UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET mr Maja V. Ignjatov DIVERZITET POPULACIJE Xanthomonas spp. PATOGENA PAPRIKE U SRBIJI Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE mr Maja V. Ignjatov DIVERSITY OF Xanthomonas spp. POPULATION - PEPPER PATHOGENS IN SERBIA Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Komisija za ocenu i odbranu: Mentor: dr Aleksa Obradović, redovni profesor Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet Članovi komisije: dr Jelica Balaž, redovni profesor Univerzitet u Novom Sadu - Poljoprivredni fakultet dr Mirjana Milošević, naučni savetnik Institut za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad dr Jelica Gvozdanović-Varga, viši naučni saradnik Institut za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad dr Milan Ivanović Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet Datum odbrane:____________________ Zahvalnica  Posebno se zahvaljujem svom mentoru profesoru dr Aleksi Obradoviću, koji je definisao plan i program istraživanja ove doktorske disertacije. Zahvaljujem se na velikom strpljenju, predusretljivosti, bezrezervnoj podršci i prenetom znanju tokom zajedničkog rada.  Veliko hvala profesorki dr Mirjani Milošević na savetima, podršci i svemu što me je naučila.  Zahvalnost dugujem profesorki dr Jelici Balaž na prenetom znanju i pravovremenim savetima tokom višegodišnje saradnje.  dr Jelici Gvozdanović - Varga hvala na konstruktivnim savetima i sugestijama.  Veliku zahvalnost dugujem dr Zorici Nikolić na prijateljskoj podršci i dragocenim sugestijama koje su značajno doprinele kvalitetu disertacije.  Zahvaljujem se dr Katarini Gašić, dr Milanu Ivanoviću i dipl. ing Milanu Ševiću na podršci i pomoći u eksperimentalnom radu.  Želim da izrazim svoju zahvalnost koleginici mr Dragani Milošević i dipl. ing Aranki Jevtić, kao i svim kolegama iz Laboratorije za ispitivanje semena, Instituta za ratarstvo i povrtarstvo.  Zahvaljujem se svom sinu Stefanu, porodici i prijateljima na razumevanju i podršci. Doktorska disertacija realizovana je u okviru projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja, Republike Srbije, TR31030, pod nazivom: «Stvaranje sorata i hibrida povrća za gajenje na otvorenom polju i zaštićenom prostoru». DIVERZITET POPULACIJE Xanthomonas spp. PATOGENA PAPRIKE U SRBIJI Rezime. Tokom 2008, 2009 i 2010. godine prikupljeni su uzorci obolelog lišća paprike sa simptomima bakteriozne pegavosti iz različitih lokaliteta Republike Srbije. Izolacijom iz zaraženih listova dobijeno je 116 sojeva bakterija. Proučavanja patogenih, biohemijsko-fizioloških odlika ukazuju da proučavani sojevi pripadaju vrsti Xanthomonas euvesicatoria. Primenom dva serološka testa (DAS - ELISA i test aglutinacije) potvrđena je antigena uniformnost proučavanih sojeva, kao i serološka sličnost sa bakterijom X. c. pv. vesicatoria. Diferencijacija Xanthomonas spp. prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike izvršena je primenom dve molekularne metode. Prvi metod zasnivao se na restrikcionoj analizi - RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) fragmenta hrp gena (HrpB regiona) nakon digestije (sečenja) dobijenih proizvoda restrikcionim enzimima (CfoI, TaqI i HaeIII). Poređenjem restrikcionih profila proučavanih sojeva sa kontrolnim sojevima, potvrđena je sličnost sa vrstom X. euvesicatoria. Drugi molekularni metod je lančana reakcija polimeraze primenom specifičnih prajmera koji amplifikuju proizvode različite veličine specifične za: X. euvesicatoria – 173 bp; X. vesicatoria – 138 bp; X. perforans – 197 bp i X. gardneri – 154 bp. Kod svih proučavanih sojeva, uključujući i kontrolni soj X. euvesicatoria KFB (189) detektovani su fragmenti DNK veličine 173 bp, koji odgovaraju vrsti X. euvesicatoria. Utvrđeno je da je prag detekcije ove metode 0,4 x 103 CFU/ml. Proučeno je dejstvo bakar-sulfata (CuSO4), antibiotika streptomicina i kasugamicina, pri različitim koncentracijama, na razvoj bakterijskih ćelija u in vitro uslovima. U podlogu su dodati filterom sterilisani rastvori bakar-sulfata do konačne koncentracije od 100 i 200 ppm tj. aktivne komponente navedenih antibiotika do konačne koncentracije od 50, 100 i 200 ppm. Sojevi rezistentni na streptomicin nisu detektovani ovim istraživanjima. Rezistentnost prema 50 ppm kasugamicina utvrđena je kod 6 sojeva, a 19 sojeva je bilo rezistentno na 200 ppm bakar-sulfata. Dobijeni rezultati ukazuju na opasnost od razvoja rezistentnosti bakterija prema ovim jedinjenjima. Zastupljenost pojedinih fizioloških rasa među proučavanim sojevima određena je na osnovu reakcije biljaka paprike sorte Early Calwonder (ECW), njenih izogenih linija ECW- 10 (Bs1), ECW-20 (Bs2), ECW-30 (Bs3) i biljaka paprike Capsicum pubescens PI235047 (Bs4). Ustanovljeno je da proučavani sojevi predstavljaju heterogenu populaciju u kojoj su zastupljene četiri fiziološke rase bakterije X. euvesicatoria (P1, P3, P7, P8). Proučena je osetljivost 11 odabranih genotipova paprike prema rasi P8 bakterije X. euvesicatoria: HS-2, Amfora, Plamena, Anita, Novosađanka, Palanačka babura, Palanačko čudo, Slonovo uvo, Brillant F1, Bihar F1 i Boni. Samo je hibrid Bihar F1 ispoljio određeni stepen otpornosti prema bakteriji, dok su svi ostali proučavani genotipovi pokazali visok stepen osetljivosti. U ovom radu izolovani su bakteriofagi specifični prema vrsti Xanthomonas euvesicatoria, prouzrokovaču bakteriozne pegavosti paprike. Proučavanjem kruga domaćina, utvrđeno je da su izolati usko specifični prema vrsti X. euvesicatoria i da ne ispoljavaju aktivnost prema ostalim vrstama Xanthomonas spp. patogena paprike i paradajza. Ključne reči: paprika, Xanthomonas euvesicatoria, bakteriozna pegavost, karakterizacija, molekularna identifikacija, fiziološke rase, osetljivost genotipova, antibiotici, bakteriofagi Naučna oblast: Biotehničke nauke Uža naučna oblast: Fitopatologija UDK: 632.35:635.649(497.11)(043.3) DIVERSITY OF Xanthomonas spp. POPULATION - PEPPER PATHOGENS IN SERBIA Abstract. During 2008, 2009 and 2010 samples of diseased pepper leaves with bacterial spot symptoms were collected from different localities in Republic of Serbia. Total of 116 strains of bacteria were obtained by isolation from infected leaves. Studies of pathogenic, biochemical and physiological traits showed that tested strains belong to species Xanthomonas euvesicatoria. Two serological tests (DAS - ELISA and agglutination test) confirmed antigenic identity of tested bacterial isolates and serological similarity to bacteria X. c. pv. vesicatoria. Differentiation of Xantomonas spp. causal agent of bacterial spot of pepper was performed using two molecular methods. The first method was based on restriction analysis – RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) of the hrp gene fragment (HrpB region) after digestion of obtained products by restriction enzymes (CfoI, TaqI and HaeIII). Comparison of restriction profiles of studied strains to control strains confirmed the similarity with the X. euvesicatoria. The other molecular method is polymerase chain reaction of specific primers which allow amplification of different size products sprecific for: X. euvesicatoria – 173 bp; X. vesicatoria – 138 bp; X. perforans – 197 bp and X. gardneri – 154 bp. As a result, DNA fragments of 173 bp which belong to species X. euvesicatoria were detected at all studied strains, including test strain Xe KFB (189). Threshold of detection was confirmed to be 0.4x103 CFU/ml. The effects of copper-sulphate (CuSO4), antibiotics streptomycin and kasugamycin on the development of bacterial cells were studied. The sensitivity of strains to bactericides was studied in vitro by culturing bacteria on sucrose pepton agar (SPA) plates, amended with filter-sterilized aqueous solution of streptomycin and kasugamycin (50, 100, 200 ppm) or copper-sulphate (100, 200 ppm). Streptomycin resistant strains were not detected, but 6 strains were resistant to kasugamycin (50 ppm) and 19 strains to copper-sulphate (200 ppm), indicating bacterial resistance development. The pathogen races were determined according to the reaction of differential varieties of Early Calwonder (ECW), their isogenic lines (ECW-10R, ECW-20R, ECW- 30R) and Capsicum pubescens. The reaction of pepper differential varieties indicated that these strains belonged to pepper races of X. euvesicatoria (P1, P3, P7, P8). Genotype susceptibility to X. euvesicatoria (RKFB 263) was examined on 11 pepper genotypes: HS-2, Amfora, Plamena, Anita, Novosađanka, Palanačka babura, Palanačko čudo, Slonovo uvo, Brillant F1, Bihar F1 and Boni. Genotype Bihar F1 showed the highest degree of resistance to the pathogen, while all the other genotypes showed various degree of sensitivity compared to the control varieties. Bacteriophages specific to Xanthomonas euvesicatoria, causal agent of pepper bacterial spot, were isolated in this study. All phages were specific to X. euvesicatoria and did not show activity towards other Xanthomonas spp., pepper and tomato pathogens. Key words: pepper, Xanthomonas euvesicatoria, bacterial spot, characterization, molecular identification, races, susceptibility of genotype, antibiotics, bacteriophages Scientific field: Biotechnical Science Scientific discipline: Phytopathology UDC: 632.35:635.649(497.11)(043.3) SADRŽAJ 1.UVOD ........................................................................................................................ 1 1.1. Poreklo i botanička pripadnost paprike ................................................................ 1 1.2. Proizvodnja i upotreba paprike ............................................................................ 2 1.3. Rasprostranjenost i ekonomski značaj bakterija Xanthomonas spp. prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike ................................................... 4 1.4. Spektar domaćina ................................................................................................. 8 1.5. Simptomi bolesti .................................................................................................. 9 2. PREGLED LITERATURE..................................................................................... 12 2.1. Taksonomska pozicija bakterija Xanthomonas spp. prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike ................................................................................................ 12 2.2. Epidemiološko-ekološke karakteristike patogena ................................................ 14 2.3. Patogene odlike .................................................................................................... 16 2.4. Bakteriološke odlike ............................................................................................ 19 2.5. Serološke odlike bakterija Xanthomonas spp. ..................................................... 22 2.6. Molekularne odlike bakterija Xanthomonas spp. ................................................. 23 2.7. Fiziološke rase patogena ...................................................................................... 24 2.8. Primena antibiotika i bakarnih preparata.............................................................. 27 2.9. Biološka zaštita - bakteriofagi .............................................................................. 30 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ................................................................................... 33 4. MATERIJAL I METODE ..................................................................................... 34 4.1. Izolacija patogena i kontrolni sojevi korišćeni u radu ......................................... 34 4.2. Patogene odlike proučavanih sojeva .................................................................... 36 4.2.1. Inokulacija biljaka paprike ....................................................................... 36 4.2.2. Hipersenzitivna reakcija duvana .............................................................. 36 4.3. Morfološke odlike proučavanih sojeva ................................................................ 37 4.3.1. Razlikovanje bakterija po Gramu pomoću KOH testa ............................ 37 4.3.2. Posmatranje morfologije transmisionim elektronskim mkroskopom ...... 37 4.4. Odgajivačke odlike proučavanih sojeva .............................................................. 38 4.4.1. Izgled kolonija na hranljivim podlogama ................................................ 38 4.4.2. Uticaj temperature na porast bakterija ..................................................... 38 4.4.3. Tolerantnost prema NaCl ......................................................................... 39 4.4.4. Tolerantnost prema trifenil-tetrazolium hloridu ...................................... 39 4.5. Biohemijsko-fiziološke odlike sojeva .................................................................. 40 4.5.1. Aktivnost oksidaze ................................................................................... 40 4.5.2. Stvaranje katalaze .................................................................................... 40 4.5.3. Redukcija nitrata ...................................................................................... 41 4.5.4. Hidroliza želatina ..................................................................................... 41 4.5.5. Hidroliza eskulina .................................................................................... 41 4.5.6. Hidroliza skroba ....................................................................................... 42 4.5.7. Pektolitička aktivnost na kriškama krompira ........................................... 42 4.5.8. Oksidativno-fermentativni metabolizam glukoze .......................... 42 4.5.9. Stvaranje kiseline iz ugljenih hidrata ....................................................... 43 4.5.10. Korišćenje cis-akonitinske kiseline........................................................... 43 4.6. Serološke odlike proučavanih sojeva ................................................................... 44 4.6.1. DAS - ELISA test .................................................................................... 44 4.6.2. Metod aglutinacije ................................................................................... 46 4.7. Molekularne metode proučavanja ........................................................................ 47 4.7.1. Restrikciona analiza - RFLP .................................................................... 47 4.7.1.1. Umnožavanje hrp gena................................................................ 47 4.7.1.2. Digestija restrikcionim enzimima .............................................. 48 4.7.2. Diferencijacija bakterija Xanthomonas spp. primenom specifičnih prajmera ................................................................................................... 49 4.7.2.1. Utvrđivanje praga osetljivosti PCR-a ......................................... 51 4.8. Utvrđivanje fizioloških rasa ................................................................................. 52 4.9. Proučavanje osetljivosti genotipova paprike prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti .............................................................................................................. 54 4.10. Proučavanje osetljivosti proučavanih sojeva prema baktericidima ..................... 56 4.11. Bakteriofagi .......................................................................................................... 57 4.11.1. Izolacija bakteriofaga ............................................................................... 57 4.11.2. Specifičnost bakteriofaga prema Xanthomonas spp. ............................... 57 5. REZULTATI ........................................................................................................... 60 5.1. Rasprostranjenost patogena u Srbiji ..................................................................... 60 5.2. Patogene odlike proučavanih sojeva .................................................................... 64 5.2.1. Inokulacija biljaka paprike ....................................................................... 64 5.2.2. Hipersenzitivna reakcija duvana .............................................................. 65 5.3. Morfološke odlike proučavanih sojeva ................................................................ 66 5.3.1. Razlikovanje bakterija po Gramu pomoću KOH testa ............................. 66 5.3.2. Posmatranje morfologije transmisionim elektronskim mkroskopom ...... 66 5.4. Odgajivačke odlike proučavanih sojeva .............................................................. 67 5.4.1. Izgled kolonija na hranljivim podlogama ................................................ 67 5.4.2. Uticaj temperature na porast bakterija ..................................................... 69 5.4.3. Tolerantnost prema NaCl ......................................................................... 69 5.4.4. Tolerantnost prema trifenil-tetrazolium hloridu ...................................... 70 5.5. Biohemijsko-fiziološke odlike sojeva .................................................................. 71 5.6. Serološke odlike proučavanih sojeva ................................................................... 72 5.6.1. DAS - ELISA test .................................................................................... 72 5.6.2. Metod aglutinacije .................................................................................... 73 5.7. Molekularne metode proučavanja ........................................................................ 74 5.7.1. Restrikciona analiza - RFLP .................................................................... 74 5.7.1.1. Umnožavanje hrp gena ............................................................... 74 5.7.1.2. Digestija restrikcionim enzimima ............................................... 75 5.7.2. Diferencijacija bakterija Xanthomonas spp. primenom specifičnih prajmera ................................................................................................... 78 5.7.2.1. Utvrđivanje praga osetljivosti PCR-a ......................................... 80 5.8. Utvrđivanje fizioloških rasa ................................................................................. 82 5.9. Proučavanje osetljivosti genotipova paprike prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti .............................................................................................................. 85 5.10. Proučavanje osetljivosti proučavanih sojeva prema baktericidima ..................... 88 5.11. Bakteriofagi .......................................................................................................... 90 5.11.1. Izolacija bakteriofaga ............................................................................... 90 5.11.2. Specifičnost bakteriofaga prema Xanthomonas spp. ............................... 91 6. DISKUSIJA ............................................................................................................. 93 7. ZAKLJUČAK .......................................................................................................... 107 8. LITERATURA ........................................................................................................ 109 BIOGRAFIJA .............................................................................................................. 132 IZJAVE ........................................................................................................................ 133 Doktorska disertacija Uvod 1 1. UVOD 1.1 POREKLO I BOTANIČKA PRIPADNOST PAPRIKE Paprika (Capsicum annuum L.) je jedna od najvažnijih gajenih povrtarskih biljaka u svetu i kod nas. Potiče iz Centralne i Južne Amerike, odakle su je Španci, početkom XVI veka, preneli u Evropu. Bile su to sorte ljutih i sitnih plodova, danas poznate kao „čili“ i služile su kao začin. Ime paprika potiče od grčke reči "peperi" i latinske reči "piper" što znači crni biber. Imala je isti naziv kao i biber, koji se i do sada zadržao u engleskom jeziku: pepper (sweet - slatka, hot - ljuta). U Australiji se koristi i latinski naziv Capsicum, kao i "paprika" i "pepper". U naše krajeve je dospela iz Turske, te je naš, turski, mađarski i nemački naziv ove biljke isti (Gvozdenović, 2010). Paprika pripada familiji Solanaceae (pomoćnica), rodu Capsicum i vrsti annuum. Sva proučavanja vezana za klasifikaciju zasnivaju se na morfološkim i biološkim karakteristikama najrazličitijih formi paprike sakupljenih u rod Capsicum koji ima 25 vrsta, a najznačajnije su sledećih pet (Bosland i sar., 1994): - Capsicum annuum L. – najrasprostranjenija jednogodišnja vrsta paprike. - Capsicum frutescens L. – višegodišnja paprika, visine stabla 30 - 60 cm. Cvetovi imaju 5 - 6 kruničnih listića krem do belozelene boje. Plodovi su sitni. Najčešće se nalazi kao samonikla (divlja forma) u područjima Brazila, Venecuele, Meksika, Kube, Kostarike i Perua. - Capsicum pubescens Ruit at Pavon – višegodišnja biljka, razgranatog stabla. Ima plave cvetove. Seme je sitno i crno. Domovina ove paprike je Peru, Kolumbija i Gvatemala. - Capsicum bacatum L. – višegodišnja vrsta iz Južne Amerike. Odlikuje se razgranatom biljkom, cvetovi su žuti, beli ili boje kafe. - Capsicum chinense L. – vodi poreklo iz Amazona, sa Kariba, Centralne i Južne Amerike. Doktorska disertacija Uvod 2 1.2. PROIZVODNJA I UPOTREBA PAPRIKE U plodu paprike se nalazi više stotina jedinjenja u promenljivim količinama. Svakako da su od posebnog značaja ona jedinjenja koja ovom povrću daju posebne karakteristike i koje daju paprici visoku hranljivu i biološku vrednost (Somoš, 1984). To su ukus i miris, boja, sadržaj ulja, ugljenih hidrata, belančevina, celuloze, mineralnih materija, vitamina i organskih kiselina. Danas se paprika najviše gaji u Aziji, Evropi i Americi. Uglavnom se gaji u zoni umerenog pojasa, nešto u tropskim predelima, a u Evropi je to proizvod južnih krajeva. Ne retko se gaji i u zaštićenom prostoru na severu Evrope (Gvozdenović i sar., 2005). Najveći proizvođači paprike u svetu su Kina i Indonezija, ali najveće prosečne prinose imaju Španija (26,6 t/ha), Italija (23,8 t/ha), Turska (24,5 t/ha). U Srbiji se po zastupljenosti povrtarskih biljaka paprika nalazi na drugom mestu, iza paradajza (Gvozdenović i sar., 2008). Prosečna površina pod povrćem u Srbiji iznosi 247.000 ha, a oko 20.000 ha je pod usevima paprike (Republički zavod za statisiku, Beograd). Od ukupnog broja hektara pod paprikom, 75,21% se nalazi u Centralnoj i Južnoj Srbiji, sa značajno nižim prosečnim prinosom paprike u odnosu na prosečan prinos u Vojvodini (Gvozdenović i Cvejić, 2009; Vlahović i sar., 2010). U periodu od 2000 do 2009. godine prosečan prinos paprike iznosio je oko 150.000 tona na godišnjem nivou, a 2006. godine proizvedeno je 177.300 tona paprike, što je rekordna proizvodnja u poslednjih deset godina (Republički zavod za statisiku, Beograd). Srbija je 2008. godine na plenarnoj sednici Organizacije za ekonomski razvoj i saradnju (OECD) primljena u članstvo Šeme za sveže voće i povrće OECD-a. Odluku o učlanjenju donele su 23 zemlje članice te međunarodne organizacije, posle boravka Evaluacionog tima OECD – šeme za sveže voće i povrće u Srbiji (Vlahović i Puškarić, 2008). Pored obaveza o uvođenju OECD standarda, koji su gotovo jednaki sa EU standardima, Srbija je dobila pravo izdavanja međunarodnih certifikata koji joj daju pravo ravnopravnog učesnika u međunarodnoj trgovini. Ulaskom u OECD šemu za sveže voće i povrće zaokružen je ciklus učlanjenja zemlje u sve četiri OECD šeme koje propisuju standarde za trgovinu semenom, šumskim materijalom, svežim voćem i Doktorska disertacija Uvod 3 povrćem, kao i uslove koje moraju da ispunjavaju mašine kojima se obavlja poljoprivredna proizvodnja. Obzirom na to da Srbija poseduje povoljne agroekološke uslove, postoje realne mogućnosti za ostvarivanje znatno viših prinosa i veće proizvodnje. Za unapređenje povrtarske proizvodnje Marković (2004) pre svega predlaže povećanje površina pod povrćem, posebno kao drugog useva. Pored toga ističe važnost povećanja površina u zaštićenom prostoru, primenu odgovarajućih agrotehničkih mera, izbor kvalitetnog sertifikovanog semena za setvu i pravovremenu zaštitu od bolesti i štetočina. Angažovanje istraživača i stručnjaka u proizvodnji, uz pomoć lokalnih medija za emitovanje emisija sa savetima, takođe bi imalo uticaj na unapređenje povrtarske proizvodnje. U Srbiji je stvoren veliki broj domaćih sorti koje su zastupljene u prozvodnji, ali se mogu sresti i u inostranstvu. Najznačajnije sorte stvorene su u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad (Novosadska babura, Amfora, Atina, Anita, Novosađanka, Plamena i dr.) i Institutu za povrtarstvo iz Smederevske Palanke (Morava, Duga bela, Župska rana, Palanačka babura, Palanačka kapija, Palanačko čudo i dr.). Kompanija „Vitamin” – Horgoš se samostalno bavi razvojem sorti horgoške paprike poslednjih pedeset godina. Do sada su razvili prvu priznatu domaću sortu slatke začinske paprike, Horgoška slatka – 1 (HS - 1), zatim HS - 2, HS - 6, kao i sorte ljute začinske paprike Peščani grom i Tisa. Proizvodnja sertifikovanog semena paprike predstavlja značajnu privrednu aktivnost u našoj zemlji, između ostalog i kao izvozna roba koja obezbeđuje devizni priliv (Gvozdenović i Cvejić, 2009). U proizvodnji konzumne paprike cilj je što veći prinos tehnološki zrelih plodova, dok je u proizvodnji semena cilj da se što ranije zametne maksimalni broj plodova koji mogu dostići punu fiziološku zrelost. Ova činjenica diktira razlike između semenske i proizvodnje konzumne paprike, a to uslovljava i manji broj berbi u proizvodnji semenske paprike. Doktorska disertacija Uvod 4 1.3. RASPROSTRANJENOST I EKONOMSKI ZNAČAJ BAKTERIJA Xanthomonas spp. PROUZROKOVAČA BAKTERIOZNE PEGAVOSTI PAPRIKE U intenzivnoj povrtarskoj proizvodnji, bakterioze spadaju među ekonomski najštetnije bolesti. Veoma se brzo umnožavaju u povoljnim uslovima i prenose u nova područja putem semena ili sadnog materijala, što je od posebnog značaja za karantinske patogene (Balaž, 1994; Obradović i sar., 1997). Papriku parazitira veliki broj patogenih gljiva, bakterija i virusa. Fitopatogene bakterije, prouzrokovači bakterioza paprike, usled česte pojave i jakog intenziteta mogu prouzrokovati znatne gubitke (Obradović i sar., 1994, 1995; Arsenijević, 1997). Pouzrokovač bakteriozne pegavosti paprike Xanthomonas euvesicatoria (Jones i sar., 2006), poznat pod starim nazivom X. axonopodis pv. vesicatoria, prenosi se semenom i nalazi se na A2 karantinskoj listi štetnih organizama EPPO-a i Pravilniku Republike Srbije (Pravilnik o listama štetnih organizama i listama bilja, biljnih proizvoda i propisanih objekata; «Slika glasnik Republike Srbije» br. 7/10). Spada u red ekonomski najznačajnijih bolesti paprike i paradajza u svetu, posebno u uslovima tropske i suptropske klime (Aysan i Sahin, 2003; Jones i sar., 2004; Obradović i sar., 2008a; Tawfik i sar., 2009). Kao posledica korišćenja zaraženog semena za setvu, u istočnom mediteranskom delu Turske 2002. godine, zabeležen je jak intenzitet bolesti čiji se indeks oboljenja kretao od 50-95% (Aysan i Sahin, 2003). Utvrđeno je prisustvo patogena i na semenu nekih korovskih vrsta (Bogatzevska i Deneva, 1996). Do ranih 1990-tih, smatralo se da je prouzrokovač bakteriozne pegavosti paprike vrsta poznata kao Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Međutim, na osnovu rezultata proučavanja bakterioloških i molekularnih karakteristika patogena, ustanovljena je heterogenost među sojevima i uspostavljena je podela na 4 taksonomski različite grupe A, B, C i D koje čine tzv. Xanthomonas kompleks (Jones i sar., 2004). Ove četiri grupe bile su dovoljno različite da steknu status vrste: X. euvesicatoria = X. campestris (axonopodis) pv. vesicatoria (grupa A); X. vesicatoria = X. vesicatoria (grupa B); X. perforans = grupa C i X. gardneri = grupa D. Sojevi poreklom iz paprike, pripadnici grupe A (X. euvesicatoria), najšire su rasprostranjeni i ekonomski najznačajniji. Doktorska disertacija Uvod 5 X. vesicatoria i X. gardneri mogu imati značajan uticaj u regionima u kojima se nalaze. Sojevi bakterije Xanthomonas perforans do sada su izolovani samo iz paradajza. Značaj poznavanja populacije patogena u našoj zemlji, kao i usaglašavanje dobijenih rezultata sa najnovijom nomenklaturom, uslovljen je značajem paprike kao gajene biljne vrste. Bakteriozna pegavost je zvanično potvrđena u većini evropskih zemalja. U nekim od ovih zemalja bolest se nije proširila na celu teritoriju, a naročito tamo gde se dosledno sprovode sve postojeće karantinske mere. Osim većine evropskih zemalja, po podacima EPPO-a bakteriozna pegavost je zabeležena i u drugim delovima sveta, kao i na južnoj hemisferi (Slika 1) (Tabela 1). U agroekološkim uslovima Srbije prouzrokovač bakteriozne pegavosti paprike (X. euvesicatoria) redovno se sreće, a intenzitet zaraze i ekonomske štete koje prouzrokuje ova bakterija mogu biti značajne i dosta zavise od vremenskih uslova (Arsenijević, 1997; Balogh i sar., 2003; Mijatović i sar., 2007; Obradović i sar., 2009b). U našoj zemlji oboljenje se permanentno širi od sredine 80-tih godina i smatra se jednom od ekonomski najštetnijih bolesti paprike (Balaž, 1988). Usled pojave ovog oboljenja, 1987. godine, zabeležene su značajne štete u regionu Srema (okolina Rume) i nekim lokalitetima južne Bačke (okolina Srbobrana, Novog Sada i Žablja) (Balaž, 1994). Bakterija parazitira sve nadzemne delove biljaka: klijance, list, cvet, plod. Bakterija u biljku prodire kroz povrede (Calzolari, 1986) i preko stominih otvora (Leandro i Volin, 1987). Velike štete u polju i potpuno propadanje useva paprike zabeleženi su u nekim zemljama pre svega u navodnjavanim usevima tokom toplijeg dela sezone (Bashan i sar., 1985). Pohronezny i Volin (1983) beleže značajne štete koje nastaju kao posledica rane infekcije lista, cveta i ploda, dok su Ward i O´ Garro (1992) ukazali na jaku pojavu bakteriozne pegavosti na Barbadosu. Usled jakog inteziteta oboljenja izneti su podaci o velikim gubicima u SAD, Indiji, Argentini, Sudanu, Nigeriji, Egiptu i Australiji (CABI, 2004). U proizvodnom području Floride (SAD) ova bakterija prouzrokuje gubitke i do 1.5 miliona dolara (Jones i sar., 1986). U Turskoj, poslednjih godina, primećena je učestala pojava bakteriozne pegavosti paprike u proizvodnji u zaštićenom prostoru i to posebno u mediteranskom regionu (Mirik i sar., 2005). Zabeleženi su znatni gubici prinosa paradajza i paprike u Turskoj, nastali kao posledica opadanja lišća i simptoma na Doktorska disertacija Uvod 6 plodovima (Basim i sar. 2004). Tokom 2006. i 2007. godine, u Rusiji je zabeležena jača pojava bakterizne pegavosti, čiji su prouzrokovači X. gardneri i X. vesicatoria, dok X. euvesicatoria i X. perforans nisu detektovani (Ignatov i sar., 2009). Štete od prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike zabeležene su i u Sloveniji (Ravnikar i sar., 2001), Makedoniji (Mitrev i Kovačević, 2006) i dr. Kao prouzrokovači bakterioza paprike i paradajza u literaturi se navode i: Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Smith) Davis i sar. - prouzrokovač bakterioznog raka i uvelosti; Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi i sar. - prouzrokovač bakterioznog uvenuća; Pseudomonas syringae pv. tomato (Okabe) Young, Dye & Wilkie - prouzrokovač crne pegavosti i krastavosti plodova; Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall - prouzrokovač pegavosti i uvelosti (Arsenijević, 1997; CABI, 2004). Pored bakterioza, neke od ekonomski najznačajnijih gljivičnih bolesti paprike kod nas su: plamenjača - čiji je prouzrokovač Phytophthora capsici; pepelnica - koju prouzrokuje gljiva Leveillula taurica; zeleno uvenuće - koje prouzrokuje gljiva Verticillium albo-atrum; crna pegavost - koju prouzrokuje Alternaria spp.; siva plesan - Botrytis cinerea (Mijatović i sar., 2007). U proizvodnji paprike problem predstavljaju i široko rаsprostrаnjeni virusi, kаo što su virus mozаikа krаstаvcа (CMV), virus mozаikа duvаnа (TMV), virus crtičаstog mozаikа krompirа (PVY) i virus mozаikа lucerke (AMV) (Krstić i sar., 2008). Doktorska disertacija Uvod 7 Tabela 1. Zemlje u kojima je zabeležena bakteriozna pegavost (EPPO/OEPP, 2006) Evropa Azija Afrika Severna, Centralna i Južna Amerika Okeanija Austrija Belorusija Bugarska Češka Francuska Grčka Italija Mađarska Poljska Rumunija Rusija Slovačka Slovenija Španija Švajcarska Turska DNR Koreja Pakistan Filipini Indija Izrael Japan Kina Rusija Tajland Tajvan Egipat Etiopija Južna Afrika Kenija Malavija Maroko Mozambik Nigerija Sejšeli Senegal Sudan Togo Tunis Zambija Zimbabve Američka Devičanska ostrva Argentina Barbados Bermude Brazil Čile El Salvador Gvadalupe Gvatemala Honduras Jamajka Kanada Kolumbija Kostarika Kuba Martinik Meksiko Nevis Nikaragva Paragvaj Portoriko S.Vinsent SAD Surinam Sveti Kits Trinidad i Tobago Urugvaj Venecuela Australija Fidži Mikronezija Novi Zeland Palau Tonga Slika 1. Distributivna mapa rasprostranjenosti (EPPO/OEPP, 2006) Legenda:  Prisutna na teritoriji cele države  Prisutna lokalno u nekim regionima Doktorska disertacija Uvod 8 1.4. SPEKTAR DOMAĆINA Obzirom na značaj paprike kao rentabilne i profitabilne gajene biljne vrste (Đinović, 2005; Gvozdenović i Cvejić, 2009), veoma je važno očuvati usev zdravim (Balaž, 1994; Obradović i sar., 2000). Prouzrokovač bakteriozne pegavosti prenosi se semenom, tako da promet semena preko državne granice takođe predstavlja potencijalnu opasnost od unošenja i širenja novih sojeva i rasa (Pohronezny i Volin, 1983; Pohronezny i sar., 1992; Obradović i sar., 2000a). Pored glavnih domaćina, paprike i paradajza utvrđene su i prirodne infekcije na drugim vrstama rodova Lycopersicon spp. i Capsicum spp. kao što su: Datura stramonium, Hyoscyamus niger, Lycium vulgare, Nicotiana rustica, Nicandra physalodes, Physalis minima i dr. (Peterson, 1963; Laub i Stall, 1967; Bradbury, 1984). Jones i sar. (1986) utvrdili su šest korovskih vrsta domaćina ovog patogena, od kojih su dve iz familije Solanaceae: Solanum americanum i Physalis pubescens. Populacija patogena ustanovljena je i na: Ambrosia artemisifolia L., Eclipta alba L., Trifolium repens L. i Eupatorium capilifolium Watl., dok na korovskim vrstama udaljenim od mesta proizvodnje paradajza nije utvrđeno prisustvo patogena. U Bugarskoj je zabeleženo održavanje ovog patogena na korovskoj flori: Solanum nigrum, Solanum dulcamara, Physalis pubescens, Amaranthus retroflexus, Portulaca oleraceae (Bogatzevska i sar., 1992; Bogatzevska i Deneva, 1996). Svi razvojni stadijumi biljaka paprike su podložni napadu. U zaštićenom prostoru uslovi gajenja biljaka doprinose širenju i jačoj pojavi oboljenja (Obradović, 2009a). Pojava bakterioza uglavnom se uočava u objektima sa lošim higijensko-tehničkim merama, bez mogućnosti regulacije mikroklime (Arsenijević i Balaž, 1978). Osim štete koja nastaje za vreme proizvodnje u zaštićenom prostoru, bakterioze se rasadom mogu proširiti na veće površine na otvorenom polju i tako uvećati gubitke u proizvodnji (Obradović i sar. 1999). Usled velike infektivnosti i ograničenih mogućnosti suzbijanja, kontrola fitopatogenih bakterija na usevima u zaštićenom prostoru predstavlja teško rešiv problem (Obradović i sar., 2000b). Stoga je poznavanje populacije patogena Xanthomonas kompleksa, prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike od presudnog značaja za izbor mera suzbijanja (Obradović, 2009). Doktorska disertacija Uvod 9 1.5. SIMPTOMI BOLESTI Simptomi na listu - na listovima mladih biljka u početku se pojavljuju vlažne pege, sa masnim odsjajem, nepravilnog oblika (Slika 2). Vremenom tkivo u sredini ovih pega postaje mrko. Pege se povećavaju, spajaju, a nekroza zahvata veći deo liske (Slika 3). Nekrotične zone se lako lome i ispadaju, a obolelo lišće se deformiše, postaje kožasto i hlorotično, suši se i opada. Pri povoljnim uslovima za razvoj bolesti u polju, pegavost i hloroza se šire, zahvatajući mlađe lišće, a jače oboleli donji listovi žute i opadaju (Slika 4). Masovno opadanje lišća može u potpunosti ugroziti usev (Obradović i sar., 2001). Slika 2. X. euvesicatoria. Početni simptomi bakteriozne pegavosti lista paprike (prirodna infekcija) Doktorska disertacija Uvod 10 Slika 3. X. euvesicatoria. Simptomi bakteriozne pegavosti na starijem lišću (prirodna infekcija) Slika 4. X. euvesicatoria. Simptomi bakteriozne pegavosti paprike u polju (prirodna infekcija) Doktorska disertacija Uvod 11 Simptomi na plodu - najveće štete nastaju na plodovima, počev od zametanja pa sve do berbe. Na zaraženim plodovima u početku se uočavaju sitne, zelenkastomrke pege koje kasnije nekrotiraju i pucaju usled čega plod dobija krastav izgled (Slika 5). Otuda i potiče naziv za ovu bakteriju "vesicatorius" što na latinskom znači krasta, mehur ili plik. Oboleli plodovi gube tržišnu vrednost umanjujući ekonomski efekat proizvodnje (Obradović i sar., 2000a). Slika 5. X. euvesicatoria. Simptomi krastavosti plodova paprike (prirodna infekcija) Doktorska disertacija Pregled literature 12 2. PREGLED LITERATURE 2.1. TAKSONOMSKA POZICIJA BAKTERIJA Xanthomonas spp. PROUZROKOVAČA BAKTERIOZNE PEGAVOSTI PAPRIKE Skoro pola veka se smatralo da je prouzrokovač bakteriozne pegavosti paprike homogena vrsta poznata pod nazivom Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Doidge) Dye 1978. Razlike koje su se ispoljavale među sojevima dovele su do promena u sistematici. Istraživanja na bazi patogenih, biohemijskih i seroloških odlika potvrdila su da populacija bakterije X. c. pv. vesicatoria nije homogena (Bouzar i sar., 1994; Buonaurio i sar., 1994; Sahin i Miller, 1996; O´Garro, 1998; O´Garro i sar., 1999). Bakterija je prvi put izolovana u Južnoj Africi, davne 1914. godine. Neujednačenost u pogledu nekih biohemijskih i patogenih karakteristika bakterije X. c. pv. vesicatoria među prvima su uočili Burkholder i Li (1941), Dye i sar. (1964), Cook i Stall (1969), Cook (1973), Šutić (1957). Ustanovljeno je da između biljaka paradajza i paprike gajenih u neposrednoj blizini u polju ne dolazi do unakrsne zaraze, a takođe razlike su ustanovljene i u mnogim biohemijskim odlikama sojeva poreklom sa paprike i paradajza (Cook i Stall, 1982). Po Dowson-u (1939) bakterije roda Xanthomonas svrstane su u familiju Xanthomonadaceae kao patogeni varijeteti zbirne (tipske) vrste X. campestris. Međutim, nova saznanja o fitopatogenim bakterijama doprinela su da se raniji sistemi klasifikacije i nazivi vrsta preinače ili predlože sasvim novi (Van den Mooter i Swings, 1990; Bonas i sar., 1991; Jones i sar., 1993a; Bouzar i sar., 1994, Buonaurio i sar., 1994; Stall i sar., 1994; Vauterin i sar., 1995; Jones i Stall, 1998; Schaad i sar., 2001; Jones i sar. 2004; Obradović i sar., 2004; Vinatzer i Bull, 2009; Bull i sar., 2012). Pre više od dve decenije, razvojem biljne patologije, intenzivirana su proučavanja varijabilnosti u bakteriološkom pogledu među sojevima bakterije X. c. pv. vesicatoria (Jones i sar., 1986; Stall i sar., 1986; Bonas i sar., 1989). Sojevi su se pre svega razlikovali u biohemijskim osobinama, a kasnije su utvrđene fiziološke i genetske razlike. Doktorska disertacija Pregled literature 13 Prva podela u okviru vrste X. c. pv. vesicatoria na dve grupe sojeva (A i B) izvršena je na osnovu razlika u sposobnosti korišćenja ugljenikovih jedinjenja. Utvrđeno je dа su sojevi iz grupe A i B mаnje od 50% homologni (Vauterin i sar., 1990, 1991, 1993; Stall i sar., 1994). Dokazano je da sojevi u okviru svаke pojedinačne grupe međusobno imaju više od 70% sličnosti, nakon čega je usledila i prva reklasifikacija u dve grupe A i B. Kao predstavnik neamilolitičke grupe A imenovana je vrsta X. axonopodis pv. vesicatoria, dok je kao predstavnik amilolitičke grupe B imenovana vrsta X. vesicatoria (Vauterin i sar., 1993; 1995; Yang i sar., 1993; Stаll i sаr., 1994). Skoro istovremeno, Louws i sar. (1995) su metodom REP - PCR-a takođe izdvojili dve grupe sojeva u okviru vrste X. c. pv. vesicatoria. Po Bouzаr i sаr. (1994) fenotipskoj grupi A pripadaju sojevi koji sadrže α proteinski lanac veličine 32 - 35 kDа, što je u vezi i sa biohemijskom aktivnošću sojeva te grupe. Sojevi koji pripadaju ovoj grupi ne ispoljavaju amilolitičku i pektolitičku aktivnost, hidrolizuju želatin i eskulin, ne poseduju oksidazu, stvaraju kiselinu iz manoze, arabinoze, glukoze, galaktoze, dekstrina, razvijaju se na podlozi sa cis-akonitinskom kiselinom (Jones i sаr., 1993; Vauterin i sar., 1995; Jones i sar., 2000). Sa druge strane, u grupe B i C svrstani su pektolitički sojevi, sa β proteinskim lancem veličine 25 - 27 kDа (Bouzаr i sаr., 1994a). Analizom masnih kiselina gasnom hromatografijom, kao i hibridizacijom DNK, Jones i Stall (1998a) su izdiferencirali još dve grupe sojeva (C i D). Predstavnici grupe B, za razliku od grupe C, ne koriste galaktozu kao izvor ugljenika, dok su neamilolitički i nepektolitički sojevi, koji ne koriste dekstrin, galaktozu i cis-akonitinsku kiselinu svrstani u grupu D. Predloženo je da vrsta sa karakteristikama fenotipske grupe A bude preimenovana u X. euvesicatoria; grupe B - X. vesicatoria; grupe C - X. perforans i grupe D - X. gardneri (Jones i sar., 2004). Nakon postupka validacije prihvaćeni su binominalni nazivi za pomenute četiri vrste, koji se zvanično koriste od 2006. godine (VALIDATION LIST N° 109). Prema najnovijoj sistematici Xanthomonas euvesicatoria, Xanthomonas vesicatoria, Xanthomonas perforans i Xanthomonas gardneri su odvojene, pojedinačne vrste sa svojim karakteristikama. Spadaju u klasu Gammaproteobacteria, red Doktorska disertacija Pregled literature 14 Xanthomodales, familiju Xanthomodaceae i rod Xanthomonas (Tabela 2) (List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature; Formerly List of Bacterial names with Standing in Nomenclature (LBSN) - http://www.bacterio.net/). Međutim, u literaturi se često sreću stari nazivi bakterije kao što su: Xanthomonas campestris pv. vesicatoria i Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria. Veliki broj sojeva fitopatogenih bakterija komercijalno su dostupni i nalaze se u kolekcijama kao što su: Nacionalna kolekcija biljnih patogena Velike Britanije (NCPPB); ICMP - Novi Zeland; CFBP - Francuska; ATTC - SAD; LMG - Belgija. Tabela 2. Taksonomska pozicija Xanthomonas spp. u sistemu klasifikacije * List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature; Formerly List of Bacterial names with Standing in Nomenclature (LBSN) - http://www.bacterio.net/). 2.2. EPIDEMIOLOŠKO-EKOLOŠKE KARAKTERISTIKE PATOGENA Poslednjih godina u našoj zemlji zapažena je pojava bakteriozne pegavosti paprike visokog intenziteta (Balaž, 1994; Obradović i sar., 1997, 1999, 2000a, 2001). Na pojavu oboljenja najveći uticaj ima visoka relativna vlažnost vazduha tokom vegetacije (Diab i Kraljevstvo Bacteria Razdeo Proteobacteria Klasa Gammaproteobacteria Red Xanthomonadales Familija Xanthomonadaceae Rod Xanthomonas Dowson (1939) Binominalni nazivi: Xanthomonas euvesicatoria Jones i sar. (2006)* Xanthomonas vesicatoria Doidge (1920); Vauterin (1995) Xanthomonas perforans Jones i sar. (2006)* Xanthomonas gardneri Šutić (1957); Jones i sar. (2006)* Doktorska disertacija Pregled literature 15 sar., 1982). Vremenski uslovi praćeni kišom i vetrom pogoduju bržem i efikasnijem širenju bakterioza (Obradović i sar., 2000b; Balaž, 2005; McInnes i sar., 1988; Gitaitis i sar., 1992). Posebna pažnja se pridaje gajenju paprike u zatvorenom prostoru (plastični tuneli, plastenici, staklenici), u kojima se zbog navodnjavanja stvaraju idealni uslovi za razvoj bolesti (Pohronezny i Volin; 1983; Griesbach i sar., 1988; Gvozdenović i Cvejić, 2009). Optimalna temperatura za nastanak infekcije kreće se od 24 - 30ºC. Temperature iznad 35ºC tokom dana, i ispod 16ºC tokom noći, sprečavaju nastanak infekcije (Diab i sar., 1982a). U povoljnim uslovima, zaraze nastaju prvo na klijancima, a kasnije se šire i na odrasle biljke (Leben i Sleesman, 1981). Ustanovljeno je da bakterije ostvaruju inicijalnu infekciju preko stoma i hidatoda (Leandro i Volin, 1987; Rudolph, 1993). Prodor patogena ostvaruje se i kroz povrede nastale mehaničkim oštećenjima, aktivnošću insekata, kao i kroz povrede nastale usled vremenskih nepogoda (kišne kapi, vetar) (Calzolari, 1986). Glavni izvori inokuluma su seme i sadni materijal (Bashan i sar., 1982, 1982a; Leite i sar., 1995; Obradović i sar., 1997, 1999; 2004; Balaž i Delibašić, 2005). Bakterije se održavaju i na druge načine: putem biljnih ostataka u zemljištu, samoniklim biljkama i epifitno na nadzemnim biljnim delovima (Schaad i Dianese, 1981; Jones i sar., 1986; McGuire i Jones, 1991; Bogatzevska i sar., 1992, 1995). Prve podatke o prenošenju bakterije semenom izneli su Gardner i Kendrick (1923). Bashan i saradnici (1982a) utvrdili su da bakterija može zadržati vitalnost na semenu i do 10 godina. Obzirom na to da se bolest prenosi semenom koje predstavlja jedan od glavnih izvora inokuluma i medijum za širenje u nova područja gajenja paprike, od izuzetne je važnosti očuvati useve semenske paprike zdravim (Balaž, 2005; Obradović, 2009a). Fitopatogene bakterije najčešće nije lako detektovati na semenu. Zaraženo seme može biti sa i bez vidljivih znakova infekcije (latentne infekcije) (Sijam i sar., 1991). Seme u prometu, koje nije podvrgnuto adekvatnom bakteriološkom pregledu, predstavlja potencijalnu opasnost od unošenja novih patogena ili rasa (Obradović i sar., 2008a). U ciklusu preživljavanja i održavanja fitopatogenih bakterija, Leben (1981) i De Cleene (1989) ustanovili su i opisali postojanje epifitne faze u filosferi biljaka (″resident phase″), koja nastupanjem povoljnih uslova dovodi do infekcije (Bashan i sar., 1982a). Doktorska disertacija Pregled literature 16 Epifitna faza može biti prisutna na naizgled zdravim biljnim organima (lišće, pupoljci), što može, ali, ne mora dovesti do pojave oboljenja (McGuire i Jones, 1991). Zahvaljujući adhezivnim materijama (ekstra celularni polisaharidi - EPS) u omotaču bakterijskih ćelija omogućeno je epifitno održavanje bakterija na površini lista (Soto i Hultgren, 1999). Zhang i saradnici su (2009), metodom konfokalne fluorescentne laserske mikroskopije, locirali populaciju bakterije X. euvesicatoria na površini lista, pre svega, u depresijama između epidermisa ćelija i oko stoma, a kasnije i u substomatalnim komorama apoplasta. Tehnike imunofluorescentne i bioluminiscentne mikroskopije, uz korišćenje zelenog fluorescentnog proteina, poslužile su za posmatranje epifitne faze X. c. pv. campestris i X. o. pv. oryzae na površini biljnih delova i načina ostvarenja infekcije kroz prirodne otvore lista kupusa i pirinča (Daniel i Boher, 1981; Dane i Marten, 1994; So i sar., 2002; Han i sar., 2008). Prema Jones-u i sar. (1986) izvor inokuluma za naredni usev mogu biti i korovske biljne vrste na kojima se populacija bakterija epifitno održava, ali samo ukoliko su u blizini ili na parcelama na kojima su uzgajani paprika ili paradajz. Bashan i sar. (1982a) ukazuju i na mogućnost prezimljavanja bakterije u rizosferi zaraženih biljaka. Pravilna agrotehnika predstavlja značajnu meru i preventivu u sprečavanju bakterioza, a uništavanje korovskih vrsta i drugih potencijalnih domaćina redukuje pojavu bolesti (Goode i Sasser, 1980). Ova mera ne otklanja potpuno potencijalne izvore populacije bakterija, ali obezbeđuje bolju aeraciju oko biljaka smanjujući pri tom mogućnost širenja bakterija i nastanka infekcije. Uništavanje zaraženih biljnih ostataka i korova predstavlja važnu meru zaštite, naročito u tropskim regionima. Vodeći računa o potencijalnim domaćinima patogena plodored takođe predstavlja efikasnu meru zaštite. 2.3. PATOGENE ODLIKE Fitopatogene bakterije po ostvarenoj infekciji i uspostavljanju odnosa sa domaćinom, otpočinju svoj porast i reprodukciju (Minsavage i sar., 1990). Parazit potrebnu ″hranu″ pronalazi u biljci. Delujući svojim fermentnim sistemom bakterije razlažu i pretvaraju složena jedinjenja biljke u manje složena i pristupačna za usvajanje (Arsenijević, Doktorska disertacija Pregled literature 17 1997). Kao rezultat parazitne prirode bakterija, nastaju promene na biljkama koje se ispoljavaju kao pegavost, trulež, uvelost i dr. U slučaju inkompatibilnog odnosa između patogena i domaćina ili prodora u otpornog domaćina ne dolazi do pojave simptoma bolesti. U interakciji biljka - patogen pri inkompatibilnom odnosu stvaraju se aktivni kiseonični radikali (″reactive oxygen species″ ROS), koji vrše biosintezu fitoaleksina i dovode do nakupljanja tzv. PR proteina (″pathogenesis-related proteins″) (Minsavage i sar., 1990; Bogatzevska i Iliev, 1994; Swords i sar., 1996; Garcion i sar., 2007). Ustanovljeno je postojanje šest tipova ili sistema sekrecije proteina odgovornih za patogenezu: Tip I (T1SS); Tip II (T2SS); Tip III (T3SS); Tip IV (T4SS); Tip V (T5SS); Tip VI (T6SS) (Pugsley, 1993; Holland i sar., 2005; Büttner i He, 2009). Smatra se da je ključ za patogenost većine Xanthomonas patovara u postojanju trećeg (T3SS) tipa sekrecije (Huguet i sar., 1998; Nöel i sar., 2001; Buttner i Bonas, 2006; Büttner i He, 2009; Zhang i sar. 2009; Boch i Bonas, 2010). U skoro svim Gram - negativnim fitopatogenim bakterijama roda Xanthomonas pronađeni su hrp geni, odgovorni za aktivaciju T3SS sistema, posrednika u interakciji biljka domaćin - patogena bakterija (Gough i sar. 1992; Alfano i Collmer, 2004; He i sar., 2004;. Büttner i Bonas, 2006). Hromozomalni region bakterije X. euvesicatoria veličine 23kb, sadrži šest hrp transkripcionih jedinica (operona), hrpA do hrpF (Bonas i sar., 1991; Bonas, 1994). Operon hrpD sadrži šest gena (hrcQ, hrcR, hrcS,hrpD5, hrpD6, hpaA), a smatra se da je hpaA efektor protein, odgovoran za razvoj bolesti (Lorenz i Büttner, 2009). Osnovna karakteristika ovog tipa sekrecije je u tzv. «igla aparatu» (″needle apparatus″) putem kojeg se ubacuju faktori virulentnosti direktno u ćeliju domaćina (Marlovits i sar., 2004, 2006). Ova mišljenja potvrđena su istraživanjima T3SS sistema u različitim bakterijama gde je zapaženo da patogen ″montira″ filamentozne supramolekularne strukture za transport efektor proteina (He i sar., 2004; Buttner i Bonas, 2006). Isporuka efektor proteina iz citoplazme bakterije u unutrašnjost biljnih ćelija obavlja se kroz više fizičkih barijera: dve bakterijske membrane odvojene peptidoglikanoznim slojem i jedna membrana biljnih ćelija, koja je okružena gustim ćelijskim zidom (Slika 6). Očekivana reakcija može biti tipična uz pojavu simptoma bolesti ili atipična uz pojavu hipersenzitivne reakcije (Sahin i Miller, 1998). Doktorska disertacija Pregled literature 18 U biljkama koje poseduju otpornost specifičnu prema patogenu, geni otpornosti (R) kodiraju efektor proteine, odnosno prepoznaju produkte odgovarajućih avr gena (gena avirulentnosti) (Bonas i sar., 1989, 1991; Bonas i Van den Ackerveken,1997). U ovom slučaju prepoznavanje se javlja veoma brzo što dovodi do brze aktivacije odbrambenog mehanizma ćelije domaćina, koja se ispoljava u vidu hipersenzitivne reakcije biljke (Klement, 1963; Lindgren i sar., 1986). Akumulacija antimikrobnih jedinjenja, zadebljanje ćelijskog zida i ekspresija određenih odbrambenih gena u okolnom tkivu mogu da zaustave dalju kolonizaciju biljke od strane patogena (O'Garo i Charlemange, 1994). U slučaju osetljivog domaćina pojavljuju se tipični simptomi bolesti. Slika 6. Šematski prikaz sekrecije tipa III (T3S) (He i sar., 2004) Provera patogenosti izolovanih bakterija je od posebnog značaja, pošto samo pozitivna ocena opravdava ispitivanje ostalih osobina parazita do njegove potpune identifikacije (Schaad i sar., 2001). Patogeno svojstvo bakterija najpouzdanije se utvrđuje na biljci domaćinu (Schaad i sar., 2001). U literaturi su opisani postupci unošenja inokuluma različitim metodoma, a najzastupljeniji su metod prskanja, sa i bez pritiska, metod potapanja biljnih delova, sa i bez povreda, kao i metod uboda i ubrizgavanja pomoću Doktorska disertacija Pregled literature 19 medicinskog šprica (Lelliot i Stead, 1987; Obradović i sar., 2000; Schaad i sar., 2001; Agrios, 2005). Obradović i sar. (2000) proučavali su patogene karakteristike sojeva X. evesicatoria poreklom iz Srbije, metodom infiltracije suspenzije bakterija (108 CFU/ml) u tkivo između nerava petog ili šestog stalnog lista paprike sorte Palanačka babura. U cilju provere hipersenzitivnosti kao indikatora patogenosti većine fitopatogenih bakterija mogu poslužiti biljke duvana, tatule, muškatle, klice pšenice, mahune pasulja, kotiledoni listići krastavca, plodovi zelenog voća i povrća i dr. (Lelliot i Stead, 1987). 2.4. BAKTERIOLOŠKE ODLIKE Identifikacija prouzrokovača bakterioza zasnovana na korišćenju standardnih fitobakterioloških metoda zahteva dosta vremena i materijala (Balaž i Delibašić, 2005). Savremene tehnike (serološke i molekularne) imaju značaja pre svega u laboratorijskom radu za brzu i pouzdanu detekciju patogena koji se prenose semenom i sadnim materijalom (Schaad i sar., 2001). Izolacija patogena se može izvršiti korišćenjem standarnih, poluselektivnih i selektivnih hranljivih podloga (Schaad i sar., 2001). Standardna YDC podloga za izolaciju bakterija roda Xanthomonas sastoji se od kvaščevog ekstrakta, dekstroze i CaCO3 koji deluje kao pufer neutrališući kiseline koje se oslobađaju razgradnjom hranljivih materija (Schaad i Stall, 1988; Schaad i sar., 2001). Po protokolu APS-ISF-a (2010) (American Phytopathological Society - International Seed Federation), YDC podloga se navodi kao najpogodnija za morfološku identifikaciju bakterije, na kojoj se razvijaju tipične sluzaste, sjajne, žute kolonije prečnika 2 - 3 mm. Žuta boja koja potiče od pigmenta ksantomonadina predstavlja važan činilac za epifitni opstanak štiteći bakterije od UV zračenja i svetla (Poplawsky i sar., 2000). Pored standardne YDC podloge, za izolaciju i ocenu odgajivačkih karakteristika navodi se i hranljivi mesopeptonski agar (MPA). Od poluselektivnih podloga u upotrebi su: agar sa trifenil-tetrazolium hloridom (TTCA) (Kelman, 1954); hranljiva podloga sa sukiničnom i kiničnom kiselinom (mSQ) (Schaad i sar., 2001); podloga sa Tween-om 80 (=Tween B) (McGuire i sar., 1986; Sijam i Doktorska disertacija Pregled literature 20 sar., 1991) i hranljivi agar uz dodatak Tween-a i obranog mleka u prahu (MT - Milk Tween) (Goszczynska i Serfontein, 1998). U cilju izolacije bakterija iz različitih supstrata i biljnih delova McGuire i sar. (1986) razvili su Tween A, B i C podloge. Autori navode da je podloga Tween A najpogodnija za izolaciju iz plodova; Tween B za izolaciju bakterija iz lista zaraženih biljaka, dok se Tween C uspešno koristi za izolaciju patogena iz zemljišta. Značaj Tween-a 80 (C64H124O26), koji ulazi u sastav pomenutih podloga, ogleda se u hemijskom sastavu. To je polisorbat i sastoji se od sorbitana i oleinske kiseline. Hidrofilnu grupu jedinjenja čini polietar poznat kao polioksietilen, deo polimera etilen-oksida, i polisorbat koji pripada lipofiličkoj grupi polimera. Usled aktivnosti lipolitičkih enzima bakterija na ovim podlogama, uočavaju se karakteristične promene. Bakterija na Tween B podlozi formira karakteristične, mlečne zone koje nastaju od kalcijumovih soli usled oslobađanja lipida iz Tween-a 80, dok na MT podlozi bakterija pored mlečnih zona stvara i prosvetljene zone usled hidrolize kazeina iz mleka (McGuire i sar., 1986; Goszczynska i Serfontein, 1998). Ekstrakciju bakterija iz semena paprike korišćenjem ove podloge izvršili su Kritzman (1989) i Sijam i sar. (1991). Poznavanje biohemijske aktivnosti pojedinih vrsta bakterija je od velikog značaja u pogledu njihove karakterizacije. Standardne postupke proučavanja biohemijskih odlika bakterija navode Schaad (1980), Fahy i Persley (1983), Bradbury (1986), Lelliot i Stead (1987), Schaad (1989), Klement i sar. (1990), Arsenijević (1997), Schaad i sar. (2001). Najveće razlike bakterije, na osnovu kojih je moguće izvršiti diferencijaciju vrsta Xanthomonas kompleksa, ispoljavaju u enzimskim reakcijama (amilolitička i pektolitička aktivnost) i korišćenju različitih izvora ugljenikovih jedinjenja (D-galaktoza, dekstrin i cis- akonitinska kiselina), (Jones i sar., 2004; Obradović i sar., 2008; Kornev i sar., 2009) (Šema 1). Grupa A obuhvata neamilolitičke sojeve, koji ne ispoljavaju pektolitičku aktivnost, hidrolizuju želatin i eskulin, ne poseduju oksidazu, stvaraju kiselinu iz manoze, arabinoze, glukoze, galaktoze, dekstrina i razvijaju se na podlozi sa cis-akonitinskom kiselinom. Bakterija sa ovim karakteristikama imenovana je kao X. euvesicatoria (Jones i sar., 2004). Grupama B (X. vesicatoria) i C (X. perforans) pripadaju amilolitičko-pektolitički sojevi, pozitivni u reakcijama sa dekstrinom i cis-akonitinskom kiselinom. Jedina razlika Doktorska disertacija Pregled literature 21 imeđu B i C grupe ogleda se u tome što predstavnik grupe B ne koristi D-galaktozu kao izvor ugljenika. Neamilolitički i nepektolitički sojevi koji ne koriste dekstrin, D-galaktozu i cis-akonitisku kiselinu svrstani su u grupu D čiji je predstavnik vrsta X. gardneri (Vauterin i sar., 1995; Jones i sar., 2000, 2004; Obradović i sar., 2004, 2008a; Ignatov i sar., 2009; Kornev i sar., 2009; Moretti i sar., 2009). Optimalna temperatura razvoja u in vitro uslovima kreće se od 25 - 30ºC (Arsenijević, 1997), dok maksimalna temperatura razvoja iznosi 37ºC (Obradović i sar., 2001a). Karakteristike sojeva, prouzrokovača bakteriozne pegavosti u Srbiji poslednjih godina proučavali su Obradović i sar. (2004, 2008a, 2009b), Gašić i sar. (2011) i Šević i sar. (2011). Šema 1. Diferencijacija vrsta Xanthomonas kompleksa na osnovu biohemijskih karakteristika (Jones i sar., 2004) Dekstrin (+) Galaktoza (-) cis-akonitinska kiselina (+) Dekstrin (+) Galaktoza (+) cis-akonitinska kiselina (+) Amilolitički Pektolitički Grupa A X. euvesicatoria Neamilolitički Nepektolitički Grupa D X. gardneri Grupa B X. vesicatoria Grupa C X. perforans Dekstrin (+) Galaktoza (+) cis-akonitinska kiselina (+) Dekstrin (-) Galaktoza (-) cis-akonitinska kiselina (-) Doktorska disertacija Pregled literature 22 2.5. SEROLOŠKE ODLIKE BAKTERIJA Xanthomonas spp. Pored uobičajenih bakterioloških postupaka, danas su u upotrebi serološke metode koje se zasnivaju na međusobnom dejstvu antigena i antitela (Lelliott i Stead, 1987). Obzirom na potrebe za brzom i pouzdanom detekcijom biljnih patogena, serološke metode su našle veliku primenu. U laboratorijskom radu zastupljeni su: metod aglutinacije (Express agglutination test), ELISA test (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) i IF test (Immunofluorescence test), sa komercijalno dostupnim kompletima za detekciju većine fitopatogenih bakterija (Bioreba AG - Switzerland, Loewe Phytodiagnostica - Germany, Neogen Europe Ltd. - UK, DSMZ - Germany, Primediagnostic - Wageningen itd.). Metod aglutinacije je serološki metod koji se zasniva na svojstvu bakterije da u prisustvu specifičnih antitela stvara makromolekule vidljive u obliku taloga (Weir, 1978; Lelliott i Stead, 1987). Ovi testovi veoma su praktični i prilagođeni za izvođenje kako u laboratoriji tako i u poljskim uslovima, pri čemu nije potrebna prethodna izolacija niti inkubacija (Lemattre i sar., 1992). ELISA test je metoda razvijena krajem sedamdesetih godina prošlog veka (Clark i Adams, 1977; Clark, 1981). Najjednostavnija forma ove metode je PTA - ELISA (Plate- Trapped Antigen), ali je u praksi najzastupljeniji DAS - ELISA (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Serološki testovi i njihova standardizacija u biljnoj patologiji bili su izazov brojnim istraživačima. Alvarez i sar. (1985) proizveli su monoklonalna antitela za diferencijaciju vrsta Xanthomonas roda, i uspeli da razdvoje vrstu X. c. pv. campestris od ostalih patovara X. campestris tipske vrste. Međutim, sve do rezultata Lemmatre-a i saradnika iz 1992. godine, pokušaji za serološku identifikaciju bakterija su bili pojedinačni sa brojnim poteškoćama (Domen i Alvarez, 1978; Trigalet i sar., 1978; Alvarez i Lou, 1982). Naime, Lemmatre i saradnici (1992) su na Institutu za poljoprivredna istraživanja (INRA - Francuska) razvili opšti postupak za izvođenje DAS - ELISA testa u cilju detekcije Xanhomonas vrsta. Metod ELISA testa u cilju identifikacije patogena X. c. pv. vesicatoria navode Alvarez i sar., (1985); Jones i sar. (1993a); Bouzar i sar. (1994a); Sahin i Miller (1996); Ravikumar i Khan, (2002); Veena i van Vuurde (2002). Doktorska disertacija Pregled literature 23 Takođe, Mirik i sar. (2005), primenom DAS - ELISA testa uz korišćenje monoklonalnih antiseruma, detektovali su bakteriju X. c. pv. vesicatoria, analizom velikog broja izolata poreklom iz obolelih biljaka paprike u Turskoj. U Srbiji, Obradović i sar. (2000) proučavali su serološke odlike sojeva bakterija poreklom sa paprike primenom indirektnog DAS - ELISA testa. 2.6. MOLEKULARNE ODLIKE BAKTERIJA Xanthomonas spp. Imajući u vidu heterogenost populacije patogena, brza i pouzdana identifikacija imala bi višestruk kako naučni tako i praktični značaj. Lančana reakcija polimeraze (PCR - Polymerase Chain Reaction) je metoda koja je razvijena od strane Mullis-a i saradnika i jedno je od velikih otkrića u nauci (Mullis i sar., 1986). Ključna prednost ovih metoda je u tome što su nezavisne od spoljašnjih uslova, starosti i fiziološkog stanja ciljanog patogena (Louws i sar., 1995; Cuppels i Louws, 2006). Osim toga, moguće je detektovati patogene i u veoma niskim koncentracijama, kako u simptomatičnim, tako i u asimptomatičnim uzorcima. To je posebno značajno u detekciji karantinskih patogena na semenu i sadnom materijalu, kada je izolacijom teško ili nemoguće utvrditi njihovo prisustvo (McManus i Jones, 1995; Obradović i sar., 2004; Moretti i sar., 2009). Otkrićem da hromozomalni region bakterije X. c. pv. vesicatoria veličine 23kb, sadrži šest hrp transkripcionih jedinica (operona), hrpA do hrpF (Bonas i sar., 1991; Bonas, 1994; Lorenz i Buttner, 2009), došlo je do pomaka u identifikaciji vrsta Xanthomonas kompleksa ponaosob. Nakon ovih otkrića omogućena je detekcija bakterija, amplifikacijom fragmenata hrp regiona DNK a potom diferencijacijom i razdvajem grupa restrikcionim enzimima (Restriction Fragment Lenght Polymorphism-RFLP) (Leite i sar., 1995; Jones i sar., 2000; Obradović i sar., 2004). Leite i sar. (1994, 1995) ustanovili su prisustvo EcoRI kao fragmenta hrp regiona DNK prisutnog samo kod fitopatogenih patovara roda Xanthomonas. U okviru hrpB regiona (lokusa) hrp gena, izdiferencirani su fragmenti označeni kao hrpB5 do hrpB8 i na osnovu analize oligonukleotida dizajnirani su prajmeri označeni kao RST2, RST3, RST9, Doktorska disertacija Pregled literature 24 RST10, RST21 i RST22. Nakon digestije restrikcionim enzimima, PCR proizvodi se razdvajaju elektroforezom na 4% agaraznom gelu. Osetljivost ove metode je visoka obzirom da je minimalni detektovani broj bakterijskih ćelija moguć na nivou 102 CFU/ml. Mitrev i Kovačević (2006) su korišćenjem restrikcione analize, izvršili diferencijaciuju ispitivanih sojeva poreklom iz Makedonije. Ustanovili su genetsku ujednačenost sojeva koji su posedovali odlike karakteristične za vrstu Xanthomonas euvesicatoria. Metodom restrikcione analize izvršeno je grupisanje odnosno razdvajanje fenotipskih grupa Xanthomonas spp. poreklom iz paprike (Obradović i sar., 2004). Nakon amplifikacije hrp gena DNK prajmerima RST65 i RST69, izvršena je digestija PCR proizvoda veličine 420bp restrikcionim enzimima (CfoI, TaqI i HaeIII). Razvojem biotehnologije u zaštiti bilja, u novijim istraživanjima dizajnirani su specifični prajmeri za svaku od navedenih vrsta bakterija ponaosob, što olakšava i ubrzava detekciju i diferencijaciju patogena (Koenraadt i sar., 2009; Moretti i sar., 2009). Naime, za svaku vrstu je dizajniran specifičan par prajmera koji amplifikuju proizvode različitih veličina baznih parova: XeF i XeR 173 bp za X. euvesicatoria (grupa A); XvF i XvR 138 bp za X. vesicatoria (grupa B); XpF i XpR 197 bp za X. perforans (grupa C); XgF i XgR 154 bp za X. gardneri (grupa D) Koenraadt i sar. (2009). Moretti i sar. (2009), dizajnirali su prajmere i opisali metod visoke osetljivosti za detekciju vrste X. euvesicatoria, kako iz dobijenih izolata tako i iz svežeg biljnog materijala. Visoka osetljivost ove metode, utvrđene na nivou 102 CFU/ml, postignuta je smanjenjem koncentracije Mg2+ i povećavanjem temperature reakcije PCR-a. 2.7. FIZIOLOŠKE RASE PATOGENA Proučavanje otpornosti prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti počelo je šezdesetih i sedamdesetih godina istraživanjima Sowell-a (1960) i Sowell i Dempsey-a (1977). Prve otporne sorte dobijene su ukrštanjem divljih sorti sa komercijalnim genotipovima. U početku se smatralo da sojevi poreklom sa paradajza i paprike vrše unakrsnu kontaminaciju u polju, sve do 1970-tih godina kada je ustanovljena specifičnost prema domaćinu (Cook i Stall, 1969; Cook, 1973). Ustanovljene su rase koje parazitiraju Doktorska disertacija Pregled literature 25 samo paradajz (XcvT), one koje parazitiraju samo papriku (XcvP), kao i one čiji su domaćini i paprika i paradajz (XcvPT) (Cook i Guevara, 1984). U okviru grupe XcvT determinisane su tri rase (T1, T2 i T3), dok je kod sojeva poreklom sa paprike do sada determinasano 11 rasa (P0-P10) (Ritchie i Dittapongpitch, 1991; Bouzar i sar., 1994, Jones i sar., 1995, 1998, 2002; Kousik i Ritchie, 1995; Sahin i Miller, 1995; 1998; Stall i sar., 2009). Kada se govori o otpornosti biljaka prema patogenima treba imati u vidu nekoliko važnih činilaca: specifičnost domaćina i patogena, varijabilnost patogena i uticaj ekoloških faktora na njihove međuodnose (O'Garo i Charlemange, 1994). Najveće štete nastaju onda kada je domaćin osetljiv, patogen virulentan i postoje povoljni uslovi za ostvarenje infekcije (Canteros i sar., 1991). Za razliku od drugih kvantitativnih svojstava, otpornost ili osetljivost biljaka prema patogenima je rezultat međudejstva dva genoma, patogena i biljke (Minsavage i sar., 1990; Walkes i O'Garo, 1996; Momol i sar., 2002). Stall i Cook (1966) među prvima su opisali pojavu hipersenzitivne reakcije koja nastaje usled krajnje osetljivosti prema infekciji. Ovaj vid otpornosti zasniva se na modelu ″gen-za-gen″ čineći osnovu vertikalne otpornosti (Ellingboe, 1984; Hibberd i sar., 1987; Minsavage i sar., 1990). U biljkama koje poseduju otpornost specifičnu prema patogenu, geni otpornosti (R) kodiraju proteine koji prepoznaju proizvode odgovarajućih avr gena (geni avirulentnosti) (Bonas i Van den Ackerveken,1997; Bonas i Lahaye, 2002). Poznato je da se fiziološke rase razlikuju po sposobnosti zaražavanja različitih sorti (Basim, 1998), odnosno ista sorta može biti otporna prema nekim rasama a osetljiva prema drugim. Buonaurio i Servili (1999) determinisali su povećanu aktivnost biljnih enzima lipogenaze i peroksidaze u fazi kolapsa biljnih ćelija tokom hipersenzitivne reakcije. Smatra se da je lipogenaza enzim koji učestvuje u oštećivanju membrane biljne ćelije tokom HR (Slusarenko, 1996). Nakon izolacije gena otpornosti: Bs1 gen (PI 163192), Bs2 gen (PI 260435), Bs3 gen (PI 271322), stvorene su izogene linije (diferencijalne sorte): ECW - 10 (Bs1), ECW - 20 (Bs2) i ECW - 30 (Bs3) (Cook i Stall, 1982; Kousik i Ritchie, 1995; Kousik i Ritchie, 1996; Kousik i Ritchie, 1996a; Kousik i Ritchie, 1998; Sahin i Miller, 1998; Kousik i Ritchie, 1999). U početku su korišćene za identifikaciju rasa od P0 - P5 (Hibberd i sar., Doktorska disertacija Pregled literature 26 1987; Swanson i sar., 1988; Bonas i sar., 1989; Minsavage i sar., 1990; Canteros i sar., 1991), a nakon otkrića Bs4 gena otpornosti u C. pubescens (PI 235047) prema rasi P6 izdifirencirane su i ostale 4 rase P7, P8, P9 i P10 (Jones i sar., 1994, Sahin i Miler, 1995; Jones i Stall, 1998; Sahin i Miller, 1998). Na osnovu ocene reakcije diferencijalnih sorti paprike do sada je opisano 11 fizioloških rasa bakterije X. euvesicatoria (Jones i sar., 1998; Kousik i Ritchie, 1999; Sahin, 2001; Stall i sar., 2009). Protokol za utvrđivanje i razlikovanje rasnog sastava bakterije X. euvesicatoria detaljno je opisan u uputstvu APS- ISF-a (American Phytopatological Society - International Seed Federation APS-ISF, 2010). U populaciji X. euvesicatoria prisutnoj u Srbiji, Obradović i sar. (1999a, 2000, 2004) ustanovili su sojeve koji pripadaju rasama P1, P3, P7 i P8. Jones i sar. (2002) objasnili su pojavu otpornosti koja se javlja kod biljaka paprike uz izostanak hipersenzitivne reakcije (Non - HR). Ukrštanjem ECW sa PI271322 i ECW123 kao nosioca gena otpornosti prema svim rasama, stvoren je genotip paprike ECW - 12346 kao nosilac gena otpornosti prema svim rasama patogena. U ogledima izvedenim u polju i staklari nakon veštačke inokulacije sojem rase P6 nije konstatovana pojava HR. Ustanovljena je inhibicija stvaranja elektrolita odgovornih za pojavu HR. Patogeni mogu da se menjaju mutacijama pri čemu dolazi do genetičkih promena koje se prenose na potomstvo i češće su kod organizama bespolnog tipa razmnožavanja, obezbeđujući tako veću varijabilnost patogena i nastajanje novih patotipova (rasa) (Swords i sar., 1996). To je i razlog što je tokom poslednjih decenija ustanovljen veći broj rasa ovog patogena, što znatno otežava stvaranje otpornih sorti prema svim postojećim rasama. Antagonizam među rasama i međusobna kompeticija utiču na dominaciju jedne rase u odnosu na drugu tokom vegetacione sezone (O'Garro, 1998; O'Garro i Tudor, 1994; Pohronezny i sar., 1992). Gajenje osetljivog sortimenta paprike u svetu i kod nas predstavlja glavni uzrok čestih pojava bakteriozne pegavosti i to jakog intenziteta. Selekcioni pritisak nastao unošenjem gena otpornosti u komercijalne genotipove gajenih biljaka, često rezultira pojavom sojeva patogena, sposobnih da prevaziđu otpornost (Pernezny i sar., 1995; Gassmann i sar., 2000). Otpornost gajenog sortimenta prema patogenu stoga predstavlja jednu od najznačajnih mera u kontroli bakterioza (Hibberd i sar., 1987; Swanson i sar., Doktorska disertacija Pregled literature 27 1988; Bonas i sar., 1989; Minsavage i sar., 1990; Bonas i sar., 1991; Pernezny i Collins, 1997; Ritchie i sar., 1998; Sahin i Miller, 1998; Obradović i sar. 2000, 2008). 2.8. PRIMENA ANTIBIOTIKA I BAKARNIH PREPARATA U zaštiti bilja kod nas dominiraju hemijske mere borbe, odnosno korišćenje hemijskih sredstava ili pesticida koji ne obezbeđuju zadovoljavajući efekat zaštite (Obradović i sar., 2004a, 2004b, 2009). Kada se radi o fitopatogenim bakterijama, najčešće su u primeni preparati na bazi bakra. Međutim, kаo posledicа česte primene bаkаrnih prepаrаtа u svetu je utvrđena pojava rezistentnih sojeva ovih patogena (Adaskaveg i Hine, 1985; Obradović i Ivanović, 2007). Prema literaturnim podacima biološke (primena bakteriofaga) i neke novije alternativne metode (aktivatori otpornosti), ukazuju na mogućnost razvoja efikasne strategije za suzbijanje X. euvesicatoria (Obradović i sar., 2002, 2005; Obradović, 2009; Gašić i sar., 2011). Od bаktericidа uglаvnom su u upotrebi prepаrаti nа bаzi bаkrа, sаmi ili u kombinаciji sа etilenbisditiokarbamatima (EBDC) kаo što su mаneb i mаnkozeb (Balaž i sar., 2002; Grahovac i sar., 2009). Kаo posledicа česte primene bаkаrnih prepаrаtа registrovаni su sojevi X. c. pv. vesicatoria tolerаntni prema formulаcijama bаkаrnih preparata i niske osetljivosti nа kombinаciju sа EBDC fungicidimа (Mirik i sar., 2007). Pokazalo se u praksi da je primenа bаkаrnih prepаrаtа mаnje efikаsnа od njihovih kombinаcijа sа EBDC fungicidimа (Marco i Stall, 1983; Sherf i MacNab, 1986). Razlog rezistentnosti ispitivanih sojeva prema bakru leži u širokoj i čestoj upotrebi bakarnih preparata različitih formulacija (Bordovska čorba, bakar hidroksid, bakar sulfat i dr.) za kontrolu bolesti u proizvodnji (Tabela 3). Koriste se u pervenciji patogena tropskih biljaka, gde se upotrebljavaju u velikim količinama usled tropske vlažne klime i nisu zamenjeni sintetičkim fungicidima do današnjeg vremena (Adriano, 2001). Upotreba bakarnih fungicida je i dalje u porastu, budući da se površine pod povrćem na svetskom nivou povećavaju (Abbasi i sar., 2002). Prema mehanizmu delovanja svi su bazirani na toksičnosti Cu++ jona, koje bakterije pasivno apsorbuju. Bakarni preparati se primenjuju kada vremenski uslovi omogućavaju da se biljke brzo osuše. U slučaju pada temperature Doktorska disertacija Pregled literature 28 ispod 10°C, ili povećane vlažnosti, bakarni jon može na lišću nekih biljaka izazvati ožegotine (Milenković i sar., 2006). Tabela 3. Bakarna jedinjenja različitih formulacija (Tomlin, 2006) Naziv Formula Istorija upotrebe Vrsta pesticida Bakar-hidroksid Cu(OH)2 od 1968 /SAD fungicid baktericid Bakar-oktanoat Cu[CH3(CH2)6 COO]2 od 1997/ SAD fungicid baktericid algicid Bakar-oksihlorid CuCl2·3Cu(OH)2 od ranih 90-tih fungicid baktericid Bakar (II)-sulfat CuSO4·5H2O od kraja 19. veka fungicid Bakar-sulfat 3Cu(OH)2· CuSO4 / fungicid Broj antibiotika koji se koriste u fitomedicini nije veliki, u odnosu na one koji se koriste u humanoj medicini i veterini. Preparati na bazi antibiotika nisu registrovani za primenu u zaštiti bilja kod nas (Obradović i Ivanović, 2007). Streptomicin je antibiotik iz grupe aminoglukozida koji u visokim koncentracijama može biti fitotoksičan i formulisan je kao streptomicin-sulfat ili streptomicin-nitrat. Mehanizam delovanja streptomicina ogleda se u vezivanju za bakterijske ribozome i sprečavanju sinteze proteina. Primenа streptomicinа u usevu pаprike zа suzbijаnje X. c. pv. vesicatoria bilа je krаtkotrаjnа, jer je već početkom šezdesetih godinа prošlog vekа, otkrivenа rezistentnа populаcijа ove bаkterije (Stall i Thayer, 1962). Streptomicin-rezistentni sojevi ubrzo su detektovani u Argentini, Brаzilu, Kаliforniji, Floridi, Džordžiji, Ohаju, Pensilvаniji, Tаjvаnu, primorаvаjući istrаživаče dа trаgаju zа drugim rešenjimа (Stall i sar., 1986; Swanson i sar., 1988; Bender i sar., 1990; Ritchie i Dittapongpitch, 1991). Doktorska disertacija Pregled literature 29 Pored streptomicina, kasugamicin je antibiotik takođe iz grupe aminoglukozida koji se u nekim zemljama koristi u zaštiti bilja. Mehanizam delovanja se zasniva na inhibiciji ugradnje aminokiselina tokom sinteze proteina. U prometu je prisutan kao kasugamicin hidroksid, ali i kao mešavina sa bakar-oksihloridom. U cilju utvrđivanja praga osetljivosti sojeva bakterija prema antibioticima i bakru koriste se in vitro testovi. Pogodna je podloga sa saharozom i peptonom (SPA) (Lelliot i Stead, 1987; Buonaurio i sar., 1994; Pernezny i sar., 2008). Istraživanjima osetljivosti sojeva poreklom iz Srbije utvrđeno je da su koncentracije streptomicina od 20, 50, 100 i 200 ppm i bakar sulfata od 200 ppm, bile dovoljne da potpuno zaustave razvoj kolonija na podlozi (Obradović i sar., 2000a). Mitrev i Kovačević (2006), proučavali su osetljivost sojeva poreklom iz Makedonije prema streptomicin-sulfatu (100 ppm) i bakar sulfatu (200 ppm), i nisu utvrdili rezistentost prema pomenutim jedinjenjima. Rezistentne sojeve prema bakru i streptomicinu, poreklom iz Severne Karoline (SAD) navode Ritchie i Dittapongpitch (1991). Takođe, Adaskaveg i Hine (1985) identifikovali su sojeve poreklom iz Meksika, tolerantne prema formulacijama bakra. U jugoistočnom delu SAD-a (Florida, S. Karolina, Džordžija), zaštita od prouzrokovača bakteriozne pegavosti oslanja se na otpornost domaćina i efikasnost bakarnih preparata (Jones i sar., 1985, 1991, 1993; Pernezny i sar., 1995; Kousik i sar., 1996b). Pesticidi mogu biti različitog hemijskog sastava, toksikoloških osobina, perzistentnosti i potencijalni su zagađivači životne sredine. Međuprodukti degradacije često su perzistentniji od polaznog jedinjenja, ostaju duže vreme u zemljištu ili vodi (Đorđević, 2008). Nekontrolisana upotreba antibiotika i pojava rezistentnosti bakterija, ponovo je usmerila pažnju istraživača na potencijalnu primenu bakteriofaga u zaštiti bilja (Flaherty i sar., 2000; Louws i sar., 2001; Obradović i sar., 2001b, 2004a; Jones i sar., 2006; Obradović, 2009). Stoga, u cilju suzbijanja prouzrokovača bakteriozne pegavosti Obradović i sar. (2002) su proučili efekat primene nekih sojeva bakterija antagonista i stimulatora rasta biljaka, bakteriofaga specifičnih prema prouzrokovaču bolesti, kao i aktivatora indukovane otpornosti. Poslednjih godina u primeni je nova grupa preparata, tzv. aktivatora otpornosti biljaka (SAR - systemic aquired resistance inducers), koji u kontaktu sa biljkom aktiviraju biohemijske procese i dovode do povećanja odbrambene sposobnosti i smanjenja Doktorska disertacija Pregled literature 30 mogućnosti ostvarenja infekcije (Obradović i sar., 2005, 2008, 2009; Gašić i Obradović, 2012). Efikasnost nekih baktericida u suzbijanju bakteriozne pegavosti paprike proučavali su Šević i sar. (2010), pri čemu je najveću efikasnost u zaštiti paprike od prouzrokovača bakteriozne pegavosti ispoljio tretman acibenzolar-S-metil (93%). U kasnijim istraživanjima Šević i sar. (2011) potvrdili su rezultate o efikasnosti primene acibenzolar-S- metil-a prema X. euvesicatoria (KFB 13) sa 93 - 97% efikasnosti. Prema Jones i sar. (2006) tretmani bakteriofagima kombinovani sa drugim preparatima predstavljaju osnovu za buduću strategiju integralne zaštite od prouzrokovača bakteriozne pegavosti. 2.9. BIOLOŠKA ZAŠTITA - BAKTERIOFAGI Stvaranje nepovoljnih uslova za razvoj bolesti primenom agrotehničkih mera, bioloških produkata, antagonističkih organizama i superparazita su tehnologije zaštite kojima se danas teži (Obradović i sar., 2008a; Đorđević i sar., 2011). Biopesticidi podrazumevaju primenu korisnih mikroorganizama ili produkata njihovog metabolizma i predstavljaju alternativu sintetičkim jedinjenjima. Biološki agensi mogu biti na bazi korisnih gljiva, bakterija, kvasaca, virusnih čestica (bakteriofaga), kao i na bazi eteričnih ulja ili biljnih ekstrakata. Mehanizmi delovanja bioloških materija razvijaju se u pravcu direktne kompeticije, antibioze, parazitizma i indukovane otpornosti. Biopreparati predstavljaju preparate sa živim organizmima (gljive, bakterije), koji ispoljavaju toksičnost prema ekonomski značajnim patogenima gajenih biljaka. Primenom ovih preparata ostvaruje se ekološki i ekonomski opravdana proizvodnja i zaštita gajenih biljaka. U nedostatku efikasnih baktericida rešenje treba tražiti u integralnom pristupu, odnosno sintezi znanja o biologiji i epidemiologiji patogena, tehnologiji biljne proizvodnje, kao i baktericidnom efektu pojedinih supstanci. Najnovija proučavanja i integralni pristup zaštiti paprike i paradajza od prouzrokovača bakteriozne pegavosti navode Obradović i sar. (2008a). Kao prirodni antagonisti fitopatogenih bakterija navode se sojevi Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Seratia sp. (Mirik i sar., 2008). Tri soja Bacillus sp. izolovani su iz rizosfere biljaka paprike gajene u staklari i polju, a kasnije korišćeni u tretmanu biljaka u Doktorska disertacija Pregled literature 31 cilju redukcije populacije patogena. Rezultati su ukazivali na redukciju populacije od 11 - 65%, u tretmanima sa pojedinačnim Bacillus sp. sojevima i 38 - 67% u tretmanima u kombinaciji sva tri soja pomešanih u jednakim količinama. Među malobrojnim biološkim agensima, koji imaju potencijala da se koriste u zaštiti bilja i primenjuju u praksi, su bakteriofagi ili jednostavnije fagi (Flaherty i sar., 2001; Balogh i sar., 2003; Obradović i sar., 2006). Bakteriofagi žive na račun ćelije domaćina te bakterija u koju je dospeo fag počinje da bubri pri čemu dolazi do pucanja ćelijske membrane (lizis) i oslobađanja velikog broja čestica faga. Odmah nakon otkrića, s početka prošlog veka, fagi su privukli pažnju svojom sposobnošću da parazitiraju ćelije bakterija i tako utiču na redukciju njihove populacije u životnoj sredini. Nedovoljno poznavanje biologije i ekologije bakteriofaga imalo je za posledicu ograničen uspeh početnih istraživanja njihove primene u terapiji bolesti prouzrokovanih patogenim bakterijama. Tretman fagima je deo standardnog programa integralne zaštite paradajza od bakteriozne pegavosti na Floridi i južnim delovima SAD-a (Momol i sar., 2002; Jones i sar., 2006). Imajući u vidu heterogenost populacije Xanthomonas spp. patogena paprike i paradajza (Jones i sar., 2004) kao i njihovo prisustvo i štetnost, naročito u proizvodnji paprike u nas (Obradović i sar., 2004b), utvrđivanje prisustva specifičnih bakteriofaga u rejonima gajenja paprike u Srbiji i proučavanje mogućnosti njihove primene u suzbijanju patogena imalo bi višestruk kako naučni tako i praktični značaj. Prema literaturnim podacima primena bakteriofaga samih ili u kombinaciji sa aktivatorima otpornosti, ukazuju na mogućnost razvoja efikasne strategije za suzbijanje bakteriozne pegavosti paprike (Balogh, 2002; Jones i sar., 2006). Obradović i sar. (2002, 2004a, 2004b), su ispitivali efikasnost specifičnih bakteriofaga i aktivatora otpornosti (preparat Actigard 50 WG) za suzbijanje ovog patogena u usevu paradajza, pri čemu je postignuta imunizacija paradajza prema bakteriji. Ispitivanja izvođena u severnoj i centralnoj Floridi (SAD) u uslovima suptropske klime, tokom jeseni 2001. i proleća 2002. godine, korišćenjem acibenzolar-S-metil-a u kombinaciji sa bakteriofagima, značajno su redukovali bakterioznu pegavost u odnosu na ostale tretmane (Balogh i sar., 2003). Grupisanjem tretmana gde su primenjivane kombinacije sa bakteriofagima utvrđeno je da Doktorska disertacija Pregled literature 32 se prinos značajno razlikuje u odnosu na tretmane bez bakteriofaga (Balogh i sar., 2003; Obradović i sar. 2004b). Neinfektivna imunizacija se može ostvariti i fungicidima (acetil-Al, benomil, cineb, metalaksil, triazol, probenazol i dr.), makro i mikro elementima, materijama rasta i dr. Pod uticajem ovih sredstava kod biljaka se povećava sinteza belančevina, fenola i glikozida koji su sposobni da inhibiraju aktivnost enzima patogena. U odnosu na fitopatogene bakterije fagi mogu biti specifični, što je slučaj kod bakterija roda Xanthomonas. Stoga se specifični fagi mogu koristiti i u identifikaciji fitopatogenih bakterija. Zahvaljujući visokoj specifičnosti odnosa virus – bakterija domaćin, fagi su omogućili razlikovanje usko povezanih grupa fitopatogenih bakterija kao i rasa ili patogenih varijeteta iste bakterijske vrste i tako značajno doprineli klasifikaciji i identifikaciji patogenih bakterija (Klement i sar., 1990; Arsenijević, 1997). Na osnovu istraživanja u svetu i kod nas i obzirom na dinamiku populacije bakterija Xanthomonas spp. kompleksa, postoji potreba za stalnim praćenjem i proučavanjem bakteriozne pegavosti paprike kod nas, u cilju unapređenja proizvodnje i to pre svega stvaranjem manje osetljivih sorti prema patogenu. Doktorska disertacija Ciljevi istraživanja 33 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Polazna osnova ovih istraživanja je da struktura populacije prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike nije homogena. Obzirom da se po najnovijoj sistematici, kao prouzrokovači bakteriozne pegavosti paprike navode tri vrste bakterija Xanthomonas spp.: X. euvesicatoria, X. vesicatoria i X. gardneri, cilj rada bio je:  utvrđivanje sastava populacije prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike korišćenjem konvencionalnih i savremenih metoda proučavanja  utvrđivanje distribucije i areala rasprostranjenosti u agroekološkim uslovima Republike Srbije  utvrđivanje prisustva prirodnih neprijatelja koji prate populaciju bakterije  utvrđivanje osetljivosti, odnosno, rezistentnosti sojeva bakterije prema odabranim baktericidima  uzimajući u obzir postojanje 11 fizioloških rasa u svetu, jedan od ciljeva ovog rada je ustanovljavanje i identifikacija rasnog sastava, što je od presudnog značaja sa aspekta zaštite oplemenjivanjem i stvaranjem otpornih linija i sorti. Imajući u vidu heterogenost populacije Xanthomonas spp. patogena paprike kao i njihovo prisustvo i štetnost, naročito u proizvodnji u nas, utvrđivanje sastava populacije bakterija u Srbiji imalo bi višestruk kako naučni tako i praktični značaj. Doktorska disertacija Materijal i metode 34 4. MATERIJAL I METODE Eksperimentalni rad izveden je na Poljoprivrednom fakultetu Univerziteta u Beogradu - Zemunu (Institut za fitomedicinu, katedra za fitopatologiju) i Institutu za ratarstvo i povrtarstvo u Novom Sadu, Laboratoriji za ispitivanje semena. Kao predmet istraživanja odabrano je 116 sojeva poreklom iz obolelih biljaka paprike, izolovanih u periodu od 2008 - 2010. godine. Bakterijske kulture su održavane periodičnim presejavanjem na podlogu od hranljivog agara (HA), i čuvane u vidu suspenzije u sterilnoj tekućoj vodi, u mikroepruvetama (V = 1500µl), pri 5ºC (Schaad i sar. 2001). U svim testovima korišćene su sveže kulture bakterija, stare 24 časa, gajene na hranljivom agaru pri 26ºC. Doktorska disertacija realizovana je u okviru projekta Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja, Republike Srbije, TR31030, pod nazivom: «Stvaranje sorata i hibrida povrća za gajenje na otvorenom polju i zaštićenom prostoru». 4.1. IZOLACIJA PATOGENA I KONTROLNI SOJEVI KORIŠĆENI U RADU U cilju prikupljanja sojeva patogena, prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike u Srbiji, tokom proleća i leta 2008, 2009 i 2010 godine, izvršen je pregled useva paprike u najvažnijim regionima gajenja ove vrste kod nas. Prikupljeni su uzorci obolelelih biljaka sa karakterističnim simptomima bakteriozne pegavosti, sa različitih sorti paprike, iz 35 lokaliteta: Bačka Palanka, Bašaid, Čačak, Čelarevo, Despotovo, Gložan, Gospođinci, Horgoš, Kikinda, Kraljevo, Kucura, Kula, Lalić, Leskovac, Novi Kneževac, Odžaci, Pivnice, Ratkovo, Ruski Krstur, Šabac, Selenča, Senta, Silbaš, Smederevo, Smederevska Palanka, Sombor, Stanišić, Stapar, Subotica, Topola, Tovariševo, Trstenik, Velika Plana, Vrbas i jednog u Hrvatskoj (Vukovar). Uzorci su transportovani u laboratoriju u papirnim kesama, gde je dalje izvršena izolacija patogena. Obolelo lišće paprike prvo je oprano pod mlazom tekuće vode i osušeno na sterilnom filter papiru. Izolacija je obavljena maceracijom fragmenata lista, uzetih na prelazu zdravog i obolelog dela tkiva. Nakon par minuta, zasejavanje je obavljeno Doktorska disertacija Materijal i metode 35 razmazom macerata, bakteriološkom petljom po podlozi od kvaščevog ekstrakta, glukoze i CaCO3 (YDC) u Petri-posudama (R=9 cm) (Schaad, 1988; Arsenijević, 1997). Zasejane podloge su inkubirane pri 26oC, 3 - 4 dana. Za proučavanja odabrane su pojedinačne žute, sluzaste kolonije, prečnika 2 - 3 mm, tipične za rod Xanthomonas. Kao kontrolni poslužili su sojevi iz drugih kolekcija: Nacionalne kolekcije fitopatogenih bakterija Velike Britanije, Instituta za fitomedicinu, Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu i Instituta za zaštitu bilja i životne sredine, Beograd (Tabela 4). Tabela 4. Kontrolni sojevi bakterija korišćeni u testovima Šifra izolata Naziv bakterije Kolekcija NCPPB 881 Xanthomonas gardneri National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, Central Science Laboratory, Sand Huton, York, UK NCPPB 1423 Xanthomonas vesicatoria NCPPB 4321 Xanthomonas perforans NCPPB 3318 Pseudomonas syringae pv. glycinea KFB 1 KFB 13 KFB 189 Xanthomonas euvesicatoria Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet (prof. dr Aleksa Obradović) KFB 062 Xanthomonas vesicatoria B 130 Pseudomonas fluorescens KFB 85 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum TX11 Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli Institut za zaštitu bilja i životne sredine, Odsek za bolesti bilja, Beograd (dr Tatjana Popović) VŠ-BC-1 OTM-3 MAL-1 KŠ-23 Pseudomonas syringae pv. syringae Institut za zaštitu bilja i životne sredine, Odsek za bolesti bilja, Beograd (dr Veljko Gavrilović) Doktorska disertacija Materijal i metode 36 4.2. PATOGENE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA Proučavanje patogenih odlika sojeva izvršeno je na biljkama paprike sorte Kalifornijsko čudo. Proverena je i sposobnost prouzrokovanja hipersenzitivne reakcije na biljakama duvana sorte Samsun. 4.2.1. Inokulacija biljaka paprike Za proveru patogenosti proučavanih sojeva korišćena je sorta Kalifornijsko čudo. Seme paprike posejano je u plastične kutije prethodno napunjene mešavinom sterilnog supstrata (Klasmann 2) i sterilnog peska u odnosu 3:1. Nakon nicanja, biljke su presađene u plastične čaše i gajene uz smenu svetla i tame na 12 sati. Inokulacija biljaka izvršena je metodom infiltracije suspenzije bakterija pomoću medicinskog šprica, u tkivo između nerava petog ili šestog stalnog lista paprike (Obradović i sar., 2000). Za pripremu inokuluma korišćene su kolonije bakterija starosti 24 časa. Pun zahvat kolonije suspendovan je u sterilnoj destilovanoj vodi do koncentracije približno 108 CFU/ml. Nakon inokulacije, biljke paprike su održavane u laboratorijskim uslovima pri temperaturi oko 25°C. Promene su praćene svakodnevno, tokom 10 dana od inokulacije. Kao pozitivna kontrola korišćene su biljke paprike inokulisane kontrolnim sojem bakterije X. euvesicatoria (KFB 189). Kao negativna kontrola poslužile su biljke paprike tretirane sterilnom destilovanom vodom. 4.2.2. Hipersenzitivna reakcija duvana Lišće duvana sorte Samsun inokulisano je suspenzijom bakterija (~108 CFU/ml), pomoću medicinskog šprica, u tkivo između nerava sa naličja lista (Klement, 1990). Kao pozitivna kontrola korišćeno je lišće duvana inokulisano kontrolnim sojem bakterije X. euvesicatoria (KFB 189). Kao negativna kontrola poslužilo je lišće duvana u koje je izvršena infiltracija sterilne destilovane vode (Arsenijević, 1997). Biljke duvana održavane Doktorska disertacija Materijal i metode 37 su u laboratorijskim uslovima pri temperaturi oko 25°C, a pojava hipersenzitivne reakcije ocenjena je nakon 24 časa. 4.3. MORFOLOŠKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA 4.3.1. Razlikovanje bakterija po Gramu pomoću KOH testa U cilju utvrđivanja morfoloških odlika izolata primenjen je posredni metod sa 3% KOH. Jedan pun zahvat bakterijske kolonije, prenese se sterilnom bakteriološkom petljom na mikroskopsku pločicu i izmeša u kapi 3% rastvora KOH. Pod uticajem baza, ukoliko je bakterija Gram - negativna, dolazi do pucanja ćelijskog zida i oslobađanja nukleinske kiseline, usled čega kap postaje sluzaste konzinstencije. To se potvrđuje podizanjem bakteriološke petlje od površine pločice pri čemu se formira elastična nit u vidu ″končića″, za razliku od Gram - pozitivnih bakterija (Schaad i sar., 2001). Kao kontrolni izolat korišćena je Gram - negativna bakterija P. s. pv. glycinea (NCPPB 3318). 4.3.2. Posmatranje morfologije transmisionim elektronskim mikroskopom Ćelije bakterija posmatrane su elektronskim mikroskopom u Centru za elektronsku mikroskopiju Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu (Katedra za biologiju, prof. dr Aleksandra Korać). Uzorci bakterija podvrgnuti su standardnoj proceduri pripreme za transmisionu elektronsku mikroskopiju koja obuhvata fiksaciju u 2.5% rastvoru glutaraldehida u fosfatnom puferu (0.1 M, pH 7.2), ispiranje u fosfatnom puferu i postfiksaciju u 2% rastvoru osmijum-tetraoksida (OsO4) u istom puferu. Potom su uzorci dehidratisani serijom rastućih koncentracija etanola, prosvetljeni u propilen-oksidu i ukalupljeni u epoksidnoj Araldit smoli (Fluka, Nemačka). Za transmisionu elektron- mikroskopsku (TEM) analizu, aralditski kalupi tkiva su istrimovani i isečeni dijamantskim nožem (Diatome, Švajcarska) na tanke preseke debljine 70 nm, na UC6 ultramikrotomu (Leica Microsystems, Nemačka). Preseci su montirani na bakarne ili bakar-paladijumske mrežice, kontrastirani uranil acetatom i olovo citratom u EM Stain aparatu (Leica Doktorska disertacija Materijal i metode 38 Microsystems, Nemačka), a potom posmatrani na CM12 transmisionom elektronskom mikroskopu pri uveličanju od x2000-x25000 (Philips/FEI, Holandija) i snimani kamerom MegaView III (Olympus, Nemačka). 4.4. ODGAJIVAČKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA Odgajivačke odlike bakterija proučene su posmatranjem izgleda kolonija na različitim hranljivim podlogama. Ocenjen je razvoj bakterija u tečnoj (YS) podlozi pri 37°C na, kao i uticaj različitih koncentracija NaCl i trifenil-tetrazolium hlorida (TTC). 4.4.1. Izgled kolonija na hranljivim podlogama Za proučavanja odgajivačkih odlika sojeva korišćene su standardne i poluselektivne podloge. Posmatran je izgled formiranih kolonija kao što su: boja, oblik, veličina, konzistencija, ispupčenost i sjaj. Zabeležene su promene u podlogama oko formiranih kolonija proučavanih sojeva. Od standardnih podloga korišćene su: YDC (Yeast extract dextrose calcium carbonate agar) (Schaad i sar. 2001) i MPA (Mesopeptonski agar) (Fahy i Persley, 1983), a od poluselektivnih: mSQ (Schaad i sar. 2001), TTCA (Kelman, 1954), Tween B i Milk - Tween (MT) (Goszczynska i Serfontein, 1998). Zasejavanje proučavanim sojevima obavljeno je metodom razmaza po površini podloge pomoću bakteriološke petlje. Porast bakterijskih kolonija praćen je svakodnevno tokom 5 dana pri temperaturi 26°C . 4.4.2. Uticaj temperature na porast bakterija Za proučavane razvoja bakterija pri 37°C, korišćena je tečna podloga od kvaščevog ekstrakta i neorganskih soli (YS) (Fahy i Persley, 1983). Podloga je razlivena u epruvete u količini od 10 ml. Nakon sterilizacije i hlađenja do 37°C, podloga je zasejana punim zahvatom čiste kulture proučavanih sojeva u dva ponavljanja. Zasejana podloga je postavljena u vodeno kupatilo prethodno zagrejano do 37°C. Uticaj temperature na porast Doktorska disertacija Materijal i metode 39 bakterija praćen je tokom 7 dana nakon čega je ocenjeno prisustvo ili odsustvo razvoja bakterija. Kao pozitivna kontrola korišćena je podloga zasejana sojem X. euvesicatoria (KFB 189). Nezasejana podloga poslužila je kao negativna kontrola. Zamućenje podloge usled razvoja bakterija smatra se pozitivnom reakcijom, a ukoliko podloga ostaje bistra, bez zamućenja, nema razvoja, reakcija je negativna. 4.4.3. Tolerantnost prema NaCl Ocena porasta kolonija izvršena je u tečnoj podlozi od kvaščevog ekstrakta i neorganskih soli (YS) sa dodatkom NaCl koncentracija 5% i 7% (Fahy i Persley, 1983). Nakon sterilizacije i hlađenja, podloge su zasejavane punim zahvatom čiste kulture proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Razvoj bakterija u podlozi praćen je svakodnevno tokom 7 dana pri 26°C, nakon čega je ocenjeno prisustvo ili odsustvo razvoja bakterija. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj bakterije Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (KFB 85). Kao negativna kontrola korišćene su nezasejane podloge obe koncentracije. 4.4.4 Tolerantnost prema trifenil-tetrazolium hloridu Za izvođenje ovog testa korišćena je osnovna (NA) podloga u koju se, nakon autoklaviranja i hlađenja do 50°C, aseptično filtriranjem (»Sterile syringae filter«, Cronus- FSPS2602-50) dodaje 5% vodeni rastvor trifenil-tetrazolijum hlorida do konačne koncentracije 0,1% ili 0,02%. Nakon razlivanja u Petri posude, zasejavanje proučavanih sojeva izvršeno je pipetiranjem po 3 µl bakterijske suspenzije (približno 108 CFU/ml) u vidu kapi, proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Porast kolonija posmatran je tokom 4 dana pri 26ºC (Arsenijević, 1997). Kao kontrola korišćena je osnovna podloga bez dodatka trifenil-tetrazolijum hlorida. Kao negativna kontrola korišćene su nezasejane podloge obe koncentracije. Doktorska disertacija Materijal i metode 40 4.5. BIOHEMIJSKO-FIZIOLOŠKE ODLIKE SOJEVA Proučene su biohemijsko-fiziološke odlike sojeva: aktivnost oksidaze i katalaze; redukcija nitrata; hidroliza želatina, eskulina i skroba; aktivnost pektolitičkih fermenata; metabolizam glukoze (O/F test); stvaranje kiseline iz glukoze, galaktoze, manoze i dekstrina; korišćenje cis-akonitinske kiseline (Fahy i Persley, 1983; Lelliott i Stead, 1987; Klement i sar., 1990; Arsenijević, 1997; Schaad i sar., 2001). 4.5.1. Aktivnost oksidaze Za dokazivanje aktivnosti oksidaze korišćene su trake pripremljene u Institutu za virusologiju; vakcine i serume "Torlak" – Beograd. U prisustvu citohrom oksidaze (bakterija koje poseduju ovaj enzim) dolazi do oksidacije tetrametil-p-fenildiamina i stvaranja indofenola što se zapaža pojavom plavo-ljubičaste boje na traci (Kovacs, 1956). Postupak se sastoji u tome što se trake prenesu na sterilnu površinu. Pre upotrebe trake se navlaže sa po jednom kapi sterilne vode, a potom se sterilnim staklenim ili drvenim štapićem prenese deo kolonije proučavanih sojeva, ponaosob u dva ponavljanja. Posle 30 - 40 sekundi javlja se plavo-ljubičasta boja (pozitivna reakcija) ili traka ne menja boju (negativna reakcija). Očitavanje je potrebno obaviti u roku od dva minuta od trenutka nanošenja kolonije na traku. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj bakterije P. fluorescens (B 130), a kao negativna kontrolni soj bakterije P. s. pv. glycinea (NCPPB 3318). 4.5.2. Stvaranje katalaze Za dokazivanje stvaranja katalaze korišćen je 20% vodonik-peroksid (H2O2). Bakteriološkom petljom pun zahvat čiste kulture proučavanih sojeva nanošen je na mikroskopske pločice na koje je potom dodata kap vodonik-peroksida. Test je pozitivan, ukoliko se pojave mehurići gasa koji nastaju kao rezultat izdvajanja kiseonika zbog prisustva fermenta katalaze u ispitivanoj kulturi (Lelliot i Stead, 1987). Kao pozitivna kontrola korišćen je soj P. s. pv. glycinea (NCPPB 3318). Doktorska disertacija Materijal i metode 41 4.5.3. Redukcija nitrata Sposobnost razlaganja nitrata proučena je zasejavanjem bakterija ubodom u po dve epruvete sa NA podlogom uz dodatak KNO3. Nakon zasejavanja epruvete se zaliju sterilnim 3% vodenim agarom (Fahy i Hayward, 1983). Razvoj bakterija nakon pet dana pri 26ºC ukazuje na pozitivan rezultat testa i redukciju nitrata (Sands, 1990). Kao pozitivna kontrola korišćen je soj Pseudomonas fluorescens (B 130), a kao negativna kontrola poslužile su nezasejane podloge. 4.5.4. Hidroliza želatina Za proučavanje sposobnosti razgradnje (hidrolize) želatina, po 5 ml podloge od kvaščevog ekstrakta, peptona i želatina (pH 7) razliveno je u epruvete. Nakon sterilizacije i hlađenja, podloge su zasejavane punim zahvatom čiste kulture proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Rezultati su očitavani nakon 3, 7, 14 i 21 dan. Pre očitavanja epruvete sa podlogom se postavljaju u frižider pri temperaturi 4ºC u trajanju 30 minuta. Ukoliko nakon tog perioda ne dođe do očvršćavanja podloge to je znak da je zasejani soj razložio želatin usled proteolitičke aktivnosti bakterija (Lelliott i Stead, 1987). Kao pozitivna kontrola korišćen je soj P. s. pv. glycinea (NCPPB 3318), a kao negativna kontrola - nezasejana podloga. 4.5.5. Hidroliza eskulina Za ovaj test korišćena je osnovna podloga (NA) sa dodatkom eskulina. Nakon sterilizacije i hlađenja, podloge su zasejavane punim zahvatom čiste kulture proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Inkubacija je obavljena tokom 10 dana, pri 26ºC. Pozitivnu reakciju označava pojava promene boje podloge u tamnomrku ili crnu (Lelliott i Stead, 1987). Kao pozitivna kontrola korišćen je soj bakterije X. a. pv. phaseoli (TX 11), a kao negativna kontrola nezasejana podloga. Doktorska disertacija Materijal i metode 42 4.5.6. Hidroliza skroba Za proučavanje amilolitičke aktivnosti korišćena je osnovna podloga (NA) sa dodatkom rastvorljivog skroba (Lelliott i Stead, 1987). Nakon razlivanja u Petri posude, izvršeno je zasejavanje proučavanim sojevima u dva ponavljanja. Inkubacija je obavljena tokom 7 dana, pri 26ºC. Nakon sedam dana oko formiranih kolonija proučavanih sojeva doda se nekoliko kapi Lugolovog rastvora. Pojava žute boje oko bakterijske kolonije označava pozitivnu reakciju, koja ukazuje da je došlo do hidrolize skroba dejstvom amilolitičkih fermenata. Pojava plave boje oko kolonije ukazuje da skrob nije hidrolizovan i označava negativnu reakciju. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj bakterije X. a. pv. phaseoli (TX 11). 4.5.7. Pektolitička aktivnost na kriškama krompira Za ispitivanje pektolitičke aktivnosti proučavanih sojeva korišćene su oprane, oljuštene i pomoću alkohola dezinfikovane krtole krompira, koje su poprečno isečene na manje kriške debljine 7 - 8 mm. Kriške su postavljene u sterilne Petri posude a potom prelivene sterilnom destilovanom vodom do polovine visine kriški. Deo kolonije bakterije sa hranljivog agara nanet je bakteriološkom petljom na površinu kriške. Pojava razmekšavanja tkiva usled aktivnosti pektolitičkih fermenata, nakon 24 časa, predstavlja pozitivan test (Arsenijević, 1997). Kao pozitivna kontrola korišćen soj Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (KFB 85). Neinokulisane kriške krompira korišćene su kao negativna kontrola. 4.5.8. Oksidativno-fermentativni metabolizam glukoze Sposobnost bakterija da u aerobnim ili anaerobnim uslovima stvaraju kiselinu iz glukoze ispitana je prema metodici koju su predložili Hugh i Leifson (1953). U 4,5 ml osnovne podloge, nakon autoklaviranja aseptično je dodato 0,5 ml 10% vodenog rastvora glukoze, tako da konačna koncentracija bude 1%. Ubodom su zasejavane po četiri epruvete Doktorska disertacija Materijal i metode 43 svakim sojem ponaosob, od kojih se po dve zaliju sterilnim tečnim parafinom do visine sloja 15 mm. Razlaganjem glukoze od strane bakterija u aerobnim (O) i/ili anaerobnim (O/F ili F tip) uslovima dolazi do stvaranja kiseline i promene pH vrednosti podloge, što prouzrokuje i promenu boje podloge u žutu. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (KFB 85), a kao negativna kontrola nezasejane podloge. Očitavanje rezultata je vršeno trećeg i sedmog dana (Arsenijević, 1997). 4.5.9. Stvaranje kiseline iz ugljenih hidrata Razgradnja glukoze, galaktoze, manoze i dekstrina, proučena je korišćenjem osnovne Dye-ove podloge (Dye, 1968), u koju se nakon sterilizacije i hlađenja (50C), aseptično dodaju 10% rastvori ugljenih hidrata, do konačne koncentracije 1%. Ubodom su zasejavane epruvete, punim zahvatom čistih kultura proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Promena boje podloge u žutu, koja nastaje usled stvaranja kiseline aktivnošću bakterija, označava pozitivnu reakciju. Očitavanje rezultata vršeno je nakon 7, 14 i 21 dan. Za poređenje su korišćene podloge zasejane kontrolnim sojevima X. vesicatoria (NCPPB 1423), X. gardneri (NCPPB 881), X. perforans (NCPPB 4321) i X. euvesicatoria (KFB 189). Kao negativna kontrola korišćena je nezasejana podloga. 4.5.10. Korišćenje cis-akonitinske kiseline U osnovnu Dye-ove podlogu se nakon sterilizacije i hlađenja (50C), aseptično dodaje 10% rastvor cis-akonitinske kiseline do konačne koncentracije 0,5 % (O´Garro, 1998). Podloge se razlivaju u Petri posude i nakon očvršćavanja zasejavaju sa po 3 µl bakterijske suspenzije (~ 108 CFU/ml) proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Inkubacija je obavljena tokom 5 dana pri 26ºC. Pozitivnim su ocenjeni sojevi kod kojih je zabeležen porast. Kao kontrolni korišćeni su sojevi: X. vesicatoria (NCPPB 1423), X. gardneri (NCPPB 881), X. perforans (NCPPB 4321) i X. euvesicatoria (KFB 189). Kao negativna kontrola poslužila je nezasejana podloga. Doktorska disertacija Materijal i metode 44 4.6. SEROLOŠKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA U ovom radu korišćene su dve serološke metode: DAS - ELISA test (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assay) i test aglutinacije. 4.6.1. DAS - ELISA test Korišćenjem poliklonalnih antiseruma bakterije X. c. pv. vesicatoria (LOEWE Biochemica GmbH, Germany) DAS - ELISA (Double Antibody Sandwich - Enzyme Linked Immunosorbent Assay) test je izveden po uputstvu proizvođača (Tabela 5). U testu su korišćene polistirenske mikrotitarske ploče Nunc sa 96 (8 x 12) bunarčića (Šema 2). Svi proučavani sojevi testirani su u dva ponavljanja. Promena boje je praćena vizuelno, a zatim i automatskim merenjem ekstinkcije pri talasnoj dužini 405 nm (Multiskan Ascent, Thermo Labsystems, Helsinki, Finland). Dobijene vrednosti očitanih ekstinkcija pri talasnoj dužini 405 nm, izražavaju se kao srednja vrednost dva ponavljanja, za svaki soj ponaosob, uključujući kontrole. Pozitivnim reakcijama smatraju se vrednosti čija je ekstinkcija najmanje dva puta viša od srednje vrednosti negativne kontrole tzv. ″cut-off″ vrednosti (Krstić i Tošić, 1994). Doktorska disertacija Materijal i metode 45 Tabela 5. Procedura za izvođenje DAS - ELISA testa po protokolu proizvođača (LOEWE Biochemica GmbH, Germany) Procedura Reagens Zapremina (1 otvor) Vreme inkubacije Temperatura inkubacije Ispiranje Inkubacija antitela Antitela (IgG) razređena u odnosu 1:200 u puferu za oblaganje ploče 200 µl 4 sata 37°C Pufer za ispiranje Formiranje kompleksa antitelo - antigen Uzorci i kontrole u ekstrakciono/konjugatnom puferu 200 µl Tokom noći 4°C Pufer za ispiranje Primena konjugata AP - konjugat razređen u ekstrakciono/konjugatnom puferu u odnosu 1:200 200 µl 4 sata 37°C Pufer za ispiranje Enzimska reakcija Supstratni rastvor 1mg p-nitrofenil fosfata u 1 ml supstratnog pufera 200 µl 1-2 sata Sobna temperatura - Napomena: Svi puferi i rastvori pripremljenii su neposredno pre izvođenja testa. Šema 2. Prikaz rasporeda proučavanih sojeva na mikrotitarskim pločama 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Ponavljanje B I Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci K+ C II Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci K+ D I Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci B E II Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci B F I Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci K- G II Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci Uzorci K- H Napomena: U bunarčiće prve i poslednje kolone, kao i prvog i drugog reda na ploči nisu nanošeni uzorci da bi se izbegla eventualna pojava većih vrednosti ekstinkcija prilikom očitavanja. Uzorci predstavljaju suspenzije bakterija proučavanih sojeva. Doktorska disertacija Materijal i metode 46 4.6.2. Metod aglutinacije Metod aglutinacije je serološki test koji se zasniva na formiranju makromolekula, kao rezultata reakcije srodnih antitela i antigena, što se zapaža u vidu pahuljastog taloga. Za ovaj test korišćena su antitela specifična za bakteriju X. c. pv. vesicatoria, uključujući pozitivnu i negativnu kontrolu (ADGEN NEOGENEUROPE Ltd., Scotland, UK) (Slika 7). Postupak se sastoji u tome da se čiste kulture proučavanih sojeva pomoću drvene čačkalice prenesu u pripremljenu kap test reagensa, koji je prethodno nanet na test pločice u dva ponavljanja. Nakon homogenizacije kolonije i reagensa, ukoliko je reakcija pozitivna, dolazi do pojave granuloznog taloga (aglutinacija) u centru kapi, nakon 60 sekundi. U slučaju negativne reakcije, kap test reagensa ostaje prozirna, bez taloga. Rezultati su kvantitativni, vidljivi golim okom ili uz korišćenje ručne lupe. Slika 7. Komplet za izvođenje testa aglutinacije sa specifičnim antitela bakterije X. c. pv. vesicatoria, sa pozitivnom i negativnom kontrolom Doktorska disertacija Materijal i metode 47 4. 7. MOLEKULARNE METODE PROUČAVANJA Diferencijacija Xanthomonas spp. prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike izvršena je primenom dve molekularne metode. Za pripremu uzorka DNK, korišćene su sveže kulture bakterija gajene na NA podlozi tokom 24 časa. Za svaki soj, pojedinačna kolonija je suspendovana u 100 µl sterilne destilovane vode u mikrotubama. Zatvorene mikrotube zagrevane su pri 95ºC u trajanju od 15 minuta, a potom odmah prebačene na led i nakon hlađenja centrifugirane na 11000 rpm, 5 minuta. 4.7.1. Restrikciona analiza - RFLP Poređenje proučavanih sojeva u pogledu građe DNK, izvršeno je primenom restrikcione analize - RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), prema metodi koju opisuju Obradović i sar. (2004). Eksperimentalni deo izveden je u dve faze: prvo je izvršeno umnožavanje hrpB regiona DNK proučavanih sojeva prajmerima RST65 i RST69; a potom je obavljena digestija dobijenih PCR proizvoda restrikcionim enzimima CfoI, TaqI i HaeIII. Za elektroforetsko razdvajanje produkata restrikcije korišćen je 4% agarozni gel. Izvršena je restrikciona analiza kontrolnih sojeva bakterije X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. perforans i X. gardneri, kao i sojeva koji pripadaju različitim fiziološkim rasama. 4.7.1.1. Umnožavanje hrp gena Umnožavanje hrp (HrpB regiona DNK) gena proučavanih i kontrolnih sojeva obavljena je prajmerima RST65 i RST69 primenom lančane reakcije polimeraze (Tabela 6). Reakciona smeša, zapremine 25 µl, sastoji se od: 12,5 µl Master Mix Fermentas - Litvanija (Taq DNK polimeraza 0,05 U/µl, 4 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP); 0,5 µl svakog prajmera finalne koncentracije 0,2 µM; 10,5 µl H2O i 1 µl DNK. Uslovi PCR reakcije podešeni su prema programu prikazanom u tabeli 7. Dobijeni produkti su razdvojeni elektroforezom na 1,5% agaroznom gelu koji sadrži etidijum-bromid (0,5 g/ml) u 1xTBE puferu, u trajanju od 30 minuta, pri konstantnom Doktorska disertacija Materijal i metode 48 naponu od 100 V i maksimalnoj jačini struje od 5 V/cm. Na gel, u bunarčiće, nanošeno je po 10 l PCR produkata. Fotografisanje je izvršeno primenom DOC Print sistema (VILBER Lourmat, Francuska). Pozitivnom reakcijom smatrani su detektovani proizvodi veličine 420 bp, uz uslov da isti nisu zabeleženi u uzorcima koji predstavljaju negativnu kontrolu i blank. Tabela 6. Prajmeri korišćeni za umnožavanje DNK (Obradović i sar., 2004a) Tabela 7. Uslovi PCR reakcije (Leite i sar., 1995) Stadijum reakcije Temperatura (ºC) Vreme Ciklusi Početna denaturacija 94 5 min 1 Denaturacija 95 30 sek x30 Aniling 62 30 sek Ekstenzija 72 45 sek Završna ekstenzija 72 5 min 1 4.7.1.2. Digestija restrikcionim enzimima Drugi korak primenom ove metode sastoji se u digestiji dobijenih PCR proizvoda (420 bp) restrikcionim enzimima CfoI, TaqI i HaeIII (Fermentas Life Science). Uslovi digestije PCR proizvoda restrikcionim enzimima prikazani su u Tabeli 8. Nakon digestije enzimima, dobijeni fragmenti razdvojeni su na 4% agaroznom gelu koji sadrži etidijum-bromid (0,5 g/ml) u 1xTBE puferu. U bunarčiće gela pipetirano je po 10 l produkta. Razdvajanje je izvršeno elektroforezom u trajanju 60 minuta, pri Prajmeri Sekvenca (5´....3´) Veličina baznog para RST 65 GTC GTC GTT ACG GCA AGG TGG TCG 420 bp RST 69 TCG CCC AGC GTC ATC AGG CCA TC Doktorska disertacija Materijal i metode 49 konstantnom naponu 100 V i maksimalnoj jačini struje 5 V/cm. Gel je posmatran na UV transluminatoru i fotografisan pomoću DOC Print sistema (VILBER Lourmat, Francuska). Jedinstvena kombinacija (otisak) restrikcionih fragmenata karakteristična je za svaku vrstu Xanthomonas spp. ponaosob. Dobijeni restrikcioni profili upoređivani su sa profilima kontrolnih sojeva: X. vesicatoria (NCPPB 1423), X. gardneri (NCPPB 881), X. perforans (NCPPB 4321), X. euvesicatoria (KFB 189; KFB 13), kao i sa rezultaima datim od strane Obradović i sar. (2004). Tabela 8. Restrikcioni enzimi i uslovi za digestiju PCR proizvoda nakon amplifikacije Enzimi Kompatibilni enzimi* Mesto sečenja Sastav smeše za digestiju** Inkubacija (5 h) CfoI AspLEI, BstHHI, HhaI …GCG C… …C GCG… 1. PCR proizvoda 10 µl 2. voda bez nukleaze 18 µl 3. 10x Buffer R 2 µl 4. enzim 2 µl 37ºC TaqI Nema ...T CGA... ...AGC T... 65ºC HaeIII BshFI, BspANI, BsuRI,PhoI …GG CC… …CC GG… 37ºC Napomena: *Kompatibilni enzimi predstavljaju adekvatnu zamenu navedenim restrikcionim enzimima **Sastav smeše za digestiju prikazan u tabeli odnosi se na jednu reakciju. 4.7.2. Diferencijacija bakterija Xanthomonas spp. primenom specifičnih prajmera Diferencijacija proučavanih sojeva izvršena je molekularnom metodom uz primenu specifičnih prajmera za vrste Xantomonas spp. ponaosob, prema Koenraadt i sar. (2009). Korišćeni prajmeri prikazani su u Tabeli 9, a uslovi PCR reakcija prikazani su u Tabeli 10. Reakciona smeša, zapremine 25 µl, sastoji se od: 12,5 µl Master Mix Fermentas - Lithuania (Taq DNK polimeraza 0,05 U/µl, 4mM MgCl2, 0,4mM dNTP); po 0,5 µl svakog prajmera finalne koncentracije 0,2 µM; 9,5 µl H2O i 2 µl DNK. Mikrotubice sa reakcionom smešom, Doktorska disertacija Materijal i metode 50 homogenizovane su i prenete u blok PCR aparata Mastercycler ep gradient S (Eppendorf, Nemačka). Dobijeni produkti su razdvojeni elektroforezom na 1,5% agaroznom gelu koji sadrži etidijum-bromid (0,5 g/ml) u 1xTBE puferu, u trajanju od 30 minuta, pri konstantnom naponu od 100 V i maksimalnoj jačini struje od 5 V/cm. U gel je pipetirano po 10 l PCR produkata. Gel je posmatran na UV transluminatoru i fotografisan pomoću DOC Print sistema (VILBER Lourmat, Francuska). Pojava fragmenata očekivane veličine za svaku vrstu Xanthomonas spp. ponaosob smatrana je pozitivnom reakcijom, uz uslov da isti nisu zabeleženi u uzorcima koji predstavljaju negativnu kontrolu i blank. Tabela 9. Prajmeri korišćeni u radu Prajmer Sekvenca (5´........3´) Veličina baznog para Bakterija XeF CAT GAA GAA CTC GGC GTA TCG 173 bp X. euvesicatoria XeR GTC GGA CAT AGT GGA CAC ATA C XvF CCA TGT GCC GTT GAA ATA CTT G 138 bp X. vesicatoria XvR ACA AGA GAT GTT GCT ATG ATT TGC XpF GTC GTG TTG ATG GAG CGT TC 197 bp X. perforans XpR TGA CCG ATA AAG ACT GCG AAA G XgF TCA GTG CTT AGT TCC TCA TTG TC 154 bp X. gardneri XgR GTG CGA GTC AAT TAT CAG AAT GTG G Doktorska disertacija Materijal i metode 51 Tabela 10. Uslovi PCR reakcija Stadijum X. vesicatoria i X. gardneri X. euvesicatoria i X. perforans °C Vreme Ciklusi °C Vreme Ciklusi Inicijalna denaturacija 94 2 min 1 94 2 min 1 Denaturacija 94 30 sec 35 94 30 sec 35 Aniling 55 1 min 60 1 min Ekstenzija 72 1 min 72 1 min Finalna ekstenzija 72 5 min 1 72 5 min 1 4.7.2.1. Utvrđivanje praga osetljivosti PCR-a Osetljivost PCR metode proučavana je korišćenjem serije decimalnih razređenja soja RKFB 243 u sterilnoj destilovanoj vodi, počev od 0,4x108 do 0,4 CFU/ml. Gustina bakterijske suspenzije podešena je pomoću turbidimetra merenjem optičke gustine (OD=0.3) pri talasnoj dužini 600 nm. Koncentracija bakterija u uzorcima potvrđena je zasejavanjem razređenja bakterija na NA podlogu i brojanjem pojedinačnih kolonija dva dana kasnije (Klement i sar., 1990). Set prajmera XeF/XeR korišćen je za PCR reakciju (Tabela 9), prema programu prikazanom u tabeli 10. Doktorska disertacija Materijal i metode 52 4.8. UTVRĐIVANJE FIZIOLOŠKIH RASA Zastupljenost pojedinih fizioloških rasa među proučavanim sojevima određena je na osnovu reakcije biljaka paprike sorte Early Calwonder (ECW) i njenih izogenih linija: ECW-10 (Bs1), ECW-20 (Bs2), ECW-30 (Bs3), i biljaka paprike Capsicum pubescens PI235047 (Bs4) (Sahin i Miller, 1998; Stall i sar., 2009) (Tabela 11). Setva semena paprike je izvedena u plastične kutije (25x17 cm) napunjene smešom hranljivog supstrata (Klasmann 2) i sterilnog peska u odnosu 3:1. Posejano je po 50 semena odabranih sorti i linija. Nakon setve, seme je prekriveno smešom hranljivog supstrata (Klasmann 2) i sterilnog peska, debljine oko 1 cm, a kutije su potom zatvorene plastičnim poklopcima i inkubirane u termostatu na 25ºC. Nakon nicanja, kutije su otvorene i izložene izvoru svetlosti naredna 24 časa. Potom, biljke su presađene u plastične čaše i gajene u kontrolisanim uslovima uz smenu svetla (16 časova) i tame (8 časova). Biljke, u fazi šestog - sedmog stalnog lista, pažljivo su odabrane, obeležene i pripremljene za inokulaciju. Gustina bakterijske suspenzije (~108 CFU/ml) podešena je pomoću turbidimetra merenjem optičke gustine (OD=0.3) pri talasnoj dužini 600 nm. Pripremljenom suspenzijom inokulacija biljaka izvedena je metodom ubrizgavanja suspenzije bakterija pomoću medicinskog šprica bez igle (Slika 8). Na taj način suspenzija ispuni interkostalni prostor, obično između dva nerva. Slika 8. Inokulacija metodom infiltracije bakterijske suspenzije pomoću medicinskog šprica Doktorska disertacija Materijal i metode 53 Promene na inokulisanim listovima praćene su svakodnevno tokom sedam dana. Pojava hiperzenzitivne reakcije, koja se ispoljava nakon 24 časa, nastaje ukoliko se radi o otpornom domaćinu koji poseduje gene otpornosti prema avirulentnim genima patogena (Minsavage i sar. 1990). Ukoliko biljka domaćin ne poseduje gene otpornosti, do promena dolazi obično nakon pet dana od izvršene inokulacije što je posledica kompatibilnog odnosa patogen - domaćin (Sahin i Miller, 1998; Stall i sar., 2009). Diferencijacija rasa na osnovu reakcije biljaka prikazana je u tabeli 11. Tabela 11. Diferencijacija rasa na osnovu reakcije biljaka (Stall i sar., 2009). Rase Funkcionalni avirulentni (avr) geni patogena Diferencijalne linije paprike ECW* ECW-10 Bs1 ECW-20 Bs2 ECW-30 Bs3 PI235047 Bs4 P0 avrBs1, avrBs2, avrBs3, avrBs4 S HR HR HR HR P1 avrBs2, avrBs3, avrBs4 S S HR HR HR P2 avrBs1, avrBs2 S HR HR S S P3 avrBs2, avrBs4 S S HR S HR P4 avrBs3, avrBs4 S S S HR HR P5 avrBs1 S HR S S S P6 avrBs4 S S S S HR P7 avrBs2, avrBs3 S S HR HR S P8 avrBs2 S S HR S S P9 avrBs3 S S S HR S P10 nema S S S S S * ECW-Early Calwonder ne poseduje gene otpornosti (osetljiva prema svim rasama patogena) ECW-10, ECW-20, ECW-30 izogene linije sorte Early Calwonder sa različitim genima otpornosti Bs PI235047 (C. pubescens) sa Bs4 genima otpornosti koja diferencira rasu P1i P7; P3 i P8; P4 i P9; P6 i P10. (S) - Osetljiva (kompatibilna) reakcija; (HR) - Otporna reakcija Doktorska disertacija Materijal i metode 54 4.9. PROUČAVANJE OSETLJIVOSTI GENOTIPOVA PAPRIKE PREMA PROUZROKOVAČU BAKTERIOZNE PEGAVOSTI U cilju proučavanja osetljivosti genotipova paprike izvedena su dva ogleda u uslovima zaštićenog prostora (staklenik Instituta za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad, Zavod za uljane kulture). Inokulacija biljkaka potapanjem izvedena je uz primenu dve koncentracije inokuluma (106 CFU/ml i 108 CFU/ml) odabranog soja X. euvesicatoria RKFB 263 rase (P8), po metodi koju opisuju Kousik i Ritchie (1996). Gustina bakterijske suspenzije (~108 CFU/ml) podešena je pomoću turbidimetra merenjem optičke gustine (OD=0.3) pri talasnoj dužini 600 nm. Ocena pojave i intenzitea simptoma u oba eksperimenta izvršena je nakon 7 i 14 dana. Za inokulaciju je odabrano 11 genotipova paprike: HS-2, Amfora, Plamena, Anita, Novosađanka, Palanačka babura, Palanačko čudo, Slonovo uvo, hibrid - Brillant F1, Bihar F1 i Boni. Kao kontrola uzeta je sorta Early Calwonder (ECW) osetljiva prema svim rasama patogena, a kao nosilac gena otpornosti Bs2 prema genu avirulentnosti patogena avrBs2 njena izogena linija ECW - 20. Setva semena je izvedena u smešu supstrata (Klasmann 2) i sterilnog peska u odnosu 3:1. Nakon nicanja biljke su izložene fotoperiodu uz osvetljeni deo u trajanju od 16 časova i mraka u trajanju od 8 časova. Veštačka inokulacija biljaka izvedena je u fazi 5 - 6 potpuno razvijenih listova, metodom potapanja u suspenziju bakterija lisne mase biljaka u potpunosti tokom 10 sekundi (Slika 9). U suspenziju je neposredno pre inokulacije dodat okvašivač Silwet L - 77, do konačne koncentracije od 0,01%. Oba ogleda postavljena su po potpuno slučajnom blok rasporedu u četiri ponavljanja sa po pet biljaka u svakom ponavljanju. Ocena reakcije genotipova paprike prema patogenu i intenzitet zaraze izvršeni su prema skali po Horsfall i Barratt-u (HB scale) 7 i 14 dana nakon inokulacije (Horsfall i Barratt, 1945) (Tabela 12). Dobijeni podaci iz ogleda statistički su obrađeni metodom analize varijanse, a razlike između sorti i linija testirane su multiplim rang testom (Duncan test, program Statistica 10). Doktorska disertacija Materijal i metode 55 Tabela 12. Skala za ocenu po Horsfall-Barratt-u Ocena 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Infekcija (%) 0 0-3 3-6 6-12 12-25 25-50 50-75 75-87 87-94 94-97 97-100 100 Slika 9. Inokulacija metodom potapanja biljaka Doktorska disertacija Materijal i metode 56 4.10. PROUČAVANJE OSETLJIVOSTI PROUČAVANIH SOJEVA PREMA BAKTERICIDIMA Za ova proučavanja korišćena je podloga sa saharozom i peptonom (SPA) (Lelliot i Stead, 1987). Ispitivano je dejstvo bakar-sulfata (CuSO4), antibiotika streptomicina i kasugamicina, pri različitim koncentracijama, na razvoj bakterijskih ćelija (Tabela 13). U autoklaviranu i podlogu prohlađenu na 50ºC, dodati su filterom sterilisani rastvori bakar- sulfata do konačne koncentracije od 100 i 200 ppm tj. aktivne komponente navedenih antibiotika do konačne koncentracije od 50, 100 i 200 ppm (Loper i sar., 1991; Obradović i sar., 2000a). Zasejavanje je obavljeno pipetiranjem po 3 µl bakterijske suspenzije (približno 108 CFU/ml) u vidu kapi, proučavanih sojeva ponaosob u dva ponavljanja. Inkubacija zasejanih podloga obavljena je pri temperaturi 28°C. Nakon 48 časova, ocenjeno prisustvo ili odsustvo razvoja kolonija. Kao kontrolni korišćen je soj X. vesicatoria rezistentan na CuSO4 i pomenute antibiotike (KFB 062). Zasejana je i podloga bez dodatka testiranih baktericida, kao negativna kontrola. Ogled je izveden za svaki tretman u tri ponavljanja. Tabela 13. Korišćeni baktericidi Aktivna materija Koncentracija (ppm) CuSO4 100, 200 Streptomicin 50, 100, 200 Kasugamicin 50, 100 , 200 Doktorska disertacija Materijal i metode 57 4.11. BAKTERIOFAGI 4.11.1. Izolacija bakteriofaga Kao materijal za izolaciju specifičnih faga korišćeno je zemljište uzeto neposredno ispod zaraženih biljaka (Obradović i sar., 2006; Gašić i sar., 2007). Oko 200 g zemljišta potopljeno je u 200 ml 0,01 M rastvora MgSO4. Nakon kraćeg mešanja na magnetnoj mešalici smeša je ostavljena preko noći na sobnoj temperaturi. Sutradan, pažljivo je odlivena tečna faza i nakon centrifugiranja na 11000 rpm-a u trajanju od 10 min, supernatant je pipetom prenet u sterilne staklene posude. Zatim je dodat hloroform (10:1 v/v) i nakon sat vremena tretiranja, izdvojena je gornja faza suspenzije u kojoj se očekuje prisustvo faga. Mikroepruvete su čuvane pri 4°C, bez prisustva svetlosti. 4.11.2. Specifičnost bakteriofaga prema Xanthomonas spp. Do sada je utvrđeno da bakterioznu pegavost paprike u svetu može prouzrokovati više vrsta roda Xanthomonas spp. (Obradović i sar., 2004a). Takođe, poznato je i da se fagi mogu razlikovati po spektru domaćina odnosno specifičnosti prema bakterijama. Zbog toga je proučena specifičnost izolovanih faga bakterije X. euvesicatoria prema sojevima patogena izolovanih iz uzoraka paprike poreklom iz najznačajnijih regiona gajenja u Srbiji (Tabela 14). Proučena je specifičnost izolata faga prema 59 sojeva bakterije X. euvesicatoria kao i prema 7 kontrolnih sojeva, patogena paprike i paradajza (Tabela 15). Na dno prazne Petri kutije naneto je po 100 µl suspenzije svakog soja bakterije u sterilnoj česmenskoj vodi, a potom je dodata prohlađen NYA podloga. Po očvršćavanju, pipetom je na površinu podloge naneto po 4 µl suspenzije faga. Nakon 24 časa inkubacije u termostatu pri 27°C, posmatrana je pojava plakova. Test je urađen u tri ponavljanja. Doktorska disertacija Materijal i metode 58 Tabela 14. Sojevi bakterije Xanthomonas euvesicatoria korišćeni u radu Redni broj Soj Poreklo Redni broj Soj Poreklo 1. RKFB 112 Horgoš 29. RKFB 231 Novi Kneževac 2. RKFB 113 Horgoš 30. RKFB 235 Novi Kneževac 3. RKFB 114 Horgoš 31. RKFB 236 Novi Kneževac 4. RKFB 115 Horgoš 32. RKFB 239 Gospođinci 5. RKFB 116 Horgoš 33. RKFB 240 Gospođinci 6. RKFB 164 Kula 34. RKFB 241 Gospođinci 7. RKFB 165 Topola 35. RKFB 243 Gložan 8. RKFB 167 Kula 36. RKFB 244 Gložan 9. RKFB 189 Kula 37. RKFB 248 Gložan 10. RKFB 191 Despotovo 38. RKFB 249 Gložan 11. RKFB 192 Despotovo 39. RKFB 251 Pivnice 12. RKFB 198 Despotovo 40. RKFB 252 Pivnice 13. RKFB 202 Horgoš 41. RKFB 255 Silbaš 14. RKFB 203 Horgoš 42. RKFB 257 Vukovar 15. RKFB 204 Horgoš 43. RKFB 261 Ruski Krstur 16. RKFB 205 Horgoš 44. RKFB 262 Ruski Krstur 17. RKFB 208 Smederevo 45. RKFB 265 Kula 18. RKFB 212 Smederevo 46. RKFB 266 Kula 19. RKFB 213 Smederevo 47. RKFB 267 Odžaci 20. RKFB 216 Bačka Palanka 48. RKFB 269 Vrbas 21. RKFB 217 Bačka Palanka 49. RKFB 271 Kucura 22. RKFB 218 Tovariševo 50. RKFB 274 Stanišić 23. RKFB 220 Bašaid 51. RKFB 275 Stanišić 24. RKFB 221 Bašaid 52. RKFB 276 Lalić 25. RKFB 223 Senta 53. RKFB 279 Lalić 26. RKFB 224 Senta 54. RKFB 282 Sombor 27. RKFB 227 Kikinda 55. RKFB 283 Sombor 28. RKFB 228 Kikinda 56. RKFB 284 Ratkovo Doktorska disertacija Materijal i metode 59 Tabela 15. Kontrolni sojevi Xanthomonas spp. korišćeni u radu Sojevi bakterija Poreklo Opis Xanthomonas euvesicatoria KFB* 1 Kovilj Rasa P8 KFB 13 Horgoš Rasa P7 KFB 189 Družetić Rasa P8 Xanthomonas vesicatoria KFB 29 Lozovik Rasa T2 KFB 0108 NCPPB**1423 Xanthomonas perforans KFB 061 91-118 RIF Rasa T3 KFB 0109 NCPPB 4321 Xanthomonas gardneri KFB 0110 NCPPB 881 KFB 0111 NCPPB 881 KFB 0116 ATCC*** 19865 Kolekcije kontrolnih sojeva: KFB Kolekcija fitopatogenih bakterija, Poljoprivredni fakultet, Zemun. prof. dr Aleksa Obradović; NCPPB National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, UK: ATCC American Type Culture Collection, Manassas, USA Doktorska disertacija Rezultati 60 5. REZULTATI U cilju identifikacije patogena proučene su patogene, odgajivačke, biohemijsko- fiziološke, serološke i molekularne odlike sojeva. Utvrđena je rasprostranjenost patogena u Srbiji, ustanovljene su 4 fiziološke rase, različit stepen osetljivosti prema baktericidima, ocenjena je osetljivost genotipova paprike prema patogenu i izvršena je izolacija prirodnih neprijatelja - bakteriofaga. 5.1. RASPROSTRANJENOST PATOGENA U SRBIJI Topla proleća i padavine iznad višegodišnjeg proseka pogodovale su širenju patogena u svim lokalitetima tokom 2008, 2009 i 2010. godine (Tabela 16). U ovom radu je proučeno 116 sojeva bakterija, izolovanih u periodu od 2008 do 2010. godine poreklom iz 35 različitih lokaliteta paprike u Srbiji i jednog lokaliteta u Republici Hrvatskoj (Vukovar) (Tabela 17). Tabela 16. Agrometeorološki podaci prosečnih srednjih mesečnih temperatura i ukupnih količina padavina tokom juna 2008, 2009 i 2010. godine (RHMZ, Beograd) Godina Jun Srednja mesečna temperature vazduha (ºC) Sombor Kiknda Novi Sad Loznica S. Palanka Kraljevo Zaječar Niš 2008 22 22 22 22 22 21 21 23 2009 20 20 20 20 20 20 20 21 2010 20 20 20 20 21 20 20 21 Ukupna količina padavina (mm) 2008 90 123 116 119 36 63 44 28 2009 106 117 123 187 153 210 77 111 2010 238 201 174 196 137 136 94 66 Doktorska disertacija Rezultati 61 Tabela 17. Spisak proučavanih sojeva poreklom iz Srbije Sojevi RKFB Genotipovi paprike Lokalitet 164 P. čudo Kula 165 P. čudo Topola 166 P. čudo Topola 167 P. čudo Kula 189, 190 Slonovo uvo Despotovo 191, 192, 193, 194, 195, 196 Boni Despotovo 197, 198, 199, 200, 201 Boni Despotovo 202, 203 HS-2 Horgoš 204, 205, 206, 207 HS-6 Horgoš 208, 209, 210, 211 Slononvo uvo Smederevo 212, 213 Palanačka bela Smederevo 214, 215, 216, 217 Slonovo uvo Bačka Palanka 218, 219 Slonovo uvo Tovariševo 220, 221, 222 S-20 Bašaid 223, 224, 225, 226 Kaloča Senta 227, 228, 229, 230 Kaloča Kikinda 231, 232, 233 HS-6 Novi Kneževac 234, 235, 236 Slonovo uvo Novi Kneževac 237, 238, 239, 240 Ami Gospođinci 241, 242 Century Gospođinci 243, 244, 245, 246 S-20 Gložan 247, 248, 249, 250 HS-6 Gložan 251, 252, 253, 254 HS-6 Pivnice 255, 256 S-80 Silbaš 257, 258 Istra Vukovar 259, 260, 261, 262 Slonovo uvo Ruski Krstur 263, 264, 265, 266 Slonovo uvo Kula 267, 268 Slonovo uvo Odžaci 269, 270 Anita Vrbas 271, 272, 273 Slonovo uvo Kucura 274, 275 HS-8 Stanišić 276, 277, 278, 279 Slonovo uvo Lalić 280, 281 Amfora Stapar 282, 283 Ami Sombor 284, 285 Šorokšari Ratkovo 286 HS-6 Subotica 287 Slonovo uvo Senta 288 Anita Čelarevo 289 Boni Šabac 290 Atina Kraljevo 291 Kurtovska kapija Čačak 292 Palanačka babura Trstenik 293 Kurtovska kapija Smederevska Palanka 294, 295 Palanačka kapija Velika Plana 296 Amfora Leskovac 297, 298 HS-6 Horgoš 299, 300 HS-5 Selenča Doktorska disertacija Rezultati 62 Simptomi bakteriozne pegavosti paprike, gajene u polju ispoljavali su se tokom cele vegetacije, od juna do avgusta, u svim fenofazama razvoja biljaka. U početku su simptomi bili najuočljiviji na mladim listovima u vidu tamnozelenih, vlažnih pega. Vremenom središnji deo pega postajao je mrk, a obolelo lišće hlorotično i na dodir se lako odvajalo od stabljike. Osim mrkih pega i hloroze na listovima, na lisnim drškama, peteljkama i plodovima mogle su se takođe uočiti mrke pege, lezije i kraste (Slika 3, 4, 5). Prilikom prikupljanja uzoraka obolelih biljaka paprike u cilju izolacije patogena, zapažena je zastupljenost domaćih sorti paprike različitih grupa zrenja i tipova ploda. Najzastupljenije su srednje rane i srednje kasne sorte tipa babura, kapija i šipka. Većina ovih sorti poreklom je iz domaćih kompanija koje se bave selekcijom i oplemenjivanjem: "Institut za povrtarstvo" iz Smederevske Palanke, "Institut za ratarstvo i povrtarstvo" iz Novog Sada, "Superior" iz Velike Plane. Industrijske paprike sorte Horgoška slatka zastupljene su u Horgošu i okolini ali i na drugim lokalitetima Bačke i Banata. Ova sorta stvorena je kao rezultat selekcije kompanije "Vitamin" iz Horgoša i koristi se kao industrijska začinska paprika zbog visokog procenta suve materije. Međutim, pomenute sorte nisu prepoznate kao otporne ili tolerantne prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti obzirom na visok intenzitet oboljenja u polju u svim pomenutim lokalitetima u Srbiji. Visok intenzitet oboljenja zabeležen je u većini lokaliteta severnog i južnog dela Bačke (Odžaci, Kula, Vrbas, Bačka Palanka, Gložan, Čelarevo, Selenča, Despotovo, Silbaš, Bački Petrovac i Pivnice). Najveći intenzitet zabeležen je u okolini Horgoša i Subotice (Senta, Novi Kneževac, Kanjiža, Čoka). Nešto niži stepen zaraze zabeležen je u Somboru i okolini i kretao se od 5 - 10%. U Banatu, pogotovo u okolini Kikinde (selo Bašaid) zabeleženi su usevi sa infekcijom >90%. Naredne, 2009. i 2010. godine, izvršen je pregled useva paprike u zapadnim i centralnim delovima Srbije. Pojava oboljenja konstatovana je u lokalitetima: Šabac, Kraljevo, Trstenik, S. Palanka, Leskovac, Čačak i Velika Plana. Intenzitet oboljenja kretao se u intervalu od 10-50% Rasprtostranjenost prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike utvrđena je u većini proizvodnih regiona u Srbiji tokom 2008, 2009 i 2010. godine. Najveći broj Doktorska disertacija Rezultati 63 proučavanih sojeva poreklom je iz obolelih uzoraka biljaka paprike sa simptomima bakteriozne pegavosti, prikupljenih tokom 2008. godine (Slika 10). Slika 10. Mapa geografske rasprostranjenosti prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike u Srbiji Doktorska disertacija Rezultati 64 5.2. PATOGENE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA 5.2.1. Inokulacija biljaka paprike Svi proučavani sojevi ispoljili su patogenost prema biljci domaćinu - sorti paprike Kalifornijsko čudo. Razvoj simptoma odvijao se postepeno. Među proučavanim sojevima su zapažene razlike u brzini prouzrokovanja prvih simptoma. Većina sojeva je nakon trećeg dana od infiltracije, prouzrokovala promene u okviru zone infiltracije lisnog tkiva. Sa naličja lista formirale su se promene praćene pojavom tamnozelenih zona (pega), dok je sa lica lista tkivo u okviru formiranih pega bilo glatko i sjajno. Nakon 5 dana zahvaćeni deo tkiva žuti, nekrotira, dobijajući mrku boju. Nakon sedam dana zapaženo je širenje hloroze i spajanje pojedinačnih pega u veće nekrotične površine (Slika 11). Identične promene zabeležene su i na biljkama inokulisanim kontrolnim sojem bakterije X. euvesicatoria (KFB 189). Grupi proučavanih sojeva, koja se razlikovala od ostalih po prouzrokovanju prvih promena nakon pet dana, pripada 14 sojeva (RKFB: 164, 201, 209, 214, 215, 225, 247, 262, 271, 274, 280, 281, 282, 295). Na inokulisanim biljkama sterilnom destilovanom vodom nije bilo promena. Slika 11. X. euvesicatoria. Promene na listu paprike sorte Kalifornijsko čudo 7 dana od inokulacije Doktorska disertacija Rezultati 65 5.2.2. Hipersenzitivna reakcija duvana Proučavani sojevi prouzrokovali su hipersenzitivnu reakciju duvana sorte Samsun. Nakon 24 časa, promene su se ispoljile prvo u vidu hlorotičnih zona inokulisanog tkiva (Slika 12a), koja je praćena nekrozom i kolapsom lisnog tkiva posle 48 časova (Slika 12b). Kontrolni soj X. euvesicatoria (KFB 189) prouzrokovao je HR nakon 24 časa. Na mestu inokulacije sterilnom destilovanom vodom nije bilo promena. a) b) Slika 12. Promene na lisnom tkivu duvana sorte Samsun kao znak hipersenzitivne reakcije nakon inokulacije proučavanim sojevima bakterije X. euvesicatoria: a) pojava hlorotičnih zona nakon 24 časa; b) nekroza lisnog tkiva duvana posle 48 časova Doktorska disertacija Rezultati 66 5.3. MORFOLOŠKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA 5.3.1. Razlikovanje bakterija po Gramu pomoću KOH testa Svi proučavani sojevi obrazovali su sluzast ″končić″ nakon homogenizacije u kapi 3% KOH, na osnovu čega je zaključeno da pripadaju Gram-negativnim bakterijama (Slika 13), uključujući i kontrolni soj P. s. pv. glycinea. Slika 13. X. euvesicatoria. Pojava sluzastog ″končića″ 5.3.2. Posmatranje morfologije transmisionim elektronskim mikroskopom Ćelije bakterija su posmatrane elektronskim mikroskopom na Univerzitetu u Beogradu (Katedra za biologiju, prof. dr Aleksandra Korać), pod uvećanjem od x5000 i x20.000, pri čemu je utvrđeno da su bakterije štapićastog oblika sa zaobljenim ivicama, veličine od 0.9 -1.2 µm; asporogene i pojavljuju se pojedinačno ili u parovima. Na slikama su prikazani poprečni i uzdužni preseci pojedinačnih bakterija (Slika 14). a) b) Slika 14. X. euvesicatoria. Ćelije bakterija (soj RKFB 243): a) uveličanje x5000; b) uveličanje x20000 Doktorska disertacija Rezultati 67 5.4. ODGAJIVAČKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA 5.4.1. Izgled kolonija na hranljivim podlogama Posmatranjem kolonija na YDC podlozi proučavani sojevi su nakon 24 - 48 časova formirali kolonije žute boje, sluzaste konzistencije, okrugle, ispupčene, sjajne, prečnika 2-3 mm. Ovakav izgled kolonija na YDC podlozi tipičan je za predstavnike roda Xanthomonas (Slika 15a). Sedam proučavanih sojeva formirali su kolonije svetlije, krem-žute boje, sluzaste konzistencije (RKFB: 194, 195, 196, 197, 204, 205, 225). Na MPA podlozi nakon 24 časa od zasejavanja formirale su se sitne, sjajne, blago ispupčene kolonije, krem-žute boje, sluzaste konzistencije, prečnika 1 - 2 mm (Slika 15 b). Kolonije bakterija na poluselektivnim podlogama (mSQ, TTCA, Tween B, Milk- Tween) razlikovale su se u boji, kao i promenama koje su nastajale u samoj podlozi. Na mSQ podlozi proučavani sojevi su nakon dva do tri dana od zasejavanja formirali sjajne, ispupčene kolonije, ujednačene veličine (prečnika 2 - 3 mm) i brzine porasta, krem-žute boje i sluzaste konzistencije. U podlozi, neposredno ispod i oko kolonija zapaženo je prisustvo sitnih kristala, nastalih usled razgradnje kinične kiseline pod dejstvom ksantomonadina (Slika 15c). Na TTCA podlozi sa trifenil-tetrazolijum hloridom, obrazovale su se okrugle, ispupčene, sjajne, sluzaste i crvene kolonije, prečnika 2 - 3 mm. Za potpun razvoj kolonija potrebna su tri do četiri dana (Slika 15d). Na Tween B podlozi oko kolonija pojavljuju se bele (mlečne) zone kalcijumovih soli masnih kiselina koje nastaju usled oslobađanja lipida iz Tween-a 80 pod dejstvom lipolitičkih enzima. Formirane kolonije su pojedinačne sitne, okrugle, žute, sjajne, sluzaste konzistencije, prečnika 1 - 2 mm (Slika 15e). Na Milk-Tween (MT) podlozi su okrugle, sitne prečnika 1 - 2 mm, sjajne, sluzaste konnzistecije. Karakteristično je da su se u podlozi oko kolonija proučavannih izolata formirale dve zone hidrolize: I - veća prosvetljena zona nastala usled hidrolize kazeina; II - manja mlečna zona koja nastaje usled hidrolize Tween-a 80 (Slika 15f). Doktorska disertacija Rezultati 68 Slika 15. X. euvesicatoria Izgled kolonija na hranljivim podlogama (soj RKFB 263): a) YDC ; b) MPA; c) mSQ; d) TTCA podloga; e ) Tween B; f) Milk-Tween (MT) a) YDC b) MPA c) mSQ d) TTCA e) Tween B f) MT Doktorska disertacija Rezultati 69 5.4.2. Uticaj temperature na porast bakterija Svi proučavani sojevi, uključujući i kontrolni soj X. euvesicatoria (KFB 189) razvijaju se pri temperaturi 37°C, usled čega dolazi do zamućenja podloge nakon 7 dana (Slika 16). 5.4.3. Tolerantnost prema NaCl Proučavani sojevi se razvijaju u podlozi sa 5% NaCl, ali ne i u podlozi sa 7% NaCl (Slika 17). Tolerantnost prema obe koncentracije NaCl ispoljio je jedino kontrolni soj Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (KFB 85). Slika 16. Porast kolonija pri 37ºC: a) kontrolni soji X. euvesicatoria KFB 189; b) proučavani soj RKFB 243; c) negativna kontrola Slika 17. Tolerantnost prema NaCl: a) porast kolonija proučavanog soja RKFB 243 u podlozi sa 5% NaCl; b) izostanak razvoja u podlozi sa 7% NaCl-a Doktorska disertacija Rezultati 70 5.4.4. Tolerantnost prema trifenil-tetrazolium hloridu Porast kolonija proučavanih sojeva na podlozi sa 0,02% trifenil-tetrazolijum hlorida, zabeležen je nakon 2 - 3 dana od zasejavanja (Slika 18a), za razliku od koncentracije 0,1% (Slika 18b). Na kontrolnoj podlozi bez dodatka trifenil-tetrazolijum hlorida, proučavani sojevi obrazovali su kolonije nakon 48 časova (Slika 18c). a) b) c) Slika 18. Tolerantnost prema trifenil-tetrazlijum hloridu: a) porast kolonija na podlozi sa 0,02% TTC-a; b) inhibicija porasta kolonija na podlozi sa 0,1% TTC-a c) porast kolonija na kontrolnoj podlozi bez dodatka TTC-a Doktorska disertacija Rezultati 71 5.5. BIOHEMIJSKO-FIZIOLOŠKE ODLIKE SOJEVA Rezultati proučavanja biohemijsko-fizioloških karakteristika pokazali su da proučavani sojevi razlažu glukozu oksidativno (O), ne redukuju nitrate, hidrolizuju želatin i eskulin ali ne i skrob, poseduju ferment katalazu ali ne i oksidazu i pektinazu. Stvaraju kiselinu iz manoze, glukoze, galaktoze i dekstrina, i razvijaju se na podlozi sa cis- akonitinskom kiselinom (Tabela 18). Obzirom da su najviše sličnosti imali sa kontrolnim sojem KFB189, preliminarno je zaključeno da pripadaju fenotipskoj grupi A, odnosno vrsti X. euvesicatoria. Razlike su zabeležene samo među kontrolnim sojevima, i ogledaju se u stvaranju kiseline iz galaktoze, dekstrina i cis-akonitinske kiseline (Tabela 18). Tabela 18. Biohemijsko-fiziološke odlike proučavanih i kontrolnih sojeva Legenda: (-) negativna reakcija; (+) pozitivna reakcija; (O) oksidativni metabolizam *TTC - trifenil-tetrazolijum hlorid Test Proučavani sojevi Kontrolni sojevi Xanthomonas euvesicatoria KFB 189 Xanthomonas vesicatoria NCPPB 1423 Xanthomonas perforans NCPPB 4321 Xanthomonas gardneri NCPPB 881 KOH test - - - - - Aktivnost oksidaze - - - - - HR na duvanu + + + + + Porast na 37°C + + + + + Metabolizam glukoze O/F O O O O O Redukcija nitrata - - - - - Stvaranje katalaze + + + + + Hidroliza želatina Hidroliza eskulina + + + + + + + + + + Pektolitička aktivnost - - + + - Amilolitička aktivnost - - + + - Stvaranje kiseline: - glukoze - galaktoze - dekstrina - manoze + + + + + + + + + - + + + + + + + - - + Korišćenje cis- akonitinske kiseline + + + + - TTC*: - 0.02% - 0.1% + - + - + - + - + - Doktorska disertacija Rezultati 72 5.6. SEROLOŠKE ODLIKE PROUČAVANIH SOJEVA 5.6.1. DAS - ELISA test Poređenjem srednjih vrednosti ekstinkcija proučavanih sojeva, utvrđeno je da su srednje vrednosti bile dva ili više puta veće od negativne kontrole, što je ocenjeno kao pozitivna reakcija (Slika 19). Slika 19. DAS - ELISA test - pojava žute boje u bunarčiću mikrotitarske ploče Nunc - 96 znak je pozitivne reakcije; (K+) pozitivna kontrola; (B) blank; (K-) negativna kontrola. Doktorska disertacija Rezultati 73 5.6.2. Metod aglutinacije Metod aglutinacije spada u kvalitativan test obzirom da se rezultati očitavaju vizuelnim putem, odnosno posmatra se odsustvo ili prisustvo kompleksa antigen - antitelo u vidu taloga. Pojava pahuljastog taloga (aglutinat) u kapi bakterija i seruma, nakon 60 sekundi, na test pločicama, označava pozitivnu reakciju (Slika 20). Slika 20. Pojava pahuljastog taloga (kompleksa antigen - antitelo) kao znak pozitivne reakcije: polje 1 - soj RKFB 164; 2 - soj RKFB 165; 3 - soj RKFB 166; 5 - soj RKFB 167; polje 4 - pozitivna kontrola; polje 6 - negativna kontrola Doktorska disertacija Rezultati 74 5.7. MOLEKULARNE METODE PROUČAVANJA 5.7.1. Restrikciona analiza - RFLP Upoređivanjem DNK fragmenata proučavanih sojeva, dobijenih restrikcionom analizom sa kontrolnim sojevima ustanovljeno je da proučavani sojevi poseduju identičan restrikcioni profil sa kontrolnim sojem X. euvesicatoria (KFB 189). 5.7.1.1. Umnožavanje hrp gena Korišćenjem prajmera RST65 i RST69, umnožen je hrpB region pri čemu su dobijeni proizvodi veličine 420 bp svih proučavanih sojeva (Slika 21). Slika 21. Agarozni gel (1.5%) nakon amplifikacije hrpB regiona sa RST65 i RST69 prajmerima. M marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 50 - 1500 (Fermentas, SM1103); - negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; + pozitivna kontrola X. euvesicatoria KFB 189; Linije 1-12 proučavani sojevi. ~420 bp Doktorska disertacija Rezultati 75 5.7.1.2. Digestija restrikcionim enzimima Nakon digestije umnoženih fragmenata DNK proučavanih sojeva, izvršeno je razdvajanje proizvoda elektroforezom, pri čemu je dobijen restrikcioni profil za svaki soj ponaosob. Kao matrica za poređenje poslužile su jedinstvene kombinacije elektroforetskih profila kontrolnih sojeva, karakteristične za svaku vrstu Xanthomonas spp. (Slika 22). Poređenjem restrikcionih profila proučavanih sojeva sa profilima kontrolnih sojeva kao i sa ranije utvrđenim profilima koje su prikazali Obradović i sar. (2004a) nije utrvrđen polimorfizam među proučavanim sojevima. Na osnovu formiranih otisaka (profila) kontrolnih sojeva koji pripadaju različitim rasama nisu utvrđene razlike (Slika 23). Restrikcionom analizom ustanovljeno je da su profili proučavanih sojeva identični restrikcionim profilima kontrolnog soja X. euvesicatoria (KFB 189) (Slika 24, 25 i 26). Slika 22. Polimorfizam restrikcionih fragmenata referentnih sojeva na agaroznom gelu (4%) nakon digestije enzimima CfoI, HaeIII i TaqI za sve predstavnike Xanthomonas spp.: A - X. euvesicatoria (KFB189); B - X. vesicatoria (NCPPB 1423); C - X. perforans (NCPPB 4321); D - X. gardneri (NCPPB 881); M - marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 50 - 1500 bp (Fermentas, SM 1103). Doktorska disertacija Rezultati 76 Slika 23. Restrikcioni profili kontrolnih sojeva X. euvesicatoria na 4% agaroznom gelu nakon digestije ezimima (CfoI, HaeIII, TaqI). Linije 1, 4, 7 soj KFB1 (P8); Linije 2, 5, 8 soj KFB13 (P7): Linije 3 ,6, 9 izolat KFB 189 (P8); M-marker O Range Ruler 50 bp Ladder 50 - 1000 bp (Fermentas-SM 0613). Slika 24. Restrikcioni profili proučavanih sojeva na agaroznom gelu (4%) nakon digestije CfoI enzimom. M - marker O Range Ruler 50 bp Ladder 50 - 1000 bp (Fermentas - SM 0613); K - kontrolni soj X. euvesicatoria (KFB 189). ~95 bp ~245 bp ~95 bp ~143 bp Doktorska disertacija Rezultati 77 Slika 25. Restrikcioni profili proučavanih sojeva na agaroznom gelu (4%) nakon digestije HaeIII enzimom. M - marker O Range Ruler 50 bp Ladder 50 - 1000 bp (Fermentas - SM 0613); K - kontrolni soj X. euvesicatoria (KFB 189). Slika 26. Restrikcioni profili proučavanih sojeva na agaroznom gelu (4%) nakon digestije TaqI enzimom. M - marker O Range Ruler 50 bp Ladder 50 - 1000 bp (Fermentas - SM 0613); K - kontrolni soj X. euvesicatoria (KFB 189). ~143 bp ~105 bp ~245 bp ~55 bp Doktorska disertacija Rezultati 78 5.7.2. Diferencijacija proučavanih sojeva primenom specifičnih prajmera Prema molekularnoj metodi koju su opisali Koenraadt-u i sar. (2009) u ovom radu primenom specifičnih prajmera detektovane su različite veličine baznih parova među kontrolnim sojevima vrsta Xanthomonas spp. (Slika 27, 28, 29 i 30). Poređenjem amplifikovanih fragmenata proučavanih sojeva ustanovljena je veličina 173 bp, koji odgovaraju vrsti X. euvesicatoria (Slika 31). Slika 27. PCR produkti referentnih sojeva na 1.5 % agaroznom gelu amplifikovanim sa Bs XeF/XeR-(X. euvesicatoria) Linije: (M) - marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 50 - 1500 bp (Fermentas, SM 1103); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) kontrolni soj X. euvesicatoria KFB 189 (173 bp). Slika 28. PCR produkti referentnih sojeva na 1.5 % agaroznom gelu amplifikovanim sa Bs XvF/XvR-(X. vesicatoria) Linije: (M) - marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 100 - 1000 bp (Fermentas, SM 0241); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) kontrolni soj X. vesicatoria NCPPB 1423 (138 bp). 138 bp 173 bp Doktorska disertacija Rezultati 79 Slika 29. PCR produkti referentnih sojeva na 1.5 % agaroznom gelu amplifikovanim sa Bs XpF/XpR-(X. perforans) Linije: (M) - marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 50 - 1500 bp (Fermentas, SM 1103); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) kontrolni soj X. perforans NCPPB 4321 (197 bp). Slika 30. PCR produkti referentnih sojeva na 1.5 % agaroznom gelu amplifikovanim sa Bs XvF/XvR-(X. vesicatoria) Linije: (M) - marker FastRuler™ Low Range DNA Ladder 100 - 1000 bp (Fermentas, SM 0241); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) kontrolni soj X. gardneri NCPPB 881 (154 bp). 197 bp 154 bp Doktorska disertacija Rezultati 80 Slika 31. PCR produkti na 1.5 % agaroznom gelu amplifikovanim sa Bs XeF/XeR prajmerima. Linije: (M) FastRuler™ Low Range DNA Ladder (Fermentas, Lithuania); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) pozitivna kontrola KFB 189; Linije 4-35 proučavani sojevi. 5.7.2.1. Utvrđivanje praga osetljivosti PCR testa Korišćenjem prajmera XeF i XeR, amplifikovani su fragmenti DNK veličine 173 bp u veoma niskim koncentracijama. Određivanje koncentracije početne suspenzije bakterija izvršeno je metodom brojanja kolonija nakon zasejavanja serijom decimalnih razređenja (Slika 32). Najniža koncentracija bakterijske suspenzije u kojoj se mogu detektovati bakterije iznosila je 0,4 x 103 CFU/ml (Slika 33). 173 bp 173 bp Doktorska disertacija Rezultati 81 0,4 x 105 0,4 x 104 0,4 x 103 0,4 x 102 Slika 32. Određivanje koncentracije početne suspenzije bakterija metodom brojanja kolonija nakon zasejavanja serijom decimalnih razređenja Slika 33. Osetljivost PCR testa. Linije: (M) FastRuler™ Low Range DNA Ladder (Fermentas, Lithuania); (B) blank; (–) negativna kontrola P. s. pv. glycinea NCPPB 3318; (+) pozitivna kontrola KFB 189; linije 1 - 8 serija razređenja soja RKFB 243 (1:0.4108; 2:0.4107; 3:0.4106; 4:0.4105; 5:0.4104; 6:0.4103; 7:0.4102; 8:0.4101). 173 bp Doktorska disertacija Rezultati 82 5.8. UTVRĐIVANJE FIZIOLOŠKIH RASA Na osnovu ocena reakcije na biljkama paprike uočene su razlike među proučavanim sojevima. Utvrđeno je da proučavani sojevi pripadaju rasama: P1, P3, P7 i P8 bakterije X. euvesicatoria (Tabela 19). Otporna reakcija koja nastaje usled inkompatibilnog odnosa domaćin – patogen, zabeležena je na biljkama koje poseduju Bs gene otpornosti prema avirulentnim genima patogena (avr). Reakcije na biljkama koje poseduju Bs4 gene otpornosti (C. pubescens) ispoljavale su se u vidu beličasto-mrkih lezija sa jasno ograničenom ivicom (Slika 34 a), ili pojavom lezija sa ljubičasto-mrkim obodom karakteristična za izogene linije koje poseduju Bs1, Bs2 i Bs3 gene otpornosti (Slika 34 b). Na biljkama koje ne poseduju gene otpornosti, kao posledica kompatibilnog odnosa patogen - domaćin dolazi do pojave tipičnih simptoma bolesti (Slika 35a, 35b). U početku simptomi oboljenja se ispoljavaju u vidu vodenastih pega sa masnim odsjajem. Vremenom pege se povećavaju i šire, središte postaje nekrotično i mrko sa hlorotičnom zonom oko mesta inokulacije. Od ukupnog broja proučavanih sojeva, na osnovu ocenjenih reakcija biljaka, najzastupljenija je fiziološka rasa P8 (93 soja), potom rasa P7 (17 sojeva), rasa P1 sa 5 sojeva i rasa P3 (1 soj) (Tabela 19). Kontrolni soj (KFB 189) pripada rasi P8. a) b) Slika 34. Otporna reakcijama na inokulisanim delovima lista: a) beličasto-mrke zone (C. pubescens); b) pege sa ljubičasto - mrkim obodom (ECW - 20) Doktorska disertacija Rezultati 83 Slika 35. Osetljiva reakcija na biljkama sorte ECW u vidu vodenastih pega sa masnim odsjajem i pojavom hloroze oko mesta inokulacije: a) lice lista; b) naličje lista Sojevi rase P8 izolovani su iz uzoraka svih testiranih sorti paprike, dok je među sojevima poreklom sa linije HS-8 bila zastupljena samo rasa P7. Izolovani sojevi poreklom sa sorte Palanačko čudo pripadali su dvema rasama, P7 i P8. Na sojevima poreklom sa sorti Boni, Slonovo uvo i HS-6 utvrđene su po tri fiziološke rase. Sojevi poreklom sa sorte Boni pripadali su rasama P3, P7 i P8, dok su sa sorte Slonovo uvo i linije HS-6 izolovani sojevi, pored rasa P7 i P8 pripadali i rasi P1. Ukoliko se posmatra zastupljenost rasa u Srbiji u 2008. godini, može se konstatovati da je rasa P8 zastupljena u svim lokalitetima, osim u Ruskom Krsturu i Stanišiću u kojima je konstatovana rasa P7 (Slika 36). Izdvajaju se i lokaliteti u kojima su prisutne po tri rase parazita: Despotovo sa rasama 3, 7, 8 i Smederevo sa rasama 1, 7, 8. U Horgošu su prisutne rase 1 i 8, dok su u Gložanima, Kuli i B. Topoli prisutne rase 7 i 8. Sojevi poreklom iz lokaliteta Čačak, Kraljevo, Leskovac, Smederevska Palanka, Šabac, Trstenik i Velika Plana, izolovani tokom 2009 i 2010. godine pripadaju rasi P8. Doktorska disertacija Rezultati 84 Tabela 19. Zastupljenost fizioloških rasa proučavanih sojeva bakterije X. euvesicatoria Slika 36. Mapa geografske rasprostranjenosti i zastupljenosti fizioloških rasa u Srbiji Rasa Šifre sojeva RKFB P1(5) 206, 207, 209, 210, 211 P3(1) 197 P7(17) 166, 167, 189, 190, 191, 192, 193, 208, 247, 248, 249, 259, 260, 261, 262, 274, 275 P8(93) 164, 165, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 Doktorska disertacija Rezultati 85 5.9. PROUČAVANJE OSETLJIVOSTI GENOTIPOVA PAPRIKE PREMA PROUZROKOVAČU BAKTERIOZNE PEGAVOSTI Proučavani genotipovi paprike ispoljili su različit stepen osetljivosti prema bakteriji X. euvesicatoria (soj 263, P8). Prve promene tkiva na mestu infiltracije suspenzije bakterija u list paprike, uočene su nakon 3 dana od inokulacije (Slika 37a). Vremenom došlo je do širenja i pojave nekroze većeg dela liske da bi se nakon 14 dana uočilo opadanje donjeg lišća kod većine proučavanih genotipova paprike (Slika 37b). Slika 37. Simptomi na biljkama paprike sorte Brilant: a) simptomi pegavosti i hloroze lišća paprike nakon 7 dana; b) opadanje donjeg lišća nakon 14 dana Pri prvoj oceni, uz primenjenu koncentraciju inokuluma 106 CFU/ml, proučavani genotipovi paprike ispoljili su različit stepen osetljivosti, formirajući 4 statistički značajno različite grupe (Tabela 20). U prvu grupu izdvojile su se sorta Bihar i otporna linija ECW- 20, na kojima je zabeležen najmanji intenzitet simptoma u vidu malobrojnih, sitnih nekrotičnih pega, čiji se broj i veličina nisu bitno menjali između dve ocene. U drugu grupu po stepenu osetljivosti svrstana je sorta Plamena, dok je trećoj grupi pripao, pored kontrolne osetljive sorte ECW, najveći broj proučavanih genotipova paprike: Palanačko čudo, Boni, Novosađanka, Brillant F1, Anita, HS-2, Amfora i Slonovo uvo. Među ovim genotipovima nije postojala statistički značajna razlika u osetljivosti na nivou verovatnoće od 0,05. Interesantno je napomenuti da se kontrolna osetljiva sorta ECW nije pokazala kao Doktorska disertacija Rezultati 86 najosetljivija. Kao najosetljivija, sorta Palanačka babura svrstana je u četvrtu grupu osetljivosti sa ocenom intenziteta zaraze 6.3. Nakon druge ocene, posle 14 dana, na svim proučavanim genotipovima, usled spajanja pega u veće nekrotične površine, hloroze i opadanja lišća, zabeleženo je povećanje intenziteta oboljenja. Pored prve grupe sa najnižim intezitetom oboljena, u koju se svrstavaju otporna linija ECW-20 i hibrid Bihar F1, na osnovu reakcije prema patogenu izdvojile su se još 3 grupe genotipova paprike (Tabela 20). U drugu grupu osetljivosti, pored Plamene, svrstana je i sorta Boni. Trećoj grupi pripada najveći broj proučavanih genotipova uključujući i osetljivu kontrolnu sortu ECW, a nešto viši intenzitet zaraze ispoljile su: Novosađanka, Palanačko čudo, Brilant F1, Amfora, HS-2. U četvrtu najosetljiviju grupu, nakon druge ocene, osim Palanačke babure, svrstana je i sorta Slonovo uvo. Tabela 20. Intenzitet zaraze proučavanih genotipova paprike prema X. euvesicatoria P8 (konc. 106 CFU/ml) Genotipovi paprike Intenzitet zaraze (7 dan) Intenzitet zaraze (14 dan) Bihar F1 1.0a 1.1a ECW-20 1.0a 1.55a Plamena 4.5b 6.9b Palanačko čudo 4.875bc 7b Boni 4.9 bc 7.3bc Novosađanka 4.9 bc 7.3 bc Brillant F1 4.925 bc 7.35 bc Anita 5.4 bc 7.35 bc ECW 5.45 bc 7.5 bc HS-2 5.525 bc 7.55 bc Amfora 5.65 bc 7.75 bc Slonovo uvo 5.9 bc 8.0c Palanačka babura 6.325c 8.15c U drugom eksperimentu uz primenjenu koncentraciju inokuluma 108 CFU/ml, odnos između ispitivanih sorti je bio gotovo identičan kao i pri nižoj koncentraciji. Zbog visoke koncentracije suspenzije došlo je nagle nekroze biljaka lisnog tkiva te su pri prvoj oceni vrednosti bile više u odnosu na prvu ocenu pri nižoj koncentraciji gde je došlo do Doktorska disertacija Rezultati 87 postepenog razvoja simptoma. Nakon sedmog dana od inokulacije izdvojilo se 6 grupa osetljivosti, među kojima je postojala statistički značajna razlika (Tabela 21). U ovom eksperimentu samo je linija ECW-20, kao otporna, svrstana u prvu grupu. Hibrid Bihar F1 pripada drugoj grupi osetljivosti, ali simptomi u vidu sitnih nekrotičnih pega zabeleženi na ovom hibridu ipak su ukazivali da se radi o otpornoj reakciji. U drugu grupu, svrstana je i sorta Amfora sa tipičnim simptomima oboljenja, potom sledi treća grupa kojoj pripada sorta Plamena, četvrta grupa sa hibridom Brillant F1, dok se u petu grupu osetljivosti, pored kontrolne osetljive sorte ECW, ubrajaju Novosađanka, Palanačko čudo, Boni, HS-2, Anita i Slonovo uvo. Kao najosetljivija izdvojila se sorta Palanačka babura, svrstana u šestu grupu. Nakon druge ocene intenziteta zaraze (14. dana), bez tipičnih simptoma bolesti, izdajaju se otporna linija ECW-20 i hibrid Bihar F1 koji je svrstan u drugu grupu osetljivosti (Tabela 21). Trećoj grupi pripadaju Plamena i Novosađanka, a potom slede Anita, Palanačka babura, Boni, Palanačko čudo, Amfora, HS-2, ECW i Slonovo uvo. Kao najosetljiviji, u ovom ogledu, izdvojio se hibrid Brillant F1. Međutim, zbog visoke koncentracije inokuluma, koja je prouzrokovala brzu nekrozu lisnog tkiva i opadanje lišća, ocena intenziteta oboljenja nakon 14. dana bila je otežana. Tabela 21. Intenzitet zaraze proučavanih genotipova paprike prema X. euvesicatoria P8 (konc. 108 CFU/ml) Genotipovi paprike Intenzitet zaraze7 dan Intenzitet zaraze14 dan ECW-20 1.0 a 1.0a Bihar F1 3.2 b 3.5 b Amfora 3.7 b 6.525 cdef Plamena 4.525 c 6.075 c Brillant F1 5.275 d 7.0 f ECW 5.375 de 6.775 def Novosađanka 5.375 de 6.15 c Palanačko čudo 5.425 de 6.475 cde Boni 5.5 de 6.475 cde HS-2 5.575 de 6.775 def Anita 5.675 de 6.275 cd Slonovo uvo 5.7 de 6.85 ef Palanačka babura 6.075 e 6.375 cde Doktorska disertacija Rezultati 88 5.10. PROUČAVANJE OSETLJIVOSTI PROUČAVANIH SOJEVA PREMA BAKTERICIDIMA Proučavani sojevi su ispoljili različitu osetljivost prema upotrebljenim baktericidima (CuSO4, streptomicin-sulfat, kasugamicin), u in vitro uslovima (Slika 38). Prema rezultatima prikazanim u Tabeli 22 proučavani sojevi pokazali su određeni stepen rezistentnosti prema jedinjenju bakra, kao i prema antibiotiku kasugamicinu. Za razliku od ovih jedinjenja, prema streptomicinu nisu ustanovljeni rezistentni sojevi, odnosno sve primenjene koncentracije delovale su inhibitorno na razvoj sojeva. Na podlozi sa 100 ppm bakar-sulfata zabeležen je porast svih proučavanih sojeva. Međutim, koncentracija 200 ppm ovog jedinjenja u podlozi, nije zaustavila porast svih proučavanih sojeva (Tabela 22). Razlike su se ispoljile i u pogledu osetljivosti prema kasugamicinu. Pri koncentraciji 50 ppm ovog preparata u podlozi zabeležen je razvoj kolonija 6 proučavanih sojeva, dok su koncentracije 100 i 200 ppm potpuno zaustavile porast kolonija svih proučavanih sojeva. Za razliku od bakar-sulfata i kasugamicina, streptomicin - sulfat je pokazao baktericidno delovanje i pri najmanjoj koncentraciji, odnosno, ni jedan soj se nije razvio u podlozi sa 50 ppm ovog jedinjenja. Prema dobijenim rezultatima, minimalna inhibitorna koncentracija streptomicin-sulfata je 50 ppm, a kasugamicina 50 ppm za većinu i 100 ppm za sve sojeve. Minimalna inhibitorna koncentracija bakar-sulfata za većinu proučavanih sojeva iznosi 200 ppm ovog baktericida. Tabela 22. Osetljivost prema baktericidima CuSO4, streptomicinu i kasugamicinu Legenda: + normalan razvoj kolonija; – bez porasta kolonija; *Kontrola (SPA) osnovna podloga bez dodatka baktericida Baktericid Koncentracija (ppm) Ocena CuSO4 100 + 200 19 Streptomicin-sulfat 50 – 100 – 200 – Kasugamicin 50 6 100 – 200 – *Kontrola SPA + Doktorska disertacija Rezultati 89 Slika 38. Osetljivost sojeva prema baktericidima: a) potpun razvoj proučavanih kolonija na SPA podlozi sa koncentracijom CuSO4 (100 ppm); b) razvoj kontrolnog soja KFB 062 (X. vesicatoria) na podlozi sa CuSO4 (200 ppm); c) razvoj kontrolnog soja na podlozi sa kasugamicinom (50 ppm); d) izostanak porasta kolonija na podlozi sa 100 ppm kasugamicina; e) razvoj kontrolnog soja na podlozi sa streptomicin sulfatom (50 ppm); f) razvoj kontrolnog soja na podlozi sa streptomicin sulfatom (100 ppm). a) b) c) d) e) f) Doktorska disertacija Rezultati 90 5.11. BAKTERIOFAGI 5.11.1. Izolacija bakteriofaga Tokom 2008. godine prikupljeni su uzorci zemljišta neposredno oko biljaka paprike sa izraženim simptomima bakteriozne pegavosti, pri čemu je metodom direktne izolacije dobijeno 20 izolata faga (Tabela 23). Tabela 23. Izolati bakteriofaga Izolati Veza sa sojem bakterije Datum Izolacija F 9 RKFB 189 17.06.08 Zemlja F 10 RKFB 191 17.06.08 Zemlja F 11 RKFB 194 17.06.08 Zemlja F 12 RKFB 198 17.06.08 Zemlja F 13 RKFB 202 20.06.08 Zemlja F 14 RKFB 204 20.06.08 Zemlja F 15 RKFB 208 23.06.08 Zemlja F 16 RKFB 212 23.06.08 Zemlja F 17 RKFB 214 25.06.08 Zemlja F 18 RKFB 218 25.06.08 Zemlja F 19 RKFB 220 26.06.08 Zemlja F 20 RKFB 223 26.06.08 Zemlja F 21 RKFB 227 26.06.08 Zemlja F 22 RKFB 231 27.06.08 Zemlja F 23 RKFB 237 30.06.08 Zemlja F 24 RKFB 241 30.06.08 Zemlja F 25 RKFB 243 01.07.08 Zemlja F 26 RKFB 247 01.07.08 Zemlja F 27 RKFB 251 01.07.08 Zemlja F 28 RKFB 255 01.07.08 Zemlja Doktorska disertacija Rezultati 91 5.11.2. Specifičnost bakteriofaga prema Xanthomonas spp. Eksperimentom je proučena aktivnost 20 izolata faga prema Xanthomonas spp. patogenima paprike. Kao potencijalni domaćini faga, korišćeno je 59 sojeva X. euvesicatoria izolovanih iz najvažnijih rejona gajenja paprike u Srbiji i 7 sojeva X. vesicatoria, X. perforans i X. gardneri. Proučavani izolati faga ispoljili su litičku aktivnost prema svim proučavanim sojevima X. euvesicatoria (Slika 39). Nijedan od proučavanih izolata faga nije ispoljio aktivnost prema kontrolnim sojevima X. vesicatoria, X. perforans i X. gardneri, što je dokaz njihove uske specifičnosti prema vrsti X. euvesicatoria (Tabela 24). Ovim proučavanjima potvrđeno je postojanje prirodnih antagonista (bakteriofaga) u zemljištu oko biljaka paprike sa simptomima bakteriozne pegavosti čiji je prouzrokovač X. euvesicatoria. Takođe, biologija bakteriofaga, specifičnost prema bakteriji X. euvesicatoria ide u prilog činjenici da se mogu koristiti u biološkoj borbi. Osim toga, obzirom da izolati bakteriofaga nisu ispoljili aktivnost prema kontrolnim sojevima bakterija X. vesicatoria, X. perforans i X. gardneri, mogu se koristiti za brzu i pouzdanu identifikaciju bakterije X. euvesicatoria. Slika 39. Bakteriofagi specifični prema sojevima bakterije X. euvesicatoria. Formirani plakovi ukazuju na prisustvo bakteriofaga Doktorska disertacija Rezultati 92 Tabela 24. Specifičnost bakteriofaga prema kontrolnim sojevima Soj bakterije Vrsta bakterije Izolati bakteriofaga 9 11 13 14 15 16 17 18 19 20 22 24 25 KFB 189 X. euvesicatoria + + + + + + + + + + + + + KFB 1 X. euvesicatoria + + + + + + + + + + + + + KFB 13 X. euvesicatoria + + + + + + + + + + + + + KFB 29 X. vesicatoria – – – – – – – – – – – – – KFB 0108 X. vesicatoria – – – – – – – – – – – – – KFB 0109 X. perforans – – – – – – – – – – – – – KFB 061 X. perforans – – – – – – – – – – – – – KFB 0116 X. gardneri – – – – – – – – – – – – – KFB 0110 X. gardneri – – – – – – – – – – – – – KFB 0111 X. gardneri – – – – – – – – – – – – – Legenda: + formiranje prozračnog plaka; – izostanak formiranja plaka. Doktorska disertacija Diskusija 93 6. DISKUSIJA Srbija je tradicionalno povrtarska zemlja sa izvanrednim klimatskim i zemljišnim potencijalom za ovaj vid proizvodnje. Ipak, prinos povrća u Srbiji značajno je manji u odnosu na ostvareni evropski prosek (Vlahović i sar., 2006). Za stabilan prinos, u kontinuitetu, neophodan je kvalitetan semenski i sadni materijal, kao i odgovarajuća i pravovremena agrotehnika. Osim toga, za visoke prinose veoma je važno očuvati useve zdravim (Balaž, 1994; Obradović i sar., 2000b). Fitopatogene bakterije mogu prouzrokovati znatne gubitke na povrtarskim gajenim biljkama (Obradović i sar., 1995; Arsenijević, 1997). Paprika u našoj zemlji ima veliki privredni značaj i spada u grupu najznačajnijih povrtarskih biljnih vrsta. Po podacima Republičkog zavoda za statistiku (Beograd), gaji se na oko 20.000 ha. Papriku parazitira veliki broj patogenih gljiva, bakterija i virusa. U ekonomski najznačajnije patogene paprike u našim agroekološkim uslovima gajenja, ubraja se prouzrokovač bakteriozne pegavosti Xanthomonas euvesicatoria (Arsenijević i sar., 1997a; Balaž i sar., 2003; Obradović i sar. 1995; 2004a; 2008a; Gašić i sar., 2011; Šević i sar., 2011). Na rasprostranjenost i značaj ovog patogena u Srbiji pored meteoroloških činilaca, utiče gajenje osetljivog sortimenta, neadekvatno primenjena agrotehnika, tip zemljišta kao i nedovoljno efikasne mere zaštite useva (Balaž i sar., 2003; Obradović i sar., 2008a). Dugo se smatralo da bakterioznu pegavost paprike prouzrokuje relativno homogena vrsta poznata pod nazivom Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Međutim, neujednačenost u pogledu nekih biohemijskih i patogenih karakteristika među sojevima uočena je još 70-tih godina prošlog veka (Dye i sar., 1964; Cook i Stall, 1969; Cook, 1973). Podelu sojeva na dve grupe A i B među prvima su izvršili Vauterin i sar. (1995). U grupu - A svrstani su neamilolitički sojevi čiji je predstavnik vrsta imenovana kao X. axonopodis pv. vesicatoria, dok je kao predstavnik amilolitičke grupe B imenovana vrsta X. vesicatoria. Kasnije, analizom masnih kiselina gasnom hromatografijom i hibridizacijom DNK, Jones i Stall (1998) su izdiferencirali još dve grupe sojeva (C i D). Daljim Doktorska disertacija Diskusija 94 proučavanjem bakterija na nivou DNK predloženo je da vrsta sa karakteristikama fenotipske grupe A bude preimenovana u X. euvesicatoria (Jones i sar., 2006); grupa B u X. vesicatoria (Vauterin i sar., 1995); X. perforans kao predstavnik grupe C (Jones i sar., 2006) i X. gardneri kao predstavnik grupe D (Šutić, 1957; Jones i sar., 2006). Nakon postupka validacije prihvaćeni su binominalni nazivi za pomenute četiri vrste, koji se zvanično koriste od 2006. godine. Sve promene u sistematici fitopatogenih bakterija koje su se dogodile u poslednjih nekoliko godina nalaze se na validacionoj listi sa predstavnicima tipskih sojeva za svaku vrstu ponaosob (Bull i sar. 2012). Obzirom na navedene promene u sistematici fitopatogenih bakterija i činjenicu da se bakteriozna pegavost paprike pojavljuje svake godine u Srbiji, ukazala se potreba za ustanovljavanjem sastava i diverziteta populacije i usaglašavanja sa najnovijom sistematikom. Stoga je u periodu od 2008 do 2010. godine izvršeno prikupljanje i izolacija patogena iz listova obolelih biljaka paprike sa simptomima bakteriozne pegavosti. Nakon izolacije u cilju identifikacije patogena odabrano je 116 sojeva, poreklom iz 32 lokaliteta Republike Srbije. Detaljno su proučene patogene, odgajivačke, biohemijsko-fiziološke, serološke i molekularne karakteristike prikupljenih sojeva. Izvršena je diferencijacija fizioloških rasa, ocenjena je osetljivost najčešće gajenih genotipova paprike u nas prema rasi P8. Izvršena je izolacija prirodnih antagonista (bakteriofaga) i utvrđena je osetljivost sojeva prema baktericidima (CuSO4, streptomicin, kasugamicin). Potvrda patogenosti proučavanih sojeva potvrđena je na osnovu reakcije biljaka paprike sorte Kalifornijsko čudo korišćenjem metode inokulacije ubrizgavanjem bakterijske suspenzije u mezofil sa naličja lisnog tkiva. Većina proučavanih sojeva prouzrokovala je prve promene nakon tri dana od inokulacije, u vidu tamnozelenih zona sa naličja lista. Vremenom zahvaćeno tkivo žuti, nekrotira, dobijajući mrku boju i ubrzo dolazi do opadanja inokulisanog lišća. Slične rezultate o patogenosti sojeva poreklom iz paprike prema biljci domaćinu sorte Palanačka babura izneli su Obradović i sar. (2000). Novija istraživanja pokazuju da su patogena svojstva bakterija u direktnoj vezi sa postojanjem hrp (hypersensitive response and pathogenicity) gena koji je ustanovljen u skoro svim Gram - negativnim bakterijama roda Xanthomonas (Büttner i He, 2009; Boch i Bonas, 2010). Doktorska disertacija Diskusija 95 Smatra se da su upravo ovi geni ključ patogenosti većine Xanthomonas patovara koji su odgovorni za aktivaciju T3S sistema sekrecije, posrednika u interakciji biljka domaćin - patogena bakterija (Alfano i Collmer, 2004; He et ali sar., 2004;. Büttner i Bonas, 2006) Na test biljkama duvana sorte Samsun svi proučavani sojevi prouzrokovali su hipersenzitivnu reakciju posle 24 časa. Iz ove reakcije zaključeno je da se bakterije proučavanih sojeva nalaze u inkompatibilnom odnosu sa test biljkama duvana (Klement i sar., 1990). Hipersenzitivna reakcija predstavlja jedan od vidova aktivne odbrane biljaka u koju su uključeni svi mehanizmi biohemijskog suprotstavljanja napadnutih ćelija biljke. Jedan od najznačajnijih odbrambenih reakcija vezana za aktivnost membrane jeste oslobađanje kiseoničnih radikala i brojnih enzima, koja vodi do kolapsa ćelije i do njene smrti. Posledice su takve da napadnute ćelije odumiru, zahvaćeni deo lisnog tkiva nekrotira čime se zaustavlja dalje širenje patogena (Arsenijević, 1997). U morfološkom pogledu, bakterijske ćelije proučavanih sojeva su Gram-negativne, štapićastog oblika sa zaobljenim ivicama, veličine od 0.9 -1.2 µm; asporogene, pojedinačne ili u parovima. Ocenom odgajivačkih odlika, posmatranjem izgleda kolonija na standardnim (YDC i MPA) i poluselektivnim podlogama (Tween 80, Milk-Tween, mSQ i TTCA) među proučavanim sojevima nisu zapažene razlike. Na standardnoj YDC podlozi, svi proučavani sojevi su formirali žute, okrugle, sluzaste, ispupčene i sjajne kolonije, tipične za bakterije roda Xanthomonas. Po protokolu APS-ISF-a (2010) (American Phytopathological Society - International Seed Federation) YDC podloga se navodi kao najpogodnija za morfološku identifikaciju bakterije i preporučuje se za izolaciju patogena. Na mesopeptonskoj podlozi (MPA) formirane kolonije bile su sjajne, krem-žute boje, prečnika 1 - 2 mm. Međutim, od ranije je poznato da se nedostatak standardnih podloga ogleda u njihovoj neselektivnosti i razvoju velikog broja saprofitnih bakterija. Težnja istraživača tokom vremena bila je usmerena ka stvaranju podloga koje bi omogućile selektivnost pri izolaciji što bi umnogome olakšalo odabir bakterijskih kolonija. Rezultatima naših proučavanja potvrđeno je da su podloge Tween B i Milk - Tween (MT) zbog svoje selektivnosti i jednostavne pripreme veoma pogodne za razlikovanje kolonija, a promene Doktorska disertacija Diskusija 96 koje nastaju u samim podlogama, oko formiranih kolonija, karakteristične su za rod Xanthomonas. Beličasta zona koja je formirana oko kolonija proučavanih sojeva, ukazivala je na stvaranje kalcijum-oleata usled hidrolize Tween-a 80, što je već poznata karakteristika bakterija roda Xanthomonas. Po McGuire i saradnicima (1986), mlečne (bele) zone hidrolize oko formiranih kolonija, nastaju kao rezultat oslobađanja lipida iz Tween-a 80 usled aktivnosti lipolitičkih enzima. Na MT podlozi svi proučavani sojevi su, pored beličastih zona, formirali i prosvetljene zone usled hidrolize kazeina iz mleka. Ova odlika bakterija roda Xanthomonas može poslužiti kao diferencijalna karakteristika u odnosu na kolonije bakterije P. s. pv. syringae (Goszczynska i Serfontein, 1998). Na mSQ podlozi, neposredno ispod kolonija formiraju se silikati što se takođe smatra diferencijalnom karakteristikom bakterija roda Xanthomonas (Schaad i sar., 2001). Obzirom na zadovoljavajuću selektivnost podloga kao što su Tween B i MT, visoka cena hemikalija koje ulaze u sastav podloga kao što su TTCA i mSQ utiče na to da se one ređe koriste. Veću selektivnost podloga moguće je postići dodatkom određenih antibiotika, što su u svojim ogledima potvrdili Sijam i sar. (1991), Balaž i Delibašić (2005), Mirik i Aysan (2009). Porast bakterija svih proučavanih sojeva je zabeležen i u tečnoj (YS) podlozi pri 37°C, u podlozi sa 5% NaCl, kao i pri koncentraciji trifenil-tetrazolium hlorida 0,02%, što su već poznate karakteristike bakterije X. euvesicatoria (Obradović i sar. 2000a). Poznavanje biohemijske aktivnosti pojedinih vrsta bakterija je od velikog značaja u pogledu njihove identifikacije. Već je pomenuto u prethodnim poglavljima da se ocenom amilolitičke i pektolitičke aktivnosti može izvršiti diferencijacija i preliminarna potvrda identiteta vrsta Xanthomonas spp. (Vauterin i sar., 1995). Jones i sar. (2004) izdvajaju korišćenje dekstrina, D-galaktoze i cis-akonitinske kao diferencijalne testove za razlikovanje vrsta Xanthomonas spp. U našim istraživanjima, svi proučavani sojevi imali su zajedničke karakteristike kao što su odsustvo stvaranja oksidaze, oksidativni metabolizam glukoze, stvaranje kiseline iz dekstrina, galaktoze, glukoze i manoze, porast na podlozi sa cis-akonitinskom kiselinom stvaranje katalaze, nedostatak amilolitičkih i pektolitičkih enzima, hidroliza želatina i eskulina. U pogledu korišćenja azotnih jedinjenja zabeleženo je odsustvo redukujućih supstanci - ni jedan od proučavanih sojeva nije redukovao nitrate. Doktorska disertacija Diskusija 97 Imajući u vidu pomenute rezultate preliminarno je zaključeno da proučavani sojevi poseduju karakteristike bakterije X. euvesicatoria. Iako su konvencionalne metode proučavanja fitopatogenih bakterija standardnim diferencijalnim testovima i dalje u primeni, uvek je postojala težnja istraživača za razvojem pouzdanijih, bržih i automatizovanih metoda u cilju potvrde identiteta patogena. U identifikaciji bakterija danas se u velikoj meri koriste serološke metode koje se zasnivaju na enzimskim reakcijama kao što su ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), IF (Immunofluorescence) i test aglutinacije. Prema Arsenijević (1997) identifikacija bakterija serološkim putem ima za cilj dokazivanje zajedničkih antigenih stuktura pojedinih bakterija koja je uslovljena njihovom hemijskom građom. Primenom serološkog testa DAS - ELISA u našim istraživanjima, utvrđena je antigena uniformnost proučavanih sojeva sa korišćenim antitelima bakterije X. c. pv. vesicatoria. Međutim, nedovoljna specifičnost seroloških testova ogleda se u tome što su u i dalje u upotrebi poliklonalni antiserumi bakterije X. c. pv. vesicatoria. Ovaj test često je korišćen u identifikaciji X. c. pv. vesicatoria Mitrev i Kovačević (2006), Yuzbasioglu i Saygili (2007) i Tawfik i sar. (2009). Korišćenjem aglutinacionog testa, kao drugog serološkog testa u ovom radu, potvrđene su zajedničke serološke karakteristike proučavanih sojeva. Lemattre i sar. (1992) i Mclaughlin i Chen (1990) svrstavaju ovaj serološki metod u kvalitativan obzirom na to da nema egzaktnih merenja. Usled heterogene populacije Xanthomonas spp., korišćenjem primenjenih antitela bakterije X. c. pv. vesicatoria u oba primenjena serološka testa može se govoriti samo o sličnim ili istim antigenim karakteristikama proučavanih sojeva. Leite i sar. (1995) su na ovu pojavu i razlike među sojevima u serološkom smislu ukazivali u svojim ranijim istraživanjima. Smatrali su da da bi upotreba specifičnih antitela doprinela tačnijoj identifikaciji. Međutim, svoj dalji rad usmerili su u proučavanja strukture genoma bakterija Xanthomonas kompleksa u cilju iznalaženja adekvatnih metoda detekcije korišćenjem molekularnih testova. Među prvima su ustanovili da fitopatogene bakterije roda Xanthomonas, poseduju hrp gen koji je odgovoran za patogenezu, a pri tom nije prisutan u genomu saprofitnih i nepatogenih bakterija ovog roda. Doktorska disertacija Diskusija 98 Intenziviranjem ovih proučavanja koje se baziraju na molekularnim osobinama fitopatogenih bakterija roda Xanthomonas spp. Obradović i sar. (2004) sintetisali su prajmere RST 65 i RST 69 koji umnožavaju HrpB region hrp gena patogena veličine 420 bp. Utvrdili su jedinstvene restrikcione profile za svaku vrstu Xanthomonas spp. ponaosob. Molekularni metod RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) primenjen u ovom radu zasnivao se na analizi fragmenta hrp gena (HrpB regiona) pručavanih sojeva, dobijenih nakon digestije (sečenja) restrikcionim enzimima (CfoI, TaqI i HaeIII) prema metodi Obradović i sar. (2004). Među proučavanim sojevima nije utvrđen polimorfizam, obzirom da su dobijeni restrikcioni profili proučavanih sojeva bili identični sa profilom kontrolnog soja bakterije X. euvesicatoria. Međutim, razlike u izgledu restrikcionih profila ispoljile su se jedino među kontrolnim sojevima bakterija X. vesicatoria, X. perforans i X. gardneri. Takođe, polimorfizam nije utvrđen ni među sojevima koji pripadaju različitim fiziološkim rasama. Korak dalje i sintezu specifičnih prjmera za sve vrste Xanthomonas spp. u cilju identiteta proučavanih sojeva uz primenu lančane reakcije polimeraze opisali su Koenraadt i sar. (2009). Primenom ove metode i specifičnih prajmera, svi proučavani sojevi formirali su fragmente DNK veličine 173 bp. Poređenjem sa kontrolnim sojem potvrđeno je da pripadaju vrsti X. euvesicatoria. Prag detekcije ove metode utvrđen je na nivou 0,4 x 103 CFU/ml. Uzimajući u obzir rezultate ranijih proučavanja, može se konstatovati da u pogledu patogenih, morfoloških, seroloških i molekularnih odlika nije došlo do promena u sastavu populacije Xanthomonas spp. u Srbiji tokom poslednje decenije (Obradović i sar. 2004, 2008a 2000b). Neophodno je dalje i praćenje populacije Xanthomonas spp. obzirom da je paprika kao gajena biljna vrsta veoma zastupljena u povrtarskoj proizvodnji u nas, kao i da postoji opasnost od pojave novih patogena Xanthomonas spp. koji nisu do sada registrovani u Srbiji. Bakterija X. euvesicatoria rasprostranjena je na teritoriji Republike Srbije, na šta pre svega utiču povoljni agroekološki uslovi gajenja, nedovoljno razvijene efikasne mere zaštite, nepoštovanje osnovnih pravila agrotehnike i upotreba osetljivog sortimenta. Plodored kao osnovna agrotehnička mera biće uspešan samo ako se paprika na istu parcelu Doktorska disertacija Diskusija 99 vrati posle minimum 3 godine (Gvozdenović i sar. 2008). Izrazito povoljni vremenski uslovi, topla leta sa padavinama kao i obilno navodnjavanje tifonima, rasprskivačima, pogoduju širenju bakterija, te masovnoj infekciji lišća i plodova, što može dovesti do defolijacije biljaka. Prema Balaž, (2005) prouzrokovač bakteriozne pegavosti X. euvesivatoria spada u grupu tzv. termofilnih bakterija, a optimalna temperatura za ostvarenje infekcije je od 24 - 30 °C. Pogodni vremenski uslovi koji su nastupili u maju 2008. godine, kada je srednja mesečna temperatura bila je za 1.1 °C viša od proseka i imala je vrednost 17.5 °C, uticali su na masovnu pojavu i širenje bakteriozne pegavosti paprike. Obzirom da je i druga polovina maja bila značajno toplija sa temperaturama iznad ili značajno iznad uobičajenih vrednosti, u okolini Horgoša i Subotice (Senta, Novi Kneževac, Kanjiža, Čoka) u 2008. godini, zabeležen je visok intenzitet oboljenja na usevima industrijske (začinske) paprike sorte Horgoška slatka. Osim toga u ovom regionu zastupljene su domaće sorte slatke začinske paprike Horgoška slatka sa svojim varijacijama HS-1, HS-2, HS-5, HS-6, HS-8, koje su stvorene kao rezultat selekcije kompanije "Vitamin" u Horgošu. Ove sorte odlikuju se izuzetnim karakteristikama u smislu kvaliteta ploda i gaje se pre svega za mlevenje zbog visokog procenta suve materije. Međutim, sve sorte Horgoške paprike spadaju u grupu osetljivih prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti (Balaž i Delibašić, 2005). Iz godine u godinu na usevima na kojima se gaje sorte Horgoške slatke ovo oboljenje se pojavljuje u većem ili manjem intenzitetu. Jedan od razloga leži u činjenici da se setva obavlja direkto iz semena, a ugovaranjem proizvodnje ovih sorti sa poljoprivrednim proizvođačima iz cele Srbije otvara se put širenju patogena u nova područja. Pored Horgoša, visok intenzitet oboljenja zabeležen je i u drugim lokalitetima Bačke (Odžaci, Kula, Vrbas, Bačka Palanka, Gložan, Čelarevo, Selenča, Despotovo, Silbaš, Bački Petrovac i Pivnice). Analizom zastupljenog sortimenta u svim pomenutim lokalitetima zapaženo je da su u upotrebi najvećim delom domaće sorte, koje pripadaju različitim grupama zrenja i odlikuju se različitim tipovima ploda (kapije, šipke, babure). Može se reći da su biljke paprike svih pomenutih sorti bile osetljive u svim fazama razvoja (klijanci, list, cvet, plod), bez obzira na tip ploda ili grupu zrenja. Na navodnjavanim usevima, kao i na usevima na kojima nije primenjena adekvatna agrotehnika intenzitet zaraze bio je znatno viši. Doktorska disertacija Diskusija 100 U 2009. godini takođe visok intenzitet oboljenja zabeležen je u lokalitetima centralne, zapadne i južne Srbije u lokalitetima: Šabac, Kraljevo, Trstenik, Smederevska Palanka, Leskovac sa indeksom oboljenja u polju između 20 - 50%. I na ovim usevima širenju oboljenja doprineli su povoljni vremenski uslovi, osetljiv sortiment, nedovoljno efikasne mere zaštite, kao i korišćenje sistema za navodnjavanje rasprskivanjem. Primena adekvatnih mera zaštite uz pravilnu agotehniku doprinela je redukciji oboljenja u okolini Čačka i Velike Plane (10%). Još uvek se u praksi kao glavni uzrok čestih pojava bakteriozne pegavosti jakog intenziteta, navodi gajenje osetljivog sortimenta paprike (Mijatović i sar., 2004). Gubici su najveći ukoliko se infekcija javi u ranim fenofazama, kao što je zabeleženo u Izraelu (Bashan i sar., 1985); Turskoj (Mirik i sar., 2005); SAD-u (Jones i sar., 1986); Sloveniji (Ravnikar i sar., 2001); Makedoniji (Mitrev i Kovačević, 2006). Obzirom na postojanje više fizioloških rasa bakterije X. euvesicatoria, (P0 - P10) sa različitim arealom rasprostranjenja (Kousik i Ritchie, 1996; Jones i sar., 1998a; Sahin i Miller, 1998), jedan od ciljeva ovog rada bio je ustanovljavanje rasnog sastava prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike u našim uslovima, što je od presudnog značaja sa aspekta zaštite oplemenjivanjem i stvaranjem otpornih linija i sorti. Zastupljenost pojedinih fizioloških rasa među proučavanim sojevima određena je na osnovu reakcije biljaka paprike sorte Early Calwonder (ECW), njenih izogenih linija ECW- 10 (Bs1), ECW-20 (Bs2), ECW-30 (Bs3) i biljaka paprike Capsicum pubescens PI235047 (Bs4). Ključevi za identifikaciju fizioloških rasa patogena X. euvesicatoria poreklom sa paprike opisani su u protokolu za utvrđivanje i razlikovanje rasnog sastava bakterije X. euvesicatoria APS - ISF-a (American Phytopatological Society - International Seed Federation, 2010). Na osnovu razlika ispoljenih u reakciji diferencijalnih sorti paprike, među našim sojevima utvrđena je heterogenost populacije bakterije X. euvesicatoria i ustanovljeno je da pripadaju rasama: P1, P3, P7 i P8. Od ukupno 116 proučavanih sojeva X. euvesicatoria, rasi P8 pripadaju 93 soja, rasi P7 17 sojeva, rasi P1 pripada pet, a rasi P3 jedan soj. Rasa 8 je najzastupljenija kako u pogledu prisustva na gajenom sortimentu, tako i sa aspekta rasprostranjenosti po lokalitetima. Prisutna je u skoro svim lokalitetima, osim Ruskog Doktorska disertacija Diskusija 101 Krstura i Stanišića u kojima je konstatovana samo rasa 7. U Horgošu su prisutne dve rase 1 i 8, u Gložanima, Kuli i B. Topoli ustanovljene su rase 7 i 8, dok je u ostalim lokalitetima konstatovana samo rasa 8. Ni u jednom lokalitetu nisu prisutne sve četiri rase patogena, ali izdvajaju se lokaliteti u kojima su zabeležene tri rase: Despotovo (3, 7, 8) i Smederevo sa rasama 1, 7, 8. Pojavu o nejednakoj distribuciji više različitih rasa na istom lokalitetu, kao i mogućnost da različite rase mogu biti izolovane sa jedne iste sorte paprike opisao je Garton (2009) u svojoj studiji. Takav slučaj, u našim proučavanjima, zabeležen je na sortama Boni (3, 7, 8), Slonovo uvo, HS-6 (1, 7, 8) i Palanačko čudo (7, 8). Ohrabruje činjenica da nije došlo do pojave novih rasa bakterije X. euvesicatoria. U prethodnim proučavanjima Obradović-a i saradnika (1999a, 2000a, 2004a), kod nas su utvrđene rase P1, P3, P7 i P8. Rowell i sar. (1998) ističu, da bez obzira na postojanje Bs2 gena u nekih sorti, može doći do infekcije biljaka, obzirom da uvek postoji opasnost od pojave novih rasa. Neke studije ukazuju na pojavu da u toku vegetacije dolazi do promena u rasnom sastavu bakterije X. euvesicatoria (Kousik i Ritchie, 1996a). U SAD-u postoje podaci koji ukazuju na smenjivanje dominacije jedne rase u donosu na drugu. Na teritoriji Floride, Severne Karoline i oko Centralne Amerike su, kao dominantne, ustanovljene rase P0, P1 i P3 (Bouzar i sar., 1994b). Nešto kasnije su Romero i saradnici (1996) u jugoistočom delu SAD konstatovali rasu 3 kao dominantnu. Rowell i saradnici (2001) su u Centralnom i istočnom Kentakiju determinisali prisustvo rasa 1, 3, 4 i 6, dok je O´Garro (1998) ustanovio rase 1 i 6 na teritoriji Grenade. Do sada nisu registrovani komercijalni genotipovi paprike sa Bs4 genima otpornosti (Stall i sar., 2009). Obzirom na tu činjenicu Garton (2009) iznosi zabrinutost od šteta koje nanosi rasa P10 u Džordžiji kao najdominantnija rasa na tom području. U Australiji je do sada konstatovana samo rasa P4 (Bouzar i sar., 1996), dok su u Kini dominantne rase P0 i P2. Selekcioni pritisak nastao unošenjem gena otpornosti u komercijalne genotipove gajenih biljaka, često rezultira pojavom sojeva sposobnih da prevaziđu otpornost (Pernezny i Collins, 1997). Česte mutacije X. euvesicatoria omogućuju da se prevaziđu geni otpornosti (Gassmann i sar., 2000; Minsavage i sar., 1990; Ritchie i Dittapongpitch, 1991), Doktorska disertacija Diskusija 102 čiji je rezultat raspad otpora domaćina (Kousik i Ritchie, 1998). Učestalost ovih promena i mutacija utiče na rasni sastav patogena i utiče na trajnost i postojanost otpornosti biljaka (Stall i sar., 2009), što znatno otežava stvaranje otpornih sorti prema postojećim rasama. Obzirom na dominaciju i zastupljenost rase 8 u skoro svim regionima gajenja u nas, proučena je osetljivost 11 genotipova paprike: HS-2, Amfora, Plamena, Anita, Novosađanka, Palanačka babura, Palanačko čudo, Slonovo uvo, Brillant, Bihar i Boni. Kao osetljiva prema svim rasama patogena uzeta je sorta Early Calwonder (ECW), a kao nosilac gena otpornosti Bs2 prema genu avirulentnosti patogena avrBs2 njena izogena linija ECW- 20. Izvedena su dva eksperimenta sa dve primenjene koncentracije inokuluma: 106 CFU /ml i 108 CFU /ml. Na osnovu ispoljenog intenziteta zaraze odabranih genotipova paprike u uslovima veštačke inokulacije u zaštićenom prostoru, ustanovljen je visok stepen osetljivosti većine proučavanih genotipova. U oba eksperimenta, bez obzira na primenjenu koncentraciju, na inokulisanim listovima osetljivih sorti obrazovale su se karakteristične vodenaste pege, u početku tamnozelene a kasnije mrke, sa manjim ili većim hlorotičnim oreolom. Pri koncentraciji inokuluma 106 CFU /ml, došlo je do postepenog razvoja simptoma, dok je u drugom ogledu viša koncentracija inokuluma (108 CFU/ml) uticala na bržu pojavu nekroze, sušenja i opadanja lišća. Većina proučavanih genotipova, u oba eksperimenta, bila je na nivou osetljivosti sorte ECW. Kao najosetljivije, izdvojile su se sorte Palanačka babura i Slonovo uvo. Može se konstatovati da su svi proučavani genotipovi, osim hibrida Bihar-a F1, u oba ogleda, bili osetljivi prema rasi P8 patogena. Kada se govori o otpornosti biljaka prema patogenima treba imati u vidu nekoliko važnih činilaca: specifičnost domaćina i patogena, varijabilnost patogena i uticaj ekoloških faktora na njihove međuodnose (O'Garo i Charlemange, 1994; Lopes i sar., 2001). Pojava kod nekih genotipova, da iako su osetljivi, dolazi do sporijeg razvoja simptoma, manjeg intenziteta, može se donekle objasniti aktiviranjem mehanizama prirodne otpornosti domaćina usled stvaranja suspstanci koje usporavaju širenje patogena u tkivima (Pohronezny i sar., 1992). Veoma značajnu ulogu u odbrani biljaka od patogena imaju faktori prirodne otpornosti i jedinjenja kao što su fenoli, glikozidi, glukonaze, hitinaze koje usporavaju ili potpuno zaustavljaju razvoj patogena. Doktorska disertacija Diskusija 103 O'Garo i Charlemange (1994), ustanovili su da bakterijska populacija može biti značajno redukovana usled aktivnosti β-1,3- glukonaze i hitinaze, enzima koji su prirodno prisutni u tkivima cveta i lista paprike. Obzirom da je većina proučavanih genotipova ispoljila visok stepen osetljivosti prema prouzrokovaču bakteriozne pegavosti, kao i da postoji izolovan gen otpornosti prema najzastupljenijoj rasi patogena u nas, selekcija paprike na otpornost bila bi značajan doprinos kontroli ovog ekonomski značajnog oboljenja. U zaštiti bilja kod nas još uvek dominiraju hemijske mere borbe, odnosno korišćenje hemijskih sredstava ili pesticida (Obradović, 2009; Ivanović i sar., 1998). Kontrola i suzbijanje oboljenja izazvanih bakterijama, predstavljaju stalni izazov, kako za proizvođače i stručne službe, tako i za istraživače fitopatologe. Kao i kod većine bakterioznih oboljenja, ni bakteriozna pegavost paprike se ne suzbija lako i jednostavno. Potrebno je preduzeti niz mera koje uključuju: agrotehničke, hemijske, stvaranje otpornih hibrida i sorti i altenativne mere zaštite (aktivatori otpornosti i biopesticidi). Proizvođači paprike nemaju adekvatna sredstva za borbu protiv ovog patogena, a jedini registrovani baktericidi u našoj zemlji na bazi jona bakra često nisu dovoljno efikasni posebno u vremenskim uslovima koji pogoduju intenzivnom razvoju bolesti (Šević i sar., 2011a). Preparati na bazi antibiotika nisu registrovani za upotrebu u zaštiti bilja u našoj zemlji, ovom prilikom korišćeni su in vitro u eksperimentalne svrhe. Obzirom na mali spektar aktivnih materija za suzbijanje bakteriozne pegavosti paprike i nekontrolisanu upotrebu antibiotika, kao i čestu primenu bakarnih preparata, uočene razlike u osetljivosti proučavanih sojeva ukazuju da postoji velika opasnost od razvoja rezistentnosti bakterija. U našim proučavanjima minimalna inhibitorna koncentracija streptomicin-sulfata, za sve sojeve je iznosila 50 ppm. U ranijim istraživanjima osetljivosti sojeva u in vitro uslovima prema bakar-sulfatu i streptomicinu, utvrđeno je da su koncentracije streptomicina 20, 50, 100 i 200 ppm i bakar sulfata 200 ppm, potpuno zaustavile razvoj kolonija na podlozi (Obradović i sar., 2000b). Upoređivanjem rezultata iznetim u ovoj disertaciji sa prethodnim rezultatima Obradovića i saradnika (2000b), može se konstatovati da je u periodu od 2000-2011 godine došlo do pojave rezistentosti patogena prema bakru i jednim delom prema kasugamicinu, što posebno zabrinjava. Obzirom da antibiotici u našoj Doktorska disertacija Diskusija 104 zemlji nisu registrovani u zaštiti bilja, nekontrolisana i ilegalna upotreba antibiotika je ekološki neopravdana i može dovesti do pojave rezistentnih sojeva patogena, što je potvrđeno i našim rezultatima. Rezultati eksperimenta izvedenog u cilju ocene osetljivosti proučavanih sojeva prema različitim koncentracijama bakar-sulfata in vitro pokazao je da nisu svi sojevi podjednako osetljivi na bakar-sulfat. Proučavani sojevi razvijali su se podjednako pri 100 ppm bakar-sulfata u podlozi, dok koncentracija od 200 ppm CuS04 nije delovala inhibitorno na sve proučavane sojeve. To ukazuje na moguću pojavu rezistentnosti bakterije na navedeno jedinjenje bakra. Naime, 19 sojeva se slabije razvijalo u podlozi sa 200 ppm bakar-sulfata. Njihove kolonije su bile manje, slabije su se razvijale i nije dolazilo do njihovog spajanja. Razlog pojave rezistentnosti proučavanih sojeva prema ovom jedinjenju leži u širokoj i čestoj upotrebi ove i drugih aktivnih supstanci na bazi jona bakra za kontrolu mikoza i bakterioza u biljnoj proizvodnji. Kаo posledicа česte primene bаkаrnih prepаrаtа na Floridi su još 1983. godine registrovаni sojevi patogena rezistentni prema jedinjenjima bаkra i streptomicina (Marco i Stall, 1983). Pokazalo se u praksi da je primenа bаkаrnih prepаrаtа mаnje efikаsnа od njihovih kombinаcijа sа EBDC fungicidimа (Adaskaveg i Hine, 1985). Razlog rezistentnosti ispitivanih sojeva prema bakru leži u širokoj i čestoj upotrebi bakarnih preparata različitih formulacija (Bordovska čorba, bakar hidroksid, bakar sulfat) za kontrolu bolesti u proizvodnji. Stoga, u nedostatku efikasnih baktericida rešenje treba tražiti u integralnom pristupu, odnosno sintezi saznanja o biologiji i epidemiologiji patogena, tehnologiji biljne proizvodnje, kao i baktericidnom efektu pojedinih supstanci (Obradović i sar., 2008a). Prema literaturnim podacima biološke (primena bakteriofaga) i neke novije alternativne metode (aktivatori otpornosti), ukazuju na mogućnost razvoja efikasne strategije za suzbijanje X. euvesicatoria (Obradović i Ivanović, 2007; Obradović, 2009; Gašić i sar., 2011). Kao sintetisana jedinjenja, pesticidi su različitog hemijskog sastava, toksikoloških osobina, perzistentnosti i potencijalni su zagađivači životne sredine. Međuprodukti degradacije često su perzistentniji od polaznog jedinjenja i ostaju duže vreme u zemljištu ili vodi (Đorđević i sar., 2008). Doktorska disertacija Diskusija 105 Poslednjih godina u primeni je nova grupa preparata, tzv. aktivatora otpornosti biljaka (SAR-systemic aquired resistance inducers), koji u kontaktu sa biljkom aktiviraju biohemijske procese i dovode do povećanja odbrambene sposobnosti i smanjenja mogućnosti ostvarenja infekcije patogenim mikroorganizmima (Louws i sar., 2001; Romero i sar., 2001; Obradović i sar., 2005, 2008a). Louws i sar. (2001) ističu upravo mogućnost korišćenja acibenzolar-S-metil-a (SAR-Systemic Acquired Resistance) aktivatora sistemične otpornosti biljaka, kao alternativu bakarnim preparatima, u regionima u kojima su registrovani rezistentni sojevi X. euvesicatoria prema jedinjenjima bakra. Obradović i sar. (2001b, 2002a) proučavali su mogućnosti kontrole prouzrokovača bakteiozne pegavosti paradajza u rasadu korišćenjem bakteriofaga i SAR aktivatora otpornosti. Sve veći značaj proizvodnje paprike kao rentabilne biljne vrste i visokih zahteva tržišta u smislu kvaliteta, usmeriće rad i na utvrđivanje eventualnog prisustva prirodnih neprijatelja koji prate populaciju bakterije, a mogu se koristiti kao prirodni agensi u cilju biološke zaštite. Integralni pristup u zaštiti bilja, uključujući i zaštitu paprike od bakteriozne pegavosti uz korišćenje bioloških preparata navode Obradović i sar. (2005). Stvaranje nepovoljnih uslova za razvoj bolesti primenom agrotehničkih mera, bioloških produkata, antagonističkih organizama i superparazita su tehnologije zaštite kojima se danas teži (Obradović, 2009). Biopesticidi podrazumevaju primenu korisnih mikroorganizama ili produkata njihovog metabolizma i predstavljaju alternativu sintetičkim jedinjenjima. Biološki agensi mogu biti na bazi korisnih gljiva, bakterija, kvasaca, virusnih čestica (bakteriofaga), kao i na bazi eteričnih ulja ili biljnih ekstakata. Mehanizmi delovanja bioloških materija razvijaju se u pravcu direktne kompeticije, antibioze, parazitizma i indukovane otpornosti. Među onima koji su prihvaćeni za primenu u praksi nalaze se i bakteriofagi ili jednostavnije fagi (Flaherty i sar., 2000; Balogh i sar., 2003; Jones i sar., 2006; Obradović i sar., 2004a, 2006, 2008a, 2009; Gašić i sar., 2007). Bakteriofagi predstavljaju najbrojnije mikroorganizme na planeti i spadaju u posebnu grupu virusa čiji su domaćini bakterije. Poslednjih godina intenzivirana su proučavanja u cilju suzbijanja bakteriozne plamenjače voćaka i ukrasnih biljaka, bakterioznog uvenuća duvana, bakterioznog raka i pegavosti Doktorska disertacija Diskusija 106 citrusa, bakteriozne pegavosti paradajza i paprike, lisne plamenjače crnog luka i dr. (Obradović, 2009). Bakteriofagi su široko prisutni u prirodi, umnožavaju se samo u prisustvu ćelije domaćina, usko su specifični eliminišući samo kompatibilnu vrstu ili soj bakterije i netoksični su za eukariote. U ovom radu izolovani su fagi, specifični prema vrsti Xanthomonas euvesicatoria, prouzrokovaču bakteriozne pegavosti paprike. Bakteriofagi su, metodom direktne izolacije, izolovani iz uzoraka zemljišta na kome je gajena paprika. Izolovani fagi potiču iz zemljišta u neposrednoj blizini korena zaraženih biljaka. Spektar domaćina i specifičnost faga proučeno je korišćenjem 59 sojeva X. euvesicatoria i 7 sojeva X. vesicatoria, X. gardneri i X. perforans. Svi izolati faga ispoljili su specifičnost prema bakteriji X. euvesicatoria i nisu lizirali ostale Xanthomonas spp. patogene paprike i paradajza, čime je dokazano prisustvo faga kao prateće populacije patogena u prirodi. Sve ove činjenice čine fage veoma značajnim biološkim agensima za suzbijanje bolesti prozrokovanih fitopatogenim bakterijama. Postojanje bakteriofaga u zemljištu oko zaraženih biljaka kao i mogućnost izolacije potvrđuju i rezultati brojnih autora koji ukazuju na probleme prilikom izolacije faga iz filosfere biljaka (Okabe i Goto, 1963; Erskin, 1973; Flaherty i sar, 2001; Gill i sar., 2003). Ova pojava može se objasniti činjenicom da zemljište, u poređenju sa nadzemnim delovima biljke, predstavlja povoljniju sredinu za opstanak faga. Takođe, zemljište obezbeđuje zaštitu od UV zračenja i isušivanja, dva glavna faktora koja utiču na inaktivaciju faga (Iriarte i sar., 2007). Specifičnost faga prema pojedinim vrstama ili sojevima bakterija često je korišćena u identifikaciji biljnih patogena (Dye i sar., 1964; Cupples, 1984), obzirom da je procedura detekcije plakova veoma brza i efikasna. Na osnovu različite specifičnosti faga prema vrstama X. euvesicatoria, X. vesicatoria, X. gardneri i X. perforans, moguće je diferencirati ove vrste. Ustanovljavanje populacije Xanthomonas kompleksa, rasnog sastava, osetljivosti prema baktericidima trebalo bi da postane kontinuiran proces i ubuduće obzirom na česte promene i pojavu novih sojeva i rasa. Doktorska disertacija Zaključak 107 7. ZAKLJUČAK Na osnovu rezultata, dobijenih tokom ovih proučavanja, može se zaključiti sledeće:  Simptomi bakteriozne pegavosti lišća i krastavosti plodova paprike ispoljavaju se svake godine u Srbiji u većem ili manjem intenzitetu.  Iz obolelih biljaka izolovano je 116 sojeva bakterija tokom 2008, 2009 i 2010. godine.  Proučavanjem patogenih, odgajivačkih, biohemijsko-fizioloških odlika svi proučavani sojevi ispoljavaju karakteristike bakterije X. euvesicatoria.  Serološkim testovima (DAS – ELISA, aglutinacija) utvrđeno je da proučavani sojevi poseduju iste antigene karakteristike.  Identifikacija primenom molekularnih metoda (RFLP, PCR) potvrđeno je da proučavani sojevi poseduju odlike vrste X. euvesicatoria.  Na osnovu ispoljenih reakcija diferencijalnih sorti i izogenih linija paprike utvrđene su 4 fiziološke rase: P1, P3, P7, P8. Najzastupljenija je rasa P8, prisutna u svim lokalitetima u Srbiji.  Proučena je osetljivost najčešće gajenih genotipova paprike u Srbiji prema najzastupljenijoj rasi (P8) bakterije X. euvesicatoria. Utvrđeno je da su svi proučavani genotipovi paprike u našim istraživanjima ispoljili visok stepen osetljivosti prema rasi P8 bakterije X. euvesicatoria.  Utvrđen je različit stepen osetljivosti među proučavanim sojevima prema baktericidima u in vitro uslovima. Među proučavanim sojevima 19 je rezistentno prema CuSO4 (konc. 200 ppm), a 6 sojeva prema kasugamicinu koncentracije 50 ppm. Za razliku od bakar-sulfata i kasugamicina, streptomicin-sulfat je delovao baktericidno i pri najmanjoj koncentraciji. Doktorska disertacija Zaključak 108  Izolacijom iz zemljišta uzetog neposredno oko zaraženih biljaka utvrđeno je prisustvo bakteriofaga u neposrednom okruženju. Proučavani sojevi faga specifični su prema vrsti Xanthomonas euvesicatoria, dok prema ostalim Xanthomonas spp. nisu ispoljili aktivnost.  Prouzrokovač bakteriozne pegavosti lišća i krastavosti plodova paprike u Srbiji je X. euvesicatoria. Utvrđena je rasprostranjenost i diverzitet populacije na teritoriji Srbije u svim proizvodnim lokalitetima paprike. Obzirom na postojanje 4 fiziološke rase i gajenje osetljivog sortimenta preporučuje se selekcija na otpornost prema najzastupljenijoj rasi 8. Rezistenost proučavanih sojeva prema najčešće korišćenim baktericidima u nas upućuje na korišćenje novih mera zaštite. Utvrđena je populacija prirodnih antagonista – bakteriofaga čime se otvaraju mogućnosti njihove primene u identifikaciji patogena, kao i u biološkoj zaštiti.  Ustanovljavanje populacije Xanthomonas spp., rasnog sastava, osetljivosti prema baktericidima trebalo bi da postane kontinuiran proces i ubuduće obzirom na česte promene i pojavu novih sojeva i rasa. Doktorska disertacija Literatura 109 8. LITERATURA Abbasi, P., Soltani, N., Cuppels, A. D., Lazarovits, G. (2002): Reduction of bacterial spot disease severity on tomato and pepper plants with foliar applications of ammonium lignosulfonate and potassium phosphate. Plant disease, 86 (11): 1232 - 1236. Adaskaveg, J. E., Hine, R. B. (1985): Copper tolerance and zink sensitivity strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, causal agent of bacterial spot of pepper. Plant disease, 69 (11): 993 - 996. Adriano, D. (2001): Trace Elements in Terrestrial Environments: Bioavailability, Biogeochemistry and Risks of Metals. The 2nd Edition. Springer Verlag - New York. Agrios, G. N. (2005): Plant Pathology. Elsevier Academic Press, Burlington, Massachusetts, USA. Alfano, J. R., Collmer, A. (2004): Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annual Review Phytopathology, 42: 385 - 414. Alvarez, A. M., Lou, K. (1982): Rapid field identification of a bacterial pathogen by an Enzyme - Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Phytopathology, 72: 947. Alvarez, A. M., Benedict, A. A., Mizumoto, C. Y. (1985): Identification of xanthomonads and grouping of strains of Xanthomonas campestris pv. campestris with monoclonal antibodies. Phytopathology, 75: 722 - 728. Arsenijević, M., Balaž, J. (1978): Etiološka proučavanja bakteriozne pegavosti lista paprike. Savremena poljoprivreda, 7 - 8: 75 - 76. Arsenijević, M., Jovanović, O. (1993): Pseudomonas syringae pv. tomato parazit rasada paradajza. Zaštita bilja, 203: 73 - 83. Arsenijević, M., Jovanović, O. (1995): Nov postupak razlikovanja bakterija po Gramu. Zaštita bilja, 211: 57 - 62. Arsenijević, M. (1997): Bakterioze biljaka. S print. Novi Sad. Arsenijević, M., Trkulja, V., Obradović, A. (1997): Pathogenic and bacteriological characteristics of Yugoslav Erwinia soft rot strains originating from pepper and eggplant fruits. Journal of Plant Diseases and Protection, 104 (4): 394 - 402. Doktorska disertacija Literatura 110 Aysan, Y., Sahin, F. (2003): Occurrence of bacterial spot disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria on pepper in the eastern Mediterranean region of Turkey. Plant Pathology, 52: 781. Balaž, J. (1988): Pojava novih i nekih manje poznatih bakterioza u Jugoslaviji tokom 1987. godine. XII Seminar zaštite bilja, Aranđelovac. Zbornik radova: 58 - 60. Balaž, J. (1994): Pegavost lišća paprike prouzrokovana bakterijom Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Savremena poljoprivreda, vanredni broj, 42: 341 - 345. Balaž, J., Knežević, T., Rašić, Đ. (2002): Ispitivanje mogućnosti hemijskog suzbijanja ekonomski najštetnijih fitopatogenih bakterija u našim uslovima. XII simpozijum o zaštiti bilja i savetovanje o primeni pesticida, Zlatibor. Knjiga abstrakata: 132. Balaž, J., Obradović, A., Knežević, T. (2003): Bakterioze na semenu i sadnom materijalu povrtarskih, ratarskih i ukrasnih biljaka. Biljni lekar, 31 (6): 629 - 638. Balaž, J. (2005): Seme kao izvor primarnog inokuluma za nastanak bakterioza povrća i integrisane mere zaštite. Pesticidi i fitomedicina, 20 (2): 79 - 88. Balaž, J., Delibašić, T. (2005): Iznalaženje meoda za izolaciju Xanthomonas campestris pv. vesicatoria sa semena paprike. Pesticidi i fitomedicina, 20 (1): 51 - 60. Balogh, B. (2002): Strategies for improving the efficacy of bacteriophages for controlling bacterial spot of tomato. Masters Thesis, University of Florida. Florida, USA. Balogh, B., Jones, J. B., Momol, M. T., Olson, S. M., Obradović, A., King, B., Jackson, L. E. (2003): Improved efficacy of newly formulated bacteriophages for management of bacterial spot on tomato. Plant Disease, 87: 949 - 954. Bashan, Y., Okon, Y., Henis, Y. (1982): Long-term survival of Pseudomonas syringae pv. tomato and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato and pepper seeds. Phytopathology, 72: 1143 - 1144. Bashan, Y., Diab, S., Okon, Y., (1982a): Survival of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in pepper seeds and roots, in symptomless and dry leaves in non-host plants and in the soil. Plant and Soil, 68: 1691 - 170. Bashan, Y., Azaizeh, M., Diab, S., Yunis, H., Okon, Y. (1985): Crop loss of pepper plants artificially infected with Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in relation to symptom expression. Crop Protection, 4: 77 - 84. Basim, H. (1998): Recent development in molecular genetics of plant disease resistant. Turkey Journal of Biology, 22: 413 - 420. Doktorska disertacija Literatura 111 Basim, H., Basim, E., Jones, J. B., Minsavage, G. V., Dickstein, E. R. (2004): Bacterial spot of tomato and pepper caused by Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria in the western Mediterranean region of Turkey. Plant Disease, 88 (1): 85. Bedlan, G. (1985): Bacterial speck diseases of tomatoes. Pflanzenschutz, 10: 12 - 13. Bender, C. L., Malvick, D. K., Conway, K. E., George, S., Pratt, P. (1990): Characterization of pXV10A, a copper resistance plasmid in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Applied Enviromental Microbiology, 56 (1): 170 - 175. Bogatzevska, N., Iliev, I., Boneva, P. (1992): Characterization of epiphytic Pseudomonas syringae pv. tomato and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria from symptomless weeds in Bulgaria. Plant Pathogenic Bacteria, 8th Int. Con. INRA: 831 - 834. Bogatzevska, N., Iliev, I. (1994): Difference of Xanthomonas campestris pathovars (vesicatoria, glycines, phaseoli) in pathogenicity and bacteriological properties in host and non-host plants. In: Plant Pathogenic Bacteria: 523 - 526. Bogatzevska, N., Sotirova, V., Deneva, S. (1995): Naturally epiphytic survival of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on symptomless tomato and weed. TGC Report, 45: 17-18. Bogatzevska, N., Deneva, S. (1996): Survival of Xanthomonas campestris pv. glycines, phaseoli, vesicatoria in the seeds of weeds. 9th International conference Plant pathogenic bacteria, India: 72. Boch, J., Bonas, U. (2010): Xanthomonas AvrBs3 Family - Type III Effectors: Discovery and Function. Annual Review of Phytopathology, 48: 419 - 36. Bonas, U., Stall, R. E., Staskawicz, B. (1989): Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Molecular and General Genetics, 218: 127 - 136. Bonas, U., Schulte, R., Fenselau, S., Minsavage, G. V., Staskawicz, B. J. (1991): Isolation of a gene cluster from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria that determines pathogenicity and the hypersensitive response on pepper and tomato. Molecular Plant- Microbe Interacion, 4: 81 - 88. Bonas, U. (1994): hrp genes of phytopathogenic bacteria. Current Topics in Microbiology and Immunology, 192: 79 - 98. Bonas, U., Van den Ackerveken, G. (1997): Recognition of bacterial avirulence proteins occurs inside the plant cell: A general phenomenon in resistance to bacterial diseases. The Plant Journal, 12: 1 - 7. Doktorska disertacija Literatura 112 Bonas, U., Lahaye, T. (2002): Plant disease resistance triggered by pathogen-derived molecules: Refined models of specific recognition. Current Opinion in Microbiology, 5 (1): 44 - 50. Bosland, P. W., Iglesias, J., Gonzalez, M. M. (1994): 'NuMex Centennial' and 'NuMex Twilight' ornamental chiles. Horticultural Science, 29: 1090. Bouzar, H., Jones, J. B., Minsavage, G. V., Stall, R. E., Scott, J. W. (1994): Proteins unique to phenotipically of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria revealed by silver staining. Phytopathology, 84: 39 - 44. Bouzar, H., Jones, J. B., Stall, R. E., Hodge, N. C., Minsavage, G. V., Benedict, A. A., Alvarez, A. M. (1994a): Physiological, chemical, serological and pathogenic analysis of a worldwide collection of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strains. Phytopathology, 84 (7): 663 - 671. Bouzar, H., Ahmed, N. E., Somodi, G. C., Jones, J. B., Stall, R. E. (1994b): Characterization of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria strains from tomato and pepper grown in Sudan. Plant Disease, 78 (12): 1219. Bouzar, H., Jones, J. B., Somodi, G. C., Stall, R. E., Daouzli, N., Lambe, R. C., Felix- Gastelum, R., Trinidad-Correa, R. (1996): Diversity of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato and pepper fields of Mexico. Canadian Journal of Plant Pathology, 18 (1): 75 - 77. Bradbury, J. F. (1984): Genus II. Xanthomonas. Dowson 1939, 187AL, 100-210. In: Krieg NR, Holt JG, ed. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1. Baltimore, USA: Williams & Wilkins. Bradbury, J. F. (1986): Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB International Mycological Institute, Kew, England. Bull, C. T., De Boer, S. H., Denny, T. P., Firrao, G., Fischer-Le Saux, M., Saddler, G. S., Scortichini, M., Stead, D. E., Takikawa, Y. (2008): Demystifying Nomenclature of Bacterial Plant Pathogens. Journal of Plant Pathology, 90: 403 - 417. Bull, C. T., De Boer, S. H., Denny, T. P., Firrao, G., Fischer-Le Saux, M., Saddler, G. S., Scortichini, M., Stead, D. E., Takikawa, Y. (2010): Comprehensive list of names of plant pathogenic bacteria, 1980-2007. Journal of Plant Pathology, 92: 551 - 592. Bull, C. T., De Boer, S. H., Denny, T. P., Firrao, G., Fischer-Le Saux, M., Saddler, G. S., Scortichini, M., Stead, D. E., Takikawa, Y. (2012): List of new names of plant pathogenic bacteria (2008-2010). Journal of Plant Pathology, 94 (1): 21 - 27. Doktorska disertacija Literatura 113 Buonaurio, R., Stravato, V. M., Scortichini, M. (1994): Characterization of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria from Capsicum annuum L. in Italy. Plant Disease, 78: 296 - 299. Buonaurio, R., Servili, M. (1999): Involvement of lipoxygenase, lipoxygenase pathway volatiles, and lipid peroxidation during the hypersensitive reaction of pepper leaves to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Physiological and Molecular Plant Pathology, 54: 155 - 169. Burkholder, W. C., Li, C. C. (1941): Variation in Phytomonas vesicatoria. Phytopathology, 31: 753 - 755. Büttner, D., Bonas, U. (2006): Who comes first? How plant pathogenic bacteria orchestrate type III secretion. Current Opinion in Microbiology, 9 (2): 193 - 200. Büttner, D., He, Y. S. (2009): Type III Protein Secretion in Plant Pathogenic Bacteria. Plant Physiology, 150: 1656 - 1664. CABI (2004): Crop Protection Compendium - CD. Calzolari, A. (1986): Bacterial diseases of tomatoes: symptoms, epidemiology, diagnosis, control. Informatore Fitopatologico, 36: 11 - 17. Canteros, B. I., Minsavage, G. V., Bonas, U., Pring, D., Stall, R. E. (1991): A gene from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria that determines avirulence in tomato is related to avrBs3. Molecular Plant-Microbe Interactions, 4: 628 - 632. Chan, J. W. Y. F., Goodwin, P. H. (1999): The molecular genetics of virulence of Xanthomonas campestris. Biotechnology Advances, 17: 489 - 508. Clark, M. F. (1981): Immunosorbent assays in plant pathology. Annual Review of Phytopathology, 19: 83 - 106. Clark, M. F., Adams, A. N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme- linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology, 34: 475 - 483. Cook, A. A. (1973): Characterization of hypersensitivity in Capsicum annuum induced by the tomato strain of Xanthomonas vesicatoria. Phytopathology, 63: 915 - 918. Cook, A. A., Stall, R. E. (1969): Differentiation of pathotypes among isolates of Xanthomonas vesicatoria. Plant Disease, 55: 617 - 619. Cook, A. A., Stall, R. E. (1982): Distribution of races of Xanthomonas vesicatoria pathogenic on pepper. Plant Disease, 66: 388 - 389. Doktorska disertacija Literatura 114 Cook, A. A., Guevara, Y. G. (1984): Hypersensitivity in Capsicum chacoense to race 1 of the bacterial spot pathogen of pepper. Plant Disease, 68: 329 - 330. Cruz, M., Fernández, A. I. (1979): Immunofluorescence in the testing of seeds and leaves of plants with bacterial infection. Ciencias, Sanidad Vegetal. 17. Havana University, Havana, Cuba. Cupples, D. A. (1984): The use of pathovar - indicative bacteriophage leaf and fruit lesions. Phytopathology, 74: 891 - 894. Cuppels, D. A., Louws, F. J., Ainsworth, T. (2006): Development and evaluations of PCR- based diagnostic assays for the bacterial speck and bacterial spot pathogens of tomato. Plant Disease, 90: 451 - 458. Dane, F., Marten, M. H. (1994): Growth of bioluminescent Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in tomato cultivars. Horticultural Science, 29: 1037 - 1038. Daniel, J. F., Boher, B. (1981): Fluorescent antibody technique for detection of Xanthomonas campestris pv. manihotis on cassava leaves. Proceedings of the International Conference on Plant Pathogenic Bacteria 5th. In J. C. Lozano (Ed.), Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Colombia: 176 - 180. De Cleene, M. (1989): Scanning electron microscopy of the establishment of compatible and incompatible Xanthomonas campestris pathovars on the leaf surface of Italian ryegrass and maize. EPPO Bulletin, 19: 81 - 88. Diab, S., Bashan, Y., Okon, Y., Henis, Y. (1982): Effects of relative humidity on bacterial scab caused by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on pepper. Phytopathology, 72: 1257 - 1260. Diab, S., Bashan, Y., Okon, Y. (1982a): Studies on infection with Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, causal agent of bacterial scab of pepper in Israel. Phytoparasitica, 10: 183 - 191. Domen, H. Y., Alvarez, A. M. (1978): Detection of Xanthomonas campestris in soil using a direct immunofluorescent technique. Proc. 4th Int. Conf. Plant Pathogenic bacteria, 1: 301 - 305. Dye, D. W., Starr, M. P., Stolp, H. (1964): Taxonomic clarification of Xanthomonas vesicatoria based upon host specifity, bacteriophage sensitivity and cultural characteristics. Phytopathology, 51: 394 - 407. Đinović, I. (2005): Paprika je tropska biljka. Poljoprivredni list, V/55: 22. Đorđević, M., Zečević, B., Cvikić, D., Đorđević, R., Šević M. (2008): Vestal PVP-179 novi Doktorska disertacija Literatura 115 preparat za suzbijanje prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. IX Savetovanje o zaštiti bilja, Društvo za zaštitu bilja Srbije, Zlatibor. Zbornik rezimea: 86. Đorđević M., Mijatović, M., Šević, M., Obradović, A., Ivanović, M. (2011): Biological control of tomato pathogens with Bacillus subtilis in vitro. The 5th Balkan Symposium on Vegetables and Potatoes. 9 - 12 October, Tirana, Albania, Book of Abstracts: 47. Erskin, J. M. (1973): Characteristics of Erwinia amylovora bacteriophage and its possible role in the epidemiology of fire blight. Canadian Journal of Microbiology, 19: 837 - 845. Ellingboe, A. H. (1984): Genetics of host - parasite relations: An essay: 131 - 151 in: Advances in Plant Pathology, Vol. 2, D. D. Ingram and P. H. Williams, eds. Academic Press, New York. Fahy, P. C., Persley, G. J. (1983): Plant Bacterial Diseases. A Diagnostic Guide. Academic Press, Australia. Flaherty, J. E., Jones, J. B., Harbaugh, B. K., Somodi, G. C., Jackson, L. E. (2000): Control of bacterial spot on tomato in the greenhouse and field with h - mutant bacteriophages. Horticultural Science, 35: 882 - 884. Flaherty, J. E., Harbaugh, B. K., Jones, J. B., Somodi, G. C., Jackson, L. E. (2001): H- mutant bacteriophages as a potential biocontrol of bacterial blight of geranium. Hort Science, 36: 98 - 100. Garcion, C., Lamotte, O., Métraux, J. P. (2007): Mechanisms of Defence to Pathogens: Biochemistry and Physiology, in Induced Resistance for Plant Defence: A Sustainable Approach to Crop Protection (eds D. Walters, A. Newton and G. Lyon), Blackwell Publishing, Oxford, UK. Gardner, M. W., Kendrick, J. B. (1923): Bacterial spot of tomato and pepper. Phytopathology, 13: 307 - 315. Garton, J. E. Jr. (2009): Evaluation of race and copper tolerant strains of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, causal agent of bacterial leaf spot of bell pepper in Georgia. Master of science. Gassmann, W., Dahlbeck, D., Chesnokova, O., Minsavage, G. V., Jones, J. B., Staskawicz, B. J. (2000): Molecular evolution of virulence in natural field strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Journal of Bacteriology, 182: 7053 - 7059. Gašić, K., Ivanović, M., Obradović, A. (2007): Proučavanje specifičnosti bakteriofaga prema Xanthomonas sp. patogena paprike i paradajza. XIII simpozijum sa savetovanjem o zaštiti bilja, Zlatibor, Zbornik rezimea: 121 - 122. Doktorska disertacija Literatura 116 Gašić, K., Ivanović, M. M., Ignjatov, M., Ćalić, A., Obradović, A. (2011): Isolation and characterization of Xanthomonas euvesicatoria bacteriophages. Journal of Plant Pathology, 93 (2): 415 - 423. Gašić, K., Obradović, A. (2012): Indukovana otpornost biljaka. Ratarstvo i povrtarstvo, 49 (3): 326 - 334. Gill, J. J., Svirčev, A. M., Smith, R., Castle, A. J. (2003): Bacteriophages of Erwinia amylovora. Applied and Environmental Microbiology, 69: 2133 - 2138. Gitaitis, R., McCarter, S., Jones, J. (1992): Disease control in tomato transplants produced in Georgia and Florida. Plant Disease, 76 (7): 651 - 656. Goode, M. J., Sasser, M. (1980): Prevention-The key to controling bacterial spot and bacterial speck of tomato. Plant diseases, 64: 831 - 834. Goszczynska, T., Serfontein, J. (1998): Milk-Tween agar, a semiselective medium for isolation and differentiation of Pseudomonas syringae pv. syringae, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola and Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Journal of Microbiological Methods, 32: 65 - 72. Gough, C. L., Genin, S., Zischek, C., Boucher, C. A. (1992): hrp genes of Pseudomonas solanacearum are homologous to pathogenicity determinants of animal pathogenic bacteria and are conserved among plant pathogenic bacteria. Molecular plant Microbe Interaction, 5: 384 - 389. Grahovac, M., Inđić, D., Lazić, S., Vuković, S. (2009): Biofungicidi i mogućnosti primene u savremenoj poljoprivredi. Pesticidi i fitomedicina, 24 (4): 245 - 258. Griesbach, E., Lattauschke, G., Schmidt, A., Naumann, K., (1988): On the occurrence of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on pepper under glass and plastic covers. Nachrichtenblatt fur den Pflanzenschutz, 42 (9): 176 - 178. Gvozdenović, Đ., Takač, A., Bugarski, D., Jovićević, D. (2005): Mogućnost dugotrajnog čuvanja semena paprike. Selekcija i semenarstvo, 2 (2): 209 - 211. Gvozdenović, Đ., Bugarski, D., Gvozdanović-Varga, J., Vasić, M., Červenski, J., Takač, A., Jovićević, D. (2008): Doprinosi unapređenju povrtarske proizvodnje za 70 godina rada instituta za ratarstvo i povrtarstvo. Zbornik radova, 45 (1): 113 - 129. Gvozdenović, Đ., Cvejić, S. (2009): Oplemenjivanje paprike. Institut za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad. Gvozdenović, Đ. (2010): Paprika. Institut za ratarstvo i povrtarstvo. Novi Sad. Doktorska disertacija Literatura 117 Han, S. W., Park, C. J., Lee, S. W., Ronald, P. C. (2008): An efficient method for visualization and growth of fluorescent Xanthomonas oryzae pv. oryzae in planta. BMC Microbiology, 8: 164. He, S. Y., Nomura, K., Whittam, T. S. (2004): Type III protein secretion mechanism in mammalian and plant pathogens. Biochimica Biophysica Acta, 1694: 181 - 206. Hibberd, A. M., Basset, M. J., Stall, R. E. (1987): Allelism tests of three dominant genes for hypersensitive rsistance to bacterial spot of pepper. Phytopathology, 77: 1304 - 1307. Holland, I. B., Schnitt, L., Young, J. (2005): Type I protein secretion in bacteria, the ABC transporter dependent pathway. Molecular Membrane Biology, 22: 29-39. Huguet, E., Hahn, K., Wengelnik, K., Bonas, U. (1998): hpaA mutants of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria are affected in pathogenicity but retain the ability to induce host-specific hypersensitive reaction. Molecular Microbiology, 29: 1379 - 1390. Ignatov, A. N., Kornev, K. P., Mateeva, E. V., Pekhtereva, E. S., Polityko, V. A., Budenkov, N. I., Schaad, N. W. (2009): Occurence of bacterial spot and bacterial canker of tomato in the Russian Federation. Acta Horticulturae, 808: 247 - 250. Ivanović, M., Mijatović, M., Obradović, A. (1998): Suzbijanje prouzrokovača bolesti, štetočina i korova u lejama za proizvodnju rasada paradajza i paprike. Poljoprivredne aktuelnosti, 1 - 2: 59 - 63. Iriarte, F. B., Balogh, B., Momol, M. T., Smith, L. M., Wilson, M., Jones, J. B. (2007): Factors Affecting Survival of Bacteriophage on Tomato Leaf Surfaces. Applied and environmental Microbiology, 73 (6): 1704 - 1711. Jones, J. B., Jones, J. P. (1985): The effect of bactericides, tank mixing time and spray schedule on bacterial leaf spot of tomato. Proceedings of the Florida State Horticultural Society, 98: 244 - 247. Jones, J. B., Pohronezny, K. L., Stall, R. E., Jones, J. P. (1986): Survival of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Florida on tomato crop residue, weeds, seeds, and volunteer tomato plants. Phytopathology, 76 (4): 430 - 434. Jones, J. B., Woltz, S. S., Jones, J. P., Portier, K. L. (1991): Population dynamics of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on tomato leaflets treated with copper bactericides. Phytopathology, 81 (7): 714 - 719. Jones, J. B., Jones, J. P., Woltz, S. S. (1993): The effect of selected copper bactericides on population dynamics of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on tomato leaflets. Pro. of the Fl. St. Hort. Soc. 106: 160 - 163. Doktorska disertacija Literatura 118 Jones, J. B., Minsavage, G., V., Stall, R. E., Kelly, R. O., Bouzar, H. (1993a): Genetic analysis of a DNA region involved in expression of two epitops associated with lipopolysaccharide in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology, 83: 551 - 556. Jones, J. B., Stall, R. E., Minsavage, G. V., Scott , J. W., Bouzar, H. (1994): Distribution of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria races in the Caribbean and Central America. Phytopathology, 84: 1476. Jones, J. B., Stall, R. E., Scott, J. W., Somodi, G. C., Bouzar, H., Hodge, N. C. (1995): A third tomato race of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Plant Disease, 79 (4): 395 - 398. Jones, J. B., Bouzar, H., Somodi, G. C., Stall, R. E., Pernezny, K. (1998): Evidence for the preemtive nature of tomato race 3 of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Florida. Phytopathology, 88: 33 - 38. Jones, J. B., Stall, R. E. (1998): Diversity among xanthomonads pathogenic on pepper and tomato. Annual Review Phytopathology, 36: 41 - 58. Jones, J. B., Bouzar, H., Stall, R. E., Almira, E. C., Roberts, P., Bowen, B. W. (2000): Sytematic analysis of Xanthomonads (Xanthomonas spp.) associated with pepper and tomato lesions. International Journal od Systematic Bacteriology, 50: 1211 - 1219. Jones, J. B., Stall, R. E., Minsavage, G. V., Roberts, P. D., Kousik, C. S., Subramanya, S. R., Johnson, R. R. (2002): A Non-Hypersensitive resistance in Capsicum annuum to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria races associated with field resistance to all known pepper races. XII simpozijum o zaštiti bilja i savetovanje o primeni pesticida, Zlatibor. Knjiga abstrakata: 22 - 23. Jones, J. B., Lacy, G. H., Bouzar, H., Stall, R. E., Schaad, N. W. (2004): Reclassification of the Xanthomonads associated with bacterial spot disease of tomato and pepper. Systematic and Applied Microbiology, 27: 755 - 762. Jones, J. B., Iriarte, F. B., Obradović, A., Balogh, B., Momol, M. T., Jackson, L. E. (2006): Management of bacterial spot on tomatoes with bacteriophages. Proceedings of the 1st International Symposium on Biological control of Bacterial Plant Diseases. Dermstadt, Germany, 23 - 26 October. Mitt. Biol. Bundesanst. Land-Forstwirtsch, 408: 154 - 157. Kelman, A. (1954): The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology, 44: 693 - 695. Klement, Z. (1963): Rapid detection of the pathogenecity of phytopathogenic pseudomonads. Nature, 199: 299 - 300. Doktorska disertacija Literatura 119 Klement, Z., Rudolph, K., Sands, D. C. (1990): Methods in Phytobacteriology. Akademiai Kiado. Budapest. Koenraadt, H., van Betteray, B., Germain, R., Hiddink, G., Jones, J. B., Oosterhof, J. (2009): Development of specific primers for the molecular detection of bacterial spot of pepper and tomato. Acta Horticulturae (ISHS), 808: 99 - 102. Kornev, K. P., Matveeva, E. V., Pekhtereva, E. S. H., Polityko, V. A., Ignatov, A. N., Punina, N. V., Schaad, N. W. (2009): Xanthomonas species causing bacterial spot of tomato in the russian federation. Acta Horticulturae (ISHS), 808: 243 - 246. Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (1995): Isolation of pepper races 4 and 5 of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria from diseased peppers in southeastern U. S. fields. Plant Disease, 79 (5): 540. Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (1996): Disease potential of pepper bacterial spot pathogen races that overcome the Bs2 gene for resistance. Plant disease, 79 (5): 540. Kousik, C. S. Ritchie, D. F. (1996a): Race shift in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria within a season in field grown pepper. Phytopatology, 86: 952 - 958. Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (1998): Response of bell pepper cultivars to bacterial spot pathogen races that individually overcome major resistance genes. Plant Disease, 82: 181 - 186. Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (1999): Development of bacterial spot on near-isogenic lines of bell pepper carrying gene pyramids composed of defeated major resistance genes. Phytopatology, 89: 1066 - 1072. Kovacs, N. (1956): Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, 178: 703. Kritzman, G. (1989): Tomato seed assay for seedborne pathogenic bacteria. Hassadeh, 69 (4): 614 - 617. Krstić, B., Tošić, M. (1994): Biljni virusi, neke osobine i dijagnoza. Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet. Krstić, B., Bulajić, A., Đekić, I., Berenji, J. (2008): Virus bronzavosti paradajza - jedan od najdestruktivnijih biljnih virusa. Pesticidi i fitomedicina, 23: 153 - 166. Kurowski, C., Conn, K., Himmel, P. (2010): Guideline for identification of pepper bacterial leaf spot races using differential hosts. APS - ISF (www.worldseed.org) . Doktorska disertacija Literatura 120 Laub, C. A., Stall, R. E. (1967): An evaluation of Solanum nigrum and Physalis minima as suscepts of Xanthomonas vesicatoria. Plant Disease, 51: 659 - 661. Lazarovits, G., Zutra, D., Bar-Joseph, M. (1987): Enzyme-linked immunosorbent assay on nitrocellulose membranes (dot-ELISA) in the serodiagnosis of plant pathogenic bacteria. Canadian Journal of Microbiology, 33: 98 - 103. Leandro, J. R., Volin, B. R. (1987): Role of stomata opening and frequency of infection of Lycopersicon spp. by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology, 77 (9): 1311 - 1317. Leben, C., Sleesman, J. P. (1981): Bacterial pathogens: Reducing Seed and In Vitro Survival by Physical Treatments. Plant Disease, 65: 876 - 878. Leite, R. P. Jr, Minsavage, G. V., Bonas, U., Stall, R. E. (1994): Detection and identification of phytopathogenic Xanrhomonas strains by amplification of DNA sequences related to the hrp genes of X. c. pv. vesicatoria. Applied Enviromental Microbiology, 60: 1068 - 1077. Leite, R. P. Jr, Jones, J. B., Somodi, G. C., Minsavage, G. V., Stall, R. E. (1995): Detection of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria associated with pepper and tomato seed by DNA amplification. Plant Disease, 79 (9): 917 - 922. Lelliott, R. A., Stead, D. E. (1987): Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of Plants. British Society for Plant Pathology Blackwell Scientific Publications. London, UK. Lemattre, M., Narcy, J. P., Berthier, Y., Philippot, P., Jacquet, C., Clauzel, J. M. (1992): Development of serological tools for the detection of Xanthomonas species. Plant Pathogenic Bacteria, 66: 287 - 291. Lindgren, P. B., Peet, R. C., Panopoulos, N. J. (1986): Gene cluster of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola controls pathogenicity of bean plants and hypersensitivity on nonhost plants. Journal of Bacteriology, 168: 512 - 522. Lopes, C. A., Quezado-Duval, A. M. (2001): Reaction of capsicum genotypes to bacterial wilt and bacterial spot. Proceedings of the 10th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Charlottetown, Prince Edward Island, Canada: 306 - 308. Lorenz, C., Büttner, D. (2009): Functional characterization of the type III secretion ATPase HrcN from the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Journal of Bacteriology, 191: 1414 - 1428. Louws, F. J., Fulbright, D. W., Stephens, C. T., de Bruijn, F. J. (1995): Differentiation of genomic structure by rep - PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology, 85: 528 - 536. Doktorska disertacija Literatura 121 Louws, F. J., Cuppels, D. A. (2001): Appendix A: molecular techniques. In: Schaad, N. W., Jones, J. B., Chun, W. (eds) Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria, 3rd edition. APS Press: 321 - 331. Louws, F. J., Wilson, M., Campbell, H. L., Cuppels, D. A., Jones, J. B., Shoemaker, P. B., Sahin, F., Miller, S. A. (2001): Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator. Plant Disease, 85: 481 - 488. Machado, J. C., Langerak, C. J., Jacoud-Filho, D. S. (2002): Seed - borne fugi: A Contribution to Routine Seed Health Analysis. ISTA, Switzerland. Mathur, S. B., Kongsdal, O. (2003): Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. ISTA, Switzerland. Marković, V. (2004): Stanje i perspektive povrtarske proizvodnje u Vojvodini. Agrarna saznanja, Novi Sad. Marco, G. M., Stall, R. E. (1983): Control of bacterial spot of pepper initiated by strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria that differ in sensitivity to copper. Plant disease, 67 (7): 779 - 781. Marlovits, T. C., Kubori, T., Sukhan, A., Thomas, D. R., Gala´n, J. E., Unger, V. M. (2004): Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science, 306: 1040 - 1042. Marlovits, T. C., Kubori, T., Lara-Tejero, M., Thomas, D., Unger, V. M., Gala´n, J. E. (2006): Assembly of the inner rod determines needle length in the type III secretion injectisome. Nature, 441: 637 - 640. McGuire, R. G., Jones, J. B., Sasser, M. (1986): Tween media for semiselective isolation of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria from soil and plant material. Plant Disease, 70 (9): 887 - 891. McGuire, R. G., Jones, J. B. (1991): Epiphytic populations of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on tomato cultigens resistant and susceptible to bacterial spot. Plant Disease, 75: 606 - 609. McLaughlin, R. J., Chen, T. A. (1990): ELISA Methods for Plant Pathogenic Prokaryotes. In: Serological Methods for Detection and Identification of Viral and Bacterial Plant Pathogens a Laboratory Manual, Hampton, R., E. Ball and S.D. Boer (Eds.). APS Press, St. Paul Minnesota: 197 - 204. McInnes, T. B., Gitaitis, R. D., McCarter, S. M., Jaworski, C. A., Phatak, S. C. (1988): Airborne dispersal of bacteria in tomato and pepper transplant fields. Plant Disease, 72 (7): 575 - 579. Doktorska disertacija Literatura 122 McManus, P. S., Jones, A. L. (1995): Detection of Erwinia amylovora by nested PCR and PCR dot-blot and reverse blot hybridizations. Plant Disease, 85: 618 - 623. Mijatović M., Zečević B., Cvikić D., Obradović A. (2004): Diseases of pepper in Serbia and results of breeding for resistance. XII Meeting on Genetics and Breeding of Capsicum and Eggplant, Noordwijk, Netherlands. Book of abstracts: 187. Mijatović, M., Obradović, A., Ivanović, M. (2007): Zaštita povrća. AgroMivas, Smederevska Palanka. Milenković, S., Petanović, R., Jevremović, D., Milijašević, S., Tanasković, S. (2006): Aktuelana istraživanja u oblasti zaštite voćaka. Voćarstvo, 156 (40): 367 - 378. Minsavage, G. V., Dahlbeck, D., Whalen, M. C., Kearney, B., Bonas, U., Staskawicz, B. J., Stall, R. E. (1990): Gene-for-gene relationships specifying disease resistance in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria - pepper interactions. Molecular Plant Microbe Interaction, 3: 41 - 47. Mirik, M., Aysan, Y., Cinar, O. (2005): Prevalence and incidence of bacterial spot disease caused by Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on pepper in the eastern mediterranean region of Turkey. Pakistan Journal of Biological Sciences, 8 (12): 1656 - 1658. Mirik, M., Aysan, Y., Cinar, O. (2007): Copper-resistance strains of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria (Doidge) Dye in the eastern mediterranean region of Turkey. Journal of Plant Pathology, 89 (1): 153 - 154. Mirik, M., Aysan, Y., Cinar, O. (2008): Biological control of bacterial spot disease of pepper with Bacillus strains. Turkısh Journal of Agrıculture and Forestry, 32 (5): 381 - 390. Mirik, M., Aysan, Y. (2009): Detection of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria in naturally infected pepper seeds in Turkey. Journal of Plant Pathology, 91 (2): 433 - 436. Mitrev, S., Kovačević, B. (2006): Characterization of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria isolated from peppers in Macedonia. Journal of Plant Pathology, 88 (3): 321 - 324. Momol, M. T., Jones, J. B., Otson, S., Obradović, A., Balogh, B., King, P. (2002): Integrated management of bacterial Spot on Tomato in Florida. Fact Sheet PP110, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida (http://edis.ifas.ufl.edu). Moretti., C., Amatulli, M. T., Buonaurio, R. (2009): PCR-based assay for the detection of Xanthomonas euvesicatoria causing pepper and tomato bacterial spot. Applied Microbiology, 49: 466 - 471. Doktorska disertacija Literatura 123 Mullis, K., Faloona, S., Scharf, S., Saiki, R., Horn, G., Erlich, H. (1986): Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposium. Quantitative Biology, 51: 263 - 273. Noël, L., Thieme, F., Nennstiel, D., Bonas, U. (2001): cDNA-AFLP analysis unravels a genome-wide hrpG-regulon in the plant pathogen Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Molecular Microbiology, 41: 1271 - 1281. Obradović, A., Arsenijević, M., Marinković, N., Mijatović M. (1994): Bakteriozna pegavost rasada paprike. Treći jugoslovenski kongres o zaštiti bilja, Vrnjačka Banja. Zbornik rezimea: 65. Obradović, A., Arsenijević, M., Marinković, N., Mijatović, M. (1995): Bakteriozna pegavost rasada paprike. Zaštita bilja, 213: 215 - 220. Obradović, A., Arsenijević, M., Mijatović, M. (1997): Bakterioze paprike. Treće jugoslovensko savetovanje o zaštiti bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 33 - 34. Obradović, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Arsenijević, M. (1999): Characterization of pathogenic bacteria isolated from pepper in Yugoslavia. Phytomedizin, Mitteilungen aus der Deutschen Phytomedizinischen Gesellschaft, 29: 40 - 41. Obradović A., Arsenijević M., Mijatović M. (1999a): Određivanje rasa bakterije Xanthomonas campestris pv. vesicatoria patogena paprike u Jugoslaviji. Četvrto jugoslovensko savetovanje o zaštiti bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 86. Obradović, A., Arsenijević, M., Mavridis, A., Rudolph, K. (2000): Patogene i biohemijsko fiziološke karakteristike sojeva Xanthomonas campestris pv.vesicatoria patogena paprike u Srbiji. Zaštita bilja, 51 (1 - 2): 157 - 175. Obradović, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Arsenijević, M. (2000a): Bacterial spot of capsicum and tomato in Yugoslavia. OEPP/EPPO, Bulletin, 30: 333 - 336. Obradović, A., Arsenijević, M., Mijatović, M., Ivanović, M. (2000b): Sve učestalija pojava Xanthomonas campestris pv. vesicatoria parazita paradajza u Srbiji. 11. jugoslovenski simpozijum o zaštiti bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 51. Obradović, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Arsenijević, M., Mijatović, M. (2001): Bacterial diseases of pepper in Yugoslavia. In: De Boer SH (ed) Plant Pathogenic Bacteria: 255-258. Kluwer Academic Publishers, the Nederlands. Obradović, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Zdravković, J. (2001a): Sudden appearance of the tomato race of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Yugoslavia. In: De Boer SH (ed) Plant Pathogenic Bacteria (pp 350 - 352). Kluwer Academic Publishers, the Nederlands. Doktorska disertacija Literatura 124 Obradović, A., Jones, J. B., Momol, T., Olson, S., Pradhanang, P., Balogh, B. (2001b): Interaction of PGPR, bacteriophages, bacterial antagonists, and SAR inducers in control of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on tomato in the greenhouse. 17th Annual Tomato Disease Workshop, West Palm Beach, Florida. Proceedings book: 77 - 79. Obradović, A., Jones, J. B., Momol, M. T., Olson, S. M., King, p. C., Balogh, B. (2002): Mogućnosti primene nekih bioloških agenasa i aktivatora otpornosti biljaka u integralnoj zaštiti paradajza od bakteriozne pegavosti. XII simpozijum o zaštiti bilja i savetovanje o primeni pesticida, Zlatibor. Knjiga abstrakata: 40 - 41. Obradović, A., Jones, J. B., Momol, M.,T., Olson, S. M., Pradhanang, P., Balogh, B. (2002a): Efficacy of biocontrol agents and resistance inducers against tomato bacterial spot in the greenhouse. Annual Meeting of the American Phytopathological Society, Milwaukee, WI, USA. Phytopathology, 92: S 60. Obradović, A., Mavridis, A., Rudolph, K., Janse, J. D., Arsenijević, M., Jones, J. B., Minsavage, G. V., Wang, J. F. (2004): Characterization and PCR-based typing of Xanthomonas campestris pv.vesicatoria from peppers and tomatoes in Serbia. European Journal of Plant Pathology, 110: 285 - 292. Obradović, A., Jones, J. B., Momol, M. T., Balogh, B., Olson, S. M. (2004a): Management of Tomato Bacterial Spot in the Field by Foliar Applications of Bacteriophages and SAR Inducers. Plant Disease, 88: 736 - 740. Obradović, A., Jones, J. B., Momol, M. T., Balogh, B., Olson, S. M. (2004b): Bakteriofagi i aktivatori sistemične otpornosti - nova strategija u zaštiti paradajza od bakteriozne pegavosti. V kongres o zaštiti bilja Zlatibor. Knjiga abstrakata: 178 - 179. Obradović, A., Jones, J. B., Momol, M. T., Olson, S. M., Jackson, L. E., Balogh, B., Guven, K., Iriarte, F. B. (2005): Integration of biological control agents and systemic acquired resistance inducers against bacterial spot on tomato. Plant Disease, 89: 712 - 716. Obradović, A., Gašić, K., Ivanović, M. (2006): Izolacija bakteriofaga specifičnih prema sojevima Xanthomonas euvesicatoria patogenu paprike u Srbiji. VIII savetovanje o zaštiti bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 74. Obradović, A., Ivanović, M. (2007): O primeni antibiotika u zaštiti bilja. Biljni lekar, 1: 52 - 59. Obradović, A., Gašić, K., Stepanović, M. (2008): Bakteriofagi u zaštiti bilja. Biljni lekar, 36 (1): 36 - 44. Obradović, A., Jones, J. B., Balogh, B., Momol, M. T. (2008a): Integrated management of tomato bacterial spot in: Ciancio, A i Mukerji K. G. (eds.), Integrated Management of Doktorska disertacija Literatura 125 Diseases Caused by Fungi, Phytoplasma and Bacteria: 211 - 223. Springer Science+Business Media B. V. USA. Obradović, A. (2009): Bakteriofagi kao baktericidi u zaštiti bilja. Pesticidi i fitomedicina, 24: 9 - 17. Obradović, A. (2009a): Najznačajnije bakterioze biljaka gajenih u zaštićenom prostoru. Biljni lekar, 5: 513 - 527. Obradović, A. (2009b): Bakterioze paprike u Srbiji. X Savetovanje: Savremena proizvodnja povrća, Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. Savremeni povrtar - Zbornik radova: 32 - 35. O ΄Garro, L. W., Tudor, S. (1994): Contribution of four races of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria to bacterial spot in Barbados. Plant disease, 78: 88 - 90. O ΄Garro, L. W., Charlemange, E. (1994): Comparison of bacterial growth and activity of glucanase and chitinase in pepper leaf and flower tissue infected with Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Physiological and Molecular Plant Pathology, 45 (3):181 - 188. O ΄Garro, L. W. (1998): Bacterial Spot of tomato and pepper on four east caribbean islands: races, their abundance, distribution, aggressiveness, and prospects for control. Plant Disease, 82: 864 - 870. O ΄Garro, L. W., Gore, J. P., Ferguson, E. (1999): Races of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria overcoming the gene Bs2 for bacterial spot resistance in pepper, prevalent on Capsicum chinense in Barbados and Grenada and weakly pathogenic on bell pepper and tomato in the field. Plant Pathology, 48 (5): 588. Okabe, N., Goto, M. (1963): Bacteriophages of plant pathogens. Annual Review of Phytopathology, 1: 397 - 418. OEPP/EPPO (1992): Quarantine procedures. Xanthomonas campestris pv. vesicatoria – seed - testing method. EPPO/EPPO Bulletin, 22: 247 - 252. Pernezny, K., Kudela, V., Kokosková, B., Hládká, I. (1995): Bacterial diseases of tomato in the Czech and Slovak Republics and lack of streptomycin resistance among copper - tolerant bacterial strains. Crop Protection, 14 (4): 267 - 270. Pernezny, K., Collins, J. (1997): Epiphytic populations of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria on pepper: Relationships to host-plant resistance and exposure to copper sprays. Plant disease, 81: 791 - 794. Pernezny, K., Nagata, R., Havranek, N., Sanchez, J. (2008): Comparison of two culture media for determination of the copper resistance of Xanthomonas strains and their Doktorska disertacija Literatura 126 usefulness for the prediction of control with copper bactericides. Crop Protection, 27: 256 - 262. Peterson, G. H. (1963): Survival of Xanthomonas vesicatoria in soil and diseased tomato plants. Phytopathology, 53: 765 - 767. Pohronezny, K. L., Volin, R. B. (1983): The effect of bacterial spot on yield and quality of fresh market tomatoes. Horticultural Science, 18: 69 - 70. Pohronezny, K., Stall, R. E., Canteros, B. I., Kegley, M., Datnoff, L. E, Subramanya, R. (1992): Sudden shift in the prevalent race of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in pepper fields in southern Florida. Plant Disease, 76 (2): 118 - 120. Poplawsky, A. R., Urban, S. C., Chun, W. (2000): Biological role of xanthomonadin pigments in Xanthomonas campestris pv. campestris. Applied Environmental Microbiology, 66 (12): 5123 - 5127. Pugsley, A. P. (1993): The complete general seretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiological Reviews, 57: 50 - 108. Ravnikar, M., Demsar, T., Dreo, T. (2001): Laboratory diagnosis of bacterial spot on tomato and pepper. Zbornik predavanja in referatov 5. Slovensko Posvetovanje o Varstvu Rastlin, Catez ob Savi, Slovenija, 6 - 8. marec: 195 - 196. Ravikumar, M. R., Khan, A. (2002): Detection of Xanthomonas vesicatoria in tomato seeds by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Indian Journal of Agricultural Research, 36 (1): 39 - 43. Ritchie, D. F., Dittapongpitch, V. (1991): Copper and streptomycin resistant strains and host differential races of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in North Carolina. Plant disease, 75: 733 -736. Ritchie, D. F., Kousik, C. S., Paxton, T. C. (1998): Response of bacterial spot pathogen strains to four major resistance genes in pepper. Proceeding National Pepper Conference, San Antonio: 14. Romero, A. M., Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (1996): Characteristics of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria race 3 strains isolated from pepper. Phytopathology, 86: 78. Romero, A. M., Kousik, C. S., Ritchie, D. F. (2001): Resistance to bacterial spot in bell pepper induced by acibenzolar-S-methyl. Plant Disease, 85: 189 - 194. Rowell, B., Jones, R. T., Nesmith, W., Snyder, J. C. (1998): In: Proc. Natl. Pepper Conf., San Antonio, 13-15 Oct: Bacterial spot resistance, yield, and quality of bell pepper cultivars in epidemic and disease-free environments: 39 – 40. Doktorska disertacija Literatura 127 Rowell, B., Terry-Jones, R., Nesmith, W., Satanek, A., Snyder, J. C. (2001): Bacetrial spot resistance, yield and quality of bell and speciality peppers. Hort Technologie, 11 (4): 648 - 657. Rudolph, K. (1993): Infection of the plant by Xanthomonas. In Swings, J. G. & Civerolo, E. L. (Eds.), Xanthomonas. London: Chapman & Hall. Sahin, F. (2001): Pepper races 7, 8 and 10 of Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria isolated from diseased pepper plants in Turkey. Plant Pathology, 50: 809. Sahin, F., Miller, S. A. (1995): First report of pepper race 6 of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, causal agent of bacterial spot of pepper. Plant Disease, 79 (11): 1188. Sahin, F., Miller, S. A. (1996): Characterization of Ohio Strains of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Causal Agent of Bacterial Spot of Pepper. Plant Disease, 80 (7): 773 - 778. Sahin, F., Miller, S. A. (1998): Resistance in Capsicum pubescens to Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Pepper Race 6. Plant Disease, 82: 794 - 799. Sands, D. C. (1990): Physiological criteria - determinative tests. In: Methods in Phytobacteriology. Eds. Klement, Z., Rudolph, K., Sands, D.C. Akademiai Kiado, Budapest, Hungary: 133 - 143. Schaad, N. W., Stall, R. E. (1988): Xanthomonas. In: Schaad N.W., ed. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, 2nd ed. St. Paul, USA: APS Press: 81 - 94. Schaad, N. W. (1980): Gram-negative bacteria: Xanthomonas. In: Schaad, N. W., Jones, J. B., Chun, W. eds. Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. St Paul, MN, USA: 175 - 200. Schaad, N. W. (1989): Detection of Xanthomonas campestris pv. campestris in crucifers. In: Saettler, A. W., Schaad, N. W., Roth, D. A. eds. Detection of Bacteria in Seed and Other Planting Material. St Paul, MN, USA: APS Press: 68 - 75. Schaad, N., Jones, J. B., Chun, W. (2001): Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. APS Press, St. Paul, Minnesota, USA. Schaad, N. W., Dianese, J. C. (1981): Cruciferous weeds as source of inoculum of Xanthomonas campestris to black rot of crucifers. Plant diease, 64: 91 - 92. Sherf, A. F., MacNab, A. A. (1986): Vegetable diseases and their control. Vegetable diseases and their control., Ed. 2: 728. Doktorska disertacija Literatura 128 Sijam, K., Chang, C. J., Gitaitis, R. D. (1991): An agar medium for the isolation and identification of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria from seed. Phytopathology, 81 (8): 831 - 834. Slusarenko, A. J. (1996): The role of lipoxygenase in plant resistance to infection. In: Piazza, G. J., ed. Lipoxygenase and lipoxygenase pathway enzymes. Champaign: AOCS Press: 176 - 197. So, J. S., Lim, H. T., Oh, E. T., Heo, T. R., Koh, S. C., Leung, K. T. (2002): Visualizing the infection process of Xanthomonas campestris in cabbage using green fluorescent protein. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 18: 17 - 21. Somoš, A. (1984): A paprika, Akademia Kiado Budapest. Soto, G. E., Hultgren, S. J. (1999): Bacterial adhesins: common themes and variations in arcitecture and assembley. Journal of Bacteriology, 181: 1059 - 1071. Sowell, G., Jr. (1960): Bacterial spot resistance of introduced peppers. Plant Disease Report, 44: 587 - 590. Sowell, G., Dempsey, A. H. (1977): Additional sources of resistance to bacterial spot of pepper. Plant Disease, 61: 684 - 686. Stall, R. E., Thayer, P. L. (1962): Streptomycin resistance of the bacterial spot pathogen and control with streptomycin. Plant Disease, 45: 389-92 Stall, R. E., Cook, A. A. (1966): Multiplication of Xanthomonas vesicatoria and lesion development in resistant and susceptible pepper. Phytopathology, 56: 1152 - 1154. Stall, R. E., Loschke, D. C., Jones, J. B. (1986): Linkage of copper resistance and avirulence loci on a self-transmissible plasmid in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology, 76: 240 - 243. Stall, R. E., Beaulieu, C., Egel, D., Hodge, N. C., Leite, R. P., Minsavage, G. V., Bouzar, H., Jones, J. B., Alvarez, A. M., Benedict, A. A. (1994): Two genetically diverse groups of strains are included in a pathovar of Xanthomonas campestris. International Journal of Systematic Bacteriology, 44: 47 - 53. Stall, R. E., Jones J. B., Minsavage, G. V. (2009): Durability of Resistance in Tomato and Pepper to Xanthomonads Causing Bacterial Spot. Annual Review of Phytopathology, 47: 265 - 284. Swanson, J., Kearney, B., Dahlbeck, D., Staskawicz, B. (1988): Cloned avirulence gene of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria complements spontaneous race-change mutants. Molecular Plant Microbe Interaction, 1: 5 - 9. Doktorska disertacija Literatura 129 Swords, K. M., Dahlbeck, D., Kearney, B., Roy, M., Staskawicz, B. J. (1996): Spontaneous and induced mutations in a single open reading frame to both virulence and avirulence in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria avrBs2. Journal of Bacteriology, 178: 4661 - 4669. Šević, M., Gašić, K., Mijatović, M., Obradović, A. (2010): Proučavanje efikasnosti nekih baktericida u suzbijanju bakteriozne pegavosti paprike. X Savetovanje o zaštiti bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 61. Šević, M., Gašić, K., Đorđević, M., Ignjatov, M., Mijatović, M., Obradović, A. (2011): Efficacy of some bactericides in control of bacterial spot of papper. Book of Abstracts 5th Balkan Symposium on Vegetables and Potatoes, Tirana, Albania: 41. Šević, M., Gašić, K., Ignjatov, M., Đorđević, M., Mijatović, M., Obradović, A. (2011a): Pručavanje efikasnosti Acibenzolar-S-metil-a u suzbijanju prouzrokovača bakteriozne pegavosti paprike. XI Savetovanje o zaštit bilja, Zlatibor. Zbornik rezimea: 74. Šutić, D. (1957): Bakterioze crvenog patlidžana. Institut za zaštitu bilja, Beograd. Posebna izdanja, 1 - 67. Tawfik, A. E., El-Shaimaa, M. M., Barakat, M. I. E., Shalaby, O. Y. (2009): The occurence of bacterial spot of tomato in Egypt. Acta Hort. (ISHS), 808: 295 - 300. Tomlin, C. D. S. (2006): A World Compendium The Pesticide Manual, 14th edition. BCPC British Corp Production Council, UK. Trigalet, A., Samson, R., Coleno, A. (1978): A Problems Related to the Use of Serology in Phytobacteriology. Proceedings of the 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, Angers: 271 - 288. Van den Mooter, M., Swings, J. (1990): Numerical analysis of 295 phenotypic features of 266 Xanthomonas strains and related strains and an improved taxonomy of the genus. International Journal Systematic Bacteriology, 40: 348 - 369. Vauterin, L., Swings, J., Kersters, K., Gillis, M ., Mew, T . W., Schroth, M. N., Palleronni, N. J., Hildebrand, D. C., Stead, D. E., Civerolo, E. L., Hayward, A. C., Maraite, H., Stall, R. E., Vidaver, A. K., Bradbury, J. F. (1990): Towards an improved taxonomy of Xanthomonas. International Journal of Systematic Bacteriology, 40 (3): 12 - 16. Vauterin, L., Swings, J., Kersters, K. (1991): Grouping of Xanthomonas campestris pathovars by SDS-PAGE of proteins. Journal Genetics Microbiology, 137: 1677 - 1687. Doktorska disertacija Literatura 130 Vauterin, L., Hoste, B., Yang, P., Alvarez, A., Kersters, K., Swings, J. (1993): Taxonomy of genus Xanthomonas, In: Swings, J.G. and Civerolo, E. L., eds., Xanthomonas. Chapman&Hall, London: 156 - 191. Vauterin, L., Hoste, B., Kersters, K., Swings, J. (1995): Reclassification of Xanthomonas. International Journal of Systematic Bacteriology, 45: 472 - 489. Veena, M. S., van Vuurde, J. W. (2002): Indirect immunofluorescence colony staining method for detecting bacterial pathogens of tomato. Journal of Microbiological Methods, 49 (1): 11 - 17. Vlahović, B., Stevanović, S., Tomašević, D., Zelenjak, M. (2006): Agrarna proizvodnja u Republici Srbiji/Agricultural Production in Republic of Serbia. Društvo agrarnih ekonomista Srbije. Vlahović, B., Puškarić, A. (2008): Izvoz povrća iz republike Srbije, XIII Savetovanje o biotehnologiji, Čačak. Vlahović, B., Puškarić, A., Červenski, J. (2010): Obeležja proizvodnje povrća u Republici Srbiji. Ratarstvo i povrtarstvo, 47 (2): 461 - 466. Vinatzer, B. A., Bull, C. T. (2009): The impact of genomic approaches on our understanding of diversity and taxonomy of plant pathogenic bacteria. Pages 37 - 61 in: Plant Pathogenic Bacteria: Genomics and Molecular Biology. R. W. Jackson, ed. Horizon Scientific Press Hethersett, Norwich, UK. Walkes, C. M., O 'Garro, L. W. (1996): Role of extracellular polysaccharides from Xanthomonas campestris pv.vesicatoria in bacterial spot of pepper. Physiological and Molecular Plant Pathology, 48 (2): 91 - 104. Ward, H. P., O´Garro, L. W. (1992): Bacterial spot of pepper and tomato in Barbados. Plant Disease, 76: 1046 - 1048. Weir, D. M. (1978): Handbook of Experimental Immunology. Blackwell Scientific Publications. Oxford. Yang, P., Vauterin, L., Vancanneyt, M., Swings, J., Kersters, K. (1993): Application of fatty acid methyl esters for the taxonomic analysis of the genus Xanthomonas. Systematic Applied Microbiology, 16: 47 - 71. Yuzbasioglu, E. G., Saygili, H. (2007): The study on detection of important seed borne bacterial disease agents on tomato. The 2nd International symposium on tomato diseases, 8- 12 October, Kushadasi. Book of abstract: 116. Doktorska disertacija Literatura 131 Zhang, Y., Callaway, E. M., Jones, J. B., Wilson, M. (2009): Visualisation of hrp gene expression in Xanthomonas euvesicatoria in the tomato phyllosphere. European Journal of Plant Pathology, 124 (3): 379 - 390. 132 BIOGRAFIJA Maja V. Ignjatov je rođena 11.05.1972. godine u Novom Sadu. Školske 1991/1992. godine upisala je Poljoprivredni fakultet u Novom Sadu, odsek za zaštitu bilja, koji je završila 1997. godine sa prosečnom ocenom 8.60. Poslediplomske studije upisala je školske 2002/2003. godine na predmetu Fitopatologija, na Institutu za zaštitu bilja, Poljoprivrednog fakulteta u Novom Sadu. Sve ispite na poslediplomskim studijama položila je sa ocenom 9.33. Magistarski rad pod nazivom "Bakteriozna pegavost soje u Vojvodini" odbranila je 2007. godine na Poljoprivrednom fakultetu u Novom Sadu. Iste godine izabrana je u zvanje istraživača saradnika za naučnu oblast fitopatologija. Od 2001. godine zaposlena je u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo u Laboratoriji za ispitivanje semena kao saradnik na ispitivanju zdravstvene ispravnosti semena. Do sada je učestvovala je na dva Tehnološka projekta Ministarstva nauke Republike Srbije, na projektima Pokrajinskog sekretarijata za nauku i tehnološki razvoj, kao i na dva projekta Ministarstva poljoprivrede Republike Srbije. Trenutno je angažovana na projektu Ministarstva nauke i prosvete Republike Srbije TR31030: pod nazivom: «Stvaranje sorata i hibrida povrća za gajenje na otvorenom polju i zaštićenom prostoru». Učesnik je u realizaciji projektnih zadataka u tekućem FP7 projektu pod nazivom: «Seed health: development of seed treatment methods, evidence for seed transmission and assessment of seed health». Kao autor i koautor objavila je više naučnih i stručnih radova koji su objavljeni u časopisima i prezentovani na međunarodnim i domaćim skupovima. 133 Izjava o autorstvu Potpisani-a _____________Maja Ignjatov _____________ broj indeksa _____________________________________ Izjavljujem da je doktorska disertacija pod naslovom __ Diverzitet populacije Xanthomonas spp. patogena paprike u Srbiji__ rezultat sopstvenog istraživačkog rada,  da predložena disertacija u celini ni u delovima nije bila predložena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visokoškolskih ustanova,  da su rezultati korektno navedeni i  da nisam kršio/la autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranda U Beogradu, __29.05.2013. godine_____ _________________________ 134 Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Ime i prezime autora _________Maja Ignjatov _____________ Broj indeksa ________________________________________ Studijski program _____Poljoprivredne nauke_____________ Naslov rada __ Diverzitet populacije Xanthomonas spp. patogena paprike u Srbiji_ Mentor __prof. dr Aleksa Obradović, redovni profesor______________________ Potpisani/a _________ Maja Ignjatov ____________ Izjavljujem da je štampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao što su ime i prezime, godina i mesto rođenja i datum odbrane rada. Ovi lični podaci mogu se objaviti na mrežnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. Potpis doktoranda U Beogradu, __29.05.2013. godine_____ _________________________ 135 Izjava o korišćenju Ovlašćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: Diverzitet populacije Xanthomonas spp. patogena paprike u Srbiji_ koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji poštuju odredbe sadržane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio/la. 1. Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno 3. Autorstvo – nekomercijalno – bez prerade 4. Autorstvo – nekomercijalno – deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo – bez prerade 6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima (Molimo da zaokružite samo jednu od šest ponuđenih licenci, kratak opis licenci dat je na poleđini lista). Potpis doktoranda U Beogradu, __29.05.2013. godine_____ _________________________