20.5. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 950 ºC tokom 2 h Slika 20.6. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 2 h Slika 20.7. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 1 h Slika 20.8. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 950 ºC tokom 2 h Slika 20.9. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 2 h Slika 20.10. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 1 h Slika 20.11. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 950 ºC tokom 2 h Slika 20.12.XRD dijagram uzoraka HAP1 konvencionalno sinterovanog tokom 2h na 1200 ºC Slika 20.13.XRD dijagram uzoraka HAP2 konvencionalno sinterovanog tokom 2h na 1200 ºC Slika 20.14. SEM mikrografija uzorka HAP1 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom2h (poliran i nagrižen uzorak) Slika 20.15. SEM mikrografija uzorka HAP2 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2h (poliran i nagrižen uzorak) Slika 20.16. Žilavost i tvrdoća nanostrukturnih toplo presovanih i mikrostrukturnih sinterovanih uzoraka HAP1 u funkciji veličine zrna Slika 20.17. Tipična zavisnost sile- dubine utiskivanja indenta za uzorak S3 Slika 20.18. SPM slika sa površinskim otiskom uzorka S1, pri sili indenta od 2000µN, region hrapavosti od 23 nm i skeniranom veličinom površine 2 µm Slika 20.19. Redukovani moduli i tvrdoće uzoraka testiranih nanoindentacijom Slika 21.1. Rendgenska difrakciona analiza HAP3 biokeramičkih materijala mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min Slika 21.2. Rendgenska difrakciona analiza HAP4 biokeramičkih materijala mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min Slika 21.3. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 21.4. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Slika 21.5. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 21.6. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 21.7. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 21.8. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Slika 21.9. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 21.10. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 21.11. Gustina HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 21.12. Relativno linearno skupljanje HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 21.13. Tvrdoća uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 21.14. Žilavost uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Slika 21.15. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 21.16. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 21.17. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h Slika 21.18. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 21.19. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h Slika 21.20. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 21.21. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1250 ºC tokom 2 h Slika 21.22. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2h sa selektovanim porama Slika 21.23. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1200 ºC tokom 2h sa selektovanim porama Slika 21.24. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1250 ºC tokom 2h sa selektovanim porama Slika 21.25. Promene minimalne i srednje vrednosti dimenzije pora sa promenom temperature sinterovanja HAP3 Slika 21.26. Promene sferičnosti pora sa promenom temperature sinterovanja HAP3 Slika 21.27. Promena broja pora na karakterističnoj površini i promena srednje površine poprečnog preseka pore sa promenom temperature sinterovanja HAP3 Slika 21.28. Srednja vrednost sferičnosti posmatranih klasa pora na temperaturama sinterovanja 1100 ˚C, 1200 ˚C i 1250 ˚C Slika 21.29. Prečnik pora u funkciji sferičnosti za posmatrane klase pora na temperaturama sinterovanja 1100 ˚C, 1200 ˚C i 1250 ˚C Slika 21.30. Fotografije ispoliranih površina kompakta HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od: a) 3 kg i b) 1 kg Slika 21.31. Fotografije ispoliranih površina kompakta HAP3 nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od 3 kg sinterovanih na: a) 1200 ºC i b) 1250 ºC, tokom 2 h Slika 21.32. SEM mikrografija izgleda pukotine pri odreñivanju žilavosti kompakta HAP3 sinterovanog na 1200 ºC Slika 21.33. Von Misova raspodela naprezanja u HAP keramici pri zapreminskom udelu pora od 0,155; (vrednosti naprezanja su u µN/µm2= MPa) sa izračunatim SCF Slika 23.1. Mikrostrukture monofaznog konvencionalno sinterovanog uzorka HAP1 na 1200 ºC tokom 2 h, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu Slika 23.2. Mikrostrukture monofaznog spark plazma sinterovanog uzorka HAP1 na 900ºC tokom 5 min, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu Slika 23.3. Mikrostrukture monofaznog mikrotalasno sinterovanog uzorka HAP1 na 900ºC tokom 15 min, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu Slika 23.4a. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na metaboličku aktivnost L929 ćelija (Ca-hidroksiaapatit (A) - mikrostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1, Ca-hidroksiapatit (B) nanostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1) Slika 23.4b. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na vijabilnost L929 ćelija Slika 23.4c. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na nekrozu L929 ćelija Slika 23.4d. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na proliferaciju L929 ćelija nakon 1 i 3 dana Slike 23.5. Morfološke karakteristike L929 ćelija u kulturi:a) posebna kontrola- test bez materijala, b) negativna kontrola, plastika-cover slip, c) mikrostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1, d) nanostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1 Slika 23.6. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini kontrolnog uzorka Slika 23.7. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Slika 23.8. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min Slika 23.9. Rezultati MTT-testa nakon inkubacije ćelijskih linija MRC-5 sa mikrotalasno sinterovanim materijalima (1-900 ºC, 2-1200 ºC) i oporavka tokom 48 h, 72 h i 96 h, izraženi kao procenat od kontrole Slika 23.10. Rezultati DET-testa prikazani kao rast ćelija MRC-5 izloženih dejstvu mikrotalasno sinterovanih materijala (1-900 ºC, 2-1200 ºC) tokom 48 h, 72 h i 96 h, izraženi kao procenat od kontrole Slika 23.11. Ćelijska linija fibroblasta MRC-5, kontrolni uzorak: a)osvetljen uzorak, b)uzorak slikan sa faznim kontrastom Slika 23.12. Ćelijska linija fibroblasta MRC-5, zasejana na podlozi “ uzorak HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min“ Slika 23.13. SEM mikrografije humanih fibroblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Slika 23.14. SEM mikrografije humanih fibroblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min Slika 23.15. SEM mikrografije osteoblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Slika 23.16. Ukupan broj osteoblastnih ćelija vezanih za površinu mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min (N - nemodifikovan, M - modifikovan ) Slika 23.17. Stadijumi athezije osteoblastnih ćelija Slika 23.18. Broj ćelija u svakom stadijumu athezije na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini materijala Slika 23.19. Procenat ćelija u četvrtom stadijumu athezije na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini materijala Slika 23.20. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije nakon postavljanja test uzoraka Slika 23.21. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije 4 h nakon postavljanja test uzoraka Slika 23.22. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije 72 h nakon postavljanja uzoraka 1 I. UVOD Biokeramički materiali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, zbog hemijske i strukturne sličnosti sa mineralima kostiju i zuba, kao i zbog izuzetne bioaktivnosti i biokompatibilnosti, imaju danas veoma važnu ulogu u medicinskoj praksi, gde se kao implantni materijali koriste za reparaciju ili zamenu oštećenih delova humanog skeletnog sistema. Zahvaljujući velikom potencijalu u ovom domenu, materiali na bazi kalcijum- hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata u vidu gustih i kontrolisano poroznih formi, našli su veliku primenu u maksiofacialnoj i rekonstruktivnoj hirurgiji, stomatologiji i ortopediji. Komercijalno dostupni biokeramički materijali u gustoj sinterovanoj formi uglavnom su dobijeni postupkom konvencionalnog sinterovanja, a primenjuju se kao samostalni implantni materijali (npr. prilikom zamene korena zuba, pri povećavanju alveolarnih grebena, kao materijal za ispunu zubne pulpe, kao materijal za maksiofacijalne rekonstrukcije gde se zahtevaju precizno izrañeni oblici za zamenu odreñenih delova koštanog tkiva itd.) ili kao delovi kompleksnijih sistema. Materijali kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata ojačavaju vezu izmeñu tkiva i implantiranog materijala, a imaju pozitivan uticaj i na osteokonduktivnost. Dok makroporoznost kontroliše proliferaciju tkiva i transport bioloških fluida u implantiranom materijalu, mikroporoznost utiče na atheziju tkiva i implanta, kao i na brzinu resorpcije kalcijum-fosfata. Sinterabilnost prahova kalcijum-hidroksiapatita i svojstva hidroksiapatitne biokeramike zavise kako od uslova procesiranja tako i od karakteristika polaznog praha, kao što su veličina čestica, stepena aglomerisanosti, odnos Ca/P, specifične površina itd. Relativno loša mehanička svojstva hidroksiapatitne biokeramike, posebno u fiziološkim uslovima, u mnogim slu;ajevima ograničavaju njenu primenu. Konvencionalne metode sinterovanja su dugo korišćene u cilju konsolidacije metastabilnih nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita, od kojih je najčešće korišćeno sinterovanje kompakata dobijenih presovanjem na visokim pritiscima u atmosferi različitih gasova. Termička nestabilnost kalcijum-hidroksiapatita, kao i rapidno povećanje veličine zrna na visokim temperaturama predstavljaju glavne nedostatke konvencijalnog načina sinterovanja, a u velikoj meri utiču i na loša mehanička svojstva dobijenih biomaterijala. Korišćenjem tehnika kao sto su mikrotalasno sinterovanje, spark plazma sinterovanje i toplo presovanje ima se za cilj dobijanje kako gustih tako i poroznih nanostrukturnih materijala, sa što je moguće manjom prosečnom veličinom zrna i optimalnom poroznošću, što je veoma bitno za mehanička svojstva, odnosno bioaktivnost i biokompatibilnost biokeramičkih materijala. Danas je u svetu ogroman broja istraživanja baziran na pronalaženju optimalnih parametara procesiranja, koristeći konvencionalne i savremene tehnike sinterovanja, koje bi omogućile prevoñenje metastabilnih nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita u guste ili 2 kontrolisano porozne nanostrukturne biokeramičke materijale na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata poboljšanih mehaničkih svojstava i odgovarajuće bioaktivnosti i biokompatibilnosti. Naučni ciljevi ove doktorske disertacije su proučavanje procesa formiranja gustih sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata koristeći metode mikrotalasnog sinterovanja, spark plazma sinterovanja, toplog presovanja i konvencionalnog sinterovanja polazeći od nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita. Ispitivan je uticaj odnosa Ca/P u polaznom prahu, oblika i veličine čestica polaznih prahova, stepena aglomerisanosti prahova, raspodele i veličine pora, kao i parametara procesiranja na mikrostukturne i fazne karakteristike dobijenih gustih i materijala kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata. Izvršena je uporedna analiza mikrostrukturnih i faznih karakteristika sinterovanih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita, dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem, spark plazma sinterovanjem, toplim presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem. Uticaj mikrostrukturnih i faznih karakteristika dobijenih gustih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata na žilavost i tvrdoću, kao i uticaj veličine zrna i faznog sastava na nanomehaničke karakteristike gustih mikro i nanostrukturnih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata metodom nanoindentacije takoñe su ispitani u ovoj disertaciji. Jedan od ciljeva bio je i ispitivanje uticaja parametara procesiranja na mikrostrukturu kalcijum-hidroksiapatitnih materijala kontrolisane poroznosti. Ispitivan je uticaj oblika i veličine pora, kao i faznog sastava na mehanička svojstva biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata. Uticaj mikrostrukturnih parametara sinterovanih biokeramičkih materijala na bioaktivnost i biokompatibilnost ispitan je u in vitro uslovima, u simuliranom telesnom fluidu, u kulturama L929 fibroblastnih ćelija, humanih fibroblastnih ćelija i osteoblastnih ćelija tipa MC3T3-E1, kao i in vivo testom primarne kutane iritacije. 3 II. TEORIJSKI DEO 1. BIOMATERIJALI Biomaterijali se najčešće definišu kao materijali dizajnirani tako da nakon implantacije u ljudske organizame zamene delove živog sistema ili ispune odgovarajuću funkciju kroz odreñeni vremenski period u intimnom kontaktu sa živim tkivom [1]. Prema drugoj definiciji, biomaterijali su svi neživi materijali koji se koriste u medicinske svrhe sa ciljem da reaguju sa biološkim sistemima. Pod biomaterijalima se, prema pojedinim autorima podrazumeva ''bilo koja supstanca ili kombinacija sintetičkih ili prirodnih supstanci (osim lekova), koja može biti korišćena u nekom vremenskom periodu, kao celina ili deo sistema koji se tretira, sa ciljem da povećava ili menja odreñeno tkivo, organ ili funkciju tela'' [1]. Ma kako bili definisani, biomaterijali su poslednjih decenija postali neotuñivi deo kliničke prakse, a danas milioni pacijenata širom zemaljske kugle poboljšavaju kvalitet svog života uz pomoć neke vrste biomaterijala. Istraživanja ogromnog broja naučnih timova širom sveta usmerena su ka pronalaženju načina da se dobiju novi biomaterijali optimalnih svojstava [2]. Da bi mogao da se koristi pri lečenju pacijenata, novodobijeni biomaterijal mora da zadovolji odreñene zahteve po pitanju fizičko-hemijskih i mehaničkih svojstava (žilavosti, tvrdoće, Jungovog modula, čvrstoće itd.), u pogledu bioaktivnosti, biokompatibilnosti, sterizibilnosti, podsticanja formiranja tkiva itd. [3]. Fizičke i mehaničke karakteristike imaju uticaj na aktivnu funkcionalnu karakteristiku biomaterijala, dok hemijske i biološke karakteristike kontrolišu sposobnost implanta da održava svoju funkcionalnost tokom i nakon implantacije. 1.1. Podela i primena biomaterijala U toku proteklih decenija, istraživanja biomedicinskih materijala kretala su se najpre u pravcu razvoja bioinertnih, a zatim u pravcu dobijanja novih bioaktivnih materijala, koji se integrišu i aktivno reaguju sa biološkim okruženjem. Biomaterijali se mogu podeliti na osnovu nekoliko kriterijuma: prema interakciji živog tkiva i stranog materijala, prema poreklu, prema mestu primene itd. 4 Biomaterijali se na osnovu interakcije živog tkiva i implantiranog materijala, tj. biokompatibilnosti dele na: biotolerantne, bioinertne i bioaktivne. U tabeli 1.1. prikazani su neki od primera za za sve tri vrste biomaterijala. Tabela 1.1. Podela biomaterijala na osnovu interakcije živog tkiva i implantiranog materijala BIOTOLERANTNI BIOINERTNI BIOAKTIVNI Nerñajući čelik Titan i legure titana Biostakla Co-Cr-Mo legure Tantal Biokeramika Legure zlata Niobijum Polimeri Plazmirani titan Prema poreklu, biomaterijali se dele na: autologe, homologe, heterologe i aloplastične. Objašnjenje porekla i potencijalna primena navedenih vrsta biomaterijala su prikazani u tabeli 1.2. Aloplastični materijali se dalje mogu podeliti u dve velike grupe: metalne i nemetalne biomaterijale, dok se nemetalni sintetički biomaterijali mogu svrstati u tri vrste: biokeramičke, polimerne i kompozitne materijale [4]. Tabela 1.2. Podela biomaterijala prema poreklu VRSTA POREKLO PRIMENA AUTOLOGI Autoplastični biološki materijali iz istog organizma Transplantacija impaktiranih zuba, replantacija zuba i transplantacija kosti HOMOLOGI Homoplastični biološki materijali iz drugog organizma iste vrste Implantacija liofilizovane kosti iz koštanih banaka HETEROLOGI Heteroplastični biološki materijali iz organizma druge vrste Devitalizovana, deproteinizovana kost, kolagen, želatin ALOPLASTIČNI Sintetizovani materijali neživog porekla Metali, keramika, biokeramika, biostakla, polimeri... Prema mestu primene implanti se dele na: transedentalne, endoosalne, subperiostalne, transosealne, intramukozne i one koji se koriste za zamenu izgubljene kosti [5]. U zavisnosti od osteogenetskog potencijala materijala, živog tkiva za koji se materijal vezuje, kao i od vrste biomaterijala postoji nekoliko tipova mogućih interakcija. Prvi vid interakcije je distantna osteogeneza. U ovom slučaju dolazi do tolerancije koštanog tkiva 5 prema materijalu ili se prema njemu ponaša kao prema stranom tkivu. Drugi način interakcije je kontaktna osteogeneza, drugim rečima osteointegracija, koja podrazumeva interakciju tkiva sa bioinertnom grupom implanata. Koštano tkivo ovu vrstu implantata ne prepoznaje kao strano telo, već se prema njima ponaša kao da je deo kosti. Uz to, proces stvaranja kalusa kod koštanih defekata nije narušen, već se neometano obavlja uz prisnu integraciju kosti i implanta. Sledeća vrsta interakcije nastaje u slučaju ugradnje bioaktivnih materijala i predstavlja pravu vezivnom osteogenezu. Ovde se radi o bioaktivnim materijalima koji ostvaruju vezu na nivou kristalne i molekularne veze izmedju implantata i tkiva. Ovako uspostavljene veze se odlikuju dobrim mehaničkim svojstvima, jer su otporne na sile koje deluju u pravcu njihovog raskidanja. Poslednju grupu čine vezivne osteogeneze, koje karakteriše bioinertnost implanta sa osteoinduktivnim efektom. To ukazuje na mogućnost penetracije lamelarne kosti u površinu implantata, povezujući se sa njim, dok izmedju njih ostaju samo mikropore. Takav način veze je izuzetno pogodan jer takav mikroprostor ne omogućuje prisustvo bilo kog organizovanog tkiva. Ovde se takoñe odvija fizičko-hemijski proces koji povezuje implant i tkivo na atomskom i molekularnom nivou [5]. Nakon ugradnje keramičkog implanta, organizam može da reaguje na četiri načina [6]: ako je materijal toksičan, okolno tkivo odumire; ukoliko je materijal netoksičan i biološki neaktivan, oko njega se formira vlaknasto tkivo; ako je materijal netoksičan i bioaktivan, uspostavlja se veza izmeñu prirodnog tkiva i implanta u dodirnoj oblasti; i ukoliko je materijal netoksičan, a rastvorljiv okolno tkivo će ga vremenom zameniti. U zavisnosti od odgovora organizama na ugradjeni implant, biokeramički materijali se mogu klasifikovati u četiri grupe. Prvu grupu čini gusta bioinertna keramika koja se pripaja za kost cementiranjem implantata u tkivo ili punjenjem defekta presovanjem, čiji je predstavnik Al2O3. Drugu grupu čine porozni inertni keramički implanti, pri čijoj ugradnji dolazi do urastanja kosti unutar pora, što mehanički pričvršćuje kost za materijal (porozni Al2O3, kalcijum-hidroksiapatit prevučen poroznim metalima). Gusta bioaktivna keramika predstavlja treću grupu keramičkih implanata, pri čijoj se ugradnji formira hemijska veza sa koštanim tkivom, a primeri su guste forme kalcijum-hidroksiapatita, bioaktivna stakla, staklo-keramički kompozitni materijali itd. Četvrtu grupu čine gusta, neporozna (ili porozna), resorbilna keramika koja se postepeno zamenjuje koštanim tkivom (CaSO4, Ca3(PO4)2 i druge kalcijum-fosfatne soli). Na slici 1 prikazani su delovi ljudkog skeleta koji uspešno mogu da budu zamenjeni ili obnovljeni uz pomoć nekih biokeramičkih materijala. 6 Slika 1.1. Klinička upotreba biokeramičkih materijala S obzirom da je naziv ovog rada: „Ispitivanje uticaja parametara procesiranja na svojstva biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata dobijenih različitim tehnikama sinterovanja“, u daljem tekstu će akcenat biti na keramičkim aloplastičnim biomaterijalima na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata tj. sintetičkim materijalima koji se koriste kao supstituenti za odreñene delove koštanog tkiva. Potreba za korišćenjem sintetičkih koštanih supstituenata se iz dana u dan sve više povećava, a pretpostavka je da će transplantacija kosti humanih donora i životinja u budućnosti biti prevaziñena ili sasvim isključena iz kliničke prakse. Pored činjenice da se mogu jednostavno čuvati u bolnicama, bez potrebe za koštanim bankama, sintetski biomaterijali mogu imati kontrolisan kvalitet uz optimizovane mehaničke i biološke karakteristike neophodne za specifične namene. Oni takoñe mogu oblikovanjem biti prilagoñeni koštanom defektu uz korišćenje minimalnih invazivnih tehnika. Pošto ograničena dostupnost autogenetske kosti predstavlja glavni problem za hirurgiju i pacijente, neorganski implanti bazirani na kalcijum-hidroksiapatitu i kalcijum-fosfatima sintetskog porekla su dobra alternativa autogenetskom materijalu [7]. Zajednička osobina svih bioaktivnih keramičkih materijala je da se pri njihovoj ugradnji na površini formira sloj kalcijum-hidroksiapatita, koji 7 ima identičnu strukturu kao i neorganska komponenta koštanog tkiva [6, 8]. Upravo preko ovako nastalog sloja se formira veza sa koštanim tkivom, a adhezija novonastalog sloja i kosti je često veća od kohezionih sila u samom implantnom materijalu ili u živom tkivu. 1.2. Biokeramički materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata Zahvaljujući odličnoj bioaktivnosti i biokompatibilnosti, kao i zbog strukturne sličnosti sa mineralima kostiju i zuba, kalcijum-hidroksiapatit, (Ca10(PO4)6(OH)2), HAP, je predmet mnogih istraživanja u oblasti biomaterijala, a u cilju dobijanja kalcijum- hidroksiapatita u obliku pogodnom za zamenu odreñenih delova koštanog tkiva. Uprkos brojnim istraživanjima koja su voñena s ciljem da se dobiju materijali na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, i dalje se intenzivno radi na pronalaženju optimalnih uslova procesiranja, a u cilju dobijanja materijala optimalne mikrostrukture, mehaničkih svojstava, bioaktivnosti, biokompatibilnosti, itd. Prva publikacija koja o uspešnoj reparaciji koštanih defekata materijalom na bazi kalcijum-fosfata datira iz 1920. godine [9]. Pola veka kasnije, Levitt (1969) i Monroe sa saradnicima (1971.) svoje studije baziraju na metodama koje omogućuju dobijanje keramičkih materijala na bazi apatita polazeći od minerala fluorapatita, pritom ukazujući na mogućnost korišćenja ovako dobijenih materijala u medicini i stomatologiji [10, 11]. Clark sa saradnicima [12] i Hubbard [13] su meñu prvima opisali postupak za dobijanje kalcijum-fosfatne keramike polazeći od komercijalno dostupnih kalcijum-fosfatnih reagenasa. Nedugo zatim, Nery sa saradnicima [14] objavljuje prvu studiju proisteklu iz kliničke primene bifaznih biokeramičkih materijala na bazi trikalcijum-fosfata i kalcijum- hidroksiapatita. Sredinom sedamdesetih godina, tri grupe autora [15]: Jarcho sa saradnicima u SAD [16-17], deGroot i Denisen u Evropi [18-20] i Aoki u Japanu [21, 22] istovremeno ali nezavisno baziraju svoj istraživački rad na razvoju i komercijalizaciji kalcijum-hidroksiapatita kao biomaterijala za reparaciju i zamenu koštanog tkiva. Njihova istraživanja su bila bazirana na činjenici da se mineralni deo kostiju u najvećem procentu sastoji od kalcijum- hidroksiapatita, oslanjajući se na Hench-ova istraživanja iz ranih sedamdesetih, u kojima se nastajanje hemijskih veza izmeñu kostiju i staklo-keramičkih biokompozita objašnjava formiranjem meñusloja bogatog kalcijum-fosfatom. Danas se biokeramički materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata najčešće koriste u obliku: poroznih i gustih keramičkih formi [23-27], kalcijum-fosfatnih cemenata [28, 29], biokeramičkih prevlaka na različitim metalima [30-33], kompozitnih materijala na njihovoj bazi itd. 8 U zavisnosti od zastupljenosti i veličine pora, keramika na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata se koristi u: - gustoj sinterovanoj formi, - obliku biokeramike kontrolisane poroznosti i - formi skafolda. Pod gustim sinterovanim biokeramičkim materijalima podrazumevaju se materijali sa maksimalnom vrednošću otvorene mikoroporoznosti od 5 vol % i prečnikom pora ne većim od 1 µm [18, 20, 34]. Gusti sinterovani oblici na bazi HAP-a i kalcijum-fosfata dobijaju se konvencionalnim postupkom najčešće kroz tri sukcesivna koraka. Prvi korak je sinteza prahova kalcijum-hidroksiapatita koristeći komercijalno dostupne reagense, drugi korak je kompaktiranje na visokim pritiscima u kompakt željenog oblika i veličine i na kraju sinterovanje konvencionalnim tehnikama, na temperaturama do 1300ºC [15]. Snižavanjem temperature i skraćivanjem vremena sinterovanja moguće je uticati na poboljšanje mnogih svojstava finalnog materijala. Savremene metode procesiranja gustih formi HAP-a se baziraju na sintetisanju nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita optimalnih fizičko-hemijskih karakteristika, zatim na dobijanju kompakata velikih polaznih gustina pomoću visokih pritisaka, i nakon toga sinterovanju koristeći savremene tehnike, kao što su toplo presovanje, mikrotalasno sinterovanje, spark plazma sinterovanje, toplo izostatsko presovanje itd. Na taj način se dobijaju guste forme kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata željenih svojstava, koje odgovaraju primenama ovih biomaterijala za reparaciju i supstituciju odreñenih delova koštanog tkiva. O prednostima i manama konvencionalnih i savremenih postupaka za dobijanje gustih formi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, kao i uticaju parametara procesiranja na svojstva ovog tipa biokeramičkih materijala će biti više reči u narednim poglavljima. Guste forme kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata se u medicinskoj i stomatološkoj praksi primenjuju kao samostalni implantni materijali (npr. maksiofacijalni i dentalni implanti) ili kao delovi kompleksnijih sistema (npr. pri izradi dentalnih proteza, prilikom izrade veštačkih kukova itd.) [35, 36]. Koristeći navedene metode, guste forme HAP- a mogu se dobiti u vidu pravilnih i nepravilnih delova za zamenu pojedinih delova zuba. Moguće je dobiti ih i u obliku pogodnom za zamenu odreñenih delova srednjeg uha, o čemu govore brojne publikacije [37, 38]. Ova vrsta biomaterijala se neposredno koristi prilikom zamene korena zuba, sa ciljem da se minimalizuje resorpcija alveolarnog grebena kao i da se sačuva njegov oblik i veličina, što znatno povećava verovatnoću da zub sačuva svoju funkciju [20, 39]. Koriste se i za povećavanje alveolarnih grebena, sa ciljem da organizam bolje prihvati ugrañene dentalne proteze [18, 40, 41]. U formi blokova guste HAP forme se koriste kao mete pri površinskoj implantaciji odreñenih vrsta jona. 9 Pojedini autori navode da se guste forme HAP mogu koristiti kao materijal za ispunu koštanih defekata u dentalnoj i ortopedskoj praksi [42-47]; kao umetak pri ugradnji metalnih implantata [48]; kao matrix pri formiranju kompozitnih materijala [49, 50]; kao materijal za ispunu zubne pulpe [51, 52]; kao materijal za maksiofacijalne rekonstrukcije gde se zahtevaju precizno izrañeni oblici za zamenu odreñenih delova koštanog tkiva [17, 53] itd. Sve navedene primene baziraju se na superiornijim mehaničkim svojstvima guste kalcijum-fosfatne keramike, u odnosu na porozne kalcijum-fosfatne keramičke materijale. Od mehaničkih karakteristika potencijalnih implantnih gustih formi u mnogome zavisi njihova potencijalna primena. Žilavost, tvrdoća, čvrstoća na pritisak i savijanje i svi ostali mehanički parametri u velikoj meri zavise od oblika i udela poroznosti u dobijenom materijalu. Porozna kalcijum-fosfatna keramika se sama ne može primenjivati na mestima koja su izložena velikom naprezanju, već u kombinaciji sa polimerima, kao prevlaka na metalima ili u kombinaciji sa gustim biokeramičkim materijalima u zavisnosti od vrste aplikacije. Kontrolisano porozni biokeramički materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata su takoñe u velikoj meri zastupljeni u kliničkoj praksi [54-56]. Za razliku od gustih formi čiji glavna prednost leži u dobrim mehaničkim svojstvima i postojanosti tokom vremena, porozni biokeramički materijali se usled postojanja pora odlikuju većom potencijalnom dodirnom površinom za ostvarivanje veze sa tkivom. Oni tako mogu da ostvare čvrst mehanički kontakt sa živim tkivom i na taj način doprinesu boljoj osteokonduktivnosti [35, 57, 58]. Porozni biokeramički materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata su našli primenu u inženjerstvu tkiva, kao i u sistemima za kontrolisano otpuštanje lekova [59, 60]. Kontrolisano porozni biokeramički materijali mogu da se svrstaju u dve grupe, a to su materijali kontrolisane mikroporoznosti i materijali kontrolisane makroporoznosti. Makroporoznost, prema pojedinim autorima, ima uticaj na kontrolu prilaza tkiva i bioloških fluida implantiranom materijalu, dok mikroporoznost ima uticaja na adheziju implantiranog materijala i tkiva, kao i na brzinu resorpcije kalcijum fosfata. Kod makroporozne keramike veza izmeñu implanta i tkiva se formira urastanjem kostiju unutar pora na površini ili kroz ceo implant. Da bi tkivo moglo da uraste u materijal veličina pora treba da iznosi od 100 – 400 µm u prečniku, kako bi se obezbedilo snabdevanje krvlju za rast vezivnog tkiva. Vaskularno tkivo se ne javlja ako su pore manje od 100 µm [54, 61]. Kao dobro rešenje za dobijanje materijala sa kontrolisanom veličinom pora ovih dimenzija korišćena je mikrostruktura korala (Goniopora i Porites). White je sa saradnicima [3, 62] razvio proces kojim je preslikao mikrostrukturu korala i tako dobio uniformne pore željene veličine. Porozni materijali se mogu dobiti i kompaktiranjem prahova sa raznim jedinjenjima čijim bi se naknadnim uklanjanjem iz strukture (sagorevanjem, rastvaranjem itd.) dobila poroznost kontrolisanog udela i dimenzija. Predtretman hidroksiapatita pre sinterovanja vodonik-peroksidom takoñe može biti izazivač kontrolisane makroporoznosti. Porozni biokeramički materijali sa veličinom pora od 100 – 150 µm, a maksimalnom oko 500 µm su 10 predstavnici skafoldnih materijala. Osnovna uloga osteokonduktivnih skafolda je održavanje prostora ili volumena u kome se može formirati kost. Ovo je naročito važno kod defekata ''kritične veličine'', kod kojih postoji konkurencija izmeñu rasta koštanog i mekog tkiva unutar defekta [63-67]. Kontrolisanjem mikroporoznosti biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, tj. kontrolisanjem oblika i veličina pora, moguće je uticati na njihove mehaničke karakteristike. Kumar sa saradnicima je polazeći od kompozitnog praha na bazi HAP i cirkonijum-dioksida, sastavljenog od mikrosfernih čestica, dobio sinterovani materijal sa prisustvom pora sfernog oblika veličine nekoliko mikrona i izuzetno dobrim mehaničkim karakteristikama za ovaj tip keramičkih materijala. Pažljiva kontrola poroznosti, u kombinaciji sa dobrim mehaničkim karakteristikama može biti dobar preduslov za dobijanje implantnog materijala optimalnih svojstava za pojedine kliničke primene [27, 56, 59, 68]. Više o uticaju poroznosti na svojstva biokeramičkih materijala, o postupcima za dobijanje kontrolisano poroznih formi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, kao i o uticaju parametara procesiranja na svojstva ovog tipa biokeramičkih materijala će biti više reči u narednim poglavljima. Kalcijum-fosfatni biokeramički materijali se u zavisnosti od broja faza koje sadrži dele u tri grupe [69]: - Monofazna: hidroksiapatit (HAP), α i β trikalcijum-fosfat (α – TCP, β – TCP) i tetrakalcijum-fosfat (TTCP); - Bifazna (BCP): α-TCP + β-TCP, HAP + α-TCP, HAP + β-TCP, α-TCP + TTCP; - Multifazna: različite mešavine monofazne keramike. Stabilnost pojedinih faza kalcijum-fosfatne keramike zavisi od temperature, prisustva vode i od prirode okruženja [3, 70]. Na temperaturi tela, u kontaktu sa telesnim fluidima stabilne su samo dve faze: pri pH < 4,2 stabilna faza je CaHPO4·2H2O, dok je pri pH ≥ 4,2 stabilna faza Ca10(PO4)6(OH)2. Na visokim temperaturama nastaju, a nakon toga su stabilne na sobnoj temperaturi i druge kalcijum-fosfatne faze, kao što su Ca3PO4 (α- i β-trikalcijum-fosfat) i Ca4P2O9 (tetrakalcijum-fosfat, TTCP). 11 2. KALCIJUM-HIDROKSIAPATIT Termin apatit predstavlja čitavu grupu jedinjenja slične, ali ne identične strukture. Opšta hemijska formula apatita je [71]: A10(BO4)6X2 pri čemu A, BO4 i X mogu biti: A = Ca, Mg, Sr, Ba, Fe, Cd, Pb, Al... BO4 = PO43-, VO43-, SiO44-, AsO43-, CO32- X = OH-, Cl-, F-, CO32- Kalcijum-hidroksiapatit je tipičan predstavnik ove grupe jedinjenja sa tačno definisanom hemijskom formulom: Ca10(PO4)6(OH)2 Kristalna struktura kalcijum-hidroksiapatita prikazana je na slici 2.1 [72]. Hidroksiapatit kristališe heksagonalno i ima prostornu grupu P63 / m. Jedinična ćelija hidroksiapatita ima dve ivice iste dužine a = b = 9,432 Å, dok treća ivica koja je normalna na prethodne dve ima dužinu c = 6,881 Å. Hidroksilni joni leže na uglovima rombične baze jedinične ćelije praveći stubove hidroksilnim grupama sa rastojanjem polovine visine jedinične ćelije. Šest jona kalcijuma je asocirano sa ovim hidroksilnim grupama praveći jednakostranične trouglove. Trouglovi su normalni na hidroksilne grupe. Susedni trouglovi su meñusobno rotirani za 60°. Četiri atoma kalcijuma leže duž dva razdvojena niza koji su paralelni nizovima hidroksilnih grupa na polovini rastojanja izmeñu trouglova kalcijuma. Ovi atomi kalcijuma su koordinirani atomima kiseonika iz ortofosfornog tetraedra. Atomi kiseonika iz hidroksilnih grupa su pomereni za 0,3 Å od ravni trouglova kalcijuma. Hidroksilne grupe su tako orjentisane da se O-H veza nalazi duž ose, ali ne seče ravan trouglova kalcijuma. 12 a) b) - Ca; - P; - O; - H Slika 2.1. Kristalna struktura kalcijum-hidroksiapatita: (a) 3D pozicija atoma, (b) projekcija u pravcu c-ose [41, 72]. 13 Kalcijum-hidroksiapatit se javlja u tri modifikacije: - stehiometrijski kalcijum-hidroksiapatit (HAP), - kalcijum deficitaran hidroksiapatit (CDHAP) i - oksihidroksiapatit (OHAP). Stehiometrijski kalcijum-hidroksiapatit je onaj koji se može predstaviti formulom Ca10(PO4)6(OH)2. Do odstupanja od stehiometrijskog sastava hidroksiapatita dolazi usled nedovoljnih količina kalcijuma pri sintezi HAP-a, a takoñe i usled prisustva malih količina karbonata tokom sinteze, pri čemu se fosfatna grupa (tetraedarska) zamenjuje karbonatnom grupom (planarnom). Kompenzacija valentnosti se vrši zamenom O2– jona OH– jonima po šemi PO43– ↔ [CO3OH]3–. Tako nastaje kalcijum deficitarni hidroksiapatit (CDHAP), odnosno karbonatni kalcijum-hidroksiapatit, koji je identičan biološkom hidroksiapatitu koji čini mineralnu fazu koštanog tkiva [73]. Oksihidroksiapatit (OHAP) se može predstaviti formulom Ca10(PO4)6(OH)2 – 2XOX[ ]X, gde kiseonični joni i šupljine zamenjuju hidroksilne jone. U slučaju da je umesto hidroksilnih grupa prisutan fluor, on će ležati u centru trouglova kalcijuma. Kada su u strukturi apatita prisutni i fluoridni i hidroksilni joni doći će do stvaranja vodoničnih veza, a ovaj apatit ima manju rastvorljivost u odnosu na hidroksiapatit i fluoroapatit (najmanju rastvorljivost ima apatit u kome je odnos hidroksilnih i fluoridnih jona 1 : 1). 2.1. Kalcijum-hidroksiapatit u prirodi Hidroksiapatiti se osim u biološkim sistemima sreću i u prirodi [74, 75, 76]. U magmatskim i metamorfnim stenama apatiti se javljaju kao primarni minerali, dok se u sedimentnim stenama sreću kao sporedni sastojci. Pod uticajem atmosferskih prilika, tokom miliona godina, primarni minerali su se rastvarali i na taj način fosfati su dospevali u hidrosferu gde su se koncentrisali najpre u morskim organizmima, a zatim na dnu okeana. Sedimentni apatiti nalaze se blizu zemljine površine u slojevima debljine od nekoliko centimetara do preko deset metara. Najbogatija nalazišta apatita otkrivena su u Maroku, Americi, Kini, Tunisu, Kazahstanu, Alžiru i Jordanu. Apatiti koji se sreću u prirodi obično nemaju stehiometrijski sastav. U njima su uobičajeni kristalografski defekti, izazvani suptitucijom velikog broja jona. Česta pojava u prirodnim apatitima je da na mestima hidroksilnih grupa prisutan fluor. Primeri polikristalnog i monokristalnog prirodnog apatita prikazani su na slici 2.2. Njihova različita boja potiče upravo od inkorporiranih jona obojenih metala [77, 78]. 14 Slika 2.2. Primeri polikristalnog (levo) i monokristalnog (desno) prirodnog apatita [74] U prirodi je poznato više od 200 vrsta fosfatnih jedinjenja, meñu kojima samo apatiti mogu da posluže kao komercijalni izvor fosfora [79]. Osim u medicinske svrhe hidroksiapatiti se koristi i kao materijal za sorpciju odreñenih jona, kao katalizator, kao materijal za punjenje hromatografskih kolona, kao gasni senzor itd. Kalcijum–hidroksiapatit je ipak najznačajnija so kalcijuma i fosfora, i njegovo najznačajnije pojavljivanje u prirodi je u vidu neorganske komponente koštanog tkiva živih organizama. 2.2.Kalcijum-hidroksiapatit u biologiji i medicini Kalcijum-hidroksiapatit je predstavnik bioloških apatita koji su konstituenti mineralne faze kalcificiranog tkiva (enamel, zubi i kosti), kao i neke od patoloških kalcifikacija kao što su zubni kamenac, kamen u urinarnom traktu itd. Biološki apatiti se razlikuju i meñusobno, i od sintetičkog HAP po stehiometriji, sastavu, kristalnoj strukturi i ostalim fizičko-hemijskim i mehaničkim svojstvima (Tabela 2.1.). Biološki apatiti su obično kalcijum deficitarni i u njihovoj strukturi je uglavnom izvršena supstitucija fosfatnih jona karbonatnim [80, 81]. Biološki apatiti gleñi razlikuju se od apatita dentina ili kosti po kristaliničnosti i koncentraciji CO32- i Mg2+. Apatiti enamela sadrže najmanju količinu karbonatnih i jona magnezijuma i imaju veće kristale u poreñenju sa dentinom ili kostima. Apatit enamela je manje rastvoran od apatita dentina ili kosti, ali je rastvorljiviji od gustog HAP dobijenog na visokoj temperaturi. Razlike u veličini kristala i rastvorljivosti izmeñu apatita enamela, dentina i kosti mogu biti pripisane delom i razlici u koncentraciji karbonatnih i jona magnezijuma koji su prisutni u njima [82, 83, 84]. Biološki apatiti humanog enamela, dentina i kosti takoñe daju različite proizvode nakon sinterovanja iznad 800°C, jer se razlikuju po sastavu, prvenstveno usled različite kalcijum deficitarnosti. Sinterovanjem apatita kostiju iznad 800°C dobija se uglavnom HAP i mala količina CaO. Sinterovanjem apatita enamela i 15 dentina iznad 800°C dobija se HAP i mala količina β-TCP (oko 5 mas.% u enamelu i oko 12 mas.% u dentinu) [15, 34, 85]. Tabela 2.1. Uporedni prikaz sastava, kristalografskih i mehaničkih karakteristika humane gleñi, kostiju i sintetisanog hidroksiapatita [15, 85] Enamel Kost Sintetisani HAP Sastav (mas. %): Kalcijum, Ca 36,0 24,5 39,6 Fosfor, P 17,7 11,5 18,5 (Ca/P) molarni 1,62 1,65 1,67 Natrijum, Na 0,5 0,7 tr Kalijum, K 0,08 0,03 tr Magnezijum, Mg 0,44 0,55 tr Karbonatni joni, CO32- 3,2 5,8 - Fluoridni joni, F- 0,01 0,02 - Hloridni joni, Cl- 0,30 0,10 - Pepeo (potpuno neorganski) 97,0 65,0 100 Organski deo 1,0 25,0 - Apsorbovana H2O 1,5 9,7 - Elementi u tragovima: Sr, Pb, Ba, Fe, Zn, Cu tr tr tr Kristalografske osobine Parametri rešetke (+/- 0.003 A) a-osa 9,441 9,419 9,422 c-osa 6,882 6,880 6,880 Indeks kristaličnosti 70-75 33-37 100 Veličina kristala, nm 130 x 30 nm 250 x 25-50 Proizvodi nakon sinterovanja (950°C) HA + TCP HA + CaO HA 16 Osnovna funkcija skeletnog sistema je da daje potporu telu i da štiti pojedine delove tela i organe. Kosti se sastoje od organskog i neorganskog dela. Organski deo sintetišu uglavnom osteoblasti, a čine ga vlakna kolagena i amorfna osnovna supstanca. Osnovna supstanca se sastoji od glikoproteina i glikozaminoglikana, dok neorganski deo čine kristali kalcijum-hidroksiapatita igličastog oblika dužine 20-40 nm i debljine 1,5-3 nm, koji leže duž vlakana kolagena dajući kosti tvrdoću i otpornost. Struktura kostiju prikazana je na slici 2.3. Kolagena vlakna u kalcifiranom matriksu grade pravilno rasporeñene lamele (debljine 3-7 µm). Ove lamele su meñusobno paralelne i organizovane su kao koncentrični valjkovi oko središnje šupljine tj. Haversovog kanala u kome se nalaze krvni sudovi i nervna vlakna okružena vezivnim tkivom. Sve koncentrične lamele koje okružuju jedan Haversov kanal se nazivaju Haversov sistem ili osteon. Svaki osteon je izgrañen od 4-20 lamela. Kolagena vlakna u jednoj lameli su meñusobno paralelna i čine spirale oko Haversovog kanala [2, 86]. Slika 2.3. Mikro i makro struktura kosti Kost se može posmatrati kao kompozitni materijal sastavljen od tri glavne komponente: polimera, neorganske komponente i viskozne tečnosti. Neorganska komponenta kostiju sadrži različite kalcijum-fosfate. Najvažniji i najzastupljeniji je kalcijum-hidroksiapatit, Ca10 (PO4)6 (OH)2, koji se obično javlja sa mnogim supstitucijama u molekulu: K+, Mg2+, Sr2+, i Na+ umesto Ca2+; karbonatni joni umesto 17 fosfatnih jona i fluoridni joni umesto OH- grupe [87]. Neke od navedenih supstituenata imaju značajan uticaj na strukturu i mehanička svojstva minerala kostiju. Proces stvaranja kostiju naziva se osteogeneza ili osifikacija [2]. Osteogeneza je složen proces. Odvija se u mladom vaskularizovanom vezivu mezenhimnog tipa, u kome se pojavljuju koštane ćelije koje stvaraju kost (osteoblasti) i remodelirajuće ćelije (osteoklasti). Osteoblasti su ovalne ćelije veličine 15-20 mikrometara. Sintetišu organski matriks, koji se sastoji od mukopolisaharida (osteomukocid) i kolagenskih vlakana. Postoji još jedan tip ćelija - prelazna forma, izmeñu mezenhimnih ćelija i osteoblasta, a to su osteogene ćelije. Nepravilnog su oblika, nešto izdužene sa svetlijom citoplazmom i svetlijim jedrom. Malo se razlikuju od mezehimnih ćelija, ali se nalaze u blizini osteoblasta. Od osteogenih ćelija nastaju osteoblasti. Meñutim i od osteoblasta mogu nastati osteogene ćelije. Osteoblasti i osteogene ćelije se nalaze, kod potpuno formirane kosti, u koštanim kanalima (Haversovim i Volkmanovim), u endoostu i u unutrašnjem sloju periosta. Osnovna funkcionalna karaktristika osteogeneze je stalno i istovremeno odvijanje dva paralelna procesa: stvaranje i razaranje kosti. Prvi obezbeñuju osteoblasti, a drugi osteoklasti. Mišljenje je da se hidroksiapatit ne taloži direktno iz vanćelijskog fluida u kosti, ali da se prekursor kalcijum-fosfat prvi formira i transformiše u hidroksiapatit. Pretpostavlja se da je inicijalni mineral brušit, tj. da ovaj mineralni prekursor obezbeñuje ravnotežu u keramičkoj fazi kostiju [88, 89]. Posmatrano mikroskopski čitav skelet je, izuzev ljuske lavirinta, grañen od lamelarne kosti, tj. od sistema koštanih lamela koje nastaju okoštavanjem meñućelijske supstance, tj. ulaganjem kalcijumovih soli u supstancu izmeñu kolagenih fibrila. Postoji mišljenje da je veza izmeñu kolagena iz kosti i mineralne faze mnogostruka i kompleksna. Kada osteoblasti stvaraju kost, sadrže vodu umesto minerala. Postepeno, organski matriks, nazvan osteoid, ”sazreva” i kalcifikacija počinje. Pretpostavlja se da je inicijalna precipitacija kristala minerala katalizovana elementima u kolagenskoj strukturi, kao i drugim biohemijskim regulatorima. Prema tome, fizičko ureñenje ove dve faze razvija se na osnovu strukture svake od ovih faza. Inicijalni kristali rastu u trakama kolagena, i zatim se šire kroz celu strukturu kolagena. Kod ljudi, nova kost postiže oko 70 % svoje mineralne kapacitivnosti za period od otprilike 4 dana. Ovaj proces je poznat kao primarna mineralizacija. Sekundarna mineralizacija zahteva mesece sporog i asimptotskog dovoñenja kosti u normalan mineralni sadržaj. To nije maksimum mineralizacije koju kost može da dostigne. Ponekad se uočava da je koštani matriks hiperkalcificiran. U literaturi se navodi da je vreme potrebno da se ovaj proces završi oko 8 meseci posle inicijalnog formiranja dela kosti, ali se može dogoditi da traje i godinama posle. Hipermineralizacija uključuje ne samo dalju mineralizaciju organskog matriksa, već i mineralizaciju mekog tkiva u ćelijskom meñuprostoru. Ovo je patološko stanje, koje se ne dešava kod normalne kosti, uključuje izumiranje ćelija, i po svoj prilici doprinosi tome da kost bude krta i manje žilava. Hipermineralizacija je takoñe uočena uz razlaganje usled zamora materijala. Pretpostavalja se da osteociti održavaju sadržaj jona minerala kosti na nivou ispod koncentracije u krvnom serumu. Izumiranje osteocita može teoretski dozvoliti 18 hipermineralizaciju. Tok stvaranja kosti u suštini teče u dve faze i one se sukcesivno smenjuju. U prvoj fazi osteoblasti izgrañuju organski matriks (osteomukoid, osteoalbumin i kolagena vlakna) i on se naziva osteoid. U drugoj fazi osteoid se mineralizuje i postaje koštano tkivo. Mineralizacija je taloženje kristala kalcijum-hidroksiapatita u intracelularnu supstancu. Pod uticajem alkalne fosfataze koju luče osteoblasti, cepaju se glicerofosfati, oslobañajući fosfatne jone koji se vezuju sa jonima kalcijuma iz tkiva u kalcijum-fosfate, koji predstavljaju osnovni deo mineralnog dela kosti, približno 85 %. Kalcijum-karbonat je zastupljen sa približno 10 %, a ostatak čine kalcijum-hlorid i magnezijum-hlorid. Sve ove soli stvaraju kristale hidroksiapatita, koji oblažu fibrile, a prodiru delimično izmeñu njih. Potpuna mineralizovana kost sastoji se od dva osnovna dela: organskog (oko 33 %) i neorganskog (oko 67 %). Osim u kostima, kalcijum-hidroksiapatit se i u zubima javlja kao osnovni konstituent, ali u nešto drugačijem obliku, a i sam hemijski sastav delova zuba se razlikuje u poreñenju sa hemijskim sastavom kostiju. Hemijski sastav neorganskog dela zuba i kostiju (izražen u procentima) prikazan je u tabeli 2.2. Tabela 2.2. Uporedni prikaz sastava neorganskog dela zuba i kosti Sloj zuba Mineralni sastojci Ca P CO2 Mg N Ca/P P/CO2 gleñ dentin cement 96,0 76,0 72,7 35,8 27,14 25,93 17,4 13,5 12,4 3,06 3,84 3,42 0,38 0,85 0,78 0,41 3,44 4,28 2,08 2,01 2,08 5,69 4,75 3,64 kost 71,3 26,42 11,8 4,23 0,42 4,48 2,22 2,80 Osnovnu masu zuba čini zubni dentin ili zubna kost. U predelu zubne krunice nju prekriva zubna gleñ (deo sa najvećim sadržajem mineralnih sastojaka, tabela 2.2), a u predelu korena zubnu kost prekriva zubni cement. U središnjem delu krunskog i korenskog dela je zubna pulpa koja se sastoji od krvnih sudova i nervnih završetaka (Slika 2.4). Dentin predstavlja tkivo slično kosti, avaskularno i kalcifikovano. Oko 70% mase dentina čine soli kalcijuma. Nekalcifikovan je samo tanak sloj dentina (predentin) koji se nalazi neposredno uz odontoblaste. 19 Slika 2.4. Struktura zuba Osnovni izvorni materijal za stvaranje neorganskih soli kosti i zuba, fosfor i kalcijum, se nalaze u krvi. Pre deponovanja fosfata kalcijuma u neokoštalom tkivu kosti i zuba dolazi do deponovanja organskih fosfatnih jedinjenja, najčešće u vidu ATP i glikogena u osnovnom tkivu koje okoštava u toku formiranja kosti. Posle složenih biohemijskih i fizioloških procesa dolazi do formiranja apatita koji ispunjava medjuprizmatične prostore kod zubne kosti. Ceo ovaj proces zavisi od količine kalcijuma i fosfora u krvi i samom tkivu koje okoštava, od pravilne funkcije nekih endokrinih žlezda (paratireoidne, tireoidna i hipofiza) i od prisustva vitamina u hrani, a naročito A, D i C. 2.3. Svojstva kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata Kao što je već rečeno, sa jedne strane, kao najvažniji konstituent neorganske faze kostiju i zuba, a sa druge strane kao jedinjenje koje je moguće dobiti iz vodenih rastvora i pogodnim načinom procesiranja prevesti u biokeramički materijal željenih karakteristika, kalcijum- hidroksiapatit predstavlja predmet mnogih istraživanja. Stehiometrijski kalcijum- hidroksiapatit ima teorijski sastav: 39,68 mas. % Ca, 18,45 mas. % P, Ca/P maseni odnos 2,151, Ca/P molarni odnos 1,67. 20 Stehiometrijski kalcijum-hidroksiapatit ima veliku termičku stabilnost na temperaturama do 1200 °C, tj. na temperaturama manjim od 1200 °C ne dolazi do fazne transformacije HAP u druge kalcijum-fosfate. Uslovi sinteze praha kao i karakteristike dobijenog praha u mnogome utiču na fazni sastav sinterovanih biokeramičkih materijala. Ispitivanjem uticaja parametara sinteze pri precipitaciji HAP na termičku stabilnost HAP, došlo se do zaključka da niska koncentracija reaktanata i visoka reakciona temperatura dovode do povećanja termičke stabilnosti [28, 29]. Odsustvo pikova ostalih kalcijum-fosfata na difraktogramima prahova HAP žarenih na temperaturama manjim od 1200 °C, predstavlja svojevrsnu potvrdu njihove stehiometrijske prirode [23, 24, 26]. U slučaju kada je Ca/P molarni odnos manji od 1,67, tj. kada je reč o kalcijum deficitarnom hidroksiapatitu (CDHAP), sinterovanjem na temperaturama u intervalu od 900 do 1500 °C, dolazi do formiranja sledećih kalcijum-fosfatih jedinjenja: β-TCP, α-TCP (nastaje transformacijom β-TCP na temperaturama iznad 1100 °C), tetrakalcijum-fosfat Ca4(PO4)2O (TTCP) i oksiapatita prema reakcijama [90]: CDHAP → Ca10(PO4)6(OH)2 + β-Ca3(PO4)2 ( ≥ 900 °C) (2. 1.) β-Ca3(PO4)2 → α-Ca3(PO4)2 (≥ 1100 °C) (2. 2.) Ca10(PO4)6(OH)2 → 2 Ca3(PO4)2 + Ca4(PO4)2O (≥ 1300 °C) (2. 3.) Ca3(PO4)2 + CaO → Ca4(PO4)2O (≥ 1400 °C) (2. 4.) Iz jednačine 2.4 se može uočiti da kao jedan od produkata termičkog razlaganja HAP može biti i CaO. Prema nekim autorima, proizvod žarenja kalcijum deficitarnog hidroksiapatita na temperaturama iznad 900 °C je anhidrovni dikalcijum-fosfat, DCP. Kako DCP nije stabilan na ovim temperaturama, on se transformiše u β-TCP, koja predstavlja čestu pojavu pri sinterovanju CDHAP na temperaturama iznad 900 °C. Na temperaturama iznad 1100 °C trikalcijum-fosfat se pojavljuje i u vidu svoje visokotemperaturne faze α-TCP, koja nastaje transformacijom β-TCP. Ukoliko se sinterovanje apatita odvija uz prisustvo vodene pare formiranje drugih kalcijum-fosfatnih faza (β- i α-TCP, TTCP) će biti smanjeno i HAP će biti dominantna faza u konačnom proizvodu [91, 92]. Na stabilnost odreñene faze tokom žarenja moze da se utiče i suptituisanjem odreñenih jona u strukturi HAP. β- TCP ne može da se dobije precipitacijom iz vodenih rastvora, već samo može da nastane kao proizvod pri sinterovanju CDHAP. Može da se dobije kontrolisanim žarenjem prirodnih kostiju, s tim što u sastavu konačnog proizvoda zaostaju prirodno supstituisani joni [74]. β- TCP je stabilnija faza na sobnoj temperaturi, dok je visokotemperaturna modifikacija α-TCP rastvorljivija u vodi. Idelna struktura za stabilnost β- TCP je struktura koja u sebi sadrži vakansije koje su male da se u njih smesti jon kalcijuma, ali su dovoljno velike da 21 prihvate jon magnezijuma, koji utiče na stabilnost ove faze. Čist β- TCP nikada nije pronañen u biološkim sistemima, već samo u obliku β-(Ca,Mg)3(PO4)2) [82, 93-97]. U medicinskoj praksi, β- TCP se koristi u obliku fosfatnih cemenata [98-101] ili se nalazi u sastavu keramičkih biomaterijala u kombinaciji sa HAP [26, 27, 56,68, 102-109]. Kao što je već naglašeno, na temperaturama do 1125 °C trikalcijum-fosfat nastaje u obliku svoje visokotemperaturne modifikacije α-TCP. Sobzirom da prisustvo silicijuma u malim procentima stabiliše ovu fazu, neki autori je zovu silicijum-stabilisan α-TCP. U prisustvu jona silicijuma α-TCP može da nastane i na temperaturama nižim od 1000 °C. β- i α- TCP imaju isti hemijski sastav, ali se znatno razlikuju po pitanju kristalne strukture i rastvorljivosti. α-TCP faza je dosta reaktivna u vodenim rastvorima, tj. sklona je hidrolizi, zahvaljujući čemu je ovaj materijal našao izuzetno široku primenu pri proizvodnji fosfatnih cemenata [28, 29, 110-118]. Kalcijum-hidroksiapatit i trikalcijum-fosfat (β- i α-TCP) su najčešće zastupljena jedinjenja u sintetskim biokeramičkim materijalima. Kalcijum-fosfatna faza reaguje sa vodom ili telesnim fluidima, na 37˚C i formira se kalcijum-hidroksiapatit prema jednačini: 4Ca3(PO4)2 (S) + 2H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 (površina) + 2Ca2+ + 2HPO42 (2. 5.) Primena kalcijum-fosfatne keramike u mnogome zavise od njenih mehaničkih svojstava. O mehaničkim svojstvima biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata biće dosta reči kasnije, a u tabeli 2.3. date su literaturne vrednosti nekih strukturnih i mehaničkih karakteristika hidroksiapatita. Tabela 2.3. Fizičko-hemijske i strukturne karakteristike hidroksiapatita Prostorna grupa P63/m Parametri rešetke a = b = 9,432 Å; c = 6,881 Å Teorijska gustina [g/cm3] 3,168 Tvrdoća po Vikersu – u [GPa] 0,6-3 Čvrstoća na pritisak [MPa] 500 – 1000 Čvrstoća na savijanje [MPa] 115 – 200 Jung-ov modul [GPa] 80 – 100 Žilavost kIc [MPa m1/2] 0,6-1,0 Drugi kalcijum-fosfati, kao što je β-trikalcijum-fosfat (β-TCP) imaju lošija mehanička svojstva od HAP, zbog čega im je primena ograničena. Zahvaljujući tome što se β-TCP rastvara mnogo brže od HAP, i tome što lako podleže transformacijama i resorpciji pod uticajem osteoklasta, u njegovom prisustvu dolazi do stimulacije aktivnosti osteoblasta u 22 procesu stvaranja kosti. Stoga se u cilju dobijanja keramike dobrih mehaničkih karakteristika i odgovarajućih resorbilnih svojstava, HAP meša sa β-TCP. Ova keramika je poznata pod nazivom bifazna kalcijum-fosfatna keramika (BCP). Na mehanička svojstva biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata pored parametara procesiranja, kao što su vreme zadržavanja na temperaturi sinterovanja, maksimalna temperatura pri procesiranju, pritisak na kome se presuju polazni kompakti, primenjene tehnike sinterovanja kojima se materijal finalno procesira, u velikoj meri utiču karakteristike polaznih prahova. Od karakteristika polaznih prahova, pored već pomenutog Ca/P molarnog odnosa, veliki uticaj na svojstva materijala imaju i oblik i veličina čestica prahova, stepen njihove aglomerisanosti, oblik aglomerata, hemijski sastav itd. 2.4. Sintetisanje prahova kalcijum-hidroksiapatita Veliki broj postupaka sinteze kalcijum-hidroksiapatita je do danas objavljen sa ciljem da se dobije prah sa optimalnim karakteristikama, u zavisnosti od potencijalne namene. S obzirom da karakteristike polaznog praha, kao što su veličina čestica, stepen aglomerisanosti, odnos Ca/P, specifična površina itd., u velikoj meri odreñuju svojstva sinterovanih biokeramičkih materijala, sintetisanju prahova HAP sa razlogom poklanja velika pažnja. Primera radi, odnos Ca/P polaznog praha kalcijum-hidroksiapatita ima uticaj na fazni sastav sinterovanog biokeramičkog materijala. Veličina i oblik čestica praha i stepen njihove aglomerisanosti utiču na kompresibilnost i gustinu polaznih kompakata, samim tim na izbor uslova sinterovanja, koji odreñuju mnoga svojstva sinterovanih biokeramičkih materijala. Najveći broj postupaka sinteze bazira se na dobijanju hidroksiapatita iz vodenih rastvora, a karakteristike praha u velikoj meri zavise od stepena presićenja rastvora u odnosu na neku kalcijum–fosfatnu fazu. Kalcijum-hidroksiapatit je moguće dobiti iz kalcijum-fosfatnih prekursora ili bez njih, a prekursori mogu biti: oktakalcijum-fosfat, amorfni trikalcijum-fosfat, dikalcijum-fosfat dihidrat itd. Hidroksiapatit je moguće dobiti direktno, bez pojave prekursora, iz rastvora koji ima niži stepen presićenja prema hidroksiapatitu u poreñenju sa rastvorima iz kojih su dobijene amorfne prekursorske faze. Kalcijum-hidroksiapatit je moguće dobiti: različitim modifikacijama precipitacije iz vodenih rastvora [119-122], primenom hidrotermalnih uslova sinteze [123-127], reakcijama u čvrstom stanju [128, 129], sol-gel tehnikama [130-132], hidrolizom drugih kalcijum-fosfata, precipitacijom u prisustvu uree, glicina, formaldehida, heksametilentetraamina [133-136], primenom sprej pirolize [137], sintezama sa primenom ultrazvuka i mikrotalasa [138, 139] itd. Hidroksiapatiti dobijeni navedenim tehnikama su u najvećem broju slučajeva kalcijum deficitarni (Ca/P molarni < 1,67) [140-142]. Ukoliko se sinteza izvodi u vrlo baznoj sredini, 23 talog može da sadrži karbonate, što utiče na povećanje odnosa Ca/P izad 1,67. Treba naglasiti da je do sada ogroman broj studija bio posvećen problematici vezanoj za sintezu stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita (Ca/P = 1,67), s obzirom da je upravo ovaj Ca/P odnos preduslov za dobijanje monofaznih kalcijum-hidroksiapatitnih biokeramičkih materijala [143, 144]. Prema pojedinim autorima, sinteze koje vode ka formiranju stehiometrijskog HAP-a se mogu podeliti na osnovu mnogih kriterijuma u nekoliko vrsta [145]. Najčešće korišćene sinteze su, kako ih u literaturi navode, precipitacione metode bazirane na teorijskom sastavu kalcijum-hidroksiapatita. Zajedničko za ove reakcije je da odnos Ca/P u reakcionoj smeši mora da bude 1,67. Polazna jedinjenja kalcijuma su obično CaCO3, CaO, Ca(OH)2 itd. Pri sintetisanju stehiometrijskog HAP poželjno je uspostaviti inertnu atmosferu u cilju sprečavanja apsorpcije CO2, koji je uvek prisutan u vazduhu i vrlo lako se inkorporira u apatitnu strukturu. Ulaskom CO32- u hidroksiapatitnu strukturu, mogu da nastanu dva tipa karbonatnih hidroksiapatita. Tip »A« nastaje u slučaju kada jedan jon CO32- supstituiše dva jona OH-, pri čemu se formira jedna vakancija. U tipu »B«, karbonatni jon zamenjuje fosfatni jon, a pritom nastaje katjonska vakancija. Od jedinjenja fosfora pri sintetisanju stehiometrijskog HAP najčešće se koristi ortofosforna kiselina visoke čistoće ili amonijum- hidrogenfosfat, a tipična reakcija koja prati ove postupke sinteze je: 10Ca(OH)2 + 6H3PO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 18H2O (2. 6.) Nitrati i amonijumove soli se često koriste umesto hlorida i soli natrijuma [146], zbog jednostavnog razlaganja soli NH4NO3, koja nastaje pri ovim procesima kao nuzproizvod. pH rastvora se najčešće održava oko vrednosti 10, a obično se reguliše upravo dodatkom amonijaka. Precipitacija iz rastvora se odigrava ili istovremenim dodavanjem soli kalcijuma i fosfatnih jedinjenja u vodu ili dodavanje fosfatnog rastvora u vodeni rastvor soli kalcijuma. Odstojavanje rastvora nakon reakcije predstavlja važan stupanj kako bi se osiguralo dobijanje stehiometrijskog HAP [147]. Tokom starenja dobijeni HAP je sklon aglomeraciji pri čemu sitni kristali postaju sve krupniji kako se Ca/P odnos približava vrednosti 1,67 [148]. Sinteza se obično odvija pri kontrolisanoj brzini dodavanja reaktanata uz stalno mešanje, na temperaturama od 25 oC do 90 oC. pH vrednost se tokom sinteze smanjuje uklanjenjem hidroksilnih jona iz rastvora tokom taloženja hidroksiapatita. Ovim metodama se dobijaju velike količine hidroksiapatita usled velikog prinosa ovih reakcija. Problemi se obično javljaju usled nedovoljno precizne kontrole faktora koji upravljaju procesom precipitacije: pH, temperature, Ca/P odnosa regenasa i dr., što može dovesti do dobijanja proizvoda neželjenih karakteristika. HAP je moguće dobiti i precipitacionim sintezama koje vode ka dobijanju stehiometrijskog hidroksiapatita, a bazirane su na ravnotežama u rastvorima. Naime, stehiometrijski HAP je izuzetno stabilna faza u rastvorima pri pH 4,3 na 25 oC. Pod 24 pretpostavkom da se pH održava na navedenoj vrednosti, pojedini autori tvrde da bi i pri različitim odnosima Ca/P u reakcionoj smeši, konačan proizvod mogao biti stehiometrijski HAP [149-152]. U toku dovoljno dugog odležavanja precipitata u matičnom rastvoru na pH 4,3 dolazi do hidrolize drugih kalcijum-fosfata, a kao konačan proizvod dobija se kalcijum- hidroksiapatit [81-83, 153, 154]. Apatiti dobijeni raznim modifikovanim precipitacionim metodama mogu imati dosta različite karakteristike, kako u stehiometrijskom smislu, tako i u pogledu morfologije, kristaličnosti itd, a sva ova svojstva zavise od temperature rastvora, vremena starenja taloga, atmosfere, brzine dodavanja reaktanata i od niza drugih faktora. Kalcijum-hidroksiapatit se dobija i reakcijama u čvrstom stanju. Reakcijama u čvrstom stanju dobijaju se aglomerati nepravilnog oblika, nehomogenog sastava zbog nepotpunog odigravanja reakcije. Dva od mnogih načina dobijanja HAP reakcijama izmeñu čvrstih reaktanata mogu se predstaviti sledećim hemijskim reakcijama [85]: 2CaHPO4 + 2Ca4(PO4)2O → Ca10(PO4)6(OH)2 (2. 7.) 12CaHPO4 + 6Ca4(PO4)2O → 4Ca9(HPO4)(PO4)5OH + 2H2O (2. 8.) Prema reakciji 2.7. dobija se stehiometrijski kalcijum-hidroksiapatit, a prema 2.8. kalcijum deficitaran kalcijum-hidroksiapatit. Reakcijama u čvrstom stanju HAP se može dobiti i reakcijama monetita ili β-TCP sa kalcijum-hidroksidom. Za dobijanje hidroksiapatita reakcijama u čvrsom stanju, koji je manje kalcijum deficitaran i koji sadrži male količine β- TCP faze nakon sinterovanja, koriste se uglavnom komerercijalno dostupna kalcijum-fosfatna jedinjenja. Dobijanje apatita hidrotermalnim metodama za razliku od precipitacionih metoda daje proizvode visokog stepena kristaličnosti, jasno definisane i često uniformne strukture. Sinteza se izvodi tretiranjem smeše reaktanata u autoklavima na definisanoj temperaturi i pritisku. Kao i svim ostalim metodama sinteze, i hidrotermalnom metodom varirajući parametre sinteze može se u mnogome uticati na karakteristike dobijenih prahova. Kalcijum-karbonat u prisustvu odgovarajuće količine CaHPO4 ili (NH4)2HPO4 može dati HAP prema sledećim hemijskim reakcijama: 4 CaCO3 + 6 CaHPO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 6 H2O + 4 CO2 (2. 9) 10 CaCO3 + 6 (NH4)2HPO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 8H2O + 12NH3 + 10CO2 (2. 10) Prah kalcijum-hidroksiapatita se može dobiti hidrotermalnom reakcijom kalcijum- fosfata i kalcijum-oksida u prisustvu vodene pare: 3Ca2P2O7 + 4CaO + H2O → Ca10(PO4)6(OH)2 (2. 11) 25 Dobijeni HAP je stehiometrijski. Potpuna sinteza se izvrši nakon 3 h na p = 30 MPa i T= 350°C. Eksperimenti su izvoñeni u atmosferi azota. HAP se hidrotemalnim putem može dobiti velikim brojem modifikovanih metoda od kojih su neke: "gel growth" metoda, "flux growth" metoda, raznim modifikacijama reakcija Ca(EDTA)2– u fosfatnim rastvorima itd [123-127]. 3. PROCESIRANJE I SVOJSTVA BIOKERAMIČKIH MATERIJALA Nakon sinteze prahova kalcijum-hidroksiapatita, naredne faze u procesiranju biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata su: - oblikovanje i - sinterovanje. 3.1. Oblikovanje keramičkih materijala presovanjem prahova Tokom procesiranja keramičkih materijala, oblikovanje predstavlja proces pri kome dobija polazni kompakt željenog oblika, nakon čega sinterovanjem materijal dobija svoje konačne dimenzije [155]. Kao naziv za oblikovani čestični kompakt koristi se engleska reč „green body“, u prevodu zeleno telo, ali je u literaturi prihvaćen i često korišćen termin polazni kompakt. Metode oblikovanja keramičkih prahova su: oblikovanje presovanjem, oblikovanje iz suspenzija i oblikovanje plastičnih keramičkih masa. Dva osnovna tipa presovanja prahova su uniaksijalno i izostatsko presovanje. Presovanje obuhvata tri osnovna koraka: punjenje kalupa prahom, dejstvo sile tj. formiranje polaznog kompakta i vañenje ispreska iz kalupa. Svi navedeni koraci su od izuzetnog značaja, ali treba istaći da pri procesu oblikovanja kompakata presovanjem postoji još niz meñukoraka koji mogu doprineti poboljšanju svojstava polaznih kompakata, a samim tim i proces sinterovanja učiniti efikasnijim. Tokom presovanja primena pritiska dovodi do razbijanja mekih aglomerata i preureñenja čestične strukture, pri čemu se translatornim i rotacionim kretanjem keramičkih čestica vrši njihova preraspodela i preureñenje u jednu novu, mnogo efikasnije i ureñenije pakovanu strukturu. Vrlo bitne karakteristike polaznih kompakata su polazna gustina, specifična površina, raspodela veličina pora i oblik pora. Polazna gustina u velikoj meri zavisi 26 od veličine primenjenog pritiska. Sa povećanjem primenjenog pritiska polazna gustina, koordinacioni broj čestica i jačina kompakta rastu, dok zapremina, veličina i broj pora opadaju. Oblik, veličina i raspodela veličina pora u velikoj meri utiču na proces sinterovanja, tako da je moguće da se dva uzorka istih polaznih gustina različito ponašaju tokom sinterovanja usled različite raspodele veličina pora. Veličina i raspodela veličina čestica praha imaju značajan uticaj na karakteristike polaznog kompakta. Pri presovanju nanočestičnih keramičkih prahova, za postizanje polazne gustine veće od 40 % teorijske vrednosti zahtevaju se izuzetno visoki pritisci. Uticaj veličine čestica polaznog praha na veličinu pritiska pritiska presovanja se može objasniti većom površinom kontakta po jedinici zapremine kod malih nego kod velikih čestica. Ta veća površina kontakta smanjuje pogonsku silu za preureñenje čestica, usled čega se prahovi sa nano dimenzijama čestica presuju na znatno višim pritiscima. Stepen aglomerisanosti nanočestičnih prahova kao i oblik, priroda i morfologija aglomerata imaju veliki uticaj na svojstva polaznih kompakata. Na slici 3.1 prikazana je šema aglomerisanog praha na kome se vide položaji interaglomeratnih i intraaglomeratnih (interkristalitnih) pora. Slika 3.1. Šema aglomerisanog praha Ukoliko su aglomerati tvrdi i mikronskih su veličina, velika je verovatnoća da će sinterovan uzorak sadržati pore mikronskih dimenzija, što će se nepravilno odraziti na stepen denzifikacije tokom termičke obrade, tj. zahtevaće se viša temperatura sinterovanja za dobijanje gustih materijala. Tvrdi aglomerati koji nekogu ds se razbiju pod dejstvom pritiska, 27 će prouzrokovati pojavu bimodalne raspodele veličina pora u ispresku, tj. pored meñučestičnih pora u uzorku će biti prisutne i prisutne znatno krupnije meñuaglomeratne pore. Presovanjem mekih agregata na visokim pritiscima veličina pora se u velikoj meri smanjuje, a raspodela veličina pora je obično vrlo uska, tako da je za sinterovanje ovako dobijenog polaznog kompakta potrebna niža temperatura. Stepen aglomerisanosti i raspodela veličina pora mogu biti odreñeni u prahu, presovanim i sinterovanim kompaktima pomoću živinog porozimetra. Kod neaglomerisanog praha prisutna je samo jedna vrsta pora (slika 3.2.a). Ove pore su malih dimenzija i nazivamo ih intraaglomeratnim ili interkristalitnim porama. Prisustvo drugih pikova na dijagramu raspodela veličina pora (slike 3.2 b,c) ukazuje na prisustvo pora većih dimenzija tj. interaglomeratnih pora. Slika 3.2. Dijagram raspodele pora: a) neaglomerisanog praha, b) praha sa aglomeratima iste veličine i c) praha se aglomeratima različitih veličina Kompaktiranjem pre sinterovanja se povećava površina kontakta izmedju čestica i smanjuje se mogućnost za zaostajanje interaglomeratnih pora u dobijenom keramičkom materijalu. Nanokristalna keramika se primarno dobija presovanjem metastabilnih nanoprahova na visokim pritiscima, i do nekoliko GPa, a zatim sinterovanjem tako dobijenih kompakata [156, 157]. 3.2. Konvencionalno sinterovanje Definicija procesa sinterovanja prema Balshin-u i Fedochenk-u (1961) glasi: “Sinterovanjem se naziva kvantitativna i kvalitativna promena prirode kontakta izmeñu čestica praha, izazvana toplotnom pokretljivošću atoma ili jona i uzajamnim delovanjem čestica sa 28 atmosferom sinterovanja, koje je praćeno povećanjem kontaktne površine, smanjenjem poroznosti i povećanjem mehaničke čvrstoće sinterovanog tela”. Prema drugoj definiciji, sinterovanje je procesna tehnika koja se koristi u cilju dobijanja materijala kontrolisane gustine polazeći od keramičkih prahova uz pomoć toplotne energije. Tokom procesa sinterovanja disperzni sistem prelazi u fizički kontinuum, tj. očvršćava u jednu celinu uz smanjenje poroznosti, povećanje gustine i porast mehaničke čvrstoće. Materijali dobijeni sinterovanjem keramičkih prahova imaju osobne svojstvene čvrstim telima, ali i neke posebne osobine poput termičkih, dielektričkih, magnetskih i optičkih u uslovima kada je postignuta homogenost strukture sa finim zrnom, poroznost bliska nuli i definisana kristalna struktura [155, 158, 159]. Tokom sinterovanja u sistemu su u svim fazama prisutne pore, a u zavisnosti od prirode pora razlikuju se tri stadijuma sinterovanja: prvi stadijum obuhvata stanje sistema povezanih čestica sa otvorenim porama i bez znatnije promene gustine, drugi stadijum u kome sistem čestica počinje da se skuplja, pore se zaokružuju i zatvaraju, dok treći stadijum odgovara sistemu koji sadrži zatvorene i izolovane pore, udaljene jedne od drugih i izmeñu njih nema meñudejstva. Prema Robertsovom shvatanju, sinterovanje se deli samo na dva stupnja: sinterovanje u prisustvu otvorenih pora i sinterovanje u prisustvu zatvorenih pora. Prema Kofstad-u, proces sinterovanja može biti izdeljen u više perioda. U toku početnog perioda hrapavost površine čestice opada, čestice počinju da se povezuju i stvaraju agregate. Pri kraju prvog perioda počinje rast zrna i pojavljuju se metastabilne pore i pritom dolazi samo do neznatnog skupljanja od nekoliko procenata. Intermedijerni period je vreme u toku kojeg se rast zrna nastavlja, a dimenzije pora opadaju. Završni period počinje kada telo postiže 90-95% teorijske gustine, kada pore postaju diskontinualne i zatvorene. Pore obično zaostaju na granicama zrna. Završni stadijum može da obuhvati kompletno uklanjanje zaostalih pora, što vodi ka potpuno gustom materijalu. Kao negativna pojava u ovom periodu, može da nastupi diskontinualni rast odreñenih velikih zrna na račun malih, a zatvorene pore pritom postaju izolovane unutar zrna i odvojene od granice zrna. Ukoliko doñe do ovog fenomena, potpuna denzifikacija postaje veoma teška. Termin sinterovanje se redovno odnosi na proces kojim se istovremeno postiže povećanje čvrstoće i gustine kompaktiranog praha. Ponekad je moguće povećati mehaničku čvrstoću, a da ne doñe do povećanja gustine, dok je obrnuta pojava krajnje neverovatna. Prema Show-u, razlikuju se tri postupka sinterovanja keramičkih materijala. Sinterovanje u čvrstoj fazi je najčešći proces sinterovanja u toku koga svi konstituenti finalnog keramičkog materijala ostaju u čvrstom stanju, a materije se transportuje difuzijom kroz čvrstu fazu, koja dovodi do promene oblika zrna i kompletne denzifikacije keramičkog tela. Drugi postupak je viskozo sinterovanje pri kome se na temperaturi sinterovanja stvara dovoljna količina viskozne faze, koja popunjava pore polaznog keramičkog tela. Treći vid sinterovanja je sinterovanje u prisustvu tečne faze, tj. termička obrada pri kojoj se na temperaturi 29 sinterovanja stvara tečna faza, ali u količini koja nije dovoljna da na principu viskoznog tečenja popuni pore u poroznom telu. Formirana tečna faza olakšava preureñenje čestica i omogućuje značajnu promenu oblika čestica, popunjavanje pora i formiranje gustog keramičkog tela mehanizmom rastvaranja čvrste faze u njoj i naknadnog ponovnog očvršćavanja. Svi pomenuti postupci sinterovanja se u suštini sastoje od dva osnovna procesa: denzifikacije (povećanje gustine materijala) i rasta zrna (povećanje veličine zrna materijala). Pojedinačnim objašnjenjem ova dva procesa je najjednostavnije shvatiti proces sinterovanja. Gustina je po mnogima najvažnija karakteristika biokeramičkih materiajla. Veće vrednosti gustine mogu se postići ukoliko je: vreme sinterovanja duže, polazna gustina oblikovanog uzorka veća, temperatura sinterovanja viša, veličina čestica polaznog praha manja, sinterovanje potpomognuto primenom pritiska, mikrotalasa i sl. Proces sinterovanja polaznih kompakata je šematski prikazan na slici 3.3. Kao što se vidi sa slike, denzifikacija keramičkih materijala se odvija u tri faze [160]. Slika 3.3.Promena gustine i strukture keramičkog kompakta sa vremenom sinterovanja (TD-teorijska gustina) U početnoj fazi sinterovanja dolazi do preuredjivanja strukture polaznih kompakata (translatornim i rotacionim pomeranjima čestica) i početka stvaranja vratova izmedju čestica, što je praćeno veoma malim povećanjem gustine. Ta faza se može okarakterisati kao faza 30 početnog rasta vratova izmedu čestica. Početna faza sinterovanja se završava kada se dostigne oko 60-75% teorijske gustine. Drugu ili intermedijarnu fazu sinterovanja karakteriše intenzivan rast vratova izmedju čestica, pri čemu čestice gube svoj početni oblik, a medjučestični prostor se znatno deformiše, usled čega nastaju povezani kanali pora. Nakon ove faze sinterovanja materijali praktično predstavljaju čvrsta tela, koja sadrže znatnu količinu povezane mreže kontinualnih pora, otvorenih prema spoljašnjoj površini. Skupljanje tih tzv. otvorenih pora je veoma intenzivno, što je i razlog najvećeg povećanja gustine, tj. najintenzivnije denzifikacije. Kada otvorene pore usled skupljanja postanu suviše uske da bi bile stabilne, one se transformišu u zatvorene pore, a proces sinterovanja ulazi u treću fazu, tj. finalnu fazu sinterovanja. Prelaz od otvorene ka zatvorenoj poroznosti se dešava pri gustinama oko 90-93% teorijske gustine, zavisno od diedarskog ugla θ , definisanog izrazom: γb = 2γsg . cosθ /2 (3.1.) pri čemu su γsg i γb površinska energija i energija granice zrna. Kraj finalne faze sinterovanja karakteriše eliminacija zatvorenih pora i približavanje teorijskoj gustini sinterovanog keramičkog materijala. Kada se govori o konvencionalnom sinterovanju obično se postavljaju dva pitanja: zašto dolazi do sinterovanja, tj. koja je vučna (pogonska) sila sinterovanja i kako se proces sinterovanja odvija, tj. koji su mehanizmi sinterovanja. Pogonska sila za sinterovanje keramičkih materijala je smanjenje slobodne energije sistema usled zamene medjufazne granice čvrsto/gas, koja poseduje veću energiju, meñufaznom granicom čvrsto/čvrsto, koja poseduje manju energiju. Te promene mogu biti praćene samo promenom oblika pora bez skupljanja, a samim tim i bez densifikacije ili promenom oblika i veličina pora uz pojavu skupljanja, što odgovara promeni zapremine pora, a samim tim i povećanju gustine. Vučna sila za densifikaciju poroznog tela je smanjenje Gibsove energije sistema. Eliminisanjem površine čvrsto/gas dolazi do smanjenja zapremine pora, Vp, a tako i celokupne zapremine uzorka, V, usled skupljanja poroznog tela. Promena Gibsove energije je data izrazom: dG = γsg . dAsg + γb . dAb (3.2.) gde su γsg i γb površinska energija i energija granice zrna, a dAsg i dAb su odgovarajuće promene površine i površine granice zrna. Transport atoma ili jona je prouzrokovan razlikom hemijskih potencijala izmedju mesta njihove početne i krajnje destinacije. Ta razlika nije ista za sve atome, tj. jone u posmatranom materijalu, pa se razmatra njena srednja vrednost i definiše kao potencijal sinterovanja, ∆µ. Medjutim, u literaturi se češće sreće termin napon sinterovanja, Σ, koji je definisan tako da ima isti uticaj na denzifikaciju materijala kao i jedan 31 primenjeni, spoljašnji hidrostatički napon istog intenziteta i istog znaka. Napon sinterovanja se može predstaviti izrazom: Σ = dG/dV = γsg (δAsg/δV) + γb(δAb / δV) (3.3.) gde je dV promena zapremine pora (pri konstantaoj zapremini zrna). Slično tome se i potencijal sinterovanja, ∆µ , može izraziti preko: ∆µ = ( γsg . dAsg + γb . dAb )/ dξ (3.4.) gde ξ predstavlja broj atoma/jona koji je tokom procesa transportovan. Ako se jedan atom/jon transportuje sa granice zrna do površine pore, tada se pora skuplja pošto taj atom/jon sada praktično okupira deo pore, a okolna struktura se pomera prema centru pore zahvaljujući uklonjenom atomu. Prema Cocks-u, ako se zanemari doprinos energije granice zrna, uz usvajanje da su pore sferičnog oblika, rešenje izraza 3.3. ima oblik Σ = 2γsg / r (3.5.) gde je r poluprečnik pore. Vidi se da je za keramička tela sa manjim porama (malo r), vučna sila za densifikaciju veća. To daje obrazloženje zašto su u pogledu sinterovanja poželjnija polazna keramička tela dobijena od neaglomerisanih prahova sa manjim česticama. Pošto je veličina pore odredjena veličinom čestica izmedju kojih se ona formira, jasno je da keramičko telo formirano od manjih čestica sadrži manje pore, usled čega je vučna sila za densifikaciju veća. Glavni problem, koji treba razumeti u teoriji i praksi sinterovanja, je uklanjanje pora tokom procesa. Mnogi eksperimantalni rezultati su pokazali da je spora denzifikuja karakteristična za keramička tela koja sadrže velike pore, i da se pri sinterovanju (bez primene pritiska) manje pore eliminišu na nižim temperaturama nego veće. Ovu pojavu je objasnio Kingery, koji je rekao da ako je granica izmedju pore i zrna konkavna (posmatrano iz pore), doći će do migracije granice prema pori, tj. pora će se skupljati i finalno nestati. Nasuprot tome, ako je meñufazna granica pora/zrna konveksna, njeno pomeranje će teći prema zrnu, tako da će pora da raste (slično kao i kod rasta zrna). Da li će pora biti konkavna ili koveksna zavisi od veličine pore, veličine okolnih zrna i diedarskog ugla. Prelazno stanje izmeñu ta dva slučaja, tj. konkavne pore koja se skuplja i konveksne pore koja raste, okarakterisano ravnom granicom, se definiše kao kritičan odnos veličine pore prema veličini zrna. Prema tome, pora se skuplja ne zato što je mala, već zato što je odnos veličine te pore prema veličini okolnih zrna manji od definisanog kritičnog odnosa. Pokazano je da se za datu mikrostrukturu odredjenog keramičkog materijala može odrediti kritična veličina pore, ako se zna srednja veličina zrna i diedarski ugao. Na osnovu prikazanog razmatranja se može zaključiti da je temperatura konvencionalnog sinterovanja (bez primene pritiska) keramičkog tela prilagoñena najvećim 32 porama prisutnim u materijalu. Do potpunog eliminisanja pora će doći kada temperatura sinterovanja bude dovoljno visoka da obezbedi porast veličine zrna do tog nivoa, da rastuća vrednost kritične veličine pore dostigne veličinu najvećih pora u materijalu. To znači da tek kada se obezbede uslovi da su veličine svih pora u kompaktu manje od kritične veličine pore, može doći do potpune denzifikacije keramičkog tela. Izneto razmatranje objašnjava i lošu sinterabilnost oblikovanih tela dobijenih iz aglomerisanih prahova, jer su interaglomeratne pore te koje uzrokuju znatno povećanje temperature sinterovanja. Iako je pogonska sila sinterovanja ista za sve sisteme, mehanizmi kojima se postiže krajnje stanje sistema su različiti [161]. Neki od mehanizama transporta materije koji se javljaju tokom procesa sinterovanja su: isparavanje – kondenzacija, viskozni tok, površinska difuzija, difuzija duž granice zrna, zapreminska difuzija i plastične deformacije. Od navedenih mehanizama, difuzija i viskozni tok su od najvećeg značaja u keramičkim sistemima. Mehanizmom isparavanje – kondenzacija, prenos mase se ostvaruje usled razlike napona pare čvrste faze u različitim delovima sistema. Izmeñu dve čestice koje sinteruju (slika 3.4.), obrazuje se kontakt, tzv. vrat, koji ima konkavnu površinu, dok čestice koje sinteruju imaju konveksnu površinu. Zahvaljujući većem naponu pare čvrste faze na konveksnoj površini, a smanjenom naponu pare na konkavnoj površini vrata, materija isparava sa konveksne površine, prenosi se kroz gasnu fazu i kondenzuje na konkavnoj površini vrata, usled čega se povećava kontakt izmeñu čestica (mehanizam 6 na slici 3.4.). Ovaj mehanizam ne dovodi do promene rastojanja centara čestica, tj. ne doprinosi skupljanju sistema. Za mehanička svojstva materijala, pored smanjenja poroznosti, važno je i povećanje stepen ostvarenog kontakta, što se ovim mehanizmom postiže. Da bi ovaj mehanizam došao do izražaja, potrebno je da temperatura bude dosta visoka, da bi napon pare bio dovoljno izražen. Iz toga razloga ovaj mehanizam nema previše veliki značaj za oblast keramike, ali figuriše kao mehanizam u odreñenoj fazi sinterovanja. Difuzija materije u čvrstom stanju omogućava transport materije zahvaljujući razlici koncentracije vakancija na konveksnoj i konkavnoj površini. Ova razlika je rezultat pojava na krivim graničnim površinama, usled čega je koncentracija vakancija na konkavnoj površini veća nego na ravnoj površini, a na konveksnoj je manja. Prilikom sinterovanja dve sferne čestice izmeñu kojih se formira vrat koji ima konkavnu površinu, dolazi do kretanja vakancija iz oblasti vrata prema površini čestica, što odgovara difuziji materije u suprotnom smeru, odnosno sa površine čestica u oblast vrata. Pri tome materija može biti transportovana površinskom difuzijom, ali i zapreminskom difuzijom, što znači da materija sa površine difunduje po površini i kroz zapreminu zrna do vrata. Ovi mehanizmi difuzije su na slici 3.4. označeni redom sa 1 i 3. Površinska difuzija ne doprinosi skupljanju proizvoda, već samo povećanju stepena ostvarenog kontakta čestica. 33 Slika 3.4. Mehanizmi sinterovanja Koncentracija vakancija na granici dva zrna koja sinteruju je manja od koncentracije u vratu, jer se na granici zrna javlja naprezanje, tzv. kontaktni pritisak. Iz tog razloga dolazi do difuzije vakancija iz vrata u granicu zrna, odnosno difuzije materije iz granice zrna u vrat. Pri tome, difuzija može biti duž granice zrna (mehanizam 2 na slici 3.4.) ili iz granice zrna kroz zapreminu zrna do vrata (mehanizam 4 na slici 3.4.). Difuzija materije iz granice zrna u površinu vrata obezbeñuje približavanje čestica što proizvodi makroskopski efekat skupljanja materijala koji sinteruje. Ovi mehanizmi dovode istovremeno do promene oblika i veličine pora, odnosno do smanjenja ukupne poroznosti. Ukoliko u materijalu koji sinteruje postoje dislokacije, doći će do difuzije materije iz dislokacije u površinu vrata, odnosno šupljina iz vrata u dislokaciju. Ovaj mehanizam (oznaka 5 na slici 3.4.) takoñe doprinosi skupljanju proizvoda, jer se materija iz zapremine čestice premešta u vrat, ali je doprinos ovog mehanizma ukupnom skupljanju vrlo mali, zbog toga što se dislokacije u keramičkim materijalima ne javljaju u značajnoj meri. Veličina zrna sinterovanih biokeramičkih materijala u velikoj meri odreñuje njegova svojstva, a do rasta zrna dolazi u najvećoj meri u finalnoj fazi sinterovanja. Tokom ovog stadijuma sinterovanja prosečna veličina zrna se povećava na taj način što veća zrna rastu na račun manjih. Mogućnost razumevanja i kontrolisanja ovog procesa važno je iz dva razloga. Prvi je činjenica da veličina zrna utiče na mehanička, električna, magnetna, optička i druga svojstva keramičkih materijala, a takoñe i na bioaktivnost i biokompatibilnost biokeramičkih materijala. Drugi razlog vezan je za sprečavanje pojave tzv. diskontinualnog rasta zrna. Povećanje srednje veličine zrna tokom zagrevanja finozrnog materijala može da se odvija procesom normalnog i abnormalnog rasta zrna (slika 3.5.). Pri normalnom rastu veličina svih zrna raste ujednačeno a finalni proizvod je uniformna mikrostruktura. Drugi slučaj je abnormalni rasti zrna (slika 3.5.) kod koga nekoliko većih zrna raste i troši matricu koju čine okolna manja zrna, što izaziva neuniformnost kako u pogledu mikrostrukture, tako i u pogledu svojstava sinterovanog materijala. Abnormalan rast zrna može da dovede i do odvajanja pora 34 od granice zrna i njihovog uvlačenja unutar samih zrna, čime se limitira krajnja gustina, jer se tako nastale pore daljom termičkom obradom teško mogu ukloniti iz sistema. Slika 3.5. Proces normalnog i abnormalnog rasta zrna Prilikom normalnog rasta zrna dolazi do povećanja prosečne veličine zrna, a time se smanjuje broja zrna u sistemu. Pogonska sila za taj proces je razlika u energiji koju poseduje finozrno polazno keramičko telo i krupnozrni finalni produkt, što je posledica smanjenja ukupne površine granice zrna, samim tim i ukupne energije granice zrna. Dobro poznat model normalnog rasta zrna, dali su strane Burke i Turnbull. Njihovo modelovanje uključuje pomeranje granice usled transporta atoma preko granice pod dejstvom pritiska, kao posledica zakrivljenosti površine granice zrna. Razmatranjem sila, koje nastaju usled površinske zakrivljenosti na jednom izolovanom delu granice zrna, autori su zaključili da granica zrna teži da se pomera prema centru zakrivljenosti pošto to smanjuje ukupnu površinu granice, a tako i ukupnu energiju sistema. Posmatrano u dvodimenzionalnoj projekciji, energetski najpovoljniji slučaj je kada se granice zrna seku pod uglom od 120°. U dvodimenzionalnom preseku ovaj uslov je ispunjen samo ukoliko su zrna heksagonalnog oblika. Ukoliko zrna imaju manji broj strana od šest ona će biti konveksna, a ukoliko je broj strana veći od šest, zrna će biti konkavna. S obzirom da se granica zrna pomera prema centru svoje zakrivljenosti, zrna sa manje od šest stranica teže da se smanjuju, a zrna sa više od šest stranica teže da rastu, kao što je prikazano na slici 3.6. 35 Slika 3.6. Ravnotežni oblik zrna i pravac pomeranja granice zrna Osnovni ciljevi sinterovanja su povećanje gustine i minimalizovanje zaostale poroznosti materijala. Ali često da bi se dobio materijal sa optimalnim svojstvima za pojedine namene, neophodno je obezbediti i dobijanje mikrostrukture sa finim (malim) zrnima i uskom raspodelom veličina zrna. Medjutim, kao što se pokazalo, denzifikacija i rast zrna teku paralelno, pri čemu je rast zrna veoma izrazit baš u finalnoj fazi sinterovanja, kada i veoma mala povećanja gustine dovode do velikog porasta veličine zrna. Pravila koja važe pri sinterovanju materijala sa submikronskim i mikronskim veličinama zrna, često ne mogu da se primene prilikom procesiranja nanostrukturnih keramičkih materijala. Iz svih ranije navedenih razloga je od velikog značaja mogućnost kontrole rasta zrna, a postiže se na više načina: skraćivanjem vremena i snižavanjem temperature sinterovanja, primenom pritiska tokom procesa sinterovanja, korišćenjem mikrotalasa, primenom spark plazma tehnike, ali će o svemu ovome biti više reči kasnije. 3.3. Dobijanje i svojstva sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata Sinterovanje kalcijum-hidroksiapatita konvencionalnim tehnikama obično se odvija na temperaturama izmeñu 1000ºC i 1500ºC, a HAP kao stabilna faza može da nastane na temperaturama do 1360ºC. Zahvaljujući svojoj krtoj prirodi i relativno lošoj sinterabilnosti kalcijum-hidroksiapatita, biokeramika na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata ima niske vrednosti žilavosti i tvrdoće, posebno u fiziološkim uslovima, što u mnogome ograničava njenu primenu u slučajevima gde su visoke vrednosti navedenih mehaničkih parametara neophodne. Dobijanje gustih nanostrukturnih formi vrši se u cilju poboljšanja mehaničkih karakteristika kermičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum- 36 fosfata. Mehanička svojstva gustih sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita u velikoj meri zavise od karakteristika polaznih prahova HAP, pri čemu se prvenstveno misli na veličinu čestica, prisustvo i oblik aglomerata, specifičnu površinu, jonsku supstituciju, stehiometriju, stepen kristaličnosti itd. Veliki broj eksperimenata je poslednjih godina izveden da bi se definisali optimalni parametri sinterovanja kalcijum-hidroksiapatita, u cilju dobijana pogodnih oblika, optimalnih svojstava za ugradnju u ljudski organizam. Nanočestični prahovi su zbog svoje velike površinske energije metastabilni i skloni aglomerisanju. Veliki problem pri sinterovanju nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita predstavlja eliminacija intraaglomeratnih pora, koje su često uzročnik loše sinterabilnosti. Najčešće korišćena metoda za dobijanje gustih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata je sinterovanje kompakata ispresovanih na visokim pritiscima, konvencionalnim postupkom. Visokotemperaturni postupci za dobijanje HAP dovode do formiranja HAP veće kristaliničnosti, sa veličinom zrna i do nekoliko desetina mikrona, koji pokazuje minimum resorpcije tokom aktivnosti osteoklasta, pri čemu mogu ostati na mestu implantacije godinama, pa čak i decenijama. Dugotrajano prisustvo neresorbovanog keramičkog materijala može ići na štetu odvijanja procesa remodelovanja koštanog tkiva [162]. Ova svojstva mogu biti poželjna za odreñene primene, ali mogu imati nedostatke u nekim drugim slučajevima, npr. kod mlañih pacijenata ili dece u razvoju gde su resorbilni implanti poželjni, jer je poželjno da implantirani materijal vremenom počne da prelazi u koštano tkivo. Ostale korišćene tehnike sinterovanja HAP su: mikrotalasno sinterovanje, sinterovanje uz pomoć pritiska, kao što su toplo presovanje, spark plazma sinterovanje i toplo izostatsko presovanje. Primena novih tehnika sinterovanja ima za cilj dobijanje potpuno gustih nanostrukturnih materijala, sa što je moguće manjom prosečnom veličinom zrna. Gusta struktura i veličina zrna u velikoj meri odreñuju mehaničke i biološke karakteristike dobijenih sinterovanih materijala [2, 144, 161, 163]. Čist HAP ima maseni odnos Ca/P od 2,151, odnosno molarni odnos 1,67. Kod gustih sinterovanih formi HAP, ovaj odnos varira u zavisnosti od učešća α- i β-TCP faze u finalnom proizvodu. Povećanjem temperature sinterovanja intezivira se fazna transformacija HAP u α- i β- TCP. Uticaj nastajanja TCP faza pri sinterovanju HAP može da se posmatra sa više aspekata. Generalno, nastajanje TCP-a ima negativan uticaj na sam proces sinterovanja kalcijum- hidroksiapatita, ali i TCP faza kao i HAP ima odličnu biokompatibilnost. Formiranje TCP faze tokom sinterovanja negativno utiče na mehaničke karakteristike, pre svega na tvrdoću i žilavost dobijene biokeramike, uprkos većoj teorijskoj vrednosti koeficijenta žilavosti (Kic (HAP) = 0,6 – 1,0 MPa m1/2, Kic (TCP) = 1,3 MPa m1/2) [35]. Kao što je u prethodnim poglavljima navedeno, prvi pokušaji sinterovanja sintetičkog hidroksiapatita beleže se 1970-tih godina. Od tada do danas veliki broj naučnih timova se bavio ovom problematikom, proučavajući uticaj različitih parametara na sam proces 37 sinterovanja kao i na mehaničke i biološke karakteristike sinterovanih kompakata. Ispitivanja uticaja osobina polaznih prahova kao sto su: kristaličnost, stepen aglomerisanosti, stehiometrija, jonska supstitucija, kao uslova procesiranja (p, T, t, atmosfera u kojoj se sinterovanje odvija...), vršena su u cilju dobijanja gustih struktura kalcijum-hidroksiapatita sa što boljim karakteristikama, kako u morfološkom i mehaničkom, tako i u biološkom smislu [68, 164-167]. Uticaj stepena kristaličnosti prahova HAP na denzifikaciju proučavala je Landi sa saradnicima. Sintetisanjem kalcijum-hidroksiapatita modifikovanom precipitacionom metodom na različitim temperaturama, oni su varirali stepen kristaličnosti dobijenih prahova, a zatim dilatometrijskim merenjima u temperaturnom intervalu od 750-1250 °C ispitivali sinterabilnost istih. Analizom mikrostrukture sinterovanih kompakata i dilatometrijskih merenja izveden je zaključak da nizak stepen kristaličnosti prahova HAP pozitivno utiče na proces denzifikacije, što objašnjavaju simultanim dejstvom većeg broja fenomena koji prate proces sinterovanja. Sinterovanjem polaznih kompakata na temperaturama od 1000-1215 °C, dobijeni su uzorci sa značajnim udelom pora, koji opada sa porastom temperature sinterovanja, ali je praćen sa druge strane značajnim rastom zrna [68]. Ispitujući uticaj temperature sinterovanja u intervalu od 1000-1450 °C na mikrostrukturu i mehaničke karakteristike stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita, Ramesh je dobio monofazni kalcijum-hidroksiapatitni materijal na temperaturama do 1400 °C, dok iznad 1400 °C došlo do delimične transformacije HAP u α-TCP. Ustanovljeno je da je optimalna temperatura sinterovanja 1250°C, na kojoj je dobijena gusta uniformna mikrostruktura sa prosečnom veličinom zrna od 2 µm. Uzorci dobijeni na temperaturama nižim od 1250°C su bili porozni. Sa povećanjem temperature iznad 1250°C zrna su rasla a gustina opadala, što je pripisano početku dekompozicije HAP. Najveća vrednost tvrdoće, 6,08 GPa, izmerena je kod uzorka sinterovanog na 1250°C tokom 2 h [168]. Gibson je sa saradnicima proučavao strukturne promene tokom sinterovanja usled fazne transformacije kalcijum deficitarnog hydroksiapatita u β-TCP [169]. Sinterovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita sa odnosom Ca/P od 1,50 na temperaturama 500-1100 °C oni su ustanovili XRD i FTIR analizom da ova fazna transformacija počinje da se odvija u intervalu temperatura 710-740 °C. Bonfield i saradnici su ispitivali uticaj vremena i temperature sinterovanja na svojstva sinterovanih kompakata, dobijenih sinterovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita u različitim atmosferama. Kod plaznih prahova variran je procenat supstituisanih karbonatnih jona u intervalu od 3,2 do 7,8 %. Polazni kompakati su sinterovani u atmosferi suvog CO2 i CO2 sa 3 % vodene pare, u temperaturnom intervalu od 700-1300 °C. Sinterovanjem na 1000 °C tokom 24 h, u atmosferi CO2 sa 3 % vodene pare postignute su gustine bliske teorijskim. Ustanovljeno je da se oko 70 % karbonatnih jona redukuje tokom sinterovanja u struji vlažnog CO2. Sinterovanjem u struji vlažnog CO2 dobijena je translucentna biokeramika, dok se keramika dobijena sinterovanjem u struji suvog CO2 odlikuje belom bojom i znatno većim 38 zrnom. Ovu pojavu objašnjavaju nepotpunim procesom densifikacije u atmosferi suvog CO2, što je posledica manje izraženog redukcionog svojstva CO2 bez prisustva vodene pare [165]. Polazeći od dva praha HAP istog hemijskog sastava, od kojih je jedan dobijen direktnom precipitacionom metodom, a drugi spray-dry metodom, Patel je ispitivao uticaj temperature kalcinacije u intervalu 400-1000 °C na svojstva HAP [170]. On je posmatrajući karakteristike ova dva praha došao do zaključka da se spray-dry metodom dobijaju prahovi čije su čestice uže raspodele veličina i definisanijeg oblika, ali da su svojstva dobijene keramike polazeći od ovako dobijenih prahova vrlo slična. Kalcinacijom prahova HAP, kako autori tvrde, se u velikoj meri utiče na njihove karakteristike, pre svega na specifičnu površinu, što ima veliki uticaj na njihovu potencijalnu primenu u medicini u formi praha. Oni navode da promene u strukturi prahova HAP tokom kalcinacije nemaju veliki uticaj na svojstva keramičkih blokova ili granula dobijenih njihovim sinterovanjem. Ispitujući uticaj parametara sinteze prahova HAP na svojstva sinterovane biokeramike konvencionalnim postupkom, Thangamani je sa saradnicima dobio kompakte gustine oko 97 %, sa zrnima mikronskih veličina i pojavom abnormalnog rasta zrna na temperaturama preko 1200 °C [171]. Maksimalna vrednost žilavosti koju su izmerili bila je 0,88 MPa m1/2, kod uzorka sinterovanog na 1100 °C. Tvrdoća od 6,3 GPa izmerena je kod uzorka dobijenog sinterovanjem na 1300 °C, a najveća vrednost pritisne čvrstoće keramičkih materijala dobijenih u ovom radu iznosi 60,3 MPa. Razmatrajući metode procesiranja, svojstva i potencijalne primene bifaznih HAP-β- TCP biokermičkih materijala, LeGeros sa saradnicima ističe da se ova vrsta biomaterijala najčešće dobija sinterovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita na temperaturama iznad 700 °C. Oni navode da se variranjem odnosa Ca/P, a samim tim i onosa HAP/β-TCP u keramičkom materijalu direktno utiče na njegove biološke karakteristike, a samim tim i na potencijalnu medicinsku primenu. Oni takoñe potenciraju da primena ovih materijala u medicini u velikoj meri zavisi od mehaničkih svojstava, na koje stvaranje β-TCP tokom sinterovanja utiče negativno. U kliničkoj praksi bifazna biokeramika se primenjuje u obliku granula, praha kao i u gustim formama prilagoñenim odreñenoj nameni [172]. Raynaud je sa timom ispitivao proces kalcinacije i sinterovanja kalcijum deficitarnog hidroksiapatita, kroz uticaj supstituisanog hidrogenfosfatnog jona na specifičnu površinu praha kao i na svojstva dobijene bifazne HAP-β-TCP sinterovane keramike. On navodi da odnos Ca/P u velikoj meri ima uticaj na sinterabilnost kalcijum deficitarnog hidroksiapatita, čije sinterovanje počinje na oko 700 °C, pri čemu na toj temperaturi počinje i fazna transformacija HAP u β-TCP. Oni ističu da veliki udeo nastalog β-TCP ima štetan uticaj na sinterabilnost bifazne biokeramike. Sinterovani kompakti dobijeni u ovom radu se odlikuju prisustvom pora, a veličina zrna raste sa smanjenjem odnosa Ca/P [173]. Ispitujući uticaj temperature i parcijalnog pritiska vodene pare na kinetiku površinske redukcije hidroksiapatita tokom kalcinacije, ista grupa autora u drugom radu zaključuje da vodena para ima katalitičko dejstvo na proces rasta zrna pri sinterovanju hidroksiapatita. 39 Analizirajući mehanizme koji potencijalno imaju uticaj na redukciju površine tokom sinterovanja HAP, oni zaključuju da je na temperaturama ispod 850 °C površinska difuzija dominantan mehanizam. Oni takoñe navode da adsorpsija i desorpcija vodene pare na površini čestica HAP kontroliše difuzione procese. Primećeno je da se na temperaturama manjim od 850 °C zrna povezuju bez značajnije densifikacije, dok su na višim temperaturama densifikacioni mehanizmi izraženiji [174]. Ispitujući uticaj dopiranja hidroksiapatita jonima silicijuma, Patel sa saradnicima zaključuje da supstitucija jonima silicujuma ima uticaj na inhibiranje rasta zrna pri konvencionalnom sinterovanju na 1200 °C [175]. Vrednosti gustine, tvrdoće i modula elastičnosti uzoraka čistog HAP i HAP dopiranog silicijumom bile su istog reda veličine. Kalcijum-hidroksiapatitna biokeramika je obično bele boje, ali ukoliko se odlikuje velikom gustinom i zrnom nano dimenzija implantni materijali na bazi kalcijum- hidroksiapatita mogu biti translucentni. Transparentnost gustih formi kalcijum-hidroksiapatita omogućuje primenu ovih materijala za gajenje specifičnih vrsta ćelijskih kultura i perkutano praćenje vaskularizacije. Barallet je sintetisao translucentnu keramiku na bazi HAP sinterovanjem u atmosferi CO2 na temperaturi od 1300 °C i pri atmosferskom pritisku. Maksimalnu transmitancu, 13 % na pločici debljine 2 mm, imao je uzorak sinterovan tokom 4 h na 1300 °C, sa prosečnom veličinom zrna od nekoliko mikrona. On zaključuje da atmosfera CO2 pospešuje rast zrna, ali i da utiče na eliminaciju pora što u velikoj meri utiče na translucentnost materijala [176]. Sung sa saradnicima je sinterujući nanočestične prahove kalcijum-hidroksiapatita dobijene precipitacionom metodom, sa različitim Ca/P odnosom, na 1000 °C dobio materijale guste mikrostrukture sa veličinom zrna od oko 100 nm. Sinterovanjem prahova HAP na 1000 °C, najmanji udeo β-TCP u sinterovanom materijalu dobijen je pri odnosu Ca/P od 1,70, dok pri odnosu od 1,75 dolazi do nastajanja CaO tokom procesa sinterovanja [177]. Varirajući koncentraciju reaktanata i temperaturu, Kothapalli je sintetisao prah hidroksiapatita modifikovanim precipitacionim metodama i došao do zaključka da su upravo ova dva parametra ključna za veličinu i oblik dobijenih čestica HAP. On je dobijene igličaste čestice HAP dužine 53–165 nm presovao na 150 MPa, a polazne kompakte sinterovao na 1200 °C tokom 1 h, sa ciljem da ispita uticaj gustine biokeramike na njenu pritisnu čvrstoću. Analizom dobijenih rezultata, definisana je pozitivna korelacija izmeñu gustine sinterovanih uzoraka i savojne čvrstoće dobijene biokeramike. Najveća vrednost savojne čvrstoće, 57.4 MPa izmerena je kod uzorka koji je imao najveću gustinu, (92 %), a koji je dobijen sinterovanjem praha HAP sintetisanog reakcijom na 70 °C pri koncentraciji reaktanata od 20 g/l [178]. Landi sa timom je ispitivala uticaj uslova sinteze HAP i parametara sinterovanja na karakteristike karbonatnog tipa kalcijum-hidroksiapatita. Prah sa udelom karbonatnih jona u strukturi od 5,8 % sinterovan je u intervalu temperatura 500-1400°C, u različitim atmosferama (vazduh, suv i vlažan CO2). Najsličnije karakteristike biološkom hidroksiapatitu imao je 40 uzorak sinterovan na 900 °C u atmosferi vlažnog ugljen-dioksida. Karbonatni hidroksiapatiti dobijeni u ovom radu su termički vrlo stabilni, a sekundarna faza u vidu CaO ili TCP se formira tek na temperaturama izmeñu 1300-1400 °C, u količini koja zavisi od atmosfere sinterovanja [179]. Mezahi je sa saradnicima ispitujući uticaj cerijumom sabilisanog praha ZrO2 na sinterovanje kalcijum-hidroksiapatita došao do zaključka da je 1 % dodatog ZrO2 optimalan, jer je sa povećanjem njegovog sadržaja u kompozitnom materijalu primećen intenzivniji prelazak HAP u TCP tokom sinterovanja, što negativno utiče na mehanička svojstva biokeramičkog proizvoda [180]. Polazeći od nanočestičnog HAP, Shi je presovanjem na ekstremno visokom pritisku od 2,5 GPa spustio temperaturu sinterovanja HAP na 700 °C. Ovako visok pritisak uticao je na to da dobijeni materijali budu crno obojeni [181]. Dobijeni uzorci su se odlikovali tvrdoćom od 5 GPa i žilavošću u intervalu od 0,5-1,0 MPa m1/2. Teorijski model denzifikacije i rasta zrna tokom konvencionalnog sinterovanja monofazne hidroksiapatitne keramike, u cilju proučavanja sinterabilnosti HAP koristili su He i saradnici. Polazni kompakti su sinterovani na temperaturama od 1100 °C do 1150 °C, pri čemu su u svim slučajevima uočene relativno porozne mikrostrukture, a eksperimentalno dobijene vrednosti su diskutovane i poreñene sa modelom. Oni zaključuju da difuzija duž granice zrna predstavlja dominantan mehanizam pri denzifikaciji hidroksiapatita. Rezultati proistekli iz eksperimenta vezani za rasta zrna kalcijum-hidroksiapatita tokom sinterovanja imaju dobro slaganje sa korišćenim teorijskim modelom. Oni su takoñe izračunali vrednosti energija aktivacije za denzifikaciju i rast zrna, koje imaju vrednosti 1150 i 1020 kJ/mol, respektivno, u okviru posmatranog temperaturnog opsega [182]. Ulogu simuliranog telesnog fluida prilikom sinteze karbonatnog hidroksiapatita proučavala je E. Landi. Na ovaj način dobijen je nanočestični prah, sa veličinom čestica od 20 nm. Sa ciljem da se dobije gusta biokeramika na bazi HAP, nanočestični prah osušen "spray- dried" metodom je izostatski presovan na pritiscima u intervalu od 100 do 350 MPa, i konvencionalno sinterovan u opsegu temperatura od 1250-1450 °C. Vrednosti savojnih čvrstoća kompakata dobijenih na ovaj način nalaze se u intervalu 65-80 MPa, u zavisnosti od vrste praha i temperature sinterovanja (ljudska kost ima vrednost od oko 90 MPa). Iznenañujuće visoke vrednosti pritisnih čvrstoća imale su skafoldne forme dobijene sinterovanjem na 1250 °C, korišćenjem praha dobijenog u medijumu STF. Vrednost pritisnih čvrstoća ovih materijala bila je oko 23 MPa [183]. Weinand je ispitujući mogućnost dobijanja kompozitnog materijala polazeći od HAP i titan-dioksida, pokazao da je tvrdoća uzoraka opadala sa povećanjem udela titan-dioksida u uzorku [184]. Vrednosti gustine i tvrdoće uzoraka su opadale sa povećanjem temperature sinterovanja sa 1000°C na 1200 °C. Kalcinacijom prirodnog koštanog tkiva, Oktar je sa saradnicima dobio prah kalcijum- hidroksiapatita, koji je sinterovanjem u opsegu temperatura 1000°C-1400 °C preveden u 41 biokeramički materijal [185]. Najveću vrednost tvrdoće su izmerili na uzorku sinterovanom na 1400 °C, dok je maksimalna čvrstoća izmerena na uzorku sinterovanom na 1200 °C, dok je sa daljim povećanjem temperature njena vrednost opadala. Uticaj temperature na mikrostrukturu, pritisnu čvrstoću i mikrotvrdoću materijala dobijenih konvencionalnim sinterovanjem kalcinisanog humanog koštanog tkiva, ispitivao je Oktar u svojim eksperimentima. Polazni kompakti praha dobijenog kalcinacijom humanog koštanog tkiva na 850 °C, sinterovani su u atmosferi vazduha na 1000, 1100, 1200 i 1300 °C tokom 4 h. Najveći stepen denzifikacije je uočen kod uzorka sinterovanog na temperaturama većim od 1200 °C. Dobijeni materijali se odlikuju relativno poroznim mikrostrukturama, ali i boljim mehaničkim karakteristikama od materijala dobijenih u prethodnim radovima sličnim postupkom. Izmerene vrednosti pritisne čvrstoće su okvirno 60 MPa, a mikrotvrdoće oko 0,25 GPa. Autor navodi da prisustvo fluora u malim količinama može da ima pozitivan uticaj na mehaničke karakteristike dobijenih materijala [186]. Nakon sintetisanja stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita precipitacionom metodom i sinterovanja u intervalu temperatura 1140-1340 °C, Prokopiev je ispitivao uticaj temperature sinterovanja na mikrostrukturu i mehaničke karakteristike sinterovanih hidroksiapatita. Zrna konvencionalno sinterovanih kompakata su bila mikronskih veličina, i nalazila su se u rasponu od 2,3 do 3,5 µm. Jungov modul elastičnosti i pritisna čvrstoća ovako dobijene hidroksiapatitne biokeramike se povećava sa povećanjem temperature sinterovanja, a vrednosti se nalaze u okviru intervala 16-73 GPa, odnosno 5-13,8 MPa, respektivno [187]. Uticaj morfoloških karakteristika nanočestica kalcijum-hidroksiapatita na proces denzifikacije pri konvencionalnom sinterovanju na 1250 °C ispitivao je Banerje sa saradnicima. Oni su pošli od igličastih i sferičnih nanočestičnih prahova kalcijum- hidroksiapatita, sa ciljem da konvencionalnim postupkom sinterovanja dobiju guste bikeramičke materijale optimalnih svojstava. Sa povećanjem udela igličastih čestica HAP, dobijene su poroznije mikrostrukture sinterovanih uzoraka. U zavisnosti od udela igličastih čestica u polaznom prahu, dobijeni materijali su imali različite vrednosti mehaničkih parametara, posebno mikrotvrdoće i žilavosti. Povećanje udela igličastih čestica izazvalo je pad mikrotvrdoće uzoraka sa 5,5 GPa na 3,4 GPa, dok je pritom vrednost koeficijenta žilavosti povećana sa 0,6 na 1,0 MPa m1/2. Ove vrednosti ukazuju na činjenicu da morfologija čestica polaznog praha ima veliki uticaj pre svega na proces denzifikacije, a potom i na mehaničke karakteristike dobijene keramike na bazi HAP [188]. Varirajući odnos Ca/P u polaznom prahu u intervalu od 1,60 do 1,65, Pattanayak je sa saradnicima proučavao stabilnost kalcijum-hidroksiapatitne faze u gustoj keramičkoj formi. Sintetisani prahovi kalcijum-hidroksiapatita su najpre mešani sa 5 % polivinil alkohola kao aditiva za presovanje, a zatim kompaktirani uniaksijalno na izuzetno visokim pritiscima u intervalu od 400 MPa do 1,2 GPa. Rendgenskom difrakcionom analizom konstatovana je stabilnost kalcijum-hidroksiapatitne faze do 600 °C, dok na višim temperaturama kalcijum deficitaran hidroksiapatit prelazi delimično u druge kalcijum-fosfate. Prahovi kompaktirani na 42 600 MPa i konvencionalno sinterovani na temperaturama od 900-1200 °C, odlikuju se gustinama od 2,11 do 2,95 g/cm3. Najveću vrednost savojne čvrstoće od 48,7 MPa imao je uzorak sinterovan na 1100 °C. Posmatrajući zavisnost gustine od primenjenog pritiska primećeno je da se gustina kompakata povećava sa povećanjem pritiska, dok se gustina sinterovanih uzoraka povećava do pritiska od 800 MPa, za ostaje konstantna do pritiska od 1000 MPa, nakon čega sa daljim povećanjem pritiska opada [189]. Tan je sa saradnicima ispitujući uticaj pritiska na sinterabilnost HAP, presovanjem polaznih kompakata na 200 MPa izostatski, snizio temperature sinterovanja HAP sa 1250 °C na 1050 °C [190]. Materijali dobijeni sinterovanjem uzoraka prethodno izostatski presovanih na 200 MPa odlikovali su se većim vrednostima gustine, modula elastičnosti i tvrdoće u poreñenju sa uzorcima presovanim uniaksijalno na nižim pritiscima. Polazeći od aglomerisanih precipitaciono dobijenih prahova HAP sa Ca/P odnosom nešto manjim od teorijskog, Bianco je ispitujući fazu stabilnost HAP ustanovio da je HAP većinska stabilna faza tokom sinterovanja do 1300 °C, dok se neznatne količine TCP javljaju već oko 800 °C [191]. Nehomogenost mikrostrukture sintervanih uzoraka on objašnjava postojanjem tvrdih aglomerata u polaznom prahu. Konvencionalno sinterovanje biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita, polazeći od HAP dobijenog korišćenjem prirodnih resursa, proučavao je Balazi sa saradnicima. Kalcinisanjem ljuski od jaja na 900 °C, prethodno grubo očišćenih od primesa, dobijen je prah koji je potom mešan sa fosfornom kiselinom, varirajući odnos Ca/P i vreme mlevenja smeše. Veće specifične površine imali su prahovi dobijeni pri manjem odnosu Ca/P i dužim vremenom mlevenja (24 h). Nakon toga kompaktirani prah je sinterovan na temperaturama od 900-1100 °C tokom 2 h. Monofazna hidroksiapatitna keramika je dobijena konvencionalnim sinterovanjem prahova dobijenih pri većem odnosu Ca/P u polaznoj smeši i pri kraćem vremenu mlevenja na temperaturi od 1000 °C [192]. Mogućnost dobijanja biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita sa orjentisanim zrnima, koristeći magnetno polje tokom procesiranja, proučavao je Chen sa timom. U njihovim istraživanjima polazni kompakti su konvencionalno sinterovani na 1200 °C tokom 2 h, u prisustvu magnetnog polja. Navedenim postupkom dobijena je gusta biokeramika sa orijentisanim zrnima u pravcu ose koja je paralelna dejstvu magnetnog polja. Oni navode da se ovim postupkom uz menjanje pravca dejstva magnetnog polja može uticati na preferentnu orjentaciju kristala u strukturi biokeramike na bazi HAP [193]. Koristeći bakterije roda Serratia, Ledo je sa saradnicima sintetisao kalcijum deficitaran hidroksiapatit sa veličinom kristalita oko 50 nm [194]. Analizom uzoraka dobijenih sinterovanjem ovako dobijenog HAP na 1200 °C se uočava izražena kristalna struktura i porast kristalita za okvirno 20 %. Fomin je sa saradnicima polazeći od nanokristalnog HAP, prosečne veličine kristalita od 20 nm, sinterivanjem na 640 °C ispresaka dobijenih presovanjem na 3,5 GPa, dobio kompakte koji se odlikuju prosečnom veličinom zrna od oko 50 nm [195, 196]. Sinterovanje 43 istih polaznih kompakata na 750 °C rezultiralo je kompaktima tvrdoće od 5,7 GPa, dok je dalje povećanje temperature sinterovanja uticalo na smanjenje tvrdoće uzoraka. Ispitujući mogućnost poboljšanja mehaničkih svojstava HAP dodavanjem različitih udela itrijum stabilisanog praha cirkonijum-dioksida, Nayak je sinterovanjem kalcinisanih kompakata na 1250 °C dobio relativno guste kompakte sa evidentnim prisustvom HAP, TCP, ZrO2 i CaZrO3 [197]. Najveće vrednosti pritisne i savojne čvrstoće dobijene su pri udelu cirkonijum-dioksida od 2 %, dok se sa povećanjem udela ZrO2 u polaznom uzorku čvrstoća smanjivala. Kao razlog ovog smanjenja čvrstoće autori navode različite sinterabilnosti HAP i ZrO2, kao i prisustvo poroznosti. Wang je sinterujući nanočestični prah HAP konvencionalnom tehnikom tokom 24 h na 850 °C i tokom 2 h na 900 °C, dobio guste nanostrukturne materijale gustine preko 99 % i sa veličinom zrna ispod 100 nm [198]. Sa smanjenjem veličine zrna on je uočio pojavu povećanja tvrdoće i žilavosti materijala. Tvrdoća uzoraka HAP se kretala u okviru intervala 4,3-5,0 GPa, dok su vrednosti koeficijenta žilavosti bile u opsegu od 0,55 do 1,1 MPa m1/2. Ispitujući uticaj Ca/P odnosa na dielektrične karakteristike sinterovanih uzoraka HAP- , Quilitz je sa saradnicima došao do zaključka da dielektrična konstanta ima trend rasta sa povećanjem Ca/P odnosa [199]. Oni navode da razlozi ove zavisnosti nisu baš precizno definisasni, kao i da bi mogli biti u vezi sa mikrostrukturnim svojstvima materijala. Raksujarit je polazeći od prirodne kosti i polivinil alkohola ispitivao mogućnost dobijanja nanoporoznog materijala sinterovanjem polazne mešavine na 1200 °C [200]. Dobijeni materijali se karakterišu prosečnom veličinom pora od oko 100 nm i pritisnom čvrstoćom od 14,7 ± 3,2 MPa. Modifikujući precipitacionu metodu za dobijanje HAP dodavanjem limunske kiseline u polazni rastvor, Mitsionis je sa saradnicima zaključio da udeo limunske kiseline u rastvoru ima veliki uticaj na nukleaciju, kao i na svojstva kalcinisanisanog HAP, pre svega na vrednost specifične površine [201]. Kao što je već ranije rečeno, sinterovani biokeramički materijali na bazi HAP se osim u gustoj formi koriste i u vidu kontrolisano makro i mikro poroznih formi. Prisustvo pora u biokeramičkom materijalu pojačava mehanički kontakt izmeñu tkiva i implantiranog materijala [58]. Porozni biokeramički materijali su našli primenu u mnogim oblastima, izmeñu ostalog u ortopediji, stomatologiji, inženjerstvu tkiva, u sistemima za kontrolisano otpuštanje lekova itd [59, 60]. Generalno, ključ za dobijanje biomaterijala dobrih svojstava može biti upravo pažljiva kontrola poroznosti u funkciji dobrih mehaničkih svojstava. Dok makroporoznost ima veliki uticaj na osteokonduktivnost i kontroliše prilaz živog bioloških fluida i tkiva ugrañenom implantu, mikroporoznost ima uticaj na adhezivna svojstva materijala, delimično kontroliše brzinu resorpcije kalcijuma i fosfora, a može da utiče i na poboljšanje mehaničkih svojstava biokeramičkih materijala. Tacret [56] je sa saradnicima u svom radu pokušao da napravi model za predviñanje mehaničkih svojstava makro i mikroporozne bifazne HAP/β-TCP biokeramike, sa ciljem da 44 optimizuje odnos poroznosti i mehaničkih svojstava. Za formiranje makro pora kontolisanih dimenzija korišćene su naftalenske čestice prečnika 400 µm, dok su mikroporozni uzorci dobijeni presovanjem praha kalcijum-deficitarnog hidroksiapatita na 140 MPa i konvencionalnim sinterovanjem na temperaturama od 950-1100 °C. Kombinovanjem dva prilaza, u domenu dve merne skale za definisanje dimenzija pora, oni su modelom opisali uticaj oblika i veličina pora na mehaničke karakteristike, izmeñu ostalih na žilavost biokeramičkih materijala. Merenjem tvrdoće (10-80 MPa), žilavosti (0.4-0.9 MPam1/2), pritisne čvrstoće (5-20 MPa) i savojne čvrstoće (5-20 MPa) dobijeno je odlično slaganje modela i eksperimentalno utvrñenih vrednosti. Kontrolisano porozne materijale na bazi HAP dobio je Kawata sa saradnicima proučavajući mogućnost kontrolisanja pora u materijalu polazeći od kompozita sačinjenog od praha hidroksiapatita i ugljeničnih čestica, čija dimenzija upravo odreñuje veličinu i zastupljenost pora u materijalu [202]. Oni su polazili od kompakata presovanih na pritiscima u opsegu od 20-40 MPa koji su sinterovani na temperaturama od 1000-1300 °C, a dobijeni materijali su se karakterisali porama u opsegu od nekoliko mikrona do oko 150 mikrona. Novu modifikaciju hidrotermalne metode sinteze sa ciljem da dobije porozne materijale u sistemu HAP/TCP, na niskim temperaturama izučavao je Vani sa saradnicima [58]. Oni su dobili porozne uzorke sa veličinom pora od 20 nm, što po mnogim autorima omogućuje nesmetanu cirkulaciju telesnih fluida i poboljšava biokompatibilnost materijala. Bioaktivnost dobijenih biomaterijala dokazali su potapanjem uzoraka u simulirani telesni fluid, pri čemu je formiran novi sloj hidroksiapatita. Kontrolisano porozne granule na bazi hidroksiapatita i fluorhidroksiapatita polazeći od gelova i ulja kao disperionog medijuma dobio je Komlev sa saradnicima [203]. Dobijene granule nakon konvencijalnog postupka sinterovanja na 1200 °C tokom 2 h su se odlikovale prisustvom makro pora dimenzija od 50 do 200 mikrona, dok je na njihovoj površini uočena zastupljena otvorena mikroporoznost sa porama dimenzija nekoliko mikrona. Na sličan način je sinterovanjem HAP i TCP Ribeiro dobio granule kontrolisane poroznosti, pri čemu je kao izazivač poroznosti korišćen natrijum-alginat [204]. Dijametri sfernih granula bile su 632 ± 40 µm sa otvorenim porama veličine 2 µm. Kontrolisanjem poroznosti i odnosa HAP/TCP u sinterovanom materijalu, Komlev i saradnici su uspeli da kontrolišu adsorpciju proteina, pri čemu su uočili da se sa povećanjem udela TCP povećava moć sorpcije proteina [205]. 45 3.4. Dobijanje i svojstva mikrotalasno sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata Sumirajući rezultate analize svojstava biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata dobijenih različitim modifikacijama konvencionalnog postupka sinterovanja, može se konstatovati da su u najvećem broju slučajeva materijali dobijeni na relativno visokim temperaturama imali zrna mikronskih veličina, često neuniformne i porozne mikrostrukture i relativno niske vrednosti mehaničkih parametara. Sinterovani materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata su često vrlo krti, što u velikom broju slučajeva ograničava njihovu primenu. Vrednosti koeficijenta žilavosti kod navedenih materijala, što je prikazano u prethodnom poglavlju i tabeli 2.3, retko imaju veću vrednost od 1 MPa m1/2. Generalno, značajna poboljšanja mehaničkih karakteristika biokeramičkih materijala, sa akcentom na žilavost, mogu da se ostvare kroz kontrolu mikrostrukturnih parametara i faznog sastava, pre svega veličine zrna i oblika i veličine pora [26, 27, 56, 59, 206]. Smanjenje veličine zrna sa mikro na nano nivo može da utiče na povećanje žilavosti biokeramičkih materijala na dva načina. Prvi se zasniva na povećanju broja granica zrna na koji pukotina nailazi pri prostiranju. Upravo ovo povećanje broja granica zrna utiče na povećanje apsorpcije energije pukotine, tako da se njena dužina skraćuje, a žilavost materijala se shodno tome povećava. Drugi aspekt povećanja žilavosti materijala sa smanjenjem veličine zrna zasniva se na promeni mehanizma prostiranja pukotine kroz keramički materijal. Naime, mehanizam prostiranja pukotine kod mikrostrukturnih keramičkih materijala je obično transgranularan, tj. pukotina se prostire duž zrna, kao što je shematski prikazano na slici 3.7a. Dovoljno velikim smanjenjem prosečne veličine zrna, mehanizam prostiranja pukotine se menja i postaje intergranularan, jer se pukotina kreće izmeñu finih zrna keramičkog materijala (Slika 3.7b). Pukotina na taj način gubi veliku količinu energije zaobilazeći zrna nano dimenzija, što za krajnji rezultat ima porast koeficijenta žilavosti [207-210]. 46 Slika 3. 7. Transgranularni i intergranularni mehanizam prostiranja pukotine Nanostrukturni gusti i kontrolisano porozni biokeramički materijali se, kao što je prikazano, najčešće dobijaju presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem, a kao tehnike za njihovo dobijanje se često koriste i toplo presovanje, toplo izostatsko presovanje, spark plazma sinterovanje itd. Sinterovanje na visokim temperaturama tokom dugih vremenskih perioda može da dovede do nastanka krupnozrne strukture, a ponekad i do nekontrolisanog rasta pojedinih zrna na račun manjih. Takoñe mana visokotemperaturnih procesa pri procesiranju biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata je sklonost HAP ka dekompoziciji na visokim temperaturama. Sve navedeno ukazivalo je na potrebu da se procesiranje biokeramičkih materijala izvodi na što je moguće nižim temperaturama i tokom što je moguće kraćih vremenskih intervala [211-213]. 47 Sa ciljem da se prevaziñu svi navedeni problemi tokom sinterovanja keramičkih materijala, nastala je tehnika sinterovanja uz pomoć mikrotalasa, komercijalno nazvana mikrotalasno sinterovanje [214]. Ova tehnika ima ogromane prednosti, od kojih su neke: izvanredna mogućnost kontrole mikrostrukturnih parametara, odsustvo limita po pitanju oblika i veličine sinterovanih uzoraka (što ovoj tehnici donosi prednost u odnosu na ostale pri izradi materijala vrlo preciznih dimenzija koji imaju primenu u maksiofacijalnoj hirurgiji), poboljšanje mehaničkih parametara biokeramike, itd. Velika prednost ove tehnike u odnosu na ostale je i ekonomski faktor koji proističe iz uštede energije usled sinterovanja na 200-300 °C nižim temperaturama i tokom višestruko kraćih vremenskih intervala. Tokom protekle decenije, veliki broj istraživačkih timova je koristio mikrotalasno sinterovanje sa ciljem da unaprede svojstva biokeramičkih materijala. Rad baziran na mikrotalasnom sinterovanju kalcijum-hidroksiapatita prvi je objavio Fanga sa saradnicima 1994. godine [215, 216]. Mikrotalasno sinterovanje je vrlo brz proces, fundamentalno različit od konvencionalnog sinterovanja, te se stoga ni jedan zaključak vezan za kinetičke parametre dobijene pri konvencionalnom sinterovanju HAP ne može primeniti na ovu vrstu sinterovanja. Osnovna razlika ova dva tipa sinterovanja je način predavanja energije materijalu koji se sinteruje, koji je u slučaju konvencionalnog sinterovanja baziran na kondukciji od površine materijala ka središtu, dok se u slučaju mikrotalasnog sinterovanja energija prenosi ravnomerno kroz čitavu zapreminu uzorka uz odsustvo temperaturnog gradijenta [217, 218]. Upravo na ovoj karakteristici se bazira prednost mikrotalasnog sinterovanja pri procesiranju biokeramičkih materijala, koji su obično loši provodnici toplote. Zbog odsustva temperaturnog gradijenta tokom sinterovanja, prilikom mikrotalasnog sinterovanja brzina zagrevanja igra mnogo manju ulogu u poreñenju sa konvencionalnim postupkom. Na osnovu navedenih činjenica sledi da se procesom mikrotalasnog sinterovanja mogu dobiti materijali uniformnije mikrostrukture, proces može da se odvija pri većim inicijalnim brzinama zagrevanja, a s obzirom na niže temperature sinterovanja i pojava fazne transformacije je manje verovatna. Fang je sa saradnicima u jednoj od prvih studija objavljenih iz oblasti mikrotalasnog sinterovanja, polazeći od hidrotermalno sintetisanih deaglomerisanih prahova HAP, sinterovanjem tokom 5 min na 1150 °C dobio uzorke koji su imali gustinu blisku teorijskoj i prosečnom veličinom zrna od 200 nm [219]. On navodi kao veliku prednost procesa mikrotalasnog sinterovanja ukupno vreme procesiranja biokeramike na bazi HAP od 20 min, dok je isti prah konvencionalno sinterovan tokom 4 h. Dobijeni materijali su se odlikovali translucentnošću, što autori pripisuju osobinama polaznog praha, od kojih ističu čistoću, termičku stabilnost sintetisanog praha HAP, strukturu primarnih čestica itd. Mikrotalasnim sinterovanjem precipitaciono sintetisanih nanočestičnih prahova hidroksiapatita tokom 5-10 min na 1100 °C, Yang je dobio znatno gušće kompakte od konvencionalno sinterovanh uzoraka na istoj temperaturi tokom 1 h [220]. Mikrotalasno sinterovani biokeramički kompakti su imali oko deset puta manju vrednost prosečne veličine 48 zrna od konvencionalno sinterovanih materijala. Poredeći reakciju osteoblastnih ćelija sa površinama ove dve vrste biokeramičkih materijala na čijoj su površini uočljive pore mikronskih dimenzija, sa zrnima veličine 3-5 µm i 0,3-0,5 µm, nije uočena bitna razlika. Koristeći tehniku mikrotalasnog sinterovanja, Katakam je uspeo da dobije funkcionalno gradijentne materijale na bazi HAP, TCP i Ag [221]. On navodi da je upravo tehnika sinterovanja potpomognuta mikrotalasima optimalna za dobijanje materijala ovog tipa zbog mogućnosti kontrolisanja faznog sastava materijala usled kratkog vremena zadržavanja na temperaturi sinterovanja. Mikrotalasnim sinterovanjem nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita, Varma je tokom 5 min dobio uzorke koji su imali gustinu približno 95 %, dok je prosečna veličina zrna je bila izmeñu 200-300 nm. Izmerena vrednost mikrotvrdoće bila je 5,62 GPa. Produženjem vremena sinterovanja na 15 min, zrno je poraslo iznad 500 nm, a mikrotvrdoća je neznatno povećana usled porasta gustine materijala [214]. Wang je polazeći od kompakata sačinjenih od nanočestičnog HAP i H2O2, tehnikom mikrotalasnog sinterovanja tokom 5 min dobio kontrolisano porozne materijale, koji su imali vrednost pritisne čvrstoće od 10 MPa [222]. U poreñenju sa konvencionalno sinterovanim uzorcima, dobijene su mnogo uniformnije mikrostrukture i deset puta manja prosečna veličina zrna. Ista grupa autora je polazeći od kalcijum-deficitarnog hidroksiapatita mikrotalasnim sinterovanjem dobila porozni materijal na bazi HAP i TCP, sa poroznošću od 65 %, prosečnom veličinom zrna od 300 nm i pritisnom čvrstoćom od 6,4 MPa [223]. Najbolje mehaničke karakteristike je imao uzorak sinterovan tokom 5 min, dok je produženje vremena zadržavanja na temperaturi sinterovanja izazvalo pogoršanje mehaničkih svojstava. Mikrotalasnim sinterovanjem stehiometrijskih nanočestičnih prahova HAP na temperturama od 1000 °C do 1300 °C tokom 30 min, Ramesh je sa saradnicima proučavao uticaj parametara procesiranja na svojstva dobijenih monofaznih materijala [224, 225]. Vrednosti gustina materijala su rasle od 90 % nakon sinterovanja na 1000 °C do 99 % nakon sinterovanja na 1300 °C. Najveću vrednost tvrdoće od 6,4 GPa dobio je nakon sinterovanja na 1150 °C, dok je najveću žilavost od 1,45 MPa m1/2 imao materijal sinterovan na 1050 °C. Povećanjem temperature iznad navedenih optimuma došlo je do smanjivanja vrednosti mehaničkih parametara usled efekta veličine zrna. Poredeći module elastičnosti materijala dobijenih tehnikom mikrotalasnog sinterovanja tokom 10 min na 1200 °C sa konvencionalno sinterovanim uzorcima dobijenim na istoj tempertauri tokom 2 h, Oliveira i saradnici ustanovili su da su vrednosti slične, i iznose približno 105 GPa [226]. Nakon što je dobio relativno gust biokeramički materijal tehnikom mikrotalasnog sinterovanja, sa prosečnom veličinom zrna od 300-400 nm, Seo je sa saradnicima ispitivao ponašanje materijala prilikom potapanja u destilovanu vodu sa pH vrednošću 7,4 [227]. Nakon 14 dana granice zrna su se delimično rastvorile, a mikroskopijom je pokazao da se velika mikronska zrna sastoje od manjih sub-zrna, koja su nanometarskih dimenzija. Gustu 49 polikristalnu keramiku na bazi HAP dobijenu mikrotalasnim sinterovanjem, ista grupa autora je ispitivala tako što je potapanjem u kiseli rastvor pH vrednosti 3 pratila promene na materijalu, ne bi li simulirali uslove razgradnje HAP od strane osteoklasta [228]. AFM analizom su ustanovili različito ponašanje pojedinih zrna, pri čemu su granice izmeñu zrna bile rastvorene. Sa produženjem vremena odležavanja materijala u rastvoru, hrapavost površine je postajala sve veća, a sub-zrna su bivala sve uočljivija. Autori naglašavaju da bi ovo mogao da bude dobar put ka definisanju mehanizama resorpcije ovog tipa biokeramičkih matreijala. Chanda je sa saradnicima proučavao sinterabilnost čistih i dopiranih prahova HAP i TCP u uslovima mikrotalasnog sinterovanja i ustanovio da je moguće dobiti odlične rezultate primenjujući navedenu tehniku sinterovanja u svim ispitivanim slučajevima. U svim slučajevima biokeramički prahovi su pokazali dobru denzifikaciju, uniformno skupljanje bez prisustva vidljivih pukotina i pre svega uniformnu mikrostrukturu zahvaljujući ravnomernom zagrevanju po čitavoj zapremini kompakta [229]. Mehanizam loma u slučajevima čistog HAP i TCP bio je intergranularan, dok je u slučajevima dopiranih materijala uočen transgranularni mehanizam loma. 3.5. Metode sinterovanja uz pomoć pritiska Biokeramički materijali velikih gustina se dobijaju u najvećem broju slučajeva sintezom prahova kalcijum-hidroksiapatita, kompaktiranjem prahova na visokim pritiscima i sinterovanjem. Ukoliko poslednje dve faze teku simultano reč je o sinterovanju potpomognutim pritiskom. U dosadašnjem tekstu je presovanje prahova spominjano u funkciji oblikovanja tela, tj. kao faza procesiranja koja prethodi sinterovanju. U daljem tekstu biće reči o postupcima gde se sinterovanje i dejstvo pritiska odvijaju istovremeno. Sinterovanje potpomognuto pritiskom je dosta zastupljen postupak pri procesiranju biokeramičkih materijala, a omogućava dobijanje biokeramičkih proizvoda izuzetno velikih gustina na temperaturama koje su za 250-300 °C niže nego kod konvencionalnih tehnika sinterovanja kalcijum-hidroksiapatita. Prilikom sinterovanja uz pomoć pritiska se postižu gustine i preko 99 % teorijske gustine. Sa porastom pritiska uglavnom se smanjuje poroznost sinterovanih uzoraka. Analizama ovih postupaka utvrdjeno je da odnos veličine zrna i pora koji su u neposrednom dodiru imaju veliki uticaj na densifikaciju materijala. Naime, ukoliko je veličina zrna keramičkog kompakta znatno veća od veličine pore dodatni pritisak će imati pozitivnu ulogu tokom densifikacije, dok u suprotnom slučaju pritisak nema veliki uticaj densifikaciju keramičkih materijala. 50 U zavisnosti od pravca delovanja pritiska, razlikuju se: postupci pri kojima pritisak deluje uniaksijalno (toplo presovanje i spark plazma sinterovanje) i postupci pri kojima pritisak deluje izostatski (toplo izostatsko presovanje). 3.5.1. Dobijanje i svojstva toplo presovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata Prilikom toplog presovanja uzorak se istovremeno izlaže dejstvu temperature i uniaksijalnog pritiska, a na taj način se povećava pogonska sila denzifikacije u odnosu na postupak konvencionalnog sinterovanja. Ureñaj za toplo presovanje, čija je uprošćena šema prikazana na slici 3.8, se sastoji od komore peći u kojoj se nalazi kalup sa uzorkom koji se postavlja izmeñu dva klipa. Temperature prilikom toplog presovanja koje se sreću u literaturi dostižu 2200 °C, a primenjeni pritisak ima vrednosti do 50 MPa. Kako se uniaksijalni pritisak direktno preko klipova prenosi na uzorak na izuzetno visokim temperaturama, izbor materijala od koga su napravljeni klipovi i kalup je od posebnog značaja za uspešnu primenu ove tehnike. Primena visokih temperatura, mogućnost habanja zidova kalupa i mogućnost reakcije izmeñu materijala kalupa i samog uzorka, najčešći su razlozi za primenu materijala na bazi grafita, tvrdih borida i karbida kao materijala za izradu kalupa. Iako veoma skupi, kalupi od molibdena i njegovih legura su, zbog superiornih visokotemperaturnih osobina, našli primenu u specifičnim slučajevima, ali samo pod uslovom da je tokom procesa obezbeñena atmosfera koja ove materijale štiti od oksidacije. S obzirom da se kalcijum-hidroksiapatit obično presuje na toplo na temperaturama do 1000 °C, kao materijal za izradu kalupa može da se koristi i gusta keramika dobijena sinterovanjem na višim temperaturama za 300-500 °C od temperature procesiranja. 51 Slika 3.8. Šema uredjaja za toplo uniaksijalno presovanje Toplo presovanje se obično primenjuje u slučaju sinterovanja keramičkih tela jednostavnih oblika. Najveća prednost ove metode je mogućnost ubrzane denzifikacije na nižim temperaturama i za kraće vreme, pri čemu se može izbeći visokotemperaturna oblast nestabilnosti odreñene keramičke faze i usporiti ili čak eliminisati rast zrna. Grafitni kalup prilikom toplog presovanja često raguje sa uzorkom, što predstavlja veliki problem pri korišćenju ovog postupka. Iz ovog razloga se kalup često premazuje prahovima hemijski inertnim i stabilnim na visokim temperaturama, kakav je na primer bor-nitrid. Toplo presovanje se kao metoda za konsolidaciju prahova i kompozitnih materijala primenjuje od 1950. godine. U pojedinim industrijama ne postoji alternativa toplom presovanju zbog niza prednosti, kao što su: pozitivan uticaj pritiska na kinetiku densifikacije i mogućnost kontrole rasta zrna. Meñutim, ovaj postupak zahteva primenu relativno skupe opreme. Česta pojava je i neujednačena raspodela gustine u keramičkim proizvodima dobijenim ovom tehnikom. U nekim slučajevima se pri toplom presovanju može pojaviti anizotropija u mikrostrukturi, kao posledica orjentisane kristalizacije u jednom ili više pravaca ili usled plastične deformacije individualnih čestica. Veliki nedostatak ove metode predstavlja nemogućnost izrade biokeramičkih kompakata sa nepravilnim oblicima, kakvi često imaju primenu u maksiofacijalnoj hirurgiji i ortopediji [230]. Poslednjih decenija toplo presovanje je dosta eksploatisana metoda za procesiranje kako guste tako porozne biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, kao 52 i kompozita na njihovoj osnovi. Koristeći toplo presovanje, Suchanek je polazeći od precipitaciono dobijenog nanočestičnog praha HAP pomešanog sa različitim količinama vlakana HAP dobijenih hidrotermalno, dobio vrlo guste materijale dobrih mehaničkih karakteristika. Najoptimalnija svojstva materijala dobio je toplim presovanjem na 1000 °C tokom 2 h na pritisku 30 MPa u struji argona. Gustina uzoraka bila je u intervalu 90-97 % teorijske gustine. Žilavost dobijenih kompozita dostigla je vrednost 1,4 MPa m1/2, dok vrednost koeficijenta žilavost materijala bez dodatka hidrotermalno dobijenih vlakana nije prelazila 1,0 MPa m1/2. Vrednosti tvrdoće dobijenih materijala nalaze se u intervalu 4-6 GPa [231]. Raynaud sa saradnicima je polazeći od kalcijum deficitarnog hidroksiapatita sinterovanjem dobio guste bifazne HAP-β-TCP biokeramičke materijale, a cilj sledećih istraživanja bio je da korišćenjem toplog presovanja poboljša mehaničke karakteristike ovih materijala [232]. Uzorci hidroksiapatita su toplo presovani na temperaturama u intervalu od 1100 °C – 1200 °C, na pritisku od 20 MPa, u atmosferi argona. Na temperaturi 1100°C dobijen je kompakt sa homogenom raspodelom i prosečnom veličinom zrna od okvirno 200 nm, ali sa uočljivim porama. Na višim temperaturama primetan je nekontrolisan rast zrna. Koeficijent žilavosti kompakta toplo presovanog na 1200 °C iznosio je 0,7 MPa m1/2, a sa smanjenjem temperature na 1100 °C vrednost se povećava na 1,0 MPa m1/2. Najveće vrednosti žilavosti dobijene su pri odnosu Ca/P u polaznom prahu od 1,67. Nakon potapanja uzoraka toplo presovanih na 1100 °C u simulirani telesni fluid, nakon 30 dana je primećena prva promena i to u vidu interakcije β-TCP zrnaca sa fluidom, pri čemu je površina uzorka postala hrapava sa uočljivim šupljinama, nastalih usled delimičnog rastvaranja β-TCP. Koristeći tehniku toplog presovanja u hidrotermalnim uslovima, Hashida je uspeo da dobije biokeramički materijal velike gustine i dobrih mehaničkih svojstava pri ambijentalnoj temperaturi od 300 °C. CaHPO4•2H2O + Ca(OH)2, Ca8H2(PO4)6•5H2O + Ca(OH)2, CaHPO4•2H2O + NH3•H2O, Ca8H2(PO4)6•5H2O + NH3•H2O su korišćeni kao kombinacije prekursora, dok je pritisak tople prese bio 40 MPa. Dobijeni material se odlikovao lamelarnom strukturom, koja je prema tvrñenju autora imala presudan uticaj na odlične mehaničke karakteristike dobijenih materijala [233]. Sa ciljem da strukturne parametre dovede na nano nivo, An je sa saradnicima, polazeći od nanočestičnih prahova HAP dobio izuzetno guste transparentne materijale metodom toplog presovanja. Na temperaturi od 900 °C oni su dobili potpuno guste materijale na bazi HAP sa oko 70 % većom vrednošću pritisne čvrstoće u odnosu na komercijalno dostupne materijale ove vrste. Dodavanjem oko 3 % itrijum stabilisanog praha cirkonijum-dioksida u prah HAP pre toplog presovanja, poboljšao je mehaničke karakteristike toplo presovanih kompakata koji su se odlikovali vrlo uniformnom mikrostrukturom [234]. Kombinujući metode XRD i FTIR analize, Kmita je sa saradnicima proučavajući fazni sastav toplo presovanih uzoraka HAP uočio da se u okviru temperaturnog intervala 1150-1300 °C tokom tolpog presovanja ne odvija fazna transformacija stehiometrijskog 53 hidroksiapatita u trikalcijum-fosfat. Oni ističu veliki značaj stabilnosti hidroksiapattine faze tokom procesiranja metodom toplog presovanja sa biološke tačke gledišta [235]. 3.5.2. Dobijanje i svojstva spark plazma sinterovanih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata Spark plazma sinterovanje, SPS, kao jedna od metoda u kojima se električna struja koristi za pospešivanje procesa sinterovanja, patentirano je 1933. godine u Americi, ali tada nije bilo poznato pod ovim nazivom [236, 237]. Nakoliko radova u isto vreme pojavilo se u literaturi pedesetih godina dvadesetog veka, u kojima je korišćena metoda sinterovanja potpomognuta električnom strujom, a koja je kasnije nazvana spark plazma sinterovanjem [238-241]. Danas je spark plazma sinterovanje često korišćena metoda za dobianje gustih biokeramičkih materijala na bazi HAP i kalcijum-fosfata, kao i kompozita na njihovoj osnovi. Najveće prednosti ove metode su mogućnost sinterovanja za izuzetno kratak vremenski period, sniženje temperature sinterovanja, a samim tim i mogućnost prevoñenja nanočestičnog praha u nanostrukturni keramički materijal, kao i mnogo puta potvrñene dobre mehaničke karakteristike materijala dobijenih ovom tehnikom. Primena ove tehnike sinterovanja zasniva se na termičkom efektu stuje, koja omogućava veliku brzinu zagrevanja i aktiviranje sinterovanja na nižim temperaturama, a samim tim sprečava rast zrna sprečavajući aktiviranje visokotemperaturnih mehanizama sinterovanja [160, 242]. Istovremeno korišćenje pritiska pospešuje densifikacioni proces u sinterovanom materijalu. Uprošćena šema ureñaja za spark plazma sinterovanje prikazana je na slici 3.9. 54 Slika 3.9 . Šema peći za spark plazma sinterovanje Tokom procesa spark plazma sinterovanja kalup sa uzorkom se nalazi, kao što se sa slike može videti, izmeñu gornje i donje elektrode koje prenose električni impuls klipovima. Elektrode su povezane sa SPS generatorom električne struje niskog napona (svega nekoliko volta) i velike jačine (preko 1000 A). Osnovne razlike izmeñu konvencionalnog toplog presovanja i SPS sinterovanja su u brzini zagrevanja koja potiče od različite prirode zagrevanja uzorka i kalupa u kome se on nalazi. Dok se pri toplom presovanju uzorak i kalup zagrevaju pomoću grejača koji se nalazi u zatvorenoj komori, u pećima za SPS zagrevanje se vrši Džulovim efektom električne struje koju provodi kalup, a i uzorak ukoliko je provodan. Kao dodatnu ulogu struje pored obezbeñivanja tolotne energije sistemu, navodi se i formiranje plazme, koja ima pozitivan uticaj na sinterovanje kroz efekat „čišćenja“ površine čestica [236]. Ova uloga električne energije pri sinterovanju je podržana od strane mnogih naučnika [243-246]. Tokita je u svom radu izneo neke od dokaza za pozitivnu ulogu plazme pri formiranju vratova izmeñu čestica koje sinteruju [247], ali bilo je i mnogih neslaganja sa njegovom teorijom. Nešto kasnije Ozaki [248] izvodeći eksperimente SPS tehnikom, zaključuje da do pražnjenja ne dolazi u slučajevima kada se koristi grafitni kalup. Prihvatajući ulogu plazme, Yanagisawa [249] objavljuje studiju u kojoj podvrgavanjem čestica bakra jednostrukom impulsnom pražnjenju u 55 trajanju od 500 ms zaključuje da varnica ima uticaj na povezivanje pojedinih, ali ne i svih čestica. I dalje se puno istraživanja bazira na nalaženju konkretnih dokaza za ulogu varnica pri povezivanju čestica tokom sinterovanja. Veliki broj radova je prisutan u literaturi sa temom korišćenja spark plazma sinterovana pri procesiranju biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata. Korišćenjem ove tehnike ostvaruje se istovremeno dejstvo električne struje i pritiska na prah kalcijum-hidroksiapatita, a rezultat je u velikom broju slučajeva biokeramički materijal sa nano dimenzijama zrna i dobrim mehaničkim svojstvima, a često i nastanak potpuno guste translucentne biokeramike. Proučavajući sinterabilnost hidroksiapatita metodom SPS u opsegu temperatura od 850 °C do 1100 °C, Gua je dobio uzorke gustina bliskih teorijskoj vrednosti u toku 5 min. Tvrdoća i modul elastičnosti su rasli sa porastom temperature sinterovanja do 950 °C, a sa daljim povećanjem temperature njihove vrednosti su opadale. Maksimalna vrednost žilavosti dobijena spark plazma sinterovanjem na 950 °C i iznosila je 1,25 MPa m1/2, dok je konvencijalnim sinterovanjem istog praha vrednost žilavosti bila manja od 1,0 MPa m1/2 [250]. Uporednom analizom materijala dobijenih toplim presovanjem i spark plazma sinterovanjem, polazeći od HAP dobijenog spray dry metodom Nakahira je SPS metodom na 700 °C postigao gustinu istu kao toplim presovanjem istog praha na 1200 °C. XRD analizom je u oba slučaja ustanovljena monofaznost materijala, a odležavanjem u STF bolju bioaktivnost su pokazali uzorci dobijeni spark plazma sinterovanjem [251]. Na većim temperaturama dobijeni kompakti su se odlikovali zrnom mikronskih dimenzija, dok je sniženjem temperature veličina zrna znatno redukovana, ali je i gustina uzoraka bila manja. Materijali dobijeni SPS sinterovanjem odlikovali su se prosečnom veličinom zrna od 500 nm. Khor je sa saradnicima SPS metodom dobio čiste hidroksiapatitne materijale i kompozitne materijale sa 3 vol.% ZrO2 [252, 253]. Oni takoñe ističu bolja mehanička svojstva materijala dobijenih SPS tehnikom od konvencionalno sinterovanih materijala, a konstatuje i poboljšanje mehaničkih svojstava uvoñenjem nanočestičnog ZrO2 u sistem. Odležavanjem u STF je potvrñena bioaktivnost materiaja dobijenih SPS tehnikom. Spark plazma sinterovanjem, Gu je dobio guste kompakte sa relativno dobrim mehaničkim karakteristikama, polazeći od praha kalcijum-hidroksiapatita dobijenog "spray- dried" tehnikom. Nakon in vitro ispitivanja sinterovanih kompakata u simuliranom telesnom fluidu tokom 28 dana, formiran je sloj karbonatnog apatita. Apatitni sloj je počeo da se formira nakon 24h, a nakon 28 dana formirana je gusta umrežena struktura sačinjena od mikronskih igličastih kristalita [213]. Gasnom analizom CO2 nastalog tokom spark plazma sinterovanja karbonatnog HAP, Yamaguchi je ispitivao efekat električne struje na sinterovanje HAP. CO2 je tokom termičke analize HAP počeo da se izdvaja već na 600 °C, dok je tokom SPS detektovan na nižim 56 temperaturama. Ovaj podatak ukazuje na činjenicu da se površina čestica HAP tokom procesa SPS zagreva lokalno usled toplotnog efekta električne struje [254]. Mikrosferični prah kalcijum-hidroksiapatita dobijen plazma postupkom, spark plazma sinterovanjem na 1100 °C tokom 3 min preveden je u biokeramički material gustine 96,2%. Prema Xu i saradnicima, upravo su uslovi u slučaju prahova ovog tipa su optimalni za dobijanje gustih biokeramičkih materijala na bazi HAP. Modul elastičnosti i tvrdoća su povećani za oko 15 % povišenjem temperature sa 1000 °C na 1100 °C [255]. U narednoj studiji isti autori su poredili sinterabilnost prahova sa sferičnim česticama u konvencionalnim i SPS uslovima. Tokom SPS na pritisku od 45 MPa i u opsegu temperatura 900-1200 °C tokom 3 min, pri brzini zagevanja od 100 °C/min, dobijeni su materijali znatno veće gustine nego konvencionalnim sinterovanjem na temperaturama 1000-1400 °C tokom 2 h i 5 h, pri brzini zagrevanja od 5 °C/min, 10 °C/min i 20 °C /min. Od materijala dobijenih konvencionalnim postupkom, najveću gustinu 2,86 g/cm3, imao je uzorak dobijen na 1200 °C tokom 5 h i pri brzini zagrevanja od 10 °C/min [256]. Uzorci dobijeni SPS postupkom na 1100 °C osim većom gustinom, odlikovali su se i znatno manjim zrnom od oko 1,5 µm. Spark plazma sinterovanjem ultrafinih sfernih čestica HAP/ZrO2, na 1075 °C tokom 5 min, Kumar je sa saradnicima dobio materijal kontrolisane poroznosti, sa prisustvom sfernih pora koje potiču od polaznog praha. Navedene sferne pore su intraaglomeratne pore koje se nalaze unutar sfernih čestica praha. Upravo ove sferne pore daju ovom tipu materijala specifičnu mikrostrukturu koja za posledicu ima i neobično visoke vrednosti mehaničkih parametara ovog tipa biokeramike. Postavljanjem 2-D modela autori objašnjavaju povećanje žilavosti usled formiranja specifičnog tipa mikrostrukture [59]. Spark plazma sinterovanjem kompozitnog praha HAP/5 vol.% Ag dobijeni su relativno gusti biokeramički materijali, sa ravnomerno rasporeñenim česticama srebra u HAP matriksu, dimenzija oko 200 nm. U slučaju materijala dobijenog sinterovanjem čistog hidroksiapatita mehanizam loma bio je transgranularan, dok je dodakom čestica srebra ustanovljeno da je mehanizam loma kombinacija intergranularnog i transgranularnog tipa [257]. Polazeći od praha HAP pomešanog sa 1, 3 i 5 mas. % silicijuma, spark plazma sinterovanjem na 1000 °C tokom 3 h dobijen je materijal za koji je XRD, Raman i XPS analizom utvrñeno da je silicijum u svim slučajevima ušao u apatitnu strukturu. Prisutni silicijum u sistemu izazvao je intenzivniju faznu transformaciju HAP u TCP, što prema nekim autorima pozitivno utiče na biokompatibilnost dobijenih materijala. Sa povećanjem udela silicijuma u polaznoj smeši sa 1 na 5 mas. %, jungov moduo elastičnosti je povećan za približno 15 %, tj. sa 84 GPa na 100 GPa [258]. Ispitujući mogućnost konsolidacije nanočestičnih prahova HAP na niskim temperaturama, Drouet je sa saradnicima spark plazma sinterovanjem dobio materijale u kojima nije došlo do značajnog rasta kristalita i koji su imali dobre mehaničke karakteristike. U poreñenju sa klasičnim sinterovanjem, osim finozrnije structure, autori ističu i smanjenu verovatnoću za odvijanje fazne transformacije tokom procesa termičke obrade [259]. Ista 57 grupa autora ističe da svojstva polaznih prahova u mnogome utiču na mogućnost konsolidacije istih na niskim temperaturama postupkom spark plazma sinterovanja, kao i da su u toku ispitivanja koja mogu da dovedu do boljih mehaničkih svojstava i biokompatibilnosti ovako dobijenih materijala [260]. Poslednjih nekoliko godina razni vidovi karbonskih čestica se dodaju HAP pri sinterovanju u spark plazma uslovima, sa ciljem da se poveća provodljivost matriksa. Xu je sa saradnicima, dodajući karbonske nanotube, uočio poboljšanja mehaničkih svojstava hidroksiapatitnog matriksa. Vrednost modula elastičnosti u ovoj studiji kretala se do vrednosti od 131,1 GPa dok je maksimalna vrednost tvrdoće bila 6,86 GPa, dobijena pri temperaturi sinterovanja od 1100 °C. Na nižim temperaturama dobijene su niže vrednosti navedenih mehaničkih parametara [261]. Mnogi autori navode da se kontrolisanjem osobina polaznih prahova, kao i snižavanjem temperature i skraćivanjem vremana sinterovanja, tokom primene svih navedenih tehnika sinterovanja, može uticati na još značajnija poboljšanja svojstava dobijenih gustih i kontrolisano poroznih biokeramičkih materijala na bazi HAP i TCP. 58 III. EKSPERIMENTALNA PROCEDURA-MATERIJALI I METODE 4. Sinteza prahova kalcijum-hidroksiapatita U ovom radu kao polazni materijal korišćena su četiri praha kalcijum-hidroksiapatita. Dva praha kalcijum-hidroksiapatita dobijena su modifikovanim precipitacionim metodama, dok su druga dva dobijena hidrotermalnim postupcima sinteze. 4.1. Sinteza stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita modifikovanom precipitacionom metodom Prah kalcijum-hidroksiapatita sa stehiometrijskim odnosom Ca/P dobijen je modifikovanom precipitacionom metodom [24, 26, 121]. Kalcijum-oksid, dobijen žarenjem kalcijum-karbonata analitičke čistoće tokom 4-5 h na 1000 °C u atmosferi vazduha, u malim porcijama je dodavan u destilovanu vodu tokom 10 min, uz konstantno mešanje. Na taj način dobijena suspenzija kalcijum-hidroksida je kroz sito prebačena u reakcioni balon (u cilju odvajanja neproreagovalih zrna CaO). U suspenziju kalcijum-hidroksida je zatim dodavana razblažena fosforna kiselina (1:1) kap po kap, u stehiometrijskom odnosu u skladu sa jednačinom 4.1. 10Ca(OH)2 + 6H3PO4 → Ca10(PO4)6(OH)2 + 18H2O (4.1.) pH vrednost suspenzije je na početku sinteze iznosila 11, a dodavanje fosforne kiseline je prekinuto pri pH=7,5. Dobijena suspenzija je zatim zagrevana tokom 30 min na 94 ± 1 °C uz konstantno mešanje. Nakon zagrevanja suspenzija je ostavljena da odstoji u matičnom rastvoru, sve dok se nije izdvojio gornji bistri sloj, koji je zatim dekantovan. Suspenzija je zatim, u cilju dobijanja granulisanog praha, „spray dry” metodom osušena na 105 °C. Prah sintetisan na ovaj način je obeležen i u daljem tekstu će biti navoñen kao HAP1. 4.2. Sinteza kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita modifikovanom precipitacionom metodom Prah kalcijum deficitarnog hidroksiapatita dobijen je takoñe reakcijom kalcijum- oksida, dobijenog žarenjem kalcijum-karbonata analitičke čistoće tokom 24 h na 1000 °C, i odgovarajuće količine fosforne kiseline (u skladu sa jednačinom 4.1.) [23, 26, 122]. Sinteza se 59 odvijala na temperaturi od 25 °C u četvorogrlom reakcionom balonu u atmosferi azota. Kalcijum-oksid je najpre dispergovan u destilovanoj vodi, a zatim je dobijena suspenzija titrisana fosfornom kiselinom, brzinom od 1 cm3/min uz konstantno mešanje. Brzina dodavanja fosforne kiseline regulisana je pomoću peristaltičke pumpe. Brzina mešanja je bila 300 rpm. Reakcija je prekinuta pri pH (suspenzije) = 7. Suspenzija je ostavljena u matičnom rastvoru da odstoji 24 h u inertnoj atmosferi uz konstantno mešanje, a zatim je proceñena kroz Bihnerov levak i isprana toplom destilovanom vodom. Dobijeni prah je osušen na 105 °C, sprašen u ahatnom avanu i obeležen kao HAP2, kako će u daljem tekstu i biti navoñen. 4.3. Sinteza kalcijum-hidroksiapatita hidrotermalnom metodom Prahovi kalcijum-hidroksiapatita HAP3 i HAP4 dobijeni su hidrotermalnim postupkom [27, 28, 29, 123, 124]. Kao polazna jedinjenja za sintezu kalcijum-hidroksiapatita korišćeni su: kalcijum-hlorid, natrijumova so etilendiamintetrasirćetne kiseline, natrijum- dihidrogenfosfat i urea. Sa ciljem da se dobiju prahova kalcijum-hidroksiapatita sa različitim stepenom kalcijum deficitarnosti, odnos Ca/P u polaznom rastvoru u slučaju sinteze praha HAP3 bio je 1,42, dok je pri sintezi praha HAP4 iznosio 0,96. CaCl2, Na2H2EDTA.2H2O, NaH2PO4 i urea u količinama navedenim u tabeli 4.1., su najpre rastvoreni u 2000 ml destilovane vode (istim redosledom kao što su i navedeni). Tabela 4.1. Parametri i količine reaktanata pri hirotermalnoj sintezi kalcijum-hidroksiapatita Uzorak Temperatura, °C Vreme, h CaCl2, g Na2H2EDTA.2H2O, g NaH2PO4, g Urea, g HAP3 160 3 15.96 14.8 12 12 HAP4 160 3 11 14.8 12 12 Reakcioni sud sa rastvorom je postavljen u autoklav koji je zatim postepeno zagrevan. Rastvor je u autoklavu toplotno tretiran na 160 °C tokom 3 h. Nakon toga autoklav je prirodno ohlañen tokom 24 h. Nastala suspenzija je proceñena kroz filter papir, a dobijeni talog je ispiran toplom destilovanom vodom do negativne reakcije na Cl- jone, a zatim osušen na 105 °C i sprašen u avanu. 60 5. Karakterizacija prahova kalcijum-hidroksiapatita Karakterizacija polaznih prahova kalcijum-hidroksiapatita izvršena je odreñivanjem: raspodele veličine čestica, morfoloških karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom, morfoloških karakteristika primarnih čestica transmisionom elektronskom mikroskopijom, faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom, prisustva karakterističnih grupa infracrvenom spektroskopskom analizom, specifične površine i raspodele veličina pora. 5.1. Odreñivanje raspodele veličina čestica prahova kalcijum-hidroksiapatita Raspodela veličina čestica sintetisanih prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñena je laserskim analizatorom veličine čestica, tipa Mastersizer 2000 Malvern Instruments Ltd., UK. Odreñivanje raspodele veličine čestica je vršeno iz vodene disperzije, prethodno tretirane u ultrazvučnom kupatilu tokom 1 min. 5.2. Odreñivanje morfologije prahova kalcijum-hidroksiapatita skenirajućom elektronskom mikroskopijom Morfološke karakteristike prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñene su skenirajućom elektronskom mikroskopijom na ureñaju Jeol JSM 5800 pri naponu struje vlakna od 20 keV. Prahovi kalcijum-hidroksiapatita, pre i posle ultrazvučnog tretmana su naneti na bakarni nosač i napareni legurom zlato/paladijum u naparivaču tipa Polaron SC502 Sputter coater. 5.3. Odreñivanje morfologije primarnih čestica kalcijum-hidroksiapatita transmisionom elektronskom mikroskopijom Morfologija primarnih čestica prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñena je transmisionom elektronskom mikroskopijom na ureñaju Philips EM400. Uzorci su pripremljeni tako što su prahovi kalcijum-hidroksiapatita najpre dispergovani u apsolutnom alkoholu, zatim tretirani u ultrazvučnom kupatilu i nanešeni na mrežasti nosač, i snimani pri radnom naponu od 120 keV. 61 5.4. Rendgenska difrakciona analiza prahova kalcijum-hidroksiapatita Fazni sastav prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñen je rendgenskom difrakcionom analizom na ureñajima “Bruker D8 advance diffractometer“ i “PHILIPS PW 1710“, sa CuKα zračenjem i grafitnim monohromatorom, u intervalu uglova 2θ od 20° do 50° sa korakom 0,02º. 5.5. Infracrvena spektroskopska analiza prahova kalcijum-hidroksiapatita Prisustvo karakterističnih hemijskih grupa u prahovima utvrñeno je infracrvenom spektroskopskom analizom na uredjaju MB Boman Hartmann MB 100 u oblasti talasnih brojeva od 4000 do 400 cm-1. Uzoraci su pripremljeni tako što su prahovi kalcijum- hidroksiapatita pomešani sa KBr u odnosu (HAP : KBr) = (1 : 150), a zatim homogenizovani u ahatnom avanu i ispresovani u čeličnom kalupu. 5.6. Odreñivanje odnosa Ca/P prahova kalcijum-hidroksiapatita Stehiometrijska odnosno kalcijum deficitarna priroda dobijenih prahova kalcijum- hidroksiapatita utvrñena je odreñivanjem odnosa Ca/P induktivno-spregnutom plazma spektroskopijom (ICP). Odmerena količina od 0,2500 g uzorka, rastvorena je u razblaženoj HNO3. Posle odgovarajućeg razblaživanja, odnos Ca/P je izmeren ICP metodom, na instrumentu Perkin-Elmer ICP/6500. Fosfor je meren na talasnoj dužini λ=213,618 nm, a kalcijum na λ=317,933 nm. 5.7. Odreñivanje specifične površine prahova kalcijum-hidroksiapatita Specifične površine prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñene su B.E.T. metodom, adsorpciom azota na temperaturi tečnog azota, pomoću ureñaja Thermo Finnigan/Sorptomatic 1990. 62 6. Kompaktiranje prahova kalcijum-hidroksiapatita Prahovi kalcijum-hidroksiapatita, HAP1-HAP4, kompaktirani su metodama uniaksijalnog i izostatskog presovanja na različitim pritiscima. 6.1. Uniaksijalno presovanje Prahovi kalcijum-hidroksiapatita su kompaktirani presovanjem na uniaksijalnoj presi, pri pritisku od 100 MPa tokom 1 min. Presovanje je izvršeno u čeličnom visokokvalitetno ispoliranom kalupu prečnika 12 mm. 6.2. Izostatsko presovanje Prahovi kalcijum-hidroksiapatita su kompaktirani izostatskim presovanjem na 100 MPa, 200 MPa, 300 MPa i 400 MPa tokom 1 min, u čeličnom kalupu prečnika 3,5 cm. Kao medijum za prenos pritiska korišćeno je hidraulično ulje. Prahovi su presovani u kalupu od silikonske gume prečnika 6 mm. 6.2.1. Ispitivanje uticaja veličine izostatskog pritiska na raspodelu pora i specifičnu površinu ispresovanih kompakata Specifična površina, ukupna zapremina pora, raspodela mikro i mezopora izostatski ispresovanih kompakata na pritiscima od 100 MPa, 200 MPa, 300 MPa i 400 MPa odreñena je pomoću ureñaja Thermo Finnigan/Sorptomatic 1990, adsorpciom azota na temperaturi tečnog azota. Analizom dobijenih rezultata ispitan je uticaj veličine izostatskog pritiska na raspodelu pora i specifičnu površinu ispresovanih kompakata. 6.2.2. Ispitivanje uticaja veličine izostatskog pritiska na mikrostrukturu sinterovanih kompakata kalcijum-hidroksiapatita Ispitivanje uticaja veličine izostatskog pritiska na mikrostrukturu sinterovanih kompakata kalcijum-hidroksiapatita izvršeno je tako što su izostatski ispresovani kompakati na pritiscima od 100 MPa, 200 MPa, 300 MPa i 400 MPa sinterovani konvencionalnom metodom u atmosferi vazduha na 1200 ºC tokom 2 h. Sinterovanje uzoraka je izvršeno u peći 63 proizvoñača “Elektron”, pri brzini zagrevanja od 20 ºC/min. Nakon završetka procesa sinterovanja uzorci su izvañeni iz peći i hlañeni na sobnoj temperaturi. Morfološke karakteristike sinterovanih uzoraka utvrñene su skenirajućom elektronskom mikroskopijom na ureñaju Jeol JSM 5800. 6.3. Odreñivanje gustine ispresovanih kompakata Polazna gustina uniaksijalno i izostatski ispresovanih kompakata odreñena je merenjem dimenzija i mase ispresovanih cilindara. 6.4. Uniaksijalno presovanje na ekstremno visokim pritiscima Sa ciljem da se ispita uticaj ekstremno visokih pritisaka na mogućnost snižavanja temperature sinterovanja HAP, prah kalcijum-hidroksiapatita HAP1 je ispresovan uniaksijalno u kalupu napravljenom od specijalnog čelika na pritisku od 2,5 GPa. Tako dobijeni ispresak je konvencionalno sinterovan na 900 ºC tokom 2 h. Za poreñenje morfoloških karakteristika, konvencionalno su sinterovani kompakti, izostatski ispresovani na 400 MPa, na 900 ºC tokom 2 h. Morfološke karakteristike sinterovanih uzoraka utvrñene su skenirajućom elektronskom mikroskopijom. 7. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala mikrotalasnim sinterovanjem Polazni kompakti dobijeni uniaksijalnim i izostatskim presovanjem stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita (HAP1) i kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita (HAP2), sinterovani su u laboratorijskoj peći za mikrotalasno sinterovanje. Sinterovanje je izvršeno u peći tipa Linn High Therm MHTD 1800-4,8/2, 45-135, na temperatutama od 900 °C-1200 °C, tokom 15 min, pri brzini zagrevanja 20 °C/min [26]. Zagrevanje ovog tipa peći obavlja se pomoću šest magnetrona. U svim slučajevima sinterovanja uzorci su bili postavljeni na istom mestu u peći, sa ciljem da se eliminiše uticaj geometrijskog faktora, koji je u velikoj meri uticajan kod ovog tipa sinterovanja. Uzorci su tokom sinterovanja bili postavljeni u preseku dijagonala komore za sinterovanje, a bili su okruženi silicijum-karbidnim cilindrima čija je uloga obezbeñivanje homogenog magnetnog polja u komori peći. Temperatura uzoraka je merena optičkim pirometrom, koji je postavljen na vrhu peći. Nakon završetka procesa 64 sinterovanja uzorci su hlañeni tokom 1 h do temperature od 300 °C, a zatim izvañeni iz peći i hlañeni na sobnoj temperaturi. Radi poreñenja sa mikrotalasno sinterovanim uzorcima na 900 °C i 1000 °C tokom 15 min, konvencionalno su sinterovani uzorci na 900 °C i 1000 °C tokom 2 h u laboratorijskoj peći za sinterovanje proizvoñača “Elektron”, pri istoj brzini zagrevanja polazeći od identičnih polaznih kompakata. 8. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala spark plazma sinterovanjem Prahovi HAP1 i HAP2 su sinterovani u peći za spark plazma sinterovanje, tipa Dr.Sinter SPS System-825.C, na temperatutama od 900 °C - 1200 °C u vakumu, tokom 5 i 10 min. Oko 3 g praha je sinterovano u grafitnom kalupu prečnika 20 mm. Tokom procesa spark plazma sinterovanja kalup sa uzorkom se nalazio izmeñu gornje i donje elektrode koje prenose električni impuls, a koje su povezane sa generatorom impulsa. Nakon što je prah nasut u kalup, na klipove je delovano vrlo malim početnim pritiskom kako bi se kalup učvrstio izmeñu elektroda. Tokom procesa sinterovanja, primenjeni pritisak iznosio je oko 40 MPa, napon 4 V i jačina struje 1500 A. Skupljanje uzorka je praćeno sve vreme sinterovanja. Temperatura uzorka tokom procesa sinterovanja je merena optičkim pirometrom kroz otvor koji se nalazi na grafitnom kalupu. Nakon završenog procesa sinterovanja uzorak je hlañen tokom 1 h, unutrašnjim sistemom za hlañenje. 9. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala toplim presovanje Toplo presovanje uzoraka kalcijum-hidroksiapatita HAP1 i HAP2 izvršeno je u toploj presi tipa “Astro”. Prahovi kalcijum-hidroksiapatita su prvo izostatski ispresovani na 400 MPa, a dobijeni kompakti prečnika 6 mm su toplo presovani u grafitnom kalupu prečnika 6 mm, pri pritisku od 20 MPa u struji argona [24, 25]. Nakon što je izostatski ispresovan kompakt postavljen u grafitni kalup, na klipove je delovano vrlo malim početnim pritiskom kako bi se kalup postavio izmeñu nosača. Unutrašnjost kalupa i klipovi su premazani tankim slojem bor-nitrida čija je funkcija da spreči interakciju izmeñu praha kalcijum-hidroksiapatita i grafita. Brzina zagrevanja bila je 40 ºC/min. Uzorci su toplo presovani na temperaturama 950 ºC i 1000 ºC, tokom 1 h i 2 h. Nakon završenog procesa toplog presovanja uzorci su prirodno hlañeni do sobne temperature. 65 10. Dobijanje gustih biokeramičkih materijala konvencionalnim postupkom sinterovanja Sa ciljem da se dobije gust mikrostrukturni materijal na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, koji bi poslužio za analizu uticaja smanjenja veličine zrna na svojstva dobijenih biokeramičkih materijala sa mikro na nano nivo, prahovi stehiometrijskog kalcijum- hidroksiapatita (HAP1) i kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita (HAP2) sinterovani su konvencionalnim postupkom sinterovanja. Izostatski ispresovani kompakti na 400 MPa, sinterovani su u peći proizvoñača “Elektron” tokom 2 h na temperaturi od 1200 ºC, uz inicijalnu brzinu zagrevanja od 20 ºC/min. Nakon završetka procesa sinterovanja uzorci su izvañeni iz peći i ohlañeni na sobnoj temperaturi. 11. Dobijanje poroznih biokeramičkih materijala mikrotalasnim i konvencionalnim sinterovanjem U cilju dobijanja biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti, polazni kompakti dobijeni uniaksijalnim presovanjem hidrotermalno dobijenih prahova kalcijum-hidroksiapatita HAP3 i HAP4 na 100 MPa, sinterovani su u laboratorijskoj peći za mikrotalasno sinterovanje [27]. Sinterovanje je izvršeno u peći tipa Linn High Therm MHTD 1800-4,8/2, 45-135, na temperatutama od 900 °C-1200 °C, tokom 15 min, pri brzini zagrevanja od 20 °C/min. Ostali uslovi procesiranja pri mikrotalasnom sinterovanju bili su isti kao uslovi opisani u poglavlju 7. Nakon završetka procesa sinterovanja uzorci su hlañeni tokom 1 h do temperature od 300 °C, a zatim izvañeni iz peći i ohlañeni na sobnoj temperaturi. Radi poreñenja sa mikrotalasno sinterovanim poroznim kompaktima na 1100 °C i 1200 °C tokom 15 min, konvencionalno su sinterovani uzorci na 1100 °C i 1200 °C tokom 2 h u peći za konvencionalno sinterovanje, polazeći od istih polaznih kompakata. 66 12. Karakterizacija mikrotalasno sinterovanih, spark plazma sinterovanih, toplo presovanih i konvencionalno sinterovanih biokeramičkih materijala Karakterizacija dobijenih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata različitim tehnikama sinterovanja izvršena je odreñivanjem morfoloških karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom i utvrñivanjm faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom. Prosečna veličina zrna i oblik i veličina pora dobijenih materijala odreñena je analizom slike, korišćenjem softvera Image Pro Plus Programa. 12.1. Odreñivanje gustine i relativnog linearnog skupljanja dobijenih biokeramičkih materijala Gustina dobijenih biokeramičkih materijala odreñena je Arhimedovom metodom. Relativno linearno skupljenje (RLS) uzoraka dobijenih mikrotalasnim i konvencionalnim sinterovanjem izračunato je po jednačini: RLS = (Do – D)/Do (12.1.) gde je: Do – prečnik cilindričnog uzorka pre sinterovanja D – prečnik cilindričnog uzorka posle sinterovanja. Skupljanje uzoraka sinterovanih spark plazma tehnikom je mereno pomoću senzora ugrañenog u peći, tokom procesa sinterovanja. 12.2. Analiza mikrostrukture biokeramičkih materijala skenirajućom elektronskom mikroskopijom Mikrostrukturne karakteristike sinterovanih biokeramičkih materijala odreñene su skenirajućom elektronskom mikroskopijom na ureñajima Jeol JSM 5800 i Jeol JSM-6460LV pri naponu struje vlakna od 20 keV. Analizirani su prelomi i polirane i nagrižene površine sinterovanih uzoraka. Prelomljeni uzorci učvršćeni su na metalni nosač pomoću grafitne provodne trake. Druga metoda pripreme uzoraka se sastoji iz poliranja uzoraka pomoću dijamantskih pasti i nagrizanja rastvorom HCl ili termičkim postupkom. Uzorci su nakon pripreme napareni legurom zlato/paladijum na naparivaču tipa Polaron SC502 Sputter coater i BAL-TEC, SCD 005 Sputter coater. 67 12.3. Odreñivanje prosečne veličine zrna gustih i prosečne veličine pora poroznih biokeramičkih materijala analizom SEM mikrografija Prosečna veličina zrna i raspodela veličine zrna dobijenih materijala odreñena je analizom SEM mikrografija korišćenjem softvera Image Pro Plus Programa, verzija 4.0 za windows. Približno 100 zrna je uzeto u obzir da bi se dobila prosečna vrednost veličine zrna. Korišćenjem softvera Image Pro Plus Programa je odreñen i oblik, veličina i sferičnost pora biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. 12.4. Rendgenska difrakciona analiza biokeramičkih materijala Fazni sastav dobijenih biokeramičkih materijala utvrñen je rendgenskom difrakcionom analizom na ureñaju “Bruker D8 advance diffractometer“ u intervalu uglova 2θ od 20° do 50° sa korakom 0,02º. 13. Odreñivanje mehaničkih karakteristika dobijenih biokeramičkih materijala 13.1. Odreñivanje tvrdoće Tvrdoća dobijenih biokeramičkih materijala je odreñena Vikersovom metodom indentacije. Metoda se sastoji iz utiskivanja dijamantske igle sa vrhom u obliku četvorostrane piramide u ispoliranu površinu uzorka. Površina se pre ispitivanja polira sa ciljem da se izbegne uticaj neravnina na pravac prostiranja pukotine. Nakon testa na površini ispoliranog uzorka se formiraju četvorostrani otisci. Otisci su formirani delovanjem opterećenja na površinu uzorka u trajanju od 10 s na ureñaju Weinhem Birkenau tip 532. Za očitavanje otisaka je korišćen optički mikroskop MeF (REICHERT, Beč). Korišćenjem jednačine 13.1. na osnovu dimenzija dijagonala otisaka izračunata je tvrdoća materijala [262]: Tvrdoća = 1854.4 ·X · ( N · 0.168)-2 (GPa) (13.1.) gde je: X – masa kojom se deluje (g), N – dužina dijagonale otiska (µm). 68 13.2. Odreñivanje žilavosti Žilavost (Kic) dobijenih biokeramičkih materijala je odreñena korišćenjem jednačine Evans-a i Charles-a [262]: Kic = 0,0824 P·c-3/2 ( MPa/m1/2 ) (13.2.) gde je: P – opterećenje (N), c – dužina pukotine(µm). Metoda se kao i kod odreñivanja tvrdoće sastoji iz utiskivanja dijamantske igle sa vrhom u obliku četvorostrane piramide u ispoliranu površinu uzorka. Nakon testa na površini ispoliranog uzorka se formiraju pukotine koje kreću iz temena četvorostranog otiska, a imaju pravac dijagonale. Upravo dužina tih pukotina je merodavna za izračunavanje žilavosti u jednačini 13.2. Otisci su, kao i kod odreñivanja tvrdoće, formirani delovanjem opterećenja na površinu uzorka u trajanju od 10 s na ureñaju Weinhem Birkenau tip 532. Za očitavanje otisaka je korišćen optički mikroskop MeF (REICHERT, Beč) i skenirajući elektronski mikroskop Jeol JSM 5800. 13.3. Nanoindentacija nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala Mehanička svojstva dobijenih nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala odreñena su i metodom nanoindentacije na ureñaju tipa Triboscope Nanomechanical Testing System (Hysitron, Minneapolis, MN), sa indenterom tipa Berkovich i in situ modom [263]. Ova metoda podrazumeva utiskivanje utiskivača poznatog oblika, a najčešće je to trostrana piramida definisane geometrije, u površinu materijala koji se ispituje pri čemu se istovremeno prati zavisnost sile i dubine utiskivanja. Dimenzija glave indentera korišćenog pri ispitivanju bila je 150 nm. U najčešće korišćenoj opciji ove metode, podaci se dobijaju iz jednog punog ciklusa opterećenja tj. utiskivanja indentera u površinu materijala koji se ispituje i rasterećenja. Na osnovu dobijenih podataka jednostavno se izračunavaju modul elastičnosti ispitivanog materijala E i njegova tvrdoća H. U ovoj disertaciji korišćen je metod Oliver-a i Pharr-a, koji uključuje ekstrapolaciju tangente na vrh krive rasterećenja, u cilju odreñivanja dubine utiskivanja, kada je indenter u neposrednom kontaktu sa uzorkom pri maksimalnom 69 opterećenju, Pmax. U studiji koja je metodu nanoindentacije prilagodila korišćenju u savremenim ureñajima, Oliver i Pharr dali su iscrpan prikaz razvoja ove metode i njene primene u površinskim ispitivanjima materijala. Procedura je zasnovana na problemu elastičnog kontakta prema kome je razvijen metod, koji je davao rešenja za različite oblike indentera kao što su cilindrični i konični. Za elastične kontakte i jednostavne geometrije, opšti odnos izmeñu opterećenja i deformacije tj. dubine utiskivanja može se predstaviti odnosom: mhP ⋅= α (13.3) gde je P opterećenje indentera, h je dubina utiskivanja, a α i m su konstante koje se odreñuju empirijski na osnovu dijagrana utiskivanja-indentacije. Nagib krive rasterećenja omogućuje izračunavanje tvrdoće materijala, a može da se koristi za odreñivanje modula elastičnosti. Dobijeni moduli se obično daju u obliku redukovanih modula, Er, koji su u relaciji sa vrstom materijala, kao i specifičnostima vezanim za uslove merenja i sam indenter. Ako je tvrdoća materijala mnogo manja od tvrdoće indentera, kao što je slučaj pri merenju tvrdoće biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i kalcijum-fosfata, jednačina ima oblik: Er = E/(1 - v2) (13.4.) gde je: E - Yungov modul, v - Poasonov odnos. Pri odreñivanju mehaničkih karakteristika metodom nanoindentacije, na uzorke je delovano opterećenjima od 1 i 2 mN. 14. 3D modelovanje materijala kontrolisane poroznosti metodom konačnih elemenata Trodimenziono modelovanje metodom konačnih elemenata, preko reprezentativnih zapreminskih elemenata (unit cell), je korišćeno da bi se utvrdio uticaj oblika i veličine pora na mehanička svojstva materijala kontrolisane poroznosti na bazi HAP. Sa ciljem da se napravi model koji će što je moguće realnije simulirati mikrostrukturu dobijenih materijala kontrolisane poroznosti, pošlo se od realnog 3D rasporeda pora, šematski predstavljenog na slici 14.1a [264-266]. Ipak, ovakav realan slučaj, sa slučajnom raspodelom pora nije podesan za kompjutersko modelovanje. Korišćenjem metode reprezentativnih zapreminskih elemenata, 70 kompleksnost ovog problema se u znatnoj meri redukuje. Ovom metodom se pretpostavlja da je porozan keramički materijal sastavljen od mnoštva elementarnih jedinica koje imaju isti oblik, fazni sastav, geometriju ćelije i mehanička svojstva (Slika 14.1b). Površinski centrirana kubna ćelija prikazana na slici 14.1c se smatra reprezentativnim elementom za približnu simulaciju realne mikrostrukture dobijene porozne keramike. Na svakom uglu i na sredini svake strane jedinične ćelije se nalazi po jedna sferna pora, drugim rečima slučajan raspored pora je idealizovan ovim rasporedom. Model podrazumeva da jedinična ćelija sve vreme zadržava oblik paralelopipeda, s tim što nakon dejstva sile, stranice ćelije ostaju paralelne i ortogonalne, samo im se dužina menja. a) b) c) - realna mikrostruktura - - idealna mikrostruktura - - jedinična ćelija - Slika 14.1. Šematski prikaz idealizacije rasporeda i oblika pora prilikom modelovanja Model takoñe podrazumeva: (1) linearno elastično ponašanje keramike na bazi HAP, tj. da je zavisnost izmeñu napona i deformacije proporcionalna; (2) da se ispitivana keramika ponaša kao izotropni materijal; (3) da su sve pore istog oblika i istih dimenzija; (4) da se materijal ne uništava pri primenjenim opterećenjima. Za izračunavanje faktora pojačavanja naprezanja za različite oblike pora, jedinična ćelija prikazana na slici 14.2 je opterećena u pravcu y-ose. Zbog simetrije jedinične ćelije i primenjenog opterećenja, kao i zbog izotropnosti materijala, model je uprošćen tako što je jedna osmina jedinične ćelije uzeta u razmatranje (Slika 14.2). Lokalni koordinatni sistem prikazan na slici 14.2 odgovara globalnom koordinatnom sistemu, a dimenzije redukovane jedinične ćelije su prenete sa realne mikrostrukture tj. sa SEM mikrografije materijala čija se svojstva modeluju, i iznose 3x3x3 µm. Pored dimenzija koje su poslužile ze formiranje reprezentativnog elementa, ulazni parametri su bili i dimenzije pora, njihov oblik kao i zapreminski udeo pora u realnom materijalu. 71 Slika 14.2. Koordinatne mreže konačnih elemenata za: a) sferne i b) nepravilne pore kod hidroksiapatitne keramike Svi tipovi 3D modela su dobijeni korišćenjem ANSYS 5.7, softver paketa za konačne elemente. Korišćeni elementi su 10-to čvorni tetraedri. Reprezentativna mreža konačnih elemenata korišćena za izračunavanje pristine čvrstoće prikazana na slici 14.2 se sastoji od 69435 elemenata i 97546 čvorova. Svaki čvor ima tri stepena slobode koji odgovaraju tri stepena translacije. Podaci o materijalu korišćeni u analizi konačnim elementima uzeti su iz literature [25], gde je vrednost Jungovog modula približno E = 100 GPa, a vrednost Poasonovog koeficijenta ν = 0,28. 15. In vitro i in vivo ispitivanja bioaktivnosti i biokompatibilnosti nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala 15.1. In vitro ispitivanja bioaktivnosti materijala u simuliranom telesnom fluidu Uticaj veličine zrna, tj. smanjenja zrna sa mikro na nano nivo, na bioaktivnost dobijenih biokeramičkih materijala ispitan je in vitro testom u simuliranom telesnom fluidu. Ispitivanja dobijenih materijala su obavljena tako što su uzorci najpre potopljeni u simulirani telesni fluid, 28 dana odležavali na temperaturi od 37 °C, a zatim su osušeni na 105 °C tokom 4 sata. Sastav Kokubo simuliranog telesnog fluida koji je korišćen prilikom in vitro testova prikazan je dat u tabeli 15.1. [267, 268]. Tabela 15.1. Sastav simuliranog telesnog fluida Jon Na+ K+ Ca2+ Mg2+ Cl- HCO3- HPO42- SO42- c(mg/l) 142,0 5,0 2,5 1,5 147,8 4,2 1,0 0,5 72 Mikrostruktura uzoraka je nakon in vitro testova analizirana pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa. Bioaktivnost dobijenih materijala je ustanovljena analizom morfoligije površine uzoraka nakon tretmana u STF. 15.2. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi L929 fibroblasta Uticaj veličine zrna na biokompatibilnost mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 ispitan je na ćelijskoj liniji humanih fibroblasta L929. Ova fibroblastna mišja ćelijska linija je dobijena iz bolnice Hammersmith, London. Ćelije se permanentno čuvaju u tečnom azotu. Nedelju dana pre eksperimenta ćelije su odmrznute, i ispirane od dimetil-sulfoksida (DMSO) u kome su bile smrznute a zatim su kultivisane u plastičnim bočicama za kulture u termostatu na 37 °C i 5 % CO2. Medijum za kulturu je bio kompletni RPMI medijum. Posle sedmodnevne kultivacije konfluentan sloj ćelija je ispran od medijuma a zatim tripsiniziran korišćenjem 2 ml 0,1 % rastvora tripsina (Serva, kataloški broj 37260.02) u toku 10 minuta na 37 °C u termostatu. Pod uticajem tripsina ćelije su odlepljene od podloge, isprane dva puta centrifugiranjem, izbrojane a zatim korišćene za eksperimente. MTT-test MTT test je korišćen za proučavanje metaboličke aktivnosti ćelija. Princip metode se bazira na merenju aktivnosti sukcinil dehidrogenaza u mitohondrijama vijabilnih ćelija. Kompaktni uzorci kalcijum-hidroksiapatita su postavljani u centar bazena plastičnih ploča sa 96 bazena. Nakon toga oko uzoraka pažljivo je naneta suspenzija L929 ćelija u kompletnom RPMI medijumu sa 10 % FCS (0,5 x 104 ćelija/bazenu). Kontrolu su činili uzorci plastike (cover slips) istih dimenzija kao i uzorci za testiranje. Posebnu kontrolu su činili bazeni samo sa L929 ćelijama. Broj replikata je bio 6. Test uzorci i kontrolni uzorci su pre toga sterilisani autoklaviranjem. Inkubacija materijala sa ćelijama je trajala 24 časa, nakon čega su uzorci pažljivo izvañeni iz bazena a ćelije inkubirane sa 100 µl 3-[4,5 dimetil-tiazol – 2 lil]-2,5 difenil tetrazolium bromidom (MTT) (Sigma, Munich, Germany) (1 mg/mL), rastvorenim u kompletnom RPMI medijumi. Bazen sa 100 µl MTT korišćen je kao blank kontrola. Posle 3 sata inkubacije (37 °C, 5 % CO2) dodato je 100 µl / bazenu 10 % sodium – dodecil sulfata (SDS) – 0.1N HCl (Serva, Heidelberg, Germany) radi rastvaranja intracelularnog formazana. Ploče su inkubirane preko noći na sobnoj temperaturi. Optčka gustina (OD) je merena na 570 nm spektrofotometrom (Behring ELISA Processor II, Ingelberg, Germany). Metabolička aktivnost je odreñena na osnovu OD kontrolnih L929 ćelija bez materijala koja je uzeta kao 100 %. 73 Vijabilnost ćelija Kompaktni uzorci kalcijum-hidroksiapatita su postavljani u centar bazena plastičnih ploča sa 96 bazena kako je opisano kod MTT eseja. Inkubacija materijala sa ćelijama je trajala 24 časa, nakon čega su uzorci pažljivo izvañeni iz bazena a ćelije su tripsinizirane i ispirane. Stepen vijabilnosti ćelija je odreñivan bojenjem ćelija sa 1 % Tripan plavim. Korišćenjem svetlosnog mikroskopa nevijabilne ćelije se uočavaju kao pozitivne, plavo obojene ćelije. Procenat nevijabilnih (mrtvih) ćelija je odreñen na osnovu brojanja minimalno 500 ukupnih ćelija po uzorku. Vijabilnost je izračunata po formuli: 100 % - % nevijabilnih ćelija. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost triplikata. Test proliferacije L929 ćelije su kultivisane 24 h odnosno 3 dana sa uzorcima kalcijum-hidroksiapatita ili kontrolnim uzorcima kako je ranije opisano. Posebnu kontrolu su činili bazeni samo sa L929 ćelijama. Po isteku inkubacionog perioda uzorci su pažljivo izvañeni iz bazena a zatim su ćelije tripsinizirane, isprane i izbrojane u Neubair-ovoj komorici. Broj replikata je iznosio 6. Rezultati stepena proliferacije su prikazani u relativnim brojevima, pri čemu je broj ćelija u kulturama bez ispitivanih materijala iznosi 100 %. Test nekroze Kompakti kalcijum-hidroksiapatita su postavljani u centar bazena plastičnih ploča sa 96 bazena kako je opisano kod MTT eseja. Inkubacija materijala sa ćelijama je trajala 24 h, nakon čega su uzorci pažljivo izvañeni iz bazena a ćelije su tripsinizirane i ispirane. Ćelije su inkubirane sa propidium jodidom (PI) (Sigma) rastvorenim u PBS-u (40 µl PI / 1ml PBS) koji boji nekrotične ćelije. Procenat pozitivnih ćelija je izmeren korišćenjem citofluorimetra. Rezultati su izraženi kao relativna vijabilnost L929 ćelija kultivisanih sa test materijalima u odnosu na vijabilnost ćelija kultivisanih bez materijala. Kvalitativni esej Kompaktni uzorci kalcijum-hidroksiapatita su postavljani u centar bazena plastičnih ploča sa 96 bazena kako je opisano kod MTT eseja. Inkubacija materijala sa ćelijama je trajala 24 časa i nakon toga ćelije su ispitivane ispod invertnog svetlosnog mikroskopa Reichert, Austria analizom. Citotoksični efekat je procenjivan notiranjem malformacija, degeneracija, odlepljivanja od podloge, fragmentacije i lize ćelija oko uzorka. 74 Tabela 15.2. Kvalitativno morfološko stepenovanje citotoksičnosti Stepen Reakativnost Izgled ćelijskih kultura 0 odsustvo citotoksičnosti Ćelije su adherentne i normalnog izgleda, ne uočavaju se znaci lize i degeneracije. Mogu biti prisutne diskretne intracitoplazmatične granule. 1 diskretna citotoksičnost Do 20% ćelija je zaokrugljenog oblika i slabo adherentno, bez vidljivih intracitoplazmatičnih granula. Pojedine lizirane ćelije. Blaga inhibicija rasta ćelija. 2 blaga citotoksičnost Do 50% ćelija je zaokrugljenog oblika i slabo adherentno, bez vidljivih intracitoplazmatičnih granula. Umerena liza ćelija. Inhibicija rasta ćelija do 50%. 3 umerena citotoksičnost Do 70% ćelija je zaokrugljenog oblika ili lizirano, ćelijski sloj je potpuno narušen, inhibicija rasta ćelija veća od 50%. 4 ozbiljna citotoksičnost Skoro potpuna destrukcija ćelijskog sloja. 15.3. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi humanih fibroblasta Uticaj veličine zrna na biokompatibilnost mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 ispitan je na ćelijskoj liniji humanih fibroblasta pluća (MRC-5), koje rastu zalepljene za podlogu suda (Costar, 25cm3) u medijumu „Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco BRL, UK)“, sa 4,5g/l glukoze i 10% FCS („fetal calf serum, Sigma“). Medijum sadrži antibiotike: penicilin 100 IJ/ml i streptomicin 100µg/ml. Ćelijska linija je održavana pod standardnim uslovima: na temperaturi 37 °C u atmosferi zasićenoj vlagom, i sa 5 % CO2 (Heraeus). Ćelijska linija je presañivana dva puta nedeljno, a u eksperimentima je korišćena u logaritamskoj fazi rasta izmeñu trećeg i desetog presañivanja. U eksperimentima su korišćene samo žive (vijabilne) ćelije. Broj ćelija i njihova vijabilnost odreñeni su testom odbacivanja boje sa 0, 1 % tripan plavim. Vijabilnost ćelija korišćenih u eksperimentu je bila veća od 90%. DET („Dye exclusion test“-test odbacivanja boje) Ćelije humanih fibroblasta pluća sakupljene u logaritamskoj fazi rasta, su tripsinizirane, resuspendovane i izbrojane u 0, 1 % rastvoru tripan plavog. Vijabilne ćelije su posejane u Petrijevim šoljama („Center well“, Falcon) na kompakte HAP1, mikrotalasno 75 sinterovane na 900 °C i 1200 °C tokom 15 min, u koncentraciji 2⋅105/ml. U kontrolnim uzorcima nije bilo ispitivanih materijala. Petrijeve šolje sa zasejanim ćelijama ostavljene su u termostatu na 37 °C, u atmosferi koja sadrži 5 % CO2 narednih 48 h, 72 h i 96 h. Po isteku inkubacije, nakon 48 h, 72 h i 96 h ćelije su brojane pomoću invertnog mikroskopa u komoricama za brojanje. Korišćena je Neubauer-ova komorica gde se ćelije broje u četiri kvadrata. Svaki kvadrat je podeljen na 16 manjih kvadrata tako da ih ima ukupno 64. Zatim se odmerava 100 µl medijuma sa ćelijama i tome dodaje 100 µl boje 0,1 % tripan-plavog. Rastvor se intenzivno promućka i nekoliko kapi se nanese na sva polja komorice za brojanje. Tripan-plavo boji mrtve ćelije, dok žive ćelije ostaju neobojene. Broj ćelija u 1ml suspenzije se izračunava iz jednačine: X = x ⋅ 10 ⋅ 2 ⋅ 1000 (15.1.) gde je: 10 - dubina komore, 2 - faktor dilucije, 1000 - zapreminski koeficijent, x - broj ćelija u 16 kvadrata (prosečan broj ćelija u 4⋅16 kvadrata). Citotoksičnost je izražena u procentima, a računa se prema formuli: CI = (1-Ns/Nk) ⋅ 100, (15.2.) pri čemu je: Nk - broj ćelija kontrolnih uzoraka, Ns - broj ćelija uzoraka sa ispitivanim materijalom. Frakcija preživelih ćelija izražava se u procentima, a računa se prema formuli: %K = (Ns/Nk) x 100 (15.3.) pri čemu je: Nk - broj ćelija kontrolnih uzoraka, Ns - broj ćelija uzoraka sa ispitivanim materijalom. 76 Kolorimetrijski test sa tetrazolijum solima (MTT- test) Ćelije humanih fibroblasta pluća sakupljene u logaritamskoj fazi rasta, se takoñe najpre tripsiniziraju, resuspenduju i izbroje u 0,1 % tripan plavom. Vijabilne ćelije su posejane u Petrijevim šoljama (50mm, Center well, Falcon) u kojima su se nalazili ispitivani materijali, u koncentraciji 2⋅105/ml. Kontrolni uzorci nisu sadržali ispitivane materijale. Petrijeve šolje sa zasejanim ćelijama ostavljaju se da odleže u termostatu na 37 °C, u atmosferi koja sadrži 5 % CO2 narednih 48 h. Po isteku perioda inkubacije vrši se presejavanje ćelija sa ispitivanih supstanci u svež medijum. Vijabilne ćelije su posejane (u koncentraciji 5x103/100µl) u kvadriplikatu u mikrotitar ploče sa 96 otvora. Ploče sa zasejanim ćelijama odležavaju u termostatu na 37 °C, narednih 48 h, 72 h i 96 h. Rastvor MTT, pripremljen neposredno pre dodavanja, dodat je u sve otvore na ploči u zapremini od 10 µl/otvoru i inkubacija je nastavljena naredna 3 h (u termostatu na 37 °C, sa 5% CO2 ). Po isteku 3 h u svaki otvor je dodato po 100 µl 0,04 mol/HCl u izopropanolu. Apsorbancija je očitavana odmah po isteku inkubacije na čitaču za mikrotitar ploče (Multiscan, MCC/340) na talasnoj dužini od 540 nm i referentnoj od 690 nm. Otvori na ploči koji su sadržali samo medijum i rastvor MTT, ali ne i ćelije, služili su kao slepa proba. Citotoksičnost je izražena u procentima prema formuli: CI = (1-As/Ak) ⋅ 100 (15.4.) pri čemu je: Ak - apsorbancija kontrolnih uzoraka, As - apsorbancija uzoraka sa ispitivanim materijalom. Frakcija preživelih ćelija izražava se u procentima, a računa se prema formuli: %K = (Ns/Nk) x 100 (15.5.) pri čemu je: Nk - broj ćelija kontrolnih uzoraka, Ns - broj ćelija uzoraka sa ispitivanim materijalom. 77 Agar difuzioni test Kao medijum pri agar difuzionom testu korišćen je „Eagle's Basal Medium“, koji sadrži 2,2 g/l natrijum-bikarbonata, 3,0 g/l HEPES-a i 50 ml/l seruma. Pripremljena je i dupla koncentracija medijuma bez HEPES-a i pri koncentraciji natrijum-bikarbonata od 1 g/l. Pri ovom testu moguće je koristiti bilo koji 3 % agar ili 3 % agarozu u destilivanoj vodi. Agar je sterilisan autoklaviranjem, a medijum prečišćen filtriranjem. Osnovna boja pripremljena je rastvaranjem stok solucije 1 % vodenog rastvora „neutral red“ u 1/100 ml/l slanog fosfatnog pufera, neposredno pre korišćenja. Rastvor „neutral red“ je čuvan zaštićen od svetla. Korišćene su Petrijeve šolje prečnika 100 mm. Korišćene su takoñe ćelije u logaritamskoj fazi rasta. Pripremljeno je po 10 ml ćelijske suspenzije (2,5x105 ćelija/ml) u Petrijevim šoljama i inkubirano na 37 °C, u atmosferi sa 5 % CO2, tokom 24h. Sterilni agar je otopljen na 100 °C u vodenom kupatilu i ohlañen na 37 °C. Agar je zatim pomešan sa dva puta koncentrovanim, sveže pripremljenim medijumom u odnosu 1:1 i zagrejan na 48 °C. Aspiriran je medijum iz svake Petrijeve šolje i zamenjen sa 10 ml svežom agar/medijum mešavinom. Agar je ostavljen da očvrsne na sobnoj temperaturi (oko 30 min), zatim je dodato 10 ml „neutral red“ rastvora i ostavljeno 15 – 20 min. Višak „neutral red“ rastvora je odbačen. Petrijeva šolja je bila zaštićena od svetla da se, u prisustvu „neutral red“ ćelije ne bi oštetile. U svaki sud je zatim dodato po dva uzorka test materijala i kontrole, pazeći pritom da uzorci budu udaljeni jedan od drugog kao i od zidova Petrijevih šolja, i inkubirano na 37 °C tokom 24 h. Ispitivan materijal je ispitan u kvadriplikatu (dva suda po vrsti test materijala). Obezbojenost zone oko testiranog materijala i kontrole je procenjena pomoću invertnog mikroskopa sa kalibrisanom pregradom, a indeks obezbojavanja (Decolorization Index) i indeks liziranja (Lysis Index) su odreñeni za svaki uzorak. Odgovor ćelije (Cell response) se predstavlja kao količnik: indeks obezbojavanja/indeks liziranja. 15.4. In vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1 Adhezija osteoblastnih ćelija na monofaznom hidroksiapatitnom materijalu ispitana je na gustim mikrotalasno sinterovanim uzorcima. Za potrebe ovog eksperimenta, izostatskim presovanjem stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita (HAP1) na 400 MPa dobijeni su diskovi prečnika 8 mm koji su mikrotalasno sinterovani na 1200 ºC tokom 15 min. U eksperimentu su korišćene dve grupe test materijala, tj. kompakti mikrotalasno sinterovanog HAP1 pre i posle modifikacije naelektrisanja površine. Naelektrisanje površine materijala je modifikovano da bi se ispitao uticaj negativnog naelektrisanja površine gustih biokeramičkih 78 hidroksiapatitnih materijala na adheziju osteoblastnih ćelija. Prevoñenje naelektrisanja površine uzoraka iz pozitivnog u negativno izvršeno je u autoklavu postupkom hidrogenizacije, pri čemu se odvija depozicija jona vodonika na površini hidroksiapatitnog materijala. Uzorci HAP1 su tokom 1 h bili izloženi dejstvu vodonika, pri radnom pritisku od 6 MPa. Efekat modifikacije naelektrisanja površine je utvrñen detektovanjem emisije elektrona osloboñenih iz površine uzorka. Ćelije korišćene u eksperimentu bile su mišji osteoblasti MC3T3-E1, odgajane u McCoyevom medijumu u koji je dodato 10 % seruma telećeg fetusa, HEPES pufer i penicilin/streptomicin. Pre ispitivanja, u medijum sa kulturom ćelija je dodat tripsin-EDTA, nakon čega su ćelije odležale tokom 1 h na 37 ºC. U ovako pripremljenu kulturu ćelija, pri koncentraciji 5 x 105 ćelija/ml potopljeni su uzorci HAP-a i ostavljeni da odstoje tokom 1 h na 37 ºC. Nakon 1 h suspenzija je dekantovana, a neprilepljene ćelije su uklonjene ispiranjem sa fosfatnim puferovanim rastvorom. Uzorci su fiksirani u 2,5 % rastvoru glutaraldehida puferovanom sa natrijum- kakodilatom i pripremljeni za SEM dehidratacijom u etanolu, nakon čega su osušeni u tečnom C02. SEM snimci osteoblastnih ćelija na površini materijala dobijene su pri uvećanju 300 puta i na radnom odstojanju od 13 mm. Ukupan broj ćelija i procenat ćelija u svakom stadijumu athezije odreñen je brojanjem ćelija na četiri uzorka. 15.5. SEM histološka anliza u okviru in vitro ispitivanja Histološka ispitivanja u okviru in vitro testova urañena je skenirajućom elektronskom mikroskopijom na ureñaju JEOL-JSM 6460LV. Uzorci sa ćelijskim kulturama nakon in vitro ispitivanja su fiksirani na bakarnom nosaču i prvo posmatrani skenirajućim elektronskim mikroskopom u niskom vakumu, pri radnom pritisku od 50 Pa i naponu od 20 KeV. Nakon snimanja mikrografija pri niskom vakumu, osušeni uzorci su napareni zlatom i posmatrani u visokom vakumu, pri istom radnom naponu. 15.6. In vivo ispitivanja biokompatibilnosti materijala metodom primarne kutane iritacije Iritacioni potencijal materijala ispitivan je prema meñunarodnim standardima za ispitivanje biokompatibilnosti, ISO 10993-10:2002/Amd 1: 2006, Biološka evaluacija medicinske opreme, Deo 10: Testovi iritacije i odložene reakcije hipersenzibilizacije. 79 Test materijali (Test uzorci): Iritacioni potencijal ispitivan je za sledeće materijale:  Monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min  Monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 1200 ºC tokom 15 min Test materijal (u obliku diskova prečnika 6,5 mm) bio je u čvrstom stanju pre nanošenja na kožu. Negativna kontrola: Kao negativna kontrola korišćen je materijal koji ne izaziva iritacionu reakciju, hipoalergijski elastični flaster za fiksiranje (SENSIFIKS). Pozitivna kontrola: Kao pozitivna kontrola korišćen je preparat koji potvrñeno dovodi do iritacionih promena, sterilni vodeni rastvor mlečne kiseline (2-hydroxypropanoic acid) koncentracije 98 %, proizvoñač Sigma), na sterilnom filter papiru Milipore, dijametra 5 mm x 2 mm. Eksperimentalne životinje Eksperimenti su urañeni na kunićima mužkog pola (Novozelanski beli kunići, telesne mase 4,2 ± 0,4 kg). Do početka eksperimenta životinje su držane u vivarijumu Instituta za fiziologiju, pod kontrolisanim laboratorijskim uslovima (temperature 22±2 °C, 14 sati svetlo/10 sati mrak, pristup vodi i hrani ad libitum). Eksperimenti su bili odobreni od strane Etičkog komiteta za rad sa eksperimentalnim životinjama Medicinskog fakulteta u Beogradu (br. 3556 od 16.01.2009 godine), i sprovedeni su u saglasnosti sa principima Vodiča Nacionalnog Instituta za zdravlje, za brigu i korišćenje laboratorijskih životinja, kao i prema meñunarodnim standardima ISO10993-2: zahtevi za blagostanje životinja. Dvadeset četiri sata pre primene test materijala, krzno u predelu dorzalne strane trupa obrijano je električnim brijačem na svakom kuniću. Na svakom kuniću obrijana oblast kože leña bila je podeljena u 4 polja iste površine (20 mm x 20 mm), a test material je primenjen na samo dva od četiri polja. Na druga dva polja primenjeni su negativna kontrola (samo hipoalergijski adhezivni flaster, bez test materijala) i pozitivna kontrola (98% mlečna kiselina). Tri kunića su korišćena po grupi; kako je svaki kunić imao po dva mesta za aplikovanje test-materijala, to je ukupno šest oblasti kože bilo moguće analizirati, radi utvrñivanja iritativnih efekata test materijala i njihovih poreñenja sa pozitivnom i negativnom kontrolom. 80 Svi ispitivani delovi kože kunića (tretirani i kontrolni) prekriveni su gazom i hipoalergijskim flasterom. Test-materijal je u direktnom kontaktu sa kožom bio tokom četiri sata. Nakon četiri sata uklonjeni su hipoalergijski flaster, gaza i test supstanca. Nakon jednog sata izvršeno je makro-patološko ispitivanje kože na znake iritacije (prisustvo eritema i edema). Ispitivanje je ponovljeno posle 24 sata, 48 sati i 72 sati (Draize et al. 1944). U toku procene iritacije kože utvrñivano je prisustvo eritema i edema. Stepen izraženosti eritema i edema gradiran je na skali od 0 do 4. Klasifikacija eritema izvršena je na sledeči način: 0 – odsustvo eritema, 1 – veoma slab eritem, jedva uočljiv, 2 – dobro definisan eritem, 3 – umeren do težak eritem, 4 – veoma težak eritem (intenzivan, tamno crven), do povreda u dubini kože (Tabela 15. 3). Klasifikacija edema izvršena je na sledeči način: 0 – odsustvo edema, 1 – veoma slab edem, jedva učljiv, 2 – slab edem (granica polja dobro definisana, uzdignuta - prsten), 3 – umeren edem (uzdiže se približno 1mm), 4 – težak edem (uzdiže se više od 1 mm i širi se više, dalje od mesta izlaganja) (Tabela 15. 4). Tabela 15. 3. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija eritema Klasifikacija eritema Gradiranje Odsustvo eritema 0 Veoma slab eritem, jedva uočljiv 1 Dobro definisan eritem 2 Umeren do težak eritem 3 Veoma težak eritem (intenzivan) 4 Tabela 15. 4. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija edema Klasifikacija edema Gradiranje Odsustvo edema 0 Veoma slab edem, jedva uočljiv 1 Slab edem (granice polja uzdignuta) 2 Umeren edem (uzdiže se 1 mm) 3 Težak edem (uzdiže se više od 1 mm) 4 81 Skor primarne kutane iritacije izračunavan je za svakog kunića po formuli: ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) K hhh T hhh životinjabroj EdErEdErEdEr životinjabroj EdErEdErEdEr SPI         +++++ −         +++++ = ∑∑ 724824724824 gde je Er - eritem; Ed- edem. Indeks primarne kutane iritacije (PII) izračunavan je kao aritmetička sredina vrednosti SPI od tri testirane životinje. PII = ΣSPI / 3. Testirani materijal je, na osnovu vrednosti PII, ocenjivan kao: neiritirajući, blago iritirajući, umereno iritirajući i veoma iritirajući (Tabela 15.5.). Tabela 15. 5. Ocena test materijala na osnovu indeksa primarne kutane iritacije (PII) PII Ocena test materijala 0,0 – 0,4 neiritirajući 0,5 – 1,9 blago iritirajući 2,0 – 4,9 umereno iritirajući 5,0 – 8,0 veoma iritirajući Statistička analiza Rezultati eritema i edema su prikazani kao pojedinačna vrednost za svaku životinju i svako mesto aplikovanja test supstance. Rezultati skora primarne kutane iritacije i indeksa primarne kutane iritacije prikazani su kao srednja vrednost. Poreñenje značajnosti razlika izmeñu srednjih vrednosti skora primarne kutane iritacije izmeñu eksperimentalnih grupa vršeno je uz pomoć Student t-testa. Razlika je smatrana statistički značajnom na nivou p < 0,05. 82 IV. REZULTATI I DISKUSIJA 16. Rezultati karakterizacije polaznih prahova kalcijum-hidroksiapatita U ovom poglavlju prikazani su rezultati karakterizacije sintetisanih prahova kalcijum-hidroksiapatita odreñivanjem: - raspodele veličine čestica, - morfoloških karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom, - morfoloških karakteristika primarnih čestica transmisionom elektronskom mikroskopijom, - faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom, - prisustva karakterističnih grupa infracrvenom spektroskopskom analizom, - odnosa Ca/P i specifične površine B.E.T. metodom. 16.1. Rezultati odreñivanja raspodele veličina čestica kalcijum-hidroksiapatita Raspodela veličina čestica precipitaciono sintetisanih prahova kalcijum- hidroksiapatita, HAP1 i HAP2, prikazana je na slici 16.1. Sa slike se uočava da su čestice prahova HAP1 i HAP2 nalaze veličine od 200 nm do 5 µm. Analizom dijagrama raspodele veličina čestica praha HAP1 primećuje se prisustvo izrazito velikog broja čestica u opsegu 200 - 400 nm, dok najveći broj čestica iz tog intervala ima veličinu od 300 nm. Prah HAP2 sadrži čestice znatno šire raspodele dimenzija, a najveći broj čestica ima veličinu od 350 nm do 800 nm. Kod oba precipitaciono dobijena praha se uočava priličan broj čestica veličine od 1- 5 µm. S obzirom na činjenicu da su nanočestični prahovi metastabilni, zahvaljujući visokoj vrednosti površinske energije, oni su često skloni aglomerisanju. Navedene vrednosti veličina čestica ukazuju da su precipitaciono sintetisani prahovi kalcijum-hidroksiapatita HAP1 i HAP2 delimično sačinjeni od aglomerata dimenzija od 1 µm do 5 µm. Kako je raspodela velilčina čestica prahova HAP odreñena iz vodenog rastvora prethodno tretiranog ultrazvukom, veliki broj čestica veličine nekoliko stotina nanometara ukazuje na činjenicu da su prisutni aglomerati mekani, tj. da se čestice pod dejstvom ultrazvuka delimično deaglomerišu. Sve ove tvrdnje bi trebalo da potvrde rezultati odreñivanja morfologije prahova skenirajućom i transmisionom elektronskom mikroskopijom. 83 0.01 0.1 1 10 100 1000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 HAP2 B ro j c es tic a, % Velicina cestica, µm HAP1 Slika 16.1. Raspodela veličina čestica prahova HAP1 i HAP2 Raspodela veličina čestica hidrotermalno sintetisanih prahova kalcijum- hidroksiapatita, HAP3 i HAP4, prikazana je na slici 16.2. Sa slike se može uočiti da se prah HAP3 sastoji od čestica nešto većih dimenzija, što se može dovesti u vezu sa većom koncentracijom polaznog rastvora, tj. većim polaznim odnosom Ca/P, usled povećane mase rastvorenog CaCl2 za oko 50 %. Većina čestica praha HAP3 se nalaze u intervalu od 1,5 µm do 5 µm. Ove vrednosti ukazuju da je prah HAP3 aglomerisan, kao i da su aglomerati vrlo otporni na dejstvo ultrazvuka, za razliku od prahova HAP1 i HAP2. Raspodela veličina čestica praha HAP4 ukazuje na prisustvo čestica u rasponu od 250 nm do 3 µm. Ovi rezultati dovode do zaključka da je prah HAP4 takoñe sačinjen od aglomerata mikronskih dimenzija, ali i da je evidentno prisustvo čestica nanometarskih dimenzija nakon tretmana ultrazvukom. 0.01 0.1 1 10 100 1000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 HAP3 HAP4 Velicina cestica, µm Br o j c es tic a, % Slika 16.2. Raspodela veličina čestica prahova HAP3 i HAP4 84 16.2. Rezultati odreñivanja morfologije prahova kalcijum-hidroksiapatita skenirajućom elektronskom mikroskopijom SEM mikrografije praha kalcijum-hidroksiapatita HAP1 prikazane su na slikama 16.3 i 16.4. Na slici 16.3 prikazana je mikrgrafija praha HAP1, granulisanog „spray dry” metodom na 105 ºC, koji nije ultrazvučno tretiran. Sa mikrografije se uočava prisustvo uglavnom sferičnih granula mikronskih dimenzija i manjeg broja nepravilnih aglomerata, dimenzija od nekoliko stotina nanometara. Slika 16.3. SEM mikrografija praha HAP1 Da bi se utvrdila struktura aglomerata, prah je dispergovan u apsolutnom alkoholu i tretiran ultrazvukom. SEM mikrografija tako pripremljenog uzorka praha HAP1 prikazana je na slici 16.4. Sa slike se uočava prisustvo finih subčestica dimenzija približno 200-300 nm, što je u slkadu sa rezultatima raspodele veličina čestica za prah HAP1. Slika 16.4. SEM mikrografija praha HAP1 nakon tretiranja ultrazvukom 85 Na slikama 16.5 i 16.6 prikazane su SEM mikrografije praha HAP2. Na slici 16.5 primećuje se prisustvo aglomerata nepravilnog oblika mikronskih dimenzija, kao i odreñen broj neaglomerisanih čestica HAP. Nakon tretmana u ultrazvučnom kupatilu, kao i u slučaju praha HAP1, uočava se prisustvo velikog broja finih subčestica dimenzija nekoliko stotina nanometara (Slika 16.6). Slika 16.5. SEM mikrografija praha HAP2 Slika 16.6. SEM mikrografija praha HAP2 nakon tretiranja ultrazvukom 86 Formiranje većih čestica iz inicijalno formiranih nanokristala se objašnjava njihovom agregacijom. Matijević [269-274] i saradnici su objasnili da formiranje uniformnih čestica u koloidnim sistemima uglavnom ide kroz fazu inicijalnog indukcionog perioda gde dolazi do zasićenja rastvora koji vodi nukleaciji čestica. Dalje ti nukleusi rastu difuzionim mehanizmom, pri čemu se formiraju primarne čestice (subčestice) koje se agregiraju formirajući sekundarne čestice, tj. aglomerate. Sa mikrografije na slici 16.7 se može uočiti da su hidrotermalnom sintezom dobijeni sferni aglomerati vrlo pravilnog oblika i uske raspodele veličina, koje se kreću u opsegu od 1,5 do 5 µm, sto je u skladu sa rezultatima raspodele veličina čestica za prah HAP3, prikazanim na slici 16.2. Slika 16.7. SEM mikrografija praha HAP3 Prikazane sferne čestice su aglomerati sačinjeni od štapićastih subčestica nanometarskih dimenzija, što se može uočiti na slici 16.8. Analizom mikrostrukture preseka sfernih aglomerata uočava se da su ovi aglomerati šuplji, te da je evidentno prisustvo sfernih intraaglomeratnih pora. Sa slike 16.9. se uočava da je i u slučaju sinteze praha HAP4 dobijen aglomerisan prah, kao i da su aglomerati uglavnom sfernog oblika. Dimenzije čestica od kojih je sačinjen prah HAP4 su nešto manje u poreñenju sa sfernim česticama praha HAP3. 87 Slika 16.8. SEM mikrografija preseka sferne čestice praha HAP3 Slika 16.9. SEM mikrografija praha HAP4 88 16.3. Rezultati odreñivanja morfologije primarnih čestica kalcijum-hidroksiapatita transmisionom elektronskom mikroskopijom Morfologija primarnih čestica prahova HAP1 i HAP2 prikazana je na TEM snimcima 16.10 i 16.11. Analizom ovih slika može se zaključiti da se prahovi HAP1 i HAP2 sastoje od primarnih čestica, vrlo slične morfologije dužine do 100 nm i širine oko 20-30 nm. Dobijene nanočestice imaju igličast oblik i vrlo su uske raspodele veličina. Čestice kalcijum-hidroksiapatita HAP1 su neznatno većih dimenzija od čestica praha HAP2. Slika 16.10. TEM snimak primarnih čestica praha HAP1 89 Slika 16.11. TEM snimak primarnih čestica praha HAP2 16.4. Rezultati rendgenske difrakcione analize prahova kalcijum-hidroksiapatita Na slici 16.12 prikazani su rezultati rendgenske difrakcione analize prahova HAP1 i HAP2. Sa dijagrama se može zaključiti da je modifikovanim precipitacionim sintezama došlo do formiranja kalcijum-hidroksiapatita, tj. da u oba slučaja postoji veliko slaganje položaja difrakcionih pikova sa pikovima karakterističnih za kalcijum-hidroksiapatit na kartici JCPDS 9-432. Analizirajući difrakcione pikove prahova HAP1 i HAP2 nije uočeno prisustvo drugih faza. Na osnovu intenziteta i širine pikova, može se uočiti da kalcijum- hidroksiapatiti HAP1 i HAP2 imaju relativno nizak stepen kristaliničnosti. Primarne čestice prahova HAP1 i HAP2 su sastavljene od kristalita veličine oko 35 nm, čija je veličina ustanovljena korišćenjem Shererove jednačine. Odavde se može zaključiti da primarne čestice sadrže 2-3 kristalita. 90 20 40 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ∗ - HAP ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ HAP 2 HAP 1 In te n zi te t 2Θ Slika 16.12. Rendgenska difrakciona analiza prahova HAP1 i HAP2 Rezultati rendgenske difrakcione analize prahova HAP3 i HAP4 su prikazani na slici 16.13. Kao i u slučaju precipitaciono sintetisanih prahova, kod oba difraktograma se uočava veliko slaganje sa pikovima na kartici JCPDS 9-432, pa se može zaključiti da je hidrotermalnim sintezama u oba slučaja došlo do formiranja kalcijum-hidroksiapatita. Prisustvo drugih faza nije uočeno, a analizom oblika pikova uočava se nešto veća kristaliničnost u odnosu na prahove HAP1 i HAP2. Korišćenjem Šererove jednačine izračunata je veličina kristalita hidrotermalno dobijenih prahova, i ona iznosi približno 50 nm. 20 40 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 In te n zi te t HAP 4 HAP 3 ∗ - HAP 2Θ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ Slika 16.13. Rendgenska difrakciona analiza prahova HAP3 i HAP4 91 16.5. Rezultati infracrvene spektroskopske analize prahova kalcijum-hidroksiapatita Rezultati FTIR analize prahova HAP1 i HAP2 prikazani su na slici 16.14. FTIR spektri oba praha sadrže trake karakteristične za kalcijum-hidroksiapatit. Trake karakteristične za fosfatne grupe uočavaju se na 462, 553, 595, 958 i 1024-1115cm-1. Trake karakteristične za hidroksilne jone javljaju se na 3584 i 636 cm-1, a traka karakteristična za HPO42- jon uočljiva je na 873 cm-1. Široke trake na 1650 i 3440 cm-1 ukazuju na prisustvo adsorbovane vode u materijalu. 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 PO4 3- OH- PO4 3- PO4 3- PO4 3-PO4 3- HPO4 2- HAP 2 HAP 1 Talasni broj, cm-1 Slika 16.14. Infracrvena spektroskopska analiza prahova HAP1 i HAP2 FTIR spektri prahova HAP3 i HAP4 prikazani su na slici 16.15, a na njima se uočava prisustvo traka karakterističnih za kalcijum-hidroksiapatit, na istim talasnim dužinama kao i na slici 16.14. Jasno izražene trake koje se javljaju na FTIR spektrima prahova HAP3 i HAP4, na talasnim brojevima 873, 1420 i 1480 cm-1 potiču od inkorporiranih karbonatnih jona u apatitnu strukturu. 92 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 CO3 2- CO3 2- OH- PO4 3- PO4 3- PO4 3- PO4 3- PO4 3- HPO4 2- HAP 4 HAP 3 Talasni broj, cm-1 Slika 16.15. Infracrvena spektroskopska analiza prahova HAP3 i HAP4 16.6. Rezultati odreñivanje odnosa Ca/P i specifične površine prahova kalcijum-hidroksiapatita Rezultati proistekli iz odreñivanja odnosa Ca/P induktivno-spregnutom plazma spektroskopijom prahova HAP1 i HAP2 dati su u tabeli 16.1. Vrednost Ca/P odnosa kod praha HAP1 iznosi 1,67, što odgovara stehiometrijskom odnosu karakterističnom za kalcijum-hidroksiapatit. Stehiometrijski odnos Ca/P u dobijenom prahu bi trebalo da bude garancija da tokom sinterovanja na temperaturama do 1200 ºC neće doći do fazne transformacije kalcijum-hidroksiapatita u trikalcijum-fosfat. Odnos Ca/P u slučaju praha HAP2 iznosi 1,62. Na osnovu ove vrednosti se može zaključiti da je kalcijum-hidroksiapatit HAP2 kalcijum deficitaran, kao i da tokom sinterovanja može doći do delimične fazne transformacije u trikalcijum-fosfat. Tabela 16.1. Vrednosti odnosa Ca/P prahova HAP1 i HAP2 Oznaka praha Odnos Ca/P HAP1 1,67 ± 0,01 HAP2 1,62 ± 0,01 93 U tabeli 16.2 su prikazani polazni odnosi Ca/P u rastvoru pre hidrotermalnog tretmana pri sintezi HAP3 i HAP4. Na osnovu ovih vrednosti može se očekivati da odnos Ca/P bude bliži stehiometrijskom u slučaju HAP3, kao i da će se prilikom sinterovanja u manjem procentu odviti fazna transformacija kalcijum-hidroksiapatita u trikalcijum-fosfat. Tabela 16.2. Vrednosti odnosa Ca/P u polaznom rastvoru prahova HAP3 i HAP4 U tabeli 16.3 prikazane su vrednosti specifičnih površina sintetisanih prahova. Najveću vrednost specifične površine ima prah HAP2. Može se primetiti da hidrotermalno sintetisani prahovi imaju znatno manje vrednosti specifičnih površina od precipitaciono dobijenih kalcijum-hidroksiapatita, što može da se dovede u vezu sa većom kristaliničnošću hidrotermalno sintetisanih prahova. Tabela 16.3. Vrednosti specifičnih površina prahova HAP1 – HAP4 Oznaka praha Odnos Ca/P HAP3 1,42 ± 0,01 HAP4 0,96 ± 0,01 Oznaka praha Specifična površina, m2/g HAP1 59 ± 5 HAP2 72 ± 1 HAP3 39± 3 HAP4 36 ± 3 94 17. Karakterizacija uniaksijalno i izostatski ispresovanih kompakata kalcijum-hidroksiapatita Uniaksijalnim presovanjem prahova kalcijum-hidroksiapatita HAP1-HAP4, pri dejstvu pritiska od 100 MPa dobijeni su kompakati čije su gustine prikazane u tabeli 17.1. Vrednost gustina polaznih kompakata prahova HAP1 i HAP2 su identične, i iznose 44 % od teorijske gustine kalcijum-hidroksiapatita. Kompakti dobijeni uniaksijalnim presovanjem prahova HAP3 i HAP4 imaju neznatno veću vrednost gustine, i ona iznosi 1,40 g/cm3 tj. oko 45% od teorijske gustine kalcijum-hidroksiapatita. Tabela 17.1. Vrednosti gustina uniaksijalno presovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 100MPa Sa ciljem da se dobije veća polazna gustina kompakata, a samim tim i da se poveća dodirna površina izmeñu čestica pre sinterovanja, prahovi HAP1-HAP4 su najpre ispresovani uniaksijalno na 100 MPa, a zatim izostatski na 400 MPa, a gustine tako dobijenih kompakata su prikazane u tabeli 17.2. Iz tabele se može oučiti da se kompakti dobijeni izostatskim presovanjem prahova odlikuju znatno većim polaznim gustinama, i da se vrednosti polaznih gustina kreću i do 60% od teorijske vrednosti u slučaju HAP1. Kompakti drugih prahova se odlikuju nešto manjim, ali takoñe relativno visokim vrednostima polaznih gustina. U slučaju hidrotermalno sintetisanih prahova, izostatskim presovanjem na 400 MPa, postižu se za oko 13 % veće polazne gustine u poreñenju sa uniaksijalno presovanim kompaktima. Tabela 17.2. Vrednosti gustina izostatski presovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 400 MPa Oznaka praha Gustina kompakata, g/cm3 % teorijske gustine HAP1 1,35 44 HAP2 1,35 44 HAP3 1,40 45 HAP4 1,40 45 Oznaka praha Gustina kompakata, g/cm3 % teorijske gustine HAP1 1,89 60 HAP2 1,76 56 HAP3 1,83 58 HAP4 1,83 58 95 Na slici 17.1 prikazane su SEM mikrografije izostatski ispresovanih kompakata HAP1-HAP4 na 400 MPa. Sa mikrografija se uočava izuzetno gusta mikrostruktura ispresovanih kompakata HAP1 i HAP2. Na osnovu mikrografske analize se može zaključiti da su prahovi HAP1 i HAP2 sačinjeni od mekih aglomerata, i da je presovanjem moguće dobiti kompakte izuzetno visokog stepena uniformnosti. U slučaju prahova HAP3 i HAP4 se takoñe uočava gusto pakovanje polaznih čestica, ali je primetno da su sferni aglomerati čestica postojani i nakon dejstva izuzetno visokog pritisaka. Na osnovu ovoga se može zaključiti da je u slučaju prahova HAP3 i HAP4 reč o izuzetno tvrdim i postojanim sfernim aglomeratima. a) b) c) d) Slika 17.1. SEM mikrografije izostatski ispresovanih kompakata HAP1 – HAP4 na 400 MPa 96 17.1. Rezultati ispitivanja uticaja veličine izostatskog pritiska na raspodelu pora ispresovanih kompakata Sa ciljem da se utvrdi zavisnosti raspodele veličina pora i specifične površine kompakata polaznih prahova od veličine primenjenog pritiska, stehiometrijski prah kalcijum-hidroksiapatita HAP1 je izostatski ispresovan na pritiscima od 100 MPa, 200 MPa, 300 MPa i 400 MPa. Gustine dobijenih kompakata su prikazane u tabeli 17.3., odakle se može videti da gustine značajno rastu sa povećanjem pritiska. Tabela 17.3. Vrednosti gustina izostatski presovanih kompakata HAP1 na 100 - 400 MPa Na slici 17.2 je prikazana zavisnost ukupne zapremine pora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska. Ukupna zapremina pora nepresovanog praha kalcijum- hidroksiapatita iznosila je 0,59 cm3/g. Nakon presovanja praha na 100 MPa specifična zapremine pora je smanjena na 0,41 cm3/g. Daljim povećanjem pritiska vrednost ukupne zapremina pora je sve vreme imala trend pada, a pri maksimalnom primenjenom pritisku od 400 MPa iznosila je 0,29 cm3/g, što je za približno 50 % manja vrednost od polazne zapremine pora nepresovanog praha. Da bi se ustanovilo u kom opsegu se kreću veličine pora ispresovanih kompakata, odreñena je njihova raspodela u mezo i mikro intervalu, a utvrñena je i zavisnost zapremine mikro i mezo pora od pritiska. Pritisak, MPa Gustina kompakata, g/cm3 % teorijske gustine 100 1,43 45 200 1,54 49 300 1,67 53 400 1,89 60 97 0 100 200 300 400 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 Uk u pn a za pr em in a po ra , c m 3 /g Pritisak, MPa Slika 17.2. Ukupna zapremina pora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Raspodela veličina mezopora praha HAP1 prikazana je na slici 17.3. Sa dijagrama se uočava vrlo široka raspodela veličina, kao i da najveći udeo pora u mezo opsegu (2-50 nm) ima vrednost od 30-40 nm. Sa slike 17.4 uočava se da se presovanjem na pritisku od 100 MPa pikovi sa maksimalnom visinom na dijagramu raspodele mezopora pomeraju ka manjim vrednostima, tj. da se najveći udeo pora nalazi u intervalu od 10-25 nm. 0.00 0.01 0.02 0.0 0.1 0.2 0.3 1 10 100 ø / nm V P o re / c m 3 g - 1 d V /d ø / c m 3 n m - 1 g - 1 Slika 17.3. Raspodela veličina mezopora praha HAP1 98 0.00 0.01 0.02 0.03 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 10 100 ø / nm V P o re / c m 3 g - 1 d V /d D (cm 3 n m - 1 g - 1 ) Slika 17.4. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 100 MPa Daljim povećanjem pritiska na 200 MPa dobija se kompakt koji karakteriše izuzetno uska raspodela veličina mezopora, a najveći udeo mezopora ima vrednost približno 15 nm (Slika 17.5.). Sa dijagrama na slici 17.5 takoñe se uočava znatno manji broj pora u intervalu od 2-10 nm, sto je posledica smanjenja dimenzija pora iz mezo u mikro opseg usled dejstva većeg pritiska. Daljim povećanjem pritiska na 300 MPa, odnosno 400 MPa, (Slike 17.6 i 17.7.) trend pomeranja pikova sa maksimalnom visinom na dijagramu raspodele mezopora prema manjim vrednostima se nastavlja. 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 1 10 100 ø / nm V P o re / c m 3 g - 1 d V /d D (cm 3 n m - 1 g - 1 ) Slika 17.5. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 200 MPa 99 0.00 0.02 0.04 0.0 0.1 0.2 0.3 1 10 100 ø / nm V P o re / c m 3 g - 1 d V /d ø / c m 3 n m - 1 g - 1 Slika 17.6. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 300 MPa 0.00 0.02 0.04 0.06 0.0 0.1 0.2 1 10 100 ø / nm V P o re / c m 3 g - 1 d V /d ø / c m 3 n m - 1 g - 1 Slika 17.7. Raspodela veličina mezopora kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa Pomeranja pikova sa maksimalnom visinom na dijagramu raspodele mezopora prema manjim vrednostima sa povećanjem pritiska, prati smanjenje ukupne zapremine mezopora, što je prikazano na slici 17.8. Na dijagramu 17.8 se može uočiti povećanje ukupne zapremine mezopora pri presovanju na 100 MPa, u odnosu na nepresovan prah, što je posledica smanjenja veličine pora većih od 50 nm na mezo nivo veličina. Poredeći ukupnu zapreminu pora i ukupnu zapreminu mezopora, (Slike 17.2 i 17.8), možemo zaključiti da većina prisutnih pora u kompaktima HAP1 presovanim na pritiscima u intervalu 100-400 MPa pripada mezo nivou. 100 0 100 200 300 400 0.22 0.24 0.26 0.28 0.30 0.32 0.34 0.36 0.38 0.40 Uk u pn a za pr e m in a m e zo po ra , c m 3 /g Pritisak, MPa Slika 17.8. Zapremina mezopora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Zapremina mikropora kompakata HAP1 u funkciji pritiska prikazana je na slici 17.9. Sa dijagrama se vidi da uzorak ispresovan na 100 MPa ima znatnoveći udeo mikropora od samog praha HAP1. Razlog za to može da bude smanjenje veličine odreñenog broja mezopora, bliskim po dimenzijama mikroporama (slike 17.3 i 17.4.) ispod vrednosti od 2 nm. Daljim povećanjem pritiska do vrednosti od 300 MPa ukupna zapremina mikropora se smanjuje, što je posledica smanjenja njihovog broja i dimenzija usled dejstva izrazito velikih pritisaka, a zatim beleži porast kod kompakta ispresovanog na 400 MPa. S obzirom na činjenicu da je daljim povećanjem pritiska logično bilo da se veličina mikropora i dalje smanjuje, pretpostavka je da ovaj porast njihove ukupne zapremine može da bude posledica smanjenja većeg broja mezopora na nivo ispod 2 nm, tj, da je upravo vrlo visok pritisak od 400 MPa uzrok ovog trenda rasta udela mikropora. 101 0 100 200 300 400 0.027 0.028 0.029 0.030 0.031 0.032 Pritisak, MPa Uk u pn a za pr e m in a m ik ro po ra , cm 3 /g Slika 17.9. Zapremina mikropora kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Identičan trend porasta i opadanja kao na dijagramu zavisnosti zapremine mikropora od pritiska, uočljiv je i na dijagramu zavisnosti specifične površine kompakata HAP1 od pritiska (Slika 17.10.), što je logičan sled s obzirom na dominantan uticaj mikropora na vrednost specifične površine. 0 100 200 300 400 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 Pritisak, MPa Sp e ci fic n a po v rs in a , m 2 /g Slika 17.10. Specifična površina kompakata HAP1 u funkciji izostatskog pritiska Uopšteno posmatrano, analizom uticaja pritiska na raspodelu i ukupnu zapreminu pora, može se zaključiti da se izostatskim presovanjem na 400 MPa dobija polazni kompakt sa najmanjom ukupnom zapreminom pora, minimalnom zapreminom mezopora i najmanjom dimenzijom mezopora. 102 17.2. Rezultati ispitivanja uticaja pritiska na sinterovanje kalcijum-hidroksiapatita Sa ciljem da se ustanovi uticaj izostatskog pritiska na sinterabilnost kalcijum- hidroksiapatita, kompakti HAP1 ispresovani izostatski na pritiscima od 100-400 MPa sinterovani su na temperaturi 1200 ºC tokom 2 h. Mikrostrukture sinterovanih uzoraka su prikazane na slikama 17.11-17.14. Sa SEM slika se uočava da sa porastom pritiska od 100 MPa do 300 MPa dolazi do intenziviranja denzifikacije materijala pri sinterovanju. Slika 17.11. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 100 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Slika 17.12. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 200 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h 103 Slika 17.13.SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 300 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Mikrostruktura uzorka izostatski ispresovanog na 400 MPa, a zatim sinterovanog na 1200 ºC (Slika 17.14.) ukazuje na znatan porast gustine dobijenog uzorka u odnosu na uzorke presovane na nižim pritiscima, što je bilo za očekivati nakon analize rezultata dobijenih odreñivanjem raspodela pora ispresovanih kompakata. Gustina uzoraka ispresovanog na 400 MPa i sinterovanog na 1200 ºC iznosi 3,00 g/cm3 tj. 95% od teorijske gustine kalcijum-hidroksiapatita. Prosečna veličina zrna uzorka dobijenog pri ovim uslovima iznosila je 3 µm. Slika 17.14. SEM mikrografija kompakta HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h 104 Generalno, ispitivanjem uticaja veličine izostatskog pritiska na presovanje nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita, zaključeno je da se presovanjem na pritisku od 400 MPa dobijaju polazni kompakti najvećih gustina (1,89 g/cm3 ili 60 % TG), najmanje ukupne zapremine pora, najuže raspodele veličina pora i najmanje zapremine mezopora, kao i da se sinterovanjem ovako dobijenih kompakata dobijaju materijali najvećih gustina i najuniformnije mikrostrukture. 17.3. Rezultati uniaksijalnog presovanja i sinterovanja kalcijum-hidroksiapatita na ekstremno visokim pritiscima Jedan od osnovnih ciljeva pri procesiranju savremenih biokeramičkih materijala je dobijanje materijala velikih gustina i uniformnih mikrostruktura sa što je moguće manjom prosečnom veličinom zrna. Jedan od načina da se dobije gust biokeramički materijal sa finozrnom strukturom je snižavanje temperature sinterovanja, presovanjem prahova na ekstremno visokim pritiscima, reda veličine GPa. Na ovaj način se značajno povećava mehanički kontakt izmeñu čestica praha i iz tog razloga je sinterovanje moguće na nižim temperaturama. Na slici 17.15a je prikazana mikrostruktura uzorka dobijenog presovanjem praha HAP1 na pritisku od 2,5 GPa i sinterovanog na 900 ºC tokom 2 h. S obzirom na činjenicu da je temperatura sinterovanja kalcijum-hidroksiapatita u konvencionalnim uslovima najčešće 1200 ºC, u ovom slučaju primena ekstremno visokih pritisaka uticala je na snižavanje temperature sinterovanja na 900 ºC. Sinterovanjem na 300 ºC nižoj temperaturi od uobičajene za kalcijum-hidroksiapatit, dobijen je gust uzorak koji se odlikuje prosečnom veličinom zrna od 150 nm. a) b) Slika 17.15. SEM mikrografija kompakta HAP1: a) uniaksijalno ispresovanog na 2.5 GPa, b) isostatski ispresovanog na 400 MPa, a nakon toga sinterovanih na 900 ºC tokom 2 h 105 Na slici 17.15b je prikazana mikrostruktura uzorka ispresovanog na 400 MPa i sinterovanog pri istim uslovima kao i uzorak na slici 17.15a. Na slici 17.15b se uočava porozna mikrostruktura i pored primene relativno velikog pritiska od 400 MPa, koji očigledno nije dovoljan da bi snizio temperaturu sinterovanja u konvencionalnim uslovima na 900 ºC. Poredeći ove dve mikrostrukture može se konstatovati pozitivan efekat primene ekstremno visokih pritisaka na densifikaciju i mikrostrukturne karakteristike dobijenih biokeramičkih materijala. 18. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem Primena mikrotalasa pri procesiranju biokeramičkih materijala sinterovanjem imala je za cilj da snižavanjem temperature i skraćivanjem vremena sinterovanja limitira rast zrna, a samim tim omogući dobijanje materijala optimalnih mikrostrukturnih, faznih i mehaničkih karakteristika. Homogena raspodela temperatura po zapremini uzorka, koju omogućuje homogeno mikrotalasno polje uspostavljeno u komori za sinterovanje, omogućuje dobijanje materijala izuzetno homogene mikrostrukture. Sa ciljem da se dobiju gusti biokeramički materijali, monofazni kalcijum- hidroksiapatitni i bifazni na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, sa zrnima nano dimenzija, polazni kompakti HAP1 i HAP2 su mikrotalasno sinterovani na temperaturama od 900-1200 ºC tokom 15 min. Karakterizacijom je utvrñen uticaj parametara procesiranja mikrotalasnim sinterovanjem na mikrostrukturu, fazni sastav i mehanička svojstva dobijenih biokeramičkih materijala. 18.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom Rezultati rendgenske difrakcione analize uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita, HAP1, na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min su prikazani na slici 18.1. Analizom difraktograma je utvrñeno prisustvo pikova karakterističnih za kalcijum-hidroksiapatit kod svih sinterovanih uzoroka. Odsustvo pikova karakterističnih za trikalcijum-fosfat u svim slučajevima pokazuje da nije došlo do fazne transformacije kalcijum-hidroksiapatita, te se može sa sigurnošću tvrditi da je mikrotalasnim sinterovanjem praha HAP1 došlo do formiranja monofaznog kalcijum- hidroksiapatitnog biokeramičkog materijala. 106 Na slici 18.2 prikazani su XRD dijagrami uzoraka HAP2 mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min. Analizom ovih dijagrama dolazi se do zaključka da se sinterovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita, HAP2, na 900 ºC i 1000 ºC dobijaju bifazni kompakti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i β-trikalcijum-fosfata. Sa difraktograma se može uočiti da je u oba slučaja kalcijum-hidroksiapatit dominantna faza. U slučaju uzorka sinterovanog na 1000 ºC uočava se nešto veći procenat nastalog β- trikalcijum-fosfata u odnosu na uzorak sinterovan na 900 ºC. Poreñenjem faznog sastava ova dva uzoraka sa uzorcima sinterovanim na 1100 ºC i 1200 ºC, primećuje se da se na temperaturama iznad 1100 ºC odigrava fazna transformacija β-TCP u α-TCP, kao i da se udeo α-TCP u uzorku povećava sa povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC. 20 30 40 50 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 d) c) b) a) d) 1200ºC c) 1100ºC b) 1000ºC a) 900ºC In te n zi te t 2Θ Slika 18.1. Rendgenska difrakciona analiza uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP1 na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min 107 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 d) c) b) a)    • * * * * • • * ** * *  − α−TCP * - HAP • − β−TCP d) 1200ºC c) 1100ºC b) 1000ºC a) 900ºC In te n zi te t 2Θ Slika 18.2. Rendgenska difrakciona analiza uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP2 na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min 18.2. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom Mikrostrukture uzoraka dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP1 na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min prikazane su na slikama 18.3-18.6. Skenirajućom elektronskom mikroskopijom površine lomova je utvrñeno da se dobijeni biomaterijali odlikuju gustim i uniformnim mikrostrukturama. Sa mikrografije uzorka sinterovanog tokom 15 min na 900 °C prikazanog na slici 18.3 se može uočiti gusta mikrostruktura, homogena raspodela veličine zrna, prosečne veličine zrna 130 nm. 108 Slika 18.3. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 18.4. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min SEM mikrografi uzoraka HAP1 na slikama 18.4-18.6 ukazuju na postepen porast zrna sa nano na mikro nivo sa povećanjem temperature sinterovanja. Mikrostruktura uzorka sinterovanog na 1000 °C, prikazana je na slici 18.4. Sa ove slike se može uočiti takoñe gusta mikrostruktura, homogena raspodela veličine zrna sa nešto većom vrednošću prosečne veličine zrna od 250 nm. Dalje povećanje temperature sinterovanja na 1100 °C utiče na porast zrna na 0,75 µm (Slika 18.5.). Mikrostruktura uzorka sinterovanog tokom 15 min na 1200 °C, (Slika 18.6.), odlikuje se takoñe gustom mikrostrukturom i prosečnom veličinom zrna od 1,6 µm. 109 Slika 18.5. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 18.6. SEM mikrografija uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Na slikama 18.7-18.10 prikazane su mikrostrukture bifaznih HAP/TCP biokeramičkih kompakata mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min. Prosečna veličina zrna uzoraka mikrotalasno sinterovanih na 900 °C i 1000 °C je 100 nm i 480 nm, respektivno (Slike 18.7 i 18.8.). 110 Slika 18.7. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min Slika 18.8. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min 111 Slika 18.9. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Povećanje temperature sinterovanja na 1200 °C izaziva rapidno povećanje prosečne veličine zrna na 4,7 µm (Slika 18.10.), što je trostruko veća vrednost veličine zrna u odnosu na sinterovan kompakt HAP1 u kome nije došlo do fazne transformacije HAP-a u TCP. Slika 18.10. SEM mikrografija uzorka HAP2 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Na slici 18.11 prikazana je zavisnost veličine zrna od temperature sinterovanja u slučaju monofaznih HAP1 i bifaznih HAP2 biokeramičkih materijala, koja pokazuje da su prosečne veličine zrna u slučaju HAP2 značajno veće na temperaturama većim od 1000 ºC 112 u odnosu na HAP1. Sa povećanjem temperature sinterovanja povećava se razlika vrednosti prosečne veličine zrna bifaznih HAP/TCP kompakata u odnosu na monofazne HAP kompakte. 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 0 2 4 6 HAP1 HAP2 V el ic in a zr n a, µm Temperatura mikrotalasnog sinterovanja,ºC Slika 18.11. Veličina zrna HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Brži rast zrna pri sinterovanju kalcijum deficitarnog hidroksiapatita je u skladu sa objavljenim rezultatima Raynauda sa saradnicima [173]. Prema njihovim tvrdnjama, povezivanje primarnih čestica HAP-a se tokom sinterovanja odvija u tri sukcesivna koraka: zaobljivanja čestica, formiranje mostova na mestima kontakata čestica i formiranja zrna stapanjem čestica, brzinom koja prema njihovim tvrdnjama raste sa smanjenjem odnosa Ca/P. Nastajanje vakancija odlaskom CO2 iz strukture omogućuje olakšani transfer materije, i utiče na brži rast zrna u slučaju sinterovanja kalcijum deficitarnog HAP. Brži rast zrna sa smanjenjem odnosa Ca/P u polaznom prahu prema istim autorima je dovedeno u vezu sa intenzivnijim povezivanjem čestica na nižim temperaturama u slučaju kalcijum deficitarnog HAP-a, što se prema njihovim pretpostavkama dešava pre početka fazne transformacije HAP-a u TCP. 18.3. Rezultati odreñivanja gustine i relativnog linearnog skupljanja Na slici 18.12 prikazano je relativno linearno skupljanje kompakata HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja. Sa dijagrama se uočava da je tokom sinterovanja kompakata HAP1 na 900 ºC i 1000 ºC skupljanje iznosilo 20,4 % odnosno 24,5 %, respektivno. Daljim povećanjem temperature sinterovanja do 1200 ºC vrednost relativnog linearnog skupljanja se neznatno povećava, dok je ranije uočen značajan rast prosečne veličine zrna u okviru ovog intervala temperatura, sa nano na mikro nivo. 113 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 10 12 14 16 18 20 22 24 26 Li ne ar n o sk u pjl an je, % Temperatura mikrotalasnog sinterovanja,ºC HAP1 HAP2 Slika 18.12. Relativno linearno skupljanje HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Gustine monofaznih kompakata HAP1 sinterovanih na temperaturama od 900 ºC do 1200 ºC su prikazani u tabeli 18.1, a nalaze se u okviru intervala od 2,76 g/cm3 do 2,98 g/cm3. Tabela 18.1. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP1 na 900 - 1200 ºC Tokom sinterovanja kompakta HAP2 vrednost relativnog linearnog skupljanja na 900 ºC iznosi svega 11 %. Razlog ovako malom skupljanju materijala je loša sinterabilnost kalcijum deficitarnog HAP2 na temperaturi 900 ºC, što se potvrñuje vrednošću gustine uzorka koja iznosi svega 1,60 g/cm3 (Tabela 18.2.). Povećanjem temperature sinterovanja na 1000 ºC, vrednost relativnog linearnog skupljanja rapidno raste i dostiže maksimalnu vrednost od približno 25 %, dok sa daljim povećanjem temperature do 1200 ºC neznatno opada. Gustina kompakata HAP2 sinterovanog na 1000 ºC iznosi 2,60 g/cm3, dok sa daljim porastom temperature sinterovanja na 1200 ºC i gustina biokeramičkih kompakata dobijenih sinterovanjem HAP2 opada do vednosti 2,56 g/cm3. Smanjenje vrednosti relativnog linearnog skupljanja kao i smanjenje gustine bifaznog materijala sa porastom temperature sinterovanja iznad 1000 ºC pripisuje faznoj transformaciji β-TCP (3,07 g/cm3) → α-TCP (2,84 g/cm3), koja je obično praćena ekspanzijom i nastankom faze sa manjom teorijskom gustinom. Temperatura sinterovanja, ºC Gustina kompakata, g/cm3 900 2.76 1000 2.79 1100 2.90 1200 2.98 114 Tabela 18.2. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP2 na 900 - 1200 ºC 18.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem Dijagram na slici 18.13 prikazuje zavisnost tvrdoće sinterovanih uzoraka HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja. U slučaju monofaznih HAP1 kompakata, povećanje temperature mikrotalasnog sinterovanja sa 900 ºC na 1200 ºC dovodi do relativno malog povećanje tvrdoće, sa 3,45 GPa na 4,85 GPa. U slučaju bifaznih HAP/TCP kompakata, maksimalna vrednost tvrdoće se postiže sinterovanjem na 1000 ºC, i iznosi 4,28 GPa, što je i očekivano s obzirom na vrednosti pre svega relativnog linearnog skupljanja, a takoñe i gustine. Daljim povećanjem temperature sinterovanja, vrednost tvrdoće bifaznih HAP/TCP kompakata opada. Smanjenje tvrdoće pripisuje se sa jedne strane ekpanziji izazvanom faznom transformacijom β-TCP → α-TCP, koja inicira pojavu naprezanja u sinterovanom materijalu, a sa druge strane intenzivnom rastu zrna do vrednosti 4,7 µm, pri sinterovanju HAP2 na 1200 ºC [173, 198]. Generalno, ovi razlozi mogu biti uzrok manjh vrednosti tvrdoće bifaznih HAP/TCP materijala u poreñenju sa monofaznim materijalima na bazi kalcijum-hidroksiapatita. 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 2 4 6 8 Tv rd o ca , G Pa Temperatura mikrotalasnog sinterovanja,ºC HAP1 HAP2 Slika 18.13. Tvrdoća uzoraka HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Temperatura sinterovanja, ºC Gustina kompakata, g/cm3 900 1.60 1000 2.60 1100 2.58 1200 2.56 115 Žilavost mikrotalasno sinterovanih monofaznih uzoraka kalcijum-hidroksiapatita i bifaznih HAP/TCP kompakata u funkciji temperature sinterovanja prikazana je na slici 18.14. Vrednost žilavosti bifaznog HAP/β-TCP kompakta dobijenog na 900 ºC iznosi 0,56 MPa m1/2, dok povećanje temperature sinterovanja na 1000 ºC utiče na povećanje žilavosti na 0,75 MPa m1/2. Dalje povećanje temperature sinterovanja na 1200 ºC iniciralo je delimičnu transformaciju β-TCP u α-TCP, koja je praćena povećanjem žilavosti do vrednosti 0,92 MPam1/2. Povećanje žilavosti sa povećanjem temperature sinterovanja objašnjava se većim stepenom sinterovanja na višim temperaturama, bez obzira što se gustina kompakata smanjuje sa povećanjem temperature. Gustina se smanjuje, kao što je već rečeno zbog fazne transformacije β-TCP (3,07 g/cm3) veće gustine u α-TCP (2,84 g/cm3) manje gustine. Drugi potencijalni razlog za povećanje žilavosti je veći udeo trikalcijum-fosfata u bifaznom sistemu, koji ima veću teorijsku vrednost žilavosti od kalcijum-hidroksiapatita (Teorijske vrednosti koeficijenata žilavosti: Kic (HAP) = 0,9 MPa m1/2 i Kic (TCP) = 1,3 MPa m1/2). 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 HAP1 HAP2 Zi la v o st , M Pa m 1/ 2 Temperatura mikrotalasnog sinterovanja,ºC Slika 18.14. Žilavost uzoraka HAP1 i HAP2 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Uprkos većoj teorijskoj vrednosti koeficijenta žilavosti trikalcijum-fosfata, njegovo nastajanje tokom sinterovanja HAP ima negativan efekat na sam proces sinterovanja, kao i na mehanička svojstva sinterovanog materijala, što se vidi poreñenjem vrednosti žilavosti bifaznih materijala sa monofaznim hidroksiapatitnim materijalima, dobijenih na 900 ºC, 1000 ºC i 1100 ºC. Sam proces sinterovanja se prema pojedinim autorima usporava sa porastom udela TCP u bifaznoj smeši [55, 173, 232]. Prisustvo većeg udela TCP u HAP matriksu može biti limitirajući faktor za sinterovanje, što se dovodi u vezu sa difuzionim fenomenima i intenzivnijem povezivanjem primarnih čestica koje se odvija na nižim temperaturama od temperature fazne transformacije. Kao što je već navedeno, ovaj fenomen je povezan sa nastajanjem vakancija u strukturi prilikom sinterovanja kalcijum deficitarnog HAP, što omogućuje olakšani transfer materije direktno utičući na brži rast 116 zrna u bifaznom sistemu. Generalno posmatrano monofazni biokeramički materijali na bazi HAP-a imaju bolja mehanička svojstva u odnosu na bifazne HAP/TCP materijale, te je stoga odsustvo TCP u biokeramičkim materijalima, sa stanovišta mehanike poželjno. Analizom dijagrama prikazanog na slici 18.14, uočava se da mikrotalasno sinterovani monofazni biokeramički materijali imaju veće vrednosti žilavosti u odnosu na bifazne biokeramičke materijale. Vrednosti koeficijenata žilavosti monofaznog HAP i bifaznog HAP/TCP kompakta sinterovanih na 900 ºC iznose 1,30 MPa m1/2 i 0,56 MPa m 1/2 , respektivno, dok vrednosti koeficijenata žilavosti kompakata sinterovanih na 1100 ºC iznose 0,89 MPa m1/2 i 0,75 MPa m1/2, respektivno. Uočava se da snižavanje temperature sinterovanja i smanjenje veličine zrna ka nano nivou utiče na povećanje razlike vrednosti žilavosti izmeñu monofaznih materijala na bazi HAP i bifaznih HAP/TCP biomaterijala, kao i da je ta razlika u slučaju materijala sinterovanih na 900 ºC veća od 50 %. Sa slike 18.14 se uočava da žilavost monofaznog HAP raste sa sniženjem temperature sinterovanja, što ide u prilog činjenici da smanjenja veličine zrna ima dominantan uticaj na porast žilavosti ovih materijala. Žilavost monofaznih HAP kompakata se sa smanjenjem temperature sinterovanja sa 1200 ºC na 900 ºC povećava od vrednosti 0,85 MPa m1/2 na 1,3 MPa m1/2 (Slika 18.14). Na slici 18.15 je prikazana zavisnost žilavosti monofaznih materijala na bazi HAP u funkciji prosečne veličine zrna. HAP kompakti sinterovani na 1200 ºC i 1100 ºC, koji se odlikuju prosečnom vrednošću veličine zrna od 1,59 µm i 750 nm, imaju vrednosti koeficijenata žilavosti od 0,85 MPa m1/2 and 0,89 MPa m1/2, respektivno. 0 .0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1 .2 1 .4 1 .6 1.8 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Zi la v o st , M Pa m 1/ 2 V elicina zrna, µm Slika 18.15. Žilavost uzoraka HAP1 u funkciji veličine zrna 117 Smanjenje prosečne veličine zrna na 240 nm inicira povećanje žilavosti do vrednosti od 1,04 MPa m1/2, dok je maksimalna vrednost žilavosti od 1,30 MPa m1/2, izmerena kod uzorka sa prosečnom veličinom zrna od 130 nm. Generalno, vrednosti koeficijenata žilavosti HAP koje se sreću u literaturi se kreću u intervalu od 0,60 do 1 MPa m1/2 [181, 188, 198, 232]. Raynaud sa saradnicima [232] je dobio metodom toplog presovanjem materijale na bazi HAP koji su se odlikovali koeficijentom žilavosti od 1,0 ± 0,1 MPa m1/2. Benarjee sa saradnicima [188] je konvencionalnim sinterovanjem dobio biokeramiku na bazi HAP sa žilavošću od 0,6 do oko 1 MPa m1/2. Vrednost žilavosti uzorka HAP dobijenog u ovom radu procesom mikrotalasnog sinterovanja na 900 ºC tokom 15 min je za oko 30 % veća od prosečnih vrednosti objavljenih u literaturi za ovaj tip keramičkih materijala. Tip loma kod mikrostrukturne keramike na bazi HAP, koja se dobija na visokim temperaturama konvencionalnim postupkom sinterovanja, je obično transgranularan, tj. pukotina se prostire duž zrna kermičkog materijala [26, 161, 171, 209]. Povećanje žilavosti sa smanjenjem veličine zrna se obično dešava kod biokeramike gde je mehanizam loma intergranularan, gde glavni doprinos povećanju otpora prostiranju pukotine pružaju granice zrna, kojih je znatno veći broj u slučaju nanostrukturnog materijala. Mehanizam loma u slučaju monofaznih mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP u ovom radu je intergranularan, što je potvrñeno SEM snimcima površine lomova (18.3- 18.6.), gde su uočljiva čitava zrna istrgnuta iz strukture. Sniženjem temperature i skraćivanjem vremena sinterovanja primenom mikrotalasa, limitiran je rast zrna, a samim tim je povećana apsorpcija energije pukotine na granicama zrna duž njenog prostiranja. Na slikama 18.16 a, b i c prikazani su otisci Vikersove piramide na ispoliranoj površini uzoraka HAP1, mikrotalasno sinterovanih na temperaturama 1200 ºC, 1100 ºC i 900 ºC. Sa slika se jasno vidi da su nakon Vikersovog testa pukotine višestruko manje prilikom testiranja uzoraka sa nano dimenzijama zrna, u poreñenju sa uzorcima koji sadrže zrna mikronskih dimenzija. 118 a) b) c) Slika 18.16. Mikrografije ispoliranih površina monofaznih HAP1 kompakata nakon Vikersovog testa, mikrotalasno sinterovanih na: a) 1200 ºC b) 1100 ºC i c) 900 ºC 18.5. Uporedna analiza karakteristika gustih biokeramikih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem Biomaterijali mikrotalasno sinterovani tokom 15 min, uporeñeni su sa konvencionalno sinterovanim uzorcima tokom 2 h na istim temperaturama. Mikrografije na slikama 18.17 i 18.18 prikazuju mikrostrukture konvencionalno sinterovanih uzoraka HAP1 i HAP2 na 900 ºC i 1000 ºC tokom 2 h. Na osnovu slika se može zaključiti da se konvencionalnim sinterovanjem na 900 ºC i 1000 ºC, tokom osam puta dužeg vremena sinterovanja u odnosu na mikrotalasno sinterovanje, dobijaju uzorci koji se odlikuju neuniformnim i poroznim mikrostrukturama. 119 Slika 18.17. SEM mikrografije uzoraka HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovanih na 900 ºC tokom 2 h Slika 18.18. SEM mikrografije uzoraka HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovanih na 1000 ºC tokom 2 h Vrednosti relativnog linearnog skupljanja ovako dobijenih kompakata su za oko 2 % manje u poreñenju sa mikrotalasno sinterovanim uzorcima na istim temperaturama tokom osam puta kraćeg vremenskog intervala. Poredeći konvencionalno sinterovane materijale sa mikrotalasno sinterovanim uzorcima, zaključeno je da se pri mikrotalasnom sinterovanju za višestruko kraće vreme sinterovanja dobijaju uniformnije i gušće mikrostrukture, koje potvrñuju pozitivan uticaj mikrotalasa na sinterovanje kalcijum- hidroksiapatita zahvaljujući homogenoj raspodeli energije mikrotalasa, koja obezbeñuje uniformno zagrevanje po celoj zapremini uzorka. 120 U tabeli 18.3 prikazane su mehaničke karakteristike mikrotalasno i konvencionalno sinterovanih uzoraka. Tabela 18.3. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih konvencionalnim i mikrotalasnim sinterovanjem Uočava se da se mikrotalasno sinterovani uzorci tokom osam puta kraćeg vremena sinterovanja odlikuju znatno većim vrednostima i žilavosti i tvrdoće. Razlika u vrednostima mehaničkih karakteristika je veća kod uzoraka dobijenih na 900 ºC, gde je vrednost žilavosti za oko 80 % veća kod uzorka dobijenog mikrotalasnim sinterovanjem. 18.6. Rezultati karakterizacije gustih biokeramičkih materijala izostatski ispresovanih i mikrotalasno sinterovanih Sa ciljem da se dobiju materijali većih gustina i još boljih mehaničkih svojstava, prah HAP1 je izostatski ispresovan na 400 MPa, a zatim je mikrotalasno sinterovan na 850 ºC, 900 ºC i 1200 ºC tokom 15 min. Mikrostrukture dobijenih kompakata prikazane su na slikama 18.19, 18.20 i 18.21. Sa SEM mikrografije prikazane na slici 18.19 se vidi da je sinterovanjem na 1200 ºC tokom 15 min dobijena potpuno gusta mikrostruktura, sa zrnima veličine od 1 do 4 µm. Gustina ovog uzorka je veća od 99 % od teorijske vrednosti za HAP. Snižavanjem temperature sinterovanja na 900 ºC, dobijen je uzorak sa gustinom od 96 % od teorijske gustine i prosečnom veličinom zrna od približno 150 nm (Slika 18.20.). Na slici 18.21 prikazana je mikrostruktura uzorka sinterovanog tokom 15 min na 850 ºC. Snižavanjem temperature sinterovanja na 850 ºC gustina uzorka je smanjena na 93 %, dok prosečna vrednost veličine zrna ovog uzorka iznosi približno 100 nm (Slika 18.21.). Temperatura sinterovanja,ºC 900 900 1000 1000 Vrsta sinterovanja konvencionalno mikrotalasno konvencionalno mikrotalasno Vreme, min 120 15 120 15 Tvrdoća, GPa 2,75 3,45 3,95 4,19 Žilavost, MPa m1/2 0,77 1,30 0,89 1,04 121 Slika 18.19. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Slika 18.20. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min 122 Slika 18.21. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski ispresovanog na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 850 ºC tokom 15 min Uzorak HAP1 izostatski ispresovan na 400 MPa i mikrotalasno sinterovan na 1200 ºC tokom 15 min, odlikuje se tvrdoćom od 5,0 GPa, dok koeficijent žilavosti ima verdnost 0,87 MPa m1/2 (Tabela 18.4.). Snižavanjem temperature sinterovanja na 900 ºC, pri istom vremenu sinterovanja, žilavost materijala se povećava do vrednosti 1,34 MPa m1/2, što je ujedno najveća vrednost žilavosti kod mikrotalasno sinterovanih materijala . Tabela 18.4. Uslovi procesiranja i mehanička svojstva monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem Tvrdoća monofaznog HAP se neznatno smanjuje sa snižavanjem temperature sinterovanja na 900 ºC, i njena vrednost iznosi 4,75 GPa. Poreñenjem vrednosti žilavosti i tvrdoće ovih uzoraka sa uniaksijalno presovanim, a zatim mikrotalasno sinterovanim uzorcima pri istim uslovima, može se zaključiti da se izostatskim presovanjem na 400 MPa pre sinterovanja postiže blago povećanje žilavosti, dok se tvrdoća materijala značajno povećava, približno za 20 %. Daljim snižavanjem temperature sinterovanja na 850 ºC, vrednost tvrdoće se smanjuje na 3,5 GPa, dok žilavost pada do vrednost od 1,17 MPa m1/2, a razlog je povećanje poroznosti usled slabije denzifikacije materijala tokom sinterovanja. Temperatura sinterovanja,ºC 1200 900 850 Vrsta sinterovanja mikrotalasno mikrotalasno mikrotalasno Vreme, min 15 15 15 Tvrdoća, GPa 5,0 4,75 3,5 Žilavost, MPa m1/2 0,87 1,34 1,17 123 19. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem Procesiranjem biokeramičkih materijala tehnikom spark plazma sinterovanja imalo se za cilj da se primenom električnih impulsa, proizvedenih pri naponu od 4 V i jačini struje od 1500 A, snizi temperatura sinterovanja i višestruko skrati vreme sinterovanja. Kao i u slučaju mikrotalasnog sinterovanja na taj način je moguće limitirati rast zrna, poboljšati karakteristike sinterovanog materijala i dovesti do velike uštede energije. Sa ciljem da se dobiju gusti bikeramički nanostrukturni materijali, monofazni na bazi kalcijum-hidroksiapatita i bifazni na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, sa nano dimenzijama zrna, polazni prahovi HAP1 i HAP2 su sinterovani na temperaturama od 900-1200 ºC tokom 5-10 min u peći za spark plazma sinterovanje. Karakterizacijom je utvrñen uticaj parametara spark plazma sinterovanja na mikrostrukturu, fazni sastav, gustinu i mehanička svojstva dobijenih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum- hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata. 19.1. Rezultati odreñivanja gustine i skupljanja U tabeli 19.1 prikazane su vrednosti gustina uzoraka HAP1 dobijenih spark plazma sinterovanjem na 900 ºC, 1000 ºC i 1200 ºC tokom 10 min. S obzirom na teorijsku vrednost gustine kalcijum-hidroksiapatita koja iznosi 3,16 g/cm3, može se uočiti da su postupkom spark plazma sinterovanja dobijeni uzorci gustina bliskih teorijskoj vrednosti. Najveću gustinu 3,12 g/cm3 tj. 98,5 % TG je imao kompakt dobijen sinterovanjem na 1000 ºC. Manja gustina uzorka sinterovanog na 1200 ºC se može objasniti izuzetno velikim rastom zrna (videće se kasnije na SEM mikrografiji uzorka) i usled toga delimičnim pucanjem uzorka, pa se može zaključiti da je 1200 ºC previsoka temperatura za sinterovanje praha HAP1 spark plazna tehnikom. Sinterovanjem na 900 ºC gustine uzoraka su bile nešto manje, približno 90 % od teorijske vrednosti za HAP. 124 Tabela 19.1. Vrednosti gustina spark plazma sinterovanih kompakata HAP1 na 900 - 1200 ºC Skupljanje uzoraka tokom procesa sinterovanja prikazano je na slikama 19.1 - 19.3. U svim slučajevima se postiže maksimalna vrednost skupljanja neposredno nakon postizanja temperature sinterovanja (približno 5 min od početka zagravanja sistema). Najveće skupljanje se uočava u slučaju sinterovanja na 1000 ºC, što je i očekivano s obzirom na vrednosti gustina iz tabele 19.1. Nakon postizanja maksimalne vrednosti skupljanja, uzorci se neznatno šire tokom zadržavanja na temperaturi sinterovanja. 0 d a y s 0 0 :0 3 :1 9 .9 00 d a y s 0 0 :0 6 :3 9 .9 00 d a y s 0 0 :0 9 :5 9 .9 00 d a y s 0 0 :1 3 :1 9 .9 00 d a y s 0 0 :1 6 :3 9 .9 0 0 2 4 1 2 1 59630 Su pl jan je, m m V r e m e , m in Slika 19.1. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 900 ºC tokom 10 min Temperatura sinterovanja, ºC Gustina kompakata, g/cm3 900 2,85 1000 3,12 1200 3,03 125 0 d a y s 0 0 :0 3 :1 9 .9 00 d a y s 0 0 :0 6 :3 9 .9 00 d a y s 0 0 :0 9 :5 9 .9 00 d a y s 0 0 :1 3 :1 9 .9 00 d a y s 0 0 :1 6 :3 9 .9 0 0 2 4 6 1 2963 1 50 V r e m e , m in Su pl jan je, m m Slika 19.2. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 1000 ºC tokom 10 min Uočena ekspanzija se intenzivira sa povećanjem temperature sinterovanja: najmanja na 900 ºC, nešto viša na 1000 ºC, a značajno viša na 1200 ºC, što se može dovesti u vezu sa rastom zrna, koje je u slučaju SPS HAP1 znatno intenzivnije na visokim temperaturama. Poreñenjem krivih skupljanja pri sinterovanju na 900 ºC i 1000 ºC, uoćava se nešto manja ekspanziju na 900 ºC, ali je skupljanje na 1000 ºC dosta veće, što rezultira većom gustinom kompakta sinterovanog na 1000 ºC. 0 d a y s 0 0 :0 3 :1 9 .9 00 d a y s 0 0 :0 6 :3 9 .9 00 d a ys 0 0 :0 9 :5 9 .9 00 d a y s 0 0 :1 3 :1 9 .9 0 0 2 4 1 51 29630 Su pl jan je, m m V r e m e , m in Slika 19.3. Skupljanje u funkciji vremena tokom procesa spark plasma sinterovanja na 1200 ºC tokom 10 min 126 19.2. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom Rezultati rendgenske difrakcione analize uzoraka kalcijum-hidroksiapatita, HAP1, sinterovanog spark plazma tehnikom na 900 ºC, 1000 ºC i 1200 ºC su prikazani na slici 19.4. Analizom difraktograma u slučaju sva tri uzoroka identifikovani su isključivo pikovi karakteristični za kalcijum-hidroksiapatit. Odsustvo pikova karakterističnih za trikalcijum- fosfat u svim slučajevima pokazuje da nije došlo do fazne transformacije kalcijum- hidroksiapatita, te se može se sa sigurnošću tvrditi da je spark plazma sinterovanjem praha HAP1 došlo do formiranja monofazne biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita. Oblik pikova ukazuje na vrlo visok stepen kristaličnosti dobijenog biomaterijala. 20 30 40 50 0 500 1000 1500 2000 2500 * * * * * * * - HAP c) b) a) a) 1200ºC b) 1000ºC c) 900ºC 2Θ In te n zi te t Slika 19.4. Rendgenska difrakciona analiza materijala dobijenih spark plazma simterovanjem HAP1 na 900 ºC, 1000 ºC i 1200 ºC tokom 10 min Poreñenjem oblika i odnosa visina pikova uzoraka spark plazma sinterovanih sa pikovima mikrotalasno sinterovanih uzoraka na istim temperaturama (Slika 18.1), uočava se da je pri spark plazma sinterovanju praha HAP1 došlo do preferentne kristalizacije usled dejstva pritiska tokom sinterovanja. Slična pojava bi trebala da se uoči prilikom rendgenske difrakcione analize toplo presovanih uzoraka HAP1. Na slici 19.5 prikazan je XRD dijagram uzorka HAP2 dobijenog spark plazma sinterovanjem na 900 ºC tokom 10 min. Analizom ovog dijagrama uočava se da sinterovanjem kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita spark plazma tehnikom, kao i 127 u slučaju mikrotalasnog sinterovanja, na 900 ºC dobija bifazni biokeramički materijal na bazi kalcijum-hidroksiapatita i β-trikalcijum-fosfata. 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 In te n zi te t 2Θ • • • ** * * * * * * • − β−TCP * - HAP Slika 19.5. Rendgenska difrakciona analiza materijala dobijenih spark plazma simterovanjem HAP2 na 900 ºC tokom 10 min 19.3. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom Mikrostruktura uzorka HAP1, spark plazma sinterovanog na 1200 ºC tokom 10 min, prikazana na slici 19.6, pokazuje da je sinterovanjem pri ovim uslovima došlo do znatnog rasta zrna, a uočene su i pukotine koje su verovatno posledica velike brzine zagrevanja i visokih temperatura sinterovanja. Smanjenjem vremena zadržavanja uzorka na 1200 ºC na 5 min, dobijen je uzorak čija je mikrostruktura prikazana na slici 19.7. Prikazani uzorak se odlikuje gustom mikrostrukturom, ali je veličina zrna izuzetno velika i iznosi približno 20 µm. 128 Slika 19.6. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1200 ºC tokom 10 min Slika 19.7. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1200 ºC tokom 5 min 129 Da bi se pronašli parametri procesiranja spark plazma sinterovanjem koji će rezultirati gustim materijalom, sa nanometarskom prosečnom veličinom zrna, temperatura sinterovanja je dalje snižavana, najpre na 1000 ºC, a zatim na 900 ºC, a morfologija ovako dobijenih uzoraka prikazana je na slikama 19.8-19.10. Uzorak sinterovan na 1000 ºC tokom 10 min odlikuje se izuzetno gustom mikrostrukturom, što je u skladu sa izmerenom gustinom prikazanom u tabeli 19.1, dok se veličina zrna kreće u intervalu od 1-7 µm. Analizom slike 19.8. može se uočiti da je na 1000 ºC došlo do formiranja prilično neuniformne strukture i široke raspodele veličina zrna, što je ukazalo na potrebu da se temperatura sinterovanja smanji na 900 ºC. Slika 19.8. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 1000 ºC tokom 10 min Uzorak sinterovan na 900 ºC tokom 10 min, prikazan na slici 19.9, odlikuje se relativno gustom mikrostrukturom i prosečnom veličinom zrna od 250 nm. Skraćivanjem vremena sinterovanja na 5 min, na temperaturi sinterovanja od 900 ºC veličina zrna je smanjena na 150 nm. Uočava se da je prosečna veličina zrna uzoraka sinterovanih na 900 ºC u odnosu na uzorak sinterovan na 1000 ºC manja okvirno dvadeset do trideset puta (Slika 19.11.), sto može da bude bitan preduslov za poboljšanje mehaničkih svojstava i pored nešto manje vrednosti gustine (Tabela 19.1.). 130 Slika 19.9. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 10 min Slika 19.10. SEM mikrografija uzorka HAP1 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 5 min 131 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 -2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 V el ic in a zr n a, µm Temperatura, ºC Slika 19.11. Veličina zrna HAP1 u funkciji temperature spark plazma sinterovanja Kako je sinterovanjem na 900 ºC dobijen monofazni materijal uniformne strukture sa najmanjim zrnima, kalcijum deficitarni HAP2 je sinterovan pri istim uslovima u peći za spark plazma sinterovanje, sa ciljem da se istom tehnikom dobije nanostrukturni bifazni biokeramički kompakt. Mikrostruktura preloma ovako dobijenog bifaznog uzorka prikazana je na slici 19.12, a sa nje se uočava gusta mikrostruktura (gustina uzorka iznosi 3,09 g/cm3) sa prosečnom veličinom zrna od oko 800 nm. Veća prosečna vrednost veličine zrna u odnosu na uzorak HAP1 sinterovan pri istim uslovima objašnjava se faznom transformacijom HAP u β-TCP, što je u prethodnom poglavlju primećeno i detaljnije objašnjeno prilikom mikrotalasnog sinterovanja praha HAP2. Bifazni kompakt dobijen spark plazma sinterovanjem na 900 ºC karakteriše se pet puta većim zrnom u odnosu na uzorak pri čijem sinterovanju nije došlo do fazne transformacije. Karakterizacijom mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 i HAP2 je takoñe utvrñena veća vrednost prosečne veličine zrna u slučaju bifaznih kompakata, ali je razlika u dimenzijama zrna bila znatno manja (Slika 18.11.). 132 Slika 19.12. SEM mikrografija uzorka HAP2 spark plazma sinterovanog na 900 ºC tokom 10 min Na osnovu ispitivanja uticaja parametara procesiranja na mikrostrukturne i fazne karakteristike spark plazma sinterovanih biokeramičkih materijala, može se zaključiti da se ovom tehnikom sinterovanja mogu dobiti gusti nanostrukturni materijali na bazi kalcijum- hidroksiapatita i bifazni na bazi kalcijum-hidroksiapatita i β-trikalcijum-fosfata, koji se u odnosu na konvencionalno sinterovane materijale odlikuju većim gustinama i višestruko manjim zrnom. Monofazni materijali dobijeni SPS HAP1 na 900 ºC imaju zrna sličnih dimenzija kao i kod materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem na istoj temperaturi, ali imaju i nešto veće gustine. 19.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem Mehaničke karakteristike monofaznih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem pri različitim uslovima procesiranja prikazani su u tabeli 19.2. Tvrdoća i žilavost uzoraka sinterovanih na 1200 ºC tokom 5 i 10 min nisu prikazani u tabeli, usled vrlo niskih vrednosti tvrdoće (manjih od 1 GPa) i nemogućnosti izazivanja pukotine u pravcu dijagonale otiska utiskivanjem Vikersovog indenta. Uzorak HAP1 sinterovan na 1000 ºC tokom 10 min, sa mikronskom veličinom zrna, odlikuje se tvrdoćom od 2,30 GPa, dok koeficijent žilavosti ima verdnost od 0,8 MPa m1/2. Snižavanjem temperature na 900 ºC pri istom vremenu sinterovanja rastu i tvrdoća i žilavost, do vrednosti 3,15 GPa i 0,93 MPa m1/2, respektivno. Skraćivanjem vremena sinterovanja na 5 min, vrednost tvrdoće raste na 4,75 GPa, dok žilavost dostiže vrednost od 1,00 MPa m1/2. 133 Tabela 19.2. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike monofaznih HAP biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem Temperatura sinterovanja, ºC Vreme, min Tvrdoća, GPa Žilavost, MPa m 1/2 1000 10 2,30 0,80 900 10 3,15 0,93 900 5 4,75 1,00 Uočava se da se i žilavost i tvrdoća monofaznih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem povećavaju sa smanjenjem veličine zrna. Poreñenjem vrednosti mehaničkih parametara spark plazma sinterovanog uzoraka HAP1 na 900 ºC i 1000 ºC sa mikrotalasno sinterovanim uzorcima na istoj temperaturi, uočava se da mikrotalasno sinterovani uzorci, dobijeni na istim temperaturama, imaju veće vrednosti i žilavosti i tvrdoće. S obzirom na činjenicu da je kalcijum-hidroksiapatit relativno loš provodnik električnog impulsa, može se pretpostaviti da bi dodavanje pojedinih nanostrukturnih provodnih materijala u odreñenom procentu, u velikoj meri doprineli denzifikaciji matriksa sačinjenog od stehiometrijskog hidroksiapatita HAP1 i time uticali na bolje karakteristike novonastalog kompozitnog materijala. 134 20. Procesiranje i svojstva gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem Toplim presovanjem kao jednom od metoda sinterovanja uz pomoć pritiska na visokim temperaturama, kojom se u praksi postižu velike gustine keramičkih materijala, u ovom radu dobijeni su materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata. Precipitaciono sintetisani prahovi kalcijum-hidroksiapatita HAP1 i HAP2 su najpre izostatski ispresovani na 400 MPa, nakon čega su toplo presovani na 950 ºC i 1000 ºC varirajući vreme sinterovanja, u struji argona, pri pritisku od 20 MPa, a rezultati karakterizacije ovako dobijenih materijala su prikazani u ovom poglavlju. 20.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava i mikrostrukturnih karakteristika biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem Na slici 20.1 su prikazani rezultati rendgenske difrakcione analize toplo presovanog kompakta stehiometrijskog kalcijum-hidroksiapatita, HAP1 na 1000 ºC tokom 2 h, što predstavlja maksimalnu temperaturu i najduže vreme toplog presovanja primenjeno u ovom radu. Analizom pikova difraktograma je utvrñeno da pri ovim uslovima nije došlo do fazne transformacije kalcijum-hidroksiapatita u trikalcijum-fosfat. Stoga se može se sa sigurnošću tvrditi da je toplim presovanjem praha HAP1 došlo do formiranja monofazne biokeramike na bazi kalcijum-hidroksiapatita, kao i u slučaju mikrotalasnog sinterovanja i spark plazma sinterovanja istog praha. Oblik pikova ukazuje na vrlo visok stepen kristaličnosti dobijenog biomaterijala, kao i u slučaju spark plazma sinterovanih kompakata HAP1 (Slika 19.4.). Poreñenjem oblika i odnosa veličina pikova toplo presovanog uzorka sa pikovima spark plazma sinterovanog uzorka na istoj temperaturi, uočava se da je i u slučaju toplo presovanih kompakata HAP1 došlo do preferentne kristalizacije usled dejstva pritiska tokom procesiranja. 135 20 30 40 50 2Θ In te n zi te t ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ * - H A P Slika 20.1. XRD dijagram uzoraka HAP1 toplo presovanog 2 h na 1000ºC u struji argona XRD dijagram uzoraka HAP2 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 2 h, prikazan je na slici 20.2. Analizom ovog dijagrama se uočava da toplim presovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita, slično kao u slučaju mikrotalasnog sinterovanja i spark plazma sinterovanja, dobija bifazni kompakt na bazi kalcijum-hidroksiapatita i β- trikalcijum-fosfata, pri čemu je kalcijum-hidroksiapatit dominantna kristalna faza. 20 30 40 50 2Θ In te n zi te t • • • ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ • − β−TCP * - HAP Slika 20.2. XRD dijagram uzoraka HAP2 toplo presovanog 2 h na 1000ºC u struji argona 136 Na slikama 20.3 i 20.4 prikazane su mikrostrukture površine lomova uzoraka HAP1 toplo presovanih na 1000 ºC tokom 2 h i 1h, respektivno. Sa mikrografija se uočavaju izuzetno guste mikrostrukture u oba slučaja, a na osnovu dimenzija istrgnutih zrna iz strukture uočava se da su zrna nano dimenzija. Slika 20.3. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 2 h Slika 20.4. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 1 h 137 Toplim presovanjem na 950 ºC tokom 2 h dobijen je takoñe izuzetno gust kompakt, čija je nanostruktura prikazana na slici 20.5. Na slici 20.5 se mogu uočiti zrna istrgnuta iz strukture čija je dimenzija manja od 100 nm. Slika 20.5. SEM mikrografija uzorka HAP1 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 950 ºC tokom 2 h Na slikama 20.3-20.5 se uočava da uzorci sadrže zrna nano dimenzija. Raspodela veličina zrna toplo presovanih uzoraka je odreñena korišćenjem softvera Image Pro Plus Program, pri čemu je više od 100 zrna uzeto u obzir pri proračunu, a prikazana je histogramski. Rezultati raspodele veličine zrna su prikazani na slikama 20.6-20.8. Na slici 20.6 je prikazana raspodela veličina zrna uzorka HAP1 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 2 h, a sa histograma se oučava da se najveći broj zrna nalazi u intervalu veličina od 200-700 nm. Prosečna vrednost veličine zrna ovog uzorka iznosi 380 nm. 138 Slika 20.6. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 2 h Slika 20.7. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 1000 ºC tokom 1 h Smanjenjem vremena zadržavanja uzorka na temperaturi od 1000 ºC na 1 h, prosečna vrednost veličine zrna se smanjuje na 140 nm. Sa histograma na slici 20.7 može se primetiti da je raspodela veličina zrna znatno uža, te da se veličine zrna nalaze u intervalu od 100-300 nm. Toplim presovanjem hidroksiapatita HAP1 na 950 ºC tokom 2 h dobijena su zrna uglavnom manjih dimenzija od 100 nm, a prosečna vrednost veličine zrna iznosi 50 nm (Slika 20.8, tabela 20.1). 139 Slika 20.8. Raspodela veličina zrna kompakta HAP1 toplo presovanog na 950 ºC tokom 2 h Na slikama 20.9 i 20.10 su prikazane SEM mikrografije bifaznih kompakata dobijenih toplim presovanjem praha HAP2 na 1000 ºC tokom 2 h i 1 h. Dobijeni uzorci se odlikuju gustim mikrostrukturama i prosečnom veličinom zrna od 400 nm u slučaju uzorka procesiranog tokom 2h, dok prosečna veličina zrna uzorka dobijenog tokom 1 h iznosi 170 nm. Smanjenjem temperature toplog presovanja na 950 ºC, veličina zrna bifaznog HAP2 kompakta je smanjena na 80 nm (Slika 20.11). Slika 20.9. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 2 h 140 Slika 20.10. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 1000 ºC tokom 1 h Slika 20.11. SEM mikrografija uzorka HAP2 izostatski presovanog na 400 MPa, i toplo presovanog na 20 MPa i 950 ºC tokom 2 h 141 U tabeli 20.1, uz prosečne vrednosti veličine zrna, prikazane su i gustine toplo presovanih uzoraka HAP1 i HAP2. Vrednosti gustina translucentnih HAP1 biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem se kreću u intervalu od 2,93 - 3,06 g/cm3, što predstavlja 93-97 % od teorijske vrednosti za kalcijum-hidroksiapatit. Tabela 20.1. Veličina zrna i gustina presovanih uzoraka HAP1 and HAP2 Gustine bifaznih HAP2 komapkata nakon toplog presovanja se nalaze u intervalu od 3,00 g/cm3 do 3,10 g/cm3. Poreñenjem prosečnih velična zrna, uočava se da slično materijalima dobijenim prethodnim tehnikama, i u slučaju toplo presovanih materijala veličina zrna je veća pri nastajanju bifaznog sistema pri istim uslovima procesiranja, što je pojašnjeno u poglavlju 18. 20.2. Rezultati odreñivanja faznog sastava i mikrostrukturnih karakteristika biokeramičkih materijala dobijenih konvencionalnim sinterovanjem U cilju uporedne analize strukturnih, faznih, mehaničkih i nanomehaničkih karakteristika gustih nanostrukturnih materijala dobijenih toplim presovanjem sa gustim mikrostrukturnim materijalima, polazni kompakti izostatski ispresovani na 400 MPa su konvencionalno sinterovani na 1200 ºC tokom 2h, što predstavlja najčešće uslove za sinterovanje HAP u konvencionalnim uslovima [24, 26, 27]. Ovim postupkom dobijeni su biokeramički materijali gustine 3,00 g/cm3, odnosno 95% teorijske gustine HAP. Na slici 20.12 su prikazani rezultati rendgenske difrakcione analize konvencionalno sinterovanog kompakta kalcijum-hidroksiapatita, HAP1 na 1200 ºC tokom 2 h. Analizom pikova difraktograma utvrñeno je da nije došlo do fazne transformacije kalcijum- hidroksiapatita u trikalcijum-fosfat, stoga se može zaključiti da je konvencionalnim sinterovanjem praha HAP1 na 1200 ºC tokom 2 h došlo do formiranja monofaznog biokeramičkog materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita. Oznaka uzorka Temperatura , ºC Vreme, h Gustina, g/cm3 Veličina zrna, nm HAP1 950 2 2,93 50 HAP1 1000 1 3,06 140 HAP1 1000 2 3,05 380 HAP2 950 2 3,00 80 HAP2 1000 1 3,10 170 HAP2 1000 2 3,06 400 142 20 40 0 50 100 150 200 250 300 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ * - HAP 2Θ In te n zi te t Slika 20.12. XRD dijagram uzoraka HAP1 konvencionalno sinterovanog tokom 2 h na 1200ºC Na slici 20.13 prikazan je XRD dijagram uzoraka HAP2 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h. Analizom ovog dijagrama uočava se da se konvencionalnim sinterovanjem kalcijum deficitarnog kalcijum-hidroksiapatita, dobija bifazni keramički materijal na bazi kalcijum-hidroksiapatita i β-trikalcijum-fosfata. 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 2Θ In te n zi te t • − β −T C P ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ • • • * - H A P Slika 20.13. XRD dijagram uzoraka HAP2 konvencionalno sinterovanog tokom 2 h na 1200ºC 143 Analizom SEM mikrografija uzoraka HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovanih na 1200 ºC, slike 20.14 i 20.15, uočavaju se vrlo slične guste mikrostrukture. Mikrostruktura dobijenih materijala se odlikuje uskom raspodelom veličina zrna, sa prosečnom veličinom zrna od 3 µm. Slika 20.14. SEM mikrografija uzorka HAP1 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2h (poliran i nagrižen uzorak) Slika 20.15. SEM mikrografija uzorka HAP2 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2h (poliran i nagrižen uzorak) 144 Mikrostrukturni biokeramički materijali dobijenim konvencionalnim sinterovanjem u daljem radu su poreñeni sa nanostrukturnim biokeramičkim materijalima, u cilju ispitivanja uticaja smanjenja veličine zrna u gustoj strukturi sa mikro na nano nivo na mehaničke i nanomehaničke karakteristike biomaterijala na bazi HAP i TCP. 20.3. Rezultati ispitivanja uticaja veličine zrna na karakteristike gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem mikroindentacijom Mikroindentacijom su odreñene vrednosti žilavosti i tvrdoće, testirajući Vikersovom metodom tri uzorka HAP1: konvencionalno sinterovan na 1200 ºC tokom 2 h (prosečne veličine zrna od 3 µm), toplo presovan na 1000 ºC tokom 1 h (prosečne veličine zrna od 140 nm) i toplo presovan na 950 ºC tokom 2 h (prosečne veličine zrna od 50 nm). Dijagram na slici 20.16 prikazuje zavisnost tvrdoće monofaznih biokeramičkih materijala HAP1 u funkciji veličine zrna. Sa slike se uočava da smanjenje prosečne veličine zrna sa 3 µm na 140 nm dovodi do povećanja vrednosti tvrdoće sa 2,39 GPa na 3,24 GPa. Sa daljim smanjenjem zrna na 50 nm, tvrdoća raste do vrednosti 4,30 GPa. Na osnovu ovih rezultata može se zaključiti da smanjenje zrna sa mikro na nano nivo kod monofaznih biokeramičkih materijala utiče na povećanje tvrdoće za približno 45 %. 0 500 1000 1500 2000 2500 30002,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 Zi la v o st s, M Pa m 1/ 2 Tv rd o ca , G Pa Velicina zrna, nm Slika 20.16. Žilavost i tvrdoća nanostrukturnih toplo presovanih i mikrostrukturnih sinterovanih uzoraka HAP1 u funkciji veličine zrna(■ – tvrdoća, □ - žilavost) 145 Žilavost monofaznih biokeramičkih materijala u funkciji veličine zrna takoñe je prikazana na slici 20.16. Vrednost žilavosti gustog mikrostrukturnog uzorka HAP1 dobijenog konvencionalnim sinterovanjem na 1200 ºC tokom 2 h, sa prosečnom veličinom zrna od 3 µm, iznosi 0,28 MPa m1/2. Sa smanjenjem prosečne veličine zrna na 140 nm, vrednost žilavosti je povećana na 1,25 MPa m1/2. Daljim smanjenjem zrna na 50 nm, vrednost koeficijenta žilavosti dostiže vrednost od 1,52 MPa m1/2. U poredjenju sa literaturnim vrednostima žilavosti kalcijum-hidroksiapatita [181, 188, 198, 232], čija vrednost uglavnom ne prelazi 1,0 MPa m1/2, vrednost žilavosti uzorka sa prosečnom veličinom zrna od 50 nm, dobijenog toplim presovanjem HAP1 na 950 ºC, je veća za približno 50 %. Na osnovu slike 20.16 može se zaključiti da smanjenje veličine zrna sa mikro na nano nivo utiče na simultano povećanje žilavosti i tvrdoće monofaznih biokeramičkih materijala, što je prvi put pokazano u radu sačinjenom od rezultata iz ove doktorske disertacije [24], a potvrñeno citatom u časopisu ”Biomaterials” u okviru rada čiji su autori J. Wang i L. Shaw [198]. Porast žilavosti usled smanjenja prosečne veličine zrna sa mikro na nano nivo, može se objasniti promenom mehanizma loma. Tip loma kod mikrostrukturne HAP keramike dobijene konvencionalnim postupkom sinterovanja na visokim temperaturama je obično transgranularan [198]. Sniženje temperature sinterovanja primenom toplog presovanja sa 1200 ºC na 950 ºC, uticalo je na smanjenje dimenzija zrna sa jedne strane, i sa druge strane promenom mehanizma loma iz transgranularnog u intergranularan. Činjenica da je mehanizam loma u slučaju toplo presovanih HAP1 uzoraka intergranularan je potvrñena na slikama površine loma (20.3-20.5), gde su uočljiva čitava zrna istrgnuta iz nanostrukture. Upravo u ovoj činjenici se nalazi odgovor za višestruko povećanje žilavosti kod toplo presovanih HAP1 kompakata, jer glavni doprinos povećanju otpora prostiranju pukotine upravo pružaju granice zrna, kojih je znatno veći broj u slučaju nanostrukturnog materijala. Pravac prostiranja pukotine prilikom intergranularnog tipa loma vodi izmeñu zrna, a kako je kod nanostrukturnih materijala veliki broj zrna zbog malih dimenzija na putu prostiranja pukotine, ona na velikom broju mesta gubi energiju i samim tim joj je ukupna dužina manja. Intergranularan tip loma je uočen i prilikom loma mikrotalasno i spark plazma sinterovanih uzoraka, sačinjenih od zrna nano dimenzija [26]. 146 20.4. Rezultati ispitivanja nanomehaničkih karakteristika gustih biokeramičkih materijala dobijenih toplim presovanjem i konvencionalnim sinterovanjem nanoindentacijom U cilju ispitivanja uticaja veličine zrna i faznog sastava na nanomehaničke karakteristike, gustih mikro- i nanostrukturnih biokeramičkih materijala na bazi HAP i TCP, uporeñeni su uzorci HAP1 i HAP2 konvencionalno sinterovani na 1200 ºC tokom 2 h i uzorci toplo presovani na 1000 ºC tokom 1 h. U cilju pojednostavljenja diskusije, nanostrukturni uzorci HAP1 i HAP2 označeni su kao S1 i S2, dok su uzorci HAP1 i HAP2 sa mikro dimenzijama zrna označeni kao S4 i S3, redom [25]. Test nanoindentacije na gustim sinterovanim materijalima na bazi HAP i TCP, je najpre sproveden pri primenjenom opterećenju od 1 mN i brzinom opterećivanja i rasterećivanja od 50 µN/s. Pri većem opterećenju od 2 mN, brzina opterećivanja i rasterećivanja bila je 100 µN/s, sa vremenom zadržavanja od 20s na maksimalnom opterećenju u oba slučaja. Vreme zadržavanja od 20 s na maksimalnom opterećenju je odabrano da bi se minimalizovao efekat puzanja materijala, koji bi mogao imati uticaja na izračunate vrednosti Jungovog modula elastičnosti i tvrdoće. Slika 20.17 predstavlja primer tipične zavisnosti sile i dubine utiskivanja indenta pri ispitivanju nanoindentacijom uzorka S3. Prikazana kriva se, kao i krive dobijene prilikom ispitivanja drugih uzoraka odlikuje kontinualnošću, bez velikih skokova i padova pri opterećenju i rasterećenju površine uzorka. -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 O pt e re ce n je, µN Deformacija, nm 1000 µN 2000 µN Slika 20.17. Tipična zavisnost sile- dubine utiskivanja indenta za uzorak S3 147 Skeniranjem površine otiska indenta, skenirajući mikroskop sa pokretnom sondom (SPM), (Slika 20.18.), nisu uočene niti pukotine niti lomovi oko površine otiska indenta. Dodatnim skeniranjem i 3D snimkom deformisane površine, pokazano je formiranje nagomilavanja materijala po ivicama otiska kome je pojava brazdastog profila duž linije indenta dala uobičajenu korektnu formu. Slično nagomilavanja materijala je inače primetan kod monokristala hidroksiapatita, pokazujući da je plastičnost uobičajena pojava kod nanostrukturne hidroksiapatitne keramike [275, 276]. Tvrdoća i Jungov moduo izračunati prema Oliveru i Pharru, mogu u mnogome zavisiti od nagomilavanja površine, posebno ukoliko je odnos dubine otiska indenta i maksimalnog pomeranja tokom testiranja veći od 0,7. U našem slučaju ovaj odnos je bio u svim slučajevima manji od 0,7, tako da se može konstatovati da nagomilavanje materijala nije uticalo na tačnost odreñivanja nanomehaničkih karakteristika. Redukovani moduli elastičnosti i tvrdoće sinterovanih i toplo presovanih uzoraka testiranih nanoindentacijom prikazani su na slici 20.19. U slučaju zrna nano dimenzija i u slučaju zrna mikro dimenzija, pri obe vrednosti primenjene sile, vrednosti modula i tvrdoće su veće kod uzoraka gde nije došlo do formiranja bifaznog sistema, tj. prelaska HAP u β- TCP (S1,S4) od vrednosti dobijenih testiranjem bifaznog materijala, HAP/β-TCP (S2,S3), što nedvosmisleno pokazuje da formiranja β-TCP pri sinterovanju ima negativan efekat na nanomehaničke karakteristike gustih biokeramičkih materijala. Znatno veće vrednosti standardne devijacije rezultata pri testiranju bifaznih HAP/β-TCP uzoraka, ukazuju takoñe na lošije nanomehaničke karakteristike izazavane nehomogenim karakteristikama ispitivane površine uzorka, koje su posledica formiranja druge faze. Slika 20.18. SPM slika sa površinskim otiskom uzorka S1, pri sili indenta od 2000µN, region hrapavosti od 23 nm i skeniranom veličinom površine 2 µm 148 Sa slike 20.19 se uočavaju nešto manje vrednosti modula i znatno manje vrednosti tvrdoće sa povećanjem opterećenja. He [277] i saradnici navode da pri većim opterećenjima postoji veća verovatnoća za nastanak oštećenja uzorka u vidu pukotina i lomova, što može biti razlog smanjenja vrednosti mehaničkih parametara. S obzirom da prilikom testiranja uzoraka u ovoj disertaciji nije došlo do stvaranja vidljivih oštećenja ni pri jednom opterećenju u okruženju indenta, ovaj njihov zaključak ne može primeniti. Mnogo podesnije objašnjenje ove pojave se može dati na osnovu činjenice da se procesom poliranja površine uzorka pojedini slojevi sabijaju i da izazivaju pojavu zaostalih naprezanja. Veća standardna devijacija vrednosti mehaničkih parametara pri primeni manjeg opterećenja, ukazuje da se relnije vrednosti dobijaju primenom opterećenja od 2 mN. Razlika vrednosti tvrdoće uzorka S1, pri različitim opterećenjima je 17,9 %. Kod ostalih uzoraka S2, S3 i S4 razlike vrednosti tvrdoća su 13,4 %, 1,9 % i 5,7 %, respektivno. Uočava se da uzorci sa manjom vrednošću zrna imaju veća odstupanja tvrdoća u zavisnosti od primenjene sile. Sličan trend odstupanja vrednosti uočen je i pri odreñivanju modula, ali sa manjim vrednostima odstupanja. Objašnjenje za odstupanja vrednosti tvrdoće i modula u velikoj meri kod nanostrukturnih materijala može da bude i činjenica da je dubina utiskivanja indenta, okvirno 110 nm, vrlo bliska vrednosti veličine zrna materijala (najmanja vrednost iznosi 140 nm). 1 2 0 20 40 60 80 100 120 140 Re du ce d M o du lu s (G Pa ) Force (mN) S1 S2 S3 S4 1 2 0 2 4 6 8 10 12 14 H a rd ne ss (G Pa ) Force (mN) S1 S2 S3 S4 Slika 20.19. Redukovani moduli i tvrdoće uzoraka testiranih nanoindentacijom Poredeći nanomehaničke karakteristike uzoraka sa različitom veličinom zrna može se izvesti nekoliko zaključaka, a pažljivim biranjem uslova procesiranja može se glasati za i protiv prisustva β-TCP u implantnim materijalima, kao definitivno negativne pojave za mehaničke karakteristike, ali isto tako i kao jedne vrlo biokompatibilne faze. Kod čistog HAP, smanjenje veličine zrna izaziva povećanje vrednost tvrdoće, a smanjenje vrednost modula, manje pri sili od 2 mN, a više pri sili od 1 mN. Ova pojava je u skladu sa očekivanjima proizašlih iz Hall-Petch jednačine [278, 279]. Kod bifaznih potencijalno 149 implantnih HAP/β-TCP materijala, sa smanjenjem veličine zrna utiče se na povećanje vrednosti tvrdoće i modula, i pri dejstvu sile od 1mN i pri dejstvu sile od 2 mN. Uočavamo da smanjenje veličine zrna u oba slučaja, i kod monofaznih i kod bifaznih materijala, utiče na povećanje tvrdoće. Dobijene vrednosti modula i tvrdoća su u rangu literaturnih vrednosti, što je još jedna potvrda da se materijali dobijeni u ovom radu na osnovu ispitanih mehaničkih svojstava mogu koristiti kao materijali za reparaciju koštanog tkiva [280-282]. Maksimalna vrednost modula elastičnosti je izmerena na monofaznom mikrostrukturnom uzorku sa veličinom zrna od 3 µm i iznosi 133 GPa, dok je maksimalna vrednost tvrdoće zabeležena kod nanostrukturnog uzorka sa veličinom zrna od 140 nm, i ona iznosi 12,18 GPa. Vrednosti modula i tvrdoće za bifazne materiajle sa mikronskim dimenzijama zrna iznose (101.61, 6.76) GPa, dok kod uzoraka sa nano dimenzijama zrna iznose (115.72, 8.76) GPa, što je u redu veličina sa nanomehaničkim svojstvima prirodnih i sintetskim materijala ovog tipa u literaturi. 150 21. Procesiranje i svojstva poroznih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem Sa ciljem da se dobiju biokeramički materijali kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, hidrotemalno dobijeni prahovi HAP3 i HAP4 su mikrotalasno sinterovani na temperaturama od 900 ºC do 1200 ºC tokom 15 min. Nakon dejstva izostatskog pritiska od 400 MPa (Slika 17.1 c,d), sferna struktura čestica i sferni oblik intraaglomeratnih pora u njihovom središtu nisu narušeni. Polazna ideja bila je da se mikrotalasnim sinterovanjem polaznih kompakata dobije kontrolisano porozni materijal, čija bi maksimalna dimenzija pora upravo bila odreñena dimenzijom sfernih intraaglomeratnih pora, dok bi interaglomeratne pore nepravilnog oblika tokom sinterovanja bile eliminisane ili bi se sa njihovim smanjivanjem povećavala njihova sferičnost. Na taj način bi se dobio materijal kontrolisane poroznosti, u kome bi se najveći broj zaostalih pora odlikovao sferičnošću, što bi prema literaturnim podacima mogao biti dobar preduslov za dobre mehaničke karakteristike dobijenog biokeramičkog materijala [27, 56, 221]. 21.1. Rezultati odreñivanja faznog sastava rendgenskom difrakcionom analizom Rezultati rendgenske difrakcione analize kompakata HAP3, mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min prikazani su na slici 21.1. 20 30 40 50 0 50 100 150 200 250 300 350   • • •  − α−TCP • − β−TCP * - HAP * * ** * * * d) c) b) a) d) 1200ºC c) 1100ºC b) 1000ºC a) 900ºC In te n zi te t 2Θ Slika 21.1. Rendgenska difrakciona analiza HAP3 biokeramičkih materijala mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min 151 XRD dijagrami pokazuju da se kalcijum-hidroksiapatit u materijalima sinterovanim na sve četiri temperature javlja kao dominantna kristalna faza. Mali deo kalcijum- hidroksiapatita se na temperaturama 900 ºC i 1000 ºC transformisao u β-TCP. Na 1100 ºC je dobijen uzorak kod koga je osim β-TCP prisustna i neznatna količina α-TCP, dok se kod uzorka sinterovanog na 1200 ºC pored dominantne hidroksiapatitne faze javlja samo mali udeo α-TCP. XRD dijagrami kompakata HAP4, mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min prikazani su na slici 21.2. Analizom dijagrama se uočava da se sinterovani uzorci sadrže, kao i u slučaju HAP3, HAP i TCP, s tim što se na osnovu odnosa pikova zaključuje da se znatno veći udeo HAP transformisao u TCP u odnosu na sinterovane HAP3 kompakte, čime je definitivno potvrñeno da je sa manjim polaznim odnosom Ca/P u reakcionoj smeši dobijen kalcijum deficitarniji hidroksiapatit (Ca/P (HAP3) = 1,42 i Ca/P (HAP4) = 0,96). 20 30 40 50 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 d) 1200ºC c) 1100ºC b) 1000ºC a) 900ºC d) c) b) a) • • •     * ** * * * *  − α−TCP • − β−TCP * - HAP In te n zi te t 2Θ Slika 21.2. Rendgenska difrakciona analiza HAP4 biokeramičkih materijala mikrotalasno simterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min Mikrotalasnim sinterovanjem kalcijum-hidroksiapatita HAP4 na 900 ºC i 1000 ºC dobijen je bifazni kompakt sastavljen od HAP i β-TCP, dok je nakon sinterovanja na 1100 ºC identifikovano prisustvo značajnog udela α-TCP. Povećanje temperature sinterovanja na 1200 ºC rezultira materijalom u kome je dominantna kristalna faza α-TCP, dok se HAP i β-TCP javljaju u vrlo maloj količini. 152 21.2. Analiza mikrostrukturnih karakteristika skenirajućom elektronskom mikroskopijom Mikrostrukturne kaarakteristike kompakata, dobijenih presovanjem prahova HAP3 i HAP4 na 100 MPa, a nakon toga mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC, 1000 ºC, 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min prikazani su na slikama 21.3 - 21.6, odnosno na slikama 21.7 - 21.10, respektivno. Sa slike 21.3 se uočava da nakon presovanja na 100 MPa i sinterovanja na 900 ºC, sferna sruktura čestica HAP3 nije narušena i da vratovi izmeñu čestica nisu formirani. Primećena je mala promena oblika subčestica u okviru sfernih aglometrata usled dejstva temperature od 900 ºC. Mikrostruktura uzorka sinterovanog na 1000 °C, prikazana je na slici 21.4, a sa ove slike se može uočiti da je došlo do slabog povezivanja sfernih aglomerata, kao i da je došlo do nastanka sferičnih zrna nanometarskih dimenzija po površini sfernih aglomerata. Povećanjem temperature na 1100 °C došlo je do stvaranja čvrstih i stabilnih veza izmeñu sfernih aglomerata, što se može uočiti na površini loma ovog uzorka prikazang na slici 21.5. Na mikrografiji se uočava postojanje sfernih intraaglomeratnih pora i interaglomeratnih pora nepravilnog oblika. Mikrostruktura uzorka sinterovanog tokom 15 min na 1200 °C, (slika 21.6.), odlikuje se takoñe poroznom mikrostrukturom, pri čemu je udeo sfernih pora znatno veći u odnosu na uzorak sinterovan na 1100 °C, što je delimično posledica nestanka a delimično zaokruživanja pora nepravilnog oblika. Nešto deblji vratovi izmeñu sfernih čestica su uočeni na površini loma uzorka sinterovanog na 1200 °C. Slika 21.3. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min 153 Slika 21.4. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Analizom slika 21.5 i 21.6 može se zaključiti da je maksimalna vrednost veličine pora odreñena dimenzijom sfernih intraaglomeratnih pora, čija dimenzija u slučaju HAP3 iznosi približno 2 µm. Na osnovu navedenog može se zaključiti da je mikrotalasnim sinterovanjem praha HAP3 sastavljenog od čvrstih sfernih aglomerata moguće dobiti biokeramički materijal kontrolisane poroznosti, pri čemu maksimalna dimenzija pora zavisi od veličine intraaglomerisanih pora čestica polaznog praha. Slika 21.5. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min 154 Slika 21.6. SEM mikrografija uzorka HAP3 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min Sa slika 21.7 i 21.8 se vidi da je i u slučaju praha HAP4 na temperaturi 1000 °C došlo do slabog povezivanja sfernih aglomerata, kao i da je došlo do formiranja sferičnih zrna nanometarskih dimenzija po površini sfernih aglomerata. Povećanjem temperature na 1100 °C došlo je do stvaranja čvrstih i stabilnih mostova izmeñu sfernih aglomerata (Slika 21.9). Slika 21.7. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC tokom 15 min 155 Slika 21.8. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1000 ºC tokom 15 min Na mikrografiji prikazanoj na slici 21.10 se uočava, kao i u slučaju kompakata HAP3 postojanje sfernih intraaglomeratnih pora i interaglomeratnih pora nepravilnog oblika, čiji su broj i veličina znatno manji nakon sinterovanja na 1200 °C. Primetno je da se porozni kompakti HAP4 odlikuju nešto manjom dimenzijom pora, u odnosu na HAP3 kompakte, a razlog tome može da bude nešto manja dimenzija polaznih sfernih čestica praha HAP4. Slika 21.9. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min 156 Slika 21.10. SEM mikrografija uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min 21.3. Rezultati odreñivanja gustine i relativnog linearnog skupljanja Gustina sinterovanih uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja prikazana je na slici 21.11. Sa povećanjem temperature sinterovanja sa 900 ºC na 1200 ºC, gustina kompakata HAP3 se povećava od vrednosti 1,43 g/cm3 do 2,20 g/cm3. Gustine uzoraka HAP4 sinterovanih na temperaturama u intervalu od 900 ºC - 1200 ºC su nešto manje i kreću se izmeñu 1,45 i 1,96 g/cm3. U slučaju oba praha najveća porast gustine je uočljiv pri porastu temperature sa 1000 ºC na 1100 ºC, jer upravo u ovom temperaturnom intervalu dolazi do nastajanja mostova izmeñu sfernih čestica. Povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC gustina se u slučaju oba kompakta neznatno povećava, a nastale veze izmeñu aglomerata se pojačavaju. Generalno, razlog manjim vrednostima gustina kompakata HAP4 je mnogo intenzivnija fazna transformacija HAP (3,16 g/cm3) u β-TCP (3,07 g/cm3) i α-TCP (2,84 g/cm3), tj. faze sa manjim vrednostima gustine. Manje gustine uzoraka kod kojih je došlo do intenzivnije fazne transformacije su posledica uočene ekspanzije, što je potvrñeno merenjem linearnog skupljanja uzoraka. 157 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1,5 2,0 2,5 HAP4 HAP3 G u st in a, g/ cm 3 Temperatura,ºC Slika 21.11. Gustina HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Relativno linearno skupljanje uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja prikazano je na slici 21.12. Sa porastom temperature sinterovanja sa 900 ºC na 1100 ºC, linearno skupljanje uzoraka HAP3 raste do vrednosti 17,4 % dok u slučaju HAP4 raste do 13,7 %. Dalje povećanje temperature sinterovanja na 1200 ºC izaziva skoro zanemarljiv porast vrednosti skupljanja. Znatno intenzivnija fazna transformacij HAP u TCP, koja je praćena ekspanzijom, je glavni razlog manjeg skupljanja praha sa manjim Ca/P odnosom. Ovi rezultati potvrñuju, ranije objašnjenu, manje intenzivnu denzifikaciju pri sinterovanju prahova sa manjim Ca/P odnosom. 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 HAP4 HAP3 R el at iv n o li n ea rn o sk up lja n je, % Temperatura,ºC Slika 21.12. Relativno linearno skupljanje HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja 158 21.4. Rezultati ispitivanja mehaničkih karakteristika poroznih biokeramičkih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem Formiranje biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti na bazi HAP, β-TCP i α-TCP, za krajnji cilj imalo je poboljšanje mehaničkih karakteristika, delimično tvrdoće, a pre svega žilavosti. Tvrdoća sinterovanih HAP3 i HAP4 biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja, prikazana je na slici 21.13. Povećanje temperature sinterovanja sa 900 ºC na 1200 ºC dovelo je do porasta tvrdoće do maksimalne vrednosti od 2,70 GPa u slučaju uzoraka HAP3, a do vrednosti 1,80 GPa u slučaju kompakata HAP4. Intenzivnija fazna transformacij HAP u TCP, koja je praćena i većom ekspanzijom u slučaju uzoraka HAP4, utiče na stvaranje zaostalih naprezanja unutar keramičkih materijala, koji nastaju pri denzifikaciji, što je, pretpostavlja se, glavni uzrok navedene razlike vrednosti tvrdoća materijala gde je dominantna faza HAP u odnosu na materijal kod koga je dominantna faza α-TCP. 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 0 2 4 Tv rd o ca , G Pa Temperatura,ºC HAP 4 HAP 3 Slika 21.13. Tvrdoća uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja Kako je biokeramika na bazi HAP i TCP vrlo krta, osnovni razlog za dobijanje materijala kontrolisane poroznosti bio je povećanje žilavosti i uspostavljanje bolje veze sa tkivom. Na povećanje žilavosti materijala može da se utiče formiranjem mikrostrukture u pravcu stvaranja prepreka pukotini duž pravca njenog prostiranja, izazivajući povećanu adsorpciju energije pukotine, a samim tim utičući na njeno skraćivanje. Povećanje žilavosti kontrolisanjem parametara mikrostrukture materijala može da se postigne uz pomoć više 159 mehanizama, od kojih je jedan bio višestruko smanjenje veličine zrna, opisan u ranijim poglavljima. Dodavanjem čestica materijala veće žilavosti u sistem i na taj formiranje kompozitnih materijala je često korišćena metoda za povećanje žilavosti. U ovom delu rada povećanje žilavosti materijala na bazi HAP i TCP izazvano je kombinovanjem dva efekta. Prvi efekat se sastoji u nastajanju strukture sa prisustvom čvrstih vratova izmeñu sfernih čestica polaznog praha za čije narušivanje je potrebna velika energija, te je brzina prostiranje pukotine obrnuto proporcionalno energiji potrebnoj za stvaranje dve nove površine nastale „rušenjem“ formiranih vratova. Drugi efekat koji utiče na smanjenje dužine pukotine je sa jedne strane postojanje sfernih intraaglomeratnih pora a sa druge povećanje sferičnosti interaglomeratnih pora u materijalu tokom sinterovanja. Ovaj efekat se objašnjava činjenicom da je sfera idealan oblik pore, tj. kada pukotina tokom prostiranja naiñe na krute sferične aglomerate u čijem središtu se nalaze sferne intraaglomeratne pore, nastavlja svoj put obilazeći oko sfernih pora, pri čemu gubi znatnu količinu energije, što utiče na smanjenje njene dužine, a za krajnji cilj ima povećanje žilavosti materijala [56, 221]. Žilavost sinterovanih HAP3 i HAP4 biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti, prikazana je na slici 21.14, u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja. Vrednosti žilavosti uzoraka HAP3 i HAP4 sinterovanih na 900 ºC i 1000 ºC su vrlo niske, i nalaze se u intervalu od 0,35 MPa m1/2 do 0,50 MPa m1/2. Ovako niske vrednosti ukazuju na činjenicu da se na ovim temperaturama sinterovanje navedenih prahova nije odvilo u potpunosti, što potvrñuju SEM mikrografije na slikama 21.3., 21.4., 21.7., 21.8. Povećanje temperature sinterovanja sa 1000 ºC na 1200 ºC utiče na povećanje žilavosti do vrednosti od 1,25 MPa m1/2 u slučaju oba praha (Slika 21.14). Sa slike 21.14 se takoñe uočava da uzorci sinterovani na 1100 ºC imaju manju žilavost od uzoraka sinterovanih na 1200 ºC, što je direktna posledica nastajanja čvršćih veza izmeñu sfera i povećanja sferičnosti interaglomeratnih pora. 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Zi la v o st , M Pa m 1/ 2 Temperatura,ºC HAP 4 HAP 3 Slika 21.14. Žilavost uzoraka HAP3 i HAP4 u funkciji temperature mikrotalasnog sinterovanja 160 Vrednosti žilavosti mikrotalasno sinterovanih biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti dobijenih u ovom radu su iznad literaturnih vrednosti žilavosti kako poroznih tako i gustih materijala na bazi HAP i TCP, koje se kreću u intervalu 0,6 – 1,0 MPa m1/2. Na dijagramu prikazanom na slici 21.14 uočava se da uzoraci HAP3 i HAP4 sinterovani na 1200 ºC, imaju isti koeficijent žilavosti iako kod uzoraka HAP3 dominantnu kristalnu fazu predstavlja kalcijum-hidroksiapatit, dok je uzorak HAP4 sinterovan na istoj temperaturi po faznom sastavu u najvećem procentu α-TCP. Ova činjenica ide u prilog zaključku da fazni sastav ima inferioran uticaj na žilavost ovako dobijenih materijala u odnosu na njihovu specifičnu mikrostrukturu, koja se odlikuje prisustvom sfernh pora i jakih mostova izmeñu sfernih čestica. 21. 5. Uporedna analiza karakteristika poroznih biokeramikih materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem i konvencionalnim sinterovanjem α-TCP kao dominantna faza u slučaju kompakata HAP4, karakteriše se odličnom bioaktivnošću i biokompatibilnošću. Zbog dobre resorbilnosti, α-TCP igra vrlo važnu ulogu u stomatološkoj i ortopedskoj praksi. Merenjem žilavosti uzorka HAP4 uniaksijalno presovanog na 100 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC utvrñeno da se ovaj biokeramički materijal odlikuje visokom vrednošću koeficijenta žilavosti. Sa ciljem da se žilavost još poveća, prah HAP4 je ispresovan na 400 MPa, a zatim mikrotalasno sinterovan na 1100 ºC i 1200 ºC tokom 15 min. Mikrostrukture kompakata formiranih na ovaj način prikazane su na slikama 21.15 i 21.16, sa kojih se uočava da se dobijeni materijal odlikuje uniformnom mikrostrukturom, kao i da su dimenzije sfernih intraaglomeratnih pora nešto manje nego u slučaju uzoraka presovanih na 100 MPa a zatim mikrotalasno sinterovanih na istim temperaturama (Slike 21.9 i 21.10). Primena višestruko većeg pritiska dovela je do stvaranja kompakata sa intimnijim kontaktom polaznih čestica, koji su rezultirali jačim vratovima formiranim meñu sfernim aglomeratima nakon sinterovanja i većom gustinom finalnog materijala. Gustina uzorka sinterovanog na 1100 ºC ima vrednost 2,60 g/cm3, a sa povećanjem temperature na 1200 ºC, gustina raste do vrednosti 2,70 g/cm3, što je za oko 30 % vrednosti teorijske gustine veće nego u slučaju uzoraka presovanih na 100 MPa, zatim mikrotalasno sinterovanih. 161 Slika 21.15. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC tokom 15 min Slika 21.16. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min 162 Žilavost izostatski ispresovanog uzoraka HAP4 na 400 MPa i mikrotalasno sinterovanog na 1100 ºC iznosi 1,32 MPa m1/2, dok je tvrdoća istog uzorka 2,45 GPa. Povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC, žilavost se povećava do vrednosti od 1,35 MPa m1/2, a tvrdoća takoñe raste do vrednosti od 2,55 GPa. Visok izostatski pritisak je uslovio jaču denzifikaciju materijala, smanjenje veličine pora, i formiranje finozrne mikrostrukture, što je uticalo na porast žilavosti i tvrdoće materijala. Na osnovu ovih rezultata može se reći da kombinacija izostatskog presovanja na 400 MPa i mikrotalasnog sinterovanja kompakata HAP4 rezultira biokeramičkim materijalima na bazi α-TCP, sa znatno poboljšanim mehaničkim svojstvima u poreñenju sa materijalom dobijenim kombinacijom uniaksijalnog presovanja i mikrotalasnog sinterovanja. Izostatski ispresovani kompakti HAP4 su i konvencionalno sinterovani na temperaturama 1100 ºC i 1200 ºC tokom 2 h, a mikrostrukture ovako sintetisanih uzoraka prikazani su na slikama 21.17 i 21.18, respektivno. Gustine ovako dobijenih kompakata su bile znatno manje od uzoraka mikrotalasno sinterovanih na istim temperaturama tokom 15 min, i iznosile su 2,54 g/cm3 i 2,62 g/cm3, respektivno. Slika 21.17. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h 163 Slika 21.18. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h U tabeli 21.1 prikazane su mehaničke karakteristike biokeramičkih materijala na bazi α-TCP dobijenih konvencionalnim i mikrotalasnim sinterovanjem. Koeficijent žilavosti uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1100 ºC iznosi 0,88 MPa m1/2, a sa povećanjem temperature na 1200 ºC, žilavost raste do vrednosti od 1,20 MPa m1/2. Tvrdoća uzorka HAP4 konvencionalno sinterovanog na 1100 ºC iznosi 2,25 GPa, i raste do vrednosti 2,35 GPa sa povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC. Na osnovu ovih rezultata zaključujeno je da se mikrotalasnim sinterovanjem kalcijum-hidroksiapatita HAP4 dobija biokeramički materijal kontrolisane poroznosti na bazi α-TCP, znatno boljih mehaničkih svojstava u odnosu na materijal dobijen konvencionalnim sinterovanjem tokom osam puta dužeg vremena zadržavanja na temperaturi sinterovanja. Ovo povećanje tvrdoće i žilavosti usled primene mikrotalasa ukazuje da pored oblika i broja pora, kao i čvrstih vratova izmeñu sfernih aglomerata, finozrna struktura i veća gustina takoñe utiču na mehanička svojstva ovog tipa biokeramike. Tabela 21.1. Uslovi procesiranja i mehaničke karakteristike uzoraka HAP4 dobijenih konvencionalnim i mikrotalasnim sinterovanjem Temperatura sinterovanja,ºC 1100 1100 1200 1200 Vrsta sinterovanja konvencionalno mikrotalasno konvencionalno mikrotalasno Vreme, min 120 15 120 15 Tvrdoća, GPa 2.25 2.45 2.35 2.55 Žilavost, MPa m1/2 0.88 1.32 1.20 1.35 164 21.6. Rezultati ispitivanja uticaja oblika, veličine i broja pora na mehaničke karakteristike poroznih biokeramikih materijala U ovom poglavlju prikazani su rezultati ispitivanja uticaja parametara procesiranja na oblik i veličinu pora, kao i uticaj oblika i veličine pora na mehaničke karakteristike dobijenih biokeramičkih materijala. U tom cilju prah HAP3 je izostatski ispresovan na 400 MPa, a ispresovani kompakti su nakon toga konvencionalno sinterovani na 1100 ºC, 1200 ºC i 1250 ºC tokom 2 h. Za analizu je odabran prah HAP3 zato što ima veće intraaglomeratne pore, što olakšava njihovo detektovanje i analizu slike, ali i zbog manjeg uticaj fazne transformacije na karakteristike sinterovanog materijala u slučaju praha HAP3, čijim sinterovanjem kalcijum-hidroksiapatit u vrlo malom procentu prelazi u TCP. Na slici 21.19 prikazana je mikrostruktura uzorka HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h. Na slici se uočava postojanje sfernih intraaglomeratnih pora i interaglomeratnih pora nepravilnih dimenzija, kao i delimično formiranje vratova izmeñu sfernih aglomerata. Gustina ovog uzorka iznosi 2,58 g/cm3 (Tabela 21.2). Povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC gustina se povećava do vrednosti 2,64 g/cm3, a sa SEM mikrografije prikazane na slici 21.20 uočava se da je došlo do formiranja vrlo jakih veza izmeñu sfernih aglomerata. Uočava se i mnogo manji broj nepravilnih interaglomeratnih pora u mikrostrukturi. Slika 21.19. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h 165 Slika 21.20. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1200 ºC tokom 2 h Daljim povećanjem temperature sinterovanja na 1250 ºC i dalje se smanjuje broj nepravilnih interaglomeratnih pora (Slika 21.21), formiraju se još jače veze izmeñu sfernih aglomerata, a gustina uzorka iznosi 2,66 g/cm3 (Tabela 21.2). Slika 21.21. SEM mikrografija izostatski ispresovanog uzorka HAP3 sinterovanog na 1250 ºC tokom 2 h 166 Tabela 21.2. Vrednosti gustina mikrotalasno sinterovanih kompakata HAP3 na 1100 - 1250 ºC Vizuelna zapažanja karakteristika mikrostrukture uzoraka potvrñena su i kvantifikovana softverom za analizu slike. Najpre su polazeći od SEM mikrografija formirane binarne slike sa selektovanim (detektovanim) porama za morfološku analizu. Binarne slike uzoraka HAP3 sinterovanih na 1100 ºC, 1200 ºC i 1250 ºC tokom 2 h prikazane su na slikama 21.22-21.24. Sa ovako formiranih slika mnogo je lakše odrediti oblik i veličinu pora, a razlog je dosta izraženiji kontrast u poreñenju sa originalnim SEM slikama. Dobijene slike predstavljaju dobru bazu za dalju morfološku analizu. Slika 21.22. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1100ºC tokom 2h sa selektovanim porama Slika 21.23. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1200ºC tokom 2h sa selektovanim porama Slika 21.24. Deo SEM mikrografa uzorka HAP3 sinterovanog na 1250ºC tokom 2h sa selektovanim porama Temperatura sinterovanja, ºC Gustina kompakata, g/cm 3 1100 2.58 1200 2.64 1250 2.66 167 Analizom binarnih slika dobijeni su podaci o obliku i veličini pora, pri čemu se izračunate prosečne vrednosti dimenzija pora odnose na približno 100 detektovanih pora po uzorku. Statističkom analizom detektovanih pora dobijene su minimalne i srednje vrednosti dimenzija pora, a njihove vrednosti u zavisnosti od temperature sinterovanja prikazane su na slici 21.25. Sa slike se uočava porst minimalne vrednosti dimenzije pora sa porastom temperature, što je u skladu sa očekivanjem jer najmanje pore nestaju sa povećanjem temperature sinterovanja. Srednja vrednost veličine pora uzorka sinterovanog na 1100 ºC iznosi 0,68 µm i raste do vrednosti 0,85 µm sa povećanjem temperature sinterovanja na 1250 ºC. Slika 21.25. Promene minimalne i srednje vrednosti dimenzije pora sa promenom temperature sinterovanja HAP3 Vrednosti sferičnosti pora u zavisnosti od temperature sinterovanja prikazane su na slici 21.26. Sferičnost je definisana kao: Sferičnost = prečnik 2/(4· π · površina preseka pore) (21. 1.) Njena minimalna vrednost iznosi 1 i ova vrednost je karakteristična za idealnu sferu. Slika 21.26. Promene sferičnosti pora sa promenom temperature sinterovanja HAP3 168 Sa slike 21.26 uočava se da su najmanje pore u svim slučajevima idealne sfere, dok srednja i maksimalna vrednost sferičnosti opadaju sa porastom temperature. Maksimalna vrednost sferičnosti pora značajno opada pri porastu temperature sinterovanja sa 1100 ºC na 1200 ºC, a manje pri porastu temperature na 1250 ºC. Uočava se da su nepravilne pore nestabilne, kao i da teže da sa porastom temperature postignu sferičnu geometriju. Kako je za svaki uzorak ista površina preseka uzeta u razmatranje, odreñen je i ukupan broj pora, kao i površina poprečnog preseka pore u zavisnosti od temperature sinterovanja, a rezultati su prikazani na slici 21.27. Očigledno je da se broj pora smanjuje sa povećanjem temperature sinterovanja, dok srednja vrednost površine poprečnog preseka pora raste iz razloga što raste i srednja vrednost prečnika pora (Slika 6.25). Slika 21.27. Promena broja pora na karakterističnoj površini i promena srednje površine poprečnog preseka pore sa promenom temperature sinterovanja HAP3 Sa ciljem da se još preciznije definiše morfologija dobijenih uzoraka, u zavisnosti od vrednosti dimenzija pora definisano je nekoliko klasa pora, i odreñena je njihova sferičnost na različitim temperatura sinterovanja, a vrednosti su prikazane na slici 21.28. Uočava se da najmanje pore ostaju sferične na svim temperaturama, dok se sferičnost pora smanjuje sa povećanjem njihovih dimenzija. Na temperaturi od 1100 ºC uočljive su pore nepravilnog oblika dimenzija većih od 3 µm, dok se na većim temperaturama one smanjuju do dimenzija izmeñu 2-3 µm. Takoñe je uočljivo da se sferičnost klasa pora od 0,5-1 µm i 1-2 µm znatno povećava sa porastom temperature sinterovanja, što u mnogome utiče na povećanje ukupne sferičnosti pora. 169 Slika 21.28. Srednja vrednost sferičnosti posmatranih klasa pora na temperaturama sinterovanja 1100 ˚C, 1200 ˚C i 1250 ˚C. Na slici 21.29 prikazane su dimenzije klasa pora definisanih na osnovu njihove sferičnosti, u zavisnosti od temperature sinterovanja. Kod svih uzoraka, bez obzira na kojoj su temperaturi sinterovani najsferičnije pore imaju najmanji prečnik. Dimenzije pora sa vrednostima sferičnosti od 1,2 do 3,0 su vrlo slične na različitim temperaturama sinterovanja. Ukoliko se posmatraju pore u okviru iste klase sferičnosti, a na različitim temperaturama sinterovanja, može se uočiti da se srednje vrednosti prečnika neznatno povećavaju. Zaključci vezani za oblik i veličinu pora dobiće svoj pravi značaj tek nakon analize njihovog uticaja na žilavost dobijenih biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. 170 Slika 21.29. Prečnik pora u funkciji sferičnosti za posmatrane klase pora na temperaturama sinterovanja 1100 ˚C, 1200 ˚C i 1250 ˚C. Kao što je ranije već navedeno povećanje broja sferičnih pora uz istovremeno smanjenje broja pora nepravilnih dimenzija, tj. povećanje ukupne sferičnosti pora ima pozitivan uticaj na povećanje žilavosti materijala. Merenjem vrednosti žilavosti uzoraka HAP3 podvrgnutih analizi slike i definisanju oblika i veličine pora, potvrñene su ove pretpostavke. Žilavost uzorka sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h iznosi 1,0 MPa m1/2. Sa povećanjem temperature sinterovanja na 1200 ºC žilavost uzorka raste do vrednosti od 1.30 MPa m1/2, dok dalji porast temperature na 1250 ºC ne utiče mnogo na promenu ove vrednosti žilavosti, koja ostaje konstantna. Ova visoka vrednost žilavosti za ovaj tip keramike je upravo direktna posledica povećanja sferičnosti pora, tj. procentualnim povećanjem udela sfernih pora u ukupnoj poroznosti, što je u ovom poglavlju i kvantitativno prikazano. Ispolirane površine kompakta HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od 3 kg i 1 kg prikazane su na slikama 21.30 a i b. Uočava se da je opterećenje od 3 kg bilo preveliko za odreñivanje žilavosti uzorka, jer se pukotine ne prostiru u pravcu dijagonale otiska. Smanjenjem opterećenja na 1 kg dobijen je vrlo pravilan otisak sa uočenim pukotinama u pravcu dijagonala otisaka. 171 a) b) Slika 21.30. Fotografije ispoliranih površina kompakta HAP3 sinterovanog na 1100 ºC tokom 2 h nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od: a) 3 kg i b) 1 kg 172 Na slikama 21.31 a i b prikazani su otisci nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od 3 kg u slučaju uzoraka sinterovanih na 1200 ºC i 1250 ºC, gde se primećuje izuzetno pravilan oblik otiska i pukotina u pravcu dijagonala, vidno kraća od pukotine na slici 21.30, što slikovito potvrñuje da je povećanjem temperature sinterovanja dobijen materijal sa boljim mehaničkim karakteristikama. a) b) Slika 21.31. Fotografije ispoliranih površina kompakta HAP3 nakon Vikersovog testa sa opterećenjem od 3 kg sinterovanih na: a) 1200 ºC i b) 1250 ºC, tokom 2 h 173 Nakon ispitivanja Vikersovim testom uzorak sinterovan na 1200 ºC, je termički nagrižen, a SEM slika pukotine prikazana je na slici 21.32. Sa slika je dobijena potvrda pretpostavke da pukotina zaobilazi sferne pore pri čemu nailazi na jake vratove formirane izmeñu postojanih sfernih aglomerata, što potkrepljuje teoriju da prisustvo sfernih intraaglomeratnih pora doprinosi povećanju vrednosti koeficijenta žilavosti biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. Slika 21.32. SEM mikrografije izgleda pukotine pri odreñivanju žilavosti kompakta HAP3 sinterovanog na 1200 ºC 21.7. Analiza rezultata 3D modeliranja metodom konačnih elemenata Model formiran metodom konačnih elemenata potvrdio je da kontrolisano porozna keramika na bazi HAP, sa dominantnim sfernim porama, ima bolja mehanička svojstva od poroznih biokeramičkih materijala sa porama nepravilnog oblika, tj. da je sfera poželjan oblik pore u poroznom biokeramičkom materijalu. Na slici 21.33 su prikazani rezultati koji idu u prilog ovom tvrñenju. Na toj slici su prikazane raspodele ekvivalentnog napona izračunatog na osnovu složenog naponskog stanja primenom hipoteze Von Missesa. Von Missesa-ova raspodela naprezanja modelovanog keramičkog materijala nakon deformacije prikazana na slici 21.33., dobijena je opterećivanjem mreže konačnih elemenata sa definisanim pomeranjem čvorova pozicioniranih na gornjoj površini reprezentativnog zapreminskog elementa, RZE, (y = 3 µm), u pravcu y-ose. Nominalno naprezanje (σnom) je definisano kao ukupna reakcija na površinu suprotnu opterećenoj površini, podeljen vrednošću površine (A = 9 µm2), a u praksi predstavlja fiktivni (zamišljeni) RZE bez pora, a opterećen na isti način kao i RZE sa slike 21.33. Vrednosti naprezanja prikazane na slici 21.33, su rezultat opterećenja koje odgovara deformaciji od 1%. Okolina pora, gde se javlja maksimalno naprezanje (σmax), je pogodno mesto za lokalnu deformaciju, kao i za nastajanje i prostiranje pukotine. 174 Sferne pore σmax= 187,41 MPa σnom= 85,15 MPa SCF= 2,21 Pukotina iz pore paralelna pravcu dejstva sile σmax= 118,75 MPa σnom= 95,21 MPa SCF= 1,25 Pukotina iz pore ortogonalna pravcu dejstva sile σmax= 343,53 MPa σnom= 89,41 MPa SCF= 3,84 Slika 21.33. Von Misses-ova raspodela naprezanja u HAP keramici pri zapreminskom udelu pora od 0,155; (vrednosti naprezanja su u µN/µm2= MPa) sa izračunatim SCF Faktora pojačavanja naprezanja, SCF (stress concentration factor), predstavlja odnos maksimalnog i nominalnog naprezanja (SCF = σmax / σnom). SCF je koeficijent koji je obrnuto proporcionalan mehaničkoj čvrstoći materijala. Dobijene vrednosti SCF za kontrolisano porozne materijale na bazi HAP, sa poroznošću od približno 15 % se kreće od vrednosti 3,84, u slučaju kada su pore izduženog oblika i kada se prostiru u pravcu ortogonalnom na pravac opterećenja, do vrednosti 1,25 u slučaju pora izduženog oblika koje se prostiru u pravcu dejstva sile. Prvi slučaj predstavlja materijal sa teorijski posmaterano najboljim mehaničkim svojstvima, dok drugi predstavlja materijal sa najlošijim mogućim mehaničkim svojstvima. Oba posmatrana granična slučaja se u realnom materijalu praktično ne sreću, dok je u ovj disertaciji pokazano da je moguće dobiti kontrolisano porozan materijal na bazi HAP sa dominantnim sfernim porama u mikrostrukturi. Za materijal sa sfernim porama, izračunata vrednost SCF bila je 2,21. Ova vrednost ukazuje da se mehanička svojstva materijala kontrolisane poroznosti na bazi HAP, dobijenih u ovoj disertaciji nalaze izmeñu ova dva granična slučaja. Pošto je nezamislivo, praktično nemoguće, dobiti material sa izduženim porama u pravcu dejstva opterećenja, ovi rezultati nedvosmisleno ukazuju na činjenicu da je postojanje sfernih pora u materijalu kontrolisane poroznosti na bazi HAP dobra polazna osnova za relativno dobra mehanička svojstva, u odnosu na materiale sa nepravilnim oblikom pora. Povećanje broja sfernih pora u odnosu na nesferne, u jednom ovakvom kontrolisano poroznom materijalu, omogućuje poboljšanje njegovih mehaničkih svojstava. 175 22. Uporedna analiza svojstava biokeramičkih materijala dobijenih različitim tehnikama sinterovanja Kako je konvencionalnim postupkom sinterovanja dobijen najveći broj komercijalno dostupnih implantnih materijala na bazi HAP i TCP i kako je ovo ujedno i najčešće eksploatisan postupak za dobijanje biokeramičkih materijala, polazna osnova za uporednu analizu rezultata u ovoj diskusiji biće upravo rezultati dobijeni konvencionalnim sinterovanjem stehiometrijskog HAP1. Kao optimalni parametri procesiranja pri dobijanju gustih monofaznih biokeramičkih formi konvencionalnim postupkom u slučaju praha HAP1 ustanovljeni su: izostatski pritisak pretpresovanja praha 400 MPa, temperatura sinterovanja 1200 ºC i vreme zadržavanja na temperaturi sinterovanja 2 h. Konvencionalnim sinterovanjem praha HAP1 pri navedenim uslovima, dobijen je monofazni biokeramički materijal na bazi HAP gustine 3,00 g/cm3 sa prosečnom veličinom zrna od 3 µm. Dobijeni materijal je imao vrednost tvrdoće od 2,39 GPa i vrlo mali koeficijent žilavosti od svega 0,28 MPa m1/2. Pokušaji da se dobije gust monofazni biokeramički materijal sa manjom prosečnom veličinom zrna konvencionalnim postupkom sinterovanja na nižim temperaturama i pri dužim vremenima sinterovanja, rezultirali su materijalima sa manjom prosečnom veličinom zrna, ali i značajno manjim gustinama i izrazito poroznim mikrostrukturama. Materijali dobijeni na nižim temepraturama od 1200 ºC su imali nešto bolja mehanička svojstva, u poreñenju sa gustim mikrostrukturnim materijalom sinterovanim na 1200 ºC, usled drastičnog smanjenja prosečne veličine zrna, ali su vrednosti mehaničkih parametara bile i dalje veoma niske. Ideja da se primenom savremenih tehnika sinterovanja, polazeći od stehiometrijskog HAP1, i pronalaženjem optimalne kombinacije parametara procesiranja dobiju gusti monofazni nanostrukturni materijali poboljšanih mehaničkih svojstava, podrazumevala je: primenu pritiska tokom sinterovanja, kombinovani efekat pritiska i električne stuje u okviru spark plazma sinterovanja ili mikrotalasno sinterovanje. Primenom toplog presovanja u atmosferi argona, pri pritisku od 20 MPa u kombinaciji sa izostatskim pritiskom pretpresovanja od 400 MPa, snižena je temperatura sinterovanja praha HAP1 na 950 ºC, pri relativno dugom vremenu zadržavanja na temperaturi sinterovanja od 2 h. Dobijeni monofazni hidroksiapatitni materijal odlikovao se znatno manjom prosečnom veličinom zrna od 50 nm, ali i nešto manjom gustinom u odnosu na napred opisan konvencionalno sinterovan monofazni biokeramički materijal na temperaturi 1200 ºC. Smanjenje prosečne veličine zrna sa mikro na nano nivo u gustoj strukturi kod monofaznih biokeramičkih materijala rezultovalo je translucentnošću materijala, kao i povećanjem tvrdoće do vrednosti 4,30 GPa, odnosno koeficijenta žilavosti do vrlo visoke vrednosti 1,52 MPa m1/2. Mikrostrukture materijala dobijenih toplim presovanjem praha HAP1 na nižim temperaturama od 950 ºC odlikovale su se uočljivom 176 poroznošću i dosta manjim gustinama. Na višim temperaturama, toplim presovanjem praha HAP1 dobijeni su takoñe monofazni materijali izuzetno velikih gustina bliskih teorijskoj vrednosti, sa nešto većom prosečnom veličinom zrna ali i sa nešto lošijim mehaničkih svojstavima u poreñenju sa materijalom dobijenim na 950 ºC, ali takoñe mnogo boljim mehaničkim svojstavima u odnosu na konvencionalno sinterovane materijale. Koristeći se rezultatima dobijenim pri izradi ove doktorske disertacije kombinovanjem dve do sada diskutovane tehnike, odnosno konvencijalnog sinterovanja i toplog presovanja, prvi put je pokazano da se sa dovoljno velikim smanjenjem veličine zrna, sa mikro na nano nivo, simultano mogu povećati i žilavost i tvrdoća biokeramičkih hidroksiapatitnih materijala [24, 198]. Vrlo važno je istaći da se smanjenjem prosečne veličine zrna na nano dimenzije promenila vrsta loma po svojoj prirodi relativno krte biokeramike na bazi HAP iz transgranularnog u intergranularni, imajući za posledicu veliki porast žilavosti materijala. Rendgenska difrakciona analiza toplo presovanih uzoraka HAP1 je pokazala da je pri formiranju monofaznih gustih materijala došlo do preferentne kristalizacije usled dejstva pritiska tokom sinterovanja, ali da je na svim temperaturama došlo do formiranja monofaznog hidroksiapatitnog materijala. Na osnovu poreñenja prosečne veličine zrna i mehaničkih svojstava gustih monofaznih hidroksiapatitnih biokeramičkih materijala, može se uočiti da je mogućnost sniženja temperature sinterovanja primenom pritiska, tehniku toplog presovanja postavilo daleko iznad konvencijalnog postupka. Spark plazma sinterovanje, kao još novija i naprednija tehnika koja slično toplom presovanju podrazumeva primenu pritiska tokom sinterovanja, tokom koje se električna struja koristi za pospešivanje procesa sinterovanja, omogućila je u slučaju praha HAP1 dobijanje monofaznih biokeramičkih materijala veće gustine u poreñenju sa materijalima dobijenih konvencionalnim sinterovanjem i toplim presovanjem na još nižoj temperaturi. Naime pri spark plazma sinterovanju praha HAP1 na 900 ºC uz drastično kraće vreme sinterovanja od svega 5 min, dobijen je monofazni biokeramički materijal izuzetno velike gustine koji je po ivicama bio translucentan. Ovaj postupak sinterovanja u slučaju HAP1 sa jedne strane doprinosi povećanju gustine na nižoj temperaturi i pri višestruko kraćem vremenu procesiranja u odnosu na tehniku toplog presovanja, dok sa druge srane dobijeni materijal ima takoñe finozrnu strukturu ali i nešto veću vrednost prosečne veličine zrna, koja iznosi oko 150 nm. Nešto veća prosečna veličina zrna monofaznih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem u odnosu na toplo presovan materijal rezultira nešto manjom vrednošću koeficijenta žilavosti od 1,00 MPa m1/2, dok je tvrdoća ovih materijala veća od materijala dobijenih prethodno opisanim postupcima usled intenzivnije denzifikacije i iznosi 4,75 GPa. Na temperaturama od 1000 ºC do 1200 ºC tokom 5 do 15 min, spark plazma sinterovanjem praha HAP1 dobijeni su takoñe monofazni materijali velikih gustina, sa većom prosečnom veličinom zrna ali sa pojavom pukotina i sa dosta lošijim mehaničkim svojstvima u poreñenju sa materijalom dobijenim na 900 ºC. Vrsta loma u slučaju spark plazma sinterovanih materijala na temperaturama nižim od 1000 ºC je intergranularan, dok je na višim temperaturama usled velikog rasta zrna priroda loma transgranularna. Može se konstatovati da je spark plazma sinterovanjem HAP1 potvrñeno 177 da se sa smanjenjem prosečne veličine zrna sa mikro na nano nivo istovremeno povećavaju i tvrdoća i žilavost biokeramičkih materijala. Rendgenska difrakciona analiza spark plazma sinterovanih uzoraka HAP1 je pokazala da je pri formiranju monofaznih gustih materijala, slično kao kod toplo presovanih uzoraka, došlo do preferentnog rasta zrna usled dejstva pritiska tokom sinterovanja. Svojstva gustih monofaznih hidroksiapatitnih biokeramičkih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem ukazuju na niz prednosti ove tehnike sinterovanja u odnosu na konvencijalni postupak. Znatno kraće vreme sinterovanja na nižoj temperaturi, kao i odsustvo pretpresovanja na visokim pritiscima, tehniku spark plazma sinterovanj pri procesiranju monofaznih hidroksiapatitnih biokeramičkih materijala izdiže u odnosu na konvencionalno sinterovanje i tolpo presovanje. Poreñenjem svojstava monofaznih hidroksiapatitnih materijala dobijenih spark plazma sinterovanjem sa toplo presovanim materijalima, uočava se da obe tehnike imaju svoje prednosti i da u zavisnosti od željenih svojstava materijala i ekonomskih parametara jedna od njih dobija prednost u odnosu na drugu. Sa druge strane, generalni nedostatak obe tehnike sinterovanja potpomognute pritiskom predstavlja nemogućnost direktne izrade biokeramičkih kompakata sa nepravilnim oblicima, kakvi često imaju primenu u maksiofacijalnoj hirurgiji i ortopediji, već zahtevaju naknadnu obradu. Tehnika koja se tokom izrade ove doktorske disertacije po dosta kriterijuma pokazala kao optimalna za procesiranje biokeramičkih materijala na bazi HAP je mikrotalasno sinterovanje. Uspostavljanjem homogenog mikrotalasnog polja tokom sinterovanja omogućeno je procesiranje monofaznih materijala na bazi HAP gustine 96 % od teorijske gustine tokom 15 min na 900 ºC. Izuzetno uniformna mikrostruktura ovako dobijenog gustog materijala je posledica odsustva temperaturnog gradijenta u samom materijalu tokom procesiranja zahvaljujući mikrotalasima koji obezbeñuju homogeno zagrevanje po čitavoj zapremini procesiranog materijala. Najmanja vrednost prosečne veličine zrna u gustoj nanostrukturi iznosi 100 nm, a postignuta je upravo pri prethodno navedenim uslovima procesiranja, polazeći od izostatski ispresovanog kompakta na pritisku od 400 MPa. Vrednost koeficijenta žilavosti materijala dobijenog na ovaj način je relativno visoka i iznosi 1,34 MPa m1/2, dok je tvrdoća uzorka identična tvrdoći uzorka procesiranog spark plazma tehnikom na istoj temperaturi i iznosi 4,75 GPa. Koristeći ovu tehniku sinterovanja na temperaturama do 1200 ºC, tokom 15 min su dobijeni materijali tvrdoće i do 5,0 GPa, što je izuzetno visoka vrednost za ovaj tip keramike, a treba istaći da se za razliku od prethodno navedenih tehnika materijali dobijeni na višim temperaturama odlikuju odsustvom pukotina i uniformnom raspodelom veličina zrna. Uniformne finozrne mikrostrukture materijala, dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem HAP1 mogu biti garancija i za ujednačene vrednosti mehaničkih parametara u svim pravcima, za razliku od nanostrukturnih i finozrnih materijala dobijenih tehnikama koje podrazumevaju primenu pritiska tokom sinterovanja. 178 Polazeći od nanočestičnog kalcijum deficitarnog HAP2, postupkom konvencionalnog sinterovanja, kao i u slučaju stehiometrijskog nanočestičnog HAP1, optimalni parametri procesiranja za dobijanje gustih bifaznih biokeramičkih materijala su: izostatski pritisak pretpresovanja praha 400 MPa, temperatura sinterovanja 1200 ºC i vreme zadržavanja na temperaturi sinterovanja 2 h. Na ovaj način dobijen je gust bifazni biokeramički materijal na bazi HAP i β-TCP sa prosečnom veličinom zrna od 3 µm. Na nižim temperaturam su kao i u slučaju sinterovanja HAP1 dobijeni su materijali velike poroznosti. Toplim presovanjem i spark plazma sinterovanjem HAP2, slično kao pri procesiranju monofaznih biokeramičkih materijala dobijeni su gusti bifazni biokeramički materijali na znatno nižim temperaturama od materijala dobijenih konvencionalnim postupkom. Najniža temperatura na kojoj je toplim presovanjem HAP2 dobijen gust materijal bila je kao i u slučaju HAP1 950 ºC, na kojoj je tokom 2 h procesiranja dobijen nanostrukturni bifazni biokeramički materijal sa prosečnom veličinom zrna od 80 nm. Bifazni kompakt dobijen spark plazma sinterovanjem na 900 ºC odlikovao se takoñe velikom gustinom, ali je prosečna veličina zrna bila oko deset puta veća u odnosu na toplo presovan bifazni materijal. Na osnovu ovog rezultata se može uočiti da je velika brzina zagrevanja prilikom SPS prilikom formiranja bifaznih gustih materijala, kao i prilikom procesiranja monofaznih materijala inicirala veći rast zrna u odnosu na materijale procesirane toplim presovanjem. Mikrotalasnim sinterovanjem HAP2 dobijeni su takoñe bifazni materijali uniformnih mikrostruktura sa veličinom zrna u intervalu 480 nm - 4,7 µm. Može se zaključiti da je svim primenjenim tehnikama sinterovanja, polazeći od kalcijum deficitarnog hidroksiapatita dobijeni bifazni biokeramički materijali, kao i da je u svim slučajevima bifazni materijal na bazi HAP i TCP imao veću prosečnu veličinu zrna, upravo zbog nastanka TCP kao druge faze, u odnosu na monofazni biokeramički materijal dobijen pri identičnim uslovima procesiranja. Nehomogenost faznog sastava i brži rast zrna na nižim temperaturama sinterovanja, pri svim postupcima formiranja gustih bifaznih biokeramičkih materijala, generalno utiče na nešto lošija mehanička i nanomehanička svojstva ovih materijala u odnosu na monofazne biokeramičke materijale dobijene pri istim uslovima procesiranja. Ispitujući uticaj faznog sastava i veličine zrna monofaznih i bifaznih, nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala metodom nanoidentacije, uočeno je da nastajanje β-TCP faze tokom procesiranja ima dominantan uticaj na nanomehanička svojstva ovih materijala, kao i da smanjenje veličine zrna i kod monofaznih i kod bifaznih biokeramičkih materijala, utiče povećanje tvrdoće. Materijali kontrolisane poroznosti na bazi HAP i TCP su u okviru ove doktorske disertacije dobijani tehnikama konvencijalnog sinterovanja i mikrotalasnog sinterovanja. Ispitujući uticaj uslova procesiranja na svojstva biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti, ustanovljeno je da fazni sastav ima inferioran uticaja na mehanilčka svojstva ovih materijala u poreñenju sa uticajem koji ima mikrostruktura sa prisutnim sfernim porama i čvrstim vratovim uspostavljenim izmeñu izuzetno čvrstih sfernih aglomerata. Ovakva mikrostruktura je, kao dominantan faktor, pre svega uticala na visoke vrednosti koeficijenta žilavosti ovog tipa biokeramičkih materijala, dobijenih konvencijalnim i 179 mikrotalasnim sinterovanjem. Ali i pored dominantnog uticaja navedenih mikrostrukturnih karakteristika na svojstva ovog tipa materijala, prilikom procesiranja biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti tehnikom mikrotalasnog sinterovanja su za višestruko kraće vreme sinterivanja dobijeni bifazni biokeramički materijali osetno boljih mehaničkih svojstava, tj. za oko 10 % veće tvrdoće i za oko 15-50 %, u zavisnosti od temperature sinterovanja, veće vrednosti koeficijenata žilavosti u odnosu na konvencionalno sinterovane materijale. Razlog za poboljšanje mehaničkih svojstava usled primene mikrotalasa tokom procesiranja materijala kontrolisane poroznosti je sa jedne strane razlika u gustini materijala usled intenzivnije denzifikacije tokom mikrotalasnog sinterovanja, tokom znatno kraćeg vremena procesiranja. Sa druge strane finozrnija i uniformnija mikrostruktura dobijenih materijala, koja je posledica znatno kraćeg zadržavanja na temperaturi sinterovanja, može da bude ključan faktor za poboljšana mehanička svojstva mikrotalasno sinterovanih materijala kontrolisane poroznosti. Može se zaključiti da kratko vreme i niska temperatura, kako gustih tako i kontrolisano poroznih biokeramičkih materijala, pri procesiranju tehnikom mikrotalasnog sinterovanja idu u prilog njenoj ekonomskoj opravdanosti. Uniformnost mikrostrukture, mogućnost kontrolisanja prosečne veličine zrna na nano nivou, dobra mehanička svojstva i jednostavnost izrade biokeramičkih materijala komplikovanih oblika, samo su neke u nizu prednosti mikrotalasnog sinterovanja u odnosu na druge korišćene tehnike za dobijanje gustih i kontrolisano poroznih materijala polazeći od prahova HAP1-HAP4. 180 23. Rezultati in vitro i in vivo ispitivanja nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala U ovom poglavlju prikazani su rezultati ispitivanja bioaktivnosti i biokompatibilnosti materijala, dobijenih u okviru ove doktorske disertacije, in vitro i in vivo metodama. 23.1. Rezultati in vitro ispitivanja bioaktivnosti materijala u simuliranom telesnom fluidu Mikrostruktura konvencionalno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 2 h, koja se karakteriše prosečnom veličinom zrna od 3 µm, nakon 28 dana tretmana u simuliranom telesnom fluidu (STF) na telesnoj temperaturi prikazana je na slici 23.1. Sa SEM mikrografije se mogu uočiti kristalne skupine veličine oko 1 µm, sastavljene od vrlo tankih igličastih i lisnati kristala dužine nakoliko stotina nanometara. Formiranje uočenog novog sloja na površini biokeramičkih materijala je posledica izmene jona biomaterijala i rastvora STF. Igličasta mikrostruktura novonastalog sloja apatita na površini gustog biokeramičkog materijala nakon tretmana u STF, slična strukturi prikazanoj na slici 23.1, je uobičajena prilikom odreñivanja bioaktivnosti mikrostrukturnih materijala na bazi HAP i TCP u STF [188, 213, 251]. Slika 23.1. Mikrostrukture monofaznog konvencionalno sinterovanog uzorka HAP1 na 1200ºC tokom 2h, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu 181 Na površini monofaznog biokeramičkog kompakta dobijenog spark plazma sinterovanjem praha HAP1 na 900 ºC tokom 5 min, sa prosečnom veličinom zrna od oko 100 nm, nakon in vitro testa u simulanom telesnom fluidu došlo je do formiranja kristala čija je mikrostruktura prikazana na slici 23.2. Sa slika se uočava nekoliko različitih oblika kristala u novonastalom sloju, od skoro sferičnih zrna dimenzija od 100-250 nm, do štapićastih oblika dužine oko 1 µm i debljine stotinak nanometara. Slika 23. 2. Mikrostrukture monofaznog spark plazma sinterovanog uzorka HAP1 na 900ºC tokom 5 min, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu Površina mikrotalasno sinterovanog uzorka HAP1 na 900 ºC tokom 5 min, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu prikazana je na slici 23.3. Na površini monofaznog biokeramičkog materijala dobijenog na ovaj način, čija je gusta mikrostruktura sačinjena od zrna dimenzija od 100 nm do 150 nm, nakon tretmana u STF došlo je do formiranja kristala dimenzija od 50 nm do 100 nm. Slične mikrostrukture novonastalog sloja HAP na površini sinterovanog biokeramičkog materijala, nakon tretmana u STF prikazali su Sun i Ribeiro sa saradnicima u svojim publikacijama [283, 284]. 182 Slika 23. 3. Mikrostrukture monofaznog mikrotalasno sinterovanog uzorka HAP1 na 900ºC tokom 15 min, nakon in vitro testa tokom 28 dana u simulanom telesnom fluidu In vitro testovima u simuliranom telesnom fluidu gustih monofaznih mikrostrukturnih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita dobijenih konvencionalnim sinterovanjem, spark plazma sinterovanjem i mikrotalasnim sinterovanjem, pokazano je da se radi o bioaktivnim materijalima. U sva tri slučaja došlo je do formiranja kristala apatita na površini sinterovanog materijala, ali se u zavisnosti od 183 temperature sinterovanja, veličine zrna i primenjene tehnike sinterovanja razlikuju mikrostrukture nastalih kristalnih slojeva. Na osnovu mikrostruktura uzoraka nakon tretmana u STF može se zaključiti da je i u slučaju gustih monofaznih biokeramičkim materijala sa mikronskim i nano dimenzijama zrna potvrñena bioaktivnost, kao i da mikrostruktura formiranog sloja zavisi od veličine zrna. 23.2. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi L929 fibroblasta Ni jedan od dva ispitivana mikrotalasno sinterovana uzoraka HAP1 nije ispoljavao citotoksični efekat, što se uočava na osnovu morfoloških analiza ćelijskih kutura (Slike 23. 5 a-d.), ispitivanja metaboličke aktivnosti ćelija L929 (Slika 23. 4 a.), vijabilnosti ćelija (Slika 23. 4 b.) i nekroze ćelija (Slika 23. 4 c.). Na osnovu broja ćelija u kulturi zapaža se stimulatorni efekat, posebno nanostrukturnih mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1, na proliferaciju ćelija koji je izraženiji nakon produžene inkubacije od 3 dana (Slika 23. 4 d.). Slične promene se uočavaju i pri morfološkoj analizi ćelijskih kultura koje su bile u kontaktu sa mikrotalasno sinterovanim mikro- i nanostrukturnim uzorcima HAP1, posebno kod nanostrukturnih uzoraka sinterovanih na 900 ºC (Slika 23. 5 d.). Slika 23. 4 a. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na metaboličku aktivnost L929 ćelija (Ca-hidroksiaapatit (A) - mikrostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1, Ca-hidroksiapatit (B) nanostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1) 184 Slika 23. 4 b. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na vijabilnost L929 ćelija Slika 23. 4 c. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na nekrozu L929 ćelija Slika 23. 4 d. Efekat mikrotalasno sinterovanih uzoraka HAP1 na proliferacijuL929 ćelija nakon 1 i 3 dana, *- p< 0.5 u odnosu na kontrolu. 185 a) b) c) d) Slike 23. 5. Morfološke karakteristike L929 ćelija u kulturi:a) posebna kontrola- test bez materijala, b) negativna kontrola, plastika-cover slip, c) mikrostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1, d) nanostrukturni mikrotalasno sinterovan uzorak HAP1 Oba ispitivana uzorka mikrotalasno sinterovana uzoraka HAP1 ne ispoljavaju citotoksični efekat na L929 ćelije u kratkotrajnoj kulturi. Ćelije L929 brže rastu u blizini uzoraka kalcijum-hidroksiapatita u odnosu na kontrolni uzorak, pri čemu uzorak sa nanostrukturnom površinom snažnije stimuliše procese ćelijske proliferacije. Histološka analiza ćelija Na slikama 23. 6 a i b su prikazani delovi površine referentnog uzorka plastike (cover slips) na kojima se nalazi veliki broj fibroblastnih L929 ćelija, a analizom navedenih SEM mikrografija se može uočiti da ćelije generalno posmatrano dobro atheriraju na površinu referentnog uzorka, kao i da su ćelije različitih oblika, od trouglastog, preko vretenastog do okruglastog. Sa slika treba uočiti ćelije koje su celim 186 svojim obimom spregnute sa referentnim materijalom i čije je telo praktično paralelno sa površinom materijala, a upravo ovakve ćelije su prikazane uveličane na slici 23. 6 c. Ovakvi oblici ćelija ukazuju na njihovu odličnu spregnutost sa površinom materijala, a položaj njihovih citoplazmatičnih produžetaka ukazuje na težnju da se ostvari veza sa susednim fibroblastnim čelijama, što se još bolje može uočiti na slici 23. 6 d, na kojoj su citoplazmatični produžetci dve ćelije u neposrednom kontaktu. Na slici 23.6 e je prikazan primer slabo razvijene ćelije koja je takoñe priljubljena za referentni material i koja je okruglastog oblika bez razvijenih citoplazmatskih produžetaka. Njen oblik ukazuje na njenu smanjenu metaboličku aktivnost, a senka koja se javlja na njenom kontaktu sa referentnim materijalom ukazuje na relativno slabu vezu sa površinom materijala. Slika 23. 6 f prikazuje primer fibroblastne L929 čelije koja je pomoću svojih citoplazmatičnih nastavaka relativno dobro pričvršćena za podlogu od referentnog materijala, osim dela obima ćelije gde je uočljiva senka koja ukazuje na lošilu atheziju tela ćelije u odnosu na delove sa citoplazmatičnim produžecima. Voluminoznost prikazane ćelije ukazuje na njenu potencijalnu metaboličku aktivnost. a) b) c) d) Slika 23. 6. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini kontrolnog uzorka 187 e) f) Slika 23. 6. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini kontrolnog uzorka Na slikama 23. 7 a-h su prikazani delovi površine uzorka HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC tokom 15 min u kontaktu sa fibroblastnim L929 ćelijama. Na SEM mikrografijama prikazanim na slikama 23. 7 a i b prikazane su fibroblastne ćelije vrlo pravilnog trouglastog i nešto zaobljenijeg oblika koje atheriraju obimom tela i pomoću citoplazmatičnih produžetaka na površinu mikrostrukturnog monofaznog hidroksiapatitnog materijala. Poreñenjem ove dve slike može se uočiti da je nešto čvršću vezu sa mikrostrukturnim HAP1 matrerijalom ostvarila fibroblastna ćelija na slici 23.7 a, na šta nam ukazuje manja površina senke na kontaktu ćelija-sinterovan materijal. Uočava se da su ćelije potencijalno metabolički aktivne, na šta ukazuje njihova voluminozna priroda. Skeniranjem čitave površine matrijala uočeno je da su upravo ćelije prikazane na slikama 23. 7 a i b u većini, dok su oblici ćelija prikazani na slikama 23. 7 c i d u velikoj manjini prisutni na površini mikrotalasno sinterovanog mikrostrukturnog HAP1 materijala. Oblik ćelije prikazane na slici 23. 7 c ukazuje na njenu devitaliziranost i smanjenu metaboličku aktivnost, kao i na relativno lošu atheziju. Dijametralno suprotna pojava predstavljena je na slici 23. 7 d, na kojoj je prikazana izrazito voluminozna fibroblastna ćelija koja se u potpunosti prostire po površini mikrostrukturnog HAP1 materijala. Odsustvo senke na kontaktu material-ćelija, na slici 23. 7 d, ukazuje na dobru atheziju na ovaj način spregnute fibroblastne ćelije. Na slikama 23. 7e-h prikazani su različiti položaji i oblici citoplazmatičnih nastavaka, koji u svim prikazanim slučajevima pospešuju atheziju ćelija na gustom mikrostrukturnom hidroksiapatitnom materijalu. Na svim slikama je uočljiva voluminozna skrama preko zrna mikronskih veličina gusto pakovanih u mikrostrukturu materijala. Položaji citoplazmatičnih produžetaka ukazuje na težnju da se ostvari veza sa ne samo sa materijalom već i sa drugim fibroblastnim čelijama, što ide u prilog njihovom proliferacionom potencijalu. 188 a) b) c) d) e) f) Slika 23. 7. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min 189 g) h) Slika 23. 7. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Na slikama 23. 8 a-j su prikazani delovi površine mikrotalasno sinterovanog nanostrukturnog HAP1 u kontaktu sa L929 fibroblastnim ćelijama. Na slici 23. 8 a je prikazana površina nanostrukturnog HAP1 materijala na kojoj se nalazi veliki broj fibroblastnih ćelija različitih oblika, u položaju koji evidentno pokazuje da su čvrsto priljubljene za površinu materijala. Potpuno odsustvo senke izmeñu tela ćelije i delova površine materijala, prikazanih na slikama 23. 8 b i c, ukazuje na izuzetno dobru atheziju fibroblasta i guste apatitne nanostrukture. Na navedenim mikrografijama uočene su potpuno raširene fibroblastne ćelije sa vretenastom i sferičnom osnovom. Telo fibroblasta je u svim slučajevima voluminozno (Slike 23. 8 a-j), što govori u prilog činjenici da se radi o mladim sintetski i metabolički aktivnim ćelijama. a) b) Slika 23. 8. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min 190 c) d) e) f) Slika 23. 8. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min Na slikama 23. 8 d-h fibroblastne ćelije trouglastog, vretenastog i kružnog pljosnatog oblika su potpuno raširene i celim obimom naležu na površinu materijala, bez postojanja meñuprostora. Sa ovih slika se uočava da su ćelije celim obimom priljubljene za sinterovan material, kao i da su potpuno raširene po materijalu, u toj meri da se mikrostruktura materijala nazire ispod površine ćelija. Sa mikrografija prikazanim na slikama 23. 8 e i h se primećuje težnja ćelija, koje su potpuno spregnute sa materijalom, za uspostavljanjem meñusobnog kontakta i formiranjem kontinualne mreže, što ukazuje na njihove proliferaciona svojstva. Na slikama 23. 8 i, j potvrñuje se dobra athezija L929 fibroblastnih ćelija na površini nanostrukturnog HAP1 materijala, a mogu se uočiti citoplazmatični produžeci i tanak kontinualan film na krajevima ćelije, koji prijanjaju na zrna nano dimenzija, koji idu u prilog čvrstoj vezi ćelije sa gustim mikrotalasno sinterovanim monofaznim nanostrukturnim materijalom na bazi kalcijum-hidroksiapatita. 191 g) h) i) j) Slika 23. 8. SEM mikrografije fibroblastnih L929 ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min 23.3. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala u kulturi humanih fibroblasta Nakon 48 h ispitivanja citotoksičnog efekta uzoraka HAP1, mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC i 1200 ºC tokom 15 min, MTT testom u kulturi MRC-5 ćelija, konstatovano je da je nivo citotoksičnosti dosta nizak i da iznosi 12,57 % i 9,20 %, respektivno. Period oporavka od 72 h bio je u slučaju ćelija zasejanih na oba ispitivana materijala dovoljan da nivo citotoksičnosti značajno opadne, dok je nakon perioda oporavka od 96 h indeks citotoksičnosti imao negativne vrednosti. Negativan predznak ukazuje da ne postoji citotoksični efekat, već da je došlo do proliferacije ćelija (reparativna regeneracija). Negativne vrednosti indeksa citotoksičnosti nakon oporavka ćelija tokom 96 h, u slučaju oba ispitivana biokeramička materijala, ukazuju na činjeniču da se uočeno blago citotoksično dejstvo nakon ispitivanog perioda potpuno gubi [285, 286]. 192 Kako ni jedan od materijala nije ispoljio citotoksični efekat nakon perioda oporavka od 96 h, brzinu i stepen regeneracije ćelija je podesno predstaviti i brojem vijabilnih ćelija u odnosu na kontrolni uzorak. Slika 23. 9. upravo prikazuje stepen oporavka ćelija tj. broj vijabilnih ćelija u odnosu na kontrolni uzorak u zavisnosti od vremena oporavka. Sa dijagrama se uočava da je u slučaju oba ispitivana materijala značajan efekat oporavka nakon 96 h, u poreñenju sa efektima nakon 48 h i 72 h. Treba naglasiti da rezultati MTT-testa ne pokazuju da postoji statistički značajna razlika oporavka ćelija tokom vremena izmeñu dva ispitivana materijala. Može se zaključiti da izlaganje MRC-5 ćelija dejstvu mikrotalasno sinterovanih mikro- i nanostrukturnih minofaznih hidroksiapatitni materijali, tokom perioda oporavka u trajanju od 96 h, u oba slučaja izaziva stimulaciju metaboličke aktivnosti tj. primećuje se da se broj vijabilnih ćelija povećava iznad broja vijabilnih ćelija kontrolnog uzorka. MTT 0 20 40 60 80 100 120 140 48h 72h 96h vreme % K 1 2 Slika 23. 9. Rezultati MTT-testa nakon inkubacije ćelijskih linija MRC-5 sa mikrotalasno sinterovanim materijalima (1-900 ºC, 2-1200 ºC) i oporavka tokom 48 h, 72 h i 96 h, izraženi kao procenat od kontrole Uticaj uzoraka HAP1, mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC i 1200 ºC tokom 15 min, na rast ćelija meren je i DET metodom [285, 286] neposredno po završetku inkubacije kolorimetrijskim testom 48, 72, odnosno 96 h nakon isteka inkubacije. Uticaj ispitivanog materijala na vijabilnost ćelija je i u ovom slučaju izražen procentom od kontrole, a rezultati testa su prikazani na slici 23. 10. Nakon kontinuiranog delovanja materijala tokom 48h, vrednosti – izražene procentom od kontrole – za oba ispitivana materijala meñusobno se statistički značajno ne razlikuju, bez obzira na vreme ostavljeno u svežem medijumu. Sa dijagrama se uočava da je u slučaju oba ispitivana materijala značajan efekat oporavka ćelija nakon 96 h, što potvrñuje rezultate MTT-testa. 193 DET 0 20 40 60 80 100 120 140 48h 72h 96h vreme % K 1 2 Slika 23. 10. Rezultati DET-testa prikazani kao rast ćelija MRC-5 izloženih dejstvu mikrotalasno sinterovanih materijala (1-900 ºC, 2-1200 ºC) tokom 48 h, 72 h i 96 h, izraženi kao procenat od kontrole Nakon izvoñenja agar difuzionog testa po isteku perioda inkubacije od 24 h, u slučaju uzoraka HAP1 mikrotalasno sinterovanih na 900 ºC i 1200 ºC, indeks obezbojavanja bio je jednak nuli, tj. nije došlo do promene boje podloge. Nakon testiranja oba materijala sa podlogom od agra indeks liziranja je takoñe bio jednak nuli, tj. ni u jednom slučaju nisu detektovane lizirane (uginule) ćelije. Na osnovu vrednosti odgovora ćelija (indeks obezbojavanja/indeks liziranja) koji je u slučaju oba testirana materijala bio je jednak nuli, agar difuzionim testom je potvrñeno da mikrotalasno sinterovani mikro- i nanostrukturni monofazni hidroksiapatitni materijali nisu citotoksični. Histološka anliza ćelija Po isteku perioda inkubacije ćelija s implantacionim materijalima, nakon 48 h izvršena je histološka analiza ćelija pomoću svetlosnog mikroskopa. S obzirom na netransparentnost ispitivanog materijala, jedina mogućnost fotodokumentacije histoloških rezultata svetlosnim mikroskopom jeste prikaz graničnog područja implantacionog materijala koje je osvetljeno i sadrži fibroblaste. U okviru oglednih grupa opisana je kontaktna površina izmeñu fibroblasta i implantacionog materijala, kao i morfologija samih fibroblasta [287]. Kontrolnu grupu predstavlja kontinuirana ćelijska linija humanih fibroblasta MRC- 5, koji su prikazani na slici 23. 11 a i b, a koji rastu zalepljeni za dno laboratorijskog suda. 194 a) b) Slika 23.11. Ćelijska linija fibroblasta MRC-5, kontrolni uzorak: a)osvetljen uzorak, b)uzorak slikan sa faznim kontrastom Sve ćelije imaju izgled vitalnih mladih fibroblasta s vretenastim i trouglastim ćelijskim telom. Veoma retke ćelije su vretenasto izdužene, istanjenog ćelijskog tela, što 195 odgovara morfološkim karakteristikama zrelih fibroblasta – fibrocita. Ćelijski produžetci se odvajaju od ćelijskog tela, dajući ćelijama često zvezdast izgled. Na mestu kontakta fibroblastne kulture MRC-5 sa nanostrukturnim mikrotalasno sinterovanim biokeramičkim materijalom nalaze se vitalni fibroblasti s mehurastim i trouglastim ćelijskim telom. Fibroblasti su u neposrednom dodiru sa površinom materijala u različitoj meri, te se tako u ivičnoj zoni mogu naći fibroblasti koji ćelijskim telom naležu na podlogu i oni koji uranjaju jednim produžetkom u podlogu a ćelijsko telo i ostali produžetci pripadaju dnu posude (Slika 23. 12 a, b). Interesantno je primetiti da odreñen broj tankih citoplazmatskih produžetaka je uočljiv uz sam materijal, što je dokaz da je ćelijsko telo sa ćelijskim produžecima u neposrednom kontaktu sa materijalom, pri čemu je ćelija je i dalje vitalna. Na pojedinim mestima zapažaju se pojedinačne okruglaste ćelije bez produžetaka, čiji broj je mali koje mogu predstavljati avitalne ćelije. Sa slika se uočava da fibroblasti koji su u kontaktu sa materijalom i fibroblasti sa dna posude, koji nisu u kontaktu s implantacionom podlogom, imaju sve karakteristike mladih vitalnih fibroblasta s produžecima, koji grade mrežu i istovetni su s kontrolnim ćelijama [287, 288]. a) Slika 23.12. Ćelijska linija fibroblasta MRC-5, zasejana na podlozi “ uzorak HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min“ 196 b) Slika 23.12. Ćelijska linija fibroblasta MRC-5, zasejana na podlozi “ uzorak HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min“ Histološkom analizom skenirajućom elektronskom mikroskopijom opisana je kontaktna površina izmeñu humanih fibroblasta i mikrotalasno sinterovanih mikro- i nanostrukturnih monofaznih hidroksiapatitnih materijala kao i morfologija i meñusobni odnos fibroblasta. Na slikama 23. 13 a i b je predstavljen deo površine mikrostrukturnog HAP1 na kome se nalazi veliki broj MRC-5 fibroblastnih ćelija. Ćelije su evidentno spregnute sa površinom materijala, a generalno su različitih oblika, od vretenastog, blago zaobljenog do trouglastog oblika. Izmeñu pojedinih ćelija i materijala se u tragovima javlja senka, što pokazuje da mali broj ćelija delom svog obima nije savršeno priljubljen za površinu materijala. Ali treba naglasiti da je većina ćelija u položaju koji ide u prilog njihovoj čvrstoj vezi sa površinom materijala. Na ćelijama su uočljivi citoplazmatični produžetci različitih dužina, a pri većim uvećanjima (Slike 23. 13 c i d) uočava se da i telo čelije i citoplazmatični produžetci u velikoj meri adheriraju na podlogu od mikrostrukturnog HAP1. Položaj tela ćelija i njihovih nastavaka na slici 23. 13 c pokazuje da pojedinačni fibroblasti pokušavaju da organizuju kontinualnu mrežu pomoću citoplazmatskih produžetaka koji su različitog oblika i broja. Na slikama 23. 13 e i f prikazane su fibroblastne ćelije trouglastog oblika koje su svojim produžetcima čvrsto vezane za mikrostrukturni materijal. 197 a) b) c) d) e) f) Slika 23. 13. SEM mikrografije humanih fibroblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Na slikama 23. 14 a i b je prikazan deo površine mikrotalasno sinterovanog nanostrukturnog HAP1 na kome se uočavaju MRC-5 fibroblastne ćelija u položaju koji evidentno pokazuje da su čvrsto priljubljene za površinu materijala. Na slici 23. 14 a fibroblastna ćelija je potpuno raširena i celim obimom naleže na površinu materijala, bez 198 postojanja meñuprostora. Telo fibroblasta je voluminozno, što govori u prilog činjenici da se radi o mladim sintetski aktivnim ćelijama. Odsustvo senke izmeñu tela i nastavaka ćelije i površine materijala na slikama 23. 14. a i b, kao i na slikama snimanim pri većim uvećanjima 23. 9 c i d, potvrñuje dobru atheziju ćelija na površinu materijala. Slike 23. 14 c-f pokazuju na različitim uvećanjima vrlo dobro prijanjenje obima fibroblastnih ćelija za površinu nanostrukturnog HAP1 materijala. Sa ovih slika se uočava da su ćelije celim obimom priljubljene za material, kao i da su u toj meri raširene po površini materijala da se zrna nano dimenzija naziru ispod citoplazmatičnih produžetaka. a) b) c) d) Slika 23. 14. SEM mikrografije humanih fibroblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min 199 e) f) g) h) Slika 23. 14. SEM mikrografije humanih fibroblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 900 ºC tokom 15 min 23.4. Rezultati in vitro ispitivanja biokompatibilnosti materijala odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1 Ispitivanjem biokompatibilnosti mikrotalasno sinterovanog monofaznog hidroksiapatitnog materijala HAP1, odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3- E1, utvrñeno je da su ćelije sa površinom ispitivanog implantnog materijala uspostavile čvrstu vezu [289, 290]. Na slikama 23.15. prikazane su SEM mikrografije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1 na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min. Na slikama se uočavaju osteoblastne ćelije u položaju koji potvrñuje njihovu dobru atheziju na površini ispitivanog materijala. Položaj citoplazmatičnih produžetaka ukazuje na težnju osteoblastnih ćelija da formiraju kontinualnu mrežu po površini mikrotalasno 200 sinterovanog HAP1. Na dnu slike 23.15 a se može videti način povezivanja dve osteoblastne ćelije na površini ispitivanog hidroksiapatitnog materijala. a) b) Slika 23. 15. SEM mikrografije osteoblastnih ćelija na površini mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min Slika 23. 16. prikazuje kvantitativno adheziju osteoblastnih ćelija vezanih za površinu mikrotalasno sinterovanog HAP1 na pre i posle modifikacije naelektrisanja 201 površine. Nakon modifikacije naelektrisanje površine jedne grupe monofaznih hidroksiapatitnih uzoraka, naelektrisanje površine postalo je negativnije. Druga grupa ne modifikovanih uzoraka je bila pozitivnije naelektrisana. Sa dijagrama na slici 23. 16 se može uočiti da je broj osteoblastnih ćelija koje su uspostavile vezu sa površinom ispitivanog materijala neznatno veći u slučaju uzoraka čije je naelektrisanje površine negativnije, te se može zaključiti da modifikacija naelektrisanja površine, u slučaju mikrostrukturnog mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC, nije osetnije uticala na adheziju osteoblastnih ćelija za površinu materijala. Slika 23. 16. Ukupan broj osteoblastnih ćelija vezanih za površinu mikrotalasno sinterovanog HAP1 na 1200 ºC tokom 15 min (N - nemodifikovan, M - modifikovan ) Slika 23. 17 slikovito prikazuje stadijume athezije osteoblastnih ćelija na površini ispitivanog materijala, a stadijumi se definišu na sledeći način: Faza 1: Ćelije na površini materijala su skupljene i okrugle sa filopodijom Faza 2: Ćelije na površini materijala su sa lamelipodijama Faza 3: Ćelije su celim obimom u kontaktu sa površinom materijalom Faza 4: Ćelije se u potpunosti prostiru po površini materijala Slika 23. 17. Stadijumi athezije osteoblastnih ćelija Na slici 23. 18. prikazan je broj ćelija u svakom od četiri stadijuma athezije na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini mikrotalasno sinterovanog materijala na bazi 1 2 3 4 202 HAP. Uočava se da je u oba slučaja najveći broj ćelija u trećoj fazi athezije, tj. ćelije su celim svojim obimom u kontaktu sa površinom ispitivanog materijala, dok je potpuno prostran (4. stadijum athezije) po površini materijala nešto manji broj ćelija. Slika 23. 18. Broj ćelija u svakom stadijumu athezije na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini materijala Slika 23. 19. prikazuje procenat ćelija u četvrtom stadijumu athezije u odnosu na ukupan broj ćelija na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini ispitivanog materijala. Uočava se da je neznatno veći udeo potpuno spregnutih ćelija prisutan na pozitivnijoj tj. nemodifikovanoj površini mikrotalasno sinterovanih hidroksiapatinih materijala. Slika 23. 19. Procenat ćelija u četvrtom stadijumu athezije na modifikovanoj i nemodifikovanoj površini materijala 203 23.5. Rezultati in vivo ispitivanja biokompatibilnosti materijala metodom primarne kutane iritacije Sistemska reakcija podnošljivost – tolerancija Nakon jednokratnog aplikovanja test materijala svi kunići su se dobro oporavili i nisu pokazivali znake bolesti u narednih 72 sata. Lokalna reakcija Efekat monofaznog HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min Eritem i edem nisu bili prisutni posle 24, 48 i 72 sata na tretiranim mestima ni kod jedne od ispitivanih životinja. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 23. 1. Nije bilo statistički značajne razlike u vrednosti SPI izmeñu tretiranih mesta i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p>0.05). Indeks primarne kutane iritacije za HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC bio je 0 na skali od 0,00 do 8,00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC nema iritirajuće osobine. Tabela 23. 1. Skor eritema i edema posle primene HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 900 ºC Kunić 24 s. 48 s. 72 s. (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 2 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 3 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije 204 Efekat monofaznog HAP1 mikrotalasno sinterovan na 1200 ºC tokom 15 min Eritem i edem nisu bili prisutni posle 24, 48 i 72 sata na tretiranim i kontrolnim mestima ni kod jedne od tretiranih životinja. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 23. 2. Nije bilo statistički značajne razlike u vrednosti SPI izmeñu tretiranih mesta i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p>0.05). Indeks primarne kutane iritacije za pHAP + celuloza bio je 0 na skali od 0,00 do 8,00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, HAP1 mikrotalasno sinterovan na 1200 ºC tokom 15 min nema iritirajuće osobine. Tabela 23. 2. Skor eritema i edema posle primene HAP1 mikrotalasno sinterovanog na 1200 ºC Kunić 24 c 48 c 72 c (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 2 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 3 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije Efekat mlečne kiseline (98%) – pozitivna kontrola U prvom vremenskom periodu analize reakcije kože (24 sata nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98%) dobro definisan eritem (skor 2) uočen je kod dve od tri testirane životinje. Kod treće životinje uočen je slab eritem (skor 1). Takoñe, u ovom vremenskom periodu uočen je slab edem kod dve životinje (skor 1). U drugom vremenskom periodu analize reakcije kože (48 sati nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98 %) uočen je slab eritem (skor 1) kod sve tri životinje i slab edem (skor 1) kod dve od tri živitinje. U trećem vremenskom periodu analize reakcije kože (72 sata 205 nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98%) iritacija kože je bila povučena, smanjena i slab eritem (skor 1) ostao je kod jedne životinje, a kod druge dve životinje nije uočeno prisustvo eritema (skor 0). U ovom vremenskom periodu edem je uočen kod jedne od tri životinje. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 23. 3. Postojala je statistički značajna razlika u vrednosti SPI izmeñu mesta tretiranih mlečnom kiselinom (98 %) i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p<0.05). Indeks primarne kutane iritacije za mlečnu kiselinu (98 %), koja je korišćena kao pozitivna kontrola bio je 0,84 na skali od 0,00 do 8,00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, mlečna kiselina (98%) ima blago iritirajuće osobine. Tabela 23. 3. Skor eritema i edema posle primene mlečne kiseline 98% (pozitivna kontrola) Kunić 24 c 48 c 72 c (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 2 0 1 0 0 0 6/6-0/6=1.00 Edem 1 0 1 0 1 0 2 Eritem 2 0 1 0 0 0 6/6-0/6=1.00 0.84 Edem 1 0 1 0 1 0 3 Eritem 1 0 1 0 1 0 3/6-0/6=0.50 Edem 0 0 0 0 0 0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije U testu primarne kutane iritacije za oba ispitivana test materijala (monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min i monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min) srednja vrednost indeksa primarne kutane iritacije je bila nula. U direktnom, jednokratnom kontaktu sa kožom ni jedan od dva ispitivana test materijala nije ispoljio iritirajuća svojstva. 206 PRILOG POGLAVLJU 23.5. Slika 23.20. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije nakon postavljanja test uzoraka Slika 23. 21. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije 4 h nakon postavljanja test uzoraka Slika 23. 22. Fotografije prikazuju test primarne kutane iritacije 72 h nakon postavljanja uzoraka 207 IV. ZAKLJUČCI Stehiometrijski i kalcijum deficitarni nanočestični prahovi kalcijum-hidroksiapatita, sačinjeni od igličastih primarnih čestica dužine do 100 nm i širine oko 20-30 nm, sintetisani su modifikovanim precipitacionim metodama i korišćeni kao polazni materijal za proučavanje procesa formiranja gustih biokeramičkih materijala na bazi kalcijum-hidroksiapatita i kalcijum-fosfata različitim tehnikama sinterovanja. Ispitivanjem uticaja veličine izostatskog pritiska na presovanje nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita, zaključeno je da se presovanjem na pritisku od 400 MPa dobijaju polazni kompakti najvećih gustina (1,89 g/cm3 ili 60 % TG), najmanje ukupne zapremine pora, najuže raspodele veličina pora i najmanje zapremine mezopora. Konvencionalnim sinterovanjem kompakata, dobijenih presovanjem stehiometrijskog praha kalcijum-hidroksiapatita na 400 MPa, na 1200 ºC tokom 2 h dobijen je monofazni biokeramički materijal na bazi kalcijum-hidroksiapatita, uniformne mikrostrukture sa prosečnom veličinom zrna od 3 µm i gustinom od 3,00 g/cm3 tj. 95 % TG. Mikrotalasnim sinterovanjem stehimetrijskog praha kalcijum-hidroksiapatita dobijeni su monofazni hidroksiapatitni biokeramički materijali, dok su u slučaju kalcijum deficitarnog hidroksiapatita dobijeni bifazni materijali na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum- fosfata. U oba slučaja dobijeni materijali se odlikuju uniformnim mikrostrukturama, ravnomernim skupljanjem u svim pravcima i velikim gustinama, što je potvrda veoma dobre sinterabilnosti nanočestičnih prahova HAP u uslovima mikrotalasnog sinterovanja. Uniformne mikrostrukture monofaznih materijala na bazi HAP sinterovanih na temperaturama u intervalu od 900 ºC - 1200 ºC tokom 15 min, sačinjene su od zrna prosečne veličine od 130 nm do 1,59 µm. Povećanje temperature sinterovanja sa 900 ºC na 1200 ºC tokom formiranja bifazne HAP/TCP biokeramike, inicira znatno veći rast zrna nego u slučaju dobijanja monofazne biokeramike. Kalcijum deficitarni hidroksiapatit tokom procesa mikrotalasnog sinterovanja na 900 ºC i 1000 ºC transformiše u finozrni HAP/β-TCP materijal, dok se povećanjem temperature iznad 1100 ºC inicira fazna transformacija β-TCP-a u α-TCP koja je praćena značajnom ekspanzijom. Dobijeni monofazni biokeramički materijali se odlikuju znatno većim vrednostima koeficijenata žilavosti od bifazne HAP/TCP biokeramike. Sa smanjenjem prosečne veličine zrna povećava se razlika vrednosti koeficijenata žilavosti ove dve vrste mikrotalasno sinterovanih biokeramičkih materijala. Smanjenje veličine zrna u slučaju mikrotalasno sinterovane monofazne biokeramike na bazi HAP sa 1,59 µm na 240 nm, rezultira povećanjem žilavosti sa 0,85 MPa m1/2 to 1,04 MPa m1/2, a najveća vrednost žilavosti od 1,30 MPa m1/2 je dostignuta u slučaju monofazne biokeramike sa prosečnom veličinom zrna od 130 nm. Mehanizam loma u slučaju mikrotalasno sinterovanih monofaznih materijala je intergranularan, tj. redukovanjem temperature i vremena sinterovanja primenom mikrotalasa tokom sinterovanja značajno je smanjena prosečna veličina zrna, čime je povećana absorpcija energije pukotine na granicama zrna duž njenog prostiranja, što je glavni uzrok većih 208 vrednosti žilavosti nanostrukturnih materijala. Tvrdoća mikrotalasno sinterovanih materijala na bazi HAP sa povećanjem temperature sinterovanja sa 900 ºC na 1200 ºC raste od vrednosti 3,45 GPa do 4,85 GPa, što je posledica povećanja gustine materijala. Kombinacijom izostatskog presovanja na pritisku od 400 MPa i mikrotalasnog sinterovanja na 900 ºC tokom 15 min, dobijen je nanostrukturni monofazni biokeramički materijal na bazi HAP gustine 96 % TG i poboljšanih mehaničkih svojstava, sa vrednošću koeficijenta žilavosti od 1,34 MPa m1/2 i tvrdoće 4,75 GPa, što je najoptimalnija kombinacija mehaničkih svojstva kod materijala dobijenih mikrotalasnim sinterovanjem. Mikrotalasnim sinterovanjem nanočestičnih prahova HAP tokom 15 min, postignute su znatno veće gustine, uniformnije mikrostrukture i superiornija mehanička svojstva u odnosu na konvencionalno sinterovane uzorake na istoj temperaturi tokom višestruko dužeg vremena procesiranja. Sinterovanjem nanočestičnih prahova kalcijum-hidroksiapatita metodama potpomognutim pritiskom, tj. spark plazma sinterovanjem i toplim presovanjem, dobijeni su materijali sa izuzetno velikim gustinama i unifornim mikrostrukturama sa prosečnom veličinom zrna od mikro do nano nivoa. Kao i u slučaju mikrotalasnog sinterovanja, spark plazma sinterovanjem i toplim presovanjem praha kalcijum-hidroksiapatita sa stehiometrijskim Ca/P odnosom dobjena je monofazna biokeramika, dok su bifazni biokeramički materijali dobijeni sinterovanjem kalcijum deficitarnog hidroksiapatita. U slučaju uzoraka dobijenih spark plazma sinterovanjem, najveća vrednost gustine 3,12 g/cm3 ( 98,5 % TG) je postignuta sinterovanjem na 1000 ºC tokom 10 min. Snižavanjem temperature sinterovanja na 900 ºC i skraćivanjem vremena na 5 min dobijaju se nešto manje gustine, ali se prosečna veličina zrna približava nano nivou i iznosi približno 150 nm. Upravo pri ovim uslovima, spark plazma sinterovanjem dobijen je monofazni uzorak sa najmanjim zrnom i najvećom vrednošću koeficijenta žilavosti od 1,00 MPa m1/2, dok je vrednost tvrdoće iznosila 4,75 GPa. Toplim presovanjem stehimetrijskog praha kalcijum-hidroksiapatita dobijeni su translucentni monofazni biokeramički materijali na bazi HAP sa prosećnom veličinom zrna u intervalu od 50 nm, u slučaju uzorka toplo presovanog na 950 ºC tokom 2 h, do veličine od 380 nm u slučaju uzorka procesiranog na 1000 ºC tokom 2 h. Translucentnost dobijenih uzoraka je potvrda izuzetno velike gustine i dimenzije zrna merljive na nano skali. Ispitivanje uticaja smanjenja prosečne veličine zrna na mehanička svojstva, dovelo je do zaključka da smanjenje zrna sa mikro na nano nivo inicira istovremeno povećanje i žilavosti i tvrdoće gustih monofaznih biomaterijala. Uporednom analizom konvencionalno sinterovanih i toplo presovanih monofaznih biomaterijala, zaključuje se da sa smanjenjem veličine zrna sa 3 µm na 50 nm, koeficijent žilavosti povećava sa 0,28 MPa m1/2 do vrednosti od 1,52 MPa m1/2, dok se tvrdoća povećava od vrednosti 2,39 GPa do 4,30 GPa. Ispitujući uticaj faznog sastava i veličine zrna toplo presovanih i konvencionalno sinterovanih monofaznih i bifaznih, nano- i mikrostrukturnih biokeramičkih materijala metodom nanoidentacije, zaključeno je da nastajanje β-TCP faze tokom procesiranja ima 209 dominantan uticaj na nanomehaničke karakteristike biokeramike na bazi HAP i TCP. Nanoindentacijom je utvrñeno da u slučaju monofazne biokeramike smanjenje veličine zrna sa mikro na nano nivo izaziva povećanje tvrdoće i smanjenje Jungovog modula elastičnosti. Analizirajući rezultate nanoindentacije bifazne HAP/β-TCP biokeramike, smanjenjem veličine zrna povećavaju se vrednosti i tvrdoće i modula elastičnosti. Zaključeno je da smanjenje veličine zrna i kod monofaznih i kod bifaznih biokeramičkih materijala, izaziva povećanje tvrdoće, što je u skladu sa očekivanjima proizašlih iz Hall-Petch-ove jednačine. Biokeramički materijali kontrolisane poroznosti na bazi kalcijum-hidroksiapatita i trikalcijum-fosfata, dobijeni su polazaći od hidrotemalno dobijenih prahova, sačinjenih od aglomerata sfernog oblika sa sfernim intraaglomeratnim porama u središtu. Nakon dejstva izostatskog pritiska od 400 MPa sferna struktura čestica nije narušena, te je zaključeno da je mikrotalasnim sinterovanjem polaznih kompakata moguće dobiti kontrolisano porozni materijal, čija je maksimalna dimenzija pora odreñena dimenzijom sfernih intraaglomeratnih pora. Prilikom sinterovanja polaznih kompakata na 1200 ºC tokom 15 min u slučaju hidroksiapatita sa većim Ca/P odnosom pored dominantne hidroksiapatitne faze javlja se mali udeo α-TCP, koji je dominantna kristalna faza u slučaju materijala dobijenog sinterovanjem hidrotermalno dobijenog kalcijum-hidroksiapatita sa manjim Ca/P odnosom. U oba slučaja povećanje temperature mikrotalasnog sinterovanja utiče na povećanje gustine i udela sfernih pora u materijalu, što za posledicu ima poboljšanje mehaničkih svojstava poroznih materijala na bazi HAP i TCP. Nakon mikrotalasnog sinterovanja na 1200 ºC žilavosti dobijenih materijala imala je vrednost 1,25 MPa m1/2 u slučaju oba praha, što navodi na zaključak da fazni sastav ima inferioran uticaj na žilavost ovih materijala u odnosu na njihovu specifičnu mikrostrukturu koja se odlikuje prisustvom sfernih intraaglomeratnih pora i uspostavljenih snažnih kontinualnih vratova izmeñu vrlo postojanih sfernih aglomerata. Primena izostatskog pritiska od 400 MPa pri presovanju sfernih čestica, uticala je na intenzivniju densifikacije pri sinterovanju i formiranja jačih vratova izmeñu sfernih aglomerata. Kao posledica usledilo je povećanje žilavosti biokeramičkog materijala u kome je dominantna kristalna faza α-TCP do vrednosti 1,35 MPa m1/2, što je izuzetno visoka vrednost za ovaj tip biokeramičkih materijala. Mikrotalasnim sinterovanjem su dobijeni biokeramički materijali kontrolisane poroznosti na bazi HAP i α-TCP znatno boljih mehaničkih svojstava u odnosu na biomaterijale dobijene konvencionalnim sinterovanjem tokom osam puta dužeg vremena zadržavanja na temperaturi sinterovanja. Definisanjem morfologije pora analizom slike, zaključeno je da se sa povećanjem temperature sinterovanja ukupan broj pora smanjuje dok se njihova sferičnost povećava, pri čemu sferične pore ne menjaju oblik, dok nepravilne pore postaju sferičnije. Povećanje broja sferičnih pora uz istovremeno smanjenje broja pora nepravilnih dimenzija, tj. povećanje ukupne sfričnosti pora ima pozitivan uticaj na povećanje žilavosti biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. Metodom konačnih elemenata je zaključeno da je prisustvo sfernih 210 pora u kontrolisano poroznom materijalu na bazi HAP i TCP, jedan od preduslova za dobra mehanička svojstva biokeramičkih materijala kontrolisane poroznosti. In vitro ispitivanjima nano- i mikrostrukturnih gustih sinterovanih monofaznih materijala na bazi HAP u STF potvrñena je njihova bioaktivnost. Pokazano je da smanjenje prosečne veličine zrna sa mikro na nano nivo utiče na mikrostrukturu novonastalog kalcijum- fosfatnog sloja na površini biokeramičkog materijala tokom ispitivanja bioaktivnosti u simuliranom telesnom fluidu. In vitro ispitivanjima nano- i mikrostrukturnih monofaznih hidroksiapatitnih materijala u kulturi ćelija L929 pokayano je da nijedan od dva ispitivana materijala nije ispoljavao citotoksični efekat, što se uočava na osnovu morfoloških analiza ćelijskih kutura, ispitivanja metaboličke aktivnosti, vijabilnosti ćelija i nekroze ćelija. Ćelije L929 brže rastu u blizini uzoraka kalcijum-hidroksiapatita u odnosu na kontrolni uzorak, pri čemu uzorak sa nanostrukturnom površinom snažnije stimuliše procese ćelijske proliferacije. Na osnovu rezultata MTT, DET, agar difuzionih in vitro testova sa humanim fibroblastnim ćelijama zaključeno je da mikrotalasno sinterovani mikro- i nanostrukturnih monofazni hidroksiapatitni materijali ne pokazuju citotoksični efekat. Tokom perioda oporavka MRC-5 ćelija mikro- i nanostrukturnih minofazni hidroksiapatitni materijali izazivaju stimulaciju metaboličke aktivnosti, tj. primećuje se da se broj vijabilnih ćelija povećava iznad broja vijabilnih ćelija kontrolnog uzorka, što je dokaz dobre proliferacije fibroblastnih ćelija na ispitivanim materijalima. Histološkom analizom ćelija je zaključeno da fibroblasti koji su u kontaktu sa mikrotalasno sinterovanim HAP imaju sve karakteristike mladih vitalnih fibroblasta s produžecima, koji grade mrežu i istovetni su sa kontrolnim ćelijama. Rezultati histološke SEM analize upućuju na zaključak da su u slučaju oba ispitana materijala: L929 i MRC-5 ćelije čvrsto vezane za površinu materijala, da se radi o mladim sintetski aktivnim ćelijama, da i telo čelije i citoplazmatični produžetci u velikoj meri atheriraju na podlogu, ali i da je u slučaju nanostrukturnog HAP1 znatno veća prionljivost ćelija na površinu u odnosu na mikrostrukturne materijale, tj. ćelije su potpuno raširene i celim obimom naležu na površinu materijala. Ispitivanjem biokompatibilnosti mikrotalasno sinterovanog monofaznog hidroksiapatitnog materijala HAP1 in vitro, odreñivanjem adhezije osteoblastnih ćelija MC3T3-E1, utvrñeno je da su ćelije sa površinom ispitivanog potencijalno implantnog materijala uspostavile čvrstu vezu. Modifikacija naelektrisanja površine u slučaju mikrotalasno sinterovanog HAP1, nije osetnije uticala na adheziju osteoblastnih ćelija za površinu materijala. Zaključeno je i da je najveći broj ćelija u trećoj fazi adhezije, tj. ćelije su celim svojim obimom u kontaktu sa površinom mikrotalasno sinterovanog materijala. Prilikom in vivo ispitivanja biokompatibilnosti, testom primarne kutane iritacije za oba ispitivana materijala (monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min i monofazni HAP1 mikrotalasno sinterovan na 900 ºC tokom 15 min) srednja vrednost indeksa 211 primarne kutane iritacije je bila nula. U direktnom, jednokratnom kontaktu sa kožom ni jedan od dva ispitivana test materijala nije ispoljio iritirajuća svojstva. DALJI PRAVCI ISTRAŽIVANJA Predmet budućih istraživanja mogu biti: - ispitivanje mogućnosti uvoñenja u sistem čestica sa superiornijim mehaničkim svojstvima npr. itrijum ili cerijum stabilisanog cirkonijum- dioksida prilikom mikrotalasnog i spark plazma sinterovanja, sa ciljem da se dobiju bioaktivni materijali sa još boljim mehaničkim svojstvima; - ispitivanje mogućnosti dobijanja kompozitnog materijala sačinjenog od kalcijum-hidroksiapatita i karbonskih nanotuba sa ciljem da se poveća provodnost matriksa tokom spark plazma sinterovanja i poboljšaju mehanička svojstva dobijenih biokeramičkih materijala; - nastavak in vitro i in vivo ispitivanja uticaja mikrostrukturnih parametara na bioaktivnost i biokompatibilnost gustih i kontrolisano poroznih biokeramičkih materijala na bazi HAP i TCP; - ispitivanje mogućnosti aplikacije materijala dobijenih tokom izrade ove doktorske disertacije u stomatologiji, ortopediji i maksiofacijalnoj hirurgiji. 212 LITERATURA 1. M. Wang, “Biomaterials and Tissue Engineering”, Springer, New York (2004). 2. J. B. Park, “Biomaterials An Introduction“, Plenum Press, New York (1992). 3. L. L. Hench, “Bioceramics: From Concept to Clinic”, J. Am. Ceram. Soc. 74 (1991) 1487-1510. 4. L. R. Barrack, “Bone Graft Extenders, Substitutes, and Osteogenic Proteins”, J. Orthop. 20 (2005) 94-97. 5. S. Radulović-Pantelić, “Stomatološka protetika nadoknade na implantatima”, Jugoslovenska knjiga, Beograd (1998). 6. L. L. Hench, “Biomaterials: a forecast for the future”, Biomater. 19 (1998) 1419-1423. 7. C. T. Laurencin, M. A. Ambrosio, M. D. Borden, J. A. Cooper, “Tissue engineering: orthopedic applications“, Ann. Rev. Biomed. Eng. 1 (1999) 19-46. 8. C. Schwartz, C. R. Bordei, “Biphasic phospho-calcium ceramics used as bone substitutes are efficient in the management of severe acetabular bone loss in revision total hip arthroplasties“, Eur. J. Orthop. Surg. Traumatol. 15 (2005) 191-196. 9. F. H. Albee, “Studies in bone growth. Triple calcium phosphate as a stimulus to osteogenesis“, Ann. Surg. 71 (1920) 32-36. 10. G. E. Levitt, P. H. Crayton, E. A. Monroe, R. A. Condrate, “Forming methods for apatite prosthesis”, J. Biomed. Mater. Res. 3 (1969) 683-685. 11. Z. A. Monroe, W. Votawa, D. B. Bass, J. McMullen, “New calcium phosphate ceramic material for bone and tooth implants”, J. Dent. Res. 50 (1971) 860-862. 12. W. J. Clark, T. D. Driskell, C.R. Hassler, V. J. Tennery, L. McCoy, “Calcium phosphate resorbbable ceramics, a potential alternative to bone grafing”, IADR Prog. Abst. 52 (1973) 259. 13. W. Hubbard, “Physiological calcium phosphate as orthopedic implant material”, Ph.D. Thesis, Marquete University (1974). 14. E. B. Nery, K. L. Lynch, W. M. Hirthe, K. H. Mueller, “Bioceramic implants in surgically produced infrabony defects”, J. Periodont. 46 (1975) 328-339. 15. R. Z. LeGeros, J. P. LeGeros, “Dense hydroxyapatite“u “An introduction to bioceramics", ed. L. L. Hench, J. Wilson, World Scientific Publishing Co. Pti. Ltd 1 (1993) 139-180. 16. M. Jarho, J. F. Kay, H. P. Drobeck, R. H. Doremus, “Tissue cellular and subcellular events at bone-ceramic hydroxyapatite interface” , J. Bioeng. 1 (1976) 79-92. 17. M. Jarho, C. H. Bolen, M. B. Thomas, J. Bobick, J. F. Kay, R. H. Doremus, “Synthesis and characterization in dense polycrystalline forms”, J. Mater. Sci. 11 (1976) 2027- 2035. 18. K. de Groot, “Ceramic of calcium phosphates: preparation and properties” u “Bioceramics of calcium phosphate”, ed. K. de Groot, CRC Press, Boca Ration, FL. (1983) 100-114. 19. J. G. C. Peelen, B. V. Rejda, K. de Groot, “Preparation and properties of sintered hydroxyapatite”, Ceramurgia Int. 4 (1980) 71-73. 20. H. Denissen, “Dental root implants of apatite ceramics”, Ph.D. Thesis, Vrije Universiteit te Amsterdam (1979). 213 21. H. Akao, J. Aoki, K. Kato, “Mechanical properties of sintered hydroxyapatite for prothetic application”, J. Mater. Sci. 16 (1981) 809-812. 22. H. Akao, K. Kato, M. Ogiso, “Sintered hydroxyapatite as a new dental implant material”, J. Dent. Outlook 49 (1977) 567-575. 23. Dj. Veljović, B. Jokić, I. Jankovic-Častvan, I. Smičiklas, R. Petrovic, Dj. Janaćković, “Sintering Behaviour of Nanosized HAP Powder ” Key Engin. Mater. 330-332 (2007) 259-262. 24. Dj. Veljović, B. Jokić, R. Petrović, E. Palcevskis, A. Dindune, I. N. Mihailescu, Dj. Janaćković, “Processing of dense nanostructured HAP ceramics by sintering and hot pressing“, Ceram. Int. 35 (2009) 1407–1413. 25. C. Y. Tang, P. S. Uskoković, C. P. Tsui, Dj. Veljović, R. Petrović, Dj. Janaćković, “Influence of microstructure and phase composition on the nanoindentation characterization of bioceramic materials based on hydroxyapatite”, Ceram. Int. 35 (2009) 2171–2178. 26. Dj. Veljović, I. Zalite, E. Palcevskis, I. Smičiklas, R. Petrović, Dj. Janaćković, “Microwave sintering of fine grained HAP and HAP/TCP bioceramics”, Ceram. Int. 36 (2010) 595–603. 27. Dj. Veljović, E. Palcevskis, A. Dindune, S. Putić, I. Balać, R. Petrović, Dj. Janaćković, Microwave sintering improves the mechanical properties of biphasic calcium phosphates from hydroxyapatite microspheres produced from hydrothermal processing, J. Mater. Sci. 45 (12) (2010) 3175-3183. 28. B. Jokić, I. Janković-Častvan, Dj. Veljović, R. Petrović, S. Drmanić, Dj. Janaćković, “Preparation of α-TCP cements from calcium deficient hydroxyapatite obtained by hydrothermal method”, Key Engin. Mater. 309-311 (2006) 821-824. 29. B. Jokić, I. Janković-Častvan, Dj. Veljović, D. Bučevac, K. Obradović-Djuričić, R. Petrović, Dj. Janaćković, “Synthesis and settings behaviour of α-TCP from calcium defficient hyroxyapatite otained by hydrothermal method”, J. Opt. Adv. Mater. 9 (2007) 1904-1910. 30. D. Stojanović, B. Jokić, Dj. Veljović, R. Petrović, P. S. Uskoković, Dj. Janaćković, “Bioactive glass apatite coating for titanium implant synthesized by electrophoretic deposition”, J. Europ. Ceram. Soc. 27 (2007) 1595-1599. 31. D. Tanasković, Dj. Veljović, R. Petrović, C. Cojanu, C. Ritoscu, I. N. Mihailescu, Dj. Janaćković, “Double-layer bioactive glass coatings obtained by pulsed laser deposition”, Key Engin. Mater. 361-363 (2008) 277-280. 32. S. Eraković, Dj. Veljović, P. N. Diouf, T. Stevanović, M. Mitrić, S. Milonjić, V. Mišković-Stanković,“Electrophoretic deposition of biocomposite lignin/hydroxyapatite coatings on titanium“, Int. J. Chem. React. Eng. 7 (2009) 62. 33. D. Tanaskovic, B. Jokic, G. Socol, A. Popescu, I. N. Mihailescu, R. Petrovic, Dj. Janackovic,“Synthesis of functionally graded bioactive glass-apatite multistructures on Ti substrates by pulsed laser deposition“, App. Surf. Sci., 254 (2007) 1279–1282. 34. H. Denissen, C. Mangano, G. Cenini, “Hydroxyapatite implants“, Piccin Nuova Libraria, S.P.A. (1985). 35. J. Chevalier, L. Gremillard, “Ceramics for medical applications: A picture for the next 20 years“, J. Eur. Ceram. Soc. 29 (2009) 1245–1255. 36. M. Descamps, J. C. Hornez, A. Leriche, “Manufacture of hydroxyapatite beads for medical applications“, J. Eur. Ceram. Soc. 29 (2009) 369–375. 214 37. C. A. Van Blitterswijk, “Calcium phosphate middle ear implants“, Ph. D. Thesis, Rijksuniversitiet te Leiden (1985). 38. C. A. Van Blitterswijk, S. C. Hasseling, J. J. Grote, H. K. Korerte, K. de Groot, “The biocompatibility of hydroxyapatite ceramic: A study of retrieved human middle ear implants“, J. Biomed. Mater. Res. 24 (1990) 433-453. 39. J. H. Quinn, J. N. Kent, “Alveolar ridge maintenance with solid nonporous hydroxyapatite root implants“,Oral. Surg. 58 (1984) 511-516. 40. A. N. Cranin, G. P. Tobin, J. Gelbman, “Applications of hydroxyapatite in oral and maxillofacial surgery, part II: Ridge augmentation and repair of major oral defects“, Compend. Contin. Educ. Dent. 8 (1987) 334-345. 41. M. I. Kay, R. A. Young, A. S. Posner, “Cristal structure of hydroxyapatite“, Nature 204 (1964) 1050-1053. 42. H. Oonishi, E. Tsuji, H. Ishimaru, M. Yamamoto, J. Delecrin, “Clinical significance of chemical bonds between bioactive ceramics and bone in orthopaedic surgery“, “Bioceramics“, ed. G. Heimke, German Ceramic Societe 2 (1990) 286-293. 43. E. Nery, R. Z. LeGeros, G. Daculsi, “Tissue response to biphasic calcium phosphate ceramic with different ratios of biphasic calcium phosphate ceramic with different ratios of HA/TCP in periodontal osseous defects“, J. Periodontal 63 (1992) 729-735. 44. S. J. Froum, J. Kushner, L. Scopp, S. S. Stahl, “Human clinical and histologic response to durapatite implants in intraosseous lesion,case reports“, J. Periodontal 53 (1986) 719-725. 45. P. N. Galgut, I. M. Waite, S. M. B. Tinkler, “Histological investigation of the tissue response to hydroxyapatite used as an implant material in periodontal treatment“, Clin. Mater. 6 (1990) 105-121. 46. J. Wilson, G. E. Merwin, “Biomaterials for facial bone augmentation: comparative studies“, J. Biomed. Mater. Res. Appl. Biomat. 22 (1988) 159-177. 47. J. Wilson, S. B. Low, “Bioactive ceramics for periodontal treatment“, J. Appl. Biomat. 3 (1992) 123-129. 48. L. Linkow, “Bone transplants using the symphysis, the iliac crest and synthetic bone materials“, J. Oral. Implantol. 11 (1984) 211-217. 49. W. Bonfield, “Hydroxyapatite reinforced polyethylene as an analogous material for bone replacement“ u “Bioceramics: Materials characteristics versus in vivo behaviour“ ed. P. Ducheyne, J. E. Lemons, Ann. NY Acad. Sci., New York 523(1988) 173-177. 50. R. Z. LeGeros, B. Penugonda, “Potential use of calcium phosphate as fillers in composite restorative biomaterials“, Second world congress on biomaterials, Washington (1984). 51. A. Jean, B. Kerebel, R. Z. LeGeros, “Effects of various calcium phosphatematerials on the reparative dentin bridge“, J. Endo. 14 (1988) 83-87. 52. R. M. Frank, P. Widermann, J. Hemmerle, “Pulp capping with synthetic hydroxyapatite in human premolars“, J. Appl. Biomat. 2 (1991) 243-250. 53. R. A. Young, J. C. Elliot, “Scale bases for several properties of apatites“, Archs. Oral. Biol. 11 (1966) 699-707. 54. E. C. Shors, R. E, Holmes, “Porous hydroxyapatite“ u “An introduction to bioceramics", ed. L. L. Hench, J. Wilson, World Scientific Publishing Co. Pti. Ltd 1 (1993) 181-190. 215 55. R. Z. LeGeros, S. Lin, R. Rohanizadeh, D. Mijares, J. P LeGeros, “Biphasic calcium phosphate bioceramics: Preparation, properties and applications“, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 14 (2003) 201–209. 56. F. Tancret, J. M. Bouler, J. Chamousset, L. M. Minois, ”Modelling the mechanical properties of microporous and macroporous biphasic calcium phosphate bioceramics”, J. Eur. Ceram. Soc. 26, (2006), 3647–3656. 57. M. Descamps, J. C. Hornez, A. Leriche, ”Manufacture of hydroxyapatite beads for medical applications”, J. Eur. Ceram. Soc. 29 (2009) 369–375. 58. R. Vani, E. K. Girija, K. Elayaraja, S. P. Parthiban, R. Kesavamoorthy, S. N. Kalkura, ”Hydrothermal synthesis of porous triphasic hydroxyapatite(α and β) tricalcium phosphate”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. Doi 10.1007/s10856-008-3480-8. 59. R. Kumar, K. H. Prakash, P. Cheang, K. A. Khor, ”Microstructure and mechanical properties of spark plasma sintered zirconia-hydroxyapatite nano-composite powders”, Acta. Mater. 53 (2005) 2327–2335. 60. M. Kawata, H. Uchida, K. Itatani, I. Okada, S. Koda, M. Aizawa, ”Development of porous ceramics with well-controlled porosities and pore sizes from apatite fibers and their evaluations”, J. Mater. Sci.:Mater. Med. 15 (2004) 817–823. 61. J. S. Temenoff, A. G. Mikos, "Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering", Biomater. 21 (2000) 2405-2412. 62. E. W. White, J. N. Webber, D. M. Roy, E. L. Owen, R. T. Cchirolf, R. A. White “Replamineform Porous Biomaterials for Hard Tissue Implant Applications”, J. Biomed. Mater. Res. Symp. 6 (1975) 23-27. 63. C. Klein, P. Patka, W. Den Hollander, ”Macroporous calcium phosphate bioceramics in dog femora: A histological study of interface and biodegradation” 10 (1989) 59-62. 64. W. E. Brown, L. C. Chow, ”A new calcium phosphate, water setting cement”, Cements Research Progrss A. C. S., Ohio (1986) 352-379. 65. P. J. Capano, ”The chemical synthesis and biomedical and dental applications of the first truly successful, in vivo replacement for bones, teeth and similar materials”, PhD. Thesis, University of Texas, Austin (1987). 66. B. Constanc, S. W. Young, ”Pilot investigations of a calcium phosphate cement in a rabbit femoral canal model and a canine humeral plug model”, Transaction of the 17th annual meeting, Societe for Biomaterials, Scottsdale, ariyona, (1991) 92. 67. P. D. Costantino, C. D. Friedman, K. Jones, L. C. Chow, H. J. Pelzer, G, A. Sisson, ”Hydroxyapattie cement: I. Basic chemistry and histological properties”, Arch Otolar. Head neck Surg. 117 (1991) 92. 68. E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, S. Sprio, ”Densifcation behaviour and mechanisms of synthetic hydroxyapatites”, J. Eur. Ceram. Soc., 20 (2000) 2377-2387. 69. R. M. Novaković, M. Giordani, “Biomaterials”, Center for Multidisciplinary Studies of Belgrade University, Beograd (1996). 70. S. V. Dorozhkin, “Calcium orthophosphate-based biocomposites and hybrid biomaterials“, J. Mater. Sci. 44 (2009) 2343–2387. 71. J. B. Park, R. S. Lakes, “Ceramic Implant Materials“, Springer, New York, (2007). 72. H. Kim, “Synthesis and control of microstructure, mechanical properties and bioactivity in biphasic and preferentially oriented calcium phosphate bioceramics“, PhD. Thesis, University of Alabama, Birmingham (2007). 73. M. Mathew, S. Takagy, “Structures of Biological Minerals in Dental Research“, J. Res. Natl. Inst. Stand. Technol. 106 (2001) 1035–1044. 216 74. S. V. Dorozhkin, “Calcium Orthophosphates in Nature, Biology and Medicine“, J. Mater. Sci. 2 (2009) 399-498. 75. P. Becker, “Phosphates and phosphoric acid: raw materials technology and economics of the wet process“, ed. M. Dekker, “In Fertilizer science and technology series“, New York, USA (1989). 76. P. J. Cook, J. H. Shergold, “Phosphate deposits of the world: phosphate rock resources“, ed. D. F. Davidson, Cambridge University Press, Cambridge, USA 2 (2005) 600. 77. E. Cantelar, G. Lifante, T. Calderon, R. Melendrez, A. Millan, M. A. Alvarez, M. Barboza-Flores, “Optical characterisation of rare earths in natural fluorapatite“, J. Alloys Compd. 323-324 (2001) 851-854. 78. H. B. Ribeiro, K. J. Guedes, M. V. B. Pinheiro, S. Greulich-Weber, K. Krambrock, “About the blue and green colours in natural fluorapatite“, Phys. Status Solid C 2 (2005) 720-723. 79. D. E. C. Corbridge, “Phosphorus”, Elseivier, Amsterdam (1985). 80. R. Z. Le Geros, O. R. Trautz, J. P. Le Geros, ”Crystalographic Studies of the Carbonate Substitution in the Apatite Structure”, PhD Thesis, New York University (1967). 81. R. Z. Le Geros, G. Bonel, J. P. Le Geros, “Apatites in Biological Systems”, Prog. Cristal. Growth. Charact. 4 (1981) 1-45. 82. R. Z. Le Geros, “Calcium phosphates in oral biology and medicine“, u “Monograph in oral science“ed. H. Myers, S. Karger, Basel (1991). 83. R. Z. Le Geros, “Incorporation of magnesium in synthetic and biological apatite“, u “Tooth enamel IV“, ed. R. W. Fearnhead, S. Suga, Elsevir science publisher, Amsterdam (1984) 32-36. 84. R. Z. Le Geros, M. S. Tung, “Chemical stability of carbonate and fluoride containing apatites“, Caries. Res. 17 (1983) 419-429. 85. R. Z. Le Geros, “Crystallographic studies of the carbonate substitution in the apatite structure“, PhD. Thesis, New York University (1967). 86. D. Trpinac, “Histologija“, Colibri, Beograd (1994). 87. S. R. Simon “Orthopedic Basic Science”,u ed. I. L. Rosemont, American Academy of Orthopaedic Surgeons (1994). 88. A. L. Boskey, A. S. Posner, “Bone structure, composition and mineralization“, Orthopaedic Clinics of North America 15 (1984) 597-612. 89. S. Popović, ”Embriologija čoveka”, Svetozar Marković, Beograd, (1983) 96-103. 90. K. de Groot, C. P. A. T. Klein, J. G. C. Wolke, J. M. A. De Bliek, ”Chemistry of calcium phosphate bioceramics”, u ”Handbook of bioactive ceramics, vol 2”, ed. T. Yamamuro, L. L. Hench, J. Wilson, CRC Press, Boca Ration, Florida (1990) 3-16. 91. F. Micelli, A. Maffezzoli, R. Terezi, V. A. M. Luprano, ”Characterization of the kinetic behavior of resin modified glass-ionomer cements by DSC, TMA and ultrasonic wave propagation ”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 12 (2001) 151-156. 92. F. C. M. Driessens, M. G. Boltong, O. Bermudez, J. A. Planell, M. P. Ginebra, E. Fernandez, ”Effective formulations for the preparation of calcium phosphate ”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 5 (1994) 164-170. 93. W. C. O’Neill, ”The fallacy of the calcium-phosphorus product”, Kidney Int. 72 (2007) 792-796. 217 94. R. Z Le Geros, ”Formation and transformation of calcium phosphates: relevance to vascular calcification”, Kardiol., Suppl. 3 (2001) 90. 95. A. Becker, M. Epple, K. M. Müller, I. Schmitz, ”A comparative study of clinically wellcharacterized human atherosclerotic plaques with histological, chemical, and ultrastructural methods”, J. Inorg. Biochem. 98 (2004) 2032-2038. 96. B. Wopenka, J. D. Pasteris, ”A mineralogical perspective on the apatite in bone”, Mater. Sci. Eng.,C 25 (2005) 131-143. 97. T. Kodaka, K. Debari, S. Higashi, ”Magnesium-containing crystals in human dental calculus”, J. Electron Microsc. 37 (1988) 73-80. 98. A. A. Mirtchi, J. Lemaitre, E. Munting, ”Calcium phosphate cements: study of the β- tricalcium phosphate – dicalcium phosphate – calcite cements”, Biomater. 11 (1990) 83-88. 99. A. A. Mirtchi, J. Lemaitre, E. Munting, ”Calcium phosphate cements: effect of fluorides on the setting and hardening of β-tricalcium phosphate – dicalcium phosphate – calcite cements”, Biomater. 12 (1991) 505-510. 100. J. Lemaitre, E. Munting, A. A. Mirtchi, ”Setting, hardening and resorption of calcium phosphate ionic cements”, Rev. Stomatol. Chir. Maxillofac., 93 (1992) 163- 165. 101. K. Ohura, M. Bohner, P. Hardouin, J. Lemaitre, G. Pasquier, B. Flautre, ”Resorption of, and bone formation from, new β-tricalcium phosphate-monocalcium phosphate cements: an in vivo study”, J. Biomed. Mater. Res. 30 (1996) 193-200. 102. A. Lecomte, H.Gautier, J. M. Bouler, A. Gouyette, Y. Pegon, G. Daculsi, C. Merle, ”Biphasic calcium phosphate: a comparative study of interconnected porosity in two ceramics”, J. Biomed.Mater. Res. B Appl. Biomater. 84B (2008)1-6. 103. J. M. Bouler, M. Trecant, J. Delecrin, J. Royer, N. Passuti, G. Daculsi, ”Macroporous biphasic calcium phosphate ceramics: Influence of five synthesis parameters on compressive strength”, J. Biomed. Mater. Res., 32 (1996) 603-609. 104. J. Wang, W. Chen, Y. Li, S. Fan, J. Weng, X. Zhang, ”Biological evaluation of biphasic calcium phosphate ceramic vertebral laminae”, Biomater. 19 (1998) 1387- 1392. 105. G. Daculsi, ”Biphasic calcium phosphate concept applied to artificial bone, implant coating and injectable bone substitute”, Biomater. 19 (1998) 1473-1478. 106. G. Daculsi, P. Weiss, J. M. Bouler, O. Gauthier, F. Millot, E. Aguado, ”Biphasic calcium phosphate/hydro soluble polymer composites: a new concept for bone and dental substitution biomaterials”, Bone Mater. 2 (2009) 456. 107. G. Daculsi, O. Laboux, O. Malard, P. Weiss, ”Current state of the art of biphasic calcium phosphate bioceramics”, J. Mater. Sci. Mater. Med., 14, (2003) 195- 200. 108. I. Alam, I. Asahina, K. Ohmamiuda, S. Enomoto, ”Comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics impregnated with rhBMP-2 as bone substitutes”, J. Biomed. Mater. Res. 54 (2001) 129-138. 109. G. Daculsi, ”Biphasic calcium phosphate granules concept for injectable and moldable bone substitute”, Adv. Sci. Technol. 49 (2006) 9-13. 110. O. Bermudez, M. G. Boltong, F. C. M. Driessens, J. A. Planell, ”Development of some calcium phosphate cements from combinations of α-TCP, MCPM and CaO”, J. Mater. Sci. Mater. Med. 5 (1994) 160-163. 218 111. K. Kurashina, H. Kurita, M. Hirano, A. Kotani, C. P. Klein, K. de Groot, ”In vivo study of calcium phosphate cements: implantation of an α-tricalcium phosphate / dicalcium phosphate dibasic/tetracalcium phosphate monoxide cement paste”, Biomater. 18 (1997) 539-543. 112. F. C. M. Driessens, J. A. Planell, M. G. Boltong, I. Khairoun, M. P. Ginebra, ”Osteotransductive bone cements”, Proc. Inst. Mech. Eng., H: J. Eng. Med. 212 (1998) 427-435. 113. S. Takagi, L. C. Chow, K. Ishikawa, ”Formation of hydroxyapatite in new calcium phosphate cements”, Biomater. 19 (1998) 1593-1599. 114. H. Yamamoto, S. Niwa, M. Hori, T. Hattori, K. Sawai, S. Aoki, M. Hirano, H. Takeuchi, ”Mechanical strength of calcium phosphate cement in vivo and in vitro”, Biomater. 19 (1998) 1587-1591. 115. E. Fernandez, M. P. Ginebra, M. G. Boltong, F. C. M. Driessens, J. Ginebra, E. A. de Maeyer, R. M. H. Verbeeck, J. A. Planell, ”Kinetic study of the setting reaction of a calcium phosphate bone cement”, J. Biomed. Mater. Res. 32 (1996) 367-374. 116. E. Fernandez, F. J. Gil, S. M. Best, M. P. Ginebra, F. C. M. Driessens, J. A. Planell, ”The cement setting reaction in the CaHPO4-α-Ca3(PO4)2 system: an X-ray diffraction study”, J. Biomed. Mater. Res. 42 (1998) 403-406. 117. E. Fernandez, F. J. Gil, M. P. Ginebra, F. C. M. Driessens, J. A. Planell, S. M. Best, ”Production and characterization of new calcium phosphate bone cements in the CaHPO4 – α-Ca3(PO4)2 system: pH, workability and setting times”, J. Mater. Sci. Mater. Med. 10 (1999) 223-230. 118. B. R. Constantz, I. C. Ison, M. T. Fulmer, R. D. Poser, S. T. Smith, M. Vanwagoner, ”Skeletal repair by in situ formation of the mineral phase of bone”, Science, 267 (1995) 1796-1799. 119. K. C. B. Yeong, J. Wang, S. C. Ng, ”Fabricating Densified Hydroxyapatite Ceramics from a Precipitated Precursor”, Mater. Letters, 38 (1999) 208-213. 120. A. Osaka, Y. Miura, K. Takeuchi, M. Asada, K. Takahashi, ”Calcium apatite prepared from calcium hydroxide and orthophosphoric acid”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 2 (1991) 51-55. 121. E. Palcevskis, A. Dindune, L. Kuznecova, A. Lipe, Z. Kanepe, ”Granulated composite powders on basis of hydroxyapatite and plasma-processed zirconia and alumina nanopowders”, Latvian J. Chem. 2 (2005) 128-138. 122. I. Smičiklas, A. Onjia, S. Raičević, “Experimental design approach in the synthesis of hydroxyapatite by neutralization method“, Sep. Purif. Technol. 44 (2005) 97-102. 123. Dj. Janackovic, I. Petrovic-Prelevic, Lj. Kostic-Gvozdenovic, R. Petrovic, V. Jokanovic, D. Uskokovic, “Influence of synthesis parameters on the particle sizes of nanostructured calcium-hydroxyapatite“, Key Engin. Mater. 192-195 (2001) 203-206. 124. Dj. Janackovic, I. Jankovic, R. Petrovic, Lj. Kostic-Gvozdenovic, S. Milonjic, D. Uskokovic, “Surface properties of HAP particles obtained by hydrothermal decomposition of urea and calcium-EDTA chelates“, Key Engin. Mater. 240-242 (2003) 437-440. 125. T. Hattori, Y. Iwadate, “Hydrothermal preparation of calcium hydroxyapatite powders”, J. Am. Ceram. Soc. 73(6) (1990) 1803-1805. 126. F. Wakai, Y. Kodama, S. Sakaquchi, “Superplasticity of hot isostatically hydroxyapatite”, J. Am. Ceram. Soc. 73 (1990) 457-460. 219 127. Y. Fujishiro, T. Sato, A. Okuwaki, “Coating of hydroxyapatite on titanium plates by the hydrothermal reactions of Ca(EDTA)2– in phosphate solutions”, u Proceedings of the Second International Meeting of Pacific Rim Ceramic Societies, Carns, Australia (1996) 18-21. 128. R. Rao, H. N. Roopa, T. S. Kanan, “Solid state synthesis and thermal stability of HAP and HAP – β-TCP composite ceramic powders“, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 8 (1997) 511. 129. R. Rao, H. Nroopa, T. S. Kannan, “Powders of pure β-tricalcium phosphate (β- TCP), hydroxyapatite (HAP) and a biphasic composite mixture of HAP+β-TCP“, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 8 (1997) 511-518. 130. P. Layrolle, A. Ito, T. Tateishi, “Sol-gel synthesis of amorphous calcium phosphate and sintering into microporous hydroxyapatite bioceramics“, J. Am. Ceram. Soc. 81 (1998) 1421. 131. Y. Masuda, K. Matsubara, S. Sakka, “Synthesis of HAP from metal alkoxides trough sol-gel technique“, J. Ceram. Soc. Jpn. 98 (1990) 1255-1266. 132. S. Bose, S. K. Saha, “Synthesis of hydroxyapatite nanopowders via sucrose- templated Sol-Gel method“, J. Am. Ceram. Soc. 86 (6) (2003) 1055-1057. 133. T. A. Cuneyt, “Synthesis of biomimetic Ca-hydroxyapatite powders at 37 degrees C in synthetic body fluids“, Biomater. 21 (2000) 1429-38. 134. B. Jokic, D. Tanaskovic, I. Jankovic-Castvan, S. Drmanic, R. Petrovic, Dj. Janackovic, “Synthesis of nanosized calcium hydroxyapatite particles by the catalytic decomposition of urea with urease“, J. Mater. Res. 22 (2007) 1156-1161. 135. M. A. Verges, C. F. Gonzalez, M. M. Gallego, M. Solier, I. Cachadina, E. Matijevic, “A new route for the synthesis of calcium-deficient hydroxyapatites with low Ca/P ratio: Both spectroscopic and electric characterization“, J. Mater. Res., 15 (2000) 2534-2539. 136. T. Nakajima, M. Kandori, K. Ishikawa, T. Yasukawa, A. Matsuura, “Preparation of nonstoichiometric calcium hydroxyapatite using formamide“, Mater. Res. Bull. 34 (1999) 589-601. 137. M. Aizava, T. Hanazava, K. Itatani, F. S. Howell, A. Kishioka, “Characterization of hydroxyapatite powders prepared by ultrasonic spray-pyrolysis technique“, J. Mater. Sci. 34 (1999) 2865-2871. 138. Y. Fang, D. K. Agrawal, D. M. Roy, R. Roy, “Fabrication of porous hydroxyapatite ceramics by microwave processing“, J. Mater. Res. 7 (1992) 490-495. 139. Y. Fang, D. K. Agrawal, D. M. Roy, R. Roy, P. W. Brown, “Ultrasonically accelerated synthesis of hydroxyapatite“, J. Mater. Res. 7 (1992) 2294-2298. 140. M.V. Regi, L.M.R. Lorenzo, A.J. Salinas, “Synthesis and characterisation of calcium deficient apatite“, Sol. State Ionics 101-103 (1997) 1279-1285. 141. M. Okazaki, Y. Miake, H. Tohda, T. Yanagisawa, J. Takahashi, “Fluoridated apatite synthesized using a multi-step fluoride supply system“, Biomater. 20 (1999) 1303-1307. 142. D. Tadic, F. Peters, M. Epple, “Continuous synthesis of amorphous carbonated apatites“, Biomater. 23 (2002) 2553–2559. 143. R. A. Young, D. W. Holcomb, “Variability of Hydroxyapatite Preparations“, Calcif. Tissue Int. 34 (1982) S17-S32. 220 144. H. Wang, “Hydroxyapatite degradation and biocompability“, PhD. Thesis, The Ohio State University, Ohio (2004). 145. J. C. Elliott, “Structure and Chemistry of the Apatites and Other Calcium Orthophosphates“, (1994). 146. J. L. Meyer, B.O. Fowler, “Lattice Defects in Nonstoichiometric Calcium Hydroxyapatite“, Inorg. Chem. 21 (1982) 3029-3035. 147. T. Honda, M. Takagi, N. Uchida, K. Saito, K. Uematsu, “Post-compositional control of hydroxylapatite in an aqueous medium“, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 1 (1990) 114-117. 148. L. M. Rodriguez-Lorenzo, M. Vallet-Regi., “Controlled crystallization of calcium phosphate apatites“, Chem. Mater. 12 (2000) 2460-2465. 149. D. E. C. Corbridge, “Phosphorus: An Outline of its Chemistry, Biochemistry and Technology“ (1990). 150. H. Monma, T. Kamiya, “Preparation of Hydroxyapatite by the Hydrolysis of Brushite“, J. Mater. Sci. 22 (1987) 4247-4250. 151. S. R. Silverman, R. K. Fuyat, J. D. Weiser, “Quantitative Ditermination of Calcite Associated with Carbonate-Bearing Apatites“, Am. Miner. 37 (1952) 211-222. 152. I. Mayer, S. Wahnon, S. Cohen, “Preparation of Hydroxyapatites via the MSO4 Sulphates (M=Ca, Sr, Pb and Eu)“, Mater. Res. Bull. 14 (1979) 1479-1483. 153. R. Z. Le Geros, M. H. Taheri, G. Quirolgico, J. P. Le Geros, “Formation and stability of apatites: Effects of some cationic substituents“, Proc. 2nd International congress of phosphorus compounds, Boston 89-103 (1980) 41-53. 154. R. Z. Le Geros, R. Kijkowska, J. P. Le Geros, “Formation and transformation of octacalcium phosphate OCP: Preliminary report“, Scanning Electron Micro. 4 (1984) 1771-1777. 155. V. V. Srdić, ” Procesiranje novih keramičkih materijala ”, Tehnološki Fakultet, Novi Sad (2004). 156. M. J. Mayo, “Nanocrystalline ceramics for structural applications: processing and properties“. Nanostructured Materials science and technology, ed. G. M. Chow, and N. I. Noskova, , NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Russia (1997) 361-385. 157. J. R. Groza, “Nanosintering“, Nanostruct. Mater. 12 (1999) 987. 158. M. Tecilazić–Stevanović, ”Osnovi tehnologije keramike”, Tehnološko– Metalurški Fakultet, Beograd (1990). 159. S. L. Kang “Sintering Densification, Grain Growth And Microstructure“, Elsevir, Amsterdam (2005). 160. R. M. German, ”Sintering theory and practice”, The Pensylvania state University, Pensylvania, (1996). 161. W. D. Kingery, H. K. Bowen, D. R. Uhlman, “Introduction to Ceramics“, John Wiley and Sons, New York (1976). 162. E. P. Frankenburg, S. A. Goldstein, T. W. Bauer, S. A. Harris, R. D. Poser, “Biomechanical and histological evolution of calcium phosphate cement“, J. Bone Joint Surg. 80 (1998) 1112-1124. 163. Dj. Veljović, “Proučavanje procesa formiranja nanostrukturnih biokeramičkih materijala na bazi hidroksiapatita“, Magistarski rad, TMF, Beograd (2007). 164. M. G. S. Murray, J. Wang, C. B. Ponton, P. M. Marquis, “An improvement in processing of hydroxyapatite ceramics“, J. Mater. Sci. 30 (1995) 3061-3074. 221 165. J. E. Barralet, S. Best, W. Bonfield, “Effect of sintering parameters on the density and microstructure of carbonate hydroxyapatite“, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 11 (2000) 719-724. 166. K. A. Gross, K. A. Bhadang, “Sintered hydroxyfluorapatites. Part III: Sintering and resultant mechanical properties of sintered blends of hydroxyapatite and fluorapatite“, Biomater. 25 (2004) 1395-1405. 167. K. A. Gross, L. M. Rodríguez-Lorenzo, “Sintered hydroxyfluorapatites. Part II: Mechanical properties of solid solutions determined by microindentation“, Biomater. 25 (2004) 1385-1394. 168. G. Muralithran, S. Ramesh, ”The effects of sintering temperature on the properties of hydroxyapatite”, Ceram. Int. 26 (2000) 221-230. 169. I. R. Gibson, I. Rehman, S. M. Best, W. Bonfield, ”Characterization of the transformation from calcium-deficient apatite to β-tricalcium phosphate”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 12 (2000) 799-804. 170. N. Patel, I. R. Gibson, S. Ke, S. M. Best, W. Bonfield, ”Calcining influence on the powder properties of hydroxyapatite”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 12 (2001) 181- 188. 171. N. Thangamani, K. Chinnakali, F. D. Gnanama, ”The effect of powder processing on densification, microstructure and mechanical properties of hydroxyapatite”, Ceram. Int. 28 (2002) 355-362. 172. R. Z. Legeros, S. Lin, R. Rohanizaden, D. Mijares, J. P. Legeros, ”Biphasic calcium phosphate bioceramics: preparation, properties and applications”, J. Mater. Sci.: Mater. Med 14 (2003) 201-209. 173. S. Raynaud, E. Champion, D. Bernache-Assollant, ”Calcium phosphate apatites with variable Ca/P atomic ratio II. Calcination and sintering”, Biomater. 23 (2002) 1073-1080. 174. D. Bernache-Assollant, A. Ababou, E. Champion, M. Heughebaert, ”Sintering of calcium phosphate hydroxyapatite Ca10(PO4)6(OH)2 I. Calcination and particle growth”, J. Eur. Ceram. Soc. 23 (2003) 229–241. 175. N. Patel, E. L. Follon, I. R. Gibson, S. M. Best, W. Bonfield, ”Comparison of Sintering and Mechanical Properties of Hydroxyapatite and Silicon-Substituted Hydroxyapatite ”, Key Engin. Mater. 240-242 (2003) 919-922. 176. J. E. Barralet, G. J. P. Fleming, C. Campion, J. J. Harris, ”Formation of translucent hydroxyapatite ceramics by sintering in carbon dioxide atmospheres”, J. Mater. Sci. 38 (2003) 3979-3993. 177. Y. M. Sung, J. C. Lee, J. W. Yang, ”Crystallization and sintering characteristics of chemically precipitated hydroxyapatite nanopowder”, J. Cryst. Growth. 262 (2004) 467-472. 178. C. Kothapalli, M. Wei, A. Vasiliev, M. T. Shaw, ”Influence of temperature and concentration on the sintering behavior and mechanical properties of hydroxyapatite”, Acta Mater. 52 (2004) 5655-5663. 179. E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, L. Vichi, M. Sandri, ”Influence of synthesis and sintering parameters on the characteristics of carbonate apatite”, Biomater. 25 (2004) 1763-1770. 180. F. Mezahi, A. Harabi, S. Achour, ”Effect of Stabilised ZrO2 on Sintering of Hydroxyapatite”, Key Engin. Mater. 264-268 (2004) 2031-2034. 222 181. J. Shi, U. Bismayer, A. Klocke, S. Gierlotka, B. Palosz, ”High-Pressure and - Temperature Sintering of Nanosized Hydroxyapatite Powders ”, Key Engin. Mater. 288-289 (2005) 175-178. 182. Z. He, J. Ma, C. Wang, ”Constitutive modeling of the densification and the grain growth of hydroxyapatite ceramics”, Biomater. 26 (2005) 1613-1621. 183. E. Landi, A. Tampieri, G. Celotti, R. Langenati, M. Sandri, S. Sprio, ”Nucleation of biomimetic apatite in synthetic body fluids: dense and porous scaffold development”, Biomater. 26 (2005) 2835-2845. 184. W. R.Weinand, F. F. R. Goncalves, W. M. Lima, ”Effect of Sintering Temperature in Physical-Mechanical Behaviour and in Titanium-Hydroxyapatite Composite Sinterability”, Mater. Sci. Forum 530-531 (2006) 249-254. 185. F. N. Oktar, H. Aydin, G. Goller, S. Agathopoulos, G.Rocha, S. Sennaroglu, S. Kayali, ”Influence of Sintering Temperature on Mechanical Properties of Biologically Derived Hydroxyapatite Bodies”, Key Engin. Mater. 309-311 (2006) 45-48. 186. F. N. Oktar, ”Microstructure and mechanical properties of sintered enamel hydroxyapatite”, Ceram. Int. 33 (2007) 1309-1314. 187. O. Prokopiev, I. Sevostianov, ”Dependence of the mechanical properties of sintered hydroxyapatite on the sintering temperature”, Mater. Sci. and Engin. 431 (2006) 218-227. 188. A. Banerjee, A. Bandyopadhyay, S. Bose, ”Hydroxyapatite nanopowders: synthesis, densification and cell–materials interaction”, Mater. Sci. and Engin. 27 (2007) 729-735. 189. D. Pattanayak, R. Dash, R. C. Prasad, B. T. Rao, T. R. Rama Mohan, ”Synthesis and sintered properties evaluation of calcium phosphate ceramics”, Mater. Sci. and Engin. C 27 (2007) 684-690. 190. C. Y. Tan, S. Ramesh, A. S. Hamdi, I. Sopyan, ”Sinterability Of Hydroxyapatite Compacts Prepared By Cold Isostatic Pressing For Clinical Applications”,Biomed 06, IFMBE Proceedings 15 (2007) 137-140. 191. A. Bianco, I. Cacciotti, M. Lombardi, L. Montanaro, G. Gusmano, ”Thermal stability and sintering behaviour of hydroxyapatite nanopowders”, J. Therm. Anal. Calor. 88 (2007) 237-243. 192. C. Balazsi, F. Weber, Z. Kover, E. Horvath, C. Nemeth, ”Preparation of calcium–phosphate bioceramics from natural resources”, J. Eur. Ceram. Soc. 27 (2007) 1601-1606. 193. W. Chen, Y. Kinemuchi, T. Tamura, K. Miwa, K. Watari, ”Grain-oriented calcium hydroxyapatite ceramic and film prepared by magnetic alignment”, Mater. Lett. 61 (2007) 6-9. 194. H. M. Ledo, E. A. C. Thackray, I. P. Jones, P. M. Marquis, L. E. Macaskie, E. R. Sammons, ”Microstructure and composition of biosynthetically synthesised hydroxyapatite”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 19 (2008) 3419-3427. 195. A. S. Fomin, S. M. Barinov, V. M. Ievlev, V. V. Smirnov, B. P. Mikhailov, E. K. Belonogov, N. A. Drozdova, ”Nanocrystalline hydroxyapatite ceramics produced by low-temperature sintering after high-pressure treatment”, Dok. Chem. 418 (2008) 22-25. 196. A. S. Fomin, S. M. Barinov, V. M. Ievlev, V. V. Smirnov, B. P. Mikhailov, E. K. Belonogov, N. A. Drozdova, ”Nanocrystalline Hydroxyapatite Ceramics”, Inorg. Mater. 45 (2008) 1193-1196. 223 197. Y. Nayak, R. P. Rana S. K. Pratihar S. Bhattacharyya, ”Pressureless sintering of dense hydroxyapatite–zirconia composites ”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 19 (2008) 2437-2444. 198. J. Wang, L. L. Shaw, ” Nanocrystalline hydroxyapatite with simultaneous enhancements in hardness and toughness”, Biomater. 30 (2009) 6565-6572. 199. M. Quilitz, K. Steingrover, M. Veith, ”Effect of the Ca/P ratio on the dielectric properties of nanoscaled substoichiometric hydroxyapatite”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 21 (2010) 399-405. 200. A. Raksujarit, K. Pengpat, G. Rujijanagul, T. Tunkasiri, ”Processing and properties of nanoporous hydroxyapatite ceramics”, Mater. Design 31 (2010) 1658- 1660. 201. A. I. Mitsionis, T. C. Vaimakis, C. C. Trapalis, ”The effect of citric acid on the sintering of calcium phosphate bioceramics”, Ceram. Int. 36 (2010) 623-634. 202. M. Kawata, H. Uchida, K. Itatani, I. Okada, S. Koda, M. Aizawa, ”Development of porous ceramics with well-conrolled porosities and pore sizes from apatite fibers and their evaluations”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 15 (2004) 817-823. 203. V.S. Komlev, S. M. Barinov, E. Girardin, S. Oscarsson, A. Rosengren, F. Rustichelli, V. P. Orlovski, ”Porous spherical hydroxyapatite and fluorhydroxyapatite granules: processing and characterization”, Sci. Technol. Adv. Mater. 4 (2003) 503- 508. 204. C. C. Ribeiro, C. C. Barrias, M. A. Barbosa, ”Preparation and characterisation of calcium-phosphate porous microspheres with a uniform size for biomedical applications”, J. Mater. Sci.: Mater. Med. 17 (2006) 455-463. 205. O. L. Kubarev, V. S. Komlev, M. Maitz, S. M. Barinov, ”Bioactive composite ceramics in the hydroxyapatite-tricalcium phosphate system”,Dok. Chem. 413 (2007) 72-74. 206. A. Tampieri, G. Celotti, F. Szontagh, E. Landi, ”Sintering and characterization of HA and TCP bioceramics with control of their strength and phase purity” , J. Mater. Sci: Mater. Med. 8 (1997) 29-37. 207. P. van Landuyt, F. Li, J. P. Keustermans, J. M. Streydio, F. Delannay, E. Muting, ”The influence of high sintering temperatures on the mechanical properties of hydroxyapatite” , J. Mater.Sci.: Mater.Med. 6 (1995) 8-13. 208. B. R. Lawn, T. Jensen, A. Arora, ”Brittleness as an indentation size effect”, J.Mater. Sci.Lett. 11 (1976) 573-575. 209. Y. M. Chiang, D. P. Birnie, W. D. Kingery, ”Physical ceramics”, John Wiley and Sons, New York (1997) 477-485. 210. B. R. Lawn, D. B. Marshall, ”Hardness, toughness and brittleness: an indentation analysis” , J. Am. Ceram. Soc. 62 (1979) 347-350. 211. M. J. Mayo, ”Nanocrystalline ceramics for structural applications: processing and properties”, in: G. M. Chow, N. I. Noskova, Nanostructured (Ed.), Materials science technology, NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Russia, (1997) 361-385. 212. J. R. Groza, ”Nanosintering”, Nanostruct. Mater. 12 (1999) 987-992. 213. Y. W. Gua, K. A. Khora, P. Cheang, ”Bone-like apatite layer formation on hydroxyapatite prepared by spark plasma sintering (SPS) ”, Biomater. 25 (2004) 4127- 4134. 224 214. S. Vijayan, H. Varma, ”Microwave sintering of nanosized hydroxyapatite powder compacts” , Mater. Letters 56 (2002) 827-831. 215. Y. Fang, D. K. Agrawal, D. M. Roy, R. Roy, ”Microwave sintering of hydroxyapatite” , J. Mater. Res. 9 (1994) 180-187. 216. W. H. Sutton, ”Microwave processing of ceramic materials” , Am. Ceram. Soc. Bull. 68 (1989) 376-386. 217. X. Wang, H. Fan, Y. Xiao, X. Zhang, ”Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite/β-tricalcium phosphate ceramics by microwave sintering”, Mater. Letters 60 (2006) 455-458. 218. S. Ramesh, C. Y. Tan, S. B. Bhaduri, W. D. Teng, I. Sopyan, ”Densification behaviour of nanocrystalline hydroxyapatite bioceramics”, J. Mater. Process. Techn. 206 (2008) 221-230. 219. Y. Fang, D. K. Agrawal, D. M. Roy, R. Roy, ”Fabrication of transparent hydroxyapatite ceramics by ambient-pressure sintering”, Mater. Letters 23 (1995) 147- 151. 220. Y. Yang, J. L. Ong, ”Rapid sintering of hydroxyapatite by microwave processing”, J. Mater. Sci. Letters 21, 2002, 67-69. 221. S. Katakam, D. S. R. Krishna, T. S. S. Kumar, ”Microwave processing of functionally graded bioactive materials” , Mater. Letters 57 (2003) 2716-2721. 222. X. L. Wang, Z. Wang, H. S. Fan, Y. M. Xiao, X. D. Zhang, ”Fabrication of Porous Hydroxyapatite Ceramics by Microwave Sintering Method” ,Key Engin. Mater. 288-289 (2005) 529-532. 223. X. Wang, H. Fan, Y. Xiao, X. Zhang, ”Fabrication and characterization of porous hydroxyapatiteβ-tricalcium phosphate ceramics by microwave sintering”, Mater. Letters 60 (2006) 455-458. 224. S. Ramesh, C. Y. Tan, S. B. Bhaduri, W. D. Teng, ”Rapid densification of nanocrystalline hydroxyapatite for biomedical applications” , Ceram. Int. 33 (2007) 1363-1367. 225. S. Ramesh, C. Y. Tan, S. B. Bhaduri, W. D. Teng, I. Sopyand, ”2008 Densification behaviour of nanocrystalline hydroxyapatite bioceramics ”, J. Mater. Process. Technol. 206 (2008) 221-230. 226. F. A. C. Oliveira, P. Pascaud, J. Domingues, T. Marcelo, J. C. Fernandes, L. G. Rosa, ”Elastic properties of microwave sintered hydroxyapatite”, 4th International Materials Symposium Materiais (2007). 227. D. S. Seo, H. Kim, K. H. Hwang, J. K. Lee, ”Surface Dissolution of Hydroxyapatite Prepared by Microwave Sintering”, Key Engin. Mater. 330-332 (2007) 227-230. 228. D. S. Seo, J. K. Lee, ”AFM analysis of anisotropic dissolution in dense hydroxyapatite”, Ultramicro. 108 (2008) 1157-1162. 229. A. Chanda, S. Dasgupta, S. Bose, A. Bandyopadhyay, ”Microwave sintering of calcium phosphate ceramics”, Mater. Sci. Engine.C 29 (2009) 1144-1149. 230. R. Halouani, D. Bernache-Assollant, E. Champion, A. Ababou, ”Microstructure and related mechanical properties of hot pressed hydroxyapatite ceramics”, J. Mater. Sci: Mater. Med. 5 (1994) 563-568. 231. W. Suchanek, M. Yashima, M. Kakihana, M. Yoshimura, ”Processing and mechanical properties of hydroxyapatite reinforced with hydroxyabatite whiskers”, Biomater. 17 (1996) 1715-1723. 225 232. S. Raynaud, E. Champion, J. P. Lafon, D. Bernache-Assollant, ”Calcium phosphate apatites with variable Ca/P atomic ratio III. Mechanical properties and degradation in solution of hot pressed ceramics” , Biomater. 23 (2002) 1081-1089. 233. J. Li, T. Hashida, ”Preparation of hydroxyapatite ceramics by hydrothermal hot-pressing method at 300 °C”, J. Mater. Sci. 42 (2007) 5013-5019. 234. E. S. Ahn, N. J. Gleason, A. Nakahira, J. Y. Ying, ”Nanostructure Processing of Hydroxyapatite-based Bioceramics”, Nano Letters 1 (2001) 149-153. 235. A. Rapacz-Kmita, C. Paluszkiewicza, A. Slosarczyka, Z. Paszkiewicz, ”FTIR and XRD investigations on the thermal stability of hydroxyapatite during hot pressing and pressureless sintering processes”, J. Molecul. Struct. 744-747 (2005) 653-656. 236. Z. A. Munir, U. Anselmi-Tamburini, ”The effect of electric field and pressure on the synthesis and consolidation of materials: A review of the spark plasma sintering method”, J. Mater. Sci. 41 (2006) 763-777. 237. G. F. Taylor, US Patent No. 1,896,854 (1933). 238. R. W. Boesel, M. I. Jacobson, I. S. Yoshioka, Proc. Fall Powder Met. Conf. Metal Powder Industries Federation, New York (1970) 75-99. 239. C. G. Goetzel, V. S . Demarchi, ”Electrically activated pressure sintering (spark sintering) of titanium powders”, Powder Met. Int. 3 (1971) 80. 240. K. Inoue, US Patent 3,340,052 (1967). 241. Idem., US Patent 3,656,946 (1972). 242. D. E. Clark, W. H. Sutton, ”Microwave processing of materials”, Annu. Rev. Mater. Sci. 26 (1996) 299. 243. M. Tokita, ”Development of large-size ceramic/metal bulk FGM fabricated by spark plasma sintering”, Mater. Sci. Forum 308-311 (1999) 83. 244. Z. Shen, M. Johnson, Z. Zhao, M. Nygren, ”Spark plasma sintering of alumina”, J. Amer. Ceram. Soc. 85 (2002) 1921. 245. M. Omori, ”Sintering, consolidation, reaction and crystal growth by the spark plasma system (SPS)”, Mater. Sci. Eng. A287 (2000) 183. 246. D. Zhang, Z. Fu, R. Yuan, J . Guo, ”Spark Plasma Sintering : A Promising New Technique and its Mechanism”, u ”Multiphased Ceramic Materials”, ed. W. H. Tuan and J. K. Guo, ””, Springer, Berlin, (2004) 65. 247. M. Tokita, ”Preparation of Functionally Graded Materials by Spark Plasma Sintering”, New Ceram. 7 (1994) 63. 248. K. Ozaki, K. Kobayashi , T. Nishio, A. Matsumoto, A. Sugyiama, ”Sintering Phenomena on Initial Stage in Pulsed Current Sintering”, J. Jpn. Soc. Powder Metall. 47 (2000) 293. 249. O. Yanagashiwa, H. Kuramoto, K. Matsugi, M. Komatsu, Mater. Sci. Eng. A350 (2003) 184. 250. Y. W. Gua, N. H. Loha, K. A. Khora, S. B. Tora, P. Cheang, ”Spark plasma sintering of hydroxyapatite powders”, Biomater. 23 (2002) 37-43. 251. A. Nakahira, M. Tamai, H. Aritani, S. Nakamura, K. Yamashita, ”Biocompatibility of dense hydroxyapatite prepared using an SPS process”, J. Biomed. Mater. Res. 62 (2002) 550-557. 252. R. Kumar, P. Cheang, K. A. Khor, ”Spark plasma sintering and in vitro study of ultra-fine HA and ZrO2–HA powders”, J. Mater. Process. Technol. 140 (2003) 420- 425. 226 253. K. A. Khor, Y. W. Gu, P. Cheang, F. Y. C. Boey, ”The Characteristics and properties of Hydroxyapatite Prepared by Spark Plasma Sintering (SPS)”, Key Engin. Mater. 240-242 (2003) 497-500. 254. N. Yamaguchi, H. Tanaka, O. Ohashi, ”Gas Analysis in Spark Plasma Sintering of Hydroxyapatite”, Mater. Sci. Forum 449-452 (2004) 793-796. 255. J. L. Xu, K. A. Khor, Y. W. Gu, R. Kumar, P. Cheang, ”Radio frequency (rf) plasma spheroidized HA powders: powdercharacterization and spark plasma sintering behavior”, Biomater. 26 (2005) 2197-2207. 256. J. L. Xu, K. A. Khor, R. Kumar, ”Physicochemical differences after densifying radio frequency plasma sprayed hydroxyapatite powders using spark plasma and conventional sintering techniques”, Mater. Sci. Engin. A 457 (2007) 24-32. 257. B. T. Lee, N. Y. Shin, J. K. Han, H. Y. Song, ”Microstructures and fracture characteristics of spark plasma-sintered HAp–5 vol.% Ag composites”, Mater. Sci. Engin. A 429 (2006) 348-352. 258. J. L. Xu, K. A. Khor, ”Chemical analysis of silica doped hydroxyapatite biomaterials consolidated by a spark plasma sintering method”, J. Inorg. Biochem. 101 (2007) 187-195. 259. C. Drouet, F. Bosc, M. Banu, C. Largeot, C. Combes, G. Dechambre, C. Estournes, G. Raimbeaux, C. Rey, ”Nanocrystalline apatites From powders to biomaterials”,Powder Technol. 190 (2009) 118-122. 260. D. Grossin, S. Rollin-Martinet, C. Estournes, F. Rossignol, E. Champion, C. Combes, C. Rey, C. Geoffroy, C. Drouet, ”Biomimetic apatite sintered at very low temperature by spark plasma sintering”, Acta Biomater. 6 (2010) 577-585. 261. J. L. Xu, K. A. Khor, J. J. Sui, W. N. Chen, ”Preparation and characterization of a novel hydroxyapatite carbon nanotubes composite and its interaction with osteoblast like cells”,Mater. Sci. Engin. C 29 (2009) 44-49. 262. A. G. Evans, E. A. Charles, ”Fracture toughness determinations by indentation”, J. Am. Ceram. Soc. 59 (1976) 371-372. 263. W. C. Oliver, G. M. Pharr, ”An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments” , J. Mater. Res. 7 (1992) 1564-1583. 264. I. Balać, P. S. Uskoković, N. Ignjatović, R. Aleksić, D. Uskoković, ”Stress analysis in hydroxyapatite/poly-L-lactide composite biomaterials”, Comput. Mater. Sci. 20 (2001) 275-283. 265. I. Balać, P. S. Uskoković, R. Aleksić, D. Uskoković, ”Predictive modeling of the mechanical properties of particulate hydroxyapatite reinforced polymer composites”, J. Biomed. Mater. Res. 3 (2002) 793-799. 266. I. Balać, M. Milovančević, C. Y. Tang, P. S. Uskoković, D. Uskoković, ”Estimation of the elastic properties of a particulate polymer composite using a face- centered cubic FE model”, Mater. Lett. 8 (2004) 2437-2441. 267. T. Kokubo, S. Ito, M. Shigematsu, S. Sakka, T. Yamamuro, ”Fatigue and life- time of bioactive glass-ceramic A-W containing apatite and wollastonite”, J. Mater. Sci. 22 (1987) 4067–4070. 268. T. Kokubo, H. Takadama, ”How useful is SBF in predicting in vivo bone bioactivity” , Biomater. 27 (2006) 2907–2915. 227 269. E. Matijević, “Preparation and Characterization of Well defined Powders and Their Aplications in Technology”, J.Europ.Ceram.Soc. 18 (1998) 1357-1364. 270. V. Privman, D. V. Goia, J. Park, E. Matijević, “Mechanism of Formation of Monodispersed Colloids by Aggregation of nanosiye Precursors”, J.Colloid Interface Sci. 213 (1999) 36-45. 271. D. V. Goia, E. Matijević, “Tailoring the Particle Size of monodispersed Colloidal Gold”, Colloids . Surf. A 146 (1999) 139-152. 272. J. Park, V. Privman, E. Matijevic, “Model of Formation of Monodispesed Colloids”, J. Phys. Chem. B, 105 (2001) 11630-11635. 273. S. Libert, V. Gorshov, V. Privman, D. Gioa, E. Matijević, “Formation of monodispersed Cadmium Sulfide Particles by Aggregation of nanosize Precursors”, Adv. Colloid . Interface Sci. 100-102 (2003) 169-183. 274. I. Sondi, E. Matijević, “Homogeneous Precipitation by Enzime-Catalyzed reaction. 2. Strontium and Barium Carbonates” Chem. Mater. 15 (2003) 1322-1326. 275. B. Viswanath, R. Raghavan, N. P. Gurao, U. Ramamurty, N. Ravishankar, “Mechanical properties of tricalcium phosphate single crystals grown by molten salt synthesis“, Acta Biomater. 4 (2008) 1448-1454. 276. B. Viswanath, R. Raghavan, U. Ramamurty, N. Ravishankar, “Mechanical properties and anisotropy in hydroxyapatite single crystals“, Scripta Mater. 57 (2007) 361-364. 277. L. H. He, O. C. Standard, T. T. Y. Huang, B. A. Latella, M. W. Swain, “Mechanical behaviour of porous hydroxyapatite“, Acta Biomater. 4 (3) (2008) 577- 586. 278. R. A. Masumura, P. M. Hazzledine, C. S. Pande, “Yield stress of fine grained materials“, Acta Mater. 46 (1998) 4527-4534. 279. S. Guicciardi, T. Shimozono, G. Pezzotti, “Nanoindentation Characterization of Sub-Micrometric Y-TZP Ceramics“, Adv. Eng. Mater. 8 (2006) 994-997. 280. P. S. Uskokovic, C. Y. Tang, C. P. Tsui, N. Ignjatovic, D. P. Uskokovic, “Micromechanical properties of a hydroxyapatite/poly-l-lactide biocomposite using nanoindentation and modulus mapping“, J. Eur. Ceram. Soc. 27 (2007) 1559-1564. 281. R. R. Kumar, M. Wang, “Modulus and hardness evaluations of sintered bioceramic powders and functionally graded bioactive composites by nanoindentation technique“ , Mater. Sci. Eng. A 338 (2002) 230-236. 282. E. Ho, M. Marcolongo, “Effect of coupling agents on the local mechanical properties of bioactive dental composites by the nano-indentation technique“, Dent. Mater. 21 (2005) 656-664. 283. R. Sun, M. Li, Y. Lu, A. Wang, “Immersion behavior of hydroxyapatite (HA) powders before and after sintering“, Mater. Charact. 56 (2006) 250-254. 284. C. Ribeiro, E. C. S. Rigo, P. Sepu, J. C. Bressiani, A. H. A. Bressiani, “Formation of calcium phosphate layer on ceramics with different reactivities“, Mater. Sci. .Engin. C 24 (2004) 631–636. 285. G. Bogdanović, J. Raletić-Savić, N. Marković, “In vitro assays for antitumor- drug screening on human tumor cell lines: dye exclusion test and colorimetric cytotoxicity assey“, Onkološki arhiv 2(4) (1994) 181-184. 228 286. T. Mosmann, “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Aplication to proliferation and cytotoxicity assays“, J, Immunol. Methods 65(1983) 55-63. 287. N. Ignjatović, P. Ninkov, V. Kojić, M. Bokurov, V. Srdić, D. Krnojelac, S. Selaković, D. Uskoković, „Cytotoxicity and fibroblast properties during in vitro test of biphasic calcium phosphate/poly-dl-lactide-co-glycolide biocomposites and different phosphate materials“, Microsc. Res. Tech. 69 (2006) 976–982. 288. B. Alliot-Light, A. Jean, M. Gregoire, “Comparative effect of calcium hydroxide and calcium hydroxyapatite on the cellular activity of human pulp fibroblasts in vitro”, Archs Oral Bid. 39 (1994) 481-489. 289. E. A. dos Santos, M. Farina, G. A. Soares, K. Anselme, “Surface energy of hydroxyapatite and tricalcium phosphate ceramics driving serum protein adsorption and osteoblast adhesion”, J Mater Sci: Mater Med 19 (2008) 2307–2316. 290. K. Anselme, “Osteoblast adhesion on biomaterials”, Biomater. 21 (2000) 667- 681. BIOGRAFIJA ðorñe Veljović je roñen 03.08.1977. godine u Kragijevcu, gde je završio osnovnu i srednju školu. Tehnološko-metalurški fakultet u Beogradu je upisao 1996. godine. Na ovom fakultetu je diplomirao 2002. godine sa temom: ’’Ispitivanje mogućnosti alkaline i kiselinske aktivacije bentonita i sepiolita’’. Poslediplomske studije upisao je školske 2002/03. godine na Tehnnološko–metalurškom fakultetu Univerziteta u Beogradu na smeru za neorgansku hemijsku tehnologiju. Na poslediplomskim studijama je uspešno položio sve ispite predviñene planom i programom sa prosečnom ocenom 9,88. Magistarsku tezu pod nazivom ’’PROUČAVANJE PROCESA FORMIRANJA NANOSTRUKTURNIH BIOKERAMIČKIH MATERIJALA NA BAZI HIDROKSIAPATITA’’, rañenu pod mentorstvom profesora ðorña Janaćkovića, uspešno je odbranio 18.09.2007 godine. Od jula 2002. godine do jula 2003. godine radio je u Institutu za ispitivanje materijala Srbije kao inženjer u Laboratoriji za veziva i hidroizolaciju. Od 2003. do 2007. godine radio je na Tehnološko- metalurškom fakultetu u Beogradu kao istraživač pripravnik, a od decembra 2007. godine u svojstvu istraživača saradnika. ðorñe Veljović je učestvovao ili učestvuje na istraživanjima u okviru pet domaćih i dva meñunarodna naučno-istraživačka projekta. Do sada je objavio sedam radova u vrhunskim meñunarodnim časopisima (M21), jedan rad u istaknutom meñunarodnom časopisu (M22), pet radova u časopisima meñunarodnog značaja (M23), dva rada u časopisima nacionalnog značaja, jedan rad saopštena na skupu meñunarodnog značaja štampan u celini, dva rada saopštena na skupu nacionalnog značaja štampana u celini, trinaest radova saopštenih na skupovima meñunarodnog značaja štampana u izvodu, šest radova saopštenih na skupu nacionalnog značaja štampanih u izvodu. Učestvovao je u realizaciji deset elaborata i studija. Učestvovao je u izvodjenju vežbi i izradi više diplomskih radova iz oblasti neorganske hemijske tehnologije i oblasti materijala. Član je Srpskog hemijskog društva. III. Objavljeni i saopšteni rezultati koji čine deo teze Radovi u vrhunskim časopisima meñunarodnog značaja (M21) 1. Dj. Veljović, B. Jokić, R. Petrović, E. Palcevskis, A. Dindune, I. N. Mihailescu, Dj. Janaćković, “Processing of Dense Nanostructured HAP Ceramics by Sintering and Hot Pressing“, Ceram.Int., 35 (2009) 1407–1413 (ISSN 0272-8842, IF 1,686). 2. C. Y. Tang, P. S. Uskoković, C. P. Tsui, Dj. Veljović, R. Petrović, Dj. Janaćković, “Influence of microstructure and phase composition on the nanoindentation characterization of bioceramic materials based on hydroxyapatite”, Ceram. Int., 35, (2009) 2171–2178 (ISSN 0272-8842, IF 1,686). 3. Dj. Veljović, I. Zalite, E. Palcevskis, I. Smičiklas, R. Petrović, Dj. Janaćković, “Microwave sintering of fine grained HAP and HAP/TCP bioceramics”, Ceram. Int., 36 (2010) 595–603 (ISSN 0272-8842, IF 1,686). 4. Dj. Veljović, R. Jančić-Hajneman, I. Balać, B. Jokić, S. Putić, R. Petrović, Dj. Janaćković, “ The effect of the shape and size of the pores on the mechanical properties of porous HAP-based bioceramics“, Ceram. Int., Doi: 10.1016/j.ceramint.2010.09.014 (2010) (ISSN 0272-8842, IF 1,686). Radovi u istaknutom meñunarodnom časopisu (M22) 1. Dj. Veljović, E. Palcevskis, A. Dindune, S. Putić, I. Balać, R. Petrović, Dj. Janaćković, Microwave sintering improves the mechanical properties of biphasic calcium phosphates from hydroxyapatite microspheres produced from hydrothermal processing, J. Mater. Sci., 45 (12) (2010) 3175-3183 (ISSN 0022-2461, IF 1,471). Page 1/1 Page 1/1