UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET mr Dragana N. Milošević DIVERZITET I KARAKTERIZACIJA VIRUSA PAPRIKE U SRBIJI doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Dragana N. Milošević, MsC DIVERSITY AND CHARACTERIZATION OF PEPPER VIRUSES IN SERBIA Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Komisija za ocenu i odbranu: Mentor: dr Branka Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet ___________________________________ Članovi komisije: dr Mirko Ivanović, redovni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet ___________________________________ dr Zorica Nikolić, naučni savetnik Institut za ratarstvo i povrtarsvo, Novi Sad ___________________________________ dr Mirjana Milošević, naučni savetnik Institut za ratarstvo i povrtarsvo, Novi Sad ___________________________________ dr Aleksandra Bulajić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet ___________________________________ Datum odbrane: _____________________ Doktorska disertacija realizovana je u okviru projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja, Republike Srbije, TR31030, pod nazivom: «Stvaranje sorata i hibrida povrća za gajenje na otvorenom polju i zaštićenom prostoru». Posebnu zahvalnost dugujem svom mentoru profesorki dr Branki Krstić, koja je definisala plan i program istraživanja ove aktuelne i savremene teme. Takođe se zahvaljujem na svemu što me je naučila, na nesebično prenetom znanju i bezrezervnoj pomoći tokom izrade doktorske disertacije. Zahvaljujem se profesorki dr Aleksandri Bulajić i profesoru dr Mirku Ivanoviću, na konstruktivnim savetima i sugestijama. Zahvaljujem se profesorki dr Mirjani Milošević na dragocenoj pomoći i sugestijama koje su značajno doprinele kvalitetu disertacije. Najlepše hvala dr Zorici Nikolić na razumevanju i korisnim savetima koje mi je pružila tokom izrade i pisanja doktorske disertacije. Zahvalnost dugujem dr Ivani Stanković na uloženom trudu i pravovremenim savetima u toku ove višegodišnje saradnje. Takođe, želim da izrazim svoju zahvalnost koleginici mr Maji Ignjatov i ostalim kolegama iz Laboratorije za ispitivanje semena, Instituta za ratarstvo i povrtarstvo. DIVERZITET I KARAKTERIZACIJA VIRUSA PAPRIKE U SRBIJI Rezime. Dvogodišnjim proučavanjima pojave i rasprostranjenosti virusa u usevu paprike u Srbiji utvrĎeno je da se virusi javljaju svake godine kako u proizvodnji rasada, tako i u usevu paprike bilo da je gajen u zaštićenom prostoru ili na otvorenom polju. Serološkim analizama prikupljenih uzoraka paprike primenom DAS–ELISA testa, detektovano je prisustvo pet virusa: virus mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV), virus crtičastog mozaika krompira (Potato virus Y, PVY), virus bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus mozaika lucerke (Alfalfa mosaic virus, AMV) i virus blagog šarenila paprika (Pepper mild mottle virus, PMMoV), koji su se javili u pojedinačnim ili kompleksnim infekcijama. U obe godine istraţivanja, utvrĎeno je dominantno prisustvo CMV i/ili PVY u proizvodnji rasada, kao i kod oba načina gajenja paprika. Pregledom useva paprike u različitim lokalitetima gajenja zabeleţena je pojava niza simptoma na lišću, stablu, cvetovima i plodovima, koji su upućivali na virusnu zarazu, ali nije bilo moguće utvrditi njihovu povezanost sa detektovanim virusom. Za molekularnu detekciju i identifikaciju kao i za potvrdu rezultata dobijenih na osnovu antigenih osobina, korišćeni su odabrani izolati virusa paprike koji su detektovani u usevu paprike serološkim analizama. Amplifikacija različitih regiona genoma virusa obavljena je primenom RT–PCR metode korišćenjem odgovarajućih specifičnih prajmera. Nakon sekvencioniranja i višestrukog uparivanja sekvenci izolata sa sekvencama drugih virusa dostupnih u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti obavljena je molekularna identifikacija odabranih izolata virusa paprike poreklom iz naše zemlje. Determinisane su nukleotidne sekvence CP gena tri izolata CMV, AMV i PMMoV, sekvence gena za P1 protein tri izolata PVY, sekvence NC gena tri izolata TSWV, kao i nukleotidne sekvence RdRp gena tri izolata PMMoV. Filogenetska analiza na osnovu sekvenci gena za P1 protein, pokazala je grupisanje izolata PVY iz Srbije u klaster sa ostalim evropskim izolatima nekrotičnih sojeva, zatim na osnovu sekvenci CP gena izolata CMV, utvrĎena je pripadnost ispitivanih izolata iz paprike podgrupi IA gde je svrstana većina sojeva iz drugih delova sveta. Filogenetska analiza izolata TSWV pokazuje grupisanje ispitivanih izolata u klaster koji čini većina izolata iz Evrope, dok je na osnovu sekvence CP gena izolata AMV, pokazano grupisanje izolata u četiri genetička soja, gde se većina izolata, uključujući i ispitivane, izdvojila u grupu I. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence CP gena izolata PMMoV, pokazalo je svrstavanje ispitivanih izolata u prvu grupu sa izolatima koji izazivaju hipersenzitivnu reakciju (HR) na paprici koja je nosilac L 3 rezistentnog gena. U okviru ove disertacije proučavana je prisutnost i rasprostranjenost virusa paprike u Srbiji, usvojene su i poboljšane molekulаrne tehnike njihove detekcije, identifikаcije i dat je doprinos boljem rаzumevаnju njihovog poreklа i širenjа u nаšoj zemlji. Ključne reči: paprika, virusi, Cucumber mosaic virus, Potato virus Y, Tomato spotted wilt virus, Alfalfa mosaic virus, Pepper mild mottle virus, DAS–ELISA, RT-PCR. Naučna oblast: Biotehničke nauke Uţa naučna oblast: Fitopatologija UDK: 578.869:635.649(497.11)(043.3) DIVERSITY AND CHARACTERIZATION OF PEPPER VIRUSES IN SERBIA Abstract. A two-year investigation of the presence and distribution of pepper viruses in Serbia revealed that viruses occur each year of transplant, and also in greenhouse and in open field production. Serological analyses of collected pepper samples using DAS- ELISA test detected the presence of five viruses: Cucumber mosaic virus (CMV), Potato virus Y (PVY), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Alfalfa mosaic virus (AMV) and Pepper mild mottle virus (PMMoV), which occurred in single or complex infections. The prevalence of CMV and/or PVY was found in both years of investigation in transplant production and in both ways pepper is grown in Serbia. Survey of pepper crops in different growing regions indicated the occurrence of a number of symptoms on leaves, stem, flowers and fruit, which resembled those of virus infection, but it was not possible to determine their association with detected virus. Selected pepper virus isolates were used for molecular detection and identification as well as for confirmation of the results obtained on the basis of antigenic properties, which have been detected in a crop of pepper by serological analysis. The amplification of different genome regions was performed by RT-PCR method, using specific corresponding primers of the respective viruses. After the sequencing, sequences of Serbian virus isolates were compared with the respective virus sequences available in the GenBank and calculation of genetic homology was performed for molecular identification of selected isolates of the pepper viruses originating from our country. Nucleotide sequences of CP gene of three isolates of CMV, AMV and PMMoV, the P1 protein gene sequence of three PVY isolates, sequences of NC gene of three TSWV isolates and nucleotide sequences of RdRp gene of three PMMoV isolates were determined. Phylogenetic analysis based on gene sequences for P1 protein showed a grouping of PVY isolates from Serbia in a cluster with other European isolates of necrotic strains. On the basis of CP gene phylogenetic analysis, it was shown that tested pepper CMV isolates from Serbia belong to subgroup IA, where most strains from the other parts of the world are classified. Phylogenetic analysis of TSWV isolates showed grouping of Serbian isolates into cluster with most of the isolates from Europe, while, based on the CP gene sequences of AMV isolates, showed grouping of isolates into four genetic strains, where most of the isolates, including tested, allocated in group I. Reconstructed phylogenetic tree based on CP gene sequences of PMMoV isolates showed that the tested isolates belong to the first group of isolates with the isolates that cause hypersensitive response (HR) on pepper carrying the L3 resistant gene. The present study investigated the presence and distribution of pepper viruses in Serbia the molecular methods for their detection, identification and characterization were implemented and improved, and contribution regarding better understanding of their origin and expansion in our country was done. Key words: pepper, viruses, Cucumber mosaic virus, Potato virus Y, Tomato spotted wilt virus, Alfalfa mosaic virus, Pepper mild mottle virus, DAS-ELISA, RT-PCR Scientific field: Biotechnical Science Scientific discipline: Phytopathology UDC: 578.869:635.649(497.11)(043.3) SADRŽAJ 1.UVOD.………………………………………………….................................................... 1 2. PREGLED LITERATURE…………………………………………………………..... 4 2.1. Paprika kao gajena biljka …………………………………………………………..….. 4 2.1.1. Poreklo paprike……………………………………………………………...…... 4 2.1.2. Naziv i podela paprike……………………………………………………..…… 4 2.1.3. Morfologija paprike…………………………………………………………….. 6 2.1.4. Gajenje paprike………………………………………………………………..... 6 2.1.5. Značaj i perspektive gajenja paprike……………………………………...…… 7 2.2. Bolesti i štetočine paprike………………………………………………………..……. 8 2.3. Virusi paprike i njihov značaj………………………………………………………….. 9 2.4. Proučavanja virusnih oboljenja paprike u svetu…………………………………..…… 9 2.5. Proučavanja virusnih oboljenja paprike u našoj zemlji……………………...………… 10 2.6. Pregled virusa koji se najčešće javljaju u rasadu, zaštićenom prostoru i na otvorenom polju………………………………………………………………………………………… 11 2.7. Osnovne karakteristike najznačajnjih virusa paprike…………………..……………… 12 2.7.1. Virus mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV)………….………….. 12 2.7.2. Virus crtičastog mozaika krompira (Potato virus Y, PVY)…………………..… 15 2.7.3. Virus bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus, TSWV)…………….… 19 2.7.4. Virus mozaika duvana (Tobacco mosaic virus, TMV)……………………..…… 24 2.7.5. Virus mozaika lucerke (Alfalfa mosaic virus, AMV)…………………………… 26 2.7.6. Virus blagog šarenila paprike (Pepper mild mottle virus, PMMoV)…………… 28 2.8. Kontrola virusnih oboljenja paprike…………………………………………….……... 30 3. CILJEVI ISTRAŢIVANJA………………………………………………………….… 32 4. MATERIJAL I METODE…………………………………………………….……….. 33 4.1. Pregled terena i sakupljanje uzoraka obolelih biljaka paprike………………………… 33 4.2. Direktni imunoenzimski metod na ploči (DAS–ELISA)……………………………… 34 4.3. Molekularna detekcija virusa paprike primenom reverzne transkripcije praćene lančanom reakcijom polimeraze (RT–PCR)………….…………………………………….. 37 4.3.1. Ekstrakcija RNA iz biljnog materijala……………………………………..…… 38 4.3.2. Molekularna detekcija izolata CMV…………………………………………….. 39 4.3.3. Molekularna detekcija izolata PVY……………………………………….……. 41 4.3.4. Molekularna detekcija izolata TSWV…………………………………………... 42 4.3.5. Molekularna detekcija izolata AMV……………………………………………. 44 4.3.6. Molekularna detekcija izolata PMMoV………………………..……………...... 45 4.3.7. Vizuelizacija PCR produkta…………………………...........................………... 47 4.4. Molekularna identifikacija virusa paprike……………………………………….…….. 48 4.5. Filogenetska analiza…………………………………………………………………… 50 5. REZULTATI…………………………………………………………………………… 57 5.1. Simptomi u rasadu, zaštićenom prostoru i polju……………….……………………… 57 5.2. Serološka detekcija virusa…………………………………………………………..…. 59 5.2.1. Prisustvo i rasprostranjenost virusa u usevu paprike tokom 2009. godine......... 59 5.2.2. Prisustvo virusa u usevu paprike tokom 2010. godine………………………… 66 5.2.3. Rasprostravnjenost virusa paprike i prisustvo virusa na pojedinim sortama...... 73 5.2.4. Zastupljenost virusa paprike u obe ispitivane godine.......................................... 75 5.3. Simptomi virusa paprike…………………………………………………..…………… 79 5.4. Molekularna detekcija izolata virusa paprike……………………………….…….…… 87 5.4.1. Ekstrakcija RNA iz biljnog materijala………………………………….…….… 87 5.4.2. Molekularna detekcija izolata CMV………………………………….………… 87 5.4.3. Molekularna detekcija izolata PVY………………………………….………… 88 5.4.4. Molekularna detekcija izolata TSWV……………………………….….……… 89 5.4.5. Molekularna detekcija izolata AMV…………………………………………… 92 5.4.6. Molekularna detekcija izolata PMMoV…………………………...…………… 93 5.5. Molekularna identifikacija izolata virusa paprike poreklom iz Srbije……….………… 95 5.5.1. Molekularna identifikacija izolata CMV……………………………….………. 95 5.5.2. Molekularna identifikacija izolata PVY………………………………...……… 96 5.5.3. Molekularna identifikacija izolata TSWV……………………………………… 97 5.5.4. Molekularna identifikacija izolata AMV………………………….………….… 98 5.5.5. Molekularna identifikacija PMMoV…………………………………………… 99 5.6. Molekularna karakterizacija najznačajnijih virusa paprike u Srbiji……......………….. 101 5.6.1. Filogenetska analiza sekvenci CMV…………………………………………… 101 5.6.2. Filogenetska analiza sekvenci PVY……….…………………………………… 104 5.6.3. Filogenetska analiza sekvenci TSWV…………………………………..……… 107 5.6.4. Filogenetska analiza sekvenci AMV…………………………………………… 109 5.6.5. Filogenetska analiza sekvenci PMMoV………………………………..………. 112 6. DISKUSIJA………………………………….….....................................……………… 114 6.1. Serološka identifikacija virusa paprike……….................................................……….. 115 6.2. Povezanost simptoma na prirodno zaraţenim biljakam paprike i detektovanih virusa.. 119 6.3. Molekularna detekcija i identifikacija virusa paprika..................................................... 121 6.3.1. Detekcija CMV primenom RT–PCR metode………………………….………. 122 6.3.2. Detekcija PVY primenom RT–PCR metode…………………………..………. 123 6.3.3. Detekcija TSWV primenom RT–PCR metode………………………………… 124 6.3.4. Detekcija AMV primenom RT–PCR metode………………………………….. 125 6.3.5. Detekcija PMMoV primenom RT–PCR metode………………………………. 126 6.4. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata virusa paprike poreklom iz Srbije sa izolatima virusa iz drugih delova sveta………………………………………… 126 6.4.1. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata CMV…………... 127 6.4.2. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata PVY.................... 128 6.4.3. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata TSWV…………. 129 6.4.4. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata AMV…………... 131 6.4.5. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata PMMoV……….. 132 6.5. Filogenetska analiza virusa paprike……………………………………………………. 133 6.5.1. Filogenetska analiza CMV izolata…………………………………………….. 133 6.5.2. Filogenetska analiza PYV izolata …………………………………………….. 135 6.5.3. Filogenetska analiza TSWV izolata…………………………………………... 136 6.5.4. Filogenetska analiza AMV izolata……………………………………………. 138 6.5.5. Filogenetska analiza PMMoV izolata…………………………………………. 139 7. ZAKLJUČAK…………………………………………………………………………... 141 8. LITERATURA……………………………………………………………………….…. 145 PRILOZI……………………………………………………………………………….. 178 BIOGRAFIJA…………………………………………………………………..……… 200 IZJAVE............................................................................................................................ 201 1 1. UVOD Po svom poreklu, paprika (Capsicum annuum L.) je tropska biljka poreklom iz Centralne i Juţne Amerike, odakle su je Španci doneli u Evropu početkom XVI veka. U naše krajeve dospela je iz Turske, te je, turski, maĎarski, nemački i naš naziv ove biljke isti (Greenleaf, 1986). Paprika u našoj zemlji ima veliki privredni značaj i spada u grupu najznačajnijih povrtarskih useva. Površine pod paprikom variraju iz godine u godinu sa tendencijom povećanja. U svetu, paprika se gaji na oko 1.600.000 ha sa prosečnim prinosom od 14 t/ha, dok se u Srbiji proizvodi na oko 21.000 ha, sa prosečnim prinosom od 8,3 t/ha (Gvozdenović, 2010). Površine pod paprikom u našoj zemlji povećavaju se pre svega u Vojvodini i u područjima gde ima preraĎivačkih kapaciteta. Razlog za povećanje površina, kako kod nas tako i u svetu, je zbog kvalitetnije ishrane i biološki vaţnih materija u paprici (Marković, 2004). U nacionalnoj privredi zemlje ovo povrće ima veliki značaj, kako za ishranu stanovništva, tako i u meĎunarodnoj trgovini, jer se pored izvoza u sveţem stanju, izvoze i razni proizvodi od paprike, kao i začini, što svakako čini i devizni priliv zemlji. Gaji se na otvorenom polju i u zaštićenom prostoru. Zbog višestrukog načina upotrebe u ishrani kao i u preraĎivačkoj industriji, smatra se veoma cenjenim povrćem. U zavisnosti od sorte i cilja proizvodnje, koristi se u tehnološkoj (upotrebnoj) ili fiziološkoj (botaničkoj) zrelosti u sveţem i preraĎenom stanju, dok se začinska koristi za proizvodnju mlevene začinske paprike (Jovanović, 1946). Mlevena začinska paprika se dobija od fiziološko zrelih i osušenih plodova. To je začin crvene boje, dobre moći bojenja, prijatnog mirisa, a poboljšava ukus i miris hrani. Brojne biljne bolesti izazvane gljivama, bakterijama i virusima mogu da smanje ili ugroze uspešnu proizvodnju kako semenske tako i konzumne paprike ometajući normalan razvoj biljke i umanjujući prinos i kvalitet plodova. Fitopatogeni virusi predstavaljaju grupu patogena koji svake godine odnose deo roda paprike, a nije retkost da prouzrokuju gubitke i do 90% (Krstić i Bulajić, 2008). Velike štete mogu da nastanu naročito kad je usev zaraţen sa dva ili više virusa usled ispoljavanja sinergističkog delovanja. TakoĎe, velike štete mogu nastati ako se zaraze jave u ranim fazama razvoja biljke, pre svega ukoliko doĎe do zaraze rasada. Praćenje pojave virusa, njihova detekcija i identifikacija, kao i utvrĎivanje prevalentnih virusa za odreĎene regione 2 gajenja prvi je i osnovni korak u sprečavanju njihovog širenja kada se već pojave u usevu paprike ili sprečavanju ponovne pojave u sledećem ciklusu proizvodnje. Zbog značajnih šteta koje često prouzrokuju, viroze paprike su predmet proučavanja mnogih autora u svetu (Choi et al., 2005a; Arli-Sokmen et al., 2005; Ozaslan et al., 2006). U Srbiji, prva proučavanja virusa paprike bila su vazana za virus mozaika duvana (Panjan i Prpić, 1955), virus mozaika krastavca i virus mozaika lucerke (Šutić, 1959; Delević, 1963). Dosadašnja malobrojana proučavanja utvrdila su prisustvo sledećih virusa paprike u Srbiji: virus bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV), virus crtičastog mozaika krompira (Potato virus Y, PVY), virus mozaika lucerke (Alfalfa mosaic virus, AMV), virus mozaika duvana (Tobacco mosaic virus, TMV), virus mozaika krompira (Potato virus X, PVX) i virus blagog šarenila paprike (Pepper mild mottle virus, PMMoV) (Mijаtović, 1986; Mijаtović i sаr., 1999, 2002, 2005; Krstić i sar., 1996). Iako su simptomi izazvani virusima veoma varijabilni i zavise od domaćina, ekoloških uslova i vrste virusa, najčešći simptomi su nekrotične pege, crtičavost, prstenaste pege, zakrţljalost, uvenuće, itd. Simptomi na zaraţenim biljkama, mogu ličiti na simptome mikozne ili bakterijske bolesti, a takoĎe često moţe da doĎe do zabune izmeĎu simptoma viroznih oboljenja i simptoma koji se javljaju pod uticajem herbicida ili oštećenja od zagaĎenja vazduha ili mineralnih nedostataka. Dakle, ako se dijagnostika viroza na biljkama vrši samo na osnovu simptoma često moţe da doĎe i do grešaka (Ozaslan et al., 2006). S obzirom da virusi svake godine smanjuju prinos i kvalitet paprike u našoj zemlji, a pojedinih godina se javljaju u epidemijskim razmerama, stalno praćenje prisustva, rasprostranjenosti i učestalosti viroza paprike, pravilna detekcija prouzrokovača i kombinovanje različitih metoda u cilju njihove identifikacije i karakterizacije, od velikog su značaja i imaju kao osnovni cilj razvijanje i primenu adekvatnih i pravovremenih mera kontrole. Imajući u vidu navedene činjenice, ova doktorska disertacija predstavlja doprinos sveobuhvatnijem sagledavanju problematike koju virusi izazivaju u proizvodnji paprike, a posebno unapreĎenju metoda detekcije, identifikacije i 3 karakterizacije virusa prisutnih u našoj zemlji, kao osnov za razumevanje epidemiologije u cilju uspešne prevencije i kontrole virusnih bolesti paprike u Srbiji. 4 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Paprika kao gajena biljka 2.1.1. Poreklo paprike Mišljenja o poreklu paprike su podeljena. Većina smatra da ona vodi poreklo iz Juţne Amerike, Brazila i severnih zemalja Juţne Amerike, kao i iz Centralne Amerike, Meksika, Gvatemale, Tihookeanskih ostrva i Antila. Iz ovih krajeva paprika je prenešena na sever (u SAD) i na jug (u Kolumbiju, Venecuelu, Ekvador, Peru, Boliviju, Paragvaj, Čile, Argentinu i Urugvaj) (Veselinov, 1984). TakoĎe, postoji, mišljenje da paprika vodi poreklo iz Azije, i to iz zapadnog dela Indije. Kao potvrdu ovom tvrĎenju navodi se da su kod cara Nerona pronaĎene slike paprika pod nazivom Piper i Rotunde, što odgovara današnjem nazivu ove vrste povrća na jeziku raznih naroda (Filov, 1956). Nakon otkrića Amerike, paprika je preneta u Evropu i raširena po celom svetu. Prvi su za nju saznali Španci, jer ju je Kolombo preneo iz Novog Sveta, sa svog drugog puta u Ameriku, 1493. godine. U početku je gajena u baštama kao ukrasna biljka, a zatim kao povrće za jelo i začin. Gajenje je prvo prošireno u Portugaliji, a zatim i u drugim evropskim zemljama. Već u XVII veku više nije korišćena samo kao začin nego i kao salata, naročito u Španiji, Italiji i na Balkanu. U našu zemlju paprika je prenata iz Turske, i to za vreme turske okupacije u XVII veku (Veselinov, 1984). 2.1.2. Naziv i podela paprike Ime paprika potiče od grčke reči p e p e r i i latinske reči p i p e r što znači crni biber. Naš naziv za papriku takoĎe potiče od grčko-latinske reči p e p e r i - p i p e r , što znači biber. U početku gajenja paprike smatralo se da je to zamena za biber, pre svega zbog ljutine. Srpski, turski i maĎarski naziv je isti – p a p r i k a , pa vlada mišljenje da je u Srbiji i MaĎarskoj dospela iz Turske. Kod većine naziva, osnova reči paprike u imenu je p i p e r . Paprika pripada familiji Solanaceae (pomoćnica), rodu Capsicum i vrsti annuum. Sva proučavanja vezana za klasifikaciju zasnivaju se na morfološkim i biološkim 5 karakteristikama najrazličitijih formi paprike sakupljenih u rod Capsicum koji ima 25 vrsta, a najznačajnije su sledećih pet (Bosland et al., 1994): 1. Capsicum frutescens L. – višegodišnja paprika, visine stabla 30-60 cm. Cvetovi imaju 5-6 kruničnih listića krem do belozelene boje. Plodovi su sitni i biljke su samonikle (divlje forme) iz Brazila, Venecuele, Meksika, Kube, Kostarike i Perua. 2. Capsicum pubescens Ruit at Pavon – višegodišnja biljka, razgranatog stabla. Ima plave cvetove, a seme sitno i crno. Domovina ove paprike je Peru, Kolumbija i Gvatemala. 3. Capsicum bacatum L. – višegodišnja vrsta iz Juţne Amerike. Odlikuju se razgranatom biljkom, cvetovi su ţuti, beli ili boje kafe. Plodovi su trešnjolike do izduţene forme na dugim drškama. Posebno su otporni na sušu i niske temperature. 4. Capsicum chinense L. – vodi poreklo iz Amazona i trougla Kariba, Centralne i Juţne Amerike. Cvetovi su joj krem bele boje, a prašnici plave, dok je plod različite veličine, oblika i boje. 5. Capsicum annuum L. – jednogodišnja vrsta, za gajenje u tropskim uslovima i u zaštićenom prostoru. Kod nas je to jednogodišnja zeljasta biljka koja bi mogla biti i dvogodišnja pri gajenju u područjima toplog klimata ili u zaštićenom prostoru. Od navedenih vrsta najrasprostranjenija je i najveći privredni značaj ima Capsicum annuum koja se deli na sledeće podvrste: 1. Capsicum annuum ssp. macrocarpum, var. grossum var. longum 2. Capsicum annuum ssp. microcarpum, var. chipka P. var. cerasiforne Mill 3. Capsicum annuum ssp. fascikulatum 6 2.1.3. Morfologija paprike Korenov sistem paprike jako je razgranat i ţiličast. Najvećim delom se nalazi u oraničnom sloju, slabe usisne i regenerativne moći. Stablo je zeljasto i razgranato, čvrsto, starenjem donji delovi odrvenjavaju. Visina stabla se kreće od 30-90 cm, mada, u zaštićenom prostoru, moţe da dostigne visinu i preko 2 m. Paprika je dikotiledona kultura. Pravi listovi su prosti, eliptični, jajoliki, zašiljeni na dugoj peteljci sa izraţenim glavnim nervom. Krupnoplode paprike imaju širokoeliptične liske i obrnuto, sitnoplode imaju uskolancetaste liske. Površina lista je glatka. Kod nekih sorti manje ili više je izraţena maljavost. Cvetovi paprike su najčešće pojedinačni, dok u nekim slučajevima mogu se javiti dva do tri zajedno. Cvet paprike je hermafroditan (dvopolan) i nalazi se u pazuhu listova. Svojom graĎom cvet je podešen za samooplodnju, meĎutim postoji i mogućnost stranooplodnje. Plod, u botaničkom smislu, je šuplja bobica na kojoj razlikujemo perikarp (mesnati deo ploda), centralnu placentu (semenošu), bočne placente (pregrade i ţilice), seme, čašicu i peteljku. Plod paprike je veoma različit i zavisi od sorte. Osnovne razlike se uočavaju u obliku ploda, veličini, površini, boji, debljini perikarpa, ljutini, graĎi čašice i drške ploda, kao i poloţaju ploda na biljci (babure, paradajz paprike, dugačke, feferone, trešnjolike i buketne paprike) (Merkulov i sar., 2000). Duţ unutrašnje strane mesa ploda (perikarpa) u obliku trake, od osnovice pa do vrha ploda, proteţe se uzduţna ili bočna placenta (ţilica ili pregrada). Na svim ţilicama nalaze se ţlezde koje sadrţe kapsaicin. Ukus ploda paprike potiče od alkaloida kapsaicina i prema njegovoj količini, plod moţe biti ljut, srednje ili slabo ljut i sladak. Seme paprike je tanko, pljosnato, bubreţastog oblika, sa izraţenim oţiljkom, spojnim mestom sa placentom ploda. Prečnik semena je 3-5 mm, debljine 0,5-1 mm. Semena ljuska (semenjača) je glatka, čvrsta, debela, zlatno-ţute do sive boje. 2.1.4. Gajenje paprike Paprika se u svetu gaji na oko 1.600.000 ha sa prosečnim prinosom od 14 t/ha. U Srbiji se gaji na površini od oko 21.000 ha sa prosečnim prinosom od 8,3 t/ha (Gvozdenović, 2010). Najveći proizvoĎači paprike u svetu su Kina i Indonezija. Kina ima relativno visoke prosečne prinose (12 t/ha) dok Indonezija ima niske (2,5 t/ha). Najveće prosečne 7 prinose ima Španija (26,6 t/ha) i Italija (23,8 t/ha). Porast površina pod paprikom u našoj zemlji je pre svega u Vojvodini i u područjima gde ima preraĎivačkih kapaciteta. Razlog za povećanje površina, kako u svetu tako i kod nas, je zbog kvalitetnije ishrane i biološki vaţnih materija u paprici. Rezultati niskih prinosa kod nas su nedovoljno poznavanje bioloških osobina paprike i neodgovarajuće agrotehnike, kao i nepravovremena i neodgovarajuća kontrola biljnih bolesti. Paprika se gaji kao jednogodišnja ili višegodišnja kultura u zavisnosti od klimatskih uslova i regiona. Kod nas se gaji jednogodišnja paprika, jer to diktiraju klimatski uslovi. Uspeva u svim rejonima naše zemlje gde su srednje dnevne temperature za vreme vegetacije iznad 15 ° C. Kod nas se gaje razni tipovi paprike, kako za potrošnju u sveţem stanju i preradu u razne proizvode, tako i za proizvodnju začina. Gajenje začinske paprike je uglavnom skoncentrisano u Vojvodini gde se nalazi oko 80% celokupne proizvodnje u Srbiji. Kod nas se začinska paprika gaji na oko 4.000 do 5.000 ha godišnje (Marković i Vračar, 1998). 2.1.5. Značaj i perspektive gajenja paprike U nacionalnoj privredi zemlje ovo povrće ima veliki značaj, kako za ishranu stanovništva, tako i u meĎunarodnoj trgovini, jer se pored izvoza u sveţem stanju izvoze i razni proizvodi od paprike, kao i začini, što svakako čini i devizni priliv zemlji. Značaj paprike proizilazi i po površinama na kojima se gaji. Ona je pre svega visokoakumulativna kultura jer ostvaruje visok dohodak po jedinici površine. Veoma je intenzivna kultura. Gaji se na otvorenom polju i u zaštićenom prostoru. Zbog višestrukog načina upotrebe u ishrani kao i u preraĎivačkoj industriji, smatra se veoma cenjenim povrćem. U zavisnosti od sorte i cilja proizvodnje, koristi se u tehnološkoj (upotrebnoj) ili fiziološkoj (botaničkoj) zrelosti u sveţem i preraĎenom stanju, dok se začinska koristi za proizvodnju mlevene začinske paprike. Mlevena začinska paprika se dobija od fiziološko zrelih i osušenih plodova. To je začin crvene boje, dobre moći bojenja, prijatnog mirisa, a poboljšava ukus i miris hrani (Jovanović, 1946). 8 2.2. Bolesti i štetočine paprike Kako se paprika gaji zbog ploda, bitno je da se pored prinosa, ostvari i visok kvalitet ploda. Jedan od uslova za postizanje visokog prinosa i dobrog kvaliteta ploda paprike je efikasna zaštita od štetnih organizama, uzročnika bolesti, štetočina i korova. Bolesti paprike se javljaju još u rasadničkom periodu naročito za vreme hladnih i oblačnih dana koja nastaju aktivnošću fitopatogenih organizama. Osetljiva je na gljive, bakterije, viruse, pa i fitoplazme. Korišćenje lošeg semena, supstrata, loše higijene i uopšte nepovoljnih uslova, uzrok su pojave različitih oboljenja. Jedno od bitnih oboljenja rasada paprike je poleganje rasada izazvano gljivom Rizoctonia solani, koja izaziva truleţ korena i prizemnog dela stabla kako u zaštićenom prostoru tako i na otvorenom polju (Ivanović i Ivanović, 2001). Jedna od ekonomski najznačajnijih gljivičnih bolesti paprike kod nas je plamenjača čiji je prouzrokovač Phytophthora capsici a izaziva uvenuće i sušenje biljaka kao i truleţ stabla pri osnovi (Mijatović i sar., 2007). TakoĎe, postoji još nekoliko bitnih oboljenja paprike meĎu kojima je zeleno uvenuće koje prouzrokuje gljiva Verticillium albo-atrum, zatim Botrytis cinerea prouzrokovač sive plesni koji kod mladih biljaka izaziva poleganje ili topljenje rasada, dok se kod starijih biljaka na stablu javljaju sivomrke pege. Pepelnicu paprike prouzrokuje gljiva Leveillula taurica pri čemu se pojavljuju hlorotične mrlje na gornjoj strani lista koje ga mogu u potpunosti prekriti. Na lišću biljaka zaraţene gljivom Alternaria spp. koja prouzrokuje crnu pegavost, javljaju se pege koje su krupne, sivomrke, sa crnim koncentričnim krugovima i oivičeni hlorotičnim oreolom. Pege se mogu pojaviti i duţ stabla i na plodovima (Jovićević i sar., 2006; Ivanović i Ivanović, 2001). Od bakterioza na paprici se javlja bakteriozna plamenjača rasada i nekrotična pegavost lišća (prouzrokovač Pseudomonas syringe) (Buonaurio and Scortichini, 1994) i bakteriozna pegavost i krastavost plodova paprika (prouzrokovač Xanthomonas campestris pv. vesicatoria) (Ignjatov i sar., 2010). Pored gljiva, bakterija i virusa, na paprici problem predstavljaju lisne vaši i tripsi. Papriku zaraţava veći broj virusa koji se prenose na neperzistentan način većim brojem raznih vrsta vaši. Dosadašnja ispitivanja pokazala su da su vaši Myzus persicae i Aphis gossypii ispoljile naročitu aktivnost u prenošenju virusa na papriku. Posle ishrane 9 na zaraţenoj biljci, M. persicae je, na primer, sposobna da u toku prvih pet minuta obavi najveći broj zaraza, a svoju vektorsku aktivnost zadrţava najčešće 10 do 30 minuta, a najduţe do 4 časa. Smatra se da je TSWV najrasprostranjeniji virus u svetu, zahvaljujući brzoj ekspanziji svog najefikasnijeg vektora-kalifornijskog tripsa, Frankliniella occidentalis. MeĎutim, njegovi prenosioci mogu biti i drugi tripsi Thrips tabaci, Frankliniella schultzei i F. fusca. Pošto su populacije vaši i tripsa skoro redovno mnogobrojne, to je i njihova uloga u prenošenju virusa veoma značajna. 2.3. Virusi paprike i njihov značaj UtvrĎeno je dа više od 45 rаzličitih virusа moţe dа zаrаzi pаpriku, аli se smаtrа dа je meĎu njimа svegа nekoliko ekonomski znаčаjno (Green and Kim, 1990). Listа virusа infektivnih zа pаpriku stаlno se proširuje ne sаmo zbog pojаve novih virusа već i zbog nаstаnkа novih pаtotipovа/sojevа u okviru populаcije pojedinih virusа. Pojаvа i rаsprostrаnjenost većine vrstа virusа zаvise od brojnih fаktorа kаo što su region i lokаcijа gаjenjа, vegetаcionа sezonа, genotip pаprike i drugih. Neki virusi su široko rаsprostrаnjeni, kаo što su Cucumber mosaic virus (virus mozаikа krаstаvcа, CMV), Tobacco mosaic virus (virus mozаikа duvаnа, TMV), Potato virus Y (virus crtičаstog mozаikа krompirа, PVY) i Alfalfa mosaic virus (virus mozаikа lucerke, AMV), dok su drugi još uvek vezаni sаmo zа odreĎenа geogrаfskа područjа (Begomovirus-i) (Krstić i Bulаjić, 2008). MeĎutim, situаcijа se vremenom menjа. Nаjbolji primer zа to je Tomato spotted wilt virus (virus bronzаvosti pаrаdаjzа, TSWV). Ovаj virus se rаnije češće jаvljаo u suptropskim i tropskim regionimа, аli dаnаs je opšte rаsprostrаnjen nа svojim brojnim domаćinimа, uključujući i pаpriku (Krstić i Bulаjić, 2007). 2.4. Proučavanja virusnih oboljenja paprike u svetu Zbog znаčаjnih štetа koje često prouzrokuju, viroze pаprike su predmet proučаvаnjа mnogih аutorа u svetu. Conti and Masenga (1977), proučаvаjući prisustvo virusа infektivnih zа pаpriku u Itаliji, utvrdili su dа je nаjzаstupljeniji bio CMV u 80,2% biljаkа pаprike gаjene nа otvorenom prostoru, dok je u zаštićenom prostoru nаjzаstupljeniji bio TMV sа 84%. Osim ovа dvа virusа zаbeleţeno je prisustvo i PVY, 10 AMV, Potato virus X (virus mozaika krompira, PVX), Broad bean wilt virus (virus uvenulosti boba, BBWV) i Tobacco rattle virus (virus šuštavosti duvana, TRV). Premа istrаţivаnjimа Gaborjanyi et al. (1998), nаjzаstupljeniji virusi pаprike u MаĎаrskoj su TMV, CMV, PVY i TSWV, čije se infekcije kreću i do 100%. Premа podаcimа Kovаčevskog (1977) (loc. cit. Mijаtović i sаr., 1999), u Bugаrskoj je inficirаnost pаprike sа CMV iznosilа 80% do 90%, а u nešto mаnjem procentu su identifikovаni TMV, PVY i TSWV. Sepulveda et al. (2005) su konstаtovаli dа je oko 30% pаprike u severnom Čileu inficirаno sа dvа ili više virusа. Detekcijom virusа DAS-ELISA testom utvrĎeni su CMV, TSWV, AMV, PVY, Impatiens necrotic spot virus (virus nekrotične pegavosti impatiensa, INSV), Tomato mosaic virus (virus mozaika paradajza, ToMV) i TMV. Tokom istrаţivаnjа kojа su sprovedenа 1998. i 1999. godine u Turskoj, determinisаno je šest virusа AMV, CMV, PVY, ToMV, TMV i TSWV. Od 313 testirаnih biljаkа, 42 biljke posedovаle su mešаnu infekciju TMV i PVY (15,4%) što je predstаvljаlo nаjčešću mešаnu infekciju (Arli-Sokmen et al., 2005). Iаko su Tobacco etch virus (virus graviranosti duvana, TEV) i PVY nаjzаstupljeniji u stаkleničkoj proizvodnji i proizvodnji u polju u Kаliforniji (Abdalla et al., 1991), Pepper mottle virus (virus šаrenilа pаprike, PepMoV) se često smаtrа kаo uzročnik smаnjenja porаstа biljаkа kаo i gubitаka prinosа plodovа (Rodriguez-Alvardo et al., 2002; Yoshihiro et al., 2003). TаkoĎe, PepMoV je od velike vаţnosti, i predstаvljа nаjčešće detektovаni Potyvirus u Juţnoj Koreji otkаko je dаt prvi izveštаj o ovom virusu 1991. godine (Im et al., 1991). MeĎutim, zа Korejsku industriju pаprike ovo nije pаtogen sаm po sebi toliko problemаtičаn kаo CMV i PVY. Ovaj virus je veomа znаčаjаn i dovodi do teških gubitаkа u prinosu plodа kаdа se jаvi zаjedno sа Pepper mild mottle virus (virus blаgog šаrenilа pаprike, PMMoV) (Jung-Heon et al., 2006). 2.5. Proučavanja virusnih oboljenja paprike u našoj zemlji Iаko se virusi nа pаprici kod nаs jаvljаju svаke, а pojedinih godinа mogu dа izаzovu epidemije, nisu dovoljno proučeni. U Srbiji, prvа proučаvаnjа virusа pаprike bilа su vezаnа zа TMV (Pаnjаn i Prpić, 1955), CMV i AMV (Šutić, 1959; Delević, 1963). Dosаdаšnjа mаlobrojnа proučаvаnjа utvrdilа su prisustvo sledećih virusа: TSWV, CMV, PVY, AMV, TMV, PMMoV, PepMV i Pepper veinal mottle virus (virus 11 šаrenilа nerаvа pаprike, PepVMV) (Mijаtović, 1986; Krstić i sar., 1996, 2005; Mijаtović i sаr., 1999, 2002, 2005). Prvih pet virusа ekonomski su znаčаjni u proizvodnji pаprike u Srbiji, а ostаlа tri se jаvljаju sporаdično (Mijаtović i sаr., 2007; Krstić i Bulаjić, 2008). Istrаţivаnjа u Srbiji sprovedenа 2007. godine nа devet lokаlitetа gаjenjа pаprike pokаzаlа su prisustvo virusа iz dve osnovne grupаcije: kаrаntinski (TSWV) i ekonomski štetni (CMV, AMV i TMV) (Tomić i sаr., 2007). 2.6. Pregled virusa koji se najčešće javljaju u rasadu, zaštićenom prostoru i na otvorenom polju Osobine i biologija svakog virisa odreĎuju njegovu izrazitiju pojavu bilo u zaštićenom prostoru ili na otvorenom polju. Neki od virusa paprike se prenose sokom zaraţenih biljaka (mehanički), drugi semenom, vašima ili tripsima, a uglavnom se svi odrţavaju u korovskim vrstama i drugim gajenim biljkama domaćinima. Dosadašnja proučavanja pokazala su da su za stakleničku proizvodnju više vezani virusi koji se prenose mehanički ili putem zemljišta (zaraţeni biljni ostataci u zemljištu) bez vektora, dok se na otvorenom polju češće javljaju virusi koji se prenose insektima vektorima. Na biljkama rasada paprike izvori primarnih virusnih infekcija su zaraţeno seme, biljni ostaci i korovi, sa kojih viruse prenose lisne vaši, a takoĎe gust sklop biljka u lejama pogoduje širenju virusa koji se prenose dodirom (Mijatović, 2011) Jedan od najrasprostranjenijih virusa na paprici je TMV, koji se moţe odrţati u zemljištu i nekoliko godina. Širenje virusa sokom zaraţenih biljaka, odnosno mehanički, pre svega se odnosi na TMV, PMMoV i ostale Tobamovirus-e, i zbog toga mogu se često javiti u stakleničkoj proizvodnji. Za ove viruse nije ustanovljeno širenje vektorima. CMV, PVY i AMV, prenose se biljnim vašima na neperzistntan način, što znači da je njihova pojava veća u proizvodnji na otvorenom polju. Veliki broj vrsta vaši moţe da prenosi ove viruse, ali najveću aktivnost i efikasnost imaju Myzus persicae (zelena breskvina vaš) i Aphis gossypii (pamukova vaš). TMV, PMMoV i drugi Tobamovirusi i AMV prenose se semenom paprike i to u visokom procentu. Drugi izvor zaraze su zaraţene biljke i biljni ostaci u zemljištu, u kojima ovi virusi opstaju toliko dugo dok se zaraţeno biljno tkivo ne raspadne, što znači da se zaraţene biljke ovim virusima mogu javiti još i u rasadu. 12 TSWV prenosi se drugom vrstom insekata, tripsima i to na perzistentan način. Tako vektor osim za širenje ujedno sluţi i za odrţavanje virusa. Zbog pojave efikasnijeg vektora, Frankliniella occidentalis, koji je više vezan za zaštićen prostor, bez obzira što je širenje virusa insektima više vezano za otvoreno polje, virus bronzavosti paradajza ugroţava proizvodnju paprike i u zaštićenom prostoru u našoj zemlji. Ovaj virus se ne prenosi semenom paprike ili drugih biljaka domaćina (Krstić i Bulajić, 2008). 2.7. Osnovne karakteristike najznačajnjih virusa paprike Papriku u prirodnim uslovima zaraţava veliki broj virusa, ali mnogi od njih se javljaju sporadično, ne izazivajući velike gubitke u proizvodnji. Kao najzastupljeniji i ekonomski najznačajniji virusi u svetu, ali i u našoj zemlji izdvajaju se CMV, PVY, TSWV, TMV, AMV i PMMoV (Arli-Sokmen et al., 2005; Choi et al., 2005a; Ozaslan et al., 2006; Tomić i sar., 2007). 2.7.1. VIRUS MOZAIKA KRASTAVCA (Cucumber mosaic virus, CMV) Virus mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV) član je roda Cucumovirus, familije Bromoviridae (Rodríguez-Alvarado et al., 1995). CMV je opisan pre oko 90 godina, kao prouzrokovač opasnog oboljanja krastavca i dinje u SAD-u. Nakon tog perioda, CMV se proširio u mnoge delove sveta i kako u pojedinačnim tako i u mešanim infekcijama, identifikovan je kao uzročnik brojnih epidemija u različitim delovima sveta (Palukaitis et al., 1992). CMV pripada grupi opšte rasprostranjenih virusa infektivnih za papriku. Prisutan je svuda gde se gaje osetljive biljne vrste, mada je pojava oboljenja, koje ovaj virus prouzrokuje, najizraţenija u umerenom klimatskom regionu (Krstić i Vico, 2004). Oboljenje koje ovaj virus izaziva je geogrаfski široko rаsprostrаnjeno i otkriveno je u Evropi, Austrаliji, Severnoj Americi (Zitikaitė and Samuitienė, 2009). U Srbiji je CMV prvo utvrĎen 1956. godine na industrijskoj paprici u Horgošu (Šutić, 1982). Mijatović i sar. (1999) u svojim istraţivanjima navode ovaj virus kao najrasprostranjeniji, kada je bio prisutan u svim ispitivanim lokalitetima sa zarazom i do 100%. TakoĎe i novija istraţivanja pokazuju da je ovaj virus tokom 2007. godine bio 13 prevalentan u mnogim lokalitetima gajenja paprike kada se zaraza javljala i do 86% (Tomić i sar., 2007). Štetnost virusa ogleda se u smanjenom prinosu i pogoršanom kvalitetu plodova. U rano zaraţenih biljaka, gubici u prinosu su posebno izraţeni i mogu se kretati od 60% do 100% (Šutić, 1995). Virus mozaika krastavca moţe da zarazi 1287 biljnih vrsta u okviru 518 rodova i 100 familija (Edwardson and Christie, 1997). U našoj zemlji, pored zaraze paprike, prisustvo virusa dokazano je i na duvanu, paradajzu, običnoj tikvi, vrgu, dinji, lucerki, crvenoj detelini i pasulju (Šutić, 1995; Mijatović i sar., 1999; Krstić i sar., 2002; Dukić i sar. 2002b; Dukić i sar., 2004a; Petrović, 2008; Đekić, 2010; Vučurović i sar., 2010). Na donjem starijem lišću javljaju se prstenaste pege ili hrastolike nekrotične šare. Pojava prstenastih pega je česta pojava, a takoĎe i blagi do umereni mozaik. Rane infekcije značajno smanjuju veličinu, brojnost i kvalitet plodova. Plodovi su krţljavi, deformisani i sa čestom nekrozom površinskog tkiva (Krstić i Bulajić, 2007). Kod nekih osetljivih sorti često se javlja nekroza duţ stabla. Virus izaziva metličavost biljaka, odnosno formiranje većeg broja grančica sa skraćenim internodijama i zbijenim lišćem. Ukoliko su infekcije rane, metličavost zahvata cele biljke (Krstić i Vico, 2004). CMV se sastoji od tri vrste čestica identične veličine, koje nose različite RNA (RNA1, RNA2 i RNA3). Čestice su izometrijskog oblika, prečnika oko 30 nm izgraĎene od nukleinske kiseline (18%) i proteina, koji čine 82% ukupne teţine (Francki et al., 1979; Palukaitis et al., 1992). Proteinski omotač se sastoji od 180 identičnih proteinskih podjedinica, molekulske mase 24,5 kDa, a svaka proteinska podjedinica izgraĎena je od 218–220 aminokiselina (Francki et al., 1979; Palukaitis et al., 1992). Genom čine tri jednolančane infektivne genomne RNA (RNA1, RNA2 i RNA3) (Balaji et al., 2008) i dve subgenomne RNA4 i RNA4A (Palukaitis et al., 1992). RNA1 i RNA2 kodiraju 1a i 2a proteine uključene u replikaciju virusa (Nitta et al., 1988; Hayes and Buck, 1990; Palukaitis et al., 1992), a RNA2 sadrţi i region koji se prepisuje u subgenomsku RNA4A i kodira 2b protein, koji ima ulogu u širenju virusa i ispoljavanju virulentnosti (Ding et al., 1994, 1995). RNA3 kodira stvaranje 3a proteina čija je funkcija u širenju virusa u biljci zbog čega se često označava i kao transportni 14 protein („movement protein“) (Canto et al., 1997; Perry et al., 1994, 1998). RNA3 nosi i gen koji se prepisuje u subgenomsku RNA4 i kodira sintezu proteina omotača virusa (Palukaitis et al., 1992; Gallitelli, 2000) (Slika 1). Slika 1. Genomna organizacija virusa mozaika krastavca (http://viralzone.expasy.org/all_by_species/135.html) Neki sojevi CMV poseduju i RNA5, koja predstavlja mešanu populaciju nukleotida konzerviranog 3’ terminalnog regiona genomskih RNA1 i RNA2. Smatra se da RNA5 ima ulogu u replikaciji CMV. Neki sojevi virusa poseduju i satelitnu RNA (satRNA) (Blanchard et al., 1996), koja zavisi od genoma CMV u pogledu svoje replikacije i širenja. Prisustvo satRNA ima uticaja na ekspresiju simptoma, odnosno na ublaţavanje ili pojačavanje simptoma na zaraţenim biljkama (Grieco et al., 1997). Mnogobrojni domaćini, jednogodišnji i višegodišnji, zeljasti i drvenasti, gajeni i spontani, predstavljaju mnogobrojne izvore zaraza ovog virusa. U prirodi se CMV lako prenosi na neperzistentan način sa više od 80 vrsta vaši, prvenstveno sa Myzus persicae i Aphis gossypii (Palukaitis et al., 1992; Kaper and Waterworth, 1981). Efikasnost prenošenja vašima zavisi od nekoliko faktora, kao što su biotip vektora, soj virusa, uslovi spoljašnje sredine i priroda vegetacije. TakoĎe, CMV se prenosi semenom 22 vrste biljaka u različitom stepenu (Palukaitis et al., 1992). UtvrĎeno je da se prenosi semenom sledećih gajenih i korovskih biljaka: Glycine max L. Merril, Phaseolus vulgaris L., Stelaria media (L.) Vill, Vigna unguiculata (L.) Walp itd. S obzirom da se virus prenosi semenom malog broja povrtarskih biljaka, većina epidemija se javlja zbog toga što primarni virusni inokulum predstavljaju zaraţene korovske vrste (Krstić i Vico, 2004). Virus se lako prenosi sokom (mehanički) zaraţenih biljaka. Ovaj način prenošenja je naročito opasan ako su zaraţene mlade biljke u rasadu. Zbog njihovog gustog sklopa, u toku nege rasada i kasnije, prilikom presaĎivanja, zaraza se moţe 15 dodirom preneti na sve biljke. Značajno je pomenuti da se virus odrţava i prenosi zaostalim zaraţenim biljnim delovima u zemljištu. Ovaj način prenošenja je od posebne vaţnosti u proizvodnji rasada i biljaka u zaštićenom prostoru, jer se u staklenicima i plastenicima biljni ostaci sporije razlaţu nego na otvorenom polju. Veliki broj različitih sojeva virusa mozaika krastavca, njihovih grupa i podgrupa je do danas opisano (Kaper and Waterworth, 1981; Perry et al., 1993). Veliki broj sojeva virusa mozaika krastavca prijavljenih iz celog sveta svrstani su u dve podgrupe, podgrupu I i podgrupu II, na osnovu bioloških, seroloških (Wahyuni et al., 1992; Hu et al., 1995; Ilardi et al., 1995) i molekularnih osobina (Owens and Palukaitis, 1988; Owen et al., 1990; Szilassy et al., 1999; Rizos et al., 1992; Sialer et al., 1999). Filogenetskom analizom, na osnovu sekvenci gena, podgrupa I se dalje moţe podeliti podgrupe IA i IB (Palukaitis and Zaitlin, 1997; Roossinck et al., 1999; Roossinck, 2002). U podgrupu IB svrstani su Istočnoazijski izolati CMV, dok u podgrupu IA su svrstani sojevi iz celog sveta (Roossinck et al., 1999). 2.7.2. VIRUS CRTIČASTOG MOZAIKA KROMPIRA (Potato virus Y, PVY) Potato virus Y je vrsta roda Potyvirus koji zajedno sa rodovima Rymovirus, Bymovirus i Ipomovirus spadaju u familiju Potyviridae (Brunt, 1992). Ovi rodovi su prvobitno razlikovani na osnovu njihovih prenosilaca (vektora): rod Potyvirus se prenosi vašima, Rymovirus grinjama, Bymovirus gljivama sa zaraţenog korena i Ipomovirus pomoću bele leptiraste vaši. 1998. godine, dodata su još dva roda Macluravirus (Badge et al., 1997) i Tritimovirus (Salm et al., 1996; Pringle, 1999), koji se prenose vašima i grinjama. Rod Potyvirus uključuje više od 200 definitivnih ili mogućih članova, dok je fam. Potyviridae najveća familija u koju spada blizu 25% poznatih biljnih virusa. Virus crtičastog mozaika krompira prvi put je opisan 1931. godine na biljkama duvana sorte „White Burley“ (Smith, 1931, loc. cit. Todorović, 1995). U Evropi, prisutan je od sredine 1980.-tih godina i još uvek je odgovoran za velike gubitke u proizvodnji mnogih biljaka familije Solanaceae (Kogovšek et al., 2007). PVY je široko rasprostranjen u celom svetu na velikom broju familija, ali je najčešći na biljkama koje pripadaju familiji Solanaceae. Izolati PVY iz paprike su identifikovani i proučavani u 16 Turskoj (Yilmaz et al., 1983; Erkan, 1986), Španiji (Arteaga and Ortega, 1986), Francuskoj (Selassie et al., 1985), Italiji (Davino et al., 1989) i u mnogim drugim zemljama. U Srbiji, pored paprike, prisustvo PVY dokazano je i na duvanu i krompiru (Mijatović i sar., 1999; Milošević, 1989, 1992; Todorović, 1995; Bulajić i sar., 2006; Đekić, 2010). Iako se PVY navodi kao jedan od ekonomski najvaţnijih virusa paprike (Tomlison, 1987; Agrios, 1988; Kogovšek et al., 2007), ovaj virus je malo proučavan na paprici u našoj zemlji. Tokom proučavanja rasprostranjenosti virusa paprike u Srbiji, Mijatović i sar. (1999) su naveli podatak da je PVY identifikovan u 22% ispitivanih uzoraka i kao takav zauzima treće mesto po zastupljenosti posle TMV i CMV. Istraţivanja širom sveta pokazala su da je PVY ekonomski vrlo značajan virus (Tomlinson, 1987; Milne, 1988; Shukla et al., 1994). PVY spada u prvih pet virusa koji ugroţavaju proizvodnju povrća u svetu (Milne, 1988). On je jedan od ekonomski najznačajnijih virusa na paradajzu i paprici u mnogim zemljama, kako u zaštićenom prostoru tako i na otvorenom polju (Tomlinson, 1987). Nekrotični soj ovog virusa izaziva smanjenje prinosa i kvaliteta plodova kod nekih sorti paradajza (Gebre-Selassie et al., 1987; Legnani et al., 1995), a na usevima paprike se često vezuje sa teškim oboljenjima (Edwardson and Christie, 1997). TakoĎe je česta mešana infekcija ovog virusa sa TEV, PepMoV i TMV (Abdallah et al., 1991). Krug prirodnih domaćina ovog virusa je širok i obuhvata do devet familija, uključujući najznačajnije biljne vrste kao što su paprika (Capsicum spp.), krompir (Solanum tuberosum ssp. tuberosum L.), duvan (Nicotiana spp.), paradajz (Lycopersicon esculentum L.), neke ukrasne biljke (Dahlia i Petunia spp.) i mnoge korovske vrste (Datura spp., Physalis spp., Solanum dulcamara i S. nigrum) (Jeffries, 1998). Na Novom Zelandu opisane su nove vrste koje predstavljaju prirodnog domaćina PVY: Cotula australis (Sieber ex Spreng.) i Capsella bursa-pastoris L. (Fletcher, 2001). Virus crtičastog mozaika krompira pojedinih godina javlja se u znatnom procentu. Ovaj virus takoĎe izaziva različite simptome, mada su najčešći tipični mozaik i formiranje uskih tamnozelenih površina oko nerava. Manje virulentni sojevi prouzrokuju hlorozu nerava i blagi mozaik, a virulentni sojevi ovog virusa izazivaju nekrozu vršnih delova paprike, sušenje i opadanje lišća. Biljke su slabo razvijene i 17 formiraju deformisane plodove sa nekrotičnim pegama. Rane infekcije imaju za posledicu zakrţljale biljke, slabo formiranje plodova, koji zbog lošeg izgleda nemaju trţišnu vrednost (Edwardson and Christie, 1997; Krstić i Bulajić, 2008). Čestice PVY su izduţene, filamentozne, veličine 730 x 11 nm izgraĎene od nukleinske kiseline (5,4–6,4% ukupne teţine) i proteina, koji čine 93,6–94,6% ukupne teţine. Genom PVY, kao i kod ostalih članova Potyvirus roda, čini jednolančana infektivna ribonukleinska kiselina ((+)ssRNA), molekulske mase 3,1 x 10 6 Da (De Bokx and Huttinga, 1981; Büchen–Osmond, 2006). Slika 2. Genomna organizacija virusa crtičastog mozaika krompira (http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/50.html) Jednolančana infektivna RNA je duţine 9741-9795 Kb, sa 3 poly (A) repom (region sastavljen od više adenina) i kratkim virusno-kodiranim proteinom (VPg) povezanim sa genomom („viral protein genome–linked“) (Glasa and Candresse, 2005). Genom sadrţi jedan jednostavni okvir čitanja (ORF-Open Reading Frame) koji se translacijom prevodi u jedan veliki poliprotein, a on se post-translaciono virus kodiranim proteazama razlaţe na više manjih funkcionalnih proteina. Ulogu proteaza imaju P1, HC–pro i NIa proteini. U graĎi virusnih čestica učestvuju CP protein i VPg protein. CP protein gradi kapsid, dok je VPg protein kovalentno vezan za 5’ kraj nukleinske kiseline. Ostali proteini, P3, Cl, NIa-pro, NIb i RdRp su nestrukturni, javljaju se u zaraţenim biljnim ćelijama i imaju ulogu u replikaciji virusa, širenju virusa u biljci i prenošenju virusa vašima (Robaglia et al., 1989; Shukla et al., 1994) (Slika 2). Lisne vaši su najznačajniji vektori virusa i uglavnom su odgovorne za širenje PVY u prirodi. Harrington and Gibson (1989) su identifikovali 26 vrsta vaši familije Aphididae koje predstavljaju vektore PVY. M. persicae je najefikasniji vektor ovog virusa (Katis and Gibson, 1985; Woodford, 1992). Njoj je za usvajanje virusa 18 potrebno veoma kratko vreme od 2-3 minuta ishrane na oboleloj biljci, a svoju infektivnost zadrţavaju do 4 časa. Pored ove vaši, kao vektori virusa javljaju se i Aphis fabae, Macrosiphum euphorbiae, Myzus certus, Phorodon humuli, Rhopalosiphum insertum i druge (Büchen-Osmond, 2006). Razlog epidemijskog širenja ovog virusa u našoj zemlji je to što se prenosi velikim brojem lisnih vaši (Milošević, 1992). Zaraţen korov ili kulturno bilje, npr. paradajz ili duvan u blizini paprike mogu da sluţe kao izvor primarne infekcije. Od korava koji su značajni kao izvor inokuluma ovog virusa su: Solanum nigrum i ostale Solanum spp., Portulaca oleracea i Physalis spp. (Luis- Arteaga and Ponz, 2003). Virus se ne prenosi semenom paprike (Mijatović i sar., 2007). Na osnovu lokalnih i sistemičnih simptoma na različitim sortama krompira, duvana i biljci Physalis floridana, izolati PVY su podeljeni na tri soja: PVY O (obični soj), PVY N (nekrotični soj) i PVYC (crtičasti soj). Simptomi sistemične zaraze koje izaziva obični soj su u vidu blagog mozaika, naboranosti i kovrdţavosti lišća na krompiru, hlorotičnog šarenila na duvanu, a na Physalis floridana izaziva sistemičnu nekrozu. Ovaj soj je široko rasprostranjen širom sveta. Nekrotični soj prouzrokuje veoma blago hlorotično šarenilo kod većine sorti krompira, sistemičnu nekrozu nerava duvana i hlorotično šarenilo na Physalis floridana. Zаbeleţen u Juţnoj Americi, Evropi, Africi, Aziji (Weidemаnn, 1988) i Novom Zelаndu (Fletcher, 1989). Crtičasti soj na nekim sortama krompira izaziva hipersenzibilnu reakciju, dok na drugim prouzrokuje sistemični mozaik. Simptomi na duvanu i vrsti Physalis floridana slični su simptomima koje izaziva obični soj. PVYC soj je poznаt u Evropi, Severnoj Americi, Indiji, Juţnoj Africi, Austrаliji, Novom Zelаndu i Ekvаdoru (Elis et al., 1997). Velika varijabilnost PVY često je uslovljena genetskom rekombinacijom (Revers et al., 1996). Tako je i za PVY ustanovljeno postojanje većeg broja rekombinantnih sojeva: PVYNTN koji je identifikovаn u većini zemаljа širom svetа gde se gaji krompir: SAD (McDonаlds and Sing, 1996; Croslin et аl., 2002; Nie and Sing, 2003), Jаpаn (Ohshimа et al., 2000), i Peru (Sаlаzаr et al., 2000); PVYZ (Jones, 1990), kao i PVYN W koji je postao dominantan u Poljskoj (Chrzanowska, 1991), а otkriven je u nekoliko drugih zemаljа, uključujući Frаncusku, Špаniju (Blаnko-Urgoiti et аl., 1998; Kerlаn et аl., 1999), Nemаčku i Rusiji (Chrzanowska, 1991; Glais et al., 2005). PVYN:O zаbeleţen je u Kаnаdi (Mаnitobа) i SAD (Minesotа, Montаnа, Severnа Dаkotа) (Sing et al., 2003). 19 Prema Gebré Sélassié et al. (1985) izolati virusa PVY sa paprike svrstani su u tri patotipa PVY-0, PVY-1 i PVY-1-2, u zavisnosti od mogućnosti da prevaziĎu gene otpornosti (pvy1, pvy2) prisutne u nekoliko sorti paprike. Prema Choi et al. (2005b) u okviru ova tri patotipa izolati se dalje grupišu na obične i nekrotične, u zavisnosti da li prouzrokuju simptome u vidu promene boje duţ nerava lista ili simptome u vidu nekroze lista. 2.7.3. VIRUS BRONZAVOSTI PARADAJZA (Tomato spotted wilt virus, TSWV) Virus bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus, TSWV) tipičan je predstavnik roda Tospovirus, familije Bunyaviridae (Francki et al., 1991), i jedan je od najrasprostranjenijih i najznačajnijih biljnih virusa (Goldbach and Peters, 1994). Ovaj virus je 50-tih godina prošlog veka bio jedini član „Tomato spotted wilt“ grupe (Matthews, 1979). MeĎutim, danas se zna da ovom rodu pripada veći broj značajnih fitopatogenih virusa, i ti virusi u većini slučajeva imaju izrazito širok krug domaćina i njihovi vektori su tripsi. Tospovirus rod obuhvata 19 različitih vrsta, osam potpuno definisanih, usaglašenih i prihvaćenih od strane ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses) dok se preostali virusi, za sada, označavaju kao privremeni i verovatni pripadnici ovog roda (Fauquet et al., 2005). TSWV se nalazi na EPPO A2 listi (OEPP/EPPO, 2008), a u Srbiji na listi IA deo II ( Štetni organizmi za koje je poznato da su prisutni na ograničenom području Republike Srbije i čije je unošenje i širenje u Republiku Srbiju zabranjeno ) („Sluţbeni glasnik RS“ br. 7/2010). Virus bronzavosti paradajza je virus za koji se smatra da je najrasprostranjeniji i da ima najširi krug domaćina meĎu svim biljnim virusima. TSWV je prvi put detektovan na paradajzu u Australiji 1915. godine (Brittlebank, 1919), od tada se virus proširio u mnoge delove sveta. Nakon II Svetskog rata potvrĎeno je prisustvo TSWV u Zapadnoj Evropi, SAD, Istočnoj Evropi, Juţnoj Americi i Juţnoj Africi, dok se 1950. godine, virus proširio u sve zemlje Juţne Evrope u kojima se proizvodi duvan i pri tom je u pojedinim godinama nanosio značajne ekonomske štete. Virus bronzavosti paradajza je široko rasprostranjen i javlja se u umerenim, suptropskim i tropskim regionima sveta. Prisutan je u svim zemljama EPPO regiona, Aziji, Africi, Severnoj, Centralnoj i Juţnoj Americi, Karibima, kao i zemljama Okeanije 20 (OEPP/EPPO, 2004). U našem okruţenju 1972. godine ovo oboljenje je naĎeno u Grčkoj i jugoistočnom delu Makedonije na usevima duvana (Chatzivassiliou et al., 2000; Tsakiridis and Ivancheva-Gabrovska, 1980), dok je u Sloveniji TSWV konstatovan 2000. godine na duvanu, paprici i paradajzu (Mavrič and Ravnikar, 2001). Prvi podaci o prisustvu ovog virusa na paprici u Srbiji potiču iz 1998. godine (Mijatović i sar., 1999), od tada je praćenjem simptoma, primećena sve učestalija pojava ovog virusa, što govori o njegovom progresivnom širenju. Juna 2002. godine u plastenicima u okolini Beograda, zabeleţeni su na lišću paprike simptomi hlorotičnih i nekrotičnih šara, bez deformacije liski. Iz plodova sa ovakvim simptomima molekularno je identifikovan TSWV (Dukić i sar., 2002a). U većem broju lokaliteta u Srbiji prisustvo virusa je dokazano 2005. i 2006. godine na paradajzu, paprici, luku, duvanu i mnogobrojnim vrstama ukrasnih biljaka (Krstić i sar., 2005; Krstić i Bulajić, 2007; Stanković i sar., 2011a; Zindović i sar., 2011; Stanković i sar., 2012; Stanković i sar., 2013). Kako se poslednjih godina oboljenje koje ovaj virus izaziva javljalo u sve većim razmerama, Dukić i sar. (2002a) su pristupili molekularnoj karkterizaciji TSWV izolata paprike iz naše zemlje. TSWV izaziva gubitke u proizvodnji raznih useva širom sveta. Virus je odgovoran za brojne epidemije na različitim usevima i različitim delovima sveta, a najčešće na povrću, duvanu i ukrasnim biljkama (Krstić i Bulajić, 2007). U Francuskoj i Španiji su zabeleţene epidemije na paradajzu, paprici i Anemone vrstama, kako na biljkama gajenim u zaštićenom prostoru tako i na biljkama u polju (OEPP/EPPO, 1999). Potpun izostanak prinosa konstatovan je u proizvodnji paprike i paradajza u zaštićenom prostoru (Fineti Sialer et al., 2000) i na otvorenom polju (Gitatis et. al., 1998), a takoĎe da gubici u proizvodnji mogu biti i do 100% navodi i Berling et al. (1990). TSWV je poznat po tome što pored paprike napada veliki broj drugih, kako gajenih tako i korovskih biljaka. Kao prirodni domaćini ovog virusa navodi se veliki broj vrsta, oko 1090 biljnih vrsta iz 15 familija monokotiledonih, 69 familija dikotiledonih biljaka i jedne familije razdela Pteridiophyta, fam. Pteridaceae (Parrella et al., 2003). Parazitira kako dikotiledone tako i monokotiledone biljke, a najbrojniji prirodni domaćini virusa su u okviru familija Asteraceae (247 vrsta), Solanaceae (172 21 vrste) i Fabaceae (60 vrsta) (Krstić i Bulajić, 2007). MeĎu povrtarskim biljkama glavni domaćini virusa su paradajz, paprika i plavi patlidţan. U druge osetljive povrtarske biljke spadaju Lactuca sativa L., Phaseolus vulgaris, Pisum sativum L., Vicia faba L. i Vigna sinensis L. (Kucharek et al., 2000; Rusevski, 2001). TSWV je u periodu od 2002. do 2008. godine u našoj zemlji detektovan osim na paprici, duvanu i paradajzu, i na soji, salati, mrkvi, i ukrasnim biljakama iz 21 roda, a pre svega na: Impatiens, Petunia, Sinningia, Pelargonium, Lysimachia, Chrysanthemum, Begonia, Tagetes, Cyclamen, Gerbera, Salvia i Gazania (Krstić i Bulajić, 2007; Petković i sar., 2007; Simić i sar., 2007; Đekić, 2010). Posebno mesto pripada brojnim korovskim biljkama koji su stalni pripodni domaćini virusa bronzavosti paradajza. Virus je, takoĎe infektivan i za: tatulu (Datura stramonium L.), pomoćnicu (Solanum nigrum L.), mišjakinju (Stelaria media), bokvicu (Plantago major L.) i dr. (Šutić, 1995; Brunt et al., 1997). Virus bronzavosti paradajza prouzrokuje različite simptome na različitim biljkama domaćinima. Varijabilnost u pogledu ispoljavanja simptoma moţe biti uslovljena vremenom infekcije, starošću biljke i različitim faktorima spoljne sredine (temperatura, svetlost i dr.). TakoĎe, raznolikost u pogledu ispoljavanja simptoma moţe biti posledica prisustva različitih sojeva virusa. TSWV na paprici izaziva uglavnom ţutilo lišća i cele biljke, kao i krţljavost, a čest je i mozaik sa izraţenim koncentričnim prstenastim pegama ili hlorotični linijski mozaik na starijem lišću. Zaraţeno lišće moţe da ima bronzastu boju. Mlado lišće je deformisano, sitno, naborano, sa zadebljalim nervima. Dugačke nekrotične pruge na stablu proširuju se sve do vršnog meristema. Infekcija ovim virusom ometa zametanje plodova. Na zrelim plodovima uočavaju se mozaične i hlorotične i nekrotične prstenaste pege. Plodovi formirani nakon infekcije su najčešće deformisani i zakrţljali. MlaĎi plodovi najčešće u potpunosti podleţu nekrozi. TSWV moţe da izazove izumiranje grančica, skraćivanje internodija stabla, tako da biljke imaju ţbunast izgled ili propadaju (Goldberg, 2000; Krstić i sar., 2008; Cho et al., 2009; Zindović, 2010). Virioni TSWV su kvazisferičnog oblika (po nekim istraţivačima izometrijskog) i prečnika oko 80 do 120 nm (Sivparsad and Gibba, 2008). Genom čine tri linearne (–) ssRNA neinfektivne, ili (+/–) ssRNA „ambisense” (ambiinformaciona), označene kao S 22 (short), M (middle) i L (large) smeštene unutar dvostruke lipoproteinske membrane (Brunt et al., 1996; Sivparsad and Gubba, 2008; Silva et al., 2001). Slika 3. Genomna organizacija virusa bronzavosti paradajza (http://viralzone.expasy.org/all_by_species/82.html) Najveća RNA (L-RNA) je negativne polarnosti (-) i monocistronska. L-RNA kodira L protein koji predstavlja virusnu RNA-zavisnu RNA polimerazu i uključen je u transkripciju i replikaciju (Pappu et al., 2000; Silva, 2001). M-RNA fragment ima „ambisense“ (+/-) polarnost. Na 5’ kraju kodira nestrukturni protein (NSm-„non-structural protein“) dok na 3’ kraju kodira prekursore glikoproteina G1 i G2. Glikoproteini imaju značajnu ulogu u meĎusobnoj interakciji virus-vektor (Fauquet et al., 2005), dok NSm protein učestvuje u kretanju virusa iz ćelije u ćeliju („movement“, transportni protein), ekspresiji simptoma i stimuliše stvaranje cevastih (tubularnih) struktura u protoplastu biljnih ćelija i ćelijama tripsa. Najkraći S-RNA frgment ima „ambisense“ (+/-) polarnost. Na 5’ kraju S-RNA kodira nestrukturni protein (NSs-„ non-structural protein“), dok na 3’ kraju kodira nukleokapsid (NC-„nucleocapsid“). Nukleokapsid (NC) ima ulogu u formiranju proteinskog omotača oko virusne RNA i kontroliše promenu procesa transkripcije u proces translacije, dok NSs protein ima ulogu u ekspresiji simptoma i ispoljavanju supresorske aktivnosti u procesu „utišavanja gena“ („gen silencing“) od strane biljke domaćina (Mumford et al., 1996; Pappu et al., 1998; Silva et al., 2001) (Slika 3). Virus se odrţava u mnogobrojnim prirodnim domaćinima koji sluţe i kao izvori zaraze. Korovi imaju značajnu ulogu u odrţavanju i širenju TSWV. Kao široko rasprostranjeni korovi, a u isto vreme domaćini TSWV ističu se: gorčika (Sonchus sp.), ljutić (Ranunculus arvensis (L.), maslačak (Taraxacum officinale L.), mišjakinja (Stellaria media), čičak (Arctium lappa L.), piskavica (Solanum dulcamara L.), 23 pepeljuga (Chenopodium album L.), štavelj (Rumex crispus L.), tatula (Datura stramonium), bokvica (Plantago major L.), poponac (Polygonum convolvulus L.), štir (Amaranthus albus L.), lisac (Polygonum lapathifolium L.), tušt (Portulaca oleracea L.), ţutenica (Senecio vulgaris L.), pomoćnica (Solanum nigrum) i drugi (Jorda et al., 1995; OEPP/EPPO, 1999; Parrella et al., 2003; Love, 2005). Osnovni načini širenja TSWV u prirodi su prenošenje vektorima, mehanički i prenošenje zaraţenim propagativnim biljnim materijalom: I. Širenje putem vektora. Vrste tripsa koji su poznati kao prenosioci Tospovirus-a, pripadaju rodovima Frankliniella i Thrips. U literaturi kao najznačajnije vrste TSWV vektora se navode: Frankliniella occidentalis (zapadni cvetni trips), F. schultzei (pamukov trips), F. fusca (duvanov trips), F. intonsa (cvetni trips) i Thrips palmi, Thrips tabaci (lukov trips) (Maris et al., 2003; Fauquet et al., 2005). Vrste roda Tospovirus prenose larve drugog stupnja (L2) i imago, ako su se larve u prvom stupnju (L1) (0-2 dana starosti) ishranjivale na zaraţenoj biljci. Ukoliko se larva u prvom stupnju nije ishranjivala na zaraţenoj biljci, virus ne prenosi L2 larva i imago. Prilikom ishrane na zaraţenim biljkama, larve usvajaju virus iz citoplazme biljne ćelije. Virus se transportuje do srednjeg creva larve, a zatim i do pljuvačne ţlezde. Lučenjem pljuvačke prilikom ishrane, trips prenosi virus na zdravu biljku (Nagata et al., 1999; Rusevski, 2001). Za unošenje virusa u organizam larve T. tabaci potrebna je ishrana larve na zaraţenoj biljci najmanje 10 minuta. Inkubacioni period u insektu iznosi do 10 dana, a njegova najveća infektivnost traje 23 dana posle unošenja virusa u telo vektora, a ponekad se infektivnost proteţe i na ceo ţivot insekta. Ne prenosi se na potomstvo insekta. Virus se odrţava i u prezimelim zaraţenim tripsima. Posle aktiviranja s proleća oni postaju sposobni za prenošenje virusa. Tripsi se prenamnoţavaju u godinama sa toplim i suvim vremenom, pa se tada i bronzavost paradajza javlja u štetnim razmerama. II. Mehaničko prenošenje. Mehaničko prenošenje TSWV u prirodi malo je verovatno iz razloga što virus ima veoma nestabilnu prirodu (Best, 1968). Drugi autori smatraju da sok zaraţenih biljaka moţe da bude izvor TSWV i da svako mehaničko oštećenje zaraţenih biljaka omogućava prenošenje infektivnog soka na zdrave biljke (Kucharek et al., 2000). MeĎutim, mehaničko prenošenje, iako je moguće, nema značaja u odnosu na efikasno širenje vektorima (Krstić i Bulajić, 2007). 24 III. Širenje putem meĎunarodne trgovine. TSWV se intenzivno širi putem meĎunarodne trgovine biljaka i biljnih delova. Širenje TSWV reznicama, rasadom, krtolama, lukovicama itd. su od posebnog zanačaja. Veliki značaj u prenošenju virusa imaju krtole krompira pa samim tim krompir sapada i u domaćina ovog virusa (Rodoni and Henderson, 2004). MeĎutim, najznačajnije je širenje zaraţenim biljkama ili biljnim delovima ukrasnih biljaka (Krstić i Bulajić, 2008). Izolati virusa koji pripadaju Tospovirus rodu prvo su identifikovani na osnovu antigenih osobina i uspostavljena je klasifikacija na VI serogrupa (Kormelink et al., 1998) u kojoj je TSWV bio jedini predstavnik serogrupe I. Današnjom klasifikacijom, na osnovu geografske rasprostranjenosti i filogenetske analize, svi Tospovirus–i podeljeni su u američku i evroazijsku grupu, pri čemu TSWV pripada američkoj grupi. TSWV ispoljava izuzetnu varijabilnost i u prirodi postoji kao kompleks sojeva (Chatzivassiliou et al., 2000; Mandal et al., 2006). Filogenetske analize na osnovu kodirajućih (NC, NSm i NSs) i nekodirajućih (IGR na S i M RNA) sekvenci, otkrivaju sličnosti i razlike na molekularnom nivou izmeĎu različitih izolata TSWV, koje su u korelaciji sa geografskim poreklom virusa (Pappu et al., 1998; Bhat et al., 1999; Heinze et al., 2003; Tsompana et al., 2005). 2.7.4. VIRUS MOZAIKA DUVANA (Tobacco mosaic virus, TMV) Virus mozaika duvana (Tobacco mosaic virus, TMV) tipičan je predstavnik roda Tobamovirus i familije Virgaviridae (Silva et al., 2008). Virus mozaika duvana jedan je od najbolje proučenih virusa. Prva istraţivanja o ovom virusu dao je Adolf Mayer 1886. godine. Kasnije, proučavan je od strane mnogih autora u svetu (Dawson, 1999; Stoimenova and Yordanova, 2005; Silva et al., 2008) i kod nas. MeĎu prvo opisanim virusima na paprici u Jugoslaviji je virus mozaika duvana (Panjan i Prpić, 1955). Dalja istraţivanja ovog virusa vršili su Jasnić (1978), Šutić i sar. (1978), Tošić i sar. (1979) i Mijatović (1986, 1995). Istraţivanja u proteklih nekoliko godina pokazuju tendenciju smanjenja zaraze paprike ovim virusom, tako je 1999. godine bio prisutan sa 26% (Mijatović i sar., 1999), dok 2007. godine sa 17% (Tomić i sar., 2007). 25 TMV moţe da inficira 199 biljnih vrsta iz 30 familija (Shew and Lucas, 1991). U najznačajnije prirodne domaćine ovog virusa ubrajaju se biljke familije Solanaceae: duvan, paprika, paradajz i krompir (Himmel, 2003; Đekić, 2010). Na starijem lišću zaraţenom ovim virusom javlja se ţutilo, dok je na mlaĎem izraţen mozaik. Najkarakterističniji simptom koji ovaj virus izaziva je ţuto zeleno šarenilo lišća. Listovi mogu da budu uvijeni, deformisani i sitniji. Na cvetovima javljaju se nekrotične crtice. Biljke zaostaju u porastu, smanjen je broj formiranih plodova koji su deformisani i ponekad sa pojavom nekrotičnih pega. Duţ stabla takoĎe se mogu javiti nekroze (Krstić i Bulajić, 2008). Čestice virusa su štapićaste, veličine 300 x 18 nm sa centralnom šupljinom prečnika 4 nm, izgraĎene od nukleinske kiseline (5% ukupne teţine) i proteina koji čine 95% ukupne teţine čestice. Proteinski omotač se sastoji od 2130 identičnih proteinskih podjedinica, rasporeĎenih u vidu heliksa oko centralne šupljine (Stryer and Lubert, 1988). Genom TMV čini jednolančana infektivna ribonukleinska kiselina ((+)ssRNA), molekulske mase 2 x 10 6 Da (Silva et al., 2008; Gibbs, 1977). Za 5’ kraj nukleinske kiseline vezan je 7–metilguanozin, dok je 3’ kraj aminoacetiliran sa histidinom i gradi strukturu sličnu transportnoj RNA (Knapp and Lewandowski, 2001). Genom virusa kodira sintezu četiri proteina: CP protein (protein omotača virusa) - molekulske mase 17,5 kDa; MP protein („movement protein“) - molekulske mase 30 kDa koji omogućava širenje virusa u biljci i dva nestrukturna proteina - molekulske mase 126 i 183 kDa koji se javljaju u zaraţenim biljnim ćelijama i imaju ulogu u replikaciji virusa (proteini virusne polimeraze) (Zaitlin, 1999; Knapp and Lewandowski, 2001) (Slika 4). Slika 4. Genomna organizacija virusa mozaika duvana (http://viralzone.expasy.org/all_by_species/51.html) Virus se veoma lako prenosi mehaničkim putem. Ne prenosi se putem vektora, iako postoje navodi o tome, meĎutim, to je najverovatnije bila posledica mehaničkog 26 dodira insekata sa biljkom (Lojek and Orlob, 1969; Harris and Bradley, 1973). Virusne čestice i zaraţeni biljni ostaci ovim virusom mogu vrlo lako predstavljati izvor zaraze. TakoĎe, jedan od osnovnih načina prenošenja virusa mozaika duvana u stakleničkoj proizvodnji je prenošenje kontaminiranom odećom, alatom i mašinama (Broadbent and Fletcher, 1963). Na paprici virus mozaika duvana odnosno njegovi sojevi prouzrokuju različite simptome oboljenja. Sa paprike je izolovano nekoliko sojeva ovog virusa koji se meĎusobno razlikuju kako po simptomima koje prouzrokuju na paprici i test biljkama tako i serološki (Holmes, 1934; Mc Kinney, 1952; Greenleaf et al., 1964). Na osnovu simptoma koje prouzrokuju na paprici, reakciji test biljaka, biofizičkih konstanti i seroloških reakcija moţemo konstatovati da su u našoj zemlji uglavnom rasprostranjena dva soja ovog virusa. Soj koji prouzrokuje nekrotične simptome na paprici i slab mozaik, i soj koji izaziva simptome mozaika bez nekroze (Mijatović, 1995). 2.7.5. VIRUS MOZAIKA LUCERKE (Alfalfa mosaic virus, AMV) Virus mozaika lucerke (Alfalfa mosaic virus, AMV) predstavnik je roda Alfamovirus, familije Bromoviridae (Zitikaitè and Samuitienè, 2008). Prvi put je otkriven 1931. godine u Americi, kao prouzrokovač oboljenja lucerke (Bos and Jaspars, 1971). U zemljama Istočne Evrope, kao što su Bugarska, MaĎarska i Srbija moţe da dovede do značajnih gubitaka u proizvodnji paprike. TakoĎe, svake godine se javlja i u usevima paprike u zemljama Severne Amerike, ali gubici nisu od ekonomskog značaja (Creamer, 2003). Virus mozaika lucerke ubraja se u grupu opšte rasprostranjenih virusa i smatra se da je prisutan u svim područjima gajenja paprike (Arli-Sokmen et al., 2005). Virus mozaika lucerke u Srbiji je prvo utvrĎen u rejonu Horgoša 1956. godine (Šutić, 1959), a prema podacima Delevića (1963) ovaj virus prouzrokuje značajne štete. Istraţivanja sprovedena 1999. godine pokazala su da je AMV bio prisutan u usevu paprike, ali ne u značajnoj meri (Mijatović i sar., 1999). Noviji podaci o AMV u našoj zemlji, pre svega o prisustvu i rasprostranjenosti, ali i prvi podaci o molekularno identifikovanim i okarakterisanim izolatima, potiču iz proučavanja ovog virusa na paradajzu (Krstić i 27 sar., 2007a), paprici (Tomić i sar., 2007; Krstić i Bulajić, 2008) i lucerki (Bulajić i sar., 2010). AMV ima širok krug domaćina i ustanovljeno je da se javlja kod velikog broja zeljastih i drvenastih biljaka (150 biljnih vrsta) iz 22 familija (Schmelzer et al., 1973). Ovaj virus moţe da se prenese na oko 430 biljnih vrsta iz 51 familija (Hull, 1969; Crill et. al., 1970; Schmelzer et al., 1973; Jaspars and Bos, 1980). Većina biljaka domaćina pripada familijama Fabaceae, Solanaceae i Asteraceae (Jaspars and Bos, 1980). Od povrtarskih biljaka najznačajniji domaćini su paprika, luk, pasulj, grašak, salata, paradajz i plavi patlidţan (Zitikaitè and Samuitienè, 2008). U Srbiji, pored paprike, prisustvo AMV dokazano je i na lucerki, duvanu (Šutić, 1995; Đekić, 2010) detelini, grašku (Šutić, 1995) i pasulju (Petrović, 2008). Kako se virus prenosi semenom paprike, simptomi se mogu uočiti još na kotiledonim listićima. Najčešći simptom na paprici zaraţenoj ovim virusom su ţućkastobeličaste pege različitog oblika i veličine. Biljke zaostaju u porastu i što su infekcije ranije, deformacije su izraţenije. Na plodovima koji su krţljavi, deformisani, mogu se javiti linearne trake beličaste ili ţućkaste boje (Krstić i Bulajić, 2007). Virus mozaika lucerke sastoji se od četiri vrste čestica: B (bottom), M (middle), Tb (top b) i Ta (top a) koje nose različite RNA (RNA1, RNA2, RNA3 i RNA4). Čestice su izgraĎene od nukleinskih kiselina (16%) i proteina koji čine 84% ukupne teţine (Jaspars and Bos, 1980; Büchen–Osmond, 2006). Genom čine tri jednolančane infektivne genomne RNA (RNA1, RNA2 i RNA3) i subgenomska RNA4 (Bol, 1999). RNA1 i RNA2 kodiraju P1 i P2 proteine uključene u replikaciju virusa (Bol, 1999), dok je RNA3 bicistronska i kodira stvaranje MP proteina („movement protein“) koji je odgovoran za širenje virusa u biljci (Erny et al., 1992). RNA3 nosi i gen koji se prepisuje u subgenomsku RNA4 i kodira sintezu proteina omotača virusa (CP proteina) (Tenllado and Bol, 2000). Za 5’ kraj nukleinskih kiselina vezan je 7–metilguanozin, a na 3’ kraju se nalazi struktura slična transportnoj RNA (Bol et al., 1971) (Slika 5). 28 Slika 5. Genomna organizacija virusa mozaika lucerke (http://viralzone.expasy.org/all_by_species/133.html) Vektori virusa u prirodi su mnogobrojne vrste vaši koje ga prenose na neperzistentan način. Smatra se da najmanje 14 vrsta vaši mogu da prenesu ovaj virus, a kao najčešći vektor navodi se vrsta Myzus persicae (Crill et al., 1970). TakoĎe, značajni vektori ovog virusa su i vrste Aphis fabae, Aphis medicaginis, Acyrthosiphon pisum, Myzus certus, Macrosiphum euphorbiae i druge (Garran and Gibbs, 1982). Virus mozaika lucerke lako se prenosi i sokom zaraţenih biljaka paprike. Ovaj način prenošenja je naročito značajan u rasadu, gde se biljke dodiruju u gustom sklopu. Prenošenje sokom doprinosi većem širenju virusa u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru, što se ostvaruje dodirom biljaka u toku nege i gajenja. Značajno širenje virusa mozaika lucerke postiţe se i semenom lucerke, paprike i semenom nekih korova (Datura stramonium, Solanum nigrum, Chenopodium quinoa i Melilotus sp.) (Zitikaitè and Samuitienè, 2008). Do danas je opisan veliki broj sojeva koji se meĎusobno razlikuju po krugu domaćina i simptomima koje izazivaju na biljkama domaćinima. Prve klasifikacije bile su na osnovu simptoma koje prouzrokuju na biljkama Phaseolus vulgaris i Vigna unguiculata, kasnije su izolati AMV grupisani u sojeve na osnovu agregacije čestica u citoplazmi zaraţenih ćelija duvana, mogućnosti prenošenja polenom i semenom i na osnovu fizičko–hemijskih osobina (Jaspars and Bos, 1980). MeĎutim, Kraal (1975) je predloţio grupisanje sojeva na osnovu hemijskih osobina proteinskog omotača. 2.7.6. VIRUS BLAGOG ŠARENILA PAPRIKE (Pepper mild mottle virus, PMMoV) Virus blagog šarenila paprike (Pepper mild mottle virus, PMMoV) tipičan je predstavnik roda Tobamovirus (Martinez-Ochoa et al., 2003). 29 PMMoV je jedan od glavnih virusa koji se javlja na paprici (Genda et al., 2005; Oka et al., 2008). Virus je prisutan u Severnoj Americi (Adkins et al., 2001; Beczner et al., 1997), Australiji (Pares, 1985), Japanu (Honda and Kameya-lwaki, 1991; Ikegashira et al., 2004), Kini (Xiang et al., 1994; Wang et al. 2006), Tajvanu (Green and Wu, 1991), Evropi (Alonso et al., 1989; Marte and Wetter, 1986) i Severnoj Africi (Mnari-Hattab et al., 2006). PMMoV je prvi put identifikovan na paprici u Americi (McKinney, 1952). Od tada veliki broj istraţivača je proučavao ovaj virus (Svoboda et al., 2006; Jarret et al., 2008; Sidaros et al., 2009). Novija istraţivanja pokazuju da ovaj virus moţe biti prisutan i u stolici čoveka praćen specifičnim simptomima (Colson et al., 2010). U Srbiji je prvi put utvrĎeno njegovo prisustvo 1996. godine kada su Krstić i sar. (1996) izolovali ovaj virus iz biljaka paprike sorte Duga bela. Virus je ekonomski značajan za papriku koja se gaji u plastenicima i tunelima i često dovodi do značajnog smanjenja prinosa (Wetter and Conti, 1988). U proizvodnji paprike, infekcije mogu biti i do 100%, što drastično smanjuje prinos plodova paprike (Wetter and Conti, 1988; Green, 2003). Simptomi na lišću ispoljavaju se u vidu blagog šarenila, deformacija listova i nekrotičnih pega (Mijatović i sar., 2007). Plodovi su sitni, deformisani sa karakterističnim nekrozama što dovodi do redukovanja prinosa, a što utiče na ekonomsku produktivnost paprike u svetu (Nagai, 1981; Alonso et al., 1989). Čestice virusa su štapićaste, veličine 300 x 18 nm sa centralnom šupljinom prečnika 4 nm, izgraĎene od nukleinske kiseline (5% ukupne teţine) i proteina koji čine 95% ukupne teţine čestice. Proteinski omotač se sastoji od 2130 identičnih proteinskih podjedinica, rasporeĎenih u vidu heliksa oko centralne šupljine (Stryer and Lubert, 1988). Genom PMMoV čini jednolančana infektivna ribonukleinska kiselina ((+)ssRNA). Virusni genom kodira sintezu ukupno četiri proteina: (i) CP protein (protein omotača virusa), molekulske mase 17,5 kDa; (ii) MP protein („movement protein“) molekulske mase 30 kDa koji omogućava širenje virusa u biljci i (iii) dva nestrukturna proteina molekulske mase 126 i 183 kDa koji se javljaju u zaraţenim biljnim ćelijama i imaju ulogu u replikacji virusa–proteini virusne polimeraze (Wang et al., 2006). 30 Smatra se da postoje četiri soja PMMoV, P0, P1, P1,2 i P1,2,3 koji se razlikuju prema hipersenzitivnoj reakciji koju izazivaju na paprici koje su nosioci L 1 , L 2 , L 3 i L 4 rezistentnih gena. Ovi sojevi se meĎu sobom ne razlikuju serološki (Green, 2003; Takeuchi et al., 2005). Virus se lako prenosi mehaničkim putem, kontaminiranim rukama radnika prilikom obavljanja različitih agrotehničkih mera, kao i zaraţenim semenom paprike (Lewandowski, 1999; Svoboda et al., 2006). 2.8. Kontrola virusnih oboljenja paprike Izraţena zaraza paprike brojnim virusima sa različitom epidemiologijom i često velike štete u našoj zemlji, ukazuju da kontroli viroza paprike treba posvetiti posebnu paţnju. Neophodno je rigorozno kontrolisati zarazu semena (na prisustvo TMV i AMV), poboljšati fitosanitarnu ispravnost proizvodnje (TMV i CMV), kao i stalno kontrolisati populaciju vektora (TSWV, CMV i AMV) (Krstić i Bulajić, 2007). Kod većine virusnih zaraza, osnovu kontrole oboljenja koje izazivaju čine preventivne mere (Šutić, 1995; Krstić i Vico, 2004; Krstić i Bulajić, 2007): Rasad paprike treba proizvoditi odvojeno od rasada drugih osetljivih povrtarskih biljaka, kao i od rasada duvana; Izbegavanje ranih infekcija (izolovanje proizvodnje rasada, zaštitni pojasevi oko useva ili primena mineralnih ulja koja bi omela prenošenje virusa vašima); Papriku treba prostorno odvajati od biljaka koje mogu biti izvor zaraze virusima (lucerka i crvena detelina); Pre početka proizvodnje, kao i u toku proizvodnje, korov oko useva treba tretirati insekticidima, jer se kolonije vaši prvo formiraju i razvijaju na njima odakle prelaze na biljke paprike; S obzirom da se virusi koji se prenose vašima, prenose na neperzistentan način, insekticidi ne mogu da spreče širenje virusa u usevu i sa useva na usev u toku vegetacije. Primena insekticida u toku vegetacije nije efikasna, ali tretiranja u toku proizvodnje rasada i neposredno pred rasaĎivanje moţe da bude veoma korisna; 31 Kontrola vektora-tripsa u cilju sprečavanja prenošenja TSWV. Ukoliko se reaguje na vreme i uključi pravilan izbor insekticida, rotacija insekticida iz različitih hemijskih grupa i kvalitetna primena, moguće je efikasno uništiti većinu populacije tripsa; Gajenje otpornih sorti je jako vaţna mera, kojom se moţe značajno smanjiti problem virusnih zaraza. 32 3. CILJEVI ISTRAŢIVANJA Izučаvаnje virozа imа izuzetаn znаčаj zbog velike brojnosti virusа infektivnih zа pаpriku i njihove rаzličite epidemiologije, što zаhtevа potpuno rаzličit pristup kontroli virusnih bolesti. Dobijeni podаci o virusimа pаprike, nаročito informаcije o strukturi populаcije prevаlentnih vrstа, biće nezаmenljivi u oplemenjivаčkom rаdu nа selekciji genotipovа pаprike sа povišenim nivoom otpornosti. Izučаvаnje prisustvа i rаsprostrаnjenosti TSWV nа pаprici u nаšoj zemlji od izuzetnog je znаčаjа zbog ponovne pojаve u epidemijskim rаzmerаmа ovog ''re- emerging'' virusа u svetu i Evropi. Rezultаti ovih ispitivаnjа doprineće potpunijem sаgledаvаnju prisustvа ovog virusа nа teritoriji Srbije u usevu pаprike kаo jednoj od nаjvаţnijih biljаkа domаćinа. Izuzetan značaj virusa paprike i njihova nedovoljna proučenost u našoj zemlji doveli su do definisanja osnovnih ciljeva ove doktorske disertacije: – utvrĎivanje prisustva i rasprostranjenosti virusa paprike u našoj zemlji u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju, primenom ELISA testa; – molekularna detekcija i identifikacija prisutnih virusa paprike u Srbiji primenom RT–PCR metode; – sekvencioniranje amplifikovanih fragmenta virusa prisutnih u Srbiji i utvrĎivanje nukleotidne i aminokiselinske sličnosti sa sekvencama izolata odgovarajućih virusa poreklom iz različitih delova sveta; – rekonstrukcija filogenetskih stabala izolovanih virusa paprike u Srbiji i odreĎivanje mesta izolata virusa poreklom iz Srbije u odnosu na izolate poreklom iz drugih delova sveta; Detаljnijа ispitivаnjа prisutnih virusа pаprike kod nаs, kаo i primenа nаjsаvremenijih molekulаnih tehnikа, unаprediće metode detekcije, identifikаcije i karakterizacije ovih virusа, doprineće inventаrizаciji virusа u Srbiji i doprineće rаzumevаnju njihovog poreklа i dаljeg širenjа u nаšoj zemlji. 33 4. MATERIJAL I METODE 4.1. Pregled terena i sakupljanje uzoraka obolelih biljaka paprike Tokom 2009. i 2010. godine, radi utvrĎivanja prisustva, rasprostranjenosti i učestalosti virusa paprike u Srbiji, pregledani su različiti lokaliteti gajenja paprike u Srbiji. Prisustvo virusa kao i njihova rasprostranjenost utvrĎivana je kako u proizvodnji paprike u rasadu, proizvodnji u zaštićenom prostoru, tako i u proizvodnji paprike na otvorenom polju, s tim što se vodilo računa da se obuhvati veći broj sorti. Iz pregledanih useva prikupljeni su uzorci paprike sa simptomima koji su ukazivali na moguću virusnu zarazu. Uzimanje uzoraka je obavljeno u polju na usevima kod kojih se sumnjalo na prisustvo virusa. Ukoliko su parcele bile manjih dimenzija ili intenzitet zaraze slab, sakupljen je manji broj uzoraka sa simptomima, a ukoliko su parcele bile veće ili je intenzitet zaraze bio jači, uzorci su sakupljani kretanjem po usevu dijagonalno odabirom uzoraka sa simptomima. Tom prilikom sakupljeno je ukupno 881 uzorak paprike, i to 457 uzoraka paprike u 2009.-toj i 424 uzoraka u 2010.-toj godini. Za vreme pregleda useva paprike, vršena je i ocenu intenziteta zaraze, tako što je utvrĎivana učestalost pojave virusnih simptoma, odnosno procenat zaraţenih biljaka. Tokom 2009. godine, 121 uzorak je sakupljen tokom pregleda proizvodnje paprike u rasadu na 15 lokaliteta gajenja: Bačka Palanka, Obrovac, Veternik, Kruševac (dva useva paprike), Srbobran, Kula, Ruma, ĐurĎevo, Ţabalj, Pivnice, GospoĎinci, Rimski Šančevi, Aleksinac i Šabac. Prilikom pregleda proizvodnje paprike u zaštićenom prostoru prikupljeno je 129 uzoraka sa 15 lokaliteta gajenja: Lukino Selo, Srbobran, Velika Plana, Trstenik, Smederevo, Kikinda, ĐurĎevo, Selenča, Aleksinac, Sivac, Sombor, Čačak, Pivnice, Ţabalj i Veternik. Iz useva proizvodnje paprike na otvorenom polju, prikupljeno je 207 uzoraka sa 16 lokaliteta gajenja: Selenča, Velika Plana, Horgoš (dva useva paprike), Ravno Selo, Čonoplja, Čačak, ĐurĎevo, Trstenik, Bačka Palanka, Senta, Kraljevo, Smederevo, InĎija, Veternik i Aleksinac. Tokom 2010. godine, ispitivanje prisustva virusa na paprici gajene u rasadu, obuhvatilo je pregled 13 lokaliteta: Aleksinac, Bukovac, Ruma, Trestenik, Kula, Srbobran, Rimski Šančevi, InĎija, Sombor, Bačka Palanka, Šabac, Subotica i Bačka 34 Topola. Sakupljeno je ukupno 115 uzoraka sa simptomima virusne zaraze. Pregled prisustva virusnih zaraza u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru obavljen je sa 14 lokaliteta gajenja: Pećinci, Lukino Selo, Ţabalj, Ruma, Šabac, Kać, Valjevo, Horgoš, Sirig, Uţice, Aleksinac, Sombor, Kikinda i Smederevo i tom prilikom je za dalju analizu prikupljen 141 uzorak. Iz useva proizvodnje paprike u polju, prikupljeno je 168 uzoraka sa 16 lokaliteta gajenja: ĐurĎevo, Bačka Topola, Ruma, Šabac, Horgoš, Kikinda, Bački Jarak, Čonoplja, Smederevo, Uţice, Aleksinac, Valjevo, Knjaţevac, Bukovac, Vašica, Rimski Šančevi. Svaki formiran uzorak, sastojao se od više listova paprike sa jedne biljke. Sakupljeni uzorci su do laboratorije transportovani u plastičnim kesama u ručnom friţideru. Ukoliko je analiza raĎena u roku od 48 časova, uzorci su čuvani na temperaturi od +4°C, a ukoliko je do analize bio potreban vremenski period od nekoliko dana, uzorci su čuvani na -20°C do trenutka analize. Prethodna saznanja o simptomima oboljenja koje uzrokuju virusi na paprici (Ozaslan et al., 2006; Krstić i Bulajić, 2007; Mijatović i sar., 2007; Lamb et al., 2008) iskorišćena su za identifikaciju patogena u prirodnim uslovima. Tokom pregledа biljаkа uočeni simptomi u vidu promenа opšteg izgledа biljаkа ili promenа nа lišću, stаblu i plodovima zаbeleţeni su i dokumentovаni fotogrаfijom, tаko dа bi se nа osnovu formirаne dokumentаcije o ispitivаnim uzorcimа i zаvršenih lаborаtorijskih аnаlizа moglo utvrditi postojаnje veze izmeĎu odreĎenog dokаzаnog virusа i simptomа koje izаzivа nа pаprici. 4.2. Direktni imunoenzimski metod na ploči (DAS–ELISA) Prikupljeni uzorci paprike koji su po simptomima nagoveštavali da se radi o virusnoj prirodi oboljenja, serološki su analizirani u cilju detekcije najrasprostranjenijih i ekonomski najznačajnijih virusa paprike, pri čemu bi se na osnovu seroloških analiza utvrdila prisutnost i rasprostranjenost virusa paprike po lokalitetima u obe ispitivane godine. Uzorci paprike sa simptomima virusnih zaraza sakupljeni tokom 2009. i 2010. godine, testirani su primenom direktne imunoenzimske metode na ploči (DAS–ELISA) po protokolu koji su opisali Clark and Adams (1977), korišćenjem komercijalnih 35 poliklonalnih antiseruma specifičnih za detekciju odgovarajućih virusa i po uputstvu proizvoĎača (Loewe Biochemica GmbH, Nemačka). Serološko testiranje uzoraka obuhvatilo je detekciju devet najznačajnijih virusa paprike: virus mozaika krastavca (Cucumber mosaic virus, CMV), virus crtičastog mozaika krompira (Potato virus Y, PVY), virus bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus, TSWV), virus mozaika lucerke (Alfalfa mosaic virus, AMV), virus mozaika duvana (Tobacco mosaic virus, TMV), virus mozaika krompira (Potato virus X, PVX), virus šаrenilа pаprike (Pepper mottle virus, PepMoV), virus blagog šarenila paprike (Pepper mild mottle virus, PMMoV) i virus šаrenilа nerаvа pаprike (Pepper veinal mottle virus, PVMV). Jedan uzorak za analizu, pripreman je kao zbirni uzorak više fragmenata listova ili stabla, peteljke ili plodova iste biljke sa izraţenim simptomima. Uzorci su pripremani homogenizacijom biljnog materijala u ekstrakcionom puferu u odnosu 1:20. Specifična poliklonalna antitela i poliklonalna antitela konjugovana sa alkalnom fosfatazom korišćena su u razreĎenju 1:200 u odgovarajućem puferu. Svaki uzorak je testiran u dva ponavljanja. Promena boje je praćena vizuelno, a zatim i merenjem ekstinkcije na talasnoj duţini 405 nm na spektrofotometru (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems, Helsinki, Finland). Osnovni koraci, u izvoĎenju DAS–ELISA testa bili su sledeći: o Polisterinske mikrotitarske ploče obeleţene su specifičnim antitelima (IgG) na virus čije se prisustvo ispituje. o Napravljen je rastvor za oblaganje ploče u odnosu 1 IgG : 200 pufera za oblaganje i u svako udubljenje na ploči je dodato 200 µl pomenutog rastvora. Ploča je umotana u transparentnu foliju i zatim je stavljena na inkubaciju u trajanja 4 časa na 37°C. o Nakon inkubacije, ploče su isprane 4 puta puferom za ispiranje. o Homogenizacija uzorka vršena je pomoću avana i tučka u ekstrakcionom puferu u razreĎenju 1:20. o U udubljenja na mikrotitarskoj ploči, koja su prethodno isprana puferom za ispiranje naneto je 200 µl svakog ispitivanog uzorka u dva ponavljanja. Pozitivna i negativna kontrola su takoĎe nanete u dva ponavljanja. Inkubacija je vršena na +4°C preko noći. 36 o Posle ispiranja ploče, u bunarčiće je uneto po 200 l antitela konjugovanih sa alkalnom fosfatazom (antibody–AP–conjugate), razreĎenog u konjugatnom puferu u odnosu 1:200, a ploče su inkubirane 4 časa na 37°C. o Posle inkubacije, mikrotitarske ploče ispirane su kako je napred navedeno, a zatim je u svaki bunarčić uneto po 200 l pripremljenog supstrata (p–nitrofenilfosfat) u supstratnom puferu (20 l/20 ml). Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi do pojave bojene reakcije (1-2 časa). o Nakon 1-2 časa po dodavanju supstrata, intenzitet bojene reakcije očitavan je spektrofotometrijski na automatskom čitaču (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems, Helsinki, Finland) merenjem ekstinkcije na talasnoj duţini od 405 nm. Rezultati za svaki uzorak su preračunati kao prosečna vrednost dva ponavljanja, a pozitivnim su se smatrali svi uzorci čija je vrednost apsorpcije bila dva ili više puta veća od negativne kontrole. 37 Za izvoĎenje DAS–ELISA testa (LOEWE Biochemica GmbH, Germany) korišćeni su sledeći puferi: Pufer za prekrivanje ploča (Coating buffer) pH 9,6 Na2CO3 1,59 g NaHCO3 2,93 g dH2O 1000 ml Pufer za ispiranje (Wash buffer) NaCl 8,0 g Na2HPO4 x 12H2O 2,9 g KH2PO4 0,2 g KCl 0,2 g Tween 20 0,5 ml dH2O 1000 ml Pufer za ekstrakciju/ konjugatni pufer (Sample buffer /Conjugate) pH 7,4 Polivinilpirolidon 20 g bovine serum albumin 2 g NaN3 0,1 g NaCl 8,0 g Na2HPO4 x 12H2O 2,9 g KH2PO4 0,2 g KCl 0,2 g Tween 20 0,5 ml dH2O do 1000 ml Supstratni pufer (Substrate buffer) pH 9,8 Diethanolamine 97 ml MgCl2 x 6 H2O 0,2 g dH2O do 1000 ml 4.3. Molekularna detekcija virusa paprike primenom reverzne transkripcije praćene lančanom reakcijom polimeraze (RT–PCR) Detekcija izolata virusa koji su tokom ovog rada izolovani iz prirodno zaraţenih biljka paprike i potvrda rezultata dobijenih serološkim analizama, obavljena je pomoću metode reverzne transkripcije praćene lančanom reakcijom polimeraze (Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction, RT–PCR). RT-PCR reakciji prethodila je ekstrakcija totalne RNA iz zaraţenog biljnog materijala, primenom Rneasy Plant Mini Kita (Qiagen, Hilden, Germany) prema uputstvu proizvoĎača. RT-PCR metoda za molekularnu detekciju, identifikaciju i karakterizaciju odabranih izolata virusa izvoĎena je primenom protokola za „One–step“ RT–PCR kit 38 (Qiagen, Hilden, Germany) po uputstvu proizvoĎača. Po ovom protokolu, reakcije reverzne transkripcije i lančane polimeraze izvode se jedna za drugom u istoj PCR tubici. Primenom PCR metode i korišćenjem specifičnih prajmera vrši se sinteza odreĎenog, ciljnog dela DNA. Od više raspoloţivih nukleinskih kiselina, prajmeri prepoznaju i vezuju se za komplementarna mesta i kroz veći broj ponovljenih ciklusa lančane reakcije polimeraze omogućavaju amplifikaciju samo ciljne sekvence DNA. Kako izolovani virusi paprike imaju genom u vidu RNA, da bi se mogla obaviti njihova detekcija primenom PCR metode, neophodno je prethodno prepisati virusnu RNA u komplementarni lanac DNA (cDNA). Ovaj korak označava se kao reverzna transkripcija ili RT korak. Analiza dobijenih PCR produkata obavlja se elektroforetskim razdvajanjem u agaroznom gelu i vizuelizacijom bojenjem etidijum bromidom i posmatranjem pod UV svetlom. Pozitivnom reakcijom smatrana je pojava traka produkta očekivane veličine baznih parova (bp). 4.3.1. Ekstrakcija RNA iz biljnog materijala Ekstrakcija RNA iz lišća prirodno zaraţenih biljaka paprike izvedena je primenom Rneasy Plant Mini Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany) prema uputstvu proizvoĎača. Za izolaciju ukupnih RNA iz lišća paprike, korišćeno je 100 mg zamrznutog biljnog materijala prethodno čuvanog na -80°C. Ekstrakcija ukupne RNA obavljena je na sledeći način:  Zaraţeno lišće je izmacerirano u avanu sa tučkom, dodavanjem tečnog azota.  Usitnjen biljni materijal i tečni azot su prebačeni u ependorf tubicu od 2 ml u koju je dodato 450 µl RLT pufera, a zatim je sadrţaj tubice vorteksovan.  Tubice su inkubirane 3 min u vodenom kupatilu na 56°C, u cilju što efikasnije razgradnje biljnog tkiva.  Nakon inkubacije uzorak je prebačen u QIAshredder spin filter u tubicama od 2 ml i centrifugiran 3 min na maksimalnom broju obrtaja (14 000 obrtaja/min) u cilju odstranjivanja ćelijskih delova i homogenizacije lizata.  Supernatant je pipetiran u novu ependorf tubicu od 2 ml pazeći da se ne razbije talog. U tubicu je dodato 225 µl 96% etanola da bi se razbistrio supernatant. 39  Sadrţaj tubice je zatim pipetiran u RNase spin filter smešten u nove kolekcione tubice od 2 ml. Centrifugiranjem uzorka 15 s na ≥10 000 rpm obezbeĎeno je izdvajanje i vezivanje RNA za filter kao i uklanjanje većeg dela DNA koji se odbacuje zajedno sa supernatantom.  Na RNase spin filter smešten u kolekcionu tubicu pipetirano je 700 µl RW1 pufera za ispiranje, a zatim je izvršeno centrifugiranje 15 s na ≥10000 rpm.  Tečna faza je odbačena, a na RNase spin filter je pipetirano 500 µl RPE pufera u cilju ispiranja RNA, tubica sa uzorkom centrifugirana je 15 s na ≥10 000 rpm.  Tečna faza je odbačena, a ispiranje RNase spin filtera je ponovljeno sa novih 500 µl RPE pufera, centrifugiranjem 2 min na ≥10 000 rpm.  Nakon centrifugiranja RNase spin filter je prebačen u novu kolekcionu tubicu i centrifuguran 1 min na maksimalnom broju obrtaja da bi se uklonili ostaci etanola i pufera.  Rnase spin filter je prebačen u novu kolekcionu tubu od 1,5 ml i pipetirano je 40 µl RNase-free vode direktno na filter. Centrifugiranje je trajalo 1 min na ≥10 000 rpm da bi se rastvorila RNA.  Pipetirano je još 10 µl RNase-free vode direktno na filter, a takoĎe je izvršeno i centrifugiranje kao u prethodnom koraku.  Tako dobijena i izolovana RNA čuvana je na –80°C. 4.3.2. Molekularna detekcija izolata CMV Za ova ispitivanja odabrana su četiri izolata CMV koji su prethodno detektovani serološkom metodom: 1. P-14-09 sakupljen 2009. godine (Velika Plana) 2. PL-25-09 sakupljen 2009. godine (Velika Plana) 3. PL-43-09 sakupljen 2009. godine (Smederevo) 4. PL-52-09 sakupljen 2009. godine (Kikinda) Kao pozitivna kontrola korišćen je izolat ovog virusa iz paradajza (746–07) (Stanković et al., 2011) koji se nalazi u kolekciji biljnih virusa Katedre za fitopatologiju, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kao negativna 40 kontrola korišćena je PCR smeša sa svim reagensima potrebnim za umnoţavanje DNA, ali je umesto 0,8 μl uzorka dodato 0,8 μl RNase free vode. Za molekularnu detekciju CMV izolata iz paprike korišćeni su prajmeri Au1u/Au2d koji obuhvataju celi gen za proteinski omotač i delove 5’ i 3’ neprepisujućih regiona koji se nalaze na RNK3 segmentu (ili subgenomnom RNK4)(Krstić i sar., 2002) (Tabela 1): Tabela 1. Prajmeri korišćeni za detekciju CMV Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca prajmera 5'-3' Veličina amplikoma (bp) CP gen Au1u CAT GGA TGC TTC TCC RCG AG 847 Au2d CGT AAG CTG GAT GGA CAA CC RT–PCR reakcije obavljane su u 20 µl zapremine PCR smeše, koja je sadrţavala: 4 µl 5x Qiagen OneStep RT–PCR pufera (koji sadrţi 12,5 mM MgCl2), 0,8 µl dNTP mešavine (koji sadrţi po 10 mM svakog dNTP, finalne koncentracije u smeši 400 µM), 0,8 µl Qiagen OneStep RT–PCR smeše enzima (koji sadrţi Omniscript Reverse transkriptazu, Sensiscript Reverse transkriptazu i HotStar Taq DNA polimerazu), po 1,2 µl svakog prajmera finalne koncentracije 0,6 µM, 11,2 µl RNase– free vode i 0,8 µl izolovane ukupne RNA. Reakcija je izvedena pri sledećim uslovima: – reverzna transkripcija 30 min na 50°C – denaturacija Omniscript Reverse transkriptaze i Sensiscript Reverse transkriptaze, aktivacija HotStar Taq DNA polimeraze kao i inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 15 min na 95ºC 15 min na 95°C – denaturacija 30 s na 94°C – hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 30 s na 58°C (35 ciklusa) – i elongacija 30 s na 72°C – finalna elongacija 10 min na 72°C 41 4.3.3. Molekularna detekcija izolata PVY Za ova ispitivanja odabrano je četiri izolata čija je prethodna detekcija obavljena DAS-ELISA testom: 1. PL-28-09 sakupljen 2009. godine (Velika Plana) 2. PL-15-09 sakupljen 2009. godine (Srbobran) 3. PL-3-10 sakupljen 2010. godine (Pećinci) 4. PL-108-10 sakupljen 2010. godine (Aleksinac) Kao pozitivna kontrola korišćen je izolat D7-06 izolovan iz biljke duvana koji je ranije okarakterisan (Stanković et al., 2011) i nalazi se u kolekciji biljnih virusa Katedre za fitopatologiju, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kao negativna kontrola korišćena je PCR smeša sa svim reagensima potrebnim za umnoţavanje DNA, ali je umesto 0,8 μl uzorka dodato 0,8 μl RNase free vode. Korišćeni su prajmeri PVYc/PVYd (Tabela 2) čije sekvence umnoţavaju deo genoma vezan za sekvencu 5’ neprepisujućeg (5’ UTR) regiona i gena za P1 protein, regiona sa najvećom varijabilnošću unutar genoma PVY (Marie–Jeanne Tordo et al., 1995; Glais et al., 1996). Mesto vezivanja PVYc prjmera je homologo sa ciljnom sekvencom od 1-21 nt, a PVYd prajmera komplementarno pozicijama nukleotida od 955-975. Degenerativni prajmer PVYd omogućava prepoznavanje svih do sada testiranih PVY izolta. Tabela 2. Prajmeri korišćeni za detekciju PVY Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca prajmera 5'-3' Veličina amplikona (bp) Gen za P1 protein PVYc AAT TAA AAC AAC TCA ATA CA 975 PVYd TGY GAH CCA CGC ACT ATG AA PCR reakcije obavljane su u 20 µl zapremine PCR smeše, čiji je sadrţaj opisan u prethodnom poglavlju. 42 Reakcija je izvedena pri sledećim uslovima: – reverzna transkripcija 30 min na 50°C – denaturacija Omniscript Reverse transkriptaze i Sensiscript Reverse transkriptaze, aktivacija HotStar Taq DNA polimeraze kao i inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 15 min na 95ºC – denaturacija 1 min na 94°C – hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 57°C (35 ciklusa) – elongacija 1 min na 72°C – finalna elongacija 10 min na 72°C 4.3.4. Molekularna detekcija izolata TSWV Molekularna detekcija TSWV uraĎena je na tri odabrana izolata iz paprike koji su prethodno detektovani na serološkom nivou: 1. PL-35-09 sakupljen 2009. godine (Trstenik) 2. PL-60-09 sakupljen 2009. godine (ĐurĎevo) 3. PL-14-10 sakupljen 2010. godine (Lukino Selo) Kao pozitivna kontrola korišćen je izolat 53-05 dobijen iz biljke Nicotiana tabacum koji je ranije okarakterisan (Stanković et al., 2011) i nalazi se u kolekciji biljnih virusa Katedre za fitopatologiju, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kao negativna kontrola korišćena je PCR smeša sa svim reagensima potrebnim za umnoţavanje DNA, ali je umesto 0,8 μl uzorka dodato 0,8 μl RNase free vode. Umnoţavanje različitih delova genoma izolata TSWV obavljeno je primenom „One–step“ RT–PCR kita (Qiagen, Hilden, Germany) korišćenjem tri para prajmera koji umnoţavaju fragmente cDNK od 276 bp (Mumford et al., 1996a; OEPP/EPPO, 2004), 800 bp (Jain et al., 1998; Pappu et al., 1998; Holguin-Pena and Rueda- Puente, 2007) i 738 bp (Vučurović et al., 2012), locirane na različitim delovima genoma TSWV čije su sekvence date u tabeli 3. 43 Tabela 3. Prajmeri korišćeni za detekciju TSWV Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca prajmera 5'-3' Veličina amplikona (bp) RdRp gen L RNA L2 TSWVF ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA 276 L1 TSWVR AGG AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC NC gen S RNA TSWVgene F ATG TCT AAG GTT AAG CTC 800 TSWVgene R TTA AGC AAG TTC TGT GAG NC gen S RNA TSWV CP-f GT TAA GCT CAC TAA GAA ARC A 738 TSWV CP-r TTT AAC YCC RAA CAT TTC ATA GA PCR reakcije obavljane su u zapremini PCR reakcione smeše od 20 µl, čiji je sadrţaj opisan u poglavlju 3.3.2. Odstupanja postoje kod prajmera TSWV CP-f/ TSWV CP-r gde je prajmer TSWV CP-f dodat u količini od 2,4 µl, dok je TSWV CP-r u količini od 3,6 µl, kao i 7,6 µl RNase–free vode. RT-PCR reakcija je izvedena pri sledećim uslovima: reverzna transkripcija 30 min na 50°C denaturacija Omniscript Reverse transkriptaze i Sensiscript Reverse transkriptaze, aktivacija HotStar Taq DNA polimeraze kao i inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 15 min na 95ºC denaturacija, hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) i elongacija (veći broj ciklusa) – uslovi za izvoĎenje reakcije su u zavisnosti od vrste korišćenih prajmera finalna elongacija 10 min na 72°C Zavisno od korišćenih prajmera uslovi za izvoĎenje PCR reakcije bili su sledeći: L2 TSWVF/L1 TSWVR par prajmera: denaturacija 1 min na 94°C hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 55°C (35 ciklusa) elongacija 1 min na 72°C 44 TSWVgene F/TSWVgene R par prajmera: denaturacija 1 min na 94°C hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 55°C (40 ciklusa) elongacija 2 min na 72°C TSWV CP-f/ TSWV CP-r par prajmera: denaturacija 1 min na 94°C hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 53°C (40 ciklusa) elongacija 1 min na 72°C 4.3.5. Molekularna detekcija izolata AMV Za ova ispitivanja odabrani su sledeći izolati AMV sa različitih lokaliteta: 1. P-27-09 sakupljen 2009. godine (Velika Plana) 2. PL-2-10 sakupljen 2010. godine (Pećinci) 3. P-10-10 sakupljen 2010. godine (Bačka Topola) Kao pozitivna kontrola korišćen je izolat ovog virusa 196-08 poreklom iz duvana (Stanković et al., 2011) koji se nalazi u kolekciji biljnih virusa Katedre za fitopatologiju, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kao negativna kontrola korišćena je PCR smeša sa svim reagensima potrebnim za umnoţavanje DNA, ali je umesto 0,8 μl uzorka dodat o0,8 μl RNase free vode. Za molekularnu detekciju AMV izolata iz paprike korišćeni su prajmeri CP AMV1/ CP AMV2, koji umnoţavaju segment DNK finalne duţine 751 bp koji obuhvata kodirajući gen za proteinski omotač (CP) virusa (Finetti–Sialer et al., 1997; Parella et al., 2000). Mesto vezivanja CP AMV1 prajmera je homologo sa ciljnom sekvencom od 1187-1205 nt, a CP AMV2 prajmera komplementarno pozicijama nukleotida od 1920-1938 (Tabela 4). 45 Tabela 4. Prajmeri korišćeni za detekciju AMV Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca prajmera 5'-3' Veličina amplikona (bp) CP gen CP AMV1 TCC ATC ATG AGT TCT TCA C 751 CP AMV2 AGG ACT TCA TAC CTT GAC C PCR reakcije su obavljane u PCR reakcionoj smeši od 20 µl, čiji je sadrţaj opisan u poglavlju 3.3.2. Reakcija je izvedena pri sledećim uslovima: reverzna transkripcija 30 min na 50°C denaturacija Omniscript Reverse transkriptaze i Sensiscript Reverse transkriptaze, aktivacija HotStar Taq DNA polimeraze kao i inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 15 min na 95ºC denaturacija 1 min na 95°C hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 49°C (35 ciklusa) elongacija 2 min na 72°C finalna elongacija 10 min na 72°C. 4.3.6. Molekularna detekcija izolata PMMoV Za ova ispitivanja odabrana su tri izolata PMMoV čija je prethodna detekcija obavljena DAS-ELISA testom: 1. P-57-09 sakupljen 2009. godine (Čonoplja) 2. P-60-09 sakupljen 2009. godine (Čonoplja) 3. P-3-10 sakupljen 2010. godine (ĐurĎevo) Pozitivna kontrola nije postojala. Kao negativna kontrola korišćena je PCR smeša sa svim reagensima potrebnim za umnoţavanje DNA, ali je umesto 0,8 μl uzorka dodato 0,8 μl RNase free vode. 46 Za molekularnu detekciju PMMoV izolata iz paprike korišćeni su prajmeri P12/3/P12/3A (Velasco et al., 2002) i PMR1/ PMF1 (Hamada et al., 2002), čije su sekvence date u tabeli 5 i koji omogućavaju amplifikaciju RdRp i CP gena virusa. Tabela 5. Prajmeri korišćeni za detekciju PMMoV Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca prajmera 5'-3' Veličina amplikona (bp) RdRp gen P12/3 ACAGCGTTTGGATCTTAGTAT 836 P12/3A GTGCGGTCTTAATAACCTCA CP gen PMR1 CGGAATTCGAGTTATCGTACTCGCCACGGACG 474 PMF1 CGCGGATCCAGAACTCGGAGTCATCGGAC PCR reakcije su obavljane u zapremini PCR reakcione smeše od 20 µl, čiji je sadrţaj opisan u poglavlju 3.3.2. Reakcija je izvedena pri sledećim uslovima: reverzna transkripcija 30 min na 50°C, denaturacija Omniscript Reverse transkriptaze i Sensiscript Reverse transkriptaze, aktivacija HotStar Taq DNA polimeraze kao i inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 15 min na 95ºC denaturacija, hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) i elongacija (veći broj ciklusa) - uslovi za izvoĎenje reakcije su u zavisnosti od vrste korišćenih prajmera. finalna elongacija 10 min na 72°C. Zavisno od korišćenih prajmera uslovi za izvoĎenje PCR reakcije bili su sledeći: P12/3 i P12/3A par prajmera: denaturacija 30 s na 92°C, hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 30 s na 60°C (30 ciklusa) elongacija 45 s na 72°C 47 PMF1 i PMR1 par prajmera: denaturacija 30 s na 94°C, hibridizacija nukleinskih kiselina (annealing) 1 min na 50°C (35 ciklusa) elongacija 1 min na 72°C 4.3.7. Vizuelizacija PCR produkta Dobijeni produkti su elektroforetski razdvojeni u 1% agaroznom gelu. Agarozni gel je pripremljen rastvaranjem odgovarajuće količine agaroze u odgovarajućoj količini 1x TBE pufera (0,1 g:10 ml) i zagrevanjem do temperature ključanja u mikrotalasnoj pećnici. Pod mlazom hladne vode, ohlaĎen gel do temperature 60°C, razliven je u kalup za horizontalnu elektroforezu, u koji je prethodno postavljen češalj, a zatim je ostavljen na sobnoj temperaturi pola sata da se ohladi i očvrsne. Po očvršćavanju gela, češalj je izvaĎen, a kalup je uronjen u kadicu za horizontalnu elektroforezu sa 1x TBE puferom (90 mM Tris, 90 mM Borna kiselina, 1 mM Na2EDTA). Uzorci su pripremljeni od 1 µl boje (6x Loading dye, Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania) i 5 μl PCR proizvoda. Zа odreĎivаnje veličine umnoţenih аmplikonа korišćeni su markeri MassRulerTMDNA ladder, Mix i O'RangeRulerTM 100bp DNA Ladder (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania). Pripremljeni uzorci nanošeni su na gel sa bunarčićima u odgovarajućem rasporedu. Reakcija elektroforeze je obavljena u aparatu za elektroforezu (BlueMarine 100, Serva electrophoresis GmbH, UK) pri konstantnom naponu od 40 mA u trajanju od pribliţno 40 min. Posle završene elektroforeze, gel je inkubiran 15 min u rastvoru za bojenje od destilovane vode i etidijumbromida u finalnoj koncentraciji od 0,5 µg/ml. Amplifikovani fragmenti posmatrani su u mračnoj komori na transiluminatoru (Biometra, UK) pod UV svetlošću. Pojava traka na očekivanoj poziciji u poreĎenju sa markerom, smatrana je pozitivnom reakcijom. Dobijeni rezultati dokumentovani su fotografisanjem agaroznog gela. 48 4.4. Molekularna identifikacija virusa paprike U cilju odreĎivаnjа redosledа nukleotidа u аmplifikovаnom delu genomа, višestrukog uparivanja sekvenci odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata odgovarajućih virusa dostupnih u NCBI (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland, USA) bazi podataka, proračuna genetičke sličnosti, kao i u cilju filogenetske analize, obаvljeno je sekvencionirаnje. Nаkon sinteze, PCR produkti izolata odabranih zа sekvencionirаnje prečišćeni su pomoću QIAquick PCR Purification Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany). Višestrukim uparivanjem sekvenci izolata sa sekvencama drugih virusa dostupnih u NCBI bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti obavljena je molekularna identifikacija odabranih izolata virusa paprike poreklom iz naše zemlje. Za sekvencioniranje je odabrano ukupno 16 izolata i to: četiri izolata PVY, i po tri izolata CMV, AMV, TSWV i PMMoV. Za sekvencioniranje izolata CMV, TSWV, AMV korišćeni su PCR produkti dobijeni korišćenjem prajmera koji omogućavaju amplifikaciju CP odnosno NC gena, za izolate PVY produkti dobijeni korišćenjem prajmera koji omogućavaju umnoţavanje 5’ UTR i gena za P1 protein, dok su za sekvencioniranje izolata PMMoV korišćeni PCR produkti dobijeni korišćenjem prajmera koji omogućavaju amplifikaciju RdRp i CP gena (Tabela 6). 49 Tabela 6. Prajmeri korišćeni za umnoţavanje fragmenata za sekvencioniranje Virus Izolat Naziv prajmera Ciljna sekvenca CMV PL-43-09 Au1u/Au2d CP gen CMV PL-52-09 Au1u/Au2d CP gen CMV PL-25-09 Au1u/Au2d CP gen PVY PL-3-10 PVYc/PVYd 5’ UTR i gen za P1 protein PVY PL-15-09 PVYc/PVYd 5’ UTR i gen za P1 protein PVY PL-28-09 PVYc/PVYd 5’ UTR i gen za P1 protein PVY PL-108-10 PVYc/PVYd 5’ UTR i gen za P1 protein TSWV PL-35-09 TSWV CP-f/ TSWV CP-r CP gen TSWV PL-14-10 TSWV CP-f/ TSWV CP-r CP gen TSWV PL-60-09 TSWV CP-f/ TSWV CP-r CP gen AMV P-10-10 CP AMV1/CP AMV2 CP gen AMV PL-2-10 CP AMV1/CP AMV2 CP gen AMV P-27-09 CP AMV1/CP AMV2 CP gen PMMoV P-3-10 PMR1/PMF1 CP gen PMMoV P-57-09 PMR1/PMF1 CP gen PMMoV P-60-09 PMR1/PMF1 CP gen PMMoV P-3-10 P12/3/P12/3A RdRp gen PMMoV P-57-09 P12/3/P12/3A RdRp gen PMMoV P-60-09 P12/3/P12/3A RdRp gen Nakon uspešne sinteze, PCR produkti izolata odreĎenih za sekvencioniranje prečišćeni su pomoću QIAquick PCR Purification Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany), prateći upustvo proizvoĎača: 1. Jedna zapremina dobijenog PCR produkta i miksa pomešana je sa pet zapremina PBI pufera, a zatim prebačena u QIAquick kolonu smeštenu u kolekcionu tubicu i centrifugirana 1 min na maksimalnom broju obrtaja (13000 rpm) u cilju vezivanja DNA za filter. 2. Tečna faza je odbačena, a u QIAquick kolonu je pipetirano 750 µl PE pufera u cilju ispiranja RNA, posle čega je tubica sa uzorkom centrifugirana 1 min na 13 000 rpm. 3. Tečna faza je odbačena, a QIAquick kolona vraćena u istu kolekcionu tubicu i centrifugurana 1 min na 13 000 rpm da bi se uklonili ostaci pufera. 4. U cilju rastvaranja DNA u QIAquick kolonu smeštenu u novu tubicu od 1,5 ml pipetirano je 50 µl EB pufera i centrifugirano 1 min na 13 000 rpm. Tako dobijena DNA čuvana je na +4°C za dalji rad. U cilju provere čistoće uzoraka, njihove molekularne mase i količine sintetisane DNA, uzorci su zatim elektroforetski razdvojeni na 1% agaroznom gelu. Količina 50 umnoţenih fragmenata u uzorcima odreĎena je poreĎenjem dobijenih produkata sa fragmentima komercijalnog markera 100 bp DNA Ladder (Serva GmbH, UK). Reakcije sekvencioniranja uraĎene su u BMR Genomics (Padova, Italy) na ABI Prism 3700 automatskom kapilarnom sekvencionatoru. Umnoţeni fragmenti gena virusa sekvencionirani su u oba smera upotrebom odgovarajućih prajmera, odnosno prajmerima koji su korišćeni za njegovo umnoţavanje. Nakon sekvencioniranja, dobijene sekvence odabranih izolata CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV obraĎene su u programu FinchTV Version 1.4.0. i podnete u NCBI banku gena, posle čega im je dodeljen pristupni broj (GenBank Accession number). Pomoću MEGA verzije 4.0 (Thompson et al., 1994; Tamura et al., 2007) i pomoću BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analize izvršeno je meĎusobno poreĎenje dobijenih sekvenci kao i višestruko poreĎenje dobijenih sekvenci sa dostupnim sekvencama odgovarajućeg regiona genoma virusa u GenBank bazi podataka (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) čime je obavljena potvrda identifikacije dobijene sekvence. Za proračun nukleotidne i aminokiselinske sličnosti na osnovu sekvence dela genoma odabranog izolata sa izolatima ovog virusa iz drugih delova sveta, kao i za filogenetske analize upotrebljen je softverski paket MEGA verzija 4.0. 4.5. Filogenetska analiza Nakon sekvencioniranja amplifikovanih fragmenata, utvrĎena je njihova filogenetska sličnost sa sekvencama dostupnim u NCBI bazi podataka. Molekularna karakterizacija virusa: CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV, infektivnih za papriku, obavljena je filogenetskom analizom (proučavanje evolutivne povezanosti) odabranih izolata sa drugim izolatima dostupnim u NCBI bazi podataka. Za filogenetske analize odabrana su četiri izolata PVY i po tri izolata CMV, TSWV, AMV i PMMoV. Nakon obrade dobijenih sekvenci CP gena izolata CMV, PVY, AMV i PMMoV, NC gena izolata TSWV, i gena za P1 protein za izolate PVY, obavljeno je meĎusobno poreĎenje, kao i njihovo poreĎenje sa odgovarajućim sekvencama dostupnim u NCBI bazi podataka (tabela 7, 8, 9, 10 i 11). Nakon toga rekonstruisano je filogenetsko stablo, 51 korišćenjem Maximum Parsimony metode i bootstrap analize sa 1000 ponavljanja integrisanih unutar MEGA 4 programa. U rekonstrukciji filogenetskog stbla, kod CMV, PVY i PMMoV korišćena je „outgroup-a”. Stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci celog gena za protein omotača virusa i delove 5’ i 3’ neprepisujućih regiona CMV rutovano je korišćenjem sekvence izolata ER (U15730), stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci gena za P1 protein PVY rutovano je korišćenjem sekvence izolata PepMoV (M96425), dok je stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci CP gena PMMoV rutovano korišćenjem sekvence izolata TMV (X70883) i ToMV (AF411922). PoreĎenje nukleotidne identičnosti i aminokiselinske sličnosti izmeĎu sekvenci korišćenih za filogenetsko stbalo obavljeno je, takoĎe, korišćenjem MEGA 4 programa. Odabrane sekvence za rekonstrukciju filogenetskih stabala skraćene su prema duţini najkraće sekvence. Za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci NC gena TSWV izolata, odabrane sekvence su skraćene na duţinu 632 bp prema sekvencama iz NCBI baze podataka Z36882 i AJ296599. Za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci gena za P1 protein PVY izolata, odabrane sekvence isečene su na duţinu 756 bp sekvence prema sekvencama iz NCBI baze podataka: EU252529, AF012027, AF012026 i naše sekvence PL-3-10. Za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci CP gena CMV izolata, odabrane sekvence su skraćene na duţinu 657 bp prema većem broju sekvenci iz NCBI baze podataka. Za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci CP gena AMV izolata, odabrane sekvence su skraćene na duţinu 600 bp prema sekvenci iz NCBI baze podataka FJ858264, dok su za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci CP gena PMMoV izolata sekvence skraćene na 474 bp, prema duţini sekvence većine izolata odabranih filogenetsku analizu. 52 Tabela 7. Sekvence CP gena odabranih izolata CMV korišćenih za filogenetsku analizu Izolat Geografsko poreklo Biljka domaćin Acc. No. Literaturni izvor PL-25-09 Velika Plana paprika KC288146 Ova proučavanja PL-43-09 Smederevo paprika KC288147 Ova proučavanja PL-52-09 Kikinda paprika KC288148 Ova proučavanja MAD99/4 Španija tikva AJ829770 Bonnet et al.,2005 MAD96/1 Španija dinja AJ829768 Bonnet et al.,2005 I17F Francuska - X16386 Noel and Tahar, 1989 MAD99/1 Španija dinja AJ829776 Bonnet et al., 2005 Ban Izrael banana U43888 Gafny et al., 1996 702-07 Srbija duvan GQ340670 Nije publikovano CMV-P6 USA duvan D10545 Shintaku,1991 207 Australija paradajz AJ585517 Nije publikovano 151-08 Srbija tikva HM065509 Nije publikovano 115-08 Srbija tikva HM065510 Nije publikovano CMV-FC USA duvan D10544 Shintaku, 1991 PR36 USA - M98500 Nije publikovano - Kolumbija banana U32859 Reichel et al., 1996 P1 Kina - AJ006988 Zhou et al., 1999 KM Japan dinja AB004780 Takeshita and Takanami, 1997 Cas Poljska Lilium spp. DQ018286 Berniak et al., 2010 RB Kina pasulj AJ006990 Liu et al., 1999 113 USA - AF523340 Lin et al., 2003 NT9 Tajvan - D28780 Hsu et al.,1995 Trk7 MaĎarska - L15336 Salanki et al.,1994 C7-2 Japan - D42079 Chaumpluk et. al., 1996 M-48 Tajvan - D49496 Nije publikovano K USA - AF127977 Roossinck et al., 1999 ABI Koreja gladiola L36525 Nije publikovano Tfn Italija paradajz Y16926 Nije publikovano pCP25 Indija Physalis minima X89652 Haq et al.,1996 Ixora USA Ixora spp. U20219 McGarvey et al., 1995 Oahu Havaji banana U31220 Hu et al., 1995 S USA - AF063610 Nije publikovano Q Australija - M21464 Nije publikovano LS USA - AF127976 Roossinck et al., 1999 Simp2 Poljska ljiljan FJ621495 Berniak et al., 2010 M2 Japan - AB006813 Nije publikovano Kin Engleska - Z12818 Boccard and Baulcombe, 1993 ER Indija Vigna unguiculata U15730 Naidu et al., 1995 Legenda: – nije pronaĎen podatak 53 Tabela 8. Sekvence gena za P1 protein PVY izolata korišćene za filogenetsku analizu Izolat Geografsko poreklo Biljka domaćin Acc. No. Literaturni izvor PL-3-10 Pećinci paprika KC288144 Ova proučavanja PL-15-09 Srbobran paprika KC288143 Ova proučavanja PL-28-09 Velika Plana paprika KC288142 Ova proučavanja PL-108-10 Aleksinac paprika KC288145 Ova proučavanja D7-06 Srbija duvan GQ290476 Nije publikovano D35-06 Srbija duvan GQ290475 Nije publikovano Slovenia1 Slovenija - AJ315739 Nije publikovano Sl 64 Slovenija krompir AF401604 Nie and Singh, 2002 Sl 50 Slovenija krompir AF401603 Nie and Singh, 2002 PVYN-N242 Francuska krompir AF248499 Nije publikovano 605 Švajcarska - X97895 Jakab et al., 1997 Tu 648 Kanada krompir AF401610 Nie and Singh, 2002 v942490 Velika Britanija - EF016294 Nije publikovano Linda Nemačka duvan AJ890345 Schubert et al., 2007 Satina Nemačka duvan AJ890347 Schubert et al., 2007 423–3 USA krompir AY884982 Lorenzen et al., 2006 N 5Yt Kanada duvan AF401605 Nie and Singh, 2002 Rusia Velika Britanija - AJ315746 Nije publikovano California Kalifornija - AJ315744 Nije publikovano English Velika Britanija - AJ315747 Nije publikovano Tu 619 USA krompir AF401608 Nie and Singh, 2002 Tu 660 USA krompir AF401609 Nie and Singh, 2002 N 27 Kanada krompir AF401606 Nie and Singh, 2002 N Jg Kanada krompir AF401607 Nie and Singh, 2002 N266 Kanada krompir AF401600 Nie and Singh, 2002 N394 Kanada krompir AF401601 Nie and Singh, 2002 Canada Kanada - AJ315745 Nije publikovano USA USA - AJ315742 Nije publikovano Ukraine Ukrajina - AJ315740 Nije publikovano 803 Finska krompir AJ245555 Maki–Valkama et al., 2000 Viikki Finska krompir AJ245556 Maki–Valkama et al., 2000 Hungarian MaĎarska - M95491 Thole et al., 1993 Ditta Poljska duvan AJ890344 Schubert et al., 2007 Scotland Velika Britanija - AJ315743 Nije publikovano Adgen Francuska krompir AJ890348 Schubert et al., 2007 LYE84.2 Španija paradajz AJ439545 Moury et al., 2002 SON41 Francuska Solanum nigrum AJ439544 Nije publikovano PepMoV Kalifornija - M96425 Vance et al., 1992 Legenda: – nije pronaĎen podatak. 54 Tabela 9. Sekvence NC gena TSWV izolata korišćene za filogenetsku analizu Izolat Geografsko poreklo Biljka domaćin Acc. No. Literaturni izvor PL-35-09 Trstenik paprika KC182565 Ova proučavanja PL-14-10 Lukino Selo paprika KC182564 Ova proučavanja PL-60-09 ĐurĎevo paprika KC182566 Ova proučavanja 53–05 Srbija duvan GQ373173 Nije publikovano 33–06 Srbija duvan GQ355467 Nije publikovano 39–06 Srbija duvan GQ373172 Nije publikovano T304 Italija paradajz Z36882 Vaira et al., 1995 T992 Italija paradajz AY848922 Ciuffo et al., 2005 Spain–2 Španija paradajz AY744480 Tsompana et al., 2005 Spain–1 Španija paradajz AY744479 Tsompana et al., 2005 LC Španija - X94550 Nije publikovano DH37 Bugarska paradajz AJ418779 Heinze et al., 2003 BS97 Bugarska duvan AJ418777 Heinze et al., 2003 10HK96 Bugarska duvan AJ418778 Heinze et al., 2003 Le98/527 Nemačka Lysimachia AJ297611 Heinze et al., 2003 TSWV–D Holandija Dahlia AF020660 Qiu et al., 1998 NC–1 Severna Karolina Dahlia AY744476 Tsompana et al., 2005 NC–3 Severna Karolina Dahlia AY744478 Tsompana et al., 2005 NC–2 Severna Karolina kikiriki AY744477 Tsompana et al., 2005 TSWV–10 Severna Karolina kikiriki AF020659 Qiu et al., 1998 98/0472 Juţna Afrika krompir AJ296600 Heinze et al., 2001 TSWV–GP Juţna Afrika kikiriki EF059705 Sivparsad and Gubba, 2008 C27084 Češka Republika kala AJ296599 Heinze et al., 2001 AC Dţodţija duvan AF064469 Pappu et al., 1998 MC Dţordţija duvan AF064472 Pappu et al., 1998 Tospo–G Japan Chrysanthemum AB038342 Nije publikovano Tospo–C Japan Chrysanthemum AB038341 Nije publikovano Ordinary strain Japan - AB088385 Takeda et al., 2002 CA–1 Kalifornija Aster AY744468 Tsompana et al., 2005 CA–4 Kalifornija Chrysanthemum AY744471 Tsompana et al., 2005 TSWV–BL Havaiji salata L20953 Pang et al., 1992 L Havaiji salata X61799 Kim et al., 1994 BR Brazil paradajz D00645 de Haan et al., 1989 Legenda: – nije pronaĎen podatak 55 Tabela 10. Sekvence CP gena izolata AMV korišćenih za filogenetsku analizu Izolat Geografsko poreklo Biljka domaćin Acc. No. Literaturni izvor P-10-10 Bačka Topola paprika KC182567 Ova proučavanja PL-2-10 Pećinci paprika KC182569 Ova proučavanja P-27-09 Velika Plana paprika KC182568 Ova proučavanja 196-08 Srbija duvan FJ527749 Nije publikovano VRU Velika Britanija lupina AF015716 Thole et al.,1998 15/64 Velika Britanija lupina AF015717 Thole et al.,1998 S Velika Britanija lucerka X00819 Ravelonandro et al., 1984 425 Medison SAD bela detelina K02703 Barker et al.,1983 425 Leiden SAD bela detelina L00162 Koper-Zwarthoff et al.,1977 126-A Italija paradajz AJ130704 Parrella et al., 2000 195-AN Italija Portulaca oleracea AJ130705 Parrella et al., 2000 F-430 Italija pasulj AJ130706 Parrella et al., 2000 Danza Italija paradajz Y09110 Finetti Sialer et al., 1997 Lye-80 Francuska paradajz AJ130703 Parrella et al., 2000 Caa-1 Francuska paprika AJ130707 Parrella et al., 2000 Dac-16 Francuska mrkva AJ130708 Parrella et al., 2000 Lyh-1 Francuska Solanum spp. AJ130709 Parrella et al., 2000 Ca375 Kanada krompir DQ314749 Xu and Nie, 2006 Ca175 Kanada krompir DQ314750 Xu and Nie, 2006 Ca399 Kanada krompir DQ314751 Xu and Nie, 2006 Ca400 Kanada krompir DQ314752 Xu and Nie, 2006 Ca401 Kanada krompir DQ314753 Xu and Nie, 2006 Ca508 Kanada krompir DQ314754 Xu and Nie, 2006 Ca518 Kanada krompir DQ314755 Xu and Nie, 2006 Ca616 Kanada krompir DQ314756 Xu and Nie, 2006 N20 Australija - AF332998 Jayasena and Randles, 2004 NZ34 Novi Zeland grašak AF215664 Timmerman-Vaughan et al., 2001 KR1 Koreja krompir AF294432 Nije publikovano KR2 Koreja krompir AF294433 Nije publikovano Legenda: – nije pronaĎen podatak 56 Tabela 11. Sekvence CP gena PMMoV izolata korišćene za filogenetsku analizu Izolat Geografsko poreklo Biljka domaćin Acc. No. Literaturni izvor P-60-09 Čonoplja paprika KC288151 Ova proučavanja P-57-09 Čonoplja paprika KC288150 Ova proučavanja P-3-10 ĐurĎevo paprika KC288149 Ova proučavanja Iw Japan paprika AB254821 Hamada et al., 2007 L4BV Japan paprika AB276030 Genda et al., 2007 P Koreja paprika AB084456 Nije publikovano KR Koreja - AB126003 Nije publikovano PO Koreja paprika AF103776 Nije publikovano Ge1 Japan paprika AB062049 Nije publikovano Ge5 Japan paprika AB062051 Nije publikovano Ge4 Japan paprika AB062050 Nije publikovano DF01 Brazil paprika AB550911 Oliveira et al., 2010 CN Kina paprika AY859497 Wang et al., 2006 Taiwan Tajvan - M87827 Nije publikovano OH Japan paprika AB062052 Nije publikovano JP-J Japan paprika AB000709 Kirita et al., 1997 S Španija paprika M81413 Alonso et al., 1991 Na Japan paprika AB062054 Nije publikovano SP-Ia Španija paprika AJ308228 Velasco et al., 2002 Italian Italija paprika X72587 Nije publikovano Tosa Japan paprika AB062053 Nije publikovano LinsBR08 Brazil paprika AM411433 Nije publikovano - Kina - AY632863 Nije publikovano PMMV1.2 Italija - AJ429088 Letschert et. al, 2002 Pe1 Japan paprika AB119482 Takeuchi et. al., 2005 P98/15 Španija paprika FR671392 Fraile et al., 2011 P99/23 Španija paprika FR671393 Fraile et al., 2011 P96/44 Španija paprika FR671388 Fraile et al., 2011 P83/4 Španija paprika FN594853 Fraile et al., 2011 P85/29 Španija paprika FN594869 Fraile et al., 2011 P89/4.2 Španija paprika FN594881 Fraile et al., 2011 P02/2 Španija paprika FN594870 Fraile et al., 2011 P86/10 Španija paprika FN594889 Fraile et al., 2011 PMMoV- BD Kina paprika HQ699079 Nije publikovano TMV Nemačka - X70883 Kuhlmann et. al., 1993 ToMV Brazil paradajz AF411922 Moreira et. al., 2003 Legenda: - nije pronaĎen podatak. 57 5. REZULTATI 5.1. Simptomi u rasadu, zaštićenom prostoru i polju Pregledom proizvodnje rasada i useva paprike u različitim lokalitetima gajenja kako u zaštićenom prostoru, tako i na otvorenom polju zabeleţena je pojava niza simptoma koji su upućivali na virusnu zarazu i koji su varirali u zavisnosti od biljke domaćina, vremena ostvarene infekcije i vrste virusa. Simptomi na biljkama u rasadu bili su slabo izraţeni, usled čega obolele biljke nisu mogle, sa sigurnošću, biti razlikovane od zdravih. Ipak, tokom ovih istraţivanja, na odreĎenom broju biljaka uočeni su simptomi u vidu blagog mozaika i hloroze lišća, nekrotičnih lezija kao i različite deformacije liske (Slika 6, 7). Slika 6. PVY: Hloroza i deformacija lista Slika 7. CMV: Deformacija lista Pregledom useva paprike u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju zabeleţena je pojava biljaka koje su često zaostajale u porastu, a usled skraćivanja internodija poprimale su ţbunast izgled (Slika 8). Simptomi su se manifestovali osim u vidu promena opšteg izgleda biljaka i hromatskim i morfološkim promena na listovima i plodovima. Lišće obolelih biljaka, bilo je sitnije, slabo naborano, često sa različitim tipovima mozaika, od blagog do jako izraţenog, sa mozaičnim šarama ţućkaste boje i hlorotičnim površinama koje kasnije zahvataju ceo list (Slika 9). Hlorotične promene često su bile praćene pojavom izumiranja tkiva i to uglavnom u vidu nekroze nerava 58 lista i nekrotičnih pega na stablu. Na plodovima, koji su bili krţljavi, deformisani i sa nekrozom površinskog tkiva, često su bile prisutne i linearne beličaste ili ţućkaste pruge i prošaravanja. Na zaraţenim biljkama primećena je pojava nekroze stable, cvetne drške, kao i čašičnih i kruničnih listića (Slika 10). Slika 8. CMV: Ţbunast izgled biljka Slika 9. PVY: Hlorotično šarenilo lišća Slika 10. CMV: Deformacija plodova i nekroza stabla 59 5.2. Serološka detekcija virusa Serološka istraţivanja sprovedena u cilju identifikacije i utvrĎivanja prisutnosti virusa na paprici u Srbiji, obuhvatila su primenu direktne imunoenzimske metode na ploči (DAS–ELISA), korišćenjem komercijalnih poliklonalnih antiseruma (Loewe Biochemica GmbH, Nemačka) specifičnih za detekciju devet najznačajnijih virusa paprike: CMV, PVY, TSWV, TMV, AMV, PVX, PepMoV, PMMoV i PVMV. 5.2.1. Prisustvo i rasprostranjenost virusa u usevu paprike tokom 2009. godine Ispitivanja sprovedena tokom 2009. godine, koja se tiču paprike gajene u rasadu, obuhvatala su pregled 15 različitih lokaliteta proizvodnje, gde je ustanovljeno prisustvo tri virusa koji se prenose vašima na neperzistentan način: CMV, PVY i AMV. Na svim lokalitetima procenjen je intenzitet zaraze od 5-10%. Od ukupno sakupljenih 121 uzoraka, prisustvo virusa dokazano je u 23,97%, dok u 76,03% testiranih uzoraka nije utvrĎeno prisustvo nijednog od ispitivanih virusa (Grafikon 1). Najzastupljeniji virus bio je CMV detektovan u 18,18% testiranih uzoraka, dok je prisustvo PVY i AMV utvrĎeno samo kod izuzetno malog broja uzoraka (3,31% i 2,48%) (Tabela 12). Svi detektovani virusi bili su zastupljeni isključivo u pojedinačnoj zarazi. Prisustvo TSWV, TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nije ustanovljeno ni u jednom od testiranih uzoraka. Rezultati testiranja paprike u rasadu, takoĎe ukazuju na nizak procenat ili odsustvo virusa koji se prenose semenom paprike, kakvi su TMV, AMV i PMMoV. Kod ukupno testiranih 129 uzoraka paprike sakupljenih na 15 različitih lokaliteta proizvodnje paprike u zaštićenom prostoru, ustanovljeno je prisustvo četiri virusa, i to tri virusa koji se prenose vašima na neperzistentan način (PVY, CMV, AMV) i TSWV, koji se prenosi tripsima. Na svim lokalitetima procenjen je intenzitet zaraze od 20-40%, a najčešći simptomi bili su blagi do izraţeni mozaik na listovima, a takoĎe se mogla uočiti i uvijenost i deformisanost listova. Prisustvo navedenih virusa u testiranim uzorcima paprike detektovano je sa relativno ujednačenom učestalošću. Najzastupljeniji virus, u pojedinačnim ili mešanim zarazama, bio je PVY (32,56%), zatim CMV (31,01%) i TSWV (23,26%), dok je AMV bio detektovan u nešto manjem broju uzoraka (17,05%) (Tabela 13). Kod najvećeg broja uzoraka utvrĎena je 60 pojedinačna zaraza izazvana TSWV (23,26%), koji je u Lukinom Selu, Trsteniku i ĐurĎevu detektovan kao jedini prisutan virus. Kod 17,05% testiranih uzoraka detektovana je pojedinačna zaraza PVY i CMV, a kod 12,40% pojedinačna zaraza AMV kao i mešana zaraza PVY i CMV. Mešana zaraza PVY i AMV, kao i CMV i AMV detektovana je u malom broju uzoraka, kod 3,10%, odnosno 1,55% testiranih uzoraka. Kod 13,18% uzoraka nije utvrĎeno prisustvo nijednog od ispitivanih virusa, mada su simptomi bili tipični za virusne zaraze, što je uputilo na prisustvo virusa koji nisu uključeni u ova ispitivanja (Grafikon 2). Prisustvo TMV, PVX , PMMoV, PepMoV i PVMV nije dokazano ni u jednom testiranom uzorku. Ispitivanjem prisustva i rasprostranjenosti virusa paprike u polju tokom 2009. godine na 16 lokaliteta utvrĎeno je prisustvo četiri virusa PVY, AMV, CMV i PMMoV (Tabela 14). Na svim pregledanim lokalitetima intenzitet zaraze virusima bio je preko 50%. U usevima paprike gajenim na otvorenom polju, od ukupno testiranih 207 uzoraka sa simptomima, ustanovljeno je prisustvo virusa koji se prenose vašima na neperzistentan način sa dominantnim prisustvom PVY (51,21%) u pojedinačnim i mešanim zarazama. U značajnom broju uzoraka ustanovljeno je prisustvo CMV (37,20%) i AMV (21,74%), dok je prisustvo PMMoV ustanovljeno u manjem broju uzorka (1,45%), i to u Čonoplji u vidu mešane infekcije sa dva ili tri virusa. U pogledu pojedinačnih zaraza, najzastupljenije su bile zaraze izazvane PVY (25,60%), a zatim pojedinačne zaraze CMV i AMV (15,46%). U pogledu mešanih zaraza, detektovane su zaraze dva ili tri virusa. Najčešće je detektovana mešana zaraza dva virusa i to PVY i CMV (18,84%), dok su ostale mešane zaraze dokazane u relativno malom broju uzoraka, PVY i AMV (3,87%), AMV i CMV (0,97%), PVY i PMMoV (0,97%), a samo u 4 od 207 uzoraka (1,93%) je imalo mešanu zarazu sa sva tri detektovana virusa. Kod 16,91% testiranih uzoraka nije utvrĎeno prisustvo ispitivanih virusa (Grafikon 3). Od virusa uključenih u ova ispitivanja, nije utvrĎeno prisustvo TSWV, TMV, PVX, PepMoV i PVMV. 61 Tabela 12. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u rasadu u 2009. godini Lokalitet Broj uzoraka PVY CMV AMV Bez prisustva testiranih virusa Bačka Palanka 6 0 2 (33,33)* 4 (66,67) Obrovac 7 0 1 (14,29) 0 6 (85,71) Veternik 6 2 (33,33) 0 0 4 (66,67) Kruševac I 7 0 0 0 7 (100) Kruševac II 7 0 0 0 7 (100) Srbobran 5 0 0 2 (40) 3 (60 ) Kula 4 1 (25) 1 (25) 0 2 (50) Ruma 10 0 1 (10) 1 (10) 8 (80) ĐurĎevo 10 0 2 (20) 0 8 (80) Ţabalj 8 0 1 (12,50) 0 7 (87,50) Pivnice 14 0 3 (21,43) 0 11 (78,57) GospoĎinci 8 0 1 (12,50) 0 7 (87,50) Rimski Šančevi 13 0 0 0 13 (100) Aleksinac 13 0 10 (76,92) 0 3 (23,089) Šabac 3 1 (33,33) 0 0 2 (66,67) UKUPNO: 121 121 4 (3,31) 22 (18,18) 3 (2,48) 92 (76,03) Legenda: * broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka) 62 Tabela 13. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u pojedinačnim i mešanim infekcijama u zaštićenom prostoru u 2009. godini Lokalitet B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana zaraza B ez p ri su st v a te st ir an ih v ir u sa Ukupna zaraza TSWV AMV CMV PVY PVY +AMV PVY +CMV AMV +CMV TSWV AMV CMV PVY Lukino Selo 10 10 (100) 0 0 0 0 0 0 0 10 (100) 0 0 0 Srbobran 10 0 0 0 8 (80)* 0 0 0 2 (20) 0 0 0 8 (80) Velika Plana 10 0 0 0 0 4 (40) 4 (40) 0 2 (20) 0 4 (40) 4 (40) 8 (80) Trstenik 10 10 (100) 0 0 0 0 0 0 0 10 (100) 0 0 0 Smederevo 5 0 0 5 (100) 0 0 0 0 0 0 0 5 (100) 0 Kikinda 10 0 0 4 (40) 0 0 4 (40) 0 2 (20) 0 0 8 (80) 4 (40) ĐurĎevo 10 10 (100) 0 0 0 0 0 0 0 10 (100) 0 0 0 Selenča 15 0 4 (20) 0 5 (33,33) 0 0 0 6 (40) 0 4 (26,67) 0 5 (33,33) Aleksinac 10 0 0 7 (70) 1 (10) 0 2 (20) 0 0 0 0 9 (90) 3 (30) Sivac 5 0 5 (100) 0 0 0 0 0 0 0 5 (100) 0 0 Sombor 5 0 0 0 5 (100) 0 0 0 0 0 0 0 5 (100) Čačak 6 0 0 4 (66,67) 1 (16,67) 0 1 (16,67) 0 0 0 5 (83,33) 2 (33,33) Pivnice 10 0 5 (50) 0 0 0 0 0 5 (50) 0 5 (50) 0 0 Ţabalj 8 0 2 (25) 2 (25) 2 (25) 0 0 2 (25) 0 0 4 (50) 4 (50) 2 (25) Veternik 5 0 0 0 0 0 5 (100) 0 0 0 0 5 (100) 5 (100) UKUPNO: 129 30 (23,26) 16 (12,4) 22 (17,05) 22 (17,05) 4 (3,1) 16 (12,4) 2 (1,55) 17 (13,18) 30 (23,26) 22 (17,05) 40 (31,01) 42 (32,56) Legenda: *broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka) 63 Tabela 14. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u pojedinačnim i mešanim infekcijama u polju tokom 2009. godine Lokalitet B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana zaraza B ez p ri su st v a te si ra n ih v ir u sa Ukupna zaraza A M V C M V P V Y P V Y + A M V P V Y + C M V A M V + C M V P V Y + P M M o V A M V + P V Y + C M V P V Y + P M M o V + C M V A M V C M V P V Y P M M o V Selenča 10 5 (50)* 0 0 0 0 0 0 0 0 5 (50) 5 (50) 0 0 0 Velika Plana 15 3 (20) 7 (46,67) 0 0 0 2 (13,33) 0 0 0 3 (20) 5 (33,33) 9 (60) 0 0 Horgoš I 10 6 (60) 0 2 (20) 0 0 0 0 0 0 2 (20) 6 (60) 0 2 (20) 0 Ravno Selo 15 5 (33,33) 0 3 (20) 2 (13,33) 2 (13,33) 0 0 1 (6,67) 0 2 (13,33) 8 (53,33) 3 (20) 8 (53,33) 0 Horgoš II 5 0 1 (20) 0 0 3 (60) 0 0 1 (20) 0 0 1 (20) 5 (100) 4 (80) 0 Čonoplja 9 0 0 6 (66,67) 0 0 0 2 (22,22) 0 1 (11,11) 0 0 1 (11,11) 9 (100) 3 (33,33) Čačak 15 0 4 (26,67) 0 0 6 (40) 0 0 0 0 5 (33,33) 0 10 (66,67) 6 (40) 0 ĐurĎevo 15 0 4 (26,67) 4 (26,67) 0 4 (26,67) 0 0 0 0 3 (20) 0 8 (53,33) 8 (53,33) 0 Trstenik 10 0 4 (40) 4 (40) 0 0 0 0 0 0 2 (20) 0 4 (40) 4 (40) 0 B. Palanka 15 3 (20) 0 8 (53,33) 2 (13,33) 0 0 0 0 0 2 (13,33) 5 (33,33) 0 10 (66,66) 0 Senta 20 5 (25) 3 (15) 7 (35) 0 0 0 0 0 0 5 (25) 5 (25) 3 (15) 7 (35) 0 64 Legenda: * broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka) L o k al it et B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana infekcija B ez p ri su st v a te st ir an ih v ir u sa Ukupna zaraza A M V C M V P V Y P V Y + A M V P V Y + C M V A M V + C M V P V Y + P M M o V A M V + P V Y + C M V P V Y + P M M o V + C M V A M V C M V P V Y P M M o V Kraljevo 15 0 0 8 (53,33)* 0 4 (26,67) 0 0 0 0 3 (20) 0 4 (26,67) 12 (80) 0 Smederevo 15 0 7 (46,67) 2 (13,33) 0 6 (40) 0 0 0 0 0 0 13 (86,67) 8 (53,33) 0 InĎija 15 0 0 5 (33,33) 4 (26,67) 4 (26,67) 0 0 0 0 2 (13,33) 4 (26,67) 4 (26,67) 13 (86,67) 0 Aleksinac 14 5 (35,71) 2 (14,29) 2 (14,29) 0 4 (28,57) 0 0 0 0 0 5 (35,71) 6 (42,86) 6 (42,86) 0 Veternik 9 0 0 2 (22,22) 0 6 (66,67) 0 0 1 (11,11) 0 0 1 (11,11) 7 (77,78) 9 (100) 0 UKUPNO: 207 32 (15,46) 32 (15,46) 53 (25,6) 8 (3,85) 39 (18,84) 2 (0,97) 2 (0,97) 3 (1,45) 1 (0,48) 35 (16,91) 45 (21,74) 77 (37,2) 106 (51,21) 3 (1,45) 65 Grafikon 1. Zastupljenost virusa paprike u rasadu 2009. godine Grafikon 2. Zastupljenost pojedinačnih i mešanih infekcija paprike u zaštićenom prostoru 2009. godine Grafikon 3. Zastupljenost pojedinačnih i mešanih infekcija paprike na otvorenom polju 2009. godine 66 5.2.2. Prisustvo virusa u usevu paprike tokom 2010. godine Ispitivanja sprovedena tokom 2010. godine, koja se tiču pregleda rasada paprike na prisustvo virusnih infekcija, obuhvatila su pregled 13 različitih lokaliteta proizvodnje rasada paprika. Rezultati su pokazali da je kao u prethodnoj godini ispitivanja, ustanovljeno prisustvo tri virusa koji se prenose vašima na neperzistentan način: CMV, PVY i AMV. Od ukupno sakupljenih 115 uzoraka, prisustvo virusa dokazano je u 35,65%, dok u 64,35% testiranih uzoraka nije utvrĎeno prisustvo nijednog od ispitivanih virusa (Grafikon 4). Najzastupljeniji virus bio je CMV detektovan u 20,87% testiranih uzoraka. Drugi po zastupljenosti bio je PVY (11,3%), dok je prisustvo AMV utvrĎeno samo kod izuzetno malog broja uzoraka (3,48%) (Tabela 15). Svi detektovani virusi bili su zastupljeni isključivo u pojedinačnoj zarazi. Prisustvo TSWV, TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nije ustanovljeno ni u jednom od ispitivanih uzoraka. Kao i u prethodnoj godini, rezultati testiranja paprike u rasadu, ukazuju na nizak procenat ili odsustvo virusa koji se prenose semenom paprike, kao što su TMV, AMV i PMMoV. Kod ukupno testiranih 141 uzoraka paprike sakupljenih na 14 različitih lokaliteta proizvodnje paprike u zaštićenom prostoru, kao i prethodne godine ustanovljeno je prisustvo četiri virusa, i to tri virusa (PVY, CMV, AMV) koji se prenose vašima na neperzistentan način i TSWV, koji se prenosi tripsima. Na svim pregledanim lokalitetima intenzitet zaraze virusima bio je preko 20-30%. Najzastupljeniji virus, u pojedinačnim ili mešanim zarazama, bio je CMV (36,17%), zatim PVY (31,21%) i AMV (17,73%), dok je TSWV bio detektovan u nešto manjem broju uzoraka (6,38%) (Tabela 16). Kod najvećeg broja uzoraka utvrĎena je pojedinačna zaraza CMV (27,66%), dok je PVY bio zastupljen sa 19,15%, AMV sa 14,18%, TSWV 6,38%. Mešana zaraza PVY i AMV, kao i PVY i CMV je detektovana u 10,64% odnosno 8,51% testiranih uzoraka. Kod 20,57% uzoraka nije utvrĎeno prisustvo nijednog od ispitivanih virusa (Grafikon 5). Prisustvo TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nije dokazano ni u jednom testiranom uzorku. Ispitivanja sprovedena tokom 2010. godine, pregledom različitih lokaliteta proizvodnje paprike na otvorenom polju, konstatovano je prisustvo četiri virusa: PVY, CMV, AMV i PMMoV (Tabela 17). Na svim pregledanim lokalitetima intenzitet zaraze virusima bio je preko 50%. U usevima paprike gajenim na otvorenom polju, od ukupno 67 testiranih 168 uzoraka sa simptomima, ustanovljeno je prisustvo virusa koji se prenose vašima na neperzistentan način sa dominantnim prisustvom CMV (50%) u pojedinačnim i mešanim zarazama. U značajnom broju uzoraka ustanovljeno je prisustvo PVY (40,48%) i AMV (16,67%), dok je prisustvo PMMoV zabeleţeno u ĐurĎevu i Čonoplji u znatno manjem procentu (1,19%). U pogledu pojedinačnih zaraza, najzastupljenije su bile zaraze izazvane CMV (33,33%), zatim PVY (23,81) i AMV (12,5%), dok je PMMoV bio zastupljen u jednom od 168 prikupljenih uzoraka (0,59%). U pogledu mešanih zaraza, detektovane su zaraze dva ili tri virusa. Najčešće je detektovana mešana zaraza dva virusa i to PVY i CMV (13,69%), dok su ostale mešane zaraze PVY i AMV, CMV i AMV dokazane u relativno malom broju uzoraka (1,79%). U jednom od 168 uzoraka (0,59%) zabeleţena je mešana zaraza tri virusa AMV, PVY i CMV, kao i u jednom uzorku mešana zaraza tri virusa PVY, CMV i PMMoV (Grafikon 6). Kod 11,31% testiranih uzoraka nije utvrĎeno prisustvo ispitivanih virusa, što je ukazalo na uključivanje šireg kruga virusa infektivnih za papriku u sledeće preglede useva paprike u Srbiji. Od virusa uključenih u ova ispitivanja, nije utvrĎeno prisustvo TSWV, TMV, PVX, PepMoV i PVMV. 68 Tabela 15. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u rasadu u 2010. godini Legenda: * broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka) Lokalitet Broj uzoraka PVY CMV AMV Bez prisustva testiranih virusa Aleksinac 10 1(10)* 7 (70) 0 2 (20) Bukovac 6 0 2 (33,33) 0 4 (66,67) Ruma 8 2 (25) 0 0 6 (75) Trstenik 12 2 (16,67) 4 (33,33) 0 6 (50) Kula 5 1 (20) 0 0 4 (80) Srbobran 6 0 0 2 (33,33) 4 (66,67) Rimski Sancevi 5 0 2 (40) 0 3 (60) InĎija 11 2 (18,18) 1 (9,09) 0 8 (72,73) Sombor 8 0 3(37,5) 0 5 (62,5) Bačka Palanka 10 1 1 (10) 0 8 (80) Šabac 12 2 (16,68) 1 (8,33) 0 9 (75) Subotica 9 1 (11,11) 1 (11,11) 1 (11,11) 6 (66,67) Bačaka Topola 13 1 (7,69) 2 (15,38) 1 (7,69) 9 (69,23) UKUPNO: 115 13 (11,3) 24 (20,87) 4 (3,48) 74 (64,35) 69 Tabela 16. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u pojedinačnim i mešanim infekcijama u zaštićenom prostoru u 2010. godini Legenda: * broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka) Lokalitet B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana zaraza B ez p ri su st v a te st ir an ih v ir u sa Ukupna zaraza TSWV AMV CMV PVY PVY +AMV PVY +CMV TSWV AMV CMV PVY Pećinci 12 0 2 (16,67)* 5 (41,67) 1 (8,33) 0 0 4 (33,33) 0 2 (16,67) 5 (41,67) 1 (8,33) Lukino Selo 10 4 (40) 0 0 3 (30) 0 2 (20) 1 (10) 4 (40) 0 2 (20) 5 (50) Ţabalj 7 0 0 6 (85,71) 0 0 0 1 (14,29) 0 0 6 (85,71) 0 Ruma 10 0 2 (20) 4 (40) 2 (20) 0 1 (10) 1 (10) 0 2 (20) 5 (50) 3 (30) Šabac 15 3 (20) 0 (0) 4 (26,67) 4 (26,67) 1 (6,67) 0 3 (20) 3 (20) 1 (6,67) 4 (26,67) 5 (33,33) Kać 5 0 0 4 (80) 0 0 1 (20) 0 0 0 5 (100) 1 (20) Valjevo 10 0 2 (20) 1 (10) 3 (30) 1 (10) 0 3 (30) 0 3 (30) 1 (10) 4 (40) Horgoš 15 0 4 (26,67) 4 (26,67) 2 (13,33) 0 1 (6,67) 4 (26,67) 0 4 (26,67) 5 (33,33) 3 (20) Sirig 5 0 2 (40) 0 0 1 (20) 1 (20) 1 (20) 0 3 (60) 1 (20) 2 (40) Uţice 10 0 0 3 (30) 2 (20) 0 3 (30) 2 (20) 0 0 6 (60) 5 (50) Aleksinac 15 0 3 (20) 6 (40) 4 (26,67) 0 0 2 (13,33) 0 3 (20) 6 (40) 4 (26,67) Sombor 15 2 (13,33) 2 (13,33) 2 (13,33) 3 (20) 0 3 (20) 3 (20) 2 (13,33) 2 (13,33) 5 (33,33) 6 (40) Kikinda 7 0 1 (14,29) 0 3 (42,86) 2 (28,57) 0 1 (14,29) 0 3 (42,86) 0 5 (71,43) Smederevo 5 0 2 (40) 0 0 0 0 3 (60) 0 2 (40) 0 0 UKUPNO: 141 9 (6,38) 20 (14,18) 39 (27,66) 27 (19,15) 5 (10,64) 12 (8,51) 29 (20,57) 9 (6,38) 25 (17,73) 51 (36,17) 44 (31,21) 70 Tabela 17. Prisustvo i procentualne zastupljenost virusa paprike u pojedinačnim i mešanim infekcijama na otvorenom polju u 2010. godini Lokalitet B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana zaraza B ez p ri su st v a te st ir an ih v ir u sa Ukupna zaraza A M V C M V P V Y P M M o V P V Y + A M V P V Y + C M V A M V + C M V A M V + P V Y P V Y + P M M o V A M V C M V P V Y P M M o V ĐurĎevo 7 1 (14,29) 0 4 (57,14) 1 (14,29) 0 0 0 0 0 1 (14,29) 1 (14,29) 0 4 (57,14) 1 (14,29) B.Topola 15 4 (26,67) 6 (40)* 0 0 0 3 (20) 0 0 0 2 (13,33) 4 (26,67) 9 (60) 3 (20) 0 Ruma 15 0 9 (60) 2 (13,33) 0 0 0 0 0 0 4 (26,67) 0 9 (60) 2 (13,33) 0 Šabac 10 2 (20) 0 4 (40) 0 1 (10) 1 (10) 0 0 0 2 (20) 3 (30) 1 (10) 6 (60) 0 Horgoš 15 1 (6,67) 8 (53,33) 2 (13,33) 0 0 3 (20) 0 1 (6,67) 0 0 2 (13,33) 12 (80) 6 (40) 0 Kikinda 7 0 5 (71,43) 1 (14,29) 0 0 0 0 0 0 1 (14,29) 0 5 (71,43) 1 (14,29) 0 B. Jarak 10 0 4 (40) 2 (20) 0 0 2 (20) 1 (10) 0 0 1 (10) 1 (10) 7 (70) 4 (40) 0 Čonoplja 15 0 5 (71,43) 7 (46,67) 0 0 2 (13,33) 0 0 1 (6,67) 0 0 8 (53,33) 10 (66,67) 1 (6,67) Smederevo 5 0 0 5 (100) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 (100) 0 Uţice 10 3 (30) 0 0 0 2 (20) 0 0 0 0 5 (50) 5 (50) 0 2 (20) 0 Aleksinac 12 1 (8,33) 7 (58,33) 2 (16,67) 0 0 0 1 (8,33) 0 0 1 (8,33) 2 (16,67) 8 (66,67) 2 (16,67) 0 71 Legenda: * broj zaraţenih uzoraka (procenat infekcije preračunat na osnovu broja testiranih uzoraka Lokalitet B ro j u zo ra k a Pojedinačna zaraza Mešana zaraza B ez p ri su st v a te st ir an ih v ir u sa Ukupna zaraza A M V C M V P V Y P M M o V P V Y + A M V P V Y + C M V A M V + C M V A M V + P V Y P V Y + P M M o V A M V C M V P V Y P M M o V Valjevo 10 2 (20) 3 (30) 3 (30) 0 0 1 (10) 0 0 0 1 (10) 2 (20) 4 (40) 4 (40) 0 Bukovac 10 0 1 (10) 5 (50) 0 0 3 (30) 0 0 0 1 (10) 0 4 (40) 8 (80) 0 Vašica 7 1 (14,29) 1 (14,29) 1 (14,29) 0 0 4 (51,14) 0 0 0 0 1 (14,29) 5 (71,43) 5 (71,43) 0 Rimski Šančevi 10 2 (20) 3 (30) 2 (20) 0 0 2 (20) 1 (10) 0 0 0 3 (30) 6 (60) 4 (40) 0 UKUPNO: 16 8 21 (12,50) 56 (33,33) 40 (23,81) 1 (0,59) 3 (1,79) 23 (13,69) 3 (1,79) 1 (0,59) 1 (0,59) 19 (11,31) 28 (16,67) 84 (50) 68 (40,48) 2 (1,19) 72 Grafikon 4. Zastupljenost virusa paprike u rasadu 2010. godine Grafikon 5. Zastupljenost pojedinačnih i mešanih infekcija paprike u zaštićenom prostoru 2010. godine Grafikon 6. Zastupljenost pojedinačnih i mešanih infekcija paprike na otvorenom polju 2010. godine 73 5.2.3. Rasprostravnjenost virusa paprike i prisustvo virusa na pojedinim sortama Ispitivanjem rasprostranjenosti virusa paprike tokom dve godine, konstatovana je dominantna rasprostranjenost CMV i PVY u odnosu na ostale detektovane viruse (TSWV, AMV i PMMoV). Ispitivanja rasprostranjenosti virusa u rasadu, pokazala su da je 2009. godine CMV bio zastupljen u devet lokaliteta od ukupno pregledanih 15, dok je 2010. godine bio nešto zastupljeniji kada je bio prisutan u deset od pregledanih 13 lokaliteta. PVY je imao daleko veću rasprostranjenost u 2010. godini kada je detektovan u devet lokaliteta u odnosu na 2009. godinu kada bio je detektovan na tri lokaliteta. AMV je u obe godine ispitivanja bio prisutan na malom broju lokaliteta i to 2009. godine na 2, a 2010. na 3 lokaliteta (Grafikon 7 i 8). Tokom 2009. godine, ispitivanje rasprostranjenosti virusa na paprici gajene u zaštićenom prostoru, obuhvatilo je pregled 13 lokaliteta, a 2010. godine 14 lokaliteta. Najrasprostranjeniji virus u 2009. godini bio je PVY, na devet lokaliteta, dok su 2010. godine PVY i CMV bili zastupljeni na istom broju lokaliteta (12). CMV je tokom 2009. godine bio zabeleţen na nešto manjem broju lokaliteta (sedam), dok je AMV u obe godine ispitivanja zauzimao treće mesto i to 2009. godine njegova zastupljenost zabeleţena je na 10 lokaliteta, a 2010. na 5 lokaliteta. TSWV je u obe godine ispitvanja zabeleţen na tri lokaliteta (Grafikon 7 i 8). Tokom 2009. i 2010. godine, ispitivanje rasprostranjenosti virusa na paprici gajene na otvorenom polju, obuhvatilo je pregled 16 lokaliteta. U obe godine ispitivanja najrašireniji virus bio je PVY i to na 14 lokaliteta u 2009. godini i na 16 lokaliteta u 2010. godini. CMV zauzimao je drugo mesto i bio je zastupljen na 13 lokaliteta u obe godine ispitivanja. Tokom 2009. godine PMMoV bio je zabeleţen na jednom, a 2009. godine na dva lokaliteta (Grafikon 7 i 8). 74 Grafikon 7. Rasprostranjenost virusa paprike u 2009. godini Grafikon 8. Rasprostranjenost virusa paprike u 2010. godini Prilikom prikupljanja uzoraka paprike vodilo se računa da budu obuhvaćene različite sorte paprike. U Srbiji je uglavnom zastupljen stari sortiment. Korišćene sorte u izradi ove disretacije nisu prepoznate kao otprone ili tolerantne na viruse. U svetu danas postoje konvencionalnim putem dobijene rezistantne i tolerantne sorte paprike kao i transgene sorte koje jesu rezistentne na viruse (http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Tables/TableList.htm). Analizom rezultata nije uočena značajna razlika u pogledu osetljivosti sorti na prisustvo pojedinih 75 virusa. Jedino što se moţe videti iz analize dobijenih rezultata, je da je samo kod sorte Pinćir i Belladona detektovan TSWV. Kod svih ostalih sorata je konstatovano pribliţno jednako prisustvo CMV, PVY i AMV, s tim sto su Horgoške sorte HS 2, HS 5 i HS 6, sorte namenjene za industrijsku proizvodnju paprike, imale nešto veću prisutnost AMV u odnosu na druge sorte. PMMoV je detektovan na sortama Kalifornijsko čudo i Amfora (Grafikon 9). Amfora, Kalifornijsko čudo, Šorokšari i Slonovo uvo su sorte koje su imale najveći broj mešane zaraze dva ili tri virusa. Grafikon 9. Prisutnost virusa po sortama u 2009. i 2010. godini 5.2.4. Zastupljenost virusa paprike u obe ispitivane godine Ispitivanjem prisustva i rasprostranjenosti virusa paprike tokom dve godine, konstatovano je prisustvo 5 virusa i to: CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV (Tabela 18). Ni u jednoj godini ispitivanja nije utvrĎeno prisustvo TMV, PVX, PepMoV i PVMV. Ispitivanja prisutnosti virusa na paprici u rasadu, pokazala su dominantno prisustvo CMV u obe ispitivane godine. U znatno niţem procentu bili su zastupljeni PVY i AMV, dok TSWV, TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nisu bili detektovani ni u jednoj ispitivanoj godini (Grafikon 10). Tokom 2009. godine, PVY je 76 bio najdominantniji, kako u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru tako i u proizvodnji na otvorenom polju (Grafikon 11). Drugi po zastupljenosti bio je CMV, meĎutim, 2010. godine došlo je do promena, i ovaj virus bio je najzastupljeniji u proizvodnji paprike, kako u zaštićenom prostoru tako i na otvorenom polju, dok je PVY bio prisutan u nešto manjem broju uzoraka (Grafikon 12). Prisustvo AMV ustanovljeno u obe godine ispitivanja kako u zaštićenom prostoru tako i na otvorenom polju, i to 2009. godine bio je četvrti po zastupljenosti, kako u zaštićenom prostoru tako i u polju, dok je 2010. godine njegovo prisustvo dokazano u nešto većem broju uzoraka i zauzimao je treće mesto iza PVY i CMV. TSWV bio je zabeleţen samo u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru kako u 2009. tako i u 2010. godini, s tim što je veća prisutnost ovog virusa zabeleţena u prvoj godini ispitivanja. PMMoV detektovan je samo u proizvodnji paprike u polju i to na manjem broju uzoraka, u obe ispitivane godine. PoreĎenjem učestalosti pojave detektovanih virusa tokom dve godine ispitivanja ustanovljeno je da su se virusi u proizvodnji paprike u rasadu nalazili u pojedinačnim infekcijama. U proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru dominantna je bila pojedinačna zaraza, meĎutim mogla se uočiti i mešana zaraza sa dva virusa, gde je najdominantija mešana zaraza bila izazvana PVY i CMV u obe godine ispitivanja. U prizvodnji paprike u polju takoĎe je dominirala pojedinačna zaraza, meĎutim, pored mešane zaraze dva virusa detektovana je i mešana zaraza tri virusa. I u proizvodnji paprike na otvorenom polju najdominantija mešana zaraza bila je izazvana PVY i CMV u obe godine ispitivanja. 77 Grafikon 10. Zastupljenost virusa paprike u rasadu u 2009. i 2010. godini Grafikon 11. Zastupljenost virusa paprike u zaštićenom prostoru u 2009. i 2010. godini Grafikon 12. Zastupljenost virusa paprike u polju u 2009. i 2010. godini (%) (%) (%) 78 Tabela 18. Prisustvo i procentualna zastupljenost virusa paprike u pojedinačnim i mešanim infekcijama po godinama ispitivanja Tipovi zraze Virus Način gajenja paprike Rasad Zaštićeni prostor Polje 2009. 2010. 2009. 2010. 2009. 2010. P o je d in a čn a z a ra za TSWV 0/121 0% 0/115 0% 30/129 23,26% 9/141 6,38% 0/207 0% 0/168 0% PVY 4/121 3,31% 13/115 11,30% 22/129 17,05% 27/141 19,15% 53/207 25,60% 40/168 23,81% TMV 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 0/207 0% 0/168 0% CMV 22/121 18,18% 24/115 20,87% 22/129 17,05% 39/141 27,66% 32/207 15,46% 56/168 33,33% AMV 3/121 2,48% 4/115 3,48% 16/129 12,40% 20/141 14,18% 32/207 15,46% 21/168 12,50% PMMoV 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 0/207 0% 1/168 0,59% PVX 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 0/207 0% 0/168 0% PepMoV 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 0/207 0% 0/168 0% PVMV 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 0/207 0% 0/168 0% Ukupno 29/121 23,97% 41/115 35,65% 90/129 69,77% 95/141 67,38% 117/207 56,52% 118/168 70,24% M eš a n a za ra za Dva virusa 0/121 0% 0/115 0% 22/129 17,05% 17/141 12,06% 51/207 24,64% 29/168 17,26% Tri virusa 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 4/207 1,93% 2/168 1,19% Ukupno 0/121 0% 0/115 0% 22/129 17,05% 17/141 12,06% 55/207 26,57 31/168 18,45% U k u p n a z a ra za TSWV 0/121 0% 0/115 0% 30/129 23,26% 9/141 6,38% 0/207 0% 0/168 0% PVY 4/121 3,31% 13/115 11,30% 42/129 32,56% 44/141 31,21% 106/207 51,21% 68/168 40,48% CMV 22/121 18,18% 24/115 20,87% 40/129 31,01% 51/141 36,17% 77/207 37,20% 84/168 50,00% AMV 3/121 2,48% 4/115 3,48% 22/129 17,05% 25/141 17,73% 45/207 21,74% 28/168 16,67% PMMoV 0/121 0% 0/115 0% 0/129 0% 0/141 0% 3/207 1,45% 2/168 1,19% 79 5.3. Simptomi virusa paprike Iako je poznato da virusi paprike mogu da izazivaju veoma različite tipove simptoma u zavisnosti od starosti biljke, uslova spoljašnje sredine (naročito temperature), kao i u zavisnosti od soja virusa, postojanje izvesne veze izmeĎu tipa simptoma i detektovanog virusa moguće je samo u pojedinim slučajevima. Prisustvo PVY utvrĎeno je u uzorcima paprike sa raznolikim simptomima, a najčešće u vidu hlorotičnog prosvetljavanja nerava (Slika 11), hlorotičnog prošaravanja listova sa ili bez deformacije mladih listova (Slika 12), nekroze listova, mozaikom u vidu hlorotičnih prstenova i sitnih tamno zelenih površina. Većina biljaka u kojima je dokazano prisustvo PVY bile su krţljave i često ţbunastog izgleda često praćene nekrozom mlaĎih listova, što je upućivalo na rane zaraze u toku vegetacije (Slika 13). Slika 11. PVY: Hlorotično prosvetljavanje nerava 80 Slika 12. PVY: Hlorotično prošaravanje listova Slika 13. PVY: Nekroza mlaĎeg lišća Iako se smatra da nijedan drugi biljni patogen ne izaziva takav niz simptoma kao TSWV, u ovim istraţivanjima prisustvo TSWV ustanovljeno je u uzorcima paprike sa simptomima blagog do izraţenog mozaika (Slika 14). Na nekim biljkama pored mozaika primećena je i hloroza nerava. 81 Slika 14. TSWV: Blagi mozaik na listovima Prisustvo CMV utvrĎeno je u uzorcima paprike sa izraţenim simptomima mozaika i hlorotičnog prošaravanja (Slika 15). Ono što je karakteristično za biljke zaraţene ovim virusom, uz navedene simptome, su i deformacija ili blaga klobučavost listova (Slika 16), kao i izraţena deformacija plodova (Slika 17). Slika 15. CMV: Mozaik i hlorotično prošaravanje listova 82 Slika 16. CMV: Deformacija i blaga klobučavost listova Slika 17. CMV: Deformacija ploda Najčešći simptomi na paprici zaraţenoj virusom AMV su hlorotično beličaste pege različitog oblika i veličine koje se vremenom spajaju, tako da u nekim slučajevima zahvataju i čitave liske (Slika 18). Nešto drugačiji, ali vrlo slični simptomi su rasute bele do ţute tačkice koje mogu prekriti celu lisku (Slika 19). Jedino kod ovog virusa, simptomi na paprici su karakteristični i nisu primećeni kod ispoljavanja simptoma zaraza koje drugi virusi paprike izazivaju. 83 Slika 18a. AMV:Hlorotično beličaste površine na listu Slika 18b. AMV:Hlorotično beličaste površine na listu 84 Slika 19. AMV: Rasute bele do ţute tačkice Simptomi koji su se javljali na paprici zaraţenoj virusom PMMoV, je prošaranost listova tamno zelenim površinama koje su rasute po celoj liski (Slika 20). Slika 20. PMMoV: Prošaranost listova tamno zelenim površinama Mešane zaraze sa dva ili više virusa najčešće su menjale tip kao i intenzitet ispoljavanja simptoma usled sinergističkog delovanja. Izuzetak su biljke u kojima je konstatovana mešana zaraza izazvana PVY i AMV koje su pokazivale simptome tipa hlorotičnog prošaravanja i šarenila listova najčešće praćene prisustvom ţutih površina 85 koje se često javljaju pri pojedinačnim zarazama virusom AMV. Mešana zaraza PVY i CMV odlikuje se kompleksnijom slikom simptoma, zbog čega simptomi gube dijagnostički značaj. Najčešći simptomi koji su se javljali na biljkama su hlorotično prošaravanje liske uz blagu ili jaču deformaciju, ţuto-zeleni mozaik (Slika 21), šarenilo listova, sitne tamno zelene površine na liski uz blago kovrdţanje, kao i nekroza listova uz blagu deformisanost listova (Slika 22). Na plodovima uočena je izraţena nekroza sa ili bez deformisanosti (Slika 23). Mešana infekcija AMV i CMV utvrĎena je kod biljka sa simptomima svetlozelenih površina i deformacije listova (Slika 24). Mešana zaraza PVY, AMV i CMV uglavnom se ispoljavala simptomima hlorotičnog prošaravanja, deformacija i ţutobelih površina. Slika 21. PVY i CMV: Ţutozeleni mozaik Slika 22. PVY i CMV: Nekroza listova uz blagu deformisanost 86 Slika 23: PVY i CMV: Nekroza plodova sa i bez deformacija Slika 24: PVY i AMV: Svetlo zelene površine i deformacija listova Kako je na paprici u našoj zemlji prisutno najmanje pet virusa, u pojedinačnim i mešanim zarazama, uočeni simptomi i njihova veza sa virusom prouzrokovačem imaju samo preliminarni dijagnostički značaj. Mada je u slučaju pojedinačnih zaraza paprike dijagnostički značaj uočenih simptoma veći, ipak postavljanje dijagnoze samo na osnovu simptomatologije nije moguće. Simptomi, koliko god bili izraţeni i karakteristični, ipak samo ukazuju na postojanje zaraze odreĎenim virusom, a konačna tačna dijagnoza moţe se postaviti samo posle odgovarajućih laboratorijskih analiza. 87 5.4. Molekularna detekcija izolata virusa paprike Za molekularnu detekciju i potvrdu rezultata dobijenih na osnovu antigenih osobina, korišćeni su odabrani izolati virusa: CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV koji su detektovani u usevu paprike serološkim analizama. Amplifikacija različitih regiona genoma virusa sa odgovarajućim setom prajmera obavljena je primenom „One–step“ RT–PCR kita, po protokolu proizvoĎača (Qiagen, Germany). Pojava amplikona, prilikom elektroforetskog razdvajanja PCR produkata očekivane veličine smatrana je za pozitivnu reakciju. 5.4.1. Ekstrakcija RNA iz biljnog materijala Ekstrakcija RNA iz lišća prirodno zaraţenih biljaka paprike izvedena je pomoću Rneasy Plant Mini Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany) prema uputstvu proizvoĎača. Tako dobijena i izolovana RNA čuvana je na –80°C. 5.4.2. Molekularna detekcija izolata CMV Molekularna detekcija CMV izvršena je primenom „One–step“ RT–PCR metode korišćenjem prajmera Au1u/Au2d. Kod testiranih uzoraka paprike P-14-09, PL- 43-09, PL-25-09 PL-52-09, sa lokaliteta Velika Plana, Smederevo i Kikinda, uspešno su amplifikovani fragmenti očekivane veličine od oko 850 bp koji obuhvataju ceo gen za protein omotača virusa i delove 5’ i 3’ neprepisujućih regiona. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike i pozitivne kontrole (izolat 746–07 iz paradajza) sa korišćenim markerom (M), kod sva četiri ispitivana izolata ustanovljeno je prisustvo fragmenta očekivane veličine od 847 bp (Slika 25). Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom). 88 847bp Slika 25. Detekcija fragmenata od 847 bp primenom seta prajmera Au1a/Au2d. Kolone: M–MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1– izolat PL-43-09, 2–izolat P-14-09, 3–izolat PL-52-09, 4– izolat PL-25-09, 5-pozitivna kontrola (746-07 iz paradajza), 6 - negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda). 5.4.3. Molekularna detekcija izolata PVY Molekularna detekcija PVY izvršena je primenom „One–step“ RT–PCR metode primenom prajmera PVYc/PVYd koji omogućavaju amplifikaciju dela genoma vezanog za sekvencu 5’ UTR i gena za P1 protein (helper komponenta, HC–Pro). Odabrani su izolati koji su prethodno okarakterisani na serološkom nivou, PL-28-09, PL-3-10, PL- 15-09, PL-108-10 poreklom iz Pećinaca, Srbobrana, Aleksinca i Velike Plane. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike i pozitivne kontrole (izolat 7-06 iz duvana) sa korišćenim markerom (M) kod sva četiri ispitivana izolata došlo je do amplifikacije ciljne sekvence, odnosno dobijen je specifični fragment od 975 bp (Slika 26). Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom). 89 975bp Slika 26. Detekcija fragmenata od 975 bp primenom seta prajmera PVYc/PVYd. Kolone: Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat PL-28-09, 2- izolat PL-3-10, 3- izolat PL-15-09, 4-izolat PL-108- 10, 5- pozitivna kontrola (izolat 7-06 iz duvana), 6- negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) 5.4.4. Molekularna detekcija izolata TSWV Molekularna detekcija TSWV izvršena je primenom „One–step“ RT–PCR metode sa prajmerima L2 TSWV F/L1 TSWV R, koji omogućavaju amplifikaciju fragmenta RdRp gena L RNA TSWV (delimična sekvenca gena za RNA–zavisnu RNA polimerazu), zatim prajmerima TSWVgene F/TSWVgene R i TSWV CP-f/TSWV CP-r, koji omogućavaju amplifikaciju NC (nucleocapsid) gena S RNA. Za ovu analizu odabrani su izolati PL-14-10, PL-60-09, PL-35-09, sa lokaliteta Lukino Selo, ĐurĎevo i Trstenik, koji su prethodno okarakterisani na serološkom nivou. Primenom RT-PCR reakcije uz korišćenje para prajmera L2 TSWV F/L1 TSWV R i poreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih izolata i pozitivne kontrole (izolat 53-05 iz duvana) sa korišćenim markerom (M), za sva tri ispitivana izolata amplifikovan je fragment veličine oko 276 bp. Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom) (Slika 27). 90 267bp Slika 27. Detekcija fragmenata od 276 bp primenom seta prajmera L2 TSWV F/L1 TSWV R. Kolone: M-Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat PL-14-10, 2- izolat PL-35-09, 3- izolat PL-60-09, 4- pozitivna kontrola (53-05 iz duvana), 5 - negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) Primenom para prajmera TSWVgene F/TSWVgene R, koji omogućavaju amplifikaciju NC gena S RNA TSWV i poreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike i pozitivne kontrole (53-05 iz duvana) sa korišćenim markerom (M), utvrĎeno je prisustvo fragmenta očekivane veličine od 800 bp kod izolata PL-35-09. Kod izolata PL-14-10 i PL-60-09, kao i kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom) nije došlo do amplifikacije ciljne sekvence (Slika 28). 91 800bp Slika 28. Detekcija fragmenata od 800 bp primenom seta prajmera TSWVgene F/TSWVgene R. Kolone: M-Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat PL-35-09, 2- izolat PL-14-10, 3- izolat PL-60-09, 4- pozitivna kontrola (53-05 iz duvana), 5 - negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) Primenom para prajmera TSWV CPf /TSWV CPr, koji takoĎe omogućavaju amplifikaciju NC gena i poreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike i pozitivne kontrole (izolat 53-05 iz duvana) sa korišćenim markerom (M), kod sva tri ispitivana uzorka utvrĎeno je prisustvo fragmenta očekivane veličine od 738 bp. Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom) (Slika 29). 92 738bp Slika 29. Detekcija fragmenata od 738 bp primenom seta prajmera CP1 TSWV/CP2 TSWV. Kolone: M-Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat PL-14-10, 2- izolat PL-35-09, 3- izolat PL-60-09, 4- pozitivna kontrola (53-05 iz duvana), 5 - negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) 5.4.5. Molekularna detekcija izolata AMV U odabranim izolatima PL-2-10, P-10-10, P-27-09 iz Pećinaca, Bačke Topole i Velike Plane koji su prethodno okarakterisani na serološkom nivou izvršena je molekularna detekcija AMV primenom „One–step“ RT–PCR uz korišćenje prajmera AMV CP1/AMV CP2. Primenom ovih prajmera došlo je do uspešne amplifikacije regiona genoma koji obuhvata deo gena za protein omotača što je potvrĎeno prisustvom pojedinačnog fragmenta odgovarajuće veličine od 751 bp, kako kod ispitivanih uzoraka tako i kod pozitivne kontrole (Slika 30). Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom). 93 751bp Slika 30. Detekcija fragmenata od 751 bp primenom seta prajmera AMV CP1/AMV CP2. Kolone: M-Marker (O'RangeRulerTM 100bp DNA Ladder (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat PL-2-10, 2- izolat P-10-10, 3- izolat P-27-09, 4- pozitivna kontrola (196-08 iz duvana), 5- negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) 5.4.6. Molekularna detekcija izolata PMMoV Molekularna detekcija PMMoV izvršena je primenom „One–step“ RT–PCR metode sa prajmerima PMR1/PMF1 koji omogućavaju amplifikaciju CP gena virusa i primenom prajmera P12/3/P12/3A koji omogućavaju amplifikaciju delimične sekvence RdRp gena virusa. Odabrani su izolati P-3-10, P-57-09, P-60-09 iz ĐurĎeva i Čonoplje koji su prethodno okarakterisani na serološkom nivou. Za molekularnu detekciju PMMoV izolata iz paprike korišćeni su prajmeri PMR1/PMF1 koji umnoţavaju segment DNK finalne duţine 550 bp koji obuhvata kodirajući gen za proteinski omotač (CP) virusa. Mesto vezivanja PMR1 prajmera je komplementarno pozicijama nukleotida od 6194-6217, a PMF1 prajmera je komplementarno pozicijama nukleotida od 5642-5661. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike sa korišćenim markerom (M), ustanovljeno je da je kod sva tri testirana uzorka dobijen specifični fragment od 550 bp (Slika 31). 94 Pozitivna kontrola nije postojala, a do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom). 550bp Slika 31. Detekcija fragmenata od 474 bp primenom seta prajmera PMR1/PMF1. Kolone: M-Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat P-3-10, 2- izolat P-57-09, 3- izolat P-60-09, 4- negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) Primenom „One–step“ RT–PCR sa prajmerima P12/3/P12/3A, koji omogućavaju amplifikaciju RdRp gena i poreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih uzoraka paprike sa korišćenim markerom (M), ustanovljeno je da je kod sva tri testirana uzorka dobijen specifični fragment od 836 bp (Slika 32). Pozitivna kontrola nije postojala, a do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole (PCR smeša sa RNase free vodom). 95 836bp Slika 32. Detekcija fragmenata od 836 bp primenom seta prajmera P12/3/P12/3A. Kolone: M-Marker (MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania), 1- izolat P-3-10, 2- izolat P-57-09, 3- izolat P-60-09, 4- negativna kontrola (PCR mix bez uzorka, voda) 5.5. Molekularna identifikacija izolata virusa paprike poreklom iz Srbije Odabrani izolati najznačajnijih virusa paprike, za koje je primenom seroloških i molekularnih metoda utvrĎeno da pripadaju TSWV, PVY, CMV, AMV i PMMoV, korišćeni su za sekvencioniranje u cilju njihove identifikacije i čime je omogućeno proučavanje genetičke sličnosti sekvenci ispitivanih izolata virusa paprike poreklom iz Srbije sa izolatima virusa iz drugih delova sveta dostupnih u NCBI bazi podataka. 5.5.1. Molekularna identifikacija izolata CMV Molekularna identifikacija odabranih izolata CMV obavljena je, nakon sekvencioniranja CP regiona, višestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti dobijenih sekvenci sa sekvencama drugih izolata CMV dostupnih u GenBank bazi podataka. Odabrana su tri izolata sa različitih lokaliteta, izolat PL-25-09 (Velika Plana), PL-43-09 (Smederevo) i PL-52-09 (Kikinda). 96 Za sekvencioniranje korišćeni su PCR produkti dobijeni korišćenjem para prajmera Au1u/Au2d koji omogućavaju amplifikaciju CP gena nakon čega je dobijena delimična sekvenca 5’ UTR, sekvenca kompletnog CP gena i delimična sekvenca 3’ UTR subgenomne RNA4. Dobijene sekvence CP gena odabranih izolata (KC288146 za izolat PL-25-09, KC288147 za izolat PL-43-09 i KC288148 za izolat PL-52-09), uporeĎene su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata CMV dostupnih u GenBank bazi podataka. Proračun genetičke sličnosti CP gena, pokazao je visok stepen nukleotidne (98,1-99,7%) i aminokiselinske (98,6-100%) homologije izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona. Proračunom genetičke sličnosti sekvenci izolata dobijenih u ovom radu, utvrĎen je najviši stepen nukleotidne sličnosti izmeĎu izolata PL-43-09 i PL-52-09 (99,5%), izolat PL-52-09 ima stepen identičnosti 99,4% sa izolatom PL-25-09, dok je izmeĎu izolata PL-43-09 i PL-25-09 stepen nukleotidne sličnosti 99,2%. Izolat PL-43-09 ima najviši stepen nukleotidne identičnosti (99,5%) sa izolatom iz duvana iz Amerike (U20668), izolatom Ny iz Australije (U22821), izolatom iz Amerike (D10538) i izolatom iz paradajza iz Španije (AM183119). Izolat PL-25-09 ima 99,7% identičnosti sa izolatom iz duvana iz Amerike (U20668), izolatom Ny iz Australije (U22821), izolatom iz Amerike (D10538) i izolatom 701-09 iz Srbije (GQ340670), dok PL-52-09 ima 99,7% identičnosti sa izolatom iz duvana iz Amerike (U20668), izolatom Ny iz Australije (U22821), izolatom iz Amerike (D10538) (prilog 1). Potpunu identičnost u aminokiselinskoj sekvenci (100%) ispoljili su ispitivani izolati CMV poreklom iz paprike sa većinom izolata odabranih iz NCBI baze podataka (prilog 2). 5.5.2. Molekularna identifikacija izolata PVY Molekularna identifikacija izolata PVY izvršena je višestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti sekvenci odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Za ova ispitivanja odabrana su četiri izolata PL- 28-09 (Velika Plana), PL-3-10 (Pećinci), PL-15-09 (Srbobran) i PL-108-10 (Aleksinac) koji su prethodno okarakterisani na serološkom nivou. Nakon sekvencioniranja fragmenta umnoţenih u PCR reakciji korišćenjem prajmera PVYc/PVYd, dobijene su delimične sekvence 5’ UTR i gena za P1 protein. 97 Dobijene sekvence izolata (KC288142 za izolat PL-28-09, KC288144 za izolat PL-3- 10, KC288143 za izolat PL-15-09 i KC288145 za izolat PL-108-10), uporeĎivane su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata PVY dostupnim u GenBank bazi podataka. MEGA4 softerom izvršen je proračun genetičke sličnosti kako izmeĎu ispitivanih izolata tako i sa drugim izolatima PVY. Upotreba MEGA4 softvera pokazala je 98,8-100% nukleotidne i 98,2-100% aminokiselinske identičnosti ispitivanih izolata sa sekvencama CP gena drugih izolata PVY deponovanih u NCBI bazi podataka. Proračunom genetičke sličnosti sekvenci izolata dobijenih u ovom radu, utvrĎen je najviši stepen nukleotidne sličnosti izmeĎu izolata PL-15-09, PL-108-10 i PL-28-09 (99,9%). Izolat PL-3-10 ima stepen identičnosti 99,3% sa izolatom PL-15-09 dok sa izolatima PL-108-10 i Pl-28-09 ima nešto niţi stepen identičnosti od 99,1%. IzmeĎu izolata PL-108-10 i PL-28-09 stepen nukleotidne sličnosti je 99,7%. Najviši stepen nukleotidne identičnosti ispitivani izolati pokazali su sa izolatom Sl 64 (AF401604) iz krompira poreklom iz Slovenije, izolatom D35-06 (GQ290475) iz duvana poreklom iz Srbije i izolatom 38MYPVY (HQ335258) iz krompira iz Kolumbije. Izolat PL-3-10 pokazao je 99,3% nukleotidne identičnosti sa svim navedenim izolatima, izolat PL-15- 09 100%, dok su izolati PL-108-10 i PL-28-09 pokazali 99,9% nukleotidne identičnosti (prilog 3). Sa većinom odabranih izolata iz NCBI baze padataka, ispitivani izolati pokazuju visok stepen homologije aminokiselinskih sekvenci, i to 99,6% izolati PL-3- 10, PL-28-09, PL-108-10, a izolat PL-15-09 poseduje 100% homologije sa većinom odabranih izolata (prilog 4). 5.5.3. Molekularna identifikacija izolata TSWV Višestrukim uparivanjem sekvenci ispitivanih izolata dobijenih sekvencioniranjem CP regiona genoma ovog virusa sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti primenom MEGA4 softvera, izvršena je molekularna identifikacija odabranih izolata virusa bronzavosti paradajza iz paprike poreklom iz Srbije. Za ova ispitivanja odabrana su tri izolata, PL-14-10 (Lukino Selo), PL-60-09 (ĐurĎevo) i PL-35-09 (Trstenik). Nakon sekvencioniranja PCR produkta dobijenog korišćenjem para prajmera TSWV CP-f/TSWV CP-r koji omogućavaju amplifikaciju CP gena, dobijene delimične 98 sekvence CP gena odabranih izolata (KC182564 za izolat PL-14-10, KC182566 za izolat PL-60-09 i KC182565 za izolat PL-35-09) uporeĎene su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata TSWV dostupnih u GenBank bazi podataka korišćenjem MEGA4 softvera. MEGA4 softver pokazao je visok stepen nukleotidne homologije (98,7-100%) odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata TSWV dostupnim u NCBI bazi podataka, kao i visok stepen aminokiselinske sličnosti (97,8-100%). Na osnovu proračuna genetičke sličnosti izmeĎu samih ispitivanih izolata utvrĎeno je da izolati meĎu sobom imaju 99,7% sličnosti nukleotidne sekvence. Najviši stepen nukleotidne identičnosti sva tri izolata imaju sa izolatom Sr-603 iz paradajza iz Srbije (GU369723). PL-60-09 ima 100% identičnosti sa ovim izolatom dok izolati PL-14-10 i PL-35-09 99,7% (prilog 5). Stepen aminokiselinske homologije izmeĎu ispitivanih izolata i odabranih izolata iz NCBI baze podataka iznosio je 100% (izolati PL-60-09 i PL-35-09) i 99,6% (izolat PL-14-10) sa izolatima iz Srbije: Sr-603 iz paradajza (GU369723), 240- 09 iz tikve (JF303081), 236-09 iz tikve (JF303080), Is-56 iz duvana (GU369729), 53-05 iz duvana (GQ373173), 33-06 iz duvana (GQ355467), i izolatom iz duvana poreklom iz Holandije (D13926) (prilog 6). 5.5.4. Molekularna identifikacija izolata AMV Nakon sekvencioniranja CP regiona genoma AMV, molekularna identifikacija odabranih izolata obavljena je, višestrukim uparivanjem dobijenih sekvenci sa sekvencama drugih izolata AMV dostupnih u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti primenom MEGA4 softvera. Za sekvencioniranje odabrana su tri izolata, PL-2-10 (Pećinci), P-10-10 (Bačka Topola) i P-27-09 (Velika Plana). Sekvencioniranjem fragmenata dobijenih u PCR reakciji korišćenjem para prajmera CP AMV1/CP AMV2 dobijene su delimične sekvence CP gena i 3’ UTR subgenomne RNA4. Dobijene sekvence CP gena odabranih izolata (KC182569 za izolat PL-2-10, KC182567 za izolat P-10-10 i KC182568 za izolat P-27-09) uporeĎene su sa dostupnim sekvencama drugih izolata AMV u GenBank bazi podataka. Proračun genetičke sličnosti CP gena, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,5-100%) i aminokiselinske (97,5-100%) homologije izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona. Proračunom genetičke sličnosti sekvenci izolata 99 dobijenih u ovom radu, utvrĎen je najviši stepen nukleotidne sličnosti izmeĎu izolata P- 10-10 i PL-2-10 (99,6%). Izolat P-27-09 ima stepen identičnosti 99,2% sa izolatom PL- 2-10, dok izmeĎu izolata P-10-10 i P-27-09 stepen nukleotidne sličnosti je 98,7%. Najviši stepen nukleotidne identičnosti izolati P-10-10 i PL-2-10 pokazali su sa izolatom 196-08 (FJ 527749) iz duvana iz Srbije (100% i 99,6%), dok je izolat P-27-09 pokazao najviši stepen identičnosti (98,7%) sa izolatom 196-08 (FJ 527749) iz duvana iz Srbije, izolatom No.14 (AB451173) iz krompira iz Japana, izolatom NY-B 2002 iz pasulja (AY340071) poreklom iz Amerike, izolatom NZ34 iz graška (AF215664) poreklom iz Novog Zelanda i izolatom iz duvana (M59241) poreklom iz Holandije (prilog 7). Potpunu homologiju u aminokiselinskoj sekvenci (100%) ispoljili su ispitivani izolati AMV iz paprike poreklom iz Srbije sa izolatom 196-08 iz duvana iz Srbije (FJ527749), izolatom Hz iz duvana iz Kine (HQ316637), izolatom No.14 iz krompira iz Japana (AB451173), izolatom TN iz soje iz Amerike (HQ185568), izolat iz duvana iz Holandije (M59241) i izolatom S-30 iz lucerke iz Australije (HM807305) (prilog 8). 5.5.5. Molekularna identifikacija izolata PMMoV Molekularna identifikacija PMMoV izvršena je višestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti sekvenci odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata PMMoV dostupnih u GenBank bazi podataka. Za ova ispitivanja odabrana su tri izolata P-3-10 (ĐurĎevo), P-57-09 (Čonoplja) i P-60-09 (Čonoplja). Sekvencioniranjem fragmenta umnoţenih u PCR reakciji korišćenjem prajmera PMR1/PMF1 koji omogućavaju amplifikaciju CP gena dobijene su kompletne sekvence CP gena i 3’UTR i 5’ UTR subgenomne RNA. Dobijene sekvence izolata PMMoV (KC288149 za izolat P-3-10, KC288150 za izolat P-57-09 i KC288151 za izolat P-60- 09), uporeĎene su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Proračun genetičke sličnosti CP gena izmeĎu ispitivanih izolata i izolata PMMoV dostupnih u NCBI bazi podataka iz različitih geografskih regiona, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,5-100%) i aminokiselinske (98,5-100%) homologije. Proračunom genetičke sličnosti sekvenci dobijenih u ovom radu utvrĎeno je da izolat P- 60-09 ima 99,5% nukleotidne sličnosti sa izolatom P-3-10 i P-57-09, dok za izolate P-3- 100 10 i P-57-09 nisu utvrĎene razlike u nukleotidnoj sekvenci CP gena. Najviši stepen identičnosti, 100% za izolat P-60-09, odnosno 99,5% za izolate P-3-10 i P-57-09, odabrani izolati PMMoV iz paprike poreklom iz Srbije pokazali su sa MaĎarskim izolatima Sz24 (AM491598), Sz17 (AM491596), Sz15 (AM491595), Sz13 (AM491594), Sz23 (AM491601) iz paprike, izolatom P91/2 iz paprike (FR671383) iz Španije, izolatom AY632863 iz Kine, izolatom PMMV1.2 (AJ429088) iz Italije, izolatom iz paprike LinsBR08 (AM411433) iz Brazila, izolatima iz prehrambenih proizvoda MRS-PV3p-RP-22 i MRS-PV3p-CyP-54 (GQ427044, GQ427043) iz Francuske (prilog 9). Potpunu identičnost u aminokiselinskoj sekvenci (100%) ispitivani izolati PMMoV ispoljili su sa svim izolatima odabranih iz NCBI baze podataka, osim sa izolatom L4BV iz paprike iz Japana (AB276030) (prilog 10). Nakon sekvencioniranja fragmenata umnoţenih u PCR reakciji korišćenjem prajmera koji omogućavaju amplifikaciju RdRp gena (P12/3/P12/3A) dobijene su delimične sekvence RdRp gena ispitivanih izolata. Dobijene sekvence izolata PMMoV (KC288154 za izolat P-3-10, KC288152 za izolat P-57-09 i KC288153 za izolat P-60- 09), uporeĎene su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata PMMoV dostupnih u GenBank bazi podataka. Proračun genetičke sličnosti CP gena izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,1-99,7%) i aminokiselinske (93,3-99,2%) homologije. Proračunom genetičke sličnosti sekvenci dobijenih u ovom radu utvrĎeno je da izolat P-60-09 ima 99,4% nukleotidne sličnosti sa izolatom P-3-10 i P-57-09, dok za izolate P-3-10 i P-57-09 nisu utvrĎene razlike u nukleotidnoj sekvenci RdRp gena. Najviši stepen nukleotidne identičnosti (P-60-09 99,7%, P-3-10 i P-57-09 99,4%) ispitivani izolati su pokazali sa izolatima L4BV (AB276030) i Iw (AB254821) iz paprike iz Japana i KR iz paprike (AB126003) poreklom iz Koreje (prilog 11). Najveći stepen homologije aminokiselinskih sekvenci, ispitivani izolati ispoljavaju sa izolatom Iw iz paprike poreklom iz Japana (AB254821), i to izolati P-57-09 i P-3-10 98,7%, a izolat P-60-09 99,6% (prilog 12). 101 5.6. Molekularna karakterizacija najznačajnijih virusa paprike u Srbiji Dobijene sekvence uparene su sa odgovarajućim odabranim sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka i rekonstruisano je filogenetsko stablo Maximum Parsimony metodom i bootstrap analizom sa 1 000 ponavljanja integrisanog unutar MEGA 4 programa. Filogenetska analiza uraĎena je na osnovu delimične sekvenca CP gena izolata TSWV, AMV i CMV, delimične nukleotidne sekvence gena za P1 protein izolata PVY, kompletne sekvence CP gena izolata PMMoV. Za ova ispitivanja korišćene su sekvence sledećih izolata poreklom iz Srbije: PL-14-10, PL-35-09 i PL-60-09 koji pripadaju virusu bronzavosti paradajza, sekvence izolata PL-2-10 , P-10-10 i P-27-09 virusa mozaika lucerke, sekvence izolata PL-28-09, PL-3-10, PL-15-09 i PL-108-10 virusa crtičastog mozaika krompira, sekvence izolata PL-43-09, PL-52-09 i PL-25-09 virusa mozaika krastavca i sekvence izolata P-3-10, P- 57-09 i P-60-09 virisa šarenila paprike. 5.6.1. Filogenetska analiza sekvenci CMV Delimične sekvence CP gena tri izolata CMV iz paprike poreklom iz Srbije, koje su deponovane u NCBI bazi podataka i 35 sekvenci odabranih izolata CMV, meĎusobno su uparene, izvršeno je njihovo poreĎenje i rekostruisano je filogenetsko stablo (Maximum Parsimony metod). Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence duţine 657 bp (Slika 33), pokazalo je razdvajanje odabranih izolata CMV u dve podgrupe I i II. Najveći broj izolata CMV, kao i ispitivani izolati, pripadaju podgrupi I. Proračunom genetičke sličnosti utvrĎen je stepen nukleotidne sličnosti naših izolata i izolata prikazanih u filogenetskom stablu, od 70,1% do 99,7% (prilog 13), dok je stepen aminokiselinske sličnosti iznosio od 79,1% do 100% (prilog 14). Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe II (0,011±0,002), dok je varijabilnost u okviru podgrupe Ia bila nešto veća (0,016±0,002). Najveća varijabilnost zabeleţena je unutar podgrupe Ib (0,067±0,006). Intergrupna varijabilnost izmeĎu 102 podgrupa Ia i Ib bila je 0,068±0,007. IzmeĎu podgrupe Ia i grupe II varijabilnost je bila 0,284±0,023, dok je izmeĎu podgrupe Ib i grupe II varijabilnost bila 0,285±0,022 (Tabela 19). Tabela 19. Proračun genetičke udaljenosti sekvenci unutar i izmeĎu klastera CMV izolata (Ia) (Ib) (II) (Ia) 0,016±0,002 (Ib) 0,068±0,007 0,067±0,006 (II) 0,284±0,023 0,285±0,022 0,011±0,002 103 Slika 33. Maximum Parsimony stablo rekonstruisano na osnovu delimične sekvence gena za P1 protein 38 izolata CMV. Filogenetsko stablo je rekonstruisano korišćenjem programa MEGA verzija 4.0 i bootstrap analize sa 1000 ponavljanja. 104 5.6.2. Filogenetska analiza sekvenci PVY Delimične sekvence gena za P1 protein četiri izolata PVY iz paprike poreklom iz Srbije, koje su deponovane u NCBI bazi podataka i 34 sekvenci odabranih izolata PVY iz različitih regiona širom sveta, meĎusobno su uparene, izvršeno je njihovo poreĎenje i rekostruisano je filogenetsko stablo (Maximum Parsimony metod) (Slika 34). Filogenetska analiza nukleotidnih sekvenci ovog dela genoma pokazuje da su odabrani izolati grupisani u tri jasno odvojene grupe ili klastere, pri čemu prva grupa odgovara nekrotičnim sojevima (PVYN i PVYNTN), a druge dve PVYO i PVYC soju. U okviru PVY N /PVY NTN klastera uočavaju se dva sub–klastera koja su u saglasnosti sa geografskim poreklom izolata: (ia) izolati nekrotičnih sojeva poreklom iz Evrope i (ib) izolati nekrotičnih sojeva poreklom iz Amerike. Mada se izolati uglavnom grupišu u skladu sa geografskim poreklom ima i nekoliko izuzetaka, tako u okviru sub–klastera izolata nekrotičnih sojeva PVY poreklom iz Evrope (Srbija, Slovenija, Francuska, Švajcarska, Nemačka i Velika Britanija) grupiše se i izolat iz Kanade (Tu–648) i izolati iz USA (423–3 i PB312), dok se u okviru izolata nekrotičnih sojeva poreklom iz Amerike nalaze i dva izolata iz Velike Britanije (PVY N–Ru i PVYN–English AJ315747). Rezultati filogenetske analize pokazuju da se ispitivani izolati poreklom iz Srbije nalaze u okviru sub–klastera PVYN/PVYNTN izolata poreklom iz Evrope. Proračunom genetičke sličnosti utvrĎen je stepen nukleotidne sličnosti ispitivanih izolata i izolata prikazanih u filogenetskom stablu od 60,7% do 100% (prilog 15), dok je stepen aminokiselinske sličnosti iznosio od 50,7% do 100% (prilog 16). Proračunom genetičke udaljenosti sekvenci u okviru izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar sub-klastera (ia) (0,010±0,002) i (ib) (0,019±0,003) dok je varijabilnost u okviru drugih grupa bila nešto veća, 0,046±0,005 unutar klastera (iii) i 0,141±0,011 unutar klastera (ii). Varijabilnost izmeĎu grupa bila je najveća izmeĎu klastera (ia) i (ii) i (ib) i (ii) (0,374±0,026), a nešto manja izmeĎu klastera (ia) i (iii) i (ib) i (iii) (0,361±0,027, 0,361±0,026). IzmeĎu klastera (ii) i (iii) varijabilnost je bila 0,205±0,015. Najmanja intergrupna varijabilnost bila je izmeĎu klastera (ia) i (ib) (0,087±0,010) (Tabela 20). 105 Tabela 20. Proračun genetičke udaljenosti sekvenci u okviru i izmeĎu klastera PVY izolata (ia) (ib) (ii) (iii) (ia) 0,010±0,002 (ib) 0,087±0,010 0,019±0,003 (ii) 0,374±0,026 0,374±0,026 0,141±0,011 (iii) 0,361±0,027 0,361±0,026 0,205±0,015 0,046±0,005 Legenda: (ia)–izolati PVYN/PVYNTN soja poreklom iz Evrope; (ib)–izolati PVY N /PVY NTN soja poreklom iz Amerike; (ii)–izolati PVYC soja; (iii)–izolati PVYO soja 106 Slika 34. Maximum Parsimony stablo rekonstruisano na osnovu delimične sekvence gena za P1 protein 38 izolata PVY. Filogenetsko stablo je rekonstruisano korišćenjem programa MEGA verzija 4.0 i bootstrap analize sa 1 000 ponavljanja. 107 5.6.3. Filogenetska analiza sekvenci TSWV Za filogenetsku analizu TSWV na osnovu CP gena, odabrane su sekvence tri izolata TSWV iz paprike poreklom iz Srbije, koje su deponovane u GenBank bazu podataka i 30 sekvenci izolata TSWV iz različitih regiona širom sveta. MeĎusobno uparivanje, skraćivanje, njihovo poreĎenje i rekonstruisanje filogenetskog stabla (Maximum Parsimony) uraĎeno je korišćenjem programa integrisanog u programu MEGA verzija 4.0. iz 632 bp fragmenta NC gena. Filogenetska analiza pokazala je postojanje šest klastera, odnosno šest geografskih subpopulacija: (i) izolati poreklom iz Evrope (većina evropskih izolata), (ii) izolati iz Japana, (iii) izolati iz Španije, (iv) izolati sa Havaja, (v) izolati iz Kalifornije (vi) izolati iz Dţordţije i Severne Karoline. U klasteru (i) sa izolatima iz Evrope grupisala su se i dva izolata iz Severne Karoline (NC–1 i NC–3) i izolati iz Juţne Afrike (98/0472 i TSWV–GP), a u klasteru (iii) sa izolatima iz Španije nalazi se T304 izolat iz Italije. Rezultati filogenetske analize pokazuju da se izolati TSWV poreklom iz paprike iz Srbije grupišu sa većinom evropskih izolata u klasteru (i) (Slika 35). Proračunom genetičke sličnosti utvrĎen je visok stepen nukleotidne sličnosti ispitivanih izolata i izolata prikazanih u NC filogenetskom stablu, od 95,4% do 99,8% (prilog 17), dok je stepen aminokiselinske sličnosti iznosio od 88,2% do 99,5% (prilog 18). Proračunom genetičke udaljenosti sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar klastera (v) (0,002±0,002), dok je varijabilnost u okviru drugih grupa bila nešto veća, 0,008±0,004 unutar klastera (iv), 0,010±0,003 unutar klastera (ii), 0,011±0,002 unutar klastera (i), 0,011±0,003 unutar klastera (iii) i 0,012±0,003 unutar klastera (vi). Intergrupna varijabilnost bila je najveća izmeĎu klastera (ii) i (vi) (0,040±0,007) dok je najmanja intergrupna varijabilnost bila je izmeĎu klastera (ii) i (iii) (0,003±0,006) (Tabela 21). 108 Tabela 21. Prosečne vrednosti genetičke sličnosti unutar i izmeĎu klastera (i) (ii) (iii) (iv) (v) (vi) (i) 0,011±0,002 (ii) 0,029±0,005 0,010±0,003 (iii) 0,029±0,006 0,003±0,006 0,011±0,003 (iv) 0,027±0,005 0,027±0,006 0,013±0,003 0,008±0,004 (v) 0,028±0,006 0,028±0,006 0,015±0,004 0,010±0,003 0,002±0,002 (vi) 0,038±0,006 0,040±0,007 0,025±0,005 0,021±0,005 0,019±0,005 0,012±0,003 Legenda: (i) - izolati poreklom iz Evrope (većina evropskih izolata), (ii) - izolati iz Japana, (iii) - izolati iz izolati iz Španije, (iv) - izolati sa Havaja, (v) - izolati iz Kalifornije (vi) - izolati iz Dţordţije i Severne Karoline. Slika 35. Maximum Parsimony stablo rekonstruisano na osnovu delimične sekvence NC gena 33 izolata TSWV. Filogenetsko stablo je rekonstruisano korišćenjem programa MEGA verzija 4.0 i bootstrap analize sa 1 000 ponavljanja. 109 5.6.4. Filogenetska analiza sekvenci AMV Delimične sekvence CP gena tri izolata AMV iz paprike poreklom iz Srbije, koje su deponovane u GenBank bazi podataka i 26 sekvenci odabranih izolata AMV meĎusobno su uparene, izvršeno je njihovo poreĎenje Maximum Parsimony metodom i rekostruisano je filogenetsko stablo. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence duţine 600 bp pokazuje izdvajanje četiri klastera, odnosno grupisanje izolata AMV u četiri genetička soja, nezavisno od geografskog porekla i biljke domaćina (Slika 36). Većina izolata, dva iz Koreje (KR1 i KR2), dva iz Amerike (425 Medison i 425 Leiden) i po jedan iz Italije (Danza), Kanade (Ca 175) Velike Britanije (S), Australije (N20) i Novog Zelanda NZ34) izdvojila se u grupu I. TakoĎe u ovu grupu spadaju i tri izolata AMV iz paprike poreklom iz Srbije (P-27-9, PL-2-10 i P-10-10) zajedno sa još jednim izolatom iz Srbije (196-08). Drugu molekularnu grupu čine sedam izolata iz Kanade (Ca518, Ca401, Ca399, Ca400, Ca375, Ca508, Ca616). Izolati iz Italije (F-430, 126A, 195-AN) čine treću molekularnu grupu, dok su se četiri izolata iz Francuske (Caa-1, Dac16, Lyh-1, Lye-80) i dva izolata iz Velike Britanije (VRU, 15/64) izdvojili u četvrtu grupu. Proračunom genetičke sličnosti utvrĎen je stepen nukleotidne sličnosti izolata prikazanih u filogenetskom stablu, od 93,7% do 99,5% (prilog 19), dok je stepen aminokiselinske slicnosti iznosio od 93% do 100% (prilog 20). Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe (ii) (0,009±0,002), dok je varijabilnost u okviru drugih grupa bila nešto veća, 0,018±0,004 unutar grupe (iii), 0,021± 0,003 unutar grupe (i) i 0,021±0,004 unutar grupe (iv). Intergrupna varijabilnost bila je najveća izmeĎu grupa (i) i (iv) kao i izmeĎu (ii) i (iv) (0,057±0,008), zatim izmeĎu grupa (iii) i (iv) (0,056±0,008), (i) i (iii) (0,031±0,005), a nešto manja izmeĎu grupa (i) i (ii) kao i izmeĎu (ii) i (iii) (0,025±0,004) (Tabela 22). 110 Tabela 22. Proračun genetičke udaljenosti sekvenci unutar i izmeĎu klastera AMV izolata (i) (ii) (iii) (iv) (i) 0,021±0,003 (ii) 0,025±0,004 0,009±0,002 (iii) 0,031±0,005 0,025±0,004 0,018±0,004 (iv) 0,057±0,008 0,057±0,008 0,056±0,008 0,021±0,004 111 Slika 36. Maximum Parsimony stablo rekonstruisano na osnovu delimične sekvence CP gena 29 izolata AMV. Filogenetsko stablo je rekonstruisano korišćenjem programa MEGA verzija 4.0 i bootstrap analize sa 1 000 ponavljanja. 112 5.6.5. Filogenetska analiza sekvenci PMMoV Delimične sekvence CP gena tri izolata PMMoV iz paprike poreklom iz Srbije, deponovane u GenBank bazi podataka i 33 sekvenci odabranih izolata PMMoV iz različitih regiona sveta, meĎusobno su uparene, izvršeno je njihovo poreĎenje i rekostruisano je filogenetsko stablo (Maximum Parsimony metod). Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence CP gena duţine 550 bp, pokazalo je razdvajanje odabranih izolata PMMoV u dva klastera, pri čemu prva grupa odgovara izolatima koji izazivaju hipersenzitivnu reakciju (HR) na paprici i koje su nosioci L 3 rezistentnog gena, a drugu grupu čine izolati koji ne poseduju ovu osobinu. Ispitivani izolati iz Srbije grupišu se u prvi klaster (Slika 37). Proračunom genetičke sličnosti utvrĎen je stepen nukleotidne sličnosti izolata PMMoV prikazanih u filogenetskom stablu, od 93,1% do 100% (prilog 21), dok je stepen aminokiselinske sličnosti iznosio od 96,8% do 100% (prilog 22). Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, manja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe (ii) (0,010±0,004), dok je varijabilnost u okviru prve grupe bila nešto veća, 0,016±0,003. Intergrupna varijabilnost izmeĎu grupa (i) i (ii) bila 0,060±0,010 (Tabela 23). Tabela 23. Proračun genetičke udaljenosti sekvenci unutar i izmeĎu klastera PMMoV izolata (i) (ii) (i) 0,016±0,003 (ii) 0,060±0,010 0,010±0,004 Legenda: (i)– izolati koji izazivaju HR reakciju na paprici koje su nosioci L3 rezistentnog gena; (ii)– izolati koji ne izazivaju HR reakciju na paprici koje su nosioci L3 rezistentnog gena 113 Slika 37. Maximum Parsimony stablo rekonstruisano na osnovu delimične sekvence CP gena 36 izolata PMMoV. Filogenetsko stablo je rekonstruisano korišćenjem programa MEGA verzija 4.0 i bootstrap analize sa 1 000 ponavljanja. 114 6. DISKUSIJA Brojne biljne bolesti mogu da smanje ili ugroze uspešnu proizvodnju paprike ometajući normalan razvoj biljke i umanjujući prinos i kvalitet plodova. Zbog značajnih šteta koje često prouzrokuju, viroze paprike su predmet proučavanja mnogih autora u svetu (Marchoux et al., 1991; Arli-Sokmen et al., 2005; Choi et al., 2005a; Ozaslan et al., 2006). UtvrĎeno je dа više od 45 rаzličitih virusа moţe dа zаrаzi pаpriku, аli se smаtrа dа je meĎu njimа svegа nekoliko ekonomski znаčаjno (Green and Kim, 1990). Prvа proučаvаnjа virusа pаprike u Srbiji bilа su vezаnа zа Tobacco mosaic virus (virus mozika duvana, TMV) (Pаnjаn i Prpić, 1955), Cucumber mosaic virus (virus mozaika krastavca, CMV) i Alfalfa mosaic virus (virus mozaika lucerke, AMV) (Šutić, 1959; Delević, 1963). Prvi podaci o prisustvu Tomato spotted wilt virus (virus bronzavosti paradajza, TSWV) na paprici u Srbiji potiču iz 1998. godine (Mijatović i sar., 1999). Od tada je praćenjem simptoma, primećena sve učestalija pojava ovog virusa na različitim biljkama domaćinima, što govori o njegovom progresivnom širenju. Dosаdаšnjа mаlobrojnа proučаvаnjа utvrdilа su prisustvo sledećih virusа: TSWV, CMV, Potato virus Y (virus crtičastog mozaika krompira, PVY), AMV, TMV, Pepper mild mottle virus (virus blagog šarenila paprike, PMMoV), Pepper mottle virus (virus šarenila paprike, PepMoV) i Pepper veinal mottle virus (virus šarenila nerava paprike, PVMV) (Mijаtović, 1986; Krstić i sar., 1996, 2005; Mijаtović i sаr., 1999, 2002, 2005). Prvih pet virusа ekonomski su znаčаjni u proizvodnji pаprike u Srbiji, а ostаlа tri se jаvljаju sporаdično (Mijаtović i sаr., 2007; Krstić i Bulаjić, 2008). Juna 2002. godine u plastenicima u okolini Beograda, zabeleţeni su na lišću paprike simptomi hlorotičnih i nekrotičnih šara, bez deformacije liski, a iz plodova sa ovakvim simptomima primenom molekularnih metoda je identifikovan TSWV (Dukić i sar., 2002a). U većem broju lokaliteta u Srbiji prisustvo virusa je dokazano 2005. i 2006. godine na paradajzu, paprici, duvanu i mnogobrojnim vrstama ukrasnih biljaka (Krstić i sar., 2005; Krstić i Bulajić, 2007). Kako se poslednjih godina oboljenje koje ovaj virus izaziva javljalo u sve većim razmerama, Dukić i sar. (2002a) su pristupili molekularnoj karkterizaciji TSWV izolata paprike iz naše zemlje. Istrаţivаnjа u Srbiji sprovedenа 2007. godine nа devet lokаlitetа gаjenjа pаprike pokаzаlа 115 su prisustvo virusа iz dve osnovne grupаcije: kаrаntinski (TSWV) i ekonomski štetni (CMV, AMV i TMV) (Tomić i sаr., 2007). Pregledom proizvodnje rasada i useva paprike u različitim lokalitetima gajenja kako u zaštićenom prostoru, tako i na otvorenom polju zabeleţena je pojava niza simptoma koji su upućivali na virusnu zarazu i koji su varirali u zavisnosti od starosti biljke domaćina, vremena ostvarene infekcije i vrste virusa. Procenjena učestalost virusnih infekcija, u pregledanim lokalitetima proizvodnje paprike u rasadu tokom 2009. i 2010. bila je od 5% do 10%, u lokalitetima proizvodnje paprike u zaštićenom prostoru od 20% do 40%, dok je u lokalitetima proizvodnje paprike na otvorenom polju bila preko 50%. Simptomi na biljkama u rasadu bili su slabo izraţeni, usled čega obolele biljke nisu mogle, sa sigurnošću, biti razlikovane od zdravih. Ipak, tokom ovih istraţivanja, na odreĎenom broju biljaka uočeni su simptomi u vidu blagog mozaika i hloroze lišća, nekrotičnih lezija kao i različite deformacije liske. Pregledom useva paprike u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju zabeleţena je pojava biljaka koje su često zaostajale u porastu ili ţbunastog izgleda. Lišće obolelih biljaka, bilo je sitnije, slabo naborano, a često sa različitim tipovima mozaika, od blagog do jako izraţenog, sa mozaičnim šarama ţućkaste boje i hlorotičnim površinama koje kasnije zahvataju ceo list, često su se javili i simptomi nekroze nerava lista i nekrotičnih pega na stablu. Na plodovima, koji su bili krţljavi, deformisani i sa nekrozom površinskog tkiva, često su bile prisutne i linearne beličaste ili ţućkaste pruge i prošaravanja. Identični ili slični simptomi uočeni tokom ovih istraţivanja zabeleţeni su i u ranijim ispitivanjima viroza paprike u našoj zemlji (Krstić i Bulajić, 2008; Mijatović i sar., 2007; Tomić i sar., 2007). 6.1. Serološka identifikacija virusa paprike DAS-ELISA test korišćenjem poliklonalnih antitela, najčešće je korišćena metoda za rutinsku detekciju virusa paprike (Mijatović, 1999; Chatzivassiliou et al., 2000; Rusevski, 2001; Kim et al., 2004; Krstić i sar., 2005). Na osnovu rezultata dobijenih serološkim testiranjem korišćenjem DAS-ELISA testa u toku ovih istraţivanja u usevu paprike u našoj zemlji ustanovljeno je prisustvo pet virusa: CMV, PVY, TSWV, AMV i 116 PMMoV čija se učestalost po godinama i lokalitetima menjala. Ni u jednoj godini ispitivanja nije utvrĎeno prisustvo TMV, PVX, PepMoV i PVMV. Ispitivanja rasprostranjenosti virusa u rasadu, pokazala su da je najrašireniji virus kako 2009. tako i 2010. godine bio CMV, dok je PVY imao je neznatno manju rasprostranjenost u obe godine isptitvanja. Kod gajenja paprike u zaštićenom prostoru najrasprostranjeniji virus u 2009. godini bio je PVY, dok su 2010. godine PVY i CMV bili zastupljeni na istom broju lokaliteta. PVY bio je najrasprostranjeniji virus i na paprici gajenoj na otvorenom polju u obe godine ispitivanja, dok je CMV zauzimao drugo mesto. Zitter and Florini (1984) navode da je CMV najvaţnije virusno oboljenje paprike rasprostranjeno u celom svetu, a da je PVY najzastupljeniji virus na biljkama iz porodice Solanaceae. U ovim istraţivanjima, najčešće detektovani virusi u 2009. i 2010. godini bili su CMV i PVY, kako u proizvodnji paprike u rasadu tako i u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju. Na osnovu prethodnih i u ovom radu obavljenih ispitivanja, zastupljenost CMV je stalno visoka. CMV je u istraţivanjima sprovedenim u ovom radu 2009. godine imao dominantno prisustvo u rasadu (20,87%), dok je bio drugi po zastupljenosti u proizvodnji paprike u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju (zaštićeni prostor 31,01%, otvoreno polje 37,20%). U 2010. godini zauzimao je prvo mesto kako u zaštićenom prostoru tako i na otvorenom polju i rasadu (zaštićeni prostor 36,17%, otvoreno polje 50%, rasad 20,87%). CMV je bio dominantan u usevu paprike 1999. godine (Mijatović i sar., 1999) i 2007. godine (Tomić i sar., 2007). Ovako značajna zastupljenost CMV dokazana je i u drugim područjima gajenja paprike u svetu (Conti and Masenga, 1977; Gaborjanyia et al., 1998; Sepulveda et al., 2005). Dominantno prisustvo PVY u ovim istraţivanjima predstavlja značajnu razliku u odnosu na 1999. godinu kada je bio treći po zastupljenosti u usevu paprike (Mijatović i sar., 1999) i 2007. godinu kada njegovo prisustvo nije ustanovljeno (Tomić i sar., 2007). Dominantno prisustvo PVY potvrĎeno je i u drugim područjima gajenja paprike u svetu (Arli-Sokmen, 2005; Choi et al., 2005b). Iako je AMV stalno prisutan u usevu paprike (Mijatović i sar., 1999; Tomić i sar., 2007), AMV je pokazao tendenciju lokalizovane pojave, pri čemu se uglavnom javljao na manjem broju lokaliteta, ali sa značajnijom učestalošću pri gajenju paprike na otvorenom polju sa uočljivim i prepoznatljivim simptomima. Što se tiče zastupljenosti ovog virusa, u toku 117 2009. godine dokazan je u manjem broju testiranih uzoraka u rasadu i zaštićenom prostoru (2,48% i 17,05%) u odnosu na 2010. godinu kada je taj procenat iznosio 3,48%, odnosno 17,73%. U proizvodnji paprike na otvorenom polju u prvoj godini ispitivanja, 2009. godine, AMV je bio nešto zastupljeniji (21,74%) u odnosu na drugu 2010. godinu (16,67%). Njihova pojava i rasprostranjenost svakako zavise od izvora inokuluma, prisustva i brojnosti vektora-vaši, kao i sposobnosti prenošenja pojedinim vrstama vaši (Zitter, 1977). TSWV je u obe godine ispitivanja zabeleţen na tri lokaliteta, meĎutim što se tiče zastupljenosti virusa u pregledanim uzorcima paprike gajene u zaštićenom prostoru moţe se uočiti značajnije prisustvo u 2009. (23,26%) nego u 2010. godini (6,38%) što nije neobično imajući u vidu epidemiologiju ovog virusa. MeĎutim, s obzirom da se poslednjih godina oboljenje koje ovaj virus izaziva javlja u sve većim razmerama, i da se njegov krug domaćina u našoj zemlji širi i da je dokazan na duvanu (Krstić i sar., 2005a, 2005b; Dukić i sar., 2006; Đekić i sar., 2006; Krstić i sar., 2006a, 2006b, 2006c, 2006d; Stanković et al., 2011) paradajzu, paprici, luku i mnogobrojnim vrstama ukrasnih biljaka (Krstić i Bulajić, 2007; Đekić i sar., 2007a, 2007b; Krstić i sar., 2007a, 2007b; Petković i sar., 2007; Simić i sar., 2007; Tomić i sar., 2007, Stanković i sar., 2011; Zindović i sar., 2011; Stanković i sar., 2012; Stanković i sar., 2013), bilo je za očekivati daleko veću učestalost TSWV. TakoĎe i širok krug domaćina meĎu povrćem i korovima i efikasno širenje tripsima (Krstić i Bulajić, 2007) dovodi do toga da se očekuje da TSWV bude u daljoj ekspanziji na paprici, naročito u zaštićenom prostoru. PMMoV, koji je detektovan u Srbiji 1996. godine pomoću test biljaka (Krstić i sar., 1996), u našim ispitivanjima ustanovljen je samo u proizvodnji paprike na otvorenom polju i to u 2009. godini na 2 uzorka (1,19%) na jednom lokalitetu (Čonoplja), a u 2010. godini na 3 uzorka (1,45%), na dva lokaliteta (Čonoplja i ĐurĎevo). Sobzirom na to da je virus ustanovljen 1996. godine, nije se znatnije raširio u našoj zemlji, pre svega iz razloga što je virusu PMMoV jedini domaćin paprika. MeĎutim, paprika se u Srbiji gaji uglavnom u privatnom sektoru na malom posedu, gde proizvoĎači vode računa o sakupljanju biljnih ostataka u slučaju obolevanja biljaka, što je od velikog zanačaja jer se PMMoV moţe odrţavati u zemljištu na biljnim ostacima nekoliko meseci, a takoĎe i zimski period moţe doprineti smanjenju inokuluma 118 (http://www.apsnet.org/edcenter/advanced/topics/PopGenetics/Documents/Garcia_ext ra.pdf). U ispitivanim uzorcima paprike gajene u rasadu, zaštićenom prostoru i na otvorenom polju nije utvrĎeno prisustvo TMV, mada su Mijatović i sar. (1999) kao i Tomić i sar. (2007) ustanovili da je ovaj virus prisutan i pojedinih godina veoma značajan na paprici. Analiza dobijenih rezultata ukazuje na tendenciju smanjenja značaja zaraze paprike sa TMV, verovatno usled dobrog zdravstvenog stanja semena ili dobro sprovedenih higijenskih mera u proizvodnom procesu gajenja paprike. Osim pojedinačnih zaraza, u kojima su najčešće detektovani PVY i CMV, virusi su dokazani i u mešanim infekcijama dva ili tri virusa. Najčešća mešana infekcija dva virusa bila je sa PVY i CMV, dok je najčešća mešana infekcija sa tri virusa bila izazvana PVY, CMV i AMV. Avilla et al. (1997) navode da je u Španiji u usevu paprike najčešća mešana infekcija bila CMV i PVY, što je saglasno sa dobijenim rezultatima u ovim istraţivanjima. Sudarsono et al. (1998) navode da je najčešća mešana infekcija kod ljute paprike bila u kombinaciji tri virusa TMV, PVY i CMV. Arli–Sokmen et al. (2005) takoĎe navode da je mešana infekcija virusima konstatovana na paprici i u Turskoj, i to infekcija TMV i PVY je bila najčešća(15,4%). Pojava i rasprostranjenost većine vrsta virusa zavise od brojnih faktora kao što su region i lokacija gajenja, vegetaciona sezona, genotip paprike i drugih. Conti and Masenga (1977) proučavajući prisustvo virusa parazita paprike u Italiji, utvrdili su da je najzastupljeniji bio CMV u 80,2% biljaka paprike gajenih na otvorenom prostoru, dok je u zaštićenom prostoru najzastupljeniji bio TMV sa 84%. Osim ova dva virusa zabeleţeno je prisustvo i PVY, AMV, PVX, Broad bean wilt virus (virus uvenulosti boba, BBWV) i Tobacco rattle virus (virus šuštavosti duvana, TRV). Prema istraţivanjima Gaborjanyia et al. (1998), najzastupljeniji virusi paprike u MaĎarskoj su TMV, CMV, PVY, i TSWV čije se infekcije kreću i do 100%. Prema podacima Kovačevskog (1977) (loc. cit. Mijatović i sar., 1999), u Bugarskoj je inficiranost paprike izazvana CMV iznosila je 80% do 90%, a u nešto manjem procentu su identifikovani TMV, PVY i TSWV. Sepulveda et al. (2005) su konstatovali da je oko 30% paprike u severnom Čileu inficirano sa dva ili više virusa. Detekcijom virusa DAS-ELISA testom utvrĎeni su CMV, TSWV, AMV, PVY, Impatiens Necrotic Spot Virus (INSV), Tomato mosaic virus (ToMV) i TMV. Tokom istraţivanja koja su sprovedena 1998. i 1999. godine u Turskoj, determinisano je šest virusa AMV, 119 CMV, PVY, ToMV, TMV i TSWV. Od 313 testiranih biljaka, 42 biljke posedovale su mešanu infekciju izazvanu TMV i PVY (15,4%) što je predstavljalo najčešću mešovitu infekciju (Arli-Sokmen et al., 2005). Dobijeni podaci u ovoj disertaciji korespondiraju sa rezultatima dobijenim pregledom literaturnih podataka. PMMoV virus je u našim rezultatima pokazao nisku prisutnost (1,45% u 2009. i 1,19% u 2010.), mada Lamb et al. (2008) ukazuju na podatke da taj virus moţe da dostigne nivo zaraţenosti biljaka i do 30%. Intenzitet pojave virusa je zavisio od godine, ali evidentno je da CMV i PVY nisu toliko dominantni kao ranije. Nivo zaraţenosti uzoraka paprika u sprovedenim istraţivanjima se kretao npr. kod CMV u 2009. godini u zaštićenom prostoru i polju 31,01% i 37,2%, a u 2010. godini 36,17%, i 50%, što je značajno niţe u odnosu na 80,2% ustanovljene zaraze CMV (Conti and Masenga, 1977) ili zaraţenosti paprike sa TSWV, AMV i PVY koja se u MaĎarskoj kretala i do 100% (Gaborjanyia et al., 1998). 6.2. Povezanost simptoma na prirodno zaraţenim biljkama paprike i detektovanih virusa Pregledom proizvodnje rasada i useva paprike u različitim lokalitetima gajenja kako u zaštićenom prostoru, tako i na otvorenom polju zabeleţena je pojava niza simptoma koji su upućivali na virusnu zarazu i koji su varirali u zavisnosti od starosti biljke, uslova spoljašnje sredine (naročito temperature), kao i u zavisnosti od soja virusa. Posle detekcije i identifikacije virusa analizom prikupljenih uzoraka, pokušano je da se poveţu simptomi na biljkama u polju sa detektovanim virusom. Kako je na paprici u našoj zemlji prisutno najmanje pet virusa, u pojedinačnim i mešanim zarazama, uočeni simptomi i njihova veza sa virusom prouzrokovačem imali su samo preliminarni dijagnostički značaj. Mnogi istraţivači (Boiteux et al., 1996; Echer and Costa, 2002) su opisali simptome na paprici prouzrokovane infekcijom PVY koji su istovetni simptomima zapaţenim u toku ovih istraţivanja. PVY je izazivao različite simptome, a najčešće u vidu hlorotičnog prosvetljavanja nerava, hlorotičnog prošaravanja listova sa ili bez deformacije mladih listova, često praćeno nekrozom listova, mozaikom u vidu hlorotičnih prstenova i sitnih 120 tamno zelenih površina. Veliki broj biljaka zaraţenih virusom PVY, bile su krţljave i često ţbunastog izgleda, što je upućivalo na rane zaraze u toku vegetacije. Simptomi koje izaziva PVY, uočeni u toku ovih istraţivanja, u saglasnosti su i sa navodima iz literature koje opisuju Mijatović i sar. (2002). Verovatno nijedan drugi biljni patogen ne izaziva takav niz simptoma kao TSWV, a neke biljke ili sorte u usevu mogu biti zaraţene i bez ispoljavanja simptoma (Kucharek et al., 2000). Simptomi koje izaziva TSWV varijaju na istoj biljnoj vrsti u zavisnosti od sorte, starosti biljke, vremena infekcije i uslova spoljašnje sredine, od kojih temperatura ima veoma vaţnu ulogu u jačini ispoljavanja simptoma (Allen et al., 1991). U ovim istraţivanjima prisustvo TSWV ustanovljeno je u uzorcima paprike sa simptomima blagog do izraţenog mozaika. Na nekim biljkama pored mozaika primećena je i hloroza nerava. Slične simptome tipa hlorotičnog šarenila, deformacija listova i slabiju ili jaču nekrozu opisuju i drugi autori bilo na prirodno ili veštački zaraţenim biljkama (Soler et al., 1999; Chatzivassiliou et al., 2000; Thomas-Carroll and Jones, 2003; Coutts et al., 2004). Krstić i sar. (2008) navode da se infekcija ovog virusa odlikuje simptomima ţutila lišća i čitavih biljaka, mozaika sa koncentričnim prstenastim pegama ili hlorotičnim linijskim mozaikom na starijem lišću, a česta je i pojava bronzane boje lišća. Slične simptome tipa mozaične prstenaste pegavosti i nekrotične prstenaste pegavosti navodi Rusevski (2001). Prisustvo CMV utvrĎeno je u uzorcima paprike sa izraţenim simptomima mozaika i hlorotičnog prošaravanja. Ono što je karakteristično za biljke zaraţene ovim virusom, uz navedene simptome, su i deformacija ili blaga klobučavost listova. Krstić i Vico (2004) navode kao početne simptome koje ovaj virus izaziva, hlorotični mozaik, dok se u kasnijim fazama javljaju hlorotične pege nepravilog oblika. Čest tip simptoma je i nekroza do koje dolazi u kasnijim fazama razvoja mozaičnih šara i pega. Hlorotične lokalne lezije i sistemični mozaik takoĎe su karakteristični simptomi koje izaziva CMV (Ozaslan et al., 2006; Zitikaitė and Samuitienė, 2009). Tokom ovih istraţivanja, najčešći simptomi zabeleţeni na paprici zaraţenoj virusom AMV su hlorotično beličaste pege različitog oblika i veličine koje se vremenom spajaju, tako da u nekim slučajevima zahvataju i čitave liske, a vrlo slični simptomi su rasute bele do ţute tačkice koje mogu prekriti celu lisku. Simptomi na listovima paprike zaraţene sa AMV uočene tokom ovih istraţivanja bili su slični opisima simptoma koje navode Mijatović i sar. (2007). Simptomi koji su se javljali na 121 paprici za koju je utvrĎeno da je zaraţena virusom PMMoV, bili su u vidu prošaranosti listova tamnozelenim površinama rasutih po celoj liski, što je u saglasnosti sa navodima literature (Sevik, 2011; Svoboda et al., 2006). Iako su u saglasnosti sa opisom simptoma, ne moţe se na osnovu simptoma reći o kom je virusu reč, jer su takvi simptomi opisani i za neke druge viruse paprika, na primer simptomi koje izaziva Pepper mottle virus (PeMoV) su veoma slični simptomima PVY (Zitter and Florini 1984), simptomi Tomato spotted wilt virus su veoma slični simptomima koje izaziva Curly top viruses (virus kovrdţavosti vrha) na paprici (Koike et al., 2010). Kod odreĎenog broja biljaka koji su ukazivali na simptome viroznih oboljenja nisu konstatovani ispitivani virusi. Objašnjenje moţe biti prisustvo virusa koji nisu uključeni u istraţivanja ili to da simptomi inficiranih biljaka mogu ličiti na simptome koje prouzrokuju patogene gljive i bakterije, a takoĎe često moţe da doĎe do zabune kod uspostavljanja dijagnoze izmeĎu simptoma prouzrokovanih viroznim oboljenjima i simptoma koji se javljaju kao posledica nepravilno primenjenih herbicida ili oštećenja od zagaĎenja vazduha ili nedostatka mineralnih materija. Stoga, simptomi, koliko god bili izraţeni i karakteristični, ipak samo ukazuju na postojanje zaraze virusom, a konačna tačna dijagnoza moţe se postaviti samo primenom odgovarajućih laboratorijskih analiza. Dakle, ako se dijagnostika viroza na biljkama vrši samo na osnovu simptoma često moţe da doĎe i do grešaka (Ozaslan et al., 2006). 6.3. Molekularna detekcija i identifikacija virusa paprike Serološka detekcija virusa koji su tokom ovog rada dokazni u prirodno zaraţenim biljkama paprike, potvrĎena je primenom metode reverzne transkripcije praćene lančanom reakcijom polimeraze (Reverse Transcription and Polymerase Chain Reaction, RT–PCR). RT–PCR metoda je primenjena za detekciju i identifikaciju izolata CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV koji predstavljaju najznačajnije viruse paprike, a koji su prethodno identifikovani serološkom metodom. Ekstrakcija RNA iz lišća prirodno zaraţenih biljaka paprike izvedena je primenom Rneasy Plant Mini Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany) čime se obezbeĎuje najbolji kvalitet 122 totalne RNA i dobijaju najpouzdaniji rezultati prilikom daljeg testiranja (Dietzgen et al., 2005). 6.3.1. Detekcija CMV primenom RT–PCR metode Detekciju četiri izolata CMV omogućila je primena „One–step“ RT–PCR. Ovu metodu koristili su u svojim istraţivanjima u cilju ustanovljavanje prisustva CMV brojni istraţivači (Gildow et al., 2008; Raj et al., 2008; Chen et al., 2011). Za potvrdu o prisustvu CMV u testiranim uzorcima listova paprike korišćeni su prajmeri CMV Au1u/CMV Au2d koji umnoţavaju segment DNK finalne duţine 847 bp koji obuhvata kodirajući gen za proteinski omotač virusa (Stanković et al., 2011). Kod sva četiri ispitivana izolata došlo je do amplifikacije jednog jasnog benda očekivane veličine, čime je potvrĎena pripadnost ispitivanih izolata virusu mozaika krastavca. Molekularna metoda na bazi PCR-a je mnogo pogodnija od seroloških metoda za dobijanje informacija o virusnom genomu i za filogenetske analize. Kombinovano korišćenje seroloških i molekularnih metoda preporučuje se za epidemiološka proučavanja i proučavanja varijabilnosti izolata u okviru populacije CMV (Đekić i sar., 2008a; Golnaz et al., 2009). Molekularne metode zasnovane na PCR–u, su osetljivije i preciznije od seroloških (Jacobi et al., 1998; Bousalem et al., 2000) i imaju prednost pri detekciji virusa kada se nalaze u biljci u niskoj koncentraciji, što moţe biti slučaj i sa nekim izolatima CMV (Chen et al., 2003; Yu et al., 2005; Chen et al., 2011). U ovim istraţivnjima korišćena metoda RT-PCR omogućila je uspešnu amplifikaciju, pri čemu nije bilo problema sa niskom koncentracijom korišćenih izolata, kako primenom serološke metode tako i primenom RT-PCR-a. Korišćenje RT–PCR i CMV specifičnih prajmera u jednom koraku (jednoj tubi) omogućava jednostavnu, brzu i preciznu detekciju, te se kao takva moţe koristiti u dijagnostičkim laboratorijama, kao jednostavna alternativa serološkim analizama (Đekić, 2010; Ali and Kobayashi, 2010). Ova istraţivanja su pokazala da to vaţi i za dokazivanje CMV u paprici i da je ovaj protokol koji je primenjen u izradi ove disrtacije pouzdan. 123 6.3.2. Detekcija PVY primenom RT–PCR metode Molekularna detekcija četiri izolata PVY obavljena je primenom „One–step“ RT– PCR metode prema protokolu proizvoĎača, uz korišćenje univerzalnih prajmera za PVY (PVYc/PVYd). Primenom para prajmera PVYc/PVYd (Marie–Jeanne Tordo et al., 1995; Glais et al., 1996), čije sekvence umnoţavaju deo genoma vezan za sekvencu 5’ neprepisujućeg (5’ UTR) regiona i gena za P1 protein, utvrĎeno je prisustvo fragmenta veličine oko 975 bp kod sva četiri ispitivana izolata. Pošto je prevencija najefikasnije sredstvo za kontrolu ovog virusa, što pored ostalog zahteva i rano otkrivanje zaraze u ranoj fazi, takva metoda treba da bude selektivna i specifična. Molekularna dijagnostika je metod koji ispunjava ove zahteve (Helgera et al., 2001). Bulajić i sar. (2006) i Đekić i sar. (2007b), u cilju detekcije virusa crtičastog mozaika krompira u duvanu koristili su takoĎe ove prajmere, dok su Glais et al. (1996) primenom ovih prajmera detektovali 18 izolata PVY različitih sojeva. Obzirom da su izolati PVY na osnovu lokalnih i sistemičnih simptoma na različitim sortama krompira, duvana i biljci Physalis floridana, podeljeni na tri soja: PVY O (obični soj), PVYN (nekrotični soj) i PVY C (crtičasti soj), a takoĎe i zbog postojanja većeg broja rekombinantnih sojeva: PVY NTN (Croslin et аl., 2002; Ohshimа et al., 2000; Sаlаzаr et al., 2000), PVYZ (Jones, 1990), PVY N W (Chrzanowska, 1991; Blаnko-Urgoiti et аl., 1998; Kerlаn et аl., 1999, Glais et al., 2005) kao i PVY N:O (Sing et al., 2003), univerzalni prajmeri su vrlo značajni u detekciji PVY na različitim biljnim vrstama (Schubert et al., 2007). PVY izolati koji su infektivni prema paprici su manje proučavani i prema Gebré Sélassié et al. (1985) izolati virusa PVY sa paprike svrstani su u tri patotipa PVY-0, PVY-1 i PVY-1-2, u zavisnosti od mogućnosti da prevaziĎu gene otpornosti (vy1, vy2) prisutne u nekoliko sorti paprike. Prema Choi et al. (2005b) u okviru ova tri patotipa, izolati se dalje grupišu na obične i nekrotične, u zavisnosti da li prouzrokuju simptome u vidu promene boje duţ nerava lista ili simptome u vidu nekroze lista. Korišćenje RT–PCR i PVY univerzalnih prajmera u jednom koraku (jednoj tubi) omogućava jednostavnu i brzu detekciju, naročito zbog postojanja većeg broja sojeva kao i 124 rekombinantnih sojeva ovog virusa, stoga je preporučljivo da se ova metoda koristi u dijagnostičkim laboratorijama. 6.3.3. Detekcija TSWV primenom RT–PCR metode Molekularna detekcija tri odabrana izolata TSWV izvršena je primenom „One– step“ RT–PCR kita po protokolu proizvoĎača, uz korišćenje tri para prajmera: L2 TSWV F/L1 TSWV R, TSWVgene F/TSWVgene R i TSWV CP-f/TSWV CP-r. Primenom prajmera L2 TSWV F/L1 TSWV R (Mumford et al. 1996a; OEPP/EPPO, 2004), koji omogućavaju amplifikaciju RdRp gen L RNA (delimična sekvenca gena za RNA-zavisnu RNA polimerazu), prisustvo fragmenta očekivane veličine ustanovljeno je u svim ispitivanim izolatima. Korišćenjem različitih parova prajmera, odgovornih za amplifikaciju različitih regiona genoma virusa utvrĎeno je da najveću specifičnost i pogodnost u pogledu detekcije TSWV u biljnom materijalu imaju prajmeri odgovorni za amplifikaciju gena NC protein (Zindović, 2010). Tako je pomoću prajmera TSWV CP-f / TSWV CP-r (Vučurović et al., 2011), koji omogućavaju amplifikaciju NC gena S RNA uspešno detektovano prisustvo fragmenta veličine oko 738 bp kod svih ispitivanih izolata. Primenom prajmera TSWVgene F/TSWVgene R (Jain et al., 1998; Pappu et al., 1998; Holguín–Peña and Rueda–Puente, 2007), koji takoĎe omogućavaju amplifikaciju NC gena S RNA TSWV, utvrĎeno je prisustvo fragmenta veličine oko 800 bp kod jednog ispitivanog izolata (PL-35-09), dok kod izolata PL-14-10 i PL-60-09 nije došlo do pojave očekivanog amplikona. Ispitivanja su pokazala, da su TSWV CP-f / TSWV CP-r najpogodniji prajmeri za rutinska testiranja paprike na prisustvo TSWV. U cilju proučavanja epidemiologije virusa i unapreĎenja kontrole TSWV neophodno je sprovesti pouzdanu detekciju i identifikaciju virusa u različitim biljnim vrstama (Dietzgen et al., 2005). TakoĎe, tačna i brza dijagnoza virusa je veoma bitan faktor u kontroli biljnih virusa, kao što je TSWV, meĎutim serološke metode posebno ELISA metod, se trenutno najčešće koristi u rutinskoj detekciji virusa iz zaraţenih bijaka. UtvrĎeno je da je PCR metoda pogodnija za detekciju TSWV u odnosu na ELISA metod, u biljkama u kojima se nalazi u veoma niskoj koncentraciji, zbog svoje veće osetljivosti (Krstić i sar., 125 2008a; Đekić i sar., 2008). Analize na bazi nukleinskih kiselina kao što je PCR su osetljivije i specifičnije od seroloških metoda, a neke od varijanti se koriste i u rutinskoj analizi (Henson and French, 1993). Reverznu transkripciju (RT-PCR) za detekciju raznih Tospovirus-a razvili su i opisali brojni autori (Dewey et al., 1996; Mumford et al., 1994; Mumford et. al., 1996a). Mumford et al. (2000) razvili su real-time RT-PCR metodu na bazi TaqMan tehnologije, koja je veoma osetljiva tehnika, pogodna za velika testiranja kao i za ispitivanje prisustva Tospovirus-a u tripsima. 6.3.4. Detekcija AMV primenom RT–PCR metode Razvijen je veći broj metoda za detekciju i identifikaciju različitih izolata virusa mozaika lucerke zasnovanih na različitim osobinama virusa. Pored biotesta zasnovanog na korišćenju indikator biljaka kao što su Pisum sativum, Amaranthus retroflexus, Nicotiana tabacum, Chenopodium amnaranticolor i dr. (Zitikaitè and Samuitienè, 2008) najčešća metoda koja se koristi za detekciju AMV na različitim biljnih vrstama je ELISA test (Pešić and Hiruki, 1986; Bulajić i sar., 2010; Petrović, 2008). Xu and Nie (2006) navode da se pravilna identifikacija Alfamovirus–a moţe obaviti i na osnovu izgleda čestica korišćenjem elektronskog mikroskopa. MeĎutim, molekularne metode zasnovane na RT–PCR–u, zbog svoje velike osetljivosti i preciznosti (Robinson, 1992), imaju prednost pri detekciji virusa kada se nalaze u biljci u niskoj koncentraciji, što moţe biti čest slučaj sa AMV. Stoga molekularna detekcija tri izolata AMV iz paprike izvršena je primenom „One–step“ RT– PCR metode i korišćenjem prajmera koji omogućavaju amplifikaciju CP gena, CP AMV1/CP AMV2. Primenjene prajmere koristili su brojni istraţivači (Finetti–Sialer et al., 1997; Parella et al., 2000) kako bi omogućili amplifikaciju dela genoma vezanog za CP gen izolata AMV iz paprike. Prisustvo fragmenta veličine oko 751 bp omogućilo je molekularnu detekciju ovog virusa i potvrdu rezultata ispitivanja primenom serološke metode. U tom smislu primenjena RT-PCR metoda uz upotrebu specifičnih prajmera CPAMV1/CPAMV2 pokazala se uspešnom za detekciju i identifikaciju izolata AMV iz duvana Srbije (Đekić, 2010), kao i izolata ovog virusa iz paprike. 126 6.3.5. Detekcija PMMoV primenom RT–PCR metode Detekcija izolata PMMoV na molekularnom nivou obavljena je primenom „One– step“ RT–PCR metode uz korišćenje prajmera P12/3/P12/3A (Velasco et al., 2002) i PMR1/ PMF1 (Hamada et al., 2002) koji omogućavaju amplifikaciju RdRp i CP gena virusa. Prisustvo PMMoV dokazano je u našoj zemlji (Krstić i sar., 1996), ali korišćenjem konvencionalnih metoda, pomoću test biljaka, tako da ova istraţivanja predstavljaju prvu molekularnu detekciju ovog virusa u uzorcima zaraţene paprike u Srbiji. Primenom P12/3/P12/3A prajmera koji omogućavaju amplifikaciju RdRp, kod ispitivanih izolata iz paprike došlo je do amplifikacije fragmenta veličine oko 836 bp što potvrĎuje prisustvo PMMoV u testiranim uzorcima, na osnovu litraturnih podataka (Velasco et al., 2002). Aktivnošću prajmera PMR1/PMF1, koji omogućavaju amplifikaciju CP gena virusa, kod ispitivanog izolata iz paprike dobijen je fragment veličine oko 550 bp, meĎutim, primenom ovog para prajmera Hamada et al. (2002) su dobili fragment veličine 474 bp. 6.4. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata virusa paprike poreklom iz Srbije sa izolatima virusa iz drugih delova sveta Molekularna identifikacija najznačajnijih virusa paprike obavljena je nakon sekvencioniranja odreĎenih delova genoma karakterističnih za pojedine viruse, zatim višestrukog uparivanja dobijenih sekvenci sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka kao i proračunom genetičke identičnosti sekvenci ispitivanih izolata i sekvenci izolata virusa iz različitih geografskih regiona. Za ovu analizu odabrani su izolati za koje je primenom seroloških i molekularnih metoda utvrĎeno da pripadaju CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV. 127 6.4.1. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata CMV Ranija istraţivanja populacije CMV kod nas bila su usmerena na izolate poreklom iz paradajza, paprike, obične tikve (Dukić i sar., 2004b) i duvana (Đekić, 2010), i tom prilikom je izvršena identifikacija CMV poreĎenjem dobijenih sekvenci sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka kao i proračunom genetičke identičnosti sekvenci ispitivanih izolata i sekvenci izolata virusa iz različitih geografskih regiona. MeĎusobna genetička identičnost izolata CMV (PL-43-09, PL-25-09 i PL-52-09) izolovanih iz paprike sa lokaliteta Smederevo, Ţabalj i Horgoš kao i identičnost sa izolatima poreklom iz različitih delova sveta ispitana je analizom sekvenci CP gena. Proračun genetičke identičnosti CP gena, pokazao je visok stepen nukleotidne (98,1-99,7%) i aminokiselinske (98,6-100%) homologije izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona. Najviši stepen nukleotidne identičnosti ispitivani izolati pokazali su sa izolatima iz Amerike, Australije, Španije i Srbije, dok su potpunu identičnost u aminokiselinskoj sekvenci (100%) ispitivani izolati ispoljili sa većinom izolata odabranih iz GenBank baze podataka. Proračunom meĎusobne genetičke identičnosti sekvenci izolata dobijenih u ovom radu, utvrĎen je visok stepen nukleotidne identičnosti (99,2-99,5%). Na osnovu visokog stepena homologije sekvenci sva tri ispitivana izolata, potvrĎeno je da odabrani ispitivani izolati iz paprike pripadaju virusu mozaika krastavca. Na osnovu istraţivanja Vučurović i sar. (2010) BLAST analiza pokazala je 93 do 99% nukleotidne identičnosti izolata CMV iz tikve poreklom iz Srbije, sa sekvencama CP gena drugih izolata CMV deponovanih u GenBank bazi podataka. Najviši stepen identičnosti 99,2%, izolat je pokazao sa izolatima iz cukinija, dinje i paradajza iz Španije, a najmanju identičnost od 93,1% sa izolatom iz Koreje iz Nicotiana tabacum cv. Burley21. Đekić (2010) navode da je stepen nukleotidne identičnosti izolata iz duvana iz Srbije sa izolatima CMV S–I podgrupe dostupnih u GenBank bazi podataka preko 93%. 128 6.4.2. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata PVY MeĎusobna genetička identičnost PL-15-09, PL-28-09, PL-3-10 i P-108-10 izolata PVY izolovanih iz paprike sa lokaliteta Srbobran, Velika Plana, Pećinci i Aleksinac, kao i identičnost sa izolatima poreklom iz različitih delova sveta ispitana je analizom sekvenci gena za P1 protein. Upotreba MEGA4 softvera pokazala je 98,8-100% nukleotidne i 98,2- 100% aminokiselinske identičnosti ispitivanih izolata sa sekvencama CP gena drugih izolata PVY deponovanih u GenBank bazi podataka. Proračunom genetičke identičnosti sekvenci izolata dobijenih u ovom radu, utvrĎen je visok stepen nukleotidne identičnosti koji se kretao od 99,1% do 99,9%. Najviši stepen nukleotidne identičnosti ispitivani izolati pokazali su sa izolatom Sl 64 iz krompira poreklom iz Slovenije, izolatom D35-06 iz duvana poreklom iz Srbije i izolatom 38MYPVY iz krompira iz Kolumbije. Sa većinom odabranih izolata iz GenBank baze padataka, ispitivani izolati pokazuju visok stepen homologije aminokiselinskih sekvenci (99,6%-100%). UtvrĎena nukleotidna identičnost ispitivanih izolata PVY iz paprike poreklom iz Srbije, sa ostalim PVY izolatima, potvrĎuje njihovu identifikaciju kao PVY. Ranija istraţivanja populacije PVY poreklom iz duvana u Srbiji pokazala su samo prisustvo nekrotičnog soja (Bulajić et al., 2006; Đekić et al., 2007b). Nie and Singh (2002) ustanovili su da tipični PVYN i PVYNTN izolati pokazuju oko 70% identičnosti sa izolatima PVY O, dok je stepen nukleotidne identičnosti izolata iz različitih biljnih vrsta u okviru PVY N soja veći, 90%. Kada se govori o nukleotidnoj sličnosti treba imati na umu da svaki rod virusa kao što je Potyvirus, kojoj pripada PVY, ima odreĎene molekularne kriterijume po kojima se izolat razvrstava. Smatra se da nukleotidna povezanost sekvenci genoma postoji ako je identitet amino kiselinske sekvence regiona CP manji od 80% a identitet nukleotidne sekvence manji od 85% od celog genoma (Plyusnin et al., 2011). Adams et al. (2005) su izneli da je 76-77% nt sekvence CP gena optimalan demarkacioni kriterijum za identifikaciju Potyvirus-a. Osim toga, Aleman-Verdaguer et al. (1997) i Shukla et al. (1994) su izneli da je identitet aa sekvence regiona CP meĎu izolatima Potyvirus-a preko 90%. Filogenetska analiza optimizovanih nukleotida (NT) predstavnika iz familije 129 Potiviridae ukazuje na redosled vrsta u porodici i obezbeĎuje snaţnu podršku za nekoliko podgrupa u okviru roda Potyvirus. Adams et al. (2005) su ustanovili da većina vrsta u okviru roda Potyvirus imaju 50-55% nukleotidne identitičnih sa drugim članovima roda, ali da postoje značajne grupe koje bliţe korespondiraju i kod kojih je nukleotidna identičnost veća 76%, dok je aminokiselinska identičnost veća 82%. Analizirajući rezultate istraţivanja Adamsa et al. (2005) i Plyusnin et al. (2011) koji ukazuju na kriterijume koji odreĎuju pripadnost odreĎenog virusa nekoj porodici, odnosno rodu, ispitivani izolati pripadaju PVY vrsti, pošto im je nukleotidna identičnost sa ostalim izolatima PVY veća od 77% a aminokiselinska slicnost veća od 90%. 6.4.3. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata TSWV Primena i razvoj molekularnih metoda omogućili su utvrĎivanje taksonomske poveznosti virusa bronzavosti paradajza sa članovima familije Bunyaviridae i njegovo svrstavanje u poseban rod (Law et al., 1992), kao i pouzdanu identifikaciju i karakterizaciju TSWV kod različitih biljaka domaćina i u različitim geografskim regionima. Nakon sekvencioniranja PCR produkata dobijenih korišćenjem para prajmera TSWV CP-f/TSWV CP-r koji omogućavaju amplifikaciju CP gena, dobijene delimične sekvence NC gena odabranih izolata uporeĎene su meĎusobno kao i sa sekvencama drugih izolata TSWV dostupnih u GenBank bazi podataka. Rezultati su pokazali visok stepen nukleotidne identičnosti (98,7-100%) odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata TSWV dostupnim u GenBank bazi podataka, kao i visok stepen aminokiselinske identičnosti (97,8-100%). Najviši stepen nukleotidne identičnosti sva tri izolata pokazala su sa izolatom Sr-603 iz paradajza iz Srbije (GU369723). Sekvencione analize NC gena koriste se i kao kriterijumi prilikom definisanja i opisivanja novih Tospovirus-a, obzirom na visok nivo odstupanja u nukleotidnoj sekvenci NC regiona različitih virusa ovog roda (Pappu et al., 2000). Što znači da bi neki izolat bio opisan kao novi Tospovirus, potrebno je da procenat homologije aminokiselinske sekvence njegovog NC proteina bude manji od 90% u poreĎenju sa istom sekvencom poznatih virusa ovog roda (Goldbach and Peters, 130 1994). Istraţivanja Sivparsad and Gubba (2008) ukazuju da ne postoji visok stepen varijabilnosti unutar NC sekvence izolata iz juţne Afrike i izolata drugih geografskih regiona. Visok stepen homologije nukleotidne sekvence NC gena (95-98%) različitih ispitivanih izolata iz Bugarske i Nemačke saopštili su Heinze et al. (2003), a Chatzivassiliou et al. (2000) su utvrdili 96% do 99% homologije u nukleotidnoj sekvenci NC gena ispitivanih izolata poreklom iz Grčke i izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Đekić (2010) ispitivala je genetičku identičnost izolata TSWV izolovanih iz duvana sa lokaliteta Beška sa ostalim izolatima TSWV poreklom iz različitih delova sveta, čime se pokazalo da se homologija sekvenci NC gena kretala se od 96,8% do 99,1%, NSm gena 92,7% do 98,9%, dok je homologija sekvenci RdRp gena takoĎe bila visoka i kretala se od 96% do 100%. Na osnovu visokog stepena homologije sekvenci, potvrĎeno je da odabrani izolati, PL-35-09, PL-60-09 i PL-14-10 iz paprike pripadaju virusu bronzavosti paradajza. Na osnovu sekvenci NC gena, izolati PL-35-09, PL-60-09 i PL-14-10 pokazuju izuzetno visok stepen homologije, pri čemu sva tri izolata meĎu sobom pokazuju identičnost od 99,7%, tako da se na osnovu sekvence NC gena ne moţe zaključiti da izmeĎu ovih izolata postoji varijabilnost. TakoĎe, izolati TSWV iz duvana poreklom iz Srbije pokazuju nukleotidnu identičnost meĎu sobom od 99,9% do 100% (Đekić, 2010). Iako izolati TSWV poreklom sa različitih domaćina ispoljavaju veliku varijabilnost i u prirodi se javljaju kao kompleks sojeva (de Avila et al., 1990; Mandal et al., 2006), utvrĎen je visok stepen nukleotidne identičnosti NC gena TSWV izolata širom sveta (de Avila et al., 1993; Pappu et al., 1998). Visok stepen nukleotidne identičnosti (>95%) NC gena utvrdili su i Dietzgen et al. (2005) ispitujući Australijske izolate TSWV poreklom iz različitih delova kontinenta i različitih domaćina, a takoĎe, su i Persley et al. (2006) utvrdili minimalne razlike izmeĎu NC sekvence Australijskih izolata poreklom iz paprike, salate, paradajza, krompira i nekoliko vrsta ukrasnih biljaka. 131 6.4.4. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata AMV Molekularna ispitivanja izolata AMV dobijenih u toku ovih istraţivanja, osim detekcije bila su usmerena i na njihovu identifikaciju. Genetička identičnost izolata P-27-09 (Velika Plana), PL-2-10 (Pećinci) i P-10-10 (Bačka Topola), ispitana je poreĎenjem sekvence CP gena odabranog izolata sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. BLAST analiza pokazala je visok stepen nukleotidne sličnosti sekvence ispitivanog izolata sa sekvencama gena za protein omotača drugih izolata AMV. Proračun genetičke identičnosti CP gena, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,5-100%) i aminokiselinske (97,5-100%) homologije izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona. Proračunom genetičke identičnosti sekvenci izolata dobijenih u ovom radu, utvrĎen je visok stepen nukleotidne identičnosti izmeĎu ispitivanih izolata (98,7-99,6%). Najviši stepen nukleotidne identičnosti ispitivani izolati AMV pokazali su sa izolatima iz Srbije, Japana, Amerike, Novog Zelanda i Holandije. Potpunu homologiju u aminokiselinskoj sekvenci ispitivani izolati pokazali su sa izolatima iz Srbije, Kine, Japana, Amerike i iz Australije. Prema tome, na osnovu visokog stepena homologije sekvence CP gena, potvrĎeno je da ispitivani izolati iz paprike pripadaju virusu mozaika lucerke. Finetti Sialer et al. (1997) su u Italiji izolovali i okarakterisali novi soj AMV- Danza, koji izaziva simptome hloroze i nekroze na paradajzu i ispoljava 99-96% identičnosti u sekvenci gena za protein omotača sa ostalim ranije opisanim izolatima. UporeĎivanjem sekvenci za protein omotača, više izolata sa različitim geografskim poreklom, Parrella et al. (2000) ustanovili su da njihova genetička identičnost iznosi 93- 99% na nivou nukleotidne sekvence, odnosno 92 -100% na aminokiselinskom nivou. Visok stepen nukleotidne identičnosti (>98%) CP gena utvrdili su i Xu and Nie (2006) ispitujući 8 izolata ovog virusa iz krompira poreklom iz Kanade. Kako u rodu Alfamovirus, postoji samo jedan član, AMV, ne postoje demarkacioni kriterijumi za razlikovanje vrsta u okviru ovog roda (Plyusnin et al., 2011). 132 6.4.5. Analiza nukleotidnih sekvenci i genetička identičnost izolata PMMoV Populacija PMMoV poreklom iz Srbije do sada nije ispitivana na molekularnom nivou, nije poznata genetička struktura, kao ni variranje srpskih izolata u odnosu na izolate PMMoV poreklom iz Evrope i drugih delova sveta. S obzirom da nije poznata genetička struktura populacije PMMoV prisutne u usevu paprike, molekularna ispitivanja izolata PMMoV dobijena u toku ovih istraţivanja, osim detekcije bila su usmerena i na njihovu identifikaciju. MeĎusobna genetička identičnost P-57-09, P-60-09 i P-3-10 izolata PMMoV izolovanih iz paprike iz lokaliteta Čonoplja i ĐurĎevo, kao i identičnost sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka, ispitana je poreĎenjem nukleotidne sekvence CP i RdRp regiona. Proračun genetičke identičnosti CP gena izmeĎu ispitivanih izolata i izolata PMMoV dostupnih u GenBank bazi podataka iz različitih geografskih regiona, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,5-100%) i aminokiselinske (98,5-100%) homologije. Proračunom genetičke identičnosti sekvenci dobijenih u ovom radu utvrĎen je visok nivo identičnosti ispitivanih izolata 99,5-100%. Najviši stepen identičnosti, odabrani izolati PMMoV iz paprike poreklom iz Srbije pokazali su sa izolatima iz MaĎarske, Španije, Kine, Italije, Brazila i iz Francuske. Potpunu identičnost u aminokiselinskoj sekvenci (100%) naši ispitivani izolati ispoljili su sa većinom izolata odabranih iz GenBank baze podataka. Proračun genetičke identičnosti RdRp gena izmeĎu ispitivanih izolata i izolata iz različitih geografskih regiona, pokazao je visok stepen nukleotidne (97,1-99,7%) i aminokiselinske (93,3-99,2%) homologije. Proračunom genetičke identičnosti sekvenci dobijenih u ovom radu utvrĎeno je da izolati meĎu sobom imaju 99,4-100% nukleotidne identičnosti. Najviši stepen nukleotidne identičnosti ispitivani izolati su pokazali sa izolatima iz Japana i Koreje. Najveći stepen homologije aminokiselinskih sekvenci, ispitivani izolati ispoljavaju sa izolatom iz Japana. Na osnovu visokog stepen homologije CP i RdRp sekvenci ispitivanih izolata sa sekvencama dostupnim u NCBI bazi podataka, dokazano je da svi ispitivani izolati pripadaju PMMoV. 133 Identifikaciju virusa blagog šarenila paprike na osnovu proučavanja sekvenci saopštili su i drugi autori (Hamada et al., 2002; Velasco et al., 2002; Verhoeven et al., 2002). Na osnovu istraţivanja sprovedenih od strane Kalman (2001), MaĎarski izolati pokazuju visok stepen identičnosti nukleotidne sekvence sa ranije opisnim izolatima (94- 99%), dok je stepen identičnosti aminokiselinske sekvence 95-100%. 6.5. Filogenetska analiza virusa paprike Molekularna ispitivanja odabranih izolata iz paprike poreklom iz Srbije su osim detekcije i identifikacije obuhvatila i karakterizaciju virusa, u cilju proučavanja genetičke stukture i variranja ispitivanih izolata u odnosu na izolate poreklom iz Evrope i drugih delova sveta. Filogenetska analiza uraĎena je na osnovu delimične sekvenca CP gena izolata CMV, TSWV i AMV, delimične nukleotidne sekvence gena za P1 protein izolata PVY, kompletne sekvence CP gena izolata PMMoV. Dobijene sekvence su uparene sa odgovarajućim odabranim sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka i rekonstruisano je filogenetsko stablo Maximum Parsimony metodom i bootstrap analizom sa 1 000 ponavljanja integrisanog unutar MEGA 4 programa. 6.5.1. Filogenetska analiza CMV izolata Veliki broj različitih sojeva virusa mozaika krastavca, njihovih grupa i podgrupa je do danas opisano (Kaper and Waterworth, 1981; Perry et al., 1993). Veliki broj sojeva virusa mozaika krastavca prijavljenih iz celog sveta svrstani su u dve podgrupe, podgrupu I i podgrupu II, na osnovu bioloških, seroloških (Hu et al., 1995; Ilardi et al., 1995) i molekularnih osobina (Owens and Palukaitis, 1988; Owenet et al., 1990; Rizos et al., 1992; Sialer et al., 1999). Filogenetskom analizom, na osnovu sekvenci gena, podgrupa I se dalje moţe podeliti podgrupe IA i IB (Palukaitis and Zaitlin, 1997; Roossinck et al., 1999; Roossinck, 2002). U podgrupu IB svrstani su Istočnoazijski izolati CMV dok u podgrupu IA su svrstani sojevi iz celog sveta (Roossinck et al., 1999). Rezultati Liu et al. (2009) su pokazali da bi se izolati CMV genetički mogli podeliti u tri grupe I, II, i III na 134 osnovu gena koji kodiraju MP, CP, 1a, i 2a proteine i u dve grupe na osnovu gena 2b. Grupa I bi se dalje mogla podeliti u dve podgrupe (IA i IB) na osnovu gena koji kodiraju CP, MP, 2a, i 2b proteine i u tri podgrupe (IA, IB, i IC) na osnovu gena koji kodira 1a protein. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu 38 sekvenci CP gena, uključujući i tri izolata iz paprike iz Srbije pokazalo je razdvajanje odabranih izolata CMV u dve grupe I i II, što su opisali i Francki et al. (1979) i Palukaitis et al. (1992). Ispitivani izolati pripadaju grupi I u koju je svrstana većina svetskih izolata ovog virusa (Roossinck et al., 1999). Grupa I je podeljena u dve podgrupe (ia) i (ib) pri čemu se izolati iz paprike poreklom iz Srbije grupišu u podgrupu (ia) sa većinom sojeva iz celog sveta. Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe II, zatim kod podgrupe Ia, dok je najveća varijabilnost zabeleţena unutar podgrupe Ib. Najmanja intergrupna varijabilnost izmeĎu podgrupa Ia i Ib, dok je izmeĎu podgrupe Ia i grupe II kao i izmeĎu podgrupe Ib i grupe II varijabilnost bila najveća. Nukleotidna identičnost izolata iz paprike poreklom iz Srbije sa izolatima iz filogenetskog stabla bila je od 70,1% do 99,7%, a aminokiselinska identičnost se kretala od 79 do 100%. Kako navode Yu et al. (2005), stepen nukleotidne identičnosti izolata u okviru CMV S–I podgrupe je od 88,8% do 99,2%, a izmeĎu izolata S–I i S–II podgrupe ispod 80%. Bonnet et al. (2005) ističu da većina izolata CMV (98%) pripada S–I podgrupi, a čak 64% izolata S–IA podgrupi. Veoma izraţenoj varijabilnosti izmeĎu izolata CMV doprinose mutacije, rekombinacije i pseudorekombinacije, kao najznačajniji faktori varijabilosti (Palukaitis and Garcia-Arenal, 2003), ali posebnu paţnju treba posvetiti i veoma značajnoj trgovinskoj razmeni koja moţe značajno da doprinese pojavi novih sojeva, gde do tada nisu bili prisutni, kao što je slučaj sa nedavnom introdukcijom sojeva IB podgrupe u Italiju (Gallitelli, 2000). Prisustvo izolata ove grupe, koji mogu da pričine veoma velike štete, do tada je bilo karakteristično samo za Aziju i Ameriku. Sve ove činjenice ukazuju na potrebu stalnog praćenja i analize strukture populacije virusa mozaika krastavca kod nas. 135 6.5.2. Filogenetska analiza PYV izolata U ovom radu odreĎene su i uporeĎene nukleotidne sekvence CP regiona genoma četiri izolata PVY. Filogenetska analiza 38 sekvenci gena za P1 protein izolata PVY iz različitih delova sveta, uključujući i četiri izolata iz paprike iz Srbije (PL-15-09, PL-28-09, PL-3-10, PL-108-10), pokazala je njihovo grupisanje u tri osnovna klastera: (i) klaster kome pripadaju svi izolati nekrotičnih PVYN i PVYNTN sojeva, (ii) klaster kome pripadaju svi izolati PVY C soja i (iii) klaster kome pripadaju izolati PVY O soja. Klaster (i) nekrotičnih izolata, moţe se podeliti na sub–klaster kome pripadaju izolati iz Evrope i sub– klaster kome pripadaju izolati poreklom iz Severne Amerike, što ukazuje da su PVYN i PVY NTN sojevi poreklom sa istog kontinenta meĎusobno sličniji nego sa odgovarajućim sojem poreklom sa drugog kontinenta (Đekić, 2010). Uočeni su i neki izuzeci, kao što je svrstavanje nekih izolata iz Kanade i USA u grupu evropskih nekrotičnih izolata, što govori o njihovom evropskom poreklu i verovatnu introdukciju putem uvoza krompira. Uočena je i obrnuta situacija, grupisanje nekih izolata iz Velike Britanije sa severnoameričkim nekrotičnim izolatima, što govori o postojećem „gen flow“ izmeĎu Evrope i Severne Amerike, a koji je omogućen intenzivnom razmenom biljnog materijala (Đekić, 2010). Filogenetske analize sekvenci CP gena (Ohshima et al., 2000) i cele genomne sekvence izolata PVY NTN (Ogawa et al., 2008) poreklom iz Japana pokazuju njihovo grupisanje u poseban klaster. Izolati iz paprike poreklom iz Srbije grupišu se u sub–klaster (ia) sa ostalim evropskim izolatima PVY N i PVY NTN sojeva. Ispitivani izolati imaju visoku nukleotidnu i aminokiselinsku identičnost sa PVYNTN izolatom (Sl. 64) iz krompira iz Slovenije. Nukleotidna identičnost izolata PVY iz paprike poreklom iz Srbije sa izolatima iz filogenetskog stabla bila je od 60,7% do 100%, a aminokiselinska identičnost se kretala od 50,7 do 100%. Proračunom genetičke udaljenosti sekvenci u okviru izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar sub-klastera (ia) gde spadaju i ispitivani izolati, a poreĎenjem intergrupne varijabilnosti moţe se reći da je sub-klaster (ia) imao najmanju intergrupnu varijabilnost sa sub-klasterom (ib) u koji spadaju izolati iz Amerike, a najveću sa klasterom (ii) koji predstavlja izolate koji pripadaju soju PVYc. Smatra se da 136 je širenje populacije nekrotičnih sojeva vezano za kontinentalnu i interkontinentalnu trgovinsku razmenu zaraţenih krtola krompira (Lorezen et al., 2006). Slične podatke daje i Đekić (2010) zbog velike sličnosti izolata iz duvana iz Srbije sa izolatima iz krompira iz Slovenije. Prenošenje PVY vašima na neperzistentan način, znači njegovo kratko zadrţavanje na stiletu vektora (2–4 časa), tako da se njegovo prenošenje vašima na veću udaljenost retko dešava (Berger et al., 1987), što opet potvrĎuje prethodne navode. Na osnovu ovih rezultata utvrĎeno je da sva četiri izolata iz paprike poreklom iz Srbije pripadaju grupi nekrotičnih sojeva, mada se na ovaj način ne mogu razlikovati i ne moţe doneti tačan zaključak kom soju pripadaju, PVYN, odnosno PVYNTN soju. 6.5.3. Filogenetska analiza TSWV izolata Dosadašnja filogenetska proučavanja Tospovirus roda, odnosila su se na proučavanje osobina različitih gena, u cilju klasifikacije i karakterizacije različitih tospovirusa. UtvrĎeno je da je stepen genetičke različitosti u sekvenci NC gena osnovni kriterijum klasifikacije Tospovirus-a (Pappu et al., 2000). TakoĎe, vrste roda Tospovirus su odreĎene na osnovu specifičnosti njihovih vektora, raspona biljaka domaćina, seroloških odnosa u N proteinu i po kriterijumu da njihova N proteinska sekvenca pokazuje manje od 90% identiteta sa bilo kojom drugom opisanom vrstom roda Tospovirus (Plyusnin et al., 2011). Prag od 90% identiteta amino-kiseline (AA) tospoviral N sekvenci proteina je jedan od vaţnih kriterijuma za odreĎivanje vrste virusa i trenutno je opšte prihvaćen. Silva et al. (2001) je predloţio da klasifikacija u okviru roda Tospovirus moţe da obuhvati i druge parametre, kao što je poreĎenje sekvenci N i NSm proteina. Lovato et al. (2004) i Nagata et al. (2007) su predloţili korišćenje sekvence gena G prekursora u taksonomske svrhe. Nagata et al. (2007) su takoĎe predloţili upotrebu IGR 3'UTR duţine kao i dodatnih parametara za razvrstavanje u taksonomiji Tospovirus roda. Na osnovu filogenetskih analiza N i NSm i geografske rasprostranjenosti, Tospovirus-i su svrstani u dve grupe, američku i evropsku. Virus bronzavosti paradajza svrstan je u američku grupu tj. vodi poreklo sa Američkog kontinenta (Silva et al., 2001). TakoĎe, veliki broj istraţivača je na 137 osnovu filogenetskih istraţivanja dokazao da je u okviru američke grupe opisan veliki broj geografskih subpopulcija (Tsompana et al., 2005; Sivparsad and Gubba, 2008). Filogenetska proučavanja virusa bronzavosti paradajza uraĎena su na osnovu osobina NC gena izolata poreklom iz različitih geografskih regiona i različitih biljaka domaćina. NC gen tri izolata TSWV sakupljenih u različitim lokalitetima u 2009. i 2010. godini, sekvencionirani su i na osnovu njihovih i dostupnih sekvenci drugih izolata, rekonstruisano je filogenetsko stablo. Na rekonstruisanom filogenetskom stablu jasno se uočava grupisanje izolata u odvojene klastere na osnovu geografskog porekla. Istraţivanja su pokazala postojanje dve osnovne grupe izolata, evropske i američke, kao i veći broj subpopulacija u okviru američke grupe. Na osnovu varijabilnosti sekvenci NC gena različitih izolata, izolati su svrstani u šest klastera, (i) izolati poreklom iz Evrope (većina evropskih izolata), (ii) izolati iz Japana, (iii) izolati iz Španije, (iv) izolati sa Havaja, (v) izolati iz Kalifornije (vi) izolati iz Dţordţije i Severne Karoline. Isti način grupisanja izolata TSWV iz različitih delova sveta, a na osnovu sekvenci NC i Nsm gena utvrdili su i Tsompana et al. (2005). Rezultati filogenetskih analiza, sprovedenih u ovom radu, pokazuju da se izolati TSWV poreklom iz paprike iz Srbije nalaze u klasteru koji čini većina izolata iz Evrope (Bugarska, Italija, Nemačka, Češka Republika, Holandija i Srbija), poreklom sa različitih domaćina, uključujući i papriku. Najveću genetičku identičnost izolati iz paprike poreklom iz Srbije pokazali su sa izolatima iz duvana iz Srbije (99,8%), dok je nukleotidna identičnost izolata TSWV iz paprike poreklom iz Srbije sa izolatima iz filogenetskog stabla bila od 95,4% do 99,8%, a aminokiselinska identičnost se kretala od 88,2 do 99,5%. Proračunom genetičke udaljenosti sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar klastera (v), dok je varijabilnost u okviru drugih grupa bila nešto veća. Intergrupna varijabilnost bila je najveća izmeĎu klastera (ii) i (vi), dok je najmanja intergrupna varijabilnost bila je izmeĎu klastera (ii) i (iii). MeĎutim, postoje i izvesna odstupanja vezana za grupisanje izolata na osnovu geogrfskog poreklu. U ovom radu, kao i u radu Tsompana et al. (2005) i Đekić (2010), ta odstupanja odnose se na grupisanje izolata TSWV iz Afrike i nekih izolata iz Severne Karoline sa evropskim izolatima, kao i izdvajanje izolata iz Španije od ostalih evropskih 138 izolata. Nischwitz et al. (2007) objašnjavajući genetičku identičnost izolata TSWV iz Severne Karoline (NC 1 i NC 3) i iz Afrike (98/0472 i TSWV–GP) sa izolatima iz Holandije, navode tzv. „gen flow“ iz Evrope u Severnu Karolinu i iz Evrope u Severnu Afriku, koji je uočen i za neke druge Tospovirus–e. Izdvajanje španskih izolata TSWV od drugih evropskih izolata, moţe se pripisati dvema nezavisnim introdukcijama TSWV u Evropu, pri čemu španski izolati imaju bliţeg zajedničkog evolutivnog pretka sa izolatima izvan evropskog, odnosno sa američkog kontinenta (Đekić, 2010). Analizirajući izolate jednog drugog Tospovirus–a, IYSV (Iris yellow spot virus), došlo se do sličnih zaključaka (Bulajić et al., 2009). Izolati poreklom iz Italije, uključeni u ova ispitivanja, pokazuju na osnovu NC filogenetskog stabla grupisanje sa španskim ili ostalim evropskim izolatima, dok jedan izolat T922 iz paradajza, pripada ostalim evropskim. Ovi rezultati upućuju na višestruku introdukciju TSWV u Italiju i moguću rekombinaciju nekih izolata putem izmene celih genomnih segmenata, što je jedan od mogućih vidova velike varijabilnosti unutar TSWV (Qui et al., 1998; Qui and Moyer, 1999). Sagledavanjem NC filogenetskog stabla, uočava se da se jedan izolata TSWV poreklom iz Brazila ne grupiše sa ostalim izolatima uključenim u analizu. Ovaj izolat moţe se smatrati posebnim klasterom ili podgrupom jednog velikog klastera u kome se nalaze izolati iz Kalifornije, Dţordţije, Havaja i Španije. 6.5.4. Filogenetska analiza AMV izolata Na osnovu tri sekvenci izolata AMV dobijenih u ovom radu i dostupnih sekvenci drugih izolata, rekonstruisano je filogenetsko stablo, koje pokazuje četiri različite grupe, odnosno grupisanje izolata AMV u najmanje četiri genetička soja. Na rekonstruisanom filogenetskom stablu izdvajaju se četiri klastera, odnosno grupisanje izolata AMV u četiri genetička soja, nezavisno od geografskog porekla i biljke domaćina. Većina izolata, izdvojila su se u grupu I. TakoĎe u ovu grupu spadaju i tri ispitivna izolata AMV iz paprike poreklom iz Srbije (P-27-9, PL-2-10 i P-10-10). Drugu molekularnu grupu čine sedam izolata iz Kanade, izolati iz Italije čine treću molekularnu grupu, dok su se četiri izolata iz 139 Francuske i dva izolata iz Velike Britanije izdvojili u četvrtu grupu. Prema istraţivanjima Stanković i sar. (2011), izolat iz duvana (196-08) iz Srbije, nalazi se u IV grupi koju čine sedam izolata iz Kanade, tri iz Italije, kao i izolat iz lucerke iz Srbije. MeĎutim, Parrella et al. (2000) utvrdili su podelu izolata različitog geografskog porekla i iz različitih biljaka domaćina u dve odvojene grupe, a nukleotidna identičnost izolata izmeĎu dve grupe bila je manja od 96%. Sa druge strane, istraţivanja u Kanadi pokazala su da se svi izolati AMV sa krompira grupišu u jedan od najmanje četiri klastera izolata ovog virusa (Xu and Nie, 2006). Nukleotidna identičnost izolata AMV iz paprike poreklom iz Srbije sa izolatima iz filogenetskog stabla bila je od 93,7% do 99,5%, a aminokiselinska identičnost se kretala od 93 do 100%. Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, najmanja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe (ii), dok je varijabilnost u okviru drugih grupa bila nešto veća. Intergrupna varijabilnost bila je najveća izmeĎu grupa (i) i (iv) kao i izmeĎu (ii) i (iv) a najmanja manja izmeĎu grupa (i) i (ii) kao i izmeĎu (ii) i (iii). Svi ovi podaci ukazuju na neophodna dalja izučavanja genetičke strukture populacije AMV i definisanje novih kriterijuma, uključujući proučavanje drugih delova genoma ovog virusa. OdreĎivanje varijabilnosti u okviru populacije ovog virusa u usevu paprike, ali i u drugim biljkama domaćina u Srbiji doprineće boljem poznavanju epidemiologije ovog patogena, a sve u cilju osmišljavanja i sprovoĎenja što efikasnijih mera kontrole, kao i prevencije mogućih introdukcija novih sojeva za našu zemlju usled veoma intenzivne meĎunarodne razmene biljnog materijala. 6.5.5. Filogenetska analiza PMMoV izolata Kako populacija PMMoV poreklom iz paprike iz Srbije do sada nije ispitivana na molekularnom nivou, molekularna ispitivanja, osim detekcije i identifikacije bila su usmerena i na njihovu karakterizaciju. Smatra se da postoje četiri soja PMMoV, P0, P1, P1,2 i P1,2,3 koji se razlikuju prema hipersenzitivnoj reakciji koju izazivaju na paprici koje su nosioci L 1 , L 2 , L 3 i L 4 rezistentnih gena (Mijatović i sar., 2007). Ovi sojevi se meĎu sobom ne razlikuju serološki (Green, 2003; Takeuchi et al., 2005). Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence CP 140 gena duţine 550 bp, pokazalo je razdvajanje odabranih izolata PMMoV u dva klastera. Ispitivani izolati iz Srbije kao i većina odabranih izolata grupišu se u prvi klaster što znači da pripadaju izolatima koji izazivaju hipersenzitivnu reakciju (HR) na paprici koja je nosilac L 3 rezistentnog gena, drugu grupu koju čine tri izolata koji ne poseduju ovu osobinu. Proračunom genetičke identičnosti utvrĎen je stepen nukleotidne identičnosti izolata PMMoV prikazanih u filogenetskom stablu, od 93,1% do 100%, dok je stepen aminokiselinske sličnosti iznosio od 96,8% do 100%. Proračunom genetičke udaljenosti CP sekvenci unutar izdvojenih grupa, manja varijabilnost ustanovljena je unutar grupe (ii), dok je varijabilnost u okviru prve grupe bila nešto veća. Intergrupna varijabilnost izmeĎu grupa (i) i (ii) bila 0,060±0,010. 141 7. ZAKLJUČAK Na osnovu obavljenih istraţivanja sprovedenih u ovoj doktorskoj disertaciji i dobijenih rezultata moţe se zaključiti sledeće: Prisustvo virusa utvrĎivano je tokom 2009. i 2010. godine kako u proizvodnji paprike u rasadu, proizvodnji u zaštićenom prostoru, tako i u proizvodnji paprike na otvorenom polju.  Prikupljeni uzorci paprike koji su po simptomima nagoveštavali da se radi o virusnoj prirodi oboljenja, serološki su analizirani u cilju detekcije najrasprostranjenijih i ekonomski najznačajnijih virusa paprike, pri čemu se na osnovu seroloških analiza utvrdila prisutnost i rasprostranjenost virusa paprike po lokalitetima u obe ispitivane godine.  Uzorci su testirani primenom DAS–ELISA testa, korišćenjem komercijalnih poliklonalnih antiseruma specifičnih za detekciju devet najznačajnijih virusa paprike: Tomato spotted wilt virus (virus bonzavosti paradajza, TSWV), Potato virus Y (virus crtičastog mozaika krompira, PVY), Cucumber mosaic virus (virus mozaika krastavca, CMV), Tobacco mosaic virus (virus mozaika duvana, TMV), Alfalfa mosaic virus (virus mozaika lucerke, AMV), Potato virus X (virus mozaika krompira PVX), Pepper mottle virus (virus šаrenilа pаprike, PepMoV), Pepper mild mottle virus (virus blаgog šаrenilа pаprike PMMoV) i Pepper veinal mottle virus (virus šаrenilа nerаvа pаprike, PVMV). Ispitivanja prisutnosti virusa na paprici u rasadu, pokazala su dominantno prisustvo CMV u obe ispitivane godine, dok u znatno niţem procentu bili su zastupljeni PVY i AMV. Od ukupno sakupljenih 121 uzoraka, prisustvo virusa dokazano je u 23,97%, dok u 76,03% testiranih uzoraka nije utvrĎeno prisustvo nijednog od ispitivanih virusa. Na svim lokalitetima procenjen je intenzitet zaraze od 5-10%. TSWV, TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nisu bili detektovani ni u jednoj ispitivanoj godini.  Ispitivanja prisutnosti virusa na paprici u zaštićenom prostoru pokazuju da je tokom 2009. godine PVY bio najdominantniji, a drugi po zastupljenosti bio je CMV, dok je 2010. godine bilo obrnuto. Prisustvo AMV ustanovljeno u obe godine ispitivanja i to 2009. godine bio je četvrti po zastupljenosti, dok je 2010. godine njegovo prisustvo dokazano u nešto većem broju uzoraka i zauzimao je treće mesto iza PVY i CMV. TSWV bio je 142 zabeleţen kako u 2009. tako i u 2010. godini, s tim što je veća prisutnost ovog virusa zabeleţena u prvoj godini ispitivanja. Na svim lokalitetima procenjen je intenzitet zaraze od 20-40%. TMV, PVX, PMMoV, PepMoV i PVMV nisu bili detektovani ni u jednoj ispitivanoj godini. Ispitivanja prisutnosti virusa na paprici na otvorenom polju pokazuju da je tokom 2009. godine, PVY bio najdominantniji, a drugi po zastupljenosti bio je CMV, koji je 2010. godine bio najzastupljeniji u proizvodnji paprike na otvorenom polju, dok je PVY bio prisutan u nešto manjem broju uzoraka. Prisustvo AMV ustanovljeno u obe godine ispitivanja i bio je treći po zastupljenosti iza PVY i CMV. PMMoV detektovan je samo u proizvodnji paprike u polju i to na manjem broju uzoraka, u obe ispitivane godine. Na svim pregledanim lokalitetima intenzitet zaraze virusima bio je preko 50%. TSWV, TMV, PVX, PepMoV i PVMV nisu bili detektovani ni u jednoj ispitivanoj godini.  Kod sva tri načina gajenja paprika bila je dominantna pojedinačna zaraza, meĎutim u zaštićenom prostoru i na otvorenom polju mogla se uočiti mešana zaraza sa dva virusa, gde je najdominantija mešana zaraza bila sa PVY i CMV u obe godine ispitivanja. U prizvodnji paprike na otvorenom polju, pored mešane zaraze dva virusa detektovana je i mešana zaraza tri virusa.  Kako je na paprici u našoj zemlji prisutno najmanje pet virusa, u pojedinačnim i mešanim zarazama, uočeni simptomi i njihova veza sa virusom prouzrokovačem imaju samo preliminarni dijagnostički značaj. Simptomi, koliko god bili izraţeni i karakteristični, ipak samo ukazuju na postojanje zaraze odreĎenim virusom, a konačna tačna dijagnoza moţe se postaviti samo posle odgovarajućih laboratorijskih analiza.  Odabrani izolati najznačajnijih virusa paprike, za koje je primenom seroloških i molekularnih metoda utvrĎeno da pripadaju CMV, PVY, TSWV, AMV i PMMoV, korišćeni su za dalje analize sekvenci odreĎenih delova genoma u cilju njihove identifikacije i čime je omogućeno proučavanje genetičke identičnosti sekvenci ispitivanih izolata virusa paprike poreklom iz Srbije sa izolatima virusa iz drugih delova sveta dostupnih u GenBank bazi podataka. 143  Ustanovljen je visok stepen nukleotidne identičnosti gena za P1 protein ispitivanih izolata PVY poreklom iz Srbije sa izolatom iz Slovenije, Srbije i Kolumbije. Determinisane su nukleotidne sekvence CP gena tri izolata CMV, AMV i PMMoV, sekvence NC gena tri izolata TSWV, kao i nukleotidne sekvence RdRp gena tri izolata PMMoV. Rezultati molekularne identifikacije pokazali su najveću identičnost izolata TSWV sa izolatom Sr-603 iz paradajza iz Srbije, izolata CMV sa izolatima iz Amerike, Austarlije, Španije i Srbije, izolata AMV sa izolatima iz Srbije, Japana, Amerike, Novog Zelanda i Holandije kao i izolata PMMoV sa izolatima iz MaĎarske, Španije, Kine, Italije, Brazila i iz Francuske. Na osnovu sekvence RdRp gena izolati PMMoV pokazuju najveću identičnost sa izolatima iz Japana i Koreje.  Proučаvаnje evolutivne povezаnosti izolаtа odreĎenog virusа, višestruko upаrivаnje sekvenci i rekonstrukcijа filogenetskog stаblа sekvencionirаnih izolаtа nаjrаsprostrаnjenijih i nаjučestаlijih virusа pаprike iz Srbije sа izolаtimа dostupnim u bаzi podаtаkа, obаvljeno je korišćenjem Maximum Parsimony metode, integrisаne unutаr progrаmа MEGA verzijа 4.0 i bootstrap аnаlize sа 1 000 ponаvljаnjа.  Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci CP gena, uključujući izolate iz paprike iz Srbije pokazalo je razdvajanje odabranih izolata CMV u dve grupe I i II, dok se grupa I dalje deli na podgrupe IA i IB. U podgrupu IB svrstani su istočnoazijski izolati CMV dok u podgrupu IA je svrstana većina sojeva iz celog veta. Ispitivani izolati poreklom iz paprike iz Srbije CMV pripadaju podgrupi I.  Filogenetska analiza na osnovu sekvenci gena za P1 protein, pokazala je grupisanje izolata PVY u tri osnovna klastera koji odgovaraju opisanim sojevima ovog virusa. Izolati PVY iz paprike poreklom iz Srbije grupišu se u klaster sa ostalim evropskim izolatima nekrotičnih sojeva (PVYN i PVYNTN). Velika identičnost izolata iz paprike iz Srbije sa izolatima iz krompira iz Slovenije, ukazuje, takoĎe, da su zaraţene krtole krompira osnovni rezervoar PVY i da je razmenom zaraţenih krtola izmeĎu drţava doprinelo širenju virusa.  Rezultati filogenetskih analiza pokazuju grupisanje izolata TSWV poreklom iz paprike iz Srbije u klaster koji čini većina izolata iz Evrope. Najveću genetičku identičnost 144 i grupisanje izolati poreklom iz Srbije pokazali su sa izolatima iz Bugarske upućujući na protok gena („gen flow“) izmeĎu ova dva geografska regiona Evrope.  Na filogenetskom stablu rekonstruisanom na osnovu sekvence CP gena, pokazalo je grupisanje izolata AMV u četiri genetička soja, nezavisno od geografskog porekla i biljke domaćina. Većina izolata, izdvojila se u grupu I. TakoĎe u ovu grupu spadaju i tri ispitivna izolata AMV iz paprike poreklom iz Srbije.  Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvence CP gena, pokazalo je razdvajanje odabranih izolata PMMoV u dva klastera, pri čemu prva grupa odgovara izolatima koji izazivaju hipersenzitivnu reakciju (HR) na paprici i koje su nosioci L 3 rezistentnog gena, a drugu grupu čine izolati koji ne poseduju ovu osobinu. Ispitivani izolati iz Srbije grupišu se u prvi klaster.  Ispitivаnje prisutnih virusа pаprike kod nаs, kаo i primenа nаjsаvremenijih molekulаrnih tehnikа, unаpredila je metode detekcije, identifikаcije i karakterizacije ovih virusа, doprinelo je inventаrizаciji virusа u Srbiji, a takoĎe je i doprinelo rаzumevаnju njihovog poreklа i dаljeg širenjа u nаšoj zemlji. 145 8. LITERATURA Abdalla, O. A., Desjardins, P. R. and Dodds, J. A. (1991): Identification, disease incidence and distribution of viruses infecting peppers in California. Plant Disease, 75: 1019-1023. Adams, M. J., Antoniw, J. F. and Fauqet, C. M. (2005): Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae. Archives of Virology, 150: 459-479. Adkins, S., Lamb, E. M., Roberts, P. D., Gooch, M. D., Breman, L. and Shuler K. D. (2001): Identification of Pepper mild mottle virus in commercial Bell Pepper in Florida. Plant Disease, 85: 679. Agrios, G. N. (1988): Plant Pathology. Academic Press Inc., London: 1-803. Aleman-Verdaguer, M .E., Goudou-Urbino, C., Dubern, J., Beachy, R. N. and Fauquet, C. (1997): Analysis of the sequence diversity of the P1, HC, P3, NIb and CP genomic regions of several yam mosaic potyvirus isolates: implications for the intraspecies molecular diversity of potyviruses. Journal of General Virology, 78: 1253-1264. Ali, A. and Kobayashi, M. (2010): Seed transmission of Cucumber mosaic virus in pepper. Journal of Virological Methods, 163 (2): 234-237. Allen, W. R., Matteoni, J. A., Broadbent, A. B. (1991): Factors relating to epidemiology and symptomatology in florist´s chrysanthemum infected with Tomato spotted wilt virus. pp. 28-45. In: Hsu, H. T., Lawson, R. H. (eds): Virus-Thrips-Plant Interactions of TSWV. Springfield, National Technology Information Service. Alonso, E. I., Garcia Luque, M. J., Avila-Rincon, B., Wicke, M.T., Serra and Diaz- Ruiz, J. R. (1989): A tobamovirus causing heavy losses in protected pepper crops in Spain. Journal of Phytopathology, 125: 67-76. Alonso, E., Garcia-Luque, I., de la Cruz, A., Wicke, B., Avila-Rincon, M. J., Serra, M. T., Castresana, C. and Diaz-Ruiz, J. R. (1991): Nucleotide sequence of the genomic RNA of Pepper mild mottle virus, a resistance-breaking tobamovirus in pepper. Journal of General Virology, 72 (Pt 12): 2875-2884. 146 Arli-Sokmen, M., Mennan, H., Sevik, M. A. and Ecevit O. (2005): Occurrence of viruses in field-grown pepper crops and some of their reservoir weed hosts in Samsun, Turkey. Phytoparasitica, 33 (4): 347-358. Arteaga, M. L., Ortega, R. G. (1986): Biological characterization of PVY as isolated from pepper in Spain. In: Meeting on genetics and breeding on capsicum and eggplant, Proceedings. Zaragoza: Eucarpia, 6: 183-188. Avilla, C., Collar, J. L., Duque, M. and Fereres, A. (1997): Yield of bell pepper (Capsicum annuum) inoculated with CMV and/or PVY at different time intervals, zeitschrift fur pflanzenkrankheiten und pflanzenschutz. Journal of plant diseases and protection, 104: 1-8. Badge, J., Robinson, D. J., Brunt, A. A. and Foster, G. D. (1997): 3'-Terminal sequences of the RNA genomes of narcissus latent and maclura mosaic viruses suggest that they represent a new genus of the Potyviridae. Journal of General Virology 78: 253-257. Balaji, B., Bhat, A. I. and Eapen (2008): A phylogenetic reexamination of Cucumber mosaic virus isolates based on 1a, 2a, 3a and 3b proteins. Indian Journal of Virology, 19 (1): 27–33. Barker, R. F., Jarvis, N. P., Thompson, D. V., Loesch-Fries, L. S. and Hall, T. C. (1983): Complete nucleotide sequence of alfalfa mosaic virus RNA3. Nucleic Acids Research, 11 (9): 2881-2891. Beczner, J., Hamilton, R. and D. M. Rochon. (1997): Characterization of an isolate of Pepper mild mottle tobamovirus occurring in Canada. Canadian Journalof Plant Pathology: 83-88. Berger, P. H., Zeyen, R. J. and Gorth, J. V. (1987): Aphid retention of Maize dwarf mosaic virus (Potyvirus): epidemiological implications. Annals of Applied Biology, 111: 337–344. Berling, A., Lianas-Bousquet, W., Malezieux, S., Gebre-Selassie, K. (1990): Tomato spotted wilt virus. Connaitre le probleme pour enrayer l’ epidemie. Phytoma, 422: 46-50. 147 Berniak, H., Kaminska, M. and Malinowski, T. (2010): Cucumber mosaic virus groups IA and II are represented among isolates of naturally infected lilies. European Journal of Plant Pathology, 127: 305-309. Best, R. J. (1968): Tomato spotted wilt virus. Adv. Virus Res. 13: 65-146. Bhat, A. I., Pappu, S. S., Pappu, H. R., Deom, C. M. and Culbreath, A. K. (1999): Analysis of the intergenic region of Tomato spotted wilt virus medium RNA segment. Virus research, 61: 161-170. Blanchard, C. L., Boyce, P. M. and Anderson, B. J. (1996): Cucumber mosaic virus RNA5 is mixed population derived from the conserved 3’–terminal regions of genomic RNAs 2 and 3. Virology, 217: 598-601. Blanco-Urgoiti, Tribodet, Leclere, Ponz, Pérez de San Román, Legorburu and Kerlan (1998): European Journal of Plant Pathology 104 : 811. Boccard, F. and Baulcombe, D. (1993): Mutational analysis of cis-acting sequences and gene function in RNA3 of cucumber mosaic virus. Virology, 193 (2): 563-578. Boiteux, L. S., Cupertino, F. P., Silva, C., Dusi, A. N., Monte-Neshich, D. C., Vlugt, R. A. A. and Fonseca M. E. N. (1996): Resistance to potato virus Y (pathotype 1–2) in Capsicum annuum and Capsicum chinense is controlled by two independent major genes. Euphytica, 87 (1): 53-58. Bol, J. F. (1999): Alfalfa mosaic virus and Ilarviruses: involvement of coat protein in multiple steps of the replication cycle. Journal of General Virology, 80: 1089-1102. Bol, J. F., van Vloten–Doting, L. and Jaspars, E. M. J. (1971): A functional equivalence of top component a RNA and coat protein in the initiation of infection by Alfalfa mosaic virus. Virology, 46: 73-85. Bonnet, J., Fraile, A., Sacristan, S., Malpica, J. M. and Garcia–Arenal, F. (2005): Role of recombination in the evolution of natural populations of Cucumber mosaic virus, a tripartite RNA plant virus. Virology, 332 (1): 359-368. Bos, L. and Jaspars, E. M. J. (1971): CMI/AAB Descriptions of plant viruses. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK, 46: 1-4. Bosland, P. W., Iglesias, J. and Gonzalez, M. M. (1994): 'NuMex Centennial' and 'NuMex Twilight' ornamental chiles. HortScience 29: 1090. 148 Bousalem, S., Dallot, S. and Guyader, S. (2000): The use of phylogenetic data to develop molecular tools for the detection for the detection and genotyping of Yam mosaic virus. Potential application in molecular epidemiology. Journal of Virological Methods, 90: 25–36. Brittlebank, C. C. (1919): Tomato diseases. Agricultural Journal of Victoria 17: 213-235. Broadbent and Fletcher (1963): Annals of Applied Biology 52: 233. Brunt, A. A. (1992): The general properties of Potyviruses. Archives of Virology Supplementum, 5: 3-16. Brunt, A. A., Crabtree, K., Dallwitz, M. J., Gibbs, A. J., Watson, L. and Zurcher, E. J. (1996): Tomato spotted wilt virus. Plant Viruses On line: Descriptions and Lists from the VIDE Database. Version: 20th August 1996. (http://biology. anu.edu.au/Groups/MES/vide/). Brunt, A. A., Crabtree, K., Dallwitz, M. J., Gibbs, A. J. Watson, I., Zurcher, E. J. (1997): Tomato spotted wilt tospovirus. Plant virus online. Descriptions and lists from the VIDE database. Büchen–Osmond, C. (2006): Potato virus Y. In: ICTVdB–The Universal Virus Data base. Version 4. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/). Bulajić, A., Zindović, J., Berenji, J., Dukić, N., Đekić, I., Duduk, B., Krstić, B. (2006): Nekrotični soj virusa crtičastog mzaika krompira na duvanu u srbiji. Zbornik rezimea VIII savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor: 67-68. Bulajić, A. Đekić, I., Jović, J., Krnjajić, S., Vučurović, A. and Krstić, B. (2009): Incidence and distribution of Iris yellow spot virus on onion in Serbia. Plant Disease, 93(10): 976- 982. Bulajić, A., Vučurović, A., Stanković, I., Ristić, D., Ivanović, M., Krstić, B. (2010): Razvijanje metode za odreĎivanje učestalosti zaraze virusom mozaika lucerke u usevu semenske lucerke. X savetovanje o zaštiti bilja, Zbornik rezimea radova, Društvo za zaštitu bilja Srbije: 77-78. Buonaurio, R., Scortichini, M. (1994): Pseudomonas syringae pv. syringae on pepper seedlings in Italy. Plant Pathology, 43 (1): 216–219. 149 Canto, T., Prior, D. A. M., Hellwald, K. H., Oparka, K. J. and Palukaitis, P. (1997): Characterization of Cucumber mosaic virus. IV. Movement protein and coat protein are both essential for cellto-cell movement of cucumber mosaic virus. Virology, 237: 237-248. Chatzivassiliou E. K., Weekes, R., Morris, J., Wood, K. R., Barker, I and Katis, N. I. (2000). Tomato spotted wilt virus (TSWV) in Greece: its incidence following the expansion of Frankliniella occidentalis, and characterisation of isolates collected from various hosts. Annals of Applied Biology, 137: 127-134. Chaumpluk, P., Sasaki, Y., Nakajima, N., Nagano, H., Nakamura, I., Suzuki, K., Mise, K., Inouye, N., Okuno, T. and Furusawa, I. (1996): Six new subgroup I members of Japanese cucumber mosaic virus as determined by nucleotide sequence analysis on RNA3's cDNAs. Ann. Phytopathol. Soc. Japan, 62: 40-44. Chen, Y. K. (2003): Occurence of cucumber mosaic virus in ornamental plants and perspectives of transgenic control. Ph.D. Thesis, Wageningen University, The Netherlands: 144. Chen, Sh., Gu, H., Wang, X., Chen, J. and Zhu, W. (2011): Multiplex RT-PCR detection of Cucumber mosaic virus subgroups and Tobamoviruses infecting Tomato using 18S rRNA as an internal control. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 43(6): 465-471. Cho, J. D., Kim, J. S., Kim, J. Y., Choi, G. S. and Chung, B. N. (2009): Biological Characteristics and Nucleotide Relationships in Korean Tomato spotted wilt virus isolates. The Plant Pathology Journal, 25 (1) : 26-37. Choi, G. S., Kim, J. H., Lee, D. H., Kim, J. S. and Ryu, K. H. (2005a): Occurrence and Distribution of Viruses Infecting Pepper in Korea. Journal of Plant Pathology, 21 (3): 258-261. Choi, H. S., Ko, S. J., Kim, M. K., Park, J. W., Lee, S. H., Kim, K. H., Were, H. K., Choi, J. K. and Takanami, Y. (2005b): Characteristics of Potato virus Y Isolated from Paprika in Korea. Journal of Plant Pathology, 21 (4) : 349-354. Chrzanowska, M. (1991): New isolates of the necrotic strain of Potato virus Y (PVY N ) found recently in Poland. Potato Research, 34: 179-182. 150 Ciuffo, M., Finetti–Sialer, M. M., Gallitelli, D. and Turina, M. (2005): First report in Italy of a resistance-breaking strain of Tomato spotted wilt virus infecting tomato cultivars carrying the sw5 resistance gene. Plant Pathology, 54: 564-565. Clark, M. F. and Adams, A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34: 475-483. Colson, P., Richet, H., Desnues, C., Balique, F., Moal, V. (2010): Pepper Mild Mottle Virus, a Plant Virus Associated with Specific Immune Responses, Fever, Abdominal Pains, and Pruritus in Humans. PLoS ONE 5(4): e10041. Conti, M. and Masenga, V. (1977): Identification and prevalence of pepper viruses in northwest Italy. Phitopath. Z., 90: 212-222. Coutts, B. A., Thomas-Carroll, M. L., Jones, R. A. C. (2004): Patterns of spread of Tomato spotted wilt virus in field crops of lettuce and pepper: spatial dynamics and validation of control measures, Annual of Applied Biology, 145: 231-245. Creamer, R. (2003): Alfalfa mosaic virus. In: Compendium of Pepper Diseases. Crill, Hagedorn and Hanson (1970): Res. Bull. agric. Exp. Stn Univ. Wis. 280: 40. Croslin, Hamm, Eastwell, Thornton, Brown, Corsini, Shiel & Berger (2002): Plant Disease, 86: 1177. Davino, M., Areddia, R., Polizzi, G. and Grimaldi,V. (1989): Observations on pitting in pepper fruit in Sicily. Difesa delle Piante, 12 (1-2): 65-73. Dawson, W. O. (1999): Tobacco mosaic virus virulence and avirulence. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B., 342: 645-651. de Avila, A. C., Huguenot, C., Resende, R. de O., Kitajima, E. W., Goldbach, R. W. and Peters, D. (1990): Serological differentiation of 20 isolates of Tomato spotted wilt virus. Journal of General Virology, 71: 2801 – 2807. de Avila, A. C., de Haan, P., Kormelink, R., Resende, R. de O., Goldbach, R. W. and Peters, D. (1993): Classification of Topoviruses based on phylogeny of nucleoprotein. Journal of General Virology, 74: 153-159. De Bokx, J. A. and Huttinga, H. (1981): Potato virus Y. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, No 242 (No 37 revised). 151 De Haan, P., Wagemakers, L., Peters, D. and Goldbach, R. (1989): Molecular cloning and terminal sequence determination of the S and M RNAs of tomato spotted wilt virus. Journal of General Virology, 70 (PT 12): 3469-3473. Delević, B. (1963): Viroze paprike u SR Srbiji. Institut za zaštitu bilja S. R. Srbije. Dewey, R. A., Semorile, L. C., Grau, O. (1996): Detection of Tospoviruse species by RT- PCR of the N gene and restriction enzyme digestions of the products. Journal of Virological Methods, 56: 19-26. Dietzgen, R. G., Twin, J., Taltz, J., Selladurai, S., Carroll, M. L., Coutts, B. A., Berryman, D. I. and Jones, R. A. (2005): Genetic variability of Tomato spotted wilt virus in Australia and validation of real time RT–PCR for its detection in single and bulked leaf samples. Annals of Applied Biology, 146: 517 – 530. Ding, S. W., Anderson, B. J., Haase, H. R. and Symons, R. H. (1994): New overlapping gene encoded by the cucumber mosaic virus genome. Virology, 198: 593-601. Ding, S. W., Li, W. X. and Symons, R. H. (1995): A novel naturally occurring hybrid gene encoded by a plant RNA virus facilitates long distance virus movement. EMBO J. 14: 5762-5772. Dukić, N., Finetti Sialer, M., Gallitelli, D., Krstić, B., Vico, I., Duduk, B. (2002a): Molekularna identifikacija virusa bronzavosti paradajza na paprici. XII Simpozijum o zaštiti bilja i savetovanje o primeni pesticida. Zlatibor: 72. Dukić, N., Finetti Sialer, M. M., Gallitelli, D. i Duduk, B. (2002b): Molekularna identifikacija izolata virusa mozaika krastavca u Jugoslaviji-podgrupe IA. Zbornik rezimea XII simpozijuma o zaštiti bilja i savetovanja o primeni pesticida, Zlatibor: 75. Dukić, N. (2004a): Karakterizacija i molekularna detekcija virusa obične tikve (Cucurbita pepo L.) u Srbiji. Magistarska teza. Univerzitet u Beogradu. Poljoprivredni fakultet, Zemun. Dukić, N., Krstić, B., Finetti Sialer, M. M., Gallitelli, D., Vico, I. i Berenji, J. (2004b): Metoda dot-blot hibridizacije nukleinskih kiselina u detekciji virusa paprike, paradajza i obične tikve. Zbornik rezimea V kongresa o zaštiti bilja sa meĎunarodnim učešćem, Zlatibor: 104. 152 Dukić, N., Bulajić, A., Berenji, J., Đekić, I., Duduk, B. i Krstić, B. (2006): Prisustvo i rasprostranjenost virusa duvana u Srbiji. Pesticidi i fitomedicina, 21: 205-214. Đekić, I., Dukić, N., Bulajić, A., Berenji, J., Duduk, B., Antonijević, D. i Krstić, B. (2006): Karakterizacija virusa bronzavosti paradajza i nivo otpornosti nekih genotipova duvana u Srbiji. Zbornik rezimea VIII savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor: 69-70. Đekić, I., Bulajić, A., Berenji, J. i Krstić, B. (2007a): Neravnomerna distribucija Tomato spotted wilt virus u duvanu, paradajzu i paprici. Zbornik rezimea XIII simpozijuma sa savetovanjem o zaštiti bilja, Zlatibor: 117-118. Đekić, I., Bulajić, A., Zindović, J., Berenji, J., Pauković, M. i Krstić, B. (2007b): Identifikacija sojeva virusa crtičastog mozaika krompira na duvanu. Pesticidi i fitomedicina, 22: 155-163. Đekić, I., Bulajić, A., Vučurović, A., Ristić, D. i Krstić, B. (2008): Uticaj neravnomerne distribucije virusa bronzavosti paradajza na serološko dokazivanje virusa u paradajzu, paprici i ukrasnim biljkama. Pesticidi i fitomadicina, 23: 225-234. Đekić, I., Bulajić, A., Jović, J., Krnjajić, S., Vučurović, A., Berenji, J., Krstić, B. (2008a): Zastupljenost i molekularna detekcija virusa mozaika krastavca u usevu duvana. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 40 (81): 70-82. Đekić, I. (2010): Priusutvo, rаsprostrаnjenost i kаrаkterizаcijа virusа duvаnа u Srbiji. Doktorskа disertаcijа. Poljoprivredni fаkultetu Univerziteta u Beogrаdu. Echer, M. de M., Costa, C. de P. (2002): Reaction of sweet pepper to the potato virus Y (PVY m ) 1 : Scientia Agricola, 59 (2): 309-314. Edwardson and Christie (1997): Florida Agricultural Experiment Station Monograph Series 18-II: 467. Ellis, Stace-Smith and de Villiers (1997): Plant Disease 81: 481. Erkan, S (1986). Potato virus Y on pepper, in Turkey. Phytopathol. Mediterr. 25: 149-150. Erny, C., Schoumacher, F., Jung, C., Gagey, M. J., Godeefroy–Colburn, T., Stussi– Garaud, C. and Berna, A. (1992): An N–proximal sequence of the Alfalfa mosaic virus movement protein is necessary for association with cell walls in transgenic plants. Journal of General Virology, 73: 2115-2119. 153 Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U. and Ball, L. A. (2005): Virus Taxonomy, Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier/Academic Press, London. Filov, A. I. (1956): Perec i baklaţan, Seljlozgiz, 368. Finetti–Sialer, M. M., Di Franco, A., Papanice, M. A. and Gallitelli, D. (1997): Tomato necrotic yellows induced by a novel strain of Alfalfa mosaic virus. Journal of Plant Pathology, 79: 115-120. Finetti Sialer, M. M., Parrela, G., Papanice, M., Vovlas, C. and Gallitelli, D. (2000): Biodiversity of viruses infecting tomato in Italy: methods for diagnosis and diversification, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 30: 301-304. Fletcher (2001): New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 29: 213. Fletcher (1989): New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 17: 259. Fraile, A., Pagan, I., Anastasio, G., Saez, E. and Garcia-Arenal, F. (2011): Rapid genetic diversification and high fitness penalties associated with pathogenicity evolution in a plant virus. Molecular Biology and Evolution, 28 (4): 1425-1437. Francki, R. I. B., Mossop, D. W. and Shkula, D. D. (1979): Cucumber mosaic virus. CMI/AAB Description of Plant Viruses, 213. Francki, R. I. B., Fauquet, C. M., Knudson, D. L., Brown, F. (1991): Classification and nomenclature of viruses: Fifth report of the international committee on taxonomy of viruses. Archives of Virology (Supplement), 2. Gaborjanyi, R., Horvath, J., Kovacs, J. and Kazinczi, G. (1998): Role of viruses in pepper decline in Hungary. Xth Eucarpia Meeting of Capsicum and Eggplant, Avignon, France: 129-132. Gafny, R., Wexler, A., Mawassi, M., Israeli, Y. and Bar-Joseph, M. (1996): Natural infection of banana by a satellite-containing strain of cucumber mosaic virus. Phytoparasitica, 24 (1): 49-56. Gallitelli, D. (2000): The ecology of Cucumber mosaic virus and sustainable agriculture. Virus Research, 71: 9-21. Garran, J. and Gibbs, A. (1982): Studies on Alfalfa mosaic virus and alfalfa aphids. Australian Journal of Agricultural Research, 33 (4): 657-664. 154 Gebré Sélassié, K., Marchoux, G., Delecolle, B., Pochard, E. (1985): Variabilité naturelle des souches du virus Y de la pomme de terre dans les cultures de piment du sud-est de la France. Caracterisation et classification en pathotypes. Agronomie, 5: 621-630. Gebré Sélassié, Marchoux, Laterrot and Blancard (1987): PHM –Revue Horticole, 281: 43. Genda, Y., Sato, G. K., Nunomura, O., Hirabayashi, T., Ohnishi, J., and Tsuda S. (2005): Immunolocalization of Pepper mild mottle virus in Capsicum annuum seeds. Journal of General Plant Pathology., 71: 238-242. Genda, Y., Kanda, A., Hamada, H., Sato, K., Ohnishi, J. and Tsuda, S. (2007): Two Amino Acid Substitutions in the Coat Protein of Pepper mild mottle virus Are Responsible for Overcoming the L(4) Gene-Mediated Resistance in Capsicum spp. Phytopathology, 97 (7): 787-793. Gibbs, A. J. (1977): Tobamovirus group. CMI/AAB Description of Plant Viruses, 184. Gildow, F. E., Shah, D. A., Sackett, W. M., Butzler, T., Nault, B. A. and Fleischer, S. J. (2008): Transmission efficiency of Cucumber mosaic virus by aphids associated with virus epidemics in snap bean. Phytopathology, 98: 1233-1241. Gitatis, R. D. Dowler, C. C., Chalfant, R. B. (1998): Epidemiology of Tomato spotted wilt in pepper and tomato in Southern Georgia. Plant Disease, 82: 752-756. Glais, L., Kerlan, C., Tribodet, M., Marie-Jeanne Tordo, V., Robaglia, C. and Astier- Manifacier, S. (1996): Molecular characterization of Potato virus Y N isolates by PCR–RFLP. European Journal of Plant Pathology, 102: 655–662. Glais, L., Tribodet, M. and Kerlan, C. (2005): Specific detection of the PVY N–W variant of Potato virus Y. Journal of General Virology Methodes, 125: 83-93. Glasa, M. and Candresse, T. (2005): Partial sequence analysis of an atypical Turkish isolate provides further information on the evolutionary history of Plum pox virus (PPV). Virus research, 105: 199-206. Goldbach, R. W. and Peters, D. (1994): Possible causes of the emergence of Tospovirus diseases. Seminars in Virology 5:113-120. 155 Goldberg, N. P. (2000): Tomato spotted wilt virus. http://www.cahe.nmsu.edu/pubs/_h/h- 242.html. Golnaz, N., Jafarpour, B., Rastegar, M. F. and Sabokkhiz, M. A. (2009): Detection of Cucumber mosaic virus and Typing Using Serological and Molecular Methods in Razavi Khorasan Province. Pakistan Journal of Biological Sciences, 12: 657-659. Green, S. K. and Kim, J. S. (1990): Characteristics and control of viruses infecting peppers. Asian Vegetable Research and Development Center Technical Bulletin, 18: 1-60. Green, S. K. and Wu, S. F. (1991): Tobamoviruses on Capsicum annuum in Taiwan. Plant Disease, 75: 86. Green, S. K. (2003). Pepper mild mottle virus. In Pernezny et al. (eds): Compendium of pepper diseases. American Phytopathological Society, St. Paul, MN.: 32-33. Greenleaf, W. H., Cook, A. A., Hleyn, A. N. J. (1964): Resistence to Tobacco mosaic virus in Capsicum with reference to the samsun latent strain. Phytopathology, 54: 1367-1371. Greenleaf, W. H. (1986): Pepper Breeding in Breeding Vegetable Crops. M. J. Basset et AVI publiching Co inc. Wesport Connecticut (USA): 67-133. Grieco, F., Lanave, C. and Gallitelli, D. (1997): Evolutionary dinamiccs of Cucumber mosaic virus satellite RNA during natural epidemics in Italy. Virololgy, 229: 166- 174. Gvozdenović, Đ. (2010): Paprika. Institut za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad. Hamada, H., Tomita, R., Iwadate, Y., Kobayashi, K., Munemura, I., Takeuchi, S., Hikichi, Y. and Suzuki, K. (2007): Cooperative effect of two amino acid mutations in the coat protein of Pepper mild mottle virus overcomes L (3)-mediated resistance in Capsicum plants. Virus Genes, 34 (2): 205-214. Haq, Q. M. R., Singh, B. P. and Srivastava, K. M. (1996): Biological, serological and molecular characterization of a cucumber mosaic virus isolate from India.Plant Pathol. 45: 823-828. Harrington and Gibson (1989): Potato Research, 32: 167. Harris and Bradley (1973): Virology, 52: 295. 156 Hayes, R. J. and Buck, K. W. (1990): Complete replication of a eukaryotic virus RNA in vitro by a purified RNA-dependent RNA polymerase. Cell, 63: 363-368. Himmel, P. T. (2003): Tobacco mosaic virus. Compendium of Pepper Diseases: 38-39. Hamada, H., Takeuchi, S., Kiba, A., Tsuda, S., Hikichi, Y., Okuno, T. (2002): Amino Acid Changes in Pepper mild mottle virus Coat Protein That Affect L3 Gene- mediated Resistance in Pepper. Journal of General Plant Pathology, 68 (2): 155- 162. Heinze, C., Letschert, B., Hristova, D., Yankulova, M., Kauadjouor, O., Willingmann, P., Atanassov, A. and Adam, G. (2001): Variability of the N–protein and the intergenic region of the S RNA of Tomato spotted wilt tospovirus (TSWV). New Microbiology, 24: 175-187. Heinze, C., Willingmann, P., Schwach, F. and Adam, G. (2003): An unusual large intergenic region in the S–RNA of a Bulgarian Tomato spotted wilt virus isolate. Archives of Virology, 148: 199-205. Helgera P.R., Taborda, R., Docampo, D.M. and Ducasse, D.A. (2001): Immunocapture reverse transcription-polymerase chain reaction combined with nested PCR greatly increases the detection of Prunus necrotic ring spot virus in the peach. Journal of Virological Methods, 95: 93-100. Henson, J. M. and French, R. (1993): The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis. Ann. Rev. Plant Pathol., 31: 81-109. Holguín–Peña, R. J. and Rueda–Puente, E. O. (2007): Detection of Tomato spotted wilt virus in tomato in the Baja California Peninsula of Mexico. Plant Disease, 91 (12): 1682. Holmes, F. O. (1934): Inheritance of ability to localize tobacco mosaic virus. Phytopathology, 24: 637-642. Honda, Y. and Kameya-Iwaki, M. (1991): Studies on plant virus disease control in Japan. Proceedings of the Conference on Integrated Control of Plant VirusDiseases, vol. 1, Taiwan: 13-19. 157 Hsu, Y.H., Wu, C.W., Lin, B.Y., Chen, H.Y., Lee, M.F. and Tsai, C.H. (1995): Complete genomic RNA sequences of cucumber mosaic virus strain NT9 from Taiwan. Archives of Virology, 140: 1841-1847. http://www.apsnet.org/edcenter/advanced/topics/PopGenetics/Documents/Garcia_extr a.pdf. Characterization of Evolutionary Potential of the Viruses Analyzed. http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Tables/TableList.htm Tables of Disease Resistant Varieties available for the following crops. Cornel University. Vegetable MD Online. Hu, J. S., Li, H. P., Barry, K., Wang, M. and Jordan, R. (1995):Comparison of dot blot ELISA and RT-PCR assays for detection of two Cucumber mosaic virus isolates infecting banana in Hawaii. Plant Disease, 79: 902-906. Hull (1969): Adv. Virus Res. 15: 365. Ignjatov, M., Gašić, K., Ivanović, M., Šević, M., Obradović, A., Milošević, M. (2010): Karakterizacija sojeva Xanthomonas euvesicatoria, patogena paprike u Srbiji. Pesticidi i fitomedicina, 25 (2): 139-149. Ikegashira, Y., Ohki, T., Ichiki, U., Higashi, T., Hagiwara, K., Omura, T., Honda, Y. and Tsuda, S. (2004): An immunological system for the detection of Pepper mild mottle virus in soil from green pepper fields. Plant Disease, 88: 650-656. Ilardi, V., Mazzei, M., Loreti, S., Tomassoli, L. and Barba, M. (1995): Biomolecular and serological methods to identify strains of Cucumber mosaic cucumovirus on tomato. EPPO Bull, 25: 321-327. Im, K. H., Chung, B. K., Yoon, J. Y. and Green, S. K. (1991): A survey on viruses infecting peppers (Capsicum annuum) in Korea by microplate method of enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA). Journal of Plant Pathology,7: 251-256. Ivanović, M., Ivanović, D. (2001): Mikoze i pseudomikoze. Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu. Jacobi, V., Bachand, G. D., Hamelin, R. C. and Castello, J. D. (1998): Development of a multiplex immunocapture RT–PCR assay for the detection and differentiation of Tomato and Tobacco mosaic tobamovirus. Journal of Virological Methods, 74: 167- 178. 158 Jain, R. K., Pappu, S. S., Pappu, H. R. and Culbreath, A. K. (1998): Molecular diagnosis of Tomato spotted wilt tospovirus infection of peanut and other field and greenhouse crops. Plant Disease, 82 (8): 900-904. Jakab, G., Droz, E., Brigneti, G., Baulcombe, D. and Malnoe, P. (1997): Infectious in vivo and in vitro transcripts from a full–length cDNA clone of PVY–N605, a Swiss necrotic isolate of Potato virus Y. Journal of General Virology, 78: 3141-3145. Jarret, R. L., Gillaspie, A. G., Barkley N. A. and Pinnow D. L. (2008): The Occurrence and Control of Pepper Mild Mottle Virus (PMMoV) in theUSDA/ARS Capsicum Germplasm Collection. Seed technology. Vol. 30 (1): 26-36. Jasnić, S. M. (1978): Proučavanje epidemiologije virusa mozaika paradajza na paprici. Novi Sad: Poljoprivredni fakultet, doktorska disertacija. Jaspars, E. M. J., Bos, L. (1980): Alfalfa mosaic virus. CMV/AAB Description of Plant Viruses, No. 229. Jayasena, K. W. and Randles, J. W. (2004): A short insert in the leader sequence of RNA 3L, a long variant of Alfalfa mosaic virus RNA3, introduces two unidentified reading frames. Virus Genes, 29 (3): 311-316. Jeffries (1998) in FAO/IPGRI Technical Guidelines for the Safe Movement of Germplasm 19, p. 70, Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations / International Plant Genetic Resources Institute. Jones, R. A. C. (1990): Strain group specific and virus specific hypersensitive reactions to infection with Potyviruses in potato cultivars. Annals of Applied Biology, 117: 93- 105. Jorda, C., Ortega, A. and Juarez, M. (1995): New hosts of Tomato spotted wilt virus. Plant Disease, 79: 538. Jovanović, V. (1946): Proizvodnja prerada i upotreba paprike, zadruţnoizdavačko preduzeće Beograd, Poljoprivredna biblioteka: 1-43. Jovićević, D., Gvozdenović, Đ., Bugarski., D. (2006): Bolesti paprike i paradajza. Zbornik radova Naučnog instituta za ratarstvo i povrtarstvo, 42: 333-344. 159 Jung-Heon, H., Hong-Soo, C., Dong, H. K., Hung-Rul, L. and Byung-Dong, K. (2006): Biological, Physical and Cytological Properties of Pepper mottle virus-SNU1 and Its RT-PCR Detection. Journal of Plant Pathology, 22 (2): 155-160. Kalman, D., Palkovics, L., Gáborjányi (2001): Serologycal, pathological and molecular characterization of Hungarian Pepper mild mottle tobamovirus (PMMoV) isolates. Acta Phytopthol. Entomol. Hung., 36: 31-42. Kaper, J. M., Waterworth, H. E. (1981): Cucumoviruses. In: Kurstak E. (ed.) Handbook of plants virus infections. Elsevier/North Holland Biomedical Press, 257-332. Katis N., Gibson, R. W. (1985): Transmission of potato virus Y by cereal sphids. Potato Res. 28(1): 65-75. Kerlan, Tribodet, Glais and Guillet (1999): Journal of Phytopathology 147: 643. Kim, J. W., Sun, S. S. M. and German, T. L. (1994): Disease resistance in tobacco and tomato plants transformed with the Tomato spotted wilt virus nucleocapsid gene. Plant Disease, 78: 615-621. Kirita, M., Akutsu, K., Watanabe, Y., Tsuda, S. (1997): Nucleotide sequence of the Japanese isolate of Pepper mild mottle tobamovirus (TMV-P) RNA. Ann. Phytopath. Soc. Jpn., 63: 373-376. Knapp, E. and Lewandowski, D. J. (2001): Tobacco mosaic virus, not just a single component virus anymore. Molecular Plant Pathology, 2 (3): 117- 123. Kogovšek, P., Gow, L., Pompe–Novak, M., Gruden, K., Foster, G. D., Boonham, N. and Ravnikar, M. (2007): Development of a new method for distinguishing of PVY NTN and PVY N . Books of apstract of 8. Slovenian Conference on Plant Protection, Radenci, Slovenia: 63. Koike, S. T., Tian T. and Liu, H. Y. (2010): First report of tobacco rattle virus in Spinach in California. Plant Disease, 94: 125-125. Koper-Zwarthoff, E. C., Lockard, R. E., Alzner-deWeerd, B., RajBhandary, U. L. and Bol, J. F. (1977): Nucleotide sequence of 5' terminus of alfalfa mosaic virus RNA 4 leading into coat protein cistron. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (12): 5504-5508. Kormelink, R., Peters, D. and Goldbach, R. (1998): Tomato spotted wilt virus. CMI/AAB Description of plant viruses: 363. 160 Kraal (1975): Amino acid analysis of alfalfa mosaic virus coat proteins: an aid for viral strain identification. Virology, 66: 336-340. Krstić, B., Krnjaja, V., Mijatović, M., Tošić, M. (1996): Virus blagog šarenila paprike prisutan u Srbiji. Zbornik kratkih sadrţaja Prvog balkanskog simpozijuma Povrće i krompir: 164. Krstić, B., Vico, I., Dovas, C. I., Eythimiou, C., Katis, N. I. i Berenji, J. (2002): Molekularna detekcija i delimična karakterizacija jugoslovenskih izolata virusa mozaika krastavca. Zbornik rezimea XII simpozijuma o zaštiti bilja i savetovanja o primeni pesticida, Zlatibor: 74. Krstić, B. i Vico, I. (2004): Kontrola virusa mozaika krastavca u okvirima odrţive poljoprivrede. Biljni lekar, 5: 359-363. Krstić, B., Bulajić, A., Dukić, N., Berenji, J. (2005): Virus bronzavosti paradajza na duvanu, povrću i ukrasnim biljkama na području Srbije. II Simpozijum o zaštiti bilja u Bsni i Hercegovini, Teslić: 15-16. Krstić, B., Bulajić, A. and Dukić, N. (2005a): Occurrence of Tomato spotted wilt virus and Impatiens necrotic spot virus in Serbia. Proceeding of Articles XXXth Meeting for Plant Protection in Republica Macedonia and Ist Congress of Plant Protection „Enviromental Concern and Food Safety”, Ohrid, Macedonia: 85-88. Krstić, B., Dukić, N., Vico, I., Bulajić, A. i Berenji, J. (2005b): Principi kontrole virusa bronzavosti paradajza. Zbornik saţetaka Naučno-stručnog savjetovanja agronoma Republike Srpske „Poljoprivreda RS kao sastavni dio evropskih integracionih procesa”, Jahorina, BiH: 45. Krstić, B., Bulajić, A., Dukić, N. i Duduk, B. (2006a): Virus bronzavosti paradajza i virus nekrotične pegavosti Impatiensa. Zbornik predavanja Seminara pejzaţne hortikulture, Banja Vrujci: 63-75. Krstić, B., Bulajić, A., Dukić, N. i Duduk, B. (2006b): Prisustvo fitopatogenih virusa u pošiljkama cveća iz uvoza i u domaćoj proizvodnji. Zbornik predavanja Seminara pejzaţne hortikulture, Banja Vrujci: 57-62. 161 Krstić, B., Bulajić, A., Dukić, N., Duduk, B. i Berenji, J. (2006c): Integralna zaštita duvana od virusa bronzavosti paradajza. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 79: 49-60. Krstić, B., Vico, I., Berenji, Ј., Dukić, N. i Bulajić, А. (2006d): Opšti principi kontrole virusnih oboljenja duvana sa posebnim osvrtom na virus mozaika duvana. Zbornik radova Naučnog instituta za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad, 42: 401-412. Krstić, B. i Bulajić, A. (2007): Karantinski virusi povrća i ukrasnih biljaka u zaštićenom prostoru. Poljoprivredni fakultet, Beograd, i Ministarstvo poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede RS, Beograd. Krstić, B., Bulajić, A. i Đekić, I. (2007a): Ekonomski značajni i karantinski virusi paradajza u Srbiji. Zbornik rezimea IV simpozijuma o zaštiti bilja u Bosni i Hercegovini, Teslić: 13. Krstić, B., Bulajić, A. and Đekić, I. (2007b): The Tospoviruses in greenhouse tomato and ornamental crops in Serbia. Abastracts book of 5th Balkan Congress for Microbiology, Budva, Montenegro: 133. Krstić, B. i Bulajić, A. (2008): Ekonomski značajni i karantinski virusi paprike u Srbiji. Zbornik radova IX savetovanja “Savremena proizvodnja povrća“. Novi Sad: 24- 28. Krstić, B., Bulajić, A., Đekić, I., Berenji, J. (2008): Virus bronzavosti paradajza-jedan od najdestruktivnijih biljnih virusa. Pesticidi i fitomedicina, 23: 153-166. Krstić, B., Bulajić, A. i Đekić, I. (2008a): Virus bronzavosti paradajza (virus pegavog uvenuća paradajza) i Tomato spotted wilt virus, TSWV–Standardna operativna procedura za fitopatološke dijagnostičke laboratorije. Univerzitet u Beogradu– Poljoprivredni fakultet i Ministarstvo poljoprivrede, vodoprivrede i šumarstva, Beograd. Kucharek, T., Brown, L., Johnson, F. and Funderburk, J. (2000): Tomato spotted wilt virus of agronomic, vegetable and ornamental crops. Plant Pathology Fact Sheet. Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Science, University of Florida. http://plantpath.ifos.ufl.edu/takextpub/Fact Sheet/circ0914.pdf 162 Kuhlmann, U., Sarkar, S. and Rohde, W. (1993): Capsid protein gene sequences of four tobacco mosaic virus strains defective for virus assembly. Nucleic Acids Res. 21 (14): 3325. Lamb E. M., Adkins S., Shuler K. D. and Roberts P. D. (2008): Pepper Mild Mottle Virus, University of Florida, IFAS Extention. Law, M. D., Speck, J. and Moyer, J. W. (1992): The M RNA of impatiens necrotic spot Tospovirus (Bunyaviridae) ha san ambisense genomic organization, Virology, 188: 732-741. Legnani, Gebre Selassie, Nono Womdim, Gognalons, Moretti, Latterot and Marchoux (1995): Euphytica, 86: 219. Letschert, B., Adam, G., Lesemann, D., Willingmann, P. and Heinze, C. (2002): Detection and differentiation of serologically cross-reacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP. Journal of Virological Methods, 106 (1): 1-10. Lewandowski, D. J. (1999). Genus Tobamovirus. In: Van Regenmortel MHV, Fauquet CM, Bishop DHL, Carstens EB, Estes MK, Lemon SM, Maniloff J, Mayo MA, McGeoch D, Pringle CR, Wickner RB (eds) Virus taxonomy: Seventh report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego: 889–894. Lin, H. X., Rubio, L., Smythe, A., Jiminez, M. and Falk, B. W. (2003): Genetic diversity and biological variation among California isolates of Cucumber mosaic virus. Journal of General Virology, 84 (1): 249-258. Liu, Y., Zhou, X., Xue, C. and Li, D. (1999): Sequence Analysis and expression in E. coli of coat protein gene of cucumber mosaic virus isolate infecting Phaseolus angularis. Nong Ye Sheng Wu Ji Shu Xue Bao, 7: 51-54. Liu, Y. Y., Yu, S. L., Lan, Y. F., Zhang, C. L, Hou, S. S., Li, X. D., Chen, X. Z., Zhu X. P. (2009): Molecular variability of five Cucumber mosaic virus isolates from China. Acta virologica, 53: 89-97. Lojek and Orlob (1969): Science 164: 1407. 163 Lorenzen, J. H., Meacham, T., Berger, P. H., Shiel, P. J., Crosslin, J. M., Hamm, P. B. and Kopp, H. (2006): Whole genome characterization of Potato virus Y isolates collected in the western USA and their comparison to isolates from Europe and Canada. Archives of Virology, 151 (6): 1055-1074. Lovato, F., Nagata, T., Resende, R., Ávila A. and Inoue-Nagata A. (2004): Sequence Analysis of the Glycoproteins of Tomato Chlorotic Spot Virus and Groundnut Ringspot virus and Comparison with other Tospoviruses. Virus Genes, 29 (3): 321-328. Love, P. G. (2005): Tomato spotted wilt virus in tobacco. www.ces. ncsu.edu/robenson/agriculture/tospotwiltvirus.pdf,. Luis-Artega and Ponz, F. (2003): Potato virus Y. Compendium of Pepper Diseases. Maki-Valkama, T., Valkonen, J. P., Kreuze, J. F. and Pehu, E. (2000): Transgenic resistance to PVY(O) associated with post–transcriptional silencing of P1 transgene is overcome by PVY(N) strains that carry highly homologous P1 sequences and recover transgene expression at infection. Molecular Plant–Microbe Interactions, 13 (4): 366-373. Mandal, B., Pappu, H. R., Csinos, A. S. and Culbreath, A. K. (2006): Response of peanut, pepper, tobacco and tomato cultivars to two biologically distinct isolates of Tomato spotted wilt virus. Plant Disease, 90: 1150-1155. Marchoux, G., Gebre-Selassie, K. and Villevieille, M. (1991): Detection of Tomato spotted wilt virus and transmission by Frankliniella occidentalis in France. Plant Pathology, 40: 347-351. Marie–Jeanne Tordo, V., Chschulska, A. M., Fakhfakh, H., Le Romancer, M., Robaglia, C. and Astier–Manifacier, S. (1995): Sequence polymorphism in the 5’ NTR and in the P1 codng region of Potato virus Y genomic RNA. Journal of General Virology, 76: 939-949. Maris, P. C., Joosten, N. N., Goldbach, R. W., Peters, D. (2003): Restricted Spread of Tomato spotted wilt virus in Thrips-Resistant Pepper. Phytopathology, 93 (10): 1223-1227. 164 Marković, M. (2004): Tehnologija proizvodnje i standardi kvaliteta začinske paprike. Zbornik radova Naučnog instituta za ratarstvo i povrtarstvo, 40: 335-342. Marković, V., Vračar, Lj. (1998): Proizvodnja i prerada paprike. Feljton d.o.o. Novi Sad. Marte, M. and C. Wetter. (1986): Occurrence of Pepper mild mottle virus in pepper cul- tivars from Italy and Spain. Journal of Plant Disease and Protection, 93: 37-43. Martínez-Ochoa, N., Langston, D. B., Mullis, S.W., Flanders, J. T. (2003). First Report of Pepper mild mottle virus in jalapeno Pepper in Georgia. Online. Plant Health Progress doi:10.1094/PHP-2003-1223-01-HN. Matthews, R. E. F. (1979): Classification and nomenclature of viruses. 3rd report of the International Committee on Taxonomy on Viruses. Intervirology, 12: 131-296. Mavrič, I. and Ravnikar, M. (2001): First report of Tomato spotted wilt virus and Impatiens necrotic spot virus in Slovenia. Plant Disease, 85 (12): 1288. Mayer, A. (1886): Ueber die Mosaikkrankheitt des Yabasks. Landwirtsch. Versuchsstationen, 32: 557-578. McDonald and Singh (1996): American Potato Journal 73: 317. McGarvey, P., Tousignant, M., Geletka, L., Cellini, F. and Kaper, J. M. (1995): The complete sequence of a cucumber mosaic virus from Ixora that is deficient in the replication of satellite RNAs. Journal of General Virology, 76 (9): 2257-2270. McKinney, H. H. (1952): Two strains of tobacco mosaic virus one of which is seed borne in an etch-immune pengent pepper. Plant Disease Rep. 36, 184-187. Merkulov L., Gvozdenović, Đ., Krstić, B., Krstić, L. (2000): Uporedna anatomska analiza perikarpa nekih sorti paprike (Capsicum annuum L.), Zbornik radova, PMF, Serija za biologiju, 29: 48-56. Milošević, D. (1989): Rasprostranjenost nekih virusa krompira na području Zapadne Srbije. Zaštita bilja, 189: 367-374. Milošević, D. (1992): Occurence of the necrotic strain of Potato virus Y (PVY) in some localities in Serbia. Zaštita bilja, 201: 197-202. Mijatović, M., (1986): Reakcija nekih sorata paprike prema virusu mozaika duvana. Magistarski rad. Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu. 165 Mijatovic, M., (1995): Proučavanje otpornosti paprike prema virusu mozaika duvana. Doktorska disertacija, Poljoprivredni fakultet, Beograd. Mijatović, M., Obradović, A., Ivanović, M., Stevanović, D. (1999): Rasprostranjenost i intenzitet pojave nekih virusa parazita paprike u Srbiji. Zaštita bilja, 50: 151-159. Mijatović, M., Ivanović, M., Obradović, A., Zečević, B. (2002): Potato virus Y (PVY) on pepper in Serbia. Acta Horticulturae, 579: 454-549. Mijatovic, M., Zecevic, B., Ivanovic, M., Obradovic A. (2005): Diseases of pepper in Serbia and results of breeding for resistance. Folia horticulturae. Ann. 17/2: 53-60. Mijatović, M., Obradović, A., Ivanović, M. (2007): Zaštita povrća. AgroMivas, Smederevska Palanka. Mijatović M. (2011): Zaštita rasada http://www.poljoberza.net/AutorskiTekstoviJedan. aspx?ime=MM001.htm&autor=6 Milne (1988) in The Plant Viruses, vol.4, The filamentous plant viruses, p. 333, ed. R. G. Milne, New York: Plenum Press. Mnari-Hattab, M., Ezzaier, K. and Hamza, N. (2006): Sequence analysis of a Tunisian isolate of Pepper mild mottle virus (PMMoV) that overcomes L1 and L2 resistance genes of pepper in Tunisia. Tunisian Journal of Plant Protection 1: 65-71. Moreira, S. R., Colariccio, A., Eiras, M., Chaves, A. L. R. and Galleti, S. R. (2003): Characterization of the Tomato mosaic virus infecting tomato in Sao Paulo State, Brazil. Fitopatol. Bras. 28: 602-607. Moury, B., Morel, C., Johansen, E. and Jacquemond, M. (2002): Evidence for diversifying selection in Potato virus Y and in the coat protein of other potyviruses. Journal General Virological, 83 (10): 2563-2573. Mumford, R. A., Barker, I. and Wood, K. R. (1994): The detection of tomato spotted wilt virus using the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, 46: 303-311. Mumford, R. A. Barker, I. and Wood, K. R. (1996): The biology of Tospoviruses. Annals of Applied Biology, 128: 159-183. 166 Mumford, R. A., Barker, I. And Wood, K. R. (1996a): An improved method for the detection of tospoviruses using the polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, 57: 109-115. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I. and Boonham, N. (2000): Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus using a multiplex real-time fluorescent reverse-transcription polymerase chain reaction assay. Phytopathology, 90: 448– 453. Nagai, Y. (1981): Control of mosaic disease of tomato and sweet pepper caused by Tobacco mosaic virus. Spec. Bull. Chiba. Agric. Exp. Stn., 9: 1-109. Nagata, T., Inoue-Nagata, A. K., Smid, H. M., Goldbah, R., Peters, D. (1999): Tissue tropsm related to vector competence if Frankliniella occidentalis for tomato spotted wilt tospovirus. Journal of General Virology, 80: 507-515. Nagata, T., Carvalho, K. R., Sodré, R. D. A., Dutra, L. S., Oliveira, P. A., Noronha, E. F., Lovato, F. A., Resende, R. O., Ávila, A. C. and Inoue-Nagata, A. K. (2007): The glycoprotein gene of Chrysanthemum stem necrosis virus and Zucchini lethal chlorosis virus and molecular relationship with other tospoviruses. Virus Genes, 35 (3): 785-793. Naidu, R. A., Hu, C. C., Pennington, R. E. and Ghabrial, S. A. (1995): Differentitation of eastern and western strains of peanut stunt cucumovirus based on satellite RNA support and nucleotide sequence homology. Phytopathology 85: 502-507. Nie, X. and Singh, R. P. (2002): Probable geographical grouping of PVY N and PVY NTN based on sequence variation in P1 and 5’-UTR of PVY genome and methods for differentiating North American PVY NTN . Journal of Virological Methods, 103: 145- 156. Nie, X. and Singh, R. P. (2003): Virus Genes, 26: 39. Nischwitz, C., Pappu, H. R., Mullis, S. W., Sparks, A. N., Langston, D. B., Csinos, A. S. and Gitaitis, R. D. (2007): Phylogenetic analysis of Iris yellow spot virus isolates from onion (Allium cepa) in Gorgia (USA) and Peru. Journal of Phytopathology, 155: 531-535. 167 Nitta, N., Takanami, Y., Kuwata, S. and Kubo, S. (1988): Inoculation with RNAs I and 2 of cucumber mosaic virus induces viral RNA replicase activity in tobacco mesophyll protoplasts. Journal of General Virology, 69: 2695-2700. Noel, M. J. and Ben Tahar, S. (1989): Nucleotide sequence of the coat protein gene and flanking regions of Cucumber Mosaic Virus (CMV) strain I17F. Nucleic Acids Res. 17 (24): 10492. OEPP/EPPO (1999): Data sheets on quarantine pests. Tomato spotted wilt virus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 29: 465-472. OEPP/EPPO (2004): Diagnostic protocols for regulated pests PM 7/34. Tomato spotted wilt virus, Impatiens necrotic spot virus and Watermelon silver mottle tospovirus. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 34: 271 – 279. OEPP/EPPO (2008): EPPO A1 and A2 lists of pests recommended for regulation as quarantine pests. EPPO standard PM 5/3 (2). http://www.eppo.org/QUARANTINE/quarantine.htm Ogawa T., Tomitaka Y., Nakagawa A., Ohshima K., (2008): Genetic structure of a population of Potato virus Y inducing potato tuber necrotic ringspot disease in Japan; comparison with North American and European populations. Virus Research, 131: 199-212. Ohshima, Sako, Hiraishi, Nakagawa, Matsuo, Ogawa, Shikata and Sako (2000): Plant Disease, 84: 1109. Oka, N., Ohki, T., Honda, Y., Nagaoka, K. and Takenaka, M. (2008): Inhibition of Pepper mild mottle virus with Commercial Cellulases, Journal of Phytopathology, 156: 65-67. Oliveira, L. M., Inoue-Nagata A. K. and Nagata T. (2010): Complete genome nucleotide sequence of Pepper mild mottle virus isolated in the Federal District, Brazil. Tropical Plant Pathology, 35 (6): 373-376 . Owens, J. and Palukaitis, P. (1988): Characterization of Cucumber mosaic virus. I. Molecular heterogeneity mapping of RNA 3 in eight CMV strains. Virology, 69: 496-502. 168 Owen, J., Shintaku, M., Aeschleman, P., Tahar, S. F. and Palukaitis, P. (1990): Nucleotide sequence and evolutionary relationships of Cucumber mosaic virus (CMV) strains, CMV RNA 3. Journal of General Virology, 71: 2243-2249. Ozaslan, M., Bas, B., Aytekin, T. and Sıgırcı, Z. (2006): Identification of pepper vıruses by Das-ELISA assays in gaziantep-Turkey. Journal of Plant Pathology, 5: 11-14. Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. I. B. (1992): Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res., 41: 281-349. Palukaitis, P. and Zaitlin, M. (1997): Replicase-mediated resistance to plant virus diseases. Advances in Virus Research, 48: 349-377. Palukaitis, P. and García-Arenal, F. (2003): Cucumoviruses. Advances in Virus Research, 62: 242-323. Pang, S. Z., Nagpala, P. G., Wang, M., Slightom, J. L. and Gonsalves, D. (1992): Resistance to heterologous isolates of Tomato spotted wilt virus in transgenic tobacco expressing its nucleocapsid protein gene. Phytopathology, 82: 1223-1229. Panjan, M., Prpić, Z. (1955): O jednoj varijanti mozaika duvana izolovanog sa paprike. Arhiv za poljoprivredne nauke, VIII, 19: 3-9. Pappu, H., Pappu, S., Jain, R., Bertrand, P., Culbreath, A., McPherson, R. and Csinos, A. (1998): Sequence characteristics of natural populations of Tomato spotted wilt tospovirus infecting flue–cured tobacco in Georgia. Virus Genes, 17 (2): 169-177. Pappu, S. S., Bhat, A. I., Pappu, H. R., Deom, C. M. and Culbreath, A. K. (2000): Phylogenetic studies of tospoviruses (Family: Bunyaviridae) based on the intergenic region sequences of small and medium genomic RNAs. Archives of Virology, 145 (5): 1035-45. Parrella, G., Lanave, C., Marchoux, G., Finetti–Sialer, M. M., Di Franco, A. and Gallitelli, D. (2000): Evidence for two distinct subgroups of Alfalfa mosaic virus (AMV) from France and Italy and their relationships with other AMV strains. Archives of Virology, 145: 2659-2667. 169 Parrella, G., Gognalons, P., Gebre-Selassie, K., Vovlas C. and Marchoux, G. (2003): An update of the host range of Tomato spotted wilt virus. Journal of Plant Pathology, 85: 227-264. Pares, R .D. (1985): A tobamovirus infecting Capsicum in Australia. Ann. Appl. Biol. 106: 469-474. Perry, K. L., Habili, N., Dietzgen, R. G. (1993): A varied population of cucumber mosaic virus from peppers. Plant Pathology, 42: 806-810. Perry, K. L., Zhang, L., Shintaku, M. H. and Palukaitis, P. (1994): Mapping determinants in cucumber mosaic virus for transmission by Aphis gossypii. Virology, 205: 591-595. Perry, K. L., Zhang, L. and Palukaitis, P. (1998): Amino acid changes in the coat protein of cucumber mosac virus differentially affect transmission by the aphids Myzus persicae and Aphis gossypii. Virology, 242: 204-210. Persley, D. M., Thomas, J. E. and Sharman, M. (2006): Tospoviruses–an Australian perspective. Australasian Plant Pathology, 35: 161-180. Petković, N., Jeremić, S., Simić, A., Tomić, Đ., Đekić, I., Bulajić, A. i Krstić, B. (2007): Tomato spotted wilt virus prouzrokovač sistemične zaraze Petunia x hybrida. Zbornik rezimea XIII simpozijuma sa savetovanjem o zaštiti bilja, Zlatibor: 131- 132. Petrović, D. (2008): Rasprostranjenost virusa pasulja u Vojvodini. Magistarska teza, Poljoprivredni fakultet, Univetrzitet u Novom Sadu. Pešić, Z. and Hiruki, C. (1986): Different rates Alfalfa mosaic virus incidence in seed coat and embryo of alfalfa seed. Canadian Journal of Plant Pathology, 8: 39-42. Plyusnin, A., Beaty, B. J., Elliott, R. M., Goldbach, R., Kormelink, R., Lundkvist, A., Schmaljohn, C. S. and Tesh, R. B. (2011): Bunyaviridae. In: King AMQ, Adams MJ, Carstens EB, Lefkowitz EJ, eds. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses. Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego, Elsevier: 725-741. 170 Pringle, C. R. (1999). Virus taxonomy. The Universal System of Virus Taxonomy, updated to include the new proposals ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses during 1998 [news]. Archives of Virology, 144: 421-429. Qiu, W. P., Geske, S. M., Hickey, C. M. and Moyer, J. W. (1998): Tomato spotted wilt tospovirus genome reassortment and genome segment–specific adaptation. Virology, 244: 186-194. Qiu, W. and Moyer, J. W. (1999): Tomato spotted wilt tospovirus adapts to TSWV N gene–derived resistance by genome reassortment. Phytopathology, 89: 575-582. Raj, S. K., Kumar, S., Snehi, S. K. and Pathre, U. (2008): First Report of Cucumber mosaic virus on Jatropha curcas in India. Plant Disease, 92 (1): 171. Ravelonandro, M., Pinck, M. and Pinck, L. (1984): Complete nucleotide sequence of RNA 3 from alfalfa mosaic virus, strain S. Biochimie 66 (5): 395-402. Reichel, H., Marino, L., Kummert, J., Belalcazar, S. and Narvaez, J. (1996): Caracterizacion del gen de la proteina de la capside de dos aislamientos del virus del mosaico del pepino (CMV), obtenidos de platano y banano (Musa spp.). Revista Corpoica 1: 1-5. Revers, F., Le Gall, O., Candresse, T., Le Romancer, M. and Dunez, J. (1996): Frequent occurance of recombinat Potyvirus isolates. Journal of General Virology, 77: 1953-1965. Rizos, H., Gunn, L. V., Pares, R. D. and Gillings, M. R. (1992): Differentiation of Cucumber mosaic virus isolates using the polymerase chain reaction, Journal General Virology, 73: 2099-2103. Robaglia, C., Durand–Tardif, M., Tronchet, M., Boudazin, G., Astier–Manifacier, S. and Casse–Delbart, F. (1989): Nucleotide sequence of Potato virus Y (N strain) genomic RNA. Journal of General Virology, 70: 935-947. Robinson, D. J. (1992): Detection of Tobacco rattle virus by reverse transcription and polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, 40: 57-66. Rodriguez-Alvarado, G., Kurath, G., Dodds, J. A. (1995): Heterogeneity in pepper isolates of cucumber mosaic virus. Plant Disease, 79: 450-455. 171 Rodoni, B. and Henderson, A. (2004): Tomato spotted wilt virus in potatoes. Agricultural Notes. State of Victoria, Department of Primary Industries. ww.dpi.vic.gov.au. Roossinck, M. J. (2002): Evolutionary history of Cucumber mosaic virus deduced by phylogenetic analyses; J. Virol. 76: 3382-3387. Roossinck, M. J., Zhang, L. and Hellward, K. (1999): Rearrangements in the 5' nontranslated region and phylogenetic analyses of Cucumber mosaic virus RNA 3 indicate radial evolution of three subgroups. J. Virol. 76: 6752-6758. Rusevski, R. (2001): Virus bronzavosti paradajza-patogen paprike u Makedoniji. Doktorska disertacija, Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Begradu. Salanki, K., Thole, V., Balazs, E. and Burgyan, J. (1994): Complete nucleotide sequence of the RNA 3 from subgroup II of cucumber mosaic virus (CMV) strain: Trk7. Virus Res. 3: 379-384. Salazar, Bartolini and Flores (2000): Fitopatologia, 35: 87. Salm, S. N, Rey, M. E, Rybicki, E. P. (1996). Phylogenetic justification for splitting the Rymovirus genus of the taxonomic family Potyviridae. Archives of Virology, 141: 2237-2242. Schmelzer, Schmidt and Beczner (1973): Biol. Zbl. 92: 211. Schubert, J., Fomitcheva, V. and Sztangret–Wisniewska, J. (2007): Differentiation of Potato virus Y strains using improved sets of diagnostic PCR–primers. Journal of Virological Methods, 140: 66-74. Selassie, G. K., Marchoux, G., Delecolle, B. and Pochard, E. (1985): Variabilite naturelle des souches du virus Y de la pomme de terre dans les cultures de piment du sudla France. Caracterization et classification en pathotypes. Agronomie, 5 (7): 621-634. Sepulveda, P., Larrain, P., Quiroz, C., Rebufel, P. and Grana, F. (2005): Identification and incidence of pepper viruses in north central Chile and its association with vectors. Agricultura Tecnica, 65: 235-245. Sevik, M. A. (2011): Occurrence of pepper mild mottle virus in greenhousegrown pepper (Capsicum annuum L.) in the West Mediterranean region of Turkey. African Journal of Biotechnology, 10 (25): 4976-4979. 172 Shew, H. D. and Lucas, G. B. (1991): Compendium of Tobacco Diseases. American Phytopathological Society Press, St. Paul, MN. Shintaku, M. (1991): Coat protein gene sequences of two cucumber mosaic virus strains reveal a single amino acid change correlating with chlorosis induction. Journal of General Virology, 72 (10): 2587-2589. Shukla, D. D., Ward, C. W. and Brunt, A. A. (1994): The Potyviridae, CAB International, Wallingford, UK. Sialer, M. M., Cillo, F., Barbarossa, L. and Gallitelli, D. (1999): Differentiation of Cucumber mosaic virus subgroups by RT-PCR RFLP. Journal of Plant Pathology, 81: 145-148. Sidaros, S. A., El-Kewey S. A., Hala A. Amin, Eman. A. H. Khatab, Emeran, A. A., El- Khalik, S. A. and El-Kady, M. A. S. (2009): Cloning and Sequencing of a cDNA Encoding the Coat Protein of an Egyptian Isolate of Pepper mild mottle virus. 5 (2): 109-118. Silva, M. S., Martins, C. R. F., Bezerra, I. C. M., Nagata, I., de Avila, A. C. and de Resende, R. O. (2001): Sequence diversity of NSm movement protein of Tospoviruses. Archives of Virology, 146: 1267-1281. Silva, R. M., Souto, E. R., Pedroso, J. C., Arakava, R., Almeida, Á. M. R., Barboza, A. A. L. and Vida, J. B. (2008): Detection and Identification of TMV Infecting Tomato Under Protected Cultivation in Paraná State. Brazilian archives of biology and technology51 (5): 903-909. Simić, A., Jeremić, S., Tomić, Đ., Petković, N., Đekić, I., Bulajić, A. i Krstić, B. (2007): Tomato spotted wilt virus na Dahlia vrstama u Srbiji. Zbornik rezimea XIII simpozijuma sa savetovanjem o zaštiti bilja, Zlatibor: 133-134. Singh, McLaren, Nie and Singh (2003): Plant Disease 87: 679. Sivparsad, B. J. and Gubba, A. (2008): Isolation and molecular characterization of Tomato spotted wilt virus (TSWV) isolates occurring in South Africa. African Journal of Agricultural Research, 3 (6): 428-464. Sluţbeni glasnik Republike Srbije (2010): Pravilnik o utvrĎivanju lista karantinski štetnih organizama, 7/2010. 173 Soler, S., Diez, M. J., Rosello, S., Nuez, F. (1999): Movement and distribution of Tomato spotted wilt virus in resistant and susceptible accessions of Capsicum spp. Canadian Journal of Plant Pathology, 21: 317-325. Stanković, I., Bulajić, A., Vučurović, A., Ristić, D., Milojević, K., Berenji, J., Krstić B. (2011): Status of tobacco viruses in Serbia and molecular characterization of tomato spotted wilt virus isolates. Acta virologica, 55: 337-347. Stanković, I., Bulajić, A., Vučurović, A., Ristić, D., Jović, J. and Krstić, B. (2011a): First Report of Tomato spotted wilt virus on Gerbera hybrida in Serbia. Plant Disease, 95 (2): 226. Stanković, I., Bulajić, A., Vučurović, A., Ristić, D., Milojević, K., Nikolić, D. and Krstić B. (2012): First Report of Tomato spotted wilt virus Infecting Onion and Garlic in Serbia. Plant Disease, 96 (6): 918. Stanković, I., Bulajić, A., Vučurović, A., Ristić, D., Milojević, K., Nikolić, D. and Krstić, B. (2013): First Report of Tomato spotted wilt virus on Chrysanthemum in Serbia. Plant Disease, 97 (1): 150. Stoimenova, E. and Yordanova, A. (2005): Tobamovirus strain P101 isolated from pepper in bulgaria. Biotechnol. & Biotechnol. Eq.: 30-35. Stryer and Lubert (1988). Biochemistry. San Francisco: W.H. Freeman. Sudarsono, S. L., Nurhayati, E. and Suseno R. (1998): Mixed infection among TMV, PVY and CMV. Capsicum and Egg plant Newsletter, 17: 11-14. Svoboda, J., Červená, G., Rodová, J. and Jokeš, M. (2006): First Report of Pepper mild mottle virus in Pepper Seeds Produced in the Czech Republic. Plant Protect. Sci., 42 (1): 34–37. Szilassy, D., Sala´nki, K. and Bala´zs, E. (1999): Molecular Evidence for the existence of two distinct subgroups in Cucumber mosaic cucumovirus. Virus Genes 18: 221- 227. Šutić, D. (1959): Die Rolle des Paprikasamens bei der Virusübertragung. Phytopath. Ztschrift. Bd. 36, Hf. 1: 84-93. Šutić, D., Tošić, M., Pešić, Z. (1978): Virus mozaika duvana prouzrokovač nekroze paprike. Zaštita bilja, 146: 309-315. 174 Šutić, D. (1982): Viroze biljaka. Beograd: Nolit. Šutić, D. (1995): Viroze biljaka. Institut za zaštitu bilja i ţivotnu sredinu, Politop-P, Beograd. Takeda, A., Sugiyama, K., Nagano, H., Mori, M., Kaido, M., Mise, K., Tsuda, S., Okuno, T. (2002): Identification of a novel RNA silencing suppressor, NSs protein of Tomato spotted wilt virus. FEBS Letters, 532 (1–2): 75-79. Takeshita, M. and Takanami, Y. (1997): Complete nucleotide sequences of RNA3s of cucumber mosaic virus KM and D8 strains. J. Fac. Agric. Kyushu Univ. 42: 27-32. Takeuchi, S., Hamada, H., Toyoda, K., Suzuki, K., Kiba, A., Hikichi, Y. and Okuno, T., (2005): Discrimination between tobamoviruses and their pathotypes for L- gene-mediated resistance in green pepper (Capsicum annuum L.) by reverse transcription-polymerase chain reaction. Journal of General Plant Pathology, 71: 60-67. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. and Kumar, S. (2011): MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 28: 2731-2739. Tenllado, F. and Bol, J. F. (2000): Genetic detection of the multiple functions of Alfalfa mosaic virus coat protein in viral RNA replication, encapsidation and movement. Virology, 268: 29-40. Thole, V., Dalmay, T., Burgyan, J. and Balazs, E. (1993): Cloning and sequencing of Potato virus Y (Hungarian isolate) genomic RNA. Gene, 123 (2): 149-156. Thole, V., Miglino, R. and Bol, J. F. (1998): Amino acids of alfalfa mosaic virus coat protein that direct formation of unusually long virus particles. Journal of General Virology, 79 (12): 3139-3143. Thomas-Carroll, M. L., Jones, R. A. C. (2003): Serological, biological properties and fitness of resistance-breaking strains of Tomato spotted wilt virus in pepper. Annual applied of Biology, 142: 235-243. Thompson, J. D., Higgins D. G., and Gibson, T. J. (1994): CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence 175 weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680. Timmerman-Vaughan, G. M., Pither-Joyce, M. D., Cooper, P. A., Russell, A. C., Goulden, D. S., Butler, R. C. and Grant, J. E. (2001): Partial Resistance of Transgenic Peas to Alfalfa Mosaic Virus under Greenhouse and Field Conditions. Crop Sci. 41 (3): 846-853. Todorović, B. (1995): Prilog proučavanju izolata virusa crtičastog mozaika krompira. Zaštita bilja, 212: 111-119. Tomić, Đ., Jeremić, S., Simić, A., Petković, N., Đekić, I., Bulajić, A. i Krstić, B. (2007): Status viroza paprike u Srbiji. Zbornik rezimea XIII simpozijuma sa savetovanjem o zaštiti bilja, Zlatibor: 114-115. Tomlinson (1987): Annals of Applied Biology 110: 661. Tošić, M., Ivanović, M., Mitrović, G., Krsmanović, Ţ. i Kojić, Z. (1979): Prilog poznavanju viroza paprike u našoj zemlji. Zaštita bilja, 150: 335-343. Tsakiridis, J. P., Ivancheva-Gabrovska, T. (1980): Tomato Spotted Wilt Virus on Tobacco. Coresta Symp., Manila-Philippines: 1-32. Tsompana, M., Abad, J., Purugganan, M. and Moyer, J. W. (2005): The molecular population genetics of the Tomato spotted wilt virus (TSWV) genome. Molecular Ecology, 14: 53-66. Vaira, A. M., Semeria, L., Crespi, S., Lisa, V., Allavena, A. and Accotto, G. P. (1995): Resistance to Tospoviruses in Nicotiana benthamiana transformed with the N gene of Tomato spotted wilt virus: correlation between transgene expression and protection in primary transformants. Molecular Plant-Microbe Interactions, 8: 66- 73. Vance, V. B., Moore, D., Turpen, T. H., Bracker, A. and Hollowell, V. C. (1992): The complete nucleotide sequence of pepper mottle virus genomic RNA: comparison of the encoded polyprotein with those of other sequenced potyviruses.Virology 191 (1): 19-30. Velasco, L., Janssen, D., Ruiz-Garcia, L., Segundo, E., Cuadrado, I. M. (2002): The complete nucleotide sequence and development of a differential detection assay 176 for a Pepper mild mottle virus (PMMoV) isolate that overcomes L3 resistance in pepper. Journal of Virological Methods, 106 (1): 135-40. Verhoeven, J. Th. J., Willemen, T. M. and Roenhorst, J. W. (2002): First report of Pepper mottle virus in tomato. Plant Disease, 86 (2): 186-186. Veselinov, E. (1984): Pipera, Sofija. Vučurović, A., Bulajić, A., Stanković, I., Ristić, D., Berenji J., Jović, J., Krstić, B. (2010): Zastupljenost, molekularna detekcija i identifikacija virusa mozaika krastavca u usevima tikava u Srbiji. X Savetovanje o zaštiti bilja, Zlatibor: 58-59. Vučurović, A., Bulajić, A., Stanković, I., Ristić, D., Berenji, J., Jović, J., Krstić, B. (2012): Non-persistently aphid-borne viruses infecting pumpkin and squash in Serbia and partial characterization of Zucchini yellow mosaic virus isolates. European Journal of Plant Pathology, 133: 935-947. Wahyuni W. S., Dietzen R. G., Handa, K. and Francki, R. I. B. (1992): Serological and biological variation between and within subgroup I and II strains of Cucumber mosaic virus. Plant Pathology, 41: 282-297. Wang, X., Liu, F., Zhou, G., Li, X. H. and Li, Z. (2006): Detection and molecular characterization of Pepper mild mottle virus in China. Journal of Phytopathology 154: 755-757. Weidemann (1988): Potato Research 31: 85. Wetter, C. and Conti, M. (1988). Pepper mild mottle virus. CMI/AAB descriptions of plant viruses: no. 330: 4. Woodford, J. A. T. (1992): Virus transmission by aphidsin potato crops. Netherlands Journal of Plant Pathology, 98 (2): 47-54. Xiang, B. C., Xie, H., Cui, X. M., Li, C., Liu, S. P., Xi, D. H. and Yin. Y. Q. (1994): Isolatingand identification of Pepper mild mottle tobamovirus in Xinjiang. Chin. Journal of Virology: 240-244. Xu, H. and Nie, J. (2006): Identification, characterization and molecular detection of Alfalfa mosaic virus in potato. Phytopathology, 96: 1237-1242. Yilmaz, M. A., Davis, R. F. and Varney, E. H. (1983): Viruses on vegetable crops along the mediterranean coast of Turkey. Phytopathology, 73: 378. 177 Yu, C., Wu, J. and Zhou, X. (2005): Detection and subgrouping of Cucumber mosaic virus isolates by TAS–ELISA and immunocapture RT–PCR. Journal of Virological Methods, 123: 155–161. Yoshihiro, O., Kyoji, H., Hisashi, I., Shoichi, I. and Kei, A. (2003): First report of Pepper mottle virus on Capsicum annuum in Japan. Journal of General Plant Pathology, 69: 348-350. Zaitlin, M. (1999): Elucidation of the genom organization of Tobacco mosaic virus. Philosophical Transactions of the Royal Society London B, 354: 587-591. Zhou, X., Liu, Y., Xue, C. and Li, D. (1999): Comparison on biology, serology and coat protein gene sequences of two cucumber mosaic virus strains. Zi Ran Ke Xue Jin Zhan, 9: 1254-1261. Zindović, J. (2010): Molekularna karakterizacija izolata virusa bronzavosti paradajza (Tomato spotted wilt virus) iz različitih domaćina i različitog geografskog porekla. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu. Poljoprivredni fakultet, Zemun Zindović, J., Bulajić, A., Krstić, B., Ciuffo, M., Margaria, P. and Turina, M. (2011): First Report of Tomato spotted wilt virus on Pepper in Montenegro. Plant Disease, Vol. 95, 7: 882. Zitikaitè, I. and Samuitienè, M. (2008): Identification and some properties of Alfalfa mosaic alfamovirus isolated from naturally infected tomato crop. Biologija, 54 (2): 83-88. Zitikaitė, I. and Samuitienė, M. (2009): Detection and characterization of Cucumber mosaic virus isolated from sweet peppers. Scientific works of the lithuanian institute of horticulture and lithuanian university of agriculture. Sodininkystė ir darţininkystė, 28(3): 281-288. Zitter, T. A. (1977): Epidemiology of aphid-borne viruses. In: Harris, K.F. & K. Maramorosch, K. [eds.] Aphids as Virus Vectors. Academic Press, New York. Zitter, T. A . and Florini, D. (1984): VEGETABLE CROPS,Virus Diseases of Pepper , Fact Sheet Page: 736.00, COOPERATIVE EXTENSION • NEW YORK STATE • CORNELL UNIVERSITY, http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Virus_Pepper.htm 178 Prilog 1. Proračun stepena nukleotidne identičnosti CP gena CMV izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka G Q 3 4 0 6 7 0 7 0 2 -0 7 U 2 0 6 6 8 U 2 2 8 2 1 N y D 1 0 5 3 8 F n y H M 0 6 5 5 0 9 1 5 1 -0 8 A M 1 1 4 2 7 3 L e0 2 A J5 8 5 5 1 7 2 0 7 A J5 1 7 8 0 2 U 6 6 0 9 4 A B 4 4 8 6 9 3 T o C M V 5 -3 A B 4 4 8 6 9 2 T o C M V 5 -2 A B 4 4 8 6 9 1 T o C M V 5 -1 A J8 2 9 7 7 6 M A D 9 9 /1 A J8 2 9 7 7 5 M A D 9 9 /3 A J8 2 9 7 7 3 M A D 0 1 /3 A J8 2 9 7 7 0 M A D 9 9 /4 X 1 6 3 8 6 A M 1 8 3 1 1 9 R i- 8 A B 4 4 8 6 9 6 P o C M V 9 -1 1 G U 4 5 3 9 1 8 F n y E U 9 2 1 7 5 7 6 5 0 -0 7 A J8 2 9 7 7 7 B A R 9 6 /1 A J8 2 9 7 7 2 M A D 9 3 /1 A J8 2 9 7 7 1 M A D 9 6 /3 A J8 2 9 7 6 8 M A D 9 6 /1 A J8 2 9 7 6 7 M A D 0 1 /1 A J8 2 9 7 6 6 M A D 0 1 /4 A J8 2 9 7 6 5 M A D 0 1 /2 A Y 8 7 1 0 7 1 B 2 3 Y 1 8 1 3 7 I 1 7 F D 0 0 4 6 2 C A B 4 4 8 6 9 5 P o C M V 7 -7 A B 4 4 8 6 9 4 P o C M V 7 -5 A J8 2 9 7 7 4 M A D 9 6 /2 A J5 1 1 9 9 0 A J1 3 1 6 2 4 D G U 3 6 2 6 6 9 A Y 3 8 0 5 3 3 D Q 2 9 5 9 1 4 V K D _ 0 0 3 6 9 H Q 9 1 6 3 5 4 G d P L -4 3 -0 9 P L -5 2 -0 9 P L -2 5 -0 9 GQ340670 702-07 U20668 99,7 U22821 Ny 99,7 100 D10538 Fny 99,7 100 100 HM065509 151-08 99,5 99,5 99,5 99,5 AM114273 Le02 99,5 99,8 99,8 99,8 99,4 AJ585517 207 99,5 99,8 99,8 99,8 99,4 99,7 AJ517802 99,5 99,8 99,8 99,8 99,4 99,7 99,7 U66094 99,5 99,8 99,8 99,8 99,4 99,7 99,7 99,7 AB448693 ToCMV5-3 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 AB448692 ToCMV5-2 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 100 AB448691 ToCMV5-1 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 100 100 AJ829776 MAD99/1 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 99,7 99,7 99,7 AJ829775 MAD99/3 99,4 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,7 AJ829773 MAD01/3 99,4 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 99,4 99,7 99,5 AJ829770 MAD99/4 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 99,7 99,7 99,7 100 99,7 99,7 X16386 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 99,7 99,7 99,7 100 99,7 99,7 100 AM183119 Ri-8 99,7 99,7 99,7 99,7 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,7 99,7 99,7 99,7 99,4 99,4 99,7 99,7 AB448696 PoCMV9-11 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,2 99,2 99,5 99,5 99,5 GU453918 Fny 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,2 99,4 99,5 99,5 99,5 99,4 EU921757 650-07 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 98,9 98,9 98,9 98,8 98,9 98,9 98,9 98,9 98,8 98,8 AJ829777 BAR96/1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,2 99,2 99,5 99,5 99,8 99,7 99,4 98,8 AJ829772 MAD93/1 99,2 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,5 99,4 99,8 99,5 99,5 99,2 99,1 99,2 98,8 99,1 AJ829771 MAD96/3 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,2 99,2 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 98,8 99,4 99,1 AJ829768 MAD96/1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,8 99,5 99,8 99,8 99,8 99,5 99,4 99,5 98,8 99,4 99,7 99,4 AJ829767 MAD01/1 99,4 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,7 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,7 99,7 99,5 99,7 99,7 99,4 99,2 99,2 98,8 99,2 99,4 99,2 99,5 AJ829766 MAD01/4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,8 99,5 99,8 99,8 99,8 99,5 99,4 99,5 98,8 99,4 99,7 99,4 100 99,5 AJ829765 MAD01/2 99,2 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,5 99,4 99,8 99,5 99,5 99,2 99,1 99,2 98,8 99,1 100 99,1 99,7 99,4 99,7 AY871071 B23 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,5 99,2 99,2 99,5 99,5 99,5 99,7 99,4 98,8 99,7 99,1 99,7 99,4 99,2 99,4 99,1 Y18137 I17F 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,5 99,5 99,5 99,8 99,5 99,5 99,8 99,8 99,5 99,4 99,4 98,8 99,4 99,4 99,4 99,7 99,5 99,7 99,4 99,4 D00462 C 99,2 99,5 99,5 99,5 99,1 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 98,8 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 AB448695 PoCMV7-7 99,4 99,4 99,4 99,4 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,7 99,7 99,7 99,4 99,1 99,1 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 98,6 99,2 98,9 99,2 99,2 99,1 99,2 98,9 99,2 99,2 98,9 AB448694 PoCMV7-5 99,4 99,4 99,4 99,4 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,7 99,7 99,7 99,4 99,1 99,1 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 98,9 99,2 98,9 99,2 99,2 99,1 99,2 98,9 99,2 99,2 98,9 99,4 AJ829774 MAD96/2 99,4 99,4 99,4 99,4 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,4 99,4 99,4 99,7 99,4 99,7 99,7 99,7 99,4 99,2 99,4 98,6 99,2 99,5 99,2 99,8 99,4 99,8 99,5 99,2 99,5 98,9 99,1 99,1 AJ511990 99,1 99,4 99,4 99,4 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 98,9 98,6 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,8 99,1 98,8 AJ131624 D 99,1 99,4 99,4 99,4 99,2 99,4 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 98,9 98,6 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,8 98,8 98,8 98,8 GU362669 99,1 99,4 99,4 99,4 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,4 99,4 99,4 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,1 99,2 98,9 98,6 99,2 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,2 98,9 98,9 99,1 99,4 98,8 99,1 98,8 AY380533 99,1 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 99,1 99,1 99,1 99,1 99,2 98,9 98,6 99,2 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 98,9 99,2 98,9 98,9 98,8 98,8 98,8 98,8 99,1 99,1 DQ295914 VKD 00369 98,6 98,6 98,6 98,6 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,6 98,6 98,6 98,3 98,1 98,3 98,3 98,3 98,3 98,5 98,1 98,1 98,5 98,1 98,1 98,1 98,1 98,1 98,1 98,5 98,1 98,1 98,3 98,3 98 98 98,1 98,9 98,3 HQ916354 Gd 99,2 98,9 98,9 98,9 98,8 98,8 98,8 98,8 98,8 98,9 98,9 98,9 98,9 98,6 98,6 98,9 98,9 98,9 99,1 98,8 98,5 98,8 98,5 98,8 98,8 98,6 98,8 98,5 98,8 98,8 98,5 98,6 98,6 98,6 98,3 98,3 98,3 98,3 97,8 PL-43-09 99,2 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,2 99,2 99,2 99,5 99,1 99,1 98,8 99,4 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,9 99,2 98,9 99,2 98,9 99,2 98,9 98,1 98,5 PL-52-09 99,4 99,7 99,7 99,7 99,2 99,5 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 98,9 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,4 99,1 99,4 99,1 99,4 99,1 98,3 98,6 99,5 PL-25-09 99,7 99,7 99,7 99,7 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,4 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,2 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,6 98,9 99,2 99,4 179 Prilog 2. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata CMV i izolata iz GenBank baze podataka G Q 3 4 0 6 7 0 7 0 2 - 0 7 U 2 0 6 6 8 U 2 2 8 2 1 N y D 1 0 5 3 8 F n y H H M 0 6 5 5 0 9 1 5 1 -0 8 A M 1 1 4 2 7 3 L e0 2 A J5 8 5 5 1 7 2 0 7 A J5 1 7 8 0 2 U 6 6 0 9 4 A B 4 4 8 6 9 3 T o C M V 5 -3 A B 4 4 8 6 9 2 T o C M V 5 -2 A B 4 4 8 6 9 1 T o C M V 5 -1 A J8 2 9 7 7 6 M A D 9 9 /1 A J8 2 9 7 7 5 M A D 9 9 /3 A J8 2 9 7 7 3 M A D 0 1 /3 A J8 2 9 7 7 0 M A D 9 9 /4 X 1 6 3 8 6 A M 1 8 3 1 1 9 R i- 8 A B 4 4 8 6 9 6 P o C M V 9 -1 1 G U 4 5 3 9 1 8 F n y E U 9 2 1 7 5 7 6 5 0 -0 7 A J8 2 9 7 7 7 B A R 9 6 /1 A J8 2 9 7 7 2 M A D 9 3 /1 A J8 2 9 7 7 1 M A D 9 6 /3 A J8 2 9 7 6 8 M A D 9 6 /1 A J8 2 9 7 6 7 M A D 0 1 /1 A J8 2 9 7 6 6 M A D 0 1 /4 A J8 2 9 7 6 5 M A D 0 1 /2 A Y 8 7 1 0 7 1 B 2 3 Y 1 8 1 3 7 I 1 7 F D 0 0 4 6 2 C A B 4 4 8 6 9 5 P o C M V 7 -7 A B 4 4 8 6 9 4 P o C M V 7 -5 A J8 2 9 7 7 4 M A D 9 6 /2 A J5 1 1 9 9 0 A J1 3 1 6 2 4 D G U 3 6 2 6 6 9 A Y 3 8 0 5 3 3 D Q 2 9 5 9 1 4 V K D _ 0 0 3 6 9 H Q 9 1 6 3 5 4 G d P L -4 3 -0 9 P L -5 2 -0 9 P L -2 5 -0 9 GQ340670 702-07 U20668 100 U22821 Ny 100 100 D10538 Fny 100 100 100 HM065509 151-08 100 100 100 100 AM114273 Le02 100 100 100 100 100 AJ585517 207 100 100 100 100 100 100 AJ517802 100 100 100 100 100 100 100 U66094 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 AB448693 ToCMV5-3 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 AB448692 ToCMV5-2 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 AB448691 ToCMV5-1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 AJ829776 MAD99/1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 AJ829775 MAD99/3 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 AJ829773 MAD01/3 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 AJ829770 MAD99/4 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 X16386 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 AM183119 Ri-8 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 AB448696 PoCMV9-11 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 GU453918 Fny 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 EU921757 650-07 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,6 99,1 99,1 99,1 99,1 98,6 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 AJ829777 BAR96/1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 AJ829772 MAD93/1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 AJ829771 MAD96/3 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 AJ829768 MAD96/1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 AJ829767 MAD01/1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 AJ829766 MAD01/4 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 AJ829765 MAD01/2 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 AY871071 B23 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 Y18137 I17F 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 98,6 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 D00462 C 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,1 98,6 98,6 98,6 98,6 98,1 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 97,7 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,6 98,1 AB448695 PoCMV7-7 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 AB448694 PoCMV7-5 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 AJ829774 MAD96/2 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 AJ511990 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 AJ131624 D 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 98,6 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 98,1 99,5 99,5 99,5 99,5 GU362669 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 100 99,5 AY380533 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 98,6 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 98,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 DQ295914 VKD_00369 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 98,6 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 98,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99,1 99,5 99,1 HQ916354 Gd 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 100 99,5 100 99,5 99,5 PL-43-09 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 100 99,5 100 99,5 99,5 100 PL-52-09 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 100 99,5 100 99,5 99,5 100 100 PL-25-09 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 99,5 100 100 100 100 100 100 99,1 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 98,6 100 100 100 100 99,5 100 99,5 99,5 100 100 100 180 Prilog 3. Proračun stepena nukleotidne identičnosti gena za P1 protein PVY izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka A F 4 0 1 6 0 4 _ 1 5 4 -1 0 5 6 E F 0 2 6 0 7 5 _ 1 8 1 -9 3 6 6 G Q 2 9 0 4 7 5 _ 1 6 4 -2 5 8 4 G Q 2 9 0 4 7 6 _ 1 4 6 -8 8 9 A Y 7 4 5 4 9 4 _ 1 8 9 -2 8 1 6 H Q 3 3 5 2 5 8 _ 1 3 5 -8 7 0 A J3 1 5 7 3 9 H M 3 6 8 6 5 7 A Y 7 0 3 4 8 3 _ 7 0 -7 9 8 G U 5 5 0 5 1 6 _ 1 6 4 -2 5 8 4 A Y 7 4 5 4 9 1 _ 1 8 9 -9 3 7 4 A B 4 6 1 4 5 0 _ P V Y -2 7 E F 0 1 6 2 9 4 _ v 9 4 2 4 9 0 A F 4 0 1 6 0 3 _ 1 5 4 -1 0 5 6 A Y 7 4 5 4 9 2 _ N :O -L 5 6 A J8 9 0 3 4 4 _ D it ta A Y 7 4 5 4 9 3 _ N :O -M b 5 8 A J5 8 4 8 5 1 _ S A S A _ 2 0 7 A B 4 6 1 4 5 5 S Y R -I -1 5 A J8 9 0 3 4 7 _ S at in a A Y 7 4 5 4 9 5 _ N :O -M b 5 5 H M 3 6 8 6 5 2 _ E S F .C H .N T N H M 3 6 8 6 5 1 _ A Z A .T A .O .T H M 3 6 8 6 5 0 _ A Z A .T A .O H M 3 6 8 6 5 5 _ H A M .K A .O F J2 0 4 1 6 5 _ N IB -N T N A B 2 7 0 7 0 5 A Y 8 8 4 9 8 2 _ 4 2 3 -3 M 9 5 4 9 1 G Q 2 0 0 8 3 6 _ H N 2 E F 0 2 6 0 7 6 A F 4 0 1 6 1 0 X 9 7 8 9 5 F J6 6 6 3 3 7 _ N _ N y sa F J4 2 3 0 3 0 _ C ao h ai F J4 2 3 0 2 9 _ G u iy an g A J3 1 5 7 3 8 H M 3 6 8 6 5 6 _ H O R .M IN .N T N .T D Q 1 5 7 1 7 8 _ ID -1 G U 0 7 4 0 0 1 _ H ei lo n g ji an g P L -3 -1 0 P L -1 5 -0 9 P L -2 8 -0 9 P L -1 0 8 -1 0 AF401604_154-1056 EF026075_181-9366 99,9 GQ290475_164-2584 99,4 99,3 GQ290476_146-889 100 99,9 99,4 AY745494_189-2816 99,6 99,4 99 99,6 HQ335258_135-870 100 99,9 99,4 100 99,6 AJ315739 99,9 99,7 99,3 99,9 99,4 99,9 HM368657 99,7 99,6 99,1 99,7 99,3 99,7 99,6 AY703483_70-798 99,6 99,4 99 99,6 100 99,6 99,4 99,3 GU550516_164-2584 99,4 99,3 100 99,4 99 99,4 99,3 99,1 99 AY745491_189-9374 99,6 99,4 99 99,6 100 99,6 99,4 99,3 100 99 AB461450_PVY-27 99,4 99,3 98,8 99,4 99,6 99,4 99,3 99,1 99,6 98,8 99,6 EF016294_v942490 99,6 99,4 99 99,6 99,7 99,6 99,4 99,3 99,7 99 99,7 99,9 AF401603_154-1056 99,6 99,4 99 99,6 99,7 99,6 99,4 99,3 99,7 99 99,7 99,6 99,7 AY745492_N:O-L56 99,4 99,3 98,8 99,4 99,9 99,4 99,3 99,1 99,9 98,8 99,9 99,4 99,6 99,6 AJ890344_Ditta 99,3 99,1 98,8 99,3 99,4 99,3 99,1 99 99,4 98,8 99,4 99,6 99,7 99,4 99,3 AY745493_N:O-Mb58 99,3 99,1 98,7 99,3 99,7 99,3 99,1 99 99,7 98,7 99,7 99,3 99,4 99,4 99,6 99,1 AJ584851_SASA_207 99,4 99,3 98,8 99,4 99,9 99,4 99,3 99,1 99,9 98,8 99,9 99,4 99,6 99,6 99,7 99,3 99,6 AB461455 SYR-I-15 99,3 99,1 99 99,3 99,4 99,3 99,1 99 99,4 99 99,4 99,3 99,4 99,4 99,3 99,3 99,1 99,3 AJ890347_Satina 99,1 99 98,5 99,1 99,3 99,1 99 98,8 99,3 98,5 99,3 99,4 99,6 99,3 99,1 99,3 99 99,1 99 AY745495_N:O-Mb55 99,3 99,1 98,7 99,3 99,7 99,3 99,1 99 99,7 98,7 99,7 99,3 99,4 99,4 99,6 99,1 99,4 99,6 99,1 99 HM368652_ESF.CH.NTN 99,3 99,1 98,7 99,3 99,4 99,3 99,1 99 99,4 98,7 99,4 99,6 99,7 99,4 99,3 99,4 99,1 99,3 99,1 99,3 99,1 HM368651_AZA.TA.O.T 99,1 99 98,5 99,1 99,3 99,1 99 98,8 99,3 98,5 99,3 99,1 99,3 99,3 99,1 99 99 99,1 99 98,8 99 99 HM368650_AZA.TA.O 98,8 98,7 98,2 98,8 99 98,8 98,7 98,5 99 98,2 99 98,8 99 99 98,8 98,7 98,7 98,8 98,7 98,5 98,7 99 99,1 HM368655_HAM.KA.O 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 99,1 98,8 FJ204165_NIB-NTN 99 98,8 98,4 99 99,1 99 98,8 98,7 99,1 98,4 99,1 99 99,1 99,1 99 98,8 98,8 99 98,8 98,7 98,8 98,8 98,7 98,4 98,7 AB270705 99,3 99,1 98,7 99,3 99,4 99,3 99,1 99 99,4 98,7 99,4 99,3 99,4 99,4 99,3 99,1 99,1 99,3 99,1 99 99,1 99,1 99,3 99 99 98,8 AY884982_423-3 99,3 99,1 98,7 99,3 99,4 99,3 99,1 99 99,4 98,7 99,4 99,6 99,7 99,4 99,3 99,4 99,1 99,3 99,1 99,3 99,1 99,4 99 98,7 99 98,8 99,1 M95491 99 98,8 98,4 99 98,5 99 98,8 98,7 98,5 98,4 98,5 98,7 98,8 98,5 98,4 98,5 98,2 98,4 98,2 98,4 98,2 98,5 98,1 97,8 98,1 97,9 98,2 98,5 GQ200836_HN2 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 EF026076 99,4 99,3 98,8 99,4 99,9 99,4 99,3 99,1 99,9 98,8 99,9 99,4 99,6 99,6 99,7 99,3 99,6 99,7 99,3 99,1 99,6 99,3 99,1 98,8 99,4 99 99,3 99,3 98,4 99,4 AF401610 99 98,8 98,4 99 99,4 99 98,8 98,7 99,4 98,4 99,4 99 99,1 99,1 99,3 98,8 99,1 99,3 98,8 98,7 99,1 99 98,7 98,5 99 98,5 98,8 98,8 97,9 99 99,3 X97895 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 99,4 99,4 99 FJ666337_N_Nysa 99 98,8 98,4 99 99,4 99 98,8 98,7 99,4 98,4 99,4 99 99,1 99,1 99,3 98,8 99,1 99,3 98,8 98,7 99,1 98,8 98,7 98,4 99 98,5 98,8 98,8 97,9 99 99,3 99,1 99 FJ423030_Caohai 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 99,7 99,4 99 99,4 99 FJ423029_Guiyang 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 99,7 99,4 99 99,4 99 99,7 AJ315738 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,1 99,3 99,3 99,4 99 99,3 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 99,1 99,4 99 99,1 99 99,1 99,1 HM368656_HOR.MIN.NTN.T 99 98,8 98,4 99 99,1 99 98,8 98,7 99,1 98,4 99,1 99 99,1 99,1 99 98,8 98,8 99 98,8 98,7 98,8 98,8 99,9 99 99 98,5 99,1 98,8 97,9 98,7 99 98,5 98,7 98,5 98,7 98,7 98,7 DQ157178_ID-1 99,1 99 98,5 99,1 99,6 99,1 99 98,8 99,6 98,5 99,6 99,4 99,3 99,3 99,4 99 99,6 99,4 99 98,8 99,3 99 98,8 98,5 99,1 98,7 99 99 98,1 99,1 99,4 99 99,1 99 99,1 99,1 99,1 98,7 GU074001_Heilongjiang 99 98,8 98,4 99 99,1 99 98,8 98,7 99,1 98,4 99,1 99 99,1 99,1 99 98,8 98,8 99 98,8 98,7 98,8 98,8 98,7 98,7 98,7 98,5 98,8 98,8 97,9 98,7 99,3 98,5 98,7 98,5 98,7 98,7 98,7 98,5 98,7 PL-3-10 99,3 99,1 98,7 99,3 98,8 99,3 99,1 99 98,8 98,7 98,8 98,7 98,8 98,8 98,7 98,5 98,5 98,7 98,5 98,4 98,5 98,5 98,4 98,1 98,4 98,2 98,5 98,5 98,2 98,4 98,7 98,2 98,4 98,2 98,4 98,4 98,4 98,2 98,4 98,2 PL-15-09 100 99,9 99,4 100 99,6 100 99,9 99,7 99,6 99,4 99,6 99,4 99,6 99,6 99,4 99,3 99,3 99,4 99,3 99,1 99,3 99,3 99,1 98,8 99,1 99 99,3 99,3 99 99,1 99,4 99 99,1 99 99,1 99,1 99,1 99 99,1 99 99,3 PL-28-09 99,9 99,7 99,3 99,9 99,4 99,9 99,7 99,6 99,4 99,3 99,4 99,3 99,4 99,4 99,3 99,1 99,1 99,3 99,1 99 99,1 99,1 99 99 99 98,8 99,1 99,1 98,8 99 99,3 98,8 99 98,8 99 99 99 98,8 99 98,8 99,1 99,9 PL-108-10 99,9 99,7 99,3 99,9 99,4 99,9 99,7 99,6 99,4 99,3 99,4 99,3 99,4 99,4 99,3 99,1 99,1 99,3 99,1 99 99,1 99,1 99 98,7 99 98,8 99,1 99,1 98,8 99 99,3 98,8 99 98,8 99 99 99 98,8 99 98,8 99,1 99,9 99,7 181 Prilog 4. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence gena za P1 protein izolata PVY i izolata iz GenBank baze podataka A F 4 0 1 6 0 4 1 5 4 -1 0 5 6 E F 0 2 6 0 7 5 1 8 1 -9 3 6 6 G Q 2 9 0 4 7 5 1 6 4 -2 5 8 4 G Q 2 9 0 4 7 6 1 4 6 -8 8 9 A Y 7 4 5 4 9 4 1 8 9 -2 8 1 6 H Q 3 3 5 2 5 8 1 3 5 -8 7 0 A J3 1 5 7 3 9 H M 3 6 8 6 5 7 A Y 7 0 3 4 8 3 7 0 -7 9 8 G U 5 5 0 5 1 6 1 6 4 -2 5 8 4 A Y 7 4 5 4 9 1 1 8 9 -9 3 7 4 A B 4 6 1 4 5 0 P V Y -2 7 E F 0 1 6 2 9 4 v 9 4 2 4 9 0 A F 4 0 1 6 0 3 1 5 4 -1 0 5 6 A Y 7 4 5 4 9 2 N :O -L 5 6 A J8 9 0 3 4 4 D it ta A Y 7 4 5 4 9 3 N :O -M b 5 8 A J5 8 4 8 5 1 S A S A _ 2 0 7 A B 4 6 1 4 5 5 S Y R -I -1 5 A J8 9 0 3 4 7 S at in a A Y 7 4 5 4 9 5 N :O -M b 5 5 H M 3 6 8 6 5 2 E S F .C H .N T N H M 3 6 8 6 5 1 A Z A .T A .O .T H M 3 6 8 6 5 0 A Z A .T A .O H M 3 6 8 6 5 5 H A M .K A .O F J2 0 4 1 6 5 N IB -N T N A B 2 7 0 7 0 5 A Y 8 8 4 9 8 2 4 2 3 -3 M 9 5 4 9 1 G Q 2 0 0 8 3 6 H N 2 E F 0 2 6 0 7 6 A F 4 0 1 6 1 0 X 9 7 8 9 5 F J6 6 6 3 3 7 N _ N y sa F J4 2 3 0 3 0 C ao h ai F J4 2 3 0 2 9 G u iy an g A J3 1 5 7 3 8 H M 3 6 8 6 5 6 _ H O R .M IN .N T N .T D Q 1 5 7 1 7 8 ID -1 G U 0 7 4 0 0 1 H ei lo n g ji an g P L -3 -1 0 P L -1 5 -0 9 P L -2 8 -0 9 P L -1 0 8 -1 0 AF401604 154-1056 EF026075 181-9366 100 GQ290475 164-2584 100 100 GQ290476 146-889 100 100 100 AY745494 189-2816 100 100 100 100 HQ335258 135-870 100 100 100 100 100 AJ315739 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 HM368657 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 AY703483 70-798 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 GU550516 164-2584 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 AY745491 189-9374 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 AB461450 PVY-27 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 EF016294 v942490 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 AF401603 154-1056 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 AY745492 N:O-L56 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 AJ890344 Ditta 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 AY745493 N:O-Mb58 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 AJ584851 SASA_207 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 AB461455 SYR-I-15 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 AJ890347 Satina 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 AY745495 N:O-Mb55 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 HM368652 ESF.CH.NTN 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 HM368651 AZA.TA.O.T 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 HM368650 AZA.TA.O 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 98,2 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 98,7 HM368655 HAM.KA.O 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 98,2 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 98,7 98,2 FJ204165 NIB-NTN 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 98,2 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 98,7 98,2 98,2 AB270705 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 AY884982 423-3 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 M95491 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,2 97,8 98,7 98,7 98,7 98,2 98,7 98,7 98,2 98,2 98,7 98,7 98,2 98,2 98,2 98,7 98,2 97,8 97,8 97,8 98,2 98,7 GQ200836_HN2 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 EF026076 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 100 AF401610 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 100 100 X97895 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 100 100 100 FJ666337 N_Nysa 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 FJ423030 Caohai 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 100 100 100 100 99,6 FJ423029 Guiyang 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 AJ315738 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 98,2 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 98,7 98,2 98,2 98,2 98,7 99,1 97,8 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 98,7 HM368656 HOR.MIN.NTN.T 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 98,2 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 99,1 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 98,2 98,2 98,7 99,1 97,8 99,1 99,1 99,1 99,1 98,7 99,1 98,7 98,2 DQ157178 ID-1 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 GU074001 Heilongjiang 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,2 97,8 98,7 98,7 98,7 98,2 98,7 98,7 98,2 98,2 98,7 98,7 98,2 98,2 98,2 98,7 98,2 98,7 97,8 97,8 98,2 98,7 97,4 98,7 98,7 98,7 98,7 98,2 98,7 98,2 97,8 97,8 98,2 PL-3-10 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 99,1 98,2 PL-15-09 100 100 100 100 100 100 99,6 99,1 100 100 100 99,6 100 100 99,6 99,6 100 100 99,6 99,6 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 100 98,7 100 100 100 100 99,6 100 99,6 99,1 99,1 99,6 98,7 99,6 PL-28-09 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 99,6 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 99,1 98,2 99,1 99,6 PL-108-10 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 98,7 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,6 99,6 99,1 99,1 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 98,7 99,1 99,6 98,2 99,6 99,6 99,6 99,6 99,1 99,6 99,1 98,7 98,7 99,1 98,2 99,1 99,6 99,1 182 Prilog 5. Proračun stepena nukleotidne identičnosti NC gena TSWV izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka G U 3 6 9 7 2 3 S r- 6 0 3 JF 3 0 3 0 8 1 2 4 0 -0 9 JF 3 0 3 0 8 0 2 3 6 -0 9 G U 3 6 9 7 2 9 Is -5 6 G Q 3 7 3 1 7 3 5 3 -0 5 G Q 3 5 5 4 6 7 3 3 -0 6 F R 6 9 3 2 5 7 S T M 3 B F R 6 9 3 0 5 9 L Y E 4 6 F R 6 9 3 0 5 8 L Y E 4 0 F R 6 9 3 0 5 6 L Y E 1 8 3 F R 6 9 3 0 5 5 L A S 2 G U 3 6 9 7 2 8 Is -3 6 7 G U 3 5 5 9 4 0 Is -2 7 8 G U 3 5 5 9 3 9 Is -2 8 8 G U 3 3 9 5 0 8 Is -2 4 6 G U 3 3 9 5 0 6 Is -1 4 1 D Q 4 3 1 2 3 8 D Q 4 3 1 2 3 7 D Q 3 9 8 9 4 5 A F 0 2 0 6 6 0 F R 6 9 3 2 5 6 S O O 6 F R 6 9 3 0 6 3 L Y E P O F R 6 9 3 0 6 2 L Y E 8 9 F R 6 9 3 0 6 0 L Y E 4 7 F R 6 9 3 0 5 4 L aR eu n io n F R 6 9 3 0 4 8 C H M 6 F R 6 9 3 0 4 6 C A A 1 9 G U 3 6 9 7 2 2 P -2 4 0 G U 3 6 9 7 2 1 P -2 0 2 /1 G U 3 6 9 7 1 9 I- 1 8 6 G U 3 3 9 5 0 7 Is -2 2 8 A Y 7 4 4 4 7 6 N C -1 A J2 9 6 6 0 1 8 -H ip _ 9 6 -1 2 A J2 9 6 5 9 9 C 2 7 0 8 4 D 1 3 9 2 6 4 7 -1 4 5 0 PL-60-09 100 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.7 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.7 99.6 PL-14-10 99.7 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.4 99.3 PL-35-09 99.7 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.4 99.3 H Q 2 6 0 9 8 2 T S W V -N w o n F R 6 9 3 0 6 1 L Y E 4 8 F R 6 9 3 0 5 7 L Y E 3 4 4 F R 6 9 3 0 5 2 F ra n ce 7 7 G U 3 6 9 7 1 6 Is -3 3 4 A Y 7 4 4 4 7 8 N C -3 A J4 1 8 7 8 1 L E 9 8 /5 2 7 A J4 1 8 7 7 7 B S 9 7 A J2 9 7 6 1 1 L E 9 8 /5 2 7 A J2 9 7 6 1 0 B S 9 7 F R 6 9 3 0 4 9 C IE 4 3 G U 3 6 9 7 2 5 T -1 0 0 3 A Y 8 4 8 9 2 2 G U 3 6 9 7 2 0 M iz -3 G U 3 6 9 7 1 7 Is -3 4 4 G Q 3 7 3 1 7 2 3 9 -0 6 A Y 8 7 9 1 0 7 A J4 1 8 7 8 0 G D 9 8 A J2 9 7 6 0 9 G D 9 8 A J2 9 6 6 0 2 D a9 6 /1 A J2 9 6 5 9 8 9 7 F R 6 9 3 0 5 1 D ah li a G U 3 6 9 7 2 4 S r- 7 3 9 A Y 8 7 9 1 1 0 T S W V -1 4 5 5 A Y 8 1 8 3 2 1 T S W V -1 4 3 9 A J4 1 8 7 7 9 D H 3 7 G U 3 6 9 7 1 5 Is -2 7 9 A Y 8 1 8 3 2 0 T S W V -1 4 3 8 P L -6 0 -0 9 P L -1 4 -1 0 P L -3 5 -0 9 PL-60-09 99.6 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.3 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99 PL-14-10 99.3 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.7 99.7 PL-35-09 99.3 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.8 98.7 99.7 99.7 183 Prilog 6. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence NC gena izolata TSWV i izolata iz GenBank baze podataka G U 3 6 9 7 2 3 S r- 6 0 3 JF 3 0 3 0 8 1 2 4 0 -0 9 JF 3 0 3 0 8 0 2 3 6 -0 9 G U 3 6 9 7 2 9 Is -5 6 G Q 3 7 3 1 7 3 5 3 -0 5 G Q 3 5 5 4 6 7 3 3 -0 6 F R 6 9 3 2 5 7 S T M 3 B F R 6 9 3 0 5 9 L Y E 4 6 F R 6 9 3 0 5 8 L Y E 4 0 F R 6 9 3 0 5 6 L Y E 1 8 3 F R 6 9 3 0 5 5 L A S 2 G U 3 6 9 7 2 8 Is -3 6 7 G U 3 5 5 9 4 0 Is -2 7 8 G U 3 5 5 9 3 9 Is -2 8 8 G U 3 3 9 5 0 8 Is -2 4 6 G U 3 3 9 5 0 6 Is -1 4 1 D Q 4 3 1 2 3 8 D Q 4 3 1 2 3 7 D Q 3 9 8 9 4 5 A F 0 2 0 6 6 0 F R 6 9 3 2 5 6 S O O 6 F R 6 9 3 0 6 3 L Y E P O F R 6 9 3 0 6 2 L Y E 8 9 F R 6 9 3 0 6 0 L Y E 4 7 F R 6 9 3 0 5 4 L aR eu n io n F R 6 9 3 0 4 8 C H M 6 F R 6 9 3 0 4 6 C A A 1 9 G U 3 6 9 7 2 2 P -2 4 0 G U 3 6 9 7 2 1 P -2 0 2 /1 G U 3 6 9 7 1 9 I- 1 8 6 G U 3 3 9 5 0 7 Is -2 2 8 A Y 7 4 4 4 7 6 N C -1 A J2 9 6 6 0 1 8 -H ip _ 9 6 -1 2 A J2 9 6 5 9 9 C 2 7 0 8 4 PL-60-09 100 100 100 100 100 100 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.1 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 PL-14-10 100 100 100 100 100 100 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.1 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 PL-35-09 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 98.7 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 D 1 3 9 2 6 4 7 -1 4 5 0 H Q 2 6 0 9 8 2 T S W V -N w o n F R 6 9 3 0 6 1 L Y E 4 8 F R 6 9 3 0 5 7 L Y E 3 4 4 F R 6 9 3 0 5 2 F ra n ce 7 7 G U 3 6 9 7 1 6 Is -3 3 4 A Y 7 4 4 4 7 8 N C -3 A J4 1 8 7 8 1 L E 9 8 /5 2 7 A J4 1 8 7 7 7 B S 9 7 A J2 9 7 6 1 1 L E 9 8 /5 2 7 A J2 9 7 6 1 0 B S 9 7 F R 6 9 3 0 4 9 C IE 4 3 G U 3 6 9 7 2 5 T -1 0 0 3 A Y 8 4 8 9 2 2 G U 3 6 9 7 2 0 M iz -3 G U 3 6 9 7 1 7 Is -3 4 4 G Q 3 7 3 1 7 2 3 9 -0 6 A Y 8 7 9 1 0 7 A J4 1 8 7 8 0 G D 9 8 A J2 9 7 6 0 9 G D 9 8 A J2 9 6 6 0 2 2 0 _ D a9 6 /1 A J2 9 6 5 9 8 9 7 F R 6 9 3 0 5 1 D ah li a G U 3 6 9 7 2 4 S r- 7 3 9 A Y 8 7 9 1 1 0 T S W V -1 4 5 5 A Y 8 1 8 3 2 1 T S W V -1 4 3 9 A J4 1 8 7 7 9 D H 3 7 G U 3 6 9 7 1 5 Is -2 7 9 A Y 8 1 8 3 2 0 T S W V -1 4 3 8 P L -6 0 -0 9 P L -1 4 -1 0 P L -3 5 -0 9 PL-60-09 100 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.1 99.6 99.1 99.1 99.6 100 99.1 99.6 99.6 99.1 98.2 99.6 99.6 98.7 98.7 98.7 98.7 98.7 PL-14-10 100 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.6 99.1 99.6 99.1 99.1 99.6 100 99.1 99.6 99.6 99.1 98.2 99.6 99.6 98.7 98.7 98.7 98.7 98.7 100 PL-35-09 99.6 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 99.1 98.7 99.1 98.7 98.7 99.1 99.6 98.7 99.1 99.1 98.7 97.8 99.1 99.1 98.2 98.2 98.2 98.2 98.2 99.6 99.6 184 Prilog 7. Proračun stepena nukleotidne identičnosti CP gena AMV izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka F J5 2 7 7 4 9 1 9 6 -0 8 H Q 3 1 6 6 3 7 H z A B 4 5 1 1 7 3 N o .1 4 H Q 1 8 5 5 6 8 T N M 5 9 2 4 1 H M 8 0 7 3 0 5 S -3 0 A F 2 1 5 6 6 4 N Z 1 A Y 3 4 0 0 7 1 N Y -B 2 0 0 2 L 0 0 1 6 2 1 2 0 -7 8 5 P -1 0 -1 0 P -2 7 -0 9 P L -2 -1 0 FJ527749 196-08 HQ316637 Hz 99,6 AB451173 No. 14 99,2 98,7 HQ185568 TN 97,5 97 96,6 M59241 99,2 98,7 98,3 97,5 HM807305 S-30 98,7 98,3 98,7 96,1 98,7 AF215664 NZ1 98,3 97,9 98,3 97,5 98,3 97,9 AY340071 NY-B 2002 98,3 97,9 98,3 96,6 98,3 97 97,5 L00162 120-785 99,2 98,7 98,3 96,6 98,3 97,9 98,3 98,3 P-10-10 100 99,6 99,2 97,5 99,2 98,7 98,3 98,3 99,2 P-27-09 98,7 98,3 98,7 97,9 98,7 97,5 98,7 98,7 97,9 98,7 PL-2-10 99,6 99,2 98,7 97,9 98,7 98,3 98,7 97,9 98,7 99,6 99,2 185 Prilog 8. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata AMV i izolata iz GenBank baze podataka F J5 2 7 7 4 9 1 9 6 -0 8 H Q 3 1 6 6 3 7 H z A B 4 5 1 1 7 3 N o .1 4 H Q 1 8 5 5 6 8 T N M 5 9 2 4 1 H M 8 0 7 3 0 5 S -3 0 A F 2 1 5 6 6 4 N Z 1 A Y 3 4 0 0 7 1 N Y -B 2 0 0 2 L 0 0 1 6 2 1 2 0 -7 8 5 P -1 0 -1 0 P -2 7 -0 9 P L -2 -1 0 FJ527749 196-08 HQ316637 Hz 100 AB451173 No. 14 100 100 HQ185568 TN 100 100 100 M59241 100 100 100 100 HM807305 S-30 100 100 100 100 100 AF215664 NZ1 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 AY340071 NY-B 2002 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 98,7 97,5 L00162_120-785 97,5 97,5 97,5 97,5 97,5 97,5 98,7 98,7 P-10-10 100 100 100 100 100 100 98,7 98,7 97,5 P-27-09 100 100 100 100 100 100 98,7 98,7 97,5 100 PL-2-10 100 100 100 100 100 100 98,7 98,7 97,5 100 100 186 Prilog 9. Proračun stepena nukleotidne identičnosti CP gena PMMoV izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka F R 6 7 1 3 8 3 P 9 1 /2 A Y 6 3 2 8 6 3 A M 4 1 1 4 3 3 A M 4 9 1 5 9 8 S z2 4 A M 4 9 1 5 9 6 S z1 7 A M 4 9 1 5 9 5 S z1 5 A M 4 9 1 5 9 4 S z1 3 A M 4 9 1 6 0 1 S z2 3 A B 2 5 4 8 2 1 A B 1 2 6 0 0 3 A B 0 8 4 4 5 6 P G Q 4 2 7 0 4 4 M R S -P V 3 p -R P -2 2 G Q 4 2 7 0 4 3 M R S -P V 3 p -C y P -5 4 A B 1 1 9 4 8 2 A J4 2 9 0 8 8 2 0 2 -6 7 5 _ P M M V 1 .2 L 3 5 0 7 4 1 0 -4 8 3 F R 6 7 1 3 9 2 P 9 8 /1 5 A M 4 9 1 5 9 7 S z2 0 A B 2 7 6 0 3 0 A B 0 6 2 0 4 9 P M M o V -G e1 G Q 4 2 7 0 4 6 M R S -P V 3 p -C y P -5 5 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 P -5 7 -0 9 FR671383 P91/2 AY632863 100 AM411433 100 100 AM491598 Sz24 100 100 100 AM491596 Sz17 100 100 100 100 AM491595 Sz15 100 100 100 100 100 AM491594 Sz13 100 100 100 100 100 100 AM491601 Sz23 100 100 100 100 100 100 100 AB254821 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 AB126003 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 AB084456 P 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 100 GQ427044 MRS-PV3p-RP-22 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 99,5 GQ427043 MRS-PV3p-CyP-54 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 99,5 100 AB119482 99 99 99 99 99 99 99 99 98,5 98,5 98,5 99 99 AJ429088_202-675 PMMV1.2 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 99,5 100 100 99 L35074 10-483 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 99,5 100 100 99 100 FR671392 P98/15 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 99 99 99,5 99,5 98,5 99,5 99,5 AM491597 Sz20 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 100 100 99,5 99,5 98,5 99,5 99,5 99 AB276030 98 98 98 98 98 98 98 98 97,5 98,5 98,5 98 98 97 98 98 97,5 98,5 AB062049 PMMoV-Ge1 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98 98 98 98,5 98,5 97,5 98,5 98,5 98 98 97,5 GQ427046 MRS-PV3p-CyP-55 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 99 99 99,5 99,5 98,5 99,5 99,5 99 99 97,5 99 P-60-09 100 100 100 100 100 100 100 100 99,5 99,5 99,5 100 100 99 100 100 99,5 99,5 98 98,5 99,5 P-3-10 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 99 99 99,5 99,5 98,5 99,5 99,5 99 99 97,5 98 99 99,5 P-57-09 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99,5 99 99 99 99,5 99,5 98,5 99,5 99,5 99 99 97,5 98 99 99,5 100 187 Prilog 10. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata PMMoV i izolata iz GenBank baze podataka F R 6 7 1 3 8 3 P 9 1 /2 A Y 6 3 2 8 6 3 A M 4 1 1 4 3 3 A M 4 9 1 5 9 8 S z2 4 A M 4 9 1 5 9 6 S z1 7 A M 4 9 1 5 9 5 S z1 5 A M 4 9 1 5 9 4 S z1 3 A M 4 9 1 6 0 1 S z2 3 A B 2 5 4 8 2 1 A B 1 2 6 0 0 3 A B 0 8 4 4 5 6 P G Q 4 2 7 0 4 4 M R S -P V 3 p -R P -2 2 G Q 4 2 7 0 4 3 M R S -P V 3 p -C y P -5 4 A B 1 1 9 4 8 2 A J4 2 9 0 8 8 2 0 2 -6 7 5 _ P M M V 1 .2 L 3 5 0 7 4 1 0 -4 8 3 F R 6 7 1 3 9 2 P 9 8 /1 5 A M 4 9 1 5 9 7 S z2 0 A B 2 7 6 0 3 0 A B 0 6 2 0 4 9 P M M o V -G e1 G Q 4 2 7 0 4 6 M R S -P V 3 p -C y P -5 5 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 P -5 7 -0 9 FR671383 P91/2 AY632863 100 AM411433 100 100 AM491598 Sz24 100 100 100 AM491596 Sz17 100 100 100 100 AM491595 Sz15 100 100 100 100 100 AM491594 Sz13 100 100 100 100 100 100 AM491601 Sz23 100 100 100 100 100 100 100 AB254821 100 100 100 100 100 100 100 100 AB126003 100 100 100 100 100 100 100 100 100 AB084456 P 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 GQ427044 MRS-PV3p-RP-22 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 GQ427043 MRS-PV3p-CyP-54 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 AB119482 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 AJ429088 202-675_PMMV1.2 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 L35074 10-483 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 FR671392 P98/15 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 AM491597 Sz20 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 AB276030 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 98,5 AB062049 PMMoV-Ge1 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,5 GQ427046 MRS-PV3p-CyP-55 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,5 100 P-60-09 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,5 100 100 P-3-10 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,5 100 100 100 P-57-09 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98,5 100 100 100 100 188 Prilog 11. Proračun stepena nukleotidne identičnosti RdRp gena PMMoV izolata sa izolatima iz GenBank baze podataka. A B 2 7 6 0 3 0 7 0 -4 9 0 8 A B 2 5 4 8 2 1 7 0 -4 9 0 8 A B 1 2 6 0 0 3 7 0 -4 9 0 8 A B 5 5 0 9 1 1 7 0 -4 9 0 8 A Y 8 5 9 4 9 7 7 0 -4 9 0 8 E F 0 6 1 1 4 2 T u n - 1 2 _ 1 8 3 P -5 7 -0 9 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 AB276030 70-4908 AB254821 70-4908 99,7 AB126003 70-4908 99,7 99,7 AB550911 70-4908 97,5 97,5 97,5 AY859497 70-4908 97,5 97,5 97,5 99,7 EF061142 Tun-12_183 97,5 97,5 97,5 100 99,7 P-57-09 99,4 99,4 99,4 97,1 97,2 97,1 P-60-09 99,7 99,7 99,7 97,5 97,5 97,5 99,4 P-3-10 99,4 99,4 99,4 97,1 97,2 97,1 100 99,4 189 Prilog 12. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence RdRp gena izolata PMMoV i izolata iz GenBank baze podataka A B 2 7 6 0 3 0 7 0 -4 9 0 8 A B 2 5 4 8 2 1 7 0 -4 9 0 8 A B 1 2 6 0 0 3 7 0 -4 9 0 8 A B 5 5 0 9 1 1 7 0 -4 9 0 8 A Y 8 5 9 4 9 7 7 0 -4 9 0 8 E F 0 6 1 1 4 2 T u n - 1 2 _ 1 8 3 P -5 7 -0 9 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 AB276030 70-4908 AB254821 70-4908 99,6 AB126003 70-4908 99,2 99,6 AB550911 70-4908 94,2 94,6 94,2 AY859497 70-4908 94,2 94,6 94,2 99,2 EF061142 Tun- 12_183 94,2 94,6 94,2 100 99,2 P-57-09 98,3 98,7 98,3 93,3 93,3 93,3 P-60-09 99,2 99,6 99,2 94,2 94,2 94,2 98,3 P-3-10 98,3 98,7 98,3 93,3 93,3 93,3 100 98,3 190 Prilog 13. Proračun stepena homologije CP gena CMV izolata i izolata iz GenBank baze podataka prikazanih u filogenetskom stablu A J5 8 5 5 1 7 2 0 7 H M 0 6 5 5 0 9 1 5 1 -0 8 H M 0 6 5 5 1 0 1 1 5 -0 8 D 1 0 5 4 4 M 9 8 5 0 0 U 3 2 8 5 9 A J0 0 6 9 8 8 P 1 A B 0 0 4 7 8 0 K M D Q 0 1 8 2 8 6 C as A J0 0 6 9 9 0 R B A F 5 2 3 3 4 0 1 1 3 D 2 8 7 8 0 T ai w an Y 1 6 9 2 6 T fn D 4 2 0 7 9 C 7 -2 D 4 9 4 9 6 M 4 8 A F 1 2 7 9 7 7 K L 3 6 5 2 5 A B I X 8 9 6 5 2 U 3 1 2 2 0 O ah u U 2 0 2 1 9 Ix o ra M 2 1 4 6 4 F J6 2 1 4 9 5 S im p 2 A B 0 0 6 8 1 3 M 2 A F 0 6 3 6 1 0 S Z 1 2 8 1 8 K in A F 1 2 7 9 7 6 L S L 1 5 3 3 6 tr k 7 A J8 2 9 7 7 0 M A D 9 9 /4 A J8 2 9 7 6 8 M A D 9 6 /1 X 1 6 3 8 6 I1 7 F A J8 2 9 7 7 6 M A D 9 9 /1 U 4 3 8 8 8 G Q 3 4 0 6 7 0 7 0 2 -0 7 D 1 0 5 4 5 C M V -P 6 P L -2 5 -0 9 P L -5 2 -0 9 P L -4 3 -0 9 AJ585517 207 HM065509 151-08 99,4 HM065510 115-08 99,2 99,2 D10544 98,9 98,9 99,1 M98500 97,4 97,4 97,6 97,4 U32859 97,8 97,8 97,9 98,1 98,1 AJ006988 P1 98,1 98,1 97,9 98,4 97,8 98,1 AB004780 KM 97,1 97,4 97,3 97,4 96,8 97,8 97,8 DQ018286 Cas 96,4 96,8 96,6 96,4 96,1 95,8 96,8 96,8 AJ006990 RB 94,8 94,8 94,9 94,6 93,4 93,4 94,1 94,1 93,7 AF523340 113 95,6 95,3 94,7 95,1 94,8 94,9 95,6 95,3 94,2 94,9 D28780 Taiwan 95,1 95,1 94,2 94,9 94,2 94,8 95,1 95,1 93,7 94,8 99,5 Y16926 Tfn 95,4 95,4 94,6 94,9 94,2 94,8 95,1 95,4 94,1 95,1 99,5 99,7 D42079 C7-2 93,7 94,3 93,9 93,6 94,1 93,8 94,1 94,1 92,7 93,2 94,9 94,6 94,6 D49496 M48 91,8 92,5 92 92,3 91,1 91,4 91,8 92,2 91,4 90,9 91,4 91,2 91,6 91,3 AF127977 K 94,1 94,8 93,9 93,9 93,2 93,7 94,1 94,1 93 92,9 94,2 94,4 94,8 94,3 94,2 L36525 ABI 93,7 94,1 93,2 93,2 92,9 93 93,4 93,4 92,5 93,2 94,3 94,4 94,8 94,6 93,2 97,9 X89652 91,7 91,7 91,1 90,8 90,9 90,9 90,6 91,1 89,6 92 92,7 92,9 93,2 92 89,7 91,8 92,2 U31220 Oahu 90 90 89,4 89,8 89,5 89,6 90,5 89,8 88,7 92 91,1 91,3 91,6 90,4 87,2 91,3 90,8 88 U20219 Ixora 92,3 92,3 92,1 91,8 91,4 91,6 91,9 92,3 90,3 93,5 93,2 93,4 93,7 92,7 90,3 93,4 93,4 92,9 91,8 M21464 71,8 72,7 72 72,3 72,8 72,5 72,7 73,7 72,3 71,3 73,2 73,4 73,9 72,6 70,3 74,1 73 70,9 70,4 70,8 FJ621495 Simp2 71,3 72,2 71,5 71,8 72,3 72 72,2 73,2 71,8 70,9 72,7 73 73,4 72,1 69,8 73,6 72,5 70,4 69,4 70,3 99,1 AB006813 M2 71,5 72,5 71,7 72 72,5 72,3 72,5 73,4 72 71,1 72,9 73,2 73,6 72,3 70 73,6 72,5 70,6 70,1 70,6 99,4 99,4 AF063610 S 70,6 71,5 70,8 71,1 71,1 71,3 71 72,5 70,6 69,6 71,5 71,8 72,3 70,9 68,8 72,4 71,3 69,1 68,7 69,1 98,4 98,4 98,7 Z12818 Kin 70,8 71,8 71 71,3 71,8 71,6 71,8 72,7 71,6 70,6 72,3 72,5 73 71,6 69,6 73,4 72,7 70,6 70,1 70,6 99,1 99,1 99,4 98,4 AF127976 LS 71,3 72,2 71,5 71,8 72,3 72 72,2 73,2 71,8 70,9 72,7 73 73,4 72,1 69,8 73,6 72,5 70,4 69,9 70,3 99,5 99,5 99,5 98,6 99,2 L15336 trk7 70,1 71,1 70,4 70,6 71,1 70,9 71,1 72,1 70,6 69,7 71,6 71,8 72,3 70,9 68,6 72,5 71,4 69,2 69,2 69,2 98,6 98,4 98,7 97,8 98,4 98,7 AJ829770 MAD99/4 99,5 99,2 99,4 98,7 97,6 97,9 97,9 97,3 96,3 94,6 95,1 94,6 94,9 93,9 91,8 93,9 93,6 91,7 89,8 92,5 72,2 71,7 72 71 71,3 71,7 70,6 AJ829768 MAD96/1 99,5 99,2 99,4 98,7 97,6 97,9 97,9 97,3 96,3 94,6 95,1 94,6 94,9 93,9 91,8 93,9 93,6 91,7 89,8 92,5 72,2 71,7 72 71 71,3 71,7 70,6 100 X16386 I17F 99,5 99,2 99,4 98,7 97,6 97,9 97,9 97,3 96,3 94,6 95,1 94,6 94,9 93,9 91,8 93,9 93,6 91,7 89,8 92,5 72,2 71,7 72 71 71,3 71,7 70,6 100 100 AJ829776 MAD99/1 99,5 99,2 99,4 98,7 97,6 97,9 97,9 97,3 96,3 94,6 95,1 94,6 94,9 93,9 91,8 93,9 93,6 91,7 89,8 92,5 72,2 71,7 72 71 71,3 71,7 70,6 100 100 100 U43888 99,1 98,7 98,9 98,6 97,8 97,8 98,1 97,1 96,1 94,8 95,3 94,8 95,1 94,1 92 93,7 93,7 91,8 90 92,7 72,7 72,2 72,5 71 71,8 72,2 71,1 99,5 99,5 99,5 99,5 GQ340670 702-07 99,5 99,5 99,4 98,7 97,6 97,9 97,9 97,3 96,3 94,6 95,1 94,9 95,3 94,1 92 94,2 93,9 91,8 90,2 92,8 72,2 71,8 72 71 71,3 71,8 70,6 99,7 99,7 99,7 99,7 99,2 D10545 CMV-P6 99,2 98,9 98,7 98,4 96,9 97,6 97,6 96,9 95,9 94,6 94,7 94,6 94,9 93,6 91,6 94,2 93,9 91,1 90,2 92,5 71,5 71 71,3 70,3 70,6 71 69,9 99,1 99,1 99,1 99,1 98,6 99,1 PL-25-09 99,5 99,5 99,1 98,7 97,3 97,6 97,9 96,9 96,3 94,9 95,1 94,9 95,3 93,7 92 94,2 93,9 91,8 90,5 92,8 72 71,5 71,7 70,8 71 71,5 70,4 99,4 99,4 99,4 99,4 98,9 99,7 99,1 PL-52-09 99,5 99,2 99,7 99,1 97,3 97,6 97,9 96,9 96,6 95,3 95,1 94,6 94,9 93,6 92 93,9 93,6 91,1 89,8 92,1 71,8 71,3 71,5 70,6 70,8 71,3 70,1 99,4 99,4 99,4 99,4 98,9 99,4 99,1 99,4 PL-43-09 99,4 99,4 99,5 99,2 97,4 97,8 98,1 97,1 96,8 94,8 94,9 94,4 94,7 93,7 92,2 94,1 93,4 90,9 89,6 91,9 72,2 71,8 72 71 71,3 71,8 70,6 99,2 99,2 99,2 99,2 98,7 99,2 98,9 99,2 99,5 191 Prilog 14. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata CMV i izolata iz GenBank baze podataka uključenih u filogenetsko stablo A J5 8 5 5 1 7 2 0 7 H M 0 6 5 5 0 9 1 5 1 -0 8 H M 0 6 5 5 1 0 1 1 5 -0 8 D 1 0 5 4 4 C M V -F C M 9 8 5 0 0 P R 3 6 U 3 2 8 5 9 A J0 0 6 9 8 8 P 1 A B 0 0 4 7 8 0 K M D Q 0 1 8 2 8 6 C as A J0 0 6 9 9 0 R B A F 5 2 3 3 4 0 1 1 3 D 2 8 7 8 0 N T 9 Y 1 6 9 2 6 T fn D 4 2 0 7 9 C 7 -2 D 4 9 4 9 6 M 4 8 A F 1 2 7 9 7 7 K L 3 6 5 2 5 A B I X 8 9 6 5 2 p C P 2 5 U 3 1 2 2 0 O ah u U 2 0 2 1 9 Ix o ra M 2 1 4 6 4 F J6 2 1 4 9 5 S im p 2 A B 0 0 6 8 1 3 M 2 A F 0 6 3 6 1 0 S Z 1 2 8 1 8 K in A F 1 2 7 9 7 6 L S L 1 5 3 3 6 tr k 7 A J8 2 9 7 7 0 M A D 9 9 /4 A J8 2 9 7 6 8 M A D 9 6 /1 X 1 6 3 8 6 I1 7 F A J8 2 9 7 7 6 M A D 9 9 /1 U 4 3 8 8 8 B an G Q 3 4 0 6 7 0 7 0 2 -0 7 D 1 0 5 4 5 C M V -P 6 P L -2 5 -0 9 P L -5 2 -0 9 P L -4 3 -0 9 AJ585517 207 HM065509 151-08 100 HM065510 115-08 100 100 D10544 CMV-FC 99,5 99,5 99,5 M98500 PR36 99 99 99 98,5 U32859 99 99 99 98,5 99 AJ006988 P1 98,5 98,5 98,5 98,1 98,5 98,5 AB004780 KM 99 99 99 98,5 99 99 99,5 DQ018286 Cas 98,5 98,5 98,5 98,1 98,5 98,5 99 99,5 AJ006990 RB 98,1 98,1 98,1 97,6 97,1 97,1 96,6 97,1 96,6 AF523340 113 99 99 99 98,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 D28780 NT9 98,5 98,5 98,5 99 98,5 98,5 98,1 98,5 98,1 97,6 99,5 Y16926 Tfn 99 99 99 98,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 100 99,5 D42079 C7-2 97,6 97,6 97,6 97,1 97,6 97,6 97,1 97,6 97,1 96,6 98,5 98,1 98,5 D49496 M48 93,2 93,2 93,2 92,7 93,2 93,2 92,7 93,2 92,7 93,2 94,2 93,7 94,2 93,7 AF127977 K 98,1 98,1 98,1 97,6 98,1 98,1 97,6 98,1 97,6 98,1 99 98,5 99 98,5 95,1 L36525 ABI 96,6 96,6 96,6 96,1 96,6 96,6 96,1 96,6 96,1 96,6 97,6 97,1 97,6 98,1 93,7 98,5 X89652 pCP25 95,1 95,1 95,1 94,7 95,1 95,1 94,7 95,1 94,7 96,1 96,1 95,6 96,1 94,7 91,7 96,1 94,7 U31220 Oahu 93,2 93,2 93,2 92,7 93,2 93,2 93,2 93,2 92,7 94,2 94,2 93,7 94,2 92,7 89,3 94,2 92,7 92,2 U20219 Ixora 95,6 95,6 95,6 95,1 95,6 95,6 95,1 95,6 95,1 96,6 96,6 96,1 96,6 95,1 92,7 96,6 95,1 95,1 92,7 M21464 81,6 81,6 81,6 81,1 81,6 81,6 82 82,5 82,5 80,6 81,6 81,1 81,6 80,6 79,1 81,6 80,1 81,1 76,2 80,1 FJ621495 Simp2 81,6 81,6 81,6 81,1 81,6 81,6 82 82,5 82,5 80,6 81,6 81,1 81,6 80,6 79,1 81,6 80,1 81,1 76,2 80,1 100 AB006813 M2 81,6 81,6 81,6 81,1 81,6 81,6 82 82,5 82,5 80,6 81,6 81,1 81,6 80,6 79,1 81,6 80,1 81,1 76,2 80,1 100 100 AF063610 S 80,6 80,6 80,6 80,1 80,6 80,6 81,1 81,6 81,6 79,6 80,6 80,1 80,6 79,6 77,7 80,6 79,1 80,1 75,2 79,1 97,6 97,6 97,6 Z12818 Kin 81,6 81,6 81,6 81,1 81,6 81,6 82 82,5 82,5 80,6 81,6 81,1 81,6 80,6 79,1 81,6 80,1 81,1 76,2 80,1 99,5 99,5 99,5 97,1 AF127976 LS 81,6 81,6 81,6 81,1 81,6 81,6 82 82,5 82,5 80,6 81,6 81,1 81,6 80,6 79,1 81,6 80,1 81,1 76,2 80,1 100 100 100 97,6 99,5 L15336 trk7 79,6 79,6 79,6 79,1 79,6 79,6 80,1 80,6 80,6 78,6 79,6 79,1 79,6 78,6 77,2 79,6 78,2 79,1 75,2 78,2 97,6 97,6 97,6 95,1 97,1 97,6 AJ829770 MAD99/4 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 AJ829768 MAD96/1 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 X16386 I17F 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 100 AJ829776 MAD99/1 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 100 100 U43888 Ban 99,5 99,5 99,5 99 98,5 98,5 98,1 98,5 98,1 97,6 98,5 98,1 98,5 97,1 92,7 97,6 96,1 94,7 92,7 95,1 81,1 81,1 81,1 80,1 81,1 81,1 79,1 99,5 99,5 99,5 99,5 GQ340670 702-07 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 100 100 100 99,5 D10545 CMV-P6 99 99 99 99 98,1 98,1 97,6 98,1 97,6 97,1 98,1 98,1 98,1 96,6 92,2 97,1 95,6 94,2 92,2 94,7 80,6 80,6 80,6 79,6 80,6 80,6 78,6 99 99 99 99 98,5 99 PL-25-09 99,5 99,5 99,5 99 98,5 98,5 98,1 98,5 98,1 98,5 98,5 98,1 98,5 97,1 92,7 97,6 96,1 95,6 93,7 96,1 81,1 81,1 81,1 80,1 81,1 81,1 79,1 99,5 99,5 99,5 99,5 99 99,5 98,5 PL-52-09 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 100 100 100 99,5 100 99 99,5 PL-43-09 100 100 100 99,5 99 99 98,5 99 98,5 98,1 99 98,5 99 97,6 93,2 98,1 96,6 95,1 93,2 95,6 81,6 81,6 81,6 80,6 81,6 81,6 79,6 100 100 100 100 99,5 100 99 99,5 100 192 Prilog 15. Proračun stepena homologije gena za P1 protein izolata PVY i izolata iz GenBank baze podataka prikazanih u filogenetskom stablu A F 4 0 1 6 0 0 N 2 6 6 A F 4 0 1 6 0 1 N 3 9 4 A F 4 0 1 6 0 3 S I 5 0 A F 4 0 1 6 0 4 S l 6 4 A F 4 0 1 6 0 5 N 5 Y t A F 4 0 1 6 0 6 N 2 7 A F 4 0 1 6 0 7 N J g A F 4 0 1 6 0 8 T u 6 1 9 A F 4 0 1 6 0 9 T u 6 6 0 A F 4 0 1 6 1 0 T u 6 4 8 A J2 4 5 5 5 5 8 0 3 A J2 4 5 5 5 6 V ii k k i A F 2 4 8 4 9 9 N -N 2 4 2 X 9 7 8 9 5 6 0 5 A J3 1 5 7 3 9 S lo v en ia 1 A J3 1 5 7 4 4 C al if o rn ia A J3 1 5 7 4 6 R u si a A J3 1 5 7 4 5 C an ad a A J3 1 5 7 4 0 U k ra in e A J3 1 5 7 4 2 U S A A J3 1 5 7 4 3 S co tl an d A J8 9 0 3 4 4 D it ta A J8 9 0 3 4 8 A d g en A J4 3 9 5 4 5 L Y E 8 4 ,2 A J4 3 9 5 4 4 S O N 4 1 A J8 9 0 3 4 5 L in d a A J8 9 0 3 4 7 S at in a G Q 2 9 0 4 7 5 D 3 5 -0 6 G Q 2 9 0 4 7 6 D 7 -0 6 A Y 8 8 4 9 8 2 4 2 3 -3 E F 0 1 6 2 9 4 v 9 4 2 4 9 0 A J3 1 5 7 4 7 E n g li sh M 9 5 4 9 1 H u n g ar ia n P L -3 -1 0 P L -1 5 -0 9 P L -2 8 -0 9 AF401600 N266 FF401601 N394 100 AF401603 SI 50 92,2 92,2 AF401604 Sl 64 91,7 91,7 99,6 AF401605 N 5Yt 93,9 93,9 91,1 90,9 AF401606 N 27 99,4 99,4 91,9 91,4 93,9 AF401607 N Jg 99,4 99,4 91,8 91,4 93,6 99,2 AF401608 Tu 619 99 99 91,7 91,2 93,7 98,7 98,7 AF401609 Tu 660 99,6 99,6 92 91,5 94 99,3 99,3 99,4 AF401610 Tu 648 91,8 91,8 99,2 99 90,7 91,5 91,5 91,4 91,7 AJ245555 803 64,5 64,5 64,1 63,4 63,4 64,1 63,5 64,6 64,8 64,3 AJ245556 Viikki 65 65 64,9 64,1 63,9 64,6 64 65,1 65,3 65,1 98,5 AF248499 N-N242 91,2 91,2 98,9 98,7 90,1 90,9 90,9 90,7 91,1 98,6 63,2 64 X97895 605 91,5 91,5 99,2 99 90,4 91,2 91,2 91 91,4 98,9 62,6 63,4 98,9 AJ315739 Slovenia1 91,5 91,5 99,4 99,9 90,7 91,2 91,2 91 91,4 98,9 63,1 63,9 98,6 98,9 AJ315744 California 99,2 99,2 92,5 92 94,2 99,2 98,9 99 99,6 92,2 64,6 65,1 91,5 91,8 91,8 AJ315746 Rusia 98,5 98,5 92 91,5 93,4 98,5 98,2 98 98,6 91,7 65,1 65,6 91,1 91,4 91,4 99 AJ315745 Canada 62,9 62,9 64,6 63,9 64,4 62,5 61,9 63 63,3 64,7 94,2 94,4 63,7 63,6 63,6 64 64,6 AJ315740 Ukraine 64 64 64,4 63,7 63,9 63,6 63 63,9 64,3 64,5 95,1 95,3 64,5 63,9 63,4 64,1 64,6 94,2 AJ315742 USA 64,5 64,5 65,9 65,2 64,4 64,1 63,5 64,6 64,8 65,9 95,3 95,4 65,5 64,9 64,9 65,6 66,1 96,1 95,6 AJ315743 Scotland 64,1 64,1 64,6 63,8 65,4 63,5 64 64,8 64,8 64,4 79,1 80,1 63,7 63,6 63,6 65 64,8 80,3 78,7 80,3 AJ890344 Ditta 91,5 91,5 99,4 99,3 90,4 91,2 91,2 91,1 91,4 98,9 63,4 64,2 98,6 98,9 99,2 91,9 91,4 63,9 63,7 65,2 64,2 AJ890348 Adgen 63,7 63,7 64 63,2 65 63,2 63,6 64,5 64,4 63,8 79,4 80,4 63 62,9 62,9 63,6 62,8 79,8 79 79,4 97,9 63,5 AJ439545 LYE84,2 61,8 61,8 62,5 62,2 61,8 61,2 61,7 62,6 62,5 62,2 79,6 79,8 62 62,5 61,9 61,7 62 77,8 79 77,6 81,5 62,5 82,5 AJ439544 SON41 61,4 61,4 62,4 61,5 63,3 60,8 61,3 61,7 61,6 61,6 79,1 79,7 61,4 61,8 61,3 60,8 61 77,9 78,9 79,3 82,7 61,9 82,8 87,1 AJ890345 Linda 91 91 98,9 98,7 89,9 90,7 90,7 90,6 90,9 98,3 63,5 64,2 98 98,3 98,6 91,4 91,2 64 63,8 65,2 63,9 98,6 63,3 62,3 61,7 AJ890347 Satina 91,3 91,3 99,3 99,2 90,2 91 91 90,9 91,2 98,7 63,1 63,9 98,5 98,7 99 91,7 91,2 63,4 63,4 64,9 63,3 99,3 62,7 62,2 61,5 98,5 GQ290475 D35-06 91,7 91,7 99,6 100 90,9 91,4 91,4 91,2 91,5 99 63,4 64,1 98,7 99 99,9 92 91,5 63,9 63,7 65,2 63,8 99,3 63,2 62,2 61,5 98,7 99,2 GQ290476 D7-06 91,5 91,5 99,4 99,9 90,7 91,2 91,2 91,1 91,4 98,9 63,1 63,9 98,6 98,9 99,7 91,9 91,4 63,7 63,5 64,9 63,9 99,2 63,3 62 61,3 98,6 99 99,9 AY884982 423-3 91,8 91,8 99,4 99,3 91,1 91,5 91,5 91,4 91,7 98,9 63,6 64,4 98,6 98,9 99,2 92,2 91,7 64,1 63,9 65,4 64,6 99,4 63,7 62,5 61,8 98,6 99,3 99,3 99,2 EF016294 v942490 91,8 91,8 99,4 99,9 91,1 91,5 91,5 91,4 91,7 98,9 63,1 63,9 98,6 98,9 99,7 92,2 91,7 63,6 63,9 64,9 63,6 99,2 62,9 62,5 61,3 98,6 99 99,9 99,7 99,2 AJ315747 English 99,4 99,4 92,5 92 94,2 99,2 99,2 99 99,6 92,2 64 64,6 91,5 91,8 91,8 99,7 99 63,5 63,6 65,1 65 91,9 63,6 61,7 61,3 91,4 91,7 92 91,9 92,2 92,2 M95491 Hungarian 90,7 90,7 98,5 98,9 90,9 90,4 90,4 90,2 90,6 97,9 62,4 63,2 97,6 97,9 98,7 91,1 90,6 62,9 62,7 64,2 63,7 98,5 62,5 61,5 61,4 97,6 98,3 98,9 98,7 98,5 98,7 91,1 PL-3-10 91,2 91,2 98,9 99,3 90,1 90,9 90,9 90,7 91 98,3 62,6 63,4 98 98,3 99,2 91,5 91 63,6 62,9 64,4 63,1 98,6 62,4 61,9 60,7 98 98,5 99,3 99,2 98,6 99,2 91,5 98,2 PL-15-09 91,7 91,7 99,6 100 90,9 91,4 91,4 91,2 91,5 99 63,4 64,1 98,7 99 99,9 92 91,5 63,9 63,7 65,2 63,8 99,3 63,2 62,2 61,5 98,7 99,2 100 99,9 99,3 99,9 92 98,9 99,3 PL-28-09 91,5 91,5 99,4 99,9 90,7 91,2 91,2 91 91,4 98,9 63,1 63,9 98,6 98,9 99,7 91,8 91,4 63,6 63,4 64,9 63,6 99,2 62,9 61,9 61,3 98,6 99 99,9 99,7 99,2 99,7 91,8 98,7 99,2 99,9 193 Prilog 16. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence gena za P1 protein izolata PVY i izolata iz GenBank baze podataka uključenih u filogenetsko stablo. A F 4 0 1 6 0 0 N 2 6 6 A F 4 0 1 6 0 1 N 3 9 4 A F 4 0 1 6 0 3 S I_ 5 0 A F 4 0 1 6 0 4 S l_ 6 4 A F 4 0 1 6 0 5 N _ 5 Y t A F 4 0 1 6 0 6 N _ 2 7 A F 4 0 1 6 0 7 N _ Jg A F 4 0 1 6 0 8 T u _ 6 1 9 A F 4 0 1 6 0 9 T u _ 6 6 0 A F 4 0 1 6 1 0 T u _ 6 4 8 A J2 4 5 5 5 5 8 0 3 A J2 4 5 5 5 6 V ii k k i A F 2 4 8 4 9 9 P V Y N -N 2 4 2 X 9 7 8 9 5 6 0 5 A J3 1 5 7 3 9 S lo v en ia 1 A J3 1 5 7 4 4 C al if o rn i A J3 1 5 7 4 6 R u si a A J3 1 5 7 4 5 C an ad a A J3 1 5 7 4 0 U k ra in e A J3 1 5 7 4 2 U S A A J3 1 5 7 4 3 S co tl an d A J8 9 0 3 4 4 D it ta A J8 9 0 3 4 8 A d g en A J4 3 9 5 4 5 L Y E 8 4 .2 A J4 3 9 5 4 4 S O N 4 1 A J8 9 0 3 4 5 L in d a A J8 9 0 3 4 7 S at in a G Q 2 9 0 4 7 5 D 3 5 -0 6 G Q 2 9 0 4 7 6 D 7 -0 6 A Y 8 8 4 9 8 2 4 2 3 -3 E F 0 1 6 2 9 4 v 9 4 2 4 9 0 A J3 1 5 7 4 7 E n g li sh M 9 5 4 9 1 H u n g ar ia n P L -3 -1 0 P L -1 5 -0 9 P L -2 8 -0 9 P L -1 0 8 -1 0 AF401600 N266 AF401601 N394 100 AF401603 SI_50 83,9 83,9 AF401604 Sl_64 83,4 83,4 99,5 AF401605 N_5Yt 86,8 86,8 83,4 83,9 AF401606 N_27 99,5 99,5 83,4 82,9 87,3 AF401607 N_Jg 99 99 83,4 82,9 86,8 99,5 AF401608 Tu_619 97,6 97,6 83,4 82,9 87,3 98 97,6 AF401609 Tu_660 98,5 98,5 83,4 82,9 87,3 99 98,5 99 AF401610 Tu_648 83,9 83,9 99 98,5 83,4 83,4 83,4 83,4 83,4 AJ245555 803 54,1 54,1 52,7 52,2 51,2 53,7 53,2 54,1 54,6 53,2 AJ245556 Viikki 54,6 54,6 53,2 52,7 52,2 54,1 53,7 55,1 55,1 53,7 97,1 AF248499 N-N242 82,4 82,4 97,1 96,6 82,4 82 82 82 82 97,1 51,7 52,2 X97895 605 82,4 82,4 97,6 97,1 82 82 82 82 82 97,6 50,7 51,2 96,6 AJ315739 Slovenia1 82,9 82,9 99 99,5 83,4 82,4 82,4 82,4 82,4 98 51,7 52,2 96,1 96,6 AJ315744 Californi 98 98 83,9 83,4 87,8 98,5 98 98,5 99,5 83,9 54,1 54,6 82,4 82,4 82,9 AJ315746 Rusia 96,6 96,6 83,4 82,9 86,3 97,1 96,6 96,1 97,1 83,4 54,1 54,6 82 82 82,4 97,6 AJ315745 Canada 53,2 53,2 54,6 54,1 54,6 52,7 52,2 53,2 53,7 54,6 90,2 90,2 54,6 53,7 53,7 53,7 53,7 AJ315740 Ukraine 53,2 53,2 53,7 53,2 52,2 52,7 52,2 53,2 53,7 53,7 91,2 91,2 53,7 53,7 52,7 53,2 53,2 91,2 AJ315742 USA 53,2 53,2 54,6 54,1 53,2 52,7 52,2 53,2 53,7 54,6 92,7 92,7 54,6 53,7 53,7 54,1 54,1 93,2 93,7 AJ315743 Scotland 54,1 54,1 53,7 53,2 56,6 54,6 54,1 55,1 55,1 53,2 67,8 69,3 53,7 52,7 53,2 55,6 55,6 70,2 69,8 69,3 AJ890344 Ditta 83,4 83,4 99,5 99 82,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 98,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 AJ890348 Adgen 54,1 54,1 53,2 52,7 55,6 54,6 54,1 55,1 55,1 52,7 67,3 68,8 53,2 52,2 52,7 54,6 54,6 69,3 69,3 67,8 96,6 52,7 AJ439545 LYE84.2 53,2 53,2 54,1 53,7 51,7 53,7 54,1 53,7 53,7 53,2 67,8 67,3 53,7 53,7 53,7 53,2 53,7 66,3 68,8 67,3 72,2 53,7 72,2 AJ439544 SON41 50,7 50,7 51,7 51,2 52,7 51,2 51,7 51,2 51,2 50,7 65,4 65,9 51,2 51,2 50,7 50,7 50,2 65,9 67,3 67,8 73,2 51,2 72,7 78 AJ890345 Linda 82,9 82,9 99 98,5 82,4 82,4 82,4 82,4 82,4 98 52,7 53,2 96,1 96,6 98 82,9 82,4 54,6 53,7 54,6 54,1 98,5 53,7 54,6 52,2 AJ890347 Satina 82 82 98 97,6 81,5 81,5 81,5 81,5 81,5 97,1 51,7 52,2 95,1 95,6 97,1 82 81,5 53,2 52,2 53,7 51,7 98,5 51,2 53,2 50,7 97,1 GQ290475 D35-06 83,4 83,4 99,5 100 83,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 99,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 99 52,7 53,7 51,2 98,5 97,6 GQ290476 D7-06 82,9 82,9 99 99,5 83,4 82,4 82,4 82,4 82,4 98 51,7 52,2 96,1 96,6 99 82,9 82,4 53,7 52,7 53,7 53,2 98,5 52,7 53,2 50,7 98 97,1 99,5 AY884982 423-3 83,4 83,4 99,5 99 82,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 98,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 100 52,7 53,7 51,2 98,5 98,5 99 98,5 EF016294 v942490 83,4 83,4 99,5 100 83,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 99,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 99 52,7 53,7 51,2 98,5 97,6 100 99,5 99 AJ315747 English 98,5 98,5 84,4 83,9 88,3 99 98,5 98 99 84,4 53,7 54,1 82,9 82,9 83,4 99,5 98 53,2 52,7 53,7 55,6 83,9 54,6 53,2 50,7 83,4 82,4 83,9 83,4 83,9 83,9 M95491 Hungarian 81,5 81,5 96,1 96,6 84,4 81 81 81,5 81,5 95,1 52,2 52,7 94,1 93,7 96,1 82 81 54,1 53,2 54,1 53,2 96,6 51,7 52,7 51,7 95,1 95,1 96,6 96,1 96,6 96,6 82 PL-3-10 82,4 82,4 97,6 98 82 82 82 82 82 96,6 50,7 51,2 94,6 95,1 98 82,4 82 52,7 51,2 52,7 52,2 97,1 51,7 53,7 49,3 96,6 95,6 98 97,6 97,1 98 82,9 94,6 PL-15-09 83,4 83,4 99,5 100 83,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 99,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 99 52,7 53,7 51,2 98,5 97,6 100 99,5 99 100 83,9 96,6 98 PL-28-09 83,4 83,4 99,5 100 83,9 82,9 82,9 82,9 82,9 98,5 52,2 52,7 96,6 97,1 99,5 83,4 82,9 54,1 53,2 54,1 53,2 99 52,7 53,7 51,2 98,5 97,6 100 99,5 99 100 83,9 96,6 98 100 PL-108-10 82,9 82,9 99 99,5 83,4 82,4 82,4 82,4 82,4 98 51,7 52,2 96,1 96,6 99 82,9 82,4 53,7 52,7 53,7 52,7 98,5 52,2 53,2 50,7 98 97,1 99,5 99 98,5 99,5 83,4 96,1 97,6 99,5 99,5 194 Prilog 17. Proračun stepena homologije NC gena TSWV izolata i izolata iz GenBank baze podataka prikazanih u filogenetskom stablu G Q 3 5 5 4 6 7 3 3 -0 6 G Q 3 7 3 1 7 2 3 9 -0 6 G Q 3 7 3 1 7 3 5 3 -0 5 Z 3 6 8 8 2 T 3 0 4 A Y 8 4 8 9 2 2 T 9 9 2 A Y 7 4 4 4 8 0 S P A IN -2 A Y 7 4 4 4 7 9 S P A IN -1 X 9 4 5 5 0 L C A J4 1 8 7 9 D H 3 7 A J4 1 8 7 7 7 B S 9 7 A J4 1 8 7 7 8 1 0 H K 9 6 A J2 9 7 6 1 1 L E 9 8 /5 2 7 A F 0 2 0 6 6 0 T S W V -D A Y 7 4 4 4 7 6 N C -1 A Y 7 4 4 4 7 8 N C -3 A Y 7 4 4 4 7 7 N C -2 A F 0 2 0 6 5 9 T S W V -1 0 A J2 9 6 6 0 0 9 8 /0 4 7 2 E F 0 5 9 7 0 5 T S W V -G P A J2 9 6 5 9 9 C 2 7 0 8 4 A F 0 6 4 4 6 9 A C A F 0 6 4 4 7 2 M C A B 0 3 8 3 4 2 T o sp o -G A B 0 3 8 3 4 1 T o sp o -C A B 0 8 8 3 8 5 O rd in a ry _ st ra in A Y 7 4 4 4 6 8 C A -1 A Y 7 4 4 4 7 1 C A -4 L 2 0 9 5 3 T S W V -B L X 6 1 7 9 9 L D 0 0 6 4 5 B R P L -6 0 -0 9 P L -3 5 -0 9 P L -1 4 -1 0 GQ355467 33-06 GQ373172 39-06 99 GQ373173 53-05 100 99 Z36882 T304 97,2 96,9 97,2 AY848922 T992 99 98,4 99 97,2 AY744480 SPAIN-2 97,4 97,1 97,4 98,6 97,4 AY744479 SPAIN-1 97,4 97,4 97,4 98,6 97,4 99,7 X94550 LC 97,1 96,7 97,1 98,2 97,1 99,4 99,4 AJ41879 DH37 98,9 98,2 98,9 96,7 98,6 96,9 96,9 96,6 AJ418777 BS97 99,2 98,6 99,2 96,7 98,6 96,9 96,9 96,6 98,4 AJ418778 10HK96 98,4 97,7 98,4 96,2 97,7 96,1 96,1 95,7 97,6 97,9 AJ297611 LE98/527 99,2 98,6 99,2 97,4 99,5 97,6 97,6 97,2 98,7 98,7 97,9 AF020660 TSWV-D 99,5 98,9 99,5 97,4 99,5 97,6 97,6 97,2 99 99 98,2 99,7 AY744476 NC-1 99,5 98,9 99,5 97,4 99,5 97,6 97,6 97,2 99 99 98,2 99,7 100 AY744478 NC-3 99,2 98,6 99,2 97,4 99,2 97,2 97,2 96,9 98,7 99 97,9 99,4 99,7 99,7 AY744477 NC-2 96,7 96,4 96,7 97,9 97,1 97,7 97,7 97,4 96,2 96,2 95,7 96,9 96,9 96,9 96,9 AF020659 TSWV-10 95,5 95,5 95,5 97,1 95,9 96,9 97,2 96,6 95 95 94,2 95,7 95,7 95,7 95,7 98,2 AJ296600 98/0472 98,2 97,6 98,2 96,1 97,9 96,2 96,2 95,9 97,4 97,7 97,2 97,7 98,1 98,1 97,7 95,6 94,3 EF059705 TSWV-GP 98,6 98,2 98,6 97,1 98,9 96,9 97,2 96,6 98,1 98,1 97,2 99 99 99 98,7 96,2 95,4 97,1 AJ296599 C27084 99,5 98,9 99,5 97,4 99,5 97,6 97,6 97,2 99 99 98,2 99,7 100 100 99,7 96,9 95,7 98,1 99 AF064469 AC 96,7 96,4 96,7 97,9 97,1 97,7 97,7 97,4 96,2 96,2 95,7 96,9 96,9 96,9 96,9 99,7 98,2 95,6 96,2 96,9 AF064472 MC 96,7 96,7 96,7 97,9 97,1 97,7 98,1 97,4 96,2 96,2 95,4 96,9 96,9 96,9 96,9 99 98,9 95,2 96,6 96,9 99 AB038342 Tospo-G 97,4 97,1 97,4 96,7 97,4 96,9 96,9 96,6 96,9 96,9 96,1 97,2 97,6 97,6 97,2 96,6 95,4 96,2 96,6 97,6 96,6 96,2 AB038341 Tospo-C 97,4 97,1 97,4 96,7 97,4 96,9 96,9 96,6 96,9 96,9 96,1 97,2 97,6 97,6 97,2 96,2 95,4 96,2 96,6 97,6 96,2 96,2 99 AB088385 Ordinary_strain 97,6 97,2 97,6 96,7 97,2 96,7 96,7 96,4 96,7 97,1 96,3 97,1 97,4 97,4 97,1 96,1 95,2 96,4 96,4 97,4 96,1 96,1 98,9 99,2 AY744468 CA-1 97,4 97,1 97,4 98,6 97,7 98,7 98,7 98,4 96,9 96,9 96,1 97,6 97,6 97,6 97,2 98,4 97,6 96,2 96,9 97,6 98,4 98,4 97,2 97,2 97,1 AY744471 CA-4 97,6 97,2 97,6 98,4 97,6 98,6 98,6 98,2 97,1 97,1 96,2 97,4 97,7 97,7 97,4 98,2 97,4 96,4 96,7 97,7 98,2 98,2 97,4 97,4 97,2 99,8 L20953 TSWV-BL 97,2 96,9 97,2 98,4 97,6 98,6 98,6 98,2 96,7 96,7 95,9 97,4 97,4 97,4 97,1 97,9 97,1 96,1 96,7 97,4 97,9 97,9 97,1 97,4 96,9 98,9 98,7 X61799 L 97,7 97,4 97,7 98,9 98,1 99 99 98,7 97,2 97,6 96,4 97,9 97,9 97,9 97,9 98,4 97,6 96,6 97,2 97,9 98,4 98,4 97,6 97,6 97,4 99,4 99,2 99,2 D00645 BR 96,9 96,2 96,9 97,1 96,6 97,2 97,2 96,9 96,4 96,4 95,6 96,7 96,7 96,7 96,4 96,6 95,7 95,7 96,1 96,7 96,6 96,6 96,1 96,1 96,2 97,2 97,1 97,4 97,6 PL-60-09 99,8 99,2 99,8 97,4 99,2 97,6 97,6 97,2 99 99,4 98,6 99,4 99,7 99,7 99,4 96,9 95,7 98,4 98,7 99,7 96,9 96,9 97,6 97,6 97,7 97,6 97,7 97,4 97,9 97,1 PL-35-09 99,5 98,9 99,5 97,1 98,9 97,2 97,2 96,9 98,7 99 98,2 99 99,4 99,4 99 96,6 95,4 98,1 98,4 99,4 96,6 96,6 97,2 97,2 97,4 97,2 97,4 97,1 97,6 96,7 99,7 PL-14-10 99,5 98,9 99,5 97,1 98,9 97,2 97,2 96,9 98,7 99 98,2 99 99,4 99,4 99 96,6 95,4 98,1 98,4 99,4 96,6 96,6 97,2 97,2 97,4 97,2 97,4 97,1 97,6 96,7 99,7 99,7 195 Prilog 18. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence NC gena izolata TSWV i izolata iz GenBank baze podataka uključenih u filogenetsko stablo G Q 3 5 5 4 6 7 3 3 -0 6 G Q 3 7 3 1 7 2 3 9 -0 6 G Q 3 7 3 1 7 3 5 3 -0 5 Z 3 6 8 8 2 T 3 0 4 A Y 8 4 8 9 2 2 T 9 9 2 A Y 7 4 4 4 8 0 S p ai n -2 A Y 7 4 4 4 7 9 S p ai n -1 X 9 4 5 5 0 L C A J4 1 8 7 9 D H 3 7 A J4 1 8 7 7 7 B S 9 7 A J4 1 8 7 7 8 1 0 H K 9 6 A J2 9 7 6 1 1 L e9 8 /5 2 7 A F 0 2 0 6 6 0 T S W V -D A Y 7 4 4 4 7 6 N C -1 A Y 7 4 4 4 7 8 N C -3 A Y 7 4 4 4 7 7 N C -2 A F 0 2 0 6 5 9 T S W V -1 0 A J2 9 6 6 0 0 9 8 /0 4 7 2 E F 0 5 9 7 0 5 T S W V -G P A J2 9 6 5 9 9 C 2 7 0 8 4 A F 0 6 4 4 6 9 A C A F 0 6 4 4 7 2 M C A B 0 3 8 3 4 2 T o sp o -G A B 0 3 8 3 4 1 T o sp o -C A B 0 8 8 3 8 5 O rd in a ry _ st ra in A Y 7 4 4 4 6 8 C A -1 A Y 7 4 4 4 7 1 C A -4 L 2 0 9 5 3 T S W V -B L X 6 1 7 9 9 L D 0 0 6 4 5 B R P L -6 0 -0 9 P L -3 5 -0 9 P L -1 4 -1 0 GQ355467 33-06 GQ373172 39-06 96,8 100 GQ373173 53-05 100 96,8 Z36882 T304 91,4 90,3 91,4 AY848922 T992 97,8 95,7 97,8 91,9 AY744480 Spain-2 91,9 90,9 91,9 95,2 92,5 AY744479 Spain-1 91,9 91,9 91,9 95,2 92,5 98,9 X94550 LC 91,9 90,9 91,9 95,2 92,5 98,9 98,9 AJ41879 DH37 97,3 95,2 97,3 90,9 96,8 91,4 91,4 91,4 AJ418777 BS97 97,3 95,2 97,3 89,8 96,2 90,3 90,3 90,3 95,7 AJ418778 10HK96 97,3 95,2 97,3 90,9 96,2 90,3 90,3 90,3 95,7 95,7 AJ297611 Le98/527 97,8 95,7 97,8 91,9 98,9 92,5 92,5 92,5 96,8 96,2 96,2 AF020660 TSWV-D 98,9 96,8 98,9 91,9 98,9 92,5 92,5 92,5 97,8 97,3 97,3 98,9 AY744476 NC-1 98,9 96,8 98,9 91,9 98,9 92,5 92,5 92,5 97,8 97,3 97,3 98,9 100 AY744478 NC-3 97,8 95,7 97,8 91,9 97,8 91,4 91,4 91,4 96,8 97,3 96,2 97,8 98,9 98,9 AY744477 NC-2 91,9 90,9 91,9 95,2 92,5 94,6 94,6 94,6 91,4 90,3 90,3 92,5 92,5 92,5 92,5 AF020659 TSWV-10 88,7 88,7 88,7 93 89,2 92,5 93,5 92,5 88,2 87,1 87,1 89,2 89,2 89,2 89,2 95,7 AJ296600 98/0472 96,2 94,1 96,2 89,8 96,2 90,3 90,3 90,3 94,6 94,6 94,6 95,2 96,2 96,2 95,2 90,3 87,1 EF059705 TSWV-GP 96,2 95,2 96,2 91,4 97,3 90,9 91,9 90,9 95,2 94,6 94,6 97,3 97,3 97,3 96,2 90,9 88,7 93,5 AJ296599 C27084 98,9 96,8 98,9 91,9 98,9 92,5 92,5 92,5 97,8 97,3 97,3 98,9 100 100 98,9 92,5 89,2 96,2 97,3 AF064469 AC 91,9 90,9 91,9 95,2 92,5 94,6 94,6 94,6 91,4 90,3 90,3 92,5 92,5 92,5 92,5 98,9 95,7 90,3 90,9 92,5 AF064472 MC 91,4 91,4 91,4 94,6 91,9 94,1 95,2 94,1 90,9 89,8 89,8 91,9 91,9 91,9 91,9 97,3 97,3 88,7 91,4 91,9 97,3 AB038342 Tospo-G 93,5 92,5 93,5 91,4 93 91,9 91,9 91,9 93 91,9 91,9 93 94,1 94,1 93 91,9 88,7 91,9 91,4 94,1 91,9 90,3 AB038341 Tospo-C 94,1 93 94,1 91,9 93,5 92,5 92,5 92,5 93,5 92,5 92,5 93,5 94,6 94,6 93,5 91,4 89,2 92,5 91,9 94,6 91,4 90,9 97,3 AB088385 Ordinary_strain 94,1 93 94,1 91,4 93 91,4 91,4 91,4 92,5 92,5 92,5 93 94,1 94,1 93 90,3 88,2 92,5 91,4 94,1 90,3 89,8 96,2 97,8 AY744468 CA-1 93,5 92,5 93,5 96,8 94,1 97,3 97,3 97,3 93 91,9 91,9 94,1 94,1 94,1 93 96,2 94,1 91,9 92,5 94,1 96,2 95,7 93,5 94,1 93 AY744471 CA-4 94,1 93 94,1 96,2 93,5 96,8 96,8 96,8 93,5 92,5 92,5 93,5 94,6 94,6 93,5 95,7 93,5 92,5 91,9 94,6 95,7 95,2 94,1 94,6 93,5 99,5 L20953 TSWV-BL 91,9 90,9 91,9 95,2 92,5 95,7 95,7 95,7 91,9 90,3 90,3 92,5 92,5 92,5 91,4 94,6 92,5 90,3 90,9 92,5 94,6 94,1 91,9 93,5 91,4 97,3 96,8 X61799 L 93,5 92,5 93,5 96,8 94,1 97,3 97,3 97,3 93 93 91,9 94,1 94,1 94,1 94,1 96,2 94,1 91,9 92,5 94,1 96,2 95,7 93,5 94,1 93 98,9 98,4 97,3 D00645 BR 91,9 89,8 91,9 91,9 91,9 92,5 92,5 92,5 91,4 90,3 90,3 91,9 91,9 91,9 90,9 91,4 89,2 90,3 90,3 91,9 91,4 90,9 89,8 90,3 90,3 94,1 93,5 93,5 94,1 PL-60-09 99,5 97,3 99,5 91,9 98,4 92,5 92,5 92,5 97,8 97,8 97,8 98,4 99,5 99,5 98,4 92,5 89,2 96,8 96,8 99,5 92,5 91,9 94,1 94,6 94,6 94,1 94,6 92,5 94,1 92,5 PL-35-09 98,9 96,8 98,9 91,4 97,8 91,9 91,9 91,9 97,3 97,3 97,3 97,8 98,9 98,9 97,8 91,9 88,7 96,2 96,2 98,9 91,9 91,4 93,5 94,1 94,1 93,5 94,1 91,9 93,5 91,9 99,5 PL-14-10 98,4 96,2 98,4 90,9 97,3 91,4 91,4 91,4 96,8 96,8 96,8 97,3 98,4 98,4 97,3 91,4 88,2 95,7 95,7 98,4 91,4 90,9 93 93,5 93,5 93 93,5 91,4 93 91,4 98,9 99,5 196 Prilog 19. Proračun stepena homologije CP gena AMV izolata i izolata iz GenBank baze podataka prikazanih u filogenetskom stablu D Q 3 1 4 7 5 3 C a4 0 1 D Q 3 1 4 7 5 1 C a3 9 9 D Q 3 1 4 7 5 2 C a4 0 0 D Q 3 1 4 7 4 9 C a3 7 5 A J1 3 0 7 0 6 F -4 3 0 Y 0 9 1 1 0 D an za A F 3 3 2 9 9 8 N 2 0 K 0 2 7 0 3 4 2 5 _ M ed is A J1 3 0 7 0 7 C aa -1 A F 0 1 5 7 1 7 1 5 /6 4 D Q 3 1 4 7 5 4 C a5 0 8 D Q 3 1 4 7 5 0 C a1 7 5 A J1 3 0 7 0 4 1 2 6 A A J1 3 0 7 0 5 1 9 5 -A N A F 0 1 5 7 1 6 V R U A J1 3 0 7 0 8 D ac 1 6 A F 2 9 4 4 3 2 K R 1 X 0 0 8 1 9 S A F 2 9 4 4 3 3 K R 2 D Q 3 1 4 7 5 6 C a6 1 6 A J1 3 0 7 0 9 L y h -1 A J1 3 0 7 0 3 L y e- 8 0 L 0 0 1 6 2 4 2 5 _ L ei d e D Q 3 1 4 7 5 5 C a5 1 8 F J5 2 7 7 4 9 1 9 6 -0 8 A F 2 1 5 6 6 4 N Z 3 4 P L -2 -1 0 P -1 0 -1 0 P -2 7 -0 9 DQ314753 Ca401 DQ314751 Ca399 99,7 DQ314752 Ca400 99 99 DQ314749 Ca375 99 99 99,7 AJ130706 F-430 98,1 98,1 97,8 97,8 Y09110 Danza 97,4 97,4 97,4 97,4 97,6 AF332998 N20 97,5 97,5 97,8 97,8 97,3 98 K02703 425_Medis 97,4 97,4 97,8 97,8 97,3 99 98,3 AJ130707 Caa-1 94,6 94,6 94,8 95,2 95 95 95,3 94,6 AF015717 15/64 93,5 93,5 93,7 93,7 93,9 93,5 94,3 93,5 97,3 DQ314754 Ca508 98,3 98,3 98,6 98,6 98,1 97,1 97,1 97,1 94,4 93,3 DQ314750 Ca175 97,4 97,4 97,4 97,4 97,3 99,3 97,3 98,3 94,3 93,1 97,4 AJ130704 126A 97,3 97,3 96,9 96,9 98,1 96,8 96,4 96,8 94,4 93,5 97,3 96,4 AJ130705 195-AN 97,5 97,5 97,1 97,1 98,3 96,9 96,8 96,6 94,8 93,9 97,5 96,6 98,1 AF015716 VRU 94,6 94,6 94,8 95,2 95 94,2 95 94,6 98,3 98 94,4 93,9 94,4 94,8 AJ130708 Dac16 94,3 94,3 94,4 94,8 94,6 94,6 95 94,2 99,3 97,6 94,1 94,3 94,1 94,5 98,3 AF294432 KR1 96,4 96,4 96,8 96,8 96,2 97,6 96,2 98 93,5 92,8 96 97,3 95,7 95,5 93,5 93,5 X00819 S 97,1 97,1 97,4 97,4 96,6 97,6 97,3 98 93,9 93,1 96,4 97,3 95,7 95,9 93,9 93,9 96,2 AF294433 KR2 96,9 96,9 97,3 97,3 96,7 98,1 96,8 98,1 94,1 93,3 96,6 97,8 95,9 96,1 94,1 94,1 99,5 96,7 DQ314756 Ca616 98,3 98,3 98,6 98,6 98,1 97,1 97,1 97,1 94,4 93,3 100 97,4 97,3 97,5 94,4 94,1 96 96,4 96,6 AJ130709 Lyh-1 94,8 94,8 95 95,3 95,2 94,8 95,2 94,8 99,2 97,1 94,6 94,1 94,6 95 98,5 98,8 93,7 94,1 94,3 94,6 AJ130703 Lye-80 93,4 93,4 93,6 93,9 93,7 93 94,1 93,4 97,1 97,3 93,2 92,6 93,9 93,6 97,8 97,5 92,6 92,6 93,2 93,2 96,9 L00162 425_Leide 97,5 97,4 97,8 97,8 97,3 98 99,7 98,3 95,3 94,2 97,1 97,3 96,4 96,8 95 95 96,2 97,3 96,7 97,1 95,2 94,1 DQ314755 Ca518 98,3 98,3 98,7 99 97,8 97,4 97,8 97,8 95,2 93,7 97,6 96,7 96,9 97,1 95,2 94,8 96,4 97,4 96,9 97,6 95,3 93,9 97,8 FJ527749 196-08 98,3 98,3 98,3 98,3 98,1 98,1 98,1 98,1 95,2 94,1 97,6 97,4 97,3 97,5 95,2 94,8 96,7 97,4 97,3 97,6 95,3 93,9 98,1 98,3 AF215664 NZ34 97,5 97,5 97,8 97,8 97,3 98 100 98,3 95,3 94,3 97,1 97,3 96,4 96,8 95 95 96,2 97,3 96,8 97,1 95,2 94,1 99,7 97,8 98,1 PL-2-10 98,5 98,5 98,5 98,5 98,3 98,3 98,3 98,3 95 94,2 97,8 97,6 97,5 97,6 95,3 95 96,9 97,6 97,4 97,8 95,2 94,1 98,3 98,5 99,5 98,3 P-10-10 98,5 98,5 98,5 98,5 98,3 98,3 98,3 98,3 95 93,9 97,8 97,6 97,5 97,6 95 94,6 96,9 97,6 97,4 97,8 95,2 93,7 98,3 98,5 99,5 98,3 99,7 P-27-09 98,1 98,1 98,1 98,1 98,3 98 97,6 98 95,3 94,6 97,8 97,3 97,5 97,6 95,7 95,3 96,9 97,3 97,4 97,8 95,5 94,5 97,6 98,1 98,8 97,6 99,3 99 197 Prilog 20. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata AMV i izolata iz GenBank baze podataka uključenih u filogenetsko stablo D Q 3 1 4 7 5 3 C a4 0 1 D Q 3 1 4 7 5 1 C a3 9 9 D Q 3 1 4 7 5 2 C a4 0 0 D Q 3 1 4 7 4 9 C a3 7 5 A J1 3 0 7 0 6 F -4 3 0 Y 0 9 1 1 0 D an za A F 3 3 2 9 9 8 N 2 0 K 0 2 7 0 3 4 2 5 _ M ed is o n A J1 3 0 7 0 7 C aa -1 A F 0 1 5 7 1 7 1 5 /6 4 D Q 3 1 4 7 5 4 C a5 0 8 D Q 3 1 4 7 5 0 C a1 7 5 A J1 3 0 7 0 4 1 2 6 A A J1 3 0 7 0 5 1 9 5 -A N A F 0 1 5 7 1 6 V R U A J1 3 0 7 0 8 D ac 1 6 A F 2 9 4 4 3 2 K R 1 X 0 0 8 1 9 S A F 2 9 4 4 3 3 K R 2 D Q 3 1 4 7 5 6 C a6 1 6 A J1 3 0 7 0 9 L y h -1 A J1 3 0 7 0 3 L y e- 8 0 L 0 0 1 6 2 4 2 5 _ L ei d en D Q 3 1 4 7 5 5 C a5 1 8 F J5 2 7 7 4 9 1 9 6 -0 8 A F 2 1 5 6 6 4 N Z 3 4 P L -2 -1 0 P -1 0 -1 0 P -2 7 -0 9 DQ314753 Ca401 DQ314751 Ca399 99 DQ314752 Ca400 99 99 DQ314749 Ca375 99 99 100 AJ130706 F-430 97,5 97,5 97,5 97,5 Y09110 Danza 97,5 97,5 97,5 97,5 99 AF332998 N20 95 95 96 96 95,5 96,5 K02703 425_Medison 97 97 98 98 97,5 98,5 97 AJ130707 Caa-1 93 93 94 94 93,5 93,5 94,5 93,5 AF015717 15/64 93,5 93,5 94,5 94,5 93,5 93,5 95 94 98,5 DQ314754 Ca508 98 98 99 99 97,5 97,5 95 97 93,5 93,5 DQ314750 Ca175 98,5 98,5 98,5 98,5 98 99 95,5 97,5 93 93 98,5 AJ130704 126A 94,5 94,5 94,5 94,5 96 96,5 93 96 91,5 91,5 94,5 95,5 AJ130705 195-AN 95,5 95,5 95,5 95,5 97 97 94 95,5 93,5 93 95,5 96 96 AF015716 VRU 94 94 95 95 94 94 94,5 94,5 98 98,5 94 93,5 92 93,5 AJ130708 Dac16 93,5 93,5 94,5 94,5 94 94 95 94 99,5 99 94 93,5 92 93,5 98,5 AF294432 KR1 96 96 96 96 96,5 97,5 95 98 91,5 92 95 96,5 95 94,5 92,5 92 X00819 S 97,5 97,5 98,5 98,5 98 98 97 98,5 94,5 95 97,5 97 95 96 95 95 96,5 AF294433 KR2 97,5 97,5 97,5 97,5 98 99 96,5 98,5 93 93,5 96,5 98 95,5 96 94 93,5 98,5 98 DQ314756 Ca616 98 98 99 99 97,5 97,5 95 97 93,5 93,5 100 98,5 94,5 95,5 94 94 95 97,5 96,5 AJ130709 Lyh-1 94 94 95 95 94,5 94,5 94,5 94,5 99 98,5 94,5 94 92,5 94 99 99,5 92,5 95 94 94,5 AJ130703 Lye-80 92 92 93 93 92 92 93,5 92,5 96 96,5 92 91,5 92 91,5 96 96,5 90,5 93,5 92 92 96 L00162 425_Leiden 95,5 95,5 96,5 96,5 96 97 99,5 97,5 95 95,5 95,5 96 93,5 94,5 95 95,5 95,5 97,5 97 95,5 95 94 DQ314755 Ca518 97,5 97,5 98,5 98,5 98 98 96,5 98,5 94 94,5 97,5 97 95 96 95 94,5 96,5 99 98 97,5 95 93 97 FJ527749 196-08 98,5 98,5 98,5 98,5 99 99 96,5 98,5 94 94,5 97,5 98 96 97 95 94,5 97,5 99 99 97,5 95 93 97 99 AF215664 NZ34 95 95 96 96 95,5 96,5 100 97 94,5 95 95 95,5 93 94 94,5 95 95 97 96,5 95 94,5 93,5 99,5 96,5 96,5 PL-2-10 98,5 98,5 98,5 98,5 99 99 96,5 98,5 94 94,5 97,5 98 96 97 95 94,5 97,5 99 99 97,5 95 93 97 99 100 96,5 P-10-10 98,5 98,5 98,5 98,5 99 99 96,5 98,5 94 94,5 97,5 98 96 97 95 94,5 97,5 99 99 97,5 95 93 97 99 100 96,5 100 P-27-09 98,5 98,5 98,5 98,5 99 99 96,5 98,5 94 94,5 97,5 98 96 97 95 94,5 97,5 99 99 97,5 95 93 97 99 100 96,5 100 100 198 Prilog 21. Proračun stepena homologije CP gena PMMoV izolata i izolata iz GenBank baze podataka prikazanih u filogenetskom stablu A B 2 5 4 8 2 1 Iw A B 2 7 6 0 3 0 L 4 B V A B 0 8 4 4 5 6 P A B 1 2 6 0 0 3 K R A F 1 0 3 7 7 6 P O A B 0 6 2 0 4 9 G e1 A B 0 6 2 0 5 1 G e5 A B 0 6 2 0 5 0 G e4 A B 5 5 0 9 1 1 D F 0 1 A Y 8 5 9 4 9 7 C N M 8 7 8 2 7 T ai w an A B 0 6 2 0 5 2 O H M 8 1 4 1 3 S A B 0 6 2 0 5 4 N a A J3 0 8 2 2 8 S P -I a X 7 2 5 8 7 It al ia n A B 0 6 2 0 5 3 T o sa X 7 0 8 8 3 T M V A F 4 1 1 9 2 2 T o M V A B 0 0 0 7 0 9 JP -J F N 5 9 4 8 8 9 P 8 6 /1 0 F N 5 9 4 8 7 0 P 0 2 /2 F N 5 9 4 8 6 9 P 8 5 /2 9 A Y 6 3 2 8 6 3 A J4 2 9 0 8 8 P M M V 1 .2 F R 6 7 1 3 9 2 P 9 8 /1 5 A M 4 1 1 4 3 3 L in sB R 0 8 A B 1 1 9 4 8 2 P e1 F N 5 9 4 8 8 1 P 8 9 /4 .2 F R 6 7 1 3 9 3 P 9 9 /2 3 F N 5 9 4 8 5 3 P 8 3 /4 F R 6 7 1 3 8 8 P 9 6 /4 4 H Q 6 9 9 0 7 9 P M M o V -B D P -5 7 -0 9 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 AB254821 Iw AB276030 L4BV 98,7 AB084456 P 99,6 99,1 AB126003 KR 99,6 99,1 100 AF103776 PO 98,1 97,2 98,1 98,1 AB062049 Ge1 98,7 98,3 98,7 98,7 97,2 AB062051 Ge5 98,5 98,1 98,5 98,5 97 99,8 AB062050 Ge4 98,5 98,1 98,5 98,5 97 99,8 99,6 AB550911 DF01 98,1 97,2 98,1 98,1 97 97,6 97,4 97,4 AY859497 CN 97 96,5 97,4 97,4 95,9 96,5 96,3 96,3 98,9 M87827 Taiwan 97,4 97 97,9 97,9 96,3 97 96,8 96,8 99,4 99,1 AB062052 OH 97,4 97 97,9 97,9 96,3 97 96,8 96,8 99,4 98,7 99,1 M81413 S 97,6 97,2 98,1 98,1 96,5 97,2 97 97 99,6 98,9 99,4 99,4 AB062054 Na 97,6 97,2 98,1 98,1 96,5 97,2 97 97 99,6 98,9 99,4 99,4 99,6 AJ308228 SP-Ia 93,8 92,9 93,8 93,8 92,2 93,3 93,1 93,1 94,5 93,6 93,8 93,8 94,1 94,1 X72587 Italian 94 93,1 94,1 94,1 92,4 93,6 93,3 93,3 94,5 93,6 93,8 93,8 94,1 94,1 98,5 AB062053 Tosa 94 93,1 94,1 94,1 92,4 93,6 93,3 93,3 94,5 93,6 93,8 93,8 94,1 94,1 98,5 100 X70883 TMV 51,5 52 52,3 52,3 51 51,5 51 51,6 51,6 52,1 52 51,6 51,6 51,5 51,6 52,3 52,3 AF411922 ToMV 54,4 52,8 54,5 54,5 53,1 54,3 53,8 54,3 54,2 54,3 54,2 53,5 54,2 53,4 56,4 55,8 55,8 71 AB000709 JP-J 97,9 97,4 98,3 98,3 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 99,1 99,6 99,6 99,8 99,8 94,3 94,3 94,3 52 53,8 FN594889 P86/10 97,9 97,4 98,3 98,3 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 99,1 99,6 99,6 99,8 99,8 94,3 94,3 94,3 52 53,8 100 FN594870 P02/2 97,9 97 97,9 97,9 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 98,7 99,2 99,1 99,4 99,4 94,3 94,3 94,3 51,2 54,6 99,6 99,6 FN594869 P85/29 97,9 97 97,9 97,9 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 98,7 99,2 99,1 99,4 99,4 94,3 94,3 94,3 51,2 53,8 99,6 99,6 99,6 AY632863 99,8 98,9 99,8 99,8 98,3 98,9 98,7 98,7 98,3 97,2 97,6 97,6 97,9 97,9 94 94,3 94,3 52 54,8 98,1 98,1 98,1 98,1 AJ429088 PMMV1.2 99,6 98,7 99,6 99,6 98,1 98,7 98,5 98,5 98,1 97 97,4 97,4 97,6 98,1 93,8 94 94 51,5 54,4 97,9 97,9 97,9 97,9 99,8 FR671392 P98/15 99,2 98,3 99,2 99,2 97,6 98,3 98,1 98,1 98,1 97 97,4 97,4 97,6 97,6 94,3 95 95 52 55,2 97,9 97,9 97,9 97,9 99,4 99,2 AM411433 LinsBR08 99,8 98,9 99,8 99,8 98,3 98,9 98,7 98,7 98,3 97,2 97,6 97,6 97,9 97,9 94 94,3 94,3 52 54,8 98,1 98,1 98,1 98,1 100 99,8 99,4 AB119482 Pe1 99,4 98,5 99,4 99,4 97,9 98,5 98,3 98,3 97,9 96,8 97,2 97,2 97,4 97,4 93,6 93,8 93,8 52,8 54,8 97,6 97,6 97,6 97,6 99,6 99,4 98,9 99,6 FN594881 P89/4.2 98,1 97,2 98,1 98,1 97 97,6 97,4 97,4 100 98,9 99,4 99,4 99,6 99,6 94,5 94,5 94,5 51,6 54,2 99,8 99,8 99,8 99,8 98,3 98,1 98,1 98,3 97,9 FR671393 P99/23 97,9 97 97,9 97,9 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 98,7 99,1 99,1 99,4 99,4 94,3 94,3 94,3 52,1 54,6 99,6 99,6 99,6 99,6 98,1 97,9 97,9 98,1 97,6 99,8 FN594853 P83/4 98,1 97,2 98,1 98,1 97 97,6 97,4 97,4 100 98,9 99,4 99,4 99,6 99,6 94,5 94,5 94,5 51,6 54,2 99,8 99,8 99,8 99,8 98,3 98,1 98,1 98,3 97,9 100 99,8 FR671388 P96/44 97,9 97 97,9 97,9 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 98,7 99,2 99,1 99,4 99,4 94,5 94,5 94,5 51,6 54,2 99,6 99,6 99,6 99,6 98,1 97,9 97,9 98,1 97,6 99,8 99,6 99,8 HQ699079 PMMoV-BD 97,9 97,4 98,3 98,3 96,8 97,4 97,2 97,2 99,8 99,1 99,6 99,6 99,8 99,8 94,3 94,3 94,3 52 53,8 100 100 99,6 99,6 98,1 97,9 97,9 98,1 97,6 99,8 99,6 99,8 99,6 P-57-09 99,6 98,7 99,6 99,6 98,1 98,7 98,5 98,5 98,1 97 97,4 97,4 97,6 97,6 93,8 94 94 52,4 55,3 97,9 97,9 97,9 97,9 99,8 99,6 99,2 99,8 99,4 98,1 97,9 98,1 97,9 97,9 P-60-09 99,6 98,7 99,6 99,6 98,1 98,7 98,5 98,5 98,1 97 97,4 97,4 97,6 97,6 93,8 94,1 94,1 51,6 54,8 97,9 97,9 97,9 97,9 99,8 99,6 99,2 99,8 99,4 98,1 97,9 98,1 97,9 97,9 99,6 P-3-10 99,6 98,7 99,6 99,6 98,1 98,7 98,5 98,5 98,1 97 97,4 97,4 97,6 97,6 93,8 94 94 52,4 55,3 97,9 97,9 97,9 97,9 99,8 99,6 99,2 99,8 99,4 98,1 97,9 98,1 97,9 97,9 100 99,6 199 Prilog 22. Proračun stepena homologije aminokiselinske sekvence CP gena izolata PMMoV i izolata iz GenBank baze podataka uključenih u filogenetsko stablo A B 2 5 4 8 2 1 Iw A B 2 7 6 0 3 0 L 4 B V A B 0 8 4 4 5 6 P A B 1 2 6 0 0 3 K R A F 1 0 3 7 7 6 P O A B 0 6 2 0 4 9 G e1 A B 0 6 2 0 5 G e5 A B 0 6 2 0 5 0 G e4 A B 5 5 0 9 1 1 D F 0 1 A Y 8 5 9 4 9 7 C N M 8 7 8 2 7 T ai w an A B 0 6 2 0 5 2 O H M 8 1 4 1 3 S A B 0 6 2 0 5 4 N a A J3 0 8 2 2 8 S P -I a X 7 2 5 8 7 It al ia n A B 0 6 2 0 5 3 T o sa X 7 0 8 8 3 T M V A F 4 1 1 9 2 2 T o M V A B 0 0 0 7 0 JP -J F N 5 9 4 8 8 9 P 8 6 /1 0 F N 5 9 4 8 7 0 P 0 2 /2 F N 5 9 4 8 6 9 P 8 5 /2 9 A Y 6 3 2 8 6 3 A J4 2 9 0 8 8 P M M V 1 .2 F R 6 7 1 3 9 2 P 9 8 /1 5 A M 4 1 1 4 3 3 L in sB R 0 8 A B 1 1 9 4 8 2 P e1 F N 5 9 4 8 8 1 P 8 9 /4 .2 F R 6 7 1 3 9 3 P 9 9 /2 3 F N 5 9 4 8 5 3 P 8 3 /4 F R 6 7 1 3 8 8 P 9 6 /4 4 H Q 6 9 9 0 7 9 P M M o V -B D P -5 7 -0 9 P -6 0 -0 9 P -3 -1 0 AB254821 Iw AB276030 L4BV 98,7 AB084456 P 100 98,7 AB126003 KR 100 98,7 100 AF103776 PO 96,8 95,5 96,8 96,8 AB062049 Ge1 98,7 97,5 98,7 98,7 95,5 AB062051 Ge5 98,1 96,8 98,1 98,1 94,9 99,4 AB062050 Ge4 98,1 96,8 98,1 98,1 94,9 99,4 98,7 AB550911 DF01 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 AY859497 CN 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 M87827 Taiwan 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 AB062052 OH 98,7 97,5 98,7 98,7 95,5 97,5 96,8 96,8 98,7 98,7 98,7 M81413 S 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 AB062054 Na 99,4 98,1 99,4 99,4 96,2 98,1 97,5 97,5 99,4 99,4 99,4 98,1 99,4 AJ308228 SP-Ia 96,8 95,5 96,8 96,8 94,3 95,5 94,9 94,9 96,8 96,8 96,8 95,5 96,8 96,2 X72587 Italian 98,1 96,8 98,1 98,1 94,9 96,8 96,2 96,2 98,1 98,1 98,1 96,8 98,1 97,5 98,7 AB062053 Tosa 98,1 96,8 98,1 98,1 94,9 96,8 96,2 96,2 98,1 98,1 98,1 96,8 98,1 97,5 98,7 100 X70883 TMV 70,1 70,1 70,1 70,1 68,8 70,1 69,4 70,1 70,1 70,1 70,1 70,1 70,1 70,1 70,1 70,7 70,7 AF411922 ToMV 72,6 71,3 72,6 72,6 70,1 72 71,3 72 72,6 72,6 72,6 72,6 72,6 72,6 72 73,2 73,2 82,2 AB000709 JP-J 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 FN594889 P86/10 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 FN594870 P02/2 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 FN594869 P85/29 99,4 98,1 99,4 99,4 96,2 98,1 97,5 97,5 99,4 99,4 99,4 98,1 99,4 98,7 96,2 97,5 97,5 69,4 72 99,4 99,4 99,4 AY632863 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 AJ429088 PMMV1.2 99,4 98,1 99,4 99,4 96,2 98,1 97,5 97,5 99,4 99,4 99,4 98,1 99,4 100 96,2 97,5 97,5 70,1 72,6 99,4 99,4 99,4 98,7 99,4 FR671392 P98/15 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 AM411433 LinsBR08 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 AB119482 Pe1 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 FN594881 P89/4.2 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 FR671393 P99/23 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 FN594853 P83/4 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 FR671388 P96/44 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 100 HQ699079 PMMoV-BD 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 100 100 P-57-09 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 100 100 100 P-60-09 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 P-3-10 100 98,7 100 100 96,8 98,7 98,1 98,1 100 100 100 98,7 100 99,4 96,8 98,1 98,1 70,1 72,6 100 100 100 99,4 100 99,4 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 200 BIOGRAFIJA Dragana N. Milošević je roĎena 18.12.1980. godine u Novom Sadu. Školske 1999/2000. godine upisala je Poljoprivredni fakultet u Novom Sadu, odsek za zaštitu bilja, koji je završila 2004. godine sa prosečnom ocenom 9.42. Diplomski rad pod nazivom "Uloga gajenih biljaka u procesu fitoremedijacije " odbranila je ocenom 10 čime je dobila diplomu o stečenom visokom obrazovanju i stručnim nazivom diplomirani inţenjer poljoprivrede. Poslediplomske studije upisala je školske 2005/2006. godine na predmetu Fitopatologija, na Institutu za zaštitu bilja, Poljoprivrednog fakulteta u Novom Sadu, a magistarski rad pod nazivom: „Rasprostranjenost virusa pasulja u Vojvodini”, odbranila je 2008. godine. Iste godine izabrana je u zvanje istraţivača saradnika. Od 2005. godine zaposlena je u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo u Laboratoriji za ispitivanje semena kao saradnik na ispitivanju zdravstvene ispravnosti semena. Do sada je učestvovala je na dva Tehnološka projekta Ministarstva nauke Republike Srbije, na projektu Pokrajinskog sekretarijata za nauku i tehnološki razvoj, kao i na dva Inovaciona projekta Ministarstva nauke Srbije. Trenutno je angaţovana na dva projekta Ministarstva nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije: « Razvoj novih sorti i poboljšanje tehnologija proizvodnje uljanih biljnih vrsta za različite namene» i « Stvaranje sorata i hibrida povrća za gajenje na otvorenom polju i zaštićenom prostoru» čiji je rezultat doktorska disertacija. Bila je učesnik nekoliko meĎunarodnih i domaćih skupova, a kao autor i koautor objavila je 55 naučnih i stručnih radova koji su objavljeni u vodećim nacionalnim časopisima i prezentovani na meĎunarodnim i domaćim skupovima. 201 Izjava o autorstvu Potpisani-a ______________Dragana Milošević___________ broj indeksa ______________________________________ Izjavljujem da je doktorska disertacija pod naslovom Diverzitet i karakterizacija virusa paprike u Srbiji rezultat sopstvenog istraţivačkog rada, da predloţena disertacija u celini ni u delovima nije bila predloţena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visokoškolskih ustanova, da su rezultati korektno navedeni i da nisam kršio/la autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranda U Beogradu, _19.03.2013. godine_ 202 Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Ime i prezime autora _________Dragana Milošević________________ Broj indeksa _______________________________________________ Studijski program _____Poljoprivredne nauke____________________ Naslov rada Diverzitet i karakterizacija virusa paprike u Srbiji____ Mentor __prof. dr Branka Krstić, redovni profesor_________________ Potpisani/a _________ Dragana Milošević__________________ Izjavljujem da je štampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao što su ime i prezime, godina i mesto roĎenja i datum odbrane rada. Ovi lični podaci mogu se objaviti na mreţnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. Potpis doktoranda U Beogradu, __19.03.2013. godine___ 203 Izjava o korišćenju Ovlašćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: Diverzitet i karakterizacija virusa paprike u Srbiji koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji poštuju odredbe sadrţane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio/la. 1. Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno 3. Autorstvo – nekomercijalno – bez prerade 4. Autorstvo – nekomercijalno – deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo – bez prerade 6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima (Molimo da zaokruţite samo jednu od šest ponuĎenih licenci, kratak opis licenci dat je na poleĎini lista). Potpis doktoranda U Beogradu, _19.03.2013. godine_