UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Dejan S. Pljevljakušić UTICAJ USLOVA GAJENJA NA MORFOLOŠKE I HEMIJSKE OSOBINE I BIOLOŠKE EFEKTE EKSTRAKATA Arnica montana L. doktorska disertacija Beograd, 2012 UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET Dejan S. Pljevljakušić UTICAJ USLOVA GAJENJA NA MORFOLOŠKE I HEMIJSKE OSOBINE I BIOLOŠKE EFEKTE EKSTRAKATA Arnica montana L. doktorska disertacija Beograd, 2012 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Dejan S. Pljevljakušić INFLUENCE OF GROWING CONDITIONS ON MORPHOLOGICAL AND CHEMICAL PROPERTIES AND BIOLOGICAL EFFECTS OF EXTRACTS OF Arnica montana L. Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 Svom mentoru, redovnom profesoru dr Zori Dajić-Stevanović, izražavam veliku zahvalnost na sveobuhvatnom angažovanju i podršci, vrednim savetima i stručnoj pomoći tokom izrade ove disertacije. Profesoru emeritusu dr Slobodanu Milosavljeviću, naučnom savetniku dr Dragoju Radanoviću, naučnom savetniku dr Nebojši Menkoviću, vanrednom profesoru dr Slavici Jelačić, kao i višem naučnom saradniku dr Teodori Janković najiskrenije se zahvaljujem na svestranoj stručnoj pomoći, korisnim sugestijama i podršci u toku izrade ovog rada. Najtoplije se zahvaljujem mr Bertalanu Galabošiju na poslatom semenskom materijalu, dipl. inž. Sreti Brkiću na pomoći u proizvodnji rasada, šum. teh. Branki Spasojević i celoj radnoj ekipi rasadnika NP „Tara“ na vremenu i energiji uloženoj u realizaciju poljskog ogleda, vanrednom profesoru dr Svetlani Antić-Mladenović na hemijskim analizama zemljišta i stajskog đubriva, stručnom saradniku dipl. biol. Radenku Radoševiću, dipl. biol. Milošu Bokorovu i dr Dragani Rančić na mikrografijama, mr Miroslavu Novakoviću, mr Aleksandru Nešiću i dr Dejanu Gođevcu na izolovanju i identifikaciji flavonoidnih jedinjenja, mr Ljubodragu Vujisiću i mr Mihailu Ristiću na pomoći u identifikaciji hemijskih profila etarskih ulja, mr Milki Jadranin na pomoći u tečno-masenoj hromatografiji, dipl. farm. Gordani Zdunić i mr Tatjani Stević na pomoći oko određivanja bioloških efekata, naučnom savetniku dr Katarini Šavikin na korisnim savetima u vezi izrade teze, dipl. inž. Milovanu Jezdiću i dipl. inž. Damiru Beatoviću na pomoći u merenjima na ogledu, farm. teh. Snežani Vild na tehničkoj pomoći u laboratoriji. Svim kolegama iz Instituta za proučavanje lekovitog bilja "Dr Josif Pančić", koji su mi svako na sebi svojstven način pomogli u izradi ovog rada, dugujem veliku zahvalnost. Najveću zahvalnost dugujem mojoj supruzi na strpljenju, roditeljima na omogućenom školovanju, mom bratu i prijateljima koji su mi se našli kada mi je bilo najpotrebnije tokom izrade ove disertacije. Poljoprivredni fakultet-Beograd Mentor: Redovni profesor, dr Zora Dajić-Stevanović, Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet _______________________________ Članovi komisije: Profesor emeritus, dr Slobodan Milosavljević, Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet _______________________________ Naučni savetnik, dr Nebojša Menković, Institut za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ Beograd _______________________________ Vanredni profesor, dr Slavica Jelačić, Univerzitet u Beogradu, Poljoprivredni fakultet _____________________________ Viši naučni saradnik, dr Teodora Janković, Institut za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ Beograd _______________________________ Datum odbrane:____________________ Rezime Doktorska disertacija Uticaj uslova gajenja na morfološke i hemijske osobine i biološke efekte ekstrakata Arnica montana L. - Rezime - Arnica montana L. (Asteraceae) je višegodišnja planinska biljka čije se cvetne glavice (Arnicae flos) uglavnom koriste za spoljašnju upotrebu kod modrica i uganuća u fitofarmaceutskim preparatima kao što su masti, kreme i gelovi. Do pre par godina svetsko tržište pomenute sirovine je zadovoljavano isključivo iz spontanog resursa, ali su biljne populacije, zbog prekomernog sakupljanja, znatno degradirane, zbog čega je u većini evropskih zemalja stavljena zabrana za njeno dalje sakupljanje iz prirode. Obzirom da tražnja za ovom sirovinom na tržištu ne opada, kultivacija arnike se nameće kao jedino održivo rešenje zadovoljenja potreba farmaceutske industrije. Budući da A. montana (narodni naziv – arnika) nije autohtona biljna vrsta za područje Srbije, iako se spontano javlja u planinskim oblastima nekih susednih zemalja i Balkanskog poluostrva uopšte, cilj ovih istraživanja je bio da se iznađe tehnološko rešenje njivske proizvodnje na osnovu ispitivanja uticaja vremena zasnivanja, primene đubrenja i tipa sadnica. U istraživanju su pored cvetne glavice, kao glavne droge, posmatrani i podzemni organi arnike: rizom i koren, kao sporedne sirovine. Prva faza eksperimentalnog rada obuhvatila je trogodišnji tro-faktorijalni poljski ogled načina proizvodnje arnike, pri čemu su se kao faktori ispitivali: vreme zasnivanja useva (prolećna i jesenja sadnja), đubrenje (stajnjak i NPK) i način zasnivanja useva (iz semena i klonskom propagacijom – deobom bokora). U drugoj fazi eksperimenta, izvršena je karakterizacija sirovine u smislu njene brze identifikacije, hromatografskim tehnikama identifikovani su prisutni sekundarni metaboliti i određen njihov sadržaj u ispitivanim uzorcima i testirani su biološki efekti odabranih ekstrakata. Ispitivanja su vršena na ogledu postavljenom 2008. godine na lokalitetu Kaluđerskih bara (1008 m n.v.), na planini Tara, u krugu rasadnika Nacionalnog Parka „Tara“. Obzirom na to da arnika prvu vegetaciju provodi u fazi rozete sva merenja morfoloških parametara, prinosa i hemijskih karakterizacija sirovina vršena su tokom 2009. i 2010. godine. Na ogledu su praćeni sledeći parameri: prečnik rozete, visina cvetnog izdanka, broj cvetnih izdanaka, broj cvetnih glavica, prečnik cvetne glavice, broj sekundarnih rozeta. Određeni su sledeći prinosi: prinos cvetne glavice, prinos Rezime Doktorska disertacija rizoma, prinos korena i prinos etarskog ulja (rizoma i korena). U okviru identifikacije biljne sirovine izvršena je poredbena mikroskopska analiza i određen hemijski profil tankoslojnom hromatografijom droge Arnicae flos u odnosu na moguće falsifikate: cvetne glavice biljaka Calendula officinalis i Doronicum columnae. U cilju lokalizacije i određivanja mehanizama ekskrecije etarskog ulja u rizomu i korenu arnike, izvršena je: mikroskopska analiza ultra-tankih preseka pod svetlosnim mikroskopom, ispitivana je fluorescencija i urađeno više različitih histohemijskih bojenih testova, pripremljeni su i analizirani preseci skenirajućom i transmisionom elektronskom mikroskopijom. Hemijska karakterizacija cvetnih glavica arnike obuhvatila je kvalitativnu i kvantitativnz analizu sekundarnih metabolita iz grupe seskviteprenskih laktona i fenolnih jedinjenja (fenolne kiseline i flavonoidi). U okviru hemijske karakterizacije etarskog ulja rizoma i korena izvršena je identifikacija i kvantifikacija glavnih komponenti. Od svih varijanti faktora indukovanih na ogledu, varijanta prolećne sadnje sadnica iz vegetativne propagacije se pokazala kao nepoželjna. Kod ove varijante došlo je do cvetanja velikog broja biljaka odmah nakon sadnje, što je uslovilo iscrpljivanje potencijala biljke na formiranje cvetonosne stabljike, cveta i ploda. Ova pojava je, kako je pokazano u narednoj godini, bila posledica uznapredovale generativne faze razvića biljaka u trenutku rasađivanja. Kao posledica slabog ukorenjavanja biljke ove varijante su u velikoj meri uginule, a preživele biljke su se slabije razvile. Vrednosti dobijene sa ove varijante zastupljene su u statističkim analizama, ali nisu uzimane u obzir za poređenje sa literaturnim podacima. Faktor vremena sadnje je bio statistički značajan za sve merene parametre osim za prinos korena u 2009. i prinos rizoma u 2010. godini. Takođe je variranje faktora vrste sadnica imalo statistički značajan uticaj na sve merene parametre, osim na prinos rizoma i korena u 2009. godini i prinos rizoma i prečnik cvetne glavice u 2010. godini. Faktor vrste đubrenja je imao statistički značajan uticaj na variranje vrednosti gotovo svih morfoloških parametara, ali su statistički značajne faktorske interakcije u većini slučajeva prikrivale doprinos unetih hraniva, tako da se diskusija o značajnosti tretmana đubrenja u gajenju arnike morala rasčlaniti na pojedinačne varijante vrste sadnica i vremena sadnje. Vrednosti prečnika rozete su se kretale od 12,4 – 23,4 cm (14,5 – 28,2 cm) u drugoj (odnosno trećoj) vegetaciji. Visina cvetnih izdanaka se kretala od 20,5 – 34,1 cm Rezime Doktorska disertacija (25,5 – 41,7 cm), dok su se prosečne vrednosti broja cvetnih izdanaka kretale od 1,5 – 5,0 (2,4 – 12,6). Broj cvetnih glavica po biljci je varirao od 7,2 – 16,3 (8,4 – 38,9), prečnik cvetnih glavica se kretao od 6,0 – 7,5 cm (6,4 – 9,1 cm), a broj sekundarnih rozeta od 5,7 – 18,3 (25,3 – 35,4). Prinos cvetnih glavica se kretao od 59,8 – 143,5 kg/ha (116,2 – 258,7 kg/ha), prinos rizoma od 106,3 – 373,7 kg/ha (475,9 – 897,5 kg/ha), a prinos korena od 194,3 – 426,4 kg/ha (420,9 – 615,0 kg/ha). Sadržaj etarskog ulja se u rizomu kretao od 4,0 – 4,8% (2,1 – 3,1%), dok je u korenu bio od 1,1 – 3,2% (1,7 – 2,4%). Mikroskopskim snimanjem samlevenog biljnog materijala pod različitim uveličanjima ustanovljena je jednostavna procedura identifikacije cveta arnike u odnosu na dva pretpostavljena falsifikata. Tako, pored ostalih karakterističnih detalja, cvetne glavice arnike i D. columnae sadrže vidljive i lako prepoznatljive papuse, za razliku od C. officinalis, dok se po debljini papusi arnike (69±16 μm) mogu razlikovati od papusa D. columnae (30±7 μm). Analizom hromatograma dobijenih tankoslojnom hromatografijom pouzdano se može identifikovati cvetna glavica nevena koji se od ostale dve vrste razlikuje po prisustvu zone izražene narandžaste fluorescencije u donjoj polovini hromatograma na Rf ~ 0,4. Ova zona po položaju odgovara rutinu u smeši standarda, a odsutna je u uzorcima cvetnih glavica A. montana i D. columnae. U uzorku A. montana jasno se uočava još jedna zona narandžaste fluorescencije na Rf ~ 0,65 koja je potpuno odsutna u uzorku C. officinalis i jedva primetna u uzorku D. columnae. Ova zona po položaju i fluorescenciji odgovara standardu izokvercitrina. Seskviterpenski laktoni prisutni u cvetnoj glavici arnike su identifikovani i određen je njihov ukupni sadržaj izražen kao dihidrohelenalin tiglat (DHHT), koji se u 2009. godini kretao od 7,9 – 13,2 mg/g, a u 2010. godini od 4,6 – 13,9 mg/g. U obe posmatrane godine biljna sadržaj seskviterpenskih laktona u drogi Arnicae flos je bio veći od minimuma (4 mg/g) koji propisuje Evropska farmakopeja 6.0. U uzorcima cvetne glavice arnike identifikovano je pet fenolnih jedinjenja i određen sadržaj jedne fenolne kiseline (hlorogenska kiselina) i dva dominantna flavonoida (kvercetin-3-O- glukozida i kemferol-3-O-glukozida). Sadržaj hlorogenske kiseline se kretao od 3,1 – 6,0 mg/g (1,9 – 6,57 mg/g) u drugoj (odnosno trećoj) vegetaciji, kvercetin-3-O- glukozida od 8,4 – 13,9 mg/g (7,8 – 12,5 mg/g), a kemferol-3-O-glukozida od 2,1 – 4,7 mg/g (2,1 – 4,5 mg/g). U hemijskom profilu etarskog ulja rizoma i korena dominantno Rezime Doktorska disertacija (ca. 80%) su bili zastupljeni derivati timola i to prvenstveno 2,5-dimetoksi-p-cimen (28,9 – 40,7%) i timol metil etar (9,6 – 27,2%). U ispitivanju antioksidativne aktivnosti ekstrakata cvetnih glavica arnike veću sposobnost neutralizacije DPPH radikala imao je ekstrakt sa maksimalnom vrednošću sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona u odnosu na ekstrakt sa minimalnom vrednošću, dok su razlike u antioksidativnoj aktivnosti esktrakata sa maksimalnom i minimalnom vrednošću sume sadržaja tri kvantifikovana fenolna jedinjenja bile neznatne. Testirani ekstrakti ispoljili su i antimikrobnu aktivnost, gde su se minimalne vrednosti za inhibiciju rasta devet sojeva bakterija i jednog kvasca kretale od 2 – 15 μl/ml. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja je bila selektivna, gde su MIC vrednosti za određene mikroorganizme (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus flavus, Listeria monocytogenes i Salmonella enteritidis) bile izuzetno male (5 μl/ml), dok je kvasac Candida albicans bio visoko rezistentan na sva testirana etarska ulja (MIC koncentracija kretala se i do 83 μl/ml). Plantažnim gajenjem arnike u agroekološkim uslovima Srbije može se dobiti do 300 kg/ha kvalitetne sirovine Arnicae flos i oko 1000 kg/ha podzemnih organa iz kojih se može destilacijom dobiti oko 30 l etarskog ulja bogatog aromatičnim jedinjenjima. Kao najbolja varijanta gajenja izdvojila se kombinacija jesenje sadnje sadnicama proizvedenim iz semena u bloku mineralnog đubrenja, dok se kao najnepovoljnija varijanta pokazala kombinacija zasnivanja plantaže na proleće sadnicama dobijenim vegetativnom propagacijom. Ključne reči: arnika, lekovito bilje, seskviterpenski laktoni, fenolna jedinjenja, etarsko ulje, mikroskopska analiza, histohemija, antioksidativna aktivnost, antimikrobna aktivnost Naučna oblast: Biotehnologija Uža naučna oblast: Ratarstvo i povrtarstvo UDK:582.998.16:631.575:615.451.1 Summary Doctoral Dissertation Influence of growing conditions on morphological and chemical properties and biological effects of extracts of Arnica montana L. - Summary - Arnica (Arnica montana L., Asteraceae) is a perennial mountain plant whose flower heads (Arnicae flos) are mainly used for topical treatment of bruises and sprains in phytopharmaceutical preparations such as ointments, creams and gels. Until few years ago, the world market demand for this raw material was almost exclusively covered from the spontaneous resources, but plant populations are, due to over- collecting, significantly degraded, what caused prohibition of its collection from the wild in most of European countries. Since the demand for this raw material on the market is constant rise, cultivation arnica is imposed as the only sustainable solution to meet the needs of the pharmaceutical industry. Since the A. montana plant specie is not native to the region of Serbia, although it occurs spontaneously in some mountain areas of neighboring countries and the Balkans in general, the aim of this study was to find a suitable technology solution of field cultivation based on the examination of induced various ecological factor effects. In this research, beside observations connected with flower heads, as the main drug, underground parts of arnica: rhizome and roots, were also studied as side products. The first phase of the experimental work included a three-year three-factorial field experiment in different modes of production, where as the factors examined: time of plantation establishment (spring and autumn planting), fertilization (manure and NPK) and methods of propagation (from seed and clonal propagation - division of the tuft). In the second phase of the experiment, characterization of the raw material was carried out in the terms of its rapid identification, qualitative evaluations based on the content of secondary metabolites and testing of biological effects of extracts obtained. Tests were performed on the field experiment conducted in 2008 at locality of Kaludjerske Bare (1008 m) on mountain Tara, in area of Nursery production department of the National Park "Tara". Since arnica its first vegetation remains in the rosette phenophase, all measurements of morphological parameters, yields and chemical Summary Doctoral Dissertation characterizations of raw materials was carried out in 2009 and 2010 year. Following parameters were examined at the trial: rosette diameter, height of flower shoots, number of flower shoots, number of flower heads per plant, flower head diameter and number of secondary rosettes. Yields were observed for the flower heads, rhizomes, roots and essential oils (in rhizomes and roots). Identification of the raw material Arnicae flos against possible forgeries, Calendulae flos and flower heads of Doronicum columnae, was performed by comparative microscopic imaging and thin layer chromatography. We examined the localization and mechanisms of excretion of essential oil in rhizome and roots by recording of ultra-thin sections under the light microscope, by examining the fluorescence after histochemical staining, and by recording with scanning and transmission electron microscopy. Chemical characterization of flower heads included quantification and qualification of secondary metabolites from the group of sesquiterpene lactones and phenolic compounds (phenolic acids and flavonoids). In the frame chemical characterization of essential oils of the rhizomes and roots, quantification and identification of key components were done. From all factor combinations induced in an experiment, variant of spring planting of seedlings from vegetative propagation is shown to be highly undesirable. In this variant large number plants flowered immediately after planting, causing depletion of plant potential on forming flower shoots, flower heads and seeds. This phenomenon, as shown in the following year, was the consequence of an advanced generative development stage of plants at the time of planting. As a result of poor rooting, plants these variants were withered in a large scale, while survived plants were small and weak. The values obtained from these variants are represented in statistical analysis, but were not considered for comparison with literature data. Factor of planting time was statistically significant for all measured parameters except for root, in 2009, and rhizome yield in 2010 year. Similarly, the variation of type of propagation factor had a statistically significant effect on all the measured parameters, except for the root and rhizome yield in 2009, and rhizome yield and the diameter of the flower head in 2010. Type of fertilizer factor had a significant influence on variations of almost all morphological parameters, but it also had statistically significant interactions with other two factors in most cases, which dissembled nutrient contribution in plant development, Summary Doctoral Dissertation therefore the discussion on the significance of fertilization treatments in growing arnica had to be divided on individual observations within other two factor combinations. Rosette diameter values ranged from 12.4 - 23.4 cm (14.5 - 28.2 cm) in the second (third) vegetation. Height of flower shoots ranged from 20.5 - 34.1 cm (25.5 - 41.7 cm), while the average value of the number of flowering shoots ranged from 1.5 - 5.0 (2.4 - 12.6). Number of flower heads per plant ranged from 7.2 - 16.3 (8.4 - 38.9), diameter of flower heads ranged from 6.0 - 7.5 cm (6.4 - 9.1 cm), and the number of secondary rosette of 5.7 - 18.3 (25.3 - 35.4). Flower heads yield ranged from 59.8 - 143.5 kg/ha (116.2 - 258.7 kg/ha), rhizome yield from 106.3 - 373.7 kg/ha (475.9 - 897.5 kg/ha), and root yield from 194.3 - 426.4 kg/ha (420.9 - 615.0 kg/ha). The content of essential oil in the rhizome ranged from 4.0 - 4.8% (2.1 - 3.1%), while in the roots ranged from 1.1 to 3.2% (1.7 - 2.4%). Through microscopic imaging of grounded plant material a simple identification procedure of arnica flower heads against two presumed forgeries has been established. Among to other typical details, arnica flower heads and D. columnae contain visible and easily recognizable pappi, unlike C. officinalis. Also pappi of arnica are much thicker (69±16 μm) than pappi of D. columnae (30±7 μm). Furthermore, thin-layer chromatography can reliably distinguish C. officinalis from the other two species, since the extract of this plant in the lower half of the chromatogram (Rf ~ 0.4) has zone with strong orange florescence, which corresponds to location of rutin in the standard mixture, while is absent in A. montana and D. columnae. In the sample of A. montana another zone with orange fluorescence was clearly visible at Rf ~ 0.65, which was absent in sample of C. officinalis and barely visible in D. columnae. This zone by its position and fluoresnece responds to isoquercitrin standard. Sesquiterpene lactones present in arnica flower were identified and quantified in its overall content, expressed as dihydrohelenalin tiglate (DHHT), which ranged, in 2009, from 7.9 – 13.2 mg/g and, in 2010, from 4.6 - 13.9 mg/g. Considering both years, the herbal drug Arnicae flos meet the quality criteria of minimum total sesquiterpene lactones content (4 mg/g) prescribed by the European Pharmacopoeia 6.0. In the flower head samples five phenolic compounds has been identified, out of which content of one phenolic acid (chlorogenic acid) and two dominant flavonoids (quercetin-3-O-glucoside and kaempherol-3-O-glucoside) has been estimated. Chlorogenic acid content ranged Summary Doctoral Dissertation from 3.1 - 6.0 mg/g (1.9 - 6.6 mg/g) in the second (third) vegetation, quercetin-3-O- glucoside from 8.4 - 13.9 mg/g (7.8 - 12.5 mg/g) and kaempherol-3-O-glucoside from 2.1 - 4.7 mg / g (2.1 - 4.5 mg/g). In chemical profiles of the essential oils of rhizomes and roots dominant components were thymol derivates (ca. 80%), mainly 2,5- dimethoxy-p-cymene (28.9 - 40.7%) and thymol methyl ether (9.6 - 27.2%). In examined antioxidant activity of extracts of arnica flower heads greater ability to neutralize DPPH radicals had extract with maximum content of total sesquiterpene lactones compared with extract with minimum content, while differences in the antioxidant activities of extracts with maximum and minimum value of the sum of the three quantified phenolic compounds were negligible. Tested extracts exhibited also antimicrobial activity, where minimum inhibitory concentrations (MICs) of nine strains of bacteria and one yeast ranged from 2-15 μl/ml. The antimicrobial activity of the essential oil was selective, where the MIC values for certain microorganisms (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus flavus, Listeria monocytogenes and Salmonella enteritidis) were very small (5 μl/ml), but the yeast Candida albicans was highly resistant to all tested essential oils (MIC concentrations ranged up to 83 μl/ml). From cultivation of arnica in agro-ecological conditions of Serbia can be obtained up to 300 kg/ha of quality raw material Arnicae flos and up to 1000 kg/ha of underground organs, from which can be extracted, by distillation, about 30 l of essential oils rich in aromatic compounds. As the best variant proved to be combination of autumn planting of seedlings produced from seeds in a block of mineral fertilizer, while the least favorable option has been shown combination of spring established variants where seedlings are obtained from vegetative propagation. Keywords: arnica, herbs, medicinal plants, yield, sesquiterpene lactones, DHHT, flavonoids, essential oils, antioxidant activity, antimicrobial activity Scientific field: Biotechnology Scientific discipline: Field and Vegetable Crops UDC: 582.998.16:631.575:615.451.1 Cilj istraživanja Doktorska disertacija Spisak skraćenica x aritmetička sredina ca. otprilike, oko (lat. circa) UZ ultrazvučno UV ultraljubičasti spektar Rt retenciono vreme DHHT 11α, 13-dihidrohelenalin tiglat DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil MeOH metanol HPLC visokokvalitetna tečna hromatografija TLC tankoslojna hromatografija HPTLC visokokvalitetna tankoslojna hromatografija GC gasna hromatografija GC/MS gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom NMR nuklearna magnetna rezonanca LC tečna hromatografija ESI elektrosprej jonizacija TOF vreme letenja (Time Of Flight) MS masena spektrometrija DAD diodni detektor SEM skenirajuća elektronska mikroskopija TEM transmisiona elektronska mikroskopija P biljke sa prolećnog plota sadnje J biljke sa jesenjeg plota sadnje O biljke sa bloka đubrenog stajskim đubrivom M biljke sa bloka đubrenog mineralnim đubrivom (NPK) K biljke sa bloka bez primene đubriva (kontrola) G biljke razmnožene iz semena (generativnim putem) V biljke razmnožene deljenjem bokora (vegetativnim putem) JESEN biljke sa jesenjeg plota sadnje PROLEĆE biljke sa prolećnog plota sadnje Generativno biljke razmnožene iz semena (generativnim putem) Vegetativno biljke razmnožene deljenjem bokora (vegetativnim putem) NPK biljke sa bloka đubrenog mineralnim đubrivom Stajnjak biljke sa bloka đubrenog stajskim đubrivom Kontrola biljke sa bloka bez primene đubriva MIC minimalne inhibitorne koncentracije SL seskviterpenski laktoni Sadržaj Doktorska disertacija Sadržaj 1. UVOD 1 2. PREGLED LITERATURE 2 2.1. Rod Arnica 2 2.1.1. Etimologija naziva roda Arnica 2 2.1.2. Upotreba arnike u tradicionalnoj medicini 4 2.2. Biologija vrsta roda Arnica 6 2.2.1. Taksonomija 6 2.2.3. Botaničke osobine roda 7 2.2.2. Rasprostranjenje i prirodna staništa 8 2.3. Oficinalnost droga vrsta roda Arnica 9 2.4. Arnica montana – narodni nazivi i sinonimi 9 2.5. Arnica montana – botaničke karakteristike 10 2.6. Droge arnike 10 2.6.1. Cvetna glavica arnike - Arnicae flos 10 2.6.1.1. Sinonimi 10 2.6.1.2. Oficinalnost 11 2.6.1.3. Opis droge 11 2.6.1.4. Identifikacija droge 12 2.6.1.5. Hemijski sastav 14 2.6.1.6. Biološki efekti 16 2.6.2. Koren arnike - Arnicae radix 18 2.6.2.1. Sinonimi 18 2.6.2.2. Oficinalnost 18 2.6.2.3. Opis droge 18 2.6.2.4. Identifikacija droge 18 2.6.2.5. Hemijski sastav 19 2.6.2.6. Biološki efekti 19 2.5. Kultivacija 20 2.5.1. Izvori biljne sirovine Arnicae flos i opravdanost gajenja 20 2.5.2. Sortiment 21 2.5.3. Iskustva u gajenju arnike 21 3. CILJ ISTRAŽIVANJA 26 4. RADNE HIPOTEZE 26 5. MATERIJAL I METODE ISTRAŽIVANJA 28 5.1. Materijal 28 5.1.1. Biljni materijal 28 5.1.2. Đubriva 28 5.2. Metode 29 Sadržaj Doktorska disertacija 5.2.1. Poljski ogled 29 5.2.1.1. Proizvodnja sadnica 31 5.2.1.2. Postavka i održavanje ogleda 34 5.2.2. Testirane karakteristike 35 5.2.2.1. Morfološki parametri 35 5.2.2.2. Prinosi 37 5.2.2.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga 38 5.2.2.4. Hemijska analiza droga 41 5.2.2.5. Biološki efekti 47 5.2.3. Statističke metode 49 6. REZULTATI ISTRAŽIVANJA 51 6.1. Morfološki parametri 55 6.2. Prinosi 83 6.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga 107 6.4. Hemijska analiza droga 123 6.5. Međusobni odnosi testiranih karakteristika 146 6.6. Biološki efekti 152 7. DISKUSIJA 157 7.1. Morfološki parametri 158 7.2. Prinosi 167 7.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga 174 7.4. Hemijska analiza droga 178 7.5. Međusobni odnosi testiranih karakteristika 185 7.6. Biološki efekti 187 8. ZAKLJUČAK 190 9. LITERATURA 192 10. PRILOZI 210 11. BIOGRAFIJA AUTORA 218 Uvod Doktorska disertacija 1 1. UVOD Arnika (Arnica montana L.) je višegodišnja planinska biljka iz familije Asteraceae, koja nije autohtona biljna vrsta za područje Srbije, iako se spontano javlja u planinskim oblastima nekih susednih zemalja i Balkanskog poluostrva uopšte (Gajić, 1975; Ferguson, 1976). Njena introdukcija u Srbiji otpočela je 2004. godine na planini Tara (Radanović et al., 2006), dok su prvi pokušaji na kultivaciji njenog srodnika A. chamissonis otpočeli još 2000. godine na planini Suvobor (Roki et al., 2001). Najveći deo sirovine arnike na tržištu (uglavnom cvetne glavice) potiče iz prirode. Populacije arnike su dugo bile eksploatisane uglavnom u zemljama najvećih potrošača ove sirovine kao što su Nemačka, Švajcarska i Velika Britanija (Kathe, 2006). U međuvremenu, vrsta je postala strogo zaštićena u Francuskoj, Nemačkoj i drugim zemljama, pa je kao takva navedena u Aneksu D Uredbe Saveta EU (EU Council Regulation No. 338/97) i u Aneksu V(b) Direktive o staništima EU (92/43/EC – Directive on the Conservation of Natural Habitats and Wild Fauna and Flora) (Lange, 1998). Kultivacija arnike u svetu se razvija već više decenija (Galambosi, 2004; Dachler i Pelzmann, 1999; Bomme, 1999) gde se pokazala moguća, ali isto tako komplikovana i prilično skupa, u poređenju sa sakupljanjem biljne sirovine iz prirode (Delabays i Mange, 1991; Bomme et al., 1995). Cvetna glavica arnike (Arnicae flos) se uglavnom koristi za spoljašnju upotrebu kod modrica i uganuća u fitofarmaceutskim preparatima kao što su masti, kreme i gelovi. Kao droga koriste se osušene cvetne glavice. Glavne aktivne komponente koje ispoljavaju farmakološki efekat su uglavnom seskviterpenski laktoni kao što su helenalin, 11α,13-dihidrohelenalin i njihovi estarski derivati (Lyss et al., 1997). Droga Arnicae flos je oficinalna po V evropskoj farmakopeji (Ph. Eur. 6.0) gde se kao zahtev kvaliteta postavlja minimalni sadržaj od 0.4% ukupnih seskviterpenskih laktona. Sva sirovina arnike odgajana u našoj zemlji zadovoljila je zahteve evropske farmakopeje (Radanovic et al., 2007) Pregled literature Doktorska disertacija 2 2. PREGLED LITERATURE 2.1 Rod Arnica 2.1.1. Etimologija naziva roda Arnica Naziv generičkog imena roda Arnica Rupp. najverovatnije proizilazi iz deformacije grčke reči Ptarnica, kinuti, aludirajući na cvet koji izaziva takvu reakciju (Muñoz, 1987). U literaturi se još pominje i povezanost grčke reči „arnakis“ – jagnjeća koža, sa teksturom lista (Austin, 2004) što je, sudeći po morfološkoj sličnosti, manje verovatno. Prvo pominjanje imena Arnica koje se pojavljuje u literaturi je u drugom tomu Knjige biljaka od Teodora Tabernaemontanusa (Tabernaemontanus, 1625), gde je slika biljke Arnica montana prikazana je u kvalitetnom drvorezu, ali je podvedena pod ime Caltha alpina (Slika 1). U nastavku, Tabernaemontanus u delu sinonima dodaje „... aber von den Medicis, Arnica.“ (Slika 2). Slika 1. Arnica pod imenom Caltha alpina u Kreuterbuch, 1625. Slika 2. Prvo pominjanje imena Arnica, 1625. U pomenutoj knjizi, ime Arnica nije vezivano ni za jednu drugu biljku. Ista biljka se pojavljuje u Rupovoj “Flori Jene” (Rupp, 1718), gde biljka pod imenom Arnica Shroederi (Slika 3), ukazuje na današnju A. montana, pa se smatra da je ovo Pregled literature Doktorska disertacija 3 prva primena termina Arnica kao tehničkog imena (Maguire,1943). Naziv ovog roda i danas u sufiksu nosi ime ovog botaničara – upravo: Arnica Rupp. Slika 3. Prva primena termina Arnica kao tehničkog imena u Rupovoj „Flori Jene“, 1718. Italijanski fizičar Matioli koji u svojim Komentarima (Mattioli, 1570) nesumljivo prikazuje sliku A. montana pod poglavljem „Alisma“ (Slika 4), ali je prateći opis „Alisma, alii, Datmasonium“ veoma blizak prevodu Dioskoridove „De Materia Medica“ (Dioscoridis, 1552), koja je vodena bokvica (Maguire, 1943). Slika 4. Crtež Arnica montana pod imenom Alisma u Matiolijevim „Komentarima“, 1570 Slika u Matiolijevim „Komentarima“, ali ne i prateći opis, verovatno je najstariji poznati zapis biljke iz roda Arnica (Maguire,1943). Pregled literature Doktorska disertacija 4 U literaturi šesnaestog i sedamnaestog veka, termin Doronicum je bio taj za koji su evropski botanički autoriteti najčešće vezivali rod Arnica. Karl Line je u svom delu Flora Lapponica (Linnaei, 1732) prepoznao dve vrste Arnica i to Doronicium foliis oblongo-ovalibuts (Slika 5), koja je današnja A. montana, i Doronicum foliis lanceolatis, koja je današnja evropska vrsta A. alpina. Ove biljke se pod istim imenima pojavljuju i u Lineovoj Flora Suecica (Linnaei, 1745). Slika 5. Jedna od dve prepoznate vrste Arnica u Lineovoj „Flora Lapponica“ pod nazivom roda Doronicum Moderna taksonomija roda Arnica počinje od Lieneovog klasika Species Plantarum (Linnaei, 1753), u kojem je prepoznato šest vrsta za koje je usvojeno Rupovo ime Arnica. Samo jedna od navedenih, Arnica montana, će ostati u rodu Arnica do današnjih dana. Raspoređivanje ostalih biljaka po različitim rodovima kao što su Doronicum, Gerbera, Senecio, itd., je bilo potpuno prihvaćeno još pre uvođenja De Kandolinog ranog taksonomskog sistema Prodromus (Candolle, 1824). Nakon ovog perioda, intenziviraju se botaničke determinacije, revizije i sistematizacije roda Arnica, od strane brojnih svetskih botaničara, da bi u poslednjoj reviziji u rodu ostale zastupljene 32 vrste (Maguire,1943). 2.1.2. Upotreba arnike u tradicionalnoj medicini Dokumentovano korišćenje u medicinske evropskog predstavnika arnike, A. montana, seže čak do 14. veka, gde se pominje u enciklopediji Mateusa Silvatikusa za menstrualne bolove (Ekenäs, 2008). Od 16. veka, široko se pominje kao "lek za rane" za lečenje spoljnih povreda (Mayer i Czygan, 2000). Line takođe, u Flora Suecica (1745), pominje arniku kao zamenu za duvan. Pregled literature Doktorska disertacija 5 Kada su Evropljani, koji su bili upoznati sa lekovitim efektima arnike, stigli u Novi Svet, otkrili su da domorodci takođe koriste druge vrste arnike u svojoj primitivnoj medicini. Kroz brojna etnobotanička istraživanja potvđeno je korišćenje severno-američkih vrsta A. acaulis, A. angustifolia, A. cordifolia, A. latifolia, i A. discoidea u tradicionalnoj medicini (Ekenäs, 2008), kao što je prikazano u Tabeli 1. Zanimljivo je kako su široko razdvojene grupe ljudi koristili razne vrste arnike za lečenje poremećaja koji bi zajedno mogli biti grupisani u zapaljenja. Da arnika nije pogodna za bezbednu internu samoremedikaciju pokazuje slučaj švajcarskog botaničara Konrada fon Gesnera (1516-1565) koji se, testirajući njene farmakološke efekte u internoj upotrebi na sebi, otrovao (Dobelis, 1986). Uprkos Gesnerovom incidentu upotreba arnike ostaje popularna u velikom delu Evrope. Poznati pesnik, filozof, dramski pisac i botaničar Johan Volfgang fon Gete (1749-1832) je izjavio da mu je arnika u starosti pomogla da se oslobodi svoje hronične angine (Bown, 2001). Duke i saradnici (2002) savetuju da arniku ne treba koristi interno, gde u isto vreme potvrđuju da postoje dobri dokazi za blagotvorno dejstvo u spoljnoj aplikaciji. Arnika se još uvek koristi interno u Nemačkoj, dok je Velikoj Britaniji i Sjedinjenim Američkim Državama njena upotreba ograničena samo na spoljnu (Bown, 2001). Herc i Sosa (1988) su utvrdili da ova vrsta sadrži seskviterpenske laktone kao i mnoge druge vrste iz roda Arnica, dok su Ebert i sar. (1988) potvrdili da arnika sadrži i flavonoidne glikozide. Iako su se razne vrste arnika koristile za lečenje raznih bolesti, danas je njena upotreba ograničena samo na spoljašnju (Bown, Tabela 1. Severno-američke vrste arnike dokumentovane u tradicionalnoj upotrebi (Ekenäs, 2008) Vrsta Upotreba Preparat Deo biljke Etnička grupa i lokacija A. acaulis bol u leđima infuzija koren Catawba, Severna Karolina A. angustifolia stomačni problemi infuzija - Gwich’in, Jukon i SZT A. cordifolia očno crvenilo - - Shuswap, BK modrice, otoci i posekotine melem cela biljka Thompson, BK tubekoloza infuzija cela biljka Thompson, BK A. cordifolia i A. latifolia afrodizijak - koren Okanagan-Colville, BK A. discoidea lečenje rana - - Maidu, Kalifornija SZT: Severo-zapadne teritorije, BK: Britanska Kolumbija Pregled literature Doktorska disertacija 6 2001; Duke et al., 2002). U spoljašnjoj aplikaciji, biljka se smatra baktericidom i vezikantom, a koristi se za lečenje modrica, oteklina, ogrebotina i malih rana. Na Slici 6 prikazana je reklama, iz 1852. godine, za tečni uljani preparat na bazi arnike namenjen za lečenje širokog spektra bolesti kod ljudi i domaćih životinja. Slika 6. Reklama za ulje arnike iz 1852. godine (preuzeto sa fr.wikipedia.org; autor: Burdsall, J.R.) 2.2. Biologija vrsta roda Arnica 2.2.1. Taksonomija Familija: Asteraceae (Compositae) Podfamilija: Asteroideae Tribus: Heliantheae (Arniceae, Senecioneae) Podtribus: Chaenactidinae (Senecioninae) Pozicija roda Arnica L. u familiji Asteraceae je još uvek kontraverzna (Maguire, 1943). Nakon godina raspoređivanja u tribus Senecioneae, (Bentham, 1873; Hoffmann, 1894), integrisan je u tribus Heliantheae, (Robinson, 1981; Nordenstam, 1977) što je zasnovano na morfološkim i hemijskim karktaristikama. Budući je trenutna klasifikacija kontroverzna postoje mišljenja da bi trebalo oformiti novi tribus „Arniceae“ Pregled literature Doktorska disertacija 7 (Nordenstam, 1977; Seaman, 1982). Klasifikacija roda Arnica: U rodu se nalazi 32 vrste Arnica, koje su podeljene u 5 podrodova (Maguire,1943): 1. Podrod Arctica, na primer sa: A. alpina, A. fulgens, A. sororia; 2. Podrod Austromontana, Sect. Eulatifolia, na primer sa: A. cordifolia, A. nevadensis; Sect. Eradiatae, na primer sa: A. venosa, A. viscosa; 3. Podrod Chamissonis, Sect. Euchamissonis, na primer sa: A. chamissonis; Sect. Eulongifolia, na primer sa: A. longifolia; Sect. Eumollis, na primer sa: A. amplexicaulis, A. mollis; 4. Podrod Montana, na primer sa: A. acaulis, A. montana; 5. Podrod Andropurpurea na primer sa: A. lessingii A. sachalinensis. 2.2.2. Botaničke osobine roda Višegodišnje zeljaste biljke; cvetna stabljika prosta ili ređe razgranata; listovi prosti sedeći, većina skupljena u rozetu, dok su na cvetnoj stabljici raspoređeni nisko uglavnom naspramno, a ređe naizmenično; žuta cvetna glavica sa zigomorfnim ženskim jezičastim cvetovima, koji ponekad poptuno izostaju, i radijalnim hermafroditnim trubastim cvetovima; krunični listići dlakavi lancetasti, jedno- ili dvoredi, čašica je konveksna i dlakava; ahenija je izbrazdana, glatka ili dlakava; papus svilenkast sa jednim redom čekinja (HagerROM, 2002). Pregled literature Doktorska disertacija 8 2.2.3. Rasprostranjenje i prirodna staništa Biljke iz roda Arnica se rasprostiru uglavnom po Severnoj Americi, a samo nekoliko vrsta se nalazi na tlu Azije (Slika 7). U Evropi se nalaze samo A. montana i A. angustifolia (Syn. A. alpina) (Maguire, 1943). Arnika se može na prirodnim staništima pronaći u velikom broju evropskih država kao što su Au Be Cz Da Ga Ge He Ho Hs Hu It Ju Lu No Po Rm Rs(B,C,W) Su (Tutin et al., 1964-1980). Iako nije autohtona biljna vrsta za područje Srbije (Gajić, 1975), spontano se javlja u planinskim oblastima nekih susednih zemalja i Balkanskog poluostrva uopšte (Ferguson, 1976). Na teritoriji bivše SFRJ (Ju) je pronađena u Sloveniji (Baričevič i Rode, 2000), Bosni i Hercegovini i Crnoj Gori (N. Menković, usmena komunikacija). U Rumuniji je arnika široko rasprostranjena u planinskim područjima (Michler, 2007), dok je u Bugarskoj ograničena na usko područje planine Rila (Assyov et al., 2006). Prirodna staništa su im uglavnom visokoplaninske livade sa Nardus stricta (Oberdorfer et al., 1994) obrazovane na silikatima (Bruelheide i Scheidel, 1999). Slika 7. Svetska distribucija biljaka iz roda Arnica (Maguire, 1943) Pregled literature Doktorska disertacija 9 2.3. Oficinalnost droga vrsta roda Arnica Od svih vrsta iz roda Arnica, samo su dve zastupljene kao oficinalne droge po famakopejama i to A. montana i A. chamssonis. U Tabeli 2. dat je pregled oficinalnih droga poreklom od ove dve vrste. Tabela 2. Oficinalnost droga arnike (HagerROM, 2002) Vrsta Ogran Droga Farmakopeje A. montana cvetna glavica Arnicae flos DAB 10; PF X; BHP 83; Belg V; Ned 6; Hisp IX; BPC 49; Helv VII; ÖAB 90; AB-DDR; Mar 29 A. montana koren Arnicae radix ÖAB 90; Hisp IX; A. chamissonis cvetna glavica Arnicae flos AB-DDR; DAB 10; 2.4. Arnica montana - narodni nazivi i sinonimi U Tabeli 3 dat je pregled sinonima i narodnih naziva za A. montana. Tabela 3. Pregled sinonima i narodnih naziva za A. montana Latinski naziv Arnica montana L. Sinonimi Doronicum arnica Desf.; Doronicum montanum Lam. (HagerROM, 2002) Domaći nazivi: brđanka, brđanka žuta, veprina, veprovac, zlatenica, konjski petrovac, majasil trava, mali divlji neven, modrice, modrulja, moravka, paprica, potras gorska, tičji neven, trava od majasila (Simonović, 1959) Ruski: арника горная, баранник горный, баранка, купальник, пу-повник, лесная титунь (Rabinovič, 1987) Engleski: Arnica, Celtic bane, Leopard's bane, Mountain, Mountain tobacco (HagerROM, 2002) Pregled literature Doktorska disertacija 10 Nemački: Arnika, Bergwohlverleih, Wundkraut, Fallkraut, Kraftwurz, Kraftrosen, Mutterkraut, Engelkraut, Stichkraut (Mayer and Czygan, 2000), Bergdotterblume, Johannisblume, St- Luzianskraut, Stichwurzel, Schnupftabaksblume, Tabakblume, Verfangkraut, Wohlverleih, Wulfesblaume, Wulfsblöme, Wulfsblom (HagerROM, 2002) Francuski: Arnique, Arnica, Panacée des chutes, Tabac des Vosges (Simonović, 1959) 2.5. Arnica montana – botaničke karakteristike Arnika je zeljasta i višegodišnja biljka koja razvija cvetne stabljike visine 20 do 60 cm i prosečne debljine 0,5 cm; obično nerazgranate, tripartijske i simpodijalne. Podzemno razvija braonkasti rizom koji može biti dugačak čak i do 23 cm, a sastavljen je od šest partija, razgranat. Jedna biljka obično ima dva do tri rizoma iz kojih bočno izrastaju, do 1 mm debeli, žućkasto-braonkasti korenovi. Četiri do šest sedećih listova formiraju ravnu prizemnu rozetu. Listovi su celi ovalni do objajasti sa pet (ili sedam) lisnih nerava. Cvetna stabljika je visine do 60 cm prekrivena je glandularnim trihomama sa dva do šest manjih sedećih, ovalnih do lancetastih, celih do blago nazubljenih, naspramno raspređenih, listića. Cvetna glavica je terminalna i obično je u osi sa najvišljim parom listića; 6 – 8 cm u prečniku; žumance do narandžasto-žuta, retko bledo-žuta; karakteristično prijatnog mirisa; čašica i krunica su dlakave; ženski cvetovi su jezičasti i ima ih 12 – 20; hermafroditni cvetovi su trubasti i ima ih do 100. Plod je ahenija sa čekinjastim papusom. 2.6 Droge arnike 2.6.1 Cvetna glavica arnike - Arnicae flos 2.6.1.1. Sinonimi Flores Arnicae; Flores Calendulae alpinae; Flores Plantaginis montanae; Flores Ptarmicae; Flores Alismae; Flos Arnicae Pregled literature Doktorska disertacija 11 2.6.1.2. Oficinalnost (HagerROM, 2002) Arnikablüten – DAB 10; Arnica – PF X; BHP 83; Arnicae Flos – Belg V; Ned 6; Hisp IX; BPC 49; Helv VII; Ph Eur. 6.0. Flos Arnicae – ÖAB 90; Flores Arnicae – AB-DDR; Arnica Flower – Mar 29 Definicija droge po farmakopejama „Cele ili delimično izlomljene cvetne glavice biljke Arnica montana L.“ (Ph.Eur. 6.0 ); „Suva, u komadu ili izlomljena cvetna glavica sa čašicom“ DAB 10, PF X, BPC 49, ÖAB 90, Helv VII, AB-DDR, BHP 83, Mar 29; „Suvi, od čašice i čašičnih listića oslobođeni, pojedinačni cvetovi (trubasti i jezičasti) cvetne glavice“ Belg V, Ned 6, Hisp IX; „Sveže ili suve cvetne glavice“ (BAz, 1984) 2.6.1.3. Opis droge (Ph.Eur. 6.0 ) Cvetna glavica je, kada je raširena, prečnika oko 20 mm, oko 15 mm duboka i ima 2-3 cm dugačku cvetnu dršku. Involukrum se sastoji od 18-24 izduženo lancetastih brakteja, sa zašiljenim vrhom, poređanih u 1-2 reda: brakteje, oko 8-10 mm dugačke, su zelene sa žućkasto-zelenim spoljnim dlačicama koje se mogu videti pod lupom. Cvetna loža, oko 6 mm u prečniku, je konveksna, saćasta i pokrivena dlačicama. Na periferiji lože nalazi se oko 20 jezičastih cvetova 20 - 30 mm dugačkih, a na disku se nalazi veliki broj cevastih cvetova dugačkih oko 15 mm. Tučak, oko 4-8 mm dugačak, je krunisan papusom od belih dlačica 4 - 8 mm dugačkim. U suvoj drogi u manjoj meri mogu biti prisutne i braon ahenije, krunisane papusom ili ne. Pregled literature Doktorska disertacija 12 2.6.1.4. Identifikacija droge Morfološka identifikacija (Ph.Eur. 6.0 ) Involukrum se sastoji od izduženih ovalnih brakteja sa zašiljenim vrhovima, po obodu dlakavim. Jezičasti cvetovi imaju redukovanu čašicu krunisanu finim, svetlucavim, beličastim dlačicama koje nose male trihome. Narandžasto-žuta krunica jezičastih cvetova ima 7-10 paralelnih nerava, a na vrhu joj se nalaze tri mala režnja. Prašnici su sa tri antere i nisu kompletno razvijeni. Iz uskog braon tučka izlazi stubić podeljen na dve grane zakrivljene ka spolja. Trubasti cvetovi su aktinomorfni. Tučak i čašica su slični kao kod jezičastih cvetova. Kratka krunica ima 5 trouglastih režnjeva, a 5 fertilnih prašnika je spojeno u antere. Slika 8. Biljka arnike sa botaničkim detaljima (Köhler, 1883-1914) Pregled literature Doktorska disertacija 13 Hemijska identifikacija Za analizu biljnih droga u praškastom obliku uobičajeno se koristi tehnika tankoslojne hromatografije (TLC). Identifikacija droga se vrši na osnovu prisustva jedinjenja koja su karakteristična za određenu biljnu vrstu. Za brzu identifikaciju droge Arnicae flos koristi se metoda po Vagneru (Wagner et al., 1984). Falsifikati i zamene Falsifikati i zamene najčešće potiču iz kruga žuto-cvetajućih biljaka roda Asteraceae. Elektronska publikacija HagerROM (2002) navodi 11 vrsta koje se najčešće sreću kao falsifikati droge Arnicae flos (Tabela 4). Tabela 4. Biljke koje se najčešće nalaze u prometu kao falsifikati droge Arnicae flos Naziv biljne vrste Razlika za raspoznavanje Anthemis tinctoria Plodnik je bez papusa; cvetna loža sa paljama (ljuspastim listićima) Buphthalmum salicifolium Involukrum postavljen u više redova, antere su na donjem kraju slabije razvijene Calendula officinalis Plodnik je bez papusa, jezičasti cvetovi sa četiri nerva (linije) Doronicum clusii Kratak (1 mm dužine) plodnik bez papusa, jezičasti cvetovi sa četiri nerva (linije) Doronicum pardalianches Plodnik je bez papusa, jezičasti cvetovi sa četiri do pet nerava Heterotheca inuloides Jezičasti cvetovi bez papusa, cevasti cvetovi sa dvorednim papusom, žig tučka u obliku slova V (nije kao kod cvetnih glavica arnike savijen naniže), plodovi bez fitomelanina , sitni, ovalni (kod arnike su tanki, dugi sa fitomelanom), trihomi plodnika su dugi i tanki, sa ćelijama postavljenim u dva reda Inula britannica i druge vrste istog roda Jezičasti cvetovi sa četiri nerva, plodnik go Pulicaria dysenterica Dvoredan papus Scorzonera humilis Svi cvetovi su jezičasti (50), ahenija duplo veća Senecio doronicum Plodnik go, mali prizmatični kristali u centru Tragopogon pratensis Svi cvetovi su jezičasti, paperjast papus u obliku štita. Pregled literature Doktorska disertacija 14 2.6.1.5. Hemijski sastav Kao i ostali biljni lekovi, arnika takođe predstavlja mešavinu različitih grupa aktivnih materija koje zajedno doprinose ukupnom delovanju. Nesumnjivo su seskviterpenski laktoni sastojci droge sa najjačom aktivnošću (Lyss et al., 1997, Wagner et al., 2004; Merfort, 2003; Wagner i Merfort, 2007). Pored sekviterpenskih laktona najviše izučavana jedinjenja u cvetu arnike su svakako flavonoidi u formama flavonoidnih glikozida (Merfort i Wendisch 1987, 1992), flavonoidnih glukunorida (Merfort i Wendisch 1988) i flavonoidnih aglikona (Merfort i Wendisch 1985). Ostale prateće supstance u cvetu arnike su karotenoidi (Vanhaelen, 1973), diterpeni (Schmidt et al., 1992); arnidiol (triterpen) (Santer i Stevenson, 1962), pirolizidinski alkaloidi (tusilagin i izotusilagin) (Paßreiter et al., 1992), poliacetileni (Schulte et al., 1969), kumarini (umbeliferon i skopoletin) (Willuhn, 1989), fenolne kiseline (holorogenska kiselina, kafena kiselina i cinarin) (Merfort, 1992; Ebert et al., 1988; Kohlmünzer 2000; Reyes-Salas et al. 2002), lignani (Schmidt et al. 2006) and oligosaharidi (White et al., 1985; Kennedy et al., 1988). Etarska ulja sadrže masne kiseline, timolne derivate, monoterpene i seskviterpene (Güntzel et al., 1967; Kating et al., 1970; Willuhn, 1972a, b; HagerROM, 2002; Ristić et al., 2007). Seskviterpenski laktoni cvetne glavice arnike su pseudoguainolidnog tipa (Pinchon and Pinkas, 1988; Willuhn, 1989). U suvoj drogi ih ima između 0.2 – 0.8% i dominantno su zastupljeni kao estri helenalina (Helenalin) i dihidrohelenalina (11α, 13- Dihydrohelenalin) i kratko-lančanih masnih kiselina (HagerROM, 2002) (Slika 9). Willuhn i saradnici (1994) predložili su 0.4% m/m kao minimalnu količinu ukupnih seskviterpenskih laktona za farmakopejsku standardizaciju droge Arnicae flos. Taj kriterijum je usvojen i trenutno je važeći po šestoj evropskoj farmakopeji (Ph.Eur. 6.0). Pregled literature Doktorska disertacija 15 Slika 9. Helanalin(A) i dihidrohelenalin(B) i mogući estri (HagerROM, 2002) U analizama hemijskog sastava arnike otkrivena je regionalnost u sadržaju pojedinih seskviterpenskih laktona, gde srednje-evropske vrste arnike sadrže dominantno helenalinske estre, dok kod španskog tipa arnike prevladavaju dihidrohelenalinski estri (Willuhn et al., 1995; Perry et al., 2009). Takođe je primećeno da su kod biljaka sa većih nadmorskih visina (1330-1460 m) zastupljeniji helenalinski estri, a su kod biljaka iz nižih predela bili dominantni dihidrohelenalinski estri (Perry et al., 2009). Flavonoidi imaju značajna antioksidativna i antibakterijska svojstva (Iauk et al. 2003; Santos et al. 2006) i pretpostavlja se da sinergistički deluju sa seskviterpenskim laktonima (Willuhn 1991). Fenolne komponente cvetne glavice arnike su uglavnom fenolne kiseline (ca. 50 mg/g) i flavonoidi (ca. 20 mg/g) (HagerROM, 2002; Merfort, 1992; Kohlmünzer, 2000; Reyes-Salas et al., 2002). Od fenolnih kiselina najzastupljenije su hlorogenska, 3,5-dikafeoilhinska (Ganzera et al., 2008) i drugi derivati kafene kiseline, dok su od fenolnih jedinjenja najzastupljeniji kvercetin-3-O- glukozid, kempferol-3-O-glukozid, kempferol-3-O-glukoronid, 6-metoksikempferol-3- O-glukozid i hispidulin (Spitaler et al., 2008; Albert et al., 2009). Schilcher i sar. (2007) takođe su prijavili su 16 flavonidnih aglikona i 17 flavonoidnih glikozida u hemijskom sastavu ekstrakata cvetne glavice, od kojih izdvajaju hispidulin kako najaktivniju komponentu. Pregled literature Doktorska disertacija 16 2.6.1.6. Biološki efekti Iako se u literaturi pominje moguća upotreba cvetne glavice arnike za antibiotsku aktivnost (Kolodziej, 1993; Willuhn et al., 1982), usled moguće toksičnosti (Wijnsma, 1995; Macêdo, 2004), danas se upotrebljava isključivo zbog svojih anti- inflamatornih svojstava (Duke et al., 2002). Seskviterpenski laktoni pokazuju jaku anti-inflamatornu aktivnost utičući na zapaljenske procese u početnim fazama (Garcìa-Piñeres et al., 2001). Mikromolarne koncentracije helenalina, dihidrohelenalina i njihovih estara, inhibiraju aktivaciju transkripcionih faktora NF-κB i NF-AT (Lyss et al., 1999; Tornhamre et al., 2001; Klaas et al., 2002) (Slika 10). Transkripcioni faktor NF-κB uzrokuje ekspresiju više od 150 gena kao reakciju na zapaljenje, bakterijske i virusne procese. Aktivatori NF-κB i tipovi ispoljenih gena čine ga ključnim faktorom imuno odgovora ljudskog tela (Garcìa- Piñeres et al., 2001). Faktor NF-κB se sastoji od dve podjedinice p50 i p65, i kao takav je prisutan u neaktivnoj formi u citoplazmi. Treća subjedinica IκB sprečava njegov ulazak u ćelijsko jedro. U toku zapaljenja, bekterijske ili virusne infekcije, inhibitorna podjedinica IκB se razgrađuje i tada NF-κB prelazi u jedro, vezuje se za DNK i inicira formiranje različitih medijatora zapaljenja (proteini akutne faze, pro-zapaljenskih citokina kao što su IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 i tumor-nekrozni-faktor (TNF-α) (Merfort, 2003). Helenalin takođe pokazuje inhibitorno delovanje u ovom procesu tako što sprečava vezivanje NF-κB za DNK. Majklovom reakcijom adicije helenalin se vezuje za podjedinicu p65 transkripcionog faktora (Rüngeler et al., 1999). Preparati arnike inhibiraju NF-AT i na taj način sprečavju produkciju citokina tipova IL-2, IL-3, GMCSF, IFN-g i TNF-α. Ovi medijatori su takođe uključeni u tok zapaljenske reakcije. U poređenju sa ostalim anti-inflamatornim supstancama, seskviterpenski laktoni inhibiraju zapaljenski proces u njegovoj suštinskoj tački nastajanja. Nesteroidni anti- inflamatorni lekovi (NSAIDs) ili osnovne anti-reumatske supstance deluju samo u daljim fazama zapaljenskog procesa na nivou enzima koji učestvuju u metabolizmu arahidonske kiseline, ali su do ovog momenta, zapaljenski procesi već uveliko otpočeli (Rüngeler et al., 1999). Pojedini autori navode i citotoksičnu aktivnost seskviterpenskih Pregled literature Doktorska disertacija 17 laktona izolovanih iz cvetne glavice arnike, zbog čega može naći primenu i u lečenju različitih vrsta karcinoma (Woerdenbag et al., 1994; Lopez-Anton et al., 2007). Pored naširoko proučavane anti-inflamatorne aktivnosti seskviterpenskh laktona, zastupljenih u cvetnoj glavici arnike, manja pažnja je pridavana je sporednim farmakološkim aktivnostima fenolih komponenti. Od fenolnih sekundarnih metabolita najzastupljenije su fenolne kiseline i flavonoidi (Spitaler et al., 2006). Biološke aktivnosti fenolnih jedinjenja su dosta proučavane, kako zbog njihove velike rasprostranjenosti u biljnom svetu, tako i zbog relativno male toksičnosti (Janković, 2005). Najviše je proučavana antioksidativna aktivnost in vitro zbog sposobnosti fenolnih jedinjenja da redukuju slobodne radikale (Pourmorad et al., 2006). Gawlik- Dziki i sar. (2011) su pokazali da tinktura cvetne glavice arnike ima antioksidativne osobine. Slika 10. NF-κB zapaljenski procesi i delovanje arnike (Bioforce Monograph) Pregled literature Doktorska disertacija 18 2.6.2. Koren arnike - Arnicae radix 2.6.2.1. Sinonimi Od ostalih naziva u literaturi su najčešće zastupljeni Arnicae rhizoma; Radix Arnicae; Radix Doronici germanici; Rhizoma Arnicae. 2.6.2.2. Oficinalnost Koren arnike je oficinalan po austrijskoj (Radix Arnicae – ÖAB 90) i španskoj (Arnicae Rhizoma – Hisp IX) farmakopeji. Definicija droge po farmakopejama „Osušeni rizom sa korenom“ (ÖAB 90, Hisp IX). 2.6.2.3. Opis droge (ÖAB 90) Rizom je skoro cilindričan, obično zakrivljen, dužine do 10 cm, debljine do 5 mm, crvenkasto-braon boje. Površina rizoma je hrapava sa ožiljcima od stabljika i listova. Na preseku se vidi široka sivkasta kora, venac žućkasto-sivog drvenastog dela sa braonkasto-sivim oznakama. Iz donjeg dela rizoma izlazi veliki broj adventivnih korenova, 1 mm debljine, koji se u suvom stanju veoma lako lome. 2.6.2.4. Identifikacija droge U farmakopejama nije opisan postupak identifikacije ove droge (HagerROM, 2002) Falsifikati i zamene U Tabeli 5. dat je pregled najčešćih falsifikata droge Arnicae rhizoma. Pregled literature Doktorska disertacija 19 Tabela 5. Biljke koje se najčešće nalaze u prometu kao falsifikati droge Arnicae rhizoma Naziv biljne vrste Razlika za raspoznavanje Eupatorium cannabinum Adventivni korenovi izlaze sa svih strana i po celoj dužini rizoma Fragaria vesca Hieracium murorum Hieracium umbellatum Hypochoeris maculate Nemaju eksretornih ćelija Geum urbanum Miriše na karanfil Solidago virgaurea Rizom je deblji, veliki broj tankih korenčića, skoro aromatičan 2.6.2.5. Hemijski sastav Rizom i koren vrste A. montana se odlikuju visokim sadržajem etarskog ulja. U rizomu se nalazi 2.70 do 6.31%, a u korenu 1.75 do 3.74% etarskog ulja (HagerROM, 2002). Odnos korena i rizoma u suvoj drogi je otprilike 1:1. Glavne komponente (oko 90%) etarskog ulja su derivati timola (Willhun, 1972b; Rossetti et al., 1984; Pinchon and Pinkas, 1988). 2.6.2.6. Biološki efekti U litereturi se ne mogu pronaći podaci o farmakološkom delovanju korena arnike (HagerROM, 2002). Budući da je poznata hemijska sturkura etarskog ulja, sa visokim sadržajem timola i timolnih derivata, može se pretpostaviti da bi se u spoljnoj upotrebi moglo koristiti kao antiseptičko sredstvo. U pogledu antiseptičke primene u veterinarskoj medicini, droga Arnicae radix je predložena za uključivanje u Aneks II Regulative Saveta (EEC) No. 2377/90 (Lange, 1998). Pregled literature Doktorska disertacija 20 2.5. Kultivacija 2.5.1. Izvori biljne sirovine Arnicae flos i opravdanost gajenja Do pre par decenija unazad arnika (Arnica montana L.) je bila uobičajena biljka na tlu Evrope (Kathe, 2006). Mogla se pronaći širom kontinenta najčešće na kiselim zemljištima planinskih pašnjaka do 2850 m.n.v. (Bown, 2001). Kao i mnoge druge biljne vrste, populacije arnike su postepeno proređivane ili potpuno nestale sa delova područja predhodnog rasprostiranja. Razlozi za ovakav nepovoljni trend su mnogostruki: prekomerno sakupljanje biljaka iz prirodnih staništa, intenzifikacija poljoprivrede, velika gustina stoke na staništima arnike i promene namene zemljišta (Kathe, 2006). Godišnja svetska tražnja za suvom cvetnom glavicom arnike se procenjuje na oko 50 t (Galambosi, 2004). Najveći deo sirovine arnike potiče iz prirode. Glavni izvori cvetne glavice biljke Arnica montana, u Evropi su Rumunija i Španija (Lange, 1998). Populacije arnike su dugo bile eksploatisane u glavnom u zemaljama najvećih potrošača ove sirovine kao što su Nemačka, Švajcarska i Velika Britanija (Kathe, 2006). U međuvremenu, vrsta je postala strogo zaštićena vrsta u Francuskoj, Nemačkoj i drugim zemljama, pa je kao takva navedena u Aneksu D Uredbe Saveta EU (EU Council Regulation No. 338/97) i u Aneksu V(b) Direktive o staništima EU (92/43/EC – Directive on the Conservation of Natural Habitats and Wild Fauna and Flora). Poslednjih godina najveća količina biljne droge Arnicae flos, na evropskom tržištu, je uvežena iz južne i jugoistočne Europe, a naročito iz Španije i Rumunije (Lange, 1998). U nekim delovima Rumunije, populacije arnike su još uvijek relativno velike, ali trend uništenja ili konverzije staništa i pritiska usled prekomernog sakupljanja može ugroziti i arniku i druge lekovite biljke prirodnih resursa u zemlji. Iz tog razloga su svetske organizacije za zaštitu životne sredine WWF-UK i WWF-DCP (Danube-Carpathian Programme) u saradnji sa Univerzitetom poljoprivrednih nauka i veterine (USAMV) iz Kluža-Napoke u Rumuniji, pokrenuli projekt „Očuvanje istočno-evropskog lekovitog bilja: Arnica montana u Rumuniji“ (Michler et al., 2008). Kultivacija arnike u svetu se razvija već više decenija (Heeger, 1956; Bomme, 1999; Dachler i Pelzmann, 1999; Galambosi, 2004) gde se pokazala moguća, ali isto Pregled literature Doktorska disertacija 21 tako komplikovana i prilično skupa, u poređenju sa biljnom sirovinom iz prirode. Budući da je svetska tražnja farmaceutske i kozmetičke industrije za cvetnom glavicom arnike u stalnom porastu, a prirodni resursi sve ugroženiji, kultivacija ove kulture se ispostavlja kao jedini održivi način obezbeđivanja sirovine za tržište (Smallfield i Douglas, 2008). 2.5.2. Sortiment Godine 1990. profesor Urlih Bome iz Bavarskog državnog istraživačkog centra za poljoprivredu (LfL) je proizveo prvu sortu arnike pod nazivom ’ARBO’ (Kathe, 2006), koja je postala komercijalno dostupna nekoliko godina kasnije, i do danas je jedina priznata sorta vrste Arnica montana L. (Blatt für Sortenwesen, 2010). ‘ARBO’ u proseku daje oko 90 cvetnih glavica po biljci, a potvrđeno je da u hemiskom sastavu suve droge sadrži oko 0,7% flavonoida i oko 0.8% seskviterpenskih laktona (Bomme, 1999). 2.5.3. Iskustva u gajenju arnike Arnika se može naći u spontanoj flori od Skandinavije do Iberijskog poluostrva, a njena distribucija je uglavnom ograničena na planinske livade siromašne u hranivima (Bruelheide & Scheidel, 1999). Većina autora je definiše kao biljku hladnih staništa, ali optimalna nadmorska visina za gajenje u literaturi nije precizno definisana, budući da su ogledi izvođeni na različitim geografskim širinama (Bomme et al., 1995; Galambosi, 2004; Smallfield i Douglas, 2008). Istraživanja na polju introdukcije arnike na Novom Zelandu su pokazala da biljka, na nižim nadmorkim visinama, nije prešla u generativnu fazu (Smallfield i Douglas, 2008), dok se, u pogledu kvaliteta biljne droge, ukupna količina derivata kafene kiseline, flavonoida i fenola značajno se povećava sa povećanjem nadmorske visine (Spitaler et al., 2008). Takođe se i štete nanete od strane puževa golaća pojavljuju kao ograničavajući faktor na nižim nadmorskim visinama (170 m) (Bruelheide i Scheidel, 1999; Bruelheide, 2003). U našim agreoekološkim uslovima Stepanović i saradnici (2009) preporučuju gajenje arnike u planinskim predelima na visini od 900 do 1500 m nadmorske visine. Pregled literature Doktorska disertacija 22 Arnika je vrlo osetljiva prema tipu zemljišta. Najbolje uspeva na rastresitim, humusom-bogatim, dobro aerisanim oceditim zemljištima. pH vrednost zemljišta bi trebalo da se kreće od blago kiselog do neutralnog, s tim da procenat kalcijuma (CaCO3) u zemljištu ne bi smeo da prelazi 1,5%, pošto u suvišku dovodi do hloroze, slabog porasta i uginuća biljaka (Dachler i Pelzmann, 1999; Bomme, 1999). Ukoliko su ispoštovani osnovni agroekološki uslovi, arnika se u kulturi može gajiti i do četiri godine (Marquard i Kroth, 2001) Razmnožavanje Arnika se razmnožava setvom ili deljenjem rozeta (vegetativno). Seme arnike je cilindričnog oblika sa težinom hiljadu semena između 0.9 – 1.3 g i dobrom klijavošću koja je obično ispod 80% (Smallfield i Douglas, 2008). Direktna setva arnike je moguća, ali obično dovodi do neujednačenog sklopa, pa se preporučuje zasnivanje plantaža putem sadnica (Prommersberger i Dapper, 1995; Bomme, 1991; Smallfield i Douglas, 2008). Tretman semena za obe procedure ima smisla (Bomme et al., 1995). Ovo se može izvesti putem sedmodnevnog hlađenja vlažnog semena na 5°C (Bomme et al., 1995), potapanjem semena na 48 sati u destilovanu vodu ili sedmodnevno potapanje u rastvor polietilen-glikola-6000 sa naknadnim sušenjem semena (Prommersberger & Dapper, 1995; Bomme, 1991; Bomme, 1999), pri čemu se postiže bolja sinhronizacija klijanja (Smallfield i Douglas, 2008). Pri konstantnoj temperaturi od 18 – 20°C i optimalnoj vlažnosti, seme arnike bi trebalo da klija u roku od pet do sedam (deset) dana (Marquard i Kroth, 2001). Sadnice se proizvode setvom semena u kontejnere za proizvodnju rasada. Sadnica je spremna za presađivanje nakon 6-8 nedelja, kada ima formirana 3-4 para pravih listova i dobro razvijen koren (Smallfield i Douglas, 2008). Sadnju treba obaviti u aprilu ili najkasnije u maju mesecu (Bomme et al. 1995; Marquard i Kroth, 2001). Iako neki strani autori preporučuju postizanje većeg broja biljaka po hektaru (čak i do 125000) sužavanjem međurednog rastojanja na 30 ili 40 cm (Bomme et al. 1995; Muñoz, 1987), za naše uslove se preporučuje model 60-70 cm rastojanje između redova i 23 - 25 cm u redu (Stepanović et al., 2009) zbog primene Pregled literature Doktorska disertacija 23 standardne (nespecijalizovane) poljoprivredne mehanizacije: Ovim rasporedom se postiže 60000 – 72500 biljaka po hektaru. Đubrenje Potrebe arnike za hranivima u zemljištu su prilično male (Prommersberger i Dapper, 1995; Bomme, 1991). Na zemljištima koja su prebogata hranivima arnika može reagovati lisnim ožegotinama ili čak uginućem (Dachler i Pelzmann, 1999). Uprkos ovoj tvrdnji, višegodišnji ogledi u Južnom Tirolu pokazuju da arnika pozitivno reaguje na dodatnu ishranu dajući pri tom veću rozetu, višlje i razgranatije biljke sa većim brojem cvetnih glavica (Seeber et al., 1997). Ishranu u kulturi arnike treba prilagoditi postojećem potencijalu hraniva, tako da primenu đubrenja treba uraditi tek posle izvršene analize zemljišta (Marquard i Kroth, 2001). Bomme i saradnici (1995) savetuju primenu đubriva neposredno pred sadnju u količini 150 kg N/ha, 70-84 kg P2O5/ha i 100-240 K2O/ha. Stepanović i saradnici (2009), ukazuju da fosfor pospešuje cvetanje, a da je njegova pristupačnost na jako kiselim zemljištima otežana, tako da posebnu pažnju treba posvetiti đubrenju ovim elementom. Budući da kalcijum u zemljištu može prouzrokovati hlorozu arnike (Bomme et al., 1995), smanjeni porast i oslabljeno usvajanje fosfora i magnezijuma (Jenelten i Feller, 1992), izbegavaju se đubriva koja u sebi sadrže kalcijum, kao i zemljišta koja ovaj element sadrže više od 1,5% (Bomme, 1999). Bolesti i štetočine Na neodgovarajućim zemljištima (alkalna i neutralna) učestala je pojava hloroze (Dachler i Pelzmann, 1999). Pojava mušice Tephritis arnicae L. (Slika 11) može da nanese velike štete, obzirom da ovaj insekt polaže jaja u cvetni pupoljak, u ranoj fazi, tako da larve pojedu veliki deo cvetne glavice prilikom otvaranja cvetova (Marquard i Kroth, 2001) Pregled literature Doktorska disertacija 24 Slika 11. Pojava larve mušice Tephritis arnicae L. na cvetnoj glavici arnike (preuzeto sa fr.wikipedia.org) Od gljivičnih obolenja prisutne su Phyllosticta arnicae, koja izaziva venuće arnike, i Sphaerotheca humuli var. fuliginea, koja izaziva pepelnicu (Dachler i Pelzmann, 1999). Nega Od mera nege u kulturi arnike, najznačajnija je svakako borba protiv korova (Stepanović et al., 2009), budući da za nju trenutno ne postoje registrovana zaštitna sredstva (Krushe i Kusterer, 2010). Savetuje se regularna međuredna obrada motičastim ili rotacionim kultivatorima radi provazdušenja zemljišta i uklanjanja korovske flore (Prommersberger i Dapper, 1995) sa posebnom pažnjom na izbegavanje povređivanja podzemnih i nadzemnih delova kulture (Bomme et al., 1995). U sušnim prilikama i prilikom zasnivanja plataže poželjno je umereno navodnjavanje (Marquard i Kroth, 2001). Stepanović i saradnici (2009) takođe predlažu i prihranu azotom u sredini vegetacije u dozi 27 – 40 kg N/ha. Upotreba zaštitnih sredstava u kulturi arnike je moguća ukoliko naručilac sirovine propiše kritične maksimalne vrednosti rezidua aktivne materije upotrebljenog sredstva (Prommersberger i Dapper, 1995). Pregled literature Doktorska disertacija 25 Žetva i prinosi Berba cvetnih glavica arnike počinje u drugoj godini i obavlja se ručno ukoliko ne postoje specijalizovani berači (Marquard i Kroth, 2001). Optimalan trenutak žetve cvetnih glavica je kada je cvetna stabljika potpuno razvijena, kunučni listići i jezičasti cvetovi potpuno otvoreni, a trubasti cvetovi otvoreni od polovine do punog diska (Douglas et al., 2004). U našim klimatskim uslovima cvetna glavica se bere od sredine maja do kraja juna, ali, zavisno od nadmorske visine, ovaj rok može biti pomeren (Stepanović et al., 2009). Berba se obavlja višekratno na svaka 4 - 7 dana, zavisno od intenziteta cvetanja (Prommersberger i Dapper, 1995; Bomme, 1991). Zavisno od lokacije i pristupačnosti, za branje jednog kilograma svežih cvetnih glavica potrebno je oko 26 minuta (Bomme, 1991). Berbe bi trebalo obavljati po suvom vremenu u podnevnim časovima kada je nivo aktivnih materija najviši (Prommersberger i Dapper, 1995). Koren se vadi nakon tri ili četiri godine kultivacije u oktobru ili novembru, vibracionom vadilicom za krompir (Prommersberger i Dapper, 1995; Bomme, 1991). Prinosi suve cvetne glavice se po većini autora kreću između 300 – 700 (1000) kg/ha (Bomme, 1991; Dachler und Pelzmann, 1999; Muñoz, 1987; Stepanović et al., 2009). Prinosi korena se kreću od 500 – 1000 kg/ha (Dachler i Pelzmann, 1999) do 700 – 2300 kg/ha (Bomme, 1999), opet u zavisnosti od gustine biljaka na parceli. Arnika se može brati od druge do četvrte godine, a nakon toga prinosi opadaju (Bomme, 1999; Stepanović et al., 2009). Sušenje Cvetna glavica se suši u sušarama odmah nakon branja na temperaturi od 40° C (Prommersberger i Dapper, 1995; Bomme, 1991). Manje količine se mogu prirodno sušiti u tankom sloju na zasenjenom i provetrenom mestu (Bomme, 1991). Odnos mase sveže i suve cvetne glavice je 4-5:1, a korena 3:1 (Dachler i Pelzmann, 1999). Koren je manje osetljiv i može se sušiti, opran i uzdužno isečen, na 50° C (Marquard i Kroth, 2001). Cilj istraživanja Doktorska disertacija 3. CILJ ISTRAŽIVANJA Za sirovinom cvetne glavice arnike (Arnice flos) postoji rastuća međunarodna tražnja obzirom da je neophodan sastojak mnogih masti i gelova koji se koriste u proizvodima za medicinsku, fizioterapeutsku i sportsku masažu, kako i u sve većem broju preparata namenjenih za ličnu kozmetiku. Većina svetske proizvodanje osušenog cveta arnike još uvek zavisi od samoniklih resursa. Prirodne populacije arnike su ugrožene zahvaljujući gubitku staništa, promenama u ekološkim uslovima i prevelikoj eksploataciji za medicinske svrhe, pa su u većini evropskih zemalja uvedene specijalne mere zaštite ove biljne vrste. Kako potreba za arnikom na svetskom tržištu nastavlja raste, gajenje ove biljne vrste dobija na značaju kao održivi izvor kvalitetne biljne sirovine. Budući da Srbija ima reputaciju izvoznika velikih količina visokokvalitetnih „industrijom nezagađenih“ lekovitih biljnih sirovina u zemlje Evropske Unije, a da su područja planinskih livada i pašnjaka nedovoljno iskorišćena, gajenje arnike bi moglo da pruži altrenativni izvor prihoda seoskim domaćinstvima na većim nadmorskim visinama. Cilj ovog rada je bio da se proučavanjem morfoloških, proizvodnih i hemijskih osobina pod uticajem tri indukovana faktora (vreme sadnje, vrsta sadnica i vrsta đubrenja) iznađe optimalan model gajenja arnike u agroekološkim uslovima planinskog regiona Srbije. Poseban akcenat u toku istraživanja je stavljen na proučavanje jačine odnosa između pojedinih posmatranih osobina radi boljeg razumevanja biologije formiranja prinosa cvetnih glavica. Pored prinosa cvetne glavice, kao sporedni proizvodi, proučavani su i podzemni organi arnike (rizom i koren) koji sadrže velike količine etarskog ulja u kojima su dominantno zastupljena aromatična jedinjenja. Jedan od ciljeva istraživanja je bio da se mikroskopskim snimanjem samlevenog biljnog materijala pod različitim uveličanjima i tehnikom tankoslojne hromatografije ustanovi jednostavna procedura identifikacije cveta arnike u odnosu na dva pretpostavljena falsifikata. Takođe je proučavana mikrostruktura skladišnih kanala i mehanizam ekskrecije etarskih ulja u podzemnim organima. Važna grupa ciljeva u ovom radu bila je hemijska karakterizacija droga arnike (cvetnih glavica, rizoma i korena), dobijenih od biljaka gajenih u agroekološkim uslovima planinskog regiona zapadne Srbije, gde je pored kvantifikacije najvažnijih grupa sekundarnih metabolita po prvi put na sirovini iz ovog regiona izvršena identifikacija jedinjenja seskviterpenskg Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 27 kompleksg i dominantnih fenolnih jedinjenja, dok je na podzemnim organima po prvi put po prvi put izvrsena detaljna razdvojena karakterizacija etarskog ulja rizoma i korena. U cilju doprinosa već poznatim aktivnostima aktivnih materija arnike, izvšeno je uporedno testiranje antioksidativne i antimikrobne aktivnosti ekstrakata cvetne glavice i etarskih ulja podzemnih organa. 4. RADNE HIPOTEZE U ovom istražjivanju pošlo se od sledećih pretpostavki: - Da će različiti uslovi gaјenja arnike usloviti razlike u odgovaraјućim morfološkim parametrima i prinosu sirovina. - Da će posmatrane osobine arnike biti međusobno zavisne. - Da će različiti uslovi gaјenja imati uticaјa na poјavu razlika u hemiјskom sastavu sirovine, odnosno hemijskim profilima biljnih droga arnike (cvetne glavice, rizom, koren). - Da će uzorci iz viših faza prerade biljnih sirovina (ekstrakti cvetnih glavica i etarsko ulje rizoma i korena), različitog hemiјskog sastava, ispoljiti različite biološke aktivnosti in vitro, tј. imati različitu antimikrobnu i/ili antioksidativnu aktivnost. U cilju testiranja radnih hipoteza, razvijene su i testirane odgovarajuće nulte hipoteze za svaki posmatrani parametar po svakom indukovanom faktoru. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 28 5. MATERIJAL I METODE ISTRAŽIVANJA 5.1. Materijal 5.1.1. Biljni materijal Za zasnivanje ogleda korišćeno je seme arnike sorte ’ARBO’, trenutno jedine priznate sorte ove vrste, koje je nabavljeno posredstvom semenske razmene iz Centra za poljoprivredna istraživanja u Finskoj (Beratalan Galambosi, MTT Agrifood Research Finland, Jokioinen). 5.1.2. Đubriva Stajsko đubrivo – zgoreli goveđi stajnjak (u daljem tekstu – stajnjak) je nabavljano u dva navrata (proleće i jesen) od lokalnog proizvođača sa Kaluđerskih Bara, a pregled fizičko-hemijske analize te dve partije je dat je u Tabeli 8. Specifična gustina stajanjaka bila je 0.8 kg/dm3. Tabela 8. Pregled fizičko-hemijskih osobina stajnjaka kojim je đubren ogled Karakteristika Proleće Jesen pH 8.79 8.81 Vlaga (%) 75.20 79.10 Suva materija (%) 24.80 20.90 Organska materija (% na svežu masu) 17..98 15.40 Mineralne materije (% na svežu masu) 6.82 5.50 Organska materija (% na suvu masu) 72.50 73.60 Organski ugljenik (% na suvu masu) 36.25 36.80 Mineralne materije (% na suvu masu) 27.50 26.40 C/N 16.55 9.92 Sadržaj soli (% na svežu masu) 0.15 0.50 Ukupni N (% na suvu masu) 2.19 2.68 Ukupni N (% na svezu masu) 0.54 0.56 P2O5 744 265 AL-pristupačni K2O (mg/100 g sveže mase) 240 500 Kao mineralno đubrivo korišćeno je kompleksno NPK đubrivo formulacije 15:15:15 (HIP-Azotara, Pančevo). Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 29 5.2. Metode 5.2.1. Poljski ogled Eksperimentalna lokacija Mesto na kome je postavljena ogledna plantaža arnike se nalazi u regionu Zapadne Srbije na planini Tara u okviru rasadnika Nacionalnog parka „Tara“ na lokalitetu Kaluđerske bare (43°53'44.17"N 19°33'11.62"E, 1008 m.n.v.) (Slika 12). Slika 12. Lokalitet ogleda Zemljište je distrično-smeđe blago kisele reakcije formirano na serpentinu (Radanovic et al., 2007). Uzimanje uzoraka zemljišta za analizu je rađeno pre đubrenja, pri čemi su deset nezavisnih uzoraka po bloku đubrenja spajani u jedan reprezentativni za analizu. Agrohemijska analiza zemljišta je obuhvatila: 1. Reakciju zemljišta (pH) – po potenciometrijskoj metodi 2. Sadržaj humusa – metodom Turina modifikovanom po Simakovoj Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 30 3. Ukupni azot (%N) – motoda po Kjeldahl-u 4. Lakopristupačni azot (NH4+, NO3-) – metodom modifikovanom po Bremner-u 5. Lakopristupačni fosfor i kalijum – Al-metodom po Egner-Riehm-u Za analizu zemljišta korišćene su standardne metode (Džamić et al., 1996). Agrohemijske analize zemljišta odrađene su u laboratoriji za fiziologiju i agrohemiju Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu. Rezultati analiza pH reakcije i hraniva u zemljištu data je u Tabeli 6. Tabela 6. pH reakcija i potencijal plodnosti zemljišta ogledne parcele pH NH4 NO3 Al-P2O5 Al-K2O Varijanta đubrenja* H2O nKCL Humus % Ukupni N % mg/kg mg/100g PO 6.35 4.95 PM 6.42 5.27 PK 6.54 5.34 JO 6.41 5.17 JM 6.17 4.18 JK 6.53 5.20 4.2 0.21 6.7 20.1 20 26.4 * P -prolećno zasnivanje, J -jesenje zasnivanje, O - stajnjak, M -mineralno đubrivo, K - kontrola Klimatske karakteristike Na Grafiku 1. prikazan je klimadijagram po Walter-u (Walter et al., 1975) za lokalitet Zaovine, koji je udaljen oko 25 km od lokaliteta Kaluđerske Bare gde je ogled postavljen. Obzirom da se meteorološka stanica nalazi na istoj planini i na približno istoj nadmorskoj visini (ca. 900 m), smatrali smo da klimatski podaci dobijeni iz ovog izvora verno prezentuju variranje u temperaturi i količini padavina na samom ogledu. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 31 Grafik 1. Klimadijagram po Walteru za lokalitet Zaovine Pregled maksimalnih, minimalnih i prosečnih godišnjih temperatura dat je u Tabeli 7, zajedno sa prosečnim temperaturama u vegetaciji (mart – septembar) i sumom godišnjih padavina. Tabela 7. Temperaturni proseci, ekstremi i sume padavina na lokalitetu Zaovine periodu 2008-2010 Temperatura Padavine Prosečna T u vegetaciji Prosek Min Max Σ (mart - sept.) Godina oC oC oC mm oC 2008 11.44 -7.33 28.00 819 15.46 2009 10.92 -6.83 23.78 806 16.06 2010 10.54 -9.33 26.33 936 15.25 5.2.1.1. Proizvodnja sadnica Proizvodnja sadnica iz semena Seme je sejano u pikir sanduke 400 x 250 x 80 mm, a pikiranje je vršeno u kontejnere dimenzija 494 x 274 x 40 mm sa 66 ćelija. Kao setveni supstrat korišćen je treset Floradur B fine (Floragard, Nemačka), a kao supstrat za pikiranje korišćen je Floradur B Grossier + Argile (Floragard, Nemačka). Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 32 Postupak proizvodnje sadnica arnike traje oko 3 meseca, a započinje setvom semena u pikir sanduke. Seje se prirodno seme, dorađeno prema uobičajenoj semenarskoj proceduri klijavosti oko 80%. Težina 1000 semenki arnike se kreće od 0.9 do 1.3 g. Setva je obavljena omaške u pikir sanduke napunjene komercijalnim setvenim supstratom, a seme prekriveno tankim slojem supstrata (oko 3 mm). U našim temperaturnim uslovima za klijanje (oko 15 – 25oC) arnika je nikla u roku od 7 – 10 dana (Slika 13). Slika 13. Klijanje arnike Slika 14. Faza pred pikiranje Do pikiranja, od mera nege, održavana je samo optimalna vlažnost supstrata. Pikiranje je obavljeno kada je biljka dostigla fazu početka formiranja trećeg pravog lista (otprilike mesec dana od nicanja) (Slika 14). Pikiranje je obavljeno u kontejnere za proizvodnju rasada napunjene komercijalnim supstratom za pikiranje (Slike 15 i 16). Slika 15. Ispikirani kontejner Slika 16. Faza pred sadnju Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 33 Zapremina pojedinačne ćelije u kontejneru je bila 50 ml. Nakon pikiranja i punog porasta trećeg pravog lista (otrilike 15 dana nakon pikiranja), sve do sadnje, pored redovnog oržavanja vlage supstrata, i zasene po potrebi, u vremenskom razmaku od 10 dana primenjivana je prihrana kompleksnim tečnim NPK hranivom (Wuxal, Chemical Agrosava) (formulacije 8:8:6) u 0.3% razblaženju. Nakon faze formiranja punog četvrtog pravog lista, rasad je prenešen na kaljenje, u planinski mikroklimat, na lokalitet ogleda, bez direktne insolacije. Nakon nedelju dana kaljenja, čim su se ukazale povoljne vremenske prilike, rasad je posađen (Slike 17 i 18). Slika 17. Sadnica arnike Slika 18. Sadnja arnike Sadnice za prolećnu sadnju su proizvedene u stakleniku, dok su sadnice za jesenju sadnju proizvedene na otvorenom uz prisustvo jutarnje direktne insolacije do 11h i zasenom u drugom delu dana. Proizvodnja sadnica deljenjem bokora Sadnice za vegetativnu propagaciju su dobijane deobom bokora biljaka arnike istog semenskog porekla (sorta ‘ARBO’) iz prethodnih poljskih ogleda gajenja na istom lokalitetu od biljaka koje su ušle u treću vegetaciju. Sadnice su i za prolećni i za jesenji rok vađene i odvajane neposredno pre sadnje. Sadnice dobijene deobom bokora predstavljene su na Slici 19. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 34 Slika 19. Sadnice dobijene deljenjem bokora na sekundarne rozete sa pripadajućim rizomom i korenom 5.2.1.2. Postavka i održavanje ogleda Ogled gajenja arnike je postavljen u 2x3x2 Split-plot eksperimentalnom dizajnu. Šematski prikaz ogleda (jednog plota sadnje) dat je u Prilogu 1. Ispitivan je uticaj tri indukovana faktora: 1. Vreme sadnje – prolećni i jesenji rok zasnivanja 2. Vrsta đubriva – stajnjak, NPK i kontrola 3. Vrsta sadnica – sadnice proizvedene iz semena (generativne) i proizvedene deljenjem bokora (vegetativne ili klonske) Prolećna sadnja obavljena je 12. maja 2008. godine (Slika 20), a jesenja sadnja 10. oktobra 2008. godine. Ova dva roka se razlikuju 151 dan u vremenu sadnje. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 35 Slika 20. Postavka ogleda na lokalitetu Kaluđerske bare, Tara Đubrivo je unešeno u zemljište freziranjem neposredno pred sadnju i to u količini: 1. Stajnjak - 100 m3/ha 2. NPK – 2 t/ha Površina ogleda je podeljena na dva osnovna plota po vremenu sadnje: prolećni i jesenji, a na svakom plotu su razdvojena tri sub-plota po tipu đubrenja: stajsko đubrivo, mineralno đubrivo i kontrola. U svakom sub-plotu su se nalazile osam parcelica koje su predstavljale po četiri ponavljanja dva tipa sadnica: iz semena i deobom bokora. Sve biljke su bile posađene u rasporedu 20x70 cm, a svaka parcelica je sadržala 72 biljke. Prostorni razmak između osnovnih plotova je bio 2 m, između sub-plotova 1.5 m, a između parcelica 1 m. Ukupna površina ogleda bila je 680 m2, površina osnovnih plotova 340 m2, površina sub-plotova 100 m2 i površina parcelica 8,4 m2. Šematski prikaz jednog plota sadnje ogleda predstavljen je u Prilogu 1. Od mera nege primenjivano je zalivanje nakon sadnje i redovno okopavanje. 5.2.2. Testirane karakteristike 5.2.2.1. Morfološki parametri Svi morfološki parametri, osim broja sekundarnih rozeta, mereni su, odnosno brojani, neposredno pred početak branja cvetnih glavica. Za prolećni deo ogleda Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 36 prikupljeni su podaci za 2009. i 2010. godinu, a za jesenji deo ogleda samo za 2010. godinu. Merenja su vršena metrom, a brojanja ručno. Brojanje sekundarnih rozeta je vršeno zajedno sa vađenjem korena i za oba roka sadnje su prikupljeni podaci za 2009. i 2010. godinu. Prečnik rozete [cm] Za vrednost parametra prečnika rozete meren je maksimalni prečnik listova rozete (Slika 21A). Slika 21. Način merenja prečnika rozete (A) i visine cvetnog izdanka (B) Visina cvetnog izdanka [cm] Visina cvetnog izdanka je merena metrom od površine zemlje do terminalne cvetne glavice (Slika 21B). Broj cvetnih izdanaka Izolovane cvetne stabljike, koje vode poreklo iz iste rozete, brojane su ručno. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 37 Broj cvetnih glavica Broj cvetnih glavica po biljci je naknadno izračunati parametar koji predstavlja odnos ukupno ubranih cvetnih glavica po parcelici i broja biljaka cvetalih na parcelici. Prečnik cvetne glavice [cm] Parametar prečnik cvetne glavice je meren lenjirom na terminalnoj cvasti neposredno pred prvu žetvu i predstavlja maksimalno rastojanje najudaljenijih tačaka dva naspramna jezičasta cveta. Broj sekundarnih rozeta Brojanje sekudrnih rozeta je rađeno zajedno sa vađenjem podzemnih organa arnike. Jedino na taj način je bilo moguće prebrojati novonastale rozete koje se na matičnoj biljci nalaze u veoma gustom sklopu. 5.2.2.2. Prinosi Prinos cvetnih glavica [kg/ha] Berbe cvetnih glavica su obavljane ručno, a brane su samo one cvetne glavice čiji su cevasti cvetovi bili potpuno otvoreni. Berbe su vršene periodično u razmaku od oko 5 dana, koliko je otprilike potrebno da se cvetne glavice nižeg sprata u potpunonsti razviju. Cvetne glavice sa jedne parcelice su prebrojavane u toku branja, skladištene u kartonske kese kao posebne partije i razdvojeno sušene. Sušenje ubranih cvetnih glavica je organizovano na sušarskim lesama i zasenjenoj promajnoj prostoriji (Prilog 4 C i D). Temperatura u prostoriji nije prelazila 30oC. Nakon sušenja (vlaga < 10%) cvetne glavice su merene na laboratorijskoj vagi, a prinosi preračunavani na kg/ha. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 38 Prinos rizoma i korena [kg/ha] Podzemni organi arnike su vađeni na kraju vegetacionog perioda (kraj oktobra). Operacija vađenja je vršena ašovom, a izvađene biljke oprane pod jakim mlazom vode i ostavljene na sušenje u tankom sloju na zasenjenom promajnom mestu. Nakon sušenja, baštenskim makazama je odstranjivana rozeta od podzemnih delova, a koren odvajan od rizoma ručnim krunjenjem. Prinosi po ponavljanjima su mereni na laboratorijskoj vagi i preračunavani na kg/ha. Prinos etarskog ulja rizoma i korena [% m/m] Priprema uzoraka za destilaciju etarskog ulja je bazirana na vazdušno suvom biljnom matrijalu. Samleveni uzorak se stavlja u balon za destilaciju i destiliše pomoću Klevendžer tipa aparata prema proceduri Jugoslovenske Farmakopeje (Ph Yug IV, 1984). Procenat prinosa (%) ulja u uzorku izračunat je na bazi apsolutno suvog uzorka. Ovaj parametar nije meren u ponavljanjima zbog nedostatka biljnog materijala. 5.2.2.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga Mikroskopska analiza praškova i preseka podzemnih organa rađena je na lupi LEICA XTL 3400D i mikroskopu LEICA DCML opremljenim digitalnom kamerom i pratećim softverom IM1000. Kao ragens za identifikaciju cveta arnike upotrebljen je Opšti reaktiv čiji je sastav dat u Tabeli 10., a pregled upotrebljenih reagenasa za histohemijske analize podzemnih organa dat je u Prilogu 2. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 39 Tabela 10. Sadržaj Opšteg reaktiva Reagens Predmet bojenja Boja Anilin-sulfat odrveneli elementi – traheje, traheide, mehanička vlakna, sklerenhimske ćelije zlatnožuto Feri-amonijum-sulfat tanini plavocrno ili zeleno Sudan III masna i etarska ulja, smole, suberin, kutin, vosak crveno Jod skrob plavoljubičasto Tankoslojna hromatografija Priprema uzorka Suve cvetne glavice biljnog materijala (Arnica montana, Calendula officinalis, Doronicum columnae) su samlevene, precizno izmerene (1.0 g) i ekstrahovane sa 10 ml metanola na ultrazvučnom kupatilu u trajanju od 15 min. Ekstrakti su nakon hlađenja profiltrirani. Smešu standarda je činio rastvor kafene kiseline (2 mg), hlorogenske kiseline (2 mg) i rutina (5 mg) u 30 ml metanola. Standard izokvercitina je zasebno rastvoren u metanolu u koncentraciji 1 mg/ml. HPTLC uslovi HPTLC analiza urađena je u skladu s metodom opisanom ranije, uz manje izmene (Wagner et al., 1984). Camag HPTLC aparat opremljen Linomat 5 aplikatorom uzorka, automatskom komorom za razvijanje ADC2, TLC Scanner 3 jedinicom i trans- iluminatorom Reprostar 3 je korišćen za analizu. Uzorci ekstrakata biljnih droga (2 μl), smeša standarda (3 μl) i izokvercitin (3 μl) naneti su na HPTLC ploču (20 × 10 cm silikagel 60, 0.25 mm debljina sloja, proizvođač Merck) u širini traka od 12 mm. Ploča je razvijana u mobilnoj fazi etil acetat-voda-mravlja kiselina-sirćetna kiselina (100:27:11:11, v/v) u zasićenoj komori. Nakon razvijanja, ploča je osušena 10 min na 120°C. Nakon sušenja, izvršena je derivatizacija hromatograma prskanjem prirodnim reaktivom (NP/PEG). Ploča je zatim posmatrana pod UV-lampom na talasnoj dužini 365 nm. Fotografisanje ploče vršeno je u trans-iluminatoru Reprostar 3 opremljenim softverski kontrolisanim digitalnim foto-aparatom. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 40 Lokalizacija etarskog ulja u rizomu i korenu Svetlosna mikroskopija Za opšta histološka zapažanja uzeti su uzorci rizoma i korena sa biljaka sa kraja druge godine gajenja. Preparati nastali parafinskim rezovima (5-10μm) su obojeni pomoću alcian plave i safranina (1% u 50 posto etanola). Polu-tanki preseci (0.9-1.0 μm debljine) su obojeni pomoću 0,25% toluidinskim plavim O u vodi (Ruzin, 1999). Analiza prikaza sprovedena korištenjem LEICA DCML mikroskopa opremljenog digitalnom kamerom i softverom IM1000. Histohemijska analiza Rizom i koren arnike (25 mm i 5 mm u prečniku, respektivno) secirani su ručno poprečno. Sva histohemijska ispitivanja obavljena su upotrebom svežeg biljnog materijala. Urađene su sledeće histohemijske reakcije: Phloroglucinol-HCl za lignin, (Jensen, 1962), Ruthenium crvena za pektine (Johansen, 1940), Lugol za skrob (Johansen, 1940), Fuchsin kiselina za proteine (Peterson i sur, 2008. ), Sudan III i Sudan crna B za lipide (Johansen, 1940; Lison, 1960), Gvožđe-trihlorid za fenolna jedinjenja (Johansen 1940), aluminijum-trihlorid za flavonoide (Guerin i sur., 1971), hloridni vanilin (Mace i Howell, 1974), gvožđe-sulfat i gvožđe-hlorid (Clark, 1981; Johansen, 1940) za tanine, Wagner-ov reagens i Dittmar-ov reagens za alkaloide (Furr i Mahlberg, 1981) i sumporna kiselina za seskviterpenske laktone (Geissmen i Griffin, 1971). Standardni kontrolni postupci u svim testovima su urađeni istovremeno. Pregled upotrebljenih reagenasa za histohemijske analize podzemnih organa A. montana dat je u Prilogu 2. Fluorescentna mikroskopija Za ispitivanja fluorescentne mikroskopije korišćen je epifluorescentni mikroskop (Leica DMLS opremljen HBO 50 W živinom lampom) i rasponom filter blokova (A: BP 340 - 380, I3: BP 450-490 i N2.1: BP 515-580). Nebojeni preseci su Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 41 promatrani pod UV (340-380 nm), kako bi se istražila prisutnost fenola koji su autofluorescirali na tim talasnim dužinama (Ruzin, 1999). Materijal je takođe bio tretiran s aluminijum trihloridom za ispitivanje prisustva flavonoida (Guerin i sur., 1971). Elektronska mikroskopija - skenirajuća (SEM) i transmisiona (TEM) Da bi se istražila ultrastruktura sekretornog tkiva, primenjene su tehnike SEM i TEM. Na SEM su uzorci su osušeni obloženi zlatom u BAL-TEC ISS 005 Sputter Coater u periodu od 100 sekundi na 30mA, a korišćen je JEOL JSM-6460 LV elektronski mikroskop sa ubrzanjem napona od 15 kV. Uzorci za TEM istraživanja su fiksirani u 2% glutar-aldehidu u cacodylate puferu u periodu od 24 sata na 4°C, nakon čega su isprani cacodylate puferu, post- fiksirani u osmijum-tetroksidu (1%, 0,1 M cacodylate pufer, pH 7.4), kontrastovani sa olovo-citratom i uranil acetatom, dehidrirani serijom etanolnih razblaženja i konačno infiltrirani i ugrađeni u epoksidne smole (EPON 812 sa DDSA i MNA). Nakon polimerizacije na 60°C, izrezani su preseci debljine 60 nm korišćenjem LEICA Ultracut-UCT ultramicrotome i staklenog noža. Uzorci su pregledavani pod MORGANI 268 transmisionim elektronskim mikroskopom na 100 kV. 5.2.2.4. Hemijska analiza droga Određivanje sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona [mg/g] Analitička ekstrakcija Ekstrakcija seskviterpenskih laktona iz cveta arnike za kvanitativnu i kvalitativnu analizu je rađena po modifikovanoj metodi Douglas i sar. (2004). Samleveni biljni materijal (1 g) je preliven sa CHCl3 (20 mL) čemu je dodat interni standard (1 mg Santonin) i postavljen na ultrazvučno kupatilo (5 min, 50 Hz). Rastvor je profiltriran, ispran (3x2 mL CHCl3), uparen do suvog ( na 35oC, vakuum uparivač), ekstrakt je rastvoren u MeOH (2 mL) i nanesen na kolonu oktadecilsilan silika gel, Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 42 reverzna faza (BAKERBOND SPE, 6 mL zapremina, 1000 mg punjenje, 40 μm veličina čestice, 60 Å), prethodno nakvašenu smešom restvarača MeOH:H2O (3:2, 3 mL). Kolona je puštena da se ocedi do suvog, a kombinovani ocedak se hladio na -20oC (30 min), filtrirao (Phenex 13 mm 0.45 μm PTFE) i tako dobijeni rastvor se aplikovao na HPLC i LC/MS. HPLC analiza Određivanje sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona u biljnom materijalu A. montana je izvedena po metodi propisanoj u farmakopeji (Ph. Eur. 6.0), a analiza se obavljala na tečnom hromatografu Hewlett-Packard HP 1090. Injekciona zapremina uzorka je 20 μl. Protok kroz kolonu je bio 1.2 ml/min, a UV detekcija na 225 nm. Kolona: Superspher 100 RP-18 LiChroCART 125-4 dimenzije: l = 120 mm, ∅ = 4 mm; stacionarna faza: oktadecilsilil silika gel za hromatografiju R (4 μm) Mobine faze: - mobilna faza A: voda (H2O) - mobilna faza B: metanol (MeOH) Vreme (min) Mobilna faza A (procenat V/V) Mobilna faza B (procenat V/V) 0 – 3 62 38 3 – 20 62 → 55 38 → 45 20 – 30 55 45 30 – 55 55 → 45 45 → 55 55 – 57 45 → 0 55 → 100 57 – 70 0 100 70 - 90 62 38 Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 43 Proračun procenta sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona, izraženih preko dihidrohelenalin tiglata (DHHT) vrši se po sledećoj formuli: SLS = površina svih pikova koji po spektru referišu kao seskviterpenski laktoni, a na hromatogramu ispitivanog uzorka se pojavljuju posle pika internog standarda (santonin) Ss = površina pika internog standarda (santonin) u ispitivanom uzorku m = masa ispitivanog uzorka, u gramima [g] C = koncentracija santonina u rastvoru internog standarda korošćenog u ispitivanju uzorka, u miligramima po mililitru [mg/ml] V = zapremina rastvora internog standarda korišćenog u ispitivanju uzorka, u mililitrima [ml] 1.187 = korelacioni faktor između pikova dihidrohelenalin tiglata i santonina Sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona se izračunava preko odnosa površine internog standarda i površina ostalih pikova koji po retencionom vremenu izlaze posle pika standarda, a koji svojim spektrom odgovaraju seskviterpenskim laktonima. LC-MS analiza seskviterpenskih laktona LC/MS analiza je izvršena na Agilent MSD TOF aparatu, povezanim sa Agilent 1200 series HPLC koristeći istu kolonu, mobilne faze, protok eluiranja i gradijentni program kao i kod analitičkog HPLC-a. Napon fragmentora je bio 140V, a opseg spektralnog snimanja 225 nm. Maseni spektri su dobijeni na Agilent Esi-MSD TOF uređaju. Injekciona zapremina je bila 5 μl. Protok sušećeg gasa (N2) je bio 10 l/min, pritisak raspršivača 45 psig, a temperatura sušećeg gasa 350°C . Za elektrosprej jonizaciju (ESI), uslovi su bili sledeći: napon kapilare 4000 V, skimer 60 V, Oct RF V 250 V, opseg masa 100 do 1500 m/z. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 44 Određivanje sadržaja fenolnih komponenti [mg/g] Analitička ekstrakcija Samlevenih 100 mg cveta je tri puta sonifikovan na UZ kupatilu sledećim redosledom: 1. u 5 mL MeOH/ (CH3)2CO/ H2O (3/1/1, v/v/v) – 30 min 2. u 5 mL MeOH/ (CH3)2CO/ H2O (3/1/1, v/v/v) – 30 min 3. u 5 mL MeOH/ H2O (1/1, v/v) – 30 min Između svake sonifikacije rastvor je profiltriran u normalni sud od 20 mL i na kraju ispran sa 20 mL MeOH/(CH3)2CO/H2O (3/1/1, v/v/v). Sud je dopunjen do 20 mL sa smešom rastvarača MeOH/(CH3)2CO/H2O (3/1/1, v/v/v). Odavde je izdvojeno 10 mL rastvora i upareno do suvog. Suvi ostatak je pokupljen sa 2 mL MeOH/(CH3)2CO/H2O (3/1/1, v/v/v), koji je nakon filtracije aplikovan na HPLC. HPLC analiza Kvantifikacija dominantnih fenolnih komponenti izvršena je HPLC analizom po ranije opisanoj metodi (Spitaler et al., 2006). Analize su rađene na Agilent 1200 aparatu opremljenim DAD detektorom, a primenjeni su sledeći parametri metode: kolona Phenomenex Synergi Hydro-Rp 80A 150 mm × 4.6 mm (4 μm veličina čestica); mobilna faza A, H2O/HCOOH/CH3COOH (99/0.9/0.1, v/v/v); faza B, MeCN/MeOH/HCOOH/CH3COOH (89/10/0.9/0.1, v/v/v/v); protok, 1.00 ml min−1; injekciona zapremina 10 μl; talasna dužina detekcije 350 nm; temperatura kolone, sobna; linearni gradient, 0 min 5% B, 5 min 15% B, 20 min 16% B, 35 min 18% B, 45 min 19% B, 55 min 27.5% B, 60 min 65% B, 65 min 98% B, 70 min stop. Količine jedinjenja su određivane poređenjem površina pikova, dobijenih za pojedina fenolna jedinjenja, sa površinama pikova eksternih standarda kalibrisanih prethodno u različitim razblaženjima po istoj metodi. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 45 Za formiranje kalibracionih kriva za kvantifikaciju flavonoida upotrebljena su razblaženja čistih jedinjenja dobijenih semipreparativnom HPLC tehnikom, dok je za formiranje kalibracione krive za hlorogensku kiselinu korišćen komercijalni HPLC standard (Sigma Aldrich, Nemačka). LC/MS analiza fenolnog kompleksa LC/MS analiza je izvršena na Agilent MSD TOF aparatu, povezanim sa Agilent 1200 series HPLC koristeći istu kolonu, mobilne faze, gradijentni program i protok eluiranja kao za HPLC analizu. Napon fragmentora bio je od 140V. Opseg spektralnog snimanja 190 – 550 nm. Maseni spektri su dobijeni na Agilent Esi-MSD TOF uređaju. Protok sušećeg gasa (N2) je bio 12 l/min, pritisak raspršivača 45 psig, temperatura sušećeg gasa 350°C . Za elektrosprej jonizaciju (ESI), uslovi su bili sledeći: negativna jonska polarnost, napon kapilare 4000 V, skimer 60 V, Oct RF V 250 V, opseg masa 100 do 2500 m/z. Ekstrakcija i izolovanje dominantnih fenolnih komponenti Samleveni cvet biljke (5.0 g) je ekstrahovan tri puta sistemom rastvarača metanol/aceton/voda (3:1:1). Sirovi ekstrakt prečišćavan je hromatografijom na koloni silika gela (260 x 30 mm). Gradijentno eluiranje je započeto metilen-hloridom (95%), a polarnost eluensa povećavana je dodavanjem metanola (Tabela 11). Tabela 11. Gradijentno eluiranje gravitacione hromatografije ekstrakta cveta arnike Eluens Procentni sadrzaj Zapremina frakcije [ml] metilen hlorid-metanol 95:5 200 metilen hlorid-metanol 90:10 100 metilen hlorid-metanol 85:15 100 metilen hlorid-metanol 80:20 200 metilen hlorid-metanol 75:25 100 metilen hlorid-metanol 70:30 300 metilen hlorid-metanol 65:35 200 metilen hlorid-metanol 60:40 100 metilen hlorid-metanol-mravlja kis. 55:45 200 metilen hlorid-metanol-mravlja kis. 54:45:1 200 metilen hlorid-metanol-mravlja kis. 48:50:2 100 metilen hlorid-metanol-mravlja kis. 28:70:2 100 metanol-mravlja kis. 98:2 100 metanol-mravlja kis. 98:2 100 Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 46 Sakupljeno je 90 frakcija koje su spajane na osnovu TLC analize. Spojene frakcije 83-90 su dalje prečišćavane na semipreparativnom HPLC odakle su izdvojena dva fenolna jedinjenja, kvercetin 3-O-β-D-glukozid i kempferol 3-O-β-D-glukozid, čija je identifikacija potvrđene NMR analizom. Dobijena čista jedinjenja su korišćena kao eksterni standardi u kvantifikaciji dominantnih fenolnih komponenti u cvetnoj glavici A. montana. Semipreparativni HPLC Izolovanje komponenti ekstrakta cveta arnike izvršeno je na Agilent 1200 aparatu opremljenim sa DAD model G1315B, binarnom pumpom G1312A, autosamplerom model G1313A i kolonom Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 μm, 250 x 9,4 mm). Mobilna faza A je bila 0.2% mravlja kiselina u vodi, a mobilna faza B acetonitril. Protok eluiranja je bio 4 mL/min sa gradijentnim programom (0-25 min 10-20% B, 25- 30 min 20-30% B, 30-35 min 30-60% B, 35-37 min 60-100% B). UV-VIS detekcija je praćena na 254 nm, 280 nm i 320 nm. Injekciona zapremina je iznosila 50 μl, a postupak hromatografisanja je ponovljen dvadeset puta. Izolovana su dva jedinjenja iz ekstrakta cveta A. montana: kvercetin 3-O-β-D-glukozid (2 mg) i kempferol 3-O-β-D- glukozid (1,5 mg). NMR analiza 1H i 13C NMR spektri (500,13 MHz za 1H) su snimani na Bruker Avance 500 spektrometru opremljenom sa 5 mm inverznom probom. Spektri su snimani na temperaturi od 298 K, u u deuterisanom metanolu (CD3OD) kao rastvaraču. Hemijska pomeranja su data u δ skali u odnosu na tetrametilsilan kao interni standard. Za 13C NMR spektroskopiju, korišćena je pulsna sekvenca „inverse gated decoupling“. Prikupljeno je 8000 skenova sa vremenom relaksacije 10s. Tris (2,4-pentadionato) hrom (III) (CrAcac) koncentracije 50 mM je korišćen kao relaksacioni reagens. Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 47 Hemijska analiza etarskih ulja rizoma i korena GC-FID i GC-MS analiza Kvalitativna i kvantitativna analiza sprovedena je pomoću GC-FID i GC-MS. U prvom slučaju korišćen je gasni hromatograf model HP-5890 Series II opremljen sa split-splitless injektorom, HP-5 kapilarne kolone (25 m x 0,32 mm, debljine 0,52 μm) i plamen-jonizujućim detektorom (FID). Kao gas nosač korišćen je vodonik (1 ml/min). Injektor je grejan na 250°C, detektor na 300° C, a temperatura kolone je linearno programirana od 40° - 260°C (4°/min). GC-MS analiza je sprovedena pod gotovo istim analitičkim uslovima, koristeći HP G 1800C Series II GCD analitički sistem, opremljen s HP-5MS kolonom (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm). Kao gas nosač korišćen je helijum. Linija za transfer (MSD) je grejana na 260°C. EI masenog spektra (70 eV) bio je podešen za skeniranje u modu m/z raspona 40-400. U svakom pojedinačnom slučaju analiziralo se 1 μL uzorka rastvorenog u etanolu (20 μl / 2 ml) ubrizganog u split modu (1:30). Identifikacija komponenti je izvedena poređenjem njihovih masenih spektara i retencionih indeksa sa spektrima dobijenih iz autentičnih uzoraka i/ili NIST/Wiley bibliotekama spektara, korišćenjem različitih vrsta pretrage (PBM/NIST/AMDIS) i dostupnim literaturnim podacima (Adams, 2007; Hochmuth, 2006). Procenat udela komponenti se izračunavao iz elektronskih merenja pomoću plamen-jonizujuće detekcije (FID; 250oC). 5.2.2.5. Biološki efekti Odabir ekstrakata i ulja za testiranje bioloških aktivnosti Za testiranje bioloških aktivnosti odabrani su ekstrakti cvetnih glavica arnike čiji je sadržaj sekundarnih metabolita (SL i fenolnih jedinjenja) kvantifikovan HPLC analizom i etarska ulja rizoma i korena čiji su hemijski profili okarakterisani GC i GC/MS analizom. Od svakog tipa ekstrakta izabrana su po dva: ekstrakt sa maksimalnim sadržajem i ekstrakt sa minimalnim sadržajem određene grupe jedinjenja. Tako su za testiranje bioloških aktivnosti seskviterpenskih laktona uzeti ekstrakti sa Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 48 maksimalnim i minimalnim sardžajem ukupnih seskviterpenskih laktona (SL max i SL min, respektivno). Na sličan način odabrani su i ekstrakti za biološke testove iz grupe fenolnih jedinjenja, gde su izdvojeni ekstrakt sa maksimalnom sumom i ekstrakt sa minimalnom sumom sardžaja tri kvantifikovana jedinjenja (hlorogenska kiselina, kvercetin-3-O-glikozid, kempferol-3-O-glikozid) (F max i F min, respektivno). Odabir etarskih ulja za antimikrobne testove vršen je na osnovu procenta aromatičnih jedinjenja u hemijskom sastavu, tako su i za rizom i za koren odabrani predstavnici sa maksimalnim sumom i minimalnom sumom sadržaja aromatičnih jedinjenja (AU max i AU min, respektivno). Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala Za uzorke dobijene u procesu ekstrakcije seskviterpenskih laktona i flavonoida iz cveta arnike, koji su korišćeni za kvalitativnu i kvantitativnu analizu (sa najmanjim odnosno najvećim sadržajem ovih sekundarnih metabolita), ispitivana je sposobnost neutralizacije 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikala po metodi Silve i sar. (2005). Ekstrakti (100 μL) su pomešani sa 1400 μL of 80 μM metanolnog rastvora DPPH radikala i ostavljeno u mraku 20 min. Apsorbancija rastvora je zatim merena na 517 nm. Procenat neutralizacije DPPH radikala je izračunat korišćenjem sledeće formule: I (%) = [(Ak-Aa) / Ak] × 100 gde je Ak apsorbancija negativne kontrole (koja umesto ispitivanih ekstrakata sadrži 100 μl odgovarajućeg rastvarača), a Aa je apsorbancija uzoraka. Konstruisan je grafik zavisnosti procenta neutralizacije DPPH radikala od koncentracije ekstrakta. Koncentracije ekstrakata koje neutrališu 50% DPPH radikala (EC50 vrednosti) su zatim određene korišćenjem algoritma nelinearne regresije. Dobijeni rezultati predstavljaju srednju vrednost tri određivanja. Antiomikrobna aktivnost Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 49 Testirane su Gram-negativne i Gram-pozitivne bakterije zajedno sa jednim patogienim kvascem. U testu su korišćene sledeće bakterije: Escherichia coli (ATCC 35210), Salmonella typhimurium (ATCC 13311), Salmonella enteritidis (ATCC 13076), Bacillus subtilis (ATCC 10907), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Listeria monocytogenes (ATCC 19117), Proteus mirabilis (izolat), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterobacter cloacae (ATCC 13883), Micrococcus luteus (ATCC 10240), Micrococcus flavus (ATCC 14452) i gljivični patogen Candida albicans (ATCC 10231). Mikroorganizmi su nabavljeni iz Mikološke laboratorije, Odseka za biljnu fiziologiju Instituta za biološka istražvanja “Siniša Stanković” u Beogradu. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) određene su mikrodilucionom metodom prema uputstvima Nacionalnog odbora za kliničke laboratorijske standarde (NCCLS, 1997). Metanolni ekstrakti cvetnih glavica su primenjivani u izvornom obliku, a etarska ulja su razređivana u dimetil sulfoksidu (DMSO) u odnosu 1:1. Serijska razređenja su testirana u mikrotitarskim pločama (96 bunara). U svim testovima se samo poredila antimikrobna aktivnost između ekstrakata sa najvišom i najnižom koncentracijom određene grupe jedinjenja. 5.2.3. Statističke metode Sva morfološka brojanja i merenja su rađena na po 10 slučajno izabranih biljaka po svakom ponavljanju kombinacije tretmana. Hemijske analize su rađene na reprezentativnom uzorku iz mase cvetnih glavica ubranih po parcelici. Sva merenja i analize, osim prinosa etarskih ulja su rađena u četiri ponavljanja. Podaci u tabelama i grafikonima su predstavljeni kao aritmetička sredina ± standardna devijacija. Uticaj pojedinačnih faktora i njihovih interakcija na posmatrane osobine testiran je preko dvofaktorske i trofaktorske analize varijanse, čiji su rezultati predstavljeni tabelarno sa vrednistima verovatnoće prihvatanja nulte hipoteze. Statistička značajnost razlika između aritmetičkih sredina svih osnovnih skupova posmatranih kombinacija faktora za određeno svojstvo testirana je analizom varijanse sa pratećim post-hoc Dankanovim testom, gde su u graficima i tabelama različitim slovima označene statističke značajnosti testa na nivou p<0,05. Značajnosti razlika između srednjih vrednosti plotova vremena zasnivanja i varijanti vrste sadnica utvrđene su Studentovim t-testom. Značajnosti razlika između blokova đubrenja za svaku posmatranu osobinu utrvđene su analizom Materijal i metode istraživanja Doktorska disertacija 50 varijanse, a rezultati su prikazani na posebnom tipu grafika, gde su predstavljene aritmetičke sredine posmatranog svojstva sa rasponom intervala variranja od 95% pouzdanosti i pratećim verovatnoćama prihvatanja nulte hipoteze. Jačina veza između posmatranih parametara prikazivana je grafički ili tabelarno i okarakterisana Pirsonovim koeficijentima korelacije (r), sa pratećom statističkom značajnošću. Pored indukovanih faktora na ogledu praćen je i faktor vremena (starenja) koji nije planiran u eksperimentu, ali je de facto bio prisutan i u posmatranju višegodišnjih biljaka očekivano značajan kod svakog morfološkog parametra ponaosob. Proučavanjem faktora starenja u ovom radu nije se pretendovalo da se odgovori na uticaj faktora godine, pošto je od ranije poznato da se razlike između aritmetičkih sredina merenih svojstava na višešegodišnjim biljkama u dve uzastopne godine ne mogu smatrati nezavisnim (Hadživuković, 1991; Fernandez, 2007), već da se okarakteriše trend razvića biljaka i akumulacije sekundarnih metabolita. Identifikacija zajedničkih varijansi u skupu posmatranih osobina analizirana je faktorskom analizom (miltivarijaciona statistička tehnika), zasnovanoj na korelacionoj matrici originalnih podataka, a ekstrakcija faktora je izvršena metodom glavnih komponenti (PCA). Kriterijum za odabir broja faktora je bio dvostruk: s jedne strane da eigenvalues budu veće od 1, a s druge strane da prelom linije skri (scree) testa maksimizuje procenat objašnjene varijanse. Pojednostavljenje faktorske strukture i maksimizacija faktorskih opterećenja izvršena je Varimax normalizovanom rotacijom. Kao rezultat faktorske analize tabelarno su prikazana faktorska opterećenja, eigenvalues i procenti objašnjene varijanse, dok su grafičkim prikazima predstavljena scree-plot eigenvalues i fakrorska opterećenja dva faktora koji nose najveću informaciju. Faktorska opterećenja promenljivih su u analizi ocenjivana kao značajna ukoliko im je vrednost prevaziazila 0,7; da bi se očuvala valjanost testa (construct validity), kako su predložili brojni autori (Shimp i Sharma,1987; Carmines and Zeller, 1979; Hulland, 1999). Za determinaciju sekvencijalne klasifikacije varijanti zasnivanja plantaže prema poželjnim osobinama korišćeno je Ivanovićevo odstojanje (I-odstojanje) (Ivanović, 1977). Sve statističke analize i testovi (izuzev I-odstojanja), kao i izlazni grafici, urađeni su u programskom paketu STATISTICA v.7.0. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 51 6. REZULTATI ISTRAŽIVANJA Prezentacija rezultata U prezentovanju rezultata korišćeni su grafički i tabelarni prikazi. Za predstavljanje varijanti određene kombinacije faktora korišćene su kombinacije slova P, J, G, V, O, M i K, koja su pojašnjena u spisku skraćenica [npr. POG – za biljke iz prolećnog plota sadnje (P) u bloku đubrenja stajskim đubrivom (O) razmnožene generativnim putem (G)]. Prolećni i jesenji plot sadnje su definisani oznakama PROLECE i JESEN, a tipovi sadnica su označeni Generatvno i Vegetativno. U stubičnim graficima različita slova označavaju statističke značajnosti Dankanovog testa na nivou p<0.05, dok su oznakama *, ** i n.s. označene statističke značajnosti t-testa na nivou verovatnoća p<0.05, p<0.01 i nije značajno, respektivno. Stanje ogleda i broj preživelih biljaka Biljke arnike posađene na proleće su cvetale u narednoj godini, dok su biljke posađene na jesen celu vegetaciju 2009. godine provele u fazi rozete. U 2010. godini su cvetale biljke oba plota sadnje. Šematski prikaz termina sadnje, faza rozete i cvetanja (berbi) i termina vađenja podzemnih organa arnike u trogodišnjem ogledu dat je na Slici 22. Slika 22. Vremenski prikaz osnovnih faza razvića i termina sadnje i vađenja biljaka Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 52 Neposredno nakon sadnje prolećnog dela ogleda (10 dana) došlo je do cvetanja varijanti zasnovanih iz vegetativnih sadnica (Slika 23). Ova neočekivana pojava, koja je zahvatila preko 90 % varijante, uticala je na slabiji prijem ovih sadnica i do 85% (Grafik 2). Loši početni uslovi imali su za posledicu slabiji razvoj preživelih biljaka na toj varijanti, što se kasnije odrazilo na većinu praćenih parametara na ogledu. Kod varijanti zasnovanih iz sadnica proizvedenih iz semena (u nastavku – generatvnih sadnica) u prolećnoj sadnji nije došlo do pojave ranog iscvetavanja, tako da je prijem sadnica ove varijante u odnosu na vegetativnu varijantu bio znatno bolji (Prilog 4 A). Slika 23. Pojava ranog cvetanja na varijantama razmnoženim deljenjem bokora 31. maj 2008. godine Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 53 POG PMG PKG POV PMV PKV 0 20 40 60 80 100 Pr ež iv el e bi ljk e [% ] Grafik 2. Procenat preživelih biljaka na ogledu na dan prve žetve 2009. godine Uzrok ovoj pojavi je, kako je pokazano u narednoj godini, uznapredovala generativna faza na matičnim biljkama sa kojih su deljenjem bokora proizvedene vegetativne sadnice (Slika 24). Slika 24. Vegetativne sadnice sa formiranom cvetnom glavicom 6. maj 2009. godine Pretpostavka je da su biljke fiziološki reagovale ka produženju vrste u smislu formiranja cveta i semena, trošeći pri tom celokupan energetski potencijal na nadzemni deo, što je uslovilo lošiji razvoj korenovog sistema i uginuće. U narednoj godini broj preživelih biljaka se dodatno smanjivao (Grafik 3), ali je procentualni bilans ovih varijanti bio približan nivou varijanti zasnovanih generativnim sadnicama (Tabela 12). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 54 POG PMG PKG POV PMV PKV JOG JMG JKG JOV JMV JKV 0 20 40 60 80 100 Pr ež iv el e bi ljk e [% ] Grafik 3. Procenat preživelih biljaka na ogledu na dan prve žetve 2010. godine Tabela 12. Odnos preživelih biljaka na plotu prolećne sadnje u dve uzastopne godine neposredno pred berbu cveta Varijanta 2009 2010 Δ % % % POG 91.3 75.7 15.6 PMG 89.2 74.7 14.6 PKG 83.7 72.6 11.1 POV 17.0 4.2 12.8 PMV 31.6 3.8 27.8 PKV 22.6 3.8 18.8 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 55 6.1. Morfološki parametri Prečnik rozete U 2009. godini vrednosti merenja prečnika rozete na ogledu A. montana su se kretale od 12,4 – 23,4 cm (Grafik 4). Na grafiku se vidi da je faktor vrste đubriva imao uticaj samo na prečnike rozeta generativnih sadnica i da su obe varijante đubrenja ocenjene statističkom značajnošću u odnosu na kontrolu, ali i međusobno, gde su varijante đubrene mineralnim đubrivom razvile veće prečnike rozeta ( x = 23,4 cm) od varijanti đubrenih stajnjakom ( x = 21,7 cm). Takođe je uočljivo da su varijante vegetativnog razmnožavanja imale značajno manje prečnike (12,4 – 13,8 cm). Grafik 4. Vrednosti izmerenih prečnika rozeta u 2009. godini U 2010. godini prečnik rozete na celom ogledu se kretao od 14,5 – 28,1 cm (Grafik 5). Posmatrajući vrednosti prečnika rozeta može se zaključiti da su u 2010. godini najmanje prečnike rozeta imale varijante vegetativno razmnožene na proleće, a da su varijante jesenje sadnje imale ujednačene prečnike u visini đubrenih varijanti prolećne sadnje. Uticaj đubrenja je bio osetan samo na prolećno sađenom plotu, gde su se sve đubrene varijante statistički značajno razlikovale od kontrolnih varijanti. Na plotu Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 56 sađenom u jesen đubrene varijante su u proseku imale veće prečnike rozeta, ali razlike od kontrolnih varijanti nisu bile statistički značajne. Grafik 5. Vrednosti merenja prečnika rozete u 2010. godini I pored iznetih zapažanja o uticaju faktora vrste đubriva na posmatrni parametar prečnika rozeta arnike, ukupan uticaj ovog faktora u obe posmatrane godine nije bio statistički značajan (Grafik 6). Očigledno je da su đubrene varijante na ogledu u proseku imale veće prečnike rozeta u odnosu na kontrolne varijante, ali su verovatnoće za prihvatanje nulte hipoteze bile p=0,15 (u 2009. godini) i p=0,20 (u 2010. godini). Grafik 6. Uticaj đubrenja na prečnik rozete arnike u 2009. i 2010. godini Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 57 Razlike u dimenzijama rozete u dve uzastopne godine su bile očekivane i njihova statistička značajnost je predstavljena na Grafiku 7A. Grafik 7. Uticaj starenja (A) i vremena zasnivanja (B) na prečnik rozete Vrednosti prečnika rozeta posmatrene preko uticaja faktora vremena sadnje su predstavljeni na Grafiku 7B., gde se može videti da su u 2010. godini prečnici rozeta na delu ogleda sađenog na proleće u proseku bili statistički veoma značajno manji od prečnika rozeta jesenje sađenog plota. Na ovakvu statističku značajnost u velikoj meri utiče negativni doprinos slabije razvijenih biljaka vegetativno razmnoženih varijanti u plotu prolećne sadnje. Faktor vrste sadnica uticao je na variranje vrednosti prečnika rozete samo na plotu prolećne sadnje (Grafik 8). Uticaj ovog faktora bio je značajan u obe posmatrane godine, gde su u 2009. godini generativno razmnožene biljke u proseku formirale veće prečnike rozeta ( x = 20,3 cm) u odnosu na biljke iz vegetativne propagacije ( x = 13,0 cm). Takođe su i u 2010. godini, na prolećnom plotu sadnje, biljke iz generativnih varijanti formirale veće prečnike rozeta ( x = 25,1 cm) u odnosu na biljke iz vegetativnih varijanti ( x = 16,6 cm). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 58 Grafik 8. Uticaj vrste sadnica na prečnik rozete u 2009. i 2010. godini Razlike u prosečnim vrednostima prečnika rozeta na plotu jesenje sadnje nisu bile statistički značajne. Visina cvetnog izdanka U 2009. godini vrednosti merenja visine cvetnog izdanka na ogledu gajenja arnike su se kretale od 19,7 – 34,2 cm (Grafik 9). Iz priloženog se može videti da su veću visinu cvetnih izdanaka imale biljke iz varijanti generativnog razmnožavanja (28,3 – 34,2 cm), dok su varijante vegetativnog razmnožavanja formirale znatno niže izdanke (19,7 – 23,2 cm). Takođe su biljke iz generativne propagacije bolje reagovale na uneto hranivo, tako da su se đubrene varijante statistički veoma značajno razlikovale od kontrolnih varijanti. Varijante đubrene mineralnim đubrivom su u proseku formirale najviše cvetne izdanke ( x = 34,2 cm). Nešto niže izdanke su formirale varijante đubrene stajnjakom ( x = 31,2 cm), a najniže izdanke, u ovom tipu propagacije, formirale su biljke kontrole grupe ( x = 28,3 cm). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 59 Grafik 9. Vrednosti izmerenih visina cvetnih izdanaka u 2009. godini Biljke iz vegetativne propagacije su lošije reagovale na uneto hranivo, tako da đubrene varijante ovog tipa razmnožavanja nisu formirale statistički značajno više izdanke u odnosu na kontrolne varijante. U 2010. godini visina cvetnog izdanka na celom ogledu se kretala od 25,6 – 41,7 cm (Grafik 10). Grafik 10. Vrednosti izmerenih visina cvetnih izdanaka u 2009. godini Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 60 Najviše cvetne izdanke su formirale đubrene varijante jesenjeg plota sadnje, zatim varijante generativne propagacije prolećnog plota sadnje i na kraju varijante vegetativne propagacije prolećnog plota sadnje. Uticaj đubrenja u ovoj godini bio je primetan u svim posmatranim varijantama, ali, iako osetan, uticaj faktora đubrenja na delu ogleda razmnoženim generativno u prolećnom plotu sadnje nije bilo statistički značajnih razlika đubrenih varijanti u odnosu na kontrolne varijante. Ukupni uticaj faktora đubrenja na visinu cvetnog izdanka je bio značajan samo u 2010. godini (p=0,018), gde su se oba bloka đubrenja (stajnjak i NPK) statistički veoma značajno razlikovali od kontrole (Grafik 11). Grafik 11. Uticaj đubrenja na visinu cvetnog izdanka arnike u 2009. i 2010. godini Uticaj starenja na visinu cvetnog izdanka na prolećnom plotu sadnje je bio očekivano statistički veoma značajan, gde su biljke u 2009. godini formirale niže cvetne izdanke ( x = 26,7 cm) od biljaka u 2010. godini ( x = 33,1 cm) (Grafik 12A). Grafik 12. Uticaj starenja (A) i vremena zasnivanja ogleda (B) na visinu cvetnog izdanka Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 61 Faktor vremena zasnivanja je po pitanju ovog parametra bio statistički veoma značajan, tako da su u 2010. godini biljke iz jesnjeg plota sadnje imale značajno više vrednosti ( x = 38,4 cm) u odnosu na biljke iz prolećnog plota sadnje ( x = 33,1 cm) (Grafik 12B). Grafik 13. Uticaj vrste sadnica na visinu cvetnog izdanka Faktor vrste sadnica imao je uticaj na variranje vrednosti visine cvetnog izdanka samo na prolećno sađenom plotu (Grafik 13), gde su u obe posmatrane godine generativno razmnožene biljke formirale više cvetne izdanke u poređenju sa varijantama vegetativne propagacije (Prilog 4 E i F). Iako su biljke iz generativne propagacije na plotu jesenje sadnje imale više cvetne izdanke od biljaka iz vegetativnih varijanti, razlike između aritmetičkih sredina ovih varijanti nisu bile statistički značajne. Visina cvetnog izdanka je u obe posmatrane godine bila u uskoj vezi sa prečnikom rozete (Grafik 14). Obzirom na korelacione koeficijente r=0.93 u 2009. godini, i r=0.83, u 2010. godini, može se zaključiti da su ova dva parametra u veoma jakoj pozitivnoj korelacionoj vezi. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 62 Grafik 14. Jačine veza između prečnika rozete i visine cvetnog izdanka Broj cvetnih izdanaka U 2009. godini broj cvetnih izdanaka na ogledu kretao se od 1,5 – 5,0 izdanaka po biljci (Grafik 15). Iz prikazanog se može zaključiti da su varijante generativne sadnje formirale veći broj cvetnih izdanaka (2,2 – 5,0) u odnosu na biljke iz vegetativne propagacije (~ 1,5). Takođe je uticaj đubrenja na variranje broja cvetnih izdanaka bio statistički značajan samo u generativnim varijantama, gde su obe đubrene varijante formirale veći broj (stajnjak - ca. 4,8; NPK ca. – 5,0) cvetnih izdanaka u odnosu na kontrolu (ca. 2,2). Grafik 15. Broj cvetnih izdanaka na ogledu arnike u 2009. godini Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 63 U 2010. godini broj cvetnih izdanaka na celom ogledu se kretao od 2,5 – 12,7 (Grafik 16). Najveći broj cvetnih izdanaka formirala je varijanta vegetativnog razmnožavanja, đubrena stajnjakom i sađena na jesen ( x = 12,7 izdanaka), a najmanji broj cvetnih izdanaka su formirale varijante vegetativnog razmnožavanja u prolećnom plotu sadnje (2,5 – 3,8 izdanaka). Statistički značajan uticaj đubrenja na variranje ovog svojstva je bio primetan samo u varijantama generativnog razmnožavanja prolećnog plota sadnje i vegetativnog razmnožavanja jesenjeg plota sadnje, gde su, u oba slučaja, đubrene varijante formirale veći broj cvetnih izdanaka, ali se međusobno nisu statistički značajno razlikovale. Grafik 16. Broj cvetnih izdanaka na ogledu arnike u 2010. godini Iako su pomenute dve varijante povoljno reagovale na uneto hranivo u zemljište, ukupni uticaj faktora đubrenja na celom ogledu nije bio statistički značajan ni u jednoj posmatranoj godini (Grafik 17). Tako je mogućnost prihvatanja nulte hipoteze ocenjena verovatnoćom od p=0,24 u 2009. godini, odnosno sa p=0,25 u 2010. godini. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 64 Grafik 17. Uticaj đubrenja na broj cvetnih izdanaka na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Na plotu prolećne sadnje biljke arnike su u 2009. godini formirale statistički značajno manji broj cvetnih izdanaka ( x = 2,8 izdanaka) nego u narednoj godini ( x = 5,5 izdanaka) (Grafik 18A). Grafik 18. Uticaj starenja (A) i vremena zasnivanja ogleda (B) na broj cvetnih izdanaka Uticaj vremena zasnivanja na vrednosti ovog svojstva je bio statistički veoma značajan, tako da su biljke arnike sađene u jesenjem plotu sadnje formirale veći broj cvetnih izdanaka ( x = 9,9 izdanaka) od biljaka sađenih u prolećnom plotu sadenje ( x = 5,5 izdanaka) (Grafik 18B). Uticaj faktora vrste sadnica na broj cvetnih izdanaka na ogledu gajenja arnike bio je značajan u obe posmatrane godine samo na plotu prolećne sadnje, gde su biljke iz generativne propagacije imale statistički veoma značajno više ( x = 4,0 u 2009. i x = 8,3 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 65 u 2010. godini) cvetnih izdanaka od vegetativno razmnoženih varijanti ( x = 1,5 u 2009. i x = 2,8 u 2010. godini) (Grafik 19). Biljke jesenjeg plota sadnje su imale najviše formiranih cvetnih izdanaka u 2010. godini. U ovom delu ogleda vegetativno razmnožene varijante su formirale veći broj cvetnih izdanaka ( x = 10,3) u odnosu na varijante generativne propagacije ( x = 9,4), ali razlike između ovih varijanti nisu ocenjene statističkom značajnošću. Grafik 19. Uticaj vrste sadnica na broj cvetnih izdanaka u 2009. i 2010. godini Jačina zavisnosti parametra broja cvetnih izdanaka od prečnika rozete i visine cvetnog izdanka ocenjena je u obe posmatrane godine kao statistički veoma značajna (p<0,01). Tako je pozitivni korelacioni odnos broja stabljika i prečnika rozete okarakterisan koeficijentom korelacije r = 0,91 u 2009. godini, odnosno r = 0,88 u 2010. godini (Grafik 20). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 66 Grafik 20. Odnosi prečnika rozete i broja cvetnih izdanaka Takođe se pokazalo da je veza broja cvetnih izdanaka sa visinom cvetnog izdanka u obe posmatrane godine ima prirodu pozitivne korelacije (r=0,80 u 2009.; r=0,81 u 2010. godini) (Grafik 23). Grafik 21. Odnosi visine cvetnog izdanka i broja cvetnih izdanaka Broj cvetnih glavica po biljci U 2009. godini ukupan period branja cveta bio je 26 dana u toku kojih je urađeno osam žetvi. Raspored broja ubranih cvetnih glavica arnike na ogledu u 2009. godini dat je Grafiku 22. i u Tabeli 13. Iz prikazanih podataka može se zaključiti da su biljke iz vegetativne propagacije nešto ranije ušle u fazu tehnološke zrelosti za berbu, tako da je glavna žetva (31 – 41% od ukupno ubranog cveta) vegetativno razmnoženih varijanti bila druga žetva (25. maj), a najveći broj cvetnih glavica na varijantama generativno razmnoženim ubrano je u četvrtoj žetvi (3. jun). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 67 I II III IV V VI VII VIII Žetve 0 100 200 300 400 500 600 Br oj cv et nih g lav ic a POG PMG PKG A I II III IV V VI VII VIII Žetve 0 10 20 30 40 50 B ro j c ve tn ih g lav ic a POV PMV PKV B Grafik 22. Broj cvetnih glavica u 2009. godini po berbama na prolećnom delu ogleda sa generativnim (A) i vegetativnim (B) sadnicama; Tabela 13. Broj cvetnih glavica [%] po žetvama u 2009 . godini 21. maj 25. maj 27. maj 3. jun 5. jun 8. jun 10. jun 15. jun I II III IV V VI VII VIII POG 1.04 15.89 16.84 39.34 10.61 11.58 3.24 1.44 PMG 0.97 16.48 13.45 33.39 11.83 14.23 6.36 3.30 PKG 1.07 17.90 15.21 34.18 8.36 13.80 6.45 3.03 POV 20.93 41.09 23.26 9.30 3.10 1.55 0.78 0.00 PMV 16.89 31.10 26.01 20.64 3.49 0.27 1.07 0.54 PKV 21.79 36.96 18.68 7.39 14.79 0.00 0.39 0.00 Prosečan broj cvetnih glavica po biljci na ogledu gajenja arnike u 2009. godini se kretao od 1,2 – 10,5 (Grafik 23). Veći broj cvetnih glavica po biljci su formirale biljke iz generativnih varijanti razmnožavanja, gde su se i đubrene varijante (stajnjak x = 10,1; NPK x = 10,5) statistički značajno razlikovale od kontrole ( x = 3,1), ali ne i međusobno. Varijante iz vegetativne propagacije su formirale od 1,2 – 1,5 cvetne glavice po biljci što je okarakterisano statistički značajnom razlikom u odnosu na varijante iz gnerativne propagacije. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 68 Grafik 23. Prosečan broj cvetnih glavica po biljci na ogledu arnike u 2009. godini U 2010. godini ukupan period branja cveta bio je 23 dana u toku kojih je urađeno šest žetvi (Grafik 24), a . Najmasovnija žetva kod biljaka prolećnog dela ogleda razmnoženih generativno bila je 8. juna, dok je kod biljaka koje su razmnožene vegetativno period branja najvećeg broja cvetnih glavica, slično kao i prethodne godine, bio pomeren devet dana unapred (31. maj), osim kod neđubrene varijante koja je imala približno ujednačenu disperziju branja u prve tri žetve (Tabela 14). Biljke jesenjeg dela ogleda su kasnile sa cvetanjem tako da je berba na ovim varijantama počela tek u drugoj žetvi. Nezavisno od tipa sadnica imale su svoj maksimum branja u petoj žetvi (11. jun), dok je prethodna, četvrta, žetva po masovnosti bila odmah iza pete, tako da ove dve žetve zajedno predstavljaju u masi u proseku 73.4% svih ubranih cvetnih glavica. Disperzija branja i količine ubranih cvetnih glavica data je na Grafiku 24, gde se može videti da se u ovoj godini broj cvetnih glavica prolećnog dela ogleda u varijantama generativnog razmnožavanja kreće u maksimalnim žetvama u rangu 300 – 500 cvetnih glavica po parcelici (Grafik 24A), dok se kod varijanti vegetativnog razmnožavanja taj broj kreće u rangu od 10 do 30 cvetnih glavica po parcelici (Grafik 24B). Na jesenjem plotu ogleda obe varijante tipa sadnica su imale prilično ujednačen raspored branja po žetvama. U slučaju generativnih sadnica prosečan broj cvetnih glavica po parcelici se Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 69 kretao oko 800 cvetnih glavica (Grafik 24C), a kod vegetativno razmnoženih varijanti oko 600 cvetnih glavica (Grafik 24D). I II III IV V VI Branje 0 100 200 300 400 500 600 700 800 B ro j c ve tn ih g la vi ca POG PMG PKGA I II III IV V VI Branje 0 10 20 30 40 50 60 70 B ro j c ve tn ih gla vi ca POV PMV PKVB I II III IV V VI Branje 0 200 400 600 800 1000 1200 Br oj c ve tn ih g la vi ca JOG JMG JKGC I II III IV V VI Branje 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 B ro j c ve tn ih gla vi ca JOV JMV JKVD Grafik 24. Broj cvetnih glavica u 2010. godini po berbama na prolećnom delu ogleda sa generativnim (A) i vegetativnim (B) sadnicama; na jesenjem delu ogleda sa generativnim (C) i vegetativnim (D) sadnicama. Tabela 14. Broj cvetnih glavica [%] po žetvama u 2010. godini 24. maj 28. maj 31. maj 8. jun 11. jun 15. jun I II III IV V VI POG 0.2 8.4 26.5 34.1 27.6 3.2 PMG 0.9 5.6 21.2 32.7 37.5 2.2 PKG 0.0 7.7 17.5 42.4 30.1 2.3 POV 18.2 5.3 73.3 0.5 2.7 0.0 PMV 17.6 22.0 36.8 23.6 0.0 0.0 PKV 36.0 28.1 29.2 6.7 0.0 0.0 JOG 0.0 2.2 15.2 31.2 45.2 6.2 JMG 0.0 1.7 13.8 29.5 45.4 9.6 JKG 0.0 2.2 13.5 15.3 62.9 6.1 JOV 0.0 4.0 17.5 33.8 36.6 8.1 JMV 0.0 2.5 14.0 28.9 42.8 11.9 JKV 0.0 3.8 15.0 27.3 41.5 12.4 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 70 Raspored prosečnog broja cvetnih glavica po biljci u 2010. godini na ogledu gajenja arnike po varijantama dat je na Grafiku 25. Iz prikazanih podataka se može zaključiti da su se vrednosti kretale od 8,4 – 38,9 i da su biljke iz jesenjeg plota sadnje formirale veći broj cvetnih glavica po biljci (27,2 – 37,4 cvetnih glavica), u odnosu na biljke prolećnog plota sadnje (8,4 – 25,2 cvetnih glavica), ali i da je faktor đubrenja imao uticaj samo na biljke koje su generativno razmnožene, gde se đubrene varijante nisu međusobno statistički značajno razlikovale. Faktor đubrenja nije imao nikakav uticaj na vegetativno razmnožene biljke arnike u plotu jesenje sadnje. Grafik 25. Prosečan broj cvetnih glavica po biljci arnike na ogledu u 2010. godini Na prolećnom plotu sadnje uticaj faktora đubrenja je bio značajan u varijanti mineralnog đubrenja kod generativno razmnoženih biljaka i u varijanti đubrenja stajnjakom kod vegetativno razmnoženih varijanti. U isto vreme razlike između varijanti različitog tipa đubrenja nisu bile statistički značajne ni u jednoj varijanti tipa sadnica. Uprkos pojedinačnim značajnim razlikama između đubrenih i kontrolnih varijanti, uticaj faktora đubrenja na celom ogledu nije bio statistički značajan ni u jednoj Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 71 posmatranoj godini (Grafik 26). Đubrene varijante su u obe godine imale više prosečne vrednosti, ali su mogućnosti prihvatanja hipoteza o jednakosti aritmetičkih sredina posmatranih populacija osnovnih skupova ocenjene sa verovatnoćama p=0.17 u 2009. godini i p=0,18 u 2010. godini. Grafik 26. Uticaj đubrenja na broj cvetnih glavica na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Broj cvetnih glavica po biljci je u 2010. godini na prolećnom plotu sadnje očekivano bio statistički veoma značajno veći ( x = 16,6) nego u 2009. godini ( x = 4,6) (Grafik 27A). Grafik 27. Uticaj starenja biljaka (A), vremena zasnivanja (B) na broj cvetnih glavica po biljci Uticaj faktora vremena zasnivanja na plantaži arnike u pogledu broja cvetnih glavica po biljci se pokazao statistički veoma značajnim (Grafik 27B). Tako su biljke iz Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 72 prolećnog plota sadnje formirale statistički veoma značajno manji broj cvetnih glavica po biljci ( x = 16,6) u poređenju sa biljkama iz jesenjeg plota sadnje ( x = 35,5). Uticaj faktora vrste sadnica na broj cvetnih glavica po biljci je bio značajan samo na plotu prolećne sadnje, gde su biljke iz generativne propagacije formirale veći broj cvetnih glavica ( x = 7,9 u 2009.; x = 20,6 u 2010. god.) u odnosu na biljke iz vegetativne propagacije ( x = 1,3 u 2009.; x = 12,7 u 2010. god.) (Grafik 28) (Prilog 4 E i F). Kod biljaka iz jesenjeg plota sadnje uticaj faktora vrste sadnica nije bio statistički značajan. Grafik 28. Uticaj vrste sadnica na broj cvetnih glavica po biljci na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Od veza sa prethodno obrađenim morfološkim osobinama, parametar broj cvetnih glavica po biljci gradi statistički veoma značajne pozitivne korelacione odnose (p<0.01) u obe posmatrane godine sa: prečnikom rozete, r = 0,91 u 2009. godini (odnosno r=0,71 u 2010. godini), visinom cvetnog izdanka, r=0,85 (r=0,83), i brojem cvetnih izdanaka, r=0.96 (r=0.71) (Grafici 29, 30 i 31). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 73 Grafik 29. Odnos prečnika rozete i broja cvetnih glavica po biljci u 2009. i 2010. godini Grafik 30. Odnos visine cvetnog izdanka i broja cvetnih glavica po biljci u 2009. i 2010. godini Grafik 31. Odnos broja cvetnih izdanka i broja cvetnih glavica po biljci u 2009. i 2010. godini Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 74 Prečnik cvetne glavice U 2009. godini na ogledu gajenja arnike prečnik cvetne glavice se kretao od 5,9 – 7,5 cm (Grafik 32). Iz prikazanog se može zaključiti da su u ovoj godini biljke iz vegetativne propagacije formirale statistički veoma značajno veće prečnike cvetnih glavica u odnosu na biljke iz generativne propagacije. Varijante đubrenja nije uticalo na formiranje značajno većih prečnika u odnosu na kontrolnu varijantu ni u jednom tipu sadnica. Grafik 32. Prosečan prečnik cvetne glavice arnike na ogledu u 2009. godini U 2010. godini prečnici cvetnih glavica na ogledu su se kretali od 6,4 – 9,1 cm (Grafik 33). Najveći prosečni prečnik cvetne glavice zabeležen je na varijanti generativnih sadnica u bloku đubrenja stajnjakom na jesenjem plotu sadnje ( x = 9.1 cm), a najmanji na prolećnom plotu sadnje kod varijante generativnih sadnica bez primene đubriva ( x = 6,4 cm). Uopšteno gledajući podatke iz 2010. godine, najmanje prečnike cvetnih glavica su imale varijante generativnog razmnožavanja na prolećnom plotu sadnje, dok su ostale varijante sa manjim ili većim razlikama bile prilično ujednačene po ovom parametru. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 75 Grafik 33. Prosečan prečnik cvetne glavice arnike na ogledu u 2010. godini Iako su u 2010. godini đubrene varijante u oba plota sadnje i kod oba tipa sadnica u proseku dale veće vrednosti prečnika cvetnih glavica, ukupan uticaj faktora đubrenja na posmatranu osobinu ni u jednoj posmatranoj godini nije bio statistički značajan (Grafik 34). Prihvatanje hipoteza o jednakosti aritmetičkih sredina osnovnih skupova blokova đubrenja, u dve posmatrane godine, ocenjene su sa verovatnoćama od 86%, u 2009 godini, i 8% u 2010. godini. Grafik 34. Uticaj faktora đubrenja na prečnik cvetne glavice arnike u 2009. i 2010 godini. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 76 Na delu ogleda sađenog na proleće u 2009. godini je prečnik cvetne glavice bio statistički značajno manji ( x = 6,7 cm) nego u 2010. godini ( x = 7,4 cm) (Grafik 35A). Uticaj faktora vremena zasnivanja je u 2010. godini bio u pogledu vrednosti prečnika cvetne glavice statistički veoma značajan, gde su biljke iz jesenjeg roka sadnje razvile veće prečnike cvetnih glavica ( x = 8,1 cm) u odnosu na biljke iz prolećnjeg roka sadnje ( x = 7,4 cm) (Grafik 35B). Grafik 35. Uticaj starenja (A) i vremena zasnivanja ogleda (B) na prečnik cvetne glavice Uticaj faktora vrste sadnica na prečnike cvetnih glavica arnike je bio statistički veoma značajan na prolećnom plotu sadnje, gde su vegetativne sadnice u obe godine razvile veće prečnike cvetnih glavica ( x = 7,3 cm, u 2009.; x = 7.9 cm, u 2010.) u odnosu na biljke iz generativne propagacije ( x = 6,0 cm, u 2009.; x = 6,8 cm, u 2010.) (Grafik 36) (Prilog 4 E i F). Kod biljaka iz jesenjeg plota sadnje je bila obrnuta situacija. U ovom roku sadnje su biljke iz generativnih varijanti razmnožavanja razvile statistički značajno veće prečnike cvetnih glavica ( x = 8,5 cm) u odnosu na biljke iz vegetativne propagacije ( x = 7,7 cm). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 77 Grafik 36. Uticaj vrste sadnica na prečnik cvetne glavice na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Svojstvo prečnika cvetne glavice je u 2009. godini pokazalo statistički veoma značajne negativne korelacione odnose sa prečnikom rozete, visinom cvetnog izdanka i brojem cvetnih glavica po biljci (Tabela 15). Međutim, u 2010. godini, takvi odnosi prestaju da važe. Tabela 15. Odnosi prečnika cvetne glavice na ogledu arnike sa prethodno obrađenim morfološkim parametrima u 2009. i 2010. godini 2009 2010 r r Prečnik rozete -.5501 -.0074 p=.005 p=.960 Visina cvetnog izdanka -.6232 .0530 p=.001 p=.721 Broj cvetnih izdanaka -.5165 -.0050 p=.010 p=.973 Broj cvetnih glavica po biljci -.5321 .2355 p=.007 p=.107 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 78 Broj sekundarnih rozeta Prosečan broj sekundarnih rozeta na ogledu arnike u 2009. godini kretao se od 5,7 – 18,3 (Grafik 37). Najveći broj sekundarnih rozeta formirale su biljke iz prolećnog plota sadnje (13,3 – 18,3), a najmanje biljke iz jesenjeg plota sadnje (5,7 – 8,3). Uticaj faktora đubrenja je bio statistički značajan samo u slučaju vatijante generativnog razmnožavanja u bloku đubrenja stajnjakom na prolećnom plotu sadnje u odnosu na kontrolnu varijantu. Grafik 37. Prosečan broj sekundarnih rozeta na ogledu arnike u 2009. godini U 2010. godini broj sekundarnih rozeta na ogledu se kretao od 25,3 – 35,0 (Grafik 38). Nisu uočene statistički značajne razlike između posmatranih varijanti, ali se može reći da je na prolećnom plotu sadnje varijanta đubrenja mineralnim đubrivom formirala najveći broj sekundarnih rozeta, dok su nasuprot ovome varijante mineralnog đubrenja na jesenjem plotu sadnje formirale najmanji broj sekundarnih rozeta. Takođe varijante đubrene stajskim đubrivom su, u ovoj godini, na jesenjem plotu sadnje formirale najveći broj sekundarnih rozeta. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 79 Grafik 38. Prosečan broj sekundarnih rozeta na ogledu arnike u 2009. godini Uticaj faktora đubrenja na broj sekundarnih rozeta, posmatrajući variranje vrednosti ovog paramatra na celom ogledu, nije bio statistički značajan ni u jednoj od posmatranih godina (Grafik 39). Verovatnoće prihvatanja nulte hipoteze o jednakosti aritmetičkih sredina osnovnih skupova blokova đubrenja ocenjene su verovatnoćom p=0,37 u 2009., odnosno p=0,34 u 2010. godini. Grafik 39. Uticaj faktora đubrenja na broj sekundarnih rozeta arnike u 2009. i 2010 godini. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 80 Broj rozeta je na oba plota sadnje bio statistički veoma značajno viši u 2010. godini u odnosu na 2009. godinu (Grafik 40). Tako su se vrednosti ovog parametra na prolećnom plotu sadnje kretale oko 16,2 rozete, u 2009. godini, i oko 30,4 rozete, u 2010. godini (Grafik 40A). Isto tako su se vrednosti ovog parameta na jesenjm plotu sadnje kretale oko 6,7 rozete, u 2009. godini, i oko 29,8 rozete u 2010. godini (Grafik 40B). Grafik 40. Uticaj starenja na broj sekundarnih rozeta arnike na prolećnom (A) i jesenjem (B) plotu sadnje Uticaj vremena zasnivanja na broj sekundarnih rozeta na ogledu arnike bio je statistički veoma značajan samo u 2009. godini (Grafik 41), gde su biljke sađene na proleće formirale veći broj sekundarnih rozeta ( x = 16,3 cm) u odnosu na biljke sađene na jesen ( x = 6,7 cm) (Grafik 41A). Broj formiranih sekundarnih rozeta se u 2010. godini na oba plota sadnje ujednačava (oko 30 rozeta na oba plota sadnje), pa razlike između sredina testiranih skupova nisu statistički značajne (Grafik 41B). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 81 Grafik 41. Uticaj vremena zasnivanja na broj sekundarnih rozeta arnike u 2009. (A) i 2010. (B) godini Uticaj vrste sadnica na broj sekudarnih rozeta na jesenjm plotu sadnje u obe posmatrane godine nije bio statistički značajan (Grafik 42). Grafik 42. Uticaj vrste sadnica na broj sekundarnih rozeta na jesenjem plotu sadnje u 2009. i 2010. godini Parametar broj sekundarnih rozeta je bio u statistički značajnoj pozitivnoj korelaciji (r=0,71) sa prečnikom rozete samo u 2009. godini (Grafik 43). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 82 Grafik 43. Odnosi prečnika rozete i broja sekundarnih rozeta na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Isto tako značajne pozitivne korelacije broj sekundarnih rozeta ostvaruje u 2009. godini sa većinom prethodno obrađivanih morfoloških osobina (Tabela 16), dok sa prečnikom cvetne glavice gradi negativno korelisanu vezu (r = - 0,46). U 2010. godini gubi se jačina i statistička značajnost korelacionih odnosa posmatranog parametra sa visinom cvetnog izdanka i brojem cvetnih glavica po biljci, dok jačina ostalih veza slabi. Tabela 16. Odnosi parametra broj sekundarnih rozeta arnike sa prethodno proučavanim osobinama 2009 2010 r r Visina cvetnog izdanka .6460 .1894 p=.001 p=.197 Broj cvetnih izdanaka .6914 .2959 p=.000 p=.041 Broj cvetnih glavica po biljci .7160 .1425 p=.000 p=.334 Precnik cvetne glavice -.4566 -.3784 p=.025 p=.008 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 83 6.2. Prinosi Prinos cvetnih glavica U 2009. godini obavljeno je osam žetvi cvetnih glavica arnike samo na prolećnom plotu sadnje. Najveće mase ubranog cveta (15,5 – 30,2%) bile su u drugoj, trećoj i četvrtoj žetvi kod biljaka iz generativne propagacije (Grafik 44A), odnosno u prvoj, drugoj i trećoj (11,4 – 47,1%) kod biljaka razmnoženih deobom bokora (Grafik 44B) (Tabela 17). I II III IV V VI VII VIII Branje 0 10 20 30 40 50 60 70 P rin os c ve ta [g ] POG PMG PKGA I II III IV V VI VII VIII Branje 0 2 4 6 8 10 12 14 P rin os c ve ta [g ] POV PMV PKVB Grafik 44. Prinosi cveta u 2009. godini po berbama na prolećnom delu ogleda sa generativnim (A) i vegetativnim (B) sadnicama Tabela 17. Prinosi cvetnih glavica [%] u svakoj pojedinačnoj žetvi u 2009. godini 21. maj 25. maj 27. maj 3. jun 5. jun 8. jun 10. jun 15. jun I II III IV V VI VII VIII POG 1.5 30.2 16.8 30.2 9.0 8.8 2.4 1.2 PMG 1.7 25.0 15.5 27.1 10.3 12.5 5.1 2.8 PKG 1.4 27.5 17.0 29.7 6.7 10.7 4.7 2.3 POV 37.0 38.3 14.8 7.2 2.1 0.4 0.2 0.0 PMV 28.6 31.5 19.1 17.0 2.8 0.1 0.7 0.2 PKV 29.9 47.1 11.4 3.9 7.5 0.0 0.2 0.0 Prinosi cvetnih glavica u 2009. godini su se kretali od 5.2 – 143.6 kg/ha (Grafik 45). Iz prikazanih podataka se može videti da su biljke iz generativnih varijanti razmnožavanja imale znatno veće prinose cvetnih glavica od biljaka iz vegetativne propagacije. Takođe se može zaključiti da je uticaj đubrenja bio statistički značajan samo na varijantama generativnog razmnožavanja, gde su đubrene varijante dale veće Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 84 prinose ( x = 143,6 kg/ha, varijanta đubrena stajnjakom, i 136,4 kg/ha, varijanta đubrena NPK) od kontrolne varijante ( x = 59,8 kg/ha). Prinosi na delu ogleda razmnoženim deljenjem bokora su bili znatno skromniji i kretali su se od 5,2 – 15,4 kg/ha. Grafik 45. Prosečni prinosi cvetnih glavica arnike u 2009. godini U 2010. godini obavljene su šest žetvi cvetnih glavica arnike. Dinamika žetvi u ovoj godini je bila slična kao u 2009. godini. Preko 70% ubranog cveta raspoređeno je u tri žetve i to u trećoj, četvrtoj i petoj, u svim varijantama osim u varijantama vegativnog razmnožavanja na prolećno sađenom plotu, gde su najmasovnije bile prve tri žetve (Grafik 46ABCD i Tabela 18). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 85 I II III IV V VI Branje 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 P rin os c ve ta [g ] POG PMG PKGA I II III IV V VI Branje 0 1 2 3 4 5 6 P rin os c ve ta [ g] POV PMV PKVB I II III IV V VI Branje 0 20 40 60 80 100 120 140 P rin os c ve ta [g ] JOG JMG JKGC I II III IV V VI Branje 0 20 40 60 80 100 120 140 Pr in os c ve ta [ g] JOV JMV JKVD Grafik 46. Prinosi cveta u 2010. godini po berbama na prolećnom delu ogleda sa generativnim (A) i vegetativnim (B) sadnicama; na jesenjem delu ogleda sa generativnim (C) i vegetativnim (D) sadnicama. Tabela 18. Prinosi cvetnih glavica [%] u svakoj pojedinačnoj žetvi u 2010. godini 24. maj 28. maj 31. maj 8. jun 11. jun 15. jun I II III IV V VI POG 0.4 10.6 33.6 27.4 26.8 1.2 PMG 1.2 11.3 29.7 27.9 28.8 1.1 PKG 0.0 10.8 24.3 41.8 21.8 1.3 POV 11.4 3.6 82.5 0.4 2.1 0.0 PMV 22.8 22.7 34.0 20.4 0.0 0.0 PKV 46.3 10.2 26.5 16.9 0.0 0.0 JOG 0.0 3.3 21.9 33.9 37.0 4.0 JMG 0.0 2.7 20.4 31.3 39.9 5.8 JKG 0.0 3.5 19.8 27.2 45.3 4.1 JOV 0.0 5.7 23.9 34.4 30.7 5.2 JMV 0.0 4.7 22.6 25.1 39.1 8.5 JKV 0.0 5.5 20.9 29.9 35.7 8.0 Prinosi cvetnih glavica u 2010. godini su se kretali od 3,7 – 258,7 kg/ha (Grafik 47). Na plotu prolećne sadnje biljke iz generativne propagacije su dale statistički značajno više prinose cvetnih glavica od biljaka razmnoženih vegetativnim putem. Kod biljaka iz generativne propagacije ovog plota je, takođe je bio uočljiv i uticaj đubrenja Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 86 koji se ogledao u višim prinosima đubrenih varijanti ( x = 176,9 kg/ha, varijanta đubrena stajnjakom, i 200,4 kg/ha, varijanta đubrena NPK) u odnosu na kontrolu ( x = 116,2 kg/ha). Varijante vegetativnog razmnožavanja na prolećnom plotu sadnje su dale izuzetno niske prinose cvetnih glavica koji su se kretali od 3,7 – 5,6 kg/ha. Biljke jesenjeg plota sadnje su dale najveće prinose cvetnih glavica (od 175,7 – 258,7 kg/ha), ali je samo na generativno razmnoženim varijantama uticaj đubrenja bio statistički značajan. Ovde su đubrene varijante dale viši prinos cvetnih glavica ( x = 250,9 kg/ha, varijanta đubrena stajnjakom, i 258,7 kg/ha, varijanta đubrena NPK) u poređenju sa kontrolom ( x = 175,8 kg/ha). Grafik 47. Prosečni prinosi cvetnih glavica arnike u 2010. godini Uprkos statistički značajnom uticaju faktora đubrenja na prinos cvetnih glavica u varijantama generativnog razmnožavanja, u oba plota sadnje, ukupan uticaj faktora đubrenja na ogledu arnike nije bio statistički značajan ni u jednoj godini posmatranja (Grafik 48). Prihvatanje nultih hipoteza o jednakosti aritmetičkih sredina osnovnih skupova blokova đubrenja u 2009. i 2010. godini, ocenjeno je sa verovatnoćama p=0.41 i p=0.47, respektivno. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 87 Grafik 48. Uticaj faktora vrste đubrenja na prinos cvetnih glavica arnike u 2009. i 2010. godini Za testiranje uticaja faktora starenja biljaka i vremena sadnje sa prolećno sađenog plota uzimane su u razmatranje samo biljke iz generativne propagacije (GEN)(Grafik 49), pošto se uključivanjem vegetativno razmnoženih varijanti ukupna varijansa značajno povećavala čime se prikrivala statistički značajna razlika između aritmetičkih sredina osnovnih skupova vrednosti prinosa cvetne glavice u dve uzastopne godine. Isti princip posmatranja primenjen je i u narednom testu radi uniformnosti prikaza. Prinos cvetne glavice na prolećnom plotu sadnje u 2010. godini bio je očekivano statistički značajno viši od prinosa u 2009. godini, ali samo u slučaju izolovanog posmatranja generativno razmnoženih biljaka (Grafik 49A). U 2010. godini razlika između aritmetičkih sredina nivoa pronosa cvetne glavice na prolećnom i jesenjm plotu bila je statistički veoma značajna (Grafik 49B), gde su biljke iz jesenjeg dale više prinose ( x = 218,3 kg/ha) od biljaka iz prolećnog plota sadnje ( x = 84,8 kg/ha). Grafik 49. Uticaj starenja generativno razmnoženih biljaka (A) i vremena zasnivanja ogleda (B) na prinos cvetnih glavica arnike Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 88 Uticaj faktora vrste sadnica je bio značajan samo na prolećnom plotu sadnje i to u obe posmatrane godine (Grafik 50). Na delu ogleda sađenom na proleće biljke iz generativne propagacije su u 2009. (odnosno 2010.) godini dale više prinose cvetnih glavica ( x = 113,3 kg/ha, odnosno x = 164,6 kg/ha) od vegetativno razmnoženih varijanti ( x = 11,2 kg/ha, odnosno x = 4,9 kg/ha). Na jesenjem plotu ogleda biljke iz generativne su takođe dale više prinose ( x = 228,4 kg/ha) u odnosu na one iz vegetativne propagacije ( x = 208,1 kg/ha), ali razlike njihovih aritmetičkih sredina nisu bile statistički značajne (Prilog 4 B). Grafik 50. Uticaj vrste sadnica na prinos cvetne glavice arnike u 2009. i 2010. godini U Tabeli 19. dat je pregled dve preračunate osobine na osnovu broja prisutnih biljaka na parcelici u trenutku žetve. Na osnovu ovog prikaza se može sagledati kakav bi bio prinosni potencijal pojedinih varijanti da nije bilo propadanja biljaka, odnosno da je na ogledu očuvan teoretski pun sklop od 71428 biljaka/ha (raspored 70 x 20 cm). Iz ove tabele se može zaključiti da bi u 2009. godini najviše prinose dale đubrene varijante generativnog tipa razmnožavanja, a najniže varijante vegetativnog razmnožavanja. Takođe na ovom plotu slična situacija se ponavlja i u 2010. godini, dok se na jesenjem plotu sadnje kao najprinosnija izdvaja varijanta generativnog razmnožavanja đubrena mineralnim đubrivom. Sve ostale varijante su po teoretskim prinosima vrlo ujednačene i bliske najboljoj varijanti, osim kontrolne varijante đubrenja kod generativnog tipa sadnica koja se statistički značajno razlikuje od ove grupe. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 89 Tabela 19. Preračunati prinosi cveta po biljci i u teoretskom sklopu (71428 biljaka/ha) Varijanta Prinos cveta po biljci [g] a Teoretski prinos cveta [kg/ha] 2009 POG 2.21 ± 0.42 a 158.14 ± 29.91 a PMG 2.11 ± 0.93 a 150.83 ± 66.73 a PKG 0.98 ± 0.52 b 69.67 ± 36.99 b POV 0.86 ± 0.39 b 31.07 ± 2.25 b PMV 0.67 ± 0.10 b 47.59 ± 7.30 b PKV 0.43 ± 0.03 b 61.24 ± 28.18 b 2010 POG 3.31 ± 0.64 de 236.20 ± 45.78 de PMG 3.75 ± 1.20 cd 267.75 ± 85.84 cd PKG 2.28 ± 1.05 e 163.08 ± 74.97 e POV 1.90 ± 0.51 e 135.55 ± 36.29 e PMV 2.04 ± 0.27 e 145.56 ± 19.45 e PKV 1.40 ± 0.51 e 99.82 ± 36.49 e JOG 5.39 ± 0.21 ab 384.90 ± 14.75 ab JMG 5.84 ± 0.92 a 417.09 ± 65.44 a JKG 4.20 ± 1.04 bcd 299.72 ± 74.44 bcd JOV 5.26 ± 0.76 ab 375.49 ± 54.24 ab JMV 4.87 ± 1.24 abc 347.69 ± 88.41 abc JKV 4.98 ± 0.55 abc 355.56 ± 39.33 abc a Razlicita slova označavaju statisticku znacajnost Dankanovog testa na nivou p<0.05 Prinos cvetne glavice u obe posmatrane godine gradi pozitivne korelacione odnose sa određenim brojem morfoloških parametara kako što su: prečnik rozete (r=0,94 u 2009, i r=0,82 u 2010. godini) (Grafik 51), visina cvetnog izdanka (r=0,91 i r=0,83) (Grafik 52), broj cvetnih izdanaka (r=0,91 i r=0,83) (Grafik 53) i broj cvetnih glavica po biljci (r=0,95 i r=0.86) (Grafik 54). Grafik 51. Odnosi prečnika rozeta sa prinosom cvetne glavice na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 90 Grafik 52. Odnosi visina cvetnih izdanaka sa prinosom cvetne glavice na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Grafik 53. Odnosi broja cvetnih izdanaka sa prinosom cvetne glavice na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Grafik 54. Odnosi broja cvetnih glavica po biljci sa prinosom cvetne glavice na ogledu arnike u 2009. i 2010. godini Izmereni prečnici cvetnih glavica su ostvarili statistički značajan negativno korelisan odnos sa prinosom cvetne glavice u 2009. godini (r= - 0,60), ali se taj odnos nije zadržao i u 2010. godini (Tabela 14). Takođe broj formiranih sekundarnih rozeta u Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 91 2009. godini ostvaruje pozitivno korelisan odnos ocenjen statistički veoma značajno (r=0,74), koji se gubi u narednoj godini (Tabela 20). Tabela 20. Korelacioni odnosi prinosa cvetne glavice sa prečnikom cvetne glavice i brojem sekundarnih rozeta Prinos cvetne glavice [kg/ha] 2009 2010 r r Precnik cvetne glavice [cm] -.6048 .0656 p=.002 p=.658 Broj sekundarnih rozeta .7467 .2328 p=.000 p=.111 Prinos rizoma U 2009. godini prinosi rizoma su se kretali od 106,3 – 373,7 kg/ha, gde je najveći prinos izmeren na prolećnom plotu sadnje kod varijante generativnog razmnožavanja u bloku đubrenja stajskim đubrivom ( x = 373,7 kg/ha), a najniže prinose rizoma imale su varijante generativnog razmnožavanja na jesenjem plotu sadnje (od 106,3 – 142,5 kg/ha) (Grafik 55) (Prilog 5 A, D i E). Uticaj đubrenja u ovoj godini nije bio statistički značajan ni u jednoj od posmatranih varijanti tipa sadnica. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 92 Grafik 55. Prosečni prinosi rizoma na ogledu arnike u 2009. godini U 2010. godini prinosi rizoma su se kretali od 475,9 – 897,5 kg/ha (Grafik 56). Prinosi rizoma su na celom ogledu po svim varijantama bili prilično ujednačeni, a uticaj đubrenja, kao u prethodnoj godini nije bio statistički značajan. Grafik 56. Prosečni prinosi rizoma na ogledu arnike u 2010. godini Skroman uticaj faktora vrste đubrenja po varijantama se istim takvim pokazao i na celom ogledu, gde razlike između tretmana ni u jednoj posmatranoj godini nisu bile statistički značajne (Grafik 57). Hipoteze o jednakosti aritmetičkih sredina skupova su ocenjene verovatnoćama p=0,18 u 2009. godini, i p=0,11 u 2010. godini. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 93 Grafik 57. Uticaj vrste đubrenja na prinos rizoma u 2009. i 2010. godini Prinos rizoma je na oba plota sadnje u 2010. godini bio statistički značajno viši nego u 2009. godini (Grafik 58A i B). Grafik 58. Uticaj starenja na prinos rizoma brđake na prolećnom (A) i jesenjem (B) plotu sadnje Biljke sa prolećnog plota sadnje su dale u obe posmatrane godine stitistički značajno veće prinose u odnosu na biljke sa jesenjeg plota sadnje (Grafik 59 A i B). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 94 Grafik 59. Uticaj faktora vremena zasnivanja na prinos rizoma brđake u 2009. (A) i 2010. (B) godini Uticaj faktora vrste sadnica na prinos rizoma ni u jednoj od posmatranih godina na jesenjem plotu sadnje nije bio značajan (Grafik 60). Grafik 60. Uticaj faktora vrste sadnica na prinos rizoma arnike u 2009. i 2010. godini na jesenjem plotu sadnje Jačina veze između broja sekundarnih rozeta i prinosa rizoma okarakterisana je statistički značajnim pozitivnim korelacijama, pa se može reći da je veza između ove dve osobine u 2009. godini bila jaka (r = 0,80), a u 2010. godini osrednja (r = 0,54) (Grafik 61). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 95 Grafik 61. Jačina zavisnosti prinosa rizoma od broja sekundarnih rozeti Veze sa ostalim posmatranim osobinama nisu bile statistički značajne osim veze sa brojem cvetnih glavica po biljci, koja je u 2009. godini okarakterisana kao osrednja pozitivna korelacija (r = 0,59), a u 2010. godini kao slaba negativna korelacija (r = - 0,39) (Tabela 21). Tabela 21. Korelacioni odnosi prinosa rizoma sa ostalim posmatranim osobinama Prinos rizoma [kg/ha] 2009 2010 r r Precnik rozete [cm] .4478 -.0507 p=.144 p=.772 Visina cvetnog izdanka [cm] .3121 -.1624 p=.323 p=.351 Broj cvetnih izdanaka .5613 -.0393 p=.058 p=.823 Broj cvetnih glavica po biljci .5934 -.3931 p=.042 p=.019 Precnik cvetne glavice .4301 -.1584 p=.163 p=.363 Prinos cvetne glavice [kg/ha] .5632 -.2833 p=.057 p=.099 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 96 Prinos korena Prosečne vrednosti prinosa korena u 2009. godini na ogledu arnike su se kretale od 194,3 – 426,4 kg/ha (Grafik 62) (Prilog 5 A, B i C). Iako su đubrene varijante, po svakom tipu sadnica, na oba plota sadnje, bile prinosnije od kontrolnih varijanti, između aritmetičkih sredina svih varijanti na ogledu nisu uočene statistički značajne razlike (F8, 27=1,1240, p=0,3790). Grafik 62. Prinosi korena arnike u 2009. godini U 2010. godini prinosi korena su se kretali od 420,7 – 614,7 kg/ha (Grafik 63). Najveće prinose su postigle đubrene varijante generativno razmnoženih biljaka na prolećnom plotu sadnje i kontrolna varijanta generativnog razmnožavanja na jesenjm plotu sadnje (605,5 – 614,7 kg/ha). Statistički značajno najniže prinose korena su imale varijante vegetativnog razmnožavanja u bloku mineralnog đubrenja i kontrole na jesenjm plotu sadnje (427,5 kg/ha i 420,7 kg/ha, respektivno). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 97 Grafik 63. Prinosi korena arnike u 2010. godini Uticaj faktora vrste đubrenja u obe posmatrane godine nije uzrokovao variranje prinosa korena arnike na ogledu da bi se razlike između blokova đubrenja mogle oceniti kao statistički značajne (Grafik 64). Grafik 64. Uticaj đubrenja na prinos korena arnike u 2009. i 2010. godini Prinosi korena u 2010. godini su na oba plota sadnje po visini nadmašili prinose iz 2009. godine (Grafik 65). Uticaj starenja u pogledu prinosa korena je ocenjen kao statistički veoma značajan. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 98 Grafik 65. Uticaj starenja na prinos korena na prolećnom (A) i jesenjem plotu (B) sadnje Uticaj vremena sadnje je samo u drugoj posmatranoj godini (2010.) ocenjen statističkom značajnošću (p<0,05) dok u prvoj godini (2009.) razlika između aritmetičkih sredina dva plota sadnje nije bila statistički značajna (Grafik 66). Grafik 66. Uticaj vremena sadnje na prinos korena u 2009. (A) i 2010. (B) godini Uticaj faktora vrste sadnica na prinos korena nije bio statistički značajan ni u jednoj posmatranoj godini na jesenjem plotu sadnje (Grafik 67). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 99 Grafik 67. Uticaj vrste sadnica na prinos korena arnike na jesenjem plotu sadnje Prinos korena je u obe posmatrane godine pokazao statistički značajnu pozitivnu korelisanost da prinosom rizoma (Grafik 68). Tako je jačina veze ova dva svojstva u 2009. godini ocenjena kao jaka koeficijentom korelacije r=0,88, dok je u 2010. godini ocenjena kao osrednja koeficijentom r=0,49. Od veza sa ostalim osobinama prinos korena arnike u prvoj posmatranoj godini nije imao značajnih korelacija, dok je u drugoj godini ostvario slabu negativnu korelaciju sa osobinom broj cvetnih glavica po biljci koja je ocenjena koeficijentom r = - 0,31 i verovatnoćom p=0,029. Grafik 68. Odnosi između prinosa rizoma i prinosa korena arnike u 2009. i 2010. godini. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 100 Prinos etarskog ulja korena i rizoma Prinos etarskog ulja korena u 2009. godini kretao se od 1,05 – 3,15%, dok se prinos etarskog ulja rizoma kretao od 3,98 – 4,83% (Grafik 69). Grafik 69. Procenat etaskog ulja u korenu i rizomu u 2009. godini po varijantama U narednoj, 2010. godini, prinosi ova dva organa su se ujednačili, pa se prinos etarskog ulja u korenu kretao od 1,7 – 2,4 %, a u rizomu od 2,1 – 3,1% (Grafik 70). Grafik 70. Procenat etaskog ulja u korenu i rizomu u 2010. godini po varijantama Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 101 U Tabeli 22. dat je pregled vetovatnoća prihvatanja nulte hipoteze o jednakosti aritmetičkih sredina prinosa etarskog ulja posmatranih blokova đubrenja. Iz prikazanog se može zakjučiti da ni jedna predstavljena verovatnoća nije bila manja od 0,05, odnosno da uticaj faktora vrste đubrenja ni u jednoj posmatranoj godini nije imao statistički značajan uticaj na prinos etarskih ulja korena i rizoma. Tabela 22. Uticaj faktora vrste đubrenja na prinos etarskog ulja korena i rizoma Vrsta đubrenja a p 2009 Koren 0.7653 Rizom 0.5097 2010 Koren 0.2489 Rizom 0.1288 a Date p vrednosti predstavljaju verovatnoće prihvatanja nulte hipoteze Prinos etarskog ulja (%) je u obe godine bio statistički veoma značajno viši u rizomu nego u korenu (Grafik 71 A i B) Grafik 71. Prinosi etarskog ulja (%) u korenu i rizomu u 2009. (A) i 2010. (B) godini Uticaj starenja na prinos etarskog ulja u korenu je bio statistički značajan samo kod biljaka sa prolećnog plota sadnje (Grafik 72A i B), gde je procenat ulja u 2009. godini bio viši ( x = 2,7%) u odnosu na 2010. godinu ( x = 2,1%). Prinosi etarskog ulja u rizomu su na oba posmatrana plota bili statistički veoma značajno viši ( x = 4,7%, na Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 102 prolećnom plotu i x = 4,4%, na jesenjem plotu) u 2009. godini u odnosu na 2010. godinu ( x = 2,9% na prolećnom plotu i x = 2,5%, na jesenjem plotu) (Grafik 72C i D). Grafik 72. Uticaj starenja na prinos etarskog ulja korena na prolećnom (A) i jesenjem (B) plotu sadnje i etarskog ulja rizoma na prolećnom (C) i jesenjem (D) plotu sadnje Uticaj faktora vremena zasnivanja plantaže je ocenjen kao statistički značajan samo u slučaju prinosa etarskog ulja korena u 2009. godini (Grafik 73A). Aritmetičke sredine prinosa ulja u korenu, u drugoj, i rizomu, u obe posmatrane godine, nisu se razlikovale između plotova sadnje (Grafik 73B, C i D). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 103 Grafik 73. Uticaj vremena zasnivanja na prinos etarskog ulja korena u 2009. (A) i 2010. (B) godini i etarskog ulja rizoma u 2009. (C) i 2010. (D) godini Uticaj faktora vrste sadnica na prinos etarskog ulja, u obe posmatrane godine, na jesenjem plotu sadnje, nije bio statistički značajan ni u jednom od posmatranih podzemnih organa (Grafik 74A, B, C i D) Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 104 Grafik 74. Uticaj vrste sadnica na prinos etarskog ulja korena u 2009. (A) i 2010. (B) godini i etarskog ulja rizoma u 2009. (C) i 2010. (D) godini, na jesenjem plotu sadnje. Prinosi eterskog ulja korena nisu u obe posmatrane godine pokazali statistički značajnu vezu sa prinosom korena (r = -0,16), dok su prinosi etarskog ulja rizoma pokazali statistički jaku negativnu korelisanost sa prinosom rizoma (r = -0,79) (Grafik 75). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 105 Grafik 75. Odnosi prinosa etarskih ulja korena i rizoma sa prinosima biomase podzemnih organa Uticaj faktora na variranje morfoloških parametara i prinosa U Prilogu 3 dat je tabelarni pregled aritmetičkih sredina svih proučavanih morfoloških parametara i prinosa zajedno sa označenim statističkim značajnostima između varijanti, a na Tabeli 23 je predstavljen pojedinačni uticaj faktora na svaku posmatranu osobinu zajedno sa međusobnom interakcijom faktora. Iz prikazonog se može zaključiti da su svi indukovani faktori imali uticaj na variranje vrednosti nadzemnog dela arnike, ali da su u pogledu formiranja sekundarnih rozeta i prinosu podzemnnih organa imali skroman doprinos. Takođe je prisutan i veliki broj interakcija između faktora koje su u velikom broju slučajeva prikrivale statističku značajnost faktora vrste đubrenja (Grafici 6, 11, 17, 26 i 48). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 106 Tabela 23. Pregled uticaja faktora na variranje morfoloških parametara i prinosa i interakcija između fakotra Izvor varijacije Prečnik rozete a Visina cvetnog izdanka Broj cvetnih izdanaka Broj cvetnih glavica po biljci Prečnik cvetne glavice Prinos cvetne glavice Broj sekundarnih rozeta Prinos rizoma Prinos korena 2009 p p p p p p p p Vrsta sadnica (B) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.7340 0.1258 0.8701 Vrsta đubrenja (C) 0.0014 0.0011 0.0289 0.0008 0.6689 0.0380 0.6756 0.2197 0.3301 B x C 0.0209 0.0353 0.0521 0.0012 0.8533 0.0230 0.9617 0.2854 0.4020 2010 Vreme sadnje (A) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0008 0.0000 0.1240 0.0398 0.0468 Vrsta sadnica (B) 0.0000 0.0000 0.0003 0.0000 0.3682 0.0000 0.2680 0.1701 0.5362 Vrsta đubrenja (C) 0.0003 0.0000 0.0130 0.0082 0.0177 0.0224 0.1832 0.1098 0.6830 A x B 0.0000 0.0002 0.0000 0.0000 0.0001 0.0000 0.0000 0.1181 0.8626 A x C 0.0178 0.5077 0.5942 0.5160 0.5761 0.6441 0.2974 0.9608 0.4213 B x C 0.3163 0.9076 0.5619 0.0077 0.3814 0.0127 0.2108 0.8509 0.5681 A x B x C 0.5457 0.5582 0.0825 0.7510 0.9114 0.8988 0.7932 0.0460 0.1745 a p vrednosti u tabeli predstavljaju verovatnoće prihvatanja nulte hipoteze Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 107 6.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga Makroskopski pregled Na slici 25. prikazan je makroskopski pregled droga Arnicae i Calendulae flos, kao i cveta Doronicum columnae od slike otvorenog cveta (A), preko osušenih (B) i samlevenih (C) cvetnih glavica do slike praška pod lupom (D). Slika 25. Makroskopski prikaz droga Arnicae flos, Calendulae flos i cveta Doronicum columnae; A – cvetne glavice u punom cvetnoj glavici; B – osušene cvetne glavice; C – samlevene cvetne glavice; D – sprašeni cvet pod lupom (x40) Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 108 Na ovom pregledu se može uočiti kako je u fazi punog cveta najlakše razlikovati ove tri biljne vrste, ali da se uočljive razlike polako gube već na nivou osušenih glavica, dok su na nivou samlevenih glavica jedva uočljive. Prilikom pregleda pod lupom (pod uveličanjem x40) veoma je teško razlikovati sprašene delove cveta posmatrane tri biljne vrste. Mikroskopska analiza Na Slici 26 predstavljen je uporedni pregled delova cvetne glavice arnike sa dva pretpostavljena falsifikata. Slika 26. Mikroskopski prikaz delova droga Arnicae flos, Calendulae flos i cveta Doronicum columnae; A – dlake na aheniji; B – žlezdane dlake na involukrumu; C – uljane kapljice u krunicama jezičastih cvetova; D – papus; E – prašnici; F – žig tučka Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 109 Slika 27. pokazuje razlike u dlakama koje su prisutne u bazi krunice cevastih cvetova vrsta A. montana i C. officinalis. Kod A. montana se vide dugačke jednostruke višećelijske dlake (Slika 27 - dk), dok su kod C. officinalis jasno uočljive višećelijske dlake sastavljene od dva reda ćelija (Slika 27 - ddk). Slika 27. Mikroskopski prikaz dlaka u baznom delu krunice cevastih cvetova kod A. montana i C. officinalis; dk - duge višećelijske dlake; ddk – dvostruke duge višećelijske dlake. Na Slici 28. predstavljena je sprašena droga Arnicae flos gde se pod mikroskopskim uveličanjem x5 mogu uočiti dvostruke dlake sa površine ahenija (da), jednostruke višećelijske dlake sa baze krunice cevastih cvetova (dk), deo krunice cevastih cvetova (k), površina dela epidermisa ahenije prekrivena rđastim mrljama i delovi papusa dijametra ca. 70 μm. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 110 Slika 28. Sprašena droga Arnicae flos pod mikroskopskim uveličanjem x5; dk – duge višećelijske dlake sa baze krunice cevastih cvetova; da – dvostruke dlake sa površine ahenije; p – papus dijametra ca. 70 μm; ah – površina ahenije prektivena rđavim mrljama; k – deo krunice cveta. Na Slici 29. prikazan je mikroskopski pregled praha cvetne glavice C. officinalis (x5) gde se mogu uočiti dvostruke dlake poreklom sa baze krunice cevastih cvetova Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 111 (ddk), deo prašnika (a), delovi krunice cvetova (k) i delovi žlezdanih dlaka poreklom sa involukruma (di). Važna karakteristika prilikom identifikacije je da u prahu cvetnih glavica C. officinalis nisu prisutni ostaci papusa. Slika 29. Sprašena droga Calendulae flos pod mikroskopskim uveličanjem x5; ddk – dvostruke višećelijske dlake sa baze krunice cevastih cvetova; di – višećelijske žlezdane dlake sa površine involukruma; a – deo prašnika (antere); k – deo kunice cveta. Prah vrste D. columnae pod mikroskopskim uveličanjem predstavljen je na Slici 30. Na slici se mogu uočiti srcasti krajevi žlezdanih dlaka poreklom sa involukruma i delovi papusa dijametra ca. 30 μm. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 112 Slika 30. Sprašeni cvet D. columnae pod mikroskopskim uveličanjem x5; di – višećelijske žlezdane dlake sa površine involukruma (srcaste glave); p – papus dijametra ca. 30 μm; Radi lakše identifikacije vrsta i lokalizacije sekundarnih metabolita upotrebljen je Opšti reaktiv (Tabela 10), ali se bojena reakcija ispoljila samo na žlezdanim dlakama Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 113 brakteja vrste A. montana (Slika 31). Ovakva bojena reakcija kod svih vrsta nije bila očekivana i na osnovu prezentovanog se ne može pouzdano tvrditi da u različitim fazama razvića preostale dve biljne vrste ne bi došlo do ispoljavanja bojene reakcije. Stoga se ova metoda ne može preporučiti kao pouzdan način za identifikacju vrsta. Slika 31. Bojena reakcija žezdanih dlaka na braktejama A. montana usled primene prirodnog reagensa Sumirane razlike u delovima sprašenih cvetnih glavica sve tri vrste posmatranih pod mikroskopom, prezentovane su u Tabeli 24. Tabela 24. Razlike u delovima cvetnih glavica uočljivih pod mikroskopom Vrsta Deo cvetne glavice Arnica montana Calendula officinalis Doronicum columnae Dlake na aheniji Dvostruke, providne bez glavice Jednostruke sa glavicom Dvostruke, providne bez glavice Dlake na involukrumu Kratke, u obliku dobošarske palice Piramidalno višećelijske sa glavicom na vrhu Dvoredo višećelijske sa srcastom glavicom Papus Uočljiv, debljine 69±16 mm Nije uočljiv Uočljiv, debljine 30±7 mm Dlake u bazi krunice cevastih cvetova Višećelijske duge jednostruke Višećelijske duge dvostruke Višećelijske duge jednostruke Bojena reakcija prirodnim reagensom Prisutna u žlezdanim dlakama brakteja Nije prisutna Nije prisutna Ukratko samo na bazi prisustva i dimenzija papusa može se pouzdano tvrditi o kojoj biljnoj vrsti, od tri ispitivane, je reč. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 114 Tankoslojna hromatografija Slika 32. HPTLC identifikacija biljne droge Arnicae flos pod UV svetlošću (365 nm); T1 – smeša standarda (rutin, hlorogenska kiselina, kafena kiselina), 1 – Arnica montana, 2 – Calendula officinalis, 3 – Doronicum columnae, T2 – standard izokvercitina. Na sredini HPTLC hromatograma (Rf ~ 0,55) uočava se zona koja daje plavu florescenciju (Slika 32), a koja po položaju odgovara hloragenoj kiselini u smeši standarda (T1). Ta zona ima najjaču flurescenciju u uzorku D. columnae, malo slabiju kod C. officinalis, a najslabiju u uzorku cveta A. montana. Ispod te zone nalazi se zona koja ima narandžastu flurescenciju (Rf ~ 0,4), a koja je jasno izražena u uzorku C. officinalis, potpuno odsutna u uzorku cveta A. montana, dok u uzorku D. columnae postoji nagoveštaj ove zone. Ta narandžasta zona po položaju odgovara rutinu u smeši standarda (T1). Sledeća narandžasto flurescentna zona može se uočiti na Rf ~ 0,65 koja je jasno vidljiva jedino u uzorku A. montana, potpuno odsutna u uzorku C. officinalis i jedva primetna u uzorku D. columnae. Ova zona po položaju i flurescenciji odgovara standardu izokvercitina (T2). Zona koja u smeši standarda predstavlja standard kafene kiseline nalazi se na vrhu hromatograma (Rf ~ 0,9) i podjednako je zasupljena u svim Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 115 ispitivanim uzorcima. U uzorku A. montana na Rf ~ 0,6 (između izokvercitina i hlorogenske kiseline) nalazi se bledo-narandžasta zona koja gasi fluorescenciju hlorogenske kiseline, kao i zona sa žućkastom fluorescencijom na na Rf ~ 0.7 koja je za razliku od prethodne zastupljena u svim uzorcima. U uzorku C. officinalis se u donjem delu hromatograma, pored opisanih zona, nalaze dve zone sa jasnom žutom flurescencijom. Jedna se nalazi odmah iznad rutina na Rf ~ 0,45, a druga znatno bliže početku htomatograma na Rf ~ 0,2. Ove zone su zastupljene samo u uzorku C. officinalis. U gornjem delu hromatograma uzorka D. columnae nalazi se zona plave flurescencije (Rf ~ 0.8) koja je zastupljena samo u ovom uzorku. Lokalizacija etarskog ulja u rizomu i korenu Svetlosna mikroskopija Brojne ćelije kortikalnog parenhima koje sadrže amorfne, žućkasto obojene kapljice čiste supstance, prečnika od 3-70 µm (prosečno 18±14 µm) su uočene koristeći nebojene ručne poprečne preseke korena potopljenog u vodu (Slika 33A). U kortikalnom regionu korena su prisutni intercelulari naslonjeni na sprovodne snopiće (Slika 33B), ali specijalizovane sekretorne epitelijalne ćelije koje okružuju ove intercelulare nisu uočene. Na uzdužnom preseku ovi intercelulari su izduženi, prečnika 12-77 µm i dužine ponekad i preko 400 µm. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 116 Slika 33. Poprečni preseci korena i rizoma Arnica montana A – Nebojeni ručni poprečni presek korena potopljenog u vodi na kome se vide uskladištene kapljice ulja u ćelijama kortikarnog parenhima i intercelularima kao žućkaste tačke B – Polutanki poprečni presek na kome se vide mali intercelulari u kori korena blizu sprovodnih sudova (obeleženo zvezdicama) C – Nebojeni ručni poprečni presek rizoma potopljenog u vodu na kome se vide žućkasta skladišta uljanih kapljica u intercelularima kore D – Uzdužni parafinski presek na kome se vidi izduženi intercelular u blizini sprovodnih sudova (obeleženo zvezdicama) E – Polutanki presek mladog rizoma (d=5mm) na kome se vide intercelulati u kori (obeleženo zvezdicama) F- Polutanki presek starijeg rizoma (d = 25 mm) na kome se vidi veliki intercelular i sekretorne ćelije manjih dimenzija koje okužuju šupljinu. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 117 Kod rizoma su uočeni veliki intercelulari od kojih se većina nalazi u primarnoj kori zajedno sa floemom (Slika 33C). Ove šupljine su različitih dimenzija i kreću se od 19 µm do 550 µm u prečniku. Takođe njihov broj varira od 30-50 po preseku, zavisno od prečnika rizoma. Kada se pogleda uzdužni presek šupjine su izodijametrične i manje ili više izdužene (Slika 33D) sa dužinom 102-1845 µm (prosečno 516,7 ± 443,6 µm). Ove šupljine sadrže žute amorfne kapljice jasno vidljive na nebojenim svežim ručnim presecima potopljenim u vodi (Slika 33C). Sadržaj šupljina i ćelija koje ih okružuju se može smatrati lipofilnim obzirom na žućkastu boju, viskoznost i zaokruženost u sferične kapljice nerastvorljive u vodi. U mladom rizomu (precnika 5 mm) primećuju se mnoge deobe parenhimskih ćelija kore, što najverovatnije ima za cilj formiranje novih sekretornih šupljina za skladištenje etarskog ulja. Lumen šupljine je okružen epitelijalnim ćelijama odgovornim za sintezu ulja i sekreciju u šupljinu (Slike 33 E i F). Epitelijalne ćelije kod starijeg rizoma se povećavaju i izdužuju, gde neke od njih nastavljaju sa deobom na račun čega se povećavaju šupljine. Prosečna veličina epitelijalne ćelije je 19,8 ± 11,4 µm, a kreće se u opsegu od 4,4 to 69,4 µm. Histohemijska analiza Histohemijski testovi koji su obavljeni na korenu i rizomu A. montana sa Sudan bojama ukazuju na lipidnu prirodu kapljica (Slika 34), dok je usvajanje boje upotrebom drugih testova bilo negativno (Prilog 2). Bojenje sadržaja intercelulara u korenu i rizomu Sudan bojama nije bilo očigčledno, zbog lakog rastvarnja uljanih kapljica u rastvoru boje, obzirom da je rastvor bio etanolni. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 118 Slika 34. Bojenje za lipide kod korena i rizoma A. montana A-B – Uljane kapljice u ćelijama kore korena i centralnom delu korena obojene narandžasto sa Sudan III (A) i crno sa Sudan Black (B). C-D – Uljana skladišta u kortikalnom sekretornom regionu rizoma obojena narandžasto sa Sudan III (C) i crno sa Sudan Black (D). Zabeleženo je najintenzivnije bojenje jednoslojnog epitelijuma i odsustvo boje u intercelularima (obeleženo strelicama), najverovatnije zbog toga što se ulje u intercelularima rstvorilo u rastavaču boje (70% etanol) Fluorescentna mikroskopija Uljana skladišta svežih preseka korena potopljenog u vodi ispitivanih sa fluorescentnim mikroskopom emitovala su slabu svetlo-žutu auto-fluorescenciju pod UV ekscitacijom (BP 340-380 nm). Intenzivnija fluorescencija je dobijena posmatranjem pod dve ostale talasne dužine (BP 450-490 nm i 515-580 nm) (Slika 35). Autofluorescencija pod UV ukazuje na prisustvo fenolnih jedinjenja (Ruzin, 1999). Najveća skladišta ulja u korenu su lokalizovana u kortikalnom regionu, u intercelularima koji se nalaze u blizini sprovodnih snopića. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 119 Slika 35. Nebojeni poprečni ručni presek korena Arnica montana potopljenog u vodi i posmatranog u svetlom polju (A) i fluorescentnoj mikroskopiji (B-D) A – Žute uljane kapljice u kortikalnim ćelijama i u lumenu intercelulara B-D – Uljane kapi u intercelularima i u idioblastu ćelija sekretornog parenhima su vidljive kao žućkaste tačke sa slabom fuorescencijom pod UV (B) i intenzivna autofluorescencija pod filterima I3 (C) i N2.1. (D). Sveži poprečni preseci rizoma pod fluorescentnim mikroskopom su pokazali da uljane kapljice koje ispunjavaju lumen šupljina imaju slabo žutu autofluorescenciju pod UV, ali takođe i jaku žutu i crvenu autofluorescenciju na ostale dve talasne dužine, respektivno (Slika 36). Uljane kapljice nađene u epitelijalnim ćelijama i stalim ćelijama kore u blizini šupljina pokazivale su autofluorescenciji na sličan način. Iz prisustva uljanih kapljica u sekretornim šupljinama i u epitelijalnoj zoni može se izvesti pretpostavka da se etarsko ulje sintetiše u epitelijalnim ćelijama grupisanim u nekoliko slojeva oko šupljina u koje ga sekrecijom izlučuju. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 120 Slika 36. Nebojeni poprečni ručni presek rizoma Arnica montana potopljenog u vodi i posmatranog u svetlom polju (A) i fluorescentnoj mikroskopiji (B-D) A – Lumen sekretornih šupljina ispunjen žutim kapima ulja. B-D – Uljane kapi vidljive kao žućkaste tačke sa slabom fuorescencijom pod UV (B) i intenzivna autofluorescencija pod filterima I3 (C) i N2.1. (D). Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) Upotrebom skenirajuće elektronske mikroskopije rizoma A. montana potvđeno je prisustvo velikih intercelulara (Slika 37A i B) koji služe ka mesto skladištenja ulja. Septa između šupljina isunjenih uljem su u nekim slučajevima nasilno prekinute porastom šupljina, što sjedinjuje susedne šupljine i povećava njihovu dužinu od otprilike 0,3 mm do 0,8 mm, ponekad i više. U lumenu šupljina, čak i na poprečnom preseku moguće je videti zaostale delove pokidanih septi (Slika 37C i D). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 121 Slika 37. Skenirajuće elektronske mikrografije poprečnih preseka rizoma A. montana A – primećuju se veliki subepidermalni sektretorni rezervoari u kori B – septa između dva intercelulara (obeleženo strelicom) C-D – zaostali delovi pokidane septe u lumenu šupljine (obeleženo strelicom) Transmisiona elektronska mikroskopija (TEM) TEM mikrografije epitelijalnih ćelija prikazuju gusto obojenu perifenu citoplazmu sa jedrom većim od okolnih ćelija i velikim brojem uljanih kapljica (Slika 38ABC). Diktiozomi sa njihovim sekretornim vezikulama su takođe vidljivi u epitelijalnim ćelijama (Slika 38D), jasno ukazujući na sintezu i sekreciju etarskog ulja. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 122 Slika 38. Transmisiona elektronska mikroskopija ćelija u sekterotnom regionu rizoma A. montana. A –Učestalost uljanih kapljica posmatrana u epitelijalnim ćelijama (E). Lumen šupljine (CL) B – Epitelijalna ćelija pokazuje elektron-gustu perifernu citoplazmu. Uljane kapljice (L) C – Detalj epitelijalne ćelije gde je prikazano jedro (N) i uljane kapljice (L) D - Detalj epitelijalne ćelije gde su prikazane sekretorne vezikule diktiozoma (obeleženo strelicama). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 123 6.4. Hemijska analiza droga Sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona Kvantifikacija ukupnih seskviterpenskih aktona u cvetnoj glavici arnike izvršena snimanjem ekstrakta tečnom hromatografijom na 225 nm. Karakteristični DAD hromatogram dat je na Slici 39, gde se može uočiti crveno obojeni pik internog standarda (santonina) i žuto obojeni pikovi koji po UV-spektru odgovaraju seskviterpenskim laktonima. Slika 39. HPLC hromatogram kvantitativnog određivanja sadržaja seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici A. montana Identifikacija seskviterpenskih laktona u ekstraktu cvetne glavice arnike urađena na osnovu kombinacije LC/MS tehnika čiji je karakteristični hromatogram prikazan na Slici 40. Slika 40. LC-MS hromatogram kvalitativnog određivanja sadržaja seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici A. montana Očitane vrednosti molekulskih masa i molekulske formule date su po retencionim vremenima u Tabeli 25. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 124 Tabela 25. LC-MS analiza seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici A. montana # RT Formula M M+H M+NH4 M+Na M+K 2M+H 2M+NH4 2M+Na g/mol g/mol g/mol g/mol g/mol g/mol g/mol g/mol 1 12.869 C19H24O5 332.1623 333.1694 350.1961 355.1518 371.1254 687.3136 2 15.017 C19H22O5 330.1467 331.1537 348.1806 678.3256 683.2819 3 16.605 C19H24O5 332.1623 333.1692 350.1962 355.1515 371.1254 682.3575 687.3132 4 18.803 C20H26O5 346.1779 347.1852 364.2116 369.1674 385.1426 715.3450 5 21.626 C20H24O5 344.1624 345.1698 362.1962 367.1527 383.1255 706.3590 711.3134 6 24.768 C20H26O5 346.1780 347.1852 364.2118 369.1670 385.1416 710.3903 715.3447 7 25.946 C20H26O5 346.1781 347.1854 364.2119 369.1670 715.3450 Na osnovu retencionih vremena i molekulskih masa, izvršena je identifikacija seskviterpenskih laktona prisutnih u ekstraktu cveta arnike, a dobijeni podaci zajedno sa strukturnim formulama su pregledno složeni u Tabeli 26. Tabela 26. Pregled spektara i strukturnih formula seskvitepenskih laktona u cvetnoj glavici A. montana SAN α-santonin Formula: C15H18O3 M=246.13 Rt=9.132 λmax= 242, 266(r) nm 1 dihidro- helenalin- metakrilat Formula: C19H24O5 M=332.16 Rt=13.275 λmax= 212 nm 2 helenalin- metakrilat Formula: C19H22O5 M=330.15 Rt=15.487 λmax= 212 nm Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 125 3 helenalin- izobutirat Formula: C19H24O5 M=332.16 Rt=17.079 λmax= 220 nm 4 dihidro- helenalin-tiglat Formula: C20H26O5 M=346.18 Rt=19.191 λmax= 222 nm 5 helenalin-tiglat Formula: C20H24O5 M=344.16 Rt=22.145 λmax= 220 nm 6 helenalin-2- metilbutriril Formula: C20H26O5 M=346.18 Rt=25.337 λmax= 218 nm 7 helenalin- izovalerat Formula: C20H26O5 M=346.18 Rt=26.748 λmax= 222 nm Sadržaj ukupnih seskviterpenskih aktona (DHHT) se u cvetnoj glavici arnike u 2009. godini kretao od 7,7 – 13,2 mg/g (Grafik 76). Iz prikazanog grafika se može Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 126 videti da su veći sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona imale varijante vegetativnog razmnožavanja (9,5 – 13,2 mg/g), dok su varijante generativnog razmnožavanja imale manji sadržaj DHHT (7,7 – 7,9 mg/g). Najveće prinose DHHT, u varijantama vegetativne propagacije, ostvarile su biljke iz mineralnog i kontrolnog bloka đubrenja. Grafik 76. Sadržaj DHHT u cvetnim glavicama arnike u 2009. godini U 2010. godini sadržaj DHHT u cvetnoj glavici arnike se kretao od 4.6 – 13,9 mg/g (Grafik 77). Najveći sadržaj DHHT imale su, kao i u prethodnoj godini, varijante vegetativne propagacije na prolećnom plotu sadnje. U toj varijanti se javljaju i razlike u prinosu đubrenih varijanti i kontrole, ali i između đubrenih varijanti. Tako su biljke iz bloka mineralnog đubriva, i kontrolne varijante, imale viši ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona od biljaka iz bloka đubrenog stajskim đubrivom. Najmanje prinosne varijante u sadržaju DHHT bile su đubrene varijante generativnog razmnožavanja na prolećnom plotu sadnje, kao i varijanta generativnog razmnožavanja na jesenjem plotu sadnje u bloku mineralnog đubrenja. Preostale varijante na ogledu se međusobno nisu statistički značajno razlikovale. Na grafiku se takođe vidi da su sve varijante u svojim aritmetičkim sredinama zadovoljile minimum kriterijuma Evropske Farmakopeje (PhEur 6.0), ali isto tako je uočljivo da su vrednosti ukupnog sadržaja seskviterpenskih laktona u pojedinim ponavljanjima generativno razmnoženih biljaka u Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 127 blokovima mineralnog đubrenja, prolećnjeg i jesenjeg plota sadnje (PMG i JMG), bile ispod propisanog farmakopejskog minimuma. Grafik 77. Sadržaj DHHT u cvetnim glavicama arnike u 2010. godini Iako je, u 2010. godini, faktor vrste đubrenja uticao na prinos DHHT u varijantama vegetativnog razmnožavanja na prolećnom plotu sadnje, ukupni uticaj ovog faktora na sadržaj DHHT u cvetnoj glavici arnike na ogledu nije bio značajan ni u jednoj posmatrranoj godini (Grafik 78). Mogućnost prihvatanja nulte hipoteze je ocenjena veoma visokim verovatnoćama: p = 0.97, u 2009., i p = 0.95, u 2010. godini. Grafik 78. Uticaj faktora đubrenja na sadržaj DHHT u cvetnim glavicama arnike Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 128 Posmatrajući prinose ukupnih seskviterpenskih laktona na prolećnom plotu sadnje, može se reći da nije bilo statističi značajnih razlika u sadržaju DHHT između 2009. i 2010. godine (Grafik 79A). Faktor vremena zasnivanja je uticao na variranje u sadržaju seskviterpenskih laktona, pa su biljke sađene na proleće u proseku imale veći sadržaj ( x = 8,5 mg/g) u odnosu na biljke sa jesenjeg plota sadnje ( x = 5,7 mg/g) (Grafik 19B). Grafik 79. Uticaj starenja (A) i vremena zasnivanja ogleda (B) na sadrzaj DHHT u cvetnoj glavici arnike Faktor vrste sadnica uticao je na sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici samo na prolećnom plotu sadnje (Grafik 80). Vegetativno razmnožene biljke na prolećnom plotu sadnje imale su u proseku veći sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici ( x = 11,7 mg/g, u 2009., i x = 11,8 mg/g, 2010. godini) od generativno razmnoženih varijanti na istom plotu ( x = 7,8 mg/g, u 2009., i x = 5,1 mg/g, 2010. godini). Na jesenjem plotu sadnje nije bilo statistički značajnih razlika u pogledu sadržaja DHHT između varijanti različitog tipa razmnožavanja. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 129 Grafik 80. Uticaj vrste sadnica na ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici arnike Odnos između prinosa cvetne glavice i sadržaja DHHT u njoj je u obe godine bio statistički značajno negativno korelisan (r = -0,52 u 2009. i r = -0,78 u 2010. godini) (Grafik 81). To praktično znači da su biljke sa najnižim prinosima cvetne glavice u isto vreme imale i najveći sadržaj DHHT i obrnuto. Grafik 81. Odnos prinosa cvetne glavice i sadržaja DHHT Sadržaj DHHT u cvetnim glavicama je takođe ispoljio u obe posmatrane godine, statistički značaje negativne korelacione odnose sa svim parametrima koji su uticali na prinos cvetne glavice (komponentama prinosa) (Tabela 27), što je i bilo za očekivati obzirom visoke vrednosti korelacionih koeficijenata ovih parametara sa parametrom prinosa cvetne glavice. Odnos sadržaja DHHT sa prečnikom cvetne glavice je u prvoj posmatranoj godini ocenjen značajnom jakom pozitivnom korelacijom (r = 0.81), ali se Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 130 ista gubi u narednoj godini, što pokazuje da je ova veza nestabilna i nepogodna za izvođenje zaključka. Tabela 27. Odnosi sadržaja DHHT u cvetnoj glavici sa ostalim osobinama Sadržaj DHHT 2009 2010 [mg/g] [mg/g] Prečnik rozete [cm] -.5492 -.7331 p=.005 p=.000 Visina cvetnog izdanka [cm] -.5851 -.7132 p=.003 p=.000 Broj cvetnih izdanaka -.4761 -.6996 p=.019 p=.000 Broj cvetnih glavica po biljci -.5214 -.5541 p=.009 p=.000 Prečnik cvetne glavice .8158 .1200 p=.000 p=.416 Broj rozeta -.3898 -.2936 p=.060 p=.043 Prinos rizoma -.2096 -.1271 p=.326 p=.389 Prinos korena .0747 -.0578 p=.729 p=.696 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 131 Sadržaj dominantnih fenolnih komponenti HPLC analiza Cvetna glavica arnike je ekstrahovana smešom rastvarača metanol/aceton/voda (3:1:1) i analiziran je HPLC metodom, čiji je hromatogram prikazan na Slici 41. Kao dominantna jedinjenja posmatrane su komponente koje su na hromatogramu po visini pika prelazile 50 mAU. Na osnovu karakterističnih UV spektara, jedinjenja su preliminarno grupisana u dve grupe: fenolne kiseline (P1-P3) i flavonoidi (F1 i F2). Slika 41. HPLC DAD hromatogram ekstrakta cveta arnike (λ = 350 nm) Identifikacija dominantnih fenolnih komponenti Identifikacija dominantnih fenolnih komponenti izvršena je putem HPLC i LC- MS hromatografije poređenjem retencionih vremena, UV-spektara i molekulskih masa odabranih komponenti sa literaturnim podacima. Na Slici 42. predstavljen je LC-MS hromatogram na kome su obeleženi pikovi čija je identifikacija potvđena detaljima koji su predstavljeni u Tabeli 28. Slika 42. LC-ESI TOF MS hromatogram fenolnog kompleksa ekstrakta cveta arnike Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 132 Tabela 28. HPLC i LC-MS parametri odabranih jedinjenja # Rt-DAD UV spektar Rt-ESI ToF Molekulska formula Masa komponente Naziv komponente (min) λmax (nm) (min) (g mol−1) P1 8,78 220; 242; 308r; 328 7,72 C16H18O9 354.31 hlorogenska kiselina P2 10.21 228; 256; 298; 344 9,02 C9H6O4 180.16 6,7- dihidroksi kumarin * F1 28,93 256; 266r; 308r; 354 22,67 C21H20O12 464.09 kvercetin-3- O-glc P3 37.68 218; 242; 310r; 330 30,78 C25H24O12 516.45 3,5- dikafeoilhina kiselina F2 40,44 250r; 266; 304r; 348 32,24 C21H20O11 448.10 kempferol-3- O-glc * - označava tentativnu identifikaciju Izolovanje čistih flavonoidnih jedinjenja (F1 i F2) Metanolni ekstrakt je razdvojen na više frakcija hromatografijom na koloni silika gela (260 x 30 mm) (Metode poglevlje 3.3.2.4.2.1.). Frakcije 83-90 su spojene i semipreparativnom HPLC hromatografijom izolovana su dva jedinjenja: kvercetin 3-O- β-D-glukozid (izokvercitrin) (F1) i kempferol 3-O-β-D-glukozid (F2) (astragalin). Identifikacija izolovanih jedinjenja izvršena je na osnovu retencionih vremena, UV spektara, masenih spektara i 1H-NMR spektara. Kvercetin-3-O-β-D-glukozid (F1) Na Slici 43 prikazan je UV spektar izolovanog jedinjenja koje je na HPLC-DAD hromatogramu izlazilo na 25,9 minutu. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 133 Slika 43. UV spektar (λ = 350 nm) kvercetin-3-O-β-D-glukozida (F1) u MeOH (Rt = 25.9 min) Identifikacija izolovanog F1 jedinjenja izvršena je HPLC i LC/MS analizom, a dobijeni podaci su prezentovani u Tabeli 28. Struktura izolovanog jedinjenja dodatno je potvrđena NMR analizom čiji je 1H NMR spektar predstavljen na Slici 44. zajedno sa strukturnom formulom jedinjenja. Slika 44. 1H NMR (CD3OD) spektar kvercetin-3-O-β-D-glukozida (F1) Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 134 Na Slici 45. prikazan je UV spektar izolovanog jedinjenja koje je na HPLC- DAD hromatogramu izlazilo na 36,6 minutu. Slika 45. UV spektar (λ = 350 nm) kempferol-3-O-β-D-glukozida (F2) u MeOH (Rt = 36.6 min) Identifikacija izolovanog F2 jedinjenja izvršena je HPLC i LC/MS analizom, a dobijeni podaci su prezentovani u Tabeli 28. Struktura izolovanog jedinjenja dodatno je potvrđena NMR analizom čiji je 1H NMR spektar predstavljen na Slici 46. zajedno sa strukturnom formulom jedinjenja. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 135 Slika 46. 1H NMR (CD3OD) spektar kempferol-3-O-β-D-glukozida (F2) Kvantifikacija dominantnih fenolnih komponenti Kvantifikacija fenolnih jedinjenja u cvetnoj glavici arnike je izvršena HPLC tehnikom, metodom eksternih standarda, i sadržaj tri odabrana jedinjenja: hlorogenske kiseline (P1), kvercetin-3-O-β-D-glukozida (F1) i kempferol-3-O-β-D-glukozida (F2) je prikazan u Tabeli 29. Sadržaj hlorogenske kiseline u cvetnoj glavici arnike se u 2009. godini kretao od 3,1 – 6.0 mg/g, gde su varijante iz generativne propagacije prosečno imale veći sadržaj od varijanti vegetativnog razmnožavanja. Đubrenje je, u ovoj godini, imalo uticaj na sadržaj hlorogenske kiseline samo u varijantama vegetativne propagacije, gde su se vrednosti đubrenih varijanti statistički značajno razlikovale od kontrole. U 2010. godini sadržaj hlorogenske kiseline se kretao od 1,9 – 6,6 mg/g, gde su se vrednosti varijanti u blokovima đubrenja stajnjakom na oba plota sadnje statistički značajno razlikovale od svih ostalih varijanti. Sadržaj kvercetin-3-O-β-D-glukozida se u 2009. godini kretao od 8,4 – 13,9 mg/g, gde su kao i u slučaju sadržaja hlorogenske kiseline, generativno razmnožene varijante imale statistički značajno viši sadržaj od varijanti vegetativne propagacije. Uticaj đubrenja na variranje sadržaja ovog jedinjenja je bilo statistički značajno jedino u slučaju vegetativno razmnoženih biljaka u bloku đubrenja stajskim đubrivom. U 2010. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 136 godini sadržaj kvercetin-3-O-β-D-glukozida se kretao od 7,8 – 12,53 mg/g. Kao i u slučaju sadržaja hlorogenske kiseline, najprinosnije u sadržaju izokvercitrina su takođe bile varijante generativne propagacije u blokovima đubrenja stajnjakom na oba plota sadnje. Sadržaj kempferol-3-O-β-D-glukozida u 2009. godini se kretao od 2,1 – 4,7 mg/g, gde se nije mogla uočiti neka pravilnost u statističkoj značajnosti đubrenih varijanti, obzirom da su kod generativno razmnoženih varijanti najprinosnije biljke u ovom jedinjenju bile sa kontrolne varijante đubrenja, dok su kod vegetativno razmnoženih biljaka biljke sa bloka đubrenog stajskim đubrivom imale stistički značajno veći sadržaj astragalina u odnosu na biljke sa blokova mineralnog đubrenja i kontrole. U 2010. godini sadržaj astragalina se kretao od 2,1 – 4,5 mg/g, gde se po niskom sadržaju ovog jedinjenja statistički značajno izdvojila jedino varijanta vegetativnog razmnožavanja u bloku đubrenja stajskim đubrivom na jesenjem plotu sadnje. Sve ostale varijante na ogledu u pogledu sadržaja astragalina nisu se statistički značajno razlikovale. Tabela 29. Sadrzaj dominantnih fenolnih komponenti u cvetnoj glavici A. montana hlorogenska kiselina kvercetin-3-O-β-D-glukozid kempferol-3-O-β-D-glukozid [mg/g] a [mg/g] [mg/g] 2009 POG 6.00 ± 0.77 a 12.65 ± 0.70 a 2.57 ± 0.24 cd PMG 5.60 ± 0.40 a 13.91 ± 0.33 a 3.45 ± 1.05 bc PKG 5.77 ± 0.26 a 13.66 ± 0.57 a 4.74 ± 0.34 a POV 4.24 ± 0.46 b 10.84 ± 0.65 b 4.05 ± 0.46 ab PMV 3.76 ± 0.42 b 9.24 ± 0.80 c 2.61 ± 0.65 cd PKV 3.08 ± 0.24 c 8.37 ± 0.91 c 2.07 ± 0.20 d 2010 POG 6.57 ± 2.18 a 12.53 ± 2.04 a 3.23 ± 1.21 ab PMG 2.57 ± 0.10 b 10.08 ± 0.79 b-f 3.29 ± 0.65 ab PKG 2.86 ± 0.59 b 11.10 ± 1.09 a-d 3.89 ± 1.08 a POV 2.54 ± 0.36 b 9.85 ± 0.84 c-f 3.54 ± 0.40 ab PMV 2.68 ± 0.37 b 8.07 ± 0.58 ef 3.86 ± 0.63 a PKV 2.85 ± 0.64 b 8.17 ± 0.43 ef 3.16 ± 0.28 ab JOG 5.48 ± 0.95 a 12.22 ± 1.58 ab 3.66 ± 0.31 ab JMG 2.85 ± 1.01 b 10.29 ± 1.46 a-e 3.89 ± 0.73 a JKG 2.82 ± 0.62 b 9.92 ± 0.86 b-f 4.03 ± 0.87 a JOV 1.87 ± 0.54 b 7.76 ± 1.52 f 2.06 ± 1.09 b JMV 3.04 ± 0.95 b 11.38 ± 1.89 abc 4.46 ± 1.07 a JKV 2.05 ± 0.47 b 8.85 ± 0.09 def 3.43 ± 1.51 ab a Različita slova označavaju statističku značajnost Dankanovog testa na nivou p<0.05 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 137 Na grafiku 82. prikazan je uticaj faktora vrste đubrenja na sadržaj hlorogenske kiseline u cvetnoj glavici arnike. Uticaj ovog faktora je bio statistički veoma značajan samo u 2010. godini, gde su varijante u bloku đubrenja stajnjakom imale viši sadržaj od biljaka sa ostalih blokova đubrenja. Grafik 82. Uticaj đubrenja na sadržaj hlorogenske kiseline u cvetnoj glavici arnike Na Grafiku 83. prikazan je uticaj faktora vrste đubrenja na sadržaj kvercetin-3- O-β-D-glukozida u cvetnoj glavici arnike. Iz prikazane analize se može zaključiti da uticaj ovog faktora ni u jednoj posmatranoj godini nije bio statistički značajan, odnosno da se hipoteza o jednakosti aritmetičkih sredina osnovnih skupova blokova đubrenja prihvata sa verovatnoćama p = 0.80, u 2009., i p = 0.23, u 2010. godini. Grafik 83. Uticaj đubrenja na sadržaj kvercetin-3-O-β-D-glukozida u cvetnoj glavici arnike Na Grafiku 84. prikazan je uticaj faktora vrste đubrenja na kempferol-3-O-β-D- glukozida u cvetnoj glavici arnike. Uticaj ovog faktora na variranje sadržaja posmatranog jedinjenja je bio statistički značajan samo u drugoj posmatranoj godini, ali Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 138 ne može izvući kvalitetan zaključak o uzročno-posledičnoj vezi đubrenja i ovog svojstva, obzirom da su biljke đubrenih blokova, po sadržaju kempferol-3-O-β-D- glukozida, ni u jednoj godini nisu statistički značajno prevazilazile biljke iz kontrolnih varijanti, niti su kontrolne varijante bile prinosnije od đubrenih. Grafik 84. Uticaj đubrenja na sadržaj kempferol-3-O-β-D-glukozida u cvetnoj glavici arnike U 2009. godini biljke arnike na ogledu su u proseku imale statistički veoma značajno viši sadržaj hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-β-D-glukozida, dok u slučaju sadržaja kempferol-3-O-β-D-glukozida nije bilo statistički značajnih razlika između posmatranih godina (Grafik 85). Grafik 85. Uticaj starenja na sadržaj hlorogenske kiseline (A), kvercetin-3-O-β-D- glukozida (B) i kempferol-3-O-β-D-glukozida (C) u cvetnoj glavici arnike na prolećnom plotu sadnje Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 139 Faktor vremena sadnje nije statistički značajno uticao na sadržaj odabranih fenolnih jedinjenja (Grafik 86 A, B i C). Grafik 86. Uticaj vremena sadnje na sadržaj hlorogenske kiseline (A), kvercetin-3-O-β- D-glukozida (B) i kempferol-3-O-β-D-glukozida (C) u cvetnoj glavici arnike Biljke iz generativne propagacije su, u obe posmatrane godine i na oba plota sadnje, imale statistički značajno veći prinos hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-β-D- glukozida u odnosu na biljke razmnožene deljenjem bokora (Tabela 30). Variranje sadržaja kempferol-3-O-β-D-glukozida u cvetnim glavicama arnike nije bilo statistički značajno uslovljeno tipom sadnica. D Tabela 30. Uticaj tipa sadnica na sadržaj odabranih fenolnih jedinjenja Proleće Jesen 2009 2010 2010 Generativno 5.79 ** 4.00 * 3.71 ** Hlorogenska kiselina Vegetativno 3.69 2.69 2.32 Generativno 13.41 ** 11.24 ** 10.81 * Kvercetin-3-O-β-D-glukozid Vegetativno 9.48 8.69 9.33 Generativno 3.59 n.s. 3.47 n.s. 3.86 n.s. Kempferol-3-O-β-D-glukozid Vegetativno 2.91 3.52 3.32 U prvoj godini (2009) hlorogenska kiselina i kvercetin-3-O-β-D-glukozid ostvaruju korelacione odnose sa većinom posmatranih paramatara, ali u sledećoj godini (2010) jedini jak korelacioni odnos (r >0.5) je odnos između ova dva jedinjenja (Grafik Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 140 87). Kempferol-3-O-β-D-glukozid nije ostvarivao značajne jake korelacione veze sa ostalim posmatranim parametrima. Grafik 87. Odnos između sadržaja hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-β-D- glukozida u cvetnoj glavici arnike Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 141 Tabela 31. Pregled uticaja faktora na variranje hemijskih parametara i interakcija između fakotra Izvor varijacije DHHT Hlorogenska kiselina Kvervetin-3-O-glukozid Kemferol-3-O-glukozid 2009 p p p p Vrsta sadnica (B) 0.0000 0.0000 0.0000 0.0021 Vrsta djubrenja (C) 0.0535 0.0055 0.0435 0.2645 B x C 0.0293 0.0418 0.0000 0.0000 2010 Vreme sadnje (A) 0.0000 0.1476 0.7311 0.6829 Vrsta sadnica (B) 0.0000 0.0000 0.0000 0.2807 Vrsta djubrenja (C) 0.0789 0.0000 0.0235 0.0284 A x B 0.0000 0.8484 0.0943 0.1942 A x C 0.0317 0.0963 0.0014 0.1272 B x C 0.0000 0.0000 0.0009 0.0498 A x B x C 0.0138 0.5386 0.0069 0.1260 a p vrednosti u tabeli predstavljaju verovatnoće prihvatanja nulte hipoteze Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 142 Hemijski profili etarskih ulja korena i rizoma Izdestilisana etarska ulja iz korena i rizoma arnike analizirana su tehnikom gasne hromatografije (GC), a identifikacija komponenti ulja tehnikom gasno-masene hromatografije (GC/MS). Karakterističan hromatogram etarskog ulja korena predstavljen je na Slici 47., a karakterističan hromatogram etarskog ulja rizoma predstavljen je na Slici 48. Slika 47. Karakteristični hromatogram etarskog ulja korena A. montana Slika 48. Karakteristični hromatogram etarskog ulja rizoma A. montana U Tabeli 32. dat je kompletan pregled hemijskog sastava etarskih ulja korena i rizoma odakle se vidi da su glavne komponente u dve uzastopne godine bili aromatični ugljovodonici, kao što su 2,5-dimetoksi-p-cimen (37,9 – 40,6% i 28,9 – 30,0%, respktivno), timol metil ethar (9,6 – 10,6% i 26,1 – 27,1%, respektivno), p- metoksiheptanofenon (6,1 – 8,9% i 7,0 – 7,5%, respektivno) i 2,6-diizopropilanisol (12,8 – 14,1% i 8,9 – 10,4 %, respektivno) (Tabela 30). Seskviterpenska frakcija bila je prisutna u manjoj meri (11,1 – 15,7% i 7,1 – 8,2%, respektivno) i mogu se primetiti kvalitativne razlike. Na kraju druge vegetacije rizom je sadržao trans-kariofillen dok koren nije. Na kraju treće vegetacije rizom je sintetisao germakren D, dok je koren sintetisao trans-kariofilen. Takođe se može primetiti da se ova dva etarska ulja razlikuju Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 143 u sadržaju pojedinih komponenti. Koren je sadržao veću količinu 2,5-dimetoksi-p- cimena, 2,6-diizopropilanisola, 7-epi-silfiperfol-5-ena i α-isokomena, dok je rizom veće količine timol metil etra, p-diizopropil-benzena, pinchoten acetata, p- metoksheptanofenona, p-cimena i α-felandrena. Tabela 32. Hemijski sastav (%m/m) etraskog ulja iz korena i tizoma arnike Koren Rizom 2009 2010 2009 2010 # Komponenta RIa % % % % 1 kamfen 938 0.30 ± 0.09 0.21 ± 0.05 0.22 ± 0.07 0.29 ± 0.10 2 α-felandren 996 0.62 ± 0.14 0.61 ± 0.19 1.34 ± 0.31 1.12 ± 0.53 3 p-cimen 1017 0.72 ± 0.21 1.10 ± 0.33 1.75 ± 0.41 1.72 ± 1.08 4 limonene 1020 0.51 ± 0.11 0.38 ± 0.07 0.56 ± 0.09 0.58 ± 0.15 5 p-menta-2,4(8)-dien 1081 0.07 ± 0.02 0.10 ± 0.02 0.13 ± 0.03 0.11 ± 0.03 6 α-terpineol 1186 0.09 ± 0.02 0.13 ± 0.03 0.09 ± 0.03 0.13 ± 0.02 7 timol, metil etar 1229 10.57 ± 3.92 9.64 ± 2.90 27.16 ± 6.72 26.10 ± 8.83 8 karvakrol, metil ether 1236 0.38 ± 0.07 0.35 ± 0.05 0.44 ± 0.02 0.47 ± 0.10 9 p-diizopropil-benzen 1242 1.62 ± 0.73 2.02 ± 0.76 3.96 ± 1.00 5.73 ± 1.93 10 bornil acetat 1277 0.32 ± 0.10 0.33 ± 0.09 0.36 ± 0.35 0.05 ± 0.02 11 timol 1293 0.28 ± 0.11 0.59 ± 0.18 0.25 ± 0.23 0.19 ± 0.07 12 silfiperfol-5-en 1314 0.76 ± 0.31 1.80 ± 0.42 0.19 ± 0.06 0.39 ± 0.18 13 7-epi-silfiperfol-5-en 1332 2.33 ± 0.92 0.15 ± 0.05 0.63 ± 0.16 0.16 ± 0.04 14 silfiperfol-6-en 1365 0.14 ± 0.06 0.39 ± 0.11 0.21 ± 0.09 0.56 ± 0.16 15 modhef-2-en 1369 0.66 ± 0.27 0.03 ± 0.00 0.18 ± 0.06 0.11 ± 0.04 16 α-izokomen 1376 7.57 ± 3.33 5.17 ± 1.21 1.60 ± 0.45 1.27 ± 0.40 17 β-izokomen 1394 1.14 ± 0.44 0.86 ± 0.19 0.29 ± 0.07 0.23 ± 0.07 18 izobornil izobutanoat 1406 0.96 ± 0.24 1.12 ± 0.21 0.74 ± 0.33 1.12 ± 0.30 19 trans-kariofilen 1408 - 1.07 ± 0.50 3.39 ± 2.47 1.11 ± 0.15 20 2,5-dimetoksi-p-cimene 1417 37.94 ± 3.80 40.65 ± 3.80 28.89 ± 5.15 29.99 ± 5.89 21 α-trans-bergamoten 1426 0.50 ± 0.35 0.50 ± 0.23 0.42 ± 0.31 0.40 ± 0.17 22 2,6-diizopropilanisol 1438 12.76 ± 1.73 14.1 ± 1.18 8.88 ± 1.89 10.38 ± 2.32 23 cis-β-farnesen 1448 0.44 ± 0.37 0.29 ± 0.03 0.42 ± 0.08 0.41 ± 0.13 24 germakren D 1471 1.17 ± 0.00 0.02 ± 0.01 - 1.42 ± 1.89 25 pinchoten acetat* 1473 2.35 ± 0.51 2.51 ± 0.29 4.24 ± 0.86 4.73 ± 2.33 26 p-metoksiheptanofenon 1476 6.97 ± 0.93 7.50 ± 0.77 8.90 ± 1.26 6.12 ± 4.25 27 izobornil 2-metil butanoat 1496 0.18 ± 0.05 0.16 ± 0.03 0.27 ± 0.10 0.10 ± 0.10 28 izobornil izovalerat 1506 0.13 ± 0.03 0.23 ± 0.05 0.10 ± 0.04 0.37 ± 0.23 29 β-seskvifelandren 1514 0.62 ± 0.31 0.62 ± 0.33 0.27 ± 0.14 0.13 ± 0.05 30 dimetil-jonon 1571 0.30 ± 0.08 0.12 ± 0.02 0.11 ± 0.03 0.30 ± 0.09 31 zieron 1578 0.24 ± 0.08 0.04 ± 0.01 0.63 ± 0.20 0.67 ± 0.33 32 n.i. 1633 0.07 ± 0.00 0.09 ± 0.02 0.13 ± 0.04 0.18 ± 0.06 33 n.i. 1677 0.99 ± 0.30 2.04 ± 0.64 0.59 ± 0.11 0.42 ± 0.18 34 n.i. 1790 0.36 ± 0.09 0.27 ± 0.09 0.98 ± 0.24 0.44 ± 0.21 35 3-(3-hidroksi-4-metil-fenil)-3,4,4- trimetil-ciklopentanon 1989 0.84 ± 0.18 1.13 ± 0.24 0.92 ± 0.39 0.43 ± 0.44 36 n.i. 1993 0.85 ± 0.26 0.55 ± 0.47 0.33 ± 0.05 0.50 ± 0.54 37 2-metil-propionska kiselina-2-[3- [(acetiloksi)metil]oksiranil]-5- metilfenil estar 2018 4.22 ± 1.47 2.15 ± 2.89 1.87 ± 0.54 1.04 ± 0.67 38 n.i. 2106 1.17 ± 0.58 0.98 ± 0.98 0.88 ± 0.43 0.56 ± 1.05 Procenat identifikovanih 96.60% 96.07% 97.16% 97.91% n.i. – nije identifikovano * - tentativna identifikacija a Retenciona vremena odgovaraju n-alkanima na HP-% kapilarnoj koloni Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 144 Uprosečene vrednosti sadržaja identifikovanih jedinjenja etarskih ulja korena i rizoma arnike za obe posmatrane godine prikazani su na Slici 48. kao normalizovani hromatogrami sa imenima i strukturnim formulama glavnih komponenti (>4%). Glavne komponente ulja 1 timol, metil etar 2 p-diizopropil-benzen 3 α-izokomen 4 trans-kariofilen 5 2,5-dimetoksi-p-cimen 6 2,6-diizopropilanisol 7 pinchoten acetat 8 p-metoksiheptanofenon 9 2-metil-propionska kiselina Slika 49. Normalizovani hromatogrami sa strukturnim formulama glavnih komponenti etarskih ulja korena i rizoma arnike. Sa prikazanih hromatograma (Slike 47 i 48), iz Tabele 30 i sa normalizovanih hromatograma (Slika 49), može se zaključiti da su hemijski profili etarskih ulja korena i rizoma arnike veoma slični, sa izuzetkom sadržaja timol-metil estra, koji se u ulju rizoma pojavljavljuje kao druga dominantna komponenta, dok je u korenu jasno izražena dominacija samo 2,5-dimetoksi-p-cimena. U oba ulja najzastupljenija je bila frakcija aromatičnih ugljovodonika, dok su seskviterpeni i monoterpeni imali manji udeo (Grafik 92). Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 145 0 20 40 60 80 100 Koren Rizom % m /m MT + OMT ST + OST AU+ OAU Grafik 92. Glavne grupe komponenti zastupljene u korenu i rizomu A. montana MT – monoterpeni, OMT – oksigenovani monoterpeni; ST – sesvkiterpeni, OST – oksigenovani seskviterpeni; AU – aromatični ugljovodonici, OAU – oksigenovani aromatični ugljovodonici Rezultati klasifikacije etarskih ulja korena i rizoma arnike po sličnosti predstavljeni su u dendrogramu na Grafiku 93. Iz prikazane klasifikacije se može videti da su se sve varijante etarskog ulja korena, izuzev varijante generativnog razmnožavanja u bloku mineralnog đubrenja na jesenjem plotu sadnje, grupisale u jednu grupu na udaljenosti ispod 8 jedinica rastojanja, dok su se sve varijante eratskih ulja rizoma, takođe, grupisale u jednu grupu na oko 7 jedinica rastojanja, izuzev vegetativno razmnožene varijante u kontrolnom bloku đubrenja na jesenjem plotu sadnje. Single Linkage Euclidean distances 0 2 4 6 8 10 12 Linkage Distance JKG_R JMV_R JMG_R JOG_R JOV_R PKG_R PMG_R POG_R JMG_K JKV_R JKV_K PKG_K JOG_K JOV_K JKG_K JMV_K PMG_K POG_K Grafik 93. Euklidova rastojanja gajenih varijanti arnike po sličnosti hemijskog sastava etarskog ulja Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 146 6.5. Međusobni odnosi testiranih karakteristika Iz korelacione matrice svih posmatranih osobina u 2009. godini ekstrahovano je tri faktora* metodom glavnih komponenti. Broj značajnih faktora određen je kriterijumom eigenvalues većih od 1 (Grafik 88). Grafik 88. Eigenvalues u 2009. godini (Scree-plot) * Termin „FAKTOR“ koji se koristi u faktorskoj analizi predstavlja veštačku promenljivu koja objašnjava međuzavisnost većeg broja promenljivih i nema veze sa terminom „Faktor“ koji se koristi u ANOVA. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 147 Iz faktorskih opterećenja posmatranih osobina arnike u 2009. godini koja su data u Tabeli 33. može se zaključiti da su se posmatrani parametri grupisali po: komponentama prinosa cvetne glavice - Faktor 1, hemijske karakteristike cvetne glavice - Faktor 2 i grupa podzemnih organa - Faktor 3. Tabela 33. Faktorska opterećenja posmatranih osobina u 2009. godini. Opterećenja na faktorua Faktor Faktor Faktor 2009 1 2 3 Prečnik rozete 0.9190 0.1946 0.1831 Visina cvetnog izdanka 0.8732 0.2999 0.0865 Broj cvetnih izdanaka 0.9142 0.1164 0.2706 Broj cvetnih glavica po biljci 0.9400 0.1164 0.2370 Prečnik cvetne glavice -0.5686 -0.6394 0.1890 Prinos cvetne glavice 0.9326 0.1723 0.2092 Broj sek. rozeta 0.6385 0.2738 0.5013 Prinos rizoma 0.4409 0.0989 0.8703 Prinos korena 0.0548 -0.1835 0.8913 Sadržaj DHHT -0.4627 -0.7462 0.0695 Hlorogenska kiselina 0.6627 0.6494 0.0510 Kvercetin-3-O-glc 0.5733 0.7885 0.0398 Kempferol-3-O-glc -0.2247 0.9146 0.0338 a crveno su markirana opterećenja >0.70 Procenat ukupne varijanse koji je objašnjen ekstrahovanim faktorima u 2009. godini zajedno sa eigenvalues dat je u Tabeli 34., odakle se može videti da Faktor 1 nosi najveću informaciju i da objašnjava preko 60% ukupne varijanse, Faktor 2 objašnjava oko 18% varijanse, dok Faktor 3 objašnjava oko 9% ukupne varijanse. Kumulativno, prva dva faktora objašnjavaju preko 78% ukupne varijanse, a sva tri faktora zajedno preko 87% ukupne varijanse. Tabela 34. Eigenvalues faktora u 2009. godini i procenat varijanse koji objašnjavaju Faktor Eigenvalues % Ukupne objašnjene varijanse Kumulativni eigenvalues % Kumulativno objašnjene varijanse 1 7.8576 60.4433 7.8576 60.4433 2 2.3793 18.3019 10.2369 78.7452 3 1.1321 8.7088 11.3690 87.4541 Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 148 Na Grafiku 89. predstavljena su faktorska opterećenja posmatranih osobina u odnosu na Faktor 1 i Faktor 2 koji nose najveću informaciju pojašnjanja ukupne varijanse. Na Grafiku , kao i u Tabeli 33, se može videti da su se osobine koje su usko vezane za prinos cvetne glavice (komponente prinosa) značajno korelisane (faktorska opterećenja >0,7) sa Faktorom 1, dok su hemijske karakteristike korelisane sa Faktorom 2 (fenolna jedinjanja pozitivno, a sadržaj DHHT negativno). Prinos korena i rizoma značajno su korelisani sa Faktorom 3, ali na ovom grafiku gravitiraju sredini koordinatnog sistema, što ukazuje na slabe veze ova dva parametra sa prezentovanim faktorima. Redukcijom podataka možemo zaključiti da su na prinos cvetne glavice u 2009. godini najviše uticale: visina cvetnog izdanka, prečnik rozete, broj cvetnih glavica po biljci i broj cvetnih izdanaka. Takođe se može zaključiti da je sadržaj fenolnih jedinjenja negativno korelisan sa sadržajem ukupnih seskviterpenskih laktona (DHHT). Grafik 89. Faktorska opterećenja za prva dva faktora (>78% objašnjene ukupne varijanse) Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 149 Iz korelacione matrice svih posmatranih osobina u 2010. godini ekstrahovano je četiri faktora metodom glavnih komponenti. Broj značajnih faktora određen je kriterijumom eigenvalues većih od 1 (Grafik 90). Grafik 90. Vrednosti latentnih korenova u 2010. godini (Scree-plot) Kao i u prethodnoj godini, iz faktorskih opterećenja posmatranih osobina arnike u 2010. godini (Tabela 35) može se zaključiti da su se posmatrani parametri grupisali po: komponentama prinosa cvetne glavice (ovaj put zajedno sa negativno korelisanim sadržajem DHHT) - Faktor 1, hemijske karakteristike cvetne glavice (samo fenolna jedinjenja) - Faktor 2, grupa podzemnih organa - Faktor 3 i ostale osobine – Faktor 4. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 150 Tabela 35. Faktorska opterećenja posmatranih osobina u 2010. godini. Opterećenja na faktorua Faktor Faktor Faktor Faktor 2010 1 2 3 4 Prečnik rozete 0.9167 0.1363 0.0199 0.0883 Visina cvetnog izdanka 0.8970 0.2465 -0.0140 0.0157 Broj cvetnih izdanaka 0.9056 -0.0577 0.0657 0.0710 Broj cvetnih glavica po biljci 0.8579 -0.0664 -0.2647 -0.1790 Prečnik cvetne glavice 0.0861 0.0051 0.0007 -0.9166 Prinos cvetne glavice 0.9465 0.0759 -0.0920 0.0060 Broj sek. rozeta 0.2816 -0.2090 0.2078 0.6814 Prinos rizoma 0.0293 0.0109 0.8816 0.1698 Prinos korena -0.1349 0.1163 0.7978 0.0099 Sadržaj DHHT -0.8239 -0.0803 -0.1407 -0.2238 Hlorogenska kiselina 0.1412 0.7255 0.4233 -0.1181 Kvercetin-3-O-glc 0.2958 0.8431 0.2501 -0.0028 Kempferol-3-O-glc -0.0953 0.8010 -0.2991 -0.1043 a crveno su markirana su opterećenja >0.7 Procenat ukupne varijanse koji je objašnjen ekstrahovanim faktorima u 2010. godini zajedno sa vrednostima latentnih korenova dat je u Tabeli 36., odakle se može videti da Faktor 1 nosi najveću informaciju i da objašnjava oko 40% ukupne varijanse, Faktor 2 objašnjava oko 17%, Faktor 3 oko 15%, Faktor 4 oko 8% ukupne varijanse. Kumulativno, prva dva faktora objašnjavaju preko 56% ukupne varijanse, a sva četiri faktora zajedno skoro 80% ukupne varijanse. Tabela 36. Eigenvalues faktora u 2010. godini i procenat varijanse koji objašnjavaju Faktor Eigenvalues % Total objašnjene varijanse Kumulativni eigenvalues % Kumulativno objašnjene varijanse 1 5.1261 39.4313 5.1261 39.4313 2 2.2566 17.3586 7.3827 56.7900 3 1.9844 15.2645 9.3671 72.0544 4 1.0113 7.7793 10.3784 79.8337 Grafik 15. predstavlja su faktorska opterećenja posmatranih osobina u 2010 godini u odnosu na dva faktora koji nose najveću informaciju pojašnjanja ukupne varijanse (preko 56%). Na grafiku se može videti da su osobine koje su usko vezane za prinos cvetne glavice (komponente prinosa) značajno pozitivno korelisane sa Faktorom 1, ali da je sa istim faktorom sadržaj DHHT negativno korelisan. Ostale hemijske Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 151 karakteristike (fenolna jedinjenja) su pozitivno korelisane sa Faktorom 2. Prinosi korena i rizoma značajno su korelisani sa Faktorom 3, ali, obzirom da grafički prikaz predstavlja samo prva dva faktora, na ovom grafiku faktorska opterećenja ovih parametara su locirana na sredini koordinatnog sistema, što ukazuje na slabe veze ova dva parametra sa prezentovanim faktorima. Ostale osobine: broj sekundarnih rozeta i prečnik cvetne glavice, nisu korelisane ni sa jednim napred ekstrahovanim faktorom, tako da su pripale Faktoru 4, koji po definiciji nije korelisan ni sa jednim od prethodno objašnjenih faktora. Redukcijom podataka možemo zaključiti da su na prinos cvetne glavice u 2010. godini, kao i u prethodnoj godini, najviše uticale: visina cvetnog izdanka, prečnik rozete, broj cvetnih glavica po biljci i broj cvetnih izdanaka. Takođe se može zaključiti da je prinos cvetnih glavica u ovoj godini bio negativno korelisan sa sadržajem ukupnih seskviterpenskih laktona (DHHT). Grafik 91. Faktorska opterećenja za prva dva faktora u 2010. godini (>56% objašnjene ukupne varijanse) Za sekvencijalnu klasifikaciju varijanti zasnivanja plantaže arnike uzeti su parametri prinosa i hemijskog sastava cvetne glavice, gde je prinos cvetne glavice Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 152 proglašen za najbitnije svojstvo. Kako su diskriminacioni efekti računati kao udaljenost od maksimalnih vrednosti izabranih osobina, sekvencionalno rangiranje je u recipročnom odnosu sa visinom izračunatog I-odstojanja (Tabela 37). Kao maksimalne vrednosti poželjinih parametara uzete su Xmax = {prinos cvetne glavice; ukupni sadržaj SL; sadržaj kvercetin-3-O-glukozida; sadržaj hlorogenske kiseline; sadržaj kemferol-3- O-glukozida} = {258,69; 13,92; 12,53; 6,57; 4,46}. Tabela 37. Rangirane varijante zasnivanja plantaže arnike prema prinosu i hemijskom sastavu cvetne glavice Model I-odstojanje Rang JOG 1.3345 I JMV 1.9896 II JMG 2.0142 III POG 2.1538 IV JKG 2.8368 V PMG 3.0620 VI JKV 3.1804 VII PKG 3.2222 VIII JOV 4.1240 IX POV 4.5216 X PMV 4.6539 XI PKV 5.3325 XII Na ovaj način rangirane kombinacije indukovanih faktora daju odgovor koliko su udaljene od najpoželjnije varijante koja uzima prinos cvetne glavice za najbitnije svojstvo, ne zanemarujući pri tom važnost hemijskih karakteristika. 6.6. Biološki efekti Odabrani ekstrakti za biološke testove Za biološke testove odabrani su ekstrakti i etarska ulja sa ekstremnim vrednostima sadržaja sekundarnih metabolita (Tabela 38). Tako su od ekstrakata cvetne glavice arnike odabrani ekstrakt sa najvećim (SL max) i najnižim sadržajem DHHT (SL min), a isto tako i ekstrakti sa najvišim (F max) i najnižim (F min) ukupnim sadržajem tri kvantifikovana fenolna jedinjenja: hlorogenske kiseline (P1), kvercetin-3-O- Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 153 glukozida (F1) i kemferol-3-O-glukozida (F2). Kao kriterijum za razdvajanje etarskih ulja rizoma i korena uzeta je suma procentualnog učešća aromatičnih jedinjenja, tako da su i u jednom i u drugom slučaju maksimalne vrednosti označene sa AU max, a minimalne sa AU min. Svi ekstrakti i etarska ulja uzeti su iz 2010. godine. U Tabeli 36 takođe su prikazano poreklo uzoraka maksimalnih i minimalnih vrednosti kao i njihova razlika u vrednostima. U testovima antioksidativne aktivnosti korišćeni su ekstrakti cvetne glavice arnike, dok su za testiranje antimikrobne aktivnosti, pored ovih ekstakata, testirane i aktivnosti etaskih ulja rizoma i korena. Tabela 38. Odabrani ekstrakti i etarska ulja za testiranje bioloških efekata Maksimalne vrednosti Minimalne vrednosti Vrednost Poreklo Oznaka Vrednost Poreklo Oznaka Razlika (Max- Min) [mg/g] [mg/g] [mg/g] DHHT 14.66 PMV1 SL max 3.31 JMG3 SL min 11.35 Σ(P1+F1+F2) 28.54 POG3 F max 9.54 JOV3 F min 19.01 [%m/m] [%m/m] [%m/m] Rizom ΣAU 88.17 JMG AU max 78.06 JOV AU min 10.11 Koren ΣAU 85.30 PKG AU max 72.72 JOV AU min 12.59 Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala Testirani ekstrakti sa maksimalnim i minimalnim sadržajem fenolnih jedinjenja i seskviterpenskih laktona, iskazali su antioksidativnu aktivnost sa vrednošću IC50 od 0,18 mg/g (F max) i 0,21 mg/g (F min), dok su osnovni rastvori dobijeni u ekstrakciji seskviterpenskih laktona pokazali procenat inhibicije od 99,4% (SL max) i 52,7% (SL min). Antimikrobna aktivnost U Tabeli 39 prikazane su minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) odabranih ekstrakata cvetnih glavica arnike. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 154 Tabela 39. Antimikrobna aktivnost ekstrakata cvetnih glavica arnike Mikroorganizmi Gram +/- SL max SL min F max F min μl/ml μl/ml μl/ml μl/ml Escherichia coli - 5 5 5 5 Salmonella typhimurium - 5 12 5 8 Staphylococcus aureus + 10 15 3 8 Pseudomonas aeruginosa - 12 13 7 10 Proteus mirabilis - 5 13 5 12 Bacillus subtilis + 8 12 12 10 Micrococcus luteus + 12 15 12 6 Micrococcus flavus + 12 15 10 7 Listeria monocytogenes + 7 15 2 8 Salmonella enteritidis - 6 15 4 10 Enterobacter cloacae + 7 12 6 8 Candida albicans Kvasac 6 8 4 8 Testirani ekstrakti ispoljili su takođe umerenu antimikrobnu aktivnost gde su se minimalne vrednosti za inhibiciju rasta devet sojeva bakterija i jednog kvasca kretale od 2 – 15 μl/ml. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja je bila selektivna, gde su MIC vrednosti za određene mikroorganizme (E. coli, S. typhi, S. aureus, P. aeruginosa, M. flavus, L. monocytogenes i S. enteritidis) bile izuzetno male (5 μl/ml), dok je kvasac Candida albicans bio visoko rezistentan na sva testirana etarska ulja (MIC koncentracija kretala se i do 83 μl/ml). Od testiranih ekstrakata najslabiju aktivnost ispoljio je ekstrakt SL min jer je bila potrebna najveća konceentracija za potpunu inhibiciju rasta bakterija i kvasca. Najveći broj bakterija je bio inhibiran koncentracijom od 15 μl, a to znači da su bakterije ispoljile sličnu osetljivost na pomenuti ekstrakt, izuzev E. coli, čiji je rast bio potpuno inhibiran koncentracijom od 5 μl/ml. Takođe je i kvasac Candida albicans ispoljio veću osetljivost na ekstrakt (MIC je 8 μl). Najveći antimikrobni potencijal ispoljio je ekstrakt F max jer su se minimalne inhibitorne koncentracije kretale od 2 do 12 μl/ml, u zavisnosti od testiranog Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 155 mikroorganizma. Rast najvećeg broja bakterija bio je inhibiran koncentracijama ispod 10 μl/ml. Najniža potrebna koncentracija od 2 μl bila je neophodna za inhibiciju rasta Gram pozitivne bakterije L. monocytogenes. Nešto većom koncentracijom od 3 ul inhibiran je rast S. aureus. Koncentracija od 4 μl je bila MIC za S. enteritidis i C. albicans. Koncentracija od 5 μl je bila baktericidna za sledeće Gram negativne bakterije E. coli, S. typhimurium i P. mirabilis. Najveću rezistentnost na ekstrakt F max ispoljile su Micrococcus-i i B. subtilis sa MIC od 10 odnosno 12 μl/ml. Izvesne sličnosti u antimikrobnoj aktivnosti ispoljio je i ekstrakt SL max na koji su takođe najveću otpornost ispoljile pomenute Gram pozitivne bakterije (Micrococcus- i Bacillus). Takođe je koncentracija od 5 ul bila MIC za E. coli, S. tiphy., P. mirabilis, kao i kod ekstrakta F max. Ono što se može uočiti iz Tabele 36. je da odstupaju MIC vrednosti za Listeria monocytogenes koja je ispoljila veću otpornost na ekstrakt SL max (MIC je 7 μl/ml) u odnosu na ekstrakt F max (2 μl/ml). Takođe, veću rezistentnost na SL max ekstrakt ispoljile su S. aureus i P. aeruginosa, za čiju je potpunu inhibiciju rasta bilo potrebno 10 odnosno 12 μl/ml ekstrakta. Testirane bakterije su ispoljile ujednačenu osetljivost na ekstrakt F min jer je većina njih bila inhibirana koncentracijama od 8 do 10 μl/ml. Izuzetak su bile bakterije E. coli (MIC = 5 μl) i M. luteus (MIC = 6 μl) koje su ispoljile veću osetljivost. Rezultati istraživanja Doktorska disertacija 156 U Tabeli 40 prikazana je antimikrobna aktivnost (MIC) etraskih ulja podzemnih organa arnike. Tabela 40. Antimikrobna aktivnost etraskih ulja podzemnih organa arnike Mikroorganizmi Gram +/- AU min AU min AU max AU max rizom koren rizom koren ml/ml ml/ml ml/ml ml/ml Escherichia coli - 33.3 38.8 5 5 Salmonella typhimurium - 44.4 38.8 5 5 Salmonella enteritidis 38.8 44.4 16.6 33.3 Staphylococcus aureus + 27.7 38.8 5 11.1 Pseudomonas aeruginosa - 27.7 38.8 5 11.1 Proteus mirabilis - 27.7 55.5 11.1 27.7 Bacillus subtilis + 38.8 33.3 11.1 11.1 Micrococcus luteus + 33.3 27.7 16.6 11.1 Micrococcus flavus + 44.4 33.3 11.1 5 Listeria monocytogenes + 55.5 33.3 5 5 Candida albicans Kvasac 66.6 83.3 83.3 55.5 Najveću aktivnost su ispoljili AU max (rizom) i AU max (koren) u zavisnosti od testirane bakterije. MIC su se kretale od 5 – 33 μl/ml za bakterije kada je u pitanju AU max-rizom, a kada je u pitanju antimikrobma aktivnost AU max-koren MIC su se kretale od 5 – 27 μl/ml. Etarska ulja AU min-rizom i AU min-koren su prema dobijenim rezultatima imala uglavnom ujednačeni efekat na testirane bakterije uz pojedina odstupanja sa ispoljenom znatno slabijom antimirkobnom akktivnošću u odnosu na AU max etarska ulja korena i rizoma. Minimalne inhibitorne koncentracije su se za AU min- rizom, kao i za AU min-koren, kretale od 27,7 do 55,5 μl/ml. Ono sto se može uočiti je da je kvasac Candida albicans visoko rezistentan na sva testirana etarska ulja. MIC koncentracija za C. albicans kretala se i do 83 μl/ml. Diskusija Doktorska disertacija 157 7. DISKUSIJA Stanje ogleda i broj preživelih biljaka Proizvodnja rasada iz semena i vegetativnim putem je bila prilično jednostavna i u velikoj meri uspešna, iako neki literaturni podaci ukazuju na probleme u imitiranju prirodnih uslova za razvoj klijanca (Kalynyak et al., 1995; Petrova et al., 2012). Iz prethodnih istraživanja plantažnog gajenja arnike primećeno je da biljke provode čitavu jednu vegetaciju u fazi rozete (Bomme et al., 1995; Galambosi, 1999; Radanovic et al., 2007), a da tek u narednoj vegetaciji razvijaju generativne organe. Iz vremenskog prikaza osnovnih faza razvića (Slika 22) može se videti da su u 2009. godini u fazu romiranja cvetnih izdanaka prešle samo biljke iz prolećnog plota sadnje. Na postavljenom ogledu očekivalo se da sve biljke iz prolećne sadnje 2008. godine cvetaju tek u 2009. godini, međutim neposredno nakon sadnje prolećnog dela ogleda (19 dana) došlo je do cvetanja varijanti zasnovanih iz vegetativnih sadnica (Slika 23). Ova pojava, koja je zahvatila preko 60 % varijante, uticala je na slabiji prijem ovih sadnica što je dovelo do desetkovanja broja biljaka (76 % uginulih) u prvoj posmatranoj godini (2009) (Grafik 2). Loši početni uslovi imali su za posledicu slabiji razvoj preživelih biljaka na toj varijanti, što se kasnije odrazilo na većinu praćenih parametara na ogledu. Uzrok ovoj pojavi je uznapredovala generativna faza na matičnim biljkama sa kojih su deljenjem bokora proizvedene vegetativne sadnice što je dokumentovano u maju naredne godine (Slika 24). Pretpostavka je da su biljke fiziološki reagovale ka produženju vrste u smislu formiranja cveta i semena, trošeći pri tom celokupan energetski potencijal na nadzemni deo, što je uslovilo lošiji razvoj korenovog sistema i uginuće velikog broja biljaka. Kod varijanti zasnovanih iz sadnica proizvedenih iz semena (u nastavku – generatvnih sadnica) u prolećnoj sadnji nije došlo do pojave ranog cvetavanja, tako da je prijem sadnica ove varijante u odnosu na vegetativnu varijantu bio znatno bolji (prosečno 12% uginulih) u prvoj posmatranoj godini. U narednoj godini (2010) broj preživelih biljaka se dodatno smanjivao (Grafik 3), ali je procentualni bilans uginulih biljaka vegetativnih varijanti na prolećnom delu ogleda bio blizak nivou uginulih biljaka generativnih varijanti (Tabela 12). Biljke posađene na jesen 2008. godine su formirale generativne organe tek u 2010. godini. Može se reći da Diskusija Doktorska disertacija 158 su biljke iz prolećnog dela ogleda imale 2008. godinu kao prvu vegetaciju provedenu u fazi rozete, dok su biljke iz jesenjeg dela ogleda kraj 2008. godine prihvatile kao pripremu za zimu, a 2009. godinu kao svoju prvu vegetaciju. Jesenji deo ogleda je takođe pretrpeo gubitke što je najverovatnije posledica lošeg prezimljavanja. Gubici na jesenjem delu ogleda su bili ujednačeni na obe varijante sadnog materijala. U ovom slučaju vegetativne sadnice su sađene van generativne faze, nisu trošile rezerve energije na razvoj nadzemnog dela, tako da su razvile jednako dobar korenov sistem kao i sadnice proizvedene iz semena (Prilog 4A). Prethodna istraživanja na polju razmnožavanja arnike takođe su obuhvatila proučavanje vegetativne propagacije. Kating i Seidel (1967) preporučuju vegetativno razmnožavanje A. montana reznicama rizoma posebno ožiljenim u zaštićenom prostoru kao prevazileženje neuspeha njihovih prethodnika. Oni ne navode problem ranog iscvetavanja, ali su im sadnice pristigle na sadnju u polju nakon fotoperioda za prelazak u generativnu fazu razvića (23. VI). Prijem sadnica u takvim uslovima bio je oko 75%. Evstatieva i saradnici (2012) su deobom rozete postavili mikro ogled na Rodopskim planinama (1500 m). Iako je sadnja bila prolеćna (maj), autori nisu prijavili pojavu nakon ranog cvetanja (odmah nakon sadnje), ali im je prijem sadnica bio umanjen za 27%. Klonska propagacija je ekonomičniji metod dobijanja sadnica utoliko što ne traži grejani prostor (prolećna proizvodnja sadnica iz semena za prolećnu sadnju), ni zasenu sa svakodnevnim zalivanjem i negom (letnja proizvodnja sadnica iz semena za jesenju sadnju). Što se prijema sadnica arnike tiče, na ovom nivou se može zaključiti da se vegetativna propagacija u prolećnom roku sadnje, zbog velikog procenta propadanja biljaka, ne može preporučiti kao model zasnivanja plantaže, a da su ostali primenjeni modeli podjednako dobri. 7.1. Morfološki parametri Prečnik rozete Dijametar rozete arnike na ogledu se u 2009. godini kretao od 12.4 – 23.4 cm (Grafik 4), dok se u 2010. godini kretao od 14.47 – 28.15 cm (Grafik 5). Prikupljeni Diskusija Doktorska disertacija 159 podaci su u skladu sa većinom literaturnih podataka. Seidel i Kating (1967) su merili prečnike rozeta na dva lokaliteta u drugoj vegetaciji prolećno posađenih biljaka, gde su se vrednosti kretale od 14.7 – 34 cm. Smallfield i Douglas (2008) procenjuju da biljke u dobrim agroekološkim uslovima mogu razviti rozete prečnika 25 – 30 cm. Galambosi i saradnici (1998) navode vrednosti prečnika rozete 13, 15, 22 i 37 cm, u prvoj, drugoj, trećoj i četvrtoj godini gajenja, respektivno. Seeber i sar. (1997) su poredili prečnike rozeta biljaka na prirodnim staništima i iz kultivacije gde su samonikle biljke imale prečnik oko 10 cm (max. 18 cm), a gajene biljke oko 15,3 cm (max. 25 cm). Bezzi i Ghidini (1988) prijavljuju prečnike rozeta od 7.1 – 14.8 cm. Takođe su Balabanova i Vitkova (2010) izmerile prečnike rozeta od 16.3 – 25.6 cm na biljkama starim 10 meseci. Na variiranje prečnika rozete u 2009. godini statistički značajno su uticala oba indukovana faktora (vrsta sadnica i vrsta đubrenja) (Tabela 23), ali je statistički značajna interakcija faktora prikrila izolovano dejstvo faktora vrste đubrenja na celom ogledu (p=0.15) (Grafik 6). Posmatrano po razdvojenim varijantama vrsta razmnožavanja, faktor vrste đubrenja je imao statistički značajan uticaj na dijametar rozete generativno razmnoženih biljaka, dok na variranje ovog svojstva kod biljaka iz vegetativne propagacije nije imao uticaj (Grafik 4). U narednoj godini (2010) takođe su svi indukovani faktori ispoljili statistički značajan uticaj na variranje prečnika rozete arnike. I u ovoj godini, kao i u prethodnoj, izolovani uticaj đubrenja nije bio statistički značajan (p=0.20) (Grafik 6). Ovo je s jedne strane posledica zaostale interakcije faktora vrste đubrenja i vrste sadnica iz prethodne godine, a s druge strane loše reakcije biljaka iz jesenjeg plota sadnje na uneto hranivo u zemljište (Grafik 5). U ovoj godini je u pogledu posmatranog parametra statistički bila značajna iterakcija između faktora vremena sadnje i vrsta sadnica, kao i između vremena sadnje i vrste đubrenja (Tabela 23). Biljke su u drugoj godini formirale očekivano statistički značajno veće prečnike rozeta (Grafik 7A). Izolovano dejstvo faktora vremena sadnje je statistički značajno uticalo na variranje ovog svojstva, gde su biljke sa jesenjg plota sadnje formirale veće prečnike rozeta (Grafik 7B). Ovaj fenomen je umnogome posledica niskih vrednosti prečnika rozeta veretetivno razmnoženih biljaka na prolećnom plotu sadnje koje su uticale na srednju vrednost ovog paremetra na celom plotu. Posmatranjem izolovanih uticaja faktora vrste sadnica, u dve godine na dva plota sadnje, možemo zaključiti da je Diskusija Doktorska disertacija 160 ovaj faktor u obe godine bio statistički značajan samo na prolećnom plotu sadnje, dok na jesenjem plotu nije bio statistički značajan (Grafik 8). Uzrok ovakvom rasporedu značajnosti faktora vrste sadnica na posmatranom parametru prečnika rozeta je lošiji prijem sadnica vegetativno razmnoženih biljaka na prolećnom plotu sadnje. Variranje prečnika rozete je u obe godine bilo u jakoj pozitivnoj korelacionoj vezi sa visinom cvetnog izdanka (Grafik 14), što je dodatno potvrđeno faktorskom analizom gde ova dva svojstva dele zajedničku varijansu sa ostalim komponentama prinosa (Grafici 89 i 91). Visina cvetnog izdanka Dobijene vrednosti visina cvetnih izdanaka arnike u 2009. i 2010 godini od 19.7 – 34.2 cm i od 25.6 – 41.7 cm, respektivno (Grafici 9 i 10) su delimično u saglasnosti sa literaturnim podacima. Naime, literaturni podaci o visini cvetnog izdanka su veoma varijabilni i kreću se u vrednostima od 20 – 60 cm. Jedna grupa autora upravo ovaj opseg navodi kao eksperimentalne vrednosti merenja (Munoz, 1987; HagerROM, 2002; Smallfield i Douglas, 2008), dok se kod druge grupe autora ove vrednosti kreću do 40 cm (Seeber et al., 1997; Dachler i Pelzmann, 1999; Radanović et al., 2007; Heeger, 1956). Od posmatranih uticaja faktora u 2009. godini statistički značajnim su se pokazali i faktor vrste sadnica i faktor vrste đubrenja, ali i njihova međusobna interakcija (Tabela 23). Tako izolovani faktor vrste đubriva, u ovoj godini, iako statistički značajan u dvo-faktorskoj analizi varijanse, nije značajno uticao na variranje visine cvetnog izdanka na celom ogledu (p=0.36) (Grafik 11). Ovakva nedoslednost je posledica statistički značajnog uticaja interakcije između faktora faktora (p=0.03), gde su lošije razvijene biljke iz vegetativne propagacije na prolećnom plotu sadnje, koje nisu reagovale na uneto hranivo u zemljište, uticale na ukupnu varijansu, onemogućujući pri tom statitičko razlikovanje aritmetičkih sredina osnovnih skupova đubrenih varijanti iz generativne propagacije, koje su u izdvojenom posmatranju reagovale na uneta hraniva (Grafik 9). U 2010. godini svi indukovani faktori na ogledu gajenja arnike su statistički značajno uticali na variranje vrednosti visine cvetnog izdanka, ali i interakcija faktora vreme zasnivanja i vrste sadnica (Tabela 23). U ovoj Diskusija Doktorska disertacija 161 godini izolovani uticaj đubrenja je imao statistički značajan uticaj na visinu cvetnog izdanka (Grafik 11). To se takođe moglo zaključiti i sa Grafika 10, gde su sve varijante sadnica u oba plota sadnje pokazale statistički značajne razlike između aritmetičkih sredina osnovnih skupova đubrenih varijanti u odnosu na kontrolu. Biljke arnike su na prolećnom plotu sadnje u trećoj vegetaciji (2010) formirale očekivano statistički značajno više cvetne izdanke nego u drugoj vegetaciji (Grafik 12A). Izolovano dejstvo faktora vremena sadnje je statistički značajno uticalo na variranje visine cvetnog izdanka, u 2010. godini, gde su biljke sa jesenjg plota sadnje formirale više izdanke (Grafik 12B). Uticaj faktora vrste sadnica posmatran zasebno je kao i kod parametra prečnika rozete bio stetistički značajan u ube posmatrane godine samo na prolećnom plotu sadnje, dok između aritmetičkih sredina osnovnih skupova generativno i vegetativno razmnoženih biljaka na jesenjm plotu sadnje nije bilo statistički značajnih razlika (Grafik 13). Ovaj parametar je, kao što je rečeno, u obe posmatrane godine ostvario statistički veoma značajne pozitivne korelacione veze sa prečnikom rozete, a zajedno su u faktorskoj analizi, po faktorskim opterećenjima, svrstani u grupu komponenti prinosa cvetne glavice (Grafik 89 i 91). Broj cvetnih izdanaka Broj cvetnih izdanaka se na plantaži arnike kretao od 1,5 – 10,5 u 2009. godini (Grafik 15) i od 2,4 – 12,6 u 2010. godini (Grafik 16). Ovakav raspon vrednosti broja cvetnih izdanaka je u skladu sa prethodno publikovanim podacima na gajenim biljkama A. montana, koji se razlikuju u odnosu na godinu posmatranja. Po većini autora, u drugoj godini gajenja, biljka razvija od 0.6 – 5 cvetnih izdanaka, dok se taj broj u traćoj vegetaciji povećava na 5 – 35 cvetnih izdanaka po biljci (Bezzi i Ghidini, 1988; Seeber et al., 1997; Galambosi, 2004; Radanović et al., 2007; Galambosi, 2000; Evstatieva et al., 2012). U 2009. ispoljen je značajan uticaj oba indukovana faktora (vrsta sadnica i vrsta đubrenja) na vrednosti merenog parametra (Tabela 23). Interakcija između faktora u ovoj godini nije bila statistički značajna, ali je verovatnoća prihvatanja nulte hipoteze bila veoma mala (p=0.052), tako možemo reći da iako nije postojala statistička Diskusija Doktorska disertacija 162 značajnost u interakciji faktora vrsta sadnica i vrsta đubrenja, prihvatanje alternativne hipoteze je podržano u preko 94% slučajeva. Ovom interakcijom se može objasniti zašto faktor đubrenja izolovano posmatrano nije imao statistički značajan uticaj na broj cvetnih izdanaka u ovoj godini (p=0,24) (Grafik 17). Na poljskom ogledu ova informacija praktično znači da je statistički značajan uticaj đubrenja na varijantama generativnog razmnožavanja, u ukupnoj varijansi, potisnut lošom reakcijom na đubrenje vegetativno razmnoženih varijanti (Grafik 15). Dakle vrsta sadnica je značajno uticala na reakciju biljaka na uneto hranivo. U narednoj godini (2010), uticaji svih indukovanih faktora na posmatrano svojstvo su bili statistički značajni (Tabela 23). Interakcija između faktora vreme sadnje i vrsta sadnica je takođe bila statistički veoma značajna, ali i interakcija između svih faktora nije bila zanemarljiva (p=0,082). To znači da su biljke u preko 91% slučajeva varirale u broju cvetnih izdanaka zavisno od zajedničke varijanse ova tri faktora. Ovom poslednjom interakcijom se može objasniti slab doprinos faktora vrste đubrenja u pogledu vrednosti broja cvetnih izdanaka u 2010. godini (p=0,25) (Grafik 17). Jednofaktorska analiza varijanse za ovo svojstvo u 2010. godini rasvetjava koje su varijante pozitivno reagovale na uneto hranivo, a koje nisu (Grafik 16). Iz prikazanih variranja vrednosti broja cvetnih izdanaka se može videti dobra reakcija biljaka sa đubrenih blokova generativno razmnoženih varijanti na prolećnom plotu sadnje u odnosu na biljke iz vegetativne propagacije na istim blokovima, a takođe i izostanak reakcije đubrenih plotova generativno razmnoženih varijanti jesenjeg plota sadnje. Biljke arnike su na prolećnom plotu sadnje u trećoj vegetaciji formirale očekivano statistički značajno više cvetnih izdanaka nego u drugoj vegetaciji (Grafik 18A). Uticaj faktora vremena zasnivanja je bio značajan u pogledu variranja vrednosti ovog parametra (Grafik 18A). Uticaj vrsta sadnica je bio, kako i kod prethodna dva proučavana svojstva, statistički značajan samo na prolećnom plotu sadnje, gde su generativno razmnožene biljke formirale veći broj cvetnih izdanaka od vegetativno razmnoženih biljaka (Grafik 19). U obe posmatrane godine, broj cvetnih izdanaka je bio u statistički značajnim jakim korelacionim odnosima sa prečnikom rozete i visinom cvetnog izdanka (Grafici 20 i 21). Jačina veze sa prečnikom rozete ocenjena je korelacionim koreficijentom r=0.91, u 2009. godini, odnosno r=0.88 u 2010. godini. Takođe su značajni i korelacioni koeficijenti veze broja cvetnih izdanaka i visine Diskusija Doktorska disertacija 163 cvetnog izdanka, koji su uzimali vrednosti r=0.79, u 2009. godini, odnosno r=81, u 2010. godini. Na ovom nivou se može zaključiti da su bolje razvijene biljke arnike bile superiorne u odnosu na lošije razvijene po sva tri do sada obrađena svojstva. Visoki korelacioni koeficijenti ukazuju na to da su biljke sa većim brojem cvetnih izdanaka u isto vreme imale i veće prečnike rozeta i više cvetne izdanke. Faktorska analiza je u obe posmatrane godine po faktorskim opterećenjima broj cvetnih izdanaka grupisala zajedno sa prinosom cvetnih glavica i ostalim parametrima koji utiču na ovaj prinos (Grafici 89 i 91). Broj cvetnih glavica po biljci U drugoj vegetaciji arnike (2009) broj cvetnih glavica po biljci se kretao od 1,2 – 10,5 (Grafik 23), dok su se vrednosti ovog svojstva u trećoj vegetaciji kretale od 8,4 – 38,9. Naši rezultati u pogledu vrednosti ovog parametra u potpunosti odgovaraju literaturnim podacima. Najsličniji su vrednostima biljaka gajenim na Rodopima koje su u drugoj vegetaciji imale od 1 - 4, a u trećoj vegetaciji od 25 – 38 cvetnih glavica po biljci (Evstatieva et al., 2012). Galambosi (2004) je prijavio slične rezultate u drugoj i trećoj godini, prosečno 5, odnosno 28, cvetnih glavica, respektivno. Biljke gajene na malč folijama su, u našim ekološkim uslovima, dale u drugoj vegetaciji od 2.7 – 5.5 cvetnih glavica po biljci (Radanović et al., 2007), dok su biljke gajene na četiri lokaliteta u Italiji dale od 0.9 – 6.1 cvetnih glavica po biljci (Bezzi i Ghidini, 1988). Bomme (1999) navodi da selektovana sorta ‘ARBO’ može u četvrtoj vegetaciji da dostigne u proseku oko 90 cvetnih glavica po biljci. Sličan nalaz je prijavio Galambosi (2000) na lokalnoj finskoj polulaciji A. montana gde je izbrojao u četvrtoj godini cvetanja (peta vegetacija) maksimalnih 98 cvetnih glavica po biljci. Iz podataka prezentovanih na Graficima 22 i 23, kao i iz Tabela 13 i 14, može se zaključiti da berba cvetnih glavica arnike, u agroekološkim uslovima planinskog regiona zapadne Srbije, traje oko 25 dana i da po terminu za početak berbe pristiže oko 20. maja. Na ovo svojstvo, u obe posmatrane godine, statistički značajno su uticali svi indukovani faktori na ogledu (Tabela 23). U 2009. godini se pored uticaja faktora vrsta Diskusija Doktorska disertacija 164 sadnica i vrsta đubriva, statistički značajnom pokazala i njihova interakcija. Ova interakcija, koja se prenela i u narednu godinu (2010) uslovila je, kao i u slučaju prethodno proučavanih svojstava, maskiranje statističke značajnosti uticaja faktora vrste đubriva na celom ogledu (Grafik 26), gde je prihvatanje nulte hipoteze ocenjeno sa verovatnoćom p=0.17, u 2009. godini, odnosno sa p=0.18, u 2010. godini. U prilog ovome idu statističke značajnosti đubrenih blokova u odnosu na kontrolni blokove na izolovanim varijantama vrste sadnica u oba plota sadnje (Grafici 23 i 25). Prosečan broj cvetnih glavica po biljci u trećoj vegetaciji je očekivano bio statistički značajno veći od broja cvetnih glavica po biljci u drugoj vegetaciji (Grafik 27A). Uticaj faktora vremena zasnivanja na variranje broja cvetnih glavica po biljci je u 2010. godini bio statistički veoma značajan. Uticaj faktora vrste sadnica an vatiranje broja cvetnih glavica po biljci je bio, kao i kod prethodno proučavanih morfoloških osobina, statistički značajan samo na prolećnom plotu sadnje (Grafik 28). Ovo je posledica prethodno pomenute pojave ranog cvetanja vegetativno razmnoženih varijanti i lošijeg prijema ovih sadnica. Na jesenje plotu sadnje između aritmetičkih sredina osnovnih skupova varijanti generativnog i vegetativnog razmnoževanja nije bilo statitički značajnih razlika. Posmatrana osobina (broj cvetnih glavica po biljci) je usko vezana sa prečnikom rozete, visinom cvetnog izdanka i brojem cvetnih izdanaka, gde su jačine veza ocenjene korelacionim koeficijentima u 2009. godini r=0.91(odnosno r=0.71, u 2010. godini), r=0.85 (r=0.73) i r=0.96 (r=0.71), respektivno. Takođe u faktorskoj analizi, ova osobina je, u obe posmatrane godine, usko korelisana sa Faktorom 1 koji grupiše promenljive koje dele zajedničku varijansu sa prinosom cvetne glavice (Grafici 89 i 91). Prečnik cvetne glavice Vrednosti prečnika cvene glavice na ogledu arnike u 2009. godini su se kretale od 5,9 – 7,5 cm (Grafik 32), dok su se u 2010. godini iste vrednosti kretale od 6,4 – 9,1 cm (Grafik 33). Literaturni podaci koji opisuju ovaj parametar potvrđuju naše nalaze i vrednosti se uglavnom kreću od 4 – 8 cm. Tako Smallfield i Douglas (2008) navode upravo ovaj raspon , dok Munoz (1987) prijavljuje znatno uži raspon od 7 – 8 cm. Ostali autori potvrđuju da se kod merenja prečnika cvetne glavice biljke A. montana mogu Diskusija Doktorska disertacija 165 očekivati vrednosti od 6 – 8 cm (Heeger, 1956; HagerROM, 2002; Evstatieva et al., 2012). Na variranje vrednosti ovog parametra je u drugoj vegetaciji (2009) uticao samo faktor vrste sadnica, dok uticaj faktora vrste đubriva nije bio statistički značajan (Tabela 23). U trećoj vegetaciji (2010) indukovani faktori vreme sadnje i vrsta đubrenja na su statistički značajno uticali na variranje izmerenih vrednosti prečnika cvetne glavice. Takođe je, u ovoj godini, i interakcija faktora vremena sadnje i vrste sadnica bila statistički značajna. Uticaj đubrenja na variranje ovog svojstva nije bio statistički značajan, ni u jednoj od posmatranih godina, ali je prihvatanje nulte hipoteze, u 2010. godini, bilo ocenjeno verovatnoćom od 8,2%. Što zapravo znači da su se aritmetičke sredine osnovnih skupova vrednosti prečnika cvetnih glavica đubrenih blokova, razlikovale od kontrolnih blokova u 91,8% slučajeva, što se nije pokazalo kao statistički značajno, ali nije ni zanemarljivo mali procenat slučajeva. I kod ovog parametra očekivano su se, kao i kod prethodno posmatranih morfoloških osobina, statiskički značajno razlikovale aritmetičke sredine osnovnih skupova vrednosti prečnika rozete u drugoj i trećoj vegetaciji (Grafik 35A). Takođe je i faktor vremena sadnje značajno je uticao na variranje vrednosti ovog svojstva (Grafik 35B), gde su biljke iz jesenje sadnje formirale veće cvetne glavice u poređenju sa biljakma iz proećnog plota sadnje. Faktor vrste sadnica se u rezltatima trofaktorske analize varijanse, za treću vegetaciju (2010) nije pokazao kao statistički značajan, ali je u isto vreme statistički veoma značajna bila interakcija ovog faktora sa faktorom vremena sadnje (Tabela 23). Ova interakcija je uticala na neispoljavanje statističke značajnosti faktora vrste sadnica, kako se u izolovanim t-testovima pokazalo (Grafik 36), gde su na prolećnom plotu sadnje veće prečnike cvetnih glavica formirale biljke iz vegetativne propagacije, a na jesenjem plotu obrnuto, iz generativne propagacije (Prilog 4 E i F). Ova nedoslednost je uticala na neispoljavanje statističke značajnosti kakva je pokazana u t-testovima. Prečnik cvetne glavice je u prvoj godini ostvario statistički značajne negativno korelisane veze sa prečnikom rozete, visinom cvetnog izdanka i brojem cvetnih glavica po biljci, koje su ocenjene korelacionim koeficijentima r=-0.55, r=-0.62 i r=-0.53 (Tabela 15), respektivno, ali se ti odnosi nisu ponovili u narednoj godini, tako da se gubi sledljivost pretpostavke da su prečnici cvetnih glavica arnike obrnuto srazmerni vrednostima komponenata prinosa. Faktorskom analizom je pokazano da se ova osobina Diskusija Doktorska disertacija 166 po faktorskom opterećenju, u 2009. godini, ne koreliše značajno ni sa jednim ekstrahovanim faktorom, dok se u 2010. godini značajno negativno koreliše sa Faktorom 4 (ostale osobine) sa kojim se značajno pozitivno koreliše faktorsko opterećenje broja sekundarnih rozeta (Grafici 89 i 91). Za ovu ovu osobinu se na ovom nivou istraživanja ne može izvesti jasan zaključak čime je fiziološki uslovljena ni kakva je njena uloga u formiranju prinosa. Broj sekundarnih rozeta Vrednosti broja sekundarnih rozeta arnike su u 2009. godini varirale između 5,7 – 18,3 (Grafik 37), dok se u 2010. godini kretao od 25,3 – 35,0 (Grafik 38). Literaturnih podataka o broju formiranih sekundarnih rozeta ima veoma malo, što je i razumljivo obzirom na činjenicu da je za ispravno brojanje u drugoj i trećoj vegetaciji neophodno izvaditi, oprati biljku i pažljivo razdvajati formirane rozete. Tako su samo Evstatieva i saradnici (2012) prijavili da su na kraju treće vegetacije uspeli da prikupe 4160 rozeta sa 20 m2. To u proračunu daje oko 52 sekundarne rozete po biljci što je u proseku znatno više od broja sekundarnih rozeta na biljkama u našem ogledu na kraju treće vegetacije (od 25.3 – 35.0) (Grafik 38). Na variranje ovog parametra u 2009. godini uticao je samo faktor vremena zasnivanja (Grafik 41A). To praktično znači da je broj sekundarnih rozeta u trećoj vegetaciji dostigao nivo broja rozeta prolećnog plota sadnje. Odavde se može zaključiti da variranje ovog parametra utiče na parametre koji su vezani za prinos samo u početnim fazama razvića, ali kada se biljka stabilizuje (u našem slučaju u trećoj vegetaciji) broj sekundarnih rozeta se ujednači na svim varijantama, pa između varijanti prestaju da postoje statistički značajne razlike. Razlog za pojavu ove asimetrije najverovatnije leži u post-žetvenoj biologiji biljke koja se ogleda u formiranju novih rozeta. Nakon branja cveta cvetna stabljika se suši, a biljka usmerava svu prikupljenu energiju na formiranje novih rozeta. Iz tog razloga su biljke posađene na proleće, koje su cvetale u 2009. godini, formirale veći broj sekundernih rozeta na kraju te godine. U narednoj godini su sve biljke na ogledu cvetale i sve su nakon branja cveta pristupile formiranju novih rozeta. Optimalan broj rozeta je najverovatnije uslovljen gustinom sadnje biljaka, tako da su biljke koje su sađene na proleće i one koje su sađene na jesen Diskusija Doktorska disertacija 167 u trećoj vegetaciji dostigle svoj optimum gustine i tako se izjednačile po broju sekundarnih rozeta (Grafik 38). U trećoj vegetaciji (2010), ni jedan od indukovanih faktora na ogledu nije statistički značajno uticao na variranje vrednosti ove osobine, ali se statistički veoma značajnom pokazala interakcija između faktora vremena sadnje i vrste sadnica (Tabela 23). Ova interakcija je očekivana i prisutna kod svih proučavanih nadzemnih parametara arnike, upravo zbog lošijeg razvića biljaka iz vegetativne propagacije na prolećnom plotu sadnje. Biljke arnike su u 2010. godini formirale, na oba plota sadnje, očekivano statistički značajno veći broj sekundarnih rozeta nego u 2009. godini (Grafik 40 A i B). Uticaj vrste sadnica na broj sekudarnih rozeta na jesenjm plotu sadnje u obe posmatrane godine nije bio statistički značajan (Grafik 42). Od odnosa sa drugim morfološkim osobinama broj sekundarnih rozeta, u 2009. godini, ostvaruje značajne pozitivne korelacione veze sa većinom prethodno proučavanih parametara, osim sa prečnikom cvetne glavice sa kojim gradi negativno korelisan odnos (Grafik 43 i Tabela 16). Međutim te značajne veze u narednoj godini (2010) slabe, tako da se na ovom nivou israživanja ne može izvesti pouzdan zaključak o pravilnosti uzajamnih odnosa broja sekundarnih rozeta i ostalih merenih osobina na ogledu. Faktorkom analizom, u 2009. godini, ovaj parametar po svom faktorskom opterećenju nije bio značajno korelisan ni sa jednim od ekstrahovanih faktora, dok se u 2010. godini grupisao u elemente Faktora 4 – odnosno ostale osobine. 7.2. Prinosi Prinos cvetnih glavica Prinos cvetnih glavica na ogledu gajenja arnike u 2009. godini se kretao od 5.2 – 143.6 kg/ha (Grafik 45), dok se u 2010. godini kretao od od 3,7 – 258,7 kg/ha (Grafik 47). Dobijeni prinosi su, u svojim maksimalnim vrednostima, u skladu sa ranije publikovanim rezultatima i najsličniji su nalazima iz Italije (Bezzi i Ghidini, 1988), dok su znatno niži od prinosa postignutih u Nemačkoj (Bomme i Daniel, 1994). Pregled literaturnih podataka o visinama prinosa u dosadašim istraživanjima dat je u Tabeli 41. Diskusija Doktorska disertacija 168 Tabela 41. Literaturni podaci o visinama prinosa suve cvetne glavice A. montana Zemlja istraživanja Prinos kg/ha Izvor Italija 94 - 284 Bezzi i Ghidini, 1988 Nemačka 1330* Bomme i Daniel, 1994 Finska 110 - 530 Galambosi, 2004 Novi Zeland 223 - 570 Douglas et al., 2004 Novi Zeland 200 - 700 Smallfield i Douglas, 2008 Nemačka 570 - 1140 Bomme et al., 1995 Nemačka 150 - 1100 Bomme, 1999 Španija 600 - 750 Munoz, 1987 Nemačka 500 - 1000 Marquard i Kroth, 2001 Nemačka 500 - 1000 Dachler i Pelzmann, 1999 Nemačka 500 - 1000 Heeger, 1956 Srbija 30 - 340 Radanović et al., 2007 Bugarska 310 - 470 Evstatieva et al., 2012 Austrija 570 - 1100 Seeber et al., 1997 * posebno selektovane biljke Veliko variranje prinosa cveta A. montana u literaturi, kakvo je prikazano u Tabeli 41, je posledica više faktora, ali je najverovatnije najznačajniji uticaj staništa. Prirodno stanište arnike su visokoplaninske livade i verovatno je da uticaj visokih temperatura negativno utiče na razviće biljaka, pri čemu se smanjuje prinos. Variranja prijavljene visine prinosa unutar istog istraživanja je u većini slučajeva posledica nejednakog doprinosa prve i druge godine cvetanja (druga i teća vegetacija), gde autori najčešće izdvajaju drugu godinu kao prinosniju. Ovo je opet posledica formiranja većeg broja organa, u drugoj godini cvetanja, koji posredno učestvuju u prinosu cvetne glavice. Najveći prinosi su prijavljeni u Namačkoj, dok su najniži u Srbiji i Italiji. Prethodna istraživanja na kultivaciji arnike u našem klimatu na planini Tara (Radanović et al., 2007), dala su slične rezultate kao što su nalazi u ovom radu, odnosno 30 kg, 340 kg, 200 kg i 100 kg, u prvoj, drugoj, trećoj i četvrtoj godini cvetanja, respektivno. Sa Grafika 44 i 46, kao iz Tabela 17 i 18, može se zaključiti da je ritmika branja cvetnih glavica, u ukupnom trajanju od oko 20 dana bila podeljena u 6 – 8 berbi, a da je najveća količina ubranih cvetnih galvica (preko 70%) smeštena u tri glavne berbe. Glavne berbe vegetativno razmnoženih varijanti su u obe posmatrane godine su otpočinjale ranije nego kod ostalih varijanti na ogledu. Uticaj svih indukovanih faktora na prinos cvetne glavice, u obe posmatrane godine je bio značajan (Tabela 23), ali su Diskusija Doktorska disertacija 169 takođe bile značajne i interakcije faktora vrsta sadnica i vrsta đubriva, u obe godine, i vreme sadnje i vrsta sadnica u 2010. godini. Interakcije faktora vrste sadnica sa vrstom đubriva su dalje uticale na prikrivanje statističke značajnosti uticaja faktora vrste đubriva na prinos cvetne glavice arnike.Tako zbog losijeg prijema i slabijeg razvića biljaka iz vegetativne propagacije prolećnog plota sadnje, faktor vrste đubriva nije u svom ukupnom dejstvu na ogledu statistički značajno uticao na prinos cvetne glavice ni u jednoj od posmatranih godina (Grafik 48). Interakcije faktora vrste sadnica sa vrstom đubriva su dalje uticale na prikrivanje statističke značajnosti uticaja faktora vrste đubriva na prinos cvetne glavice arnike. Kada se uticaj faktora vrste đubrenja proučava izolovano, po varijantama vrste sadnica, uočava se da postoje statistički značajne razlike imeđu aritmetičkih sredina osnovnih skupova đubrenih blokova i kontrolnih blokova kod generativno razmnoženih varijanti u obe posmatrane godine (Grafik 45 i 47). Prethodno publikovani podaci uglavnom govore o skromnom ili nikakvom doprinosu đubrenja u stvaranju većeg prinosa cvetnih glavica A. montana. Prema Bomme et al. (1995) na plodnim zemljištima arnika se može uzgajati bez primene velike količine đubriva. Ista grupa autora pokazala je da su prinosi cveta arnike, u tri uzastopne godine, bili viši na neđubrenim (356 – 755 kg/ha) nego na đubrenim varijantama (266 – 635 kg/ha). Seeber et al. (1997) prijavljiju veće prinose u verijantama đubrenim mineralnim đubrivom (850 – 1100 kg/ha) u odnosu na kontrolu (575 - 870 kg/ha). Nasuprot ovim nalazima istraživanja rađena u našem klimatu pokazuju da uticaj đubrenja može znatno unaprediti prinos cveta, gde su varijante đubrene mineralnim đubtivom dale za 20.5%, a varijante đubrene stajnjakom za 9.4%, veće prinose cveta u odnosu na kontrolnu varijantu (Radanović et al., 2007). Valja napomenuti da je ovo istraživanje rađeno na malč folijama, pa se bolja reakcija usvajanja hraniva može pripisati posebnim ekološkim uslovima u kojima su biljke gajene. Biljke iz generetivno razmnoženih varijanti na prolećnom plotu sadnje su imale očekivano statistički značajno veći prinos cvetne glavice u 2010. godini u poređenju sa 2009. godinom (Grafik 49A). Takođe su i biljke sa jesenjeg plota sadnje u proseku postigle statistički značajno veće prinose od generativno razmnoženih biljaka sa prolećnog plota sadnje (Grafik 49B). Faktor vrste sadnica je statistički veoma značajno uticao na visinu prinosa cvetne glavice (Grafik 50), što je i očekivano obzirom da je ovaj faktor uticao na variranje vrednosti svih posmatranih komponenti prinosa, osim na prečnik cvetne glavice u 2010. godini, pa Diskusija Doktorska disertacija 170 samim tim i na prinos cvetne glavice kao super-svojstva. Radi boljeg pregleda prinosnog potencijala svih proučavanih varijanti na ogledu, uvedene su dve teoretske vrednosti: prinos cvetnih glavica po biljci i teoretski prinos cvetnih glavica (Tabela 19). Iz ovakvog pregleda se može zakjučiti, da bi biljke iz jesenjeg plota sadnje, i bez masovnog propadanja vegetativno razmnoženih biljaka iz prolećnog plota sadnje, bile superiornije po prinosu cvetne glavice. Takođe se iz ovog pregleda može pretpostaviti da bi najveći prinos cvetnih glavica (417,1 kg/ha), u trećoj vegetaciji, postigla generativno razmnožena varijanta u bloku mineralnog đubrenja posađena na jesen (JMG). Sudeći po jačini veze najveći uticaj na visinu prinosa imale su osobine: prečnik rozete, visina cvetnog izdanka, broj cvetnih izdanaka i broj cvetnih glavica po biljci, čije su jačine veze sa prinosom cvetne glavice ocenjene korelacionim koeficijentima koji su se kretali, u obe posmatrane godine, od r = 0,82 do r = 0,94 (Grafici 51-54). Prečnik cvetne glavice je bio negativno korelisan sa prinosom cvetne glavice u 2009. godini (r = -0.60), ali se ta veza nije zadržala i u narednoj godini (r = 0.06) (Tabela 20). Takođe se i osobina broj sekundarnih rozeta u drugoj vegetaciji statistički veoma značajnoo pozitivno koreliše sa visinom prinosa (r = 0.75), ali se u trećoj vegetaciji ta veza gubi. Faktorskom analizom je utvrđeno da su upravo pobrojane osobine, sa visokim koeficijentima korelacije sa prinosom cvetne glavice, u obe posmatrane godine, po svojim faktorskim opterećenjima delile zejedničku varijansu sa Faktorom 1 – prinos i komponente prinosa (Grafik 89 i 91). Ovakvo grupisanje je bilo očekivano obzirom da je za izradu faktorske analize korišćena korelaciona matrica. Na ovom nivou istraživanja može se zaključiti da su biljke iz jesenje sadnje dale značajno veće prinose, da je uticaj faktora vrste đubrenja osetan samo kod generativno razmnoženih biljaka, da faktor vrste sadnica ima uticaj na prinos samo kod biljaka sađenih u proleće i da variranje vrednosti većine odabranih komponenti prinosa u velikoj meri utiče na visinu prinosa. Prinos rizoma i korena Rezultati merenja masa podzemnih organa arnike su se pokazali jako heterogeni (Grafik 19 i 20). U svakoj posmatranoj godini mereni parametri su imali izuzetno velike Diskusija Doktorska disertacija 171 koeficijente varijacije (CV%) koji su u svojim maksimalnim vrednostima kod prinosa rizoma iznosili 38,8%, u 2009. godini (odnosno 48,1%, u 2010. godini), a u slučaju prinosa korena 82,2% (48,2%). Ovakva neujednačenost u vrednostima uticala je veliki raspon masa, gde je u 2009. godini minimalna vrednost mase rizoma (57.1 kg/ha) bila skoro 10 puta manja od maksimalne vrednosti (502.1 kg/ha), a isto tako i minimalna vrednost mase korena (85,0 kg/ha) skoro 10 puta manja od maksimalne vrednosti (822.8 kg/ha). U drugoj posmatranoj godini (2010) se smanjuje raspon između ekstremnih vrednosti na oko 4 puta u slučaju rizoma i oko 2 puta u slučaju korena (Tabela 31). Prinosi rizoma su se u 2009 godini kretali od 106.3 – 373.7 kg/ha (odnosno 475.9 – 897.5 kg/ha u 2010. godini) (Grafici 55 i 56), a prinosi korena od 194.3 – 426.4 kg/ha (odnosno 420.7 – 614.7 kg/ha) (Grafici 62 i 63). Podaci o prinosima podzemnih organa dobijeni sa ogleda su u skladu sa literaturnim podacima. Autori koji su obrađivali ovu temu nisu pridavali posebnu pažnju razdvojenom posmatranju podzemnih organa nego su jednim terminom “koren” ili “rizom” objedinjavali oba organa u jedan pojam. Podaci o tako prikazanom prinosu (zajedno rizom i koren) na našem ogledu se kreću od 0.8 – 1.5 t/ha, a u prethodno objavljenim studijama se prinos kretao od oko 1 t/ha (Bezzi i Ghidini, 1988), preko 0.8 – 2.8 t/ha (Bomme et al., 1995; Heeger 1956) do 3 t/ha i više (Marquard i Kroth, 2001; Dachler i Pelzmann, 1999). Naši nalazi su najsličniji podacima dobijenim sa oglednog gajenja arnike u Italiji (Bezzi i Ghidini, 1988), dok su naši prinosi u svom maksimumu dvostruko niži od prijavljenih prinos podzemnih organa arnike gejene u Nemačkoj (Marquard i Kroth, 2001; Dachler i Pelzmann, 1999). Ovakva različitost je, kao i kod prinosa cvetnih glavica, najverovatnije posedica povoljnijih agroekoloških uslova za gajenje ove biljke u zemljama Centralne Evrope. Uticaj faktora đubrenja ni u jednoj posmatranoj godini nije ispoljio statističku značajnost u pogledu variranja vrednosti prinosa podzemnih organa (Grafici 57 i 64) (Tabela 23). Biljke su u 2009. godini imale očekivano statistički manje prinose podzemnih organa u odnosu na biljke iz 2010. godine, na oba plota sadnje (Grafik 58 i 65). Uticaj vremena zasnivanja je u drugoj vegetaciji bio statistički veoma značajan na variranje prinos rizoma, dok je u trećoj vegetaciji uticaj ovog faktora bio značajan na variranje prinosa i rizoma i korena (Grafik 59 i 66). Uzrok ovim razlikama je najverovatnije dužina vegetacionog perioda, gde su biljke posađene na proleće imale u prethodnoj godini (2008) jednu čitavu vegetaciju više (Slika 22), u kojoj su formirale Diskusija Doktorska disertacija 172 veći broj sekundarnih rozeta (Grafik 41). Jačina veze imeđu ove dve prinosa rizoma i broja sekundarnih rozeta se može okarakterisati u 2009. godini kao jaka (r = 0.80), a u 2010. godini kao osrednja (r = 0.54) (Grafik 61). Između prinosa rizoma i prinosa korena u obe posmatrane godine postoji statistički značajna pozitivna korelaciona veza. Ta veza je u 2009. godini ocenjena kao jaka koeficijentom korelacije r = 0.88, dok je u 2010. godini ocenjena kao osrednja koeficijentom r =0.49. Prinosi korena sa dela ogleda posađenog na proleće su bili viši u odnosu na vrednosti ovog parametra dobijenih sa dela ogleda sađenog na jesen. Takođe, na jesenjem delu ogleda, viši prinos korena su imale biljke koje su razmnožene generativno od biljaka koje su razmnožene deobom bokora. U drugoj posmatranoj godini (2010) na prinos rizoma ima uticaj samo faktor vremena zasnivanja i interakcija svih indukovanih faktora (Tabela 23). To praktično znači da su se na kraju treće vegetacije, u pogledu vrednosti ovog parametra, oslabljeni uticaji faktora vrste đubriva i vrste sadnica ujednačili, ali da je očuvan bonitet povoljne kombinacije faktora i to upravo: prolećne sadnje (zbog duže vegetacije u trenutku posmtranja), đubrenja stajnjakom i vegetativnog načina razmnožavanja (varijanta POG = 897,5 kg/ha; Tabela 31), ali da razlike između sredina plotova vremena sadnje, blokova đubrenja i varijanti razmnožavanja ponaosob nisu pokazale statističku značajnost. U istoj godini na prinos korena utiče faktore vremena sadnje, gde je prolećna sadnja favorizovana zbog duže vegetacije prolećno sađenih biljaka u trenutku posmatranja (Grafik 66B). Po faktorskim opterećenjima podzemni organi arnike su se u obe posmatrane godine gupisale u poseban Faktor 3. To znači da su sa veoma malim delom varijanse ove dve osobine učestvovale u variranju osobina koje su uticale na visinu prinosa cvetne glavice. Prinos etarskog ulja korena i rizoma Prinos etarskog ulja iz korena gajene arnike u 2009. godini kretao se od 1.05 – 3.15% (1.71 – 2.40% u 2010. godini), dok se prinos etarskog ulja rizoma kretao od 3.98 – 4.83% (2.09 – 3.07% u 2010. godini) (Grafici 69 i 70). Dobijene vrednosti prinosa su u saglasnosti sa već publikovanim rezultatima, gde većina autora navodi vrednost od 1,5% kao maksimalnu (Willuhn, 1969; Dachler i Pelzmann, 1999; Bomme et al., 1995; Diskusija Doktorska disertacija 173 Munoz, 1987; Heeger, 1956), izuzev Fenaroli (1963) koji navodi maksimalnih 6,3% ulja (Bezzi i Ghidini, 1989). Uticaj faktora vrste đubrenja na prinos etarskog ulja korena i rizoma nije bio značajan ni u jednoj od posmatranih godina (Tabela 22), što je u suprotnosti sa nalazima Chang i sar. (1998), gde pri povećanju koncentracije pristupačnih hraniva u zemljuštu dolazi do povećanja sadržaja etarskog ulja u korenu korejske valerijane (Valerianafauriei var. dasycarpa Hara). Takođe, Ezz El-Din i Hendawy (2010) navode da postoji pozitivna korelacija između količine unetog hraniva u zemljište i sadržaja etarskog ulja u korenu selena (Levisticum officinale). U obe posmatrane godine u rizomima arnike akumulirala se statistički značajno veća količina etarskog ulja (Grafik 71). Ovakva raspodela ulja je najverovatnije posledica različite morfologije ova dva organa, što se može uočiti na poprečnim presecima (Slike 34 i 37), gde rizomi razvijaju veće šupljine u intercelularima koje im služe za skladištenje ulja (Slika 36). Uticaj starenja na prinos etarskog ulja je bio izraženiji kod rizoma nego kod korena, gde su biljke iz druge posmatrane godine (2010) imale niži sadržaj etarskog ulja od biljaka iz prve posmatrane godine (2009) (Grafik 72), što je najverovatnije posledica formiranja većeg broja sekundarnih rozeta u trećoj vegetaciji u odnosu na drugu. U prilog ovoj tvrdnji ide ranije pokazana pozitivno korelisana veza broja sekundarnih rozeta i prinosa rizoma (Grafik 61), a takođe i negativno korelisana veza sadržaja etarskog ulja u rizomu i prinosa rizoma (Grafik 75). Uticaj faktora vremena zasnivanja je bio statistčki značajan samo na variranje vrednosti prinosa ulja u korenu prve posmatrane godine (Grafik 73). Ova značajnost je očekivana budući da su biljke iz prolećne sadnje imale čitavu jednu vegetaciju duže razviće (Slika 22). Uticaj vrste sadnica na jesenjem plotu sadnje nije bio značajan u pogledu variranja prinosa ulja u podzemnim organima (Grafik 74), što je bilo za očekivati obzirom na ujednačenost u prijemu i formiranju svih ostalih organa oba tipa sadnica. Diskusija Doktorska disertacija 174 7.3. Mikroskopska i hromatografska karakterizacija droga Makroskopska analiza Makroskopska identifikacija biljne droge Arnicae flos u poređenju sa pretpostavljenim falsifikatima, Calenduale flos i cvetnom glavicom Doronicum columne, je izvodljiva golim okom do nivoa osušenih cvetnih glavica (Slika 25 A i B), dok je u sprašenom obliku identifikacija otežana čak i pod lupom (x40) (Slika 25 B i C). Da bi se sa sigurnošću ustanovilo o kojoj sprašenoj drogi je reč, moraju se koristiti veća mikroskopska uveličanja. Mikroskopska analiza Mikroskopski pregled delova cvetnih glavica (Slika 26) otkriva specifičnosti pojedinih delova koji bi mogli poslužiti za brzu identifikaciju droge Arnicae flos. Tako su dlačice na ahenijama kod A. montana i D. columnae dvostruke, bez glave i providne dok su kod C. officinalis kratke, sa glavičastim savršetkom i ispunjene saržajem (Slika 26A). Kod vrsta A. montana i D. columnae debljina papusa se veoma razlikuje (Slika 26D). Tako A. montana ima papuse debljine oko 69±16 μm, što je u skladu sa već publikovanim rezultatima (Deutschmann et al., 1979; Eschrich, 1979), dok D. columnae ima oko 30±7 μm. Ovo je u isto vreme i najlakše uočljiva razlika u sprašenom obliku cvetnih glavica, koja može poslužiti kao ključ za razlikovanje ove dve vrste pod mikroskopskim uveličanjem. Povoljna karakteristika papusa je da mu se retko narušava struktura po dužini, tako da i u samlevenom obliku zadržava dimenziju debljine. Prašnici svih posmatranih vrsta su veoma slični s tim što su prašnici vrste D. columnae uži (Slika 26E). Ova karakteristika se nažalost ne može koristiti kao ključ za identifikaciju vrsta u sprašenom obliku obzirom da se prašnici cepkaju na sitne komade gubeći pri tom informaciju o početnim dimenzijama. Žigovi tučaka ove tri vrste na slici 26F izgledaju potpuno različito, ali je to najverovatnije posledica nejednake razvijenosti u toku faze punog cvetanja. Žigovi tučaka sve tri vrste su u svom punom razviću mnogo sličniji nego što je to prikazano na ovoj slici. Ove tri vrste, kao i ostale biljke iz familije Asteraceae, razvijaju dvodelni žig tučka sa lastavičasto savijenim krajevima. Takođe se, Diskusija Doktorska disertacija 175 zbog narušavanja strukture prilikom mlevenja cvetnih glavica, eventualne razlike u strukturi žiga tučka ne bi mogle koristiti za identifikaciju vrsta. Vrste A. montana i C. officinalis se mogu razlikovati i po dlakama koje su pr isutne u bazi kruničnih listića Slika 27, ali je pouzdaniji pokazatelj debljina papusa (Slike 28 i 30). Primese cveta nevena u drogi Arnica flos mogu biti uočene već pod uveličanjem x5 preko karakterističnih žlezdanih dlaka sa baze kruničnih listića i sa listića involukruma (Slika 29). Opisane anatomske karakteristike arnike su u skladu sa literaturnim podacima (Deutschmann et al., 1979; Pfänder, 2002; Eschrich, 1979). Iz sumiranih mikroskopki uočljivih razlika između posmatrane tri biljne vrste predstavljene u Tabeli 24, možemo izvesti zaključak da se na osnovi prisustva i debljine papusa može najbrže i najlakše identifikovati biljna droga Arnicae flos. Tankoslojna hromatografija Iz prezentovanih rezultata HPTLC analize ekstrakata cvetnih glavica A. montana i dva pretpostavljena falsifikata, C. officinalis i D. columne (Slika 32) može se zaključiti da je ova tehnika pogodna za brzu identifikacija droge Arnicae flos. Dobijeni hromatogrami A. montana i C. officinalis su u skladu sa ranije publikovanim rezultatima (Wagner et al., 1984). Jasna disktincija cvetnih glavica A. montana i D. columnae u odnosu na C. officinalis je moguća zahvaljujući sadržaju rutina. U prethodnim istraživanjima je pokazano da arnika u svom fenolnom kompleksu ne sadrži rutin (HagerROM, 2002; Merfort, 1992; Kohlmünzer, 2000; Reyes-Salas et al., 2002; Ganzera et al., 2008; Spitaler et al., 2008; Albert et al., 2009; Schilcher et al., 2007). Nasuprot ovim istraživanjima, Craciunescu i sar. (2012) prijavljuju značajne količine rutina u ekstraktima cvetnih glavica A. montana i nadzemnom delu biljke Artemisia absinthium. Ovakvo ne slaganje u rezultatima je verovatno posledica nepodudaranja metodskih postupaka u analizama fenolnog kompleksa. U našem istraživanju tehnikom tankoslojne hromatografije u ekstraktu cvetne glavice arnike nije bila vidljiva zona koja bi po položaju odgovarala standardu rutina (Slika 32). Diskusija Doktorska disertacija 176 Lokalizacija etarskog ulja u rizomu i korenu Sekretorni kanali u korenu arnike u kojima se nakuplja etarsko ulje verovatno služe kao odbrambeni mehanizam od zemljišnih štetočina. Dobro je poznato da sekretorne strukture koje su prisutne kod viših biljaka imaju važnu ekološku ulogu u odbrani biljaka od biljojeda i patogena (Cury and Appezzato-da-Glória, 2009; Werker, 1993). Sekretorni kanali smešteni u sub-epidermalnoj zoni rizoma arnike, takođe mogu imati ulogu rezervoara etarkog ulja, koje biva oslobođeno samo kada je rizom fizički ozleđen. Miris koji se oslobađa prilikom povređivanja korena i rizoma može služi kao repelent ili kao otrov za larve insekata koje bi bile položene u sam koren ili ostale za ostale biljojede, kao što je, recimo, slučaj sa sekretornim kanalima u listovima biljke Rustia Formosa (Vieira et al, 2001). Etarsko ulje može služiti i kao nematocid (Oka et al., 2000, Choi et al., 2007) ili da ima antifungalne komponente kao što su nađeni kod estragona (Meepagala et al., 2002). Za ulje rizoma Solidago canadensis se pretpostavlja da ima potencijal u alelopatskoj supresiji kompetitora (Curtis and Lersten, 1990; Johnson et al., 2010) Unutrašnji sekretorni prostori ispunjeni uljem ili smolom su široko rasprotranjeni kod glavočika i najčešće se na zivaju 'dukti' ili 'kanali'. Združivanje sekretornih rezervoara sa floemom, kao što je slučaj u rizomu A. montana, je takođe uobičajeno kod biljaka iz familije Asteraceae (Lotocka i Geszprych, 2004; Lersten i Curtis, 1988; Curtis i Lersten, 1990). Međutim, postoje samo par objavljenih studija koje opisuju prisustvo uljnih rezervaoara u korenovima i adventivnim korenovima. Uljni kanali i šupljine su detaljno anatomski analizirane u korenovima Mikania cordifolia i M. sessilifolia, Trixis nobilis, Pterocaulon alopecuroides, Vernonia elegans i V. megapotamica (Asteraceae) (Cury and Appezzato-da-Glória, 2009) i u rizomima vrsta Rhaponticum carthamoides, Eupatorium rugosum i Solidago canadensis (Lotocka and Geszprych, 2004; Curtis and Lersten, 1986, 1990; Lersten and Curtis, 1987, 1989). U rizomu vrste Rhaponticum carthamoides sekretorni rezervoari su opisani kao kanali (Lotocka and Geszprych, 2004), dok se uljem ispunjeni sekretorni prostori u rizomu vrste Eupatorium rugosum smatraju tubularnim, obzirom da su značajno kraći od dukta, a očigledno duži od sferične ili ovalne šupljine (Curtis and Lersten, 1986). Ponekad se Diskusija Doktorska disertacija 177 oblici rezervoara mogu menjati u toku razvića, kao na primer u rizomu i korenu vrste Solidago altissima (Lersten and Curtis, 1987, 1989; Curtis and Lersten, 1990), gde se inicijalne tubularne šupljine u odmaklim fazama razvoja spajaju u jednu cev zahvaljujući distorziji i raskidu septi. Šupljine koje su prethodno opisivane u podzemnim organima familije Asteraceae su obično poravnate sa epetelom, kao što je slučaj u rizomima vrsta Solidago canadensis (Curtis and Lersten, 1990) i Eupatorium rugosum (Curtis and Lersten, 1986). Lotocka i Geszprych (2004) su u rizomu vrste Rhaponticum carthamoides pronašli sva sloja ćelija, epitel i omotač, koji okružuju rezervoare. Upoređujući stare i mlade rizome vrste Solidago canadensis, Curtis and Lersten (1990) su primetili da su epitelijalne ćelije u nivou uljnih šupljina u različitim fazama mitoze. Isti autori su takođe primetili da su mlade uljane šupljine, čak i samo delimično otvorene, sadržale sekterotne produkte, odakle su izvukli zaključak da se deobe ćelaija i proces sekrecije najverovatnije odvija simultano. Šizogeni intercelulari, obzirom da su inicijalno nastali deobom žlezdane ćelije, prostorno su poravnati sa sekretornim epitelijalnim ćelijama. Uljani rezervoari u korenu arnike su verovatno takođe šupljine, ali lumen intercelulara u korenovima nije okružen epitelijanim ćelijama. Kod korena vrste Solidago canadensis, takođe se nisu mogle uočiti epitelijalne ćelije oko uljanih šupljina (Curtis and Lersten, 1990). Šupljine u rizomu arnike su najverovatnije šizogenog porekla. U familiji Asteraceae, sekretorni rezervoari su najčešće karekterisani kao šizogeni (Curtis and Lersten, 1986), npr. u rizomima vrsta Solidago canadensis (Curtis and Lersten, 1990) i Eupatorium rugosum (Curtis and Lersten, 1986), ali je i lizogeno poreklo takođe prijavljeno (Rossi-Monteiro et al., 1994). Histohemijska analiza Histohemijski testovi su potvrdili uljanu strukturu sekterornih produkata u podzemnim organima arnike. Uljane naslage svežih preseka korena i rizoma ispitivanih pod UV zacima emitovale su difuznu i slabo svetlo-žutu autofluorescenciju, ukazujući time na prisustvo fenolnih jedinjenja u svom sastavu (Ruzin, 1999). U pogledu UV Diskusija Doktorska disertacija 178 autofluorescencije postoje samo nekoliko izveštaja rađenih na rizomu i korenu biljaka iz familije Asteraceae i svi oni pokazuju različite rezultate. Preseci korena Tagetes patula pokazali su plavo-žutu fluorescenciju pod UV spektrom, obzirom da sadrži tiofene u etarskom ulju (Poli et al, 1995). Takođe, u korenu vrste Santolina insularis epitelijum unutrašnjih sekretornih rezervoara i sami sekretorni produkti su emitovali svetlu žuto- plavufluorescenciju pod UV (365 nm), zahvaljujući prisustvu kumarina i flavonoida (Sacchetti et al., 1997). Autofluorescencija ispitivanih ulja bila je intenzivnija na talasnim dužinama od 450–490 nm i 515–580 nm nego pod UV spektrom (340–380 nm), što može biti objašnjeno hemijskim sastavom ulja. Obzirom da je hemijska analiza etarskih ulja u podzemnim organima arnike pokazala se sastoje uglavnom od aromatičnih ugljovodonika, koji su u osnovi fenolni (timolni) derivati, moguće je da ove komponente daju bolju fluorescenciju na drugim talasnim dužinama. Ovo otvara mogućnost za dalja istraživanja koja bi imala za cilj upotrebu ostale dve talasne dužine kao alatke za brzu detekciju srodnih komponenti u histohemijskim istraživanjima. 7.4. Hemijska analiza droga Određivanje sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona Analiza sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici arnike je urađena HPLC tehnikom po metodi opisanoj u VI evropskoj farmakopeji (PhEur 6.0). Identifikacija jedninjenja je izvršena poređenjem retencionih vremena (Slika 39), molekulskih masa dobijenih tehnikom tečno-masene hromatohrafije (Tabela 25) i UV spektara (Tabela 26) sa referentnim jedinjenjima iz prethodnih studija (Willuhn i Leven, 1991; Perry et al., 2009; Heldmaier, 2007; Douglas et al., 2004; Bilia et al., 2006, Staneva et al., 2010). Količine ukupnih seskviterpenskih laktona, izražene preko dihidrohelenalin tiglata (DHHT), su se u cvetnoj glavici arnike kretale od 7,7 – 13,2 mg/g (Grafik 76), u 2009. godini, odnosno od 4.6 – 13,9 mg/g (Grafik 77), u 2010. godini. Minimalne vrednosti DHHT u obe posmatrane godine bile su iznad farmakopejskog minimuma Diskusija Doktorska disertacija 179 kvaliteta od 4 mg/g (PhEur 6.0). Dobijeni podaci o sadržaju seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici arnike su u skladu sa prethodno publikovanim rezultatima (Tabela 42). Maksimalni ukupni sadržaj DHHT u ispitivanim uzorcima cvetnih glavica arnike sa ogleda (13.9 mg/g) prevazilazi najvišu literaturnu vrednost (13.4 mg/g) (Seeber et al., 1997). Ova maksimalna vrednost je dostignuta u uzorcima cvetnih glavica sa morfološki slabije razvijene varijante, vegetativno razmnožene biljke u bloku mineralnog đubrenja na prolećnom plotu sadnje (Grafik 77). Biljke vegetativno razmnoženih varijanti posađenih u proleće su se, kako je ranije objašnjeno (Diskusija 5.1.), slabije razvile od ostalih varijanti na ogledu. Takođe su biljke ovih varijanti formirale i najmanji broj cvetnih glavica po biljci (Grafik 28). Pojava da je sadržaj sekundarnih metabolita u biljnom materijalu negativno korelisan sa prinosom nije retka. Tako su Yang i sar. (2005) na primeru biljke Chisantemum coronarium pokazali da sa opadanjem prinosa dolazi do procentualno veće akumulacije seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici. Takođe, Sulpice i sar. (2009) ističu da je nivo većine biljnih metabolita u negativnoj korelaciji sa biomasom, a Ibrahim i sar. (2011) logiku veće akumulacije sekundarnih metabolita nalaze u poremećenom C/N odnosu, gde biljke usled nemogućnosti sinteze proteina, nakupljene organske materije iz fotosinteze akumliraju u vidu sekundarnih metabolita. U našem slučaju, gde su se biljke vegetativno razmnožene varijante u prolećnoj sadnji loše ukorenile, slabije koristile hranivo iz zemljišta i formirale mali broj organa, verovatno je da je došlo do veće akumulacije sekundarnih metabolita u malom broju formiranih cvetnih glavica. Tabela 42. Literaturni podaci o sadžaju ukupnih seskviterpenskuh laktona u cvetnoj glavici A. montana Izvor Ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona mg/g Hager ROM, 2002 2 - 8 Willuhn et al., 1995 3,1 – 10,2 Heldmaier, 2007 6,44 ± 0,15 Douglas et al., 2002 ~ 8,54 Seemann et al., 2010 5,9 – 11,0 Staneva et al., 2011 ~ 9,5 Spitaler et al., 2006 7,96 – 12,95 Seeber et al., 1997 7,5 – 13,4 Bomme, 1999 ~ 8,0 Diskusija Doktorska disertacija 180 Od indukovanih faktora na ogledu u 2009. godini statistički značajan uticaj na sadržaj DHHT je imao samo faktor vrste sadnica (Tabela 31). Uticaj đubrenja na variranje ukupnog sadržaja seskviterpenskih laktona nije bio značajan ni u jednoj od posmatranih godina (Grafik 78). Sličan kvalitativni odgovor dobili su Bomme i sar. (1995) u ogledima arnike sa azotnim đubrivima gde takođe nisu postojale statistički značajne razlike između tretmana. Izolovani odgovor u sadržaju DHHT na primenjena đubriva uočljiv je samo na primeru vegetativno razmnoženih biljaka u prolećnom plotu sadnje u trećoj vegetaciji (Grafik 77), ali pošto sledljivost takve značanosti nije bila zastupljena u prethodnoj godini (Grafik 76), niti je podržana značajnim razlikama između đubrenih blokova u prinosu cvetnih glavica ove varijante u 2010. godini (Grafik 47), verovatno je u pitanju slučajnost. U 2010. godini od faktora na ogledu statistički značajno su na variranje parametra sadržaja DHHT u cvetnoj glavici uticali vreme sadnje i vrsta sadnica (Tabela 31). Između posmatranih godina nije bilo statistički značajnih razlika u pogledu sadržaja DHHT (Grafik 79A), ali je faktor vremena sadnje statistički značajno uticao na variranje sadržaja DHHT u cvetnim glavicama arnike (Grafik 79B). Ova značajnost je očekivana obzirom na utvrđeni veći sadržaj DHHT u cvetnim glavicama slabije razvijenih biljaka iz vegetativne propagacije na plrolećnom plotu sadnje (Grafik 77). Uticaj faktora vrste sadnica na variranje ukupnog sadržaja seskviterpenskih laktona bio je značajan samo na prolećnom plotu sadnje (Grafik 80), što je posledica prethodno opisanog fenomena veće akumulacije DHHT u slabije razvijenim biljkama u varijantama vegetativne propagacije na prolećnom plotu sadnje. Ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona u cvetnoj glavici arnike, u obe posmatrane godine, bio je u statistički značajno negativno korelisan sa nivoom prinosa cvetne glavice (Grafik 81), ali je isto tako bio u negativnim korelacijama i sa većinom komponenata prinosa (Tabela 27). Sadržaj DHHT je sa prečnikom cvetne glavice samo u prvoj godini bio u statistički značajnoj pozitivnoj korelaciji, ali se ta veza u narednoj godini gubi. Sa brojem sekundrnih rozeta i prinosom podzemnih organa, sadržaj ukupnih seskviterpenskih laktona ni u jednoj posmatranoj godini nije imao statistički značejne korelacione veze. Sadržaj DHHT se po faktorskim opterećenjima, u prvoj posmatranoj godini (2009) značajno korelisao sa Faktorom 2 – „hemijske karakteristike cvetne glavice“ (Tabela 33; Grafik 89), dok se u 2010. godini grupisao u Faktor 1 – „komponente prinosa cvetne glavice“, ali sa jakim negativnim koeficijentom korelacije Diskusija Doktorska disertacija 181 r = -0.82 (Tabela 34; Grafik 91). Odavde se može zaključiti da je u većini slučajeva pozitivna promena u varijansi komponenti prinosa i prinosa cvetne glavice uticala na opadanje sadržaja DHHT. Sa priloženog hromatgrama (Slika 39) takođe se može zaključiti da su dominantna seskviterpenska jedinjenja helenalinskog tipa (helenalin metakrilat (2), helenalin izobutirat (3), helenalin tiglat (5) i helenalin-2-metilbutirilat (6)). Proporcije helenalinskih i dihidro helenalinskih estara mogu varirati u odnosu na geografsku širinu, tako arnika iz centralne Evrope sadrži uglavnom helenalinske estre, dok biljke iz španskih kolekcija sadrže uglavnom dihidro helenalinske estre (Willuhn et al., 1994). Perry i sar. (2009) upravo na španskim samoniklim arnikama pokazuju da su varijacije u sadržaju ova dva tipa seskviterpenskih laktona posledica nadmorske visine, gde biljke sa viših nadmorskih visina sadrže uglavnom helenalinske estre, a biljke iz nižih predela dihidrohelenalinske estre. Ovo je važno sa stanovišta farmakologije obzirom da se helenalin i dihidrohelenalinrazlikuju i po antiinflamatornoj aktivnosti i po alergenim sporednim efektima (Perry et al., 2009). Tinkrura arnike sa većim sadržajem helenalina se u nekoliko antiinflamatornih studija pokayala aktivnijom od tinkture sa visokim sadržajem dihidrohelenalina (Klaas et al., 2002). I u drugim biljkama familije asteraceae moguće je pronaći seskviterpenske laktone pseudoguanolidnog tipa. Tako je iz listova biljke Vernoniopsis caudata izolovan je 11α,13-dihidrohelenalin-[2-(1-hidroksietil)acrilat] čiji je ekstrakt pokazao antiplazmodijalnu aktivnost (Ramanandraibe et al., 2005), kao i helenalin iz vrsta Helenium sp. (Seaman, 1982). Sadržaj dominantnih fenolnih komponenti Fenolna jedinjenja su identifikovana poređenjem sa autentičnim referentnim jedinjenjima izolovanim iz arnike u prehodnim studijama (Merfort, 1984; Merfort i Wendisch, 1987; Spitaler et al., 2006) (Tabela 28). Od identifikovanih jedinjenja za određivanje sadržaja odabrana je jedna fenolna kiselina (hlorogenska kiselina) i dva dominantna flavonoida (kvercetin-3-O-glukozid i kempferol-3-O-glukozid). Pregled sadržaja odabranih fenolnih jedinjenja u cvetnoj glavici arnike dat je u Tabeli 29. Sadržaj hlorogenske kiseline se kretao od 3.1 – 6.0 mg/g (1.9 – 6.57 mg/g) u drugoj (odnosno trećoj) vegetaciji, kvercetin-3-O-glukozida od 8.4 – 13.9 mg/g (7.8 – Diskusija Doktorska disertacija 182 12.5 mg/g), a kemferol-3-O-glukozida od 2.1 – 4.7 mg/g (2.1 – 4.5 mg/g). Naši podaci su u saglasnosti sa prethodno publikovanom studijom Albert i sar. (2009) gde se sadržaj hlorogenske kiseline kretao od 4,4 – 6,7 mg/g, kvercetin-3-O-glukozida od 9,7 – 11,7 mg/g, a kemferol-3-O-glukozida od 2,2 – 3,7 mg/g. Ostali literaturni podaci koji se tiču sadržaja flavonoida i fenolnih kiselina u cvetnoj glavici arnike (Spitaler et. al., 2006; Ganzera et al., 2008; Aiello et al., 2012) navode samo sume sadržaja te dve grupe jedinjenja. Spitaler i sar. (2008) ispitivali su zavisnost nadmorske visine i sadržaja fenolnih komponenti u cvetnim glavicama gajene arnike. Pokazano je da se ukupni sadržaj fenola se povećava sa povećanjem nadmorske visine, a takođe se povećava i potencijal neutralizacije slobodnih radikala. Kvantifikovana jedinjenja su uobičajene komponente penolnog kompleksa biljaka iz familije Asteraceae, njihovo prisustvo je potvrđeno u prethodnim studijama (Krimplstätter et al., 2011; Lin and Harnly, 2010; Lai et al., 2007). Pojedini autori navode 3,5-dikafeoilhina kiselinu kao dominantnu fenolnu komponentu (Gouveia et al., 2013; Kim et al., 2012) koja je takođe identifikovana i u našim ekstraktima (Tabela 28), ali zbog teškoća u izolaciji čistog jedinjenja (standarda) nije kvantifikovana. Od indukovanih faktora na ogledu, faktor vrste sadnica je u 2009. godini statistički značajno uticao variranje svih fenolnih jedinjenja (Tabela 31), ali je interakcija između ovog faktora i faktora vrste đubrenja uticala na neispoljavanje statističke značajnosti u slučaju sadržaja kemperol-3-O-glukozida (Tabela 30). Faktor vrste đubrenja je, u ovoj godini, statistički značajno uticao na variranje sadržaja hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-glukozida (Tabela 31), međutim statistički veoma značajne su se pokazale i interakcije faktora vrste sadnica sa faktorom vrste đubrenja, tako da u pojedinačnoj analizi uticaj faktora đubrenja u ovoj godini nije bio statistički značajan (Grafici 82 i 83). U 2009. godini biljke arnike na ogledu su imale statistički veoma značajno viši sadržaj hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-β-D-glukozida, nego u 2010. godini, dok u slučaju sadržaja kempferol-3-O-β-D-glukozida nije bilo statistički značajnih razlika između posmatranih godina (Grafik 85). U trećoj vegetaciji (2010) fakrtor vremena sadnje nije imao uticaj na variranje sadržaja ni jednog od posmatranih fenolnih jedinjenja (Tabela 31) (Grafik 86). Uticaj faktora vrste sadnica, u ovoj godini, bio je stetistički značajan samo na sadržaj hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O- glukozida (Tabela 29). Faktor vrste đubrenja je, u 2010. godini, imao statistički Diskusija Doktorska disertacija 183 značajan uticaj na sadržaj svih proučavanih fenolnih jedinjenja (Tabela 31), ali se zbog značajne interakcije sa faktorom vrste sadnica, u slučaju kvercetin-3-O-glukozida, statistička značajnost ovog faktora nije ispoljila (Grafik 82). Uticaj faktora vrste đubrenja na variranje sadržaja fenolnih jedinjenja u cvetnim glavicama arnike je bio statistički značajan u drugoj posmatranoj godini, ali ne može izvući kvalitetan zaključak o uzročno-posledičnoj vezi đubrenja i ovog svojstva, obzirom da biljke đubrenih blokova, po sadržaju fenolnih jedinjenja, ni u jednoj godini nisu statistički značajno prevazilazile biljke iz kontrolnih varijanti, niti su kontrolne varijante bile prinosnije od đubrenih. Ibrahim i sar. (2011) navode da između sadržaja fenolnih jedinjenja u cvetnoj glavici Labisia pumila i dostupnosti azota u zemljištu postoji značajna negativna korelacija. Na osnovu naših rezultata nije se mogla izvući slična zakonitost u odnosu unetih hraniva u zemljište i sadržaja fenolnih jedinenja u cvetnoj glavici arnike. Faktor đubrenja je statistički značajano uticao samo na variranje sadržaja hlorogenske kiseline u drugoj posmatranoj godini (Grafik 82), gde sa varijanta iz bloka đubrenja stajskim đubrivom statistički značajno razlikovala od varijanti bloka mineralnog đubrenja i bloka kontrole. Većina istraživanja (Ibrahim et al., 2011; ) dovodi ukupni sadržaj fenolnih jedinjenja i koncentraciju mineralnog azota u zemljuštu u negativnu korelaciju (Ibrahim et al., 2011), tako da se u ovom slučaju ne može izvući jasan zaključak. Takođe je uočena i statistička značajnost uticaja faktora đubrenja na sadržaj kempferol-3-O-glukozida u 2010. godini, ali su u ovom slučaju biljke iz kontrolnog bloka imale viši sadržaj od biljaka iz bloka đubrenja stjanjakom, tako da se ova uslovljenost može smatrati nelogičnom, a uzroke treba tražiti u drugim indukovanim ili slučajnim faktorima i njihovim interakcijama. Faktor vremena sadnje nije značajno uticao na sadržaj ni jednog od posmatranih fenolnih jedinjanja (Grafik 19). U obe posmatrane godine faktor vrste sadnica je značajno uticao na variranje sadržaja hlorogenske kiseline i kvercetin-3-O-glukozida, gde su u oba slučaja generativno razmnožene varijante u proseku imale veći sadržaj u odnosu na varijante iz vegetativne propagacije (Grafik 19). Fenolna jedinjenja su se po svojim faktorskim opterećenjima, kako je pokazano u faktorskoj analizi (Grafici 89 i 91), izdvajala u poseban Faktor 2. U 2009. godini njima je bio pridružen i ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona, ali se taj parametar u 2010. godini po svom faktorskom opterećenju jako negativno korelisao sa Faktorom 1, Diskusija Doktorska disertacija 184 koji objašnjava varijansu prinosa i komponenata prinosa cvetne glavice (Tabela 33). Odavde se može zaključiti da na variranje tri kvantifikovane fenolne komponente nisu značajno uticale promene ostalih merenih parametara na ogledu. Jedinjenja koja su u ovom istraživanju kvantifikovana takođe su prisutna i u drugim biljkama familije Asteraceae (Apáti et al., 2004; Maas et al., 2008; Romani et al., 2002; EMEA 2008; Landa et al., 2009; Mendiondo et al., 2011; Saleh i Bohm, 1971), kao i u drugim familijama (Plazonić et al., 2009; Trute i Nahrstedt, 1997; Barros et al., 2012). Hemijski profili etarskih ulja rizoma i korena Rezultati hemijskog sastava ulja pokazuju da se dva jedinjenja 2,5-dimetoksi-p- cimen i timol metil etar mogu izdvojiti kao dominantna i oba su prepoznata kao derivati timola. Ovi nalazi su uskladu sa prethodno objavljenim podacima gde je prijavljeno da se glavna frakcija etarskog ulja sastoji uglavnom (82,5%) od etara, estara i tercijarnih alkohola, a prijavljeno je i prisustvo timol metil etra (Willuhn, 1972b). Ipak postoje velika neslaganja između hemijskog sastava ulja podzemnih organa A. montana prepoznatog u ovom radu (Tabela 32) i literaturnih podataka. Tako je Rohloff (2003) identifikovao manji broj komponenti (20) sa timol izobutiratom kao dominantnim jedinjenjem (20%), dok je timol metil etar bio prisutan u veoma maloj količini (1,6%). Ova neslaganja mogu biti posledica različitih tehnika korišćenih prilikom analize ulja. Do ovih nalaza, najkompletiniji izveštaj o etarskom ulju korena arnike dali su Weremczuk-Jezyna et al. (2011) gde su dve glavne komponente ulja bile prepoznate kao 10-izobutiriloksi-8,9-didehidro-timol izobutirat i 10-izobutiriloksi-8,9-didehidro timol metil etar. Slični hemijski sastavi etarskih ulja, sa ista dva aromatična ugljovodonika kao glavnim komponentama, su objavljeni za nadzemne delove različitih vrsta iz familije Asteraceae (Alilou et al., 2008; Owolabi et al., 2010; Tabanca et al., 2010). Za timolne derivate je poznato da ispoljavaju antimikrobnu i insekticidnu aktivnost (Stojakowska et al., 2005; Liang et al., 2007; Zhao et al., 2010, Tabanca et al., 2010). Etarsko ulje biljke Eupatorium capillifolium sa timol metil etar i 2,5-dimetoksi-p-cimen kao glavnim Diskusija Doktorska disertacija 185 komponentama je pokazalo insekticidnu aktivnost (Tabanca et al., 2010). Jaka antifungalna aktivnost je zabeležena kod etarskog ulja biljke Bubonium imbricatum koja ima sličan hemijski sastav kao ulje arnike (Alilou et al., 2008). Aeschbach et al. (1994) su pokazali da timol poseduje korisna antioksidativna svojstva nakon čega su predložili da se uvrsti u dodatke hrani. Svi pomenuti rezultati ukazuju na mogućnost da i etarsko ulje podzemnih delova A. montana poseduju antimikrobnu, insekticidnu i antioksidativnu aktivnost. Prema literaturnim podacima, arnika u cvetnim glavicama sadrži manje od 0.1 % etarskog ulja, čije su glavne komponente seskviterpeni (oko 50%), dok su aromatična jedinjenja slabije zastupljena (Ristic et al. 2007). Ovakva velika hemiska različitost između etarskog ulja nadzemnih i podzemnih organa nije neobična u familiji Asteraceae. Prema Metcalfe i Chalk (1950) sekretorni kanali kod glavočika, koji se javljaju u stabljici i korenu iste vrste, nastaju kao dva odvojena sistema i do uginuća ostaju razdvojeni do kraja životnog ciklusa biljke. 7.5. Međusobni odnosi testiranih karakteristika Faktorskom analizom prinosa, morfoloških i hemijskih parametara, utvrđeno je da pojedine osobine dele zajedničku varijansu (Tabele 33 i 35). Od najvećeg značaja u ovom istraživanju je svakako parametar prinosa cvetne glavice, uz koji se grupisao određeni broj merenih svojstava. Obzirom da je polazna matrica za izradu faktorske analize bila korelaciona, za očekivati je bilo da su parametri sa visokim vrednostima korelacionih koeficijenata u vezi sa prinosom cvetne glavice odgovorni za variranje ovog svojstva. U grafičkim prikazima faktorskih opterećenja, obe posmatrane godine, moguće je uočiti grupisanje određenih morfoloških parametara oko parametra prinosa cvetne glavice (Grafici 89 i 91). Iz ove analize se može zaključiti da u formiranju prinosa cvetne glavice najveći doprinos daju parametri: prečnik rozete, visina cvetnog izdanka, broj cvetnih izdanaka i broj cvetnih glavica po biljci. Sekvencionalno razdvajanje svih varijanti zasnivanja po poželljnim osobinama prinosa i hemijskog sastava cvetne glavice rezultiralo je rangiranjem u kojem prva tri mesta zauzimaju đubrene varijante iz jesenjeg zasnivanja (Tabela 37). Već na ovom nivou moguće je uočiti relativan doprinos faktora vrste sadnica na jesenjm plotu sadnje, Diskusija Doktorska disertacija 186 obzirom na činjenicu da je prvi rang (I) dodeljen generativno razmnoženoj varijanti (JOG), a već drugi (II) varijanti vegetativne propagacije (JMV). Na sledeća dva rangirana mesta nalaze se generativno razmnožena varijanta u bloku đubrenja stajskim đubrivom iz prolećnog zasnivanja (POG) i varijanta generativnog razmnoževanja u kontrolnom bloku đubrenja na jesenjem plotu sadnje (JKG). Ova dva ranga (IV i V) ukazuju na prekid kontinuiteta ranga jesenjeg plota sadnje uplivom prolećno sađene varijante (POG) koja odskače po visokom sadržaju kvantifikovanih fenolnih jedinjenja (Tabela 29), ali takođe i na visoko rangiranu varijantu iz kontrolnog bloka đubrenja (JKG) koja se odlikuje visokim sadržajem kvantifikovanih flavonoida (F1 i F2) (Tabela 29). Najslabije rangirane su bile varijante vegetativnog razmnožavanja u prolećnom terminu sadnje (X – XII), što je bilo i očekivano obzirom na odabir prinosa kao najvažnije osobine u ovoj sekvencijalnoj klasifikaciji i nivo postignutih prinosa ove tri varijante (Grafici 45 i 47). U donošenju odluke za preporučeni model gajenja može se koristiti i princip izolovanog posmatranja prinosa, budući da su sve varijante zasnivanja zadovoljile farmakopejski minimum kvaliteta (Grafici 76 i 77). Kao rezultat ovakvog pristupa u drugoj godini posmatranja (2010), mogli bi se odlučiti za najprinosnije varijante (JMG, JOG i JOV), a kao tehnološki najjeftinija varijanta zasnivanja sa visokim prinosom cvetne glavice mogla bi se izdvojiti varijanta vegetativnog razmnožavanja biljaka đubrena stajskim đubrivom u jesenjm roku sadnje (JOV). Prinosi podzemnih organa arnike i sadržaj etarskokg ulja nisu uzimani u obzir prilikom opredeljivanja za preporučeni model, obzirom da se radi o sporednim sirovinama. Sistematizovan prikaz rangiranja po prinosima cvetnih glavica i kvantifikovanih sekundarnih metabolita dat je na Slici 50. Diskusija Doktorska disertacija 187 Slika 50. Rangirani modeli zasnivanja plantaže arnike po prinosima u 2010. godini 7.6. Biološki efekti Ispitivanje sposobnosti neutralizacije DPPH radikala U ispitivanju antioksidativne aktivnosti ekstrakata cvetnih glavica arnike veću sposobnost neutralizacije DPPH radikala imao je ekstrakt sa maksimalnom vrednošću sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona (SL max) u odnosu na ekstrakt sa Diskusija Doktorska disertacija 188 minimalnom vrednošću (SL min), dok su razlike u antioksidativnoj aktivnosti esktrakata sa maksimalnom (F max) i minimalnom (F min) vrednošću sadržaja tri kvantifikovana fenolna jedinjenja su bile neznatne. Na ovom nivou istraživanja se može zaključiti da esktrakt sa većom koncentracijom seskviterpenskih laktona poseduje veći potencijal neutralizacije slobodnih radikala. Budući da su fenolna jedinjenja ispoljavaju širok spektar aktivnosti (Janković, 2005; Zheng i Wang, 2001; Hossein Goli et al. 2012; Saravanakumar et al. 2009; Wojdylo et al. 2007) i zbog sposobnosti flavonoida da redukuju slobodne radikale kao što su superoksid, peroksil, alkosil i hidroksil radikali (Pietta, 2000), očekivalo se da razlika između antioksidativne aktivnosti ekstrakta koji je imao najveću sumu kvantifikovanih jedinjenja (F max) i ekstrakta sa najmanjim sadržajem (F min) biti izražena. Međutim aktivnosti ova dva ekstrakta su bile gotovo ujednačene. Razlog ovako slabo izraženoj razlici u aktivnostima najverovatnije leži u sumi nekvantifikovanih fenolnih jedinjenja u oba ekstrakta, koje su takođe iskazivale aktivnost. Utoliko pre što nije utvrđen sadržaj ranije prijavljenog najaktivnijeg fenolnog jedinjenja, hispidulina (Schilcher et al., 2007). Antimikrobna aktivnost U poređenju antimikrobnih aktivnosti ekstrakata cvetne glavice arnike može se zaključiti da su ekstrakti seskviterpenskih laktona i ekstrakti fenolnih jedinjenja pokazali približno istu aktivnost. Razlike u aktivnostima između ekstrakata sa maksimalnim i minimalnim sadržajem određene grupe jedienjenja su bile očigledne (Tabela 39). U slučaju ekstrakta sa maksimalnim sadržajem ukupnih seskviterpenskih laktona (SL max) MIC vrednosti za sve posmatrane mikroorganizme su bile niže od MIC vrednosti za ekstraks sa minimalnim sadržajem (SL min), što je bilo i očekivano obzirom na ranije prijavljenu antimikrobnu aktivnost SL (Giesbrecht et al. 1990; Neerman, 2003; Chaturvedi, 2011) Ekstrakt sa maksimalnim sadržajem tri kvantifikovana fenolna jedinjenja (F max) je pokazao veću antimikrobnu aktivnost od ekstrakta sa minimalnom vrednošću (F min) kod osam od dvanaest mikroorganizama, dok je za tri Gram pozitivne bakterije (B. subtilis, M. luteus, M. flavus) ispoljio nižu aktivnost. Iz Tabele 39 takođe se može zaključiti da je koliformna (indikator fekalnog zagađenja) bakterija E. coli ujednačeno reagovala na sve testirane ekstrakte i da je MIC uniformno iznosila 5 ul/ml. Ovo nam ukazuje da bi se testirani ekstrakti potencijalno mogli koristiti kao prirodno antimikrobno sredstvo u eliminaciji ove patogene bakterije Diskusija Doktorska disertacija 189 koja je u ranijim istraživanjima izolovana i identifikovana sa pojedinog lekovitog bilja. Stević (2009) je konstatovala čestu kontaminaciju uzoraka koprive, zdravca, pitome nane i drugih biljaka, ovom bakterijom. Pretpostavka je da kontaminacija potiče od sporadičnih tečnih ekskremenata domaćih životinja tokom ispaše (S. Tasić, usmena komunikacija). Literaturni podaci takođe potvrđuju da ekstrati cvetne glavice arnike mogu ispoljiti baktericidna svojstva protiv Listeria monocytogenes i Salmonella typhimurium (Leung, 1980). Takođe je utvrđeno da helenalin i srodni seskviterpeni poreklom iz arnike imaju antimikrobno djelovanje protiv Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Corynebacterium insidosum, Micrococcus roseus, Mycobacterium phlei, Sarcinia lutea i Proteus vulgaris (Lee et al., 1977). Ista grupa autora navodi da helenalin pokazuje antifungalnu aktivnost protiv Trichophyton mentagrophytes, Epidermaphyton spp. i Botrytis cinerea. Antimikrobna aktivnosta etarskih ulja rizoma i korena arnike prikazana u Tabeli 40 je bila očekivana utoliko što su fenolna jedinjenja poznata kao antimikrobni agensi. Komponente fenolnih struktura, kao što su karvakrol, eugenol i timol, važe za vrlo aktivne u antimikrobnim testovima (Dorman i Deans, 2000). Jedinjenja koja pripadaju ovoj klasi su poznate kao baktericidni ili bakteristatični agensi zavisno od primenjene koncentracije (Pelczar et al., 1988). Ova jedinjenja su jako aktivna uprkos njihovoj relativno maloj rastvorljivosti u vodi, što je u potvrđeno u prethodnim istraživanjima (Shapiro et al., 1994; Meena i Sethi 1994; Jeongmok et al., 1995). Jaku aktivnost fenolnih jedinjenja je moguće objasniti alkilnom supstitucijom u fenolnom jezgru, za koju je poznato da povećava antimikrobnu aktivnost fenola (Pelczar et al., 1988). Budući da su se testirana ulja u ovom istražianju razlikovala u sumi fenolnih jedinjenja oko 10% kod ulja rizoma (12,6% kod ulja korena), očekivana veća antimikrobna aktivnost se ispoljila na sve testirane mikroorganizme, osim na C. albicans (Tabela 40). Odavde se može zaključiti da ulja korena i rizoma arnike mogu poslužiti kao dobri baktericidi, ali ne i kao dobri fungicidi. Zaključak Doktorska disertacija 190 8. ZAKLJUČAK Kultivacija alohtone vrste Arnica montana u cilju dobijanja kvalitetne sirovine Arnicae flos za farmaceutsku industriju, u agroekološklim uslovima Srbije je moguća. Testirajući različite modele zasnivanja plantaže nakon trogodišnjeg posmatranja i analize dobijenih sirovina doneti su sledeći zaključci: #1 Plantažnim gajenjem arnike u agroekološkim uslovima Srbije može se dobiti do 300 kg/ha kvalitetne sirovine Arnicae flos i oko 1000 kg/ha podzemnih organa iz kojih se može destilacijom dobiti oko 30 l etarskog ulja bogatog aromatičnim jedinjenjima. #2 Hemijskom analizom ekstrakata cvetne glavice utvđeno je da ukupni sadržaj seskviterpenskih laktona kod svih testiranih varijanti zadovoljava kriterijum kvaliteta propisan Evropskom farmakopejom, ali i da poseduju značajan nivo pojedinih fenolnih jedinjenja (hlorogenske kiseline, kvercetin-3-O-glikozida i kempferol-3-O-glukozida). #3 Proučavajući biologiju formiranja prinosa cvetne glavice, ustanovljene su mnoge jake korelacione veze između posmatranih osobina, a kao komponente prinosa prepoznata je grupa osobina čije variranje vrednosti u velikoj meri utiče na variranje prinosa cvetne glavice. U tu grupu spadaju sledeća svojstva: prečnik rozete, visina cvetne stabiljike, broj cvetnih stabljika i broj cvetnih glavica po biljci. #4 Mikroskopskom analizom sprašene droge i tehnikom tankoslojne hromatografije ustanovljena je brza i jednostavna metoda za identifikaciju cvetne glavice arnike u odnosu na dva pretpostavljena falsifikata C. officinalis i D. columnae. Po istom principu u daljem istraživanju može se obraditi serija biljaka koje se u prometu lekovitih sirovina makroskopskim pregledom teško razlikuju od Arnicae flos. #5 U ispitivanju antioksidativne aktivnosti ekstrakata cvetnih glavica arnike veću sposobnost neutralizacije DPPH radikala imao je ekstrakt sa maksimalnom vrednošću sadržaja ukupnih seskviterpenskih laktona u odnosu na ekstrakt sa minimalnom vrednošću, dok su razlike u antioksidativnoj aktivnosti esktrakata sa maksimalnom i minimalnom vrednošću sadržaja tri kvantifikovana fenolna jedinjenja su bile neznatne. Testirani ekstrakti ispoljili su i antimikrobnu Zaključak Doktorska disertacija 191 aktivnost, gde su minimalne vrednosti za inhibiciju rasta devet sojeva bakterija i jednog kvasca u većini slučajeva bile niže kod ekstrakata sa većim sadržajem sekundarnih metabolita. Antimikrobna aktivnost etarskih ulja je bila selektivna, gde su MIC vrednosti za određene mikroorganizme bile izuzetno male, dok je kvasac Candida albicans bio visoko rezistentan na sva testirana etarska ulja. Budući da odabrani ekstrakti sa maksimalnim sadržajem tri odabrana fenolna jedinjenja nisu imala značajno veću biološku aktivnost u odnosu na ekstrakt sa minimalnim sadržajem, a da je to sudeći po literaturnim podacima bilo za očekivati, u daljim istraživanjima trebalo bi akcenat staviti na izolovanje i kvantifikaciju preostalih jedinjenja iz fenolnog kompleksa, kao i njihove pojedinačne antioksidativne i antimikrobne aktovnosti. #6 Podzemni organi arnike sadrže značajne količine etarskog ulja u kojima dominiraju fenolna jedinjenja. Ulje se sintetiše u epitelijalnim ćelijama kortikalnog parenhima odakle se izlučuje u intercelulare koji se u daljem razviću spajaju u kanale. #7 Model zasnivanja plantaže arnike na proleće iz vegetativnih sadnica se pokazao kao nepoželjan zbog uznapredovale generativne faze razvića sadnica koja je uslovila lošije ukorenjavanje ovih varijanti i veliki procenat uginuća biljaka. Kao najpovoljniji model zasnivanja pri sekvencijalnoj klasifikaciji, baziranoj na visini prinosa i kvalitetu cvetne glavice, izdvojena je varijanta generativnog razmnožavanja u bloku đubrenja stajskim đubrivom posađena na jesen. Obzirom da je nivo postignutog prinosa cvetne glavice ispod svetskog proseka, a da se u ovom istraživanju pokušalo odgovoriti samo na neka od agrotehničkih pitanja, dalja istraživanja bi trebalo da obuhvate testove gajenja na različitim nadmorskim visinama i različitim tipovima zemljišta. Takođe, u cilju pojeftinjenja proizvodnje, poželjno bi bilo razmotriti opcije mehanizovane berbe cvetnih glavica specijalizovanim beračima, obzirom da utrošak radne snage prilikom ručnog branja nije zanemarljiv. Literatura Doktorska disertacija 192 9. LITERATURA Adams, R.P. (2007) Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography / Mass Spectrometry. 4th ed. Allured Publishing Corp., Carol Stream, Illinois. Albert, A., Sareedenchai, V., Heller, W., Seidlitz, H.K. and Zidorn, C. (2009) Temperature is the key to altitudinal variation of phenolics in Arnica montana L. cv. ARBO, Oecologia, 160, pp. 1-8. Apáti, P., Houghton, P.J. and Kéry, A. (2004) HPLC investigation of antioxidant components in Solidago herba, Acta Pharm Hung., 74, pp. 223-31. Assyov, B., Petrova, A., Dimitrov, D. and Vassilev, R. (eds) (2006) Conspectus of the Bulgarian vascular flora, Distribution maps and floristic elements, p 452., Bulgarian—Swiss Biodiversity Conservation Program, 2nd edn. BSBCP, Sofia. Austin, D.F. (2004) Arnica in: Florida Ethnobotany, pp. 110 – 111, CRC Press. Balabanova, V., Vitkova, A. (2010) Pecularities in ontogenesis of Arnica montana L. in Bulgaria. Comptes Rendus de l'Académie Bulgare des Sciences, 2, pp. 1301- 1306. BAz (1984) Arnica flos, Arnikablüten, Bundesanzeiger, 5.12.1984., Heftnummer: 228., ATC-Code: D03CA. Monographie BGA/BfArM (Kommission E). Baricevic, D. and Rode, J. (2000) Directives of the national program on medicinal and aromatic plants in Slovenia, Proceedings, pp. 12-14, 1st CMAPSEEC, May 29 - June 3, 2000, Aranđelovac, FR Yugoslavia. Barros, L., Dueñas, M., Carvalho, A.M., Ferreira, I.C. and Santos-Buelga, C. (2012) Characterization of phenolic compounds in flowers of wild medicinal plants from Northeastern Portugal, Food Chem Toxicol., 50, pp. 1576-82. Bentham, G. (1873). Notes on the classification, history, and geographical distribution of Compositae, J. Linn. Soc. Bot., 13, pp 335-557. Bezzi, A. and Ghidini, G. (1989) Prime esperienze di coltivazione di Arnica montana L. sulle Alpi meridionali e sull'Appennino settentrionale, Estratto Dagli Annali, Vol. XI, pp. 306-320, Nuova Stampa Rapida, Trento. Literatura Doktorska disertacija 193 Bilia, A.R., Bergonzi, M.C., Mazzi, G. and Vincieri F.F. (2006) Development and stability of semisolid preparations based on a supercritical CO2 Arnica extract, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, pp. 449-454. Bioforce Monograph: Arnica montana L. (AtroMed/Rheuma-Gel), A. Vogel, Switzerland, Source: http://www.avogel.ca/downloads/Studies/Monography- Absolut-Arnica.pdf Blatt für Sortenwesen (2010), Bundessortenamt, pp. 80, Osterfelddamm, Hannover. Bomme, U. (1991) Arnika kann jezt auch feldmäßig angebaut werden, Aktuelles für den Landwirt., 1, pp. 5. Bomme, U. (1999) Anbau und Ziichtung von Arnica montana L. Zeizschrift fur Arznei- und Gewurzpflanzen, 4, pp. 202-203. Bomme, U., Mittermeier, M., Regenhardt, I. (1995) Ergebnisse zur Entwicklung eines Verfahrens für den feldmäßigen Anbau von Arnica montana L. (2. Mitteilung), Drogenreport, 8, pp. 3-11. Bomme, U. and Daniel, G. (1994) First results on selection breeding of Arnica montana L. Gartenbau- wissenschaft, 59, pp. 67-71. Bown, D. (2001) Herbal: the essential guide to herbs for living. Pavillion, London. Bruelheide, H. (2003) Translocation of a montane meadow to simulate the potential impact of climate change, Applied Vegetation Science, 6, pp. 23-34. Bruelheide, H. and Scheidel, U. (1999) Slug herbivory as a limiting factor for the geographical range of Arnica montana, Journal of Ecology, 87, pp. 839-848. Cai, Y., Luo, Q., Sun, M. and Corke, H. (2004) Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer, Life Science, 74, pp. 2157-84. Candolle, A.P. (1837) Prodromus systemati naturalis regni vegetabilis sive enumeratio contracta ordinum, generum specierumque plantarum huc usque cognitarum, juxta methodi naturalis normas digesta, 6, pp. 316-318, Treuttel et Würtz., Paris. Carmines, E. and Zeller, R. (1979) Reliability and Validity Assessment, Sage Paper Series on Quantitative Applications No. 07-017, Beverly Hills, CA: Sage Publications Inc. Literatura Doktorska disertacija 194 Chang, H.C., Ouk, K.H., Young H.C., Seung G.Y. (1998) Effect of fertilization rates on growth, root yield and essential oil composition in Korean valerian (Valerianafauriei var. dasycarpa Hara), Korean Journal of Crop Science, 42, pp. 814–820. Chaturvedi, D. (2011) Sesquiterpene lactones: structural diversity and their biological activities. In: Tiwari, V., Mishra, B., (eds.) Opportunity, Challenge and Scope of Natural Products in Medicinal Chemistry, pp. 313–334, Kerala, India, Research Signpost. Choi, I.H., Park, J.Y., Shin, S.C., Kim, J. and Park, I.K., (2007) Nematicidal activity of medicinal plant essential oils against the pinewood nematode (Bursaphelenchus xylophilus), Applied Entomology and Zoology, 42, pp. 397-401. Clark, G. (1981) Staining procedures. Williams&Wilkins, Baltimore. Craciunescu, O., Constantin D, Gaspar A, Toma L, Utoiu E and Moldovan L. (2012) Evaluation of antioxidant and cytoprotective activities of Arnica montana L. and Artemisia absinthium L. ethanolic extracts, Chemistry Central Journal, 6, pp. 97. Curtis, J.D. and Lersten, N.R. (1986) Development of Bicellular Foliar Secretory Cavities in White Snakeroot Eupatorium rugosum (Asteraceae), American Journal of Botany, 73, pp. 79-86. Curtis, J.D. and Lersten, N.R. (1990) Oil reservoirs in stem, rhizome, and root of Solidago canadensis (Asteraceae, tribe Astereae). Nordic Journal of Botany, 10, pp. 443-449. Cury, G. and Appezzato-da-Glória, B. (2009) Internal secretory spaces in thickened underground systems of Asteraceae species, Australian Journal of Botany, 57, pp. 229-239. Dachler, M und Pelzmann, H. (1999) Arznei- und Gewürzpflanzen Anbau, Ernte, Aufbereitung. Klosterneuburg: Oesterreichischer Agrarverlag. Deutschmann, F., Hohmann, B., Sprecher, E. und Stahl E. (1979) Arnicae flos - Arnikablüten In: Pharmazeutische Biologie 3, Drogenanalyse I: Morphologie und Anatomie, pp. 101-104, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart – New York. Delabays, N. and Mange, N. (1991) Culture of Arnica montana L.: the agronomy and plant protection, Rev Suisse Vitic Arboric Hortic., 23, pp. 313–319. Literatura Doktorska disertacija 195 Dioscoridis, P. (1552) Anazarbei, De medicinali materia libri sex /Ioanne Ruellio Suessionensi interprete, s.3.p.144, Publication info: Lugduni :Apud Balthazarem Arnolletum. Dobelis, I. (1986) Magic and Medicine of Plants, Pleasantville, NY: Reader’s Digest Association, Inc. Dorman, H.J.D. and Deans S.G. (2000) Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils, Journal of Applied Microbiology, 88, pp. 308–316. Douglas, J.A., Smallfield, B.M., Burgess, E.J., Perry, N.B., Anderson, R.E., Douglas, M.H., Glennie, V.L. (2004) Sesquiterpene lactones in Arnica montana: a rapid analytical method and the effects of flower maturity and simulated mechanical harvesting on quality and yield, Planta Medica, 70, pp. 166-170. Duke, J., Bogenschutz, du Cellier, and Duke, P (2002) Handbook of Medicinal Herbs 2nd ed., CRC Press, Boca Raton, Florida. Džamić, R.A., Stevanović, D., Jakovljević, M. (1996) Praktikum iz agrohemije. Beograd: Poljoprivredni fakultet. Ebert, M., Merfort, I. and Willuhn, G. (1988) Flavonoid Distribution in Arnica Subgenera Montana and Austromontana, Phytochemistry, 27, pp. 3849-52. Ekenäs, C. (2008) Phylogenies and Secondary Chemistry in Arnica (Asteraceae), Dissertation, Faculty of Science and Technology, Universitatis Upsaliensis, Uppsala, Sweden. EMEA (2008) European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use: ASSESSMENT REPORT ON SOLIDAGO VIRGAUREA L., HERBA, Doc. Ref. EMEA/HMPC/285759/2007, Canary Wharf, London, E14 4HB, UK. Eschrich, W. (1979) Flores Arnicae - Arnikablüten In: Pulver-Atlas der Drogen des Deutschen Arzneibuches, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart-New York. Evstatieva, Lj.N., Todorova, M.N. and Petrova, M.I. (2012) Vegetative cultivation of Arnica montana L. in Bulgaria, Proceedings of 7th Conference on Medicinal and Aromatic Plants of Southeast European Countries (CMAPSEEC), 27-30 May 2012, Subotica, Serbia. Ezz El-Din, A. and Hendawy, S.F. (2010) Comparative Efficiency of Organic and Chemical Fertilizers on Herb Production and Essential Oil of Lovage Plants Grown in Egypt, American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 8, pp. 60-66. Literatura Doktorska disertacija 196 Fenaroli, G. (1963) Sostanze aromatiche naturali, (Vol. I), [Ed.] Ulrico Hoepli, Milano. Ferguson, I. K. (1976) Arnica. L. In: Tutin, T.G. et al. [Eds.] Flora Europaea, pp. 189– 190. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Fernandez, G. (2007) Design and analysis of commonly used comparative horticultural experiments, HortScience 42, pp. 1052–1069. Furr, Y., Mahlberg, P.G. (1981) Histochemical analysis of laticifers and glandular trichomes in Cannabis sativa, Journal of Natural Products, 44, pp. 153-159. Gajić, M. (1975) Fam. Asteraceae u: Flora SR Srbije (Redakcioni odbor: Josifović, M., Stjepanović, L., Kojić, M. i Nikolić, V), VII tom, str. 1-465, Srpska akademija nauka i umetnosti, Beograd. Galambosi, B. (2000) Acclimatization studies with cold tolerant medicinal plants in Finland. In: Speciality chemicals for the 21st century, ADEME/IENICA International Seminar: Intermediary products, Cosmetics and perfumes, Medicinal applications, 16 - 17 September 1999, Valbonne, France, pp. 104-113. Galambosi, B. (2004) Introduction of Arnica montana L. in Finland. Zeizschrift fur Arznei- und Gewurzpflanzen, 4, pp. 174-180. Galambosi, B., Sz-Galambosi, Zs., Svoboda, K.P. and Deans, S.G. (1998) Flower Yield and Antioxidant Properties of Arnica montana L. Grown in Finland, Drogenreport, Jg.11, 19, pp. 10-13. Ganzera, M., Egger, C., Zidorn, C. and Stuppner, H. (2008) Quantitative analysis of flavonoids and phenolic acids in Arnica montana L. by micellar electrokinetic capillary chromatography, Anal Chim Acta, 614, pp. 196–200. García-Piñeres, A.J., Castro, V., Mora, G., Schmidt, T.J., Strunck, E., Pahl, H.L. and Merfort, I. (2001) Cysteine 38 in p65/NF-kappaB plays a crucial role in DNA binding inhibition by sesquiterpene lactones, J. Biol. Chem., 276, pp. 39713-20. Gawlik-Dziki, U., Swieca, M., Sugier, D. and Cichocka, J.(2011) Comparison of in vitro lipoxygenase, xanthine oxidase inhibitory and antioxidant activity of Arnica montana and Arnica ahamissonis tinctures, Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus, 10, pp. 15-27. Giesbrecht, A.M., Davino, S.C., Nassis, C.Z., Young, M.C., Lopes, J.L.C., Rodrigues, D.C., Vichnewski, W., Nasi, A.M.T.T., Dias, D.A. and Lopes, J.N.C. (1990). Antimicrobial activity of sesquiterpene lactones. Quím. Nova, 13, pp. 312-314. Literatura Doktorska disertacija 197 Geissman, T.A. and Griffin, T.S. (1971) Sesquiterpene lactones: acid - catalysed color reactions as an aid in structure determination, Phytochemistry, 10, pp. 2475- 2485. Gouveia, S., Gonçalves, J. and Castilho C.P. (2013) Characterization of phenolic compounds and antioxidant activity of ethanolic extracts from flowers of Andryala glandulosa ssp. varia (Lowe ex DC.) R.Fern., an endemic species of Macaronesia region, Industrial Crops and Products, 42, pp. 573–582. Guerin, H.P., Delaveau, P.G. and Paris, R.R. (1971) Localiiations histochemiques 11: procedes simples de localisation de pigments Bavoniques. Application a quelques Phanerogames, Bulletin de la Sociiti botanigue de France, 118, pp. 29- 36. Güntzel, U., Seidel, F. and Kating, H. (1967) Studies on the contents of Arnica-species. I. Content on essential oil in the flowers of different Arnica-species, Planta Med, 15, pp. 205–214. Hadživuković, S., (1991) Statistički metodi s primenom u poljoprivredi i biološkim istraživanjima. Drugo prošireno izdanje, Ogledi s višegodišnjim zasadima, pp. 328., Poljoprivredni fakultet, Institut za ekonomiku poljoprivrede i sociologiju sela, Novi Sad. HagerROM (2002) Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe: [Eds.] W. Blaschek, S. Ebel, E. Hackenthal, U. Holzgrabe, K. Keller, J. Reichling, [Ass.] H.-D., Höltje, Mehrplatzversion/Windows/Update (German Edition) [CD-ROM] Heeger, E.F. (1956) Handbuch de Arznei- und Gewürzpflanzenbaus, pp. 19-42, Berlin: Deut-scher Bauernverlag. Heldmaier, M. (2007) Phytochemische Charakterisierung öliger Extrakte aus pflanzlichen Drogen. Dissertation. Hamburg. Herz, W. and Sosa, V.E. (1988) Sesquiterpene lactones and other constituents of Arnica acaulis, Phytochemistry, 27, pp. 155-159. Hochmuth, D. (2006) MassFinder 3: GC/MS visualisation, interpretation, and library Administration mass spectral library “Terpenoids and related constituents of essential oils”, 1999–2006, Hamburg, Germany. Hoffmann, O. (1894) Compositae In: Engler A, Prantl K (Hrsg.) Die natürlichen Pflanzenfamilien, Bd. 4, pp. 87–391, Verlag W. Engelmann, Leipzig. Literatura Doktorska disertacija 198 Hossein Goli, S., Mokhtari, F. and Rahimmalek, M. (2012) Phenolic Compounds and Antioxidant Activity from Saffron (Crocus sativus L.) Petal, Journal of Agricultural Science, 4, pp. 175-181. Hulland, J. (1999) Use of Partial Least Squares (PLS) in Strategic Management Research: A review of four recent studies, Strategic Management Journal, 20, pp. 195-204. Ibrahim, M.H., Jaafar, H.Z., Rahmat, A., Rahman, Z.A. (2011) Effects of nitrogen fertilization on synthesis of primary and secondary metabolites in three varieties of kacip fatimah (Labisia pumila blume), International Journal of Molecular Sciences, 12, pp. 5238-5254. Iauk, L., Lo Bue, A.M., Milazzo, I., Rapisarda, A. and Blandino, G. (2003) Antibacterial activity of medicinal plant extracts against periodontopathic bacteria, Phytother Res., 17, pp. 599–604. Ibrahim, M.H., Jaafar, H.Z., Rahmat, A., Rahman, Z.A. (2011) Effects of nitrogen fertilization on synthesis of primary and secondary metabolites in three varieties of kacip fatimah (Labisia pumila Blume). Int. J Mol. Sci., 12, pp. 5238-54. Ivanović B. (1977) Classification Theory, Institut za ekonomiku industrije, Beograd, (in Serbian). Janković, T. (2005) Uporedno ispitivanje hemijskog sastava biljnih vrsta roda Gentianella, Doktorska disertacija, Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu. Jensen, W.A. (1962). Botanical Histochemistry - principles and practice. W. H. Freeman and Co., University of California, Berkeley. Jenelten, U. and Feller, U. (1992) Mineral nutrition of Arnica montana L. and Arnica chamissonis ssp. foliosa maguire: Differences in the cation acquisition., Journal of Plant Nutrition, 15, pp. 2351 – 2361. Jeongmok, K., Marshall, M.R. and Wei, C. (1995) Antibacterial activity of some essential oil components against five foodborne pathogens. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43, pp. 2839–2845. Johansen, D.A. (1940). Plant microtechnique. McGraw-Hill, New York, London. Johnson, R.H., Halitschke, R. and Kessler, A. (2010) Simultaneous analysis of tissue- and genotype-specific variation in Solidago altissima (Asteraceae) rhizome Literatura Doktorska disertacija 199 terpenoids, and the polyacetylene dehydromatricaria ester, Chemoecology, 20, pp. 255-264. Kalynyak, P.P., Trofymyak, T.B., Komisarenko, M.F. and Blyum, Y.B. (1995) Production of callus lines for plants from Arnica genus and analysis of their biosynthetic activity, Dopov Natsional Akad Nauk Ukrayiny, 9, pp. 107–110. Kathe, W. (2006) Conservation of Eastern-European Medicinal Plants: Arnica montana in Romania in R.J. Bogers, L.E. Craker and D. Lange (eds.), Medicinal and Aromatic Plants, pp. 203-211. © 2006 Springer. Printed in the Netherlands. Kating, H. and Seidel, F. (1967) Cultivation experiments with Arnica species. II. Vegetative propagation of Arnica montana L., Planta Medica, 15, pp. 420-429. Kating, H., Rinn, W. and Willuhn, G. (1970) Studies on the substance of species of Arnica. 3. Fatty acids in etheric oils of the flowers of various species of Arnica, Planta Med, 18, pp. 130–146. Kim, S.M., Jeon, J.S., Kang, S.W., Jung, Y.J., Ly, L.N. and Um, B.H. (2012) Content of antioxidative caffeoylquinic acid derivatives in field-grown Ligularia fischeri (Ledeb.) Turcz and responses to sunlight, J Agric Food Chem., 60, pp. 5597- 603. Klaas, C.A., Wagner, G., Laufer, S., Sosa, S., Della Loggia, R., Bomme, U., Pahl, H.L., Merfort, I. (2002) Studies on the anti-inflammatory activity of phytopharmaceuticals prepared from Arnica flowers, Planta Medica, 68, pp 385- 391. Kohlmünzer, S. (ed) (2000) Farmakognozja. Pharmacognosy. Guide for pharmacy students. pp. 669, PZWL, Warszawa. Köhler, F.E. (1883-1914) Köhler's Medizinal-Pflanzen in naturgetreuen Abbildungen mit kurz erläuterndem Texte : Atlas zur Pharmacopoea germanica, Gera - Untermhaus, Germany. Kolodziej, H. (1993) Sesquiterpenlactone – Biologische Aktivitäten, Deutsche Apotheker Zeitung, 133, pp 15-25. Krimplstätter, R., Ma, B., Spitaler, R., Ellmerer, E. and Zidorn, C. (2011) Phenolics from Rhagadiolus stellatus (Asteraceae, Cichorieae). Sci Pharm., 79, pp. 175-9. Literatura Doktorska disertacija 200 Krushe, M. und Kusterer, A. (2010) Genehmigungen/Zulassungen der Pflanzenschutzmittelanwendungen im Arznei- und Gewürzpflanzenbau, Stand 22.12.2009, Zeitschrift für Arznei- & Gewürzpflanzen,15, pp. Lai, J.P., Lim, Y.H., Su, J., Shen, H.M. and Ong, C.N. (2007) Identification and characterization of major flavonoids and caffeoylquinic acids in three Compositae plants by LC/DAD-APCI/MS, J. Chromatogr., 848, pp. 215–225. Landa, A., Casado, R. and Calvo, M.I. (2009) Identification and quantification of flavonoids from Chuquiraga spinosa (Asteraceae), Nat Prod Commun., 4, pp.1353-5. Lange, D. (1998) Europe’s Medicinal and Aromatic Plants: Their Use, Trade and Conservation. A TRAFFIC Species in Danger Report, TRAFFIC International, Cambridge, United Kingdom. Lee, K-H., Toshiro, I., Wu, R-Y. and Geissman T.A. (1977) Structure–antimicrobial activity relationships among the sesquiterpene lactones and related compounds. Phytochemistry, 16, pp. 117–118. Lersten, N.R. and Curtis, J.D. (1987) Internal secretory spaces in Asteraceae. A review and original observations on Conyza canadensis (tribe Astereae). La Cellule, 74, pp. 179-196. Lersten, N.R. and Curtis, J.D. (1988) Secretory reservoirs (ducts) of two kinds in giant ragweed (Ambrosia trifida; Asteraceae), American Journal of Botany, 75, pp. 1313-1323. Lersten, N.R. and Curtis, J.D. (1989) Foliar oil reservoir anatomy and distribution in Solidago canadensis (Asteraceae, tribe Astereae), Nordic Journal of Botany, 9, pp. 281-287. Leung, A.Y. (1980) Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs and Cosmetics. New York-Chichester: Wiley. Lin, L.Z. and Harnly, J.M. (2010) Identification of the phenolic components of chrysanthemum flower (Chrysanthemum morifolium Ramat), Food Chemistry, 120, pp. 319–326. Linnaei, C. (1732) Flora Lapponica, pp. 248-250, Itinere Impenfis Soc. Reg. Scient. Usalaliensis. Literatura Doktorska disertacija 201 Linnaei, C. (1745) Flora Suecica: exhibens plantas per regnum Sveciae crescentes, systematice cum differentiis specierum, synonymis autorum, nominibus incolarum, solo locorum, usu pharmacopaeorum. (DORONICUM - No. 684.), pp. 245-246, Publication info: Stockholmiae :Sumtu & literis Laurentii Salvii. Linnaei, C. (1753) Species plantarum :exhibentes plantas rite cognitas, ad genera relatas, cum differentiis specificis, nominibus trivialibus, synonymis selectis, locis natalibus, secundum systema sexuale digestas, 2, pp. 884-885, Publication info: Holmiae : Impensis Laurentii Salvii. Lison, L. (1960) Histochemie et cytochemie animales:principes et methodes. Gauthier- Villars, Paris. Lopez-Anton, N., Hermann, C., Murillo, R., Merfort, I., Wanner, G., Vollmar, A.M. and Dirsch, V.M. (2007) Sesquiterpene lactones induce distinct forms of cell death that modulate human monocytederived macrophage responses, Apoptosis, 12, pp. 141–153. Lotocka, B.and Geszprych, A. (2004) Anatomy of the vegetative organs and secretory structures of Rhaponticum carthamoides (Asteraceae), Botanical Journal of the Linnean Society, 104, pp. 207-233. Lyss, G., Schmidt, T.J., Merfort, I., Pahl, H.L. (1997) Helenalin, an anti-inflammatory sesquiterpene lactone from Arnica, selectively inhibits transcription factor NF- κB, Biological Chemistry 378 (9), pp. 951-961. Maas, M., Petereit, F. and Hensel, A. (2008) Caffeic acid derivatives from Eupatorium perfoliatum L., Molecules, 14, pp. 36-45. Mace, M.E. and Howell, C.R. (1974). Histochemistry and identification of condensed tannin precursor in roots of cotton seedlings, Canadian Journal of Botany, 52, pp. 2423-2426. Macêdo, S.B., Ferreira, L.R., Perazzo, F.F. and Carvalho, J.C. (2004) Anti- inflammatory activity of Arnica montana 6cH: preclinical study in animals, Homeopathy, 93, pp. 84-87. Maguire, B. (1943) A monograph of the genus Arnica (Senecioneae, Compositae), Brittonia, 4, pp. 386-510. Marquard, R. und Kroth, E. (2001). Arnika In: Anbau und Qualitätsanforderungen ausgewählterArzneipflanzen, pp. 24- 33. AgriMedia, Bergen Dümme. Literatura Doktorska disertacija 202 Mattioli, P. A. (1570) Commentarii in libros sex Pedacii Dioscoridis. Anazarbei de medico materia, p. 604, Vincent Valgrisum, Venice. Mayer, J.G. and Czygan, F.C. (2000) Arnica montana L. oder Bergwohlverleigh - Ein kulturhistorischer Essay - und über die Schwierigkeiten einen solchen zu verfassen, Zeitschrift für Phytotherapie, 21, pp. 30-36. Meena, M.R. and Sethi, V. (1994) Antimicrobial activity of the essential oils from spices. Journal of Food Science and Technology Mysore, 31, pp. 68–70. Meepagala, K.M., Sturtz, G. and Wedge, D.E. (2002) Antifungal Constituents of the Essential Oil Fraction of Artemisia dracunculus L. Var. dracunculus, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, pp. 6989-6992. Mendiondo, M.E., Juáreza, B.E., Zampini, C., Isla, M.I. and Ordoñez, R. (2011) Bioactivities of Chuquiraga straminea sandwith, Nat Prod Commun., 6, pp. 965-8. Merfort, I. (2003) Arnika: Neue Erkenntnisse zum Wirkungsmechanismus einer traditionellen Heilpflanze, Forschende Komplementärmedizin und Klassische Naturheilkunde, 10 (Suppl. 1), pp. 45-48. Merfort, I. and Wendisch, D. (1985) Flavonoids from Arnica montana and Arnica chamissonis, Planta Med, 51, pp. 136–138. Merfort, I. and Wendisch, D. (1987) Flavonoid glycosides from Arnica montana and Arnica chamissonis, Planta Med, 53, pp. 434–437. Merfort, I. and Wendisch, D. (1988) Flavonoid glucuronides from the flowers of Arnica montana, Planta Med, 54, pp. 247–250. Merfort, I. and Wendisch, D. (1992) New flavonoid glycosides from Arnicae flos DAB 9., Planta Med, 58, pp. 355–357. Michler, B., Fischer, H., Pacurar, F., Stoie, A., Rotar, I., Reif, A. (2008) Monitoring sustainable use of medicinal plants: The case study of Arnica montana in the Apuseni Mountains in Romania, Community Ecology. Muñoz, F. (1987) Arnica montana in: Plantas medicinales y aromáticas. Estudio, cultivo y procesado, pp. 130-106, Mundi-Prensa, Madrid, Spain. NCCLS (1997) National Committee for Clinical Laboratory Standards, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts, Approved Standard M27-A, Villanova, PA. Literatura Doktorska disertacija 203 NCCLS (1998) National Committee for Clinical Laboratory Standards, Development of in vitro susceptibility testing criteria and quality control parameters, Tentative guideline M23-T3, Villanova, PA. Neerman, M.F. (2003) Sesquiterpene lactones: a diverse class of compounds found in essential oils possessing antibacterial and antifungal properties, International Journal of Aromatherapy, 13, pp. 114-120. Nordenstam, B. (1977) Senecioneae and Liabeae - systematic review. In: The biology and chemistry of the Compositae, V.H. Heywood, J.B. Harborne, and B.L. Turner [eds.], vol. II, pp. 799–830, Academic Press, London, UK. Oberdorfer, E., Müller, T. and Korneck, D. (1994) Pflanzensoziologische Exkursionsflora, Stuttgart: Ulmer. Oka, Y., Nacar, S., Putievsky, E., Ravid, U., Yaniv, Z. and Spiegel, Y. (2000) Nematicidal Activity of Essential Oils and Their Components Against the Root- Knot Nematode, Phytopathology, 90, pp. 710-715. Paßreiter, C.M., Willuhn, G., Röder, E. (1992) Tussilagine and Isotussilagine: two pyrrolizidine alkaloids in the genus Arnica. Planta Med., 58, pp. 556–557. Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. and Krieg, N.R. (1988) Control of microorganisms, the control of microorganisms by physical agents In: Microbiology pp. 469–509. New York: McGraw-Hill International. Perry, N.B., Burgess, E.J., Guitia´n, M.A.R., Franco, R.R., Mosquera, E.L., Smallfield, B.M., Joyce, N.I. and Littlejohn, R.P. (2009) Sesquiterpene Lactones in Arnica montana: helenalin and dihydrohelenalin chemotypes in Spain. Planta Med., 75, pp. 660–666. Peterson, R.L., Peterson, C.A., Melville, L.H. (2008) Teaching Plant Anatomy Through Creative Laboratory Exercises Science. NRC Press, Ottawa, Ontario. Petrova, M., Zayova, E., Vassilevska-Ivanova, R. and Vlahova, M. (2012) Biotechnological approaches for cultivation and enhancement of secondary metabolites in Arnica montana L., Acta Physiologiae Plantarum, 34, pp. 1597- 1606. Pfänder, H.J. (2002) Blütendrogen - Arnicae flos In: Farbatlas zur Drogenanalyse unter Verwendung des Stereomikroskops, pp. 39, Deutscher Apotheker Verlag. Literatura Doktorska disertacija 204 Ph. Eur. 6.0 (2008) Arnica flower In: European Pharmacopoeia, 6th ed., pp. 3400- 3403, Council of Europe, Strasbourg. Ph. Jug. IV, 1984. Pharmacopeia Jugoslavica. 4th ed. Federal Institute for Health Care, Belgrade. Pietta P.G. (2000) Flavonoids as Antioxidants, Journal of Natural Products, 63, pp 1035–1042. Pinchon, T.M. and Pinkas, M. (1988) The genus Arnica [LE GENRE ARNICA] Plantes Medicinales et Phytotherapie, 22, pp. 124-156. Plazonić, A., Bucar, F., Males, Z., Mornar, A., Nigović, B. and Kujundzić, N. (2009) Identification and quantification of flavonoids and phenolic acids in burr parsley (Caucalis platycarpos L.), using high-performance liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry, Molecules, 14, pp. 2466-90. Poli, F., Sacchetti, G. and Bruni, A. (1995) Distribution of internal secretory structures in Tagetes patda (Asteraceae), Nordic Journal of Botany, 15, pp. 197-205. Pourmorad, F., Hosseinimehr, S.J., Shahabimajd, N. (2006) Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants, Afr. J. Biotechnol., 5, pp. 1142-1145. Prommersberger, S. und Dapper, H. (1995) Kultivierungmöglichkeiten von Arnica Montana, Bumschulpraxis, 25, pp. 210-213. Rabinovič, M.I. (1987) Лекарственные растения в ветеринарной практике, Агропромиздат, Moskva, Rusija Radanović, D., Nastovski, T., Pljevljakušić D., Jevđović R. (2006) Growing results of some MAP species at mountaneous region of Serbia, III Conference on MAP of Southeast European Countries, 5 – 8. 9. 2004, Nitra, Slovak Republic, Proceedings, pp. 84 - 93. Radanović, D., Pljevljakušić, D., Nastovski, T., Ristić, M. (2007) Influence of fertilization model and PE mulch on yield and quality of Arnica (A. montana) at dystric cambisol, Zemljište i Biljka, 56 (3), pp. 85-95. Ramanandraibe, V., Martin, M.-T., Rakotondramanana, D.L., Mambu, L., Ramanitrahasimbola, D., Labaïed, M., Grellier, P. et al. (2005) Pseudoguanolide Literatura Doktorska disertacija 205 sesquiterpene lactones from Vernoniopsis caudata and their in vitro antiplasmodial activities, Journal of Natural Products, 68, pp. 800-803. Razavi, S.M., Zahri, S., Zarrini, G., Nazemiyeh, H. and Mohammadi, S. (2009) Biological activity of quercetin-3-O-glucoside, a known plant flavonoid, Bioorg Khim., 35, pp 414-416. Reyes-Salas, O., Rangel-Ordoez, L., Manzanilla-Cano, J.A., Barcel-Quintal, M.H. and Dosal-Gmez, M.A. (2002) Voltammetric determination of caffeic acid in Arnica Montana, Analytical Lett. 35, pp. 971–984. Ristić, M., Krivokuća-Đokić, D., Radanović, D., Nastovski, T., (2007) Essential oil of Arnica montana and Arnica chamissonis, Hemijska industrija, 61, pp. 272-277. Robinson, H. (1981) A revision of the tribal and subtribal limits of the Heliantheae (Asteraceae), Smithsonian Contributions to Botany, 51, pp. 1–102. Roki, D., Menković, N., Šavikin-Fodulovic, K., Krivokuća-Đokić, D., Ristić, M., Grubišić, D. (2001) Flavonoids and essential oil in flower heads of introduced Arnica chamissonis. Journal of Herbs Spices and Medicinal Plants, 8(4): 19-27. Romani, A., Pimnelli, P., Galardi, C., Sani, G., Cimato, A. and Heimler, D. (2002) Polyphenols in greenhouse and open-air-grown lettuce, Food Chem., 79, pp. 337-342. Rossetti, V., Lombard, A., Sancin, P., Buffa, M., Di Stefano, R. (1984) Characterization of Arnica-Montana Dried Roots, Int. J Crude Drug Res., 22, pp. 53-60. Rossi-Monteiro, W., Morales, C.M., Fahn, A. and Caldeira, W. (1994) Observations on the development of the foliar secretory cavities of Porophyllum lanceolatum (Asteraceae), Nordic Journal of Botany, 15, pp. 69-76. Ruzin, S.E. (1999) Plant microtechnique and microscopy. Oxford University Press., Oxford, New York. Rüngeler, P., Castro,V., Mora, G., Goren, N., Vichnewski, W., Pahl, H.L., Merfort, I. and Rupp, H.B. (1718) Flora Jenensis, p. 163, Francofvrti & Lipsiae: apud Ernestvm Clavd. Bailliar. Sacchetti, G., Romagnoli, C., Ballero, M., Tosi, B. and Poli, F. (1997) Internal Secretory Structures and Preliminary Phytochemical Investigation on Flavonoid Literatura Doktorska disertacija 206 and Coumarin Content in Santolina insularis (Asteraceae). Phyton, 37, pp. 219- 228. Saleh, N.A. and Bohm, B.A. (1971) Flavonoids of Arctium minus (Compositae), Experientia, 27, pp. 1494. Santer, J.O. and Stevenson, R. (1962) Arnidiol and faradiol, J Org Chem, 27, pp. 3204– 3208. Santos, M.D., Almeida, M.C., Lopes, N.P. and de Souza, G.E. (2006) Evaluation of the anti-inflammatory, analgesic and antipyretic activities of the natural polyphenol chlorogenic acid. Biol Pharm Bull, 29, pp 2236–2240. Saravanakumar, A., Venkateshwaran, K., Vanitha, J., Ganesh, M., Vasudevan, M. and Sivakumar, T. (2009) Evaluation of antibacterial activity, phenol and flavonoid contents of Thespesia populnea flower extracts, Pak J Pharm Sci., 22, pp. 282-6. Schilcher, H., Kammerer, S., Wegener, T. (2007) Leitfaden Phytotherapie, 3rd Edition, pp. 43-44, Urban & Fischer Verlag/ Elsevier GmbH, München. Schmidt, T.J. (1999). Inhibition of transcription factor NF-kappaB by sesquiterpene lactones: a proposed molecular mechanism of action, Bioorg. Med. Chem., 7, pp. 2343-2352. Seaman, F.C. (1982) Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae, Bot. Rev., 48, pp. 121-595. Seeber, H., Abraham, H., Santer, H. und Stupner, H. (1997) Kulturversuche in Südtirol mit Arnica montana L., Drogenreport, 10, 16, pp. 10-16. Seemann, A., Wallner, T., Poschlod, P. and Heilmann, J. (2010) Variation of sesquiterpene lactone contents in different Arnica montana populations: influence of ecological parameters, Planta Medica, 76, pp. 837-42. Shapiro, S., Meier, A. and Guggenheim, B. (1994) The antimicrobial activity of essential oils and essential oil components towards oral bacteria. Oral Microbiology and Immunology, 9, pp. 202–204. Shimp, T. and Sharma, S. (1987). Consumer ethnocentrism construction and validation of the CETSCALE, Journal of Marketing Research, 24. pp. 280-289. Schulte, K.E., Rücker, G. and Reithmayr, K. (1969) Certain constituents of Arnica chamissonis and other Arnica species, Lloydia, 32, pp. 360–368. Silva, B.A., Ferreres, F., Malva, J.O., and Dias, A.C. (2005). Phytochemical and Literatura Doktorska disertacija 207 antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic extracts. Food Chemistry, 90, pp. 157–167. Simonović, D. (1959) Arnica (L.) Rupp. In: Botanički rečnik, pp. 47-48, SANU, Beograd. Smallfield, B.M. and Douglas, M.H. (2008) Arnica montana a grower’s guide for commercial production in New Zealand. A report prepared for New Zealand Arnica Growers’ Group, pp. 2, New Zealand Institute for Crop and Food Research Limited, Christchurch, New Zealand. Schmidt, T.J., Paßreiter, C.M., Wendisch, D. and Willuhn, G. (1992) First diterpens from Arnica, Planta Med., 58(Suppl 1), A713. Schmidt, T.J., Stausberg, S., von Raison, J., Berner, M. and Willuhn, G. (2006) Lignans from Arnica species, Nat Prod Res, 20, pp. 443–453. Spitaler, R., Schlorhaufer, P.D., Ellmerer, E.P., Merfort, I., Bortenschlager, S., Stuppner, H., Zidorn, C. (2006) Altitudinal variation of secondary metabolite profiles in flowering heads of Arnica Montana cv. ARBO. Phytochemistry, 67, pp. 409–417. Spitaler, R., Winkler, A., Lins, I., Yanar, S., Stuppner, H. and Zidorn, C. (2008) Altitudinal Variation of Phenolic Contents in Flowering Heads of Arnica montana cv. ARBO: a 3-Year Comparison, Journal of Chemical Ecology, 34, pp. 369-375. Staneva, J., Denkova, P., Todorova, M. and Evstatieva L. (2011) Quantitative analysis of sesquiterpene lactones in extract of Arnica montana L. by 1H NMR spectroscopy, J Pharm Biomed Anal., 54, pp. 94-99. Stepanović, B., Radanović, D., Turšić, I., Nemčević, N., Ivanec, J. (2009) Uzgoj ljekovitog i aromatičnog bilja, pp. 67-72, Jan Spider, Pitomača, Hrvatska. Stević, T. (2009) Mikrobiološka kontrola lekovitog bilja, Specijalistički rad, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. Tabernaemontanus Jacobus Theodorus (1613) Neuw vollkommentlich Kreuterbuch :mit scho ̈nen und kunstlichen Figuren aller Gewachs der Bäumen, Stauden und Kra ̈utern so in teutschen und welschen Landen, auch in Hispanien, Ostund West Indien oder in der Newen Welt - Das andere Theil, Vol. 2, p. 48, Publication info: Franckfurt am Mayn :Durch Paulum Jacobi in Verlegung Johann Dreytels. Literatura Doktorska disertacija 208 Tornhamre, S., Schmidt, T.J., Näsman-Glaser, B., Ericsson I. and Lindgren, J.A. (2001) Inhibitory effects of helenalin and related compounds on 5-lipoxygenase and leukotriene C4 synthase in human blood cells, Biochem. Pharmacol., 62, pp. 903-911. Trute, A. and Nahrstedt, A. (1997) Identification and quantitative analysis of phenolic compounds from the dry extract of Hedera helix, Planta Med., 63, pp. 177-9. Tutin, T.G., Heywood, V.H., Burges, N.A., Moore D.M. and. Valentine D.H (eds.) (1964-1980) Flora Europaea. Vol. 4, Plantaginaceae to Composite, Cambridge University Press, Cambridge. Vanhaelen, M. (1973) Identification of carotenoids in Arnica montana, Planta Med., 23, pp. 308–311. Vieira, R.C., Delprete, P.G., Leitao, G.G. and Leitao, S.G. (2001) Anatomical and chemical analyses of leaf secretory cavities of Rustia formosa (Rubiaceae). American Journal of Botany, 88, pp. 2151-2156. Wagner, S. and Merfort, I. (2007) Skin penetration behaviour of sesquiterpene lactones from different Arnica preparations using a validated GC-MSD method, J Pharm Biomed Anal, 43, pp. 32–38. Wagner, H., Bladt, S. and Zgainski, E.M. (1984) Arnicae flos in: Plant Drug Analysis — A Thin Layer Chromatography Atlas, pp.177, Springer Verlag, Berlin- Heidelberg-New York-Tokyo. Wagner, S., Suter A. and Merfort, I. (2004) Skin penetration studies of Arnica preparations and of their sesquiterpene lactones, Planta Medica, 70, pp. 897– 903. Walter, H., Harnickell, E., and Mueller-Dombois, D. (1975) Climate-diagram maps of the individual continents and the ecological climatic regions of the earth. Springer-Verlag, Berlin. Werker, E. (1993) Function of essential oil-secreting glandular hairs in aromatic plants of the Lamiaceae: A review, Flavour and Fragrance Journal, 8, pp. 249-255. White, C.A., Kennedy, J.F., Lombard, A. and Rossetti, V. (1985) Analysis of a homologous series of non-reducing oligosaccharides from Arnica montana L Roots, Brit Polym J, 17, pp. 327–329. Literatura Doktorska disertacija 209 Wijnsma, R., Woerdenbag, H.J. und Busse, W. (1995) Die Bedeutung von Arnika - Arten in der Phytotherapie, Z. Phytotherapie, 16, pp. 48 - 62. Willuhn, G. (1989) Arnikablüten. In: Wichtl M (Hrsg.) Teedrogen, 2. Aufl., S. 66–69, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart, Germany. Willuhn, G. (1972a) Studies on the contents of Arnica species. V. Content and variations in content of volatile oils in the various organs of Arnica species, Planta Med., 21, pp. 221–245. Willuhn, G. (1972b) Studies on the components of arnica species. VI. Characterization and preparative separation of volatile oils from roots, rhizoma, leaves and flowerheads of various arnica species, Planta Medica, 21, pp. 329-42. Willuhn, G. i Leven, W. (1991). Zur qualitativen und quantitativen Analyse der Sesquiterpenlactone von Arnikabluten. Pharm. Ztg. Wisss. 136, pp. 32-39. Willuhn, G., Leven, W., Luley, C. (1994) Arnica flowers. German Pharmacopeia 10 (DAB 10): investigation of the qualitative and quantitative variability of sesquiterpene lactone contents of official Arnica crude drugs. Deutsche Apotheker Zeitung, 134,pp. 49-59. Willuhn, G., Merfort, I., PaBreiter, C.M. and Schmidt T.J. (1995) Chemistry and systematics of the genus Arnica, In: D. J. N. Hind. C. Jeffrey & G. V. Pope [eds.], Advances in Compositae systematics, pp. 167-195, Chapman & Hall, London. Willuhn, G., Röttger, P.M. und Quarck, W. (1982) Untersuchungen zur antimikrobiellen Aktivität der Sesquiterpenlactone der Arnikablüten. Pharmazeutische Zeitung, 127, pp. 2183-2185. Woerdenbag, H.J., Merfort, I., Passreiter, C.M., Schmidt, T.J., Willuhn, G., Van Uden, W., Pras, N., Kampinga, H.H. and Konings, A.W.T. (1994) Cytotoxicity of flavonoids and sesquiterpene lactones from Arnica species against the GLC-4 and the COLO 320 cell lines, Planta Med., 60, pp. 434–437. Wojdyło, A,, Oszmiański, J. and Czemerys, R. (2007) Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs, Food Chemistry, 105, pp. 940–949. Zheng, W. and Wang, S.Y. (2001) Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs, J Agric Food Chem., 49, pp. 5165-70. Prilozi Doktorska disertacija 210 10. PRILOZI 10.1. Prilog 1 – Šema ogleda Prilozi Doktorska disertacija 211 10.2. Prilog 2 – reagensi za histohemijske analize Pregled upotrebljenih reagenasa za histohemijske analize podzemnih organa A. montana Bojena procedura Ciljana jedinjenja Uočena boja Rezultati Sudan Crna B masti crna ++ Sudan III masti narandžasta do crvena ++ Fuksin kiselina proteini pink-crvena - Rutenijum crvena pektini (polisaharidi) pink- crvena - Lugol sktob tamno-plava do crna - Feri-sulfat (gvožđe III sulfat) tanini (fenolna jedinjenja) tamno-plava - Feri-hlorid tanini (fenolna jedinjenja) (o-dihidroksi fenoli) polifenoli tamno-zelena - Hidrohlorni vanilin fenolna jedinjenja (flavonoidi) (tanini) pink-crvena - Floroglucinol-HCl lignin crvena - Autoflurescencija nebojenih sekcija A: BP 340-380 lignin i fenolna jedinjenja svetlo-plava do beličasta ± Autoflurescencija nebojenih sekcija I3: BP 450-490 lignin i fenolna jedinjenja svetlo-žuta ++ Autoflurescencija nebojenih sekcija N2.1: BP 515-580 fenolna jedinjenja svetlo-crvena ++ Vagnerov reagent alkaloidi crveno-braon - Ditmarov reagent alkaloidi crveno-braon - Sumporna kiselina seskviterpenski laktoni crvena - Aluminium trihloride pod UV flavonoidi plavo-zelena - Results: (-) odsutno, (±) neznatno, (+) intenzivno, (++) veoma intenzivno Prilozi Doktorska disertacija 212 10.3. Prilog 3 Pregled vrednosti svih agronomskih parametara na ogledu u 2009. i 2010. godini Precnik rozete a [cm] Visina cvetnog izdanka [cm] Broj cvetnih izdanaka Broj cvetnih glavica po biljci Prečnik cvetne glavice [cm] Prinos cveta [kg/ha] Prinos cveta po biljci [g] Broj sekundarnih rozeta Prinos korena [kg/ha] Prinos rizoma [kg/ha] Et.u. KOR [%] Et.u. RIZ [%] 2009 POG 21.69 ± 3.98 b 31.15 ± 5.38 b 4.80 ± 2.98 a 10.13 ± 2.87 a 5.98 ± 0.81 b 143.55 ± 22.07 a 2.21 ± 0.42 a 18.25 ± 2.06 a 423.03 ± 269.65 373.75 ± 90.31 a 2.55 3.98 PMG 23.40 ± 4.35 a 34.17 ± 5.17 a 5.02 ± 3.24 a 10.47 ± 3.23 a 6.13 ± 0.55 b 136.39 ± 64.79 a 2.11 ± 0.93 a 17.25 ± 3.95 ab 312.50 ± 106.80 302.32 ± 103.69 ab 2.50 4.81 PKG 15.64 ± 4.21 c 28.25 ± 5.50 c 2.24 ± 1.69 b 3.14 ± 1.00 b 5.91 ± 0.33 b 59.84 ± 35.58 b 0.98 ± 0.52 b 13.25 ± 3.86 b 235.89 ± 127.25 231.43 ± 97.66 a-d 3.15 5.22 POV 12.38 ± 3.42 d 19.72 ± 6.14 e 1.50 ± 1.26 b 1.47 ± 0.29 c 7.15 ± 0.78 a 5.18 ± 2.73 c 0.86 ± 0.39 b - - - PMV 13.85 ± 3.39 d 23.15 ± 5.58 d 1.48 ± 0.71 b 1.28 ± 0.16 c 7.47 ± 0.78 a 15.38 ± 6.40 bc 0.67 ± 0.10 b - - - PKV 13.16 ± 3.35 d 21.49 ± 4.43 de 1.46 ± 0.90 b 1.23 ± 0.13 c 7.23 ± 0.72 a 13.13 ± 8.18 bc 0.43 ± 0.03 b - - - JOG - - - - - - - 6.50 ± 1.29 c 399.10 ± 85.29 142.50 ± 47.29 d 2.51 4.58 JMG - - - - - - - 6.00 ± 0.82 c 426.43 ± 207.11 128.39 ± 50.35 d 1.05 4.62 JKG - - - - - - - 8.25 ± 1.71 c 295.35 ± 152.16 106.25 ± 19.66 d 2.02 4.03 JOV - - - - - - - 8.00 ± 5.60 c 299.82 ± 141.65 239.46 ± 183.56 a-d 1.62 4.25 JMV - - - - - - - 6.00 ± 1.41 c 367.68 ± 140.36 190.89 ± 57.61 bcd 1.99 4.19 JKV - - - - - - - 5.75 ± 0.50 c 194.28 ± 45.13 156.25 ± 56.65 cd 1.50 4.83 2010 POG 26.67 ± 4.18 ab 37.56 ± 1.90 bc 9.73 ± 1.42 b 20.46 ± 1.42 bc 7.05 ± 0.84 def 176.90 ± 20.67 b 3.31 ± 0.64 de 28.50 ± 6.56 614.75 ± 75.35 a 897.49 ± 254.58 a 2.11 2.88 PMG 27.68 ± 4.62 a 38.00 ± 1.89 abc 9.08 ± 2.03 b 25.19 ± 6.89 b 6.89 ± 0.51 ef 200.69 ± 71.87 ab 3.75 ± 1.20 cd 35.25 ± 4.57 613.68 ± 88.61 a 707.14 ± 306.23 ab 1.90 2.74 PKG 20.93 ± 3.42 c 34.65 ± 3.15 c 6.00 ± 0.67 c 16.00 ± 6.14 c 6.38 ± 0.61 f 116.25 ± 50.89 c 2.28 ± 1.05 e 27.50 ± 8.23 558.17 ± 118.28 ab 644.64 ± 46.17 ab 2.17 3.07 POV 18.60 ± 5.14 d 29.83 ± 1.67 d 3.08 ± 1.01 d 15.38 ± 2.75 c 7.86 ± 0.95 bcd 5.40 ± 1.16 d 1.90 ± 0.51 e - - - PMV 16.65 ± 5.70 d 30.17 ± 4.48 d 2.50 ± 1.03 d 14.30 ± 5.46 cd 8.17 ± 0.54 abc 5.64 ± 4.36 d 2.04 ± 0.27 e - - - PKV 14.47 ± 3.98 e 25.60 ± 2.62 e 2.72 ± 1.02 d 8.38 ± 3.84 d 7.80 ± 0.69 bcd 3.67 ± 2.38 d 1.40 ± 0.51 e - - - JOG 26.90 ± 3.66 ab 41.50 ± 0.91 ab 9.50 ± 1.58 b 37.12 ± 1.59 a 9.09 ± 0.44 a 250.86 ± 12.86 a 5.39 ± 0.21 ab 32.75 ± 7.04 496.59 ± 38.28 ab 575.53 ± 83.07 b 2.12 2.30 JMG 27.33 ± 3.28 ab 41.75 ± 1.68 a 9.50 ± 2.20 b 38.95 ± 4.90 a 8.49 ± 0.98 ab 258.69 ± 69.63 a 5.84 ± 0.92 a 26.75 ± 7.68 464.46 ± 79.17 ab 556.07 ± 53.00 b 1.73 2.09 JKG 25.03 ± 3.50 b 35.10 ± 0.72 c 9.13 ± 3.66 b 27.19 ± 2.62 b 7.86 ± 0.43 bcd 175.77 ± 38.79 b 4.20 ± 1.04 bcd 29.50 ± 11.93 605.47 ± 252.39 a 640.35 ± 301.81 ab 1.77 2.68 JOV 28.15 ± 4.72 a 39.30 ± 1.85 ab 12.73 ± 2.83 a 36.60 ± 6.27 a 7.86 ± 0.52 bcd 225.83 ± 29.41 ab 5.26 ± 0.76 ab 35.00 ± 4.97 521.04 ± 66.60 ab 754.28 ± 102.10 ab 1.81 2.58 JMV 27.28 ± 4.64 ab 38.33 ± 4.54 abc 9.45 ± 0.78 b 37.39 ± 4.26 a 8.12 ± 0.82 a-d 187.89 ± 53.68 b 4.87 ± 1.24 abc 25.25 ± 4.79 427.51 ± 74.81 b 570.53 ± 100.08 b 1.71 2.26 JKV 26.38 ± 4.49 ab 34.35 ± 2.24 c 8.85 ± 2.11 b 36.01 ± 4.65 a 7.19 ± 0.48 c-f 210.46 ± 18.44 ab 4.98 ± 0.55 abc 29.75 ± 12.12 420.72 ± 54.79 b 475.89 ± 92.39 b 2.40 3.01 a Različita slova označavaju statističku značajnost Dankanovog testa na nivou p<0.05 Prilozi Doktorska disertacija 213 10.4. Prilog 4 Prilozi Doktorska disertacija 214 10.5. Prilog 5 Prilozi Doktorska disertacija 215 10.6. Prilog 6 Изјава о ауторству Потписани Дејан Пљевљакушић ___________________ број уписа 06/9 _______________________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом „Утицај услова гајења на морфолошке и хемијске особине и биолошке ефекте екстракта Arnica montana L.„ • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанта У Београду, ___29.03.2012._године__ __ ___ Prilozi Doktorska disertacija 216 10.7. Prilog 7 Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора ___Дејан Пљевљакушић___________________________ Број уписа ______06/9____________________________________________ Студијски програм __Воћарство и виноградарство - Помологија___ Наслов рада _„Утицај услова гајења на морфолошке и хемијске особине и биолошке ефекте екстракта Arnica montana L.„ Ментор ___ Проф. др Зора Дајић Стевановић ____________________ Потписани ____ Дејан Пљевљакушић_________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанта У Београду, ____29.03.2012. године Prilozi Doktorska disertacija 217 10.8. Prilog 8 Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: _„Утицај услова гајења на морфолошке и хемијске особине и биолошке ефекте екстракта Arnica montana L.„, која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима Потпис докторанта У Београду, _29.03.2012. године 218 11. BIOGRAFIJA AUTORA Dejan (Stevan) Pljevljakušić rođen je 1975. godine u Beogradu, gde je završio osnovnu i srednju školu. Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu upisao je 1996/1997. godine na Odseku za ratarstvo, gde je diplomirao 2002. godine sa prosečnom ocenom ostvarenom u toku studija 8,17. Doktorske studije upisao je na studijskom programu Ekologija i agrotehnika lekovitog, aromatičnog i začinskog bilja, školske 2006/2007 godine. Od 2003. godine uposlenik je Odseka za poljoprivredna istraživanja i razvoj Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“, gde radi kao istraživač-saradnik. Kao koautor napisao je više naučnih radova od kojih su četiri publikovana u vrhunskim međunarodnim časopisima. Učestvovao je u realizaciji većeg broja naučnih projekata finansiranih od strane Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj.