UNIVERZITET U BEOGRADU TEHNOLOŠKO-METALURŠKI FAKULTET ODREĐIVANJE TRAGOVA LEKOVA U VODI METODOM TEČNE HROMATOGRAFIJE SA TANDEM MASENOM SPEKTROMETRIJOM -doktorska disertacija- Svetlana D. Grujić Beograd, 2009. godine Mentor: Dr Mila Laušević, redovni profesor Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu Članovi komisije: Dr Tatjana Vasiljević, docent Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Slobodan Petrović, redovni profesor Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Jasna Đonlagić, redovni profesor Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu Dr Slobodan Milosavljević, redovni profesor Hemijskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Datum odbrane: Želim da se zahvalim prof. dr Mili Laušević za svesrdnu i nesebičnu podršku koju mi je pružala tokom pet godina mentorstva, kao i za stručne savete i izuzetnu saradnju prilikom izrade doktorske disertacije. Docent dr Tatjani Vasiljević dugujem iskrenu zahvalnost za svestranu pomoć i stručne sugestije tokom izrade ove teze. Prof. dr Slobodanu Petroviću zahvaljujem se, pre svega, na vrednim savetima koje mi je pružio prilikom pisanja ovog rada, kao i na pomoći prilikom nabavljanja analitičkih standarda lekova. Želim da se zahvalim i ostalim članovima Komisije, prof. dr Jasni Đonlagić i prof. dr Slobodanu Milosavljeviću na korisnim i kreativnim sugestijama koje su mi pružili tokom pisanja doktorske disertacije. Konačno, posebno se zahvaljujem svojim koleginicama i kolegama sa Katedre za opštu i neorgansku hemiju, kao i Katedre za analitičku hemiju i kontrolu kvaliteta, Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu na izvanrednom duhu saradnje, razumevanju i neizmernoj podršci. ODREĐIVANJE TRAGOVA LEKOVA U VODI METODOM TEČNE HROMATOGRAFIJE SA TANDEM MASENOM SPEKTROMETRIJOM Izvod. Prisustvo tragova lekova u životnoj sredini postalo je predmet posebnog interesovanja u poslednjoj deceniji. U postrojenjima za prečišćavanje otpadnih voda lekovi se ne uklanjanju efikasno, zbog čega dospevaju u prirodne vode. Najveći problem predstavlja prisustvo antibiotika, zbog mogućnosti nastajanja rezistentnih bakterijskih sojeva. Zbog ograničenog znanja o koncentraciji, degradaciji i posledicama prisustva lekova u životnoj sredini, tragovi lekova u vodi još uvek nisu zakonski regulisani. Većina analitičkih metoda za određivanje tragova lekova obuhvata hemijski slična jedinjenja iz jedne ili dve grupe lekova, uglavnom antibiotika. Veoma je teško ekstrahovati i detektovati hemijski različite analite iz većeg broja grupa lekova sa prihvatljivim prinosima i granicama detekcije. Zbog toga još uvek postoji potreba za novim, pouzdanim, multirezidualnim analitičkim metodama, koje omogućavaju brzo, osetljivo i selektivno određivanje tragova lekova u uzorcima iz životne sredine. U ovoj studiji je opisan razvoj, optimizacija i primena analitičke metode za određivanje i pouzdanu potvrdu devetnaest lekova iz različitih farmakoloških grupa pri koncentracijama reda veličine ng dm−3. Za analizu su odabrani lekovi koji spadaju među najčešće korišćene u Srbiji i pripadaju glavnim grupama lekova, kao što su antibiotici (β-laktami, cefalosporini, sulfonamidi, makrolidi i tetraciklini), benzodiazepini, antiepileptici i analgoantipiretici. Za efikasnu ekstrakciju i predkoncentrisanje analita iz uzoraka vode razvijena je i optimizovana procedura ekstrakcije na čvrstoj fazi. Ekstrakti su analizirani metodom tečne hromatografije sa tandem masenom spektrometrijom, uz korišćenje jonskog trapa i elektrosprej jonizacije. Optimizovano je hromatografsko razdvajanje analita i uspostavljeni su pouzdani protokoli za maseno-spektrometrijsku potvrdu prisustva analita. Metoda je primenjena u analizi realnih uzoraka vode. Utvrđeno je da svi ispitivani uzorci sadrže tragove lekova. Dokazano je prisustvo karbamazepina, azitromicina, trimetoprima i paracetamola. Ključne reči: multirezidualna analiza, antibiotici, tragovi lekova, tečna hromatografija– –tandem masena spektrometrija, jonski trap, ekstrakcija na čvrstoj fazi, analiza vode. DETERMINATION OF DRUG RESIDUES IN WATER BY LIQUID CHROMATOGRAPHY – TANDEM MASS SPECTROMETRY Abstract. The presence of drug residues in the environment has become a subject of growing concern in the past decade. Wastewater treatment plants are not designed to remove drugs from the effluents and consequently they are released into natural waters. The major problem is the presence of antibiotics, because it can lead to generation of resistant bacterial strains. Owing to the limited knowledge on concentrations, degradation and effects of drugs in the environment, they have not yet been included in any environmental regulations. The majority of analytical methods for determination of drug residues include chemically similar compounds from one or two drug classes, most of them being antibiotics. It is very difficulty to extract and detect chemically dissimilar analytes from a number of drug classes with acceptable recoveries and limits of detection. Therefore, there is still need for new, reliable, multiresidual analytical methods, which enable rapid, sensitive and selective determination of pharmaceuticals in environmental samples, at trace levels. This study describes development, optimization and application of the analytical method for determination and reliable confirmation of nineteen drugs from different therapeutic classes at ng dm−3 levels. Pharmaceuticals that are among the most frequently used in Serbia and that belong to the major drug groups, as antibiotics (β-lactams, cephalosporines, sulfonamides, macrolides and tetracyclines), benzodiazepines, antiepileptics, and analgoantipyretics, were chosen for the study. Solid-phase extraction procedure for efficient extraction and preconcentration of the analytes from water samples was developed and optimized. Extracts were analyzed using liquid chromatography–ion trap– tandem mass spectrometry with electrospray ionization. The chromatographic separation of the analytes was optimized, and reliable mass-spectrometric confirmation protocols were established. The method was applied to real water samples for monitoring of the selected drugs. The study has shown that all investigated samples contained drug residues, revealing the presence of carbamazepine, azithromycin, trimethoprim and paracetamol. Keywords: multiresidual analysis, antibiotics, drug residues, liquid chromatography– –tandem mass spectrometry, ion trap, solid-phase extraction, water analysis. SADRŽAJ SADRŽAJ 1. UVOD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2. TEORIJSKI DEO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.1. Putevi kojima lekovi dospevaju u životnu sredinu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2.2. Uklanjanje lekova u postrojenjima za prečišćavanje otpadnih voda . . . . . . . . . . . . . . 4 2.3. Degradacija lekova u životnoj sredini . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.4. Uklanjanje lekova u postrojenjima za prečišćavanje pijaće vode. . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.5. Problem prisustva lekova u prirodnoj i pijaćoj vodi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.6. Lekovi detektovani u prirodnoj i pijaćoj vodi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.7. Lekovi odabrani za analizu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2.8. Analitika lekova – zahtevi i problemi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.9. Priprema uzoraka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.10. Tečna hromatografija visoke performanse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.11. Masena spektrometrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.12. Sprega tečne hromatografije sa masenom spektrometrijom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.12.1. Tandem masena spektrometrija odabranih grupa lekova . . . . . . . . . . . . . . . 31 3. EKSPERIMENTALNI DEO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.1. Rastvori odabranih lekova i reagensi. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3.2. Snimanje masenih spektara analita. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.3. Optimizacija hromatografskog razdvajanja analita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.4. Optimizacija HPLC-MS/MS parametara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.5. Ekstrakcija analita na čvrstoj fazi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.5.1. Izbor SPE kertridža. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.5.2. Izbor optimalne pH-vrednosti uzorka vode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.5.3. Izbor optimalne zapremine eluenta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.5.4. Izbor optimalne zapremine uzorka vode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.5.5. Validacija metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 3.6. Kalibracija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 3.7. Uzimanje uzoraka vode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 SADRŽAJ 4. REZULTATI I DISKUSIJA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.1. Maseni spektri analita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.2. Formiranje adukta amoksicilina sa metanolom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 4.2.1. Uticaj sastava rastvarača na ESI masene spektre amoksicilina . . . . . . . . . . . . . . 66 4.2.2. Formiranje adukta amoksicilina sa metanolom tokom vremena . . . . . . . . . . . . . 71 4.2.3. Uticaj aditiva mobilne faze na efikasnost jonizacije amoksicilina . . . . . . . . . . . 73 4.2.4. Linearnost detektora za određivanje amoksicilina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 4.3. Optimizacija hromatografskog razdvajanja analita i HPLC-MS/MS parametara . . 76 4.4. Ekstrakcija analita na čvrstoj fazi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.4.1. Izbor SPE kertridža . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78 4.4.2. Izbor optimalne pH-vrednosti uzorka vode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81 4.4.3. Izbor optimalne zapremine eluenta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 4.4.4. Izbor optimalne zapremine uzorka vode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84 4.4.5. Validacija razvijene metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 4.5. Kalibracija i uticaj matrice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 4.6. Analiza realnih uzoraka . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 4.7. Potvrda prisustva analita . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 5. ZAKLJUČNA RAZMATRANJA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 6. ZAKLJUČAK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100 LITERATURA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 PRILOG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112 OBJAVLJENI NAUČNI RADOVI IZ DOKTORSKE DISERTACIJE . . . . . . . . . . . . . . . . 123 Savremena istraživanja u oblasti analitike zagađujućih supstanci u životnoj sredini proširena su sa tradicionalnih zagađujućih supstanci, kao što su polihlorovani bifenili, policiklični aromatični ugljovodonici i pesticidi, na „nove zagađujuće supstance“ kao što su lekovi i hormoni. Tragovi lekova u životnoj sredini postali su predmet interesovanja naučne javnosti u poslednjoj deceniji, s obzirom na to da niske koncentracije ovih analita ranije nisu mogle biti detektovane. Lekovi dospevaju u životnu sredinu, u najvećoj meri, kao posledica nepotpunog uklanjanja iz komunalnih otpadnih voda. Međutim, u Srbiji, u svega nekoliko gradova postoje postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda, a Beograd nije jedan od njih. Procesi prečišćavanja površinske i podzemne vode takođe ne mogu u potpunosti ukloniti lekove, pa se u tragovima mogu naći i u vodi za piće. Pijaća voda tako može da sadrži tragove antibiotika, analgetika, sedativa i dr. Iako su koncentracije ovih lekova u vodi izuzetno niske, reda veličine µg dm–3 ili ng dm–3, za razliku od ostalih zagađujućih supstanci, lekovi su napravljeni tako da imaju efekte na čoveka pri niskim koncentracijama. Zbog toga njihov kontinualan unos u životnu sredinu može dovesti do dugoročnih negativnih posledica po zdravlje čoveka i vodenih životinja. Najnovija istraživanja su pokazala da niske količine lekova u vodi utiču na sporiji rast ljudskih embriona, da mogu izazvati upalu krvnih ćelija i da ubrzavaju razmnožavanje ćelija raka dojke. Kod životinja je dokazan negativan uticaj na reproduktivnu funkciju i mogućnost borbe protiv infekcija. Ipak, efekti dugoročnog konstantnog izlaganja niskim količinama lekova po ljudsko zdravlje još uvek nisu dobro poznati. Poznato je da prisustvo antibiotika u životnoj sredini predstavlja problem zbog pojave bakterijskih sojeva rezistentnih na ove lekove. Ako se uzme u obzir da se u Evropskoj Uniji godišnje upotrebi oko 8500 t antibiotika u humanoj medicini i 4700 t u veterini, moguće je shvatiti zbog čega je ovo jedan od najaktuelnijih problema u hemiji životne sredine. Iako je registrovano više od 3000 aktivnih sastojaka lekova, analitičke metode su razvijene za određivanje oko 150 lekova u uzorcima iz životne sredine. Većina ovih analitičkih metoda zasnovana je na gasnoj hromatografiji sa masenom spektrometrijom koja često zahteva derivatizaciju, tj. hemijsku modifikaciju analita. U poslednjoj deceniji, tečna hromatografija visoke performanse sa tandem masenom spektrometrijom je postala najpouzdanija tehnika za određivanje polarnih zagađujućih supstanci u životnoj sredini zbog visoke selektivnosti i izuzetne osetljivosti. Većina radova koja se bavi analizom tragova lekova u vodi fokusirana je na specifičnu grupu lekova, s posebnim naglaskom na antibiotike koji se smatraju najvećim problemom. S obzirom na to da su u životnoj sredini prisutne različite grupe lekova u veoma kompleksnim smešama, razvoj multirezidualne analitičke metode je izuzetno značajan. Takođe, broj studija o zastupljenosti tragova lekova u životnoj sredini je malobrojan, pa su i podaci o stepenu zagađenja vode lekovima veoma ograničeni. Kao posledica nedovoljnog poznavanja zastupljenosti i mogućih posledica prisustva lekova u životnoj sredini, u svetu još uvek ne postoje propisi o maksimalno dozvoljenim koncentracijama ovih jedinjenja u životnoj sredini. Zbog toga su svetska istraživanja fokusirana na razvoj osetljivih i pouzdanih analitičkih metoda za detekciju niskih koncentracija lekova, kao i dobijanje informacija o prisustvu, ponašanju, razgradnji i vremenu zadržavanja ovih zagađujućih supstanci u životnoj sredini. 1 . U V O D 1. UVOD 2 Predmet ovog rada je razvoj i primena nove, brze i osetljive multirezidualne analitičke metode za određivanje tragova odabranih lekova u vodi. Za analizu su odabrani lekovi pripadaju glavnim grupama lekova, kao što su antibiotici (β-laktami, cefalosporini, sulfonamidi, makrolidi i tetraciklini), benzodiazepini, antiepileptici i analgoantipiretici, a koji spadaju u najčešće korišćene u našoj zemlji. Rad obuhvata razvoj postupaka za efikasnu ekstrakciju i predkoncentrisanje veoma različitih analita, optimizaciju hromatografskih postupaka za razdvajanje i uspostavljanje protokola za potvrdu prisustva analita pomoću masenog detektora. Posebna pažnja je posvećena izboru reakcija za pouzdanu maseno- spektrometrijsku detekciju tragova lekova i razvoju novih načina identifikacije i nedvosmislene potvrde prisustva analita. Razvijena metoda je primenjena na realne uzorke površinskih i podzemnih voda, pri čemu je dobijena studija o stanju zagađenosti vode najčešće korišćenim lekovima u našoj zemlji. 3 2.1. PUTEVI KOJIMA LEKOVI DOSPEVAJU U ŽIVOTNU SREDINU Lekovi dospevaju u životnu sredinu kao posledica intenzivnog i konstantnog korišćenja u humanoj medicini i veterini. Glavni izvori zagađenja površinskih i podzemnih voda aktivnim supstancama lekova su gradske i poljoprivredne otpadne vode, odnosno domaćinstva, bolnice i poljoprivredna zemljišta (Halling-Sørensen et al. 1998; Robinson et al. 2007). Na slici 1 prikazani su mogući izvori zagađenja i putevi kojima lekovi dospevaju u površinske i podzemne vode. KOMUNALNE OTPADNE VODE POSTOJENJA ZA PRERADU OTPADNIH VODA AKTIVNI MULJ POVRŠINSKE VODE PODZEMNE VODE PIJAĆA VODAFARMACEUTSKAINDUSTRIJA ODLAGANJE OTPADA (NEISKORIŠĆENI LEKOVI) LEKOVI (HUMANA MEDICINA) LEKOVI (VETERINA) OTPADNE VODE (BOLNICE) OTPADNE VODE (DOMAĆINSTVA) IZLUČEVINE STAJSKO ĐUBRIVOOTPAD DEPONIJE ZEMLJIŠTE Slika 1. Putevi kojima lekovi dospevaju u površinske i podzemne vode (Heberer 2002). Najznačajniji put kojim lekovi dospevaju u životnu sredinu su komunalne otpadne vode. Nakon konzumiranja, u ljudskom organizmu lek podleže nizu metaboličkih reakcija, pri čemu nastaju metaboliti koji su često polarniji od polaznog jedinjenja. Zbog toga su rastvorljiviji u vodi, a time i često toksičniji od polazne supstance (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Lekovi se izlučuju delimično transformisani, pri čemu se i do 50% leka izluči u neizmenjenom obliku (Hirsch et al. 1999; Heberer 2002). U životnoj sredini, kao i u procesima prečišćavanja vode, metaboliti se mogu transformisati u polazno jedinjenje (Ternes 2001; Weigel et al. 2004). Sledeći važan izvor tragova lekova u životnoj sredini su farme na kojima se lekovi intenzivno koriste za uzgoj stoke i živine. Najviše se upotrebljavaju antibiotici, za lečenje infekcija i preventivno, ali i kao dodatak hrani radi pospešivanja rasta životinja (Hirsch et al. 1999). Upotrebom stajskog đubriva, antibiotici se dalje mogu preneti na poljoprivredno zemljište, a ispiranjem zemljišta i u podzemne vode (Hartig et al. 1999; Heberer 2002). Izvor zagađenja površinskih i podzemnih voda je i farmaceutska industrija, odnosno otpadne vode iz proizvodnje lekova. Ipak, ovo je lokalno zagađenje, koje ima uticaj na ograničeno područje (Hirsch et al. 1999). Odlaganjem lekova kojima je prošao rok upotrebe na deponije može doći do zagađenja podzemnih voda usled spiranja ovakvog zemljišta (Jørgensen and Halling-Sørensen 2000). 2 . T E O R I J S K I D E O 2. TEORIJSKI DEO 4 2.2. UKLANJANJE LEKOVA U POSTROJENJIMA ZA PREČIŠĆAVANJE OTPADNIH VODA U postrojenjima za preradu i prečišćavanje gradskih otpadnih voda postoje dva stupnja zadržavanja štetnih supstanci. Prvi stupanj obuhvata adsorpciju zagađujućih supstanci, a zatim taloženje i uklanjanje čvrste supstance, dok drugi obuhvata aerobnu i anaerobnu biodegradaciju na aktivnom mulju (Robinson et al. 2007). Pre nego što se otpusti u površinske vode, u nekim postrojenjima se otpadna voda i dezinfikuje, obično hlorisanjem ili ultraljubičastim zračenjem (Ternes et al. 2002a). S obzirom na to da većina lekova spada u polarna jedinjenja, dobro rastvorljiva u vodi i slabo biodegradabilna, lako mogu da izbegnu sedimentaciju i biološki tretman u procesu prečišćavanja otpadnih voda (Bendz et al. 2005). Koagulacija, flokulacija i procesi taloženja uglavnom nisu delotvorni u uklanjanju rastvorenih organskih zagađujućih supstanci (Ternes et al. 2002b). Biološki procesi su veoma efikasni za smanjenje koncentracije biodegrada- bilnih jedinjenja, dok se hlorisanje vode ili ozonizacija smatraju najefikasnijim načinom uklanjanja većeg broja lekova (Kim et al. 2007). Istraživanja su pokazala da se u postrojenjima za prečišćavanje gradskih otpadnih voda može eliminisati oko 40–60% lekova (Ternes 1998; Díaz-Cruz and Barceló 2005). Ukoliko se primenjuje i dezinfekcija, krajnje koncentracije lekova mogu biti još niže, pri čemu je hlorisanje vode efikasnije od ultraljubičastog zračenja (Renew and Huang 2004). Ipak, mnoge studije (Ternes 1998; Petrović et al. 2003, Ashton et al. 2004) su pokazale da se lekovi generalno slabo uklanjaju u procesima prečišćavanja otpadnih voda, posebno zbog činjenice da većina postrojenja ne sprovodi dezinfekciju otpadnih voda. Efikasnost ukljanjanja leka u procesu prečišćavanja zavisi od mnogih faktora, kao što su priroda aktivne supstance leka, sastav otpadnih voda, tehnologija prerade otpadnih voda, tip i vreme korišćenja aktivnog mulja, temperatura, i dr. (Carballa et al. 2004; Roberts and Thomas 2006). Poznato je, na primer, da je procenat uklanjanja kiselih jedinjenja, kao što su lekovi diklofenak, ibuprofen i acetilsalicilna kiselina, prilično nizak (Petrović et al. 2003). Zbog velike rastvorljivosti u vodi, izuzetne polarnosti i otpornosti na degradaciju, ove supstance se teško adsorbuju i lako prolaze kroz procese prečišćavanja, ali i procese prirodne filtracije, i dospevaju do podzemnih voda i vode za piće (Buser et al. 1998; Ternes et al. 2002a). U procesu biodegradacije, koji je svakako efikasniji od procesa taloženja, ukloni se manje od 10% karbamazepina i trimetoprima (Clara et al. 2004), dok je efikasnost biodegradacije diklofenaka 10–39% (Hernando et al. 2006). 2. TEORIJSKI DEO 5 2.3. DEGRADACIJA LEKOVA U ŽIVOTNOJ SREDINI Degradacija leka u životnoj sredini zavisi od hemijskih osobina aktivne supstance. Zbog postojanja raznih funkcionalnih grupa u molekulu aktivne supstance leka, kao što su karboksilna, hidroksilna, aldehidna ili amino grupa, kapacitet adsorpcije molekula na čvrstoj matrici, kao što je sediment, zavisi od pH sredine i sastojaka čvrste matrice (Jørgensen and Halling-Sørensen 2000; Robinson et al. 2007). Mnogi lekovi su lipofilni, zbog čega lako prolaze kroz ćelijsku membranu i bioakumuliraju se u vodenim životinjama (Halling- -Sørensen et al. 1998). U vodenoj sredini aktivna supstanca se može dalje degradovati putem abiotičkih i biotičkih procesa. Abiotičke transformacije se odvijaju putem hidrolize i fotolize (Tixier et al. 2003). Pošto su lekovi po pravilu otporni na hidrolizu, jer su predviđeni za oralnu upotrebu, obim ove reakcije je za većinu lekova zanemarljiv. Najznačajniji način abiotičke transformacije lekova u površinskim vodama je direktna i indirektna fotoliza (Andreozzi et al. 2003). Direktna fotoliza se javlja direktnom apsorpcijom sunčeve svetlosti, dok indirektna fotoliza uključuje prirodne materije, kao što su huminske kiseline, koje pod uticajem sunčevog zračenja stvaraju jake oksidacione agense koji zatim degraduju ostatke lekova. Sporedni proizvodi ovakve degradacije često mogu biti toksičniji od polazne supstance (Nikolaou et al. 2007). Iako je postojanost lekova u životnoj sredini relativno mala, oni su sveprisutni zbog toga što je brzina kojom se otpuštaju u okolinu mnogo veća od brzine njihove degradacije i transformacije (Bendz et al. 2005). Od antibiotika, sulfonamidi i fluorohinolini su najpostojaniji u životnoj sredini, zatim makrolidi, tetraciklini, aminoglikozidi i β-laktami (Huang et al. 2001). 2.4. UKLANJANJE LEKOVA U POSTROJENJIMA ZA PREČIŠĆAVANJE PIJAĆE VODE Tretman podzemne vode za proizvodnju vode za piće obuhvata aeraciju, flokulaciju sa filtracijom ili filtraciju kroz pesak, i dezinfekciju. Ukoliko se prečišćava površinska voda, koristi se mnogo efikasnija flokulacija sa filtracijom. Savremene tehnologije za proizvodnju pijaće vode uključuju i ozonizaciju, kao i adsorpciju na granulisanom aktivnom uglju. Ipak, tragovi lekova u sirovoj vodi, koja se koristi za proizvodnju pijaće vode, teško se uklanjaju uobičajenim procesima prečišćavanja. Ispitivanja su pokazala da je za lekove, kao što su sulfametoksazol, karbamazepin, diklofenak i ibuprofen, uklanjanje flokulacijom manje od 20%. Ozonizacija i adsorpcija na aktivnom uglju su veoma efikasni, ali uklanjanje nije kvantitativno za sva jedinjenja (Zwiener 2007). Podaci o transportu kroz procese prečišćavanja i konačnoj degradaciji lekova u životnoj sredini su prilično ograničeni. Razlog je činjenica da je ranije postojalo svega nekoliko analitičkih metoda koje su, sa ograničenom sigurnošću, mogle da detektuju niske koncentracije lekova u vodi (Jørgensen and Halling-Sørensen 2000). 2. TEORIJSKI DEO 6 2.5. PROBLEM PRISUSTVA LEKOVA U PRIRODNOJ I PIJAĆOJ VODI Problemi vezani za prisustvo lekova u životnoj sredini uključuju poremećaje fizioloških procesa i reproduktivne funkcije organizama, razvoj rezistentnih bakterija i povećanje toksičnosti nekih farmaceutski aktivnih supstanci (Kolpin et al. 2002). Pojava rezistentnosti mikroorganizama na antibiotike je svakako jedan od najznačajnijih problema. Antibiotici su u širokoj upotrebi u humanoj medicini i veterini u cilju sprečavanja ili tretiranja bakterijskih infekcija, a takođe se intenzivno koriste u uzgoju stoke i živine. Procenjena godišnja potrošnja antibiotika u Evropskoj Uniji (EU) i Sjedinjenim Američkim Državama (SAD) je oko 20000 t. Konstantno izlaganje bakterija malim koncentracijama antibiotika uslovljava pojavu rezistentnosti, čime se ugrožava zdravlje čoveka jer se sve veći broj infekcija ne može lečiti postojećim antibioticima (Díaz- Cruz and Barceló 2005). Poznato je, na primer, da se u bolnicama često javljaju infekcije izazvane Klebsiellae sojem bakterija. Istraživanja su pokazala da je 90% soja otporno na antibiotik ampicilin, a da 6% soja ispoljava višestruku rezistentnost (Hirsch et al. 1999). Ispitivanje prisustva bakterija u komunalnim otpadnim vodama je pokazalo da se više od 95% bakterija ukloni tokom procesa prečišćavanja, ali da većina preostalih bakterija ispoljava rezistentnost (Radtke and Gist 1989; Malik and Ahmad 1994). Ispitivana je kontaminacija reka i jezera koliformnim bakterijama i utvrđeno je da iako je količina bakterija mnogo manja nego u otpadnim vodama, izolovani sojevi pokazuju gotovo identičnu rezistentnost kao sojevi iz otpadnih voda (Alvero 1987; Al-Ghazali et al. 1988; Campeau et al. 1996). Zabrinjavajuća je činjenica da je više od 70% bakterijskih sojeva neosetljivo na barem jedan antibiotik, a mnogi pokazuju višestruku rezistentnost. Smatra se da je najviše rezistentnosti stvoreno prema penicilinima, posebno ampicilinu, a zatim tetraciklinima i makrolidima, kao što je eritromicin (Hirsch et al. 1999). Pored antibiotika, prisustvo drugih lekova u vodi takođe može predstavljati problem. Ukoliko je čovek, putem vode za piće, neprekidno izložen malim koncentracijama raznovrsnih lekova, može doći do povećanja toksičnosti leka, tj. gubitka tolerancije čoveka prema toj hemijskoj supstanci i pojave negativnih simptoma. Posebno su značajni antiinflamatorni lekovi i regulatori masti, zbog učestalosti njihovog korišćenja (Petrović et al. 2005). Problem predstavljaju i lekovi koji se prepisuju za niz psiholoških poremećaja, jer mogu imati negativan uticaj na funkciju nervnog sistema. Mnoge studije su pokazale negativan uticaj otpadnih voda iz bolnica na vodene organizme i pojavu toksičnosti (Hernando et al. 2006). Tako je, na primer, uočena pojava toksičnosti leka diklofenaka pri konstantnom izlaganju riba koncentraciji od 500 µg dm−3 tokom 28 dana (Robinson et al. 2007). Prisustvo hormona u vodenoj sredini izaziva ozbiljne posledice kod raznih vodenih organizama. Uočene su promene u razvoju i reproduktivnim funkcijama riba i vodozemaca, kao što su smanjenje plodnosti i feminizacija mužjaka, pri koncentracijama od nekoliko ng dm–3 (Jørgensen and Halling-Sørensen 2000). Površinske i podzemne vode su glavni izvor pijaće vode širom sveta. Tragovi lekova koji se ne uklone kvantitativno u procesima prečišćavanja voda i koji prođu kroz prirodne procese prečišćavanja mogu se očekivati u vodi za piće. I pored toga, lekovi su veoma retko detektovani u pijaćoj vodi. Zbog ograničenog znanja o unosu, degradaciji i posledicama prisustva lekova u životnoj sredini, još uvek ne postoje zakonski regulisani maksimalno dozvoljeni nivoi za tragove lekova u pijaćoj vodi, niti zakonski propisi o njihovom monitoringu (Zwiener 2007). 2. TEORIJSKI DEO 7 2.6. LEKOVI DETEKTOVANI U PRIRODNOJ I PIJAĆOJ VODI S obzirom na to da se u većim evropskim zemljama lekovi koriste u količinama od nekoliko stotina tona godišnje (Nikolaou et al. 2007), a da se tokom procesa prečišćavanja otpadnih voda lekovi nepotpuno eliminišu (Ternes 1998), zagađenje prirodnih voda antibioticima i drugim farmaceutskim proizvodima je očekivano. Istraživanja sprovedena tokom poslednje decenije su pokazala da je više od 80 aktivnih sastojaka različitih grupa lekova prisutno u prečišćenim otpadnim vodama, površinskim i podzemnim vodama, kao i vodi za piće, u koncentracijama od ng dm–3 do mg dm–3 (Halling-Sørensen et al. 1998; Ternes 1998; Sacher et al. 2001; Ternes et al. 2001; Heberer 2002; Kolpin et al. 2002; Hilton and Thomas 2003; Petrović et al. 2003; Carballa et al. 2004; Renew and Huang 2004). U tabeli 1 su sumarno prikazani rezultati ispitivanja voda u svetu i koncentracije odabranih lekova, detektovanih u otpadnim vodama pre i posle prečišćavanja, kao i površinskim i podzemnim vodama. Najčešće detektovani lekovi u vodenoj sredini su antiepileptik karbamazepin, antibiotici sulfametoksazol i eritromicin, zatim trimetoprim, kao i analgoantipiretici ibuprofen, diklofenak, acetilsalicilna kiselina i paracetamol. Prvi radovi o prisustvu lekova u otpadnim i površinskim vodama su objavljeni u Sjedinjenim Američkim Državama sedamdesetih godina (Tabak and Bunch 1970; Hignite and Azarnoff 1977). Međutim, tada se mnogo više pažnje posvećivalo hormonima kao zagađujućim supstancama u životnoj sredini. Tragovi lekova u životnoj sredini postali su predmet velikog interesovanja naučne javnosti tek kada je uspostavljena direktna veza između prisustva aktivnih supstanci leka u prirodnim vodama i poremećaja kod riba (Purdom et al. 1994; Jobling et al. 1998). Jedna od prvih studija o zastupljenosti tragova lekova u vodenoj sredini objavljena je 1985. godine (Richardson and Bowron 1985). Ipak, intenzivnija ispitivanja zagađenja prirodnih voda ostacima lekova, sa nedvosmislenom potvrdom, su sprovedena tokom poslednjih deset godina. Nacionalna studija o prisustvu lekova u vodenim tokovima SAD-a pokazala je da 80% analiziranih uzoraka sadrži tragove farmaceutskih jedinjenja (Kolpin et al. 2002). U 139 uzoraka površinskih voda detektovano je oko 95 farmaceutskih supstanci, uključujući antibiotike, analgetike, lekove za srce i steroide u koncentracijama manjim od mg dm–3. Ispitivani vodeni tokovi su pod direktnim uticajem otpadnih voda, nizvodno od urbanih područja i stočnih farmi. U uzorcima površinskih voda u Ontariju, Kanadi, u koje se ulivaju gradske otpadne vode i vode sa poljoprivrednog zemljišta, pronađeni su karbamazepin, trimetoprim i eritromicin (Hao et al. 2006). Karbamazepin je detektovan u svim uzorcima voda. S obzirom na to da se ovaj lek isključivo koristi u humanoj medicini, jedino objašnjenje za njegovo prisustvo u vodi sa poljoprivrednog zemljišta je korišćenje aktivnog mulja iz procesa prečišćavanja otpadnih voda kao đubriva. Pored karbamazepina, u površinskim vodama u Kanadi često su detektuju i antiinflamatorni lekovi (acetilsalicilna kiselina, diklofenak i ibuprofen) u koncentracijama reda veličine ng dm−3 (Miao et al. 2002). U nedavnoj studiji, u vodi sa poljoprivrednog zemljišta koje je navodnjavano prečišćenom otpadnom vodom, pronađeni su antiinflamatorni lekovi (Pedersen et al. 2005). U 44% uzoraka rečne vode u Koreji detektovani su tragovi lekova, i to u 17% uzoraka uzvodno od izlivanja otpadnih voda i 53% nizvodno od izliva. U ove reke se ulivaju prečišćene otpadne industrijske vode. Najčešće su detektovani paracetamol, ibuprofen i karbamazepin, u više od 80% uzoraka (Kim et al. 2007). U reci Elbe u Nemačkoj detektovani su diklofenak, ibuprofen, karbamazepin i niz antibiotika, u opsegu koncentracija 20–140 ng dm–3 (Weigel et al. 2004). Ibuprofen, diklofenak, trimetoprim, sulfametoksazol i karbamazepin su pronađeni u rekama u Švedskoj u koncentraciji od 0,12–2,2 µg dm−3 (Bendz et al. 2005). 2. TEORIJSKI DEO 8 Tabela 1. Lekovi detektovani u otpadnim, površinskim i podzemnim vodama. KONCENTRACIJA LEKA (ng dm–3) LEK otpadne vode prečišćene otpadne vode površinske vode podzemne vode LITERATURA SEDATIVI 3700 25 Ternes 1998 100–800 30–250 Öllers et al. 2001 900 Sacher et al. 2001 2100 250 Ternes et al. 2001 870–1200 Andreozzi et al. 2003 426 367 0,7 Miao and Metcalfe 2003a 10–150 10–150 Stolker et al. 2004 420 410 30 Gros et al. 2006a 0,20–16 Hao et al. 2006 1 Lissemore et al. 2006 350 130 Gómez et al. 2007 226 4,5–61 Kim et al. 2007 Karbamazepin 9–37 Pedrouzo et al. 2007 Diazepam 40 Ternes 1998 ANTIBIOTICI Sulfametoksazol 480 Hirsch et al. 1998 300–1500 30–85 Hartig et al. 1999 400 470 Hirsch et al. 1999 220 Lindsey et al. 2001 410 Sacher et al. 2001 1900 Kolpin et al. 2002 50–90 Andreozzi et al. 2003 243 Miao et al. 2004 10–100 10–100 Stolker et al. 2004 1300 Batt and Aga 2005 590 390 – Gros et al. 2006a 2,8 Lissemore et al. 2006 95–320 Botitsi et al. 2007 136 20 Kim et al. 2007 18–23 Zhang and Zhou 2007 Trimetoprim 120 Hirsch et al. 1998 870 Hirsch et al. 1999 150 Kolpin et al. 2002 40–130 Andreozzi et al. 2003 128 12 Ashton et al. 2004 140 Batt and Aga 2005 1172 290 11 Gros et al. 2006a 0,60–2,0 Hao et al. 2006 2,7 Lissemore et al. 2006 12–180 Botitsi et al. 2007 58 3,2–5,3 Kim et al. 2007 Eritromicin 620 Hirsch et al. 1998 240 Hirsch et al. 1999 49 Sacher et al. 2001 1700 Kolpin et al. 2002 109 159 Ashton et al. 2004 80 Miao et al. 2004 10–100 10 Stolker et al. 2004 200 80 – Yang and Carlson 2004 1,9–6,9 Hao et al. 2006 5,6 Lissemore et al. 2006 130 3,4 Kim et al. 2007 Azitromicin 152 96 8 Gros et al. 2006a 38 Miao et al. 2004 Doksiciklin 7,8 Lissemore et al. 2006 2. TEORIJSKI DEO 9 Tabela 1. (nastavak) KONCENTRACIJA LEKA (ng dm–3) LEK otpadne vode prečišćene otpadne vode površinske vode podzemne vode LITERATURA ANALGOANTIPIRETICI Ibuprofen 70 Ternes 1998 870–85000 2700 Farré et al. 2001 5–1500 5–80 Öllers et al. 2001 200 Kolpin et al. 2002 50–7110 Andreozzi et al. 2003 3800 Hilton and Thomas 2003 4201 1105 Ashton et al. 2004 5533 – Quintana and Reemtsma 2004 516 266 60 Gros et al. 2006a 84000 7100 Gómez et al. 2007 65 28 Kim et al. 2007 18–44 Pedrouzo et al. 2007 Diklofenak 150 Ternes 1998 28–392 Ahrer et al. 2001 100–700 20–150 Öllers et al. 2001 590 Sacher et al. 2001 3020 2510 Heberer 2002 680–5450 Andreozzi et al. 2003 599 154 Ashton et al. 2004 10 10 Stolker et al. 2004 2333 1561 272 Quintana and Reemtsma 2004 250 215 29 Gros et al. 2006a 40–110 Botitsi et al. 2007 1500 900 Gómez et al. 2007 40 3,0 Kim et al. 2007 25–41 Pedrouzo et al. 2007 3–68 Zhang and Zhou 2007 Acetilsalicilna kiselina 220 25 Ternes 1998 13000 Farré et al. 2001 25–100 25–100 Stolker et al. 2004 1561 92 1098 Quintana and Reemtsma 2004 13–19 Pedrouzo et al. 2007 Paracetamol 110 Kolpin et al. 2002 10194 2102 42 Gros et al. 2006a 84000 220 Gómez et al. 2007 1,8–19 4,1–73 Kim et al. 2007 12–30 Pedrouzo et al. 2007 Metamizol 14000 4900 Gómez et al. 2007 2. TEORIJSKI DEO 10 U komunalnim otpadnim vodama nakon prečišćavanja detektovani su tragovi sedativa, analgoantipiretika i antibiotika, u velikom broju istraživanja (Hirsch et al. 1999; Ahrer et al. 2001; Farré et al. 2001; Richardson 2002; Hilton and Thomas 2003; Miao and Metcalfe 2003c; Petrović et al. 2003; Göbel et al. 2004; Miao et al. 2004; Renew and Huang 2004; Batt and Aga 2005). Svega nekoliko radova se bavi prisustvom lekova u otpadnim vodama iz bolnica, pri čemu je najveća pažnja posvećena antibioticima (Lindberg et al. 2004), ali su u značajnijim koncentracijama detektovani i diklofenak i karbamazepin (Gómez et al. 2006). Lekovi su takođe detektovani u podzemnoj i pijaćoj vodi, sedimentima i zemljištu (Ternes 1998, 2001; Miao and Metcalfe 2003a). Ipak, lekovi su mnogo više rasprostranjeni u površinskim vodama, nego u podzemnim, zbog toga što su površinske vode pod većim uticajem otpadnih voda (Zwiener 2007). U pijaćoj vodi, aktivne supstance lekova su detektovane veoma retko, u svega nekoliko slučajeva (Heberer 2002; Zwiener 2007). S obzirom na to da se lekovi u pijaćoj vodi javljaju u koncentracijama manjim od ng dm−3, razlog retke detekcije može može biti i nedovoljno niska granica detekcije korišćene analitičke metode. Farmaceutska jedinjenja koja su pronađena u vodi za piće su jedinjenja koja imaju veliku hemijsku stabilnost, nisku biodegradabilnost i niski koeficijent adsorpcije. Ova jedinjenja prolaze neizmenjena kroz procese biodegradacije i adsopcije na aktivnom mulju u procesima prečišćavanja otpadnih voda, zatim kroz procese biodegradacije, fotolize i adsorpcije na suspendovanim česticama u površinskim vodama, biodegradaciju i adsorpciju tokom filtracije vode na rečnim obalama i kroz podzemni tok vode, kao i kroz razne stupnjeve prečišćavanja vode za piće. U pijaćoj vodi u Nemačkoj, Italiji, Engleskoj, SAD-u i Kanadi detektovani su antiepileptik karbamazepin (maksimalna koncentracija 258 ng dm−3) i analgoantipiretici diklofenak (6 ng dm−3) i ibuprofen (3 ng dm−3) (Hummel et al. 2006; Dorne et al. 2007; Zwiener 2007). U pijaćoj vodi pronađeni su i acetilsalicilna kiselina (25–100 ng dm−3) i antibiotik sulfametoksazol (manje od 25 ng dm−3) (Stolker et al. 2004). Antiinflamatorni lekovi (analgetici i antipiretici) se konzumiraju u velikim količinama, zbog čega se često detektuju u vodenoj sredini u značajnim koncentracijama (Ternes 1998; Stumpf et al. 1999; Heberer 2002). Sa ekološkog stanovišta spadaju u najznačajnije farmaceutski aktivne supstance. Acetilsalicilna kiselina i paracetamol su dva najpopularnija analgoantipiretika, koji se godišnje prodaju u količinama od oko 500 t u većim evropskim zemljama. Acetilsalicilna kiselina se veoma lako degraduje u mnogo aktivniji oblik – salicilnu kiselinu, koja se zapravo detektuje u životnoj sredini. Međutim, salicilna kiselina ne mora isključivo poticati od acetilsalicilne kiseline. Naime, salicilna kiselina se često koristi za konzerviranje hrane, pa je ovo još jedan značajan izvor njene pojave u vodenoj sredini (Heberer 2002). Paracetamol (ili acetaminofen) se lako degraduje i uklanja u procesima prečišćavanja otpadnih voda. Uprkos velikom unosu, efikasnost prečišćavanja za paracetamol je izuzetno visoka – oko 99% (Gómez et al. 2007). U ispitivanjima otpadnih i površinskih voda u Nemačkoj detektovan je u manje od 10% otpadnih voda, a nije detektovan u rečnoj vodi (Ternes 1998). U ispitivanjima 139 uzoraka površinskih voda u SAD-u, pod uticajem gradskih otpadnih voda, paracetamol je pronađen u 17% uzoraka pri srednjoj koncentraciji od 110 ng dm−3 (Kolpin et al. 2002). U većim evropskim zemljama se godišnje proda oko 75 t diklofenaka (Heberer 2002), dok se u svetu godišnje proizvede nekoliko stotina tona ovog leka (Botitsi et al. 2007). Ovaj analgoantipiretik se smatra jednim od najznačajnijih lekova u vodenoj sredini. Spada u lekove koji je najlošije uklanjanju u procesima prečišćavanja otpadnih voda (Tixier et al. 2003). Efikasnost eliminacije od svega 17% upućuje na njegovu postojanost tokom procesa prečišćavanja, što je potvrđeno istraživanjima koje su sproveli Buser et al. (1998) i Stumpf et al. (1999). Diklofenak je često detektovan u otpadnim i površinskim vodama u Austriji 2. TEORIJSKI DEO 11 (Ahrer et al. 2001), Brazilu (Stumpf et al. 1999), Nemačkoj (Ternes 1998), Španiji (Farré et al. 2001), Švajcarskoj (Öllers et al. 2001) i SAD-u (Kolpin et al. 2002), u maksimalnoj koncentraciji od nekoliko desetina µg dm–3. Ipak, uočena je veoma brza i intenzivna fotolitička degradacija diklofenaka u prirodnim vodama (Buser et al. 1998), što su potvrdili i rezultati monitoringa površinskih voda u Nemačkoj (Sacher et al. 2001). U Brazilu, Nemačkoj i Švajcarskoj, ibuprofen je detektovan u otpadnim i površinskim vodama u koncentracijama nižim od onih za diklofenak (Ternes 1998; Stumpf et al. 1999; Öllers et al. 2001). S obzirom na to da se u većim evropskim zemljama godišnje proda oko 180 t ovog leka (Heberer 2002), niže koncentracije mogu se objasniti efikasnom eliminacijom u procesima prečišćavanja otpadnih voda – do 75% (Ternes 1998; Stumpf et al. 1999). Iako su drugi autori utvrdili još viši procenat otklanjanja, oko 95% (Metcalfe et al. 2003; Roberts and Thomas 2006; Gómez et al. 2007), koncentracije ibuprofena u tretiranim otpadnim vodama su i dalje veoma visoke, reda veličine µg dm–3 (Gómez et al. 2007). Slične prosečne koncentracije su detektovali i drugi autori u prečišćenim otpadnim vodama (Metcalfe et al. 2003; Ashton et al. 2004; Bendz et al. 2005; Santos et al. 2005). Ibuprofen se smatra jednim od najčešće detektovanih lekova u površinskim vodama (Ashton et al. 2004; Weigel et al. 2004; Comoretto and Chiron 2005; Roberts and Thomas 2006), iako se izluči u obliku polaznog jedinjenja u svega 15% i u najvećem procentu uklanja u procesu prečišćavanja (Tixier et al. 2003). Značajno prisustvo u prirodnim vodama može se objasniti velikim konzumiranjem ibuprofena i postojanošću u vodenoj sredini (Ternes 1998; Buser et al. 1998; Farré et al. 2001; Öllers et al. 2001; Kolpin et al. 2002). Metamizol (ili dipiron) je antiinflamatorni lek, zabranjen za upotrebu u SAD-u, Engleskoj i Švedskoj. U Nemačkoj, Italiji i Španiji je, međutim, u širokoj upotrebi. Često se koristi u bolnicama, zbog čega je jedan od lekova pronađenih u visokim koncentracijama u otpadnim bolničkim vodama. Visoka koncentracija metamizola u sirovoj, neprerađenoj otpadnoj vodi objašnjava se blizinom bolnica. Efikasnost eliminacije u procesima prečišćavanja iznosi oko 71%, a u prečišćenim otpadnim vodama detektovano je prosečno 4,9 µg dm–3 metamizola (Gómez et al. 2007). O prisustvu i degradaciji antibiotika u otpadnim i površinskim vodama sprovedeno je nekoliko obimnih istraživanja u Nemačkoj (Hirsch et al. 1999), SAD-u (Lindsey et al. 2001; Kolpin et al. 2002) i Kanadi (Miao et al. 2004). Pronađeni su makrolidni antibiotici (eritromicin), sulfonamidi (sulfametoksazol) i trimetoprim, u koncentracijama od nekoliko µg dm–3. U uzorcima površinskih, podzemnih i otpadnih voda u Nemačkoj nisu detektovani penicilini niti tetraciklini (Hirsch et al. 1999). Ovo nije iznenađujuće kada se zna da penicilini zbog hemijske nestabilnosti β-laktamskog prstena brzo hidrolizuju, a da se tetraciklini lako talože sa katjonima, kao što je Ca2+ (Vartanian et al. 1998) i akumuliraju u sedimentima i mulju. Ipak, Lindsey et al. (2001), Kolpin et al. (2002) i Miao et al. (2004) su detektovali tetracikline u otpadnim i površinskim vodama. Posle penicilina, makrolidi su drugi najčešće korišćeni antibiotici u Kanadi, posebno klaritromicin, a zatim azitromicin i eritromicin. Eritromicin je detektovan u svim uzorcima prečišćenih otpadnih voda u Kanadi (Miao et al. 2004). S obzirom na to da eritromicin lako gubi jedan molekul vode, u životnoj sredini se uglavnom detektuje u obliku svog dehidratacionog proizvoda (Hirsch et al. 1999). Sulfonamidi su otporni na degradaciju i dovoljno hidrofilni da dospeju u životnu sredinu. Sulfametoksazol je detektovan u svim ispitivanim otpadnim vodama u Kanadi (Miao et al. 2004), a u vodenim tokovima u SAD-u učestalost detekcije je bila 19% (Kolpin et al. 2002). Često je detektovan u prečišćenim otpadnim vodama u Nemačkoj, pri maksimalnoj koncentraciji od 2,0 µg dm–3 (Hirsch et al. 1999). U otpadnim i površinskim vodama u 2. TEORIJSKI DEO 12 Nemačkoj ispitivano je prisustvo 13 sulfonamida (Hartig et al. 1999). Sulfametoksazol je detektovan u koncentraciji od 1500 µg dm–3 u prečišćenim otpadnim vodama, i u koncentraciji od 0,030–0,085 µg dm–3 u površinskim vodama. Često je detektovan i u podzemnim vodama, u koncentraciji od 0,22 µg dm–3 u SAD-u (Lindsey et al. 2001) i 0,41–0,47 µg dm–3 u Nemačkoj (Hirsch et al. 1999; Sacher et al. 2001). Sulfametoksazol se veoma često koristi u kombinaciji sa trimetoprimom (lek Baktrim), zbog čega se i trimetoprim često detektuje u vodenoj sredini. Trimetoprim je jedan od najčešće detektovanih neutralnih lekova u životnoj sredini. Pronađen je u prečišćenim otpadnim vodama, kao i površinskoj vodi (Miao et al. 2004). Pored otpadnih (Hirsch et al. 1999), površinskih i podzemnih voda (Sacher et al. 2001; Kolpin et al. 2002), antibiotici su detektovani i u sedimentima, zemljištu i stajskom đubrivu (Hamscher et al. 2002; Pfeifer et al. 2002). Najčešće detektovan sedativ u komunalnim otpadnim i površinskim vodama i jedan od najrasprostranjenijih lekova u vodenoj sredini Evrope je antiepileptik karbamazepin (Ternes 1998; Ahrer et al. 2001; Öllers et al. 2001; Sacher et al. 2001; Tixier et al. 2003; Weigel et al. 2004; Comoretto and Chiron 2005). Ispitivanja su pokazala da se ne otklanja značajno tokom prečišćavanja otpadnih voda (manje od 10%) (Ternes 1998; Ternes et al. 2002a; Tixier et al. 2003). Mnoge studije su pokazale da se ne zadržava ni tokom prirodne filtracije na rečnim obalama, zbog čega je detektovan u brojnim uzorcima podzemnih voda u maksimalnoj koncentraciji od 1,1 µg dm–3 (Sacher et al. 2001). Iako se karbamazepin lako metaboliše i izluči svega 2–3% u neizmenjenom obliku, samo jedinjenje je definisano kao najpostojanije u procesima prečišćavanja otpadnih i površinskih voda i može se koristiti kao indikator urbanog zagađenja (Clara et al. 2004). Interesantno je da su neka istraživanja pokazala povećanje koncentracije karbamazepina nakon prečišćavanja otpadnih voda, što se može objasniti ponovnim formiranjem karbamazepina iz njegovih metabolita (Vieno et al. 2006). Od ostalih sedativa, diazepam je pronađen u površinskim vodama u Italiji (Calamari et al. 2003). Konačno, postavlja se pitanje pouzdanosti navedenih podataka o prisustvu tragova lekova u vodama. Naime, u većini navedenih istraživanja analiti su detektovani prema kriterijumima koji se u poslednjih par godina smatraju nedovoljno pouzdanim. Problem „lažnih“ pozitivnih rezultata biće razmatran na konkretnim primerima nastalim tokom izrade ovog rada. 2. TEORIJSKI DEO 13 2.7. LEKOVI ODABRANI ZA ANALIZU Za upotrebu u humanoj medicini i veterini registrovano je oko 3000 različitih farmaceutskih supstanci sa veoma različitim hemijskim strukturama (Ternes 2001; Hilton and Thomas 2003). S obzirom na ovako veliki broj jedinjenja, kojima treba dodati i ogroman broj metabolita, nemoguće je razviti metodu za posmatranje svih ovih supstanci u životnoj sredini. Zato je u razvoju analitičke metode neophodno napraviti izbor ekološki relevantnih jedinjenja, tj. odabir supstanci koje potencijalno predstavljaju problem u životnoj sredini. Farmaceutske supstance koje će biti analizirane odabrane su, pre svega, na osnovu velike količine koja se godišnje proda u beogradskim apotekama. Zatim, uzeta je u obzir i stabilnost posmatrane supstance tokom metabolizma, kao i otpornost na degradaciju u životnoj sredini. Na ovaj način odabrana su jedinjenja koja imaju veliki potencijal za ulazak u životnu sredinu u neizmenjenom obliku. Takođe, vodilo se računa o tome da u istraživanje budu uključeni predstavnici svih grupa antibiotika koje se najčešće koriste u našoj zemlji. Odabrano je devetnaest farmaceutski aktivnih supstanci, koje su osnovni sastojci lekova koji spadaju među najčešće korišćene u Srbiji. Iako je ovih 19 jedinjenja samo mali deo onoga što se koristi, ona predstavljaju početak za ovakva istraživanja. Odabrane supstance, kao i nazivi lekova u čiji sastav ulaze i farmakološke grupe kojima pripadaju, prikazane su u tabeli 2. Antibiotici su jedinjenja koja inhibiraju rast ili uništavaju mikroorganizme, pre svega bakterije, u organizmu čoveka i životinja, a pritom su selektivno toksična, tj. ne oštećuju sam organizam. Pod antibioticima su se nekada podrazumevala isključivo prirodna jedinjenja, nastala kao proizvod metabolizma bakterija i gljivica. Nakon proizvodnje hemijski modifikovanih antibiotika, definicija je proširena i na polusintetske lekove. U antibiotike su se tako ubrajali penicilini, tetraciklini, makrolidi, aminoglikolizi i amfenikoli. Danas antibiotici uključuju i sintetske lekove (sulfonamide, hinoline, nitrofurane, nitroimidazole, itd.), pa se generalno antibiotikom smatra svaki antibakterijski lek (Gentili et al. 2005). Postoji više načina klasifikacije antibiotika, ali sa analitičkog stanovišta najkorisnija je podela na osnovu hemijske strukture na sedam grupa, pri čemu prve četiri grupe spadaju u najčešće korišćene (Díaz-Cruz and Barceló 2005; Granelli and Branzell 2007): 1. β-laktami (penicilini, cefalosporini); 2. sulfonamidi; 3. makrolidi; 4. tetraciklini; 5. aminoglikozidi; 6. glikopeptidi; 7. linkozamidi. β-Laktami predstavljaju važnu grupu antibiotika koja se intenzivno koristi u medicini i veterini za lečenje i prevenciju bakterijskih infekcija. Obuhvataju nekoliko podgrupa, od kojih su penicilini i cefalosporini najvažniji. Iako su urađene brojne studije o zastupljenosti penicilina u otpadnim (Ternes 2001), površinskim (Hirsch et al. 1998) i podzemnim vodama (Sacher et al. 2001), ovi lekovi nikada nisu detektovani. Ovo se može objasniti brzom degradacijom u životnoj sredini, uz pomoć enzima β-laktamaza (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Pošto je poznato da β-laktamski antibiotici često izazivaju alergijske reakcije kod osetljivih ljudi, neophodno je ispitivati postojanje tragova ovih lekova u vodi. Pored prirodnih penicilina, polusintetska jedinjenja su od velikog značaja, zbog toga što su manje podložna dejstvu β-laktamaza, i time stabilnija u životnoj sredini (Rabbolini et al. 1998). 2. TEORIJSKI DEO 14 Tabela 2. Odabrane farmaceutski aktivne supstance, nazivi lekova u čiji sastav ulaze i farmakološke grupe kojima pripadaju. FARMACEUTSKI AKTIVNA SUPSTANCA NAZIV LEKA FARMAKOLOŠKA GRUPA ANTIBIOTICI Ampicilin trihidrat Ampicilin-Hemofarm, Panfarma; Pentrexyl-Galenika Penicilinski antibiotik Amoksicilin trihidrat Amoksicilin-Hemofarm, Panfarma, Jugoremedija; Sinacilin-Galenika Penicilinski antibiotik Cefaleksin Cefaleksin-Hemofarm, Panfarma; Palitrex-Galenika Cefalosporinski antibiotik Sulfametoksazol+trimetoprim Trimosul-Hemofarm, Panfarma; Bactrim-Galenika Kombinacije sulfonamida sa trimetoprimom Eritromicin etilsukcinat Eritromicin-Hemofarm, Zorka Pharma, Jugoremedija Makrolidni antibiotik Azitromicin Hemomycin-Hemofarm Makrolidni antibiotik Doksiciklin Doksiciklin-Hemofarm, Panfarma, Jugoremedija; Dovicin-Galenika Tetraciklinski antibiotik SEDATIVI Diazepam Diazepam-Hemofarm, Panfarma, Jugoremedija; Bensedin-Galenika Benzodiazepinski anksiolitik Bromazepam Bromazepam-Hemofarm Benzodiazepinski anksiolitik i mišićni relaksant Lorazepam Lorazepam-Hemofarm, Zorka Pharma Benzodiazepinski anksiolitik Karbamazepin Karbapin-Hemofarm, Panfarma; Galepsin-Galenika; Tegretol-Novartis Antikonvulziv, antiepileptik Fenobarbiton Phenobarbiton-Hemofarm, Panfarma; Fenobarbiton-Galenika Antikonvulziv, antiepileptik ANALGOANTIPIRETICI Ibuprofen Ibuprofen- Hemofarm, Panfarma, Jugoremedija; Brufen-Galenika Nesteroidni antireumatik, analgoantipiretik Paracetamol Febricet-Hemofarm, Panfarma; Miralgin-Hemofarm; Paracetamol-Jugoremedija, Galenika; Caffetin-Galenika Analgoantipiretik Metamizol natrijum Baralgin-Jugoremedija; Novalgetol-Galenika; Analgin-Alkaloid Analgoantipiretik i spazmolitik Flurbiprofen Flugalin-Galenika Antireumatik Acetilsalicilna kiselina Midol-Hemofarm, Panfarma; Acetysal-Jugoremedija; Acetisal pH 8, Anbol-Galenika Analgoantipiretik Diklofenak natrijum Diklofenak-Hemofarm, Panfarma, Jugoremedija; Diklofen-Galenika Nesteroidni antireumatik, antiinflamatorno sredstvo 2. TEORIJSKI DEO 15 Sulfonamidi su grupa sintetskih antibiotika koji se koriste u humanoj medicini i veterini za prevenciju i lečenje bolesti, ali i kao dodaci hrani da bi pospešili rast životinja. Spadaju u najčešće korišćene lekove u veterini, zbog niske cene, širokog spektra dejstva i efikasnosti u pospešivanju rasta. Široka upotreba sulfonamida dovela je do akumulacije u mesu, jajima i mleku, kao i ribi (Hartig et al. 1999). Prisustvo tragova ovih lekova u hrani ili vodi predstavlja ozbiljan toksikološki problem, jer neki od njih prouzrokuju alergijske reakcije (Gentili et al. 2005). Sulfonamidi su veoma otporni na degradaciju i dovoljno hidrofilni da dospeju u vodenu sredinu (Díaz-Cruz and Barceló 2005; Botitsi et al. 2007). U kombinaciji sa sulfametoksazolom veoma često se koristi trimetoprim (obično u odnosu 5:1), zbog čega je potrebno pratiti i tragove ovog leka u vodenoj sredini (Renew and Huang 2004). Makrolidi su važna grupa prirodnih antibakterijskih supstanci koje se široko koriste u humanoj medicini i veterini. Primarno ih biosintetišu zemljišni mikroorganizmi, posebno Streptomicee, ali i gljivice i biljke. Antibiotik eritromicin je prvi put izolovan 1952. god. iz Saccharopolyspora erythraea, a potpuna hemijska sinteza je postignuta samo jednom, 1981. god. (Gates et al. 1999). Tragovi ovih lekova detektovani su u rečnoj i podzemnoj vodi, kao i u prečišćenim otpadnim vodama u nekoliko istraživanja sprovedenih u Nemačkoj (Hirsch et al. 1998, 1999; Sacher et al. 2001), Švajcarskoj (McArdell et al. 2003; Göbel et al. 2004), SAD-u (Kolpin et al. 2002; Yang and Carlson 2004) i Kanadi (Miao and Metcalfe 2003b; Miao et al. 2004). U našoj zemlji, ali i svetu, najviše se koriste eritromicin i azitromicin. Prilikom analize uzoraka površinskih voda eritromicin se često detektuje u obliku degradacionog proizvoda koji nastaje gubitkom jednog molekula vode. Naime, eksperimenti su pokazali da se ovaj gubitak javlja pri vrednosti pH < 7, a poznato je da nakon konzumiranja eritromicin prolazi kroz veoma kisele uslove u stomaku. Ipak, degradacioni proizvod više ne ispoljava antibiotička svojstva (Hirsch et al. 1999). Tetraciklini su polusintetski antibiotici širokog spektra dejstva, koji se koriste u humanoj medicini i veterini za tretiranje mnogih oboljenja, ali i kao aditivi za pospešivanje rasta životinja (Gentili et al. 2005). Jako se adsorbuju na organskoj materiji, zbog čega dugo mogu ostati u zemljištu ili biti transportovani u površinske vode putem suspendovanih čestica (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Interes za tetracikline se povećao kada je otkriveno da se prilikom sinteze struktura može modifikovati bez smanjenja biološke aktivnosti, što je dovelo do intenzivnog traženja novih i efikasnijih modifikovanih tetraciklinskih antibiotika (Vartanian et al. 1998). Sedativi su lekovi koji deluju kao depresori centralnog nervnog sistema i prouzrokuju pospanost i različite nivoe umirenja, u zavisnosti od primenjene doze. Po hemijskom sastavu dele se na benzodiazepinske i nebenzodiazepinske hipnotike, barbiturate i agoniste melatonin receptora. Benzodiazepini su supstance sa širokim spektrom terapeutskih upotreba koje prouzrokuju smanjenje psihičke prenapregnutosti i umirenje, uz otklanjanje straha. Koriste se kao sedativi, mišićni relaksanti, anksiolitici i antikonvulzanti (Smyth et al. 2000). Njihova upotreba je počela 1960. god. i od tada je konstantan razvoj novih lekova sa bržim delovanjem i manje aktivnim metabolitima (Smink et al. 2004). Najčešće korišćen benzodiazepin je diazepam. Bromazepam ima najveći potencijal u zloupotrebi zbog izuzetno brzog dejstva (Chèze et al. 2004). Karbamazepin je veoma važan lek za epilepsiju, jednu od najčešćih bolesti centralnog nervnog sistema. Izuzetno je efikasan i siguran kao antikonvulzant, zbog čega danas zamenjuje veoma često korišćeni fenobarbiton (Miao and Metcalfe 2003a). Analgoantipiretici su lekovi protiv bolova, koji suzbijaju i povišenu telesnu temperaturu, a većina deluje i antiinflamatorno tj. stišava i zaustavlja proces zapaljenja. Nakon izolovanja salicilne kiseline 1829. god. u širokoj su upotrebi u humanoj medicini i prihvaćeni su kao sigurni lekovi, zbog čega se mogu kupiti i bez recepta (Heberer 2002). 2. TEORIJSKI DEO 16 2.8. ANALITIKA LEKOVA – ZAHTEVI I PROBLEMI Izbor analitičke metode za detekciju lekova u nekom uzorku zavisi, pre svega, od očekivanih koncentracija. Tečna hromatografija visoke performanse (HPLC, engl. high performance liquid chromatography) u kombinaciji sa ultraljubičastim (UV, engl. ultraviolet) ili fluorescentnim detektorom obično se koristi za detekciju lekova u koncentracijama od µg dm–3 do mg dm–3. Za detektovanje nižih koncentracija, reda veličine ng dm–3, koriste se hibridne tehnike kao što su gasna hromatografija-masena spektrometrija (GC-MS, engl. gas chromatography-mass spectrometry) i tečna hromatografija visoke performanse u kombina- ciji sa masenom spektrometrijom (HPLC-MS) ili samo LC-MS (Ternes et al. 2001). Za postizanje izuzetne osetljivosti i visoke selektivnosti očigledno je neophodna maseno- -spektrometrijska detekcija. Međutim, gasna hromatografija se može uspešno primeniti u analizi ograničenog broja lekova. Zbog termičke nestabilnosti i polarnosti značajnog broja lekova, neophodna je njihova derivatizacija pre gasno-hromatografske analize. Na ovaj način, vreme analize se značajno produžava, metoda često nije reproduktivna pri niskim koncentracijama i nastaju neželjeni proizvodi (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Zato je HPLC-MS najpogodnija i najčešće primenjivana tehnika za analizu lekova pri koncentraciji reda veličine ng dm–3. Izuzetno je osetljiva i zahteva manje od 1 pg analita (Miao and Metcalfe 2003a). Selektivnost i osetljivost se povećava korišćenjem tandem masene spektrometrije (MS/MS) koja omogućava nedvosmisleno razlikovanje analita (Lopez de Alda et al. 2003). Tako su, na primer, poslednjih godina impresivni napredak u razvoju i primeni doživele LC-MS i LC-MS/MS metode analize antiinflamatornih lekova, zahvaljujući velikoj polarnosti i kiselosti ovih analita, sa pKa vrednostima u opsegu 4–4,5, i izbegavanju derivatizacionog koraka potrebnog za GC-MS analizu (Farré et al. 2007). Svaki analitički postupak se sastoji od pripreme uzorka, razdvajanja i kvantifikacije analita i analize podataka. Priprema uzoraka je neophodna da bi se analiti izolovali iz matrice, prečistili i koncentrovali. Osnovni zahtevi koje jedna analitička metoda mora da ispunjava su visok prinos (min. 70%), niska granica detekcije (LOD, engl. limit of detection), niska granica kvantifikacije (LOQ, engl. limit of quantification) i visoka reproduktivnost tj. niska relativna standardna devijacija (RSD). Granica detekcije analitičke metode se definiše kao najmanja koncentracija analita koju je moguće pouzdano detektovati. To je uobičajeno ona koncentracija analita pri kojoj je odnos signala i šuma jednak 3, dok je granica kvantifikacije ona koncentracija analita pri kojoj je odnos signala i šuma jednak 10. Takođe je neophodno da odgovor detektora bude linearan, tj. da je dobijeni signal direktno proporcionalan prisutnoj koncentraciji analita. Danas se najčešće koriste tri metode kvantitativne analize: metoda sa eksternim standardima, metoda standardnog dodatka i metoda sa internim standardima (Ahmed 2001). Za multirezidualne metode, u kojima se analiziraju lekovi iz različitih grupa, neophodni su interni standardi za svaku od grupa lekova. Ovo može predstavljati problem, pošto za mnoge grupe lekova ne postoje izotopski analozi (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Zbog toga se u HPLC-MS analizi preporučuje korišćenje tzv. standarda koji odgovaraju matrici (engl. matrix-matched standards). Naime, poznato je da sastojci uzorka tj. matrice mogu značajno da utiču na odziv masenog detektora, u smislu smanjenja ili povećanja signala. Ova pojava se naziva uticaj matrice (engl. matrix effect). Smanjenje signala analita se objašnjava smanjenom jonizacijom analita zbog velikog prisustva sastojaka matrice (Fagerquist et al. 2005). Standardi koji odgovaraju matrici pripremaju se tako što slepa proba (uzorak u kojem nisu detektovani tragovi lekova) prolazi kroz proceduru 2. TEORIJSKI DEO 17 pripreme uzorka, i u konačno dobijeni ekstrakt (sa sastojcima matrice koji utiču na odgovor detektora) se dodaje standardni rastvor analita. Uticaj matrice se može odrediti kao odnos površine pika analita u „matrix-matched“ standardu i površine pika analita u rastvaraču (npr. metanolu). U današnje vreme postoji veliki broj analitičkih metoda za određivanje specifičnih grupa lekova, ali postoji potreba za multirezidualnim metodama analize veoma različitih grupa lekova. Prednost metode za detekciju određene grupe analita, ili čak samo jednog analita, je u tome što je moguće optimizovati metodu radi dobijanja maksimalnog prinosa u specifičnoj matrici. Prilikom razvoja multirezidualnih metoda analize različitih grupa jedinjenja, osnovni cilj je analiza što većeg broja analita, dok je optimizacija prinosa metode važan, ali sekundarni cilj. Jedan od problema u razvoju multirezidualnih metoda jeste dobijanje veoma različitih prinosa za analite različitih hemijskih osobina. Kao posledica različite polarnosti, analiti će se različito zadržavati na adsorbensu prilikom pripreme uzorka, što može prouzrokovati gubitak preciznosti i ponovljivosti za neke od njih. Takođe, prisustvo velikog broja analita u jonskom izvoru, može prouzrokovati kompetitivnu jonizaciju. Ponovljivost analitičke metode biće dobra samo za jedinjenja koja su u tom procesu favorizovana. Što su analiti više hemijski različiti, to je teže razviti analitičku metodu za njihovu detekciju u matrici sa prihvatljivim prinosima. Zbog toga je jedan od zahteva u razvoju multirezidualnih analitičkih metoda kompromis u izboru eksperimentalnih uslova, što često znači nemogućnost dobijanja najboljih rezultata za svako od jedinjenja (Gros et al. 2006a). Ipak, razvoj multirezidualnih metoda je neophodan zbog toga što njihova primena u svakodnevnim, rutinskim analizama omogućava dobijanje velikih količine podataka nakon samo jedne analize (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Osnovni zahtev u HPLC analizi lekova je izbor odgovarajuće mobilne faze. Sastav mobilne faze mora biti takav da se mogu dobiti reproduktivna retenciona vremena, zadovoljavajući oblici pikova i efikasna jonizacija analita radi povećanja osetljivosti MS detektora. Acetonitril i metanol se najčešće biraju kao organske komponente mobilne faze. Kao aditivi, često se koriste isparljiva jedinjenja, kao što su amonijum-acetat ili mravlja kiselina (Díaz-Cruz and Barceló 2005; Farré et al. 2007). Tako se pri analizi anti- inflamatornih lekova, zbog njihovog kiselog karaktera, preporučuje korišćenje rastvora mravlje kiseline ili amonijum-formijata, da bi se dobili dobri oblici pikova analita i povećala retencija u reverzno-faznoj tečnoj hromatografiji. Korišćenjem mravlje ili sirćetne kiseline snižava se pH-vrednost mobilne faze i postiže da se slabo kiseli analiti nalaze u nedisosovanom obliku, što povećava njihovo zadržavanje na hromatografskoj koloni. Međutim, korišćenje kiseline prouzrokuje smanjenje intenziteta signala molekulskog anjona analita koji se koristi za njegovu MS detekciju. Zbog toga se umesto kiseline preporučuje dodatak amonijum-acetata ili amonijum-formijata. Jonski par nastao od amonijum-jona i anjona analita daje dobar oblik hromatografskog pika, a veoma lako disosuje u jonskom izvoru dajući molekulski anjon, zbog čega se intenzitet njegovog signala ne smanjuje (Gómez et al. 2006). Iako potpuno hromatografsko razdvajanje analita nije neophodno kada se koristi MS/MS detektor, određeni stepen razdvajanja poboljšava reproduktivnost metode i olakšava detekciju analita. Jedna od najčešće korišćenih grupa lekova i najčešće korišćenih antibiotika su β-laktami. Razvijen je veliki broj metoda za detekciju pojedinačnih β-laktama ili određene β-laktamske grupe (penicilina ili cefalosporina) u raznim matricama (Bruno et al. 2001a; Riediker and Stadler 2001; De Baere et al. 2002; Holstege et al. 2002; Fagerquist and Lightfield 2003), a veoma su retke metode gde su pored β-laktama analizirane i druge grupe lekova. U ovim metodama se za određivanje samo jednog analita obično koristi LC-UV 2. TEORIJSKI DEO 18 tehnika, dok se u analizi specifične grupe lekova uobičajeno koriste LC-MS ili LC-MS/MS metode. U literaturi postoje analitičke metode za određivanje farmaceutskih jedinjenja u površinskim, podzemnim i otpadnim vodama pri niskim koncentracijama, ali je većina fokusirana na specifičnu grupu lekova, posebno antibiotike zbog mogućnosti stvaranja rezistencije (Hirsch et al. 1999; Ternes et al. 2001; Gentili et al. 2005). Multirezidualne metode analize različitih grupa lekova su neophodne radi dobijanja pouzdanih informacija o njihovoj rasprostranjenosti u prirodi, mogućnostima uklanjanja, kao i konačnoj degradaciji u životnoj sredini (Sacher et al. 2001; Stolker et al. 2004; Kim and Carlson 2005). Prilikom analize različitih grupa lekova mogu se javiti raznovrsni problemi. Tako, na primer, prilikom analize penicilina često nastaju epimeri, a proces je katalizovan katjonima teških metala, zbog čega se preporučuje silanizacija staklenog posuđa (Lopez de Alda et al. 2003; Díaz-Cruz and Barceló 2005). Generalno, β-laktamski antibiotici su jedinjenja sa ograničenom stabilnošću zbog prisustva četvoročlanog prstena u strukturi. Termički su nestabilni, izomerizuju u kiseloj sredini i nestabilni su u prisustvu alkohola (Gentili et al. 2005). Analiza amoksicilina u kompleksnim matricama je posebno otežana njegovom amfoternom prirodom i visokom polarnošću (Menelaou et al. 1999). Sulfonamidi imaju amfoterna svojstva, sa pKa vrednostima u opsegu 5,5–10,4 (Hartig et al. 1999), ali se više uzima u obzir bazni karakter (Gentili et al. 2005; Botitsi et al. 2007) i preporučuje dodatak kiseline mobilnoj fazi radi pospešivanja protonovanja za MS detekciju (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Makrolidni antibiotici su bazna i lipofilna jedinjenja sa laktonskim prstenom koji je nestabilan u kiseloj sredini i prilično degradabilan (Gentili et al. 2005). Danas se u ekološkim istraživanjima najveća pažnja posvećuje detektovanju farmaceutski aktivnih oblika jedinjenja, dok se metaboliti i proizvodi raznih transformacija manje analiziraju. Izuzetak je eritromicin, koji se u mnogim analitičkim metodama detektuje u obliku dehidroeritromicina, degradacionog proizvoda nastalog gubitkom jednog molekula vode (Hirsch et al. 1998; Ternes 2001; Kolpin et al. 2002; Yang and Carlson 2004). Iako se generalno smatra da do dehidratacije dolazi tokom jonizacije, eksperimenti su pokazali da se ovaj gubitak javlja već u vodenom rastvoru pri pH < 7, zbog čega se degradacioni proizvod delimično formira i u standardnom rastvoru. Ukoliko se pH-vrednost podesi na 7, eritromicin se ne degraduje i moguće ga je lako odrediti u polaznom obliku. U analizama uzoraka površinskih voda utvrđeno je prisustvo samo degradovanog proizvoda, što ukazuje na to da se eritromicin već nalazi u ovom obliku u vodenoj sredini. Ovo se objašnjava činjenicom da nakon konzumiranja eritromicin prolazi kroz veoma kisele želudačne uslove (Hirsch et al. 1999). Tetraciklini su nestabilni u baznoj sredini i fotodegradabilni. Amfoterni su i lako formiraju metalne komplekse (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Značajan broj sedativa smatra se „neutralnim lekovima“ jer ne sadrže kisele funkcio-nalne grupe, zbog čega mogu da se analiziraju na neutralnim pH-vrednostima, kao i GC-MS tehnikom bez derivatizacije (Ternes 2001). Ovde spadaju karbamazepin, diazepam i bromazepam (Hummel et al. 2006). Pod „kiselim lekovima“ podrazumevaju se farmaceutska jedinjenja koja sadrže karboksilne ili hidroksilne grupe, i ovde se ubraja znatan broj analgoantipiretika, kao što su ibuprofen i acetilsalicilna kiselina. Prilikom analize ovih lekova neophodno je uzeti u obzir veliki uticaj pH-vrednosti. Na primer, na kiselim pH-vrednostima (pH = 2–3), karboksilne i hidroksilne grupe biće protonovane, što utiče na izbor adsorbensa za koncentrovanje analita, kao i način njihove detekcije (Ternes 2001). Prilikom razvoja analitičke metode za detekciju tragova lekova neophodno je uzeti u obzir prethodno navedena ograničenja i zahteve. 2. TEORIJSKI DEO 19 2.9. PRIPREMA UZORAKA Priprema uzoraka je veoma važan deo svake analitičke metode za koju je uobičajeno potrebno oko 60% vremena trajanja analize. Idealna tehnika pripreme uzorka treba da bude jednostavna, efikasna, selektivna, jeftina i kompatibilna sa širokim spektrom instrumentalnih metoda. Međutim, još uvek nije pronađena metoda koja u potpunosti ispunjava navedene zahteve (Blasco et al. 2002). Pošto su uzorci iz životne sredine veoma kompleksni po sastavu i sadrže analite u niskim koncentracijama, nije moguće direktno injektovanje uzorka u hromatografski sistem. Neophodno je takav uzorak pripremiti, tj. izolovati, koncentrovati i prečistiti analit. Izbor metode pripreme uzorka zavisi od fizičko-hemijskih osobina analita (kiselo-baznih svojstava, stabilnosti, isparljivosti, rastvorljivosti u vodi i organskim rastvaračima), prirode uzorka (agregatnog stanja, čistoće, sadržaja masti i ulja) i instrumentalne metode analize uzorka (Robinson et al. 2007). Za predkoncentrisanje tragova lekova iz vode mogu se koristiti tečno-tečna i tečno- -čvrsta ekstrakcija. Tečno-tečna ekstrakcija se zasniva na raspodeli analita između dva rastvarača u kojima je njegova rastvorljivost različita (Pedersen et al. 2005). Ograničenja tečno-tečne ekstrakcije su lako stvaranje emulzija i upotreba velikih količina organskih rastvarača za ekstrakciju analita. Kod tečno-čvrste ekstrakcije analit se raspodeljuje između tečnog uzorka i čvrstog adsorbensa (Buchberger 2007). Jedna od najčešće korišćenih tečno- -čvrstih ekstrakcija je ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE, engl. solid-phase extraction), koja se najviše koristi za izolovanje i predkoncentrisanje analita iz uzoraka voda (Lindsey et al. 2001; Zhu et al. 2001; Yang and Carlson 2004). Zahvaljujući jednostavnosti, brzini, efikasnosti i manjoj potrošnji organskih rastvarača, ova tehnika je uzela primat nad klasičnom tečno-tečnom ekstrakcijom. Do zadržavanja analita dolazi tako što se uzorak vode propušta kroz poroznu čvrstu fazu sa velikim afinitetom prema analitu. Izborom odgovarajućeg rastvarača, analit se kasnije eluira sa čvrste faze. Ograničenja SPE tehnike su unošenje sastojaka matrice uzorka u ekstrakt i upotreba skupih kolona pakovanih čvrstom fazom koje se obično bacaju nakon jedne upotrebe. Odlična alternativa klasičnim metodama pripreme uzoraka je mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (SPME, engl. solid-phase microextraction) (Arthur and Pawliszyn 1990; Zhang et al. 1994). U ovoj tehnici pripreme uzoraka koriste se silikatna vlakna obložena stacionarnom fazom i analit se raspodeljuje između stacionarne faze i matrice uzorka. Nakon uspostavljanja ravnoteže, adsorbovani analit se desorbuje organskim rastvaračem i analizira (Kumazawa et al. 2003). SPME metoda poseduje niz prednosti nad SPE tehnikom, kao što su brzina, upotreba minimalnih zapremina rastvarača (obično oko 100 puta manjih od prosečnih za SPE) i manjih zapremina uzorka (oko 25 cm3 za SPME, dok je za SPE potrebno oko 500 cm3). Vlakna koja se koriste u SPME se mogu koristi nekoliko puta, dok su SPE kolone (kertridži) predviđeni za samo jednu upotrebu (Rodríguez et al. 2004; Kataoka 2005; Balakrishnan et al. 2006). Ipak, SPE se mnogo više koristi za određivanje raznih analita u uzorcima voda, zbog toga što je osetljivija tehnika od SPME, sa granicom detekcije 1000 do 20000 puta nižom od onih za SPME (Balakrishnan et al. 2006; Pedrouzo et al. 2007). Ekstrakcija lekova iz čvrstih matrica iz životne sredine, kao što su zemljište i sedimenti, može se izvesti sonifikacijom, ili usitnjavanjem i homogenizacijom uzorka, u prisustvu rastvarača (Hamscher et al. 2002). Još jedna tehnika pripreme čvrstih uzoraka je disperzija matrice na čvrstoj fazi (MSPD, engl. matrix solid-phase dispersion) (Barker et al. 1989). Zasniva se na disperziji uzorka na adsorbensu i omogućava istovremeno razaranje, usitnjavanje i homogenizaciju čvrstih i polučvrstih uzoraka, kao i ekstrakciju, razdvajanje i 2. TEORIJSKI DEO 20 prečišćavanje analita u jednom koraku. U avanu sa tučkom, uzorak se usitnjava i homogenizuje zajedno sa adsorbensom (npr. SiO2, Al2O3, Florisil – po sastavu magnezijum- -silikat, ili C18 koji sadrži polimerno vezane oktadecil-grupe i oko 17% ugljenika), a zatim se ovom smešom pakuje kolona, u kojoj je uzorak ravnomerno dispergovan u celokupnom pakovanju (Barker 2000). MSPD je veoma brza i jednostavna metoda, sa značajno smanjenom upotrebom rastvarača, kod koje ne postoji mogućnost nastanka emulzija. Procedura ekstrakcije na čvrstoj fazi, koja se najčešće koristi u pripremi uzoraka voda za analizu tragova lekova, prikazana je na slici 2. Nakon izbora odgovarajuće SPE kolone, eksperimentalna procedura sastoji se iz četiri koraka: 1. kondicioniranje kolone – propuštanje male zapremine odgovarajućeg rastvarača kroz pakovanje kolone radi pripreme adsorbensa za adsorpciju analita; 2. nanošenje uzorka – propuštanje uzorka vode kroz kolonu, pri čemu se analit adsorbuje na pakovanju kolone; 3. ispiranje kolone – propuštanje minimalne zapremine odgovarajućeg rastvarača (obično dejonizovane vode sa malim sadržajem organskog rastvarača) kroz kolonu radi uklanjanja polarnih nečistoća i soli iz uzorka vode koja su se zadržala na adsorbensu; 4. eluiranje – propuštanje odgovarajućeg rastvarača u kojem se analit dobro rastvara i desopcija analita sa kolone. Ako je eluent rastvarač koji se ne meša sa vodom, preporučuje se sušenje adsorbensa na vakuumu pre eluiranja. Slika 2. Procedura ekstrakcije na čvrstoj fazi. Ekstrakcija na čvrstoj fazi izvodi se na kertridžima (špricevima, kolonama) određene zapremine (1–60 cm3) koji su napunjeni adsorbensom (mase 0,1–10 g, veličine čestica oko 50 µm). Pakovanje kertridža je fiksirano sa donje i gornje strane teflonskim ili polietilenskim fritama (Fritz and Macka 2000). Kao adsorbensi se najčešće koriste silikatni materijali sa polarnim i nepolarnim funkcionalnim grupama koje omogućavaju selektivne i specifične interakcije sa analitima. Na osnovu interakcija između adsorbensa i analita, ekstrakcija na čvrstoj fazi može biti jonoizmenjivačka, normalno-fazna i reverzno-fazna. Jonoizmjenjivačka ekstrakcija na čvrstoj fazi zasniva se na jonskoj interakciji između analita i adsorbensa. Adsorbens ima katjonske ili anjonske funkcionalne grupe i zadržava jone analita suprotnog naelektrisanja. Normalno-fazna ekstrakcija na čvrstoj fazi podrazumeva interakcije između polarnog analita i polarnog adsorbensa uz nepolarnu matricu uzorka. Kao adsorbensi najčešće se koriste silikatni materijali sa polarnim funkcionalnim grupama (npr. –CN, –NH2). 2. TEORIJSKI DEO 21 Reverzno-fazna ekstrakcija na čvrstoj fazi se odvija između nepolarnog ili slabo polarnog analita i nepolarnog adsorbensa uz polarnu matricu uzorka. Adsorbensi koji se najčešće koriste za reverzno-faznu ekstrakciju su silikatni materijali sa alkil (C18 i C8) ili aril grupama. Pored silikatnih materijala, veliku primenu imaju i ugljenični materijali koji se uglavnom koriste za izolovanje polarnih jedinjenja (Dean 1998). Na slici 3 prikazani su razni kertridži koji se koriste za ekstrakciju na čvrstoj fazi. Slika 3. Kertridži za izvođenje ekstrakcije na čvrstoj fazi. Tokom devedesetih godina došlo je do razvoja novih polimernih adsorbenasa sa poboljšanim karakteristikama, kao što su bolje zadržavanje kiselih analita bez zakišeljavanja uzorka, mogućnost dodatnih interakcija sa analitom i olakšano kvašenje. Jedna od najznačajnijih prednosti upotrebe polimernih pakovanja je izvođenje multirezidualne analize bez podešavanja pH-vrednosti uzorka (Gómez et al. 2006). Njihovom upotrebom priprema uzorka je pojednostavljena, smanjena je mogućnost kisele hidrolize drugih analita u multirezidualnoj analitičkoj proceduri i nije neophodno prečišćavanje uzorka radi uklanjanja huminskih i fulvo kiselina. Poslednjih godina većina metoda pripreme uzoraka se zasniva na upotrebi polimernih adsorbenasa kao što su Oasis HLB kertridži (Waters, Milford, SAD) (Quintana and Reemtsma 2004) i Lichrolut®EN kertridži (Merck, Darmstadt, Nemačka) (Farré et al. 2001). Upotreba HLB (engl. hydrophilic-lipophilic balance) kertridža, sa uravnoteženim hidrofilnim i lipofilnim karakteristikama, omogućava ekstrakciju kiselih, neutralnih i baznih analita u širokom opsegu pH-vrednosti. Sastoji se iz umreženog polimera na bazi N-vinilpirolidona sa divinilbenzenom. Hidrofilna svojstva su posledica prisustva N-vinilpirolidona, a lipofilna svojstva potiču od divinilbenzena. Poseduje odlične mogućnosti kvašenja hidrofilnog N-vinilpirolidona, zbog čega sušenje pakovanja kertridža nema negativan efekat na prinos metode i nije neophodan kontinualan tok kroz kolonu (Öllers et al. 2001). Na HLB kertridžu je moguća ekstrakcija kiselih analita iz vode bez zakišeljavanja uzorka. Naime, većina antiinflamatornih lekova je po prirodi kisela, sa pKa-vrednostima između 4 i 4,5, zbog čega u vodenom rastvoru postoje u jonizovanom obliku i slabo se zadržavaju na nepolarnim, lipofilnim adsorbensima. Da bi se ova grupa farmaceutskih jedinjenja zadržala na nepolarnim kertridžima, neophodno je podesiti pH-vrednost uzorka na 2–3. Zahvaljujući svom hemijskom sastavu, Oasis HLB kertridži omogućavaju ekstrakciju ovih analita bez zakišeljavanja uzorka (Gómez et al. 2006; Gros et al. 2006a). Lichrolut®EN kertridž ne poseduje tako dobre karakteristike kao HLB adsorbens, ali se preporučuje za ekstrakciju polarnih analita na niskim pH-vrednostima, kao i neutralnih lekova (kao što su karbamazepin i makrolidni antibiotici) na pH = 7 (Gros et al. 2006a). Prilikom ispitivanja efikasnosti raznih stacionarnih faza za ekstrakciju odabranih lekova, u mnogim radovima je utvrđeno da je Oasis HLB najbolji adsorbens za veliki broj analita (Ahrer et al. 2001; Hilton and Thomas 2003; Quintana and Reemtsma 2004; Gómez et al. 2006; Gros et al. 2006a). 2. TEORIJSKI DEO 22 Na slici 4 je prikazana aparatura potrebna za izvođenje ekstrakcije na čvrstoj fazi koja omogućava istovremenu ekstrakciju većeg broja uzoraka. Aparatura se sastoji od staklene kade na kojoj se nalazi izvod sa manometrom za vezivanje vakuum pumpe, koja je često neophodna. Staklena kada se zatvara perforiranim poklopcem na koji se postavljaju kertridži, tj. SPE kolone sa adsorbensima. U kadu se stavlja stalak sa kivetama, koje se nalaze neposredno ispod svakog kertridža i služe za sakupljanje ekstrakta prilikom eluiranja kolona rastvaračem. Slika 4. Aparatura za ekstrakciju na čvrstoj fazi. Veoma važan parametar koji utiče na efikasnost ekstrakcije na čvrstoj fazi je pH-vrednost rastvora, tj. uzorka vode, pošto određuje hemijski oblik analita, njegovu stabilnost i interakciju sa adsorbensom (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Tako, na primer, zakišeljavanje rastvora prouzrokuje smanjenje disocijacije slabo kiselih analita, što vodi povećanju efikasnosti ekstrakcije, ako se nedisosovani oblik analita vezuje za SPE kertridž (Zhang and Zhou 2007). Takođe je primećeno da je ekstrakcija sastojaka matrice uzorka manja na pH = 7, u poređenju sa nižim pH-vrednostima (Pichon et al. 1996; Sørensen and Elbæk 2005). Naime, najčešći problem prilikom ekstrakcije organskih analita iz kompleksnih matrica je velika količina prirodne organske supstance, kao što su huminske i fulvo kiseline. Prisustvo ovih kompleksnih organskih jedinjenja u ispitivanom uzorku može uticati na smanjenje adsorpcije analita, zbog kompetitivnog vezivanja za adsorbens, kao i na probijanje (engl. breakthrough) kapaciteta kertridža. Pored umanjene efikasnosti ekstrakcije, može doći do ometanja detekcije analita, zbog smanjenja efikasnosti jonizacije analita. Tako je prilikom kvantifikacije tetraciklina uočeno smanjenje signala za 30–70% u prisustvu huminskih kiselina (Hao et al. 2006). Do smanjenja efikasnosti ekstrakcije tetraciklinskih antibiotika može doći i zbog ireverzibilnog vezivanja za silanolne grupe stakla. Zbog toga se pri radu sa staklenim posuđem preporučuje silanizacija, ispiranjem staklenog posuđa rastvorom dimetildihlorsilana. Na ovaj način se sprečava vezivanje tetraciklina za stakleno posuđe i poboljšava efikasnost njihove ekstrakcije (Lopez de Alda et al. 2003). Takođe je poznato da tetraciklini imaju veliki afinitet ka helatnom vezivanju katjona metala. Ukoliko se pre ili tokom pripreme uzorka doda jako helatno sredstvo, kao što su oksalna kiselina (Cherlet et al. 2003) ili Na2EDTA (Niessen 1998; Ternes 2001; Di Corcia and Nazzari 2002), može se umanjiti vezivanje i ekstrakcija metala prisutnih u površinskim vodama (Hirsch et al. 1998, 1999; Lindsey et al. 2001; Ternes 2001; Zhu et al. 2001; Yang and Carlson 2004). Međutim, prisustvo ovih neisparljivih supstanci može prouzrokovati brzo zaprljanje jonskog izvora i drastično smanjenje osetljivosti MS detektora (Gentili et al. 2005). 2. TEORIJSKI DEO 23 U poslednjoj deceniji, najčešći način pripreme uzoraka za određivanje tragova lekova u vodi je ekstrakcija na čvrstoj fazi praćena HPLC-MS analizom, posebno kada se analiziraju termički nestabilni i slabo isparljivi analiti. Obično se koriste zapremine uzorka između 50 i 500 cm3 (Lindsey et al. 2001; Göbel et al. 2004; Yang and Carlson 2004; Buchberger 2007), a nakon predkoncentrisanja se postižu granice detekcije između 1 i 200 ng dm–3, u zavisnosti od zapremine uzorka i korišćenog masenog detektora. Ukoliko se koristi MS/MS detektor, mogu se postići niže granice detekcije i smanjiti zapremina uzorka za pripremu (Pozo et al. 2006). Međutim, većina razvijenih SPE–HPLC-MS/MS analitičkih metoda fokusirana je na jednu ili dve grupe lekova. Zbog toga je pravi izazov uporedna ekstrakcija i analiza nekoliko grupa lekova različitih polarnosti, rastvorljivosti, pKa-vrednosti i stabilnosti. 2.10. TEČNA HROMATOGRAFIJA VISOKE PERFORMANSE Hromatografija je fizička metoda razdvajanja supstanci iz smeša, koja se zasniva na različitoj raspodeli analita između dve faze, od kojih je jedna nepokretna (stacionarna), a druga pokretna (mobilna) faza. Mobilna faza može biti tečnost, gas ili superkritični fluid, dok stacionarna faza može biti čvrsta, tečna ili gel. Kod tečne hromatografije, mobilna faza je tečna, a stacionarna faza je čvrsta ili tečna i predstavlja pakovanje hromatografske kolone. Do hromatografskog razdvajanja dolazi usled različitog stepena interakcije analita iz smeše sa mobilnom i/ili stacionarnom fazom, zbog čega je različito vreme prolaska analita od mesta unošenja uzorka do mesta detekcije. Vreme zadržavanja analita u hromatografskom sistemu predstavlja retenciono vreme (Ardrey 2003). Tečna hromatografija visoke performanse koristi se, pre svega, za analizu neisparljivih i termički nestabilnih polarnih analita. Kod ove metode mobilna faza je pod visokim pritiskom (do oko 400 bar ili 4·107 Pa), da bi se ostvario neprekidan protok mobilne faze i reproduktivna hromatografija (Ardrey 2003). Mobilna faza mora biti visoke čistoće, male viskoznosti, hemijski inertna i kompatibilna sa detektorom, i u njoj analit mora biti rastvoran. Pakovanje hromatografske kolone se sastoji od čestica veoma malih dimenzija, čime se obezbeđuje velika kontaktna površina, a time i visoka rezolucija, tj. visoki stepen razdvajanja, po čemu je metoda i dobila naziv. Pakovanje kolone sadrži čestice ujednačene veličine (3–10 µm), sa veličinom pora od 70 do 300 Å, površinom od 50 do 250 m2 g–1 i 1–5 adsorpcionih centara po 1 nm2 (Pryde and Gilbert 1979). Na slici 5 prikazani su osnovni principi tečne hromatografije. 2. TEORIJSKI DEO 24 HROMATOGRAM ANALIT 1 ANALIT 2 ANALIT 3 ANALIT 4 INJEKTOVANJE PR O T O K Slika 5. Osnovni principi tečne hromatografije. Prema polarnosti hromatografskog sistema razlikuju se normalno-fazna i reverzno- -fazna tečna hromatografija. Kod normalno-fazne hromatografije stacionarna faza je polarna, a mobilna faza je nepolarna, pa se polarni analiti duže zadržavaju na koloni i eluiraju sa većim retencionim vremenom. Reverzno-fazna hromatografija podrazumeva nepolarnu stacionarnu fazu i pretežno polarnu mobilnu fazu, pa se na koloni duže zadržavaju manje polarni analiti i eluiraju sa kolone sa većim retecionim vremenom. Protok mobilne faze može biti izokratski ili gradijentan. Pri izokratskom protoku, kroz hromatografsku kolonu protiče mobilna faza konstantnog sastava, dok se kod gradijentnog protoka sastav mobilne faze postepeno menja tokom analize (Ardrey 2003). 2. TEORIJSKI DEO 25 Tečni hromatograf visoke performanse sastoji se iz sledećih delova (slika 6): 1. rezervoar mobilne faze (staklene boce sa rastvaračima koji sačinjavaju mobilnu fazu); 2. pumpa (za postizanje visokih pritisaka i stabilnog protoka mobilne faze); 3. sistem za unošenje uzorka (injektor i/ili autosempler); 4. kolona (dužine 10–25 cm, unutrašnjeg prečnika 3–5 mm, veličine čestica 3–10 µm); 5. detektor (UV, fluorescentni, maseni i dr.); 6. računar (za sakupljanje i obradu rezultata). Slika 6. Osnovni delovi tečnog hromatografa visoke performanse: a) šematski prikaz; b) Surveyor HPLC sistem (Thermo Fisher Scientific, SAD). REZERVOAR MOBILNE FAZE RAČUNAR DETEKTOR PUMPA INJEKTOR/ AUTOSEMPLER KOLONA REZERVOAR MOBILNE FAZE DETEKTOR AUTOSEMPLER PUMPA KOLONA b)a) 2. TEORIJSKI DEO 26 2.11. MASENA SPEKTROMETRIJA Masena spektrometrija (MS) je analitička metoda koja se zasniva na jonizovanju uzorka i razdvajanju nastalih jona prema odnosu mase i naelektrisanja (m/z). Ova metoda omogućava identifikaciju analita na osnovu informacija o molekulskoj masi i strukturi jedinjenja. Prednost metode je izuzetna osetljivost, jer se potrebne informacije mogu dobiti analizom svega 1 pg analita (Ardrey 2003). Maseni spektrometar se sastoji iz jonskog izvora, analizatora, detektora i vakuum sistema. U jonskom izvoru dolazi do jonizacije molekula analita. Nastali joni se zatim u analizatoru razdvajaju prema odnosu mase i naelektrisanja. Nakon razdvajanja, detektor registruje signale svih jona. Analizator i maseni detektor nalaze se pod vakuumom da bi se međusobna interakcija jona svela na minimum. U jonskom izvoru, jonizacija uzorka se može izvesti na više načina (Ardrey 2003): jonizacija elektronskim udarom (EI, engl. electron impact ionization), termosprej jonizacija (TS, engl. thermospray ionization), hemijska jonizacija (CI, engl. chemical ionization), hemijska jonizacija na atmosferskom pritisku (APCI, engl. atmospheric pressure chemical ionization), elektrosprej jonizacija (ESI, engl. electrospray ionization) i dr. U poslednjoj deceniji, APCI i ESI su postale najčešće korišćene tehnike jonizacije prilikom HPLC-MS analize zagađujućih supstanci u životnoj sredini (Reemtsma 2003; Zwiener and Frimmel 2004). APCI se koristi za analizu jedinjenja srednje i male polarnosti (Horimoto et al. 2000; Pfeifer et al. 2002; Lopez de Alda et al. 2003). ESI se pretežno koristi za analizu polarnih analita, ali se može koristiti i u analizi manje polarnih jedinjenja, zbog čega se većina autora opredeljuje za ovu tehniku. Takođe, za značajan broj lekova, npr. β-laktame (Díaz-Cruz and Barceló 2005), karbamazepin (Petrović et al. 2005) i antiinflamatorne lekove (Ahrer et al. 2001), ESI tehnika je mnogo osetljivija od APCI jonizacione tehnike. Nastanak jona elektrosprej jonizacijom (slika 7) opisan je nastankom finog spreja tečnosti u prisustvu jakog električnog polja (Fenn et al. 1989; Fenn 1993), pri čemu dolazi do desolvatacije jona analita na atmosferskom pritisku. Naime, analit rastvoren u polarnom i isparljivom rastvaraču se raspršuje u struji azota kroz kapilaru čiji je vrh pod visokim naponom (Bruins et al. 1987). Pod dejstvom električnog polja, na atmosferskom pritisku, aerosol sastavljen od višestruko naelektrisanih kapljica napušta kapilaru u obliku finog spreja. Kapljice se polako smanjuju usled isparavanja rastvarača i, kada gustina naelektrisanja prevaziđe površinski napon, dolazi do eksplozije kapljica, pri čemu nastaje veliki broj malih kapljica. Proces se ponavlja i kao rezultat nastaju desolvatisani joni analita koji kroz jonsku kapilaru stižu do masenog analizatora pod vakuumom (Constantopoulos et al. 1999). Faktori koji utiču na nastanak jona elektrosprej jonizacijom su: pH-vrednost rastvora, pKa analita, temperatura, protok i sastav mobilne faze, kao i koncentracija aditiva i analita (Kamel et al. 1999; Zhao et al. 2002; Mathis and McCord 2005). Sa povećanjem pKa-vrednosti analita, povećava se intenzitet signala protonovanog molekula (Kamel et al. 1999). Sastav mobilne faze utiče na stabilnost elektrospreja. Sa povećanjem udela organskog rastvarača u mobilnoj fazi, potpomaže se nastanak stabilnog elektrospreja (Cech and Enke 2001). Veći udeo organskog rastvarača u mobilnoj fazi utiče i na povećanje osetljivosti, tj. povećanje odgovora ESI-MS detektora (Straub and Voyksner 1993; Kamel et al. 1999). Utvrđeno je da je intenzitet signala jona polarnih analita veći u mobilnoj fazi sa metanolom, nego u mobilnoj fazi koja kao organsku komponentu sadrži acetonitril (Mathis and McCord 2005). 2. TEORIJSKI DEO 27 + + + + + + + + ++ ISPARAVANJE RASTVARAČA + + + + + +++ + + + + MOLEKUL ANALITA + + + + + VIŠESTRUKO NAELEKTRISANA KAPLJICA EKSPLOZIJA KAPLJICE + + ++ + + + JONI ANALITAVIŠESTRUKO NAELEKTRISANA KAPLJICA KA MASENOM DETEKTORU KAPILARA ANALIT U MOBILNOJ FAZI KAPLJICE RASTVARAČA SA ANALITOM JONSKA KAPILARA STRUJA N2 Slika 7. Prikaz elektrosprej jonizacije. Mnogi tradicionalni puferi i aditivi mogu imati negativan uticaj na ESI proces, zbog toga što prisustvo konkurentnih vrsta u rastvoru smanjuje efikasnost jonizacije analita (Borges and Henion 2005). Preporučene koncentracije aditiva u mobilnoj fazi su do 20 mM (Constantopoulos et al. 1999; Storm et al. 1999; Zhao et al. 2002). Neisparljive, teško rastvorljive soli, kao što su fosfati ili sulfati, trebalo bi izbegavati, jer mogu da kristališu u jonskom izvoru, prouzrokuju koroziju, kao i da utiču na nastanak kompleksnih masenih spektara. Iako je određeni sastav mobilne faze, sadržaj aditiva i pH-vrednost rastvora, optimalan za ESI jonizaciju analita, on ne mora biti optimalan i za hromatografsko razdvajanje analita. Zbog toga je pri razvoju LC-ESI-MS metode potrebno pronaći ravnotežu između potreba tečne hromatografije i efikasne elektrosprej jonizacije (Jeanville et al. 2003). 2. TEORIJSKI DEO 28 ESI je „meka“ jonizaciona tehnika kojom se dobijaju protonovani ([M+H]+) ili deprotonovani (M–H]–) molekuli analita, što zavisi od polarnosti električnog polja. Često dolazi do pojave višestruko naelektrisanih jona ([M+nH]n+), kao i adukata molekula analita sa rastvaračem ([M+R+H]+, odnosno [M+R–H]–). Zbog stvaranja višestruko naelektrisanih jona, ESI omogućava LC-MS analizu jedinjenja sa velikom molarnom masom (do 4000000 g mol–1), jer se njihov signal pojavljuje na m/z vrednostima (Di Corcia and Nazzari 2002; Ardrey 2003; Gentili et al. 2005). Da bi se potpomoglo protonovanje molekula baznih analita, obično se u mobilnu fazu dodaju organske kiseline (mravlja ili sirćetna). Za neutralne analite, koji teško jonizuju, kao aditivi se koriste organske soli (npr. amonijum- acetat ili amonijum-formijat), čime se pospešuje formiranje adukata sa katjonima (NH+4 , Na+ ili K+) ili anjonima (acetatni ili formijatni) u rastvoru (Zhu and Cole 2000). Slika 8. Prikaz ESI-MS sistema sa jonskim trapom. Najčešće korišćeni maseni analizatori u LC-MS analizi tragova lekova u životnoj sredini su trostruki kvadrupol (QqQ, engl. triple quadrupole) i jonski trap (IT, engl. ion trap) (Hernández et al. 2004). QqQ analizator je znatno osetljiviji i precizniji od jonskog trapa, ali visoka cena ovog instrumenta ograničava njegovu dostupnost. Jonski trap poseduje jedinstvenu mogućnost da izvodi više stupnjeva masene analize (MSn), zbog čega je veoma selektivan, što može poboljšati odnos signala i šuma tako da granica detekcije jonskog trapa bude prihvatljiva za kvantifikaciju niskih koncentracija analita u kompleksnim uzorcima iz životne sredine (Wieboldt et al. 1998; Bartolucci et al. 2000). Uvođenjem novih jonskih trapova, kao što je linearni jonski trap, poboljšane su osetljivost i granica detekcije (Hager and Le Blanc 2003; Batt and Aga 2005). Jonski trap izvodi masenu analizu tandemski u vremenu, a QqQ tandemski u prostoru (Niessen 2003; Gentili et al. 2005). 2. TEORIJSKI DEO 29 Jonski trap se sastoji od jedne prstenaste i dve tanjiraste elektrode (slika 8) koje zatvaraju prsten sa obe strane (Ardrey 2003). U LC-MS analizi se koriste jonski trapovi sa eksternom jonizacijom, gde joni nastaju u jonskom izvoru, a zatim se unose u jonski trap. Pod uticajem radiofrekventnog polja, joni se u trapu kreću po stabilnim putanjama i mogu da se čuvaju u trapu od nekoliko milisekundi do nekoliko sati (Picó et al. 2004). Za maksimalnu efikasnost joni treba da su fokusirani oko centra trapa gde je polje najbliže idealnom. Ovo se postiže uvođenjem helijuma koji sudarajući se sa jonima smiruje njihove oscilacije i na taj način ih stabilizuje. Povećanjem radiofrekventnog napona joni analita se šalju iz trapa ka detektoru, pri čemu se snima maseni spektar. Kod MSn analize, izolovanje jona analita koji treba dalje da se fragmentiše postiže se povećanjem napona, pri čemu se iz trapa izbacuju svi ostali joni osim onih sa traženim m/z odnosom. Nakon fragmentacije joni dospevaju do detektora koji registruje njihovo prisustvo i relativnu koncentraciju. Praćenjem odgovora masenog detektora u toku vremena dobija se hromatogram. U toku rada može se izabrati snimanje celog masenog spektra i na taj način se dobija ukupni jonski hromatogram (TIC, engl. total ion chromatogram). Ukoliko se odabere registrovanje određenog jona dobija se hromatogram odabranog jona (SIM, engl. selected ion monitoring). Može se odabrati detektovanje jona nastalog fragmentacijom određenog jona i kao rezultat se dobija hromatogram odabrane reakcije (SRM, engl. selected reaction monitoring). 2.12. SPREGA TEČNE HROMATOGRAFIJE SA MASENOM SPEKTROMETRIJOM Veliko ograničenje hromatografije je nemogućnost precizne identifikacije komponenata smeše, čak i kada su potpuno hromatografski razdvojene. Identifikacija se zasniva na poređenju retencionih vremena nepoznatih sastojaka i standardnih supstanci pod istim eksperimentalnim uslovima. Međutim, čak i kada su retenciona vremena identična, to ne mora biti siguran pokazatelj da je u pitanju isto jedinjenje. Moć masene spektrometrije je u tome da su maseni spektri većine supstanci dovoljno specifični da omoguće njihovu identifikaciju sa visokim stepenom sigurnosti. Kombinovanje separacionih mogućnosti hromatografije sa identifikacionim mogućnostima masenog spektrometra omogućava razlikovanje supstanci sa istim ili sličnim retencionim vremenima na osnovu njihovih različitih masenih spektara. Savremene hibridne tehnike za detekciju niskih koncentracija analita, reda veličine ng dm–3, su gasna hromatografija u kombinaciji sa masenom spektrometrijom i tečna hromatografija visoke performanse u kombinaciji sa masenom spektrometrijom (Hirsch et al. 1998; Ahrer et al. 2001; Farré et al. 2001; Öllers et al. 2001; Sacher et al. 2001; Ternes et al. 2001; Kolpin et al. 2002; Lopez de Alda et al. 2003). GC- MS se rutinski koristi tokom poslednjih 40 godina u analizi velikog broja jedinjenja u raznim matricama. Međutim, mnogi analiti su izuzetno polarni i termički nestabilni, zbog čega je neophodna njihova derivatizacija pre GC analize (Hartig et al. 1999; Di Corcia and Nazzari 2002; Ternes et al. 2002a). Derivatizacija veoma različitih, kiselih i baznih, jedinjenja tokom analize je veoma teška i zahteva puno vremena, zbog čega se za analizu kompleksnih smeša analita koristi LC-MS tehnika. Prednost ove metode je i mogućnost analize jedinjenja sa velikom molarnom masom koja nisu pogodna za GC-MS. Osamdesetih godina je došlo do razvoja LC-MS tehnike, a njena široka instrumentalna primena nastupila je tokom devedesetih godina. Do promene u analitičkoj metodologiji došlo je sa promenom kontrole kvaliteta voda sa tradicionalnih zagađujućih supstanci ograničene polarnosti, koje su analizirane pomoću GC-MS, na polarnija jedinjenja za koja je LC-MS odgovarajuća tehnika analize (Reemtsma 2001a; Miao and Metcalfe 2003b). 2. TEORIJSKI DEO 30 Tek nakon razvoja tandem masene spektrometrije (MS/MS ili MS2) polovinom devedesetih godina postala je moguća precizna i pouzdana detekcija veoma niskih koncentracija analita u kompleksnim matricama. U tandem masenoj spektrometriji prvo se izoluju prekursor joni analita, a zatim se izaziva njihova fragmentacija sudarima sa inertnim gasom, obično argonom ili helijumom, i vrši analiza dobijenih fragmentnih jona. Tandem masena analiza može biti tandemska u vremenu ili tandemska u prostoru. Kada postoje tri prostorno odvojena masena spektrometra, pri čemu se u prvom vrši izolovanje prekursor jona, u drugom njegova fragmentacija, a u trećem analiza jona nastalih fragmentacijom, oni izvode masenu analizu istovremeno, kao tandem u prostoru. Kod tandema u vremenu, masena analiza se izvodi u istom prostoru, ali u različito vreme, kao kod jonskog trapa (Picó et al. 2004). Tandem masena spektrometrija omogućava identifikaciju i kvantifikaciju analita koji imaju istu molekulsku masu, ali različite fragmentne jone, kao i onih jedinjenja koja nisu potpuno hromatografski razdvojena (Bruno et al. 2001b). Ipak, određeni stepen razdvajanja je potreban radi smanjenja uticaja matrice i poboljšanja odnosa signala i šuma, čime se postiže povećanje signala analita (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Kombinovanjem tečne hromatografije sa tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) dobijena je visoko selektivna i osetljiva tehnika za nedvosmisleno razlikovanje analita, čak i u kompleksnim matricama, čime je značajno pojednostavljena priprema uzorka (Lopez de Alda et al. 2003; Gentili et al. 2005; Petrović et al. 2005). Ipak, ograničenje ove tehnike je u tome što biblioteke masenih spektara analita nisu dovoljno razvijene, pogotovo u slučaju elektrosprej jonizacije, zbog čega je njihova identifikacija znatno otežana (Ferrer and Thurman 2003). Iako se LC-ESI-MS/MS tehnika uspešno koristi u kvantitativnoj analizi tragova analita, njen veliki nedostatak je pojava uticaja matrice ili matriks efekta, koja može dovesti do pogrešne kvantifikacije. Naime, uočeno je smanjenje, a u ređim slučajevima i povećanje, intenziteta signala analita u prisustvu sastojaka matrice koji se koeluiraju sa analitom (Matuszewski et al. 1998; Gros et al. 2006a), što nepovoljno utiče na reproduktivnost i preciznost analize. U nekim slučajevima je uočeno smanjenje signala analita i do 90% (Gros et al. 2006a; Hummel et al. 2006). Tačan mehanizam putem kojeg sastojci matrice ometaju elektrosprej jonizaciju analita još uvek nije poznat, ali je poznato da se ovaj efekat javlja u kompleksnim matricama (Hummel et al. 2006). Smanjena jonizacija analita, prilikom analize kompleksnih matrica, može se objasniti visokom koncentracijom neisparljivih supstanci u spreju koja smanjuju efikasnost nastanka ili isparavanja kapljica, što dalje utiče na količinu naelektrisanih jona u gasnoj fazi koja stiže do detektora (King et al. 2000; Becker et al. 2004; Lindberg et al. 2004; Renew and Huang 2004; Sørensen and Elbaek 2005). Takođe, adsorpcija analita na organskoj materiji uzorka može umanjiti koncentraciju rastvorenog analita koji se jonizuje (Sterner et al. 2000; Gómez et al. 2006). Uticaj matrice je teško predvideti, jer su sastojci matrice drugačiji kod svakog uzorka. Ipak, primećeno je da lekovi iz iste grupe antibiotika pokazuju slično smanjenje intenziteta signala (Renew and Huang 2004). Postoji nekoliko načina da se smanji uticaj matrice u LC-ESI-MS/MS analizi i dobiju ispravni kvantitativni rezultati. Najbolji način za postizanje maksimalne osetljivosti i reproduktivnosti signala je smanjenje količine sastojaka matrice primenom selektivne ekstrakcije i poboljšanjem prečišćavanja uzorka. Takođe, poboljšanjem hromatografskog razdvajanja moguće je umanjiti uticaj matrice (Stüber and Reemtsma 2004). Naime, uočeno je da je matriks efekat više izražen sa povećanjem retencionog vremena, što se objašnjava time da se i matrica uzorka hromatografski razdvaja, a uglavnom je sastavljena od manje polarnih jedinjenja (King et al. 2000; Petrović et al. 2005). Veoma efikasan način za eliminisanje uticaja matrice je primena odgovarajuće kalibracione metode, a najčešće 2. TEORIJSKI DEO 31 korišćene su eksterna kalibracija sa standardima koji odgovaraju matrici, zatim metoda standardnog dodatka, kao i upotreba internog standarda (Gros et al. 2006a). Primena odgovarajućeg internog standarda (strukturno sličnog jedinjenja ili izotopski označenog standarda) je posebno korisna, ali je često potrebno više internih standarda koji odgovaraju različitim analitima u smeši, a koji nisu uvek komercijalno dostupni ili su skupi (King et al. 2000; Petrović et al. 2005). Metoda standardnog dodatka je pouzdana metoda, koja značajno poboljšava preciznost određivanja, ali zahteva dosta vremena (Reemtsma 2001b; Becker et al. 2004). Zato se za kvantifikaciju preporučuje primena standarda koji odgovaraju matrici. Ovi standardi se pripremaju tako što se standardni rastvor analita dodaje u ekstrakt uzorka dobijen nakon njegove pripreme, na primer, SPE procedurom (Gentili et al. 2005). Prilikom detektovanja analita u realnim uzorcima pomoću LC-ESI-MS mogu se dobiti lažni pozitivni rezultati. Nesigurnost je posebno velika kada se veći broj analita detektuje sa ograničenim hromatografskim razdvajanjem, kao i kada je matrica uzorka kompleksna. Radi izbegavanja lažnih pozitivnih rezultata potrebna je potvrda prisustva analita u uzorku. Za potvrdu prisustva analita prilikom LC-MS analize neophodno je da retenciono vreme analita ne odstupa više od 5% od retencionog vremena standarda, kao i da odnos intenziteta signala fragmentnih jona analita iz uzorka ne odstupa više od 20% od njihovog odnosa u standardu (Li et al. 1996; Reemtsma 2001b). Evropska Unija je definisala neophodne uslove za potvrdu prisustva tragova organskih zagađujućih supstanci masenom spektrometrijom na osnovu sistema identifikacionih poena (Commission Decision 2002/657/EC), pri čemu se potreban broj identifikacionih poena može postići posmatranjem dva ili više prelaza, tj. reakcija fragmentacije, za svaki analit. Pozitivni rezultati za tragove lekova u vodi u literaturi su potvrđeni posmatranjem dva karakteristična SRM prelaza za svaki analit (Hernández et al. 2004; Renew and Huang 2004; Pozo et al. 2006). Potvrdna analiza se izvodi ponovljenim injektovanjem pozitivnog uzorka uz korišćenje proširene MS metode sa dodatnim SRM prelazima. U slučajevima kada prekursor jon fragmentacijom daje samo jedan produkt jon, potvrda se može postići daljom fragmentacijom fragmentnog jona, tj. MS3 analizom (Díaz- -Cruz and Barceló 2005). 2.12.1. Tandem masena spektrometrija odabranih grupa lekova Putevi fragmentacije penicilina i cefalosporina objašnjeni su početkom devedesetih godina (Voyksner and Pack 1991; Straub and Voyksner 1993). U procesu elektrosprej jonizacije, ovi antibiotici mogu da formiraju i pozitivne (ESI+) i negativne (ESI–) jone. Međutim, za peniciline je intenzivniji signal pozitivnih jona, kao i njihova fragmentacija, dok je za cefalosporine intenzivniji signal negativnih jona (Blanchflower et al. 1994). Naime, ESI– obično ima manje hemijskog šuma (Becker et al. 2004). Penicilinski, β-laktamski antibiotici se fragmentišu uz otvaranje i cepanje β-laktamskog prstena. Fragmentacijom prekursor jona, tj. protonovanog molekula, nastaje intenzivni fragmentni jon m/z 160, koji se smatra specifičnim za β-laktamsku grupu (Hirsch et al. 1998, 1999; Díaz-Cruz and Barceló 2005). β-Laktamski antibiotici lako formiraju adukte sa katjonima, kao što su Na+, K+ i NH+4 . Vezivanjem katjona za organske molekule nastaju kompleksi koji su veoma stabilni i teško se fragmentišu. Nastanak adukata sa katjonima može biti koristan prilikom analiza u kojima je poželjno izbeći fragmentaciju nekih analita (Faye et al. 2000). 2. TEORIJSKI DEO 32 Sulfonamidi se mogu detektovati kao pozitivni i kao negativni joni. Protonovani i deprotonovani molekuli sulfonamida tokom MS/MS fragmentacije daju isti produkt jon m/z 156, tj. [NH2PhSO2]+ ili [NH2PhSO2]– (Hao et al. 2006). U procesu fragmentacije nastaju i drugi fragmenti specifični za sulfonamide, kao što su m/z 108 (usled daljeg gubitka SO) i m/z 92 (od gubitka SO2) (Hirsch et al. 1998, 1999; Díaz-Cruz and Barceló 2005). Makrolidni antibiotici se mogu lako protonovati i analizirati kao pozitivni joni. Fragmentni joni makrolida nastaju gubitkom dva karakteristična šećera, dezozamina (175 Da) i kladinoze (176 Da), kao i vode (Hirsch et al. 1998; Miao et al. 2004; Yang and Carlson 2004). Šećeri se mogu dalje fragmentisati, pri čemu nastaju joni m/z 158 ([dezozamin+H–H2O]+) i m/z 116 ([kladinoza+H–CH3]+) (Miao et al. 2004). Međutim, ovi fragmentni joni se ne mogu detektovati, jer je najmanja masa fragmentnog jona koja se može detektovati pri radu sa jonskim trapom definisana kao trećina mase prekursor jona koji se fragmentiše (Díaz-Cruz and Barceló 2005). Tetraciklinski antibiotici se lako protonuju i analiziraju kao pozitivni joni, mada je moguća analiza i negativnih jona. Za fragmentaciju protonovanog molekula tetraciklina dominantan je gubitak molekula H2O i NH3, pri čemu nastaje [M+H–H2O–NH3]+ (Hirsch et al. 1998, 1999; Zhu et al. 2001; Hamscher et al. 2002; Kamel et al. 2002). Kiseli antiinflamatorni lekovi, kao što su ibuprofen i acetilsalicilna kiselina, detektuju se kao negativni joni. Acetilsalicilna kiselina se veoma lako i brzo degraduje u salicilnu kiselinu, zbog čega je prekursor jon zapravo deprotonovani molekul salicilne kiseline (m/z 137) (Heberer 2002). Pri MS/MS fragmentaciji prekursor joni gube molekul CO2 (44 Da). Za ove lekove je karakteristično da je fragmentni jon nastao otpuštanjem CO2 jedini produkt jon, što znači da nema dodatnih jona za potvrdu prisustva ovih analita (Stolker et al. 2004; Petrović et al. 2005). Neutralni antiinflamatorni lekovi, kao što je paracetamol, se analiziraju kao pozitivni joni, pri čemu je prekursor jon protonovani molekul. Za antiepileptik karbamazepin karakterističan je gubitak NHCO grupe (43 Da) (Petrović et al. 2005). 33 3.1. RASTVORI ODABRANIH LEKOVA I REAGENSI Hemijske strukture i relativne molekulske mase odabranih analita, iz grupa antibiotika, sedativa i analgoantipiretika, prikazane su u tabeli 3. Tabela 3. Hemijske strukture i relativne molekulske mase odabranih lekova. LEK HEMIJSKA STRUKTURA Mr LEK HEMIJSKA STRUKTURA Mr Ampicilin H2N O NH N H H O S O OH 349 Eritromicin O O O OH OH OH O O O OH O O OH N 733 Amoksicilin OH H2N O NH N H H O S O OH 365 Azitromicin N O OH OH O O OH O O OH O O NOH 748 Cefaleksin H2N O NH N H O S OH O 347 Doksiciklin H OH OH OH O O OH N OH H O NH2 444 Sulfametoksazol S O O NHH2N N O 253 Diazepam Cl N N O 284 Trimetoprim O O O N N NH2 NH2 290 Bromazepam Br N N H O N 315 3 . E K S P E R I M E N T A L N I D E O 3. EKSPERIMENTALNI DEO 34 Tabela 3. (nastavak) LEK HEMIJSKA STRUKTURA Mr LEK HEMIJSKA STRUKTURA Mr Lorazepam Cl N N H O HO Cl 320 Metamizol N NO N O3S 310 Karbamazepin N O NH2 236 Flurbiprofen F H O OH 244 Fenobarbiton N N H O H O O 232 Acetilsalicilnakiselina O OH O O 180 Ibuprofen OH O 206 Diklofenak Cl Cl N HOH O 295 Paracetamol OH N H O 151 Analitički standardi lekova visoke čistoće (> 90%) su dobijeni od domaćih farmaceutskih kompanija (Hemofarm i Zorka-Pharma). Standardni rastvor svakog analita pripremljen je u metanolu pri koncentraciji 300 µg cm–3. Naime, prethodnim eksperimentima je utvrđeno da neki od odabranih analita nisu rastvorni u vodi (eritromicin, azitromicin, flurbiprofen), ili u acetonitrilu (ampicilin, amoksicilin, cefaleksin), zbog čega je metanol odabran kao najbolji rastvarač za sve analite. Mešanjem određenih zapremina pojedinačnih standardnih rastvora i razblaživanjem metanolom, pripremljen je rastvor svih lekova koncentracije 10 µg cm–3, a zatim i 100 ng cm–3. Svi rastvori su čuvani na –4 oC. Za podešavanje pH-vrednosti uzoraka voda korišćeni su koncentrovana sirćetna kiselina i amonijak, analitičke čistoće, proizvođača Roth (Karlsruhe, Nemačka). Ostali reagensi, kao npr. trihlorsirćetna kiselina (TCA) i natrijum-etilendiamintetraacetat (Na2EDTA), bili su analitičke čistoće, proizvođača Riedel-de Haën (Seelze, Nemačka). Svi korišćeni rastvarači bili su HPLC čistoće, od proizvođača Fluka (Buchs, Švajcarska) ili Sigma-Aldrich (Steinheim, Nemačka). Ultračista voda je dobijena primenom GenPure sistema (TKA, Niederelbert, Nemačka) za dobijanje vode HPLC čistoće. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 35 3.2. SNIMANJE MASENIH SPEKTARA ANALITA Maseni spektri analita dobijeni su korišćenjem LCQ Advantage (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) jonskog trapa, kao masenog spektrometra. Kao jonizaciona tehnika korišćena je elektrosprej jonizacija. Unošenjem standardnog rastvora svakog analita koncentracije 10 µg cm–3 u tok mobilne faze, koja sadrži jednake delove metanola i vode, podešena je osetljivost masenog spektrometra za odabrani jon svakog ispitivanog analita. Utvrđeno je da su za detektovanje svih lekova koji se analiziraju kao pozitivni joni, optimalni sledeći parametri jonskog izvora: temperatura kapilare (290 °C), protok azota (25 au, tj. 25 arbitrary units, jedinica na skali opsega 0–100 koji je definisan LCQ Advantage sistemom) i napon izvora (4,5 kV). Za analite koji se analiziraju kao negativni joni, optimalni parametri jonskog izvora su sledeći: temperatura kapilare (290 °C), protok azota (23 au) i napon izvora (4,5 kV). Za svaki analit odabran je prekursor jon, najčešće protonovani ili deprotonovani molekul, zatim je optimizovana koliziona energija, tj. energija sudara sa atomima helijuma u jonskom trapu, za reakciju fragmentacije prekursor jona, i konačno je odabrana reakcija fragmentacije, tj. izabran je najintenzivniji i najstabilniji fragmentni jon. U daljim MSn reakcijama fragmentacije, uz optimizaciju kolizione energije, dobijeni su stabilni i intenzivni fragmentni joni. Obrada rezultata izvršena je pomoću softverskog paketa Xcalibur v. 1,3 (Thermo Fisher Scientific, SAD). 3.3. OPTIMIZACIJA HROMATOGRAFSKOG RAZDVAJANJA ANALITA Za tečno-hromatografsku analizu visoke performanse korišćen je Surveyor HPLC sistem (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD). Reverzno-fazno razdvajanje analita je izvršeno na Zorbax Eclipse® XDB-C18 koloni (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD), dimenzija 4,6 mm x 75 mm x 3,5 µm. Ispred hromatografske kolone postavljena je predkolona istog proizvođača, dimenzija 4,6 mm x 12,5 mm x 5 µm. Za hromatografsko razdvajanje analita koji se detektuju kao pozitivni joni, mobilna faza se sastojala od ultračiste vode (A), metanola (B) i 10% (v/v) vodenog rastvora sirćetne kiseline (C). Za analite koji se detektuju kao negativni joni, u mobilnoj fazi je izostavljena sirćetna kiselina da bi se izbeglo protonovanje analita i time smanjenje signala. Isprobavanjem različitih gradijenata mobilne faze, utvrđeno je da se optimalno hromatografsko razdvajanje analita postiže korišćenjem gradijenata prikazanih u tabeli 4. Nakon hromatografskog razdvajanja analita, početni uslovi su uspostavljeni tokom 15 min. Zapremina od 0,01 cm3 (10 µl) konačno dobijenog ekstrakta je injektovana u HPLC sistem. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 36 Tabela 4. Sastav i gradijent mobilne faze za hromatografsko razdvajanje pozitivnih (ESI+) i negativnih (ESI–) jona analita. VREME (min) PROTOK (cm3 min–1) H2O (%) CH3OH (%) 10% CH3COOH (%) ESI(+) 0,00 0,600 65,0 33,0 2,0 12,00 0,600 0,0 98,0 2,0 15,00 0,600 0,0 98,0 2,0 15,10 0,600 65,0 33,0 2,0 30,00 0,600 65,0 33,0 2,0 ESI(–) 0,00 0,600 60,0 40,0 0,0 7,00 0,600 0,0 100,0 0,0 10,00 0,600 0,0 100,0 0,0 10,10 0,600 60,0 40,0 0,0 25,00 0,600 60,0 40,0 0,0 3.4. OPTIMIZACIJA HPLC-MS/MS PARAMETARA Nakon izbora mobilne faze, ponovo je podešena osetljivost masenog spektrometra i optimizovani su instrumentalni uslovi za nedvosmislenu identifikaciju tragova odabranih lekova. Standardni rastvor svakog analita koncentracije 10 µg cm–3 unošen je u tok mobilne faze sastava 65/33/2 (A/B/C), prilikom analize pozitivnih jona, odnosno 60/40 (A/B), pri analizi negativnih jona, uz protok mobilne faze od 0,6 cm3 min–1. Za svaki analit su snimljeni maseni spektri pozitivnih i negativnih jona u opsegu m/z 50–1000. Najintenzivniji joni u MS spektru su dalje fragmentisani, uz optimizaciju energije sudara za dobijanje najintenzivnijeg i najstabilnijeg fragmentnog jona. Na osnovu rezultata MSn analize, izabrane su karakteristične reakcije fragmentacije za kvantitativno određivanje svakog analita u konačno razvijenoj HPLC-MS/MS metodi. SRM detekcija pozitivnih jona je podeljena na pet vremenskih segmenata, a u svakom segmentu su sakupljani podaci za maksimalno četiri analita. Naime, osetljivost MS detekcije se smanjuje sa povećanjem broja uporedo snimanih spektara. Da bi se masena detekcija mogla podeliti na vremenske segmente, neophodno je bilo postići određeni nivo hromatografskog razdvajanja analita. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 37 3.5. EKSTRAKCIJA ANALITA NA ČVRSTOJ FAZI 3.5.1. Izbor SPE kertridža Za ekstrakciju lekova iz vode koristi se veliki broj raznovrsnih SPE kertridža, različitih proizvođača, pri čemu se obično određeni adsorbensi, tj. pakovanja kertridža, preporučuju za određenu farmakološku grupu lekova, ili za lekove iste polarnosti. Pregledom literature, za ispitivanje efikasnosti ekstrakcije veoma različitih, odabranih analita iz vode, izabrani su sledeći SPE kertridži (Bruno et al. 2001b; Sacher et al. 2001; Ternes 2001; Miao et al. 2002; Miao et al. 2004; Batt and Aga 2005; Yang et al. 2005): 1. a) Oasis HLB (30 mg/1 cm3), b) Oasis MCX (30 mg/1 cm3) od proizvođača Waters (Milford, Massachusetts, SAD); 2. a) Supelclean ENVI-18 (500 mg/6 cm3), b) Supelclean ENVI-Chrom P (250 mg/6 cm3), c) Supelclean ENVI-Carb (500 mg/6 cm3), d) Supelclean LC-SCX (500 mg/3 cm3) od proizvođača Supelco (Bellefonte, Pennsylvania, SAD); 3. a) BAKERBOND Speedisk Octadecyl C18 (20 mg/1 cm3), b) BAKERBOND SDB-1 (200 mg/3 cm3), c) BAKERBOND Arom. Sulf. Acid (100 mg/1 cm3), d) BAKERBOND Speedisk H2O-Philic DVB (50 mg/3 cm3) od proizvođača J.T. Baker (Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, Holandija). Pored komercijalno dostupnih kertridža, za ekstrakciju na čvrstoj fazi korišćeni su i kertridži pripremljeni pakovanjem dijatomejske zemlje (Sigma-Aldrich), koja je tretirana različitim reagensima, u prazne SPE kolone. Oasis HLB kertridž, sa polimernim pakovanjem koje se sastoji od hidrofilnog poli(N-vinilpirolidona) i lipofilnog divinilbenzena, poseduje uravnotežene hidrofilne i lipofilne karakteristike. Specifičan sastav povećava sposobnost za reverzno-fazno zadržavanje polarnih analita, u poređenju sa tradicionalnim reverzno-faznim adsorbensima, kao što je silikatni materijal sa C18 grupama. Za razliku od reverzno-faznih C18 pakovanja, poseduje odlične mogućnosti kvašenja vodom, zbog čega sušenje pakovanja kolone nema negativan efekat na prinos metode. Po preporuci proizvođača, može se primenjivati za ekstrakciju kiselih, baznih i neutralnih jedinjenja, u celokupnom opsegu pH-vrednosti. Oasis MCX kertridž predstavlja kombinaciju katjonskog izmjenjivača i reverzno- -faznog adsorbensa koja se preporučuje za ekstrakciju baznih jedinjenja, u celom opsegu pH-vrednosti. Supelclean ENVI-18 je kertridž namenjen za reverzno-faznu ekstrakciju iz vodenih rastvora. Sadrži polimerno vezane oktadecil-grupe (C18) i oko 17% ugljenika. Pakovanje je otporno na ekstremne pH-vrednosti, pa je moguće vršiti ekstrakciju u širokom opsegu pH. Preporučuje se za prečišćavanje, ekstrakciju i koncentrovanje zagađujućih supstanci iz uzoraka vode iz životne sredine. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 38 Supelclean ENVI-Chrom P kertridž sadrži kopolimer stirena i divinilbenzena, pogodan za adsorpciju ili reverzno-faznu ekstrakciju iz vodenih rastvora, u širokom opsegu pH. Koristi se za zadržavanje hidrofobnih jedinjenja sa delimično hidrofilnim karakteristikama. Proizvođač posebno preporučuje ovaj kertridž za ekstrakciju aromatičnih i fenolnih jedinjenja iz vodenih matrica u životnoj sredini. Supelclean ENVI-Carb je kertridž pakovan grafitnim neporoznim ugljenikom koji je namenjen za reverzno-faznu ekstrakciju iz vodenih rastvora. Zbog velikog afiniteta pakovanja prema polarnim i nepolarnim organskim jedinjenjima, moguće ih je ekstrahovati i iz polarnih i iz nepolarnih matrica. Supelclean LC-SCX kertridž sadrži katjonski jonoizmenjivač, tj. adsorbens sa anjonskim funkcionalnim grupama koje potiču od alifatične sulfonske kiseline. Preporučuje se za jonoizmenjivačku ekstrakciju baznih analita. BAKERBOND Speedisk Octadecyl C18 je kertridž koji se preporučuje za reverzno- -faznu ekstrakciju slabo polarnih i nepolarnih analita. BAKERBOND SDB-1 kertridž je pakovan kopolimerom stirena i divinilbenzena, sa velikim kapacitetom za polarne analite. Preporučuje se za ekstrakciju aromatičnih i fenolnih jedinjenja iz vode. BAKERBOND Arom. Sulf. Acid je kertridž koji sadrži jak katjonski izmenjivač, na bazi aromatične sulfonske kiseline. BAKERBOND Speedisk H2O-Philic DVB je kertridž sa pakovanjem na bazi divinilbenzena koji se može koristi za adsorpciju hidrofobnih i slabo hidrofilnih jedinjenja. Dijatomejska zemlja, poznata i kao dijatomit, je prirodna sedimentna stena nastala od fosilnih ostataka diatoma, važne grupe eukariotskih algi i najčešće vrste fitoplanktona. Karakterističan hemijski sastav dijatomita je: oko 89% SiO2, 3,8% Al2O3, 1% Fe2O3, 2,5% Na2O, 2,5% K2O, 0,5% CaO, 0,5% MgO i 0,2% TiO2. Zbog mekoće, lako se usitnjava do finog praška, koji ima abrazivna svojstva i veoma je lagan zbog velike poroznosti. Zbog odličnih adsorpcionih svojstava, često se koristi za adsorpciju toksičnih tečnosti, kao npr. za čišćenje naftnih mrlja. Kertridži sa dijatomitom su pripremljeni punjenjem prazne SPE kolone (zapremine 6 cm3) tretiranim adsorbensom (mase 500 mg) i komprimovanjem pakovanja između dve porozne frite, na način prikazan na slici 9. Pripremljena su tri različita pakovanja kolone: čist dijatomit, dijatomit tretiran rastvorom Na2EDTA i dijatomit tretiran trihlorsirćetnom kiselinom. Rastvor Na2EDTA je pripremljen rastvaranjem 0,15 g ove soli u 0,2 cm3 ultračiste vode. Zatim je ovaj rastvor dodat u 1 g dijatomejske zemlje, smeša je homogenizovana i ostavljena da se suši na vazduhu 24 časa. Polovina ove smeše korišćena je za pakovanje kolone. Rastvor TCA je dobijen razblaživanjem 0,1 cm3 koncentrovane kiseline sa 1,5 cm3 ultračiste vode. U 1 g dijatomita dodato je 0,5 cm3 pripremljenog rastvora TCA, smeša je promešana i ostavljena da se suši na vazduhu 24 časa. Polovina ove smeše korišćena je za pakovanje kolone. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 39 Slika 9. Priprema SPE kertridža pakovanih dijatomejskom zemljom. Na osnovu literature i prema predloženim procedurama proizvođača kertridža, definisano je devet različitih SPE procedura za pripremu uzoraka vode, uz korišćenje trinaest SPE kertridža. Naime, pojedini kertridži različitih proizvođača imaju sličan sastav pakovanja i preporučuju se za ekstrakciju istih grupa analita, zbog čega mogu biti deo iste SPE procedure. Prilikom izbora optimalnog SPE kertridža za ekstrakciju veoma različitih lekova iz vode, korišćene su sledeće SPE metode (šeme 1–8): 1. SPE-C18 (Hirsch et al. 1999; Sacher et al. 2001; Ternes 2001; Ternes et al. 2001; Zhu et al. 2001; Miao et al. 2002; Hernando et al. 2004; Zuehlke et al. 2004); 2. SPE-SDB/CHROM (Hirsch et al. 1999; Ternes 2001); 3. SPE-UGLJENIČNI (Bruno et al. 2001b); 4. SPE-KATJONSKI (Stolker et al. 2004); 5. SPE-HLB I (Miao and Metcalfe 2003a; Miao et al. 2004); 6. SPE-HLB II (Farré et al. 2001; Öllers et al. 2001; González-Barreiro et al. 2003; Hilton and Thomas 2003; Quintana and Reemtsma 2004); 7. SPE-HLB III (Miao et al. 2004; Yang and Carlson 2004; Yang et al. 2004, 2005; Batt and Aga 2005; Batt et al. 2006); 8. SPE-DIJATOMIT I; 9. SPE-DIJATOMIT II. Uzorci vode za SPE procedure pripremljeni su dodatkom smeše svih lekova koncentracije 10 µg cm–3, tako da očekivana koncentracija svakog analita, nakon ekstrakcije na čvrstoj fazi, iznosi 100 ng cm–3. Svi konačno dobijeni ekstrakti su filtrirani kroz poli(viniliden fluorid) (PVDF) filter (Roth, Karlsruhe, Germany), veličine pora 0,45 µm. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 40 Šema 1. Priprema uzorka vode metodom SPE-C18. SPE-C18 Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 0,5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 2 x 0,5 cm3 CH3OH; 2 x 0,5 cm3 H2O; 2 x 0,5 cm3 H2O (pH = 3) Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: BAKERBOND C18 (20 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 3 cm3 CH3OH; 3 cm3 H2O; 3 cm3 H2O (pH = 3) Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 4 cm3 5% CH3OH SPE kolona: Supelclean ENVI-18 (500 mg/6 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 41 Šema 2. Priprema uzorka vode metodom SPE-SDB/CHROM. SPE-SDB/CHROM Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 3 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 2 x 1 cm3 CH3OH; 2 x 1 cm3 H2O Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 1 cm3 5% CH3OH SPE kolona: BAKERBOND SDB-1 (200 mg/3 cm3) Supelclean ENVI-Chrom P (250 mg/6 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 42 Šema 3. Priprema uzorka vode metodom SPE-UGLJENIČNI. SPE-UGLJENIČNI Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 3 cm3 CH3OH; 3 cm3 H2O; 3 cm3 H2O (pH = 3) Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 4 cm3 5% CH3OH SPE kolona: Supelclean ENVI-Carb (500 mg/6 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 43 Šema 4. Priprema uzorka vode metodom SPE-KATJONSKI. SPE-KATJONSKI Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 0,5 cm3 CH3OH/NH3 (95:5) Kondicioniranje kolone: 2 x 0,5 cm3 CH3OH; 2 x 0,5 cm3 H2O Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 2% CH3COOH 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: OASIS MCX (30 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 5 x 1 cm3 CH3OH/NH3 (95:5) Kondicioniranje kolone: 2 x 1 cm3 CH3OH; 2 x 1 cm3 H2O Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 1 cm3 2% CH3COOH 2 x 1 cm3 5% CH3OH SPE kolona: BAKERBOND Arom. Sulf. Acid (100 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 4 x 2 cm3 CH3OH/NH3 (95:5) Kondicioniranje kolone: 2 x 2 cm3 CH3OH; 2 x 2 cm3 H2O Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 2 cm3 2% CH3COOH 2 x 2 cm3 5% CH3OH SPE kolona: Supelclean LC-SCX (500 mg/3 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 44 Šema 5. Priprema uzorka vode metodom SPE-HLB I. Šema 6. Priprema uzorka vode metodom SPE-HLB II. SPE-HLB I Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 0,5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 2 x 0,5 cm3 CH3OH; 2 x 0,5 cm3 H2O Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: OASIS HLB (30 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu SPE-HLB II Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 0,5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 2 x 0,5 cm3 CH3OH; 2 x 0,5 cm3 H2O 2 x 0,5 cm3 H2O (pH = 3) Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: OASIS HLB (30 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode (pH = 3) Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 45 Šema 7. Priprema uzorka vode metodom SPE-HLB III. SPE-HLB III Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 0,5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 2 x 0,5 cm3 CH3OH; 2 x 0,5 cm3 H2O; 2 x 0,5 cm3 H2O (Na2EDTA; pH = 3) Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: OASIS HLB (30 mg/1 cm3) Uzorak: 5 cm3 vode + 0,05 cm3 5% Na2EDTA (pH = 3) Sušenje kolone: 5 min. na vakuumu Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 2 x 1 cm3 CH3OH Nanošenje uzorka Ispiranje kolone: 2 x 0,5 cm3 5% CH3OH SPE kolona: BAKERBOND H2O-Philic DVB (50 mg/3 cm3) Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu Uzorak: 5 cm3 vode + 0,05 cm3 5% Na2EDTA (pH = 3) Kondicioniranje kolone: 2 x 1 cm3 CH3OH; 2 x 1 cm3 H2O; 2 x 1 cm3 H2O (Na2EDTA; pH = 3) 3. EKSPERIMENTALNI DEO 46 Šema 8. Priprema uzorka vode metodama SPE-DIJATOMIT I i SPE-DIJATOMIT II. SPE-DIJATOMIT I Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 5 cm3 CH2Cl2/CH3OH (1:1) Kondicioniranje kolone: 1 cm3 H2O Nanošenje uzorka SPE kolona (500 mg/6 cm3): DIJATOMIT DIJATOMIT + Na2EDTA DIJATOMIT + TCA Uzorak: 5 cm3 vode Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu SPE-DIJATOMIT II Rekonstituisanje: 1 cm3 CH3OH Uparavanje do suva Eluiranje: 5 cm3 CH3OH Kondicioniranje kolone: 1 cm3 H2O Nanošenje uzorka SPE kolona (500 mg/6 cm3): DIJATOMIT DIJATOMIT + Na2EDTA DIJATOMIT + TCA Uzorak: 5 cm3 vode Sušenje kolone: 10 min. na vakuumu 3. EKSPERIMENTALNI DEO 47 3.5.2. Izbor optimalne pH-vrednosti uzorka vode Nakon izbora kertridža za ekstrakciju odabranih lekova iz vode, optimizovana je pH-vrednost uzorka vode pri kojoj je najveći prinos ekstrakcije svakog analita. Za eksperiment su odabrane sledeće pH-vrednosti: 3,0, 4,5, 6,0 i 7,5. Uzorci vode su pripremljeni dodatkom smeše svih lekova koncentracije 10 µg cm–3 ultračistoj vodi, tako da očekivana koncentracija svakog analita, nakon ekstrakcije na čvrstoj fazi, iznosi 100 ng cm–3. Pre nanošenja pripremljenog uzorka vode, pakovanje kolone je kondicionirano sa 5 cm3 metanola, zatim 5 cm3 ultračiste vode, i konačno 5 cm3 ultračiste vode sa pH-vrednošću podešenom tako da odgovara pH-vrednosti pripremljenog uzorka vode. Na kondicionirani kertridž je nanesen pripremljeni uzorak vode, zapremine 100 cm3, sa pH-vrednostima podešenim na 3,0, 4,5, 6,0 i 7,5. Nakon nanošenja pripremljenog uzorka, kolona je isprana sa 5 cm3 5% rastvora metanola. Potom je pakovanje sušeno 10 min. na vakuumu. Za eluiranje analita korišćeno je 10 cm3 metanola. Zatim je ekstrakt uparavan do suva u struji azota u vodenom kupatilu na temperaturi od 40 ºC. Nakon rekonstituisanja sa 1 cm3 metanola, ekstrakt je filtriran kroz PVDF filter i analiziran. 3.5.3. Izbor optimalne zapremine eluenta Za određivanje optimalne zapremine rastvarača, koja je potrebna za potpuno eluiranje analita sa SPE kolone, korišćen je uzorak vode, zapremine 100 cm3, prethodno pripremljen dodatkom smeše svih lekova ultračistoj vodi tako da koncentracija svakog analita u konačno dobijenom ekstraktu iznosi 100 ng cm–3. Zbog pojednostavljenja, eksperiment je izveden bez podešavanja pH, tj. na pH = 4,5, što je pH-vrednost ultračiste vode. SPE kertridž je kondicioniran dodatkom 5 cm3 metanola, a zatim 5 cm3 ultračiste vode. Pripremljen uzorak vode je nanesen na kolonu, kolona je isprana sa 5 cm3 5% rastvora metanola, a zatim sušena na vakuumu 10 min. Eluiranje je prvo izvedeno sa 7 cm3 metanola. Zatim je kertridž eluiran sa dodatna 3 cm3 metanola. Onda su sakupljeni inkrementi od po još 3 cm3 i 2 cm3 eluata. Ekstrakti su upareni do suva, rekonstituisani sa 1 cm3 metanola, filtrirani kroz PVDF filter i analizirani. 3.5.4. Izbor optimalne zapremine uzorka vode Za optimizaciju zapremine uzorka vode koja se nanosi na kertridž, vršen je odabir između 50, 100, 250 i 500 cm3 uzorka. Različite zapremine uzoraka vode pripremljene su dodatkom smeše svih lekova ultračistoj vodi tako da koncentracija svakog analita u konačno dobijenom ekstraktu iznosi 100 ng cm–3. Ovaj eksperiment je izveden na pH = 3,0, s obzirom na to da je većina analita ekstrahovana sa najvećim prinosom na ovoj pH-vrednosti. Pakovanje kolone je kondicionirano sa 5 cm3 metanola, zatim 5 cm3 ultračiste vode, i konačno 5 cm3 ultračiste vode sa pH-vrednošću podešenom na 3. Nakon nanošenja različitih zapremina uzorka, kolona je isprana sa 5 cm3 5% rastvora metanola i sušena 10 min. na vakuumu. Za eluiranje analita korišćeno je 15 cm3 metanola. Ekstrakt je uparen do suva, rekonstituisan sa 1 cm3 metanola, filtriran kroz PVDF filter i analiziran. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 48 3.5.5. Validacija metode Razvijena i optimizovana metoda je konačno testirana na realnom uzorku podzemne vode koji je pripremljen tako da sadrži odabrane lekove u koncentraciji 100 i 500 ng dm–3. U konačno dobijenim ekstraktima očekuju se koncentracije od 10 i 50 ng cm–3. Prethodnom analizom uzorka podzemne vode utvrđeno je da ne sadrži tragove posmatranih analita. Pre dodatka smeše lekova, uzorak podzemne vode je filtriran kroz filter sa staklenim vlaknima (Whatman GmbH, Dassel, Nemačka), veličine pora < 1 µm. Pripremljeni uzorak vode je analiziran prema optimizovanoj SPE proceduri. Eksperiment je izveden bez podešavanja pH i na pH = 3, koristeći 100 cm3 uzorka vode i 15 cm3 metanola kao eluenta. 3.6. KALIBRACIJA Prilikom detekcije analita pomoću ESI masenog spektrometra, pouzdana kalibracija se može postići korišćenjem internog standarda (Batt and Aga 2005; Gómez et al. 2006), eksternom kalibracijom sa standardima koji odgovaraju matrici (Gros et al. 2006b; Kang et al. 2007) ili metodom standardnog dodatka (Conley et al. 2008). Tradicionalna eksterna kalibracija sa standardima u rastvaraču nije pouzdana zbog uticaja matrice koji se javlja u ESI procesu. Interni standard je obično jedinjenje strukturno slično analitu ili izotopski obeležen analit. Prilikom analize smeša različitih jedinjenja, teško je pronaći interni standard koji bi odgovarao većini analita. Smatra se da je metoda standardnog dodatka komplikovana za rad i da zahteva previše vremena. Zbog toga je kao kalibraciona metoda odabrana metoda eksterne kalibracije sa standardima koji odgovaraju matrici uzorka. Za eksperimente optimizacije analitičke metode, standard je pripremljen tako što je ultračista voda prolazila kroz SPE proceduru, uporedo sa uzorkom, a nakon uparavanja do suva, ekstrakt je rekonstituisan sa 1 cm3 smeše svih lekova koncentracije 100 ng cm–3. Za eksperimente sa realnim uzorcima voda, za svaku vrstu vode (podzemnu i površinsku) je napravljeno pet kalibracionih rastvora, koncentracija 10, 25, 50, 100 i 250 ng cm–3, na osnovu kojih je dobijena eksterna kalibraciona kriva sa pet tačaka. Standardi su pripremljeni dodatkom rastvora svih lekova u ekstrakte slepe probe nakon SPE procedure. Pre pripreme kalibracionih rastvora, utvrđeno je da slepe probe ne sadrže tragove odabranih analita. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 49 3.7. UZIMANJE UZORAKA VODE Analizirano je ukupno 26 uzoraka vode, od čega 15 uzoraka površinske, 9 uzoraka podzemne i 2 uzorka otpadne vode (tabela 5). Iz reke Dunav uzeto je 9 uzoraka u 9 gradova nizvodno od ušća Save u Dunav (slika 10): Beograd, Smederevo, Ram, Veliko Gradište, Donji Milanovac, Tekija, Kladovo, Kusjak i Radujevac. Ispitivana su tri uzorka savske vode, uzeta u blizini Ušća, neposredno pre ulivanja u Dunav, kao i po jedan uzorak rečne vode iz Nišave (Niš), Tamiša (Pančevo) i uzorak vode iz jezera Očaga (Lazarevac) (slika 11). Gradovi u kojima su uzeti uzorci vode nemaju postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda. Da bi se ispitao direktan uticaj otpadnih voda na podzemne, kao i površinske vode, uzeta su dva uzorka otpadnih voda iz kanala Surčin i Galovica (slika 12), zatim tri uzorka podzemnih voda iz dva pijezometra u neposrednoj blizini kanala, i dva uzorka iz reke Save nizvodno od izlivanja kanala u reku (uzorci Sava-Sajam i Sava-Brankov most). U kanale Surčin i Galovica ulivaju se otpadne vode sa poljoprivrednih dobara i farmi životinja. Uzorci podzemnih voda su sakupljeni iz pijezometra 5 (slika 12) koji se nalazi odmah pored kanala Surčin i pijezometra 4 koji se nalazi na samoj obali, pre izlivanja kanala u reku Savu. Iz pijezometra 4 uzeta su dva uzorka sa različitih dubina koji su označeni kao 4 i 4p, pri čemu 4p označava uzorak sa manje dubine, tj. plići. Takođe je uzet uzorak iz pijezometra 2 (slika 12) koji se nalazi na samoj farmi životinja. Konačno, analizirani su uzorci iz reni bunara i pogona za preradu vode Bežanija, kao i česmenska voda, u cilju ispitivanja prisustva tragova lekova u vodi koja se koristi za piće, kao i mogućnosti njihovog uklanjanja u procesima prečišćavanja. U sklopu javnog komunalnog preduzeća „Beogradski vodovod i kanalizacija“ postoji pet postrojenja za preradu i prečišćavanje vode: Bežanija, Banovo brdo, Bele vode, Makiš i Vinča. Postrojenja Bežanija, Banovo brdo i deo pogona Bele vode prerađuju podzemnu vodu. Drugi deo postrojenja Bele vode i pogon Makiš prerađuju savsku vodu, dok se u postrojenju Vinča prerađuje dunavska rečna voda. Odnos podzemne i površinske vode koja se prerađuje je 70:30, što znači da se grad Beograd pretežno snabdeva vodom iz podzemnih izvora, tj. reni bunara izgrađenih u priobalju reke Save. U pogonu za preradu vode Bežanija osnovu sistema za obezbeđenje sirove podzemne vode čini 60 reni bunara, a voda se doprema iz dva pravca – Progara i Ušća (slika 13). U ovom postojenju, uobičajena tehnologija pripreme vode, kojom se obezbeđuje kvalitet prečišćene vode u skladu sa zakonskom regulativom, obuhvata procese aeracije, taloženja, filtracije i dezinfekcije. Aeracijom se uklanjaju rastvorna jedinjenja gvožđa i mangana, usled oksidacije do slabo rastvorljivih Fe(OH)3 i MnO2, kao i nepoželjni rastvorljivi gasovi vodonik-sulfid, amonijak i drugi. Ispod površine za aeraciju nalazi se taložni bazen u kojem se razdvajaju čvrsta i tečna faza pod uticajem gravitacije. Zatim se tečna faza pod pritiskom propušta kroz filtere koji se sastoje iz sloja peska i sloja antracita. Konačno, voda se dezinfikuje hlorom radi uklanjanja patogenih mikroorganizama. U pogonu za preradu vode Bežanija uzeta su tri uzorka vode: po jedan uzorak iz dva aeratora – Progar i Ušće u kojima se nalazi sirova voda sakupljena iz reni bunara iz pravca Progara i iz pravca Ušća, kao i uzorak iz bazena čiste vode, nakon faze dezinfekcije. Takođe je uzet po jedan uzorak vode iz reni bunara kod Progara (RB-92) i reni bunara na Ušću (RB-4). Svi uzorci su sakupljeni u plastičnim bocama zapremine 500 cm3 i čuvani u zamrzivaču, bez dodatka konzervansa, do analize, obično 1–2 dana nakon uzimanja uzoraka. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 50 Tabela 5. Opis analiziranih uzoraka vode. UZORAK VODE OPIS UZORKA VODE Beograd Rečna voda iz Dunava kod Beograda Smederevo Rečna voda iz Dunava kod Smedereva Ram Rečna voda iz Dunava kod Rama Veliko Gradište Rečna voda iz Dunava kod Velikog Gradišta Donji Milanovac Rečna voda iz Dunava kod Donjeg Milanovca Tekija Rečna voda iz Dunava kod Tekije Kladovo Rečna voda iz Dunava kod Kladova Kusjak Rečna voda iz Dunava kod Kusjaka Radujevac D un av n iz vo dn o Rečna voda iz Dunava kod Radujevca Sava Rečna voda iz Save kod Ušća u Beogradu Nišava Rečna voda iz Nišave kod Niša Tamiš Rečna voda iz Tamiša kod Pančeva Očaga Jezerska voda iz jezera Očaga kod Lazarevca Kanal Surčin Otpadna voda sa poljoprivrednih dobara i farmi životinja Kanal Galovica Otpadna voda sa poljoprivrednih dobara i farmi životinja Pijezometar 5 Podzemna voda pored kanala Surčin Pijezometar 4p Podzemna voda pre izlivanja kanala u Savu, sa manje dubine Pijezometar 4 Podzemna voda pre izlivanja kanala u Savu, sa veće dubine Pijezometar 2 Podzemna voda sa farme životinja Sava (Sajam) Rečna voda iz Save kod Sajma, nizvodno od kanala Sava (Brankov most) Rečna voda iz Save kod Brankovog mosta, nizvodno od kanala RB-92 (Progar) Podzemna voda iz reni bunara 92 kod Progara Aerator-Progar Sirova podzemna voda iz niza reni bunara iz pravca Progara RB-4 (Ušće) Podzemna voda iz reni bunara 4 na Ušću Aerator-Ušće Sirova podzemna voda iz niza reni bunara iz pravca Ušća Bazen čiste vode Prečišćena voda, nakon faze dezinfekcije 3. EKSPERIMENTALNI DEO 51 Slika 10. Prikaz mesta uzorkovanja iz reke Dunav. Slika 11. Prikaz mesta uzorkovanja površinske vode u Srbiji. 3. EKSPERIMENTALNI DEO 52 Slika 12. Prikaz mesta uzorkovanja vode iz otpadnih kanala i podzemne vode iz pijezometara. Slika 13. Raspored reni bunara beogradskog izvorišta podzemne vode u sistemu za transport sirove vode. 53 4.1. MASENI SPEKTRI ANALITA Maseni spektri pozitivnih (ESI+) ili negativnih (ESI–) jona analita, na osnovu kojih su odabrani prekursor joni i reakcije fragmentacije u najintenzivnije i najstabilnije fragmentne jone, prikazani su na slikama 14–32. Na spektrima su crvenom elipsom ( ) označeni fragmentni joni odabrani za kvantifikaciju svakog analita, dok su plavim pravougaonikom ( ) označeni joni odabrani za potvrdu prisustva analita. Za potvrdu su odabrani dodatni fragmentni joni prekursor jona ili joni nastali daljom fragmentacijom fragmentnih jona odabranih za kvantifikaciju analita. U Prilogu (slike 54–65) su dati ostali MSn spektri odabranih lekova dobijeni MSn reakcijama fragmentacije analita u jonskom trapu. Rezultati su pokazali da u procesu elektrosprej jonizacije trimetoprima (slika 18), eritromicina (slika 19), azitromicina (slika 20), diazepama (slika 22), bromazepama (slika 23), karbamazepina (slika 25) i paracetamola (slika 28) nastaju samo pozitivni joni. Kod ovih jedinjenja u MS spektrima dominiraju protonovani molekuli ([M+H]+), dok su kod makrolida – eritromicina i azitromicina (slike 19 i 20) veoma intenzivni i adukti sa katjonom natrijuma ([M+Na]+). Maseni spektar bromazepama (slika 23) karakterističan je za jedinjenja koja sadrže brom. U spektru se uočavaju dva, podjednako zastupljena jona, koji odgovaraju protonovanom molekulu bromazepama (m/z 316) i protonovanom molekulu koji sadrži izotop broma (m/z 318). Za navedene analite je utvrđeno da ih je potrebno analizirati kao pozitivne jone i da se njihova identifikacija i kvantifikacija treba zasnivati na izolovanju protonovanog molekula, kao prekursor jona za dalju MSn analizu. Farmaceutska jedinjenja koja u procesu elektrosprej jonizacije stvaraju samo negativne jone su: fenobarbiton (slika 26), ibuprofen (slika 27), metamizol (slika 29), flurbiprofen (slika 30) i acetilsalicilna kiselina (slika 31). Izuzev acetilsalicilne kiseline, u MS spektrima ovih analita dominiraju deprotonovani molekuli ([M–H]–), koji su odabrani kao prekursor joni za MSn dalju analizu navedenih analita. AMPICI~1 #370 RT: 6.82 AV: 1 NL: 4.10E6 F: + c ESI Full ms [ 100.00-1000.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 382.0 383.1 AMPICI~1 #208-224 RT: 3.18-3.35 AV: 8 NL: 1.57E6 F: + c ESI Full ms2 382.10@23.00 [ 105.00-1000.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 222.9 364.9 364.0 332.9205.9 a) 382.0 b) [M+CH3OH+H]+ Slika 14. Maseni spektri ampicilina: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+CH3OH+H]+. 4 . R E Z U L T A T I I D I S K U S I J A 4. REZULTATI I DISKUSIJA 54 AMOXIC~1 #329 RT: 6.76 AV: 1 NL: 1.08E7 F: + c ESI Full ms [ 50.00-1000.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 397.9 399.0 420.0 AMOXIC~1 #95 RT: 1.70 AV: 1 NL: 1.30E7 F: + c ESI Full ms2 398.00@21.00 [ 105.00-420.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 380.9 397.9 a) b) AMOXIC~1 #132-150 RT: 2.37-2.63 AV: 16 NL: 6.54E6 F: + c ESI Full ms3 398.00@21.00 380.90@23.00 [ 100.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 349.0 287.0 c) [M+CH3OH+H]+ Slika 15. Maseni spektri amoksicilina: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+CH3OH+H]+; c) ESI(+)MS3 [M+CH3OH+H]+. CEFALE~1 #52 RT: 0.74 AV: 1 NL: 1.31E6 F: + c ESI Full ms [ 300.00-1000.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 380.0 391.1 301.2 402.0 338.2 CEFALE~1 #166-221 RT: 3.15-4.32 AV: 13 NL: 8.55E4 F: + c ESI Full ms2 379.80@22.00 [ 100.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 222.9 363.0330.9 302.0 362.0 336.0229.9 346.0150.9 266.9 379.9 a) b) [M+CH3OH+H]+ 222.9 Slika 16. Maseni spektri cefaleksina: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+CH3OH+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 55 F: + c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 254.0 663.3255.1 SULFAM~2 #74 RT: 1.26 AV: 1 NL: 4.44E4 F: + c ESI Full ms2 254.30@34.00 [ 70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 188.0 156.0 190.2 194.2 147.4 235.8 253.9 SULFAM~2 #36 RT: 3.25 AV:1 NL: 5.54E5 [M+H]+ a) b) Slika 17. Maseni spektri sulfametoksazola: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+. TRIMET~1 #48 RT: 0.76 AV: 1 NL: 2.41E7 T: + c ESI ms [ 50.00-1000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 291.1 278.9 TRIMET~1 #101-190 RT: 1.43-2.50 AV: 71 NL: 3.54E6 F: + c ESI Full ms2 291.20@40.00 [ 80.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 230.1 258.0 261.2123.1 275.1 a) b) [M+H]+ Slika 18. Maseni spektri trimetoprima: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 56 ERITRO~1 #6 RT: 0.09 AV: 1 NL: 5.39E6 F: + c ESI ms [ 50.00-1000.00] 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 734.1 735.2 756.2 ERITRO~1 #133-243 RT: 2.61-3.57 AV: 76 NL: 5.20E6 F: + c ESI Full ms2 734.30@26.00 [ 500.00-800.00] 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 576.1 716.0522.2 558.1 698.0 540.1 a) b) [M+H]+ [M+Na]+ Slika 19. Maseni spektri eritromicina: a)ESI(+)MS; b)ESI(+)MS2 [M+H]+. AZITRO~1 #676 RT: 14.37 AV: 1 NL: 1.35E7 T: + c ESI Full ms [ 100.00-2000.00] 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 749.3 750.4 771.4591.6 AZITRO~1 #152-188 RT: 2.92-3.50 AV: 36 NL: 8.69E6 F: + c ESI Full ms2 749.30@25.00 [ 205.00-800.00] 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 591.2 AZITRO~1 #402 RT: 7.90 AV: 1 NL: 2.50E6 F: + c ESI Full ms3 749.30@25.00 591.30@28.00 [ 110.00-500.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 434.3 398.2 a) b) [M+H]+ c) [M+Na]+ Slika 20. Maseni spektri azitromicina: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS3 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 57 DOXICI~1 #26-50 RT: 0.52-0.98 AV: 24 NL: 3.48E6 F: + c ESI Full ms2 445.00@25.00 [ 120.00-500.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 428.1 459.8 429.0 a) DOXICI~1 #13-60 RT: 3.35-3.52 AV: 10 NL: 6.73E6 F: + c ESI Full ms [ 400.00-1000.00] 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 445.0 b) [M+H]+ Slika 21. Maseni spektri doksiciklina: a)ESI(+)MS; b)ESI(+)MS2 [M+H]+. diazepam #319 RT: 5.14 AV: 1 NL: 3.55E7 F: + c ESI Full ms [ 50.00-500.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 285.1 287.196.6 124.592.764.8 278.9 diazepam #106 RT: 1.44 AV: 1 NL: 6.02E6 F: + c ESI Full ms2 285.20@40.00 [ 75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 257.1 222.2 228.1154.1 182.1 diazepam #171 RT: 2.45 AV: 1 NL: 1.16E6 F: + c ESI Full ms3 285.20@40.00 257.10@39.00 [ 70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 228.1 222.3 193.2 221.1 a) b) c) [M+H]+ Slika 22. Maseni spektri diazepama: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS3 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 58 BROMAZ~1 #334 RT: 7.30 AV: 1 NL: 2.02E6 F: + c ESI Full ms2 318.10@36.00 [ 85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 290.0 BROMAZ~1 #51 RT: 0.93 AV: 1 NL: 4.44E6 F: + c ESI Full ms [ 100.00-1000.00] 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 316.1 318.1 BROMAZ~1 #120-139 RT: 2.22-2.61 AV: 20 NL: 1.90E6 F: + c ESI Full ms2 316.10@36.00 [ 100.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 288.0 a) b) c) [M+H]+ [izotop+H]+ Slika 23. Maseni spektri bromazepama: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS2 [izotop+H]+. LORAZE~1 #118 RT: 2.36 AV: 1 NL: 2.80E6 F: + c ESI Full ms3 321.00@28.00 302.90@26.00 [ 80.00-350.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 275.3 303.0 LORAZE~1 #197 RT: 4.06 AV: 1 NL: 7.34E6 F: + c ESI Full ms [ 50.00-500.00] 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 321.0 323.0 303.1 305.0 325.0 LORAZE~1 #74 RT: 1.42 AV: 1 NL: 4.77E6 F: + c ESI Full ms2 321.00@28.00 [ 85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 302.9 275.3 a) b) c) [M+H]+ Slika 24. Maseni spektri lorazepama: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS3 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 59 KARBAM~1 #306 RT: 4.56 AV: 1 NL: 3.27E7 F: + c ESI Full ms [ 50.00-1000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 237.1 96.5 KARBAM~1 #75 RT: 1.11 AV: 1 NL: 1.05E7 F: + c ESI Full ms2 237.10@30.00 [ 65.00-250.00] 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 194.3 219.9 237.0 a) b) [M+H]+ Slika 25. Maseni spektri karbamazepina: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+. FENOBA~1 #7 RT: 0.13 AV: 1 NL: 3.56E5 F: - c ESI ms [ 50.00-1000.00] 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 231.0 FENOBA~1 #96 RT: 1.96 AV: 1 NL: 4.33E4 F: - c ESI Full ms2 231.00@29.00 [ 60.00-250.00] 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 187.9 84.9 198.9 a) b) [M–H]– Slika 26. Maseni spektri fenobarbitona: a) ESI(–)MS; b) ESI(–)MS2 [M–H]–. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 60 IBUPRO~1 #8 RT: 0.19 AV: 1 NL: 8.05E5 F: - c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 204.9 205.9 IBUPRO~1 #198 RT: 3.72 AV: 1 NL: 1.68E5 F: - c ESI Full ms2 204.90@25.00 [ 55.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 159.1 160.7 204.9 IBUPRO~1 #392 RT: 7.88 AV: 1 NL: 2.16E4 F: - c ESI Full ms3 204.90@25.00 159.10@32.00 [ 50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 143.1 158.9 a) b) c) [M–H]– Slika 27. Maseni spektri ibuprofena: a) ESI(–)MS; b) ESI(–)MS2 [M–H]–; c) ESI(–)MS3 [M–H]–. PARACE~1 #335 RT: 4.42 AV: 1 NL: 1.37E7 T: + c ESI Full ms [ 50.00-1000.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 152.1 124.6 278.8 PARACE~1 #100 RT: 1.48 AV: 1 NL: 2.27E6 F: + c ESI Full ms2 152.10@32.00 [ 50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 110.1 152.0 a) b) [M+H]+ Slika 28. Maseni spektri paracetamola: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 61 METAMI~1 #23 RT: 0.49 AV: 1 NL: 2.90E5 F: - c ESI Full ms [ 50.00-500.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 309.8 METAMI~1 #110 RT: 2.32 AV: 1 NL: 2.58E5 F: - c ESI Full ms2 310.00@25.00 [ 85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 190.9 309.9 METAMI~1 #182 RT: 3.87 AV: 1 NL: 5.83E4 F: - c ESI Full ms3 310.00@25.00 191.00@29.00 [ 50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 175.8 81.0 191.0 80.0 a) b) c) [M–H]– Slika 29. Maseni spektri metamizola: a) ESI(–)MS; b) ESI(–)MS2 [M–H]–; c) ESI(–)MS3 [M–H]–. FLURBI~1 #9 RT: 0.20 AV: 1 NL: 2.25E4 F: - c ESI ms [ 50.00-1000.00] 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 242.8 243.5 FLURBI~1 #206 RT: 4.37 AV: 1 NL: 3.00E4 F: - c ESI Full ms2 242.90@25.00 [ 65.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 199.0 243.1 199.8 a) b) [M–H]– Slika 30. Maseni spektri flurbiprofena: a) ESI(–)MS; b) ESI(–)MS2 [M–H]–. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 62 ACETIL~1 #8 RT: 0.17 AV: 1 NL: 1.82E5 F: - c ESI Full ms [ 50.00-500.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 137.0 296.8 ACETIL~1 #115 RT: 2.28 AV: 1 NL: 6.05E4 F: - c ESI Full ms2 137.00@31.00 [ 50.00-150.00] 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 93.0 137.3 a) b) [M–COCH3]– Slika 31. Maseni spektri acetilsalicilne kiseline: a) ESI(–)MS; b) ESI(–)MS2 [M–COCH3]–. BG_DIK~2 #29 RT: 0.55 AV: 1 NL: 1.70E6 F: + c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 295.9 297.9 DIKLOF~1#7 RT : 0.55 AV : 1 NL 1.70E6 F: + c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] R el at iv e A bu nd an ce DIKLOF~1 #19 RT: 0.38 AV: 1 NL: 3.67E5 T: + c ESI Full ms2 296.00@25.00 [ 80.00-320.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 277.9 249.9 296.2 DIKLOF~1 #36 RT: 0.77 AV: 1 NL: 2.62E5 F: + c ESI Full ms3 296.00@25.00 278.00@22.00 [ 75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 249.9 277.9 a) b) c) [M+H]+ Slika 32. Maseni spektri diklofenaka: a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS3 [M+H]+. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 63 U MS spektru acetilsalicilne kiseline (slika 31) dominira jon m/z 137. Ovaj jon predstavlja deprotonovani molekul salicilne kiseline. Naime, poznato je da se u rastvoru acetilsalicilna kiselina (Mr = 180) veoma brzo degraduje (slika 33) u salicilnu kiselinu (Mr = 138) (Heberer 2002). Zbog toga se identifikacija i kvantifikacija acetilsalicilne kiseline zasniva na izolovanju deprotonovanog molekula salicilne kiseline, kao prekursor jona za dalju MSn analizu. Mr=180 Mr=138 O OH O O O OH OH Slika 33. Degradacija acetilsalicilne kiseline u salicilnu kiselinu. Ampicilin (slike 14 i 55), amoksicilin (slike 15 i 56), cefaleksin (slike 16 i 57), sulfametoksazol (slike 17 i 58), doksiciklin (slike 21 i 62), lorazepam (slike 24 i 64) i diklofenak (slike 32 i 66) u procesu jonizacije stvaraju i pozitivne i negativne jone. Međutim, u MS spektrima navedenih analita se uočava da je intenzitet pozitivnih jona značajno veći od intenziteta negativnih jona. Zbog toga je odabrano da se dalje izvodi MSn analiza pozitivnih jona. U MS spektrima β-laktama – ampicilina, amoksicilina i cefaleksina (slike 14–16) se ne mogu uočiti protonovani molekuli, ali zato dominiraju veoma intenzivni protonovani adukti sa metanolom ([M+CH3OH+H]+). Poznato je da penicilini reaguju sa alkoholima, pri čemu nastaju peniciloil estri (Bruno et al. 2001b). Zbog prisustva nestabilnog četvoročlanog prstena u β-laktamskoj strukturi, ovi antibiotici su podložni degradaciji u prisustvu alkohola i toplote (Rabbolini et al. 1998). Cepanjem β-laktamskog prstena (slika 34) u molekul se uvodi dodatna bazna grupa (sekundarni amin) čime se povećava sposobnost vezivanja protona. Za navedene analite, protonovani adukt sa metanolom je odabran kao prekursor jon za dalju MSn analizu. OH H2N O NH N H H O S O OH H2N O NH HN H H S O OH O OCH3 OH + CH3OH Mr=365 Mr=397 Slika 34. Nastanak adukta amoksicilina sa metanolom. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 64 Nakon odabira prekursor jona za svaki analit, u daljoj MSn analizi je optimizovana koliziona energija, tj. energija sudara sa atomima helijuma, za dobijanje stabilnih i intenzivnih fragmentnih jona. Vrednosti kolizione energije, preciznije normalizovane kolizione energije, izražene su u procentima, na skali 0–100% koja je definisana LCQ sistemom. Dobijeni MSn spektri su prikazani na slikama 14–32 i u Prilogu (slike 55–66), a rezultati optimizacije ESI-MSn analize su sumarno dati u tabeli 6. Za većinu odabranih analita je karakteristično da MS/MS fragmentacijom nastaje više od jednog fragmentnog jona, koji se dalje fragmentišu (MS3 analiza), pri čemu se dobijaju stabilni fragmenti. Značajan broj analita daje i MS4 spektar. Na osnovu dobijenih rezultata, za svaki analit je odabrana karakteristična reakcija fragmentacije prekursor jona u najintenzivniji i najstabilniji fragmentni jon. Dodatne MSn reakcije mogu se koristiti za potvrdu prisustva odabranih analita, tj. za potvrdu pozitivnih rezultata u realnim uzorcima. Međutim, u slučaju paracetamola, flurbiprofena i acetilsalicilne kiseline, nije bilo moguće dobiti više od jednog fragmentnog jona u MS2 analizi, niti stabilan MS3 fragment. Jedini stabilan fragmentni jon paracetamola u jonskom trapu nastaje reakcijom fragmentacije m/z 152 → m/z 110, iako se u literaturi pominju i druge MS2 fragmentacije, kao m/z 152 → m/z 93 za pozitivne jone (Gros et al. 2006b) i m/z 150 → m/z 107 za negativne jone (Gómez et al. 2006). Ovi rezultati su dobijeni korišćenjem trostrukog kvadrupola. Smatra se da je, u ovakvim slučajevima, dovoljan dokaz prisustva leka ukoliko retenciono vreme pozitivnog rezultata u SRM hromatogramu ne odstupa više od 3% od retencionog vremena analitičkog standarda (Gros et al. 2006b). Tabela 6. MSn reakcije fragmentacije odabranih lekova u jonskom trapu. LEK MS Koliziona energija (%) MS2 Koliziona energija (%) MS3 Koliziona energija (%) MS4 Ampicilin 382 [M+CH3OH+H]+ 23 223 365 333 25 25 – 206 259 – 25 – – 178 – – 380 [M+CH3OH–H]– 22 302 28 270 – – Amoksicilin 398 [M+CH3OH+H]+ 21 381 23 349 30 255 420 [M+Na]+ 26 342 – – – – 396 [M+CH3OH–H]– 24 318 25 224 301 27 25 192 207 Cefaleksin 380 [M+CH3OH+H]+ 22 223 302 331 363 24 – – – 206 – – – 23 – – – 178 – – – 402 [M+Na]+ – – – – – – 378 [M+CH3OH–H]– – – – – – – Sulfametoksazol 254 [M+H]+ 34 188 156 25 24 160 108 – – – – 252 [M–H]– 29 156 – – – – Trimetoprim 291 [M+H]+ 40 230 123 258 275 40 – 30 35 201 – 230 257 – – 35 35 – – 202 229 4. REZULTATI I DISKUSIJA 65 Tabela 6. (nastavak) Eritromicin 734 [M+H]+ 26 576 716 22 20 558 522 22 – 540 – 756 [M+Na]+ 32 598 33 580 33 466 Azitromicin 749 [M+H]+ 25 591 28 434 29 416 771 [M+Na]+ 29 613 595 30 31 438 479 – – – – Doksiciklin 445 [M+H]+ 25 428 460 27 28 410 428 28 – 339 – 443 [M–H]– 25 399 – – – – Diazepam 285 [M+H]+ 40 257 39 228 222 36 – 193 – Bromazepam 316 [M+H]+ 36 288 35 261 209 35 – 182 – 318 [izotop+H]+ 36 290 35 263 209 35 – 182 – Lorazepam 321 [M+H]+ 28 303 26 275 – – 319 [M–H]– 26 283 – – – – Karbamazepin 237 [M+H]+ 30 220 194 23 – 192 – – – – – Fenobarbiton 231 [M–H]– 29 188 85 – – – – – – – – Ibuprofen 205 [M–H]– 25 159 161 32 – 143 – – – – – Paracetamol 152 [M+H]+ 32 110 – – – – Metamizol 310 [M–H]– 25 191 29 176 81 – – – – Flurbiprofen 243 [M–H]– 25 199 – – – – Acetilsalicilna kiselina 137 [M–COCH3]– 31 93 – – – – Diklofenak 296 [M+H]+ 25 278 22 250 26 215 294 [M–H]– 25 250 37 214 – – 4. REZULTATI I DISKUSIJA 66 4.2. FORMIRANJE ADUKTA AMOKSICILINA SA METANOLOM Za identifikaciju i kvantifikaciju tragova β-laktamskih antibiotika, kao što su ampicilin, amoksicilin i cefaleksin, u različitim matricama obično se koriste protonovani molekuli ovih analita (Riediker and Stadler 2001; De Baere et al. 2002; Holstege et al. 2002; Fagerquist and Lightfield 2003; Becker et al. 2004; Bogialli et al. 2004; Lindberg et al. 2004; Cha et al. 2005; Fagerquist et al. 2005; De Baere and De Backer 2007; Granelli and Branzell 2007). U svega nekoliko radova (Bruno et al. 2001b) za određivanje β-laktama korišćeni su protonovani adukti sa rastvaračem. Preliminarni eksperimenti su pokazali da se u masenim spektrima β-laktama pojavljuju veoma intenzivni protonovani adukti sa metanolom (slike 14–16). Stvaranje ovih adukata nije moguće izbeći kada je metanol prisutan u sistemu, ili kao rastvarač uzorka ili kao sastojak mobilne faze. Zbog toga su ispitivane mogućnosti korišćenja adukta sa metanolom za kvantitativno određivanje β-laktama, na primeru amoksicilina, pomoću elektrosprej tandem masene spektrometrije sa jonskim trapom (Grujic et al. 2008). Takođe je ispitivan uticaj nekoliko uobičajenih rastvarača, kao i aditiva mobilne faze, na efikasnost jonizacije amoksicilina i formiranje adukta sa metanolom. 4.2.1. Uticaj sastava rastvarača na ESI masene spektre amoksicilina U hemijskoj strukturi amoksicilina (tabela 3) nalaze se jako kisela i jako bazna grupa. Zbog toga u elektrosprej jonizacionom procesu nastaju i pozitivni i negativni joni. Međutim, intenzitet pozitivnih jona (slika 35) je nekoliko puta veći od intenziteta odgovarajućih negativnih jona, nezavisno od sastava rastvarača. Na slici 35 su prikazani maseni spektri amoksicilina rastvorenog u četiri različita rastvarača: vodi, metanolu, smeši metanol/voda (50:50) i smeši metanol/2 mM amonijum-acetat (50:50). Za maseni spektar pozitivnih jona amoksicilina u vodi (slika 35a) karakterističan je protonovani molekul i adukt sa katjonom natrijuma, kao i intenzivni dimeri. Kada se amoksicilin rastvori u čistom metanolu, dimeri su suzbijeni i u spektru dominiraju monomolekulske vrste (slika 35b). U prisustvu metanola se javlja jak signal protonovanog adukta sa amoksicilinom ([M+CH3OH+H]+, m/z 398). Kao posledica uvođenja dodatne bazne grupe u molekul (slika 34) i povećane sposobnosti vezivanja protona, intenzitet signala takvih protonovanih adukata je mnogo veći od intenziteta protonovanih molekula amoksicilina (slika 35b). 4. REZULTATI I DISKUSIJA 67 Slika 35. Maseni spektri pozitivnih i negativnih jona amoksicilina (c = 100 µg cm–3) u rastvaraču: a) vodi; b) metanolu; c) smeši metanol/voda (50:50); d) smeši metanol/2 mM amonijum-acetat (50:50). 4. REZULTATI I DISKUSIJA 68 Na slici 36 je grafički predstavljen intenzitet protonovanih i deprotonovanih molekula amoksicilina i adukata sa metanolom. 0.0 4.0x106 8.0x106 1.2x107 1.6x107 2.0x107 2.4x107 [M+CH3OH+H]+ [M+CH3OH-H]-[M-H]-[M+H]+ m/z 396m/z 364m/z 398m/z 366 In te nz ite t j on a metanol metanol/voda (50:50) voda metanol/2 mM NH4OAc (50:50) Slika 36. Intenzitet protonovanih i deprotonovanih molekula i metanol-adukta amoksicilina u različitim rastvaračima pri koncentraciji 100 µg cm–3. Takođe je ispitivan uticaj smeše rastvarača metanol/voda, kao i metanol/amonijum- -acetat, na izgled masenih spektara amoksicilina (slike 35c i 35d). Iako je protonovani molekul intenzivan, amoksicilin i dalje teži da formira adukt sa metanolom, kao i dimere. Izgleda da je nemoguće potpuno suzbiti formiranje ovog adukta kada je metanol prisutan u sistemu. Najintenzivniji signal je dobijen dodatkom amonijum-acetata smeši metanol/voda (slike 35d i 36). Poznato je da amonijum-soli pospešuju reakcije protonovanja u gasnoj fazi i povećavaju intenzitet [M+H]+-jona (Kamel et al. 1999; Mathis and McCord 2005). Elektrosprej jonizacijom nastaje i određena količina (20–30%) adukata sa natrijumom, [M+Na]+ (m/z 388, slika 35a) i [M+CH3OH+Na]+ (m/z 420, slike 35b i 35d). Naime, katjoni Na+ i K+ su prisutni kao nečistoće u organskim rastvaračima. Oni su takođe prisutni u uzorcima i teško se uklanjaju. Adukti sa natrijumom se često uočavaju u ESI masenim spektrima zbog kontaminacije iz staklenog posuđa. Formiranje ovih adukata ukazuje na osetljivost ESI-MS spektara na katjonske nečistoće (Kamel et al. 1999). S obzirom na to da intenzitet adukata sa alkalnim katjonima u masenim spektrima zavisi od stepena kontaminacije sistema (Bruno et al. 2001b) koja se ne može kontrolisati, ovi adukti ne mogu koristiti u identifikaciji i kvantifikaciji analita. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 69 Za negativni jonski spektar (ESI–) amoksicilina (slika 35) karakteristični su deprotonovani molekul i deprotonovani adukt sa metanolom. Takođe su prisutni odgovarajući dimeri. Dodatak vode ima nepovoljan efekat na nastanak negativnih jona i njihov intenzitet se značajno smanjuje (slike 35 i 36). Formiranje adukata pored protonovanih molekula je generalno neželjeni proces, jer se njihovom fragmentacijom ne dobijaju strukturno značajni fragmentni joni, koji su neophodni za identifikaciju analita (Bruno et al. 2001b). Međutim, fragmentacijom adukata amoksicilina sa metanolom (slika 37) dobijeni su stabilni i intenzivni fragmentni joni. F: - c ESI Full ms2 396.20@23.00 [105.00-450.00] NL: 1.52E6 150 200 250 300 350 400 450 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 318.0 281.1 396.2301.1224.0 322.0 F: + c ESI Full ms2 397.80@28.00 [105.00-450.00] NL: 2.28E6 150 200 250 300 350 400 450 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 380.9 349.0 397.9 330.4 353.0 a) F: + c ESI Full ms2 366.10@25.00 [100.00-400.00] NL: 2.83E5 150 200 250 300 350 400 450 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 348.8 366.1 333.7 305.0 244.7 c) F: - c ESI Full ms2 363.90@22.00 [100.00-400.00] NL: 1.30E5 100 150 200 250 300 350 400 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 319.9 222.8 363.9 [A]+ [A-NH3]+ [A]- [M+H]+ [M+H-NH3]+ [M-H]- [M-H-COO]- [A-78]- b) d) Slika 37. MS/MS spektri amoksicilina (c = 10 µg cm–3): a) protonovanog metanol-adukta [A]+; b) deprotonovanog metanol-adukta [A]–; c) protonovanog molekula [M+H]+; d) deprotonovanog molekula [M–H]–. U oba masena spektra pozitivnih jona (slike 37a i 37c) uočava se gubitak molekula amonijaka (De Baere et al. 2002). U spektru deprotonovanog molekula vidi se karakterističan gubitak CO2, pri čemu nastaje fragmentni jon m/z 320. MS/MS spektar deprotonovanog adukta sa metanolom [A]– pokazuje gubitak mase od 78 Da, pri čemu nastaje fragmenti jon m/z 318. Slično amoksicilinu, i drugi β-laktami, kao ampicilin i cefaleksin, formiraju stabilne adukte sa metanolom. Na slici 38 su prikazani maseni spektri ampicilina rastvorenog u smeši metanola i vode (50:50). 4. REZULTATI I DISKUSIJA 70 AMP_35~1 #35-136 RT: 0.65-2.65 AV: 47 NL: 1.47E6 F: + c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 382.1 350.1 404.1 372.1 AMP_35~1 #223 RT: 4.54 AV: 1 NL: 5.60E5 F: + c ESI Full ms2 350.10@23.00 [ 95.00-380.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 159.9 173.9 190.8 332.9 349.8 AMP_35~1 #385 RT: 7.82 AV: 1 NL: 2.04E6 F: + c ESI Full ms2 382.00@24.00 [ 105.00-400.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 222.9 364.9 364.0 381.9205.9 amp-348 #16 RT: 0.39 AV: 1 NL: 5.00E5 F: - c ESI Full ms [ 150.00-1000.00] 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 380.30 348.20 amp-348 #224 RT: 4.73 AV: 1 NL: 2.59E5 F: - c ESI Full ms2 348.20@21.00 [ 95.00-360.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 303.98 207.01 347.80 amp-348 #436 RT: 9.17 AV: 1 NL: 5.39E5 F: - c ESI Full ms2 380.00@24.00 [ 100.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 301.95 264.97 379.85 a) b) c) d) e) f) [M+H]+ [M+CH3OH+H] + [M–H]– [M+CH3OH–H] – Slika 38. Maseni spektri ampicilina (c = 10 µg cm–3) u smeši metanol/voda (50:50): a) ESI(+)MS; b) ESI(+)MS2 [M+H]+; c) ESI(+)MS2 [M+CH3OH+H]+; d) ESI(–)MS; e) ESI(–)MS2 [M–H]–; f) ESI(+)MS2 [M+CH3OH–H]–. Uočava se postojanje intenzivnog protonovanog metanol-adukta (slika 38, m/z 382), kao i protonovanog molekula (m/z 350), kao u slučaju amoksicilina. Daljom fragmentacijom se dobijaju stabilni i intenzivni fragmentni joni koji se mogu koristiti za identifikaciju i kvantifikaciju ampicilina. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 71 4.2.2. Formiranje adukta amoksicilina sa metanolom tokom vremena S obzirom na to da se metanol često koristi kao rastvarač za analitičke standarde lekova, sam ili u smeši sa vodom, kao i da je uobičajen sastojak mobilne faze, formiranje adukta amoksicilina sa metanolom nije lako izbeći. Problem se može prevazići upotrebom acetonitrila, drugog često korišćenog organskog rastvarača u tečnoj hromatografiji. Međutim, preliminarni eksperimenti su pokazali da su monomolekulske vrste u masenom spektru amoksicilina mnogo intenzivnije kada se koristi metanol umesto acetonitrila. U cilju detaljnog ispitivanja procesa nastanka adukta amoksicilina sa metanolom, ovaj proces je praćen tokom vremena. Sveže pripremljen rastvor amoksicilina u metanolu, koncentracije 100 µg cm–3, je injektovan direktno u ESI izvor, bez protoka mobilne faze, uz detekciju pozitivnih jona. Stabilnost rastvora amoksicilina je posmatrana tokom perioda od sedam dana. Rezultati su grafički prikazani na slici 39, zajedno sa MS spektrima na početku eksperimenta i nakon sedam dana. Slika 39. Nastanak metanol-adukta (m/z 398) i preuređenih dimera amoksicilina tokom perioda od sedam dana pri koncentraciji od 100 µg cm–3 u metanolu. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 72 U sveže pripremljenom rastvoru amoksicilina u metanolu (slika 39) proces derivatizacije započinje odmah, i adukt sa metanolom lako i brzo nastaje. Na početku eksperimenta je najintenzivniji jon m/z 349, koji nastaje fragmentacijom protonovanog molekula m/z 366 (slika 37c). Raspadanje amoksicilina je takođe veoma izraženo i započinje odmah po rastvaranju analita. Tokom vremena, intenzitet jona m/z 349 i m/z 366 se drastično smanjuje. Na kraju eksperimenta, nakon sedam dana, protonovani molekul m/z 366 je potpuno degradovan, a dolazi do uravnoteženja intenziteta metanol-adukt jona m/z 398 i njegovog fragmentnog jona m/z 381 (slika 37a). Pošto se najizraženije promene dešavaju tokom prvih 20 sati (slika 39), eksperiment je ponovljen sa sveže pripremljenim rastvorom amoksicilina manje koncentracije (10 µg cm–3), a intenzitet različitih jona je posmatran tokom perioda od 16 sati. Naime, za podešavanje osetljivosti masenog spektrometra i posmatranje različitih uticaja na intenzitet signala pogodnija je, prema literaturi, koncentracija od 10 µg cm–3. Takođe, uzevši u obzir da određivanje tragova lekova podrazumeva koncentracije reda veličine ng cm–3, prethodna koncentracija amoksicilina od 100 µg cm–3 je prilično visoka. Rezultati ponovljenog eksperimenta su prikazani na slici 40a. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0.0 1.0x105 2.0x105 3.0x105 4.0x105 In te nz ite t j on a Vreme (h) m/z 349 m/z 366 m/z 398 a) b) 0 20 40 60 80 100 120 140 1.0x105 2.0x105 3.0x105 4.0x105 5.0x105 6.0x105 7.0x105 In te nz ite t j on a Vreme (min) m/z 366 m/z 398 Slika 40. Nastanak adukta amoksicilina sa metanolom, pri koncentraciji od 10 µg cm–3: a) tokom perioda od 16 sati; b) tokom prva dva sata. Uočava se da se najveće promene u intenzitetu dva najvažnija jona, m/z 366 i m/z 398, dešavaju tokom prva dva sata. Zbog toga je eksperiment ponovljen, a promene intenziteta jona su registrovane na svakih 5 min. Rezultati su prikazani na slici 40b. Jasno se uočava da formiranje adukta sa metanolom započinje odmah po pripremi svežeg rastvora. Sa smanjenjem intenziteta protonovanog molekula m/z 366, povećava se intenzitet protonovanog metanol-adukta m/z 398. Nakon 40 min, protonovani adukt postaje intenzivniji od proto- novanog molekula. Nakon dva sata, intenziteti ovih jona postaju konstanti i ne menjaju se značajnije tokom narednih 14 sati (slika 40a), ukazujući na to da konverzija molekula amoksicilina u adukt sa metanolom dostiže ravnotežu. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 73 4.2.3. Uticaj aditiva mobilne faze na efikasnost jonizacije amoksicilina U cilju ispitivanja uticaja sastava mobilne faze, tj. aditiva koji se često dodaju, na efikasnost ESI procesa, rastvor amoksicilina u metanolu koncentracije 10 µg cm–3 ostavljen je jedan dan na sobnoj temperaturi da bi se molekul u potpunosti konvertovao u adukt sa metanolom. Na početku eksperimenta je optimizovan odnos metanola i vode u mobilnoj fazi, bez aditiva, a rezultati su prikazani na slici 41. T: + c ESI Full ms [300.00-1500.00] NL: 4.13E5 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 398.1 420.2 442.2 [M+CH3OH+H]+ [M+CH3OH+Na]+ a) b) [M+CH3OH+2Na]+ 0 20 40 60 80 100 0.0 7.5x104 1.5x105 2.3x105 3.0x105 3.8x105 4.5x105 In te nz ite t j on a Metanol u mobilnoj fazi sa vodom (%) m/z 398 Slika 41. a) Zavisnost intenziteta protonovanog metanol-adukta (m/z 398) od sadržaja metanola u mobilnoj fazi; b) MS spektar pri sadržaju metanola od 60%. Utvrđeno je da se najveći intenzitet signala jona m/z 398 postiže pri odnosu metanola i vode 60:40 (slika 41a). Maseni spektar pri ovom sastavu mobilne faze (slika 41b) je veoma čist, bez klaster-jona, kao što su dimeri ili trimeri. U MS spektru dominira metanol-adukt jon, kao i dva dodatna adukta sa natrijumom. Pri optimalnom odnosu metanol/voda sprovedeni su dalji eksperimenti da bi se procenio uticaj amonijum-acetata i sirćetne kiseline, dva najčešće korišćena aditiva mobilne faze, na efikasnost jonizacije amoksicilina. Aditivi se često dodaju mobilnoj fazi da bi pospešili nastanak jona u ESI procesu, povećali rastvorljivost analita i poboljšali hromatografsko razdvajanje kompleksnih smeša (Constantopoulos et al. 1999; Kamel et al. 1999; King et al. 2000). Rezultati eksperimenata su predstavljeni na slici 42. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 74 0 2 4 6 8 10 6.0x105 8.0x105 1.0x106 1.2x106 1.4x106 1.6x106 1.8x106 In te nz ite t j on a Koncentracija CH3COOH u mobilnoj fazi (%) m/z 398 0 1 2 3 4 1.0x105 2.0x105 3.0x105 4.0x105 5.0x105 m/z 398 In te nz ite t j on a Koncentracija NH4OAc u mobilnoj fazi (mM) a) b) Slika 42. Zavisnost intenziteta protonovanog metanol-adukta (m/z 398) od koncentracije aditiva u mobilnoj fazi: a) amonijum-acetata; b) sirćetne kiseline, pri odnosu metanol/voda 60:40. Amonijum-acetat se često dodaje mobilnoj fazi da bi pospešio jonizaciju analita (Kamel et al. 1999; Mathis and McCord 2005). Takođe se koristi za stabilizaciju retencionih vremena analita. Međutim, ovaj aditiv može i smanjiti signal analita (Hilton and Thomas 2003). U literaturi se kao optimalne navode koncentracije od 4 mM (Hilton and Thomas 2003), kao i 2 mM (Mathis and McCord 2005). Pri većim koncentracijama intenzitet signala analita se smanjuje zbog potiskivanja jonizacije (Constantopoulos et al. 1999; King et al. 2000; Mathis and McCord 2005). U eksperimentu je ispitivan uticaj koncentracije amonijum- -acetata na intenzitet signala analita (slika 42a). Različiti procenti 20 mM rastvora amonijum- -acetata u vodi, sa pH-vrednošću podešenom na 5,5 pomoću mravlje kiseline, mešani su sa metanolom i vodom, održavajući u mobilnoj fazi optimalan odnos metanol/voda 60:40. Utvrđeno je da je optimalna koncentracija amonijum-acetata u mobilnoj fazi 0,2 mM (2·10–4 mol dm–3), što odgovara sadržaju od 1% 20 mM amonijum-acetata u mobilnoj fazi. Intenzitet protonovanog metanol-adukta m/z 398 u prisustvu amonijum-acetata je svega 10% veći od intenziteta signala bez aditiva. Može se zaključiti da amonijum-acetat ne poboljšava značajnije intenzitet signala amoksicilina i da je efekat potiskivanja jonizacije više izražen, jer sa povećanjem sadržaja ovog aditiva u mobilnoj fazi intenzitet signala analita opada (slika 42a). Ovaj rezultat je u suprotnosti sa prethodnim zapažanjem da amonijum- -acetat značajno povećava intenzitet metanol-adukta amoksicilina (slike 35d i 36). Međutim, prethodno zapažanje je uočeno za veoma visoku koncentraciju amoksicilina od 100 µg cm–3. Za određivanje tragova amoksicilina, amonijum-acetat bi trebalo izbegavati kao aditiv mobilnoj fazi. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 75 Takođe je ispitivan uticaj sirćetne kiseline, kao aditiva mobilne faze, na intenzitet signala amokcilina (slika 42b). Poznato je da dodatak kiseline mobilnoj fazi poboljšava oblik hromatografskog pika analita i pospešuje protonovanje, tj. nastanak [M+H]+-jona u procesu jonizacije. Molekuli analita se protonuju sa visokom efikasnošću čak i kada rastvor sadrži malu količinu protona. U ovu svrhu se često koristi sirćetna kiselina, u širokom opsegu koncentracija u zavisnosti od prirode analita (Bruno et al. 2001b). U eksperimentu je menjan sadržaj 10% sirćetne kiseline u mobilnoj fazi, održavajući optimalan odnos metanol/voda 60:40, pri koncentraciji amoksicilina od 10 µg cm–3. Najveći intenzitet signala amoksicilina je dobijen sa 0,1% sirćetne kiseline u mobilnoj fazi, što je 4,3 puta veće od intenziteta signala analita bez aditiva. Utvrđeno je da sirćetna kiselina značajno povećava intenzitet protonovanog metanol-adukta amoksicilina, zbog čega je neophodna kao aditiv mobilne faze pri kvantifikaciji tragova amoksicilina. 4.2.4. Linearnost detektora za određ ivanje amoksicilina Linearnost ESI-MS/MS detektora za kvantifikaciju tragova amoksicilina, koristeći reakciju fragmentacije protonovanog metanol-adukta, ispitana je u širokom opsegu koncentracija od 10 ng cm–3 do 100 µg cm–3. Rastvori amoksicilina različitih koncentracija ostavljeni su jedan dan na sobnoj temperaturi da bi se molekul u potpunosti konvertovao u adukt sa metanolom. Rastvori su unošeni u injektor masenog detektora kroz koji je uspostavljen konstantan protok mobilne faze, brzine 0,2 cm3 min–1 i sastava metanol:voda:10% sirćetna kiselina 60:39:1. Za svaku koncentraciju je izvedeno po pet merenja, na osnovu kojih je konstruisana kriva zavisnosti srednje površine pika analita od koncentracije. Rezultati su prikazani na slici 43. Utvrđeno je da je odgovor detektora linearan u posmatranom opsegu koncentracija sa koeficijentom korelacije (R) 0,99384. Međutim, linearnost je bila mnogo bolja za niže koncentracije, do 500 ng cm–3, pošto je R za ovaj opseg iznosio 0,99941. Na ovaj način je potvrđeno da je nastanak metanol-adukta amoksicilina linearna funkcija koncentracije analita za širok opseg koncentracija, i da se metanol-adukt može pouzdano koristiti za identifikaciju i kvantifikaciju tragova amoksicilina (Grujic et al. 2008). 0 20000 40000 60000 80000 100000 0.0 1.0x108 2.0x108 3.0x108 4.0x108 5.0x108 R=0,99384 P<0,0001 N=11 Po vr ši na p ik a Koncentracija amoksicilina (ng cm-3) a) 0 100 200 300 400 500 0.0 1.0x106 2.0x106 3.0x106 4.0x106 5.0x106 6.0x106 R=0,99941 P<0,0001 N=6 Po vr ši na p ik a Koncentracija amoksicilina (ng cm-3) b) Slika 43. Linearnost masenog detektora za reakciju fragmentacije m/z 398 → m/z 381 u opsegu koncentracija: a) 10 ng cm–3 – 100 µg cm–3; b) 10 – 500 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 76 4.3. OPTIMIZACIJA HROMATOGRAFSKOG RAZDVAJANJA ANALITA I HPLC-MS/MS PARAMETARA Na osnovu rezultata MSn analize, za kvantifikaciju svakog analita je odabrana karakteristična reakcija fragmentacije prekursor jona u najintenzivniji i najstabilniji fragmentni jon. Rezultati su prikazani u tabeli 7. Detektovanjem odabranih fragmentnih jona tokom HPLC-MS/MS analize dobijeni su hromatogrami proizvoda odabranih reakcija fragmentacije. SRM detekcija je podeljena na više vremenskih segmenata da bi se zadržala osetljivost detekcije. Detekcija pozitivnih jona (ESI(+)MS) je podeljena na pet vremenskih segmenata, a u svakom segmentu su sakupljani podaci za maksimalno četiri analita (tabela 7). SRM detekcija negativnih jona (ESI(–)MS) je podeljena na dva vremenska segmenta. Kvantifikacija je izvršena na osnovu površina pikova analita u SRM hromatogramima. Tipični maseni hromatogrami dobijeni analizom standardne smeše lekova koji se analiziraju kao pozitivni joni pri koncentraciji 250 ng cm–3 prikazani su na slici 44. Na slici 45, prikazani su hromatogrami dobijeni analizom standardne smeše lekova koji se analiziraju kao negativni joni pri koncentraciji 500 ng cm–3. Tabela 7. HPLC–MS i MS/MS parametri za kvantitativno određivanje odabranih lekova. LEK VREMENSKI SEGMENT (min) PREKURSOR JON (m/z) I.W.* KOLIZIONA ENERGIJA (%) FRAGMENTNI JON (m/z) I.W. * ESI(+)MS Trimetoprim 291 1,5 40 230 2 Paracetamol 152 1,5 32 110 2 Amoksicilin 0,0–3,4 398 2 21 381 2 Sulfametoksazol 254 1,5 34 188 2 Ampicilin 382 1,5 23 223 2 Cefaleksin 380 1,2 22 331 2 Azitromicin 3,4–6,2 749 2 25 591 2 Doksiciklin 6,2–8,2 445 2 25 428 2 Eritromicin 734 3 26 576 2 Bromazepam 316 1 36 288 1 Karbamazepin 237 1 30 194 1 Lorazepam 8,2–11,2 321 1 28 303 1 Diazepam 285 1 40 257 1 Diklofenak 11,2–15,0 296 1,5 25 278 1 ESI(–)MS Acetilsalicilna kis. 137 2 31 93 2 Metamizol 310 2,5 25 191 2 Fenobarbiton 0,0–8,0 231 2 29 188 2 Ibuprofen 205 2,5 25 159 2 Flurbiprofen 8,0–12,0 243 5 25 199 2,5 * I.W. (engl. isolation width) – maseni opseg detekcije jona (Da) oko posmatranog jona. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 77 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 1.80 2.14 2.58 4.03 4.80 4.96 5.47 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 7.29 9.10 9.23 9.68 10.66 11.93 13.37 NL: 6.25E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [229.10-231.10] NL: 4.59E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 152.10@32.00 [109.10-111.10] NL: 4.77E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 397.80@21.00 [379.90-381.90] NL: 2.27E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 254.00@34.00 [187.00-189.00] NL: 1.37E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 382.00@23.00 [221.90-223.90] NL: 1.05E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 380.00@22.00 [330.00-332.00] NL: 1.61E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 749.30@25.00 [590.30-592.30] NL: 5.56E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 445.00@25.00 [427.30-429.30] NL: 1.50E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 734.10@26.00 [575.10-577.10] NL: 1.24E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 316.10@36.00 [287.60-288.60] NL: 8.94E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [193.90-194.90] NL: 1.50E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 321.00@28.00 [302.40-303.40] NL: 2.67E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 285.20@40.00 [256.70-257.70] NL: 5.35E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 295.90@25.00 [277.30-278.30] TRIMETOPRIM PARACETAMOL AMOKSICILIN SULFAMETOKSAZOL AMPICILIN CEFALEKSIN AZITROMICIN DOKSICIKLIN ERITROMICIN BROMAZEPAM KARBAMAZEPIN LORAZEPAM DIAZEPAM DIKLOFENAK Slika 44. Maseni hromatogrami standardne smeše lekova koji se analiziraju kao pozitivni joni pri koncentraciji 250 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 78 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 50 100 4.28 5.22 5.33 9.71 9.40 NL: 2.25E4 TIC F: - c ESI SRM ms2 137.10@31.00 [92.10-94.10] NL: 3.22E5 TIC F: - c ESI SRM ms2 310.00@25.00 [190.00-192.00] NL: 2.09E4 TIC F: - c ESI SRM ms2 231.00@29.00 [186.80-188.80] NL: 5.40E4 TIC F: - c ESI SRM ms2 204.90@25.00 [158.10-160.10] NL: 1.34E4 TIC F: - c ESI SRM ms2 242.70@25.00 [196.70-201.70] ACETILSALICILNA KISELINA METAMIZOL FENOBARBITON IBUPROFEN FLURBIPROFEN Slika 45. Maseni hromatogrami standardne smeše lekova koji se analiziraju kao negativni joni pri koncentraciji 500 ng cm–3. 4.4. EKSTRAKCIJA ANALITA NA ČVRSTOJ FAZI 4.4.1. Izbor SPE kertridža Rezultati ispitivanja efikasnosti deset komercijalno dostupnih kertridža za ekstrakciju odabranih lekova iz vode, kao i tri kertridža pripremljena punjenjem tretiranom dijatomejskom zemljom, prikazani su u tabeli 8. U tabeli su za svaki analit zasenčena tri najbolja rezultata, tj. prinosi najbliži vrednosti od 100%. Na osnovu prinosa metoda datih u tabeli 8, može se uočiti da nijedan testirani adsorbens ne omogućava efikasnu ekstrakciju svih odabranih analita. Uzevši u obzir da je potrebno efikasno ekstrahovati veoma hemijski različite analite, u literaturi se dobrim smatraju prinosi metode veći od 70%. Utvrđeno je da su najveći prinosi za većinu analita (81–112%) dobijeni korišćenjem OASIS HLB kertridža, bez podešavanja pH-vrednosti uzorka. Od četrnaest analita, na ovom adsorbensu su sa najnižim prinosima (55–81%) ekstrahovani β-laktamski antibiotici – amoksicilin, ampicilin i cefaleksin. Međutim, sa izuzetkom cefaleksina, ove vrednosti su među najvećim za prinose β-laktama na svim testiranim SPE kolonama. Cefaleksin je jedini analit ekstrahovan na HLB kertridžu sa niskim prinosom od 55%. S obzirom na to da je većina veoma različitih lekova efikasno ekstrahovana iz vode upotrebom HLB adsorbensa, ovaj kertridž je odabran za dalji razvoj SPE metode. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 79 Tabela 8. Prinosi metoda na različitim kertridžima pri koncentraciji lekova od 100 ng cm–3. PRINOS METODE (%) SPE METODA KERTRIDŽ Tr im et op rim Pa ra ce ta m ol A m ok si ci lin Su lfa m et ok sa zo l A m pi ci lin C ef al ek si n A zi tro m ic in D ok si ci kl in Er itr om ic in B ro m az ep am K ar ba m az ep in Lo ra ze pa m D ia ze pa m D ik lo fe na k SPE-C18 C18 Bakerbond 71 3 14 58 38 68 61 4 4 75 89 84 85 83 ENVI-18 Supelclean 73 2 9 34 30 34 52 19 5 79 88 89 76 84 SPE-SDB/CHROM SDB-1 Bakerbond 5 82 3 74 3 29 5 4 5 58 90 68 4 58 ENVI-Chrom P Supelclean 74 110 32 80 44 108 80 44 32 66 82 87 16 69 SPE-UGLJENIČNI ENVI-Carb Supelclean 52 17 1 1 1 7 70 63 1 3 90 50 68 1 SPE-KATJONSKI MCX Oasis 82 73 34 78 36 61 112 120 2 80 91 90 86 90 Arom. Sulf. Acid Bakerbond 88 1 73 110 28 38 80 66 2 70 84 106 86 48 LC-SCX Supelclean 78 2 15 99 12 39 68 46 3 102 93 98 96 89 SPE-HLB I HLB Oasis 103 88 77 115 81 55 112 85 100 84 98 102 93 100 SPE-HLB II HLB Oasis (pH = 3) 102 86 47 81 36 58 91 65 4 89 91 93 89 93 SPE-HLB III HLB Oasis (pH = 3; Na2EDTA) 85 62 45 72 66 82 18 5 3 92 93 94 92 80 H2O-Philic DVB Bakerbond (pH = 3; Na2EDTA) 89 85 76 110 107 83 61 4 3 93 98 92 89 90 SPE-DIJATOMIT I DIJATOMIT I 78 33 12 16 7 19 14 17 34 54 49 24 41 69 DIJATOMIT I (Na2EDTA) 55 17 13 11 5 13 25 17 35 20 23 22 50 13 DIJATOMIT I (TCA) 27 14 15 9 17 17 19 3 24 22 30 21 43 39 SPE-DIJATOMIT II DIJATOMIT II 108 28 15 12 11 38 9 57 78 43 40 35 63 24 DIJATOMIT II (Na2EDTA) 32 18 11 19 8 3 30 9 15 18 46 43 85 27 DIJATOMIT II (TCA) 46 23 17 5 17 5 12 58 1 17 46 38 92 40 4. REZULTATI I DISKUSIJA 80 Nakon HLB kertridža, sledeći po efikasnosti ekstrakcije odabranih lekova iz vode je H2O-Philic DVB kertridž. Iako su prinosi metode na ovom adsorbensu prilično visoki za većinu analita (76–110%), u slučaju doksiciklina i eritromicina su dobijeni veoma niski prinosi (4% i 3%). Korišćenjem SDB-1 Bakerbond SPE kolone dobijeni su niski prinosi metode za značajan broj analita. Iako su adsorbensi SDB-1 Bakerbond i ENVI-Chrom P Supelclean sličnog sastava, ekstrakcija lekova je bila znatno uspešnija na ENVI-Chrom P adsorbensu. Paracetamol i cefaleksin su najefikasnije ekstrahovani upotrebom ovog kertridža. Međutim, značajan broj ostalih analita nije uspešno ekstrahovan, kao npr. diazepam (16%), amoksicilin i eritromicin (po 32%), ampicilin i doksiciklin (po 44%), zbog čega ovaj kertridž nije odabran za dalji razvoj SPE procedure. Iako katjonski adsorbensi omogućavaju efikasnu ekstrakciju trimetoprima (78–88%), sulfametoksazola (78–100%), bromazepama (70–102%), karbamazepina (84–93%), lorazepama (90–106%) i diazepama (86–96%), zbog veoma niske ekstrakcije eritromicina (2–3%), kao i paracetamola, nisu odabrani za dalji razvoj SPE metode. Utvrđeno je da C18-kertridži, kao i ugljenični kertridž, nisu pogodni za ekstrakciju odabranih lekova iz vode, pošto se mnogo bolji prinosi dobijaju upotrebom drugih testiranih adsorbenasa. Slični rezultati dobijeni su i za ekstrakciju na dijatomejskoj zemlji, posebno prema proceduri DIJATOMIT I. Prinosi ekstrakcija na dijatomejskoj zemlji su generalno niski za većinu odabranih analita. Postoji svega nekoliko izuzetaka, kao što su ekstrakcija trimetoprima i eritromicina na netretiranoj dijatomejskoj zemlji, prema SPE proceduri DIJATOMIT II, kao i ekstrakcija diazepama prema istoj proceduri na dijatomejskoj zemlji tretiranoj trihlorsirćetnom kiselinom. Ipak, rezultati ukazuju na to kertridži pakovani dijatomejskom zemljom nisu prihvatljivi za ekstrakciju odabranih lekova iz vode. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 81 4.4.2. Izbor optimalne pH-vrednosti uzorka vode Za optimizaciju pH-vrednosti uzorka vode u cilju dobijanja najboljih prinosa metode za ispitivane lekove odabrane su sledeće vrednosti: 3,0, 4,5, 6,0 i 7,5. Vrednost pH od 7,5 odgovara prosečnoj pH-vrednosti prirodnih voda. Rezultati eksperimenta su predstavljeni u tabeli 9 i grafički na slikama 46 i 47. Tabela 9. Prinosi i ponovljivosti metoda za različite pH-vrednosti uzorka vode. PRINOS METODE, % (RSD) pH-vrednost uzorka vode LEK pH = 3,0 pH = 4,5 pH = 6,0 pH = 7,5 ESI(+)MS Trimetoprim 82 (7) 73 (7) 58 (4) 64 (8) Paracetamol 27 (6) 50 (8) 31 (7) 30 (3) Amoksicilin 6 (0) 5 (0) 10 (1) 11 (0) Sulfametoksazol 91 (11) 50 (11) 57 (6) 78 (8) Ampicilin 16 (1) 11 (1) 20 (0) 28 (0) Cefaleksin 31 (1) 20 (4) 11 (1) 24 (6) Azitromicin 90 (7) 53 (3) 32 (4) 11 (6) Doksiciklin 96 (6) 25 (6) 62 (6) 52 (13) Eritromicin 35 (3) 62 (2) 63 (3) 75 (7) Bromazepam 86 (1) 67 (2) 62 (3) 76 (0) Karbamazepin 92 (8) 73 (3) 67 (11) 88 (14) Lorazepam 86 (6) 82 (6) 68 (7) 85 (6) Diazepam 94 (3) 80 (3) 63 (0) 82 (3) Diklofenak 76 (17) 75 (16) 70 (11) 86 (8) ESI(–)MS Acetilsalicilna kis. 78 (3) 10 (3) 23 (6) 1 (0) Metamizol 3 (0) 12 (3) 22 (6) 26 (4) Fenobarbiton 86 (18) 60 (16) 62 (7) 76 (8) Ibuprofen 80 (6) 80 (17) 69 (4) 69 (14) Flurbiprofen 78 (11) 88 (17) 50 (8) 86 (10) 4. REZULTATI I DISKUSIJA 82 Rezultati su pokazali da za sve odabrane lekove postoji zavisnost prinosa metode od pH-vrednosti. Ovo je posebno izraženo za azitromicin, doksiciklin i acetilsalicilnu kiselinu (slike 46 i 47). Da bi se ovi lekovi ekstrahovali sa visokom efikasnošću neophodna je jako kisela sredina (pH = 3,0). S druge strane, niske pH-vrednosti treba izbegavati pri ekstrakciji eritromicina i metamizola. Za većinu analita (63%), prinosi metode su bili najveći na pH = 3,0. Na pH = 7,5 značajnih 26% analita je predkoncentrisano sa najvećim prinosima. Za samo dva analita, paracetamol i flurbiprofen, pH = 4,5 je bila optimalna pH-vrednost. Međutim, flurbiprofen je ekstrahovan sa visokim prinosom i na pH-vrednostima 3,0 i 7,5 (slika 47). Za paracetamol (slika 46), pH-vrednost 4,5 je izgleda jedini izbor, pošto je prinos metode bio 20% veći nego na drugim pH-vrednostima. Ni u jednom slučaju, vrednost pH = 6,0 nije bila optimalna za ekstrakciju ispitivanih analita. Utvrđeno je da ekstrakciju odabranih lekova iz vode treba izvoditi na dve pH-vrednosti, tj. bez podešavanja pH uzorka vode (pH ~ 7,5) i na pH = 3. 0 20 40 60 80 100 120 D ik lo fe na k Tr im et op rim D ia ze pa m Lo ra ze pa m K ar ba m az ep in Br om az ep am Er itr om ic in A zi tro m ic in D ok si ci kl in A m ok si ci lin Su lfa m et ok sa zo l A m pi ci lin Ce fa le ks in Pa ra ce ta m ol pH = 3,0 pH = 4,5 pH = 6,0 pH = 7,5Pr in os m et od e (% ) Slika 46. Prinosi metode odabranih lekova koji se analiziraju kao pozitivni joni na različitim pH-vrednostima. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 83 0 20 40 60 80 100 120 pH = 3,0 pH = 4,5 pH = 6,0 pH = 7,5 M et am iz ol Fe no ba rb ito n Ib up ro fe n Fl ur bi pr of en A ce til sa lic iln a ki s. Pr in os m et od e (% ) Slika 47. Prinosi metode odabranih lekova koji se analiziraju kao negativni joni na različitim pH-vrednostima. 4.4.3. Izbor optimalne zapremine eluenta Sledeći korak u razvoju SPE metode bila je optimizacija zapremine rastvarača koja je potrebna za potpuno eluiranje analita sa SPE adsorbensa. U preliminarnim eksperimentima, kao eluenti su testirani metanol, dihlormetan, acetonitril i njihove smeše. Najbolji rezultati, tj. dobri prinosi i čisti ekstrakti, dobijeni su sa metanolom, zbog čega je odabran kao ekstrakcioni eluent, bez dodatka drugih rastvarača. Manji prinosi metode, dobijeni korišćenjem acetonitrila ili dihlormetana kao eluenta, mogu se objasniti slabom rastvorljivošću pojedinih analita u ovim rastvaračima. Tako su, na primer, β-laktami nerastvorni u acetonitrilu. Za eluiranje lekova sa HLB SPE kertridža testirane su zapremine metanola od 7, 10, 13 i 15 cm3. Rezultati, prikazani u tabeli 10, su pokazali da je za većinu odabranih lekova zapremina od 7 cm3 metanola dovoljna za potpuno eluiranje sa kolone. Izuzetak su makrolidi, eritromicin i azitromicin. Naime, sa sledeća 3 cm3 metanola eluirano je dodatnih 2% eritromicina, ukazujući na to da je 10 cm3 metanola potrebno za potpuno eluiranje ovog leka sa SPE kertridža. Azitromicin je eluiran sa kolone tek sa poslednja 2 cm3 metanola, što predstavlja 15 cm3 ekstrakcionog rastvarača potrebnog za njegovo eluiranje sa kolone. Konačno je utvrđeno da je 15 cm3 metanola optimalna zapremina rastvarača za eluiranje svih odabranih analita sa SPE adsorbensa. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 84 Tabela 10. Prinosi metoda za različite zapremine eluenta (pH = 4,5). PRINOS METODE (%) Zapremina eluenta LEK 7 cm3 +3 cm3 +3 cm3 +2 cm3 ESI(+)MS Trimetoprim 83 – – – Paracetamol 85 – – – Amoksicilin 38 – – – Sulfametoksazol 78 – – – Ampicilin 68 – – – Cefaleksin 59 – – – Azitromicin – – – 64 Doksiciklin 15 – – – Eritromicin 80 2 – – Bromazepam 66 – – – Karbamazepin 95 – – – Lorazepam 84 – – – Diazepam 85 – – – Diklofenak 96 – – – ESI(–)MS Acetilsalicilna kis. 25 – – – Metamizol 10 – – – Fenobarbiton 105 – – – Ibuprofen 68 – – – Flurbiprofen 91 – – – 4.4.4. Izbor optimalne zapremine uzorka vode Poslednji korak u razvoju i optimizaciji SPE procedure bio je izbor zapremine uzorka vode koja će, pre svega, omogućiti što veći faktor predkoncentrisanja uzorka. Međutim, ukoliko je zapremina uzorka prevelika, postoji mogućnost ispiranja i gubitka analita sa kolone pre eluiranja rastvaračem. Takođe je potrebno uzeti u obzir da analiza manjih zapremina uzorka značajno skraćuje vreme analize. Testirane su zapremine od 50, 100, 250 i 500 cm3 uzorka vode. Rezultati su prikazani u tabeli 11. Za većinu analita, najveći prinosi su dobijeni u slučaju predkoncentrisanja 100 cm3 ili 250 cm3 uzorka vode. Polovina ovih analita je pokazivala i do 30% veće prinose za zapreminu uzorka od 250 cm3. Međutim, sa izuzetkom eritromicina, njihovi prinosi pri analizi 100 cm3 uzorka bili su i dalje visoki 4. REZULTATI I DISKUSIJA 85 (> 80%) i prihvatljivi. Najizraženija razlika u prinosima dobijena je za azitromicin, koji pokazuje smanjenje prinosa od skoro 70% kada se umesto 100 cm3 analizira 250 cm3 uzorka vode. Zapremina uzorka od 500 cm3 je prevelika, u smislu vremena analize i značajnog gubitka analita. Ovo je posebno izraženo za doksiciklin koji pokazuje smanjenje prinosa od 61% u poređenju sa prinosom za 250 cm3 uzorka. Samo za dva analita, lorazepam i ibuprofen, zapremina od 500 cm3 bila je optimalna. Međutim, njihovi prinosi za 100 cm3 uzorka bili su oko 100%. Nekoliko analita za koje je optimalna zapremina od 50 cm3, izuzev paracetamola, pokazuju nešto manje prinose prilikom analize 100 cm3 uzorka vode. Konačno je utvrđeno da je za analizu optimalna zapremina uzorka od 100 cm3, jer omogućava visoke prinose metode za većinu odabranih lekova i značajno skraćuje vreme SPE procedure. Tabela 11. Prinosi metoda za različite zapremine uzorka vode (pH = 3). PRINOS METODE (%) Zapremina uzorka vode LEK 50 cm3 100 cm3 250 cm3 500 cm3 ESI(+)MS Trimetoprim 136 115 85 61 Paracetamol 57 34 18 15 Amoksicilin 25 24 15 16 Sulfametoxazol 68 108 85 75 Ampicilin 37 52 2 6 Cefaleksin 65 60 21 10 Azitromicin 97 117 48 – Doxiciklin 66 82 101 40 Eritromicin 16 18 26 22 Bromazepam 84 99 107 71 Karbamazepin 90 103 105 99 Lorazepam 94 100 98 105 Diazepam 86 93 105 99 Diklofenak 64 81 111 96 ESI(–)MS Acetilsalicilna kis. 88 110 96 85 Metamizol 3 12 3 – Fenobarbiton 88 100 110 90 Ibuprofen 54 102 90 115 Flurbiprofen 55 120 112 89 4. REZULTATI I DISKUSIJA 86 4.4.5. Validacija razvijene metode Razvijena i optimizovana metoda je konačno testirana na uzorku podzemne vode u koji je dodata smeša svih odabranih lekova tako da koncentracija u ispitivanom uzorku iznosi 100 i 500 ng dm–3. Prinosi metode i ponovljivost, izražena kao relativna standardna devijacija (RSD), su određeni analizom tri probe svakog uzorka, u tri dana. Rezultati su prikazani u tabeli 12. Tabela 12. Prinosi i ponovljivost razvijene metode sa vrednostima granice detekcije i kvantifikacije za ispitivane lekove. PRINOS METODE, % (RSD) c = 100 ng dm–3 c = 500 ng dm–3 LEK pH = 3,0 pH ~ 7,5 pH = 3,0 pH ~ 7,5 LOD (ng dm–3) LOQ (ng dm–3) ESI(+)MS Trimetoprim 87 (13) 82 (8) 92 (6) 111 (10) 0,34 1,14 Paracetamol 35 (12) 80 (19) 23 (18) 97 (8) 0,50 1,67 Amoksicilin 22 (13) 51 (6) 17 (8) 55 (6) 0,79 2,63 Sulfametoksazol 91 (8) 94 (3) 85 (3) 103 (14) 1,24 4,13 Ampicilin 17 (21) 74 (14) 28 (10) 70 (16) 1,73 5,77 Cefaleksin 44 (19) 48 (6) 38 (7) 52 (5) 1,63 5,44 Azitromicin 90 (9) 65 (22) 86 (8) 41 (15) 2,58 8,59 Doksiciklin 98 (11) 62 (6) 118 (14) 43 (7) 8,06 26,88 Eritromicin 23 (16) 96 (4) 14 (16) 90 (13) 1,65 5,48 Bromazepam 100 (3) 94 (8) 97 (7) 112 (3) 1,35 4,52 Karbamazepin 89 (17) 108 (16) 92 (12) 114 (8) 0,27 0,90 Lorazepam 110 (6) 96 (13) 104 (5) 109 (2) 0,55 1,82 Diazepam 90 (24) 92 (5) 94 (15) 95 (10) 0,76 2,54 Diklofenak 96 (9) 102 (5) 92 (18) 120 (6) 0,15 0,49 ESI(–)MS Acetilsalicilna kis. 100 (11) 7 (11) 82 (3) 14 (20) 3,33 11,10 Metamizol 23 (27) 65 (15) 16 (22) 67 (17) 7,66 25,54 Fenobarbiton 95 (5) 96 (9) 89 (15) 83 (5) 0,99 3,32 Ibuprofen 82 (10) 87 (17) 80 (7) 72 (14) 3,28 10,93 Flurbiprofen 98 (12) 93 (5) 80 (18) 98 (7) 12,46 41,53 RSD su generalno bile manje od 20%, sa nekoliko izuzetaka. Nije uočena zavisnost ponovljivosti metode od koncentracije analita ili pH-vrednosti. Utvrđeno je da azitromicin, doksiciklin i acetilsalicilna kiselina moraju biti ekstrahovani u kiseloj sredini, pošto su njihovi prinosi, npr. za 500 ng dm–3 i pH = 3 bili značajno veći (82–118%) u poređenju sa vrednostima za pH ~ 7.5, tj. bez podešavanja pH (14–43%). Vrednosti pH analiziranih 4. REZULTATI I DISKUSIJA 87 uzoraka prirodne vode bile su u opsegu 6,70–8,39 za površinske i 7,20–7,70 za podzemne vode, što daje prosečnu vrednost od 7,5. Ekstrakcija i predkoncentrisanje paracetamola, ampicilina, eritromicina i metamizola su bili mnogo uspešniji bez podešavanja pH-vrednosti uzorka vode, pošto su njihovi prinosi (67–97%) bili značajno veći nego u kiseloj sredini (14–28%). Iako je za ekstrakciju β-laktama, amoksicilina i cefaleksina, povoljnija pH- -vrednost oko 7,5, prinosi metode od 55% za amoksicilin i 52% za cefaleksin smatraju se niskim. Granice detekcije (LOD) i kvantifikacije (LOQ) razvijene metode za svaki analit su izračunate koristeći odnos signala i šuma (S/N, engl. signal to noise) iz SRM masenih hromatograma za uzorak podzemne vode sa dodatom smešom lekova. Granica detekcije metode je izračunata kao koncentracija pri kojoj bi vrednost S/N iznosila 3, dok vrednost granice kvantifikacije odgovara vrednosti S/N = 10. Rezultati LOD i LOQ su prikazani u tabeli 12. Izračunate vrednosti LOD su bile u opsegu od 0,15 ng dm–3 do 12,46 ng dm–3, dok su odgovarajuće vrednosti LOQ bile u opsegu 0,49–41,53 ng dm–3. Utvrđeno je da najnižu granicu detekcije i kvantifikacije imaju trimetoprim, karbamazepin i diklofenak, a najvišu doksiciklin, metamizol i flurbiprofen. Takođe je testirana linearnost razvijene metode za detekciju odabranih lekova u opsegu koncentracija 10–250 ng cm–3 u konačno dobijenom ekstraktu. U Prilogu su date krive zavisnosti površine pika svakog analita od koncentracije u ekstraktu (slika 66). Za lekove koji se detektuju kao pozitivni joni, koeficijenti korelacije, tj. linearnosti (R), bili su u opsegu od 0,98308 za paracetamol i diklofenak do 0,99939 za lorazepam. Za detekciju negativnih jona, koeficijenti korelacije su bili niži, od 0,98282 za flurbiprofen do 0,99155 za acetilsalicilnu kiselinu. 4.5. KALIBRACIJA I UTICAJ MATRICE Kao kalibraciona metoda korišćena je metoda eksterne kalibracije sa standardima koji odgovaraju matrici uzorka, a koji su pripremljeni za koncentracije 10, 25, 50, 100 i 250 ng cm–3. Za svaki odabrani lek je ispitana linearnost kalibracione krive. Rezultati su pokazali da su kalibracione krive linearne, sa koeficijentima korelacije u opsegu od 0,98717 za metamizol do 0,99980 za ampicilin. Standardi koji odgovaraju matrici su korišćeni da bi se eliminisao uticaj matrice, tj. smanjenje ili povećanje signala analita u prisustvu sastojaka matrice. Uticaj matrice se može izračunati kao odnos površine pika analita u standardu koji odgovara matrici i površine pika analita u rastvaraču. Za većinu odabranih lekova, pri koncentraciji od 100 ng cm–3, uticaj matrice nije bio značajno izražen, pošto je smanjenje ili povećanje signala analita bilo manje od 20%. Međutim, za cefaleksin i metamizol je uočeno značajno smanjenje signala do 35%, koje bi moglo dovesti do netačne kvantifikacije, ukoliko se ne koriste standardi koji odgovaraju matrici. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 88 4.6. ANALIZA REALNIH UZORAKA Razvijena i optimizovana analitička metoda je primenjena na realne uzorke površinskih i podzemnih voda, pri čemu je dobijena studija o stanju zagađenosti voda lekovima koji spadaju u najčešće korišćene u našoj zemlji. Rezultati analize, prikazani u tabeli 13, podeljeni su u četiri grupe prema grupama uzoraka. U prvoj grupi uzoraka vode nalazi se 9 uzoraka iz reke Dunav koji su uzeti u 9 gradova nizvodno od ušća Save u Dunav. Drugu grupu čine uzorci vode uzeti iz nekoliko reka i jezera u Srbiji. Treću grupu sačinjavaju uzorci vode iz otpadnih kanala, zatim uzorci podzemne vode iz pijezometara u blizini otpadnih kanala, kao i uzorci savske vode nizvodno od izlivanja kanala u reku. U četvrtoj grupi se nalaze uzorci vode iz reni bunara i pogona za preradu vode Bežanija. U pogonu za preradu vode Bežanija uzeta su tri uzorka vode: po jedan uzorak iz dva aeratora – Progar i Ušće u kojima se nalazi sirova voda sakupljena iz reni bunara iz pravca Progara i iz pravca Ušća, kao i uzorak iz bazena čiste vode, nakon faze dezinfekcije. Takođe je uzet po jedan uzorak vode iz reni bunara kod Progara (RB-92) i reni bunara na Ušću (RB-4). Ispitivanje je pokazalo da je oko 80% ispitivanih uzoraka voda sadržalo tragove lekova. Odabrani lekovi nisu detektovani u dva uzorka podzemne vode iz pijezometara 5 i 2, zatim u uzorku vode iz reni bunara 4, niti u rečnoj vodi iz Nišave. Posebno je značajno da uzorak iz bazena čiste vode, nakon faze dezinfekcije u pogonu za preradu vode Bežanija, nije sadržao tragove ispitivanih lekova, što je u skladu sa rezultatom analize uzorka česmenske vode koji nije sadržao tragove analita. Od devetnaest traženih lekova, u uzorcima voda su detektovana četiri leka – trimetoprim, paracetamol, azitromicin i karbamazepin. U 80% analiziranih uzoraka vode pronađeni su tragovi karbamazepina, u opsegu koncentracija 6–130 ng dm–3. Karbamazepin je jedan od najčešće detektovanih lekova u vodenoj sredini, iako se izlučuje u aktivnom obliku u svega nekoliko procenata (Ternes 1998). Koncentracija ovog antiepileptika u površinskim i podzemnim vodama u Srbiji je slična vrednostima koje su pronađene u površinskoj vodi u Švajcarskoj (30–250 ng dm–3, Öllers et al. 2001), Španiji (9–37 ng dm–3, Pedrouzo et al. 2007; do 110 ng dm–3, Gros et al. 2006b), Kanadi (0,20–16 ng dm–3, Hao et al. 2006) i Južnoj Koreji (4,5–61 ng dm–3, Kim et al. 2007). Učestalost detekcije karbamazepina u površinskim vodama se obično objašnjava malim procentom uklanjanja (< 10%) u procesima prečišćavanja otpadnih voda (Ternes 1998; Gros et al. 2006b). U životnoj sredini, karbamazepin je veoma otporan i prolazi kroz prirodne procese prečišćavanja i filtracije vode na rečnim obalama, zbog čega se detektuje u podzemnim vodama u koncentracijama do 900 ng dm–3 (Sacher et al. 2001). Takođe je potrebno uzeti u obzir da terapija ovim lekom obično traje čitav život, za razliku od terapije antibioticima ili analgoantipireticima, zbog čega postoji konstantan unos karbamazepina u prirodne vode. Karbamazepin je detektovan u svim uzorcima dunavske vode, ali nije uočen pravilan trend promene koncentracije karbamazepina u uzorcima nizvodno od Beograda, kao grada sa najvećim brojem stanovnika. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 89 Tabela 13. Tragovi odabranih lekova u realnim uzorcima voda. KONCENTRACIJA (ng dm–3) UZORCI VODE T rim et op rim Pa ra ce ta m ol A m ok si ci lin Su lfa m et ok sa zo l A m pi ci lin C ef al ek si n A zi tro m ic in D ok si ci kl in Er itr om ic in B ro m az ep am K ar ba m az ep in Lo ra ze pa m D ia ze pa m D ik lo fe na k A ce til sa lic iln a ki s. M et am iz ol Fe no ba rb ito n Ib up ro fe n Fl ur bi pr of en DUNAV Beograd 29 20 Smederevo 24 Ram 55 15 V. Gradište 8,0 D. Milanovac 14 Tekija 170 130 Kladovo 78 20 Kusjak 16 Radujevac 16 Sava 610 50 Nišava Tamiš 24 310 36 30 Očaga (Lazarevac) 174 81 30 Kanal Surčin 12 Kanal Galovica 150 15 Pijezometar 5 Pijezometar 4p 13 Pijezometar 4 14 Pijezometar 2 Sava (Sajam) 29 Sava (B. most) 43 RB-92 (Progar) 25 10 Aerator-Progar 140 6,0 RB-4 (Ušće) Aerator-Ušće 15 Bazen čiste vode 4. REZULTATI I DISKUSIJA 90 Antibiotik azitromicin je detektovan u 22% analiziranih uzoraka vode. Prisustvo ovog leka u prirodnim vodama predstavlja veliki problem, zbog mogućnosti pojave rezistentnosti bakterijskih sojeva na ovaj antibiotik. Koncentracije azitromicina detektovane u površinskim i podzemnim vodama u Srbiji (25–140 ng dm–3) su veće od koncentracija u rečnoj vodi Španije (do 20 ng dm–3, Gros et al. 2006b) i SAD-a (do 77 ng dm–3, Jones-Lepp 2006). Posebno zabrinjava njegovo prisustvo u reni bunaru 92 kod Progara (25 ng dm–3), a zatim i značajno povećana koncentracija u vodi iz aeratora u kome se sakuplja voda iz većeg broja reni bunara iz pravca Progara (140 ng dm–3). Povećanje koncentracije azitromicina ukazuje na to da su i ostali reni bunari iz pravca Progar najverovatnije kontaminirani ovim antibiotikom. Ipak, u procesu prečišćavanja pijaće vode dolazi do njegovog potpunog uklanjanja, što je potvrđeno činjenicom da ovaj lek nije detektovan u uzorku iz bazena čiste vode, niti u česmenskoj vodi. Azitromicin je takođe detektovan u koncentraciji od 150 ng dm–3 u vodi iz otpadnog kanala Galovica. S obzirom na to da u podzemnoj vodi iz pijezometara u blizini kanala nije pronađen azitromicin, može se zaključiti da nije došlo do spiranja ovog antibiotika iz otpadnog kanala do podzemnih voda. Paracetamol je pronađen u 15% ispitivanih uzoraka voda, tj. u četiri uzorka rečne vode, u opsegu koncentracija 78–610 ng dm–3. Ovo su prilično visoke koncentracije, u poređenju sa koncentracijama detektovanim u rečnoj vodi u Španiji (12–30 ng dm–3, Pedrouzo et al. 2007; do 250 ng dm–3, Gros et al. 2006b), Južnoj Koreji (4,1–73 ng dm−3, Kim et al. 2007) i SAD-u (110 ng dm–3, Kolpin et al. 2002). U procesima prečišćavanja otpadnih voda ovaj lek se uklanja sa veoma visokom efikasnošću od 99% (Gómez et al. 2007). Visoki nivoi ovog analgoantipiretika u rečnoj vodi u Srbiji mogu se objasniti činjenicom da gradovi u kojima su uzorci rečne vode uzeti nemaju postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda. Paracetamol se lako degraduje i uklanja u prirodnim procesima prečišćavanja voda, zbog čega nije detektovan u podzemnim vodama u Srbiji, niti u uzorcima vode uzetim u postrojenju za preradu vode za piće, uprkos značajnom konzumiranju ovog leka i visokoj koncentraciji u rečnoj vodi. Trimetoprim, obično u kombinaciji sa sulfametoksazolom, sačinjava lek koji se koristi kao antibiotik. Iako sulfametoksazol nije detektovan u ispitivanim uzorcima voda, trimetoprim je pronađen u 15% ispitivanih uzoraka, u opsegu koncentracija 24–174 ng dm–3. Slično paracetamolu, detektovan je samo u površinskim vodama. U poređenju sa koncentracijama pronađenim u površinskim vodama u Španiji (do 20 ng dm–3, Gros et al. 2006b), Engleskoj (do 42 ng dm–3, Ashton et al. 2004) i Južnoj Koreji (3,2–5,3 ng dm−3, Kim et al. 2007), nivoi detektovani u površinskim vodama u Srbiji su značajno veći, što se ponovo može objasniti nepostojanjem postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 91 4.7. POTVRDA PRISUSTVA ANALITA Potvrda pozitivnih rezultata je izvedena ponovnom analizom ekstrakta uzorka vode uz proširenu analitičku metodu sa dodatnim SRM prelazima odabranim iz tabele 6. Na slikama 48–52 prikazani su karakteristični maseni hromatogrami sa potvrdom prisustva detektovanih lekova, i to: karbamazepina (slika 48), azitromicina (slike 49 i 51), paraceta- mola (slika 50) i trimetoprima (slika 52). Prema sistemu identifikacionih poena, pomoću kojeg je Evropska Unija definisala neophodne uslove za potvrdu prisustva organskih zagađujućih supstanci masenom spektrometrijom (Commission Decision 2002/657/EC), za potvrdu je neophodan minimum od 3 identifikaciona poena. Kod masenog spektrometra niske rezolucije, kakav je jonski trap, prekursor jon ima vrednost jednog identifikacionog poena, a svaki fragmentni jon ima vrednost 1,5 identifikacionih poena. Zbog toga se najmanje dva fragmentna jona moraju koristiti za potvrdu prisustva analita. Ovo je posebno značajno u eliminisanju lažnih pozitivnih rezultata kada se kvantifikacija zasniva na SIM analizi ili jednom SRM prelazu. Zbog toga su za svaki analit odabrana dva SRM prelaza između prekursor jona i dva najintenzivnija fragmentna jona, što ukupno ima vrednost 4 identifikaciona poena. Međutim, za paracetamol postoji samo jedan SRM prelaz (tabela 6), i ne postoje dodatne MSn fragmentacije koje bi se mogle iskoristiti za potvrdu. Potvrda prisustva paracetamola je postignuta poređenjem retencionih vremena analita i standarda paracetamola u SRM hromatogramima (slika 50). Smatra se da je dovoljan dokaz prisustva ovog analita razlika u retencionim vremenima manja od 3% (Gros et al. 2006b). 4. REZULTATI I DISKUSIJA 92 RT: 0.00 - 15.99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 RT: 9.60 AA: 181626 SN: 364 RT: 9.62 NL: 1.06E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [193.90-194.90] NL: 7.82E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [219.30-220.30] RAM a) R el at iv e A bu nd an ce REAKCIJA KVANTIFIKACIJE ESI(+)MS2 m/z 237 → m/z 194 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS2 m/z 237 → m/z 220 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce RT: 9.68 MA: 239339 SN: 144 RT: 9.70 NL: 2.08E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [193.90-194.90] NL: 4.38E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [219.30-220.30] TEKIJA b) NL: 9.64E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [219.30-220.30] 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce RT: 9.68 MA: 433988 SN: 341 RT: 9.70 MM STANDARD 50 ng cm-3 c) NL: 4.05E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 237.10@30.00 [193.90-194.90] R el at iv e A bu nd an ce R el at iv e A bu nd an ce Slika 48. Maseni hromatogrami sa potvrdom prisustva karbamazepina: a) uzorka RAM; b) uzorka TEKIJA; c) standarda koncentracije 50 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 93 RT: 0.00 - 16.08 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 RT: 5.47 AA: 3351587 SN: 324 RT: 5.48 NL: 8.54E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 749.30@25.00 [590.30-592.30] NL: 1.27E4 TIC F: + c ESI CRM ms3 749.30@25.00 591.30@28.00 [433.30-435.30] RAM a) R el at iv e A bu nd an ce REAKCIJA KVANTIFIKACIJE ESI(+)MS2 m/z 749 → m/z 591 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS3 m/z 749 → m/z 591 → m/z 434 RT: 0.00 - 16.08 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 RT: 5.46 AA: 6096131 SN: 505 RT: 5.48 NL: 1.42E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 749.30@25.00 [590.30-592.30] NL: 5.66E4 TIC F: + c ESI CRM ms3 749.30@25.00 591.30@28.00 [433.30-435.30] MM STANDARD 100 ng cm-3 b) R el at iv e A bu nd an ce Slika 49. Maseni hromatogrami sa potvrdom prisustva azitromicina: a) uzorka RAM; b) standarda koncentracije 100 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 94 RT: 0.00 - 15.99 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce RT: 2.17 AA: 414090 SN: 119 NL: 1.41E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 152.10@32.00 [109.10-110.10] a) KLADOVO R el at iv e A bu nd an ce REAKCIJA KVANTIFIKACIJE ESI(+)MS2 m/z 152 → m/z 110 RT: 0.00 - 16.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 R el at iv e A bu nd an ce RT: 2.17 AA: 525173 SN: 196 NL: 3.85E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 152.10@32.00 [109.10-110.10] b) MM STANDARD 100 ng cm-3 R el at iv e A bu nd an ce Slika 50. Maseni hromatogrami paracetamola: a) uzorka KLADOVO; b) standarda koncentracije 100 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 95 RT: 0.00 - 16.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 RT: 5.48 AA: 4253130 SN: 320 NL: 7.62E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 749.30@25.00 [590.30-592.30] NL: 1.90E4 TIC F: + c ESI CRM ms3 749.30@25.00 591.30@28.00 [ 433.30-435.30] RT: 5.40 GALOVICA a) R el at iv e A bu nd an ce REAKCIJA KVANTIFIKACIJE ESI(+)MS2 m/z 749 → m/z 591 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS3 m/z 749 → m/z 591 → m/z 434 RT: 0.00 - 15.97 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 0 20 40 60 80 100 RT: 5.50 AA: 7421884 SN: 547 RT: 5.41 NL: 4.15E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 749.30@25.00 [590.30-592.30] NL: 1.67E5 TIC F: + c ESI CRM ms3 749.30@25.00 591.30@28.00 [ 433.30-435.30] MM STANDARD 250 ng cm-3 b) R el at iv e A bu nd an ce Slika 51. Maseni hromatogrami sa potvrdom prisustva azitromicina: a) uzorka GALOVICA; b) standarda koncentracije 250 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 96 RT: 0.00 - 16.01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 RT: 1.41 MA: 200848 SN: 158 RT: 1.46 RT: 1.37 RT: 1.39 NL: 2.50E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [122.32-123.85] NL: 1.72E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [229.35-230.85] NL: 9.44E3 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [257.35-258.85] NL: 1.48E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [274.45-275.95] TAMIŠ a)REAKCIJA KVANTIFIKACIJEESI(+)MS2 m/z 291 → m/z 123 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS2 m/z 291 → m/z 230 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS2 m/z 291 → m/z 258 REAKCIJA POTVRDE ESI(+)MS2 m/z 291 → m/z 275 RT: 0.00 - 16.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Time (min) 0 50 100 0 50 100 0 50 100 0 50 100 RT: 1.40 MA: 1532758 SN: 359 RT: 1.46 RT: 1.37 RT: 1.39 NL: 1.29E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [122.32-123.85] NL: 1.03E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [229.35-230.85] NL: 9.19E4 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [257.35-258.85] NL: 1.54E5 TIC F: + c ESI SRM ms2 291.20@40.00 [274.45-275.95] MM STANDARD 50 ng cm-3 b) Slika 52. Maseni hromatogrami sa potvrdom prisustva trimetoprima: a) uzorka Tamiš; b) standarda koncentracije 50 ng cm–3. 4. REZULTATI I DISKUSIJA 97 Prilikom analize uzoraka voda uočeno je nekoliko lažnih pozitivnih rezultata, od kojih je najizraženiji bio lažni pozitivni rezultat za diklofenak u svakom analiziranom uzorku vode (slika 53). U cilju identifikacije ovog jedinjenja snimljen je MS2 spektar fragmentacije nepoznatog jona. Masa nepoznatog jona je m/z 296 i javlja se na istoj m/z vrednosti kao i diklofenak. Kao što se može videti na slici 53a, fragmentacijom jona m/z 296 nastaje najintenzivniji jon m/z 278 (kao u slučaju diklofenaka), kao i manje zastupljeni joni m/z 261, 243, 233 i 170. Dodatni fragmentni joni diklofenaka (slika 53c) su m/z 250 i slabo zastupljeni m/z 215, 230 i 249. Maseni hromatogram standarda koji odgovara matrici uzorka (slika 53b) jasno pokazuje prisustvo dva jedinjenja sa istom reakcijom fragmentacije m/z 296 → m/z 278. Nepoznato jedinjenje se eluira sa hromatografske kolone oko 1,2 min. nakon diklofenaka, zbog čega nema sumnje da je maseni hromatogram prikazan na slici 53a lažni pozitivni rezultat. Činjenica da je promenom gradijenta mobilne faze moguće uticati na pomeranje retencionog vremena ovog jedinjenja i njegovo eluiranje zajedno sa diklofenakom, ukazuje na neophodnost potvrde pozitivnih rezultata. Slika 53. Maseni hromatogrami za reakciju fragmentacije m/z 296 → m/z 278: a) uzorka rečne vode sa lažnim pozitivnim rezultatom; b) standarda diklofenaka u matrici; c) standarda diklofenaka u rastvaraču, sa MS2 spektrima jona m/z 296. 98 Zaključak Cilj ovog rada bio je razvoj i primena nove, brze i osetljive multirezidualne analitičke metode za određivanje tragova odabranih antibiotika, sedativa i analgoantipiretika u vodi. U radu je razvijen postupak za efikasnu ekstrakciju i predkoncentrisanje veoma različitih analita, optimizovano je hromatografsko razdvajanje analita i uspostavljeni su protokoli za potvrdu prisustva analita pomoću masenog detektora. Posebna pažnja je posvećena izboru reakcija za pouzdanu maseno-spektrometrijsku detekciju tragova lekova i razvoju novih načina identifikacije i nedvosmislene potvrde prisustva analita. Razvijena metoda je primenjena na realne uzorke površinskih i podzemnih voda, pri čemu je dobijena prva studija o stanju zagađenosti vode lekovima koji spadaju među najčešće korišćene u našoj zemlji (Grujic et al. 2009). Na osnovu rezultata dobijenih u ovom radu može se zaključiti sledeće: o optimalnim uslovima za ekstrakciju na čvrstoj fazi i predkoncentrisanje tragova devetnaest najčešće korišćenih lekova iz vode: Veoma različiti analiti, iz farmakoloških grupa antibiotika (β-laktami, cefalosporini, sulfonamidi, makrolidi i tetraciklini), benzodiazepina, antiepileptika i analgoanti- piretika, najefikasnije se mogu ekstrahovati iz vode upotrebom OASIS® HLB SPE kertridža. Ekstrakciju odabranih lekova iz vode neophodno je izvesti na dve pH-vrednosti, u kiseloj sredini (pH = 3) i bez podešavanja pH (pH ~ 7,5). Za ekstrakciju azitromicina, doksiciklina i acetilsalicilne kiseline potrebna je jako kisela sredina, a treba je izbegavati pri ekstrakciji paracetamola, ampicilina, eritromicina i metamizola. Najpogodniji rastvarač za eluiranje odabranih lekova sa kolone je metanol. Za potpuno eluiranje većine odabranih lekova sa SPE kolone (OASIS® HLB, 200 mg/ 6 cm3) dovoljno je 7 cm3 metanola. Izuzetak su makrolidi – eritromicin i azitromicin, za čije je potpuno eluiranje potrebno 10 cm3, odnosno 15 cm3 metanola. Optimalna zapremina uzorka vode za analizu je 100 cm3, što značajno skraćuje vreme pripreme uzorka i daje faktor predkoncentrisanja 100. Za većinu ispitivanih analita dobijeni su visoki prinosi razvijene metode, uglavnom veći od 80%. Jedino se prinosi od 55% za amoksicilin i 52% za cefaleksin smatraju niskim. Granice detekcije razvijene metode su u opsegu 0,15–12,46 ng dm–3, dok su odgovarajuće granice kvantifikacije u opsegu 0,49–41,53 ng dm–3. Najnižu granicu detekcije i kvantifikacije imaju trimetoprim, karbamazepin i diklofenak, a najvišu doksiciklin, metamizol i flurbiprofen. S obzirom na to da su vrednosti granica detekcije i kvantifikacije reda veličine onih koje se očekuju u uzorcima prirodnih voda, razvijena i optimizovana metoda je primenljiva u analizi realnih uzoraka voda. Ponovljivost razvijene metode je dobra, sa vrednostima RSD uglavnom manjim od 20%. Metoda je linearna, sa koeficijentima korelacije od 0,98308 za paracetamol i diklofenak do 0,99939 za lorazepam, za lekove koji se detektuju kao pozitivni joni. Za detekciju negativnih jona, koeficijenti korelacije su niži, od 0,98282 za flurbiprofen do 0,99155 za acetilsalicilnu kiselinu. 5 . Z A K L J U Č N A R A Z M A T R A N J A 5. ZAKLJUČNA RAZMATRANJA 99 Za većinu odabranih lekova uticaj matrice nije izražen, pošto je smanjenje ili povećanje signala analita manje od 20%. Međutim, za cefaleksin i metamizol je uočeno značajno smanjenje signala do 35%, koje bi moglo dovesti do pogrešne kvantifikacije. Uticaj matrice se može uspešno eliminisati upotrebom standarda koji odgovaraju matrici. o maseno-spektrometrijskoj detekciji, identifikaciji, kvantifikaciji i nedvosmislenoj potvrdi prisustva tragova devetnaest najčešće korišćenih lekova: Lekovi koji se analiziraju kao pozitivni joni, čija identifikacija i kvantifikacija se zasniva na izolovanju protonovanog molekula, kao prekursor jona za dalju MSn analizu, su sledeći: trimetoprim, eritromicin, azitromicin, diazepam, bromazepam, karbamazepin i paracetamol. Farmaceutska jedinjenja koja se analiziraju kao negativni joni su: fenobarbiton, ibuprofen, metamizol, flurbiprofen i acetilsalicilna kiselina. Za ampicilin, amoksicilin, cefaleksin, sulfametoksazol, doksiciklin, lorazepam i diklofenak, koji u procesu jonizacije stvaraju i pozitivne i negativne jone, intenzitet pozitivnih jona je značajno veći od intenziteta negativnih jona, zbog čega je dalje potrebno izvoditi MSn analizu pozitivnih jona. Za pouzdanu identifikaciju i kvantifikaciju tragova β-laktama – ampicilina, amoksi- cilina i cefaleksina, može se koristiti protonovani adukt sa metanolom, kao prekursor jon za dalju MSn analizu (Grujic et al. 2008). Kvantifikacija odabranih analita može se uspešno izvesti na osnovu jednog SRM prelaza, tj. karakteristične reakcije fragmentacije prekursor jona u najintenzivniji i najstabilniji fragmentni jon. Dodatne MSn reakcije se mogu iskoristiti za potvrdu prisustva analita, tj. za potvrdu pozitivnih rezultata u realnim uzorcima, ponovnom analizom pozitivnih uzoraka uz proširenu metodu sa dodatnim SRM prelazima, u skladu sa sistemom koji je definisala Evropska Unija. Potvrda prisustva analita je veoma važna zbog eliminisanja lažnih pozitivnih rezultata, koji su posebno uočeni za diklofenak u svakom analiziranom uzorku vode. U slučaju paracetamola, flurbiprofena i acetilsalicilne kiseline, za koje nije moguće dobiti više od jednog fragmentnog jona u MS/MS analizi, niti stabilnu MS3 fragmentaciju, potvrda se može postići poređenjem retencionih vremena pozitivnih rezultata i analitičkih standarda u SRM hromatogramima, pri čemu odstupanje treba biti manje od 3%. Pri kvantifikaciji tragova analita koji se analiziraju kao pozitivni joni neophodno je koristiti sirćetnu kiselinu kao aditiv mobilne faze, jer značajno povećava intenzitet protonovanih molekula analita, dok bi amonijum-acetat trebalo izbegavati. 100 Multirezidualna analitička metoda razvijena i optimizovana u ovom radu je brza, osetljiva, precizna i pouzdana za određivanje i potvrdu tragova odabranih lekova iz farmakoloških grupa antibiotika (β-laktama, cefalosporina, sulfonamida, makrolida i tetraciklina), benzodiazepina, antiepileptika i analgoantipiretika u vodi, koji spadaju među najčešće korišćene u našoj zemlji. Razvijen je postupak za efikasnu ekstrakciju i predkoncentrisanje veoma različitih analita iz vode. Odabrani lekovi se najefikasnije mogu ekstrahovati iz vode upotrebom OASIS® HLB SPE kolone. Optimalna zapremina uzorka vode za analizu je 100 cm3. Ekstrakciju je neophodno izvesti na dve pH-vrednosti, u kiseloj sredini (pH = 3) i bez podešavanja pH (pH ~ 7,5). Za potpuno eluiranje odabranih lekova sa kolone potrebno je 15 cm3 metanola. U radu je optimizovano hromatografsko razdvajanje analita i uspostavljeni su protokoli za potvrdu prisustva analita pomoću masenog detektora. Posebna pažnja je posvećena izboru reakcija za pouzdanu maseno-spektrometrijsku detekciju tragova lekova i razvoju novih načina identifikacije i nedvosmislene potvrde prisustva analita. Tako se za pouzdanu identifikaciju i kvantifikaciju tragova β-laktama može koristiti protonovani adukt sa metanolom, kao prekursor jon za dalju MSn analizu. Primenom metode u analizi realnih uzoraka površinskih i podzemnih voda dobijena je prva studija o stanju zagađenosti vode lekovima u našoj zemlji. Od devetnaest traženih lekova, detektovani su tragovi četiri leka – trimetoprima, paracetamola, azitromicina i karbamazepina. Karbamazepin je detektovan u 80% analiziranih uzoraka voda, u opsegu koncentracija 6–130 ng dm–3. Antibiotik azitromicin je detektovan u 22% uzoraka (25–140 ng dm–3), dok su paracetamol (78–610 ng dm–3) i trimetoprim (24–174 ng dm–3) pronađeni u 15% uzoraka površinske i podzemne vode. U poređenju sa koncentracijama ovih lekova detektovanim u vodama evropskih zemalja, koncentracije u vodama u Srbiji su prilično visoke, što se može objasniti činjenicom da gradovi u kojima su uzorci vode uzeti nemaju postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda. Od svih pronađenih lekova, prisustvo azitromicina predstavlja najveći problem, zbog mogućnosti pojave rezistentnosti bakterijskih sojeva na ovaj antibiotik. Posebno zabrinjava njegovo prisustvo u vodi iz reni bunara, a zatim i značajno veća koncentracija u vodi iz aeratora u kome se sakuplja voda iz velikog broja reni bunara. Ipak, u procesu prečišćavanja pijaće vode dolazi do njegovog potpunog uklanjanja, što je potvrđeno činjenicom da azitromicin nije detektovan u uzorku iz bazena čiste vode, niti u česmenskoj vodi. Zapravo, uzorak iz bazena čiste vode i uzorak česmenske vode nisu sadržali tragove nijednog od ispitivanih lekova. 6 . Z A K L J U Č A K 101 1. Ahmed F.E. (2001): Analyses of pesticides and their metabolites in foods and drinks, Trends Anal. Chem., 11, 649–661. 2. Ahrer W., Scherwenk E. and Buchberger W. (2001): Determination of drug residues in water by the combination of liquid chromatography or capillary electrophoresis with electrospray mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 910, 69–78. 3. Al-Ghazali M.R., Jazrawi S.F. and Al-Doori Z.A. (1988): Antibiotic resistance among pollution indicator bacteria isolated from Al-Khair River, Baghdad, Water Res., 22, 641–644. 4. Alvero C.C. (1987): Antibiotic resistance of heterotrophic bacterial flora of two lakes, System Appl. Microbiol., 9, 169–172. 5. Andreozzi R., Raffaele M. and Nicklas P. (2003): Pharmaceuticals in STP effluents and their solar photodegradation in aquatic environment, Chemosphere, 50, 1319–1330. 6. Ardrey R.E. (2003): Liquid chromatography–mass spectrometry: an introduction, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, West Sussex, England. 7. Arthur C.L. and Pawliszyn J. (1990): Solid phase microextraction with thermal desorption using fused silica optical fibers, Anal. Chem., 62, 2145–2148. 8. Ashton D., Hilton M. and Thomas K.V. (2004): Investigating the environmental transport of human pharmaceuticals to streams in the United Kingdom, Sci. Total Environ., 333, 167–184. 9. Balakrishnan V.K., Terry K.A., Toito J. (2006): Determination of sulfonamide antibiotics in wastewater: A comparison of solid phase microextraction and solid phase extraction methods, J. Chromatogr. A, 1131, 1–10. 10. Barker S.A, Long A.R. and Short C.R. (1989): Isolation of drug residues from tissues by solid-phase dispersion, J. Chromatogr. A, 475, 353–361. 11. Barker S.A. (2000): Matrix solid-phase dispersion, J. Chromatogr. A, 885, 115–127. 12. Bartolucci G., Pieraccini G., Villanelli F., Moneti G. and Triolo A. (2000): Liquid chromatography tandem mass spectrometric quantitation of sulfamethazine and its metabolites: direct analysis of swine urine by triple quadrupole and by ion trap mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 967–973. 13. Batt A.L. and Aga D.S. (2005): Simultaneous analysis of multiple classes of antibiotics by ion trap LC/MS/MS for assessing surface water and groundwater contamination, Anal. Chem., 77, 2940–2947. 14. Batt A.L., Bruce I.B, Aga D.S. (2006): Evaluating the vulnerability of surface waters to antibiotic contamination from varying wastewater treatment plant discharges, Environ. Pollut., 142, 295–302. 15. Becker M., Zittlau E. and Petz M. (2004): Residue analysis of 15 penicillins and cephalosporins in bovine muscle, kidney and milk by liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Anal. Chim. Acta, 520, 19–32. 16. Bendz D., Paxeus N.A., Ginn T.R. and Loge F.J. (2005): Occurrence and fate of pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Höje River in Sweden. J. Hazard. Mater., 122, 195–204. 17. Blanchflower W.J., Hewitt S.A. and Kennedy D.G. (1994): Confirmatory assay for the simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using liquid chromatography–electrospray mass spectrometry, Analyst, 199, 2595–2601. L I T E R A T U R A LITERATURA 102 18. Blasco C., Font G. and Picó Y. (2002): Comparison of microextraction procedures to determine pesticides in oranges by liquid chromatography-mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 970, 201–212. 19. Bogialli S., Capitolino V., Curini R., Di Corcia A., Nazzari M. and Sergi M. (2004): Simple and rapid liquid chromatography-tandem mass spectrometry confirmatory assay for determining amoxicillin and ampicillin in bovine tissues and milk, J. Agric. Food Chem., 52, 3286–3291. 20. Borges V. and Henion J. (2005): Determination of pharmaceutical compounds in aqueous dimethyl sulfoxide by electrospray ionization mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 19, 415–423. 21. Botitsi E., Frosyni C. and Tsipi D. (2007): Determination of pharmaceuticals from different therapeutic classes in wastewaters by liquid chromatography–electrospray ionization–tandem mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1317–1327. 22. Bruins A.P., Covey T.R. and Henion J.D. (1987): Ion spray interface for combined liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometry, Anal. Chem., 59, 2642–2646. 23. Bruno F., Curini R., Di Corcia A., Nazzari M. and Samperi R. (2001a): Solid-phase extraction followed by liquid chromatography-mass spectrometry for trace determination of β-lactam antibiotics in bovine milk, J. Agric. Food Chem., 49, 3463–3470. 24. Bruno F., Curini R., Di Corcia A., Nazzari M. and Samperi R. (2001b): Method development for measuring trace levels of penicillins in aqueous environmental samples, Rapid Commun. Mass Spectrom., 15, 1391–1400. 25. Buchberger W.W. (2007): Novel analytical procedures for screening of drug residues in water, waste water, sediment and sludge, Anal. Chim. Acta, 593, 129–139. 26. Buser H.R., Poiger T. and Müller M.D. (1998): Occurrence and fate of the pharmaceutical drug diclofenac in surface waters: rapid photodegradation in a lake, Environ. Sci. Technol., 32, 3449–3456. 27. Calamari D., Zuccato E., Castiglioni S., Bagnati R. and Fanelli R. (2003): Strategic Survey of Therapeutic Drugs in the Rivers Po and Lambro in Northern Italy, Environ. Sci. Technol., 37, 1241–1248. 28. Campeau R.C., Gulli L.F. and Graves J.F. (1996): Drug resistance in Detroit River Gram-negative bacilli, Microbios, 88, 205–212. 29. Carballa M., Omil F., Lema J.M., Llompart M., Garcia-Jares C., Rodriguez I., Gomez M. and Ternes T. (2004): Behavior of pharmaceuticals, cosmetics and hormones in a sewage treatment plant, Water Res., 38, 2918–2926. 30. Cech N.B. and Enke C.G. (2001): Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals, Mass Spectrom. Rev., 20, 362–387. 31. Cha J.M., Yang S. and Carlson K.H. (2005): Rapid analysis of trace levels of antibiotic polyether ionophores in surface water by solid-phase extraction and liquid chromatography with ion trap tandem mass spectrometric detection, J. Chromatogr. A, 1065, 187–198. 32. Cherlet M., Schelkens M., Croubels S. and De Baker P. (2003): Quantitative multi- residue analysis of tetracyclines and their 4-epimers in pig tissues by high-performance liquid chromatography combined with positive-ion electrospray ionization mass spectrometry, Anal. Chim. Acta, 492, 199–213. 33. Chèze M., Villain M. and Pépin G. (2004): Determination of bromazepam, clonazepam and metabolites after a single intake in urine and hair by LC–MS/MS Application to forensic cases of drug facilitated crimes, Forensic Sci. Int., 145, 123–130. LITERATURA 103 34. Clara M., Strenn B. and Kreuzinger N. (2004): Carbamazepine as a possible anthropogenic marker in the aquatic environment: investigations on the behaviour of Carbamazepine in wastewater treatment and during groundwater infiltration, Water Res., 38, 947–954. 35. Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002, implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, Official Journal of the European Communities, L221, 8–36. 36. Comoretto L. and Chiron S. (2005): Comparing pharmaceutical and pesticide loads into a small Mediterranean river, Sci. Total Environ., 349, 201–210. 37. Conley J.M., Symes S.J., Kindelberger S.A. and Richards S.M. (2008): Rapid liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the determination of a broad mixture of pharmaceuticals in surface water, J. Chromatogr. A, 1185, 206–215. 38. Constantopoulos T.L., Jackson G.S. and Enke C.G. (1999): Effects of salt concentration on analyte response using electrospray ionization mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 10, 625–634. 39. De Baere S. and De Backer P. (2007): Quantitative determination of amoxicillin in animal feed using liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection, Anal. Chim. Acta 586, 319–325. 40. De Baere S., Cherlet M., Baert K. and De Backer P. (2002): Quantitative analysis of amoxycillin and its major metabolites in animal tissues by liquid chromatography combined with electrospray ionization tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 74, 1393–1401. 41. Dean J.R. (1998): Extraction methods for environmental analysis, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, West Sussex, England. 42. Di Corcia A. and Nazzari M. (2002): Review. Liquid chromatographic–mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacterial agents in animal food products, J. Chromatogr. A, 974, 53–89. 43. Díaz-Cruz M.S. and Barceló D. (2005): LC–MS2 trace analysis of antimicrobials in water, sediment and soil, Trends Anal. Chem., 24, 645–657. 44. Dorne J.L.C.M., Ragas A.M.J., Frampton G.K., Spurgeon D.S. and Lewis D.F. (2007): Trends in human risk assessment of pharmaceuticals, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1167– 1172. 45. Fagerquist C.K. and Lightfield A.R. (2003): Confirmatory analysis of β-lactam antibiotics in kidney tissue by liquid chromatography/electrospray ionization selective reaction monitoring ion trap tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 17, 660–671. 46. Fagerquist C.K., Lightfield A.R. and Lehotay S.J. (2005): Confirmatory and quantitative analysis of β-lactam antibiotics in bovine kidney tissue by dispersive solid- -phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 77, 1473–1482. 47. Farré M., Ferrer I., Ginebreda A., Figueras M., Olivella L., Tirapu L., Vilanova M. and Barceló D. (2001): Determination of drugs in surface water and wastewater samples by liquid chromatography–mass spectrometry: methods and preliminary results including toxicity studies with Vibrio fischeri, J. Chromatogr. A, 938, 187–197. 48. Farré M., Petrovic M. and D. Barceló (2007): Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSAIDs in water samples, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1203–1214. LITERATURA 104 49. Faye T., Brunot A., Sablier M., Tabet J.C. and Fujii T. (2000): Sodium ion attachment reactions in an ion trap mass spectrometer, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 1066–1073. 50. Fenn J.B. (1993): Ion formation from charged droplets: roles of geometry, energy, and time, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 4, 524–535. 51. Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F. and Whitehouse C.M (1989): Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules, Science, 246, 64–71. 52. Ferrer I. and Thurman E.M. (2003): Liquid chromatography/time-of-flight/mass spectrometry (LC/TOF/MS) for the analysis of emerging contaminants, TrAC Trend. Anal. Chem., 22 (10), 750–756. 53. Fritz J.S. and Macka M. (2000): Solid-phase trapping of solutes for further chromatographic or electrophoretic analysis, J. Chromatogr. A, 902, 137–166. 54. Gates P.J., Kearney G.C., Jones R., Leadlay P.F. and Staunton J. (1999): Structural elucidation studies of erythromycins by electrospray tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 13, 242–246. 55. Gentili A., Perret D. and Marchese S. (2005): Liquid chromatography-tandem mass spectrometry for performing confirmatory analysis of veterinary drugs in animal-food products, Trends Anal. Chem., 24, 704–733. 56. Göbel A., McArdell C.S., Suter M.J. and Giger W. (2004): Trace determination of macrolide and sulfonamide antimicrobials, a human sulfonamide metabolite, and trimethoprim in wastewater using liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 76, 4756–4764. 57. Gómez M.J., Martínez Bueno M.J., Lacorte S., Fernández-Alba A.R. and Agüera A. (2007): Pilot survey monitoring pharmaceuticals and related compounds in a sewage treatment plant located on the Mediterranean coast, Chemosphere, 66, 993–1002. 58. Gómez M.J., Petrović M., Fernández-Alba A.R. and Barceló D. (2006): Determination of pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters, J. Chromatogr. A, 1114, 224–233. 59. González-Barreiro C., Lores M., Casais M.C. and Cela R. (2003): Simultaneous determination of neutral and acidic pharmaceuticals in wastewater by high-performance liquid chromatography–post-column photochemically induced fluorimetry, J. Chromatogr. A, 993, 29–37. 60. Granelli K. and Branzell C. (2007): Rapid multi-residue screening of antibiotics in muscle and kidney by liquid chromatography-electrospray ionization–tandem mass spectrometry, Anal. Chim. Acta 586, 289–295. 61. Gros M., Petrović M. and Barceló D. (2006a): Multi-residue analytical methods using LC-tandem MS for the determination of pharmaceuticals in environmental and wastewater samples: a review, Anal. Bioanal. Chem., 386, 941–952. 62. Gros M., Petrović M. and Barceló D. (2006b): Development of a multi-residue analytical methodology based on liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS) for screening and trace level determination of pharmaceuticals in surface and wastewaters, Talanta, 70, 678–690. 63. Grujic S., Vasiljevic T., Lausevic M. and Ast T. (2008): Study on the formation of an amoxicillin adduct with methanol using electrospray ion trap tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 22, 67–74. 64. Grujic S., Vasiljevic T. and Lausevic M. (2009): Determination of multiple pharmaceutical classes by liquid chromatography-ion trap-tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1216, 4989–5000. LITERATURA 105 65. Hager J.W. and Le Blanc Y.J.C. (2003): High-performance liquid chromatography– –tandem mass spectrometry with a new quadrupole/linear ion trap instrument, J. Chromatogr. A, 1020, 3–9. 66. Halling-Sørensen B., Nielsen S.N., Lanzky P.F., Ingerslev F., Lützhøft H.C.H. and Jørgensen S.E. (1998): Occurrence, fate and effects of pharmaceutical substances in the environment– a review, Chemosphere, 36, 357–393. 67. Hamscher G., Sczesny S., Höper H. and Nau H. (2002): Determination of persistent tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 74, 1509–1518. 68. Hao C., Lissemore L., Nguyen B., Kleywegt S., Yang P. and Solomon K. (2006): Determination of pharmaceuticals in environmental waters by liquid chromatography/electrospray ionization/tandem mass spectrometry, Anal. Bioanal. Chem., 384, 505–513. 69. Hartig C., Storm T. and Jekel M. (1999): Detection and identification of sulphonamide drugs in municipal waste water by liquid chromatography coupled with electrospray ionisation tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 854, 163–173. 70. Heberer T. (2002): Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data, Toxicol. Lett., 131, 5–17. 71. Hernández F., Ibáñez M., Sancho J.V. and Pozo Ó.J. (2004): Comparison of different mass spectrometric techniques combined with liquid chromatography for confirmation of pesticides in environmental water based on the use of identification points, Anal. Chem., 76, 4349–4357. 72. Hernando M.D., Mezcua M., Fernández-Alba A.R. and Barceló D. (2006): Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments, Talanta, 69, 334–342. 73. Hernando M.D., Petrovic M., Fernández-Alba A.R. and Barceló D. (2004): Analysis by liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry and acute toxicity evaluation for β-blockers and lipid-regulating agents in wastewater samples, J. Chromatogr. A, 1046, 133–140. 74. Hignite C. and Azarnoff D.L. (1977): Drugs and drug metabolites as environmental contaminants: chlorophenoxyisobutyrate and salicylic acid in sewage water effluent, Life Sci., 20, 337–341. 75. Hilton M.J. and Thomas K.V. (2003): Determination of selected human pharmaceutical compounds in effluent and surface water samples by high-performance liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1015 (1-2), 129–141. 76. Hirsch R., Ternes T., Haberer K. and Kratz K-L. (1999): Occurrence of antibiotics in the aquatic environment, Sci. Total Environ., 225, 109–118. 77. Hirsch R., Ternes T.A., Haberer K., Mehlich A., Ballwanz F. and Kratz K. (1998): Determination of antibiotics in different water compartments via liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 815, 213–223. 78. Holstege D.M., Puschner B., Whitehead G. and Galey F.D. (2002): Screening and mass spectral confirmation of β-lactam antibiotic residues in milk using LC-MS/MS, J. Agric. Food Chem., 50, 406–411. LITERATURA 106 79. Horimoto S., Mayumi T., Aoe K. and Nishimura N. (2000): Identification of FC/TA- -891 and its metabolite, FCE22101 by high performance liquid chromatography- -atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry using bromoform, Chromatographia, 52, 741–744. 80. Huang C.H., Renew J.E., Smeby K.L., Pinkerston K. and Sedlak D.L. (2001): Assessment of potential antibiotic contaminants in water and preliminary occurrence analysis, Water Resour. Update, 120, 30–40. 81. Hummel D., Löffler D., Fink G. and Ternes T.A. (2006): Simultaneous determination of psychoactive drugs and their metabolites in aqueous matrices by liquid chromatography mass spectrometry, Environ. Sci. Technol., 40, 7321–7328. 82. Jeanville P.M., Estapé E.S. and Torres-Negrón de Jeanville I. (2003): The effect of liquid chromatography eluents and additives on the positive ion responses of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester using electrospray ionization, Int. J. Mass Spectrom., 227, 247–258. 83. Jobling S., Noylan M., Tyler C.R., Brighty G. and Sumpter J.P. (1998): Widespread sexual disruption in wild fish, Environ. Sci. Technol., 32, 2498–2506. 84. Jones-Lepp T.L (2006): Chemical markers of human waste contamination: analysis of urobilin and pharmaceuticals in source waters, J. Environ. Monit., 8, 472–478. 85. Jørgensen S.E. and Halling-Sørensen B. (2000): Drugs in the environment, Chemosphere, 40, 691–699. 86. Kamel A.M., Brown P.R. and Munson B. (1999): Effects of mobile-phase additives, solution pH, ionization constant and analyte concentration on the sensitivities and electrospray ionization mass spectra of nucleoside antiviral agents, Anal. Chem., 71, 5481–5492. 87. Kamel A.M., Fouda H.G., Brown P.R. and Munson B. (2002): Mass spectral characterization of tetracyclines by electrospray ionization, H/D exchange, and multiple stage mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 13, 543–557. 88. Kang J., Hick L.A. and Price W.E. (2007): Using calibration approaches to compensate for remaining matrix effects in quantitative liquid chromatography/electrospray ionization multistage mass spectrometric analysis of phytoestrogens in aqueous environmental samples, Rapid Commun. Mass Spectrom., 21, 4065–4072. 89. Kataoka H. (2005): Recent advances in solid-phase microextraction and related techniques for pharmaceutical and biomedical analysis, Curr. Pharm. Anal., 1, 65–84. 90. Kim S. and Carlson K. (2005): LC–MS2 for quantifying trace amounts of pharmaceutical compounds in soil and sediment matrices, TrAC Trend. Anal. Chem., 24 (7), 635–644. 91. Kim S.D., Cho J., Kim I.S., Vanderford B.J. and Snyder S.A. (2007): Occurrence and removal of pharmaceuticals and endocrine disruptors in South Korean surface, drinking, and waste waters, Water Res., 41, 1013–1021. 92. King R., Bonfiglio R., Fernandez-Metzler C., Miller-Stein C. and Olah T. (2000): Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 11, 942–950. 93. Kolpin D.W., Furlong E.T., Meyer M.T., Thurman E.M., Zaugg S.D., Barber L.B. and Buxton H.T. (2002): Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: a national reconnaissance, Environ. Sci. Technol., 36, 1202–1211. 94. Kumazawa T., Lee X., Sato K. and Suzuki O. (2003): Review. Solid-phase microextraction and liquid chromatography/mass spectrometry in drug analysis, Anal. Chim. Acta, 492 (1-2), 49–67. LITERATURA 107 95. Li L.Y.T., Campbell D.A., Bennet P.K. and Henion J. (1996): Acceptance criteria for ultratrace HPLC-tandem mass spectrometry: quantitative and qualitative determination of sulfonylurea herbicides in soil, Anal. Chem., 68, 3397–3404. 96. Lindberg R., Jarnheimer P., Olsen B., Johansson M. and Tysklind M. (2004): Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards, Chemosphere, 57, 1479–1488. 97. Lindsey M., Meyer M. and Thurman E.M. (2001): Analysis of trace levels of sulphonamide and tetracycline antimicrobials in groundwater and surface water using solid-phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry, Anal. Chem., 73, 4640–4646. 98. Lissemore L., Hao C., Yang P., Sibley P.K., Mabury S. and Solomon K.R. (2006): An exposure assessment for selected pharmaceuticals within a watershed in Southern Ontario, Chemosphere, 64, 717–729. 99. Lopez de Alda M.J., Díaz-Cruz S., Petrovic M. and Barceló D. (2003): Review. Liquid chromatography–(tandem) mass spectrometry of selected emerging pollutants (steroid sex hormones, drugs and alkylphenolic surfactants) in the aquatic environment, J. Chromatogr. A, 1000 (1-2), 503–526. 100. Malik A. and Ahmad M. (1994): Incidence of drug and metal resistance in E. coli strains from sewage water and soil, Chem. Environ. Res., 3, 3–11. 101. Mathis J.A. and McCord B.R. (2005): Mobile phase influence on electrospray ionization for the analysis of smokeless powders by gradient reverse phase high- -performance liquid chromatography-ESIMS, Forensic Sci. Int., 154, 159–166. 102. Matuszewski B.K., Constanzer M.L. and Chavez-Eng C.M. (1998): Matrix effect in quantitative LC/MS/MS analyses of biological fluids: a method for determination of finasteride in human plasma at picogram per milliliter concentrations, Anal. Chem., 70, 882–889. 103. McArdell C.S., Molnar E., Suter M.J. and Giger W. (2003): Occurrence and fate of macrolide antibiotics in wastewater treatment plants and in the Glatt Valley watershed, Switzerland, Environ. Sci. Technol., 37, 5479–5486. 104. Menelaou A., Somogyi A.A, Barclay M.L. and Bochner F.J. (1999): Simultaneous quantification of amoxycillin and metronidazole in plasma using high-performance liquid chromatography with photodiode array detection, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., 261–266. 105. Metcalfe C.D., Koening B.G., Bennie D.T., Servos M., Ternes T.A. and Hirsch R. (2003): Occurrence of neutral and acidic drugs in the effluents of Canadian sewage treatment plants, Environ. Toxicol. Chem., 22, 2872–2889. 106. Miao X. and Metcalfe C.D. (2003a): Determination of carbamazepine and its metabolites in aqueous samples using liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 75, 3731–3738. 107. Miao X. and Metcalfe C.D. (2003b): Determination of pharmaceuticals in aqueous samples using positive and negative voltage switching microbore liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Mass Spectrom., 38, 27–34. 108. Miao X. and Metcalfe C.D. (2003c): Determination of cholesterol-lowering statin drugs in aqueous samples using liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A., 998, 133–141. LITERATURA 108 109. Miao X., Bishay F., Chen M. and Metcalfe C.D. (2004): Occurrence of antimicrobials in the final effluents of wastewater treatment plants in Canada, Environ. Sci. Technol., 38, 3533–3541. 110. Miao X., Koenig B.G. and Metcalfe C.D. (2002): Analysis of acidic drugs in the effluents of sewage treatment plants using liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 952, 139–147. 111. Niessen W.M.A. (1998): Review. Analysis of antibiotics by liquid chromatography– –mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 812 (1-2), 53–75. 112. Niessen W.M.A. (2003): Review. Progress in liquid chromatography–mass spectrometry instrumentation and its impact on high-throughput screening. J. Chromatogr. A, 1000 (1-2), 413–436. 113. Nikolaou A., Meric S. and Fatta D. (2007): Occurrence patterns of pharmaceuticals in water and wastewater environments, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1225–1234. 114. Öllers S., Singer H.P., Fässler P. and Müller S.R. (2001): Simultaneous quantification of neutral and acidic pharmaceuticals and pesticides at the low-ng/ l level in surface and waste water, J. Chromatogr. A, 911, 225–234. 115. Pedersen J.A., Soliman M. and Suffet I.H. (2005): Human pharmaceuticals, hormones, and personal care product ingredients in runoff from agricultural fields irrigated with treated wastewater, J. Agric. Food Chem., 53, 1625–1632. 116. Pedrouzo M., Reverté S., Borrull F., Pocurull E. and Marcé R.M. (2007): Pharmaceutical determination in surface and wastewaters using high-performance liquid chromatography-(electrospray)-mass spectrometry, J. Sep. Sci., 30, 297–303. 117. Petrović M., Gonzalez S. and Barceló D. (2003): Analysis and removal of emerging contaminants in wastewater and drinking water, Trends Anal. Chem., 22, 685–696. 118. Petrović M., Hernando M.D., Díaz-Cruz M.S. and Barceló D. (2005): Liquid chromatography–tandem mass spectrometry for the analysis of pharmaceutical residues in environmental samples: a review, J. Chromatogr. A, 1067, 1–14. 119. Pfeifer T., Tuerk J., Bester K. and Spiteller M. (2002): Determination of selected sulfonamide antibiotics and trimethoprim in manure by electrospray and atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 16, 663–669. 120. Pichon V., Cau Dit Coumes C., Chen L., Guenu S., Hennion M.C. (1996): Simple removal of humic and fulvic acid interferences using polymeric sorbents for the simultaneous solid-phase extraction of polar acidic, neutral and basic pesticides, J. Chromatogr. A, 737, 25–33. 121. Picó Y., Blasco C. and Font G. (2004): Environmental and food applications of LC- -tandem mass spectrometry in pesticide-residue analysis: an overview, Mass Spectrom. Rev., 23, 45–85. 122. Pozo O.J., Guerrero C., Sancho J.V., Ibáñez M., Pitarch E., Hogendoorn E., Hernández F. (2006): Efficient approach for the reliable quantification and confirmation of antibiotics in water using on-line solid-phase extraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1103, 83–93. 123. Pryde A. and Gilbert M.T. (1979): Application of high performance liquid chromato- graphy, Chapman & Hall Ltd., London-New York. 124. Purdom C.E., Hardiman P.A., Bye V.J., Eno N.C., Tyler C.R. and Sumpter J.P. (1994): Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works, Chem. Ecol., 8, 275–285. 125. Quintana J.B. and Reemtsma T. (2004): Sensitive determination of acidic drugs and triclosan in surface and wastewater by ion-pair reverse-phase liquid chromato- graphy/tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18, 765–774. LITERATURA 109 126. Rabbolini S., Verardo E., Da Col M., Gioacchini A. and Traldi P. (1998): Negative ion electrospray ionization tandem mass spectrometry in the structural characterization of penicillins, Rapid Commun. Mass Spectrom., 12, 1820–1826. 127. Radtke T.M. and Gist G.L. (1989): Wastewater sludge disposal- antibiotic resistant bacteria may pose health hazard, J. Environ. Health, 52, 102–105. 128. Reemtsma T. (2001a): The use of liquid chromatography-atmospheric pressure ionization-mass spectrometry in water analysis – Part I: Achievements, TrAC Trend. Anal. Chem., 20 (9), 500–517. 129. Reemtsma T. (2001b): The use of liquid chromatography-atmospheric pressure ionization-mass spectrometry in water analysis – Part II: Obstacles, TrAC Trend. Anal. Chem., 20 (10), 533–542. 130. Reemtsma T. (2003): Review. Liquid chromatography–mass spectrometry and strategies for trace-level analysis of polar organic pollutants. J. Chromatogr. A, 1000, 477–501. 131. Renew J.E. and Huang C.H. (2004): Simultaneous determination of fluoroquinolone, sulfonamide, and trimethoprim antibiotics in wastewater using tandem solid phase extraction and liquid chromatography–electrospray mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1042, 113–121. 132. Richardson M.L. and Bowron J.M. (1985): The fate of pharmaceutical chemicals in the aquatic environment: A review, J. Pharm. Pharmacol., 37, 1–12. 133. Richardson S.D. (2002): Environmental mass spectrometry: emerging contaminants and current issues, Anal. Chem., 74, 2719–2742. 134. Riediker S. and Stadler R.H. (2001): Simultaneous determination of five β-lactam antibiotics in bovine milk using liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 73, 1614–1621. 135. Roberts P.H. and Thomas K.V. (2006): The occurrence of selected pharmaceuticals in wastewaters effluent and surface waters of lower Tyne catchment, Sci. Total Environ., 356, 143–153. 136. Robinson I., Junqua G., Van Coillie R. and Thomas O. (2007): Trends in the detection of pharmaceutical products, and their impact and mitigation in water and wastewater in North America, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1143–1151. 137. Rodríguez I., Carpinteiro J., Quintana J.B., Carro A.M., Lorenzo R.A. and Cela R. (2004): Solid-phase microextraction with on-fiber derivatization for the analysis of anti-inflammatory drugs in water samples, J. Chromatogr. A, 1024, 1–8. 138. Sacher F., Lange F.T., Brauch H. and Blankenhorn I. (2001): Pharmaceuticals in groundwaters. Analytical methods and results of a monitoring program in Baden- -Wurttemberg, Germany, J. Chromatogr. A, 938, 199–210. 139. Santos J.L., Aparicio I., Alonso E. and Callejón M. (2005): Simultaneous determination of pharmaceutically active compounds in wastewater samples by solid phase extraction and high-performance liquid chromatography with diode array and fluorescence detectors, Anal. Chim. Acta, 550, 116–122. 140. Smink B.E., Brandsma J.E., Dijkhuizen A., Lusthof K.J, de Gier J.J., Egberts A.C.G. and Uges D.R.A. (2004): Quantitative analysis of 33 benzodiazepines, metabolites and benzodiazepine-like substances in whole blood by liquid chromatography–(tandem) mass spectrometry, J. Chromatogr. B, 811, 13–20. 141. Smyth W.F., McClean S. and Ramachandran V.N. (2000): A study of the electrospray ionisation of pharmacologically significant 1,4-benzodiazepines and their subsequent fragmentation using an ion-trap mass spectrometer, Rapid Commun. Mass Spectrom., 14, 2061–2069. LITERATURA 110 142. Sørensen L.K. and Elbæk T.H. (2005): Determination of mycotoxins in bovine milk by liquid chromatography tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. B, 820, 183–196. 143. Sterner J.L., Johnston M.V., Nicol G.R. and Ridge D.P. (2000): Signal suppression in electrospray ionization Fourier transform mass spectrometry of multi-component samples, J. Mass Spectrom., 35, 385–391. 144. Stolker A.A.M., Niesing W., Hogendoorn E.A., Versteegh J.F.M., Fuchs R. and Brinkman U.A.Th. (2004): Liquid chromatography with triple-quadrupole or quadrupole-time of flight mass spectrometry for screening and confirmation of residues of pharmaceuticals in water, Anal. Bioanal. Chem., 378, 955–963. 145. Storm T., Reemtsma T. and Jekel M. (1999): Use of volatile amines as ion-pairing agents for the high-performance liquid chromatographic–tandem mass spectrometric determination of aromatic sulfonates in industrial wastewater, J. Chromatogr. A, 854, 175–185. 146. Straub R.F. and Voyksner R.D. (1993): Determination of penicillin G, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin and cephapirin by high-performance liquid chromatography- electrospray mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 647, 167–181. 147. Stüber M. and Reemtsma T. (2004): Evaluation of three calibration methods to compensate matrix effects in environmental analysis with LC-ESI-MS, Anal. Bional. Chem., 378, 910–916. 148. Stumpf M., Ternes T.A., Wilken R.D., Rodrigues S.V. and Baumann W. (1999): Polar drug residues in sewage and natural waters in the state of Rio de Janeiro, Brazil, Sci. Total. Environ., 225, 135–141. 149. Tabak H.H. and Bunch R.L. (1970): Steroid hormones as water pollutants. I. Metabolism of natural and synthetic ovulation inhibiting hormones by microorganisms of activated sludge and primary settled sewage, Dev. Ind. Microbiol., 11, 367–376. 150. Ternes T., Bonerz M. and Schmidt T. (2001): Determination of neutral pharmaceuticals in wastewater and rivers by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 938, 175–185. 151. Ternes T.A. (1998): Occurrence of drugs in German sewage treatment plants and rivers, Wat. Res., 32 (11), 3245–3260. 152. Ternes T.A. (2001): Analytical methods for the determination of pharmaceuticals in aqueous environmental samples, TrAC Trend. Anal. Chem., 20 (8), 419–433. 153. Ternes T.A., Meisenheimer M., McDowell D., Sacher F., Brauch H.J., Haist-Gulde B., Preuss G., Wilme U. and Zulei-Seibert, N. (2002a): Removal of pharmaceuticals during drinking water treatment, Environ. Sci. Technol., 36, 3855–3863. 154. Ternes T.A., Andersen H., Gilberg D. and Bonerz M. (2002b): Determination of estrogens in sludge and sediments by liquid extraction and GC/MS/MS, Anal. Chem., 74, 3498–3504. 155. Tixier C., Singer H.P., Ollers S. and Muller S.R. (2003): Occurrence and fate of carbamazepine, clofibric acid, diclofenac, ibuprofen, ketoprofen, and naproxen in surface waters, Environ. Sci. Technol., 37, 1061–1068. 156. Vartanian V.H., Goolsby B. and Brodbelt J.S. (1998): Identification of tetracycline antibiotics by electrospray ionization in a quadrupole ion trap, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 9, 1089–1098. 157. Vieno N.M., Tuhkanen T. and Kronberg L. (2006): Analysis of neutral and basic pharmaceuticals in sewage treatment plants and in recipient rivers using solid phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry detection, J. Chromatogr. A, 1134, 101–111. LITERATURA 111 158. Voyksner R.D. and Pack T. (1991): Investigation of collisional-activation decomposition process and spectra in the transport regions of an electrospray single- -quadrupole mass spectrometer, Rapid Commun. Mass Spectrom., 5, 263–268. 159. Weigel S., Aulinger A., Brockmeyer R., Harms H., Löffer J., Reincke H., Schmidt R., Stachel B., von Tümpling W. and Wanke A. (2004): Pharmaceuticals in the river Elbe and its tributaries, Chemosphere, 57, 107–126. 160. Wieboldt R., Campbell D.A. and Henion J. (1998): Quantitative liquid chromatographic–tandem mass spectrometric determination of orlistat in plasma with a quadrupole ion trap, J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl., 708, 121–129. 161. Yang S. and Carlson K.H. (2004): Solid-phase extraction–high-performance liquid chromatography–ion trap mass spectrometry for analysis of trace concentrations of macrolide antibiotics in natural and waste water matrices, J. Chromatogr. A, 1038, 141–155. 162. Yang S., Cha J. and Carlson K. (2004): Quantitative determination of trace concentrations of tetracycline and sulfonamide antibiotics in surface water using solid- -phase extraction and liquid chromatography/ion trap tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 18, 2131–2145. 163. Yang S., Cha J. and Carlson K. (2005): Simultaneous extraction and analysis of 11 tetracycline and sulfonamide antibiotics in influent and effluent domestic wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1097, 40–53. 164. Zhang Z., Yang M.J. and Pawliszyn J. (1994): Solid-phase microextraction. A solvent- -free alternative for sample preparation, Anal. Chem., 66, 844A–853A. 165. Zhang Z.L. and Zhou J.L. (2007): Simultaneous determination of various pharmaceutical compounds in water by solid-phase extraction–liquid chromatography– –tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1154, 205–213. 166. Zhao J.J., Yang A.Y. and Rogers D. J. (2002): Effects of liquid chromatography mobile phase buffer contents on the ionization and fragmentation of analytes in liquid chromatographic/ionspray tandem mass spectrometric determination, J. Mass Spectrom., 37, 421–433. 167. Zhu J. and Cole R.B. (2000): Formation and decompositions of chloride adduct ions, [M+Cl]−, in negative ion electrospray ionization mass spectrometry, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 11, 932–941. 168. Zhu J., Snow D.D., Cassada D.A., Monson S.J. and Spalding R.F. (2001): Analysis of oxytetracycline, tetracycline and chlortetracycline in water using solid-phase extraction and liquid chromatography–tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 928, 177–186. 169. Zuehlke S., Duennbier U. and Heberer T. (2004): Determination of polar drug residues in sewage and surface water applying liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Anal. Chem., 76, 6548–6554. 170. Zwiener C. (2007): Occurrence and analysis of pharmaceuticals and their transformation products in drinking water treatment, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1159–1162. 171. Zwiener C. and Frimmel F.H. (2004): LC-MS analysis in the aquatic environment and in water treatment–a critical review. Part II: Applications for emerging contaminants and related pollutants, microorganisms and humic acids, Anal. Bioanal. Chem., 378, 862–874. 112 AMPICI~1 #243-291 RT: 3.96-4.83 AV: 41 NL: 1.84E5 F: + c ESI Full ms3 382.10@23.00 364.90@25.00 [ 100.00-370.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 259.0 318.9 233.0 348.0178.0 365.0333.0 AMPICI~1 #13-48 RT: 0.32-0.79 AV: 19 NL: 1.53E5 F: + c ESI Full ms5 382.10@23.00 222.90@25.00 205.90@25.00 178.00@31.00 [ 50.00-180.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 118.0 AMPICI~1 #54-88 RT: 1.75-2.03 AV: 11 NL: 6.58E4 F: + c ESI Full ms6 382.10@23.00 222.90@25.00 205.90@25.00 178.00@31.00 118.00@25.00 [ 50.00-120.00] 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 91.1 118.091.7 AMPICI~1 #407 RT: 7.41 AV: 1 NL: 6.68E5 F: - c ESI Full ms [ 300.00-1000.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 380.1 461.9 544.0 439.8 AMPICI~1 #484 RT: 8.88 AV: 1 NL: 2.18E5 F: - c ESI Full ms2 380.20@22.00 [ 100.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 302.0 265.0 379.9 AMPICI~1 #534 RT: 10.09 AV: 1 NL: 4.81E4 F: - c ESI Full ms3 380.20@22.00 302.00@28.00 [ 80.00-350.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 270.1 302.0 a) b) c) d) e) f) Slika 54 . MSn maseni spektri ampicilina: a)ESI(+)MS3 [M+CH3OH+H]+; b)ESI(+)MS5 [M+CH3OH+H]+; c)ESI(+)MS6 [M+CH3OH+H]+; d)ESI(–)MS; e)ESI(–)MS2 [M+CH3OH–H]–; f)ESI(–)MS3 [M+CH3OH–H]–. P R I L O G PRILOG 113 AMOXIC~1 #203 RT: 3.72 AV: 1 NL: 3.73E6 F: + c ESI Full ms4 398.00@21.00 380.90@23.00 349.00@30.00 [ 95.00-400.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 255.0 349.0 363.0 AMOXIC~1 #228-245 RT: 4.30-4.68 AV: 18 NL: 1.80E6 F: + c ESI Full ms5 398.00@21.00 380.90@23.00 349.00@30.00 255.00@30.00 [ 70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 208.9 236.9165.1 AMOXIC~1 #274 RT: 5.45 AV: 1 NL: 1.23E6 F: + c ESI Full ms6 398.00@21.00 380.90@23.00 349.00@30.00 255.00@30.00 208.90@26.00 [ 55.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 165.1 209.0 a) b) c) AMOXIC~1 #422 RT: 8.84 AV: 1 NL: 8.02E5 F: - c ESI Full ms [ 50.00-1000.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 396.0 477.9 815.0559.7 AMOXIC~1 #471 RT: 9.56 AV: 1 NL: 8.52E5 F: - c ESI Full ms2 396.00@24.00 [ 105.00-400.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 317.9 395.9281.0 362.0223.9 AMOXIC~1 #532 RT: 10.49 AV: 1 NL: 2.52E5 F: - c ESI Full ms3 396.00@24.00 317.90@25.00 [ 85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 223.9 300.9 AMOXIC~1 #585 RT: 11.42 AV: 1 NL: 1.39E5 F: - c ESI Full ms4 396.00@24.00 317.90@25.00 224.00@27.00 [ 60.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 192.0 223.9 AMOXIC~1 #643 RT: 12.53 AV: 1 NL: 1.38E5 F: - c ESI Full ms4 396.00@24.00 317.90@25.00 300.90@25.00 [ 80.00-350.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 207.0 300.9 d) e) f) g) h) Slika 55. MSn maseni spektri amoksicilina: a)ESI(+)MS4 [M+CH3OH+H]+; b)ESI(+)MS5 [M+CH3OH+H]+; c)ESI(+)MS6 [M+CH3OH+H]+; d)ESI(–)MS; e)ESI(–)MS2 [M+CH3OH–H]–; f)ESI(–)MS3 [M+CH3OH–H]–; g)ESI(–)MS4 [M+CH3OH–H]–; h)ESI(–)MS4 [M+CH3OH–H]–. PRILOG 114 CEFALE~1 #312-347 RT: 6.49-7.21 AV: 29 NL: 1.23E4 F: + c ESI Full ms4 379.80@22.00 222.90@24.00 205.80@23.00 [ 55.00-210.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 178.1 206.0 CEFALE~1 #612 RT: 12.40 AV: 1 NL: 2.23E5 F: - c ESI Full ms [ 300.00-1000.00] 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 378.0 460.0 386.9 560.6492.0305.1 782.0437.9397.0 542.2 b) c) CEFALE~1 #254-292 RT: 5.09-5.80 AV: 32 NL: 4.35E4 F: + c ESI Full ms3 379.80@22.00 222.90@24.00 [ 60.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 205.9 106.1 a) Slika 56. MSn maseni spektri cefaleksina: a)ESI(+)MS3 [M+CH3OH+H]+; b)ESI(+)MS4 [M+CH3OH+H]+; c)ESI(–)MS. SULFAM~2 #135 RT: 2.59 AV: 1 NL: 2.39E4 F: + c ESI Full ms3 254.30@34.00 188.00@25.00 [ 50.00-200.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 160.3 187.8 SULFAM~2 #228 RT: 4.88 AV: 1 NL: 1.51E4 F: + c ESI Full ms3 254.30@34.00 156.00@24.00 [ 50.00-200.00] 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 108.1 92.0 156.2 SULFAM~1 #14 RT: 0.23 AV: 1 NL: 1.31E5 F: - c ESI Full ms [ 50.00-1000.00] 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 252.1 579.9527.1 729.0 SULFAM~1 #108 RT: 2.17 AV: 1 NL: 4.16E4 F: - c ESI Full ms2 252.10@29.00 [ 65.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 156.1 252.0 a) b) c) d) Slika 57. MSn maseni spektri sulfametoksazola: a)ESI(+)MS3 [M+H]+; b)ESI(+)MS3 [M+H]+; c)ESI(–)MS; d)ESI(–)MS2 [M–H]–. PRILOG 115 TRIMET~1 #272-329 RT: 3.84-4.60 AV: 52 NL: 2.54E5 F: + c ESI Full ms3 291.20@40.00 230.10@40.00 [ 60.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 201.3 202.1110.1 123.1 215.2187.2 213.2 TRIMET~1 #412-447 RT: 6.10-6.62 AV: 36 NL: 1.19E6 F: + c ESI Full ms3 291.20@40.00 258.10@30.00 [ 70.00-270.00] 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 230.1 TRIMET~1 #473-533 RT: 7.10-8.15 AV: 61 NL: 1.07E5 F: + c ESI Full ms4 291.20@40.00 258.10@30.00 230.10@35.00 [ 60.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 202.1 201.3 110.1 229.3215.2123.1 187.2 213.1 TRIMET~1 #592-611 RT: 9.06-9.34 AV: 20 NL: 6.99E5 F: + c ESI Full ms3 291.20@40.00 275.20@35.00 [ 80.00-290.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 257.1 TRIMET~1 #638-686 RT: 9.83-10.68 AV: 49 NL: 1.50E5 F: + c ESI Full ms4 291.20@40.00 275.20@35.00 257.20@35.00 [ 70.00-270.00] 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 229.2 a) b) c) d) e) Slika 58. MSn maseni spektri trimetoprima: a)ESI(+)MS3 [M+H]+; b)ESI(+)MS3 [M+H]+; c)ESI(+)MS4 [M+H]+; d)ESI(+)MS3 [M+H]+; e)ESI(+)MS4 [M+H]+. PRILOG 116 ERITRO~1 #312-351 RT: 4.73-5.35 AV: 38 NL: 1.38E6 F: + c ESI Full ms3 734.30@26.00 576.20@22.00 [ 155.00-600.00] 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 558.1 540.1522.1 ERITRO~1 #372-419 RT: 5.82-6.74 AV: 48 NL: 4.02E5 F: + c ESI Full ms4 734.30@26.00 576.20@22.00 558.00@22.00 [ 150.00-600.00] 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 540.0 522.0 558.1 ERITRO~1 #447-503 RT: 8.44-8.71 AV: 13 NL: 1.36E5 F: + c ESI Full ms5 734.30@26.00 576.20@22.00 558.00@22.00 540.00@22.00 [ 145.00-600.00] 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 522.0 157.9 540.1 ERITRO~1 #705-723 RT: 12.70-13.04 AV: 16 NL: 1.66E6 F: + c ESI Full ms2 756.20@32.00 [ 205.00-800.00] 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 598.3 738.3 580.3 ERITRO~1 #763-791 RT: 14.09-14.56 AV: 21 NL: 3.80E5 F: + c ESI Full ms3 756.20@32.00 598.30@33.00 [ 160.00-600.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 580.2 484.1 466.2410.1 598.2 ERITRO~1 #800 RT: 15.02 AV: 1 NL: 4.33E4 F: + c ESI Full ms4 756.20@32.00 598.30@33.00 580.20@33.00 [ 155.00-600.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 466.1 535.2 423.2309.1 a) b) c) d) e) f) Slika 59. MSn maseni spektri eritromicina: a)ESI(+)MS3 [M+H]+; b)ESI(+)MS4 [M+H]+; c)ESI(+)MS5 [M+H]+; d)ESI(+)MS2 [M+Na]+; e)ESI(+)MS3 [M+Na]+; f)ESI(+)MS4 [M+Na]+. PRILOG 117 AZITRO~1 #441 RT: 8.69 AV: 1 NL: 5.14E4 F: + c ESI Full ms4 749.30@25.00 591.30@28.00 573.20@28.00 [ 155.00-600.00] 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 416.3 457.2 573.4 430.8 AZITRO~1 #377-394 RT: 7.33-7.73 AV: 18 NL: 1.09E5 F: + c ESI Full ms5 749.30@25.00 591.30@28.00 434.30@29.00 416.30@29.00 [ 110.00-500.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 300.1 398.1186.0174.1156.1 358.1256.0 AZITRO~1 #579 RT: 11.85 AV: 1 NL: 5.02E5 F: + c ESI Full ms2 771.40@29.00 [ 210.00-800.00] 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 613.3595.4 AZITRO~1 #604 RT: 12.50 AV: 1 NL: 9.43E4 F: + c ESI Full ms3 771.40@29.00 613.20@30.00 [ 165.00-650.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 438.1 551.3 456.0 539.3 613.0 AZITRO~1 #655-674 RT: 13.83-14.32 AV: 20 NL: 5.56E4 F: + c ESI Full ms3 771.40@29.00 595.30@31.00 [ 160.00-650.00] 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 479.1 577.2 537.2 438.3 453.2420.1 509.2 a) b) c) d) e) Slika 60. MSn maseni spektri azitromicina: a)ESI(+)MS4 [M+H]+; b)ESI(+)MS5 [M+H]+; c)ESI(+)MS2 [M+Na]+; d)ESI(+)MS3 [M+Na]+; e)ESI(+)MS3 [M+Na]+. PRILOG 118 DOXICI~1 #91 RT: 1.94 AV: 1 NL: 1.04E6 F: + c ESI Full ms3 445.00@25.00 428.10@27.00 [ 115.00-450.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 410.0 441.8339.0 321.0 428.0392.0 DOXICI~1 #133 RT: 3.01 AV: 1 NL: 4.27E5 F: + c ESI Full ms4 445.00@25.00 428.10@27.00 410.00@28.00 [ 110.00-450.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 338.9 321.1 392.0 382.0 DOXICI~1 #172-192 RT: 4.11-4.46 AV: 13 NL: 2.43E5 F: + c ESI Full ms5 445.00@25.00 428.10@27.00 410.00@28.00 339.00@25.00 [ 90.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 321.0 DOXICI~1 #254 RT: 6.24 AV: 1 NL: 2.64E5 F: + c ESI Full ms3 445.00@25.00 459.80@28.00 [ 125.00-500.00] 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 428.0 459.8 DOXICI~1 #418-452 RT: 9.50-9.92 AV: 32 NL: 4.88E5 F: - c ESI Full ms [ 400.00-1000.00] 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 443.2 524.8 547.1444.2 616.8 DOXICI~1 #483 RT: 10.41 AV: 1 NL: 3.56E5 F: - c ESI Full ms2 443.30@25.00 [ 120.00-500.00] 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 399.1 426.0400.0 444.0358.1 a) b) c) d) e) f) Slika 61. MSn maseni spektri doksiciklina: a)ESI(+)MS3 [M+H]+; b)ESI(+)MS4 [M+H]+; c)ESI(+)MS5 [M+H]+; d)ESI(+)MS3 [M+H]+; e)ESI(–)MS; f)ESI(–)MS2[M–H]–. PRILOG 119 BROMAZ~1 #155 RT: 2.98 AV: 1 NL: 4.11E5 F: + c ESI Full ms3 316.10@36.00 288.00@35.00 [ 75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 209.3 261.0 182.3 BROMAZ~1 #233 RT: 4.91 AV: 1 NL: 1.27E5 F: + c ESI Full ms4 316.10@36.00 288.00@35.00 261.00@35.00 [ 70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 182.2 BROMAZ~1 #362 RT: 7.94 AV: 1 NL: 5.35E5 F: + c ESI Full ms3 318.10@36.00 290.00@35.00 [ 75.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 209.3 263.0 BROMAZ~1 #430 RT: 9.65 AV: 1 NL: 1.24E5 F: + c ESI Full ms4 318.10@36.00 290.00@35.00 263.00@35.00 [ 70.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 182.3 b) a) c) d) Slika 62. MSn maseni spektri bromazepama: a)ESI(+)MS3 [M+H]+; b)ESI(+)MS4 [M+H]+; c)ESI(+)MS3 [izotop+H]+; d)ESI(+)MS4 [izotop+H]+. LORAZE~1 #217-232 RT: 4.30-4.47 AV: 16 NL: 1.41E6 F: - c ESI Full ms [ 50.00-500.00] 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 318.9 320.9 314.8 322.9 LORAZE~1 #261 RT: 5.05 AV: 1 NL: 2.79E5 F: - c ESI Full ms2 318.90@26.00 [ 85.00-350.00] 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 283.0 318.9 a) b) Slika 63. MSn maseni spektri lorazepama: a)ESI(–)MS; b)ESI(–)MS2 [M–H]–. PRILOG 120 KARBAM~1 #267 RT: 3.87 AV: 1 NL: 8.44E5 F: + c ESI Full ms3 237.10@30.00 219.90@23.00 [ 60.00-250.00] 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 192.2 219.8 Slika 64. ESI(+)MS3 [M+H]+ maseni spektar karbamazepina. DIKLOF~1 #48 RT: 1.08 AV: 1 NL: 9.04E4 F: + c ESI Full ms4 296.00@25.00 278.00@22.00 250.00@26.00 [ 65.00-270.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 215.3 250.1 214.3 DIKLOF~1 #32 RT: 0.64 AV: 1 NL: 4.07E5 F: - c ESI Full ms2 293.90@25.00 [ 80.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 250.0 293.7 DIKLOF~1 #67 RT: 1.46 AV: 1 NL: 2.99E4 F: - c ESI Full ms3 293.90@25.00 250.00@37.00 [ 65.00-300.00] 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R el at iv e A bu nd an ce 214.1 195.9 249.8 a) b) c) Slika 65. MSn maseni spektri diklofenaka: a)ESI(+)MS4 [M+H]+; b)ESI(–)MS2 [M–H]–; c)ESI(–)MS3 [M–H]–. PRILOG 121 0 50 100 150 200 250 0.0 5.0x106 1.0x107 1.5x107 2.0x107 2.5x107 R=0,99682 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija trimetoprima (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 1.0x106 2.0x106 3.0x106 4.0x106 5.0x106 6.0x106 R=0,98308 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija paracetamola (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 1.0x106 2.0x106 3.0x106 4.0x106 5.0x106 6.0x106 7.0x106 8.0x106 R=0,99069 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija amoksicilina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 1.0x106 2.0x106 3.0x106 4.0x106 5.0x106 6.0x106 7.0x106 R=0,99859 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija sulfametoksazola (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 1.0x106 2.0x106 3.0x106 4.0x106 5.0x106 6.0x106 R=0,99384 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija doksiciklina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 5.0x106 1.0x107 1.5x107 2.0x107 2.5x107 R=0,99843 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija azitromicina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0 1x106 2x106 3x106 4x106 5x106 6x106 R=0,98986 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija ampicilina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 2.0x106 4.0x106 6.0x106 8.0x106 1.0x107 1.2x107 1.4x107 1.6x107 1.8x107 R=0,99778 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija bromazepama (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 2.0x105 4.0x105 6.0x105 8.0x105 1.0x106 1.2x106 R=0,99049 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija cefaleksina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 5.0x106 1.0x107 1.5x107 2.0x107 2.5x107 R=0,99843 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija eritromicina (ng cm-3) Slika 66. Provera linearnosti razvijene metode. PRILOG 122 0 50 100 150 200 250 5.0x105 1.0x106 1.5x106 2.0x106 2.5x106 3.0x106 3.5x106 4.0x106 R=0,99155 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija acetilsalicilne kiseline (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0 1x105 2x105 3x105 4x105 5x105 6x105 7x105 R=0,98886 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija metamizola (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 2.0x105 4.0x105 6.0x105 8.0x105 1.0x106 1.2x106 1.4x106 R=0,98623 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija fenobarbitona (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 2.0x105 4.0x105 6.0x105 8.0x105 1.0x106 1.2x106 1.4x106 1.6x106 1.8x106 2.0x106 2.2x106 R=0,98343 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija ibuprofena (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0 1x106 2x106 3x106 4x106 5x106 R=0,98282 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija flurbiprofena (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 1.0x107 2.0x107 3.0x107 4.0x107 5.0x107 R=0,99862 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija karbamazepina (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 2.0x106 4.0x106 6.0x106 8.0x106 1.0x107 1.2x107 1.4x107 1.6x107 R=0,99939 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija lorazepama (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 2.0x106 4.0x106 6.0x106 8.0x106 1.0x107 1.2x107 1.4x107 1.6x107 1.8x107 R=0,99866 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija diazepama (ng cm-3) 0 50 100 150 200 250 0.0 2.0x106 4.0x106 6.0x106 8.0x106 1.0x107 1.2x107 R=0,98308 P<0,0001 Po vr šin a pi ka Koncentracija diklofenaka (ng cm-3) Slika 66. (nastavak) 123 OBJAVLJENI NAUČNI RADOVI IZ DOKTORSKE DISERTACIJE 1. S. Grujić, T. Vasiljević, M. Laušević, T. Ast, Study on the formation of an amoxicillin adduct with methanol using electrospray ion trap tandem mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom., 22 (2008) 67–74. 2. S. Grujić, T. Vasiljević, M. Laušević, Determination of multiple pharmaceutical classes in surface and ground waters by liquid chromatography–ion trap–tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 4989–5000.