UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Ivana D. Adamović UTICAJ DODAVANJA DAIDZEINA U HRANU SUPRASNIH KRMAĈA NA RAST I RAZVOJ MIŠIĆNOG TKIVA POTOMSTVA Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Ivana D. Adamović INFLUENCE OF DAIDZEIN SUPPLEMENTATION TO SOWS DIET ON GROWTH AND DEVELOPMENT OF MUSCLE TISSUE IN THE PROGENY Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. Ovo istraživanje je obavljeno pri LEIBNIZ INSTITUTE FOR FARM ANIMAL BIOLOGY, DUMMERSTORF, GERMANY Istraživaĉka jedinica MUSCLE BIOLOGY AND GROWTH pod supervizijom Dr. rer. nat. Charlotte Rehfeldt http://www1.fbn-dummerstorf.de/de/Forschung/FBs/fb6/rehfeldt/rehfeldt.htm This study was conducted in the LEIBNIZ INSTITUTE FOR FARM ANIMAL BIOLOGY, DUMMERSTORF, GERMANY Research Unit MUSCLE BIOLOGY AND GROWTH under supervision of Dr. rer. nat. Charlotte Rehfeldt http://www1.fbn-dummerstorf.de/de/Forschung/FBs/fb6/rehfeldt/rehfeldt.htm KOMISIJA Mentor: 1. Dr Duško Vitorović, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet _________________________________ Ĉlanovi komisije: 2. Dr Milica Petrović, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet _________________________________ 3. Dr Gordana Ušćebrka, redovni profesor, Univerzitet u Novom Sadu, Poljoprivredni fakultet _________________________________ 4. Dr Vesna Poleksić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet _________________________________ 5. Dr Zdenka Blagojević, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Fakultet veterinarske medicine _________________________________ Datum odbrane: UTICAJ DODAVANJA DAIDZEINA U HRANU SUPRASNIH KRMAĈA NA RAST I RAZVOJ MIŠIĆNOG TKIVA POTOMSTVA Apstrakt Cilj rada je bio da se ispitaju efekti dodavanja izoflavona daidzeina u hranu suprasnih krmaĉa tokom kasne faze suprasnosti, na porast telesne mase, morfološke i mikroskopske osobine mišića m semitendinosus, kod novorĊene prasadi i tovljenika na kraju tova. TakoĊe, ispitivan je uticaj veliĉine legla na ove osobine kako kod prasadi tako i kod tovljenika, i uticaj pola kod životinja na kraju tova. Disertacija je sprovedena u dva zasebna eksperimenta. U Eksperimentu 1, krmaĉe su hranjene smešom u koju je bila ukljuĉena sojina saĉma, a krmaĉe iz ogledne grupe su od 85-og dana suprasnosti dobijale sintetiĉki daidzein u koliĉini 8 mg/kg hraniva. U Eksperimentu 2, krmaĉe su hranjene smešom koja nije sadržala soju, a ogledna grupa je od 85-og dana suprasnosti dobijala u hrani sintetiĉki daidzein u koliĉini 1 mg/kg telesne mase. Dobijeni rezultati su pokazali da nije došlo do statistiĉki znaĉajnog uticaja daidzeina na povećanje postnatalnog porasta telesne mase i morfoloških osobina mišića m. semitendinosus, kako kod novoroĊene prasadi tako ni kod tovljenika na kraju tova. Tretman krmaĉa daidzeinom, u toku kasne faze suprasnosti, imao je mali ali ne statistiĉki znaĉajan uticaj na strukturu mišića m. semitendinosus, kod novoroĊene prasadi, izražen kroz povećanje ukupnog broja vlakana, broj primarnih vlakana i odnos sekundarna:primarna vlakna. Veliĉina legla, kroz inverzan odnos sa masom prasadi pri roĊenju, imala je znaĉajan uticaj na strukturu mišića m semitendinosus, kod prasadi. Tako su prasad iz malih legala imala statistiĉki znaĉajno veći ukupan broj mišićnih vlakana kao i broj primarnih i sekundarnih vlakana. Kod tovljenika iz Eksperimenta 1, nije ispoljena znaĉajna promena broja, procentualne zastupljenosti i površine STO, FTO i FTG vlakana, pod uticajem daidzeina. Nasuprot tome, kod tovljenika iz Eksperimenta 2 (krmaĉe hranjene obrocima bez soje), dodavanje daidzeina je dovelo do smanjenja % FTO (za 3,5%) a povećanja % udela FTG vlakana (za 5%). Proseĉan broj jedara po jednom mišićnom vlaknu, kod tovljenika, nije bio promenjen pod uticajem daidzeina. Konstatovan je trend smanjenja broja jedara sa smanjenjem površine vlakna. Pol ispitivan kod tovljenika kao jedini faktor, ili u interakciji sa tretmanom, ispoljio je uticaj na telesnu masu, morfološke osobine m. semitendinosus, ukupan broj vlakana i zastupljenost pojedinih tipova vlakana u mišiću. Konaĉno, rezultati ove doktorske disertacije ukazali su na marginalni uticaj dodavanja daidzeina u hranu krmaĉa tokom kasne faze suprasnosti, na postanatalni rast i strukturu mišića m semitendinosus kod potomaka, i ukazali na potrebu daljih istraživanja u pravcu ispitivanja efekata drugih koncentracija i vremena dodavanja ovog jedinjenja suprasnim krmaĉama na mišićno tkivo potomstva. Kljuĉne reĉi: porast mišića, struktura mišićnog tkiva, mišićna vlakna, daidzein, svinje Nauĉna oblast: Zootehnika Uţa nauĉna oblast: Anatomija i fiziologija domaćih i gajenih životinja UDK broj: 636.086.8:636.4(043.3) INFLUENCE OF DAIDZEIN SUPPLEMENTATION TO SOWS DIET ON GROWTH AND DEVELOPMENT OF MUSCLE TISSUE IN THE PROGENY Abstract The aim of this work was to investigate the effects of isoflavone daidzein supplementation to sows diet during late gestation on body weight, morphological and histological characteristics of m. semitendinosus in newborn piglets and slaughter pigs. Also, the influence of litter size on these characteristics in newborn piglets and slaughter pigs, and the ifluence of gender in slaughter pigs were investigated. The investigation was conducted in two separate experiments. In Experiment 1, sows were fed standard feed which included soy meal. Sows from experimental group were supplemented with 8 mg of synthetic daidzein per kg of feed and day. In Experiment 2, feed of sows did not contain soy, and experimental group of sows was supplemented with 1mg of synthetic daidzein per kg of body weight. The obtained results showed that daidzein supplementation did not influence the increase of body weight and morphological characteristics of m. semitendinosus, neither in newborn piglets nor in slaughter pigs. Treatment of sows with daidzein during late gestation had a minor, but not statistically significant influence on m. semitendinosus structure in newborn piglets, expressed as an increase of total muscle fiber number, number of primary fibers and secondary:primary ratio. Litter size, through its inverse relationship with birth weight, had significant influence on m. semitendinosus structure in newborn piglets. Small littter piglets had significantly higher total number of muscle fibers, number of primary and number of secondary fibers. Daidzein supplementation to sows did not influence muscle fiber type distribution and area of STO, FTO and FTG fibers in progeny at slaughter in Experiment 1. Conversely, in Experiment 2, daidzein supplementation to sows caused significant decrease of FTO percentage (for 3,5%) and increase of FTG percentage (for 5%). Number of nuclei per muscle fiber was not changed in slaughter pigs under daidzein treatment. It was found that number of nuclei per muscle fiber tends to decrease with decrease of muscle fiber cross sectional area. The influence of gender as the only factor, or in interaction with treatment, was detected for body weight, morphological characterisctics of m. semitendinosus, total number of muscle fibers and fiber type distribution in muscle of slaughter pigs. Finally, the results of this PhD thesis point at marginal influence of daidzein supplementation to sows diet during late gestation on postnatal growth and structure of m semitendinosus in the offspring. Further investigations with different concentrations of daidzein, and different timing of their supplementation to sows should be conducted with the aim to obtain better knowledge on influence of this isoflavone on skeletal muscle structure in the offspring. Key words: muscle growth, structure of muscle tissue, muscle fibers, daidzein, pig Sadrţaj strana 1. Uvod 1 2. Pregled literature 4 2.1 Struktura mišićnog tkiva 4 2.1.1 GraĊa popreĉno-prugastog mišićnog tkiva 4 2.1.1.1 Tipovi mišićnih vlakana 8 2.1.2 Miogeneza – prenatalni razvoj mišićnog tkiva 11 2.1.3 Postnatalni razvoj mišićnog tkiva 16 2.1.4 Odnos broja i preĉnika mišićnih vlakana 18 2.2 Uticaj razliĉitih faktora na rast mišića i strukturu mišićnog tkiva 19 2.2.1 Naslednost i uticaj selekcije 19 2.2.2 Karakteristike mišića 22 2.2.3 Vrsta ţivotinje 23 2.2.4 Rasa 24 2.2.5 Jedinka 27 2.2.6 Pol 27 2.2.7 Uticaj okoline 28 2.2.7.1 Fetalna ishrana 28 2.2.7.2 Postnatalna ishrana 29 2.2.7.3 Temperatura okoline 30 2.2.7.4 Fizička aktivnost 31 2.2.8 Uticaj veliĉine legla i mase na roĊenju 31 2.2.9 Uticaj faktora rasta i hormona 33 2.2.9.1 Mišićni regulatorni faktori (MRF) 33 2.2.9.2 Insulinski faktori rasta 34 2.2.9.3 Miostatin 35 2.2.9.4 Hormoni 35 2.2.9.4.1 Hormon rasta 35 2.2.9.4.2 Hormoni štitne žlezde 37 2.2.9.4.3 Polni hormoni – estrogen 38 2.3 Izoflavoni – Fitoestrogeni 39 2.3.1 Metabolizam izoflavona 41 2.3.2 Fiziološki efekti izoflavona 42 2.3.3 Uticaj izoflavona na mišićno tkivo 45 2.4 Uticaj strukture mišićnog tkiva na kvalitet mesa 48 3. Ciljevi i zadaci istraţivanja 52 4. Materijal i metod rada 53 4.1 Ţivotinje i ishrana 53 4.1.1 Eksperiment 1 53 4.1.2 Eksperiment 2 56 4.2 Histološke i histohemijske analize mišićnog tkiva 58 4.3 Statistiĉka obrada podataka 63 5. Rezultati 66 5.1 Histološke i histohemijske analize mišićnog tkiva 66 5.2 Eksperiment 1 70 5.2.1 Prasad 70 5.2.1.1 Proizvodne osobine 70 5.2.1.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a 71 5.2.1.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a 73 5.2.2 Tovljenici 77 5.2.2.1 Proizvodne osobine 77 5.2.2.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a 78 5.2.2.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a 80 5.3 Eksperiment 2 91 5.3.1 Prasad 91 5.3.1.1 Proizvodne osobine 91 5.3.1.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a 92 5.3.1.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a 94 5.3.2 Tovljenici 98 5.3.2.1 Proizvodne osobine 98 5.3.2.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a 99 5.3.2.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a 102 6. Diskusija 114 7. Zakljuĉak 144 8. Literatura 147 9. Biografija autora 164 10. Prilozi - Izjave 165 Spisak korišćenih skraćenica: MyHC – myosine heavy chain – teški lanac miozina MyLC – myosine light chain – laki lanac miozina ATPaza – adenozin trifosfataza SDH – sukcinat dehidrogenaza STO – slow twitch oxidative fiber – sporo okidajuće oksidativno mišićno vlakno FTO – fast twitch oxidative fiber – brzo okidajuće oksidativno mišićno vlakno FTG – fast twitch glycolitic fiber – brzo okidajuće glikolitiĉko mišićno vlakno SP ćelije – side pupulation cells – populacija pluripotentnih ćelija u mišićnom tkivu P vlakna – primarna mišićna vlakna – primarna generacija mišićnih vlakana S vlakna – sekundarna mišićna vlakna – sekundarna generacija mišićnih vlakana T vlakna – tercijalna mišićna vlakna – tercijalna generacija mišićnih vlakana MLD – musculus longissimus dorsi IGF – insulin like growth factors – insulinski faktori rasta MRF – mišićni regulatorni faktori MyoD – myogenine determination factor D – gen odgovoran za usmeravanje ćelija ka formiranju mioblasta Myf5 – myogenic factor 5 – mišićni faktor 5 MRF4 – myogenic regulation factor 4 – mišićni regulatorni faktor 4 GF – growth factors – faktori rasta GH – growth hormone – hormon rasta ST – somatotropin – hormon rasta DES – dietilstilbestrol ER – estrogeni receptori PSE – pale, soft, exudative meat – bledo, meko, vodnjikavo meso DFD – dark, firm, dry meat – tamno, tvrdo, suvo meso MJ ME – mega džul metaboliĉke energije NADH – nikotinamid adenin dinukleotid redoksid GLM – general linear model LSM – least squares means SE – standard error – standardna greška 1 1. Uvod Proizvodnja i trgovina mesom veoma su vaţne grane stočarstva i poljoprivrede uopšte. Stalni porast prosečne potrošnje mesa po stanovniku u razvijenim zemljama, i potrošnja ispod proseka u Srbiji ukazuju da naša zemlja ima mogućnosti i da bi trebalo da razvija ovu granu poljoprivrede u cilju zadovoljavanja potreba najpre sopstvenog trţišta ali isto tako i mogućnosti izvoza u druge drţave. Najveći proizvoĎač svinjskog mesa u svetu je Kina (Stamenković i sar., 2008), a najveći uvoznici su upravo zemlje Evropske Unije. Najveću godišnju potrošnju svinjskog mesa po stanovniku imaju evropske zemlje, gde prednjače Danska i Španija sa 65 kg mesa godišnje ( http://poljoprivreda.info/?oid=6&id=666 ). Srbija izvozi svinjsko meso na evropska trţišta u marginalnom i skromnom obimu. Tokom dugog niza godina odgajivanje svinja išlo je u pravcu povećanja mesnatosti i smanjenja debljine leĎne slanine, tako da je danas gotovo postignut biološki maksimum što se tiče količine tzv. bezmasnog, krtog mesa (lean meat). TakoĎe, jednostrana selekcija dovela je do pojave različitih problema, kako zdravstvenih, tako i onih vezanih za kvalitet mesa. Istovremeno sve više je rasla briga potrošača o kvalitetu mesa, osobini koju je teško oceniti obzirom da zavisi od velikog broja aspekata, kako objektivnih tako i subjektivnih (Sosnicki i sar., 2003). Usled rastućih zahteva potrošača u pogledu kvaliteta mesa, mesna industrija preduzela je odreĎene korake ka njihovom zadovoljenju. Postoji veći broj relativno jednostavnih metoda merenja kvaliteta mesa, pomenimo samo merenje pH vrednosti mesa 45 minuta i 24 časa nakon klanja, koje su danas standardno uključene u odgajivačke programe. Sa druge strane, meso kao krajnji, komercijalni proizvod, nastaje od skeletnih mišića koji dok je ţivotinja ţiva imaju izuzetno vaţnu fiziološku funkciju drţanja u normalnom 2 poloţaju ili pokretanja pojedinih delova ili celog tela. Obzirom da masa mišića čini oko 40% telesne mase ţivotinja pri roĎenju i preko 50% od ukupne telesne mase kod odraslih ţivotinja (Rehfeldt i sar., 2007, Kosovac i sar., 2008), rast i razvoj mišića su praktično glavne komponente porasta tela. Zbog toga je neophodno stalno proširivanje znanja o nastanku i razvoju mišićnog tkiva, kao i faktorima koji mogu imati uticaj na ove procese. Savremena svinjarska proizvodnja ima veoma teţak zadatak – da istovremeno podmiri veoma različite, često suprotne zahteve: da se obim proizvodnje mesa poveća toliko da moţe zadovoljiti potrebe krajnjih potrošača; da se selekcijom ne naruše osnovne biološke i fiziološke mogućnosti ţivotinja; da kvalitet mesa bude u skladu sa zahtevima konzumenata odnosno preraĎivačke industrije; da se proces proizvodnje mesa ubrza, a da pri tome troškovi proizvodnje ne preĎu granicu rentabilnosti. Zbog toga se, tokom poslednjih godina, različite grane industrije spajaju u sve kompleksnije sisteme proizvodnje hrane – „value chains“ ili lance vrednosti, koji uključuju vertikalno ali i horizontalno povezane učesnike (Sosnicki i Newman, 2010). Cilj ovakvih lanaca je da postignu stalnu konkuretnost na trţištu kroz usmeravanje resursa ka efektnoj proizvodnji dobara koja potrošaču nude odličan i prepoznatljiv kvalitet. Stanje svinjarske proizvodnje u Srbiji znatno je pogoršano tokom proteklih dvadesetak godina (Petrović i sar., 2005). Razlozi za ovakav, negativan trend, su mnogostruki, od nerazjašnjenih pravno-vlasničkih odnosa, nedovoljno uspešnih privatizacija, nepovoljnih cena, sve do opadanja broja nerastova i nazimica koje ulaze u performans test, neplanskih ukrštanja ili nepoštovanja odgajivačkih programa itd. Prema podacima Privredne Komore Srbije, u 2007-oj godini prosečna godišnja potrošnja mesa po stanovniku u Evropskoj Uniji iznosila je oko 70 kg, dok je u Srbiji bila 48,7 kg, što se moţe tumačiti slabijom kupovnom moći graĎana, ali i malim obimom proizvodnje mesa. Ako se posmatra potrošnja samo svinjskog mesa, tokom 2003-će, 2004-te i 2005-te godine, prosečna godišnja potrošnja svinjskog mesa po glavi 3 stanovnika iznosila je oko 16 kg u Srbiji, dok je u zemljama Evropske Unije bila oko 45 kg (Petrović i sar., 2005). Sve navedeno govori o mogućnostima daljeg razvoja proizvodnje svinjskog mesa i u našoj zemlji. Da bi se organizovala proizvodnja optimalnog obima i kvaliteta, neophodno je zadovoljiti veliki broj kriterijuma, od smeštajnih kapaciteta, preko pravilne selekcije i odgajivanja, do potreba u hrani. MeĎutim, kako je meso praktično najvaţniji proizvod koji se od ove vrste domaćih ţivotinja moţe koristiti, a s obzirom na sve veće zahteve potrošača za odreĎenim kvalitetom mesa i proizvoda od mesa, potrebno je raditi na poboljšanju proizvodnje ne samo u smislu povećanja količine, već i u pogledu strukture i kvaliteta mesa. Imajući u vidu sa jedne strane specifičnosti naše zemlje i uslove u kojima se svinjarstvo u Srbiji trenutno nalazi, i svetske trendove u svinjarskoj proizvodnji, Petrović i sar. (2005) predlaţu čitav niz mera koji bi za cilj imali specijalizaciju proizvodnje, definisanje odgajivačkih programa koji bi vodili konstantnom poboljšavanju genetske osnove svinja ali istovremeno bili fleksibilni i podloţni promenama u skladu sa zahtevima potrošača. Naučna dostignuća iz oblasti svinjarstva samo su jedna karika koja neosporno mora biti uključena u takav „lanac vrednosti“ proizvodnje svinjskog mesa. 4 2. Pregled literature 2.1 Struktura mišićnog tkiva U organizmu ţivotinja prisutne su dve vrste mišićnog tkiva: glatko i poprečno-prugasto (Ross i Pawlina, 2006). Poprečno-prugasto mišićno tkivo dalje se po osnovu mesta gde se nalazi moţe podeliti na: skeletno, visceralno i srčano mišićno tkivo. Visceralno, srčano i glatko mišićno tkivo imaju veoma vaţne fiziološke funkcije jer potpomaţu disanje, gutanje (visceralno mišićno tkivo), grade srčani mišić (srčano mišićno tkivo), odnosno ulaze u sastav unutrašnjih organa (glatko mišićno tkivo), ali sa ekonomske strane gledišta u proizvodnji mesa ove vrste mišićnog tkiva nemaju značaj. Za proizvodnju mesa vaţno je poprečno-prugasto mišićno tkivo. Ovo tkivo izgraĎuje skeletne mišiće, a u komercijalnom smislu predstavlja – meso. 2.1.1 Građa poprečno-prugastog mišićnog tkiva Jedinica graĎe i funkcije poprečno-prugastog mišićnog tkiva je mišićno vlakno ili mišićna ćelija. Mišićna vlakna u mišiću nisu naslagana nasumice već u pravilne snopove okruţene epimizijumom, spoljašnjim omotačem od gustog veziva koje obavija ceo mišić (Slika 1). Od epimizijuma se ka unutrašnjosti mišića proteţu tanke pregrade (septe) od vezivnog tkiva, koje obavijaju snopove mišićnih vlakana unutar mišića. Vezivno tkivo oko svakog snopa vlakana naziva se perimizijum, a ovakva mišićna formacija – snop mišićnih vlakana obavijen perimizijumom naziva se fascikul (snop). Fascikuli se mogu videti na poprečnom preseku mišića i golim okom. TakoĎe, svako pojedinačno mišićno vlakno unutar fascikula obavijeno je tankim slojem vezivnog tkiva koje se naziva endomizijum. Svi vezivno tkivni omotači u okviru mišića, zajedno sa kolagenom koji se nalazi izmeĎu vlakana na završetku mišića se spajaju formirajući tetivu, koja pričvršćuje mišić za kost. 5 Slika 1. Šematski prikaz poprečnog preseka mišića (http://training.seer.cancer.gov/images/anatomy/muscular/muscle_structure.jpg) Mišićno vlakno je dugačka ćelija, pribliţno kruţnog poprečnog preseka, sa većim brojem jedara rasporeĎenih po periferiji citoplazme. Duţina vlakna moţe biti od nekoliko milimetara do nekoliko centimetara, a prečnik vlakna varira od 10 do 100 µm. Svako vlakno je inervisano i preko mreţe kapilara snabdeveno krvlju. Kao i svaka druga ćelija, tako je i mišićna ćelija obavijena ćelijskom membranom, koja kod mišićnih ćelija ima specifičan naziv – sarkolema. Unutar ćelije nalazi se citoplazma – sarkoplazma, sa tipičnim ćelijskim organelama od kojih su za funkciju vlakna od najvećeg značaja mitohondrije i sarkoplazmatični retikulum. U sarkoplazmi mišićnog vlakna prisutan je i veliki broj još tanjih miofibrila, na kojima se uočavaju tamne pruge A diskovi i svetle pruge I diskovi. Tamne i svetle pruge posledica su tačno odreĎenog rasporeda sastavnih delova miofibrila – mikrofilamenata sastavljenih od molekula aktina i miozina, i različite sposobnosti filamenata da refraktuju svetlost. Osim što poprečno-prugastom mišićnom tkivu daju karakterističan izgled, po kome je ova vrsta mišićnog tkiva i dobila naziv, sastavni delovi filamenata - aktin i miozin su molekuli preko kojih se obavlja sloţen proces mišićne kontrakcije. Miofibrili sadrţe dve vrste mikrofilamenata: debele, koji se sastoje uglavnom od molekula miozina, i tanke koji se sastoje uglavnom od molekula aktina, ali u njihovoj graĎi učestvuju i proteini tropomiozin i troponin. Da bi se očuvala efikasnost i brzina mišićne kontrakcije, neophodno je prisustvo tzv. dodatnih proteina: titina, nebulina, 6 dezmina i drugih (Poleksić i sar., 2003, Ross i Pawlina, 2006). Ovi proteini čine oko 25% ukupnih proteina u mišićnom vlaknu, a imaju ulogu u regulaciji rastojanja, povezivanja i pravilnog postavljanja mikrofilamenata pri kontrakciji. Debeli filament sastoji se od oko 200 pojedinačnih molekula miozina. Svaki molekul miozina izgraĎen je od 6 polipeptidnih lanaca: dva teška i četiri laka. Dva lanca teškog miozina (myosine heavy chain – MyHC) formiraju dvostruki heliks, čiji je jedan deo ravan i naziva se rep, a suprotni deo heliksa je „odmotan“ i formira dve miozinske glave. U graĎi svake miozinske glave osim teškog miozina učestvuju i po dva lanca lakog miozina (myosine light chain – MyLC). Molekuli miozina su u okviru debelog filamenta spojeni preko svojih repova, a miozinske glave „štrče“ na suprotnim krajevima filamenta okrenute ka spoljašnjosti, tj. ka tankim – aktinskim filamentima. Ukupna duţina debelog filamenta, kada je mišić relaksiran, je negde oko 1,6 µm. Tanki filament sastoji se od spiralno uvijenih dvostrukih lanaca aktina, tropomiozina i globularnog troponina. Molekul aktina tokom kontrakcije mišića komunicira sa miozinskim filamentima. Uloga tropomiozina je da kada je mišić relaksiran prepokriva aktivna mesta na aktinu, i onemogućava interakciju aktina i miozina. Troponin ima funkciju da sa jedne strane pričvršćuje molekul tropomiozina za aktin, a sa druge strane troponin ima snaţan afinitet prema jonima kalcijuma, koji iniciraju kontrakciju. Duţina tankog filamenta, kada je mišić relaksiran, je negde oko 1 µm. Raspored debelih i tankih filamenata u miofibrilu je tačno odreĎen. Naime, duţinom miofibrila jedna na drugu vezuju se sarkomere (Slika 2). Spoj dve sarkomere naziva se Z linija. Na svakoj Z liniji vezani su tanki filamenti, koji se od Z linije pruţaju ka sredini sarkomere. MeĎutim, dva aktinska filamenta koja se prostiru sa suprotnih Z linija ne spajaju se na sredini, već izmeĎu dva suprotna aktinska filamenta, kada je mišić relaksiran postoji slobodan prostor - H zona. Kada je mišić u kontrakciji, aktinski filamenti sa suprotnih Z linija se dodiruju na samoj sredini sarkomere u tzv. M liniji. M linija je takoĎe mesto koje predstavlja sredinu debelog, miozinskog filamenta. Miozinski filamenti rasporeĎeni su tako da je svaki okruţen sa po 6 tankih filamenata. Region sarkomere gde su na preseku pristuni i debeli i tanki filamenti naziva se A disk, 7 ili A zona, zbog toga što je ovaj deo sarkomere anizotropan – ne refraktuje svetlost. Deo sarkomere gde su pristuni samo tanki aktinski filamenti, refraktuje svetlost, izotropan je, pa se naziva I disk ili I zona. Slika 2. GraĎa mišićnog vlakna (http://1.bp.blogspot.com/_1MW6Tajv9y0/S-dn2Wi2sDI/AAAAAAAAAA4/TwvE6a74DYM/s400/muscle.gif) Različite zone sarkomera susednih miofibrila se poklapaju, A zona jednog miofibrila naleţe na A zonu susednog, takoĎe I zona jednog miofibrila naleţe na I zonu susednog, pa se na uzduţnom preseku mišića mogu lepo uočiti pravilno rasporeĎene tamne i svetle pruge (Slike 3 i 4) 8 Slika 3. (levo) Slika poprečno prugastog mišićnog tkiva – elektronska mikroskopija (http://www.amtimaging.com/www11/src_gallery/gallery_2012/xr16m_2012/041_striatedmuscle.jpg) Slika 4. (desno) Slika poprečno prugastog mišićnog tkiva – svetlosna mikroskopija (http://www.sciencephoto.com/image/303273/large/P1550028-Primate_Skeletal_Muscle-SPL.jpg) Danas je opšte prihvaćena teorija po kojoj se kontrakcija mišića odvija tzv. klizanjem filamenata. Ona započinje kada jon kalcijuma otkrije aktivna mesta na molekulu aktina. Za aktivna mesta vezuju se glave teškog miozina sa debelog filamenta, i čitava sarkomera se skraćuje klizanjem aktinskih filamenata izmeĎu miozinskih ka središtu sarkomere odnosno M liniji. Kontrahovanjem na miofibrilu uzduţno postavljenih sarkomera i do 30% svoje duţine, postiţe se smanjenje duţine čitavog miofibrila. A kontrahovanjem grupe miofibrila koji grade mišićno vlakno smanjuje se i duţina celog vlakna. Energija neophodna za proces kontrakcije dobija se hidrolizom ATP-a. 2.1.1.1 Tipovi mišićnih vlakana Najrasprostranjeniji protein u mišićnom vlaknu je miozin. Ovaj protein je takoĎe i pokretač mišićne kontrakcije, pa bi se moglo reći da on odreĎuje mehaničke osobine i potrebe u energiji jednog mišićnog vlakna (Reggiani i Mascarello, 2004). U organizmu različitih vrsta kičmenjaka otkriven je veliki broj izoformi miozina. U skeletnoj muskulaturi sisara prisutno je osam izoformi teškog miozina: embrionska, perinatalna, IIa, IIx, IIb, ekstraokularna, β-spora i α-srčana izoforma (Weiss i Leinwand, 1996). Neke od ovih izoformi prisutne su samo u odreĎenom periodu ţivota jedinke, npr. tokom embrionalnog razvića, ili kod odraslih ţivotinja samo tokom regeneracije mišića; neke izoforme specifične su za odreĎene grupe mišića, tako npr. ţvakaći i očni mišići u svom sastavu imaju izoforme teškog miozina koje se ne mogu naći u poprečno- 9 prugastim mišićima trupa ili ekstremiteta. Treba napomenuti i to da u jednom mišićnom vlaknu moţe istovremeno biti prisutno više izoformi MyHC (Rosser i Bandman, 2003), ali kontraktilne osobine, a time i tip vlakna, zavisiće od one izoforme koja ja najviše zastupljena (Shiaffino i Reggiani, 1996) U skeletnim mišićima, odnosno pojedinačnim mišićnim vlaknima odraslih svinja, nalaze se zastupljene četiri izoforme teškog miozina (Schiaffino i Reggiani, 1994, Lefaucheur i sar., 1998), i tri izoforme lakog miozina (Schiaffino i Reggiani, 1994). Brzina kontrakcije mišićnog vlakna zavisi od brzine hidrolize molekula ATP-a koji se koristi za kontrakciju. Način i brzina hidrolize ATP-a u direktnoj su vezi sa izoformom MyHC (Galler i sar., 1994). Za klasifikaciju vlakana u odreĎene tipove vaţan je još i energetski metabolizam (Gauthier, 1969). Kontraktilnost teškog miozina histološki se ispituje na osnovu razlika u osetljivosti na aktomiozin ATP-azu na odreĎenoj pH vrednosti (Brooke i Kaiser, 1970, Guth i Samaha, 1970). Po ovom osnovu, mišićna vlakna se mogu podeliti na spora i brza. Osim po osnovu brzine kontrakcije, vlakna se razlikuju i po načinu energetskog metabolizma (Gauthier, 1969). U histologiji se tip energetskog metabolizma moţe utvrditi ispitivanjem mitohondrijalnog enzima sukcinat-dehidrogenaze (SDH). Ovo omogućava grupisanje vlakana u oksidativna ili crvena koja su tamne boje na histološkim preparatima, i glikolitička ili bela koja se na histološkim preparatima vide kao bela ili svetla. Primenom metoda konvencionalnog - histoenzimološkog odreĎivanja tipa vlakana, koje kombinuje ove dve vaţne karakteristike vlakana - brzinu kontrakcije i tip metabolizma, kod odraslih ţivotinja mogu se razdvojiti tri tipa mišićnih vlakana: sporo kontrahujuća (okidajuća) oksidativna (STO), brzo kontrahujuća (okidajuća) oksidativna (FTO) i brzo kontrahujuća (okidajuća) glikolitička (FTG) (Brooke i Kaiser, 1970, Tunell i Hart, 1977, Guth i Samaha, 1970) (Tabela 1, iz Lefaucheur i Gerrard, 2000). Spora mišićna vlakna su vlakna duţe izdrţljivosti, zaduţena za spore i dugotrajne pokrete, i nalaze se 10 kao više prisutna u onim mišićima koji obezbeĎuju pravilno drţanje, stajanje. To su uglavnom dublje partije mišića trupa i ekstremiteta. Brza vlakna su zaduţena za obavljanje kratkotrajnih ali brzih pokreta, i čine većinu vlakana u mišićima koji utiču na pokretanje odreĎenih delova tela, ili u onim mišićima koji se slabije koriste (tipičan primer su grudni i mišići krila kod ţivine). Tabela 1. Biohemijske osobine različitih tipova mišićnih vlakana (Lefaucheur i Gerrard, 2000) Biohemijska osobina Tip vlakana STO (ßR, I) FTO (αR, IIA) FTG (αW, IIB) Tip kontrakcije Sporo-okidajuća Brzo-okidajuća Brzo-okidajuća Tip metabolizma oksidativni oksido-glikolitički glikolitički AM-ATPaza + ++ +++ Glikogen + +++ +++ Mioglobin +++ +++ + Masti +++ ++ + Prokrvljenost +++ +++ + Prečnik + ++ +++ + slabo izraţeno; ++ srednje izraţeno; +++ veoma izraţeno Histoenzimološke metode odreĎivanja tipa vlakana danas su u širokoj primeni. MeĎutim, novija istraţivanja, koja se zasnivaju na odreĎivanju prisustva izoformi teškog miozina ukazuju na potrebu razdvajanja vlakana na 4 tipa (Lefaucheur i sar., 2004, Chang i sar., 2003). Kod svinja se sporo-okidajuća tip I vlakna sastoje preteţno od miofibrila koji sadrţe tzv. sporu, slow ili β izoformu teškog miozina. U sastavu brzo- okidajućih tip II vlakana učestvuju tri izoforme teškog miozina: IIa, IIx i IIb. UtvrĎeno je da se izoforma teškog miozina IIa nalazi prisutna uglavnom u brzo-okidajućim oksidativnim IIA (FTO) vlaknima, dok brzo-okidajuća IIB (FTG) vlakna sadrţe različite izoforme teškog miozina u zavisnosti od mišića. Tako npr. m. longissimus dorsi svinja sadrţi mešavinu čistog IIx, hibridnog IIx/IIb ili čistog IIb teškog miozina, dok duboka partija m. semitendinosus-a u FTG vlaknima sadrţi samo čistu IIx izoformu teškog miozina (Lefaucheur i sar, 1998). Prisustvo izoforme teškog miozina IIb u mišićnim vlaknima moţe biti uzrok lošijem kvalitetu mesa kod svinja (Chang i sar., 2003), mada su neka istraţivanja pokazala pozitivnu korelaciju izmeĎu osobina kvaliteta mesa i zastupljenosti teškog miozina IIb (Depreux i sar., 2002). Moguće je da odraţavanje zastupljenosti pojedinih izoformi teškog miozina na kvalitet mesa zavisi od vrste mišića i genotipa. 11 Izoforme lakog miozina, MyLC, takoĎe prolaze kroz transformacije tokom fetalnog i postnatalnog perioda, a kod odraslih ţivotinja prisutne su tri izoforme koje prate odgovarajuće izoforme teškog miozina odnosno tipove vlakana. Izoforme lakog miozina su: spora MyLC1s, zastupljena u sporim STO vlaknima, i dve brze izoforme MyLC1f i MyLC3f koje se obe istovremeno nalaze u brzim FTO i FTG vlaknima (Schiaffino i Reggiani, 1994). Ipak, i podelu vlakana na osnovu zastupljenosti pojedinih izoformi teškog miozina trebalo bi shvatiti uslovno. Danas većina autora (Reggiani i Mascarello, 2004; Pette i Staron, 2000; Lefaucheur, 2004, Schiaffino i Reggiani, 1996) smatra da je mišićno tkivo izuzetno heterogeno tkivo sastavljeno od više tipova i podtipova vlakana, koji prolaze kroz kontinuirane fenotipske promene odgovarajući na izmenjene mehaničke, hormonalne, neuralne ili druge zahteve. Schiaffino i Reggiani (1994) navode da prisustvo i izoformi teškog, i izoformi lakog miozina utiču na kontraktilne osobine mišićnih vlakana, i da upravo različite kombinacije izoformi dva tipa miozina daju mišićnim vlaknima različitu brzinu i snagu kontrakcije. Istraţivanja Rosser-a i Bandman-a (2003) ukazuju i na pojavu više izoformi teškog miozina u okviru jednog mišićnog vlakna. Zbog toga su neophodna dalja istraţivanja u cilju što preciznije klasifikacije vlakana na pojedine tipove. 2.1.2 Miogeneza – prenatalni razvoj mišićnog tkiva Proces nastanka mišićnih ćelija ili vlakana naziva se miogeneza. Osim za mišiće glave, izvor mišićnih ćelija praktično svih skeletnih mišića u telu su somiti. Somiti su parne loptaste skupine mezodermalnih ćelija koje se formiraju sa lateralnih strana neuralne cevi, tokom embrionalnog razvića. Daljom deobom (Slika 5), ćelije somita se determinišu kao: - dermatom – skup ćelija od koga će daljom transformacijom nastati ćelije dermisa koţe - miotom – skup ćelija od kojih se formiraju mioblasti ili ćelije prekurzori mišićnih vlakana - sklerotom – skup ćelija od koga će se razviti kičmeni pršljenovi i rebra 12 Ključni momenat u diferencijaciji ćelija prema odreĎenim linijama predstavlja uključivanje gena, a za usmeravanje ćelija ka formiranju mioblasta, odnosno mišićnih ćelija vaţni su geni Myogenin i MyoD. Signali za opredeljivanje ćelija ka odreĎenim linijama, najverovatnije, dolaze od nervne cevi i notohorde. Slika 5: Determinacija ćelija somita u tri različite linije (http://www.bionalogy.com/skeletal_system_fil es/image002.jpg) Miotom je skup ćelija koje su opredeljene ka diferencijaciji mišićnog tkiva. Ove prve, početne ćelije ili prekurzori ćelija mišićnog tkiva nazivaju se mioblasti (Slika 6). To su bipolarne, jednojedarne ćelije, koje se ubrzano dele. Najveći broj mioblasta ulazi u proces diferencijacije, koji podrazumeva njihovu fuziju u sincicijum i stvaranje višejedarnih, izduţenih primarnih vlakana. Stvaranje primarnih vlakana dešava se u ranim fazama miogeneze, smatra se u prvoj fazi ili prvom talasu stvaranja mišićnih vlakana (Wigmore i Stickland, 1983). U ovoj fazi mišići još uvek nisu prepoznatljivi, a primarna vlakna su dosta velikog obima, meĎusobno su razdvojena. Broj primarnih vlakana predstavlja samo mali deo ukupnog broja mišićnih vlakana koji će se po završetku fetalnog perioda naći u finalnom mišiću. Na prvu fazu nastavlja se drugi talas proliferacije, koji se ogleda u formiranju sekundarnih vlakana na površini primarnih. Do kraja miogeneze, svako primarno vlakno biće okruţeno sa većim brojem sekundarnih, a takve skupine vlakana nazivaju se klasteri. Broj formiranih sekundarnih vlakana na površini primarnog vlakna zavisi od vrste, i moţe biti 5-10 kod pacova, 20-25 kod svinja (Stickland i Handel, 1986; Nissen i 13 sar., 2003) a čak do 70 kod ovaca. Nastankom klastera, prekida se proces proliferacije, primarna vlakna se smanjuju u obimu, dok se sekundarna izduţuju i povećavaju obim - hipertrofiraju, tako da se kod odraslih jedinki praktično ne vidi razlika u veličini i obimu izmeĎu primarnih i sekundarnih vlakana. Jedan broj mioblasta ne ulazi u procese fuzije, već ostaje u stanju mirovanja i zadrţava svoj prvobitni izgled i funkciju i kod odraslih ţivotinja. S obzirom da se najveći deo sadrţaja DNK u jedrima mišića akumulira postnatalno (Allen i sar., 1979), pretpostavlja se da su upravo ovi mioblasti baza za stvaranje DNK kod odraslih jedinki, jer učestvuju u procesima regeneracije i porasta mišićnog tkiva. Ove ćelije nazivaju se „stem“ ćelije, a prva otkrivena vrsta stem ćelija bile su satelitske ćelije (satellite cells) (Mauro, 1961). Novija istraţivanja pokazuju prisustvo i drugih pluripotentnih ćelija u mišićnom tkivu, od kojih populacija tzv. SP ćelija (side population cells) privlači sve veću paţnju. MeĎusobni odnosi različitih subpopulacija stem ćelija, i njihova tačna uloga u postnatalnom razvoju mišićnog tkiva pitanja su na koje je moguće dobiti odgovor samo daljim naučnim istraţivanjima. Slika 6: Šematski prikaz determinacije i diferencijacije mišićnih ćelija (Brameld i sar., 1998) Osim što se primarna i sekundarna vlakna stvaraju u različitim fazama miogeneze, smatra se takoĎe i da ove dve vrste vlakana vode poreklo od različitih mioblasta. Primarna ili P-vlakna nastaju od embrionalnih mioblasta, a sekundarna ili S-vlakna od fetalnih mioblasta (Swatland i Cassens, 1973). Hiperplazija DETERMINACIJA Hipertrofija Zrelo mišićno vlakno Rani miotubul Mioblast DIFERENCIJACIJA Mezenhimalni prekursor MioD Mif-5 Miogenin MRF 4 14 Kod svinja, kod kojih gestacija traje 114 dana, proces formiranja primarnih vlakana počinje oko 25-30 dana gestacije i traje do 50-60 dana, dok su prva S vlakna vidljiva već oko 50tog dana gestacije, a formiraju se sve do 80tog dana (Swatland i Cassens, 1973; Wigmore i Stickland, 1983). Kod ove vrste ţivotinja opisana su i tercijalna vlakna koja se razvijaju izmeĎu sekundarnih, i to tokom prvih dana ili nedelja postnatalnog ţivota (Brameld, 2008). Picard i sar. (2002) navode da kod domaćih ţivotinja, osobine mišićnih vlakana igraju značajnu ulogu u kvalitetu mesa. Ontogeneza mišićnih vlakana počinje veoma rano u toku embrionalnog ţivota, sa sukcesivnom pojavom dve ili tri vrste mioblasta koji predstavljaju izvor (poreklo) različitih tipova mišičnih vlakana. Kod malih ţivotinja (ţivina, glodari), primarna i sekundarna generacija vlakana nastaju tokom embrionalnog i fetalnog stupnja razvića. Kod većih vrsta (goveda, ovce, svinje) treća generacija vlakana nastaje tokom kasnog fetalnog ili ranog postanatalnog perioda. Na kraju ovih dve ili tri faze miogeneze, ukupan broj mišićnih vlakana u jednom mišiću je fiksiran, ostaje stalan. Uporedo sa miogenezom, odvija se i proces kontraktilne i metaboličke diferencijacije mišićnih vlakana. Primarna P vlakna koja nastaju u prvom talasu proliferacije mioblasta nose embrionalnu izoformu teškog miozina koji se kasnije transformiše u tzv. β, tip I ili spori (slow) teški miozin. Ovakva izoforma ostaje prisutna i tokom postnatalnog ţivota a primarnim vlaknima daje sposobnost spore kontrakcije, pa se ovakva vlakna kod odraslih ţivotinja nazivaju i sporo kontrahujuća ST (slow- twitch) vlakna. Sekundarna S vlakna koja nastaju u drugom talasu proliferacije mioblasta nose u početku takoĎe embrionalnu izoformu MyHC. MeĎutim, kod ovih vlakana se emrionalni MyHC moţe transformisati ili u β teški miozin kod onih S vlakana koja ostaju priljubljena uz centralno postavljeno P vlakno formirajući na taj način klastere, ili se moţe transformisati u tzv. α, tip II ili brzi (fast) teški miozin (Picard i sar., 2002). Brzi MyHC daće vlaknima sposobnost brze kontrakcije, pa se ova vlakna nazivaju još i brzo kontrahujuća FT (fast-twitch) vlakna. Pojednostavljeni prikaz diferencijacije vlakana kod svinja tokom miogeneze i nakon roĎenja, zasnovan na tranzicijama izoformi teškog miozina prikazan je na Slici 7. 15 Slika 7. Diferencijacija mišićnih vlakana skeletnih mišića svinja (Lefaucheur i sar., 2000) Neka istraţivanja ukazuju da je broj vlakana fiksiran pri roĎenju ili ubrzo nakon roĎenja (Wigmore i Stickland, 1983, Rehfeldt i sar., 2000, Brameld i sar., 2003). U praktičnom smislu to sa jedne strane znači da se nakon roĎenja povećanje mesnatosti ne moţe odvijati po osnovu povećanja broja vlakana u mišiću, već samo po osnovu hipertrofije onog broja vlakana sa kojim je jedinka roĎena; a sa druge strane ukazuje na miogenezu kao period u kome bi manipulacija sa brojem mišićnih vlakana jedino bila moguća. Ipak, prema drugim autorima, proces formiranja mišićnih vlakana nešto je sloţeniji kod krupnih sisara gde se mogu ubrojati i svinje. Istraţivanja Mascarello-a i sar. (1992), i Lefaucher-a i sar. (1995), pokazala su da se kod svinja pri samom završetku gestacije i u ranom post-natalnom periodu formira još jedna populacija vlakana, tzv. tercijalnih ili T vlakana. Smatra se da ova vlakna koriste S-vlakna kao matricu za svoje formiranje. Poreklo mioblasta koji se spajaju radi formiranja tercijalnih vlakana nije poznato. Brameld i sar. (2008) takoĎe ističu da se intrauterino stvaranje mišićnih vlakana, odvija u dva ili tri talasa (faze). Prvo se formiraju primarna vlakna. Njihovo stvaranje je 16 praćeno pojavom sekundarnih vlakana, koja se razvijaju oko postojećih primarnih. Kod krupnijih vrsta, ustanovljena su i tercijalna vlakna, koja se razvijaju izmeĎu sekundarnih. Vreme pojavljivanja pojedinih tipova vlakana je različito kod različitih vrsta (Tabela 2). Tabela 2. Faze gestacije u kojima se razvijaju pojedini tipovi mišićnih vlakana kod različitih vrsta sisara (Brameld i sar, 2008) Vrsta Duţina graviditeta Primarna vlakna Sekundarna vlakna Tercijalna vlakna Pacov 22 dana 14-16 df 17-19 df / Zamorac 68 dana 30 df 30-35 df / Svinja 114 dana 35 df 55 df 0 – 15 dpn Ovca 145 dana 32 df 38 df 62-76 df Govedo 278-283 dana 60 df 90 df 110 df df – dana fetalnog ţivota; dpn – dana postnatalnog ţivota Kod mladunčadi, novoroĎenčadi, najveći broj primarnih vlakana su transformiše se u sporo oksidativna (tip I) mišićna vlakna. U isto vreme, najveći broj sekundarnih i tercijalnih vlakana razviće se u vlakna brzokontrahujućeg tipa (tipovi IIA i IIB) (Brameld i sar., 2008). 2.1.3 Postnatalni razvoj mišićnog tkiva Ispitivanja velikog broja autora (Staun, 1963, Handel i Stickland, 1988, Dwyer i sar., 1993) pokazala su da je broj mišićnih vlakana kod sisara i ptica fiksiran po roĎenju, i da se tokom postnatalnog ţivota porast mišića ne dešava na bazi povećanja broja vlakana, već po osnovu porasta veličine (prečnika i duţine) vlakana – hipertrofije (Wegner i sar., 2000, Rowe i Goldspink, 1969). Ovaj proces odvija se zahvaljujući proliferativnoj aktivnosti satelitskih ćelija koje predstavljaju izvor jedara koja se ugraĎuju u rastuća vlakna (Allen i sar., 1999). Kao što je već rečeno, smatra se da se proces formiranja vlakana kod svinja završava negde do 80-tog dana gestacije, i da nakon toga nema promena u broju vlakana. Pa ipak, kod svinja je primećen porast broja vlakana u prvih nekoliko nedelja nakon roĎenja (Rehfeldt i sar., 2000, Rehfeldt i sar., 2008). Moguće objašnjenje ovakve pojave jeste da se broj vlakana povećava usled sazrevanja, produţavanja i prorastanja već postojećih mišićnih vlakana izmeĎu drugih vlakana u mišiću (Ontell i Kozeka, 1984), a da nije rezultat produkcije novih vlakana, dok drugi autori (Lefaucheur i sar., 1995, Rehfeldt i sar., 2008, Berard i sar., 2011) smatraju da se kod svinja u završnim fazama suprasnosti, i neposredno nakon roĎenja formira treća 17 generacija vlakana malog prečnika. Prema Berard i sar. (2011) pojava povećavanja broja vlakana u prvim nedeljama postnatalnog ţivota kod svinja, rezultat je zajedničkog delovanja oba procesa: i produţavanja i prorastanja postojećih vlakana izmeĎu drugih vlakana u mišiću, i razvoja nove populacije tercijalnih vlakana. Istraţivanje ovih autora pokazalo je najintenzivnije povećanje broja vlakana do 3-će nedelje postnatalnog ţivota prasadi. Prema Rehfeldt i sar. (1987) prečnik mišićnih vlakana kod svinja rase Nemački landras povećava se od momenta roĎenja pa sve do dvadesete nedelje ţivota kada dostiţe plato, i kasnije ostaje relativno konstantan. Za razliku od prečnika vlakana, broj mišićnih vlakana ne menja se već od pete nedelje starosti (Slika 8). Slika 8. Postnatalni razvoj prečnika mišićnog vlakna i ukupnog broja vlakana na poprečnom preseku mišića m. Semitendinosus kod svinja (Rehfeldt i sar., 2000) Razumevanje mehanizma postnatalnog porasta mišićnih vlakana, hipertrofije, veoma je vaţno kako sa fiziološkog, tako i sa proizvodnog stanovišta. Smatra se da se pri porastu mišićnog vlakna u njega ubacuju jedra iz satelitskih ćelija, i da svako jedro ishranjuje svoj odreĎeni region citoplazme (Bruusgaard i sar., 2003), dok se tokom atrofije vlakana jedra uklanjaju usled apoptoze (Allen i sar., 1999), odnosno da se kao rezultat porasta u mišićnim ćelijama povećava broj jedara (Williams i Goldspink, 1971., Allen i sar., 1995) ili da je broj jedara u mišićnim vlaknima veći kod ţivotinja čija su vlakna većeg prečnika (Rehfeldt i sar., 2008), a da se pri atrofiji broj jedara smanjuje (Allen i sar., 1995) ili da je broj jedara po mišićnom vlaknu manji kod vlakana manjeg prečnika 18 (Rehfeldt i sar., 2008). McCall i sar. (1998), i Bruusgaard i sar. (2003) sugerišu da je broj jedara proporcionalan ili zapremini citoplazme mišićnog vlakna, ili spoljašnjoj površini vlakna. Kadi i sar. (1999) navode da porast broja jedara tokom hipertrofije mišića ne prati proporcionalno povećanje mišićnih vlakana. Broj jedara mogao bi biti ključni faktor u regulaciji porasta mišića, ili posledica ovog procesa (Gundersen i Bruusgaard, 2008), zbog čega su neophodna dalja ispitivanja ove osobine mišićnih vlakana odnosno mišićnog tkiva. 2.1.4 Odnos broja i prečnika mišićnih vlakana Treba napomenuti interesantnu pojavu antagonizma izmeĎu debljine i broja mišićnih vlakana. I jedna i druga karakteristika – i debljina i broj mišićnih vlakana u pozitivnoj su korelaciji sa površinom mišića, meĎutim izmeĎu debljine i broja mišićnih vlakana postoji negativna korelacija. Što je veći broj vlakana u mišiću, ta će vlakna biti manje debljine, i obrnuto, što su vlakna deblja – njihov je broj u okviru jednog mišića manji. Negativni koeficijenti korelacije utvrĎeni su kada su ţivotinje ţrtvovane u istom uzrastu (Rehfeldt i sar., 1988, Fiedler i sar., 1997), ili pri istoj telesnoj masi (Staun, 1972, Larzul, 1997), ili čak pri različitom uzrastu i različitoj masi (Osterc, 1974). Obe ove osobine mišićnog tkiva: i broj i prečnik vlakana u pozitivnoj su sprezi sa površinom mišića (Slika 9). Slika 9. MeĎusobni odnos površine poprečnog preseka mišića, prečnika mišićnih vlakana i ukupnog broja vlakana na poprečnom preseku mišića, izraţen preko koeficijenata korelacije (Rehfeldt i sar., 2000) 19 2.2 Uticaj različitih faktora na rast mišića i strukturu mišićnog tkiva Od strukture mišićnog tkiva i njegovog porasta, direktno zavise količina i kvalitet mesa, a ove osobine proizvod su delovanja genetskih, nutritivnih i faktora okoline (Sosnicki i sar., 2003). Zbog toga naredno poglavlje obraĎuje uticaje pojedinačnih faktora na rast i osobine mišića. 2.2.1 Naslednost i uticaj selekcije Naslednost moţe biti definisana u uţem i širem smislu (Falconer, 1981). Definisana u širem smislu pomoću tzv. metoda blizanaca (Komi i Karlsson, 1979), naslednost je granica do koje je individualna varijacija u okviru populacije genetički determinisana. Sa druge strane, naslednost u uţem smislu moţe biti odreĎena pomoću veštačkih selekcijskih eksperimenata (Nakamura i sar., 1993), i predstavlja granicu do koje se individualno variranje u okviru populacije prenosi na narednu generaciju. Broj mišićnih vlakana i njihova veličina nisu determinisane isključivo genetikom, kako se ranije mislilo obzirom na relativnu konstantnost ovih osobina tokom postnatalnog ţivota. Koeficijenti naslednosti za ove osobine mišićnog tkiva variraju od 0,12 do 0,88, a većina se nalazi izmeĎu 0,2 i 0,5, pa se danas smatra da bi veoma vaţan uticaj na ove osobine mogli imati materinski faktori. U Tabeli 3 prikazane su vrednosti koeficijenta heritabiliteta h 2 za najvaţnije osobine mišićnog tkiva. Variranja izmeĎu autora su prisutna usled primene različitih metoda odreĎivanja heritabiliteta. Tabela 3. Koeficijent naslednosti h 2 broja i prečnika mišićnih vlakana (Rehfeldt i sar., 2000) Vrsta Koeficijent naslednosti h 2 Izvor Broj vlakana Prečnik vlakana Miševi m. extensor digitorum longus 0.23-0.24 0.16-0.21 Rehfeldt i sar. (1988) Ţivina m. pectoralis superficialis 0.12-0.49 0.00-0.26 Locniskar i sar. (1980) Svinje m. longissimus dorsi 0.43-0.48 0.30-0.50 Staun (1972) 0.22 0.34 Larzul i sar (1997) Goveda m. longissimus dorsi 0.35 0.74 Osterc (1974) Iz serije selekcijskih istraţivanja na povećan okvir tela ili brz porast kod svinja (Wicke, 1989, Wicke i sar., 1991) moţe se zaključiti da se razlike u masi mišićnog tkiva kao 20 rezultat različitih vidova odgajivanja i selekcije mogu pripisati promenama i u broju i u veličini mišićnih vlakana. Selekcija na veću masu dovodi do povećanja proliferacije mioblasta i/ili satelitskih ćelija, o čemu se zaključuje na osnovu povećanog broja mionukleusa (jedara) mišićnih ćelija (Knizetzova i sar., 1972, Brown i Stickland, 1994), stvaranja veće količine DNK i time veće ukupne količine mišićne DNK (Knizetzova i sar., 1972). Prema principima porasta mišićnog tkiva, uvećana proliferacija dovodi do formiranja većeg broja mišićnih vlakana. Prema nekim autorima nivo proliferativnog odgovora zavisi od toga kako primenjena selekcija utiče na hormonalni status ţivotinje, pre svega odnos hormona rasta i IGF-a (insulin like growth factor), s obzirom da je IGF veoma vaţan faktor rasta koji stimuliše proliferaciju mioblasta i satelitskih ćelija (Florini i sar., 1991). Ipak, korelaciju izmeĎu selekcije i hormonalnog odgovora ţivotinja potrebno je dalje ispitivati. Promene koje bi se mogle očekivati kao odgovor na primenjenu selekciju mogu se predvideti pomoću genetičkih koeficijenata korelacije. Antagonizam izmeĎu veličine i broja vlakana zasniva se na genetičkoj povezanosti. Koeficijenti korelacije izmeĎu veličine i broja vlakana kod miševa, kokoši i svinja variraju od –0,4 do -0,8 (Staun, 1972, Rehfeldt i sar., 1988, Fiedler i sar., 1997, Larzul i sar., 1997). To znači da će se selekcijom na povećanu mišićnu masu zahvaljujući vlaknima većeg prečnika dobiti potomstvo sa manjim brojem mišićnih vlakana. Kod svinja je uočena pozitivna korelacija izmeĎu broja mišićnih vlakana ili njihove veličine sa procentom tzv. bezmasnog mesa – lean meat (Larzul i sar., 1997, Rehfeldt i sar., 2000). Rehfeldt i sar. (2000) nisu pronašli značajnu korelaciju izmeĎu ove dve karakteristike mišićnog tkiva sa debljinom leĎne slanine. Suprotno njima, Larzul i sar. (1997) dobili su negativnu korelaciju (-0,26) izmeĎu veličine vlakana i debljine leĎne slanine. 21 Korelacije izmeĎu veličine i broja vlakana i dnevnog prirasta veoma su kontradiktorne prema različitim autorima, i variraju od -0,49 do +0,46 za povezanost prirasta i broja vlakana, odnosno od +0,03 do +0,74 za povezanost prirasta i veličine vlakana (Rehfeldt i sar., 2000, Staun, 1972, Larzul i sar., 1997) (Tabela 4). Prema istraţivanju Larzul-a i sar. (1997) povećanje količine bezmasnog mesa u trupu korelira sa veličinom vlakana (r = 0,47), ali ne i brojem vlakana (r = 0,08). Veličina vlakna, tačnije povećanje veličine vlakana, negativno utiče na tehnološke karakteristike mesa kao što su gubitak vode (sposobnost vezivanja vode), boja, i pH vrednost (Rehfeldt i sar., 2000, Staun, 1972, Larzul i sar., 1997). Korelacija izmeĎu broja vlakana i kvaliteta mesa je manje jasna. Tabela 4. Genetičke korelacije izmeĎu broja i poprečnog preseka vlakana u m. longissimus dorsi svinja (r ± SE) i osobina porasta i kvaliteta mesa (Rehfeldt i sar., 2000) Osobina Broj vlakana Poprečni presek vlakana Prosečan dnevni prirast* (g/dan) 0,46 ± 0,15 0,03 ± 0,19 Debljina leĎne slanine (mm) -0,05 ± 0,11 -0,12 ± 0,18 Procenat bezmasnog mesa 0,38 ± 0,12 0,52 ± 0,08 Gubitak vode (%) -0,05 ± 0,19 0,64 ± 0,25 Refleksija (17h post mortem) -0,05 ± 0,14 0,32 ± 0,14 pH (45min post mortem) 0,13 ± 0,14 -0,37 ± 0,19 Brocks i sar. (2000) su ispitivali dva mišića svinja, i dve linije selekcije: na malu debljinu leĎne slanine i na brz porast. Ispitivanje je pokazalo da selekcija na malu debljinu leĎne slanine rezultira smanjenjem broja oksidativnih, sporo-okidajućih vlakana, i povećanjem glikolitičkih, brzo-okidajućih vlakana, što ima za posledicu povećanje količine tzv. bezmasnog mesa (lean meat). Autori nisu zapazili promene u prečniku vlakana zavisno od primenjene selekcije. Osim selekcije, na strukturu mišićnog tkiva, i eventualne promene u strukturi tokom miogeneze, mogu uticati i drugi faktori. Neki od njih prikazani su u Tabeli 5. 22 Tabela 5. Značajnost faktora koji utiču na strukturu mišićnog tkiva (Lefaucheur i Gerrard, 2000) Faktor Ukupan broj vlakana Procentualna zastupljenost tipova vlakana Prečnik vlakna Mišić *** *** ** Vrsta *** ** * Rasa *** ** * Jedinka ** ** ** Pol NS ** ** Fetalna ishrana ** * ** Postnatalna ishrana NS * ** Temperatura ambijenta NS ** * Fizička aktivnost NS ** ** Postnatalni promoteri rasta Hormon rasta NS NS ** β – agonisti NS ** ** Steroidi NS ** ** NS p>0,05; * p <0.05; ** p<0.01; *** p<0.001 2.2.2 Karakteristike mišića Tip mišića, njegova lokacija i funkcija svakako su najznačajniji faktori koji utiču na zastupljenost različitih vrsta vlakana u okviru mišića (Klosowska i Fiedler, 2003; Solomon i Dunn, 1988). Dublje postavljeni mišići čija je funkcija odrţavanje stava ţivotinje su oksidativni i sadrţe više sporo-kontrahujućih oksidativnih vlakana. Površinski mišići koji učestvuju u brzim pokretima odreĎenih delova tela sadrţe veći broj glikolitičkih vlakana. Zastupljenost vlakana takoĎe se veoma moţe razlikovati i u okviru jednog mišića. Tipičan primer je m. semitendinosus kod svinja, gde se u površinskom tzv. svetlom delu nalazi oko 4% vlakana tipa I, a u dubokom sloju mišića tzv. tamnom delu, moţe se naći i do 45% ovog tipa vlakana (Beermann i sar., 1990). Kirchofer i sar. (2002) su, na primeru goveda, ustanovili da u istom mišiću, zastupljenost tipova mišićnih vlakana moţe biti različita. Ona odreĎuje da li će taj mišić biti svrstan u grupu crvenog ili belog mesa. Broj i prečnik β – crvenih, α-crvenih i α- belih mišićnih vlakana su korišćeni za odreĎivanje procenta mišićnih vlakana, površine preseka vlakana i procentualne zastupljenosti vlakana u mišiću. Mišići koji su sadrţavali više od 40% β – crvenih vlakana su klasifikovani u grupu crvenog mesa, a oni sa više od 40% α-belih mišićnih vlakana su klasifikovani u grupu belog mesa. Ostali mišići su klasifikovani u grupu prelaznog mesa. Autori navode da funkcionalne i biohemijske 23 osobine svakog mišića, mogu imati uticaj na karakteristike prerade mesa i kvaliteta za konzum. MeĎutim, ovaj uticaj još uvek nije jasno definisan. Sazil i sar. (2005) su, na primeru ovaca, ustanovili da postoje razlike izmeĎu različitih mišića, iste jedinke, u pogledu zastupljenosti vlakana Tipa I (sporokontrahujuća) i vlakana tipa II (brzokontrahujuća). Zochowska i sar (2005) su potvrdili da kod divljih svinja postoje razlike u strukturi izmeĎu tri mišića buta: m. quadriceps femoris, m. biceps femoris i m. semimembranosus. Najveću površinu poprečnog preseka vlakana kao i najveći procenat vlakana tipa I (spora oksidativna) i IIA (brza oksidativna) imali su mišići m. biceps femoris i m. semimembranosus. Najmanji procenat vlakana tipa I a najveći procenat vlakana tipa IIB (brza glikolitička) imao je mišić m. quadriceps femoris. 2.2.3 Vrsta životinje Vrsta ţivotinje takoĎe veoma utiče na ukupan broj vlakana, kao i na strukturu tkiva (Rehfeldt i sar., 1999). Zapravo, bilo bi ispravnije reći da veličina tela zavisi više od ukupnog broja vlakana, a manje od dijametra vlakana. To praktično znači da krupnije ţivotinje imaju veći broj vlakana u pojedinim mišićima, ali da je kod različitih vrsta prečnik vlakana veoma sličan. U Tabeli 6 prikazani su dijametri mišićnih vlakana različitih vrsta ţivotinja. Tabela 6. Prečnik mišićnih vlakana u m. longissimus dorsi odraslih jedinki različitih vrsta (Rehfeldt i sar., 1999) Vrsta ţivotinja Prečnik mišićnog vlakna (µm) Kokoš 20 Koza 22 Rovčica 19 Ovca 25 Divlja svinja 72-85 Domaća svinja 40-80 Jelen lopatar 19 Irvas 45 Bivo 26 Zebu 78 Jak 70 Govedo 55-67 Slon 51 Kit 55 24 Iz ovih podataka moţemo uočiti da prečnik vlakana varira od oko 20µm do oko 80µm, što je razlika od četiri puta. MeĎutim, ako se uporedi okvir tela, razlika izmeĎu rovčice kao najmanje i kita kao najmasivnije vrste iznosi 2,5 miliona puta. Interesantno je još napomenuti da se vlakna najvećeg prečnika ne nalaze kod najveće vrste (kita ili slona) već kod svinja. MeĎutim, zastupljenost različitih vrsta vlakana veoma se razlikuje u zavisnosti od telesnog okvira, pa je kod bikova utvrĎena proporcija I, IIA i IIB vlakana u MLD-u: 35%, 24% i 41% (Brandstetter i sar., 1998a), kod svinja rase jorkšir: 10%, 7% i 83% (Larzul i sar., 1997), a kod novozelandskih zečeva: 1%, 6% i 93% (Gondret i sar., 1996), pokazujući jasnu pozitivnu zavisnost većeg procenta sporo-okidajućih oksidativnih vlakana i veličine tela ţivotinje. 2.2.4 Rasa U okviru iste vrste ţivotinja, ono što najviše utiče na osobine mišićnog tkiva su genetski faktori, u prvom redu rasa. Na primer, kod većine rasa goveda nema značajnih razlika u broju i veličini mišićnih vlakana (Osterc, 1974, Wegner i sar., 2000). MeĎutim, izuzetak su tzv. double-muscled (u bukvalnom prevodu: duplo-mišićave) rase: Belgijska plava, Piedmontese, Blond’Aquitaine. Kod ovih rasa goveda nema promena u veličini – prečniku mišićnih vlakana (Wegner i sar., 2000), ali je broj vlakana uvećan zahvaljujući mutacijama miostatin gena (McPherron i sar., 1997), odgovornog za porast i diferencijaciju mišićnih ćelija (Slika 10). Slika 10. Belgijsko plavo goveče (http://www.occupyforanimals.org/uploads/7/7/3/ 5/7735203/9149001_orig.jpg) 25 Jasne razlike u broju i prečniku mišićnih vlakana mogu se uočiti poreĎenjem domaćih i divljih tipova iste vrste ţivotinja. Evropska domaća svinja ima vlakna većeg prečnika u odnosu na svog divljeg pretka (Szentkuti i Schlegel, 1985), a takoĎe i veći broj vlakana u m. semitendinosus-u (Tabela 7). Opšte je prihvaćena ideja da je domestikacija dovela do promene zastupljenosti različitih tipova vlakana u smeru povećanja broja glikolitičkih, a smanjenja broja oksidativnih (Rehelić i Puač, 1981, Solomon i West, 1985). Tabela 7. Broj mišićnih vlakana i površina poprečnog preseka (LSMeans±SE) u m. semitendinosus-u divlje (WP) i domaće svinje (DP) nakon 7 i 20 nedelja starosti (Rehfeldt i sar., 2000) Nedelja starosti 7 20 Broj vlakana (x 10 3 ) WP 611±38 554±29 DP 908±54** 860±54** Površina poprečnog preseka (µm2) WP 407±36 1440±136 DP 1082±51*** 3855±255*** ** p<0.01; *** p<0.001 IzmeĎu Velikog Jorkšira i minijaturnih rasa iste starosti utvrĎene su jasne razlike u broju vlakana, ali ne i prečniku (Stickland i Handel, 1986). Nisu uočene značajne razlike u broju i prečniku vlakana izmeĎu nekoliko različitih savremenih mesnatih rasa svinja i nešto starije Saddleback rase (Rehfeldt i sar., 2000), o čemu svedoče rezultati prikazani u Tabeli 8. Moguće objašnjenje ovakve pojave je da je kod modernih mesnatih rasa svinja, kao što su Pijetren ili Veliki Jorkšir, broj i prečnik mišićnih vlakana doveden do krajnjih granica mogućnosti selekcije na mesnatost, što bi značilo da bi se morale pronalaziti nove strategije radi postizanja daljih promena u budućnosti. Tabela 8. Broj i prečnik mišićnih vlakana (MEAN±SD) u m. longissimus dorsi kod različitih rasa svinja (Rehfeldt i sar., 2000) Rasa svinja n Broj vlakana (× 10 6 ) Prečnik vlakna (µm) Nemački Landras 694 1,041±0,280 68,9±9,5 Nemački Jorkšir 137 1,016±0,251 70,0±8,4 Leicoma 1052 1,061±0,275 68,6±9,4 Schwerfurter 77 1,109±0,309 68,9±10,7 Pijetren 26 1,107±0,178 71,3±8,8 Saddleback 17 0,909±0,178 67,1±7,8 Lefaucheur i sar. (2003) navode da su, kod odraslih svinja prisutna četiri tipa vlakana i to: spora tip I, i brza tip IIa, IIb i IIx. Kod tovljenika, teških oko 100 kg, zastupljenost navedenih tipova vlakana je 10, 7, 15 i 68 % u MLD-u dok je u romboidnom mišiću 68, 12, 20 i 0 %. 26 Što se tiče zastupljenosti pojedinih tipova vlakana zavisno od rase, studije na jagnjadima (Solomon i sar., 1981) i govedima (Dreyer i sar., 1977) pokazale su da rano- sazrevajuće rase imaju veći procenat αW vlakana, i manji procenat αR vlakana u odnosu na kasno-sazrevajuće rase slične klanične mase ili uzrasta. Slično je utvrĎeno i kod svinja. Kod ţivine, Nikolić i Vitorović (1998) navode razlike u intenzitetu porasta mišića izmeĎu pilića lakog i teškog tipa, dok su Ušćebrka i sar. (2008) , ustanovili različitu strukturu mišića (grudi i zadnjih ekstremiteta) kod divljih ptica (fazan i jarebica) i domaće ţivine. Divlje ptice su imale veći procenat intermedijarnih vlakana nego domaće ptice, u svim ispitivanim mišićima. Kod divljih ptica, procenat crvenih i belih vlakana je bio veći u mišićima ekstremiteta nego u grudnoj muskulaturi. Rede i sar. (1986) poredili su visoko selekcionisane rase Veliki Jorkšir i Švedski Landras sa autohtonim rasama Mangulicom i Crnom Slavonskom, i utvrdili veći procenat belih, glikolitičkih vlakana većeg prečnika (αW) u m. longissimus dorsi kod visoko selekcionisanih rasa. Essen-Gustavsson i Lindholm (1984) dobili su slične rezultate uporeĎujući divlje svinje i Švedskog Landrasa. Njihovo istraţivanje je pokazalo da mišići divljih svinja imaju veći oksidativni kapacitet od mišića Landrasa, što govori o većoj zastupljenosti oksidativnih αR vlakana kod divljih svinja. Suprotno njima, Henckel i sar. (1997) su radeći na m. longissimus-u kod velikog jorkšira i landrasa, primetili pozitivnu korelaciju izmeĎu porasta mišića i aktivnosti nekih oksidativnih enzima karakterističnih za oksidativna mišićna vlakna. Karlsson i sar. (1993) nisu utvrdili nikakav značajniji efekat selekcije na visok porast mesa na strukturu mišićnih vlakana kod švedskog jorkšira. Slične rezultate na MLD-u velikog jorkšira dobili su i Larzul i sar. (1997). Velike razlike u rezultatima različitih autora ukazuju da je odnos izmeĎu strukture mišićnih vlakana i karakteristika porasta još uvek nedovoljno jasan i zahteva dodatna 27 istraţivanja. Isto se to moţe reći i za duţinu vlakana koja je najslabije proučavana karakteristika u okviru histologije mišića. 2.2.5 Jedinka Postoji veoma veliko variranje u strukturi mišićnog tkiva izmeĎu jedinki iste rase odgajanih u istim uslovima. Istraţivanje Larzul-a i sar. (1997) pokazalo je variranje u površini αR vlakana u m. longissimus dorsi kod velikog jorkšira od 2,1% do 18,4%. Slično variranje primetno je i kod ukupnog broja vlakana. Obe ove osobine – i struktura mišićnog tkiva (zastupljenost pojedinih tipova vlakana), i ukupan broj mišićnih vlakana visoko su nasledni, sa koeficijentima heritabiliteta h 2 od 0.22 do 0.88 (Staun, 1963, Larzul i sar., 1997). Ipak, ne postoji metoda merenja ukupnog broja vlakana na ţivim ţivotinjama, pa neki autori predlaţu uspostavljanje neke vrste markera za procenu ukupnog broja mišićnih vlakana (Lefaucheur i Gerrard, 2000). 2.2.6 Pol Literaturni podaci o uticaju pola na broj i zastupljenost vlakana u mišićima veoma su različiti. Staun (1963) nije pronašao uticaj pola na broj vlakana kod domaćih ţivotinja. Kod goveda je utvrĎeno da se kastracijom značajno povećava udeo glikolitičkih vlakana na račun oksido-glikolitičkih (Dreyer i sar., 1977). Moguće je da polni hormoni, najpre testosteron, utiču na malobrojnost glikolitičkih vlakana kod bikova. Ipak, aplikovanje testosterona kastriranim zamorcima dovelo je do promene oksidativnih αR vlakana u glikolitička αW vlakna (Lyons i sar., 1986). Kod svinja je veliki broj istraţivanja pokazao razliku izmeĎu ţenki i kastrata. Larzul i sar. (1997) ustanovlili su veći prečnik mišićnih vlakana kod krmača, ali nisu našli razlike u zastupljenosti pojednih vrsta vlakana izmeĎu krmača i nerastova. Ipak, Lefaucheur i Gerrard (2000) utvrdili su značajno veći procenat oksidativnih vlakana kod intaktnih muţjaka u odnosu na ţenke, ukazujući na činjenicu da kastracija dovodi do smanjenja broja αR vlakana kod svinja. Velloto i sar. (2010) uočili su kod svinja značajne efekte pola na veličinu vlakana, obzirom da su u svom istraţivanju zabeleţili statistički značajno veća vlakna kod muţjaka u odnosu na ţenke. 28 Berrard i sar. (2009), i Bee (2004) ukazuju na razlike u zastupljenosti pojedinih vrsta vlakana i karakteristika mišićnog tkiva kod ţivotinja različitog pola u zavisnosti od veličine legla odnosno mase na roĎenju. TakoĎe, moguće je da ispoljavanje uticaja pola na broj i zasupljenost pojedinih tipova vlakana zavisi i od vrste mišića (Te Paas i sar., 2004). 2.2.7 Uticaj okoline 2.2.7.1 Fetalna ishrana Dotok hranljivih materija je od opšteg značaja za razvoj ploda. Naročito je vaţna ishrana majke tokom kasne gestacije s obzirom da se u ovom periodu dešava najveći porast ploda. MeĎutim i pravilna ishrana tokom rane gestacije itekako moţe imati uticaja na razvoj fetusa, zbog toga što se proliferacija i diferencijacija ćelija različitih tkiva dešava upravo u ovom periodu, što moţe imati uticaj i na kasniji razvoj (Brameld i sar., 1998). Vršena su različita ispitivanja adekvatne ishrane majki, ili ishrane ispod ili iznad zahteva na razvoj mišićnog tkiva potomstva. Dwyer i Stickland (1992a), i Dwyer i sar. (1995) ispitivali su uticaj 60% i 30% umanjene ishrane bremenitih zamoraca i pacova tokom cele gestacije, ili tokom početnih ili završnih faza gestacije i utvrdili negativne efekte ovakve ishrane na broj mišićnih vlakana koji se formira kod potomstva. Suprotno njima, Beermann (1983) nije našao nikakve efekte smanjene ishrane majki (za 50% od kontrolne grupe) na broj vlakana novoroĎenih pacova. Prema Zhu i sar. (2006), kod potomstva gravidnih ovaca restriktivno hranjenih u periodu od 21og do 78og dana gestacije na račun smanjena procenta FTO vlakana povećao se procenat FTG vlakana u m. longissimus dorsi. Kod svinja je ispitivan uticaj povećane ishrane tokom različitih faza gestacije odnosno miogeneze na karakteristike mišićnog tkiva potomstva. Dwyer i sar. (1994) i Nissen i sar. (2003) nisu uočili statistički značajne promene broja vlakana nakon povećane ishrane majki tokom različitih perioda miogeneze, mada je broj vlakana imao tendenciju porasta kod potomaka krmača koje su od 25.-50. dana gestacije hranjene duplom količinom hrane u odnosu na kontrolu. Suprotno tome, Gatford i sar. (2003) uočili su značajan pozitivan efekat povećane ishrane krmača na broj mišićnih vlakana kod 29 potomstva. Što se tiče smanjenog unosa hrane kod suprasnih krmača, veći broj autora se slaţe da smanjenje količine hrane dovodi do pojave krţljavosti prasadi (runting), a ako se posmatraju karakteristike mišićnog tkiva, smanjen unos hrane dovodi do smanjenja broja sekundarnih vlakana što za direktnu posledicu ima postnatalno smanjenje potencijala porasta mišića (Wigmore i Stickland, 1983, Handel i Stickland, 1987). Ustanovljeno je da ishrana gravidnih majki moţe imati uticaj na broj sekundarnih vlakana u mišićima potomstva (Brameld i sar., 2003). MeĎutim, značajni efekti nisu ustanovljeni u svim istraţivanjima. Razlog tome je, najverovatnije, činjenica da su ispitivanja obavljana u različito vreme, kao i da je nivo ishrane ili uzrast potomstva čiji je uticaj ispitivan bio različit. Brameld i sar. (2008) su, kod prasadi, ustanovili da je broj formiranih sekundarnih vlakana zavistan od ishrane. Na primer, poreĎenjem prasadi male, srednje i velike mase pri roĎenju, ustanovljeno je da krupnija prasad imaju veći broj mišićnih vlakana. To je posledica bolje intrauterine ishrane. Udvostručavanje ishrane majki u bilo kom od sledećih perioda: 25-55; 50-80 ili 25-80 dana graviditeta, rezultira povećanjem odnosa sekundarna:primarna vlakna, kod prasadi uzrasta 35 dana. Autori ističu da manipulacije sa ishranom majki, ispoljavaju efekte onda kada je do manipulacije ishranom došlo pre diferencijacije i formiranja mišićnih vlakana. Veći broj istraţivanja (Stickland i Handel, 1986, Dwyer i sar., 1993, Rehfeldt i Kuhn, 2006) ukazuje na relativno konstantan broj primarnih vlakana novoroĎene prasadi, gde ova vlakna čine 3-5% ukupnog broja vlakana, i da ovaj parametar nije podloţan uticajima različitih faktora. Ipak, Rehfeldt i sar. (2001a) ukazuju na značajno povećanje broja primarnih vlakana kod potomstva krmača tretiranih somatotropinom tokom rane faze miogeneze, dok Rehfeldt i sar. (2012) ukazuju na smanjenje broja primarnih vlakana kod prasadi pri ishrani majki krmača tokom gestacije obrocima sa smanjenim procentom proteina. 2.2.7.2 Postnatalna ishrana Ishrana ţivotinja nakon roĎenja nema uticaja na broj mišićnih vlakana, što je i logično ako se uzme u obzir činjenica da je broj vlakana odreĎen tokom procesa miogeneze pre 30 roĎenja. MeĎutim, način ishrane moţe uticati na prečnik vlakana i na procentualnu zastupljenost odreĎenih tipova vlakana u mišićima. Kod svinja, i drugih vrsta domaćih ţivotinja, veća količina energije u obroku povećava količinu intramuskularnog masnog tkiva na čiji se račun smanjuje prečnik vlakana, a time i količina tzv. bezmasnog, krtog mesa (lean meat). Shodno tome, restrikcija ishrane dovodi do smanjenja količine masnog tkiva, povećanja prečnika vlakana, i povećanja procentualne zastupljenosti oksidativnih αR vlakana na račun glikolitičkih αW vlakana (Harisson i sar., 1996, Lefaucheur, 1990, Brandstetter i sar., 1998b) Restrikcija ishrane (30% od ad libitum unosa) kod svinja telesne mase od 7kg do 100kg nije uzrokovala promene u procentualnoj zastupljenosti pojedinih vlakana, ali je dovela do povećanja prečnika vlakana što je u skladu sa smanjenjem količine masti i većom mesnatosti kod ovako hranjenih ţivotinja (Leafucheur, 1989). Restrikcija ishrane 50% od ad libitum unosa u ranijim fazama (izmeĎu 3-će i 7-me nedelje starosti) nije dovela do promena zastupljenosti vlakana u m. longissimus-u, ali je izazvala veoma značajno povećanje (+43%) vlakana tipa I u crvenom m. romboideus-u (Harisson i sar., 1996). Kod krmača u laktaciji koje su dobijale obroke koji nisu zadovoljavali ni uzdrţne a ni potrebe za laktaciju dolazi do značajnog gubitka i masnog ali i mišićnog tkiva. U m. longissimus-u ovo je praćeno smanjenjem prečnika glikolitičkih vlakana a povećanjem prečnika oksidativnih vlakana, iako je bio smanjen obim i oksidativnog i glikolitičkog metabolizma (Lefaucheur, 1990). Ovo se moţe objasniti činjenicom da kod krmača nakon prašenja mišićno tkivo predstavlja nekih 40% telesne mase, a sastoji se u najvećoj meri od glikolitičkih vlakana. Zato će upravo ova vlakna organizam krmače koristiti kao izvor proteina, i zbog toga će se njihov broj smanjivati. 2.2.7.3 Temperatura okoline Dugotrajno izlaganje niskim temperaturama moţe dovesti do promena u strukturi mišićnog tkiva, na taj način što se povećava obim oksidativnog metabolizma, a to znači i procenat vlakana tipa I (Herpin i Lefaucheur, 1992). Lossec i sar. (1998) istraţivali su uticaj niţih (24 do 15°C) i viših (34 do 30°C) temperatura u prvih 5 dana ţivota 31 novoroĎene prasadi na strukturu m. longissimus-a i m. romboideus-a. Rezultati ovog istraţivanja pokazali su značajno povećanu zastupljenost vlakana tipa I u oba mišića, povećan obim oksidativnog metabolizma, i nepromenjen obim glikolitičkog metabolizma na niţim temperaturama. MeĎutim, ostaje da se istraţe razlozi ove pojave - da li su promene u strukturi mišićnog tkiva rezultat konstantnog drhtanja (radi zagrevanja tela) prasadi, ili moţda izmenjenog metabolizma pojedinih hormona. 2.2.7.4 Fizička aktivnost Najveći broj istraţivača se slaţe da fizička aktivnost tj. veţbanje povećava nivo oksidativnog a smanjuje nivo glikolitičkog metabolizma u mišićima koji su uključeni u veţbanje (Essen Gustavsson, 1993). Generalno, povećana aktivnost prouzrokuje prelazak IIB vlakana u IIX pa u IIA i konačno u vlakna tipa I, dok smanjena aktivnost prouzrokuje suprotnu tranziciju iz vlakana tipa I do vlakana tipa IIB. Ipak, istraţivanja uticaja električnih stimulusa na strukturu mišića nisu najpodobnija za predviĎanje efekata spontanog veţbanja koje se javlja recimo kod drţanja ţivotinja u slobodnom sistemu (Petersen i sar., 1998) na zastupljenost pojedinih tipova vlakana u mišićnom tkivu. Iako neka istraţivanja pokazuju promenu zastupljenosti pojedinih tipova vlakana usled veţbanja, odnosno slobodnog kretanja u „obogaćenom okruţenju“, većina autora smatra da su te promene minorne ili dvosmislene (Te Paas i sar., 2004). Sa druge strane, intenzivna proizvodnja, naročito u svinjarstvu, praktično i ne ostavlja mnogo prostora za veţbanje kao mogućnost izmena strukture mišićnog tkiva. 2.2.8 Uticaj veličine legla i mase na rođenju Tokom poslednjih godina selekcija u svinjarstvu bila je usmeravana i na povećanje broja prasadi u leglu, što za posledicu ima sve veće razlike u masi prasadi u okviru istog legla, i opšte smanjenje mase prasadi na roĎenju (Quiniou i sar., 2002). Moguće objašnjenje ove pojave jeste manje izraţeno povećanje dotoka hranljivih materija fetusima u odnosu na povećanje veličine legla (Perre i Etienne, 2000), odnosno mnogo jače izraţena kompeticija za hranljive materije izmeĎu fetusa in utero, što dovodi do 32 smanjenja mase fetusa i mase prasadi na roĎenju sa povećanjem veličine legla (Quiniou i sar., 2002). Town i sar. (2004) su ustanovili da su, kod krmača sa većim brojem fetusa (i potencijalno većim leglom) fetusi imali manju masu, manju masu mišića, površinu poprečnog preseka mišića kao i manji ukupni broj sekundarnih vlakana, u odnosu na krmače sa manjim brojem fetusa (hirurški je odstranjen jedan jajovod). MeĎutim, broj primarnih vlakana, odnos primarna:sekundarna vlakna kao i zastupljenost tipova mišićnih vlakana se nije značajno razlikovao. Veliki broj autora saglasan je da je kod prasadi veće mase na roĎenju, veći i ukupan broj mišićnih vlakana (Wigmore i Stickland, 1983, Dwyer i Stickland, 1991, Rehfeldt i sar., 2001, Nissen i sar., 2004, Rehfeldt i Kuhn, 2006), i da ova razlika nastaje ili usled povećanja broja sekundarnih vlakana koje se formiraju oko svakog primarnog (Wigmore i Stickland, 1983), ili usled povećanja i broja primarnih vlakana i odnosa sekundarna:primarna vlakna (Dwyer i Stickland, 1991). Novija istraţivanja (Rehfeldt i Kuhn, 2006, Gondret i sar., 2006, Berard i sar., 2008) pokazuju da prasad manje mase na roĎenju imaju sporiji porast i da su mišićna vlakna na kraju tova znatno većeg prečnika (Gondret i sar., 2006). Kod ovakvih jedinki je veći sadrţaj masti u trupu, veći udeo nepoţeljnih gigantskih vlakana u mišićnom tkivu, i lošiji kvalitet mesa u pogledu sposobnosti zadrţavanja vode i mekoće mesa (Rehfeldt i Kuhn, 2006). Rehfeldt i Kuhn (2006) pretpostavili su da je kod prasadi manje mase na roĎenju manji broj vlakana u mišićnom tkivu, zbog čega je hipertrofija vlakana izraţenija. Takve jedinke dostiţu maksimum porasta mišićnih vlakana brţe nego prasad veće mase na roĎenju, pa se nakon dostizanja platoa porasta mišića dostupna energija koristi za deponovanje masti. Zbog svega navedenog, postavlja se pitanje da li selekcija i dalje treba da ide u smeru povećavanja broja prasadi u leglu. Berard i sar. (2008) ukazuju da je uticaj veličine legla na porast, osobine trupa i kvalitet mesa samo posredan, i da se zapravo ostvaruje kroz inverznu korelaciju sa masom na roĎenju. Sa druge strane, Beaulieu i sar. (2010) su u 33 svom istraţivanju potvrdili da veličina legla utiče na masu prasadi na roĎenju, da prasad manje mase na roĎenju nešto sporije dostiţu klaničnu teţinu, ali da masa na roĎenju nije bitnije uticala na sastav trupa ili kvalitet mesa za konzum. 2.2.9 Uticaj faktora rasta i hormona U regulaciju mišićnog rasta i diferencijacije mišićnih ćelija uključen je, dakle, veliki broj faktora: od spoljašnjih faktora okoline, preko unutrašnjih genetskih faktora, sve do faktora rasta (growth factors) i hormona koji na ćelijskom nivou stimulišu ćelije u razvoju preko receptora i faktora transkripcije. Ispitivanja molekularnih signala koji indukuju miogenezu novijeg su datuma, bila su omogućena razvojem sve osetljivijih „bioloških alata“. Ovakva istraţivanja započeta su na vinskoj mušici Drosophila melanogaster, i dovela su do fundamentalnih otkrića o molekularnim mehanizmima koji su uključeni u razvoj organa i tkiva, a koja se mogu primeniti na gotovo sve ţivotinjske vrste (Hossner, 2005). UtvrĎeno je da su mnogi od proteina koji deluju kao meĎućelijski signali ili unutarćelijski faktori transkripcije gotovo identični kod poptuno različitih vrsta, od valjkastih crva do čoveka. Ovakvo očuvanje strukture i funkcije genskih produkata kod potpuno različitih organizama ukazuje na ogroman značaj biohemijskih signala i njihovu centralnu ulogu u razvojnim procesima koji odreĎuju formu i funkciju odraslog organizma (Hossner, 2005). 2.2.9.1 Mišićni regulatorni faktori (MRF) Ovo su faktori transkripcije koji utiču na opredeljivanje ćelija na miogenezu i indukuju diferencijaciju mišićnih vlakana. Kod kičmenjaka postoje četiri mišićna regulatorna faktora (Hossner, 2005): Myf5 (myogenic factor 5), MyoD (myogenin determination factor D), MRF4 i miogenin. Myf5 i MyoD igraju ključnu ulogu u „regrutovanju“ i usmeravanju ćelija ka liniji miogeneze. Ukoliko jedan od ovih faktora nije prisutan u embrionu, drugi će preuzeti njegovu ulogu, meĎutim ako oba izostanu u embriogenezi – nema uopšte mioblasta niti formiranja mišićnog tkiva. Zbog toga se ova dva faktora smatraju primarnim mišićnim regulatornim faktorima. Miogenin i MRF 4 su sekundarni faktori u regulaciji miogeneze, javljaju se kasnije tokom embrionalnog razvoja i uslovljavaju završne procese diferencijacije mišićnih ćelija. 34 2.2.9.2 Insulinski faktori rasta Insulinski faktori rasta (insuline like growth factors, IGFs): IGF I, IGF II i insulin, su jedinjena koja pripadaju grupi faktora rasta (growth factors, GF), a koja imaju centralnu ulogu u razvoju, diferencijaciji i funkciji mišićnog tkiva. Ovo je grupa jedinjenja koju proizvodi i jetra, ali i ćelije mišićnog tkiva uključujući mioblaste, satelitske ćelije, mišićna vlakna i fibroblaste. To praktično znači da ovi sveprisutni faktori mogu delovati na mišićno tkivo endokrinim, parakrinim ili autokrinim mehanizmima. Kako sumira Hossner (2005), hormon rasta – GH, verovatno nema direktne anaboličke efekte na mioblaste, satelitske ćelije ili miotubule, već su njegovi efekti zapravo rezultat posrednog delovanja preko IGF faktora. U mišićnom tkivu, IGF faktori povećavaju iskorišćavanje glukoze i amino-kiselina, smanjuju nivo proteolize a povećavaju nivo sinteze proteina. TakoĎe utiču na prekurzore mišićnih ćelija povećavajući njihovu proliferaciju i diferencijaciju. Svaki od IGF faktora ima svoj odgovarajući receptor u tkivu. Nedostatak bilo nekog od faktora rasta, bilo njegovog receptora u mišićnom tkivu dovodi do ozbiljnih poremećaja u razvoju, i vrlo često do smrti jedinke neposredno nakon roĎenja. Suprotno tome, Mathews i sar. (1988) utvrdili su da je porast mišićnog i koštanog tkiva bio za oko 30% veći kada su koncentracije (nivoi) IGF I u cirkulaciji bili za 50% veći nego kontrolne vrednosti. Buonomo i Klindt (1993), Owens i sar. (1999), Klindt i sar. (1998) uočili su kod svinja u porastu pozitivnu korelaciju izmeĎu koncentracije IGF I u krvi i količine bezmasnog mesa sa jedne strane, i koncentracije IGF II u krvi i deponovanja masnog tkiva (debljine leĎne slanine). Efekti IGF faktora na miogenezu zavise od stadijuma razvoja mioblasta. U ranim fazama razvoja IGF faktori stimulišu proliferaciju. Nastavak stimulacije ćelija IGF-om dovodi do ćelijske diferencijacije, uz aktiviranje ekspresije miogenina, MyoD i Myf5. Osim na miogenezu, IGF faktori indukuju i odrţavanje i rast odraslog (zrelog) mišićnog tkiva. Kod odraslih ţivotinja rast mišićnog tkiva odvija se na osnovu proizvodnje jedara od strane satelitskih ćelija i dodavanja tih jedara mišićnim vlaknima. Veći broj istraţivanja pokazao je da IGF faktori indukuju proliferaciju satelitskih ćelija, diferencijaciju i fuziju tj. stvaranje miotubula. 35 2.2.9.3 Miostatin Miostatin je negativni regulator mišićnog rasta. On inhibira diferencijaciju, tako što inhibira ekspresiju mišićnih regolatornih faktora MyoD i miogenina, odnosno proliferaciju mioblasta (Thomas i sar., 2000, Hossner, 2005). Ako se mioblasti tretiraju miostatinom, ćelijska proliferacija, sinteza DNK i proteina se smanjuju. Najjednostaviji primer je primer „double-muscled“ fenotipa goveda, kod kojih se zapravo javlja prirodna mutacija miostatin gena koja za posledicu ima neaktivan molekul miostatina. Kod ovakvih jedinki ne uvećava se broj mišića, već se javlja izraţena hipertrofija, povećanje broja mišićnih vlakana a time i celokupne mišićne mase. 2.2.9.4 Hormoni 2.2.9.4.1 Hormon rasta Hormon rasta (growth hormone, GH) ili somatotropin (ST), je protein koji se sintetiše i izlučuje iz hipofize. Osamdesetih godina dvadesetog veka, sa proizvodnjom rekombinantnog ST, počela su obimna istraţivanja uticaja ovog hormona na rast i laktaciju, uz istovremeno ispitivanje mogućnosti njegove komercijalne upotrebe. Ispitivanja na svinjama (sumirano u Etherton i Bauman, 1998) su pokazala da somatotropin ima efekte na raspodelu hranljivih materija izmeĎu mišića i masnog tkiva, dovodeći do povećanja količine bezmasnog mesa. Dnevna primena pST-a u dozama preko 100 µg po kg telesne mase, kod svinja u tovu u trajanju 30-77 dana moţe povećati dnevni prirast 10-20%, poboljšati iskorišćavanje hrane za 13-33%, smanjiti deponovanje masti i do 70%, i stimulisati akumulaciju proteina (rast mišića) i do 62%. TakoĎe, apliciranje hormona rasta u različitim intervalima suprasnosti moţe imati statistički značajne efekte na mišiće potomaka. Tretiranje suprasnih krmača hormonom rasta u periodu 10-24 dana suprasnosti povećava broj vlakana kod podmlatka (Rehfeldt i sar., 1993), i utiče na poboljšanje uslova rasta i povećanje telesne mase manje prasadi (Rehfeldt i sar., 2001). Ukoliko se hormon rasta aplikuje u kasnijim fazama: od 25-50- 36 og dana, od 50-64-og, ili od 80-94-og dana suprasnosti nije uočena promena u broju mišićnih vlakana kod potomstva (Rehfeldt i sar., 1993, Gatford i sar., 2003). Mehanizam delovanja somatotropina na rast nije u potpunosti poznat. Veliki broj autora smatra da somatotropin ne deluje direktno na ciljne ćelije, već stimuliše lučenje IGF faktora u jetri i drugim tkivima, koji potom indukuju različite odgovore u različitim tkivima. U prilog ovoj teoriji ide i činjenica da somatotropin ne prolazi kroz placentu, pa ipak se kod prasadi čije su majke dobijale somatotropin zapaţaju promene u masi, broju mišićnih vlakana itd. (Rehfeldt i sar., 1993, Rehfeldt i sar., 2001). Ovakva meĎusobna sprega hormona rasta i IGF faktora naziva se somatomedin osa (Slika 11). Slika 11. Šematski prikaz somatomedin ose, i uticaja hormona rasta preko IGF faktora na različita tkiva (Hossner, 2005) Ipak, istraţivanje koje su sproveli Klindt i sar., 1998., ispitujući dejstvo somatotropina, IGF I, i kombinacije ova dva faktora pokazalo je da je efekat samog somatotropina na povećanje deponovanja proteina i povećanje količine bezmasnog mesa znatno veći od efekta bilo pojedinačnog IGF I, bilo kombinacije somatoropin + IGF I, ukazujući na 37 mogućnost direktnog delovanja somatotropina na target ćelije. U ovom istraţivanju sam somatotropin povećao je dnevni prirast za 43%, količinu proteina u trupu za 88%, količinu bezmasnog mesa za 16%. Sam IGF I povećao je dnevni prirast za 22%, količinu proteina u trupu za 33% a količinu bezmasnog mesa za 5%. Efekti zajedničkog aplikovanja ST + IGF I, bili su isti kao kada je aplikovan sam ST. Veći broj autora proučavao je efekte dodavanja hormona rasta suprasnim krmačama na porast i karakteristike mišićnog tkiva potomaka. Gatford i sar. (2004) uočili su efekte dugotrajne aplikacije hormona rasta (od 25-og do 100-og dana suprasnosti) krmačama koje su bile na restriktivnoj ishrani čije je potomstvo na roĎenju imalo veću masu i duţinu tela. Ovi autori takoĎe su zapazili manji pad mase prasadi sa povećanjem legla kod krmača koje su tretirane hormonom rasta. Rehfeldt i sar. (2001) zapazili su da aplikovanje hormona rasta krmačama u periodu od 10-og do 27-og dana suprasnosti dovodi do povećanja mase samo one prasadi koja su pripadala grupi najlakših prasadi u leglu. Kuhn i sar. (2004) takoĎe su ispitivali uticaj dodavanja hormona rasta u periodu 10-27-og dana gestacije, a rezultati su potvrdili povećanje mase samo kod najmanje prasadi, dok se masa prasadi koja su pripadala srednjoj i najvišoj teţinskoj kategoriji smanjivala kod krmača tretiranih ST-om. Osim ovoga, kvalitet mesa kod tovljenika čije su majke tretirane hormonom rasta bio je lošiji, u smislu većeg sadrţaja intramuskularne masti i većeg gubitka vode. Rehfeldt i sar. (1993) i Rehfeldt i sar. (2001) utvrdili su povećanje broja vlakana kod krmača tretiranih hormonom rasta u periodu od 10-27-og dana suprasnosti, odnosno kod krmača tretiranih u periodu od 84-90-og dana suprasnosti. 2.2.9.4.2 Hormoni štitne žlezde Poznato je da nedostatak hormona štitne ţlezde moţe prouzrokovati veoma ozbiljne poremećaje u rastu i razvoju. Ovi hormoni igraju veoma vaţnu ulogu u razvoju centralnog nervnog sistema, ali obzirom da oni regulišu korišćenje energije i kiseonika u svim tkivima, tako su veoma vaţni i za normalan razvoj mišićnog tkiva (Muscat i sar., 1995). Jacobs i sar., 1996., ukazali su na smanjenu mogućnost satelitskih ćelija da se 38 diferenciraju i spajaju u mišićne ćelije kod hipotiroidnih pacova u prvih 40 dana postnatalnog ţivota. Sa druge strane, izlaganje prevelikim dozama tireoidnih hormona dovodi do degradacije proteina i atrofije mišića. Zbog toga je korišćenje hormona štitne ţlezde kao eventualnih promotera rasta potpuno isključeno. 2.2.9.4.3 Polni hormoni - estrogen Polni hormoni su proizvodi polnih ţlezda – jajnika (i placente), i testisa. Ţenski polni hormoni su estrogen i progesteron, a muški testosteron. Njihova je uloga da obezbede normalan rad polnih organa u cilju regulacije reprodukcije, a takoĎe utiču i na ispoljavanje sekundarnih polnih karakteristika. Preţivari su jedina vrsta domaćih ţivotinja kod kojih je ustanovljen nedvosmislen pozitivan efekat estrogena na porast mišićne mase, povećanje dnevnog prirasta, iskorišćavanje hrane uz minimalna povećanja konzumiranja hrane, i smanjenje deponovanja masti. Nakon sintetisanja dietilstilbestrola, DES, krajem tridesetih godina prošlog veka, ispitivan je uticaj ovog sintetičkog estrogena na proizvodne karakteristike domaćih ţivotinja, i kako je pokazan povećan dnevni prirast kod junica, ovaca i ţivine, DES je patentiran kao stilbestrol i korišćen sve do 1979. godine kada je zabranjen kao potencijalno karcinogen. MeĎutim, u nekim zemljama i dalje se koriste slična jedinjenja (estradiol 17β, estradiol benzoat, zeranol, dienestrol...) kao promoteri rasta u govedarstvu. Estrogeni imaju mnogo manje efekata kod nepreţivara. Kod intaktnih muţjaka – nerasta, aplikovanje estrogena povećava unos hrane ali i njeno iskorišćavanje, a time povećava prirast, smanjuje karakterističan nepoţeljan miris mesa, ali i u manjoj meri povećava količinu masnog tkiva (Hancock i sar., 1991). Kod kastrata i nazimica pozitivni efekti estrogena su ograničeni, a sa druge strane estrogen uslovljava povećan razvoj vimena, smanjujući time mogućnost upotrebe stomaka za slaninu (Hancock i sar., 1991). 39 Mehanizam delovanja estrogena na porast svinja nije potpuno razjašnjen. Rempel i Clapper (2002), i Hilleson-Gayne i Clapper (2005) su u svojim istraţivanjima utvrdili zavisnost koncentracije IGF-a od 17β estradiola, gde je aplikacija estradiola dovodila do povećanja koncentracije IGF-a u serumu (Rempel i Clapper, 2002), a smanjivanje koncentracije estradiola u serumu uz pomoć inhibitora dovodilo je do smanjenja koncentracije IGF-a (Hilleson-Gayne i Clapper, 2005). Prema ovim autorima, dakle, estradiol bi posredno preko IGF ose mogao imati uticaj i na porast svinja. Najizraţenije efekte estradiola na promene u koncentraciji IGF-a ovi autori su zapazili kod nerasta. Sa druge strane, ispitujući uticaj estrogena in vitro - na kulture mišićnih ćelija svinja, Mau i sar. (2008) nisu primetili gotovo nikakve efekte na proliferaciju mišićnih ćelija pri fiziološkim koncentracijama, ali je zato zapaţeno inhibitorno dejstvo estrogena na proliferaciju mišićnih ćelija ukoliko je estrogen aplikovan u suprafiziološkim koncentracijama. Do sličnih zaključaka došli su Tsai i sar. (2007), utvrdivši in vivo smanjenje telesne mase i nivoa IGF-a u mišićima kod ovariektomisanih ţenki pacova sa implantom koje je sadrţao estradiol 17β. Enns i Tiidus (2010), uočili su stimulirajuţe dejstvo estrogena u obnavljanju mišićnog tkiva kod ljudi nakon povreda, preko aktivacije i proliferacije satelitskih ćelija. Moguće je da su različiti rezultati u pogledu efekata estrogena posledica različitih polova koji su korišćeni u različitim eksperimentima, ili korišćenja estrogena u kombinaciji sa androgenim agensima. Evidentno je da je mehanizam delovanja estrogena na mišićno tkivo različit u zavisnosti od vrste, pola, uzrasta, pa čak i faktora okoline. Rasvetljavanje ovih mehanizama zahteva dodatna istraţivanja. 2.3 Izoflavoni – Fitoestrogeni Mnoge biljne vrste koje se koriste bilo u ishrani ljudi, bilo kao hrana za ţivotinje imaju sposobnost da indukuju reakcije organizma slično hormonima. Veoma dobro poznat primer estrogenog dejstva biljaka je tzv. „clover desease“ – pojava dugoročne neplodnosti kod ovaca na ispaši detelinom (Fritsche i Steinhart, 1999). 40 Fitoestrogeni predstavljaju grupu hemijskih jedinjenja biljnog porekla, koja imaju estrogena ili antiestrogena dejstva. Ova jedinjenja identifikovana su u preko 300 različitih biljaka (Tham i sar., 1998), kao što su: beli luk, peršun, soja, detelina, lucerka, pšenica, ječam, pirinač, šargarepa, krompir, jabuka, kruška, groţĎe i dr. Zajedničke osobine svih fitoestrogena su da im je hemijska struktura veoma slična strukturi estrogena (Slika 12), da u organizmu imaju sposobnost vezivanja za estrogene receptore, i izazivanja bilo estrogenih, bilo antiestrogenih reakcija metabolizma, zavisno od njihove koncentracije, koncentracije endogenog estrogena i individualnih karakteristika jedinke, pre svega pola i hormonalnog statusa (Tham i sar., 1998). U hrani koja je standardno u upotrebi kako za ishranu ljudi, tako i za ishranu ţivotinja, najviše su zastupljene dve kategorije fitoestrogena: izoflavoni i lignani. Pored ove dve grupe, postoji i treća grupa fitoestrogena – kumestani. Za razliku od veoma široko prisutnih lignana, izoflavoni se nalaze skoro isključivo u leguminozama, a naročito bogat izvor ovih jedinjenja je soja (Tham i sar., 1998, Reinli i Block, 1996). Dva jedinjenja iz grupe izoflavona koja se danas najintenzivnije proučavaju su daidzein i genistein, a pored njih u soji je prisutan i glicitein, ali u znatno manjim količinama. Slika 12. Sličnost hemijske strukture fitoestrogena i estrogena Koncentracija izoflavona u različitim proizvodima od soje varira od 0,1 do 3mg/g hraniva, a zavisi od sorte soje, lokacije uspevanja, zrelosti biljke, i posebno od načina obrade. Tako npr. sojine viršle ili tofu jogurt mogu sadrţati samo deseti deo količine izoflavona koji se nalazi u celom zrnu soje (0,2-0,3 prema 2-4 mg izoflavona/g) (Tham i sar., 1998). Ipak, i ovako obraĎeni proizvodi sadrţe znatno veću količinu izoflavona u 41 odnosu na druge biljne vrste. Ukupan sadrţaj izoflavona, i količine daidzeina i genisteina u pojedinim proizvodima od soje prikazani su u Tabeli 9. Tabela 9. Količina izoflavona u različitim proizvodima od soje, mg izoflavona/kg hraniva Proizvod Ukupno izoflavona Daidzein Genistein Izvor Zrno soje 1 1176 365 640 Tham i sar., 1998 Zrno soje 2 4215 1355 2676 Prţeno zrno soje 2661 941 1426 Sojino brašno 2014 412 1453 Tofu 532 238 245 Tempeh 865 405 422 Miso 647 272 281 Sojina sačma / 395-488 506-695 Fritsche i Steinhart, 1999 Sojine ljuspice / < 0,1 18,4 Sojine flekice / 363-475 1275-1547 Izoflavoni se mogu naći u jednom od sledeća četiri oblika: - kao nekonjugovani aglikani (daidzein, genistein) - kao konjugovani ß-glikozidi (daidzin, genistin) - kao acetil-glikozidi - kao malonil-glikozidi Hemijski oblik u kome se izoflavoni nalaze veoma je vaţan, jer moţe uticati na dostupnost, biološku aktivnost i konačno – fiziološke efekte ovih jedinjenja (Setchell i Cassidy, 1999). U biljkama se izoflavoni javljaju uglavnom kao glikozidi, s tim što su acetil- i malonil-glikozidi jedinjenja veoma osetiljiva na temperaturu, i lako se konvertuju do stabilnijih ß-glikozida (Barnes i sar., 1994). 2.3.1 Metabolizam izoflavona Nakon gutanja i dospevanja hraniva do ţeluca, konjugovani izoflavoni bivaju hidrolizovani do bioaktivnih aglikana, daidzeina ili genisteina. Hidroliza se odvija uz pomoć crevnih glikozidaza, za koje se smatra da su mikrobiološkog porekla. Daidzein i genistein mogu biti ili absorbovani kao takvi, gde nakon absorpcije idu do jetre i dalje se transofrmišu, ili se ova jedinjenja dalje metabolišu do specifičnih metabolita uključujući i najaktivniji ekvol (Setchell i Cassidy, 1999.) (Slika 13). Ovakva šema metabolizma je veoma zavisna i od drugih komponenata ishrane. 42 Veći sadrţaj ugljenih hidrata pospešuje biotransformaciju fitoestrogena i sintezu ekvola (Setchell i Cassidy, 1999), dok povećani sadrţaj masti smanjuje sposobnost mikroflore da razgraĎuje daidzein i sintetiše ekvol (Ren i sar., 2001). Ipak, ključnu ulogu u biotransformaciji izoflavona ima prisustvo različitih populacija mikroorganizama u digestivnom traktu (Setchell i Cassidy, 1999). UtvrĎeno je da upotreba antibiotika blokira metabolizam izoflavona, kao i da odojčad u prvim mesecima ţivota kada još uvek nije formirana stomačna mikroflora nisu sposobna za sintezu ekvola (Setchell i Cassidy, 1999). TakoĎe, kod preţivara absorpcija izoflavona dešava se već u buragu, a u krvnoj plazmi se detektuje 95-99% ekvola u konjugovanoj formi. Kod svinja metabolizam izoflavona nije potpuno razjašnjen, a količina konjugovanog ekvola u plazmi je znatno niţa nego kod preţivara – 50-70% (Ren i sar., 2001). Slika 13. Glavne biotransformacije u metabolizmu izoflavona u organizmu ljudi i ţivotinja (Setchell i Cassidy, 1999) 2.3.2 Fiziološki efekti izoflavona Nakon konzumiranja soje, izoflavoni, transformisani najpre od strane mikroorganizama, ulaze u cirkulaciju gde dostiţu koncentraciju nekoliko puta veću od koncentracije endogenog estrogena. Još 1946. godine Bennetts i sar. (1946) utvrdili su da su izoflavoni uzrok pojave neplodnosti kod ovaca na ispaši detelinom. MeĎutim, posebna paţnja proučavanju ovih jedinjenja usmerava se nakon otkrića Akyame i sar. 1987., koji 43 su utdvrdili da je genistein moćan inhibitor protein tirozin kinaza – grupe enzima koja ima ključnu ulogu u formiranju i nekontrolisanom rastu ćelija raka. U isto vreme, porast opšte svesti o znatno učestalijoj pojavi različitih oboljenja a naročito hormon-zavisnih tumora u zapadnim zemljama o odnosu na istočne zemlje, prvenstveno Japan i Kinu, naveo je naučnu populaciju na sve opseţnija istraţivanja soje koja dominira u ishrani ljudi u zemljama dalekog istoka, i fitoestrogena koji se u soji nalaze, i koji bi se mogli koristiti u prevenciji i lečenju tumora. Najpre se pretpostavljalo da bi fitoestrogeni u organizmu izazivali hormonalne reakcije, slično endogenom estrogenu. MeĎutim dalja istraţivanja pokazala su i mnoge druge, kako in vivo, tako i in vitro efekte fitoestrogena (Setchell, 1998.), i da zapravo ova jedinjenja putem različitih mehanizama: - imaju antikancerogene efekte - smanjuju rizik od kardio-vaskularnih bolesti - smanjuju nivo holesterola u krvi - ublaţavaju osteoporozu - ublaţavaju simptome menopauze Hemijska struktura izoflavona veoma je slična hemijskoj strukturi estrogena, što objašnjava sposobnost ovih jedinjenja da se vezuju za estrogene receptore (ER), i da u organizmu izazivaju efekte slične estrogenu. MeĎutim, zbog kompeticije sa endogenim estrogenom prema ER, izoflavoni deluju i kao antagonisti ovom hormonu. To praktično znači da će se izoflavoni ponašati ili kao endogeni estrogen, ili blokirati aktivnost endogenog estrogena, u zavisnosti od koncentracije, broja ER, koncentracije endogenog estrogena, vrste tkiva i drugih faktora. U in vivo uslovima predviĎanje akcije izoflavona još je komplikovanije, jer uključuje i zavisnost efekata izoflavona od načina administracije, hemijske forme izoflavona, njihovog metabolizma, biološke dostupnosti, duţine izlaganja ovim jedinjenjima, statusa endogenog estrogena itd. Otkriće još jednog tipa estrogenog receptora – ERß (Kuiper i sar., 1996a) delimično razjašnjava različite efekte estrogena u različitim tkivima. Prvobitno poznati, „klasični“ 44 estrogeni receptori ERα, i novootkriveni ERß, moguće da imaju različite uloge u genskoj regulaciji, a takoĎe se razlikuje i zastupljenost ovih receptora u različitim tkivima. Tako je kod pacova utvrĎeno prisustvo ERα u materici, testisima, jajnicima, bubrezima, epididimisu, štitnoj ţlezdi, a ERß najviše je zastupljen u prostati, plućima, bešici, mozgu (Kuiper i sar., 1996. a, b; Setchell i Cassidy, 1999). Zastupljenost različitih tipova estrogenih receptora u organizmu čoveka prikazano je na Slici 14. Prisustvo različitih tipova receptora kod različitih vrsta ţivotinja prikazano je u Tabeli 10. Ono što je još veoma vaţno jeste da je afinitet različitih estrogenih jedinjenja različit prema dva tipa estrogenih receptora, a konkretno fitoestrogeni imaju značajno veći afinitet prema ERß nego prema ERα (Kuiper i sar. 1998). Slika 14. Zastupljenost estrogenih receptora ERα i ERß u telu čoveka (Setchell i Cassidy, 1999) 45 Tabela 10. Prisustvo pojedinih tipova estrogenih receptora kod različitih vrsta ţivotinja (Kalbe i sar., 2007) Vrsta ţivotinja Tip estrogenog receptora Pacovi ERα Miševi ERα, ERß Ovce ER Zečevi ER Goveda ERα, ERß Čovek ERα, ERß Ţivina (kokoška) ERα, ERß Istraţivanja prisustva i uloge estrogenih receptora u mišićnom tkivu novijeg su datuma. Wiik i sar. (2009) utvrdili su postojanje oba tipa receptora u mišićima ljudi, oba pola, i različitog uzrasta. Njihovo istraţivanje pokazalo je prisustvo ER i u jedrima samih mišićnih vlakana, i u kapilarima koji okruţuju vlakna. Iste nalaze dobili su Kalbe i sar. (2007) pri ispitivanju nekoliko mišića svinja, i prvi potvrdili prisustvo ERα i ERß u mišićnom tkivu kod ove vrste ţivotinja. To znači da i mišićno tkivo predstavlja ciljno tkivo za delovanje estrogena, kako endogenog, tako i onih supstanci koje oponašaju estrogen, a meĎu koje spadaju i izoflavoni. 2.3.3 Uticaj izoflavona na mišićno tkivo Zbog sposobnosti da oponašaju estrogen, moguće je da bi izoflavoni mogli uticati na rast i sastav trupa kod svinja. Primena različitih estrogenih jedinjenja u svinjarskoj proizvodnji dovodi do smanjenja masti u trupu i povećava mišićavost (Lee i sar., 2005, Bidner i sar., 1972). MeĎutim, rezultati autora koji su ispitivali uticaj izoflavona na mišićno tkivo kod različitih vrsta ţivotinja, i porast i kvalitet trupa uopšte, veoma se razlikuju. Payne i sar. (2001) ispitivali su uticaj tri nivoa izoflavona u hrani za kastrate i nazimice u tovu. Kastrati su dobijali: 1. sojinu sačmu (1,14 mg/g ukupnih izoflavona); 2. sojin protein (0,06 mg/g ukupnih izoflavona); 3. sojin protein uz dodatak izoflavona do nivoa kao u prvoj grupi. Nazimice su dobijale: 1. sojinu sačmu (1,14 mg/g ukupnih izoflavona); 2. sojinu sačmu + dodatak izoflavona u koncentraciji dva puta većoj nego u sojinoj sačmi; 3. sojinu sačmu + dodatak izoflavona u koncentraciji pet puta većoj nego 46 u sojinoj sačmi. Autori su pratili dnevni prirast i konzumiranje hrane, površinu MLD-a, debljinu slanine, procenat mišića u trupu i tehnološke osobine mesa (pH24, temperaturu mesa, boju, tvrdoću i druge). Posmatrajući čitav period tova, izoflavoni nisu uticali na dnevni prirast i dnevno konzumiranje hrane kod kastrata, ali posmatrano samo u završnoj fazi tova, prosečan dnevni prirast i konzumiranje hrane bili su značajno veći (p<0,10) kod ţivotinja hranjenih koncentratom sojinog proteina. Duţina trupa, teţina i procenat bezmasnog mesa, dnevni prirast bezmasnog mesa bili su povećani, a debljina slanine smanjena kod kastrata koji su dobijali dodatne izoflavone u ishrani. MeĎutim, izmeĎu kastrata hranjenih sojinim brašnom, i kastrata hranjenih sojinim proteinom uz dodatak izoflavona nije bilo značajnih razlika. Tehnološke osobine mesa nisu se razlikovale (p>0,10) kod kastrata iz različitih eksperimentalnih grupa. Kod nazimica iz tri eksperimentalne grupe nije bilo razlika ni u jednoj od posmatranih osobina. Na osnovu rezultata, Payne i sar. (2001) zaključili su da izoflavoni smanjuju sadrţaj masti i povećavaju količinu bezmasnog mesa kod kastrata u tovu, ali ne i kod nazimica, i da dodavanje izoflavona iznad količina koje se normalno nalaze u sojinom brašnu nema uticaja na poboljšavanje karakteristika trupa i kvaliteta mesa. Kuhn i sar. (2004) nisu uočili razlike u porastu i osobinama trupa kod kastrata hranjenih obrocima sa različitim količinama izoflavona. Liu i sar. (1999) utvrdili su povećanje mase na roĎenju kod muške prasadi kao posledicu ishrane majki uz dodatak malih doza izoflavona. Jiang i sar. (2007) ispitivali su uticaj dodavanja različitih doza izoflavona (0, 10, 20, 40, 80 mg/kg) kod brojlera muškog pola hranjenih istim osnovnim obrokom bez sojine sačme. Rezultati su pokazali da dodatak izoflavona od 10 i 20 mg/kg povećava prosečan dnevni prirast ali i konzumiranje hrane. Dodatak izoflavona 40mg/kg povećao je sposobnost zadrţavanja vode kod mesa, i pH vrednost mesa. Na osnovu rezultata Jiang i sar. (2007) zaključili su da dodatak izoflavona u ishrani muških brojlera ima pozitivan uticaj na porast i kvalitet mesa. MeĎutim, u eksperimentima sa kulturama mišićnih ćelija (in vitro), pokazalo se da izoflavoni inhibiraju rast i razvoj mišićnih ćelija. Jones i sar. (2005) utvrdili su da fitoestrogeni, a naročito genistein, pri koncentraciji ≥ 1 µmol/l, inhibira proliferaciju mišićnih ćelija pacova u in vitro uslovima, mada ne utiče na degradaciju ili razgradnju 47 proteina. Slične rezultate dobili su i Ji i sar. (1999), koji su utvrdili da genistein veoma jako inhibira proliferaciju i fuziju mioblasta pacova, da je jačina inhibicije zavisna od doze genisteina, i da su efektivne doze već od 1 µmol/l. Autori nisu zapazili negativne efekte genisteina na degradaciju proteina. TakoĎe, uočili su da je negativan efekat genisteina na fuziju mioblasta prisutan onda kada se genistein dodaje tokom prva 24 časa inicijacije formiranja miotubula. Ukoliko je genistein dodavan kasnije, nakon prvih 24 sata inicijacije, nije imao nikakve efekte na fuziju mioblasta. Posmatrajući sintezu miozina, autori su uočili takoĎe veoma štetno dejstvo genisteina, pri visokim dozama, i dugoj izloţenosti. Pri niskim dozama (1 µmol/l), što odgovara koncetraciji u serumu ljudi i pacova kod kojih je zastupljena soja u ishrani, genistein je povećao obim sinteze miozina. Mau i sar. (2008) proučavali su direktne efekte genisteina i daidzeina na proliferativne kulture mišićnih ćelija poreklom od novoroĎene prasadi. Korišćene su doze izoflavona od 0,1, 1, 10 i 100 µM, koje se inače mogu izmeriti u serumu nakon konzumiranja formula za ishranu odojčadi na bazi soje, ili biljnih hraniva koja se koriste u ishrani svinja. Rezultati ovog istraţivanja pokazali su takoĎe zavisnost efekata od primenjenje doze izoflavona, i znatno jače inhibitorno dejstvo genisteina na proliferaciju mišićnih ćelija. Ovakvo dejstvo genistein je pokazao već pri dozi od 1 µM. Sa druge strane, daidzein čak i pri znatno većim dozama - do 10 µM, nije imao štetne efekte na rast mišićnih ćelija svinja. Slično istraţivanje, na kulturama mišićnih ćelija svinja sproveli su Rehfeldt i sar. (2009). Primenjene su iste doze genisteina i daidzeina (0,1, 1, 10, 20 i 100 µmol/l) i 17β-estradiol (0,1, 1 nmol/l) tokom poslednjih 26 časova kultivacije ćelija. Miogena diferencijacija nije bila promenjena pod dejstvom bilo koje od koncentracija izoflavona ili estradiola. Ovo je na prvi pogled u suprotnosti sa nalazima Ji i sar. (1999), ali ovi autori su utvrdili inhibitorno dejstvo genisteina na proliferaciju i fuziju mioblasta kada je on aplikovan u toku inicijacije. Zbog toga Rehfeldt i sar. (2009) zaključuju da inhibitorni efekat genisteina zavisi od stadijuma razvoja ćelijskih kultura, i da iz tog razloga, ukoliko se dodaje kasnije, genistein kao i daidzein i estradiol nemaju efekta na diferencijaciju. MeĎutim, ovi autori su potvrdili inhibitorno dejstvo genisteina u 48 zavisnosti od primenjene doze, i odsustvo efekta daidzeina i 17β-estradiola na sintezu proteina. UtvrĎeno je da niske doze genisteina, daidzeina i 17β-estradiola smanjuju degradaciju proteina u kulturama mišićnih ćelija, što bi potencijalno moglo doprineti povećanju akumulacije proteina u skeletnim mišićima svinja. 2.4 Uticaj strukture mišićnog tkiva na kvalitet mesa Interakcija izmeĎu mišićnih vlakana, njihovog energetskog metabolizma i različitih faktora okoline determiniše postmortalnu transformaciju mišića u meso. Histohemijske i biohemijske osobine mišića, kao što su zastupljenost pojedinih tipova vlakana, veličina (prečnik) vlakana, oksidativni i glikolitički kapacitet, sadrţaj glikogena i masti, utiču na kvalitet mesa (Karlsson i sar., 1999). Varijacije u kvalitetu mesa ogromne su kako izmeĎu različitih vrsta ţivotinja, tako i u okviru iste vrste, i posledica su zajedničkog delovanja genetske osnove jedinke, uslova okoline u kojima se ţivotinja nalazi i pre- i post-mortem biohemijskih procesa u samom mišićnom tkivu. Kod svinja, karakteristike mesa koje su od najveće vaţnosti u pogledu kvaliteta su pH vrednost, boja i sposobnost zadrţavanja vode, a ove osobine u velikoj meri zavise od strukture mišićnog tkiva, veličine - prečnika vlakana i njihove snabdevenosti krvlju - kapilarizacije (Henckel, 1995, Klont i sar., 1998). Dva parametra kvaliteta mesa koja su najčešće u upotrebi za odreĎivanje kvaliteta mesa su pH vrednost 45-60 min post-mortem (pH1) i pH vrednost 24 sata nakon klanja (pH24), zbog toga što mogu sa velikom preciznošću ukazati na tehnološki i konzumni kvalitet mesa (Van der Wal i sar., 1995). Meso dobrog kvaliteta ima pH24 vrednost 5,7-5,8. Poremećaji pH vrednosti povezani su sa tri moguća nepoţeljna stanja mesa nakon klanja, a to su: svetlo, mekano, vodnjikavo (PSE – pale, soft, exudative) meso kod koga je pH24 vrednost oko 5,5; tamno, tvrdo, suvo (DFD – dark, firm, dry) meso kod koga je pH24 vrednost veća od 6,2; i kiselo (acid) meso kod koga je pH24 vrednost ispod 5,5. U 49 današnjim proizvodnim uslovima najčešće nepoţeljno stanje mesa je PSE meso. Zbog svoje vaţnosti, pokazatelji pH vrednosti danas su standardno uključeni u odgajivačke programe. Selekcija na veću količinu bezmasnog mesa i veću zastupljenost vlakana većeg prečnika, posebno tipa IIB, kod svinja rezultira u slabijoj kapilarizaciji a time nedovoljnoj ishranjenosti kiseonikom i hranljivim materijama, oteţanoj eliminaciji CO2 i laktata (Fiedler i sar., 1993, Henckel i sar., 1997), što za posledicu ima sniţavanje pH vrednosti mesa nakon klanja, i smanjen kvalitet mesa. Kod modernih mesnatih rasa svinja, selekcijom se forsira dobijanje vlakana većeg prečnika, ali ovakva vlakna imaju tendenciju da se smanjuje broj mitohondrija u njihovom sastavu. Metabolizam ovakvih vlakana je glikolitički, ona spadaju u grupu brzo-okidajućih tzv. belih vlakana. Brojna istraţivanja na svinjama pokazala su da se za povećan broj belih vlakana vezuju problemi PSE mesa (Larzul i sar., 1997, Fiedler i sar., 1999) i osetljivosti na stres (Fiedler i sar., 1993, 1999). Brzo-okidajuća, bela vlakna proizvode energiju za kontrakciju uglavnom kroz glikolitički metabolizam, pa u uslovima kada su zahtevi za energijom visoki (neposredno pred klanje) ovakvim metabolizmom se stvara prevelika količina laktata koji se ne moţe eliminisati iz ćelija, denaturišu se proteini, i pH vrednost drastično pada. Prema Maltin i sar. (1997), izraţena hipertrofija vlakana takoĎe utiče na smanjenje mekoće svinjskog mesa. Ukoliko se posmatra veza izmeĎu broja mišićnih vlakana, i mesnatosti i pH vrednosti mesa, utvrĎeno je da postoji širok opseg optimalnog broja vlakana koji garantuje i dobru mesnatost i istovremeno dobar kvalitet mesa ukoliko su vlakna umerene veličine (Lengerken i sar., 1997). Ukoliko su bilo veličina, bilo broj vlakana na ekstremnim vrednostima, meso će imati veliki gubitak vode i nisku pH vrednost. Pri optimalnom balansu veličine i broja vlakana smanjuje se gubitak vode, podiţe pH vrednost, povećava se mesnatost i kvalitet mesa. Kako sumiraju Te Paas i sar. (2004), mekoća mesa pozitivno je korelirana sa veličinom vlakana, a prečnik vlakana povećava se od najmanjih – vlakana tipa I, preko vlakana tipa IIA, do vlakana tipa IIB koja su najvećeg prečnika (Tabela 11). Vlakna tipa IIB su 50 glikolitička vlakna, dakle njihova funkcija zavisi od glikogena koji se u ovim vlaknima nalazi u većoj količini. Glikogen daje mesu sladak ukus, pa je meso sa većim udelom vlakana tipa IIB mekše i ukusnije. MeĎutim, metabolizmom glikogena u ovim vlaknima dolazi do nakupljanja veće količine laktata koji sniţava pH, a nizak pH uz visoku temperaturu denaturiše proteine, i meso gubi sposobnost zadrţavanja vode. Visok sadrţaj glikogena, odnosno veći udeo IIB vlakana predispozicija je za PSE meso. Sa druge strane, vlakna tipa I i IIA su oksidativna vlakna, bogata mioglobinom i mitohondrijama, pa daju mesu poţeljnu crvenu boju. Ipak, jačina post-mortem kontrakcije odnosno skraćivanja najveća je u vlaknima tipa I, koja takoĎe imaju i mali sadrţaj glikogena, pa će od mišićnog tkiva bogatog vlaknima tipa I nastati meso koje je tvrdo i bezukusno. Ono što mesu sa većim udelom vlakana tipa I i IIA daje pozitivne karakteristike jeste bolja kapilarizacija ovih vlakana, i sposobnost da se štetni produkti metabolizma (pre svega laktat) efikasnije izbacuju iz vlakana. Tabela 11. Povezanost osobina mišićnih vlakana i osobina kvaliteta mesa (Te Paas i sar., 2004.) Osobina mišićnih vlakana Osobina kvaliteta mesa Visok sadrţaj glikogena + sladak ukus + tendendcija ka PSE Oksidativni kapacitet + pH24 + tendencija ka DFD Kapilarizacija + kvalitet za konzum Duţina sarkomere + mekoća mesa Prečnik mišićnog vlakna + mekoća mesa Sadrţaj intramuskularne masti + ukus mesa za konzum + pozitivan uticaj pojedinih osobina mišićnih vlakana na osobine kvaliteta mesa Još jedna odlika mišićnih vlakana usko vezana za kvalitet mesa je pojava tzv. gigantskih-dţinovskih vlakana. Ovakva vlakna javljaju se na uzorcima mišića svinja uzetih post-mortem, ali ne i na uzorcima sa biopsije (Handel i Stickland, 1986). Najčešće su gigantska vlakna ovalnog ili kruţnog preseka, izrazito velikog prečnika, i smeštena po obodu mišićnog fascikula. Smatra se da nastaju hiper-kontrakcijom mišićnih vlakana koja nisu sposobna da proĎu kroz normalnu relaksaciju nakon inicijalnog rigor mortisa. U mišićima kod kojih nema problema sa kvalitetom mesa, učestalost pojave gigantskih vlakana je manja od 0,5%. Veća procentualna zastupljenost ovih vlakana rezultira u lošijem kvalitetu mesa dobijenog od m. longissimus dorsi kod Pijetren svinja (Fiedler i sar., 1999). 51 Kao zaključak moţe se reći da ekstremna hipertrofija mišićnih vlakana, bilo pri suviše niskom ili suviše visokom broju vlakana, uz pojavu gigantskih vlakana predstavljaju jake indikatore mesa lošeg kvaliteta. To znači da bi optimalan balans izmeĎu broja vlakana i njihove postnatalne hipertrofije mogao biti ključni zahtev u selekciji na povećanu količinu bezmasnog mesa i dobar kvalitet mesa. 52 3. Ciljevi i zadaci istraživanja Fitoestrogeni daidzein i genistein su normalno prisutni u biljci soje, koja ulazi u sastav koncentrovanih smeša za ishranu svinja. Ove supstance u organizmu se ponašaju slično polnom hormonu estrogenu, i deluju na različite organe i tkiva. Cilj ovog rada bio je da se utvrdi uticaj dodavanja daidzeina u hranu suprasnih krmača na proizvodne osobine i osobine mišićnog tkiva potomstva, kao i uticaji veličine legla kod prasadi i tovljenika, i pola kod tovljenika na pomenute osobine. Radi ostvarivanja postavljenih ciljeva definisani su sledeći istraţivački zadaci: 1. Ispitati uticaj dodavanja daidzeina u kasnoj fazi gestacije u dva različita obroka za ishranu suprasnih krmača. Prvi obrok koncipirati tako da uz dodatak sintetičkog daidzeina, u obroku bude prisutna i soja kao prirodni izvor daidzeina, i to u količini standardnoj za ishranu svinja. U drugom obroku soju potpuno izbaciti iz obroka i dodavati samo sintetički daidzein. Kod potomstva kontrolnih i tretiranih krmača, radi utvrĎivanja uticaja daidzeina pratiti sledeće osobine: proizvodne osobine krmača, morfološke i histološke osobine m. semitendinosus- a prasadi, morfološke i histološke osobine m. semitendinosus-a tovljenika. TakoĎe ispitati eventualni uticaj daidzeina u zavisnosti od veličine legla kod novoroĎene prasadi i tovljenika, odnosno pola kod tovljenika. 2. Ispitati uticaj veličine legla kao faktora, formiranjem dve grupe legala prema broju prasadi: malog i velikog. U okviru oba legla pratiti: proizvodne osobine krmača, morfološke i histološke osobine m. semitendinosus-a prasadi, morfološke i histološke osobine m. semitendinosus-a tovljenika. TakoĎe utvrditi moguć uticaj interakcije tretmana krmača daidzeinom i veličine legla na navedene osobine. 3. Ispitati uticaj pola kao faktora na proizvodne osobine, morfološke i histološke osobine mišićnog tkiva tovljenika, i moguće različite efekte suplementacije daidzeina krmačama kod potomaka različitog pola na kraju tova. 53 4. Materijal i metod rada Istraţivanje je obavljeno na oglednom dobru Instituta za Biologiju domaćih ţivotinja u Roštoku, u Nemačkoj (Leibnitz Institute for Farm Animal Biology - FBN, Dummerstorf – Rostock), pri odeljenju za Biologiju i porast mišića (Research Unit Muscle Biology and Growth). Za ispitivanje su korišćene ţivotinje rase Nemački landras, a sve procedure drţanja i korišćenja ţivotinja bile su u saglasnosti sa Pravilnikom Komiteta za zaštitu ţivotinja, Ministarstva Poljoprivrede i Zaštite ţivotne sredine Nemačke. Istraţivanje je sprovedeno u okviru dva zasebna eksperimenta. 4.1 Životinje i ishrana 4.1.1 Eksperiment 1 Šesnaest multiparih krmača osemenjeno je semenom jednog nerasta rase Nemački landras u dva uzastopna ponavljanja sa po osam krmača u svakom ponavljanju. Suprasnost je potvrĎena 28-og dana gestacije ultrazvučnim aparatom. Krmače su bile prosečne početne telesne mase 180±7 kg, i broja prašenja 3,0±0,3. Nakon utvrĎivanja suprasnosti krmače su podeljene na eksperimentalnu (n=8) i kontrolnu grupu (n=8), pri čemu su ţivotinje iz obe grupe bile ujednačene po telesnoj masi, debljini leĎne slanine i broju prašenja. Krmače su bile smeštene u individualne boksove, pod kontrolisanim uslovima okoline (temperatura 19°C, relativna vlaţnost vazduha 60-80%). Sve ogledne ţivotinje imale su slobodan pristup vodi, i hranjene su ručno dva puta dnevno koncentrovanom smešom za ishranu suprasnih krmača (Denkavit, Trede&Pein GMBH&Co. KG, Itzehohe, Germany). Do 104-og dana suprasnosti ţivotinje su dobijale koncentrovanu smešu (smeša Denka 1) sa 14,5% sirovih proteina (SP) i 11,8 MJ metaboličke energije (ME), a 54 od 105-115-og dana suprasnosti smešu sa 17,8% SP i 13 MJ ME (smeša Denka 2). U smešu je bila uključena sojina sačma. U skladu sa povećanjem potreba ţivotinja tokom suprasnosti, količina koncentrovane smeše povećavana je postepeno od 2,6 kg dnevno po grlu na početku do 5,0 kg dnevno na kraju suprasnosti. Kompletan sastav smeša za ishranu suprasnih krmača u Eksperimentu 1 dat je u Tabeli 12. Od 85-og dana gestacije eksperimentalnoj grupi krmača je u smešu dodavan daidzein (donacija Poljoprivrednog Univerziteta iz Nanjinga, Kina) u količini 8 mg/kg hraniva. Prema Kuhn i sar. (2004) količina daidzeina u sojinoj sačmi koja se standardno uključuje u obrok je 407 µg/g sačme, odnosno u obroku koji sadrţi 15% sojine sačme prisutno je oko 61 mg daidzeina po kilogramu hraniva. Uz dodatak daidzeina u količini 8 mg/kg hraniva, a s obzirom na povećanje količine smeše davane svakoj krmači, i povećanje procenta sojine sačme u obroku, to daje ukupnu dnevnu količinu daidzeina od oko 280 do 450 mg u periodu od 85-od dana gestacije do kraja suprasnosti kod tretiranih krmača. Tokom trajanja eksperimenta dve krmače iz kontrolne grupe isključene su iz ogleda zbog pojave koštanog oboljenja, odnosno preranog prašenja. Radi indukcije prašenja, krmačama iz obe grupe je 114-og dana suprasnosti intramuskularno aplicirana injekcija 1 ml sintetičkog prostaglandin analoga (cloprostenol, 75 mg/ml: AniMedica West, Chemische Produkte GmbH, Senden, Germany). Nakon prašenja evidentirana je telesna masa sve prasadi i veličina legla svake krmače. Iz svakog legla uzeta su po dva muška praseta mase pribliţne prosečnoj masi prasadi u leglu i radi uzorkovanja mišićnog tkiva ţrtvovana nakon anesteziranja sa 1 ml mešavine ursotamina (Ursotamin, Serumwerk Bernburg AG, Germany) i kombelena (Combelen, Bayer AG, Leverkusen, Germany) u odnosu 1:1. Preostala muška prasad kastrirana su 5 dana nakon prašenja, a sva prasad ostala su sa krmačama sve do zalučenja sa 28 dana starosti, nakon čega su stavljena u tov. Ishrana prasadi tokom čitavog perioda odgajivanja i tova bila je ad libitum. Ishrana prasadi koncentrovanom smešom započeta je 10 dana nakon prašenja, starter smešom koja je 55 sadrţala 14 MJ ME, 19% sirovih proteina i 1,3% lizina. Sastav početne smeše (Kern 1, Trede&Pein, GMBH&Co. KG, Itzehohe, Germany) za ishranu prasadi dat je u Tabeli 12. U periodu odgajivanja, od 42-og do 70-og dana, za ishranu je korišćena grover smeša sa 13,8 MJ ME, 18,9% sirovih proteina i 1,21% lizina. Sastav grover smeše (Kern 2) dat je u Tabeli 12. Tokom faze tova, od 71-og do 180-og dana tovljenici su bili smešteni u grupama i individualno hranjeni uz pomoć elektronskog čipa (INSENTEC, Marknesse, The Netherlands). Smeša korišćena u fazi tova bila je komercijalna finišer smeša (Mast MM) sa 13 MJ ME, 17% sirovih proteina i 0,94% lizina. Sastav finišer smeše dat je u Tabeli 12. Tabela 12. Sastav koncentrovanih smeša (u %, osim gde je drugačije naznačeno) korišćenih za ishranu krmača i prasadi u Eksperimentu 1 i Eksperimentu 2. Sastav koncentrovane smeše Kern 11 Kern 22 Mast MM3 Denka 14 Denka 25 Pšenica 15,00 44,00 26,00 18,00 18,00 Termički obraĎen kukuruz 30,00 15,00 / / / Ječam 11,00 9,00 28,00 31,00 34,00 Tritikale / / 15,00 7,00 11,00 Stočni grašak / / 6,00 / / Ovas / / / / 4,00 Pšenične mekinje / / / 14,00 2,00 Ovsene mekinje / / / 2,00 / Suvi rezanac šećerne repe / / / 7,00 / Sojina sačma 16,00 17,00 15,00 15,00 20,00 Sačma uljane repice / / 4,00 / / Riblje brašno 5,00 5,00 / / 2,00 Pivski kvasac / / / / 2,00 Glukoza 1,00 1,00 / / / Melasa / 1,00 2,00 2,50 2,00 Biljno ulje 2,00 1,50 1,50 1,00 2,00 Denka Ferkel 50 / 5,00 / / / Kern 200 AD Rietz 20,00 / / / / Mineralno-vitaminski premiks / 1,50 2,50 2,50 3,00 Energija (MJ ME) 14,00 13,80 13,00 12,60 13,00 Sirovi protein 19,00 18,90 17,00 17,60 17,80 Lizin 1,30 1,21 0,94 0,95 0,95 Sirova mast 5,60 4,20 3,90 4,20 4,20 Sirova vlakna 3,00 3,20 4,50 5,00 4,50 Ca 0,80 0,80 0,75 0,90 0,90 P 0,66 0,67 0,50 0,70 0,70 Vitamin A (IU) 16000 16000 10000 16000 20000 Vitamin D3 (IU) 2000 2000 1000 1600 2000 Vitamin E (mg) 170 75 50 45 80 Antibiotik, avilamycin (promoter rasta) (mg) 40 / / / / Kompleks kiselina kompleks org. kiselina kompleks org. kiselina propionska kiselina propionska kiselina propionska kiselina Fitaza (FTU) 500 500 / / / 1 starter smeša za ishranu prasadi u periodu 10-42 dana starosti 56 2 grover smeša za ishranu ţivotinja u tovu u periodu 43-70 dana starosti 3 finišer smeša za ishranu ţivotinja u tovu u periodu 71-180 dana starosti 4 kompletna smeša za ishranu suprasnih krmača od 1-104 dana suprasnosti 5 kompletna smeša za ishranu suprasnih krmača od 105-114 dana suprasnosti Sve ţivotinje koje su ušle u tov merene su jednom nedeljno do odlučenja sa 28 dana starosti, a zatim na svake tri nedelje do 175-og dana starosti i potom na klanju. 4.1.2 Eksperiment 2 Šesnaest multiparih krmača osemenjeno je semenom jednog nerasta rase Nemački landras u dva uzastopna ponavljanja sa po osam krmača u svakom ponavljanju. Suprasnost je potvrĎena 28-og dana gestacije ultrazvučnim aparatom. Nakon utvrĎivanja suprasnosti krmače su podeljene na eksperimentalnu (n=8) i kontrolnu grupu (n=8), pri čemu su ţivotinje iz obe grupe bile ujednačene po telesnoj masi (prosečno 235,8 ± 12,7kg) i broju prašenja (prosečno 4,1 ± 0,7). Krmače su bile smeštene u individualne boksove, pod kontrolisanim uslovima okoline (temperatura 19°C, relativna vlaţnost vazduha 60-80%). Sve ogledne ţivotinje imale su slobodan pristup vodi, i hranjene su ručno dva puta dnevno specijalnim koncentrovanom smešom koja se bazirala na pšenici i tritikaleu, a nije sadrţala soju (Rez. 164.0, Trede&Pein GMBH&Co. KG, Itzehohe, Germany). Tokom čitavog trajanja suprasnosti ţivotinje su dobijale koncentrovanu smešu (smeša Rez. 164.0.) sa 16% sirovih proteina, 13,0 MJ ME. U skladu sa povećanjem potreba ţivotinja tokom suprasnosti, količina smeše povećavana je postepeno od 2,6 kg dnevno po grlu na početku do 5,0 kg dnevno na kraju suprasnosti. Kompletan sastav koncentrovane smeše za ishranu suprasnih krmača u Eksperimentu 2 dat je u Tabeli 13. Od 85-og dana gestacije eksperimentalnoj grupi je u smešu dodavan čist, sintetički daidzein u količini 1 mg po kg telesne mase dnevno. Obzirom na prosečnu telesnu masu krmača u eksperimentu 2, ukupna količina daidzeina davana krmačama bila je oko 180- 260 mg dnevno. Tokom trajanja eksperimenta jedna krmača iz eksperimentalne grupe isključena je iz ogleda zbog utvrĎene laţne suprasnosti. 57 Radi indukcije prašenja, krmačama iz obe grupe je 114-og dana suprasnosti intramuskularno aplicirana injekcija 1 ml sintetičkog prostaglandin analoga (cloprostenol, 75 mg/ml, AniMedica West, Chemische Produkte GmbH, Senden, Germany). Nakon prašenja evidentirana je telesna masa sve prasadi i veličina legla svake krmače. I u eksperimentu 2 odmah po prašenju iz svakog legla uzeta su po dva muška praseta telesne mase najpribliţnije prosečnoj masi prasadi u leglu. Prasad je ţrtvovana intramuskularnom aplikacijom 1,25 mg propionilpromazina (0,2 ml Combelen, Bayer AG, Leverkusen, Germany) i 50 mg ketamina (0,5 ml Ursotamin, Serumwerk Bernburg AG, Germany), radi uzimanja uzoraka misića m. semitendinosus za detaljne histološke analize. Tabela 13. Sastav koncentrovane smeše (u %, osim gde je drugačije naznačeno) za ishranu suprasnih krmača u Eksperimentu 2 Sastav smeše Rez. 164.0. 1 Pšenica 22,00 Tritikale 25,00 Raţ 14,00 Sačma uljane repice 11,00 Ječam 10,60 Stočni grašak 10,00 Pšenične mekinje 4,00 Kalcijum karbonat 1,40 Sojino ulje 0,70 L-lizin 0,38 So 0,37 Monokalcijum-fosfat 0,30 Aditiv 0,20 DL-metionin 0,05 Energija (MJ ME) 13,0 Sirovi protein 16,00 Lizin 0,94 Sirova mast 3,00 Sirova vlakna 4,80 Ca 0,75 P 0,50 Na 0,18 Vitamin A (IU) 10000 Vitamin D3 (IU) 1000 Vitamin E (mg) 50 Cu (mg) 25 Kompleks kiselina propionska kiselina 1 kompletna smeša za ishranu surpasnih krmača od 1-114 dana suprasnosti 58 Preostala muška prasad kastrirana su 5 dana nakon prašenja, a sva prasad ostala su sa krmačama sve do zalučenja sa 28 dana starosti, nakon čega su stavljena u tov. Ishrana prasadi tokom čitavog perioda odgajivanja i tova bila je ad libitum. Ishrana prasadi koncentrovanom smešom započeta je 10 dana nakon prašenja, starter smešom koja je sadrţala 14 MJ ME, 19% sirovih proteina i 1,3% lizina. Sastav početne smeše (Kern 1, Trede&Pein, GMBH&Co. KG, Itzehohe, Germany) za ishranu prasadi dat je u Tabeli 12. U periodu odgajivanja, od 42-og do 70-og dana, za ishranu je korišćena grover smeša sa 13,8 MJ ME, 18,9% sirovih proteina i 1,21% lizina. Sastav grover smeše (Kern 2) dat je u Tabeli 12. Tokom faze tova, od 71-og do 180-og dana tovljenici su bili smešteni u grupama i individualno hranjeni uz pomoć elektronskog čipa (INSENTEC, Marknesse, The Netherlands). Smeša korišćena u fazi tova bila je komercijalna finišer smeša (Mast MM) sa 13 MJ ME, 17% sirovih proteina i 0,94% lizina. Sastav finišer smeše dat je u Tabeli 12. 4.2 Histološke i histohemijske analize mišićnog tkiva Za histološke i histohemijske analize disekciran je m. semitendinosus desne noge kod prasadi, a kod tovljenika isti mišić sa leve noge. Kod novoroĎene prasadi mereni su teţina i duţina mišića, kao i obim mišića na središnjem – najširem delu. Površina poprečnog preseka mišića (muscle cross sectional area – MCSA) preračunata je preko obima mišića. Komadi tkiva isecani iz središnjeg dela mišića lepljeni su na postolja od plute, i momentalno zamrzavani u izopentanu porinutom u tečni azot. Fotografije postupka diseciranja i merenja mišića kod prasadi prikazane su na Slikama 15, 16, 17 i 18. 59 Slika 15. Poloţaj mišića m. semitendinosus Slika 16. Seciranje mišića Slika 17. Merenje duţine i obima mišića Slika 18. Priprema uzorka za zamrzavanje U kriostatu (Reichert-Jung, Leica, Nussloch, Germany) na temperaturi -20°C na zamrznutom uzorku mišića sečena je serija poprečnih preseka debljine 10 ili 16 µm, zavisno od daljih analiza. Rezovi mišićnog tkiva debljine 10 µm bojeni su eozinom (Romeis, 1989), a rezovi debljine 16 µm bojeni su na miozin ATPazu nakon kisele preinkubacije na pH 4,2 (Guth i Samaha, 1970). Za razliku od prasadi, kod tovljenika je iz svakog mišića uzimano po dva uzorka: jedan uzorak mišićnog tkiva iz tamnog (duboka partija) i jedan uzorak iz svetlog dela mišića (površinska partija) na središnjem – najširem delu mišića. Ovakav postupak standardno se primenjuje kod analiziranja m. semitendinosus-a zbog toga što se raspored različitih tipova vlakana razlikuje u ova dva dela mišića: u dubokim partijama mišića znatno više su prisutna tamna, spora, oksidativna vlakna (STO), dok su u površinskim partijama mišića mnogobrojnija svetla, brza, glikolitička vlakna (FTG). Zbog toga se za dalje analize uzimaju vrednosti pojedinih parametara, izračunate kao prosečne vrednosti 60 karakteristika iz obe regije mišića. Uzorci mišića su lepljeni na postolja od plute, i momentalno zamrzavani u izopentanu porinutom u tečni azot. Rezovi tkiva debljine 10 µm sečeni su u kriostatu na temperaturi -20°C. Za bojenje citoplazme i jedara primenjeno je bojenje hematoksilin-eozinom (Romeis, 1989), a klasifikacija vlakana na sporo-okidajuća oksidativna (STO), brzo-okidajuća oksidativna (FTO) i brzo-okidajuća glikolitička (FTG) omogućena je kombinovanim bojenjem na NADH-tetrazolium reduktazu NADH-TR (Novikoff i sar., 1961) i kiselo preinkubiranu ATP-azu na pH 4,2 (Guth i Samaha, 1970). Za utvrĎivanje ukupnog broja vlakana na poprečnom preseku mišića kod novoroĎene prasadi korišćeni su preparati tkiva bojeni eozinom, a mikroskop podešavan na uveličanje 250 (objektiv 20; okular 12,5). Slučajno odabrana mikroskopska slika tj. vidno polje projektovana je na papir tačno odreĎene površine (format A5). Za svaki preparat tkiva brojana su vlakna na pedeset A5 papira korišćenjem olovke-brojača. Izračunato je da, pri uvećanju mikroskopa 250, površina jednog papira A5 formata čini 0,19734 mm 2 sa preparata mišića, time 50 papira A5 formata iznosi 9,867 mm2 sa preparata mišića, što čini 8-12% ukupne površine poprečnog preseka mišića. Ukupan broj vlakana preračunat je na osnovu površine poprečnog preseka mišića i broja vlakana prebrojanom na površini od pedeset papira A5 formata. Za preračunavanje broja primarnih vlakana korišćeni su preparati tkiva bojeni na ATP- azu. S obzirom da se smatra da kod mišića prasadi centralno postavljeno tamno obojeno (tip I) vlakno u klasteru nastaje diferencijacijom primarnog vlakna, to se broj primarnih vlakana dobija brojanjem centralnih tamno obojenih vlakana najvećeg prečnika u klasteru, ili brojanjem celih klastera. Broj sekundarnih vlakana preračunava se oduzimanjem broja primarnih od ukupnog broja vlakana. Za brojanje primarnih vlakana mikroskop je podešavan na uveličanje 125 (objektiv 10; okular 12,5), slučajno odabrano vidno polje projektovano je takoĎe na papir A5 formata, ali je proces ponavljan na deset papira A5 formata, odnosno na ukupnoj površini 7,8407 mm2. Parametri koji su bili podvrgnuti daljoj statističkoj analizi radi utvrĎivanja efekta dodavanja daidzeina suprasnim krmačama od 85-od dana gestacije su: 61 1. Proizvodne osobine: - masa na roĎenju (kg) 2. Morfološke osobine m. semitendinosus: - teţina mišića (g) - duţina mišića (cm) - obim mišića (cm) - površina poprečnog preseka mišića (cm2) 3. Histološke osobine m. semitendinosus: - ukupan broj vlakana na poprečnom preseku - broj primarnih vlakana na poprečnom preseku - broj sekundarnih vlakana na poprečnom preseku - procenat primarnih vlakana (%) - odnos sekundarna : primarna vlakna Preparati mišićnog tkiva tovljenika posmatrani su pod uveličanjem objektiva mikroskopa 10, i preko kamere povezane sa računarom slika obraĎivana uz pomoć programskog softvera AMBA (IBSB, Berlin, Germany). Najpre je na preparatima bojenim hematoksilin-eozinom utvriĎivan broj jedara, broj vlakana i površina pojedinačnih vlakana, a zatim preparat mišića iste ţivotinje bojen kombinovanom reakcijom na NADH-tetrazolium reduktazu i kiselo-preinkubiranu ATP-azu pri pH 4,2 korišćen za utvrĎivanje tipa vlakana. Naime, prilikom obrade preparata bojenog hematoksilin-eozinom, površina pojedinačnih vlakana odreĎuje se na osnovu obima. Preparati se obraĎuju u računarskom programu AMBA, tako što se svako pojedinačno vlakno opcrtava po svojoj ivici. Program dobija informaciju o obimu vlakna, i na osnovu ovog podatka preračunava površinu vlakna. Kada se sva vlakna sa preparata opcrtaju, dobija se izgled mreţe ili saća. Ovakva slika sluţi kao „šablon“ za dalju obradu preparata na kome se posmatraju tipovi vlakana. Šablon ostaje zapamćen u programu, i vidljiv na monitoru kada se za mikroskopiranje postavi preparat bojen kombinovanom reakcijom na NADH-tetrazolium reduktazu i kiselo-preinkubiranu ATP-azu pri pH 4,2. Pod mikroskopom se traţi isti deo preparata koji je prethodno bio 62 posmatran na hematoksilin-eozin preparatu, dakle potrebno je da se šablon vidljiv na monitoru poklopi sa rasporedom vlakana na NADH-TR preparatu. Dalji postupak svodi se na označavanje tipova vlakana zavisno od njihove boje, a za svako označeno vlakno program ima podatak o obimu tj. površini. Na ovaj način omogućeno je precizno merenje površine svakog tipa vlakna pojedinačno. Za svakog tovljenika mereno je oko 400-500 vlakana, 50% u tamnom (dubokom), i 50% u svetlom (površinskom) regionu mišića. Parametri koji su bili podvrgnuti daljoj statističkoj analizi radi utvrĎivanja efekta dodavanja daidzeina suprasnim krmačama od 85-og dana gestacije, na osobine mišića tovljenika su: 1. Proizvodne osobine: - masa na roĎenju (kg) - klanična masa (kg) 2. Morfološke osobine m. semitendinosus: - teţina mišića (g) - duţina mišića (cm) - obim mišića (cm) - površina poprečnog preseka mišića (cm2) 3. Histološke osobine m. semitendinosus: - ukupan broj vlakana na poprečnom preseku - prosečna površina STO vlakna (µm2) - prosečna površina FTO vlakna (µm2) - prosečna površina FTG vlakna (µm2) - prosečna površina mišićnog vlakna (bez obzira na tip) (µm2) - procenat STO vlakana u ukupnom broju vlakana na poprečnom preseku (%) - procenat FTO vlakana u ukupnom broju vlakana na poprečnom preseku (%) - procenat FTG vlakana u ukupnom broju vlakana na poprečnom preseku (%) - broj jedara po jednom STO vlaknu 63 - broj jedara po jednom FTO vlaknu - broj jedara po jednom FTG vlaknu - prosečan broj jedara po jednom vlaknu (bez obzira na tip) - površina STO vlakna po jednom jedru (µm2) - površina FTO vlakna po jednom jedru (µm2) - površina FTG vlakna po jednom jedru (µm2) - prosečna površina vlakna (bez obzira na tip) po jednom jedru (µm2) - broj vlakana na 1cm2 površine mišića 4.3 Statistička obrada podataka Podaci su podvrgnuti analizi varijanse korišćenjem GLM i mešovitog modela klasifikacije SAS (SAS System for Windows Release 8e, SAS Institute Inc., Cary, NC 27513, USA). Podaci prikazani u tabelama su least squares means (LSM) ± standardna greska (SE). Podaci za osobine krmača analizirani su GLM metodom sa tretmanom (daidzein, kontrola), ponavljanjem, veličinom legla i njihovim interakcijama kao fiksnim faktorima. Podaci za osobine potomstva analizirani su mešovitim modelom analize varijanse gde su tretman, veličina legla, pol, ponavljanje i odgovarajuće interakcije uzete za fiksne faktore, a krmača kao slučajan faktor. U Eksperimentu 1 faktor veličine legla definisan je kao L1 za legla manja od 14, i L2 za legla veća ili jednaka 14 prasadi, obzirom da je 14 bila izračunata medijana za ovu osobinu, dok je u Eksperimentu 2 izračunata medijana iznosila 15, tako da je pod malim leglom (L1) podrazumevano leglo sa manje od 15 prasadi, a pod velikim leglom (L2) leglo sa 15 ili više prasadi. Značajnost razlika testirana je Studentovim t-testom (p<0,05). Kod prasadi analiza je izvedena prema sledećoj formuli: yijklm = µ + Tri + Pj + VLk + Kl(ik) + TrPij + TrVLik + eijklm 64 gde je: yijklm – posmatrana osobina µ - ukupni prosek Tri – efekat i-tog nivoa tretmana (i = 0, 1) Pj – efekat j-tog nivoa ponavljanja (j = 1, 2) VLk – efekat k-tog nivoa veličine legla (k = 1, 2) Kl(ik) – slučajni efekat l-te krmače u okviru i x k-tog nivoa tretmana x veličine legla (l = k,..., gi) TrPij – efekat interakcije tretman x ponavljanje TrVLik – efekat interakcije tretman x veličina legla eijklm – slučajni rezidualni efekat Kod tovljenika analiza je izvedena prema sledećoj formuli: yijklm = µ + Tri + Sj + VLk + Kl(ik) + TrSij + TrVLik + eijklm gde je: yijklm – posmatrana osobina µ - ukupni prosek Tri – efekat i-tog nivoa tretmana (i = 0, 1) Sj – efekat j-tog nivoa pola (j = 1, 2) VLk – efekat k-tog nivoa veličine legla (k = 1, 2) Kl(ik) – slučajni efekat l-te krmače u okviru i x k-tog nivoa tretmana x veličine legla (l = k,..., gi) TrSij – efekat interakcije tretman x pol TrVLik – efekat interakcije tretman x veličina legla eijklm – slučajni rezidualni efekat Broj observacija (n) za sve osobine kod prasadi iznosio je 12 u kontroli i 16 u tretmanu u okviru Eksperimenta 1, odnosno 15-16 u kontroli i 13-14 u tretmanu u okviru 65 Eksperimenta 2. Kod tovljenika, broj observacija (n) za masu na roĎenju bio je 88 u kontroli i 84 u tretmanu u okviru Eksperimenta 1, i 98 u kontroli i 83 u tretmanu u okviru Eksperimenta 2. Klanična masa utvrĎivana je na 30 tovljenika u kontroli i 32 tovljenika u tretmanu u Eksperimentu 1, odnosno 66 tovljenika u kontroli i 52 tovljenika u tretmanu u Eksperimentu 2. Morfološke osobine m. semitendinosus merene su na 16 (kontrola) i 15 tovljenika (tretman) u Eksperimentu 1, odnosno 66 (kontrola) i 52 tovljenika (tretman) u Eksperimentu 2. Histološke osobine mišića utvrĎivane su na 15 tovljenika u kontrolnoj i 14 tovljenika u oglednoj grupi Eksperimenta 1, odnosno 25- 29 tovljenika (kontrola) i 22-23 tovljenika (tretman) u okviru Eksperimenta 2. 66 5. Rezultati 5.1 Histološke i histohemijske analize mišićnog tkiva Različitim histološkim i histoenzimološkim tipovima bojenja uzoraka mišićnog tkiva dobijaju se histološki preparati na kojima se mogu utvrĎivati različite osobine ovog tkiva. Kod prasadi i tovljenika u Eksperimentima 1 i 2 ovog istraţivanja korišćeno je nekoliko tipova bojenja. Kod prasadi se za utvrĎivanje ukupnog broja vlakana koristilo bojenje eozinom. Rezovi mišićnog tkiva isečeni u kriostatu na debljinu 10 µm bojeni su eozinom prema Romeis (1989). Izgled preparata nakon ove vrste bojenja prikazan je na slici 19. Moţe se uočiti pravilna rasporeĎenost mišićnih ćelija, kao i njihova ravnomerna obojenost, bez obzira na veličinu ili tip. Slika 19. Izgled preparata mišićnog tkiva neonatalne prasadi, bojenje eozinom, uveličanje objektiva 10× Za preračunavanje broja primarnih i sekundarnih vlakana kod prasadi korišćeni su preparati tkiva sečeni u kriostatu na debljinu 16 µm i bojeni na miozin ATPazu nakon kisele preinkubacije na pH 4,2 (Guth i Samaha, 1970). Izgled preparata mišićnog tkiva dobijenog nakon ove vrste bojenja prikazan je na slici 20, gde se uočavaju razlike u obojenosti vlakana. Tamno obojena, centralno postavljena vlakna najvećeg prečnika u 67 klasteru su primarna vlakna (P), a vlakna koja nakon bojenja ostaju svetle boje su sekundarna vlakna (S) (slika 20.). Broj primarnih vlakana se dobija brojanjem tamno obojenih vlakana u klasteru, ili brojanjem celih klastera. Broj sekundarnih vlakana preračunava se oduzimanjem broja primarnih od ukupnog broja vlakana. Slika 20. Izgled preparata mišićnog tkiva neonatalne prasadi, bojenje na miozin ATP-azu nakon kisele preinkubacije na pH 4,2, uveličanje objektiva 20× (P – primarna vlakna, S – sekundarna vlakna) Za razliku od prasadi, kod tovljenika je iz svakog mišića uzimano po dva uzorka: jedan uzorak mišićnog tkiva iz tamnog (duboka partija) i jedan uzorak iz svetlog dela mišića (površinska partija) na središnjem – najširem delu mišića. Rezovi tkiva debljine 10 µm sečeni su u kriostatu na temperaturi -20°C. Za bojenje citoplazme i jedara primenjeno je bojenje hematoksilin-eozinom (Romeis, 1989), i na ovako pripremljenim preparatima utvrĎivan je ukupan broj vlakana, površina pojedinačnih vlakana i broj jedara. Izgled preparata mišićnog tkiva tovljenika bojen hematoksilin-eozinom prikazan je na slikama 21a (desno), 21b (desno), 22a (desno) i 22b (desno), gde je na svakoj slici uokvireno po nekoliko jedara mišićnih ćelija. Moţe se uočiti da su sva vlakna na preparatu jednako obojena, i da se tamno obojena jedra nalaze rasporeĎena po obodu svakog vlakna. Klasifikacija vlakana na sporo-okidajuća oksidativna (STO), brzo-okidajuća oksidativna (FTO) i brzo-okidajuća glikolitička (FTG) omogućena je kombinovanim bojenjem na NADH-tetrazolium reduktazu NADH-TR (Novikoff i sar., 1961) i kiselo preinkubiranu ATP-azu na pH 4,2 (Guth i Samaha, 1970). Izgled mišićnog tkiva tovljenika nakon ove vrste bojenja prikazan je na slikama 21a (levo), 21b (levo), 22a (levo) i 22b (levo). Na 68 ovim preparatima uočava se različit intenzitet boje vlakana na osnovu čega se ona razvrstavaju u jedan od tri tipa: najintenzivnije obojena, tamna vlakna su sporo- okidajuća oksidativna STO vlakna; boja srednjeg intenziteta karakteristična je za brzo- okidajuća oksidativna FTO vlakana; dok najmanju koncentraciju boje i time najsvetliji izgled vlakana imaju brzo-okidajuća glikolitička FTG vlakna. Na Slikama 21a i 21b prikazan je preparat istog preseka mišića jedne jedinke histološki bojen na dva različita načina, s tim što su preparati na slici 21a uzeti iz tamnog dela mišića, a preparati na slici 21b iz svetlog dela mišića. Na Slikama 22a i 22b su različito bojeni preparati istog preseka mišića druge jedinke, gde slika 22a prikazuje preparate tamnog dela mišića, a slika 22b preparate svetlog dela mišića. Na ovim slikama moţe se već na prvi pogled uočiti razlika u zastupljenosti pojedinih tipova vlakana u različitim partijama m. semitendinosus-a: u dubokom tamnom delu mišića veoma su zastupljena STO vlakna (slike 21a (levo) i 22a (levo)), dok se u svetlom delu mišića nalazi mali broj STO vlakana, a preovladavaju FTG vlakna (slike 21b (levo) i 22b (levo)). Slika 21a. Preparat tamnog dela mišića m. semitendinosus iste ţivotinje: kombinovano bojenje na NADH- TR i ATP-azu radi utvrĎivanja tipova vlakana (levo), i bojenje hematoksilin-eozinom radi utvrĎivanja površine vlakana i broja jedara (desno), uveličanje objektiva 40× (STO - sporo okidajuća oksidativna; FTO - brzo okidajuća oksidativna; FTG – brzo okidajuća glikolitička mišićna vlakna) 69 Slika 21b. Preparat svetlog dela mišića m. semitendinosus iste ţivotinje: kombinovano bojenje na NADH- TR i ATP-azu radi utvrĎivanja tipova vlakana (levo), i bojenje hematoksilin-eozinom radi utvrĎivanja površine vlakana i broja jedara (desno), uveličanje objektiva 40× (STO - sporo okidajuća oksidativna; FTO - brzo okidajuća oksidativna; FTG – brzo okidajuća glikolitička mišićna vlakna) Slika 22a. Preparat tamnog dela mišića m. semitendinosus iste ţivotinje: kombinovano bojenje na NADH- TR i ATP-azu radi utvrĎivanja tipova vlakana (levo), i bojenje hematoksilin-eozinom radi utvrĎivanja površine vlakana i broja jedara (desno), uveličanje objektiva 40× (STO - sporo okidajuća oksidativna; FTO - brzo okidajuća oksidativna; FTG – brzo okidajuća glikolitička mišićna vlakna) Slika 22b. Preparat svetlog dela mišića m. semitendinosus iste ţivotinje: kombinovano bojenje na NADH- TR i ATP-azu radi utvrĎivanja tipova vlakana (levo), i bojenje hematoksilin-eozinom radi utvrĎivanja površine vlakana i broja jedara (desno), uveličanje objektiva 40× (STO - sporo okidajuća oksidativna; FTO - brzo okidajuća oksidativna; FTG – brzo okidajuća glikolitička mišićna vlakna) 70 5.2 Eksperiment 1 U periodu od 85-og dana gestacije do kraja suprasnosti eksperimentalnoj grupi krmača je u smešu dodavan daidzein u količini 8 mg/kg hraniva. U smešu za ishranu je bila uključena sojina sačma. 5.2.1 Prasad 5.2.1.1 Proizvodne osobine Prosečne vredosti mase prasadi na roĎenju u okviru kontrolne i eksperimentalne grupe, kao i u leglima različite veličine, u okviru kontrolne odnosno eksperimentalne grupe, prikazani su u Tabeli 14. Moţe se videti da je masa prasadi na roĎenju kod potomstva krmača tretiranih daidzeinom (1,32 kg) bila za 100 g veća od mase prasadi netretiranih krmača (1,22 kg). MeĎutim ova razlika nije bila statistički značajna (p=0,2102) (Slika 23). TakoĎe, utvrĎene su brojčane razlike u masi prasadi na roĎenju izmeĎu legala različite veličine kako u okviru kontrolne, tako i u okviru ogledne grupe ţivotinja. Masa prasadi je bila veća kod ţivotinja iz manjih legala (Tabela 14), ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Slika 23). Uticaj tretiranja krmača daidzeinom na masu prasadi pri roĎenju, nije bio statistički značajan (p=0,5224) pri poreĎenju prasadi iz manjih legala kao ni pri poreĎenju prasadi iz većih legala (p=0,2620) (Slika 23). Tabela 14. Masa prasadi na roĎenju u zavisnosti od tretmana i veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 12 16 8 4 12 4 Masa prasadi, kg 1,22±0,05 1,32±0,05 1,32±0,06 1,13±0,08 1,37±0,05 1,26±0,08 71 Slika 23. Nivo statističke značajnosti (p) za masu prasadi u zavisnosti od tretmana i veličine legla 5.2.1.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a U Tabeli 15 prikazan je uticaj tretmana na morfološke osobine m. semitendinosus-a: masu mišića, duţinu mišića, obim mišića i površinu poprečnog preseka mišića kod prasadi. U Tabeli 16 prikazane su srednje vrednosti ovih osobina mišića kod legala različite veličine u okviru kontrolne i tretirane grupe. Tabela 15. Vrednosti morfoloških osobina mišića m. semitendinosus-a u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 12 16 Masa m. semitendinosus, g 2,72±0,16 2,80±0,14 Duţina m. semitendinosus, cm 4,73±0,16 4,97±0,15 Obim m. semitendinosus, cm 3,65±0,13 3,62±0,11 Površina m. semitendinosus, cm2 1,07±0,07 1,05±0,07 Tabela 16. Vrednosti morfoloških osobina mišića m. semitendinosus-a u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 8 4 12 4 Masa m. semitendinosus, g 2,98±0,20 2,54±0,25 2,99±0,14 2,61±0,25 Duţina m. semitendinosus, cm 4,79±0,21 4,68±0,25 5,14±0,15 4,80±0,25 Obim m. semitendinosus, cm 3,78±0,16 3,53±0,19 3,66±0,11 3,58±0,19 Površina m. semitendinosus, cm2 1,14±0,09 1,00±0,11 1,07±0,07 1,03±0,11 Rezultati prikazani u navedenim tabelama ukazuju da tretman krmača daidzeinom nije imao uticaj ni na jednu od posmatranih morfoloških osobina mišića m. semitendinosus-a kod prasadi (Slike 24, 25, 26 i 27). Kao i kod mase prasadi na roĎenju, rezultati posmatranih osobina bili su brojčano veći kod prasadi iz malih legala u odnosu na prasad iz velikih legala, kako u okviru kontrolne, tako i u okviru eksperimentalne grupe 0,2773 0,1064 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,2102 0,2620 0,5224 72 (Tabela 16), ali te razlike nisu bile statistički značajne (Slike 24, 25, 26 i 27). Interakcija tretmana i veličine legla nije imala statistički značajan uticaj na morfološke osobine m. semitendinosus-a (Slike 24, 25, 26 i 27). Slika 24. Nivo statističke značajnosti (p) za masu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 25. Nivo statističke značajnosti (p) za duţinu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 26. Nivo statističke značajnosti (p) za obim m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla 0,7227 0,3567 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,8493 0,8614 0,5696 0,2885 0,7343 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,3220 0,7399 0,2176 0,2285 0,2178 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,8736 0,8612 0,9774 73 Slika 27. Nivo statističke značajnosti (p) za površinu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla 5.2.1.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a Rezultati histoloških analiza strukture mišića m. semitendinosus-a, u zavisnosti od tretiranja krmača daidzeinom tokom faze kasne suprasnosti, prikazani su u Tabelama 17 i 18. Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku m. semitendinosus-a, bio je veći kod prasadi tretiranih krmača (ogledna grupa). Iz Tabele 17 se moţe videti da je ukupan broj vlakana iznosio 352.296 kod kontrolne grupe, i 368.003 kod ogledne grupe prasadi. Od tog broja su kod kontrolne grupe 13.200, a kod ogledne grupe 14.631 činila primarna vlakna, a broj sekundarnih vlakana iznosio je 339.096 kod kontrolne, i 353.372 kod ogledne grupe (Tabela 17). Iako je broj vlakana (ukupan, primarna i sekundarna) bio veći kod eksperimentalne grupe, razlike u ukupnom broju vlakana, odnosno broju pojedinih tipova vlakana izmeĎu kontrolne i eksperimentalne grupe ţivotinja nisu bile statistički značajne (Slike 28, 29 i 30). Tabela 17. Ukupan broj, broj primarnih i broj sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u prasadi u kontrolnoj i tretiranoj grupi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 12 16 Ukupan broj vlakana 352296±18749 368003±16770 Broj primarnih vlakana 13200±762,55 14631±682,04 Broj sekundarnih vlakana 339096±18085 353372±16176 Uticaj veličine legla na vrednosti ukupnog broja vlakana i pojedinih tipova vlakana kod prasadi, kontrolne i tretirane grupe ţivotinja, prikazan je u Tabeli 18. Na Slikama 28, 29 0,7626 0,3817 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,8131 0,8853 0,5454 74 i 30 dati su grafički prikazi značajnosti razlika u pogledu ispitivanih osobina izmeĎu eksperimentalnih grupa i u zavisnosti od veličine legla. Prasad iz malih legala imala su veće vrednosti broja mišićnih vlakana u odnosu na prasad iz većih legala. Ukupan broj vlakana bio je veći kod prasadi iz malih legala, i to za oko 54 000, kod kontrolne grupe. Kod eksperimentalne grupe uticaj veličine legla postoji ali je manji nego kod kontrolne grupe, obzirom da je ukupan broj vlakana kod prasadi iz malog legla eksperimentalne grupe veći za 43 000, u odnosu na prasad iz velikih legala. Ove razlike nisu bile statistički značajne (Slika 28). Veličina legla imala je statistički značajan uticaj na broj primarnih vlakana u okviru kontrolne grupe ţivotinja (p=0,05) (Slika 29), gde je značajno veći broj vlakana ovog tipa utvrĎen u okviru malog legla (15.053) u odnosu na veliko leglo (11.347) (Tabela 18). IzmeĎu malog i velikog legla u okviru tretmana nije bilo razlike u broju primarnih vlakana (Tabela 18, Slika 29). Broj sekundarnih vlakana bio je brojčano veći kod jedinki iz malih legala kako u okviru kontrolne tako i u okviru eksperimentalne grupe, ali razlike nisu bile statistički značajne (Slika 30). Interakcija tretmana i veličine legla nije uticala na posmatrane osobine (Slike 28, 29 i 30). Tabela 18. Ukupan broj, broj primarnih i broj sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 8 12 4 4 Ukupan broj vlakana 379248±23716 325343±29046 389131±16770 346876±29046 Broj primarnih vlakana 15053±964,55 11347±1181,33 14742±682,04 14520±1181.33 Broj sekundarnih vlakana 364196±22876 313996±28018 374389±16176 332355±28018 75 Slika 28. Nivo statističke značajnosti (p) za ukupan broj vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 29. Nivo statističke značajnosti (p) za broj primarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 30. Nivo statističke značajnosti (p) za broj sekundarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Procentualna zastupljenost primarnih vlakana kao i odnos sekundarna:primarna vlakna kod prasadi kontrolne i ogledne grupe prikazani su u Tabeli 19, dok su u Tabeli 20 prikazane ove osobine i u zavisnosti od veličine legla. Kako se moţe videti, procenat primarnih vlakana je bio veoma ujednačen izmeĎu prasadi kontrolne i ogledne (tretman- daidzein) grupe i kretao se od 3,76% kod kontrolne do 3,96% kod tretirane grupe. Odnos sekundarna:primarna vlakna bio je 25,90 kod kontrolne, odnosno 24,75 kod tretirane grupe (Tabela 19). Nije utvrĎen statistički značajan uticaj tretmana na navedene osobine (Slike 31 i 32). Slična procentualna zastupljenost primarnih vlakana i 0,2545 0,2006 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,5553 0,6189 0,7453 0,8764 0,0512 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,2114 0,1063 0,8013 0,2545 0,2006 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,5553 0,6189 0,7453 76 odnos sekundarna:primarna vlakna uočeni su i kod malih i velikih legala u okviru kontrolne odnosno eksperimentalne grupe (Tabela 20). Nisu utvrĎene statistički značajne razlike izmeĎu legala različite veličine u okviru kontrolne i tretirane grupe pojedinačno, kao ni uticaj interakcije tretmana i veličine legla (Slike 31 i 32). Tabela 19. Udeo pojedinih tipova vlakana i odnos sekundrarna:primarna vlakna u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 12 16 Primarna vlakna, % 3,76±0,14 3,96±0,13 Odnos sekundarna:primarna vlakna 25,90±0,99 24,75±0,88 Tabela 20. Udeo pojedinih tipova vlakana i odnos sekundrarna:primarna vlakna u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi 8 12 4 4 Primarna vlakna, % 3,97±0,18 3,56±0,22 3,80±0,13 4,13±0,22 Odnos sekundarna:primarna vlakna 24,33±1,25 27,47±1,53 25,81±0,88 23,64±1,53 Slika 31. Nivo statističke značajnosti (p) za procenat primarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 32. Nivo statističke značajnosti (p) za odnos sekundarna:primarna vlakna u zavisnosti od tretmana i veličine legla 0,2738 0,1638 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,4184 0,1311 0,3710 0,2344 0,1972 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,3293 0,1135 0,4651 77 5.2.2 Tovljenici 5.2.2.1 Proizvodne osobine U Tabeli 21 prikazani su rezultati proizvodnih osobina: masa na roĎenju (početna) i klanična (završna) masa tovljenika. Masa na roĎenju bila je ujednačena (p=0,54) i iznosila je 1,23 kg kod jedinki iz kontrolne grupe, i 1,26 kg kod jedinki iz ogledne grupe. Masa na kraju tova, odnosno masa na klanju varirala je od 103,09 kg u tretiranoj grupi do 108,35 kg kod netretiranih ţivotinja, pri čemu razlika u masi nije bila statistički značajna (p=0,15). Tretiranje suprasnih krmača daidzeinom nije imalo uticaja na masu tovljenika pri klanju. Tabela 21. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika (LSM ± SE) Osobina Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,23±0,03 (88) 1,26±0,04 (84) 0,54 Klanična masa, kg (n) 108,35±2,35 (30) 103,09 ±2,22 (32) 0,15 Ispitivanje uticaja tretmana u okviru malog, odnosno velikog legla, pokazalo je da nema statistički značajnog efekta tretmana ni na masu na roĎenju, ni na klaničnu masu tovljenika kako unutar malog legla, tako ni unutar velikog legla (Tabela 22). Tabela 22. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola Tretman p Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,34±0,05 (41) 1,33±0,04 (55) 0,68 1,11±0,04 (47) 1,20±0,04 (29) 0,24 Klanična masa, kg (n) 110,81±3,14 (17) 105,50±2,35 (23) 0,22 105,88±3,50 (13) 100,69±3,77 (9) 0,35 Ukoliko se posmatra uticaj tretmana na masu na roĎenju i klaničnu masu tovljenika, po polovima, moţe se reći da iako postoje brojčane razlike u srednjim vrednostima za ove osobine izmeĎu jedinki muškog i ţenskog pola, kontrolnih i oglednih ţivotinja, ove razlike ipak nisu statistički značajne (Tabela 23.) Tabela 23. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola Tretman p Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,25±0,04 (42) 1,30±0,06 (23) 0,50 1,21±0,04 (46) 1,22±0,04 (61) 0,84 Klanična masa, kg (n) 110,51±2,82 (15) 105,84±2,66 (15) 0,23 106,18±2,71 (15) 100,35±2,62 (17) 0,13 78 Polazeći od činjenice da tretman kao faktor nije imao statistički značajan efekat na masu na roĎenju i klaničnu masu, ispitan je uticaj veličine legla na ove osobine za sve ţivotinje, bez obzira da li su pripadale kontrolnoj ili oglednoj grupi, i bez obzira kog su bile pola. Prasad iz malog legla imala su veću masu na roĎenju i masu na klanju. UtvrĎena je statistički veoma značajno veća masa na roĎenju (p=0,01), kod prasadi iz malog legla (1,34 kg) u odnosu na prasad iz velikog legla (1,15 kg) (Tabela 24.). Ipak, pri završnom uzrastu tova, odnosno prilikom klanja nije bilo statistički značajne razlike u masi kod ţivotinja iz malog legla u odnosu na ţivotinje iz velikog legla (p=0,18). Tabela 24. Uticaj veličine legla na proizvodne osobine tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo Veliko leglo p Masa na roĎenju, kg (n) 1,34±0,03 (96) 1,15±0,03 (76) 0,01 Klanična masa, kg (n) 108,16±1,96 (40) 103,28±2,57 (22) 0,18 TakoĎe je analiziran uticaj pola kao faktora na masu na roĎenju i klaničnu masu, gde su za poreĎenje uzete sve ţivotinje muškog, odnosno sve ţivotinje ţenskog pola, bez obzira da li su bile tretirane ili netretirane, i da li su poticale iz malog ili velikog legla. UtvrĎen je značajan efekat pola (p=0,02) na klaničnu masu, pri čemu su jedinke muškog pola bile prosečne mase 108,17 kg, a jedinke ţenskog pola 103,27 kg (Tabela 25). Pol kao faktor nije imao efekat na masu ţivotinja na roĎenju. Tabela 25. Uticaj pola na proizvodne osobine tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol Ţenski pol p Masa na roĎenju, kg (n) 1,28±0,04 (65) 1,22±0,03 (107) 0,20 Klanična masa, kg (n) 108,17±1,94 (30) 103,27±1,88 (32) 0,02 5.2.2.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a Rezultati o uticaju tretiranja krmača daidzeinom na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a potomstva prikazani su u Tabeli 26. Tretman nije imao efekat na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, obzirom da su prosečne vrednosti za ove osobine bile gotovo identične kod oglednih i eksperimentalnih 79 ţivotinja: masa mišića se kretala oko 470 g, duţina mišića oko 23 cm, obim mišića oko 21 cm, a površina poprečnog preseka mišića bila je od 35,77 cm2 (kod ţivotinja iz kontrolne grupe) do 37,28 cm 2 (kod eksperimentalnih ţivotinja) (Tabela 26). Tabela 26. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=16) Tretman (n=15) p Masa mišića, g 470,68±30,07 472,15±29,07 0,97 Duţina mišića, cm 23,74±0,72 23,26±0,62 0,64 Obim mišića, cm 21,17±0,57 21,62±0,55 0,60 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 35,77±1,85 37,28±1,77 0,59 IzmeĎu kontrolnih i oglednih ţivotinja je utvrĎena razlika u vrednostima za pojedine morfološke osobine posmatrano zasebno u malom leglu, i zasebno u velikom leglu (Tabela 27), pri čemu su svi parametri bili veći u tretiranoj grupi u okviru malog legla, odnosno manji u tretiranoj grupi velikog legla. MeĎutim, ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 27). Tabela 27. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE, (n) Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=13) Tretman (n=10) p Kontrola (n=3) Tretman (n=5) p Masa mišića, g 463,39±28,78 492,21±31,61 0,54 477,97±52,89 452,09±48,95 0,74 Duţina mišića, cm 23,06±0,63 24,25±0,71 0,28 24,42±1,31 22,26±1,01 0,26 Obim mišića, cm 21,05±0,54 21,99±0,60 0,31 21,29±1,00 21,25±0,92 0,98 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 35,44±1,75 38,56±1,95 0,30 36,10±3,27 35,99±2,96 0,98 TakoĎe, ni interakcija tretmana i pola nije imala efekte na morfološke osobine mišića (Tabela 28). Tretman nije uslovio značajne razlike u vrednostima za pojedine osobine mišića ni u okviru muškog, ni u okviru ţenskog pola. Tabela 28. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=8) p Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Masa mišića, g 449,59±33,80 460,69±32,51 0,82 491,77±32,30 483,61±32,61 (7) 0,86 Duţina mišića, cm 23,01±0,96 22,94±0,81 0,95 24,47±0,87 23,57±0,89 0,48 Obim mišića, cm 21,03±0,65 21,37±0,62 0,71 21,31±0,62 21,88±0,63 0,53 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 35,35±2,14 36,41±2,03 0,73 36,18±2,03 38,15±2,05 0,50 80 Polazeći od činjenice da nije utvrĎen značajan efekat tretmana na masu, duţinu, obim i površinu poprečnog preseka mišića, ispitan je uticaj samo veličine legla kao faktora na ove osobine. Kao i kod klanične mase (Tabela 24), tako ni kod morfoloških osobina mišića nije uočena statistički značajna razlika izmeĎu pojedinih osobina kod ţivotinja iz malog legla u odnosu na ţivotinje iz velikog legla (Tabela 29). Tabela 29. Uticaj veličine legla na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=23) Veliko leglo (n=8) p Masa mišića, g 477,80±21,37 465,03±36,03 0,78 Duţina mišića, cm 23,65±0,47 23,34±0,83 0,76 Obim mišića, cm 21,52±0,40 21,27±0,68 0,77 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 37,00±1,31 36,04±2,21 0,73 Kod jedinki ţenskog pola uočena je brojčano nešto veća masa mišića m. semitendinosus-a (487,69 g) u odnosu na muške ţivotinje (455,14 g) (Tabela 30). Ali ni za ovu, ni za ostale morfološke osobine nije utvrĎena statistički značajna razlika izmeĎu jedinki različitog pola (Tabela 30). Tabela 30. Uticaj pola na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=16) Ţenski pol (n=15) p Masa mišića, g 455,14±23,45 487,69±22,95 0,12 Duţina mišića, cm 22,98±0,63 24,02±0,62 0,21 Obim mišića, cm 21,20±0,45 21,59±0,44 0,35 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 35,88±1,47 37,16±1,44 0,37 5.2.2.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku mišića kretao se od 882.162 vlakana kod kontrolnih jedinki do 1.008.844 vlakana kod tretiranih ţivotinja. Iako je broj vlakana bio veći u eksperimentalnoj grupi za oko 126.700, ova razlika statistički nije potvrĎena kao značajna, kao takoĎe ni razlika (od oko 22.000) u broju vlakana na 1cm2 površine mišića (Tabela 31). Tabela 31. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=14) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 882162±60162 1008844±58793 0,21 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 24756±1592,51 26980±1508,33 0,37 81 Sličan odnos moţe se primetiti i pri poreĎenju kontrolnih i eksperimentalnih jedinki zasebno u okviru malog, odnosno velikog legla. I u okviru malog, i u okviru velikog legla tretirane ţivotinje imale su veće vrednosti za ukupan broj vlakana na poprečnom preseku i broj vlakana na 1cm 2 površine mišića, meĎutim razlike u vrednostima nisu bile statistički značajne (Tabela 32). Tabela 32. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=12) Tretman (n=3) p Kontrola (n=10) Tretman (n=4) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 914048±57877 992206±63045 0,41 850275±106078 1025481±99257 0,29 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 25782±1484,86 26060±1628,31 0,91 23729±2842,71 27900±2539,45 0,34 Pri ispitivanju uticaja tretmana u okviru različitih polova, ustanovljena je tendencija uticaja tretiranja krmača daidzeinom (p=0,07) ka većem ukupnom broju vlakana na poprečnom preseku mišića kod ţivotinja ţenskog pola čije su majke bile tretirane (1.106.724 vlakana) u odnosu na kontrolne ţenke (922.744 vlakana) (Tabela 33). Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku mišića nije se razlikovao kod kontrolnih i eksperimentalnih ţivotinja muškog pola. Pored toga nije primećen statistički značajan efekat tretmana na broj vlakana na 1cm 2 površine mišića kod muških tovljenika. Kod jedinki ţenskog pola, tretiranje krmača daidzeinom dovelo je do većeg broja (za 3.900) vlakana po 1 cm 2. MeĎutim, razlike u odnosu na kontrolnu grupu nisu bile statistički potvrĎene kao značajne (Tabela 33). Tabela 33. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Kontrola (n=7) Tretman (n=7) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 841579±69816 910964±69403 0,49 922744±67278 1106724±66807 0,07 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 24343±1999,2 24891±1920,24 0,85 25168±1893,36 29069±1874,04 0,16 Uticaj veličine legla, kao jedinog faktora, na ukupan broj vlakana i broj vlakana na 1cm2 površine mišića, posmatran je na svim ţivotinjama grupno, bez obzira na pripadnost polu, i bez obzira da li su ţivotinje pripadale kontrolnoj ili oglednoj grupi (obzirom da 82 tretman nije pokazao značajne efekte). Ustanovljeno je da veličina legla nema značajan uticaj na ove dve posmatrane osobine kod tovljenika (Tabela 34). Tabela 34. Uticaj veličine legla na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=22) Veliko leglo (n=7) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 953127±42791,00 937878±72637,00 0,87 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 25921±1101,84 25815±1905,90 0,96 Pri analiziranju uticaja pola kao faktora, na svim ţivotinjama bez obzira na veličinu legla kojoj su muţjaci odnosno ţenke pripadali, i bez obzira na pripadnost kontrolnoj ili eksperimentalnoj grupi, uočena je visoko značajna razlika u ukupnom broju vlakana na poprečnom preseku mišića (p=0,01), koji je bio značajno veći kod ţenskih nego kod muških ţivotinja. Kod ţivotinja muškog pola iznosio je 876.271 vlakana, a kod ţivotinja ţenskog pola 1.014.734 vlakana (Tabela 35). Broj vlakana na 1cm2 površine mišića bio je, takoĎe, brojčano veći kod ţenskih u odnosu na muške ţivotinje, ali ta razlika nije bila statistički značajna. Tabela 35. Uticaj pola na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=14) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 876271±49222,00 1014734±47407,00 0,01 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 24617±1386,01 27119±1331,99 0,14 Ispitivanje uticaja tretmana na površinu pojedinih tipova vlakana pokazalo je brojčano manje vrednosti za sve ispitivane osobine: površinu STO, FTO i FTG vlakana i prosečnu površinu vlakna kod tretiranih ţivotinja u odnosu na netretirane, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 36). Najveću površinu imala su STO vlakna, od 4315,61 µm 2 kod tretiranih do 4654,45 µm 2 kod kontrolnih ţivotinja, a najmanje površine bila su FTG vlakna od 3558,25 µm2 kod eksperimentalnih ţivotina do 3794,77 µm 2 kod kontrolnih. Tabela 36. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=14) p Površina STO vlakna 4654,45±521,77 4315,61±514,72 0,67 Površina FTO vlakna 4360,03±345,76 3778,83±337,52 0,30 Površina FTG vlakna 3794,77±207,82 3558,25±190,03 0,45 Prosečna površina vlakna 4123,80±251,94 3777,13±237,75 0,37 83 Isti odnos izmeĎu tretiranih i netretiranih jedinki moţe se primetiti i u okviru zasebno posmatranog malog, odnosno velikog legla, gde su srednje vrednosti svih posmatranih obeleţja bile manje kod tretiranih ţivotinja u odnosu na kontrolne, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 37). Tabela 37. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=12) Tretman (n=3) p Kontrola (n=10) Tretman (n=4) p Površina STO vlakna 4639,17±507,45 4398,72±547,16 0,76 4669,72±915,66 4232,50±872,00 0,75 Površina FTO vlakna 4174,68±332,23 4100,15±362,23 0,89 4545,38±609,96 3457,50±569,65 0,26 Površina FTG vlakna 3687,13±187,60 3659,00±203,15 0,92 3902,40±375,19 3457,50±321,21 0,42 Prosečna površina vlakna 4024,08±234,10 3921,76±256,57 0,78 4223,52±450,30 3632,50±400,35 0,38 Ukoliko se efekat tretmana posmatra u okviru zasebno muškog, odnosno ţenskog pola, ponovo se uočavaju manje prosečne vrednosti površina svih tipova vlakana kod tretiranih ţivotinja u odnosu na kontrolnu grupu. Ove razlike su brojčano nešto izraţenije kod ţivotinja ţenskog pola, ali ni kod ţenskih ni kod muških ţivotinja nisu statistički značajne (Tabela 38). Tabela 38. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Kontrola (n=7) Tretman (n=7) p Površina STO vlakna 4913,61±584,97 4512,17±587,02 0,63 4395,28±568,27 4119,05±565,23 0,73 Površina FTO vlakna 4526,17±402,68 4189,56±399,83 0,56 4193,89±387,73 3368,10±384,95 0,15 Površina FTG vlakna 3801,98±277,10 3782,54±256,11 0,96 3787,56±259,20 3333,96±256,11 0,23 Prosečna površina vlakna 4234,36±318,59 4051,64±304,77 0,68 4013,24±301,26 3502,62±298,11 0,24 Ukoliko se porede sve ţivotinje poreklom iz malih legala, bez obzira na pol i tretman, sa svim ţivotinjama iz velikih legala, moţe se videti da nije bilo statistički značajnih razlika u prosečnim vrednostima površina STO, FTO i FTG vlakana i prosečnoj površini vlakana (Tabela 39). To ukazuje da veličina legla kao faktor nema uticaja na ispitivane osobine kod tovljenika. Tabela 39. Uticaj veličine legla na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=22) Veliko leglo (n=7) p Površina STO vlakna 4518,94±373,13 4451,11±632,22 0,93 Površina FTO vlakna 4137,42±245,74 4001,44±417,30 0,79 Površina FTG vlakna 3673,07±138,26 3679,65±246,95 0,98 Prosečna površina vlakna 3972,92±173,66 (22) 3928,01±301,27 (7) 0,90 84 MeĎutim, ukoliko se posmatra uticaj pola na navedena obeleţja, uočava se statistički značajno manja površina FTO vlakana kod ţenki (3780,99 µm2) u odnosu na muţjake (4357,86 µm 2 ) (Tabela 40). I ostali tipovi vlakana bili su manje površine kod ţenskih u odnosu na muške jedinke, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 40). Tabela 40. Uticaj pola na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=14) p Površina STO vlakna 4712,89±414.36 4257,16±400,75 0,22 Površina FTO vlakna 4357,86±283,73 3780,99±273,19 0,05 Površina FTG vlakna 3792,26±188,66 3560,76±182,19 0,35 Prosečna površina vlakna 4143,00±220,45 3757,93±211,91 0,15 Rezultati o procentualnoj zastupljenosti pojedinih tipova vlakana u strukturi mišića prikazani su u Tabeli 41. Procentualno su najviše u mišiću bila zastupljena FTG vlakna, negde oko 50% i kod kontrolne i kod ogledne grupe. Oko 30% od ukupnog broja vlakana su činila FTO vlakna, a preostalih 20% činila su STO vlakna (Tabela 41). Tretman nije doveo do statistički značajnih promena u procentualnoj zastupljenosti pojedinih tipova vlakana u odnosu na kontrolnu grupu. Tabela 41. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=14) p STO vlakna, % 20,38±1,32 20,53±1,21 0,94 FTO vlakna, % 27,29±2,07 29,72±1,99 0,44 FTG vlakna, % 51,02±2,09 48,95±1,98 0,51 Sličan odnos izmeĎu pojedinih tipova vlakana primetan je i kod kontrolne i ogledne grupe u okviru zasebno malog, odnosno velikog legla (Tabela 42). U okviru malog legla uočen je nešto malo veći procenat STO vlakana i oko 4% više FTO vlakana kod eksperimentalne grupe, dok je procenat FTG vlakana za oko 5% manji kod tretiranih ţivotinja, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 42). U velikom leglu procenat pojedinih tipova vlakana bio je pribliţno jednak kod kontrolne i eksperimentalne grupe i iznosio oko 22% STO vlakana, oko 26% FTO vlakana i oko 50% FTG vlakana. 85 Tabela 42. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=12) Tretman (n=3) p Kontrola (n=10) Tretman (n=4) p STO vlakna, % 18,45±1,20 19,20±1,30 0,69 22,31±2,39 21,87±2,05 0,89 FTO vlakna, % 28,92±1,96 32,70±2,15 0,26 25,66±3,67 26,74±3,35 0,84 FTG vlakna, % 52,00±1,94 47,32±2,13 0,18 50,04±3,74 50,58±3,33 0,92 Analizirana interakcija pola i tretmana kao faktora nije pokazala značajne efekte na zastupljenost pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus-u tovljenika. Procenat STO vlakana iznosio je oko 20% kod oglednih i kontrolnih ţivotinja kako muškog, tako i ţenskog pola; procenat FTO vlakana kod muţjaka kretao se od 28% kod kontrolnih do 32% kod oglednih ţivotinja, ali ova razlika nije bila statistički značajna, dok je procenat FTG vlakana bio veći kod kontrolne grupe, oko 50%, u odnosu na eksperimentalnu grupu, oko 47% (Tabela 43). Kod ţenskih ţivotinja je i procenat FTO i procenat FTG vlakana bio ujednačen kod kontrolne i ogledne grupe, i iznosio oko 27% FTO vlakana i oko 52% FTG vlakana (Tabela 43). Tabela 43. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Kontrola (n=7) Tretman (n=7) p STO vlakna, % 20,57±1,77 20,80±1,63 0,93 20,19±1,65 20,27±1,63 0,98 FTO vlakna, % 28,12±2,51 31,95±2,45 0,29 26,46±2,39 27,50±2,37 0,76 FTG vlakna, % 49,61±2,64 46,78±2,53 0,45 52,44±2,50 51,12±2,47 0,71 Ispitivanjem uticaja samo veličine legla kao faktora na procentualnu zastupljenost pojedinih tipova vlakana, bez obzira na pol ţivotinja i pripadnost kontrolnoj ili tretiranoj grupi, mogu se uočiti brojčane razlike u procentu STO vlakana, koji je bio veći kod ţivotinja iz velikog legla, oko 22%, u odnosu na ţivotinje iz malog legla oko 19%; takoĎe se razlikovao i procenat FTO vlakana koji je bio veći kod malog legla, oko 31%, a dosta manji kod velikog legla, oko 26% (Tabela 44). Uočene razlike nisu bile statistički značajne. Procenat FTG vlakana bio je pribliţno isti kod jedinki iz malih i velikih legala, oko 50% (Tabela 44). Tabela 44. Uticaj veličine legla na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=22) Veliko leglo (n=7) p STO vlakna, % 18,82±0,88 22,09±1,57 0,15 FTO vlakna, % 30,81±1,45 26,20±2,49 0,19 FTG vlakna, % 49,66±1,44 50,31±2,50 0,83 86 Posmatranjem pola kao faktora, i njegovog uticaja na zastupljenost pojedinih tipova vlakana u mišiću, moţe se uočiti da su STO vlakna bila pribliţno jednako zastupljena kod jedinki različitih polova, oko 20%; FTO vlakna bila su u većem procentu zastupljena kod muţjaka, oko 30%, u odnosu na ţenke gde je FTO vlakana bilo oko 27%; dok je kod muţjaka zabeleţen manji procenat FTG vlakana, oko 48% u odnosu na ţenke gde su FTG vlakna bila zastupljenija, oko 52% (Tabela 45). Ipak, uočene razlike u procentu FTO i FTG vlakana nisu bile statistički značajne. Tabela 45. Uticaj pola na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=14) p STO vlakna, % 20,68±1,20 20,23±1,16 0,77 FTO vlakna, % 30,03±1,75 26,98±1,68 0,12 FTG vlakna, % 48,19±1,83 51,78±1,76 0,11 Dodavanje daidzeina u hranu suprasnih krmača nije imalo efekta na broj jedara po pojedinim tipovima vlakana kod potomstva (Tabela 46). I kod kontrolne i kod ogledne grupe tovljenika uočen je pribliţno jednak broj jedara po jednom STO i po jednom FTG vlaknu, kao i prosečan broj jedara po vlaknu. Jedino je broj jedara po jednom FTO vlaknu bio brojčano manji kod tretiranih jedinki (1,66) u odnosu na kontrolne ţivotinje (2,04), ali ni ova razlika, ni razlike u broju jedara po STO i FTG vlaknu, i prosečnom broju jedara po vlaknu, nisu bile statistički značajne. Tabela 46. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=14) p Broj jedara po STO vlaknu 2,25±0,18 2,07±0,17 0,51 Broj jedara po FTO vlaknu 2,04±0,13 1,66±0,13 0,11 Broj jedara po FTG vlaknu 1,53±0,07 1,55±0,06 0,84 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,82±0,08 1,68±0,08 0,30 Ukoliko se uticaj tretmana ispituje u okviru zasebno malog, a zasebno velikog legla, moţe se uočiti da kod malog legla tretman nije imao efekte ni na jedno od posmatranih obeleţja (Tabela 47), dok je kod velikog legla postojao jak trend (p=0,06) smanjenja broja jedara po jednom FTO vlaknu pod uticajem tretmana. Kod kontrolnih ţivotinja zabeleţeno je 2,34 jedra po jednom FTO vlaknu, a kod eksperimentalnih je broj jedara po jednom FTO vlaknu iznosio 1,52 (Tabela 47). Ostale posmatrane osobine (broj 87 jedara po STO i FTG vlaknu, prosečan broj jedara po vlaknu) nisu se statistički značajno razlikovale kod ţivotinja iz velikog legla pod uticajem tretmana (Tabela 47). Tabela 47. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=12) Tretman (n=3) p Kontrola (n=10) Tretman (n=4) p Broj jedara po STO vlaknu 2,22±0,17 2,08±0,18 0,61 2,27±0,32 2,05±0,29 0,63 Broj jedara po FTO vlaknu 1,74±0,13 1,80±0,14 0,78 2,34±0,23 1,52±0,22 0,06 Broj jedara po FTG vlaknu 1,35±0,06 1,51±0,07 0,15 1,71±0,12 1,58±0,11 0,49 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,63±0,08 1,70±0,08 0,58 2,00±0,15 1,67±0,13 0,17 Ukoliko se uticaj tretmana ispituje u okviru pola, moţe se zaključiti da dodavanje daidzeina suprasnim krmačama nije imalo efekta na broj jedara po pojedinim tipovima vlakana kod potomaka muţjaka, dok je kod ţenki jedino broj jedara po FTO vlaknu imao jaku tendenciju smanjenja (p=0,06) kod oglednih ţivotinja (Tabela 48). Ostali parametri, ni kod ţenskih ţivotinja nisu bili značajno promenjeni pod uticajem tretmana. Tabela 48. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Kontrola (n=7) Tretman (n=7) p Broj jedara po STO vlaknu 2,27±0,23 2,08±0,22 0,56 2,22±0,22 2,05±0,22 0,59 Broj jedara po FTO vlaknu 2,08±0,16 1,73±0,15 0,13 2,01±0,15 1,59±0,15 0,06 Broj jedara po FTG vlaknu 1,52±0,09 1,57±0,08 0,67 1,53±0,08 1,52±0,08 0,91 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,84±0,11 1,72±0,10 0,42 1,80±0,10 1,65±0,10 0,31 Ispitivanje uticaja veličine legla kod svih ţivotinja zajedno, bez obzira na pripadnost polu i kontrolnoj ili oglednoj grupi, na broj jedara po pojedinim tipovima vlakana pokazalo je da ovaj faktor nije značajnije uticao ni na jednu od posmatranih osobina (Tabela 49). Jedino je broj jedara po FTG vlaknu imao tendenciju povećanja (p=0,09) sa povećanjem veličine legla (Tabela 49). Tabela 49. Uticaj veličine legla na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo(n=22) Veliko leglo (n=7) p Broj jedara po STO vlaknu 2,15±0,12 2,16±0,22 0,98 Broj jedara po FTO vlaknu 1,77±0,09 1,93±0,16 0,43 Broj jedara po FTG vlaknu 1,43±0,05 1,64±0,08 0,09 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,67±0,06 1,83±0,10 0,22 88 Uticaj pola kao jedinog faktora nije bio izraţen na broj jedara po STO, FTO i FTG vlaknu, kao ni na prosečan broj jedara po jednom vlaknu, obzirom da su zabeleţene skoro jednake vrednosti datih osobina kod muţjaka i kod ţenki (Tabela 50). Tabela 50. Uticaj pola na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=14) p Broj jedara po STO vlaknu 2,17±0,16 2,14±0,15 0,85 Broj jedara po FTO vlaknu 1,90±0,11 1,80±0,11 0,37 Broj jedara po FTG vlaknu 1,55±0,06 1,53±0,06 0,82 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,78±0,07 1,72±0,07 0,55 Površina pojedinih tipova vlakana po jednom jedru nije se značajno menjala pod uticajem tretmana (Tabela 51). Površina STO vlakna po jednom jedru bila je gotovo identična kod kontrolnih i oglednih ţivotinja, oko 482 µm2. Površina FTO vlakna po jednom jedru bila je nešto veća kod kontrolnih (470,11 µm2) u odnosu na ogledne ţivotinje (441,80 µm2), dok je površina FTG vlakna po jednom jedru bila veća kod tretiranih ţivotinja (439,78 µm2) u odnosu na kontrolnu grupu (405,20 µm2). Prosečna površina vlakna po jednom jedru neznatno je varirala, a razlike u posmatranim osobinama izmeĎu kontrolne i eksperimentalne grupe nisu bile statistički značajne (Tabela 51). Tabela 51. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=14) p Površina STO vlakna po jedru 482,51±24,47 481,20±22,63 0,97 Površina FTO vlakna po jedru 470,11±18,37 441,80±16,83 0,32 Površina FTG vlakna po jedru 405,20±25,45 439,78±25,09 0,39 Prosečna površina vlakna po jedru 443,50±16,19 450,08±15,55 0,78 Slično tome, tretman nije imao značajne efekte na površine pojedinih tipova vlakana po jednom jedru ni u okviru zasebno malog odnosno velikog legla. Kao i kod efekta tretmana grupno na sve ţivotinje, tako je i izmeĎu kontrolnih i oglednih ţivotinja u okviru malog legla, i u okviru velikog legla, površina STO vlakna po jednom jedru bila skoro jednaka, dok su kod drugih osobina zabeleţene brojčane razlike izmeĎu kontrole i tretmana, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 52). 89 Tabela 52. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=12) Tretman (n=3) p Kontrola (n=10) Tretman (n=4) p Površina STO vlakna po jedru 477,69±22,31 475,64±24,30 0,95 487,33±44,03 486,75±38,18 0,99 Površina FTO vlakna po jedru 423,18±16,61 435,60±18,01 0,64 517,05±33,14 448,00±28,44 0,19 Površina FTG vlakna po jedru 373,50±24,73 420,56±26,69 0,27 436,90±44,68 459,00±42,49 0,74 Prosečna površina vlakna po jedru 411,63±15,30 437,41±16,78 0,32 475,37±28,75 462,75±26,18 0,76 Tretman nije imao statistički značajne efekte na površine pojedinih tipova vlakana po jednom jedru ni u okviru pola (Tabela 53). Najveće brojčane razlike zabeleţene su u površini FTO vlakana po jednom jedru kod muţjaka gde su kontrolne ţivotinje imale za oko 50 µm 2 veću površinu ovog tipa vlakna po jedru u odnosu na eksperimentalne jedinke, dok je kod ţenki površina FTG vlakna po jednom jedru bila za isto toliko - oko 50 µm 2 veća kod oglednih u odnosu na kontrolne ţivotinje (Tabela 53). Ipak, ni ove razlike nisu bile statistički značajne. Tabela 53. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=8) Tretman (n=7) p Kontrola (n=7) Tretman (n=7) p Površina STO vlakna po jedru 461,50±32,08 467,68±30,01 0,89 503,52±30,11 494,71±29,76 0,84 Površina FTO vlakna po jedru 464,26±24,42 411,63±22,62 0,13 475,97±22,86 471,98±22,59 0,90 Površina FTG vlakna po jedru 406,91±28,62 423,84±28,70 0,68 403,50±27,78 455,71±27,63 0,20 Prosečna površina vlakna po jedru 441,61±19,71 429,64±19,22 0,67 445,39±18,79 470,53±18,62 0,35 IzmeĎu jedinki poreklom iz malog i jedinki poreklom iz velikog legla, bez obzira na pol i pripadnost kontrolnoj odnosno oglednoj grupi, nisu uočene statistički značajne razlike u površini pojedinih tipova vlakana po jednom jedru (Tabela 54). Zabeleţena je jedino tendencija (p=0,10) povećanja površine FTO vlakna po jedru sa povećanjem veličine legla. Tabela 54. Uticaj veličine legla na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=22) Veliko leglo (n=7) p Površina STO vlakna po jedru 476,67±16,49 487,04±29,14 0,77 Površina FTO vlakna po jedru 429,39±12,25 482,52±21,84 0,10 Površina FTG vlakna po jedru 397,03±18,19 447,95±30,83 0,23 Prosečna površina vlakna po jedru 424,52±11,35 469,06±19,44 0,12 Statističkom analizom uticaja pola na površinu pojedinih tipova vlakana po jednom jedru, utvrĎeno je da ovaj faktor nije imao efekta na posmatrana obeleţja, obzirom da 90 brojčane razlike koje su zabeleţene po pojedinim osobinama izmeĎu jedinki različitog pola, nisu bile statistički značajne (Tabela 55). Tabela 55. Uticaj pola na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=14) p Površina STO vlakna po jedru 464,59±21,96 499,12±21,17 0,22 Površina FTO vlakna po jedru 437,95±16,65 473,97±16,07 0,11 Površina FTG vlakna po jedru 415,38±20,26 429,61±19,59 0,43 Prosečna površina vlakna po jedru 435,62±13,77 457,96±13,22 0,15 91 5.3 Eksperiment 2 Od 85-og dana gestacije eksperimentalnoj grupi krmača je u smešu za ishranu dodavan čist, sintetički daidzein u količini 1 mg po kg telesne mase dnevno. Za razliku od Eksperimenta 1, smeše za ishranu krmača u Eksperimentu 2 nisu sadrţale soju. 5.3.1 Prasad 5.3.1.1 Proizvodne osobine Rezultati o masi prasadi na roĎenju u okviru kontrolne i ogledne grupe, kao i u malom i velikom leglu pojedinačno u kontrolnoj i tretiranoj grupi ţivotinja dati su u Tabeli 56. Masa prasadi u kontrolnoj grupi iznosila je 1,28 kg, a masa prasadi u eksperimentalnoj grupi bila je 1,26 kg, i nije se statistički značajno razlikovala od kontrolne (p=0,8117) (Slika 33). Kako u okviru kontrolne, tako i u okviru ogledne grupe zabeleţena je veća masa prasadi kod jedinki iz malih legala (Tabela 56). Tako je u okviru kontrolne grupe masa na roĎenju bila za oko 180 g veća kod prasadi iz malih legala u odnosu na prasad iz velikih legala, ali ova razlika nije bila statistički značajna (p=0,1757). U okviru ogledne grupe statistički značajno veća masa na roĎenju uočena je kod prasadi iz malog legla (p=0,018) (Slika 33). Uticaj tretmana u okviru malog legla nije bio statistički značajan (p=0,5260), kao takoĎe ni u okviru velikog legla (p=0,2814). Tabela 56. Masa prasadi na roĎenju u zavisnosti od tretmana i veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 16 14 6 10 6 6 Masa prasadi, kg 1,28±0,06 1,26±0,07 1,37±0,10 1,19±0,07 1,47±0,10 1,05±0,09 92 Slika 33. Nivo statističke značajnosti (p) za masu prasadi u zavisnosti od tretmana i veličine legla 5.3.1.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a Rezultati o uticaju tretiranja suprasnih krmača daidzeinom na morfološke osobine m. semitendinosus-a: masu mišića, duţinu mišića, obim mišića i površinu poprečnog preseka mišića kod prasadi prikazani su u Tabeli 57. Kao što se moţe videti, tretman nije imao uticaj na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a, o čemu svedoče i grafički prikazi znanačajnosti razlika na Slikama 34, 35, 36 i 37 (posebno za svaku osobinu). Masa mišića varirala je od 2,63 g kod ogledne do 2,77 g kod kontrolne grupe, duţina mišića bila je ujednačena kod obe grupe, oko 4,80 cm, obim mišića bio je u rasponu od 3,40 cm kod eksperimentalne do 3,53 cm kod kontrolne grupe, a površina poprečnog preseka mišića bila je 0,93 cm2 kod ogledne i 1 cm 2 kod kontrolne grupe. Tabela 57. Vrednosti morfoloških osobina mišića m. semitendinosus-a u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 16 14 Masa m. semitendinosus, g 2,77±0,20 2,63±0,22 Duţina m. semitendinosus, cm 4,81±0,12 4,80±0,14 Obim m. semitendinosus, cm 3,53±0,12 3,40±0,14 Površina m. semitendinosus, cm2 1,00±0,07 0,93±0,07 Odnos izmeĎu malog i velikog legla uočen za masu prasadi na roĎenju, primetan je i kod morfoloških osobina mišića, gde su za sve posmatrane osobine kako u okviru 0,0180 0,1757 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,8117 0,2814 0,5260 93 kontrolne tako i u okviru tretirane grupe, zabeleţene veće vrednosti pojedinih osobina kod ţivotinja iz manjih legala (Tabela 58). Iako je brojčana razlika u vrednostima pojedinih osobina u okviru kontrolne grupe bila uočljiva, ona nije bila statistički značajna (Slike 34, 35, 36 i 37). MeĎutim, u okviru eksperimentalne grupe registrovan je statistički značajan uticaj veličine legla. Statistički značajno manja masa (p=0,0508) i duţina mišića (p=0,0484) bila je kod velikog legla u odnosu na ţivotinje iz malog legla, dok se za obim i površinu mišića mogao konstatovati jak trend smanjenja vrednosti sa povećanjem legla (Slike 34, 35, 36 i 37). Uticaj veličine legla na morfološke osobine mišića, posmatran unutar kontrolne i ogledne grupe prasadi nije bio statistički značajan (Slike 34, 35, 36 i 37). Tabela 58. Vrednosti morfoloških osobina mišića m. semitendinosus-a u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 6 6 10 8 Masa m. semitendinosus, g 2,94±0,32 2,60±0,24 3,15±0,32 2,11±0,30 Duţina m. semitendinosus, cm 4,86±0,20 4,77±0,15 5,13±0,20 4,48±0,19 Obim m. semitendinosus, cm 3,73±0,20 3,34±0,15 3,68±0,20 3,13±0,19 Površina m. semitendinosus, cm2 1,11±0,10 0,90±0,08 1,08±0,10 0,80±0,10 Slika 34. Nivo statističke značajnosti (p) za masu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla 0,0508 0,4251 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,6498 0,2438 0,6601 94 Slika 35. Nivo statističke značajnosti (p) za duţinu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 36. Nivo statističke značajnosti (p) za obim m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 37. Nivo statističke značajnosti (p) za površinu m. semitendinosus-a u zavisnosti od tretmana i veličine legla 5.3.1.3 Histološke osobine m. semitendinsus-a Rezultati histoloških merenja broja vlakana u m. semitendinosus-u, u zavisnosti od dodavanja daidzeina u hranu suprasnih krmača, prikazani su u Tabeli 59. Ukupan broj 0,0781 0,1355 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,4909 0,4158 0,8330 0,0879 0,1621 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,5131 0,4212 0,8639 0,0484 0,7097 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,9390 0,2603 0,3801 95 mišićnih vlakana i broj sekundarnih vlakana bili su veći kod kontrolne u odnosu na tretiranu grupu. Broj primarnih vlakana bio je veći kod eksperimentalnih ţivotinja (Tabela 59). Iako je kod kontrolne grupe bilo za oko 50 hiljada više mišićnih vlakana u odnosu na oglednu grupu, ova razlika nije bila statistički značajna (Slika 38). Slično je i za razlike u broju primarnih i sekundarnih mišićnih vlakana (Slike 39 i 40). Tabela 59. Ukupan broj, broj primarnih i broj sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 15 13 Ukupan broj vlakana 458267±29587 409373±32359 Broj primarnih vlakana 14496±679,09* 15435±870.41 Broj sekundarnih vlakana 442777±29077 393938±31811 *Broj ispitivane prasadi je iznosio 16 Uticaj veličine legla na ove osobine prikazan je u Tabeli 60. Za sve tri osobine broja vlakana zabeleţene su znatno veće vrednosti kod malih legala u odnosu na velika legla, kako u okviru kontrolne, tako i u okviru eksperimentalne grupe ţivotinja. Razlike u ukupnom broju, broju primarnih i broju sekundarnih vlakana izmeĎu malog i velikog legla u okviru ogledne grupe nisu bile statistički značajne (Slike 38, 39 i 40). MeĎutim, ukupan broj vlakana (p=0,0391) i broj sekundarnih vlakana (p=0,0414) bili su statistički značajno veći kod malih legala, dok je kod broja primarnih vlakana uočen jak trend (p=0,0744) povećanja sa smanjenjem veličine legla (slike 38, 39 i 40). Interakcije tretmana i veličine legla nisu bile statistički značajne za posmatrane osobine (Slike 38, 39, 40). Tabela 60. Ukupan broj, broj primarnih i broj sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 5 10 5 8 Ukupan broj vlakana 533189±48545 383345±33836 454342±48545 364403±42800 Broj primarnih vlakana 15919±1088,96* 13073±811,67 16966±1405,85 13904±1026.69 Broj sekundarnih vlakana 515281±47664 370272±33316 437376±47664 350499±42142 *Broj ispitivane prasadi je iznosio 6 96 Slika 38. Nivo statističke značajnosti (p) za ukupan broj vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 39. Nivo statističke značajnosti (p) za broj primarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 40. Nivo statističke značajnosti (p) za broj sekundarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Rezultati o strukturi m. semitendinosus-a, izraţeni kroz procentualnu zastupljenost primarnih vlakana i odnos sekundarna:primarna vlakna, prikazani su u Tabeli 61. U okviru tretirane grupe zabeleţen je veći procenat primarnih vlakana 3,80%, u odnosu na kontrolnu grupu gde je iznosio 3,38%, a shodno tome je i odnos sekundarna:primarna vlakna bio veći kod kontrolne (29,05) u poreĎenju sa eksperimentalnom grupom (25,67) (Tabela 61). Ipak, razlike u vrednostima za ove posmatrane osobine nisu bile statistički značajne (Slike 41 i 42). 0,2143 0,0414 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,2944 0,7237 0,2857 0,1220 0,0744 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,4230 0,5455 0,5744 0,2072 0,0391 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,3016 0,7387 0,2885 97 Tabela 61. Udeo pojedinih tipova vlakana i odnos sekundrarna:primarna vlakna u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Broj prasadi (n) 15 13 Primarna vlakna, % 3,38±0,22 3,80±0,24 Odnos sekundarna:primarna vlakna 29,05±1,76 25,67±1,92 Rezultati ispitivanja uticaja veličine legla u okviru kontrole, odnosno u okviru tretmana, su pokazali da je u obe grupe veći procenat primarnih vlakana i time manji odnos sekundarna:primarna vlakna bio kod velikog legla (Tabela 62), ali razlike u vrednostima nisu bile statistički značajne (Slike 41 i 42). TakoĎe nije uočena statistička značajnost efekta tretmana na posmatrane osobine ni u okviru malog legla, ni u okviru velikog legla (Slike 41 i 42). Tabela 62. Udeo pojedinih tipova vlakana i odnos sekundrarna:primarna vlakna u m. semitendinosus-u u kontrolnoj i tretiranoj grupi prasadi u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Broj prasadi (n) 5 10 5 8 Primarna vlakna, % 3,32±0,35 3,45±0,25 3,71±0,35 3,88±0,32 Odnos sekundarna:primarna vlakna 29,50±2,86 28,61±2,03 26,31±2,86 25,04±2,57 Slika 41. Nivo statističke značajnosti (p) za procenat primarnih vlakana u zavisnosti od tretmana i veličine legla Slika 42. Nivo statističke značajnosti (p) za odnos sekundarna:primarna vlakna u zavisnosti od tretmana i veličine legla 0,7517 0,8085 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,2354 0,3116 0,4569 0,7410 0,7626 KONTROLA TRETMAN Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo 0,2404 0,3310 0,4488 98 5.3.2 Tovljenici 5.3.2.1 Proizvodne osobine Rezultati proizvodnih osobina tovljenika: mase na roĎenju i klanične mase, u zavisnosti od ishrane suprasnih krmača, prikazani su u Tabeli 63. Masa na roĎenju bila je skoro potpuno ista kod kontrolnih i oglednih ţivotinja i iznosila je 1,28 kg. Ni klanična masa tovljenika nije se značajno razlikovala izmeĎu kontrolne grupe gde je iznosila 114,22 kg, i ogledne grupe gde je prosečno iznosila 115,70 kg. Tabela 63. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,28±0,05 (98) 1,28±0,06 (83) 0,98 Klanična masa, kg (n) 114,22±1,27 (66) 115,70±1,42 (52) 0,46 Ishrana suprasnih krmača daidzeinom nije ispoljila efekat ni posmatrano zasebno u malom, odnosno u velikom leglu. Masa jedinki na roĎenju iznosila je 1,37 kg u kontrolnoj, odnosno 1,39 kg u eksperimentalnoj grupi malog legla, a u okviru velikog legla bila je nešto veća kod kontrolnih ţivotinja 1,18 kg, u odnosu na eksperimentalne 1,16 kg (Tabela 64). Razlike u masi izmeĎu kontrolne i ogledne grupe kako u okviru malog, tako i u okviru velikog legla nisu bile statistički značajne. Klanična masa tretiranih i kontrolnih ţivotinja poreklom iz malog legla bila je gotovo identična, oko 115kg, dok je kod ţivotinja iz velikog legla tretman uslovio blago povećanje klanične mase od 116,60 kg, u odnosu na kontrolne ţivotinje – 113,17 kg (Tabela 64). Ova razlika u masi ipak nije bila statistički značajna. Tabela 64. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola Tretman p Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,37±0,08 (30) 1,39±0,08 (28) 0,84 1,18±0,06 (68) 1,16±0,07 (55) 0,84 Klanična masa, kg (n) 115,27±2,00 (26) 114,81±1,97 (24) 0,87 113,17±1,55 (40) 116,60±1,92 (28) 0,21 Tretman nije ispoljio uticaj u okviru pola, pa ni kod ţivotinja muškog pola, ni kod ţivotinja ţenskog pola, nije ustanovljena statistički značajna razlika u masi na roĎenju i klaničnoj masi izmeĎu kontrolnih i eksperimentalnih ţivotinja (Tabela 65). 99 Tabela 65. Uticaj tretmana na proizvodne osobine tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola Tretman p Kontrola Tretman p Masa na roĎenju, kg (n) 1,30±0,06 (46) 1,26±0,07 (41) 0,67 1,25±0,05 (52) 1,29±0,06 (42) 0,60 Klanična masa, kg (n) 118,35±1,57 (28) 119,82±1,92 (25) 0,55 110,09±1,45 (38) 111,59±1,65 (27) 0,49 Polazeći od činjenice da tretman nije imao značajan uticaj na masu na roĎenju i klaničnu masu, sve ţivotinje, bez obzira na pol, podvrgnute su analizi uticaja veličine legla. Rezultati su prikazani u Tabeli 66. Ova analiza pokazala je da veličina legla ima značajan uticaj na ove dve osobine. Statistički značajno (p=0,02) manja masa na roĎenju izmerena je kod ţivotinja iz velikog legla (1,17 kg) u odnosu na ţivotinje iz malog legla (1,38 kg) (Tabela 66). Ustanovljena razlika kod klanične mase izmeĎu jedinki iz legala različite veličine nije bila statistički značajna. Tabela 66. Uticaj veličine legla na proizvodne osobine tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo Veliko leglo p Masa na roĎenju, kg (n) 1,38±0,06 (58) 1,17±0,05 (123) 0,02 Klanična masa, kg (n) 115,04±1,40 (50) 114,88±1,24 (68) 0,94 Uticaj pola na proizvodne osobine bio je upravo suprotan: kod prasadi muškog i ţenskog pola nije bilo razlike u masi na roĎenju, ali je razlika u klaničnoj masi tovljenika različitog pola bila veoma visoko statistički značajna (p<0,0001), pri čemu je bila veća kod muţjaka i iznosila 119,08 kg, u odnosu na ţivotinje ţenskog pola kod kojih je iznosila 110,84 kg (Tabela 67). Tabela 67. Uticaj pola na proizvodne osobine tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol Ţenski pol p Masa na roĎenju, kg (n) 1,28±0,05 (87) 1,27±0,04 (94) 0,82 Klanična masa, kg (n) 119,08±1,24 (53) 110,84±1,10 (65) <0,0001 5.3.2.2 Morfološke osobine m. semitendinosus-a Rezultati ispitivanja uticaja dodavanja daidzeina suprasnim krmačama na masu, duţinu, obim i površinu poprečnog preseka mišića dati su u Tabeli 68. Jedino je masa mišića bila za nekih 10 g veća kod tretiranih ţivotinja u odnosu na jedinke iz kontrolne grupe, 100 ali ova razlika nije bila statistički značajna. Duţina mišića bila je gotovo ista kod kontrolne i ogledne grupe, oko 22,5 cm; takoĎe je i obim mišića bio pribliţno jednak kod obe grupe, oko 19,5cm; a površina mišića varirala je od 30,59 cm2 kod kontrolne, do 31,16 cm 2 kod eksperimentalne grupe ţivotinja (Tabela 68). Razlike u vrednostima za pojedine osobine izmeĎu kontrolne i tretirane grupe ţivotinja nisu bile statistički značajne. Tabela 68. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=66) Tretman (n=52) p Masa mišića, g 439,25±8,91 450,34±10,01 0,44 Duţina mišića, cm 22,44±0,22 22,53±0,24 0,80 Obim mišića, cm 19,53±0,31 19,74±0,35 0,66 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 30,59±1,00 31,16±1,12 0,71 Tretman nije imao značajne efekte kako u okviru malog, tako ni u okviru velikog legla. Za sve posmatrane osobine nije bilo statistički značajnih razlika izmeĎu kontrolnih i eksperimentalnih ţivotinja (Tabela 69). Masa mišića je bila brojčano nešto veća kod tretiranih ţivotinja iz velikog legla 456,53 g, u odnosu na sve ostale grupe gde je bila ujednačena oko 440g; duţina mišića bila je oko 22,5 cm, a obim oko 19,5 cm kod svih grupa, dok je površina poprečnog preseka mišića iznosila oko 30,5 cm2 i kod kontrolne i kod eksperimentalne grupe, kako u malom, tako i u velikom leglu. Tabela 69. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=26) Tretman (n=24) p Kontrola (n=40) Tretman (n=28) p Teţina mišića, g 439,82±14,06 444,15±13,85 0,83 438,69±10,89 456,53±13,51 0,34 Duţina mišića, cm 22,62±0,34 22,43±0,33 0,69 22,27±0,26 22,63±0,33 0,41 Obim mišića, cm 19,41±0,49 19,69±0,49 0,69 19,65±0,38 19,79±0,47 0,83 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 30,31±1,58 30,99±1,56 0,77 30,86±1,22 31,34±1,52 0,81 Ujednačene vrednosti za posmatrane osobine zabeleţene su i kod kontrolnih i eksperimentalnih ţivotinja u okviru muškog i ţenskog pola. Unutar polova tretman nije ispoljio značajan uticaj. Tako ni kod muţjaka, ni kod ţenki nisu uočene statistički značajne razlike u teţini, duţini, obimu i površini poprečnog preseka mišića izmeĎu kontrolne i ogledne grupe ţivotinja (Tabela 70). 101 Tabela 70. Uticaj tretmana na morfološke osobine mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=28) Tretman (n=25) p Kontrola (n=38) Tretman (n=27) p Teţina mišića, g 427,42±11,01 451,15±13,48 0,18 451,08±10,18 449,52±11,58 0,92 Duţina mišića, cm 22,16±0,27 22,39±0,34 0,60 22,73±0,25 22,68±0,29 0,89 Obim mišića, cm 19,11±0,37 19,59±0,45 0,42 19,95±0,35 19,90±0,40 0,93 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 29,26±1,20 30,67±1,45 0,46 31,91±1,12 31,66±1,27 0,88 Polazeći od činjenice da tretman nije imao efekat na morfološke osobine mišića, sve ţivotinje grupisane su prema pripadnosti malom odnosno velikom leglu, a bez obzira na pol i tretman. Rezultati su prikazani u Tabeli 71. Ovom analizom utvrĎeno je da veličina legla novoroĎene prasadi, kao faktor, nije imala uticaja na masu, duţinu, obim i površinu poprečnog preseka mišića kod tovljenika i da su sve osobine imale skoro iste vrednosti kod jedinki iz malog i kod jedinki iz velikog legla: teţina mišića bila je oko 442 g kod ţivotinja iz malog i oko 447 g kod ţivotinja iz velikog legla; duţina mišića u oba legla bila je oko 22,5 cm, obim mišića oko 19,5 cm, a površina poprečnog preseka mišića oko 31 cm2 i kod malog i kod velikog legla, te nije bilo statistički značajnih razlika izmeĎu legala različite veličine (Tabela 71). Tabela 71. Uticaj veličine legla na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=50) Veliko leglo (n=68) p Teţina mišića, g 441,98±9,87 447,61±8,68 0,68 Duţina mišića, cm 22,52±0,24 22,45±0,21 0,82 Obim mišića, cm 19,55±0,35 19,72±0,30 0,72 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 30,65±1,11 31,10±0,97 0,76 MeĎutim, ispitivanje uticaja pola kao faktora na morfološke osobine mišića pokazalo je da osim mase mišića gde nije bilo statistički značajne razlike izmeĎu jedinki muškog (439,29 g) i ţenskog pola (450,30 g), za sve ostale osobine – duţinu (p=0,08), obim (p=0,06) i površinu poprečnog preseka mišića (p=0,06) postojala je jaka tendencija povećanja vrednosti kod jedinki ţenskog pola (Tabela 72). Tabela 72. Uticaj pola na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=53) Ţenski pol (n=65) p Teţina mišića, g 439,29±8,70 450,30±7,71 0,25 Duţina mišića, cm 22,27±0,22 22,70±0,19 0,08 Obim mišića, cm 19,35±0,29 19,92±0,26 0,06 Površina poprečnog preseka mišića, cm2 29,96±0,94 31,79±0,85 0,06 102 5.3.2.3 Histološke osobine m. semitendinosus-a Rezultati histoloških merenja broja mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića m. semitendinosus, kod tovljenika, u zavisnosti od ishrane suprasnih krmača dodatkom daidzeina, prikazani su u Tabeli 73. Ukupan broj mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića bio je manji kod ogledne u odnosu na kontrolnu grupu ţivotinja i kretao se od 996.788 kod oglednih ţivotinja do 1.013.157 kod kontrolnih jedinki, a broj vlakana na 1cm 2 površine mišića varirao je od 30.492 kod tretiranih do 30.585 kod kontrolnih ţivotinja (Tabela 73). Statistički efekat tretmana na ove osobine nije potvrĎen, obzirom da razlike u vrednostima izmeĎu dve posmatrane grupe nisu bile statistički značajne (Tabela 73). Tabela 73. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=27) Tretman (n=23) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 1013157±43106 996788±54557 0,83 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 30585±1403,78 30492±1750,59 0,97 Rezultati ispitivanja uticaja tretmana, u okviru zasebno malog odnosno velikog legla, prikazani su u Tabeli 74. Moţe se uočiti razlika u ukupnom broju vlakana izmeĎu kontrolne i ogledne grupe i kod malog, i kod velikog legla. Kod malog legla tretirana grupa ţivotinja imala je za oko 57.000 veći broj vlakana u odnosu na kontrolnu, dok je kod velikog legla broj vlakana kod tretiranih ţivotinja bio manji za oko 90.000 nego kod jedinki iz kontrolne grupe, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 74). Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića kretao se u istom pravcu, i bio veći kod tretiranih (31.210) u odnosu na kontrolne ţivotinje (28.472) u okviru malog legla, a u velikom leglu bio je veći kod kontrolnih (32.698) nego kod eksperimentalnih ţivotinja (29.773) (Tabela 74). Ipak, ni za ovu osobinu nisu zabeleţene statistički značajne razlike u vrednostima izmeĎu pojedinih grupa. Tabela 74. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=16) Tretman (n=13) p Kontrola (n=11) Tretman (n=10) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 942328±55902 999752±66141 0,55 1083986±64659 993824±75082 0,43 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 28472±1869,87 31210±2080,23 0,40 32698±2067,75 29773±2578,41 0,44 103 Ukoliko se uticaj tretmana ispituje u okviru svakog pola zasebno, moţe se uočiti da su tretirane ţivotinje muškog pola imale za skoro 90.000 veći ukupan broj vlakana na poprečnom preseku i za oko 4.000 veći broj vlakana na 1cm2 površine mišića u odnosu na kontrolne ţivotinje, ali ove razlike u broju vlakana nisu bile statistički značajne (tabela 75). Suprotno, kod ţenki je uočena tendencija smanjenja broja vlakana kod tretiranih ţivotinja, obzirom da je u tretiranoj grupi ţivotinja ukupan broj vlakana na poprečnom preseku bio za oko 122.000 manji nego kod kontrolnih, dok je broj vlakana na 1cm 2 površine mišića bio manji za oko 4.000 (tabela 75). Tabela 75. Uticaj tretmana na broj mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=10) Tretman (n=5) p Kontrola (n=17) Tretman (n=18) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 1035388±67691 1124655±96152 0,45 990926±53391 868921±50701 0,11 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 30629±1965,76 34546±2762,69 0,25 30542±1622,02 26437±1694,21 0,09 Pošto nije uočen efekat tretmana na broj vlakana na poprečnom preseku i broj vlakana na 1cm 2 površine mišića, ţivotinje su grupisane prema pripadnosti malom odnosno velikom leglu, bez obzira na pol i tretman, i izvršena analiza uticaja veličine legla kao faktora na ove osobine. Rezultati su pokazali da iako izmeĎu malog i velikog legla postoje numeričke razlike u prosečnim vrednostima za obe posmatrane osobine, ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 76). Tabela 76. Uticaj veličine legla na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=29) Veliko leglo (n=21) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 971040±43300,00 1038905±49543,00 0,35 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 29841±1398,55 31236±1652,56 0,55 MeĎutim, poreĎenje prema polu kao jedinom faktoru, bez obzira na veličinu legla i tretman, pokazalo je statistički značajne razlike izmeĎu muţjaka i ţenki, gde je ukupan broj vlakana na poprečnom preseku kod muţjaka bio za 150.000, a broj vlakana na 1cm 2 površine mišića za oko 4.000 veći nego kod ţenki (Tabela 77). Nivoi značajnosti 104 razlika za ova dva obeleţja izmeĎu dve posmatrane grupe jedinki prikazani su u Tabeli 77. Tabela 77. Uticaj pola na broj mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=35) p Ukupan broj vlakana na poprečnom preseku 1080022±58795,00 929923±36814,00 0,04 Broj vlakana na 1cm 2 površine mišića 32588±1695,34 28489±1172,74 0,03 Rezultati merenja površine različitih tipova vlakana prikazani su u tabeli 78. Moţe se uočiti neznatno veća površina STO, FTO i prosečna površina vlakna kod tretiranih ţivotinja u odnosu na netretirane, dok je površina FTG vlakna bila manja kod tretiranih jedinki u poreĎenju sa kontrolnim ţivotinjama. Ipak, zabeleţene razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 78). Tabela 78. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=29) Tretman (n=23) p Površina STO vlakna 3785,88±223,88 3853,48±281,45 0,64 Površina FTO vlakna 3256,22±188,13 3493,10±238,38 0,49 Površina FTG vlakna 3357,31±178,56 3329,42±226,69 0,93 Prosečna površina vlakna 3398,73±180,58 3437,20±227,91 0,90 Tretman nije imao efekata ni u okviru pojedinačno posmatranog malog, odnosno velikog legla (Tabela 79). MeĎutim, iako razlike u posmatranim osobinama nisu bile statistički značajne, u Tabeli 79 moţe se videti da su eksperimentalne ţivotinje iz malog legla imale brojčano manje prosečne vrednosti za površine svih tipova vlakana pojedinačno, dok su, obrnuto, u velikom leglu zabeleţene veće vrednosti za površine svih tipova vlakana kod tretiranih ţivotinja. Tebela 79. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=18) Tretman (n=13) p Kontrola (n=11) Tretman (n=10) p Površina STO vlakna 4103,61±297,90 3712,65±331,62 0,45 3468,16±331,23 3994,31±426,45 0,40 Površina FTO vlakna 3608,06±246,49 3513,36±282,71 0,82 2904,38±281,33 3472,83±353,42 0,30 Površina FTG vlakna 3548,87±233,10 3201,26±269,28 0,40 3165,74±267,68 3457,58±334,32 0,54 Prosečna površina vlakna 3645,75±238,40 3344,76±269,42 0,46 3151,72±268,64 3529,64±341,58 0,45 105 Slični odnosi uočavaju se i pri ispitivanju uticaja tretmana u okviru zasebno muških, a zasebno ţenskih ţivotinja. Kod muţjaka su površine svih tipova vlakana bile manje kod tretiranih ţivotinja, mada razlike u srednjim vrednostima nisu bile statistički značajne (Tabela 80). Suprotno muţjacima, kod ţenki su upravo tretirane ţivotinje imale sve tipove vlakana veće površine u odnosu na kontrolne, pri čemu je razlika u površini FTO vlakana bila statistički značajna (p=0,03), dok razlike izmeĎu vrednosti površine STO, FTG i prosečne površine vlakna nisu bile statistički značajne (Tabela 80). Tabela 80. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=11) Tretman (n=5) p Kontrola (n=18) Tretman (n=18) p Površina STO vlakna 3853,38±289,63 3493,99±414,30 0,48 3718,39±249,85 4212,97±276,15 0,19 Površina FTO vlakna 3277,07±255,62 3052,82±370,80 0,62 3235,37±215,89 3933,38±231,49 0,03 Površina FTG vlakna 3297,25±245,27 2842,05±356,77 0,30 3417,36±206,25 3816,78±219,54 0,19 Prosečna površina vlakna 3372,65±239,66 2969,94±345,46 0,34 3424,82±204,41 3904,46±222,51 0,12 Rezultati analize uticaja veličine legla na površinu pojedinih tipova vlakana, bez obzira na pol ţivotinja i tretman, prikazani su u Tabeli 81. Moţe se uočiti da su površine svih tipova vlakana bile veće kod ţivotinja iz malog legla: površina STO vlakna bila je veća za oko 170 µm 2, površina FTO vlakna za oko 370 µm2, površina FTG vlakna za oko 65 µm 2 veća u odnosu na veliko leglo, a time je i prosečna površina vlakna kod ţivotinja iz malog legla bila veća u odnosu na eksperimentalne jedinke, i to za oko 155 µm2. Uticaj legla kao faktora nije potvrĎen jer ove razlike nisu bile statistički značajne ni za jednu posmatranu osobinu (Tabela 81). Tabela 81. Uticaj veličine legla na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=31) Veliko leglo (n=21) p Površina STO vlakna 3908,13±222,89 3731,23±269,99 0,64 Površina FTO vlakna 3560,71±187,54 3188,61±225,86 0,28 Površina FTG vlakna 3375,06±178,08 3311,66±214,14 0,83 Prosečna površina vlakna 3495,26±179,88 3340,68±217,28 0,61 Kao i kod morfoloških osobina mišića (Tabela 72) i broja vlakana u okviru mišića (Tabela 77), tako je i kod površina pojedinih tipova vlakana uočen uticaj pola na ove osobine (Tabela 82). Površina STO, FTO i FTG vlakana i prosečna površina vlakna bile 106 su veće kod jedinki ţenskog pola. Površina STO vlakna bila je za oko 300 µm2 veća kod ţenki u odnosu na muţjake, ali ova razlika nije bila statistički značajna, za površinu FTO vlakna uočena je tendencija (p=0,09) povećanja kod ţenki, dok su površina FTG vlakna (p=0,03) i prosečna površina vlakna (p=0,03) bile statistički značajno veće kod ţivotinja ţenskog pola u odnosu na muţjake (Tabela 82). Tabela 82. Uticaj pola na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=16) Ţenski pol (n=36) p Površina STO vlakna 3673,69±252,75 3965,68±186,20 0,27 Površina FTO vlakna 3164,94±225,19 3584,37±158,27 0,09 Površina FTG vlakna 3069,65±216,47 3617,07±150,61 0,03 Prosečna površina vlakna 3171,30±210,23 3664,64±151,07 0,03 Uticaj tretmana na procentualnu zastupljenost pojedinih tipova vlakana u ukupnom broju prikazan je u Tabeli 83. Učešće STO vlakana u ukupnom broju vlakana kod kontrolnih ţivotinja bilo je 17,81%, a kod eksperimentalnih 16,20%, a razlika izmeĎu ove dve vrednosti nije bila statistički značajna. Procenat FTO vlakana bio je statistički značajno manji (p=0,05) kod tretiranih ţivotinja (17,23%) u odnosu na kontrolne (20,71%), dok se na račun smanjenja procenta STO i FTO vlakana kod eksperimentalne grupe značajno povećao (p=0,05) procenat FTG vlakana (66,54%) u odnosu na kontrolnu grupu gde je zabeleţeno 61,44% (Tabela 83). Tabela 83. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=29) Tretman (n=23) p STO vlakna, % 17,81±0,64 16,20±0,82 0,22 FTO vlakna, % 20,71±0,65 17,23±0,85 0,05 FTG vlakna, % 61,44±0,94 66,54±1,22 0,05 Sličan efekat tretmana primetan je i ako se posmatra zasebno malo, a zasebno veliko leglo. Ni kod malog, ni kod velikog legla, procenat STO vlakana nije bio značajno promenjen pod dejstvom tretmana kod eksperimentalne grupe u odnosu na kontrolnu, mada su nešto niţe vrednosti zabeleţene kod tretiranih ţivotinja (Tabela 84). Procenat FTO vlakana je i kod malog, i kod velikog legla imao tendenciju smanjenja kod tretiranih ţivotinja, tako da je kod malog legla zabeleţeno 21,06% FTO vlakana kod 107 kontrolnih i 17,60% FTO vlakana kod tretiranih ţivotinja, dok je u okviru velikog legla učešće FTO vlakana kod kontrole bilo 20,36% a kod ogledne grupe 16,87% (Tabela 84). Procenat FTG vlakana bio je povećan kod tretiranih jedinki, s tim što zabeleţeno povećanje od oko 3,5% u okviru malog legla nije bilo statistički značajno, dok je u okviru velikog legla uočena jaka tendencija (p=0,06) ka povećanju učešća FTG vlakana kod ogledne grupe (67,96%) u odnosu na kontrolnu grupu (61,28%) (Tabela 84). Tabela 84. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=18) Tretman (n=13) p Kontrola (n=11) Tretman (n=10) p STO vlakna, % 17,34±0,81 17,29±0,98 0,97 18,28±0,97 15,11±1,17 0,13 FTO vlakna, % 21,06±0,81 17,60±1,03 0,08 20,36±1,01 16,87±1,17 0,11 FTG vlakna, % 61,60±1,17 65,11±1,48 0,16 61,28±1,44 67,96±1,68 0,06 Ispitivanje uticaja tretmana u okviru zasebno muškog, i zasebno ţenskog pola, pokazalo je značajne efekte ove interakcije na procentualnu zastupljenost pojedinih tipova vlakana (Tabela 85). Jedino procenat STO vlakana kod muţjaka nije bio značajno promenjen pod uticajem tretmana. Kod ţenki je uočena jaka tendencija (p=0,07) smanjenja učešća STO vlakana kod tretiranih (16,73%) u odnosu na netretirane jedinke (18,78). Procenat FTO vlakana bio je 20,15% kod muţjaka iz kontrolne grupe, i statistički veoma značajno niţi (p=0,01) kod tretiranih muških ţivotinja gde je iznosio 15,41%. Kod ţenki je tretman ispoljio jaku tendenciju (p=0,06) smanjenja procentualnog učešća FTO vlakana u ukupnom broju vlakana. Procenat FTG vlakana bio je pod uticajem tretmana značajno povećan (p=0,03) kod muţjaka, i veoma značajno povećan (p=0,01) kod ţenki. Kod ţivotinja oba pola je učešće FTG vlakana bilo za oko 5% veće kod tretiranih u odnosu na netretirane ţivotinje (Tabela 85). 108 Tabela 85. Uticaj tretmana na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=11) Tretman (n=5) p Kontrola (n=18) Tretman (n=18) p STO vlakna, % 16,84±0,93 15,66±1,36 0,48 18,78±0,76 16,73±0,78 0,07 FTO vlakna, % 20,15±1,01 15,41±1,50 0,01 21,27±0,81 19,06±0,79 0,06 FTG vlakna, % 63,07±1,44 68,80±2,15 0,03 59,81±1,17 64,27±1,13 0,01 Rezultati ispitivanja samo uticaja veličine legla na ove osobine strukture mišića prikazani su u Tabeli 86. Veličina legla kao jedini ispitivani faktor, bez obzira na pol i pripadnost ţivotinja kontrolnoj ili tretiranoj grupi, nije imala značajan uticaj na procentualno učešće pojedinih tipova vlakana u ukupnom broju. Procenat STO vlakana kretao se oko 17% kod oba legla, procenat FTO vlakana iznosio je oko 19%, a procenat FTG vlakana oko 64% (Tabela 86). Tabela 86. Uticaj veličine legla na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=31) Veliko leglo (n=21) p STO vlakna, % 17,32±0,64 16,69±0,76 0,55 FTO vlakna, % 19,33±0,66 18,62±0,77 0,51 FTG vlakna, % 63,36±0,94 64,62±1,11 0,42 Rezultati ispitivanja samo uticaja pola na ove sobine strukture mišića prikazani su u Tabeli 87. Ispitivanje uticaja pola kao jedinog faktora, bez obzira na veličinu legla iz kog su ţivotinje potekle, i pripadnost kontrolnoj ili oglednoj grupi, pokazalo je veoma značajne efekte ovog faktora na posmatrane osobine. Najjači uticaj pol je ispoljio na procenat FTG vlakana, koji je kod muţjaka iznosio 65,94% a kod ţenki 62,04%, a razlika u dobijenim vrednostima bila je veoma statistički značajna (p=0,01) (Tabela 87). Procentualna zastupljenost FTO vlakana bila je veća kod ţenki (20,17%) u odnosu na muţjake (17,78%), što je takoĎe bila statistički značajna razlika (p=0,03). Procentualna zastupljenost STO vlakana bila je nešto veća kod jedinki ţenskog pola (17,76%) u odnosu na muţjake (16,25%), ali ova razlika nije bila statistički značajna (Tabela 87). 109 Tabela 87. Uticaj pola na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana na poprečnom preseku mišića tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=16) Ţenski pol (n=29) p STO vlakna, % 16,25±0,82 17,76±0,54 0,12 FTO vlakna, % 17,78±0,90 20,17±0,57 0,03 FTG vlakna, % 65,94±1,29 62,04±0,81 0,01 Rezultati ispitivanja uticaja tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima vlakana i prosečnom broju jedara po jednom vlaknu prikazani su u Tabeli 88. Sva posmatrana obeleţja bila su veoma ujednačena kod kontrolne i eksperimentalne grupe, tako da je broj jedara po STO vlaknu varirao od 1,86 kod kontrole, do 1,90 kod ogledne grupe, broj jedara po FTO vlaknu kretao se od 1,53 kod kontrolnih do 1,60 kod oglednih ţivotinja, broj jedara po FTG vlaknu bio je 1,52 kod kontrole i 1,50 kod ogledne grupe, dok je prosečan broj jedara po jednom vlaknu bio gotovo identičan kod obe grupe (Tabela 88). Razlike u prosečnim vrednostima izmeĎu kontrolne i ogledne grupe za sve posmatrane osobine nisu bile statistički značajne. Tabela 88. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=25) Tretman (n=22) p Broj jedara po STO vlakanu 1,86±0,12 1,90±0,14 0,86 Broj jedara po FTO vlakanu 1,53±0,06 1,60±0,07 0,49 Broj jedara po FTG vlakanu 1,52±0,05 1,50±0,06 0,86 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,57±0,04 1,58±0,05 0,93 Nisu uočene statistički značajne razlike kod tretiranih ţivotinja u odnosu na kontrolne, ni u okviru pojedinačno ispitivanog malog legla, ni u okviru velikog legla (Tabela 89). Osim broja jedara po jednom STO vlaknu, koji je kod malog legla bio brojčano niţi kod tretiranih ţivotinja (1,85) u odnosu na kontrolne (1,96), ostale osobine imale su gotovo identične vrednosti kod obe posmatrane grupe. Kod ţivotinja iz velikog legla, tretirane ţivotinje su imale numerički veći broj jedara po jednom STO (1,95) i po jednom FTO vlaknu (1,59) u odnosu na kontrolne (1,76 i 1,46, pojedinačno), ali ni ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 89). 110 Tabela 89. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=12) p Kontrola (n=10) Tretman (n=10) p Broj jedara po STO vlakanu 1,96±0,15 1,85±0,17 0,65 1,76±0,17 1,95±0,21 0,55 Broj jedara po FTO vlakanu 1,59±0,07 1,61±0,08 0,88 1,46±0,88 1,59±0,10 0,41 Broj jedara po FTG vlakanu 1,55±0,06 1,57±0,07 0,81 1,49±0,07 1,44±0,08 0,86 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,61±0,06* 1,63±0,07 0,90 1,54±0,07 1,54±0,07 0,99 *broj ţivotinja n=14 Uticaj tretmana kod muških i kod ţenskih jedinki bio je različit. Kod ţivotinja muškog pola, tretman je uslovio smanjenje broja jedara po svim tipovima vlakana, a time i prosečan broj jedara po jednom vlaknu, mada zabeleţene razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 90). Kod ţenskih ţivotinja uočen je suprotan efekat tretmana, koji je uslovio povećanje broja jedara po jednom STO vlaknu sa 1,85 kod kontrolne na 2,03 kod ogledne grupe; broj jedara po FTO vlaknu povećao se sa 1,50 kod kontrolnih na 1,70 kod eksperimentalnih ţivotinja; broj jedara po FTG vlaknu bio je 1,52 kod kontrole i 1,61 kod eksperimentalne grupe; a prosečan broj jedara po jednom vlaknu zabeleţen kod kontrolnih jedinki bio je 1,56, a kod oglednih 1,69 (Tabela 90). IzmeĎu tretiranih i netretiranih ţivotinja ţenskog pola statistički značajna razlika zabeleţena je u broju jedara po jednom FTO vlaknu (p=0,04), što je uticalo i na tendenciju (p=0,11) povećanja prosečnog broja jedara po jednom vlaknu pod uticajem tretmana (Tabela 90). Tabela 90. Uticaj tretmana na broj jedara po pojedinim tipovima mišĎićnih vlakana tovljenika u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=10) Tretman (n=5) p Kontrola (n=15) Tretman (n=17) p Broj jedara po STO vlaknu 1,87±0,15 1,76±0,21 0,67 1,85±0,13 2,03±0,14 0,35 Broj jedara po FTO vlaknu 1,55±0,08 1,49±0,11 0,67 1,50±0,07 1,70±0,07 0,04 Broj jedara po FTG vlaknu 1,52±0,07 1,40±0,10 0,37 1,52±0,06 1,61±0,05 0,30 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,59±0,07 1,47±0,10 0,34 1,56±0,06* 1,69±0,05 0,11 * broj ţivotinja n=14 111 Veličina legla kao jedini ispitivani faktor, bez obzira na pol ţivotinja i pripadnost kontrolnoj ili oglednoj grupi, nije imala statistički značajan uticaj na posmatrane osobine (Tabela 91), mada se kod ţivotinja iz velikog legla mogla uočiti brojčano manja prosečna vrednost svih posmatranih obeleţja u odnosu na jedinke poreklom iz malih legala. Tabela 91. Uticaj veličine legla na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=27) Veliko leglo (n=20) p Broj jedara po STO vlaknu 1,90±0,11 1,85±0,14 0,78 Broj jedara po FTO vlaknu 1,60±0,05 1,53±0,06 0,44 Broj jedara po FTG vlaknu 1,56±0,05 1,46±0,05 0,25 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,62±0,04* 1,54±0,05 0,27 *broj ţivotinja n=26 TakoĎe nije bilo statistički značajnih razlika u broju jedara po pojedinim tipovima vlakana i prosečnom broju jedara po jednom vlaknu, izmeĎu ţivotinja različitog pola (Tabela 92). Ipak, za sve posmatrane osobine primetne su brojčano veće vrednosti kod ţivotinja ţenskog pola (Tabela 92). Tabela 92. Uticaj pola na broj jedara po pojedinim tipovima mišićnih vlakana tovljenika, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=32) p Broj jedara po STO vlaknu 1,82±0,13 1,94±0,10 0,38 Broj jedara po FTO vlaknu 1,52±0,07 1,60±0,05 0,29 Broj jedara po FTG vlaknu 1,46±0,06 1,56±0,04 0,16 Prosečan broj jedara po vlaknu 1,53±0,06 1,63±0,04* 0,16 * broj ţvotinja n=31 Površine STO, FTO i FTG vlakana i prosečna površina vlakna po jednom jedru nisu se značajno menjale pod uticajem tretmana, iako se mogu uočiti nešto niţe vrednosti za sve posmatrane osobine kod tretiranih u odnosu na kontrolne ţivotinje (Tabela 93). Tabela 93. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Kontrola (n=25) Tretman (n=22) p Površina STO vlakna po jedru 500,68±15,42 495,67±18,96 0,85 Površina FTO vlakna po jedru 490,60±17 467,61±20,89 0,46 Površina FTG vlakna po jedru 472,60±16,71 467,26±20,53 0,85 Prosečna površina vlakna po jedru 481,54±15,10 472,10±18,51 0,72 112 Rezultati ispitivanja uticaja tretmana na površine pojedinih tipova vlakana i prosečnu površinu vlakna po jednom jedru, posmatrano zasebno u okviru malog, i zasebno u okviru velikog legla prikazani su u Tabeli 94. U malom leglu, primetne su nešto veće vrednosti svih obeleţja kod tretiranih u odnosu na kontrolne ţivotinje, ali ove razlike u prosečnim vrednostima izmeĎu dve grupe nisu bile statistički značajne. U okviru velikog legla, ţivotinje iz tretirane grupe imale su brojčano manje vrednosti svih posmatranih osobina u poreĎenju sa kontrolnim jedinkama, ali ove razlike nisu bile statistički značajne (Tabela 94). Tabela 94. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru u zavisnosti od veličine legla, LSM ± SE Malo leglo Veliko leglo Osobina Kontrola (n=15) Tretman (n=12) p Kontrola (n=10) Tretman (n=10) p Površina STO vlakna po jedru 481,03±19,37 502,11±23,38 0,54 520,33±23,62 489,23±26,02 0,44 Površina FTO vlakna po jedru 464,25±21,35 469,69±25,77 0,88 516,95±26,04 465,53±28,68 0,28 Površina FTG vlakna po jedru 454,77±20,98 510,28±25,32 0,19 490,43±25,59 424,24±28,19 0,18 Prosečna površina vlakna po jedru 460,92±18,91 501,86±22,82 0,26 502,16±23,06 442,33±25,40 0,18 Ukoliko se uticaj tretmana na površine pojedinih tipova vlakana i prosečnu površinu vlakna po jednom jedru posmatra u okviru svakog od polova, mogu se uočiti relativno mala variranja u prosečnim vrednostima pojedinih osobina izmeĎu kontrolne i eksperimentalne grupe ţivotinja, kako kod muţjaka, tako i kod ţenki (Tabela 95), pa ni kod jedne od osobina nisu zabeleţene statistički značajne razlike izmeĎu posmatranih grupa. Tabela 95. Uticaj tretmana na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru u zavisnosti od pola, LSM ± SE Muški pol Ţenski pol Osobina Kontrola (n=10) Tretman (n=5) p Kontrola (n=15) Tretman (n=17) p Površina STO vlakna po jedru 508,83±23,62 506,71±33,29 0,96 492,53±19,37 484,62±17,99 0,77 Površina FTO vlakna po jedru 498,87±26,04 488,98±36,68 0,13 482,34±21,35 446,23±19,83 0,90 Površina FTG vlakna po jedru 481,77±25,59 495,00±36,05 0,77 463,43±20,98 439,53±19,49 0,41 Prosečna površina vlakna pojedru 489,82±23,06 496,65±32,49 0,86 473,26±18,91 447,54±17,56 0,33 Rezultati poreĎenja površina pojedinih tipova vlakana i prosečne površine vlakna po jednom jedru kod ţivotinja iz malog sa jedinkama iz velikog legla, bez obzira na pol i tretman, prikazani su u Tabeli 96. Površina STO i FTO vlakna po jednom jedru bila je manja kod ţivotinja iz malog legla, dok je površina FTG vlakna i prosečna površina vlakna po jednom jedru bila veća kod jedinki iz malog legla u odnosu na ţivotinje iz 113 velikog legla. Ipak, razlike u prosečnim vrednostima posmatranih osobina izmeĎu legala različite veličine nisu bile statistički značajne (Tabela 96). Tabela 96. Uticaj veličine legla na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Malo leglo (n=27) Veliko leglo (n=20) p Površina STO vlakna po jedru 491,57±15,18 504,78±17,57 0,59 Površina FTO vlakna po jedru 466,97±16,73 491,24±19,37 0,39 Površina FTG vlakna po jedru 482,53±16,44 457,34±19,03 0,37 Prosečna površina vlakna po jedru 481,39±14,82 472,24±17,15 0,70 Pol kao jedini ispitivani faktor, bez obzira na pripadnost ţivotinja malom ili velikom leglu, kontrolnoj ili tretiranoj grupi, nije imao značajnije efekte na površinu pojedinih tipova vlakana i prosečnu površinu vlakna po jednom jedru (Tabela 97). Ipak, sve posmatrane osobine bile su brojčano niţe kod jedinki ţenskog pola u odnosu na muţjake. Površina STO vlakna po jednom jedru kretala se od 488,58 µm2 kod ţenki do 507,77 µm 2 kod muţjaka; površina FTO vlakna bila je kod ţenki 464,28 µm2 a kod muţjaka 493,93 µm2; površina FTG vlakna po jednom jedru bila je 451,48 µm2 kod ţenskih ţivotinja i 488,38 µm2 kod ţivotinja muškog pola, a prosečna površina vlakna po jednom jedru iznosila je 493,24 µm 2 kod muţjaka u odnosu na 460,40 µm2 kod ţenki (Tabela 97). Tabela 97. Uticaj pola na površinu (µm2) pojedinih tipova mišićnih vlakana tovljenika po jednom jedru, LSM ± SE Osobina Muški pol (n=15) Ţenski pol (n=32) p Površina STO vlakna po jedru 507,77±20,41 488,58±13,22 0,43 Površina FTO vlakna po jedru 493,93±22,49 464,28±14,57 0,11 Površina FTG vlakna po jedru 488,38±22,11 451,48±14,32 0,17 Prosečna površina vlakna po jedru 493,24±19,92 460,40±12,90 0,17 114 6. Diskusija Osnovni cilj rada je bio da se ispita da li izoflavon soje, daidzein, dodat u obrok suprasnih krmača tokom kasne faze graviditeta, ima uticaja na povećanje mase prasadi pri roĎenju i na kraju tova, morfološku i mikroskopsku strukturu i porast skeletnih mišića potomaka. Pored daidzeina, praćen je i uticaj veličine legla i pola (kod tovljenika) na navedene osobine. Istraţivanje je sprovedeno u dva zasebna eksperimenta. U Eksperimentu 1, krmače su hranjene smešom u koju je bila uključena sojina sačma, a od 85og dana gestacije dodavan je sintetički daidzein u količini 8 mg/kg hraniva. U Eksperimentu 2, krmače su hranjene smešom koja nije sadrţala ni soju ni proizvode od soje, tako da kontrolna grupa krmača nije uopšte dobijala daidzein tokom čitavog perioda suprasnosti, dok je oglednoj grupi krmača od 85og dana gestacije čist sintetički daidzein aplikovan u količini 1 mg/kg telesne mase. Zbog razlika u postavkama Eksperimenata 1 i 2, rezultati dobijeni u svakom od njih nisu meĎusobno poreĎeni. Dobijeni rezultati, i u Eksperimentu 1 i u Eksperimentu 2, su pokazali da masa prasadi pri roĎenju nije bila pod uticajem dodavanja daidzeina u obrok majki. Ukoliko je posmatran samo uzorak muške prasadi, na kojem su kasnije obavljanje i histološke analize mišića prasadi, moţe se zaključiti da različiti tretmani u Eksperimentu 1, i u Eksperimentu 2 nisu uticali na masu muške prasadi na roĎenju (Slika 43). Ovi rezultati nisu u skladu sa rezultatima koje su dobili Liu i sar. (1999) i Ren i sar. (2001), koji su ustanovili povećanje mase muške prasadi pri roĎenju kao posledicu ishrane majki uz dodatak daidzeina. 115 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Slika 43. Masa prasadi na roĎenju, ţrtvovane za histološke analize (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Liu i sar. (1999) navode da je daidzein, izoflavon prisutan u velikoj količini u zrnu soje i drugih leguminoza. Strukturno je sličan estrogenima sisara. Ovi autori su ustanovili da ishrana suprasnih krmača sa obrocima u koje je bio dodat daidzein, dovodi do poboljšanja pre i post-natalnog porasta novoroĎene muške prasadi. Ren i sar. (2001) su ispitujući uticaj dodavanja daidzeina u hranu suprasnih krmača od 85. dana gestacije, ustanovili da je daidzein doveo do značajnog povećanja mase na roĎenju kod muške prasadi i da je ispoljio uticaj na fetalni rast, dok kod prasadi ţenskog pola nije imao uticaj na porast mase na roĎenju. Ovi autori izveli su zaključak da je daidzein preko povećane ekspresije IGF I receptora u mišiću imao stimulativan uticaj na porast. U istraţivanju Ren i sar. (2001), doze daidzeina su bile slične kao u Eksperimentu 1 ovog istraţivanja. Rezultati Eskperimenta 1, u kome su krmače takoĎe imale soju uključenu u obrok, i uz to dobijale sintetički daidzein, pokazuju da je kod eksperimentalne grupe prasadi muškog pola masa bila nešto veća (1,32 kg) u odnosu na kontrolnu prasad (1,22 kg), ali ova razlika nije potvĎena kao statistički značajna. Proširivanje uzorka i statistička analiza podataka za svu prasad koja su ušla u tov (n=172 u Eksperimentu 1, i n=181 u Eksperimentu 2) potvrdili su nalaze dobijene samo 116 za mušku prasad, da tretman daidzeinom nije uticao na masu prasadi na roĎenju (Slika 44). 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Eksperiment 1 Eksperiment 2 Slika 44. Masa na roĎenju sve prasadi obuhvaćene istraţivanjem (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Slične konstatacije, o odsustvu uticaja daidzeina, su utvrĎene i za telesnu masu na kraju tova, koja se nije značajno razlikovala izmeĎu tovljenika kontrolne i eksperimentalne grupe, kako u Eksperimentu 1, tako i u Eksperimentu 2 (Slika 45). 90 95 100 105 110 115 120 125 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Eksperiment 1 Eksperiment 2 Slika 45. Klanična masa na kraju tova, svih ţivotinja obuhvaćenih istraţivanjem (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Nasuprot daidzeinu, veličina legla ispitivana kao jedini faktor, imala je veći efekat na masu prasadi pri roĎenju (Slika 46). Ovi rezultati su u skladu sa onima koje navode 117 Town i sar. (2004), koji su ustanovili veću telesnu masu kod prasadi, kada je broj prasadi u materici bio smanjen jednostranim podvezivanjem jajovoda. Kod velikih legala, izmeĎu prasadi postoji veoma izraţeno takmičenje (kompeticija) za hranom u materici majki, tako da je snabdevanje plodova hranljivim materijama teţe nego kada je broj prasadi manji. Do sličnih konstatacija su došli i Perre i Etienne (2000), i Quiniou i sar. (2002). 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Eksperiment 1 Eksperiment 2 Slika 46. Masa sve prasadi na roĎenju u zavisnosti od veličine legla (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Interakcija tretmana i veličine legla, nije imala uticaj na masu prasadi na roĎenju kod uzorka koji je obuhvatio svu prasad koja su ušla u tov. MeĎutim, posmatrano na uzorku samo muške prasadi (n=12) koja su kasnije korišćena za histološke analize, u Eksperimentu 2 je uočen statistički značajan uticaj (p=0,02) daidzeina na masu prasadi iz legala različite veličine (Slika 47). Ovakav rezultat mogao bi potvrditi nalaze Ren i sar. (2001) koji izveštavaju o stimulatornim efektima daidzeina na masu muške prasadi na roĎenju. 118 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Slika 47. Masa prasadi na roĎenju, ţrtvovane za histološke analize, u zavisnosti od tretmana i veličine legla (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Rehfeldt i Kuhn (2006) pokazali su da razlike u masi koje postoje izmeĎu različitih teţinskih grupa kod novoroĎene prasadi, imaju isti trend i kod odraslih ţivotinja na kraju tova. Uočeni uticaj veličine legla na masu prasadi na roĎenju, nije zabeleţen kod klanične mase tovoljenika, ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2 (Slika 46). TakoĎe na klaničnu masu nije uticala ni interakcija tretmana i veličine legla (slika 48). 90 95 100 105 110 115 120 125 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo Slika 48. Klanična masa tovljenika u zavisnosti tretmana i veličine legla (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Postanatalni porast prasadi i masa na kraju tova nisu bili pod značajnim uticajem ishrane majki daidzeinom, kao ni veličinom legla. Veći uticaj, imao je pol (Slika 49). 119 Klanična masa tovljenika muškog pola, u Eksperimentu I, bila je statistički značajno (p=0,02), a u Eksperimentu II veoma visoko statistički značajno (p< 0,0001) veća u odnosu na jedinke ţenskog pola. 90 95 100 105 110 115 120 125 Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Eksperiment 1 Eksperiment 2 Slika 49. Klanična masa tovljenika u zavisnosti pola (kg). Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Za ceo period tova, od roĎenja, telesna masa se povećala oko 84 puta, u eksperimentu 1. Veće povećanje, kao i veće vrednosti klanične mase su postignute u eksperimentu 2. Kod muških tovljenika povećanje telesne mase iznosi oko 93 puta a kod ţenki 87 puta. O značajnom uticaju pola na klaničnu masu tovljenika izveštavaju Kuhn i sar. (1995), Bee (2004). Dodavanje daidzeina u obrok suprasnih krmača od 85-og dana gestacije nije ispoljilo uticaj na masu prasadi na roĎenju, i klaničnu masu tovljenika kako u okviru muškog, tako ni u populaciji jedinki ţenskog pola, ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2. Mau i sar. (2006) navode da je uloga estrogena i supstanci sličnih estrogenima, kao što su fitoestrogeni u hrani, u porastu skeletnih mišića kod prasadi, još uvek velika nepoznanica. Oni su, u in vitro uslovima, ispitivali efekte estrogena (estradiol, estron) i izoflavona (genistein, daidzein) na porast kulture satelitskih ćelija kod svinja. Na osnovu dobijenih rezultata, autori ukazuju da i estrogeni i izoflavoni mogu imati 120 direktni uticaj na rast mišičnih ćelija kod svinja, ali ti uticaji su zavisni od dva faktora: doze i vremena davanja. Postanatalni porast mišića u ovom istraţivanju je praćen preko morfoloških osobina mišića m. semitetdinosus-a (masa, duţina, obim i površina poprečnog preseka), kod novoroĎene prasadi i tovljenika na kraju tova. Ustanovljeno je da ove osobine nisu bile pod uticajem ishrane majki uz dodatak daidzeina u toku kasne faze suprasnosti. Uticaj dodavanja daidzeina se nije ispoljio ni kod prasadi u Eksperimentu 1 (tabela 15, slika 24, 25, 26, 27) ni kod prasadi u Eksperimentu 2 (tabela 57, slika 34, 35, 36, 37). TakoĎe dodavanje daidzeina u obrok suprasnih krmača nije imalo uticaja na morfološke osobine mišića kod tovljenika ni u Eksperimentu 1 (tabela 26), ni u Eksperimentu 2 (tabela 68). Od roĎenja do kraja tova, masa i poprečni presek mišića m. semitendinosus-a, pokazuju najveće promene. Tako se masa mišića uvećava oko 170 puta a površina poprečnog preseka 35 – 54 puta. Promene znatno manjeg intenziteta se dogaĎaju kod osobina duţine i obima mišića. Vrednost duţine m.semitendinosus-a, se od roĎenja do kraja tova povećala 4,7 do 5 puta, dok se obim ovog mišića povećao 5,7 do 6 puta. Dobijene vrednosti su u skladu sa onima koje, za isti mišić, navode Rehfeldt i sar. (2008) kod domaćih svinja. Ovi autori su, poredeći divlje i domaće svinje, ustanovili da i pored sličnih vrednosti na roĎenju, posle 20 nedelja tova, dolazi do značajnih razlika u pogledu morfoloških osobina mišića, kao posledice domestikacije. Razlike su najveće kod onih parametara koji se i najviše povećavaju sa uzrastom, a to su masa i poprečni presek mišića. Svakako da su ove promene povezane sa promenama u veličini (prečniku) i broju mišićnih vlakana, kao posledica selekcije odnosno domestikacije svinja. Za razliku od tretmana daidzeinom, znatno veći uticaj na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a, imala je veličina legla i to samo kod prasadi a ne i kod tovljenika. Kako navode Berard i sar. (2008), ovaj faktor - veličina legla, zapravo svoj uticaj ispoljava indirektno, preko telesne mase prasadi, jer su prasad iz manjih legala imala veću telesnu masu u odnosu na prasad iz većih legala. Zato je ispravnije govoriti o uticaju telesne mase na roĎenju na odreĎene osobine mišića. U Eksperimentu 1, kao i u 121 kontrolnoj grupi Eksperimenta 2 ovog istraţivanja, prisutne su navedene razlike u morfološkim osobinama m. semitendinosus-a, ali one nisu potvrĎene kao statistički značajne. U oglednoj grupi Eksperimenta 2, prasad iz malih legala, odnosno prasad veće telesne mase, imala su statistički značajno veću masu (p=0,05) i duţinu mišića (p=0,05), u odnosu na prasad iz velikih legala (Tabela 97). Za osobine obim (p=0,09) i površina (p=0,08) poprečnog preseka m. semitendinosus-a utvrĎene su tendencije povećanja vrednosti kod prasadi iz malih legala u odnosu na prasad iz većih legala, što je u skladu sa novodima Perre i Etienne (2000), Quiniou i sar. (2002), Town i sar. (2004). Tabela 97. Uticaj tretmana na masu prasadi na roĎenju i morfološke osobine mišića u Eksperimentu 2 u zavisnosti od veličine legla, LSM±SE Osobina Kontrola p Tretman p Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Masa prasadi, kg 1,37±0,10 1,19±0,07 0,18 1,47±0,10 1,05±0,09 0,02 Masa m. semitendinosus, g 2,94±0,32 2,60±0,24 0,43 3,15±0,32 2,11±0,30 0,05 Duţina m. semitendinosus, cm 4,86±0,20 4,77±0,15 0,71 5,13±0,20 4,48±0,19 0,05 Obim m. semitendinosus, cm 3,73±0,20 3,34±0,15 0,16 3,68±0,20 3,13±0,19 0,09 Površina m. semitendinosus, cm2 1,11±0,10 0,90±0,08 0,14 1,08±0,10 0,80±0,10 0,08 Uticaj veličine legla, ili interakcije tretmana i veličine legla na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a, nije primećen kod tovljenika, obzirom da izmeĎu vrednosti pojedinih posmatranih osobina kod legala različite veličine nisu zabeleţene statistički značajne razlike. Kod tovljenika je, meĎutim, uočen uticaj pola na morfološke osobine m. semitendinosus-a. I u Eksperimentu 1, i u Eksperimentu 2, jedinke ţenskog pola imale su veće vrednosti za morfološke osobine mišića u odnosu na jedinke muškog pola (Tabela 98). U Eksperimentu 1 ove razlike u vrednostima nisu bile statistički značajne. U Eksperimentu 2 masa mišića nije bila pod uticajem pola, dok su za duţinu, obim i površinu poprečnog preseka m. semitendinosus-a, utvrĎene tendencije porasta kod tovljenika ţenskog pola u odnosu na muţjake, na kraju tova. Bee (2004) je takoĎe ustanovio jak uticaj pola na morfološke osobine mišića m. semitendinosus-a, mada je 122 ovaj autor utvrdio jak uticaj pola i na masu m. semitendinosus-a, što nije u skladu sa rezultatima Eksperimenta 1 i Eksperimenta 2 ovog istraţivanja. Neki autori nisu registrovali uticaj pola pri analizi mišića m. longissimus-a (Staun, 1963; Rehfeldt i sar., 1999), dok je kod istog mišića Bee (2004) utvrdio statistički veoma značajno veću površinu poprečnog preseka mišića kod tovljenika ţenskog pola u odnosu na kastrate. Isti autor nije utvrdio efekat pola pri ispitivanju m. rectus femoris-a (Bee, 2004). Moguće je da pol ima različite efekte na morfološke osobine kod različitih mišića, ali bi radi potpunijeg sagledavanja uticaja ovog faktora bilo neophodno sprovesti dalja istraţivanja. Tabela 98. Uticaj pola na morfološke osobine mišića tovljenika, LSM±SE Osobina Muški pol Ţenski pol p Eksperiment 1 Masa m. semitendinosus, g 455,14±23,45 487,69±22,95 0,12 Duţina m. semitendinosus, cm 22,98±0,63 24,02±0,62 0,21 Obim m. semitendinosus, cm 21,20±0,45 21,59±0,44 0,35 Površina m. semitendinosus, cm2 35,88±1,47 37,16±1,44 0,37 Eksperiment 2 Masa m. semitendinosus, g 439,29±8,70 450,30±7,71 0,25 Duţina m. semitendinosus, cm 22,27±0,22 22,70±0,19 0,08 Obim m. semitendinosus, cm 19,35±0,29 19,92±0,26 0,06 Površina m. semitendinosus, cm2 29,96±0,94 31,79±0,85 0,06 Masa mišića u najvećoj meri zavisi od broja i veličine mišićnih vlakana, dok drugi elementi mišićnog tkiva (npr. vezivno tkivo) u manjoj meri utiču na finalnu masu mišića. I broj, i veličina odnosno prečnik mišićnih vlakana u pozitivnoj su korelaciji sa površinom mišića i posledično njegovom masom, meĎutim izmeĎu debljine i broja mišićnih vlakana postoji negativna korelacija: što je veći broj vlakana u mišiću, ta će vlakna biti manje debljine, i obrnuto, što su vlakna deblja – njihov je broj u okviru jednog mišića manji (Rehfeldt i sar., 2000). Dok je broj mišićnih vlakana u pozitivnoj korelaciji sa količinom bezmasnog mesa, smatra se da prekomerno povećanje prečnika vlakana ima negativan uticaj na kvalitet mesa (Te Paas i sar., 2004). TakoĎe, broj mišićnih vlakana je veoma vaţna determinanta brzine postnatalnog rasta, obzirom da ţivotinje sa većim brojem vlakana rastu brţe i efikasnije iskorišćavaju hranu u odnosu na jedinke sa manjim brojem vlakana u mišiću (Dwyer i sar., 1993, Dwyer i sar., 1994). 123 Zbog toga je ukupan broj vlakana jedna od najvaţnijih histoloških osobina pri ispitivanju mišićnog tkiva. Kod svinja, kod kojih gestacija traje 114 dana, proces formiranja vlakana odvija se u dve ili tri faze. U prvoj fazi, koja počinje oko 25-30 dana gestacije i traje do 50-60 dana formira se prvi talas tzv. primarnih ili P vlakana, dok su prva sekundarna ili S vlakna vidljiva već oko 50tog dana gestacije, a formiraju se sve do 80tog dana (Swatland i Cassens, 1973; Wigmore i Stickland, 1983). Sekundarna vlakna razvijaju se na površini primarnih vlakana, tako da se oko svakog P vlakna moţe razviti 20-25 sekundarnih vlakana (Stickland i Handel, 1986; Nissen i sar. 2003). Novija istraţivanja (Brameld, 2008, Berard i sar., 2011) ukazuju na postojanje treće faze formiranja vlakana, tokom koje se izmeĎu sekundarnih vlakana razvijajaju tercijalna ili T vlakna, i to tokom prvih dana ili nedelja postnatalnog ţivota. Broj primarnih i sekundarnih vlakana, i odnos sekundarna:primarna vlakna pokazatelji su potencijala porasta i mase mišića (Dwyer i sar., 1993). Veći broj istraţivanja (Stickland i Handel, 1986, Dwyer i sar., 1993, Rehfeldt i Kuhn, 2006) ukazuje na relativno konstantan broj primarnih vlakana novoroĎene prasadi, gde ova vlakna čine 3- 5% ukupnog broja vlakana, i da ovaj parametar nije podloţan uticajima različitih faktora. Ipak, Rehfeldt i sar. (2001a) ukazuju na značajno povećanje broja primarnih vlakana kod potomstva krmača tretiranih somatotropinom tokom rane faze miogeneze, dok Rehfeldt i sar. (2012) ukazuju na smanjenje broja primarnih vlakana kod prasadi pri ishrani majki krmača tokom gestacije obrocima sa smanjenim procentom proteina. U ovim istraţivanjima promene broja primarnih vlakana uočene su kod prasadi srednje ili najmanje teţinske grupe, što moţe ukazivati na mogućnost manipulacija sa brojem primarnih vlakana kod onih ţivotinja kod kojih je uočen manji ukupan broj mišićnih vlakana i posledično manja telesna masa. Za razliku od broja primarnih vlakana, broj sekundarnih vlakana zavisi od različitih faktora (ishrane, genetike i dr.) i smatra se da je ovo osobina koja više doprinosi varijacijama u ukupnom broju vlakana (Wigmore i Stickland, 1983, Dwyer i Stickland, 1991, Rehfeldt i sar., 2001a). Ukupan broj vlakana u m. semitendinosus-u kod novoroĎene prasadi u ovom istraţivanju kretao se od oko 350x103 do oko 450x103, što je u skladu sa rezultatima 124 drugih autora (Stickland i Handel, 1986, Rehfeldt i sar., 1993, Dwyer i sar., 1994). Broj primarnih vlakana u posmatranom mišiću kretao se od 11-15.000, a broj sekundarnih vlakana od oko 320x10 3 do oko 440x10 3, što takoĎe odgovara nalazima drugih autora (Stickland i Handel 1986, Rehfeldt i Kuhn, 2006). Tretman suprasnih krmača daidzeinom tokom kasne faze gestacije nije imao statistički značajne efekte na ukupan, broj primarnih i broj sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u novoroĎene prasadi ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2 (Slika 50). MeĎutim, u okviru Eksperimenta 2 ovog istraţivanja, ukupan broj vlakana i broj sekundarnih vlakana bili su kod oglednih ţivotinja za oko 50.000 niţi u odnosu na kontrolne ţivotinje. Ji i sar. (1999) i Rehfeldt i sar. (2009) utvrdili su inhibitorno dejstvo pre svega genisteina na proliferaciju i fuziju mioblasta, ali onda kada je genistein dodavan u toku inicijacije mioblasta, i odsustvo bilo kakvih efekata (Rehfeldt i sar., 2009) na mišićno tkivo kada su izofolavoni dodavani u kasnim fazama. Mau i sar. (2008) i Rehfeldt i sar. (2009), navode znatno slabije dejstvo daidzeina na mišićne ćelije u poreĎenju sa genisteinom. Uočene razlike u ukupnom broju vlakana, i u broju sekundarnih vlakana izmeĎu kontrolne i eksperimentalne grupe ţivotinja u Eksperimentu 2 ovog istraţivanja nisu potvrĎene kao statistički značajne. Ovakav nalaz, ipak, nameće potrebu daljeg ispitivanja uticaja dodavanja daidzeina tokom kasne faze suprasnosti na osobine mišića kod podmlatka. 13200 14631 14496 15435 339096 353372 442777 393938 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Broj primarnih vlakana Broj sekundarnih vlakana Slika 50. Broj primarnih i sekundarnih vlakana u m. semitendinosus prasadi u zavisnosti od tretmana. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 125 Procenat primarnih vlakana u ovom istraţivanju kretao se od 3,38 do 4,13, a odnos broja sekundarnih prema broju primarnih vlakana kretao se oko 25, osim kod kontrolnih ţivotinja u Eksperimentu 2, gde je zabeleţen odnos 29,05, mada ova vrednost nije bila statistički značajno veća u odnosu na vrednost od 25,67 zabeleţenu kod tretiranih ţivotinja u Eksperimentu 2 (Slika 51). Stickland i Handel (1986) i Rehfeldt i Kuhn (2009) zabeleţili su kod m. semitendinosus-a odnos sekundarna:primarna vlakna 24,6 odnosno 22,93, što odgovara nalazima dobijenim u ovom istraţivanju. Veći odnos sekundarna:primarna vlakna u kontrolnoj grupi Eksperimenta 2 svakako je posledica većeg broja sekundarnih vlakana kod ovih ţivotinja u odnosu na sve ostale grupe, dok je broj primarnih vlakana kod ove grupe bio u nivou ostalih grupa. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Primarna vlakna, % 0 5 10 15 20 25 30 35 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Odnos sekundarna : primarna vlakna Slika 51. Procenat primarnih vlakana i odnos sekundarna:primarna vlakna u m. semitendinosus prasadi, u zavisnosti od tretmana. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 126 Veličina legla imala je, posredno preko mase na roĎenju, znatno veći uticaj na ukupan broj vlakana, kao i broj primarnih i sekundarnih vlakana u m. semitendinosus-u novoroĎene prasadi, kako u Eksperimentu 1 tako i u Eksperimentu 2 (Slika 52). Iako su u okviru Eksperimenta 1 za sve navedene osobine uočene veće vrednosti kod jedinki iz malog legla, jedino je razlika u broju primarnih vlakana kod kontrolnih ţivotinja potvrĎena kao statistički značajna (p=0,05). U okviru Eksperimenta 2, kontrolna mala legla imala su statistički značajno veći ukupan broj vlakana (p=0,04) i broj sekundarnih vlakana (p=0,04), i jaku tendenciju povećanja broja primarnih vlakana (p=0,07) sa smanjenjem broja prasadi u leglu. Slično kretanje vrednosti broja vlakana je utvrĎeno i kod legala različite veličine u okviru tretmana, ali bez statistički potvrĎenih značajnosti. Ovakvi rezultati potpuno su u skladu sa rezultatima drugih autora koji su utvrdili veći broj vlakana kod ţivotinja veće mase na roĎenju (Wigmore i Stickland, 1983, Dwyer i Stickland, 1991, Rehfeldt i sar., 2001, Nissen i sar., 2004, Town i sar., 2004). 15053 11347 14742 14520 364196 313996 374389 332355 0 100000 200000 300000 400000 500000 Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Kontrola Tretman Broj primarnih vlakana Broj sekundarnih vlakana Eksperiment 1 15919 13073 16966 13904 515281 370272 437376 350499 0 100000 200000 300000 400000 500000 Malo leglo Veliko leglo Malo leglo Veliko leglo Kontrola Tretman Eksperiment 2 Slika 52. Broj primarnih i sekundarnih vlakana u m. semitendinosus prasadi u zavisnosti od tretmana i veličine legla. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 127 Procenat primarnih vlakana, kao relativni pokazatelj, bio je dosta ujednačen i kada je u okviru kontrole i tretmana posmatran uticaj veličine legla kao faktora. Ovaj parametar kretao se od oko 3,3 do oko 4,1%, a razlike izmeĎu legala različite veličine nisu bile statistički značajne, što je u skladu sa rezultatima Dwyer i sar. (1994). Obzirom da veličina legla ili nije uticala na statistički značajne promene broja pojedinih tipova vlakana, ili su te promene bile u istom smeru (kod kontrolnih legala različite veličine u Eksperimentu 2), odnos sekundarna:primarna vlakna ostao je takoĎe relativno konstantan, sa vrednostima koje su se kod većine grupa kretale u rasponu 24-26, osim kod kontrolne grupe u Eksperimentu 2, gde je i kod malog i kod velikog legla odnos sekundarna:primarna vlakna bio oko 29. Na osnovu rezultata ovog istraţivanja moţe se reći da veličina legla nije imala uticaj na procenat primarnih vlakana i odnos sekundarna:primarna vlakna. Prema Rehfeldt i sar. (1987) prečnik mišićnih vlakana kod svinja rase Nemački landras povećava se od momenta roĎenja pa sve do dvadesete nedelje ţivota kada dostiţe plato, i kasnije ostaje relativno konstantan. Za razliku od prečnika vlakana, broj mišićnih vlakana ne menja se već od pete nedelje starosti. Zbog toga su sve eventualne manipulacije sa brojem mišićnih vlakana moguće jedino tokom intrauterinog razvoja i tokom prvih nedelja postnatalnog ţivota. Dakle, zbog pojave novih mišićnih vlakana u toku prvih nedelja postnatalnog ţivota, koja su najverovatnije posledica kombinovanog delovanja prorastanja i izduţivanja postojećih vlakana sa jedne strane, i razvoja tercijalnih mišićnih vlakana sa druge strane (Berard i sar., 2011), broj mišićnih vlakana u m. semitendinosus-u povećava se od oko 300 - 400 x 10 3 koliko se moţe izmeriti kod novoroĎene prasadi (Stickland i Handel, 1986, Rehfeldt i sar., 1993, Dwyer i sar., 1994, Rehfeldt i sar., 1999) do oko 650 – 1.000 x 10 3 vlakana koliko se moţe uočiti kod odraslih ţivotinja (Nissen i sar., 2003, Gondret i sar., 2005, Rehfeldt i Kuhn, 2006, Rehfeldt i sar., 2008). Rezultati sprovedenog Eksperimenta 1 i Eksperimenta 2 ovog istraţivanja, u saglasnosti su sa nalazima prethodno pomenutih autora u pogledu ukupnog broja mišićnih vlakana u m. semitendinosus-u tovljenika. Tretman suprasnih krmača daidzeinom nije imao 128 statistički značajan uticaj na ukupan broj vlakana na poprečnom preseku mišića, obzirom da se u Eksperimentu 1 ukupan broj vlakana kretao od oko 900 x 10 3 kod kontrole do 1.000 x 10 3 kod eksperimentalne grupe, dok je u Eksperimentu 2 broj vlakana kod kontrolnih i oglednih ţivotinja bio ujednačen, oko 1.000 x 103. Broj vlakana preračunat na 1cm2 površine mišića kretao se oko 25.000 u Eksperimentu 1, i oko 30.000 u Eksperimentu 2, i takoĎe nije bio pod uticajem dodavanja daidzeina (Slika 53). 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Ukupan broj vlakana 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 Broj vlakana po cm² Slika 53. Broj vlakana ukupno i po cm 2 m. semitendinosus tovljenika u zavisnosti od tretmana. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 129 Rehfeldt i Kuhn (2006) pokazali su da razlike u masi koje postoje izmeĎu različitih teţinskih grupa kod novoroĎene prasadi, zadrţavaju isti trend i kod odraslih ţivotinja na kraju tova. Rezultati istraţivanja Rehfeldt i Kuhn (2006) pokazali su takoĎe da morfološke osobine mišića: masa, duţina, i površina poprečnog preseka, kao i ukupan broj mišićnih vlakana koreliraju sa masom na roĎenju, i da kod prasadi koja su pri roĎenju bila manje mase sve navedene osobine imaju manje vrednosti u odnosu na prasad iz srednje ili najveće teţinske grupe kod kojih su autori utvrdili najveću masu, duţinu i površinu poprečnog preseka m. semitendinosus-a, i najveći ukupan broj vlakana na poprečnom preseku. Ovakav trend nije uočen kod tretirane grupe ţivotinja u Eksperimentu 2 ovog istraţivanja u okviru kojeg je postojala statistički značajna razlika u masi na roĎenju izmeĎu ţivotinja iz malog i velikog legla, ta razlika se manifestovala i u tendencijama smanjenja vrednosti morfoloških osobina mišića kod prasadi iz velikih legala, ali je ukupan broj vlakana kod tovljenika poreklom iz malih i iz velikih legala bio ujednačen, oko 1.000 x 103, te razlika u ukupnom broju vlakana kod tovljenika, kod kojih je pri roĎenju bila utvrĎena značajna razlika u masi, nije bila statistički značajna (p=0,9517). Veličina legla ispitivana kao jedini faktor, u ovom istraţivanju nije imala uticaj na ukupan broj vlakana na poprečnom preseku mišića, kao ni na broj vlakana na 1 cm2 površine mišića ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2. TakoĎe, interakcija tretmana i veličine legla nije uticala na promene u ukupnom broju vlakana, kao ni u broju vlakana na 1 cm 2 površine mišića. U pogledu uticaja pola na broj mišićnih vlakana u mišiću, nalazi većeg broja autora su kontradiktorni. Tako Staun (1963), Dwyer i sar. (1994), Nissen i sar. (2003), nisu pronašli nikakav uticaj pola na broj vlakana na poprečnom preseku mišića kod svinja. Rehfeldt i sar. (1999) ukazuju na veći broj mišićnih vlakana kod muških jedinki različitih vrsta. Nissen i sar. (2003) utvrdili su statistički značajno manji broj vlakana kod ţenskih jedinki potomaka krmača hranjenih ad libitum u periodu od 25og do 50og dana gestacije u poreĎenju sa muškim potomcima iste grupe krmača. 130 U ovom istraţivanju, pol je ispoljio veoma značajan uticaj na ukupan broj vlakana na poprečnom preseku i broj vlakana na 1 cm2 površine mišića i u Eksperimentu 1 i u Eksperimentu 2 (Slika 54). MeĎutim, u Eksperimentu 1 utvrĎen je statistički značajno veći (p=0,01) ukupan broj vlakana kod ţivotinja ţenskog pola, dok je u Eksperimentu 2 statistički značajno veći ukupan broj vlakana (p=0,04) i broj vlakana na 1 cm2 površine mišića (p=0,03) zabeleţen kod kastrata. 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Experiment 1 Experiment 2 Ukupan broj vlakana 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Experiment 1 Experiment 2 Broj vlakana po cm² Slika 54. Broj vlakana ukupno i po cm 2 m. semitendinosus tovljenika u zavisnosti od pola. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Ispitivan je i uticaj tretmana u okviru polova. U Eksperimentu 1, kod muškog pola je tretiranje krmača fitoestrogenom daidzeinom dovelo do povećanja ukupnog broja vlakana za oko 70.000, mada ovo povećanje nije bilo statistički značajno. Isti trend 131 povećanja ukupnog broja vlakana kod muških potomaka krmača koje su dobijale daidzein, za oko 90.000, uočen je i u Eksperimentu 2, ali ni u ovom slučaju razlika nije bila statistički značajna. Ipak, kod ţenskih ţivotinja u Eksperimentu 1, dodavanje daidzeina u ishranu njihovih majki krmača, uslovilo je povećanje ukupnog broja vlakana za oko 185.000 u odnosu na ţenske potomke krmača koje nisu dobijale daidzein, što je statistički potvrĎeno kao jaka tendencija (p=0,07). Suprotno tome, u Eksperimentu 2 su ţenski potomci krmača tretiranih daidzeinom imali za oko 120.000 vlakana manje u poreĎenju sa ţenskim jedinkama potomcima kontrolnih krmača (p=0,11). Ovakvi rezultati donekle su u saglasnosti sa nalazima drugih autora. Rempel i Clapper (2002), i Hilleson-Gayne i Clapper (2005) su u svojim istraţivanjima utvrdili zavisnost koncentracije IGF-a od 17β estradiola, gde je aplikacija estradiola dovodila do povećanja koncentracije IGF-a u serumu (Rempel i Clapper, 2002), a smanjivanje koncentracije estradiola u serumu uz pomoć inhibitora dovodilo je do smanjenja koncentracije IGF-a (Hilleson-Gayne i Clapper, 2005). Prema ovim autorima, dakle, estradiol bi posredno preko IGF ose mogao imati uticaj i na porast svinja odnosno porast mišićnog tkiva. Enns i Tiidus (2010) ukazuju na stimulirajuće dejstvo estrogena u obnavljanu mišićnog tkiva nakon povreda, preko aktivacije i proliferacije satelitskih ćelija. Mau i sar. (2008) nisu primetili gotovo nikakve efekte estrogena na proliferaciju mišićnih ćelija pri fiziološkim koncentracijama, ali je zato zapaţeno inhibitorno dejstvo estrogena na proliferaciju mišićnih ćelija ukoliko je estrogen aplikovan u suprafiziološkim koncentracijama. Efekti dodavanja fitoestrogena tokom graviditeta na porast i karakteristike mišića verovatno su zavisni od doze, jedinjenja koje se koristi, mišića koji se isputuje, i zbog toga je za rasvetljavanje značaja i efekata ovih jedinjenja na mišićno tkivo, neophodno sprovesti dodatna istraţivanja. Osim promene u ukupnom broju vlakana od momenta roĎenja prasadi, tokom prvih nekoliko nedelja postnatalnog ţivota, u ovom periodu se takoĎe odvija transformacija primarnih, sekundarnih i tercijalnih vlakana koja su se mogla uočiti u mišiću novoroĎene prasadi, u različite tipove vlakana koji postoje u mišiću odraslih ţivotinja. Smatra se da će se od primarnih (P) vlakana razviti sporo okidajuća oksidativna STO 132 vlakna, dok će se većina sekundarnih (S) i tercijalnih (T) vlakana transformisati u brzo okidajuća vlakna, koja će po metabolizmu biti ili oksidativna (FTO), ili glikolitička (FTG) u zavisnosti od toga da li su se razvijala u neposrednoj blizini primarnih vlakana, ili dalje od njih (Picard i sar., 2002, Brameld i sar., 2008). Kako je broj vlakana u mišiću fiksiran tokom prvih nekoliko nedelja postnatalnog ţivota, i nakon toga se više ne menja (Rehfeldt i sar., 1987, Rehfeldt i sar., 2000, Rehfeldt i sar., 2008), postnatalni porast mišića ne dešava se na bazi povećanja broja vlakana, već po osnovu hipertrofije vlakana odnosno povećanja njihovog prečnika i duţine (Wegner i sar., 2000, Rowe i Goldspink, 1969). Ipak, prekomerno povećanje prečnika mišićnih vlakana po pravilu ukazuje na manji broj vlakana u mišiću (Handel i Stickland, 1987., Bee, 2004), što zajedno dovodi do problema sa kvalitetom mesa (Henckel i sar., 1997, Fiedler i sar., 1999). Prema Maltin i sar. (1997), izraţena hipertrofija vlakana takoĎe utiče na smanjenje mekoće svinjskog mesa. Zbog toga veliki broj autora ukazuje na optimalan balans izmeĎu broja vlakana i njihove postnatalne hipertrofije kao ključni zahtev u selekciji na povećanu količinu bezmasnog mesa i dobar kvalitet mesa u savremenoj svinjarskoj proizvodnji. Na veličinu vlakna mogu uticati različiti faktori. Rehfeldt i sar. (2008) utvrdili su statistički veoma značajne razlike u površini svih tipova vlakana izmeĎu divljih i domaćih svinja rase Nemački Landras, u uzrastu od 7 i od 20 nedelja starosti, i to kod tri ispitivana mišića: m. semitendinosus, m. psoas major i m. longissimus dorsi. Bee i sar. (2004) ustanovili su jak uticaj pola na površinu različitih tipova vlakana u m. rectus femoris-u svinja, dok taj uticaj nije uočen u m. longissimus dorsi-ju i m. semitendinosus-u ovih ţivotinja. Isti autor je uočio uticaj mase na roĎenju na veličinu FOG vlakana u m. semitendinosus-u, dok kod drugih posmatranih mišića ovaj faktor nije imao nikakav uticaj. Gondret i sar. (2005) ispitivali su tri mišića tovljenika: m. longissimus lumborum, m. rhomboideus i m. semitendinosus, i zapazili značajan uticaj mase na roĎenju na površinu mišićnih vlakana, kod sva tri ispitivana mišića. Bee (2004) je takoĎe kod m. semitendinosus-a uočio uticaj različitog nivoa energije u obroku 133 suprasnih krmača tokom rane gestacije na veličinu vlakana, mada taj efekat nije uočen kod m. longissimus dorsi-ja i m. rectus femoris-a. U ovom istraţivanju, površine pojedinih tipova vlakana kretale su se od oko 3500 do oko 4500 µm 2 , što predstavlja vrednosti u skladu sa nalazima drugih autora (Rehfeldt i sar., 2008, Gondret i sar., 2005, Velotto i sar., 2010). Tretman krmača daidzeinom tokom kasne suprasnosti, nije imao uticaja na površinu pojedinih tipova mišićnih vlakana ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2 (Slika 55). Efekat dodavanja daidzeina nije uočen ni u interakciji sa polom kao faktorom, niti u interakciji sa veličinom legla kao faktorom. 0 1000 2000 3000 4000 5000 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Površina STO vlakna, µm² Površina FTO vlakna, µm² Površina FTG vlakna, µm² Prosečna površina vlakna, µm² Eksperiment 1 0 1000 2000 3000 4000 5000 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Površina STO vlakna, µm² Površina FTO vlakna, µm² Površina FTG vlakna, µm² Prosečna površina vlakna, µm² Eksperiment 2 Slika 55. Uticaj tretmana na površinu pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 134 Staun (1963) nije uočio promene u veličini mišićnih vlakana u zavisnosti od pola. Nissen i sar. (2003) nisu zabeleţili efekte ni pola, ni povećane ishrane majki tokom različitih faza suprasnosti na veličinu vlakana m. semitendinosus-a potomstva. Suprotno tome, Larzul i sar. (1997), su u svom istraţivanju utvrdili statistički značajno veću površinu FTO i FTG, i prosečnu površinu vlakna u m. longissimus dorsi-ju kod ţenki u odnosu na muţjake. Velotto i sar. (2010) utvrdili su značajan efekat pola na veličinu sva tri tipa mišićnih vlakana, kod sva tri mišića (m. psoas minor, m. longissimus dorsi i m. rhomboideus) koja su ispitivali, gde su muţjaci imali veće površine pojedinih tipova vlakana u odnosu na ţenke. Bee (2004) utvrdio je različit uticaj pola kod različitih mišića: u m. longissimus dorsi-ju i m. rectus femoris-u svi tipovi mišićnih vlakana bili su veće površine kod kastrata nego kod ţenskih tovljenika. MeĎutim, i u tamnom, i u svetlom delu m. semitendinosus-a , Bee (2004) je zabeleţio statistički veoma značajno veće površine svih tipova vlakana kod ţenki u odnosu na muţjake. U ovom istraţivanju takoĎe je uočen efekat pola na površinu mišićnih vlakana (slika 56). U okviru Eksperimenta 1, uočena je statistički značajno veća površina FTO vlakna kod kastrata u odnosu na ţenke. Zabeleţena je i brojčano veća površina i STO, i FTG, i prosečna površina vlakna kod muţjaka, ali ove razlike nisu potvrĎene kao statistički značajne. Rezultati Eksperimenta 1 u skladu su sa nalazima Velotto i sar. (2010). U okviru Eksperimenta 2, pol kao faktor delovao je u smeru povećanja površina svih tipova vlakana kod ţenskih tovljenika u odnosu na muţjake. Površina STO vlakna bila je veća kod ţenki nego kod muţjaka, mada bez statistički potvrĎene značajnosti, za površinu FTO vlakna utvrĎena je tendencija (p=0,09) povećanja kod ţenki, dok su površina FTG i prosečna površina vlakna bile statistički potvrĎeno veće (p=0,03) kod ţenskih ţivotinja. Ovakvi rezultati su u potpunosti saglasni sa nalazima Larzul i sar. (1997) i Bee (2004). Razlike u rezultatima o veličini mišićnih vlakana kod drugih autora, Eksperimenta 1 i Eksperimenta 2 ovog istraţivanja, mogle bi biti posledica različitih mišića korišćenih za ispitivanje, različite ishrane majki tokom trajanja suprasnosti, različite rase, korišćenja 135 intaktnih muţjaka ili kastrata u ispitivanju itd. Zbog toga bi bilo neophodno sprovesti dalja istraţivanja o uticaju pola na ove karakteristike mišićnih vlakana. 0 1000 2000 3000 4000 5000 Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Površina STO vlakna, µm² Površina FTO vlakna, µm² Površina FTG vlakna, µm² Prosečna površina vlakna, µm² Eksperiment 1 0 1000 2000 3000 4000 5000 Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Površina STO vlakna, µm² Površina FTO vlakna, µm² Površina FTG vlakna, µm² Prosečna površina vlakna, µm² Eksperiment 2 Slika 56. Uticaj pola na površinu pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Pored veličine mišićnih vlakana, na kvalitet mesa veoma utiče i zastupljenost pojedinih tipova vlakana u mišićnom tkivu (Karlsson i sar., 1999). Kod modernih mesnatih rasa svinja, selekcijom se forsira dobijanje vlakana većeg prečnika, ali ovakva vlakna imaju tendenciju smanjenja broja mitohondrija u svom sastavu. Metabolizam ovakvih vlakana je glikolitički, ona spadaju u grupu brzo-okidajućih (fast twitch) ili tzv. belih vlakana. Brojna istraţivanja na svinjama pokazala su da se za povećan broj FTG vlakana vezuju problemi PSE mesa (Larzul i sar., 1997, Fiedler i sar., 1999) i osetljivosti na stres 136 (Fiedler i sar., 1993, 1999). Brzo-okidajuća, FTG vlakna proizvode energiju za kontrakciju kroz glikolitički metabolizam, pa u uslovima kada su zahtevi za energijom visoki (neposredno pred klanje) ovakvim metabolizmom se stvara prevelika količina laktata koji se ne moţe eliminisati iz ćelija, denaturišu se proteini, i pH vrednost drastično pada, što uslovljava lošiji kvalitet mesa. Zastupljenost različitih vrsta vlakana u mišiću odraslih ţivotinja zavisi od velikog broja faktora, najpre vrste, rase i pola ţivotinja, a zatim tipa mišića, njegove lokacije i funkcije, ishrane tokom intrauterinog razvoja itd (Lefaucheur i Gerrard, 1998, Rehfeldt i sar., 1999, Wegner i sar., 2000, Klosowska i Fiedler, 2003, Brameld i sar., 2008). Larzul i sar. (1997) u m. longissimus dorsi-ju utvrdili su oko 10% STO vlakana, oko 16% FTO i oko 74% FTG. U istom mišiću, Bee i sar. (2004) utvrdili su 8-9% STO vlakana, oko 21% FTO, i oko 70% FTG vlakana. U m. rhomboideus-u su najzastupljenija STO vlakna – oko 64%, FTO vlakna učestvuju sa oko 14-15%, a FTG vlakna sa 21-22% (Gondret i sar., 2005). Zastupljenost pojedinih tipova vlakana takoĎe se moţe veoma razlikovati i u okviru jednog mišića. Tipičan primer je m. semitendinosus kod svinja, gde se u površinskom tzv. svetlom delu mišića nalazi oko 4% vlakana tipa STO, a u dubokom sloju mišića tzv. tamnom delu, moţe se naći i do 45% ovog tipa vlakana (Beermann i sar., 1990). Bee (2004) utvrdio je oko 6-7% STO vlakana u površinskom, svetlom delu mišića, i oko 30% ovog tipa vlakana u dubokoj, tamnoj partiji m. semitendinosus-a. Ukoliko se ovaj mišić posmatra u celosti, učešće pojedinih tipova vlakana varira u različitim istraţivanjima. Rehfledt i sar. (2008) utvrdili su oko 25% STO, oko 30% FTO i oko 45% FTG vlakana. U svom istraţivanju, Bee (2004) je u m. semitendinosus-u zabeleţio oko 19% STO vlakana, oko 26% FTO i oko 55% FTG vlakana. U ovom istraţivanju, u okviru Eksperimenta 1 utvrĎeno je oko 20% STO vlakana, 27- 29% FTO vlakana i 49-51% FTG vlakana (Slika 57), što u potpunosti odgovara nalazima Bee (2004) i Rehfeldt i sar. (2008). Dodavanje daidzeina u hranu suprasnih krmača nije imalo uticaja na zastupljenost pojedinih tipova vlakana u okviru mišića. 137 MeĎutim, u okviru Eksperimenta 2, utvrĎen je značajan uticaj tretmana na procentualnu zastupljenost FTO (p=0,05) i FTG (p=0,05) vlakana, i to tako što se kod ţivotinja iz tretirane grupe procenat FTO vlakana smanjio za oko 3,5% u odnosu na kontrolu, a na račun tog smanjenja povećan je procenat FTG vlakana za oko 5% (Slika 57). Procentualna zastupljenost FTO i FTG vlakana u Eksperimentu 2, dosta se razlikuje u poreĎenju sa nalazima drugih autora, kao i u poreĎenju sa nalazima Eksperimenta 1 ovog istraţivanja. Mogući uzrok takvog odstupanja je nestandardna ishrana suprasnih krmača u Eksperimentu 2, u kome u obrok tokom čitave suprasnosti nije bila uključena soja. Ovakvo objašnjenje moglo bi biti u skladu sa nalazima Zhu i sar. (2006), koji su utvrdili statistički značajno smanjenje procenta FTO i povećanje procenta FTG vlakana kod potomstva ovaca koje su restriktivno hranjene u periodu od 21og do 78og dana gestacije. 20.38 20.53 17.81 16.2 27.29 29.72 20.71 17.23 51.02 48.95 61.44 66.54 0% 20% 40% 60% 80% 100% Kontrola Tretman Kontrola Tretman Experiment 1 Experiment 2 STO vlakna FTO vlakna FTG vlakna Slika 57. Procentualna zastupljenost pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika u zavisnosti od tretmana. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Veličina legla, ispitivana kao jedini faktor, nije imala uticaj na procentualnu zastupljenost pojedinih tipova vlakana ni u okviru Eksperimenta 1, ni u okviru Eksperimenta 2. U okviru Eksperimenta 2 uočena je interakcija tretmana i veličine legla, koja se ispoljila u vidu tendencije smanjenja procenta FTO vlakana kod tretiranih ţivotinja i iz malog (p=0,08) i iz velikog legla (p=0,11), i kao tendencija povećanja procenta FTG vlakana kod tretiranih ţivotinja iz velikog legla (p=0,06) (Slika 58). Ove tendencije, ipak, verovatno nisu posledica uticaja veličine legla, već su posledica dejstva 138 tretmana koji je u okviru Eksperimenta 2 uticao upravo na zastupljenost FTO i FTG vlakana. 17.34 17.29 18.28 15.11 21.06 17.6 20.36 16.87 61.6 65.11 61.28 67.96 0% 20% 40% 60% 80% 100% Kontrola Tretman Kontrola Tretman Malo leglo Veliko leglo STO vlakna FTO vlakna FTG vlakna Slika 58. Uticaj veličine legla i tretmana na procenat pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika, Eksperiment 2. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Ispitivanjem pola kao jedinog faktora ustanovljeno je da ovaj faktor nije imao uticaj na procentualnu zastupljenost STO vlakana ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2, što je u skladu sa nalazima drugih autora (Larzul i sar., 1997, Bee, 2004) (Slika 59). Procenat FTO vlakana bio je nešto niţi kod ţenki (27%) nego kod muţjaka (30%) u Eksperimentu 1, a u Eksperimentu 2 je utvrĎen statistički značajno veći procenat ovog tipa vlakana kod ţenskih tovljenika u odnosu na muške (p=0,03). Procenat FTG vlakana je bio nešto veći kod ţenki (52%) u odnosu na muţjake (48%) u Eksperimentu 1. U Eksperimentu 2 se na račun uočenog povećanja procenta FTO vlakana, kod ţenskih ţivotinja smanjio procenat FTG vlakana, i bio statistički značajno manji (p=0,01) u odnosu na ţivotinje muškog pola (Slika 59). Ovakvi rezultati nisu u skladu sa Larzul i sar. (1997) i Bee (2004) koji u svojim istraţivanjima nisu utvrdili uticaj pola na procentualnu zastupljenost FTO i FTG vlakana. 139 20.68 20.23 16.25 17.76 30.03 26.98 17.78 20.17 48.19 51.78 65.94 62.04 0% 20% 40% 60% 80% 100% Muški pol Ţenski pol Muški pol Ţenski pol Eksperiment 1 Eksperiment 2 STO vlakna FTO vlakna FTG vlakna Slika 59. Uticaj pola na procenat pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars Interakcija pola i tretmana nije imala značajne efekte u okviru Eksperimenta 1 ovog istraţivanja. MeĎutim, u Eksperimentu 2, zabeleţene su statistički značajni efekti ove interakcije (Slika 60). Procenat STO vlakana ponovo nije bio promenjen pod uticajem tretmana kod muških jedinki, dok je kod ţenki imao tendenciju smanjenja (p=0,07) kod tretiranih ţivotinja. Trend smanjenja učešća FTO i povećanja ucešća FTG vlakana koji je bio zabeleţen kao posledica tretmana, ispoljio se i kod muţjaka i kod ţenki. 16.84 15.66 18.78 16.73 20.15 15.41 21.27 19.06 63.07 68.8 59.81 64.27 0% 20% 40% 60% 80% 100% Kontrola Tretman Kontrola Tretman Muški pol Ţenski pol STO vlakna FTO vlakna FTG vlakna Slika 60. Uticaj pola i tretmana na procenat pojedinih tipova vlakana u m. semitendinosus tovljenika, Eksperiment 2. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 140 Ovakvi nalazi ukazuju da je procentualna zastupljenost sporo kontrahujućih oksidativnih vlakana najmanje podloţna promenama, što je u skladu sa nalazima drugih autora (Dwyer i sar., 1994., Larzul i sar., 1997, Nissen i sar., 2003, Bee, 2004). Zastupljenost FTO i FTG vlakana sa druge strane, pod uticajem je velikog broja faktora, pa je i odnos ovih tipova vlakana i postnatalnog porasta još uvek nedovoljno razjašnjen i zahteva dodatna istraţivanja. Da bi se obezbedila što veća i kvalitetnija proizvodnja svinjskog mesa, neophodno je razumevanje mehanizma hipertrofije - postnatalnog porasta mišićnih vlakana sa fiziološkog stanovišta. Smatra se da se pri porastu mišićnog vlakna u njega ubacuju jedra iz satelitskih ćelija, i da svako jedro ishranjuje svoj odreĎeni region citoplazme (Bruusgaard i sar., 2003), dok se tokom atrofije vlakana jedra uklanjaju usled apoptoze (Allen i sar., 1999). Tako se kao rezultat porasta u mišićnim ćelijama povećava broj jedara (Williams i Goldspink, 1971., Allen i sar., 1995) ili se broj jedara u mišićnim vlaknima povećava sa povećanjem prečnika vlakana (Rehfeldt i sar., 2008), a pri atrofiji broj jedara smanjuje (Allen i sar., 1995) ili se broj jedara po mišićnom vlaknu smanjuje sa smanjenjem prečnika vlakana (Rehfeldt i sar., 2008). Bruusgaard i sar. (2003) ukazuju da je broj jedara proporcionalan ili zapremini citoplazme mišićnog vlakna, ili spoljašnjoj površini vlakna. Ova osobina mišićnog tkiva mogla bi biti ključni faktor u regulaciji porasta mišića, ili posledica ovog procesa (Gundersen i Bruusgaard, 2008), zbog čega su neophodna dalja ispitivanja ove osobine mišićnih vlakana odnosno mišićnog tkiva. Rehfeldt i sar. (2008) ispitivali su nekoliko mišića svinja rase Nemački Landras, i ustanovili da je broj jedara po mišićnom vlaknu kod svinja bio ujednačen i u uzrastu od 7 nedelja starosti kada se kretao u rasponu od 0,7 do1 jedro/vlaknu, i u uzrastu od 20 nedelja kada se kretao u rasponu od oko 1,5 do oko 1,8 kod m. semitendinosus-a, m. psoas major-a i m.longissimus dorsi-ja. U istraţivanju Rehfeldt i sar. (1993) kod novoroĎene prasadi u m. semitendinosus-u je zabeleţeno 0,95 – 1,17 jedara po mišićnom vlaknu. 141 U Eksperimentu 1 ovog istraţivanja prosečan broj jedara po jednom vlaknu kretao se od 1,68 do 1,82, i nije bio pod uticajem dodavanja daidzeina u obrok suprasnih krmača (Slika 61). Najveći broj jedara imala su STO vlakna (2,07-2,25) koja su u ovom Eksperimentu bila najveće površine, a najmanji broj vlakana (oko 1,55) uočen je kod FTG vlakana, koja su bila najmanje površine poprečnog preseka. Nešto niţe vrednosti za ovu osobinu izmerene su u Eksperimentu 2, ali je trend smanjenja broja jedara po vlaknu sa smanjenjem površine vlakna, uočen i Eksperimentu 2, što je u skladu sa nalazima Rehfeldt i sar. (2008). 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Broj jedara po jednom STO vlaknu Broj jedara po jednom FTO vlaknu Broj jedara po jednom FTG vlaknu Prosečan broj jedara po jednom vlaknu Eksperiment 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Kontrola Tretman Broj jedara po jednom STO vlaknu Broj jedara po jednom FTO vlaknu Broj jedara po jednom FTG vlaknu Prosečan broj jedara po jednom vlaknu Eksperiment 2 Slika 61. Broj jedara po tipovima vlakana u zavisnosti od tretmana. Vrednosti LSM prikazane su kao stubići, a vrednosti SE kao error bars 142 Veličina legla, ispitivana kao jedini faktor, ili u interakciji sa tretmanom daidzeinom, nije imala efekta na broj jedara po pojedinim tipovima vlakana, niti na prosečan broj jedara po jednom vlaknu, ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2. U okviru Eksperimenta 1 zabeleţeno je nešto manje jedara po vlaknu kod tovljenika poreklom iz malih legala, dok je u Eksperimentu 2 kod tovljenika iz malih legala bio utvrĎen veći broj jedara po vlaknu. Pol nije imao uticaj na broj jedara po mišićnom vlaknu, ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2. Najveći broj jedara po vlaknu utvrĎen je za STO vlakna, a najmanji broj jedara zabeleţen je za FTG vlakna i kod muţjaka i kod ţenki. Ovakvi rezultati, o odsustvu uticaju pola na broj jedara po jednom mišićnom vlaknu, u skladu su sa nalazima Beerman (1983). TakoĎe, interakcija pola i tretmana pokazala je uticaj jedino kod ţenskih ţivotinja, u oba Eksperimenta, na broj jedara po jednom FTO vlaknu, ali u Eksperimentu 1 tretman suprasnih krmača daidzeinom doveo je do smanjenja broja jedara po FTO vlaknu (p=0,06), dok su ţenke potomci tretiranih krmača u Eksperimentu 2 imale veći broj jedara po FTO vlaknu (p=0,04) u poreĎenju sa netretiranim ţivotinjama. Domestikacija i selekcija na povećanu količinu bezmasnog mesa doveli su do povećanja prečnika mišićnih vlakana, i povećanja zastupljenosti brzo okidajućih glikolitičkih vlakana (Rahelić i Puač, 1981, Solomon i West, 1985, Rehfeldt i sar, 2008), što je zbog oteţane prokrvljenosti i snabdevenosti vlakana hranljivim materijama za posledicu imalo pojavu problema sa stres sindromom i kvalitetom mesa (Larzul i sar., 1997, Fiedler i sar., 1999). Kadi i sar. (1999) navode da porast broja jedara tokom hipertrofije mišića ne prati povećanje mišićnih vlakana proporcionalno, dok su McCall i sar. (1998) utvrdili povećanje broja jedara srazmerno povećanju zapremine mišićnog vlakna. Nalazi Bruusgaard i sar. (2003) ukazuju na različito kretanje broja jedara u zavisnoti od metabolizma mišića, obzirom da se u oksidativnom m. soleusu-u broj jedara povećavao srazmerno povećanju vlakana, dok se u glikolitičkom m. extensor digitorum longus-u broj jedara nije povećavao u proporciji sa veličinom mišićnih vlakana. Zbog toga se pri histološkim ispitivanjima mišića kao vaţna osobina mišićnog tkiva odreĎuje i odnos broja jedara i površine vlakana. Rehfeldt i sar. (2008) utvrdili su oko 500-600 jedara na 143 mm 2 površine mišićnog vlakna u m. semitendinosus-u, m. psoas major-u i m. longissimus dorsi-ju kod svinja starosti 20 nedelja. U ovom istraţivanju, utvrĎivana je površina pojedinih tipova vlakana po jednom jedru. Na jedno jedro dolazilo je oko 450 µm 2 mišićnog vlakna u Eksperimentu 1, odnosno 470-480 µm 2 mišićnog vlakna u Eksperimentu 2. Tretman krmača daidzeinom nije imao uticaj na ovu osobinu mišićnog tkiva ni u Eksperimentu 1, ni u Eksperimentu 2. Nešto veće površine svih tipova vlakana po jednom jedru kod tovljenika poreklom iz velikog legla u odnosu na ţivotinje iz malih legala, uočene su i u Eksperimentu 1, i u Eksperimentu 2, ali su jedino kod površine FTO vlakana po jednom jedru u Eksperimentu 1 statistički potvrĎene kao tendencije (p=0,10). Interakcija tretmana i veličine legla nije imala uticaja na ovu osobinu ni u jednom Eksperimentu. Nisu registrovani ni statistički značajni uticaji pola, i interakcije pola i tretmana na površinu pojedinih vlakana po jednom jedru. Ipak, površine svih tipova vlakana po jednom jedru bile su nešto veće kod jedinki ţenskog pola u okviru Eksperimenta 1, dok su vrednosti za ovu osobinu bile veće kod tovljenika muškog pola u Eksperimentu 2. 144 7. Zaključak Rezultati prikazani u ovoj doktorskoj disertaciji navode na izvoĎenje sledećih zaključaka, da pod primenjenim eksperimentalnim uslovima, dodavanja izoflavona soje, daidzeina, u obrok krmača tokom završne faze suprasnosti (od 85-og dana do kraja gestacije): 1. Nije došlo do statistički značajnog uticaja na povećanje postnatalnog porasta telesne mase i morfoloških osobina mišića m. semitendinosus, kako kod novoroĎene prasadi tako ni kod tovljenika, na kraju tova. 2. Za razliku od tretmana daidzeinom, znatno veći uticaj na telesnu masu i morfološke osobine mišića m. semitendinosus, kod novoroĎene prasadi, imala je veličina legla. Prasad iz malih legala imala su statistički značajno veću masu, duţinu, obim i površinu poprečnog preseka mišića m. semitendinosus u odnosu na prasad iz većih legala. Veličina legla kao faktor nije uticala na telesnu masu i morfološke osobine mišića kod odraslih ţivotinja na kraju tova. 3. Tretman krmača daidzeinom, u toku kasne faze suprasnosti, imao je mali ali ne i statistički značajan uticaj na histološku strukturu mišića m. semitendinosus kod novoroĎene prasadi, izraţen kroz povećanje ukupnog broja mišićnih vlakana, broj primarnih mišićnih vlakana i odnos sekundarna:primarna mišićna vlakna. 4. Slična konstatacija se moţe navesti i za tovljenike iz Eksperimenta 1, kod kojih nije ispoljena značajna promena broja, procentualne zastupljenosti i površina STO, FTO i FTG mišićnih vlakana, pod uticajem daidzeina. Nasuprot tome u Eksperimentu 2, dodavanje daidzeina u obrok krmača hranjenih obrocima bez soje je dovelo do smanjenja procenta FTO (za 3,5%) i povećanja udela FTG mišićnih vlakana (za 5%) kod tovljenika. 145 5. Prosečan broj jedara po jednom mišićnom vlaknu, kod tovljenika, nije bio promenjen pod uticajem daidzeina. Konstatovan je trend smanjenja broja jedara sa smanjenjem površine mišićnog vlakna. Tako su STO mišićna vlakna imala najveći broj jedara dok su FTG mišićna vlakna, namanje površine, imala najmanji broj jedara. 6. Veličina legla, odnosno masa prasadi pri roĎenju, imala je značajan uticaj na histološku strukturu mišića m semitendinosus kod prasadi. Tako su prasad iz malih legala (veće mase na roĎenju) imala statistički značajno veći ukupan broj mišićnih vlakana, kao i broj primarnih i sekundarnih mišićnih vlakana. Uticaj veličine legla na procenat primarnih mišićnih vlakana i odnos sekundarna: primarna vlakna, nije ispoljen. 7. Kod tovljenika je ispoljen značajan uticaj pola na telesnu masu i morfološke osobine mišića m semitendinosus. Klanična masa tovljenika muškog pola bila je statistički značajno (Eksperiment 1: p< 0,02, Eksperiment 2: p< 0,0001) veća u odnosu na jedinke ţenskog pola. Nasuprot tome, tovljenici ţenskog pola imali su veće vrednosti mase, duţine, obima i površine poprečnog preseka ovog mišića u odnosu na jedinke muškog pola. 8. Pol je takoĎe ispoljio i statistički značajne efekte na ukupan broj mišićnih vlakana i broj mišićnih vlakana po 1 cm2 površine mišića m semitendinosus tovljenika. MeĎutim, u okviru Eksperimenta 1 veće vrednosti oba parametra uočene su kod jedinki ţenskog pola, dok su u okviru Eksperimenta 2, veći ukupan i broj mišićnih vlakana na 1 cm2 površine mišića zabeleţeni kod tovljenika muškog pola. 9. Uticaj pola, kao jedinog faktora, kao i uticaj interakcije pola i tretmana daidzeinom, nisu se ispoljili na zastupljenost pojedinih tipova mišićnih vlakana u Eksperimentu 1. MeĎutim u Eksperimentu 2, zabeleţen je statistički značajan efekat ove interakcije. Trend smanjenja učešća FTO i povećanja učešća FTG 146 mišićnih vlakana, koji je zabeleţen kao posledica tretmana, ispoljio se, i u ovom slučaju, i kod muţjaka i kod ţenki. 10. Rezultati ove doktorske disertacije ukazali su na marginalni uticaj dodavanja daidzeina u hranu krmača tokom kasne faze suprasnosti, na postanatalni rast i strukturu mišića m semitendinosus, kod potomaka. Istovremeno, otvorena su pitanja stvarne efikasnosti daidzeina, pa ovi rezultati predstavljaju dobru osnovu za dalja istraţivanja, u pravcu odreĎivanja optimalne koncentracije i vremena njegovog davanja suprasnim krmačama. 147 8. Literatura 1. Akyama, T., Ishida, J., Nakagawa, S., Ogawara, H., Watanabe, S., Itoh, N., Shibuya, M., Fukami, Y., 1987. Genistein, a Specific Inhibitor of Tyrosine- specific Protein Kinases. The Journal of Biological Chemistry, 262: 5592-5595. 2. Allen, R. E., Merkel, R. A., Young, R. B., 1979. Cellular aspects of muscle growth: myogenic cell proliferation. Journal of Animal Science, 49: 115-127. 3. Allen, D. L., Monke, S. R., Talmadge, R. J., Roy, R. R., Edgerton, V. R., 1995. Plasticity of myonuclear number in hypertrophied and athrophied mammalian skeletal muscle fibers. J. Appl. Physiol., 78: 1969-1976. 4. Allen, D. L., Roy, R. R., Edgerton, V. R., 1999. Myonuclear domains in muscle adaptation and disease. Muscle Nerve, 22: 1350-1360. 5. Barnes, S., Kirk, M., Coward, L., 1994. Isoflavones and their conjugates in soy foods: exctraction conditions and analysis by HPLC-mass spectrometry. J. Agric. Food Chem., 42: 2466-2474. 6. Beaulieu, A. D., Aalhus, J. L., Williams N. H., Patience J. F., 2010. Impact of piglet birth weight, birth order, and litter size on subsequent growth performance, carcass quality, muscle composition, and eating quality of pork. Journal of Animal Science, 88:2767-2778. 7. Bee, G., 2004. Effect of early gestation feeding, birth weight, and gender of progeny on muscle fiber characteristics of pigs at slaughter. Journal of Animal Science, 82: 826-836. 8. Beermann, D. H., 1983. Effect of maternal dietary restriction during gestation and lactation, muscle, sex and age on various indices of skeletal muscle growth in the rat. Journal of Animal Science, 57(2): 328-337. 9. Beermann, D. H., Fishell, V. K., Roneker, K., Boyd, R. D., Armbruster, G., Souza, L., 1990. Dose-response relationships between porcine somatotropin, muscle composition, muscle fibre characteristics and pork quality. J. Anim. Sci., 68: 2690-2697. 148 10. Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L., 1946. A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia. Aust. J. Agric. Res., 22: 131-138. 11. Berard, J. Kreuzer, M., Bee, G., 2008. Effect of litter size and birth weight on growth, carcass and pork quality, and their relationship to postmortem proteolysis. Journal of Animal Science, 86: 2357-2368. 12. Berard, J. Kreuzer, M., Bee, G., 2009. Effect of birth weight and gender on growth performance and carcass characteristics of pigs originating from large litters. Schriftenreihe aus dem Institut für Nutztierwissenschaften der ETH Zürich. 31, 83-86. 13. Berard, J., Kalbe, C., Loesel, D., Tuchscherer, A., Rehfeldt, C., 2011. Potential sources of early-postnatal increase in myofibre number in pig skeletal muscle. Histochemie, 136: 217-225. 14. Bidner, T. D., Merkel, R. A., Miller, E. R., 1972. Effects of a combination of diethylstilbestrol and methyltestosterone on performance, carcass traits, serum and muscle characteristics of pigs. J. Anim. Sci., 35: 525-533. 15. Brameld, J. M.,Buttery, P. J, Dawson, J. M., Harper, J. M. M., 1998. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proceedings of the Nutrition Society, 57: 207-217. 16. Brameld, J., Fahey, A., Langley-Evans, S., Buttery, P., 2003. Nutritional and hormonal control of muscle growth and fat depostion. Archives of Animal breeding, 46 (special issues), 143-156. 17. Brameld, J., Zoe, T., Daniel, R., 2008. In utero effects on livestock muscle development and body composition. Australian Journal of Experimental Agriculture, 48, 921-929 18. Brandstetter, A. M., Picard, B., Geay, Y., 1998a. Muscle fibre characteristics in four muscles of growing bulls – I. Postnatal differentiation. Livestock Production Science, 53: 15-23. 19. Brandstetter, A. M., B. Picard, Y. Geay., 1998b. Muscle fibre characteristics in four muscles of growing male cattle – II. Effect of castration and feeding level. Livestock Production Science, 53: 25-36. 149 20. Brocks, L., Klont, R. E., Buist, W., De Greef, K., Tieman, M., Engel, B., 2000. The effects of selection of pigs on growth rate vs leaness on histochemical characteristics of different muscles. Journal of Animal Science, 78: 1247-1254. 21. Brooke, M. H., Kaiser K. K., 1970. Muscle fibre types: How many and what kind. Archives of Neurology, 23: 369-379. 22. Brown, S. C., Stickland, N. C., 1994. Muscle at birth in mice selected for large and small body size. Journal of Anatomy, 184: 371-380. 23. Bruusgaard, J. C., Liestol, K., Ekmark, M., Kollstad, K., Gundersen, K., 2003. Number and spatial distribution of nuclei in the muscle fibres of normal mice studied in vivo. J. Physiol, 551: 467-478. 24. Buonomo, F. C., Klindt, J., 1993. Ontogeny of growht hormone (GH), insulin- like growth factors (IGF I and IGF II) and IGF binding protein-2 (IGFBP-2) in genetically lean and obese swine. Domest. Anim. Endocrinol., 10: 257-265. 25. Chang, K. C., Da Costa, N., Blackley, R., Southwood, O., Evans, G., Plastow, G., Wood, J. D., Richardson, R. I., 2003. Relationship of myosin heavy chain fibre types to meat quality traits in traditional and modern pigs. Meat Science, 64: 93-103. 26. Depreux, F. F. S., Grant, A. L., Gerrard, D. E., 2002. Influence of halothane genotype and body-weight on myosin heavy chain composition in pig muscle as related to meat quality. Livestock Production Science, 73: 265-273. 27. Dreyer, J. H., Naude, R. T., Henning, J. W. N., Rossouw, E., 1977: The influence of breed, castration and age on muscle fibre type and diameter in Friesland and Afrikaner cattle. S. Afr. J. Anim. Sci., 7: 171-180. 28. Dwyer, C. M., Stickland, N. C., 1991. Sources of variation in mzofiber number within and between litters of pigs. Animal Production, 52: 527-533. 29. Dwyer, C. M., Stickland, N. C., 1992. Does the anatomical location of a muscle affect the influence of undernutrition on muscle fibre number? Journal of Anatomy, 188: 373-376. 30. Dwyer, C. M., Fletcher, J. M., Stickland, N. C., 1993. Muscle cellularity and postnatal growth in the pig. Journal of Animal Science, 71: 3339-3343. 150 31. Dwyer C. M., Stickland, N. C., Fletcher, J. M., 1994. The influence of maternal nutrition on muscle fibre number development in the porcine fetus and on subsequent postnatal growth. Journal of Animal Science, 72: 911-918. 32. Dwyer, C. M., Madgwick, J. A., Ward, S. S., Stickland, N. C., 1995. Effects of maternal undernutrition in early gestation on the development of fetal myofibres in the guinea-pig. Reproduction, Fertility and Development, 7: 1285-1292. 33. Enns, D. L., Tiidus, P. M., 2010. The Influence of Estrogen on Skeletal Muscles: Sex matters. Sports Medicine 40, number 1: 41-58. 34. Essen-Gustavsson, B., Lindholm, A., 1984. Fiber types and metabolic characteristics in muscles of wild boars, normal and halothane sensitive Swedish Landrace pigs. Comp. Biochem. Physiol., 78A: 67. 35. Essen-Gustavsson, B., 1993. Muscle fiber characteristics in pigs and relationships to meat quality parameters – review. In: E. Puolanne and D. I. Demeyer (Ed.) Pork Quality: Genetic and Metabolic Factors. pp 140-159. CAB International, Wallingford, UK. 36. Etherton, T. D., Bauman, D. E., 1998. Biology of Somatotropin in Growth and Lactation of Domestic Animals. Phisiological Reviews, 78: 745-761. 37. Falconer, D.S., 1981. In: Introduction to Quantitative Genetics. Ronald Press, New York. 38. Fiedler, I., Ender, K., Wicke, M., von Langerken, G., 1993. Relationships between micro-structure of muscle tissue and stress susceptability in Landrace pigs (halothane sensitivity). Arch. Anim. Breed., 36: 525-538. 39. Fiedler, I., Rehfeldt, C., Dietl, G., Ender, K., 1997. Phenotypic and genetic parameters of muscle fiber number and size. Journal of Animal Science, 75 (suppl. 1), 165. 40. Fiedler, I., Ender, K., Wicke, M., Maak, S., von Lengerken, G., Meyer, W., 1999. Structural characteristics of muscle fibres in pigs with different malignant hyperthermia susceptibility and different meat quality. Meat Science, 53: 9-15. 41. Florini J. R., Ewton, D. Z., Magri, K. A., 1991. Hormones, growth factors, and myogenic differentiation. Am. Rev. Physiol., 53: 201-216. 42. Fritsche, S., Steinhart, H., 1999. Occurrence of hormonally active compounds in food: a review. Eur. Food. Res. Technol., 209: 153-179. 151 43. Galler, S., Schmitt, T. L., Pette, D., 1994. Stretch activation, unloaded shortening velocity, and myosin heavy chain isoforms of rat skeletal muscle fibres. Journal of Physiology 478: 513-521. 44. Gatford, K. L., Ekert, J. E., Blackmore, K., De Blasio, M. J., Boyce, J. M., Owens, J. A., Campbell, R. G., Owens, P. C., 2003. Variable maternal nutrition and growth hormone treatment in the second quarter of pregnancy in pigs alter semitendinosus muscle in adolescent progeny. British Journal of Nutrition, 90: 283-293. 45. Gatford, K. L., Boyce, J. M., Blackmore, K., Smits, R. J., Campbell, R. G., Owens, P. C., 2004. Long-term, but not short-term, treatment with somatotropin during pregnancy in underfed pigs increases the body size of progeny at birth. J. Anim. Sci., 82: 93-101. 46. Gauthier, G. F., 1969. On the relationship of ultrastructural and cytochemical features to color in mammalian skeletal muscle. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 95: 462-482. 47. Gondret, F., Lefaucheur, L., Dalbis, A., Bonneau, M., 1996. Myosin isoform transitions in four rabbit muscles during post-natal growth. J. Muscle Res. Cell Motil., 17: 657-667. 48. Gondret, F., Lefaucheur, L., Louveau, I., Lebret, B., Pichodo, X., Le Cozler, Y., 2005. Influence of piglet birth weight on postnatal performance, tissue lipogenic capacity and muscle histological traits at market weight. Livestock Production Science 93: 137-146. 49. Gondret, F., Lefaucheur, L., Juin, H., Louveau, I., Lebret, B., 2006. Low birth weight is associated with enlarged muscle fiber area and impaired meat tenderness of the longissimus muscle in pigs. Journal of Animal Science, 84: 93- 103. 50. Gundersen, K., Bruusgaard, J. C., 2008. Nuclear domains during muscle atrophy: nuclear lost or paradigm lost? J. Physiol., 586: 2675-2681. 51. Guth, L., Samaha, F. J., 1970. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp. Neurol., 28: 365-367. 52. Hancock, D. L., Wagner, J. F., Anderson, D. B., 1991. Effects of estrogens and androgens on animal growth. In: Pearson, A. M and Dutson, T. R. (eds) Growth 152 regulation in Farm Animals, Advances in Meat Research, Elsevier, London, 7: 255-284. 53. Handel, S. E., Stickland, N. C., 1986. Giant muscle fibres in skeletal muscle of normal pigs. Journal of Comparative Pathology, 96: 447-457. 54. Handel, S. E., Stickland, N. C., 1987. The growth and differentiation of porcine skeletal muscle fibre types and the influence of birthweight. Journal of Anatomy, 152: 107-119. 55. Handel, S. E., Stickland, N. C., 1988. Catch-up growth in pigs: A relationship with muscle cellularity. Animal Production, 47: 291-295. 56. Harrison, A. P., Rowlerson, A. M., Dauncey, M. J., 1996. Selective regulation of myofiber differentiation by energy status during postnatal development. Am. J. Physiol., 39: 667-674. 57. Henckel, P., 1995. Perimortal metabolic events and consequences for meat quality. In: Proceedings of 2 nd Dummerstorf Muscle Workshop. Muscle growth and meat quality. FBN Dummerstorf, Rostock, Germany, 77-82. 58. Henckel, P., Oksbjerg, N., Erlandsen, E., Barton-Gade, P., Bejerholm, C., 1997. Histo- and biochemical characteristics of the longissimus dorsi muscle in pigs and their relationship to performance and meat quality. Meat Science, 47: 311- 321. 59. Herpin, P., Lefaucheur, L., 1992. Adaptive changes in oxidative metabolism in skeletal muscle of cold-acclimated piglets. J. Therm. Biol., 17: 277-285. 60. Hilleson-Gayne, C. K., Clapper, J. A., 2005. Effects of decreased estradiol 17β on the serum and anterior pituitary IGF-I system in pigs. Journal of Endocrinology, 187: 369-378. 61. Hossner, K. L., 2005. Hormonal Regulation of Farm Animal Growth. CABI Publishing 62. Jacobs, S. C. J. M., Baer, P. R., Bootsma, A. L., 1996. Effect of hypothyroidism on satellite cells and postnatal fiber development in the soleus muscle of rat. Cell Tissue Res, 286: 137-144. 63. Ji, S., Willis, G. M., Frank, R., Cornelius, S. G., Spurlock, M. E., 1999. Soybean isoflavones, Genistein and Genistin, Inhibit Rat Myoblast Proliferation, Fusion and Myotube Protein Synthesis. J. Nutr., 129: 1291-1297. 153 64. Jiang, Z. Y., Jiang, S. Q., Lin, Y. C., Xi, P. B., Yu, D. Q., Wu, T. X., 2007. Effects of Soybean Isoflavone on Growth Performance, Meat Quality, and Antioxidation in Male Broilers. Poultry Science, 86: 1356-1362. 65. Jones, K. L., Harty, J., Roeder, M. J., Winters, T. A., Banz, W. J., 2005. In vitro effects of soy phytoestrogens on rat skeletal muscle cells. J. Med Food, 8 (3): 327-331. 66. Kadi, F., Eriksson, A., Holmner, S., Butler-Brown, G. S., Thornell, L. E., 1999. Cellular adaptation of the trapezius muscle in strength-trained athletes. Histochem. Cell Bio., 111: 189-195 67. Kalbe, C., Mau, M., Wollenhaupt, K., Rehfeldt, C., 2007. Evidence for estrogen receptor alpha and beta expression in skeletal muscle of pigs. Hostochem. Cell Biol., 127: 95-107. 68. Karlsson, A., Enfaelt, A. C., Essen-Gustavsson, B., Lundstroem, K., Rydhmer, L., Stern, S., 1993. Muscle histochemical and biochemical properties in relation to meat quality during selection for increased lean tissue growth rate in pigs. Journal of Animal Science, 71: 930-938. 69. Karlsson, A., Klont, R. E., Fernandez, X., 1999. Skeletal Muscle Fibres as Factors for Pork Quality. Livestock Production Science, 60: 255-269. 70. Kirchofer, K., Calkins, R., Gwarteny, B., 2002. Fiber-type composition of muscles of the beef chuck and round. J. Anim. Sci., 80: 2872-2878. 71. Klindt, J., Yen, J. T., Buonomo, F. C., Roberts, A. J., Wise, T., 1998. Growth, Body Composition, and Endocrine Responses to Chronic Administation of Insulin-Like Growth Factor I and (or) Porcine Growth Hormone in Pigs. J. Anim. Sci., 76: 2368-2381. 72. Klont, R. E., Brocks, L., Eikelenboom, G., 1998. Muscle fibre type and meat quality. Meat Science, 49: 219-221. 73. Klosowska, D., Fiedler, I., 2003. Muscle fiber typer in pigs of different genotypes in relation to meat quality. Animal Science papers and Reports, 21: 49-60 74. Knizetzova, H., Knize, B., Kopezny, V., Fulka, J., 1972. Concentration of nuclei in chicken muscle fibre in relation to the intensity of growth. Ann. Biol. Anim. Bioch. Biophys., 12: 321-328. 154 75. Komi, P.V., Karlsson, J., 1979. Physical performance, skeletal muscle enzyme activities, and fibre types in monozygous and dizygous twins of both sexes. Acta Physiol. Scand., 462: 1-28. 76. Kosovac, O., Stanišić, N., Ţivković, B., Radović, Č., Pejčić, S., 2008. Kvalitet trupa i mesa svinja različitih genotipova. Biotechnology in Animal Husbandry, 24, 1-2: 77-86. 77. Kuhn, G., Hennig, U., Kalbe, C., Rehfeldt, C., Ren, M.Q., Moors, S., Degen, G.H., 2004. Growth performance, carcass characteristics and bioavailability of isoflavones in pigs fed soybean based diets. Archives of Animal Nutrition 58: 265-276. 78. Kuhn, G., Kanitz, E., Tuchscherer, M., Nuernberg, G., Hartung, M., Ender, K., Rehfeldt, C., 2004. Growth and carcass quality of offspring in response to porcine somatotropin (pST) treatment of sows during early pregnancy. Livestock Prod. Science, 85: 103-112. 79. Kuiper, G. G. J. M., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Nilsson, S., Gustaffson, J. A., 1996a. Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 5925-5930. 80. Kuiper, G. G. J. M., Carlsson, B., Grandien, K., Enmark, E., Haggblad, J., Nilsson, S., Gustaffson, J. A., 1996b. Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogenic receptors α and ß. Endocrinology, 138: 863-870. 81. Kuiper, G. G. J. M., Lemmen, J. G., Carlsson, B., Corton, J. C., Safe, H. S., Van Der Saag, P. T., Van Der Burg, B., Gustaffson, J. A., 1998. Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor ß. Endocrinology, 139: 4252-4263. 82. Larzul, C., Lefaucheur, L., Ecolan, P., Gogue, J., Talmant, A., Sellier, P., Monin, G., 1997. Phenotypic and genetic parameters for Longissimus muscle fiber characteristics in relation to growth, carcass and meat quality traits in Large White pigs. Journal of Animal Science, 75: 3126-3137. 83. Lee, C. Y., Ha, S. H., Baik, K. H., Sohn, S. H., Park, B. C., Park, M. J., 2005. Effects of estradiol implantation on growth, carcass traits and circulating 155 concentrations of insulin like growth factors (IGFs) and IGF-binding protein-3 in finishing barrows. Livestock Prod. Sci., 96: 149-155. 84. Lefaucheur, L. A, 1989. Influence d’une restriction alimentaire sur la composition de la carcasse et quelques caracteristiques musculaires chez le porc. D. E. A. thesis, University of Clermont II, Clermont-Ferrand, France 85. Lefaucheur, L. A., 1990. Changes in muscle fiber populations and muscle enzyme activities in the primiparous lactating sow. Reprod. Nutr. Dev., 30: 523- 531. 86. Lefaucheur, L., Hoffman, R. K., Gerrard, D. E., Okamura, C. S., Rubinstein, N., Kelly, A., 1998. Evidence for Three Adult Fast Myosin Heavy Chain Isoforms in Type II Skeletal Muscle Fibers in Pigs. Journal of Animal Science, 76: 1584- 1593. 87. Lefaucheur, L., Gerrard, D., 2000. Muscle fiber plasticity in farm mammals. Journal of Animal Science, 77: 1-19. 88. Lefaucheur, L., Ecolan P., Barzic, Y., Marion, J., Dividich, J., 2003. Early postnatal food intake alters myiofiber maturation in pig skeletal muscle. Journal of Nutrition, 133: 140-147 89. Lefaucheur, L., Milan, D., Ecolan, P., Le Callennec, C., 2004. Myosin heavy chain composition of different skeletal muscles in Large White and Meishan pigs. Journal of Animal Science, 82: 1931-1941. 90. Lengerken, G., Wicke, M., Maak, S., 1997. Stress susceptibility and meat- quality situation and prospects in animal breeding and research. Arch. Anim. Breed., 40 (suppl.): 163-171. 91. Liu, G. T., Zheng, Y. L., Chen, W. H., Chen, J., Han, Z. K., 1999. Effect of daidzein fed to pregnant sows on milk production and the levels of hormones in colostrums. Journal of Nanjing Agricultural University, 22: 69-72. 92. Locknisar, F., Holcman, A., Zagozen, F., 1980. Muscle fiber investigations in poultry. Zbornik Biotehniske Fakultete Universe v Ljubljani Kmetiljstvo (Zivinoreja), 35: 7–24 93. Lossec, G., Ecolan, P., Herpin, P., Lefaucheur, L., 1998. Influence of environmental temperature on maturation of skeletal muscle during the early postnatal period in pig. J. Anim. Sci., 76 (Suppl. 1): 132 (abstr.) 156 94. Lyons, G. E., Kelly, A. M., Rubinstein, N., 1986. Testosterone-induced changes in contractile protein isoforms in the sexually dimorphic temporalis muscle of guinea pigs. J. Biol. Chem., 261: 13278-13284. 95. Maltin, C. A., Warkup, C. C., Matthews, K. R., Grant, C. M., Porter, A. D., Delday, M. I., 1997. Pig muscle fibre characteristics as a source of variation in eating quality. Meat Science, 47: 237-248. 96. Mascarello, F., Stecchini, M. L., Rowlerson, A. and Ballocchi, E. (1992) Tertiary myotubes in postnatal growing pig muscle detected by their myosin isoform composition. Journal of Animal Science 70, 1806–1813. 97. Mathews, L. S., Hammer, R. E., Behringer, R. R., D’Ercole, A. J., Bell, G. I., Brisnter, R. L., Palmiter, R. D., 1988. Growth enhancement of transgenic mice expressing human insulin-like growth factor I. Endocrinology, 123: 2827-2833. 98. Mau, M., Kalbe, C., Viergutz, T., Nuernberg, G., Rehfeldt, C., 2008. Effects of Dietary Isoflavones on Proliferation and DNA Integrity of Myoblasts Derived from Newborn Piglets. Pediatric Research, 63: 39-45. 99. Mauro, A., 1961. Satellite cell of skeletal muscle fibers. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology 9: 493-495. 100. McCall, G. E., Allen, D. L., Linderman, J. L., Grindeland, R.E., Roy, R. R., Mukku, V. R., Edgerton, V. R., 1998. Maintenance of myonuclear domain size in rat soleus after overload and growth hormone/IGF I treatment. J. Appl. Physiol., 84: 1407-1412. 101. McPherron, A.C., Lee, S. J., 1997. Double muscling in cattle due to mutations in myostatin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12457-12461. 102. Muscat, G. E., Downes, M., Dowhan, D., 1995. Regulation of vertebrate muscle differentiation by thyroid hormone: the role of the MyoD gene family. Bioessays 17: 211-218. 103. Nakamura T., Masui, S., Wada, M., Kotoh, H., Mikami, H., Katsuta, S., 1993. Heredity of muscle fibre type composition estimated from a selection experiment in rats. Eur. J. Appl. Physiol., 66: 85-89. 104. Nikolić, Z., Vitorović, D., 1998. Muscle growth in light and heavy type of chickens. Acta Veterinaria, vol.48, No. 5-6, 303-308. 157 105. Nissen, P.M., Danielsen, V. O., Jorgensen, P.F., Oksbjerg, N., 2003. Increased maternal nutrition of sows has no beneficial effects on muscle fiber number or postnatal growth and has no impact on the meat quality of the offspring. Journal of Animal Science, 81: 67-76. 106. Nissen, P. M., Jorgensen, P. F., Oksbjerg, N., 2004. Within-litter variation in muscle fibre characteristics, pig performance and meat quality traits. Journal of Animal Science, 82: 414-421. 107. Novikoff, A. B., Shin, W., Drucker, J., 1961: Mitochondrial localization of oxidative enzymes staining results with two tetrazolium salts. Journal of Biophysics Biochemistry and Cytology, 9: 47-61. 108. Ontell, M., Kozeka, K., 1984. Organogenesis of the mouse extensor digitorum longus muscle: a quantitative study. American Journal of Anatomy, 171: 149- 161. 109. Osterc, J., 1974. Diameter and number of muscle fibers in musculus longissimius dorsi in connection with production properties of some cattle breeds. PhD Thesis, University of Ljubljana, pp 1-67. 110. Owens, P. C., Gatford, K. L., Walton, P. E., Morley, W., Campbell, R. G., 1999. The Relationship Between Endogenous Insulin-like Growth Factors and Growth in Pigs. J. Anim. Sci., 77: 2098-2103. 111. Payne, R. L., Bidner, T. D., Southern, L. L., Geaghan, J. P., 2001. Effects of dietary soy isoflavones on growth, carcass traits and meat quality in growing- finishing pigs. J. Anim. Sci., 79: 1230-1239. 112. Petersen, J. S., Henckel, P., Oksbjerg, N., Sorensen, M. T., 1998. Adaptations in muscle fiber characteristics induced by physical activity in pigs. Animal Science, 66: 733-740. 113. Petrović, M., Radojković, D., Mijatović, M., 2005. Current condition in pig production and potentials for development. Biotechnology in Animal Husbandry, 21: 155-159. 114. Perre, M. C., Etienne, M., 2000. Uterine blod flow in sows: Effects of pregnancy stage and litter size. Reproduction, Nutrition, Development, 40: 369-382. 115. Pette, D., Staron, R. S., 2000. Myosin isoforms, Muscle Fibre Types, and Transitions. Microscopy Research and Technique, 50: 500-509. 158 116. Picard, B., Lefaucheur, L., Berri, C., Duclos M., 2002. Muscle fibre ontogenesis in farm animal species. Reproduction Nutrition Development, 42, 415-431. 117. Poleksić, V., Bogojević, J., Marković, Z., Dulić Stojanović, Z., 2003. Zoologija. Poljoprivredni fakultet. Beograd 118. Quiniou, N., Dagorn, J., Gaudre, D., 2002. Variation of piglets’ birth weight and consequences on subsequent performance. Livestock Production Science, 78: 63-70. 119. Rahelic, S., Puac, S., 1981. Fiber types in longissimus dorsi from wild and highly selected pig breeds. Meat Science, 5: 439-450. 120. Rede, R., Pribisch, V., Rahelic, S., 1986. Untersuchungen ueber die Beschaffenheit von Schlachttierkoerpern und Fleisch primitiver und hochselektierter Schweinerassen. Fleischwirtsch., 66: 898. 121. Reggiani, C., Mascarello, F., 2004: Fibre type identification and functional characterization in adult livestock animals. Muscle Development of Livestock Animals – Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, 39-68. 122. Rehfeldt, C., Fiedler, I., Wegner, J., 1987: Veraenderungen der Mikrostruktur des Muskelgewebes bei Labormaeusen, Rindern und Schweinen waehrend des Wacshtums. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 101: 669-680. 123. Rehfeldt, C., Buenger, L., Dietl, G., Fiedler, I., Wegner, J., 1988. On the heritability of muscle structure in response to selection for growth and fitness- studies on laboratory mice. Arch. Anim. Breed., 5: 465-475. 124. Rehfeldt, C., Fiedler, I., Weikard, R., Kanitz, E., Ender, K., 1993. It is possible to increase skeletal muscle fibre number in utero. Biosci. Rep., 13: 213-220. 125. Rehfeldt, C., Stickland, N. C., Fiedler, I., Wegner, J., 1999. Environmental and genetic factors as sources of variation in skeletal muscle fibre number. Basic Appl. Myol. 9 (5): 235-253. 126. Rehfledt, C., Fiedler, I., Dietl, G., Ender, K, 2000: Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection. Livestock Production Science, 66: 177-188. 127. Rehfeldt, C., Kuhn. G., Vanselow, J., Fuerbass, R., Fiedler, I., Nuernberg, G., Clelland, C. A., Stickland, N. C., Ender, K., 2001a. Maternal treatment with 159 somatotropin during early gestation affects basic events of myogenesis in pigs. Cell Tissue Res., 306: 429-440. 128. Rehfeldt, C., Kuhn, G., Nuernberg, G., Kanitz, E., Schneiders, F., Beyer, M., Nuernberg, K., Ender, K., 2001b. Effects of exogenous somatotropin during early gestation on maternal performance, fetal growht, and compositional traits in pigs. J. Anim. Sci., 79: 1789-1799. 129. Rehfeldt, C., Kuhn, G., 2006. Consequences of birth weight for postnatal growth performance and carcass quality in pigs as related to myogenesis. J. Anim. Sci., 84: 113-124. 130. Rehfeldt, C., Henning, M., Fiedler, I., 2008. Consequences of pig domestication for skeletal muscle growth and cellularity. Livestock Science, 116: 30-41. 131. Rehfeldt, C., Kalbe, C., Nuernberg, G., Mau, M., 2009. Dose-Dependant Effects of Genistein and Daidzein on Protein Metabolism in Porcine Myotube Cultures. J. Agric. Food. Chem. 57, 852-857. 132. Rehfeldt, C., Lefaucheur, L., Block, J., Stabenow, B., Pfuhl, R., Otten, W., Metges, C., Kalbe, C., 2012. Limited and excess protein intake of pregnant gilts differently affects body composition and cellularity of skeletal muscle and subcutaneus adipose tissue of newborn and weanling piglets. European Journal of Nutrition, 51: 151-165. 133. Reinli, K., Block, G., 1996. Phytoestrogen content of foods – compendium of literature values. Nutr. Cancer, 26: 123-148. 134. Rempel, L. A., Clapper, J. A., 2002. Administration of estradiol-17beta increases anterior pituitary IGF-I and relative amounts of serum and anterior pituitary IGF- binding proteins in barrows. Journal of Animal Science, 80: 214-224. 135. Ren, M. Q., Kuhn, G., Wegner, J., Chen, J., 2001. Review: Isoflavones, substances with multi-biological and clinical properties. Eur. J. Nutr., 40: 135- 146. 136. Romeis, B., 1989. Mikroskopische Technik. P. BÖCK (Ed.), Urban & Schwarzenberg (696pp), München. 137. Ross, M. H., Pawlina, W., 2006. Histology: A Text and Atlas: With Correlated Cell and Molecular Biology. Lippincott Williams & Wilkins, Fifth Edition. 160 138. Rosser, B. W. C., Bandman, E., 2003. Heterogenity of protein expresion within muscle fibers. Journal of Animal Science, 81: 94-101. 139. Rowe, R. W. E., Goldspink, G., 1969. Muscle fibre growth in five different muscle in both sexes of mice. Journal of Anatomy, 104: 519-530. 140. Sazil, A., Parr, T., Sensky, P., Jones, S., Bardsley, R., Buttery, P., 2005. The relationship between slow and fast myosin heavy chain content, calpastin and meat tenderness in different ovine skeletal muscle. Meat Science, 69,1,17-25. 141. Schiaffino, S., Reggiani, C., 1994. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. Journal of Applied Physiology, 77: 493-501. 142. Schiaffino, S., Reggiani, C., 1996. Molecular diversity of myofibrillar proteins: Gene regulation and functional significance. Physiol. Rev., 76: 371-423. 143. Setchell, K. D. R., Cassidy, A., 1999. Dietary Isoflavones: Biological Effects and Relevance to Human Health. Journal of Nutrition, 129: 758-767. 144. Setchell, K., 1998. Phytoestrogens: the biochemistry, physiology and implications for human health of soy isoflavones. Am. J. Clin. Nutr., 68: 1333- 1346. 145. Solomon, M. B. , Moody, W. G., Kemp, J. D., Ely, D. G., 1981. Effect of breed, slaughter weight and sex on histological properties of ovine muscle. Journal of Animal Science, 52: 1019-1025. 146. Solomon, M. B., West, R. L., 1985. Profile of fiber types in muscles from wild pigs native to the United States. Meat Science, 13: 247-254. 147. Solomon, B., Dunn, C., 1988. Simultaneous histochemical determination of three fiber types in single section of ovine, bovine and porcine skeletal muscle. Journal of Animal Science, 66: 255-264. 148. Sosnicki, A. A., Pommier, S., Klont, E. R., Newman, S., Plastow, G., 2003. Best-cost production of high quality pork: Bridging the gap between pig genetics, muscle biology/meat science and consumer trends. Proceedings of Manitoba Pork Seminar. 149. Sosnicki, A. A., Newman, S., 2010. The support of meat value chains by genetic technologies. Meat Science, 86: 129-137. 150. Stamenković, T., Milićević, D., Dević, B., 2008. Proizvodnja svinjskog mesa u svetu i njene tendencije. Tehnologija mesa 49, 1-2: 67-72. 161 151. Staun, H., 1963. Various factors affecting number and size of muscle fiber in the pig. Acta Agric. Scand., 13: 293-322. 152. Staun, H., 1972. The nutritional and genetic influence on number and size of mucle fibres and their response to carcass quality in pigs. World Rev. Anim. Prod., 8: 18-26. 153. Stickland, N. C., Handel, S. E., 1986. The number and types of muscle fibers in large and small breeds of pigs. Journal of Anatomy. 147: 181-189. 154. Szentkuti, L., Schlegel, O., 1985. Genetic and functional influences on fibre type proportions and fibre diameter in m. longissimus dorsi and m. semitendinosus of pigs. Studies on trained domestic pigs and restrained wild type pigs. Dtsch. Tierarztl. Wschr, 92: 93-97. 155. Swatland, H. J., Cassens, R. G., 1973. Prenatal development, histochemistry and innervation of porcine muscle.Journal of Animal Science 36:343-354. 156. Te Paas, M. F. W., Everts, M. E., Haagsman, H. P., 2004. Muscle Development of Livestock Animals. Physiology, Genetics and Meat Quality. CABI Publishing, Wallingford, Oxfordshire, UK. 157. Tham, D.M., Gardner, C. D., Haskell W. L., 1998. Potential Health Benefits of Dietary Phytoestrogens: A Review of the Clinical, Epidemiological and Mechanistic Evidence. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 83: 2223-2235. 158. Thomas, M., Langley, B., Berry, C., Sharma, M., Kirk, S., Bass, J., Kambadur, R., 2000. Myostatin, a negative regulator of muscle growth, functions by inhibiting myoblast proliferation. The Journal of Biological Chemistry, vol 275, No 51: 40235-40243. 159. Town, S., Putman, C., Turchinsky, N., Dixon, W., Foxroft, G., 2004. Number of conceptuses in utero affects porcine fetal muscle development. Reproduction, 128, 443-454. 160. Tsai, W. J. A., McCormick, K. M., Brazeau, D. A., Brazeau, G. A., 2007. Estrogen Effects on Skeletal Muscle Insulin-Like Growth Factor 1 and Myostatin in Ovariectomized Rats. Exp. Biol. Med., 232: 1314-1325. 162 161. Tunell, G., Hart, M. N., 1977. Simultaneus Determination of Skeletal Muscle Fiber, Types I, IIA and IIB by Histochemistry. Archives of Neurology, 34: 171- 173. 162. Ušćebrka, G., Stojanović, S., Ţikić, D., Kanački, Z., 2008. Morfodynamics of skeletal musculature of birds. Savremena poljoprivreda, 57, 1-2, 44-50. 163. Van der Wal P.G., De Vries, A. G., Eikelenboom, G., 1995. Predictive value of slaughterhouse measurements of ultimate pork quality in seven halothane negative Yorkshire populations. Meat Science 40, 183-191. 164. Velotto, S., Vitale, C., Stassi, T., Crasto, A., 2010. New Insights into Muscle Fibre Types in Casertana Pig. Acta Vet. Brno, 79: 169-176. 165. Wegner, J., Albrecht, E., Fiedler, I., Teuscher, F., Papstein, H. J., Ender, K., 2000. Growth and breed related changes of muscle fibre characteristics in cattle. Journal of Animal Science, 78: 1485-1496. 166. Weiss, A., Leinwand, L., 1996. The mamalian myosin heavy chain gene family. Annual Review of Cell and Developmental Biology, 12: 417-439. 167. Wicke, M., 1989. Influences of a divergent selection for muscle structure characteristics of m. longissimus dorsi on stress susceptibility and carcass quality in pigs. PhD Thesis, University of Leipzig, Germany, pp 1-115. 168. Wicke, M., Lengerken, G., Fiedler, I., Altmann, M., Ender, K., 1991. Effects of selection for muscle structure characteristics of m. longissimus dorsi on stress susceptibility and meat quality in pigs. Fleischwirtschaft, 71: 437-442. 169. Wigmore, P. M., Stickland, N. C., 1983. Muscle development in large and small pig fetuses. Journal of Anatomy. 137: 235-245. 170. Wiik, A., Ekman, M., Johansson, O., Jansson, E., Esbjornsson, M., 2009. Expression of both oestrogen receptor alpha and beta in human skeletal muscle tissue. Histochem. Cell Biol., 131: 181-189. 171. Williams, P., Goldspink, G., 1971. Longitudinal growth of striated muscle fibers. J. Cell Sci., 9: 751-767. 172. Zhu, M. J., Ford, S. P., Means, W. J., Hess, B. W., Nathanielsz, P. W., Du, M., 2006. Maternal nutrient restriction affects properties of skeletal muscle in offspring. J. Physiol. 575: 241-250. 163 173. Zochowska, J., Lachowicz, K., Gajowiecki, L., Sobzak, M., Kotowicz, M., Zych, A., 2005. Effect of carcass weight and muscle on texture and myiofibrile characteristics of wild boar meat. Meat Science 71, 244-248. http://poljoprivreda.info/?oid=6&id=666 http://training.seer.cancer.gov/images/anatomy/muscular/muscle_structure.jpg http://1.bp.blogspot.com/_1MW6Tajv9y0/S- dn2Wi2sDI/AAAAAAAAAA4/TwvE6a74DYM/s400/muscle.gif http://www.amtimaging.com/www11/src_gallery/gallery_2012/xr16m_2012/041_ striatedmuscle.jpg http://www.sciencephoto.com/image/303273/large/P1550028- Primate_Skeletal_Muscle-SPL.jpg http://www.bionalogy.com/skeletal_system_files/image002.jpg http://www.occupyforanimals.org/uploads/7/7/3/5/7735203/9149001_orig.jpg 164 8. Biografija autora Ivana Adamović roĎena je 1976. godine u Beogradu. Završila je Poljoprivredni fakultet, Odsek za stočarstvo 2000. godine, sa prosečnom ocenom u toku studija 9,17. Boravila je na stručnoj praksi u Norveškoj 1999. i 2001. godine. Upisala je poslediplomske studije na Poljoprivrednom fakultetu 2000. godine na grupi Fiziologija i ishrana domaćih ţivotinja. U skladu sa reformom studija prema Bolonjskoj konvenciji, sa magistarskih studija upisala se na doktorske studije, studijski program Zootehnika, školske godine 2006/2007. Tokom studija bila stipendista Republičke Fondacije za razvoj naučnog i umetničkog podmlatka (1997/98), stipendista Srpske Akademije Nauka i Umetnosti (1998-2001). Septembra 2000. godine bila meĎu 1000 dobitnika stipendije "Stipend for the Promising Generation" koju je dodeljivala ambasada Kraljevine Norveške. Od 1.10.2001. godine zaposlena kao asistent na predmetu Anatomija domaćih i gajenih ţivotinja, na odseku za Zootehniku, Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu. U toku oktobra 2002., a zatim januara i februara 2004. godine boravi na “Institute for the Biology of Farm Animals, Department of Muscle Biology and Growth”, Dummerstorf, Nemačka, radi stručnog usavršavanja iz oblasti mikrostrukture mišića i kvaliteta mesa svinja. Koautor je 20 radova objavljenih u domaćim i stranim naučnim časopisima, od kojih su tri rada iz grupe M20. Tečno govori engleski jezik, sluţi se nemačkim jezikom. 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.