UNIVERZITET U BEOGRADU STOMATOLOŠKI FAKULTET Milan B. Petrović BIOLOŠKA AKTIVNOST KOMPOZITNIH ĆELIJSKIH NOSAČA NA BAZI VISOKOPOROZNIH HIDROKSIAPATITA I NJIHOV UTICAJ NA TKIVNO INŽENJERSTVO KOSTI Doktorska disertacija Beograd 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF DENTISTRY Milan B. Petrović BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE COMPOUND SCAFFOLDS BASED ON HIGHLY POROUS HYDROXYAPATITE AND THEIR INFLUENCE ON BONE TISSUE ENGINEERING Doctoral dissertation Belgrade 2012. Mentori: Prof. dr Miroslav Vukadinović, Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet, Klinika za maksilofacijalnu hirirgiju Prof. dr Dejan Marković Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet, Klinika za dečju i preventivnu stomatologiju Članovi komisije: Prof. dr Miodrag Gavrić, Univerzitet u Beogradu, Stomatološki fakultet, Klinika za maksilofacijalnu hirirgiju Doc. dr Jelena Sopta, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet, Insutut za patologiju dr sc. Snežana Pašalić, Ministarstvo prosvete i nauke Datum odbrane_____________ Doktorska disertacija je realizovana na Institutu Vinča, na Institutu za Medicinska istraživanja Univerziteta u Beogradu, na Institutu za fiziologiju Medicinskog fakulteta univerziteta u Beogradu, na Institutu za hirurgiju Veterinarskog fakulteta Univerziteta u Beogradu i na Institutu za patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Želeo bih da se zahvalim: Svom mentoru Prof. dr Miroslavu Vukadinoviću, na podršci koju mi pruža od mog prvog dana susreta sa maksilofacijalnom hirurgijom, na prijateljskim, stručnim i ljudskim savetima i na pomoći koju mi je pružio u mom usavršavanju i napredovanju u hirurgiji. Velika mi je čast i privilegija što sam svoje prve ozbiljne samostalne hirurške intervencije uradio pod njegovim budnim nadzorom. Ko-mentoru Prof. dr Dejanu Markoviću, jer me je uveo u svet nauke o inženjerstvu tkiva i svojim znanjem, iskustvom i prijateljskim savetima inspirisao u izradi ove disertacije. Dr Vukomanu Jokanoviću, na bezuslovnoj pomoći, entuzijazmu i optimizmu koji je preneo i na mene tokom ove studije. Doc. dr Jeleni Sopti, na dragocenim idejama i pomoći u obradi histoloških preparata. Dr Aleksandri Konić, na trudu i pomoći u izradi laboratorijskog dela doktorata. Prof. dr Petru Milosavljeviću na prijateljskoj pomoći koju mi je pružio na Veterinarskom fakultetu u Beogradu. Prof. dr Zvezdani Kojić, na pomoći u izvođenju doktorata. Dr Ivanu Soldatoviću, na stručnim i prijateljskim savetima i pomoći da se izborim sa statističkim problemima. Dr Nebojši Nikoliću, na drugarskim savetima i na rečima podrške kad mi je bilo najpotrebnije. Jovanu, Branku i Jelisaveti na radosti koju mi donose svaki dan. Jeleni na ljubavi, razumevanju i strpljenju. A najveću zahvalnost dugujem svojim roditeljima, Branku i Dušanki, što su bili to što jesu u mom životu! BIOLOŠKA AKTIVNOST KOMPOZITNIH ĆELIJSKIH NOSAČA NA BAZI VISOKOPOROZNIH HIDROKSIAPATITA I NJIHOV UTICAJ NA TKIVNO INŽENJERSTVO KOSTI Tkivno inženjerstvo koštanog tkiva se u ovom veku razvilo u jedno od glavnih polja istraživanja u regenerativnoj medicini. Ono predstavlja alternativni pristup u odnosu na konvencionalne koštane transplantate. Osnovni cilj ove vrste terapije je da popravi, regeneriše i rekonstruiše oštećeno ili bolešću zahvaćeno tkivo. Osnovu tkivnog inženjerstva čine ćelijski nosači koji predstavljaju razne vrste biomaterijala sposobnih da učestvuju u regeneraciji koštanog tkiva. Veliki broj materijala je istraživan i analiziran sa ciljem da se koristi kao ćelijski nosač na koji bi mogle da se zasejavaju ćelije. Ćelijski nosač koji bi tim ćelijama omogućio rast, proliferaciju i njihovo unošenje u defekte kosti nakon čega bi novostvoreno tkivo preuzimalo strukturu i funkciju obolelog dela tkiva. Hidroksiapatiti i drugi kalcijum fosfatni materijali imali su široku upotrebu kao koštani zamenici više od dve decenije. Zbog loših mehaničkih osobina poroznih hidroksiapatita došlo je do ograničenja njihove primene. U slučaju kada se kombinuju u kompozitne materijale sa odgovarajućim polimer/biopolimer tankim filmovima, porozni hidroksiapatiti dobijaju optimalne osobine potrebne ćelijskim nosačima, koje mogu pružiti odlične uslove za infiltraciju, rast i aktivnost ćelija neophodnih u tkivnom inženjerstvu kosti. Osnovni cilj doktorske disertacije bio je izvršiti karakterizaciju, ispitati biokompatibilnost i biofunkcionalnost poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom(pHAP), poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa PLGA (pHAP+PLGA) i poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa metforminom (pHAP+metformin). Istraživanje je podrazumevalo karakterizaciju ispitivanih materijala uz pomoć Fourier transform infracrvene spektroskopije (FTIR), metodom rentgen difrakcije (XRD), metodom atomski forsirane mikroskopije (AFM), analizom skening elektronske mikroskopije (SEM) i BET metodom. Biokompatibilnost je ispitivana pomoću MTT testa (indirektni kontakt ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom L 929 fibroblasta), LDH testa (direktni kontakt ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom L 929 fibroblasta) i testom kutane iritacije. Biofunkcionalnost ispitivanih materijala bila je istraživana njihovom implantacijom u defekte kritične veličine od 6 mm u predelu kalvarije kunića. Nakon 12 nedelja životinje su bile žrtvovane, a uzorci tkiva su obrađeni za patohistološku analizu. Optičkom mikroskopijom kvantitativno i kvalitativno obrađivani su sledeći parametri: veličina defekta, prisustvo džinovskih ćelija, prisustvo neoangiogeneze, prisustvo bazofila, postojanje znakova nespecifičnog zapaljenja u tkivu, pojava novostvorene kosti, prisustvo fibroplazije u tkivu i procenat mineralizacije. Rezulati istraživanja pokazuju da su ispitivani ćelijski nosači bili savršeno dizajnirani i da su imali idealnu morfologiju površine koja je uticala na način deponovanja hidroksiapatita kao i na aktivnost površine materijala neophodne za ćelijske nosače. Ispitivani materijali pokazali su postojanje citotoksičnosti u indirektnom kontaktu sa kulturom ćelija, ali i da su njihove površine u direktnom kontaktu sa kulturom ćelija pogodne za adheriranje ćelija i za njihovu proliferaciju i da se odlikuju karakteristikama koje omogućavaju rast ćelija. Rezultati testa kutane iritacije pokazali su da ni jedan od ispitivanih materijala ne izaziva iritaciju i da se mogu smatrati neiritirajućim pa su iz tog razlog pogodni za primenu u in vivo uslovima. Porozni hidroksiapatit i kompozitni ćelijski nosač pHAP sa PLGA doveo je do stvaranja nove kosti uz značajno prisustvo mineralizacije u defektima kritične veličine kalvarije kunića. pHAP sa PLGA se pokazao, na osnovu ovog istraživanja jednak, a po nekim parametrima i bolji od primenjenog zlatnog standarda BioOss-a. pHAP sa metforminom nije pokazao očekivane rezultate. Istraživanje je pokazalo da pHAP sa PLGA u daljim eksperimentima može da posluži kao osnova za dobijanje ćelijskog nosača u tkivnom inženjerstvu kosti i da omogući vezivanje osteoblasta ili nekog od prekursora osteoblasta, njihov rast i diferencijaciju. Ključne reči: tkivno inženjerstvo kosti, ćelijski nosači, porozni hidroksiapatit, polilaktidkoglikolid, metformin Naučna oblast: Stomatološke nauke Uža naučna oblast: Ćelijski nosači UDK broj: 615.46:616.71-003.93(043.3) BIOLOGICAL ACTIVITY OF THE COMPOUND SCAFFOLDS BASED ON HIGHLY POROUS HYDROXYAPATITE AND THEIR INFLUENCE ON BONE TISSUE ENGINEERING Since the beginning of this century the bone tissue engineering has developed into one of the essential research fields in reconstructive medicine, as an alternative approach compared with the conventional bone transplants. The main objective of this kind of therapy is to repair, regenerate and reconstruct the damaged or disease-stricken tissue. Tissue engineering is based on scaffolds which are of various biomaterials capable of participating in the process of bone tissue regeneration. A great number of materials has been researched and analyzed so as to be used as a scaffold for cell seeding. Therefore, the scaffold would enable those cells to grow, proliferate and penetrate the bone defects, whereupon the new tissue would take over the structure and function of the damaged tissue. Hydroxyapatites and other calcium phosphate materials were widely used as bone replacements for more than two decades. However, the poor mechanical features of porous hydroxyapatites led to their limited use. In case when they are combined into the compound materials together with polymer/biopolymer thin films, the porous hydroxyapatites acquire optimal characteristics required by scaffolds, which can offer excellent conditions for cell infiltration, growth and activity which is necessary in bone tissue engineering. The main objective of the doctoral dissertation was to carry out the characterization, examine the biocompatibility and biofunctionality of porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method (pHAP), porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method in combination with PLGA (Phap + PLGA) and porous hydroxyapatite created by the modified hydrothermal method in combination with metformin (pHAP + metformin). The research included the characterization of the tested materials by means of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), X-ray distraction method (XRD), atomic forse microscopy method (AFM), scanning electorn microscopy analysis(SEM) and BET method. Biocompatibility was examined by MTT test (indirect contact of the tested materials with the cell culture L 929 fibroblasts), LDH test (direct contact of the tested materilas with the cell culture L929 fribroblasts) and test of local effects on skin in rabbits. Biofunctionality of the examined materials was researched by their implatation into defects of critical size of 6mm in the region of parietal bone in rabbits. After 12 weeks the animals were sacrifised, and tissue samples were prepared for pathohistological analysis. By means of the optical microscopy the following parametres were determined both quantitatively and qualitatively: the size of the defect, the presence of giant cells, the presence of neoangiogenesis, the presence of basophils, the presence of nonspecific inflammation in the tissue, the appearance of the newly created bone, the presence of fibroplasia in the tissue and the percentage of mineralization. The results showed that the examined scaffolds were perfectly designed and they had the ideal surface morphology which had an impact on how the hydroxyapatite deposit as well as on the material surface activity necessary for scaffolds. The examined materilas indicated the presence of cytotoxicity in indirect contact with cell culture, but also showed that their surfaces, in direct contact with cell culture, are suitable for cell adhering and their proliferation, and furthermore, they have features which enable the cell growth. The results of the test of local effects on skin in rabbits, showed that none of the examined materilas causes irritation and can be considered as non-irritating, so due to that fact they are suitable for in vivo application. The porouse hydroxyapatite and compound scaffold pHAP with PLGA led to the creation of the new bone together with considerable presence of mineralization in critical sized defects. According to this reasearch, pHAP with PLGA has proved to be equal, and to certain parameters, even better than the applied BioOssR golden standard. pHAP with metformin did not show expected results. The research has shown that, in further experiments, pHAP together with PLGA can be the basis for generating the scaffold in bone tissue engineering and provide settlement of osteoblasts or any of osteoblast precursors, their growth and differentiation. Key words: bone tissue engineering, scaffolds, porous hydroxyapatite, poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA), metformin Scientific field: Dentistry Scientific field Specalized: Scaffolds UDC: 615.46:616.71-003.93(043.3) SADRŽAJ 1.UVOD 1 2.PREGLED LITERATURE 3 2.1. KOŠTANO TKIVO 3 2.1.1. GRAĐA KOSTI 3 2.1.2. STRUKTURA KOŠTANOG TKIVA 3 2.1.3. SASTAV KOŠTANOG TKIVA 4 2.1.4. KOŠTANO ZARASTANJE 6 2.1.4.1.PRIMARNO ZARASTANJE KOŠTANOG TKIVA 6 2.1.4.2.SEKUNDARNO KOŠTANO ZARASTANJE 7 2.2.ZAMENICI KOŠTANOG TKIVA 7 2.2.1.AUTOGENI ZAMENICI KOSTI 9 2.2.2.ALOGENI ZAMENICI KOSTI 10 2.2.2.1. Zamrznuta kost 10 2.2.2.2. Zamrznuta sušena kost 10 2.2.2.3.Demineralizovana zamrznuta sušena kost 11 2.2.2.4.Deproteinizovana kost 11 2.2.3.KSENOGENI ZAMENICI KOSTI 11 2.2.4.ALOPLASTIČNI ZAMENICI KOSTI 11 2.2.4.1.Biokeramike 12 2.2.4.2.Aloplastični materijali na bazi silicijuma 13 2.2.5.FAKTORI RASTA 13 2.2.6.SMEŠE 13 2.3.TKIVNO INŽENJERSTVO 14 2.3.1.DEFINICIJA 14 2.3.2.OSNOVNI PRINCIPI 14 2.3.3.TKIVNO INŽENJERSTVO KOSTI 16 2.3.3.1.KOMPONENTE TKIVNOG INŽENJERSTVA KOSTI 16 2.3.3.1.1.Osteogene ćelije 16 2.3.3.1.2.Osteoinduktivne susptance - faktori rasta 17 2.3.3.1.2.1..Metformin 19 2.3.3.1.3.Ćelijski nosači 20 2.3.3.2.MATERIJALI U TKIVNOM INŽENJERSTVU KOSTI 24 2.3.3.2.1.Podela biokeramičkih materijala 25 2.3.3.2.2.Porozni hidroksiapatiti (pHAP) 25 2.3.3.2.3.Kompozitni materijali 37 2.3.3.4.SAVREMENI KONCEPTI KONSTRUKCIJE SKAFOLDA 32 3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA 35 4.MATERIJAL I METODOLOGIJA 37 4.1.TESTIRANI MATERIJALI 37 4.1.1.Karakterizacija 38 4.2.ISPITIVANJE DIREKTNE I INDIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ANALIZIRANIH JEDINJENJA 40 4.2.1.Ispitivanje indirektne citotoksičnosti 40 4.2.2.Ispitivanje direktne citotoksičnosti 43 4.3.ISPITIVANJE BIOKOMPATIBILNOSTI: TEST PRIMARNE KUTANE IRITACIJE 44 4.3.1.Test materijali (Test uzorci): 44 4.3.2.Eksperimentalne životinje 44 4.3.3.Eksperimentalni protokol 45 4.3.4.Statistička analiza 47 4.4.ISPITIVANJE BIOFUNKCIONALNOSTI: IN VIVO PREDKLINIČKI TESTOVI NA ANIMALNOM MODELU 48 4.4.1.Subjekti 48 4.4.2.Testirani materijali 49 4.4.3.Test procedura 49 4.4.3.1.Anestezija 49 4.4.3.2.Randomizacija 49 4.4.3.3.Hirurška procedura 50 4.4.4.Preparacija tkiva 51 4.4.5.Obrada tkiva za patohistološku analizu 51 4.4.6.Histološko ocenjivanje 52 4.4.7.Statistička analiza 53 5.REZULTATI 54 5.1.SINTEZA ČESTICA HIDROKSIAPATITA, KERAMIČKIH HIDROKSIAPATITNIH ĆELIJSKIH NOSAČA I NOSAČA SA INFILTRIRANIM TANKIM FILMOVIMA POLIMERA 54 5.1.1. Karakterizacija HA praha 56 5.1.1.1.XRD analiza 56 5.1.1.2.Infracrveni spektar hidrotermalno dobijenog HA 57 5.1.1.3.AFM analiza 58 5.1.1.4.SEM analiza 59 5.1.1.5.BET analiza 60 5.1.2. Karakterizacija HA skafolda 60 5.1.2.1. Makroskopska razmatranja 60 5.1.2.2. AFM i SEM analiza 60 5.1.2.3.FTIR analiza 64 5.1.2.4.XRD analiza 65 5.1.2.5.SEM analiza Phap sa PLGA 66 5.2.REZULTATI ISPITIVANJA DIREKTNE I INDIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ANALIZIRANIH MATERIJALA 67 5.2.1.Ispitivanje citotoksičnosti – indirektni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - MTT test 67 5.2.2.Ispitivanje citotoksičnosti – direktni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - LDH test 81 5.3.TEST PRIMARNE KUTANE IRITACIJE 85 5.3.1.Sistemska reakcija podnošljivost - tolerancija 85 5.3.2.Lokalna reakcija 85 5.3.2.1.Efekat pHAP 85 5.3.2.2.Efekat pHAP + metformin 86 5.3.2.3.Efekat pHAP + PLGA 87 5.3.2.4.Efekat mlečne kiseline (98%) – pozitivna kontrola 88 5.4.ISPITIVANJE BIOFUNKCIONALNOSTI: IN VIVO PREDKLINIČKI TESTOVI NA ANIMALNOM MODELU 91 5.4.1.Opis i karakteristike uzorka 91 5.4.2.Veličina defekta 92 5.4.3.Prisustvo nespecifičnog zapaljenja 96 5.4.4.Prisustvo džinoviskih ćelija 101 5.4.5.Novostvorena kost 105 5.4.6.Prisustvo fibroplazije 110 5.4.7.Neoangiogeneza 114 5.4.8.Procenat mineralizacije 117 5.4.9.Prisustvo bazofila 122 6.DISKUSIJA 125 6.1. DISKUSIJA MATERIJALA 125 6.2.DISKUSIJA TESTOVA INDIREKTNE I DIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ISPITIVANIH MATERIJALA 129 6.2.1.Diskusija indirektnog kontakta ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom 130 6.2.2.Diskusija direktnog kontakta ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom 132 6.3.DISKUSIJA TESTA IRITACIJE 134 6.4.DISKUSIJA TESTA BIOFUNKCIONALNOSTI NA ANIMALNOM MODELU 135 7.ZAKLJUČAK 143 8.LITERATURA 145 11.UVOD Problem gubitka koštanog tkiva je predmet izučavanja različitih oblasti medicinskih nauka, sa zajedničkim ciljem da se omogući njegova nadoknada. U oblasti oralne i maksilofacijalne hirurgije, nadoknada koštanih defekata nastalih nakon operacija tumora, cista, kominutivnih fraktura kostiju lica i vilica, kao i nakon infekcija koštanog tkiva, predstavlja poseban izazov s obzirom da osim funkcionalnog ima i estetski značaj za pacijenta. Čvrsti zamenici kosti koji se koriste u cilju nadoknade defekata koštanog tkiva su implantacioni ili transplantacioni materijali, humanog, životinjskog ili sintetskog porekla koji mehanički popunjavaju defekte kosti a sa svojim osteokonduktivnim, osteoinduktivnim i osteogenetskim karakterom omogućavaju bolje zarastanje. Zamenici kosti se dele na autogene, alogene, ksenogene, aloplastične zamenike, faktore rasta i kompozite, odnosno kombinacije više zamenika različitih vrsta. Ni jedan od navedenih koštanih zamenika u funkciji nadoknade i regeneracije koštanog tkiva nije se pokazao kao idealan. U poslednjoj deceniji intenzivno se razvija nova grana medicine, tkivno inženjerstvo. Terapijski pristup trajne zamene obolelog tkiva sintetičkim materijalima, u mnogim poljima potisnut je ćelijskom ili genskom terapijom ili različitim metodama tkivnog inženjerstva. Tkivno inženjerstvo koštanog tkiva se u ovom veku razvilo u jedno od glavnih polja istraživanja u regenerativnoj medicini. Procenjuje se da svake godine u svetu oko milion pacijenata ima potrebu za razne tretmane koštanih defekata. Tkivno inženjerstvo kosti predstavlja alternativni pristup u odnosu na konvencionalne koštane transplantate. Osnovni cilj tkivnog inženjerstva je da popravi, regeneriše i rekonstruiše oštećeno ili bolešću zahvaćeno tkivo. Osnovu tkivnog inženjerstva čine ćelijski nosači koji predstavljaju razne vrste biomaterijala sposobnih da učestvuju u regeneraciji koštanog tkiva. Predmet doktorske disretacije je ispitivanje biološke aktivnosti kompozitnih ćelijskih nosača na bazi visokoporoznog hidroksiapatita kao i njihov uticaj na tkivno inženjerstvo koštanog tkiva korišćenjem aktuelne i objektivne metodologije. U kratkoj ali bogatoj istoriji tkivnog inženjerstva kosti, veliki broj materijala je istraživan i analiziran sa ciljem da se koristi kao ćelijski nosač na koji bi mogle da se zasejavaju ćelije. Ćelijski nosač koji bi tim ćelijama omogućio rast, proliferaciju i njihovo unošenje 2u defekte kosti nakon čega bi novostvoreno tkivo preuzimalo strukturu i funkciju obolelog dela tkiva. Hidroksiapatiti i drugi kalcijum fosfatni materijali imali su široku upotrebu kao koštani zamenici više od dve decenije. Zbog loših mehaničkih osobina poroznih hidroksiapatita došlo je do ograničenja njihove primene. U slučaju kada se kombinuju u kompozitne materijale sa odgovarajućim polimer/biopolimer tankim filmovima, porozni hidroksiapatiti dobijaju optimalne osobine potrebne ćelijskim nosačima, koje mogu pružiti odlične uslove za infiltraciju, rast i aktivnost ćelija neophodnih u tkivnom inženjerstvu kosti. 32.PREGLED LITERATURE 2.1.KOŠTANO TKIVO Kost je dinamično visoko vaskularizovano tkivo sa jedinstvenom sposobnošću da zarasta i remodeluje se bez ostavljanja ožiljka(1,2). Koštano tkivo obezbeđuje mehaničku stabilnost skeletu koja mu je potrebna zbog opterećenja, kretanja i zbog zaštite vitalnih organa. Kost služi i kao rezervoar mineralnih materija i ima važnu ulogu u homeostazi kalcijuma u organizmu. Koštana srž je mesto gde se stvaraju eritrociti, pojedine vrste leukocita i trombociti. Zahvaljujući svojoj složenoj građi kost je u stanju da odgovori na ovako različite funkcionalne zahteve koje ima u organizmu kičmenjaka. Dobro razumevanje strukture i ćelijskih komponenti koštanog tkiva je preduslov za razumevanje procesa tkivnog inženjerstva kosti. 2.1.1.GRAĐA KOSTI Na makroskopskom nivou koštano tkivo je organizovana kao:  trabekularna kost - sistem građe spongiozne kosti, visoko porozna, sa visokom koncentracijom krvnih sudova i ćelija, niske gustine sa slabim mehaničkim osobinama  kompaktna kost - sistem građe kortikalne kosti, vrlo malo porozna, sa malo krvnih sudova i ćelija, visoke gustine, odličnih mehaničkih osobina U zavisnosti od međusobnog odnosa spongiozne i kompaktne kosti kao i po njihovom spoljašnjem izgledu kosti koje sačinjavaju skelet dele se na:  cevaste ili tubularne kosti  kratke kosti  pljosnate kosti  duge kosti 2.1.2.STRUKTURA KOŠTANOG TKIVA Kost se strukturno deli na periost, korteks, endost i medularni kanal. 4Periost je membranozni omotač spoljne površine kosti, slabo vezan za nju osim na mestima pripoja tetiva, mišića i zglobnih kapsula. Sastoji se od spoljašnjeg i unutrašnjeg sloja. Spoljašnji sloj je fibrozan, čvršći i bogat krvnim sudovima i nervnim završecima. Unutrašnji sloj sadrži veliki broj osteogenih ćelija koji obezbeđuju apofizni rast kosti. Periost je vezan za korteks pomoću Sherpey-evih vlakana. Korteks predstavlja kompaktnu kost i čini ga osnovna jedinica osteon ili Haversov sistem. Osteon je cindričnog oblika dijametra od 200 do 250 μm paralelno postavljen sa osovinom kosti i sastoji se od 5 do 20 koncentrično poređanjih koštanih lamela debljine 3 do 7 μm u čijem se centru nalazi neuro-vaskularni kanal Havers-ov kanal(3). U osteonu se paralelno sa lamelama nalaze osteociti, takođe kružno postavljeni oko Havers-ovog kanala, međusobno povezani citoplazmatičnim produžecima. Iz periosta u Haversov kanal prodiru krvni sudovi kroz transverzalne nutritivne Volkmanove kanale. Endost je tanak sloj ćelijsko-vezivnog tkiva koji učestvuje u procesima osteogeneze i hematopoeze. Medularni kanal ograničava spongioznu kost, a samo spongiozno tkivo sačinjavaju međusobno povezane i ukrštene trabekule koje ograničavaju sistem lakuna ispunjenih koštanom srži. 2.1.3.SASTAV KOŠTANOG TKIVA Koštano tkivo se sastoji od:  koštanih ćelija  međućelijske supstance kosti Postoje tri tipa koštanih ćelija: Osteoblasti - mononuklearne , specijalizovane, ne terminalno diferentovane ćelije porekla mezenhimalnih matičnih ćelija, sa naglašenom anaboličkom aktivnošću, veličine oko 30 μm i sa jedrom okruglog oblika koje je ekscentrično postavljeno(4). Produkuju osnovne sastojke organskog matriksa koštanog tkiva: proteinske molekule, od kojih se u ekstracelularnom prostoru stvaraju kolageni fibrili, zatim mukopolisaharide, alkalnu fosfatazu, osteokalcin i osteonektin. Imaju uticaja na regulaciju aktivnosti osteoklasta. 5Osteociti - najbrojnije ćelije u koštanom tkivu i predstavljaju terminalno diferentovane osteoblaste. To su okrugle i tamne ćelije koje se nalaze okružene koštanim lamelama koje međusobno i sa okolnom supstancom komuniciraju citoplazmatičnim produžecima. Njihova osnovna uloga je održavanje homeostatske regulacije minerala iz kosti, pre svih kalcijuma i fosfora. Smatra se da deluju kao mehanosenzorne ćelije koje upućuju osteoklaste gde i kada da resobuju kost i aktiviraju osteoblaste gde i kada da stvore kost(4). Osteoklasti - mnogojedarne džinovske ćelije, porekla hematopoeznih matičnih ćelija, veličine do 100 μm, čiji je osnovni zadatak resorpcija kosti. Osteoklasti poseduju jedinstven i efikasan mehanizam razlaganja neorganskog dela matriksa kosti organskim kiselinama i organskog dela matriksa kosti proteolitičkim enzimima (5). Zajedno sa ostalim ćelijama učestvuje u održavanju homeostaze koštanog tkiva. Mesta aktivnosti osteoklasta karakteriše se prisustvom koštanih lakuna - Howship-ove lakune. Međućelijska supstanca predstavlja kompleksan matriks koji se sastoji od: Neorganska mineralizovana komponenta - sastoji se od mineralnih soli koje se u kostima javljaju u heksagonalnoj kristalnoj formi hidroksiapatita (Ca10[PO4]6[0H]2) dimenzija 50 nm x 25 nm x 2,5 nm(6). Po sastavu mineralnu kost čini 85% kalcijum i fosfor, 10% kalcijum karbonat, 5% kalcijum hlorid i magnezijum sulfat i u neznatnim količinama soli natrijuma, kalijuma. Mineralna komponenta kosti odgovorna je za tvrdoću koju koštano tkivo poseduje. Organska nemineralizovana komponenta - Najveći deo, oko 95% organskog sastava međućelijske supstance, čine tip I kolagena vlakna. Makromolekule aminokiselina koje se stvaraju u osteoblastima izlučuju se u ekstracelularni prostor gde se pod dejstvom enzima organizuju u kolagene fibrile(7). Na nanostrukturnom nivou kolageni fibrili sastoje od po tri međusobno u heliks uvijena kolagena molekula dužine 1000 aminokiselina. Organsku komponentu čine i glikoproteini, proteoglikani i sijaloproteini koji igraju važnu ulogu u rastu i diferencijaciji osteoblasta, osteocita i osteoklasta kao i u procesu remodelacije kosti(8). Organska komponenta kosti je odgovorna za elastična svojstva koštanog tkiva. 62.1.1.4.KOŠTANO ZARASTANJE Koštano tkivo poseduje regenerativni kapacitet zahvaljujući kome se štiti od povreda koje mogu umanjiti funkciju skeleta. Takođe ovaj regenerativni kapacitet koštanog tkiva, kao sposobnost remodelovanja, aktivan je tokom razvoja skeleta kao i u odraslom dobu vršeći njegovu stalnu adaptaciju neophodnu zbog konstantnih izmena uslova i novih zahteva koji se postavljaju ovom tkivu(9). Remodelovanje kosti predstavlja dobro organizovanu seriju bioloških događaja koji dovode do idukcije i kondukcije kosti, uključujući veliki broj ćelija i intra i ekstraćelijskih molekularnih signala. Remodelovanje kosti je precizno prostorno i vremenski definisano a sve sa ciljem da se na optimalan način kost regeneriše i da se skeletu vrati željena funkcija(10). Za razliku od mekih tkiva koja zarastaju stvarajući ožiljno tkivo, kost zarasta bez ožiljka stvarajući novu kost. Zarastanje koštanog tkiva, ili premošćavanje oštećenog dela koštanog tkiva do potpunog uspostavljanja anatomskog i funkcionalnog integriteta kosti odvija se na dva načina(1):  primarno koštano zarastanje  sekundarno koštano zarastanje Način zarastanja oštećenog koštanog tkiva osim od vrste, težine i primenjenih terapeutskih metoda zavisi i od individualnih faktora kao što su: starosna dob, poremećaji metabolizma, hronična oboljenja, lokalna prokrvljenost, ranije primenjena zračna terapija, prisustvo osteoporoze i drugo. 2.1.4.1.Primarno zarastanje koštanog tkiva Zarastanje na ovaj način moguće je jedino u posebnim uslovima, odnosno uz pomoć kompresivne osteosinteze, kada su koštani fragmenti egzaktno reponirani i spojeni pod aksijalnim pritiskom u stanju potpunog mirovanja. U navedenim uslovima mezenhimalne celije Haverzovih kanala eksprimuju dominantno osteoblastnu diferencijaciju što omogucava sintezu osteoidnog matriksa koji ispunjava frakturnu pukotinu. 72.1.4.2.Sekundarno zarastanje koštanog tkiva Ovaj način zarastanja se najčešće sreće u kliničkoj praksi. U toku sekundarnog zarastanja, koštano tkivo prolazi put ponovljene normalne fetalne osteogeneze, uključujući intramembranoznu i enhondralnu osifikaciju. Isti molekularni i ćelijski mehanizmi koji regulišu hondrogenezu i osteogenezu, učestvuju i u koštanoj regeneraciji(12). Sekundarno koštano zarastanje započinje neposredno nakon oštećenja koštanog tkiva pojavom hematoma u frakturnoj pukotini, subperiostalno i u okolini preloma. U koštanoj srži i u okolnom vaskularnom vezivnom tkivu nastaje aseptično zapaljenje koje dovodi do hiperemije i ćelijske migracije. Kao posledica reaktivne acidoze dolazi do demineralizacije u regiji frakturne linije, dok aktivni osteoklasti uklanjaju frakturne nekrotične ivice što rezultira proširenjem frakturne pukotine. U hematom i frakturnu pukotinu prodiru mezenhimalne stem ćelije poreklom iz kambijalnog sloja periosta i iz koštane srži(13), koje premošćuju pukotinu, umnožavaju se i diferenciraju kao odgovor na prisustvo faktora rasta i citokina iz trombocita, susednih ćelija i tkiva, stvarajući hrskavičavi skafold ili predkalus. Stvoreni hondrociti prelaze iz proliferativne u hiperplastičnu fazu kao i u fetalnom razvoju. Najveći broj hiperplastičnih hondrocita neminovno podleže apoptozi što je praćeno remodelovanjem ekstracelularnog matriksa novostvorenim kolagenim vlaknima a nakon toga i stvaranjem nove kosti - osteoidni kalus. Funkcionalnim opterećenjem frakturnog dela, novostvorena kost dobija formu lamelarne kosti. 2.2.ZAMENICI KOŠTANOG TKIVA Najveći broj povreda koštanog tkiva zaraste uz pomoć standardnih konzervativnih ili hirurških metoda. Veliki defekti kosti koji nastaju nakon operacija tumora, cista, kominutivnih preloma, infekcija ili usled ne srastanja fragmenata frakturirane kosti zahtevaju složene procedure nadoknade koštanog tkiva uz pomoć koštanih zamenika. Koštani zamenici koji se koriste u cilju nadoknade defekata koštanog tkiva su implantacioni ili transplantacioni materijali, humanog, životinjskog ili sintetskog porekla koji mehanički popunjavaju defekte. 8Oni na kost domaćina mogu reagovati u vidu četiri različita mehanizma(14):  Osteokondukcija - označava rast koštanog tkiva apozicijom sa i na kost domaćina u prisustvu zamenika kosti  Osteoindukcija - označava stimulaciju i aktivaciju mezenhimalnih matičnih ćelija iz okolnog tkiva koje migriraju prema koštanom zameniku, proliferišu u njegovom prisustvu i diferenciraju se u pravcu hondroblasta i osteoblasta koji će obezbediti formiranje kosti. Ovaj proces se omogućava uz pomoć niza kaskadnih signala i aktiviranjem većeg broja ekstra i intracelularnih receptora.  Osteogeneza - označava sposobnost da se kost stvori čak i u odsustvu lokalnih osteoprogenitornih ćelija. Osteoprogenitorne ćelije se nalaze unutar zamenika koštanog tkiva, sposobne su da prežive proceduru implantacije, mogu da migriraju i da se diferenciraju u pravcu osteoblasta.  Osteointegracija – označava premošćavanje koštanim tkivom izmedju površine kosti domaćina i površine koštanog supstituenta. Osteokondukcija, osteoindukcija i osteogeneza su tri elementa koštane regeneracije koji rezultiraju osteointegracijom ili konačnim spajanjem izmedju koštanog zamenika i kosti domaćina. Zamenici koštanog tkiva trebalo bi da budu(14): osteokonduktivni, osteoinduktivni, biokompatibilni, bioresorptivni, strukturno slični koštanom tkivu, laki za korišćenje i jeftini. Najveći broj koštanih zamenika koji su komercijalno dostupni u kliničkoj praksi odlikuju se osteokonduktivnošću, razlukuju se u mehaničkim svojstvima i imaju malu sposobnost osteoindukcije. Prema aktivnostima koje poseduju zamenici kosti mogu se podeliti na(15):  Autogena kost – organska materija koja formira kost putem osteogeneze, osteokondukcije i osteoindukcije  Alograft – npr.demineralizovana zamrznuta sušena kost(DFDB), karakteriše se osteokonduktivnosću i osteoindukcijom  Aloplastični materijali – sintetskog ili prirodnog porekla koji izazivaju osteokonduktivnu reakciju kosti domaćina 9Prema svom poreklu, materijali koji se koriste kao zamenici kosti mogu se svrstati u dve kategorije(16):  Humanog ili životinjskog porekla: o Živa (autograftovi) o Neživa (alograftovi, ksenograftovi)  Sintetske materije(keramičke materije, bioglas, polimeri itd) Na osnovu korišćene literature zamenici kosti se po vrsti mogu podeliti na:  Autogene  Alogene (zamrznuta kost, zamrznuta suva kost, demineralizovana zamrznuta suva kost, deproteinizovana kost)  Ksenogene(najčešće bovinog porekla)  Aloplastične zamenike kosti(keramika, polimeri i kompoziti)  Faktori rasta(TGF, rekombinantne forme BMP, PDGF)  Smeše - kombinacije više zamenika različite vrste 2.2.1.AUTOGENI ZAMENICI KOSTI Autogeni zamenici kosti sadrže u sebi neorganski matriks, kao i neke žive postosteogenetske osteocite, osteoklaste, osteoblaste i sržne organske proteine neophodne za indukciju mezenhimalnih matičnih ćelija. Predstavljaju zlatni standard u hirurgiji nadoknade koštanih defekata i poseduju optimalne osteokonduktivne, osteoinduktivne i osteogenetske karakteristike neophodne za adekvatno zarastanje kosti(17). Poseduju značajnu primarnu stabilnost, u zavisnosti od veličine i oblika, kao i od mesta sa koga se uzimaju. Mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim zamenicima kosti, čime se smanjuje količina koštanog tkiva koje je potrebno za rekonstrukciju. U poslednjoj deceniji ustanovila se i nova tehnika rekonstrukcije koštanih tkiva vaskularizovanim koštanim autogenim graftovima koji se uzimaju sa različitih lokacija: fibule, skapule, ilijačnog grebena. Nakon podizanja ovakvog koštanog grafta koštani defekti se rekonstruišu koristeći se mikrovaskularnim tehnikama čime se postiže dobra vaskularizacija grafta nakon učinjene transplantacije. I pored svega klinička upotreba autogenih koštanih transplantata je ograničena postojanjem traume u predelu davajuće regije, koja se povećava sa povećanjem dimenzija neophodnog koštanog grafta(18). 10 Najčešće komplikacije koje se dešavaju na donorskom mestu ovakvih koštanih graftova su hematomi, gubitak krvi, povrede nerava, pojava hernija, infekcije, povrede velikih arterija, prelomi, nestabilnost preostalih koštanih struktura, vidljivi defekti tkiva, transplantacije tumora kao i hronični bolovi. Njihova primena je limitirana i kod starijih osoba i kod dece. 2.2.2.ALOGENI ZAMENICI KOSTI Alogeni zamenici kosti su supstituenti nastali uzimanjem uzoraka sa iste vrste, ali različitog genotipa. Neophodna je dodatna obrada ovako dobijenog koštanog materijala u cilju redukcije imunog odgovora domaćina, čime se smanjuju biološka (osteoindukcija) i mehanička svojstva grafta. I pored procesa obrade mogućnost prenošenja virusnih infekcija (HIV, hepatitis B i C), bakterijskih infekcija, malignih bolesti, autoimunih bolesti i toksina, je prisutna (14). Prema načinu obrade postoje četiri vrste alogenih zamenika za kost:  Zamrznuta kost  Zamrznuta sušena kost  Demineralizovana zamrznuta sušena kost  Deproteinizovana kost 2.2.2.1. Zamrznuta kost Uzima se sa kadavera i izlaže niskoj temperaturi na kojoj se čuva do njegove primene. Osteogenetski potencijal je manji nego kod autogene kosti. Zračenjem zamrznute kosti redukuju se imunološke rekacije domaćina ali se time i smanjuje induktivni karakter ove kosti. 2.2.2.2.Zamrznuta sušena kost Uzima se sa kadavera i sa živih osoba po striktno određenim uslovima koje propisuje banka tkiva. Zamrzava se na -70C i suši se do 5% vode u tkivu uz prethodno ispiranje antibiotskim ratsvorima. Postoji manja opasnost od prenošenja virusnih infekcija nego kod zamrznute kosti, ali su osteoinduktivna i mehanička svojstva mnogo manja u odnosu na zamrznutu kost. 11 2.2.2.3.Demineralizovana zamrznuta sušena kost Ova vrsta zamenika za kost nastaje dekalcifikacijom kortikalne kosti, kada se neorganski deo ukloni hemijskim putem, kiselinama, nakon čega se zamrzava. Takav način obrade takođe redukuje mogućnost infekcije i potencijalne imunološke reakcije domaćina a pri tome ne eliminiše koštane faktore rasta, zbog čega je ova vrsta koštanog supstituenta više osteoinduktivna u odnosu na mineralizovane alogene materijale. 2.2.2.4.Deproteinizovana kost U svojoj osnovnoj strukturi sadrži neorgansku komponentu kosti, mineralne soli u formi kristala hidroksiapatita. Postupak deproteinizacije podrazumeva termičku ili kombinaciju termičke i hemijske obrade. Ovi koštani supstituenti se karakterišu osteokonduktivnim načinom zarastanja kosti. Procesi dekalcinacije i deproteinizacije dovode do smrti ćelija čime je primarna osteogeneza smanjena. 2.2.3.KSENOGENI ZAMENICI KOSTI To su zamenici nastali od druge vrste koji nakon obrade imaju osteokonduktivni karakter. U praksi se najčešće koriste ksenogeni zamenici kosti bovinog porekla. Zbog velikog antigenog potencijala neophodno je sprovesti postupak deproteinizacije termičkom obradom svežih materijala. U današnje vreme na ovim prostorima najčešće se koristi deproteinizovana bovina kost pod imenom ’’Bio-oss’’ Švajcarske firme Geistlich Pharme. To je materijal nastao deproteinizacijom bovine kosti poroznosti 75- 80%. U zavisnosti od indikacija, ovaj materijal se može koristiti u vidu spongioznih ili kortikalnih granula dimenzija od 0,25 do 1 mm ili od 1 do 2 mm, kao spongiozni blok promera 1x1x2cm i kolageni blok sastavljen od 100mg spongioznih granula i 10% kolagena. 2.2.4.ALOPLASTIČNI ZAMENICI KOSTI Aloplastični zamenici kosti su sintetski materijali koji su pristupačni, biokompatibilni i bezbedni, tako da se mogu primeniti kao koštani supstituenti. Idealno sintetski koštani graftovi bi trebalo da budu kompatibilni, da pokazuju minimalnu fibroznu reakciju, da podležu remodelovanju i da podržavaju novostvorenu koštanu 12 formaciju(14). Sa stanovišta mehaničkih osobina sintetski zamenici kosti bi trebalo da imaju sličnu čvrstoću kao kortikalna ili spongiozna kost koju bi trebalo da zamene. Nedostaci aloplastičnih materijala su: niska ili nepredvidiva resorpcija, teškoće u rukovanju, povremeno izazivanje inflamatornih reakcija tipa ’’stranog tela’’(19). 2.2.4.1.Biokeramike Biokeramički materijali su sintetički zamenici za kost koji u svom sastavu imaju kalcijum fosfat. Trikalcijum fosfatna keramika ima stehiometrijske karakteristike slične amorfnim koštanim prekursorima dok je hidroksiapatit sličan mineralnom delu kosti. Pokazano je da izazivaju biološki odgovor slično kao koštano tkivo i da su visoko biokompatibilni(20). Samostalno ne poseduju osteogene kao ni osteoinduktivne osobine. Osteoblasti intimno naležu na površinu ovih keramičkih materijala, formiraju koštano tkivo koje mineralizuje i koje je podložno kasnijoj remodelaciji. Obično se kombinuju sa drugim materijalima ili sa autogenom kosti, čime se postiže funkcionalnost i brža resorpcija. Tečni kalcijum fosfat sastoji se od alfa trikalcijum fosfata koji se kombinuje sa kalcijum karbonatom i monokalcijum fosfatom. Priprema se u tečnoj formi i ubrizgava se u koštani defekt gde dobija čvrstu formu bez oslobađanja toplote. Inicijalna čvrstoća ovih materijala po ubrizgavanju jednaka je čvrstoći kortikalne kosti. Podleže remodelovanju i potpuno se zamenjuje novim koštani tkivom. Ultraporozni beta trikalcijum fosfat, je visokoporozni biokeramički materijal čija je poroznost preko 90% sa porama veličine od 1 do 1000 μm. Ima karakteristike trabekularne kosti koja omogućava fagocitnu aktivnost, resorpciju i infiltraciju osteoblastima i faktorima rasta. Visoka poroznost je neophodna za dobru vaskularizaciju i stvaranje novog koštanog tkiva. Kao i ostali keramički materijali ne poseduje osteoinduktivne i osteogenetske karakteristike. Koralni hidroksiapatit je u osnovi hidroksiapatit dobijen iz prirodnih materijala, iz morskih korala. Karakteriše se visokom poroznošću i sastoji se od hidroksiapatita koji je sličan humanoj kortikalnoj kosti(21). Mogu se koristiti i kao nosači za faktore rasta ili BMP(bone morphogenenetics protein). 13 2.2.4.2.Aloplastični materijali na bazi silicijuma Bioaktivno staklo je tvrd, solidan(neporozan) materijal koji se sastoji od kalcijuma, fosfora i silicijum dioksida. U zavisnosti da li dominira kalcijum oksid ili silicijum dioksid proizvodi se u tečnom ili čvrstom stanju. Poseduje osteokonduktivne i osteointegrativne karakteristike. Ima značajno veću čvstinu od keramičkih materijala kao što je hidroksiapatit ali je sklon pucanju i tesko ga je fiksirati za susednu kost. U novije vreme pojavila se bioaktivna keramika koja ima poboljšana mehanička svojstva u odnosu na bioaktivno staklo. Glas jonomerni cementi (prvi put korišćeni u stomatologiji) sastoje se od kalcijum/aluminijum/fluorosilikatnog staklenog praha pomešanog sa polikarboksilnom kiselinom čime se stvara porozna cementna pasta. Pasta prelazi u čvrsto stanje nakon 5 minuta nakon čega je nerastvorljiva u vodi. Nakon 24 sata ima karakteristike kortikalne kosti. Biokompatibilni su i osteointegrišu slično kao bioaktivno staklo. Porozna struktura obezbeđuje osteokondukciju i urastanje koštanih ćelija. Glas jonomer cementi su neresorptivi i ne zamenjuju se koštanim tkivom. Mogu se kombinovati sa antibioticima i visokomolekularnim proteinima koji se sporo oslobađaju u tkivima. 2.2.5.FAKTORI RASTA Poseduju visoka osteoinduktivna svojstva i najčešće se koriste u kombinaciji sa nekim drugim zamenikom kosti u cilju rekonstrukcije koštanih defekata(22). Faktori rasta koji su najviše zastupljeni u rekonstrukciji koštanih defekata su: BMP (bone morphogenenetics protein), TGF alfa i TGF beta (transforming growth factor), PDGF (platelet derived growth factor), PRP (platelet rich plasma). 2.2.6.SMEŠE Smeše predstavljaju kombinacije više zamenika različitih vrsta. Nastanak ovakvih kombinacija je rezultat potreba za korigovanjem nedostataka pojedinačnih zamenika sa ciljem da se iskoriste najbolje osobine svakog elementa u smeši ponaosob. Najčešće su stvarane smeše materijala sa osteokonduktivnim i osteointegrativnim svojstvima sa onima koji poseduju osteoinduktivna svojstva. 14 2.3.TKIVNO INŽENJERSTVO 2.3.1.DEFINICIJA U poslednjoj deceniji intenzivno se razvija nova grana medicine, tkivno inženjerstvo. Terapijski pristup trajne zamene obolelog tkiva sintetičkim materijalima, u mnogim poljima potisnut je ćelijskom ili genskom terapijom ili različitim metodama tkivnog inženjerstva. Na taj način jedno od najvažnijih polja biomedicinskih istraživanja postaje regenerativna terapija. Jednu od prvih definicija inženjerstva tkiva dali su Langer i Vacanti “ kao interdisciplinarnog polja koje primenjuje principe inženjerstva i nauke o životu na razvoj bioloških supstituenata koji restauriraju, održavaju i poboljšavaju funkcije tkiva i organa” (23). Tkivno inženjerstvo se zasniva na poznavanju procesa embriologije, sastava, funkcije i regeneracije tkiva. Kombinacija živih ćelija, biološki aktivnih molekula i strukturiranih ćelijskih nosača – skafolda koji formiraju konstrukciju za tkivno inženjerstvo u cilju obnove i regeneracije tkiva jeste najčešći koncept kojim se danas objašnjava tkivno inženjerstvo(24). Tkivno inženjerstvo je neizostavni deo regenerativne medicine. Inženjerstvo tkiva napredovalo je od korišćenja biomaterijala koji mogu popraviti ili zameniti obolelo ili oštećeno tkivo ka korišćenju 3D skafolda u kojima se ćelije zasejavaju pre implantacije. Sadašnji ciljevi inženjerstva tkiva su da kreira ili uvede formiranje specifičnog tkiva na specifično mesto kroz selekciju i manipulaciju ćelijama, matricama i biološkim stimulansima. Ovi konstrukti živih ćelija mogu biti funkcionalno, strukturno i mehanički uporedivi sa tkivima koje moraju da zamene. 2.3.2.OSNOVNI PRINCIPI Tkivno inženjerstvo je zasnovano na postojanju tri osnovne komponente koje se inače nalaze u osnovi svakog tkiva:  ćelije  ekstracelularni matriks i  signalni sistem. 15 Funkcionalno tkivo može se razviti korišćenjem jedne ili više komponenti iz ove trijade. Kombinovanje postojećih znanja o interakciji molekula ekstracelularnog matriksa i postojećih ćelija sa saznanjima koja postoje o genskoj ekspresiji potrebnoj za indukovanje diferencijacije ćelija i specifičnog rasta odredjenih tkiva, pruža osnovu za prevođenje bazičnih naučnih saznanja u racionalni razvoj komponenti trijade tkivnog inženjerstva. Dva osnovna pristupa su danas utvrđena u cilju proizvodnje tkiva metodom inženjerstva. Prvo, ćelijski nosači, skafoldi, mogu biti korišćeni kao potpora za ćelijsku kulturu, koja se zasejava na njima u ’’in vitro’’uslovima. Ćelije se nakon toga stimulišu da se razmnožavaju i diferenciraju unutar matriksa ćelijskog nosača, formirajući na taj način tkivo koje je spremno za transplantaciju. Drugi pristup podrazumeva korišćenje skafolda kao nosača faktora rasta ili lekova, tako da nakon implantacije u tkiva stimulišu ćelije iz tela domaćina da se umnožavaju i naseljavaju matriks skafolda formirajući novo tkivo na i unutar transplantiranog matriksa. Ova dva pristupa ne isključuju jedan drugog i mogu se međusobno kombinovati(26). Nezavisno od tipa tkiva, ćelije, ekstracelularni matriks, krvni sudovi, nervi, međućelijska komunikacija i interakcija ćelija i matriksa između njih su samo neki od činioca koji utiču na rast i razvoj tkiva ’’in vivo’’. Svaka od ovih komponenti ponaosob mora biti kombinovana u dobro koordinisanom sistemu i vremenski i prostorno. Pored toga, dobro razrađen hirurški plan implementacije, preduslov je za uspešnu ’’in vivo’’ aplikaciju koncepta tkivnog inženjerstva. Neophodno je pažljivo rukovanje kompleksnim tkivom dobijenim tkivnim inženjerstvom, zbog prevencije oštećenja osetljivih ćelija ili bioaktvinih supstanci tokom implantacije. U zavisnosti od tkiva koje se regeneriše, period ’’in vitro’’ gajenja novostvorenog tkiva varira od jednog dana do nekoliko meseci. Ovaj period se najčešće koristi za umnožavanje ćelija ili za indukovanje diferencijacije matičnih ćelija u specifična tkiva. U ekperimentalnim uslovima konceptom tkivnog inženjerstva uspešno su stvorena različita tkiva kao što su kost, hrskavica, jetra, mišić, koža i ostalo(25). Korišćenje bioreaktora za dinamičko ćelijsko kultivisanje tkivnih inženjeriranih konstrukata treba da omogući razvoj strategije pogodnog i efikasnog zasejavanja ćelija da bi se postigla uniformna ćelijska distribucija unutar velikog skafolda, koja mehanički podržava ćelije i automatski kontroliše masu tkivne kulture. 16 2.3.3.TKIVNO INŽENJERSTVO KOSTI Upotreba raznih koštanih zamenika u nadoknadi koštanih defekata sa različitim funkcionalno i estetski nedovoljno zadovoljavajućim rezultatima, nametnula je potrebu razvoja tkivnog inženjerstva kosti. U zavisnosti od toga koji deo koštano-skeletnog sistema se nadoknađuje koštano tkivo stvoreno tkivnim inženjerstvom može biti različitih karakteristika(18). Za nadoknadu defekata dugih cevastih kostiju primarno je postići visoku mehaničku stabilnost dok inicijalno postignut oblik nije prioritet. Sa druge strane prilikom nadoknade defekata u kraniofacijalnoj regiji, primarno je postići oblik kostiju koje se nadoknađuju, dok mehanička stabilnost, iako potrebna, nije tako neophodna kao u slučaju nadoknade cevastih kostiju. U zavisnosti od mesta implantacije, inicijalna vaskularizacija može biti ključna za prihvatanje novostvorenog koštanog tkiva i prevenciju pojave infekcije. Mehanička stabilnost, osteokondukcija (sposobnost materijala da omogući uvodjenje tkiva koje stvara kost u defekt), osteoindukcija (sposobnost da se indukuje stvaranje koštanog tkiva i da se stimulišu osteoblasti domaćina za stvaranje kosti), osteogeneza (sposobnost da se stvara koštano tkivo de novo) i lako rukovanje moraju biti u ravnoteži sa ciljem da se ispune sve potrebe za kliničkom upotrebom tkivnog inženjerstva koštanog tkiva(18). 2.3.3.1.Komponente tkivnog inženjerstva kosti 2.3.3.1.1.Osteogene ćelije Osteogene ćelije su obavezan deo svake strategije tkivnog inženjerstva kosti(18). Ove ćelije ne predstavljaju homogenu ćelijsku populaciju(27). Danas je još uvek nepoznato koji tip osteogenih ćelija bi bio najpogodniji za tkivno inženjerstvo kosti. Ove ćelije se ili transplantiraju sa odgovarajućim skafoldom u koštani defekt ili pomoću osteoinduktivnih faktora bivaju privučene iz lokalnog tkiva domaćina i naseljavaju postavljeni skafold. Glavni uspeh na ovom polju postiže se pomoću primarnih ćelija uzetih od pacijenta i zatim umnoženih i diferenciranih u matriksu ćelijskog nosača, skafolda, čime se stvara tkivo spremno za reimplantaciju. 17 Mezenhimalne stem ćelije, stromalne ćelije koštane srži, periostalne ćelije i osteoblasti podjednako su uspešno korišćene u stvaranju koštanog tkiva(18,28,29). Izolacija osteogenih ćelija, njihovo efikasno umnožavanje, posedovanje stabilnosti u osteogenom fenotipu, mogućnost stvaranja koštanog tkiva u ’’in vivo’’ uslovima i sigurnost u dužem vremenskom periodu, osnovni su preduslovi koji se moraju ispuniti da bi bilo koji tip osteogenih ćelija bile uspešne u kliničkoj primeni. Klinička primena tkivnog inženjerstva kosti je već opisana. Quatro i saradnici tretirali su tri pacijenta sa velikim defektima tibije, ulne i humerusa koristeći visokoporozni hidroksiapatitni skafold na koji su zasejane i u ’’in vitro’’uslovima umnožene stromalne ćelije koštane srži fiksirane kolagenim gelom. Svi pacijenti su se uspešno oporavili bez većih kompikacija. Vacandi i saradnici rekonstruisali su palac pacijenta koristeći periostalne ćelije u skafoldu od hidroksiapatita na bazi korala(30). Funkcija šake kod ovog pacijenta se značajno popravila mada je histopatološkom analizom otkriveno da je samo 5 % implantiranog tkiva bilo kost. Mezenhimalne stem ćelije zajedno sa trombocitima bogatom plazmom koji su postavljeni u skafoldu od beta trikalcijum fosfata indukovali su stvaranje koštanog tkiva kod operacije podizanja sinusa(31). Ishod ovih početnih kliničkih studija nije se pokazao znatno boljim u odnosu na standardne hirurške rekonstruktivne metode. 2.3.3.1.2.Osteoinduktivne supstance - faktori rasta Prisustvo osteoinduktivnih supstanci u tkivnom inženjerstvu imaju izuzetan značaj sa stanovišta boljeg i usmerenijeg transporta signala sa ćelije na ćeliju i ćelijske medjusobne komunikacije tokom procesa proliferacije “keramičkog-koštanog” skafolda(39). Faktori rasta imaju dvojak značaj. S jedne strane, oni se mogu posmatrati kao faktori, čijim uvođenjem u strukturu skafolda, moguće je dodatno aktivirati i usmeriti ćelije na određene vrste međusobne signalizacije i proliferacije, koja uključuje u sebe i moguće mehanizme uspostavljanja aktivnih struktura, koje omogućuju bržu angiogenezu i proliferaciju krvnih sudova i nutrijenata, te na taj način pospešuju brži proces ćelijske proliferacije i rasta. S druge strane, oni daju informacije o stanjima tkiva i veoma su značajni sa stanovišta dijagnostike vezane za promene na tkivima u kontaktu sa implantiranim materijalom. 18 Osteoinduktivne supstance se klinički već koriste samostalno za rekonstrukciju koštanih defekata ili za ubrzavanje procesa zarastanja na mestu frakturnih pukotina. U osteoinduktivne faktore koji se koriste u tkivnom inženjerstvu kosti spada BMP (bone morphogenenetics protein), TGF alfa i TGF beta (transforming grown factor), PDGF (platelet derived growth factor), PRP (platelet rich plasma), DMB (demineralised bone matrix) (16). BMP pogotovo tipovi 2, 4 i 7 uveliko se koriste u većini slučajeva kao osteoinduktivne supstance u tkivnom inženjerstvu kosti(34). Pripada grupi faktora rasta bitnih za stvaranje i regeneraciju koštanog tkiva i dostupan je u različitim formama za kliničku upotrebu. Jedan od ograničavajućih faktora za primenu BMPa u tkivnom inženjerstvu jeste dužina njegovog prisustva na mestu regeneracije. U poslednje vreme ovaj problem se rešava kombinovanjem BMPa sa odgovarajućim skafoldima koji regulišu brzinu njegovog oslobađanja. Postoji nekoliko objavljenih predkliničkih studija o korišćenju BMPa i rekombinovanog humanog BMPa u regeneraciji koštanog tkiva, koji su u koncentrovanom obliku aplikovani u kombinaciji sa skafoldima, kompozitnim materijalima i gelovima. Studije su obuhvatale regeneraciju koštanih tkiva na animalnim modelima ulne, tibije, radijusa, femura i defekata kalvarije(35). Danas je primena rhBMPa odobrena za kliničke studije za augmentaciju poda sinusa. U tim studijama otkriveno je da i pored podjednako uspešnih rezultata u odnosu na korišćenje autologne kosti za augmentaciju sinusa, u slučajevima kada je korišćena rhBMP, novoformirana kost bila je veće gustine(36). Pored toga nisu se javljale parestezije, bolovi, nelagodnosti na mestu davajuće regije, koji nastaju u postupcima kada se koriste autograftovi(37). Trombocitima bogata plazma(PRP) sadrži pored PDGFa(platelet derived growth factor) u zavisnosti od načina procesuiranja i aplikacije, različite faktore rasta(32). Dokazano je indukovanje stvaranja koštanih formacija u prisustvu PRPa u eksperimentalnim i kliničkim studijama. Zajedno sa različitim skafoldima omogućava migraciju osteogenih ćelija domaćina prema matriksu ćelijskih nosača. Ograničene kliničke studije postoje i kada se koriste druge osteoinduktivne supstance u tkivnom inženjerstvu kosti. Uglavnom se zasnivaju na malim serijama pacijenata bez jasne kontrole i to većinom u kraniofacijalnim rekonstrukcijama. 19 Aplikacija i indikacija za primenu pojedinih osteoinduktivnih supstanci još nije standardizovana. 2.3.3.1.2.1..Metformin Metformin je već duže vreme u medicini poznat kao oralni antidijabetik koji se ordinira insulin rezistentnim pacijentima sa dijabetesom tip 2. Smatra se da je to insulin senzitivan lek, koji smanujuje nivo glikemije bez povećanja sekrecije insulina(39). Dokazano je da metformin ima još nekoliko korisnih efekata na kardiovaskularni sistem kao što su regulacija koncentracije lipida u krvi, smanjuje sklonost ka intravaskularnoj trombozi smanjenjem koncentracije i aktivnosti inhibitora aktivnosti plazminogena 1, smanjuje agregaciju i adheziju trombocita i povećava aktivnost tkivnog aktivatora plazminogena i pojačava endotelnu disfunkciju(40). Nekoliko studija, kako in vivo tako i in vitro pokazuje da metformin deluje kroz aktivaciju tirozin kinaze(41) i aktivaciju AMP protein kinaze(AMPK) (42,43). AMPK fosforiliše multiple enzime koji su uključeni u više biosintetičkih puteva, kao što su na primer acetil-CoA karboksilaza, hidroksimetilglutaril-CoA reduktaza, glikogen sintetaza i endotelijalna azot monoksid sintetaza (eNOS). Metformin poboljšava metabolizam glukoze aktivirajući AMP protein kinazu(AMPK), koji sa druge strane učestvuje u povećanju količine endotelijalne azot monoksid sintetaze (eNOS) kao i BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) (44,45,46). BMP-2 i eNOS učestvuju u diferencijaciji i mineralizaciji osteoblasta čime se objašnjava direktni osteogenetski potencijal metformina kod pacijenata sa dijabetesom(46,47). U kliničkom okruženju dijabetesne osteopenije i osteoporoze, ovi efekti prezervacije kosti kod pacijenata koji su uzimali metformin mogu biti vrlo značajni. Tada se došlo na ideju da bi metformin bio koristan ne samo kao lek kod pacijenata sa dijabetesom tip 2, već i kod pacijenata sa osteoporozom zahvaljujući njegovoj osobini da stimuliše stvaranje koštanog tkiva. U prvim istraživanjima, koja su sprovedena poslednjih godina, dokazano je da metformin u okviru kompozitnih ćelijskih nosača u ``in vitro`` uslovima stimuliše formiranje kosti (48,49). Kao osteoinduktivna susptanca koja se može kombinovati sa ćelijskim nosačima, metformin se pokazao kao perspektivan u tkivnom inženjerstvu kosti. 20 2.3.3.1.3.Ćelijski nosači Svako vitalno tkivo sastoji se od matriksa i ćelija. Matriks funkcioniše kao biološki trodimenzionalni skafold za ćelije unutar tkiva i omogućava ćelijama adekvatno okruženje i arhitekturu specifičnu za svako tkivo ponaosob(38). Fiziološki on služi kao rezervoar za vodu, hranljive materije, citokine, faktore rasta i omogućava ćelijama da ih koristi. Tri glavna svojstva karakteristična za ovu kompleksnu mrežu matriksa koji postoji u tkivima, mogu se iskoristiti u svrhe tkivnog inženjerstva: mehanička podrška, adhezija ćelija i učestvovanje u komunikaciji između ćelija(18,24). Osnova tkivnog inženjerstva predstavlja zasejavanje i razvoj ćelija na različitim nosačima od biomaterijala, nakon čega se stvara novo tkivo. Biomaterijal koji se koristi u tkivnom inženjerstvu mora izazvati specifičnu reakciju ćelija na molekularnom nivou. Trebalo bi da bude u interakciji sa ćelijama, odnosno da omogući njihovo pripajanje na svoju površinu, proliferaciju, diferencijaciju, produkciju ekstracelularnog matriksa i njegovu organizaciju. Iz tog razloga je selekcija biomaterijala kao ćelijskog nosača ključna tačka u tkivnom inženjerstvu. Obično, mada nije neophodno, poželjno je da dođe do razgradnje ili rastvaranja biomaterijala tokom formiranja novog tkiva. Očigledno, biokompatibilnost materijala je najznačajnija kod ovih procesa. Ključ uspeha biokompatibilnosti, bilo kog materijala, je postizanje fizičke i mehaničke funkcije, a bez izazivanja bilo kakve nepoželjne reakcije tkiva domaćina. Od biomaterijala koji se koristi kao ćelijski nosač, u tkivnom inženjerstvu, očekuje se da izazove željenu reakciju domaćina. Od ćelijskih nosača koji se koriste u tkivnom inženjerstvu očekuje se da odrede oblik novostvorenog tkiva i olakšaju poželjno ponašanje ćelija, njihovu migraciju na željeno mesto, njihov rast i diferencijaciju. Ćelije zasejane na nosač mogu i spontano regenerisati tkivo, bez smernica koje potiču od nosača. Međutim, uglavnom nosač u okviru svoje molekulske strukture poseduje ligande (funkcionalne grupe za vezivanje ćelija) koji bivaju prepoznati od strane ćelija, u odgovarajućem vremenskom trajanju i u odgovarajućoj količini. Ako ćelijske nosače uzmemo kao primer, skoro da više nema smisla koristiti potpuno inertne materijale ili materijale koji nemaju strogo određenu aktivnost. Površinske modifikacije igraju značajnu ulogu u biomedicinskim uređajima, biosenzorima, biomaterijalima i implantima(50). U većini biomedicinskih primena, 21 površina je primarni agens koji dolazi u kontakt sa biomolekulima, telesnim fluidima, ćelijama i tkivima. Ona deluje kao pasivni i aktivni modulator detekcije, biokompatibilnosti i ćelijske adhezije. Zato je jedan od najvažnijih uslova za njihovu uspešnu primenu u biomedicini dobra kontrola i manipulacija izmedju biotskih i abiotskih komponenata. To je kompleksno polje, koje je predmet studiranja dinamike bioloških procesa koji se odvijaju izmedju bioloških komponenata i implantiranih površina. Mnoge hemijske tehnike su razvijene za površinsku modifikaciju keramike, metala, i sintetičkih polimera. Ovim modifikacijama, najčešće se modifikuju samo fizičko-hemijske osobine materijala, pri čemu površina ima pasivnu ulogu, delujući kao neka vrsta fizičke barijere izmedju tela i materijala. Sada se centar istraživanja sve više pomera ka razvoju aktivnih biomaterijala koji su odgovorni za ćelijska ponašanja i promene mikrookoline. Zato materijali koji se koriste kao ćelijski nosaći, skafoldi, treba da budu funkcionalizovani sa biološkim ligandima, kao što su peptidi ili proteini pri čemu njihovo prisustvo treba da bude i prostorno i vremenski kontrolisano(51). Za uspešno korišćenje biomolekula na modifikovanoj površini skafolda potrebna je izuzetna pažnja tokom procesa modifikacije, posebno kada se koriste biopolimeri na bazi peptida, koji daju brojne prednosti u odnosu na konvencionalne tehnike modifikacije, jer su takvi polimeri:  biokompatibilniji sa ćelijama i tkivima od sintetičkih materijala  lako u sebe ugrađuju biološki korisne ligande  obezbedjuju precizniju kontrolu strukture i funkcija biopolimera, i  biodegradibilniji su od sintetičkih polimera u većini slučajeva (52,53). Skafold kao osnovni element konstrukcije tkivnog inženjerstva kosti, zahteva da bude integrisan sa okolnim koštanim tkivima i da omogući inicijalnu 3D mrežu na koju mogu da adheriraju i proliferišu ćelije, produkujući proteine ekstracelularnog matriksa- ECM. Da bi to moglo biti realno realizovano, nužno je kreirati takve konstrukcije skafolda koje će u što je moguće većoj meri podražavati strukturu i morfologiju prirodne kosti. Struktura skafolda treba da je biokompatibilna i da je bliska dizajnu prirodnog ECM, tj. da poseduje veoma visoku poroznost sa međusobno povezanim porama u svim pravcima, da bi mogla da omogući rast ćelija i njihovu reorganizaciju i da ima hemiju površine, koja pospešuje vezivanje ćelija i njihovu diferencijaciju i proliferaciju. Uz to, takva struktura treba da poseduje dobre mehaničke osobine, da bi 22 omogućila naseljavanje i razmnožavanje ćelija bez nepotrebnog pritiska unutar skafolda u ’’in vitro’’ uslovima, kao i da bi izdržala statička i dinamička naprezanja i fiziološka opterećenja u uslovima ’’in vivo’’. Generalno gledano, struktura skafolda mora biti zadovoljavajuće čvrstine, ne samo da se odupire promeni oblika zbog činjenice da žive ćelije urastaju i naseljavaju njegove pore, već i zbog sila trakcije koje se javljaju u toku procesa zarastanja nakon aplikacije materijala sa ćelijama unutar defekta koji se nastoji rekonstruisati procesom tkivnog inženjerstva kosti(24). Ipak u toku ’’in vivo’’ faze, zbog postojanja eksterne ili interne fiksacije koji smanjuju aktivnost pacijenta koja bi mogla ugroziti proces zarastanja u toku ranog perioda oporavka, potreba za takvim mehaničkim osobinama skafolda može biti redukovana. Skafold treba da poseduje i kontrolisanu brzinu biodegradacije, koja je optimalno podešena u odnosu na brzinu stvaranja novog koštanog tkiva, koje zamenjuje skafold novom kosti. Veličina pora, distribucija i struktura treba da budu takvi da mogu zadovoljiti specifične zahteve u primeni, od kojih jako zavisi ćelijska adhezija, proliferacija, depozicija matriksa kao i formiranje krvnih sudova unutar skafolda da bi se potpomogao rast tkiva. Svi ovi faktori zavise, u osnovi, u najvećoj meri od hemijskih i bioloških svojstava materijala od koga je izgrađen skafold, koštanih ćelija koje naseljavaju njegovu strukturu u ’’in vitro’’ ili ’’in vivo’’ uslovima i efikasnosti transfera signala izmedju ćelija(50). Skafold podržava ćelijsku kolonizaciju, migraciju, rast i diferencijaciju i često vodi razvoju traženih tkiva ili deluje na sličan način kao vezikule za isporuku lekova. Skafold napravljen od polimera, keramike ili kompozita, mora posedovati specifične karakteristike uključujući visoku poroznost, visoku specifičnu površinu, strukturnu čvrstoću, specifični 3D oblik i biodegradibilnost(54) Principi inženjerstva koštanih tkiva počivaju na konstrukciji dovoljno aktivnih poroznih keramičkih struktura, dobro definisane morfologije njihovih zidova koja je kombinovana sa tankim filmovima odgovarajućih polimera ili/i biopolimera da bi se obezbedila dovoljno kvalitetna podloga za iniciranje rada koštanih ćelija i za njihova skladna medjusobna balansiranja kinetike procesa resorpcije materijala i formiranja nove kosti. U ’’in vitro’’ uslovima manja poroznost stimuliše osteogenezu smanjujući ćelijsku proliferaciju ali omogućavajući veću ćelijsku agregaciju. Nasuprot tome, u ’’in vivo’’ uslovima visoka poroznost i veličina pora rezultiraju u boljem urastanju koštanog tkiva. Prema ranim radovima, zaključeno je da je potrebna veličina pora od minimum 100 μm, neophodna 23 za naseljavanje ćelija, njihovu migraciju i transport. Zbog potrebe za vaskularizacijom, dokazano je da je veličina pora utiče na proces osteogeneze. Pore male veličine favorizuju hipoksične uslove i indukuju formiranje osteohondralne formacije pre nego što ostegeneza započne. Suprotno tome, skafoldi koji obiluju porama velikog promera, vrlo brzo se vaskularizuju i vode direktnoj osteogenezi(24). Preživljavanje ćelija unutar većih ćelijskih nosača uveliko zavisi od veličina pora u njima(55). Eksperimentalnim markiranjem ćelija otkriven je značajan gubitak ćelija u toku prve nedelje od transplantacije poroznog bovinog koštanog matriksa pomešanog sa autolognim osteoblastima(56). Iz ovih razloga indukcija vaskularizacije predstavlja integralni element svakog uspešnog koncepta tkivnog inženjerstva kosti. U skorijim ’’in vitro’’ i ’’in vivo’’ istraživanjima , preporučuje se da veličina pora skafolda bude jednaka ili veća od 300 μm, sa objašnjenjem da su to optimalne veličine pora za zadovoljavajuću revaskularizaciju grafta (57,58). Kost ima sposobnost remodelacije u uslovima fiziološkog opterećenja ’’in vivo’’. Na osnovu ovog fiziološkog procesa koji se odvija u koštanim tkivima, postoji potreba za kontrolom degradacije i kinetike resorpcije skafolda na taj način što će bioresorptivni ćelijski nosač zadržati svoja mehanička svojstva 3 do 6 meseci( 1 do 3 meseca u ’’in vitro’’ sredini i 1 do 3 meseca na mestu regeneracije. Iz tog razloga matriks skafolda može početi da gubi svoja mehanička svojstva i da se metaboliše u telu, bez postojanja reakcije organizma na prisustvo stranog tela posle 12 do 18 meseci(59). Mehanička svojstva bioresorptivnog 3D skafolda u momentu implantacije moraju odgovarati mehaničkim svojstvima tkiva domaćina što je više moguće. Ono bi moralo posedovati dovoljnu črvstinu i snagu koju mora zadržati dovoljno dugo dok koštano tkivo koje urasta potpuno ne zameni matriks skafolda koji polako nestaje. Degradacija i kinetika resorpcije materijala skafolda mora biti podešena tako da se ćelijama koje ga naseljavaju i umnožavaju se, omogući sekrecija i stvaranje ekstracelularnog matriksa u početnoj i aktivnoj fazi naseljavanja ćelijama(1 do 4 nedelja ’’in vivo’’), dok materijal postepeno nestaje ostavljajući dovoljno prostora za rast novih ćelija i tkiva. Mehanička potpora od strane 3D skafolda trebalo bi da postoji sve dok tkivnim inženjerstvom novostvorena kost ne stekne ista ta svojstva tako da omogući samostalnu potporu za svoj dalji rast i razvoj. Kako matriks skafolda polako nestaje, sile kontrakcije koje nastaju na mestu implantacije tkiva i stres koji izazivaju, dovode do 24 smanjenja zapremine implantiranog tkiva u odnosu na zapreminu originalno postavljenog skafolda(60). Iz svih tih razloga, neophodno je u ’’in vitro’’ uslovima stvoriti konstrukciju skafold-ćelije koja će imati mehanička svojstva slična koštanom tkivu čiju regeneraciju nameravamo da sprovedemo. Da bismo mogli sa uspehom da realizujemo takve strukture potrebno je duboko razumevanje, geometrije njihove strukturne hijerarhije i razumevanje hemijskih i bioloških uslova njihovog samoorganizovanja u strukturu prirodne kosti. Veoma bitnu ulogu ima, ne samo poroznost, njena distribucija i ukupan zapreminski udeo unutar keramičkih nosača/skafolda, nego i njena nanotopologija, izgled strukturnih elemenata koji formiraju njene zidove i njihov međusobni raspored, razvijenost površine, udeli aktivnih grupa koje pripadaju tankim polimernim, biopolimernim ili koloidnim filmovima nanetim na takve strukture da bi ih funkcionalizovali u željenom pravcu i tako inicirali aktivnost koštanih ćelija(50). 2.3.3.2.MATERIJALI U TKIVNOM INŽENJERSTVU KOSTI Svi materijali koji se koriste u inženjerstvu koštanih tkiva dele se u četiri osnovne grupe: biokeramike, biopolimere, metale i kompozite(50). Svi oni koriste se u konstrukcijama veštačkih nosača-skafolda, koji imaju ulogu da preuzmu na sebe, privremeno ili stalno, funkcije oštećenih koštanih tkiva. Za svaki od navedenih materijala, među najvažnijim biološkim osobinama su osobine resorpcije materijala, njihova površinska aktivnost i biokompatibilnost. Biokeramički materijali, prirodni ili sintetički, korišćeni samostalno ili u kombinaciji sa polimerima, najpogodniji su od svih biomaterijala za tkivni inženjering tvrdih i mekih tkiva. Biokeramički materijali se smatraju biokompatibilnim, tvrdim, sa relativno slabom otpornošću na naprezanje, odličnom kompresivnom snagom, visokom otpornošću na trošenje i sa pogodnim niskim frikcionim osobinama pri artikulaciji(24). Biokeramički materijali imaju najveći značaj, zbog svoje visoke efikasnosti u proliferaciji ćelija i resorpciji tokom vremena, koja je praćena formiranjem nove prirodne kosti. U takve materijale spadaju: hidroksiapatit pomerene stehiometrije, biostakla, apatit-volastonitni kompoziti i β-trikalcijum fosfat, koji su svojim sastavom i funkcionalnim svojstvima najbliži sastavu prirodne kosti. Ovi materijali mogu da obezbede okolinu u kojoj će ECM proteini biti adsorbovani, rezultujući adhezijom 25 osteoblasta i znatno bržom proliferacijom nego kod bilo kog drugog materijala, uključujući i titan. 2.3.3.2.1.Podela biokeramičkih materijala Biokeramički materijali se dele na(62): a) bioinertnu keramiku b) poroznu keramiku c) bioaktivnu keramiku – obuhvata biostaklo, bioaktivnu staklokeramiku i hidroksiapatit d) bioresorptivnu keramiku Nakon ugrađivanja biokeramičkog implantata, u organizmu se mogu javiti četiri vrste reakcija na implantat: 1. ukoliko je materijal toksičan, dolazi do odumiranja okolnog tkiva; 2. ukoliko je materijal netoksičan i inertan, oko njega se formira vezivno tkivo; 3. ukoliko je materijal netoksičan i biološki aktivan, obrazuje se veza između prirodnog tkiva i implantata, na dodirnoj površini 4. ukoliko je materijal netoksičan i rastvorljiv, postepeno će ga zameniti okolno tkivo. 2.3.3.2.2.Porozni hidroksiapatiti (pHAP) Kalcijum hidroksiapatit predstavlja najznačajniju so kalcijuma i fosfora. Sva jedinjenja kalcijum-fosfata mogu se javiti u tri glavna strukturna tipa: apatitni, glaserit i kalcijum fosfatni – npr. dikalcijum fosfat dihidrat, anhidrovani dikalcijum fosfat i monokalcijum fosfat. Hidroksiapatit se javlja u tri modifikacije(63): 1.Sterhiometrijski hidroksiapatit – može se predstaviti formulom Ca10(PO4)6(OH)2. Do odstupanja od stehiometrijskog hidroksiapatita, dolazi usled prisustva malih količina karbonata, kada se fosfatna grupa zameni karbonatnom. 2.Kalcijum deficitarni HAP – isti je kao biološki koji čini mineralnu fazu u kostima, nastaje zamenom dvovalentnih kiseonikovih jona jednovalentnim hidroksilnim. 26 3.Oksihidroksiapatit – dolazi do zamene hidroksilnih jona dvovalentnim kiseonikovim. Struktura apatita je veoma pogodna za supstituciju drugim jonima. Zamenom Ca, PO4 i OH jona drugim jonima, može doći do promene u parametrima – rešetke, morfologiji i rastvorljivosti. Umesto kalcijuma, mogu se naći joni stroncijuma, magnezijuma, barijuma, olova. Fosfatne jone mogu zameniti vanadati, borati i manganati. Kod supstitucije, veličina i količina supstituisanih jona, direktno utiče na razliku u parametrima rešetke, između supstituisanog i nesupstituisanog HAPa. Biološki HAP, koji ulazi u sastav kostiju i zuba, razlikuje se od čistog - po stehiometriji, sastavu, fizičkim i mehaničkim osobinama. On je najčešće kalcijumom deficitaran i uvek karbonatno supstituisan, što u velikoj meri utiče na mehaničke osobine ovog minerala. Biološki hidroksiapatit, u kombinaciji sa kolagenom, gradi matricu koja daje veliku čvrstoću kostima. Mehaničke osobine sintetskog hidroksiapatita, uglavnom zavise od načina njegove sinteze, koji uključuju temperaturu, pritisak, pH, i uslova njegovog naknadnog termičkog tretmana (sinterovanja). Uglavnom HAP je krt i pokazuje malu otpornost na mehaničke stresove, što je usko povezano sa njegovom poroznošću. Po svojoj strukturi, on može biti neporozni i porozni. Takođe, može biti u granulama ili blokovima. Neporozni, preciznije rečeno mikroporozni - sa maksimalnom poroznošću do 5% zapremine i mikroporama od oko 1 μm, kristalima veličine preko 2000 A – ima široku primenu u medicini i stomatologiji. Porozni HAP – ima pore od najmanje 100 μm – što dozvoljava prožimanje koštanim tkivom. Kalcijum HAP se može dobiti i u formi bifaznog kalcijum fosfata, gde je HAP u većini, u smesi sa trikalcijumfosfatom. Hidroksiapatit i drugi kalcijum fosfatni materijali, smatraju se osteokonduktivnim i imali su široku upotrebu kao koštani zamenici, više od dve decenije. Nažalost, oni ne kombinuju dobre mehaničke osobine sa visokom poroznošću, pa je došlo do ograničenja njihove primene. Takvo dizajniranje materijala nije na odgovarajući način rešeno, mada su korišćene različite tehnike i pristupi, kao što su: sol- gel, termalno indukovana fazna separacija, kombinovane tehnike livenja i simultanog luženja i sinterovanje mikrosfera. Pored njih značajno mesto pripada tehnici templejta 27 raznih vrsta polimernih pena, elektroforetske depozicije, superkritičnog fluida, membranske laminacije, zatim tehnologija baziranih na visokim pritiscima. Takodje, prisutne su i tehnike sumblimacionog sušenja, brzog štampanja, uz korišćenje lasera i biomimetske tehnike dobijanja skafolda. I pored svega toga, problemi dizajniranja idealnog skafolda još uvek su prisutni(64,64,66). U osnovi, tkivno inženjerstvo zasniva se na postojanju aktivne porozne strukture, poznate kao skafold, koja ima dobro definisanu morfologiju unutrašnjih zidova. Ove strukture se najčešće prave od poroznog kalcijum hidroksiapatita umereno pomerene stehiometrije. Ćelijski nosači na bazi poroznog kalcijum hidroksiapatita(pHAP) već se nalaze u širokoj upotrebi u kliničkoj praksi u stomatologiji i u ortopediji i karakterišu se kao dobri biokompatibilni i ostekonduktivni materijali(67,68). Zahvaljujući svojoj strukturi, koja je slična strukturi prave kosti, pHAP se široko koristi u ortopedskoj i maksilofacijalnoj hirurgiji za reparaciju defekata kosti, u rekonstrukcijama srednjeg uha, kao prevlaka na dentalnim i ortopedskim implantima. U oralnoj hirurgiji, ima primenu za augmentaciju alveolarne kosti, uz metalne implante. U parodontologiji, primenjuje se u vođenoj regeneraciji tkiva, terapiji infrakoštanih parodontalnih džepova. U slučaju kad se kombinuje sa odgovarajućim polimer/biopolimer tankim filmovima (zbog njihove biokompatibilnosti, mehaničkih karakteristika i biodegradibilnosti), skafoldi na bazi pHAPa mogu pružiti odlične uslove za inicijaciju, rast i aktivnosti koštanih ćelija(69,70). 2.3.3.2.3.Kompozitni materijali Kako bi se postigla što bolja kompatibilnost nosača-skafolda i koštanih ćelija koje naseljavaju njihovu površinu, došlo je do kombinovanja tako formiranih poroznih keramičkih skafolda sa polimerima, i dobijene su različite nove formulacije kompozitnih materijala. Osnovni zadatak biomaterijala koji se koriste u tkivnom inženjerstvu jeste da obezbede biokompatibilnu površinu i zadovoljavajuće mehaničke karakteristike. Konvencionalni jednokomponentni polimeri ne mogu ispuniti ovaj zadatak. Iz tog razloga se istražuju različiti višekomponentni polimeri kombinovani sa poroznim hidroksiapatitom u cilju stvaranja novog multifunkcionalnog biomaterijala. Polimeri koji su ugrađeni u dizajn skafolda poboljšavaju aktivnost i naglašavaju 28 nanotopologiju unutrašnjih zidova skafolda, omogućavajući tako efikasniju aktivaciju ćelija uključenih u proces tkivnog inženjerstva, kao i njihov rast i razvoj. Jedna takva nova formulacija kompozitnih materijala primenjena je u okviru projekta osnovnih istraživanja 172026 čiju realizaciju u aspektima biološke primene sledi program ove disertacije. Kao tanki filmovi na zidovima keramičkih skafolda, korišćeni su različiti prirodni rafinisani polimeri organizovani u dobro definisane polimerne strukture i egzaktne hemijske forme, poput alginata, modificiranog skroba, celuloze,sa\ i sintetičkih polimera kao što je familija alifatičnih poliestara koji se nazivaju poliglikolidi, polilaktidi i njihovi kopolimeri. Prednost obe korišćene vrste polimera je u mogućnosti njihove široke reprodukcije i dobre kontrole njihovih osobina: konformacije, brzine razgradnje i nanostrukture. Zbog svega toga, oni imaju potencijal da budu široko primenjeni kao nosači prilikom transplantacije ćelija i kao ćelijski nosači u tkivnom inženjerstvu, obzirom da je poznato da kombinacija prirodnih ili veštačkih polimera sa hidroksiapatitom (kompozitni ćelijski nosači) predstavlja osnovu tkivnog inženjerstva kosti. Pored skafolda kao keramičkih nosača sa dobro prilagođenim osobinama degradacije i bioaktivnosti, sa mehaničkim osobinama koje mogu da služe kao potpora celom sistemu tokom procesa stvaranja novog koštanog tkiva u kombinaciji sa polimernim sistemima kao tankim filmovima, veoma su popularne i procesne tehnike konvencionalnih polimernih materijala (prilagođene su i proširene na ugradnju neorganskih bioaktivnih faza u poroznu 3D polimernu mrežu). Polimerni materijali, kao što su hidrogelovi, posebno u injektibilnoj formi, bude izuzetno interesovanje zbog svoje hidrofilnosti, pogodnosti za inkapsulaciju ćelija, slično prirodnom ECM u neinvazivnim primenama (50). Jedna od najčešće korišćenih u poslednjoj deceniji je grupa sintetičkih polimera i kopolimera, koja pripada porodici poliestara. Medju njima najznačajniji su: PLA- polilaktidna kiselina, PGA-poliglikolidna kiselina, i kopolimeri tipa PLGA- poli(laktid- ko-glikolidne) kiselina. Ovi materijali igraju veoma važnu ulogu i u oblikovanju različitih formi skafolda. Bitna osobina navedenih polimera je da njihova resorbilnost i mehaničke karakteristike mogu da zadovolje razne vrste primena u maksilofacijalnoj i ortopedskoj hirurgiji, na zbrinjavanju defekata kritične veličine i kao fiksatori za podršku srastanju koštanih tkiva bez naknadne hirurške intervencije njihovog 29 uklanjanja, posle srastanja (kod loma kostiju). Sposobnost degradacije, takve materijale čini veoma podobnim i za razne druge primene, koje obuhvataju i primene vezane za inkapsulaciju lekova sa kontrolisanim brzinama otpuštanja. U idealnom slučaju, kad se koriste takvi materijali za funkcionalizovanje keramičkih struktura skafolda, brzina degradacije takvih polimera, kao i keramičkih nosača na kojima se nalaze naneti kao tanki filmovi, treba da odgovara brzini formiranja novog koštanog tkiva. Skafold koji je inicijalno formiran, tokom procesa osteointegracije tokom primene unutar organizma degradira, pri čemu njegove mehaničke osobine, takođe degradiraju skladno sa rastom mehaničkih osobina novoformiranih koštanih tkiva koja preuzimaju na sebe ulogu nosećih elemenata u konstrukciji nove kosti. Pored PLA, PGA, PLGA polimera, veoma značajnu ulogu u formiranju kompozitne skafold strukture imaju i poli(metal-metakrilati, poli(e- kaprolaktonati), polihidroksibutarati, polietileni, polipropileni, poliuretani, poli(-etilen- tereftalati), polietarketoni i polisulfonski polimeri. Glavna prednost sintetskih polimera iz grupe poliglikolida jeste u tome što se razgrađuju hidrolitički, što dovodi do razgradnje polimernih lanaca i oslobađanja jedinjenja koja su prirodno prisutna u organizmu i zbog toga mogu biti metabolisana. Ovi polimeri imaju dugačku istoriju upotrebe kao resorptivni hirurški konci i resorptivni osteosintetski materijal. Estarske veze kod ovih polimera su hidrolitički labilne i oni se razgrađuju neenzimskom hidrolizom. Njihovi razgradni produkti su netoksični prirodni metaboliti i iz organizma se eliminišu kao ugljendioksid i voda. Stepen degradacije ovih polimera može biti podešavan da zadovolji zahteve, na period od nekoliko nedelja do nekoliko godina menjanjem hemijskog sastava, molekularne težine i njene distribucije, kao i kristaliničnosti. Biodegredabilni polimer-neorganski bioaktivni kompoziti pokazuju bioaktivno ponašanje, podesivu kinetiku biodegradacije i mehaničke osobine pogodne za primenu u regeneraciji kosti (50). Kompozitni nosači moraju biti tako dizajnirani da se keramičke čestice ne samo ugrade u polimerni matriks, nego i da se nalaze na površini i tako ostvare osteokonduktivnu funkciju. Takođe, bazni produkti razgradnje hidroksiapatita i trikalcijumfosfata neutrališu kiselost polimernih jedinjenja. 30 Takozvana prva generacija kompozitnih nosača je stvorena na Nacionalnom Univerzitetu Singapura. Korišćena je metoda modelovanja fuzionom depozicijom (FDM), a korišćena je kombinacija HA i PCL (59). Druga generacija kompozitnih nosača je proizvedena 2007 FDM metodom (71). Polimer - CaP kompozit je imao dobre mehaničke i biohemijske osobine, uključujući snagu koja potiče od keramike, čvrstinu i plastičnost polimera, kao i dobru degradacionu i resorpcionu kinetiku. Rekonstrukcija segmentnih defekata na dugim kostima predstavlja klinički izazov. U cilju prevazilaženja problema upotrebe skafolda u područjima velikog opterećenja, razvijen je kompozitni nosač baziran na poli L,D laktičnoj kiselini. On se može koristiti kao nosač proteina i faktora rasta, uz istovremeno izdržavanje opterećenja koje kost normalno podnosi. Cilj je bio poboljšanje postojeće FDM metode za proizvodnju materijala visoke snage, uz istovremeno povećanje poroznosti na 75-80%. Upotreba sintetičkih ili prirodnih nosača sa slabim mehaničkih osobinama (visoka poroznost) i brza degradaciona kinetika su rezultirali u graftovima koji mogu biti korišćeni u oblastima niskog opterećenja. Godine 2007. prvi put je objavljena upotreba jedinstvenog kompozitnog nosača za tkivno inženjerstvo kosti, koji se sastojao od kombinacije biodegradabilnog PLGA i bioresorptivnog CaP cemanta procesom fuzije čestica i fazne separacije(72). Nosač se karakteriše visokom makroporoznošću, sa makroporama od 0,8 – 1,8mm, poroznošću od 81-91% i poboljšanim mehaničkim osobinama, zahvaljujući polimeru. Novi pristup fomiranju kompozitnih nosača na bazi polimera i CaP keramike predstavljen je 2004. godine(73). Kombinovan je degradabilni PLGA u obliku mikrosfera i slabo kristalni CaP koji je fuzionisan u te mikrosfere. Dobijen je trodimenzioni skafold za regeneraciju kosti koji je imao poroznu interkonekciju i mehaničke osobine u rangu trabekularne kosti. Procesom sferoidizacije čestice soli u plamenu i njihovim sinterovanjem, 2004. godine postignuta je interkonekcija slane osnove, koja je bila napunjena sa karbonizovanim fluoroapatitnim prahom i polilaktičnim polimerom (74). Dobijen je kompozitni nosač i pokazano je da se upotrebom sferičnih i većih čestica soli može dobiti veći prostor pora. 31 Primećeno je da je indukcija hidroksiapatita poboljšala mehaničke osobine i adsorpciju proteina od strane kompozitnih nosača sastavljenih od nanohidroksiapatita i PLLA. Oni poseduju visoku poroznost od preko 90%i dobro kontrolisanu arhitekturu pora. Dobijaju se TIPS(termički indukovana fazna separacija) metodom (75). Preparacija i morfologija 3D poroznih kompozita od PLGA I PLLA od strane drugih autora su dali slične rezultate, pri čemu su kompozitne pene pokazale značajno poboljšanje mehaničkih osobina uprkos poroznosti od preko 95% (76). Slični, visokoporozni kompozitni nosači, napravljeni od PLLA i HA TIPS tehikom, prilikom zasejavanja osteoblastnim ćelijama i kultivisanjem in vitro, pokazali su duboko prodiranje ćelija u unutrašnjost nosača kao i njihovu ravnomernu distribuciju. Procenat preživljavanja ćelija na ovakvom nosaču je veći nego na nosaču napravljenom od PLLA, kao i bolja proliferacija i veća ekspresija kost-specifičnih markera. Na taj način je demonstrirana dobra osteokonduktivnost (77). Penasti nosači, napravljeni od PLLA i PLLA i HA, pripremani su metodom čvrsto/tečne fazne separacije.Rezultati su pokazali da čisto polimerni nosači podržavaju ćelijski rast samo na spoljašnjosti matriksa, dok je kod kompozitnih dolazilo do prodora ćelija kroz unutrašnju strukturu nosača. Istraživanja 3D hidroksiapatit-kolagen kompozitnih nosača, napravljenih od biomimetički mineralizovanog kolagena, pokazala su interkonekcijsku strukturu pora i elastične mehaničke osobine. In vivo subkutana implantacija je pokazala resorpciju nakon dva meseca putem fagocitoze, kao i resorpciju i zamenu materijala novim koštanim tkivom posle implantacije u defekte dugih kostiju, nakon tri meseca. Penasti kompozitni nosači otvorenih ćelija, koji se sastoje od resorptivne PLA i keramičkih punioca, HA ili beta –trikalcijum fosfata, razvijeni su 2006. godine metodom površinske ugljen-dioksid penaste tehnike. Ovakvi nosači su imali unutrašnju 3D strukturu koja je imala anizotropnu morfologiju(78). Davis laboratorija je objavila razvoj njihove takozvane treće generacija materijala za nosača (72). Njihovi rezultati su pokazali da dodatak tankog Ca-P filma na površinu makroporoznog PLGA-CaP kompozitnog nosača stvara osteokonduktivni nosač veće kompresivne snage koji sprečava razvitak hroničnog inflamatornog odgovora. Ova trofazna konstrukcija prevazilazi i biološka i mehanička ograničenja 32 koje su prethodni materijali pokazivali. Dobijen je jedinstven, potpuno resorptivan nosač kao zamena za graftove tarabekularne kosti(79). U poslednjoj deceniji, jedan od najčešće korišćenih polimera za izradu kompozitnih skafolda je PLGA( kopolimer PLA – polilaktidna kiselina i PGA – poliglikolična kiselina), zbog svoje utvrđene biokompatibilnosti i stepena degradacije koji zavisi i može se regulisati međusobnim odnosom dveju komponenata koje se nalaze u njegovom sastavu(80,81,82). U najnovije vreme razvijaju se materijali na bazi kompozita HA/HDPE hidroksiapatit-polietilen visoke gustine i PLGA/HA kompozita, koji se odlikuju odličnom biokompatibilnošću i mogu da oponašaju prirodnu kost, jer su njihove osobine slične osobinama kosti. Time takvi materijali, postaju obećavajuće matrice skafolda nosivih kosti, koje bi mogle da omoguće optimalnu ćelijsku diferencijaciju i mineralizaciju koštanih tkiva. Ćelije se na takvim materijalima dobro adheriraju, posebno na hidroksiapatitnoj komponenti, što sve ima za rezultat dobru ćelijsku proliferaciju i integraciju-osteokonduktivnost koštanih implanta, izgradjenih od HA/HDPE i PLGA/HA kompozita. 2.3.3.4. SAVREMENI KONCEPTI KONSTRUKCIJE SKAFOLDA Osnovne funkcionalne strukture ćelija i tkiva definisane su na nanometarskom nivou pa zbog toga razumevanje nanobiologije i primena nanotehnologije predstavljaju novi pravac u istraživanju tkivnog inženjerstva(83). Nanotehnologija omogućava razvijanje novog sistema koji imitira složena, hijerarhijski organizovana prirodna tkiva(84). Nanotehnologija uključuje materijale koji poseduju makar jednu dimenziju na nanometarskom nivou i pomoću kojih se mogu praviti strukture, uređaji i sistemi novih karakteristika. Uopšteno rečeno polimerni nanokompoziti su rezultat kombinacije polimera i biomaterijala na nanometarskom nivou(85,86). Interakcija između nanostruktura i polimernog matriksa je osnova za poboljšanje mehaničkih i funkcionalnih karakteristika nanokompozita u poređenju sa konvencionalnim mikrokompozitima. U poslednje dve decenije bilo je znatnog napretka u istraživanjima u cilju poboljšanja karakteristika materijala koristeći nanometarski stvorene strukture, pri čemu se koristila prednost u visokom odnosu površina/zapremina nanomaterijala(87). Nanokompozitni materijali uvek pokazuju odličan balans između snage i čvrstine i obično imaju unapređene karakteristike u odnosu na karakteristike 33 individualnih komponenti(88). Ako posmatramo prirodni koštani matriks kao kompozitni materijal sastavljen od kolagena i apatita, nanokompozitni materijali su savršena zamena kao skafoldi za tkivno inženjerstvo kosti(89). Loše mehaničke karakteristike koje su bile svojstvene polimernim poroznim skafoldima danas se ispravljaju mogućnošću kombinovanja nanostukturnih čestica sa biodegradibilnim polimerima čime se značajno poboljšavaju i modeluju mehanička, električna i degradibilna svojstva biomaterijala(90). Međusobna adhezija između nanopartikula i polimernog matriksa je glavni faktor koji utiče na karakteristike nanokompozita. U cilju boljeg vezivanja između dve komponente nanokompozita razvijene su različite tehnike. Primarna struktura skafolda, koju je moguće realizovati na brojne načine, kao što su sol-gel postupak, termički indukovana fazna separacija, posebno je pogodna za proizvodnju 3D nanokompozitnog keramika-polimernog skafolda sa kontrolisanom mikrostrukturom i makrostrukturom za nesmetanu proliferaciju koštanog tkiva. Za dobijanje takvih skafolda koriste se raznolike tehnike proizvodnje skafolda, kao što su konvencionalne tehnike livenja u polimernoj matrici u dobro definisanim formama kalupa (uz naknadno uklanjanje polimera rastvaranjem u organskom rastvaraču), fazna separacija, luženje porogena, sinterovanje mikrosfera (koristeći u prvom koraku tehniku isparavanja, a potom sinterovanja u drugom koraku), kreiranje skafolda korišćenjem tehnike templejta od polimernih pena, tehnike proizvodnje skafolda primenom vlakana ili tehnika umakanja, elektroforetske depozicije, biomimetskim samoasembliranjem, koristeći tehnike superkritičnih pritisaka, kao kod pripreme skafolda iz kompozita PLGA i hidroksiapatita, tehnike membranske laminacije, tehnike visokih pritisaka, ’’freeze drying’’-a i tehnika brzog štampanja različitih formi skafolda unapred kreiranih uz pomoć odgovarajućih kompjuterskih programa(50). Proces izrade skafolda mora obezbediti visok nivo kontrole njihovih makro- i mikro-strukturnih osobina što je ključni zahtev za njihovu specifičnu primenu. Zavisno od materijala za skafold i strategije inženjerstva tkiva, od strane različitih istraživačkih timova, razrađene su i različite metodologije i uslovi procesiranja skafolda radi optimizacije performansi datog finalnog sistema za unapred određenu namenu. U saglasnosti sa tim, procesne procedure, u svakom od konkretnih slučajeva, treba da budu odabrane tako da ne menjaju hemijske i biokompatibilne osobine materijala, koje bi svojom promenom mogle ograničiti efekte njegove kliničke primene. Pored 34 navedenog opšteg uslova, neophodno je da materijal bude proizveden u preciznoj geometriji da bi se uklapao na mestu implantata, da ima međusobno povezane pore i dovoljno visoku gustinu pora sa pravilnom morfologijom, veličinom i distribucijom i da uz to njegov kvalitet bude visoko reproduktivan. 35 3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA U okviru analize naučne problematike postavljena je radna hipoteza:  Porozni hidroksiapatit dobijen modifikovanom hidrotermalnom metodom, porozni hidroksiapatit dobijen modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa PLGA i porozni hidroksiapatit dobijen modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa metforminom poseduju dobru biokompatibilnost, ne ispoljavaju toksična svojstva i štetne efekte po zdravlje i u direktnom kontaktu sa koštanim tkivom domaćina omogućavaju bolju vaskularizaciju i dublju infiltraciju novoformirane kosti u odnosu na standardne materijale. Utvrđivanje istinitosti postavljene hipoteze obaviće se eksperimentalno. Za potrebe naučnog ispitivanja definisan je sledeći cilj istraživanja doktorske disertacije:  Izvršiti karakterizaciju, ispitati biokompatibilnost i biofunkcionalnost poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom, poroznog hidrosiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa PLGA i poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa metforminom Za postizanje postavljenog cilja istraživanja doktorske disertacije, definisani su sledeći zadaci:  Izvršiti karakterizaciju ispitivanih materijala (poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom, poroznog hidrosiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa PLGA i poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom u kombinaciji sa metforminom)  Utvrditi biokompatibilnost ispitivanih materijala u direktnom i indirektnom kontaktu sa ćelijama 36  Utvrditi površinske karakteristike ispitivanih materijala u kontaktu sa ćelijama  Utvrditi iritativni efekat ispitivanih materijala  Utvrditi efikasnost ispitivanih materijala u popunjavanju koštanih defekata 37 4.MATERIJAL I METODOLOGIJA 4.1.Testirani materijali Za potrebe ovog istraživanja, korišćen je novi sintetički biomaterijal, porozni hidroksiapatit dobijen metodom templejta polimerne pene na bazi poliuretana. Sam proces sinteze čestica hidroksiapatita izveden je modifikovanom metodom hidrotermalne sinteze asistirane delovanjem površinski aktivne supstance polietilen vinil acetat/versatata. Nakon dobijanja keramičkog konstrukta (nosača) na nosač poroznog hidroksiapatita deponovan je tanki film metformina i polilaktidkoglikolida (PLGA). Kao pozitivan standard upotrebljen je deproteinizovani goveđi koštani materijal (Bio Oss R, cancellous granule 0,25 – 1,0 mm veličine, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland). Postupak dobijanja kompozitnih keramičkih nosača poroznog hidroksiapatit- polimerni tanki film odvijao se u više faza. Prvo su dobijene čestice hidroksiapatita primenom modifikovane metode hidrotermalne sinteze uz učešće polietilen vinil acetat/versatatom u svojstvu površinski aktivne supstancije . Postupak dobijanja poroznih granula podrazumevao je sintezu praha hidroksiapatita, koja je obavljena hidrotermalnim postupkom na 1500C, pod pritiskom od 15 bara, tokom 8h tretmana, uz prisustvo kopolimera polietilenvinilacetata/versatata, PEVA/PEVV. Na taj način su dobijene čestice veličine ispod 200 nm sa veoma pravilnom geometrijom. Da bi se dobile čestice što veće aktivnosti, veće specifične površine i stepena amorfizacije površine praha, prah je potom tretiran mehanohemijski, posle čega su dobijene čestice bile nanometarskog reda veličine (ispod 20 nm). Takav red veličine čestica odgovarao je redu veličine kristalnih domena (uređenih delova čestice), pre mehanohemijskog tretmana (XRD analiza daje vrednosti oko 16 nm, ako se primeni Šerrer-ova formula). Mehanohemijski postupak se odvijao uz prisustvo kopolimera PEVA/PEVV. Radi dobijanja odgovarajuće suspenzije podešen je odnos tečne i čvrste faze tako da suspenzija ima odgovarajuću konzistenciju i reologiju pogodnu za izlivanje. Kad je postignut optimum viskoznosti suspenzije, njome je natopljena poliuretanska pena dobro definisane poroznosti. Nakon toga je celi sistem podvrgnut procesu pirolize i sinterovanja na 8000C u prvom koraku, a potom na 13000C 38 u drugom koraku da bi se dobili visokoporozni kompakti kalcijum hidroksiapatita (skafoldi). Skafold je potom granulisan i delići granula koji su manji od 300 µm korišćeni su za taloženje (depoziciju) tankog filma na staklenim pločama, za eksperimente na ćelijskim linijama, dok su granulacije između 300μm i 1 mm, korišćene za tretman defekata kritične veličine kalvarije zeca. Deponovanje granula na staklene pločice za eksperimente na ćelijskim linijama izvedeno je uz pomoć polistirenskog lepka, prema sledećoj proceduri: fine granule reda veličine 0-300 μm karbonatnog hidroksiapatita deponovane su na staklene pločice debljine oko 1 mm, tako što su staklene pločice premazane prethodno slojem polistirenskog lepka koji je omogućio lepljenje za površinu monosloja granula kalcijum hidroksiapatita. Nakon lepljenja jednog sloja granula na površini pločice ostatak granula je uklonjen i potom je izvedena depozicija tankih filmova polimera PLGA i metformina. Kod deponovanja tankih polimernih filmova metformin je rastvoren u vodi i PLGA u hloroformu (koncentrat od 1% w/w) pre deponovanja unutar pora granula CHA sloja. Debljina deponovanih polimernih filmova bila je prosečne veličine 10 μm. Biomimetski postupak je izveden tako što su granule (granule za istraživanja na ćelijskim kulturama i granule za kutanu i subkutanu implantaciju i za patohistološka istraživanja) potopljene u superzasićeni SBF pripremljen uz pomoć modifikovane procedure (koncentrat (mol dm-3) svakog jona: Cl- - 0.054, Na+ - 0.0542, Ca2+- 0.0025, PO43- - 0.001, Mg2+ - 0.0003, CO32- - 0.0006 i K+ - 0.0014; pH su podešene na 7.4) i ostavljene da stare 6 nedelja na temperaturi od 37 °C (u univerzalnim pećima, MEMMERT UNB 400). Volumen SBF je kontrolisan i konstantan tako što se dodaje dejonizovana voda čija je pH vrednost podešena na 7.4. Koncentracija Ca2+ je periodično verifikovana uz pomoć atomske apsorpcione spektroskopije. Posle odležavanja, uzorci se sklanjaju sa medijuma, ispiraju se dejonizovanom vodom i određuju se njihove karakteristike. 4.1.1.Karakterizacija Faze koje su sakupljene na različitim polimer filmovima su ispitane uz pomoć Fourier transform infracrvene spektroskopije (Nicollet 380 FTIR, Thermo Electron 39 Corporation) u prigušenoj totalnoj refleksiji (ATR). FTIR spektar je zabeležen u spektralnom opsegu 4000-400 cm−1. Metod (Philips PW 1050) rentgen difrakcije (XRD) korišćen je za strukturnu analizu dobijenih faza. Podaci su analizirani u opsegu 2θ od 9 do 67◦ sa korakom skeniranja od 5◦, i vremenom ekspozicije od 2 sekunde po koraku. Veličina kristalita je izračunavana pomoću Šererove jednačine, d = Kλ/Bcosθ, gde d (u nm) predstavlja prosečan prečnik kristalita, K je faktor oblika, B širina difrakcije (l2l) na polovini svoje maksimalne visine, λ je dužina talasa korišćenih rentgenskih zraka, i θ je ugao Brag- ov ugao difrakcije. HA, tanki polimerni filmovi i faze koje su biomimetskim procesom nastale na različitim polimernim filmovima su ispitane uz pomoć Fourier-ove transform infracrvene spektroskopije (Nicollet 380 FTIR, Thermo Electron Corporation) u prigušenoj totalnoj refleksiji (ATR). FTIR spektar je sniman u spektralnom opsegu 4000-400 cm−1. Skening elektronska mikroskopija je korišćena da bi se ispitala morfologija i mikrostruktura svih uzorka, posebno hidrotermalno dobijenog HA, keramičkih nosača nastalih iz njega i deponovanih faza biomimetskog HA na površini tankih filmova polimera deponovanih na HA nosačima. Uzorci su prevučeni zlatom spaterovanjem, a potom je njihova morfologija i energetsko disperzivna analiza (EDS) praćena pomoću SEM JOEL mikroskopa. Za snimanje površine HA nosača u 2D i 3D korišćena je atomska mikroskopija sila (AFM), uredjaj Quesant. SBET: Za određivanje specifične površine HA praha i njegove mikro- i nano- poroznosti korišćena je BET metoda, koja se zasniva na merenju adsorpcije azota na - 196 0C na odgovarajućoj aparaturi opremljenoj sa TCD detektorom (Gas chromatograph Varian Aerograph, model 920). Specifična površina se izračunava sa BET metodom u jednoj tački. Pri tome, prepostavlja se da su sintetizovane čestice sferoidnog oblika što omogućuje određivanje njihovog srednjeg prečnika na osnovu formule: (dBET = 6/ρSw) gde je Sw .specifična površina, a ρ teorijska gustina HA (3.156 g/cm3). 40 4.2. ISPITIVANJE DIREKTNE I INDIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ANALIZIRANIH JEDINJENJA Drugi deo istraživanja sproveden je na Institutu za medicinska istraživanja, Univerziteta u Beogradu. Laboratorijska in vitro studija uključivala je istraživanje biološkog odgovora ćelijske kulture na testirane materijale na osnovu preporuke međunarodnog standarda ISO/DIS 10993-5: Test for cytotoxicity: in vitro method; MEM Extraction Cytotoxicity Test T-7-2(91). U ispitivanjima direktne i indirektne citotoksičnosti korišćena je kultura mišjih fibroblasta L929 (ATCC) Za postizanje optimalnih uslova ćelije su gajene u odgovarajućim posudama, u hranljivom medijumu (DMEM) uz dodatak 10% fetalnog seruma govečeta (FSG), L-glutamina (3mM), penicilina (100 IU/ml), streptomicina (100µg/ml). Nakon suplementacije pH rastvor hranljive podloge je rastvorom bikarbonatnog pufera doveden do vrednost 7,2 i profiltriran kroz filter veličine pora od 0,22µm. Uslovi gajenja su podrazumevali temperaturu od 37°C, u atmosferi vazduha, sa 5% ugljen dioksida. Optimizacija uslova gajenja ćelija podrazumevala je konstruisanje eksponencijalnih kriva rasta ćelija u zavisnosti od vremena gajenja, za različite koncentracije zasađenih ćelija u nultom vremenu. Broj ćelija, koji je srazmeran apsorbanciji, praćen je nakon 2h, 24h, 48h, 72h i 96h. Ispitivane su krive rasta pri sađenju 500, 1000, 2000, 4000 i 8000 ćelija. Na osnovu kriva rasta izračunato je vreme duplikacije ćelija i na osnovu toga određen optimalan broj ćelija korišćen u eksperimentima, koji je iznosio 6000 ćelija po bazenu ploče sa 96 bazena, kod ispitivanja indirektne tokičnosti, odnosno 100000 po bazenu ploče sa 6 bazena kod ispitivanja direktne toksičnosti. 4.2.1.Ispitivanje indirektne citotoksičnosti Ispitivanje indirektne toksičnosti podrazumeva ispitivanje toksičnosti ekstrakata ispitivanih jedinjenja, odnosno njihovih degradacionih proizvoda. Ispitivani ekstrakti dobijeni su suspendovanjem jedinjenja u podlozi za gajenje ćelija (DMEM sa 10% FCS) u koncentraciji od 0,2g/ml i inkubiranjem na 37ºC u trajanju od 1h, 24h ili 72h, uz 41 konstantnu agitaciju. Nakon inkubacije, dobijene suspenzije su centrifugirane 10min na 2000 obrtaja u minuti, dekantovane, izmerena je pH vrednost dobijenih rastvora i rastvor je filtriran kroz filter dijametra pora 22µm. Ovako dobijeni ekstrakti su dalje korišćeni za ispitivanje indirektne citotoksičnosti Za ispitivanje delovanja ispitivanih ekstrakata, ćelije su nakon tripsinizacije resuspendovane u hranljivoj podlozi i u odgovarajućem broju zasejavane u mirkoploču sa 96 bazena. Protokol zasejavanja prikazan je na slici 4.1. Slika 4.1. Faze u postavljanju eksperimenta na ćelije u kulturi Na jednoj mikroploči sa 96 bazena moguće je ispitati delovanje 2 različita jedinjenja (a). U redove A i H mikrotitar ploče dodata je podloga, kako bi se zadržala dovoljna vlažnost u ploči prilikom inkubacije (b). U redove B-F, u kolonama 4-9 zasejan je optimalan broj ćelija (c), određen iz kriva eksponencijalnog rasta (6000 ćelija po bazenu). Ćelije su suspendovane u 100µl podloge. Samo 100 µl podloge dodaje se u kolone 1-3 i 10-12, u svim redovima (d). Apsorbance u ovim bunarima korišćene su kao slepe probe. Nakon 24h od zasejavanja ćelija, ćelije su adherirale za dno ploče i ušle u fazu eksponencijalnog rasta. Iz ploča je aspiriranjem uklonjena podloga i dodate su serije razblaženja ispitivanih rastvora, odozgo na dole, od najmanje do najveće koncentracije (e) u ukupnoj zapremini od 150 µl. Red B predstavlja kontrolu, tj. u bazene je dodato samo 150 µl hranljive podloge. Mikroploča je nakon toga inkubirana 72h pri temperaturu od 37°C, u atmosferi vazduha, sa 5% ugljen dioksida. MTT test u mikrokulturi je test za In vitro određivanje osetljivosti (hemosenzitivnosti) ćelija na delovanje različitih supstanci. MTT (3[4,5-dimetiltiazol-2- il]-2,5-difenil tetrazolijum bromid) je tetrazolijumska so žute boje koja se u metabolički aktivnim ćelijama, redukcionom reakcijom u mitohondrijama, katalizovanom enzimom sukcinat dehidrogenaza, prevodi u kristale formazana. Ljubičasti kristali formazana, inače nerastvorni u vodenom rastvoru, postaju rastvorni dodavanjem SDS-a ili nekog 42 drugog rastvarača. Tako dobijen rastvoren formazanski produkt kvantifikuje se spektrofotometrijski na ELISA čitaču na talasnoj dužini od 570nm. Slika 4.2. Redukcija tetrazolijum-soli do formazana Test je prvi put opisao Mosman 1983. godine, a u dalje opisanim eksperimentima primenjivana modifikacija metode Mosmana, koju su dali Ohno i Abe (92), a koja uključuje korišćenje natrijum dodecil sulfata (SDS) umesto dimetil sulfoksida (DMSO) za rastvaranje nastalog formazanskog proizvoda, čime se povećava osetljivost testa i eliminiše korak odlivanja, usled koga može da dođe do gubitka ćelija koje su u mitozi. Nakon inkubacije ćelija sa odgovarajućim agensom u bazene mikrotitar ploče dodaje se po 20 µl MTT rastvora, koncentracije 5 mg/ml u fosfatnom puferu. Mikrotitar ploče se inkubiraju 4h u inkubatoru na 37ºC u sredini obogaćenoj sa 5% CO2, nakon čega se u bazene dodaje 100 µl 10% SDS-a u 0,01M HCl, a narednog dana optička gustina dobijenog obojenog proizvoda meri se na čitaču miktoploča na talasnoj dužini od 570nm a rezultati se dalje obrađuju studentovim T testom. Preživljavanje (S, od engl. survival-preživljavanje) je kvantifikovano korišćenjem formule za dobijanje indeksa preživljavanja S: Auzorka - srednja vrednost izmerene apsorbance na 570 nm u otvoru sa tretiranim ćelijama Akontrole - srednja vrednost izmerene apsorbance na 570 nm u otvoru sa netretiranim ćelijama probasl probasl kontrole uzorka A A A AS . .   43 Asl.proba - srednja vrednost izmerene apsorbance na 570 nm u otvoru bez ćelija a sa rastvorom ispitivane supstance Množenjem indeksa preživljavanja (S) sa 100, dobija se procenat preživljavanja. IC50 je koncentracija citotoksičnog agensa koja indukuje 50% inhibicije u preživljavanju ciljnih ćelija. Ova vrednost se koristi kao mera intenziteta antiproliferativnog dejstva nekog agensa. Pokazana je korelacija rezultata MTT testa i rezultata 3H-Tdr testa i 51Cr testa i smatra se adekvatnom zamenom radioaktivnih tehnika. 4.2.2.Ispitivanje direktne citotoksičnosti MTT test je kolorimetrijski test i osnovno ograničenje testa je da rastvor čija se apsorbancija na kraju meri bude bistar. Ovo onemogućava primenu MTT testa za određivanje direktne citotoksičnosti, tj. nakon gajenja ćelija direktno na ispitivanom materijalu. Za ovo određivanje koristi se LDH test citotoksičnosti u kome se preživljavanje, odnosno vijabilnost ćelija procenjuje na osnovu procenta LDH (laktat dehidrogenaze) koji se nađe u ekstraćelijskoj sredini. LDH (laktat dehidrogenaza) je citoplazmatski enzim koji se nakon lize oslobađa u ekstraćelijsku sredinu i LDH test predstavlja meru integriteta ćelijske membrane. Nakon delovanja ispitivanih agenasa nivo LDH u supernatantu se određuje oksidacijom laktata do piruvata koji zatim reaguju sa tetrazolijumskom soli pri čemu nastaje formazan, u vodi rastvorna supstanca plave boje čiji se intenzitet određuje spektrofotometrijski. Za određivanje direktne citotoksičnosti na mikroskopske ljuspice je nanošen tanak sloj ispitivanih materijala, koje su zatim lepljene u ploče sa 6 bazena i ploče nakon toga sterilisane x-zracima. U ovako pripremljene ploče se direktno na mikroskopsku pločicu, odnosno ispitivani materijal nanosi se optimalan broj L929 ćelije suspendovanih u hranljivom medijumu koje se dalje inkubiraju u trajanju od 1h, 24h i 72h, u inkubatoru na 37ºC u sredini obogaćenoj sa 5% CO2. Nakon završetka inkubacije, neposredno pre lize, ćelije su mikroskopirane i evaluirane u pogledu morfologije i odnosa prema ispitivanom materijalu. Nakon inkubacije preživljavanje, odnosno broj ćelija, procenjuje se tako što se one izlažu fizičkoj lizi, tj. ploče se u 3 ciklusa naizmenično zamrzavaju na -20ºC i odmrzavaju, zatim centrifugiraju, i nivo LDH se određuje iz dobijenog supernatanta. 44 Broj ćelija se na osnovu nivoa LDH određuje iz prethodno konstruisanje kalibracione krive, koja se formira nezavisno za svaki eksperiment, odnoso svaku korišćenu pasažu ćelija, uporedo sa izvođenjem eksperimenta. 4.3.ISPITIVANJE BIOKOMPATIBILNOSTI: TEST PRIMARNE KUTANE IRITACIJE Treći deo istraživanja sproveden je na Institutu za Fiziologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Iritacioni potencijal materijala ispitivan je prema međunarodnim standardima za ispitivanje biokompatibilnosti, ISO 10993-10:2002/ Amd 1: 2006, Biološka evaluacija medicinske opreme, Deo 10: Testovi iritacije i odložene reakcije hipersenzibilizacije(93). 4.3.1.Test materijali (Test uzorci): Iritacioni potencijal ispitivan je za sledeće materijale:  pHAP  pHAP + metformin  pHAP + PLGA Test materijal (u obliku praha pre nanošenja na kožu) pripreman je za aplikovanje putem mešanja praha (količine 1 gram) i destilovane vode. Negativna kontrola: Kao negativna kontrola korišćen je materijal koji ne izaziva iritacionu reakciju, hipoalergijski elastični flaster za fiksiranje (SENSIFIKS). Pozitivna kontrola: Kao pozitivna kontrola korišćen je preparat koji potvrđeno dovodi do iritacionih promena, sterilni vodeni rastvor mlečne kiseline (IUPAC: 2- hydroxypropanoic acid koncentracije 98%, proizvođač Sigma), na sterilnom filter papiru Milipore, dijametra 5mm x 2mm. 4.3.2.Eksperimentalne životinje Eksperimenti su urađeni na kunićima muškog pola (Novozelanski beli kunići, telesne mase 4.2  0.4 kg) koji su odgajeni u vivarijumu Instituta za medicinsku fiziologiju. Do početka eksperimenta životinje su držane pod kontrolisanim 45 laboratorijskim uslovima (temperature 22  2 °C,14 sati svetlo/10 sati mrak, pristup vodi i hrani ad libitum). Eksperimenti su bili odobreni od strane Etičkog komiteta za rad sa eksperimentalnim životinjama Stomatološkog fakulteta u Beogradu (br. 36/5 od 15.05.2009. godine), i sprovedeni su u saglasnosti sa principima Vodiča Nacionalnog Instituta za zdravlje, za brigu i korišćenje laboratorijskih životinja, kao i prema međunarodnim standardima ISO10993-2: zahtevi za blagostanje životinja(94). 3.3.3.Eksperimentalni protokol Dvadesetčetiri sata pre primene test materijala, krzno u predelu dorzalne strane trupa obrijano je električnim brijačem na svakom kuniću. Na svakom kuniću obrijana oblast kože leđa bila je podeljena u 4 polja iste površine (20 mm x 20 mm) i test material, primenjen je na samo dva od četiri polja. Na druga dva polja primenjeni su negativna kontrola (samo hipoalergijski adhezivni flaster, bez test materijala) i pozitivna kontrola (98% mlečna kiselina). Tri kunića su korišćena po grupi; kako je svaki kunić imao po dva mesta za aplikovanje test-materijala, to je ukupno šest oblasti kože bilo moguće analizirati, radi utvrđivanja iritativnih efekata test materijala i njihovih poređenja sa pozitivnom i negativnom kontrolom. Svi ispitivani delovi kože kunića (tretirani i kontrolni) prekriveni su gazom i hipoalergijskim flasterom. Test-materijal je u direktnom kontaktu sa kožom bio tokom četiri sata. Nakon četiri sata uklonjeni su hipoalergijski flaster, gaza i test supstanca. Nakon jednog sata izvršeno je makro-patološko ispitivanje kože na znake iritacije (prisustvo eritema i edema). Ispitivanje je ponovljeno posle 24 sata, 48 sati i 72 sati (Draize et al. 1944)(95). U toku procene iritacije kože utvrđivano je prisustvo eritema i edema. Stepen izraženosti eritema i edema gradiran je na skali od 0 do 4. Klasifikacija eritema izvršena je na sledeči način: 0 – odsustvo eritema, 1 – veoma slab eritem, jedva uočljiv, 2 – dobro definisan eritem, 3 – umeren do težak eritem, 4 – veoma težak eritem (intenzivan, tamno crven), do povreda u dubini kože (Tabela 4.1.). Klasifikacija edema izvršena je na sledeći način: 0 – odsustvo edema, 1 – veoma slab edem, jedva uočljiv, 2 – slab edem (granica polja dobro definisana, 46 uzdignuta - prsten), 3 – umeren edem (uzdiže se približno 1mm), 4 – težak edem (uzdiže se više od 1mm i širi se više, dalje od mesta izlaganja) (Tabela 4.2.). Tabela 4.1.. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija eritema Klasifikacija eritema Gradiranje Odsustvo eritema 0 Veoma slab eritem, jedva uočljiv 1 Dobro definisan eritem 2 Umeren do težak eritem 3 Veoma težak eritem (intenzivan) 4 Tabela 4.2. Test primarne kutane iritacije: Klasifikacija edema Klasifikacija edema Gradiranje Odsustvo edema 0 Veoma slab edem, jedva uočljiv 1 Slab edem (granice polja uzdignute) 2 Umeren edem (uzdiže se 1 mm) 3 Težak edem (uzdiže se više od 1 mm) 4 Skor primarne kutane iritacije izračunavan je za svakog kunića po formuli:             K hhh T hhh životinjabroj EdErEdErEdEr životinjabroj EdErEdErEdEr SPI            724824724824 gde je Er - eritem; Ed- edem. Indeks primarne kutane iritacije (PII) izračunavan je kao aritmetička sredina vrednosti SPI od tri testirane životinje. PII = ΣSPI / 3. Testirani materijal je, na osnovu vrednosti PII, ocenjivan kao: neiritirajući, blago iritirajući, umereno iritirajući i veoma iritirajući (Tabela 4.3.). 47 Tabela 4.3. Ocena test materijala na osnovu indeksa primarne kutane iritacije (PII) PII Ocena test materijala 0.0 – 0.4 neiritirajući 0.5 - 1.9 blago iritirajući 2.0 - 4.9 umereno iritirajući 5.0 – 8.0 veoma iritirajući 4.3.4.Statistička analiza Rezultati eritema i edema su prikazani kao pojedinačna vrednost za svaku životinju i svako mesto aplikovanja test supstance. Rezultati skora primarne kutane iritacije i indeksa primarne kutane iritacije prikazani su kao srednja vrednost. Poređenje značajnosti razlika između srednjih vrednosti skora primarne kutane iritacije između eksperimentalnih grupa vršeno je uz pomoć Student t-testa. Razlika je smatrana statistički značajnom na nivou p < 0.05. Slika 4.3.Novozelandski beli kunić 48 Slika 4.4. Test primarne kutane iritacije 4.4.ISPITIVANJE BIOFUNKCIONALNOSTI: IN VIVO PREDKLINIČKI TESTOVI NA ANIMALNOM MODELU Četvrti deo istraživanja sproveden je na Institutu za hirurgiju, Veterinarskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu i na Institutu za patologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. 4.4.1.Subjekti Eksperimenti su odobreni od strane Etičkog komiteta za rad sa eksperimentalnim životinjama Stomatološkog fakulteta u Beogradu (br. 36/12 od 23.11.2009. godine), i biće sprovedeni u saglasnosti sa principima Vodiča Nacionalnog Instituta za zdravlje, za brigu i korišćenje laboratorijskih životinja, kao i prema međunarodnim standardima ISO10993-2: zahtevi za blagostanje životinja(96). Animalni model u ovom eksperimentalnom delu istraživanja bili su novozelandski beli kunići, i to dvanaest životinja oba pola ( 6 muškog i 6 ženskog pola), iz različitih legla, starosti oko 4 49 meseca, telesne težine oko 3 kilograma. Životinje su bile odgajene i smeštene u profesionalnoj odgajivačnici Novozelandskih belih kunića, vlasnika Dragana Matovinovića, ul.Obrenovački put 224E u Bariču, člana Udruženja odgajivača sitnih životinja „AVALA“ Beograd, registarski broj 45. Životnje su bile smeštene svaka u posebnom kavezu, u kontrolisanoj sredini, sa kontrolisanom ishranom (Veterinarski zavod Subotica, Srbija) i dnevnom profesionalnom negom. 4.4.2.Testirani materijali Testirani materijali bili su porozni hidroksiapatit (pHAP), porozni hidroksiapatit(pHAP) u kombinaciji sa polilaktidkoglikolidom(PLGA) i porozni hidroksiapatit(pHAP) u kombinaciji sa metforminom. Pozitivna i negativna kontrola bile su deproteinizovani goveđi koštani mineral (Bio OssR, cancellous 0.25 - 1,0mm veličine, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland)(DBBM) i ``prazni prostori`` . Materijali su korišćeni prema uputstvima proizvođača. 4.4.3.Test procedura 4.4.3.1.Anestezija Opšta disocijativna anestezija sprovedena je za sve hirurške procedure(97) i sastojala se iz premedikacije Ksilazinom(2% Xylazin, 5mg/kg telesne težine, Cp pharma, Bergdorf, Germany) intramuskularnom injekcijom, a posle toga intramuskularnom injekcijom kombinacije Ketamina (Ketamin 500mg/ml, Laboratorio Sanderso S.A., Santiago, Chile) u dozi od 35mg/kg telesne težine, i Acepromazina (Acepromezine 50ml, Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., St. Joseph, Mo 64506 U.s.a.,) u dozi od 0,75mg/kg telesne težine(88). Dužina trajanja anestezije bila je prosečno oko 100 minuta. 4.4.3.2.Randomizacija Dizajn implantacije i randomizaciona šema bili su latin blok dizajna (Latin square block design, Statistical Analysis System, 1989). Modifikovani Latin blok dizajn (98) sastoji se u rotacionoj dodeli materijala defektima čime se balansirano distribuira svaki materijal i u anteriornu i u posteriornu regiju kalvarije. 50 Tabela 4.4..Distribucija testiranih materijala prema randomizacionoj šemi Koštani defekt Životinja 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 I A B C D A B C D A B C D1 II B C D A B C D A B C D1 A III C D A B C D A B C D1 A B IV D A B C D A B C D1 A B C A - pHAP, B - pHAP + PLGA C - pHAP + metformin D - Bio Oss R, cancellous granule 0,25 – 1,0 mm veličine, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland (pozitivna kontrola) D1- prazan prostor (negativna kontrola) Uzorci su obeleženi posebnim kodovima tako da istraživač koji je vršio njihovu analizu nije bio upoznat kojoj grupi pripada ispitivani uzorak. 4.4.3.3.Hirurška procedura Hirurška procedura je sprovedena pod aseptičkim uslovima i na način koji obezbeđuje minimalnu traumu. Koža glave zečeva obrijana je i dezinfikovana rastvorom joda, a potom je izvedena incizija po sredini lobanje. Središnja incizija na glavi zečeva protezala se od parijetalne kosti (Os parietale – Sutura coronalis) do čeone kosti (Os frontale – Incisura supraorbitalis caudalis). Musculus frontoscutularis i musculus frontalis preparisani su do parijetalne i čeone kosti. 51 Koža i periosteum pažljivo su preparisani i podignuti da bi se otkrile parijetalne kosti. Sa obe strane kalvarije po dva defekta pune debljine i kritične veličine, 6,0 mm u prečniku, napravljena su pomoću trepan borera (AC Dental Implant system, 6,0mm trepan borer, ukupna dužina 32 mm, dužina sečivnog dela 15,8 mm, unutrašnji dijametar 6 mm, spoljašnji dijametar 6,95 mm, titanium legura) , pod konstantnim ispiranjem fiziološkim rastvorom (Natrii Chloridi Infundibile, rastvor za infuziju, Zdravlje A.D.Leskovac). Oštrim ekskavatorom uklonjeno je koštano tkivo načinjeno preparacijom trepan borerom. Randomizacija testiranih materijala izvršena je tako što su materijali postavljani rotacionom tehnikom (u smeri kazaljke na satu, po prethodno navedenom modifikovanom Latin blok dizajnu), naizmenično, da bi se obezbedila balansirana distribucija materijala između prednjih i zadnjih regiona kosti kalvarije(99). Koža je potom ponovo vraćena na mesto da bi prekrila eksperimentalnu površinu i ušiveno suturama (SofsilkTM 4-0, SynetureR, , England) horizontalnim madrac šavom. Postoperativno životinje su primile analgetike (Moradol, Galenika) u dozi od 0,1 do 2,0 mg/kg telesne težine kao subkutanu injekciju svakih 8 sati naredna tri dana. Antibiotik (Chloramphenicol, Galenika) u dozi od 60mg/kg telesne težine primenjen je jednom dnevno u narednih pet dana. Životinje su bile smeštene u pojedinačnim kavezima do kraja eksperimenta. Period ocenjivanja trajao je dvanaest nedelja. 4.4.4.Preparacija tkiva Eksperimentalne životinje su posle perioda ocenjivanja od 12 nedelja žrtvovane intravenskom injekcijom od 10ml rastvora Pentobarbitola (Pentobarbital sodium salt 100mg/ml, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany). Nakon toga ispreparisane su parijetalne kosti i potopljene u 10% formalin. 4.4.5.Obrada tkiva za patohistološku analizu Reprezentativni uzorci koštanog tkiva kalvarije koji su makroskopski odgovarali defektima pune debljine i kritične veličine, 6,0mm u prečniku nakon hirurške intervencije fiksirani su u 10% formalinu. 52 Svi uzorci su dekalcinisani u rastvoru za dekalcinaciju: 8%HCl iz 37% (v/v) koncentrata i 10% HCOOH iz 89% (v/v) koncentrata u PBS-u tokom ∼24h na 37°C. Nakon potpune dekalcinacije, procenjene subjektivnom metodom, iskustveno, uzorci su dehidrirani u alkoholu i ukalupljeni u parafinske kalupe. Iz parafinskih kalupa sečeni su serijski tkivni preseci (po 4 sa svakog uzorka) standardne debljine 5μm. Rutinski su preparati bojeni hematoksilin eozin (H&E) bojenjem. Od histohemijskih metoda primenjena su: trihromno bojenje po Massonu (Massons trichrome stain) i bojenje von Kossa. Mikroskopski preparati su analizirani optičkom mikroskopijom uz primenu programa za morfometriju Software “ Cell-B” by Olympus, mikroskop Olympus 5. Uz navedeni softver patohistološki parametri su analizirani kvalitativno i semikvantitativno i kvanitativno. 4.4.6.Histološko ocenjivanje I Optičkom mikroskopijom u bioptičkom materijalu kvanitativno (merenje) su ocenjivani sledeći parametri: 1. Veličina defekta (u mm) 2. Prisustvo džinovskih ćelija (0/HPM, 1-3/HPM, 4,5/HPM, >5/HPM ) 3. Prisustvo neoangiogeneze (0/HPM, 1,2/HPM, 3,4/HPM, >4/HPM) 4. Prisustvo bazofila (0/HPM, 1,2/HPM, 3-5/HPM, >5/HPM ) II Optičkom mikroskopijom u bioptičkom materijalu kvalitativno (prisutno/odsutno) ocenjivani su sledeći parametri: 1. Nespecifično zapaljenje u tkivu 2. Novostvorena kost 3. Fibroplazija u tkivu III Optičkom mikroskopijom u bioptičkom materijalu semikvantitativno ocenjivani su sledeći parametri: 1. Procenat mineralizacije (0, <25%, 26-50%, >50%) 53 4.4.7.Statistička analiza U ovoj studiji korišćene su deskriptivne i analitičke statističke metode. Od deskriptivnih, koriščeni su: - Apsolutni i relativni brojevi (%) - Mere centralne tendencije (aritmetička sredina, medijana) - Mere disperzije (standardna devijacija, minimum, maksimum) Od analitičkih metoda korišćeni su testovi razlike. Korišćeni testovi spadaju u grupu neparametarskih testova. Testovi su: - Hi-kvadrat test - Fišerov test tačne verovatnoće - Mann-Whitney U test - Kruskal-Wallis test Pored testova razlike rađena je i analiza povezanosti. U ove svrhe korišćena je Spirmanova korelaciona analiza. Rezultati su i grafički prikazani pomoću stubičastog i boxplot dijagrama. Podaci su obrađeni u SPSS 12.0 (Statistical Package for the Social Sciences, Chicago, Illinois) softverskom paketu. Sve analize u kojima je p vrednost manja od 0.05 su smatrane statistički značajne. 54 5.REZULTATI 5.1.SINTEZA ČESTICA HIDROKSIAPATITA, KERAMIČKIH HIDROKSIAPATITNIH ĆELIJSKIH NOSAČA I NOSAČA SA INFILTRIRANIM TANKIM FILMOVIMA POLIMERA Dobijeni apatit je bio magnezijum supstituisani karbonatni kalcijum hidroksiapatit tipa B, kod koga su PO43- joni u rešetki apatita zamenjeni sa jonima CO32- . Detaljna razmatranja korišćenjem rendgenske difrakcije - XRD i Furrier transform infracrvene spektroskopije-FTIR publikovana u prethodnim referencama potvrdila su strukturu tog tipa hidroksiapatita. To je veoma važno, jer takav tip apatita preovlađuje u kostima mladih ljudi/dece i on je idealan sa stanovišta njegove kristaliničnosti i resorbilnosti, što je prvi uslov optimalne dinamičke ravnoteže između osteoblasta i osteoklasta, tokom formiranja novog koštanog tkiva. Radi utvrđivanja optimalnih opsega svih datih procesnih parametara izvedeno je dodatno i termodinamičko modeliranje stabilnosti svih fosfatnih kristalnih struktura, posebno hidroksiapatita, pretpostavljajući setove hemijskih jednačina datih u tabeli 5.1. koji pokazuju sve moguće reakcije, koje se mogu javiti tokom sinteze hidroksiapatita. Tabela 5.1.1.Reakcije kao elementi termodinamičkih proračuna 55 Dijagrami fazne stabilnosti hidroksiapatita dobijeni su na osnovu korišćenja termodinamičkih podataka, koji uključuju prvenstveno podatke o promeni slobodne energije za različite jonske vrste prisutne u rastvoru, saglasno setu datih reakcija, primenom modifikovanog termodinamičkog modela Helgeson–Kirkham–Flowers – HKF. Temperaturne funkcije zavisnosti toplotnog kapaciteta i entalpije formiranja, podešene su za sve moguće reakcione faze kao što su hidroksiapatit, monetit i brušit i utvrdjene granice fazne stabilnosti, svake od njih, što je bilo odlučujuće za izbor polja mogućeg izbora pH vrednosti, kao i ostalih parametara sinteze hidroksiapatita. pH Grafikon 5.1. Dijagram fazne stabilnosti hidroksipatita Grafikon fazne stabilnosti hidroksipatita dobijen na osnovu istraživanja Veillard and Tardy bio je osnova i za naša praktična razmatranja i sinteze. Proces sinteze asistiran je dalje micelarnom koncentracijom površinski aktivne supstancije, da bi se ograničio rast čestica hidroksiapatita i da bi one dobile usmeren 56 oblik, što je od izuzetnog značaja za mogućnost dirigovanog kreiranja površine skafolda. Sam mehanizam uticaja etilen vinil acetat/verstata na mehanizam sinteze hidroksiapatita u osnovi povezan je sa nastajanjem brojnih naelektrisanih aktivnih centara koji su tipični za micelarne sisteme i koji simbolički u vodenim sistemima daju okruženje ekvivalentno prstenu u kome su naelektrisane glave površinski aktivne supstance-njihovi polarni delovi okrenute ka polarnom rastvaraču-vodi, u našem slučaju negativno naelektrisane acetatne i versatatne grupe, koje su okrenute ka vodi, nalazeći se u spoljašnjem delu prstena micele, uslovljavaju usmerenu nukleaciju hidroksiapatita kroz privlačenje i vezivanje Ca2+ jona, a potom i fosfatnih jona na Ca2+jone u okviru tetraedarske simetrije, i tako redom dalje, sve dok se ne definiše u celosti veličina čestice. 5.1.1. Karakterizacija HA praha 5.1.1.1. XRD analiza XRD analiza (Slika 5.4.1.) pokazuje da hidrotermalno sintetisani prah je zaista po svome sastavu kalcijum hidroksiapatit Ca10(PO4)6(OH)2 (JCPDS 9–432). O tome svedoči prisustvo svih karakterističnih kristalografskih ravni HA: (2 1 1) za 2θ =31.9; (112) za 2θ = 32.26, (3 0 0) za 2θ =33.12, (0 0 2) za 2θ = 25.86, (2 2 2) za 2 θ = 46.86 i (2 1 3) za 2 θ = 49.58. Slika 5.1.1. XRD spektar hidrotermalno sintetisanog praha hidroksiapatita 57 5.1.1.2. Infracrveni spektar hidrotermalno dobijenog HA IC spektar sintetisanog praha (Slika 5.1.2.) pokazuje trake karakteristične za HAP. Trake na oko 1092 i 1042 cm−1 odgovaraju asimetričnim istežućim (ν3), dok trake na oko 603 i 569 cm−1 odgovaraju savijajućim (ν4) vibracijana PO43- grupa. Trake na 957 i 473 cm−1 potiču od simetričnih istežućih vibracija (ν1 and ν2) PO43- grupa. Oslobođajuće i istežuće vibracije OH- grupa detektovane su na oko 630 i 1626 cm-1, redom. Istežuće vibracije CO32− grupe na 1442, 1406 i 875 cm−1 su takođe prisutne, što ukazuje na inkorporaciju karbonatnih grupa u strukturu apatita. Traka na 630 cm−1 se pripisuje oslobađajućim vibracijama OH- grupa. Evidentno je da je dobijen karbonatni apatit B tipa i da zamena na položajima OH- jona, uočena na osnovu promene oblika i položaja trake na 3658 cm−1, nije dominatno prouzrokovana zamenom OH− jona CO32− jonima. Slika 5.1.2.: Infracrveni spektar hidrotermalno dobijenog hidroksiapatita 58 5.1.1.3.AFM analiza Morfologija površine pHAP-PEVA/PEVV jezgro-omotač struktura hidroksiapatitne čestice analizirane pomoću mikroskopije atomskih sila, AFM, uz korišćenje SPM softvera za izračunavanje raspodele čestica pokazuje da su čestice pretežno veličine oko 60 nm (slika 5.1.3.) i imaju sferoidan ili sasvim poligonalan (heksagonalan) oblik, kao što je prikazano na (slika 5.1.4. i 5.1.5.) pri čemu neke od čestica dosežu vrednost i do oko 500 nm. Slika 5.1.3. AFM: tipičan izgled hidrotermalno dobijenih čestica hidroksiapatita Slika 5.1.4. AFM: snimak čestica hidroksipatita 59 Slika 5.1.5. AFM: slika čestica hidroksiapatita: jasno uočljiva heksagonalna forma hidroksiapatita 5.1.1.4. SEM analiza Posmatrajući SEM mikrofotografije (Slika 5.1.6.) očigledno je da se HA prah sastoji od aglomerata, koji se sastoje od malih sfernih čestica reda veličine od 200 nm. Ovi aglomerati imaju nepravilne forme i medjusobno vrlo su slični i po obliku i veličini (1 - 5µm). Slika 5.1.6. SEM: Tipična morfologija aglomerata HA praha 60 5.1.1.5. BET analiza BET analiza pokazuje podatke vezane za specifičnu površinu čestica praha, ukupnu poroznost unutar čestica praha i srednji prečnik pora koje se nalaze u tim česticama (tabela 5.1.2.). Tabela 5.1.2. Parameteri specifične površine praha i njegove poroznosti određeni BET metodom Uzorak SBET, m 2/g Ukupna zapremina pora, cm3/g Srednji prečnik pora, nm Udeo mezopora,% Udeo makropora,% HA prah 12 1.00 310 10 90 Srednji prečnik pora određen iz specifične površine koristeći BET metodu iznosio je 160 nm. 5.1.2. Karakterizacija HA skafolda 5.1.2.1. Makroskopska razmatranja Kao što se vidi na slici 5.1.7. HA skafold je izuzetno porozna 3D struktura. Pore su cilindrične, međusobno povezane i nalaze se u opsegu od 0.1 do 1 mm. Većina pora ima širinu (prečnik) 0.2 - 0.3 mm. Slika 5.1.7. Hidroksiapatitni skafold 5.1.2.2. AFM i SEM analiza Dobijeni prah hidroksipapatita bio je osnova za dobijanje skafolda definisane unutrašnje geometrije-poroznosti, sa porama reda veličine 200 nm do 1 mm. 61 Trodimezionalni izgled čestica samonukleisanog pHAP prikazan je na AFM snimcima, na sl.5.1.8., na kojoj se vrlo jasno uočavaju slojevi pHAP, koji rastu sloj po sloj nižući se jedan na drugi, formirajući prvo ostrvca, koja se međusobno potom spajaju u monolitne strukture kroz procese sekundarne nukleacije, koje prati proces erozije površine ostvaca usled dinamičkih nestabilnosti unutar kanala između ostrvaca, izazvanih dejstvom kapilarnih sila unutar datog SBF fluida. Slika 5.1.8. AFM. Tipičan trodimenzionalni izgled slojeva tankog filma samonukleiranog pHAP na površini polimera nanetog na površinu hidroksiapatitnog nosača (skafolda) Preuzeti iz knjige V. Jokanović, Nanomedicina, najveći izazov 21 veka, DATA STATUS, Beograd, 2012, ISBN 978-86-7478-152-4 Nakon procesa izgaranja poliuretanske mreže i sinterovanja keramičke faze na 800 0C, dodnosno 13000C dobijena je struktura skafolda data na sl. 5.1.9., 5.1.10. i 5.1.11. Slika 5.1.9. Tipičan izgled zidova skafolda hidroksiapatita. SEM 62 Slika 5.1.10. Tipičan izgled zidova skafolda hidroksiapatita. SEM Slika 5.1.11. Tipičan izgled zidova skafolda hidroksiapatita. SEM Na slici 5.1.9. jasno se uočava lamelaran izgled zidova skafolda, sa velikim brojem lamela dužine veće od 5 μm. Na slici 5.1.10. uočava se takodje, igličasta struktura keramičkih zidova, sa dužinom iglica 1μm i prečnikom 50 nm, a na slici 5.1.11. jasno je uočljiva struktura koja podseća na paukovu mrežu, sa nitima dužine 5- 10 μm i prečnika 40 nm. 63 Slika 5.1.12. AFM: Tipičan izgled strukture pHAP skafolda dobijenog metodom templejta polimerne pene Slika 5.1.13. AFM: Tipičan izgled strukture pHAP skafolda dobijenog metodom templejta polimerne pene 64 Slika 5.1.14. AFM: Tipičan izgled strukture pHAP skafolda dobijenog metodom templejta polimerne pene Slika 5.1.14. pokazuje trodimenzionalnu strukturu , tzv. strukturu češlja, koja je izuzetno bitna za dobro naleganje ćelija pri kontaktu sa skafoldom. Kanali koji definišu zajedno sa ispupčenjima morfologiju unutrašnjih zidova skafolda, su dužine 30 μm, širine 3 μm, razgranati su i imaju debljinu zida 3-5 μm. Jasna je njihova izrazita geometrijska orijentacija, uslovljena samom formom čestica i polimernog templejta. 5.1.2.3.FTIR analiza Analiza FTIR spektra otkriva da, faza, koja je biometički samoansemblirana na površini pHAP /polimer kompozita, je pHAP blago pomerene stihometrije. Slika 5.1.15. IR spektar samoansebliranog pHAP na različitim vrstama polimernih filmova: 1- alginat, 2 – celuloza, 3 - PLGA 65 Sva tri IR spektra na slici 5.1.15. pokazuju trake karakteristične za pHAP: traka malog intenziteta, koja odgovara istezanju hidoksilne grupe uočava se na oko 3570 cm- 1; traka na oko 1640 cm-1pripisuje se deformacionom modu OH grupa; trake locirane na 600 do 650 cm-1se pripisuju slobodnom modu oscilovanja O-H vibracije; vibracija asimetričnog istezanja PO43- uočava se na oko 970-1090 cm-1 ; a vibracija simetričnog istezanja PO43- je prisutna na 550 do 640 cm-1, dok trake na oko 430 do 450 cm- 1delimično odgovaraju ν2 simetričnom modu istezanja PO43- vibracije. Karakteristike krivulja PLGA polimera su takodje vidljive u IR spektru: traka registrovana na 2995 cm-1 odgovara C-H asimetričnoj istežućoj vibraciji, dok trake na oko 2950 i 2880 cm-1 odgovaraju C-H simetričnom istežućoj vibraciji; izražena traka na 1760 cm-1 se pripisuje C=O istezanju; traka na oko 1100-1280 cm-1 se pripisuje istezanju alfatičnog etra C–O–C; trake koje se nalaze u oblasti 1400-1500 cm-1 odgovaraju CH2, CH3, and CH deformacionim vibracijama; i traka koja se nalazi na oko 750 cm-1 pripisuje se uvrtanju dugačkog CH2 lanca (65) 5.1.2.4.XRD analiza Karakteristični difrakcioni vrhovi koji odgovaraju (121), (120), (123) i (004) ravni jasno pokazuju da su pHAP samostalno sastavljene na površini PLGA deponovane sa površine pHAP skafolda (slika. 5.1.16). Proračun veličine kristalita izveden primenom Šererove formule pokazuje male razlike u stepenu kristaliniteta između različitih uzoraka (prosečna veličina kristalita za celulozu je 7.9 nm, za alginat 8,7 nm i PLGA 9,7 nm,). Iako postoje najmanje vrednosti veličine krastilita za samoansemblirani pHAP na površini celuloznog tankog filma i najveće vrednosti za PLGA tanki film, te razlike su zanemarljive. Osim toga, semikvantitivne hemijske analize, izvedene metodom energetski disperzivne spektroskopije (EDS analize), pokazuju da su vrednosti Ca/P za sve tanke filmove bliske vrednostima stehometrijske pHAP ( Ca/P za PLGA 1.65). 66 Slika 5.1.16 XRD spektar pHAP samostalno sastavljenog na različitim polimer filmovima: 1- celuloza, 2-alginat, 3- PLGA 5.1.2.5.SEM analiza pHAP sa PLGA SEM studija otkriva veoma razvijenu morfologiju pHAP čestica. (a) (b) Slika 5.1.17. pHAP sastavljen na PLGA tankom filmu: a) manje uvećanje i b) veće uvećanje Samostalno sastavljena pHAP na površini PLGA tankog filma je prikazana na slici 5.1.17.: posmatrane loptaste čestice pokazuju izuzetno razvijenu morfologiju sa 67 strukturama nalik laticama na datoj površini. Veličina čestice su uglavno kreće od 2.5 do 3.5 µm, međutim, prisutne su i neke manje (0.7 – 1.5 µm) i mali broj nešto većih čestica (4.3 - 8.5 µm). Širina latičastih struktura na datoj površini je samo 15-20 nm. Udaljenost između čestica je u rasponu od 900 nm do 1.8 µm. 5.2.REZULTATI ISPITIVANJA DIREKTNE I INDIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ANALIZIRANIH MATERIJALA 5.2.1.Ispitivanje citotoksičnosti – indirektni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - MTT test Rezultati MTT testa su izraženi kao procenat vijabilnih ćelija u odnosu na kontrolu – čista ćelijska kultura L929 fibroblasta bez ispitivanog materijala. Kontrolna grupa pokazuje preživljavanje 100 procenata ćelija. Pozitivnu kontrolu predstavljao je 4% fenol, koji je doveo do preživljavanja nešto više od 30% ćelija u kulturi, što je visoko statistički značajna razlika (p<0.005) u odnosu na kontrolu. Rezultati MTT testa prikazani su na slici 5.2.1. 68 Kontrola pHAP Slika 5.2.1.1. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 24sata ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP-u 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a. 1h 24h 72 h 69 Kontrola pHAP Slika 5.2.1.2. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 48 sati ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP-u 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a. 1h 24h 72h 70 Kontrola pHAP Slika 5.2.1.3. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 72 sata ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP-u 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a. 24h 1h 72h 71 Grafikon 5.2.1.1. Preživljavanje ćelijske kulture L929 fibroblasta miša u prisustvu ekstrakta pHAP u različitim koncentracijama nastalim nakon izlaganja hranljive podloge materijalu nakon 1, 24 i 72 sata. Broj vijabilnih ćelija L929 fibroblasta eksponencijalno se smanjuje pri njihovom izlaganju produktima degradacije u vremenskom periodu od 24h, 48h i 72h, odnosno citotoksičnost se povećava sa povećanjem vremena kojem su ćelije izložene ekstraktima pHAP-a (grafikon 5.2.1.1.). Citotoksičnost je najviše izražena kod ekstrakta pHAP-a koji je nastao izlaganjem hranljive podloge materijalu u najdužem vremenskom periodu, u ovom eksperimentu 72 sata. Ispitivani materijal pHAP nije doveo do kompletnog citotoksičnog efekta na kulturu fibroblasta L929. PHAP conc(mg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 pr ež iv lja va nj e će lija (% ) 0 20 40 60 80 100 120 140 ekstrakcija 1h ekstrakcija 24h ekstrakcija 72h 72 Kontrola pHAP + PLGA \ Slika 5.2.1.4. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 24sata ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + PLGA 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a i PLGA. 24h 72 h 1h 73 Kontrola pHAP + PLGA Slika 5.2.1.5.. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 48 sati ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + PLGA 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a i PLGA. 72h 24h 1h 74 Kontrola pHAP + Slika 5.2.1.6. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 72 sata ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + PLGA 1, 24 i 72h. Uočava se povećanje citotoksičnosti sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja hranljive podloge ekstraktu pHAP-a i PLGA. 24h 72h 1h 75 Grafikon 5.2.1.2. Preživljavanje ćelijske kulture L929 fibroblasta miša u prisustvu ekstrakta pHAP sa PLGA u različitim koncentracijama nastalim nakon izlaganja hranljive podloge materijalu nakon 1, 24 i 72 sata. Broj vijabilnih ćelija L929 fibroblasta smanjuje se pri njihovom izlaganju produktima degradacije u vremenskom periodu od 24h, 48h i 72h, odnosno citotoksičnost se povećava sa povećanjem vremena kojem su ćelije izložene ekstraktima pHAP sa PLGA(Grafikon 5.2.1.2.). Citotoksičnost je najviše izražena kod ekstrakta pHAP-a koji je nastao izlaganjem hranljive podloge materijalu u najdužem vremenskom periodu, u ovom eksperimentu 24 sata. Ispitivani materijal pHAP sa PLGA nije doveo do kompletnog citotoksičnog efekta na kulturu fibroblasta L929. PHAP+PLGA conc. (mg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 pr ež iv lja va nj e će lija (% ) 0 20 40 60 80 100 120 140 ekstrakcija 1h ekstrakcija 24h ekstrakcija 72h 76 Kontrola pHAP + metformin \ Slika 5.2.1.7. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 24sata ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + metformin 1, 24 i 72h. Uočava se početna izražena citotoksičnost nakon čega dolazi do povećanja broja vijabilnih ćelija (nakon 72h). 72h 1h 24h 77 Kontrola pHAP + metformin Slika 5.2.1.8. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 48 sati ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + metformin 1, 24 i 72h. Uočava se početna izražena citotoksičnost nakon čega dolazi do povećanja broja vijabilnih ćelija (nakon 72h). 24h 72h 1h 78 Kontrola pHAP + metformin Slika 5.2.1.9. Mikroskopski prikaz mišjih fibroblasta u kulturi – L929 tretiranih 72 sati ekstraktima koji su nastali nakon izlaganja hranljive podloge pHAP + metformin 1, 24 i 72h. Uočava se početna izražena citotoksičnost nakon čega dolazi do povećanja broja vijabilnih ćelija (nakon 72h). 24h 72h 1h 79 Grafikon 5.2.1.3. Preživljavanje ćelijske kulture L929 fibroblasta miša u prisustvu ekstrakta pHAP sa metforminom u različitim koncentracijama nastalim nakon izlaganja hranljive podloge materijalu nakon 1, 24 i 72 sata. Broj vijabilnih ćelija L929 fibroblasta smanjuje se pri njihovom izlaganju produktima degradacije u vremenskom periodu od 24h, 48h i 72h, odnosno citotoksičnost se povećava sa povećanjem vremena kojem su ćelije izložene ekstraktima pHAP sa metforminom(Grafikon 5.2.1.3.). Za razliku od drugih ispitivanih materijala pHAP u kombinaciji sa metforminom pokazuje izrazitu citotoksičnost u niskim koncentracijama (do 10mg/ml) bez obzira na vremenski period izloženosti hranljive podloge ovom materijalu. Nakon toga dolazi do oporavka i čak porasta broja ćelijske populacije fibroblasta L929 , da bi pri koncentracijama većim od 60 mg/ml došlo do pojave ravnomernog povećanja citotoksičnosti sa porastom koncentracije produkata degradacije, kao kod ostalih ispitivanih materijala. Ispitivani materijal pHAP sa PHAP+metformin conc.(mg/ml) 0 20 40 60 80 100 120 pr ež iv lja va nj e će lija (% ) 20 40 60 80 100 120 ekstrakcija 1h ekstrakcija 24h ekstrakcija 72h 80 metforminom nije doveo do kompletnogcitotoksičnog efekta na kulturu fibroblasta L929. Kontrola Fenol 4% nakon 24 h Fenol 4% nakon 48 h Fenol 4% nakon 24 h Slika 5.2.1.10. Pozitivnu kontrolu predstavljao je 4% fenol, koji je doveo do preživljavanja nešto više od 30% ćelija u kulturi. 81 5.2.2.Ispitivanje citotoksičnosti – direktni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - LDH test Slika 5.2.2.1. Ispitivanje citotoksičnosti – direktni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - LDH test sa pHAP - om. Vidi se veliki broj ćelija fibroblasta L929 normalne morfologije koje su u bliskom kontaktu sa pHAP-om. 82 Slika 5.2.2.2. Ispitivanje citotoksičnosti – direktni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - LDH test sa pHAP +PLGA. Vidi se veliki broj ćelija fibroblasta L929 normalne morfologije koje su u bliskom kontaktu sa pHAP-om. Na slici se vidi da su umnožene ćelije naselile i mikroskopsku pločicu sa fiksiranim pHAP + PLGA. 83 Slika 5.2.2.3. Ispitivanje citotoksičnosti – direktni kontakt ispitivanog materijala sa ćelijskom kulturom - LDH test sa pHAP +metformin. Gusto naseljene ćelije prekrivaju ivice mikroskopske pločice i ispitivani materijal koji je fiksiran na pločici. 84 Grafikon 5.2.2.1. Broj ćelija adheriran na pHAP, pHAP sa PLGA i pHAP sa metforminom. Kao što se vidi na Grafikonu 5.2.2.1. značajna ćelijska proliferacija i adhezija nadjena je kod svih ispitivanih materijala. U ovom eksperimentu, pHAP, pHAP sa PLGA i pHAP sa metforminom nisu pokazali citotoksičnost u direktnom kontaktu sa ćelijskom kulturom fibroblasta L929. Prvog dana eksperimenta, broj ćelija u prisustvu svakog od ispitivanih materijala nije se značajno uvećao. Od drugog dana eksperimenta ćelije su se umnožavale i njihov broj je eksponencijalno rastao. Na kraju eksperimenta, sedmog dana, ćelije fibroblasta L929 su bile u bliskom kontaktu sa svakim od ispitivanih materijala u velikom broju i neizmenjene morfologije. 85 5.3.REZULTATI ISPITIVANJA TESTA PRIMARNE KUTANE IRITACIJE 5.3.1.Sistemska reakcija podnošljivost - tolerancija Nakon jednokratnog aplikovanja test materijala svi kunići su se dobro oporavili i nisu pokazivali znake bolesti u naredna 72 sata. 5.3.2. Lokalna reakcija 5.3.2.1.Efekat pHAP Eritem i edem nisu bili prisutni posle 24, 48 i 72 sata na tretiranim mestima ni kod jedne od ispitivanih životinja. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 5.3.1. Nije bilo statistički značajne razlike u vrednosti SPI između tretiranih mesta i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p>0.05). Indeks primarne kutane iritacije za pHAP bio je 0 na skali od 0.00 do 8.00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, zakljućeno je da pHAP nema iritirajuće osobine. Tabela 5.3.1.. Skor eritema i edema posle primene pHAP Kunić 24 s. 48 s. 72 s. (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 2 Ertem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 3 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije 86 5.3.2.2. Efekat pHAP + metformin Eritem i edem nisu bili prisutni posle 24, 48 i 72 sata na tretiranim i kontrolnim mestima ni kod jedne od tretiranih životinja. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 5.3.2. Nije bilo statistički značajne razlike u vrednosti SPI između tretiranih mesta i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p>0.05). Indeks primarne kutane iritacije za pHAP + celuloza bio je 0 na skali od 0.00 do 8.00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, zakljućeno je da pHAP + metformin nema iritirajuće osobine. Tabela 5.3.2.. Skor eritema i edema posle primene pHAP + metformin Kunić 24 c 48 c 72 c (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 2 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 3 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije 87 5.3.2.3. Efekat pHAP + PLGA Eritem i edem nisu bili prisutni posle 24, 48 i 72 sata na tretiranim i kontrolnim mestima ni kod jedne od tretiranih životinja. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 5.3.3. Nije bilo statistički značajne razlike u vrednosti SPI između tretiranih mesta i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p>0.05). Indeks primarne kutane iritacije za pHAP + PLGA bio je 0 na skali od 0.00 do 8.00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, zakljućeno je da pHAP + PLGA nema iritirajuće osobine. Tabela 5.3.3. Skor eritema i edema posle primene pHAP + PLGA Kunić 24 c 48 c 72 c (red.broj) T a Kb T K T K SPI PII 1 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 2 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 3 Eritem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0/6-0/6=0 Edem 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 0-0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije 88 5.3.2.4. Efekat mlečne kiseline (98%) – pozitivna kontrola U prvom vremenskom periodu analize reakcije kože (24 sata nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98%) dobro definisan eritem (skor 2) uočen je kod dve od tri testirane životinje. Kod treće životinje uočen je slab eritem (skor 1). Takođe, u ovom vremenskom periodu uočen je slab edem kod dve životinje (skor 1). U drugom vremenskom periodu analize reakcije kože (48 sati nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98%) uočen je slab eritem (skor 1) kod sve tri životinje i slab edem (skor 1) kod dve od tri živitinje. U trećem vremenskom periodu analize reakcije kože (72 sata nakon uklanjanja flastera sa mlečnom kiselinom, 98%) iritacija kože je bila povučena, smanjena i slab eritem (skor 1) ostao je kod jedne životinje, a kod druge dve životinje nije uočeno prisustvo eritema (skor 0). U ovom vremenskom periodu edem je uočen kod jedne od tri životinje. Skor primarne kutane iritacije pojedinačnih životinja prikazan je u Tabeli 5.3.4. Postojala je statistički značajna razlika u vrednosti SPI između mesta tretiranih mlečnom kiselinom (98%) i kontrolnih mesta (negativna kontrola) (p<0.05). Indeks primarne kutane iritacije za mlečnu kiselinu (98%), koja je korišćena kao pozitivna kontrola bio je 0.84 na skali od 0.00 do 8.00. Na osnovu ovog indeksa primarne kutane iritacije, mlečna kiselina (98%) ima blago iritirajuće osobine. 89 Tabela 5.3.4. Skor eritema i edema posle primene mlečne kiseline 98% (pozitivna kontrola) Kunić 24 c 48 c 72 c (red.broj) T a K b T K T K SPI PII 1 Eritem 2 0 1 0 0 0 6/6-0/6=1.00 Edem 1 0 1 0 1 0 2 Eritem 2 0 1 0 0 0 6/6-0/6=1.00 0.84 Edem 1 0 1 0 1 0 3 Eritem 1 0 1 0 1 0 3/6-0/6=0.50 Edem 0 0 0 0 0 0 a Tretirano mesto b Kontrolno mesto SPI – Skor primarne iritacije PII – Indeks primarne kutane iritacije Slika 5.3.1. Fotografija prikazuje test primarne kutane iritacije nakon postavljanja test uzoraka. (test material primenjen na kožu). 90 Slika 5.3.2. Fotografija prikazuje test primarne kutane iritacije nakon fiksiranja postavljenih test uzoraka. (test material primenjen na kožu). Slika 5.3.3. Fotografija prikazuja test primarne kutane iritacije. Rezultati testa nakon direktnog jednokratnog kontakta uzorka test materijala i kože u trajanju od 4 sata. 91 U testu primarne kutane iritacije za tri ispitivana test materijala (pHAP, pHAP + metformin i pHAP + PLGA) srednja vrednost indeksa primarne kutane iritacije je bila nula. U direktnom, jednokratnom kontaktu sa kožom ni jedan od tri ispitivana test materijala (pHAP; pHAP + metformin i pHAP + PLGA) nije ispoljio iritirajuća svojstva, i mogu se smatrati neiritirajućim materijalima. Usled toga, pogodni su za primenu u in vivo uslovima. 5.4. ISPITIVANJE BIOFUNKCIONALNOSTI: IN VIVO PREDKLINIČKI TESTOVI NA ANIMALNOM MODELU 5.4.1.Opis i karakteristike uzorka U ovoj studiji bilo je uključeno dvanaest novozelandskih belih kunića oba pola ( 6 muškog i 6 ženskog pola), iz različitih legla, starosti oko 4 meseca, telesne težine oko 3 kilograma. Sve životinje dobro su se oporavile posle opšte anestezije i hirurške intervencije, a rane na koži zarasle su per primam intentionem. Nakon evolucionog perioda od dvanaest nedelja uzorci od svih dvanaest operisanih životnja bili su na raspolaganju za analizu. Ni jedna životinja nije pokazala znakove infekcije. Tokom histološke pripreme uzoraka jedan uzorak iz grupe ispitivanog materijala pHAP sa metforminom i jedan uzorak iz grupe pozitivne kontrole BioOssR bili su oštećeni i nisu mogli da se koriste u analizi. Tabela 5.4.1. Distribucija ispitivanih materijala Broj uzoraka % Kumulativno % Valid bez materijala 4 8.7 8.7 pHAP+PLGA 12 26.1 34.8 BioOss 7 15.2 50.0 pHAP+MTF 11 23.9 73.9 pHAP 12 26.1 100.0 Total 46 100.0 92 Ukupno je analizirano 46 uzoraka sa ispitivanim materijalom. Od toga bilo je 12 uzoraka iz grupe pHAP sa PLGA, 12 uzoraka pHAP, 11 pHAP sa metforminom, 4 negativne kontrole i 7 uzoraka iz grupe pozitivne kontrole BioOssR . 5.4.2.Veličina defekta Tabela 5.4.2. Distribucija veličine defekta u mm 12 nedelja nakon ugradnje ispitivanih materijala Materijal N Aritmetičkasredina Median Minimum Maximum Raspon SD bez materijala 4 4.975 5.150 3.9 5.7 1.8 .8461 pHAP+PLGA 12 3.967 4.000 2.1 6.0 3.9 1.2978 BioOss 7 4.614 5.000 3.1 5.7 2.6 .8934 pHAP+MTF 11 5.236 5.700 3.1 6.0 2.9 1.0782 pHAP 12 5.200 5.600 3.3 6.0 2.7 .8749 Total 46 4.778 5.150 2.1 6.0 3.9 1.1372 Iz tabele se vidi da je najmanja prosečna vrednost defekta u grupi PLGA. Ali, iz iste tabele se vidi da je najveći varijabilitet bio u pomenutoj grupi, odnosno raspon vrednosti je daleko veći od ostalih grupa. Analizirajući podatke, Kruskal-Wallis testom utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika između 5 ispitivanih grupa po veličini defekta (X2=9.686; df=4; p=0.040). Rezultati su i grafički prikazani na grafikonu 5.4.1. 93 Grafikon 5.4.1.Prosečne vrednosti defekta kod ispitivanih materijala 12 nedelja nakon implantacije. Uporedjujući pHAP sa PLGA, koji je pokazao postojanje najmanje prosečne vrednosti defekta, sa pozitivnom kontrolom gde je bio postavljen BioOss koji se koristi kao zlatni standard, utvrđeno je da je veličina defekta bila manja u grupi koja sadrži pHAP sa PLGA. Tabela 5.4.3. Prosečne vrednosti defekta uporedno kod pHAP sa PLGA i kod BioOsa Materijal N Mean Rank Sum of Ranks pHAP + PLGA 12 9.00 108.00 BioOss 7 11.71 82.00 Velicina defekta Total 19 bez materijala pHAP+PLGA BioOss pHAP+MTF pHAP Materijal 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 Velicin a d efekta 94 Analizirajući ove podatke Mann-Whitney U testom utvrđeno je da nema statistički značajne razlike između ove dve grupe po veličini defekta (Z=-1.016; p=0.326). Slika 5.4.1.: U kosti prisutna potpuna nadoknada defekta novostvorenim koštanim tkivom sa elementima mineralizacije (strelica). Materijal pHAP+PLGA (Trihromno bojenje Masson, 40x) Tabela 5.4.4. Prosečne vrednosti defekta uporedno kod pHAP sa PLGA i kod pHAP-a Materijal N Mean Rank Sum of Ranks Velicina defekta pHAP + PLGA 12 9.08 109.00 pHAP 12 15.92 191.00 Total 24 95 Analizirana je i veličina defekta u grupi implantiranih materijala čistog pHAP-a sa pHAP-om i PLGA. Utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika kod ove dve grupe materijala, odnosno da je pHAP sa PLGA pokazao manju prosečnu veličinu defekta u odnosu na čist pHAP(Z=-2.373; p=0.016). Slika 5.4.2.: U kosti prisutan defekt ispunjen granulacionim tkivom sa elementima inflamacije (strelica). Materijal pHAP (Trihromno bojenje Masson, 40x) 96 5.4.3.Prisustvo nespecifičnog zapaljenja Tabela 5.4.5. Prisustvo nespecifičnog zapaljenja u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Nespecificno zapaljenje Total ne da Materijal bez materijala broj 1 3 4 % 25.0% 75.0% 100.0% pHAP + PLGA broj 10 2 12 % 83.3% 16.7% 100.0% BioOss broj 4 3 7 % 57.1% 42.9% 100.0% pHAP + MTF broj 2 9 11 % 18.2% 81.8% 100.0% pHAP broj 8 4 12 % 66.7% 33.3% 100.0% Total broj 25 21 46 % 54.3% 45.7% 100.0% Iz tabele 5.4.5. vidi se da je nespecifično zapaljenje najčešče bilo prisutno u negativnoj kontroli i u defektima ispunjenih sa pHAP + metforminom, dok su defekti koji su bili ispunjeni čistim pHAP - om i kombinacijom pHAP - a sa PLGA pokazali prisustvo nespecifičnih znakova zapaljenja u najmanjem broju slučajeva. 97 Grafikon 5.4.2. Prisustvo znakova nespecifičnog zapaljenja u prisustvu različitih materijala. Tabela 5.4.6. Prisustvo nespecifičnog zapaljenja u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i BioOss. Nespecificno zapaljenje Total ne da Materijal pHAP+PLGA broj 10 2 12 % 83.3% 16.7% 100.0% BioOss broj 4 3 7 % 57.1% 42.9% 100.0% Total broj 14 5 19 % 73.7% 26.3% 100.0% Iz tabele 5.4.6., kada se uzmu u obzir samo pHAP sa PLGA i BioOss vidi se da je veći broj defekata imao nespecifično zapaljenje u grupi BioOss u odnosu na grupu bez materijala pHAP+PLGA BioOss pHAP+MTF pHAP Materijal 0 2 4 6 8 10 N Nespecificno zapaljenje ne da 98 pHAP sa PLGA. Analizirajući razliku ove dve grupe u odnosu na pojavu nespecifičnog zapaljenja, utvrđeno je da nema značajne razlike između primenjenih materijala u odnosu na pojavu zapaljenja (Fisher’s Exact Test p=0.305). Grafikon 5.4.3. Prisustvo nespecifičnog zapaljenja u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i BioOss. pHAP+PLGA BioOss Materijal 0 2 4 6 8 10 N Nespecificno zapaljenje ne da 99 Slika 5.4.3: U kosti prisutan defekt ispunjen granulacionim tkivom sa elementima hroničnog zapaljenja. Uočava se mešovit mono i polimorfonuklearni infiltrat. (strelice). Materijal BioOss (HE, 40x) Tabela 5.4.7. Prisustvo nespecifičnog zapaljenja u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Nespecificno zapaljenje Total ne da Materijal pHAP+PLGA broj 10 2 12 % 83.3% 16.7% 100.0% pHAP broj 8 4 12 % 66.7% 33.3% 100.0% Total broj 18 6 24 % 75.0% 25.0% 100.0% Uzimajući u obzir PLGA i pHAP vidi se da je nespecifično zapaljenje prisutno u većem broju kod defekata ispunjenih sa pHAP ali takođe bez statistički značajne razlike(Fisher’s Exact Test p=0.640). 100 Slika 5.4.4.: Novostvoreno koštano tkivo koje je lako celularno pokazuje iregularnu građu gredica. Koštani defekt ispunjen u celosti. Nema elemenata inflamacije. Diskretna, teško uočljiva granica izmedju kosti domaćina i novostvorene kosti. (crne linije). Materijal pHAP+PLGA (HE, 40x) 101 5.4.4. Prisustvo džinoviskih ćelija Tabela 5.4.8. Prisustvo džinovskih ćelija u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Dzinovske celije nema 1.2/HPM 3,4/HPM >5/HPM Total broj 1 0 0 3 4bez materijala % 25.0% .0% .0% 75.0% 100.0% broj 8 2 2 0 12pHAP+PLGA % 66.7% 16.7% 16.7% .0% 100.0% broj 1 0 4 2 7BioOss % 14.3% .0% 57.1% 28.6% 100.0% broj 1 3 2 5 11pHAP+MTF % 9.1% 27.3% 18.2% 45.5% 100.0% broj 4 2 2 4 12 Materijal pHAP % 33.3% 16.7% 16.7% 33.3% 100.0% broj 15 7 10 14 46Total % 32.6% 15.2% 21.7% 30.4% 100.0% Analizirajući prisustvo džinovskih ćelija u defektima koji su ispunjeni ispitivanim materijalom, iz tabele 5.4.8. vidi se da su u negativnoj kontroli(75%) kao i u defektima ispunjenim sa pHAP + metforminom(45%) nađene džinovske ćelije u najvećem broju. Bez prisustva džinovskih ćelija najčešće su bili defekti ispunjeni sa pHAP+PLGA(66,7%). 102 Grafikon 5.4.4. Prisustvo džinovskih ćelija u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Analizirajući podatke, Kruskal-Wallis testom utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika između 5 ispitivanih grupa prema prisustvu džinovskih ćelija u defektima (X2=12.219; df=4; p=0.011). bez materijala pHAP + PLGA BioOss pHAP+ MTF pHAP Materijal 0 2 4 6 8 N Dzinovske celije nema 1,2/HPM 3,4/HPM >5/HPM 103 Slika 5.4.5.: Koštani defekt delom ispunjen novostvorenom kosti (NK) a delom partikulama materijala (BO) oko koga se nalaze džinovske ćelije tipa oko stranog tela (strelica). Materijal BioOss (HE, 200x) Tabela 5.4.9. Prisustvo džinovskih ćelija u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i BioOss. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks Dzinovske celije pHAP+PLGA 12 7.50 90.00 BioOss 7 14.29 100.00 Total 19 Dodatnim testiranjem defekata ispunjenih sa pHAP+PLGA i BioOss materijalima, i analiziranjem ovih podataka Mann-Whitney U testom, utvrdjeno je da postoji statistički značajna razlika u prisustvu džinovskih ćelija izmedju ove dve grupe(Z=-2.730; p=0.005). NK BO 104 Slika 5.4.6.: Novostvorena kost (NK) remodelira defekt. Pored kosti prisutne i trake umnoženog veziva koje odgovaraju fibroplaziji (FP). Bez prisustva džinovskih ćelija. Materijal pHAP+PLGA (HE, 200x) Tabela 5.4.10. Prisustvo džinovskih ćelija u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks pHAP+PLGA 12 9.83 118.00 pHAP 12 15.17 182.00 Dzinovske celije Total 24 Takođe, analiziranjem podataka dobijenih za pHAP+PLGA i pHAP Mann- Whitney U testom,utvrdjeno je da ne postoji statistički značajna razlika u prisustvu džinovskih ćelija izmedju ove dve grupe(Z=-1.989; p=0.061). NK FP 105 5.4.5.Novostvorena kost Tabela 5.4.11. Prisustvo novostvorene kosti u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Novostvorena kost ne da Total Materijal bez materijala broj 2 2 4 % 50.0% 50.0% 100.0% pHAP+PLGA broj 0 12 12 % .0% 100.0% 100.0% BioOss broj 0 7 7 % .0% 100.0% 100.0% pHAP+MTF broj 6 5 11 54.5% 45.5% 100.0% pHAP broj 0 12 12 % .0% 100.0% 100.0% Total broj 8 38 46 % 17.4% 82.6% 100.0% U odnosu na novostvorenu kost, analiza je pokazala da je kod defekata ispunjenih sa pHAP+PLGA, pHAP i Biooss novostvorena kost je bila formirana u svim slučajevima. Kod defekata ispunjenih sa pHAP+metforminom novostvorena kost bila stvorena u 5(45,5%) slučajeva dok se u 6 (55,5%) slučajeva nije formirala, dok se u negativnoj kontrolnoj grupi (prazan defekt) novostvorena kost pojavila u 50% a nije je bilo u drugih 50% slučajeva. 106 Grafikon 5.4.5. Postojanje novostvorene kosti u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Novostvorena kost se u 100% slučajeva stvorila u defektima ispunjenim sa čistim pHAP-om kao i u defektima ispunjenim sa pHAP-om u kombinaciji sa PLGA i sa pozitivnom kontrolom, defektom ispunjenim sa BioOss-om. Defekti ispunjeni sa pHAP-om u kombinaciji sa metforminom pokazali da je stvaranje nove kosti bilo isto kao i u negativnoj kontrolnoj grupi. bez materijala pHAP+ PLGA BioOss pHAP+ MTF pHAP Materijal 0 2 4 6 8 10 12 N Novostvorena kost ne da 107 Slika 5.4.7.: Koštano tkivo mestimično ispunjava defekt (strelice). Iregularne zone mineralizacije u gredicama sa dominantnim prisustvom organskog, nemineralizovanog matriksa. Prisutne partikule materijala (pHAP). Materijal pHAP (Trihromno bojenje Masson, 40x) pHAP 108 Slika 5.4.8.: Novostvorene koštane gredice u iregularnom aranžmanu popunjavaju defekt. U gredicama prisutna približno jednaka količina nemineralizovanog i mineralizovanog osteoida. Fokalno vidljive sitne partikule materijala (BO). Materijal Bio Oss (Trihromno bojenje Masson, 40x) BO BO 109 Slika 5.4.9.: Regularna građa koštanih gredica u novostvorenoj kosti. Dominantno je prisustvo mineralizovanog osteoida. Koštano tkivo pokazuje lamelarnu građu. Materijal pHAP+PLGA. (Trihromno bojenje Masson, 40x) 110 5.4.6.Prisustvo fibroplazije Tabela 5.4.12. Prisustvo vezivnog tkiva u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Fibroplazija bez fibroplazije vezivo 25% vezivo 50% vezivo 75% Total Materijal bez materijala broj 0 1 0 3 4 % .0% 25.0% .0% 75.0% 100.0% pHAP+PLGA broj 0 7 4 1 12 % .0% 58.3% 33.3% 8.3% 100.0% BioOss broj 0 1 2 4 7 % .0% 14.3% 28.6% 57.1% 100.0% pHAP+MTF broj 3 4 1 3 11 % 27.3% 36.4% 9.1% 27.3% 100.0% pHAP broj 0 4 6 2 12 % .0% 33.3% 50.0% 16.7% 100.0% Total broj 3 17 13 13 46 % 6.5% 37.0% 28.3% 28.3% 100.0% Posmatrajući prisustvo vezivnog tkiva u defektima ispunjenim ispitivanim materijalom, nađeno je da je najveći procenat veziva, preko 75% bio u defektima ispunjenim sa BioOss-om. Najmanje veziva, ispod 25%, pronađeno je u defektima u kojima je implantiran pHAP u kombinaciji sa PLGA(58,3%). Analizirajući rezultate Kruskal-Wallis testom utvrđeno je da izmedju 5 ispitivanih grupa nema statistički značajne razlike na konvencionalnom nivou značajnosti od 0.05, ali obzirom da je signifikantnost egzaktnog testa 0.063 , možemo ukoliko pomerimo nivo greške za 2% da kažemo da je ova razlika značajna. (X2=12.219; df=4; p=0.063). 111 Grafikon 5.4.6. Prisustvo vezivnog tkiva u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Tabela 5.4.13. Prisustvo vezivnog tkiva u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i BioOss. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks Fibroplazija pHAP+PLGA 12 7.88 94.50 BioOss 7 13.64 95.50 Total 19 Uporednim testiranjem defekata ispunjenih sa pHAP+PLGA i BioOss i analiziranjem ovih podataka Mann-Whitney U testom, utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika u odnosu na postojanje fibroplazije kod ove dve grupe(Z=-2.300; p=0.025). bez materijala pHAP+PLGA BioOss pHAP+MTF pHAP Materijal 0 1 2 3 4 5 6 7 N bez fibroplazije vezivo 25% vezivo 50% vezivo 75% Fibroplazija 112 Slika 5.4.9.: Naglašeno prisustvo fibroplazije (FP). Proliferisani fibroblasti okružuju koštano tkivo na mestu defekta. Materijal Bio Oss (Trihromno bojenje Masson, 100x) FP 113 Slika 5.4.10.: Novostvoreno koštano tkivo pokazuje lamelarnu gradju. Nema elemenata fibroplazije. Naglašena mineralizacija osteoidnog matriksa. Materijal pHAP+PLGA. (Trihromno bojenje Masson, 100x) Tabela 5.4.14. Prisustvo vezivnog tkiva u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks pHAP+PLGA 12 10.92 131.00 pHAP 12 14.08 169.00 Fibroplazija Total 24 Poredeći prisustvo fibroplazije kod defekata ispunjenih sa pHAP+PLGA i sa pHAP-om, i analiziranjem tih podataka Mann-Whitney U testom, utvrdjeno je da ne postoji statistički značajna razlika u u odnosu na postojanje fibroplazije kod ove dve grupe(Z=-1.203; p=0.312). 114 5.4.7.Neoangiogeneza Tabela 5.4.15. Prisustvo novoformiranih krvnih sudova u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima. Neoangiogeneza bez angiogeneze 1,2 ks/HPM 3,4 ks/HPM više od 4ks /HPM Total Materijal bez materijala broj 0 1 1 2 4 % .0% 25.0% 25.0% 50.0% 100.0% pHAP+PLGA broj 1 4 5 2 12 % 8.3% 33.3% 41.7% 16.7% 100.0% BioOss broj 1 2 3 1 7 % 14.3% 28.6% 42.9% 14.3% 100.0% pHAP+MTF broj 4 1 5 1 11 % 36.4% 9.1% 45.5% 9.1% 100.0% pHAP broj 1 7 3 1 12 % 8.3% 58.3% 25.0% 8.3% 100.0% Total broj 7 15 17 7 46 % 15.2% 32.6% 37.0% 15.2% 100.0% U odnosu na prisusvo novostvorenih krvnih sudova u defektima dobijeni podaci analizirani su Kruskal Wallis testom, a statistički značajna razlika izmedju svih ispitivanih grupa nije potvrđena. (X2=3.683; df=4; p=0.465). Takodje statistički značajna razlika nije pronađena ni poređenjem i analiziranjem Mann Whitney U testom podataka vezanih za prisustvo neoangiogeneze u defektima ispunjenih sa pHAP+PLGA i Biooss, (Z=-0,179; p=0.965), kao pHAP+PLGA i pHAP (Z=-1.055; p=0.345). 115 Slika 5.4.11.: Brojni krvni sudovi prisutni u fibroblastičnoj stromi (strelice). Uočavaju se ostaci materijala sa gigantocelularnom reakcijom tipa oko stranog tela (BO). Materijal Bio Oss (Trihromno bojenje Masson, 100x) BO 116 Slika 5.4.12.: Oko novostvorene kosti se uočavaju pojedinačni krvni sudovi dilatiranih lumena (strelice). Materijal pHAP+PLGA. (Trihromno bojenje Masson, 100x) 117 5.4.8.Procenat mineralizacije Tabela 5.4.16. Procenat mineralizacije u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima Procenat mineralizacije bez mineralizacije <25% 25- 50% >50% Total Materijal bez materijala broj 1 2 1 0 4 % 25.0% 50.0% 25.0% .0% 100.0% pHAP+PLGA broj 0 1 3 8 12 % .0% 8.3% 25.0% 66.7% 100.0% BioOss broj 0 2 4 1 7 % .0% 28.6% 57.1% 14.3% 100.0% pHAP+MTF broj 6 1 4 0 11 % 54.5% 9.1% 36.4% .0% 100.0% pHAP broj 0 5 4 3 12 % .0% 41.7% 33.3% 25.0% 100.0% Total broj 7 11 16 12 46 % 15.2% 23.9% 34.8% 26.1% 100.0% Analizirajuci dobijene rezultate vezane za stepen mineralizacije defekata ispunjenih ispitivanim materijalom, iz tabele se vidi da je najveći procenat mineralizacije bio prisutan u defektima ispunjenih sa PLGA, u 66,7% slučajeva bilo je prisutno više od 50% mineralizovane kosti. Dobijeni podaci analizirani su Kruskal Wallis testom, i pronadjena je statistički značajna razlika izmedju svih ispitivanih grupa (X2=18.574; df=4; p=0.001). 118 Grafikon 5.4.7. Procenat mineralizacije u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima U defektima koji su bili ispunjeni sa pHAP u kombinaciji sa metforminom mineralizacije nije bila prisutna u najvećem broju slučajeva(54,5%), više nego u negativnim kontrolama gde mineralizacija nije bila registrovana u 25% slučajeva. Tabela 5.4.17. Procenat mineralizacije u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i BioOss. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks Procenat mineralizacije pHAP+PLGA 12 11.92 143.00 BioOss 7 6.71 47.00 bez materijala pHAP+ PLGA BioOss pHAP+ MTF pHAP Materijal 0 2 4 6 8 N Procenat mineralizacije bez mineral. <25% 25-50% >50% 119 Total 19 Poredeći defekte ispunjene sa pHAP+PLGA i BioOss ponaosob i analizirajući dobijene podatke Mann Whitney U testom dobijena je statistički značajna razlika izmedju ove dve grupe (Z=-2.118; p=0.039). Tabela 5.4.18. Procenat mineralizacije u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Materijal N Mean Rank Sum of Ranks pHAP+PLGA 12 15.46 185.50 pHAP 12 9.54 114.50 Procenat mineralizacije Total 24 Takođe analizirajući podatke dobijene za pHAP+PLGA i pHAP Mann Whitney U testom došlo se do zaključka da je prisutna statistički značajna razlika između ova dva materijala kad je u pitanju procenat mineralizacije. (Z-2.204; p=0.052). Slika 5.4.13.: Mineralizacija u gredicama je naglašeno iregularna. Koštane gredice pokazuju manje od 25% mineralizacije. Dominantno je prisusrtvo organskog 120 nemineralizovanog koštanog matriksa, koje čini više od 75% koštane mase. Materijal pHAP. (Trihromno bojenje Masson, 200x) Slika 5.4.14.: Umereno regularna mineralizacija novostvorene kosti. Mineralizovani i nemineralizovani matriks su približno podjednako zastupljeni u koštanom tkivu, sa oko 50%. Materijal BioOss. (Trihromno bojenje Masson, 200x) 121 Slika 5.4.15.: Mineralizacija u gredicama je regularna, lamelarnog tipa. Koštane gredice pokazuju više od 75% mineralizacije. Dominantno je prisusrtvo mineralizovanog koštanog matriksa. Materijal pHAP+PLGA. (Trihromno bojenje Masson, 200x) 122 5.4.9. Prisustvo bazofila Tabela 5.4.19. Procena prisustva bazofila u defektima ispunjenim ispitivanim materijalima Bazofili nisu nadjeni 1,2 /HPM 3 -5 /HPM više od 5/HPM Total Materijal bez materijala broj 2 1 1 0 4 % 50.0% 25.0% 25.0% .0% 100.0% pHAP+PLGA broj 9 2 1 0 12 % 75.0% 16.7% 8.3% .0% 100.0% BioOss broj 5 1 0 1 7 % 71.4% 14.3% .0% 14.3% 100.0% pHAP+MTF broj 5 4 1 1 11 % 45.5% 36.4% 9.1% 9.1% 100.0% pHAP broj 4 2 4 2 12 % 33.3% 16.7% 33.3% 16.7% 100.0% Total broj 25 10 7 4 46 % 54.3% 21.7% 15.2% 8.7% 100.0% Podaci dobijeni o prisustvu bazofila u defektima pokazali su da je u defektima ispunjenim sa PLGA u 75% slučajeva bazofili nisu nađeni, u BioOss-u kod 71% slučajeva. Statističkom obradom ovih podataka Kruskal Wallis testom statistička značajnost nije nađena Tabela 5.4.20. Procena prisustva bazofila u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Bazofili ne da Total broj 9 3 12pHAP +PLGA % 75.0% 25.0% 100.0% broj 4 8 12 Materijal pHAP % 33.3% 66.7% 100.0% broj 13 11 24Total % 54.2% 45.8% 100.0% 123 Grafikon 5.4.8. Procena prisustva bazofila u defektima ispunjenim sa pHAP+PLGA i pHAP. Ukoliko se podaci o prisustvu bazofila predstave kao da li su oni prisutni ili nisu, analizom Chi-Square nalazi se statistički značajna razlika u njihovom prisustvu izmedju PLGA I pHAP (X2=4.196; df=1; p=0.041). Tabela 5.4.21. Spirmanova korelaciona analiza ispitivanih parametara međusobno Vel. defeka Dzinovske celije Fibroplazija Neoangiogeneza Procenat mineralizacije Bazofili Velicina defekta 1.000 .233 -.074 -.317(*) -.410(**) .046 Dzinovske celije .233 1.000 .377(**) .443(**) -.590(**) .505(**) Fibroplazija -.074 .377(**) 1.000 .306(*) -.091 .246 Neoangio- geneza -.317(*) .443(**) .306(*) 1.000 -.197 .378(**) Procenat minerali-zacije - .410(**) -.590(**) -.091 -.197 1.000 - .436(**) Bazofili .046 .505(**) .246 .378(**) -.436(**) 1.000 * Značajnost na nivou 0.05 ** Značajnost na nivou 0.01 pHAP+PLGA pHAP Materijal 0 2 4 6 8 10 N Bazofili ne da 124 U tabeli 5.4.21. prikazana je međusobna korelacija ispitivanih parametara. Uočava se da je prisustvo defekta u preparatima obrnuto proporcionalno procentu mineralizacije i prisustvu krvnih sudova. Takođe što je više prisutna fibroplazija, što je veći broj registrovanih novih krvnih sudova i što je više prisutnih bazofila, veća je mogućnost nalaženja i džinovskih ćelija. U slučaju visokog procenta mineralizacije, džinovske ćelije nisu nađene. Neoangiogeneza je srazmerna pojavi fibroplazije u preparatima a obrnuto srazmerna procentu mineralizacije. 125 6.DISKUSIJA 6.1. DISKUSIJA MATERIJALA Tkivno inženjerstvo koštanog tkiva se zasniva na zasejavanju ćelija na veštački proizveden ekstracelularni matriks-ćelijski nosač, uz prisustvo biološki aktivnih molekula. Visoko porozni nosači igraju važnu ulogu u zasejavanju ćelija, njihovoj migraciji, proliferaciji i diferencijaciji, tako da oni aktivno učestvuju vode formiranje novog tkiva u tri dimenzije. Idealan skafold bi trebalo da bude biokompatibilan, biorastvorljiv, da ima dobre mehaničke osobine i da pospešuje ćelijsko vezivanje, diferencijaciju i proliferaciju(59). Razmatranja za sintetisanje novih nosača su izuzetno kompleksna i uključuju sastav materijala, arhitekturu, strukturnu mehaniku, površinske osobine, brzinu degradacije, raspadne produkte kao i kompoziciju dodatih komponenti i naravno, promene svih ovih faktora tokom vremena. Od komponenti koje ulaze u sastav budućeg nosača zavise njegove osobine, arhitektura određuje veličinu pora i njihovu međusobnu povezanost, što je jedna od najvažnijih osobina. Da bi došlo do dobre vaskularizacije i nesmetanog protoka nutritivnih materija, kao i eliminacije razgradnih produkata, optimalna veličina pora bi trebalo da bude oko 300 nm, zatim, trebalo da imaju dobru interkonekciju i da procenat poroznosti materijala bude što veći. Kritični momenat je uskladiti ove zahteve sa dobrim mehaničkim osobinama. Osnovne biološke interakcije, kao što su vezivanje proteina i peptida, adhezija ćelija, njihova migracija i proliferacija, predstavljaju primarne funkcije površinskih osobina nosača, a brzina degradacije mora biti usklađena sa stvaranjem novog tkiva, pri čemu se mora voditi računa o biokompatibilnosti raspadnih produkata (24). Do sada su mnogobrojni materijali korišćeni kao ćelijski nosači pri tkivnom inženjerstvu koštanog tkiva, pri čemu se svi mogu podeliti u dve osnovne grupe: prirodni i veštački. Različiti biokeramički materijali su imali široku upotrebu u tkivnom inženjerstvu kosti. Oni se smatraju biokompatibilnim, tvrdim, krtim, sa relativno lošim osobinama pri istezanju, ali odličnom kompresivnom snagom, visokom otpornošću na trošenje. Hidroksiapatit se više od dve decenije koristi kao zamenik kosti zbog svojih pogodnih osobina i sličnosti sa neorganskom komponentom prirodne kosti. On je 126 osteokonduktivan, biokompatibilan, ima sporu resorpciju i pri visokoj poroznosti ima loše mehaničke osobine (100). Mnogi tipovi polimera koristili su se za tkivno inženjerstvo kosti, a jednostavno se mogu podeliti na prirodne i sintetičke. Prirodni materijali imaju potencijalnu prednost biološkog prepoznavanja što može pozitivno podržati ćelijsku adheziju i funkciju. Ipak, oni mogu dovesti do imune reakcije domaćina i mogu sadržavati patogene nečistoće. Takođe, kod njih se manje može uticati na mehaničke osobine i biorazgradljivost, a neki od njih nemaju veliku rasprostranjenost u prirodi, što ih čini dosta skupim. S druge strane sintetski polimeri imaju mogućnost široke proizvodnje, uz kontrolu mehaničkih osobina, stepena degradacije i mikrostrukture. Iako su mnogobrojni polimeri ispitivani u cilju njihove upotrebe u tkivnom inženjerstvu, ni jedan od njih ne ispunjava sve zahteve za ćelijskog nosača u inženjerstvu kosti, uglavnom zbog slabih mehaničkih osobina, koje potiču od visoke poroznosti, kao i brze resorpcione kinetike (101). Kompozitni ćelijski nosači predstavljaju najnoviji tip ćelijskih nosača. Kombinacija polimera i bioaktivne keramike predstavlja jednu vrstu kompozitnih ćelijskih nosača. Zbog svega ovoga mi smo se odlučili za ispitivanje poroznog hidroksiapatita kao i kompozitnih materijala i to poroznog hidroksiapatita u kombinaciji sa prirodnim polimerom polilaktidkoglikolidom - PLGA i sa metforminom kao aktivnom supstancom. Njihova kombinacija dovodi do poboljšanja mehaničkih osobina skafolda, a osnovni izazov pri njihovoj sintezi je postizanje dobrog hemijskog i/ili mehaničkog vezivanja hidroksiapatita i polimera. Mešavina ovih materijala pokazuje i bolje osteokonduktivne osobine od pojedinačnih sastojaka(102). Na ovaj način se u mnogome rešavaju i problemi povezani sa biokompatibilnošću polimera, koji uglavnom potiču od njihove brze degradacije i produkata razgradnje. Neorganski punioci hidroksiapatita koji se ugrađuju u brzo razgradljivi matriks polimera dovode do željenog nivoa degradacije i resorpcije nosača. Osobine kompozitnih nosača bi trebalo da budu dizajnirane tako da keramičke čestice budu ugrađene ne samo u unutrašnjosti već i na površini nosača, što poboljšava biološke osobine materijala. Takođe, produkti razgradnje hidrokisiapatita dovode do neutralizacije kiselih produkata razgradnje polimera, što opet dovodi do poboljšanog okruženja za ćelije, na koje pad pH nekada ima fatalan učinak(102). 127 Veliki izazov u nauci o materijalima i tehnologiji na području tkivnog inženjerstva je kontrola tačnosti i reproduktivnosti izrade skafolda zbog standardizacije procesa izrade. Razne tehnike izrade skafolda za procesiranje raznih polimernih i kompozitnih materijala i razvoj različitih mikrostruktura je sada veoma aktuelna tema istraživanja. Ipak još uvek i pored brojnih tehnika koje se primenjuju svaka od njih poseduje određene nedostatke sa stanovišta kontrole poroznosti skafolda, veličine pora i distribucije, kao i prisustva ostataka toksičnih rastvarača u skafoldu. Razumevanje mehanizma nukleacije pHAP-a u SBF je bitno za dublja istraživanja na ovom polju. Dalja unapređenja se mogu postići odabiranjem odgovarajućih polimera za funkcionalizaciju skafolda. Kao što je dobro poznato, karboksilne/hidroksilne grupe u PLGA lancima se ponašaju kao aktivni činioci u pokretanju nukleacije. Ove negativno naelektrisane grupe, u početnoj fazi nukleacije, privlače Ca2+ jone iz SBF koji se potom vezuju za površinu polimera. Slika 6.1.1. Strukturna formula PLGA U sledećem koraku, PO43- joni su privučeni pozitivno naelektrisanim Ca2+ jonima. Zbog toga proces nukleacije kalcijum fosfata započinje početnim vezivanjem Ca2+ jona za aktivnu grupu odgovarajućih polimera i naknadnim vezivanjem PO43- jona za Ca2+ jone. Kao što je već prikazano (103,104,105), koncentracija karboksilnih/hidroksilnih grupa na polimernoj površini skafolda (data preko gustine centara nukleacije) verovatno igra veoma bitnu ulogu u učestalosti i mehanizmu nukleacije kalcijum fosfata (106). Gustina mesta nukleacije može takođe uticati i na veličinu aglomerata i njihovu morfologiju. Rezultati prikazani u ovom radu jasno potvrđuju ovu pretpostavku. U slučaju PLGA, kao što je prikazano, uočen je relativno mali udeo spojenih čestica u procesu samoorganizovanja, što je verovatno uzrokovano značajno manjim udelom karboksilnih aktivnih grupa u PLGA. Veći aglomerati (neki i preko 8 µm) su posmatrani kada je korišćen PLGA, koji verovatno ima manji broj 128 nukleacionih prostora koji dalje stvaraju odgovarajući rast kalcijum-fosfatnih nukleusa i zrnaca. Rezultati ovog rada prikazuju samostalno sastavljen pHAP na površini PLGA tankog filma. Loptaste čestice pokazuju izuzetno razvijenu morfologiju sa strukturama nalik laticama na datoj površini. Veličina čestica se uglavno kreće od 2.5 do 3.5 µm. Slične vrednosti veličine čestica (prosečnog prečnika od 2.44 µm) su pokazane u nekim radovima posvećenim apatitnim biomimetskim strukturama koje su razvijene na PLGA skafoldu (69). Morfologija čestica izgleda veoma slična morfologiji dobijenoj u ovom radu, mada same slike su nedovoljno jasne i gustina naseljavanja je znatno manja nego u našim istraživanjima. Čak i kad je korišćen1.5xSBF ta gustina naseljavanja je bila neuporedivo manja nego u našim eksperimentima. Kod Que i saradnika (107) takođe je pokazano da pri korišćenju 1.5xSBF za apatitnu nukleaciju na PLGA, gustina naseljavanja je bila manja i proces nukleacije izgleda da je bio u svojoj početnoj fazi (veličina čestica je bila manja od pola mikrona za vreme nukleacije od 24 h.). Sve ovo ukazuje da, mada se u principu procesi u svim slučajevima odvijaju sličnim mehanizmima, brzina odvijanja procesa samoansembliranja biomimetskog karbonatnog hidroksiapatita u našim eksperimentima odvijala se neuporedivo većom brzinom, što ukazuuje da su naši uzorci bili savršeno dizajnirani i da su naši keramički nosači imali idealnu morfologiju povšine koja je uticala značajno i na sam način deponovanja hidroksiapatita i na aktivnost površine tako deponovonih tankih filmova, koji su saglasno svojoj maloj debljini zadržali morfologiju keramičkog nosača (skafolda). Dobijeni rezultat upućuje da je za očekivati i vrlo brz proces naseljavanja progenitorskih ćelija na površinama takvog skafolda i njihovu veoma brzu diferencijaciju u osteoblastne ćelije i brzu osteointegraciju koja sledi potom. Takav zaključak posebno je proveravan istraživanjima koja su izvedena na animalnom modelu kalvarije kunića. Samoorganizovane nanostrukture dobijene u ovoj studiji mogu igrati značajnu ulogu u razumevanju rasta ćelija na površini skafolda. Nekoliko studija koje se bave ponašanjem ćelija na apatitu formiranom na površini polimera potvrdjuju njegovu sposobnost da favorizuju osteoblastni rast ćelija (90, 108, 109, 110). Dalja istraživanja će se fokusirati na ponašanje ćelija na dobijenim strukturama koje su ovde opisane. Ovim radom je prikazan novi metod proizvodnje skafolda. Postignut je poboljšan nanostrukturni dizajn prethodno stvorenih pHAP skafolda uz pomoć 129 biomimetičkog tretmana u SBF. Da bi se unapredila nukleacija biomimetičke apatitne faze PLGA tanki filmovi su naneti na površinu skafolda pre uranjanja u SBF. Faza biometički nukleisana u SBF, po FTIR merenjima, je kalcium hidroksiapatit. To je verovatno karbonatni apatit, iako FTIR spektar ne daje dovoljno dokaza kojima bi se podržala ova pretpostavka, zato što su COO- grupe takođe prisutne u polimernim lancima. SEM mikrografije jasno pokazuju strukture slične biološkom apatitu u svim slučajevima(Slike 5.1.9.; 5.1.10.; 5.1.11.). Posebno dobar primer ovih struktura se može videti u slučaju PLGA substrata. Ova studija je pokazala kako dobiti strukture slične biološkom apatitu pomoću dodatnog nanodizajniranja poroznog pHAP skafolda biometičkim tretmanom. Dobijene struktutre oponašaju strukturu prirodne kosti i pogodne su za srastanje i rast ćelija, omogućavajući bržu regeneraciju kosti, kako je prikazano u nekim studijama(50). Ovaj mehanizam apatitne formacije in vitro je verovatno sličan mehanizmu nastajanja prirodnog koštang tkiva in vivo. Na taj način nanodizajniran skafold obezbeđuje uslove koji su slični fiziološkim za rast i proliferaciju ćelija. 6.2.DISKUSIJA TESTOVA INDIREKTNE I DIREKTNE CITOTOKSIČNOSTI ISPITIVANIH MATERIJALA In vitro ispitivanje citotoksičnosti biomaterijala je početni korak u svakom istraživanju biokompatibilnosti. U ovoj studiji, kompozitni materijali su ispitivani kroz kvalitativne i kvantitativne analize, pri indirektnom (MTT test) i direktnom (LDH test) kontaktu sa ćelijskom kulturom. Treba imati u vidu da ovi testovi ne daju biološku ocenu materijala već samo ocenu citotoksične aktivnosti(79). U suprotnom, medikamenti sa potvrđenom pozitivnom kliničkom upotrebom mogli bi biti pogrešno procenjeni. Ćelijske kulture kao biološki sistemi za testiranje našli su široku primenu u savremenim istraživanjima iz više razloga. Najznačajnija je mogućnost dobre reproduktibilnosti ispitivanja(79). Kontinuirane ćelijske linije, standardizovane i dostupne svim laboratorijama koje se bave ovim poslom, omogućavaju da se eksperiment pod istovetnim uslovima više puta ponovi, a dobijeni rezultati se mogu uporediti sa istraživanjima drugih istraživača ili laboratorija koje su primenile istu metodologiju. Kontinuirane ćelijske linije predstavljaju proste ponavljajuće sisteme bez 130 specifičnih metaboličkih aktivnosti koje imaju ciljne ćelije in vivo. Upravo zbog toga, one se mogu smatrati kao konstanta unutar odredjenog sistema ispitivanja, pa je time i smanjen broj varijabilnih parametara koji utiču na ispitivani materijal, čime se fokusira isključivo na efekat materijala. Uslove kakvi postoje in vivo bolje simuliraju primarne ćelijske kulture, čije specifične metaboličke aktivnosti odgovaraju onima koje poseduju ciljne ćelije. Za njihovo kultivisanje potrebna je duža i nestandardna procedura koju ne mogu ispoštovati sve laboratorije. Zbog toga u standardnim tehnikama ISO metodologija preporučuju se kontinuirane ćelijske linije. Osim toga, određena istraživanja pokazala su da u osnovnim karakteristikama nema bitnijih razlika kod ocene glavnih demonstriranih efekata poredeći oba tipa ćelijskih kultura. Nepostojanje razlika evidentnije je ukoliko je citotoksičan efekat jače izražen (111). Kontinuirane ćelijske linije - potiču iz kolekcije tipa-kulture (L-929, 3T3 mišji fibroblasti), humani diploidni fibroblasti Wl-38, humane epitelne ćelije (He-La), ili primarne ćelije, uglavnom gingive, mukoze i pulpnih fibroblasta. Preporučuje se da se sam tok istraživanja uvek sprovede kroz ispitivanja serije srodnih materijala za koje su rezultati ispitivanja već poznati, a da se evaluacija citotoksičnosti prezentira kroz podatke dobijene rangiranjem u odnosu na njih (112). U ovom istraživanju korišćene su kontinuirane ćelijske kulture fibroblasta miša L929 (NCTC clone). 6.2.1.Diskusija indirektnog kontakta ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom Pri ispitivanju indirektnog kontakta materijala sa ćelijskom kulturom vršena je kvantitativna evaluacija dobijenih rezultata uz pomoć MTT testa, uz korišćenje ekstrakta ispitivanih materijala. MTT test je standardni test koji se široko koristi prilikom ispitivanja citotoksičnosti hidroksiapatita i njegovih kombinacija sa različitim polimerima. On omogućava indirektnu ocenu ćelijskog rasta i proliferacije pošto mitohondrije živih ćelija oksidiraju MTT rastvor, dajući karakteristično plavo ljubičasto prebojene krajnje produkte. Ovim testom se odredjuje broj vijabilnih ćelija u odnosu na kontrolnu grupu, koja pokazuje 100% preživljavanja ćelija. Pozitivnu kontrolu predstavljao je 4% fenol, koji je doveo do preživljavanja nešto više od 30% ćelija u kulturi, što je visoko statistički značajna razlika (p<0.005) u odnosu na negativnu kontrolu. 131 U ovom istraživanju broj vijabilnih ćelija L929 fibroblasta eksponencijalno se smanjuje pri njihovom izlaganju produktima degradacije ispitivanih materijala u vremenskom periodu od 24h, 48h i 72h, odnosno citotoksičnost se povećava sa povećanjem vremena u kome su ćelije izložene ekstraktima ispitivanih materijala. U slučaju ispitivanja indirektne citotoksičnosti pHAP-a i pHAP-a u kombinaciji sa PLGA, dobijeni rezultati pokazuju da nema velike razlike u preživljavanju ćelija u zavisnosti od dužine ekstrahovanja ispitivanih materijala u hranljivoj podlozi. Sa povećanjem vremenskog perioda izlaganja ćelija fibroblasta L929 ekstraktima različitih koncentracija dolazi do eksponencijalnog smanjenja broja vijabilnih ćelija u kulturi. U slučaju pHAP-a u kombinaciji sa metforminom pokazuje izrazitu citotoksičnost u niskim koncentracijama (do 10mg/ml) bez obzira na vremenski period izloženosti hranljive podloge ovom materijalu. Nakon toga dolazi do oporavka i čak porasta broja ćelijske populacije fibroblasta L929 , da bi pri koncentracijama većim od 60 mg/ml došlo do pojave ravnomernog povećanja citotoksičnosti sa porastom koncentracije produkata degradacije, kao kod ostalih ispitivanih materijala. Ni jedan od ispitivanih materijala( pHAP , pHAP + PLGA i pHAP sa metforminom) nije doveo do kompletnog citotoksičnog efekta na kulturu fibroblasta L929. Indirektnim kontaktom i MTT testom prikazan je kratkotrajni efekat razgradnih produkata ispitivanih materijala na ćelijsku kulturu, posle izvršenog ekstrahovanja datih materijala u hranljivom medijumu. Razlike u citotoksičnosti testiranih materijala mogu biti objašnjene termalnim degradacijama polimernih lanaca koji su se pojavili tokom proizvodnje kompozitnih jedinjenja (113). Tokom proizvodnje kompozitnih materijala u odnosu na proizvodnju čistog polimera u samom materijalu dolazi do stvaranja fragmenata niske molekularne mase. Ovi fragmenti lako prelaze u rastvor tokom preparacije ekstrakta za ispitivanja, i samim tim se u rastvoru povećava koncentracija produkata razgradnje kod kompozitnih materijala. Ovaj viši nivo degradacije može objasniti postignuti citotoksični efekat polikoglikolida u kompozitnom jedinjenju sa hidroksiapatitom (113). Nikolić i sar. (79), dobili su statistički značajan citotoksičan efekat pri ispitivanju indirektne citotoksičnosti pHAP u kombinaciji sa PLGA, što su objasnili prethodno navedenom činjenicom. Međutim, Douglas i sar. (101) u svom istraživanju gde su ispitivali dejstvo PHAP i PLGA na ćelijsku kulturu humanih osteoblasta nisu dobili statistički značajnu razliku u odnosu na kontrolnu grupu MTT 132 testom, što se poklapa sa rezultatima ovog istraživanja. Autori su ekstrahovanje ispivanog materijala vršili u različitim vremenskim periodima od 10 minuta do 24 časa i došli do zaključka da je najveći broj citotoksičnih supstanci oslobođeno u prvih 10 minuta ekstrahovanja. Ovo govori da se nimalo ili vrlo mala količina toksičnih materijala oslobodila u vremenskom periodu izmedju 10 minuta i 24 časa. Na ovaj način se mogu objasniti i rezultati koji su dobijeni ovim istraživanjem, s obzirom na činjenicu da je preživljavanje ćelija fibroblasta L929 bilo slično bez obzira na dužinu ekstrahovanja materijala u hranljivoj podlozi. Pri prvom kontaktu materijala sa hranljivom podlogom rastvaraju se degradacioni produkti koji su nastali u postupku izrade kompozitnih jedinjenja, što se dešava u prvih sat vremena ekstrahovanja. Dalje izlaganje hranljive podloge ispitivanim materijalima neće dovesti do daljeg rastvaranja materijala, pa se ni dobijeni rezultati ne razlikuju vezano za različita vremena ekstrakcije. Sasvim su drugačiji rezultati testa indirektne citotoksičnosti kada je u pitanju pHAP u kombinaciji sa metforminom. Rezultati pokazuju izrazitu citotoksičnost u niskim koncentracijama (do 10mg/ml) bez obzira na vremenski period izloženosti hranljive podloge ovom materijalu. Nakon toga dolazi do oporavka i čak porasta broja ćelijske populacije fibroblasta L929 , da bi pri koncentracijama većim od 60 mg/ml došlo do pojave ravnomernog povećanja citotoksičnosti sa porastom koncentracije produkata degradacije, kao kod ostalih ispitivanih materijala. 6.2.2.Diskusija direktnog kontakta ispitivanih materijala sa ćelijskom kulturom Pri ispitivanju direktnog kontakta materijala sa ćelijskom kulturom koristi se LDH test citotoksičnosti u kome se preživljavanje, odnosno vijabilnost ćelija procenjuje na osnovu procenta LDH (laktat dehidrogenaze) koji se nađe u ekstraćelijskoj sredini. Laktat dehidrogenaza se kvantifikuje u cilju izračunavanja broja ćelija adheriranih na površinu materijala. Ovaj citolitički enzim se godinama koristio za merenje gubitka integriteta ćelijske membrane(114,115). Indirektno merenje aktivnosti LDH, koja je prisutna u citoplazmi intaktnih ćelija, može se izvršiti samo ako se izvrši liza ćelija. S obzirom da je dokazano da je LDH aktivnost direktno proporcionalna broju ćelija(116), razvijena je nova eksperimentalna procedura koja koristi merenje aktivnosti jednog enzima u cilju kvantifikacije adheriranja ćelija na ispitivani materijal(113). 133 Rezultati su pokazali značajnu ćelijsku proliferaciju i adheziju u prisustvu svih ispitivanih materijala. U ovom eksperimentu, pHAP, pHAP sa PLGA i pHAP sa metforminom nisu pokazali citotoksičnost u direktnom kontaktu sa ćelijskim kulturom fibroblasta L929. Prvog dana eksperimenta, broj ćelija u prisustvu svakog od ispitivanih materijala nije se značajno uvećao. Od drugog dana eksperimenta ćelije su se umnožavale i njihov broj je eksponencijalno rastao. Na kraju eksperimenta, sedmog dana, ćelije fibroblasta L929 su bile u bliskom kontaktu sa svakim od ispitivanih materijala u velikom broju i neizmenjene morfologije. Adhezija ćelija i proliferacija različitih tipova ćelija na različite površine zavisi od karakteristika površina samih polimera u kompozitnim ćelijskim nosačima kao što su stepen hidratacije(117,118), površinski napon (119), površinsko naelektrisanje i topografija(120). Ćelijska adhezija je bolja ukoliko je površina hidrofilnija što omogućava adsorpciju površinskih proteina nestabilnim i reverzibilnim vezama(117). Umeren stepen hidratacije substrata omogućava ćelijama da deponuju svoje proteine za adheziju menjajući ih za proteine koji se mnogo bolje vezuju. Veruje se da je ovaj mehanizam sporiji na ekstremno hidrofobnim ili hidrofilnim površinama, što je verovatno jedan od glavnih razloga zbog kojih ćelije ne proliferišu i ne adheriraju na njima(121). U ovom istraživanju svi ispitivani materijali nisu pokazali razlike u ćelijskoj adheziji, što govori da su svi faktori koji utiču na proces adhezije i proliferacije ćelija za ispitivane materijale slični. Takođe i drugi faktori mogu uticati na ćelijsku adheziju. Hemijske karakteristike, kao što su prisustvo karboksilnih(122) i hidroksilnih(123) grupa, mogu biti važne u zavisnosti od vrste ćelija, za adheziju ćelija i za njihov rast. Curtis i sar. (30) našli su da je prisustvo velikog broja hidroksilnih grupa ima suprotan efekat. Ova istraživanja pokazuju da je potreba za optimalnom gustinom hidroksilnih grupa potrebna da bi se postigla dobra ćelijska adhezija. Topografija materijala takođe je veoma bitna kad se diskutuje o ćelijskoj adheziji. Studije koje se odnose na morfologiju površine biomaterijala pokazale su postojanje afiniteta različitih tipova ćelija za hrapave površine materijala(124). Rezultati eksperimenata ovog rada, kao i karakterizacija ispitivanih materijala pokazuje da su površine pHAP, pHAP sa PLGA kao i pHAP sa metforminom pogodne za adheriranje ćelija i za njihovu proliferaciju i da se odlikuju karakteristikama koje omogućavaju rast ćelija u direktnom kontaktu sa ovim materijalima. I pored dokazane citotoksičnosti u 134 testu indirektnog kontakta, već je napomenuto da više faktora utiče na adheziju i proliferaciju ćelija, tako da sa stanovišta nauke o materijalima to nije presudno za ponašanje ćelija u direktnom kontaktu sa ispitivanim materijalima, što je slučaj i u ovom radu. 6.3.DISKUSIJA TESTA IRITACIJE Cilj testa primarne kutane iritacije je bio da odredi iritativne osobine pHAPa u kombinaciji sa razlicitim polimerima u toku njegove jednokratne primene na intaktnu kožu kunića. Testovi iritacije su jedan od međunarodno standardizovanih načina da se utvrdi lokalni iritirajući potencijal medicinske opreme, materijala ili ekstrakata, koristeći mesta kao sto su koža i mukozne membrane, najčešće u animalnim modelima. Po preporukama ISO 10993-10 u metodama rada kao eksperimentalne životinje korišćeni su kunići, soja Novozelandski beli, zbog izuzetno osetljive i svetle kože na kojoj se lako uočavaju sve nastale promene. Svi kunići preživeli su celokupno trajanje istraživanja. Za vreme trajanja istraživanja kunići su izgledali zdravi i aktivni. Nije bilo znakova trovanja, neželjenih farmakoloških efekata ili neuobičajenog ponašanja kunića. Indeks primarne kutane iritacije kod kunića sa svim testiranim materijalima i negativnom kontrolom je iznosio nula, Indeks primarne kutane iritacije kod kunića u grupi pozitivna kontrole, na kraju istraživanja (72 sata nakon aplikacije) imali su vrednost 2.11. U ovoj grupi životinja učestalost i težina iritacije smanjivala se sa vremenom. Nakon sedam dana od primene supstance (mlečne kiseline 98%) i u ovoj grupi ispitivanih životinja više nije bilo znakova iritacije kože. U ovim istraživanjima biokompatibilnosti pozitivne i negativne kontrolne grupe su neophodne da bi potvrdile adekvatno izvođenje test procedure ili da bi se u odnosu na njih adekvatno procenjivali rezultati. Svi uzorci materijala su ispitivani u obliku paste. Sve oblasti kože kunića pokazale su iste osobine, bez reakcije crvenila (eritem) i bez edema, što u ovom testu ukazuje da nema rastvorljivog štetnog sadržaja koji se otpušta iz materijala i natapa ćelije kože. Indeks primarne kutane iritacije iznosio je 0.0. Na osnovu ovih rezultata zaključeno je da kompozitni ćelijski nosači nisu ispoljili iritirajući efekat. Nakon in vivo 135 ispitivanja u testu primarne kutane iritacije može se zaključiti da ispitivani materijali u obliku paste mogu biti u kontaktu sa kožom bez efekta iritiranja kože. 6.4.DISKUSIJA TESTA BIOFUNKCIONALNOSTI NA ANIMALNOM MODELU Ispitivanje biofunkcionalnosti nekog materijala i njegovog osteoinduktivnog i osteokonduktivnog efekta vrši se na predkliničkom animalnom modelu, koji je jednostavan, lak za izvođenje i koji dozvoljava poređenje različitih osteopromotivnih materijala(125). Istraživanjima je potvrđeno da je predklinički model u kome se koriste životinje , kao što su pacovi i kunići, esencijalan u razvoju i ocenjivanju novih zamenika kosti. Testovi na životinjama za materijale koji će se koristiti u tkivnom inženjerstvu moraju se sagledati sa sledećih aspekata: izbor defekta, izbor životinje, starost životinje, anatomsko mesto i veličina lezije(126). Koštani defekti kritične veličine predstavljaju aktivan model za studiju zarastanja kosti, s obzirom da, po definiciji, ne zarastaju bez intervencije(127,128). Dobro dokumentovani dokazi jasno potvrđuju da, ukoliko se defekti kosti kritične veličine ostave ne tretirani, oni neće spontano zarasti, odnosto kost se neće spontano regenerisati(129). Na osnovu ovoga zaključuje se da različiti biomaterijali mogu biti ocenjivani kao tretmani izbora sa ciljem da se ustanovi da li mogu da postignu regeneraciju. Regeneracija defekata kritične veličine proučavana je kod kalvarija hrčaka, na femuru, tibiji, mandibuli i kalvariji pacova, na femoralnim kondilima, tibiji, radijusu i kalvariji kunića, kao i na metatarzusu ovaca i ilijačnoj kosti koza. Defekti na kalvariji kunića pune debljine, veličine 6 mm, koji su korišćeni u ovom eksperimentu, ispunjavali su kriterijume za koštane defekte kritične veličine (125,130,131,132,133,134,135). Model defekata kritične veličine u predelu kalvarije kunića uzet je iz sledećih razloga: prvo, zbog slabe vaskularizacije tog predela; drugo, zbog slabe razvijenosti mišića; treće, zbog slabo prisutne koštane srži kao potencijalnog izvora matičnih ćelija i četvrto zbog kvaliteta kosti koji je sličan karakteristikama kostiju kranio-maksilofacijalne regije(136). Sve to, ovaj model čini relevantnim i pouzdanim za testiranje koštanih zamenika(137). Sve životinje su dobro podnele hiruršku proceduru i bile su sposobne da se hrane dan posle hirurške intervencije. 136 Analiza nalaza sugeriše da je ispitivanje modela sa defektom kritične veličine na kalvariji kunića sa niskim morbiditetom. U ovoj studiji korišćen je disocijativni oblik anestezije zbog nemogućnosti intubiranja kunića i samim tim nemogućnosti sprovođenja inhalacione anestezije, kako zbog anatomskih specifičnosti respiratornih puteva, tako i zbog velikog stresnog faktora koji eksperiment proizvodi kod ovih životinja(97). Operativna procedura formiranja polumesečaste incizije i podizanje kutanog flapa na vrhu kalvarije kunića radi eksponiranja kranijalne kosti i formiranja defekta u skladu je sa već objavljenim studijama(138,139). Transosealni defekti u kosti lobanje prečnika 6mm pravljeni su posebnim trepan borerima, a vodilo se računa da ne dođe do povrede tvrde ovojnice mozga(dure mater)(130). Ovaj eksperimenatlni pretklinički model na životinjama omogućava takozvani dizajn u paru, pri čemu se na obe strane sagitalne linije kosti lobanje prave defekti(140). Ripamonti i sar. (98) koristili su sličan model formiranja defekta kosti pune debljine sa obe strane kalvarije, i to kod majmuna. Korišćen je dizajn oblika kvadrata (Latin blok square design) radi postavljanja materijala u defekte, a sastojao se u rotacionoj dodeli materijala defektima, čime se balansirano distribuira svaki materijal i u anteriornu i u posteriornu regiju kalvarije (Statistical Analysis System, 1989)(98). Kao negativna kontrola korišćen je prazan defekt koji se spontano ispunjavaju krvlju(141), a kao pozitivna kontrola BioOss (Bio OssR, cancellous 0.25 - 1,0mm veličine, Geistlich AG, Wolhusen, Switzerland). Posle postavljanja materijala, defekti i materijal prekriveni su periostom i kožom. Periost je očuvan radi boljeg urastanja i vaskularizacije. U ovoj studiji korišćena je modifikovana metodologija po Hammerleu i sar. (141), tako što nije korišćena membrana za prekrivanje postavljenih materijala pre repozicije flapa. Nakon perioda ocenjivanja i po žrtvovanju životinja, kosti lobanje su podvrgnute metodologiji histološke pripreme nedekalcifikovanih uzoraka. Prilikom zarastanja kosti i nakon implantacije materijala sledi niz događaja. Inicijalno kao odgovor na povredu dolazi do osteoindukcije, tako što se iniciraju različiti tipovi preživelih ćelija(142). Na mesto povrede prodiru mezenhimalne stem ćelije poreklom iz kambijalnog sloja periosta i iz koštane srži (13), koje premošćuju pukotinu, umnožavaju se i diferenciraju u preosteoblaste kao odgovor na prisustvo 137 faktora rasta i citokina iz trombocita, susednih ćelija i tkiva. Preosteoblasti se vremenom diferencireju u osteocite. Diferencirane koštane ćelije sada su odgovorne za rast kosti na površini poznatoj kao osteokonduktivna površina i proces se naziva osteokonduktivni proces. To znači da osteokondukcija zavisi od osteoindukcije i definisana je kao proces urastanja kapilara, perivaskularnog tkiva i osteoprogenitor ćelija iz površine kosti u strukturu koštanog grafta(143). Ipak osteokondukcija se razlikuje između biomaterijala zato što nije samo kost odgovorna za rast kosti na površini defekta nego i implantirani materijal(144). Rezultatima merenja veličine defekta utvrđeno je da postoji statistički značajna razlika između 5 ispitivanih grupa po veličini defekta. Pokazalo su da je najmanja prosečna vrednost defekta u grupi pHAP u kombinaciji sa PLGA (3,9mm) ali je i najveći varijabilitet bio u pomenutoj grupi, odnosno raspon vrednosti je daleko veći od ostalih grupa. Uporedjujući pHAP sa PLGA sa pozitivnom kontrolom gde je bio postavljen BioOss, koji se koristi kao zlatni standard, utvrđeno je da je veličina defekta bila manja u grupi koja sadrži pHAP sa PLGA, ali bez statistički značajne razlike između ove dve grupe, što se slaže sa nalazima drugih autora(145). Objašnjenje se može tražiti u malom broju uzoraka ili u kratkom periodu ocenjivanja nedovoljnom da se u potpuosti reparira defekt u kosti. U nekim grupama uočene su izuzetno visoke i niske vrednosti za ispunjenost koštanog defekta što je rezultiralo velikom standardnom devijacijom, što takođe govori o potrebi za većim uzorkom. Odabrani broj uzoraka i dužina perioda ocenjivanja u ovoj studiji zasnovani su na iskustvima prethodnih studija. Ne treba zaboraviti da se eksperimenti na životinjama moraju koristiti u skladu sa etičkim principima i dobrom istraživačkom praksom, koji takođe određuju broj životinja koje se mogu koristiti u istraživanju. Analizirana je i veličina defekta u grupi implantiranih materijala čistog pHAP-a sa pHAP-om i PLGA. Na slici 5.4.1. gde je preparat sa implantiranim materijalom pHAP + PLGA, jasno se uočava novostvorena kost lamelarne građe koja je svojim većim delom mineralizovana. Sa druge strane čist pHAP, koji je prikazan na slici 5.4.2., pokazuje još uvek prisutan defekt uz prisustvo granulacionog tkiva sa elementima nespecifičnog zapaljenja. Utvrdjeno je da postoji statistički značajna razlika kod ove dve grupe materijala, odnosno da je pHAP sa PLGA pokazao manju prosečnu veličinu defekta u odnosu na čist pHAP. Ovakav rezultat je potvrđen i u ispitivanjima kod drugih autora i ukazuje da kombinacija poroznog 138 hidroksiapatita sa polimerom PLGA poseduje bolje osteokonduktivne osobine(102). Ova studija je pokazala da je prisustvo nespecifičnog zapaljenja u defektima najčešće registrovano u negativnoj kontrolnoj grupi(prazne rupe) i u grupi gde je bio implantiran pHAP sa metforminom. Prisustvo nespecifičnog zapaljenja u preparatu ukazuje na produžen period stvaranja koštanog tkiva ili čak na nemogućnost stvaranja kosti. U prisustvu partikula BioOss-a koje se još nisu resorbovale, što se vidi na slici 5.4.3., formirano je granulaciono tkivo uz postojanje jako izražene limfocitne infiltracije. U defektma gde su bili implantirani čist pHAP i pHAP sa PLGA limfocitna infiltracija je bila manje izražena(slika 5.4.4.). Samostalno pHAP i pHAP u kombinaciji sa PLGA pokazali su najmanje prisustvo znakova zapaljenja, ali bez statistički značajne razlike u odnosu na BioOss. Istraživanjem je bilo obuhvaćeno i prisustvo džinovskih ćelija u defektima ispunjenim ispitivanim materijalom. Postojanje džinovskih ćelija u materijalu ukazuje na reakciju tkiva na partikule ispitivanog materijala kao na prisustvo stranog tela. Zadatak ove vrste ćelija je da ukloni ostatke materijala iz tkiva. Rezultati su pokazali da je ta vrsta ćelija najčešće nađena u negativnoj kontrolnoj grupi, u 75% slučajeva, i u grupi gde je implantiran pHAP sa metforminom, u 45% slučajeva. U odnosu na ostale ispitivane materijale prisutna je statistički značajna razlika. Takođe, upoređujući prisustvo ovih ćelija kod BioOss-a i pHAP-a sa PLGA nađena je statistički značajna razlika, pošto je u defektima gde je bio postavljen kompozitni materijal pHAP sa PLGA bilo najmanje džinovskih ćelija. Na slici 5.4.5. gde je prikazan preparat sa implantiranim BioOss-om, jasno se uočava novostvorena lamelarna kost, ali i ostatak partikula materijala okružen višejedarnim džinovskim ćelijama. Resorpcija pHAP sa PLGA bila je brža u odnosu na BioOss, što je jedan od osnovnih zadataka neophodnih za izradu ćelijskih nosača, tako da su se džinovke ćelije u preparatima koji su sadržali pHAP sa PLGA retko nalazile. Postojanje novostvorene kosti registrovano je u svim slučajevima gde je implantiran pHAP, pHAP u kombinaciji sa PLGA i BioOss. Procenat mineralizacije je bio najveći kod kompozitnog materijala pHAP sa PLGA(66,7%). U odnosu na BioOss i na čist pHAP nađena je statistički značajna razlika. Novostvorena kost u preparatima sa pHAP i PLGA pokazivala je dobru lamelarnu građu, sa jasno usmerenim osteocitima i dominantno izraženom mineralizacijom(slika 5.4.9.). Implantirani čist pHAP (slika 139 5.4.7.) takođe je pokazao postojanje novostvorene kosti, ali je kost bila nepravilne građe, sa iregularnim zonama mineralizacije u gredicama, sa dominantnim prisustvom organskog nemineralizovanog matriksa i sa prisutnim partikulama materijala. Ovaj nalaz ukazuje na to da kompozitni ćelijski nosač pHAP koji u sebi sadrži polimer PLGA poseduje bolju osteokonduktivnost u odnosu na porozni hidroksiapatit samostalno. Na preparatima koji su sadržali BioOss (slika 5.4.8.), vidljive su novostvorene koštane gredice koje u iregularnom aranžmanu popunjavaju defekt, dok je u gredicama prisutna približno jednaka količina nemineralizovanog i mineralizovanog osteoida uz prisustvo partikul amaterijala, koje su se retko uočavale u preparatima pHAP-a sa PLGA. Sve to ukazuje da je ostekonduktivnost ispitivanog pHAP-a sa PLGA bila bolja u odnosu na pozitivnu probu koju je predstavljao BioOss. Najmanje novostvorene kosti i najmanji procenat mineralizacije registrovan je u negativnoj kontrolnoj grupi i kod pHAP-a sa metforminom. Takođe je nađeno da postoji statistički značajna razlika u postojanju vezivnog tkiva između pozitivne kontrole, BioOss-a sa jedne strane i pHAP-a sa PLGA i čistog pHAP-a sa druge strane. U 75% slučajeva vezivno tkivo je otkriveno u defektima ispunjenih BioOss-om dok je u 25% slučajeva bilo u defektima sa pHAP+PLGA. U odnosu na prisustvo vezivnog tkiva, statistička razlika između pHAP-a i pHAP-a sa PLGA nije pronađena. Prisustvo vezivnog tkiva je obrnuto proporcionalno postojanju koštanog tkiva i može se reći da prethodi njegovom stvaranju. Iz ovog rezultata očigledno je da je stvaranje kosti kod kompozitnog ćelijskog nosača pHAP sa PLGA pa čak i kod poroznog hidroksiapatita samostalno implantiranog, bilo brže nego kod standardnog materijala koji je korišćen u ovoj studiji BioOss-a. Analizom postojanja novostvorenih krvnih sudova i bazofila izmedju ispitivanih grupa, statistička razlika nije nađena. Prisustvo neoangiogeneze ukazivalo je na sporije stvaranje koštanog tkiva. PHAP sa PLGA je, s obzirom na brže stvaranje koštanog tkiva u odnosu na druge ispitivane materijale pokazao postojanje manjeg broja krvnih sudova, ali bez statistički značajne razlike. Može se zaključiti da je porozni hidroksiapatit, kao zamenik kosti, imao pozitivan uticaj na novo formiranje kosti. Još jednom je potvrđena biokompatibilnost kalcijum hidroksiapatita kao i njegov osteokonduktivan potencijal. Takođe nanostrukturne čestice hidroksiapatita pokazale su veći stepen bioaktivnosti i 140 osteointegracije u odnosu na mikrostrukturni hidrokisapatit(146). Utvrđeno je da je adsorpcija proteina i adhezija ćelija veća u slučajevima kad se koriste nanostrukturne nego mikrostrukturne granule hidroksiapatita(147). Iz drugih istraživanja, poznato je da nanosturkturne čestice hidroksiapatita imaju pozitivan uticaj na formiranje kosti tako što stimulišu osteogenu diferencijaciju iz mezenhimalnih stem ćelija. Takođe je pokazano da ovaj pozitivan efekat zavisi od koncentracije nanočestica hidroksiapatita, i da ove čestice u velikim koncentracijama dovode čak do suprotnog efekta na osteogenu diferencijaciju matičnih ćelija(148). Prema tome, samo prisustvo nanočestica hidroksiapatita kao zamenika kosti nije dovoljna garancija postojanja pozitivnog biloškog efekta. Međutim, nanokompozitni materijal koji se sastoji od nanočestica hidroksiapatita i polimera PLGA ima karakteristike potrebnog skafolda. Na najvažniji faktor jednog nanokompozitnog ćelijskog nosača, stepen degradacije, utiču (90): nanostruktura (oblik, dimenzija, funkcionalizacija, sastav), karakteristike polimera (molekularna težina , kristaliničnost), površinske karakteristike (poroznost, hidrofilnost), obrada (morfologija, povezanost komponenti, veličina pora). Stepen degradacije, sa druge strane utiče na: biokompatibilnost, ćelijski odgovor, funkcionalnost materijala, obrazac otpuštanja aktivnih supstanci. Porozni hidroksiapatit koji se kao skafold implantirao u kalvariju kunića kao nanokompozitni materijal u kombinaciji sa PLGA pokazao je statistički značajnu razliku u smanjenju defekata kritične veličine u odnosu na čist pHAP. Istraživanja Kima i sar.(145), koja se poklapaju sa rezultatima ove studije, pokazuju da hidroksiapatit presvučen polimerom PLGA pravi površinsku strukturu granula obloženog apatita PLGA/pHAP koje omogućavaju stvaranje veće površine za kontakt sa osteogenim ćelijama. Površinske karakteristike nanokompozitnog skafolda ključni su faktor u uspešnom vođenju tkivnog inženjerstva, s obzirom da je prva interakcija između ćelija i supstrata adsorpcija proteina i ćelijska adhezija(149). Većina sintetičkih hidroksiapatita tokom raznih faza sinteze dobijaju specifičnu površinu od oko 2m2/g, čime se smanjuju mikropore(150) i osteokonduktivnost(151). BioOssR poseduje površinu od 79,7m2/g dok pHAP sa polimerom sadrži specifičnu površinu od oko 84m2/g(152). Povećanjem specifične površine materijala, povećava se površina koja je u kontaktu sa ćelijama, a s obzirom da se specifična površina ova dva materijala neznatno razlikuje, to može biti jedan od razloga sličnih rezultata koje su u ovom radu pokazala ova dva materijala, što 141 je potvrđeno i kod drugih autora(52,137,152). Osim toga pHAP se u in vivo uslovim sporo razgrađuje, a nepotpuno razgrađene čestice pHAP mogu ugroziti ili onemogućiti potpuno koštano zarastanje(153). Iz tog razloga pHAP samostalno daje lošije rezultate u smanjenju veličine defekta nego kada je u kombinaciji sa PLGA. Naravno, u zavisnosti od udela komponenti u PLGA, brzina degradacija polimera može se modelovati, što takođe predstavlja prednost ovog kompozitnog materijala. Karakteristike degradacije skafolda su ključne u izboru bionanokompozita i njegovog dizajna za tkivno inženjerstvo kosti(100,154,155,156). Iz tog razloga polimerni nanokompozitni skafold mora imati odgovarajući dizajn i ispunjavati određene kriterijume, koji uključuju biokompatibilnost, specifičnu biodegradibilnost, mehaničke karakteristike i u nekim slučajevima da ispunjavaju estetske zahteve(90). Biomaterijal ne sme samo stimulisati i podržavati rast tkiva u defektu, već u isto vreme mora da se odgovarajućom brzinom razgrađuje u netoksične sastojke , kako se stvara novo tkivo. U tom pogledu pHAP sa PLGA pokazao je dobre karakteristike u ovom istraživanju, što je potvrđeno i od strane drugih autora(145,146). Upoređujući sa deproteinizovanom bovinom kosti (BioOssR), apatitno obložene granule pHAP-a sa PLGA imaju nekoliko prednosti. Prvo, granule pHAP u kombinaciji sa PLGA su sintetičkog porekla i ne postoji rizik od prenosa zaraznih bolesti i izazivanja reakcija imunog sistema. Drugo, apatitno obložene granule se jednostavno proizvode u velikim količinama. Treće, fizičke karakteristike i stepen degradacije pHAP-a sa PLGA se takođe jednostavno reguliše odnosom komponenti laktida i glikolida u polimeru, čime se može uticati na osobine materijala u zavisnosti od kliničkih zahteva. Površina pHAP sa PLGA je bila obložena apatitom kao kod prirodne kosti inkubacijom u SBF. I pored toga što je sintetički kalcijum fosfat bioaktivan, njegova sličnost sa mineralima prirodne kosti je generalno slaba i njegove biloške karakteristike su daleko od one koju poseduje prirodna kost. Hidroksiapatit generisan tokom inkubacije u SBF je vrlo sličan nativnoj kosti, i zbog toga može da obezbedi bolju osteokonduktivnu sredinu za formiranje koštanog tkiva nego sintetički hidroksiapatit(69,155). Kompozitni materijal pHAP sa PLGA pokazao je zadovoljavajuću regeneraciju kosti in vivo u poređenju sa komercijalno dostupnim i široko prihvaćenim ksenogenim materijalom za graftovanje, BioOss-omR. BioOssR ima 142 minerale prirodne kosti na svojoj površini, s obzirom da se radi o deproteinizovanoj kosti, i visoko je porozan. Zahvaljujući tome, minerali kosti koji se nalaze na površini stimulišu formiranje kosti na implantiranom materijalu i omogućavaju visoku ostekondukciju(156). Na sličan način apatitno obložene granule pHAP sa PLGA na svojoj površini stimulišu stvaranje kosti i omogućavaju visoku osteokondukciju(145). Smatra se da je direktan kontakt sa osteogenim ćelijama koje migriraju iz okolnog tkiva odgovoran za ubrzanje stvaranja koštanog tkiva na površini granula pHAP sa PLGA. Iz svega gore navedenog, može se reći da pHAP sa PLGA može da se razmatra kao moguća alternativa za BioOss. Ono što je bio i cilj ovog rada, pokazalo se da pHAP sa PLGA može da se koristi u daljim istraživanjima kao ćelijski nosač, koji bi u kombinaciji sa osteogenim ili stem ćelijama uz prisustvo osteoinduktivnih supstanci učestvovao u tkivnom inženjerstvu kosti. Dalja istraživanja u većim serijama u in vivo uslovima trebalo bi da utvrde mogućnost primene ovog materijala u terapeutske svrhe. 143 7.ZAKLJUČAK Na osnovu uporednog ispitivanja poroznog kalcijum hidroksiapatita, poroznog kalcijum hidroksiapatita u kombinaciji sa polilaktidkoglikolidom i poroznog kalcijum hidroksiapatita u kombinaciji sa metforminom, iz dobijenih rezultata može se zaključiti sledeće: 1. Struktura nanodizajniranog poroznog hidroksiapatita dobijenog modifikovanom hidrotermalnom metodom, bila je slična strukturi prirodne kosti. Kompozitni ćelijski nosač sintetisan na bazi ovakvog poroznog hidroksiapatita koji u sebi sadrži i PLGA, takođe poseduje nanostrukturu koja je po karakteristikama slična strukturi prirodne kosti. 2. Ispitivani materijali pokazali su citotoksičan efekat na ćelijsku kulturu fibroblasta L929, ali ni jedan od ispitivanih materijala( pHAP , pHAP + PLGA i pHAP sa metforminom) nije doveo do kompletnog citotoksičnog efekta na kulturu fibroblasta L929. 3. Rezultati eksperimenta ovog rada, kao i karakterizacija ispitivanih materijala pokazuje da su površine pHAP, pHAP sa PLGA kao i pHAP sa metforminom pogodne za adheriranje ćelija i za njihovu proliferaciju i da se odlikuju karakteristikama koje omogućavaju rast ćelija u direktnom kontaktu sa ovim materijalima. 4. U testu primarne kutane iritacije ni jedan od tri ispitivana test materijala (pHAP; pHAP + metformin; pHAP + PLGA) nije ispoljio iritirajuća svojstva, i mogu se smatrati neiritirajućim materijalima. Usled toga, pogodni su za primenu u in vivo uslovima. 5. U testu biofunkcionalnosti, a na osnovu analiziranih histopatoloških parametara, uočeno je stvaranje nove kosti, prisustvo mineralizacije i reparatura defekata kritične veličine u slučajevima kad su implantacioni materijali bili pHAP i pHAP sa PLGA, što govori o njihovom osteokonduktivnom potencijalu. pHAP sa PLGA se pokazao, na osnovu ovog istraživanja jednak, a po nekim 144 parametrima i bolji od primenjenog zlatnog standarda BioOss-a. pHAP sa metforminom nije pokazao očekivane rezultate. 6. Na osnovu prethodno navedenog, pHAP sa PLGA može u daljim istraživanjima da posluži kao osnova za dobijanje ćelijskog nosača u tkivnom inženjerstvu kosti i da omogući vezivanje osteoblasta ili nekog od prekursora osteoblasta, njihov rast i diferencijaciju. 145 8.LITERATURA 1. Buckwalter JA, Glimcher MJ, Cooper RR, Recker R.Bone biology. II: Formation, form, modeling, remodeling, and regulation of cell function. Instr Course Lect. 1996;45:387-99. 2. Buckwalter JA, Glimcher MJ, Cooper RR, Recker R.Bone biology. I: Structure, blood supply, cells, matrix, and mineralization. Instr Course Lect. 1996;45:371- 86 3. Bullough P.Atlas of orthopaedic pathology.New York:Gover Medical Publishing,1992. 4. Caetano-Lopes J, Canhão H, Fonseca JE. Osteoblasts and bone formation.Acta Reumatol Port. 2007 Apr-Jun;32(2):103-10. 5. Suda, T., Takahashi, N. and Martin, T. J. (1992). Modulation of osteoclast differentiation. Endocr. Rev. 13, 66-80. 6. Ziv V, Weiner S.Bone crystal sizes: a comparison of transmission electron microscopic and X-ray diffraction line width broadening techniques. Connect Tissue Res. 1994;30(3):165-75. 7. Lačković V, Bumbaširević V, Vuzevski V.Histološki atlas.Nauka Beograd, 2000. 8. Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view.Kneser U, Schaefer DJ, Polykandriotis E, Horch RE.J Cell Mol Med. 2006 Jan- Mar;10(1):7-19. Review. 9. Dimitriou R, Jones E, McGonagle D, Giannoudis PV. Bone regeneration: current concepts and future directions.BMC Med. 2011 May 31;9:66. 10. Bates P, Ramachandran M: Bone injury, healing and grafting. In BasicOrthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. Edited by: Ramachandran M.London: Hodder Arnold; 2007:123-134. 11. Piščević A. Zarastanje preloma. U: Piščević A.,Gavrić M., Sjerobabin I. Maksilofacijalna hirurgija. Beograd: Izdavačka agencija Draganić, 1995:149- 150 146 12. Ferguson C, Alpern E, Miclau T, Helms JA: Does adult fracture repair recapitulate embryonic skeletal formation? Mech Dev 1999, 87:57-66. 13. Kraus KH, Kirker-Head C. Mesenchymal stem cells and bone regeneration.Vet Surg. 2006 Apr;35(3):232-42. 14. Giannoudis PV, Dinopoulos H, Tsiridis E. Bone substitutes: an update.Injury. 2005 Nov;36 Suppl 3:S20-7. 15. Misch CE, Dietsh F. Bone-grafting materials in implant dentistry. Implant Dent. 1993 Fall;2(3):158-67. 16. Kokovic V.Vaskularizacija sintetickog kalcijumhidroksiapatita i njegove smese sa humanom deproteinizovanom kosti implantiranih u donju vilicu pasa. Magistarska teza, VMA, Beograd, 2001. 17. Gazdag AR, Lane JM, Glaser PM, Forster RA.Alternatives to autogenous bone grafts, afficacy and indications. J Am Acad Orthop Surg. 1995; 3: 1-8 18. Kneser U, Schaefer DJ, Polykandriotis E, Horch RE.Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view.J Cell Mol Med. 2006 Jan- Mar;10(1):7-19. 19. Van Heest A,SwiontowskiM.Bone-graft supstitutes.Lancet 1999;353(suppl 1):28-9 20. Hollinger JO, BrekkeJ. Role of bone supstitutes. Clin Orthop 1996;324:55-65 21. Elsinger EC, Leal L. Coralline hydroxyapatite bone graft substitutes.J Foot Ankle Surg 1996;35:396-9 22. Thorwarth M, Wehrhan F, Schultze-Mosgau S, Wiltfang J, Schlegel KA. PRP modulates expression of bone matrix proteins in vivo without long-term effects on bone formation.Bone. 2006 Jan;38(1):30-40. Epub 2005 Oct 28. 23. Langer RS, Vacanti JP.Tissue engineering: the challenges ahead. Sci Am. 1999 Apr;280(4):86-9. 24. Hutmacher DW, Schantz JT, Lam CX, Tan KC, Lim TC.State of the art and future directions of scaffold-based bone engineering from a biomaterials perspective. J Tissue Eng Regen Med. 2007 Jul-Aug;1(4):245-60. 25. Stock UA, Vacanti JP.Tissue ingeneering:current state and prospects.Annu Rev Med.2001;52:443-22 147 26. Howard D, Buttery LD, Shakesheff KM, Roberts SJ.Tissue engineering: strategies, stem cells and scaffolds. J Anat. 2008 Jul;213(1):66-72. Epub 2008 Apr 15. 27. Bruder SP, Fox BS.Tissue engineering of bone. Cell based strategies. Clin Orthop Relat Res. 1999 Oct;(367 Suppl):S68-83. 28. Gröger A, Kläring S, Merten HA, Holste J, Kaps C, Sittinger M.Tissue engineering of bone for mandibular augmentation in immunocompetent minipigs: preliminary study. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg. 2003;37(3):129-33. 29. Aubin JB. Advances in the osteoblast lineage. Biochem Cell Biol.1998;76:899- 910 30. Vacanti CA, Bonassar LJ, Vacanti MP, Shufflebarger J.Replacement of an avulsed phalanx with tissue-engineered bone. N Engl J Med. 2001 May 17;344(20):1511-4. 31. Trautvetter W, Kaps C, Schmelzeisen R, Sauerbier S, Sittinger M.Tissue- engineered polymer-based periosteal bone grafts for maxillary sinus augmentation: five-year clinical results. J Oral Maxillofac Surg. 2011 Nov;69(11):2753-62. Epub 2011 Jun 16. 32. Sammartino G, Tia M, Marenzi G, di Lauro AE, D'Agostino E, Claudio PP.Use of autologous platelet-rich plasma (PRP) in periodontal defect treatment after extraction of impacted mandibular third molars. J Oral Maxillofac Surg. 2005 Jun;63(6):766-70. 33. Cheng X, Lei D, Mao T, Yang S, Chen F, Wu W.Repair of critical bone defects with injectable platelet rich plasma/bone marrow-derived stromal cells composite: experimental study in rabbits. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg. 2008 Apr;14(2):87-95. 34. Reddi AH.BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins.Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Jun;16(3):249-50. 35. Bessa PC, Casal M, Reis RL. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic concepts). J Tissue Eng Regen Med. 2008 Jan;2(1):1-13. Review. 148 36. Garg A.Bone morphogenetic protein (BMP) for sinus lift.Dent Implantol Update. 2010 Apr;21(4):25-9. 37. Ward BB, Brown SE, Krebsbach PH.Bioengineering strategies for regeneration of craniofacial bone: a review of emerging technologies. Oral Dis. 2010 Nov;16(8):709-16. doi: 10.1111/j.1601-0825.2010.01682.x. 38. Huang S, Ingber DE.The structural and mechanical complexity of cell-growth control.Nat Cell Biol. 1999 Sep;1(5):E131-8. 39. Garber A. Metformin and other biguanides: pharmacology and therapeutic usage, In: DeFronzo RA, Ferrannini E, Keen H, Zimmet P.: International In: International Textbook of Diabetes Mellitus, third edition. John Wiley & Sons, Ltd., 2004 : 851–865. 40. Cortizo AM, Sedlinsky C, McCarthy AD, Blanco A, Schurman L. Osteogenic actions of the anti-diabetic drug metformin on osteoblasts in culture. Eur J Pharmacol. Apr 24(2006);536(1-2):38-46. 41. Dominguez LJ, Davidoff AJ, Srinivas P, Standley P,Walsh MF, Sowers JR. Effects of metformin on tyrosine kinase activity, glucose transport and intracellular calcium in rat vascular smooth muscle. Endocrinology 137(1996), 113–121. 42. Zhou G, Myers R, Li Y, Chen Y, Shen X, Fenyk-Melody J, Wu M, Ventre J, Doebber T, Fujii N, Musi N, Hirshman MF, Goodyear LJ, Moller DE. Role of AMP-activated protein kinase in mechanism of metformin action. J. Clin. Invest. 108(2001), 1167–1174 43. Musi N, Hirshman MF, Nygren J, Svanfeldt M, Bavenholm P, Rooyackers O, Zhou G, Williamson JM, Ljunqvist O, Efendfic S, Moller DE, Thorell A, Goodyear LJ. Metformin increases AMPactivated protein kinase activity in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes. Diabetes 51(2002), 2074–2081. 44. Zou M, Kirkpatrick SS, Davis, BJ, Nelson JS,Wiles WG, Schlattner U, Neumann D, Brownlee M, Freeman M, Goldman MH. Activation of the AMP- activated protein kinase by the anti-diabetic drug metformin in vivo. J. Biol. Chem. 279(2004), 43940–43951. 45. Chen ZP, Mitchelhill KI, Michell BJ, Stapleton D, Rodriguez-Crespo I,Witters LA, Power DA, Ortiz de Montellano PR, Kemp BE.AMP-activated protein 149 kinase phosphorylation of endothelial NO synthase. FEBS Lett. 443(1999), 285– 289. 46. Kanazawa I, Yamaguchi T, Yano S, Yamauchi M, Sugimoto T.Metformin enhances the differentiation and mineralization of osteoblastic MC3T3-E1 cells via AMP kinase activation as well as eNOS and BMP-2 expression. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Oct 24;375(3):414-9. 47. Van't Hof RJ, Ralston S. Nitric oxide and bone. Immunology 103(2001),255– 261. 48. Shah M, Kola B, Bataveljic A, Arnett TR, Viollet B, Saxon L, Korbonits M, Chenu C. AMP-activated protein kinase (AMPK) activation regulates in vitro bone formation and bone mass. Bone. 2010 Aug;47(2):309-19. 49. Jeyabalan J, Shah M, Viollet B, Chenu C. AMP-activated protein kinase pathway and bone metabolism. J Endocrinol. 2012 Mar;212(3):277-90. 50. Jokanović V, Nanomedicina, najveći izazov 21 veka, DATA STATUS, Beograd, 2012, ISBN 978-86-7478-152-4 51. Jokanović V, Nikčević I, Dacić B, Uskoković D, Synthesis of nanostructured carbonated calcium hydroxyapatite by ultrasonic spray pyrolysis, J. Ceramic Processing Research 2 (2004) 157-162 52. Jokanović V, Izvonar D, Dramicanin MD, Jokanovic B, Zivojinovic V, Markovic D, Dacic B.Hydrothermal synthesis and nanostructure of carbonated calcium hydroxyapatite.J Mater Sci Mater Med. 2006 Jun;17(6):539-46. 53. Jokanovic V, Jokanovic B, Izvonar D, Dacic B.Thin films of SiO2 and hydroxyapatite on titanium deposited by spray pyrolysis.J Mater Sci Mater Med. 2008 May;19(5):1871-9. 54. Logeart-Avramoglou D, Anagnostou F, Bizios R, Petite H.Engineering bone: challenges and obstacles. J Cell Mol Med. 2005 Jan-Mar;9(1):72-84. 55. Kneser U, Kaufmann PM, Fiegel HC, Pollok JM, Kluth D, Herbst H, Rogiers X.Long-term differentiated function of heterotopically transplanted hepatocytes on three-dimensional polymer matrices. J Biomed Mater Res. 1999 Dec 15;47(4):494-503. 56. Kneser U, Stangenberg L, Ohnolz J, Buettner O, Stern-Straeter J, Möbest D, Horch RE, Stark GB, Schaefer DJ.Evaluation of processed bovine cancellous 150 bone matrix seeded with syngenic osteoblasts in a critical size calvarial defect rat model. J Cell Mol Med. 2006 Jul-Sep;10(3):695-707. 57. Ma PX, Zhang R.Microtubular architecture of biodegradable polymer scaffolds. J Biomed Mater Res. 2001 Sep 15;56(4):469-77. 58. Hollister SJ.Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 2005 Jul;4(7):518-24. 59. Hutmacher DW.Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials. 2000 Dec;21(24):2529-43. 60. Hutmacher DW, Ng KW, Kaps C, Sittinger M, Kläring S.Elastic cartilage engineering using novel scaffold architectures in combination with a biomimetic cell carrier. Biomaterials. 2003 Nov;24(24):4445-58. 61. Ginebra MP, Traykova T, Planell JA, Calcium phosphate cements as bone drug delivery systems: A review, J. Control. Release 113 (2006) 102–110. 62. Hench LL: Bioceramics:From concept to clinic.J Am Ceram Soc,1991,74(7):1487-510 63. Kvirak N, Tas AC: Synthesis of Calcium Hydrxyapatita-Tricalcium Phosphate Composite Bioceramic Powders and Their Sintering Behavior.J Am Ceram Soc,1998, 81,2245 64. Jokanović V, Nikčević I, Dacić B, Uskoković D, Synthesis of nanostructured carbonated calcium hydroxyapatite by ultrasonic spray pyrolysis, J. Ceramic Processing Research 2 (2004) 157-162 65. Jokanović VR, Izvonar D, Dramičanin MD, Jokanović B, Živojinović V, Marković D, Dacić B. (2006) Hydrothermal synthesis and nanostructure of carbonated calcium hydroxyapatite. Journal of materials science-materials in medicine, 17(6): 539-546 66. Janackovic Dj, Jankovic I, Petrovic R,Kostic-Gvozdenovic Lj, Milonjic S, Uskokovic D: Influence of Synthesis Parameteres on the particle Sizes of Nanostructured Calcium-Hydroxyapatite.Key Engin Mater:240-242,2003 67. Habraken WJ, Wolke JG, Jansen JA.Ceramic composites as matrices and scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 2007 May 30;59(4-5):234-48. 151 68. Ginebra MP, Traykova T, Planell JA. Calcium phosphate cements as bone drug delivery systems: a review.J Control Release. 2006 Jun 28;113(2):102-10. 69. Zhang R, Ma PX, Biomimetic Polymer/Apatite Composite Scaffolds for Mineralized Tissue Engineering, Macromol. Biosci. 4 (2004) 100–111. 70. Wang M: Biomaterials and Tissue Engineering,2004,Springer 71. Zhou Y., Chen F., Ho ST et al.: Combined marrow stromal cell-sheet tecniques and high – strengh biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts Biomaterials 2007;28(5):814-824. 72. Lickorish D, Guan L, Davies JE.: A three-phase, fully resorbable, polyester/calcium phosphate scaffold for bone tissue engineering: evolution of scaffold design. Biomaterials 2007;28(8): 1495–1502. 73. Khan YM, Katti DS, Laurencin CT.: Novel polymer-synthesized ceramic composite-based system for bone repair: an in vitro evaluation. J Biomed Mater Res A 2004;69(4): 728–737. 74. Gross KA, Rodriguez-Lorenzo LM.: Biodegradable composite scaffolds with an interconnected spherical network for bone tissue engineering. Biomaterials 2004;25(20): 4955–4962. 75. Wei G, Ma PX.: Structure and properties of nanohydroxyapatite/ polymer composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2004;25(19): 4749–4757. 76. Zhang RY, Ma PX.:Porous poly(L-lactic acid)/apatite composites created by biomimetic process. J Biomed Mater Res 1999;45: 285–293. 77. Ma PX, Zhang R, Xiao G, Franceschi R.: Engineering new bone tissue in vitro on highly porous poly(α-hydroxyl acids)/hydroxyapatite composite scaffolds. Biomed Mater Res 2001;54(2): 284–293. 78. Mathieu LM, Mueller TL, Bourban PE, et al.:Architecture and properties of anisotropic polymer composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials 2006; 27(6): 905–916. 79. Nikolić N: Odnos biloške aktivnosti i strukturnog dizajna hidroksiapatitnih ćelijskih nosača(magistarska teza). Beograd: Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, 2009. 152 80. Kim SS, Park MS, Jeon O, Choi CY, Kim BS., Poly(lactide-co- glycolide)/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering, Biomaterials 27 (2006) 1399–1409. 81. Jayasuriya AC, Assad M, Jayatissa AH, Ebraheim NA, Dissolution behavior of biomimetic minerals on 3D PLGA scaffold, Surf. Coat. Technol. 200 (2006) 6336–6339. 82. Ngiam M, Liao S, Patil AJ, Cheng Z, Chan CK, Ramakrishna S, The fabrication of nano-hydroxyapatite on PLGA and PLGA/collagen nanofibrous composite scaffolds and their effects in osteoblastic behavior for bone tissue engineering, Bone 45 (2009) 4–16. 83. Christenson EM, Anseth KS, van den Beucken Jeroen JJP, Chan CK, Ercan B,Jansen JA, et al. Nanobiomaterial applications in orthopedics. JorthopaedicRes 2007;25(1):11e22. 84. Gleiter H. Nanostructured materials, basic concepts and microstructure. ActaMater 2000;48:1e12. 85. Gorrasi G, Vittoria V, Murariu M, Ferreira ADS, Alexandre M, Dubois P. Effect of filler content and size on transport properties of water vapor in PLA/calcium sulfate composites. Compos Sci Technol 2008;9:627e32. 86. Peponi L, Tercjak A, Torre L, Mondragon I, Kenny JM. Nanostructured physical gel of SBS block copolymer and Ag/DT/SBS nanocomposites. J Mater Sci 2009;44:1287e93. 87. Qiao R, Brinson LC. Simulation of intherphase percolation and gradients in polymer nanocomposites. Compos Sci Technol 2009;69:491e9. 88. Tjong SC. Structural and mechanical properties of polymer nanocomposites. Mater Sci Eng R 2006;53:73e197. 89. Murugan R, Ramakrishna S. Development of nanocomposites for bone grafting. Compos Sci Technol 2005;65:2385e406. 90. Armentano I, Dottori M, Fortunati E, Mattioli S, Kenny JM. Biodegradable polymer matrix nanocomposites for tissue engineering: A review. Polymer Degradation and Stability 2010;95 (11): 2126-2146 91. ISO/DIS 10993-5:In Biological evaluation of medical devices:Tests for cytotoxicity:in vitro methods.1992. 153 92. Ohno M, Abe T.Rapid colorimetric assay for the quantification of leukemia inhibitory factor (LIF) and interleukin-6 (IL-6). J Immunol Methods. 1991 Dec 15;145(1-2):199-203. 93. ISO/DIS 10993-10:In Biological evaluation of medical devices:Tests for irritation and sensitization .1994. 94. ISO/DIS 10993-6:In Biological evaluation of medical devices:Tests for local effects after implantation.1994. 95. ISO/TR 7405:Biological evaluation of dental materials.,1984 96. Harkness JE, Wagner JE. The Biology and Medicine of Rabbits and Rodents 4th ed. Baltimore, 1995. Williams and Wikins, 96-104 97. Ripamonti U, Van Den Heever B, Sampath TK, Tucker MM, Rueger DC, Reddi AH.Complete regeneration of bone in the baboon by recombinant human osteogenic protein-1 (hOP-1, bone morphogenetic protein-7). Growth Factors. 1996;13(3-4):273-89 98. Živojinović RV.Biloški aspekti primene kalcijum hidroksiapatita I mineratl trioksid agregata u terapiji obolele pulpe(doktorska disertacija). Beograd: Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, 2008. 99. Maquet V, Boccaccini AR, Pravata L, Notingher I, Jerome R.: Porous poly(α- hydroxyacid)/bioglass composite scaffolds for bone tissue engineering. I: Preparation and in vitro characterization. Biomaterials 2004;25(18): 4185–4194. 100. Douglas T, Pamula E, Hauk D, Wiltfang J, Sivananthan S, Sherry E, Warnke PH. Porous polymer/hydroxyapatite scaffolds: characterization and biocompatibility investigations.J Mater Sci Mater Med. 2009 Sep;20(9):1909- 15. 101. Hofmann I, Müller L, Greil P, Müller FA, Calcium phosphate nucleation on cellulose fabrics, Surf. Coat. Technol. 201 (2006) 2392–2398. 102. Jokanović V., Marković D. Biološki nosači-skafoldi, osnov tkivnog inženjerstva u stomatologiji.U:Stamenković D(sa sar.). Stomatološki materijali, knjiga 2. Beograd:Stomatološki fakultet u Beogradu,2012:429-454 103. Čolović B, Jokanović V, Todorović-Marković B, Marković Z. AFM investigations of calcium hydroxyapatite thin films on the surface of thin silica films, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, 11 (2009) 70-75. 154 104. Nge TT, Sugiyama J.Surface functional group dependent apatite formation on bacterial cellulose microfibrils network in a simulated body fluid. J Biomed Mater Res A. 2007 Apr;81(1):124-34. 105. Hashizume M, Horii H, Kikuchi J, Kamitakahara M, Ohtsuki C, Tanihara M, Effects of surface carboxylic acid groups of cerasomes, morphologically stable vesicles having a silica surface, on biomimetic deposition of hydroxyapatite in body fluid conditions, J. Mater. Sci.: Mate. Med. 21 (2010) 11–19. 106. Tampieri A, Sandri B, Landi E, Celotti G, Roveri N, Mattioli-Belmonte M, Virgili L, Gabbanelli F, Biagini G. HA/alginate hybrid composites prepared through bio-inspired nucleation, Acta Biomaterialia 1 (2005) 343–351. 107. Wang L, Shelton RM, Cooper PR, Lawson M, Triffitt JT, Barralet JE. Evaluation of sodium alginate for bone marrow cell tissue engineering, Biomaterials 24 (2003) 3475–3481 108. Tommila M, Jokilammi A, Terho P, Wilson T, Penttinen R, Ekholm E, Hydroxyapatite coating of cellulose sponges attracts bone-marrow-derived stem cells in rat subcutaneous tissue, J. R. Soc. Interface 6 (2009) 873-880. 109. Qu X, Cui W, Yang F, Min C, Shen H, Bei J, Wang S, The effect of oxygen plasma pretreatment and incubation in modified simulated body fluids on the formation of bone-like apatite on poly(lactide-co-glycolide) (70/30), Biomaterials 28 (2007) 9–18. 110. Schmalz G.:Use of cell cultures for toxicity testing of dental materials- advantages and Limitations,J Dent Suppl 1994;2(22):6-11 111. Marković LJD. Ispitivanje biokompatibilnosti svetlosno polimerizujućih glas jonomer cemenata (disrtacija). Beograd: Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu, 1998. 112. Marques AP, Reis RL, Hunt JA.: The biocompatibility of novel starch-based polymers and composites:in vitro studies. Biomaterials 2002;23:1471-1478. 113. Ito Y, Sisido M, Imanishi Y.Attachment and proliferation of fibroblast cells on polyetherurethaneurea derivates. Biomaterials 1997;8:464-72 155 114. Allen M, Millett P, Dawes E, Rushton N.Lactate dehydrogenase activity as a rapid and sensitive test for the quantification of cell numbers in vitro. Clin Mater. 1994;16(4):189-94. 115. Wroblewski F, La Due JS.Lactic dehydrogenase activity in blood. Proc Soc Exp Biol Med 1955;90:210-3 116. van Wachem PB, Beugeling T, Feijen J, Bantjes A, Detmers JP, van Aken WG.Interaction of cultured human endothelial cells with polymeric surfaces of different wettabilities.Biomaterials. 1985 Nov;6(6):403-8. 117. van Kooten TG, Schakenraad JM, van der Mei HC, Busscher HJ. Influence of substratum wettability on strenght of adhesion of human fibroblasts. Bomaterials 1993;13:897-904 118. Hattori S, Andrade LD, Hibbs JB, Gregonis DE, King RN.Fibroblast cell proliferation on charged hydroxyethyl methacrylate copolymers.J Colloid Interface Sci 1985;103:72-8 119. van der Valk P, van Pelt AW, Busscher HJ, de Jong HP, Wildevuur CR, Arends J.Interaction of fibroblasts and polymer surfaces: relationship between surface free energy and fibroblast spreading. J Biomed Mater Res. 1983 Sep;17(5):807- 17. 120. Koyano T, Minoura N, Nagura M, Kobayashi K.Attachment and growth of cultured fibroblast cells on PVA/chitosan-blended hydrogels. J Biomed Mater Res. 1998 Mar 5;39(3):486-90. 121. Ertel SI, Ratner BD, Horbett TA.Radiofrequency plasma deposition of oxygen- containing films on polystyrene and poly(ethylene terephthalate) substrates improves endothelial cell growth. J Biomed Mater Res. 1990 Dec;24(12):1637- 59. 122. Curtis AS, Forrester JV, McInnes C, Lawrie F.Adhesion of cells to polystyrene surfaces. J Cell Biol. 1983 Nov;97(5 Pt 1):1500-6. 123. Rich A, Harris AK.Anomalous preferences of cultured macrophages for hydrophobic and roughened substrata.J Cell Sci 1981;5:1-7. 124. Le Guehennec L, Goyenvalle E, Aguado E, Houchmand-Cuny M, Enkel B, Pilet P, Daculsi G, Layrolle P.Small-animal models for testing macroporous 156 ceramic bone substitutes. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2005 Jan 15;72(1):69-78. 125. Liebschner MA.Biomechanical considerations of animal models used in tissue engineering of bone.Biomaterials. 2004 Apr;25(9):1697-714. 126. Bosch C, Melsen B, Vargervik K.Importance of the critical-size bone defect in testing bone-regenerating materials.J Craniofac Surg. 1998 Jul;9(4):310-6. 127. Rudert M.Histological evaluation of osteochondral defects: consideration of animal models with emphasis on the rabbit, experimental setup, follow-up and applied methods.Cells Tissues Organs. 2002;171(4):229-40. 128. Huh JY, Choi BH, Kim BY, Lee SH, Zhu SJ, Jung JH.Critical size defect in the canine mandible.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005 Sep;100(3):296-301. 129. Hämmerle CH, Schmid J, Olah AJ, Lang NP.Osseous healing of experimentally created defects in the calvaria of rabbits using guided bone regeneration. A pilot study.Clin Oral Implants Res. 1992 Sep;3(3):144-7. 130. Anderson ML, Dhert WJ, de Bruijn JD, Dalmeijer RA, Leenders H, van Blitterswijk CA, Verbout AJ.Critical size defect in the goat's os ilium. A model to evaluate bone grafts and substitutes. Clin Orthop Relat Res. 1999 Jul;(364):231-9. 131. Viateau V, Guillemin G, Yang YC, Bensaid W, Reviron T, Oudina K, Meunier A, Sedel L, Petite H.A technique for creating critical-size defects in the metatarsus of sheep for use in investigation of healing of long-bone defects.Am J Vet Res. 2004 Dec;65(12):1653-7. 132. Springer IN, Açil Y, Kuchenbecker S, Bolte H, Warnke PH, Abboud M, Wiltfang J, Terheyden H.Bone graft versus BMP-7 in a critical size defect-- cranioplasty in a growing infant model.Bone. 2005 Oct;37(4):563-9. 133. Jäger M, Sager M, Lensing-Höhn S, Krauspe R.The critical size bony defect in a small animal for bone healing studies (I): Comparative anatomical study on rats' femur.Biomed Tech (Berl). 2005 Apr;50(4):107-10. 134. Rimondini L, Nicoli-Aldini N, Fini M, Guzzardella G, Tschon M, Giardino R.In vivo experimental study on bone regeneration in critical bone defects using 157 an injectable biodegradable PLA/PGA copolymer.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005 Feb;99(2):148-54. 135. Kruse A, Jung RE, Nicholls F, Zwahlen RA, Hämmerle CH, Weber FE.Bone regeneration in the presence of a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute material. Clin Oral Implants Res. 2011 May;22(5):506-11 136. Schmitz JP, Hollinger JO.The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions.Clin Orthop Relat Res. 1986 Apr;(205):299- 308. 137. Hämmerle CH, Schmid J, Lang NP, Olah AJ.Temporal dynamics of healing in rabbit cranial defects using guided bone regeneration.J Oral Maxillofac Surg. 1995 Feb;53(2):167-74. 138. Slote C.On surgical techniques to increase bone density and volume. Studies on rat and rabbit. Department of Biomaterials, Institute for Surgical Sciences, Sahlgrenska Academy, Goteborg University, Sweden, 2003. 139. Bidic SM, Calvert JW, Marra K, Kumta P, Campbell P, Mitchell R, Wigginton W, Hollinger JO, Weiss L, Mooney MP. Rabbit calvarial wound healing by means of seeded Caprotite scaffolds.J Dent Res. 2003 Feb;82(2):131-5. 140. Schmid J, Hämmerle CH, Flückiger L, Winkler JR, Olah AJ, Gogolewski S, Lang NP.Blood-filled spaces with and without filler materials in guided bone regeneration. A comparative experimental study in the rabbit using bioresorbable membranes. Clin Oral Implants Res. 1997 Apr;8(2):75-81. 141. Frost HM.The biology of fracture healing. An overview for clinicians. Part II.Clin Orthop Relat Res. 1989 Nov;(248):294-309. 142. Urist MR, Grant TT, Lindholm TS, Mirra JM, Hirano H, Finerman GA.Induction of new-bone formation in the host bed by human bone-tumor transplants in athymic nude mice. J Bone Joint Surg Am. 1979 Dec;61(8):1207- 16. 143. Albrektsson T, Johansson C.Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration.Eur Spine J. 2001 Oct;10 Suppl 2:S96-101. 158 144. Kim SS, Kim BS.Comparison of osteogenic potential between apatite-coated poly(lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite particulates and Bio-Oss. Dent Mater J. 2008 May;27(3):368-75. 145. Lewandrowski KU, Bondre SP, Wise DL, Trantolo DJ.Enhanced bioactivity of a poly(propylene fumarate) bone graft substitute by augmentation with nano- hydroxyapatite.Biomed Mater Eng. 2003;13(2):115-24. 146. Ginebra MP, Driessens FC, Planell JA. Effect of the particle size on the micro and nanostructural features of a calcium phosphate cement: a kinetic analysis. Biomaterials 2004;25:3453–62. 147. Liu Y, Wang G, Cai Y, Ji H, Zhou G, Zhao X, Tang R, Zhang M.In vitro effects of nanophase hydroxyapatite particles on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 2009 Sep 15;90(4):1083-91. 148. Vitte J, Benoliel AM, Pierres A, Bongrand P. Is there a predictable relationship between surface physical-chemical properties and cell behaviour at the interface? Eur Cells Mater 2004;7:52e63 149. Weibrich G, Trettin R, Gnoth SH, Götz H, Duschner H, Wagner W.Determining the size of the specific surface of bone substitutes with gas adsorption. Mund Kiefer Gesichtschir. 2000 May;4(3):148-52. 150. Henkel KO, Gerber T, Lenz S, Gundlach KK, Bienengräber V.Macroscopical, histological, and morphometric studies of porous bone-replacement materials in minipigs 8 months after implantation. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006 Nov;102(5):606-13. Epub 2006 May 19. 151. Götz W, Gerber T, Michel B, Lossdörfer S, Henkel KO, Heinemann F. Immunohistochemical characterization of nanocrystalline hydroxyapatite silica gel (NanoBone(r)) osteogenesis: a study on biopsies from human jaws. Clin Oral Implants Res. 2008 Oct;19(10):1016-26. 152. Van Landuyt P, Li F, Keustermans JP, Steydio JM, Delannay F, Munting E.The influence of high sintering temperatures on the mechanical properties of hydroxiapatite. J Mater Sci Mater Med 1995;6:8-13 159 153. Yang YY, Shi M, Goh SH, Moochhala S, Heller J. POE/PLGA composite microspheres: formation and in vitro behavior of double walled microspheres. J Control Release 2003;88(2):201e13. 154. Loo SCJ, Ooi CP, Boey YCF. Radiation effects on poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) and poly(l-lactide) (PLLA). Polym Degrad Stab 2004;83(2):259e65. 155. Hurrell S, Cameron RE. Polyglycolide: degradation and drug release. Part I:changes in morphology during degradation. J Mater Sci Mater Med 2001;12(9):811e6. 156. Lickorish D, Ramshaw JA, Werkmeister JA, Glattauer V, Howlett CR.Collagen-hydroxyapatite composite prepared by biomimetic process. J Biomed Mater Res A. 2004 Jan 1;68(1):19-27. Dr Milan Petrović rođen je 9. X 1967.godine u Kumanovu. Osnovnu i srednju školu završio je u Beogradu. Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu upisao je 1987. godine, a diplomirao je 1994. godine sa prosečnom ocenom 9,10. Obavezni lekarski staž završio je 1995. godine, kada je položio stručni ispit za doktora medicine. Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu upisao je 1995. godine, a diplomirao je 2001. godine sa prosečnom ocenom 9,14. Obavezni staž završio je 2002. godine na Stomatološkom fakultetu u Beogradu kada je položio stručni ispit za doktora stomatologije. Specijalistički ispit iz predmeta maksilofacijalna hirurgija položio je 2002. godine sa odličnom ocenom. Doktorske studije iz naučne oblasti Maksilofacijalna hirurgija, dr Milan Petrović upisao je školske 2007/2008. godine i položio sve ispite predviđene nastavnim planom i programom doktorskih studija. Nastavno-naučno veće Stomatološkog fakulteta je 2011. godine donelo odluku o usvajanju predloga teme doktorske disertacije. Dr Milan Petrović objavio je 7 naučnih radova, od kojih su 4 u međunarodnim časopisima. Učestvovao je na domaćim i međunarodnim kongresima gde je prezentovano 68 naučnih radova u kojima je bio autor ili koautor. Dr Milan Petrović zaposlen je od 1995. godine na Klinici za Maksilofacijalnu hirurgiju Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu.