UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET BEOGRAD–ZEMUN Mr Petar M. Mitrović MORFOLOŠKA I MOLEKULARNA KARAKTERIZACIJA I IDENTIFIKACIJA GLJIVE UZROČNIKA RAKA STABLA ULJANE REPICE U SRBIJI doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE MSc Petar M. Mitrović MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF FUNGI CAUSING STEM CANKER OF OILSEED RAPE IN SERBIA Doctoral Dissertation Belgrade, 2013. UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET BEOGRAD – ZEMUN Mentor: Dr Mirko Ivanović, redovni profesor Poljoprivredni fakultet Beograd – Zemun Članovi komisije: Dr Aleksa Obradović, redovni profesor, član Poljoprivredni fakultet Beograd – Zemun Dr Ana Marjanović–Jeromela, član Institut za ratarstvo i povrtarstvo – Novi Sad Dr Vojislav Trkulja, vanredni profesor, član Poljoprivredni fakultet Banja Luka Dr Ivana Vico, docent, član Poljoprivredni fakultet Beograd – Zemun Datum odbrane:_______________ MORFOLOŠKA I MOLEKULARNA KARAKTERIZACIJA I IDENTIFIKACIJA GLJIVE UZROČNIKA RAKA PRIZEMNOG STABLA ULJANE REPICE U SRBIJI REZIME Rak prizemnog dela stabla ekonomski je vaţno oboljenje uljane repice u Evropi, Australiji i Severnoj Americi. Ovu bolest prouzrokuju dve vrste: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. de Not (anamorfni stadium Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. i Leptosphaeria biglobosa Shoem and Brun. Štete od L. maculans u Kanadi godišnje prelaze 30 miliona dolara, dok u Velikoj Britaniji, u uslovima povoljnim za razvoj patogena, štete mogu biti i do 56 miliona evra. Gljiva prouzrokuje velike štete i u Australiji a prisutna je i u Africi, Juţnoj Americi i Aziji. Iako se Leptosphaeria maculans nalazila na listi karantinskih patogena u bivšoj Jugoslaviji , još 1965. godine je registrovana kao parazit karfiola u okolini Splita. Tokom 1983. konstatovana je u mnogim proizvodnim regionima Jugoslavije. Patogen je sa uljane repice izolovan 1987/88. a tokom 1995. godine u Republici Srbiji izolovan je sa semenskog i konzumnog kupusa. Tokom 2005. i 2006. godine parazit je izolovan u svim proizvodnim područjima uljane repice u Vojvodini. Iako je parazit kod nas izolovan još 1987/88, zatim 1995. godine i tokom 2005/06, ni patogen niti oboljenje koje prouzrokuje na uljanoj repici nisu detaljnije proučavani. Zbog toga su sprovedena morfološka i molekularna istraţivanja 119 izolata gljiva izolovanih sa uljane repice u našoj zemlji da bi se dobili pouzdani podaci o etiologiji suve truleţi korena i raka stabla uljne repice i identifikovali uzročnici ovog značajnog oboljenja. Proučene su morfološke, patogene i molekularne karakteristike 119 izolata izolovanih tokom 2008/10. godine u regionu (Vojvodina) Srbije. Pored izolata iz naše zemlje u ovim istraţivanjima su korišćena i dva izolata iz Velike Britanije, kao referentni izolati. Svi proučavani izolati na podlozi od krompira (PDA) obrazuju plodonosna tela  piknide sa piknosporama. Piknospore su jednoćelijske, hijalne, uglavnom prave, sa ili bez kapi ulja na krajevima kod svih izolata. Od 119 izolata 8 izolata (K-111, K-112, K-113, K-114, K-115, K-116, K-117 i K- 118) imaju brz i pravilan porast micelije na PDA podlozi, obrazuju ţutomrki pigment, za razliku od ostalih koji se sporo razvijaju, ne obrazuju pigment, a ivice kolonija su nepravilnog oblika. Svi izolati obrazuju belu do prljavobelu miceliju. Uz pomoć Burkardovog hvatača spora i sparivanja izolata metodom čačkalica, utvrĎeno je da gljiva, pored anamorfnog, u Srbiji formira i teleomorfni stadium sa pseudotecijama, askusima i askosporama. Pseudotecije su mrke, okruglaste, veličine od 313 do 532 µm. Askospore su septirane (5 septi), prave, do malo povijene, veličine 610 µm x 4274 µm. Metodom slučajnog izbora, u okviru svoje grupe izdvojeni su sledeći izolati. Kao predstavnici B grupe izabrani po slučajnom metodu, izolati K-113 i K-115 stvaraju pigment u tečnoj Czapek-ovoj podlozi ali ne stvaraju fitotoksin. Izolati St-5, C-3 i S-11, kao predstavnici grupe A, ne stvaraju ţutomrki pigment u Czapek-ovoj podlozi ali stvaraju fitotoksin. Pripadnost patogenim grupama (PG) odreĎena je na osnovu ispoljenih simptoma na inokulisanim kotiledonima diferencijalnih sorti (Westar, Quinta i Glacier) uljane repice. Istraţivanja su pokazala da 8 izolata pripada PG1, 5 izolata pripada PG2, 22 izolata pripada PG3 i 84 izolata pripada PG4 patogenoj grupi, dok PGT patogena grupa nije identifikovana. U ovim istraţivanjima utvrĎeno je da seme ima značajnu ulogu u epidemiologiji oboljenja. Inokulaciom semena je dokazano da se parazit, pored askospora, moţe širiti i zaraţenim semenom. Molekularna karekterizacija je obavljena primenom PCR i PCR-RFLP. Ovim analizama utvrĎeno je da su u Srbiji prisutne obe vrste prouzrokovača suve truleţi (raka) korena i raka stabla uljane repice, Leptosphaeria biglobosa NA1 podgrupa i Leptosphaeria maculans. Determinacija vrsta i strukture populacije „Leptosphaeria kompleksa“ u regionima gajenja uljane repice moţe posluţiti za sagledavanje epidemiologije parazita, kao i za mere suzbijanja. Ključne reči: Uljana repica, zaraţeno seme, diferencijalne sorte, Leptosphaeria biglobosa, Leptosphaeria maculans, izolati, patogena grupa, micelija, askospora, piknidi, piknospore, pseudotecija, PCR, PCR-RFLP. Naučna oblast: Biotehničke nauke Uţa naučna oblast: Fitopatologija UDK: 632.4+633.85(497.11) MORPHOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION AND IDENTIFICATION OF FUNGI CAUSING STEM CANKER OF OILSEED RAPE IN SERBIA ABSTRACT Stem canker of oilseed rape is economicaly important desease in Europe, Australia and North America. This disease is caused by two species: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. de Not (anamorphic stadium Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. i Leptosphaeria biglobosa Shoem and Brun. Damage caused by L. maculans in Canada annually exceeds $ 30 million, while in the UK, under conditions favorable for pathogen development, the damage could be as high as 56 million. The fungus causes severe damage in Australia too and it is present in Africa, South America and Asia. Although Leptosphaeria maculans is on the list of quarantine pathogens in the former Yugoslavia, in 1965. it is registered as cauliflower parasite around Split. During the 1983rd was found in many manufacturing regions of Yugoslavia. The pathogen was isolated from oilseed rape in 1987/88. and during 1995. has been isolated from cabbage. During 2005 and 2006 parasit has been isolated in all production areas of oilseed rape in Vojvodina. Although parasite was isolated in 1987/88, then again in 1995. and during 2005/2006, Iako je parazit kod nas izolovan još 1987/88, zatim 1995. godine i tokom 2005/06, either pathogen or disease that causes on the oilseed rape were not investigated further. Therefore, morphological and molecular studies of 119 isolates of fungi isolated from oilseed rape in our country were carried out in order to obtain reliable data on the etiology of dry root rot and stem canker of oilseed rape and to identify the causes of this important disease. Were studied morphological, pathogenic and molecular characteristics of 119 strains isolated during 2008/10. in the region (Vojvodina) of Serbia. In addition to isolates from our country in these studies were used and the two isolates from the UK, as well as reference strains. All studied isolates on a potato medium (PDA) form fruiting bodies pycnidia with pycnospores. Pycnospores are unicellular, hyalic, mostly straight, with or without a drop of oil on the ends in all isolates. Eight isolates out of 119 (K-111, K-112, K-113, K-114, K-115, K-116, K-117 i K-118) have quick and proper mycelia growth on PDA medium, form yellow-brownish pigment, unlike others who are slow to develop, do not form the pigment and the edges of colonies are irregular in shape. All isolates form white to dirt-white mycelia. Using Burkards spore catcher and isolates mating with toothpick method, it was found that fungus, in addition to anamorphic, in Serbia forms and teleomorphic stadium with pseudotecia, ascus and ascospores. Pseudotecia are brown, round, size from 313 to 532 µm. Ascospores Askospores are septated (5 septa), straight to slightly curved, sized from 6-10 µm x 4274 µm. By random choice method, within their group the following isolates were segregated. As elected representatives of the B group of the randomized method, isolates K-113 and K-115 produce pigment in liquid Czapek's medium but do not create phytotoxin. Isolates ST-5, C-3 and C-11, as well as representatives of groups A, does not produce yellow-brown pigment in Czapek's medium but creates phytotoxin. Affiliation to pathogenic groups (PG) was determined on the basis of symptoms displayed in the inoculated cotyledons of differential cultivars (Westar, Quinta and Glacier) of oilseed rape. Studies have shown that 8 isolates belongs to PG1, 5 isolates belongs to PG2, 22 isolates belongs to PG3 and 84 isolates belongs to PG4 pathogenic group, while PGT pathogen group is not identified. In this study, it was determined that seed has an important role in the epidemiology of the disease. Seed inoculation has proven that parasite, in addition to ascospores, may spread with infected seed. Molecular characterization was performed using PCR and PCR-RFLP. These analyzes confirmed, in Serbia, the presence of both species causing dry rot (cancer) root and stem canker of oilseed rape, Leptosphaeria biglobosa NA1 subrgoup and Leptosphaeria maculans. The determination of species and population structure of "Leptosphaeria complex" in the growing area of oilseed rape can be used for understanding the epidemiology of the parasite, as well as control measures. Key words: Oilseed rape, infected seed, differential cultivar, Leptosphaeria biglobosa, Leptosphaeria maculans, isolates, pathogenic group, mycelium, ascospore, pycnidia, pycnospores, pseudotecia, PCR, PCR-RFLP. Scientific area: Biotechnical Science Specific scientific area: Phytopathology UDK: 632.4+633.85(497.11) SADRŢAJ I UVOD................................................................................................................... 1 II CILJ ISTRAŽIVANJA...................................................................................... 4 III RADNA HIPOTEZA........................................................................................ 5 IV PREGLED LITERATURE.............................................................................. 6 4.1. Rasprostranjenost i značaj................................................................... 6 4.2. Simptomi............................................................................................. 7 4.3. Biologija i epidemiologija gljive......................................................... 8 4.4. Razlike izmeĎu L. maculans i L. Biglobosa........................................ 11 4.5. Morfološke karakteristike.................................................................... 14 V MATERIJAL I METOD RADA....................................................................... 15 5.1. Izolacija gljive i dobijanje monospornih kultura................................. 15 5.2. Morfološke karakteristike.................................................................... 16 5.3. Dokazivanje postojanja teleomorfnog stadijuma gljive...................... 16 5.4. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi........................ 19 5.5 Ekstrakcija, izolacija i karakterizacija fitotoksina............................... 19 5.6. Identifikacija fitotoksina LC – MS – MS metodom............................ 20 5.7. Ispitivanje fitotoksičnosti.................................................................... 21 5.8. OdreĎivanje patogenih grupa.............................................................. 21 5.9. Prenošenje patogena semenom............................................................ 23 5.10 Molekularna karakterizacija................................................................ 24 5.11 Ekstrakcija DNK................................................................................ 24 5.12 PCR–RFLP analiza.............................................................................. 26 VI REZULTATI ISTRAŽIVANJA...................................................................... 28 6.1. Simptomi bolesti.................................................................................. 28 6.2. Morfološke karakteristike proučavanih izolata................................... 31 6.3. Dokazivanje postojanja teleomorfnog stadijuma gljive...................... 35 6.4. Infektivnost askospora ........................................................................ 37 6.5. Obrazovanje pseudotecija i askospora u laboratorijskim uslovima.... 38 6.6. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi........................ 39 6.7. Ekstrakcija, izolacija i karakterizacija fitotoksina............................... 40 6.8. Test fitotoksičnosti.............................................................................. 59 6.9 OdreĎivanje patogenih grupa.............................................................. 60 6.10. Prenošenje patogena semenom............................................................ 65 6.11. Molekularna karakterizacija................................................................ 68 VII DISKUSIJA..................................................................................................... 78 7.1. Morfološke karakteristike proučavanih izolata................................... 79 7.2. Dokazivanje savršenog stadijuma....................................................... 80 7.3. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi........................ 83 7.4. Dokazivanje fitotoksina....................................................................... 83 7.5. OdreĎivanje patogenih grupa.............................................................. 88 7.6. Prenošenje patogena semenom............................................................ 89 7.7. Molekularna karakterizacija................................................................ 90 VIII ZAKLJUČAK................................................................................................ 93 IX LITERATURA.................................................................................................. 95 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 1 I. UVOD Uljana repica (Brassica napus var. oleifera L.) spada meĎu četiri najvaţnije uljane biljke u svetu (Marinković i sar. 2007). Najviše se gaji u Kini, Indiji, Australiji, Kanadi i zemljama Zapadne Evrope (Francuska i Nemačka). Na evropskom kontinentu i Australiji uglavnom se gaji ozima forma dok je u Kanadi dominantna jara uljana repica. Uljana repica se gaji zbog semena koje sadrţi 4048% ulja i 1825% proteina (Marjanović-Jeromela i sar. 2002; Marinković i sar. 2003). Ulje kod starih sorti uljane repice se karakterisalo visokim sadrţajem eruka kiselina i glukozinolata. Zbog sadrţaja navedenih materija, ulje nije korišćeno za ishranu ljudi, a sačma zbog prisustva glukozinolata, nije upotrebljavana u ishrani domaćih ţivotinja. U poslednje vreme, selekciom su stvorene sorte i hibridi koji ne sadrţe navedene materije u toksičnim koncentracijama. Pored navedenog načina upotrebe, u mnogim zemljama se ulje uljane repice sve više koristi u proizvodnji biodizela. Mogućnost proizvodnje biodizela iz repičinog ulja predstavlja osnovni razlog za povećanje proizvodnje kod nas (Mitrović i sar. 2009). Iako je uljana repica u Srbiji bila poznata još 30-ih godina prošlog veka, tehnologija proizvodnje i zaštita predstavljaju priličnu nepoznanicu. Smanjenje prinosa, a u nekim slučajevima i preoravanje zasejanih površina, i pored klimatskih faktora i agrotehničkih mera, moţe biti izazvano i neblagovremenom zaštitom (suzbijanje korova štetnih insekata i fitopatogenih gljiva). Uljanu repicu parazitira veći broj patogenih gljiva: Plasmodiophora brassicae Wor. Peronospora parasitica (Pers.) Fr. Alternaria brassicae (Berk.) Sacc, Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. de Not, Leptosphaeria biglobosa Shoem and Brun, Sclerotinia sclerotiouru (Lib.) de Bary, Botrytis cinerea Pers, Erisiphe cruciferarum Opix ex Junell i neke druge. Sve navedene vrste, u zavisnosti od klimatskih i drugih faktora, mogu prourokovati manje ili veće štete na usevu. Na osnovu literaturnih podataka, rak stabla i suva truleţ korena je ekonomski najvaţnija bolest uljane repice u Evropi, Australiji i Severnoj Americi (Fitt et al. 2006). Ovu bolest prouzrokuju dve vrste fitopatogenih Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 2 gljiva iz roda Leptosphaeria i to: Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. de Not anamorfni stadium: Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm i Leptosphaeria biglobosa Shoem and Brun. Obe vrste su prisutne na svim kontinentima (Anon 2004 cit loc. Fitt et al. 2006). Epidemiološki, rak stabla predstavlja najznačajnije oboljenje uljane repice širom sveta (Gosende et al. 2003, Howlett et al. 2001). Intenzitet pojave bolesti zavisi od klimatskih faktora, agrotehničkih mera i otpornosti sorata (Howlett, 2004; Aubertot et al., 2006; Sosnowski et al., 2004). Tako na primer, Pedras et al. (1996) navode da gubici prinosa od Leptosphaeria maculans u Kanadi prelaze godišnje 30 miliona dolara, a u Velikoj Britaniji se smanjenje prinosa, kod osetljivih sorti, kreće i do 50% u godinama kada je napad raka jak (Gladders & Musa 1979). Fitt et al. (2006) navode da štete od ove bolesti na uljanoj repici u Velikoj Britaniji iznose oko 56 miliona evra po vegetacionoj sezoni. U nekim godinama u Nemačkoj moţe biti zaraţeno i preko 70% biljaka (Kruger 1979, Seidel et al. 1984). Parazit prouzrokuje simptome od nicanja pa do zrenja repice . Na kotiledonima, listu i ljuskama simptomi se ispoljavaju u vidu pegavosti, dok na stablu i korenu gljiva prouzrokuje rak, odnosno suvu truleţ (Gabrielson 1983, Paul & Rowlinson 1992). Tokom jeseni, primarne infekcije patogen ostvaruje pomoću askospora koje se oslobaĎaju iz zrelih pseudotecija (Huang et al. 2003, Marcroft et al. 1999, Hammond et al. 1985). Pored askospora, u Australiji piknospore patogena ostvaruju infekciju i prouzrokuju simptome na kotiledonima i hipokotilu (Barbetti & Khangura 2000 cit loc. West et al. 2001, Gosende et al. 2003). Tokom proleća micelija iz lista nastavlja rast i preko lisne drške inficira stablo prouzrokujući simptome raka (Hammond et al. 1985, Thürwächter et al. 1999). U Srbiji, patogen je izolovan sa kupusa glavičara u Vojvodini (Mitrović 1997), a sa uljane repice 1987. godine iz okoline Negotina i tokom 1988. iz Leskovca (Antonijević 1999). U 2005. i 2006. gljiva je izolovana sa biljaka uljane repice u svim proizvodnim regionima Vojvodine (Mitrović i Marinković 2007). Pojava simptoma u mnogome zavisi od vremenskih uslova. U godinama sa sušnim letom, pojava simptoma obično izostaje ili se prvi javljaju krajem novembra ili početkom decembra.. Slika je obrnuta u godinama sa čestim padavinama, naročito u drugom delu Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 3 vegetacije, od početka aprila pa sve do zrenja. Iako za sada nema ekonomskih šteta od ovog patogena kod nas ipak, posmatrano iz godine u godinu, broj pega na listu tokom jeseni i proleća kao i simptomi raka na stablu sve su učestaliji. Masovnija pojava simptoma na nadzemnim organima biljaka navodi nas na razmišljanje da će ovaj parazit u budućnosti kao i u drugim zemljama postati ekonomski vaţno oboljenje uljane repice i kod nas. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 4 II. CILJ ISTRAŢIVANJA Cilj ove disertacije je:  da dâ pregled stanja oboljenja u svetu i kod nas;  da potvrdi postojeća i ostvari nova saznanja o patogenu izučavanjem morfoloških parametara;  da obezbedi nova saznanja o patogenu izučavanjem molekularnih karakteristika  da na osnovu dobijenih rezultata izvrši identifikaciju patogena;  da utvrdi značaj toksina i njihov uticaj na nastanak bolesti;  da odredi patogene grupe;  da diskutuje o postojećim i razradi nove mere kontrole oboljenja. Morfološka karakterizacija će se obaviti proučavanjem uobičajenih mikoloških parametara, a molekularna karakterizacija će se zasnivati na analizi sekvencioniranih delova genoma i genetskoj srodnosti/različitosti izolata gljive dobijenih u ovom radu sa kontrolnim izolatima ovog patogena dobijenim iz Velike Britanije (Center for Agricultural Research, Rothamsted). Rezultati ovih istraţivanja doprineće sagledavanju značaja raka krune i prizemnog dela stabla uljane repice u proizvodnji ove industrijske biljke kao i potpunijem sagledavanju značaja raka korena i stabla uljane repice kod nas, s obzirom na to da ova bolest kod nas nije proučavana. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 5 III. RADNA HIPOTEZA Proizvodnja uljane repice u našoj zemlji je u velikoj meri zavisna od pojave bolesti. Prethodna ispitivanja su pokazala da je bolest prisutna i kod nas. MeĎutim, ni patogen niti bolest nisu detaljnije izučavani. Nedostatak morfoloških i molekularnih istraţivanja ekonomski najznačajnijih bolesti uljane repice u našoj zemlji, kao i problemi vezani za utvrĎivanje prisustva, rasprostranjenosti i učestalosti pojave, njihovu klasifikaciju, identifikaciju, morfološku i molekularnu karakterizaciju ukazali su na potrebu njihovog svestranijeg i detaljnijeg proučavanja. Istraţivanja koja su definisana ovom disertacijom zasnivaju se na pretpostavci da su obe vrste gljiva, uzročnici raka prizemnog dela stabla uljane repice, prisutne i u Srbiji. S obzirom da na osnovu dosadašnjih istraţivanja osim pojave i prisustva ovog oboljenja kod nas drugi parametri patogena nisu detaljnije proučavani, pretpostavka je da će ova studija na osnovu morfoloških i molekularnih istraţivanja ukazati na načine i puteve širenja ovog oboljenja i doprineti unapreĎenju metoda detekcije i identifikacije, pouzdanoj molekularnoj karakterizaciji patogena i dijagnozi oboljenja na uljanoj repici, što je osnova razrade odgovarajućih mera kontrole bolesti. Postavljenim ciljevima, ova disertacija bi predstavljala doprinos ne samo u proučavanju populacije ovog/ih patogena, nego bi bila model sistem za proučavanje populacija i drugih patogena uljane repice u našoj zemlji. Rezultati ovih ispitivanja doprineće potpunijem sagledavanju prisustva ovog oboljenja na području Srbije u usevu uljane repice kao jednoj od najvaţnijih biljaka domaćina. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 6 IV. PREGLED LITERATURE 4. 1. Rasprostranjenost i značaj Rak stabla i suva truleţ korena vaţno je oboljenje uljane repice u Evropi, Australiji i Severnoj Americi (Fitt et al. 2006). Ovu bolest prouzrokuju dve vrste fitopatogenih gljiva iz roda Leptosphaeria: Leptosphaeria maculans (Desm.) ces. and de Not anamorf Phoma lingam (Tode. Fr.) Desmas, koja izaziva rak prizemnog dela stabla i suvu truleţ korena, i Leptospaeria biglobosa Shoem and Brun, koja izaziva simptome u vidu raka na gornjim delovima stabla, uglavnom izazivajući manje štete, dok ozbiljne štete moţe izazvati u zemljama sa višim letnjim temperaturama (Huang et al. 2005, Fitt et al. 2006). Obe vrste se javljaju i u Africi, Srednjoj i Juţnoj Americi i Aziji (Anon. 2004 cit loc Fitt et al. 2006). L. maculans najveće štete prouzrokuje u Zapadnoj Evropi, Australiji i Kanadi (West et al. 2001). Tako na primer Pedras et al. (1996) navode da gubici prinosa koje L. maculans prouzrokuje u Kanadi godišnje prelaze 30 miliona dolara dok se u Velikoj Britaniji, u godinama kada je napad ovog patogena jak, smanjenje prinosa kod osetljivih sorti kreće i do 50% (Gladders & Musa 1979), pri čemu Fitt et al. (2006) navode da smanjenje prinosa, odnosno novčana vrednost neostvarenog prinosa uljane repice u Velikoj Britaniji iznosi oko 56 miliona evra po vegetacionoj sezoni. U Nemačkoj suva truleţ takoĎe predstavlja ekonomski vaţno oboljenje uljane repice. U nekim godinama moţe biti zaraţeno preko 70% biljaka (Krüger 1979 Seidel et al. 1984). Krüger (1978, 1979) navodi da je bolest konstatovana u svim područjima gajenja uljane repice u Nemačkoj. U ranim 70-im godinama dvadesetog veka jake epidemije ove bolesti su zaustavile razvoj industrije uljane repice u Australiji (Bokor et al. 1975). Do sredine 1990, kao isključivi uzročnik raka stabla uljane repice u Poljskoj smatrana je L. biglobosa (Jedryczka et al. 1994). MeĎutim, Karolewski et al. (2002) navode da je L. maculans raširena u zapadnom delu Poljske a L. biglobosa u istočnom delu Poljske. U Češkoj i MaĎarskoj se takoĎe javljaju obe vrste Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 7 gljiva ( Szlavik et al. 2003) dok je u Rusiji dominantna L. biglobosa (Jedryczka et al. 2002). Bolest se reĎe javlja u Škotskoj, Indiji i Kini. West et al. (2001) navode da je u Kini sa uljane repice izolovana samo L. biglobosa. Na području bivše SFRJ Phoma lingam (teleomorf Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. de Not je prvi put registrovana na karfiolu u okolini Splita (Panjaninin, 1965). Cvjetković i sar. (1983) takoĎe navode da je tokom 1982. konstatovana u mnogim proizvodnim regionima Jugoslavije, iako se parazit nalazio na karantinskoj listi. TakoĎe, Mustapić i sar. (1984) navode da postoji opasnost da se rak stabla uljane repice proširi u mnoge proizvodne regione Jugoslavije. U Srbiji parazitna gljiva Phoma lingam je izolovana sa kupusa 1995. godine (Mitrović 1997). Sa uljane repice u Negotinu je izolovana 1987. godine, tokom 1988. u Leskovcu (Antonijević 1999), dok je tokom 2005. i 2006. godine ovaj parazit izolovan u svim proizvodnim područjima uljane repice u Vojvodini (Mitrović i Marinković, 2007). 4. 2. Simptomi U početku pege su male, svetlosmeĎe boje, često nepravilno okruglastog oblika, ponekad okruţene hlorotičnim tkivom. Pege izazvane izolatima A grupe L. maculans se povećavaju starenjem. U okviru njih se obrazuju sitna crna telašca-piknidi gljive (West et al. 1999). Ponekad centralni deo pega na listu ispada usled udara kišnih kapi. B grupa izolata L. biglobosa, takoĎe prouzrokuje sitne mrke pege sa vrlo malo piknida u okviru njih ili bez piknida (Brun et al. 1997, Thürwächter et al. 1999). Na hipokotilu micelija izaziva suţenje neposredno iznad površine zemlje ili ispod prvih listova. Vremenom suţeni deo stabla postaje crne boje. U Zapadnoj Australiji na pojedinim parcelama, u povoljnim godinama za razvoj parazita, moţe biti zaraţeno i preko 70% biljaka u fenofazi kotiledona (Barbetti & Khangura 1999). U Evropi je pojava simptoma na hipokotilu retka (Paul & Rawlinson 1992). Tokom proleća micelija gljive iz lista preko lisne drške inficira stablo (Hammond & Lewis 1987b, Thürwächter et al. 1999). Na prizemnom delu stabla, kruni ili vratu korena pege su oivičene tamnobraon ili ljubičastom marginom. Ovakve pege se mogu često zapaziti na listovima tokom jeseni u Zapadnoj Evropi (Hammond et al. 1985). Tokom obrazovanja plodova- ljuski i sazrevanja semena pege na stablu se šire i spajaju Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 8 obrazujući veću nekrotičnu površinu. Tkivo u okviru pega puca pa dolazi do stvaranja suve truleţi ili raka (Paul i Rawlinson 1992; Mitrović i Trkulja, 2010). Pored prizemnog dela stabla, simptomi se mogu često zapaziti i na gornjem delu stabla (Hammond et al. 1985; Williams i Fitt, 1999). Pege na gornjem delu stabla i granama su izduţenog oblika, sivosmeĎe boje, oivičene tamnim rubom. U kasnijem periodu, centralni deo pega postaje sivobele boje s brojnim crnim piknidima. Pege mogu biti duge i do nekoliko cm (Mitrović i Trkulja, 2010). Često se moţe zapaziti prevremeno sazrevanje biljaka koje ima za rezultat značajno smanjenje prinosa. Uvenuće biljaka je često prouzrokovano prstenastim obuhvatanjem stabala (Davies 1986) ili razaranjem unutrašnjih tkiva vrata korena usled čega dolazi do poremećaja u transportu vode (Mitrović i Marinković, 2007; Mitrović i Trkulja, 2010). U povoljnim uslovima (temperatura vlaga) parazit prouzrokuje slične pege i na ljuskama koje pucaju i prevremeno sazrevaju (Petrie i Vanterpool, 1974). Sa zaraţenih ljuski parazit prelazi na seme što moţe predstavljati problem ako se takvo seme koristi za setvu (Wood & Barbetti 1977a, Kharbanda & Stevens 1993). Jače inficirano seme je sitno, sivobele boje, dok je manje kontaminirano seme sivo do svetlocrvenkasto. U oba slučaja, pored male upotrebne vrednosti, ovakvo seme je neupotrebljivo za setvu (Mitrović i Trkulja 2010). Pored navedenih simptoma parazit prouzrokuje uvelost i propadanje cvetova. U prvim fazama dolazi do uvenuća a kasnije cvetovi postaju rudimentirani, tamne boje. U ovoj fazi cvetne grančice i drške cvetova postaju sivobele boje na kojima se zapaţaju plodonosna tela gljive – piknidi (Mitrović i Trkulja 2010). 4. 3. Biologija i epidemiologija gljive Tode (1791 cit. loc. Pound 1947) je opisao suvu truleţ (blackleg) na mrtvim stablima kupusa i njenog prouzrokovača nazvao Sphaeria lingam. S obzirom na to da je gljivu našao na mrtvim stablima kupusa, smatrao je da je u pitanju saprofitni organizam. MeĎutim, Desmaziéres (1849 cit. loc Pound 1947) je istu gljivu pronašao tokom vegetacije (na ţivim biljkama), nakon čega ju je preimenovao u rod Phoma. Potom je Rostrup (1894 cit. loc Pound 1947) u Danskoj opisao slično oboljenje na beloj rotkvi (repa) i prouzrokovača opisao kao Phoma napobrassicae Rostrup. MeĎutim, Henderson Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 9 (1918 cit loc. Pound 1947) je detaljnim izveštajem o pojavi Phoma lingam na kupusu u drţavi Wisconsin, SAD, opisao dve vrste piknida koje stvara gljiva. Isti autor navodi da postoje značajni dokazi da je P. napobrassicae u stvari vrsta Phoma lingam. Smith (1956) je otkrio savršeni stadium Leptosphaeria maculans na stabljikama uljane repice na Novom Zelandu mada se u literaturi često susreće da je savršeni stadium otkriven na Novom Zelandu 1957. godine (Anonimus 1957 cit. loc. Williams 1992). Gljiva se u prirodi odrţava pomoću piknida, micelije i pseudotecija. Piknidi se obično prenose semenom dok su pseudotecije prisutne u biljnim ostacima. U povoljnim uslovima temperature i visoke relativne vlaţnosti, piknidi i pseudotecije oslobaĎaju obilnu količinu konidija (piknospore) i askospora (Williams 1992). Prilikom setve zaraţenog semena piknidi na semenu pod uticajem zemljišne vlage pucaju i oslobaĎaju piknospore koje mogu zaraziti hipokotil ili se simptomi ispoljavaju u vidu pegavosti na kotiledonima (Barbetti & Khangura 2000 cit. loc. West et al. 2001). U okviru pega na kotiledonima stvaraju se novi piknidi. Ovi piknidi u povoljnim uslovima oslobaĎaju piknospore koje se kišnim kapima i insektima prenose na nove biljke. Piknospore klijaju u infekcionu hifu i preko stoma ili povreda inficiraju biljno tkivo. Uloga piknospora u epidemiologiji bolesti je u Zapadnoj Evropi minimalna ali je veoma značajna u Zapadnoj Australiji (West et al. 2001). S obzirom da je utvrĎeno da u Australiji infekciju klijanaca (faza kotiledona) osim askospora mogu prouzrokovati i piknospore gljive (Barbetti & Khangura 2000 cit. loc. West et al. 2001). Kontaminirano seme takoĎe moţe biti izvor inokuluma za početne infekcije kotiledona. Ove infekcije rezultiraju pojavom pega kruţnog oblika sa velikim brojem formiranih piknida u početnim stadijumima razvoja biljaka (Sylvester-Bradley & Makepeace 1985). Mogućnost prenošenja patogena semenom kupusa, uljane repice, rotkve i drugih kupusnjača je verovatno doprinela da je ova gljiva prisutna na svim kontinantima (West et al. 2001). Pored piknospora, parazit moţe ostvariti zarazu i askosporama. U Velikoj Britaniji i drugim zemljama Zapadne Evrope, askospore predstavljaju glavni izvor inokuluma za pojavu raka stabla na uljanoj repici (McGee 1977, Schramm & Hoffmann 1991, Gladders & Musa 1980). Nakon ţetve gljiva se na zaraţenim biljkama (stablima) odrţava u formi saprofitne micelije (Williams 1992). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 10 Ubrzo posle ţetve pseudotecije mogu biti vidljive na prizemnom delu stabla (područje simptoma bolesti), dok se na gornjim delovima stabla plodonosna tela formiraju nekoliko nedelja kasnije (Hammond 1985 cit. loc. West et al. 1999). Gljiva moţe da opstane u biljnim ostacima i nekoliko godina (Petrie 1986). Ipak, najveća produkcija askospora je u prvoj godini posle ţetve (McGee 1977; Sosnowski et al.2006; Naser et al.2008). Glavni vremenski faktori koji utiču na dozrevanje pseudotecija i oslobaĎanje askospora su temperatura i vlaţnost (Pérés & Poisson 1997). Formiranje pseudotecija na temperaturi od 1520°C je dosta slično za obe vrste (L. maculans, L. biglobosa), dok L. biglobosa pri temperaturi ispod 10°C formira pseudotecije vrlo sporo (Toscano-Underwood et al. 2003). Pri temperaturi 5°C sazrevanje i oslobaĎanje askospora traje manje od 58 dana, dok na 15°C traje 22 dana. Najjače infekcije lista su primećene pri temperaturi od 15 do 20°C i duţini vlaţenja lista od 48 časova (Toscano- Underwood et al. 2001). MeĎutim, infekcije se ostvaruju i na temperaturi od 5 do 20°C i duţini trajanja vlaţnog perioda od 8 do 72 časa (Toscano-Underwood et al. 2001). Biddulph et al. (1999a cit. loc. West et al. 1999) navodi da se infekcija listova moţe ostvariti na temperaturi od 4 do 20°C i duţini vlaţenja lista duţe od 4 časa. U uslovima Srednje i Zapadne Evrope oslobaĎanje askospora započinje u septembru ili oktobru najviše 1 do 2 meseca kasnije (Thürwüchter et al. 1999),dok u sušnim regionima Zapadne Australije obrazovanje pseudotecija i oslobadjanje askospora započinje 18 meseci nakon ţetve (Gladders et al.2006). U Istočnoj Evropi oslobaĎanje askospora je utvrĎeno i tokom aprila sledeće godine (Fitt et al. 2006). OsloboĎene askospore padaju na površinu lista i u povoljnim uslovima inficiraju listove preko stoma ili povreda. Infekciona hifa se širi u biljnom tkivu obrazujući haustoriju, nakon čega ona raste dalje prouzrokujući prve vidljive simptome infekcije palisadnih ćelija (Hammond & Lewis 1987a). Izumiranjem palisadnih ćelija javljaju se prvi simptomi bolesti na biljkama. A- grupa (L. maculans) na mestu infekcije izazivaju male tamne pege u okviru kojih gljiva stvara brojne piknide, dok B-grupa prouzrokuje nešto sitnije pege, tamne boje, sa nekoliko piknida ili bez stvaranja piknida na biljkama (Brun et al. 1997). Nastale pege se tokom jeseni povećavaju i postaju različitog oblika. Tokom zime i početkom proleća micelija se razvija interćelijski i preko lista i lisne drške dolazi do stabla (Hammond & Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 11 Lewis 1987a). U kontaktu micelije gljive i stabla uljane repice patogen sa biotrofnog načina ishrane prelazi na nekrotrofni, izazivajući tipične simptome raka na stablu (Hammond & Lewis 1987b). Na stablu osetljivih vrsta biljaka A grupa L. maculans prouzrokuje intenzivne povrede kortikalnog tkiva koje su svetlosmeĎe boje, često oivčene tamnijom marginom, dok B grupa veoma retko izaziva povrede korteksa ali preko povreda lisne drške inficira srţ stabla bez vidljivih spoljnih simptoma (Wes et al. 1999). 4. 4. Razlike izmeĎu L. maculans i L. biglobosa U ranijem periodu populacija gljive L. maculans na osnovu patogenosti izolata je bila deljena u dve grupe koje su označene kao virulentne ili slabovirulentne – avirulentne (McGee & Petrie 1978 Koch et al. 1989 Badawy & Hoppe 1989),zatim na osnovu RFLP analize u grupa A i B (Johnson & Lewis 1990) odnosno Tox + izolati koji stvaraju toksične materije (fitotoksine) i Tox 0 koji ne produkuju navedene materije (Balesdent et al. 1992). Jake epidemije u Australiji prouzrokuje samo grupa A, dok u Kanadi i Zapadnoj Evropi štete pričinjavaju obe grupe (Wes et al. 2001). Brun et al. (1997) i Williams and Fitt (1999) navode da se grupe razlikuju po virulentnosti, odnosno da je grupa A visoko virulentna, dok je grupa B manje virulentna. U novije vreme virulentnost izolata L. maculans se vezuje za „effector“ molekule. To su mali molekuli koji obavijaju proteine bogate cisteinom ili se vezuju na odreĎena mesta enzima prouzrokojući njihovu aktivnost, koja se ogleda u ispoljavanju fitotoksičnosti (Hogenhout et al. 2009). Koch et al. (1991) i Mengistu et al. (1991) su proučavali virulentnost različitih izolata L. maculans na tri sorte uljane repice (Westar, Quinta i Glacier) i svrstali ih u 4 patogene grupe: PG2, PG3 i PG4, dok su svi slabo virulentni izolati svrstani u PG1. Kuusk et al. (2002) navode da se patogene grupe (PG) 2, 3 i 4 mogu svrstati u grupu A a PG1 u grupu B. Na osnovu RFLP analize i analize izoenzima utvrĎeno je da agresivni izolati formiraju kompaktnu grupu koja se razlikuje od slabo virulentnih izolata. Istim metodama je, takoĎe, utvrĎeno da se slabo virulentni izolati mogu svrstati u tri podgrupe: NA1 NA2 i NA3 (Koch et al. 1991, Gall et al. 1995). Gall et al. (1995) Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 12 navode da je NA1 podgrupa dominantna u Evropi, dok je NA2 više zastupljena u Kanadi. Balesdent et al. (1998) je predloţio mogućnost identifikacije vrsta i podvrsta unutar Leptosphaeria kompleksa zasnovanu na ITS restrikcionom profilu korišćenjem 5 enzima AluI, BamHI, HaeIII, EcoRII i RsaI. Na osnovu dobijenih rezultata Balesdent et al. (1998) je podelio Leptosphaeria kompleks u 7 grupa: (1.) Brassica Tox + , (2.) Lepidium Tox + , (3.) Brassica Tox 0 NA1 podgrupa, (4.) Brassica Tox 0 NA2 podgrupa, (5.) Brassica Tox 0 NA3 podgrupa (6.) Erysimum Tox 0 i (7.) Thlaspi Tox 0 . Na osnovu AFLP istraţivanja internacionalne kolekcije reprezentativnih izolata (The International Blackleg of Crucifers Network IBCN) Purwantara et al. (2000) predlaţe dalje podgrupisanje u nekim od ovih 7 grupa. Osim razlika u molekularnim i virulentnim karakteristikama, meĎu izolatima postoji razlika i u produkciji fitotoksina sirodezmin PL (Koch et al. 1989). Sirodezmin PL je proizvod patogene gljive L. maculans i pripada klasi epipolitiodioksipiperazina (ETP) koji se karakteriše prisustvom disulfidnog mosta (Gardiner et al. 2004, 2005). Diketopiperazinski prsten potiče od cikličnog dipeptida i sumporni mostovi su odgovorni za sve poznate toksične efekte ovih molekula (Mullbacher et al. 1986). Pored sirodezmina, PL u filtratu kulture su otkriveni i drugi sirodezmini (sirodezmin B, C, H, K) (Badawy & Hope 1989, Pedras & Seguin-Swartz 1992, Pedras et al. 2007, Pedras et al. 2008a, Mitrović et. al., 2012). Mnogi selektivni toksini imaju odreĎenu ulogu u virulentnosti patogenih gljiva (Howlett 2006, Wolpert et al. 2002). Uloga neselektivnih toksina u virulentnosti je sloţenija, a produkcija toksina nije uvek u korelaciji sa virulentnošću (Elliott et al. 2007). Sirodezmini su neselektivni toksini koji izazivaju hlorozu, nekrozu, inhibiraju rast korena i odumiranje biljnih ćelija kod domaćina i biljaka koje nisu domaćini (Badawy & Hoppe 1989, Fox & Howlett 2008). Pored navedenog, ova jedinjenja se odlikuju antibakterijskim i antivirusnim osobinama (Rouxel et al. 1988). Prisustvo sirodezmina nespecifičnog za domaćina u filtratu kulture je omogućilo razvrstavanje izolata u Тоx+ ili Тоx0 (Balesdent et al. 1992, Fitt et al. 2006). Postojanje dva različita RFLP profila, povezana sa razlikama u patogenosti i proizvodnji pigmenta u tečnoj kulturi omogućuje klasifikaciju izolata u A (jako virulentni Тоx+) ili B (slabo virulentni Тоx0) grupu (Fitt Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 13 et al. 2006). U odsustvu RFLP analize agresivni (virulentni) izolati se mogu svrstati u grupu A na osnovu produkcije sirodezmina PL i nemogućnosti obrazovanja pigmenata u tečnoj Czapek-ovoj podlozi (Brun et al. 1997). Oznaka za B grupu je korišćena za slabo virulentne i avirulentne izolate, koji ne produkuju sirodezmin ali stvaraju pigment u tečnoj Czapek-ovoj podlozi (Williams & Fitt 1999). Brojna ranija istraţivanja ukazuju da izolati A grupe imaju spor i nepravilan rast na nizu agaroznih podloga, dok izolati B grupe imaju brz i pravilan oblik kolonije (Humpherson-Jones 1986, Koch et al. 1989). Prema literarnim navodima (Fitt et al. 2006, West et al. 2001) B grupa (Leptosphaeria biglobosa) pričinjava male štete na uljanoj repici koje se ogledaju u pegavosti gornjih delova stabla. MeĎutim, Balsedent et al. (1992) i Brun et al. (1997) navode da B grupa pored pegavosti lista moţe prouzrokovati i infekciju srţi stabla. U in vitro uslovima, ponovljive razlike u morfologiji pseudotecija i nemogućnost ukrštanja A sa B grupom pojedinačnih askospora i ukrštanje suprotnih tipova sparivanja A sa A ili B sa B ukazale su da su dve grupe različite vrste nazvane Leptosphaeria maculans za A grupu i Leptosphaeria biglobosa za NA 1 B grupu (Somda et al. 1997, Shoemaker & Brun 2001). Na osnovu molekularnih karakteristika, vrste domaćina i geografskog porekla (Mendes-Pereira et al. 2003) su Leptosphaeria kompleks poodelili u 7 grupa: Leptosphaeria biglobosa brassicae, Leptosphaeria biglobosa canadensis, Leptosphaeria biglobosa erysimi, Leptosphaeria biglobosa thlaspii, Leptosphaeria biglobosa australensis, Leptosphaeria maculans brassicae i Leptosphaeria maculans lepidii. Pored razdvajanja Leptosphaeria kompleksa u dve različite vrste odnosno u 7 grupa (vrsta) kod L. maculans je otkriveno 10 rasa označenih kao Avrlm1 do Avrlm9 i alm1 (Balesdent et al. 2002, 2005) i dve rase označene kao LepR1 i LepR2 (Yu et al. 2005). Za svaki AvrLm kod gljive je pronaĎen major gen kod uljane repice, označen kao RLm (Balesdent et al. 2005). Na osnovu genetičke raznolikosti, u populaciji L. maculans, dokazivanje i klasifikacija patogena se vrši pomoću diferencijalnog seta sorti kod kojih je utvrĎen RLm gen koji odgovara odreĎenom Avr lokusu L. maculans. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 14 4. 5. Morfološke karakteristike Na krompir dekstroznoj podlozi (PDA), u zavisnosti od izolata i lokaliteta, gljiva obrazuje vazdušnu miceliju, sivobele boje, dok je supstratna micelija mlečnobele boje. Vremenom dolazi do obrazovanja bledocrnog pigmenta u podlozi (Pound 1947). Kolonije su pravilnog ili nepravilnog oblika, često sa reţnjevitom ivicom (Pound 1947, Mitrović 1997). Humpherson-Jones (1986) i Koch et al. (1989) navode da izolati A grupe imaju spor i nepravilan rast na nizu agarizovanih podloga, dok izolati B grupe imaju brz porast i pravilan oblik. Mitrović (1997) takoĎe navodi da avirulentni izolati imaju brz porast u odnosu na virulentne izolate. Piknidi su dosta ravnomerno rasporeĎeni na površini kolonije i crne su boje. Gljiva obrazuje dva tipa piknida: tip 1 su piknidi skleroidnog oblika mrke boje sa suţenom ostiolom prečnika 200500 μm i Tip 2 su piknidi loptastog oblika, crni, prečnika 200600 μm sa zidom koji je sastavljen od nekoliko slojeva ćelija od kojih je spoljašnji sloj ćelija sa zadebljanim zidom. Konidije (piknospore) su bezbojne, cilindrične, jednoćelijske, uglavnom prave, neke iskrivljene, sa ili bez kapi ulja na krajevima, veličine 35 x 1,52 μm (Punithalingam & Holliday 1972). Osim piknida gljiva obrazuje i savršeni stadijum. Pseudotecije se obrazuju na stabljikama nakon skidanja useva. U početku su uronjene u biljno tkivo a vremenom dolazi do pucanja epidermisa i do pojavljivanja ostiola pseudotecija na površinu stabljike. Pseudotecije su crne, loptaste, sa ili bez ostiole, prečnika 300500 μm (Punithalingam i Holliday, 1972). Pseudotecije sadrţe veći broj askusa, a u svakom askusu se nalazi 8 askospora (West et al. 1999, Thürwächter et al. 1999). Askospore su prave do blago povijene, na krajevima su suţene i zaobljene, u početku svetlobraon a kasnije ţutobraon, sa po 5 septi veličine 3570 x 58 μ (Punithalingam & Holliday 1972; Williams 1992). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 15 V. MATERIJAL I METOD RADA 5. 1. Izolacija gljive i dobijanje monospornih kultura Kulture gljiva izolovane su iz obolelih biljnih delova uljane repice koji su prikupljeni iz devet lokaliteta (Karavukovo, Crvenka, Prigrevica, Subotica, Rimski šančevi, Srbobran, Beška, Banatsko KaraĎorĎevo, Srpski Miletić) u periodu od 2008 do 2010. godine. Gljive su determinisane na osnovu morfoloških karakteristika (porast, izgled i boja micelije, izgled ivice kolonije, prisustvo plodonosnih tela, lučenje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi, graĎa i izgled micelije, veličina, oblik, boja i graĎa pseudotecija, piknida, askusa, askospora i piknospora L. maculans; L. biglobosa), produkciji fitotoksina i virulentnosti izolata na diferencijalnim sortama. Od ukupnog broja (121 izolat), dva izolata su dobijena iz Velike Britanije označeni kao L.m (L. maculans) i L.b (L. biglobosa) i sluţili su kao kontrolni izolati u daljim istraţivanjima, dok su ostali izolati poreklom iz Srbije. Izolacija je raĎena standradnim fitopatiološkim metodama. Isečeni su sitni fragmenti sa obolelih biljnih organa i potopljeni u 3% rastvor natriumhipohlorita u trajanju od 3 do 5 minuta, a nakon toga su isprani destilovanom vodom i prirodno sušeni u kontrolisanim uslovima. Nakon sušenja, fragmenti obolelog tkiva su naneti na hranjivu podlogu od krompir dekstroznog agara (PDA) (Difco Detroit USA) koja je prethodno razlivena u Petri kutije. Da bi se sprečio razvoj bakterija, u podlogu je dodavano 50 mg streptomicin- sulfata (Galenika Beograd, Srbija) po litru. Petri kutije sa ovakvo zasejanom podlogom su stavljene u termostat na temperaturi od 25±1ºC. Posle 1015 dana je posmatrano obrazovanje sporonosnih organa pod binokularom. Dobijanje čistih kultura (izolata) je uraĎeno na sledeći način: Piknospore, koje se oslobaĎaju iz piknida u vidu jedne sluzaste kapljice, poreklom sa hranjive podloge, vrhom kopljaste igle su prenete u Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 16 plastične epruvete u kojima je prethodno dodato 2 ml sterilne vode. Pripremljena suspenzija konidija je razlivena u Petri kutije. Posle 48 časova je posmatrano klijanje konidija pod binokularom. Klijale konidije, zajedno sa delom podloge, prenete su na PDA podlogu i stavljene u termostat na 25±1ºC radi razvoja monospornih izolata gljive. Na ovaj način je izolovano 119 izolata gljive koji su korišćeni u daljim ispitivanjima. Pored ovih izolata korišćena su i dva referentna izolata dobijena iz Centra za poljoprivredna proučavanja, Rothamsted, iz Velike Britanije, a označeni su sa L.m (Leptosphaeria maculans) i L.b (Leptosphaeria biglobosa). Izolati koji su izolovani u Vojvodini označeni su početnim slovom biljnog dela (K-koren, C-cvet, L-list, S-seme) sa koga su izolovani, izuzev izolata sa stabla koji su označeni sa dva slova (St-prizemno stablo do 30 cm visine, GS-gornji delovi stabla i grana i Lj-ljuska). Nakon toga, determinsani izolati su presejani na kosu PDA podlogu i čuvani na temperaturi + 4oC. 5. 2. Morfološke karakteristike Na PDA podlozi pri temperaturi 25±1ºC proučavane su makroskopske osobine izolata (12 izolovanih i 2 kontrolna) gljive (porast, izgled i boja micelije, izgled ivice, kolonije, prisustvo plodonosnih tela, miris i lučenje pigmenata), kao i mikroskopske odlike (graĎa i izgled micelije, veličina, oblik, boja i graĎa askusa piknospora i askospora i merena veličina pseudotecija i piknida) (Muntanjola-Cvetković 1987). Ogled je postavljen u četiri ponavlja. Korišćeni su sledeći izolati: L.m i L.b kao referentni izolati i izolati K-112, K-113, K-114, K-115, K-117, K-8, LJ-3, L-10, GS-27, St-12, S-2 i C-5. Porast micelije navedenih izolata je izraţen u cm posle 5, 10 i 15 dana. 5. 3. Dokazivanje postojanja teleomorfnog stadijuma gljive Prisustvo savršenog, teleomorfnog stadiuma (L. maculans) je ispitivano na dva načina: Ţetveni ostaci sa jasno izraţenim simptomima oboljenja su prikupljeni u lokalitetu Crvenke, u plastične kese (Magyar et al. 2006). Materijal je donet u Institut za ratarstvo i povrtarstvo i stavljen na površinu zemljišta. Neposredno u blizini ţetvenih ostataka je Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 17 postavljen Burkardov hvatač spora (Burkard Manufacturing Co.Ltd) (McGee 1977, Thürwächter et al. 1999). Ogled je postavljen 10. oktobra. Zbog nedostatka padavina tokom oktobra, stabljike su prskane vodom (35 mm/m2) svaka 2 do 3 dana (Pérés et al. 1999). Mikroskopski pregled traka na Burkardovom hvataču spora je vršen svaki 7 dan. Nakon 20 dana je izvršen binokularni i mikroskopski pregled delova stabla. Pregledom je utvrĎeno obrazovanje pseudotecija sa askusima bez askospora. Tom prilikom su uzeta inficirana stabla (10 cm duţine) koja su prethodno oprana česmenskom vodom i stavljena u polietilenske kese (Poisson & Pérés 1999; Naseri et al. 2009). U svaku plastičnu kesu, pod kosim uglom, stavljeno je po 5 stabljika (ukupno 5 kesa) i dodato 2530 ml destilovane vode. Kese su delimično zatvorene i u uspravnom poloţaju stavljene u kontrolisane uslove sa 12 h fotoperiodom. Noćna temperatura je podešena na 810ºC a dnevna 1315ºC. Destilovana voda je dodata da bi obezbedila potrebnu vlaţnost za obrazovanje pseudotecija askusa i askospora i za sakupljanje askospora, koje su kasnije korišćene za proveru patogenosti. Prvi pregled je uraĎen nakon 5 dana a naredni pregledi su vršeni svaka 2 dana. Nakon pojave askospora izvršeno je merenje pod mikroskopom zrelih pseudotecija, askusa i askospora i proučena graĎa i oblik askospora. Pored morfoloških karakteristika, ispitivana su i patogena svojstva askospora na sledeći način: U dţifi saksije, koje su prethodno napunjene kompostom, rasaĎeno je po 5 klijalih semena uljane repice sorte Banaćanka. U 3 saksije kotiledoni su povreĎeni sterilnom iglom. Na povreĎeni deo mikropipetom je naneto 5 µl suspenzije askospora 10 5 (Koch et al. 1989). U sledeće 3 saksije kotiledoni su takoĎe povreĎeni, a inokulacija je raĎena prskanjem kotiledona ručnom prskalicom. Kod treće grupe biljaka inoklulacija je raĎena prskanjem bez prethodnog povreĎivanja kotiledona. Kontrolne biljke uljane repice su tretirane destilovanom vodom. Inokulisane biljke, zajedno sa kontrolom, stavljene su u kontrolisane uslove na 15ºC i 95% RH 24 časa a zatim su prenete u staklenik. Prvi pregled biljaka izvršen je posle 5 dana a pojava simptoma i promene na biljkama su posmatrane u narednih 20 dana. Reizolacija patogena iz obolelih delova je uraĎena nakon pojave simptoma. Suspenzija askospora je napravljena na sledeći način: pomoću stereo mikroskopa pseudotecije, zajedno sa delovima biljnog tkiva, odvojene su kopljastom iglom od Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 18 ostalog dela stabla i stavljene u destilovanu vodu (Mengistu et al. 1993). Ova mešavina je preneta u epruvetu i ručno protresana. Zatim je sadrţaj iz epruveta zajedno sa suspenzijom spora iz kesa proceĎen kroz sito (140 MESHA) u cilju odvajanja pseudotecija i askusa od askospora. Pomoću hemocitometra koncentracija suspenzije je podešena na oko 105 askospora po ml Suspenzija askospora je stavljena u kontrolisane uslove temperature 15ºC u narednih 48 h. Nakon klijanja askospora izvršena je provera patogenosti kako je prethodno opisano. Nastanak (formiranje) pseudotecija i askospora u laboratorijskim uslovima je uraĎena po metodi (Petrie & Lewis 1985, Mengistu et al. 1995) uz odreĎene modifikacije. Drvenasti delovi stabla ili grana bez simptoma oboljenja 8-9 cm duţine su stavljeni u Petri kutije i dva puta sterilisani na 120ºC u trajanju od 20 min. Nakon sterilizacije u Petri posude je razlivena podloga od vodenog agara u koju je prethodno dodato 50 mg streptomycin-sulfata. Tabela 1. Ukrštanje virulentnih izolata L. maculans i slabovirulentnih izolata L. biglobosa Izolati Lm GS-13 C-2 K-112 LJ-1 St-1 K-11 St-1 + – + – – + + C-2 + + + + – + – Lm + + + + + + – GS-13 + + + – – – – GS-11 + + + + – – – GS-4 + – + + + + + St-6 + + – – – + + K-16 + + + – – – + K-112 + + + + + – – K-118 + + + + + + + S-4 + + – + + + – S-10 + – + – + – + L-4 + + + – + – – L-8 + – + + + + – LJ-2 + + + – – + – K-23 + – + – – + + + - izolati koji su meĎusobno ukrštani – - izolati koji nisu meĎusobno ukrštani Sa PDA podloge fragment micelije i piknida je stavljen pored stabla na 2-3 mesta. Sa druge strane je paralelno postavljen drugi izolat. U ovim ispitivanjima su korišćeni sledeći izolati: L.m, St-1, C-2, GS-13, GS-11, GS-4, St-6, K-16, S-4, S-10, L-4, L-8, LJ- Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 19 2, K-23, LJ-1, K-11 (L. maculans) i K-112 i K-118 (L. biglobosa). Kulture su inkubirane na 25ºC±1ºC, 6 dana u tami, a zatim je rast kultura nastavljen u blizini fluorescentne svetlosti od 320-380 nm sa 12 h fotoperiodom i temperaturom 16ºC. Obrazovanje pseudotecija je praćeno u narednih 10 nedelja. Ukrštanje izolata (mating- type) je prikazano u tabeli 1. 5. 4. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi U cilju razdvjanja izolata i odreĎivanja njihove pripadnosti proučavanim gljivama (L. maculas i L. biglobosa), analizirali smo obrazovanje pigmenata u tečnoj Czapek- ovoj podlozi. Podloga je razlivena u epruvete i sterilisana u autoklavu na 120ºC u trajanju 20 minuta. U svaku epruvetu je razliveno 10 ml podloge. Nakon hlaĎenja na podlogu je naneta micelija gljive (L. maculans: L.m, St-5, C-3, S-11 i L. biglobosa: K- 113, K-115), a zatim su epruvete stavljene u uslove kontrolisane temperature (20ºC) i 12 h fotoperiodom (McGee & Petrie 1978). Formiranje pigmenta je praćeno u naredne 4 nedelje na osnovu promene boje podloge. 5. 5. Ekstrakcija, izolacija i karakterizacija fitotoksina Za ekstrakciju, izolaciju i karakterizaciju fitotoksina je korišćeno 5 izolata gljive (K-113, C-3, St-5, S-11 i L.m). Svih 5 izolata ponaosob je zasejano u Czapek-ovu tečnu podlogu (McGee & Petrie 1978) koja je prethodno razlivena u epruvete. Izolati su gajeni u kontrolisanim uslovima temperature 20ºC sa 12 h fotoperiodom. Nakon 30 dana je izvršeno filtriranje, odnosno micelija gljive je odvojena od tečne podloge. Filtrat je ekstrahovan etil-acetatom (6 ml etil-acetata je dodato u 5 ml filtrata kulture) (Koch et al. 1989, Pedras & Bisesenthal 2001). Voda iz organskog ekstrata je odvojena dodavanjem natrium-sulfata (Na2SO4). Na2SO4 je odstranjen filtriranjem kroz kvalitativni filter papir nakon čega je vršeno uparavanje u struji azota. Suvi ostatak je, potom, rastvoren u 100 ml hloroforma, na sobnoj temperaturi. Hlorofomski rastvor je staklenim kapilarom nanet na tankoslojnu (TLC) ploču (silikogel 6,20x20 cm x0,25 mm Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 20 Macherey-Nagel) i potom stavljen u kadu za razvijanje, u kojoj se nalazi kao razvijač etil-acetata: hloroform u odnosu 1:1. Posle razvijanja, ploča je izvaĎena iz kade, osušena u sušnici na 20ºC i posmatrana pod UV lampom (254 nm), pri čemu je jasno uočeno nekoliko izdiferenciranih traka za koje je na osnovu literaturnih podataka (Koch et al. 1989) pretpostavljeno da odgovaraju fitotoksinima, a na osnovu dobijenih preliminarnih rezultata postavljen je ponovo eksperiment sa većom količinom podloge za preparativno izolovanje fitotoksina. Na preparativnu ploču (silikogel G, debljina sloja 2 mm, Macherey-Nagel) nanet je hloroformski rastvor i uzorak je razvijen prema prethodno navedenom postupku. Mrlje detektovane pod UV svetlošću (označene sa 1, 2a, 2b, 2c, 2d i 3) su skinute sa preparativne ploče i svaka pojedinačno ekstrahovana u apsolutnom etanolu (20 ml) na sobnoj temperaturi, uz mešanje, u trajanju od 2 h. Nakon toga, etanolni ekstrakt je dekantovan i prečišćen preko kolone sefadeksa (SPE BARKER Bond SEPAA dex 625) prethodno kondicionirane sa 10 ml etanola. Etanolni filtrat je uparen u struji azota, a zatim je suvi ostatak korišćen za identifikaciju fitotoksina LC- MS-MS metodom i fitotoksični test. 5. 6. Identifikacija fitotoksina LC – MS – MS metodom Suvi ostaci su ponovo rastvoreni u 0,5% etanolu a zatim su ispitani tehnikom tečne hromatografije sa tandemskom masenospektrometrijskom detekcijom. Korišćen je Agilent Tecnologies series 1200 Rapid Resolution Liquid Chromatograph instrument uparen sa Agilent Tecnologies series 6410A Triple – Quad masenim detektorom sa elektrosprej jonskim izvorom. Injektovano je 1 µl nerazblaţenog uzorka. Komponente su razdvojene na Zorbax Eclipse XDB-C18 koloni dimenzija 50mm x 4,6 mm x 1,8 µm (Agilent Technologies) temperiranoj na 40ºC uzorak je eluiran u gradientnom modu: 0 min 30% B 710 min 100% B post time 2,5 min uz protok mobilne faze od 1 ml/min pri čemu je kao komponenta A korišćen 0,1% vodeni rastvor mravlje kiseline a kao komponenta B – 0,1% rastvor mravlje kiseline u acetonitrilu. Praćen je UV signal eluata na 210 nm i 240 nm (širina trake u oba slučaja 4 nm) uz 550 nm (širina trake 100 nm) kao referentnu talasnu duţinu. Kompletan eluat prosleĎen je u Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 21 elektrosprej jonski izvor bez deljenja toka. Parametri jonskog izvora bili su: pritisak nebulajzera 40 psi temperatura gasa za sušenje 350ºC protok gasa za sušenje 9l/min napon na kapilari 4000 V napon fragmentora 100 V. Svi uzorci su prvo analizirani u MS2Scan modu (MS 1 eksperiment) uz pozitivni polaritet u m/z opsegu 150900. Zatim je reprezentativni uzorak (1/2b) analiziran u Production Scan modu (MS 2 i pseudo MS 3 eksperimenti) uz (M + N) + jone predpostavljenih pikova sirodezmina kao jone prekursore i kolizioni napon 030 V (uz 10 V inkremente). Svi dobijeni podaci odreĎeni su u MassHunter Workstattion-Qualitative Analysis (ver. B.03.01) softveru (Agilent Technologies). U ispitivanim uzorcima detektovan je niz pikova jedinjenja čija molekulska masa i izotopski profil odgovaraju sirodezminima. LC-MS-MS analiza je uraĎena u laboratoriji za organsku hemiju Prirodno-matematičkog fakulteta Novi Sad, Departman za hemiju biohemiju i zaštitu ţivotne sredine. 5. 7. Ispitivanje fitotoksičnosti Na osnovu preparativnog izolovanja i LC – MS – MS analize izvršeno je ispitivanje fitotoksičnosti izolovanih fitotoksina. Frakcije (mrlje) označene sa 1, 2a, 2b, 2c, 2d i 3 sa preparativne ploče su ekstrahovane u etanolu i razblaţene sa vodom do 0,5% koncentracije etanola. Različite frakcije toksina su nanete kao male 5 µl kaplje na povreĎeni deo kotiledona uljane repice sorte Quinta (Koch et al. 1989, Bodawy & Hoppe 1989). Inokulisane biljke su drţane na 22ºC ±2ºC 70–80% relativne vlaţnosti i 12 h fotoperiod. Simptomi su ocenjeni posle 2 dana korišćenjem skale po (Badawy & Hoppe 1989): - (nema simptoma); + (slaba nekroza inokulisanog kotiledona); + + (srednja nekroza); + + + (jaka nekroza); + + + + (nekroza celog kotiledona ili lista). Kao kontrola je korišćen sirovi ekstrakt izolata K-113. 5. 8. OdreĎivanje patogenih grupa OdreĎivanje patogenih grupa (PG1, PG2, PG3, PG4) u Srbiji je uraĎena po metodi Koch et al. (1991), Mengistu et al. (1991), Chen & Fernando (2006). Seme je dezinfikovano potapanjem u 3% rastvor natrijumhipohlorita (NaOCl) u trajanju od 3 do 5 min, a nakon toga je isprano česmenskom vodom i sušeno na sobnoj temperaturi u Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 22 kontrolisanim uslovima. Uspešnost dezinfekcije je proverena na hranljivoj PDA podlozi. U po dve Petri kutije je naneto dezinfikovano seme sorti (Westar Quinta i Glacier) a kao kontrolna varijanta je korišćeno nedezinfikovano seme navedenih sorti. Nedezinfikovano seme je korišćeno kao kontrolna varijanta u odnosu na dezinfikovano seme sa ciljem dobijanja potvrde uspešnosti izvedene dezinfekcije. U svaku kutiju je stavljeno po 5 semena. Ovako pripremljene Petri kutije su stavljene u termostat na 25 0 C ± 1 0 C u tami. Nakon 15 dana je izvršen vizuelni i mikroskopski pregled semena, podloge i izniklih biljaka. U plastične kontejnere sa ćelijama dimezija 4 x 5 cm koje su prethodno napunjene sa sterilisanim supstratom zasejana je po 1 biljka. Nakon nicanja (6-7 dana), kada su se kotiledoni razdvojili izvršena je inokulacija na sledeći način: sterilnom iglom je izvršena povreda jednog kotiledona dok drugi kotiledon nije povreĎivan. Na povreĎeni deo je mikropipetom naneto 5 µl suspenzije piknospora čija je koncentracija bila (10 6 /ml). Suspenzija piknospora je dobijena na sledeći način: svaki izolat je nanet na hranljivu PDA podlogu u tri ponavljanja. Nakon 1015 dana na osnovu binokularnog pregleda u Petri kutije je dodato 10 ml sterilne destilovane vode (Bonman et al. 1981). Sterilni stakleni štapić je neţno povlačen preko površine piknida i micelije da bi došlo do oslobaĎanja piknospora. OsloboĎene piknospore iz Petri kutije su proceĎene kroz 10 MESHA sito u sterilne plastične tube. Pomoću hemocitometra koncentracija je podešena 106 piknospora po ml, a nakon toga u svaku tubu je dodato 10 µl maceriranog biljnog soka uljane repice. Pripremljena suspenzija je drţana u kontrolisanim uslovima na temperaturi 20°C ± 1°C i 12 h fotoperiodu u trajanju od 56 h a zatim je korišćenja za inokulaciju.Klijavost piknospora je proverena na osnovu mikroskopskog pregleda. Nakon inokulacije biljke su prenete u kontrolisane uslove na temperaturu od 20 0 C 95% RH i 12 h fotoperiod. Posle 48 h biljke su stavljene u uslove staklenika. Tokom praćenja pojave simptoma pravi listovi su odstranjivani više puta. Posle 12 do 13 dana ogled je ocenjen po skali Koch et al. (1991): 0 – bez pojave pegavosti i nekroze oko povreĎenog dela, 1 – ograničeno tamnjenje tkiva oko povrede pega prečnika 0,51,5 mm, 3 – tamne nekrotične pege prečnika 1,53,0 mm, 5 – tamne pege 36 mm veličine na naličju lista braonkaste, 6 – kao kod ocene vrednosti skale 5 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 23 ali manje nekrotične površine na licu lista, 7 – sivozelene pege ograničene veličine ili velike nekrotične pege, 8 – velike sivozelene pege sa ili bez piknida, 9 – velike sivozelene pege sa obilnom sporulacijom. U ovim istraţivanjima su korišćeni svi izolovani izolati iz Srbije (119 izolata) kao i 2 kontrolna izolata iz Velike Britanije. Svaki izolat je ispitivan na svim sortama uljane repice u 6 ponavljanja. S obzirom da izolati iz PG1 grupe prouzrokuju veoma slabe simptome na kotiledonima, a u cilju preglednosti izazvane fitotoksičnosti korišćena je i kontrolna varijanta (sorta Glacier, na čije kotiledone je naneta destilovana voda). 5. 9. Prenošenje patogena semenom U cilju dokazivanja načina prenošenja parazita, uraĎen je test prenošenja parazita semenom. Dezinfekcija semena je uraĎena na isti način kao što je već napred opisano u poglavlju odreĎivanje patogenih grupa. Suspenzija piknospora je dobijena na isti način ali nije proceĎena kroz sito i nije dodavan macerirani biljni ekstrakt uljane repice. U pripremljenu suspenziju, u kojoj su se osim piknospora nalazili i delovi micelije, potopljeno je seme uljane repice Quinta. Potopljeno seme je drţano na 20ºC ±1ºC i 12 h fotoperiodom u narednih 48 h. Po 5 inokulisanih semena je zatim posejano u plastične kontejnere sa ćelijama prečnika 4 x 5 cm napunjene kompostom. Nakon setve, plastični kontejneri su drţani na 25ºC ± 1ºC i 12h fotoperiod. U ovom ogledu su korišćeni sledeći izolati: C-5, L-5, K-7, LJ-3, S-11, St-1, GS-3 (L. maculans) i K-113, K-115 (L. biglobosa). Pojava simptoma je ocenjivana nakon 7 i 14 dana od momenta nicanja. Ocene su vršene sa + = vidljivi simptomi na kotiledonima ili hipokotilu i  = zdrave biljke. Kod kontrolne varijante seme je potopljeno u destilovanu vodu. Ogled je postavljen u 6 ponavljanja,a patogenost izolata gljiva u odnosu na kontrolnu varijantu je testirana primenom Dunett-ovog testa. Posle 14 dana je uraĎena reizolacija patogena. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 24 5. 10. Molekularna karakterizacija Dosadašnja istraţivanja pokazala su da morfološke karakteristike nisu dovoljne za pravilnu i pouzdanu detrminaciju gljiva izolovanih iz uljane repice. Zbog toga, u ovom istraţivanju sprovedena je molekularna identifikacija svih proučavanih izolata. Ekstrakcija DNK je izvršena:  po O´Gorman et al. (1994), uz odreĎene modifikacije po Kuusk et al. (2002);  po Day and Shattock (1997); 5. 11. Ekstrakcija DNK Micelija i piknidi su sastrugani sa PDA podloge u plastične kade. Nakon merenja teţine, micelija je preneta u sterilne avane u koje je dodat sterilni kvarcni pesak. Posle mlevenja (maceriranja) mešavini je dodato 500 µl ekstrakcionog putera (2% (w/v) CTAB 100 µl Tris-HCl pH 8,0, 20 mMEDTA pH 8,0, 1,4 MNaCl i 1% (w/v) polivinil pirolidona. Nakon inkubacije na 65ºC u trajanju od 30 min mešavina je ekstrahovana sa fenol:hloroform:izoamil alkoholom u zapreminskom odnosu (25:4:1). Posle kratkog vorteksovanja (protresanja) u mikroepruvete dodat je hloroform i izoamil alkohol u zapreminskom odnosu (24:1). Sadrţaj u mikroepruvetama je centrifugiran 10 minuta na 1300 g. Nakon centrifugiranja tečna (gornja) faza oko 500 µl je preneta u nove mikroepruvete i dodaje se 300 µl izopropanola. Ponovo se inkubira 10 min na sobnoj temperaturi a zatim se centrifugira 10 min na 1300 g. Posle centrifugiranja tečni deo je paţljivo odliven iz tube a zatim je dodato 600 µl rashlaĎenog 10% etanola. Nakon vorteksovanja u trajanju od 10 sekundi u inkubatoru tube su centrifugirane 10 min na 1300 g. Posle centrifugiranja tečnost iz tube je paţljivo odlivena i dodato 600 µl 70% etanola. Nakon kratkog vorteksovanja tečnost je odlivena a tube su stavljene u sušnicu na 50ºC u trajanju od 10 min. Dobijeni talog je rastvoren u 25 µl TE pufera pH 8,0 posle čega je ekstrakt zamrznut na 20 ºC. Na ovaj način je ekstrahovana DNK iz 7 izolata Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 25 (L.m. L. b. Referentni izolati i K-115, GS-25, ST-5, S-11, C-3. (O´Gorman et al. 1994 uz odreĎene modifikacije po Kuusk et al. 2002). Micelija i piknidi su skinuti sa podloge u plastične kade. Nakon merenja teţine micelijе i piknidа preneti su u avan i dodata je mala količina kvarcnog peska. Nakon maceriranja u avane je dodato 800 µl CTAB pufera a zatim je smeša preneta u tube 2 ml. Tube su stavljene u inkubator na 65ºC u trajanju od 1 h a na svakih 15 min sadrţaj u tubama je vorteksovan u trajanju od 5 min. Nakon inkubacije u tube je dodato 600 µl hloroforma i 10 sekundi je vorteksovan u inkubatoru na 25ºC. Tube su zatim centrifugirane 10 min na 1300g da bi došlo do razdvajanja čvrste i tečne faze. Tečna faza (oko 500 µl) je preneta u nove tube i dodato je 300 µl izopropanola. Ponovo je inkubirana 10 min na sobnoj temperaturi a zatim centrifugirana 10 min na 1300 g. Nakon centrifugiranja tečnost je odlivena iz tuba a zatim je dodato 600 µl 70% etanola. Tube su vorteksovane 10 sekundi u inkubatoru a zatim centrifugirane 10 min na 1300 g posle čega je izvršeno odlivanje tečnosti iz tuba. Otvorene tube su stavljene u sušnicu na 50 ºC u trajanju od 10 min. Dobijeni talog je rastvoren u 100 µl TE pufera i ostavljen nekoliko minuta na sobnoj temperaturi a zatim zamrznut na 20 ºC. Na ovaj način je ekstrahovana DNK iz svih izolata (ukupno 123) uključujući i referentne izolate (Day & Shattock 1997). Lančana reakcija polimeraze (PCR) Ekstrakt DNK je odmrznut i izmerena je koncentracija DNK na spektrofotometru. Iz tube je mikropipetom 10 µl DNK preneto u kivetu gde je već dodato 500 µl destilovane vode. Napravljena smeša je stavljena u spektrofotometar i očitana je koncentracija DNK koja ne sme biti ispod 50 ng/µl posle čega je izvršeno pravljenje mešavine za PCR analizu. Za izvoĎenje PCR analize ( Kuusk et al. 2002) su korišćena: dva prajmera 5´-CCCAGTGCAGTTCCAG-3´ i 5´- CATAGCAAGTGTGCATCG-3´ (APH12 prajmeri Sambrook et al. 1989 cit loc. Kuusk et al. 2002) koji amplifikuju (umnoţavaju) fragment oko 1900 bp (L. biglobosa) i dva prajmera 5´-GCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTC-3´ 5´- TCCTGCTCCTACTCCTTCTCTAGC-3´ (LMR1 prajmeri Taylor & Borgmann1994) koji amplifikuju fragment oko 580 bp i koriste se za identifikaciju grupe A izolata (L. maculans). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 26 PCR reakcija je obavljena u ukupnoj zapremini od 25 µl koja sadrţi: 1 µl gljivične DNK (L. maculans i L. biglobosa) 11 µl PCR vode 12,5 µl master mix REDTaq (Sigma Aldrich) sa MgCl2 (Taq polimeraza 0,06 U/ µl 3mM MgCl2 0,002% ţelatina i 0,4 mM dNTP) i po 12,5 µl svakog prajmera. Napravljena smeša je kratko centrifugirana a zatim su tube stavljene u PCR aparat (Eppendort master cycler gradient). Amplifikacija je uraĎena po sledećem PCR programu: 94º za 2 min sledećih 30 ciklusa, 2 min na 94ºC, 2 min na 55ºC (LMR1 prajmeri), odnosno 2 min na 60ºC (APH 12 prajmeri) i 3 min na 72ºC. PCR amplifikacija fragmenta je vizuelno posmatrana na 1,5% agaroznom gelu obojenim sa etidijum bromidom. Pored navedenih prajmera za PCR amplifikaciju su korišćeni i prajmeri PN3(5´CCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATC) i PN- 10(TCCGCTTATTGATATGCTTAAG) po Balesdent et al. (1998). Amplifikacija je obavljena u ukupnoj zapremini od 25 µl koja sadrţi: 1 µl gljivične (L. maculans i L. biglobosa) DNK 11 µl PCR vode 12,5 µl master mix REDTaq (Sigma aldrich) sa MgCl2 (Taq plimerase 0,06 U/µl 3 mM MgCl2 0,002% ţelatin 0,4 mM dNTP) i po 1,25µl svakog prajmera. Napravljena smeša je kratko centrifugirana a zatim su tube stavljene u PCR aparat (Eppendorf master cycler gradient). Svaki ciklus se sastojao od 30 s na 94ºC, 30 s na 58ºC i 1 min na 72ºC. Ukupno je obavljeno 37 ciklusa. Nakon završene PCR amolifikacije fragmenti su vizuelno posmatrani na 1,5% agaroznom gelu obojenim sa etidijum bromidom. 5. 12. PCR–RFLP analiza Od ukupno 119 izolata plus dva referentna izolata za PCR-RFLP analizu su korišćeni sledeći izolati: L.b (referentni izolat L. biglobosa) K-111, K-112, K-113, K- 114, K-115, K-116, K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-1 i L.m. (referentni izolat L. maculans). PCR-RFLP analiza je uraĎena po (Balesdenet et al. 1998) uz preporuke proizvoĎača (Fermentas life science). Deset mikrolitara PCR produkta dobijenih korišćenjem PN3 I PN10 prajmera je digestovano za 5 h na 37ºC sa 20 U sa jednim od sledećih enzima: BamHI, HaeIII, Rsa1, EcoRII i Alu1. Nakon inkubacije restrikcioni fragmenti su posmatrani u 1,5% agaroznom gelu obojenim sa 20 µl etidijum bromida. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 27 Za ovu analizu izolati su nasumično odabrani. Izolati K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2 i S-1 u ovim ispitivanjima su na neki način predstavljali grupu odnosno biljni organ sa koga su izolovani.Od ukupno 8 pod oznakom K-111, K-112, itd. za RFLP analizu je korišćeno 6 izolata. S obzirom da ovih 8 izolata u morfološkom pogledu je pokazalo veliku sličnost sa referentnim izolatom L.b 6 izolata je korišćeno za PCR-RFLP analizu da bi se identifikovalo kojoj podgrupi NA-1, NA-2 ili NA-3 L. biglobosa pripadaju izolati poreklom iz Srbije. Molekularna istraţivanja su uraĎena u biotehnološkoj laboratoriji Poljoprivrednog instituta u Banja Luci. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 28 VI. REZULTATI ISTRAŢIVANJA 6. 1. Simptomi bolesti Simptome suve truleţi (blackleg), odnosno rak stabla (stem canker) uljane repice prouzrokuju dve vrste L. maculans i L. biglobosa. Patogen (L. Maculans) prouzrokuje simptome bolesti na biljkama uljane repice od faze kotiledona pa sve do zrenja useva. U fazi kotiledona gljiva prouzrokuje suţenje prizemnog dela stabla usled čega biljke poleţu i propadaju, a na kotiledonima okruglaste sivkaste pege u okviru kojih micelija gljive obrazuje brojna mrka telašca-piknide. Napadnuti kotiledoni se suše i propadaju. Pojava simptoma u ovoj fazi razvoja je uglavnom uzrokovana setvom zarazenog semena ili ponovljenom setvom. Od faze kotiledona pa sve do zrenja, patogen vrši infekciju uglavnom pomoću askospora. OsloboĎene askospore padaju na površinu lista i u povoljnim uslovima inficiraju list preko stominih otvora (sl. 1). Askospora klija u infekcionu hifu koja u biljnom tkivu obrazuje haustoriju. Porast hife u biljnom tkivu prouzrokuje prve uočljive znake infekcije palisadnih ćelija. Sa zaraţenog lista micelija gljive tokom jeseni prelazi na vrat korena prouzrokujući promene tkiva u vidu mrkih pega (sl. 1a). Slika 1. Inficirani list uljane repice L. maculans U okviru ovih pega micelija gljive prezimljava i nastavlja razvoj iduće godine prouzrokujući simptome suve trulezi (blackleg) korena (sl. 1b). Napadnute biljke u Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 29 početku venu zatim se suše i ne donose prinos. U proljetnom delu vegetacije (april, maj) oslobodjene askospore inficiraju praktično sve nadzemne organe biljke. Na prizemnom i gornjem delu stabla i grana parazit prouzrokuje nekrotične pege i do nekoliko centimetara duţine, oivičene tamnijim (marginom) rubom (sl. 2a i 2b). Tkivo u okviru pega puca, te nataj način se stvaraju rak rane sa brojnim obrazovanim piknidima gljive. Kod inficiranih biljaka jedan deo ljuski je nedovoljno ispunjen ili su zrna štura. Veoma često u vreme nalivanja zrna (druga polovina maja i prva dekada juna) pojačani vetrovi izazivaju lomljenje biljaka na mestu infekcije,što dovodi do poleganja, povećanog procenta praznih ljuski i oteţanog skidanja useva. Pored navedenih parazit prouzrokuje uvelost i propadanje cvetova (sl. 3), pegavost ljuski (sl. 4) i lista (sl. 5). Sa zaraţenih ljuski micelija gljive prelazi na seme (sl. 6). Inficirano seme ima znatno manji sadrţaj ulja i proteina, a kod semenskih useva se ne moţe koristiti za setvu. Slika 1a. Početni simptomi suve truleţi vrata korena uljane repice Slika 1b. Krajnji simptomi suve truleţi vrata korena uljane repice Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 30 Slika 2a. Simptomi raka prizemnog dela stabla uljane repice Slika 2b. Simptomi raka gornjeg dela stabla uljane repice Slika 3. Uvelost cvetova uljane repice prouzrokovane gljivom L. maculans Slika 4. Pega na ljusci uljane repice prouzrokovane gljivom L. maculans Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 31 Slika 5. Pega na listu uljane repice prouzrokovana gljivom L maculans Slika 6. Seme (levo: zdravo seme, desno: zaraţeno 6. 2. Morfološke karakteristike proučavanih izolata Na PDA podlozi posle 5 dana (na temperaturi 25 0 C ± 1 0 C) izolati (L.m, St-12, LJ- 3, L-10, C-5, GS-27, S-2, K-8) obrazuju okruglasto nepravilne kolonije sa reţnjevitim obodom. Micelija je rastresita bele do prljavobele boje. Supstratna micelija je prljavobele boje i nepravilnog oblika. Kod druge grupe izolata (L.b, K-112 ,K-113, K- 114, K-115, K-117) vazdušna micelija je prljavobele boje, a kolonije su okruglastog oblika. Supstratna je takoĎe prljavobele boje okruglastog oblika sa ravnim obodom. Posle 10 dana (L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5) kolonija ima nepravilan oblik (u zavisnosti od izolata okruglastoreţnjevit do reţnjevit) sa nazubljenom ivicom. Centralni deo kolonije je crne boje, koja potiče od obrazovanih piknida, dok je rubni deo prljavobele boje. Supstratna kolonija je takoĎe, po obliku nepravilna, crne (mrke) boje, nazubljenih ivica sa rubom prljavobele boje. Kod izolata L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K-117 vazdušna kolonija je okruglastog oblik, po ivicama nazubljena. Centralni deo kolonije. je ţutomrke boje, dok je rub prljavobele, sa Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 32 početkom formiranja sporonosnih tela. Supstratna kolonija je okruglasta, sa pojavom ţutomrkog pigmenta u centralnom delu, dok je rub prljavobele boje nazubljenih ivica. Posle 15 dana (L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5) vazdušna kolonija zbog obilne fruktifikacije, ima mrku boju, a samo pojedini delovi ruba kolonije su prljavo bele boje. Sa starošću rubni deo kolonije postaje sve nepravilniji. Izgled vazdušne i supstratne kolonije (LJ-3 i S-2) ispitivanih izolata je prikazan na slikama 7 i 8. Slika 7. Izgled vazdušne kolonije na PDA podlozi kod (S-2 i LJ-3) izolata Slika 8. Izgled supstratne kolonije na PDA podlozi kod (S-2 i LJ-3) izolata Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 33 Posle 15 dana (L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K-117) u supstratnom delu kolonije je došlo do intenzivnijeg formiranja ţutomrkog pigmenta. Vazdušna kolonija je sivomrka, dok je rub kolonije prljavobele boje. Izgled vazdušne i supstratne kolonije kod ispitivanih izolata K-112 i K-115 je prikazan na slikama 9 i 10. Piknidi su okruglasti, mrke boje, pojedinačni ili u stromatičnim tvorevinama. Prečnik piknida kod L.b, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-117 izolata se kretao od 240480µm, a kod izolata L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5, od 220 x 510 µm. Slika 9. Izgled vazdušne kolonije na PDA podlozi kod K-112 i K-115 izolata Slika 10. Izgled supstratne kolonije na PDA podlozi kod K-112 i K-115 izolata Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 34 Piknospore se oslobaĎaju iz piknida u vidu jedne ţelatinozne kapi, krem do ruţičaste boje (Sl. 11). Piknospore su jednoćelijske, hijalne, kratko cilindrične, uglavnom prave, neke malo povijene, sa ili bez kapi ulja na krajevima veličine 1,30 x 2,20 x 2,80–5,40 µm, uglavnom kod svih ispitivanih izolata. Porast micelije i sporulacija ispitivanih izolata prikazan je u tabeli 2. Slika 11. Izgled ţelatinoznih, ruţičasto-crvenkastih kapi piknospora osloboĎenih iz piknida na zaraţenom stablu uljane repice Tabela 2. Prečnik (cm) i sporulacija kolonija ispitivanih izolata L. maculans i L. biglobosa na PDA podlozi i temperaturi 25 0 C ± 1 0 C Izolat Posle 5 dana Sporulacija Posle 10 dana Sporulacija Posle 15 dana Sporulacija L.b 1,55 - 4,30 - 9 + K-112 1,57 - 4,02 + 9 + K-113 1,50 - 4,42 + 9 + K-114 1,50 - 4,35 + 9 ++ K-115 1,60 - 4,40 + 9 ++ K-117 1,57 - 4,45 - 9 + L-10 1,67 - 2,35 + 4,10 + + + LJ-3 1,73 - 2,60 + 4,55 + + + K-8 1,57 - 2,95 + + 4,60 + + + L.m 1,51 - 3,30 + + 4,70 + + + St-12 1,48 - 2,95 + + 3,90 + + + S-2 1,40 - 2,32 + 2,70 + + + C-5 1,80 - 2,42 + + 4,05 + + + GS-27 1,50 - 2,40 + 3,05 + + + - Nema sporulacije; + Slaba sporulacija; + + Srednja sporulacija; + + + Jaka sporulacija Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 35 Na osnovu tabele 2 moţe se zapaziti da izolati L. biglobosa (L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K-117) imaju brz porast na PDA podlozi. Sporulacija kod izolata L. maculans (L.m, L-10, LJ-3, K-8, St-12, S-2, C-5 i GS-27) je dosta slabija u odnosu na grupu izolata koji pripadaju L. biglobosa. Razlike u porastu koje se mogu zapaziti izmeĎu ispitivanih izolata su zbog reţnjevitog izgleda kolonija prilikom merenja. 6. 3. Dokazivanje postojanja teleomorfnog stadijuma gljive Prisustvo askospora patogene gljive L. maculans kod nas je otkriveno na dva načina, kao što je opisano u materijalu i metodi rada. Prva pojava askospora na osnovu mikroskopskog pregleda traka Burkardovog hvatača spora je primećena 13. novembra 2009. godine. Od 13. Novembra na svakih 7 dana, je vršen pregled do 20. decembra 2009. U tom periodu, najobilnije oslobaĎanje askospora je primećeno krajem novembra i početkom decembra. Zbog niskih temperatura (golomrazica), a kasnije i sneţnih padavina dalje praćenje oslobaĎanja askospora je prekinuto. Praćenje njhovog oslobaĎanja je nastavljeno tokom proleća naredne godine OslobaĎanje je praćeno do 20. maja. Iz istih ţetvenih ostataka tokom 2010. prvo oslobaĎanje je primećeno krajem marta i početkom aprila. Od 15. aprila do 20. maja uglavnom je oslobaĎanje askospora (brojčano posmatrano) bilo pribliţno isto. I tokom jeseni i u prolećnom delu prilikom mikroskopskog pregleda uočeno je da se askospore najviše oslobaĎaju u drugom delu dana. Prvi pregled inficiranih stabala uljane repice stavljenih u plastične kese u laboratorijskim uslovima je izvršen nakon 5 dana, binokularnim pregledom pseudotecija tokom 2009.godine. Kasniji pregledi su vršeni na svakih 48 h i prva pojava askospora je registrovana nakon 11 dana. Nakon pojave askospora izvršeno je merenje i proučena graĎa sporonosnih organa. Pseudotecije su okruglastog oblika mrke boje sa kratkim vratom, prečnika od 313 do 532 µm (Sl. 12). Ostiole (vrat) se pojavljuju u momentu oslobaĎanja askospora (Sl. 13). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 36 Slika 12. L. maculans. Pseudotecija gljive Slika 13. L. maculans. Pseudotecije sa obrazovanim ostiolama Askusi su cilindrični do topuzasti sa kratkom drškom hijalni i na mestu gde se nalazi drška su suţeni dok na drugom kraju su veoma prošireni veličine 16,7221,39 µm x 90,00160,00 µm (Sl. 14). U askusima se nalaze askospore sloţene u po dva reda. Askospore su prave do blago povijene i suţene na krajevima ţutomrke boje sa 5 septi veličine: 610,5 µm x 4274 µm (Sl. 15). Uljane kapi su u početku retke, sa starenjem zrnasti sadrţaj dolazi do izraţaja i tada se septe teško uočavaju. Slika 14. L. maculans. Askus gljive Slika 15. L. maculans. Askospore gljive Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 37 6. 4. Infektivnost askospora Infektivnost askospora je ispitivana na kotiledonima uljane repice sorte Banaćanka prema postupku opisanom u metodama rada. Prva pojava simptoma se mogla zapaziti već posle 5 dana u vidu hloroze oko povreĎenog mesta. Nakon 7 dana hloroza je obuhvatila ceo kotiledon. Na biljkama gde je suspenzija konidija naneta prskanjem kotiledona pegavost se pojavila kasnije takoĎe u vidu hlorotičnih pega. Kasnije kod sva tri načina inokulacije kotiledona, centar pega je poprimio sivkastu boju sa nekrotičnim rubom (Sl. 16). Pojava plodonosnih tela je zapaţena 15 dana posle inokulacije. Rizolaciom na hranjivu PDA podlogu dobijen je konidiski stadium gljive opisan pod imenom Phoma lingam (Tode: Fr.) Desmaz. Slika 16. L. maculans Simptomi na mladim biljkama uljane repice nastali pri inokulaciji kotiledona askosporama (slika desno) – Kontrolne neinokulisane biljke (slika levo) Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 38 6. 5. Obrazovanje pseudotecija i askospora u laboratorijskim uslovima Nakon 10 nedelja od postavljanja ogleda izvršen je binokularni i mikroskopski pregled ukrštanih izolata. U tabeli 3 je prikazano kod kojih izolata su se obrazovale pseudotecije i askospore. Tabela 3. Obrazovanje pseudotecija i askospora nakon ukrštanja virulentnih izolata L. maculans i slabovirulentnih izolata L. biglobosa Izolat L.m GS-13 C-2 K-112 LJ-1 St-1 K-11 St-1 - 0 - 0 0 - + C-2 + - - - - 0 L.m - - + - - - 0 GS-13 - - - 0 0 0 0 GS-11 - - - - 0 0 0 GS-4 - 0 - - + - + * St-6 - - 0 0 0 - + K-16 - + - 0 0 0 - K-112 - - - - - 0 0 K-118 - - - - - - - S-4 - + 0 - + + * 0 S-10 - 0 - 0 - 0 + * L-4 - + * - 0 + 0 0 L-8 + 0 + - - - 0 LJ-2 - + * - 0 0 + 0 K-23 - 0 - 0 0 - - + = Obrazovane pseudotecije sa askosporama + * = Obrazovane pseudotecije bez askospora - = Odsustvo pseudotecija 0 = Nisu sparivani izolati U tab. 3 se moţe zapaziti da izolat L.m. (referentni izolat) iz geografski udaljenih regiona pokazuju kompatibilnost kod ukrštanja. Ni jedno ukrštanje nije dobijeno (obrazovanje pseudotecija) izmeĎu virulentnih (L.m., St-1. C-2, GS-13, GS-11, GS-4, St-6, K-16, S-4, S-10, L-4, L-8; Lj-2, K-23, K-11) i slabovirulentnih izolata (K-112 i K- 118) (tab. 1). Ova ukrštanja takoĎe pokazuju da izolati poreklom iz Vojvodine pripadaju različitim tipovima sparivanja, što moţe dovesti do stvaranja novih virulentnih rasa parazita (sl. 17a i b). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 39 Slika 17a i b. Pseudotecije dobijene u laboratorijskim uslovima 6. 6. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi U cilju razdvanja izolata na osnovu obrazovanja pigmenata u tečnoj Czapek-ovoj podlozi, zapaţeno je da nakon 30 dana izolati L. maculans (L.m, St-5, C-3, S-11) nisu produkovali ţutomrki pigment, u odnosu na izolate gljive L. biglobosa (K-113 i K-115), koji obrazuju ţutomrki pigment u tečnoj Czapek-ovoj podlozi (sl. 18). Slika 18. Produkcija pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 40 6. 7. Ekstrakcija, izolacija i karakterizacija fitotoksina Na osnovu ekstrakcije i karakterizacije fitotoksina koje produkuje patogena gljiva L. maculans pregledom TLC ploča pod UV lampom uočeno je 6 tačaka (mrlja) kod izolata L.m, St-5, C-3, S-11, za koje je pretpostavljeno da odgovaraju fitotoksinima, a na osnovu literarnih podataka (Koch et al. 1989). TakoĎe je uočeno da kod izolata K- 113, mrlje na TLC ploči nisu jasno izdiferencirane (uočljive), a ni Rf vrednosti nisu izračunate zbog nejasnoće mrlja, što ukazuje da ovaj izolat ne produkuje fitotoksin. Na slici 20 je prikazan izgled mrlja kod ispitivanih izolata sa izračunatim Rf vrednostima. Slika 19. Tankoslojna hromatografija etil acetatnih frakcija izdvojenih iz filtrata kulture kod 4 izolata (L.m, St-5, C-3, S-11) L. maculans i jedan izolat (K-113) L. biglobosa. Etil acetatne frakcije su izdvojene na silikogelu sa hloroformom: etil acetatom (1:1) kao razvijač. Jedinjenja su ispitana pod UV svetlom (254 nm). Rf vrednost frakcija (mrlja) 1- 6 je: 1 (Rf = 0,11), 2 (Rf = 0,17), 3 (Rf = 0,27), 4 (Rf = 0,34), 5 (Rf = 0,42) i 6 (Rf = 0,51). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 41 Na osnovu dobijenih rezultata tankoslojne hromatografije je izvršeno preparativno izolovanje fitotoksina (prema prethodno opisanoj proceduri) i tom prilikom pod UV svetlom su detektovane 3 mrlje označene sa 1, 2 i 3 a njihova Rf vrednost je: 0,15, 0,44 i 0,60. Na osnovu Rf vrednosti mrlje 2 izvršeno je dodatno nanošenje na TLC ploču i nakon razvijanja su dobijene 4 mrlje koje su označene sa 2a, 2b, 2c i 2d a njihova Rf vrednost je 2a (Rf = 0,49), 2b (Rf = 0,40), 2c (Rf = 0,32) i 2d (Rf = 0,22). Frakcije 1, 2a, 2b, 2c, 2d i 3 su zatim korišćene kako je navedeno u LC-MS-MS analizi i fitotoksičnom testu. Kod izolata St-5, C-3 i S-11, LC-MS-MS analizom su detektovani pikovi (Sl. 2023) sa molekularnom teţinom izotopskim profilom i fragmentacijskim obrascem koji su u skladu sa sirodezminima i drugim sekundarnim biomolekulama koji su otkriveni kod referentnog izolata L.m (L.maculans Sl. 23). Slika 20. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 42 Slika 21. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 43 Slika 22. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 44 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 45 Slika 23. Slika 24. U ispitivanim uzorcima detektovan je niz pikova jedinjenja čija molekulska masa i izotopski profil odgovaraju sirodezminima. Pik sa retencionim vremenom tR=1,57 min (označen sa P444) pripada jedinjenju molekulske mase 444 Da, što odgovara sirodezminu J (de-O- acetilsirodezmin A) ili njegovom 1-epimeru (de-O- acetilsirodezmin PL). NO O OH OH N O OH O S S U MS 1 spektru (sl. 25) uočavaju se slabi signali m/z 445 [M+H]+, 467 [M+Na]+ i 483 [M+K] + i fragment m/z 381 [M+H–S2] + kao osnovni jon. Profil izotopskih pikova: Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 46 A (100%), A+1 (22,9%) i A+2 (12,3%) u dobrom je slaganju sa teorijskim profilom za bruto-formulu C18H24N2O7S2 (100%, 22,9%, 12,8%). U MS 2 spektru (sl. 26) dominira fragment m/z 381 [M+H–S2] + . Pik sa tR=1,42 min (P454) pripada jedinjenju molekulske mase 454, što odgovara sirodezminu H (monosulfidni homolog 1-epi-sirodezmina A). U MS 1 spektru (sl. 27.) uočavaju se joni 455 [M+H]+, 477 [M+Na] + , 493 [M+K] + , kao i fragmenti 437 [M+H– H2O] + i 393 [M+H–H2O–CO] + . Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (22,6%), A+2 (8,4%) saglasan je sa teorijskim profilom za C20H26N2O8S (100%, 24,4%, 8,9%). NO O O OH N O OH O S O U MS 2 spektru (sl. 28) uočava se niz fragmenata koji odgovaraju gubitku alkoholne OH grupe acetil-grupe (u vidu ketena C2H2O) i neidentifikovane grupe m/z=78:437 [M+H–H2O] + , 413 [M+H–C2H2O] + , 393 [M+H–CO2] + , 377 [M+H–78]+, 351 [M+H–CO2–C2H2O] + , 315 [M+H–CO2–78] + itd. U MS 1 spektru pika sa tR=2,22 min (P476) prikazanom na slici 29 uočavaju se joni niskog intenziteta na m/z 477 [M+H] + 499 [M+Na] + i 515 [M+K] + kao i intenzivan (osnovni jon u spektru) fragment 381 [M+H–S3] + . Na osnovu molekulske mase i gubitka S3 moţe se zaključiti da je u pitanju do sada nezabeleţen de-O-acetil derivat sirodezmina C ili F. Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (25,0%), A+2 (17,2%) u saglasnosti je sa pretpostavljenom formulom C18H24N2O7S3 (teorijski profil 100%, 23,7%, 17,4%). NO O OH OH N O OH O S SS U MS 2 spektru (sl. 30) kao osnovni jon javlja se fragment 381 [M+H–S3] + a pored njega prisutni su i joni 353 [M+H–S3–CO] + i 325 [M+H–S3–2CO] + . Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 47 Detektovana su dva koja odgovaraju jedinjenjima molekulske mase 486: P486a (tR=2,03 min) i P486b (tR=2,66 min). Dva poznata jedinjenja ove mase – sirodezmin A i sirodezmin G (ili PL) – predstavljaju epimere i nije ih moguće razlikovati isključivo na osnovu MS spektra. U MS1 spektrima oba pika (sl. 31 i 33) prisutni su joni 487 [M+H] + , 509 [M+Na] + , 525 [M+K] + kao i intenzivan fragment 423 [M+H–S2] + . NO O O OH N O OH O S S O Profil izotopskih pikova A, A+1 i A+2 kod pika P486a (100%, 25%, 14,0%) odn. (100%, 23,6%, 14,2%) kod pika P486b u skladu je sa bruto formulom C20H26N2O8S2 (teorijski profil: 100%, 25,2%, 13,5%). Najznačajniji fragmenti u MS2 spektrima oba pika (sl. 32 i 34) su: 423 [M+H–S3] + , 395 [M+H–S3–CO] + , 367 [M+H–S3–2CO] + , 246 i 229. Pik sa retencionim vremenom 2,32 min označen kao P508 u MS1 spektru (sl. 35) sadrţi jone m/z 531 [M+Na] + i 547 [M+K] + slabog intenziteta, i m/z 381 [M+H–S4] + kao osnovni jon. Na osnovu molekulske mase i gubitka 4 atoma sumpora moţe se zaključiti da je u pitanju tetrasulfidni homolog de- O-acetilsirodezmina A odn. de-O-acetil-derivat sirodezmina B, E ili K. NO O OH OH N O OH O S S S S Detektovana su tri pika jedinjenja molekulske mase 518: slabo zastupljeni P518a (tR=2,71 min) i P518b (tR=2,92 min) i intenzivni P518c (tR=3,34 min). U MS 1 spektrima ovih pikova (sl. 36, 38 i 40) uočavaju se joni m/z 519 [M+H]+ 541 [M+Na]+ i 557 [M+K] + kao i intenzivan jon fragmenta m/z 423 [M+H–S3] + . Poznata su dva izomerna trisulfidna sirodezmina mase 518: sirodezmin C i F. NO O O OH N O OH O S S O S Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 48 Teorijski izotopski profil za ova jedinjenja, bruto-formule C20H26N2O8S3, dat je kao A (100%), A+1 (26,0%), A+2 (18,1%) i u dobroj je saglasnosti sa eksperimentalnim podacima: 100%, 26,5% i 17,2 % za P518a, 100%, 26,3% i 16,3% za P518b, i 100%, 26,6% i 18,8% za P518c. Budući da su sirodezmini C i F 1-epimeri, moţe se očekivati da će imati slične ili identične MS2 spektre. Zaista, MS2 spektri pikova P518a i P518c (sl. 39 i 41) pokazuju veoma sličan obrazac fragmentacije: osnovni jon na m/z 423 [M+H–S3] + , i niz fragmenata: m/z 395 [M+H–S3–CO] + , 367 [M+H–S3–2CO] + , 246, 229 i 140. MS 2 spektar trećeg pika (sl. 39) P518b značajno se razlikuje – dok je i u ovom slučaju osnovni jon 423, javlja se i više fragmenata odsutnih kod P518a i P518c – intenzivni fragment m/z=345 [M+H–S3–78] + kao i joni 501 [M+H–H2O] + i 441 [M+H–78]+. Moguće je da ovaj pik predstavlja izomer sirodezmina C i F sa različitim poloţajem acetil-grupe (na C2a-OH grupi ili bočnoj hidroksimetil-grupi). Pik sa retencionim vremenom 3,51 min, označen sa P550, u MS1 spektru (sl. 42) sadrţi slab signal na m/z 589 [M+K] + i intenzivan signal na m/z 423 [M+H–S4] + . Na osnovu molekulske mase i gubitka 4 atoma sumpora moţe se zaključiti da je u pitanju tetrasulfidni homolog sirodezmina A, odnosno sirodezmin B, D, E ili K. NO O OR1 OH N O OR2 O S S S S R1,R2 = (Ac,H) Samo u frakcijama II/1 i III/1 detektovan je pik P318 na tR=1,39 min. U MS 1 spektru (sl. 43) se pored jonâ m/z 319 [M+H] + , 341 [M+Na] + , 357 [M+K] + i 659 [2M+Na] + zapaţa i intenzivan fragment m/z 251 (osnovni jon). Molekulskoj masi od 318 odgovara fomamid. Fragment m/z 251 u tom slučaju odgovara gubitku O-vezane prenil-grupe kao C5H5. Profil izotopskih pikova: A (100 %), A+1 (18,0 %), A+2 (2,8 %) saglasan je sa pretpostavljenom formulom C17H22N2O4 (teorijski profil 100 %, 20,1 %, 2,7 %). NHNH O OOH O Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 49 U MS 1 spektru pika P311, sa tR=0,95 min uočavaju se joni m/z 312 [M+H]+, 334 [M+Na]+, 350 [M+K] + i 623 [2M+H] + , kao i jon fragmenta m/z 176. Molekulska masa odgovara fomaliginu A ili vasabidienonu E. NH OH OH O O O Slika 25. MS 1 spektar pika P444 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 50 Slika 26. MS 2 spektri pika P444, kolizione energije 0–30 V Slika 27. MS 1 spektar pika P454 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 51 Slika 28. MS 2 spektri pika P454, kolizione energije 0–30 V Slika 29. MS 1 spektar pika P476 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 52 Slika 30. MS 2 spektri pika P476, kolizione energije 0–30 V Slika 31. MS 1 spektar pika P486a Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 53 Slika 33. MS 2 spektri pika P486a, kolizione energije 0–30 V Slika 32. MS 1 spektar pika P486b Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 54 Slika 34. MS 2 spektri pika P486b, kolizione energije 0–30 V Slika 35. MS 1 spektar pika P508 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 55 Slika 36. MS 1 spektar pika P518a Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 56 Slika 39. MS 2 spektri pika P518a, kolizione energije 0–30 V Slika 40. MS 1 spektar pika P518b Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 57 Slika 39. MS 2 spektri pika P518b, kolizione energije 0–30 V Slika 41. MS 1 spektar pika P518c Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 58 Slika 41. MS 2 spektri pika P518c, kolizione energije 0–30 V Slika 42. MS 1 spektar pika P550 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 59 Slika 43. MS 1 spektar pika P318. 6. 8. Test fitotoksičnosti Na osnovu LC–MS–MS analize utvrĎeno je prisustvo različitih fitotoksina u frakcijama označenim sa 1, 2a, 2b, 2c i dr. Frakcija 2b i 2c su prouzrokovale najveću fitotoksičnost (+ + +) na kotiledonima kod sva četiri izolata (C-3, S-11, St-5 i L.m). Frakcija 2a pokazuje srednji stepen fitotoksičnosti (+ +) izuzev izolata C-3 koja je ocenjena kao slaba fitotoksičnost (+). Slika 44. Fitotoksičnost sirodezmina detektovana u frakcijama 1, 2a, 2b i 2c Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 60 Slaba fitotoksičnost je zapaţena kod frakcije 1 kod svih izolata. Frakcija 2d i 3 kod svih izolata (L. maculans), kao i izolat K-113 (L. biglobosa) nisu prouzrokovale fitotoksičnost na ispitivanim kotiledonima. Beličaste pege na ovim kotiledonima (frakcija 2d, 3 i izolat K-113) su posledica oštećenja epidermisa iglom. Fitotoksična aktivnost (sl. 44) je u saglasnosti sa rezultatima LC-MS analize i prisustvo fitotoksičnih sirodezmina u frakciji 1, 2a, 2b i 2c su ovom analizom jasno potvrĎene. 6. 9. OdreĎivanje patogenih grupa OdreĎivanje patogenih grupa je vršeno na osnovu patogenosti prema setu diferncijalnih sorti (Westar, Glacier i Quinta). Ukupno je ispitivano 119 izalata gljiva sakupljnih tokom 2009. i 2010. godine na području Vojvodine - Srbija. Patogenost prema odreĎenim sortama je ocenjivana na osnovu ispoljenih simptoma na kotiledonima. Na osnovu obavljnih ispitivanja 8 izolata pripada PG1, 5 izolata pripada PG2, 22 izolata pripada PG3 i 84 izolata PG4. Različita patogenost izolata L. maculans i L. biglobosa na diferencijalnim soratama uljane repice omogućuje razlikovanje slabo virulentnih (neagresivnih) i virulentnih (agresivnih) izolata, kao i dalju podelu virulentnih izolata u tri patogene grupe (Tab. 4). Izolati PG1 (patogena grupa L. biglobosa) prouzrokuju male nekrotične pege oko povreĎenog mesta na kotiledonu kod svih diferencijalnih sorti (sl. 45). Izolati koji pripadaju PG2 prouzrokuju velike nekrotične pege na sorti Westar u okviru kojih micelija gljive ima izraţenu sporulaciju. Na sorti Quinta izazivaju različite pege, u okviru kojih micelija ne sporuliše (sl. 45). Pege na sorti Glacier su slične po veličini koje prouzrokuju slabo virulenti izolati, ali pokazuju manju nekrozu oko inokulisanog dela. Izolati koji pripadaju PG3 imaju povećanu sporulaciju na sorti Westar i Glacier, a na sorti Quinta prouzokuju braon pege bez sporulacije (sl. 45). Izolati u okviru PG4 prouzrokuju velike nekrotične pege na svim sortama i obilno sporulišu (sl. 45). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 61 Kontrola Slika 46. Simptomi prouzrokovani izolatima gljiva L. maculans i L. biglobosa koji pripadaju patogenim grupama PG2, PG3 i PG4 L. maculans i PG1 L. biglobosa na kotiledonima diferencijalnih sorti Westar, Glacier i Quinta u odnosu na kontrolnu varijantu (sorta Glacier) Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 62 Tabela 4. Patogenost izolata L. maculans i L. biglobosa na diferencijalnim sortama (Westar, Quinta i Glacier) Izolat Poreklo Westar Quinta Glacier PG Index oboljenja na osnovu skale (Koch et al., 1989) l. b. V. Britanija 1,0 1,3 1,0 PG1 K – 111 Srbija 1,8 1,5 1,0 PG1 K – 112 Srbija 1,2 1,0 1,0 PG1 K – 113 Srbija 2,5 1,6 1,9 PG1 K – 114 Srbija 2,1 1,3 1,6 PG1 K – 115 Srbija 1,8 1,5 1,3 PG1 K – 116 Srbija 1,9 1,5 1,4 PG1 K – 117 Srbija 2,2 2,0 0,9 PG1 K – 118 Srbija 1,7 1,0 0,8 PG1 K – 21 Srbija 7,0 4,9 2,3 PG2 S – 5 Srbija 8,6 6,3 2,5 PG2 S – 9 Srbija 7,6 5,0 2,3 PG2 L – 4 Srbija 8,3 5,6 2,8 PG2 L – 8 Srbija 8,0 7,5 2,6 PG2 l. m. V. Britanija 9,0 5,9 8,5 PG3 K – 5 Srbija 8,8 5,8 8,3 PG3 K – 6 Srbija 8,1 5,3 8,5 PG3 L – 1 Srbija 8,3 5,5 7,8 PG3 L – 2 Srbija 8,5 5,1 7,6 PG3 L – 3 Srbija 8,5 4,6 7,0 PG3 L – 5 Srbija 8,8 4,3 7,8 PG3 Lj – 2 Srbija 7.6 6,0 7,0 PG3 Lj – 3 Srbija 8,0 5,8 7,5 PG3 St – 23 Srbija 8,3 5,5 8,0 PG3 St – 24 Srbija 8,3 4,6 7,1 PG3 St – 25 Srbija 7,8 2,6 6,5 PG3 St – 26 Srbija 8,6 4,3 8,1 PG3 St – 27 Srbija 8,5 4,0 8,3 PG3 Gs – 4 Srbija 8,3 6,1 8,0 PG3 Gs – 8 Srbija 8,8 6,0 8,3 PG3 Gs – 9 Srbija 8,8 6,0 7,3 PG3 Gs – 11 Srbija 8,6 5,8 8,0 PG3 K – 9 Srbija 9,0 3,6 9,0 PG3 K – 11 Srbija 9,0 5,6 8,6 PG3 K – 13 Srbija 9,0 3,8 7,5 PG3 K – 15 Srbija 9,0 4,6 8,0 PG3 St – 1 Srbija 9,0 8,6 8,1 PG4 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 63 Izolat Poreklo Westar Quinta Glacier PG St – 2 Srbija 9.0 8.6 8.3 PG4 St – 3 Srbija 9.0 8.5 7,6 PG4 St – 4 Srbija 8.0 8,6 8,6 PG4 St – 5 Srbija 9,0 9,0 8,5 PG4 St – 6 Srbija 9,0 9,0 9,0 PG4 St – 7 Srbija 8,6 7,5 8,5 PG4 St – 8 Srbija 8,6 8,5 8,5 PG4 St – 9 Srbija 8,8 8,3 8,8 PG4 St – 10 Srbija 8,3 8,1 8,0 PG4 St – 11 Srbija 9,0 8,1 9,0 PG4 St – 12 Srbija 8,5 8,3 8,6 PG4 St – 13 Srbija 8,8 8,1 7,6 PG4 St – 14 Srbija 9,0 7,5 9,0 PG4 St – 15 Srbija 9,0 8,3 8,6 PG4 St – 16 Srbija 8,8 8,5 8,3 PG4 St – 17 Srbija 8,6 7,5 8,3 PG4 St – 18 Srbija 9,0 9,0 8,5 PG4 St – 19 Srbija 8,8 8,6 7,8 PG4 St – 20 Srbija 8,8 7,6 7,0 PG4 St – 21 Srbija 8,6 7,8 7,8 PG4 St – 22 Srbija 8,7 7,3 7,0 PG4 St – 28 Srbija 9,0 8,1 8,6 PG4 K – 1 Srbija 8,6 8,6 7,8 PG4 K – 2 Srbija 8,5 7,8 8,6 PG4 K – 3 Srbija 8,6 8,0 8,0 PG4 K – 4 Srbija 8,6 7,6 8,3 PG4 K – 7 Srbija 8,6 8,8 8,5 PG4 K – 8 Srbija 9,0 8,1 9,0 PG4 K – 10 Srbija 9,0 8,6 8,1 PG4 K – 12 Srbija 9,0 8,5 7,5 PG4 K – 14 Srbija 9,0 9,0 7,8 PG4 K – 16 Srbija 9,0 8,3 8,5 PG4 K – 17 Srbija 8,6 7,8 7,5 PG4 K – 18 Srbija 9,0 7,8 8,5 PG4 K – 19 Srbija 9,0 8,8 8,1 PG4 K – 20 Srbija 9,0 8,6 8,1 PG4 K – 22 Srbija 9,0 8,6 9,0 PG4 K – 23 Srbija 9,0 8,8 8,5 PG4 K – 24 Srbija 9,0 8,0 8,3 PG4 K – 25 Srbija 9,0 8,5 8,8 PG4 C – 1 Srbija 8,6 7,5 8,3 PG4 C – 2 Srbija 8,6 8,8 8,1 PG4 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 64 Izolat Poreklo Westar Quinta Glacier PG C – 3 Srbija 8,3 7,9 7,5 PG4 C – 4 Srbija 8,6 8,6 8,1 PG4 C – 5 Srbija 8,6 8,6 8,0 PG4 C – 6 Srbija 8,8 8,5 7,5 PG4 L – 6 Srbija 8,8 7,8 8,0 PG4 L – 7 Srbija 8,8 7,6 7,0 PG4 L – 9 Srbija 8,6 8,5 8,3 PG4 L – 10 Srbija 9,0 8,0 8,8 PG4 Lj – 1 Srbija 8,0 7,0 7,3 PG4 Lj – 4 Srbija 7,8 8,0 8,1 PG4 Lj – 5 Srbija 8,6 8,1 7,5 PG4 Lj – 6 Srbija 8,0 8,3 7,1 PG4 S – 1 Srbija 8,6 8,5 7,3 PG4 S – 2 Srbija 8,1 7,6 7,0 PG4 S – 3 Srbija 8,5 8,1 7,5 PG4 S – 4 Srbija 8,8 8,6 8,5 PG4 S – 6 Srbija 8,5 8,8 8,3 PG4 S – 7 Srbija 8,8 8,1 8,1 PG4 S – 8 Srbija 8,8 8,6 8,5 PG4 S – 10 Srbija 8,6 8,2 8,5 PG4 S – 11 Srbija 9,0 8,5 7,6 PG4 Gs – 1 Srbija 9,0 8,5 8,1 PG4 Gs – 2 Srbija 8,0 8,0 7,0 PG4 Gs – 3 Srbija 9,0 8,1 8,1 PG4 Gs – 5 Srbija 8,6 7,0 7,6 PG4 Gs – 6 Srbija 8,2 7,5 7,0 PG4 Gs – 7 Srbija 8,6 7,0 7,3 PG4 Gs – 10 Srbija 8,6 7,1 8,1 PG4 Gs – 12 Srbija 8,8 7,5 7,6 PG4 Gs – 13 Srbija 9,0 7,5 7,5 PG4 Gs – 14 Srbija 8,8 8,0 7,8 PG4 Gs – 15 Srbija 8,8 8,8 8,3 PG4 Gs – 16 Srbija 8,5 8,1 7,5 PG4 Gs – 18 Srbija 8,6 8,0 7,3 PG4 Gs – 19 Srbija 8,5 8,3 7,5 PG4 Gs – 21 Srbija 9,0 8,6 8,1 PG4 Gs – 22 Srbija 9,0 8,5 8,0 PG4 Gs – 23 Srbija 9,0 8,0 8,1 PG4 Gs – 24 Srbija 9,0 9,0 8,5 PG4 Gs – 25 Srbija 8,3 8,5 8,3 PG4 Gs – 26 Srbija 8,8 8,0 7,5 PG4 Gs – 27 Srbija 9,0 8,0 7,6 PG4 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 65 Podaci prikazani u tabeli 4 ukazuju da su u Srbiji prisutne sve patogene grupe (PG 1, PG2, PG3 i PG4). Osim toga moţe se zapaziti da najviše izolata pripada PG4 grupi, a najmanje PG2 u okviru vrste L. maculans. Svi izolati (K-111, K-112, K-113, itd.) pripadaju PG1 grupi odnosno vrsti L. biglobosa. Ovom analizom kao i prethodnim analizama se potvrĎuje da u okviru istog lokaliteta mogu biti izolovani izolati koji pripadaju različitim patogenim grupama odnosno patogenim vrstama gljive (L. maculans i L. biglobosa). 6. 10. Prenošenje patogena semenom Broj inficiranih (propalih) i zdravih biljaka bio je glavni kriterijum za ocenu nivoa patogenosti (prenošenje parazita semenom) kod ispitivanih izolata. Nakon 7 dana svi izolati (L.m, C-5, L-5, K-7, LJ-3, S-11, St-1, GS-3) su pokazali odreĎenu patogenost na biljkama uljane repice (Graf. 1). Ova patogenost se ogledala u broju izniklih biljaka, poleganju biljaka (sl. 47) i (sl. 48). Kod L.b (referentni izolat L. biglobosa) K-113 i K-115 izolata nakon 7 dana nije zapaţena patogenost na biljkama uljane repice. Broj izniklih biljaka kod ovih izolata je sličan kontrolnoj varijanti (Graf. 1). Ni pri posmatranju nakon 14 dana (L.b, K-113 i K-115 izolati) nije priemećena pojava simptoma na izniklim biljkama Tabela 5. Stepen patogenosti izolata gljive u odnosu na kontrolu primenom Dunett-ovog testa Izolat % izniklih biljaka Nakon 7 dana % zdravih biljaka Nakon 14 dana L.m nz a * L.b nz nz C-5 nz ** L-5 nz ** K-7 nz ** Lj-3 nz ** S-11 ** ** St-1 ** ** GS-3 ** ** K-113 nz nz K-115 nz nz nz – nije značajno; *P < 0.05; **P < 0.01 asva poreĎenja su uraĎena na arcsin transformisanim podacima Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 66 Slika 47. Polegle i svenule biljke uljane repice nastale iz semena inokulisanog sa L. maculans Slika 48. Simpotmi na hipokotili i kotiledonima biljaka uljane repice nastale iz zaraţenog semena L. maculans (levo: zaraţena biljaka, desno – zdrava biljka) Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 67 Graf. 1. Mogućnost prenošenja gljiva L. maculans i L. biglobosa semenom. Stepen patogenosti izolata na biljkama uljane repice posle 7 dana nakon inokulacije semena Graf. 2. Mogućnost prenošenja gljiva L. maculans i L. biglobosa semenom. Stepen patogenosti izolata na biljkama uljane repice posle 14 dana nakon nokulacije semena 0 20 40 60 80 L. L.b C-5 L-5 K-7 Lj-3 S-11 St-1 GS-3 K- K-115 Kontrola % i z n ik lih b ilj a k a 0 2 4 6 8 L.m L.b C- L-5 K-7 Lj-3 S-11 St-1 GS-3 K-133 K-115 Kontrola % z d ra v ih b ilj a k a Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 68 6. 11. Molekularna karakterizacija Kao što je već navedeno u poglavlju materijal i metode rada za molekularnu identifikaciju izolata su korišćeni sledeći prajmeri: APH12, LRM1, PN3 i PN10). 580 bp 560 bp Prajmer APH12 Prajmer LRM1 PN3 i PN10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15M Slika 49. Amplifikacija DNK korišćenjem APH12, LRM1, PN3 i PN10 prajmera DNK je amplifikovana korišćenjem APH12, LRM1, PN3 i PN10 prajmerima. Na slici 49 se moţe zapaziti da nije došlo do amplifikacije DNK kod ispitivanih izolata upotrebom APH12 prajmera. Duţina traka korišćenjem LRM1 prajmera za L.m. (referentni izolat L. maculans), L. b. (referenti izolat L. biglobosa), St-16 i K-6 je 580 bp, dok kod izolata K-115 nije došlo do umnoţavanja DNK. Duţina traka korišćenjem PN3 i PN10 prajmera kod L.m, St-16 i K-6 je 560 bp, a kod L.b. i K-115 580 bp. Traka 1 L.m, 2 L.b, 3 K-115, 4 St-16, 5 K-6, APH12 prajmeri, 6 L.m, 7 L.b, 8 K-115, 9 St-16, 10 K-6, LRM1 prajmeri, 11 L.m, 12 L. b, 13 K-115, 14 St-16, 15 K-6, PN3 i PN10 prajmeri. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 69 580 bp560 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Prajmer APH12 PN3 i PN10 M Slika 50. Amplifikacija DNK korišćenjem APH12, PN3 i PN10 prajmera Na slici 50 su prikazani rezultati amplifikacije DNK korišćenjem APH12, PN3 i PN10 prajmera. Kao što se vidi i u drugom slučaju, APH12 prajmeri nisu umnoţili DNK kod ispitivanih izolata, dok je duţina traka sa PN3 i PN10 prajmerima ista kao kod prethodne PCR analize. Traka 1 L.m, 2 L.b, 3 K-111, 4 K-112, 5 K-113, 6 K-116, 7 K-114, 8 K-115, 9 L.m, 10 L.b, 11 K-112, 12 K-113, 13 K-116, 14 K-114, 15 K-115. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 580 bp M Slika 51. Amplifikacija DNK korišćenjem APH12 i LRM1 prajmera Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 70 Na slici 51. su prikazani rezultati amplifikacije DNK korišćenjem APH12 i LRM1 prajmera. I u ovoj PCR analizi APH12 nisu amplifikovali DNK ispitivanih izolata. Amplifikacija DNK sa LRM1 prajmerima je dobijena samo kod L.m, GS-25, St-5, S-11 i C-3 izolata a duţina traka je 580 bp. U ovoj PCR analizi korišćena je DNK ekstrahovana po O'Gorman et al. (1994) modifikovana po Kuusk-u et al. (2002). U svim sledećim PCR analizama ekstrakcija DNK je raĎena po Day i Shattock (1997). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 1511 13 580 bp580 bp M M Slika 52. i 53. Amplifikacija DNK korišćenjem LRM1 prajmera Na slikama 52 i 53 DNK je amplifikovana korišćenjem LRM1 prajmera. Kod svih ispitivanih izolata, kao i referentni izolat (L.m.), duţina traka je 580 bp što pokazuje da svi izolati pripadaju vrsti L. maculans. Na slici 52 traka M 500 bp marker 1 L.m, 2 St-1, 3 St-2, 4 St-3, 5 St-4, 6 St-5, 7 St-6, 8 St-7, 9 St-8, 10 St-9, 11 St-10, 12 St-11, 13 St-12, 14 St-13, 15 St-14. Na slici 53 traka M 500 bp marker, 1 L.m, 2 St-15, 3 St-16, 4 St-17, 5 St-18, 6 St-19, 7 St-20, 8 St-21, 9 St-22, 10 St-23, 11 St-24, 12 St-25, 13 St-26, 14 St- 27, 15 St-28. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 71 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 580 bp 560 bp M Slika 54. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 13 14 15119 580 bp 560 bp M Slika 55. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 72 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 1510 580 bp 560 bp M Slika 56. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera Na slikama 54, 55 i 56 DNA je amplifikovana korišćenjem PN3 i PN10 prajmera. Kod svih ispitivanih izolata, plus referentni izolat L.m. (L. maculans), duţina traka je 560 bp, dok je kod referentnog izolata L.b. (L. biglobosa) 580 bp. Na slikama 54, 55 i 56 traka M 3000 bp marker. Na slici 54 traka 1 L.m., 2 L.b, 3 GS-1, 4 GS-2, 5 GS-4, 6 GS-5, 7 GS-9, 8 GS-10, 9 GS-12, 10 GS-15, 11 GS-18, 12 GS-19, 13 GS-21, 14 GS-22, 15 GS-23. Na slici 55 traka 1 L.m, 2 L.b, 3 S-1, 4 S-2, 5 S-3, 6 S-4, 7 S-5, 8 S-6, 9 S-7, 10 S-8, 11 S-9, 12 S-10, 13 LJ-1, 14 LJ-2, 15 LJ-4. Na slici 56 traka 1 L.m, 2 K-1, 3 K- 2, 4 K-3, 5 K-4, 6 K-5, 7 K-6, 8 K-7, 9 K-8, 10 K-9, 11 K-10, 12 K-23, 13 K-24, 14 K- 25, 15 L.b. Na osnovu duţine traka sl 54,55 i 56 svi ispitivani izolati pripadaju vrsti L. maculans izuzev L.b. izolata. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 73 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 1510 560 bp M Slika 57. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 1410 560 bp M Slika 58. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera Na slici 57 i 58 DNK je amplifikovana korišćenjem PN3 i PN10 prajmera. Kod svih ispitivanih izolata plus referentni izolat L.m. (L. maculans) duţina traka je 560 bp. Na slici 57 traka M 3000 bp marker, 1 L.m, 2 K-11, 3 K-12, 4 K-13, 5 K-14, 6 K-15, 7 K-17, 8 GS-3, 9 GS-6, 10 GS-7, 11 GS-8, 12 GS-11, 13 GS-13, 14 GS-14, 15 GS-16. Na slici 58 traka M 3000 bp marker, 1 L.m, 2 L-1, 3 L-2, 4 L-3, 5 L-4, 6 L-5, 7 L-6, 8 L-7, 9 L-8, 10 L-9, 11 L-10, 12 LJ-3, 13 LJ-5, 14 LJ-6. Svi ispitivani izolati prikazani na slikama 57 i 58, a na osnovu duţine traka pripadaju vrsti L. maculans. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 74 1 2 3 4 5 6 7 8 10 13 14119 12 560 bp 580 bp M Slika 59. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera Na slici 59. DNK je amplifikovana sa PN3 i PN10 prajmerima. Traka M 3000 bp marker, 1 C-1, 2 C-2, 3 C-3, 4 C-4, 5 C-5, 6 C-6, 7 L.m, 8 L.b, 9 GS-24, 10 GS-26, 11 GS-27, 12 K-112, 13 K-117, 14 K-118. Kod izolata C-1, C-2, C-3, C-4, C-5, C-6, GS- 24, GS-26, GS-27 i L.m. duţina traka je 560 bp, dok je kod L.b, K-112, K-117 i K-118 580 bp. Na osnovu PCR analize svi izolati označeni sa C, GS i L.m pripadaju vrsti L. maculans, a L.b, K-112, K-117 i K-118 pripadaju vrsti L. biglobosa. 1 2 3 4 5 6 7 8 10 13 14119 12 560 bp 580 bp M Slika 60. Amplifikacija DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 75 Na slici 60. DNK je amplifikovana sa PN3 i PN10 prajmerima. Traka M 3000 bp marker, 1 L.b, 2 K-111, 3 K-112, 4 K-113, 5 K-115, 6 K-116, 7 K-18, 8 GS-25, 9 K-16, 10 K-19, 11 K-20, 12 K-21, 13 K-22, 14 L.m. Kod izolata L.m (referentni izolat), K-18, GS-25, K-16, K-19, K-20, K-21, K-22 duţina traka je 560 bp, dok je kod izolata L. b. (referentni izolat) K-111, K-112, K-113, K-115, K-116 580 bp. Na osnovu duţine traka svi izolati L.m, K-18, GS-25, K-16, K-19, K-20, K-21, K-22 pripadaju vrsti L. maculans, dok L.b. K-111, K-112, K-113, K-115 pripadaju vrsti L. biglobosa. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 1410 580 bp 560 bp M Slika 61a.Polimorfizam dobijen amplifikacijom DNK korišćenjem PN3 i PN10prajmera 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1411 1310 12 b) 580 bp 420 bp 140 bp M Slika 61 b. Profil dobijen digestijom amplifikovanog regiona sa BamHI Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 76 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 1411 1310 c) 460 bp 445 bp 125 bp M Slika 61 c. Profil dobijen digestijom amplifikovanog regiona sa HaeIII d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 250 bp 100 bp 120 bp 200 bp 215 bp M Slika 61 d. Profil dobijen digestijom amplifikovanog regiona sa RsaI Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 77 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 e) 125 bp 430 bp 460 bp M Slika 61 e. Profil dobijen digestijom amplifikovanog regiona sa EcoRII 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 f) 60 bp 135 bp 145 bp 325 bp 360 bp M Slika 61 f. Profil dobijen digestijom amplifikovanog regiona sa AluI Slika 61a. Polimorfizam dobijen amplifikacijom DNK korišćenjem PN3 i PN10 prajmera. Traka M 3000 bp marker, 1 L.b, 2 K-111, 3 K-112, 4 K-113, 5 K-115, 6 K- 116, 7 K-2, 8 St-16, 9 GS-25, 10 L-5, 11 C-3, 12 LJ-2, 13 S-11, 14 L.m. Nakon PCR reakcije, DNK ispitivanih izolata (Sl. 61a) je korišćena za PCR-RFLP analizu. Profili Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 78 dobijeni digestijom amplifikovanog regiona sa 61b) BamHI, 61c) HaeIII, 61d) RsaI 61e) EcoRII i 61f) AluI. Restrikcioni enzim BamHI kod L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116 seče DNK na 580 bp, dok kod K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-11 i L.m. izolata seče DNK na 420 i 140 bp (sl. 61b). Restrikcioni enzim HaeIII kod L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116 izolata seče DNK na 460 i 125 bp dok kod K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-11 i L.m. izolata seče DNK na 445 i 125 bp (sl. 61c). Na osnovu dobijenog polimorfizma svi ispitivani izolati (L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116) pripadaju vrsti L. biglobosa NA1 ili NA3 podgrupi. Restrikcioni enzim RsaI kod L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116 izolata seče DNK na 120, 215 i 250 bp dok kod K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-11 i L.m. izolata seče DNK na 100, 200 i 250 bp (sl.61d). Na osnovu duţine fragmenata svi ispitivani izolati (L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116) pripadaju vrsti L. biglobosa dok izolati K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-1 i L.m. pripadaju vrsti L. maculans. Restrikcioni enzim EcoRII kod L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116 seče DNK na 125 i 460 bp (sl.61e). Na osnovu dobijenog polimorfizma svi ispitivani izolati (L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116) pripadaju vrsti L. biglobosa NA1 podgrupa dok ostali izolati pripadaju vrsti L. maculans. Restrikcioni enzim AluI kod L.b, K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116 seče DNK na 60, 145 i 360 bp dok kod K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-11 i L.m. izolata seče DNK na 60, 135 i 325 bp (sl.61f). Na osnovu RFLP analize svi ispitivani K- 111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116, poreklom iz Srbije kao i referentni izolat L.b. pripadaju vrsti L. biglobosa NA1 podgrupa, dok K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, LJ-2, S-11, takoĎe poreklom iz Srbije, kao i referentni izolat L.m. vrsti L. maculans. Prikazane duţine traka su izraţene u bp (bazni parovi). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 79 VII. DISKUSIJA Uljana repica (Brassicae napus var. napus L.) je industrijska biljka od velikog privrednog značaja, a u oko 30 zemalja sveta je najvaţnija uljana biljna vrsta. U našoj zemlji površine pod ovom biljnom vrstom su se menjale, imale tendenciju pada i porasta, a poslednjih godina se sve više povećavaju. U poslednje dve decenije površine pod uljanom repicom variraju i kreću se od 2.000–7.000 ha (Crnobarac i Marinković, 2006). Uljana repica se gaji zbog semena, koje sadrţi 40–48% ulja i 18–25% belančevina (Marjanović-Jeromela Ana et al, 2002). Limitirajući faktor u proizvodnji uljane repice, koja se poslednjih godina sve više širi u proizvodnim reonima naše zemlje, predstavlja veliki broj fitopatogenih gljiva. MeĎu brojnim oboljenjima, rak prizemnog dela stabla je ekonomski vaţna bolest uljane repice u svetu (Fitt et al., 2006), a verovatno u skorijoj budućnosti i kod nas. Parazit prouzrokuje simptome oboljenja od fenofaze kotildona pa sve do fenofaze zrenja (Petrie, 1979; Paul and Rawlinson, 1992). Gljiva se u prirodi odrţava pomoću piknida, micelija i pseudotecija (Williams, 1992). 7. 1. Morfološke karakteristike proučavanih izolata Na PDA podlozi u početnim fazama razvoja, a i kasnije, svi ispitivani izolati (L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5, L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K- 117), stvaraju vazdušnu miceliju sivobele boje dok je supstratna micelija u početku mlečnobele boje, što je u skladu sa Williams & Fitt (1999) i Fitt et al. (2006). Vremenom dolazi do stvaranja bledocrnog pigmenta u podlozi kod izolata (L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5) (Pound 1947; Humpherson-Jones, 1986; Williams & Fitt 1999; Mitrović i Marinković 2007), dok izolati (L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K-117) stvaraju i na PDA podlozi ţutomrki pigment (Fitt et al. 2006; Hony et al. 2009). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 80 Izolati (L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5) imaju spor i nepravilan porast na PDA podlozi, sa rubom koji je često sa reţnjevitim ivicama, što je u skladu sa Pound (1947), Koch et al. (1989), Mitrović i Marinković (2007), Williams & Fitt (1999), dok L.b, K-112, K-113, K-114, K-115, K-117, imaju brz porast sa dosta pravilnim rubom (McGee & Petrie 1978, Humpherson-Jones 1983, 1986). Brun et al. (1997) navode da u odsustvu RFLP analize a na osnovu virulentnosti, produkcije pigmenta i stvaranja fitotoksina sirodezmin Pl svi izolati se mogu svrstati u dve grupe: grupa A i B. Koch et al. (1989) navodi da izolati A grupe (L. maculans) imaju spor i nepravilan porast na nizu agarizovanih podloga, dok izolati B grupe (L. biglobosa) imaju brz i pravilan porast. MeĎutim, postoji saopštenje da neki izolati A grupe (L. maculans) imaju brţi porast od B grupe (L. biglobosa) izolata, te na bazi brzine porasta na podlogama ih je teško razlikovati (Delwiche 1980 cit. loc. Williams 1992, Kharbanda & Stevens 1993, Salisbury et al. 1995). Ipak, na osnovu morfoloških i biohemijskih karakteristika Koch et al. (1989), Petrie (1988), Hill et al. (1984) su izolate podelili u dve grupe agresivne i neagresivne sojeve. Svi ispitivani izolati na PDA podlozi formiraju okruglaste piknide, mrke boje, pojedinačno ili u stromatičnim tvorevinama. Prečnik piknida kod L.b, K-112, K-113, K- 114, K-115, K-117 izolata se kreće od 240 do 480 µm ,a kod izolata L.m, L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2, C-5 od 220 do 510 µm što je u skladu sa (Punithalingam snd Holliday 1972, Hong et al. 2009). Piknospore iz piknida se oslobaĎaju u vidu jedne ţelatinozne mase krem do ruţičaste boje. Piknospore su bezbojne kratko cilindrične jednoćelijske uglavnom prave neke malo povijene sa ili bez kapi ulja na krajevima veličine 1,302,20x2,805,40 µm. Slične rezultate navode i drugi autori (Punithalingam i Holliday 1977; Williams 1992; Mitrović i Marinković 2007; Hong et al. 2009). 7. 2. Dokazivanje savršenog stadijuma Pored piknida, gljiva formira i teleomorfni stadium. Kao i u drugim zemljama Australija, Kanada, Francuska, Nemačka, Švedska, Poljska, itd. (Kuusk et al. 2002, Bokor et al. 1975, Petrie 1978, Gladders & Musa 1980, Hall 1992, Mahuku et al. 1996, McGee 1974, West et al. 1999, Pérés & Poisson 1997, Korolewski et al. 2002, Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 81 Thürwächter et al. 1999, Jedryczka et al. 1999b) tako i kod nas, na ţetvenim ostacima (stablo) micelija gljive obrazuje pseudotecije sa askusima i askosporama. Osim prisutva pategena u stablu repice, za obrazovanje savršenog stadijuma je neophodna temperatura (1520°C) i češća pojava kiše (Biddulph et al. 1999, Hammond 1985, Pérés & Poisson 1997, Huang et al. 2001, Toscano-Underwood et al. 2003). U našim klimatskim uslovima, u pojedinim godinama (visoke temperature i odsustvo atmosferskog taloga) često izostane obrazovanje pseudotecija krajem leta i tokom jeseni. Zbog toga infekcije uljane repice u jesen u našim uslovima često izostanu ili su veoma retke. Retke infekcije i kad se dese rezultat su kontaminiranog semena ili prisustva insekatskih vrsta (buvači: Phyllotreta spp.).Veoma je čest slučaj da nakon ţetve proizvodjači ne zaoravaju ţetvene ostatke.Na takvim parcelama tokom jula i avgusta često se moţe zapaziti regeneracija lisnih pupoljaka na pojedinim stablima.Ta mesta naseljavaju insekti koji se hrane mladim listom.Nakon nicanja novog useva insekti se sele sa starih strnjišta na nove parcele i tom prilikom na nogama prenose piknospore koje su se oslobodile iz piknida na starim stablima.Ova ţapaţanja su u skladi sa rezultatima (West et al. 2001, Barbetti & Khangura 2000 cit loc West et al. 2001, Wood & Barbetti 1977a). U Srbiji (Vojvodina) se askospore l, maculans i L. biglobosa osim u jesen oslobaĎaju i tokom proleća, najčešće aprila i maja meseca, što je u skladu sa rezultatima (Gladolers & Musa 1980, Fitt et al. 2006). OsloboĎene askospore preko povrede ili stoma inficiraju listove (Hammond et al. 1985) a u proleće pored lista inficiraju stabla, grane, cvetove i ljuske prodikujući na njima karekteristične simptome bolesti (sl. 1, 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, 6). Posle ţetve na ostacima obolelh delova stabla uljane repice tokom jeseni ili narednog proleća na izumrlim biljnim delovim gljve se razvijaju kao saprofiti i u biljnim delovima stvaraju pseudotecije. One su okruglastog oblika mrke boje sa kratkom ostiolom prečnika 313 do 532 µm što se slaţe sa podacima (Punithalingam & Holliday 1972, Williams 1992). Askusi su cilindrični do topuzasti sa kratkom drškom, hijalni, veličine 16,7221,39 x 90160 µm. U svakom askusu se nalazi po 8 askospora. Askospore su prave do slabo povijene i suţene na krajevima u početku svetloţute boje Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 82 sa 5 septi veličine 610,5 x 4274 µm. Sa starenjem spore postaju ţutomrke. Slične podatke navode i Punithalingam i Holliday (1972); Williams (1992); Magyar et al. (2006). Simptomi na kotiledonima inficirani askosporama se javljaju u početku u vidu zelenkastobledih pega (West et al. 1999, 2001). U kasnijem periodu, inficirano tkivo nekrotira i u središnjem delu pege dolazi do obrazovanja piknida. Nakon pojave piknida, izvršena je izolacija iz inficiranog tkiva na PDA podlogu i dobijen je konidijski stadium gljive (Smith 1956) opisan pod nazivom Phoma lingam (Tode: Fr.) Desmaz. S obzirom da je gljiva heterotalusna (Venn 1979 cit. Loc Petrie & Lewis 1985), pored obrazovanja pseudotecija i askospora u prirodnim uslovima, veći broj autora (Petrie & Lewis 1985, Mengistu et al. 1993, 1995) je dobio teleomorfni stadijum i u laboratorijskim uslovima. Mengistu et al. (1995) su uočili da na različitim podlogama je potreban različit vremeski priod za formiranje pseudotecija (7 ili 4 nedelje) i oslobaĎanje zrelih askospora. U našim ispitivanjima kod pojedinih sparivanih izolata (Tab. 3) takoĎe je dobijen savršeni stadium gljive. Kod većine drugih izolata nije došlo do obrazovanja pseudotecija i askospora, a kod odreĎenog broja izolata su se samo obrazovale pseudotecije bez askusa i askospora što je u skladu sa rezultatima (Petrie & Lewis 1985). Verovatno da, podloga koja je korišćena nije imala uticaja na odsustvo formiranja pseudotecija i askospora već nekompatibilnost izolata, mada Mengistu et al. (1995) navodi da procenat vlage u podlozi utiče na broj i zrelost pseudotecija. Obrazovanje pseudotecija izmeĎu L.m. (referentni izolat L. maculans iz Velike Britanije) i C-2 i L.m i L-8 pokazuje da virulentni izolati su visoko kompatibilni, iako potiču iz različitih regiona, odnosno drţava, što je u saglasnosti sa (Petrie & Lewis 1985). Iako Schoemaker & Brun (2001) navode da kod sparivanja izolata iz grupe A i B ili Tox + i Tox 0 nema obrazovanja savršenog stadijuma, te na osnovu toga, kao i morfoloških molekularnih i virulentnih osobina, sve virulentne izolate su svrstali u vrstu L. maculans, a slabovirulentne i avirulentne u novu vrstu označena kao L. biglobosa. U ovim ispitivanjima, takoĎe, nisu dobijene pseudotecije kod sparivanja K-112 i K-118 izolata sa L.m (referentni izolat L. maculans) GS-13, C-2, LJ-1, St-1, K-11. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 83 MeĎutim, navedeni podaci na osnovu samo ovih ispitivanja ne mogu biti relevantni zato što i kod nekih drugih izolata nije dobijen savršeni stadium. Ipak, na osnovu morfoloških i molekularnih ispitivanja produkcije pigmenta i virulentnosti, izolati K-112 i K-118 pripadaju drugoj vrsti i sasvim je logično da prilikom ispitivanja nije dobijen savršeni stadium, što je u saglasnosti, kao što je već navedeno, sa istraţivanjima (Somda et al. 1997; Schoemaker & Brun, 2001). 7. 3. Obrazovanje pigmenta u tečnoj Czapek-ovoj podlozi Kada se radi o formiranju pigmenta, pri gajenju gljva na Czapek-ovoj tečnoj podlozi, rezultati pokazuju da svi (L.m, St-5, C-3, S-11) izolati ne stvaraju ţutomrki pigment u odnosu na K-113 i K-115 izolate. Odsustvo ţutomrkog pigmenta kod ispitivanih izolata (L.m, St-5, C-3, S-11) ih svrstava u grupu virulentnih (agresivnih) izolata u odnosu na K-113 i K-115 koji obrazuju pigment, što je u skladu sa navodima (Bonman et al. 1981, Koch et al. 1989, Williams & Fitt 1999, Kuuska et al. 2002). 7. 4. Dokazivanje fitotoksina Za isptitivanje formiranja fitoksina u ovim istraţivanjima korišćeno je 5 izolata (L.m, St-5, C-3, S-11, K-113). Svi izolati su gajeni na tečnoj Čzapek-ovoj podlozi. Filtrat tečne podloge na kojoj su gajeni izolati gljiva su korišćeni za dokazivanje fitotoksina. S obzirom da izmeĎu izolata K-113 i K-115 nije primećena razlika u boji pigmenta na tečnoj Czapek podlozi, kao i zbog njhovih istih morfoloških i molekularnih karakteristika u ovim ispitivanjima je korišćen samo K-113, kao predstavnik slabovirulentnih izolata. Na TLC ploči (sl. 20) izolati koji su produkovali fitotoksine, izuzev izolata K-113, a na osnovu pregleda pod UV lampom i izračunatih Rf vrednosti (0,11, 0,17, 0,27, 0,34, 0,42 i 0,51) ukazuju na sličnost rezultata (Koch et al. 1989, Badaway & Hoppe 1989). U ovim ispitivanjima na TLC ploči (sl.20) nije vršeno razdvajanje frakcije (mrlje) pod oznakom 5 na 5a i 5b zbog kompatibilnosti frakcije što nije slučaj kod navedenih autora. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 84 Nakon preparativnog izolovanja frakcije pod oznakom 2, a na osnovu Rf vrednosti (0,44), ponovo je naneto na TLC ploču i nakon razdvajanja frakcija izračunate su Rf vrednosti 2a (Rf=0,49), 2b (Rf=0,40), 2c (Rf=0,32) i 2d (Rf=0,22). Navedene Rf vrednosti su identične sa navodima (Koch et al. 1989) u frakciji 2a i 2c, odnosno navedene Rf vrednosti se nalaze u opsegu izračunatih Rf vrednosti sirodezmina (Badaway & Hoppe 1989). Rf vrednost frakcije 4 u tankoslojnoj hromatografiji (sl.20) je identična deacetilsirodezminu PL (sintetizovan iz sirodezmina PL  Badaway & Hoppe 1989). Badaway & Hoppe (1989) frakciju 5a na osnovu Rf vrednosti označavaju sirodezminom B a 5b sirodezminom C. S obzirom da u ovim istraţivanjima nije razdvojena frakcija 5 na 5a i 5b prisustvo sirodezmina B i C je potvrĎena LC-MS-MS analizom, što je u skladu sa rezultatima (Pedras et al. 2008a, 2008b). Pik sa retencionim vremenom tR=1,57 min (označen sa P444) pripada jedinjenju molekulske mase 444 Da, što odgovara sirodezminu J (de-O-acetilsirodezmin A) ili njegovom 1-epimeru (de-O-acetilsirodezmin PL). Oba izomera ranije su već identifikovana u kulturama L. maculans (Badaway & Hoppe 1989, Pedras & Seguin- Swarts 1992, Pedras et al. 2007, Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b). U MS 1 spektru (sl. 26) uočavaju se slabi signali m/z 445 [M+H]+, 467 [M+Na]+ i 483 [M+K] + i fragment m/z 381 [M+H–S2] + kao osnovni jon. Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (22,9%) i A+2 (12,3%), slično sa teorijskim profilom za bruto-formulu C18H24N2O7S2 (100%, 22,9%, 12,8%). U MS 2 spektru (sl. 27) dominira fragment m/z 381 [M+H–S2] +. Gubitak neutralne čestice Sn saglasan je sa ponašanjem sirodezminâ i drugih epipolitiodioksopiperazina (Howlett et al. 2001, Wu et al. 2008). Pik sa tR=1,42 min (P454) pripada jedinjenju molekulske mase 454, što odgovara sirodezminu H (monosulfidni homolog 1-epi-sirodezmina A), koji je ranije već pronaĎen u kulturama L. maculans (Pedras et al. 2008a Pedras et al. 2008b). U MS1 spektru (sl. 28) uočavaju se joni (čega?) 455 [M+H]+, 477 [M+Na]+, 493 [M+K]+, kao i fragmenti 437 [M+H–H2O] + i 393 [M+H–H2O–CO] + . Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (22,6%), A+2 (8,4%) saglasan je sa teorijskim profilom za C20H26N2O8S (100%, 24,4%, 8,9%). U MS 2 spektru (sl. 29) uočava se niz fragmenata koji odgovaraju gubitku alkoholne OH grupe acetil-grupe (u vidu ketena C2H2O) i neidentifikovane grupe Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 85 m/z=78: 437 [M+H–H2O] + , 413 [M+H–C2H2O] + , 393 [M+H–CO2] + , 377 [M+H–78]+, 351 [M+H–CO2–C2H2O] + , 315 [M+H–CO2–78] + , itd. U MS 1 spektru pika sa tR=2,22 min (P476) prikazanom na sl.30 uočavaju se joni niskog intenziteta na m/z 477 [M+H]+, 499 [M+Na] + i 515 [M+K] + , kao i intenzivan (osnovni jon u spektru) fragment 381 [M+H–S3] + . Na osnovu molekulske mase i gubitka S3, moţe se zaključiti da je u pitanju deacetil derivat sirodezmina C ili F. (Badaway & Hoppe 1989) su saopštili o prisustvu deacetil sirodezmina C u filtratu L. maculans koja je dosta slična frakciji označenoj sa 3 na TLC ploči (sl.20) Zbog nedostatka informacija o ponašanju njegovog epimera jedinjenje 476 moţe biti uslovno identifikovano samo kao deacetil sirodezmin C. Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (25,0%), A+2 (17,2%) u saglasnosti je sa pretpostavljenom formulom C18H24N2O7S3 (teorijski profil 100%, 23,7%, 17,4%). U MS 2 spektru (sl.31 ) kao osnovni jon javlja se fragment 381 [M+H–S3] + , a pored njega prisutni su i joni 353 [M+H–S3–CO] + i 325 [M+H–S3–2CO] + . Isti fragmenti uočeni su i u MS2 spektrima pika P444 (koji se razlikuje samo po broju atoma sumpora u mostu), što ide u prilog pretpostavljenoj strukturi. Zatim su detektovana dva pika koja odgovaraju jedinjenjima molekulske mase 486: P486a (tR=2,03 min) i P486b (tR=2,66 min). Dva poznata jedinjenja ove mase – sirodezmin A i sirodezmin G (ili PL) – predstavljaju epimere i nije ih moguće razlikovati isključivo na osnovu MS spektra. Na osnovu njihovog relativnog odnosa i činjenice da je sirodezmin PL glavni fitotoksin L. maculans (Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b, Howlett et al. 2001, Elliott et al. 2007.) moţe se pretpostaviti da pik P486a odgovara sirodezminu A dok P486b predstavlja PL. Rf vrednost frakcije 6 (Rf=0,51) (sl.20) u tankoslojnoj hromatografiji je veoma slična koju navodi Badaway & Hoppe (1989) za sirodezmin PL standard (Rf=0,50) U MS 1 spektrima oba pika (sl. 32 i 34) prisutni su joni 487 [M+H] + , 509 [M+Na] + , 525 [M+K] + , kao i intenzivan fragment 423 [M+H–S2] + što je u skladu sa literaturnim podacima (Elliott et al. 2007). Profil izotopskih pikova A, A+1 i A+2 kod pika P486a (100%, 25%, 14,0%) odn. (100%, 23,6%, 14,2%) kod pika P486b saglasan je sa bruto formulom C20H26N2O8S2 (teorijski profil: 100%, 25,2%, 13,5%). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 86 Najznačajniji fragmenti u MS2 spektrima oba pika (sl. 33 i 35) su: 423 [M+H–S3] + , 395 [M+H–S3–CO] + , 367 [M+H–S3–2CO] + , 246 i 229. Pik sa retencionim vremenom 2,32 min, označen kao P508, u MS1 spektru (sl. 36) sadrţi jone m/z 531 [M+Na]+ i 547 [M+K]+ slabog intenziteta i m/z 381 [M+H–S4] + kao osnovni jon. Na osnovu molekulske mase i gubitka 4 atoma sumpora, moţe se pretpostaviti da je u pitanju tetrasulfidni homolog deacetilsirodezmina A, odnosno deacetil-derivat sirodezmina B, E ili K. Sirodezmin K je takoĎe pronaĎen u ekstraktu L. maculans (Pedras & Seguin-Swarts 1992). Detektovana su tri pika jedinjenja molekulske mase 518: slabo zastupljeni P518a (tR=2,71 min) i P518b (tR=2,92 min) i intenzivni P518c (tR=3,34 min). U MS 1 spektrima ovih pikova (sl. 37, 39 i 41) uočavaju se joni m/z 519 [M+H]+, 541 [M+Na] + i 557 [M+K] + kao i intenzivan jon fragmenta m/z 423 [M+H–S3] + . Poznata su dva izomerna trisulfidna sirodezmina mase 518: sirodezmin C i F. Verovatno je da 518 C predstavlja sirodezmin C, koji je poznat kao glavni sirodezmin patogene gljive L. maculans (Badaway & Hoppe 1989), dok je 518a sirodezmin F. Rf vrednost frakcije 5 u tankoslojnoj hromatografiji je identičan sirodezminu C, koji je determinisan od strane (Badaway & Hoppe 1989). Teorijski izotopski profil za ova jedinjenja bruto-formule C20H26N2O8S3 dat je kao A (100%), A+1 (26,0%), A+2 (18,1%) i u dobroj je saglasnosti sa eksperimentalnim podacima: 100%, 26,5% i 17,2% za P518a 100%, 26,3% i 16,3% za P518b i 100%, 26,6% i 18,8% za P518c. Budući da su sirodezmini C i F 1-epimeri, moţe se očekivati da će imati slične ili identične MS2 spektre. Zaista, MS2 spektri pikova P518a i P518c (sl. 38 i 42) pokazuju veoma sličan obrazac fragmentacije: osnovni jon na m/z 423 [M+H–S3] + i niz fragmenata: m/z 395 [M+H–S3–CO] + 367 [M+H–S3–2CO] + 246, 229 i 140. MS 2 spektar trećeg pika (sl. 40), P518b, značajno se razlikuje – dok je i u ovom slučaju osnovni jon 423, javlja se i više fragmenata odsutnih kod P518a i P518c – intenzivni fragment m/z=345 [M+H–S3–78] + kao i joni 501 [M+H–H2O] + i 441 [M+H–78]+. Moguće je da ovaj pik predstavlja izomer sirodezmina C i F sa različitim poloţajem acetil-grupe (na C2a-OH grupi ili bočnoj hidroksimetil-grupi). Pik sa retencionim vremenom 3,51 min označen sa P550, u MS1 spektru (sl. 43) sadrţi slab signal na m/z 589 [M+K]+ i intenzivan signal na m/z 423 [M+H–S4] + . Na Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 87 osnovu molekulske mase i gubitka 4 atoma sumpora, moţe se pretpostaviti da je u pitanju tetrasulfidni homolog sirodezmina A, odnosno sirodezmin B, D, E ili K. Sirodezmin K ranije je već detektovan u kulturama L. maculans (Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b). Oba sirodezmina B i K su pronaĎeni u kulturi L. Maculans, dok sirodezmin E je identifikovan u Sirodesmium diversum (Badaway & Hoppe 1989, Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b, Buckingham, 2007). Samo u frakcijama II/1 i III/1 detektovan je pik P318 na tR=1,39 min. U MS 1 spektru (sl. 44) se, pored jonâ m/z 319 [M+H] + , 341 [M+Na] + , 357 [M+K] + i 659 [2M+Na] + , zapaţa i intenzivan fragment m/z 251 (osnovni jon). Molekulskoj masi od 318 odgovara fomamid, jedinjenje već identifikovano u kulturama L. maculans (Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b). Fragment m/z 251 u tom slučaju odgovara gubitku O- vezane prenil-grupe kao C5H5. Profil izotopskih pikova: A (100%), A+1 (18,0%), A+2 (2,8%) saglasan je sa pretpostavljenom formulom C17H22N2O4 (teorijski profil 100%, 20,1%, 2,7%). U MS 1 spektru pika P311 sa tR=0,95 min uočavaju se joni m/z 312 [M+H] + , 334 [M+Na] + , 350 [M+K] + i 623 [2M+H] + kao i jon fragmenta m/z 176. Molekulska masa odgovara fomaliginu A ili vasabidienonu E ranije pronaĎenima u nekim kulturama L. maculans (Pedras et al. 2007). Fomalid, leptomakulini, polanrazini, fomaligoli i makulansini A i B, ranije pronaĎeni u kulturama L. maculans (Pedras et al. 2007, Pedras et al. 2008a, Pedras et al. 2008b, Howlett et al. 2001) gajenim na odreĎenim podlogama, nisu u ispitivanim uzorcima prisutni u detektabilnim količinama. Dobijeni rezultati na tankoslojnoj i preparativnoj hromatografiji sa izračunatim Rf vrednostima i LC-MS analizom ukazuju da ispitivani izolati (L.m, C-3, S-11, St-5) na Czapek-ovoj podlozi stvaraju sirodezmine (fitotoksin). Na osnovu LC-MS analize je utvrĎeno da je koncentracija sirodezmina PL i C najveća u frakciji 2b i 2c (Sl. 1721). Ove dve frakcije su ispoljile i najjaču fitotoksičnost na ispitivanim kotiledonima u odnosu na frakciju 1 i 2a (sl. 45). MeĎutim, ovde treba navesti da prilikom ispitivanja fitotoksičnosti nije vršeno razdvajanje dobijenih sirodezmina, odnosno cela frakcija (5 µl) je naneta na povreĎeni deo kotiledona. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 88 Na slikama od 17 do 21 moţe se zapaziti da su u frakcijama 1, 2a, 2b, 2c, LC-MS analizom otkriveni i drugi sirodezmini (deacetil sirodezmin Pl i deacetil sirodezmin C) koji takoĎe izazivaju fitotoksičnost, što je u skladu sa navodima Badaway & Hoppe (1989). Ako je već poznato da sirodezmin Pl i C predstavljaju glavne fitotoksine (Badaway & Hoppe 1989), sasvim je logičan zaključak zašto su frakcija 2b i 2c kod ispitivanih izolata pokazale najveću fitotoksičnost (sl. 1721). Fitotoksičnost ispitivanih sirodezmina na kotiledonima se ispoljavala u početku hlorozom, a kasnije je inficirani deo nekrotirao što je u skladu sa (Fox & Howlett 2008). Propadanje tkiva prouzrokuju polisufidni mostovi u diketopiperazinskom prstenu (Gardiner et al. 2005). Diketopiperazinski prsten potiče od cikličnog dipeptida i sumporni mostovi prenose sve poznate toksičnosti ovih molekula (Mullbacher et al. 1986). Gardiner et al. (2005) navodi da disulfidni mostovi predstavljaju ključnu strukturu za stvaranje različitih reakcija kiseonika i spajanja sa ostacima cisteina iz proteina za koje se smatra da stvaraju toksičnost kod ćelija. Iako se zna da disulfidni mostovi izazivaju toksični efekat, ipak pravi mehanizam toksičnosti još uvek nije dovoljno razjašnjen (Gardiner et al. 2004, 2005). 7. 5. OdreĎivanje patogenih grupa Od ukupno 119 izolata izolovanih tokom 2009. i 2010. godine u Srbiji (Vojvodina), a na osnovu patogenog testa na diferencijalnim sortama (Westar, Quinta i Glacier), 8 izolata pripada PG1, odnosno 6,7%, 5 izolata pripada PG2, odnosno 4,3%, 22 izolata pripada PG3, odnosno 18,4% i 84 izolata PG4 odnosno 70,5%. Ovim ispitivanjima je utvrĎeno da su sve patogene grupe prisutne u proizvodnim regionima (Vojvodine) Srbije. Slične rezultate o prisustvu PG (patogena grupa) u drugim zemljama navode Mengistu et al. 1991, Kuusk et al. 2002, Chen & Fernando 2006. Patogene grupe u okviru populacije grupe A nisu jednako zastupljene u svim regionima. U (Ontario) Kanadi, Mahuku et al. (1997) je pronašao da je PG4 bila zastupljena sa 80%, PG3 sa 11% i pod pretpostavkom da preostalih 9% pripada novoj grupi označena sa PG5. Za razliku od Mahuku et al. (1997), izolati iz zapadne Kanade uglavnom pripadaju PG2 (Mengistu et al. 1991). U Francuskoj preko 90% ispitivanih Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 89 izolata pripada PG3, preostali deo su uglavnom bili izolati iz PG4, i manji broj iz PG2 (Ansan–Melayah et al. 1997, Penaud et al. 1999a). U severnoj Dakoti (USA) i Manitoba (zapadna Kanada) u ispitivanjima koja su sproveli Chen & Fernando (2006) 76,6% izolata je pripadalo PG2 i 21,3% PG1 a preostali deo izolata je pripadao PG3, PGT i PG4. Na osnovu dobijenih simptoma na kotiledonima diferencijalnih sorti i skali (Koch et al. 1991) nije konstatovana PGT u našim istraţivanjima, što je u skladu sa navodima Chena & Fernanda (2006) da je nova PG otkrivena, za sada u SAD i Kanadi. U Švedskoj su dominantne PG3 i PG4, dok PG2 nije uopšte konstatovana a PG 1 je prisutna u veoma niskom procentu (Kuusk et al. 2002). Isti autori navode da nema korelacije izmeĎu patogene grupe i mesta infekcije i da je PG1 uglavnom posmatrana na gornjem delu stabla, dok je PG1 u Srbiji izolovana sa vrata korena. U Autraliji odnos PG3 i PG4 je izjednačen, PG2 je prisutna, ali u dosta niskom procentu, dok PG1 nije otkrivena (Mengistu et al. 1991). Ako procentualno uporedimo podatke, procenat zastupljenosti patogenih grupa PG4 i PG3 u Srbiji je dosta sličan sa podacima za ove patogene grupe u Kanadi (Mahuku et al. 1997). S obzirom da su u Srbiji od pet postojećih otkrivene četiri patogene grupe, izuzev PGT, naši podaci o zastupljenosti patogenih grupa su slični sa navodima Chen & Fernando (2006). Istraţivanja o prisustvu patogenih grupa mogu obezbediti vaţne informacije o nivou patogenosti L. maculans u proizvodnim regionima gajenja uljane repice. 7. 6. Prenošenje patogena semenom Pored ispitivanja patogenosti askospora na kotiledonima i odreĎivanja patogenih grupa na osnovu virulentnosti piknospora, izvršena su ispitivanja mogućnosti prenošenja parazita semenom. Svi izolati: L.m, C-5, L-5, K-7, LJ-3, S-11, St-1, GS-3 su prouzrokovali simptome bolesti na klijancima uljane repice, izuzev izolata L.b, K-113 i K-115, što znači da se prenose semenom uljane repice (gr.1) Nakon 14 dana procenat propalih biljaka, koje su nastale iz zaraţenog semena je uvećan kod većine ispitivanih izolata, što se slaţe sa rezultatima (Bonman et al. 1981). Pojava simptoma na hipokotilu i kotiledonima inficiranog semena, ukazuje da se parazit moţe prenositi i na ovaj način (Petrie 1979b, Hall 1992, Wood & Barbetti Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 90 1977a). Wood & Barbetti (1977a) navode da u Zapadnoj Australiji procenat inficiranog semena se kreće od 0,1–0,2% dok se u Kanadi kreće do 5% (Hall et al. 1996) Gabrielson (1983) navodi da seme moţe biti inficirano i do 18%. Pored uljane repice patogen se prenosi i drugim kupusnjačama (Gugel & Petrie 1992). Prisustvo L. maculans i L. biglobosa u celom svetu gde se repica gaji, odnosno na svim kontinentima, se moţe tumačiti i mogućnošću njihovog prenošenja semenom ove biljke (West et. al 2001). Česta pojava simptoma na kotiledonima i hipokotilu u Australiji, i pored askospora, je povezana i sa učestalom kontaminacijom semena (Barbetti & Khangura cit. loc. West et al. 2001, West et al. 2001). Iako su infekcije semena retke, mogu biti veoma vaţne u širenju patogena u nove regione (Jacobsen & Williams 1971), odnosno u širenju gljive u okviru istih i susednih regiona (Bonman et al. 1981). U eksperimentima u Kanadi učestale infekcije semena izazivaju, u početku pojavu pegavosti, a kasnije patogen prouzrokuje rak stabla (Hall et al. 1996). Ovi navodi potvrĎuju naša ispitivanja o mogućnosti prenošenja gljive putem semena. 7. 7. Molekularna karakterizacija Molekularna istraţivanja su vrešena kod 119 izolata poreklom iz Srbije i dva referentna izolata iz Velike Britanije. U sprovedenim molekularnim ispitivanjima nije dobijena (ekstrakcija DNK po Day & Shattock) amplifikacija DNK sa APH12 prajmerima (sl.50) za L.b. (referentni izolat Leptosphaeria biglobosa) K-111, K-112, K- 113, K-114, K-115 i K-116 izolate kao ni za izolat L.m. (Leptosphaeria maculans). (Kuusk et al. 2002) takodje,nije dobio amplifikaciju DNK sa APH12 prajmerima kod izolata (Leptosphaeria biglobosa ) iz Kanade i Larid 2, ali je dobio amplifikaciju DNK kod izolata iz Francuske, Poljske, Švedske i IBCN 09 izolata kod kojih su APH12 prajmeri amplifikovali fragment od oko 1900 bp. Fragmenti DNK duţine od oko 560 bp za L.m. izolat i 580 bp za L.b, K-112, K- 113, K-114, K-115, K-116 (sl. 50) amplifikovani su sa PN3 i PN10 prajmerima. Slične rezultate su dobili Balesdent et al. (1998). U ponovljenoj ekstrakciji DNK po metodi (Day & Shattock 1997) APH12 prajmer nije amplifikovao fragmente kod ispitivanih izolata, dok LRM1 prajmer je amplifikovao fragmente od oko 580 bp za L.m, L.b, St-16 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 91 i K-6, osim za izolat K-115, što se slaţe sa rezultatima (Taylor & Borgmann 1994). Isti autori navode da LRM1 prajmeri ne hibridizuju DNK slabo virulentnih izolata, sa izuzetkom jednog izolata  što se u sprovedenim istraţivanjima pokazalo da su LRM1 prajmeri amplifikovali DNK kod referentnog izolata L.b. (Leptosphaeria biglobosa) od oko 580 bp kao i kod L.m. (referentni izolat Leptosphaeria maculans), St-16 i K-6, izuzev K-115 gde nije primećen fragment u agaroznom gelu. Zbog nesaglasnosti rezultata istraţivanja uraĎena je ekstrakcija DNK po (O´Gorman et al. 1994), modifikovana po (Kuusk et al. 2002). U ovoj PCR analizi su korišćeni APH12 i LRM1 prajmeri. I u ovom slučaju APH12 prajmeri nisu amplifikovali DNK ispitivanih izolata. MeĎutim, kada su korišćeni LRM1 prajmeri došlo je do amplifikacije DNK od oko 580 bp kod referentnog izolata L.m. (Leptosphaeria maculans), GS-25, St-5, S-11 i C-3. Na drugoj strani amplifikacija DNK kod L.b. (referentni izolat) i K-115 nije dobijena (sl. 51), što je u skladu sa rezultatima (Kuusk et al. 2002). U svim ostalim analizama LRM1 prajmeri (sl. 52 i 53) su amplifikovali DNK od oko 580 bp što navodi na zaključak da svi ispitivani izolati pripadaju vrsti Leptosphaeria maculans, a što se slaţe sa rezultatima (Taylor & Borgman 1994, Kuusk et al. 2002). PN3 i PN10 prajmeri kod ispitivanih izolata (sl. 54, 55,56 itd.) amplifikuju DNK od oko 560 bp za vrstu Leptosphaeria maculans odnosno 580 bp za vrstu Leptosphaeria biglobosa što je u skladu sa rezultatima (Balesdent et al. 1998) dok Mendes–Pereira et al. (2003) navodi vrednost od 468 bp za Leptosphaeria maculans (Tox + reprezentativne izolate) odnosno 496 bp za Leptosphaeria biglobosa NA1, NA2 i NA3 podgrupu. Na osnovu RFLP profila navedene vrste se takoĎe mogu razlikovati. Upotrebom restrikcionog enzima EcoRI za sečenje DNK, uočeno je prisustvo trake duţine 430 bp kod agresivnih izolata (Leptosphaeria maculans), dok kod neagresivnih izolata (Leptosphaeria biglobosa) ovaj fragment nije primećen (Koch et al. 1991). U sprovedenim istraţivanjima svi restrikcioni enzimi (BamHI, HaeIII, EcoRII, RsaI i AluI) kod ispitivanih izolata seku DNK na jednom, odnosno na dva mesta, dok AluI i RsaI seku DNK na tri mesta. Dobijeni polimorfizam restrikcionim enzimima je omogućio identifikaciju ispitivanih izolata poreklom iz Srbije. Tako izolati K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 92 i K-116 pripadaju vrsti Leptosphaeria biglobosa dok K-2, St-16, GS-25, L-5, C-3, S-11, LJ-2 pripadaju vrsti Leptosphaeria maculans. Pored razlikovanja izolata na nivou vrsta, dobijeni polimorfizam restrikcionim enzimima HaeIII, EcoRII i AluI svi ispitivani izolati (K-111, K-112, K-113, K-114, K-115 i K-116) pripadaju vrsti Leptosphaeria biglobosa podgrupa NA1 što je u skladu sa rezultatima (Balesdent et al. 1998) koja je dominantna na Evropskom kontinentu (Gall et al. 1995, Jedryczka et al. 1999, Fitt et al. 2006). Na osnovu RFLP analize i analize izoenzima utvrĎeno je da agresivni izolati formiraju kompaktnu grupu koja se razlikuje od slabo virulentnih izolata. Istim metodama je, takoĎe, utvrĎeno da se slabo virulentni izolati mogu svrstati u tri pod grupe: NA 1 NA 2 i NA 3 (Koch et al. 1991, Gall et al. 1995). Gall et al. (1995) navode da je NA 1 podgrupa dominantna u Evropi, dok je NA 2 više zastipljena u Kanadi. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 93 VIII. ZAKLJUČAK Rezultati prikazani u ovoj disertaciji donose nova saznanja o patogenim, morfološkim i molekularnim karakteristikama gljiva uzročnika raka stabla uljane repice u Srbiji što doprinosi boljem poznavanju etiologije i epidemiologije oboljenja i njegovoj lakšoj kontroli. Istraţivanja su povrdila široku rasprostranost bolesti na celoj teritoriji Srbije (Vojvodina). Zahvaljujući primerenoj metodologiji izvršena je uspešna karakterizacija dobijenih izolata u ispitivanim uzorcima. PoreĎenjem morfoloških, patogenih i molekularnih karakteristika moţe se zaključiti da su u okviru roda Leptosphaeria u Srbiji prisutne sledeće vrste: L. maculans i L. biglobosa. U morfološkom pogledu od 12 ispitivanih izolata 5 izolata (K-112, K-113, K-114, K-115 i K-117) ima pravilan i brz porast na PDA podlozi u odnosu na (L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2 i C-5) izolate. Micelija kod svih izolata je prljavo bele boje. Veličina oblik i boja kod svih izolata je ista s tim da je veličina piknida nešto manja kod K-112, K-113, K-114, K-115 i K-117. Izolati L-10, LJ-3, K-8, GS-27, St-12, S-2 i C-5 na PDA podlozi obilnije sporulišu u odnosu na K-112, K-113, K-114, K-115 i K-117. Pored konidijskog, gljiva obrazuje i savršeni stadium u obliku pseudotecija sa askusima i askosporama. U tečnoj Czapek-ovoj podlozi izolati K-113 i K-115 produkuju ţutomrki pigment, dok St-5, C-3 i S-11 ne produkuju pigment. ali stvaraju fitotoksine. U ovim ispitivanjima dokazano je da izolati L. maculans (L.m, St-5, C-3, S-11) produkuju više fitotoksina. Dobijeni rezultati na tankoslojnoj i preparativnoj hromatografiji sa izračunatim Rf vrednostima i LC-MS analizom ukazuju da ispitivani izolati (L.m, C-3, S-11, St-5) na Czapek-ovoj podlozi stvaraju sirodezmine (fitotoksine). Na osnovu LC- MS analize je utvrĎeno da je koncentracija sirodezmina PL i C najveća u frakciji 2b i 2c. Ove dve frakcije su ispoljile i najjaču fitotoksičnost na ispitivanim kotiledonima u odnosu na frakciju 1 i 2a. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 94 Na osnovu ispoljenih simptoma na diferencijalnim sortama (Wester, Quinta i Glacier) izolati K-111, K-112, K-113, K-114, K-115, K-116, K-117 i K-118 pripadaju patogenoj grupi PG1 odnosno grupa B dok izolati od K-1 do K-25, St-1 do St-28, GS-1 do GS-27, C-1 do C-6, L-1 do L-10, S-1 do S-11, LJ-1 do LJ-6 pripadaju PG2, PG3 i PG4 odnosno grupa A. Kod veštačke inokulacije semena izolati C-5, L-5, K-7, LJ-3, S-11, St-1 i GS-3 su prouzrokovali simptome posle 7 i 14 dana, dok pojava simptoma kod K-113 i K-115 nije primećena. Na osnovu amplifikacije DNK sa PN3 i PN10 prajmerima duţina traka kod K- 111, K-112, K-113, K-114, K-115, K-116, K-117 i K-118 je 580 bp dok kod ostalih izolata (K-1 do K-25, St-1 do St-28, GS-1 do GS-27, C-1 do C-6, L-1 do L-10, S-1 do S-11, LJ-1 do LJ-6) je 560 bp. Kod RFLP analize K-111, K-112, K-113, K-115 i K-116 se razlikuju u jednom odnosno dva restrikciona mesta od K-2 St-16 GS-25 L-5 C-3 LJ-2 i S-1 izolata. Na osnovu svih sprovedenih istraţivanja se moţe zaključiti: da izolati K-111, K-112, K- 113, K-114, K-115, K-116, K-117 i K-118 pripadaju vrsti Leptosphaeria biglobosa podgrupa NA1 po novoj klasifikaciji Leptosphaeria biglobosa brassice, dok K-1 do K- 25, St-1 do St-28, GS-1 do GS-27, C-1 do C-6, L-1 do L-10, S-1 do S-11, LJ-1 do LJ-3 pripadaju vrsti Leptosphaeria maculans po novoj klasifikaciji Leptosphaeria maculans brassicae. I na kraju moţemo sa sigurnošću konstatovati da su u Srbiji prisutne obe vrste (Leptosphaeria maculans i Leptosphaeria biglobosa) kao prouzrokovači suve truleţi korena i raka stabla uljane repice (Brassica napus var. oleifera L). Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 95 IX. LITERATURA Ansan-Melayah D, Rouxel T, Bertrandy J, Letarnec B, Mendes-Pereira E, Balesdent M- H (1997): Field efficiency of Brassica napus specific resistance correlates with Leptosphaeria maculans population structure. Eur. J. Plant Pathol. 103 835–841. Antonijević D (1999): Gljivične bolesti uljane repice u SR Srbiji. Magistarski rad. Univerzitet u Beogradu Poljoprivredni fakultet Beograd-Zemun. Aubertot J N, West J S, Bousset-Vaslin L, Salam M U, Barbetti M J, Diggle A J (2006): Improved resistance management for durable disease control: a cas study of Phoma stem canker of oilseed rape (Brassica napus). Eur. J. Plant Pathol. 114: 91-106. Badawy H M A, Hoppe H H (1989): Nonspecific Phytotoxic Effects of Sirodesmins on Host and Nonhost Plants of Leptosphaeria maculans J. Phytopathology 127: 137-145. Badawy H M A, Hoppe H H (1989): Production of Phytotoxic Sirodesmins by Aggressive Strains of Leptosphaeria maculans Differing in Interactions with Oil Seed Rape Genotypes J. Phytopathology 127: 146-157. Balesdent M H, Attard A, Kuhn M L, Rouxel T (2002): New avirulence genes in the phytopathogenic fungus Leptospheria maculans. Phytopathology 92: 1122-1133. Balesdent M H, Barbetti M J, Hua Li, Sivasithamparam K, Gout L, Rouxel T (2005): Analysis of Leptospheria maculans Race Structure in a Worldwide Collection of Isolates. The American Phytopathological Society Vol. 95 No 9 1061-1071. Balesdent M H, Gall C, Robin P, Rouxel T (1992): Interspecific variation in saluble mycelial protein and esterase patterns of Leptospheria maculans French isolates. Mycological Research 96: 677-684. Balesdent M H, Jedryczka M, Jain L, Mendes-Pereira E, Bertrandy J, Rouxel T (1998): Conidia as a substrate for internal transcribed spacer-based PCR identification of Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 96 components of the Leptosphaeria maculans species complex. Phytopathology 88: 1210-1217. Barbetti M J, Khangura K (1999):Managing blackleg in the disease-prone enviroment of Western Australia Proc.of the 10 th International Rapeseed Congress,Canbera,Australia Biddulph J E, Fitt B D L, Leech P K, Welham S J, Gladders P (1999): Effects of temperature and wetness duration of infection at oilseed rape leaves by ascospores of Leptospheria maculans (stem canker). European Journal of Plant. Pathol. 105: 769-781. Bokor A, Barbetti M J, Brown A G P, MacNich G C, Wood P McR (1975): Blackleg of rapeseed. J. Agric. West. Aust. 16: 7-10. Bonman J M, Gabrielson R L, Williams P H, Delwiche P A (1981): Virulence of Phoma lingam to cabbage. Plant Disease 65: 865 – 867. Brun H, Levivier S, Eber F, Renard M, Chevre A M (1997): Electrophoretic analysis of natural populations of Leptospheria maculans directly from leaf lesions. Plant Pathology 46 147-154. Buckingham J. Dictionary of Natural Products. Version 15.1 on CD-ROM Chapman & Hall/CRC Boca Raton USA 2007. Chen Yu, Fernando W G D (2006): Prevalence of pathogenicity groups of Leptosphaeria maculans in western Canada and North Dakota USA. Can. J. Plant Pathol. 28: 533-539. Crnobarac J, Marinković R. (2006): Potencijali poljoprivrede Srbije za proizvodnju sirovina za biodizel. Traktori i pogonske mašine, 11(1): 33-37. Cvjetković B, Kišpatić J, Milatović I (1983): Morfološke i kulturalne karakteristike patogena uljane repice novog za Jugoslaviju. Zaštita bilja 34(4): 66. Davies J M L (1986): Diseases of oilseed rape.In Scarisbrick DH Daniels RW eds Oilseed Rape. London: Collins195-236. Day J P, Shattock R C (1997): Aggressiveness and other factors relating to displacement of populations of Phytophtora infestans in England and Wales. European Journal of Plant Pathology 103 379-391. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 97 Elliott C E, Gardiner D M, Thomas G, Cozijnsen A, Van de Wouw A, Howlett B J (2007): Production of the toxin sirodesmin PL by Leptosphaeria maculans during infection of Brassica napus. Mol Plant Pathol 8: 791–802. Fitt L D B, Brun H, Barbetti J M, Rimmer R S (2006): World-wide importance of phoma stem canker (Leptospheria maculans and L. biglobosa) on oilseed rape (Brassica napus). European Journal of Plant Pathology 114: 3-15. Fox E M, Howlett B J (2008): Biosynthetic gene clusters for epipolythiodioxopiperazines in filamentous fungi. Mycol. Res. 112:162-169. Gabrielson R L (1983): Blackleg disease of crucifers caused by Leptospheria maculans (Phoma lingam) and its control. Seed Science and Technology. 11: 749-780. Gall C, Balesdent M H, Desthieux I, Robin P, Rouxell T (1995): Polymorphism of Tox 0 Leptospheria maculans isolates as revealed by soluble protein and isozyme electrophoresis. Mycological Research 99 221-229. Gardiner D M, Cozijnsen J A, Wilson M L, Pedras M S C, Howlet B J (2004): The sirodesmin biosynthetic gene cluster of the plant pathogenic fungus Leptosphaeria maculans. Mol. Microbiol. 53 (5): 1307-1318. Gardiner D M, Waring P, Howlet B J (2005): The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution mode of action functions and biosynthesis. Microbiology 151: 1021-1032. Gladders P, Evans N, Marcroft S.Pinochet X (2006):Dissemination of information about management strategies and changes in farming practices for the exploitation of resistance to Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) in oilseed rape cultivars.European Journal of Plant Pathology 114,117-126. Gladders P, Musa T M (1980): Observations on the epidemiology of L. maculans stem canker in winter oilseed rape. Plant Pathology 29: 28-37. Gladers P, Musa T M (1979): The development of Leptospheria maculans in winter oilseed rape and its implications for disease control. Pests and Diseases: 129- 136. Gosende S, Penaud A, Aubertat J N, Schnieder O, Pinochet X (2003):Evolution of soil surface oilseed rape stubbles and their ability to produce spores of Leptosphaeria Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 98 maculans:preliminary results 11 th International Rapeseed CongressProceeding 41166-1168 Denmark. Gugel R K, Petrie G A (1992): History occurrence impact and control of blackleg of rapeseed. Canadian Journal of Plant Pathology 14: 36–45. Hall R (1992): Epidemiology of blackleg of oilseed rape. Canadian Journal of Plant Pathology 14: 46–55. Hall R, Chigogora J L, Phillips L G (1996): Role of seedborne inoculum of Leptosphaeria maculans in development of blackleg on oilseed rape. Canadian Journal of Plant Pathology 18: 35–42. Hammond K E, Lewis B C, Musa T M (1985): A systemic pathway for the infection of oilseed rape plants by Leptosphaeria maculans. Plant Pathology 3437-565. Hammond K E, Lewis B G (1987a):The establishment of systemic infection in leaves of oilseed rape by Leptosphaeria maculans. Plant Pathology 36: 135-147. Hammond K E, Lewis B G (1987b): Variation in stem infections caused by aggressive and non-aggressive isolates of Leptosphaeria maculans on Brassica napus var. oleifera. Plant Pathology 3653-65. Hill C B, Xu X H, Williams P H (1984): Correlations of virulence growth rate pigment production and allozyme banding patterns which differetiate virulent and avirulent isolates of Leptosphaeria maculans. Eucarpia. Cruciferae News 9: 79 . Hogenhout S A, Van der Hoorn R A, Terauchi R, Ramoun S 2009 Emerging concepts in effector biology of plant – associated organisms. Mol. Plant. Microbe. Interact. 22: 115-122. Hong S K, Kim W G, Shin D B, Choi H W, Lee Y K, Lee S Y 2009 Occurrence of stem canker on rape caused by Leptosphaeria biglobosa in Korea. Plant Pathol. J. 25(3): 294-298. Howlett B J 2004 Current knowledge of the interactio between Brassica napus and Leptosphaeria maculans. Can. J. Plant Pathol. 26: 245 – 252. Howlett B J 2006 Secondary metabolite toxins and nutrition of plant pathogenic fungi Curr. Opin. Plant Biol. 9: 371-375. Howlett B J, Idnurm A, Pedras M S C (2001): Leptosphaeria maculans the causal agent of blackleg disease of Brassicas. Fungal Genet. Biol. 33: 1-14. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 99 Huang Y J, Fitt B D L, Hall A M (2003a): Survival of A-group and B-group Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) ascospores and micelium on oilseed rape stem debris.Ann. of Appl.Biology 143: 369-399. Huang Y J, Fitt B D L, Jedruczka M, Dakowska S, West J S, Gladders P, Steed J M, Li Z Q (2005): Patterns of ascocpora release in relation to phoma stem canker epidemiology in England(Leptosphaeria maculans) and Poland (L. biglobosa). European Journal of Plant Pathology 111: 263-277. Huang Y J, Toscano-Underwood C, Fitt B D L, Todd A D, West J S, Koopmann B, Balesdent M H 2001 Effects of temperature on germination and hyphal growth from ascospores of A-group and B-group Leptosphaeria maculans (phoma stem canker of oilseed rape). Ann. Appl. Biol. 139: 193-207. Humperson-Jones F M (1983): Pathogenicity studies on isolates of Leptosphaeria maculans from brassica seed production crops in south-east England. Annals of Applied Biology 103: 37-44. Humperson-Jones F M (1986): The occurence of virulent pathotypes of Leptospheria maculans in brassica seed crops in England. Plant Pathology 35: 224-231. Jacobsen B J, Williams P H (1971): Histology and control of Brassica oleracea seed infection by Phoma lingam. Plant Disease Reporter 55: 934-8. Jedryczka M, Dakowska S, West J S, Fitt B D L (1999b The influence of wetness and temperature on the release of ascospores of Leptosphaeria maculans (blackleg) from oilseed rape debris. Poznan Poland: Materialy z Sympozjum Naukowego Polskiego Towarzystwa Fitopatologicznego `Bioroznorodnosc w fitopatologii europejskiej na przelomie wiekow'. 75. Jedryczka M, Lewartowska E, Frencel I 1994 Properties of Phoma lingam (Tode ex fr.) Desm. Isolates from Poland:Pathogenicity characterisation. Phytopathologia Polonica. 7: 71-79. Jedryczka M, Nikonorenkov V A, Levitin M, Gasich E, Lewartowska E, Portenko L 2002 Spectrum and severity of fungal diseases on spring oilseed rape in Russia. International Organisation for Biological control Bulletin 25: 13-20. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 100 Jedryczka M, Rouxel T, Balesdent M H (1999): Rep-PCR based genomic fingerprinting of isolates of Leptosphaeria maculans from Poland. European Journal of Plant Pathology. 105: 813-823. Johnson R D, Lewis B G 1990 DNK polymorphism in Leptosphaeria maculans. Physiological and Molecular Plant Pathology 37: 417-424. Karolewski Z, Kosiada T Hylak-Nowosad B, Nowacka K 2002 Changes in population structure of Leptospheria maculans in Poland. Phytopathologia Polonica. 25: 27-34. Kharbanda P D, Stevens R R (1993): Seed testing for blackleg of Canola.Vegreville AB Canada: AECV93-E1. Koch E, Badaway A M H, Hope H H 1989 Differences between aggressive and non aggressive single spore lines of Leptospheria maculans in cultural characteristics and phytotoxin production. J. Phytopathol. 124: 52-62. Koch E, Song R, Osborn C T, Williams P H 1991 Relationship between pathogenicity and phylogeny based on restriction fragment lenght polimorphism in Leptospheria maculans. Molecular Plant-Microbe Interactions 4: 341-349. Krüger W 1978 Über den Betall des Rapses durch Phoma lingam in der Bundesrepublik Deutschland. Proc of the 5th Inter. Rapeseed Conf. Malmö Sweden. 1: 338-341. Krüger W 1979Verbreitung der Wurzelhals-und Stengelfäule (verursacht durch Phoma lingam) bei Raps in der Bundesrepublik Deutschland. Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. 31: 145-148. Kutcher H R, Vandenberg C G J, Rimmer S R 1993 Variation in pathogenicity of Leptospheria maculans and Brassica spp. Based on cotyledon and stem reactions. Can. J. Plant Pathol. 15: 253-258. Kuusk A K, Happstadius I, Zhou L, Steventon L A, Giese H, Dixelius C 2002 Presence of Leptosphaeria maculans Group A and Group B Isolates in Sweden. J. Phytopathology 150 349–356. Macroft S J, Potter T D, Wratten N, Barbetti M J, Khangura R, Salisbury P A, Burton W A (1999): Alternative sources of resistance to Australian blackleg. Proceedings of the10 th International Rapeseed Congress Canberra Australia. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 101 Magyar D, Barasits T, Fischl G, Fernando W G D 2006 First report of the natural occurrence of the teleomorph of Leptosphaeria maculans on oilseed rape and airborne dispersal of ascospores in Hungary. J. Phytopathology 154: 428-431. Mahuku G S, Goodwin P H, Hall R, Hsiang T 1997 Variability in the highly virulent type of Leptosphaeria maculans within and between oilseed rape fields. Canadian Journal of Botany 75 1485-1492. Marinković R, Marjanović-Jeromela A, Crnobarac J, Lazarević J (2003) Path- coefficient analysis of yield components of rapeseed (Brassica napus L) u: Inter. Rapeseed Congres (11th) 6-10 July 2003. Copenhagen Denmark vol. III 988- 991. Marinković R, Marjanović-Jeromela A, Mitrović P (2007) Privredni značaj osobine i tehnologija proizvodnje uljane repice. Biljni lekar vol. 35 br. 4 str. 377-393. Marjanović-Jeromela A, Marinković R, Vasić D, Škorić D (2002) SaĎrţaj ulja i proteina u semenu uljane repice (Brassica napus L) u: Savetovanje Proizvodnja i prerada uljarica (43) Budva str. 117-121. Marjanović-Jeromela Ana, Marinković R, Vasić D, Škorić D. 2002. Sadrţaj ulja u semenu uljane repice (Brassica napus L.). Zbornik radova sa 43. Savetovanja industrije ulja – Budva: 117-122. McGee D C 1974 The seasonal pattern of ascospore discharge of Leptosphaeria maculans. Australian Plant Pathology Society Newsletter 3 27. McGee D C 1977 Blackleg (Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not.) of rapeseed in Victoria: sources of infection and relationships between inoculum environmental factors and disease severity. Australian Journal of Agriculture Research 28:53-62. McGee D C, Petrie G A 1978 Variability of Leptospheria maculans in relation to blackleg of oilseed rape. Phytopathology 68: 625 – 630. Mendes-Pereira E, Balesdent M H, Brun H, Rouxel T 2003 Molecular phylogeny of the Leptosphaeria maculans - Leptosphaeria biglobosa species complex. Mycol. Res. 107 (11): 1287-1304 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 102 Mengistu A, Hill C B, Williams P H 1995 A toothpick method for mating Leptosphaeria maculans the casual agent of blackleg of crucifers. Plant Disease 79 (7): 755-756. Mengistu A, Rimmer S R, Williams P H 1991 Pathogenicity grouping of isolates of Leptospheria maculans on Brassica napus cultivars and their disease relation profiles on rapid-cycling brassicas. Plant Disease 75: 1279-1282. Mengistu A, Rimmer S R, Williams P H 1993 Protocols for in vitro sporulation Ascospore release sexual mating and fertility in crosses of Leptosphaeria maculans. Plant Disease 77: 538-540. Mitrović P (1997) Paraziti kupusa. Magistarska teza Poljoprivredni fakultet Novi Sad. Mitrović P M, Orčić D Z, Sakač Z O, Marjanović-Jeromela A M, Grahovac N L, Milošević D M, Marisavljević D P 2012: Characterization of sirodesmins isolated from the phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans.J.Serb.Chem.Soc.77(10)1363-1379. Mitrović P, Marinković R 2007 Phoma lingam – a rapeseed parasite in Serbia. Proc. of the 12th Intern. Rapeseed Congres Wuhan China. March 26-30 2007/ IV 217-219. Mitrović P, Milovac Ţ, Marinković R 2009 Aktuelni problemi u zaštiti ozime uljane repice (Brassica napus var. L.). Zaštita bilja 268 127–144. Mitrović P, Trkulja V 2010 Leptosphaeria maculans i Leptosphaeria biglobosa – uzročnici raka stabla i suhe truleţi korijena uljane repice. Glasnik zaštite bilja 4: 34–45. Mullbacher A, Waring P, Tiwari-Palni U, Eichner D R 1986 Structural relationship of epipolythiodioxopiperayines and their immunomodulating activity. Mol. Immunol 23: 231-236. Mustapić Z, Vratarić M, Rajčić L 1984 Proizvodnja i prerada uljane repice. NIRO Zadrugar Sarajevo. Naseri B, Davidson J A, Scott E S 2008 Survival of Leptosphaeria maculans and associated mycobiota on oilseed rape stubble buried in soil. Plant Pathology 57 280-289. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 103 Naseri B, Davidson J A, Scott E S 2009 Maturation of pseudothecia and discharge of ascospores of Leptosphaeria maculans on oilseed rape stubble. Eur. J. Plant Pathol 125: 525-531. O'Gorman D, Hue B, Hsiang T, Goodwin P H 1994 Defection of Leptosphaeria korrae withPCR and primers for ribosomal internal transcribed spacers canadian Journal of Botany 72: 342-346. Panjanin M 1965 Suva truleţ kupusa (Phoma lingam). Biljna zaštita 617: 133-135. Paul V, Rowlinson C J 1992 Diseases and pests of rape. Verlag Theodore Mann Gelsenkirchen- Buer Germany. Pedras M S C, Biesenthal C J 2001 Secondary Metabolites from the Phytopathogenic Fungus Phoma lingam: Detection Isolation Structure Determination and Phytotoxicity of Unusual Dioxopiperazines. Phytochemistry 58 905-909. Pedras M S C, Chumala P B, Yu Y 2007 The phytopathogenic fungi Leptosphaeria maculans and L. biglobosa: chemotaxonomical characterization of isolates and metabolite production in different culture media. Canadian Journal of Microbiology 53 364-371. Pedras M S C, Sguin-Swartz G 1992 The "Blackleg" Fungus: Phytotoxins and Phytoalexins. Canadian Journal of Phytopathology 14 67-75. Pedras M S C, Yu Y 2008 Stress-driven discovery of metabolites from the fungal plant pathogen Leptosphaeria maculans: structure and activity of leptomaculins. Bioorganic & Medicinal Chemistry 16 8063-8071. Pedras M S C, Yu Y 2008 Structure and biological activity of maculansin A a phytotoxin from the phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans. Phytochemistry 69 2966-2971. Pedras M S, Taylor L J, Morales M V 1996 The blackleg fungus of rapesedd: how many species. Acta Hort. 407: 441-446. Penaud A, Jain L, Poisson B, Balesdent M-H, PeÂreÁs A 1999a Structure of populations of Leptosphaeria maculans in France. Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress 1999. Canberra Australia http://www.regional.org.au/papers/index.htm. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 104 Pérés A, Poisson B 1997 Phoma du colza: avancees enepidemiologie. CETIOM  Olkoscope 40: 37-40. Pérès A, Poisson B, Le Sourne, Maisonneuve C 1999 Leptosphaeria maculans: effect of temperature rainfall and humidity on the formation of pseudothecia. Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress Canberra Australia Petrie G A 1978 Occurrence of a highly virulent strain of blackleg (Leptosphaeria maculans). Canadian Plant Disease Survey 58 21–25. Petrie G A 1979 Blackleg of rape. Canadian Agriculture 24: 22-25. Petrie G A (1979b):Prevalence of a highly virulent strain of Leptospheria maculans (blackleg) in seed samples of rape and turnip rape produced in western Canada in 1976 and 1977.Canadian Journal Plant Science,59:899-901. Petrie G A 1986 Consequences of survival of Leptosphaeria maculans (blackleg) in canola stubble residue through an entire crop rotation sequence. Canadian Journal of Plant Pathology 8:353 (Abstract). Petrie G A 1988 The rapid differentiation of virulent and weakly virulent strains of Leptosphaeria maculans (blackleg or stem canker) and related pycnidial fungi from Brassica seeds and stems. Can. J. Plant Pathol. 10: 188-190. Petrie G A, Lewis P A 1985 Sexual compatibility of the rapeseed blackleg fungus Leptospheria maculans from Canada Australian and England. Canadian Journal of Plant Pathology 7: 253-255. Petrie G A, Vanterpool T C (1974):Infestation of crucifer seed in Western Canada by the blackleg fungus Leptospheria maculans.Canadian Plant Disease Survey 54:119-123. Poisson B, Pérès A 1999 Study of rapeseed susceptibility to primary contamination of Leptosphaeria maculans in relation to plant vegetative stage. Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress 1999. Canberra Australia. http://www.regional.org.au/papers/index.htm. Pound S G 1947 Variability in Phoma lingam. Journal of agricultural research. vol. 754: 113-133. Punithalingam E, Holliday E 1972 Leptospheria maculans CMI Descriptions of pathodenic fungi and Bacteria. No. 331. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 105 Purwantara A, Barins M J, Cozijnsen J A, Ades K P, Howlett J B 2000 Genetic diversity. Rouxel T, Chupeau Y, Fritz R, Kollmann A, Bousquet F J 1988 Biological effects of sirodesmin PLa phytotoxin produced by Leptosphaeria maculns Plant Sci. 57: 45-53. Salisbury P A, Ballinger D J, Wratten N, Plummer K M, Howlett B 1995 Blackleg disease on oilseed Brassica species in Australia: a review. Australian Journal of Experimental Agriculture 35 66572. Schramm H, Hoffmann G H 1991 Biologische grundlagen zur integrierten bekampfung von Phoma lingam (teleomorph Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces & deNot.) dem erreger der wurzelhals - und stengelhle an winterraps. ZeitschriSrfur Pyanzenkrankheiten und Pfanzenschutz 98: 581-596. Seidel D, Deabeler F, Amelung K, Engel H, Lücke W 1984 Auftrelen Schadwirkung und Bekämpfung von Phoma lingam an winterraps. Nachrichtenbl. Pflanzenschutz DDR 38: 120-123. Cited from Rev. Plant Pathol. 64: 133 (1985). Shoemaker R A, Brun H 2001 The teleomorph of the weakly aggressive segregate of Leptospheria maculans. Canadian Journal of Botany 79 412-419. Smith H C 1956 Leptosphaeria nepi the pericetial form of Phoma lingam causing dry-rot disease of Brassicas. New Zeland Science review. 14: 116-117. Somda I, Harkous S, Brun H 1997 Bipolar heterothelism in group isolates of Leptospheria maculans. Plant Pathology 60 890-896. Sosnowski M R, Scott E S, Ramsey M D 2004 Infection of Australian canola cultivars (Brassica napus) by Leptospheria maculans is influenced by cultivar and environmental conditions. Australas. Plant Pathol. 33: 401-411. Sosnowski M R, Scott E S, Ramsey M D (2006):Survival of Leptosphaeria maculans i soil on residues of Brassica napus in South Australia.Plant Pathology 55,200- 206. Sylvester-Bradley R, Makepeace R J 1985 Revision at a code for stages of development in oilseed rape (Brassica napus L.). Aspects of Applied Biology 10 395-400. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 106 Szlàvik S Z, Jedryczka M, Kiss I, Lewartowska E, Nagy G (2003): Population structure and pathogenicity grouping of L. maculans isolates from Hungary. Blackleg News 3-4. Taylor J L, Borgman I E 1994 An unusual repetetive element from highly virulent isolates of Leptospheria maculans and evidence at its transfer to a weakly virulent isolate. Mol. Plant-Microbe Interact. 7 181-188. Thürwächter F, Garbe V, Hoppe H H 1999 Ascospore discharge leaf infestation and variations in pathogenicity as criteria to predict impact of Leptosphaeria maculans on oilseed rape. Journal of Phytopathology 147: 215-222. Toscano-Underwood C, Huang Z J, Fitt L D B, Hall M A 2003 Effects of temperature on maturation of pseudothecia of Leptospheria maculans and L. biglobosa on oilseed rape stem debris. Plant Pathology 52 726-736. Toscano-Underwood C, West J S, Fitt B D L, Todd A D, Jedryczka M 2001 Development of phoma lesions on oilseed rape leaves inoculated with ascospores of A-group or B-group Leptosphaeria maculans (stem canker) at different temperatures andwetness durations. Plant Pathology 50: 28–41. West S J, Biddulph J E, Fitt B D L, Gladders P 1999 Epidemiology of Leptosphaeria maculans in relation to forecasting stem canker severity on winter oilseed rape in the UK. Ann. Appl. Biol. 135: 535-546. West S J, Kharbanda D P, Barbeti J M, Fitt L D B 2001 Epidemiology and management of Leptosphaeria maculans (phoma stem canker) on oilseed rape in Autralia Canada and Europe. Plant Pathology 50 10-27. Williams H R, Fitt L D B 1999 Differentiating A and B groups of Leptospheria maculans casual agent of stem canker (blackleg) of oilseed rape. Plant Pathology 48 161-175 Williams P H 1992 Biology of Leptosphaeria maculans. Canadian Journal of Plant Pathology 14: 30-35. Wolpert J T, Dunkle D L, Ciuffetti M L 2002 Host-selective toxins and avirulence determinants. Annu. Rev. Phytopathol. 40: 251-285. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 107 Wood P McR, Barbetti M J (1977a): The role of seed infection in the spread of blackleg of rape in Western Australia.Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry17: 1040-1044. Wu Z J, Li G Y, Fang D M, Qi H Y, Ren W J, Zhang G L 2008 Analysis of epipolythiodioxopiperazines in fungus Chaetomium cochliodes using HPLC- ESI-MS/MS/MS. Anal. Chem. 80: 217-226. Yu F, D J, Ludiate, Rimmer S R 2005 Identifivation at two novel genes for blackleg resistance in Brassica napus. Theor. Appl. Genet. 110: 969-979. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 108 BIOGRAFIJA Petar Mitrović je roĎen 28. 07. 1963. godine u Bijeljini. Osnovnu školu je završio u Crnjelovu, a srednju poljoprivrednu u Bijeljini. Poljoprivredni fakultet u Novom Sadu, smer zaštita bilja upisao je školske 1984/85. godine. Studije je okončao sa prosekom ocena 7,51, a diplomski rad “Kila kupusa pr. Plasmodiophora brassicae Wor. u Semberiji i mogućnost suzbijanja bolesti fungicidima” odbranio je 28.12.1990. godine sa ocenom 10. Školske 1992/1993 kandidat je upisao poslediplomske studije na grupi: Fitopatologija i nastavnim planom i programom poloţio sve ispite sa prosečnom osenom 8,00. Magistarski rad pod naslovom “ Paraziti kupusa” odbranio je 1997. godine. Kao volonter je radio u Departmanu za zaštitu bilja Poljoprivrednog fakulteta i Nacionalnoj laboratoriji za ispitivanje i kontrolu semena. Na DP „Planta” Futog, radio je kao referent za zaštitu bilja šest meseci gde se upoznao sa problemima u ratarsko- povrtarskoj proizvodnji. Od 04.05.2005. je zaposlen na odreĎeno vreme u Naučnom institutu za ratarstvo i povrtarstvo. U zvanje istraţivač saradnik izabran je 2006. U isto zvanje je reizabran 2010. god. Kao autor ili koautor objavio je 51 naučni rad. Sluţi se engleskim jezikom. Oţenjen je. Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 109 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 110 Mr Petar Mitrović Doktorska disertacija Poljoprivredni fakultet 111