UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Jovana G. Hrustić, dipl. inž. Karakterizacija vrsta roda Моnilinia patogena koštičavih voćaka u Srbiji i osetljivost na fungicide Doktorska disertacija BEOGRAD, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Jovana G. Hrustić, BSc. Characterization of Моnilinia species pathogens of stone fruits in Serbia and sensitivity to fungicides Doctoral Dissertation BELGRADE, 2013 Poljoprivredni fakultet – Beograd Mentor: dr Aleksandra Bulajić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet Drugi mentor: dr Brankica Tanović, naučni saradnik Institut za pesticide i zaštitu životne sredine, Beograd Članovi komisije: dr Goran Delibašić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet dr Branka Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet dr Ivana Stanković, docent Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet Datum odbrane: Ova doktorska disertacija urađena je u Institutu za pesticide i zaštitu životne sredine u Zemunu. Posebnu zahvalnost dugujem dr Brankici Tanović koja me je uvela u naučnoistraživački rad, koja je kao mentor rukovodila izradom doktorske disertacije i pružila mi neizmernu stručnu pomoć, znanje i iskustvo. Najlepše hvala mentoru prof. dr Aleksandri Bulajić na dragocenoj pomoći, podršci i korisnim savetima prilikom izrade ove doktorske disertacije. Zahvaljujem prof. dr Goranu Delibašiću na izuzetnom angažovanju i usmeravanju tokom izrade rada. Veoma sam zahvalna članovima komisije, prof. dr Branki Krstić i dr Ivani Stanković, na stručnoj pomoći, korisnim savetima i primedbama. Na nesebičnoj pomoći i uloženom trudu zahvaljujem prof. dr Mihailu Nikoliću (Poljoprivredni fakultet, Beograd), dr Slavici Gašić (Institut za pesticide i zaštitu životne sredine, Beograd), dr Andrea Patocchi i dr Maya Jänsch (Agroscope Changins-Wädenswil Research Station, Wädenswil, Švajcarska). Zahvaljujem svim kolegama iz Instituta na pomoći i razumevanju, posebno kolegama iz Laboratorije za primenjenu fitopatologiju. Naročitu zahvalnost želim da izrazim Milici Mihajlović i Mili Grahovac, vernim saradnicama čija su pomoć i podrška značajno doprinele stvaranju ove disertacije. Hvala mojoj porodici i prijateljima na podršci, strpljenju i razumevanju. KARAKTERIZACIJA VRSTA RODA Моnilinia PATOGENA KOŠTIČAVIH VOĆAKA U SRBIJI I OSETLJIVOST NA FUNGICIDE REZIME Prikupljanje obolelih delova koštičavih voćaka sa simptomima sušenja cvetova, grana i grančica i mrke truleži plodova, koje prouzrokuju vrste roda Monilinia, obavljeno je tokom trogodišnjeg perioda od 2010. do 2012. godine. Pregledom 119 lokaliteta iz 15 okruga u Srbiji, prikupljen je 321 uzorak obolelih biljnih delova kako iz komercijalnih zasada, tako i iz okućnica i sa zelenih pijaca. Dobijeno je ukupno 246 monosporijalnih izolata sa morfološkim odlikama vrsta roda Monilinia. Sa ciljem utvrđivanja rasprostranjenosti vrsta roda Monilinia i rasvetljavanja etiologije oboljenja u našoj zemlji, izvršena je identifikacija dobijenih izolata do nivoa vrste na osnovu patogenih, morfoloških, odgajivačkih i ekoloških karakteristika, sa jedne strane, i molekularnih karakteristika, sa druge strane. Na osnovu svih proučenih karakteristika utvrđeno je prisustvo tri različite vrste: M. laxa, M. fructigena i M. fructicola. Dominantan prouzrokovač mrke truleži plodova i sušenja cvetova, grana i grančica koštičavih voćaka u Srbiji je M. laxa (prisutna u 96,34% uzoraka), dok je zastupljenost ostalih vrsta ovog roda znatno manja – M. fructigena (2,44% uzoraka) i M. fructicola (1,22% uzoraka). Po prvi put u Srbiji, detektovano je prisustvo M. fructicola, patogena sa IA dela I Liste karantinskih štetnih organizama, na koštičavim voćkama u našoj zemlji. Analiza SSR markera pokazala je da izolati M. fructicola iz Srbije pripadaju haplotipu iz Italije, što ukazuje na mogući put introdukcije ovog karantinskog patogena u Srbiju. Tri vrste roda Monilinia mogu se jasno razdvojiti na osnovu kompleksa morfoloških karaktera koji obuhvata: izgled, oblik i boju kolonije, prisustvo spora i koncentričnog prstena spora u kulturi, brzinu porasta micelije, kao i veličinu konidija, načina klijanja konidija i dužinu kličine cevčice pre prvog grananja. Međutim, za pouzdanu i brzu detekciju može se preporučiti Multiplex PCR metoda koja je prilagođena i uspešno primenjena za specifično dokazivanje prisustva Monilinia spp. na koštičavim voćkama u Srbiji. Osetljivost izolata vrsta roda Monilinia na prohloraz, tebukonazol, iprodion, hlorotalonil, azoksistrobin, boskalid i fluopiram ispitana je metodom inhibicije porasta micelije. Ustanovljeno je da su izolati sve tri vrste najosetljiviji na prohloraz i tebukonazol, a visoka osetljivost utvrđena je i na iprodion, hlorotalonil i azoksistrobin. Sa druge strane, uočena je jasna razlika između vrsta roda Monilinia u osetljivosti na boskalid i fluopiram. U in vitro ispitivanjima efekta gasovite faze 56 etarskih ulja na izolate Monilinia spp. sedam etarskih ulja (pet ulja origana, ulje timijana i limunove trave) potpuno je inhibiralo porast micelije izolata sve tri testirane vrste. Sa druge strane, ispitivanja in vitro efekta formulisanih etarskih ulja origana i timijana pokazala su da formulisana ulja ispoljavaju bolji efekat u odnosu na komercijalno dostupan preparat ulja čajnog drveta i podjednako dobar efekat inhibicije porasta micelije u poređenju sa standardnim fungicidom iprodionom. Rezultati ispitivanja uticaja različitih sojeva Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. u in vitro i in vivo uslovima pokazuju da B. subtilis soj N146 ispoljava najjači antagonizam. Procesom formulacije poboljšane su osobine soja N146, a dobijene formulacije bile su efikasnije od sirove suspenzije B. subtilis. Ispitivanja efekata razvijenih formulacija na Monilinia spp. u in vitro i in vivo uslovima potvrdila su visok potencijal ovih biopreparata za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Ključne reči: Monilinia laxa, Monilinia fructigena, Monilinia fructicola, morfološke osobine, testovi patogenosti, filogenetske analize, SSR markeri, fungicidi, etarska ulja, Bacillus subtilis Naučna oblast: Biotehničke nauke Uža naučna oblast: Fitopatologija UDK: 632.952:634.57(497.11)(043.3) CHARACTERIZATION OF Моnilinia SPECIES PATHOGENS OF STONE FRUITS IN SERBIA AND SENSITIVITY TO FUNGICIDES ABSTRACT The diseased plant parts of stone fruits expressing symptoms of blossom, branch and twig blight and fruit brown rot, caused by the species from the genus Monilinia, were collected during a three-year period (from 2010 to 2012). Screening of 119 localities within 15 districts in Serbia was completed; 321 samples of diseased plant parts from commercial orchards, as well as from house yards and green markets, were collected. In total, 246 monosporial isolates with morphological characteristics resembling to those of Monilinia spp. were obtained. These isolates were identified at the species level based on their pathogenic, morphological, cultural and ecological characteristics; however, identification based on their molecular characteristics was also performed. This two-level identification was conducted in order to determine the distribution of the Monilinia species in Serbia and to clarify etiology of the disease they cause. According to their characteristics, the presence of three different species was determined: M. laxa, M. fructigena and M. fructicola. The dominant causal agent of fruit brown rot and blossom, branch and twig blight of stone fruits in Serbia was M. laxa (it was present in 96.34% samples) while the presence of M. fructigena (2.44% samples) and M. fructicola (1.22% samples) was smaller. It was the first time in Serbia that M. fructicola, a pathogen from IA part of the List I of quarantine pest organisms on stone fruit species in our country, was registered. Moreover, the analysis of SSR markers showed that M. fructicola isolates originating from Serbia belonged to the same haplotype as the isolates originating from Italy, which indicated a possible path of introduction of this species to Serbia. Three species of Monilinia genus could be clearly distinguished on the basis of the complexity of morphological characters (colony appearance, shape and colour, presence of spores and concentric ring of spores in a culture, mycelial growth rate, conidia size, mode of conidia germination and length of germ tube). However, Multiplex PCR method adjasted and successfully applied for specific attestation of presence of Monilinia spp. on stone fruit species in Serbia, can be recommended for reliable and rapid detection. Sensitivity of Monilinia species to prochloraz, tebuconazole, iprodione, chlorothalonil, azoxystrobine, boscalid and fluopyram was tested using mycelial growth inhibition method. It was found that isolates of all three tested species were the most sensitive to prochloraz and tebuconazole, but high sensitivity was also recorded for iprodione, chlorothalonil and azoxystrobine. On the other hand, clear differences among three Monilinia species in sensitivity to boscalid and fluopyram were observed. In in vitro studies of effects of the volatile phase of essential oils on Monilinia spp. isolates, showed that 7 out of 56 tested essential oils (5 oregano oils, thyme and lemon grass oil) completely inhibited mycelial growth of isolates of all three tested species. On the other hand, in vitro assays of effects of formulated oregano and thyme essential oils showed that formulated oils were more efficient than the commercially available product based on tea tree oil, and that they were equally efficient as standard fungicide iprodione. The results of studying the effects of different strains of Bacillus subtilis on Monilinia spp. isolates in vitro and in vivo showed that B. subtilis strain N146 exhibited the strongest antagonism. The formulation process of the raw suspension of B. subtilis strain N146 further improved its characteristics and the obtained formulated product proved to be more efficient than the raw suspension of B. subtilis. Investigations of the developed formulation on Monilinia spp. in both in vitro and in vivo assays confirmed high potential of this product in Monilinia spp. control. Keywords: Monilinia laxa, Monilinia fructigena, Monilinia fructicola, morphological characteristics, pathogenicity tests, phylogenic analyses, SSR markers, fungicides, essential oils, Bacillus subtilis Scientific field: Biotechnical Science Scientific discipline: Phytopathology UDC: 632.952:634.57(497.11)(043.3) Sadržaj SADRŽAJ 1. UVOD 1 2. PREGLED LITERATURE 3 2.1. Privredni značaj i botanička klasifikacija koštičavih voćaka 3 2.2. Privredni značaj koštičavih voćaka u Srbiji 3 2.3. Monilinia spp. prouzrokovač sušenja cvetova, grana i grančica i mrke truleži plodova koštičavih voćaka 4 2.4. Geografska distribucija i ekonomski značaj vrsta roda Monilinia 6 2.5. Simptomi oboljenja 8 2.6. Ciklus razvoja patogena 10 2.7. Identifikacija vrsta roda Monilinia 13 2.8. Mogućnosti suzbijanja vrsta roda Monilinia 17 2.8.1. Stvaranje otpornih sorti 18 2.8.2. Agrotehničke mere 18 2.8.3. Fizičke mere 20 2.8.4. Biološke mere 21 2.8.5. Hemijsko suzbijanje 24 2.9. Osobine najčešće korišćenih fungicida za suzbijanje Monilinia spp. 28 2.9.1. Benzimidazoli 28 2.9.2. Dikarboksimidi 29 2.9.3. Imidazoli i triazoli 30 2.9.4. Strobilurini 32 2.9.5. Pirimidil-etil-benzamidi 34 2.9.6. Karboksamidi 34 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA 36 4. MATERIJAL I METODE 37 4.1. Sakupljanje uzoraka obolelih biljaka 37 4.2. Izolacija patogena 37 4.3. Dobijanje čistih kultura monosporijalnih izolata i njihovo čuvanje 38 4.4. Provera patogenosti izolata 38 4.5. Identifikacija patogena 39 4.6. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. 41 4.7. Praćenje brzine rasta izolata Monilinia spp. 42 4.8. Odgajivačke karakteristike izolata Monilinia spp. 42 4.9. Ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. 43 4.10. Testovi unakrsne patogenosti 44 4.11. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija 45 4.11.1. Molekularna detekcija i identifikacija 45 4.11.2. Priprema izolata 45 4.11.3. Izolacija DNK 46 4.11.4. Molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije 46 4.11.5. Molekularna detekcija na osnovu amplifikacije ITS regiona 47 Sadržaj 4.11.6. Vizualizacija i analiza produkata PCR reakcije 47 4.11.7. Prečišćavanje PCR produkta i sekvencioniranje 48 4.11.8. Molekularna identifikacija i karakterizacija 49 4.11.9. SSR marker analiza izolata Monilinia fructicola poreklom iz Srbije 50 4.12. Utvrđivanje nivoa osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide 52 4.12.1. Ispitivanje osetljivosti izolata na azoksistrobin u prisustvu salicilhidroksamične kiseline (SHAM) 53 4.13. Određivanje minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije fungicida na izolate Monilinia spp. 54 4.14. Utvrđivanje antifungalnog uticaja etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 55 4.14.1. In vitro efekat gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 55 4.14.2. Određivanje minimalnog perioda ekspozicije 56 4.14.3. Proces formulacije etarskih ulja origana i timijana 56 4.14.4. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. 56 4.14.5. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. 57 4.15. Utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 57 4.15.1. Pripremanje sojeva Bacillus subtilis 57 4.15.2. Pripremanje izolata Monilinia spp. 58 4.15.3. In vitro utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 58 4.15.4. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 58 4.15.5. Razvoj formulacije preparata na bazi Bacillus subtilis 59 4.15.6. Ispitivanje efekata formulacija Bacillus subtilis na Monilinia spp. in vitro 60 4.15.7. Ispitivanje efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo 60 4.16. Statistička obrada podataka 61 5. REZULTATI 62 5.1. Simptomi oboljenja 62 5.2. Izolacija patogena i dobijanje monosporijalnih izolata 64 5.3. Provera patogenosti 66 5.4. Izolati Monilinia spp. 69 5.5. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. 69 5.6. Praćenje brzine rasta izolata Monilinia spp. 74 5.7. Odgajivačke karakteristike izolata Monilinia spp. 75 5.8. Ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. 82 5.9. Unakrsna patogenost izolata Monilinia spp. 90 5.10. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija 94 5.10.1. Molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije 94 5.10.2. Molekularna detekcija na osnovu amplifikacije ITS regiona 95 5.10.3. Molekularna identifikacija 96 5.10.4. Molekularna karakterizacija 98 Sadržaj 5.10.5. SSR marker analiza izolata Monilinia fructicola poreklom iz Srbije 101 5.11. Utvrđivanje nivoa osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide 101 5.12. Određivanje minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije fungicida na izolate Monilinia spp. 108 5.13. Utvrđivanje antifungalnog uticaja etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 109 5.13.1. In vitro efekat gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 109 5.13.2. Određivanje minimalnog perioda ekspozicije 111 5.13.3. Proces formulacije etarskih ulja origana i timijana 111 5.13.4. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. 112 5.13.5. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. 113 5.14. Utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 115 5.14.1. In vitro utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 115 5.14.2. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 116 5.14.3. Ispitivanje efekata formulacija Bacillus subtilis na Monilinia spp. in vitro 119 5.14.4. Ispitivanje efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo 121 6. DISKUSIJA 124 6.1. Monilinia spp. – geografska distribucija i značaj patogena 124 6.2. Identifikacija patogena primenom konvencionalnih metoda 126 6.2.1. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. 127 6.2.2. Odgajivačke i ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. 129 6.2.3. Patogene karakteristike izolata Monilinia spp. 130 6.2.4. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija 131 6.3. Rasprostranjenost vrsta roda Monilinia u Srbiji 134 6.4. Osetljivost izolata Monilinia spp. na fungicide 134 6.5. Biološke mere borbe 137 6.5.1. Antifungalni efekat etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 138 6.5.2. Uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 139 7. ZAKLJUČAK 141 8. LITERATURA 145 BIOGRAFIJA IZJAVE Uvod 1 1. UVOD Koštičave voćke apsolutno dominiraju u ukupnoj voćarskoj proizvodnji u Srbiji, kako po broju stabala, tako i po količini proizvedenih plodova. Međutim, proizvodnju koštičavih voćaka ugrožava veliki broj patogena među kojima se posebno ističu vrste roda Monilinia, široko rasprostranjene u svim voćarskim regionima sveta. Tri vrste roda Monilinia, u godinama sa povoljnim uslovima za njihov razvoj, mogu u potpunosti da unište prinos (Ogawa et al., 1995; Hong et al., 1997; Balaž, 2000; Larena et al., 2005). Mada su vrste ovog roda kao paraziti koštičavih voćaka intenzivno proučavane u mnogim delovima sveta, o njihovoj raširenosti, interspecijskoj i intraspecijskoj varijabilnosti u Srbiji nema dovoljno informacija. Oskudni su i podaci o njihovoj osetljivosti na najznačajnije grupe fungicida, kao i o mogućnostima biološke, odnosno ekološki prihvatljivije zaštite koštičavih voćaka. Ekonomski najznačajnija i najrasprostranjenija vrsta roda Monilinia na koštičavim voćkama u Evropi je M. laxa (Byrde and Willetts, 1977). Međutim, od 2001. godine, kada je M. fructicola po prvi put dospela na evropski kontinent (EPPO, 2002), došlo je do značajnih promena u strukturi populacije i diverzitetu vrsta roda Monilinia na koštičavim voćkama u mnogim zemljama Evrope (Muñoz et al., 2008; Petróczy et al., 2012; Villarino et al., 2012; Poniatowska et al., 2013). U našoj zemlji na koštičavim voćkama prisutne su dve vrste roda Monilinia – M. laxa i M. fructigena (Stojanović i Kostić, 1957), dok je M. fructicola, patogen sa IA dela I Liste karantinskih štetnih organizama, tek nedavno detektovana kako na plodovima koštičavih (Hrustić et al., 2013), tako i na plodovima jabučastih voćaka (Vasić et al., 2012). Ipak, kakav je međuodnos ovih vrsta na pojedinim domaćinima u Srbiji za sada nije poznato. Dobro poznavanje svih činilaca koji direktno ili indirektno utiču na razvoj oboljenja predstavlja neophodan preduslov za uspeh u sprečavanju šteta koje prouzrokuju Monilinia spp. Primena adekvatnih agrotehničkih mera trebalo bi da omogući izbegavanje napada i stvaranje nepovoljnih uslova za razvoj oboljenja. Međutim, uspeh zaštite u najvećoj meri zavisi od pravovremene primene fungicida koji treba da obezbede adekvatnu zaštitu, visok prinos i kvalitetan plod. U praksi se protiv Monilinia spp. koriste fungicidi visokog rizika za razvoj rezistentnosti, a vrste ovog Uvod 2 roda svrstane su u kategoriju patogena sa umerenim rizikom (FRAC, 2005). S obzirom da je primena fungicida najvažaniji deo programa zaštite koštičavih voćaka od vrsta roda Monilinia, poznavanje osetljivosti patogena na fungicide pruža neophodne informacije o očekivanoj efikasnosti fungicida. Sa druge strane, pooštreni kriterijumi bezbednosti hrane nameću potrebu za racionalizacijom upotrebe pesticida kao i za primenom supstanci prirodnog porekla kao zamene ili dopune konvencionalnim pesticidima (Russell, 2005). U našoj zemlji ima malo podataka o upotrebi mikroorganizama i supstanci prirodnog porekla u zaštiti koštičavih voćaka od Monilinia spp. Pregled literature 3 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Privredni značaj i botanička klasifikacija koštičavih voćaka Koštičave vrste voćaka predstavljaju značajnu grupu voćarskih kultura koje se gaje više od 5000 godina. Najznačajnije vrste ove grupe pripadaju rodu Prunus i to su: šljiva (P. domestica), višnja (P. cerasus), trešnja (P. avium), breskva (P. persica), nektarina (P. persica var. nectarina) i kajsija (P. armeniaca). Postojbina ovih vrsta je Kina i centralna Azija, osim šljive koja vodi poreklo iz Evrope (Veličković, 2002). Sve vrste koštičavih voćaka imaju veliki značaj pre svega u ishrani ljudi kao stono voće, ali se veliki deo plodova i preraĎuje. Od ukupne količine proizvedenih plodova 30% utroši se u svežem stanju ili kao zamrznuto, dok se oko 70% preradi u slatko, marmeladu, džem, kompot, žele, sok, liker i rakiju (Veličković, 2002). Tokom poslednjih desetak godina proizvodnja koštičavog voća ima tendenciju porasta sa 27,64 miliona tona proizvedenih 2000. godine na 40,21 milion tona proizvedenih 2011. godine (FAOSTAT, 2011). Najveći udeo u proizvodnji koštičavog voća ima breskva koja u ukupnoj svetskoj proizvodnji zauzima osmo mesto. Prema podacima FAOSTAT (2011) u svetu je u 2011. godini proizvedeno 21,52 miliona tona. Najveći proizvoĎač je Kina, a za njom slede Italija, Španija, SAD, Grčka, Turska, Iran, Egipat, Čile, Francuska itd. Srbija se na ovoj listi nalazi na 26. mestu, sa ukupnom proizvodnjom od 75.233 t. Šljiva je sledeća vrsta po ukupnom udelu u proizvodnji koštičavog voća sa proizvodnjom od 11,35 miliona tona tokom 2011. godine (FAOSTAT, 2011). Vodeći proizvoĎač šljive u svetu je Kina, zatim slede SAD i Srbija koja je vodeći proizvoĎač u Evropi sa ukupnom proizvodnjom od 581.874 t tokom 2011. godine. Kajsija, trešnja i višnja imaju manji udeo u ukupnoj proizvodnji koštičavog voća – 3,83; 2,24 i 1,27 miliona tona tokom 2011. godine (FAOSTAT, 2011), dok su najveći proizvoĎači Turska, Iran i Italija. 2.2. Privredni značaj koštičavih voćaka u Srbiji Voćarska proizvodnja predstavlja značajnu poljoprivrednu granu u našoj zemlji koja na relativno malom prostoru, na pet miliona ha poljoprivrednog zemljišta ima oko Pregled literature 4 250.000 ha voćnjaka sa približno 86 miliona rodnih stabala (Lukač Bulatović, 2005). Zahvaljujući povoljnim agroekološkim uslovima za gajenje svih kontinentalnih vrsta voćaka u Srbiji postoji vekovima duga tradicija proizvodnje i prerade voća i interesovanje poljoprivrednika za bavljenje voćarstvom (Nikolić i sar., 2012). U ukupnoj voćarskoj proizvodnji u Srbiji, koštičave vrste voćaka apsolutno dominiraju kako po broju stabala tako i količini proizvedenih plodova (Nikolić i sar., 2012). Šljiva je najvažnija voćka ove grupe koja prema ukupnom broju stabala i prosečnoj godišnjoj proizvodnji plodova već duži niz godina zauzima vodeće mesto i predstavlja jedan od najznačajnijih izvoznih artikala. Učešće šljive u strukturi voćarskih zasada u Srbiji iznosi 61,76% (Lukač Bulatović, 2005), a po ukupnoj godišnjoj proizvodnji koja u poslednjih pet godina premašuje 500.000 t, naša zemlja zauzima treće mesto u svetu i prvo mesto u Evropi (FAOSTAT, 2011). Druga najvažnija voćka ove grupe je višnja sa značajnom zastupljenošću u ukupnoj proizvodnji od 7,64%, zatim sledi breskva (4,76%), dok je zastupljenost ostalih vrsta, kajsije i trešnje, ispod 3,36% (Lukač Bulatović, 2005). 2.3. Monilinia spp. prouzrokovač sušenja cvetova, grana i grančica i mrke truleži plodova koštičavih voćaka Parazitne gljive iz roda Monilinia dobro su poznati biljni patogeni, rasprostranjeni širom sveta i predstavljaju jedan od ekonomski najvažnijih faktora koji ugrožavaju voćarsku proizvodnju širom sveta. Kao paraziti koštičavih voćaka, ekonomski značajne su tri vrste ovog roda: M. laxa, M. fructigena i M. fructicola (Ogawa et al., 1995). U Evropi su predmet proučavanja više od 200 godina, od 1796. godine, kada su prvi put uočeni simptomi na plodovima kruške, šljive i breskve koje je prouzrokovala vrsta M. fructigena (Byrde and Willets, 1977). Nešto kasnije (1818. godine) u Evropi je zabeleženo prisustvo druge vrste roda Monilinia - M. laxa, dok je vrsta M. fructicola na evropskom prostoru prvi put pronaĎena 2001. godine u Francuskoj (EPPO, 2002). Pisani podaci o prisustvu M. fructicola u SAD potiču iz 1881. godine (Byrde and Willets, 1977). Ove tri vrste roda Monilinia sposobne su da ostvare zarazu velikog broja gajenih biljaka. MeĎutim, štete i gubici nastaju pre svega na vrstama koje pripadaju familiji Pregled literature 5 Rosaceae, na jabuci, krušci, dunji, trešnji, višnji, šljivi, kajsiji, breskvi, nektarini i bademu, na kojima prouzrokuju različite simptome – sušenje cvetova, grančica i grana, kao i trulež plodova (Byrde and Willets, 1977). Ipak, odreĎeni nivo specijalizacije prema domaćinu postoji: M. fructigena uglavnom je patogen plodova jabučastih voćaka, M. fructicola najčešće je patogen plodova koštičavih voćaka – breskve, nektarine, šljive i kajsije, a M. laxa je patogen cvetova i grančica uglavnom koštičavih voćaka (Batra, 1991). Monilinia laxa (Aderhold and Ruhland) Honey jedan je od ekonomski najznačajnijih prouzrokovača sušenja cvetova, grana i grančica koštičavih voćaka (Holb, 2006). Sušenje cvetova predstavlja karakterističan simptom ove bolesti koja se javlja u zasadima trešnje, višnje, šljive, breskve, nektarine, kajsije i badema, ali može biti detektovana i na jabučastim voćkama (Holb, 2008; Muñoz et al., 2008). Iako najznačajnije štete prouzrokuje na cvetovima i grančicama, velike štete mogu nastati i na plodovima, naročito tokom perioda skladištenja (Holb, 2006). Na sušenje cvetova najosetljivija je kajsija, a zatim slede trešnja, breskva, višnja i šljiva (Holb, 2008). Sa druge strane, značajnija oštećenja na plodovima nego na granama i cvetovima patogen prouzrokuje na trešnji (Holb, 2006). Monilinia fructigena (Aderh. & Ruhland) Honey ex Whetzel najpoznatija je i ekonomski najznačajnija vrsta roda Monilinia na jabuci i krušci u Evropi (Jones and Aldwinckle, 1990) i primarno prouzrokuje trulež plodova, pre i tokom skladištenja, dok se infekcije cvetova, grančica i grana retko javljaju (CABI, 2004). Iako najznačajnija oštećenja prouzrokuje na jabučastim voćkama, M. fructigena može zaraziti i koštičave vrste voćaka, meĎu kojima je šljiva najosetljivija (Byrde and Willetts, 1977; CABI, 2004). Kod nas detektovana je i na bobicama nekih sorti vinove loze (Stojanović i Kostić, 1958). Monilinia fructicola (Winter) Honey prouzrokuje veoma ozbiljne štete naročito na koštičavim vrstama voćaka, kako tokom vegetacije, tako i tokom perioda transporta, skladištenja i prodaje. Smatra se da je M. fructicola najdestruktivnija vrsta ovog roda (Carstens et al., 2010). Češće napada biljne vrste podfamilije Prunoideae nego Pomoideae (Holb, 2008), a najčešće se sreće na breskvama i nektarinama (Wilson and Ogawa, 1979). Uglavnom se javlja na plodovima, ali može prouzrokovati štete i na drugim delovima biljke, čak i na listovima i granama (EPPO, 2009). Pregled literature 6 2.4. Geografska distribucija i ekonomski značaj vrsta roda Monilinia Prisustvo sve tri vrste roda Monilinia detektovano je samo u centralnoj i istočnoj Aziji, odakle vode poreklo i glavni domaćini ovih patogena - vrste roda Prunus, Malus i Pyrus (EPPO, 2000), dok se areal rasprostranjenja Monilinia spp. u drugim delovima sveta veoma razlikuje. M. fructigena rasprostranjena je u celoj Evropi, Aziji (Bliski i Daleki Istok, Indija), Severnoj Africi i nekim delovima Južne Amerike (Batra, 1991). U SAD i Australiji M. fructigena nalazi se na listi karantinskih štetnih organizama (EPPO, 2009). Sa druge strane, M. laxa detektovana je u svim voćarskim regionima širom sveta (De Cal and Melgarejo, 1999; EPPO, 2000). M. fructicola široko je rasprostranjena i ekonomski značajna u mnogim zemljama Azije (Japan od 1976. godine; Kina od 2003. godine), severne, centralne i južne Amerike (Kalifornija od 1936. godine; Kanada od 1976. godine; Gvatemala od 1976. godine; Argentina, Bolivija, Brazil, Peru i Venecuela od 1976. godine; Meksiko od 1999 godine; Panama od 1999. godine; Ekvator, Paragvaj i Urugvaj od 1999. godine), kao i u Australiji i Novom Zelandu (od 1976. godine) i Južnoj Africi (Zimbabve od 1981. godine) (EPPO, 2006). Sa druge strane, ova vrsta nalazi se na A2 EPPO listi karantinskih štetnih organizama (http://www.eppo.org/ QUARANTINE/quarantine.htm), regulisano Aneksom IV, Deo A, Sekcija I Direktiva 2000/29/EC4, i na IA delu I Liste karantinskih štetnih organizama u Srbiji. Ipak, tokom poslednjih desetak godina M. fructicola detektovana je i u mnogim zemljama Evrope: prvo u Francuskoj (EPPO, 2002), a zatim u MaĎarskoj (Petróczy and Palkovics, 2006), Češkoj Republici (Duchoslavová et al., 2007), Italiji (Pellegrino et al., 2009), Španiji (De Cal et al., 2009a), Švajcarskoj (Bosshard et al., 2006; Hilber-Bodmer, 2010), Sloveniji (Munda and Viršček Marn, 2010), Slovačkoj (Ondejková et al., 2010), Nemačkoj (Grabke et al., 2011), Poljskoj (Poniatowska et al., 2013) kao i nedavno u našoj zemlji na jabučastim (Vasić et al., 2012) i koštičavim voćkama (Hrustić et al., 2013). Gljive iz roda Monilinia najčešći su i najštetniji prouzrokovači bolesti koštičavih voćaka. Ipak, teško je naći precizan podatak o nivou šteta koju ove vrste prouzrokuju. U nekim godinama mogu znatno da smanje prinos, da ugroze plodove tokom porasta, Pregled literature 7 zrenja, transporta i skladištenja, ali nije zanemarljiva ni njihova uloga u propadanju grančica i grana čime umanjuju vitalnost biljaka posebno u godinama sa obilnim kišama tokom cvetanja (Stojanović, 2004). Značajni gubici zabeleženi su u mnogim državama: Kaliforniji (Ogawa and English, 1991; Ogawa et al.,1995; Hong et al., 1997; Michailides et al., 2007), Švajcarskoj (Vučinić, 1994) i Španiji (Larena et al., 2005). M. fructicola prouzrokuje najozbiljnije štete, naročito nakon berbe, tokom skladištenja i transporta (Ogawa and English, 1991; Hong et al., 1997). Najveći gubici koje je izazvao ovaj patogen zabeleženi su u Severnoj Americi na breskvama, trešnjama i šljivama, kada su gubici nakon berbe dostizali 80-90% (Hong et al., 1997; Larena et al., 2005), dok je potpuno propadanje nektarina zabeleženo 50-tih godina XX veka (Ogawa et al., 1995). Podjednako je teško pronaći podatke o štetama koje prouzrokuju druge vrste roda Monilinia. Obično, M. fructigena i M. laxa prouzrokuju štete sličnog nivoa značajnosti, koje se u zavisnosti od vremenskih uslova kreću u intervalu od 3-15%. Generalno, štete koje prouzrokuju ove dve vrste manje su od šteta koje prouzrokuje M. fructicola (van Leeuwen et al., 2001). Neki istraživači smatraju da su gubici koji nastaju tokom skladištenja i transporta mnogo značajniji od gubitaka koji nastaju tokom vegetacije (Ogawa and English, 1991). Hong et al. (1998) i Larena et al. (2005) ističu da u nekim slučajevima tokom perioda skladištenja gubici mogu dostići 80-85% vrednosti proizvodnje. U našoj zemlji dve vrste ovog roda - M. laxa i M. fructigena, široko su rasprostranjene i javljaju se svake godine. U periodu 1963-1966. godine, M. laxa prouzrokovala je sušenje preko 60% cvetova višnje i oko 40% cvetova kajsije, kao i značajne gubitke u prinosu šljive i breskve (Radman, 1967). Arsenijević i Rudinski (1969) navode da je tokom 1969. godine na mnogim lokalitetima u Vojvodini zabeleženo masovno sušenje i propadanje cvetova i grančica višnje i kajsije, što je, po navodima Kišpatića i sar. (1976) umanjilo prinos na pojedinim stablima i do 80%. Zbog pojave M. laxa sredinom sedamdesetih godina prošlog veka zabeležene su velike štete u rejonu Fruške Gore (Perišić i sar., 1976). Usled pojave paleži cvetova i truleži plodova u voćnjacima nastaju gubici i do 100% (Balaž, 2000), dok 5-25% zaraženih plodova dodatno propada pri transportu (Ivanović i Ivanović, 2001). U istraživanjima Pregled literature 8 Hrustić et al. (2012a) utvrĎena je zastupljenost M. fructigena u skladištima jabuke 14,4% u odnosu na prisustvo patogena iz drugih rodova. 2.5. Simptomi oboljenja Patološke promene koje izazivaju vrste roda Monilinia na različitim biljnim organima uslovili su brojne nazive oboljenja: mrka uvelost cvetova, uvelost grančica, mrka kancerozna trulež, mrka trulež plodova, evropska smeĎa trulež (Anonymous, 1997). Najčešće korišćen naziv za oboljenje koje prouzrokuju u literaturi je mrka trulež plodova i sušenje grančica i cvetova koštičavih voćaka (Ivanović i Ivanović, 2001). Karakteristični simptomi oboljenja koje prouzrokuju vrste roda Monilinia na koštičavim voćkama uočavaju se na cvetovima, granama, grančicama i plodovima u vidu sušenja, i truleži plodova. Osim toga, na šljivi utvrĎena je i infekcija i sušenje listova koju prouzrokuje M. fructicola (Michailides et al., 2007). Tri široko rasprostranjene vrste roda Monilinia prouzrokuju veoma slične simptome. Ipak, odreĎen stepen specijalizacije postoji: M. fructigena i M. fructicola primarno i najčešće prouzrokuju simptome na plodovima (Jones and Aldwinckle, 1990; Holb, 2006), dok se simptomi na cvetovima i grančicama retko javljaju (CABI, 2004; Anonymous, 2008). Nasuprot tome, M. laxa češće se može naći na cvetovima i granama/grančicama (Ogawa et al., 1975). Prvi simptom oboljenja u vidu sušenja cvetova javlja se u rano proleće (Holb, 2008). Primarne infekcije ostvaruju makrokonidije ili askospore tokom perioda cvetanja, najčešće preko žiga i stubića tučka. Kritična fenofaza za ostvarivanje infekcije cvetova je od formiranja pupoljka pa do faze precvetavanja. Istraživanja pokazuju da su cvetovi najosetljiviji u fazi punog cvetanja (Michailides et al., 2007; Holb, 2008). Mogu biti napadnuti svi delovi cveta, a simptomi bolesti ispoljavaju se u vidu uvenuća prašnika, nekroze tučka, kruničnih i čašičnih listića. Posle prodiranja u biljno tkivo gljiva brzo sporuliše i prekriva inficirano tkivo masom sivih konidija (Balaž, 2000). Zaraženo tkivo postaje svetlomrko i nekroza ubrzo zahvata cvet u celini. Ovaj tip simptoma (palež cveta-„blossom blight“) naročito je čest na višnji i kajsiji. Prema Vučinić (1993) prvi znaci bolesti na pojedinim delovima cveta ispoljavaju se već nakon Pregled literature 9 24 h po dospeću konidija, a potpuna nekroza i propadanje cvetova nastaje nakon 3-4 dana. Mada zaraženi cvetovi mogu da opadnu, najčešće ostaju pričvršćeni na granama duži vremenski period tako da micelija patogena kroz cvetnu dršku prodire u grančice i grane, gde nastavlja razvoj, izazivajući pojavu ovalnih, eliptičnih, ulegnutih mrkih pega. U kasnijim fazama razvoja oboljenja dolazi do formiranja rak-rana i sušenja listova i grana (Holb, 2008). Osim posrednog prodora patogena preko sasušenih cvetova ili peteljke trulih plodova, infekcija može nastati i direktno, kroz ozlede na kori. U vlažnim uslovima iz pega formiranih na granama curi smolotočina, a na površini kore dolazi i do sporulacije (Holb, 2008). U našim agroekološkim uslovima, naročito na kajsiji, breskvi i višnji, grančice često bivaju prstenasto obuhvaćene, tako da se deo iznad mesta zaraze suši (Ivanović i Ivanović, 2001). Uvenuće i sušenje vrha grančica nastaje 7-12 dana posle sušenja cvetova. Iz tankih grančica parazit se može proširiti i u deblje grane, odnosno starije delove drveta. Plodovi koštičavih vrsta voćaka mogu biti zaraženi u svim fazama razvoja, od zametanja do pune zrelosti, a i kasnije tokom transporta, u skladištima i na prodajnim mestima. MeĎutim, zeleni plodovi znatno su otporniji od plodova u fazi dozrevanja. Najveće štete nastaju kada doĎe do zaraze već potpuno formiranih plodova neposredno pred berbu. U plodove parazit prodire kroz rane na pokožici, ali do zaraze može doći i na mestu dodira zdravog i bolesnog ploda. Prvi simptomi na plodovima ispoljavaju se pojavom manjih kružnih, mrkih pega, koje se poput oreola obrazuju oko mesta infekcije, obično na mestu neke rane ili povrede. Ove povrede najčešće nanose insekti, koji oštećuju plodove i omogućavaju lako prodiranje parazita u plod. Razvojem oboljenja pega se uglavnom pravilno koncentrično širi, a pri uslovima povećane temperature i vlažnosti, za nekoliko dana mrka trulež potpuno zahvata plodove. Mrka pega je u početku glatka, ali brzo u okviru pege dolazi do sporulacije parazita, nastaju sitne pukotine na pokožici iz kojih izbijaju najpre beličaste, a zatim i sivkaste, jastučaste sporodohije, često u vidu koncentričnih krugova (Holb, 2008). Ovaj tip truleži poznat je pod imenom mrka ili smeĎa trulež. Kada mrka trulež potpuno zahvati plodove, oni podležu uvenuću, suše se i smežuravaju. Micelija gljive u potpunosti prožima tkivo ploda, pretvarajući ga u stromu, koja se dalje ne raspada nego očvrsne i tako pretvara plodove u „mumije“ koje ostaju da vise na grani ili opadaju na zemlju ispod krošnje i Pregled literature 10 služe za održavanje patogena tokom zime (Holb, 2008). M. fructigena prouzrokuje i crnu trulež koja nastaje na plodovima koji se čuvaju u tami. U odsustvu svetlosti zahvaćeni deo ploda poprima tamnu ili crnu boju i na njemu ne dolazi do sporulacije (Balaž, 2000; Ivanović i Ivanović, 2001). Mrka trulež plodova u uslovima povećane vlažnosti vazduha potpuno zahvata plodove trešnje i višnje posle 4-5 dana, a plodove kajsije, šljive i breskve nakon 8-10 dana razvoja. Micelija M. fructicola može izazvati latentne infekcije tako da simptomi oboljenja mogu ostati pritajeni tokom cele vegetacione sezone sve dok stepen zrelosti ploda i vremenski uslovi ne postanu optimalni za razvoj oboljenja (Luo et al., 2001; Luo and Michailides, 2003; Gell et al., 2008) kada prisustvo patogena postaje uočljivo (Batra, 1991; Emery et al., 2000; Gell et al., 2008). Latentne infekcije koje prouzrokuje M. fructicola mogu se ispoljiti u dva oblika: kao „vidljive“ latentne infekcije koje se uočavaju u vidu sitnih pega na mladim plodovima i kao „prave“ latentne infekcije koje nije moguće uočiti sve do perioda sazrevanja plodova (Michailides et al., 2007). 2.6. Ciklus razvoja patogena Vrste roda Monilinia prezimljavaju u obliku micelije u rak ranama u kori obolelih grana i grančica, као i u mumificiranim pladovima koji se nalaze u krošnji drveta ili na površini zemljišta (Villarino et al., 2010). U vlažnim uslovima, tokom zime i proleća, micelija u ovim biljnim delovima sporuliše, formira gomilice- sporodohije sa nizovima jednoćelijskih konidija koje ostvaruju primarne infekcije (Byrde and Willets, 1977; Holb, 2008). Za širenje infekcije veliki značaj imaju mumificirani plodovi na granama voćaka. Villarino et al. (2010) utvrdili su da na 70% mumija na granama i na samo 14% mumija koje se nalaze na površini zemlje dolazi do formiranja konidija koje ostvaruju infekciju. O infekcionom potencijalu mumija govori i podatak da samo po jedan mumificirani plod na svakom drvetu u jednom zasadu koštičavih voćaka omogućava pojavu mrke truleži svih plodova u zasadu (Villarino et al., 2010). Na mumificiranim plodovima najveći broj konidija nastaje neposredno pre cvetanja, dok se na cvetovima najveći broj konidija formira tokom prva dva meseca nakon ostvarene infekcije cvetova. UtvrĎeno je da se deset puta veća količina konidija Pregled literature 11 formira na prezimelim plodovima nego na cvetovima (Holb, 2008), kao i da je koncentracija spora M. fructicola u zasadima koštičavih voćaka najveća tokom perioda cvetanja i postepeno opada tokom sezone (Luo et al., 2005). Prenošenje konidija formiranih u vlažnim uslovima tokom proleća do biljnih organa omogućavaju vetar, kišne kapi (Byrde and Willets, 1977; Holb, 2008) i insekti (Ivanović i Ivanović, 2001). Parazit napada cvetove posle otvaranja, a infekcija se najčešće ostvaruje preko žiga i stubića tučka. Nakon ostvarene infekcije cveta, inicijalna hifa ostvaruje infekciju cvetnih delova koji bivaju potpuno kolonizovani masom sivkastih konidija (Balaž, 2000). Nakon zaražavanja cvetova micelija parazita dospeva u grančice i obično povlači za sobom sušenje iznad mesta infekcije sve do vrha grančice. Grančice mogu biti i neposredno zaražene preko ozleda na kori nastalih pod uticajem raznih faktora, kada parazit prstenasto obuhvata grančicu, prouzrokujući sušenje gornjih delova. U uslovima povećane vlažnosti, duž nekrotiranog tkiva grančica, obrazuju se gomilice konidija. Uvenuće i sušenje lišća nastaje kao direktna posledica zaraze grana i grančica. Reakcijom tkiva na zaraženim granama dolazi do formiranja rak rana. Plodovi mogu biti zaraženi u svim fazama razvoja direktnim prodorom kličine cevi kroz kutikulu ploda, strome ili trihome, ali i kroz pukotine i povrede nastale od insekata ili nepovoljnih uslova sredine (Ogawa et al., 1995). Najčešće infekcije su preko povreda, ali do zaraze može doći i na mestu dodira dva ploda, zaraženog i zdravog (Anonymous, 2008). Smatra se da najznačaniji put prodora patogena predstavljaju pukotine na kutikuli koje nastaju kada plod dostiže maksimalan porast nekoliko nedelja pred berbu, a koje čine 10% površine ploda (Gibert et al., 2009). Postoje oprečna mišljenja o načinima prodora patogena u plodove voćaka. Vico i Jurick (2012) navode da M. fructigena prodire direktno savladavajući barijeru koju čini kutikula produkcijom enzima kutinaze, ali takoĎe prodire i kroz rane i povrede, dok Xu and Robinson (2000) smatraju da je prodor patogena moguć samo kroz povrede na plodovima. Gibert et al. (2009) ističu da direktno prodiranje konidija M. laxa kroz nepovreĎenu kutikulu ploda nikada nije zabeleženo. Luo and Michailides (2001) utvrdili su da su mladi i zreli plodovi šljive podložniji infekciji od plodova u ostalim fazama razvoja. Slično, Biggs and Northover (1988) dokazali su da su mladi plodovi breskve veoma osetljivi na prodor patogena, Pregled literature 12 zatim postaju otporni sve do faze 2-3 nedelje pre punog zrenja kada osetljivost plodova na infekciju naglo raste. Gell et al. (2009) utvrdili su da broj konidija Monilinia spp. na površini ploda breskve značajno raste tokom perioda sazrevanja ploda i sedam dana pre berbe kada dostižu brojnost od 103 - 105 konidija po plodu. Teleomorfni stadijum, koji retko formiraju evropske vrste M. fructigena i M. laxa, ima veliki značaj u životnom ciklusu M. fructicola (Batra and Harada, 1986). Koliko retko M. fructigena formira apotecije govori podatak da su mnogi autori godinama pokušavali da dokažu formiranje apotecija M. fructigena u prirodnim uslovima, a da je prvi nalaz apotecija zabeležen pre 100 godina (Aderhold i Ruhland, 1905, loc.cit. Batra and Harada, 1986) što je kasnije i potvrĎeno pronalaženjem apotecija na prezimelim plodovima jabuke delimično prekrivenim zemljom (Batra and Harada, 1986). Objavljeno je i nekoliko uspešnih pokušaja dobijanja apotecija u laboratorijskim uslovima (Batra and Harada, 1986) čime je definitivno dokazana mogućnost njihovog nastajanja. MeĎutim, za vrstu M. fructicola teleomorfni stadijum ima veliki značaj s obzirom da izvor inokuluma mogu biti i pseudosklerocije koje se obrazuju na mumificiranim plodovima, a na kojima se formiraju apotecije sa askosporama koje u vlažnim uslovima ostvaruju infekciju cvetova (Byrde and Willetts, 1977). Teleomorfni stadijum M. fructicola Batra, prvi put je detektovan i opisan na prezimelim mumificiranim plodovima jabuke (Batra and Harada, 1986). U Evropi nije zabeleženo formiranje apotecija M. fructicola (Villarino et al., 2010), ali je njihovo obrazovanje detektovano na drugim kontinentima (Holtz et al., 1998). Istraživanja Jansch et al. (2012) primenom SSR markera potvrdila su odsustvo teleomorfnog stadijuma M. fructicola u Evropi. Pri povoljnim vremenskim uslovima za cvetanje i brzo precvetavanje, odnosno u uslovima toplog i suvog vremena, kritična fenofaza za infekciju prolazi brzo pa je mogućnost ostvarenja infekcije smanjena. Dugi period cvetanja usled nižih temperatura i čestih kiša, meĎutim, predstavlja idealne uslove za epidemijsku pojavu parazita (Trkulja, 1996). Tokom sezone patogeni ostvaruju nekoliko ciklusa sekundarnih infekcija (Holb, 2008). Istraživanja pokazuju da Monilinia spp. ostvaruju infekciju samo kada se steknu svi neophodni uslovi: povoljni vremenski uslovi, domaćin u osetljivoj fenofazi i patogen dovoljnog infekcionog potencijala (Luo et al., 2001). O značaju uslova Pregled literature 13 spoljašnje sredine govore podaci Drén et al. (2007) koji su tokom 2003. godine u uslovima suvog i toplog proleća i leta zabeležili intenzitet oboljenja niži od 10%, dok je tokom hladnog i vlažnog proleća 2004. godine intenzitet pojave sušenja cvetova bio 95%, a truleži plodova 33%. Hong et al. (1997) zabeležili su gubitke od 8-10% u fazi zrenja u toku 1995. godine i samo 0,5% gubitaka u toku 1996. godine. Temperatura i vlažnost osnovni su faktori spoljašnje sredine koji utiču na ostvarivanje infekcije, pri čemu je vlažnost istaknuta kao mnogo značajniji faktor (Gell et al., 2008). Bez perioda sa povećanom relativnom vlažnošću, čak i pri veoma visokom infekcionom potencijalu patogena, neće doći do ostvarivanja infekcije, dok period vlažnosti od 15 h obezbeĎuje ostvarivanje infekcije u preko 80% slučajeva (Biggs and Northover, 1988). Pri optimalnoj temperaturi, za ostvarivanje infekcije neophodna je vlažnost u trajanju od najmanje 3-4 h (Luo and Michailides, 2001). U zavisnosti od uslova sredine nova generacija konidija nastaje sedam dana nakon ostvarene infekcije, a u toku vegetacione sezone može se formirati nekoliko generacija konidija (Luo et al., 2001). Kada konidije dospeju na osetljivo tkivo, klijaju u roku od 2-4 h i ukoliko su povoljni uslovi vlažnosti i temperature, za tri do šest dana mogu se primetiti prvi znaci nekroze (Holb, 2008). Optimalna temperatura za razvoj oboljenja je 24°C, mada se infekcija i razvoj simptoma oboljenja javljaju u veoma širokom temperaturnom rasponu (0-35ºC), slabije na temperaturama od 0ºC do 5ºC, a konidije ne klijaju na temperaturama višim od 38ºC (Holb, 2008; Casals et al., 2010a). Istraživanja Xu et al. (2007) pokazuju da je period od samo 2 h vlažnosti dovoljan za klijanje više od 80% konidija M. laxa na temperaturi od 20-25°C. Sa druge strane, prisustvo svetlosti deluje stimulativno na formiranje konidija, ali delimično inhibira njihovo klijanje (Anonymous, 2008). 2.7. Identifikacija vrsta roda Monilinia S obzirom da se vrste roda Monilinia teško morfološki razlikuju jedna od druge i razdvajanje vrsta može predstavljati problem (Anonymous, 2008). Simptomi koje prouzrokuju ove vrste lako su prepoznatljivi i karakteristični. MeĎutim, na osnovu simptoma nije preporučljivo vršiti identifikaciju i donositi zaključak o kojoj vrsti roda Monilinia je reč (Michailides et al., 2007). M. laxa prouzrokuje intenzivnije simptome Pregled literature 14 na cvetovima i granama, dok M. fructicola mnogo veće gubitke prouzrokuje na plodovima (Ogawa et al., 1975). M. laxa se češće sreće na bademu i kajsiji, a M. fructicola na plodovima breskve, nektarine i šljive (Michailides et al., 2007). M. fructigena češće prouzrokuje simptome na jabučastim, a M. laxa i M. fructicola na koštičavim voćkama. Najčešće metode koje se primenjuju za preciznu identifikaciju vrsta roda Monilinia su konvencionalne mikološke metode koje obuhvataju proučavanje morfoloških i odgajivačkih karakteristika (Byrde and Willetts, 1977; De Cal and Melgarejo, 1999) i/ili molekularne metode (Hughes et al., 2000; Hughes, 2003; Côté et al., 2004). Identifikacija na osnovu morfoloških odlika izolata zahteva dosta vremena i veliko iskustvo, a sa druge strane, u nekim slučajevima, može da bude nepouzdana i dovede do pogrešnih zaključaka (van Leeuwen and van Kesteren, 1998; De Cal and Melgarejo, 1999). Lane (2002) navodi da ne postoji jedan specifičan morfološki karakter na osnovu kojeg se mogu pouzdano razdvojiti vrste Monilinia spp., ali da se tri vrste ovog roda ipak mogu razlikovati na osnovu istovremenog proučavanja više kvantitativnih morfoloških karakteristika. U sinoptičkom ključu za razlikovanje morfološki sličnih vrsta roda Monilinia Lane (2002) navodi sledeće karaktere: boja kolonije, brzina porasta, sporulacija, koncentrični prsten spora, ivice kolonije, rozetavost, crne zone – margine. Osim toga, značajane karakteristike za razdvajanje su i dužina kličine cevi i način klijanja konidija pre prvog grananja. Van Leeuwen and van Kesteren (1998) smatraju da se tri vrste roda Monilinia mogu pouzdano razlikovati upravo na osnovu ovih karakteristika. MeĎutim, zbog postojanja varijabilnosti izmeĎu izolata iste vrste, kao i sličnosti koje ponekad mogu da ispolje izolati različitih vrsta Monilinia spp., ipak se preporučuje korišćenje i dodatnih dijagnostičkih metoda kao što su molekularne metode. M. fructicola razlikuje se od M. laxa po celovitoj ivici kolonije, obilnoj produkciji konidija i dužoj kličinoj cevi pre grananja (EPPO, 2009; Zhu et al., 2011; Poniatowska et al., 2013). M. fructigena ima žutokrem koloniju, celovitu ivicu kolonije koja ne formira rozetu na PDA podlozi. M. laxa formira kolonije sivkasto braon boje, oblika rozete sa režnjevitom ivicom kolonije (EPPO, 2009). Konidije M. laxa na vodenom agaru formiraju kratke kličine cevi do prvog grananja (dužina kličine cevi od Pregled literature 15 konidije do prvog grananja manja od 60 μm). Sa druge strane, M. fructigena i M. fructicola formiraju kličine cevi dužine preko 220 μm pre grananja (De Cal and Melgarejo, 1999). Hu et al. (2011a) utvrdili su da konidije vrsta M. laxa i M. fructicola klijaju u jednu kličinu cev, dok izolati M. fructigena formiraju više kličinih cevi na jednoj konidiji. Brzina porasta micelije na PDA podlozi može biti koristan karakter za razdvajanje vrsta roda Monilinia. Tako se M. fructigena i M. fructicola jasno mogu razdvojiti na osnovu brzine porasta kolonije u režimu svetlosti UV/mrak, s tim da su podaci o prosečnoj brzini porasta izolata iste vrste raznoliki. Sa jedne strane, Batra (1979) potvrĎuje da se M. laxa može razlikovati od M. fructigena i M. fructicola po sporijoj brzini porasta: M. fructigena raste 11 mm/dan, dok M. laxa raste oko 7 mm/dan. Sa druge strane, De Cal and Melgarejo (1999) utvrdili su da M. fructigena dostiže maksimalnu brzinu porasta od 8 mm/dan, dok je maksimalna brzina porasta M. fructicola 20 mm/dan. Ovi oprečni podaci potvrĎuju nepouzdanost konvencionalnih metoda identifikacije. Poniatowska et al. (2013) utvrdili su da izolati M. fructicola imaju prosečno najbrži porast na PDA podlozi. Mogućnost formiranja sklerocija u kulturi takoĎe može biti značajan kriterijum razlikovanja vrsta. Batra and Harada (1986) detektovali su obrazovanje crnih, nepravilnih sklerocija u kulturi M. fructigena i tu karakteristiku smatraju specifičnom za izolate M. fructigena što je potvrĎeno i u prethodnim istraživanjima u našoj zemlji (Hrustić et al., 2012b) - izolati M. fructigena poreklom sa plodova dunje formirali su sklerocije nakon 14 dana inkubacije. Mada ove specifične karakteristike mogu poslužiti za uspešnu identifikaciju tipičnih kolonija vrsta roda Monilinia, atipične kulture M. laxa lako mogu biti pogrešno identifikovane kao M. fructigena ili M. fructicola (De Cal and Melgarejo, 1999). Istraživanja Petróczy et al. (2012) pokazuju da neki izolati M. fructigena mogu imati koloniju smeĎe boje, režnjevitih ivica, tipičnu za izolate vrste M. laxa ili M. fructicola ili da izolati M. laxa mogu imati koloniju žute boje, karakterističnu za vrstu M. fructigena. Za pouzdanu i brzu identifikaciju izolata neophodna je primena metoda molekularne biologije, pre svega lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR). Molekularna detekcija vrsta roda Monilinia uglavnom se zasniva na analizi relativno malog ITS genomnog regiona (Internal Transcribed Spacer, ITS) od približno 450 bp (Fulton et al., 1999; Snyder and Jones, 1999; Hughes et al., 2000; Pregled literature 16 Ioos and Frey, 2000; Förster and Adaskaveg, 2000; Gell et al., 2007) koji je visoko konzervativan za vrste ovog roda (Holst-Jensen et al., 1997). Prajmeri koje su dizajnirali Hughes et al. (2000) omogućavaju razdvajanje vrste M. fructicola od M. laxa, ali ne i od M. fructigena, dok prajmeri autora Ioos and Frey (2000), kao i Hughes et al. (2000) omogućavaju razlikovanje sve tri pomenute vrste. MeĎutim, posebno korisna, pouzdana i brza tehnika koja obezbeĎuje preciznu detekciju tri već pomenute vrste roda Monilinia kao i vrstu Monilia polystroma u samo jednoj reakciji je Multiplex PCR reakcija po protokolu koje su opisali Côté et al. (2004). Upotrebom specifičnih prajmera MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2 dobijaju se amplikoni različite dužine u zavisnosti od vrste: 402 bp specifični za M. fructigena, 535 bp za M. fructicola, 351 bp za M. laxa i 425 bp za M. polystroma. Prema EPPO (2009) upravo prajmeri koje su dizajnirali Hughes et al. (2000), Ioos and Frey (2000) i Côté et al. (2004) smatraju se veoma pouzdanim za detekciju vrsta roda Monilinia. MeĎutim, za pouzdanu identifikaciju i karakterizaciju izolata Monilinia spp. najčešće se koristi ITS genomni region koji se amplifikuje primenom univerzalnog para prajmera ITS1 i ITS4. Zhu et al. (2011) su korišćenjem ovog para prajmera amplifikovali sekvence 39 izolata iz Kine, uporedili dobijene sekvence sa drugim sekvencama iz različitih delova sveta i na taj način identifikovali vrste roda Monilinia, prouzrokovače mrke truleži plodova u Kini. Na osnovu dobijenih sekvenci i 57 sekvenci iz drugih delova sveta rekonstruisali su filogenetsko stablo i izvršili molekularnu karakterizaciju izolata vrsta roda Monilinia. Hu et al. (2011a) takoĎe su koristili ITS region za molekularnu identifikaciju i karakterizaciju i dokazali da se izolati ovog roda na osnovi ITS regiona jasno razdvajaju u odgovarajuće grupe, ali sa malim bootstrap vrednostima. Ovi autori su u svojim istraživanjima osim ITS genomnog regiona koristili i G3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), TUB2 (β-tubulin) i Cyt b (cytochrome b) gene za detaljniju molekularnu karakterizaciju vrsta roda Monilinia i dobili razdvajanje u odgovarajuće grupe sa većom bootstrap podrškom. Poniatowska et al. (2013) filogenetskom analizom ITS regiona potvrdili su blisku vezu izmeĎu izolata vrste M. fructicola i M. laxa sa jedne i M. fructigena i M. polystroma sa druge strane. Jansch et al. (2012) su molekularnu metodu korišćenja SSR (simple seqence repeat) markera istakli kao značajnu jer omogućava precizan uvid u diverzitet koji se dalje može koristiti u proučavanje epidemiologije i načina širenja vrste M. fructicola u Pregled literature 17 svetu. Razvili su Multiplex PCR reakciju sa pet parova prajmera koja pruža uvid u genetičku strukturu populacije M. fructicola poreklom iz različitih zemalja Evrope i Amerike. Analizom dobijenih profila primenom ovih prajmera utvrĎeno je postojanje osam različitih haplotipova poreklom sa američkog kontinenta i devet poreklom sa evropskog kontinenta. Njihovi rezultati pokazuju da je genetička varijabilnost evropskih populacija mnogo manja od genetičke varijabilnosti populacija iz SAD gde je ova vrsta široko rasprostranjena. Analiza strukture populacije ukazala je na dva nezavisna unosa M. fructicola na evropski kontinent, iz Kalifornije i istočnog dela SAD. Haplotipovi identični haplotipovima iz Kalifornije pronaĎeni su u Francuskoj, Španiji i Švajcarskoj, dok su haplotipovi identični onima iz Džordžije i Južne Karoline pronaĎeni samo u Italiji. Njihova istraživanja ukazala su na način dospevanja i širenja karantinskog patogena M. fructicola u Evropi, kao i na odsustvo ukrštanja populacije ove vrste na evropskom kontinentu. 2.8. Mogućnosti suzbijanja vrsta roda Monilinia Adekvatne mere zaštite zasada koštičavih voćaka od fitopatogenih mikroorganizama predstavljaju neophodan preduslov stabilne i profitabilne poljoprivredne proizvodnje koja u velikoj meri zavisi od stepena poznavanja biologije patogena, epidemiologije bolesti i odnosa parazit-domaćin. Samo na osnovu dobrog poznavanja svih činilaca koji direktno ili indirektno utiču na razvoj oboljenja moguće je primeniti kompleks mera kojima se sprečavaju štete. Suzbijanje patogenih gljiva roda Monilinia, prouzrokovača oboljenja velikog broja vrsta voćaka, veoma je složeno i usmereno u nekoliko pravaca. Mere suzbijanja mogu se podeliti u pet osnovnih grupa: stvaranje otpornih sorti; agrotehničke mere; fizičke mere; biološke mere; hemijske mere. Pregled literature 18 2.8.1. Stvaranje otpornih sorti Pitanju gajenja otpornih sorti, kao jednom od najefikasnijih načina borbe protiv Monilinia spp., kod nas se ne posvećuje dovoljna pažnja, a dostupni eksperimentalni podaci su oskudni i nedovoljni. Jordović (1954) proučavao je osetljivost plodova deset vodećih sorti breskve na Monilinia spp. i utvrdio da ni jedna proučavana sorta nije ispoljila potpunu otpornost, dok su ispoljene razlike u osetljivosti izmeĎu pojedinih sorti bile neznatne. TakoĎe, autor ističe da osetljivost plodova breskve na Monilinia spp. raste s njihovom zrelošću, kao i da otpornost, odnosno osetljivost plodova, umnogome zavisi od čvrstine i boje mesa ploda, debljine i čvrstine pokožice, gustine dlačica na pokožici i drugih pomoloških osobina ploda. Prema Jevremoviću (1976) sorte breskve veće bujnosti i manje rodnosti otpornije su, dok su sorte slabije bujnosti i veće rodnosti osetljivije na Monilinia spp. Iskustva iz sveta pokazuju da su sorte trešnje sa tanjom pokožicom značajno osetljivije na prodor Monilinia spp. od sorti čiji plodovi imaju deblju pokožicu. Sorte Bigarreau Burlat, János cseresznye i Valerij Cskalov veoma su otporne na sušenje cvetova (Holb, 2006). U slučaju višnje, sorte Lativiszkaja Nizkaja, Nagy Angol, Mocanesti, Ljubszkaja, Sirpotreb, Oblacsinszkaja, Cigánymeggy 3, Maraska Savena, Mettar i Elegija slabo su osetljive na M. laxa (Holb, 2006; 2008), dok su Csengodi i Kantorsjanosi otporne (Sződi et al., 2008). Kada su u pitanju kajsija i breskva smatra se da je nekoliko sorti kajsije (Neptun, Mamaia, Silvana, Sulina i Sirena) koje se gaje u Rumuniji tolerantno na prouzrokovače smeĎe truleži (Holb, 2006). Sorte šljive Čačanska najbolja i President ističu se kao umereno, a Besztercei, Silvia i Tuleu gras kao slabo osetljive na trulež plodova koju prouzrokuje M. laxa (Holb, 2006). Sa druge strane, nema podataka o radu na stvaranju sorti otpornih na M. fructicola (Holb, 2008). 2.8.2. Agrotehničke mere Istraživanja pokazuju da se agrotehničkim merama može smanjiti količina inokuluma i obezbediti mikroklimatski uslovi koji su povoljni za biljku, a nepovoljni za patogena. Pravilnim agrotehničkim odlukama pre zasnivanja zasada, odnosno izborom Pregled literature 19 terena, gustinom sadnje, uzgojnim oblikom, izborom i gajenjem manje osetljivih sorata i drugo, smanjuje se opasnost od pojave ovog oboljenja (Kišpatić i Maceljski, 1989). Pri podizanju zasada treba birati ocedne terene i redove postavljati u pravcu dominantnih vetrova, radi boljeg provetravanja zasada. U voćnjaku treba redovno sprovoditi sve higijenske mere (nega krošnje, suzbijanje korova i slično), povećavajući na taj način vitalnost voćki, a samim tim smanjujući do izvesne mere napad parazita. Ukoliko su voćke pravilno i ujednačeno prihranjene manje su podložne napadu vrsta roda Monilinia (Trkulja, 1996). Elmer et al. (2007) utvrdili su da su plodovi koji sadrže više kalcijuma u epidermisu značajno otporniji na infekciju. TakoĎe, ukoliko se izvrši prihrana kalcijumom pre berbe značajno se smanjuje učestalost pojave smeĎe truleži plodova tokom skladištenja, dok su Thomidis and Exadaktylou (2010) utvrdili korelaciju izmeĎu upotrebe bora i smanjenja infekcije plodova breskve koju prouzrokuje M. laxa. Potrebno je nastojati da voćke u fazi zrenja budu što bolje i ujednačenije snabdevene vodom, jer nakon duže suše, ukoliko padnu obilne i dugotrajne kiše, plodovi pucaju i preko nastalih rana paraziti lako prodiru u plod (Trkulja, 1996). Sa druge strane, Mercier et al. (2008) ispitivali su uticaj različitih sistema navodnjavanja i metoda orezivanja na pojavu oboljenja prouzrokovanog vrstama roda Monilinia. Utvrdili su da smanjene količine vode i ručno orezivanje imaju najbolji efekat na smanjenje pojave oboljenja. Redovna berba, uklanjanje biljnih ostataka posle berbe, sasecanje i spaljivanje obolelih i sasušenih grančica i sakupljanje i zakopavanje mumificiranih plodova, izbegavanje nepotrebnog povreĎivanja biljaka pri redovnim agrotehničkim operacijama, kao i smanjenje gustine zasada, mogu značajno da smanje intenzitet oboljenja. Smatra se da uništavanje primarnog izvora inokuluma predstavlja najznačajniju meru borbe (van Leeuwen et al., 2000; 2002a; Holb, 2006). Sakupljanje mumificiranih plodova treba izvesti još u jesen ili u rano proleće i to kako plodova koji se nalaze na zemlji, tako i onih koji su ostali u krošnjama voćki (van Leeuwen et al., 2000; 2002a). TakoĎe, ukoliko je moguće, treba uklanjati obolele plodove još u toku leta, čim se na njima ukažu prvi znaci zaraze. Ove mere mogu biti veoma korisne na okućnicama i manjim površinama jer se njima značajno umanjuje infekcioni potencijal parazita. Pregled literature 20 MeĎutim, u većim voćnjacima koji se obraĎuju, a gde je navedene mere teže sprovesti, korisno je opale mumificirane plodove duboko zaorati. Istraživanja Borve and Stensvand (2003) ukazuju na efikasnost mere pokrivanja trešnje kišnim štitovima od polietilena ili drugih vodootpornih i providnih materijala tokom kišnog perioda od cvetanja pa do branja plodova. Njihova istraživanja pokazuju da se kišni štitovi mogu koristiti kao dodatak ili čak zamena hemijskim merama borbe. 2.8.3. Fizičke mere S obzirom da u zemljama Evrope primena hemijskih mera borbe nije dozvoljena tokom perioda skladištenja, mnogi autori proučavali su mogućnost upotrebe fizičkih mera za suzbijanje vrsta roda Monilinia (Casals et al., 2010b; Karabulut et al., 2010; Zhang et al., 2010). Istraživanja su pokazala da potapanje plodova u vodu zagrejanu na 65-70°C oštećuje plodove i ne može biti efikasno, dok voda zagrejana na 55-60°C u koju su potopljeni plodovi u trajanju od 30-60 s može značajno smanjiti infekcioni potencijal vrsta roda Monilinia (Karabulut et al., 2010). Zhang et al. (2010) koristili su zagrejanu vodu na 50°C tokom 40 s i vodu temperature iznad 55°C tokom 10 s i ovim tretmanima potpuno zaustavili klijanje spora M. laxa u in vitro uslovima. Ipak, autori su potvrdili da upotreba tople vode može biti efikasna samo u kombinaciji sa drugim tretmanima kao što su konvencionalni fungicidi, biološke mere borbe ili izmenjen sastav atmosfere u skladištu (Karabulut et al., 2010; Zhang et al., 2010). Casals et al. (2010b) ispitivali su uticaj tretmana suvim i vlažnim vazduhom na visokim temperaturama na razvoj mrke truleži uskladištenih plodova. Istraživanja su pokazala da visoka vlažnost vazduha (95-99% RH) na temperaturi od 50°C tokom 2 h značajno smanjuje vitalnost konidija M. laxa i M. fructicola (92 i 94%), a osim toga pozitivno deluje na kvalitet plodova. Sa druge strane, suv vazduh pri istim temperaturnim uslovima nije ispoljio zadovoljavajući efekat. Ipak, ovi tretmani zahtevaju mnogo vremena i relativno su skupi, što utiče na njihovu ekonomsku isplativost. Pregled literature 21 2.8.4. Biološke mere Biološko suzbijanje predstavlja poseban način zaštite zasada od patogena koji se zasniva na upotrebi mikroorganizama umesto konvencionalnih fungicida, ili kao njihova dopuna, radi smanjenja količine primene hemijskih supstanci u poljoprivredi. Većina podataka koji se odnose na mogućnosti upotrebe gljiva, bakterija i kvasaca kao bioloških agenasa potiče iz poslednjih dvadesetak godina. Uspešno je razvijeno nekoliko agenasa za biološku borbu, a neki od njih već su registrovani za primenu u voćarstvu. Za zaštitu zasada od vrsta roda Monilinia kao agensi biološke borbe najčešće se koriste bakterije iz rodova Bacillus, Burkholdria i Pseudomonas, dok je poznat antagonistički efekat gljiva iz više rodova - Aureobasidium, Epicoccum, Trichoderma, Penicillium, Cladosporium i Mucor (Holb, 2006). Za suzbijanje vrsta roda Monilinia kao agense biološke borbe moguće je koristiti i kvasce - Metschnikowia pulcherrima, Pseudozyma fusiformata, Cryptococcus laurentii i Aureobasidium pullulans (Zhang et al., 2010; Mari et al., 2012). Vrste roda Bacillus najpoznatiji su agensi biološke borbe. Bakterije ovog roda formiraju spore koje imaju izraženu sposobnost preživljavanja u nepovoljnim uslovima spoljašnje sredine, a pritom ostaju metabolitički aktivne (Rodgers, 1989). Najproučavanija vrsta bakterija koja se koristi za biološku zaštitu je Bacillus subtilis (Asaka and Shoda, 1996: Brannen and Kenney, 1997; Krebs et al., 1998; Pinchuk et al., 2002), poznata duži niz godina po svojoj antimikrobnoj aktivnosti. B. subtilis aktivna je supstanca nekoliko preparata koji su registrovani u svetu (Tomlin, 2009). Vrste roda Bacillus produkuju antibiotike i lipopeptide (bacilizin, fengimicin, dificidin, bacitracin, bacilin, balilomicin B i iturin) koji deluju na različite komponente ćelijskog zida, sprečavaju prijanjanje patogena na biljne organe i veoma su poznati po izraženoj antimikrobnoj aktivnosti (Klokočar-Šmit i sar., 2003). Pusey et al. (1984) ukazali su na mogućnost suzbijanja vrsta roda Monilinia primenom B. subtilis. Istraživanja Yánez-Mendizábal et al. (2012) pokazala su da je lipoprotein fengicin osnovni antifungalni metabolit soja CPA-8 B. subtilis protiv vrsta M. laxa i M. fructicola kao i da soj CPA-8 ima veliki potencijal za suzbijanje vrsta roda Pregled literature 22 Monilinia. U našoj zemlji na bazi B. subtilis registrovan je preparat F-stop koji u sebi sadrži soj ST 1/III B. subtilis (Anonymous, 2011). Altindag et al. (2006) proučavali su primenu bakterija Burkholdria OSU-7, Bacillus OSU-142 i Pseudomonas BA-8 u suzbijanju vrste M. laxa. Sve tri bakterije bile su pogodni agensi za suzbijanje M. laxa, kako u in vitro tako i u in vivo uslovima, pri čemu su veći potencijal pokazale vrste Burkholdria OSU-7 i Bacillus OSU-142. Istraživanja Hong et al. (1998) pokazala su da tri izolata Trichoderma spp. imaju potencijal za suzbijanje Monilinia spp. tokom perioda skladištenja. U ovim testovima Trichoderma spp. omogućila je smanjenje mrke truleži od 63 do 98% na plodovima breskve i od 67 do 100% na plodovima šljive. Izolati Trichoderma spp. obezbedili su ne samo smanjenje infekcije nego i smanjenje sporulacije M. fructicola. Upotreba formulisanog preparata na bazi T. harizanum u kombinaciji sa fungicidima daje dobre rezultate (Elad, 1994). Zadovoljavajući rezultati postignuti su i primenom preparata na bazi oospora Pythium oligandrum (Filajdić i sar., 2003; Miletić i sar., 2003). Melgarejo et al. (1985) ustanovili su da pet vrsta gljiva (Aspergillus flavus, Epicoccum nigrum, Penicillium chrysogenum, P. frequentans i P. purpurogenum) inhibira porast hifa i klijanje spora M. laxa. De Cal et al. (1988) utvrdili su da P. frequentans produkuje supstance koji deluju antifungalno na M. laxa, dok su Madrigal and Melgarejo (1994) u svojim istraživanjima mehanizma delovanja bioloških agenasa otišli korak dalje i otkrilii da E. nigrum proizvodi flavipin, supstancu koja inhibira respiratorni proces i na taj način inhibitorno utiče na klijanje konidija M. laxa. Dokazano je, takoĎe, da P. purpurogenum proizvodi litičke enzime koji utiču na degradaciju hifa i spora M. laxa (Larena and Melgarejo, 1996). Chand-Goyal et al. (1996) ukazuju na dobre efekte u prevenciji Monilinia spp. primenom Cryptococcus laurentii i C. infirmo-miniatus u kombinaciji sa manjim količinama iprodiona. Mari et al. (2007) koristili su E. nigrum za sprečevanje razvoja mrke truleži na plodovima nektarine. Upotrebom suspenzije spora E. nigrum ostvarano je smanjenje truleži od 60 do 70% u odnosu na netretiranu kontrolu. De Cal et al. (2009b) takoĎe su ukazali na mogućnost upotrebe E. nigrum u inhibiciji klijanja konidija Monilinia spp. koje se nalaze na površini plodova. Autori su ispitivali efekat različitih tipova formulacija E. nigrum za suzbijanje Monilinia spp. i ustanovili da način formulacije Pregled literature 23 preparata može čak poboljšati osobine preparata u odnosu na neformulisanu suspenziju spora. Kvasac Aureobasidium pullulans nalazi se na površini mnogih plodova, a njegova antifungalna aktivnost protiv mnogih patogena u skladištu dobro je poznata (Mari et al., 2012). Mari et al. (2012) prvi su ispitivali antifungalnu aktivnost A. pullulans protiv M. laxa, M. fructigena i M. fructicola i utvrdili veliki potencijal sojeva L1 i L8. Oba ispitivana soja obezbedila su potpunu inhibiciju infekcije vrstama M. laxa i M. fructicola, dok je za vrstu M. fructigena ostvareno smanjenje infekcije od 90%. U Hrvatskoj je za suzbijanje M. fructigena na jabuci, krušci i dunji registrovan kvasac A. pullulans DSM 14940 i 14941 (Lučić, 2009), dok su Wittig et al. (1997) primenom istog kvasca u vreme cvetanja trešnje značajno smanjili infekcioni potencijal M. laxa. Zhang et al. (2010) ispitivali su antifungalnu aktivnost kvasaca A. pullulans PL5, Metschnikowia fructicola AP47 i Pseudomyza fusiformata AP6 na M. laxa. Pored toga, poznato je da su lekovite i začinske biljke važan izvor jedinjenja sa antimikrobnom aktivnošću. Etarska ulja su specifični, najčešće tečni produkti biljnih tkiva. Predstavljaju složene smeše različitih isparljivih monoterpena, seskviterpena i fenilpropanskih jedinjenja (Dorman and Deans, 2000). Pojedina etarska ulja sadrže i preko 60 supstanci meĎu kojima su terpeni, alkoholi, fenoli, kiseline, ugljovodonici, estri, ketoni i laktoni. Najzastupljenije supstance su terpeni (90%) iz kojih se izdvaja čitav niz biološki aktivnih supstanci kao sto su timol, karvakol, eugenol, geraniol, linalol i drugi. Za antimikrobno delovanje etarskih ulja odgovorne su njihova lipofilnost, slobodna hidroksilna (OH) grupa i slobodne nezasićene strukture cikloheksanskog prstena. Zbog svoje lipofilnosti i rastvorljivosti u vodi deluju na funkcionalne strukture ćelijskih membrana i enzime, što dovodi do narušavanja metabolizma i funkcionisanja ćelije (Bakkali et al., 2008 ). Brojna istraživanja ukazuju da pare etarskih ulja origana, timijana, lavande, ruzmarina, žalfije, nane, lavande, bosiljka, kima, anisa, eukaliptusa i drugih inhibiraju porast fitopatogenih gljiva (Isman, 2000; Daferera et al., 2003; Tanović i sar., 2004). UtvrĎeno je da inhibitorna aktivnost zavisi kako od vrste etarskog ulja tako i od vrste patogena (Alvarez-Castellanos, 2001; Cimanga et al., 2002). Antifungalno dejstvo etarskog ulja timijana utvrĎeno je na Botrytis cinerea (Wilson et al., 1997; Daferera et al., 2003; Tanović et al., 2005), gljive koje se prenose zemljištem iz rodova Pregled literature 24 Rhizoctonia, Pythium, Fusarium i Verticillium (Zambonelli et al., 1996; Tanović i sar., 2004; Duduk i sar., 2010) i Colletotrichum spp. (Grahovac et al., 2012). Prethodna istraživanja (Tanović et al., 2009; 2010a; Hrustić i sar., 2011) pokazala su da je gasovita faza nekih etarskih ulja visoko toksična za patogene uskladištenih plodova jabuke. U istraživanjima koja su obuhvatila etarska ulja dobijena iz više od 30 vrsta biljaka, utvrĎeno je da gasovita faza ulja timijana ispoljava najjači inhibitorni efekat. Ogledima in vitro i in vivo potvrĎena je snažna antimikrobna aktivnost ulja timijana (Hrustić i sar., 2011). Sa druge strane, istraživanja Grahovac et al. (2012) pokazuju da od 56 testiranih ulja 47 ne deluju fungicidno na porast micelije Colletotrichum spp. ni pri koncentraciji etarskog ulja od 0,16 µl/ml vazduha, a da etarska ulja origana i timijana ispoljavaju najbolji efekat na prouzrokovače truleži ploda jabuke. Liu et al. (2002) ukazali su da etarsko ulje timijana u niskim koncentracijama (2-4 mg/l) može značajno smanjiti štete koje nastaju na plodovima tokom skladištenja. U istraživanjima Lazar-Baker et al. (2011) etarsko ulje Backhousia citriodora bilo je najsnažniji inhibitor porasta M. fructicola. Proizvodnja i korišćenje biopreparata, iako predstavlja poželjno rešenje sa aspekta bezbednosti hrane, još uvek je suviše skupo da bi bilo ekonomski isplativo zbog znatno niže cene konvencionalnih fungicida (Elad, 1994). Nažalost, komercijalizacija sredstava za biološku zaštitu i njihova široka upotreba još uvek je daleko od pune realizacije (Wilson, 2011). Činjenica je da biofungicidi još uvek ne mogu u potpunosti zameniti hemijske preparate, ali sve su ozbiljniji napori u istraživanjima i komercijalizaciji novih, ekološki prihvatljivih preparata. Osim toga, biološke mere moguće je sprovoditi i kao dopunu hemijskim. 2.8.5. Hemijsko suzbijanje S obzirom da sve do sada navedene mere, iako korisne, najčešće pojedinačno nisu dovoljne za uspešnu zaštitu različitih vrsta voćaka od Monilinia spp., kao i da ekonomski efekti šteta mogu biti veliki, neophodno je redovno sprovoĎenje mera hemijskog suzbijanja, posebno u godinama povoljnim za razvoj patogena. Za suzbijanje Monilinia spp., kod nas registrovano je oko 10 aktivnih materija i njihovih kombinacija (bakar oksihlorid, prohloraz, ciprodinil+fludioksonil, prosimidon, Pregled literature 25 tiofanat-metil, vinklozolin, karbendazim, iprodion, tebukonazol, boskalid+piraklostrobin, difenokonazol, propikonazol i hlorotalonil) (Anonymous, 2011). U svetu se za ovu namenu koristi preko 30 aktivnih materija iz različitih hemijskih grupa uključujući azoksistrobin, bitertalon, kaptan, dihlofluanid, dikoran, ditianon, fenheksamid, fludioksonil, fluopiram, fluoroimid, imibenkonazol, mepanipirim, oksokonazol fumarate, propineb, triadimefon, triflumizol, tiram, triforin i ciram koje u našoj zemlji nisu registrovane za ove namene (Tomlin, 2009). Strategija suzbijanja vrsta roda Monilinia, u zavisnosti od biljke domaćina, sorte i uslova spoljašnje sredine, zasniva se na primeni fungicida 2-3 puta tokom perioda cvetanja, koje je kritično za infekciju (od fenofaze BBCH 59 do BBCH 67, Meier, 1997) i 1-2 tretmana u vreme sazrevanja plodova, pre berbe (Rüegg et al., 1997; Zehr et al., 1999). Spiegel and Stammler (2006) smatraju da je tokom razvoja i sazrevanja plodova potrebno do pet tretmana, dok Yoshimuri et al. (2004) preporučuju godišnje 1- 2 tretmana fungicidima u zasadima šljive, trešnje i višnje, a 3-4 u zasadima breskve i nektarine. Početak primene fungicida za suzbijanje Monilinia spp. vezuje se za otkriće bakarnih fungicida. Bordovska čorba i druga jedinjenja iz ove grupe primenjivana su za zimska prskanja, čime se značajno smanjivao infekcioni potencijal prezimljujućih formi patogena (Holb, 2005). Danas hemijska zaštita voćaka od vrsta roda Monilinia takoĎe počinje zimskim tretiranjem nekim od preventivnih fungicida, najčešće na bazi bakra. Ipak, neke zemlje Evrope (Skandinavske zemlje i Holandija) zabranile su upotrebu preparata na bazi bakra, što se može očekivati i u drugim zemljama Evropske Unije (Holb and Schnabel, 2005). Za suzbijanje vrsta roda Monilinia najčešće se koriste fungicidi koji utiču na sporulaciju iz sledećih hemijskih grupa: dikarboksimidi (iprodion), benzimidazoli (tiofanat-metil, karbendazim), triazoli (tebukonazol, propikonazol), strobilurini (piraklostrobin i azoksistrobin) i inhibitori sukcinat dehidrogenaze (SDH inhibitori) (boskalid) kao i protektivni fungicidi nespecifičnog mehanizma delovanja (kaptan, mankozeb, metiram, propineb, tiram, folpet, hlorotalonil i ciram) (Miessner and Stammler, 2010; Baker et al., 2011). Istraživanja pokazuju da su u suzbijanju vrsta Monilinia veoma efikasni sledeći fungicidi: benomil, tiofanat-metil, vinklozolin, iprodion, bitertanol, triforin, tebukonazol i propikonazol (Harman and Beever, 1987; Pregled literature 26 Takamura and Ochiai, 1989; Zehr et al., 1999; Thomidis et al., 2009), s tim što treba naglasiti da je benomil zbog nepovoljnih toksikoloških osobina skinut sa Aneksa 1 Direktiva 91/414/EEC i time izbačen iz upotrebe u zaštiti voćaka (EU Pesticide Database, 2012). Do osamdesetih godina XX veka najznačajniji fungicidi korišćeni za suzbijanje vrsta roda Monilinia bili su benzimidazoli, a meĎu njima najveću upotrebu imali su benomil i tiofanat-metil (Ma et al., 2003a). Benomil je uspešno korišćen za suzbijanje prouzrokovača sušenja cvetova u Kaliforniji od njegove registracije 1972. do 1977. godine kada je utvrĎena rezistentnost (Sonoda et al., 1983; Michailides et al., 1987), od kada je u široj upotrebi tiofanat-metil (Ma et al., 2003a). Od 1977. godine, kada je utvrĎena rezistentnost Monilinia spp. na benzimidazole, inhibitori sinteze ergosterola (DMI fungicidi) postaju najefikasniji i najšire primenjivani fungicidi protiv vrsta ovog roda (Zehr et al., 1999; Schnabel and Bryson, 2004). Osim DMI fungicida, u širokoj upotrebi su i dikarboksimidi, fungicidi kao što su iprodion i vinklozolin, mada je rezistentnost Monilinia spp. na ovu grupu fungicida detektovana ubrzo nakon njihovog uvoĎenja u primenu (Lim et al., 2001). Propikonazol, tebukonazol i fenbukonazol postali su standard za hemijsko suzbijanje vrsta roda Monilinia u zasadima breskve u jugoistočnom delu SAD (Zehr et al., 1999). Ispitivanja Thomidis et al. (2009) potvrdila su visoku efikasnost tebukonazola i iprodiona protiv prouzrokovača mrke truleži plodova koštičavih voćaka. Uprkos uspešnoj primeni DMI fungicida duže od 30 godina, tek nedavno je zabeležena smanjena osetljivost izolata u nekoliko regiona na istoku SAD (Zehr et al., 1999; Schnabel and Bryson, 2004). Sa druge strane, razvijen je jedan novi fungicid iz ove klase – SYR-Z048 za koji još uvek ne postoje podaci o promeni osetljivosti (Chen et al., 2012). Poslednjih godina, registrovane su nove grupe fungicida sa drugačijim mehanizmom delovanja – strobilurini, karboksamidi, hidroksianilidi i anilinopirimidini koji se preporučuju za suzbijanje prouzrokovača mrke truleži. MeĎutim, fungicidi iz grupe strobilurina, azoksistrobin i piraklostrobin, aktivne su supstance visokog rizika za razvoj rezistentnosti (Amiri et al., 2008). Zapravo, smanjena osetljivost patogena na ovu grupu jedinjenja zabeležena je u velikom broju zasada jabuke i vinove loze (Gullino et al., 2004; Köller et al., 2004), ali ne i prouzrokavača truleži plodova u zasadima breskve (Amiri et al., 2008). Primeri novih jedinjenja sa drugačijim Pregled literature 27 mehanizmima delovanja su i fenheksamid i boskalid. Fenheksamid je hidroksianilid koji u veoma malim koncentracijama snažno inhibira izduživanje inicijalnih hifa i porast micelije, a u većim koncentracijama inhibira i klijanje konidija (Schnabel and Bryson, 2004), dok boskalid iz grupe karboksamida, kao i azoksistrobin i piraklostrobin, inhibira disanje patogena i ima protektivno dejstvo (Wong and Wilcox, 2002). Za razliku od M. laxa i M. fructicola, M. fructigena značajnije štete prouzrokuje samo kada su plodovi oštećeni, tako da je najznačajnija mera borbe protiv M. fructigena suzbijanje insekata koji povreĎuju plodove i prave ulazne otvore za ovog patogena (Holb, 2006). Preporučuje se efikasno suzbijanje Ragholetis cerasi u zasadima trešnje i višnje, Grapholita funebrana u zasadima šljive, Anarsia lineatella i G. molesta u zasadima kajsije i breskve. Za suzbijanje M. fructigena na koštičavim voćkama preporučuju se 1-2 tretiranja pred berbu plodova (Balaž, 2000). Od fungicida za zaštitu plodova od prouzrokovača truleži u Srbiji registrovani su trifloksistrobin, trifloksistrobin + kaptan, karbendazim, ciprodinil + fludioksonil, tiofanat-metil, boskalid + piraklostrobin i bakterija B. subtilis (Grahovac i sar., 2011). Za suzbijanje širokog spektra mikroorganizama prouzrokovača propadanja plodova tokom skladištenja trenutno postoji veliki broj fungicida koji su registrovani u SAD. Sa druge strane, u Evropskoj Uniji, Turskoj, kao i u drugim zemljama Evrope zabranjena je primena fungicida u skladištima (Karabulut and Baykal, 2004). Ipak, u poreĎenju sa sredstvima za suzbijanje štetočina broj fungicida koji se mogu koristiti tokom skladištenja ipak je veoma mali. Mnoga sredstva koja su ranije korišćena ne preporučuju se više ili im je upotreba ograničena (Vico i Jurick, 2012). Osim toga, dobro je poznat slučaj razvoja rezistentnosti skladišnih patogena na benomil, tiabendazol i imazalil (Adaskaveg and Förester, 2010). U SAD registrovano je nekoliko fungicida za potapanje plodova koje treba uskladištiti (Mari et al., 2007). Fludioksonil i fenheksamid, registrovani za ove namene od 2003. i 2005. godine, mogu smanjiti količinu inokuluma koji je prisutan na površini plodova (Karabulut et al., 2010), ali ne mogu uticati na miceliju koja se nalazi unutar plodova. Förster et al. (2007) ispitivali su u laboratorijskim uslovima efikasnost fungicida u suzbijanju pruzrokovača mrke truleži tokom perioda skladištenja. Utvrdili su visoku efikasnost iprodiona, tebukonazola, azoksistrobina i fenheksamida, pri čemu Pregled literature 28 su iprodion i tebukonazol pokazali najbolju efikasnost na plodovima inokulisanim vrstom M. fructicola. 2.9. Osobine najčešće korišćenih fungicida za suzbijanje Monilinia spp. Za suzbijanje Monilinia spp. najčešće se koriste jedinjenja iz grupe benzimidazola, dikarboksimida i triazola. MeĎutim, u novije vreme u upotrebi su jedinjenja iz grupe strobilurina, karboksamida i pirimidil-etil-benzamida. 2.9.1. Benzimidazoli Benzimidazoli su sistemični fungicidi koji deluju na veliki broj patogena, izuzimajući pseudogljive iz klase Oomycetes. Primarni mehanizam delovanja ovih fungicida je inhibicija sinteze -tubulina, što za posledicu ima sprečavanje deobe jedra (Davidse and Ishii, 1995). Benzimidazoli sa tubulinom formiraju kompleks i sprečavaju normalno izduživanje mikrotubula u vreteno i formiranje deobnog vretena bez koga ne može da se obavi deoba jedra i završi mitotička deoba ćelije (Davidse, 1987). Najvažniji predstavnici fungicida iz ove grupe su benomil, karbendazim, tiabendazol i tiofanat-metil. Yoshimura et al. (2004) ispitivali su osetljivost izolata M. fructicola na tiofanat-metil i dobili EC50 vrednosti u intervalu od 0,17 do preko 30 µg/ml. S obzirom na veliku razliku u osetljivosti podelili su izolate u tri grupe: osetljive (EC50<2 µg/ml), umerno osetljive (EC50 2-30 µg/ml) i rezistentne (EC50>30 µg/ml). Stević i Vukša (2006) utvrdili su parametre osetljivosti izolata M. laxa na benomil; EC50 vrednosti su se kretale u intervalu od 123 do 901 µg/kg. Pojava rezistentnosti gljiva na benzimidazole posledica je promena na β- tubulinu, mestu njihovog vezivanja. Kod različitih vrsta gljiva otkriveno je desetak mutacija na genu za β-tubulin, koje za posledicu imaju rezistentnost na ova jedinjenja. Najčešće i najznačajnije mutacije dešavaju se na kodonima 198 i 200. Ma et al. (2005) utvrdili su da kod rezistentnih izolata M. laxa na benzimidazole dolazi do mutacije na kodonu 240 i zamene lecitina fenilalaninom. Sa druge strane, utvrĎena je mutacija na kodonu 198 visokorezistentnih izolata M. laxa iz Grčke (Malandrakis et al., 2012). Pregled literature 29 TakoĎe, utvrĎena je i mutacija na kodonu 198 kod visokorezistentnih i na kodonu 6 kod slabo rezistentnih izolata M. fructicola na benzimidazole. Izolati rezistentni na jedno jedinjenje iz grupe benzimidazola istovremeno su rezistentni i na ostale predstavnike ove grupe, dok ukrštena rezistenost izmeĎu benzimidazola i jedinjenja iz drugih hemijskih grupa nije utvrĎena (FRAC, 2005). Pet godina nakon početka upotrebe benomila za suzbijanje M. fructicola registrovana je pojava rezistentnosti. EC50 vrednosti rezistentnih izolata iz Kalifornije relativno su niske (0,5-4 µg/ml) u poreĎenju sa EC50 vrednostima rezistentnih izolata iz drugih delova sveta (veće od 50 µg/ml) (Yoshimura et al., 2004). MeĎutim, veoma nisku efikasnost benomila i tiofanat-metila u suzbijanju M. fructicola u polju utvrdili su Ma et al. (2003a; 2005) i Lim et al. (2006). Rezistentnost M. laxa na benomil prvi su utvrdili Ogawa et al. (1981). Michailides et al. (1987) testirali su osetljivost većeg broja izolata M. fructicola i M. laxa na benomil. Kolonije većine ispitivanih izolata M. fructicola uobičajeno su rasle na podlozi sa 1 mg/l benomila, a pojedini izolati razvijali su se i na podlozi sa 4 i 8 mg/l benomila, dok su se svi izolati M. laxa pokazali kao normalno osetljivi. 2.9.2. Dikarboksimidi Dikarboksimidi ispoljavaju protektivno delovanje u suzbijanju fitopatogenih gljiva iz rodova Botrytis, Sclerotinia, Monilinia, Alternaria, Sclerotium, Phoma, Helminthosporium, Rhizoctonia i Corticum. Različita aktivnost kao i spektar delovanja pojedinih jedinjenja iz ove grupe uslovljeni su njihovom hemijskom strukturom. Dikarboksimidi imaju cikličnu komponentu koja može biti oksazolidindion (vinklozolin i hlozolinat), sukcinimid (prosimidon i metomeklan) i hidantoin (iprodion). Primarni mehanizam delovanja dikarboksimida još uvek nije sa sigurnošću utvrĎen. UtvrĎeno je da inhibiraju porast micelije i klijanje konidija, s tim što je inhibicija klijanja konidija slabije izražena (Edlich and Lyr, 1995). Ova jedinjenja utiču na strukturu i mitotsku deobu ćelije, sintezu proteina ćelijskih membrana, RNK i DNK, a remete i metabolizam sterola i lipida. Yoshimura et al. (2004) utvrdili su EC50 vrednosti za iprodion za izolate M. fructicola u intervalu od 0,01 do 0,65 µg/ml, dok se osetljivost izolata M. fructicola iz Pregled literature 30 Koreje kretala u intervalu od 0,021-399 µg/ml (Lim et al., 2001). Stević i Vukša (2006) takoĎe su ispitivali parametre osetljivosti izolata M. laxa na iprodion i utvrdili EC50 vrednosti u intervalu od 125 do 301 µg/kg. Razvoj rezistentnosti gljiva na dikarboksimide, prvenstveno iprodion, utvrĎen je u drugoj polovini XX veka. Rezistentnost je zabeležena kod B. cinerea (Pommer and Lorenz, 1982; Beever and Brein, 1983), M. fructicola (Ritchie, 1982), Sclerotinia homeocarpa (Detweiler et al., 1983), Sclerotium cepivorum (Littley and Rahe, 1984) i Alternaria alternata (McPhee, 1980; Ma et al., 2003b). Rezistentnost M. fructicola na iprodion nije još uvek utvrĎena u SAD, ali je detektovana na Novom Zelandu i u Australiji (Yoshimura et al., 2004). 2.9.3. Imidazoli i triazoli Derivati imidazola i triazola spadaju u grupu heterocikličnih jedinjenja. Imidazoli su petočlana heterociklična jedinjenja sa dva atoma azota, a triazoli sa tri atoma azota. N-derivati imidazola i triazola inhibiraju biosintezu ergosterola gljiva i najpre su bili označeni kao EBIs (Ergosterol Biosynthesis Inhibitors). Ergosterol je glavni konstitutivni i funkcionalni deo ćelijskih membrana gljiva i predstavlja najvažniji sterol kod većine gljiva (Buchenauer, 1987). MeĎutim, ustanovljeno je da postoje gljive kojima osnovni sterol nije ergosterol, tako da je termin EBIs zamenjen izrazom SBIs (Sterol Biosynthesis Inhibitors). Fungicidi iz ovih hemijskih grupa inhibiraju demetilaciju ugljenika kod prekursora ergosterola, i to kod lanosterola u položaju C-14 ili u položaju C-24 kod metilen dihidrolanosterola, i označeni su kao DMI fungicidi (DeMethylation Inhibitors) (Kuck et al., 1995). UtvrĎeno je da se nesupstituisani azot u heterocikličnom prstenu fungicida vezuje za gvožĎe u citohromu P-450, formirajući superoksid – Fe3+ kompleks, koji inhibira dioksigene reakcije neophodne za hidroksilaciju 14 α-metil grupe intermedijera sterola, što rezultira akumulacijom 14 α-metilovanih sterola (Buchenauer, 1987). Kao posledica rane inhibicije sinteze ergosterola dolazi do akumulacije intermedijera koji sadrže metil grupu - metilovanih sterola, prvenstveno eburikola, obtusifoliola i 14 α-metilfekosterola, dok se sadržaj ergosterola u ćelijskim membranama smanjuje (Nozawa and Morita, 1986). Gljive su na taj način lišene Pregled literature 31 ergosterola, ali je najverovatnije njihov rast smanjen zbog akumulacije metilovanih sterola, koji izazivaju povećanje permeabilnosti membrana, promenu aktivnosti vezanih enzima u membrani i promene u usvajanju hranljivih materija (Buchenauer, 1987). Ovi fungicidi ne inhibiraju klijanje spora gljiva, ali veoma efikasno i u malim koncentracijama sprečavaju rast micelije. Rezultati Schnabel and Bryson (2004) ukazuju na visoku efikasnost DMI fungicida protiv Monilinia spp. ali ističu da ona može izostati u godinama sa velikim infekcionim potencijalom patogena. Yoshimura et al. (2004) utvrdili su osetljivost izolata M. fructicola na tebukonazol (EC50 0,0059-0,0607 µg/ml), pri čemu je samo 4% izolata imalo EC50>0,025 µg/ml. Stević i Vukša (2006) ispitivali su parametre osetljivosti izolata M. laxa i utvrdili EC50 za tebukonazol 14-41 µg/kg. Zehr et al. (1999) poredili su osetljivost izolata M. fructicola na propikonazol u periodu od nekoliko godina i utvrdili da je došlo do promene u osetljivosti izolata, da su izolati istog porekla tokom godina postajali manje osetljivi. Osim toga i istraživanja May-De Mio et al. (2011) pokazuju promene u osetljivosti populacija M. fructicola na tebukonazol. Izolati M. fructicola prikupljeni tokom 2000-2004. godine imaju znatno niže EC50 vrednosti (0,01-0,27 µg/ml) od izolata prikupljenih tokom 2005-2008. godine (0,01->100 µg/ml). Osim toga, autori su detektovali u novim populacijama 15,8% izolata rezistentnih na tebukonazol. Chen et al. (2012) ispitivali su osetljivost izolata M. fructicola na novi fungicid iz grupe DMI fungicida SYP-Z048. EC50 vrednosti izolata M. fructicola za novi fungicid kretale su se u intervalu od 0,003 do 0,047 µg/ml i ukazale na visoku osetljivost izolata i odsustvo rezistentnosti. Ubrzo nakon uvoĎenja DMI fungicida detektovana je rezistentnost velikog broja patogena u laboratorijskim uslovima, dok je rezistentnost u polju potvrĎena kod manjeg broja patogena. S obzirom na veoma široku primenu u velikom broju useva, rezistentnost na DMI fungicide razvija se sporije u odnosu na druge fungicide sa specifičnim mehanizmom delovanja. Nije detektovana rezistentnost izolata M. fructicola na fungicide iz ove grupe, ali je utvrĎena smanjena osetljivost izolata M. fructicola na propikonazol (Yoshimura et al., 2004). Genetski mehanizmi razvoja rezistentnosti na DMI fungicide su različiti, ali najčešće dolazi do mutacije u okviru gena za 14 α-metilazu (CYP51) ili do njegove pojačane ekspresije. Kod fitopatogene gljive M. fructicola utvrĎeno je prisustvo Pregled literature 32 genetičkog motiva „Mona“ u okviru gena MfCYP51 koji se smatra odgovornim za rezistentnost ove vrste (Luo et al., 2008). MeĎutim, istraživanja Villani and Cox (2011) pokazala su da „Mona“ nije stabilan element koji može ukazati na rezistentnost jer su kod nekih izolata dokazali rezistentnost u in vitro testovima, ali nisu detektovali prisustvo „Mona“ elementa. Autori su na osnovu ovih istraživanja zaključili da „Mona“ element ne može biti pouzdan karakter za detekciju rezistentnih izolata M. fructicola na DMI fungicide. 2.9.4. Strobilurini Strobilurini prvi put su identifikovani krajem osamdesetih godina XX veka kada su izolovani iz pojedinih gljiva iz klase Basidiomycetes. Za ove supstance utvrĎeno je da poseduju fungicidno i fungistatično delovanje, ali je njihova šira primena izostala zbog izražene fotodegradibilnosti. Na osnovu karakteristika ovih prirodnih jedinjenja stvorene su sintetičke supstance koje imaju istu osnovnu strukturu, ali znatno stabilnije molekule. Prvi fungicidi iz grupe strobilurina koji su se sredinom 90-ih godina prošlog veka pojavili na tržištu bili su azoksistrobin i kresoksim-metil (Sauter et al., 1999). Najznačajniji predstavnici ove grupe su azoksistrobin, trifloksistrobin i piraklostrobin. Fungicidi iz grupe strobilurina imaju specifičan mehanizam delovanja koji nije bio poznat do njihovog otkrića. Ove supstance vezuju se za proteinske podjedinice citohrom bc1 kompleksa u okviru elektron transportnog lanca, koji je smešten u unutrašnjoj membrani mitohondrija, remeteći proces ćelijskog disanja kod gljiva (Sauter et al., 1995; Jordan et al., 1999; Tamura and Mizutani, 1999; Fisher and Meunier, 2008). Strobilurini se vezuju za ubikvinol oksidazni (Qo) centar citohroma b, što za posledicu ima prekid transfera elektrona sa ubikvinola na citohrom C14 (Fraaje et al., 2003). S obzirom da inhibiraju ubikvinol osidazu (Qo), strobilurini i njima slična jedinjenja, gde spadaju oksazolidindioni (famoksadon) i imidazolinoni (fenamidon), u anglosaksonskoj literaturi veoma često se označavaju sa QoI fungicidi (skraćeno od Qo- Inhibitors) (FRAC, 2004). Kod nekih gljiva i biljaka, inhibitori respiratornog lanca i drugi stresni faktori mogu indukovati stvaranje takozvane alternativne oksidaze. Ova alternativna oksidaza Pregled literature 33 posredno utiče na proces disanja tako što preusmerava elektrone na ubikvinol (Q) i tako ćelije gljiva postaju manje osetljive na dejstvo ovih jedinjenja (Ypema and Gold, 1999). U in vitro testovima osetljivosti gljiva i pseudogljiva na fungicide koji remete procese disanja uočeno je da pojedine vrste poseduju sposobnost aktiviranja alternativnog načina disanja. Patogen se nesmetano razvija čak i u prisustvu visokih koncentracija fungicida, zbog čega se dobija lažna slika rezistentnosti izolata na ova jedinjenja. Ovaj fenomen se vezuje isključivo za laboratorijska ispitivanja osetljivosti i nije prisutan u ispitivanjima efikasnosti in vivo. Jedno od objašnjenja ove pojave je da biljka domaćin produkuje flavonoide i da su oni odgovorni za sprečavanje stvaranja alternativnih oksidaza. Kako bi se sprečilo korišćenje alternativnog disajnog puta u ogledima ispitivanja osetljivosti in vitro koristi se salicilhidroksamična kiselina (SHAM), supstanca koja inhibira aktiviranje alternativnih oksidaza (Ziogas et al., 1997). U istraživanjima Burnett et al. (2010) od tri fungicida iz ove hemijske grupe najbolji antisporulant protiv M. fructicola bio je trifloksistrobin. Azoksistrobin je ispoljio umerenu, a kombinacija piraklostrobin+boskalid najslabiju efikasnost. Spiegel and Stammler (2006) ispitivali su osetljivost izolata M. laxa i M. fructigena na piraklostrobin i utvrdili da nema razlike u osetljivosti izmeĎu izolata različitog porekla. Na osnovu ovih istraživanja preporučili su koncentraciju od 2,5 ppm kao diskriminacionu dozu za identifikaciju rezistentnih sojeva Monilinia spp. Stević i Vukša (2006) takoĎe su utvrdili da nema velike razlike u osetljivosti na trifloksistrobin izmeĎu izolata M. laxa različitog porekla; EC50 vrednosti za trifloksistrobin bile su 4-9 µg/kg. Kada su strobilurini uvedeni u primenu, pretpostavljalo se da će gljive teško razviti rezistentnost na ova jedinjenja zbog potpuno novog i do tada nepoznatog mehanizma delovanja. MeĎutim, do pojave rezistentnosti došlo je mnogo ranije nego što se očekivalo. Rezistentnost na strobilurine prvi put je registrovana na severu Nemačke, gde su pronaĎeni rezistentni sojevi Blumeria (Erysiphe) graminis (Ishii et al., 2001). TakoĎe, rezistentnost je detektovana i kod mnogih drugih vrsta gljiva, pa i M. fructicola (Amiri et al., 2010). U većini slučajeva rezistentnost na QoI fungicide rezultat je tačkaste mutacije u mitrohondrijalnom genu citohroma b. U položaju 143 dolazi do supstitucije glicina Pregled literature 34 alaninom (G143A), dok u položaju 129 dolazi do zamene fenilalanina leucinom. Miessner and Stammler (2010) ispitivali su značaj mesta mutacije G143A za razvoj rezistentnosti vrsta roda Monilinia na QoI fungicide. 2.9.5. Pirimidil-etil-benzamidi Pirimidil-etil-benzamidi poznati su kao inhibitori sukcinat dehidrogenaze (SDH) u respiratornom lancu i imaju značajnu ulogu u zaštiti useva i zasada od razlicitih fitopatogenih gljiva. Ovi molekuli vezuju se za proteinski kompleks II u mitohondrijalnom respiratornom lancu i na taj način remete proces disanja. Zahvaljujući ovom jedinstvenom mehanizmu delovanja, nije utvrĎena ukrštena rezistentnost jedinjenja iz ove grupe sa jedinjenjima iz drugih hemijskih grupa, kao što su strobilurini, benzimidazoli ili aminopirimidini (Avenot et al., 2008). Fluopiram je jedan od novijih fungicida iz grupe pirimidil-etil-benzamida sa sistemičnim načinom delovanja. Budući da je fluopiram nova aktivna materija iz ove grupe još uvek nema mnogo podataka o njegovom delovanju na Monilinia spp. U istraživanjima Hu et al. (2011b) utvrĎeno je da za ispitivanje osetljivost izolata M. fructicola na fluopiram nije pogodna PDA podloga jer su EC50 vrednosti bile više od 100 µg/ml za pojedine izlolate što nije saglasno sa rezultatima drugih autora (Amiri et al., 2010). Kada su za ispitivanje osetljivosti izolata M. fructicola upotrebili druge hranljive podloge dobili su potpuno drugačije rezultate. EC50 vrednosti na MM podlozi (minimal medium) za fluopiram kretale su se u intervalu od 0,059-15,6 µg/ml (Hu et al., 2011b). 2.9.6. Karboksamidi Karboksamidi su sistemični fungicidi koji inhibiraju enzim sukcinat dehidrogenazu koji predstavlja funkcionalnu jedinicu ciklusa trikarboksilnih kiselina i elektrontransportnog sistema mitohondrija, uglavnom bazidiomiceta (Kulka and Von Schelming, 1995; Spiegel and Stammler, 2006). Selektivnost ove grupe fungicida zasniva se na razlici u osetljivosti enzima na delovanje fungicida i/ili na mogućnosti Pregled literature 35 dospevanja fungicida do mesta delovanja (Leroux, 2004). Novi fungicid širokog spektra delovanja iz ove grupe je boskalid. Spiegel and Stammler (2006) ispitivali su osetljivost izolata M. laxa i M. fructigena na boskalid i utvrdili da nema razlike u osetljivosti izmeĎu izolata različitog porekla. Na osnovu ovih istraživanja preporučili su koncentraciju od 2,5 ppm kao diskriminacionu dozu za detekciju rezistentnih sojeva Monilinia spp. Sa druge strane, Hu et al. (2011b) ispitujući osetljivost izolata M. fructicola na boskalid pokazali su da PDA podloga u koju je inkorporiran fungicid nije pogodna za ispitivanje osetljivosti. EC50 vrednosti bile su više od 100 µg/ml za pojedine izlolate što nije saglasno sa rezultatima drugih autora kod kojih je utvrĎena EC50 vrednost bila manja od 10 µg/ml (Amiri et al., 2010). Kada su za ispitivanje osetljivosti izolata M. fructicola na boskalid upotrebili druge hranljive podloge dobili su potpuno drugačije rezultate. EC50 vrednosti na MM podlozi (minimal medium) za boskalid bile su 0,013-2,10 µg/ml (Hu et al., 2011b). Rezistentnost na boskalid još uvek nije detektovana za vrste roda Monilinia (Spiegel and Stammler, 2006), ali je detektovana za druge fitopatogene gljive - Alternaria alternata, Corynespora cassiicola, Botrytis cinerea, Didymella bryoniae, Podosphaera xanthii i Sclerotinia sclerotiorum (Avenot and Michailides, 2010). Kao razlog pojave rezistentnosti autori navode mutacije na genu AaSDHB kod A. alternata, genu SDH B kod B. cinerea, H278Y kod C. cassiicola, D. bryoniae i P. xanthii. Ciljevi istraživanja 36 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA U programu istraživanja ove doktorske disertacije postavljeni su sledeći ciljevi: - Da se utvrdi prisustvo, rasprostranjenost i značaj gljiva iz roda Monilinia, prouzrokovača sušenja cvetova, grana i grančica i mrke truleži plodova koštičavih voćaka u Srbiji. - Da se izvrši precizna i pouzdana identifikacija dobijenih izolata do nivoa vrste primenom morfoloških i molekularnih metoda identifikacije. - Da se prouče morfološke, odgajivačke, ekološke i patogene osobina izolata Monilinia spp. - Da se izvrši molekularna karakterizacija vrsta roda Monilinia sekvencioniranjem ITS regiona odabranih izolata, njihovim međusobnim poređenjem i određivanjem filogenetskog međuodnosa sa izolatima Monilinia spp. u svetu. - Da se ispita intraspecijska varijabilnost M. fructicola primenom SSR markera i odrede putevi introdukcije ove vrste u Srbiju. - Da se ispita osetljivost izolata Monilinia spp. na fungicide različitih mehanizama delovanja koji se uobičajeno koriste za njihovo suzbijanje. - Da se prouči osetljivost izolata Monilinia spp. na različite agense za biološku zaštitu - antagonističke mikroorganizme i etarska ulja i utvrdi mogućnost njihove upotrebe za suzbijanje Monilinia spp. Materijal i metode 37 4. MATERIJAL I METODE 4.1. Sakupljanje uzoraka obolelih biljaka Uzorci obolelih delova koštičavih voćaka sa simptomima sušenja cvetova, grana i grančica i mrke truleži plodova sakupljeni su tokom trogodišnjeg perioda od 2010. do 2012. godine. Sakupljanje početnog materijala za ispitivanje obavljeno je sa 119 lokaliteta iz 15 različitih okruga na teritoriji Republike Srbije. Biljni organi sa simptomima nalik simptomima koje prouzrokuju vrste roda Monilinia sakupljani su u zasadima i zelenim pijacama sa šest vrsta koštičavih voćaka: breskve (Prunus persica), kajsije (Prunus armeniaca), nektarine (Prunus persica var. nectarina), šljive (Prunus domestica), trešnje (Prunus avium) i višnje (Prunus cerasus). Nakon sakupljanja, zaraženi biljni delovi pakovani su pojedinačno u papirne kese, obeleženi i transportovani do Laboratorije za primenjenu fitopatologiju Instituta za pesticide i zaštitu životne sredine u Beogradu, gde su dalje ispitivani. 4.2. Izolacija patogena Iz sakupljenih uzoraka obavljena je izolacija patogena primenom standardnih fitopatoloških metoda (Dhingra and Sinclair, 1995). Sitni fragmenti sa prelaza zdravog i obolelog tkiva isecani su sterilnim skalpelom, zatim površinski sterilisani u 2% rastvoru natrijum hipohlorita (NaOCl, 1:1 komercijalna varikina) u trajanju od jedan do dva minuta i preneti na sterilnu PDA podlogu (podloga od krompira, dekstroze i agara, potato dextrose agar, PDA) (200 g krompira, 20 g dekstroze, 17 g agara, 1 l destilovane vode) (Muntañola-Cvetković, 1987). Zasejane podloge inkubirane su u mraku, na temperaturi od 24°C do pojave kolonija gljiva. Nakon inkubacije, kolonije koje po tipu porasta odgovaraju vrstama roda Monilinia u aseptičkim uslovima presejane su na svežu podlogu sa ciljem dobijanja čiste kulture gljive. Dobijeni izolati označeni su kombinacijom slova i brojeva pri čemu prvo slovo predstavlja biljku domaćina sa kojeg je izvršena izolacija (K-kajsija, B-breskva, S- šljiva, T-trešnja, V-višnja, N-nektarina), drugo slovo - deo biljke sa koje je izvršena izolacija (P-plod, G-grančica, C-cvet), a naredna slova - lokalitete sa kojih potiču. Materijal i metode 38 4.3. Dobijanje čistih kultura monosporijalnih izolata i njihovo čuvanje Sa ciljem dobijanja monosporijalnih izolata iz čistih kultura dobijenih izolata starosti sedam dana, odgajenih na PDA podlozi pripremane su suspenzije konidija. U kulture je dodato po 10 ml sterilne vode i blagim struganjem pomoću staklenog štapića obavljeno je osloboĎanje micelije i konidija od podloge. Po 100 µl tako dobijene suspenzije spora razliveno je na površinu podloge od vodenog agara (water agar, WA), pripremljene od 17 g agara i 1 l destilovane vode (Dhingra and Sinclair, 1995). Nakon inkubacije u termostatu na temperaturi 24°C u trajanju od 18-20 h, direktnim mikroskopiranjem obeležavane su i izdvajane pojedinačne proklijale konidije svakog izolata, a zatim su sterilnom iglom prenete na novu PDA podlogu. Dobijeni monosporijalni izolati su zatim presejani u epruvete sa zakošenom PDA podlogom i nakon razvoja kultura na temperaturi od 24°C, čuvane u frižideru na temperaturi od 4°C (Dhingra and Sinclair, 1995). Izolati su presejavani jednom godišnje. Za dugotrajno čuvanje izolati su skladišteni u 20% glicerolu na temperaturi od -80°C. 4.4. Provera patogenosti izolata Patogenost svih dobijenih monosporijalnih izolata proverena je veštačkom inokulacijom povreĎenih i nepovreĎenih plodova biljaka domaćina sa kojih su izolovani (Vignutelli et al., 2002). Inokulacija je obavljena nanošenjem fragmenata micelije izolata (prečnika 3 mm), uzetih sa ivice kolonija starosti sedam dana odgajenih na PDA podlozi, na prethodno površinski dezinfikovane zdrave plodove. Na plod u kontroli nanošen je fragment sterilne PDA podloge. Inokulisani plodovi inkubirani su u vlažnoj komori na temperaturi od 24°C, a pojava simptoma posmatrana je svakodnevno tokom 10 dana. Nakon pojave simptoma mrke truleži, sa inokulisanih plodova uraĎena je reizolacija patogena na PDA podlogu korišćenjem istih metoda kao i pri izolaciji. Dobijeni reizolati uporeĎeni su sa izolatima korišćenim za inokulaciju radi potvrde da su dobijeni simptomi truleži inokulisanih plodova posledica patogene aktivnosti izolata. Za dalji rad korišćeni su reizolati. Materijal i metode 39 4.5. Identifikacija patogena Nakon dobijanja 246 izolata nalik izolatima Monilinia spp. pristupilo se identifikaciji do nivoa vrste na osnovu proučavanja patogenih, morfoloških, odgajivačkih i ekoloških karakteristika i potvrde identifikacije primenom lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR). Provera patogenosti, proučavanje specifičnih morfoloških karakteristika koje je opisao Lane (2002) (boja kolonije, odlike ruba i oblik kolonije, sporulacija, prisustvo koncentričnog prstena spora, kvalitativna brzina porasta i prisustvo crne marginalne linije) i molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije uraĎeni su sa svim prikupljenim izolatima. Na osnovu preliminarnih istraživanja pomenutih kriterijuma, pre svega morfoloških, izvršen je odabir reprezentativnih izolata (Tabela 1) – predstavnika preliminarno identifikovanih vrsta Monilinia spp. za detaljnija proučavanja patogenih, morfoloških, odgajivačkih, ekoloških i molekularnih karakteristika, kao i za ispitivanje osetljivosti na fungicide. Za proučavanje efekata etarskih ulja i antagonističkih sojeva bakterije Bacillus subtilis na Monilinia spp., kao i mogućnosti njihove praktične primene, odabran je po jedan reprezentativni izolat od svake vrste. Materijal i metode 40 Tabela 1. Izolati Monilinia spp. odabrani za dalja proučavanja Vrsta Oznaka izolata Lokalitet Biljka domaćin Godina izolacije M. laxa TPGR Grocka Trešnja 2010. ŠMLEs Leskovac Šljiva 2010. ŠPSV Slankamenački Vinogradi Šljiva 2010. TPBN Bosut Trešnja 2010. ŠMLE Leskovac Šljiva 2010. VGRSD Smederevo Višnja 2011. BPSV Slankamenački Vinogradi Breskva 2012. BMLEs Leskovac Breskva 2010. TPAL Alibegovac Trešnja 2010. NPSP Stara Pazova Nektarina 2012. BPČO Čortanovci Breskva 2012. TPRŠ Rimski Šančevi Trešnja 2012. TPLČ Loznica (ČA) Trešnja 2012. BPZK Zaklopača Breskva 2012. VGRSE Sečanj Višnja 2010. VPSV Slankamenački Vinogradi Višnja 2012. ŠPIV Ivanjica Šljiva 2012. VPJR Jermenovac Višnja 2012. KPGO Golobok Kajsija 2012. KPGG Gornja Gorevnica Kajsija 2012. NPVI Vinča Nektarina 2012. M. fructigena BŠPBA Bare Šljiva 2012. VPBG Beograd Višnja 2010. ŠPPR Preljina Šljiva 2012. TPGO Golobok Trešnja 2012. ŠPBA Bare Šljiva 2012. M. fructicola NPGM Topola Nektarina 2011. NPUD1 Udovice Nektarina 2012. NPUD2 Udovice Nektarina 2012. Materijal i metode 41 4.6. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. Proučavanje morfoloških odlika obuhvatilo je proučavanje makroskopskih i mikroskopskih karakteristika odabranih izolata patogena. Makroskopske morfološke karakteristike svih dobijenih izolata proučavane su nakon inkubacije od 10 dana na PDA podlozi na temperaturi od 22°C. Posmatrane su karakteristične osobine prema navodima Lane (2002): boja kolonije, odlike ruba i oblik kolonije, sporulacija, prisustvo koncentričnog prstena spora, kvalitativna brzina porasta i prisustvo crne marginalne linije. Od mikroskopskih osobina odabranih izolata ispitivane su: izgled konidiofora, oblik i veličina konidija, koncentracija konidija po jedinici površine, način klijanja konidija, kao i dužina kličinih cevčica pre prvog grananja (Muntañola-Cvetković, 1987; Dhingra and Sinclair, 1995; van Leeuwen and van Kesteren, 1998; De Cal and Melgarejo, 1999). Od kultura izolata gajenih 10 dana na MA (malt) podlozi pripremani su privremeni mikroskopski preparati za posmatranje izgleda konidiofora i konidija. Preparat je pripreman u kapi sterilne vode u koju je sterilnom iglom nanošen fragment kolonije bez podloge, a potom prekriven pokrovnim staklom i posmatran uz pomoć optičkog mikroskopa Olympus CX41, pod uvećanjima od 40x do 100x. Na preparatima pripremanim na opisan način odreĎivana je veličina konidija odabranih izolata prosekom obračunatim za najmanje 100 ponovljenih merenja. Sve dimenzije merene su na slučajno odabranim, potpuno formiranim i zrelim konidijama u vidnom polju privremenog preparata. Od kultura iste starosti pravljena je suspenzija spora dodavanjem iste zapremine sterilne destilovane vode po jedinici površine i izvršeno je merenje koncentracije spora pomoću hemocitometra. Konidije su isprane sa 10 ml sterilne vode nakon čega je odreĎena koncentracija spora. Brojanje je izvršeno u tri ponavljanja za svaki odabrani izolat. Za odreĎivanje načina klijanja konidija i dužine kličine cevčice, kao i za utvrĎivanje procenta klijavosti konidija, 100 µl suspenzije konidija zasejano je na WA podlozi i ravnomerno rasporeĎeno korišćenjem sterilnog staklenog štapića. Nakon inkubacije od 18 h na temperaturi od 24°C u mraku posmatran je način klijanja konidija Materijal i metode 42 i merena dužina kličine cevčice od konidije do mesta prvog grananja. Mereno je 50 kličinih cevčica za svaki izolat, a eksperiment je ponovljen najmanje jednom. 4.7. Praćenje brzine porasta izolata Monilinia spp. Fragmenti micelije 12 odabranih izolata prečnika 3 mm, uzetih sa ivice sedam dana stare kolonije gljive gajene na PDA podlozi, nanošeni su na PDA podlogu u Petri kutijama prečnika 90 mm i inkubirani sedam dana na temperaturi od 24°C. Prečnik kolonije je meren u dva pravca pod pravim uglom i preračunavan je dnevni porast izolata. Ogled je izveden u četiri ponavljanja, a podaci su statistički obraĎeni. 4.8. Odgajivačke karakteristike izolata Monilinia spp. Od odgajivačkih odlika proučen je uticaj pet različitih hranljivih podloga i uticaj 12 vrednosti kiselosti PDA podloge na porast 12 odabranih izolata. Uticaj hranljivih podloga. Brzina porasta ispitivanih izolata praćena je na sledećim podlogama: krompir-dekstrozni agar (PDA, potato dextrose agar; Muntañola-Cvetković, 1987): krompir 200 g dekstroza 20 g agar 17 g destilovana voda 1 l vodeni agar (WA, water agar; Dhingra and Sinclair, 1995): agar 17 g destilovana voda 1 l Čapek agar (CzA, Czapek agar; Muntañola-Cvetković, 1987): NaNO3 3 g K2HPO4 1 g MgSO4 x 7H2O 0,50 g KCl 0,50 g FeSO4 x 7H2O 0,01 g Materijal i metode 43 saharoza 30 g agar 15 g destilovana voda 1 l malt agar (MA, malt agar; Muntañola-Cvetković, 1987): industrijski slad 500 ml agar 17 g destilovana voda 500 ml V8 agar (V8A, vegetable-8 juice agar; Miller, 1955): sok svežeg paradajza 200 ml CaCO3 3 g agar 17 g destilovana voda 800 ml Pripremljene podloge razlivane su u Erlenmajer kolbe i sterilisane u autoklavu 20 minuta, na temperaturi od 120°C i pri pritisku od 0,2 MPa. U Petri kutije prečnika 90 mm sa odgovarajućom podlogom naneti su isečci podloge sa micelijom prečnika 3 mm, uzeti sa ivice kolonije gljive gajene na PDA podlozi tokom sedam dana. Zasejane Petri kutije inkubirane su na temperaturi od 24°C u mraku. Brzina porasta merena je sedam dana nakon zasejavanja, merenjem prečnika kolonije u dva pravca pod pravim uglom. Ogled je izveden u dva nezavisna eksperimenta sa po tri ponavljanja, a podaci su statistički obraĎeni. Uticaj kiselosti podloge. Za ispitivanje uticaja kiselosti podloge na porast izolata korišćena je PDA podloga. Kiselost podloge je podešena na 12 vrednosti nakon sterilizacije u intervalu od pH 2 do pH 12 pomoću 0,1N HCl i 0,1N NaOH (Dhingra and Sinclair, 1995). Porast izolata praćen je nakon sedam dana od zasejavanja na temperaturi od 24°C u mraku, merenjem prečnika kolonije u dva pravca pod pravim uglom. Ogled je izveden u dva nezavisna eksperimenta sa po tri ponavljanja, a podaci su statistički obraĎeni. 4.9. Ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. Proučavanje ekoloških osobina obuhvatilo je uticaj abiotskih faktora, temperature i osvetljenja na porast odabranih izolata. Materijal i metode 44 Uticaj temperature. Uticaj temperature na porast izolata praćen je zasejavanjem izolata na PDA podlogu na već opisan način. Nakon zasejavanja, Petri kutije inkubirane su u mraku na sledećim temperaturama: 18, 20, 23, 25, 28 i 30°C. Porast izolata i način merenja uraĎen je po postupku opisanom kod gajenja gljiva na različitim hranljivim podlogama. Ogled je izveden u dva nezavisna eksperimenta sa po tri ponavljanja, a podaci su statistički obraĎeni. Uticaj ekstremnih temperatura. Uticaj ekstremnih temperatura na porast izolata praćen je inkubiranjem izolata zasejanih na PDA podlogu na temperaturama nižim od 4°C (od 0°C do 4°C) i višim od 30°C (od 30°C do 35°C), kako bi bile utvrĎene granične temperature porasta odabranih izolata. Porast izolata i način merenja obavljen je po postupku opisanom kod gajenja gljive na različitim hranljivim podlogama. Ogled je izveden u dva nezavisna eksperimenta sa po tri ponavljanja, a dobijeni rezultati statistički obraĎeni. Uticaj svetlosti. Porast ispitivanih izolata proučavan je zasejavanjem gljive na PDA podlozi, koja je potom inkubirana sedam dana na temperaturi od 24°C u različitim uslovima osvetljenja: stalni mrak i svetlosni režim 12 h svetlost/12 h mrak. Ogled je izveden u dva nezavisna eksperimenta sa po tri ponavljanja, a podaci su statistički obraĎeni. 4.10. Testovi unakrsne patogenosti Za testove virulentnosti odabrano je ukupno devet ispitivanih izolata, po četiri izolata M. laxa i M. fructigena dobijenih sa različitih biljaka domaćina i lokaliteta i jedan izolat M. fructicola poreklom sa ploda nektarine (Tabela 1). Virulentnost odabranih izolata proučavana je veštačkim inokulacijama povreĎenih zrelih plodova koštičavih voćaka: breskve, kajsije, nektarine, šljive, trešnje i višnje (Vignutelli et al., 2002). Plodovi koštičavih voćaka pre postavljanja ogleda površinski su dezinfikovani potapanjem u 0,5% rastvor NaClO u trajanju od pet minuta, a zatim ispirani tri puta sterilnom destilovanom vodom i prosušeni na filter papiru u aseptičnim uslovima. Potom je svaki plod povreĎivan konusnom iglom prečnika 4 mm i dubine 3 mm. U povrede je nanošen fragment micelije prečnika 3 mm uzet sa ivice kulture starosti sedam dana gajene na PDA podlozi. Kao negativna kontrola korišćeni su plodovi u koje Materijal i metode 45 je nanošen fragment sterilne PDA podloge. Za svaki izolat, za svakog domaćina, test je obavljen na ukupno 15 plodova (u tri ponavljanja sa po pet plodova). Inokulisani plodovi inkubirani su u vlažnoj komori na temperaturi od 24°C i relativnoj vlažnosti vazduha od 97%. Veličina truleži merena je nakon jedan, dva i tri dana inkubacije, a brzina širenja truleži je izračunavana na osnovu razlike u veličini lezije merene izmeĎu dva dana (mm po danu). Dobijeni rezultati statistički su obraĎeni. 4.11. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija 4.11.1. Molekularna detekcija i identifikacija Molekularna detekcija i identifikacija ispitivanih izolata Monilinia spp. obavljena je primenom metode lančane reakcije polimeraze (polimerase chain reaction, PCR) po protokolu koji su opisali White et al. (1990) i Côté et al. (2004) (Tabela 2). Tabela 2. Pregled prajmera primenjenih za detekciju i identifikaciju Monilinia spp. Ciljana sekvenca Naziv prajmera Sekvenca 5'-3' Veličina fragmenta Literaturni izvor ITS rDNK MO368-5 MO368-8R MO368-10R Laxa-R2 GCA AGG TGT CAA AAC TTC CA AGA TCA AAC ATC GTC CAT CT AAG ATT GTC ACC ATG GTT GA TGC ACA TCA TAT CCC TCG AC 351-535 bp Côté et al., 2004 ITS rDNK ITS1 ITS4 TCC GTA GGT GAA CCT GCG G TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 500-600 bp White et al., 1990 4.11.2. Priprema izolata Za potrebe molekularne detekcije i identifikacije svi izolati su zasejavani na PDA podlogu i inkubirani u mraku na temperaturi od 24°C. Nakon inkubacije u trajanju od sedam dana iz razvijene kolonije gljive sakupljena je vazdušna micelija sterilnim skalpelom koja je korišćena za ekstrakciju ukupnih DNK. Sakupljanje micelije uraĎeno je pažljivo kako bi se izbeglo unošenje fragmenata podloge u materijal za ekstrakciju. Materijal i metode 46 4.11.3. Izolacija DNK Izolacija ukupne količine dezoksiribonukleinskih kiselina (DNK) obavljena je po metodi koju su opisali Harrington and Wingfiled (1995), korišćenjem komercijalnog preparata PrepmanX (Applied Biosystems, SAD), po uputstvima proizvoĎača. Uzorak micelije odgajene na PDA podlozi uronjen je u 50 µl PrepmanX-a i inkubiran 30 min na temperaturi od 56°C, a potom 10 min na temperaturi od 100°C. Uspeh izolacije DNK i pogodnost za PCR reakciju proverena je amplifikacjiom fragmenta veličine oko 600 bp univerzalnim prajmerima ITS1 i ITS4 (White et al., 1990). Sastav reakcione smeše i uslovi PCR reakcije navedeni su kasnije u tekstu. 4.11.4. Molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije Identitet izolata utvrĎen na osnovu patogenih, morfoloških, odgajivačkih i ekoloških karakteristika, potvrĎen je specifičnom molekularnom detekcijom, primenom reakcije lančanog umnožavanja specifičnog fragmenta DNK uz korišćenje prajmera: MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2, po protokolu Côté et al. (2004). Reakciona smeša, finalne zapremine 25 µl, pripremljena je od: 12,5 µl 2 x PCR Master mix (Fermentas, Lithuania), 7,5 µl RNase−free vode (Molecular Biology Grade Water, Eppendorf), po 1 µl svakog prajmera (100 pmol/μl) i 1 µl ekstrahovane DNK uzorka. Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša u koju je umesto DNK uzorka dodata RNase−free voda. PCR reakcije izvedene su u Eppendorf Master Cycler-u (Eppendorf, Germany) pri sledećim uslovima: 1 ciklus -inicijalna denaturacija DNK (95°C - 2 min) 35 ciklusa -denaturacija DNK (95°C - 15 s) -vezivanje prajmera (60°C - 15 s) -sinteza fragmenta DNK - elongacija (72°C - 1 min) 1 ciklus -finalna inkubacija (72°C - 3 min) Materijal i metode 47 4.11.5. Molekularna detekcija na osnovu amplifikacije ITS regiona Za molekularnu detekciju i identifikaciju odabrano je 18 izolata (11 izolata M. laxa: BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV; četiri izolata M. fructigena: BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO; tri izolata M. fructicola: NPGM, NPUD1 i NPUD2), dobijenih sa različitih lokaliteta, biljaka domaćina i biljnih delova, kojima je potvrĎena patogenost i koji su prethodno okarakterisani na morfološkom nivou (Tabela 1). Korišćen je jedan par univerzalnih prajmera (ITS1/ITS4) koji omogućava umnožavanje pet genskih segmenata DNK iz ITS (Internal transcribed spacer) regiona rDNK (deo 18S rRNK, ITS1, 5.8S rRNK, ITS2 i deo 28S rRNK). PCR reakcije obavljene su po protokolu koji su opisali White et al. (1990) u radnoj zapremini od 25 μl, korišćenjem 12,5 μl 2 x PCR Master mix-a (Fermentas, Lithuania), 9,5 μl RNase−free vode (Molecular Biology Grade Water, Eppendorf), po 1μl svakog prajmera i 1 μl izolovane ukupne DNK. U svim reakcijama kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša sa svim reagensima potrebnim za umnožavanje DNK u koju je umesto DNK uzorka dodavana RNase−free voda. PCR reakcija izvedena je u Eppendorf Master Cycler-u (Eppendorf, Germany) pri sledećim uslovima reakcije: 1 ciklus -denaturacija DNK (94°C - 1 min 30 s) 29 ciklusa -denaturacija DNK (94°C - 30 s) -vezivanje prajmera (55°C - 30 s) -sinteza fragmenta DNK - elongacija (72°C - 30 s) 1 ciklus -elongacija (72°C - 9 min) 4.11.6. Vizualizacija i analiza produkata PCR reakcije Vizuelizacija amplifikovanih produkata PCR reakcija obavljena je elektroforetskim razdvajanjem u agaroznom gelu u 1 x TBE puferu (90 mM Tris, 90 mM H3BO3, 1mM EDTA) pri naponu od 100V, bojenjem u 0,1% rastvoru etidijum bromida i posmatranjem pod UV svetlom. Za vizualizaciju produkata dobijenih u Multiplex PCR reakciji pripreman je 1,5% agarozni gel, a za produkte dobijene primenom univerzalnih prajmera ITS1/ITS4 1% agarozni gel, dobijen rastvaranjem odgovarajuće količine agaroze u 1 x TBE puferu i zagrevanjem do temperature Materijal i metode 48 ključanja u mikrotalasnoj pećnici. Nakon hlaĎenja do temperature od približno 60°C, gel je razliven u kalup aparata za horizontalnu elektroforezu (BluePower 500, Serva) u koji su prethodno postavljeni separatori i češljevi, nakon čega je ostavljen na sobnoj temperaturi 30 min da se ohladi i polimerizuje. Posle polimerizacije gela i uklanjanja češljeva, kalup je uranjan u kadicu za horizontalnu elektroforezu sa 1 x TBE puferom. Uzorci za elektroforezu pripremljeni su mešanjem 5 μl produkta PCR reakcije i 1 μl boje 6x Loading dye (Fermentas, Lithuania) i naliveni u bunarčiće po odgovarajućem rasporedu. Pri elekroforezi korišćen je 100 bp DNK marker (Fermentas, Lithuania) radi odreĎivanja veličine produkta poreĎenjem sa poznatom veličinom DNK fragmenata markera. Posle završene elektroforeze gel je bojen u rastvoru etidijum bromida u trajanju od 10 min. Amplifikovani fragmenti posmatrani su u mračnoj komori pomoću UV svetla na transiluminatoru (Vilber Lourmat, France). Pojava DNK fragmenata dobijenih u Multiplex PCR reakciji veličine oko 535 bp predstavlja pozitivnu reakciju za detektovanje M. fructicola, 425 bp za M. polystroma, 402 bp za M. fructigena i 351 bp za M. laxa. Sa druge strane, prisustvo amplikona dobijenih PCR reakcijom primenom ITS1/ITS4 prajmera dužine oko 500-600 bp označeno je kao pozitivna reakcija. 4.11.7. Prečišćavanje PCR produkta i sekvencioniranje Nakon uspešne amplifikacije korišćenjem ITS1/ITS4 para prajmera, za sekvencioniranje je odabrano 18 izolata vrsta roda Monilinia (Tabela 1). PCR produkti su pre sekvencioniranja prvo prečišćeni pomoću mi-PCR Purification Kit (Metabion International, Germany), po uputstvu proizvoĎača. U tubice sa PCR produktima dodat je DNA Binding Buffer (pufer za vezivanje) i to u zapremini pet puta većoj od količine PCR smeše i sve je dobro promešano. Smeša je zatim preneta u kolone i centrifugirana 1 min pri brzini od 12000 rpm na sobnoj temperaturi. Nakon centrifugiranja filtrat je odbačen, u kolone je dodato 750 µl Column Wash Buffer-a i centrifugirano 1 min pri brzini od 12000 rpm na sobnoj temperaturi. Zatim je u kolone dodato još 250 µl istog pufera, centrifugirano pri istim uslovima i na kraju je filtrat odbačen. Kolona je prebačena u novu tubicu u koju je potom dodato 50 µl destilovane vode. Nakon Materijal i metode 49 centrifugiranja u trajanju od 1 min pri brzini od 12000 rpm, u tubici ostaje filtrat sa DNK. Prečišćeni amplikoni poslati su na uslužno sekvencioniranje u oba smera na ABI 3730XL Automatic Sequencer u Macrogen Inc. (http://dna.macrogen.com, Korea). Dobijene sekvence obraĎene su u programu FinchTV Version 1.4.0., nakon čega su dobijene konsenzus nukleotidne sekvence podnete u GenBank bazu podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) i dodeljen im je pristupni broj (GenBank Accession Number). 4.11.8. Molekularna identifikacija i karakterizacija Molekularna identifikacija 18 odabranih izolata Monilinia spp. (BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR, VPSV, BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR, TPGO, NPGM, NPUD1 i NPUD2) (Tabela 1) obavljena je, nakon sekvencioniranja ITS genomnog regiona i njihove obrade, višestrukim uparivanjem sa sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti pomoću BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analize i softverskog paket MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Višestrukim poreĎenjem dobijenih sekvenci sa dostupnim sekvencama odgovarajućih regiona genoma gljiva u GenBank bazi podataka (http://blast.GenBank.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pomoću CLUSTAL W programa (Thompson et al., 1994), obavljena je potvrda identifikacije dobijenih sekvenci. Za proračun genetičke udaljenosti i najviši stepen nukleotidne sličnosti, takoĎe je upotrebljen softverski paket MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Molekularna karakterizacija ispitivanih izolata obavljena je rekonstrukcijom filogenetskog stabla čime je pružen uvid u tačno taksonomsko mesto i evolutivnu srodnost vrsta roda Monilinia. Za filogenetske analize odabrane su sekvence izolata BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV koji su identifikovane kao M. laxa, BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO identifikovane kao M. fructigena i NPGM, NPUD1 i NPUD2 identifikovane kao M. fructicola. UporeĎivanje je vršeno sa 38 sekvenci vrsta roda Monilinia dostupnih u GenBank bazi podataka (Tabela 3). Filogenetsko stablo rekonstruisano je korišćenjem Maximum Parsimony metode, integrisane unutar programa MEGA 5 i bootstrap analize u 1000 ponavljanja. Materijal i metode 50 Filogenetsko stablo rutovano je sa dve autgrupe, vrstama Botryotinia fuckeliana (GenBank Acc. No. HQ846943) i Sclerotinia sclerotiorum (HQ846942) za koji se smatra da su genetički bliske vrstama roda Monilinia. Tabela 3. Prikaz sekvenci roda Monilinia spp. dostupnih u GenBank bazi podataka korišćenih za filogenetske analize Vrsta Naziv izolata Biljka domaćin Poreklo izolata Gen Bank pristupni broj Literaturni navod M. laxa MDA12 Nepoznato SAD HQ846948 Zhu et al., 2011 BUL1A1 Šljiva Francuska AF150676 Ioos and Frey, 2000 Hirodai no. 3272 P. mume Japan AB125612 Harada et al., 2004 Sh675 Šljiva Čile EU042149 Tian et al., neobjavljeno ES14 Nepoznato Špain EF153016 Gell et al., 2007 CBS298.31 Nepoznato SAD HQ846949 Zhu et al., 2011 1067.k Jabuka Norveška Z73784 Holst-Jensen et al., 1997 Hirodai no. 2646 P. mume Japan AB125618 Harada et al., 2004 M. fructigena GENA4 Nepoznato Velika Britanija HQ846945 Zhu et al., 2011 3FG Dunja MaĎarska AM937109 Petróczy and Palkovics, neobjavljeno UASWS0643 Jabuka Švajcarska HQ166417 Lefort et al., neobjavljeno IHEM Kruška Belgija FJ515296 Fauche and Jacon, neobjavljeno 40FG Dunja MaĎarska AM937113 Petróczy and Palkovics, neobjavljeno WASWS0333 Jabuka Švajcarska EU098121 Crovadore et al., neobjavljeno W17 Nepoznato Špain EF207424 Gell et al., 2007 COY2M Šljiva Francuska AF150680 Ioos and Frey, 2000 1079.k Šljiva Norveška Z73781 Holst-Jensen et al., 1997 M. fructicola 99.2.G5.04 Nepoznato SAD DQ314730 Schnabel and Chai, neobjavljeno Ft Nepoznato Francuska HQ846967 Zhu et al., 2011 LH01 Red bayberry Kina AM887528 Chen, neobjavljeno W1 Nepoznato Španija EF207420 Gell et al., 2007 Hirodai no. 2636 Trešnja Japan AB125615 Harada et al., 2004 M1PL Nepoznato Poljska JX312665 Poniatowska et al., 2013 782.k Breskva Norveška Z73777 Holst-Jensen et al., 1997 M10020029 Breskva Slovenija GU967379 Munda and Viršček, 2010 P164 Nepoznato Italija FJ411110 Pellegrino et al., 2009 THF-1 Breskva Kina FJ515894 Xia and Yu, neobjavljeno BHY1 Nepoznato Kina HQ846927 Zhu et al., 2011 SLT2 Breskva Kina HQ846939 Zhu et al., 2011 NE18 Nepoznato Novi Zeland HQ846919 Zhu et al., 2011 LVN8 Nepoznato SAD HQ846966 Zhu et al., 2011 DAOM231119 Vinova loza Kanada AY289185 Sholberg et al., 2003 Nepoznato Jabuka Srbija JN176564 Vasić et al., 2012 M. polystroma HML3 Šljiva Kina GU067539 Zhu and Guo, 2010 2319 Nepozanto Japan HQ856916 Zhu et al., 2011 UFT Jabuka MaĎarska AM937114 Petróczy and Palkovics, 2009 AP1 Jabuka Poljska JF820317 Jabukowska et al., neobjavljeno MP13 Jabuka Srbija JX315717 Vasić et al., 2013 4.11.9. SSR marker analiza izolata Monilinia fructicola poreklom iz Srbije Molekularni markeri koriste se za analiziranje strukture populacije patogena, a meĎu njima su najpopularniji mikrosatelitni ili SSR (simple sequence repeat) markeri. Analiza mikrosatelita ukazuje na genetički diverzitet unutar populacije i može pružiti Materijal i metode 51 informacije o meĎuodnosu pojedinih haplotipova pružajući osnovu ispitivanju filogeografije neke vrste. U saradnji sa dr Andrea Patocchi i dr Maya Jänsch sa Agroscope Changins- Wädenswil Research Station, Wädenswil, Švajcarska, odreĎeni su SSR (simple sequence repeat) markeri za tri izolata M. fructicola poreklom iz Srbije. Jansch et al. (2012) razvili su SSR markere sa ciljem utvrĎivanja preciznog porekla i genetičkog diverziteta vrste M. fructicola u Evropi. Pomoću protokola Brunner and Frey (2004) SSR markeri razvijeni su na osnovu ponavljanja AG, AT, CTT i TCG nukleotida, a kao polazne sekvence korišćene su raspoložive sekvence M. laxa i M. fructicola. Prajmeri su dizajnirani pomoću programa PRIMER3. Upotrebom Multiplex PCR kit-a (QIAGEN) u samo jednoj reakciji umnoženo je pet različitih SSR markera. PCR smeša finalne zapremine od 10 µl sadržala je 2 µl DNK, 5 µl Multiplex PCR Master Mix-a, 1 µl Q- Solution, 1 µl sterilne vode i 1 µl prajmer mix-a (finalne koncentracije CHML5f ⁄r 1,875 µM, CHMFc1f ⁄r 5 µM, CHMFc4f ⁄r 1,25 µM, CHMFc5f ⁄ r 1,875 µM i CHMFc12f ⁄r 3,75 µM). PCR reakcija izvedena je u Termocycler-u (SensoQuest) pri sledećim uslovima: 1 ciklus -inicijalna denaturacija DNK (95°C - 15 min) 35 ciklusa -denaturacija DNK (94°C - 40 s) -vezivanje prajmera (50°C - 1 min 30 s) -sinteza fragmenta DNK - elongacija (72°C - 1 min 30 s) 1 ciklus -finalna inkubacija (60°C - 30 min) Analiza dobijenih fragmenata obavljena je u ABI PRISM ® 3100 DNK kapilarnom sekvencionatoru (Applied Biosystems). Ukupna zapremina od 0,8 µl rastvorenog u odnosu 1:20 PCR produkta premeštena je u 15 µl formamida koji sadrži 0,25 µl florescentnog GeneScan™-500-LIZ™ standarda veličine (Applied Biosystems). Ovako pripremljen uzorak je denaturisan na 95°C tokom 5 min, potom brzo rashlaĎen i sekvencioniran. Za analizu podataka korišćen je GeneMApper™ v. 4.0 (Applied Biosystems). Korišćeni prajmeri umnožavaju alelne oblike različitih dužina izolata M. fructicola poreklom iz Evrope (Jansch et al., 2012): CHML5 umnožava jedan alelni oblik dužine 220 bp, marker CHMFc1 tri alelna oblika dužine 169, 173 i 176 bp, CHMFc4 dva alelna oblika od 216 i 223 bp, CHMFc 5 jedan alelni oblik od 160 bp. Materijal i metode 52 Kao marker koji detektuje najviše alalnih oblika izdvoji se CHMFc1 (sa identifikovanih 30 alelnih oblika različite dužine), dok je marker sa najmanje detektovanih alelnih oblika CHMf12 (sa jednim alelnim oblikom dužine 160 bp). Prajmeri CHML5, CHMFc4 i CHMFc 5 detektuju pet, četiri i pet različita alelna oblika. 4.12. UtvrĎivanje nivoa osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide Ispitivanja osetljivosti vrsta roda Monilinia na fungicide obuhvatila su proučavanje delovanja komercijalnih formulacija fungicida iz sedam hemijskih grupa različitih mehanizama delovanja (Tabela 4). Tabela 4. Pregled fungicida korišćenih u ispitivanjima Preparat ProizvoĎač Aktivna supstanca Hemijska grupa Sadržaj aktivne supstance Bravo 720 SC Syngenta Hlorotalonil Hloronitrili 720 g/l Kidan EC Bayer CropScience Iprodion Ditiokarbamati 255 g/kg Spartak 450-EC Sinochem Ningbo Prohloraz Imidazoli 500 g/kg Quadris Syngenta Azoksistrobin Strobilurini 250 g/kg Akord Galenika Fitofarmacija Tebukonazol Triazoli 250 g/kg Cantus BASF Boskalid Karboksamidi 500 g/kg Luna Privilege Bayer CropScience Fluopiram Piridiletilamid 500 g/l Parametri osetljivosti 12 odabranih pojedinačnih monosporijalnih izolata (10 izolata vrste M. laxa: TPBN, TPAL, TPGR, VGRSD, NPFG, VPRA, ŠMLE, ŠLJSV, ŠMLEs, BPSV i BPBN; jedan izolat M. fructigena: VPBG i jedan izolat M. fructicola: NPGM) (Tabela 1) na fungicide ocenjeni su po delimično modifikovanoj metodi Leroux and Gredt (1972). Micelija izolata starosti sedam dana zasejavana je na PDA podlogu koja sadrži različite koncentracije fungicida i inkubirana na temperaturi od 24°C. Preliminarnim ispitivanjem odreĎene su koncentracije fungicida kojima se postiže inhibicija porasta izolata izmeĎu 5% i 95% u odnosu na kontrolu. Za odreĎivanje parametara osetljivosti korišćena je skala koncentracija sa simetrično rasporeĎenim koncentracijama u utvrĎenom opsegu, kako bi se dobila što pouzdanija Materijal i metode 53 vrednost parametra EC50 (Robertson et al., 1984). Za ispitivanje osetljivosti korišćene su sledeće skale koncentracija: -za tebukonazol 0,5; 0,25; 0,125; 0,06; 0,05; 0,03; 0,025; 0,0125 i 0,006 mg/l, -za iprodion: 10; 5; 2,5; 1,25; 0,6; 0,5; 0,3; 0,25; 0,125; 0,06 i 0,03 mg/l, -za hlorotalonil: 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 i 0,06 mg/l, -za boskalid: 2000; 1500; 1000; 750; 500; 0,1; 0,05; 0,025; 0,0125 i 0,006 mg/l, -za fluopiram: 1000; 500; 250; 125; 62,5; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125 i 0,06 mg/l, -za prohloraz: 0,05; 0,025; 0,0125; 0,006 i 0,003 mg/l i -za azoksistrobin: 100; 25; 10; 5; 1; 0,1; 0,01; 0,001 mg/l. Fungicidi su prvo u aseptičkim uslovima dispergovani u sterilnoj destilovanoj vodi a zatim su, uz neprestano mešanje na magnetnoj mešalici, aseptično dodavani u rastopljenu hranljivu podlogu prethodno ohlaĎenu do 55°C da bi se sprečila termička deaktivacija aktivne supstance. Za ispitivanje osetljivosti na fungicide koriščena je PDA podloga. Odnos mešanja disperzije fungicida i podloge bio je 1:9. U hranljivu podlogu u kontroli dodavana je ista količina sterilne destilovane vode. Nakon homogenizacije, podloga je u sterilnim uslovima razlivena u Petri kutije prečnika 90 mm, a posle hlaĎenja podloge vršeno je zasejavanje odabranih izolata vrsta roda Monilinia i inkubacija u mraku na temperaturi od 24°C. Za zasejavanje su korišćeni fragmenti micelije prečnika 3 mm, uzeti sa sedam dana stare ivice kolonije, odgajane u mraku na PDA podlozi na temperaturi od 24°C. Svi testovi izvedeni su u tri ponavljanja. Nakon inkubacije od četiri dana meren je prečnik kolonije u dva pravca pod pravim uglom. Za probit analizu uzimani su odgovori na najmanje četiri koncentracije, preračunati na procenat inhibicije u odnosu na kontrolu. Izračunate su koncentracije koje inhibiraju porast micelije 50% u odnosu na kontrolu (vrednost EC50) i nagib regresione linije (b) (Finney, 1964). 4.12.1. Ispitivanje osetljivosti izolata na azoksistrobin u prisustvu salicilhidroksamične kiseline (SHAM) Ispitivanje osetljivosti izolata roda Monilinia na azoksistrobin, fungicid iz grupe strobilurina, izvršeno je metodom koja je detaljno opisana u prethodnom poglavlju. Preliminarnim testiranjima korišćenjem široke skale koncentracija azoksistrobina (1000; Materijal i metode 54 100, 10; 1; 0,10; 0,01; i 0,001 mg/l) utvrĎeno je da ni jedna koncentracija nije dovela do inhibicije porasta micelije u poreĎenju sa kontrolom u koju je dodata sterilna destilovana voda. Radi eliminisanja efekta lažne rezistentnosti na strobilurine ispitivanja su nastavljena prethodno opisanom metodom uz dodatak salicilhidroksamične kiseline (SHAM), inhibitora terminalnih oksidaza (Ziogas et al., 1997). Za svaki ispitivani izolat izvršena je prethodna provera toksičnosti SHAM-a, kako bi se utvrdilo pri kojoj koncentraciji ova sustanca ne utiče na porast izolata tako što su različite koncentracije SHAM-a od 1000; 100, 10; 1; 0,10; 0,01; i 0,001 mg/l inkorporirane u PDA podlogu pri čemu je odnos SHAM-a i podloge bio 1:9. Kao kontrola korišćena je PDA podloga u koju je dodavana sterilna destilovana voda. Podloga je zatim razlivena u Petri kutije, a nakon hlaĎenja izvršeno je zasejavanje ispitivanim izolatima. Najviše koncentracije SHAM-a pri kojima ne dolazi do inhibicije porasta micelije izolata uzete su kao radne koncentracije za mešanje sa fungicidom za svaki izolat. Zatim je smeša SHAM-a i fungicida dodata u PDA podlogu u odnosu 1:9. U kontrolu je u smeši sa SHAM-om umesto fungicida dodata sterilna destilovana voda. Zasejavanje podloga i očitavanje efekata obavljeno je kao i za ostale fungicide. 4.13. OdreĎivanje minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije fungicida na izolate Monilinia spp. OdreĎivanje minimalne fungistatične koncentracije (MFC), najniže koncentracije koja potpuno inhibira porast izolata, i minimalne letalne koncentracije (MLC), najniže koncentracije koja ispoljava letalni efekat na izolate, izvedeno je po delimično modifikovanoj metodi Ishii (1995). Za ova ispitivanja odabran je po jedan izolat M. laxa (TPGR), M. fructigena (ŠPPR) i M. fructicola (NPGM). Postupak inkorporacije različitih koncentracija fungicida u PDA podlogu i zasejavanja izolata detaljno je opisano u okviru prethodne metode. Zasejane podloge u koju su dodati fungicidi inkubirane su sedam dana u mraku na temperaturi od 24°C, nakon čega je utvrĎivan efekat potpune inhibicije porasta i odreĎivana minimalna fungistatična koncentracija fungicida. Inokulum svih izolata za koje nakon inkubacije od sedam dana na podlozi u koju je dodata odreĎena koncentracija fungicida nije zabeležen inicijalni Materijal i metode 55 porast, prebačen je na PDA podlogu bez fungicida i inkubiran dodatnih sedam dana kako bi se utvrdilo da li je data koncentracija fungicida osim fungistatičnog ispoljila i letalni efekat na proučavane izolate. Najniža koncentracija fungicida posle koje nije zabeležen inicijalni porast izolata na podlozi bez fungicida označena je kao minimalna letalna koncentracija (MLC). 4.14. UtvrĎivanje antifungalnog uticaja etarskih ulja na izolate Monilinia spp. 4.14.1. In vitro efekat gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. Antifungalna aktivnost 56 etarskih ulja različitog porekla proučavana je na PDA podlozi u staklenim Petri kutijama prečnika 90 mm. Za ova proučavanja odabran je po jedan izolat M. laxa (TPGR), M. fructigena (ŠPPR) i M. fructicola (NPGM). Podloge su zasejavane ispitivanim izolatima postavljanjem četiri isečka micelije (R=3 mm) starosti sedam dana u Petri kutije. Svi izolati su izlagani dejstvu para etarskih ulja dodatih u koncentracijama: 0,04; 0,08; 0,16; 0,32 i 0,65 µl/ml vazduha na unutrašnju stranu poklopca Petri kutije na koji je, zatim, postavljan njen donji deo sa zasejanom podlogom. Kutije su pojedinačno umotavane u samolepljivu foliju i postavljane u položaj poklopcem na dole kako bi se sprečio gubitak pare. Izlaganje dejstvu para proučavanih ulja trajalo je sedam dana, na temperaturi 24°C. Kao kontrola korišćene su kulture testiranih izolata gajene u identičnim uslovima, ali bez dodavanja etarskih ulja. Inhibicija porasta testiranih izolata ocenjivana je sedam dana nakon tretmana. Efekat koncentracija ulja koje su potpuno zaustavile porast izolata nakon izlaganja dejstvu para ulja u trajanju od sedam dana na temperaturi 24ºC, označen je kao fungistatičan, a najniža koncentracija kao minimalna fungistatična koncentracija (MFC). Nakon sedam dana, Petri kutije u kojima je porast izolata bio potpuno zaustavljen, otvarane su i provetravane pri struji vazduha u laminarnoj komori u trajanju od 30 min radi uklanjanja gasovite faza ulja i odreĎivanja fungicidnog (letalnog) efekta. Smatrano je da odreĎena koncentracija ulja ispoljava letalan efekat ako sedam dana posle provetravanja nije zabeležen inicijalni porast izolata, a minimalna koncentracija koja je ispoljila letalan efekat označena je kao minimalna letalna koncentracija (MLC). Ogled je izveden dva puta sa četiri ponavljanja po tretmanu. Materijal i metode 56 4.14.2. OdreĎivanje minimalnog perioda ekspozicije Za etarska ulja za koja su utvrĎene najniže vrednosti minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije odreĎivan je i minimalni period ekspozicije za datu koncentraciju ulja kojim se postiže letalan efekat. Po jedan izolat M. laxa (TPGR), M. fructigena (ŠPPR) i M. fructicola (NPGM) izlagan je parama etarskih ulja tokom perioda od jedan do sedam dana na prethodno opisan način. Najkraći period ekspozicije pri odreĎenoj koncentraciji ulja na kojoj je zabeležen letalni efekat utvrĎen je kao minimalni period ekspozicije. 4.14.3. Proces formulacije etarskih ulja origana i timijana Formulacije etarskih ulja origana i timijana pripremljene su mešanjem nosioca uljane faze (esterifikovano ulje repice) (80%), etarskog ulja timijana ili origana (10%) i smešom nejonskih emulgatora (10%). Homogenizacija je izvršena uz pomoć magnetne mešalice (IKA, RH basic 2) tokom perioda od 30 min i dobijene su formulacije tipa koncentrat za emulziju (EC). 4.14.4. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. Ispitivanje in vitro efekta formulisanih etarskih ulja na izolate TPGR (M. laxa), ŠPPR (M. fructigena) i NPGM (M. fructicola) izvedeno je na PDA podlozi. Formulisana etarska ulja origana i timijana dodavana su u bunarčić prečnika 10 mm u podlozi i praćena je inhibicija porasta micelije patogena u odnosu na kontrolu. Kao standardne supstance za poreĎenje korišćene su komercijalno dostupne formulacije etarskog ulja čajnog drveta (Timorex Gold, 1% emulzija) i fungicida iprodiona u koncentraciji primene, dok je kao negativna kontrola poslužila sterilna destilovana voda. Eksperiment je ponovljen dva puta. Dobijeni rezultati su statistički obraĎeni. Materijal i metode 57 4.14.5. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. Ispitivanje in vivo efekta formulisanih etarskih ulja uraĎeno je u kontrolisanim uslovima laboratorije na zrelim plodovima jabuke koji su prethodno površinski dezinfikovani u rastvoru NaClO, isprani destilovanom vodom i prosušeni na vazduhu u aseptičnim uslovima. Korišćeni su plodovi jabuke jer su dostupni tokom cele godine. Plodovi su povreĎeni pomoću konusnog bušača prečnika 4 mm i dubine 3 mm. U povredu je nanošeno 10 µl formulisanog ulja i izvršena inokulacija micelijom gljive prečnika 3 mm koja je uzeta sa ivice kolonije starosti sedam dana gajene na PDA podlozi. Za testove u in vivo uslovima korišćeni su isti izolati kao i u in vitro testovima. Kao standardne supstance za poreĎenje korišćene su komercijalno dostupne formulacije etarskog ulja čajnog drveta (Timorex Gold, 1% emulzija) i fungicida iprodiona u koncentraciji primene, dok je kao negativna kontrola poslužila sterilna destilovana voda. Inokulisani plodovi inkubirani su u vlažnoj komori na temperaturi od 24ºC i relativnoj vlažnosti vazduha 97% tokom sedam dana. Posmatrana je pojava truleži na plodovima i merena je širina i dužina lezija. Eksperiment je ponovljen najmanje jednom. Dobijeni rezultati su statistički obraĎeni. 4.15. UtvrĎivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. 4.15.1. Pripremanje sojeva Bacillus subtilis U ispitivanjima korišćeni su sojevi bakterije B. subtilis iz komercijalno dostupnih preparata - Ekstrasol (Bisolbi Inter, Rusija) i Serenade (Intrachem Bio, Italija), kao i soj B. subtilis N146 dobijen iz kolekcije Instituta za mikrobiologiju, Nacionalne Akademije Nauka iz Minska, Belorusija. Bakterije su odgajane u 100 ml tečnog Meynell medijuma (30 g melase, 7 g K2HPO4 x 3H2O, 3g KH2PO4, 0,1 g MgSO4 x 7H2O, 1,5 g (NH4)2SO4, 0,5 g Na citrat i 1 l destilovane vode) u Erlenmajer posudama na rotacionom šejkeru pri brzini od 240 rpm četiri dana na temperaturi od 28°C. Materijal i metode 58 4.15.2. Pripremanje izolata Monilinia spp. Odabran je po jedan izolat M. laxa (TPGR), M. fructigena (ŠPPR) i M. fructicola (NPGM) čije su spore i micelija korišćene za ispitivanje u in vitro i in vivo ogledima. Za dobijanje konidija korišćena je MALT podloga. Kolonije su inkubirane na temperaturi od 24°C u trajanju od 7-10 dana sve dok površinu agara u potpunosti nisu pokrile micelija i spore gljive. Nakon inkubacije, u svaku Petri kutiju dodato je 10 ml sterilne destilovane voda i Tween 20 (Sigma) (1 kap), a micelija i spore su odvojeni od podloge sterilnim štapićem. Konačna koncentracija suspenzije konidija od 1x105 konidija/ml podešena je pomoću hemocitometra. 4.15.3. In vitro utvrĎivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Ogled je izveden u Petri kutijama prečnika 90 mm u koje je razliveno 20 ml PDA podloge. Na razlivenu i očvrslu PDA podlogu po celoj površini je homogeno rasporeĎena suspenzija spora ispitivanih izolata koncentracije 105 konidija/ml. U centralnom delu zasejanih podloga izbušeni su bunarčići prečnika 10 mm u koje je dodavano po 100 µl suspenzije tri proučavana soja B. subtilis (Ekstrasol, Serenade i N146). Za standardni tretman korišćena je suspenzija iprodiona u preporučenoj koncentraciji primene, a kao negativna kontrola sterilna destilovana voda. Ocena antagonističke aktivnosti bakterija B. subtilis vršena je nakon inkubacije od 48 h na temperaturi od 24°C merenjem prečnika inhibitorne zone oko bunarčića u kojoj nije uočen porast micelije (mm) i poreĎenjem sa prečnikom inhibitorne zone u kontroli i tretmanu u kome je korišćen standardni fungicid. Ogled je izveden u četiri ponavljanja i ponovljen dva puta, a rezultati statistički obraĎeni. 4.15.4. In vivo utvrĎivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. In vivo ogled izveden je na zrelim plodovima jabuke u kontrolisanim uslovima laboratorije. Korišćeni su plodovi jabuke jer su dostupni tokom cele godine. Plodovi Materijal i metode 59 jabuke površinski su dezinfikovani na prethodno opisan način, prosušeni i povreĎeni sterilnom konusnom iglom (prečnika 4 mm i dubine 3 mm). U povrede je nanošeno 10 µl suspenzije bakterija B. subtilis. Kao standardni tretman korišćena je suspenzija iprodiona u preporučenoj koncentraciji primene, a za negativnu kontrolu sterilna destilovana voda. Inokulacija dodavanjem 10 µl suspenzije spora Monilinia spp. u povredu izvršena je u dve varijante: neposredno nakon tretmana (I varijanta) i 24 h nakon tretmana (II varijanta). Inokulisani plodovi inkubirani su u vlažnoj komori na temperaturi od 24°C i relativnoj vlažnosti vazduha 97%. Radi procene efekata tretmana posmatrana je pojava simptoma truleži na inokulisanim plodovima sedam dana nakon inokulacije, i merena dužina i širina zahvaćenog tkiva. Ogled je izveden u četiri ponavljanja i ponovljen dva puta, a rezultati su statistički obraĎeni. 4.15.5. Razvoj formulacije preparata na bazi Bacillus subtilis Tri različite formulacije preparata na bazi soja N146 B. subtilis pripremljene su na sledeći način: •Formulacija 1 pripremljena je mešanjem sirove suspenzije B. subtilis N146 (90 g) sa glicerolom (5 g) i polietilenglikolom (5 g). Homogenizacija (20 min) izvršena je uz pomoć magnetne mešalice (IKA, RH basic 2) i dobijena je formulacija tipa koncentrat za suspenziju (SC). •Formulacija 2 pripremljena je mešanjem sirove suspenzije B. subtilis N146 (90 g) sa glicerolom (5 g) i smešom nejonskih emulgatora (5 g). Homogenizacija (30 min) izvršena je uz pomoć magnetne mešalice (IKA, RH basic 2) i dobijena je formulacija tipa koncentrat za suspenziju (SC). •Formulacija 3 pripremljena je mešanjem sirove suspenzije B. subtilis N146 (45 g) sa uljem od soje (48 g), glicerolom (4,5 g) i smešom nejonskih emulgatora (2,5 g). Homogenizacija (15 min) je izvršena uz pomoć laboratorijske mešalice Ultra turex i dobijena je formulacija tipa suspoemulzija (SE). Razvijena su tri aĎuvanta na bazi biljnih ulja i smeše nejonskih emulgatora: aĎuvant na bazi ulja od soje sa 15% emulgatora, aĎuvant na bazi esterifikovanog ulja uljane repice sa 10% emulgatora i aĎuvant na bazi ulja od suncokreta sa 15% Materijal i metode 60 emulgatora. AĎuvanti su pripremljeni mešanjem uljnih faza i emulgatora korišćenjem magnetne mešalice (IKA, RH basic 2, vreme mešanja 30 min, temperatura 40°C). Neposredno pre ispitivanja formulacije 1, 2 i 3 mešane su sa sva tri aĎuvanta pojedinačno i primenjivane samostalno i u smeši sa svakim od prethodno razvijenih formulacija kako bi se utvrdio uticaj aĎuvanata na povećanje efikasnosti i izvršilo meĎusobno poreĎenje efekata. Pre samog razvoja formulacija sve predviĎene komponente formulacija (pomoćne materije) pojedinačno su ispitane kako bi se utvrdilo da li ispoljavaju fitotoksične osobine te su one materije koje su bile pozitivne isključene iz daljih ispitivanja. TakoĎe, u preliminarna istraživanja bile su uključene i slepe probe sa svim komponentama koje su korišćene u navedenim formulacijama izuzev B. subtilis N146. 4.15.6. Ispitivanje efekata formulacija Bacillus subtilis na Monilinia spp. in vitro Ogled je izveden u Petri kutijama prečnika 90 mm u kojima je prethodno razliveno 20 ml PDA podloge. Na razlivenu i očvrslu PDA podlogu po celoj površini je homogeno rasporeĎena suspenzija spora izolata vrsta roda Monilinia koncentracije 105 konidija/ml pripremljena na prethodno opisan način. U centralnom delu zasejane podloge izbušen je bunarčići prečnika 10 mm u koji je naliveno 100 µl suspenzije formulacija, kao i neformulisane (sirove) suspenzije soja B. subtilis N146 pripremljene na prethodno opisan način. Za standardni tretman korišćena je suspenzija iprodiona u preporučenoj koncentraciji primene, a kao negativna kontrola sterilna destilovana voda. Ogled je izveden u četiri ponavljanja i ponovljen dva puta, a rezultati su statistički obraĎeni. 4.15.7. Ispitivanje efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo Ispitivanje efikasnosti formulisanih preparata izvedeno je na zrelim plodovima jabuke u kontrolisanim uslovima laboratorije. Korišćeni su plodovi jabuke jer su dostupni tokom cele godine. Plodovi jabuke površinski su dezinfikovani, prosušeni i povreĎeni sterilnom konusnom iglom (prečnika 4 mm i dubine 3 mm). U povrede je Materijal i metode 61 nanošeno 10 µl formulisanih preparata na bazi B. subtilis N146. Za standardni tretman korišćena je suspenzija iprodiona u preporučenoj koncentraciji primene, sirova suspenzija B. subtilis N146 pripremljena na već opisan način, komercijalno dostupan preparat Serenade (1%), a kao negativna kontrola sterilna destilovana voda. Inokulacija dodavanjem 10 µl suspenzije spora Monilinia spp. u povredu izvršena je neposredno nakon tretmana (I varijanta) i 24 h nakon tretmana (II varijanta). Inokulisani plodovi inkubirani su u vlažnoj komori na temperaturi od 24°C i relativnoj vlažnosti vazduha 97%. Radi procene efekata tretmana posmatrana je pojava simptoma truleži na inokulisanim plodovima sedam dana nakon inokulacije i merena dužina i širina zahvaćenog dela. Ogled je izveden u četiri ponavljanja i ponovljen dva puta, a rezultati su statistički obraĎeni. 4.16. Statistička obrada podataka Podaci dobijeni u okviru praćenja brzine rasta, odgajivačkih i ekoloških karakteristika izolata, testova unakrsne patogenosti i ispitivanja efekata etarskih ulja i bakterije B. subtilis na izolate Monilinia spp. obraĎeni su jednofaktorijalnom analizom varijanse (ANOVA), a značajnost razlika srednjih vrednosti je odreĎena Dancan-ovim testom (P<0,05) korišćenjem softverskog paketa Statistika (StatSoft Inc, 2001). Dobijeni podaci prikazani su u tabelama u obliku srednjih vrednosti i standardne devijacije. Podaci dobijeni ispitivanjem osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide obraĎeni su probit analizom na osnovu principa koje je definisao Finny (1964). U tabelama su prikazane koncentracije koje inhibiraju porast 50% u odnosu na kontrolu (EC50) i nagib regresione linije (b). Razlike u osetljivosti izolata odreĎene su na osnovu preklapanja/nepreklapanja intervala poverenja za EC50 vrednosti. Rezultati 62 5. REZULTATI 5.1. Simptomi oboljenja Simptomi oboljenja koje su prouzrokovale vrste roda Monilinia uočeni su na cvetovima, granama, grančicama i plodovima u vidu sušenja cvetova, grančica i grana, i truleži plodova (Slike 1-8) na šest vrsta koštičavih voćaka u Srbiji: breskvi, kajsiji, nektarini, trešnji, višnji i šljivi. Prvi simptomi u vidu uvenuća prašnika, nekroze tučka, kruničnih i čašičnih listića zapaženi su u rano proleće, tokom sve tri godine istraživanjа (Slika 1). Zaraženi cvetovi su opadali ili, češće, ostali pričvršćeni na granama. Prvi simptomi na plodovima, u vidu manjih kružnih, mrkih pega nalik oreolu oko mesta infekcije, najčešće su uočavani na mestu rana ili povreda (Slika 2). Razvojem oboljenja pege su se pravilno koncentrično širile, a pri uslovima povišene temperature i vlažnosti, za nekoliko dana mrka trulež potpuno je zahvatala čitave plodove (Slika 6). Mrke pege u početku su bile ravne, ali ubrzo je u okviru pega dolazilo do sporulacije parazita, nastajanja sitnih pukotina na pokožici zaraženog dela ploda iz kojih su izbijale sporodohije u vidu koncentričnih krugova. Mrka trulež potpuno je zahvatala plodove, koji su venuli, sušili se, smežuravali i pretvarali u „mumije”' koje su ostajale da vise na granama ili opadale na zemlju ispod krošnje (Slika 7). Slika 1. Monilinia sp.: Sušenje cvetova višnje (prirodna infekcija) Slika 2. Monilinia sp.: Mrka trulež ploda kajsije (prirodna infekcija) Rezultati 63 Slika 3. Monilinia sp.: Mrka trulež pojedinačnog ploda šljive (prirodna infekcija) Slika 4. Monilinia sp.: Mrka trulež plodova šljive na dodiru dva ploda (prirodna infekcija) Slika 5. Monilinia sp.: Mrka trulež plodova trešnje (prirodna infekcija) Slika 6. Monilinia sp.: Mrka trulež ploda kajsije (prirodna infekcija) Rezultati 64 5.2. Izolacija patogena i dobijanje monosporijalnih izolata Prikupljanje obolelih biljnih delova koštičavih voćaka sa simptomima koje prouzrokuju vrste roda Monilinia obavljeno je tokom trogodišnjeg perioda od 2010. do 2012. godine. Pregledom 119 lokaliteta iz 15 okruga u Srbiji, prikupljen je 321 uzorak obolelih biljnih delova kako iz komercijalnih zasada, tako i iz okućnica i sa zelenih pijaca (Slika 9, Tabela 5). Tabela 5. Biljke domaćini sa kojih je izvršena izolacija Monilinia spp. Biljka domaćin Broj izolata Broj lokaliteta Šljiva 80 39 Višnja 31 18 Trešnja 66 30 Kajsija 14 6 Breskva 20 10 Nektarina 35 16 Ukupno 246 119 Slika 7. Monilinia sp.: Mumificirani plodovi šljive (prirodna infekcija) Slika 8. Monilinia sp.: Uskladišteni truli plodovi šljive (prirodna infekcija) Rezultati 65 Iz zaraženog biljnog tkiva izolacijom fitopatogenih gljiva izdvojen je veliki broj izolata koji su grupisani po izgledu i po poreklu. Dobijeno je ukupno 246 izolata sa micelijom nalik vrstama roda Monilinia, i to 192 iz svežih plodova, 45 iz mumificiranih plodova i devet iz grančica. Svi dobijeni izolati Monilinia spp. prečišćeni su do monosporijalnih izolata, koji su korišćeni za dalji rad. Slika 9. Geografska distirbucija dobijenih izolata Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 66 5.3. Provera patogenosti Patogenost dobijenih izolata proverena je na dva načina, inokulacijama povređenih i nepovređenih plodova biljaka domaćina sa kojih vode poreklo. Kao negativna kontrola, korišćeni su odgovarajući plodovi inokulisani na isti način, fragmentom sterilne podloge ili sterilnom vodom. Provera patogenosti 246 dobijenih monosporijalnih izolata Monilinia spp. primenom veštačkih inokulacija povređenih plodova biljaka domaćina sa kojih su izolovani pokazala je da su svi izolati tri dana nakon inkubacije na temperaturi od 24°C prouzrokovali trulež tkiva svetlo smeđe boje, karakterističnu za Monilinia spp. (Slika 10). Od mesta inokulacije trulež se širila zahvatajući kako pokožicu tako i mezokarp ploda. Nekrotirane površine su u završnoj fazi oboljenja prekrivene sivkastom prevlakom konidiofora i konidija parazita. Na plodovima koji su kao negativna kontrola inokulisani sterilnim fragmentom PDA podloge nije došlo do pojave simptoma tipa truleži niti bilo kakvih drugih promena. Sa inokulisanih plodova obavljena je reizolacija patogena i reizolati su upoređeni sa izolatima korišćenim za inokulaciju. Dobijeni reizolati po izgledu kolonije i morfologiji reproduktivnih tvorevina u potpunosti su odgovarali izvornim izolatima čime je potvrđena patogenost izolata i ispunjeni Kohovi postulati. Veštačka inokulacija nepovređenih plodova svih šest domaćina takođe je dovela do pojave simptoma mrke truleži plodova (Slika 11). Uočena je razlika u intenzitetu sporulacije na plodovima inokulisanim različitim vrstama roda Monilinia. Na nepovređenim plodovima inokulisanim izolatima M. laxa i M. fructigena nije došlo do formiranja spora, dok je intenzitet sporulacije na plodovima inokulisanim vrstom M. fructicola bio veoma intenzivan. Rezultati 67 Slika 10. Monilinia spp.: Trulež inokulisanih plodova koštičavih voćaka (desni plod na svakoj slici) i kontrola inokulisana fragmentom sterilne PDA podloge (levi plod na svakoj slici) Rezultati 68 Slika 11. Veštačka inokulacija nepovređenih plodova koštičavih voćaka fragmentom micelije izolata Monilinia spp. Rezultati 69 5.4. Izolati Monilinia spp. Izolacijom fitopatogenih gljiva iz zaraženih biljaka koštičavih voćaka uočena je jasna razlika u morfološkim karakteristikama izolata. Na osnovu izgleda kolonije, izolati su podeljeni u tri grupe: Monilinia spp. grupa I sa ukupno 237 izolata; Monilinia spp. grupa II sa šest izolata i Monilinia spp. grupa III sa tri izolata. Provera patogenosti, uporedno proučavanje specifičnih morfoloških karakteristika koje je opisao Lane (2002) (boja kolonije, odlike ruba i oblik kolonije, sporulacija, prisustvo koncentričnog prstena, kvalitativna brzina porasta i prisustvo crne marginalne linije) i molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije urađeni su na svim prikupljenim izolatima iz sve tri grupe (ukupno 246 izolata). Za detaljnija proučavanja morfoloških, odgajivačkih, ekoloških i molekularnih karakteristika, kao i ispitivanje osetljivosti na fungicide odabrano je 29 reprezentativnih izolata Monilinia spp. iz različitih grupa, vodeći računa o zastupljenosti vrsta roda Monilinia, biljaka domaćina i lokaliteta sa kojih su izolati dobijeni (Tabela 1). Za proučavanje efekata etarskih ulja i antagonističkih sojeva bakterije B. subtilis na Monilinia spp., kao i mogućnosti njihove praktične primene, odabran je po jedan izolat od sve tri dobijene vrste: TPGR (M. laxa), ŠPPR (M. fructigena) i NPGM (M. fructicola). 5.5. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. Makroskopske karakteristike. Na osnovu proučenih makroskopskih karakteristika (boje kolonije, odlika ruba i oblik kolonije, sporulacije, prisustva koncentričnog prstena, kvalitativne brzine porasta i prisustva crne marginalne linije) 246 izolata uočeno je njihovo razdvajanje u tri jasno odvojene grupe. Prvu grupu čini 237 izolata koji na PDA podlozi imaju svetlo smeđu do sivu koloniju oblika rozete, režnjevitih ivica, bez prisustva spora. U drugu grupu svrstano je šest izolata krem-žute boje, ravnih ivica, sa prisutnim retkim sporama, dok su u trećoj grupi tri izolata smeđe do sive boje koji obilno sporulišu, formiraju koncentrične prstenove spora i imaju ravnu ivicu kolonije. Prva grupa izolata je na osnovu pomenutih morfoloških osobina preliminarno identifikovana kao vrsta M. laxa (Slika 12, Tabela 6), druga kao M. fructigena (Slika 13, Tabela 6) i treća kao M. fructicola (Slika 14, Tabela 6). Rezultati 70 Slika 12. Monilinia laxa: Izgled micelije na PDA podlozi nakon inkubacije od sedam dana na 24°C Slika 13. Monilinia fructigena: Izgled micelije na PDA podlozi nakon inkubacije od sedam dana na 24°C Slika 14. Monilinia fructicola: Izgled micelije na PDA podlozi nakon inkubacije od sedam dana na 24°C Lice Naličje Lice Naličje Lice Naličje Rezultati 71 Tabela 6. Prikaz proučavanih makroskopskih osobina izolata roda Monilinia Vrsta Boja kolonije Oblik kolonije 1 Ivica kolonije 2 Sporulacija 3 Prisustvo koncentričnog prstena spora 4 Prisustvo crne marginalne linije 5 Brzina porasta 6 M. laxa Sivo-smeđa - R - - +/- Srednji M. fructigena Bela-žuta R C + + +/- Spor M. fructicola Sivo-smeđa - C ++ + - Brz 1 Oblik kolonije: R-rozeta, - odsustvo rozete; 2 Ivica kolonije: R-režnjevita, C- celovita; 3 Sporulacija: + prisutna, - odsutna; 4 Prisustvo koncentričnog prstena spora: + prisutan, - odsutan; 5 Prisustvo crne marginalne linije: + prisutna, - odsutna; 6 Brzina porasta: spora<70mm, srednja 70-80mm, brza>80mm za 10 dana na temperaturi 22°C. Mikroskopske karakteristike. Proučavanje mikroskopskih svojstava, odnosno utvrđivanje oblika i veličine konidija, intenziteta sporulacije, načina klijanja konidija, kao i dužine kličinih cevčica do prvog grananja ukazalo je na grupisanje svih 13 odabranih izolata Monilinia spp. u tri morfološke grupe. Svi odabrani izolati Monilinia spp. obrazuju hijalinske, jednoćelijske konidije sedam dana posle zasejavanja. Konidije su limunastog do ovalnog oblika i formiraju razgranate nizove, pri čemu je najmlađa spora ona koja se nalazi u osnovi niza. Izolati vrste M. laxa obrazuju konidije čije su dimenzije u opsegu 11,25-15,42 μm x 8,25-11,07 μm, izolati M. fructicola 16,00-16,92 μm x 9,87-10,75 μm, dok izolati M. fructigena obrazuju u proseku konidije najvećih dimenzija (19,25-23,50 μm x 11,92-13,50 μm). Uporedni pregled prosečnih dimenzija konidija 13 odabranih izolata uključenih u ispitivanjima mikroskopskih karakteristika prikazan je u Tabeli 7. Tabela 7. Prikaz prosečnih dimenzija konidija odabranih izolata Monilinia spp. Vrsta Oznaka izolata Dužina (μm) Širina (μm) Min Max Prosek Min Max Prosek M. laxa TPGR 12,50 17,50 14,32 7,50 12,50 9,17 ŠMLE 7,50 12,50 11,25 5,00 10,00 8,25 VPRA 10,00 15,00 13,00 7,50 10,00 8,87 KPST 10,00 15,00 12,00 7,50 12,50 8,62 BPSV 12,50 17,50 14,12 7,50 12,50 9,87 NPVL 15,00 25,00 15,42 10,00 15,00 11,07 M. fructigena ŠPPR 20,00 25,00 23,50 12,50 15,00 13,50 VPBG 20,00 25,00 22,00 10,00 15,00 13,00 TPGO 15,00 25,00 19,25 10,00 15,00 11,92 BŠPBA 17,50 25,00 21,42 10,00 15,00 13,07 M. fructicola NPGM 12,50 20,00 16,00 7,50 12,50 10,75 NPUD1 15,00 22,50 16,92 7,50 12,50 10,57 NPUD2 12,50 20,00 16,25 7,50 12,50 9,87 Rezultati 72 Tabela 8. Prikaz proučavanih mikroskopskih karakteristika izolata Monilinia spp. Vrsta Izolat Dužina kličine cevčice (µm) Broj konidija (cm 2 ) Klijavost konidija(%) Prosek Opseg M. laxa NPVL 40 20-70 0,29x10 4 88,00 M. fructigena ŠPPR 197 70-800 1,54x10 4 83,34 M. fructicola NPUD1 365 210-600 0,27x10 5 88,66 Izolat NPVL, predstavnik prve morfološke grupe u okviru proučavanih izolata, obrazovao je konidije prosečnih dimenzija 15,42 μm x 11,07 µm koje su klijale na WA podlozi i formirale kličine cevčice prosečne dužine 40 µm (20-70 µm) pre prvog grananja. Broj konidija izmeren pomoću hemocitometra i preračunat po jedinici površine (cm2) iznosio je 0,29 x 104 (Slika 15, Tabela 8). Izolat ŠPPR, predstavnik vrste M. fructigena, obrazovao je u proseku konidije najvećih dimenzija (23,50 µm x 13,50 µm), iz kojih se, za razliku od konidija drugih grupa izolata, iz jedne konidije formiralo nekoliko kličinih cevčica prosečne dužine 197 µm pre prvog grananja (Slika 16, Tabela 8). Slika 15. Monilinia laxa: Izgled konidija (levo) i način klijanja konidija (desno) (uvećanje 40x) Rezultati 73 Predstavnik treće morfološke grupe, izolat NPUD1, formirao je konidije prosečnih dimenzija 16,92 µm x 10,57 µm koje su klijale u kličine cevčice najveće dužine (prosečno 365 µm pre grananja). Pored toga, ovaj izolat ispoljava najveći intenzitet sporulacije formirajući najveći broj konidija po jedinici površine (0,27 x 105) (Slika 17, Tabela 8). Slika 16. Monilinia fructigena: Izgled konidija (levo) i način klijanja konidija (desno) (uvećanje 40x) Slika 17. Monilinia fructicola: Izgled konidija (levo) i način klijanja konidija (desno) (uvećanje 40x) Rezultati 74 Praćenjem procenta klijavosti na WA podlozi utvrđeno je da konidije ispitivanih izolata klijaju u sličnom procentu, odnosno nema značajnih razlika između izolata različitih vrsta. Procenat klijavosti konidija bio je od 83,34% za vrstu M. fructigena do 88% za M. laxa i 88,66% za M. fructicola (Tabela 8). 5.6. Praćenje brzine porasta izolata Monilinia spp. Na temperaturi od 24°C izolati različitih vrsta ispoljili su statistički značajnu razliku u brzini rasta kolonije (P<0,01) (Slika 18, Grafikon 1, Tabela 9). Izolati vrste M. laxa imali su dnevni porast od 6,52 do 9,48 mm/dan. U okviru te grupe najveći dnevni porast od 9,48 mm/dan zabeležen je za izolat TPGR (sa trešnje), dok je izolat TPAL (sa trešnje) rastao najsporije (6,52 mm/dan). Izolat VPBG (sa višnje), predstavnik vrste M. fructigena imao je znatno manji prosečan dnevni porast (2,38 mm/dan), dok je izolat M. fructicola (NPGM) sa nektarine imao najveći dnevni porast (10,55 mm/dan). Međutim, rezultat Duncan-ovog testa pokazuje da izolati osim što se grupišu u zavisnosti od vrste, grupišu se i u okviru pojedinih grupa. Na osnovu ove osobine, ispitivani izolati Monilinia spp. ispoljili su izraženu kako interspecijsku tako i intraspecijsku varijabilnost. Slika 18. Prosečna brzina porasta izolata Monilinia spp. nakon inkubacije od sedam dana na PDA podlozi na 24°C Rezultati 75 Grafikon 1. Prosečan dnevni porast micelije izolata Monilinia spp. na PDA podlozi Tabela 9. Prosečan dnevni porast micelije izolata Monilinia spp. na PDA podlozi Vrsta Izolat Prosečan dnevni porast (mm/dan) 1 M. laxa TPGR 9,48 ± 0,85 b ŠMLEs 9,33 ± 0,79 b ŠPSV 6,55 ± 1,42 d TPBN 9,29 ± 0,34 b ŠMLE 8,98 ± 0,57 bc VGRSD 9,45 ± 0,45 b BPSV 8,31 ± 0,33 c BMLEs 7,17 ± 0,42 d TPAL 6,52 ± 0,80 d VGRSE 7,24 ± 0,51 d M. fructigena VPBG 2,38 ± 0,27 e M. fructicola NPGM 10,55 ± 1,40 a 1 Ista slova označavaju da razlika nije statistički značajna 5.7. Odgajivačke karakteristike izolata Monilinia spp. Uticaj hranljivih podloga. Porast 12 ispitivanih izolata praćen je na pet različitih hranljivih podloga (PDA, MA, V8A, WA i CzA). Ispitivani izolati rasli su na svim hranljivim podlogama različitom brzinom, pri čemu je generalno najveći porast zabeležen na MA i PDA podlozi, dok je najmanji bio na WA podlozi (Grafikon 2, Tabela 10). Hranljive podloge uticale su statistički značajno na porast ispitivanih izolata M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 76 (P<0,01). Pored razlika u brzini porasta ispoljene su značajne razlike u morfološkim osobinama izolata na hranljivim podlogama (Slika 19). Na PDA, MA i V8A podlozi svi ispitivani izolati imali su kompaktnu miceliju, dok je na WA i CzA podlozi micelija izolata bila retka i prozračna. Izolati vrste M. laxa najbrže su rasli na MA podlozi, na kojoj je prosečan porast nakon sedam dana bio u intervalu od 63,67±4,84 mm do 84,50±1,38 mm. Izolati ove vrste prosečno najsporije su rasli na WA podlozi (23,17±2,04 do 32.83±1,94 mm). Obrazovanje konidija zabeleženo je na MA podlozi sedam dana od zasejavanja nezavisno od svetlosnog režima, kao i na PDA podlozi 10 dana od zasejavanja samo u prisustvu svetlosti. Izolati vrste M. laxa na PDA i MA podlozi formirali su koloniju karakterističnog oblika rozete, dok na ostalim podlogama ova pojava nije uočena. Izolat VPBG, vrsta M. fructigena, ispoljio je prosečno najveći porast nakon sedam dana na MA podlozi (80,17±1,72 mm), a najmanji na CzA podlozi (15,33±7,15 mm). Izolat VPBG formirao je konidije na PDA i MA podlozi sedam dana od zasejavanja nezavisno od svetlosnog režima. Na PDA i MA podlozi izolat VPBG formirao je koncentrične prstenove spora žute boje koji na ostalim ispitivanim podlogama nisu zabeleženi. Izolat NPGM, predstavnik vrste M. fructicola, imao je prosečno najveći porast na PDA podlozi (71,33±3,39 mm), a najmanji na V8A podlozi (17,67±2,80 mm). Ova vrsta, za razliku od prethodnih, formira konidije na svim ispitivanim podlogama tri dana nakon zasejavanja osim na WA. Obilno formiranje konidija u vidu koncentričnih prstenova spora naročito je izraženo na PDA podlozi. Grafikon 2. Uticaj različitih hranljivih podloga na porast micelije izolata Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 77 Slika 19. Porast izolata Monilinia spp. na različitim podlogama (PDA-podloga od krompira, dekstroze i agara; MA-malt podloga; V8A-podloga od paradajz soka; CzA-Čapekova podloga; WA-vodeni agar) Rezultati 78 T a b el a 1 0 . U ti ca j ra zl ič it ih h ra n lj iv ih p o d lo g a n a p o ra st m ic el ij e iz o la ta M o n il in ia s p p . P ro se ča n p o ra st ( m m / 7 d a n a )1 C zA * 4 8 ,6 7 ± 1 ,6 3 a 4 8 ,0 0 ± 3 ,1 6 a 3 2 ,8 3 ± 1 ,1 7 c 3 5 ,1 7 ± 1 ,1 7 c 4 1 ,8 3 ± 3 ,0 6 b 4 7 ,8 3 ± 0 ,7 5 b 4 1 ,8 3 ± 6 ,5 2 b 3 2 ,1 7 ± 2 ,3 2 c 3 4 ,1 7 ± 2 ,4 0 c 3 2 ,8 3 ± 2 ,3 2 c 1 5 ,3 3 ± 7 ,1 5 d 1 8 ,0 0 ± 2 ,4 5 d 1 I st a sl o v a u k o lo n i o zn ač av aj u d a ra zl ik a n ij e st at is ti čk i zn ač aj n a * P D A -p o d lo g a o d k ro m p ir a, d ek st ro ze i a g ar a; M A -m al t p o d lo g a; V 8 A -p o d lo g a o d p ar ad aj z so k a; C zA -Č ap ek o v a p o d lo g a; W A -v o d en i ag ar V 8 A * 3 6 ,0 0 ± 4 ,6 5 e f 3 8 ,8 3 ± 0 ,9 8 c d e 4 3 ,3 3 ± 2 ,2 5 a b 4 0 ,1 7 ± 1 ,8 3 c d 4 5 ,1 7 ± 1 ,6 0 a 4 1 ,6 7 ± 1 ,3 7 b c 3 7 ,3 3 ± 0 ,8 2 d e 3 9 ,1 7 ± 1 ,8 3 c d e 3 3 ,1 7 ± 1 ,4 7 f 3 8 ,6 7 ± 4 ,6 8 c d e 2 3 ,0 0 ± 1 ,6 7 g 1 7 ,6 7 ± 2 ,8 0 h M A * 8 2 ,8 3 ± 2 ,6 4 a 8 3 ,0 0 ± 1 ,7 9 a 7 0 ,0 0 ± 5 ,1 0 c 7 2 ,5 0 ± 2 ,6 6 b c 8 1 ,1 7 ± 1 ,1 7 a 8 4 ,5 0 ± 1 ,3 8 a 8 0 ,5 0 ± 1 ,5 2 a 7 4 ,3 3 ± 5 ,3 5 b 7 5 ,8 3 ± 3 ,0 6 b 6 3 ,6 7 ± 4 ,8 4 d 8 0 ,1 7 ± 1 ,7 2 a 5 8 ,8 3 ± 5 ,2 3 e W A * 2 7 ,6 7 ± 2 ,0 7 e f 3 1 ,6 7 ± 1 ,3 7 a b 2 6 ,8 3 ± 1 ,3 3 e 2 9 ,1 7 ± 0 ,7 5 c d ef 2 8 ,5 0 ± 2 ,0 7 d ef 3 0 ,1 7 ± 1 ,8 3 b cd 3 2 ,8 3 ± 1 ,9 4 a 2 9 ,3 3 ± 1 ,2 1 b cd e 2 3 ,1 7 ± 2 ,0 4 g 3 1 ,1 7 ± 2 ,6 4 a b c 2 1 ,1 7 ± 1 ,9 4 g 1 8 ,6 7 ± 2 ,3 4 h P D A * 6 6 ,3 3 ± 5 ,9 6 b c 6 3 ,6 7 ± 6 ,0 6 c d 4 5 ,8 3 ± 9 ,9 3 e 6 5 ,0 0 ± 2 ,3 7 c 6 3 ,1 7 ± 4 ,4 5 c d 6 6 ,1 7 ± 3 ,1 3 b c 5 8 ,3 3 ± 2 ,6 6 d 5 0 ,1 7 ± 2 ,9 3 e 4 5 ,6 7 ± 5 ,5 7 e 5 0 ,6 7 ± 3 ,5 6 e 1 6 ,6 7 ± 1 ,8 6 f 7 1 ,3 3 ± 3 ,3 9 a Iz o la t T P G R Š M L E s Š P S V T P B N Š M L E V G R S D B P S V B M L E s T P A L V G R S E V P B G N P G M V rs ta M . la x a M . fr u ct ig en a M . fr u ct ic o la Rezultati 79 Uticaj kiselosti podloge. Porast 12 ispitivanih izolata praćen je na PDA podlozi različitih pH vrednosti (pH 2-pH 11). Ispitivani izolati ispoljili su statistički značajnu razliku u brzini porasta micelije na podlogama kiselosti u intervalu pH 3-pH 9 (P<0,01). Na jako kiseloj podlozi (pH 2) porast su ispoljili izolati M. laxa i M. fructicola, a na podlogama kiselosti više od pH 9 porast je zabeležen samo za izolat M. fructigena (Grafikon 3, Tabela 11). Osim razlika u brzini porasta ispoljene su značajne razlike u morfološkim osobinama izolata na podlogama različite pH vrednosti (Slika 20). Izolati M. laxa imali su najveći prosečni porast na PDA podlozi pH vrednosti 7 (50,25±3,50 mm do 82,00±1,63 mm tokom sedam dana), dok na podlozi pH vrednosti većoj od 9 nisu uopšte rasli. Karakterističan oblik rozete bio je uočljiv na podlogama kiselosti pH 5-pH 8, dok je na drugim pH vrednostima micelija bila ravnog oboda. Sa druge strane, izolat VPBG, predstavnik vrste M. fructigena, najveći porast (30,50±2,83 mm) ispoljio je na podlozi niske pH vrednosti (pH 3) i jedini je izolat koji je rastao na podlozi pH vrednosti 10. Na podlogama kiselosti pH 5-pH 9 izolat VPBG formirao je tipičnu koloniju belo-žute boje sa koncentričnim prstenovima spora, dok je micelija na podlogama kiselosti pH 3 i pH 4 bila siva i režnjevitog oblika. Izolat NPGM, identifikovan kao M. fructicola, najbrži prosečan porast ispoljio je na PDA podlozi pH vrednosti 6, a najsporije na podlozi pH 9, dok na podlogama sa višim pH vrednostima nije rastao. Na svim podlogama različitih pH vrednosti na kojima je rastao, formirao je tipične kolonije sa koncentričnim prstenovima spora. Grafikon 3. Uticaj različitih pH vrednosti PDA podloge na porast micelije izolata Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 80 Slika 20. Porast izolata Monilinia spp. na PDA podlozi različitih pH vrednosti Rezultati 81 T a b el a 1 1 . U ti ca j ra zl ič it ih p H v re d n o st i P D A p o d lo g e n a p o ra st m ic el ij e iz o la ta M o n il in ia s p p . P ro se ča n p o ra st ( m m /7 d a n a )1 p H 1 2 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 1 I st a sl o v a u k o lo n i o zn ač av aj u d a ra zl ik a n ij e st at is ti čk i zn ač an ja p H 1 1 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 p H 1 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 2 ,0 0 ± 1 ,1 5 a 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b p H 9 2 ,0 0 ± 2 ,3 1 e 1 7 ,5 0 ± 0 ,5 8 a 1 ,2 5 ± 0 ,5 0 e 1 3 ,0 0 ± 8 ,0 8 ab 1 ,5 0 ± 0 ,5 8 e 4 ,7 5 ± 5 ,5 0 d e 9 ,7 5 ± 0 ,5 0 b c 3 ,7 5 ± 4 ,3 5 d e 8 ,0 0 ± 0 ,0 0 cd 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 4 ,2 5 ± 0 ,5 0 d e 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 e p H 8 5 6 ,5 0 ± 1 1 ,5 6 b c 5 9 ,7 5 ± 0 ,9 6 ab 4 0 ,5 0 ± 1 ,0 0 d 6 1 ,2 5 ± 2 ,6 3 ab 6 3 ,2 5 ± 2 ,2 2 a 3 9 ,7 5 ± 2 ,6 3 d 5 1 ,7 5 ± 2 ,0 6 c 5 2 ,7 5 ± 0 ,9 6 c 6 1 ,7 5 ± 3 ,3 0 ab 8 ,0 0 ± 2 ,4 5 f 5 ,7 5 ± 1 ,5 0 f 2 6 ,2 5 ± 2 ,6 3 e p H 7 7 8 ,2 5 ± 0 ,9 6 b 7 3 ,7 5 ± 1 ,8 9 6 1 ,7 5 ± 3 ,7 7 7 6 ,7 5 ± 2 ,6 3 b c 7 5 ,2 5 ± 1 ,2 6 b c 7 0 ,2 5 ± 0 ,5 0 d 6 9 ,2 5 ± 0 ,5 0 d 6 8 ,0 0 ± 1 ,8 3 d 8 2 ,0 0 ± 1 ,6 3 a 5 0 ,2 5 ± 3 ,5 0 f 8 ,0 0 ± 2 ,1 6 h 4 1 ,0 0 ± 1 ,4 1 g p H 6 5 8 ,5 0 ± 1 ,0 0 d e 6 0 ,5 0 ± 2 ,3 8 d 5 6 ,2 5 ± 1 ,5 0 ef 6 9 ,5 0 ± 2 ,0 8 b 5 8 ,5 0 ± 2 ,8 9 d e 6 5 ,2 5 ± 5 ,3 2 c 5 8 ,7 5 ± 1 ,8 9 d e 4 8 ,0 0 ± 0 ,8 2 g 6 5 ,2 5 ± 2 ,0 6 c 5 3 ,7 5 ± 0 ,5 0 f 9 ,2 5 ± 1 ,5 0 h 7 3 ,8 3 ± 0 ,0 0 a p H 5 6 9 ,2 5 ± 0 ,9 6 a 6 6 ,0 0 ± 1 ,8 3 a 4 5 ,0 0 ± 0 ,8 2 d 6 4 ,5 0 ± 2 ,0 8 a 5 5 ,7 5 ± 5 ,6 8 b 3 9 ,2 5 ± 0 ,9 6 e 5 5 ,0 0 ± 1 ,4 1 b 4 9 ,7 5 ± 2 ,5 0 cd 6 8 ,5 0 ± 1 ,2 9 a 4 9 ,0 0 ± 1 ,1 5 e 6 ,7 5 ± 2 ,5 0 f 5 2 ,2 5 ± 9 ,1 8 b c p H 4 6 9 ,2 5 ± 2 ,6 3 ab 5 5 ,7 5 ± 9 ,3 6 d 4 7 ,7 5 ± 0 ,5 0 ef 7 3 ,2 5 ± 2 ,8 7 a 6 2 ,0 0 ± 1 ,4 1 d 5 2 ,0 0 ± 2 ,1 6 d e 6 4 ,7 5 ± 2 ,9 9 b c 4 3 ,0 0 ± 2 ,1 6 f 5 5 ,5 0 ± 1 ,2 9 d 5 5 ,0 0 ± 0 ,8 2 d e 2 9 ,0 0 ± 2 ,1 6 g 5 4 ,7 5 ± 1 ,5 0 d p H 3 2 3 ,7 5 ± 3 ,7 7 cd 2 6 ,0 0 ± 4 ,0 8 c 2 0 ,2 5 ± 3 ,1 0 d 2 9 ,5 0 ± 2 .5 2 b 3 1 ,0 0 ± 0 ,8 2 b 3 1 ,2 5 ± 0 ,9 6 b 2 3 ,5 0 ± 1 ,0 0 cd 2 0 ,7 5 ± 0 ,5 0 d 2 4 ,7 5 ± 0 ,5 0 c 2 3 ,0 0 ± 0 ,0 0 cd 3 0 ,5 0 ± 2 ,3 8 b 3 5 ,0 0 ± 2 ,9 4 a p H 2 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 2 ,5 0 ± 0 ,5 8 b 0 ,5 0 ± 0 ,0 0 cd 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 4 ,2 5 ± 1 ,2 6 a Iz o la t T P G R Š M L E s Š P S V T P B N Š M L E V G R S D B P S V B M L E s T P A L V G R S E V P B G N P G M V r st a M . la x a M . fr u c ti g e n a M . fr u c ti co la Rezultati 82 5.8. Ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. Uticaj temperature. Uticaj temperatura (18, 20, 23, 25, 28 i 30°C) na porast 16 odabranih izolata praćen je na već opisan način na PDA podlozi. Svi ispitivani izolati ispoljili su statistički značajnu razliku u brzini porasta kolonije na svim temperaturama (P<0,01), pri čemu je najveći broj ispitivanih izolata ispoljio najveći prosečan porast na temperaturi od 25ºC, dok je manji broj izolata ispoljio optimalan porast na temperaturama od 23ºC i 28ºC (Grafikon 4, Tabela 12). Pored razlika u brzini kod izolata M. laxa ispoljene su razlike u morfološkim osobinama: na temperaturi 23 i 25°C kolonija je imala karakterističan oblik rozete, dok je na ostalim temperaturama kolonija imala ravnu ivicu. Sa druge strane, temperature inkubacije nisu uticale na izgled kolonije izolata M. fructigena i M. fructicola (Slika 21). Izolati M. laxa najsporije su rasli na temperaturi od 18ºC, dok su izolati M. fructigena i M. fructicola najsporije rasli na 30ºC. Grafikon 4. Uticaj različitih temperatura na porast micelije izolata Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 83 Slika 21. Porast izolata Monilinia spp. na PDA podlozi na različitim temperaturama Rezultati 84 T a b el a 1 2 . U ti ca j ra zl ič it ih t em p er at u ra n a p o ra st m ic el ij e iz o la ta M o n il in ia s p p . P ro se ča n p o ra st ( m m /7 d a n a )1 3 0 ºC 4 7 ,1 7 ± 0 ,9 8 a 3 2 ,6 7 ± 1 ,0 3 d 2 9 ,3 3 ± 0 ,5 2 e 3 5 ,5 0 ± 0 ,5 5 c 3 8 ,5 0 ± 0 ,5 5 b 4 5 ,1 7 ± 0 ,7 5 a 4 0 ,6 7 ± 1 ,7 5 b 3 9 ,8 3 ± 0 ,7 5 b 4 1 ,0 0 ± 2 ,6 1 b 1 4 ,3 3 ± 3 ,1 4 g 5 ,8 3 ± 1 ,1 7 i 7 ,6 7 ± 1 ,8 6 h i 8 ,8 3 ± 1 ,7 2 h 2 2 ,6 7 ± 4 ,4 6 f 2 4 ,0 0 ± 0 ,8 9 f 2 3 ,1 7 ± 5 ,9 8 f 1 I st a sl o v a u k o lo n i o zn ač av aj u d a ra zl ik a n ij e st at is ti čk i zn ač an ja 2 8 ºC 5 0 ,5 0 ± 2 ,0 7 ab 4 3 ,8 3 ± 2 ,3 2 cd 5 3 ,3 3 ± 1 0 ,0 5 a 4 9 ,6 7 ± 7 ,7 4 ab c 4 6 ,0 0 ± 5 ,1 0 b cd 5 3 ,6 7 ± 2 ,3 4 a 4 6 ,8 3 ± 0 ,4 1 b c 4 0 ,3 3 ± 1 ,3 7 d e 5 3 ,8 3 ± 3 ,7 6 a 4 9 ,8 3 ± 6 ,1 8 ab c 1 8 ,0 0 ± 1 ,6 7 g h 2 1 ,5 0 ± 4 ,5 5 g 1 3 ,1 7 ± 1 ,3 3 h 2 1 ,3 3 ± 7 ,3 1 g 2 8 ,5 0 ± 1 ,2 2 f 3 5 ,3 3 ± 6 ,3 8 e 2 5 ºC 5 2 ,5 0 ± 6 ,4 7 d e 4 1 ,0 0 ± 3 ,5 2 g 4 1 ,3 3 ± 1 ,8 6 g 4 7 ,5 0 ± 2 ,2 6 ef 5 8 ,1 7 ± 3 ,1 9 d 6 5 ,0 0 ± 3 ,0 3 c 5 9 ,0 0 ± 6 ,3 9 d 5 4 ,5 0 ± 2 ,7 4 d 5 7 ,5 0 ± 2 ,2 6 d 3 6 ,0 0 ± 8 ,9 4 g h 1 6 ,6 7 ± 1 ,8 6 i 4 1 ,6 7 ± 5 ,0 5 fg 3 1 ,3 3 ± 3 ,5 0 h 7 3 ,8 3 ± 9 ,8 3 b 8 2 ,8 3 ± 3 ,1 9 a 7 6 ,6 7 ± 7 ,1 5 b 2 3 ºC 6 1 ,6 7 ± 3 ,7 2 b 3 7 ,8 3 ± 2 ,6 4 f 3 9 ,1 7 ± 1 ,6 0 ef 4 7 ,1 7 ± 1 ,7 2 d 5 3 ,3 3 ± 1 ,8 6 c 6 2 ,1 7 ± 6 ,8 8 b 5 7 ,0 0 ± 2 ,4 5 b c 4 5 ,3 3 ± 6 ,5 0 d e 4 3 ,3 3 ± 1 3 ,0 9 d ef 3 9 ,3 3 ± 3 ,8 3 ef 1 8 ,3 3 ± 0 ,5 2 h 2 8 ,0 0 ± 3 ,6 3 g 2 3 ,3 3 ± 2 ,0 7 g h 7 3 ,6 7 ± 0 ,8 2 a 7 4 ,8 3 ± 8 ,4 0 a 7 8 ,6 7 ± 4 ,1 3 a 2 0 ºC 2 5 ,5 0 ± 4 ,7 6 fg 2 6 ,8 3 ± 3 ,3 1 fg 3 3 ,6 7 ± 1 ,5 1 d e 3 9 ,0 0 ± 1 ,2 6 cd 3 3 ,6 7 ± 2 ,9 4 e 2 2 ,5 0 ± 0 ,8 4 g 4 8 ,1 7 ± 3 ,6 6 b 2 9 ,5 0 ± 3 ,6 2 ef 4 1 ,6 7 ± 5 ,7 5 c 2 4 ,6 7 ± 1 ,3 7 fg 1 2 ,1 7 ± 3 ,4 3 h i 1 6 ,8 3 ± 5 ,2 3 h 1 0 ,3 3 ± 2 ,3 4 i 4 8 ,6 7 ± 1 2 ,1 6 b 5 9 ,3 3 ± 2 ,2 5 a 5 5 ,8 3 ± 4 ,5 4 a 1 8 ºC 2 7 ,8 3 ± 4 ,5 4 d 2 1 ,3 3 ± 1 ,6 3 ef 2 5 ,0 0 ± 0 ,6 5 d e 2 1 ,3 3 ± 1 ,0 3 ef 2 5 ,8 3 ± 2 ,3 2 d 1 9 ,3 3 ± 1 ,6 3 fg 2 4 ,3 3 ± 2 ,8 0 d e 3 3 ,6 7 ± 6 ,4 1 c 3 1 ,6 7 ± 3 ,5 0 c 1 5 ,8 3 ± 1 ,6 0 g 4 ,6 7 ± 0 ,8 2 i 1 5 ,5 0 ± 0 ,8 4 g 9 ,1 7 ± 1 ,4 7 h 3 9 ,0 0 ± 4 ,8 6 b 4 8 ,0 0 ± 6 ,0 7 a 5 0 ,0 0 ± 1 ,7 9 a Iz o la t T P G R Š M L E s Š P S V T P B N Š M L E V G R S D B P S V B M L E s T P A L V G R S E V P B G T P G O Š P P R N P G M N P U D 1 N P U D 2 V rs ta M . la x a M . fr u ct ig en a M . fr u ct ic o la Rezultati 85 Uticaj ekstremnih temperatura. Uticaj ekstremnih temperatura na porast 16 odabranih izolata praćen je inkubiranjem izolata zasejanih na PDA podlozi na temperaturama nižim od 4°C (od 0°C do 4°C) i višim od 30°C (od 30°C do 35°C) kako bi bile utvrđene granične temperature rasta odabranih izolata. Uočena je statistički značajna razlika u brzini porasta micelije odabranih izolata na različitim temperaturama (P<0,01). Praćenjem porasta izolata na ekstremnim temperaturama uočeno je da su izolati M. fructigena najosetljiviji kako na niske, tako i na visoke temperature; granične temperature rasta ove vrste su 4°C i 31°C. Sa druge strane, izolati vrste M. fructicola su najotporniji na uticaj niskih i visokih temperature; granične temperature rasta ove vrste su 2°C i 34°C. Vrsta M. laxa ispoljila je umerenu osetljivost na uticaj ekstremnih temperatura. Rast ovih izolata zabeležen je na temperaturama višim od 2°C i nižim od 33°C (Grafikon 5, Tabela 13). Rezultati 86 Grafikon 5. Uticaj niskih (gore) i visokih (dole) temperatura na porast micelije izolata Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 87 T a b el a 1 3 . U ti ca j n is k ih i v is o k ih t em p er at u ra n a p o ra st m ic el ij e iz o la ta M o n il in ia s p p . P ro se ča n p o ra st ( m m /7 d a n a )1 3 5 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 1 I st a sl o v a u k o lo n i o zn ač av aj u d a ra zl ik a n ij e st at is ti čk i zn ač an ja 3 4 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 b 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 a 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 a 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 a 3 3 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 e 3 ,5 0 ± 0 ,5 0 b 4 ,2 5 ± 0 ,7 8 a 2 ,7 5 ± 0 ,5 2 c 3 2 °C 8 ,5 0 ± 1 ,9 1 b c 4 ,5 0 ± 1 ,2 5 g h 3 ,2 5 ± 1 ,5 0 h i 2 ,7 5 ± 0 ,9 6 i 7 ,5 0 ± 2 ,4 3 cd 1 1 ,2 5 ± 0 ,9 6 a 6 ,2 5 ± 0 ,9 6 d ef 5 ,7 5 ± 1 ,5 0 ef g 7 ,0 0 ± 0 ,0 0 cd e 5 ,2 5 ± 1 ,2 5 fg 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 4 ,2 5 ± 0 ,5 0 g h i 9 ,5 0 ± 3 ,0 0 b 4 ,7 5 ± 0 ,9 6 i 3 1 °C 2 2 ,3 3 ± 3 ,3 1 g 1 7 ,6 7 ± 4 ,7 6 i 3 3 ,2 5 ± 2 ,9 4 a 2 5 ,6 7 ± 3 ,6 6 e 3 0 ,2 5 ± 3 ,6 2 c 3 3 ,6 7 ± 5 ,7 5 a 2 8 ,5 0 ± 3 ,4 3 d 2 4 ,3 3 ± 5 ,2 3 f 3 1 ,1 7 ± 1 ,5 1 b 1 0 ,5 0 ± 2 ,3 4 k 2 ,7 5 ± 0 ,7 5 l 2 ,0 0 ± 0 ,0 0 lm 1 ,2 5 ± 0 ,5 0 m 1 5 ,3 3 ± 2 ,2 5 j 2 0 ,7 5 ± 2 ,3 4 h 1 8 ,2 5 ± 4 ,5 4 i 4 °C 7 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 6 ,2 5 ± 0 ,5 0 d 2 ,5 0 ± 0 ,5 8 g 1 1 ,2 5 ± 0 ,5 0 a 3 ,0 0 ± 0 ,0 0 fg 3 ,7 5 ± 0 ,5 0 e 2 ,5 0 ± 0 ,5 0 g 9 ,7 5 ± 0 ,5 0 b 6 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 6 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 h 0 ,8 3 ± 1 ,6 9 h 3 ,1 7 ± 0 ,9 8 ef 3 ,7 5 ± 0 ,5 0 e 7 ,2 5 ± 0 ,5 0 c 7 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 3 °C 1 ,8 3 ± 0 ,4 1 g 3 ,3 3 ± 0 ,5 2 cd 0 ,5 0 ± 0 ,5 5 h ij 4 ,7 5 ± 1 ,7 1 b 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 h 2 ,5 0 ± 0 ,0 0 ef 0 ,3 3 ± 0 ,5 1 ij 2 ,0 0 ± 0 ,0 0 fg 0 ,6 7 ± 0 ,5 2 h i 3 ,0 0 ± 0 ,0 0 d e 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 j 3 ,6 7 ± 0 ,5 2 c 5 ,8 3 ± 0 ,7 5 a 5 ,0 0 ± 0 ,8 9 b 2 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 d 1 ,0 0 ± 0 ,0 0 c 3 ,0 0 ± 0 ,0 0 a 2 ,2 5 ± 0 ,5 0 b 1 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 °C 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 0 ,0 0 ± 0 ,0 0 Iz o la t T P G R Š M L E s Š P S V T P B N Š M L E V G R S D B P S V B M L E s T P A L V G R S E V P B G T P G O Š P P R N P G M N P U D 1 N P U D 2 V r st a M . la x a M . fr u c ti g e n a M . fr u c ti co la Rezultati 88 Uticaj svetlosti. Porast 12 ispitivanih izolata proučavan je u različitim uslovima osvetljenja na PDA podlozi. Proučavani izolati rasli su različitom brzinom u različitim uslovima osvetljenja: stalni mrak i svetlosni režim 12 h svetlost/12 h mrak (Slika 22, Grafikon 6, Tabela 14). Nakon inkubacije od sedam dana izolati vrsta M. laxa i M. fructigena najbrži prosečni porast imali su u mraku, jedino je izolat NPGM (predstavnik vrste M. fructicola) imao brži prosečan porast u svetlosnom režimu 12 h svetlost/12 h mrak. Zabeležena je statistički značajna razlika u prosečnom porastu izolata u mraku i u uslovima smene 12 h svetlost/12 h mrak (66,8±5,8 mm) na nivou značajnosti 0,05. Slika 22. Porast izolata Monilinia spp. pri različitim svetlosnim režimima Rezultati 89 Grafikon 6. Uticaj različitog svetlosnog režima na porast micelije izolata Monilinia spp. Tabela 14. Uticaj različitog svetlosnog režima na porast micelije izolata Monilinia spp. Vrsta Izolat Prosečan porast (mm/7 dana)1 Tama 12 h svetlost/ 12 h mrak M. laxa TPGR 62,83 ± 4,12ab 42,67 ± 1,86c ŠMLEs 54,17 ± 5,27c 46,67 ± 0,82b ŠPSV 43,50 ± 5,01f 31,50 ± 2,43d TPBN 66,83 ± 4,12a 54,33 ± 2,07a ŠMLE 59,00 ± 4,69b 43,50 ± 2,81c VGRSD 51,67 ± 5,28cd 47,33 ± 1,97b BPSV 51,00 ± 3,29cd 42,17 ± 2,56c BMLEs 48,83 ± 2,14de 43,17 ± 2,93c TPAL 45,67 ± 5,24ef 17,33 ± 1,97f VGRSE 47,33 ± 1,21def 18,33 ± 2,16f M. fructigena VPBG 12,50 ± 2,26h 11,17 ± 1,72g M. fructicola NPGM 22,00 ± 2,28g 25,00 ± 3,90e 1 Ista slova u koloni označavaju da razlika nije statistički značanja M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 90 5.9. Unakrsna patogenost izolata Monilinia spp. Virulentnost devet odabranih monosporijalnih izolata Monilinia spp. (četiri M. laxa, četiri M. fructigena i jedan M. fructicola) ispitana je veštačkom inokulacijom povređenih plodova breskve, nektarine, šljive, trešnje, višnje i kajsije (Slika 23). Ovi testovi pokazali su da postoji statistički značajna razlika u virulentnosti kako između izolata različitih vrsta, tako i između izolata iste vrste (P<0,01) (Grafikon 7, Tabela 15). Izuzetak predstavlaju eksperimenti izvedeni na plodovima višnje koji pokazali da ne postoji statistički značajna razliku u virulentnosti tri vrste roda Monilinia na ovim plodovima (P>0,1). Na plodovima nektarine i breskve najveću patogenost ispoljio je izolat ŠPPR (M. fructigena), poreklom sa šljive, koji je nakon tri dana na nektarini prouzrokovao nekrotičnu zonu prečnika 45 mm, odnosno 37,78 mm na breskvi. Najmanju patogenost na plodovima nektarine ispoljio je izolat NPGM (M. fructicola) sa nektarine sa nekrotičnom zonom od 17,75 mm tokom tri dana, odnosno na plodovima breskve izolat ŠPSV (M. laxa) sa šljive sa zonom od 18,22 mm. Na plodovima šljive najveću nekrotičnu zonu obrazovao je izolat BMLE (M. laxa) sa breskve, a najmanju NPGM (M. fructicola) sa nektarine. Sa druge strane, na plodovima kajsije najmanju i najveću nekrotičnu zonu obrazovali su izolati iste vrste (M. laxa). Na plodovima trešnje i višnje, izolat VPBG (M. fructigena) sa višnje ispoljio je najveću virulentnost, dok je izolat BMLE (M. laxa) sa breskve prouzrokovao najmanju zonu truleži na ovim plodovima. Rezultati 91 Grafikon 7. Prikaz unakrsne patogenosti ispitivanih izolata Monilinia spp. na plodovima koštičavih voćaka. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 92 Slika 23. Unakrsna patogenost izolata Monilinia spp. na plodovima koštičavih voćaka Rezultati 93 T a b el a 1 5 . U n ak rs n a p at o g en o st i sp it iv an ih i zo la ta M o n il in ia s p p . n a p lo d o v im a k o št ič av ih v o ća k a P re čn ik n ek ro ti čn e zo n e (m m /3 d a n a )1 M . fr u c ti co la N P G M 1 7 ,7 5 ± 3 ,6 9 d 2 5 ,4 4 ± 3 ,3 2 d e 2 2 ,2 0 ± 2 ,4 4 c 3 1 ,4 7 ± 3 ,2 7 b 1 4 ,7 3 ± 0 ,8 8 b 2 ,2 0 ± 0 ,4 1 a 1 Is ta s lo v a u k o lo n i o zn ač av aj u d a ra zl ik a n ij e st at is ti čk i zn ač an ja M . fr u c ti g e n a B Š P B A 3 6 ,1 0 ± 3 ,2 5 b c 3 7 ,3 3 ± 5 ,5 4 a 2 8 ,3 ± 3 ,1 3 b 3 1 ,8 7 ± 2 ,6 4 b N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o V P B G 3 4 ,3 0 ± 3 ,8 6 c 2 6 ,7 5 ± 3 ,4 1 d e 2 3 ,7 0 ± 4 ,1 1 c 2 8 ,8 0 ± 5 ,2 7 c 1 8 ,0 7 ± 1 ,4 4 a 2 ,3 3 ± 0 ,8 2 a Š P P R 4 5 ,0 0 ± 3 ,6 5 a 3 7 ,7 8 ± 4 ,7 9 a 2 9 ,6 0 ± 4 ,2 7 b 3 3 ,8 0 ± 3 ,7 1 ab N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o T P G O 3 3 ,5 0 ± 3 ,5 4 c 3 3 ,1 4 ± 5 ,3 7 b 3 0 ,3 0 ± 2 ,5 8 b 3 1 ,4 0 ± 3 ,3 5 b N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o M . la x a B M L E 3 7 ,0 0 ± 5 ,6 4 b c 2 8 ,3 3 ± 5 ,5 0 cd 3 5 ,0 0 ± 3 ,8 0 a 2 3 ,8 7 ± 2 ,9 7 d 1 0 ,2 1 ± 1 ,4 2 c 1 ,8 0 ± 0 ,7 7 a V G R S E 3 8 ,5 6 ± 3 ,3 9 b 3 1 ,4 4 ± 5 ,4 1 b c 2 8 ,0 0 ± 2 ,3 6 b 3 5 ,2 0 ± 2 ,3 0 a N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o Š P S V 3 4 ,1 0 ± 5 ,3 2 c 1 8 ,2 2 ± 2 ,9 1 f 2 3 ,2 0 ± 2 ,6 6 c 1 9 ,6 7 ± 3 ,2 9 e N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o T P G R 3 8 ,2 2 ± 4 ,1 8 b 2 4 ,0 0 ± 3 ,4 6 e 2 5 ,1 0 ± 2 ,6 8 c 2 6 ,5 3 ± 2 ,0 6 c N ij e o d re đ en o N ij e o d re đ en o T e st b il jk a N e k ta ri n a B r e sk v a Š lj iv a K a js ij a T re šn ja V iš n ja Rezultati 94 5.10. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija Molekularna detekcija svih 246 dobijenih izolata Monilinia spp. obavljena je primenom PCR reakcija uz korišćenje prajmera: MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2 specifičnih za detekciju Monilinia spp. i upotrebom para univerzalnih prajmera ITS1/ITS4. Molekularna identifikacija 18 odabranih izolata Monilinia spp. obavljena je, nakon sekvencioniranja ITS genomnog regiona i obrade dobijenih sekvenci, višestrukim uparivanjem sa sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti pomoću BLAST analize i softverskog paket MEGA 5. Višestrukim poređenjem dobijenih sekvenci sa dostupnim sekvencama odgovarajućih regiona genoma gljiva u GenBank bazi podataka pomoću CLUSTAL W programa, obavljena je potvrda identifikacije dobijenih sekvenci. Molekularna karakterizacija 18 odabranih izolata obavljena je rekonstrukcijom filogenetskog staba. Upoređivanje je vršeno sa 38 sekvenci vrsta roda Monilinia dostupnih u GenBank bazi podataka. Filogenetsko stablo rekonstruisano je korišćenjem Maximum Parsimony metode, integrisane unutar programa MEGA5 i bootstrap analize u 1000 ponavljanja. Određeni su markeri za tri izolata M. fructicola poreklom iz Srbije. Upotrebom Multiplex PCR kit-a u samo jednoj reakciji umnoženo je pet različitih SSR markera. Poređenje dobijenih profila izolata poreklom iz Srbije sa profilima dobijenim u prethodnim istraživanjima Jansch et al. (2012) ukazalo je na put introdukciju vrste M. fructicola u našu zemlju. 5.10.1. Molekularna detekcija primenom Multiplex PCR reakcije Kao rezultat lančane reakcije polimeraze, korišćenjem prajmera MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2, po protokolu koji su opisali Côté et al. (2004), amplifikovani su fragmenti nukleinske kiseline očekivanih veličina. Kod 237 uzoraka došlo je do amplifikacije fragmenta veličine 351 bp, karakterističnog za izolate vrste M. laxa (Slika 24). Fragmenti veličine oko 402 bp amplifikovani su u slučaju šest uzoraka detektovanih kao M. fructigena, dok je kod tri izolata došlo do amlifikacije fragmenata Rezultati 95 veličine 535 bp koji su detektovani kao vrsta M. fructicola (Slika 25). Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole. Multiplex PCR detekcijom potvrđen je identitet svih prikupljenih izolata prethodno okarakterisanih na osnovu morfoloških karakteristika. 5.10.2. Molekularna detekcija na osnovu amplifikacije ITS regiona Sa ciljem potvrde identiteta odabranih izolata, korišćen je par univerzalnih prajmera ITS1 i ITS4 koje su dizajnirali White et al. (1990). Kao rezultat lančane reakcije polimeraze, korišćenjem ovih prajmera, utvrđeno je prisustvo amplifikovanih fragmenata DNK očekivane veličine 500-600 bp kod svih ispitivanih izolata (Slika 26). Do amplifikacije nije došlo kod negativne kontrole. Slika 24. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korišćenjem prajmera MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2. Kolone: M-100 bp DNK marker; K - -negativna kontrola (PCR smeša sa RNase-free vodom); 1- izolat BPČO; 2-izolat BPZK; 3-izolat KPGG; 4-izolat KPGO; 5-izolat NPSP; 6-izolat NPVI; 7-izolat ŠPIV; 8-izolat TPLČ; 9-izolat TPRŠ; 10-izolat VPJR; 11-izolat VPSV. Slika 25. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korišćenjem prajmera MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2. Kolone: M-100 bp DNK marker; K - -negativna kontrola (PCR smeša sa RNase-free vodom); 1- izolat NPGM; 2-izolat NPUD1; 3- izolat NPUD2; 4-izolat VPBG; 5-izolat ŠPPR; 6-izolat BŠPBA; 7-izolat TPGO; 8- izolat ŠMPR; 9-izolat BŠPBA1. Rezultati 96 5.10.3. Molekularna identifikacija Sa ciljem molekularne identifikacije, uspešno je sekvencioniran ITS rDNK genomni region ukupno 18 izolata podeljenih u tri grupe, okarakterisanih na morfološkom nivou i detektovanih primenom Multiplex PCR reakcije. Nakon sekvencioniranja dobijene konsenzus nukleotidne sekvence deponovane su u GenBank bazu podataka i dodeljeni su im pristupni brojevi (Tabela 16). Identifikacija odabranih izolata izvršena je višestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti dobijenih sekvenci međusobno, kao i sa sekvencama drugih izolata ovog roda dostupnih u GenBank bazi podataka. Slika 26. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korišćenjem para prajmera ITS1/ITS4. Kolone: M-1 Kbp DNK marker; 1-izolat BPČO; 2-izolat BPZK; 3- izolat KPGG; 4-izolat KPGO; 5-izolat NPSP; 6-izolat NPVI; 7-izolat ŠPIV; 8-izolat TPLČ; 9-izolat TPRŠ; K--negativna kontrola (PCR smeša sa RNase–free vodom). Rezultati 97 Tabela 16. Izolati Monilinia spp. identifikovani tokom istraživanja sa dodeljenim GenBank pristupnim brojevima Vrsta Naziv izolata Biljka domaćin Gen Bank pristupni broj M. laxa BPCO Breskva KC515383 BPZK Breskva KC544793 KPGG Kajsija KC544794 KPGO Kajsija KC544795 NPSV Nektarina KC544796 NPVI Nektarina KC544797 SPIV Šljiva KC544798 TPLC Trešnja KC544800 TPRS Trešnja KC544801 VPJR Višnja KC544802 VPSV Višnja KC544803 M. fructigena BSPBA Šljiva KC544804 SPBA Šljiva KC544805 SPPR Šljiva KC544806 TPGO Trešnja KC544807 M. fructicola NPUD1 Nektarina KC544808 NPUD2 Nektarina KC544809 NPGM Nektarina JX127303 Međusobnim poređenjem 11 sekvenci M. laxa dobijenih u ovim istraživanjima (BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV) utvrđena je 100% međusobna sličnost 10 izolata, dok se sekvenca označena kao VPSV razlikuje u jednom nukleotidu i sličnost sa ostalim izolatima je 99,8%. Sa druge strane, međusobna identičnost izolata M. fructigena (BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO) i M. fructicola (NPGM, NPUD1 i NPUD2) bila je 100%. Između izolata M. laxa i M. fructigena uočena je razlika u devet nukleotida, odnosno sličnost od 97,9%; između M. laxa i M. fructicola tri nukleotida odnosno 99,3% identičnosti; između M. fructigena i M. fructicola 10 nukleotida razlike ili 97,9% identičnosti, što podržava razvrstavanje ovih izolata u različite vrste. BLAST analiza 11 sekvenci M. laxa dobijenih u ovom istraživanju pokazala je 100% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama pet izolata vrste M. laxa poreklom iz Španije (EF153013, EF153014, EF153015, EF153016 i EF153017). Analiza četiri sekvence M. fructigena (BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO) pokazala je 100% nukleotidne identičnosti sa 16 izolata M. fructigena poreklom iz različitih delova sveta: Švajcarske (HQ166347 i EU098121), Španije (EF207429, EF207428, EF207427, Rezultati 98 EF207426, EF207425, F207424 i FJ754275), Francuske (AF150680, AF150679, AF150678 i AF150677), Norveške (Z73779 i Z73780) i Kine (HQ908791). BLAST analiza pokazala je da su sekvence izolata NPGM, NPUD1 i NPUD2 100% identične sekvencama osam izolata M. fructicola deponovanih u GenBank bazi podataka: iz Srbije (JN176564 sa uskladištenog ploda jabuke), Italije (FJ411109), Španije (EF207423, EF207422, EF207421, EF207420 i EF207419) i Kine (FJ515894). Na osnovu navedenih proračuna genetičke sličnosti odabranih sekvenci, prva grupa od 11 izolata (BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV) identifikovana je kao vrsta M. laxa, druga grupa (BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO) kao M. fructigena, i treća (NPGM, NPUD1 i NPUD2) kao M. fructicola. Dobijeni rezultati u potpunosti su saglasni sa rezultatima dobijenim na osnovu morfoloških karakteristika i molekularne detekcije. 5.10.4. Molekularna karakterizacija Molekularna karakterizacija ispitivanih izolata obavljena je rekonstrukcijom filogenetskog stabla korišćenjem delimičnih nukleotidnih sekvenci dobijenih amplifikacijom ITS rDNK genomskog regiona. U ova ispitivanja uključene su sekvence 18 izolata, 11 sekvenci identifikovanih kao M. laxa (BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV), četiri sekvence M. fructigena (BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO) i tri sekvence M. fructicola (NPGM, NPUD1 i NPUD2) poreklom iz Srbije. Dobijene sekvence uparene su sa 38 odabranih sekvenci vrsta roda Monilinia dostupnih u GenBank bazi podataka poreklom iz različitih delova sveta. Rekonstruisano je filogenetsko stabalo primenom Maximum Parsimony metode sa bootstrap podrškom u 1000 ponavljanja. Filogenetsko stablo je rutovano sa dve autgrupe, vrstama Botryotinia fuckeliana (HQ846943) i Sclerotinia sclerotiorum (HQ846942). Analizom filogenetskog stabla uočena je podela na dva klastera koji se dalje dele na dve podgrupe. U okviru prve podgrupe prvog klastera grupisani su izolati M. laxa poreklom iz Amerike (SAD i Čile), Azije (Japan) i Evrope (Francuske, Norveške i Španije), kao i 11 izolata M. laxa dobijenih u ovim istraživanjima (BPČO, BPZK, KPGG, KPGO, NPSP, NPVI, ŠPIV, TPLČ, TPRŠ, VPJR i VPSV). Unutar druge Rezultati 99 podgrupe prvog klastera nalaze se četiri izolata M. fructicola iz Srbije (tri dobijena u ovim istraživanjima - NPGM, NPUD1, NPUD2 i jedan izolat sa uskladištenih plodova jabuke-JN176564), kao i 15 izolata M. fructicola poreklom iz Japana, Novog Zelanda, SAD-a, Kanade, Kine, Španije, Norveške, Slovenije, Poljske, Francuske i Italije. U drugom klasteru grupisali su se: u okviru jedne podgrupe izolati M. polystroma poreklom iz Mađarske, Poljske, Srbije, Japana i Kine, a u okviru druge podgrupe četiri izolata M. fructigena iz Srbije (BŠPBA, ŠPBA, ŠPPR i TPGO) sa devet izolata M. fructigena iz evropskih zemalja (Švajcarske, Norveške, Belgije, Velike Britanije, Mađarske, Španije i Francuske) (Slika 27). Rezultati 100 Slika 27. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci ITS regiona rDNK 56 izolata vrsta Monilinia spp. korišćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja. Izolati sa koštičavih voćaka iz Srbije su naznačeni Rezultati 101 5.10.5. SSR marker analiza izolata Monilinia fructicola poreklom iz Srbije U okviru ove disertacije određeni su mikrosatelitni SSR markeri za tri izolata M. fructicola poreklom iz Srbije. U ispitivanjima korišćeni su prajmeri koji umnožavaju alelne oblike različitih dužina izolata M. fructicola i to: CHML5 (umnožava jedan alelni oblik dužine 220 bp), CHMFc1 (umnožava tri alelna oblika dužine 169, 173 i 176 bp), CHMFc4 (umnožava dva alelna oblika dužine 216 i 223 bp) i CHMFc 5 (umnožava jedan alelni oblik od 160 bp). Kao marker koji detektuje najviše alalnih oblika izdvojio se CHMFc1 (sa identifikovanih 30 alelnih oblika različite dužine), dok je marker sa najmanje detektovanih alelnih oblika CHMf12 (sa jednim alelnim oblikom dužine 160 bp). Prajmeri CHML5, CHMFc4 i CHMFc 5 detektuju pet, četiri i pet različita alelna oblika. Analiza SSR markera izolata M. fructicola poreklom iz Srbije pokazala je da se izolati razlikuju po dužini alela koje amplifikuje marker CHFc4, da izolati poreklom sa jednog lokaliteta (NPUD 1 i NPUD2) imaju alelni oblik dužine 216 bp, dok izolat poreklom sa drugog lokaliteta (NPGM) ima alelni oblik dužine 223 bp (Tabela 17). Izolat NPGM ima identičan profil kao izolati M. fructicola iz Italije koji su specifični samo za to područje, dok izolati NPUD1 i NPUD2 imaju profil kao i izolati poreklom iz SAD koji su osim u SAD detektovani i u izolatima poreklom iz Italije. Tabela 17. Prikaz dobijenih alelnih oblika (bp) umnoženih pomoću SSR markera i dobijeni profili haplotipova prema nomenklaturi Jansch et al. (2012) Izolat CHMFc5 CHMFc1 CHMFc4 CHML5 CHMFc12 Profil prema nomenklaturi Jansch et al. (2012) NPUD1 86 bp 173 bp 216 bp 220 bp 160 bp US50 NPUD2 86 bp 173 bp 216 bp 220 bp 160 bp US50 NPGM 86 bp 173 bp 223 bp 220 bp 160 bp ITA01 5.11. Utvrđivanje nivoa osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide Ispitivanja osetljivosti na fungicide uključila su proučavanje delovanja sedam komercijalnih formulacija fungicida (tebukonazol, iprodion, hlorotalonil, boskalid, fluopiram, azoksistrobin i prohloraz) na porast 14 odabranih izolata Monilinia spp. Izolati su ispoljili različitu osetljivost na ispitivane fungicide. Rezultati 102 Tebukonazol. Vrednosti parametara osetljivosti (EC50 vrednosti i nagib regresione linije b) izolata Monilinia spp. na tebukonazol prikazane su u Tabeli 18. Izolati sve tri ispitivane vrste ispoljili su ujednačenu osetljivost na tebukonazol u niskim koncentracijama. EC50 vrednosti su bile u intervalu od 0,01 mg/l (izolat BMLEs, M. laxa) do 0,06 mg/l (izolat NPGM, M. fructicola) (Slika 28). Tabela 18. Osetljivost izolata Monilinia spp. na tebukonazol Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,02 (0,013-0,023) 1,11 ± 0,20 TPAL 0,01 (0,007-0,015) 1,00 ± 0,20 TPGR 0,01 (0,008-0,013) 1,33 ± 0,20 VGRSD 0,02 (0,014-0,025) 1,05 ± 0,19 NPFG 0,01 (0,009-0,015) 1,40 ± 0,020 VPRA 0,02 (0,015-0,024) 1,67 ± 0,21 ŠMLE 0,02 (0,013-0,003) 0,91 ± 0,19 ŠLJSV 0,02 (0,014-0,022) 1,32 ± 0,32 ŠMLEs 0,01 (0,008-0,016) 1,70 ± 0,33 BPSV 0,02 (0,017-0,036) 0,90 ± 0,19 BMLEs 0,01 (0,006-0,013) 1,06 ± 0,20 BPBN 0,04 (0,027-0,063) 1,06 ± 0,20 M. fructigena VPBG 0,05 (0,040-0,067) 1,37 ± 0,15 M. fructicola NPGM 0,06 (0,049-0,078) 1,40 ±0,14 * nagib regresione linije Rezultati 103 Slika. 28. Monilinia fructigena: Osetljivost izolata VPBG na tebukonazol Slika 29. Monilinia fructicola: Osetljivost izolata NPGM na iprodion Rezultati 104 Iprodion. Vrednosti parametara osetljivosti izolata Monilinia spp. na iprodion prikazane su u Tabeli 19. Najniža EC50 vrednost od 0,13 mg/l zabeležena je za izolat TPAL (M. laxa). Sličnu osetljivost ispoljili su i ostali ispitivani izolati vrste M. laxa. Izolat vrste M. fructigena ispoljio je nešto niži stepen osetljivosti na iprodion (EC50 vrednost 0,85 mg/l), dok je najmanje osetljiv bio predstavnik vrste M. fructicola, izolat NPGM poreklom sa nektarine, za koji je EC50 vrednost iznosila 3,32 mg/l (Slika 29). Na osnovu nepreklapanja intervala poverenja za EC50 vrednosti razlika u osetljivosti različitih vrsta roda Monilinia na iprodion bila je statistički značajna. Tabela 19. Osetljivost izolata Monilinia spp. na iprodion Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,14 (0,113-0,163) 1,46 ± 0,15 TPAL 0,13 (0,110-0,158) 1,54 ± 0,15 TPGR 0,17 (0,148-0,211) 1,64 ± 0,15 VGRSD 0,14 (0,115-0,174) 1,33 ± 0,15 NPFG 0,20 (0,118-0,509) 1,28 ± 0,15 VPRA 0,20 (0,173-0,229) 2,23 ± 0,18 ŠMLE 0,22 (0,185-0,257) 1,93 ± 0,17 ŠLJSV 0,17 (0,141-0,201) 1,64 ± 0,15 ŠMLEs 0,17 (0,147-0,203) 1,79 ± 0,16 BPSV 0,16 (0,136-0,202) 1,45 ± 0,15 BMLEs 0,17 (0,141-0,203) 1,58 ± 0,15 BPBN 0,15 (0,126-0,185) 1,45 ± 015 M. fructigena VPBG 0,85 (0,160-1,380) 1,01 ± 0,31 M. fructicola NPGM 3,32 (2,730-4,120) 1,38 ± 0,15 * nagib regresione linije Boskalid. Vrednosti parametara osetljivosti izolata Monilinia spp. na boskalid prikazane su u Tabeli 20. Izolati proučavanih vrsta ispoljili su velike razlike u osetljivosti na boskalid. Izolati vrste M. laxa ispoljili su ujednačenu osetljivost sa EC50 vrednostima u intervalu od 0,04 mg/l za izolat ŠMLE do 0,09 mg/l za izolat BPBN (Slika 30). Sa druge strane, izolati vrsta M. fructigena i M. fructicola ispoljili su statistički značajno nižu osetljivost na ovaj fungicid. Za izolat VPBG (M. fructigena) EC50 vrednost iznosila je 250,36 mg/l, a za najmanje osetljiv izolat M. fructicola, NPGM, na ovaj fungicid bila je 464 mg/l. Rezultati 105 Tabela 20. Osetljivost izolata Monilinia spp. na boskalid Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,06 (0,047-0,095) 1,03 ± 0,15 TPAL 0,05 (0,043-0,074) 1,24 ± 0,15 TPGR 0,07 (0,053-0,117) 1,02 ± 0,15 VGRSD 0,05 (0,041-0,076) 1,09 ± 0,15 NPFG 0,06 (0,048-0,116) 0,88 ± 0,14 VPRA 0,06 (0,044-0,103) 0,88 ± 0,14 ŠMLE 0,04 (0,036-0,060) 1,23 ± 0,15 ŠLJSV 0,05 (0,042-0,073) 1,23 ± 0,15 ŠMLEs 0,05 (0,039-0,065) 1,28 ± 0,15 BPSV 0,06 (0,047-0,082) 1,26 ± 0,15 BMLEs 0,05 (0,041-0,083) 0,98 ± 0,14 BPBN 0,09 (0,065-0,156) 1,05 ± 0,15 M. fructigena VPBG 250,36 (139,66- 565,22) 0,47 ± 0,05 M. fructicola NPGM 464 (no) 1 0,78 ± 0,27 1 no-nije određeno zbog heterogenosti odgovora u svim ponavljanjima * nagib regresione linije Hlorotalonil. Vrednosti parametara osetljivosti izolata Monilinia spp. na hlorotalonil prikazane su u Tabeli 21. Izolati M. laxa ispoljili su neznatne razlike u osetljivosti na hlorotalonil: dobijene EC50 vrednosti bile su u rasponu od 0,12 mg/l za Slika 30. Monilinia laxa: Osetljivost izolata TPGR na boskalid Rezultati 106 izolat BPSV do 0,15 mg/l za izolat ŠLJSV. Slična osetljivost zabeležena je i za M. fructigena (EC50 - 0,23 mg/l), dok je statistički značajno manje osetljiv bio izolat NPGM M. fructicola sa EC50 vrednošću od 1,06 mg/l. Tabela 21. Osetljivost izolata Monilinia spp. na hlorotalonil Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,25 (0,205-0,324) 1,44 ± 0,20 TPAL 0,26 (0,206-0,355) 1,26 ± 0,20 TPGR 0,19 (0,159-0,233) 1,60 ± 0,20 VGRSD 0,23 (0,187-0,304) 1,33 ± 0,20 NPFG 0,23 (0,191-0,282) 1,65 ± 0,21 VPRA 0,21 (0,183-0,247) 2,14 ±0,22 ŠMLE 0,19 (0,158-0,223) 1,80 ±0,21 ŠLJSV 0,19 (0,162-0,221) 2,51 ± 0,33 ŠMLEs 0,25 (0,210-0,310) 1,71 ± 0,21 BPSV 0,12 (0,096-0,149) 1,53 ±0,20 BMLEs 0,15 (0,117-0,184) 1,40 ± 0,20 BPBN 0,18 (0,144-0,219) 1,46 ± 0,20 M. fructigena VPBG 0,23 (0,200-0,260) 2,62 ± 0,24 M. fructicola NPGM 1,06 (0,830-1,480) 1,20 ± 0,20 * nagib regresione linije Fluopiram. Osetljivost izolata Monilinia spp. na fluopiram prikazana je u Tabeli 22. Utvrđene su velike razlike u osetljivosti na fluopiram, kako među izolatima različitih vrsta, tako i među izolatima iste vrste. Najniža EC50 vrednost od 0,11 mg/l zabeležena je za izolat VGRSD (M. laxa), dok je najviša EC50 vrednost zabeležena za izolat M. fructigena, VPBG (5612,28 mg/l). Razlika u osetljivosti različitih vrsta roda Monilinia na fluopiram bila je statistički značajna. Rezultati 107 Tabela 22. Osetljivost izolata Monilinia spp. na fluopiram Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,25 (0,169-0,339) 0,74 ± 0,10 TPAL 0,21 (0,122-0,321) 0,57 ± 0,10 TPGR 0,21 (0,109-0,338) 0,50 ± 0,10 VGRSD 0,11 (0,089-0,129) 1,90 ± 0,18 NPFG 10,78 (4,04-92,88) 0,59 ± 0,12 VPRA 2,99 (1,65-8,90) 0,65 ± 0,11 ŠMLE 1,97 (1,03-7,67) 0,48 ± 0,10 ŠLJSV 1,04 (0,67-2,13) 0,59 ± 0,10 ŠMLEs 0,30 (0,222-0,399) 0,85 ± 0,11 BPSV 0,39 (0,269-0,568) 0,66 ± 0,10 BMLEs 1,23 (0,76-2,78) 0,57 ± 0,10 BPBN 0,67 (0,468-1,060) 0,69 ± 0,10 M. fructigena VPBG 5612,28 (1093 - 8722) 0,30 ± 0,06 M. fructicola NPGM 386,56 (297,32-534,10) 1,01 ± 0,14 * nagib regresione linije Prohloraz. Izolati Monilinia spp. ispoljili su visoku osetljivost na prohloraz (Tabela 23). Najniža EC50 vrednost zabeležena je za izolate ŠLJSV (M. laxa) i NPGM (M. fructicola) od 0,006 mg/l, dok je najnižu osetljivost ispoljio izolat VPBG (M. fructigena) sa EC50 vrednošću od 0,023 mg/l. Tabela 23. Osetljivost izolata Monilinia spp. na prohloraz Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,010 (0,009-0,012) 2,16 ± 0,17 TPAL 0,008 (0,007-0,009) 1,77 ± 0,16 TPGR 0,008 (0,007-0,010) 1,64 ± 0,15 VGRSD 0,013 (0,011-0,015) 2,01 ± 0,16 NPFG 0,008 (0,007-0,010) 1,95 ± 0,16 VPRA 0,011 (0,093-0,123) 2,13 ± 0,17 ŠMLE 0,011 (0,009-0,013) 1,88 ± 0,17 ŠPBN 0,008 (0,007-0,009) 1,82 ±0,16 ŠLJSV 0,006 (0,005-0,007) 2,09 ± 0,22 ŠMLEs 0,007 (0,006-0,009) 1,72 ± 0,16 BPSV 0,011 (0,009-0,013) 1,87 ± 0,16 BMLEs 0,011 (0,009-0,012) 2,19 ± 0,17 BPBN 0,011 (0,009-0,013) 1,45 ± 0,15 M. fructigena VPBG 0,023 (0,019-0,028) 1,67 ± 0,16 M. fructicola NPGM 0,006 (0,005-0,008) 1,63 ± 0,16 * nagib regresione linije Azoksistrobin. Ispitivanju osetljivosti izolata Monilinia spp. na azoksistrobin prethodilo je ispitivanje osetljivosti izolata na SHAM sa ciljem određivanja najviše Rezultati 108 koncentracije koja ne utiče inhibitorno na porast izolata. Kao radna koncentracija SHAM-a za mešanje sa azoksistrobinom za sve ispitivane izolate korišćena je koncentracija od 0,1 mg/l. Parametri osetljivosti izolata Monilinia spp. na azoksistrobin prikazani su u Tabeli 24. Svi ispitivani izolati bili su osetljivi na azoksistrobin u prisustvu SHAM-a. Najniža EC50 vrednost od 0,51 mg/l zabeležena je za izolat ŠLJSV (M. laxa), dok je najviša EC50 vrednost utvrđena za izolat NPGM, M. fructicola (8,83 mg/l). Tabela 24. Osetljivost izolata Monilinia spp. na azoksistrobin Vrsta Izolat EC50 (mg/l) b* M. laxa TPBN 0,98 (0,545-1,810) 0,47 ± 0,05 TPAL 1,12 (0,512-2,920) 0,36 ± 0,04 TPGR 0,78 (0,473-1,340) 0,51 ± 0,04 VGRSD 1,01 (0,596-1,770) 0,51 ± 0,06 NPFG 2,38 (1,340-4,840) 0,48 ± 0,06 VPRA 0,69 (0,410-1,230) 0,48 ± 0,04 ŠMLE 1,55 (0,890-2,920) 0,49 ± 0,06 ŠLJSV 0,51 (0,320-0,800) 0,62 ± 0,06 ŠMLEs 0,95 (0,500-2,000) 0,39 ± 0,04 BPSV 3,35 (1,790-7,330) 0,45 ± 0,04 BMLEs 1,36 (0,310-18,800) 0,40 ± 0,04 BPBN 1,44 (0,610- 2,220) 0,29 ± 0,04 M. fructigena VPBG 5,87 (4,430-8,390) 1,08 ± 0,12 M. fructicola NPGM 8,83 (5,880-12,980) 0,69 ± 0,09 * nagib regresione linije 5.12. Određivanje minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije fungicida na izolate Monilinia spp. Minimalne fungistatične i minimalne letalne koncentracije proučavanih fungicida za tri odabrana izolata Monilinia spp., predstavnika sve tri vrste, prikazane su u Tabeli 25. Sva tri izolata bila su veoma osetljiva na tebukonazol i prohloraz koji su pri vrlo niskim koncentracijama (od 0,5 do 2 mg/l) ispoljili letalni efekat. U ovom eksperimentu najosetljiviji je bio izolat TPGR, predstavnik vrste M. laxa. Za hlorotalonil, boskalid, fluopiram i azoksistrobin zabeležene su minimalne letalne koncentracije veće od 1000 mg/l za predstavnike sve tri vrste roda Monilinia. Rezultati 109 Tabela 25. Prikaz minimalnih fungistatičnih (MFC) i minimalnih letalnih (MLC) koncentracija fungicida na odabrane izolate Monilinia spp. * mg/l 5.13. Utvrđivanje antifungalnog uticaja etarskih ulja na izolate Monilinia spp. U okviru utvrđivanja antifungalnog uticaja etarskih ulja na izolate Monilinia spp. u početnim fazama istraživanja ispitan je in vitro efekat gasovite faze 56 etarskih ulja i određen je minimalan period ekspozicije za šest odabranih ulja. Na osnovu dobijenih rezultata odabrana su dva etarska ulja, ulje timijana i origana za koje je razvijena formulacija i ispitan in vitro i in vivo efekat formulisanih preparata na odabrane izolate, predstavnike tri vrste roda Monilinia. 5.13.1. In vitro efekat gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. U Tabeli 26 prikazani su rezultati ispitivanja in vitro efekta gasovite faze 56 etarskih ulja na izolate Monilinia spp. Od proučavanih etarskih ulja, 32 ulja nisu potpuno zaustavila porast micelije izolata pri najvišoj korišćenoj koncentraciji od 0,16 μl/ml vazduha. Za 24 ulja utvrđene su MFC i MLC vrednosti u intervalu 0,02-0,16 μl/ml vazduha. Najveću toksičnost za izolate sve tri vrste ispoljilo je sedam ulja - različita ulja origana, ulje timijana i limunove trave, sa vrednošću MLC 0,02-0,04 μl/ml vazduha. Za ulja označena kao Origano B i Origano E zabeležena je najniža vrednost MLC od 0,02 μl/ml vazduha za sve tri vrste roda Monilinia. Izolati različitih vrsta roda Monilinia nisu ispoljili razliku u osetljivosti na gasovitu fazu etarskih ulja. M. laxa M. fructigena M. fructicola MFC* MLC* MFC MLC MFC MLC Tebukonazol 0,25 0,5 1 1 1 1 Iprodion 5 10 50 >1000 20 500 Hlorotalonil 5 >1000 7,5 >1000 >1000 >1000 Boskalid >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Fluopiram >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 Prohloraz 0,5 0,5 0,5 1 0,5 2 Azoksistrobin 25 >1000 500 >1000 >1000 >1000 Rezultati 110 T a b el a 2 6 . In v it ro e fe k at g as o v it e fa ze e ta rs k ih u lj a n a iz o la te M o n il in ia s p p . M . fr u ct ic o la M L C > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 2 0 ,0 2 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 M F C 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 M . fr u ct ig en a M L C > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 4 0 ,0 2 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 M F C 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 M . la x a M L C > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 2 0 ,0 2 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 M F C 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,0 2 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 2 E ta rs k a u lj a M ir o đ ij a A M ir o đ ij a B M ir o đ ij a C M ir o đ ij a D O ri g a n o A O ri g a n o B O ri g a n o C O ri g a n o D O ri g a n o F M o ra č A M o ra č B M o ra č C M o ra č D M o ra č E L a v a n d a A L a v a n d a B L a v a n d a C L a v a n d a D L a v a n d a E L a v a n d a F Ž a lf ij a A Ž a lf ij a B Ž a lf ij a C Ž a lf ij a D Ž a lf ij a E Ž a lf ij a F S a lv ia s cl a re a T im ij a n M . fr u ct ic o la M L C > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 M F C 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 M . fr u ct ig en a M L C > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 M F C 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,0 2 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 M . la x a M L C 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 M F C 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,0 4 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 > 0 ,1 6 E ta rs k a u lj a G er a n ij u m A G er a n ij u m B K a m il ic a A n is A A n is B T u rp e n ti n B o si lj a k N a n a L im u n o v a t ra v a C im et A C im et B B el i b o r K a ra n fi li ć K le k a A K le k a B P o m o ra n d ža E u k a li p tu s R u zm a ri n R u ta m o n ta n a L o v o r Č a jn o d rv o A Č a jn o d rv o B L ep to sp er m u m s co p a ri u m K im K o ri a n d er K a m fo r S a n d a l K a ri Rezultati 111 5.13.2. Određivanje minimalnog perioda ekspozicije Na osnovu rezultata prikazanih u prethodnom poglavlju, šest etarskih ulja (četiri ulja origana, ulje timijana i ulje limunove trave) za koja su određene najniže vrednosti MLC odabrano je za utvrđivanje minimalnog perioda ekspozicije za postizanje letalnog efekta (MPE) (Tabela 27). Za sva ispitivana ulja pri najvišoj koncentraciji od 0,08 µl/ml vazduha MPE bio je jedan dan. Međutim, za najnižu ispitivanu koncentraciju od 0,02 µl/ml vazduha MPE od jednog dana zabeležen je samo za ulje Origano E za izolat M. fructigena, dok je za ostale vrste taj period iznosio četri dana. Za vrste M. laxa i M. fructicola minimalan period ekspozicije od dva dana pri najnižoj ispitivanoj koncentraciji od 0,02 µl/ml vazduha zabeležen je za ulje Origano D. Tabela 27. Prikaz rezultata utvrđivanja minimalnog perioda ekspozicije (MPE) izolata Monilinia spp. za različita etarska ulja Minimalni period ekspozicije (dani) M. laxa M. fructigena M. fructicola Koncentracija (µl/ml vazduha) 0,08 0,04 0,02 0,08 0,04 0,02 0,08 0,04 0,02 Origano A 1 3 3 1 3 3 1 3 4 Origano C 1 1 >7 1 1 4 1 2 >7 Origano D 1 2 2 1 2 >7 1 2 2 Origano E 1 1 4 1 1 1 1 1 4 Timijan 1 2 4 1 2 >7 1 2 >7 Limunova trava 1 3 >7 1 3 >7 1 3 >7 5.13.3. Proces formulacije etarskih ulja origana i timijana Rezultati ispitivanja in vitro efekta gasovite faze etarskih ulja i određivanja MFC, MLC i MPE pokazali su da ulja origana i timijana ispoljavaju snažnu antimikrobu aktivnost prema izolatima Monilinia spp. i odličan potencijal da postanu aktivna materija formulisanog preparata. Za ova istraživanja odabrano je po jedno ulje timijana i origana. Rezultati 112 5.13.4. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana u poređenju sa standardnim fungicidom na bazi iprodiona i komercijalnim preparatom na bazi etarskog ulja čajnog drveta prikazan je na Grafikonu 8. Formulisana ulja timijana i origana ispoljila su statistički značajno bolji efekat u odnosu na komercijalno dostupan biofungicid (P<0,01). U poređenju sa standardnim fungicidom, formulisani preparati ispoljili su podjednako dobar efekat inhibicije porasta micelije sva tri odabrana izolata, sve tri ispitivane vrste roda Monilinia. Procenat inhibicije porasta izolata primenom formulisanog preparata na bazi timijana bio je u intervalu od 58 do 73%, a formulisanog preparata na bazi ulja origana od 55 do 89%, dok je procenat inhibicije porasta pri primeni komercijalnog preparata Timorex Gold bio od 0 do 34% (Slika 31). Slika 31. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. Rezultati 113 Grafikon 8. In vitro efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. 5.13.5. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. Rezultati ispitivanja efekta formulisanih etarskih ulja origana i timijana u in vivo uslovima prikazani su na Grafikonu 9. Testovi su pokazali da postoji statistički značajna razlika između primenjenih tretmana (P<0,01), da ispitivane formulacije ostvaruju zaštitu plodova jabuke od vrsta roda Monilinia na istom nivou kao i komercijalni preparat Timorex Gold, a znatno slabiju od standardnog preparata na bazi iprodiona. U in vivo testovima procenti inhibicije pri primeni različitih preparata bili su u intervalu od 47 do 61% za formulisano ulje timijana, od 52 do 60% za formulisano ulje origana i od 30 do 60% za preparat Timorex Gold (Slika 32). M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 114 Grafikon 9. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Slika 32. In vivo efekat formulisanih etarskih ulja origana i timijana na izolate Monilinia spp. p. Rezultati 115 5.14. Utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. U okviru utvrđivanja uticaja bakterije B. subtilis ispitan je in vitro i in vivo uticaj različitih sojeva bakterije na tri izolata, predstavnika vrsta roda Monilinia. Takođe, razvijena je formulacija preparata na bazi B. subtilis N146 i ispitan je efekat formulisanog preparata u in vitro i in vivo uslovima. 5.14.1. In vitro utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Rezultati ispitivanja uticaja različitih sojeva bakterije B. subtilis na izolate Monilinia spp. u in vitro uslovima prikazani su na Grafikonu 10. Uočena je statistički značajna razlika u procentu inhibicije porasta izolata nastala kao posledica različitih tretmana (P<0,01). Najveći procenat inhibicije dobijen je primenom suspenzije B. subtilis N146, osim u slučaju izolata M. laxa gde je najveću inhibiciju porasta izazvao B. subtilis iz preparata Serenade. Procenti inhibicije porasta izolata bili su u intervalu od 33 do 51% za B. subtilis N146, od 21 do 56% za B. subtilis iz preparata Serenade i od 21 do 43% za B. subtilis iz preparata Ekstrasol (Slika 33). Grafikon 10. In vitro utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 116 5.14.2. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Rezultati in vivo eksperimenata pokazali su da suspenzija B. subtilis N146 i obe suspenzije iz komercijalnih preparata statistički značajno smanjuju razvoj truleži inokulisanih plodova jabuke u odnosu na netretiranu kontrolu (P<0,01), kao i da se bolji efekat zaštite postiže u slučaju kada se inokulacija vrši neposredno nakon tretmana (I varijanta) (Slika 34, Grafikon 11). Efekat zaštite slabiji je u slučaju inokulacije plodova 24 h nakon tretmana za sve primenjivane tretmane, osim za standardni fungicid (Slika 35). Slika 33. In vitro uticaj različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Rezultati 117 Slika 34. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Inokulacija plodova neposredno nakon tretmana (I varijanta) Slika 35. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Inokulacija plodova 24 h nakon tretmana (II varijanta) Rezultati 118 Grafikon 11. In vivo utvrđivanje uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 119 5.14.3. Ispitivanje efekata formulacija Bacillus subtilis na Monilinia spp. in vitro Efekat tri različite formulacije B. subtilis N146 u kombinaciji sa različitim ađuvantima preliminarno je testiran na izolatu vrste M. fructicola. Rezultati ovog testa prikazani su u Tabeli 28. Uočenа je stаtistički znаčаjnа rаzlikа u širini zone inhibicije porаstа izolаtа nаstаlа kаo posledicа rаzličitih tretmаnа (P<0,01). Nаjširа zonа inhibicije dobijenа je primenom sirove suspenzije B. subtilis N146, dok je od rаzvijenih formulаcijа nаjbolji efekаt ispoljilа formulаcijа 3 koja je odabrana za dalja testiranja (Slika 36). Tabela 28. Efekati formulacija Bacillus subtilis na Monilinia fructicola in vitro Tretman Prečnik inhibitorne zone (mm) 1 Formulacija 1 33.7 ± 1.5 fg Formulacija 1 + A1 25.6 ± 0.9 i Formulacija 1+ A2 33.0 ± 1.2 gh Formulacija 1+ A3 33.2 ± 1.3 g Formulacija 2 36.3 ± 1.2 bcde Formulacija 2 + A1 36.7 ± 1.1 bc Formulacija 2+ A2 37.3 ± 1.5 b Formulacija 2+ A3 36.1 ± 0.7 bcde Formulacija 3 36.6 ± 1.1 bcd Formulacija 3 + A1 31.7 ± 1.4 h Formulacija 3+ A2 35.0 ± 2.5 def Formulacija 3+ A3 34.8 ± 3.1 ef Sirova suspenzija B. subtilis 39.6 ± 0.9 a Sirova suspenzija B. subtilis + A1 35.3± 1 cde Sirova suspenzija B. subtilis + A2 36.8 ± 1.1 bc Sirova suspenzija B. subtilis + A3 36.8 ± 0.8 bc 1 Ista slova u koloni označavaju da razlika nije statistički značanja Rezultati 120 Uticaj formulacije 3 na porast izolata Monilinia spp. prikazan je na Grafikonu 12. U slučaju primene ove formulacije na izolate M. fructigena i M. laxa došlo je do određenog poboljšanja aktivnosti formulacije u poređenju sa sirovom suspenzijom B. subtilis N146, dok je u slučaju izolata M. laxa došlo do smanjenja aktivnosti formulacije 3. In vitro ispitivanja efekata formulacije 3 na Monilinia spp. potvrdila su visok potencijal ovog biopreparata za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Slika 36. Efekati formulacija Bacillus subtilis N146 na Monilinia fructicola in vitro Rezultati 121 Grafikon 12. Efekat formulacija Bacillus subtilis na Monilinia spp. in vitro 5.14.4. Ispitivanje efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo U testove ispitivanja efikasnosti formulisanih preparata na bazi B. subtilis uključena je formulacija 3, standardni fungicid iprodion i komercijalno dostupni preparati Serenade i Ekstrasol. Rezultati in vivo eksperimenta pokazali su da i sirova suspenzija B. subtilis i formulacija 3 statistički značajno smanjuju razvoj truleži inokulisanih plodova jabuke u odnosu na netretiranu kontrolu (P<0,01). Dodatno, formulacija 3 bila je efikasnija od sirove suspenzije B. subtilis (Slika 37). Ipak, zabeležen je slabiji efekat zaštite u slučaju inokulacije plodova 24 h nakon tretmana za sve primenjivane tretmane, osim za standardni fungicid (Grafikon 13, Slika 38). M. fructigena M. fructicola M. laxa Rezultati 122 Slika 37. Efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo. Inokulacija plodova neposredno nakon tretmana (I varijanta) Slika 38. Efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo. Inokulacija plodova 24 h nakon tretmana (II varijanta) Rezultati 123 Grafikon 13. Efikasnosti formulisanih preparata na bazi Bacillus subtilis u suzbijanju Monilinia spp. in vivo M. fructigena M. fructicola M. laxa Diskusija 124 6. DISKUSIJA 6.1. Monilinia spp. - geografska distribucija i značaj patogena Proizvodnju koštičavog voća ugrožava veliki broj biljnih patogena među kojima posebno mesto zauzimaju vrste roda Monilinia. S obzirom na velike štete koje prouzrokuju patogeni ovog roda, u svetu postoji veliki broj istraživanja koja se odnose na biologiju patogena, simptome oboljenja, ekološke, morfološke i molekularne odlike, kao i mere suzbijanja ovih patogena. Sa druge strane, u našoj zemlji primetan je nedostatak podataka o prisustvu i rasprostranjenosti vrsta roda Monilinia na koštičavim voćkama, kao i o osetljivosti ovih vrsta na fungicide. U dostupnoj domaćoj literaturi uglavnom se mogu naći podaci o štetama koje su ove vrste prouzrokovale u različitim godinama, najčešće tokom godina sa izuzetno povoljnim uslovima za pojavu i širenje Monilinia spp. (Radman, 1967; Arsenijević i Rudinski, 1969; Kišpatića i sar., 1976; Perišić i sar., 1976; Balaž, 2000). S obzirom da podaci u literaturi govore o velikim promenama u strukturi populacije vrsta roda Monilinia kako na američkom, tako i na evropskom kontinentu, proučavanje diverziteta vrsta roda Monilinia u Srbiji je od izuzetnog značaja. U istraživanjima Michailides et al. (1987) detaljno je opisana promena u strukturi populacije u SAD u periodu od oko četrdeset godina. M. laxa bila je dominantan prouzrokovač mrke truleži plodova koštičavih voćaka u SAD do osamdesetih godina prošlog veka kada je struktura populacije značajno izmenjena. Istraživanja sprovedena nakon perioda od 15 godina ukazala su na široku rasprostranjenost vrsta M. fructicola i M. laxa. U preko 60% zasada detektovane su obe vrste, a zasadi u kojima je detektovana samo M. fructicola bili su brojniji u odnosu na one gde je detektovana samo M. laxa. Danas je M. fructicola dominantan patogen u SAD. Sa druge strane, od 1920. godine M. laxa je dobro poznat patogen koštičavih voćaka u Kini. U periodu od 1994. do 1996. godine M. laxa i M. fructigena bile su najvažniji prouzrokovači mrke truleži plodova koštičavih voćaka u Kini (Zhu et al., 2011). Međutim, 2003. godine prvi put je detektovana M. fructicola na ovom području i od tada se struktura populacije vrsta roda Monilinia znatno promenila (Zhu et al., 2011). Danas je M. fructicola najvažniji prouzrokovač mrke truleži plodova koštičavih voćaka u Kini (Fan et al., 2010; Zhu et Diskusija 125 al., 2011). Invanzivna pojava vrste M. fructicola na tom području, kao i velika genetička varijabilnost izolata M. fructicola iz Kine navela je mnoge istraživače na zaključak da je ova vrsta dospela u ove krajeve mnogo pre nego što je prvi put detektovana (Fan et al., 2010). Prema istraživanjima Muñoz et al. (2008) i Villarino et al. (2012) dominantna vrsta roda Monilinia u Španiji je M. laxa (procenjena učestalost je 80%), pored koje je široko rasprostranjena, ali u manjem procentu M. fructigena. Međutim, u ograničenim arealima, detektovano je i prisustvo M. fructicola (De Cal et al., 2009a) koja je brzo postala najfrekventnija vrsta roda Monilinia na uskladištenim plodovima koštičavih voćaka (Villarino et al., 2012). M. laxa i M. fructigena dominantni su prouzrokovači mrke truleži plodova i u Grčkoj (Malandrakis et al., 2012), Mađarskoj (Petróczy et al., 2012) i Srbiji (Vasiljević, 1955; Stojanović i Kostić, 1957; Hrustić et al., 2013b). Poslednjih desetak godina M. fructicola detektovana je u mnogim zemljama Evrope: prvo u Francuskoj (EPPO, 2002a), a zatim u Mađarskoj (Petróczy and Palkovics, 2006), Češkoj Republici (Duchoslavová et al., 2007), Italiji (Pellegrino et al., 2009), Španiji (De Cal et al., 2009a), Švajcarskoj (Bosshard et al., 2006; Hilber- Bodmer, 2010), Sloveniji (Munda and Viršček Marn, 2010), Slovačkoj (Ondejková et al., 2010), Nemačkoj (Grabke et al., 2011), Poljskoj (Poniatowska et al., 2013) ali i u našoj zemlji (Vasić et al., 2012; Hrustić et al., 2013). Analiza strukture populacije izolata M. fructicola poreklom iz Evrope ukazala je na dva nezavisna prodora ovog patogena na evropski kontinent. Istraživanja pokazuju da većina izolata M. fructicola iz Evrope (Španije, Francuske i Švajcarske) vode poreklo iz Kalifornije, dok je poreklo italijanskih populacija M. fructicola delom iz Kalifornije, a delom iz istočnih delova SAD (Jansch et al., 2012). U nekim evropskim zemljama, M. fructicola detektovana je samo na plodovima u prometu poreklom od domaćih proizvođača (Munda and Viršček Marn, 2010; Hrustić et al., 2013) ili iz uvoza (Bosshard et al., 2006; Petróczy and Palkovics, 2006; Ondejková et al., 2010; Petróczy et al., 2012). U Mađarskoj je utvrđena samo na plodovima iz uvoza iz Italije i Španije (Petróczy and Palkovics, 2006; Petróczy et al., 2012). Prvobitni nalaz iz Švajcarske takođe je bio na plodovima iz uvoza iz SAD (Bosshard et al., 2006), ali je nekoliko godina kasnije prisustvo ovog patogena potvrđeno i u zasadima (Hilber-Bodmer, 2010). U Slovačkoj detektovano je Diskusija 126 prisustvo izolata M. fructicola poreklom sa plodova breskve i nektarine iz Španije i Grčke, ali je prisustvo dokazano i u zasadu šljive (Ondejková et al., 2010). Navedeni podaci govore o opasnosti širenja M. fructicola u zemljama evropskog kontinenta i o značajnoj ulozi međunarodne trgovine biljnim materijalom u širenju patogena. Posebno upozorenje predstavljaju osobine po kojima se M. fructicola razlikuje od ostalih vrsta roda Monilinia. Za razliku od M. laxa i M. fructigena, M. fructicola prouzrokuje latentne infekcije koje olakšavaju širenje patogena (Michailides et al., 2007). Zatim, M. fructicola znatno obilnije stvara spore i ima duže kličine cevčice (Villarino et al., 2010) koje omogućavaju efikasnije širenje patogena. Takođe, češće formira teleomorfni stadijum koji doprinosi kako stvaranju veće količine inokuluma, tako i povećanju genetičke varijabilnosti (Batra and Harada, 1986). Osim toga postoje navodi da je M. fructicola sposobna da ostvari infekciju plodova kroz nepovređeno tkivo, za razliku od drugih vrsta ovog roda koje zarazu plodova ostvaruju samo preko povreda (Sződi et al., 2012). U Srbiji je prisustvo M. fructicola na koštičavom voću prvi put ustanovljeno 2012. godine. U istraživanjima u okviru ove disertacije patogen nije detektovan u zasadu, ali dva nezavisna uzorka prikupljena sa lokalnih zelenih pijaca od domaćih proizvođača ukazuju na nedvosmisleno prisustvo ovog patogena u Srbiji. Do sličnih zapažanja došli su i Vasić et al. (2012) koji su utvrdili prisustvo M. fructicola na uskladištenim plodovima jabuke. Tokom trogodišnjeg perioda intenzivnog pregleda 119 lokaliteta na teritoriji Srbije prikupljen je 321 uzorak obolelih biljnih delova plodova, sasušenih grančica i cvetova iz kojih je izdvojeno 246 monosporijalnih izolata sa potvrđenom patogenošću koji pripadaju rodu Monilinia. 6.2. Identifikacija patogena primenom konvencionalnih metoda Identifikacija izolata Monilinia spp. do nivoa vrste izvršena je na osnovu konvencionalnih osobina i to: morfoloških, patogenih, odgajivačkih i ekoloških karakteristika. Diskusija 127 6.2.1. Morfološke karakteristike izolata Monilinia spp. S obzirom da slične simptome prouzrokuju sve tri vrste roda Monilinia i da na osnovu simptoma nije moguće pouzdano utvrditi o kojoj vrsti roda Monilinia je reč (Michailides et al., 2007), za pouzdanu dijagnozu i identifikaciju prouzrokovača, neophodna je izolacija patogena, proučavanje patogenosti, morfoloških, odgajivačkih i ekoloških karakteristika, a potom potvrda rezultata molekularnim metodama (Byrde and Willetts, 1977; De Cal and Melgarejo, 1999; Hughes et al., 2000; Hughes, 2003; Côté et al., 2004). Izolacijom fitopatogenih gljiva iz zaraženih biljaka koštičavih voćaka, prikupljenih u okviru ovih istraživanja, uočeno je jasno grupisanje dobijenih izolata u tri grupe na osnovu razlika u morfološkim karakteristikama. Prvu grupu čini 237 izolata koji na PDA podlozi imaju svetlo smeđu do sivu koloniju oblika rozete, režnjevitih ivica, bez prisustva spora. U drugu grupu svrstano je šest izolata krem-žute boje, ravnih ivica, sa prisutnim retkim sporama, dok treću grupu čine tri izolata koji obilno sporulišu, formiraju koncentrični prsten spora i imaju ravnu ivicu kolonije smeđe do sive boje. Prva grupa izolata je na osnovu morfoloških osobina (boja kolonije, odlike ruba i oblik kolonije, sporulacija, prisustvo koncentričnog prstena, kvalitativna brzina porasta i prisustvo crne marginalne linije) identifikovana kao vrsta M. laxa, druga kao M. fructigena i treća kao M. fructicola. U svakoj grupi prisutan je veći broj izolata između kojih nisu uočene razlike u morfološkim osobinama. Dobijeni rezultati u okviru ove disertacije saglasni su sa navodima Lane (2002): da se izolati M. fructicola i M. laxa (sivkasta kolonija) mogu odvojiti od izolata M. fructigena (žuta ili krem-bela boja kolonije) na osnovu boje kolonije; da brzina porasta kolonije predstavlja varijabilan karakter koji se ne može upotrebiti za razdvajanje vrsta ovog roda; da izolati M. fructicola obilno sporulišu na PDA podlozi, M. fructigena retko, a M. laxa ne sporuliše; da se izolati M. laxa mogu odvojiti od izolata M. fructigena i M. fructicola na osnovu režnjevite ivice kolonije i samog oblika rozete. Sa druge strane, u nekim istraživanjim pokazano je da identifikacija na osnovu morfoloških karakteristika može biti pogrešna (De Cal and Melgarejo, 1999). Muñoz et al. (2008) u svojim istraživanjima pronašli su izolate M. fructigena koji su imali veoma slične karakteristike koloniji M. laxa i pokazali da lako može doći do pogrešne identifikacije vrsta roda Monilinia. Naime, Diskusija 128 identifikacija na osnovu morfoloških karakteristika potvrđena je primenom molekularnih metoda kod samo 72% proučavanih izolata. Istraživanja Petróczy et al. (2012) takođe pokazuju da neki izolati M. fructigena mogu obrazovati koloniju smeđe boje, režnjevitih ivica, tipičnu za izolate vrste M. laxa ili M. fructicola, kao i da izolati M. laxa mogu imati koloniju žute boje, karakterističnu za vrstu M. fructigena. Međutim, sve tri grupe autora nisu istovremeno koristile sve morfološke karaktere koje je neophodno proučiti za pouzdanu identifikaciju, što bi mogao biti razlog pogrešne identifikacije. Svi izolati Monilinia spp. ispitivani u okviru ove disertacije obrazovali su hijalinske, jednoćelijske konidije limunastog do ovalnog oblika, pri čemu su izolati vrste M. fructigena formirali u proseku najkrupnije konidije (19,25-23,50 x 11,92-13,50 μm), dok su izolati M. laxa obrazovali najsitnije konidije (11,25-15,42 x 8,25-11,07 μm). Dobijeni rezultati saglasni su sa rezultatima Hu et al. (2011a) po kojima M. laxa ima konidije prosečno najmanjih dimenzija i rezultatima Poniatowska et al. (2013) gde su izolati M. fructicola formirali konidije prosečno najvećih dimenzija (24 x 13 µm). Najobilnije formiranje konidija na PDA podlozi zabeleženo je kod izolata M. fructicola (0,27x10 5) što je saglasno sa rezultatima Poniatowska et al. (2013). Istraživanja su pokazala postojanje značajnih razlika u načinu klijanja konidija i dužine kličine cevčice pre prvog grananja (van Leeuwen and van Kesteren, 1998; De Cal and Melgarejo, 1999). U okviru istraživanja u ovoj disertacijei izolat M. laxa formirao je na WA podlozi kličine cevčice prosečne dužine 40 µm pre prvog grananja, izolat M. fructigena formirao je konidije koje klijaju u nekoliko kličinih cevčica prosečne dužine 197 µm, dok je izolat M. fructicola formirao prosečno najduže kličine cevčice (365 µm). U istraživanjima van Leeuwen and van Kesteren (1998) prosečna dužina kličinih cevčica pre prvog grananja za izolate vrste M. fructicola bila je 465-851 µm, za izolate M. laxa 161-466 µm, dok su izolati M. fructigena obrazovali kličine cevčice srednje dužine od 307 do 806 µm i više kljičinih cevčica po jednoj konidiji. Istraživanja De Cal and Melgarejo (1999) takođe su potvrdila da dužina kličine cevi pre prvog grananja može biti značajan karakter za razdvajanje vrsta roda Monilinia. M. laxa formira najkraće kličine cevi koje se granaju na manje od 60 µm od konidije, dok se kličine cevi koje formiraju M. fructigena i M. fructicola granaju na mnogo većoj udaljenosti (većoj Diskusija 129 od 220 µm). Hu et al. (2011a) navode da konidije vrsta M. laxa i M. fructicola klijaju u jednu kličinu cevčicu, dok izolati M. fructigena formiraju više kličinih cevčica na jednoj konidiji, što je utvrđeno i u istraživanjima obavljenim sa izolatima sve tri vrste iz Srbije. Sve morfološke (makroskopske i mikroskopske) osobine dobijenih izolata poreklom iz Srbije u skladu su sa već opisanim karakteristikama vrsta roda Monilinia koje su dali van Leeuwen and van Kesteren (1998), Lane (2002), Côté et al. (2004), Hu et al. (2011a), Zhu et al. (2011) i Poniatowska et al. (2013). 6.2.2. Odgajivačke i ekološke karakteristike izolata Monilinia spp. U ovim istraživanjima na temperaturi od 24°C izolati su ispoljili statistički značajnu razliku u brzini rasta kolonije. Prosečno najveći dnevni porast (10,55 mm/dan) imao je izolat M. fructicola, dok je izolat vrste M. fructigena rastao najsporije (2,38 mm/dan) na PDA podlozi. U istraživanjima van Leeuwen and van Kesteren (1998) i Poniatowska et al. (2013) izolati M. fructicola takođe su imali najveći prosečni porast na PDA podlozi. Prosečan porast izolata M. fructigena bio je 3,7 mm/dan (van Leeuwen et al., 2002b), M. fructicola 13 mm/dan (Van Leeuwen and van Kesteren, 1998), a M. laxa oko polovine porasta izolata M. fructicola (EPPO, 2003). U istraživanjima Petróczy et al. (2012) izolati M. fructicola imali su prosečan porast od 10,87 mm/dan, prosečan porast izolata M. fructigena bio je 6,44 mm/dan, dok je porast izolata M. laxa bio 6,65 mm/dan. U ovim istraživanjima utvrđivanja uticaja hranljivih podloga na porast izolata pokazano je da izolati M. laxa i M. fructigena prosečno najbrže rastu na MA hranljivoj podlozi, dok je za vrstu M. fructicola optimalan porast zabeležen na PDA podlozi. Pored razlika u brzini porasta ispoljene su značajne razlike u morfološkim osobinama izolata na hranljivim podlogama. Na PDA, MA i V8A podlozi svi ispitivani izolati imali su kompaktnu miceliju, dok je na WA i CzA podlozi micelija izolata bila retka i prozračna. Hu et al. (2011a) zabeležili su statistički značajno brži porast izolata svih vrsta na V8 podlozi u poređenju sa porastom na PDA podlozi. Optimalan porast izolata Monilinia spp., u ovim istraživanjima, zabeležen je na temperaturama od 23 do 28°C, dok su se granične temperature rasta bile u intervalu od 2-4°C i od 31-34°C. Praćenjem porasta izolata na ekstremnim temperaturama uočeno je Diskusija 130 da su izolati M. fructigena najosetljiviji kako na niske, tako i na visoke temperature. Osim razlika u brzini rasta izolata na različitim temperaturama, kod izolata M. laxa isopljene su razlike u morfološkim osobinama: na temperaturi 23 i 25°C kolonija je imala karakterističan oblik rozete, dok je na ostalim temperaturama kolonija imala ravnu ivicu. Sa druge strane, temperature nisu uticale na izgled kolonije izolata M. fructigena i M. fructicola. U in vitro istraživanjima Jansch et al. (2012) M. fructicola ne raste na temperaturama nižim od 8°C. Takođe, u ovim istraživanjima utvrđeno je da izolati vrsta M. laxa i M. fructigena ima najbrži prosečni porast u mraku, dok izolat M. fructicola najbrži porast ima u svetlosnom režimu 12 h svetlost/12 h mrak. 6.2.3. Patogene karakteristike izolata Monilinia spp. Testovi unakrsne patogenosti devet odabranih izolata Monilinia spp. pokazali su da postoji statistički značajna razlika u virulentnosti kako između izolata različitih vrsta, tako i između izolata iste vrste. Na plodovima nektarine i breskve najveću patogenost ispoljio je izolat M. fructigena poreklom sa šljive, dok je najmanju patogenost na plodovima nektarine ispoljio izolat M. fructicola sa nektarine, odnosno na plodovima breskve izolat M. laxa sa šljive. Na plodovima šljive najveću nekrotičnu zonu obrazovao je izolat M. laxa sa breskve, a najmanju izolat M. fructicola sa nektarine. Sa druge strane, na plodovima kajsije najmanju i najveću nekrotičnu zonu obrazovali su izolati iste vrste M. laxa. Izolat M. fructigena sa višnje ispoljio je najveću virulentnost na plodovima trešnje i višnje, dok je izolat M. laxa sa breskve prouzrokovao najmanju zonu truleži na ovim plodovima. Poreklo izolata nije uticalo na ispoljavanje stepena patogenosti na plodovima biljaka domaćina. Međutim, ove razlike između vrsta nisu zabeležene u testovima patogenosti koje su izveli Zhu et al. (2011). Simptomi mrke truleži na inokulisanim plodovima razvili su se nakon inkubacije od dva do četiri dana na temperaturi od 24°C. Prečnik zone truleži na inokulisanim plodovima nektarine bio je 23,0 do 24,5 mm/dan u zavisnosti od izolata, dok je na plodovima kajsije prečnik zahvaćena zone bio 28,6 do 33,9 mm/dan. Testovi patogenosti Poniatowska et al. (2013) pokazali su da M. fructigena i M. laxa prouzrokuju trulež koja brzo zahvata ceo plod za razliku od izolata M. fructicola koji imaju znatno sporiji stepen razvoja truleži. Muñoz et al. (2008) uočili su da izolati M. fructigena prouzrokuju veći prečnik truleži Diskusija 131 plodova u poređenju sa prečnikom truleži koji prouzrokuju izolati M. laxa. Sa druge strane, Villarino et al. (2010) zabeležili su da M. fructicola ispoljava veći stepen virulentnosti u zasadu breskve u poređenju sa vrstama M. laxa i M. fructigena. Kao moguće objašnjenje navode veću sposobnost stvaranja konidija i formiranje dužih kličinih cevčica M. fructicola. Ova grupa autora smatra da su upravo ove osobine ključne za ekspanziju M. fructicola i potiskivanje ostalih vrsta roda Monilinia. Na povređenim plodovima koštičavih voćaka svih 246 dobijenih monosporijalnih izolata Monilinia spp., nakon tri dana od inokulacije, prouzrokovalo je trulež smeđe boje karakterističnu za Monilinia spp. Nakon reizolacije sa inokulisanih plodova dobijeni su reizolati koji po izgledu kolonije i morfologiji reproduktivnih tvorevina u potpunosti odgovaraju izvornim izolatima čime je potvrđena patogenost izolata i ispunjeni Kohovi postulati za sve dobijene izolate u okviru ovih istraživanja. U testovima patogenosti u okviru ove disertacije sve ispitivane vrste roda Monilinia bile su sposobne da ostvare infekciju preko nepovređene kutikule ploda koštičavih voćaka. Međutim, o načinima prodora patogena u plodove voćaka i mogućnosti ostvarenja infekcije u literaturi postoje oprečna mišljenja. Gibert et al. (2009) i Sződi et al. (2012) smatraju da M. laxa može ostvariti zarazu plodova samo preko povreda, Vico i Jurick (2012) navode da M. fructigena može da prodre direktno kroz nepovređenu kutikula pomoću enzima kutinaze, ali takođe prodire i kroz rane i povrede. Rezultati Sződi et al. (2012) pokazuju da je M. fructicola sposobna da ostvari infekciju plodova kroz nepovređeno tkivo, dok Holb (2006) i Xu and Robinson (2000) navode da je prodor M. fructicola moguć samo kroz povrede na plodovima. 6.2.4. Molekularna detekcija, identifikacija i karakterizacija Molekularnom metodom Multiplex PCR korišćenjem prajmera i protokola koji su opisali Côté et al. (2004) amplifikovani su fragmenti ITS rDNK odgovarajuće veličine i potvrđena je identifikacija izolata na osnovu morfoloških karakteristika. Kod 237 uzoraka došlo je do amlifikacije fragmenta veličine 351 bp, tako da je ta grupa izolata detektovana kao M. laxa. Fragmenti veličine oko 402 bp amplifikovani su u slučaju šest uzoraka detektovanih kao M. fructigena, dok je kod tri izolata došlo do amplifikacije fragmenata veličine 535 bp karakterističnih za vrstu M. fructicola. Diskusija 132 Koristeći pomenuti protokol Poniatowska et al. (2013) u svojim istraživanjima od 670 ispitivanih izolata, 64,63% su detektovani kao vrsta M. fructigena, 31,64% kao M. laxa, 2,98% kao M. polystroma i 0,75% kao M. fructicola. Radi potvrde identifikacije urađeno je sekvencioniranje ITS rDNK genskog regiona izolata Monilinia spp. primenom univerzalnih prajmera ITS1/ITS4. Identifikacija odabranih izolata izvršena je višestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti dobijenih sekvenci međusobno, kao i sa sekvencama drugih izolata ovog roda dostupnih u GenBank bazi podataka. Poređenjem dobijenih sekvenci sa sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka utvrđeno je 100% nukleotidne identičnosti sekvenci uzoraka identifikovanih kao M. laxa sa pet deponovanih sekvenci izolata M. laxa poreklom iz Španije (EF153013, EF153014, EF153015, EF153016 i EF153017), uzoraka M. fructigena sa 16 deponovanih sekvenci izolata M. fructigena poreklom iz različitih delova sveta (HQ166347, EU098121, EF207429, EF207428, EF207427, EF207426, EF207425, F207424, FJ754275, AF150680, AF150679, AF150678, AF150677, Z73779, Z73780 i HQ908791) i uzoraka M. fructicola sa osam deponovanih sekvenci izolata M. fructicola poreklom iz različitih delova sveta (JN176564, FJ411109, EF207423, EF207422, EF207421, EF207420, EF207419 i FJ515894). Osim toga, međusobnim poređenjem sekvenci ITS regiona dobijenih u ovom istraživanju utvrđena je 100% nukleotidna identičnost izolata identifikovanih kao M. laxa, osim kod sekvence izolata VPSV, poreklom sa višnje uzorkovanog u Slankamenačkim Vinogradima koja se razlikuje u jednom nukleotidu (99,8% sličnosti). Između izolata M. laxa i M. fructigena uočena je identičnosti od 97,9%; između M. laxa i M. fructicola izolata 99,3% identičnost; između M. fructigena i M. fructicola 97,9% identičnosti. Hu et al. (2011a) takođe su ukazali na veliku nukleotidniu sličnost izolata Monilinia spp. Poniatowska et al. (2013) su na osnovu sekvenci ITS regiona izvršili molekularnu identifikaciju kojom je potvrđen identitet proučavanih izolata. Molekularna karakterizacija obavljena je uparivanjem 18 sekvenci ITS rDNK genomnog regiona Monilinia spp. dobijenih u ovim istraživanjima sa 38 odabranih sekvenci vrsta roda Monilinia dostupnim u GenBank bazi podataka i rekonstrukcijom filogenetskog stabla. Analizom filogenetskog stabla uočena je podela na dva klastera koji se dalje dele na dve podgrupe i bliska veza između izolata vrste M. fructicola i M. laxa sa jedne, i M. fructigena i M. polystroma sa druge strane. Slično rezultatima u ovim Diskusija 133 istraživanjima, korišćenjem univerzalnog para prajmera ITS1/ITS 4 Zhu et al. (2011) dobili su amplifikone veličine 537 do 538 bp od kojih je 421 informativan nukleotid upotrebljen za dalju analizu. Filogenetska analiza ITS sekvenci 39 izolata iz Kine i 57 izolata iz drugih delova sveta razdvojila je sve izolate u šest grupa, pri čemu je došlo do jasnog razdvajanja izolata M. laxa, M. fructigena i M. fructicola poreklom iz Kine i poreklom iz drugih delova sveta. Hu et al. (2011a) su pored nukelotidne identičnosti između izolata M. fructigena, M. fructicola i M. laxa koristili ITS genomni region za filogenetsku analizu koja je pokazala jasno razdvajanje na grupe koje odgovaraju različitim vrstama ovog roda, ali sa niskim bootstrap vrednostima. U istraživanjima Poniatowska et al. (2013) filogenetska analiza 25 ITS sekvenci poreklom iz Poljske i sekveci dostupnih u GenBank bazi podataka pokazala je grupisanje sekvenci u dva klastera koja se dele u dve podgrupe. U okviru prvog klastera jasno su se razdvojile grupe izolata koje pripadaju vrsti M. polystroma i M. fructigena, a u okviru drugog klastera M. laxa i M. fructicola. Ova istraživanja potvrdila su blisku vezu između izolata vrsta M. fructicola i M. laxa sa jedne, i M. fructigena i M. polystroma sa druge strane. SSR markeri koje su razvili Jansch et al. (2012) pružili su uvid u genetičku strukturu i diverzitet novointrodukovane vrste M. fructicola na teritoriji Evrope. Analiza SSR markera velikog broja izolata poreklom iz više evropskih zemalja i iz SAD ukazuje na poreklo ispitivanih izolata, odnosno pokazuje da je vrsta M. fructicola na teritoriju Evrope dospela iz dva nezavisna pravca iz SAD - iz Kalifornije i iz istočnog dela SAD. Većina izolata M. fructicola izolovanih u Evropi (Španija, Francuska i Švajcarska) vodi poreklo iz Kalifornije, a pojedini izolati iz Evrope imaju specifične profile detektovane samo u tim zemljama. Analiza SSR markera izolata poreklom iz Srbije pokazala je da izolati detektovani u našoj zemlji na dva nezavisna lokaliteta imaju različito poreklo, iz Italije i SAD, s tim da je profil US50 osim u SAD detektovan i kod izolata iz Italije. Ovakva slika ukazuje na veliku verovatnoću da je do introdukcije M. fructicola u našu zemlju došlo kroz dve nezavisne introdukcije, po svemu sudeći razdvojene u vremenu i prostoru. Diskusija 134 6.3. Rasprostranjenost vrsta roda Monilinia u Srbiji Na osnovu proučenih morfoloških, odgajivačkih, ekoloških, patogenih i molekularnih karakteristika izolata dobijenih u okviru ovih istraživanja utvrđeno je da prva grupa od 237 izolata pripada fitopatogenoj gljivi M. laxa, druga grupa od šest izolata vrsti M. fructigena, dok je treća grupa od tri izolata identifikovana kao M. fructicola, koja je karantinski patogen za Srbiju. Dominantan prouzrokovač mrke truleži plodova i sušenja cvetova, grana i grančica koštičavog voća i nadaleko prevalentna u Srbiji je M. laxa (96,34%), dok je zastupljenost ostalih vrsta ovog roda znatno manja – M. fructigena (2,44%) i M. fructicola (1,22%), pri čemu prisustvo karantinskog patogena M. fructicola nije detektovano u zasadima. Slično našim rezultatima, utvrđeno je da je M. laxa dominantan patogen u mnogim zemljama Evrope, uključujući Mađarsku (Petróczy et al., 2012), Španiju (Muñoz et al., 2008; Villarino et al., 2012) i Grčku (Malandrakis et al., 2012). Uprkos veoma obimnom prikupljanju uzoraka koji je uključio 119 lokaliteta i šest biljaka domaćina prisustvo M. polystroma na koštičavim voćkama u Srbiji nije dokazano, ali istraživanja će biti nastavljena i u narednom periodu. 6.4. Osetljivost izolata Monilinia spp. na fungicide U istraživanjima sprovedenim u okviru ove disertacije, ispitivani fungicidi ispoljili su različit nivo toksičnosti na proučavane izolate vrsta roda Monilinia. Svi ispitivani izolati, predstavnici sve tri vrste roda Monilinia, bili su ujednačeno osetljivi na tebukonazol u niskim koncentracijama. Dobijene EC50 vrednosti bile su u intervalu od 0,01 (izolat BMLEs, M. laxa) do 0,06 mg/l (NPGM, M. fructicola). Dobijeni rezultati saglasni su sa rezultatima Yoshimura et al. (2004) koji su utvrdili visoku osetljivost izolata M. fructicola na tebukonazol (EC50 0,0059-0,0607 µg/ml). Takođe, Stević i Vukša (2006) ispitujući parametre osetljivosti izolata M. laxa utvrdili su EC50 za tebukonazol 14-41 µg/kg. Međutim, treba uzeti u obzir istraživanja May-De Mio et al. (2011) koja su pokazala promene u osetljivosti populacija M. fructicola na tebukonazol; izolati M. fructicola prikupljeni tokom perioda 2000-2004. godine imali su znatno niže EC50 vrednosti (0,01-0,27 µg/ml) od izolata prikupljenih tokom 2005-2008. Diskusija 135 godine (0,01->100 µg/ml). Upravo zbog ovakve registrovane promene u populaciji Monilinia spp. od izuzetnog značaja je nastaviti redovan monitoring sa ciljem detekcije smanjene osetljivosti na ovaj fungicid. Sa druge strane, zabeležena je razlika u osetljivosti izolata različitih vrsta na iprodion. Svi ispitivani izolati vrste M. laxa ispoljili su sličnu osetljivost na iprodion sa EC50 vrednostima u intervalu od 0,13-0,22 mg/l. Za izolat vrste M. fructigena EC50 vrednost bila je 0,85 mg/l, dok je najmanja osetljivost utvrđena za izolat M. fructicola (EC50 3,32 mg/l). Izolat M. fructicola korišćen u našim istraživanjima pokazao je znatno manju osetljivost u poređenju sa izolatima korišćenim u istraživanjima Yoshimura et al. (2004) koji su utvridili EC50 vrednosti u intervalu od 0,01 do 0,65 µg/ml, kao i u istraživanjima Lim et al. (2001) gde su EC50 vrednosti bile 0,021-399 µg/ml. Izolati sve tri vrste ispoljili su neznatne razlike u osetljivosti na hlorotalonil. Dobijene EC50 vrednosti bile su u rasponu od 0,12 mg/l za izolat BPSV (M. laxa) do 1,06 mg/l za izolat NPGM (M. fructicola). Ispitivani izolati različitih vrsta Monilinia spp. ispoljili su velike razlike u osetljivosti na boskalid. Izolati vrste M. laxa bili su ujednačeno osetljivi (EC50 0,04 mg/l - 0,09 mg/l), dok su izolati vrsta M. fructigena i M. fructicola ispoljili znatno manju osetljivost na ovaj fungicid sa EC50 vrednostima 250,36 mg/l i 464 mg/l. Spiegel and Stammler (2006) ispitujući osetljivost izolata M. laxa i M. fructigena na boskalid, utvrdili su da nema razlike u osetljivosti između izolata različitog geografskog porekla i preporučili su diskriminacionu koncentraciju od 2,5 ppm za detekciju rezistentnih izolata Monilinia spp. Amiri et al. (2010) utvrdili su osetljivost izolata M. fructicola na boskalid, EC50 vrednosti bile su od 0,82 do 2,85 mg/l, ali i velike promene u osetljivosti između izolata izolovanih tokom dve različite godine. Osetljivost izolata bila je pet puta manja u odnosu na osetljivost izolata izolovanih dve godine ranije. U istraživanjima u okviru ove disertacije zapažene su i velike razlike u osetljivosti na fluopiram kako među izolatima različitih vrsta, tako i među izolatima iste vrste. Najniža EC50 vrednost od 0,11 mg/l zabeležena je za izolat VGRSD (M. laxa), dok je najveća EC50 vrednost zabeležena za izolat VPBG (M. fructigena) (5612,28 mg/l). Sa druge strane, Hu et al. (2011b) ispitivali su osetljivost izolata M. fructicola na boskalid i fluopiram i utvrdili da PDA podloga u koju je inkorporiran fungicid nije Diskusija 136 pogodna za ispitivanje osetljivosti. EC50 vrednosti bile su više od 100 µg/ml za pojedine izlolate što nije saglasno sa rezultatima drugih autora kod kojih je utvrđena EC50 vrednost bila niža od 10 µg/ml (Amiri et al., 2010). Kada su za ispitivanje osetljivosti izolata M. fructicola na boskalid i fluopiram upotrebili druge hranljive podloge dobili su potpuno drugačije rezultate; EC50 vrednosti na MM podlozi (minimal medium) za boskalid bila je 0,013-2,10 µg/ml, a za fluopiram 0,059-15,6 µg/ml (Hu et al., 2011b). U ovim istraživanjima za ispitivanje osetljivosti izolata Monilinia spp. na boskalid i fluopiram korišćena je PDA podloga i nije zapažena heterogenost odgovora. Na osnovu rezultata u sklopu ove disertacije, kao i na osnovu rezultata Amiri et al. (2010) PDA podloga pogodna je za ispitivanje osetljivosti izolata Monilinia spp. na boskalid i fluopiram s tim što je veoma je važno poštovati obavezu navođenja podloge na kojoj je testiranje izvedeno. Izolati sve tri vrste ispoljili su visoku osetljivost na prohloraz; najniža EC50 vrednost zabeležena je za izolate ŠLJSV (M. laxa) i NPGM (M. fructicola) od 0,006 mg/l, dok je najnižu osetljivost ispoljio izolat VPBG (M. fructigena) sa EC50 vrednošću od 0,023 mg/l. Svi ispitivani izolati pokazali su osetljivost na azoksistrobin u prisustvu SHAM- a; najniža EC50 vrednost od 0,51 mg/l zabeležena je za izolat ŠLJSV (M. laxa), dok je najveća EC50 vrednost zabeležena za izolat NPGM (M. fructicola) (8,83 mg/l). Amiri et al. (2010) takođe su ispitivali osetljivost različitih izolata M. fructicola na azoksistrobin u prisustvu SHAM-a i utvrdili EC50 vrednost koje su bile u intervalu od 0,09-0,27 mg/l. Isti autori utvrdili su tri puta nižu osetljivost na azoksistrobin u testovima rađenim 2008. godine u poređenju sa testovima rađenim 2006. godine. Na osnovu dobijenih rezultata ispitivanja osetljivosti različitih izolata Monilinia spp. na fungicide različitih mehanizama delovanja može se zaključiti da su svi ispitivani izolati ispoljili visoku osetljivost na tebukonazol, hlorotalonil, prohloraz, iprodion i azoksitrobin, dok su razlike u osetljivosti izolata različitih vrsta na fluopiram i boskalid bile vrlo izražene. Takođe, može se zaključiti da su izolati vrste M. laxa najosetljiviji na sve ispitivane fungicide, dok je izolat M. fructicola najmanje osetljiv na sve ispitivane fungicide osim na fluopiram i prohloraz za koje se kao najmanje osetljiv pokazao izolat M. fructigena. Dalja istraživanja bi trebalo da pokažu da li se osetljivost na boskalid i fluopiram može koristiti kao dodatni marker za identifikaciju vrsta. U testu određivanja Diskusija 137 minimalne letalne koncentracije utvrđeno je da su predstavnici sve tri vrste roda Monilinia veoma osetljivi na tebukonazol i prohloraz i da ovi fungicidi pri vrlo niskim koncentracijama (od 0,5 do 2 mg/l) deluju letalno na sve proučavane izolate. Najmanje toksični bili su boskalid i fluopiram koji ni pri koncentracijama višim od 1000 mg/l nisu potpuno inhibirali porast ispitivanih izolata. 6.5. Biološke mere borbe Hemijsko suzbijanje osnovna je mera zaštite koštičavih voćaka od Monilinia spp. Međutim, primena pesticida često je ograničena zbog sve strožih zahteva u pogledu ostataka u poljoprivrednim proizvodima. Da bi se zadovoljili standardi proizvodnje bezbedne hrane brojna istraživanja usmerena su na pronalaženje alternative ili dopune sintetičkim pesticidima (Bouchra et al., 2003). Primena mikroorganizama i njihovih metabolita, kao i supstanci prirodnog porekla, predstavlja prihvatljivo rešenje kako sa aspekta bezbednosti hrane, tako i sa aspekta zaštite životne sredine (Elad et al., 1993; Chao and Young, 2000; Roberts and Lohrke, 2003). Biofungicidi pomažu u smanjenju upotrebe hemijskih sredstava, što u današnje vreme predstavlja veliku prednost i jedan od najvažnijih razloga njihove primene. Osim toga, biofungicidi smanjuju rizik od pojave fitotoksičnosti za biljke-domaćine kao i rizik razvoja rezistentnosti patogena. Međutim, primena bioloških agenasa komplikovanija je od primene hemijskih jedinjenja, a spektar delovanja znatno je uži od spektra delovanja hemijskih jedinjenja. Za razliku od hemijskih jedinjenja koja deluju veoma brzo, populaciji biološkog agensa neophodno je vreme da dostigne potrebnu brojnost za postizanje vidljivih efekata. Osim toga, rok upotrebe biofungicida je kratak ukoliko se ne čuvaju pravilno. U većini slučajeva biološka sredstva su i skuplja od hemijskih (Vico i Jurick, 2012). Zatim, brojni faktori utiču na ispoljavanje biološkog dejstva antagonističkih mikroorganizama. Potrebno je da postoji interakcija između biljke domaćina, patogena, bioagensa i uslova spoljašnje sredine (Raaijmaker et al., 1995). Takođe, brojna ispitivanja potvrđuju da postoji značajna razlika u delovanju antagonista u laboratorijskim ispitivanjima i delovanju kada se oni primenjuju in vivo, što je pokazano i u našim istraživanjima. Razlika je uslovljena količinom metabolita koju mikroorganizmi produkuju, a koji su Diskusija 138 upravo i odgovorni za suzbijanje prouzrokovača bolesti. U poljskim uslovima produkcija metabolita znatno je niža, jer zavisi od brojnih fizičkih i hemijskih procesa koji se odvijaju u spoljašnjoj sredini (Engelkes et al., 1997). Pored navedenih, u literaturi se navode i drugi činioci koji utiču na stepen dejstva organizama koji se koriste kao bioagensi: temperatura, pH vrednost, sadržaj organske materije, organska đubriva i drugi (Duffy and Défago, 1997). Uprkos brojnim poteškoćama u primeni preparata biološkog porekla, trenutno postoji više od 40 komercijalnih proizvoda koji se prodaju kao biofungicidi širom sveta (Vico i Jurick, 2012). 6.5.1. Antifungalni efekat etarskih ulja na izolate Monilinia spp. Ispitivanja in vitro efekta gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. u okviru ovih istraživanja pokazala su da od 56 testiranih etarskih ulja samo sedam prouzrokuje potpunu inhibiciju porasta micelije sva tri testirana izolata pri koncentraciji od 0,04 μl/ml vazduha i višoj. Najbolji efekat zabeležen je za pet ulja origana različitog porekla, ulje timijana i ulje limunove trave. Rezultati ovih istraživanja u saglasnosti su sa brojnim istraživanjima koja pokazuju da pare etatrskih ulja origana, timijana, majorana, lavande, ruzmarina, žalfije, nane, lavande, bosiljka, kima, anisa i eukaliptusa inhibiraju porast različitih fitopatogenih gljiva (Isman, 2000; Daferera et al., 2003; Tanović et al., 2004; Arslan and Devis, 2010; Karamanoli et al., 2011), kao i sa našim prethodnim istraživanjima u kojima su ulja origana i ulje timijana ispoljila najjaču antifungalnu aktivnost (Hrustić i sar., 2011; Grahovac et al., 2012). U istraživanjima Liu et al. (2002) etarsko ulje timijana u niskim koncentracijama (2-4 mg/l) značajno je smanjilo razvoj mrke truleži koja se razvija na plodovima tokom skladištenja. Za ulja koja su ispoljila najbolji efekat u ovim istraživanjima utvrđen je minimalni period ekspozicije za postizanje letalnog efekta pri datoj koncentraciji. Rezultati su pokazali da za sva ispitivana ulja pri najvećoj koncentraciji od 0,08 µl/ml vazduha minimalni period ekspozicije je jedan dan, dok je za najnižu ispitivanu koncentraciju od 0,02 µl/ml vazduha minimalni period ekspozicije od jednog dana zabeležen samo za ulje Origano E za izolat M. fructigena. Za vrste M. laxa i M. Diskusija 139 fructicola minimalan period ekspozicije od dva dana pri najnižoj ispitivanoj koncentraciji od 0,02 µl/ml vazduha zabeležen je za ulje Origano D. Rezultati ispitivanja in vitro efekta gasovite faze etarskih ulja i određivanja MIC, MLC i MPC pokazali su da ulja origana i timijana ispoljavaju snažnu antimikrobnu aktivnost i da postoji opravdanost pokušaja formulisanja preparata na bazi ovih supstanci. Ispitivanja in vitro efekata formulisanih etarskih ulja origana i timijana pokazala su da formulisana ulja ispoljavaju bolji efekat u odnosu na komercijalno dostupni preparat Timorex Gold i podjednako dobar efekat inhibicije porasta micelije u poređenju sa standardnim fungicidom, dok su in vivo testovi pokazali da ispitivane formulacije ostvaruju zaštitu plodova jabuke od vrsta roda Monilinia na istom nivou kao i komercijalni preparat Timorex Gold, a slabiju od standardnog preparata na bazi iprodiona. 6.5.2. Uticaja različitih sojeva bakterije Bacillus subtilis na izolate Monilinia spp. Najproučavanija vrsta bakterija koja se koristi za biološku zaštitu od fitopatogenih gljiva je B. subtilis (Asaka and Shoda, 1996: Brannen and Kenney, 1997; Krebs et al., 1998; Lin et al., 2001; Heins et al., 2002; Pinchuk et al., 2002), bakterija poznata duži niz godina po svojoj antimikrobnoj aktivnosti. B. subtilis koristi se kao aktivna supstanca nekoliko preparata koji su registrovani u svetu (Tomlin, 2009). Mnogi autori ukazali su na mogućnost upotrebe B. subtilis za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Istraživanja Yánez-Mendizábal et al. (2012) pokazala su da soj CPA-8 B. subtilis u poređenju sa komercijalno dostupnim preparatom Serenade na bazi B. subtilis soj QST-713 ima veći potencijal za suzbijanje prouzrokovača mrke truleži plodova. Pusey et al. (1984) i Altindag et al. (2006), ukazali su, takođe, na mogućnost primene B. subtilis u suzbijanja vrsta roda Monilinia. Sa druge strane, istraživanja Tanović i sar. (2005; 2010a) ističu nezadovoljavajuću efikasnost bifungicida na bazi B. subtilis u suzbijanju B. cinerea u poljskim uslovima, mada su rezulatati laboratorijskih ogleda bili obećavajući. Rezultati ispitivanja uticaja različitih sojeva bakterije B. subtilis na izolate Monilinia spp. u in vitro uslovima, u okviru ove disertacije, pokazala su da B. subtilis Diskusija 140 N146 ima veliki potencijal za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Dodatno, rezultati in vivo eksperimenata potvrdili su da suspenzija B. subtilis N146 i obe suspenzije iz komercijalnih preparata statistički značajno smanjuju razvoj truleži inokulisanih plodova jabuke u odnosu na netretiranu kontrolu, kao i da se bolji efekat zaštite postiže u slučaju kada se inokulacija vrši neposredno nakon tretmana. S obzirom da je B. subtilis N146 pokazao veliki potencijal za suzbijanje Monilinia spp. formulisani su biopreparati i utvrđen je njihov potencijal za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Testiranja su pokazala da formulacija 3, formulisana kao suspo- emulzija ispoljava najjači inhibitorni efekat na sve tri vrste roda Monilinia. Zaključak 141 7. ZAKLJUČAK Na osnovu obavljenih trogodišnjih istraživanja dobijeni su rezultati iz kojih se mogu izvesti sledeći zaključci:  Izolacijom patogena iz uzoraka obolelih biljnih delova koštičavih voćaka sa 119 lokaliteta u Srbiji i proučavanjem morfoloških (makroskopskih i mikroskopskih), patogenih, odgajivačkih i ekoloških karakteristika 246 izolata, utvrđeno je da je dominantan prouzrokovač mrke truleži plodova i sušenja cvetova, grana i grančica koštičavih voćaka u Srbiji M. laxa (96,34%), dok je zastupljenost ostalih vrsta ovog roda znatno manja – M. fructigena (2,44%) i M. fructicola (1,22%).  Prisustvo M. fructicola na koštičavim voćkama u Srbiji detektovano je po prvi put 2012. godine. Patogen nije pronađen u zasadu, ali dva nezavisna uzorka prikupljena sa lokalnih zelenih pijaca od domaćih proizvođača nedvosmisleno dokazuju prisustvo ovog patogena na teritoriji naše zemlje.  Tri vrste roda Monilinia mogu se razdvojiti na osnovu istovremene primene grupe morfoloških karaktera uključujući: izgled, oblik i boju kolonije, prisustvo spora i koncentričnog prstena spora u kulturi, brzinu porasta micelije, kao i veličinu konidija, načina klijanja konidija i dužinu kličine cevčice pre prvog grananja.  Svih 246 dobijenih monosporijalnih izolata Monilinia spp. je nakon tri dana od inokulacije ploda biljke domaćina prouzrokovalo trulež smeđe boje; sa inokulisanih plodova je obavljena reizolacija i dobijeni reizolati su po izgledu kolonije i morfologiji reproduktivnih tvorevina u potpunosti odgovarali izvornim izolatima čime je potvrđena patogenost izolata i ispunjeni Kohovi postulati.  Izolati M. laxa formiraju na PDA podlozi kolonije svetlo smeđe do sive boje oblika rozete, režnjevitih ivica, bez prisustva spora. Izolati M. fructigena obrazuju kolonije krem-žute boje, ravnih ivica, sa prisutnim retkim sporama, dok je kolonija izolata M. fructicola smeđe do sive boje sa izraženom sporulacijom i koncentričnim prstenovima spora, ravnih ivica.  Konidije izolata vrste M. laxa bile su dimenzija 11,25-15,42 x 8,25-11,07 μm i klijale su na WA podlozi i formirale kličine cevčice prosečne dužine 40 µm (20-70 µm) pre prvog grananja. Konidije koje su formirali izolati M. fructigena bile su u proseku najvećih dimenzija (19,25-23,50 x 11,92-13,50 μm) iz kojih je nastajalo Zaključak 142 nekoliko kličinih cevčica prosečne dužine 197 µm pre prvog grananja, dok su spore izolata M. fructicola bile prosečnih dimenzija 16,00-16,92 x 9,87-10,75 μm i klijale su u kličine cevčice najveće dužine (prosečno 365 µm pre grananja).  Najveći prosečni dnevni porast na PDA podlozi imao je izolat M. fructicola, dok je izolat vrste M. fructigena najsporije rastao. Praćenjem porasta izolata Monilinia spp. na pet različitih hranljivih podloga utvrđeno je da su izolati M. laxa i M. fructigena prosečno najveći porast ispoljili na MA podlozi, dok je za vrstu M. fructicola optimalan porast zabeležen na PDA podlozi. Svi ispitivani izolati rasli su na svim temperaturama uključenim u ispitivanje različitom brzinom, pri čemu je najveći broj ispitivanih izolata optimalan porast ispoljio na temperaturama od 23 do 28°C, dok su granične temperature porasta bile u intervalima od 2-4°C minimum i od 31-34°C maksimum.  Test unakrsne patogenosti odabranih izolata Monilinia spp. veštačkom inokulacijom povređenih plodova koštičavih voćaka pokazao je da svi ispitivani izolati bez obzira na poreklo prouzrokuju simptome na povređenim plodovima koštičavih voćaka, ali i da postoji velika razlika u virulentnosti kako između izolata različitih vrsta, tako i između izolata iste vrste.  Testovi patogenosti pokazali su da sve tri ispitivane vrste roda Monilinia mogu ostvariti infekciju plodova svih šest vrsta koštičavih voćaka kako kroz povrede, tako i kroz nepovređenu kutikulu ploda.  Multiplex PCR metoda, koja je prilagođena i primenjena u ovim istraživanjima za brzu identifikaciju vrsta roda Monilinia, bila je dovoljno specifična i pouzdana za izolate poreklom iz Srbije, čime se kvalifikovala za primenu u vidu protokola za brzu i pouzdanu molekularnu metodu detekcije. Kao rezultat multiplex PCR metode, korišćenjem prajmera MO368-5, MO368-8R, MO368-10R i Laxa-R2, amplifikovani su fragmenti nukleinske kiseline očekivane veličine: kod izolata M. laxa došlo je do amlifikacije fragmenta veličine 351 bp, fragmenti veličine oko 402 bp amplifikovani su kod izolata detektovanih kao M. fructigena, dok je do amlifikacije fragmenata veličine od 535 bp došlo kod izolata koji su detektovani kao vrsta M. fructicola.  Identitet izolata potvrđen je analizom sekvenci ITS rDNK genomnog regiona ispitanih izolata. Analiza 11 sekvenci M. laxa dobijenih u ovom istraživanju Zaključak 143 pokazala je 100% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama pet izolata vrste M. laxa poreklom iz Španije. Analiza četiri sekvence M. fructigena dobijenih u ovom istraživanju pokazala je 100% nukleotidne identičnosti sa 16 izolata M. fructigena poreklom iz različitih delova sveta, dok su sekvence izolata M. fructicola poreklom iz Srbije 100% identične sekvencama osam izolata M. fructicola deponovanih u GenBank bazi podataka.  Rekonstrukcija filogenetskog stabla na osnovu ITS regiona rDNK pružila je uvid u evolutivnu međupovezanost izolata Monilinia spp i ukazala na blisku vezu između izolata vrste M. fructicola i M. laxa sa jedne, i M. fructigena i M. polystroma sa druge strane.  SSR analiza pokazala je da se izolati M. fructicola poreklom iz Srbije razlikuju po dužini alela amplifikovanog jednim od primenjenih prajmera što je ukazalo da se izolati M. fructicola poreklom iz Srbije mogu podeliti u dve grupe i pripadaju različitim haplotipovima, poreklom iz Italije. Time je ustanovljeno da mogući put introdukcije ove vrste u Srbiju vodi iz Italije, i da je do introdukcije došlo najmanje dva puta.  Ispitivanja osetljivosti izolata Monilinia spp. na fungicide pokazala su da su izolati sve tri vrste najosetljiviji na prohloraz i tebukonazol, a da je visoka osetljivost utvrđena i na iprodion, hlorotalonil i azoksistrobin. Sa druge strane, uočena je jasna razlika između različitih vrsta roda Monilinia u osetljivosti na boskalid i fluopiram.  Izolati vrste M. laxa ispoljili su najveću osetljivost na sve ispitivane fungicide, dok je izolat M. fructicola najmanje osetljiv na sve ispitivane fungicide osim na fluopiram i prohloraz na koje je najmanje osetljiv bio izolat M. fructigena.  Testovi određivanja minimalne fungistatične i letalne koncentracije potvrdili su visoku osetljivost izolata na tebukonazol i prohloraz, dok hlorotalonil, boskalid, fluopiram i azoksistrobin ni pri koncentracijama većim od 1000 mg/l ne deluju letalno na ispitivane izolate.  Ispitivanja in vitro efekta gasovite faze etarskih ulja na izolate Monilinia spp. pokazala su da od 56 testiranih etarskih ulja samo sedam (pet ulja origana, ulje timijana i limunove trave) potpuno inhibira porast micelije izolata sve tri testirane vrste pri koncentraciji od 0,04 μl/ml vazduha i višoj. Pri koncentraciji primene ovih ulja od Zaključak 144 0,08 μl/ml vazduha minimalan period ekspozicije kojim se postiže letalni efekat iznosi jedan dan.  Ispitivanja in vitro efekta formulisanih etarskih ulja origana i timijana pokazala su da formulisana ulja ispoljavaju bolji efekat u odnosu na komercijalno dostupan preparat ulja čajnog drveta i podjednako dobar efekat inhibicije porasta micelije u poređenju sa standardnim fungicidom iprodionom. Međutim, u testu in vivo ispitivane formulacije ostvaruju slabiju zaštitu plodova jabuke od vrsta roda Monilinia od iprodiona. Efekat formulisanih ulja je je bio na istom nivou kao i komercijalni preparat čajnog drveta.  Rezultati ispitivanja uticaja različitih sojeva bakterije B. subtilis iz komercialno dostupnih preparata i soja N146 na izolate Monilinia spp. u in vitro uslovima pokazuju da B. subtilis soj N146 ispoljava najjači antagonizam, dok rezultati in vivo eksperimenata potvrđuju da suspenzija B. subtilis N146 i dve suspenzije iz komercijalnih preparata statistički značajno smanjuju razvoj truleži inokulisanih plodova jabuke u odnosu na netretiranu kontrolu, kao i da se bolji efekat zaštite postiže u slučaju kada se inokulacija vrši neposredno nakon tretmana.  In vitro ispitivanja efekata formulacije 3 razvijene u ovom radu na Monilinia spp. potvrdila su visok potencijal ovog biopreparata za suzbijanje vrsta roda Monilinia. Rezultati su pokazali da i sirova suspenzija B. subtilis i formulacija 3 statistički značajno smanjuju razvoj truleži inokulisanih plodova jabuke u odnosu na netretiranu kontrolu. Dodatno, formulacija 3 bila je efikasnija od sirove suspenzije B. subtilis. Ipak, zabeležen je slabiji efekat zaštite u slučaju inokulacije plodova 24 h nakon tretmana za sve primenjivane tretmane, osim za standardni fungicid. Literatura 145 8. LITERATURA Adaskaveg, J.E., Förester, H. (2010): New developments in postharvest fungicide registrations for edible horticultural crops and use strategies. In: Prusky, D., Gullino, M.L. (eds). Postharvest pathology, Springer, pp. 107-119. Altindag, M., Sahin, M., Esitken, A., Ercisli, S., Guleryuz, M., Donmez, M.F., Sahin, F. (2006): Biological control of brown rot (Monilinia laxa Ehr.) on apricot (Prunus armeniaca L. cv. Hacıhaliloglu) by Bacillus, Burkholdria, and Pseudomonas application under in vitro and in vivo conditions. Biological Control, 38: 369- 372. Alvarez-Castellanos, P.P., Bishop,C.D., Pascual-Villalobas, M.J. (2001): Antifungal activity of the essential oil of flower head of garlant chrysanthemum (Chrysanthemum coronarium) against agricultural pathogens. Phytochemistry, 57: 99-102. Amiri, A., Scherm, H., Brannen, P.M., Schnabel, G. (2008): Laboratory evaluation of three rapid, agar-based assays to assess fungicide sensitivity in Monilinia fructicola. Plant Disease, 92: 415-420. Amiri, A., Brannen, P.M., Schnabel, G. (2010): Reduced sensitivity of Monilinia fructicola field isolates from South Carolina and Georgia to respiration inhibitor fungicides. Plant Disease, 94: 737-743. Anonymous (2008): Diagnostic protocol for Monilinia fructigena (apple brown rot). http://www.daff.gov.au/_data/assets/pdf_file/0016/1061332/diag-protocol-apple- brown.pdf. datum pristupa: 15.04.2011. Anonymous (2011): Pesticidi u prometu u Srbiji. Biljni lekar, 39: 279-316. Arsenijević, M., Rudinski, I. (1969): Fungicidna vrednost Bakarnog kreča 25 i Cineba S-65 u suzbijanu Monilia sp. na višnjama. Agrohemija, 5-6: 189-191. Asaka, O., Shoda, M. (1996): Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14. Applied and Environmental Microbiology, 62: 4081-4085. Avenot, H.F., Sellam, A., Karaoglanidis, G., Michailides, T.J. (2008): Characterization of mutations in the iron - sulphur subunit of succinate dehydrogenase correlating with boscalid resistance in Alternaria alternata from California pistachio. Phytopathology, 98: 736-742. Avenot, H.F., Michailides, T.J. (2010): Progress in understanding molecular mechanisms and evolution of resistance to succinate dehydrogenase inhibiting (SDHI) fungicides in phytopathogenic fungi. Crop Protection, 29: 643-651. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., Idaomar, M. (2008): Biological effects of essential oils–A review. Food and Chemical Toxicology, 46: 446-475. Literatura 146 Baker, R. et al. (2011): European Food Safety Authority. Online publication. EFSA Journal, 9: 2119. www.efsa.europa.eu/efsajournal. datum pristupa: 11.04.2012. Balaž, J. (2000): Monilia spp. kao parazit voćaka. Biljni lekar, 2-3: 155-162. Batra, L.R. (1979): First authenticated North American record of Monilinia fructigena, with notes on related species. Mycotaxon, 8: 476-484. Batra, L.R., Harada, Y. (1986): A field record of apothecia of Monilinia fructigena in Japan and its significance. Mycologia, 78: 913-917. Batra, L.R. (1991): World species of Monilinia (Fungi): their ecology, biosystematics and control. Mycologia Memoir No. 16. Beever, R.E., Brien, H.M.R. (1983): A survey of resistance to the dicarboximide fungicides in Botrytis cinerea. New Zealand Journal of Agricultural Reasearch, 26: 391-400. Biggs, A.R., Northover, J. (1988): Early and late-season susceptibility of peach fruits to Monilinia fructicola. Plant Disease, 72: 1070-1074. Borve, J., Stensvand, A. (2003): Use of a plastic rain shield reduces fruit decay and need for fungicides in sweet cherry. Plant Disease, 87: 523-528. Bosshard, E., Hilber-Bodmer, M., Scharer, H.J., Bunter, M., Duffy, B. (2006): First report of the quarantine brown rot pathogen Monilinia fructicola on imported stone fruits in Switzerland. Plant Disease, 90: 1554. Brannen, P.M., Kenney, D.S. (1997): Kodiak – a successful biological control product for suppression of soil-borne plant pathogens of cotton. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 19: 169-171. Brunner PC, Frey JE, 2004. Isolation and characterization of six polymorphic microsatellite loci in the western flower thrips Frankliniella occidentalis (Insecta, Thysanoptera). Molecular Ecology Notes 4, 599–601. Bouchra, C., Achouri, M., Hassani, L.M.I., Hmamouchi, M. (2003): Chemical composition and antifungal activity of essential oils of seven Moroccan Labiatae against Botrytis cinerea Pers. Journal of Ethnopharmacology, 89: 165-169. Buchenauer, H. (1987): Mehanism of action of triazolyl fungicides and related compounds. In: Lyr, H. (ed). Modern Selective Fungicides: properties, applications, mehanism of action. Gustav Fisher Verlag. Jena, Germany, pp. 205-232. Burnett, A.L., Lalancette, N., McFarland, K.A. (2010): Effect of QoI fungicides on colonization and sporulation of Monilinia fructicola on peach fruit and blossom blight cankers. Plant Disease, 94: 1000-1008. Literatura 147 Byrde, R.J.W., Willettes, H.J. (1977): The brown rot fungi of fruit: their biology and control. Pergamon Press, Oxford. CABI, (2004): Monilinia fructigena (brown rot). Crop Protection Compendium. CAB International, Wallingford, UK. Carstens, E., van Niekerk, J.M., Laubscher, W., Fourie, P.H. (2010): Resolving the status of Monilinia spp. in South African stone fruit orchards. Journal of Plant Pathology, 92: 35-41. Casals, C., Viñas, I., Torres, R., Griera, C., Usall, J. (2010a): Effect of temperature and water activity on in vitro germination of Monilinia spp. Journal of Applied Microbiology, 108: 47-54. Casals, C., Teixidó, N., Viñas, I., Llauradó, S., Usall, J. (2010b): Control of Monilinia spp. on stone fruit by curing treatments Part I. The effect of temperature, exposure time and relative humidity on curing efficacy. Postharvest Biology and Technology, 56: 19-25. Chand-Goyal, T., Spotts, R.A. (1996): Postharvest biological control of blue mold of apple and brown rot of cherry by natural saprophytic yeasts alone or in combination with low doses of fungicides. Biological Control, 6: 253-259. Chao, S.C., Young, D.J. (2000): Screening for inhibitory activity of essential oils on selected bacteria, fungi and viruses. Journal of Essential Oil Research, 12: 630- 649. Chen, F.P., Fan, J.R., Zhou, T., Liu, X.L., Liu, J.L., Schnabel, G. (2012): Baseline sensitivity of Monilinia fructicola from China to the DMI fungicide SYP-Z048 and analysis of DMI-resistant mutants. Plant Disease, 96: 416-422. Cimanga, K., Kambu, K., Tona, L., Apers, S., De Bruyne, T., Hermans, N., Totte, J., Pieters L., Vlietinck, A.J. (2002): Correlation between chemical composition and antibacterial activity of essential oils of some aromatic medicinal plants growing in the Democratic Republic of Congo. Journal of Ethnopharmacology, 79: 213-220. Côté, M.J., Tardif, M.C., Meldrum, A.J. (2004): Identification of Monilinia fructigena, M. fructicola, M. laxa, and Monilia polystroma on inoculated and naturally infected fruit using multiplex PCR. Plant Disease, 88: 1219-1225. Daferera, D.J., Ziogas, B.N., Polissiou, M.G. (2003): The effectiveness of plant essential oils on the growth of Botrytis cinerea, Fusarium sp. and Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Crop Protection, 22: 39-44. Davidse, L.C. (1987): Bichemical aspects of benzimidazole fungicides-actio and resistance. In: Lyr H. (ed.). Modern selective fungicides. Longman Scient. Technical, New York, pp. 53-59. Literatura 148 Davidse, L.C., Ishii, H. (1995): Biochemical and molecular aspects of the mechanisms of action of benzimidazoles, N-phenylformamidoximes and the mechanisms of resistance to these compounds in fungi. In: Lyr, H. (ed.). Modern Selective Fungicides – Properties, Applications, Mechanisms of Action. Gustav Fiser Verlag, Jena, Germany, pp. 305-322. De Cal, A., M-Sagasta, E., Melgarejo, P. (1988): Antifungal substances produced by Penicillium frequentans and their relationship to the biocontrol of Monilinia laxa. Phytopathology, 78: 888-893. De Cal, A., Melgarejo, P. (1999): Effects of long-wave UV light on Monilinia growth and identification of species. Plant Disease, 83: 62-65. De Cal, A., Gell, I., Usall, J., Vinas, I., Melgarejo, P. (2009a): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola in peach orchards in Ebro Valley, Spain. Plant Disease, 93: 763. De Cal, A., Larena, I., Liñan, M., Torres, R., Lamarca, N., Usall, J., Domenichini, P., Bellini, A., Eribe, X., Melgarejo, P. (2009b): Population dynamics of Epicoccum nigrum, a biocontrol agent against brown rot in stone fruit. Journal of Applied Microbiology, 106: 592-605. Detweiler, A.R., Vargas, J.M., Dannenberger, T.K. (1983): Resistance of Sclerotinia homeocarpa to iprodione and benomyl. Plant Disease, 67: 627-630. Dhingra, O.D., Sinclair, J.B. (1995): Basic Plant Pathology Methods. CRC Press, Ins., Boca Raton, Florida, USA. Dorman, H.J.D., Deans, S.G. (2000): Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88: 308-316. Drén, G., Szabó, Z., Soltész, M., Holb, I.J. (2007): Brown rot blossom blight and fruit rot of apricot in Hungary. International Journal of Horticultural Science, 13: 139-141. Duduk, N., Obradović, A., Ivanović, M. (2010): Uticaj etarskih ulja timijana, cimeta i karanfilića na porast micelije Colletotrichum acutatum. Pesticidi i Fitomedicina, 25: 151-156. Duchoslavová, J., Širucková, I., Zapletalová, E., Navrátil, M., Šafárová, D. (2007): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on various stone and pome fruits in the Czech Republic. Plant Disease, 91: 907. Duffy, B.K., Défago, G. (1997): Zinc improves biocontrol of Fusarium crown and root rot of tomato by Pseudomonas fluorescens and represses the production of pathogen metabolites inhibitory to bacterial antibiotic biosynthesis. Phytopathology, 87: 1250-1257. Literatura 149 Edlich, W., Lyr, H. (1995): Mechanism of action of dicarboximide fungicides. In: Lyr H. (ed.). Modern selective fungicides. 2nd revised and enlarged edition. Gustav Fisher Verlag: Jena, Stuttgart, New York, pp. 119-131. Elad, Y., Zimand, G., Zaqs, Y., Zuriel, S., Chet, I. (1993): Use of Trichoderma harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions. Plant Pathology, 42: 324-332. Elad, Y. (1994): Biological control of grape grey mould by Trichoderma harzianum. Crop Protection, 13: 35-38. Elmer, P.A.G., Spiers, T.M., Wood, P.N. (2007): Effects of pre-harvest foliar calcium sprays on fruit calcium levels and brown rot of peaches. Crop Protection, 26: 11- 18. Emery, K.M., Michailides, T.J., Scherm, H. (2000): Incidence of latent infection of immature peach fruit by Monilinia fructicola and relationship to brown rot in Georgia. Plant Disease, 84: 853-857. Engelkes, C.A., Nuclo, R.L., Fravel, D.R. (1997): Effect of carbon, nitrogen and C:N ratio on growth, sporulation and bio-control efficacy of Talaromyces flavus.Phytopathology, 87: 500-505. EPPO (2000): Distribution maps of plant diseases, No.22. Edition 6. CAB International, Wallingford, UK. EPPO (2002): First report of Monilinia fructicola in France. EPPO Reporting Service, 2002/003. EPPO (2003): EPPO standards, diagnostic protocols for regulated pests. EPPO Bulletin, 33: 245-247. EPPO (2006): Monilinia fructicola. Distribution maps of quarantine pest of Europe http://www.eppo.org/QUARANTINE/fungi/Monilinia_fructicola/MONIFC_ma p.htm. EPPO (2009): Diagnostic protocols for regulated pests - Monilinia fructicola. EPPO Bulletin, 39: 337-343. EU Pesticide Database (2012): Active substances. Regulation (EC) No 1107/2009. http://ec.europa.eu/sanco_pesticides/public/, datum pristupa: 11.04.2012. Fan, J.Y., Guo, L.Y., Xu, J.P., Luo, Y., Michailides, T.J. (2010): Genetic diversity of populations of Monilinia fructicola (Fungi, Ascomycota, Helotiales) from China. Journal of Eukaryotic Microbiology, 57: 206-212. FAOSTAT (2011): Food and Agriculture Organisation of the United Nations, http://faostat3.fao.org/home/index.html. datum pristupa: 21.05.2013. Literatura 150 Filajdić, N., Vukša, P., Ivanović, M., Rekanović, E. (2003): Biološke mere zaštite bilja: problemi i perspektive. Pesticidi i Fitomedicina, 18: 69-75. Finney, M.A. (1964): Probit analysis – A statistical treatment of the sigmoid response curve. University Press, 2nd edition, Cambridge, UK. Fisher, N., Meunier, B. (2008): Molecular basis of resistance to cytochrome bc1 inhibitors. FEMS Yeast Research, 8: 183-192. Förster, H., Adaskaveg, J.E. (2000): Early brown rot infections in sweet cherry fruit are detected by Monilinia-specific DNA primers. Phytopathology, 90: 171-178. Förster, H., Driever, G.F., Thompson, D.C., Adaskaveg, J.E. (2007): Postharvest decay management for stone fruit crops in California using the “reduced-risk” fungicides fludioxonil and fenhexamid. Plant Disease, 91: 209-215. Fraaje, B.A., Lukas, J.A., Clark, W.S., Burnett, F.J. (2003): QoI resistance development in populations of cereal pathogens in the UK. The BCPC International Congress – Crop Science & Technology. FRAC (2004): QoI working group report. http://www.frac info. FRAC (2005): Pathogen Risk List. Fungicide Resistence Action Commitettee. http://www.frac.info/publication/anhang/FRAC_Pathogen_risk%20list.pdf. datum pristupa: 01.03.2013. Fulton, C.E., van Leeuwen, G.C.M., Brown, A.E. (1999): Genetic variation among and within Monilinia species causing brown rot of stone and pome fruits. European Journal of Plant Pathology, 105: 495-500. Gell, I., Cubero, J., Melgarejo, P. (2007): Two different PCR approaches for universal diagnosis of brown rot and identification of Monilinia spp. in stone fruit trees. Journal of Applied Microbiology, 103: 2629-2637. Gell, I., De Cal, A., Torres, R., Usall, J. Melgarejo, P. (2008): Relationship between the incidence of latent infections caused by Monilinia spp. and the incidence of brown rot of peach fruit: factors affecting latent infection. European Journal of Plant Pathology, 121: 487-498. Gell, I., De Cal, A., Torres, R., Usall, J. Melgarejo, P. (2009): Conidial density of Monilinia spp. on peach fruit surfaces in relation to the incidences of latent infections and brown rot. European Journal of Plant Pathology, 123: 415-424. Gibert, C., Chadoeuf, J., Nicot, P., Vercambre, G., Genard, M., Lescourret, F. (2009): Modelling the effect of cuticular crack surface area and inoculum density on the probability of nectarine fruit infection by Monilinia laxa. Plant Pathology, 58: 1021-1031. Literatura 151 Grabke, A., Hu, M.J., Luo, C.X., Bryson, P.K., Schnabel, G. (2011): First report of brown rot of apple caused by Monilinia fructicola in Germany. Plant Disease, 95: 772. Grahovac, M., Inđić, D., Tanović, B., Lazić, S., Vuković, S., Hrustić, J., Gvozdenac, S. (2011): Integralna zaštita jabuka od prouzrokovača truleži u skladištima. Pesticidi i Fitomedicina, 26: 289-299. Grahovac, M., Hrustić, J., Tanović, B., Inđić, D., Vuković, S., Mihajlović, M., Gvozdenac, S. (2012): In vitro effects of essential oils on Colletotrichum spp. Book of Abstracts International Conference Role of Research in Sustainable Development of Agriculture and Rural Areas, Podgorica, Montenegro, pp. 135. Gullino, M.L., Gilardi, G., Tinivella, F., Garibaldi, A. (2004): Observations on the behaviour of different populations of Plasmopara viticola resistant to QoI fungicides in Italian vineyards. Phytopathology Mediterranea, 43: 341-350. Harman, J.E., Beever, D.J. (1987): The use of post-harvest fungicides to control storage rots in nectarines. Orchardist of New Zealand, 60: 384. Harada,Y., Nakao, S., Sasaki, M., Sasaki,Y., Ichihashi, Y., Sano, T. (2004): Monilia mumecola, a new brown rot fungus on Prunus mume in Japan. Journal of General Plant Pathology, 70: 297-307. Harrington, T.C., Wingfield, B.D. (1995): A PCR-based identification method for species of Armillaria. Mycologia, 87: 280-288. Hilber-Bodmer, M., Bünter, M., Patocchi, A. (2010): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on apricot in a Swiss orchard. Plant Disease, 94: 643. Holb, I.J., Schnabel, G. (2005): Effect of fungicide treatments and sanitation practices on brown rot blossom blight incidence, phytotoxicity, and yield for organic sour cherry production. Plant Disease, 89: 1164-1170. Holb, I.J. (2006): Possibilities of brown rot management in organic stone fruit roduction in Hungary. International Journal of Horticultural Science, 12: 87-91. Holb, I.J. (2008): Brown rot blossom blight of pome and stone fruits: symptom, disease cycle, host resistance, and biological control. International Journal of Horticultural Science, 14: 15-21. Holst-Jensen, A., Kohn, L.M., Jakobsen, K.S., Schumacher, T. (1997): Molecular phylogeny and evolution of Monilinia (Sclerotiniaceae) based on coding and noncoding rDNA sequences. American Journal of Botany, 84: 686-701. Holtz, B.A., Michailides, T.J., Hong, C.X. (1998): Development of apothecia from stone fruit infected and stromatized by Monilinia fructicola in California. Plant Disease, 82: 1375-1380. Literatura 152 Hong, C., Holtz, B.A., Morgan, D.P., Michailides, T.J. (1997): Significance of thinned fruit as a source of the secondary inoculum of Monilinia fructicola in California nectarine orchards. Plant Disease, 81: 519-524. Hong, C.X., Michailides, T.J., Holtz, B.A. (1998): Effects of wounding, inoculum density, and biological control agents on postharvest brown rot of stone fruits. Plant Disease, 82: 1210-1216. Hrustić, J., Tanović, B., Grahovac, M., Mihajlović, M., Delibašić, G., Vukša, P. (2011): In vitro i in vivo efekat etarskog ulja timijana na Monilinia fructigena. Zbornik rezimea radova XI savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor, pp. 36-37. Hrustić, J., Tanović, B., Mihajlović, M., Grahovac, M., Delibašić, G., Bulajić, A. (2012a): Monilinia spp. causal agents of apple fruit rot. Book of Abstracts I International Symposium and XVII Scientific Conference of Agronomists of Republica Srpska, Trebinje, Bosnia and Herzegovina, pp. 192. Hrustić, J., Grahovac, M., Mihajlović, M., Delibašić, G., Ivanović, M., Nikolić, M., Tanović, B. (2012b): Molecular detection of Monilinia fructigena as causal agent of brown rot on quince. Pesticides and Phytomedicine, 27: 15-24. Hrustić, J., Tanović, B., Mihajlović, M., Delibašić, G., Stanković, I., Krstić, B., Bulajić, A. (2013a): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on nectarine in Serbia. Plant Disease, 97: 147. Hrustić J., Mihajlović M., Bulajić A., Krstić B., Stanković I., Delibašić G., Grahovac M., Tanović B. (2013b): Presence and distribution of brown rot in stone fruits in Serbia. Abstract Volume 11th Slovenian Conference on Plant Protection with International Participation, Bled, Slovenia, pp. 37. Hu, M.J., Cox, K.D., Schnabel, G., Luo, C.X. (2011a): Monilinia species causing brown rot of peach in China. PLoS ONE, 6(9): e24990. Hu, M.J., Luo, C.X., Grabke, A., Schnabel, G. (2011b): Selection of a suitable medium to determine sensitivity of Monilinia fructicola mycelium to SDHI fungicides. Journal of Phytopathology 159: 616-620. Hughes, K.J.D., Fulton, C.E., McReynolds, D., Lane, C.R. (2000). Development of new PCR primers for identification of Monilinia species. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 30: 507-511. Hughes, K.J.D. (2003): DNA extraction from mycological organisms. SOP PLHB/M26. Central Science Laboratory, York. Ioos, R., Frey, P. (2000): Genomic Variation within Monilinia laxa, M. fructigena, and M. fructicola, and application to species identification by PCR. European Journal of Plant Pathology, 106: 373-378. Literatura 153 Ishii, H. (1995): Monitoring of fungicide resistance in fungi: biological to biochemical approaches. In: Singh, S.U., Singh, P.R. (eds). Molecular Methods in Plant Pathology, Lewis Publisher, Boca Ratton, FL, pp. 483-495. Ishii, H., Fraaije, B.A., Sugiyama, T., Noguchi, K., Nishimura, K., Takeda, T., Amano, T., Hollomon, D.W. (2001): Occurence and molecular characterization of strobilurin resistance in cucumber powdery mildew and downy mildew. Phytopathology, 91: 1166-1171. Isman, M.B. (2000): Plant essential oils for pest and disease management. Crop Protection, 19: 603-608. Ivanović, M., Ivanović, D. (2001): Mikoze i pseudomikoze biljaka. P. P. De-eM-Ve, Beograd. Jansch, M., Frey, J.E., Hilber-Bodmer, M., Broggini, G.A.L., Weger, J., Schnabel, G., Patocchi, A. (2012): SSR marker analysis of Monilinia fructicola from Swiss apricots suggests introduction of the pathogen from neighbouring countries and the United States. Plant Pathology, 61: 247-254. Jevremović, V. (1976): Osetljivost sorti breskve na Moniliju (Monilia sp.) u uslovima Ruma-Irug. Jugoslovensko voćarstvo, 39/40: 639-643. Jones, A.L, Aldwinckle, H.S. (1990): Brown rot diseases. Compendium of Apple and Pear Diseases. American Phytopathology Society Press. St. Paul, MN. pp. 100. Jordan, D.B., Livingston, R.S., Bisaha, J.J., Duncan, K.E., Pember, S.O., Picollelli M.A., Schwartz, R.S., Sternberger, J.A., Tang, X.S. (1999): Mode of action of famoxadone. Pesticide Science, 55: 105-118. Jordović, M. (1954): Osetljivost plodova nekih sorata bresaka prema parazitu Monilia sp. Arhiv za poljoprivredne nauke, 17: 96-99. Karabulut, O.A., Baykal, N. (2004): Integrated control of postharvest diseases of peaches with a yeast antagonist, hot water and modified atmosphere packaging. Crop Protection, 23: 431-435. Karabulut, O.A., Smilanick, J.L., Crisosto, C.H., Palou, L. (2010): Control of brown rot of stone fruits by brief heated water immersion treatments. Crop Protection, 29: 903-906. Kišpatić, J., Medin, A., Poparić, A., Kasap, G. (1976): M. laxa kao uzročnik sušenja mladice maraske. Poljoprivredno znanstvena smotra, 39: 317-320. Kišpatić, J., Maceljski, M. (1989): Zaštita voćaka. Znanje, Zagreb. Klokočar-Šmit, Z., Đurić, T., Inđić, D., Peričević, D., Bočarov, A., Nikolić, N. (2003): Efekat Bacillus subtilis ST/III (BEC) u zaštiti i bioregulaciji nekih povrtarskih vrsta. Zbornik rezimea Šestog savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor, pp. 68. Literatura 154 Köller, W., Parker, D.M., Turechek, W.W., Avila-Adame, C. (2004): A two-phase resistance response of Venturia inaequalis populations to the QoI fungicides kresoxim-methyl and trifloxystrobin. Plant Disease, 88: 537-544. Krebs, B., Hoding, B., Kubart, S., Workie, M.A., Junge, H., Schmiedeknecht, G., Grosch, R., Bochow, H., Hevesi, M. (1998): Use of Bacillus subtilis as biocontrol agent. I. Activities and characterization of Bacillus subtilis strains. Journal of Plant Disease and Protection, 105: 181-197. Kuck, K.H., Scheinpflug, H., Pontzen, R. (1995): DMI fungicides. In: Lyr, H. (ed). Modern Selective Fungicides: properties, applications, mechanisms of action, 2 nd revised and enlarged edition. Gustav Fisher Verlg, Jena-Stuttgart-NY, pp. 205- 258. Kulka, M., Von Schmeling, B. (1995): Carboxin fungicides and related compounds. In: Lyr, H. (ed). Modern Selective Fungicides. Gustav Fisher Verlag, Jena, Germany, pp. 133-147. Lane, C.R. (2002): A synoptic key for differentiation of Monilinia fructicola, M. fructigena and M. laxa, based on examination of cultural characters. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 32: 489-493. Larena, I., Melgarejo, P. (1996): Biological control of Monilinia laxa and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici by a lytic enzyme-producing Penicillium purpurogenum. Biological Control, 6: 361-367. Larena, I., Torres, R., De Cal, A., Liñán, M., Melgarejo, P., Domenichini, P., Bellini, A., Mandrin, J.F., Ochoa De Eribe, X., Usall, J. (2005): Biological control of postharvest brown rot (Monilinia spp.) of peaches by field applications of Epicoccum nigrum. Biological Control, 32: 305-310. Lazar-Baker, E.E., Hetherington, S.D., Ku, V.V., Newman, S.M. (2011): Evaluation of commercial essential oil samples on the growth of postharvest pathogen Monilinia fructicola (G. Winter) Honey. Letters in Applied Microbiology, 52: 227-232. Leroux, P., Gredt, M. (1972): Etude de l' action in vitro des fongicides, methode de l' incorporation ou milieu. Laboratoire de Phytopharmacie-CNRA-Versailles, pp. 1-10. Leroux, P. (2004): Chemical control of Botrytis and its resistance to chemical fungicides. In: Elad, Y., Williamson, B. Tudzynski, P. Delen, N. (eds). Botrytis: Biology, Pathology and Control. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, the Netherlands, pp. 195-222. Lim, T.H., Yi, J.C., Chang, T.H., Cha, B. (2001): Fitness of dicarboximide-resistant and sensitive Monilinia fructicola isolated from peach in Korea. Plant Pathology Journal, 17: 205-209. Literatura 155 Lim, T.H., Kim, J.H., Cha, B. (2006): Responses of peach blossom blight and brown rot fungus Monilinia fructicola to benzimidazole and diethofencarb in Korea. Plant Pathology Journal, 22: 1-6. Littley, E.R., Rahe, J.E. (1984): Specific tolerance of Sclerotium cepivorum to dicarboximide fungicides. Plant Disease, 68: 371-374. Liu, W.T, Chu, C.L., Zhou, T. (2002): Thymol and acetic acid vapors reduce postharvest brown rot of apricots and plums. Horticultue Science, 37: 151-156. Lučić, K. (2009): Sadržaj sredstava za zaštitu bilja 2009.g. Glasnik zaštite bilja, 1-2: 191-192. Lukač Bulatović, M. (2005): Tendencije promene strukture voćarske peoizvodnje u Srbiji i Vojvodini. Letopis naučnih radova, 29: 60-69. Luo, Y., Ma, Z.H., Michailides, T.J. (2001): Analysis of factors affecting latent infection and sporulation of Monilinia fructicola on prune fruit. Plant Disease, 85: 999-1003. Luo, Y., Michailides, T.J. (2001): Risk analysis for latent infection of prune by Monilinia fructicola in California. Phytopathology, 91: 1197-1208. Luo, Y., Michailides, T.J. (2003): Threshold conditions that lead latent infection to prune fruit rot caused by Monilinia fructicola. Phytopathology, 93: 102-111. Luo, Y., Michailides, T.J., Morgan, P.D., Krueger, W.H., Buchner, R.P. (2005): Inoculum dynamics, fruit infection, and development of brown rot in prune orchards in California. Phytopathology, 95: 1132-1136. Luo, C.X., Cox, K.D., Amiri, A., Schnabel, G. (2008): Occurrence and detection of the DMI resistance-associated genetic element ‘Mona’ in Monilinia fructicola. Plant Disease, 92: 1099-1103. Ma, Z., Yoshimura, M.A., Michailides, T.J. (2003a): Identification and characterization of benzimidazole resistance in Monilinia fructicola from stone fruit orchards in California. Applied and Environmental Microbiology, 69: 7145-7152. Ma, Z., Felts, D., Michailides, T.J. (2003b): Resistance to azoxystrobin in Alternaria isolates from pistachio in California. Pesticide Biochemistry and Physiology, 77: 66-74. Ma, Z.H., Yoshimura, M.A., Holtz, B.A., Michailides, T.J. (2005): Characterization and PCR-based detection of benzimidazole-resistant isolates of Monilinia laxa in California. Pest Managment Science, 61: 449-457. Madrigal, C., Melgarejo, P. (1994): Mechanisms of action of the antibiotic flavipin on Monilinia laxa and Saccharomyces cerevisiae. Mycological Research, 98: 874- 878. Literatura 156 Malandrakis, A.A., Markoglou, A.N., Ziogas, B.N. (2012): PCR-RFLP detection of the E198A mutation conferring resistance to benzimidazoles in field isolates of Monilinia laxa from Greece. Crop Protection, 39: 11-17. Mari, M., Torres, R., Casalini, N., Lamarca, N., Mandrin, J.F., Lichou, I., Larena, I., De Cal, A., Melgarejo, P., Usall, J. (2007): Control of post-harvest brown rot on nectarine by Epicoccum nigrum and physico-chemical treatments. Journal of the Science of Food and Agriculture, 87: 1271-1277. Mari, M., Martini, C., Guidarelli, M., Neri, F. (2012): Postharvest biocontrol of Monilinia laxa, Monilinia fructicola and Monilinia fructigena on stone fruit by two Aureobasidium pullulans strains. Biological Control, 60: 132-140. May-De Mio, L.L., Luo, Y., Michailides, T.J. (2011): Sensitivity of Monilinia fructicola from Brazil to tebuconazole, azoxystrobin, and thiophanate-methyl and implications for disease management. Plant Disease, 95: 821-827. McPhee, W.J. (1980): Some characteistics of Alternaria alternata strains resistant to iprodione. Plant Disease, 64: 847-849. Meier, U. (1997): Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen, BBCH- Monograph, Blackwell Wissenschafte-Verlag Berlin. Melgarejo, P., Carrillo, R., M-Sagasta, E. (1985): Mycoflora of peach twigs and flowers and its possible significance in biological control of Monilinia laxa. Transaction for the British Mycological Society, 85: 313-317. Merciera, V., Bussi, C., Plenet, D., Lescourret, F. (2008): Effects of limiting irrigation and of manual pruning on brown rot incidence in peach. Crop Protection, 27: 678-688. Michailides, T.J., Ogawa, J.M., Opgenorth, D.C. (1987): Shift of Monilinia spp. and distribution of isolates sensitive and resistant to benomyl in California prune and apricot orchards. Plant Disease, 71: 893-896. Michailides, T., Luo, Y., Ma, Z., Morgan, D.P. (2007): Brown rot of dried plum in California: new insights on an old disease. APSnet Feature Story, March 2007. http://www.apsnet.org/publications/apsnetfeatures/Pages/BrownRot.aspx. Miessner, S., Stammler, G. (2010): Monilinia laxa, M. fructigena and M. fructicola: Risk estimation of resistance to QoI fungicides and identification of species with cytochrome b gene sequences. Journal of Plant Disease and Protection, 117: 162-167. Miletić, N., Rekanović, E., Stević, M., Latinović, N., Miladinović, Z. (2003): Preliminarna ispitivanja biofungicida Polyversum (Pythium oligandrum Drechsler). Zbornik rezimea Šestog savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor, pp. 63. Miller, P.M. (1955): V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology, 45: 461-462. Literatura 157 Munda, A., Viršček Marn, M. (2010): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola affecting peach orchards in Slovenia. Plant Disease, 94:166. Muñoz, Z., Moret, A., Bech, J. (2008): Morphological and molecular characterization of Monilinia sp. isolates and pathogenicity on apple. Agrociencia, 42: 119-128. Muntañola-Cvetković, M. (1987): Opšta mikologija. NIRO Književne novine, Beograd. Nikolić, D., Keserović, Z., Magazin, N., Paunović, S., Miletić, R., Nikolić, M., Milivojević, J. (2012): Stanje i perspektive razvoja voćarstva u Srbiji. Zbornik radova i apstrakata 14. kongresa voćara i vinogradara Srbije sa međunarodnim učešćem, Vrnjačka Banja, pp. 3-22. Nozawa, Y., Morita, T. (1986): Molecular mechanisms of antifungal agents associated with membrane ergosterol. Dysfunction of memrane ergosterol and inhibition of ergosterol biosynthesis. In: Iwata, K., Vanden Bossche, H (eds). In vitro and in vivo evaluation of antifungal agents. Elsevier Science Publisher B. V., Amsterdam, The Netherlands, pp. 111-122. Ogawa, J.M., Manji, B.T., Schreader, W.R. (1975): Monilinia life cycle on sweet cherries and its control by overhead sprinkler fungicide applications. Plant Disease Reporter, 59: 876-880. Ogawa, J.M., Manji, B.T., Bose, E.A. (1981): Detection of benomyl resistant Monilinia laxa on apricot. Phytopathology, 71: 893. Ogawa, J.M., English, H. (1991): Diseases of temperate zone tree fruit and nut crops. University of California, Division of Agriculture and Natural Resources Pub. 3345. Ogawa, J.M., Zehr, E.I., Bird, W. (1995): Brown rot. In: Ogawa, J.M., Zehr, E.I., Bird, G.W., Ritchie, D.F., Uriu, K., Uyemoto, J.K. (eds). Compendium of Stone Fruit Diseases. American Phytopathological Society, St. Paul, MN. Ondejková, N., Hudecova, M., Bacigalova, K. (2010): First report on Monilinia fructicola in the Slovak Republic. Plant Protection Science, 46: 181-184. Pellegrino, C., Gullino, M.L., Garibaldi, A., Spadaro, D. (2009): First report of brown rot of stone fruit caused by Monilinia fructicola in Italy. Plant Disease, 93: 668. Perišić, M., Marković, S., Babović, M. (1976): Prilog proučavanju uzroka sušenja mladara višanja u rejonu Fruške Gore. Zaštita bilja, 136: 141-142. Petróczy, M., Palkovics, L. (2006): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on imported peach in Hungary. Plant Disease, 90: 375. Petróczy, M., Palkovics, L. (2009): First report of Monilia polystroma on apple in Hungary. European Journal of Plant Pathology, 125: 343-347. Literatura 158 Petróczy, M., Szigethy, A., Palkovics, L. (2012): Monilinia species in Hungary: morphology, culture characteristics, and molecular analysis. Trees, 26: 153-164. Pinchuk, I.V., Bressollier, P., Sorokulova, I.B., Verneuil, B, Urdaci, M.C. (2002): Amicoumacin antibiotic production and genetic diversity of Bacillus subtilis strains isolated from different habitats. Research Microbiology, 153: 269-276. Pommer, E.H., Lorenz, G. (1982): Resistance of Botrytis cinerea Pers. to dicarboximide fungicides - a literature review. Crop Protection, 1: 221-230. Poniatowska, A., Michalecka, M., and Bielenin, A. (2013): Characteristic of Monilinia spp. fungi causing brown rot of pome and stone fruits in Poland. European Journal of Plant Pathology, 135: 855-865. Pusey, P.L., Wilson, C.L. (1984): Postharvest biological control of stone fruit brown rot by Bacillus subtilis. Plant Disease, 68: 753-756. Radman, Lj. (1967): M. laxa (Ehr.) Ader et Ruhl., kao značajan faktor smanjenja prinosa nekih sorti šljive. Zaštita bilja, 85-95. Raaijmakers, J.M., Leeman, M., Van Oorschot, M.M.P., Van der Sluis, I., Schippers, B., Bakker, P.A.H.M. (1995): Dose–response relationships in biological control of fusarium wilt of radish by Pseudomonas spp. Phytopathology, 85:1075-1081. Ritchie, D.F. (1982): Effect of dichloran, iprodione, procymidone, and vinclozolin on the mycelial growth, sporulation, and isolation of resistant strains of Monilinia fructicola. Plant Disease, 66: 484-486. Roberts, D., Lohrke, S. (2003): Unated States Department of Agriculture - Agricultural research service research programs in biological control of plant diseases. Pest Managment Science, 59: 654-666. Robertson, J.L., Smith, K.L., Savin, N.E., Lavigne, R.J. (1984): Effects of dose selection and sample size on the precision of lethal dose estimates in dose- mortality regression. Journal of Economic Entomology, 77: 833-837. Rodgers, P.B. (1989): Potential of biological control organisms as a source of antifungal compounds for agrochemical and pharmaceutical product development. Pest Science, 27: 155-164. Rüegg, J., Lauber, H.P., Siegfried, W., Viret, O., Hilber, U. (1997): Experiences with anilinopyrimidines in Switzerland. Pesticide Outlook, 8: 28-33. Russell, P.E. (2005): Centenary review - A century of fungicide evolution. Journal of Agriculture Science, 143: 11-25. Sauter, H., Ammermann, E., Benoit, R., Brand, S., Gold, R.E., Grammenos, W., Kohle, H., Lorenz, G., Muller, B., Rohl, F., Schirmer, U., Speakman, J.B., Wenderoth, B., Wingert, H. (1995): Mitochondrial respiration as a target for antifungals: Lessons from research on strobilurins. In: Dixon, G.K., Copping, L.G., Literatura 159 Hollomon, D.W. (eds). Antifungal Agents: Discavery and Mode of Action. BIOS Scientific Publisher, Oxford, UK. Sauter, H., Steglich, W., Anke, T. (1999): Strobilurins: Evolution of a new class of active substances. Angewandte Chemie International Edition, 38: 1328-1349. Schnabel, G., Jones, A.L. (2001): The 14α-demethylase (CYP51A1) gene is overexpressed in Venturia inaequalis strains resistance to myclobutanil. Phytopathology, 91: 102-110. Sholberg, P.L., Haag, P.D., Hambleton, S., Boulay, H. (2003): First report of brown rot in wine grapes caused by Monilinia fructicola in Canada. Plant Disease, 87: 1268. Snyder, L.C., Jones, A.L. (1999): Genetic variation between strains of Monilinia fructicola and Monilinia laxa isolated from cherries in Canada. Canadian Journal of Plant Pathology, 21: 70-77. Sonoda, R.M., Ogawa, J.M., Manji, B.T., Shabi, E., Rough, D. (1983): Factors affecting control of blossom blight in a peach orchard with low level benomyl-resistant Monilinia fructicola. Plant Disease, 67: 681-684. Spiegel, J., Stammler, G. (2006): Baseline sensitivity of Monilinia laxa and M. fructigena to pyraclostrobin and boscalid. Journal of Plant Diseases and Protection, 113: 199-206. Stević, M., Vukša, P. (2006): Osetljivost Monilinia laxa (Ader. & Ruhl.) na fungicide različitog mehanizma delovanja. Pesticidi i Fitomedicina, 21: 297-304. Stojanović, D., Kostić, B. (1957): Prilog proučavanju vrsta Monilia na jabučastom i koštičavom voću. Zaštita bilja, 44: 69-72. Stojanović, D., Kostić, B. (1958): Monilia fructigena (Ader. et. Ruhl.) Honey na grožđu. Zaštita bilja, 46: 65-67. Stojanović, S. (2004): Poljoprivredna fitopatologija. Srpsko biološko društvo ''Stevan Jakovljević'' Kragujevac. Sződi, S.Z., Rozsnyay, Z., Rózsa, E., Turóczi, G. (2008): Susceptibility of sour cherry cultivars to isolates of Monilia laxa (Ehrenbergh) Saccardo et Voglino. International Journal of Horticultural Science, 14: 83-87. Sződi S.Z., Komjáti H., Turóczi G. (2012): Characterization of M. laxa and M. fructigena isolates from Hungary with MP-PCR. Horticulture Science, 39: 116- 122. Takamura, N., Ochiai, M. (1989): Control of brown rot of peaches by bitertanol. Annual Report of the Society of Plant Protection of North Japan, 40: 77-80. Literatura 160 Tamura, H., Mizutani, A. (1999): Mode of action of strobilurin fungicides. Journal of Pesticide Science, 24: 189-196. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Steker, G., Nei, M., Kumar, S. (2011): MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 28: 2731-2739. Tanović, B., Milijašević, S., Obradović, A., Todorović, B., Rekanović, E., Milikić, S. (2004): In vitro efekti etarskih ulja iz začinskih i lekovitih biljaka koji se prenose zemljištem. Pesticidi i Fitomedicina, 19: 233-240. Tanović, B., Rekanović, E., Potočnik, I., Todorović, I. (2005): Effectiveness of fungicides and biofungicides in the control of grey mould of raspberry in Serbia. Book of abstracts 9 th International Rubus and Ribes Symposium, Santiago, Chile, pp. 31. Tanović, B., Delibašić, G., Hrustić, J. (2009): In vitro effect of essential oils from some aromatic and medicinal plants on apple fruit pathogens. Book of Abstracts VI Congress of Plant Protection with Symposium about Biological Control of Invasive Species, Zlatibor, pp. 37. Tanović, B., Hrustić, J., Delibasic, G., (2010a): Toxicity of volatile phase of essential oils from aromatic and medicinal plants to apple fruit pathogens in vitro. Book of Abstracts of 28 th International Horticultural Congress, Lisboa, Portugal, pp. 63. Tanović, B., Hrustić, J., Ivanović, M., Delibašić, G. (2010b): Effectiveness of biofungicides in the control of grey mould in raspberry in Serbia. Proceedings 28 th International Horticultural Congress, Lisboa, Portugal, pp. 17-18. Thomidis, T., Michailides, T., Exadaktylou, E. (2009): Contribution of pathogens to peach fruit rot in northern Greece and their sensitivity to iprodione, carbendazim, thiophanate-methyl and tebuconazole fungicides. Journal of Phytopathology, 157: 194-200. Thomidis, T., Exadaktylou, E. (2010): Effect of boron on the development of brown rot (Monilinia laxa) on peaches. Crop Protection, 29: 572-576. Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J. (1994): CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680. Tomlin, C. (2009): The Pesticide Manual. British Crop Protection Council, Farnham. Trkulja, V. (1996): Vrste roda Monilia-Paraziti breskve i mogućnosti njihovog suzbijanja. Biljni lekar, 3: 531-539. Literatura 161 van Leeuwen, G.C.M., van Kesteren, H.A. (1998): Delineation of the three brown rot fungi of fruit crops (Monilinia spp.) on the basis of quantitative characteristics. Canadian Journal of Botany, 76: 2042-2050. van Leeuwen, G.C.M., Stein, A., Holb, I., Jeger, M.J. (2000): Yield loss in apple caused by Monilinia fructigena (Aderh. & Ruhl.) Honey, and spatio-temporaldynamics of disease development. European Journal of Plant Pathology, 106: 519-528. van Leeuwen, G.C.M., Baayen, R.P., Jeger, M.J. (2001): Pest risk assessment for countries of the European Union (as PRA area) on Monilinia fructicola. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 31: 481-487. van Leeuwen, G.C.M., Holb I.J., Jeger, M.J. (2002a): Factors affecting mummification and sporulation of pome fruit infected by Monilinia fructigena in Dutch orchards. Plant Pathology, 51: 787-793. van Leeuwen, G.C.M., Yen, R.P.B., Holb, I.J., Jeger, M. (2002b): Distinction of the Asiatic brown rot fungus Monilia polystroma sp. nov. from M. fructigena. Mycological Research, 106: 444-451. Vasiljević, Lj.(1955): Proučavanje nekih osobina Monilia spp. kod nas. Zaštita bilja, 32: 3-14. Vasić, M., Duduk, N., Ivanović, M.M., Obradović, A., Ivanović, M.S. (2012): First report of brown rot caused by Monilinia fructicola on stored apple in Serbia. Plant Disease, 96: 456. Vasić, M., Duduk, N., Ivanović, M.S. (2013): First report of brown rot caused by Monilia polystroma on apple in Serbia. Plant Disease, 97: 145. Veličković, M. (2002): Voćarstvo. Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu. Vico, I., Jurick, W.M. (2012): Postžetvena patologija biljaka i biljnih proizvoda. Univerzitet u Beogradu-Poljoprivredni fakultet. Vignutelli, A., Hilber-Bodmer, M., Hilber, U.W. (2002): Genetic analysis of resistance to the phenylpyrrole fludioxonil and the dicarboximide vinclozolin in Botryotinia fuckeliana (Botrytis cinerea). Mycological Research, 106: 329. Villani, S.M., Cox, K.D. (2011): Characterizing fenbuconazole and propiconazole sensitivity and prevalence of ‘Mona’ in isolates of Monilinia fructicola from New York. Plant Disease, 95: 828-834. Villarino, M., Melgarejo, P., Usall, J., Segarra, J., De Cal, A. (2010): Primary inoculum sources of Monilinia spp. in Spanish peach orchards and their relative importance in brown rot. Plant Disease, 94: 1048-1054. Villarino, M., Melgarejo, P., Usall, J., Segarra, J., Lamarca, N., De Cal, A. (2012): Secondary inoculum dynamics of Monilinia spp. and relationship to the Literatura 162 incidence of postharvest brown rot in peaches and the weather conditions during the growing season. Europian Journal of Plant Pathology, 133: 585-598. Vučinić, Z. (1993): Proučavanje ciklusa razvoja i rasprostranjenosti Monilinia spp. na koštičavim voćkama u Crnoj Gori. Poljoprivreda i šumarstvo, XXXIX 3-4: 5-18. Vučinić, Z. (1994): Monilioze voćaka. Zaštita bilja, 45: 5-17. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T. J. (eds). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego, California, USA, pp. 315-322. Wilson, E.E., Ogawa, J.M. (1979): Fungal, bacterial and certain non-parasitic diseases of fruit and nut crops in California. Californian Agricultural Science Publications, Berkeley, California, USA. Wilson, C.L., Soalr, J.M., El Ghaouth, A., Wisniewski, M.E. (1997): Rapid evaluation of plant extracts and essential oils for antifungal activity against Botrytis cinerea. Plant Disease, 81: 204-210. Wilson, C. (2011): Historical Perspective on Postharvest Biocontrol: past, present and future. International Workshop on Postharvest Biological Control: Challenges and Opportunities, Leesburg, VA, October 25-28. Wittig, H.P.P., Johnson, K.B., Psheidt, J.W. (1997): Effect of epifytic fungi on brown rot blossom blight and latent infections in sweet cherry. Plant Disease, 81: 383- 378. Wong, F.P., Wilcox, W.F. (2002): Sensitivity to azoxystrobin among isolates of Uncinula necator: Baseline distribution and relationship to myclobutanil sensitivity. Plant Disease, 86: 394-404. Xu, X.M., Robinson, J.D. (2000): Epidemiology of brown rot (Monilinia fructigena) on apple: infection of fruits by conidia. Plant Pathology, 49: 201-206. Xu, X.M., Bertone, C., Berrie, A. (2007): Effects of wounding, fruit age and wetness duration on the development of cherry brown rot in the UK. Plant Pathology, 56: 114-119. Yánez-Mendizábal, V., Zeriouh, H., Viñas, I., Torres, R., Usall, J., de Vicente, A., Pérez-García A., Teixidó, N. (2012): Biological control of peach brown rot (Monilinia spp.) by Bacillus subtilis CPA-8 is based on production of fengycin- like lipopeptides. European Journal of Plant Pathology, 132: 609-619. Yoshimura, M.A., Luo, Y., Ma, Z., Michailides, T.J. (2004): Sensitivity of Monilinia fructicola from stone fruit to thiophanate-methyl, iprodione, and tebuconazole. Plant Disease, 88: 373-378. Literatura 163 Ypema, H.L., Gold, R.E. (1999): Kresoxim-methyl-modification of a naturally occuring compound to produce a new fungicide. Plant Disease, 83: 4-19. Zambonelli, A., Zechini D’Aulerio, A., Bianchi, A., Albasini, A. (1996): Effects of essential oils on phytopathogenic fungi in vitro. Journal of Phythopathology, 144: 491-494. Zehr, E.I., Luszcz, L.A., Olien, W.C., Newall, W.C., Toler, J.E. (1999): Reduced sensitivity in Monilinia fructicola to propiconazole following prolonged exposure in peach orchards. Plant Disease, 83: 913-916. Ziogas, B.N., Baldwin, B.C., Young, J.E. (1997): Alternative respiration: A biochemical mechanism of resistance to azoxystrobin (ICIA 5504) in Septoria tritici. Pesticide Science, 50: 28-34. Zhang, D., Lopez-Reyes, J.G., Spadaro D., Garibaldi, A., Gullino, M.L. (2010): Efficacy of yeast antagonists used individually or in combination with hot water dipping for control of postharvest brown rot of peaches. Journal of Plant Diseases and Protection, 117: 226-232. Zhu, X.Q., Guo, L.Y. (2010): First report of brown rot on plum caused by Monilia polystroma in China. Plant Disease, 94: 478. Zhu, X.Q., Chen, X.Y., Guo, L.Y. (2011): Population structure of brown rot fungi on stone fruits in China. Plant Disease, 95: 1284-1291. BIOGRAFIJA Hrustić Jovana rođena je 12. februara 1986. godine u Beogradu. Osnovnu školu i srednju Medicinsku školu završila je u Beogradu. Poljoprivredni fakultet, Odsek za zaštitu bilja i prehrambenih proizvoda, Univerziteta u Beogradu završila je 2009. godine odbranom diplomskog rad pod naslovom: „In vitro efekat etarskih ulja na prouzrokovače truleži ploda jabuke”. Doktorske studije na istom fakultetu, na grupi Fitomedicina, upisala je 2009/10. godine. Od februara 2010. godine angažovana je u Institutu za pesticide i zaštitu životne sredine, Zemun, kao stipendista Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije, a od oktobra 2012. godine zaposlena je u istom Institutu, u Laboratoriji za primenjenu fitopatologiju u zvanju istraživač-pripravnik. Od februara 2010. godine bila je angažovana na realizaciji Projekata „Razvoj i unapređenje bioracionalnih metoda zaštite bilja od bolesti i štetočina”, TR20036, a od januara 2011. godine na Projektu III 46008 „Razvoj integrisanih sistema upravljanja štetnim organizmima u biljnoj proizvodnji sa ciljem prevazilaženja rezistentnosti i unapređenja kvaliteta i bezbednosti hrane“. Oba projekta finansiralo je Ministarstvo prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije. U periodu 2011-2013. godine učestvovala je u realizaciji projekta bilateralne naučno-tehnološke saradnje između Republike Srbije i Republike Belorusije pod nazivom „Ispitivanje naučne opravdanosti biološke zaštite jabuke od prouzrokovača truleži plodova tokom skladištenja“. Do sada je objavila i saopštila ukupno 41 naučni rad, od čega devet objavljenih u međunarodnim časopisima, četiri u nacionalnim časopisima, 28 saopštenih na međunarodnim i domaćim skupovima. Obavila je kraća studijska putovanja u Belorusiju u okviru realizacije bilateralnog Projekta (2011. i 2013. godine) i u BIH u okviru EU COST Training School (COST Action FP1002) (2013. godine). Govori, čita i piše engleski jezik. Bila je član izvršnog odbora X International Rubus and Ribes Symposium, Zlatibor, Serbia, 2011. godine. Član je Društva za zaštitu bilja Srbije.