UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Nemanja S. Kuzmanović IDENTIFIKACIJA, KARAKTERIZACIJA I GENETIČKI DIVERZITET SOJEVA Agrobacterium spp., PROUZROKOVAČA BAKTERIOZNOG RAKA VINOVE LOZE doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Nemanja S. Kuzmanović IDENTIFIKACIJA, KARAKTERIZACIJA I GENETIČKI DIVERZITET SOJEVA Agrobacterium spp., PROUZROKOVAČA BAKTERIOZNOG RAKA VINOVE LOZE doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Nemanja S. Kuzmanović IDENTIFICATION, CHARACTERIZATION AND GENETIC DIVERSITY OF STRAINS OF Agrobacterium spp., GRAPEVINE CROWN GALL CAUSAL AGENT Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Komisija za ocenu i odbranu: Mentor: dr Aleksa Obradović, redovni profesor Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet Članovi komisije: dr Jelica Balaž, redovni profesor Univerzitet u Novom Sadu - Poljoprivredni fakultet dr Veljko Gavrilović, viši naučni saradnik Institut za zaštitu bilja i životnu sredinu, Beograd dr Nebojša Marković, redovni profesor Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet dr Milan Ivanović, docent Univerzitet u Beogradu - Poljoprivredni fakultet Datum odbrane: _______________________ Zahvalnica Ova doktorska disertacija urađena je u Laboratoriji za fitobakteriologiju Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu, i finansirana je iz projekta III46008: “Razvoj integrisanih sistema upravljanja štetnim organizmima u biljnoj proizvodnji sa ciljem prevazilaženja rezistentnosti i unapređenja kvaliteta i bezbednosti hrane”. Deo eksperimenata realizovan je u Laboratoriji za fitobakteriologiju, Poljoprivrednog fakulteta u Bolonji, kao i u Laboratoriji za bakteriologiju, Instituta za hortikulturu u Skjernevicama, Poljska. Zahvaljujem se mentoru, prof. dr Aleksi Obradoviću, na predloženoj temi disertacije, nesebičnom angažovanju na izradi, na savetima koji su doprineli kvalitetu ovog rada, kao i na bezrezervnoj podršci i razumevanju. Takođe se zahvaljujem prof. dr Jelici Balaž na korisnim savetima i sugestijama, kao i na pomoći pri prikupljanju literature. Zahvalnost dugujem dr Veljku Gavriloviću na stručnoj pomoći, posebno pri obilasku terena i prikupljanju uzoraka, kao i na konsultacijama tokom rada na disertaciji. Zahvaljujem se prof. dr Nebojši Markoviću na saradnji i savetima tokom izrade doktorske disertacije. Posebno se zahvaljujem kolegama iz Laboratorije za fitobakteriologiju, dr Milanu Ivanoviću, dr Katarini Gašić, Anđelki Prokić i Neveni Blagojević, na pomoći koju su mi pružili u radu. Veliku zahvalnost dugujem prof. dr Asunti Bertaćini i dr Enriku Bjondiju, sa Poljoprivrednog fakulteta u Bolonji, na prenetom znanju i iskustvu, konstruktivnim sugestijama i svesrdnoj pomoći oko realizacije pojedinih faza rada. Zahvaljujem se dr Joani Pulavskoj na saradnji, znanju koje mi je pružila, korisnim predlozima i ustupljenoj literaturi. Takođe se zahvaljujem Ministarstvu prosvete, nauke i tehnološkog razvoja za stipendiranje mojih doktorskih studija. Zahvaljujem se porodici, Ani i prijateljima na razumevanju i podršci da istrajem u ostvarenju programa istraživanja ove disertacije. IDENTIFIKACIJA, KARAKTERIZACIJA I GENETIČKI DIVERZITET SOJEVA Agrobacterium spp., PROUZROKOVAČA BAKTERIOZNOG RAKA VINOVE LOZE Rezime. Bakteriozni rak smatra se jednim od najznačajnijih i najrasprostranjenijih bakterioznih oboljenja vinove loze u svetu. Glavni prouzrokovač ovog oboljenja je vrsta Agrobacterium vitis. Tokom poslednjih nekoliko godina primećena je izražena pojava bolesti u većini vinogradarskih rejona u Srbiji. Stoga je u ovom radu proučena etiologija bakterioznog raka vinove loze u našoj zemlji. Takođe, izvršena je karakterizacija i proučen genetički diverzitet prouzrokovača bolesti. Primenjene su kako klasične bakteriološke, tako i molekularne metode. U radu su takođe korišćeni i brojni referentni sojevi A. vitis poreklom iz međunarodnih kolekcija. Simptomatični uzorci vinove loze prikupljeni su u 22 lokaliteta, raspoređena u gotovo svim vinogradarskim rejonima u našoj zemlji. Izolacija bakterija vršena je na neselektivne podloge sa manitolom i kvaščevim ekstraktom (YMA). Preliminarna identifikacija izolovanih sojeva, izvedena je primenom PCR metode, korišćenjem prajmera specifičnih za plazmidne (virC, virF, virD2, ipt, tms2) i hromozomske (pehA, 23S rRNK) gene. Među izolovanim sojevima identifikovan je tumorogeni A. vitis, a za dalji rad izdvojeno je ukupno 36 reprezentativnih sojeva. Rezultati dobijeni primenom PCR metode potkrepljeni su filogenetskom analizom zasnovanoj na parcijalnoj sekvenci 16S rRNK gena. Taksonomska pripadnost proučavanih sojeva dalje je potvrđena primenom klasičnih bakterioloških metoda. Svi proučavani sojevi ispoljili su morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike karakteristične za vrstu A. vitis. Jedini izuzetak bio je soj KFB 243, koji je i pri ponavljanju testa stvaranja kiseline iz eritritola kao izvora ugljenika ispoljio odlike svojstvene vrsti A. rhizogenes/biovar 2. U cilju provere patogenosti proučavanih sojeva, vršena je inokulacija biljaka vinove loze, suncokreta i paradajza. Od ukupno 36 proučavanih sojeva, 34 su prouzrokovala razvoj tipičnih tumora na inokulisanim biljkama vinove loze. U testu patogenosti na biljkama suncokreta i paradajza, zabeležene su značajne varijacije u intenzitetu simptoma, kako unutar pojedinačnog ogleda, tako i među različitim ponavljanjima. Stoga se korišćenje paradajza i suncokreta kao test biljaka, i pored bržeg razvoja simptoma, ne može preporučiti kao pouzdan test. Među proučavanim sojevima A. vitis poreklom iz Srbije ustanovljene su genetičke razlike, vezane kako za hromozomsku, tako i plazmidnu DNK. Od ukupno 36 proučavanih sojeva, Ti plazmid 35 sojeva klasifikovan je kao oktopin/kukumopin (O/C) tip, jedan kao vitopin (V) tip, dok nopalin (N) tip Ti plazmida nije utvrđen. Genetički diverzitet proučavanih sojeva dalje je proučen primenom metoda kojima se vrši analiza sekvenci raspoređenih unutar kompletnog genoma (RAPD, Rep-PCR), a analiziran je i diverzitet pojedinačnih fragmenata prisutnih na hromozomskoj DNK (16S-23S rRNK ITS region, konstitutivni geni) primenom RFLP metode i sekvenciranjem. Na ovaj način ustanovljen je visok stepen genetičke različitosti među sojevima i definisano je više genetičkih grupa. Genotipska srodnost sojeva poreklom iz naše zemlje sa proučavanim sojevima iz inostranstva ukazivala je na njihovo zajedničko poreklo. Pored toga, utvrđeno je postojanje klonalnih grupa unutar proučavane populacije, a postojale su i snažne indicije o prisustvu klonalnih kompleksa unutar vrste A. vitis. Takođe, ustanovljena je povezanost između hromozomske i plazmidne DNK kod pojedinih genetičkih grupa. Prema 10 reprezentativnih sojeva poreklom iz Srbije, testiran je antagonistički efekat soja KFB 0207 (F2/5). Među proučavanim sojevima ustanovljene su razlike u reakciji na uticaj antagonističkog soja, od inhibicije do potpune neosetljivosti. Ključne reči: bakteriozni rak, vinova loza, Agrobacterium vitis, Ti plazmid, opin tip, PCR, RAPD, rep-PCR, konstitutivni geni, 16S-23S rRNK ITS region Naučna oblast: Biotehničke nauke Uža naučna oblast: Fitopatologija UDK: 632.35:634.8(043.3) IDENTIFICATION, CHARACTERIZATION AND GENETIC DIVERSITY OF STRAINS OF Agrobacterium spp., GRAPEVINE CROWN GALL CAUSAL AGENT Abstract. Crown gall is one of the most important and widespread bacterial diseases of grapevine throughout the world. It is predominantly caused by Agrobacterium vitis. During the last few years, serious outbreaks of the disease were observed in major viticultural regions in Serbia. Therefore, the objective of this research was to study etiology of the grapevine crown gall in this country. Characterization and study of genetic diversity of the pathogen were also performed, using conventional bacteriological and molecular methods. Various reference strains of A. vitis originating from international collections were also included. Symptomatic samples of grapevine were collected from 22 localities distributed in almost all viticultural regions in the country. Isolation of bacteria was performed on non-selective media with mannitol and yeast extract (YMA ). Preliminary identification of the isolated strains was performed using PCR method with primers specific for the plasmid (virC, virF, virD2, ipt, tms2) and chromosomal (pehA, 23S rRNA) genes. Among isolated strains, 36 representative tumorigenic A. vitis strains were selected for further study. Results obtained by PCR method were supported by phylogenetic analysis based on partial sequence of 16S rRNA gene. Taxonomic position of studied strains was further confirmed using conventional bacteriological methods. All the strains showed morphological, biochemical and physiological characteristics of A. vitis. The only exception was strain KFB 243, which showed characteristic of A. rhizogenes/biovar 2 in test of acid production from erythritol. Pathogenicity of the strains was studied by inoculation of grapevine, sunflower, and tomato plants. Out of 36 strains studied, 34 caused development of typical tumors on inoculated grapevine. In pathogenicity assay on tomato and sunflower plants, considerable variations in the intensity of symptoms were recorded, both within a single experiment, and among different repetitions. Therefore, use of tomato and sunflower as test plants, despite the rapid symptom development, cannot be recommended as a reliable test. Among studied strains of A. vitis originating from Serbia, genetic differences related to chromosomal and plasmid DNA were observed. Out of 36 strains studied, Ti plasmid of 35 strains was classified as octopine/cucumopine (O/C) type, one as vitopine (V) type, while nopaline (N) type of Ti plasmid was not detected. Genetic diversity of strains was further studied by the methods targeting sequences distributed throughout the entire genome (RAPD, Rep-PCR) and particular fragments present on chromosomal DNA (16S-23S rRNA ITS region, housekeeping genes) using RFLP and sequencing. Thus, high level of genetic diversity among strains was determined. Genotypic relatedness of Serbian strains to the strains originating from other countries suggests their common origin. In addition, the existence of clonal groups within the studied population was detected and there were strong indications of the presence of clonal complexes within the species A. vitis. Also, association between the chromosomal and plasmid DNA of particular genetic groups were found. Antagonistic effect of strain KFB 0207 (F2/5) to 10 representative strains originating from Serbia was tested. Differences in the response to the effect of antagonistic strain were determined, from inhibition to complete insensitivity. Key words: crown gall, grapevine, Agrobacterium vitis, Ti plasmid, opine type, PCR, RAPD, rep-PCR, housekeeping genes, 16S-23S rRNA ITS region Scientific field: Biotechnical Science Scientific discipline: Phytopathology UDC: 632.35:634.8(043.3) SADRŽAJ 1. UVOD ........................................................................................................................ 1 1.1 Istorijat proučavanja bakterioznog raka vinove loze ............................................... 1 1.2 Rasprostranjenost i ekonomski značaj bakterioznog raka vinove loze .................... 2 1.3 Spektar domaćina Agrobacterium spp. .................................................................... 3 1.4 Infekcioni proces i epidemiologija bakterioznog raka vinove loze ......................... 3 1.5 Simptomi bakterioznog raka vinove loze ................................................................ 5 2. PREGLED LITERATURE ........................................................................................ 7 2.1 Taksonomija roda Agrobacterium ........................................................................... 7 2.1.1 Taksonomski položaj roda Agrobacterium ....................................................... 8 2.1.2 Klasifikacija na osnovu patogenih odlika sojeva .............................................. 8 2.1.3 Prirodna klasifikacija......................................................................................... 9 2.1.4 Predlozi revizije taksonomije i pripajanje rodu Rhizobium ............................ 12 2.1.5 Genomske i novoopisane vrste ........................................................................ 12 2.2 Detekcija i identifikacija Agrobacterium vrsta ...................................................... 16 2.2.1 Izolacija patogena ............................................................................................ 16 2.2.2 Određivanje patogenosti .................................................................................. 18 2.2.2.1 Test patogenosti ........................................................................................ 18 2.2.2.2 PCR ........................................................................................................... 18 2.2.3 Diferencijacija do nivoa vrste/biovara ............................................................ 21 2.2.3.1 Biohemijsko-fiziološki testovi .................................................................. 21 2.2.3.2 Serološke metode ...................................................................................... 23 2.2.3.3 Molekularne metode ................................................................................. 23 2.2.3.4 Automatizovane metode ........................................................................... 24 2.2.3.5 Ostale metode ........................................................................................... 25 2.2.4 Detekcija Agrobacterium spp. u biljnom tkivu i zemljištu ............................. 26 2.3 Diverzitet Agrobacterium spp. ............................................................................... 27 2.3.1 Struktura populacija fitopatogenih Agrobacterium spp. ................................. 28 2.3.2 Organizacija genetičkog materijala Agrobacterium spp. ................................ 29 2.3.3 pTi/pRi ............................................................................................................ 30 2.3.3.1 Opin tip ..................................................................................................... 31 2.3.3.2 T-DNK ...................................................................................................... 32 2.3.3.3 Vir region .................................................................................................. 34 2.3.4 Genetički diverzitet Agrobacterium spp. ........................................................ 34 2.3.4.1 Sojevi poreklom iz vinove loze ................................................................ 38 2.3.4.2 Sojevi poreklom iz voćaka, ukrasnih i šumskih vrsta .............................. 39 2.3.4.3 Sojevi poreklom iz zemljišnih ekosistema ............................................... 40 2.4 Proučavanje Agrobacterium spp. u Srbiji .............................................................. 41 3. RADNA HIPOTEZA ............................................................................................... 43 4. MATERIJAL I METODE ........................................................................................ 44 4.1 Obilazak terena i uzorkovanje biljnog materijala .................................................. 44 4.2 Izolacija patogena i sojevi korišćeni u radu ........................................................... 44 4.3 Molekularna detekcija pTi i identifikacija sojeva .................................................. 45 4.3.1 Priprema uzoraka DNK ................................................................................... 50 4.3.2 PCR analiza ..................................................................................................... 50 4.3.3 Sekvenciona analiza 16S rRNK gena.............................................................. 55 4.4 Patogene odlike sojeva ........................................................................................... 56 4.5 Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike..................................... 57 4.5.1 Reakcija po Gramu .......................................................................................... 57 4.5.2 Razvoj pri 35°C ............................................................................................... 58 4.5.3 Razvoj u podlozi sa 2% NaCl ......................................................................... 58 4.5.4 Aktivnost oksidaze .......................................................................................... 58 4.5.5 Stvaranje 3-ketolaktoze ................................................................................... 59 4.5.6 Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 podlozi ................................ 59 4.5.7 Pokretljivost pri pH 7,0 ................................................................................... 60 4.5.8 Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri-amonijum-citratom ........................... 60 4.5.9 Korišćenje citrata............................................................................................. 61 4.5.10 Stvaranje kiseline iz saharoze, eritritola i melezitoze ................................... 61 4.5.11 Stvaranje baze iz tartarata ............................................................................. 61 4.6 Karakterizacija Ti plazmida ................................................................................... 62 4.7 Genetički diverzitet sojeva ..................................................................................... 63 4.7.1 Ekstrakcija DNK ............................................................................................. 63 4.7.2 RAPD .............................................................................................................. 65 4.7.3 Rep-PCR.......................................................................................................... 66 4.7.4 Analiza konstitutivnih gena ............................................................................. 66 4.7.5 Analiza 16S-23S rRNK ITS regiona ............................................................... 69 4.8 Osetljivost prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5) ................................... 72 5. REZULTATI ............................................................................................................ 73 5.1 Rasprostranjenost i simptomi bakterioznog raka vinove loze u Srbiji .................. 73 5.2 Izolacija patogena .................................................................................................. 73 5.3 Molekularna analiza sojeva.................................................................................... 75 5.3.1 Detekcija pTi/pRi i identifikacija sojeva ......................................................... 75 5.3.2 Sekvenciona analiza 16S rRNK gena.............................................................. 81 5.3.4 Specifičnost prajmera korišćenih u identifikaciji patogenih A. vitis ............... 82 5.4 Patogene odlike sojeva ........................................................................................... 82 5.5 Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike..................................... 85 5.6 Karakterizacija Ti plazmida ................................................................................... 86 5.7 Genetički diverzitet sojeva ..................................................................................... 87 5.7.1 RAPD i Rep-PCR ............................................................................................ 87 5.7.2 Analiza konstitutivnih gena ............................................................................. 94 5.7.3 Analiza 16S-23S rRNK ITS regiona ............................................................. 101 5.8 Osetljivost prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5) ................................. 106 6. DISKUSIJA ............................................................................................................ 108 7. ZAKLJUČAK ........................................................................................................ 122 8. LITERATURA ....................................................................................................... 123 1 1. UVOD Vinogradarstvo predstavlja važnu granu poljoprivrede u svetu. Ekonomski značaj gajenja vinove loze zasniva se, pre svega, na visokom intenzitetu proizvodnje i mogućnosti korišćenja zemljišta na kojima se osim vinove loze ne može gajiti većina drugih biljaka. Površine pod vinovom lozom u svetu, u 2011. godini, iznosile su 7 585 000 hektara, a zabeležen je trend smanjenja površina od 2003. godine (OIV, 2012). U Srbiji, gajenje vinove loze i proizvodnja vina imaju viševekovnu tradiciju. Vinova loza se u 2011. godini gajila na 56 434 ha (RZS, 2012). Imajući u vidu da je 1995. godine pod vinogradima zabeleženo 140 000 ha, evidentno je značajno smanjenje površina pod ovom kulturom u našoj zemlji. Poslednjih godina uloženi su napori, koji su sa manje ili više uspeha, doprineli obnavljanju vinogradarske proizvodnje u Srbiji. Ipak, gajenje vinove loze u određenoj meri mogu ograničiti različita oboljenja prouzrokovana fitopatogenim gljivama, bakterijama, virusima i fitoplazmama. Bakteriozni rak smatra se jednim od najznačajnijih i najrasprostranjenijih bakterioznih oboljenja vinove loze (Vitis vinifera L.) u svetu, a prouzrokuje ga vrsta Agrobacterium vitis (Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). Međutim, u ređim slučajevima, iz obolelih biljaka vinove loze izolovani su tumorogeni sojevi Agrobacterium tumefaciens/biovar 1 i Agrobacterium rhizogenes/biovar 2 (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Panagopoulos i sar., 1978; Burr i Katz, 1983; 1984; Süle, 1978; Al-Momani i Abussaud, 1990; Thies i sar., 1991; Ridé i sar., 2000; Argun i sar., 2002; Genov i sar., 2006a; Bini i sar., 2008b; Lόpez i sar., 2008; Kawaguchi i Inoue, 2009; Palacio-Bielsa i sar., 2009; Rouhrazi i Rahimian, 2012a; Abdellatif i sar., 2013), kao i novoopisana vrsta Rhizobium nepotum (Puławska i sar., 2012a). 1.1 Istorijat proučavanja bakterioznog raka vinove loze Prvi pisani podatak o raku vinove loze potiče iz XIX veka, kada su Fabre i Dunal (1853) opisali ovo oboljenje u Francuskoj. Bakteriozna priroda raka vinove loze utvrđena je u Italiji, krajem XIX veka (Cavara, 1897). Iz biljaka vinove loze sa simptomima raka, izolovana je bakterija, koja je nazvana Bacillus ampelopsorae, i 2 dokazana je njena patogenost. Ovo je ujedno i prvi podatak o bakterijama kao prouzrokovačima oboljenja raka na biljkama. Deset godina kasnije, u Sjedinjenim Američkim Državama (SAD), Smith i Townsend (1907) identifikovali su bakteriju, koju su nazvali Bacterium tumefaciens, kao prouzrokovača bakterioznog raka ukrasne vrste Argyranthemum frutescens. U narednim godinama sprovodila su se istraživanja u cilju otkrivanja mehanizma razvoja tumora. Kao uzrok tumorogeneze naveden je tzv. tumor- indukujući princip (eng. tumor-inducing principle, TIP) koji potiče iz Agrobacterium sp. i prenosi se u ćeliju domaćina (Braun, 1947). Kasnije, tokom 70-ih godina 20. veka, utvrđeno je da je TIP zapravo transferna DNK (T-DNK; eng. transfer DNA), koja je sastavni deo tumorogenog (eng. tumor-inducing, Ti) plazmida bakterije (Zaenen i sar., 1974; Chilton i sar., 1977). 1.2 Rasprostranjenost i ekonomski značaj bakterioznog raka vinove loze Bakteriozni rak vinove loze, prouzrokovan bakterijom A. vitis, ustanovljen je u gotovo svim evropskim zemljama gde se gaji vinova loza (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Süle, 1978; Bazzi i Burr, 1986; Lόpez i sar., 1988; Bien i sar., 1989; Ridé i sar., 2000; Genov i sar., 2006a; Zidarič, 2009), u Severnoj i Južnoj Americi (Burr i Hurwitz, 1981; Dhanvantari, 1983; De Oliveira i sar., 1994), Kini (Ma i sar., 1987), Japanu (Sawada i sar., 1990), Jugozapadnoj Aziji (Al-Momani i Abussaud, 1990; Haas i sar., 1991; Mohammadi i Fatehi-Paykani, 1999; Argun i sar., 2002; Al-Momani i sar., 2006; Al-Karablieh, 2006), Australiji (Ophel i sar., 1988), kao i u Severnoj i Južnoj Africi (Loubser, 1978; Tolba i Zaki, 2011; Chebil i sar., 2013). U Srbiji, bakteriozni rak vinove loze je prvi put uočen 1962. godine na području trsteničkog vinogorja, na sorti Kardinal uveženoj iz Italije (Panić, 1973). Štetni efekti bakterioznog raka vinove loze ogledaju se u smanjenju bujnosti i prinosa zaraženih biljaka i do 40% (Schroth i sar., 1988). U težim slučajevima, ovo oboljenje može prouzrokovati izumiranje pojedinih organa ili čitavih čokota. Izumiranje je posebno izraženo kod mladih biljaka, kada oboljenje zahvati spojno mesto podloge i plemke. Bolest je izuzetno destruktivna u rasadnicima, gde negativno utiče na srastanje i prijem kalemova, dok biljke sa vidljivim simptomima gube tržišnu vrednost i moraju biti odbačene. U ekonomskom smislu, štete od Agrobacterium spp. na voćnim vrstama i 3 vinovoj lozi na nivou SAD su procenjene na višemilionske iznose na godišnjem nivou (Kennedy i Alcorn, 1980). 1.3 Spektar domaćina Agrobacterium spp. Bakteriozni rak se pojavljuje na mnogim ekonomski značajnim gajenim vrstama, pretežno na voćkama, vinovoj lozi i ukrasnim biljkama. U in vitro ogledima, od ukupno 1193 testirane biljne vrste (pretežno golosemenice i dikotiledone skrivenosemenice), 643 bilo je osetljivo prema oboljenju (De Cleene i De Ley, 1976). Sa druge strane, oboljenju su podložne i monokotiledone vrste (De Cleene, 1985; Conner i Dommisse, 1992). Patogene vrste roda Agrobacterium mogu imati širok spektar domaćina, ali postoje i usko specijalizovani sojevi (Anderson i Moore, 1979). A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2 označavaju se kao vrste koje imaju širok spektar domaćina, dok su A. vitis, Agrobacterium rubi i Agrobacterium larrymoorei nešto specijalizovanije prema domaćinu. Tako je A. vitis izolovan isključivo iz biljaka vinove loze, ako se izuzme nalaz na kiviju u Japanu (Sawada i Ieki, 1992a). Međutim, inokulacijom različitih test biljaka utvrđeno je da kod vrste A. vitis postoje sojevi koji imaju širi ili uži spektar domaćina (Burr i Otten, 1999). A. rubi je izolovan uglavnom iz biljaka Rubus spp. i Vaccinium corymbosum (Hildebrand, 1940; Alippi i sar., 2009), dok je u in vitro ogledima ova vrsta ispoljila infektivnost prema širokom spektru biljaka (Anderson i Moore, 1979; Sawada i sar., 1992a). 1.4 Infekcioni proces i epidemiologija bakterioznog raka vinove loze Infekcioni proces tumorogenih vrsta roda Agrobacterium je veoma kompleksan i predstavlja svojevrstan prenos genetičkog materijala iz bakterije u biljku (Zhu i sar, 2000; Zupan i sar., 2000; McCullen i Binns, 2006). Patogenost je prvenstveno uslovljena prisustvom Ti plazmida (pTi) u genomu bakterije (Van Larebeke i sar., 1974; Watson i sar., 1975). Uopšteno, glavne komponente pTi uključuju T-DNK, gene virulentnosti (vir region) i gene odgovorne za katabolizam opina i konjugaciju plazmida. 4 Infekcija se odigrava kroz povrede, koje najčešće nastaju dejstvom niskih temperatura tokom zime ili kao posledica kalemljenja. U toplijim regionima, kao što su Južna Afrika i Izrael, visoke temperature i vlažnost su od podjednakog značaja u nastajanju povreda (Burr i sar., 1998). Bakterije bivaju privučene signalnim molekulima koje oslobađa povređena biljka i pričvršćuju se neposredno uz rane. Zatim dolazi do prenosa i ugradnje fragmenta pTi (T-DNK) u biljni genom, što je proces koji je prvenstveno kontrolisan aktivnošću vir gena. Ekspresijom gena prisutnih na T-DNK dolazi do nekontrolisane proizvodnje biljnih hormona auksina i citokinina, što dovodi do proliferacije biljnog tkiva i razvoja tumora. Nakon ostvarene infekcije tumori se mogu razvijati i bez prisustva patogena (White i Braun, 1942). T-DNK takođe sadrži gene odgovorne za sintezu posebne grupe jedinjenja, tzv. opina. Opini su derivati L- amino kiselina i prostih karbonilnih jedinjenja primarnog metabolizma, koje kao izvor hranljivih materija koriste Agrobacterium spp., a stimulativno deluju i na konjugaciju pTi (Chilton i sar., 2001; Kerr i sar., 1977; Ellis i sar., 1982; Dessaux i sar., 1998; Otten i sar., 2008). A. vitis sistemično zaražava vinovu lozu, prisutan je u ksilemu i može se kretati provodnim tkivom domaćina (Lehoczky, 1968; Tarbah i Goodman, 1987; Slika 1). Patogen može biti neravnomerno rasprostranjen u biljci i populaciona dinamika u pojedinim biljnim delovima može varirati u zavisnosti od sorte i doba godine (Lehoczky, 1968; Bauer i sar., 1994; Burr i sar., 1998). Prisustvo A. vitis nije utvrđeno u zelenim lastarima i pupoljcima vinove loze (Burr i sar., 1988), što može biti posledica niske osetljivosti korišćenih metoda detekcije. Tako je utvrđeno da se A. vitis može održati u latentnom obliku u vinovoj lozi dobijenoj iz zelenih pupoljaka, u laboratorijskim uslovima (Poppenberger i sar., 2002). Ukoliko se pri proizvodnji loznih kalemova koriste vioke iz zaraženih matičnih vinograda, patogen može biti raširen na velike udaljenosti putem naizgled zdravog sadnog materijala (Lehoczky i sar., 1971; Burr i Katz, 1984; Burr i sar., 1998; Slika 1). Dakle, patogen može biti latentno prisutan u asimptomatičnom materijalu, sve dok se ne uspostave povoljni uslovi za razvoj bolesti. A. vitis se održava u zemljištu, i to u rizosferi, u blizini zaraženih čokota, kao i nekoliko godina u saprofitnoj fazi, u biljnim ostacima vinove loze (Burr i sar., 1987b; Bishop i sar., 1988; Burr i sar., 1995; Slika 1). S obzirom da se delovi korena vinove 5 loze mogu održati u zemljištu duži vremenski period nakon vađenja čokota, zajedno sa njima preživljava i A. vitis predstavljajući potencijalni izvor infekcije. Slika 1. Bakteriozni rak vinove loze - ciklus oboljenja (Burr i sar., 1998) 1.5 Simptomi bakterioznog raka vinove loze Simptomi bakterioznog raka ispoljavaju se u vidu tumora na nadzemnim organima vinove loze, pretežno na prizemnom stablu, oko spojnog mesta podloge i plemke, ali i na kracima i lukovima čokota, nekada i do jednog metra iznad površine zemljišta (Arsenijević, 1997; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). Prvi simptomi pojavljuju se početkom proleća i najčešće su neupadljivi, s obzirom da su tumori u početnim fazama prekriveni mrtvom korom stabla. Novoformirani tumori su beličaste do svetlo žute, svetlo zelene ili ružičaste boje. Daljim razvojem bolesti tumori se uvećavaju, mogu biti lokalizovani i pojedinačni, ili dolazi do razvoja dužih kontinuiranih zadebljanja cilindričnog, sferičnog ili kruškastog oblika, koja u najtežim 6 slučajevima u potpunosti opasavaju stablo. Na ovaj način protok hranljivih materija i vode u biljci je otežan. Tokom jeseni tkivo tumora postaje tamno-mrke boje, hrapavo, uz prisustvo mnogobrojnih pukotina. Kako tumorogeni, tako i netumorogeni sojevi A. vitis prouzrokuju nekrozu korena i njegovo propadanje (Burr i sar, 1987a). Propadanje korena je prouzrokovano enzimom poligalakturonazom, čija je sinteza kontrolisana hromozomskim pehA genom (McGuire i sar., 1991; Rodriguez-Palenzuela i sar., 1991). 7 2. PREGLED LITERATURE 2.1 Taksonomija roda Agrobacterium Taksonomija je naučna disciplina koja se bavi klasifikovanjem živih organizama. Taksonomija bakterija sastoji se iz tri odvojene, ali međusobno povezane oblasti: klasifikacije, nomenklature i identifikacije (Brenner i sar., 2005). Klasifikacija je svrstavanje organizama u grupe (taksone) na osnovu njihove sličnosti, odnosno povezanosti. Nomenklatura je dodeljivanje imena taksonomskim grupama prema međunarodnim pravilima (eng. International Code of Nomenclature of Bacteria; Lapage i sar., 1992), dok identifikacija predstavlja praktičnu primenu klasifikacionih šema u cilju određivanja identiteta soja, kao člana već definisanog taksona ili do sada neidentifikovane vrste. Za klasifikaciju bakterija potrebno je posedovati informacije o njihovim morfološkim, biohemijskim, fiziološkim i genetičkim karakteristikama. U modernoj taksonomiji bakterija, genetičke informacije predstavljaju glavni kriterijum za razdvajanje taksona. Shodno tome, formulisana je filogenetska definicija vrste (genomske vrste), gde mogu biti uključeni sojevi sa DNK-DNK sličnošću od 70% i više, kao i sa razlikom u temperaturi topljenja DNK jednakom ili manjom od 5°C (Wayne i sar., 1987). Novije metode, kao što su sekvenciona analiza 16S rDNK, metode kojima se vrši analiza čitavog genoma gde spadaju: polimorfizam dužine amplifikovanih restrikcionih fragmenata (eng. amplified fragment length polymorphism, AFLP), metoda nasumičnog umnožavanja polimorfne DNK (eng. random amplified polymorphic DNA, RAPD), umnožavanje na osnovu repetitivnih sekvenci (eng. repetitive sequence-based PCR, Rep-PCR) i makrorestrikciona analiza i elektroforeza u pulsirajućem elektičnom polju (eng. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), ali i metode kojima se analiziraju tzv. konstitutivni (eng. housekeeping) geni (analiza multilokusnih sekvenci; eng. multilocus sequence analysis, MLSA) i sekvenciranje čitavog genoma, danas zauzimaju važno mesto u taksonomskim studijama (Stackebrandt i sar., 2002). Među pomenutim metodama, posebno perspektivna je MLSA, kojom bi mogao da se postigne značajan doprinos u različitim taksonomskim studijama (Gevers i sar., 2005). 8 Taksonomija roda Agrobacterium još uvek nije definisana na adekvatan i opšteprihvaćen način i u procesu je revizije. Poslednjih godina, klasifikacija predstavnika ovog roda predmet je brojnih debata, s obzirom da na ovom planu i dalje postoje određeni sporni elementi i otvorena pitanja. 2.1.1 Taksonomski položaj roda Agrobacterium Termin Agrobacterium (grč. agros - polje; grč. bakterion - sitan štapić) u bukvalnom prevodu znači sitan poljski štapić. U trenutku kada je ustanovljen, rod Agrobacterium sastojao se prvenstveno od dve fitopatogene vrste: A. tumefaciens, prouzrokovača tumora na različitim biljnim delovima, A. rhizogenes, prouzrokovača kosmatosti korena, i jedne nepatogene vrste Agrobacterium radiobacter (Conn, 1942). Taksonomski položaj roda Agrobacterium predstavljen je u Tabeli 1. Tabela 1. Taksonomski položaj roda Agrobacterium Taksonomska kategorija Ime Domen Bacteria Razdeo Proteobacteria Klasa Alphaproteobacteria Red Rhizobiales Familija Rhizobiaceae Rod Agrobacterium 2.1.2 Klasifikacija na osnovu patogenih odlika sojeva Kada su imena A. tumefaciens (prvobitno Bacterium tumefaciens) i A. rhizogenes (prvobitno Phytomonas rhizogenes) predložena prvi put, odnosila su se na patogene karakteristike sojeva, odnosno na simptome koje su prouzrokovali (Smith i Townsend, 1907; Riker i sar., 1930). Termin “tumefaciens” znači “načiniti tumor” (lat. tumor - oteklina, izraslina, tumor; lat. facere - raditi, činiti, načiniti), dok “rhizogenes” znači “načiniti koren” (grč. rhiza - koren; grč. gennao - raditi, činiti, načiniti). Nepatogeni predstavnik roda izolovan je iz zemljišta i nazvan A. radiobacter (prvobitno Bacillus radiobacter), zbog karakterističnih zvezdastih formacija ćelija bakterija u bojenim preparatima (lat. radius - snop, zrak; nlat. radio - koji se odnosi na zračenje; 9 Beijerinck i van Velden, 1902). Sojevi koji su imali relativno uzak krug domaćina u prirodi, pretežno ograničen na Rubus spp., definisani su kao vrsta A. rubi, prvobitno Phytomonas rubi (Hildebrand, 1940). Otuda potiče i ime vrste A. rubi (lat. rubi - koji pripada Rubus sp.). Međutim, patogenost Agrobacterium spp. određena je prisustvom Ti ili rizogenog (Ri, root-inducing) plazmida (pRi) u genomu bakterije. S obzirom da su plazmidi mobilni genetički elementi i da u prirodi može doći do njihovog gubitka ili razmene među sojevima (Kerr, 1969; Kerr i sar., 1977), klasifikacija na osnovu patogenih odlika sojeva nije održiva. 2.1.3 Prirodna klasifikacija Keane i sar. (1970) su izrazili kritiku taksonomije bazirane na patogenim odlikama sojeva. Na osnovu određenih biohemijskih i seroloških metoda, i analize protein, podelili su testirane sojeve roda Agrobacterium u dve različite grupe ili biotipa (biovara), nezavisno od njihovih patogenih odlika. Oni su predložili da se svi predstavnici roda uključe u jednu vrstu, A. radiobacter, gde se posebno navodio biotip, a patogene karakteristike su označene varijetalnim epitetom (Tabela 2). Kasnije studije, koje su uključile numeričku analizu fenotipskih odlika (White, 1972; Kersters i sar., 1973; Holmes i Roberts, 1981), biohemijske i fiziološke testove (Kersters i sar., 1973; Kerr i Panagopoulos, 1977; Süle, 1978; Holmes i Roberts, 1981), analizu DNK:DNK hibrida (De Ley i sar., 1973; De Ley, 1974), rastvorljivih proteina (Kersters i De Ley, 1975) i masnih kiselina (Sawada i sar., 1992e; Jarvis i sar., 1996) potvrdile su rezultate Keane i sar. (1970) i dovele do definisanja bar tri genetički i fenotipski različite grupe koje nisu zavisile od patogenih karakteristika sojeva. Pored glavne dve grupe koje su odgovarale biotipovima 1 i 2, definisan je i biotip 3, u koji su uključeni sojevi iz vinove loze (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Kerr i Panagopoulos, 1977; Panagapoulos i sar., 1978; Süle, 1978). Holmes i Roberts (1981) su predložili prirodnu klasifikaciju nezavisnu od patogenih odlika. Ovi autori su dva biotipa diferencirana na osnovu numeričke taksonomske analize (Keane i sar., 1970), uzdigli na nivo vrste. Predloženo je ime A. tumefaciens za biotip 1 i A. rhizogenes za biotip 2, dok bi fitopatogene karakteristike 10 Tabela 2. Poređenje različitih nomenklatura korišćenih za Agrobacterium/Rhizobium kompleks vrsta Imena vrsta na osnovu prirodne klasifikacije Imena vrsta na osnovu patogenih karakteristika Nakon Young i sar., (2001) Nakon Holmes i Roberts (1981); Bradbury (1986); Holmes (1988); Moore i sar. (2001)c Nakon Keane i sar. (1970); Kerr i Panagopoulos (1977); Panagopoulos i sar. (1978)c Nakon Kersters i De Ley (1984)c Nakon Allen i Holding (1974); Skerman i sar. (1980)c R. radiobacter (Ti)a A. tumefaciens (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 1) A. tumefaciens (biovar 1) A. tumefaciens R. radiobacter (Ri) A. tumefaciens (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 1) A. rhizogenes (biovar 1) A. rhizogenes R. radiobacter A. tumefaciens (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 1) A. radiobacter (biovar 1) A. radiobacter R. rhizogenes (Ti) A. rhizogenes (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. tumefaciens (biovar 2) A. tumefaciens R. rhizogenes (Ri) A. rhizogenes (rizogeni) A. radiobacter var. rhizogenes (biotip 2) A. rhizogenes (biovar 2) A. rhizogenes R. rhizogenes A. rhizogenes (nepatogeni) A. radiobacter var. radiobacter (biotip 2) A. radiobacter (biovar 2) A. radiobacter R. vitis (Ti) A. vitis (tumorogeni) A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 3) A. tumefaciens (biovar 3) NZ R. vitis A. vitis (nepatogeni) NZ NZ NZ R. rubib A. rubib A. radiobacter var. tumefaciens (biotip 2) A. rubi A. rubi R. larrymooreib A. larrymooreib NZ NZ NZ R. skierniewicenseb NZ NZ NZ NZ R. nepotumb NZ NZ NZ NZ a patogene karakteristike naznačene su po potrebi u cilju pojašnjenja; b poznata je jedino tumorogena sposobnost ove vrste; c NZ, nije zabeleženo. 11 bile navedene u zavisnosti da li je soj tumorogen (Ti), rizogen (Ri) ili nepatogen (Tabela 2). Vrsta A. rubi diferencirana je na osnovu fenotipskih i genetičkih odlika (Holmes i Roberts, 1981; Kersters i De Ley, 1984; Popoff i sar., 1984; Sawada i Ieki, 1992b). Koncept prirodne klasifikacije je podržan i dopunjen od jednog dela naučne javnosti (Popoff i sar., 1984; Bradbury, 1986; Sawada i sar., 1993; Moore i sar., 2001; Young i sar., 2005). Uprkos brojnim argumentima protiv, klasifikacija na osnovu patogenih odlika i dalje je ostala snažno podržana (Allen i Holding, 1974; Skerman i sar. 1980; Kersters i De Ley, 1984). Iako su Kersters i De Ley (1984) nastavili da podržavaju klasifikaciju na osnovu patogenih odlika, uvažili su prethodne studije koje su se bavile prirodnom klasifikacijom i prihvatili koncept fenotipske vrste i diferenciranje patogena na biovare (Tabela 2). Grupa sojeva sa vinove loze diferencirana je i svrstana u biovar 3 na osnovu biohemijskih i fizioloških odlika (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Kerr i Panagopoulos, 1977; Panagapoulos i sar., 1978; Süle, 1978), a kasnije i na osnovu serološke analize korišćenjem monoklonalnih antitela (Bishop i sar., 1989). Ophel i Kerr (1990) su na osnovu fenotipskih, seroloških i genetičkih odlika sojeva koji su ranije svrstavani u biovar 3 definisali novu vrstu, pod nazivom A. vitis (lat. vitis - od vinove loze). U diferenciranju Agrobacterium vrsta/biovara korišćene su i metode kojima se analizira čitav genom kao što su RAPD (Irelan i Meredith, 1996) i AFLP (Mougel i sar., 2002; Portier i sar., 2006). Jasna diferencijacija između Agrobacterium vrsta/biovara postignuta je metodom polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata (eng. restriction fragment length polymorphism, RFLP) ili sekvencionom analizom 16S i 23S rRNK gena, kao i regiona između ovih gena (eng. internal transcribed spacer, ITS; Sawada i sar., 1992d; Sawada i sar., 1993; Ponsonnet i Nesme, 1994; Oger i sar., 1998; Puławska i sar., 2000; Young i sar., 2001; Young i sar., 2004; Kwon i sar., 2005; Martens i sar., 2008; Bautista-Zapanta i sar., 2009). Takođe, u ovu svrhu se može koristiti i sekvenciona analiza konstitutivnih gena (Martens i sar., 2007; Martens i sar., 2008; Costechareyre i sar., 2010; Aujoulat i sar., 2011; Puławska i Kałużna, 2011; Puławska i sar., 2012a; Puławska i sar., 2012b; Shams i sar., 2013). 12 2.1.4 Predlozi revizije taksonomije i pripajanje rodu Rhizobium Različiti pristupi u klasifikaciji vrsta roda Agrobacterium doveli su do izvesnih nedoumica u imenovanju nekih vrsta. Pojedini autori smatraju da ime A. radiobacter ima prioritet u odnosu na A. tumefaciens, o čemu su vođene brojne polemike (Sawada i sar., 1993; Bouzar, 1994; Young i sar., 2001; 2006). Radikalan predlog revizije taksonomije predložili su Young i sar. (2001), koji su se založili da se predstavnici ovog roda pripoje rodu Rhizobium (Tabela 2). Naime, sekvenciona analiza 16S rDNK i 23S rDNK ukazivala je na međusobnu isprepletanost predstavnika rodova Rhizobium i Agrobacterium (Sawada i sar., 1993; Willems i Collins, 1993; Puławska i sar., 2000; Young i sar., 2001; 2004). Ovaj predlog postao je predmet široke diskusije u naučnim krugovima (Farrand i sar., 2003; Young i sar., 2003). Brojni autori smatrali su da grupisanje Agrobacterium spp. unutar roda Rhizobium nije u dovoljnoj meri potkrepljeno i založili se za zadržavanje roda Agrobactorium (Farrand i sar., 2003). Međunarodno telo koje se bavi taksonomijom rodova Agrobacterium i Rhizobium (The subcommittee on the taxonomy of Agrobacterium and Rhizobium) prepustilo je naučnoj javnosti da izabere koja imena žele da upotrebljavaju (Lindström i Martinez-Romero, 2002). 2.1.5 Genomske i novoopisane vrste Prateći savremeni pristup u klasifikaciji bakterija i definiciju genomske vrste, u slučaju roda Agrobacterium se kao autentične vrste mogu izdvojiti A. rubi i A. vitis (Popoff i sar., 1984; Ophel i Kerr, 1990). Nedavno je opisana i izdvojena nova vrsta A. larrymoorei (Bouzar i Jones, 2001). Sojevi A. larrymoorei izolovani su iz tumora biljaka fikusa na Floridi (Bouzar i sar., 1995a). Ime “larrymoorei” dodeljeno je ovoj vrsti u čast istaknutog fitopatologa Larija Mura, koji je posvetio svoju karijeru proučavanju bakterija roda Agrobacterium. A. rhizogenes, odnosno biovar 2, takođe je homogena genetička grupa određena na osnovu analize DNK-DNK hibrida i AFLP metodom (Popoff i sar., 1984; Portier i sar., 1996). Međutim, na osnovu sekvencione analize 16S rRNK gena, utvrđeno je da je različita od ostalih Agrobacterium vrsta i filogenetski bliža vrstama iz roda Rhizobium, i da se može označiti kao Rhizobium 13 rhizogenes (Young i sar., 2001; Portier i sar., 2006; Costechareyre i sar., 2010; Lindström i Young, 2011). A. tumefaciens, odnosno biovar 1 predstavlja kompleks od bar 9 genomskih vrsta (genomovara) na osnovu analize DNA-DNA hibrida, AFLP metode i sekvencione analize recA gena (De Ley i sar., 1973; De Ley, 1974; Popoff i sar., 1984; Mougel i sar., 2002; Portier i sar., 2006; Costechareyre i sar., 2010). Genomske vrste nazvane su G1-G9, prema nomenklaturi Mougel i sar. (2002). Diferencijacija genomskih vrsta A. tumefaciens/biovar 1 može biti izvršena i primenom RFLP analize 16S-23S rRNK ITS regiona (Vogel i sar., 2003), kao i rep-PCR metode korišćenjem BOX prajmera (Rhouma i sar., 2006). Kako bi se izbegla zabuna u terminologiji, za genomsku grupu G4 kojoj pripadaju tipski sojevi prethodno opisanih vrsta A. tumefaciens i A. radiobacter, predloženo je ime A. radiobacter (Costechareyre i sar., 2010). Pri izboru imena uzeta je u obzir i činjenica da ime A. radiobacter ima prvenstvo u odnosu na A. tumefaciens, s obzirom da je prvo objavljeno u literaturi (Young i sar., 2006). Takođe, predloženo je da se sve genomske grupe privremeno podvedu pod A. tumefaciens/biovar 1 kompleks (Costechareyre i sar., 2010). Ovo je prihvatljivo prelazno reženje dok svaka od genomskih vrsta ne bude formalno dobila ime (Lindström i Young, 2011). Pored imena A. radiobacter za genomsku vrstu G4, predloženo je ime A. fabrum za genomsku vrstu G8 (Lassalle i sar., 2011; Tabela 3). Unutar roda Agrobacterium takođe postoje neklasifikovane vrste, gde pripada atipični soj NCPPB 1650, koji se označava kao Agrobacterium sp. Smatra se i da neke vrste kvržičnih bakterija pripadaju rodu Agrobacterium, kao što je azotofiksator Allorhizobium undicola (Costechareyre i sar., 2010). Nedavno su opisane dve nove vrste tumorogenih bakterija, Rhizobium skierniewicense i R. nepotum koje su izolovane iz biljaka hrizanteme i džanarike u slučaju prve vrste, odnosno biljaka džanarike, vinove loze, maline, podloge “Colt” (Prunus avium×Prunus pseudocerasus) i trešnje u slučaju druge vrste (Puławska i sar., 2012a; 2012b). Vrsta R. skierniewicense dobila je ime po Poljskom gradu Skjernevice (polj. Skierniewice) gde je izolovan tipski soj. S obzirom da su predstavnici R. nepotum izolovani u Poljskoj i Mađarskoj, ime ove vrste odražava istorijsku vezu između ove dve zemlje, jer se za Poljake i Mađare kaže se da su sestrići (lat. nepotum - od sestrića). Sekvenciona analiza recA gena vrste R. nepotum, ukazala je da ova vrsta takođe pripada Agrobacterium tumefaciens/biovar 1 kompleksu i da predstavlja novu genomsku vrstu 14 označenu kao G14 (Puławska i sar., 2012a; Shams i sar., 2013; Tabela 3). Saïdi i sar. (2011) su iz kvržica boba (Vicia faba) izolovali sojeve srodne Agrobacterium sp., koji nisu pripadali ni jednoj do tada opisanoj vrsti. Filogenetskom analizom recA i atpD gena utvrđeno je da ovi sojevi takođe pripadaju vrsti R. nepotum (Puławska i sar., 2012a). Tabela 3. Genomske vrste Agrobacterium/Rhizobium kompleksa vrsta Genomska vrsta A. tumefaciens genomska vrsta G1 A. tumefaciens genomska vrsta G2 = R. pusense A. tumefaciens genomska vrsta G3 A. tumefaciens genomska vrsta G4 = A. radiobacter A. tumefaciens genomska vrsta G5 A. tumefaciens genomska vrsta G6 A. tumefaciens genomska vrsta G7 A. tumefaciens genomska vrsta G8 = A. fabrum A. tumefaciens genomska vrsta G9 A. tumefaciens genomska vrsta G13 A. tumefaciens genomska vrsta G14 = R. nepotum R. rhizogenes A. vitis A. rubi A. larrymoorei R. skierniewicense Agrobacterium sp. (soj NCPPB 1650) Allorhizobium undicola U poslednjih 20 godina Agrobacterium spp. su identifikovani i kao oportunistički patogeni kod čoveka, kao prouzrokovači bolničkih infekcija kod bolesnika sa kompromitovanim imunim sistemom (Edmond i sar., 1993; Coenye i sar., 2002; Amaya i Edwards, 2003; Paphitou i Rolston, 2003; Chen i sar., 2008). Tako su Agrobacterium spp. izolovani iz disajnih puteva pacijenata obolelih od cistične fibroze (Coenye i sar., 2002). Bolnički sojevi pripadali su vrsti A. tumefaciens/biovar 1 i raspoređeni unutar tri genomske vrste (Popoff i sar., 1984). Kasnije, sekvencionom analizom konstitutivnih gena kod različitih sojeva A. tumefaciens/biovar 1, utvrđeno je da su bolnički sojevi raspoređeni unutar četiri genetičke grupe A2, A3, A4 i A7, od čega 15 je većina pripadala genetičkoj grupi A7 (Aujoulat i sar., 2011). Genetička grupa A7 koja je za razliku od genetičkih grupa A2, A3 i A4, bila sastavljena isključivo od sojeva humanog porekla mogla bi da predstavlja novu vrstu pretežno povezanu sa infekcijama čoveka (Aujoulat i sar., 2011). Neke fenotipske odlike ove grupe sojeva, kao što je temperatura razvoja pri 42°C doprinose ovoj tvrdnji (Aujoulat i sar., 2011). Genetičkoj grupi A7 pripadao je i reprezentativni soj iz genomske vrste G2 A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa, što ukazuje da su ove dve grupe analogne jedna drugoj, odnosno da većina bolničkih sojeva zapravo pripada genomskoj vrsti G2. Međutim, podaci iz literature ukazuju da genomskoj grupi G2 pripadaju i pojedini sojevi poreklom iz drugih izvora, kao što je voda iz kanala (Popoff i sar., 1984) ili kvržice na bobu i slanutku (Cicer arietinum) u Tunisu (Saïdi i sar., 2011). Nedavno, sojevi Agrobacterium sp. izolovani iz rizosfere slanutka u Indiji opisani su kao nova vrsta za koju je predloženo ime Rhizobium pusense (Panday i sar., 2011). Filogenetskom analizom zasnovanoj na sekvencama recA i gyrB konstitutivnih gena, ustanovljeno je da R. pusense zapravo pripada genomskoj vrsti G2 A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa (Shams i sar., 2013). Dakle, genomska vrsta G2, kojoj pripadaju bolnički sojevi i pojedini sojevi iz drugih izvora, može biti imenovana kao R. pusense (Shams i sar., 2013; Tabela 3). Vrste roda Agrobacterium izolovane su iz nekih nepristupačnih staništa kao što su sedimenti sa dna Atlantskog okeana. Ovi marinski sojevi klasifikovani su kao nove vrste Agrobacterium atlanticum, Agrobacterium meteori, Agrobacterium ferrugineum, Agrobacterium gelatinovorum i Agrobacterium stellulatum (Rüger i Höfle, 1992). Takođe, iz vodenih makrofita u Kaliforniji su izolovani sojevi koji su imali sposobnost oksidacije arsenita i koji su opisani kao nova vrsta Agrobacterium albertimagni (Salmassi i sar., 2002). S obzirom da nisu ispunjeni osnovni kriterijumi prilikom opisa nove vrste, A. albertimagni nije zvanično priznata (prema http://www.bacterio.cict.fr). Ipak, rezultati filogenetske analize zasnovane na sekvencama recA gena, ukazivali su da je ova nepriznata vrsta jasno različita od svih do sada opisanih Agrobacterium spp. U ovom radu biće zadržan status roda Agrobacterium kao izdvojenog predstavnika familije Rhizobiaceae. Koristiće se imena A. tumefaciens i A. rhizogenes prema prirodnoj klasifikaciji, a biće naznačena i oznaka biovara. Takođe, koristiće se i imena A. vitis, A. rubi i A. larrymoorei. S obzirom da su vrste R. skierniewicense i R. nepotum na ovaj način imenovane u literaturi, u ovom slučaju će se koristiti Rhizobium 16 kao ime roda. Patogeni status, u zavisnosti da li je soj tumorogen, rizogen ili nepatogen, biće naveden po potrebi. 2.2 Detekcija i identifikacija Agrobacterium vrsta Detekcija i identifikacija patogena su preduslov za pravilnu i pouzdanu dijagnozu oboljenja. Identifikacija predstavlja proces dodeljivanja imena nepoznatoj bakteriji koju smo prethodno izolovali. Dakle, početni korak u identifikaciji je dobijanje čiste kulture bakterija. Potvrda dijagnoze dobija se tek ispunjavanjem svih Kohovih postulata, odnosno testom patogenosti na biljci domaćinu, reizolacijom i ponovnom identifikacijom. Sa druge strane, detekcija podrazumeva utvrđivanje prisustva bakterije u testiranom uzorku, na osnovu čega se može doneti preliminarna dijagnoza. Do sada je razvijen čitav niz metoda kojima se može izvršiti identifikacija i detekcija Agrobacterium spp. 2.2.1 Izolacija patogena Vrste roda Agrobacterium mogu naseljavati veoma različita staništa. Fitopatogeni predstavnici ovog roda većinom su izolovani iz tkiva tumora zaraženih biljaka. U slučaju vinove loze, bakterije su izolovane i iz soka ksilema simptomatičnih ili asimptomatičnih zaraženih biljaka (Lehoczky, 1968; Burr i Katz, 1983; Tarbah i Goodman, 1986; Bazzi i sar., 1987; Moore i sar., 2001). A. vitis takođe može biti izolovan iz ulegnutih nekrotičnih zona koje se pojavljuju na korenu sa simptomima izumiranja (Burr i sar., 1987a). Populacija bakterija nije brojna u starijem tkivu tumora, i nekada je lakše izolovati ih iz okolnog zemljišta. Brojnost Agrobacterium spp. u populaciji u zemljištu varira između 103-107 bakterijskih ćelija po gramu zemljišta (Schroth i sar., 1965; 1971; Bouzar i Moore, 1987b; Burr i sar., 1987b; Bouzar i sar., 1993b). Uočene su i sezonske varijacije brojnosti Agrobacterium spp. u zemljištu, a populacija je bila brojnija tokom proleća i leta u odnosu na jesen i zimu (Krimi i sar., 2002). Ako se zanemare zone u blizini zaraženih biljaka, sojevi Agrobacterium spp. izolovani iz zemljišta bili su uglavnom nepatogeni (Bouzar i Moore, 1987b; Vogel i 17 sar., 2003; Sobiczewski i sar., 2005). Nepatogeni sojevi ovog roda izolovani su iz zemljišta koje nije nikada korišćeno u poljoprivredne svrhe, kao što su savane i prerije Severne Amerike (Bouzar i Moore, 1987b). Iz korena američke loze (Vitis riparia) koja je rasla u spontanoj flori i koja nije imala simptome bakterioznog raka, takođe su izolovani samo nepatogeni A. vitis sojevi (Burr i sar., 1999). Međutim, Genov i sar. (2006a) su iz biljaka divlje loze (V. vinifera ssp. silvestris), koja je prisutna u šumskim predelima u Bugarskoj, izolovali tumorogene A. vitis sojeve. Nepatogeni sojevi Agrobacterium spp. izolovani su iz sedimenata poreklom sa dna Atlantskog okeana (Rüger i Höfle, 1992), Pacifika (D’Hondt i sar., 2004) i Sredozemnog mora (Süß i sar., 2006). Kao oportunistički patogeni čoveka, netumorogeni Agrobacterium sojevi izolovani su iz različitih delova ljudskog tela (Edmond i sar., 1993; Coenye i sar., 2002; Amaya i Edwards, 2003; Paphitou i Rolston, 2003; Chen i sar., 2008). Agrobacterium spp. mogu se nesmetano razvijati na većini hranljivih podloga. Hranljivi agar sa dodatkom kvaščevog ekstrakta (eng. yeast nutrient agar, YNA), podloga sa manitolom i kvaščevim ekstraktom (eng. yeast mannitol agar, YMA) i krompir dekstrozni agar (KDA) pogodne su za gajenje većine sojeva. Ove podloge takođe mogu biti korišćene za izolaciju iz tkiva tumora, pri čemu se posebna pažnja pridaje sterilnim uslovima tokom postupka izolacije. Neki sojevi zahtevaju B vitamin za svoj rast, pre svega biotin, pantotensku i/ili nikotinsku kiselinu (Matthysse, 2006). Uopšteno, na osnovnim podlogama, kolonije Agrobacterium spp. su bele, sivo-bele ili svetlo ružičaste boje, i ne stvaraju pigmente. Umereno su ispupčene, sjajne i pravilnog kružnog oblika. Neki sojevi stvaraju velike količine vanćelijskih polisaharida, koji im daju vodenastu konzistenciju. Većina sojeva ima umeren porast i za 2-4 dana dolazi do razvoja pojedinačnih kolonija na osnovnim podlogama. Međutim neki sojevi A. rhizogenes/biovar 2 imaju slabiji porast i potrebna im je jedna nedelja da bi formirali pojedinačne kolonije (Moore i sar., 2001). Optimalna temperatura razvoja za većinu sojeva iznosi 25-28°C. Razvijen je veći broj selektivnih i poluselektivnih i/ili diferencijalnih podloga koje se mogu koristiti za izolaciju Agrobacterium spp., a njihov pregled dali su Moore i sar. (2001). Ove podloge posebno su korisne pri izolaciji iz kompleksnih sredina kao što je zemljište, gde su prisutni mnogi saprofitni organizmi, a populacija Agrobacterium spp. na relativno niskom nivou. Najpogodnijim su se pokazale podloga 1A za A. 18 tumefaciens/biovar 1, 2E za A. rhizogenes/biovar 2, i Roy i Sasser (RS) podloga za A. vitis (Brisbane i Kerr, 1983; Roy i Sasser, 1983). Selektivnost 1A i 2E podloga poboljšana je dodavanjem selektivnog agensa kalijum telurita (K2TeO3; Mougel i sar., 2001). Isti agens dodavan je i u neselektivnu podlogu sa manitolom i glutaminskom kiselinom (MG) čime je postignuta bolja selektivnost (Mougel i sar., 2001). 2.2.2 Određivanje patogenosti Patogenost Agrobacterium spp. može se proveriti testom patogenosti na pogodnim biljkama. S obzirom da izvođenje testa patogenosti iziskuje značajan utrošak vremena, kao alternativa u određivanju patogenosti, poslednjih godina sve više se koriste molekularne metode, pre svega PCR. 2.2.2.1 Test patogenosti Sojevi Agrobacterium spp. mogu imati vrlo različit spektar domaćina, te je stoga pri proveri njihove patogenosti korišćeno više različitih test biljaka (Anderson i Moore, 1979; Moore i sar., 2001). Najčešće korišćene biljne vrste su paradajz (Solanum lycopersicum), suncokret (Helianthus annuus), duvan (Nicotiana tabacum), tatula (Datura stramonium), briofilum (Bryophyllum daigremontianum, syn. Kalanchoe daigremontiana), mrkva (Daucus carota) i dr. (Moore i sar., 2001). Test patogenosti podrazumeva inokulaciju test biljaka kroz povrede na tkivu. Kako bi se povećala uspešnost infekcije, preporučuje se korišćenje mladih biljaka u fazi intenzivnog rasta. Povređivanje se može izvršiti korišćenjem sečiva ili igle, dok se za inokulaciju može koristiti kako bakterijska suspenzija, tako i masa bakterijskih ćelija (Moore i sar., 2001). Inokulisane biljke potrebno je gajiti u optimalnim uslovima, koji pogoduju njihovom neometanom rastu i razvoju. Kritičan faktor za ostvarenje infekcije je temperatura, jer iznad 32°C dolazi do inhibicije patogeneze (Banta i sar., 1998). 2.2.2.2 PCR Patogenost Agrobacterium spp. uslovljena je prisustvom pTi ili pRi u njihovom genomu (Van Larebeke i sar., 1974; Watson i sar., 1975). Na ovim plazmidima nalazi se 19 većina gena koji kontrolišu procese patogeneze. U cilju detekcije i karakterizacije pTi i pRi, najviše se primenjuje lančano umnožavanje fragmenata DNK (eng. polymerase chain reaction, PCR), i u ovu svrhu dizajniran je veći broj prajmera specifičnih za pojedine plazmidne gene (Tabela 4.). Tabela 4. Lista prajmera dizajniranih za detekciju i karakterizaciju pTi i/ili pRi Ciljani region ili gen Oznaka prajmeraa Tip PCR-a Literatura T-DNK (ipt [tmr]) FGPtmr530/FGPtmr701 Konvencionalni Nesme i sar., 1990 Region između virB i virG gena FGPvir B11+21/FGPvirG15’ T-DNK (iaaM [tms1], iaaH [tms2]) ND Konvencionalni Dong i sar., 1992 T-DNK (ipt [tmr], insercioni elementi [IS866, IS868, IS869], region između 6b i vis gena) ND Konvencionalni Schulz i sar., 1993b T-DNK (nos gen A. tumefaciens pTi) FGPnos975/FGPnos1236' PCR; PCR-RFLP Ponsonnet i Nesme, 1994 virA-virB2 region A. tumefaciens pTi FGPvirA2275/FGPvirB2164' T-DNK (tms region A. tumefaciens pTi) FGPtms2-194’/FGPtms1-46’ Konvencionalni Nesme i sar., 1995 virC VCF/VCR Konvencionalni Sawada i sar., 1995 T-DNK (6b), virA ND Konvencionalni Eastwell i sar., 1995 virD2 A, C´, E´ Dupleks Haas i sar., 1995 T-DNK (ipt [tmr]) CYT/CYT´ T-DNK (6b gen A. vitis oktopin pTi) 4905/4906 Konvencionalni Kaufman i sar., 1996 T-DNK (iaaH [tms2]) tms2A/tms2B Konvencionalni Sachadyn i Kur, 1997 virB region ANTvirB11887 PCR; PCR-RFLP Pionnat i sar., 1999 virE2 VirE2PF/VirE2PR Konvencionalni Szegedi i Bottka, 2002 T-DNK (vis) VisF/VisR T-DNA (rolα gen pRi) rol-F, rol-R, rol-Pr (proba) “Real-time (Taqman)” Weller i Stead, 2002 T-DNK (vis) ocsF/ocsR Konvencionalni Tan i sar., 2003 Desni granični deo T-DNK RBF/RBR virC VCF3/VCR3; VCF5/VCR5 Konvencionalni Suzaki i sar., 2004 T-DNK (6b gen A. vitis oktopin pTi) TF/TR Konvencionalni Szegedi i sar., 2005 T-DNK (6b gen A. vitis nopalin pTi) NF/NR (Nastavak na sledećoj strani) 20 Tabela 4. Nastavak Ciljani region ili gen Oznaka prajmeraa Tip PCR-a Literatura T-DNK (iaaH [tms2]) tms2F1, tms2R2, tms2B “semi-nested” Puławska i Sobiczewski, 2005 virF gen A. vitis oktopin i nopalin pTi VirFF1/VirFR2 multipleks Konvencionalni Bini i sar., 2008b virD2 gen A. vitis (S4) vitopin pTi VirD2S4F716/VirD2S4R1036 ocs gen A. vitis (Tm4) pTi OCTF/OCTR nos gen A. vitis (AB4) pTi NOPF/NOPR virD2 VIRD59F26/VIRD59R122 VIRD62F23/VIRD62R135 Konvencionalni; “Real-time (Sybr Green)” Bini i sar., 2008a virA NVirA fw/NVirA rew “nested” Peduto i sar., 2010 T-DNK (ipt [tmr]) Tmr236F/Tmr236R Konvencionalni Yang i sar., 2011 T-DNK Tip6F/ Tip6R Konvencionalni “Real-time (Sybr Green)” Yakabe i sar., 2012 virD2 ND “Real-time” Johnson i sar., 2013 a ND, nije definisano Međutim, izražen genetički diverzitet među sojevima Agrobacterium spp. može ograničiti specifičnost PCR metode, odnosno prajmera. U jednom od pionirskih radova koji se bavio detekcijom Agrobacterium pTi primenom PCR metode, prajmeri su dizajnirani na osnovu regiona između virB i virG gena, kao i tmr gena koji se nalazi unutar T-DNK (Nesme i sar., 1990). Prvim prajmerima (virB-virG) detektovani su jedino sojevi sa nopalin tipom pTi, dok kod onih sa oktopin ili nekim drugim tipom pTi nije bilo umnožavanja specifičnih fragmenata, a drugi par prajmera (tmr) omogućavao je umnožavanje u slučaju nopalin ili oktopin tipa pTi, ali ne i agropin tipa pTi (Nesme i sar., 1990). U kasnijim studijama, takođe je saopšteno da prajmeri virB-virG nisu ispoljili specifičnost prema mnogim proučavanim patogenim sojevima Agrobacterium spp., prevashodno prema vrsti A. vitis (Cubero i sar., 1999; Palacio-Bielsa i sar., 2009). Ipak, virB-virG prajmerima umnoženi su specifični fragmenti kod pojedinih A. vitis sojeva sa oktopin tipom pTi (Cubero i sar., 1999). Dong i sar. (1992) su razvili dva para prajmera komplementarna tms genu, međutim uspešnost detekcije bila je zavisna od testiranog soja, odnosno od koncentracije ekstrahovane DNK. Sawada i sar. (1995) su dizajnirali potencijalno univerzalne prajmere za detekciju Agrobacterium pTi i pRi, ali do umnožavanja odgovarajućih fragmenata nije došlo u slučaju jednog A. vitis soja korišćenog u istraživanju. Ovo je potvrđeno i u studijama drugih istraživača, gde korišćenjem ovih 21 prajmera nije dolazilo do umnožavanja karakterističnih fragmenata pretežno kod tumorogenih sojeva A. vitis, ali i pojedinih A. tumefaciens poreklom iz vinove loze (Cubero i sar., 1999; Szegedi i Bottka, 2002; Suzaki i sar., 2004; Szegedi i sar., 2005; Palacio-Bielsa i sar., 2009). Pored toga, Eastwell i sar. (1995) su razvili prajmere za detekciju tumorogenih A. vitis sojeva na bazi sekvence virA gena, koji takođe nisu bili specifični prema svim proučavanim sojevima. Palacio-Bielsa i sar. (2009) naveli su slična opažanja koristeći ove prajmere u analizi većeg broja sojeva Agrobacterium spp. poreklom iz vinove loze. Dupleks PCR metodom sa prajmerima specifičnim za virD2 i ipt gene detektovan je širok krug tumorogenih i rizogenih sojeva Agrobacterium spp. (Haas i sar., 1995). Međutim, virD2 prajmerima umnožen je odgovarajući fragment i kod jednog nepatogenog Agrobacterium soja, dok jedan A. vitis soj nije detektovan ipt prajmerima (Haas i sar., 1995). Ovim prajmerima takođe nisu umnoženi specifični fragmenti kod pojedinih A. vitis sojeva korišćenih u kasnijim studijama (Bini i sar., 2008b; Kumagai i Fabritius, 2008). 2.2.3 Diferencijacija do nivoa vrste/biovara Diferencijacija vrsta/biovara roda Agrobacterium može se izvesti korišćenjem klasičnih bakterioloških metoda, odnosno biohemijsko-fiziološkim testovima, kao i serološkim, molekularnim i automatizovanim metodama. 2.2.3.1 Biohemijsko-fiziološki testovi Do sada je u literaturi opisan čitav niz bihemijsko-fizioloških testova koji se mogu koristiti u diferenciranju vrsta/biovara roda Agrobacterium/Rhizobium (Bouzar i sar., 1995a; 1995b; Kerr i Gibb, 1997; Bouzar i Jones, 2001; Moore i sar., 2001; Puławska i sar., 2012a; 2012b; Tabela 5). Bouzar i sar. (1995b) su predložili četiri jednostavna testa kojima se može u roku od 48h izvršiti preliminarna identifikacija A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2 i A. vitis. To su: stvaranje 3-ketolaktoze, formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3, pokretljivost pri pH 7,0 i pektolitička aktivnost pri pH 4,5. 22 Tabela 5. Biohemijsko-fiziološke karakteristike fitopatogenih vrsta roda Agrobacterium Test Vrstaa At/B1b Ar/B2b Avb Arub Alb Rsb Rnb Reakcija po Gramu - - - - - - - Aktivnost oksidaze + V V + + + + Razvoj pri 35°C + V V V - NP NP Razvoj pri 37°C + - - - NP NP NP Razvoj u podlozi sa 2% NaCl + - + + + + + Stvaranje 3-ketolaktoze + - - - - - + Reakcija u lakmus mleku ALK KIS ALK ALK ALK ALK ALK Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 - + - - V NP NP Pokretljivost pri pH 7,0 + + - NP NP NP NP Pektolitička aktivnost pri pH 4,5 - - + NP NP NP NP Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri-amonijum-citratom + - - - - + - Korišćenje citrata -/V + + - - - - Stvaranje kiseline iz: saharoze eritritola melezitoze + - + - + - V - - NP - - + - NP + - - + - - Stvaranje baze iz: L-tartarata mucinska kiselina malonske kiseline V - - + + + + - + - NP + + NP - NP NP + NP - NP a At/B1, A. tumefaciens/biovar 1; Ar/B2, A. rhizogenes/biovar 2; Av, A. vitis; Aru, A. rubi; Al, A. larrymoorei; Rs, R. skierniewicense; Rn, R. nepotum; b +, pozitivna reakcija kod više od 80% sojeva; V, 21-79% sojeva ispoljava pozitivnu reakciju; -, negativna reakcija kod više od 80% sojeva; NP, nema literaturnih podataka; ALK, alkalna reakcija; KIS, kisela reakcija. Cubero i Lόpez (2001) su razvili tzv. mikrotitarski sistem za identifikaciju Agrobacterium spp. Autori su pomoću osam odabranih biohemijskih testova, koji se izvode istovremeno u mikropločama, vršili identifikaciju A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2 i A. vitis. Primenjen je test korišćenja citrata, razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri-amonijum-citratom, proizvodnja baze iz malonske, L-tartarske i mucinske kiseline, proizvodnja kiseline iz saharoze i melezitoze i stvaranje 3- ketolaktoze. Na ovaj način čine se značajne uštede u pogledu vremena, materijala i prostora, u odnosu na tradicionalno izvođenje ovih testova. 23 2.2.3.2 Serološke metode Više različitih seroloških metoda je opisano u literaturi u cilju detekcije i identifikacije Agrobacterium spp. (Keane i sar., 1970; Miller i Vruggink, 1981; Alarcon i sar., 1987; Bazzi i sar., 1987; Bouzar i Moore, 1987a; Bazzi i sar., 1988; Bishop i sar., 1989; Michel i sar., 1990; Sawada i sar., 1992b; Sawada i sar., 1992c). Pretežno su korišćene test aglutinacije, difuzija u gelu, enzimski imunoadsorpcioni test (eng. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) i test imunofluorescencije (eng. immunofluorescence, IF). Keane i sar. (1970) su korišćenjem specifičnih antiseruma diferencirali većinu proučavanih sojeva koji su pripadali biovarima 1 i 2, dok sojevi A. rubi nisu reagovali niti sa antiserumom spicifičnim za biovar 1, kao ni sa antiserumom specifičnim za biovar 2. Kasnije studije koje su za cilj imale proizvodnju antitela specifičnih za pojedine biovare, uključujući i vrstu A. vitis, bile su delimično uspešne, s obzirom da su se pojavili problemi sa specifičnošću antiseruma (Miller i Vruggink, 1981; Alarcon i sar., 1987; Bazzi i sar., 1987; Bazzi i sar., 1988; Michel i sar., 1990). Sa druge strane, Bishop i sar. (1989) su proizveli monoklonalna antitela specifična za A. vitis, koja su se pokazala pouzdanim u determinaciji ove vrste iz čistih kultura. Sawada i sar. (1992b; 1992c) su korišćenjem pet različitih antiseruma diferencirali sojeve A. vitis u četiri grupe, što je ukazivalo na njihovu serološku heterogenost. 2.2.3.3 Molekularne metode Pojedine vrste roda Agrobacterium mogu biti diferencirane do nivoa vrste/biovara PCR metodom, korišćenjem prajmera specifičnih za određene hromozomske gene (Tabela 6). Većina studija odnosi se na diferencijaciju i identifikaciju vrste A. vitis putem detekcije pehA gena za poligalakturonazu (Eastwell i sar., 1995; Szegedi i Bottka, 2002; Peduto i sar., 2010) ili 16S rRNK gena (Kawaguchi i sar., 2005). Puławska i sar. (2006) su razvili multipleks PCR kojim se istovremeno mogu diferencirati četiri biovara/vrste analizom 23S rRNK gena (Tabela 6). Iako su 23S rRNK prajmerima uspešno identifikovani A. tumefaciens/biovar1, A. vitis i A. rubi, prajmerima specifičnim za A. rhizogenes/biovar 2 umnožen je odgovarajući fragment i kod nekih Rhizobium sojeva, te je bio potreban dodatni korak restrikcione analize PCR 24 produkta kako bi se identifikovala ova vrsta (Puławska i sar., 2006). Fragmenti specifični, kako za A. tumefaciens/biovar 1, tako i za A. rhizogenes/biovar 2, umnoženi su kod nekoliko atipičnih sojeva (Puławska i sar., 2006), koji su kasnije opisani kao nova vrsta R. nepotum (Puławska i sar., 2012a). U svom istraživanju, Lim i sar. (2009) su koristili određenu hromozomsku sekvencu za PCR detekciju A. vitis. Pored PCR metode, u cilju identifikacije i diferencijacije Agrobacterium spp. do nivoa vrste mogu se koristiti PCR-RFLP ili sekvenciona analiza ribozomalnih gena, ali i njihovih ITS regiona (Sawada i sar., 1992d; Sawada i sar., 1993; Ponsonnet i Nesme, 1994; Oger i sar., 1998; Puławska i sar., 2000; Young i sar., 2001; Young i sar., 2004; Kwon i sar., 2005; Martens i sar., 2008; Bautista-Zapanta i sar., 2009). Poslednjih godina, sve više se koristi i sekvenciona analiza konstitutivnih gena, koji poseduju još veću diskriminacionu moć u odnosu na ribozomalne gene (Martens i sar., 2007; Martens i sar., 2008; Costechareyre i sar., 2010; Aujoulat i sar., 2011; Puławska i Kałużna, 2011; Puławska i sar., 2012a; Puławska i sar., 2012b; Shams i sar., 2013). Tabela 6. Lista prajmera specifičnih za pojedine vrste/biovare roda Agrobacterium Ciljani organizam Ciljani gen Oznaka prajmera a Tip PCR-a Literatura A. vitis pehA ND Konvencionalni Eastwell i sar., 1995 A. vitis pehA PGF/PGR Konvencionalni Szegedi i Bottka, 2002 A. tumefaciens/ biovar 1, A. rhizogenes/ biovar 2, A. vitis, A. rubi 23S rRNA UF,B1R, B2R, AvR, ArR Multipleks Puławska i sar., 2006 A. vitis 16S rRNA Ab3-F3/Ab3-R4 Dupleks Kawaguchi i sar., 2005 A. vitis neidentifikovana sekvenca AVSP3-1F/AVSP3-1R AVSNP-3F/ AVSNP-3R Konvencionalni “nested” Lim i sar., 2009 A. vitis pehA pehA1, pehA2, pehA3 “nested” Peduto i sar., 2010 a ND, nije definisano 2.2.3.4 Automatizovane metode Mnoge fitopatogene bakterije proučavane su automatizovanim metodoma i vrste roda Agrobacterium nisu izuzetak. Bouzar i sar. (1993a) su analizirali sadržaj masnih 25 kiselina korišćenjem MIDI sistema za gasno-tečnu hromatografiju (МIDI, Microbial ID, Inc., Newark, DE, USA) i sposobnost sojeva da koriste različite izvore ugljenika primenom Biolog sistema (Вiolog, Inc., Hayward СА, USA). Na ovaj način diferencirani su A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2, A. vitis i A. rubi. Saglasne rezultate dobili su i drugi autori proučavajući ukupan sadržaj masnih kiselina kod Agrobacterium sojeva (Jarvis i sar., 1996; Tighe i sar., 2000; Süle i sar., 2012). Korišćenjem Biolog metode i analize masnih kiselina diferencirana je i vrsta A. larrymoorei (Bouzar i sar., 1995a; Bouzar i Jones, 2001), kao i vrste R. skierniewicense (Puławska i sar., 2012b) i R. nepotum (Puławska i sar., 2012a). 2.2.3.5 Ostale metode U literaturi su opisane i novije metode, koje mogu predstavljati alternativu konvencionalnim metodama široko primenjivanim u laboratorijskoj praksi. Brza i osetljiva identifikacija vrsta roda Agrobacterium izvođena je razdvajanjem RNK molekula niske molekulske mase metodom stepenaste elektroforeze (Velázquez i sar., 2001). Ovom metodom dobijaju se genetički profili sa tri jasne zone: 5S rRNK, klasa 1 transportne RNK (tRNK) i klasa 2 tRNK. 5S rRNK zona je svojstvena svakom rodu, dok su profili tRNK karakteristični za svaku vrstu. MALDI-TOF MS (eng. matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry) je relativno nova metoda kojom se na brz i pouzdan način može izvršiti identifikacija i klasifikacija mikroorganizama (Maier i sar., 2006). Ova metoda primenjuje u kliničkoj dijagnostici, ekološkim i taksonomskim studijama, ili kontroli kvaliteta hrane. MALDI-TOF MS metoda korišćena je prvi put u fitopatologiji u cilju brze identifikacije i grupisanja Pantoea vrsta (Rezzonico i sar., 2010). Nedavno je ova metoda primenjena u identifikaciji i filogenetskoj analizi nekoliko rodova fitopatogenih bakterija uključujući i Agrobacterium (Pothier i sar., 2011). Na ovaj način diferencirani su i genomovari A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa (J. Pothier, neobjavljen podatak). Süle i sar. (2012) su opisali metod kapilarnog izoelektričnog fokusiranja u diferencijaciji sojeva A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2, A. vitis i A. rubi. Izoelektrično fokusiranje je elektroforetska metoda razdvajanja u gradijentu pH. Prednost ove metode predstavlja brzina izvođenja, jednostavnost i niska cena koštanja. 26 2.2.4 Detekcija Agrobacterium spp. u biljnom tkivu i zemljištu Metode detekcije Agrobacterium spp. u biljnom tkivu, opisane u literaturi, pretežno se zasnivaju na primeni molekularnih metoda. Od seroloških metoda, korišćen je imunofluorescentni test u analizi soka ksilema iz reznica vinove loze i ovaj metod bio je osetljiviji u odnosu na izolaciju bakterija na selektivne podloge (Bazzi i sar., 1987). Međutim, serološkim metodama se ne mogu diferencirati patogeni sojevi Agrobacterium sp. od nepatogenih. PCR metoda omogućila je detekciju patogenih Agrobacterium sojeva, odnosno njihovog pTi. Eastwell i sar. (1995) su vršili izolaciju i prečišćavanje DNK bakterije iz reznica vinove loze, a zatim PCR umnožavanje ciljanog gena. Ovim je postignuta značajna osetljivost i veća pouzdanost detekcije A. vitis u odnosu na izolaciju na hranljive podloge. Slično, metod ekstrakcije DNK bakterije iz tkiva tumora, nakon čega je izvođen PCR, bio je osetljiviji u detekciji fitopatogenih Agrobacterium spp. u odnosu na izolaciju bakterija na selektivne hranljive podloge (Cubero i sar., 1999). PCR metoda pokazala se efikasnijom i u detekciji patogena kod veštački inokulisanih biljaka hrizanteme i breskve u odnosu na izolaciju (Puopolo i sar., 2007). Međutim, Szegedi i Bottka (2002), analizirajući uzorke soka ksilema vinove loze PCR metodom, nisu detektovali prisustvo A. vitis, koji je zatim izolovan na hranljive podloge korišćenjem istih uzoraka. Kaufmann i sar. (1996) su u cilju povećanja osetljivosti i pouzdanosti detekcije A. vitis u sadnom materijalu vinove loze razvili metodu imunokultivacije patogena, nakon čega je izvođen PCR. Bini i sar. (2008b) su koristili real-time PCR u detekciji A. vitis u uzorcima tkiva tumora, iz kojih je prethodno ekstrahovana DNK. Na ovaj način A. vitis je detektovan uz visoku osetljivost čiji je prag bio 1-10 bakterijskih ćelija po reakciji. Real-time PCR metodu za detekciju A. vitis su razvili i Johnson i sar. (2013), pri čemu su poredili različite metode ekstrakcije DNK bakterije iz čistih kultura i obogaćenih uzoraka veštački inokulisane vinove loze. Peduto i sar. (2010) su razvili PCR metodu sa umetnutim prajmerima koja je pokazala značajnu osetljivost i specifičnost u detekciji A. vitis u asimptomatičnom biljnom materijalu, gde je DNK bakterije prethodno ekstrahovana iz uzoraka. Pored navedenih protokola, gde su kao predmet PCR analize služili ekstrakti DNK iz biljnog tkiva, u literaturi je opisan i tzv. BIO-PCR gde je analiziran kompletan 27 sadržaj Petri kutija na kojima je izolovan A. vitis iz uzoraka, gde pored patogena mogu biti prisutni saprofiti i drugi mikroorganizmi (Bini i sar., 2008a; 2008b; Kumagai i Fabritius, 2008). Agrobacterium spp. nastanjuje i zemljišne ekosisteme, te je analiza uzoraka zemljišta značajna u otkrivanju potencijalnih izvora infekcije. U ovu svrhu razvijeno je više protokola koji se zasnivaju na PCR metodi. Najčešće je ekstrakcija DNK bakterije izvođena direktno iz uzoraka zemljišta (Picard i sar., 1992; Sachadyn i Kur, 1997; Benjama i sar., 2004; Yang i sar., 2011), ili je ekstrakciji prethodila izolacija na hranljive podloge (Puławska i Sobiczewski, 2005; Sobiczewski i sar., 2005). Takođe, moguće je ekstrakte zemljišta koristiti direktno u “nested” PCR reakciji (Lim i sar., 2009). Osetljivost detekcije je varirala je od 102-104 bakterijskih ćelija po gramu zemljišta (Picard i sar., 1992; Sachadyn i Kur, 1997), do samo 1-2 bakterijske ćelije po gramu zemljišta, korišćenjem protokola gde je izvršena inkubacija suspenzije zemljišta na hranljivim podlogama i ekstrakcija DNK, praćena “semi-nested” PCR metodom (Puławska i Sobiczewski, 2005). Pored navedenih konvencionalnih, u detekciji Agrobacterium spp. u biljnom tkivu primenjene su i neke inovativne metode. Korišćen je tzv. elektronski nos (eng. electronic nose, E-nose) u analizi uzoraka vinove loze na prisustvo A. vitis (Blasioli i sar., 2010). Elektronski nos je instrument namenjen analizi različitih isparljivih organskih materija, u stanju je da ih detektuje i izvrši njihovu diskriminaciju pomoću specifičnih senzora. Primenjivan je u industriji hrane, kozmetici, farmaceutskoj industriji, ali i u ekološkim studijama. Pomoću ovog instrumenta bilo je moguće diferencirati zdrave od zaraženih reznica vinove loze, koje su veštački inokulisane tumorogenim sojevima A. vitis (Blasioli i sar., 2010). 2.3 Diverzitet Agrobacterium spp. Agrobacterium spp. su kosmopolitski rasprostranjeni biljni patogeni, koji mogu parazitirati veoma širok krug gajenih, šumskih i ukrasnih biljaka. Stoga je među fitopatogenim Agrobacterium spp. zabeležena visoka stopa diverziteta. 28 2.3.1 Struktura populacija fitopatogenih Agrobacterium spp. Uvid u strukturu populacija fitopatogenih Agrobacterium spp. od velikog je značaja za razumevanje epidemiologije samog oboljenja. Struktura populacije može zavisiti od više faktora, kao što su biljka domaćin i/ili geografsko poreklo. Lόpez i sar. (1988) su uočili korelaciju između biljke domaćina i identiteta izolovanih sojeva. Većina sojeva izolovanih iz zaraženih voćaka u Španiji pripadali su vrsti A. rhizogenes/biovar 2, a sojevi iz ruže i vrbe vrsti A. tumefaciens/biovar 1. U Italiji, većina proučavanih sojeva poreklom iz voćnih vrsta takođe je pripadala vrsti A. rhizogenes/biovar 2, dok su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 izolovani iz hrizanteme (Peluso i sar., 2003). U Poljskoj, među sojevima poreklom iz različitih voćaka, dominirala je vrsta A. rhizogenes/biovar 2 (Sobiczewski, 1996; Puławska i Kałużna, 2011). A. rhizogenes/biovar 2 je takođe bila jedina ili većinski rasprostranjena vrsta na breskvi u SAD (Alconero, 1980), različitim voćkama u Grčkoj i Mađarskoj (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Süle, 1978) i koštičavom voću u Kanadi (Dhanvantari, 1978). Sa druge strane, A. tumefaciens/biovar 1 je uglavnom izolovan iz zaraženih biljaka breskve, šljive i badema u Australiji i Novom Zelandu (Keane i sar., 1970), koštičavog voća u Tunisu (Rhouma i sar., 2006; Costechareyre i sar., 2010), a u SAD iz hikori oraha (Bouzar i sar., 1983) i oraha (Gonzalez i sar., 2008). Populacija Agrobacterium spp. poreklom iz zaraženih biljaka borovnice u Argentini, sastojala se pretežno iz sojeva A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2, a u nešto manjem broju bili su prisutni sojevi A. rubi (Alippi i sar., 2012). Bakteriozni rak vinove loze može prouzrokovati više različitih tumorogenih Agrobacterium spp., među kojima dominantno mesto zauzima A. vitis. U Grčkoj, Mađarskoj, SAD, Francuskoj i Španiji, pored A. vitis, detektovani su i A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2 (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Panagopoulos i sar., 1978; Burr i Katz, 1983; 1984; Süle, 1978; Thies i sar., 1991; Ridé i sar., 2000; Lόpez i sar., 2008; Palacio-Bielsa i sar., 2009). U Mađarskoj je iz vinove loze izolovana još i vrsta Rhizobium nepotum (Puławska i sar., 2012b). U Turskoj, Italiji i Japanu je, pored A. vitis, na vinovoj lozi utvrđena još samo A. tumefaciens/biovar 1 (Argun i sar., 2002; Bini i sar., 2008b; Kawaguchi i Inoue, 2009). 29 U literaturi su zabeleženi i primeri gde je iz istog tumora, lokaliteta ili supstrata izolovano više različitih vrsta roda Agrobacterium. Tako su A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2 zajedno izolovani iz zaraženih biljaka poreklom iz istog rasadnika, a u pojedinim slučajevima i iz istog tumora (Nesme i sar., 1987; Michel i sar., 1990). Do sličnih opažanja došli su Kuzmanović i sar. (2012a; 2012b; 2013) analizirajući zaražene biljke kajsije poreklom iz istog rasadnika iz kojih su izolovali kako A. tumefaciens/biovar 1, tako i A. rhizogenes/biovar 2. Bouzar i sar. (1993b) su proučavali populaciju Agrobacterium sp. u zemljištu koje nije obrađivano 5 godina. Od ukupnog broja proučavanih sojeva 56% je pripadalo vrsti A. tumefaciens/biovar 1, a 44% vrsti A. rhizogenes/biovar 2; 33% je bilo patogeno i svi su pripadali vrsti A. tumefaciens/biovar 1. 2.3.2 Organizacija genetičkog materijala Agrobacterium spp. Predstavnici roda Agrobacterium odlikuju se kompleksnom organizacijom genoma. A. tumefaciens/biovar 1 i A. rubi poseduju jedan cirkularni i jedan linearni hromozom, što je utvrđeno PFGE analizom genoma nekoliko sojeva ovih vrsta (Allardet-Servent i sar., 1993; Jumas-Bilak i sar., 1998; Urbanczyk i sar., 2003). A. rhizogenes/biovar 2 poseduje cirkularni hromozom i veliki cirkularni replikon, dok A. vitis poseduje dva cirkularna hromozoma (Jumas-Bilak i sar., 1998; Urbanczyk i sar., 2003; Slater i sar., 2009). Pored hromozoma, Agrobacterium sojevi mogu posedovati jedan ili više plazmida, a patogeni sojevi poseduju pTi ili pRi. Mnogi autori utvrdili su značajnu varijabilnost u pogledu broja i veličine plazmida unutar genoma Agrobacterium spp. (Sheikholeslam i sar., 1979; Albiach i Lόpez, 1992; Puławska i sar., 1998; Burr i sar., 1999; Raio i sar., 2004). Albiach i Lόpez (1992) su analizirali plazmidne profile 80 sojeva A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2 i A. vitis, poreklom iz 13 domaćina u Španiji. Broj plazmida je varirao 1-5, a njihova veličina 5-1000 MDa. U Poljskoj je utvrđena slična heterogenost plazmidnih profila, broj plazmida je iznosio 1-4, a veličina 27-315 kbp (Puławska i sar., 1998). U obe studije, u Španiji i Poljskoj, nije uočena korelacija između plazmidnog profila i osetljivosti na agrocin 84 (bakteriocin proizveden od strane soja K84), biovara/vrste, domaćina i geografskog porekla. U slučaju sojeva poreklom iz Poljske, 30 takođe nije uočena korelacija između stepena virulentnosti i plazmidnog profila. Burr i sar. (1999) su analizirali nepatogene A. vitis sojeve poreklom iz divlje loze i ustanovili da broj plazmida u njihovom genomu može iznositi 0-3. Raio i sar. (2004) su proučavali populaciju tumorogenih Agrobacterium sp. poreklom iz fikusa i utvrdili heterogenost u pogledu plazmidnih profila, gde je broj plazmida varirao 1-5. Takođe, nije utvrđena veza između plazmidnog profila i geografskog porekla, virulentnosti, biovara ili RFLP otisaka 16S rRNK gena. Velázquez i sar. (2005) su otkrili postojanje A. rhizogenes/biovar 2 sojeva koji su pored pTi ili pRi posedovali i simbiotski plazmid (pSym), karakterističan za kvržične bakterije. Proučavajući ovaj fenomen, autori su pokazali da ovi sojevi mogu da izazovu razvoj tumora, odnosno kosmatost korena, ali i nodulaciju biljaka pasulja u prirodnim uslovima. Do sada je sekvenciran i mapiran čitav genom po jednog soja A. tumefaciens/biovar 1 (C58), A. rhizogenes/biovar 2 (K84) i A. vitis (S4) (Goodner i sar., 2001; Wood i sar., 2001; Slater i sar., 2009). Takođe, nedavno je sekvenciran i genom jednog soja A. tumefaciens/biovar 1 (F2), tri soja Agrobacterium sp. (H13-3, ATCC 31749, UHFBA-218) (Li i sar., 2011; Ruffing i sar., 2011; Wibberg i sar., 2011; Dua i sar., 2013), kao i nepriznate vrste Agrobacterium albertimagni (Trimble i sar., 2012). Ove studije doprinele su boljem razumevanju organizacije genoma Agrobacterium vrsta, njihovom poreklu i evoluciji. Imajući u vidu kompleksnost genetičke organizacije Agrobacterium vrsta, kod patogenih predstavnika ovog roda, analiza genetičkog diverziteta izvođena je kako na nivou hromozomske, tako i na nivou plazmidne DNK. A. vitis je jedina vrsta roda Agrobacterium koja je sistematski proučavana iz aspekta T-DNK, Ti-plazmida i hromozomske DNK (Burr i sar., 1998). 2.3.3 pTi/pRi Patogenost Agrobacterium spp. određena je prisustvom pTi ili pRi u genomu bakterije. Geni koji kontrolišu procese vezane za patogenezu takođe se nalaze i na hromozomima (Matthysse, 2006). pTi i pRi se sastoji iz više integrisanih komponenti: T-DNK, vir regiona, gena koji kontrolišu katabolizam opina, konjugaciju plazmida i 31 “quorum sensing” mehanizam, sekvence porekla replikacije i regiona inkompatibilnosti (Matthysse, 2006; Otten i sar., 1992; Slika 2). pTi i pRi poseduju mozaičnu strukturu, što ukazuje na njihovu evoluciju putem horizontalnog transfera gena (Otten i sar., 1992). Do sada je sekvencirana DNK nekoliko pTi i pRi poreklom iz Agrobacterium sp.: pTiC58 (Goodner i sar., 2001; Wood i sar., 2001), pTi15955 (GeneBank Acc. No. AF242881), pTi-SAKURA (Suzuki i sar., 2000) i pRi1724 (Moriguchi i sar., 2001). Slika 2. Šematski prikaz glavnih komponenti pTi 2.3.3.1 Opin tip U tumorima koji se razvijaju nakon infekcije Agrobacterium spp., aktivnošću gena koji se nalaze na T-DNK, dolazi do stvaranja posebne grupe jedinjenja koji se nazivaju opini. Opini su derivati L-amino kiselina i prostih karbonilnih jedinjenja primarnog metabolizma, i do sada je opisano više od 20 različitih tipova ovih molekula (Chilton i sar., 2001; Dessaux i sar., 1998). Opini predstavljaju izvor hranljivih materija za Agrobacterium spp. i stimulativno deluju na konjugaciju pTi ili pRi (Kerr i sar., 1977; Ellis i sar., 1982; Dessaux i sar., 1998; Otten i sar., 2008), mogu služiti kao atraktanti (Kim i Farrand, 1998), ali mogu delovati i inhibitorno prema pojedinim Agrobacterium sojevima (Kim i sar., 2001). Geni za katabolizam opina nalaze se takođe na plazmidu, izvan T-DNK (Montoya i sar., 1977; Slika 2). Agrobacterium spp. mogu koristiti više od jednog tipa opina, među kojima i one koje ne sintetišu sami (Moore i 32 sar., 1997; Ridé i sar., 2000). Međutim, kao izvor hranljivih materija, opine mogu koristiti i određene bakterije iz drugih rodova, kao i pojedine gljive (Tremblay i sar., 1987; Beauchamp i sar., 1990; 1991). Sojevi Agrobacterium sp., odnosno njihovi pTi ili pRi se tradicionalno nazivaju i klasifikuju prema opinima koji se stvaraju u tumoru (Dessaux i sar., 1998; Matthysse, 2006; Otten i sar., 2008). Shodno tome, sojevi A. vitis su podeljeni u tri glavne grupe: oktopin/kukumopin (O/C), nopalin (N) i vitopin (V) tip (Szegedi i sar., 1988; Paulus i sar. 1989a). Međutim, ovakav način klasifikacije nije sasvim zadovoljavajući, prvenstveno jer pojedini pTi i pRi indukuju tumore koji ne sadrže nijedan poznat tip opina (Dessaux i sar., 1998; Otten i sar., 2008). Sa druge strane, jedan plazmid može indukovati stvaranje više tipova opina, pri čemu može postojati više različitih kombinacija, što komplikuje ovaj vid klasifikacije. Budući da geni za sintezu i korišćenje opina zauzimaju relativno mali deo Ti-plazmida, moguće je da kod dva plazmida ovi geni budu slični ili identični, a da ostatak njihove plazmidne DNK bude suštinski različit. Ovo pre svega može biti posledica mozaične strukture plazmida nastale horizontalnim transferom gena (Otten i sar., 1992; Dessaux i sar., 1998). Stoga, opin tip ima samo ograničen značaj u klasifikaciji pTi i pRi (Otten i sar., 2008). Smatra se da unutar populacije A. vitis dominiraju sojevi O/C tipa (60%), zatim slede sojevi N tipa (30%), dok su sojevi V tipa malobrojniji (10%) (Burr i sar., 1998). Slični rezultati dobijeni su kada je proučavana populacija A. vitis u Mađarskoj (Szegedi, 2003) i Francuskoj (Ridé i sar., 2000). U Bugarskoj su takođe preovladavali sojevi sa O/C tipom pTi, u manjoj meri su bili prisutni oni sa V tipom pTi, dok N tip nije detektovan (Genov i sar., 2006a). Sa druge strane, 38% analiziranih A. vitis sojeva, koji su izolovani u Italiji, pripadalo je O/C grupi, 56% V grupi, dok N grupa nije utvrđena (Bini i sar., 2008b). Među proučavanim A. vitis sojevima poreklom iz Irana takođe preovladavaju oni sa V tipom pTi (Rouhrazi i Rahimian, 2012a). 2.3.3.2 T-DNK T-DNK je fragment Ti plazmida koji se tokom patogeneze prenosi i ugrađuje u biljni genom i odgovoran je za razvoj tumora. Na ovom fragmentu nalaze se geni koji kontrolišu proizvodnju biljnih hormona rasta, utiču na izmenu odgovora biljke na uticaj 33 ovih hormona, kao i geni za sintezu i izlučivanje opina (Matthysse, 2006). Geni koji imaju direktnu ili indirektnu ulogu u tumorogenezi nazivaju se još i onkogeni: gen 5, iaaM, iaaH, ipt, gen 6a i gen 6b (Britton i sar., 2008; Slika 3). Geni iaaM (tms1) i iaaH (tms2) čine tms (“tumor morphology shooty”) lokus, ipt gen čini tmr (“tumor morphology rooty”) lokus, a geni 6a i 6b čine tml (“tumor morphology large”) lokus (Slika 3). Geni iaaM i iaaH utiču na pojačanu sintezu auksina, a ipt na pojačanu sintezu citokinina. Smatra se da gen 5 i gen 6b regulišu odgovor biljke na dejstvo fitohormona, mada njihov mehanizam delovanja još uvek nije potpuno razjašnjen (Matthysse, 2006; Britton i sar., 2008). Gen 5 ima uticaja na morfologiju tumora, a gen 6b utiče na rast i veličinu tumora. Gen 6a nema direktan uticaj na proces tumorogeneze (Britton i sar., 2008). Slika 3. Šematski prikaz građe T-DNK T-DNK može imati različitu strukturu, što je detaljnije proučeno na primeru vrste A. vitis i njenih pTi (Paulus i sar., 1989a; Burr i sar., 1998). Utvrđena su tri osnovna tipa T-DNK kod ove vrste, a koji odgovaraju opin tipovima pTi. T-DNK tipovi se razlikuju u broju T-DNK komponenti, kao i rasporedu i sastavu onkogena (Paulus i sar., 1989a; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). O/C tip T-DNK se sastoji iz dve nezavisne T-DNK komponente: TA-DNK i TB-DNK, nopalin tip T-DNK sadrži pojedinačnu T-DNK komponentu, dok se vitopin tip T-DNK sastoji iz tri nezavisne T- DNK komponente: T1, T2 i T3. O/C tip T-DNK se može podeliti na dve podgrupe: jednu sa kompletnim TA-DNK (OL) i drugu sa skraćenim TA-DNK regionom (OS) (Paulus i sar., 1989a). Utvrđen je i još jedan tip T-DNK kod soja CG474, koji je srodan strukturi TA-DNK O/C tipa, ali jasno različit (Otten i sar., 1996; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). Kod OL grupe, region TA-DNK se sastoji iz onkogena 5, TA-iaaM, TA- iaaH, ipt, 6b, i gena acs (sinteza agrocinopina) i ocs (sinteza oktopina), dok se TB-DNK sastoji iz TB-iaaM, TB-iaaH, i gena cus (sinteza kukumopina) i acs (Paulus i sar., 1989a; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). U slučaju OS grupe, na TA-DNK nisu prisutni TA-iaaM, TA-iaaH i ipt. Ipak, sojevi predstavnici OS grupe i dalje su u stanju 34 da izazovu tumore, ali kroz aktivnost gena 6b, TB-iaaM i TB-iaaH. Nopalin tip T-DNK sastoji se iz onkogena 5, iaaM, iaaH, 6b i 3’, kao i gena za sintezu opina nos (sinteza nopalina) i acs (Burr i sar., 1998). T-DNK soja CG474 se odlikuje postojanjem insercionih elemenata unutar iaaM gena, koji je stoga inaktiviran, a insercioni element se nalazi i između 6b i ocs gena (Burr i Otten, 1999). I pored ovoga, soj CG474 može izazvati stvaranje tumora na vinovoj lozi. Kod vitopin tipa T-DNK, T1 se sastoji iz gena 6b i vis (sinteza vitopina), T2 iz iaaH i iaaM, a T3 iz ipt i mutiranog, neaktivnog vis gena (Canaday i sar., 1992). 2.3.3.3 Vir region Prenos i ugradnja T-DNK u biljni genom je proces koji je prvenstveno kontrolisan aktivnošću vir gena (Matthysse, 2006). Geni virA i virG predstavljaju dvokomponentni sistem, koji reaguje na fenolno jedinjenje acetosiringon, koje se oslobađa iz povređenog biljnog tkiva, a zatim reguliše i aktivira ekspresiju ostalih vir gena (Gelvin, 2003; Matthysse, 2006; McCullen i Binns, 2006). Geni virD, virC i virE kontrolišu prenos T-DNK i njegovu zaštitu od degradacije u biljnoj ćeliji. Na pojedinim Ti plazmidima prisutni su i još neki geni u vir regionu kao što su virF, virH, virJ i tzs (Matthysse, 2006). Postoje dokazi da virA, virC, virE, virF i tzs geni određuju spektar domaćina Agrobacterium sp. (Matthysse, 2006). U literaturi postoji malo podataka o vir regionu kod različitih grupa A. vitis sojeva. Čini se da je vir region O/C sojeva sličan onim opisanim kod A. tumefaciens sojeva, dok vitopin sojevi poseduju različitu strukturu vir regiona (Canaday i sar., 1992; Burr i sar., 1998). 2.3.4 Genetički diverzitet Agrobacterium spp. Prvobitne studije koje su se bavile proučavanjima genetičkog diverziteta Agrobacterium spp. bazirale su se na metodi hibridizacije, korišćenjem različitih DNK proba (Paulus i sar., 1989a; Michel i sar., 1990; Nesme i sar., 1992; Bouzar i sar., 1993b; Schulz i sar., 1993a, Otten i sar., 1996). Iako se ova metoda pokazala korisnom u karakterizaciji pTi i hromozomske DNK, ovaj pristup je nepogodan za analizu većeg broja sojeva u populacionim studijama (Ponsonnet i Nesme, 1994). Schulz i sar. (1993a) 35 su, pored metode hibridizacije, u proučavanju genetičkog diverziteta Agrobacterium sojeva koristili i PFGE metodu. Kasnije studije zasnivale su se na RFLP analizi DNK fragmenata pTi i hromozomske DNK, koji su prethodno amplifikovani PCR metodom (PCR-RFLP; Ponsonnet i Nesme, 1994; Otten i sar., 1996; Momol i sar., 1998; Pionnat sar., 1999; Burr i sar., 1999; Argun i sar., 2002; Peluso i sar., 2003; Vogel i sar., 2003; Raio i sar., 2004; Genov i sar., 2006b; Krimi i sar., 2006; Alippi i sar., 2012). Predmet RFLP analize bila je i kompletna DNK ekstrahovana iz sojeva A. vitis (Gillings i Ophel-Keller, 1995; Otten i sar., 1996). Tokom RFLP analize, DNK fragment biva isečen u kraće delove aktivnošću restrikcionog enzima (restrikcione endonukleaze), a dobijeni restrikcioni fragmenti se razdvajaju prema veličini elektroforezom u gelu. Restrikcioni enzimi prepoznaju specifične sekvence nukleotida (4-6 nukleotida određenog redosleda), koje se nazivaju sekvence prepoznavanja ili restrikciona mesta, u okviru kojih seku lanac DNK. PCR-RFLP je primenljiv u slučaju bilo kog umnoženog fragmenta DNK, a postoje i određene specijalizovane forme ove metode, kao što je metoda restrikcione analize umnožene ribozomalne DNK (eng. amplified ribosomal DNA restriction analysis, ARDRA; Vaneechoutte i sar., 1992). Ribozomalna DNK (rDNK) sastoji se iz 16S, 23S i 5S gena, organizovanih u rrn operon. Između ovih gena nalaze se ITS regioni, unutar kojih se mogu nalaziti geni koji kodiraju sintezu transportne RNK (tRNK). Operoni gena ribozomalnih proteina (rrn) mogu biti prisutni u više kopija u genomu bakterije. Npr. A. tumefaciens/biovar 1 (C58) i A. vitis (S4) poseduju četiri, a A. rhizogenes/biovar 2 (K84) tri rrn operona u svom genomu (Goodner i sar., 2001; Wood i sar., 2001; Slater i sar., 2009). PCR-RFLP analiza 16S rRNK gena pokazala se korisnom u identifikaciji i diferencijaciji Agrobacterium spp. do nivoa vrste (Ponsonnet i Nesme, 1994; Oger i sar., 1998). Međutim, usled nedovoljnog polimorfizma ovog gena, razdvajanje srodnih sojeva unutar pojedinih Agrobacterium vrsta nije moguće (Ponsonnet i Nesme, 1994). Sa druge strane, ITS region između 16S i 23S rRNK gena značajno je varijabilan u pogledu veličine i nukleotidne sekvence kod mnogih bakterija (Gürtler i Stanisich, 1996). Agrobacterium spp. nisu izuzetak, te je u cilju grupisanja sojeva primenjivana PCR-RFLP analiza 16S-23S ITS regiona (Ponsonnet i Nesme, 1994; Otten i sar., 1996; 36 Burr i sar., 1999; Argun i sar., 2002; Peluso i sar., 2003; Raio i sar., 2004; Genov i sar., 2006b). Pored razlika u veličini i sekvenci ITS regiona između različitih sojeva iste vrste, utvrđeno je i postojanje polimorfizma među rrn operonima unutar genoma pojedinačnih sojeva, pripadnika roda Agrobacterium (Bautista-Zapanta i sar., 2009). Genetički diverzitet Agrobacterium spp. proučavan je i primenom metoda kojima se vrši analiza kompletnog genoma kao što je RAPD (Irelan i Meredith, 1996; Momol i sar., 1998; Llop i sar., 2003; Puławska i Kałużna, 2011). Uopšteno, RAPD je tip PCR metode gde se fragmenti DNK umnožavaju nasumično (Welsh i McClelland, 1990; Williams i sar., 1990). U ovu svrhu koriste se kratki oligonukleotidni prajmeri, najčešće dužine 10 bp, čija je sekvenca proizvoljna. Ovakvi prajmeri se koriste u parovima ili pojedinačno, pod ne tako strogim uslovima reakcije, što se pre svega odnosi na temperaturu vezivanja prajmera koja iznosi 35-40°C. Tokom reakcije, prajmeri se vezuju za delove DNK koji su delimično ili potpuno komplementarni sekvenci prajmera. Na ovaj način dolazi do amplifikovanja više PCR produkata varijabilne veličine (~200-2000 bp) i dobijanja karakterističnih genetičkih profila. U proučavanju genetičkog diverziteta Agrobacterium sojeva korišćena je i rep- PCR metoda (Rhouma i sar., 2006; Kawaguchi i sar., 2008; Gonzales i sar., 2008; Alippi i sar., 2012). Rep-PCR razvijen je na osnovu specifičnih konzerviranih repetitivnih sekvenci REP (eng. repetitive extragenic palindromic), ERIC (eng. enterobacterial repetitive intergenic consensus) i BOX, koje su raspoređene unutar genoma različitih vrsta bakterija (Versalovic i sar., 1991; 1994). U ovu svrhu najčešće se koristi tri tipa prajmera koji odgovaraju REP, ERIC i BOX sekvencama, dok se pojedinačni protokoli nazivaju REP-PCR, ERIC-PCR i BOX-PCR, ili zbirno rep-PCR (Versalovic i sar., 1991; 1994). Prajmeri su dizajnirani da umnože DNK koja se graniči sa dva susedna repetitivna elementa, mada nije isključeno ni vezivanje prajmera za druge homologe sekvence (Louws i sar., 1999). Broj različitih fragmenata koji se umnože tokom reakcije varira (10-30 ili više), čime se dobija karakterističan genetički otisak. U analizi genetičkog diverziteta Agrobacterium spp. korišćena je i PCR metoda sa prajmerima komplementarnim pojedinim insercionim sekvencama (Rouhrazi i Rahimian, 2012b). Metode novijeg datuma, koje podrazumevaju sekvencionu analizu pojedinih gena ili regiona, kako na plazmidnom, tako i na hromozomskom delu genoma, takođe 37 su korišćene u proučavanju genetičkog diverziteta Agrobacterium spp. (Rhouma i sar., 2006; Kawaguchi i sar., 2008; Bautista-Zapanta i sar., 2009; Palacio-Bielsa i sar., 2009; Kawaguchi i Inoue, 2009; Costechareyre i sar., 2010; Aujoulat i sar., 2011; Puławska i Kałużna, 2011; Alippi i sar., 2012; Shams i sar., 2013). Postupkom sekvenciranja određuje se redosled baznih parova kod analiziranih fragmenata. Na ovaj način, mogu se vrlo precizno utvrditi razlike među njima, odnosno razlike između proučavanih sojeva. Najčešće primenjivan metod sekvenciranja DNK je tzv. Sangerov metod, koji je razvijen sedamdesetih godina prošlog veka, i koji se i dalje koristi kao standardni metod (Sanger i sar., 1977). Međutim, poslednjih godina ova metoda sve više biva zamenjena savremenijim vidovima sekvenciranja, a koje svoju primenu pronalaze i u oblasti biljne patologije (Studholme i sar., 2011). Poslednjih godina, u proučavanju genetičkog diverziteta Agrobacterium spp. korišćeni su konstitutivni geni (Kawaguchi i sar., 2008; Costechareyre i sar., 2010; Aujoulat i sar., 2011; Puławska i Kałużna, 2011; Shams i sar., 2013). Konstitutivni ili “housekeeping” geni od vitalnog su značaja za funkcionisanje ćelije, te su prisutni u genomu svih sojeva jedne vrste. Ovi geni evoluiraju veoma sporo, što ih čini pogodnim za karakterizaciju patogena u studijama koje se bave globalnom epidemiologijom (Maiden i sar., 1998; Enright i Spratt, 1999). Metoda kojom se vrši karakterizacija bakterija korišćenjem DNK sekvenci 7 konstitutivnih gena naziva se tipizacija na osnovu multilokusnih sekvenci (eng. multilocus sequence typing, MLST; Maiden i sar., 1998; Enright i Spratt, 1999). Na ovaj način analiziraju se unutrašnji fragmenti konstitutivnih gena dužine 450-500 bp. MLST metoda je prvenstveno razvijena za proučavanje epidemiologije različitih oboljenja povezanih sa sojevima koji pripadaju jednoj poznatoj vrsti. Sličan princip primenjen je takođe u taksonomskim studijama, gde je definisana posebna metoda, već pomenuta, analiza multilokusnih sekvenci (MLSA). U slučaju MLSA metode, predmet istraživanja su DNK sekvence bakterija koje pripadaju različitim taksonomskim kategorijama, uključujući i čitave rodove (Gevers i sar., 2005). 38 2.3.4.1 Sojevi poreklom iz vinove loze Proučavajući genetički diverzitet sojeva A. vitis, Paulus i sar. (1989a) su izvršili njihovu klasifikaciju na O/C, N i V tip, o čemu je bilo više reči u prethodnim poglavljima. Schulz i sar. (1993a) su PFGE metodom analizirali različite Agrobacterium sojeve, gde je utvrđena neznatna različitost među proučavanim sojevima A. vitis koji su pripadali jednoj genetičkoj grupi. Sa druge strane, Irelan i Meredith (1996) su koristili RAPD metodu u analizi Agrobacterium sojeva, a najveći stepen genetičke raznolikosti ispoljili su upravo A. vitis sojevi. Gillings i Ophel-Keller (1995) su proučavali genetički diverzitet populacije A. vitis poreklom iz Australije i poredili je sa sojevima izolovanim u SAD. Korišćenjem restrikcione analize kompletnog genoma ustanovili su genetičku heterogenost među sojevima iz Australije. Neki od proučavanih sojeva posedovali su identične genetičke profile kao i pojedini sojevi iz SAD, što je ukazivalo da je patogen otuda introdukovan u Australiju. Restrikcionom analizom kompletnog genoma i 16S-23S rRNK ITS regiona, kao i hibridizacijom sa različitim pTi probama, Otten i sar. (1996) su definisali više hromozomskih i pTi grupa među sojevaima A. vitis. Svakoj hromozomskoj grupi određenoj na osnovu analize 16S-23S rRNK ITS regiona odgovarao je određeni tip pTi (O/C, N ili V), ali je utvrđeno i postojanje nekoliko izuzetaka. Na ovo istraživanje nadovezali su se Momol i sar. (1998), koji su analizirali istu kolekciju sojeva primenom RAPD metode i RFLP analize 5´-kraja 23S rRNK gena, pri čemu su dobili saglasne rezultate. Korelaciju između RFLP profila 16S-23S rRNK ITS regiona i opin tipa pTi uočili su i Genov i sar. (2006b), analizirajući populaciju A. vitis u Bugarskoj. Proučavajući nepatogene sojeve A. vitis iz divlje loze, Burr i sar. (1999) su na osnovu RFLP analize 16S-23S rRNK ITS regiona utvrdili postojanje 15 različitih genotipova koji nisu posedovali sličnost sa prethodno definisanim 16S-23S rRNK ITS profilima kod vrste A. vitis (Otten i sar., 1996). Palacio-Bielsa i sar. (2009) su proučavali populaciju sojeva A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2 i A. vitis poreklom iz vinove loze u Španiji. Među sojevima A. vitis ustanovljeno je tri grupe na osnovu sekvencione analize 16S rRNK gena i tri tipa pTi na osnovu PCR analize i testa korišćenja opina. Svakoj od 16S rRNK grupa odgovarala je određena pTi grupa, što je takođe ukazivalo na povezanost hromozomske i plazmidne DNK kod vrste A. vitis. 39 Genetički diverzitet populacija Agrobacterium sp. poreklom iz vinove loze proučavana je i u Japanu. Primenom rep-PCR metode (ERIC i BOX prajmeri) i sekvencione analize konstitutivnih gena (pyrG, recA i rpoD) izdvojeno je pet grupa među sojevima A. vitis (Kawaguchi i sar., 2008). Kawaguchi i Inoue (2009) su proučavali sojeve A. tumefaciens/biovar 1 poreklom iz vinove loze u Japanu. U ovoj studiji su analizirane sekvence virC gena gde je uključeno i više sojeva A. vitis i neki sojevi poreklom iz drugih domaćina. Na ovaj način utvrđeno je nekoliko genetičkih grupa, jedna sastavljena isključivo od A. vitis sojeva, i druga gde su zajedno bili prisutni A. tumefaciens/biovar 1 i A. vitis sojevi poreklom iz vinove loze, dok su ostale grupe bile sastavljene od Agrobacterium spp. poreklom iz drugih domaćina. Bautista-Zapanta i sar. (2009) su utvrdili razlike u veličini i sekvenci 16S-23S rRNK ITS regiona, među proučavanim A. vitis sojevima. Kod dva proučavana soja utvrđen je i polimorfizam među rrn operonima unutar njihovog genoma. U proučavanju genetičkog diverziteta sojeva A. vitis poreklom iz vinove loze u Iranu primenjena je PCR metoda korišćenjem insercionog elementa IS50 kao genetičkog markera, čime je izdvojeno četiri genetičke grupe (Rouhrazi i Rahimian, 2012b). 2.3.4.2 Sojevi poreklom iz voćaka, ukrasnih i šumskih vrsta Michel i sar. (1990) utvrdili su različitost među sojevima A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2 koje su izolovali iz jednog šumskog rasadnika, a koja se odnosila na pTi regione: T-DNK i poreklo replikacije. Nesme i sar. (1992) su iz pojedinačnih tumora poreklom sa biljaka jasike (Populus tremula) iz jednog rasadnika, izolovali Agrobacterium sojeve sa više različitih hromozomskih i pTi genotipova. U istom istraživanju utvrđena je stabilnost pTi genotipova unutar određene grupe sojeva sa identičnim hromozomskim genotipom. Ponsonnet i Nesme (1994) vršili su RFLP analizu kako hromozomskog (16S rRNK gen, 16S-23S rRNK ITS region), tako i plazmidnog (tmr, nos, virA i virB2 geni) dela genoma većeg broja Agrobacterium sp. sojeva, pri čemu nije uočena korelacija između hromozomskih i plazmidnih genetičkih otisaka. Genetički diverzitet Agrobacterium spp. poreklom iz biljaka ruže, proučen je korišćenjem RFLP analize 16S rRNK i plazmidnih vir i tms gena (Pionnat i sar., 1999). U ovoj studiji, takođe nije uočena korelacija između karakteristika hromozomske i 40 plazmidne DNK. RFLP analizom 16S rRNK gena i 16S-23S rRNK ITS regiona ustanovljen je izrazit genetički diverzitet među sojevima A. tumefaciens/biovar 1, a genetička homogenost među A. rhizogenes/biovar 2 poreklom iz različitih biljnih vrsta u Italiji (Peluso i sar., 2003). Međutim grupa sojeva A. rhizogenes/biovar 2 poreklom iz Sardinije bila je dosta varijabilna, i razlikovala se od ostalih sojeva iste vrste poreklom iz drugih regiona u Italiji. Raio i sar. (2004) proučavali su populaciju tumorogenih Agrobacterium sp. poreklom iz fikusa i takođe primenili RFLP tehniku u analizi 16S rRNK gena i 16S-23S rRNK ITS regiona, s tim što su analizirani i plazmidni geni (vir i tms geni). Utvrđena je izrazita varijabilnost među sojevima, dok korelacija između hromozomske i plazmidne DNK nije uočena. U sličnoj studiji, gde su kao predmet proučavanja bili sojevi A. tumefaciens/biovar 1 izolovani iz biljaka eukaliptusa u Alžiru, takođe nije uočena korelacija između hromozomske DNK i plazmidnih profila (Krimi i sar., 2006). Značajan genetički diverzitet uočen je i među sojevima A. tumefaciens/biovar 1 poreklom iz različitih biljnih vrsta u Tunisu, primenom rep-PCR metode (BOX-PCR) i sekvencionom analizom recA konstitutivnog gena (Rhouma i sar., 2006; Costechareyre i sar., 2010). Rep-PCR metoda korišćenjem BOX prajmera primenjena je u proučavanjima genetičkog diverziteta sojeva iste vrste poreklom iz oraha u SAD, i na ovaj način izdvojeno je nekoliko genotipova koji su se podudarali sa geografskim poreklom sojeva (Gonzales i sar., 2008). U Poljskoj je proučavan genetički diverzitet većeg broja sojeva Agrobacterium sp. poreklom iz različitih voćaka, korišćenjem RAPD metode i sekvencionom analizom 16S rRNK i gyrB gena (Puławska i Kałużna, 2011). Ustanovljen je značajan genetički diverzitet među sojevima A. tumefaciens/biovar 1, grupa sojeva A. rhizogenes/biovar 2 bila je homogenija, pri čemu nije bilo korelacije između genetičkih grupa i geografskog porekla sojeva. U studiji gde je proučavana populacija Agrobacterium sp. poreklom iz borovnice u Argentini, utvrđeno je više genetičkih grupa primenom RFLP analize 16S rRNK gena i rep-PCR metode korišćenjem ERIC prajmera (Alippi i sar., 2012). 2.3.4.3 Sojevi poreklom iz zemljišnih ekosistema Bouzar i sar. (1993b) analizirali su populaciju Agrobacterium sp. u zemljištu koje nije obrađivano 5 godina. Iz uzoraka zemljišta izolovali su sojeve koji su pripadali 41 vrsti A. tumefaciens/biovar 1 i A. rhizogenes/biovar 2. Sojevi A. rhizogenes/biovar 2 činili su homogenu grupu na osnovu analize hromozomske DNK i bili su nepatogeni, dok su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 bili sastavljeni iz pet različitih grupa, od kojih je jedna posedovala nopalin tip pTi, druga oktopin tip pTi, a ostale su bile nepatogene. Vogel i sar. (2003) su ustanovili veoma značajnu genetičku različitost među sojevima A. tumefaciens/biovar 1 koje su izolovali iz 1cm3 zemljišta. Unutar 55 sojeva utvrđeno je ukupno 42 različita genetička profila na osnovu RFLP analize 16S-23S rRNK ITS regiona. Shams i sar. (2013) razvili su metodu koja se zasnivala na sekvencionoj analizi recA gena i kojom se može proučavati genetički diverzitet Agrobacterium sp. kroz direktnu analizu uzoraka zemljišta. Analizom DNK ekstrahovane iz zemljišta poreklom iz rizosfere divljih Poaceae vrsta, utvrđeno je prisustvo dva genomovara A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa, kao i drugih Agrobacterium sp. 2.4 Proučavanje Agrobacterium spp. u Srbiji Istraživanja na temu bakterioznog raka izvođena su u našoj zemlji još pedesetih godina prošlog veka. Bolest je tada bila zastupljena, u manjem ili većem stepenu, u skoro svim rasadnicima voćaka u Srbiji (Bošković, 1955). Zbog toga su sprovedena istraživanja u cilju procene pojedinih mera suzbijanja i pronalaska najefikasnijeg načina zaštite voćaka od ove bolesti. Međutim, nijedna proučavana mera nije dala zadovoljavajuće rezultate (Bošković, 1955). Proučavanje problematike bakterioznog raka, prvenstveno na vinovoj lozi, bilo je posebno intenzivno tokom sedamdesetih godina. U tom periodu bolest je ugrozila gajenje vinove loze u pojedinim delovima Srbije, te je došlo do krčenja mnogih vinograda, pretežno u zapadno-moravskom i subotičko-horgoškom vinogradarskom rejonu (Panić, 1973; Arsenijević i sar., 1974; 1997). Bakteriozni rak vinove loze prvi put je uočen u Srbiji 1962. godine, na području trsteničkog vinogorja, na sorti Kardinal uveženoj iz Italije (Panić, 1973; 1977). Bolest je bila prisutna u zapadno-moravskom rejonu, ali i u nišavsko-južnomoravskom, timočkom, subotičko-horgoškom, banatskom i kosovsko-metohijskom (Panić, 1973; Arsenijević i sar., 1974; Panić, 1977; Arsenijević, 1997). U Hrvatskoj, bolest je uočena u Dalmaciji, a utvrđena je i u 42 Makedoniji (Arsenijević, 1997; Butrov, 1987; Kišpatić, 1987). Prema tadašnjim zapažanjima, bakteriozni rak najčešće je bio prisutan na sortama Afusali, Kardinal, Kraljica Vinograda, Muskat Hamburg, Beli Burgundac, Merlo i Italijanski Rizling, dok su Game Crni i Crni Burgundac navedene kao nešto otpornije (Panić 1973; 1977). Iz obolelih biljaka vinove loze sa područja Horgoša izolovani su sojevi bakterija i proučene su njihove morfološke, odgajivačke, biohemijske i patogene odlike (Arsenijević i sar., 1974). Utvrđeno je da izolovani sojevi pripadaju vrsti A. tumefaciens. Tada sojevi sa vinove loze još uvek nisu bili izdvojeni kao poseban biovar, odnosno vrsta. Takođe, proučavane su metode dijagnoze bakterioznog raka na loznim kalemovima (Panić, 1976). Preliminarna dijagnoza donošena je na osnovu karakterističnih simptoma, a u cilju dokazivanja prisustva patogena u loznim kalemovima, izvršena je inokulacija test biljaka sojevima koji su izolovani iz obolelog tkiva. Problematika bakterioznog raka nije proučavana samo na vinovoj lozi kao domaćinu. Proučavane su metode dijagnoze bakterioznog raka voćaka primenom različitih zeljastih biljaka (Panić, 1974). Takođe, proučavane su osobine sojeva A. tumefaciens poreklom iz jabuke (Panić i Dinić, 1976). Nešto kasnije, A. tumefaciens je utvrđen i kao prouzrokovač bakterioznog raka pitome kupine (Arsenijević, 1989) i maline (Milijašević i sar., 2007). Posebno su proučavane mere kontrole bakterioznog raka i primena različitih mera suzbijanja patogena. Istražena je mogućnost suzbijanja bakterioznog raka jabuke i vinove loze primenom pesticida (Panić, 1981), a primenjene su i alternativne mere suzbijanja patogena, korišćenjem antibiotika ili antagonističkih sojeva gljiva i bakterija (Jovanović, 1990; 1993a; 1993b). 43 3. RADNA HIPOTEZA Bakteriozni rak je široko rasprostranjeno i veoma ozbiljno oboljenje vinove loze, a prouzrokuje ga fitopatogena bakterija A. vitis ili u ređim slučajevima srodne vrste iz roda Agrobacterium. Ovo oboljenje je u Srbiji utvrđeno pre više od 50 godina i do sada je bilo sporadično prisutno, ne izazivajući značajnije štete. Međutim, poslednjih nekoliko godina zabeležena je učestala pojava bakterioznog raka na teritoriji naše zemlje. Osnovna pretpostavka je da bakteriozni rak vinove loze u našoj zemlji prouzrokuju fitopatogene vrste roda Agrobacterium. U cilju izolacije, identifikacije i karakterizacije prouzrokovača ovog oboljenja, primeniće se raspoložive metode koje su do sada opisane u literaturi, a po potrebi će se izvršiti njihova modifikacija i optimizacija. Biće korišćene, kako klasične bakteriološke, tako i molekularne metode. Predmet molekularne identifikacije biće i raznovrsni referentni sojevi, čime će se izvršiti procena pouzdanosti ovih metoda. Jedna od hipoteza u okviru ovog istraživanja jeste da postoje izvesne razlike među sojevima rasprostranjenim u Srbiji, pre svega u njihovom genotipu. Kako bi se proučile ove razlike pristupiće se detaljnoj karakterizaciji i analizi hromozomskog i plazmidnog dela njihovog genoma. Sojevi iz Srbije biće poređeni sa referentnim sojevima različitog geografskog porekla, koji će takođe biti obuhvaćeni istraživanjem. Rezultatima istraživanja u okviru ove doktorske disertacije upotpuniće se znanje o bakterioznom raku vinove loze u našoj zemlji, što predstavlja preduslov za efikasnu kontrolu oboljenja. Prvenstveno, dobiće se odgovor o tome koje su vrste roda Agrobacterium zapravo prisutne na vinovoj lozi u Srbiji. Takođe, procenom postojećih metoda za detekciju i identifikaciju patogena, izvršiće se odabir najpogodnijih, a sve u cilju standardizacije procedure. Analizom genetičkog diverziteta doprineće se boljem razumevanju taksonomije i filogenetskih odnosa među proučavanim sojevima. Pored toga, steći će se uvid u strukturu populacije patogena i odgovoriće se na pojedina pitanja u vezi sa epidemiologijom oboljenja. 44 4. MATERIJAL I METODE 4.1 Obilazak terena i uzorkovanje biljnog materijala Tokom obilaska terena u periodu 2010-2011. godine, pregledani su vinogradi raspoređeni u svim vinogradarskim rejonima na teritoriji naše zemlje, izuzev kosovsko- metohijskog. Biljni materijal uzorkovan je na lokalitetima gde su uočeni karakteristični simptomi bakterioznog raka. Uzorkovani su delovi stabla vinove loze sa tumorima ili tumorozno tkivo odstranjeno sa stabla. Birani su još uvek vitalni delovi biljke, uglavnom mlađe tkivo, sa tumorima u početnim fazama razvoja. Nakon uzorkovanja, materijal je čuvan u plastičnim kesama, u ručnom frižideru i dopremljen u laboratoriju. Obrada uzoraka izvedena je neposredno nakon dopremanja ili je vršeno njihovo čuvanje u kraćem periodu, u frižideru, pri temperaturi oko 5°C. U ovom istraživanju, analizirano je ukupno 62 uzorka vinove loze, prikupljena u 22 različita lokaliteta. 4.2 Izolacija patogena i sojevi korišćeni u radu Izolacija bakterija izvršena je iz fragmenata mladog i aktivnog tkiva tumora. Fragmenti su prvo isprani pod mlazom česmenske vode kako bi se uklonile nečistoće, kao i saprofitni i epifitni organizmi koji mogu biti prisutni na površini biljnog materijala. Zatim je skalpelom uklonjen nekrotični deo tumora do granice sa vitalnim tkivom, nakon čega je ponovo izvedeno ispiranje. Fragmenti su površinski dezinfikovani u ~1% rastvoru NaOCl u trajanju 10-20 minuta, a zatim isprani u 3 serije sterilne destilovane vode (SDV) u aseptičnim uslovima. Pojedinačni fragmenti su preneti u sterilnu Petri kutiju gde su skalpelom izdvojeni manji isečci tkiva, prečnika nekoliko milimetara, iz površinskog dela prvobitnog fragmenta, kao i iz njegove unutrašnjosti. Izdvojeno tkivo je dodatno isečeno skalpelom na sitnije fragmente, koji su preneti u mikroepruvete zapremine 1,5 ml, sa 1 ml SDV. Kako bi se omogućilo oslobađanje bakterija u tečnu fazu, tkivo je inkubirano najmanje 1 h pri sobnoj temperaturi, uz povremeno mešanje vorteks mešalicom. Zasejano je 20 µl tečne faze na čvrste YMA podloge, koje su zatim inkubirane 3-5 dana pri 27ºC. Zasejavanje je 45 izvođeno bakteriološkom petljom, metodom iscrpljivanja u četiri poteza. Takođe, zasejavana su dva razređenja prvobitne suspenzije tkiva (10-1, 10-2). Izolati su prihvaćeni i prečišćeni na YMA ili KDA podlozi sa dodatkom 0,5% CaCO3 (KDA- CaCO3). Osim sojeva izolovanih u našoj zemlji, u pojedinim eksperimentima korišćeni su i različiti sojevi A. vitis iz međunarodnih kolekcija, kao i referentni i/ili tipski sojevi Agrobacterium sp. i Rhizobium sp. Svi Agrobacterium/Rhizobium sojevi korišćeni u radu predstavljeni su u Tabeli 7. Bakterijske kulture održavane su periodičnim presejavanjem na YMA podlozi, a čuvane su u mikroepruvetama, suspendovane u SDV pri 5ºC, ili u krioepruvetama u glicerol hranljivom bujonu pri -80ºC (Schaad i sar. 2001). U testovima gde su proučavane morfološke, odgajivačke, biohemijsko-fiziološke i patogene odlike sojeva, korišćene su sveže kulture bakterija, stare 24-48 h, gajene na YMA podlozi pri 27°C. U slučaju testova reakcija po Gramu i aktivnost oksidaze, kulture bakterija gajene su pod istim uslovima na Kingovoj podlozi B (King i sar., 1954). Za pripremu uzoraka DNK i izvođenje ekstrakcije i prečišćavanja DNK, sojevi bakterija takođe su gajeni na Kingovoj podlozi B, 24 h pri 27°C. U pojedinim testovima, kao kontrole su korišćeni i sojevi bakterija iz drugih rodova (Tabela 8), koji su gajeni na mesopeptonskom agaru 24-48 h pri 27°C. 4.3 Molekularna detekcija pTi i identifikacija sojeva Sojevi izolovani iz vinove loze analizirani su PCR metodom korišćenjem više različitih prajmera specifičnih za gene prisutne na pTi ili pRi, ali i na hromozomima. Takođe, kod jednog reprezentativnog soja (KFB 239) umnožen je fragment 16S rRNK gena, i izvršeno njegovo sekvenciranje i analiza dobijene sekvence. Podaci o korišćenim prajmerima predstavljeni su u Tabeli 9. Predmet PCR analize takođe su bili i referentni sojevi Agrobacterium spp. poreklom iz različitih lokaliteta u svetu, od kojih je 36 sojeva pripadalo vrsti A. vitis (Tabela 7). 46 Tabela 7. Sojevi Agrobacterium/Rhizobium kompleksa vrsta korišćeni u ovom radu Broj Šifra soja Ostale šifre Vrsta/ biovar Biološko porekloa,b Geografsko poreklob Godina izolacijeb Izvorc Literatura 1. KFB 239 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Vršac, Srbija 2010. Ovaj rad / 2. KFB 240 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Vršac, Srbija 2010. Ovaj rad / 3. KFB 241 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Vršac, Srbija 2010. Ovaj rad / 4. KFB 242 / A. vitis V. vinifera L. cv Cab Sav Irig, Srbija 2011. Ovaj rad / 5. KFB 243 / A. vitis V. vinifera L. cv. Chardonnay Irig, Srbija 2011. Ovaj rad / 6. KFB 244 / A. vitis V. vinifera L. cv. Chardonnay Irig, Srbija 2011. Ovaj rad / 7. KFB 245 / A. vitis V. vinifera L. Negotin, Srbija 2011. Ovaj rad / 8. KFB 246 / A. vitis V. vinifera L. Negotin, Srbija 2011. Ovaj rad / 9. KFB 247 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Vršac, Srbija 2011. Ovaj rad / 10. KFB 248 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Vršac, Srbija 2011. Ovaj rad / 11. KFB 249 / A. vitis V. vinifera L. cv. Merlot Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 12. KFB 250 / A. vitis V. vinifera L. cv. Merlot Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 13. KFB 251 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 14. KFB 252 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 15. KFB 253 / A. vitis V. vinifera L. cv. Italian Riesling Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 16. KFB 254 / A. vitis V. vinifera L. cv. Italian Riesling Smederevo, Srbija 2011. Ovaj rad / 17. KFB 255 / A. vitis V. vinifera L. cv. Demir Kapija Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 18. KFB 256 / A. vitis V. vinifera L. cv. Plovdina Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 19. KFB 257 / A. vitis V. vinifera L. Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 20. KFB 258 / A. vitis V. vinifera L. Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 21. KFB 259 / A. vitis V. vinifera L. cv. Crveni Drenak Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 22. KFB 260 / A. vitis V. vinifera L. cv. Muscat Hamburg Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 23. KFB 261 / A. vitis V. vinifera L. Šabac, Srbija 2011. Ovaj rad / 24. KFB 262 / A. vitis V. vinifera L. cv. Muscat Hamburg Vladimirci, Srbija 2011. Ovaj rad / 25. KFB 263 / A. vitis V. vinifera L. cv. Muscat Italia Vladimirci, Srbija 2011. Ovaj rad / 26. KFB 264 / A. vitis V. vinifera L. Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / 27. KFB 265 / A. vitis V. vinifera L. Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / (Nastavak na sledećoj strani) 47 Tabela 7. Nastavak Broj Šifra soja Ostale šifre Vrsta/ biovar Biološko porekloa,b Geografsko poreklob Godina izolacijeb Izvorc Literatura 28. KFB 266 / A. vitis V. vinifera L. Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / 29. KFB 267 / A. vitis V. vinifera L. Bujanovac, Srbija 2011. Ovaj rad / 30. KFB 268 / A. vitis V. vinifera L. Bujanovac, Srbija 2011. Ovaj rad / 31. KFB 269 / A. vitis V. vinifera L., cv. Merlot Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / 32. KFB 270 / A. vitis V. vinifera L., cv. Merlot Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / 33. KFB 271 / A. vitis V. vinifera L., cv. Merlot Vranje, Srbija 2011. Ovaj rad / 34. KFB 272 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Aleksandrovac, Srbija 2011. Ovaj rad / 35. KFB 273 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Aleksandrovac, Srbija 2011. Ovaj rad / 36. KFB 274 / A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Aleksandrovac, Srbija 2011. Ovaj rad / 37. KFB 0171 WIN 4.2.3 A. vitis V. vinifera L. Poljska 2010. J. Puławska / 38. KFB 0172 WIN 4.2.4 A. vitis V. vinifera L. Poljska 2010. J. Puławska / 39. KFB 0173 CG47 A. vitis V. vinifera L. cv. Chancellor Njujork, SAD 1979. CU Otten i sar., 1996 40. KFB 0203 CG49 A. vitis V. vinifera L. cv. Riesling Njujork, SAD 1979. IPV-BO Burr i sar., 1987a 41. KFB 0174 CG56 A. vitis V. vinifera L. cv. Chelois Mičigen, SAD 1979. CU Burr i sar., 1995 42. KFB 0175 CG78 A. vitis V. vinifera L. cv. Merlot Njujork, SAD 1981. CU Otten i sar., 1996 43. KFB 0176 CG81 A. vitis V. vinifera L. cv. Chardonnay Mičigen, SAD 1983. CU Otten i sar., 1996 44. KFB 0204 CG102 A. vitis V. vinifera L. cv. Chardonnay Virdžinija, SAD 1984. IPV-BO Bazzi i sar., 1988 45. KFB 0178 CG108 A. vitis V. vinifera L. cv. Zinfandel Nju Meksiko, SAD 1985. CU Otten i sar., 1996 46. KFB 0179 CG228 A. vitis V. vinifera L. cv. Cab Sav Njujork, SAD 1981. CU Otten i sar., 1996 47. KFB 0180 CG415 A. vitis V. vinifera L. cv. Chenin Blanc (sok iz ksilema) Njujork, SAD 1984. CU Otten i sar., 1996 48. KFB 0182 CG475 A. vitis V. vinifera L. cv. French Colombard Nju Meksiko, SAD 1986. CU Otten i sar., 1996 49. KFB 0185 IPV-BO 1861-5 A. vitis V. vinifera L. Friuli-Venecija Đulija, Italija 1984. IPV-BO Bini i sar., 2008a 50. KFB 0186 IPV-BO 5159 A. vitis V. vinifera L. Friuli-Venecija Đulija, Italija 2003. IPV-BO Bini i sar., 2008a 51. KFB 0187 IPV-BO 5162 A. vitis V. vinifera L. Friuli-Venecija Đulija, Italija 2003. IPV-BO Bini i sar., 2008a 52. KFB 0188 IPV-BO 5372 A. vitis V. vinifera L. Italija 2003. IPV-BO Bini i sar., 2008a 53. KFB 0189 IPV-BO 5761 A. vitis V. vinifera L. Moldavija 2004. IPV-BO Bini i sar., 2008b (Nastavak na sledećoj strani) 48 Tabela 7. Nastavak Broj Šifra soja Ostale šifre Vrsta/ biovar Biološko porekloa,b Geografsko poreklob Godina izolacijeb Izvorc Literatura 54. KFB 0190 IPV-BO 5881 A. vitis V. vinifera L. Pulja, Italija 2005. IPV-BO Bini i sar., 2008b 55. KFB 0191 IPV-BO 6048A1 A. vitis V. vinifera L. Crna Gora 2005. IPV-BO Bini i sar., 2008b 56. KFB 0192 IPV-BO 6186 A. vitis V. vinifera L. Toskana, Italija 2006. IPV-BO Bini i sar., 2008b 57. KFB 0193 IPV-BO 6207 A. vitis V. vinifera L. Vršac, Srbija 2006. IPV-BO Bini i sar., 2008b 58. KFB 0194 IPV-BO 6209 A. vitis V. vinifera L. Vršac, Srbija 2006 IPV-BO Bini i sar., 2008b 59. KFB 0195 IPV-BO 6570 A. vitis V. vinifera L. Bugarskad 2006. IPV-BO Bini i sar., 2008b 60. KFB 0196 IPV-BO 6571 A. vitis V. vinifera L. Bugarska 2006. IPV-BO / 61. KFB 0197 IPV-BO 7104 A. vitis V. vinifera L. Friuli-Venecija Đulija, Italija 2007. IPV-BO / 62. KFB 0198 IPV-BO 7105 A. vitis V. vinifera L. Friuli-Venecija Đulija, Italija 2007. IPV-BO / 63. KFB 0199 IPV-BO 8812 A. vitis V. vinifera L. Emilija-Romanja, Italija 2011. IPV-BO / 64. KFB 0200 IPV-BO 8816 A. vitis V. vinifera L. Emilija-Romanja, Italija 2011. IPV-BO / 65. KFB 0201 IPV-BO 8463 A. vitis V. vinifera L. Maroko 2011. IPV-BO / 66. KFB 0202 Av2 A. vitis V. vinifera L. Hrvatska 2006. IPV-BO / 67. KFB 0100 AB3 A. vitis V. vinifera L. cv. Alicanthe Bouchet Balatonboglár, Mađarska 1982. S. Süle Szegedi i sar., 1988 68. KFB 0205 AB4 A. vitis V. vinifera L. cv. Alicanthe Bouchet Balatonboglár, Mađarska 1982. IPV-BO Szegedi i sar., 1988 70. KFB 099 S4 A. vitis V. vinifera L. cv. Sárfehér Orgovány, Mađarska 1981. S. Süle Szegedi i sar., 1988 71. KFB 0206T K309 T; NCPPB 3554T A. vitis V. vinifera L. Barmera, Australija 1977. IPV-BO Ophel i Kerr, 1990 72. KFB 0207 F2/5 A. vitis V. vinifera L. Pretorija, Južna Afrika NP IPV-BO Burr i sar., 1997 73. KFB 096 C58 A. tumefaciens/ biovar 1 Prunus cerasus L. Njujork, SAD 1958. S. Süle Hooykaas i sar., 1980 74. KFB 0209T B6 T; ATCC 23308T A. tumefaciens/ biovar 1 Malus sp. NP 1935. IPV-BO Petit i Tempé, 1985 75. KFB 0210 Ach5 A. tumefaciens/ biovar 1 NP Belgija NP IPV-BO Petit i Tempé, 1985 (Nastavak na sledećoj strani) 49 Tabela 7. Nastavak Broj Šifra soja Ostale šifre Vrsta/ biovar Biološko porekloa,b Geografsko poreklob Godina izolacijeb Izvorc Literatura 76. KFB 0231T AR13T; ATCC 11325T A. rhizogenes/ biovar 2 Malus domestica L. NP NP UF Lippincott i Lippincott, 1969 77. KFB 0159 K84 A. rhizogenes/ biovar 2 Zemljište iz voćnjaka Australija NP KFB New i Kerr, 1972 78. KFB 098 A4 A. rhizogenes/ biovar 2 Malus domestica L. NP NP S. Süle Moore i sar., 1979 79. KFB 0233T Aru2 T; ATCC 13335T A. rubi Rubus ursinus var. loganobaccus SAD 1942. UF Lippincott i Lippincott, 1969 80. KFB 0234T AF 3.10 T; ATCC 51759T A. larrymoorei Ficus benjamina Florida, SAD 1991. UF Bouzar i sar., 1995a 81. KFB 0160T Ch 11T R.skierniewicense Chrysanthemum sp. L. Poljska NP J. Puławska Puławska i sar., 2012b 82. KFB 0165 C 3.4.1 R. nepotum “Colt” podloga Poljska 2008. J. Puławska Puławska i sar., 2012a a Cab Sav, Cabernet Sauvignon; b NP, nije poznato; c CU, Cornell University, Geneva, USA (T.J. Burr, D. Zheng); IPV-BO, Plant Pathology Department, University of Bologna, Bologna, Italy (E. Biondi); S. Süle, Plant Protection Institute, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary; UF, University of Florida, Gainesville, USA (J.B. Jones, G.V. Minsavage); KFB, Kolekcija fitopatogenih bakterija, Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija; J. Puławska, Research Institute of Horticulture, Skierniewice, Poland; d U radu Bini i sar. (2008b), kao zemlja porekla ovog soja greškom je navedena Italija. Tabela 8. Kontrolni sojevi korišćeni u pojedinim testovima Broj Šifra soja Vrsta Test Izvor 1. B56 Pseudomonas fluorescens Aktivnost oksidaze KFB 2. B130 Pseudomonas fluorescens Reakcija po Gramu KFB 3. B122 Bacillus pumilus Reakcija po Gramu KFB 4. OMP-BO 395.1/91 Pseudomonas viridiflava rep-PCR, RAPD IPV-BO 50 4.3.1 Priprema uzoraka DNK Priprema uzoraka DNK izvršena je inkubiranjem suspenzije bakterija (~108 CFU/ml) pri temperaturi 100°C, u trajanju 10 min. Lizirane bakterijske ćelije su zatim inkubirane 5 min na ledu i centrifugirane pri 8000 rpm tokom 5 min. Supernatant je korišćen direktno za PCR ili je čuvan pri -20°C za kasnija istraživanja. 4.3.2 PCR analiza U ovom istraživanju, preliminarna identifikacija sojeva, izolovanih u okviru ovog istraživanja, izvršena je primenom dupleks PCR metode korišćenjem VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmera. Prajmeri VCF3/VCR3 specifični su za virC gen koji se nalazi na pTi ili pRi, dok su prajmeri PGF/PGR komplementarni sekvenci hromozomskog gena pehA, karakterističnog za vrstu A. vitis (Szegedi i Bottka, 2002; Suzaki i sar., 2004). Kombinovanjem ova dva para prajmera, istovremeno se vrši diferencijacija patogenih sojeva Agrobacterium sp., odnosno patogenih sojeva A. vitis (Kumagai i Fabritius, 2008). Potvrda preliminarne identifikacije sojeva izvedena je daljom molekularnom analizom, korišćenjem prajmera specifičnih za druge gene (Tabela 9). A/C’ prajmeri specifični su za virD2 gen, koji je prisutan na pTi ili pRi kod širokog kruga Agrobacterium spp., dok se parom prajmera CYT/CYT’ umnožava sekvenca unutar ipt gena, koji je prisutan samo kod pTi. Kombinovanjem ova dva para prajmera u dupleks PCR reakciji, omogućava se istovremena detekcija oba gena i diferencijacija tumorogenih (sadrže Ti plazmid) i rizogenih (sadrže Ri plazmid) Agrobacterium vrsta (Haas i sar., 1995). VirFF1/VirFR2 par prajmera specifičan je za virF gen, prisutan na A. vitis O/C i N tipu pTi, a VirD2S4F716/VirD2S4R1036 za virD2 gen A. vitis (S4) V tip pTi. Kada se ova dva para prajmera koriste zajedno sa PGF/PGR prajmerima u multipleks PCR reakciji, može se izvršiti diferencijacija A. vitis sojeva koji poseduju O/C ili N tip pTi, ali i A. vitis sojeva sa V tipom pTi (Bini i sar., 2008b). Prajmerima specifičnim za virF gen takođe se mogu detektovati pojedini sojevi A. tumefaciens sa oktopin i leucinopin tipom pTi (Bini i sar., 2008b). 51 Parom prajmera tms2F1/tms2R2 karakterističnim za iaaH (tms2) gen, koji se nalazi na T-DNK, može se detektovati pTi kod širokog kruga tumorogenih sojeva Agrobacterium sp. uključujući i pojedine A. vitis (Puławska i Sobiczewski, 2005). Sojevi su diferencirani do nivoa vrste/biovara korišćenjem prajmera specifičnih za 23S rRNK gen (Puławska i sar., 2006). U istoj reakciji korišćeni su univerzalni prednji (UF) i četiri reverzna prajmera (B1R, B2R, AvR, ArR), specifična za pojedine Agrobacterium sp. vrste/biovare (Tabela 9). U reakciji sa VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmerima primenjen je protokol prema Kumagai i Fabritius (2008), uz manje modifikacije u pogledu sastava reakcione smeše. Reakciona smeša konačne zapremine 25 µl sadržala je: 1× Taq pufer sa KCl (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM prajmera, 0.5 U Taq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 2 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 94°C u trajanju 5 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 56°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 5 minuta. Dupleks PCR sa A/C’ i CYT/CYT’ prajmerima izveden je prema originalnom protokolu (Haas i sar., 1995), uz modifikacije u pogledu sastava i zapremine reakcione smeše. Reakciona smeša krajnje zapremine 25 µl sadržala je: 1× DreamTaq zeleni pufer koji sadrži 20mM MgCl2 (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 0,2 mM dNTPs, 0,4 µM prajmera, 0.5 U DreamTaq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 2,5 µl uzorka DNK. PCR reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 94°C u trajanju 1 min, 40 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 50°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C tokom 5 minuta. Multipleks PCR sa prajmerima VirFF1/VirFR2, VirD2S4F716/VirD2S4R1036 i PGF/PGR izveden je prema prethodno saopštenom protokolu (Bini i sar., 2008b). Reakciona smeša konačne zapremine 25 µl sadržala je: 1× GoTaq bezbojni pufer (Promega, Madison, WI, USA), 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,3 μM prajmera VIRFF1/VIRFR2 i VIRD2S4F716/VIRD2S4R1036, 0,4 μM prajmera PGF/PGR, 5% DMSO, 0,5 U GoTaq Flexi DNK polimeraze (Promega, Madison, WI, USA) i 5 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri 52 Tabela 9. Prajmeri korišćeni u detekciji i karakterizaciji pTi i identifikaciji sojeva Oznaka prajmera Sekvenca prajmera Ciljani region Veličina fragmenta Literatura VCF3/ VCR3 5′-GGCGGGCGYGCYGAAAGRAARACYT-3′ 5′-AAGAACGYGGNATGTTGCATCTYAC-3′ virC gen Agrobacterium sp. na pTi ili pRi 414 bp Suzaki i sar., 2004 A/ C’ 5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′ 5′-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3′ virD2 gen Agrobacterium sp. na pTi ili pRi 224 bp Haas i sar., 1995 CYT/ CYT’ 5′-GATCG(G/C)GTCCAATG(C/T)TGT-3′ 5′-GATATCCATCGATC(T/C)CTT-3′ ipt gen Agrobacterium sp. na pTi 427 bp Haas i sar., 1995 VirFF1/ VirFR2 5′-ATGAGAAATTCGAGTTTGCATGATG-3′ 5′-TCGTGATGGGTATACGCTACG-3′ virF gen A. vitis oktopin i nopalin pTi 382 bp Bini i sar., 2008b VirD2S4F716/ VirD2S4R1036 5′-GACCGCAAAACCTGCCAG-3′ 5′-GAGCCTGTATTGACGATGTC-3′ virD2 gen A. vitis (S4) vitopin pTi 320 bp Bini i sar., 2008b tms2F1/ tms2R2 5′-TTTCAGCTGCTAGGGCCACATCAG-3′ 5′-TCGCCATGGAAACGCCGGAGTAGG-3′ T-DNK (iaaH [tms2]) 617 bp Puławska i Sobiczewski, 2005 PGF/ PGR 5′-GGGGCAGGATGCGTTTTTGAG-3′ 5′-GACGGCACTGGGGCTAAGGAT-3′ hromozomski pehA gen vrste A. vitis 466 bp Szegedi i Bottka, 2002 UF/ B1R 5′-GTAAGAAGCGAACGCAGGGAACT-3′ 5′-GACAATGACTGTTCTACGCGTAA-3′ hromozomski 23S rRNK gen vrste A. tumefaciens/biovar 1 184 bp Puławska i sar., 2006 UF/ B2R / 5′-TCCGATACCTCCAGGGCCCCTCACA-3′ hromozomski 23S rRNK gen vrste A. rhizogenes/biovar 2 1066 bp Puławska i sar., 2006 UF/ AvR / 5′-AACTAACTCAATCGCGCTATTAAC-3′ hromozomski 23S rRNK gen vrste A. vitis 478 bp Puławska i sar., 2006 UF/ ArR / 5′-AAAACAGCCACTACGACTGTCTT-3′ hromozomski 23S rRNK gen vrste A. rubi 1006 bp Puławska i sar., 2006 (Nastavak na sledećoj strani) 53 Tabela 9. Nastavak Oznaka prajmera Sekvenca prajmera Ciljani region Veličina fragmenta Literatura fD1/ rP2 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' 16S rRNK gen većine Eubacteria ~1450 bp Weisburg i sar., 1991 TF/ TR 5’-TGGCCGAAATTGTTTACTTCCACCC-3’ 5’-CTATGCCGAAAGACGGCTTGACCCT-3’ 6b gen A. vitis oktopin tip pTi 520 bp Szegedi i sar., 2005 NF/ NR 5’-TTAACCCAAATGAGTACGATGACGA-3’ 5’-TTATTTCGGTACTGGATGATATTAG-3’ 6b gen A. vitis nopalin tip pTi 570 bp Szegedi i sar., 2005 visF/ visR 5'-CCGGCCACTTCTGCTATCTGA-3' 5'- CCATTCACCCGTTGCTGTTATT-3' gen za sintezu vitopina (vis) A. vitis vitopin tip pTi 561 bp Szegedi i Bottka, 2002 54 temperaturi 94°C u trajanju 1 min; 40 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 60°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 5 minuta. PCR sa prajmerima tms2F1/tms2F2 izveden je prema već definisanom protokolu (Puławska i Sobiczewski, 2005), s tim da su načinjene modifikacije u pogledu koncentracije pojedinih komponenti i zapremine reakcione smeše. Reakciona smeša krajnje zapremine 15 µl sadržala je: 1× DreamTaq zeleni pufer koji sadrži 20mM MgCl2 (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM prajmera, 0,3 U DreamTaq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 1,5 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 94°C u trajanju 1 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 63°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1,5 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 10 minuta. Multipleks PCR sa prajmerima UF/B1R/B2R/AvR/ArR izveden je prema ranije saopštenom protokolu (Puławska i sar., 2006), uz određene modifikacije u pogledu sastava i koncentracije pojedinih komponenti u reakcionoj smeši. Reakciona smeša konačne zapremine 15 µl sadržala je: 1× DreamTaq zeleni pufer koji sadrži 20 mM MgCl2 (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM prajmera, 0,3 U DreamTaq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 1,5 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 94°C u trajanju 1 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 67°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1,5 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 10 minuta. Reakcije umnožavanja DNK su izvedene u aparatu Thermo Cycler 2240 (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA). Umnoženi DNK produkti razdvojeni su elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu prilikom korišćenja A/C', ipt1/ipt2, VirFF1/VirFR2, VirD2S4F716/VirD2S4R1036, PGF/PGR, tms2F1/tms2R1 i UF/B1R/B2R/AvR/ArR prajmera, ili u 2% agaroznom gelu kada su korišćeni VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmeri. Gelovi su potom obojeni u rastvoru etidijum bromida (1 µg/ml) i posmatrani pod UV svetlom na transiluminatoru (Vilber Lourmat, Marne la Vallée Cedex, France). 55 4.3.3 Sekvenciona analiza 16S rRNK gena Soj KFB 239 je dalje analiziran sekvenciranjem 16S rRNK gena. Fragment rRNK gena je umnožen korišćenjem fD1/rP2 prajmera (Weisburg i sar., 1991). Reakciona smeša konačne zapremine 50 µl sadržala je: 1× Taq pufer sa KCl i 15 mM MgCl2 (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 0,3 mM dNTPs, 0,16 µM prajmera, 1,1 U DreamTaq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 3 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 95°C u trajanju 5 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 55°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1,5 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 5 minuta. Uspešnost umnožavanja 16S rRNK gena i kvantifikacija DNK koja je poslata na sekvenciranje određena je vizuelnim poređenjem PCR produkata sa markerom MassRuler DNA Ladder Mix (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Fragment DNK sekvenciran je u oba smera istim prajmerima koji su korišćeni pri umnožavanju (Genomed S.A., Warsaw, Poland). Dobijeni hromatogrami su vizuelizovani korišćenjem softvera FinchTV 1.4.0 (Geospiza, Inc., Seattle, WA, USA; http://www.geospiza.com). Sekvence (“forward” i “reverse”) su obrađene korišćenjem softverskog paketa MEGA 5.1 (Tamura i sar., 2011), i određena je konsenzus sekvenca ukupne dužine 1290 bp. Konsenzus nukleotidna sekvenca je dostavljena banci gena (eng. GenBank) Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (eng. National Center for Biotechnology Information, NCBI), nakon čega joj je dodeljen pristupni broj (eng. GenBank accession number). BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) program korišćen je kako bi se dobijena sekvenca uporedila sa sekvencama dostupnim u bazi podataka NCBI banke gena. Filogenetska analiza izvedena je korišćenjem dobijene sekvence soja KFB 239 i sekvenci 16S rRNK gena srodnih Agrobacterium i Rhizobium sojeva. Sojevi A. tumefaciens/biovar 1 su klasifikovani i imenovani prema studiji Mougel i sar. (2002), i predlozima Costechareyre i sar. (2010) i Lasalle i sar. (2011). Sekvence su poravnate koriščenjem CLUSTAL W algoritma integrisanog u MEGA 5.1 softverski paket i dalje analizirane korišćenjem istog softvera. Genetička udaljenost analiziranih sekvenci određena je korišćenjem Kimura-2 modela (Kimura, 1980). Filogenetsko stablo 56 konstruisano je primenom “neighbor-joining“ (NJ) metode (Saitou i Nei, 1987), sa genetičkom udaljenošću izračunatom prema Kimura-2 modelu. Statistička značajnost testirana je “bootstrap” analizom sa 1000 ponavljanja. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvence 16S rRNK gena tipskog soja vrste Bradyrhizobium japonicum. 4.4 Patogene odlike sojeva Patogenost sojeva testirana je na više biljnih vrsta: vinovoj lozi (cv. Cabernet Sauvignon), suncokretu i paradajzu (cv. Novosadski jabučar). Test biljke gajene su u stakleniku, u odgovarajućim plastičnim saksijama i tresetnom supstratu, pri temperaturi od 24±3ºC. Kao pozitivne kontrole korišćene su biljke inokulisane kontrolnim sojevima A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099, KFB 0206), a biljke inokulisane sterilnom destilovanom vodom i nepatogenim sojem A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159), kao negativne kontrole. Test patogenosti na paradajzu i suncokretu izveden je u tri ponavljanja. Pozitivnom reakcijom su smatrani jasno formirani tumori na mestu inokulacije, a negativna je bila odsustvo bilo kakvih simptoma. Prisustvo promena različitog intenziteta na mestu uboda u tkivo, unutar pojedinačnog ogleda i/ili među različitim ponavljanjima, ocenjeno je kao varijabilna reakcija. Inokulacija jednogodišnjih ili dvogodišnjih sadnica vinove loze izvedena je tokom maja, u internodije zelenih ili zrelih lastara. Svakim sojem ponaosob inokulisane su po dve biljke, povređivanjem pomoću igle ili skalpela i nanošenjem mase bakterijskih ćelija drvenom čačkalicom. Mesto inokulacije obloženo je vlažnom pamučnom vatom koja je obavijena aluminijumskom folijom, u cilju zaštite od isušivanja i održanja povoljnih uslova za infekciju. Pamučna vata i aluminijumska folija uklonjeni su nakon 48 h. Biljke vinove loze su tokom letnjih meseci gajene na otvorenom prostoru. Rezultati testa očitani su tri meseca nakon inokulacije. U cilju ispunjenja Kohovih postulata, iz jedne biljke vinove loze izvršena je reizolacija i ponovna identifikacija bakterija. Izolacija je izvršena na identičan način kao i u slučaju prirodno zaraženih biljaka. U identifikaciji izolovanih sojeva primenjena je dupleks PCR metoda, korišćenjem VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmera (Kumagai i Fabritius, 2008). 57 Sejanci suncokreta inokulisani su tokom pikiranja. Skalpelom je načinjen rez u predelu hipokotila, dubine nekoliko milimetara i dužine oko 1 cm. Potom je drvenom čačkalicom nanesena masa bakterijskih ćelija i raspoređena unutar povrede. Sejanci su zatim zasađeni, tako da mesto inokulacije bude u zemljišnom supstratu. Tri biljke su inokulisane svakim proučavanim sojem bakterija ponaosob. Rezultati testa očitani su 3- 4 nedelje posle inokulacije. Biljke paradajza gajene su iz semena i inokulisane u predelu stabla, 2-3 nedelje od trenutka pikiranja klijanaca. Biljke su inokulisane preko povreda načinjenih skalpelom, u vidu rezova dubine nekoliko milimetara i dužine oko 1 cm. Test biljke inokulisane su u internodije, a korišćeno je po tri biljke za svaki proučavani soj bakterija. Rezultati testa očitani su 3-4 nedelje nakon inokulacije. 4.5 Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike sojeva izolovanih iz vinove loze u Srbiji, proučene su korišćenjem standardnih i diferencijalnih bakterioloških testova (Bouzar i sar., 1995b; Kerr i Gibb, 1997; Moore i sar., 2001). Određena je reakcija po Gramu i aktivnost oksidaze, a od odgajivačkih odlika proučen je razvoj bakterija pri 35°C i podlozi sa 2% NaCl. Dalje, proučeno je stvaranje 3- ketolaktoze, formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 podlozi, pokretljivost bakterija pri pH 7,0, razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri-amonijum-citratom, korišćenje citrata i proizvodnja kiseline iz saharoze, melezitoze i eritritola, i baze iz tartarata. 4.5.1 Reakcija po Gramu Reakcija po Gramu određena je posrednom metodom sa 3% KOH (Suslow i sar., 1982). Masa bakterijskih ćelija, iz kulture gajene 24 h na Kingovoj podlozi B, prenesena je drvenom čačkalicom na mikroskopsku pločicu i izmešana u jednoj kapi 3% rastvora KOH. Kod Gram-negativnih bakterija dolazi do pucanja zida i oslobađanja nukleinske kiseline pod uticajem jake baze, što za posledicu ima pojavu sluzaste konzistencije kapi na pločici. To se potvrđuje podizanjem čačkalice od površine pločice pri čemu se 58 obrazuje elastična nit, što izostaje u slučaju Gram-pozitivnih bakterija. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj Gram-pozitivne bakterije Bacillus pumilus (B122), a kao negativne kontrole Pseudomonas fluorescens (B130), A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099). 4.5.2 Razvoj pri 35°C U testu razvoja bakterija pri temperaturi 35°C korišćena je tečna podloga od kvaščevog ekstrakta i neorganskih soli (YS; Dye, 1962, loc. cit. Schaad i sar., 2001). Po 5 ml podloge je razliveno u epruvete i nakon autoklaviranja postavljeno u vodeno kupatilo radi postizanja temperature 35°C pre zasejavanja. Podloga je zasejana pipetiranjem 100 µl suspenzije bakterija (~108 CFU/ml) i zatim ponovo vraćena u vodeno kupatilo. Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099), a kao negativne kontrole nezasejana podloga i soj A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159). Razvoj bakterija praćen zamućenjem podloge, ocenjen je tri do sedam dana (optimalno 5 dana) nakon zasejavanja. 4.5.3 Razvoj u podlozi sa 2% NaCl U testu razvoja bakterija u podlozi sa 2% NaCl korišćena je tečna YS podloga uz dodatak 2% NaCl (Fahy i Hayward, 1983, loc. cit. Arsenijević, 1997). Podloga je zasejana pipetiranjem po 100 µl suspenzije bakterija (~108 CFU/ml) i inkubirana pri 27°C. Razvoj bakterija praćen je u periodu 5-7 dana. Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099), a kao dodatna pozitivna KFB 096 zasejan na standardnu YS podlogu. Kao negativne kontrole korišćeni su nezasejana podloga i soj A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159). 4.5.4 Aktivnost oksidaze Aktivnost oksidaze određena je prema metodi koju je opisao Kovacs (1956). Korišćene su bakterijske kulture gajene 24 h na čvrstoj Kingovoj podlozi B i sveže pripremljen 1% rastvor N,N,N′,N′-Tetrametil-p-fenilenediamin dihidrohlorida 59 (TMPPD). Manja količina bakterija preneta je drvenom čačkalicom na filter papir, prethodno natopljen ovim rastvorom. TMPPD deluje kao veštački donor elektrona za enzim oksidazu, na ovaj način se oksidiše i menja boju u ljubičastu. Pozitivnom reakcijom smatra se pojava ljubičaste boje u roku od 10 sekundi, odloženom reakcijom ukoliko do pojave boje dođe u periodu 10-60 sekundi, dok je reakcija negativna ukoliko do pojave boje ne dođe ni nakon 60 sekundi. Za manipulaciju bakterijama preporučuje se platinasta ili plastična petlja, ili drvena čačkalica, s obzirom da tragovi gvožđa mogu katalizovati oksidaciju fenilenediamina. Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), P. fluorescens (B-56) i A. vitis (KFB 099), a kao negativna A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159). 4.5.5 Stvaranje 3-ketolaktoze A. tumefaciens/biovar 1 poseduje sposobnost proizvodnje 3-ketoglikozida iz odgovarajućih disaharida i bionskih kiselina, te je ova osobina iskorišćena za razvoj diferencijalnog testa proizvodnje 3-ketolaktoze iz laktoze (Bernaerts i DeLey, 1963). Sojevi bakterija zasejavani su u vidu kružne zone prečnika 1 cm na podlogu od laktoze i kvaščevog ekstrakta. Četiri do šest sojeva testirano je u istoj Petri kutiji. Zasejane Petri kutije su inkubirane pri 27°C u trajanju 48 h. Zatim je površina podloge prelivena Benediktovim reagensom i inkubirana pri sobnoj temperaturi. Ukoliko je došlo do stvaranja 3-ketolaktoze, žuti prsten bakar-dioksida (Cu2O) postaje vidljiv oko mase bakterijskih ćelija nakon 1 h. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), a kao negativne A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099). 4.5.6 Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 podlozi A. rhizogenes/biovar 2 proizvodi više kiseline iz glukoze u odnosu na A. tumefaciens/biovar 1 i A. vitis, što je iskorišćeno za razvoj testa za diferencijaciju ovih vrsta (Bouzar i Jones, 1992). Zasejavanje sojeva bakterija izvođeno je u vidu kružne zone prečnika 1 cm na KDA-CaCO3 podlogu. Četiri do šest sojeva testirano je u istoj Petri kutiji. Petri kutije su inkubirane pri 27°C u trajanju 2-3 dana. Kod vrsta A. 60 tumefaciens/biovar 1 i A. vitis, podloga ostaje neprovidna (nema promene), dok kod A. rhizogenes/biovar 2 oko bakterijske kolonije dolazi do pojave prosvetljenih zona nakon 3-4 dana. Kao pozitivna kontrola korišćen je soj A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159), a kao negativne A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099). 4.5.7 Pokretljivost pri pH 7,0 Pojedine vrste roda Agrobacterium mogu se diferencirati na osnovu pokretljivosti u podlozi gde su podešene različite vrednosti pH (Bush i Pueppke, 1991). A.tumefaciens/biovar 1 postaje pokretljiviji sa povećanjem pH, pokretljivost A. rhizogenes/biovar 2 blago se smanjuje, ali su ćelije i dalje pokretne, dok se pokretljivost A. vitis značajno smanjuje i ćelije su nepokretne u podlozi. U ovom testu korišćena je posebna čvrsta podloga gde je pH vrednost podešena na 7,0 (Bush i Pueppke, 1991). Proučavani sojevi bakterija zasejavani su pipetiranjem 10 µl bakterijske suspenzije (~108 CFU/ml), a Petri kutije su inkubirane pri 27°C u trajanju 2-3 dana. Testirano je po četiri soja u jednoj Petri kutiji. A. vitis gotovo je nepokretljiv u podlozi na pH 7,0 i u ovom slučaju dolazi do rasta kolonije u granicama do 0,5 mm. Biovari 1 i 2 su pokretljivi i formiraju krupne kolonije gde je rast veći od 2 mm. Bakterijski rast se uočava u vidu difuzne zone oko bakterija zasejanih prvog dana. Moguće je na istoj kutiji testirati do 4 soja. Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159), a kao negativna A. vitis (KFB 099). 4.5.8 Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri-amonijum-citratom A. tumefaciens/biovar 1 u tečnoj podlozi sa feri-amonijum citratom stvara crveno-smeđu opnu na njenoj površini i boji je u crveno-smeđe, zbog proizvodnje feri hidroksida (Hendrickson i sar., 1934). Podloga je zasejana pipetiranjem po 100 µl suspenzije bakterija (~108 CFU/ml) i inkubirana pri 27°C u trajanju 3-5 dana. Kao pozitivna kontrola koriščen je soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), a kao negativne A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099). 61 4.5.9 Korišćenje citrata Korišćenje citrata kao jedinog izvora ugljenika može se primeniti kao test u diferencijaciji pojedinih Agrobacterium spp. (Keane i sar., 1970; Moore i sar., 2001). U testu je korišćena čvrsta podloga sa natrijum citratom, neorganskim solima i brom-timol plavim (Simmons, 1926). Podloga je razlivena u epruvete i zakošena. Zasejavanje je izvedeno bakteriološkom petljom, a epruvete su inkubirane pri 27°C, u trajanju 2-4 dana. Pozitivna reakcija se ispoljava promenom boje podloge u plavu, kao posledica stvaranja baze, što utiče na indikator brom-timol plavo, koji je prisutan u podlozi. Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099), a kao negativna A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096). 4.5.10 Stvaranje kiseline iz saharoze, eritritola i melezitoze U testovima je korišćena osnovna podloga (Hayward, 1964, loc. cit. Schaad i sar., 2001), sa dodatkom šećera (saharoza, eritritol ili melezitoza), razlivena u epruvete. Sojevi bakterija zasejavani su ubodom, a epruvete su inkubirane pri 27°C, u trajanju 14 dana. U slučaju pozitivne reakcije dolazi do promene boje podloge u žutu usled oksidacije šećera, odnosno promene boje indikatora (brom-timol plavo) kao posledica stvaranja kiseline. Kod testa sa saharozom, kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099), a kao negativna A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159). Za testiranje stvaranja kiseline iz eritritola kao pozitivna kontrola korišćen je soj A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159), a kao negativne A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099). Kod testa sa melezitozom, kao pozitivna kontrola korišćen je soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), a kao negativne A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099). 4.5.11 Stvaranje baze iz tartarata U testu stvaranja baze iz tartarata korišćena je osnovna podloga (Ayers i sar., 1919, loc. cit. Kerr i Panagopoulos, 1977), sa dodatkom di-natrijum-tartarat-2-hidrata. Korišćena je čvrsta podloga koja je razlivena u epruvete i zakošena. Zasejavanje je 62 izvedeno bakteriološkom petljom, a epruvete su inkubirane pri 27°C, u trajanju 3-7 dana. U slučaju razgradnje tartarata, dolazi do promene boje podloge iz zelene u plavu, usled stvaranja baze, što utiče na promenu boje indikatora (brom-timol plavo). Kao pozitivne kontrole korišćeni su sojevi A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159) i A. vitis (KFB 099), a kao negativna A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096). 4.6 Karakterizacija Ti plazmida Opin tip pTi određen je PCR metodom, korišćenjem prajmera specifičnih za svaki od opin tipova pTi detektovanih kod A. vitis (Tabela 9). Prajmeri TF/TR korišćeni su za detekciju 6b gena A. vitis O/C pTi, NF/NR za detekciju 6b gena A. vitis N pTi, dok su prajmeri visF/visR korišćeni za detekciju gena za sintezu vitopina (vis) A. vitis V pTi (Szegedi i Bottka, 2002; Szegedi i sar., 2005). Korišćeni su isti uzorci DNK koji su prethodno pripremljeni za molekularnu detekciju pTi i identifikaciju sojeva. Analizirani su kako sojevi poreklom iz Srbije, tako i referentni sojevi iz međunarodnih kolekcija. PCR protokol se zasnivao na prethodnom saopštenju (Szegedi i Bottka, 2002; Szegedi i sar., 2005), a načinjene su modifikacije u pogledu koncentracije pojedinih komponenti, sastava i zapremine reakcione smeše. Takođe, načinjene su i manje izmene u termalnom profilu reakcije, u smislu povećanja broja ciklusa amplifikacije. Reakciona smeša konačne zapremine 15 µl sadržala je: 1× DreamTaq zeleni pufer koji sadrži 20 mM MgCl2 (Fermentas, Vilnius, Lithuania), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,5 µM prajmera, 0,3 U DreamTaq DNK polimeraze (Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 1,5 µl uzorka DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 94°C u trajanju 1 min; 35 ciklusa denaturacije pri 92°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 60°C za TF/TR, 58°C za NF/NR ili 54°C za visF/visR prajmere u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1,5 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 3 minuta. Produkti umnožavanja DNK razdvojeni su elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu. 63 4.7 Genetički diverzitet sojeva U analizi genetičkog diverziteta korišćeno je više različitih metoda. Primenjene su metode RAPD i rep-PCR kojima se vrši analiza kompletnog genoma, odnosno sekvenci raspoređenih unutar genomske DNK. Takođe, analiziran je i diverzitet određenih fragmenata prisutnih na hromozomskoj DNK, kao što su konstitutivni geni i 16S-23S rRNK ITS region. Ovi fragmenti umnoženi su korišćenjem specifičnih prajmera i analizirani RFLP metodom i sekvenciranjem. 4.7.1 Ekstrakcija DNK Za ekstrakciju DNK korišćeni su komercijalno dostupni kompleti. Za izvođenje RAPD i rep-PCR metode, kao i za analizu konstitutivnih gena korišćen je QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany; u daljem tekstu QIAamp komplet). Za analizu 16S-23S rRNK regiona korišćena je DNK ekstrahovana kompletom Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA; u daljem tekstu Wizard komplet). Postupak ekstrakcije DNK korišćenjem QIAamp kompleta izveden je prema uputstvu proizvođača. Bakteriološkom petljom zahvaćena je masa bakterija (~1/3 petlje) i suspendovana u mikroepruvetama (1,5 ml) u 180 μl ATL pufera uz intenzivno mešanje. U suspenziju bakterija pipetirano je 20 μl proteinaze K, sadržaj je izmešan vorteks mešalicom i inkubiran pri 56°C, u trajanju 1-3 h. Tokom inkubacije izvođeno je povremeno mešanje vorteks mešalicom (2-3 puta tokom 1 h inkubacije). Na ovaj način omogućava se lizis bakterijskih ćelija i oslobađanje genetičkog materijala. Zatim je izvedeno kratko centrifugiranje kako bi se uklonila tečnost iz unutrašnjosti zatvarača mikroepruvete. U uzorak je pipetirano 200 μl AL pufera, sadržaj je izmešan vorteks mešalicom u trajanju 15 s i inkubiran 10 min pri 70°C, nakon čega je izvedeno kratko centrifugiranje. Potom je pipetirano 200 μl etanola (96-100%), nakon čega je izvršeno mešanje vorteks mešalicom, u trajanju 15 s, uz korak kratkog centrifugiranja. Celokupan sadržaj, uključujući i precipitat, pipetiran je u QIAamp Mini spin kolonu smeštenu u mikroepruveti (2 ml), izbegavajući kvašenje oboda kolone. Zatim je izvršeno centrifugiranje pri 8000 rpm, u trajanju 1 min. Na ovaj način DNK ostaje 64 apsorbovana u membrani unutar QIAamp Mini spin kolone, koja je potom prebačena u novu mikroepruvetu (2 ml), a prethodna mikroepruveta sa filtratom, gde se nalaze rastvoreni proteini i ostali kontaminanti je odbačena. U QIAamp Mini spin kolonu zatim je pipetirano 500 μl AW1 pufera, i sadržaj centrifugiran pri 8000 rpm, u trajanju 1 min. Mikroepruveta sa filtratom je odbačena, a kolona je smeštena u novu mikroepruvetu (2 ml). Zatim je pipetirano 500 µl AW2 pufera, izbegavajući kvašenje oboda kolone, i izvedeno centrifugiranje pri 14000 rpm u trajanju 3 min. Kolona je prebačena u novu mikroepruvetu (2 ml) i izvedeno je centrifugiranje pri 14000 rpm, u trajanju 1 min, u cilju uklanjanja eventualno preostalog AW2 pufera u koloni. Korišćenjem AW1 i AW2 pufera, DNK koja je vezana za membranu biva prečišćena, odnosno preostali kontaminanti bivaju uklonjeni. Mikroepruveta sa filtratom je ponovo odbačena, dok je kolona smeštena u novu mikroepruvetu (1,5 ml). U kolonu je pipetirano 100 μl AE pufera, i nakon 1 min inkubacije izvedeno je centrifugiranje pri 8000 rpm u trajanju 1 min. Na ovaj način prečišćena DNK je u koncentrovanoj formi isprana (eluirana, desorbovana) iz kolone u mikroepruvetu. Kolona je odbačena, a koncentracija DNK je podešena sa AE puferom na ~10 ng/μl. Rastvor DNK čuvan je pri -20°C. Ekstrakcija DNK korišćenjem Wizard kompleta, takođe je izvedena prema uputstvu proizvođača. Bakteriološkom petljom je zahvaćena masa bakterija (~1/2 petlje) i suspendovana u mikroepruvetama (1,5 ml) u 1 ml SDV. Zatim je izvedeno centrifugiranje pri 16000g, u trajanju 2 min, supernatant je odbačen, a bakterijske ćelije su resuspendovane blagim pipetiranjem u 600 μl rastvora za lizis ćelija. Mikroepruvete su inkubirane pri 80°C, u trajanju 5 min, kako bi se omogućio lizis bakterijskih ćelija, nakon čega je sadržaj ohlađen pri sobnoj temperaturi. U ćelijski lizat je pipetirano 3 μl rastvora Rnaze uz mešanje izvrtanjem mikroepruvete 3-5 puta. Zatim su mikroepruvete inkubirane pri 37°C, u trajanju 1 h, i ohlađene pri sobnoj temperaturi. U njih je zatim pipetirano 200 μl rastvora za taloženje proteina, izvedeno je mešanje vrtložnom mešalicom pri maksimalnoj brzini u trajanju 20 s i inkubiranje 5 min na ledu. Zatim je sadržaj centrifugiran pri 16000g, u trajanju 3 min, i supernatant pipetriran u nove mikroepruvete (1,5 ml), u koje je prethodno pipetirano 600 μl izopropanola, podešenog na sobnu temperaturu. Sadržaj je izmešan laganim izvrtanjem mikroepruvete do pojave vidljive mase DNK, a zatim centrifugiran pri 16000g, u trajanju 2 min. Pažljivo je odbačen supernatant, a mikroepruvete su postavljene u vertikalan položaj na ubrus, 65 kako bi istekao čitav sadržaj. U mikroepruvete je zatim pipetirano 600 μl etanola (70%), podešenog na sobnu temperaturu, a zatim su mikroepruvete lagano izvrtane nekoliko puta, kako bi se isprao talog DNK. Zatim je sadržaj centrifugiran pri 16000g, u trajanju 2 min, etanol je pažljivo odliven, a mikroepruvete su postavljene na čist ubrus u trajanju 20 min kako bi se talog DNK osušio. Nakon sušenja, u mikroepruvete je dodato 75 μl rastvora za rehidrataciju DNK i izvršena inkubacija pri 65°C, u trajanju 1 h, tokom koje je rastvor mešan nekoliko puta. Koncentracija ekstrahovane DNK podešena je sa “nuclease free” vodom na ~10-20 ng/μl. Rastvor DNK čuvan je pri -20°C. 4.7.2 RAPD Za izvođenje RAPD metode, u nezavisnim reakcijama korišćeno je tri različita prajmera: A9, A10 i R13 (Tabela 10), koji su već primenjivani u proučavanju genetičkog diverziteta Agrobacterium spp. u studijama drugih autora (Irelan i Meredith, 1996; Momol i sar., 1998). U ovom istraživanju, analizirana su 63 soja A. vitis poreklom iz naše zemlje i inostranstva (Tabela 14), kao i A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. rhizogenes/biovar 2 (KFB 0159). Korišćen je takođe i jedan soj Pseudomonas viridiflava, kao vrsta genetički udaljena od Agrobacterium spp. Reakciona smeša konačne zapremine 25 µl sadržala je: 1× GoTaq bezbojni pufer (Promega, Madison, WI, USA), 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,8 µM prajmera, 1,25 U GoTaq Flexi DNK polimeraze (Promega, Madison, WI, USA) i 2 µl ekstrahovane DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 95°C u trajanju 5 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 30 s, vezivanja prajmera pri 36°C u trajanju 30 s i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 7 minuta. Produkti umnožavanja DNK razdvojeni su elektroforezom (80V, 60mA) u 1,5% agaroznom gelu, a dužina hoda bila je 12 cm. Dobijeni genetički profili su prevedeni u binarnu matricu, gde je beleženo prisustvo (1) ili odsustvo (0) svakog umnoženog fragmenta, pod pretpostavkom da su fragmenti jednake veličine u različitim trakama homologi. Filogenetska analiza izvedena je korišćenjem FreeTree programa (Hampl i sar. 2001), a uključeni su kako podaci za svaki prajmer pojedinačno, tako i kombinovani podaci za sva tri prajmera. 66 Primenjena je neponderisana metoda za sparivanje grupa na temelju prosečnih vrednosti (eng. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, UPGMA), korišćenjem Nei i Lijevog koeficijenta sličnosti (Nei i Li, 1979). Statistička značajnost je testirana sa 1000 “bootstrap” ponavljanja. Konstrukcija dendrograma izvedena je korišćenjem TreeView programa (Page, 1996). 4.7.3 Rep-PCR U ovom radu izveden je REP-PCR, ERIC-PCR i BOX-PCR korišćenjem REP1R-I/REP2-I, ERIC1R/ERIC2 i BOXA1R prajmera (Versalovic i sar., 1991; 1994; Tabela 10). U radu su korišćeni isti sojevi koji su analizirani RAPD metodom. Primenjen je protokol koji se zasnivao na prethodnom saopštenju drugih autora (Rademaker i de Bruijn, 1997), uz modifikacije u pogledu sastava reakcione smeše i koncentracije pojedinih komponenti. Reakciona smeša konačne zapremine 25 µl sadržala je: 1× GoTaq bezbojni pufer (Promega, Madison, WI, USA), 3 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 1 µM prajmera, 2 U GoTaq Flexi DNK polimeraze (Promega, Madison, WI, USA) i 2 µl ekstrahovane DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 95°C u trajanju 7 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 40°C za REP1R-I/REP2-I, 52°C za ERIC1R/ERIC2 ili 53°C za BOXA1R u trajanju 1 min i ekstenzije pri 65°C u trajanju 8 min. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 65°C u trajanju 16 min. Produkti umnožavanja DNK razdvojeni su elektroforezom (80 V, 60 mA) u 1,5% agaroznom gelu, a dužina hoda bila je 15 cm. Filogenetska analiza izvedena je na isti način kao i u slučaju RAPD metode. Korišćeni su podaci dobijeni REP-PCR, ERIC-PCR i BOX-PCR metodama ponaosob, kao i kombinovani podaci za sve tri metode. 4.7.4 Analiza konstitutivnih gena U ovom radu predmet analize bili su unutrašnji fragmenati tri konstitutivna gena: dnaK, gyrB i recA (Slika 4). Gen dnaK ima ulogu u regulaciji odgovora na stres i kodira sintezu jednog proteina toplotnog stresa, gyrB kodira sintezu B subjedinice DNK 67 giraze, enzima koji ima funkciju u regulisanju negativno orijentisanih navoja na DNK, te je neophodan za replikaciju bakterija, dok recA ima ulogu u reparaciji DNK i kodira sintezu enzima rekombinaze A. Ovi geni su odabrani na bazi uporedne analize sekvenci više konstitutivnih gena kod vrsta A. tumefaciens/biovar 1 KFB 096 (pristupni broj: AE007869), A. rhizogenes/biovar 2 KFB 0159 (pristupni broj: CP000628), i A. vitis KFB 099/S4 (pristupni broj: CP000633), a odabrani su oni kod kojih je uočen najveći stepen genetičkog diverziteta. Ovaj princip primenjen je pod pretpostavkom da veći stepen genetičkog diverziteta odabranih konstitutivnih gena kod ove tri vrste, može ukazivati i na veći stepen diverziteta unutar vrste A. vitis. Takođe, uzeta je u obzir i činjenica da su neki od ovih gena već korišćeni u proučavanju Agrobacterium i njima srodnih vrsta, što omogućava međusobno poređenje rezultata i uključivanja već dostupnih sekvenci. Slika 4. Šematski prikaz položaja konstitutivnih gena korišćenih u analizi genetičkog diverziteta u ovom radu. Pozicije gena zasnovane su na sekvenci genoma A. vitis S4 (pristupni broj: CP000633). Fragmenti unutar dnaK, gyrB i recA gena umnoženi su primenom PCR metode, korišćenjem prajmera koji su posebno dizajnirani u ovom radu (Tabela 10). Prajmeri su dizajnirani na osnovu poravnatih sekvenci ovih gena kod A. tumefaciens/biovar 1 KFB 096, A. rhizogenes/biovar 2 KFB 0159, i A. vitis KFB 099, pri čemu su odabrani oni regioni koji su bili visoko konzervirani. U odabiru regiona kandidata za prajmere, delimično su korišćeni i programi PrimerSelect (DNAStar, Madison, WI, USA) i Primer3 (Untergrasser i sar., 2012; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). 68 Osobine prajmera kandidata su određivane pomoću dva već pomenuta programa i programa dostupnog na internetu OligoAnalyzer 3.1 (http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/ oligoanalyzer/default.aspx). Specifičnost prajmera proverena je korišćenjem programa Primer-BLAST (Ye i sar., 2012; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). U analizu su uključeni sojevi A. vitis, predstavnici glavnih grupa definisanih na osnovu rep-PCR i RAPD metode (Tabela 16). Umnožavanje ovih gena izvedeno je prema sledećem protokolu. Reakciona smeša konačne zapremine 50 µl sadržala je: 1× GoTaq bezbojni pufer (Promega, Madison, WI, USA), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,2 µM dnaKF1/dnaKR1 ili recAF1/recAR1, ili 0,16 μM gyrBF1/gyrBR1 prajmera, 0,5 U GoTaq Flexi DNK polimeraze (Promega, Madison, WI, USA) za umnožavanja dnaK i recA gena, odnosno 0,375 U za umnožavanje gyrB gena i 2 µl ekstrahovane DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 95°C u trajanju 5 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 45 s, vezivanja prajmera pri 60°C (dnaKF1/dnaKR1; gyrBF1/gyrBR1), ili 57°C (recAF1/recAR1), u trajanju 45 s i ekstenzije pri 72°C u trajanju 45 s. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 10 minuta. Uspešnost umnožavanja konstitutivnih gena proverena je elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu. Kvantifikacija DNK za sekvenciranje izvedena je vizuelnim poređenjem PCR produkata sa markerom phiX174 DNA/BsuRI (HaeIII) (Fermentas, Vilnius, Lithuania). Fragmenti su sekvencirani istim prajmerima koji su korišćeni za umnožavanje (Macrogen Europe, Amsterdam, The Netherlands). Vizuelizacija hromatograma, obrada i određivanje konsenzus sekvenci izvršeni su korišćenjem istih programa kao i u slučaju analize 16S rRNK regiona. Konsenzus sekvence ukupne dužine 537 bp (dnaK), 539 bp (gyrB) ili 564 bp (recA), dostavljene su banci gena, nakon čega im je dodeljen pristupni broj. Za uporednu analizu dobijenih sekvenci sa sekvencama dostupnim u bazi podataka banke gena, korišćen je BLAST program. Broj različitih haplotipova, sadržaj baza guanina i citozina, broj polimorfnih mesta i indeks diverziteta (π) određeni su korišćenjem DnaSP programa (Rozas i sar., 2003). Indeksom diverziteta označava se genetički diverzitet ili polimorfizam gena u određenoj populaciji, gde vrednost 0 znači da ne postoji polimorfizam, a vrednost 1 69 označava maksimalan polimorfizam. Vrednosti ovih parametara izračunate su za svaki od proučavanih gena ponaosob, kao i za kombinaciju sekvenci sva tri gena. Filogenetska analiza izvođena je kako za svaki analizirani gen pojedinačno, tako i za kombinovanu sekvencu sva tri gena, a korišćen je MEGA 5.1 softverski paket (Tamura i sar., 2011). U filogenetsku analizu uključene su i sekvence dnaK, gyrB i recA gena kod srodnih Agrobacterium i Rhizobium sojeva, preuzete iz banke gena. Sekvence su poravnate koriščenjem CLUSTAL W algoritma, a genetička udaljenost određena je korišćenjem Kimura-2 modela (Kimura, 1980). Konstrukcija filogenetskih stabala izvedena je korišćenjem NJ metode (Saitou i Nei, 1987) u Kimura-2 modelu (Kimura, 1980) primenom bootstrap testa sa 1000 replikacija. Korišćena je i metoda maksimalne verodostojnosti (eng. maximum likelihood, ML), gde su najbolje prilagođeni modeli određeni korišćenjem posebne opcije u MEGA 5.1 programu. Za dnaK korišćen je model TN93+G (eng. Tamura-Nei and gamma rate distribution), za gyrB i kombinovane sekvence sva tri gena, T92+G (eng. Tamura 3-parameter plus gamma rate distribution), a za recA, GTR+G+I (eng. general time reversible with invariant site and a gamma rate distribution). Statistička značajnost ML filogenetskih stabala testirana je “bootstrap” analizom sa 100 ponavljanja. Filogenetska stabla su ukorenjena korišćenjem sekvenci soja Bradyrhizobium japonicum USDA 110. 4.7.5 Analiza 16S-23S rRNK ITS regiona Predmet analize u okviru ovog rada bili su i unutrašnji fragmenti 16S-23S rRNK ITS regiona. Proučavano je 36 sojeva A. vitis poreklom iz Srbije, a uključeno je i 15 sojeva A. vitis poreklom iz SAD, Mađarske i Australije (Tabela 17). U slučaju sojeva A. vitis poreklom iz međunarodnih kolekcija, odabran je po bar jedan predstavnik grupa koje su prethodno definisane na osnovu PCR-RFLP analize skoro kompletnog 16S rRNK gena i većeg dela 16S-23S rRNK ITS regiona (Otten i sar., 1996). Kod sojeva KFB 099 i KFB 0206 u banci gena su već dostupne sekvence čitavog genoma ili ribozomalnog regiona, te su ovi sojevi korišćeni kao kontrolni, odnosno za verifikaciju rezultata u pojedinim fazama istraživanja. Umnožavanje većeg dela 16S-23S rRNK ITS regiona izvršeno je korišćenjem prajmera FGPS1490-72/FGPL132' (Tabela 10). Ovi prajmeri specifični su za veći broj 70 bakterijskih vrsta iz različitih rodova. Prajmer FGPS1490-72 komplementaran je sekvenci na samom kraju 16S rRNK gena, a FGPL132' sekvenci na 16S-23S rRNK ITS regionu. S obzirom da su sekvence čitavog ribozomalnog regiona dostupne za pojedine sojeve, precizno je utvrđeno da se ovim prajmerima kod njih amplifikuju fragmenti od 1425 bp (KFB 099) ili 1246 bp (KFB 0206). Reakciona smeša konačne zapremine 50 µl sadržala je: 1× Taq pufer sa KCl (Thermo Scientific Fermentas, Vilnius, Lithuania), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 0,2 µM svakog prajmera, 1,5 U Taq DNK polimeraze (Thermo Scientific Fermentas, Vilnius, Lithuania) i 3 µl ekstrahovane DNK. Reakcija se odvijala prema sledećem programu: početna denaturacija pri temperaturi 95°C u trajanju 5 min; 35 ciklusa denaturacije pri 94°C u trajanju 1 min, vezivanja prajmera pri 55°C u trajanju 1 min i ekstenzije pri 72°C u trajanju 1 min 45 s. Završna ekstenzija odvijala se pri temperaturi 72°C u trajanju 5 minuta. Uspešnost umnožavanja proverena je elektroforezom u 1,2% agaroznom gelu. Nakon umnožavanja, PCR produkti su podvrgnuti restrikcionoj analizi sa endonukleazama TaqI, BsuRI (HaeIII) i HhaI (CfoI) (Thermo Scientific Fermentas, Vilnius, Lithuania) u nezavisnim reakcijama, a prema protokolu preporučenom od strane proizvođača, uz izvesne modifikacije. Reakciona smeša sastojala se iz 8,5 μl „nuclease free“ vode, 1 μl odgovarajućeg pufera (10X TaqI pufera za TaqI, 10X R pufera za BsuRI, i 10X Tango pufera za HhaI restrikcioni enzim), 0,5 μl odgovarajućeg enzima i 6 μl PCR produkta. Reakciona smeša inkubirana je pri 65°C u trajanju 16 h (TaqI) ili pri 37°C u trajanju 16 h (BsuRI i HhaI). Restrikcioni fragmenti razdvojeni su elektroforezom u 2,2% agaroznom gelu pri 55 V u trajanju 3 h, a dužina hoda bila je 8 cm. Dobijeni restrikcioni profili su analizirani čime su određene različite RFLP grupe. Bar jedan predstavnik svake od definisanih grupa odabran je za sekvenciranje. Umnoženi DNK fragmenti odabranih sojeva sekvencirani su u oba smera (Macrogen Europe, Amsterdam, The Netherlands) korišćenjem istih prajmera koji su korišćeni za umnožavanje. DNK fragmenti sojeva KFB 099 i KFB 0206 nisu sekvencirani, s obzirom da je sekvenca njihovog ribozomalnog regiona već dostupna u banci gena. Vizuelizacija hromatograma, obrada i određivanje konsenzus sekvenci izvršeni su korišćenjem istih programa kao i u slučaju analize 16S rRNK regiona. 71 Tabela 10. Prajmeri korišćeni u analizi genetičkog diverziteta Oznaka prajmera Sekvenca prajmera Ciljani region Veličina fragmenta Literatura A9 5'-GGGTAACGCC-3' - - - A10 5'-GTGATCGCAG-3' - - - R13 5'-GGACGACAAG-3' - - - REP1R-I/ REP2-I 5'-IIIICGICGICATCIGGC-3' 5'-ICGICTTATCIGGCCTAC-3' REP sekvence - Versalovic i sar., 1991 ERIC1R/ ERIC2 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3' 5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3' ERIC sekvence - Versalovic i sar., 1991 BOXA1R 5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3' BOX elementi - Versalovic i sar., 1994 dnaKF1/ dnaKR1 5'-CGTAAACGGCAATGGTCTT-3' 5'-TGGCAAAAGTAATCGGTATCG-3' A. vitis (S4) dnaK gen 576 bp Ovaj rad gyrBF2/ gyrBR2 5'-AAGATGTTGTCCAGCCAGGA-3' 5'-TCCTTGACACCACGCACC-3' A. vitis (S4) gyrB gen 626 bp Ovaj rad recAF1/ recAR1 5'-AACATCACGCCAATCTTCATAC-3' 5'-AGAGGACAAAACGGTGGATAAAAG-3' A. vitis (S4) recA gen 615 bp Ovaj rad FGPS1490-72/ FGPL132' 5'- TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3' 5'- CCGGGTTTCCCCATTCGG-3' 16S-23S ITS rRNK region ~1250-1450 bp Normand i sar., 1996; Ponsonnet i Nesme, 1994 72 Konsenzus sekvence dostavljene su banci gena, nakon čega im je dodeljen pristupni broj. Za uporednu analizu dobijenih sekvenci sa sekvencama dostupnim u bazi podataka banke gena, korišćen je BLAST program. Filogenetska analiza izvedena je na isti način kao i u slučaju analize 16S rRNK gena, a uključene su i sekvence srodnih sojeva preuzete iz banke gena. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvence soja Agrobacterium rhizogenes/biovar 2 K84 (KFB 0159). 4.8 Osetljivost prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5) U cilju dodatne karakterizacije i diferencijacije sojeva, primenjen je test inhibicije sa antagonističkim sojem A. vitis. Korišćen je antagonistički soj KFB 0207 (F2/5) koji inhibitorno deluje na rast sojeva A. vitis u in vitro ogledima i razvoj bakterioznog raka na inokulisanim biljkama vinove loze (Staphorst i sar., 1985; Burr i Reid, 1994; Burr i sar., 1997). Antagonistički efekat ovog soja testiran je prema 10 reprezentativnih sojeva poreklom iz Srbije, odabranih na osnovu prethodno opisane genetičke analize (Tabela 18). Kao pozitivna kontrola korišćen je tipski soj A. vitis (KFB 0206), a kao negativna referentni soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096). U ovom radu primenjena je modifikovana metoda koju je prethodno opisao Stonier (1960). Antagonistički soj KFB 0207 zasejan je pipetiranjem 50 µl bakterijske suspenzije (~108 CFU/ml) na čvrstu YMA podlogu. Kutije su zatim inkubirane 48 h pri 27ºC, nakon čega je zona porasta bakterije obeležena markerom na spoljnoj strani Petri kutije. Masa bakterija uklonjena je ubrus papirom, a kutije su zatim tretirane isparenjima hloroforma u trajanju 45 min. Istovremeno, sojevi čija je osetljivost testirana prema anatagonističkom soju, gajeni su na Kingovoj podlozi B 24-48 h pri 27ºC, nakon čega su napravljene suspenzije bakterija (107-108 CFU/ml). 100 µl suspenzije pipetirano je u epruvete sa 5 ml vodenog agara (0,7 %; 45ºC), nakon čega je izvršeno mešanje i razlivanje ovog sadržaja u Petri kutije, gde je gajen antagonistički soj. Svaki soj testiran je u tri ponavljanja. Petri kutije su zatim inkubirane 48 h pri 27ºC, nakon čega su očitani rezultati testa. 73 5. REZULTATI 5.1 Rasprostranjenost i simptomi bakterioznog raka vinove loze u Srbiji Obilaskom terena tokom 2010-2011. godine, karakteristični simptomi bakterioznog raka vinove loze uočeni su u timočkom, nišavsko-južnomoravskom, zapadno-moravskom, šumadijsko-velikomoravskom, pocerskom, sremskom i banatskom vinogradarskom rejonu. Stepen zaraze i procenat zaraženih biljaka varirali su u zavisnosti od lokaliteta. Vinogradi su bili pretežno stari 2-4 godine, a dominirale su sorte Merlot, Cabernet Sauvignon, Sauvignon Blanc i Chardonnay. Sadni materijal uglavnom je vodio poreklo iz uvoza. Simptomi oboljenja uočeni su isključivo na nadzemnom stablu, iznad i/ili oko spojnog mesta podloge i plemke (Slika 5). Tumori su bili lokalizovani na prizemnom delu stabla (Slika 5a), a zabeležena su i krupna sferična zadebljanja na samom spojnom mestu (Slika 5b). Takođe, na terenu su uočena i tumorozna zadebljanja koja su dostizala dužinu i do nekoliko desetina cm (Slika 5c). U poodmakloj fazi oboljenja tumorozna zadebljanja su potpuno obavijala stablo, a njihova površina bila je tamno-mrka, nekrotična i hrapava (Slika 5d). Simptomi bakterioznog raka nisu uočeni na podlogama vinove loze. 5.2 Izolacija patogena Tri do pet dana nakon izolacije, na YMA podlogama razvilo se više različitih tipova bakterijskih kolonija (Slika 6). Za dalja istraživanja prihvaćene su beličaste, umereno-ispupčene, sjajne i glatke kolonije, pravilnog kružnog oblika (Slika 6). Fenotipske odlike odabranih kolonija odgovarale su izgledu kontrolnih sojeva Agrobacterium spp. na istoj podlozi. 74 Slika 5. Simptomi bakterioznog raka vinove loze. Lokalizovani tumori na prizemnom stablu (A). Sferična zadebljanja na spojnom mestu podloge i plemke (B). Kontinuirana tumorozna zadebljanja na nadzemnom stablu (C). Stablo potpuno obavijeno tumorom (D). Slika 6. YMA podloga posle 3-5 dana inkubacije. Neke od tipičnih kolonija Agrobacterim spp. obeležene su crvenim strelicama. 75 5.3 Molekularna analiza sojeva 5.3.1 Detekcija pTi/pRi i identifikacija sojeva Primenom dupleks PCR metode sa VCF3/VCR3 (virC) i PGF/PGR (pehA) prajmerima izvršena je preliminarna determinacija sojeva. Među izolovanim sojevima identifikovan je patogeni A. vitis, a za dalji rad izdvojeno je ukupno 36 reprezentativnih sojeva (Tabela 11). Dakle, kod svih 36 sojeva umnoženi su fragmenti odgovarajuće veličine od 414 i 466 bp (Tabela 11; Slika 7). Od ukupno 62 analizarana uzorka, 52 je bilo pozitivno na prisustvo patogena. U cilju potvrde identifikacije sprovedena je dalja PCR analiza sojeva. Prajmeri A/C’ (virD2) i CYT/CYT’ (ipt), korišćeni su u dupleks PCR reakciji. Prajmerima A/C’ umnoženi su odgovarajući fragmenti veličine 224 bp kod svih 36 sojeva, međutim kod pojedinih sojeva signal je bio vrlo slab (Tabela 11; Slika 8). Sa druge strane, CYT/CYT’ prajmeri nisu bili specifični prema svim proučavanim sojevima i jedino je kod 4 soja došlo do umnožavanja odgovarajućeg fragmenta veličine 427 bp (Tabela 11; Slika 8). U ovoj dupleks PCR reakciji, kod pojedinih sojeva, takođe su umnoženi i brojni nespecifični fragmenti (Slika 8). U multipleks PCR reakciji sa PGF/PGR, VirFF1/VirFR2 (virF) i VirD2S4F716/VirD2S4R1036 (virD2) prajmerima, kod svih proučavanih sojeva umnoženi su odgovarajući fragmenti veličine 466 i 382 bp, ili 466 i 320 bp (Slika 9). Na ovaj način, proučavani sojevi su identifikovani kao tumorogeni A. vitis, a delimično su diferencirani i prema tipu pTi. Utvrđeno je da ukupno 35 sojeva poseduje O/C ili N tip tumorogenog plazmida, a jedan soj V tip pTi (Tabela 11). Prajmerima tms2F1/tms2R2 (iaaH) umnoženi su odgovarajući fragmenti veličine 617 bp kod 4 soja, a kod 32 soja nije došlo do umnožavanja (Tabela 11; Slika 10). Sojevi koji su bili pozitivni u ovoj PCR reakciji, poklapaju se sa onima kod kojih je umnožen odgovarajući fragment CYT/CYT’ prajmerima. U multipleks PCR reakciji sa UF/B1R/B2R/AvR/ArR (23S rRNK) prajmerima potvrđeni su rezultati dobijeni u gore navedenoj dupleks i multipleks PCR reakciji gde su korišćeni PGF/PGR prajmeri. Kod svih analiziranih sojeva poreklom iz Srbije umnožen je odgovarajući fragment veličine 478 bp, karakterističan za A. vitis (Tabela 11; Slika 11). 76 Slika 7. Umnoženi fragmenti primenom dupleks PCR metode sa prajmerima VCF3/VCR3 i PGF/PGR. KFB 096 (A. tumefaciens/biovar 1), KFB 098 (A. rhizogenes/biovar 2) i KFB 099 (A. vitis) korišćeni su kao kontrolni sojevi. M, marker (MassRuler LowRange DNA Ladder, Fermentas, Lithuania); K-, negativna kontrola. Slika 8. Umnoženi fragmenti primenom dupleks PCR metode sa prajmerima A/C’ i CYT/CYT’. KFB 096 i KFB 0209 (A. tumefaciens/biovar 1) korišćeni su kao kontrolni sojevi. K-, negativna kontrola; M, marker (MassRuler LowRange DNA Ladder, Fermentas, Lithuania). 77 Tabela 11. PCR analiza sojeva Šifra soja Vrsta/ biovara Tip plazmida (Ti/Ri, opin tip)b PCRd VCF3/ VCR3 A/ C’ CYT/ CYT’ VirFF1/ VirFR2 VirD2S4F716/ VirD2S4R1036 tms2F1/ tms2R2 PGF/ PGR UF/ B1R UF/ B2R UF/ AvR UF/ ArR TF/ TR NF/ NR visF/ visR KFB 239 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 240 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 241 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 242 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 243 A. vitis Ti, V + + - - + - + - - + - - - + KFB 244 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 245 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 246 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 247 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 248 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 249 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 250 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 251 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 252 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 253 A. vitis Ti, O/C-2 + + + + - + + - - + - + - - KFB 254 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 255 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 256 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 257 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 258 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 259 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 260 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 261 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 262 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 263 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 264 A. vitis Ti, O/C-2 + + + + - + + - - + - + - - KFB 265 A. vitis Ti, O/C-2 + + + + - + + - - + - + - - KFB 266 A. vitis Ti, O/C-2 + + + + - + + - - + - + - - KFB 267 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 268 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - (Nastavak na sledećoj strani) 78 Tabela 11. Nastavak Šifra soja Vrsta/ biovara Tip plazmida (Ti/Ri, opin tip)b PCRd VCF3/ VCR3 A/ C’ CYT/ CYT’ VirFF1/ VirFR2 VirD2S4F716/ VirD2S4R1036 tms2F1/ tms2R2 PGF/ PGR UF/ B1R UF/ B2R UF/ AvR UF/ ArR TF/ TR NF/ NR visF/ visR KFB 269 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 270 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 271 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 272 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 273 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 274 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0171 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0172 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0173 A. vitis Ti, Nc + + + + - + + - - + - - + - KFB 0203 A. vitis Ti, Nc + + + + - + + - - + - - + - KFB 0174 A. vitis Ti, Nc + + + + - + + - - + - - + - KFB 0175 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0176 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0204 A. vitis Ti, OLc + + + + - + + - - + - + - - KFB 0178 A. vitis Ti, OLc + + + + - + + - - + - + - - KFB 0179 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0180 A. vitis Ti, OSc + + - + - - + - - + - + - - KFB 0182 A. vitis Ti, OSc + + - + - - + - - + - + - - KFB 0185 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0186 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0187 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0188 A. vitis Ti, O/C, Vc + + - + + - + - - + - + - + KFB 0189 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0190 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0191 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0192 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0193 A. vitis Ti, O/C-2c + + + + - + + - - + - + - - KFB 0194 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0195 A. vitis Ti, O/C-1c + + - + - - + - - + - + - - KFB 0196 A. vitis Ti, V + + - - + - + - - + - - - + (Nastavak na sledećoj strani) 79 Tabela 11. Nastavak Šifra soja Vrsta/ biovara Tip plazmida (Ti/Ri, opin tip)b PCRd VCF3/ VCR3 A/ C’ CYT/ CYT’ VirFF1/ VirFR2 VirD2S4F716/ VirD2S4R1036 tms2F1/ tms2R2 PGF/ PGR UF/ B1R UF/ B2R UF/ AvR UF/ ArR TF/ TR NF/ NR visF/ visR KFB 0197 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0198 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0199 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0200 A. vitis Ti, V + + - - + - + - - + - - - + KFB 0201 A. vitis Ti, O/C-1 + + - + - - + - - + - + - - KFB 0202 A. vitis Ti, O/C-2 + + + + - + + - - + - + - - KFB 0100 A. vitis Ti, OSc + + - + - - + - - + - + - - KFB 0205 A. vitis Ti, Nc + + + + - + + - - + - - + - KFB 099 A. vitis Ti, Vc + + - - + - + - - + - - - + KFB 0206 A. vitis Ti, OLc + + + + - + + - - + - + - - KFB 0207 A. vitis NP - - - - - - + - - + - - - - KFB 096 At/B1 Ti, Nc + + + - - + - + - - - - - - KFB 0209 At/B1 Ti, Oc + + + / / + - + - - - - - - KFB 0210 At/B1 Ti, Oc + + + + - + - + - - - - - - KFB 0231 Ar/B2 Ric + + - / / - - - + - - - - - KFB 0159 Ar/B2 NP - - - - - - - - + - - - - - KFB 098 Ar/B2 Ric + + - - - - - - + - - - - - KFB 0233 A. rubi Tic + + + / / + - - - - + - + - KFB 0234 Al Tic + - - / / - - / / / / - - - KFB 0160 Rs Tic + / / / / / / / / / / / / / KFB 0165 Rn NP - - - / / - - + + - - - - - a At/B1, A. tumefaciens/biovar 1; Ar/B2, A. rhizogenes/biovar 2; Al, A. larrymoorei; Rs, R. skierniewicense; Rn, R. nepotum; b Ti, tumorogeni plazmid; Ri, rizogeni plazmid; O/C-1, oktopin/kukumopin tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, oktopin/kukumopin tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; OS, oktopin/kukumopin tip pTi sa skraćenim TA-DNK regionom; O, oktopin tip pTi; N, nopalin tip; V, vitopin tip; NP, nepatogeni soj (bez pTi ili pRi); c Tip plazmida i opin tip su određeni u prethodnim studijama; d +, pozitivna reakcija; -, negativna reakcija; /, nije testirano. 80 Slika 9. Umnoženi fragmenti primenom multipleks PCR metode sa prajmerima PGF/PGR, VirFF1/VirFR2 i VirD2S4F716/VirD2S4R1036. KFB 0210 (A. tumefaciens/biovar 1, oktopin pTi), KFB 0187 (A. vitis; O/C pTi) i KFB 0186 (A. vitis, V pTi) korišćeni su kao kontrolni sojevi. K-, negativna kontrola; M, marker (100bp DNA Ladder, Promega, Madison, WI, USA). Slika 10. Umnoženi fragmenti primenom PCR metode sa tms2F1/tms2R2 prajmerima. KFB 096 (A. tumefaciens/biovar 1) korišćen je kao kontrolni soj. K-, negativna kontrola; M, marker (MassRuler LowRange DNA Ladder, Fermentas, Lithuania). Slika 11. Umnoženi fragmenti primenom multipleks PCR metode sa prajmerima UF/B1R/B2R/AvR/ArR. KFB 0209 (A. tumefaciens/biovar 1), KFB 0231 (A. rhizogenes/biovar 2), KFB 0206 (A. vitis) i KFB 0233 (A. rubi) korišćeni su kao kontrolni sojevi. K-, negativna kontrola; M, marker (MassRuler LowRange DNA Ladder, Fermentas, Lithuania). 81 5.3.2 Sekvenciona analiza 16S rRNK gena Parcijalna nukleotidna sekvenca (1290 bp) 16S rRNK gena soja KFB 239, dostavljena je NCBI banci gena pod pristupnim brojem JN185718. BLAST analizom utvrđen je visok stepen nukleotidne sličnosti (99-100%) sa sekvencama drugih sojeva A. vitis dostupnim u bazi podataka. Takođe, na dendrogramu konstruisanom na osnovu filogenetske analize, soj KFB 239 je grupisan zajedno sa referentnim sojevima A. vitis (Slika 12). Slika 12. Dendrogram konstruisan na osnovu sekvenci (1290-bp) 16S rRNK gena korišćenjem NJ metode prikazuje filogenetsku vezu između soja KFB 239 i srodnih Agrobacterium/Rhizobium vrsta. Soj iz Srbije označen je podebljano. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti izračunate na osnovu 1000 ponavljanja. Pristupni brojevi navedeni su u zagradi. Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvence 16S rRNK gena soja B. japonicum ATCC 10324T. 82 5.3.4 Specifičnost prajmera korišćenih u identifikaciji patogenih A. vitis Prajmeri koji su korišćeni u detekciji pTi, kao i u identifikaciji i karakterizaciji sojeva poreklom iz Srbije, takođe su primenjeni u PCR analizi referentnih sojeva A. vitis poreklom iz međunarodnih kolekcija, a rezultati su predstavljeni u Tabeli 11. Prajmerima VCF3/VCR3, VirFF1/VirFR2 i VirD2S4F716/VirD2S4R1036 detektovan je pTi kod svih proučavanih referentnih A. vitis sojeva, osim kod nepatogenog soja KFB 0207. Prajmerima VirFF1/VirFR2 umnoženi su karakteristični fragmenti kod sojeva koji su posedovali O/C i N tip pTi, dok su prajmerima VirD2S4F716/VirD2S4R1036 umnoženi specifični fragmenti jedino kod sojeva sa V tipom pTi. A/C’ prajmerima takođe su umnoženi odgovarajući fragmenti kod svih proučavanih A. vitis sojeva, osim kod nepatogenog soja KFB 0207, ali je dobijeni signal kod pojedinih sojeva bio niskog intenziteta. Sa druge strane, prajmerima CYT/CYT’ i tms2F1/ tms2R2 odgovarajući fragment umnožen je jedino kod sojeva sa OL i N tipom pTi, kao i kod dva soja sa O/C tipom pTi (KFB 0193, KFB 0202). PGF/PGR i UF/AvR prajmerima umnoženi su odgovarajući fragmenti kod svih proučavanih A. vitis sojeva. 5.4 Patogene odlike sojeva U testu patogenosti na biljkama vinove loze, 34 soja su prouzrokovala razvoj karakterističnih tumora na inokulisanim lastarima (Tabela 12; Slika 13). Izuzetak su bili sojevi KFB 241 i KFB 247, koji su u ovom testu bili negativni, iako je molekularnom analizom utvrđeno da poseduju pTi. Kontrolni sojevi A. vitis (KFB 099, KFB 0206) indukovali su stvaranje tumora, dok kod soja A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) to nije bio slučaj. Na biljkama inokulisanim nepatogenim sojem A. rhizogenes/biovar 2 i SDV nije došlo do razvoja simptoma. Iz biljke vinove loze koja je inokulisana sojem KFB 239 izvršena je reizolacija patogena. Bakterijske kolonije koje su odgovarale fenotipu Agrobacterium sp. izolovane su iz tkiva tumora na YMA podlogu. U dupleks PCR reakciji sa VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmerima ovi sojevi identifikovani su kao tumorogeni A. vitis, čime su ispunjeni Kohovi postulati. 83 Slika 13. Test patogenosti. Biljke vinove loze inokulisane sojem KFB 239, kontrolnim sojem A. vitis KFB 0206 i SDV (A). Biljke suncokreta inokulisane sojem KFB 264, kontrolnim sojem A. vitis KFB 0206 i SDV (B). Biljke paradajza inokulisane sojem KFB 253, kontrolnim sojem A. tumefaciens/biovar 1 KFB 096 i SDV (C). 84 Tabela 12. Patogenost proučavanih sojeva na biljkama vinove loze, suncokreta i paradajza Soj Vrsta/ biovara Geografsko poreklo Godina izolacijeb Tip pTic Test patogenostid vinova loza suncokret paradajz KFB 239 A. vitis Vršac 2010. O/C-1 + V + KFB 240 A. vitis Vršac 2010. O/C-1 + V + KFB 241 A. vitis Vršac 2010. O/C-1 - V V KFB 242 A. vitis Irig 2011. O/C-1 + V V KFB 243 A. vitis Irig 2011. V + + - KFB 244 A. vitis Irig 2011. O/C-1 + V V KFB 245 A. vitis Negotin 2011. O/C-1 + V + KFB 246 A. vitis Negotin 2011. O/C-1 + V + KFB 247 A. vitis Vršac 2011. O/C-1 - V - KFB 248 A. vitis Vršac 2011. O/C-1 + V + KFB 249 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 + V + KFB 250 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 + V V KFB 251 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 + V V KFB 252 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 + V V KFB 253 A. vitis Smederevo 2011. O/C-2 + + + KFB 254 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 + - - KFB 255 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V + KFB 256 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V V KFB 257 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V + KFB 258 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V V KFB 259 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V V KFB 260 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V V KFB 261 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 + V V KFB 262 A. vitis Vladimirci 2011. O/C-1 + V + KFB 263 A. vitis Vladimirci 2011. O/C-1 + V + KFB 264 A. vitis Vranje 2011. O/C-2 + + V KFB 265 A. vitis Vranje 2011. O/C-2 + + V KFB 266 A. vitis Vranje 2011. O/C-2 + + V KFB 267 A. vitis Bujanovac 2011. O/C-1 + V + KFB 268 A. vitis Bujanovac 2011. O/C-1 + V V KFB 269 A. vitis Vranje 2011. O/C-1 + V + KFB 270 A. vitis Vranje 2011. O/C-1 + V + KFB 271 A. vitis Vranje 2011. O/C-1 + V + KFB 272 A. vitis Aleksandrovac 2011. O/C-1 + V V KFB 273 A. vitis Aleksandrovac 2011. O/C-1 + V + KFB 274 A. vitis Aleksandrovac 2011. O/C-1 + V + KFB 099 A. vitis Mađarska 1981. V + + + KFB 0206 A. vitis Australija 1977. OL + + + KFB 096 At/B1 SAD 1958. N - + + KFB 0159 Ar/B2 Australija / NP - - - a At/B1, A. tumefaciens/biovar 1; Ar/B2, A. rhizogenes/biovar 2; b /, nema podataka; c O/C-1, O/C tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, O/C tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; N, nopalin tip; V, vitopin tip; NP, nepatogeni soj (bez pTi ili pRi); d +, pozitivna reakcija; -, negativna reakcija; V, varijabilna reakcija. 85 Ukupno 17 sojeva prouzrokovalo je razvoj simptoma na paradajzu, tri su bila negativna, dok je 16 sojeva izazvalo varijabilnu reakciju inokulisanih biljaka (Tabela 12; Slika 13). U testu patogenosti na suncokretu, pet sojeva je bilo pozitivno, jedan negativan, a varijabilnu reakciju izazvalo je 30 sojeva (Tabela 12; Slika 13). Kontrolni sojevi A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096) i A. vitis (KFB 099, KFB 0206) bili su pozitivni u testu patogenosti sa obe biljne vrste, dok na biljkama inokulisanim nepatogenim sojem A. rhizogenes/biovar 2 i SDV nije došlo do razvoja tumora. 5.5 Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike Proučavani sojevi A. vitis poreklom iz Srbije ispoljili su morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike osobene vrsti A. vitis. Proučavani sojevi su Gram-negativni, oksidaza-pozitivni, razvijaju se pri 35ºC i u hranljivoj podlozi sa 2% NaCl, ne proizvode 3-ketolaktozu iz laktoze, ne stvaraju prosvetljene zone na KDA podlozi sa dodatkom CaCO3, pokretljivi su pri pH 7,0, razvijaju se u podlozi sa feri amonijum citratom bez stvaranja karakterističnog crvenog pigmenta, koriste citrate, stvaraju kiselinu iz saharoze, ali ne i iz melezitoze, i stvaraju baze iz tartarata (Tabela 13; Slika 14). Jedina odstupanja zabeležena su kod testa stvaranja kiseline iz eritritola kao izvora ugljenika. Soj KFB 243 bio je pozitivan u ovom testu, što je prema podacima iz literature jedino odlika A. rhizogenes/biovar 2 sojeva. U ovom testu, pozitivan je bio i kontrolni soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), što je takođe u suprotnosti za literaturnim podacima. Slika 14. Biohemijske odlike proučavanih sojeva: Stvaranje 3-ketolaktoze (A) i formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 (B). 86 Tabela 13. Morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike proučavanih sojeva Test AvSa,b Kontrolni sojevib KFB 096 KFB 0159 KFB 099 Reakcija po Gramu - - - - Aktivnost oksidaze + + - + Razvoj pri 35°C + + - + Razvoj u podlozi sa 2% NaCl + + - + Stvaranje 3-ketolaktoze - + - - Formiranje prosvetljenih zona na KDA-CaCO3 - - + - Pokretljivost pri pH 7.0 - + + - Razvoj i pigmentacija u podlozi sa feri- amonijum-citratom - + - - Korišćenje citrata + - + + Stvaranje kiseline iz saharoze + + - + Stvaranje kiseline iz eritritola -c + + - Stvaranje kiseline iz melezitoze - + - - Stvaranje baze iz tartarata + - + + a Proučavani A. vitis sojevi poreklom iz Srbije; b +, pozitivna reakcija; -, negativna reakcija; c Soj KFB 243 bio je pozitivan u ovom testu. 5.6 Karakterizacija Ti plazmida U multipleks PCR reakciji sa PGF/PGR, VirFF1/VirFR2 i VirD2S4F716/VirD2S4R1036 prajmerima utvrđeno je da od ukupno 36 proučavanih sojeva poreklom iz Srbije, 35 poseduje O/C ili N tip, a jedan soj V tip pTi (Tabela 11). Dalja karakterizacija sojeva izvršena je korišćenjem prajmera specifičnih za svaki od opin tipova pTi kod A. vitis. Prajmerima TF/TR specifičnim za O/C tip pTi, umnoženi su karakteristični fragmenti kod 35 od ukupno 36 proučavanih sojeva, dok prajmerima NF/NR specifičnim za N tip pTi nije došlo do umnožavanja odgovarajućih fragmenata ni kod jednog proučavanog soja A. vitis poreklom iz Srbije (Tabela 11). Prajmerima visF/visR karakterističnim za V tip pTi, umnožen je odgovarajući fragment kod jedinog soja koji je bio negativan u PCR reakciji sa TF/TR prajmerima, odnosno soja čiji je pTi označen kao V tip u već gore pomenutoj multipleks PCR reakciji (Tabela 11). Dakle, na osnovu PCR analize, pTi kod 35 sojeva klasifikovan je kao O/C tip, jedan kao V tip, dok N tip pTi nije utvrđen (Tabela 11). U poglavlju 5.3.1 navedene su izvesne razlike među sojevima utvrđene korišćenjem prajmera specifičnih za ipt i tms2 gene, koji se nalaze na T-DNK. Od ukupno 36 proučavanih sojeva, jedino je kod 4 soja sa O/C tipom pTi došlo do 87 umnožavanja odgovarajućeg fragmenta korišćenjem ovih prajmera. Stoga su O/C sojevi kod kojih nije došlo do pozitivne reakcije korišćenjem ovih prajmera označeni kao O/C- 1, a oni kod kojih su umnoženi odgovarajući fragmenti obeleženi su kao O/C-2 (Tabela 11). Predmet analize bili su i referentni sojevi A. vitis poreklom iz međunarodnih kolekcija (Tabela 11). TF/TR prajmerima umnožen je karakterističan fragment jedino kod sojeva sa O/C tipom pTi, parom prajmera NF/NR kod onih sa N tipom pTi, dok je do specifičnog umnožavanja visF/visR prajmerima došlo jedino kod sojeva sa V tipom pTi. Kod nepatogenog soja KFB 0207 nije došlo do specifičnog umnožavanja ni sa jednim pomenutim prajmerom. Kod atipičnog soja KFB 0188 do pozitivne reakcije došlo je i sa TF/TR i visF/visR prajmerima. 5.7 Genetički diverzitet sojeva 5.7.1 RAPD i Rep-PCR RAPD i rep-PCR profili ukazuju na postojanje genetičkog diverziteta među proučavanim sojevima (Slika 15; Slika 16). Genetički profili dobijeni rep-PCR metodom bili su kompleksniji u odnosu na profile dobijene RAPD metodom. Takođe, rep-PCR metoda ispoljila je veću diskriminacionu moć u odnosu na RAPD. Ovom metodom bilo je moguće razlikovati sojeve koji su posedovali identične RAPD profile. Genetički profili dobijeni RAPD i rep-PCR metodom prevedeni su u binarnu matricu, nakon čega je izvedena filogenetska analiza i konstrukcija dendrograma. Filogenetskom analizom obuhvaćeni su podaci za svaki RAPD prajmer ponaosob (A9, A10, R13), a analizirana je i matrica formirana kombinacijom podataka za sva tri prajmera (A9-A10-R13). Posebno su analizirane i binarne matrice načinjene na osnovu REP-, ERIC- i BOX-PCR profila, a analizirana je i kombinovana matrica (REP-ERIC- BOX). Na ovaj način, među proučavanim sojevima diferencirano je više različitih genetičkih grupa (Tabela 14; Slika 17; Slika 18). RAPD i rep-PCR metodama diferencirane su uglavnom istovetne genetičke grupe, dok je položaj i raspored ovih grupa na dendrogramima bio različit, u zavisnosti od korišćene metode ili prajmera. Grupisanje sojeva bilo je jasnije i preciznije na filogenetskim stablima konstruisanim na osnovu kombinovanih podataka (A9-A10-R13; REP-ERIC-BOX), u odnosu na 88 filogenetska stabla zasnovana na podacima za pojedinačne prajmere (A9, A10, R13, REP, ERIC, BOX) (podaci nisu prikazani). Filogenetskom analizom, korišćenjem kombinovanih podataka za RAPD prajmere (A9-A10-R13), diferencirano je ukupno 13 genetičkih grupa koje su obeležene slovima A-M (Tabela 14; Slika 17). Sojevi poreklom iz Srbije bili su raspoređeni unutar 7 genetičkih grupa. Grupa C bila je najbrojnija, sastavljena od ukupno 38 sojeva, od kojih je 28 bilo poreklom iz Srbije, 3 iz Italije, 2 iz Poljske, i po jedan iz Mađarske, Moldavije, Crne Gore, Bugarske i Maroka (Tabela 14). Svi sojevi iz grupe C posedovali su O/C tip pTi, od kojih soj KFB 0100 OS tip pTi, soj KFB 0193 O/C-2 tip pTi, a svi ostali sojevi posedovali su O/C-1 tip pTi. Grupa F bila je druga po brojnosti, i sastojala se od 6 sojeva poreklom iz Srbije, Italije, Mađarske i Bugarske. Ova grupa bila je sastavljena uglavnom od sojeva koji su posedovali V tip pTi, uz izuzetak soja KFB 0188 koji je posedovao gene kako za V, tako i za O/C tip pTi. Preostali soj sa V tipom pTi (KFB 0185) formirao je posebnu grupu G. Grupi E pripadao je jedan soj poreklom iz Srbije (KFB 253) sa O/C-2 tipom pTi, i dva soja sa OL tipom pTi poreklom iz SAD (KFB 0204) i Australije (KFB 0206). Po tri soja poreklom iz Srbije pripadali su grupi J (KFB 264, KFB 265, KFB 266) i grupi L (KFB 250, KFB 251, KFB 252), od kojih je prva grupa posedovala O/C-2, a druga O/C-1 tip pTi. Grupa D sastojala se od dva soja poreklom iz Italije (KFB 0198, KFB 0199) sa O/C-1 tipom pTi, a grupa M od dva soja poreklom iz SAD (KFB 0203) i Mađarske (KFB 0205) sa N tipom pTi. Po jedan soj pripadao je grupi A (KFB 257), B (KFB 0192), i I (KFB 254), a svi oni su posedovali O/C-1 tip pTi. Grupi H pripadao je soj KFB 0202 sa O/C-2 tipom pTi, a grupi K nepatogeni soj KFB 0207. Filogenetskom analizom zasnovanom na podacima za svaki prajmer ponaosob, izdvojene su identične genetičke grupe (podaci nisu prikazani). Na osnovu kombinovanih podataka za REP-, ERIC- i BOX-PCR, grupisanje sojeva bilo je istovetno kao kod RAPD prajmera, ali uz nešto različitu topologiju filogenetskog stabla (Tabela 14; Slika 18). Filogenetskom analizom baziranom na REP- i BOX-PCR metodama, takođe su diferencirane identične genetičke grupe (podaci nisu prikazani). Međutim, kod ERIC-PCR metode postojalo je izvesno odstupanje, gde soj KFB 257 nije formirao posebnu genetičku grupu, već je bio grupisan zajedno sa predstavnicima rep-PCR grupe D, odnosno RAPD grupe C (podaci nisu prikazani). 89 Slika 15. RAPD profili dobijeni korišćenjem A9 (A), A10 (B) i R13 (C) prajmera. Brojevi iznad traka odgovaraju šiframa proučavanih sojeva iz KFB kolekcije, osim oznake 395.1/91 koja se odnosi na kolekciju OMP-BO. M1, marker (1 kb DNA Ladder, Promega, Madison, WI, USA); M2, marker (100bp DNA Ladder, Promega, Madison, WI, USA). 90 Slika 16. Rep-PCR profili dobijeni korišćenjem REP (A), ERIC (B) i BOX (C) prajmera. Brojevi iznad traka odgovaraju šiframa proučavanih sojeva iz KFB kolekcije, osim oznake 395.1/91 koja se odnosi na kolekciju OMP-BO. M1x, marker (O’GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Fermentas, Lithuania); M1, marker (1 kb DNA Ladder, Promega, Madison, WI, USA); traka M2, marker (100bp DNA Ladder, Promega, Madison, WI, USA). 91 Grupisanje sojeva na osnovu RAPD i rep-PCR metode uglavnom nije odgovaralo geografskom poreklu proučavanih sojeva. Međutim, pojedine genetičke grupe bile su sastavljene isključivo od sojeva istog geografskog porekla (Tabela 14). Sa druge strane, uočena je korelacija između genetičkih grupa i opin tipa pTi (Tabela 14). Slika 17. Dendrogram konstruisan na osnovu RAPD profila proučavanih sojeva A. vitis i referentnih Agrobacterium spp. korišćenjem UPGMA metode. Soj Pseudomonas viridiflava uključen je u analizu kao vrsta koja nije srodna Agrobacterium spp. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti veće od 85% (1000 ponavljanja). 92 Slika 18. Dendrogram konstruisan na osnovu rep-PCR profila proučavanih sojeva A. vitis i referentnih Agrobacterium spp. korišćenjem UPGMA metode. Soj Pseudomonas viridiflava uključen je u analizu kao vrsta koja nije srodna Agrobacterium spp. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti veće od 85% (1000 ponavljanja). 93 Tabela 14. Genetičke grupe diferencirane na osnovu RAPD i rep-PCR analize sojeva A. vitis Soj Geografsko poreklo Godina izolacijea Tip pTi b RAPD Rep-PCR KFB 239, KFB 240, KFB 241 Vršac 2010. O/C-1 C D KFB 242, KFB 244 Irig 2011. O/C-1 C D KFB 243 Irig 2011. V F I KFB 245, KFB 246 Negotin 2011. O/C-1 C D KFB 247, KFB 248 Vršac 2011. O/C-1 C D KFB 249 Smederevo 2011. O/C-1 C D KFB 250, KFB 251, KFB 252 Smederevo 2011. O/C-1 L J KFB 253 Smederevo 2011. O/C-2 E G KFB 254 Smederevo 2011. O/C-1 I K KFB 255, KFB 256, KFB 258, KFB 259, KFB 260, KFB 261 Šabac 2011. O/C-1 C D KFB 257 Šabac 2011. O/C-1 A C KFB 262, KFB 263 Vladimirci 2011. O/C-1 C D KFB 264, KFB 265, KFB 266 Vranje 2011. O/C-2 J M KFB 267, KFB 268 Bujanovac 2011. O/C-1 C D KFB 269, KFB 270, KFB 271 Vranje 2011. O/C-1 C D KFB 272, KFB 273, KFB 274 Aleksandrovac 2011. O/C-1 C D KFB 099 Mađarska 1981. V F I KFB 0100 Mađarska 1982. OS C D KFB 0171, KFB 0172 Poljska 2010. O/C-1 C D KFB 0185 Italija 1984. V G L KFB 0186 Italija 2003. V F I KFB 0187 Italija 2003. O/C-1 C D KFB 0188 Italija 2003. O/C, V F I KFB 0189 Moldavija 2004. O/C-1 C D KFB 0190 Italija 2005. O/C-1 C D KFB 0191 Crna Gora 2005. O/C-1 C D KFB 0192 Italija 2006. O/C-1 B B KFB 0193 Vršac, Srbija 2006. O/C-2 C D KFB 0194 Vršac, Srbija 2006. O/C-1 C D KFB 0195 Bugarska 2006. O/C C D KFB 0196 Bugarska 2006. V F I KFB 0197 Italija 2007. O/C-1 C D KFB 0198 Italija 2007. O/C-1 D E KFB 0199 Italija 2011. O/C-1 D E KFB 0200 Italija 2011. V F I KFB 0201 Maroko 2011. O/C-1 C D KFB 0202 Hrvatska 2006. O/C-2 H A KFB 0203 SAD 1979. N M F KFB 0204 SAD 1984. OL E G KFB 0205 Mađarska 1982. N M F KFB 0206T Australija 1977. OL E G KFB 0207 Južna Afrika / NP K H a /, nema podataka; c O/C-1, O/C tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, O/C tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; OS, O/C tip pTi sa skraćenim TA-DNK regionom N, nopalin tip; V, vitopin tip; NP, nepatogeni soj (bez pTi ili pRi). 94 5.7.2 Analiza konstitutivnih gena Analizirano je ukupno 22 reprezentativna soja A. vitis, predstavnika glavnih genetičkih grupa diferenciranih na osnovu rep-PCR i RAPD metode. Nakon poravnanja sekvenci dnaK (537 bp), gyrB (539 bp) i recA (564 bp) genskih lokusa nisu detektovane praznine ili insercije. Rezultati analize diverziteta među nukleotidnim sekvencama za pojedinačne genske lokuse, kao i za kombinaciju sva tri proučavana lokusa predstavljeni su u Tabeli 15. Posebno su predstavljeni razultati za sve proučavane sojeve A. vitis poreklom iz Srbije i one poreklom iz inostranstva. Vrednosti indeksa diverziteta ukazuju da je nukleotidni polimorfizam unutar proučavane populacije najveći za recA lokus, zatim sledi dnaK lokus, dok je najmanji stepen diverziteta u slučaju gyrB gena. Procenat polimorfnih mesta iznosio je 9,31, 9,83, 12,41 i 10,55, redom za dnaK, gyrB, recA i kombinovanu sekvencu. Broj različitih alela za dnaK genski lokus iznosio je 10, dok je za gyrB i recA iznosio 11. Ukoliko se posmatra kombinovana sekvenca sva tri genska lokusa (1640 bp), broj različitih tipova sekvenci među svim proučavanim A. vitis sojevima iznosio je 12, kod sojeva poreklom iz Srbije 6, a kod onih iz međunarodnih kolekcija 9. Osam tipova sekvenci bilo je predstavljeno pojedinačnim sojem, dok su ostali bili predstavljeni sa 2-6 sojeva (Tabela 16). Najbrojniji je bio tip sekvence 1, predstavljen sa 6 sojeva. Tabela 15. Analiza diverziteta nukleotidnih sekvenci proučavanih sojeva A. vitis Kategorija Genski lokus Broj analiziranih sekvenci Broj različitih haplotipova Dužina sekvence % GC Broj (%) polimorfnih mesta Indeks diverziteta (π) Svi proučavani sojevi A. vitis dnaK 22 10 537 bp 58,0 50 (9,31) 0,03224 gyrB 22 11 539 bp 59,2 53 (9,83) 0,03018 recA 22 11 564 bp 56,3 70 (12,41) 0,04169 Svi 22 12 1640 bp 57,8 173 (10,55) 0,03481 Sojevi poreklom iz Srbije dnaK 8 5 537 bp 58,0 38 (7.08) 0,03252 gyrB 8 6 539 bp 59,0 36 (6,68) 0,02968 recA 8 6 564 bp 56,1 49 (8,69) 0,04173 Svi 8 6 1640 bp 57,7 123 (7,5) 0,03476 Sojevi poreklom iz međunarodnih kolekcija dnaK 14 8 537 bp 58,0 46 (8,57) 0,03180 gyrB 14 8 539 bp 59,3 46 (8,53) 0,03083 recA 14 8 564 bp 56,3 65 (11,52) 0,04341 Svi 14 9 1640 bp 57,9 157 (9,57) 0,03547 95 Procenat sličnosti između sekvenci proučavanih A. vitis sojeva kretao se u granicama 94,6-100 (dnaK), 95-100 (gyrB), 92,1-100 (recA) i 93,9-100 (dnaK-gyrB- recA). Filogenetska stabla dobijena NJ i ML metodom posedovala su slične topologije, te su prikazana samo ML filogenetska stabla za pojedinačne sekvence dnaK, gyrB i recA gena, kao i za njihovu kombinaciju (Slika 19; 20; 21; 22). Sojevi A. vitis činili su jasno izdvojenu grupu u odnosu na ostale Agrobacterium sp. koji su bili predmet filogenetske analize (Slika 19; 20; 21; 22). Međutim, filogenetska stabla (dnaK, gyrB, recA, dnaK-gyrB-recA) nisu bila saglasna među sobom. Na osnovu kombinovane sekvence dnaK, gyrB i recA gena i pojedinačnog recA genskog lokusa izdvojene su identične genetičke grupe (Slika 19; 22). U slučaju dnaK i gyrB genskih lokusa grupisanje sojeva bilo je nešto drugačije (Slika 20; 21). Ipak, filogenija zasnovana na kombinovanim sekvencama dnaK, gyrB i recA, zbog većeg broja genetičkih informacija, uzeta je kao referentna. Na filogenetskom stablu (recA-dnaK-gyrB) razlikovale su se 4 genetičke grupe: A, B, C i D (Slika 19). Grupa A bila je najbrojnija i sastojala se isključivo od sojeva sa O/C tipom pTi, koji su vodili poreklo iz Srbije (KFB 239, KFB 253, KFB 257, KFB 262), Italije (KFB 0187, KFB 0197), Poljske (KFB 0171), Mađarske (KFB 0100), SAD (KFB 0204) i Australije (K309/KFB 0206). Grupa B (9 sojeva) sastojala se uglavnom iz sojeva sa V tipom pTi, poreklom iz Srbije (KFB 243), Italije (KFB 0185, KFB 0186, KFB 0200), Bugarske (KFB 0196) i Mađarske (S4), ali i sojeva sa O/C tipom pTi poreklom iz Srbije (KFB 250, KFB 254, KFB 264). Jedini predstavnik grupe C bio je soj sa O/C tipom pTi, poreklom iz Hrvatske (KFB 0202). Dva soja sa N tipom pTi poreklom iz SAD (KFB 0203) i Mađarske (KFB 0205), bili su jedini predstavnici genetičke grupe D. Filogenetsko stablo konstruisano na osnovu sekvence dnaK genskog lokusa imalo je drugačiju topologiju, što je bilo posebno izraženo kod sojeva predstavnika gore definisanih genetičkih grupa A i B, koji su u ovom slučaju bili drugačije grupisani (Slika 20). gyrB filogenetsko stablo posedovalo je gotovo identičnu topologiju kao kod kombinovane sekvence (recA-dnaK-gyrB), ali genetičke grupe A, B, C i D nisu bile podržane visokim “bootstrap” vrednostima (Slika 21). U slučaju recA filogenetskog stabla, gore definisane genetičke grupe A, B, C i D bile su jasno izdvojene i imale su visoke “bootstrap” vrednosti (98-100), ali je njihov raspored na filogenetskom stablu bio nešto drugačiji (Slika 22). 96 Slika 19. Dendrogram konstruisan na osnovu kombinovanih parcijalnih sekvenci (1640 bp) dnaK, gyrB i recA gena korišćenjem ML metode. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti (1000 ponavljanja). Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Sojevi proučavani u ovom radu označeni su podebljano. Pored imena vrste i oznake soja, naveden je i tip pTi. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvenci soja B. japonicum USDA 110. 97 Slika 20. Dendrogram konstruisan na osnovu parcijalne sekvence (537 bp) dnaK gena korišćenjem ML metode. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti (1000 ponavljanja). Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Sojevi proučavani u ovom radu označeni su podebljano. Pored imena vrste i oznake soja, naveden je i tip pTi. Pristupni brojevi navedeni su u zagradi. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvenci soja B. japonicum USDA 110. 98 Slika 21. Dendrogram konstruisan na osnovu parcijalne sekvence (539 bp) gyrB gena korišćenjem ML metode. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti (1000 ponavljanja). Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Sojevi proučavani u ovom radu označeni su podebljano. Pored imena vrste i oznake soja, naveden je i tip pTi. Pristupni brojevi navedeni su u zagradi. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvenci soja B. japonicum USDA 110. U ovom radu nije uočena korelacija između geografskog porekla sojeva i genetičkih grupa određenih na osnovu parcijalnih nukleotidnih sekvenci dnaK, gyrB i recA gena. Takođe, potpuna korelacija nije uočena ni između genetičkih grupa i opin tipa pTi. Iako su genetičke grupe A, C i D bile sastavljene iz sojeva koji su posedovali O/C ili N tip pTi, grupi B pripadali su sojevi kako sa O/C, tako i sa V tipom pTi. 99 Slika 22. Dendrogram konstruisan na osnovu parcijalne sekvence (564 bp) recA gena korišćenjem ML metode. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti (1000 ponavljanja). Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Sojevi proučavani u ovom radu označeni su podebljano. Pored imena vrste i oznake soja, naveden je i tip pTi. Pristupni brojevi navedeni su u zagradi. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvenci soja B. japonicum USDA 110. 100 Tabela 16. Alelni profili, genetičke grupe i pristupni brojevi sojeva A. vitis korišćenih u filogenetskoj analizi Soj Geografsko poreklo Godina izolacije Tip Ti plazmidaa Tip sekvence Alelni profil Genetička grupa (dnaK-gyrB- recA) Pristupni brojb recA dnaK gyrB dnaK gyrB recA KFB 239 Vršac 2010. O/C-1 1 1 1 1 A KF751136 KF751156 KF751116 KFB 243 Irig 2011. V 2 2 2 2 B KF751137 KF751157 KF751117 KFB 250 Smederevo 2011. O/C-1 3 3 3 3 B KF751138 KF751158 KF751118 KFB 253 Smederevo 2011. O/C-2 4 4 4 4 A KF751139 KF751159 KF751119 KFB 254 Smederevo 2011. O/C-1 5 5 5 5 B KF751140 KF751160 KF751120 KFB 257 Šabac 2011. O/C-1 1 1 1 1 A KF751141 KF751161 KF751121 KFB 262 Vladimirci 2011. O/C-1 1 1 1 1 A KF751142 KF751162 KF751122 KFB 264 Vranje 2011. O/C-2 6 5 6 6 B KF751143 KF751163 KF751123 KFB 099 (S4) Mađarska 1981. V 7 6 2 7 B NC_011989b NC_011989b NC_011989b KFB 0100 Mađarska 1982. OS 1 1 1 1 A KF751135 KF751155 KF751115 KFB 0171 Poljska 2010. O/C-1 1 1 1 1 A KF751150 KF751171 KF751124 KFB 0185 Italija 1984. V 8 7 7 8 B KF751144 KF751164 KF751125 KFB 0186 Italija 2003. V 9 2 8 7 B KF751145 KF751165 KF751126 KFB 0187 Italija 2003. O/C-1 1 1 1 1 A KF751146 KF751166 KF751127 KFB 0196 Bugarska 2006. V 2 2 2 2 B KF751147 KF751167 KF751128 KFB 0198 Italija 2007. O/C-1 10 8 9 9 A KF751148 KF751168 KF751129 KFB 0200 Italija 2011. V 9 2 8 7 B KF751149 KF751169 KF751130 KFB 0202 Hrvatska 2006. O/C-2 11 9 10 10 C KF751151 KF751170 KF751131 KFB 0203 SAD 1979. N 12 10 11 11 D KF751152 KF751173 KF751132 KFB 0204 SAD 1984. OL 4 4 4 4 A KF751153 KF751174 KF751133 KFB 0205 Mađarska 1982. N 12 10 11 11 D KF751154 KF751172 KF751134 KFB 0206T (K309T) Australija 1977. OL 4 4 4 4 A AY752739 b KF751175 FR847962b a O/C-1, O/C tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, O/C tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; OS, O/C tip pTi sa skraćenim TA-DNK regionom N, nopalin tip; V, vitopin tip; b Pristupni brojevi objavljeni u drugim studijama. 101 5.7.3 Analiza 16S-23S rRNK ITS regiona Prajmerima FGPS1490-72/FGPL132' umnoženi su fragmenti 16S-23S rRNK ITS regiona, čija je veličina varirala u zavisnosti od proučavanog soja. RFLP analizom umnoženih fragmenata ustanovljeno je ukupno 12 različitih grupa među 36 proučavanih sojeva A. vitis poreklom iz naše zemlje i 12 iz inostranstva (Tabela 17, Slika 23). Većina sojeva poreklom iz Srbije, ukupno 21, i jedan iz SAD, pripadalo je RFLP grupi 1. RFLP grupe 1, 2, 3, 5 i 7 bile su heterogene po pitanju geografskog porekla, odnosno sastavljene iz sojeva poreklom kako iz Srbije, tako i iz inostranstva. Sa druge strane, preostale RFLP grupe bile su sastavljene samo od sojeva poreklom iz Srbije (RFLP grupe 4 i 6) ili samo iz inostranstva (RFLP grupe 8, 9, 10, 11 i 12). Svaka od grupa bila je sastavljena od sojeva koji su posedovali samo jedan opin tip pTi. Restrikcionim enzimima BsuRI i TaqI diferencirano je ukupno 6 i 8 grupa ponaosob, dok je nešto veći stepen diferencijacije bio u slučaju HhaI restrikcionog enzima, kojim je ustanovljeno 9 različitih grupa (Tabela 17; Slika 23). Sekvencionom analizom 16S-23S rRNK ITS regiona obuhvaćeno je ukupno 20 sojeva, bar po jedan predstavnik iz svake RFLP grupe i ovi sojevi su naznačeni u Tabeli 17. Dobijeni hromatogrami nisu ukazivali na postojanje polimorfizma među ITS regionima unutar pojedinačnih sojeva. Obradom i poravnanjem sekvenci izdvojeni su unutrašnji fragmenti 16S-23S rRNK ITS regiona koji su korišćeni za dalju analizu i dostavljeni banci gena pod pristupnim brojevima navedenim u Tabeli 17. Veličina ovih fragmenata razlikovala se u zavisnosti od proučavanog soja i kretala se 1094-1249 bp (Tabela 17). Unutar ovih fragmenata, po pravilu, nalazili su se tRNKIle i tRNKAla geni. Nukleotidna sekvenca tRNK gena bila je identična kod svih proučavanih sojeva. Procenat sličnosti između sekvenci 16S-23S rRNK ITS regiona proučavanih A. vitis sojeva kretala se u granicama 89,82-100. Na filogenetskom stablu, sojevi A. vitis formirali su pet filogenetskih grupa (Slika 24). Grupa A sastojala se od sojeva poreklom iz Srbije, Australije, Mađarske i SAD, koji su isključivo posedovali O/C pTi. Ovoj grupi 102 Slika 23. RFLP profili amplifikovanih fragmenata 16S-23S rRNK ITS regiona kod proučavanih A. vitis sojeva, dobijeni korišćenjem TaqI (A), BsuRI (B) i HhaI (C) restrikcionih enzima. Traka M, marker (MassRuler LowRange DNA Ladder, Fermentas, Lithuania) 103 Slika 24. Dendrogram konstruisan na osnovu parcijalne sekvence 16S-23S rRNK ITS regiona korišćenjem NJ metode. Uz čvorišta su naznačene “bootstrap” vrednosti (1000 ponavljanja). Dužina grana odgovara stopi supstitucija baznih parova. Sojevi proučavani u ovom radu označeni su podebljano. Pored imena vrste i oznake soja, naveden je i tip pTi. Pristupni brojevi navedeni su u zagradi. Filogenetsko stablo ukorenjeno je korišćenjem sekvenci soja R. rhizogenes K84. 104 pripadali su takođe i soj Ag63 i G-Ag-60 čije su sekvence preuzete iz banke gena i za koje nema podataka o opin tipu pTi. Grupi B pripadao je jedino soj G-Ag-27 (lokus B) poreklom iz Japana. Sojevi G-Ag-27 (lokus C), K-Ag-1 i G-Ag-37 poreklom iz Japana činili su filogenetsku grupu C koja se odlikovala identičnim sekvencama. Filogenetskoj grupi D pripadali su sojevi iz Srbije, Japana, Mađarske i SAD, a bili su zastupljeni svi opin tipovi pTi (O/C, N i V). Unutar grupe D izdvojila su se dva klastera sastavljena od sojeva čije su ITS sekvence ispoljile visok procenat identiteta ili su bile u potpunosti identične. Prvom klasteru pripadali su sojevi KFB 264 poreklom iz Srbije sa O/C pTi, kao i KFB 0174 i KFB 0179 poreklom iz SAD, koji su redom posedovali N i V pTi. Drugi klaster formirala su četiri soja poreklom iz Srbije (KFB 243), Japana (G-Ag-19), Mađarske (KFB 099) i SAD (KFB 0176), od kojih je tri posedovalo V pTi, dok za soj iz Japana nije bilo podataka o opin tipu pTi (Slika 24). Filogenetska grupa E sastojala se od tri soja poreklom iz SAD, među kojima su bila zastupljena sva tri opin tipa pTi. Korelacija između pojedinih grupa i geografskog porekla sojeva nije uočena, ako se izuzme da su grupe B i C pripadali samo sojevi poreklom iz Japana, a filogenetskoj grupi E sojevi poreklom iz SAD. Takođe, korelacija nije uočena ni između specifičnog ITS genotipa i opin tipa pTi. Međutim u slučaju grupe A i posebnog klastera vitopin sojeva unutar grupe D, postojala je povezanost između određenog ITS genotipa i opin tipa pTi. 105 Tabela 17. RFLP i sekvenciona analiza 16S-23S ITS regiona sojeva A. vitis Soja Geografsko poreklo Godina izolacije Tip Ti plazmidab RFLP profil ITS regiona RFLP grupa (ITS) Dužina sekvencic Pristupni broj u banci genac TaqI BsuRI HhaI KFB 239, KFB 240, KFB 241 Vršac 2010. O/C-1 1 1 1 1 1094 bp AB860004 KFB 242, KFB 244 Irig 2011. O/C-1 1 1 2 2 1094 bp AB860005 KFB 243 Irig 2011. V 2 2 2 3 1237 bp AB860006 KFB 245, KFB 246 Negotin 2011. O/C-1 1 1 1 1 / / KFB 247, KFB 248 Vršac 2011. O/C-1 1 1 1 1 / / KFB 249 Smederevo 2011. O/C-1 1 1 2 2 / / KFB 250, KFB 251, KFB 252 Smederevo 2011. O/C-1 3 3 3 4 1189 bp AB860007 KFB 253 Smederevo 2011. O/C-2 1 1 4 5 1094 bp AB860008 KFB 254 Smederevo 2011. O/C-1 2 4 2 6 1230 bp AB860009 KFB 255, KFB 256, KFB 257, KFB 258, KFB 259, KFB 260, KFB 261 Šabac 2011. O/C-1 1 1 1 1 1094 bp AB860010 KFB 262, KFB 263 Vladimirci 2011. O/C-1 1 1 1 1 1094 bp AB860011 KFB 264, KFB 265, KFB 266 Vranje 2011. O/C-2 4 3 3 7 1249 bp AB860012 KFB 267, KFB 268 Bujanovac 2011. O/C-1 1 1 2 2 1094 bp AB860013 KFB 269, KFB 270, KFB 271 Vranje 2011. O/C-1 1 1 1 1 / / KFB 272 Aleksandrovac 2011. O/C-1 1 1 2 2 / / KFB 273, KFB 274 Aleksandrovac 2011. O/C-1 1 1 1 1 / / KFB 0173 SAD 1979. N 5 5 5 8 1180 bp AB859995 KFB 0174 SAD 1979. N 6 2 6 9 1249 bp AB859996 KFB 0175 SAD 1981. V 5 5 7 10 1174 bp AB859997 KFB 0176 SAD 1983. V 2 2 2 3 1237 bp AB859998 KFB 0204 SAD 1984. OL 1 1 4 5 1094 bp AB859999 KFB 0178 SAD 1985. OL 7 6 8 11 1142 bp AB860000 KFB 0179 SAD 1981. V 4 3 3 7 1249 bp AB860001 KFB 0180 SAD 1984. OS 8 1 9 12 1125 bp AB860002 KFB 0182 SAD 1986. OS 1 1 1 1 1094 bp AB860003 KFB 0100 Mađarska 1982. OS 1 1 2 2 1094 bp AB859994 KFB 099 Mađarska 1981. V 2 2 2 3 1237 bp NC_011989 KFB 0206 Australija 1977. OL 1 1 4 5 1095 bp U45329 a Sojevi kod kojih je sekvenciran 16S-23S rRNK ITS region u ovom radu obeleženi su podebljano; b O/C-1, O/C tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, O/C tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; OS, O/C tip pTi sa skraćenim TA-DNK regionom N, nopalin tip; V, vitopin tip; c Odnosi se na sojeve kod kojih je sekvenciran 16S-23S rRNK ITS region. Predstavljena je dužina sekvenci nakon obrade i poravnanja. 106 5.8 Osetljivost prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5) U ovom radu utvrđene su razlike u inhibitornom uticaju antagonističkog soja KFB 0207 (F2/5), prema proučavanim sojevima A. vitis poreklom iz Srbije. Sojevi KFB 250 i KFB 253 bili su osetljivi prema antagonističkom soju, i izmerena je zona inhibicije 3-5 mm (Tabela 18; Slika 25). Kod sojeva KFB 243, KFB 257, KFB 262 i KFB 267 nije došlo do potpune inhibicije razvoja testiranog soja (Tabela 18; Slika 25). Sa druge strane, sojevi KFB 239, KFB 242, KFB 254 i KFB 263 bili su potpuno neosetljivi prema uticaju antagonističkog soja (Tabela 18). Zona inhibicije kod kontrolnog soja A. vitis KFB 0206 (K+) iznosila je 3 mm, dok je soj A. tumefaciens/biovar 1 KFB 096 (K-) bio neosetljiv (Tabela 18; Slika 25). Tabela 18. Osetljivost proučavanih sojeva prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5) Soj Vrstaa Geografsko poreklo Godina izolacije Tip Ti plazmidab Prečnik zone inhibicije (mm)c KFB 239 A. vitis Vršac 2010. O/C-1 0 KFB 242 A. vitis Irig 2011. O/C-1 0 KFB 243 A. vitis Irig 2011. V 3d KFB 250 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 5 KFB 253 A. vitis Smederevo 2011. O/C-2 3 KFB 254 A. vitis Smederevo 2011. O/C-1 0 KFB 257 A. vitis Šabac 2011. O/C-1 3d KFB 262 A. vitis Vladimirci 2011. O/C-1 3d KFB 264 A. vitis Vranje 2011. O/C-2 0 KFB 267 A. vitis Bujanovac 2011. O/C-1 3d KFB 0206 A. vitis Australija 1977. OL 3 KFB 096 At/B1 SAD 1958. N 0 a At/B1, A. tumefaciens/biovar 1; b O/C-1, O/C tip pTi kod koga nije došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; O/C-2, O/C tip pTi kod koga je došlo do specifičnog umnožavanja sa ipt i tms2 prajmerima; OL, oktopin/kukumopin tip pTi sa kompletnim TA-DNK regionom; N, nopalin tip; V, vitopin tip; c Prosečna vrednost; d Zona inhibicije nije bila jasna, već je u manjoj meri došlo do razvoja testiranih sojeva. 107 Slika 25. Osetljivost prema antagonističkom soju KFB 0207 (F2/5). Zona inhibicije kod kontrolnog soja KFB 0206 (A) i proučavanog soja KFB 253 (B). Inhibicija kod proučavanog soja KFB 267 bila je delimična (C). Zona inhibicije kod kontrolnog soja KFB 096 je izostala (D). 108 6. DISKUSIJA Bakteriozni rak vinove loze je oboljenje koje je poznato još od sredine 18. veka i prisutno je u većini područja intenzivnog gajenja ove biljne vrste (Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). Zbog svoje destruktivnosti, ovo oboljenje je i dalje od izuzetnog fitopatološkog značaja. Štete se mogu ogledati u značajnom smanjenju bujnosti i prinosa zaraženih čokota (Schroth i sar., 1988), a posebno negativno utiče na rasadničku proizvodnju. Glavni uzročnik bakterioznog raka vinove loze je vrsta A. vitis, čiji je prirodni krug domaćina ograničen na ovu biljnu vrstu. U ređim slučajevima, ovo oboljenje mogu prouzrokovati patogeni sojevi A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2 i nedavno opisana vrsta R. nepotum, koji pored vinove loze mogu parazitirati i druge biljne vrste (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Panagopoulos i sar., 1978; Süle, 1978; Burr i Katz, 1983; 1984; Thies i sar., 1991; Ridé i sar., 2000; Argun i sar., 2002; Genov i sar., 2006a; Bini i sar., 2008b; Lόpez i sar., 2008; Kawaguchi i Inoue, 2009; Palacio-Bielsa i sar., 2009; Puławska i sar., 2012a; Rouhrazi i Rahimian, 2012a; Abdellatif i sar., 2013). U Srbiji, bakteriozni rak vinove loze prvi put je uočen 1962. godine, u trsteničkom vinogorju, na sorti Kardinal uveženoj iz Italije (Panić, 1973; 1977). Smatra se da je bolest tada u našu zemlji zapravo i uneta iz Italije, putem zaraženog sadnog materijala (Panić, 1973). Masovna pojava bakterioznog raka i prevremeno sušenje čokota dovelo je do krčenja pojedinih vinograda. Nešto kasnije, iz obolelih biljaka vinove loze sa područja Horgoša izolovani su sojevi bakterija koji su na osnovu tada dostupnih metoda identifikovani kao A. tumefaciens (Arsenijević i sar., 1974). U tom periodu sojevi iz vinove loze još uvek nisu bili izdvojeni kao posebna vrsta/biovar. Od trenutka kad je prvi put utvrđen, bakteriozni rak bio je uglavnom sporadično prisutan u našim vinogradima. Stoga se ovo oboljenje i bakterija prouzrokovač nisu kod nas intenzivnije proučavali duži niz godina. Međutim, poslednjih nekoliko godina, u većini vinogradarskih rejona primećena je izražena pojava bakterioznog raka, uz visoku stopu zaraženih biljaka. Posebno su bili zahvaćeni mladi vinogradi, starosti 2-4 godine. Tipični simptomi koji su se ispoljili na zaraženim čokotima bili su snažan pokazatelj da 109 se radi o bakterioznom raku vinove loze. Sve navedeno ukazivalo je da je bolest raširena putem zaraženog sadnog materijala, koji je uglavnom vodio poreklo iz uvoza. Kako bi se izvršila pravilna i pouzdana dijagnoza oboljenja, odnosno potvrdila pretpostavka da bakteriozni rak vinove loze u Srbiji prouzrokuju fitopatogene vrste roda Agrobacterium, pristupilo se prikupljanju uzoraka, izolaciji i identifikaciji prouzrokovača. Kao najpogodnije vreme za uzorkovanje pokazao se period od septembra do decembra, kada su na zaraženim čokotima prisutni aktivni i krupni tumori, koji su se razvili tokom tekuće sezone. Ključno je obezbediti vitalno tkivo tumora, iz koga bi se uspešnije mogao izolovati patogen. U ovom radu izolacija je izvršena iz fragmenata tkiva tumora na YMA podlogu. Iako neselektivna, YMA podloga bila je pogodna za izolaciju bakterija, pri čemu je posebna pažnja posvećena dezinfekciji biljnog materijala. Sa druge strane, patogeni sojevi Agrobacterium spp. takođe mogu biti izolovani iz uzoraka zemljišta u blizini zaraženih čokota, a A. vitis i iz soka ksilema zaraženih simptomatičnih i asimptomatičnih biljaka (Burr i Katz, 1983; 1984; Szegedi i Bottka, 2002). Za pojedine Agrobacterium vrste/biovare razvijene su poluselektivne, selektivne i/ili diferencijalne podloge, koje su posebno značajne pri izolaciji bakterija iz uzoraka zemljišta (Moore i sar., 2001). Tumorogenost Agrobacterium spp. određena je prisustvom pTi u genomu bakterije (Van Larebeke i sar., 1974; Watson i sar., 1975). Taksonomija vrsta roda Agrobacterium prvenstveno se zasnivala samo na njihovim patogenim odlikama, što nije pouzdan kriterijum, budući da su plazmidi mobilni genetički elementi. Novija klasifikacija zasnovana je na jasnim i stabilnim odlikama sojeva vezanim za hromozomsku DNK. U ovom radu, diferencijacija patogenih od nepatogenih sojeva i identifikacija do nivoa vrste/biovara izvršena je primenom kako molekularnih metoda, tako i klasičnih bakterioloških testova. Utvrđeno je da bakteriozni rak vinove loze u Srbiji prouzrokuju isključivo tumorogeni sojevi A. vitis. S obzirom da su u svetu iz obolelih biljaka vinove loze izolovani tumorogeni sojevi koji su pripadali drugim Agrobacterium spp., nije isključeno njihovo prisustvo u našoj zemlji. Od ukupno 62 simptomatična uzorka vinove loze analizirana u ovom radu, kod 52 je utvrđeno prisustvo patogena. Neuspešnost izolacije iz 10 uzoraka može se objasniti činjenicom da u tumorima koji se 110 normalno razvijaju ne moraju biti prisutne vitalne ćelije patogena, imajući u vidu genetički karakter infekcije. Molekularne metode, pre svega PCR, omogućavaju brzu detekciju pTi i/ili pRi, odnosno diferencijaciju sojeva do nivoa vrste/biovara. Budući da su u literaturi utvrđeni izvesni nedostaci po pitanju specifičnosti, u ovom radu je prilikom izvođenja PCR metode kombinovano više prajmera u cilju povećanja pouzdanosti detekcije. Specifičnost prajmera primenjenih u molekularnoj identifikaciji sojeva izolovanih u našoj zemlji, zatim je proučena korišćenjem 36 referentnih sojeva A. vitis poreklom iz drugih evropskih zemalja, Severne Amerike, Afrike i Australije. U analizi su korišćeni i sojevi A. tumefaciens/biovar 1, A. rhizogenes/biovar 2, A. rubi, A. larrymoorei, R. skierniewicense i R. nepotum kao kontrole. Preliminarna identifikacija sojeva izolovanih u ovom istraživanju izvedena je primenom PCR metode sa prajmerima specifičnim za virC gen (VCF3/VCR3), koji se nalazi na pTi ili pRi, i prajmerima komplementarnim hromozomskom pehA genu (PGF/PGR), karakterističnom za vrstu A. vitis (Szegedi i Bottka, 2002; Suzaki i sar., 2004). U ranijim istraživanjima, VCF3/VCR3 prajmeri ispoljili su visok stepen specifičnosti prema širokom krugu patogenih Agrobacterium spp. (Suzaki i sar., 2004; Kawaguchi i sar., 2005; Kumagai i Fabritius, 2008; Kawaguchi i Inoue, 2009; Süle i sar., 2012), dok su PGF/PGR prajmeri bili pouzdani u diferencijaciji vrste A. vitis (Szegedi i Bottka, 2002; Bini i sar., 2008b; Kumagai i Fabritius, 2008). U ovom radu, VCF3/VCR3 i PGF/PGR prajmeri korišćeni su istovremeno u dupleks PCR reakciji (Kumagai i Fabritius, 2008), i na ovaj način je za dalji rad izdvojeno ukupno 36 reprezentativnih sojeva, identifikovanih kao patogeni A. vitis. Kada se u obzir uzmu i rezultati dobijeni sa referentnim sojevima A. vitis, ova kombinacija prajmera u dupleks PCR reakciji veoma je pogodna i može se smatrati univerzalnom metodom za rutinsku identifikaciju patogenih A. vitis. Pored tumorogenih A. vitis, VCF3/VCR3 prajmerima detektovan je pTi ili pRi plazmid kod svih proučavanih patogenih Agrobacterium sp. Korišćenjem dupleks PCR metode sa prajmerima specifičnim za virD2 (A/C’) i ipt (CYT/CYT’) gen (Haas i sar., 1995), nisu dobijeni potpuno dosledni rezultati. Kod pojedinih sojeva, pored specifičnih, umnoženi su i nespecifični fragmenti, što ukazuje na nedostatke ovih prajmera ili na potrebu da se optimizuju uslovi reakcije. Iako su sa A/C’ prajmerima umnoženi odgovarajući fragmenti kod svih 36 proučavanih sojeva 111 izolovanih u našoj zemlji, kod pojedinih sojeva signal je bio vrlo slab, što je ukazivalo na nedostatak homologije između prajmera i ciljane sekvence na genomu bakterije. Slična zapažanja po pitanju specifičnosti A/C’ prajmera zabeležena su u literaturi (Bini i sar., 2008b; Kumagai i Fabritius, 2009). Prajmerima CYT/CYT’ odgovarajući fragmenti umnoženi su samo kod 4 soja. U PCR reakciji sa prajmerima specifičnim za tms2 gen (tms2F1/tms2R2; Puławska i sar., 2005), takođe je samo kod ova 4 soja došlo do specifičnog umnožavanja. Činjenica da sa CYT/CYT’ i tms2F1/tms2R2 prajmerima nije došlo do pozitivne reakcije kod većine sojeva ukazuje na nespecifičnost ovih prajmera ili izostanak ipt i tms2 gena kod ove grupe sojeva. Slični rezultati zabeleženi su i u slučaju analiziranih referentnih A. vitis sojeva. U multipleks PCR reakciji sa kombinacijom prajmera specifičnih za virF (VirFF1/VirFR2), virD2 (VirD2S4F716/VirD2S4R1036) i pehA (PGF/PGR) gene (Bini i sar., 2008b), svih 36 proučavanih sojeva iz Srbije su identifikovani kao tumorogeni A. vitis. Ovom metodom dobijeni su očekivani rezultati i kada su analizirani referentni A. vitis sojevi poreklom iz međunarodnih kolekcija. Prednost ove metode je to što se istovremeno vrši i delimična karakterizacija sojeva u pogledu opin tipa pTi. Međutim, nedostatak ove metode, koja je razvijena prvenstveno za detekciju i identifikaciju patogenih Agrobacterium spp. iz vinove loze, predstavlja nedovoljna specifičnost prema sojevima A. tumefaciens/biovar 1 sa N tipom pTi, koji se takođe mogu javiti na ovoj biljnoj vrsti (Bini i sar., 2008b). Prajmerima specifičnim za hromozomski 23S rRNK gen (Puławska i sar., 2006), takođe su identifikovani svi proučavani sojevi A. vitis izolovani u okviru ovog istraživanja, a ovi prajmeri su bili specifični i prema svim referentnim A. vitis sojevima. Klasifikacija prokariota može se izvršiti analizom sličnosti između genskih sekvenci ribozomalne RNK (rRNK), pre svega 16S rRNK (Woese, 1987). Uprkos brojnim prednostima ove metode, klasifikacija samo na osnovu ovog kriterijuma nije dovoljna. Ukoliko postoji visok stepen sličnosti između sekvenci rRNK gena kod dva soja, potrebno je primeniti i druge metode kako bi se utvrdilo da li su analizirani sojevi dovoljno slični da bi bili označeni kao ista vrsta (Gevers i sar., 2005). Tako je metoda bazirana na analizi sekvenci 16S rRNK gena nedovoljna da bi se razlikovale genomske vrste A. tumefaciens/biovar 1 (Mougel i sar., 2002), koje su diferencirane na osnovu DNK-DNK hibridizacije (Popoff i sar., 1994), AFLP metode (Portier i sar., 2006) ili 112 sekvencione analize recA konstitutivnog gena (Costechareyre i sar., 2010; Shams i sar., 2013). Ipak, u literaturi nisu zabeleženi ovakvi slučajevi kada je u pitanju vrsta A. vitis. Stoga je u cilju potkrepljenja rezultata dobijenih PCR analizom sojeva, izvršeno sekvenciranje i analiza 16S rRNK gena odabranog soja poreklom iz naše zemlje. Parcijalna nukleotidna sekvenca 16S rRNK gena soja KFB 239 ispoljila je visok stepen nukleotidne sličnosti (99-100%) sa sekvencama drugih sojeva vrste A. vitis dostupnim u banci gena, dok je na dendrogramu konstruisanom na osnovu filogenetske analize ovaj soj bio grupisan zajedno sa referentnim sojevima A. vitis. Taksonomska pripadnost proučavanih sojeva dalje je potvrđena primenom klasičnih bakterioloških metoda, odnosno biohemijsko-fizioloških testova. Takođe, proučene su i morfološke i odgajivačke osobine sojeva. Ove metode su pouzdane, jednostavne i jeftine, te i dalje zauzimaju značajno mesto u procesu identifikacije bakterija. Međutim, mogu biti vremenski vrlo zahtevne i stoga u današnje vreme sve više bivaju zamenjene molekularnim metodama. Svi proučavani sojevi ispoljili su morfološke, odgajivačke i biohemijsko-fiziološke odlike karakteristične za vrstu A. vitis. Jedini izuzetak bio je soj KFB 243, koji je i pri ponavljanju testa stvaranja kiseline iz eritritola kao izvora ugljenika ispoljio odlike svojstvene vrsti A. rhizogenes/biovar 2. Takođe, u ovom testu je bio pozitivan i kontrolni soj A. tumefaciens/biovar 1 (KFB 096), što prema literaturnim podacime nije odlika ove vrste. Imajući u vidu ove nedoslednosti, kao i da je poslednjih godina opisano nekoliko novih vrsta iz roda Agrobacterium/Rhizobium, postoji potreba da se izvrši ponovna procena pogodnosti postojećih i eventualno uključivanje novih dijagnostičkih testova. U okviru ovog istraživanja, primenom PCR analize diferencirani su patogeni sojevi i utvrđeno je prisustvo pTi u njihovom genomu. Na ovaj način zapravo su determinisane izvesne genetske predispozicije za patogenezu. Imajući ovo u vidu, molekularne metode se mogu koristiti samo u rutinskoj i preliminarnoj analizi sojeva. Stoga je u cilju potvrde rezultata dobijenih PCR analizom, izveden test patogenosti. Mada može biti vremenski veoma zahtevan, ovaj test je jedini pouzdan način da se utvrde patogene odlike sojeva. S obzirom da patogenost sojeva nije uvek moguće testirati na biljci iz koje je soj izolovan, izbor test biljaka može biti kritičan faktor u izvođenju ogleda. Pri tome posebno treba imati u vidu podatak da među patogenim sojevima roda Agrobacterium mogu postojati razlike u spektru domaćina (Anderson i 113 Moore, 1979). Još u prvim studijama koje su se bavile tumorogenim Agrobacterium spp. iz vinove loze, uočeno je da ovi sojevi imaju spektar domaćina pretežno ograničen na biljku iz koje su izolovani (Panagopoulos i Psallidas, 1973; Panagopoulos i sar., 1978). U ovom istraživanju, test patogenosti izveden je na vinovoj lozi, suncokretu i paradajzu. Od ukupno 36 proučavanih sojeva izolovanih u ovom radu, 34 je ispoljilo patogenost na biljkama vinove loze (cv. Cabernet Sauvignon). Međutim, dva soja (KFB 241, KFB 247) bila su negativna u testu patogenosti, iako je PCR analizom utvrđeno da poseduju pTi. U literaturi je ranije saopšteno da pojedini sojevi A. vitis mogu biti specijalizovani prema određenim sortama vinove loze (Knauf i sar., 1982). Međutim, ovi sojevi su izolovani iz iste sorte vinove loze koja je korišćena za test patogenosti, te je razlog izostanka pozitivne reakcije, i posle ponavljanja testa, ostao nepoznat. U cilju potvrde etiologije oboljenja, iz biljke inokulisane sojem KFB 239 izvršena je reizolacija bakterija i njihova ponovna identifikacija korišćenjem PCR metode, čime su ispunjeni svi Kohovi postulati. Za proveru patogenosti proučavanih sojeva u ovom radu korišćene su i biljke suncokreta i paradajza. Za razliku od vinove loze, u ovom slučaju zabeležene su značajne razlike među proučavanim sojevima. Pored sojeva koji su bili pozitivni ili negativni, definisana je i treća kategorija sojeva koji su izazivali varijabilnu reakciju na test biljakama. Varijabilnom reakcijom smatrani su simptomi koji su odstupali od tipične pozitivne, odnosno negativne reakcije, ili su uočene razlike u intenzitetu simptoma, kako unutar pojedinačnog ogleda, tako i među različitim ponavljanjima. Kako bi se ustanovio razlog ovih varijacija, potrebno je sprovesti dodatna istraživanja koja bi podrazumevala analizu odnosa patogen - inokulisana biljka. Uzevši u obzir dobijene rezultate, može se zaključiti da je vinova loza, kao prirodni domaćin, najpouzdanija biljka za test patogenosti. Korišćenje suncokreta i paradajza kao test biljaka, i pored bržeg razvoja simptoma, ne može se preporučiti kao pouzdan test. Komparativne studije genoma bakterija ukazuju da se genom bakterija sastoji iz dva nezavisna, ali isprepletana dela: sržnog i fleksibilnog genoma (Hacker i Carniel, 2001). Sržnom delu pripadaju geni koji su prisutni u svim sojevima i koji imaju ulogu u osnovnim životnim funkcijama. Fleksibilni deo genoma može biti varijabilan među sojevima jedne vrste, i njemu pripadaju geni vezani za virulentnost, rezistenciju na 114 antibiotike i mobilni genetički elementi (npr. plazmidi). Ranije pomenuti ribozomalni i konstitutivni geni nalaze se na hromozomima i pripadaju tzv. sržnom delu genoma. Međutim, u ekološkim studijama i studijama koje se bave patogenim karakteristikama sojeva i odnosima između patogena i biljke domaćina, kao predmet molekularne analize mogu se koristiti fragmenti gena koji pripadaju fleksibilnom delu genoma. U ovom radu, predmet analize bile su sekvence na pTi i hromozomima (PCR, PCR-RFLP, sekvenciranje), ali i kompletna genomska DNK (RAPD, rep-PCR). Karakterizacija pTi podrazumevala je određivanje opin tipa kod 36 proučavanih sojeva izolovanih u ovom radu. Iako ima ograničen značaj, ovaj pristup se tradicionalno koristi pri klasifikaciji sojeva, odnosno njihovih pTi ili pRi (Dessaux i sar., 1998; Matthysse, 2006; Otten i sar., 2008). S obzirom da su sojevi A. vitis na osnovu opin tipa pTi podeljeni u tri glavne grupe: O/C, N i V tip (Szegedi i sar., 1988; Paulus i sar. 1989a), u okviru ovog istraživanja izvedena je PCR analiza sekvenci koje su karakteristične za svaku od ovih grupa. Na ovaj način, od ukupno 36 proučavanih sojeva, pTi 35 sojeva klasifikovan je kao O/C tip, jedan kao V tip, dok N tip pTi nije utvrđen. Slične rezultate dobili su Genov i sar. (2006b), proučavajući populaciju A. vitis u Bugarskoj. Ovi rezultati bili su delimično u skladu i sa rezultatima iz Mađarske (Szegedi, 2003) i Francuske (Ridé i sar., 2000), gde su takođe dominantni bili sojevi sa O/C tipom pTi, s tim da je tamo prisutan i N tip pTi. Prema podacima Bini i sar. (2008b), u Italiji, kao i u našoj zemlji, nije utvrđen N tip pTi unutar proučavane populacije A. vitis. Uzimajući u obzir i rezultate prethodno izvedene PCR analize, pTi sojeva kod kojih nije došlo do specifičnog umnožavanja sa prajmerima specifičnim za ipt (CYT/CYT’) i tms2 (tms2F1/tms2R2) gene (Haas i sar., 1995; Puławska i sar., 2005), označeni su kao O/C-1, a oni kod kojih su umnoženi odgovarajući fragmenti obeleženi su kao O/C-2. Između ostalih, predmet analize bili su i referentni sojevi kod kojih je T- DNK karakterisana po pitanju svoje strukture, što se pre svega odnosi na one sa O/C tipom pTi (Otten i sar., 1996). Naime, O/C tip T-DNK se može podeliti na dve podgrupe: jednu sa kompletnim TA-DNK (OL) i drugu sa skraćenim TA-DNK regionom (OS), gde izostaju TA-iaaM, TA-iaaH, ili ipt geni (Paulus i sar., 1989a; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 1999). Kasnije je utvrđeno postojanje i još jednog O/C tipa T- DNK, svojstvenog soju CG474 (Otten i sar., 1996; Burr i sar., 1998; Burr i Otten, 115 1999). Do specifičnog umnožavanja sa prajmerima specifičnim za ipt i tms2 gene došlo je kod sojeva sa OL tipom pTi, dok kod onih sa OS tipom to nije bio slučaj. Imajući ovo u vidu, može se pretpostaviti da svi ostali sojevi, kod kojih nije došlo do specifičnog umnožavanja pomenutim prajmerima (O/C-1) poseduju OS tip pTi, dok oni koji su označeni kao pozitivni (O/C-2) poseduju OL tip pTi. Međutim, detaljnija analiza je neophodna kako bi se definitivno utvrdio tip T-DNK kod ovih sojeva. Budući da su izuzetno rasprostranjene, sposobne da naseljavaju različite životne sredine i parazitiraju širok krug gajenih i šumskih biljaka, Agrobacterium spp. poseduju veoma visoku stopu genetičkog diverziteta. Analiza genetičkog diverziteta može doprineti razumevanju taksonomije, strukture i dinamike populacije fitopatogenih bakterija i obezbediti okvir za razvoj osetljivih, specifičnih i brzih metoda za detekciju patogena i dijagnozu bolesti, što je preduslov za kontrolu oboljenja (Louws i sar., 1999). U okviru ovog istraživanja korišćene su metode kojima se vrši analiza kompletnog genoma (RAPD, Rep-PCR), a analiziran je i diverzitet pojedinačnih fragmenata prisutnih na hromozomskoj DNK (16S-23S rRNK ITS region, konstitutivni geni) primenom RFLP metode i sekvenciranjem. RAPD metoda, sa prajmerima koji su korišćeni u ovoj disertaciji, već je primenjivana u proučavanju genetičkog diverziteta A. vitis u Kanadi i SAD, na osnovu čega je ustanovljen značajan genetički diverzitet unutar ove vrste (Irelan i Meredith, 1996; Momol i sar., 1998). U filogenetskoj analizi A. vitis, takođe je korišćena i rep- PCR metoda (ERIC i BOX-PCR), čime je izdvojeno više genetičkih grupa, među sojevima poreklom pretežno iz Japana (Kawaguchi i sar., 2008). S obzirom da su se pokazale podesnim za analizu genetičkog diverziteta A. vitis, ove metode su primenjene i u ovom radu. Filogenetskom analizom, zasnovanoj na RAPD metodi sa tri vrste prajmera (A9, A10, R13) i rep-PCR metodi (REP-, BOX-, ERIC-PCR), ustanovljen je visok stepen genetičkog diverziteta među sojevima A. vitis poreklom iz Srbije. Obe metode bile su gotovo podjednako pogodne za analizu genetičkog diverziteta A. vitis. Međutim, rep- PCR metoda ispoljila je veću diskriminacionu moć, jer su na ovaj način ustanovljene razlike i među sojevima koji su posedovali identične RAPD profile. Takođe, rezultati dobijeni RAPD i rep-PCR metodom bili su u velikoj meri saglasni među sobom i diferencirane su uglavnom istovetne genetičke grupe. Korišćenjem kombinovanih 116 podataka (A9-A10-R13; REP-ERIC-BOX) u filogenetskoj analizi, omogućena je jasnija i preciznija diferencijacija genetičkih grupa, koje su bile podržane visokim “bootstrap” vrednostima na filogenetskom stablu. Na ovaj način, među 63 proučavana soja A. vitis, diferencirano je ukupno 13 različitih genetičkih grupa. Sojevi poreklom iz Srbije bili su raspoređeni unutar 7 genetičkih grupa i uglavnom grupisani zajedno sa sojevima poreklom iz međunarodnih kolekcija. Međutim, izdvojene su i dve grupe sastavljene isključivo od sojeva poreklom iz Srbije. Rezultati rep-PCR i RAPD analize ukazivali su na postojanje klonalnih grupa među proučavanim sojevima A. vitis. To se pre svega odnosi na RAPD grupu C, odnosno rep-PCR grupu D, koja je bila prilično homogena i zauzimala dominantno mesto po broju sojeva. Ova grupa sastavljena je od 38 sojeva različitog geografskog porekla, izolovanih u periodu 2003-2011. godine, izuzimajući soj KFB 0100, koji je izolovan 1982. godine. Iako su bili izuzetno raznovrsni u pogledu geografskog porekla, ovi sojevi bili su genotipski srodni, te se može pretpostaviti da imaju isto poreklo, odnosno da potiču iz istog izvora zaraze. U daljem radu, detaljnije su proučeni filogenetski odnosi među reprezentativnim sojevima A. vitis, predstavnicima glavnih grupa definisanih na osnovu rep-PCR i RAPD metode. Takođe je izvršeno poređenje ovih sojeva sa drugim srodnim sojevima Agrobacterium/Rhizobium kompleksa. Predmet analize bili su unutrašnji fragmenti tri konstitutivna gena: dnaK, gyrB i recA. Ovaj pristup ranije je korišćen u proučavanju genetičkog diverziteta kod Agrobacterium spp. (Kawaguchi i sar., 2008; Costechareyre i sar., 2010; Aujoulat i sar., 2011; Puławska i Kałużna, 2011; Shams i sar., 2013). Rezultati analize nukleotidnih sekvenci svakog pojedinačnog genskog lokusa, kao i njihove kombinacije (dnaK-gyrB-recA), ukazuju na postojanje genetičkog diverziteta među proučavanim sojevima. Nukleotidni diverzitet bio je najviši za recA gen, gde je procenat polimorfnih mesta iznosio 12,14, dok je za dnaK i gyrB bio nešto manji i iznosio redom 9,48 i 9,83. Procenat polimorfnih mesta za sekvencu dnaK gena, unutar proučavane populacije A. vitis, bio je značajno niži u odnosu na sojeve A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa poreklom iz životne sredine i kliničkih uzoraka, gde je iznosio 14 (Aujoulat i sar., 2011). Procenat sličnosti između sekvenci dnaK, gyrB i recA gena, kretao se, redom, u granicama 94,6-100, 95-100 i 92,1-100. Nešto veći stepen genetičkog diverziteta utvrđen je kod sojeva pripadnika A. tumefaciens/biovar 1 117 kompleksa gde je procenat sličnosti gyrB sekvenci bio u granicama 88-100, dok je vrsta A. rhizogenes/biovar 2 bila homogenija, sa procentom sličnosti gyrB gena većim od 98,5 (Puławska i Kałużna, 2011). Ukupno 10 (dnaK), odnosno 11 (gyrB i recA) različitih alela detektovano je za sva tri genska lokusa, dok je broj različitih tipova sekvenci iznosio 12. Tip sekvence 1 bio je najbrojniji i predstavljen sa šest sojeva (KFB 239, KFB 257, KFB 262, KFB 0100, KFB 0171, KFB 0187). Ovih šest sojeva A. vitis izolovani su u periodu 1982- 2011. godine u različitim evropskim zemljama. Tip sekvence 4 bio je predstavljen sa tri soja (KFB 253, KFB 0204, KFB 0206) koji su izolovani na tri kontinenta u periodu od 35 godina. Mada je neophodna dalja analiza, koja bi uključila još konstitutivnih gena, moguće je da ove grupe predstavljaju klonalne komplekse. Određivanje klonalnih kompleksa se može postići MLST metodom, koja podrazumeva analizu uglavnom 7 genskih lokusa (Maiden i sar., 1998; Enright i Spratt, 1999). Klonalni kompleks je prvenstveno definisan kao grupa sojeva koja ima isti tip sekvence određen na osnovu 7 genskih lokusa (Enright i Spratt, 1999). Kasnije je definicija doživela određene modifikacije, te se klonalnim kompleksom smatrala grupa sojeva u kojoj svaki soj deli bar pet identičnih alela, od ukupno sedam, sa bar još jednim genotipom u grupi (Feil i sar., 2001). Feil i sar. (2004) smatraju, međutim, da definicija klonalnog kompleksa treba da bude fleksibilna i da zavisi od odlika proučavane vrste. Na filogenetskom stablu zasnovanom na podacima za kombinovanu sekvencu dnaK, gyrB i recA, gena, proučavani sojevi A. vitis formirali su monofiletičku grupu, jasno različitu od ostalih Agrobacterium/Rhizobium vrsta. Među proučavanim sojevima A. vitis, izdvojene su četiri genetičke grupe, podržane visokim “bootstrap” vrednostima. Iste grupe, uz nešto drugačiji raspored na filogenetskom stablu, izdvojene su kada je u filogenetskoj analizi korišćena sekvenca recA gena. Stoga se korišćenjem ovog genskog lokusa, može izvršiti preliminarna analiza filogenetskih odnosa unutar vrste A. vitis. Analiza recA gena pokazala se podesnom i u identifikaciji i diferencijaciji vrsta A. tumefaciens/biovar 1 kompleksa (Costechareyre i sar., 2010; Shams i sar., 2013). Sa druge strane, filogenetsko stablo konstruisano na osnovu dnaK genskog lokusa imalo je drugačiju topologiju u odnosu na ono kod recA, gyrB ili kombinovane (recA-dnaK- gyrB) sekvence. Ovakve neusaglašenosti između filogenija mogu biti posledica rekombinacija koje se odigravaju kod bakterija (Posada i sar., 2002). 118 RAPD i rep-PCR metodama analiziraju se genomske sekvence raspoređene unutar kompletnog genoma, koje iz uglavnom nepoznatih razloga evoluiraju veoma brzo (Maiden i sar., 1998). Na ovaj način mogu se detektovati mikrovarijacije među sojevima, te su ove metode pogodne za proučavanje kratkoročne epidemiologije. Sa druge strane, konstitutivni geni evoluiraju veoma sporo, što ih čini pogodnim za karakterizaciju patogena u studijama koje se bave dugoročnom, odnosno globalnom epidemiologijom (Maiden i sar., 1998; Enright i Spratt, 1999). Razlike u diskriminacionoj moći ove dve metode mogu se posmatrati na primeru genetičke grupe B, određene na osnovu analize konstitutivnih gena. Unutar ove grupe, procenat sličnosti kombinovane sekvence dnaK, gyrB i recA gena bio je u granicama 96,5-100. Međutim, kada su primenjene metode RAPD i rep-PCR, predstavnici ove genetičke grupe posedovali su među sobom izrazito različite genetičke profile. Analiza 16S-23S rRNK ITS regiona, koji može biti značajno varijabilan u pogledu veličine i nukleotidne sekvence, pokazao se posebno korisnim u grupisanju Agrobacterium spp. (Ponsonnet i Nesme, 1994; Otten i sar., 1996; Burr i sar., 1999; Argun i sar., 2002; Peluso i sar., 2003; Raio i sar., 2004; Genov i sar., 2006b; Bautista- Zapanta i sar., 2009). Stoga je ovaj pristup korišćen u cilju daljeg proučavanja filogenetskih odnosa među sojevima A. vitis, izolovanih u našoj zemlji. U ovaj segment istraživanja uključeni su i sojevi A. vitis poreklom iz međunarodnih kolekcija, predstavnici hromozomskih grupa definisanih na osnovu PCR-RFLP analize 16S rRNK gena i 16S-23S rRNK ITS regiona (Otten i sar., 1996). Predmet analize u ovom radu bili su unutrašnji fragmenati 16S-23S rRNK ITS regiona, a korišćene su metode PCR-RFLP i sekvenciranje. Sekvenciranjem ovog regiona su na precizniji način utvrđeni filogenetski odnosi među proučavanim sojevima, za razliku od većine prethodnih studija gde je korišćena jedino PCR-RFLP metoda. U ovom radu, proučavani sojevi razlikovali su se po pitanju veličine i nukleotidne sekvence ITS regiona. Moguće je da su razlike u veličini ovog regiona posledica insercija ili delecija koje su se odigrale tokom evolucije. Iako je kod pojedinačnih sojeva A. vitis utvrđeno postojanje polimorfizma među rrn operonima unutar njihovog genoma (Bautista-Zapanta i sar., 2009), to nije bio slučaj kod sojeva proučavanih u ovoj doktorskoj disertaciji. PCR-RFLP metodom, korišćenjem BsuRI, HhaI i TaqI restrikcionih enzima, izdvojeno je ukupno 12 različitih grupa među proučavanim sojevima A. vitis. Ovom 119 metodom je na relativno brz, jeftin i jednostavan način izvršena diferencijacija sojeva na osnovu ITS regiona. Sedam grupa utvrđeno je među sojevima poreklom iz Srbije, od kojih su dve bile jedinstvene i nisu ustanovljene među proučavanim sojevima poreklom iz međunarodnih kolekcija. Ovi rezultati bili su u skladu sa rezultatima dobijenim RAPD i rep-PCR metodama, kojima je među sojevima iz naše zemlje takođe diferencirano 7 različitih genetičkih grupa. Metodom sekvenciranja određen je redosled baznih parova ITS regiona kod bar jednog predstavnika iz svake RFLP grupe. Unutar ovog regiona nalazili su se tRNKIle i tRNKAla geni koji su bili visoko konzervirani. Filogenetskom analizom, izdvojeno je pet genetičkih grupa među proučavanim sojevima. Unutar ovih grupa bili su prisutni posebni klasteri sastavljeni od sojeva izolovanih u različitom vremenskom periodu i u različitim geografskim rejonima, ali čija je sekvenca ITS regiona bila identična. Npr. klaster unutar genetičke grupe A, bio je sastavljen od četiri soja, od kojih je tri korišćeno u ovom radu (KFB 253, KFB 0204, KFB 0206). Soj KFB 253 izolovan je 2011. godine u Srbiji, KFB 0204 1984. godine u SAD, dok je soj KFB 0206 izolovan 1977. godine u Australiji. Ova tri soja posedovala su isti tip sekvence i u slučaju konstitutivnih gena, odnosno identičnu sekvencu dnaK, gyrB i recA gena, što može biti još jedan pokazatelj da se radi o klonalnom kompleksu unutar vrste A. vitis. Izuzimajući genetičke grupe sastavljene isključivo od sojeva poreklom iz Japana, nije ustanovljena jasna veza između pojedinih ITS grupa i geografskog porekla sojeva. Slično je bilo i kod RAPD i rep-PCR metode, kao i kod sekvencione analize konstitutivnih gena, gde grupisanje sojeva nije odražavalo njihovo geografsko poreklo. Ovo je u skladu sa glavnim načinom širenja patogena, a to je putem zaraženog sadnog materijala. U svetskim okvirima, trgovina loznim kalemovima posebno je intenzivna, još od pojave filoksere krajem 19. veka i uvođenja tehnologije kalemljenja u vinogradarstvo. Naša zemlja nije izuzetak, a u poslednjih 10 godina, loznim kalemovima poreklom iz inostranstva zasnovan je veliki broj vinograda. Potpuna korelacija nije uočena ni između ITS genotipa i opin tipa pTi. Tako su ITS grupama D i E pripadali sojevi koji su posedovali sva tri opin tipa pTi. Uz to, sojevi KFB 264, KFB 0174 i KFB 0179 posedovali su gotovo identične ITS sekvence, ali su među njima bili zastupljeni svi tipovi pTi. Međutim, pojedine ITS grupe i klasteri bili su sastavljeni od sojeva koji su posedovali jedan određen tip pTi. Ovo je bio slučaj kod 120 ITS grupe A sastavljene isključivo od O/C sojeva ili posebnog klastera vitopin sojeva unutar grupe D. Čini se da u prirodi ne dolazi do nasumične ramene različitih tipova pTi među sojevima A. vitis, već postoji izvesna povezanost između hromozomske DNK i određenog pTi. Imajući u vidu da su ovi sojevi izolovani u periodu 1979-2011. (ITS grupa A), ili 1981-2011. godine (klaster vitopin sojeva unutar ITS grupe D), odnosno da je ovakva kombinacija hromozomske i plazmidne DNK ustaljena kroz dugi niz godina, može se pretpostaviti da u ovom slučaju postoji snažna povezanost između pojedinih pTi i bakterije domaćina. Korelacija između RFLP profila ITS regiona i opin tipa pTi različitih A. vitis sojeva je uočena i u prethodnim studijama (Paulus i sar., 1989b; Otten i sar., 1996; Genov i sar., 2006b), a sličan vid korelacije uočen je i kada je analiziran 5’ region 23S rRNK gen primenom PCR-RFLP metode (Momol i sar., 1998). Kada su primenjene metode RAPD i rep-PCR, uočen je visok stepen korelacije između genetičkih grupa i opin tipa pTi. Povezanost između RAPD profila i opin tipa pTi zabeležili su i drugi autori, analizirajući sojeve A. vitis raznovrsnog geografskog porekla (Momol i sar., 1998). Sa druge strane, kada su kod reprezentativnih sojeva izdvojenim metodama RAPD i rep-PCR, analizirani i konstitutivni geni, nije uočena potpuna korelacija između genetičkih grupa i opin tipa pTi. Genetičke grupe A, C, D i E bile su sastavljene od sojeva koji su posedovali jedan tip pTi, ali su unutar genetičke grupe B bili prisutni sojevi kako sa O/C, tako i sa V tipom pTi. Ovaj vid neusaglašenosti, pre svega, posledica je razlika između metoda RAPD i rep-PCR sa jedne strane, i analize konstitutivnih gena sa druge strane, o čemu je ranije posebno diskutovano. Na osnovu genetičke analize odabrano je 10 reprezentativnih sojeva poreklom iz Srbije, prema kojima je testiran antagonistički efekat soja KFB 0207 (F2/5). Proučavani sojevi reagovali su različito na uticaj antagonističkog soja. Kod pojedinih sojeva došlo je do inhibicije, kod nekoliko sojeva inhibicija je bila delimična, dok su pojedini bili potpuno neosetljivi. Međutim, nije poznato da li su ove razlike među sojevima posledica aktivnosti gena prisutnih na hromozomskoj ili plazmidnoj DNK, ili oboje. Neosetljivost pojedinih sojeva A. vitis na inhibitorni efekat korišćenog antagonističkog soja zabeležena je i u prethodnim studijama (Burr i Reid, 1994). Rezultati dobijeni u ovoj doktorskoj disertaciji imaju za krajnji cilj da doprinesu razvoju održive strategije kontrole bakterioznog raka vinove loze u našoj zemlji. 121 Korišćenjem različitih pristupa, prvenstveno PCR metode, postavljen je okvir za razvoj protokola za brzu, osetljivu i pouzdanu detekciju i identifikaciju patogena. Analizom genetičkog diverziteta detaljno su proučeni filogenetski odnosi među proučavanim sojevima, ali su i rasvetljena pojedina pitanja vezana za ekologiju patogena i epidemiologiju oboljenja. Pre svega, genotipska srodnost sojeva poreklom iz naše zemlje sa proučavanim sojevima iz inostranstva, ukazuje na njihovo zajedničko poreklo. U ovom radu utvrđeno je postojanje klonalnih grupa unutar proučavane populacije, a postojale su i snažne indicije o prisustvu klonalnih kompleksa unutar vrste A. vitis. Takođe, još jednom je potvrđeno postojanje povezanosti između hromozomske i plazmidne DNK kod vrste A. vitis. 122 7. ZAKLJUČAK Na osnovu rezultata dobijenih tokom ovih istraživanja, može se zaključiti sledeće: • Kao prouzrokovač bakterioznog raka vinove loze u Srbiji identifikovan je isključivo tumorogeni A. vitis. • Molekularne metode, pre svega PCR, pokazale su se pogodnim za rutinsku i preliminarnu identifikaciju sojeva A. vitis, dok su primenom klasičnih bakterioloških metoda potvrđeni ovi rezultati. • Među proučavanim sojevima A. vitis poreklom iz Srbije ustanovljene su genetičke razlike, vezane kako za hromozomsku, tako i plazmidnu DNK. • Genotipska srodnost sojeva poreklom iz naše zemlje sa proučavanim sojevima iz inostranstva, ukazuje na njihovo zajedničko poreklo. • Korišćenjem metoda RAPD i rep-PCR, kao i sekvenciranjem tri konstitutivna gena (dnaK, gyrB i recA) i 16S-23S rRNK ITS regiona, utvrđeno je postojanje klonalnih grupa unutar proučavane populacije, a postoje i snažne indicije o prisustvu klonalnih kompleksa unutar vrste A. vitis. • Ustanovljena je povezanost između hromozomske i plazmidne DNK kod pojedinih genetičkih grupa unutar vrste A. vitis. 123 8. LITERATURA Abdellatif, E., Valentini, F., Janse, J.D., Bouri, M., Rhouma, A., Chebil, S., D’Onghia, A.M. (2013): Occurrence of crown gall of the grapevine in Tunisia and characterization of Tunisian Agrobacterium vitis and A. tumefaciens strains. Journal of Plant Pathology 95, 115-126. Al-Momani, F., Abussaud, M. (1990): Characterization of Agrobacterium tumefaciens biotypes isolated from Jordan. Pakistan Journal of Botany 22, 79-84. Al-Momani, F., Albasheer, S., Saadoun, I. (2006): Distribution of Agrobacterium tumefaciens Biovars in Jordan and Variation of Virulence. Plant Pathology Journal 22, 318-322. Alarcon, B., Lόpez, M.M., Cambra, M., Ortiz, J. (1987): Comparative study of Agrobacterium biotypes 1, 2 and 3 by electrophoresis and serological methods. Journal of Applied Bacteriology 62, 295-308. Albiach, M.R., Lόpez, M.M. (1992): Plasmid heterogeneity in Spanish isolates of Agrobacterium tumefaciens from thirteen different hosts. Applied and Environmental Microbiology 58, 2683-2687. Alconero, R. (1980): Crown gall of peaches from Maryland, South Carolina, and Tennessee and problems with biological control. Plant Disease 64, 835-838. Al-Karablieh, N., Khlaif , H., Al Banna, L. (2006): Identification of Agrobacterium tumefaciens strains by PCR-RFLP analysis of the 16S-rDNA. Jordan Journal of Agricultural Science 2, 209-221. Alippi, A.M., López, A.C., Balatti, P.A. (2009): First Report of Agrobacterium rubi and A. rhizogenes Causing Crown and Root Gall and Hairy Root on Blueberry in Argentina. Plant Disease 94, 1064.3-1065. Alippi, A.M., López, A.C., Balatti, P.A. (2012): Diversity among agrobacteria isolated from diseased plants of blueberry (Vaccinium corymbosum) in Argentina. European Journal of Plant Pathology 134, 415-430. 124 Allardet-Servent, A., Michaux-Charachon, S., Jumas-Bilak, E., Karayan, L., Ramuz, M. (1993): Presence of one linear and one circular chromosome in the Agrobacterium tumefaciens C58 genome. Journal of Bacteriology 175, 7869-7874. Allen, O.N., Holding, A.J. (1974): Genus II. Agrobacterium. In: Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. Eds. R.E. Buchanan, N.E. Gibbons. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, pp. 264-267. Amaya, R.A., Edwards, M.S. (2003): Agrobacterium radiobacter bacteremia in pediatric patients: case report and review. The Pediatric Infectious Disease Journal 22, 183-186. Anderson, A.R., Moore, L.W. (1979): Host specificity in the genus Agrobacterium. Phytopathology 69, 320-323. Argun, N., Momol, M., Maden, S., Momol, E., Reid, C., Celek, H., Burr, T.J. (2002): Characterisation of Agrobacterium vitis strains isolated from Turkish grape cultivars in the central Anatolia region. Plant Disease 86, 162-166. Arsenijević, M. (1989): Agrobacterium tumefaciens parazit pitome kupine (Rubus sp.). Kongres mikrobiologov Jugoslavije (VI), 11-15.09., Maribor. Zbornik povzetkov, 53. Arsenijević, M. (1997): Bakterioze biljaka. S Print, Novi Sad. Arsenijević, M., Stojić, J., Panić, M. (1974): Prilog proučavanju bakterioznog raka (Agrobacterium tumefaciens) vinove loze u Jugoslaviji. Zaštita bilja 128-129, 257- 264. Aujoulat, F., Jumas-Bilak, E., Masnou, A., Sallé, F., Faure, D., Segonds, C., Marchandin, H., Teyssier, C. (2011): Multilocus sequence-based analysis delineates a clonal population of Agrobacterium (Rhizobium) radiobacter (Agrobacterium tumefaciens) of human origin. Journal of Bacteriology 193, 2608-2618. Banta, L.M., Bohne, J., Lovejoy, S.D., Dostal, K. (1998): Stability of the Agrobacterium tumefaciens VirB10 protein is modulated by growth temperature and periplasmic osmoadaption. Journal of Bacteriology 180, 6597-6606. 125 Bauer, C., Schulz, T.F., Lorenz, D., Eichhorn, K.W., Plapp, R. (1994): Population dynamics of Agrobacterium vitis in two grapevine varieties during the vegetation period. Vitis 33, 25-29. Bautista-Zapanta, J.N., Arafat, H.H., Tanaka, K., Sawada, H., Suzuki, K. (2009): Variation of 16S-23S internally transcribed spacer sequence and intervening sequence in rDNA among the three major Agrobacterium species. Microbiological Research 164, 604-612. Bazzi, C., Burr, T.J. (1986): La rogna della vite. Informatore Fitopatologico 36, 11-14. Bazzi, C., Piazza, C., Burr, T.J. (1987): Detection of Agrobacterium tumefaciens in grapevine cuttings. EPPO Bulletin 17, 105-112. Bazzi, C., Minardi, P., Burr, T.J., Katz, B.H., Bishop, A.L., Blanchard, L.M. (1988): Monoclonal and polyclonal antibodies in a comparative serological study of Agrobacterium Conn. biovars. Phytopathologia Mediterranea 27, 51-56. Beauchamp, C.J., Chilton, W.S., Dion, P., Antoun, H. (1990): Fungal catabolism of crown gall opines. Applied and Environmental Microbiology 56, 150-155. Beauchamp, C.J., Kloepper, J. W. Lifshitz, R. Dion, P., Antoun. H. (1991): Frequent occurrence of the ability to utilize octopine in rhizobacteria. Canadian Journal of Microbiology 37, 158-164. Beijerinck. M.W., van Delden, A. (1902): Ueber die Assimilation des freien Stickstoffs durch Bakterien. Zentralblatt für Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene II 9, 3-43. Benjama, P.A., El Gadda, M., El Boustani, E., El Modafar, C., Nesme, X., Cubero, J. (2004): Détection moléculaire spécifique de la région vir du plasmide pTi d’Agrobacterium tumefaciens dans les sols et plants au Maroc. EPPO Bulletin 34, 403-406. Bernaerts, M.J., De Ley, J. (1963): A biochemical test for crown gall bacteria. Nature 197, 406-407. 126 Bien, E., Lorenz, D., Eichhorn, K., Plapp, R. (1990): Isolation and characterization of Agrobacterium tumefaciens from the German vineregion Rheinpfalz. Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 97, 313-322. Bini, F., Geider, K., Bazzi, C. (2008a): Detection of Agrobacterium vitis by PCR using novel virD2 gene-specific primers that discriminate two subgroups. European Journal of Plant Pathology 122, 403-411. Bini, F., Kuczmog, A., Putnoky, P., Otten, L., Bazzi, C., Burr, T.J., Szegedi, E. (2008b): Novel pathogen-specific primers for the detection of Agrobacterium vitis and Agrobacterium tumefaciens. Vitis 47, 181-189. Bishop, A.L., Katz, B.H., Burr, T.J. (1988): Infection of grapevine by soilborne Agrobacterium tumefaciens biovar 3 and population dynamics in host and nonhost rhizospheres. Phytopathology 78, 945-948. Bishop, A. L., Mittak, V.L., Katz, B.H., Burr, T.J. (1989): A monoclonal antibody specific to Agrobacterium tumefaciens biovar 3 and its utilization for indexing grapevine propagation material. Phytopathology 79, 995-998. Blasioli, S., Biondi, E., Braschi, I., Mazzucchi, U., Bazzi, C., Gessa, C.E. (2010): Electronic nose as an innovative tool for the diagnosis of grapevine crown gall. Analytica Chimica Acta 672, 20-24. Bošković, M. (1955): Suzbijanje korenovog raka na voćnim sadnicama. Zaštita bilja 31, 33-44. Bouzar, H. (1994): Request for a judicial opinion concerning the type species of Agrobacterium. International Journal of Systematic Bacteriology 44, 373-374. Bouzar, H., Chilton, W.S., Nesme, X., Dessaux, Y., Vaudequin, V., Petit, A., Jones, J.B., Hodge, N.C. (1995a): A new Agrobacterium strain isolated from aerial tumors on Ficus benjamina L. Applied and Environmental Microbiology 61, 65-73. Bouzar, H., Jones, J.B. (2001): Agrobacterium larrymoorei sp. nov., a pathogen isolated from aerial tumours of Ficus benjamina. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 1023-1026. 127 Bouzar, H., Jones, J.B. (1992): Distinction of biovar 2 strains of Agrobacterium from other chromosomal groups by differential acid production. Letters in Applied Microbiology 15, 83-85. Bouzar, H., Jones, J.B., Bishop, A.L. (1995b): Simple cultural test for identification of Agrobacterium biovars. In: Methods in Molecular Biology, vol. 44: Agrobacterium Protocols. Eds. K.M.A. Garland, M.R. Davey. Humana Press, Inc., Totowa, NJ, pp. 9-13. Bouzar, H., Jones, J.B., Hodge, N.C. (1993a): Differential characterization of Agrobacterium species using carbon-source utilization patterns and fatty acid profiles. Phytopathology 83, 733-739. Bouzar, H., Moore, L.W. (1987a): Complementary methodologies to identify specific. Agrobacterium strains. Applied and Environmental Microbiology 53, 2660-2665. Bouzar, H., Moore, L.W. (1987b): Isolation of different Agrobacterium biovars from a natural oak savanna and tallgrass prairie. Applied and Environmental Microbiology 53, 717-721. Bouzar, H., Moore, L.W., Schaad, N.W. (1983). Crown gall on pecan: A survey of Agrobacterium strains and potential for biological control in Georgia. Plant Disease 67, 310-312. Bouzar, H., Quadah, D., Krimi, Z., Jones, J.B., Trovato, M., Petit, A., Dessaux, Y. (1993b): Correlative association between resident plasmids and the host chromosome in a diverse Agrobacterium soil population. Applied and Environmental Microbiology 59, 1310-1317. Bradbury, J.F. (1986): Guide to Plant Pathogenic Bacteria. CAB International Mycological Institute, London. Braun, A.C. (1947): Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown-gall. American Journal of Botany 34, 234-240. Brenner, D.J., Staley, J.T., Krieg, N.R. (2005): Classification of prokaryotic organisms and the concept of bacterial speciation. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol. 2A. Eds. D.J. Brenner, N.R. Krieg, J.T. Staley. Springer, New York, NY, pp. 27-31. 128 Brisbane, P.G., Kerr, A. (1983): Selective media for the three biovars of Agrobacterium. Journal of Applied Bacteriology 54, 425-431. Britton, M.T., Escobar, M.A., Dandekar, A.M. (2008): The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. In: Agrobacterium: from Biology to Biotechnology. Eds. T. Tzfira, V. Citovsky. Springer, NY, USA, pp. 523- 563. Burr, T.J., Bazzi, C., Süle, S., Otten, L. (1998): Crown gall of grape: biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Disease 82, 1288-1297. Burr, T.J., Bishop, A.L., Katz, B.H., Blanchard, L.M., Bazzi, C. (1987a): A root- specific decay of grapevine caused by Agrobacterium tumefaciens and A. radiobacter biovar 3. Phytopathology 77, 1424-1427. Burr, T.J., Hurwitz, B. (1981): Occurrence of Agrobacterium radiobacter pv. tumefaciens (Smith and Townsend) Conn biotype 3 on grapevines in New York State. Phytopathology 71, 206. Burr, T.J., Katz, B.H. (1984): Grapevine cuttings as potential sites of survival and means of dissemination of Agrobacterium tumefaciens. Plant Disease 68, 976-978. Burr, T.J., Katz, B.H. (1983): Isolation of Agrobacterium tumefaciens biovar 3 from grapevine galls and sap, and from vineyard soil. Phytopathology 73, 163-165. Burr, T.J., Katz, B.H., Bishop, A.L. (1987b): Populations of Agrobacterium in vineyard and non vineyard soils and grape roots in vineyards and nurseries. Plant Disease 71, 617-620. Burr, T.J., Katz, B.H., Bishop, A.L., Meyers, C.A., Mittak, V.L. (1988): Effect of shoot age and tip culture propagation of grapes on systemic infestations by Agrobacterium tumefaciens biovar 3. American Journal of Enology and Viticulture 39, 67-70. Burr, T.J., Otten, L. (1999): Crown gall of grape: biology and disease management. Annual Review of Phytopathology 37, 53-80. 129 Burr, T.J., Reid, C.L. (1994): Biological control of grape crown gall with nontumorigenic Agrobacterium vitis F2/5. American Journal of Enology and Viticulture 45, 213-219. Burr, T.J., Reid, C.L., Adams, C.E., Momol, E.A. (1999): Characterization of Agrobacterium vitis strains isolated from feral Vitis riparia. Plant Disease 83, 102- 107. Burr, T.J., Reid, C.L., Taglicti, E., Bazzi, C., Süle, S. (1997): Biological control of grape crown gall by strain F2/5 is not associated with agrocin production or competition for attachment site on grape cells. Phytopathology 87, 706-711. Burr, T.J., Reid, C.L., Yoshimura, M., Momol, E.A., Bazzi, C. (1995): Survival and tumorigenicity of Agrobacterium vitis in living and decaying grape roots and canes in soil. Plant Disease 79, 677-682. Bush, A., Pueppke, S.G. (1991): A rapid and efficient new assay for determination of the three biotypes of Agrobacterium tumefaciens. Letters in Applied Microbiology 13, 126-129. Butrov D. (1983): Prilog proučavanju bakterijskog raka vinove loze u SR Makedoniji. Magistarski rad, Poljoprivredni fakultet, Beograd-Zemun. Canaday, J., Gérard, J.C., Crouzet, P., Otten, L. (1992): Organization and functional analysis of three T-DNAs from the vitopine Ti plasmid pTiS4. Molecular Genetics and Genomics 235, 292-303. Cavara, F. (1897): Tubercolosi della vite. Intorno alla eziologia de alcune malattie di piante coltivate. Stazoni Sperimentali Agrarie Italiane 30, 483-487. Chebil, S., Fersi, R., Chenenaoui, S., Abdellatif, E., Durante, G., Zacchi, E., Rhouma, A., Mliki A. (2013): First Report of Agrobacterium vitis as Causal Agent of Crown Gall Disease of Grapevine in Tunisia. Plant Disease 97, 836-836. Chen, C.-Y., Hansen, K.S., Hansen, L.K. (2008): Rhizobium radiobacter as an opportunistic pathogen in central venous catheter associated bloodstream infection: case report and review. Journal of Hospital Infection 68, 203-207. 130 Chilton, M.D., Drummond, M.H., Merio, D.J., Sciaky, D., Montoya, A.L., Gordon, M.P., Nester, E.W. (1977): Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell 11, 263-271. Chilton, W.S., Petit, A., Chilton, M.D.; Dessaux, Y. (2001): Structure and characterization of the crown gall opines heliopine, vitopine and rideopine. Phytochemistry 58, 137-142. Coenye, T., Goran, J., Spilker, T., Vandamme, P., LiPuma, J.J. (2002): Characterization of unusual bacteria isolated from respiratory secretions of cystic fibrosis patients and description of Inquilinus limosus gen. nov. sp. nov. Journal of Clinical Microbiology 40, 2062-2069. Conn, H.J. (1942): Validity of the genus Alcaligenes. Journal of Bacteriology 44, 353- 360. Conner, A.J., Dommisse, E.M. (1992): Monocotyledonous plants as hosts for Agrobacterium. International Journal of Plant Sciences 153, 550-555. Costechareyre, D., Rhouma, A., Lavire, C., Portier, P., Chapulliot, D., Bertolla, F., Boubaker, A., Dessaux, Y., Nesme, X. (2010): Rapid and efficient identification of Agrobacterium species by recA allele analysis. Microbial Ecology 60, 862-872. Cubero, J., López, M.M. (2001): An efficient microtitre system to determine Agrobacterium biovar. European Journal of Plant Pathology 107, 757-760. Cubero, J., Martínez, M.C., Llop, P., López, M.M. (1999): A simple and efficient PCR method for the detection of Agrobacterium tumefaciens in plant tumours. Journal of Applied Microbiology 86: 591-602. D'Hondt, S., Jørgensen, B.B., Miller, D.J., Batzke, A., Blake, R., Cragg, B.A., Cypionka, H., Dickens, G.R., Ferdelman, T., Hinrichs, K.U., Holm, N.G., Mitterer, R., Spivack, A., Wang, G., Bekins, B., Engelen, B., Ford, K., Gettemy, G., Rutherford, S.D., Sass, H., Skilbeck, C.G., Aiello, I.W., Guèrin, G., House, C.H., Inagaki, F., Meister, P., Naehr, T., Niitsuma, S., Parkes, R.J., Schippers, A., Smith, D.C., Teske, A., Wiegel, J., Padilla, C.N., Acosta, J.L. (2004): Distributions of microbial activities in deep subseafloor sediments. Science 306, 2216-2221. 131 De Cleene, M. (1985): Susceptibility of monocotyledons to Agrobacterium tumefaciens. Phytopathologische Zeitschrift 113, 81-89. De Cleene, M., De Ley, J. (1976): The host range of crown gall. Botanical Review 42, 389-466. De Ley, J. (1974): Phylogeny of prokaryotes. Taxon 23, 291-300. De Ley, J., Tijtgat, R., De Smedt, J., Michiels, M. (1973): Thermal stability of DNA:DNA hybrids within the genus Agrobacterium. Journal of General Microbiology 78, 241-252. De Oliveira, J. R., Da Silva Romeiro, R., De Souza Leäo Lacerda, B. (1994): Occurrence of Agrobacterium tumefaciens Biovar 3 on Grapevine in Brazil. Journal of Phytopathology 140, 363-366. Dessaux, Y., Petit, A., Farrand, S.K., Murphy, P.J. (1998): Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. In: The Rhizobiaceae: Molecular Biology of Model Plant-Associated Bacteria. Eds. H.P. Spaink, A. Kondorosi, P.J.J. Hooykaas. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp. 173-197. Dhanvantari, B.N. (1978): Characterization of Agrobacterium isolates from stone fruits in Ontario. Canadian Journal of Botany 56, 2309-2311. Dhanvantari, B.N. (1983): Etiology of grape crown gall in Ontario. Canadian Journal of Botany 61, 2641-2646. Dong, L.C., Sun, C.W., Thies, K L., Luthe, D.S., Graves Jr., C.H. (1992): Use of polymerase chain reaction to detect pathogenic strains of Agrobacterium. Phytopathology 82, 434-439. Dua, A., Sangwan, N., Kaur, J., Saxena, A., Kohli, P., Gupta, A.K., Lal, R. (2013): Draft genome sequence of Agrobacterium sp. strain UHFBA-218, isolated from rhizosphere soil of crown gall-infected cherry rootstock Colt. Genome Announcements 1, e00302-13. 132 Eastwell, J.C., Willis, L.G., Cavileer, T.D. (1995): A rapid and sensitive method to detect Agrobacterium vitis in grapevine cuttings using the polymerase chain reaction. Plant Disease 79, 822-827. Edmond, M.B., Riddler, S.A., Baxter, C.M., Wicklund, B.M., Pascuile, A.W. (1993): Agrobacterium radiobacter a recently recognized opportunistic pathogen. Clinical Infectious Diseases 16, 388-391. Ellis, J.G., Kerr, A., Petit, A., Tempé, J. (1982): Conjugal transfer of nopaline and agropine Ti-plasmids - the role of agrocinopines. Molecular and General Genetics 186, 269-273. Enright, M.C., Spratt, B.G. (1999): Multilocus sequence typing. Trends in Microbiology 7, 482-487. Fabre, E., Dunal, F. (1853): Observations sur les maladies regantes de la vigne. Bulletin de la Société d'Agriculture du Département de l'Hérault 40, 46. Farrand, S.K., Van Berkum, P.B., Oger, P. (2003): Agrobacterium is a definable genus of the family Rhizobiaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 53, 1681-1687. Feil, E.J., Holmes, E.C., Bessen, D.E., Chan, M.-S., Day, N.P.J., Enright, M.C., Goldstein, R., Hood, D.W., Kalia, A., Moore, C.E., Zhou, J., Spratt, B.G. (2001): Recombination within natural populations of pathogenic bacteria: short-term empirical estimates and long-term phylogenetic consequences. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 182-187. Feil, E.J., Li, B.C., Aanensen, D.M., Hanage, W.P., Spratt, B.G. (2004): eBURST: inferring patterns of evolutionary descent among clusters of related bacterial genotypes from multilocus sequence typing data. Journal of Bacteriology 186, 1518- 1530. Gelvin, S.B. (2003): Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the “genejockeying” tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67, 16-37. Genov, I., Atanassov, I., Tsvetkov, I., Atanassov, A. (2006a): Isolation and characterization of Agrobacterium strains from grapevines in Bulgarian vineyards and wild grapes, V. vinifera ssp. silvestris. Vitis 45, 97-101. 133 Genov, I., Atanassov, I., Yordanov, Y., Tsvetkov, I., Atanassov, A. (2006b): Genetic diversity of Agrobacterium vitis strains, isolated from grapevines and wild grapes in Bulgaria, assessed by Cleaved Amplified Polymorphic Sequences analysis of 16S- 23S rDNA. Vitis 45, 125-130. Gevers, D., Cohan, F.M., Lawrence, J.G., Spratt, B.G., Coenye, T., Feil, E.J., Stackebrandt, E., Van de Peer, Y., Vandamme, P., Thompson, F.L., Swings, J. (2005): Opinion: re-evaluating prokaryotic species. Nature Reviews Microbiology 3, 733-739. Gillings, M., Ophel-Keller, K. (1995): Comparison of strains of Agrobacterium vitis from grapevine source areas in Australia. Australasian Plant Pathology 24, 29-37. Gonzalez, E.T., Maccree, M., Zaid, M., Kluepfel, D.A. (2008): Evaluation of Agrobacterium tumefaciens genetic diversity in CA walnut growing regions and resistance to the biocontrol agent, Agrobacterium rhizogenes K84. Phytopathology 98, S61-S61. Goodner, B., Hinkle, G., Gattung, S., Miller, N., Blanchard, M., Qurollo, B., Goldman, B.S., Cao, Y.W., Askenazi, M., Halling, C., Mullin, L., Houmiel, K., Gordon, J., Vaudin, M., Iartchouk, O., Epp, A., Liu, F., Wollam, C., Allinger, M., Doughty, D., Scott, C., Lappas, C., Markelz, B., Flanagan, C., Crowell, C., Gurson, J., Lomo, C., Sear, C., Strub, G., Cielo, C., Slater, S. (2001): Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science 294, 2323-2328. Gürtler, V., Stanisich, V.A. (1996). New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S-23S rDNA spacer region. Microbiology 142, 3-16. Haas, J.H., Moore, L.W., Ream, W., Manulis, S. (1995): Universal PCR primers for detection of phytopathogenic Agrobacterium strains. Applied and Environmental Microbiology 61, 2879-2884. Haas, J.H., Zveibil, A., Tanne, E., Manulis, S. (1991): The presence of crown gall of grape incited by Agrobacterium tumefaciens biovar 3 in Israel. Phytoparasitica 19, 311-318. 134 Hacker, J., Carniel, E. (2001): Ecological fitness, genomic islands and bacterial pathogenicity: a Darwinian view of the evolution of microbes. EMBO Reports, 2, 376-381. Hampl, V., Pavlicek, A., Flegr, J. (2001): Construction and bootstrap analysis of DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with the freeware program FreeTree: Application to trichomonad parasites. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 731-735. Hendrickson, A.A., Baldwin, I.L., Riker A.J. (1934): Studies on Certain Physiological Characters of Phytomonas tumefaciens, Phytomonas rhizogenes, and Bacillus radiobacter, Part II. Journal of Bacteriology 28, 597-618. Hildebrand, E.M. (1940): Cane gall of brambles caused by Phytomonas rubi n. sp. Journal of Agricultural Research 61, 685-696. Holmes, B. (1988): The taxonomy of Agrobacterium. Acta Horticulturae 225, 47-52. Holmes, B., Roberts, P. (1981): The classification, identification and nomenclature of agrobacteria. Journal of Applied Bacteriology 50, 443-467. Hooykaas, P.J.J., Den Dulk-Ras, H., Ooms, G., Schilperoort, R.A. (1980): Interactions between octopine and nopaline plasmids in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 143, 1295-1306. Irelan, N.A., Meredith, C.P. (1996): Genetic analysis of Agrobacterium tumefaciens and A. vitis using randomly amplified polymorphic DNA. American Journal of Enology and Viticulture 47, 145-151. Jarvis, B.D.W., Sivakumaran, S.W., Tighe, S.W., Gillis, M. (1996): Identification of Agrobacterium and Rhizobium species based on cellular fatty acid composition. Plant and Soil 184, 143-158. Johnson, K.L., Zheng, D., Kaewnum, S., Reid, C.L., Burr, T. (2013): Development of a Magnetic Capture Hybridization Real-Time PCR Assay for Detection of Tumorigenic Agrobacterium vitis in Grapevines. Phytopathology 103, 633-640. Jovanović, O. (1993a): Ispitivanje antagonističkog dejstva saprofitnih bakterija i gljiva prema Agrobacterium tumefaciens. Zaštita bilja, 204, 113-123. 135 Jovanović, O. (1993b): Ispitivanje mogućnosti primene antibiotika u suzbijanju Agrobacterium tumefaciens. Zaštita bilja, 204, 125-132. Jovanović, O. (1990): Proučavanje antagonističkog dejstva nekih gljiva i bakterija prema vrsti Agrobacterium tumefaciens (Amith and Townsend) Conn. Magistarska teza. Poljoprivredni fakultet, Beograd-Zemun. Jumas-Bilak, E., Michaux-Charachon, S., Bourg, G., Ramuz, M., Allardet-Servent, A. (1998): Unconventional genomic organization in the alpha subgroup of the Proteobacteria. Journal of Bacteriology 180, 2749-2755. Kaufman, M., Kassemeyer, H.H., Otten, L. (1996): Isolation of Agrobacterium vitis from grapevine propagating material by means of PCR after immunocapture cultivation. Vitis 35, 151-153. Kawgauchi, A., Inoue, K. (2009): Grapevine crown gall caused by Rhizobium radiobacter (Ti) in Japan. Journal of General Plant Pathology 75, 205-212. Kawaguchi, A., Sawada, H., Ichinose, Y. (2008): Phylogenetic and serological analyses reveal genetic diversity of Agrobacterium vitis strains in Japan. Plant Pathology 57, 747-753. Kawaguchi, A., Sawada, H., Inoue, K., Nasu, H. (2005): Multiplex PCR for the identification of Agrobacterium biovar 3 strains. Journal of General Plant Pathology 71, 54-59. Keane, P.J., Kerr, A., New, P.B. (1970): Crown gall of stone fruit. II. Identification and nomenclature of Agrobacterium isolates. Australian Journal of Biological Sciences 23, 585-595. Kennedy, B.W., Alcorn, S.M. (1980): Estimates of U.S. crop losses to prokaryote plant pathogens. Plant Disease 64, 674-676. Kerr, A. (1969): Transfer of virulence between isolates of Agrobacterium. Nature 223, 1175-1176. Kerr, A., Gibb, K. (1997): Bacteria and phytoplasmas as plant parasites. In: Plant Pathogens and Plant Diseases. Eds. J.F. Brown, H.J. Ogle. Rockvale Publications, NSW, Australia, pp. 86-102. 136 Kerr, A., Manigault, P., Tempé, J. (1977): Transfer of virulence in vivo and in vitro in Agrobacterium. Nature 265, 560-561. Kerr, A., Panagopoulos, C.G. (1977): Biotypes of Agrobacterium radiobacter var. tumefaciens and their biological control. Phytopathologische Zeitschrift 90, 172-179. Kersters, K., De Ley, J. (1984): Genus III. Agrobacterium Conn. In: Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 1, 8th ed. Eds. NR Krieg, JG Holt. The Williams and Wilkins Co., Baltimore-London, pp 244-254. Kersters, K., De Ley, J. (1975): Identification and grouping of bacteria by numerical analysis of their electrophoretic protein patterns. Journal of General Microbiology 87, 333-342. Kersters, K., De Ley, J., Sneath, P.H.A., Sackin, M. (1973): Numerical taxonomic analysis of Agrobacterium. Journal of General Microbiology 78, 227-239. Kim, H., Farrand, S.K. (1998): Opine catabolic loci from Agrobacterium plasmids confer chemotaxis to their cognate substrates. Molecular Plant-Microbe Interactions 11, 131-143. Kim, K.-S., Baek, C.-H., Lee, J.K., Yang, J.M., Farrand, S.K. (2001): Intracellular accumulation of mannopine, an opine produced by crown gall tumors, transiently inhibits growth of Agrobacterium tumefaciens. Molecular Plant-Microbe Interactions 14, 793-803. Kimura, M. (1980): A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16, 111-120. King, E.O., Ward, M.K., Raney, D.E. (1954): Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine 44, 301- 307. Kišpatić, J. (1987): Bolesti voćaka i vinove loze. Skripta za studente smjera VVV i Zaštite bilja, Skripta fakulteta poljoprivrednih znanosti. Sveučilište u Zagrebu, Fakultet poljoprivrednih znanosti. Zagreb. 137 Knauf, V.C., Panagopoulos, C.G., Nester, E.W. (1982): Genetic factors controlling the host range of Agrobacterium tumefaciens. Phytopathology 72, 1545-1549. Kovacs, N. (1956): Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178,703. Krimi, Z., Petit, A., Mougel, C., Dessaux, Y., Nesme, X. (2002): Seasonal fluctuations and long-term persistence of pathogenic populations of Agrobacterium spp. in soils. Applied and Environmental Microbiology 68, 3358-3365. Krimi, Z., Raio, A., Nesme, X., Dessaux, Y. (2006): Eucalyptus occidentalis plantlets are naturally infected by pathogenic Agrobacterium tumefaciens. European Journal of Plant Pathology 116, 237-246. Kumagai, L., Fabritius, A.-L. (2008): Detection and differentiation of pathogenic Agrobacterium vitis and Agrobacterium tumefaciens in grapevine using multiplex Bio-PCR. Proceedings of National Viticulture Research Conference, Davis, California. pp. 42-43. Kuzmanović, N., Gašić, K., Ivanović, M., Prokić, A., Puławska, J., Obradović, A. (2012a): Identification and characterization of Agrobacterium spp. isolated from apricot in Serbia. 1st International Congress for Bacterial Diseases of Stone Fruits and Nuts. 14-17.02., Zurich, Switzerland. Book of Abstracts, 29. Kuzmanović, N., Gašić, K., Ivanović, M., Prokić, A., Obradović, A. (2012b): Bakteriozni rak voćaka u Srbiji. 14. Kongres voćara i vinogradara Srbije sa međunarodnim učešćem, 9-12.10., Vrnjačka Banja. Zbornik radova i apstrakata, 204. Kuzmanović, N., Ivanović, M., Prokić, A., Gašić, K., Blagojević, N., Puławska, J., Obradović, A. (2013): Identification and characterization of Agrobacterium spp. isolated from apricot in Serbia. European Journal of Plant Pathology 137, 11-16. Kwon, S.W., Park, J.Y., Kim, J.S., Kang, J.W., Cho, Y.H., Lim, C.K., Parker, M.A., Lee, G.B. (2005): Phylogenetic analysis of the genera Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium on the basis of 16S rRNA gene and internally transcribed spacer region sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 55, 263-270. 138 Lapage, S.P., Sneath, P.H.A., Lessel Jr., E.F., Skerman, V.B.D., Seeliger H.P.R., Clark, W.A. (1992): International Code of Nomenclature of Bacteria, Revision. Bacteriological Code, American Society for Microbiology, Washington, DC. Lassalle, F., Campillo, T., Vial, L., Baude, J., Costechareyre, D., Chapulliot, D., Shams, M., Abrouk, D., Lavire, C., Oger-Desfeux, C., Hommais, F., Guéguen, L., Daubin, V., Muller, D., Nesme, X. (2011): Genomic species are ecological species as revealed by comparative genomics in Agrobacterium tumefaciens. Genome Biology and Evolution 3, 762-781. Lehoczky, J. (1968): Spread of Agrobacterium tumefaciens in the vessels of the grapevine after natural infection. Phytopathologische Zeitschrift 63, 239-246. Lehoczky, J. (1971): Further evidences concerning the systemic spreading of Agrobacterium tumefaciens in the vascular system of grapevines. Vitis 10, 215-221. Li, A., Geng, J., Cui, D., Shu, C., Zhang, S., Yang, J., Xing, J., Wang, J., Ma, F., Hu, S. (2011): Genome sequence of Agrobacterium tumefaciens strain F2, a bioflocculant- producing bacterium. Journal of Bacteriology 193, 5531. Lim, S.H., Kim, J.G., Kang, H.W. (2009): Novel SCAR primers for specific and sensitive detection of Agrobacterium vitis strains. Microbiological Research 164, 451-460. Lindström, K., Martínez-Romero, M.E. (2002): International Committee on Systematics of Prokaryotes Subcommittee on the taxonomy of Agrobacterium and Rhizobium. Minutes of the meeting, 4 July 2001, Hamilton, Canada. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 2337. Lindström, K., Young, J.P.W. (2011): International Committee on Systematics of Prokaryotes. Subcommittee on the taxonomy of Agrobacterium and Rhizobium: Minutes of the meeting, 7 September 2010, Geneva, Switzerland. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 61, 3089-3093. Lippincott, J.A., Lippincott. B.B. (1969): Tumour-initiating ability and nutrition in the genus Agrobacterium. Journal of General Microbiology 59, 57-75. 139 Llop, P., Lastra, B., Marsal, H., Murillo, J., López, M.M. (2003): Tracking Agrobacterium strains by a RAPD system to identify single colonies from plant tumours. European Journal of Plant Pathology 109, 381-389. López, M.M., Gorris, M.T., Montojo, A.M. (1988): Opine utilization by Spanish isolates of Agrobacterium tumefaciens. Plant Pathology 37, 565-572. López, M.M., Palacio-Bielsa, A., González-Abolafio, R., Santiago, R., Salcedo, C.I., Penyalver, R. (2008): Tumorigenic Agrobacterium rhizogenes (biovar 2) isolated from grapevine in Spain. Plant Pathology 57, 367. Loubser, J.T. (1978): Identification of Agrobacterium tumefaciens biotype 3 on grapevine in South Africa. Plant Disease Reporter 62, 730-731. Louws, F.J., Rademaker, J.L.W., de Bruijn, F.J. (1999): The three Ds of PCR-based genomic analysis of phytobacteria: Diversity, detection, and disease diagnosis. Annual Review of Phytopathology 37, 81-125. Ma, D.Q., Yanofsky, M.F., Gordon, M.P., Nester, E.W. (1987): Characterization of Agrobacterium tumefaciens strains isolated from grapevine tumors in China. Applied and Environmental Microbiology 53, 1338-1343. Maiden, M.C., Bygraves, J.A., Feil, E., Morelli, G., Russell, J.E., Urwin, R., Zhang, Q., Zhou. J., Zurth, K., Caugant, D.A., Feavers, I.M., Achtman, M., Spratt, B.G. (1998): Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95, 3140-3145. Maier, T., Kostrzewa, M. (2007): Fast and reliable MALDI-TOF MS-based microorganism identification. Nature Chemistry 2568-2571. Martens, M., Dawyndt, P., Coopman, R., Gillis, M., De Vos, P., Willems, A. (2008): Advantages of multilocus sequence analysis for taxonomic studies: a case study using 10 housekeeping genes in the genus Ensifer (including former Sinorhizobium). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58, 200-214. Martens, M., Delaere, M., Coopman, R., De Vos, P., Gillis, M., Willems, A. (2007): Multilocus sequence analysis of Ensifer and related taxa. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57, 489-503. 140 Matthysse, A.G. (2006). The genus Agrobacterium. Prokaryotes 5, 91-114. McCullen, C.A., Binns, A.N. (2006): Agrobacterium tumefaciens and Plant Cell Interactions and Activities Required for Interkingdom Macromolecular Transfer. Annual Review of Cell and Developmental Biology 22, 101-127. McGuire, R.G., Rodriguez-Palenzuela, P., Coilmer, A., Burr, T.J. (1991): Polygalacturonase production by Agrobacterium tumefaciens biovar 3. Applied and Environmental Microbiology 57, 660-664. Michel, M.F., Brasileiro, A.C., Depierreux, C., Otten, L., Delmotte, F., Jouanin, L. (1990): Identification of different agrobacterium strains isolated from the same forest nursery. Applied and Environmental Microbiology 56, 3537-3545. Milijašević, S., Gavrilović, V., Živković, S., Trkulja, N. and Puławska, J. (2007): First report of tumorigenic Agrobacterium radiobacter on raspberry in Serbia. Pesticidi i fitomedicina, 22, 113-119. Miller, H.J., Vruggink, H. (1981): An assessment of biochemical and serological tests for Agrobacterium radiobacter subsp. tumefaciens. Phytopathologische Zeitschrift 102, 292-300. Mohammadi, M., Fatehi-Paykani, R. (1999): Phenotypical characterization of Iranian isolates of Agrobacterium vitis, the causal agent of crown gall disease of grapevine. Vitis 38, 115-121. Momol, E.A., Burr, T.J., Reid, C.L., Momol, M.T., Otten, L. (1998): Genetic diversity of Agrobacterium vitis as determined by DNA fingerprints of the 5’-end of the 23S rRNA gene and Random Amplified Polymorphic DNA. Journal of Applied Microbiology 85, 685-692. Montoya, A.L., Chilton, M.-D., Gordon, M.P., Sciaky, D., Nester, E.W. (1977): Octopine and nopaline metabolism in Agrobacterium tumefaciens and crown gall tumor cells: role of plasmid genes. Journal of Bacteriology 129, 101-107. Moore, L.W., Bouzar, H., Burr, T. (2001): Agrobacterium. In: Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria, 3rd edn. Eds. N.W. Schaad, J.B. Jones, W. Chun. APS Press, St Paul, MN, USA, pp. 17-35. 141 Moore, L.W., Chilton, W.S., Canfield, M.L. (1997): Diversity of opines and opine- catabolizing bacteria isolated from naturally occurring crown gall tumors. Applied and Environmental Microbiology 63, 201-207. Moore, L., Warren, G., Strobel, G. (1979): Involvement of a plasmid in the hairy root disease of plants caused by Agrobacterium rhizogenes. Plasmid 2, 617-626. Moriguchi, K., Maeda, Y., Satou, M., Hardayani, N.S.N., Kataoka, M., Tanaka, N., Yoshida K. (2001): The complete nucleotide sequence of a plant root-inducing (Ri) plasmid indicates its chimeric structure and evolutionary relationship between tumor- inducing (Ti) and symbiotic (Sym) plasmids in Rhizobiaceae. Journal of Molecular Biology 307, 771-784. Mougel, C., Cournoyer, B., Nesme, X. (2001): Novel tellurite-amended media and specific chromosomal and Ti plasmid probes for direct analysis of soil populations of Agrobacterium biovar 1 and 2. Applied and Environmental Microbiology 67, 65-74. Mougel, C., Thioulouse, J., Perrière, G., Nesme, X. (2002): A mathematical method for determining genome divergence and species delineation using AFLP. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 573-586. Nei, M., Li, W.-H. (1979): Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76, 5269-5273. Nesme, X., Leclerc, M.C., Bardin, R. (1990): PCR detection of an original endosymbiont: the Ti plasmid of Agrobacterium tumefaciens. In: Endocitobiology IV. Eds. P. Nardon, V. Gianinazzi-Peason, A.M. Greines, L. Margullis, C. Smith. INRA Editions, Versailles, France, pp. 47-50. Nesme, X., Michel, M.-F., Digat, B. (1987): Population heterogeneity of Agrobacterium tumefaciens in galls of Populus L. from a single nursery. Applied and Environmental Microbiology 53, 655-659. Nesme, X., Picard, C., Simonet. P. (1995): Specific DNA sequences for detection of soil bacteria. In: Nucleic Acids in the Environment. Methods and applications. Eds. J.T. Trevors, J.D. van Elsas. Springer- Verlag KG, Berlin, Germany, pp. 111-139. 142 Nesme, X., Ponsonnet, C., Picard, C., Normand, P. (1992): Chromosomal and pTi genotypes of Agrobacterium strains isolated from Populus tumors in two nurseries. FEMS Microbiology 101, 189-196. New, P.B., Kerr, A. (1972): Biological Control of Crown Gall: Field Measurements and Glasshouse Experiments. Journal of Applied Bacteriology 35, 279-287. Normand, P., Ponsonnet, C., Nesme, X., Neyra, M., Simonet, P. (1996): ITS analysis of prokaryotes. In: Molecular Microbial Ecology Manual. Eds. A.D.L. Akkermans, J.D. van Elsas, F.J. de Bruijn. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 1-12. Oger, P., Dessaux, Y., Petit, A., Gardan, L., Manceau, C., Chomel, C., Nesme, X. (1998): Validity, sensitivity and resolution limit of the PCR-RFLP analysis of the rrs (16S rRNA gene) as a tool to identify soil-borne and plant-associated bacterial populations. Genetics Selection Evolution 30, S311-S321. OIV - International organisation of vine and wine (2012): Statistical report on world vitiviniculture, 10. Ophel, K., Burr, T.J., Magarey, P.A., Kerr, A. (1988): Detection of Agrobacterium turnefaciens biovar 3 in South Australian grapevine propagation material. Australasian Plant Pathology 17, 61-66. Ophel, K, Kerr, A. (1990): Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines. International Journal of Systematic Bacteriology 40, 236- 41. Otten, L., Burr, T., Szegedi, E. (2008): Agrobacterium: a disease-causing bacterium. In: Agrobacterium: From Biology to Biotechnology. Eds. T. Tzfira, V. Citovsky. Springer, NY, USA, pp. 1-46. Otten, L., Canaday, J., Gerard, J.C., Fournier, P., Crouzet, P., Paulus, F. (1992): Evolution of agrobacteria and their Ti plasmids - a review. Molecular Plant-Microbe Interactions 5, 279-287. Otten, L., de Ruffray, P., Momol, E.A., Momol, M.T., Burr, T.J. (1996): Phylogenetic relationship between Agrobacterium vitis isolates and their Ti plasmids. Molecular Plant-Microbe Interactions 9, 782-786. 143 Page, R.D.M. (1996): TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12, 357-358. Palacio-Bielsa, A., González-Abolafio, R., Álvarez, B., Lastra, B., Cambra, M.A., Salcedo, C.I., López, M.M., Penyalver, R. (2009): Chromosomal and Ti plasmid characterization of tumorigenic strains of three Agrobacterium species isolated from grapevine tumours. Plant Pathology 58, 584-593. Panagopoulos, C.G., Psallidas, P.G., Alivizatos, A.S. (1978): Studies on biotype 3 of Agrobacterium radiobacter var. tumefaciens. Proceedings of the Fourth International Conference of Plant Pathogenic Bacteria, Angers, France, 221-228. Panagopoulos, C.G., Psallidas, P.G. (1973): Characteristics of Greek isolates of Agrobacterium tumefaciens (E.F. Smith & Townsend) Conn. Journal of Applied Bacteriology 36, 233-240. Panday, D., Schumann, P., Das, S.K. (2011): Rhizobium pusense sp. nov., isolated from rhizosphere of chickpea (Cicer arietinum L.). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 61, 2632-2639. Panić, M. (1973): Bakteriozni rak vinove loze. Jugoslovensko vinogradarstvo i voćarstvo 8, 19-22. Panić, M. (1976): Metoda dokazivanja bakterioznog raka loznih kalemova. Poljoprivredna znanstvena smotra, Zagreb, 39, 301-308. Panić, M. (1977): O bakterioznom raku vinove loze. Savjetovanje o ekskoriozi i virusnim bolestima vinove loze. 16-18.11., Mostar. Zbornik radova, IRC - Hepok, 185-211. Panić, M. (1974): Primena zeljastih biljaka u dijagnozi bakterioznog raka voćaka. IV kongres biologa Jugoslavije, 25-29.06., Sarajevo. Panić, M., Dinić M. (1976): Proučavanje osobina sojeva bakterije Agrobacterium tumefaciens (Smith and Townsend) Conn, prouzrokovača korenovog raka jabuke. IV Kongres voćara Jugoslavije, 19-23.10., Ohrid. Panić, M., Ivanović, M., Dragutinović, S. (1981): Mogućnost suzbijanja raka jabuke i vinove loze primenom pesticida. Glasnik zaštite bilja 10-11, 369. 144 Paphitou, N.I., Rolston, K.V. (2003): Catheter related bacteremia caused by Agrobacterium radiobacter in a cancer patient: case report and literature review. Infection 31, 421-424. Paulus, F., Huss, B., Bonnard, G., Ridé, M., Szegedi, E., Tempé, J., Petit, A., Otten, L. (1989a): Molecular systematics of biotype III Ti plasmids of Agrobacterium tumefaciens. Molecular Plant-Microbe Interactions 2, 64-74. Paulus, F., Ridé, M., Otten, L. (1989b): Distribution of two Agrobacterium tumefaciens insertion elements in natural isolates: Evidence for stable association between Ti plasmids and their bacterial hosts. Molecular and General Genetics 219, 145-152. Peduto, F., Marchi, G., Surico, G. (2010): Indexing Agrobacterium vitis in asymptomatic grapevine propagation material by two nested PCR assays. American Journal of Enology and Viticulture 61, 102-112. Peluso, R., Raio, A., Morra, F., Zoina, A. (2003): Physioplogical, biochemical and molecular analyses of an Italian collection of Agrobacterium tumefaciens strains. European Journal of Plant Pathology 109, 291-300. Petit, A., Tempé, J. (1985): The function of T-DNA in nature. In: Molecular form and function of the plant genome. Eds. L. Van Vloten-Doting, G.S.P. Groot, T.C. Hall. New York and London: Plenum Press, pp. 625-636. Picard, C., Ponsonnet, C., Paget, E., Nesme, X., Simonet, P. (1992): Detection and enumeration of bacteria in soil by direct DNA extraction and polymerase chain reaction. Applied and Environmental Microbiology 58, 2717-2722. Pionnat, S., Keller, H., Hericher, D., Bettachini, A., Dessaux, Y., Nesme, X., Poncet, C. (1999): Ti plasmids from Agrobacterium characterize rootstock clones that initiated a spread of crown gall disease in Mediterranean countries. Applied and Environmental Microbiology 65, 4197-4206. Ponsonnet, C., Nesme, X. (1994): Identification of Agrobacterium strains by PCR- RFLP analysis of pTi and chromosomal regions. Archives of Microbiology 161, 300- 309. 145 Popoff, M.Y., Kersters, K., Kiredjian, M., Miras, I., Coynault, C. (1984): Position taxonomique de souches de Agrobacterium d’origine hospitalière. Annals of Microbiology 135A, 427-442. Poppenberger, B., Leonhardt, W. Redl, H. (2002): Latent persistence of Agrobacterium vitis in micropropagated Vitis vinifera. Vitis 41, 113-114. Portier, P., Fischer-Le Saux, M., Mougel, C., Lerondelle, C., Chapulliot, D., Thioulouse, J., Nesme, X. (2006): Identification of genomic species from Agrobacterium biovar 1 by AFLP genomic markers. Applied and Environmental Microbiology 72, 123-131. Posada, D., Crandall, K.A., Holmes, E.C. (2002): Recombination in evolutionary genomics. Annual Review of Genetics 36, 75-97. Pothier, J.F., Pflueger, V., Ziegler, D., Tonolla, M., Vogel G., Duffy, B. (2011): MALDI-TOF mass spectrometry: Applications for rapid bacterial identification and phylogenetic analysis. Phytopathology 101, S145. Puławska, J., Kałużna, M. (2011): Phylogenetic relationship and genetic diversity of Agrobacterium spp. isolated in Poland based on gyrB gene sequence analysis and RAPD. European Journal of Plant Pathology 133, 379-390. Puławska, J., Maes, M., Willems, A., Sobiczewski, P. (2000): Phylogenetic analysis of 23S rRNA gene sequences of Agrobacterium, Rhizobium and Sinorhizobium strains. Systematic and Applied Microbiology 23, 238-244. Puławska. J., Malinowski. T., Sobiczewski. P. (1998): Diversity of plasmids of Agrobacterium tumefaciens isolated from fruit trees in Poland. Journal of Phytopathology 146, 465-468. Puławska, J., Sobiczewski, P. (2005): Development of a semi-nested PCR-based method for sensitive detection of tumorigenic Agrobacterium in soil. Journal of Applied Microbiology 98, 710-721. Puławska, J., Willems, A., De Mayer, S., Süle, S. (2012a): Rhizobium nepotum sp. nov. isolated from tumors on different plant species. Systematic and Applied Microbiology 35, 215-220. 146 Puławska, J., Willems, A., Sobiczewski, P. (2006): Rapid and specific identification of four Agrobacterium species and biovars using multiplex PCR. Systematic and Applied Microbiology 29, 470-479. Puławska, J., Willems, A., Sobiczewski, P. (2012b): Rhizobium skierniewicense sp. nov. isolated from tumors on chrysanthemum and cherry plum. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 62, 895-899. Puopolo, G., Raio, A., Zoina, A. (2007): Early detection of Agrobacterium tumefaciens in symptomless artificially inoculated Chrysanthemum and peach plants using PCR. Journal of Plant Pathology 89, 185-190. Rademaker, J.L.W., de Bruijn, F.J. (1997). Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprinting and computer assisted pattern analysis. In: DNA Markers: Protocols, Applications and Overviews. Eds. G. Caetano-Anollés, P.M. Gresshoff. John Wiley, NY, USA. pp. 151-171. Raio, A., Peluso, R., Nesme, X., Zoina, A. (2004): Chromosomal and plasmid diversity of Agrobacterium strains isolated from Ficus benjamina tumors. European Journal of Plant Pathology 110, 163-174. Rezzonico, F., Vogel, G., Duffy, B., Tonolla, M. (2010): Application of whole-cell matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for rapid identification and clustering analysis of pantoea species. Applied and Environmental Microbiology 76, 4497-4509. Rhouma, A., Boubaker, A., Nesme, X., Dessaux, Y. (2006): Plasmid and chromosomal diversity of a Tunisian collection of Agrobacterium tumefaciens strains. Tunisian Journal of Plant Protection 1, 73-84. Ridé, M., Ridé, S., Petit, A., Bollet, C., Dessaux, Y., Gardan, L. (2000): Characterization of plasmid-borne and chromosome-encoded traits of Agrobacterium biovar 1, 2 and 3 strains from France. Applied and Environmental Microbiology 66, 1818-1825. Riker, A.J., Banfield, W.M., Wright, W.H., Keitt, G.W., Sagen, H.E. (1930): Studies on infectious hairy root of nursery trees of apples. Journal of Agricultural Research 41, 507-540. 147 Rodriguez-Palenzuela, P., Burr, T.J., Collmer, A. (1991): Polygalacturonase is a virulence factor in Agrobacterium tumefaciens biovar 3. Journal of Bacteriology 173, 6547-6552. Rouhrazi, K., Rahimian, H. (2012a): Characterization of Iranian grapevine isolates of Rhizobium (Agrobacterium) spp. Journal of Plant Pathology 94, 555-560. Rouhrazi, K., Rahimian, H. (2012b): Genetic diversity of Iranian Agrobacterium strains from grapevine. Annals of Microbiology 62, 1661-1667. Roy, M.A., Sasser, M. (1983): A medium selective for Agrobacterium tumefaciens biotype 3. Phytopathology 73, 810. Rozas, J., Sanchez-Del Barrio, J.C., Messeguer, X., Rozas, R. (2003): DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics 19, 2496-2497. RSZ - Republički zavod za statistiku (2012): Statistički godišnjak Republike Srbije, Poglavlje 9: Poljoprivreda, 211. Ruffing, A.M., Castro-Melchor, M., Hu, W.-S., Chen, R.R. (2011): Genome sequence of the curdlan-producing Agrobacterium sp. strain ATCC 31749. Journal of Bacteriology 193, 4294-4295. Rüger, H.-J., Höfle. M.G. (1992): Marine star-shaped-aggregate-forming bacteria: Agrobacterium atlanticum sp. nov., nom. rev.; Agrobacterium meteori sp. nov.; Agrobacterium ferrugineum sp. nov., nom. rev.; Agrobacterium gelatinovorum sp. nov., nom. rev.; and Agrobacterium stellulatum sp. nov., nom. rev. International Journal of Systematic Bacteriology 42, 133-143. Sachadyn, P., Kur, J. (1997): A new PCR system for Agrobacterium tumefaciens detection based on amplification of T-DNA fragment. Acta Microbiologica Polonica 46, 145-156. Saïdi, S., Mnasri, B., Mhamdi, R. (2011): Diversity of nodule-endophytic agrobacteria- like strains associated with different grain legumes in Tunisia. Systematic and Applied Microbiology 34, 524-530. 148 Saitou, N., Nei, M. (1987): The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-425. Salmassi, T.M., Venkatteswaren, K., Satomi, M., Nealson, K.H., Newman, D.K., Hering, J.G. (2002): Oxidation of arsenite by Agrobacterium albertimagni AOL15, sp. nov., isolated from Hot Creek, California. Geomicrobiology Journal 19, 53-66. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 5463-5467. Sawada, H., Ieki, H. (1992a): Crown gall of kiwifruit caused by Agrobacterium tumefaciens in Japan. Plant Disease 76, 212. Sawada, H., Ieki, H. (1992b): Phenotypic characteristics of the genus Agrobacterium. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 37-45. Sawada, H., Ieki, H., Kobayashi, S., Oiyama, I. (1992a): Grouping of tumorigenic Agrobacterium spp. based on Ti plasmid-related phenotypes. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 244-252. Sawada, H., Ieki, H., Masuda, I. (1995): PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains. Applied and Environmental Microbiology 61, 828-831. Sawada, H., Ieki, H., Oyaizu, H., Matsumoto, S. (1993): Proposal for rejection of Agrobacterium tumefaciens and revised descriptions for the genus Agrobacterium and for Agrobacterium radiobacter and Agrobacterium rhizogenes. International Journal of Systematic Bacteriology 43, 694-702. Sawada, H., Ieki, H., Takikawa, Y. (1990): Identification of grapevine crown gall bacteria isolated in Japan. Annals of the Phytopathologicial Society of Japan 56, 199- 206. Sawada, H., Imada, J., Ieki, H. (1992b): Evaluation of serodiagnosis for differentiating serogroups of Agrobacterium tumefaciens biovar 3. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 91-94. 149 Sawada, H., Imada, J., Ieki, H. (1992c): Serogroups of Agrobacterium tumefaciens biovar 3 determined using somatic antigens. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 52-57. Sawada, H., Oyaizu, H., Matsumoto, S., Ieki, H. (1992d): Differentiation of Agrobacterium taxa based on partial sequences of 16S rRNA. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 761-765. Sawada, H., Takikawa, Y., Ieki, H. (1992e): Fatty acid methyl ester profiles of the genus Agrobacterium. Annals of the Phytopathological Society of Japan 58, 46-51. Schaad, N.W., Jones, J.B., Chun, W. (2001): Laboratory Guide for Identification of Plant Pathogenic Bacteria. The American Phytopathological Society, St. Paul, USA. Schroth, M.N., McCain, A.H., Foott, J.H., Huisman, O.C. (1988): Reduction in yield and vigor of grapevine caused by crown gall disease. Plant Disease 72, 241-246. Schroth, M.N., Thompson, J.P., Hildebrand, D.C. (1965): Isolation of Agrobacterium tumefaciens-Agrobacterium radiobacter group from soil. Phytopathology 55, 645- 647. Schroth, M.N., Weinhold, A.R., McCain, A.H., Hildebrand, D.C., Ross, N. (1971): Biology and control of Agrobacterium tumefaciens. Hilgardia 40, 537-552. Schulz, T.F., Bauer, C., Lorenz, D., Plapp, R., Eichhorn, K.W. (1993a): Studies on the evolution of Agrobacterium vitis as based on genomic fingerprinting and IS element analysis. Systematic and Applied Microbiology 16, 322-329. Schulz, T.F., Lorenz, D., Eichhorn, K.W., Otten, L. (1993b): Amplification of different marker sequences for identification of Agrobacterium vitis strains. Vitis 32, 179-182. Shams, M., Vial, L., Chapulliot, D., Nesme, X., Lavire, C. (2013): Rapid and accurate species and genomic species identification and exhaustive population diversity assessment of Agrobacterium spp. using recA-based PCR. Systematic and Applied Microbiology 36, 351-358. Sheikholeslam, S., Lin, B.-C., Kado, C.I. (1979): Multiple-size plasmids in Agrobacterium radiobacter and A. tumefaciens. Phytopathology 69, 54-58. 150 Simmons, J.S. (1926): A culture medium for differentiating organisms of typhoid-colon aerogenes groups and for isolation of certain fungi. The Journal of Infectious Diseases 39, 209. Skerman, V.B.D., McGowan, V., Sneath, P.H.A. (1980): Approved lists of bacterial names. International Journal of Systematic Bacteriology 30, 225-420. Slater, S.C., Goldman, B.S., Goodner, B., Setubal, J.C., Farrand, S.K., Nester, E.W., Burr, T.J., Banta, L., Dickerman, A.W., Paulsen, I., Otten, L., Suen, G., Welch, R., Almeida, N.F., Arnold, F., Burton, O.T., Du, Z., Ewing, A., Godsy, E., Heisel, S., Houmiel, K. L., Jhaveri, J., Lu, J., Miller, N.M., Norton, S., Chen, Q., Phoolcharoen, W., Ohlin, V., Ondrusek, D., Pride, N., Stricklin, S.L., Sun, J., Wheeler, C., Wilson, L., Zhu, H., Wood, D.W. (2009): Genome sequences of three Agrobacterium biovars help elucidate the evolution of multichromosome genomes in bacteria. Journal of Bacteriology 191, 2501-2511. Smith, E.F., Townsend, C.O. (1907): A plant tumor of bacterial origin. Science 25, 671- 673. Sobiczewski, P. (1996): Etiology of crown gall on fruit trees in Poland. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research 4, 147-161. Sobiczewski, P., Puławska, J., Berczynski, S., (2005): Practical use of PCR-based method for detection of tumorigenic Agrobacterium in soil. Phytopathologia Polonica 35, 79-84. Stackebrandt, E., Frederiksen, W., Garrity, G.M., Grimont, P.A.D., Kämpfer, P., Maiden, M.C.J., Nesme, X., Rosselló-Mora, R., Swings, J., Trüper, H.G., Vauterin, L., Ward, A.C., Whitman, W.B. (2002): Report of the ad hoc committee for the re- evaluation of the species definition in bacteriology. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1043-1047. Staphorst, J.L., van Zyl, F.G.H., Strijdom, B.W., Groenewold, Z.E. (1985): Agrocin- producing pathogenic and nonpathogenic biotype-3 strains of Agrobacterium tumefaciens active against biotype-3 pathogens. Current Microbiology 12, 45-52. Stonier, T. (1960): Agrobacterium tumefaciens Conn. II. Production of an antibiotic substance. Journal of Bacteriology 79, 889-898. 151 Studholme, D.J., Glover, R.H., Boonham, N. (2011): Application of high-throughput DNA sequencing in phytopathology. Annual Review of Phytopathology 49, 87-105. Süß, J., Schubert, K., Sass, H., Cypionka, H., Overmann, J., Engelen, B. (2006): Widespread distribution and high abundance of Rhizobium radiobacter within Mediterranean subsurface sediments. Environmental Microbiology 8, 1753-1763. Süle, S (1978): Biotypes of Agrobacterium tumefaciens in Hungary. Journal of Applied Bacteriology 44, 207-213. Süle, S., Horká, M., Matoušková, H., Kubesová, A., Salplachta, J., Horký, J. (2012): Characterization of Agrobacterium species by capillary isoelectric focusing. European Journal of Plant Pathology 132, 81-89. Suslow, T.V., Schroth, M.N., Isaka, M. (1982): Application of a rapid method for Gram differentiation of plant pathogenic and saprophytic bacteria without staining. Phytopathology 72, 917-918. Suzaki, K., Yoshida, K., Sawada, H. (2004): Detection of tumorigenic Agrobacterium strains from infected apple saplings by colony PCR with improved PCR primers. Journal of General Plant Pathology 70, 342-347. Suzuki, K., Iwata, K. Yoshida, K. (2001): Genome analysis of Agrobacterium tumefaciens: construction of physical maps for linear and circular chromosomal DNAs, determination of copy number ratio and mapping of chromosomal virulence genes. DNA Research 8, 141-152. Szegedi, E. (2003): Opines in naturally infected grapevine crown gall tumors. Vitis 42: 39-41. Szegedi, E., Bottka, S. (2002): Detection of Agrobacterium vitis by polymerase chain reaction in grapevine bleeding sap after isolation on a semiselective medium. Vitis 41, 37-42. Szegedi, E., Bottka, S., Mikulás, J., Otten, L., Süle, S. (2005): Characterization of Agrobacterium tumefaciens strains isolated from grapevine. Vitis 44, 49-54. 152 Szegedi, E., Czakό, M., Otten, L., Koncz, C.S. (1988): Opines in crown gall tumours induced by biotype 3 isolates of Agrobacterium tumefaciens. Physiological and Molecular Plant Pathology 32, 237-247. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S. (2011): MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28, 2731-2739. Tan, B.S., Yabuki, J., Matsumoto, S., Kageyama, K., Fukui, H. (2003): PCR primers for identification of opine types of Agrobacterium tumefaciens in Japan. Journal of General Plant Pathology 69, 258-266. Tarbah, F.A., Goodman, R.N. (1986): Rapid detection of Agrobacterium tumefaciens in grapevine propagating material and the basis for an efficient indexing system. Plant Disease 70, 566-568. Tarbah, F.A., Goodman, R.N. (1987): Systemic spread of Agrobacterium tumefaciens biovar 3 in the vascular system of grapes. Phytopathology 77, 915-920. Thies, K.L., Griffin, D.E., Graves, C.H., Hegwood, C.P. (1991): Characterization of Agrobacterium isolates from muscadine grape. Plant Disease 75, 634-637. Tighe, S.W., de Lajudie, P., Dipietro, K., Lindström, K., Nick, G., Jarvis, B.D.W. (2000): Analysis of cellular fatty acids and phenotypic relationships of Agrobacterium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium and Sinorhizobium species using the Sherlock Microbial Identification System. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50, 787-801. Tolba, I.H., Zaki, M.F. (2011): Characterization of Agrobacterium vitis isolates obtained from galled grapevine plants in Egypt. Annals of Agricultural Science 56, 113-119. Tremblay, G., Gagliardo, R., Chilton, W.S., Dion, P. (1987): Diversity among opine- utilizing bacteria: identification of coryneform isolates. Applied and Environmental Microbiology 53, 1519-1524. 153 Trimble, W.L., Phung, L.T., Meyer, F., Gilbert, J.A., Silver, S. (2012): Draft genome sequence of Agrobacterium albertimagni strain AOL15. Journal of Bacteriology 194, 6986-6987. Untergrasser, A., Cutcutache, I., Koressaar, T., Ye, J., Faircloth, B.C., Remm, M., Rozen, S.G. (2012): Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40, e115. Urbanczyk, H., Suzuki, K., Yoshida, K., Kondo, K. (2003): Physical and gene maps of Agrobacterium biovar 2 strains and their relationship to biovar 1 chromosomes. Microbiology 149, 3035-3042. Van Larebeke, N., Engler, G., Holsters, M., Van den Elsacker, S., Zaenen, I., Schilperoort, R.A., Schell, J. (1974): Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability. Nature 252, 169-170. Vaneechoutte, M., Rossau, R., De Vos, P., Gillis, M., Janssens, D., Paepe, N., De Rouck, A., Fiers, T., Claeys, G., Kersters, K. (1992): Rapid identification of bacteria of the Common- adadceae with amplified ribosomal DNA-restriction analysis (ARDRA). FEMS Microbiology Letters 93, 227-234. Velázquez, E., Palomo, J.L., Lastra, B., Mateos, P., García-Benavides, P., Martínez- Molina, E. (2001): Rapid identification of Agrobacterium species by staircase electrophoresis of low molecular weight RNA profiles. European Journal of Plant Pathology 107, 931-938. Velázquez, E., Peix, A., Zurdo-Pineiro, J.L., Palomo, J.L., Mateos, P.F., Rivas, R., Munoz-Adelantado, E., Toro, N., García-Benavides, P., Martínez-Molina, E. (2005): The coexistence of symbiosis and pathogenicity-determining genes in Rhizobium rhizogenes strains enables them to induce nodules and tumours or hairy roots in plants. Molecular Plant-Microbe Interactions 18, 1325-1332. Versalovic, J., Koeuth, T., Lupski, J.R. (1991): Distribution of repetitive DNA- sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research 19, 6823-6831. 154 Versalovic, J., Schneider, M., de Bruijn, F.J., Lupski, J.R. (1994): Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and Cellular Biology 5, 25-40. Vogel, J., Normand, P., Thioulouse, J., Nesme, X., Grundmann, G. (2003): Relationship between spatial and genetic distance in Agrobacterium spp. in 1 cubic centimeter of soil. Applied and Environmental Microbiology 69, 1482-1487. Watson, B., Currier, T.C., Gordon, M.P., Chilton, M.D., Nester, E.W. (1975): Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 123, 255-264. Wayne, L.G., Brenner, D.J., Colwell, R.R., Grimont, P.A.D., Kandler, O., Krichevsky, M.I., Moore, L.H., Moore, W.E.C., Murray, R.G.E., Stackebrandt, E., Starr, M.P., Trüper, H.G. (1987): Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. International Journal of Systematic Bacteriology 37, 463- 464. Weisburg, W.G., Barns, S.M., Pelletier, D.A., Lane, D.J. (1991): 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology 173, 697-703. Weller, S.A., Stead, D.E. (2002): Detection of root mat associated Agrobacterium strains from plant material and other sample types by post-enrichment TaqMan PCR. Journal of Applied Microbiology 92, 118-126. Welsh, J., McClelland, M. (1990): Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research 18, 7213-7218. White, L.O. (1972): The taxonomy of the crown-gall organism Agrobacterium tumefaciens and its relationship to rhizobia and other agrobacteria. Journal of General Microbiology 72, 565-574. White, P.R., Braun, A.C. (1942): A cancerous neoplasm of plants: autonomous bacteria- free crown gall tissue. Cancer Research 2, 597-617. Wibberg, D., Blom, J., Jaenicke, S., Kollin, F., Rupp, O., Scharf, B., Schneiker-Bekel, S., Sczcepanowski, R., Goesmann, A., Setubal, J.C., Schmitt, R., Pühler, A., Schlüter, A. (2011): Complete genome sequencing of Agrobacterium sp. H13-3, the former Rhizobium lupini H13-3, reveals a tripartite genome consisting of a circular 155 and a linear chromosome and an accessory plasmid but lacking a tumor-inducing Ti- plasmid. Journal of Bacteriology 155, 50-62. Willems, A., Collins, M.D. (1993): Phylogenetic analysis of rhizobia and agrobacteria based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 43, 305-313. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V. (1990): DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Research 18, 6531-6535. Woese, C.R. (1987): Bacterial evolution. Microbiological Review 51, 221-271. Wood, D.W., Setubal, J.C., Kaul, R., Monks, D.E., Kitajima, J.P., Okura, V.K., Zhou, Y., Chen, L., Wood, G.E., Almeida, N.F., Woo, L., Chen, Y.C., Paulsen, I.T., Eisen, J.A., Karp, P.D., Bovee, D., Chapman, P., Clendenning, J., Deatherage, G., Gillet, W., Grant, C., Kutyavin, T., Levy, R., Li, M.J., McClelland, E., Palmieri, A., Raymond, C., Rouse, G., Saenphimmachak, C., Wu, Z.N., Romero, P., Gordon, D., Zhang, S.P., Yoo, H.Y., Tao, Y.M., Biddle, P., Jung, M., Krespan, W., Perry, M., Gordon-Kamm, B., Liao, L., Kim, S., Hendrick, C., Zhao, Z.Y., Dolan, M., Chumley, F., Tingey, S.V., Tomb, J.F., Gordon, M.P., Olson, M.V., Nester, E.W. (2001): The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58. Science 294, 2317-2323. Yakabe, L.E., Maccree, M.M., Sudarshana, P., McClean, A.E., Parker, S.R, Wechter, W.P., Presting, G., Marutani-Hert, M., Kluepfel , D.A. (2012): Novel PCR primers for detection of genetically diverse virulent Agrobacterium tumefaciens biovar 1 strains. Journal of General Plant Pathology 78, 121-126. Yang, W., Ji, L., Tan, L.-R., Li, S.-M., Wang, Y., Liu, H.-X., Luo, Y.-M. (2011): Sensitive and specific detection of Agrobacterium tumefaciens in soil using a rapid polymerase chain reaction (PCR). African Journal of Microbiology Research 5, 708- 713. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. (2012): Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics 13, 134. 156 Young, J.M., Kerr, A., Sawada, H. (2005): Genus Agrobacterium Conn 1942. In: The Proteobacteria. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed., vol. 2. Eds. D.J. Brenner, N.R. Krieg, J.T. Staley, G. Garrity. Springer, New York, USA, pp. 340-345. Young, J.M., Kuykendall, L.D., Martinez-Romero, E., Kerr, A., Sawada, H. (2001): A revision of Rhizobium Frank 1889, with an emended description of the genus, and the inclusion of all species of Agrobacterium Conn 1942 and Allorhizobium undicola De Lajudie et al. 1998 as new combinations: Rhizobium radiobacter, R. rhizogenes, R. rubi, R. undicola and R. vitis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 51, 89-103. Young, J.M., Kuykendall, L.D., Martinez-Romero, E., Kerr, A., Sawada, H. (2003): Classification and nomenclature of Agrobacterium and Rhizobium - a reply to Farrand, van Berkum and Oger. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 53, 1689-1695. Young, J.M., Park, D.C., Weir, B.S. (2004): Diversity of 16S rDNA sequences of Rhizobium spp. implications for species determinations. FEMS Microbiology Letters 238, 125-131. Young, J.M., Pennycook, S.R., Watson, D.R.W. (2006): Proposal that Agrobacterium radiobacter has priority over Agrobacterium tumefaciens. Request for an opinion. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56, 491-493. Zaenen, I., Van Larebeke, N., Van Montagu, M., Schell, J. (1974): Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains. Journal of Molecular Biology 86, 109-127. Zhu, J., Oger, P.M., Schrammeijer, B., Hooykaas, P.J.J., Farrand, S.K., Winans, S.C. (2000): The bases of crown gall tumorigenesis. Journal of Bacteriology 182, 3885- 3895. Zidarič, I. (2009): Monitoring of bacteria of the genus Agrobacterium on grapevine in 2006 and 2007. 9th Slovenian Conference on Plant Protection. 04.-05.03. Nova Gorica, Slovenia. Book of lectures and papers, 225-229. 157 Zupan, J., Muth, T.R., Draper, O., Zambryski, P. (2000): The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. The Plant Journal 23, 11-28. Biografija Nemanja Kuzmanović rođen je 13.06.1986. godine u Beogradu. Osnovnu školu i gimnaziju završio je u Beogradu. Odsek za zaštitu bilja i prehrambenih proizvoda na Poljoprivrednom fakultetu Univerziteta u Beogradu, upisao je školske 2005/06 godine. Diplomirao je 2009. godine, sa prosečnom ocenom 9,11, odbranivši diplomski rad pod nazivom „Toksini Pseudomonas syringae i detekcija siringomicina“. Na Odseku za Fitomedicinu istog fakulteta, školske 2009/10 godine, upisuje doktorske akademske studije. Od februara 2010. angažovan je kao stipendista doktorand u Laboratoriji za fitobakteriologiju pod rukovodstvom prof. dr Alekse Obradovića. U toku 2010. godine učestvovao je u organizaciji međunarodnog kursa iz oblasti fitobakteriologije pod nazivom: „Pseudomonas Pathogens of Stone Fruits and Nuts: Classical and Molecular Phytobacteriology“ koji je održan na Poljoprivrednom fakultetu u Beogradu. U okviru projekta “COST Action 873 - Bacterial diseases of stone fruits and nuts” pohađao je intenzivni kurs: “Phytosanitary Training Course for the Biosecurity Pathogen, Xylella fastidiosa” koji je održan na Mediteranskom agronomskom institutu u Bariju, Italija. U toku 2011. godine realizovao je jednomesečni studijski boravak pod nazivom: “Isolation, molecular identification and genetic diversity study of Agrobacterium spp.” u Laboratoriji za bakteriologiju Instituta za hortikulturu u Skjernevicama, Poljska. U toku 2011. godine, učestvovao je na intenzivnom kursu: “Agrobacterium Phytobacteriology Training Course” koji je održan na Univerzitetu u Lionu, Francuska. Tokom 2011. i 2012. godine, realizovao je desetomesečni studijski boravak na Poljoprivrednom fakultetu Univerziteta u Bolonji, u svojstvu studenta doktoranda na razmeni. Kao stipendista Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije bio je angažovan u okviru projekta Ministarstva nauke i tehnološkog razvoja TR20062: “Biološka zaštita kao alternativa hemijskim sredstvima za zaštitu bilja". Trenutno je angažovan na projektu Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja III46008: “Razvoj integrisanih sistema upravljanja štetnim organizmima u biljnoj proizvodnji sa ciljem prevazilaženja rezistentnosti i unapređenja kvaliteta i bezbednosti hrane”. Učestvovao je i u realizaciji međunarodnog projekta „Ring Test on Diagnosis and Detection of Erwinia amylovora” u toku 2010. godine. U periodu 2010-2013. godine bio je angažovan na realizaciji projekata Ministarstva poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede, u nadzoru pojedinih poljoprivrednih kultura na prisustvo karantinskih fitopatogenih bakterija. Tokom doktorskih studija objavio je i saopštio veći broj naučnih i stručnih radova u domaćim i međunarodnim časopisima iz oblasti fitopatologije i učestvovao na više nacionalnih i međunarodnih naučnih skupova. Član je Društva za zaštitu bilja Srbije i Društva mikrobiologa Srbije. Prilog 1. lzjava o autorstvu Potpisani-a Nemania Kuzmanovid Broj indeksa ili prijave doktorske disertacije 39109 Izjavljujem da je doktorska disertacija pod naslovom: LOZE rezultat sopstvenog istraZivadkog rad4 da predloZena doktorska disertacija u celini ni u delovima nije bila predloLenaza dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visoko5kolskih ustanova, da su rezultati korektno navedeni i da nisam kr5io/la autorska prava i koristio/la intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranda a o a a U Beogradu, 04..1o. l,ol1 . \, o*)[un ^-W Prilog 2. TZJ AV AO ISTOVETNOSTI ST^q.NIPA,NE I ELEKTRONSKE VERZIJE DOKTORSKE DISERTACIJE Ime i prezime autora Nemania Kuzmanovi6 Broj indeksa ili prijave doktorske disertacije 39109, Studijski program Polioorivredne nauke. Modul: Fitomedicina Naslov doktorske disertacije TDENTTFIKACIJA. KARAKTERIZACIJA I GENETICKI DIVERZITET SOJEVA lslobacleriunx spp.. PROUZROKOVACA BAKTERIOZNOG RAKA VINOVE LOZE Mentor prof. dr Aleksa Obradovi6 Potpisani/a Nemania Kuzmanovid Izjavljujem da je Stampana verzija moje doktorske disertacije istovetna elektronskoj veruiji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lidni podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doklora nauka, kao Sto su ime i prezime, godina i mesto rodenja i datum odbrane rada. Ovi lidni podaci mogu se objaviti na mreZnim stranicama digitalne biblioteke, u elekhonskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. U Beogradu, Q4.4Q. 7o4? Potpis doktoranda q,Js .^, U, ,^.{ Prilog 3. lzjava o kori56enju Ovla5dujem Univerzitetsku biblioteku ,,svetozar Markovid* da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: T,O7F. koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji po5tuju odredbe sadrZane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odludio/la. 1. Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno f. Autorstvo - nekomercijalno - bez prerade 4. Autorstvo - nekomercijalno - deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo -bez prerade 6. Autorstvo - deliti pod istim uslovima (Molimo da zaoknrtite samo jednu od Sest ponudenih licenci, kratak opis licenci dat je na kraju). Potpis doktoranda \t, ^ l{* ", dU Beogradu, O4.,to . 2 Q1i 1. Autorstvo - Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence, čak i u komercijalne svrhe. Ovo je najslobodnija od svih licenci. 2. Autorstvo - nekomercijalno. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. 3. Autorstvo - nekomercijalno - bez prerade. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. U odnosu na sve ostale licence, ovom licencom se ograničava najveći obim prava korišćenja dela. 4. Autorstvo - nekomercijalno - deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili sličnom licencom. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada. 5. Autorstvo - bez prerade. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. 6. Autorstvo - deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnožavanje, distribuciju i javno saopštavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na način određen od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili sličnom licencom. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada. Slična je softverskim licencama, odnosno licencama otvorenog koda.