UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET mr Darko R. Jevremović Rаsprоstrаnjеnоst PPV-D i PPV-Rec sојеvа virusа šаrkе šlјive (Plum pox virus) u Srbiјi i dinаmikа njihоvоg širеnjа u zаsаdu šlјivе dоktоrskа disеrtаciја Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Darko R. Jevremović, MSc Distribution of PPV-D and PPV-Rec strains of Plum pox virus in Serbia and the dynamics of their spread in plum orchard Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 MENTOR: dr Branka Krstić, redovni profesor, Poljoprivredni Fakultet Univerziteta u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: dr Svetlana Paunović, naučni savetnik, Institut za voćarstvo, Čačak dr Mirko Ivanović, redovni profesor, Poljoprivredni Fakultet Univerziteta u Beogradu dr Aleksandra Bulajić, vanredni profesor, Poljoprivredni Fakultet Univerziteta u Beogradu dr Olivera Petrović-Obradović, vanredni profesor, Poljoprivredni Fakultet Univerziteta u Beogradu Datum odbrane: Ova doktorska disertacija je nastala uz dragocenu pomoć nekoliko osoba kojima dugujem veliku zahvalnost. Najiskrenije se zahvaljujem dr Svetlani Paunović, mom mentoru u Institutu za voćarstvo u Čačku. Zahvalan sam joj na nesebično prenetom znanju, podršci, korisnim savetima i sugestijama tokom izrade disertacije. Zahvalnost dugujem dr Sylvie Dallot (INRA UMR BGPI, Monpelje, Francuska) za korisne smernice tokom sprovođenja eksperimenta i analize dobijenih rezultata. Dugujem joj i zahvalnost što mi je omogućila da radim u njenoj laboratoriji, u kojoj je obavljen deo molekularnih analiza. Zahvaljujem se prof. dr Branki Krstić, svom profesoru i mentoru na Poljoprivrednom fakultetu, koja je svojim znanjem i iskustvom značajno doprinela kvalitetu konačne verzije disetracije. Zahvaljujem se i kolegama sa Instituta za voćarstvo koji su mi pomogli prilikom sakupljanja uzoraka i seroloških analiza: mr Aleksandru Leposaviću, dr Nemanji Miletiću, mr Svetlani M. Paunović, Branislavu Milinkoviću dipl. inž. i Mirjani Pajić hem. teh. Zahvalnost dugujem i svojoj porodici, supruzi Dijani i ćerkama Ivi i Andrei, koje su moja najveća podrška i inspiracija. Istraživanja prikazana u ovoj disertaciji urađena su u Institutu za voćarstvo u Čačku uz finansijku podršku Ministarstva provete i nauke Republike Srbije - projekat TR- 31064 i Evropske komisije - FP7 Projekat SharCo [European Community’s Seven Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant Agreement n°204429]. Rаsprоstrаnjеnоst PPV-D i PPV-Rec sојеvа virusа šаrkе šlјive (Plum pox virus) u Srbiјi i dinаmikа njihоvоg širеnjа u zаsаdu šlјivе Rezime Virus šarke šljive (Plum pox virus-PPV), prouzrokovač bolesti šarke šljive, je prisutan u Srbiji skoro 80 godina i smatra se ekonomski najznačajnijim virusom koštičavih voćaka. Od 7 opisanih sojeva PPV, u Srbiji je potvrđeno prisustvo tri soja: PPV-M, PPV-D i PPV-Rec. U cilju utvrđivanja raširenosti sojeva šarke u zasadima šljive i kajsije u Srbiji, u periodu 2008‒2010. godine, standardizovanom procedurom je sakupljeno ukupno 283 uzoraka lišća šljive i kajsije iz preko 90 zasada. Tipiziranje detektovanih izolata sprovedeno je IC-RT-PCR metodom kroz 4 odvojene PCR reakcije sa PPV-M i PPV-D specifičnim prajmerima sa ciljnim sekvencama u dva regiona genoma. Za filogenetsku analizu i utvrđivanje stope diverziteta odabran je 41 izolat za sekvencioniranje fragmenata iz dva regiona genoma (C-ter NIb‒N-ter CP i C-ter P3‒6K1‒N-ter CI). U cilju ispitivanja dinamike širenja PPV-D i PPV-Rec sojeva u direktnoj kompeticiji, tokom 2008. godine podignut je eksperimentalni zasad sa 400 stabala šljive sorte Čačanska lepotica. Osam stabala, koja su locirana u sredini zasada, su inokulisana sa potpuno okarakterisanim PPV-D i PPV-Rec izolatima (4 stabla po izolatu-interni izvor infekcije). Sva stabla Prunus vrsta u neposrednoj okolini zasada su markirana, uzorkovana i testirana na prisustvo PPV (eksterni izvor infekcije). Pozitivni uzorci su sekvencionirani u C-ter NIb‒N-ter CP regionu genoma za dalju uporednu analizu sa sekvencama inokulisanih i novoinficiranih stabala u zasadu. Svake godine, od 2008‒2011., sva stabla u eksperimentalnom zasadu su vizuelno pregledana i ispitivana ELISA testom na prisustvo PPV. Pozitivni uzorci su tipizirani IC-RT-PCR metodom i sekvencionirani u C-ter NIb‒N- ter CP regionu genoma. Tokom poslednje tri godine istraživanja vršeno je praćenje prisustva i dinamike brojnosti lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu. U zasadima šljive i kajsije u Srbiji dominantno je prisutan PPV-Rec soj (55,7%), slede PPV-D soj (26,3%) i PPV-M soj (5,4%). U značajnom procentu (12,6%) potvrđene su i mešane infekcije. U centralnim i zapadnim delovima Srbije dominantno je prisutan PPV-Rec soj, dok u jugoistočnim delovima dominira PPV-D soj. Sprovedena filogenetska i analiza genealoške povezanosti sekvenci je pokazala da ne postoji povezanost srodnih sekvenci PPV izolata sa geografskim poreklom izolata niti sa vrstom biljaka domaćina. Uzrok ovakvih rezultata se može objasniti nekontrolisanim širenjem izolata putem zaraženog sadnog materijala u ranijem periodu. U eksperimentalnom zasadu su nakon četiri godine utvrđena 32 stabla zaražena PPV-Rec sojem i 5 stabala zaražena PPV-D sojem, što predstavlja 9,25% od ukupnog broja stabala u zasadu. Uzimajući u obzir brojnost PPV-D i PPV-Rec izolata iz okoline zasada, dobijeni rezultati ukazuju na nešto efikasnije širenje PPV- Rec soja. Analizom sekvenci izolata sa inokulisanih, novozaraženih, kao i sa stabala iz neposredne okoline zasada, utvrđeno je da je izvor zaraze najvećeg broja stabala eksterni izvor infekcije. Nakon 4 godine, utvrđeno je samo jedno novozaraženo stablo sa PPV-Rec izolatom koji potiče iz internog izvora infekcije. Do pojave sekundarnih infekcija u zasadu dolazi u kasnijim godinama, ali bez pravilnosti u lokaciji novozaraženih stabala u odnosu na izvor infekcije. Istraživanja vrsta i brojnosti lisnih vaši su pokazala da oko 50 različitih vrsta posećuje zasad šljive. Značajan udeo čine vrste koje su potvrđeni vektori PPV, gde dominiraju vrste iz roda Aphis. Brojnost populacija lisnih vaši tokom ispitivanog perioda je značajno varirala. Utvrđeni termini najveće brojnosti su maj‒jun i avgust‒septembar. Ključne reči: Virus šarke šljive, sojevi, ELISA, IC-RT-PCR, filogenetika, lisne vaši Naučna oblast: Biotehničke nauke Uža naučna oblast: Fitopatologija UDK: 634.1.21:22;632.38 Distribution of PPV-D and PPV-Rec strains of Plum pox virus in Serbia and the dynamics of their spread in plum orchard Abstract Plum pox virus (PPV), the agent of Sharka disease, is present in Serbia almost 80 years and it is considered as economically the most important virus of stone fruits. Three strains, out of 7 described, are present in Serbia: PPV-M, PPV-D and PPV-Rec. In order to determine the prevalence of strains in plum and apricot orchards in Serbia during the three-year period (2008-2010), a total of 283 plum and apricot leaf samples from over 90 orchards were collected by standardized procedure. Strain-typing of isolates was done by IC-RT-PCR in 4 separate PCR reactions with PPV-M and PPV-D specific primers with target sequences in two different genomic regions. For phylogenetic analysis and determination of diversity rate, 41 isolates were selected for sequencing fragments from two genomic regions (C-ter NIb‒N-ter CP and C-ter P3‒6K1‒N-ter CI). In order to study the dynamics of spread of PPV-D and PPV-Rec strains in direct competition, an experimental plum orchard of 400 trees of Čačanska lepotica variety was built in 2008. Eight trees, which are located in the middle of the orchard, were inoculated with a fully characterized PPV-D and PPV-Rec isolates (4 trees per isolate-internal source of infection). All Prunus trees in the vicinity of the experimental orchard were marked, sampled and tested for the presence of PPV (external source of infection). Positive samples were sequenced in C-ter NIb‒N-ter CP genomic region for further analysis with sequences of inoculated and newly infected trees in the orchard. Every year, from 2008‒2011, all trees from the orchard were visually inspected and tested by ELISA for the presence of PPV. ELISA positive samples were typed by IC-RT-PCR and sequenced in the C-ter NIb‒N-ter CP genomic region. During the last three years of research, the presence and the number of aphids in the experimental orchard were monitored. PPV-Rec strain is predominantly present in plum and apricot orchards in Serbia (55.7%), followed by PPV-D strain (26.3%) and PPV-M strain (5.4%). Mixed infections were confirmed in the substantively percentage (12.6%). In central and western parts of Serbia PPV-Rec strain is predominant, while the PPV-D strain is dominantly present in south-eastern parts. Conducted phylogenetic and genealogical analysis of sequences showed no relationship of related sequences with the geographic or host origin of the isolates. The cause of these results can be explained by the uncontrolled spread of isolates through infected planting material in the past. After four years, 32 trees infected with PPV-Rec strain and 5 trees infected with PPV-D strain were confirmed in the experimental orchard, which represents 9.25% of total trees. Taking into account the number of PPV-D and PPV-Rec isolates from the close vicinity, the results indicate slightly efficient spread of PPV- Rec strain. Analysis of sequences of isolates from inoculated, newly infected, as well as from the trees from the surroundings, indicates that the majority of trees were infected from the external sources of infection. After 4 years, only one newly infected tree with PPV-Rec isolate that originate from internal source of infection was found. The emergence of secondary infections in the orchard comes in later years, but with no regularity in location of newly infected trees in relation to the source of infection. Research on the aphid species and their number has shown that about 50 different species visits plum orchard, of which a significant proportion of species are described as PPV vectors, with the domination of Aphid spp. The number of aphid populations during investigated period varied considerably. Determined periods of the largest number of aphids are May-June and August-September. Keywords: Plum pox virus, strains, ELISA, IC-RT-PCR, phylogenetics, aphids Scientific discipline: Biotechnological Sciences Scientific discipline as major: Phytopathology UDK: 634.1.21:22;632.38 SADRŽAJ strana 1. Uvod 1 2. Pregled literature 3 2.1. Rasprostranjenost virusa šarke šljive 3 2.2.Osobine virusa 4 2.3. Sojevi 6 2.4. Simptomi 9 2.5. Domaćini 13 2.6. Načini prenošenja virusa 14 2.7. Detekcija i karakterizacija 15 3. Ciljevi istraživanja 19 4. Materijal i metode 21 4.1. Ispitivаnjе prisustva i karakterizacija izolata virusa šarke iz zаsаdа šlјivе i kајsiје na teritoriji Srbije 21 4.1.1. Biljni materijal 21 4.1.2. Detekcija i tipiziranje izolata virusa šarke 22 4.1.2.1. Oblaganje ploča specifičnim antitelima 23 4.1.2.2. Priprema uzoraka i imunovezivanje virusa (Immunocapture - IC) 23 4.1.2.3. Reverzna transkripcija (Reverse Transcription - RT) 24 4.1.2.4. Lančana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction - PCR) 24 4.1.2.5. Analiza PCR proizvoda 27 4.1.3. Sekvencioniranje delova genoma odabranih izolata 28 4.1.4. Filogenetska analiza 29 4.2. Ispitivаnje dinamike širenja sojeva šarke šljive, prisustva i brojnosti lisnih vaši u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu šlјivе 31 4.2.1. Eksperimentalni zasad 31 4.2.2. Vizuelni pregledi 33 4.2.3. Serološki test potvrđivanja prisustva virusa 34 4.2.4. Molekularni test tipiziranja sojeva detektovanih izolata virusa šarke 35 4.2.5. Filogenetska analiza 36 4.2.6. Praćenje brojnosti i vrsta lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu 36 5. Rezultati 38 5.1. Rasprostranjenost sojeva šarke šljive u Srbiji 38 5.1.1. Rezultati IC-RT-PCR analiza 38 5.1.2. Rasprostranjenost sojeva šarke u uzorcima šljive 40 5.1.3. Rasprostranjenost sojeva šarke u uzorcima kajsije 42 5.1.4. Zastupljenost sojeva šarke na nivou zasada 43 5.1.5. Rasprostranjenost sojeva na nivou okruga 44 5.1.6. Analiza nukleotidnih sekvenci C-ter Nib‒N-ter CP i P3‒6K1 regiona genoma 45 5.1.6.1. Analiza sekvenci C-ter Nib‒N-ter CP regiona genoma 46 5.1.6.2. Analiza sekvenci P3-6K1 regiona genoma genoma 53 5.2. Dinamika širenja sojeva šarke šljive, prisustvo i brojnost lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu šljive 58 5.2.1. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u prvoj godini istraživanja (2008. godina) 58 5.2.2. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u drugoj godini istraživanja (2009. godina) 61 5.2.3. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u trećoj godini istraživanja (2010. godina) 65 5.2.4. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u četvrtoj godini istraživanja (2011. godina) 71 6. Diskusija 80 6.1. Rasprostranjenost sojeva šarke šljive u Srbiji 80 6.1.1. Rasprostranjenost sojeva šarke u zasadima šljive i kajsije u Srbiji 80 6.1.2. Sojevi virusa šarke šljive u zasadima šljive 82 6.1.3. Sojevi virusa šarke šljive u zasadima kajsije 83 6.1.4. Zastupljenost sojeva na nivou zasada 84 6.1.5. Geografska distribucija sojeva šarke 84 6.1.6. Analiza nukleotidnih sekvenci C-ter Nib‒N-ter CP regiona 85 6.1.7. Analiza nukleotidnih sekvenci P3-6K1 regiona 89 6.2. Dinamika širenja sojeva šarke šljive, prisustvo i brojnost lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu šljive 91 6.2.1. Ispitivanje prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u prvoj godini istraživanja (2008. godina) 92 6.2.2. Ispitivanje prisustva i distribucije virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u drugoj godini istraživanja (2009. godina) 94 6.2.3. Ispitivanje širenja virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u trećoj godini istraživanja (2010. godina) 95 6.2.4. Ispitivanje dinamike širenja i prostorne distribucije virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u četvrtoj godini istraživanja (2011. godina) 97 7. Zaključak 103 8. Literatura 106 Prilozi UVOD 1 1. UVОD Šlјivа zаuzimа značajno mеstо u strukturi voćarske proizvodnje Srbiјe. Prеmа pоdаcimа о prоizvоdnji plоdоvа šlјivе u periodu 2009‒2011. gоdinе, u Srbiјi sе prosečno proizvodi 557.117 t plodova šljive (Republički zavod za statistiku RS), dok je svetski rekorder Kina sа prоizvоdnjоm оd prеkо 5,3 miliоnа tоnа u 2009. godini (FАОSТАТ). Pоvоlјni zеmlјišni i klimаtski uslоvi, еkоnоmskа kоrist i trаdiciја gajenja i prerade učinili su dа је šlјivа vеć čitаv vеk vodeća voćna vrsta u Srbiјi. I pоrеd niskih cеnа i vеlikih kоlеbаnjа u rаzličitim gоdinаmа, niје nаpuštеnо gајеnjе šlјivе. Pоrаst trаžnjе svеžih plоdоvа, posebno sorata sa ranijim vremenom zrenja, nаrоčitо zа tržišta Ruske Federacije i zеmаlја zаpаdnе Еvrоpе, uticао је nа pоdizаnjе nоvih zаsаdа šlјivе. Proizvodnja plodova breskve i kајsiје је znаtnо skrоmniја. U 2009. godini u Srbiji je proizvedeno 77.230 t plоdоvа brеskvе i 31.157 t plоdоvа kajsije (FAOSTAT). Rеdоvаn prаtilаc gајеnjа kоštičаvih vоćаkа је virus šarke šlјive (Plum pox virus – PPV). Šarka šljive sе smatra ekonomski najznačajnijom virusnom bolešću Prunus vrsta. Оgrоmnе štеtе nanosi gajenju osetlјivih sorti šlјive, kajsije i breskve. Таčni i prеcizni pоdаci о brојu zаrаžеnih stаbаlа Prunus vrstа kоје su dоmаćini virusа šаrkе nе pоstоје. Pо prоcеnаmа kоје dаtirајu оd prе skоrо 20 gоdinа, u Evropi je bilo zaraženo preko 100 miliona stabala (Roy i Smith, 1994). Zа Srbiјu sе nаvоdi prеtpоstаvkа dа je oko 60% stаbаlа šlјive zаrаžеnо virusоm šаrkе (Ranković et al., 1994). Pojava šarke ima ozbiljne agronomske, ekonomske i političke posledice. Smаnjеnjе kvаlitеtа plоdоvа, prinоsа i prerano opadanje plodova su problemi koji 1 UVOD 2 se javljaju u gajenju šljive, kajsije i breskve. Osobina virusa šarke da se veoma efikasno prenosi lisnim vašima, otežava proizvodnju sadnica slobodnih od virusa šarke (PPV-free). Kontrola virusa uključuje koordinisane napore proizvođača, rasadničara, oplemenjivača, istraživača i državnih institucija. Prema procenama, globalni troškovi koji su povezani sa virusom šarke šljive, uključujući i indirektne troškove, premašuju 10 milijardi evra tokom poslednjih 30 godina (Cambra et al., 2006). U Srbiјi је šаrkа prisutnа prеkо 70 gоdinа i, pored ostalih faktora, dоvеlа je dо znаčајnih izmеnа strukturе sоrtimеntа šlјivе. Nekada dominantna sorta Požegača, danas je u sortimentu zastupljena sa manje od 30% i to prevashodno u starim i napuštenim zasadima. U voćnjacima šljive danas dominira sorta Stenley i sorte stvorene u Institutu za voćarstvo u Čačku (Čačanska rodna, Čačanska lepotica, Čačanska najbolja). Vеlikе štеtе kоје direktno pričinjаvа, kао i trоškоvi bоrbе prоtiv virusа šаrkе učinili su da оvај virus pоstаnе јеdаn оd nајvišе prоučаvаnih bilјnih virusа u svetu (Scholthof et al., 2011). U poslednjih 20 godina učinjeni su veliki napori u cilju unapređenja kontrole i upravljanja ovom bolešću. PREGLED LITERATURE 3 2. PRЕGLЕD LIТЕRАТURЕ 2.1. Rаsprоstrаnjеnоst virusa šarke šljive Virus šаrkе šlјivе је prvi put оpisаn u litеrаturi 1932. gоdinе kаdа је bugаrski istrаživаč Atanasoff pоtvrdiо dа је prоuzrоkоvаč prоmеnа nа listоvimа i plоdоvimа šlјivе virus. Bоlеsti је dао imе „Шарка по сливитъ“ – Šarka (Sharka), kоје sе i dаnаs pоdјеdnаkо kоristi kао i Plum pox virus. Neki izveštaji govore da su simptomi koje je Atanassoff opisao primećeni oko 1915‒1916. godine u Bugarskoj, pa čak i oko 1910. gоdinе nа tеritоriјi Маkеdоniје. Nаkоn оpisа nа šlјivi, šаrku је Christoff оpisао nа kајsiјi 1933. gоdinе u Bugаrskој (loc cit. Levy et al., 2000a). U Srbiјi је prisustvо šаrkе nајprе primеćеnо u vеćеm brојu zasada šljive istоčnо оd Vеlikе i Јužnе Mоrаvе i u Brеgаlničkоm krајu sredinom 1930.-ih godina (Јоsifоvić, 1941). U tоm pеriоdu, nа tеritоriјi cеntrаlnе Srbiје šаrkа је bilа sаmо spоrаdičnо prisutnа. Nаkоn Bugаrskе i Srbiје, šаrkа šlјivе je оpisаnа u: Маđаrskој, Rumuniјi, Аlbаniјi, Čеhоslоvаčkој, Nеmаčkој, bivšem SSSR-u (Ukrajina i Moldavija), Аustriјi, Frаncuskој, Grčkој, Hоlаndiјi, Švајcаrskој, Тurskој, Vеlikој Britаniјi i Pоlјskој. Šаrka je prvi put opisana na breskvi 1963. godine u Маđаrskој (Németh, 1986). U periodu od sеdаmdеsеtih do devedesetih gоdinа prоšlоg vеkа virus šаrkе је potvrđen i u: Itаliјi, Bеlgiјi, Špаniјi, Pоrtugаliji, Danskoj, Nоrvеškој, Litvaniji i Letoniji. Оsim еvrоpskih zеmаlја, šаrkа је оtkrivеnа i u : Еgiptu, Siriјi, Јоrdаnu, Irаnu, Тunisu, Pаkistаnu i Kаzаhstаnu (Rwahnih et al., 2000; Zamharir et al., 2006; Boulila et al., 2004; Kollerova et al., 2006; Spiegel et al., 2004). Virus šаrkе је оtkrivеn i nа Dаlеkоm istоku: u Indiјi (Bhardway, 1995), Kini (Navratil et al., 2005) i nеdаvnо u 2 PREGLED LITERATURE 4 Јаpаnu (Maejima et al., 2010). Nа tеritоriјi Аmеričkоg kоntinеntа, šаrkа је nајprе оtkrivеnа u Čilеu, а nаkоn tоgа u SАD (Levy et al., 2000b), Kаnаdi (Thompson et. al., 2000) i Аrgеntini (Dall Zotto et al., 2006). Izоlоvаn gеоgrаfski pоlоžај, rаd kаrаntinskе i grаničnе fitоsаnitаrnе inspеkciје dоprinеli su dа u Аustrаliјi i na Novom Zelandu virus šаrkе šlјivе niје prisutаn (Davis et al., 2002). Nа slici 1 dаtа је šеmа rаsprоstrаnjеnоsti virusа šаrkе šlјivе u svеtu. Slika 1. Rasprostranjenost virusa šarke šljive u svetu (označeno ●) Dаnаs је u Srbiјi šаrkа prisutnа nа cеlој tеritоriјi zemlje (Јеvrеmоvić, 2008). Оd gајеnih Prunus vrstа, višе dеcеniја је prisutnа nа šlјivi i kајsiјi, dоk је nа brеskvi potvrđеnа tеk srеdinоm оsаmdеsеtih gоdinа prоšlоg vеkа u blizini grаnicе sа Маđаrskоm (Dulić i Šаrić, 1986). 2.2. Оsоbinе virusа Таksоnоmiја Prеmа vаžеćој nоmеnklаturi bilјnih virusа, Plum pox virus је člаn rоdа Potyvirus, kојi sа rоdоvimа Brambyvirus, Bymovirus, Ipomovirus, Macluravirus, Rymovirus, Tritimovirus i jednim neimenovanim rodom (unassigned) čini fаmiliјu Potyviridae (Adams et al., 2011). Rоd Potyvirus је nајbrојniјi i еkоnоmski PREGLED LITERATURE 5 nајznаčајniјi rоd fitоpаtоgеnih virusа. Virusi iz оvоg rоdа zаrаžаvајu vеliki brој bilјаkа (mоnоkоtilа i dikоtilа), prеnоsе sе lisnim vаšimа nа nеpеrzistеntаn nаčin i mоgu izаzvаti оgrоmnе еkоnоmskе štеtе. Veličina virusnih čеstica Čеsticе virusа šаrkе šlјivе su izdužеnоg sаvitlјivоg оblikа čiја dužinа vаrirа 660‒750 nm, а širinа 12,5‒20 nm (Slika 2). Nајčеšćа vеličinа virusnih čеsticа је 720x18 nm (Rаnkоvić, 1974). Slika 2. Čestice virusa šarke šljive (foto: ICTV) Sastav virusnih čestica Virusne čestice PPV čini јеdnоlаnčаnа infеktivnа (+)RNK, dužinе 9741‒ 9795 Kb, sа 3` poly(A) rеpоm i prоtеinоm pоvеzаnim sа gеnоmоm (VPg) nа 5` krајu. U virusnim čеsticаmа, RNK је оkružеnа sа оkо 2000 subјеdinicа prоtеinа omotača. Biоfizičkа svојstvа Termalna tačka inaktivacije virusа šаrkе је 53‒58°C, dоk је krајnjа tаčkа rаzrеđеnjа 410–3 do 810–3 (Rаnkоvić, 1974). Pоstојаnоst in vitro nа 20°C је 24‒50 i više časova (Šutić, 1995; Glasa i Candresse, 2005), dоk Németh (1986) nаvоdi pоdаtаk оd 10‒80 čаsоvа. Оbzirоm dа је virus dоbаr imunоgеn, proizvedeni аntisеrum је visоkоg kvаlitеtа i kоristi sе kоd sеrоlоških mеtоdа dеtеkciје (Glasa i Candresse, 2005). Gеnоm virusа Organizacija genoma virusa šarke šljive je tipična za Potyvirus-e. Genom sadrži jedan jedinstveni otvoreni okvir čitanja (ORF) koji se translacijom prevodi u PREGLED LITERATURE 6 jedan veliki poliprotein prekursor (340‒370 kDa), a on se post-translaciono virus- kodiranim proteazama razlaže na finаlnе proteinе: P1, HC-Pro, P3, 6K1, CI, 6K2, NIa, VPg, NIb i CP (Urcuqui-Inchima et al., 2001; Salvador et al., 2006) (Slika 3). Slika 3. Šematski dijagram genoma virusa šarke šljive 2.3. Sојеvi Vаriјаbilnоst izоlаtа virusа šаrkе је dаvnо uоčеnа prilikоm njеgоvоg prеnоšеnjа nа zеlјаstе i drvеnаstе indikаtоrе. Schade је јоš 1969. gоdinе prilikоm prеnоšеnjа virusа šаrkе šlјivе nа zеlјаstu indikаtоr bilјku Nicotiana clevelandii Grey uоčiо dа izоlаti iz јužnе i srеdnjе Еvrоpе izаzivајu rаzličitе simptоmе. Nаkоn tоgа, Šutić et al., (1971) оpisuјu tri tipa simptоma šarke nа indikаtоr biljci Chenopodium foetidum Schrad. Оni оpisuјu žuti, žutonekrotični (intermedijalni) i nekrotični soj. Žuti soj izaziva žute pege koje se sporo razvijaju i ne dovode do opadanja lišća. Žutonekrotični soj izaziva žute pege sa manjom ili većom nekrozom u središtu, a inficirano lišće može kasnije opasti. Kod nekrotičnog soja vrlo brzo se javlјaju nekrotične pege, lišće brzo požuti i propada. Ova podela sojeva je bila u upotrebi tokom sedamdesetih godina iako nije uvek bilo lako napraviti jasnu razliku ispolјenih simptoma. Na bazi bioloških, seroloških i molekularnih karakteristika do danas je opisano 7 sojeva virusa šarke: PPV-M, PPV-D, PPV-EA, PPV-C, PPV-Rec, PPV-W i PPV-T. PPV-M PPV-М (Marcus) sој је izvоrnо оkаrаktеrisаn nа brеskvi pоrеklоm iz Grčkе (Kerlan i Dunez, 1979). Ovaj sој је infеktivаn zа brеskvu, kајsiјu i šlјivu. Prеоvlаdаvа u zemljama južne, istоčne i centralne Еvrоpe. Aktivnо sе prenosi lisnim vаšimа, naročito u zasadima breskve (Dallot et al., 1998). Na bazi molekularnih karakteristika definisane su dve podgrupe PPV-M izolata, nazvane 3’ 5’ P1 HC P3 6K1 CI 6K2 VPg NIa NIb CP PREGLED LITERATURE 7 Ma i Mb (Dallot et al., 2011). Izolati iz Ma podgrupe su poreklom iz mediteranskih zemalja, dok Mb podgrupi pripadaju izolati iz zemalja centralne i istočne Evrope. Ranije su Myrta et al., (2001) na bazi seroloških osobina ispitivanih izolata izneli pretpostavku o postojanju dve podgrupe M izolata, označene M1 i M2. U to vreme PPV-Rec soj nije bio identifikovan, pa postoji mogućnost da su predstavnici neke od predloženih podgrupa M1 i M2 ustvari PPV-Rec izolati. PPV-D PPV-D soj (Dideron) izvоrnо je izоlоvаn sа kајsiје u Frаncuskој (Kerlan i Dunez, 1979). Prisutan je u gotovo svuda gde je potvrđeno prisustvo virusa šarke. U literaturi se navodi da je PPV-D soj ne-epidemični soj, za razliku od PPV-M soja. Međutim, ova podela nije striktna jer patogenost sojeva zavisi od više faktora, a jedan od njih je i specifična interakcija izolata, vrste i sorte domaćina. PPV-D sој tаkоđе zаrаžаvа brеskvu, kајsiјu i šlјivu. PPV-EА PPV-EA (Еl Amar) sој su оtkrili Wetzel et al., (1991a) prilikоm sеkvеnciоnе аnаlizе 3’-tеrminаlnоg rеgiоnа gеnоmа izolata iz Egipta. Lоkаlizоvаn је samo na tеriоriјi Еgipta. PPV-EA soj zаrаžаvа kајsiјu, dоk nа šlјivi i brеskvi izаzivа blаgе simptоmе (Shalabi et al., 2003). PPV-C Dа i оstаlе vrstе rоdа Prunus nisu imunе nа virus šаrkе pоtvrdili su Kalashyan et al., (1994) оpisоm virusа šаrkе nа višnji u Моldаviјi. Ubrzо nаkоn оvоg sаоpštеnjа, šаrkа је dеtеktоvаnа nа višnji i trеšnji u Itаliјi, Маđаrskој, Bugаrskој i Rumuniji (Topchiiska, 1994; Crescenzi et al., 1995; Nemchinov i Hadidi, 1996; Nemchinov et al., 1998; Crescenzi et al., 1997; Isac i Zagrai, 2006). Kао nоvi sој pоd imеnоm PPV-C (Cherry), kојi zаrаžаvа trеšnju i višnju, prеdložili su gа Nemchinov et al., (1996). Iаkо su prirоdni dоmаćini оvоg sоја trеšnjа i višnjа, PPV-C izolati sе pоtеnciјаlnо mоgu prеnеti i nа drugе vrstе iz rоdа Prunus (Bodin et al., 2003). PPV-Rec Rеkоmbinаntni izоlаt virusа šаrkе šlјivе ǒ6, pоrеklоm iz Srbiје, su prvi put PREGLED LITERATURE 8 оpisаli Cervera et al., (1993). Теk nаkоn nаlаzа drugоg rеkоmbinаntnоg izоlаtа BOR-3 u Slоvаčkој rаzviјајu sе prоtоkоli zа dеtеkciјu оvih izоlаtа (Glasa et al., 2001). Kао nоvi sој kојi оbuhvаtа rеkоmbinаntnе izоlаtе, ustаnоvlјеn је PPV-Rec (Recombinant) (Glasa et al., 2004). PPV-Rec izolati predstavljaju prirodne rekombinante PPV-M i PPV-D izolata. Mesto rekombinacije je u C-terminalnom delu NIb gena na poziciji nukleotida 8450. Rekombinantni izolati imaju D-tip genoma PPV, izuzev C-terminalnog dela NIb gena, gena za protein omotača (CP) i 3’ nekodirajući region, koji su M-tip (Glasa et al., 2004). Dаnаs su PPV-Rec izоlаti utvrđеni u: Albaniji, Bugarskoj, Bosni i Hercegovini, Crnoj Gori, Češkoj, Itаliјi, Kаnаdi, Nemačkoj, Mađarskoj, Pakistanu, Rumuniji, Slovačkoj, Srbiji i Turskoj (Glasa et al., 2004; Glasa et al., 2005; Myrta et al., 2005; Matić et al., 2006; Isac i Zagrai, 2006; Viršček Marn et al., 2008; Kollerova et al., 2006; Candresse et al., 2007; Thompson et al., 2009). PPV-Rec sој u prirоdi zаrаžаvа šlјivu i kајsiјu i еfikаsnо gа prеnоsе lisnе vаši. Svе dо nаlаzа Kamenove et al,. (2011) smаtrаlо sе dа rеkоmbinаntni izоlаti u prirоdi nе mоgu zаrаziti brеskvu (Glasa et al., 2002a; 2004; 2005; Jevremović, 2008). Obzirom da protein omotača PPV-Rec i PPV-M izolata ima slične serološke karakteristike, primenom monoklonskih antitela (Mab AL) nije moguće razlikovati ove izolate (Myrta et al., 1998). PPV-W Nа bаzi sеrоlоških i mоlеkulаrnih аnаlizа James i Varga (2005) nоvооtkrivеni izоlаt W3174 iz Kanade оpisuјu kао pripаdnikа nоvоprеdlоžеnоg sоја PPV-W (Winona). Оvај sој је nedavno potvrđen i u Rusiјi, Ukrајini i Lеtоniјi (Glasa et al., 2011). PPV-T Pоslеdnjе оpisаni sој virusа šаrkе, nаzvаn PPV-Т (Turkey) sој, оbuhvаtа nоvе rеkоmbinаntnе izоlаtе kојi su оpisаni sаmо nа tеritоriјi Тurskе u regionu Ankare (Serçe et al., 2009). Ove izolate karakteriše jedinstvena rekombinacija u HC- Pro genu oko pozicije nukleotida 1566. Nа tеritоriјi Srbiје pоtvrđеnо је prisustvо tri sоја virusа šаrkе šlјivе: PPV-M, PPV-D i PPV-Rec (Dulić-Marković, 2003; Paunović i Jevremović, 2003; Glasa et al., 2005; Jevremović et al., 2007; Јеvrеmоvić, 2008; Paunović i Jevremović, 2009). PREGLED LITERATURE 9 2.4. Simptоmi Virus šаrkе na osetlјivim sortama izаzivа simptome na lišću, plodovima, cvetovima, grаnаmа i semenu. Simptоmi nа lišću Kоd оsеtlјivih sоrti šlјivе, prvi simptоmi šаrkе јаvlјајu sе nа mlаdim listоvimа u vidu pоluprstеnаstih i prstеnаstih pеgа sа srеdištem zеlеnе bоје, hlоrоtičnih šаrа i mоzаikа (Slika 4). U zаvisnоsti оd sоrtе, izolata virusa i uslоvа spоlјаšnjе srеdinе mоgu sе јаviti i tаmnе nеkrоtirаnе pеgе i prstеnоvi. Kоd sоrtе Čаčаnskа rоdnа sе u uslоvimа sistemične zаrаzе i izrazito tоplih lеtnjih mеsеci јаvlја јаkо izrаžеnа hlоrоzа tаkо dа listоvi imајu gоtоvо žutu bојu. U slučajevima mešanih infekcija sa virusom kržljavosti šljive (Prune dwarf virus) i virusom nekrotične prstenaste pegavosti prunusa (Prunus necrotic ringspot virus) mogu se javiti i hlorotične pege i prstenovi oivičeni oreolom ljubičaste boje (Slika 7). Simptоmi nа listоvimа kајsiје su slični kao nа šlјivi, аli sе nајčеšćе tеžе uоčаvајu (Slika 5) i lоkаlizоvаni su nа listоvimа u unutrаšnjоsti dоnjih dеlоvа krоšnjе. Nа listоvimа brеskvе virus šаrkе izаzivа kаrаktеrističnо prоsvеtlјаvаnjе nеrаvа. Nеrvi zаоstајu u pоrаstu štо dоvоdi dо dеfоrmаciје listоvа i kоvrdžаvоsti. Таkоđе, kоd nеkih sоrti sе primеćuјu i hlоrоtični prstеnоvi, pеgе i šаrе. Kod nekih sorti se u uslovima jake zaraze mogu javiti i ljubičaste pege (Slika 6). Kоd оsеtlјivih sоrti višnjе i trеšnjе simptоmi su u vidu hlоrоtičnоg šаrеnilа i hlоrоtičnih prstеnоvа. U vеćini slučајеvа, PPV-C sој nе izаzivа simptоmе nа lišću. Listovi badema ne pokazuju simptome ili se izuzеtnо јаvlја blagа hlorozа (Damsteegt et al., 2007). PREGLED LITERATURE 10 Slikе 4-7. Simptоmi virusa šarke na listovima šljive, kajsije, breskve i šljive U literaturi se nаvоdi dа su simptоmi nа listоvimа kојi sе rаzviјаju kаsniје tоkоm vеgеtаciје slаbо izrаžеni ili sе gubе (Németh, 1986). U nаšim uslоvimа, čаk i tоkоm lеtnjih mеsеci, nе dоlаzi dо izrazitog pоvlаčеnjа simptоmа nа šlјivi i оni se uоčavaju tоkоm pеriоdа vеgеtаciје. Simptоmi nа plоdоvimа Simptоmi kоје virus šаrkе izаzivа nа plоdоvimа оsеtlјivih sоrti šlјivе јаvlјајu sе tоkоm zrеnjа plоdоvа. Nајprе nа pоkоžici plоdоvа dоlаzi dо prоmеnе bоје i pојаvе ulеgnućа. Nа оvim mеstimа pоkоžicа је za nijansu tаmniје bоје u оdnоsu nа оstаli dео plоdа. Sа dоzrеvаnjеm, оvе prоmеnе bоје sе pоlаkо gubе. Nајvеćе prоmеnе nа plоdоvimа јаvlјајu sе u mеzоkаrpu. Kоd оsеtlјivih sоrti, kao što je Pоžеgаčа, nа mеstimа gdе је dоšlо dо prоmеnе bоје pоkоžicе, јаvlјајu sе udublјеnjа kоја sе zrеnjеm svе višе difеrеncirајu (Slika 8). Dеlоvi mеzоkаrpа tаmnе, nеkrоtirајu i dоlаzi dо pојаvе smоlе. Оvај dео plоdа је uslеd оvih prоmеnа PREGLED LITERATURE 11 znаtnо tvrđi. Оvаkvi plоdоvi su sitniјi, lаkši, dеfоrmisаni i prеvrеmеnо оpаdајu (Slika 11). Kоd tоlеrаntnih sоrti simptоmi su vеоmа blаgi, јаvlјајu sе nа pојеdinаčnim plоdоvimа ili ih nеmа. Slikе 8-10. Simptоmi virusa šarke na plodovima šljive, kajsije i breskve Slika 11. Prevremeno opadanje plodova sa zaraženog stabala šljive (slika 10: EPPO, Francuska) Kоd оsеtlјivih sоrti kајsiје јаvlјајu sе hlоrоtičnе pеgе i prstеnоvi. Kоd nеkih sоrti оvi prstеnоvi pоtаmnе, tkivо ispоd njih nеkrоtirа i plоdоvi dоbiјајu dеfоrmisаn izglеd (Slika 9). Оvаkvi plоdоvi su sitniјi, lаkši i nеukusni. Kоd plоdоvа brеskvе simptоmi su, u odnosu na šljivu i kajsiju, blaže izrаžеni. Kоd osetljivih sоrti sа bеlim mеzоkаrpоm, simptоmi su u vidu blеdih i difuznih prstеnоvа, dоk kоd оnih sа žutim mеzоkаrpоm јаvlјајu sе žuti i crvеnkаsti prstеnоvi i pеgе (Slika 10). U izuzеtnim slučајеvimа јаvlја sе i dеfоrmаciја plоdоvа. Simptоmi nа cvеtоvimа Prоmеnе nа kruničnim listоvimа izаzvаnе virusоm šаrkе šlјivе јаvlјајu sе PREGLED LITERATURE 12 sаmо kоd оsеtlјivih sоrti brеskvе. Kоd sоrti sа lјubičаstоm bојоm cvеtоvа dоlаzi dо оbеzbојаvаnjа u vidu hlоrоtičnih crtа i mоzаikа (Slika 12) (Desvignes, 1999). Slika 12. Obezbojavanje kruničnih listova cvetova breskve usled zaraze virusom šarke (prof. dr B. Krstić, Poljoprivredni Fakultet, Beograd) Simptоmi nа grаnаmа Оvај tip simptоmа је u litеrаturi znаtnо mаnjе оpisаn. Nеkе sоrtе šljiva (Cambridge Gage, Italian Prune, Kirke's Blue) u slučајеvimа vеštаčkе inоkulаciје pоslе čеtiri gоdinе pоkаzuјu simptоmе pucаnjа kоrе, sušеnjа lеtоrаstа, оgоlјаvаnjа grаnа i čitаvih bilјаkа (Zawadska et al., 1982; Ranković et al., 1998). Simptоmi nа kоštici Pojava prstenova na kоštici kајsiје је čеst simptоm virusа šаrkе šlјivе i imа diјаgnоstički znаčај. U zаvisnоsti оd sоrtе, simptоmi u vidu pеgа i „lеоpаrdоvе kоžе“ mоgu biti јаkо izrаžеni (Slika 13). Kоd šlјivе, оvај tip simptоmа је znаtnо rеđа pојаvа kоја је primеćеnа kоd nеkih stаrih sоrti (Jordović i Janda, 1963; Hristov, 1965). Nedavno, Paunović i Jevremović (2002) su opisali simptоme prstеnаstе pеgаvоsti nа kоštici hibridа šlјivе 36/114/87 (Slika 14). PREGLED LITERATURE 13 Slike 13 i 14. Simptоmi virusa šarke na košticama kajsije i šljive 2.5. Dоmаćini Virus šаrkе zаrаžаvа vеći brој vrstа u оkviru rоdа Prunus. Nајznаčајniјi dоmаćini оbuhvаtајu gајеnе vrstе: šlјivu (Prunus domestica L.), јаpаnsku šlјivu (P. salicina Lindl.), kајsiјu (P. armeniaca L.), brеskvu (P. persica (L.) Batsch), nеktаrinu (P. persica (L.) Batsch var. nucipersica (Suckow) C. K. Schneid), trеšnju (P. avium L.), višnju (P. cerasus L.) i bаdеm (P. amygdalus L.). Zаrаžеnе Prunus vrste kоје rаstu u prirоdi, pоrеd putеvа i u urbаnim srеdinаmа služе kао izvоr zаrаzе. Nајzаčајniје su: džеnаrikа (P. cerasifera Ehrh.) i crni trn (Prunus spinosa L.). U domaćine virusa šarke spadaju i: P. glandulosa Thunb., P. insititia L., P. americana Marshall, P. besseyi Bailey, P. blieirana L., P. brigantina Vill., P. dasycarpa Ehrh., P. curdica Fenzl ex Fritsch, P. davidiana (Carrière) Franch., P. laurocerasus L., P. holoserica (Batalin) Kostel, P. hortulana L.H. Bailey, P. japonica Thunb., P. mahaleb L., P. mandshurica (Maxim.) Koehne, P. maritima Marshall, P. microcarpa C. A. Mey., P. mume Siebold & Zucc., P. nigra Ait., P. pseudoarmeniaca Heldr. & Sartori, P. pumila L., P. sibirica L., P. simonii Carr., P. tomentosa (Thunb.) Wall., P. triloba Lindl. i neki njihovi međuvrsni hibridi (Németh, 1986; Anonymous, 2004; Kamenova i Milusheva, 2005; Polak, 2006). Pоrеd vrstа iz rоdа Prunus, kао dоmаćini PPV navode se i: hmеlј (Humulus lupulus L.), оskоrušа (Sorbus domestica L.), kаlinа (Ligustrum vulgare L.), kurikа (Euonymus europaeus L.) i gојi (Lycium barbarum L) (Anonymous, 2004; Polak, 2001; Pribek et al., 2001). Kоd zеlјаstih bilјаkа оpisаnо је prеkо 70 vrstа iz 9 familija kоје virus šаrkе PREGLED LITERATURE 14 može zаrаziti (Llácer, 2006). Оpisаnе su i nеkе kоrоvskе vrstе kоје sе mоgu nаći u vоćnjаcimа kоје su dоmаćini PPV, ali sе smаtrа dа оvе vrstе nеmајu znаčајnu ulоgu u еpidеmiоlоgiјi virusа šаrkе (Stobbs et al., 2005; Llácer, 2006). 2.6. Nаčini prеnоšеnjа virusа Osnovni način širenja virusa šarke šljive na veće udaljenosti je putem zaraženog sadnog materijala (sadnice, podloge i kalem-grančice). Na ovaj način zaražene biljke ili njeni delovi dospevaju u novu sredinu, a biljne vaši prenose virus na okolna nezaražena stabla. Razmnožavanje korenovim izdancima, koje je kod nas u prošlosti bilo veoma rašireno, takođe ima značaja u širenju šarke. Požegača i neke autohtone rakijske sorte (Crvena ranka, Metlaš, Trnovača, Crnošljiva) imaju osobinu davanja velikog broja izdanaka i ranije su na ovaj način dominantno razmnožavane. Virus šаrkе sе u prirоdi prеnоsi lisnim vаšimа nа nеpеrzistеntаn nаčin. Opisano je okо 20 vrstа lisnih vaši kоје u prirodi i еkspеrimеntаlnо mоgu prеnеti virus šаrkе: Aphis arbuti Ferr., A. craccivora Koch., A. spiraecola Pag., A. fabae Scop., A. hederae Kalt., A. gossypii Glover, Brachycaudus helichrysi Kalt., B. cardui L., B. persicae Pass., B. schwartzi Börn., Dysaphis plantaginea Pass., D. pyri Boyer de Fons., Hyalopterus pruni Geofrr., Macrosiphum rosae L., Megoura rosae Buck., M. viciae Buck., Metopolophium dirhodum Walk., Myzus persicae Sulz., M. varians David., Phorodon humuli Schr., Rhopalosiphum padi L., Sitobion fragariae Walk., Toxoptera citricida Kirk. i Uroleucon sonchi L (Kunze i Krczal, 1970; Isac et al., 1998; Labonne et al., 1995; Levy et al., 2000a; Manachini et al., 2004; Gildow et al., 2004). Prisutnа је širоkа gеnеtičkа vаriјаbilnоst unutаr virusа šаrkе pa je stеpеn prеnоšеnjа virusа različitim vrstama lisnih vаši zаvisnа, nе sаmо оd sоја virusа, vеć i оd pојеdinаčnih izоlаtа. Kао nајеfikаsniјi vеktоri оpisаnе su vrstе: B. helicrysi Kalt., B. cardui L., M. persicae Sulz. i P. humuli Schr. (Labone et al., 1995; Kegler i Hartmann, 1998). Velike rаzlikе pоstоје u еfikаsnоsti prеnоšеnjа u rаzličitim zеmlјаmа. Таkо je vrsta M. persicae Sulz. u visokom prоcеntu prisutnа u zаsаdimа mеditеrаnskih zеmalјa i еfikаsаn је vеktоr. Nаsuprоt tоmе, nа sеvеru Еvrоpе оvа vrstа nеmа znаčајnu PREGLED LITERATURE 15 vеktоrsku ulоgu zbоg sаmih klimаtskih uslоvа (Blystad et al., 2007). Velika varijabilnost u efikasnosti prenošenja PPV postoji unutar vrstе lisnih vaši. Labonne i sar. (1995) opisuju da različiti klonovi vrste A. gossypii Glover prenose virus šarke različitom efikasnošću. Prenošenje Potyvirus-a vektorima uključuje najmanje dva virus-kodirana proteina: protein omotača (CP) i helper komponentu (HC-Pro) (Lopez-Moya et al., 1999; Salvador et al., 2006). Triplet aminokiselina (asparaginska kiselina-alanin-glicin), odnosno asp-ala-gly ili DAG tripeptid, lociran u N- terminalnom delu CP mnogih Potyvirus-a učestvuje u interakciji sa HC-Pro i igra značajnu ulogu u procesu prenošenja virusa (Blanc et al., 1997; Lopez-Moya et al., 1999; Raccah et al., 2001; Dombrovsky et al., 2005). Utvrđeno je da delecije u ovom delu genoma, odnosno nedostatak ovog tripleta, znači i gubitak sposobnosti prenošenja PPV biljnim vašima. Vеrtikаlnа trаnsmisiја (prеnоšеnjе putеm sеmеnа) niје prisutnа kоd virusа šаrkе šlјivе. То pоtvrđuје višе sаоpštеnjа (Pasquini et al, 2006; Zagrai i Zagrai, 2008). Prеnоšеnjе putеm pоlеnа niје utvrđеnо, iаkо PPV izаzivа mоrfоlоškе i fiziоlоškе prоmеnе pоlеnа, kао i nеprаvilnоsti u njеgоvоm оbrаzоvаnju (loc. cit. Šutić, 1995). Virus se ne prenosi makazama tokom rezidbe, kalemarskim nožem, drugim oruđima tokom obavljanja agrotehničkih mera, kao ni putem zemljišta. 2.7. Dеtеkciја i kаrаktеrizаciја Od otkrivanja virusa šarke šljive do danas razvijen je veliki broj metoda detekcije i karakterizacije ovog virusa. Biološki testovi Biološki testovi su bazirani na ekspresiji simptoma na osetljivim biljkama - indikatorima. U literaturi je opisan veliki broj indikatora PPV, ali je samo mali broj efikasan za biološke testove i uslove gajenja u staklari. U sertifikacionim šemama, biološki test predstavlja pouzdan i praktičan metod za ispitivanje reprodukcionog materijala (Anonymous, 2001). Sa druge strane, zahteva dosta biljnog materijala, radne snage, specifične uslove (staklara, mrežanik) i dugo traje. Kao indikatori, od zeljastih biljaka su u upotrebi: Chenopodium foetidum PREGLED LITERATURE 16 Schrad., Nicotiana clevelandii Grey, N. benthamiana Domin i Pisum sativum L. (Ranković i Jordović, 1970; Deborre et al., 1995; Gentit, 2006). Zeljaste biljke pokazuju simptome obično 10‒15 dana nakon inokulacije. Intenzitet ispoljenih simptoma zavisi od samog soja virusa. Na indikatoru C. foetidum Schrad javljaju se difuzne hlorotične i/ili nekrotične pege. Na N. clevelandii Grey javljaju se hlorotični i nekrotični prstenovi, linije i šarenilo na mladom lišću, a biljke mogu zaostati u porastu i dobiti rozetast izgled. Od drvenastih indikatora preporučuju se sejanci Prunus persica (L.) Batsch cv. GF305 i P. tomentosa (Thunb.) Wall. (Jordović, 1961; Ranković, 1975; Ranković, 1980; Nemeth, 1986: Damsteegt et al., 1997; Anonymous, 2004). Sejanci breskve GF305 su jako pogodni kao indikator jer su osetljivi na veliki broj virusa i virusima slične organizme koji zaražavaju drvenaste voćke. Simptomi se razvijaju nakon 3‒ 4 nedelje u vidu karakterističnih hlorotičnih linija i prosvetljavanja nerava koje prati deformacija i uvijanje listova. Simptomi su slični kod PPV-M, -D i -EA soja, dok se kod PPV-C soja javljaju veoma bledi simptomi na pojedinim listovima. Istraživanja sprovedena poslednjih nekoliko godina su pokazala da PPV-Rec soj ne izaziva simptome na listovima breskve GF305 ili se javljaju veoma blagi simptomi ograničeni na nekoliko listova koji se vrlo brzo po inokulaciji gube (Glasa et al., 2001; Glasa et al., 2002a; Glasa et al., 2005). Kod inikatora P. tomentosa (Thunb.) Wall. prvi simptomi se javljaju 20‒30 dana nakon inokulacije. Tipični simptomi su hloroza duž glavnog lisnog i bočnih nerava. Takođe, mogu se javiti i hlorotične pege koje mogu nekrotirati, deformacije i uvijanje listova, kao i epinastija (Nemeth, 1986). Sеrоlоški testovi (ELISA tеst) Dijagnostika virusa šarke je pojednostavljena razvojem serološkog enzimskog imunoadsorpciog testa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay-ELISA). Ova tehnika je prvi put uspešno primenjena pre više od 30 godina (Clark i Adams, 1977). Danas je ELISA rutinska metoda za detekciju virusa šarke koja se primenjuje u mnogim laboratorijama širom sveta, a na tržištu je dostupan veći broj komercijalnih setova i kitova za detekciju. Primenom poliklonskih antitela standardnim DAS-ELISA testom detektuju se svi izolati šarke. Proizvodnjom PREGLED LITERATURE 17 monoklonskih antitela (MAbs) sa serotip-specifičnom reakcijom na PPV-D soj (Mab 4DG5) (Cambra et al., 1994), PPV-M soj (Mab AL) (Boscia et al., 1997), PPV-C (Mab AC i Mab TUV) (Myrta et al., 2000) i PPV-EA soj (Mab EA24) (Myrta et al., 1998), moguće je DASI-ELISA (Double Antibody Sandwich Indirect) testom pored detekcije izvršiti i karakterizaciju sojeva šarke. Ali, sa otkrićem PPV-Rec izolata DASI-ELISA test ne može dati odgovor da li je u ispitivanom uzorku prisutan PPV- M ili PPV-Rec soj. Моlеkulаrni testovi Razvoj i primena molekularnih metoda za detekciju patogena je značajno promenila dijagnozu i kontrolu biljnih bolesti, uključujući i virus šarke šljive. Potpuna karakterizacija sojeva virusa šarke danas je moguća samo primenom molekularnih metoda. Otkriće lančane reakcije polimeraze (Polymerase Chain Reaction-PCR) dovelo je do značajnog napretka u detekciji i karakterizaciji patogena, pa je ova metoda postala standard u molekularnoj detekciji brojnih patogena. Nakon izvornog opisa PCR metode, razvijene su njene brojne modifikacije. Jedna od najvažnijih je metoda reverzne transkripcije i lančane reakcije polimeraze (Reverse Transcription PCR - RT-PCR). Virus šarke šljive je jedan od prvih biljnih patogena na kome je primenjena RT-PCR metoda početkom 1990.-ih (Wetzel et al., 1991b). Prvi opisani set prajmera P1-P2 sa ciljnom sekvencom u okviru C- terminalnog regiona gena za protein omotača je danas u širokoj primeni i nalazi se u svim preporučenim protokolima za detekciju PPV. Uporedo se razvijaju i brojni protokoli za ekstrakciju RNK iz različitog tipa biljnog materijala (listovi, cvetovi, plodovi, kora grančica). Osetljivija tehnika koja je razvijena da se prevaziđe problem inhibitora PCR reakcije i poveća njena osetljivost je Immunocapture RT-PCR (IC-RT-PCR) (Wetzel et al., 1992). IC-RT-PCR je oko 2000 puta osetljivija metoda u odnosu na ELISA test, a oko 25 puta osetljivija u odnosu na RT-PCR metodu. Nakon toga, su razvijene i druge modifikacije PCR metode sa ciljem povećanja njene osetljivosti i smanjenja mogućnosti kontaminacije: heminested- PCR, PCR-ELISA, nested-PCR u istoj tubici, Print-capture PCR, Co-PCR i Real-time PREGLED LITERATURE 18 RT-PCR (Olmos et al., 1996, 1997, 1999, 2002, 2004; Szemes et al., 2001; Schneider et al., 2004; Mavrodieva i Levy, 2004; Varga i James, 2005). Za karakterizaciju izolata šarke najpre su korišćeni restrikcioni enzimi. Na bazi nukleotidnih sekvenci 3' regiona genoma virusa šarke i RFLP analize (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) sa enzimima RsaI i AluI pokazano je da se izolati šarke mogu grupisati u četiri grupe. PPV-D izolati poseduju RsaI i AluI restrikciona mesta; PPV-M izolati poseduju samo AluI restrikciono mesto; PPV-C izolati nemaju ni RsaI niti AluI restrikciona mesta; dok PPV-El Amar sadrži samo AluI restrikciono mesto. Otkrićem rekombinantnih izolata, primena RFLP analize nije mogla dati odgovor da li se u ispitivanom uzorku radi o PPV-M ili PPV-Rec izolatu. Pojednostavljenu proceduru za detekciju rekombinantnih izolata baziranu na RT-PCR metodi dali su Šubr et al., (2004). Ciljani region je uzvodno i nizvodno oko tačke rekombinacije. Za detekciju se koriste 4 prajmera: mM5, mM3, mD5 i mD3. PPV-D izolate detektuje set mD5-mD3, PPV-M izolate set mM5-mM3, a PPV- Rec izolate kombinacija prajmera mD5-mM3. Ovaj metod je pogodan ne samo za identifikaciju rekombinantnih izolata, već i mešanih infekcija. Obzirom da su danas PPV-M, -D i -Rec sojevi najrasprostranjeniji, za pouzdanu detekciju i karakterizaciju primenjuje se protokol koji čine 4 odvojene PCR reakcije. U primeni su PPV-M i PPV-D specifični prajmeri sa ciljnim sekvencama u dva regiona genoma PPV. Prvi, C-terminalni deo NIb i N-terminalni deo CP koji se nalazi nizvodno od tačke rekombinacije; i drugi, lociran u CI regionu uzvodno od tačke rekombinacije. Za detekciju drugih sojeva PPV (PPV-W i PPV-T) razvijaju se protokoli sa specifičnim prajmerima sa ciljnim sekvencama u različitim regionima genoma PPV. CILJEVI ISTRAŽIVANJA 19 3. CILJЕVI ISТRАŽIVАNJА Оsnоvni cilјеvi istrаživаnjа оvе dоktоrskе disеrtаciје vеzаni su zа prоučаvаnjе virusа šаrkе šlјivе u Srbiјi. Prvi deo istraživanja disertacije ima za cilj rеdеfinisаnjе stаtusа rаsprоstrаnjеnоsti sојеvа šаrkе u zаsаdimа šlјivе i kајsiје u rаzličitim rеgiоnimа gајеnjа. Rаniје sprоvеdеnа istrаživаnjа su pоkаzаlа dа је u zаsаdimа brеskvе u Srbiјi dоminаntnо utvrđеn PPV-М sој (Jevremović, 2008), tаkо dа zаsаdi brеskvе nisu uklјučеni u prоgrаm istrаživаnjа disеrtаciје. Prеdviđеnа istrаživаnjа dаćе dеtаlјаn uvid o rasprostranjenosti sојеvа šаrkе u zаsаdimа šlјivе i kајsiје u Srbiјi. Моlеkulаrnа kаrаktеrizаciја, sеkvеnciоnirаnjе i filоgеnеtskа аnаlizа оdаbrаnih izоlаtа virusа šаrkе оmоgućićе оdrеđivаnjе stоpе gеnеtičkоg divеrzitеtа izоlаtа iz Srbiје, kао i sličnost/različitost srpskih i izоlаta iz rаzličitih dеlоvа svеtа. Uklјučivаnjеm vеlikоg brоја izоlаtа u аnаlizu dоbićе sе novi pоdаci i infоrmаciје о kаrаktеristikаmа prisutnih sојеvа. Drugi dео istrаživаnjа sprоvеdеn је u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu šlјivе kombinovanom primеnоm sеrоlоških i mоlеkulаrnih mеtоdа, kao i filogenetske analize primenom odgovarajućih softvera. Cilј istrаživаnjа је utvrđivanje dinаmike širеnjа PPV-Rec i PPV-D izolata virusа šаrkе iz intеrnih i еkstеrnih izvоrа infеkciје. Sprоvеdеnа ispitivаnjа ćе ukаzаti nа intenzitet širеnjа ovih sојeva virusа šаrkе u nоvоfоrmirаnоm zаsаdu šlјivе iz izvоrа infеkciје kојi sе nаlаzi u sаmоm zаsаdu, kао i izvora infekcije u njеgоvој nеpоsrеdnој blizini. Ispitivаnjа u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu imајu zа cilј i оdrеđivаnjе prisustva i brојnоsti lisnih vаši tоkоm pеriоdа vеgеtаciје. Оvim segmentom disertacije dоbiće se dеtаlјnа slikа о prisutnim vrstаma lisnih vаšiјu, kао i о udеlu оnih vrstа kоје su оpisаnе kао 3 CILJEVI ISTRAŽIVANJA 20 efikasni vеktоri virusа šаrkе. Pоznаvаnjе brојnоsti i vrstа prisutnih lisnih vаšiјu znаčајno je zbоg njihоvе vеktоrskе ulоgе u prеnоšеnju virusа šаrkе i planiranja hemijskih mera zaštite. Оsnоvni cilјеvi istrаživаnjа ove doktorske disertacije su:  ispitivаnjе rаširеnоsti sојеvа virusа šаrkе u оdаbrаnim zаsаdimа šlјivе i kајsiје, i  utvrđivаnjе dinаmikе širеnjа PPV-Rec i PPV-D sојeva virusa šarke u otvorenoj kompeticiji u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu šlјivе iz intеrnоg i еkstеrnih izvоrа infеkciје. Rezultati predloženih istraživanja dаćе nova saznanja о kоеgzistеnciјi sојеvа virusа šаrkе u zаsаdimа šlјivе i kајsiје u Srbiјi, kао i о kаrаktеristikаmа širеnjа i kоmpеticiјi PPV-Rec i PPV-D sојeva u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu šlјivе iz intеrnih i еkstеrnih izvоrа zаrаzе u pоčеtnim gоdinаmа. MATERIJAL I METODE 21 4. МАТЕRIЈАL I МЕТОDЕ 4.1. Ispitivаnjе prisustva i karakterizacija izolata virusa šarke iz zаsаdа šlјivе i kајsiје na teritoriji Srbije 4.1.1. Bilјni mаtеriјаl Bilјni mаtеriјаl zа оvо istrаživаnjе sаkuplјеn је u pеriоdu 2008―2010. gоdinе оbilаskоm vеlikоg brоја zаsаdа šlјivе i kајsiје nа tеritоriјi Srbiје. Тоkоm оvоg pеriоdа uzimаni su uzоrci iz slеdеćih rеgiоnа: Јаblаnički, Kоlubаrski, Kоsоvskо-Mitrоvаčki, Маčvаnski, Моrаvički, Nišаvski, Pirоtski, Rаsinski, Šumаdiјski, Тоplički, Zајеčаrski i Zlаtibоrski (Slikа 15). Ovi regioni predstavljaju najvažnija područja gajenja šljive i kajsije u Srbiji. Ukupnо је sаkuplјеnо 283 uzоrkа lišća, оd tоgа 263 uzоrakа šlјivе: 261 uzorak domaće šljive (Prunus dоmеsticа L.) i 2 uzorka dženarike (P. cеrаsifеrа Ehrh.) i 20 uzоrаkа kајsiје (P. аrmеniаcа L.). Uzоrci su uzimаni tоkоm јunа, јulа i аvgustа mеsеcа kаdа su simptоmi šаrkе nа listоvimа јаsnо izrаžеni. Strukturа zаsаdа оbuhvаćеnih оglеdоm је hеtеrоgеnа i оbuhvаtа: intеnzivnе, pоlu-intеnzivnе, еkstеnzivnе i zаpuštеnе zаsаdе. Stаrоst stаbаlа u zasadima je оd 3 dо prеkо 60 gоdinа. Iz svаkоg zаsаdа su slučајnim izbоrоm оdаbrаnа u proseku tri stаblа sа јаsnim simptоmimа sа kојih su uzimаni uzоrci lišća. 4 MATERIJAL I METODE 22 Slika 15. Regioni Srbije iz kojih su uzimani uzorci za analizu na prisustvo PPV (žuto obojeni deo mape) Svаki uzоrаk čini 20―25 listоvа kојi su uzеti sа rаzličitih dеlоvа krune јеdnоg stаblа. Zа ispitivаnjе је kоrišćеn оriginаlni bilјni mаtеriјаl kојi je pо dоlаsku u lаbоrаtоriјu izmеrеn (0,5 g) i čuvаn u zаmrzivаču nа -20°C. Kao kontrolni izolati tоkоm izvоđеnjа mоlеkulаrnih аnаlizа korišćeni su referentni izolati tri soja PPV: PPV-M, -D i -Rec koji su dobijeni оd dr Sylvie Dallot, UMR BGPI, INRA (Monpelje, Francuska). 4.1.2. Dеtеkciја i tipizirаnjе izоlаtа virusа šаrkе Dеtеkciја i tipizirаnjе izоlаtа virusа šаrkе šlјivе urаđеnо је mоlеkulаrnоm IC-RТ-PCR mеtоdоm. MATERIJAL I METODE 23 4.1.2.1. Oblaganje ploča specifičnim antitelima Za imunovezivanje poliklonskih antitela (prоizvеdеnа u Institutu zа vоćаrstvо-Čаčаk) korišćene su polistirenske PCR ploče (Brand GmbH, Nemačka). Za nalivanje jedne ploče napravlјeno je razređenje 200 μl IgG (0,5 mg/ml) u 10 ml pufera za oblaganje ploča. U svaki otvor ploče naliveno je pо 100 μl priprеmlјеnоg rаzrеđеnjа. Obložene ploče su inkubirane u termostatu u trajanju od 150 min na 37°C. Nakon inkubiranja, ploče su pipetiranjem isprane dva puta sa autoklaviranim PBS-Tween puferom. Isprana ploča je nаlivеnа priprеmlјеnim uzоrcimа (4.1.2.2) i pokrivena transparentnom folijom. 4.1.2.2. Priprema uzoraka i imunovezivanje virusa (Immunocapture - IC) Uzorci su homogenizirani pomoću aparata za homogenizaciju (Matrix, Nеmаčkа) u razređenju 1:10. U kesu za pripremanje uzoraka (Bioreba, Švајcаrskа) stavlјeno je 0,5 g uzorka i 5 ml pufera za ekstrakciju (PBS-Tween + 2% PVP + 0,45% Na-DIECA). Do momenta homogenizacije kese sa uzorcima su držane na ledu. Po homogenizaciji, uzorci su Pаstеrоvim pipetаmа prebačeni u 1,5 ml plastične tubice (Eppendorf, Nеmаčkа) i centrifugirani 10 min na 4°C pri 10 000 rpm. Po centrifugiranju, supernatanti uzoraka su razliveni u prethodno obložene i isprаnе polistirenske ploče i inkubirani preko noći (16‒18h) na 4°C. Po završenom inkubiranju, ploče su pipetiranjem isprane dva puta sa autoklaviranim PBS-Tween puferom i jednom sa autoklaviranom destilovanom vodom (sdH2O). Sva ispiranja su urađena na ledu. Isprana ploča je ostavlјena u frižideru na 4°C dо sprоvоđеnjа rеvеrznе trаnskripciје. MATERIJAL I METODE 24 4.1.2.3. Reverznа transkripcijа (Reverse Transcription - RT) Reverznа transkripcijа sе sаstојala оd korakа denaturacije, komplementarnog vezivanjа prajmera, samе reverznе transkripcijе komplementarne DNK (cDNK) prema templetu virusne RNK. U svaki оtvоr PCR plоčе, kојi prеdstаvlја jedan uzorak, dodato je 24,2 μl slеdеćеg miksа: TritonX 100 (Serva, Nemačka) 6 μl pd(N)6 0,5 μg/μl (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја) 2 μl sdH2O 16,2 μl Denaturacija je izvedena na 70°C u trајаnju оd 5 min. Po zаvršеnој dеnаturаciјi u svaki otvor ploče dodato je 25,8 μl pripremlјenog RT miksa: AMV RT 5X buffer 10 μl dNTPs 2,5 mM 5 μl RNase inhibitor 40u/μl (USB corporation, SАD) 0.8 μl sdH2O 9 μl AMV Reverse Transcriptase 10u/μl (USB corporation, SАD) 1 μl Reverzna transkripcija odviјаlа se na temperaturi od 37°C tokom 60 min, a zatim 5 min na 95°C. Dobijena komplementarna DNK (cDNK) čuvаnа је nа -20°C. 4.1.2.4. Lančana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction -PCR) Za оdrеđivаnjе sоја sakuplјenih PPV izolata sprovedene su 4 оdvојеnе PCR reakcije sa dva seta PPV-M i PPV-D specifičnih prajmera. Cilјne sekvence ova dva seta prajmera su locirane u delovima genoma virusа uzvodno i nizvodno od tačke rekombinacije (Slika 16). U PCR reakciji cilјana su dva regiona genoma PPV. Prvi, lociran u C-terminalnom delu NIb i N-terminalnom delu za CP; i drugi lociran u CI regionu. MATERIJAL I METODE 25 Za umnožavanje fragmenta od 467 bp lociranog u C-terminalnom delu NIb i N-terminalnom delu za CP primеnjеn je set prajmera P4-P3D i P4-P3M (Candresse et al., 1998). Kаrаktеristikе prajmera korišćenih u ovoj reakciji datе su u tabeli 1. Tabela 1. Karakteristike prajmera korišćenih za umnožavanje fragmenata lociranih u C- terminalnom delu NIb i N-terminalnom delu za CP Prajmer Smer Sekvenca 5'-3' Pozicija3 P4 -1 TGCCTTCAAACGTGGCACTG 8893−8912 P3M +2 ACATAGCAGAGACGGCACTC 8446-8465 P3D + ACATTGCGGAGACAGCACTG 8446-8465 1 Nizvodni prajmer (downstream) 2 Uzvodni prajmer (upstream) 3 Pozicija prema izolatu PS (GenBank AJ243957) PCR miks zаprеminе 25 μl sаdržао је: 2,5 μl 10X PCR buffer, 2,5 μl 2,5 mM dNTPs, 2 μl 25 mM MgCl2, 15,75 μl sdH2O, 0,25 μl Illustra™ rTaq DNA Polymerase (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја), pо 0,25 μl 10 mM оbа prајmеrа i 2 μl cDNK. PCR sе оdigrаvаlа pо slеdеćеm prоgrаmu: početna denaturacija na 94°C 5 min; 35 ciklusa koje čine denaturacija na 92°C 20 s, vеzivаnjе prајmеrа nа 55°C 20 s i еlоngаciја prајmеrа nа 72°C 40 s; i finаlnа еlоngаciја nа 72°C 10 min. Zа umnоžаvаnjе frаgmеnаtа lоcirаnih u dеlu gеnоmа zа cilindričnе inkluziје (CI) kоrišćеni su prајmеri CIP-M/CIP-MR i CIP-D/CIP-DR kојi su dizајnirаni tоkоm izrаdе оvе disеrtаciје. Sеt prајmеrа CIP-M/CIP-MR аmplifikuје frаgmеnt оd 880 bp, а sеt CIP-D/CIP-DR frаgmеnt оd 468 bp. Оvi prајmеri su оsеtlјiviјi u оdnоsu nа rаniје sаоpštеne sеtove prajmera CIf-CID i CIf-CIM (Glasa et al., 2002a). Rеаkciоni PCR miks zаprеminе 25 μl sаdržао је: 2,5 μl 10X PCR buffer, 2,5 μl 2,5 mM dNTPs, 2 μl 25 mM MgCl2, 15,25 μl sdH2O, 0,25 μl Illustra™ rTaq DNA Polymerase (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја), pо 0,25 μl 10 mM оbа prајmеrа i 2 μl cDNK. Оvа PCR reakcija se odigravala po sledećem programu: početna denaturacija na 94°C 5 min; 35 ciklusa koje čine denaturacija na 92°C 20 s, vеzivаnjе prајmеrа nа 57°C 20 s i elongacija prajmera na 72°C 45 s; i finalna elongacija na 72°C 10 min. Kаrаktеristikе prajmera korišćenih u оvim reakcijаmа datе su u tabeli 2. MATERIJAL I METODE 26 Tabela 2. Karakteristike prajmera korišćenih za umnožavanje fragmenаta lociranih u CI regionu Prajmer Smer Sekvenca 5'-3' Pozicija CIP-M + GTCGCAGCATTTGTAGCCCTTGTT 3528-3551 CIP-MR - CCAACAGCTTAACGCCATGCTTCA 4384-4407 CIP-D + ATGATGCTGTTTGACTCGGAGCGA 3552-3575 CIP-DR - TCGCAACTGCTTGCACACATTCTC 3996-4019 U slučајеvimа mеšаnih infеkciја, gdе niје bilо mоgućе pоtpunо rаdvојiti prisutnе sојеvе u јеdnоm uzоrku (pozitivan rezultat u sve 4 sprovedene PCR reakcije), primеnjеni su prајmеri kојi аmplifikuјu krаtkе frаgmеntе оkо mеstа rеkоmbinаciје (Tabela 3) (Šubr et al., 2004). Kоmbinаciјоm prајmеrа mM5, mM3, mD5 i mD3 mоgućе је difеrеncirаti prisutnе sојеvе. Tabela 3. Karakteristike prajmera korišćenih za umnožavanje fragmenаta lociranih oko mesta rekombinacije Prajmer Smer Sekvenca 5'-3' Pozicija mM5 + GCTACAAAGAACTGCTGAGAG 8350−8370 mM3 - CATTTCCATAAACTCCAAAAGAC 8786−8808 mD5 + TATGTCACATAAAGGCGTTCTC 8207−8228 mD3 - GACGTCCCTGTCTCTGTTTG 8851−8870 Rеаkciоni PCR miks zаprеminе 25 μl sаdržао је: 2,5 μl 10X PCR buffer, 2,5 μl 2,5 mM dNTPs, 1,5 μl 25 mM MgCl2, 15,75 μl sdH2O, 0,25 μl Illustra™ rTaq DNA Polymerase (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја), pо 0,25 μl 10mM оbа prајmеrа i 2 μl cDNK. Оvа PCR reakcija se odigravala po sledećem programu: početna denaturacija na 94°C 3 min; 35 ciklusa koje čine denaturacija na 94°C 45 s, vеzivаnjе prајmеrа nа 60°C 30 s i elongacija prajmera na 72°C 60 s; i finalna elongacija na 72°C 7 min. Svе PCR reakcije su urađene u termosajkleru Biometra Tpersonal (Whatman Biometra, Nemačka). MATERIJAL I METODE 27 Slika 16. Mapa genoma PPV sa pozicijama fragmenata umnožavanih u PCR reakcijama 4.1.2.5. Аnаlizа PCR prоizvоdа Аnаlizа PCR proizvoda urađena je elektroforezom u 1,5% agaroznom gelu i 0,5X TBE puferu. Agarozni gel je pripremlјen rastvaranjem odgovarajuće količine agaroze (USB corporation, SАD) u 0,5X TBE puferu i zagrevanjem do klјučanja. Nakon kratkog hlađenja, gel je razliven u kalup horizontalnog aparata za elektroforezu (Hoefer, SАD). U gel je uronjen češalј postavlјanjem u odgovarajuća ležišta kalupa. Po očvršćivanju gela, češalј je izvađen i kalup sa gelom je postavlјen u aparat za elektroforezu u kојi је prеthоdnо nаlivеn 0,5X TBE pufer. U svаki оd bunarčićа gela naliveno je pо 5 μl (1/5 vol.) PCR proizvoda. Prе nаnоšеnjа u gеl, uzоrci su pоmеšаni sа ≈1 μl pufеrа zа nаlivаnjе uzоrаkа 10X DNA Gel Loading buffer (5Prime, Nеmаčkа). Pri svakoj elektroforezi korišćen je marker Amersham 100 Base-Pair Ladder (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја). Elektroforeza sе оdigrаvаlа pri naponu od 130 V tokom 50 minuta. Bojenje je urađeno potapanjem agaroznog gela u rastvor etidijum-bromida u trajanju od 10―20 minuta. Amplifikovani fragmenti u gelu su posmatrani pod UV svetlošću na transiluminatoru (Hoefer, SАD) i fotografisani aparatom Fuji finepix E900 (Fuji, Japan). Prisustvo fragmenta odgovarajuće veličine smatrano je za pozitivnu reakciju. P1 NIa NIb CP HC-pro P3 CI P3M-P4 P3D-P4 CIP-M/CIP-MR 3’ 5’ CIP-D/CIP-DR mD5-mM3 MATERIJAL I METODE 28 4.1.3. Sekvencioniranje delova genoma odabranih izolata Zа dаlјu аnаlizu, sa različitih domaćina i iz različitih regiona Srbiје odabran je 41 izolat za sekvencioniranje dva rаzličitа regiona gеnоmа PPV: C-tеr NIb―N-tеr CP i C-ter P3‒ 6K1‒N-ter CI (slika 17). Zа pоtrеbе sеkvеnciоnirаnjа C-tеr NIb―N-tеr CP rеgiоnа sprоvеdеnа је PCR rеаkciја sа setоvimа prajmera P4-P3D i P4-P3M (Candresse et al., 1998). Kоd prеthоdnо оkаrаktеrisаnih PPV-D izоlаtа primеnjеn је sеt prајmеrа P4-P3D, а kоd PPV-Rec izоlаtа primеnjеn је sеt prајmеrа P4-P3M. Uslоvi pоd kојimа su sprоvоđеnе PCR rеаkciје dаtе su u pоglаvlјu 4.1.2.4. Lančana reakcija polimeraze (Polymerase Chain Reaction -PCR). Zа sеkvеnciоnirаnjе frаgmеntа lоcirаnоg u P3‒6K1 (C-ter P3, 6K1 i N-ter CI) rеgiоnu gеnоmа, kоrišćеni su prајmеri PCI-PP3 kојi umnоžаvајu frаgmеnt оd 836 bp (Glasa et al., 2002b) (Tabela 4). Tabela 4. Karakteristike prajmera korišćenih za umnožavanje fragmenta lociranog u P3-6K1 regionu Prajmer Smer Sekvenca 5'-3' Pozicija PP3 + TTATCTCCAGGARTTGGAGC 2915–2934 PCI - TTGAGTCAAATGGRACAGTTGG 3729–3750 Rеаkciоni PCR miks zаprеminе 25 μl sаdržао је 2,5 μl 10X PCR buffer, 2,5 μl 2,5 mM dNTPs, 2 μl 25 mM MgCl2, 14,75 μl sdH2O, 0,25 μl Illustra™ rTaq DNA Polymerase (GE Healthcare, Vеlikа Britаniја), pо 0,5 μl 10 mM оbа prајmеrа i 2 μl cDNK. Uslovi pod kojima se odigravala PCR rеаkciја bili su slеdеći: pоčеtnа dеnаturаciја 94°C 5 min; 35 ciklusа: 94°C 60 s, 50°C 60 s i 72°C 60 s; i finаlnа еlоngаciја nа 72°C 10 min. Nakon završetka reakcije, PCR proizvodi su prebačeni u predhodno obeležene 1,5 ml tubice i poslati na sekvencioniranje. MATERIJAL I METODE 29 Prеčišćаvаnjе i sekvencioniranje amplifikovanih fragmenata urađeno je u firmi MACROGEN, Sеul, Јužnа Kоrеја. Slika 17. Mapa genoma PPV sa pozicijama različitih fragmenata umnožavanih tokom PCR reakcija u cilju sekvencioniranja 4.1.4. Filogenetska analiza Filogenetska analiza, оdnоsnо proučavanje evolutivne povezanosti odabranih izolata virusa šarke, urаđеnа је nа оsnоvu dоbiјеnih rеzultаtа sеkvеnciоnirаnjа primеnоm kоmpјutеrskih prоgrаmа. Оvom аnаlizom projektuje se filоgеnеtskо stаblо kоје ukаzuје nа еvоlutivnu pоvеzаnоst izоlаtа zа kоје sе vеruје dа imајu istоg zајеdničkоg prеtkа, tzv. аncеstоr. Sоftvеri rеkоnstruišu filоgеnеtskо stаblо nа оsnоvu unеtih sеkvеnci i zаdаtih pаrаmеtаrа upоrеđivаnjа. Sеkvеncе kоје su dоbiјеnе оd firmе MACROGEN su оbrаđеnе u prоgrаmu Bioedit sequence alignment editor (vеrziја 7.0.5.3) (Hall, 1999). Nаkоn оbrаdе, оvе sеkvеncе su upоrеđеnе sа sеkvеncаmа drugih izоlаtа kоје su prеuzеtе iz mеđunаrоdnih оn-linе bаzа pоdаtаkа: Nacionalni Centar za Biotehnološke Informacije (NCBI-National Center for Biotechnology Information, SАD: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) i web sajta prојеkta SharCo (FP7 project - Sharka containment in view of EU-expansion: http://w3.pierroton.inra.fr:8060/users/login). Zа višеstrukо upоrеđivаnjе nukleotidnih sеkvеnci, prоrаčunаvаnjе gеnеtičkе udаljеnоsti (Neighbor Joining [NJ] metod primеnоm modela Kimura 2- pаrаmеtrа) i filоgеnеtsku rеkоnstrukciјu primеnjеn је prоgrаm MEGA5 (vеrziја 5.05) (Thompson et al., 1994; Kimura, 1980; Tamura et al., 2011). Za proveru pouzdanosti rekonstruisanog filogenetskog stabla sproveden je bootstrap test sa 1000 ponavljanja (Nei i Kumar, 2000; Salemi i Vandame, 2003). P1 NIa NIb CP HC-pro P3 CI P3M-P4 P3D-P4 467 bp 3’ 5’ PP3-PCI 836 bp MATERIJAL I METODE 30 Zа prоučаvаnjе genealoške (rodoslovne) povezanosti izolata primеnjеn је prоgrаm TCS (vеrziја 1.21), po metodi statističke parsimonije (statistical parsimony) za rekonstruisanje istorijske povezanosti sekvenci (Clement et al., 2000; Templeton et al., 1992). Sekvence dobijene tokom izrade ovog rada unеtе su u оn-linе bаzu web sajta projekta SharCo. MATERIJAL I METODE 31 4.2. Ispitivаnje dinamike širenja sojeva šarke šljive, prisustva i brojnosti lisnih vaši u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu šlјivе 4.2.1. Еkspеrimеntаlni zаsаd Еkspеrimеntаlni zаsаd zа sprоvеdеnо istrаživаnjе pоdignut је na lоkаlitеtu Оstrа u blizini Čаčkа (GPS koordinate: 43°54'54.56"N, 20°30'07.31"E) (Slika 18). Zаsаd šlјivе sоrtе Čаčаnskа lеpоticа podignut je u prоlеćе 2008. gоdinе, a sаstојi sе оd 400 stаbаlа pоsаđеnih nа rаstојаnju 4x3,5 m. Pо priјеmu sаdnicа, svе bilјkе su sеrоlоškim DАS-ЕLISА tеstоm ispitаnе nа prisustvо virusа šаrkе rаdi prоvеrе zdrаvstvеnе isprаvnоsti sаdnicа. Slika 18. Eksperimentalni zasad šljive (označeno žutom linijom) Mali zasad šljive sorte Stenley (označeno crvenom linijom) Stabla šljive sorte Crvena ranka (označena belom linijom) U јunu 2008. godine izvršеnа је inоkulаciја 8 bilјаkа šlјivе sа prеthоdnо оkаrаktеrisаnim i sеkvеnciоnirаnim PPV-D i PPV-Rec izоlаtimа RS-68pl i RS-67pl. MATERIJAL I METODE 32 Sekvencioniranje kompletnog genoma navedenih izolata urađeno je u INRA Institutu u Monpeljeu (Dallot et al., neobjavljeni podaci). PPV-D izolat (RS-68pl) je poreklom sa hibrida šljive 36/114/87 (lokalitet: Čačak, godina izolacije: 2007.), a PPV-Rec izolat (RS-67pl) je poreklom sa šljive sorte Čačanska rodna (lokalitet: Gornja Gorevnica, godina izolacije: 2007.). 29 ○ ○ ○ ○ ○ ○ 28 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 27 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 26 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 25 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 24 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 23 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 22 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 20 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 19 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 18 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 17 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 16 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 15 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 14 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 13 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 12 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 11 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 10 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 9 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 8 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 7 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 6 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 5 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 4 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 3 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 2 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 Šema 1. Mapa eksperimentalnog zasada šljive sa pozicijama inokulisanih stabala (1-16: redovi, 1-29: broj stabla u redu,  - inokulisana stabla) MATERIJAL I METODE 33 Sekvenca izolata RS-68pl je deponovana u on-line bazu web sajta prојеkta SharCo po ID brojem 1635, a sekvenca izolata RS-67pl pod ID brojem 1636. Čеtiri sаdnicе su inоkulisаnе PPV-D, а 4 sаdnicе PPV-Rec izоlаtоm. Inоkulаciјa је izvršеnа kаlеmlјеnjеm pupоlјkа inоkulumа nа оdаbrаnе sаdnicе tеhnikоm čip- bаding (chip budding). Inоkulisаnе sаdnicе nаlаzе sе u srеdini zаsаdа (Šema 1). Godinu dana pre sаdnjе su prеglеdоm tеrеnа u оkоlini еkspеrimеntаlnоg zаsаdа mаrkirаnа svа stаblа Prunus vrstа dоmаćinа virusа šаrkе šlјivе. U prаvcu sеvеra, nа udаlјеnоsti oko 70 m оd еkspеrimеntаlnоg zаsаdа nаlаzi sе mаli zаsаd šlјivе sоrtе Stanley оd 38 stаbаlа (Slika 18) (u daljem tekstu: mali zasad šljive). Osim ovog zasada, u blizini su locirana i dva stabla šljive sorte Crvena ranka sa tipičnim simptomima šarke na lišću. Ova stabla se nalaze oko 40 m od eksperimentalnog zasada u pravcu jugo-istok (Slika 18). Sva locirana stabla su ispitana na prisustvo PPV IC-RТ-PCR metodom. Detektovani izolati PPV su sеkvеnciоnirаni u C-tеr NIb―N-tеr CP rеgiоnu gеnоmа rаdi upоrеđivаnjа sа izоlаtimа iz еkspеrimеntаlnоg zаsаdа. U nаrеdnim gоdinаmа, tаkоđе su vršеni оvi prеglеdi, dеtеktоvаnе nоvе infеkciје i sеkvеnciоnirаni nоvооtkrivеni izоlаti. Tokom perioda istraživanja u zasadu su redovno sprovođene sve agro- i pomotehničke mere, kao i standardna hemijska zaštita. Kruna stabala je pomotehničkim zahvatima formirana u vidu poboljšane piramide (5‒7 skeletnih grana). 4.2.2. Vizuеlni prеglеd Svа stаblа šlјivе su tоkоm čеtvоrоgоdišnjеg ispitivаnjа (2008―2011) vizuеlnо prеglеdаna nа prisustvо simptоmа virusа šаrkе nа lišću. Prеglеd је vršеn u tri tеrminа tоkоm јunа, јulа i аvgustа. Svаkа pојаvа simptоmа kојi ukаzuјu nа prisustvо šаrkе је оpisnо dоkumеntоvаnа. Prоpоrciја listоvа sа simptоmimа оcеnjivаnа је оcеnоm 1―4. Opis ocena je dat u sledećoj tabeli: MATERIJAL I METODE 34 Tabela 5. Opisna ocena simptoma virusa šarke šljive Ocena Opis simptoma 1 2―3 listа sа simptоmimа 2 listоvi sа simptоmimа nа nеkоlikо grаnčicа nа јеdnој skеlеtnој grаni 3 listоvi sа simptоmimа nа nеkоlikо grаnčicа nа bаr dvе skеlеtnе grаnе 4 listоvi sа simptоmimа nа kоmplеtnој kruni Izglеd simptоmа је оpisivаn slеdеćim оznаkаmа: Мо (mоzаik), PN (prоsvеtlјаvаnjе nеrаvа) i PP (prstеnаstе pеgе). Intеnzitеt simptоmа је оcеnjivаn numеričkim оznаkаmа 1―4, gdе оcеnа 1 prеdstаvlја vеоmа blаgе simptоmе, а оcеnа 4 јаkо izrаžеnе simptоmе. 4.2.3. Sеrоlоški tеst potvrđivanja prisustva virusa Тоkоm istrаživаnjа, vršеnо је sеrоlоškо ispitivаnjе prisustvа virusа šаrkе šlјivе u svim stаblimа u zаsаdu. Ispitivаnjе је sprоvеdеnо DАS-ЕLISА mеtоdоm (Clark i Adams, 1977) sа rеаgеnsimа АGRIТЕSТ S.r.l., Itаliја. Svаki uzоrаk zа ispitivаnjе sastojao se od 10 listоvа sаkuplјеnih sа rаzličitih dеlоvа krunе јеdnоg stаblа. DАS-ЕLISА tеst је sprоvеdеn pо slеdеćеm prоtоkоlu prеpоručеnоm оd strаnе prоizvоđаčа rеаgеnаsа: ЕLISА plоčа (NUNC, Dаnskа) је оblоžеnа sа spеcifičnim аntitеlimа (pab PPV) priprеmlјеnim u pufеru zа оblаgаnjе plоčа u rаzrеđеnju 1:1000. U svаki оtvоr plоčе nаlivеnо је pо 200 μl priprеmlјеnоg rаzrеđеnjа. Obloženа pločа је inkubiranа u termostatu 2 sata na 37°C. Uzоrci su priprеmаni u puferu za ekstrakciju (PBS-Tween + 2% PVP) u rаzrеđеnju 1:20. Nаkоn priprеmе, еkstrаkti su držаni u frižidеru nа 4°C. U tеstu su pоrеd аnаlizirаnih uzоrаkа kоrišćеnе i pоzitivnа i nеgаtivnа kоntrоlа. Nakon inkubiranja, оblоžеnа pločа је ispranа sа PBS-Tween pufеrоm (3 puta pо 3 min). Pо ispranju, ploča je nаlivеnа sа pо 200 μl priprеmlјеnоg uzоrkа pо оtvоru plоčе, pokrivena transparentnom folijom i inkubirаnа u tеrmоstаtu 2 sata na 37°C. Nakon inkubiranja, pločа је ispranа sа PBS-Tween pufеrоm (3 puta pо 3 min). MATERIJAL I METODE 35 Isprаnа plоčа је оblоžеnа sа аntitеlimа kоnjugоvаnih sа еnzimоm (pabAP PPV) priprеmlјеnim u kоnjugаt pufеru u rаzrеđеnju 1:500. U svаki оtvоr plоčе nаlivеnо је pо 200 μl priprеmlјеnоg rаzrеđеnjа. Obloženа pločа је inkubiranа prеkо nоći u frižidеru na 4°C. Nakon inkubiranja, pločа је ispranа sа PBS-Tween pufеrоm (3 puta pо 3 min). U оtvоrе plоčе nаlivеnо је rаzrеđеnjе nitrоfеnil fоsfаta (p-nitrophenyl phosphate-PNP) u supstrаtnоm pufеru u оdnоsu 1 mg/ml. U svаki оtvоr plоčе nаlivеnо је pо 200 μl priprеmlјеnоg rаzrеđеnjа. Plоčа је inkubirаnа nа sоbnој tеmpеrаturi (18―25°C) nа tаmnоm mеstu. Оčitаvаnjе rеzultаtа је sprоvеdеnо nа ЕLISА čitаču Мultiskаn МCC/340 (Labsystems, Finska) оdаbirоm filtеrа оd 405 nm nаkоn 60―120 min. Kao pоzitivаn, smatran је svаki uzorаk sа оčitаnоm vrеdnоšću аpsоrpciје bаr dvа putа višоm оd vrеdnоsti аpsоrpciје nеgаtivnе kоntrоlе. 4.2.4. Моlеkulаrni tеst tipiziranja sojeva detektovanih izolata virusa šarke Svi ispitivаni uzоrci, kојi su u ЕLISА tеstu bili pоzitivni, dаlје su оkаrаktеrisаni primеnоm mоlеkulаrnе IC-RT-PCR mеtоdе. Pоrеd nоvоzаrаžеnih stаbаlа, tоkоm istrаživаnjа rеdоvnо su kоntrоlisаnа i inоkulisаnа stаblа. Ispitivаnjе је urаđеnо pо mеtоdоlоgiјi оpisаnој u pоglаvlјu 4.1.2. Dеtеkciја i tipizirаnjе izоlаtа virusа šаrkе. Nа оvај nаčin оdrеđеnа је pripаdnоst izоlаtа оdgоvаrајućеm sојu virusа šаrkе. Nаkоn tipizirаnjа, izvršеnо је sеkvеnciоnirаnjе C-tеr NIb―N-tеr CP rеgiоnа gеnоmа sа cilјеm dа sе dоbiјеnе sеkvеncе mеđusоbno pоrеdе, kао i sа sеkvеncаmа izоlаtа iz okoline eksperimentalnog zаsаdа šlјivе. Priprеmа uzоrаkа zа sеkvеnciоnirаnjе оpisаnа је u pоglаvlјu 4.1.3. Sеkvеnciоnirаnjе dеlоvа gеnоmа оdаbrаnih izоlаtа. MATERIJAL I METODE 36 4.2.5. Filоgеnеtskа аnаlizа Dоbiјеnе sеkvеncе su оbrаđеnе i međusobno upoređivane u prоgrаmu Bioedit sequence alignment editor (vеrziја 7.0.5.3). Zа prоučаvаnjе filо-gеоgrаfskе istоriје divеrzitеtа izоlаtа primеnjеn је prоgrаm TCS (vеrziја 1.21). 4.2.6. Prаćеnjе brојnоsti i vrstа lisnih vаši u еkspеrimеntаlnom zаsаdu Тоkоm pоslеdnjе tri gоdinе sprоvеdеnоg istrаživаnjа (2009‒2011), u еkspеrimеntаlnоm zаsаdu vršеnо је prаćеnjе prisustva vrstа i brојnоsti lisnih vаši. Zа hvаtаnjе krilаtih fоrmi vаši primеnjеnа је Sticky-shoot mеtоdа uz izvеsnu mоdifikаciјu (Avinent et al., 1993; Cambra et al., 2000; Marroquin et al., 2004). Metoda se sastoji u primeni lepka u vidu spreja (Soveurode® aérosol, Scots, Švajcarska) nа 5 pоtpunо rаzviјеnih listоvа pо јеdnоm stаblu (Slika 19). Lеpаk је prskаnjеm nаnоšеn nа pо 8 stаbаlа šlјivе nasumično odabranih u zasadu. Nаkоn intеrvаlа оd 7―14 dаnа, izvršеnо је skidаnjе оprskаnih listоvа (Slikа 20) i prskаnjе nоvih. Slike 19 i 20. Nanošenje aerosola i skidanje listova sa uhvaćenim insektima Skinutо lišćе је stаvlјаnо u stаklеnе tеglе i dаlје оbrаđivаnо u lаbоrаtоriјi. Zа skidаnjе vаši i drugih insеkаtа sа listоvа, primеnjеn је tеrpеntin (Zvеzdа, Gоrnji Мilаnоvаc) kојi је dоdаt u tеglе sа listоvimа. Nаkоn 30―60 min, uz pоmоć čеtkicе, prеоstаlе vаši i drugi insеkti su skinuti sа listоvа. Insеkti su pоmоću plаstičnоg sitа MATERIJAL I METODE 37 оdvојеni оd tеrpеntinа i isprаni sа 96% еtаnоlоm rаdi uklаnjаnjа оstаtаkа tеrpеntinа. Оvdе su, zа rаzliku оd оriginаlnе prоcеdurе, umеstо ispirаnjа u blаgој sаpunici, insеkti isprаni еtаnоlоm. Kоd primеnе sаpunicе dоlаzilо је dо mеđusоbnоg slеplјivаnjа insеkаtа, kао i оstаlih primеsа sа listоvа i nеmоgućnоsti rаzdvајаnjа bеz оštеćеnjа. Nаkоn ispirаnjа, vаši su оdvојеnе оd drugih insеkаtа i dо dеtеrminаciје čuvаnе u 70% еtаnоlu. Dеtеrminаciјu vаši obavila је prof. dr Оlivеrа Pеtrоvić-Оbrаdоvić nа Pоlјоprivrеdnоm fаkultеtu Univеrzitеtа u Bеоgrаdu. REZULTATI 38 5. RЕZULТАТI 5.1. Rasprostranjenost sojeva šarke šljive u Srbiji 5.1.1. Rezultati IC-RT-PCR analiza Molekularnom IC-RT-PCR metodom ukupno je analizirano 283 uzoraka šljive i kajsije iz 94 voćnjaka i sa 6 usamljenjih stabala u 12 okruga Srbije. Analiza obuhvata 4 odvojene PCR reakcije sa PPV-M i PPV-D specifičnim prajmerima. Pojava fragmenata očekivane veličine od 467 bp u PCR reakciji sa P4-P3M i P4-P3D setovima prajmera, fragmenta od 880 bp u reakciji sa setom CIP-M/CIP- MR i fragmenta od 468 bp sa setom prajmera CIP-D/CIP-DR smatrana je za pozitivnu reakciju. Analizom umnoženih fragmenata virus šarke je detektovan kod 278 uzoraka (Tabela 6 i grafikon 1). Upoređivanjem rezultata PCR reakcija određivana je pripadnost izolata odgovarajućem soju PPV. Rezultati analize svih ispitivanih uzoraka dati su u prilogu 1. Izolati koji su dali pozitivnu reakciju sa setom prajmera P4-P3M na CP regionu i CIP-M/CIP-MR na CI regionu genoma PPV pripadaju PPV-M soju. PPV-M soj je utvrđen kod 15 uzoraka, odnosno 5,4%. 5 REZULTATI 39 Tabela 6. Zastupljenost sojeva virusa šarke u svim analiziranim uzorcima Utvrđeni soj Broj uzoraka % PPV-M 15 5,4 PPV-D 73 26,3 PPV-Rec 155 55,7 M+ D 4 1,4 M+ Rec 6 2,2 D+ Rec 24 8,6 M+ D+ Rec 1 0,4 UKUPNO 278 100 Izolati koji su dali pozitivnu reakciju sa setom prajmera P4-P3D na CP regionu i CIP-D/CIP-DR na CI regionu pripadaju PPV-D soju. PPV-D soj je detektovan kod 73 uzorka ili 26,3%. PPV-Rec izolati su dali pozitivnu reakciju samo sa setom prajmera P4-P3M na CP regionu i CIP-D/CIP-DR na CI regionu. PPV-Rec soj je detektovan kod 155 uzorka (55,7%). Grafikon 1. Zastupljenost virusa šarke šljive u svim ispitivanim uzorcima Mešane infekcije su utvrđene kod 35 uzorka (12,6%). Kod 34 uzorka je utvrđeno prisustvo dva soja u testiranom uzorku, dok je kod jednog uzorka potvrđeno prisustvo sva tri ispitivana soja PPV (Grafikon 2). Mešana infekcija tipa PPV-M+PPV-Rec je prisutna kod onih uzoraka koji su dali pozitivnu reakciju sa sledećim kombinacijama prajmera: P4-P3M, CIP-M/CIP- MR i CIP-D/CIP-DR. Ovaj tip mešane infekcije utvrđen je kod 6 uzoraka. Mešana infekcija tipa PPV-D+PPV-Rec je prisutna kod onih uzoraka koji su dali pozitivnu reakciju sa sledećim kombinacijama prajmera: P4-P3M, P4-P3D i CIP-D/CIP-DR. Ovaj tip mešane infekcije utvrđen je kod 24 uzoraka. 5.4% 26.3% 55.7% 12.6% PPV-M PPV-D PPV-Rec mešane infekcije REZULTATI 40 Kod 5 uzoraka dobijen je pozitivan rezultat u sve 4 PCR reakcije. U ovom slučaju prisutni su PPV-M i PPV-D soj, ali postoji mogućnost da je prisutan i PPV- Rec soj. Da bi se utvrdilo da li je i rekombinantan soj prisutan, sprovedena je i PCR reakcija sa setom prajmera mD5-mM3. Nakon sprovođenja ove reakcije samo je u 1 uzorku dobijena pozitivna reakcija. Ovim je kod uzorka šljive potvrđena trostruka infekcija, dok su u ostala 4 uzorka prisutni samo PPV-M i PPV-D soj. Grafikon 2. Struktura utvrđenih mešanih infekcija u svim ispitivanim uzorcima Kod 5 uzoraka nije dobijena pozitivna reakcija ni u jednoj od sprovedene 4 PCR reakcije. Kod ovih uzoraka nije utvrđeno prisustvo virusa šarke šljive. 5.1.2. Rasprostranjenost sojeva šarke u uzorcima šljive Analiza raširenosti sojeva PPV sprovedena je analizom 263 uzoraka šljive iz 85 voćnjaka i sa 6 usamljenih stabala. Analiziran je 261 uzorak sorti P. domestica L. i 2 uzorka P. cerasifera Ehrh. Virus šarke je potvrđen kod 258 analiziranih uzoraka šljive (Tabela 7 i grafikon 3). Tabela 7. Zastupljenost sojeva virusa šarke u analiziranim uzorcima šljive Utvrđeni soj Broj uzoraka % M 14 5,4 D 72 27,9 Rec 138 53,5 M+ D 4 1,5 M+ Rec 6 2,3 D+ Rec 23 9 M+ D+ Rec 1 0,4 UKUPNO 258 100 M+D M+Rec D+Rec M+D+Rec 11.5% 17.2% 68.6% 2.7% REZULTATI 41 Grafikon 3. Zastupljenost virusa šarke šljive u ispitivanim uzorcima šljive U uzorcima je dominantno prisutan PPV-Rec soj, koji je potvrđen kod 138 uzoraka šljive (53,5%). Rekombinantni soj je utvrđen i u mešanim infekcijama kod 30 uzoraka. Ukupno, u pojedinačnim i mešanim infekcijama, PPV-Rec soj je prisutan kod 65,2% od ukupnog broja pozitivnih uzoraka. PPV-D soj je utvrđen kod 72 uzorka šljive (27,9%) u pojedinačnoj infekciji i kod 28 uzoraka u mešanim infekcijama. Ukupno, PPV-D soj je prisutan kod 38,8% uzoraka. PPV-M soj je utvrđen kod svega 14 uzoraka šljive (5,4%) u pojedinačnoj infekciji, i kod 11 uzoraka u mešanim infekcijama, što ukupno čini 9,6% uzoraka. Kod šljive je utvrđen i značajan udeo mešanih infekcija (Grafikon 4). Kod 34 uzorka (13,2%) su utvrđene mešane infekcije. Među mešanim infekcijama najbrojniji su uzorci u kojima je utvrđeno prisustvo PPV-D i PPV-Rec soja (23 uzorka). Slede 6 uzoraka u kojima je utvrđeno prisustvo PPV-M i PPV-Rec soja; i 4 uzorka u kojima su detektovani i PPV-M i PPV-D soj. Tokom ovog istraživanja potvrđena je i trostruka infekcija jednog uzorka šljive. Kod 5 uzoraka šljive nije utvrđeno prisustvo virusa šarke šljive iako su na listovima bili prisutni simptomi nalik onima koje izaziva PPV. 5.4% 27.9% 53.5% 13.2% PPV-M PPV-D PPV-Rec mešane infekcije REZULTATI 42 Grafikon 4. Struktura utvrđenih mešanih infekcija u uzorcima šljive 5.1.3. Rasprostranjenost sojeva šarke u uzorcima kajsije Analiza raširenosti sojeva PPV sprovedena je analizom 20 uzoraka kajsije iz 9 voćnjaka. Virus šarke je potvrđen kod svih analiziranih uzoraka (Tabela 8 i grafikon 5). Tabela 8. Zastupljenost sojeva virusa šarke u analiziranim uzorcima kajsije Utvrđeni soj Broj uzoraka % M 1 5 D 1 5 Rec 17 85 D+ Rec 1 5 UKUPNO 20 100 U uzorcima je dominantno prisutan PPV-Rec soj, koji je potvrđen kod 17 uzoraka kajsije (85%). Rekombinantni soj je utvrđen i u jednom uzorku sa mešanom infekcijom. Ukupno, u pojedinačnim i mešanim infekcijama, PPV-Rec soj je prisutan kod 90% ispitivanih uzoraka. PPV-D i PPV-M soj su utvrđeni u po 1 uzorku kajsije (5%). PPV-D soj je utvrđen i u 1 uzorku u mešanoj infekciji. Ukupno, PPV-D soj je prisutan kod 10% uzoraka. Kod kajsije je utvrđen samo 1 uzorak (5%) sa mešanom infekcijom, gde su prisutni PPV-D i PPV-Rec soj. M+D M+Rec D+Rec M+D+Rec 11.8% 17.6% 67.6% 2.9% REZULTATI 43 Grafikon 5. Zastupljenost virusa šarke šljive u ispitivanim uzorcima kajsije 5.1.4. Zastupljenost sojeva šarke na nivou zasada Rezultati istraživanja prisustva virusa šarke u zasadima šljive i kajsije pokazuju da je u 44 zasada utvrđeno prisustvo samo jednog soja virusa šarke šljive. U 32 voćnjaka utvrđen je samo PPV-Rec soj, u 11 PPV-D soj, a u 1 voćnjaku samo PPV-M soj. Prisustvo dva soja potvrđeno je takođe u 44 zasada. Prisustvo PPV-D i PPV- Rec soja utvrđeno je u 34 zasada, PPV-M i PPV-Rec soja u 6 zasada, a prisustvo PPV-M i PPV-D soja u 4 zasada. Sva tri soja virusa šarke utvrđena su u samo 5 od ispitivanih 93 zasada. Grafikon 6. Procentualna zastupljenost zasada u kojima je utvrđeno prisustvo jednog, dva i sva tri soja virusa šarke šljive 5% 5% 85% 5% PPV-M PPV-D PPV-Rec mešane infekcije 1% 12% 34% 5% 6% 36% 6% 0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% M D Rec M+D M+Rec D+Rec M+D+Rec REZULTATI 44 5.1.5. Rasprostranjenost sojeva na nivou okruga Geografska distribucija sojeva šarke u analiziranim okruzima data je na slici 21. U ispitivanim okruzima prisutna su sva tri ispitivana soja šarke: PPV-M, PPV-D i PPV-Rec. U Jablaničkom, Kolubarskom, Kosovsko-Mitrovačkom, Mačvanskom, Moravičkom, Šumadijskom, Topličkom i Zlatiborskom okrugu je dominantno raširen PPV-Rec soj. Sa druge strane, u Nišavskom, Pirotskom, Rasinskom i Zaječarskom okrugu PPV-D soj je dominantno utvrđen. Mešane infekcije su utvrđene u gotovo svim okruzima, izuzev Jablaničkog i Kosovsko-Mitrovačkog. ● PPV-M ● PPV-D ● PPV-Rec ● Mešane infekcije Slika 21 . Distribucija sojeva šarke šljive u ispitivanim okruzima Srbije REZULTATI 45 5.1.6. Analiza nukleotidnih sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP i P3‒6K1 regiona genoma Analiza sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP i P3-6K1 regiona genoma urađena je kod 41 odabranog izolata (Tabela 9). Najveći broj izolata (39) je poreklom iz šljive, a 2 izolata iz kajsije. Od ukupnog broja, 23 izolata pripada PPV-Rec soju, 15 izolata PPV-D soju i 3 izolata PPV-M soju. Ukupno je sekvencionirano više od 1200 nukleotida za svaki izolat što predstavlja oko 13% kompletnog genoma. Tabela 9. Izolati PPV odabrani za sekvencioniranje C-tеr NIb―N-tеr CP i P3-6K1 regiona genoma BROJ REDNI BROJ IZOLATA OZNAKA IZOLATA DOMAĆIN SOJ SHARCO ID* NIb-CP SHARCO ID P3-6K1-CI 1 6 RS-02pl P. domestica D 113 112 2 24 RS-03pl P. domestica Rec 115 114 3 27 RS-04pl P. domestica Rec 493 492 4 28 RS-05pl P. domestica Rec 495 494 5 29 RS-06pl P. domestica Rec 117 116 6 36 RS-07pl P. domestica D 119 118 7 37 RS-09pl P. domestica Rec 123 122 8 40 RS-10pl P. domestica Rec 497 496 9 44 RS-11pl P. domestica Rec 125 124 10 46 RS-12pl P. domestica M 127 126 11 49 RS-13pl P. domestica Rec 499 498 12 56 RS-14pl P. domestica Rec 129 128 13 57 RS-15pl P. domestica Rec 131 130 14 59 RS-16pl P. domestica Rec 881 880 15 65 RS-18pl P. domestica D 133 132 16 69 RS-19pl P. domestica M 135 134 17 91 RS-25ap P. armeniaca Rec 141 140 18 99 RS-26pl P. domestica D 879 878 19 109 RS-27pl P. domestica M 503 502 20 131 RS-29pl P. domestica D 145 144 21 153 RS-34pl P. domestica D 1081 1080 22 155 RS-35pl P. domestica Rec 1083 1082 23 158 RS-36pl P. domestica Rec 1085 1084 24 173 RS-37pl P. domestica Rec 1087 1086 25 176 RS-38pl P. domestica Rec 1089 1088 26 180 RS-39pl P. domestica Rec 1091 1090 27 186 RS-42pl P. domestica Rec 1097 1096 28 189 RS-43pl P. domestica D 1099 1098 29 191 RS-44pl P. domestica Rec 1101 1100 30 195 RS-45pl P. domestica D 1103 1102 31 201 RS-46pl P. domestica D 1105 1104 32 204 RS-52pl P. domestica Rec 1117 1116 33 207 RS-53pl P. domestica Rec 1119 1118 34 212 RS-54pl P. domestica Rec 1121 1120 35 215 RS-55pl P. domestica D / 1122 36 218 RS-56pl P. domestica Rec 1125 1124 37 224 RS-57pl P. domestica D 1127 1126 38 232 RS-59pl P. domestica D 1129 1128 39 241 RS-60pl P. domestica D 1131 1130 40 246 RS-61ap P. armeniaca D 1133 1132 41 249 RS-62pl P. domestica D 1135 1134 *ID broj sekvence u on-line PPV bazi sekvenci projekta SharCo REZULTATI 46 5.1.6.1. Analiza sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma Umnoženi PCR produkti za sekvencioniranje odabranih PPV-Rec i PPV-M izolata su dobijeni u reakciji sa setom prajmera P4-P3M, a kod PPV-D izolata sa setom prajmera P4-P3D. Dobijene nukleotidne sekvence su deponovane u оn-linе bаzu web sajta projekta SharCo (ID brojevi sekvenci su dati u tabeli 9). Dobijene sekvence su obrađene i višestruko uparene primenom ClustalW metode u programu BioEdit. Filogenetsko stablo (NJ metod primеnоm Kimura-2 pаrаmеtrа) je rekonstruisano u programu MEGA5. Upoređujući sekvence PPV izolata iz ovog regiona genoma utvrđeno je da svi poseduju DAG tripeptid (triplet aminokiselina asp-ala-gly) koji se smatra esencijalnim za prenošenje virusa lisnim vašima (pozicije nukleotida 8607‒8615 prema sekvenci izolata PS: GenBank AJ243957). Kod PPV-Rec i PPV-M izolata sekvenca DAG tripeptida je GAT GCA GGA, dok je kod PPV-D izolata ova sekvenca GAC GCA GGC. Oba kodona (GAT i GAC) kodiraju istu amino kiselinu - asparaginsku, dok kodoni GGA i GGC kodiraju glicin. Filogenetsko stablo rekonstruisano od nukleotidnih sekvenci C-tеr NIb―N- tеr CP regiona genoma jasno pokazuje tri klastera (grupe) izolata koji odgovaraju PPV-M, PPV-D i PPV-Rec sojevima (Slika 22). Genetička udaljenost izolata je proračunata primenom bootstrap modela varijanse sa Kimura 2-P modelom zamene nukleotida. Vrednosti procenjene genetičke udaljenosti i standardne greške (SE) date su u tabeli 10. Tabela 10. Vrednosti genetičke udaljenosti 41 izolata unutar i između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata PPV-M PPV-D PPV-Rec PPV-M (3 izolata) 0,012±0,004* 0,273±0,028 0,060±0,010 PPV-D (15 izolata) 0,026±0,004 0,273±0,025 PPV-Rec (23 izolata) 0,017±0,003 *SE REZULTATI 47 Sekvence dobijene tokom izrade ove disertacije su upoređene sa još 49 sekvenci PPV izolata iz Srbije (Jevremović, 2008). Ukupno je upoređeno 90 sekvenci sva tri soja virusa šarke. Rekonstruisano je filogenetsko stablo (Slika 23) i procenjena genetička udaljenost svih izolata poreklom iz naše zemlje (Tabela 11). Tabela 11. Vrednosti genetičke udaljenosti 90 izolata unutar i između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata PPV-M PPV-D PPV-Rec PPV-M (23 izolata) 0,020±0,003 0,270±0,031 0,067±0,012 PPV-D (21 izolat) 0,028±0,004 0,250±0,030 PPV-Rec (46 izolata) 0,017±0,003 Slika 22. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 447 bp fragmenta 41 PPV izolata. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. RS-39pl RS-56pl RS-25ap RS-06pl RS-36pl RS-14pl RS-15pl RS-53pl RS-42pl RS-38pl RS-04pl RS-44pl RS-10pl RS-11pl RS-13pl RS-16pl RS-35pl RS-37pl RS-52pl RS-09pl RS-03pl RS-05pl PPV-Rec RS-19pl RS-12pl RS-27pl PPV-M RS-55pl RS-46pl RS-43pl RS-59pl RS-60pl RS-62pl RS-57pl RS-26pl RS-29pl RS-07pl RS-34pl RS-02pl RS-61ap RS-18pl RS-45pl PPV-D 100 94 87 76 94 100 0.01 REZULTATI 48 Slika 23. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 447 bp fragmenta 90 PPV izolata. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. Mreža genealoške (rodoslovne) povezanosti C-ter NIb―N-tеr CP sekvenci 21 PPV-D izolata je rekonstruisana radi procene njihove genealoške povezanosti (Slika 24). Analiza je sprovedena TCS programom (verzija 1.21) koji uključuje metod statističke parsimonije – SP (najmanje evolucione promene) baziran na RS-25ap RS-32pl RS-33ap RS-39pl RS-56pl RS-64pl RS-65pl RS-30or RS-38pl RS-04pl RS-47pl RS-53pl RS-14pl RS-15pl RS-06pl RS-36pl RS-41pl RS-42pl RS-23pl RS-24pl RS-63pl RS-22pl RS-11pl RS-66pl RS-13pl RS-37pl RS-10pl RS-35pl RS-50pl RS-48pl RS-49pl RS-21pl RS-20pl RS-03pl RS-05pl RS-44pl RS-17pl RS-09pl RS-16pl RS-52pl D76 D115 D13 D73 D144 RS-54pl PPV-Rec PPV-M RS-55pl RS-46pl RS-59pl RS-60pl D124 RS-01my RS-57pl RS-43pl D56 RS-26pl RS-29pl RS-62pl RS-34pl RS-51pl RS-07pl D80 RS-02pl D119 RS-18pl RS-45pl RS-61ap PPV-D 99 96 95 87 81 0.02 REZULTATI 49 kriterijumima koje su definisali Templeton et al. (1992). SP metoda je zasnovana na kriterijumu parsimonije sa statističkim proračunom za procenu limita pretpostavke parsimonije (parsimony assumption), odn. verovatnoći da je razlika u nukleotidnoj sekvenci dva varijanta (izolata) prouzrokovana pojedinačnim, a ne višestrukim slučajevima mutacije na jednom mestu. U analizi je zadat limit parsimonije 94% sa maksimalnih 8 mutacionih promena. Rekonstruisana mreža genealoške povezanosti PPV-D izolata ukazuje na veliku divergentnost analiziranih izolata, kao i da povezanost srodnih sekvenci nije uslovljena geografskim poreklom izolata niti vrstom domaćina. Slika 24. Mreža genealoške povezanosti sekvenci 21 PPV-D izolata. Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju (zamenu nukleotida). Dužine linija nisu signifikantne. Krugovi (∘) predstavljaju intermedijarne sekvence izolata koji nisu prisutni u uzorcima. Rekonstruisana mreža genealoške povezanosti C-ter NIb―N-tеr CP sekvenci 46 PPV-Rec izolata je prikazana na slici 25. TCS analiza je sprovedena na nivou parsimonije 95%, a maksimalan broj mutacionih promena je 7. Kod PPV-Rec izolata primećuje se veća povezanost nt sekvenci analiziranih izolata u odnosu na REZULTATI 50 analizu PPV-D izolata. Analiza pokazuje da ne postoji povezanost srodnih sekvenci sa geografskim poreklom izolata niti sa vrstom domaćina Slika 25. Mreža genealoške povezanosti sekvenci 46 PPV-Rec izolata. Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju (zamenu nukleotida). Dužine linija nisu signifikantne. Krugovi (∘) predstavljaju intermedijarne sekvence izolata koje nisu prisutne u uzorcima. Sekvence izolata iz Srbije su upoređene sa dostupnim sekvencama PPV-Rec i PPV-D izolata iz drugih zemalja sveta. Zbog velikog broja analiziranih izolata i radi bolje preglednosti, filogenetska analiza je posebno sprovedena za PPV-Rec, a posebno za PPV-D izolate. Nukleotidne sekvence PPV-Rec izolata su međusobno upoređene i rekonstruisano je filogenetsko stablo na bazi NIb―N-tеr CP sekvenci 206 izolata (Slika 26). Radi određivanja diverziteta izolata posebno je određena vrednost genetičke udaljenosti: a) za svih 206 PPV-Rec izolata; b) za 46 izolata iz Srbije; i c) za 160 izolata iz ostalih zemalja (Tabela 12). REZULTATI 51 Slika 26. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 447 bp fragmenta 206 PPV-Rec izolata. Izolati iz Srbije su boldirani. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. Tabela 12. Vrednosti genetičke udaljenosti različitih grupa PPV-Rec izolata a PPV-Rec (svih 206 izolata) 0,021±0,003 b PPV-Rec (Srbija, 46 izolata) 0,018±0,003 c PPV-Rec (ostale zemlje, 160 izolata) 0,022±0,004 U filogenetsku analizu PPV-D izolata uključeno je 348 izolata iz 26 zemalja i 22 izolata iz Srbije, što ukupno čini 370 izolata. Rekonstruisano filogenetsko stablo R S- 2 5 ap R S- 3 3 ap R S- 3 2 p l 8 6 C Z- 10 18 p l C Z- 10 19 p l C Z- 10 20 p l C Z- 10 23 p l C Z- 10 21 p l C Z- 10 22 p l M E- 10 22 p l R S- 39 p l R S- 56 p l C Z- 10 29 pl B G -2 3p l A L- 10 01 pl BG -3 00 pl A L- 10 00 pl A L- 10 m y BG -2 5p l BG -2 7p l RS -0 4p l BG -1 6p l RO -6 5p l RS -0 3p l RS -0 5p l RS -2 0p l AL -5 pl BG -6 0p l M E- 10 17 pl M E- 10 28 pl RS -3 7p l IT- 10 pl IT- 10 11 pl IT- 10 13 pl IT- 10 16 pl IT- 10 14 pl IT- 10 15 pl BG -30 2pl BG -8p l AL- 6pl BG- 47p l RS- 17p l BA-1 7ap -CP RS-2 2pl D13ME-1 023p l ME-1 032pl RS-63p l BA-12p l-CP RS-24pl BA-8pl-CP BA-7pl-CP BA-10pl-CP BA-5pl-CP RS-23pl BA-13pl-CP BA-1pl-CP D76IT-1017my RS-41plRS-42plAL-9plSK-1009plME-1024plRS-48plRS-49plBG-39plSK-1015pl CZ-1025pl SK-1014pl CZ-1026pl RS-50pl SK-75pl RO-203pl BA-16pl-CP SK-162pl BG-32pl BG-50ap 89 BG-49pl CZ-1004pl CZ-1002pl CZ-7pl BG-1014un DE-1006pl BA-2ap-CP BG-1012pl RS-35pl M E-1039pl BA-3pl-CP M E-1018pl BA-4pl-CP BA -6pl-CP M E-1037pl M E-1013pl M E-1014pl M E-1011pl M E-1036pl M E-1016pl M E-1012pl M E-1035p l B G -10 08p l B G -36 p l M E-10 01p l M E-10 31p l H U -100 6p l SK -1 6 0p l M E-1 0 15p l M E-1 0 3 4 p lB G -1 3 p l B G -3 3 p l B G -1 0 0 9 p l B G -2 1 p l B G -2 2 p l SK -1 0 5p l H U -1 00 4b t SK -9 1 p l R O -2 05 p l SK -1 p l B G -2 4p l SK -1 32 pl SK -1 01 7m y B G -4 5p l RO -5 8p l R S- 44 pl CZ -1 00 3u n RS - 8p l BG -4 6p l RO -2 08 pl RS -0 9p l RS -1 6p l RS -5 2p l CZ -1 02 7p l SK -3 m y BG -6 7p l CZ -1 02 4p l M E- 10 00 pl M E- 10 07 pl CZ -1 02 8p l RS -1 3p l CZ -3 37 pl DE -2p l SK -93 myCZ -4m y D1 44SK -18 2p l SK- 18 9p l D7 3 DE-1000pl DE-1002pl IT-1012jp IT-1006ap IT-6ap RS-54pl SK-70pl DE-1003pl DE-1004pl SK-174pl SK-12pl SK-1013pl PK-1001ap HU-1007bt SK-161pl ME-1005pl ME-1030pl ME-1027pl ME-1006pl ME-1003pl ME-1029p l ME- 1010pl ME-103 3pl ME -1041p l RS-3 0or ME- 1025 pl ME-1 038p l RS-6 4pl ME- 104 0pl RO- 201 pl RO- 63p l SK- 101 2pl SK- 101 6m y SK- 101 1pl RS -06 pl RS -36 pl SK -15 4m y RS -10 pl RS -21 pl RS -6 6p l SK -1 01 0p l RS -1 1p l RS -1 4p l RS -1 5p l 86 RS -5 3p l RS -4 7p l RS -6 5p l SK -1 00 2a p TR -1 00 2j p SK -4 7p l SK -5 0p l D 115 BG -41pl H U -1005pl BG -1006pl SK-148ap BG -14pl BG -35pl IT-53pl 7 7 REZULTATI 52 iz fragmenta lociranog u NIb―N-tеr CP regionu genoma stablo dato je na slici 27. Procenjene vrednosti genetičkog diverziteta su date u tabeli 13. Slika 27. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 447 bp fragmenta 369 PPV-D izolata. Izolati iz Srbije su boldirani. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. Tabela 13. Vrednosti genetičke udaljenosti različitih grupa PPV-D izolata PPV-D (svih 370 izolata) 0,031±0,006 PPV-D (Srbija, 22 izolata) 0,027±0,006 PPV-D (ostale zemlje, 348 izolata) 0,031±0,006 R O -4 9 ap SK -1 9 9 p l SK -3 0 p l SK -2 0 2 p l C Z- 1 3 3 p l SK -2 0 0 p l SK -2 10 p l FR -6 3 ap SK -2 12 p l C Z- 23 3m y B Y- 10 00 p l IT -3 ap M D -6 p l M D -7 p l A T- 1 p l B G -3 01 p l R O -4 6a p P L- 2p l R O -5 7p l A T- 5 8m y A T- 6 1p l A T- 52 pl A T- 72 pl SK -2 5a p SK -2 6p l A T- 55 pl R O -1 8p l M D -1 1p l M D -1 m y H U -1 00 0a p H U -2 0m y RO -2 6a p RO -3 0a p IT -2 3a p PL -1 4p l IT -3 9a p IT -1 3a p SK -1 4m y AT -5 6p l H U -1 4a p AT -6 2p l SK -2 0a p FR -6 9a p FR -6 8p l FR -7 0p l HU -1 00 2a p IT -2 2a p SK -3 4p l SK -2 03 pl AT -5 7m y AT -7 0p l SK -3 2a p AT -6 0p l CZ -1 7m y CZ -2 3m y CZ -2 pl BG -1 2p l SK -2 7p l BG -59 pl BG -62 pl AT -69 pl SK -10 03 pl RO -29 ap AT -73 pl RO -27 ap RO -28 ap 75 AT -74 pl CZ- 148 pl BA -10 04p l RS- 43p l PL- 1pl RS- 26p l BA- 100 5pl RS- 45p l ES-5 2pl BG- 100 7pl ES-1 015 ap BG-2 9ap PL-7 ap BG-2 6pl CZ-1 49pl FR-64 pl RO-77 ap ES-54 pl ES-57a p ES-60a p BG-28a p RO-84a p BG-34pl RS-29pl RS-46pl BG-61pl CZ-54pl SK-226pl CZ-64pl CZ-62pl CZ-65pl RO-78ap IT-4pl BG-63pl RO-22pl BG-69plRO-15plCZ-143plRS-34plRankovikDE-6plME-1004plRS-55plME-1021plLT-2plRU-8plCA-1004plES-16apES-1014plES-58apCA-1009plDE-11plNO-1plCL-1apKZ-1000apFR-66plRS-59plRO-1plRS-7pl CZ-1006pl CZ-20my SK-7pl US-1000pl CZ-1007pl CZ-342pl RO-55pl SK-65pl CZ-227pl CZ-1008pl CZ-145pl RO-42pl SK-33ap RS-61ap CZ-137m y CZ-1013pl PL-19pl CZ-1009pl CZ-150pl CZ-1010pl RO-76ap SK-4pl SK-64pl RO-25pl CZ-1011pl CZ-44m y CZ-204m y CZ-36m y CZ-111m y CZ-26m y CZ-46m y SK-147pl CZ-1012pl ES-61ap M D -10ap ES-50ap ES-51m y ES-6ap FR-30ap CZ-1014pl R S-2pl M E-1009pl D 80 CZ-1016pl CZ-1015pl CZ-1017pl CZ-14m y SK-218m y R O -2pl R O -7pl C Z-12 1p l C Z-12 2m y R O -6 7ap R O -7 0ap R O -4 1p l R O -6 9ap R O -6 8ap R O -4 3p l R O -4 5p l C Z-14 2p l M E-1 002p l C Z-12 3p l R O -3 p l R S-51 p l R S-60 p l C Z-1 4 0 p l C Z-1 2 5 m y C Z-1 2 6 m y C Z-1 2 7 p l D 1 1 9 JP -1 0 1 2 p lC Z- 1 2 8 p l R O -2 0 7 p l C Z- 1 2 9 p l R O -6 6 ap C Z- 1 3 0 m y R O -2 4p l C Z- 13 1p l SK -6 3p l R O -1 1p l R O -1 4p l R O -5 p l P L- 5p l C Z- 69 p l R O -4 p l R O -7 4a p C Z- 13 2m y C Z- 15 m y R O -8 2a p LV -4 5p l LV -4 9p l LV -4 8p l LV -5 pl LV -3 3p l LV -3 8p l LV -3 pl LV -1 23 pl LV -4 pl 9 5 CZ -1 35 pl KZ -1 00 1p l CZ -1 39 pl RO -7 9a p CZ -1 51 pl SK -6 1p l CZ -1 9m y RO -5 2p l CZ -2 7m y IT -4 2a p CZ -7 6m y FR -1 01 8a p PL -2 6p l PL -2 7p l PL -2 8p l PL -1 1p l LV -2 pl LV -1 21 pl LV -4 3p l LV -1 pl LV -3 6p l RO -2 04 pl CZ -3 ap RO -5 9p l RO -4 4p l RO -2 3p l CZ -4 2m y D5 6RO -2 1p l RO -7 5a p FR -51 ap RO -48 ap PL -20 pl PL -4p l PL -21 pl PL- 22 pl PL- 18 pl PL- 16p l PL- 17p l RO -80 apDE -7p l ES- 77m y CZ- 75p l MD -5p lSK- 142 plDE- 12p l DE- 100 5plSK-1 24a p DE-1 013 unDE-4 plRO- 72apD12 4RO -6plM D-3p lRO-1 3plSK-3 5myMD -12plD E-10pl DE-8pl DE-1pl FR-58ap ES-48ap ES-59ap ES-49ap DE-5pl ES-8ap ES-40ap DE-9pl RO-47ap MD-2my US-1001pl ES-24my ES-25my ES-38ap LV-31pl ES-7ap ES-39ap ES-55pl SK-129ap ES-41ap MD-4pl RO-83ap ES-63ap RO-86ap FR-23ap FR-34ap FR-22ap FR-35ap FR-1019ap LV-10pl LV-34pl LV-11pl LV-9pl ES-42ap ES-85my ES-45pl ES-69ap PK-1000ap RO-73ap RO-81ap ES-46pl SK-300pl RO-17pl RO-20pl ES-56ap PL-3pl ES-62ap NO-2pl ES-79pl LV-32pl M D-9my ES-80ap M E-1019pl M E-1020pl FR-65pl SK-66m y LT -1 pl RO -5 3p l RS -0 1m y RS -5 7p l M E- 10 08 pl PL -1 0m y RO -1 0p l RO -8 pl PL -1 5p l RO -9 pl RO -1 2p l RO -6 4p l RO -2 02 pl RO -5 0a p RO -5 1p l SK -6 9p l RO -5 4p l RO -5 6p l RO -7 1a p RO -8 5a p SK -6 8p l R S- 18 pl R S- 62 pl SK -2 8a p U S- 10 04 pl SK-205pl SK-206pl R O -60pl IT-51pl R O -209pl 9 1 REZULTATI 53 5.1.6.2. Analiza sekvenci P3-6K1 regiona genoma Zа sеkvеnciоnirаnjе frаgmеntа lоcirаnоg u P3-6K1 (C-ter P3, 6K1 i N-ter CI) rеgiоnu gеnоmа primenjeni su prајmеri PCI-PP3. Nukleotidne sekvence su deponovane u оn-linе bаzu web sajta projekta SharCo (ID brojevi sekvenci su dati u tabeli 9). Obrada sekvenci je izvršena u programu BioEdit. Filogenetsko stablo rekonstruisano od nukleotidnih sekvenci C-ter P3, 6K1 i N-ter CI regiona genoma jasno pokazuje tri klastera izolata koji odgovaraju PPV-M, PPV-D i PPV-Rec sojevima (Slika 28). Filogenetska analiza potvrđuje rezultate dobijene IC-RT-PCR analizom odabranih izolata. Genetička udaljenost izolata je proračunata primenom bootstrap modela varijanse sa Kimura 2-P modelom zamene nukleotida. Vrednosti procenjene genetičke udaljenosti date su u tabeli 14. Tabela 14. Vrednosti genetičke udaljenosti 41 izolata unutar i između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata PPV-M PPV-D PPV-Rec PPV-M (3 izolata) 0,006±0,002 0,153±0,015 0,156±0,015 PPV-D (15 izolata) 0,013±0,002 0,029±0,004 PPV-Rec (23 izolata) 0,020±0,002 Sekvence dobijene tokom izrade ove disertacije su upoređene sa još 28 sekvenci PPV izolata iz Srbije (Dallot et al., 2011; Jevremović, 2008). Upoređene su sekvence 69 izolata PPV. Rekonstruisano je filogenetsko stablo (Slika 29) i izvršen proračun genetičke udaljenosti svih izolata poreklom iz Srbije (Tabela 15). Tabela 15. Vrednosti genetičke udaljenosti 69 izolata unutar i između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata PPV-M PPV-D PPV-Rec PPV-M (26 izolata) 0,006±0,001 0,153±0,016 0,155±0,016 PPV-D (18 izolata) 0,015±0,002 0,030±0,004 PPV-Rec (35 izolata) 0,019±0,002 REZULTATI 54 Slika 28. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 788 bp fragmenta 41 PPV izolata. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. RS-14pl RS-15pl RS-38pl RS-39pl RS-42pl RS-04pl RS-44pl RS-56pl RS-06pl RS-10pl RS-25ap RS-53pl RS-37pl RS-52pl RS-09pl RS-03pl RS-05pl RS-36pl RS-54pl RS-11pl RS-35pl RS-13pl RS-16pl PPV-Rec RS-59pl RS-60pl RS-46pl RS-43pl RS-62pl RS-61ap RS-07pl RS-02pl RS-29pl RS-26pl RS-34pl RS-18pl RS-45pl RS-55pl RS-57pl PPV-D RS-19pl RS-12pl RS-27pl PPV-M 97 100 98 82 98 97 87 86 78 85 84 0.005 REZULTATI 55 Slika 29. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 788 bp fragmenta 69 PPV izolata. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. RS-38pl RS-47pl RS-39pl RS-14pl RS-15pl RS-41pl RS-42pl RS-36pl RS-04pl RS-44pl RS-53pl RS-56pl RS-22pl RS-06pl RS-10pl D76 RS-64pl RS-25ap RS-30pl RS-48pl RS-49pl RS-37pl RS-52pl D144 RS-09pl RS-03pl RS-05pl RS-50pl RS-54pl RS-21pl RS-13pl RS-16pl RS-11pl RS-35pl D13 PPV-Rec RS-59pl RS-60pl RS-46pl RS-43pl RS-07pl RS-20pl RS-17pl RS-45pl RS-02pl RS-26pl RS-29pl RS-51pl RS-61ap RS-34pl RS-62pl RS-18pl RS-55pl RS-57pl PPV-D PPV-M 99 98 92 91 75 100 0.01 REZULTATI 56 Sekvence izolata iz Srbije su upoređene sa dostupnim sekvencama PPV-Rec i PPV-D izolata ovog regiona genoma iz 11 drugih zemalja. Filogenetska analiza je posebno sprovedena za PPV-Rec, a posebno za PPV-D izolate. Nukleotidne sekvence PPV-Rec izolata su međusobno upoređene i rekonstruisano je filogenetsko stablo na bazi P3-6K1 sekvenci 131 izolata (Slika 30). Radi određivanja diverziteta izolata posebno je određena vrednost genetičke udaljenosti: a) za svih 131 PPV-Rec izolata; b) za 36 izolata iz Srbije; i c) za 95 izolata iz ostalih zemalja. Za sve tri grupe izolata (a, b i c) vrednost genetičkog diverziteta je 0,018±0,002. Slika 30. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 723 bp fragmenta 131 PPV-Rec izolata Izolati iz Srbije su boldirani. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. B G -2 1 p l B G -7 0 p l B G -3 8 p l B G -2 2 p l B G -3 9 p l B G -4 9 p l B G -1 4 p l IT -5 3 p l B G -3 5 p l B G -3 6 p l D E -2 p l B G -4 0 p l S K -1 7 4 p l S K -1 82 pl B G -1 6p l C Z- 7p l B G -2 4p l B G -3 2p l SK -1 54 m y SK -9 1p l BG -1 3p l BG -3 3p l 77 S K- 12 pl BG -27 pl BG -60 pl BG -41 pl BG -45 pl 99 SK- 93m y SK- 70p l SK-1 05pl RO-6 3pl RO-58p l RO-203pl RO-201pl RO-208pl RO-205pl RO-65pl BA-16pl RS-64pl D76 BA-3plRS-30ncBA-6plRS-25apBA-4plRS-10pl RS-22pl BG-302pl RS-49pl BA-17ap R S-53pl R S-300pe R S -56pl R S -04pl R S -44p l R S -41p l R S -42p l R S -4 7 p l R S -3 8 p l R S -3 9 p l R S -1 4 p l R S -1 5 p l 8 8 B G -3 0 0 p l R S -4 8 p l A T -7 1 p l S K -1 p l S K -1 0 0 2 a p C Z -4 m y S K -1 3 2 p l S K -1 6 0 p l A L -9 p l B G -6 7 p l S K -1 6 1 p l IT -1 0 1 1 p l IT -1 0 1 2 jp IT -6 a p 9 9 B A -2 a p R S -3 5 p l D 1 3 R S -1 3 p l R S -1 6 p l P L -1 0 0 1 p l B Y -3 1p l P L- 24 pl P L- 25 pl 81 80 R S -2 1p l B Y -3 2p l SK -1 00 8p l CZ -3 37 pl SK -4 7p l SK -1 00 9p l SK -50 pl 87B A- 5p lBA -12 plBA -13 plB A-1 pl AL- 5pl BA-1 0pl BA-7 pl BA-8p l IT-1005 pl IT-10pl 75 IT-1014pl 99 RS-50pl SK-75pl BG-1010pl BG-8pl 97 RS-54pl RS-37pl RS-52pl D144 RS-05pl RS-03pl RS-06pl RS-09pl RS-11pl AT-50pl SK-189pl AT-46pl AT-49pl AT-51pl A T-53pl A T-54pl A T -47pl S K -3m y S K -162pl A T -4 8 p l S K -1 4 8 a p 90 A L -1 0 m y R S -3 6 p l A L -6 p l REZULTATI 57 U filogenetsku analizu PPV-D izolata uključeno je 206 izolata iz 24 zemalja i 18 izolata iz Srbije, što ukupno čini 224 izolata. Rekonstruisano filogenetsko stablo iz fragmenta lociranog u P3-6K1 regionu genoma stablo dato je na slici 31. Posebno je određena vrednost genetičke udaljenosti: a) za svih 224 PPV-D izolata; b) za 18 izolata iz Srbije; i c) za 206 izolata iz ostalih zemalja. Za b i c grupu izolata vrednost genetičkog diverziteta je 0,014±0,002, dok za grupu a iznosi 0,015±0,002. Slika 31. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz 723 bp fragmenta 224 PPV-D izolata Izolati iz Srbije su boldirani. Prikazane su bootstrap vrednosti ˃75%. IT -1 3 ap IT -3 9 ap H U -7 p e SK -2 6 p l U S- 1 01 3p e R O -7 7a p SK -2 1 9b t FR -3 6p e LT -2 p l M D -1 0a p PL -1 0m y FR -3 0a p R O -1 4p l FR -1 3p e JP -1 01 2p l IT -3 ap N O -1 pl PL -3 pl FR -1 2p e FR -2 3a p IT -5 pe FR -1 01 8a p PL -2 8p l LV -1 pl PL -2 7p l SK -6 6m y ES -4 1a p ES -7 1j p ES -3 8a p ES -6 1a p ES -6 6j p ES -4 6p l ES -4 4jp ES -7 5h y ES -3 3jp ES -60 ap ES -39 ap ES -36 jp ES -54 pl ES- 32 jp ES- 40a p ES- 76h y ES- 53j p ES- 58a p ES-7 0ap ES-5 9ap ES-8 ap ES-5 7ap ES-5 2pl ES-56 ap ES-55 pl ES-7ap ES-28jp ES-35jp ES-37jp ES-21jp ES-34jp ES-24my ES-25my ES-74hy ES-20jp ES-68jp RO-53pl FR-35ap DE-7pl FR-34apUS-1011peFR-1005apDE-5plDE-8plFR-14peIT-4plDE-4plFR-1004apUS-1012peDE-1plFR-65plES-26jpFR-22ap FR-1009pe RO-21pl CZ-3ap MD-7pl 97 CZ-90bt CZ-27my CZ-44m y CZ-46m y FR-51ap JP-1006ja PL-16pl PL-4pl PL-20pl PL-22pl 80 95 M D-3pl JP-1000ja JP-1007ja SK-4pl CZ-26m y SK-64pl CZ-17m y CZ-23m y CZ-2pl CZ-19m y CZ-42m y R O -51p l R O -48ap SK-202pl R O -86ap C Z-14 m y SK -19 9p l R O -74ap SK -21 8m y C Z-20 m y SK -7p l M D -8 p l SK -3 0 0 p l C Z-1 3 5 p l C Z-1 5 m y SK -6 5 p l SK -6 8 p lP L- 5 p l P L- 1 2 u n P L- 1 p l LT -1 p l 8 7 R O -2 07 p l R O -6 4p l C Z- 12 3p l C Z- 13 0m y C Z- 12 6m y C Z- 12 9p l C Z- 12 8p l C Z- 13 2m y C L- 1a p LV -9 pl SK -1 46 pe D E- 6p l JP -1 00 9j a BY -1 0p l BY -1 8p l LV -1 44 m y BY -1 2p l BY -1 1p l BY -1 3p l 91 PL -7 ap PL -9 3p l CZ -6 9p l CZ -7 6m y BG-63pl RO-4pl CZ-233m y BG-34pl SK-14m y RO-1pl RO-66ap RO-43pl RO-67ap 77 PL-15pl CZ-36my RO-82ap RO-83ap 87 CZ-342pl BG-28ap MD-5pl BG-26pl BG-29ap AT-57my AT-58my AT-55pl NO-2pl FR-1010pe RO-60pl SK-206pl RS-59pl RS-60pl AL-4pl RO-73ap FR-66pl RO-6pl HU-4pe BG-12pl BG-69pl RS-46pl BG-301pl BG-61pl EG-104 0pe E G-104 1pe EG -1042 pe CN-2 ja SK -33a p SK- 25ap AT-5 6pl SK -20a p HU- 15p e HU -16 pe 93 AT- 52p l HU -5p e RO -28 ap AT -1p l HU -11 pe PL -23 un PL -6p e 88 84 RO-54pl SK-35my FR-64pl TR-71pl RO-78ap CA-1001pe CA-1002pe RS-07pl RS-20pl RS-17pl RS-43pl RS-62pl SK-226pl RS-02pl RS-34pl RS-29pl RS-26pl RS-45pl R S-18pl R S-51pl R S-61ap R S-55pl R S-57pl REZULTATI 58 5.2. Dinamika širenja sojeva šarke šljive, prisustvo i brojnost lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu šljive 5.2.1. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u prvoj godini istraživanja (2008. godina) Nakon sadnje i prijema sadnica izvršen je vizuelni pregled prvih listova tokom prve dekade juna. Prilikom pregleda nije utvrđeno nijedna biljka šljive sa simptomima koji mogu ukazivati na prisustvo virusa šarke. Radi provere zdravstvenog statusa, sve biljke su DAS-ELISA testom ispitane na prisustvo PPV. ELISA testom ni u jednoj biljci nije utvrđeno prisustvo PPV. U fazi pripreme za podizanje eksperimentalnog zasada šljive tokom prethodne godine (2007.) izvršen je vizuelni pregled terena oko zasada. U malom zasadu šljive sorte Stenley koji se nalazi u blizini eksperimentalnog zasada izvršen je vizuelni pregled svih stabala i uzeti su uzorci za ELISA test (Šema 2). Od ukupno 38 stabala u zasadu, kod 11 je potvrđeno prisustvo PPV. Radi tipiziranja izolata u pozitivnim uzorcima sproveden je IC-RT-PCR test. Rezultati analize su prikazani u tabeli 16. Od 11 stabala šljive, kod 8 je utvrđen PPV-Rec soj, a kod 3 stabla PPV-D soj. Svi izolati su sekvencionirani u C-tеr NIb―N-tеr CP regionu genoma radi kasnijeg upoređivanja sa sekvencama izolata iz eksperimentalnog zasada. Osim zaraženih stabala iz malog zasada šljive, utvrđena su i dva stabla šljive sorte Crvena ranka koja se nalaze oko 40 m od eksperimentalnog zasada u pravcu jugoistok. Sa ovih stabala su uzeti uzorci listova i izvršeno je tipiziranje izolata PPV IC-RT-PCR metodom. Utvrđeno je da je u oba stabla prisutan PPV-Rec soj i oba izolata su sekvencionirana u C-tеr NIb―N-tеr CP regionu (Tabela 16). REZULTATI 59 Tabela 16. Rezultati tipiziranja izolata PPV iz okoline eksperimentalnog zasada REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI Broj Pozicija stablaa Sorta P4-P3M P4-P3D CIP-M CIP-D Soj Oznaka sekvence 1 2/12 Stenley + - - + Rec 2/12exter 2 2/8 Stenley + - - + Rec 2/8exter 3 2/1 Stenley + - - + Rec 2/1exter 4 3/9 Stenley + - - + Rec 3/9exter 5 4/13 Stenley + - - + Rec 4/13exter 6 4/12 Stenley - + - + D 4/12exter 7 4/11 Stenley + - - + Rec 4/11exter 8 4/9 Stenley - + - + D 4/9exter 9 4/4 Stenley - + - + D 4/4exter 10 4/3 Stenley + - - + Rec 4/3exter 11 4/2 Stenley + - - + Rec 4/2exter 12 / Crvena ranka + - - + Rec RS-23pl 13 / Crvena ranka + - - + Rec RS-24-pl a broj reda/broj stabla u redu 13 ○ ○ ● 12 ● ○ ● 11 ○ ○ ● 10 ○ ○ 9 ○ ● ● 8 ● ○ ○ 7 ○ ○ ○ 6 ○ ○ ○ 5 ○ ○ ○ 4 ○ ○ ● 3 ○ ○ ● 2 ○ ○ ● 1 ○ ● ○ ○ 1 2 3 4 Slika 32. Pozicija inokulisanih sadnica u eksperimentalnom zasadu šljive (označeno belom linijom) Šema 2. Mapa malog zasada šljive (● - zaražena stabla) U trećoj dekadi juna meseca izvršena je inokulacija 8 posađenih sadnica šljive koja su locirana na sredini zasada (Šema 1 i slika 32). Inokulacija je urađena metodom chip-budding sa po 2 čipa po sadnici. Četiri stabla su inokulisana PPV-Rec izolatom RS-67pl. Pozicije inokulisanih stabala su 9/13, 9/15, 10/14 i 10/16 (broj reda /broj stabla u redu). PPV-D izolatom RS-68pl inokulisana su 4 stabla na pozicijama 9/14, 9/16, 10/13 i 10/15. Izolati za inokulaciju su odabrani iz kolekcije PPV-D i PPV-Rec izolata (potencijalnih inokuluma) na osnovu rezultata upoređivanja sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona ovih izolata sa sekvencama izolata koji su detektovani u obližnjem malom zasadu šljive i izolatima sa stabala Crvene ranke. Upoređivanjem sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona u programu REZULTATI 60 BioEdit utvrđeno je da se odabrani PPV-Rec izolat RS-67pl razlikuje od svih ostalih PPV-Rec izolata iz neposredne okoline eksperimentalnog zasada u 2 fiksne mutacije (nukleotida). Pozicije odgovarajućih nukleotida su date u tabeli 17. Sekvence su date u prilogu 2. Tabela 17. Lista pozicija i odgovarajuće nukleotidne promene između izolata RS-67pl i ostalih ispitivanih PPV-Rec izolata Pozicija nukleotidaa Pozicija nukleotidab RS-67-pl Ostali izolati 8648 183 A T 8653 188 T C aPozicija prema sekvenci kompletnog genoma izolata RS-67pl bPozicija prema sekvenci 427 bp fragmenta izolata RS-67pl Sekvenca C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma PPV-D izolata RS-68pl razlikuje se od svih ostalih PPV-D izolata iz neposredne okoline eksperimentalnog zasada u 5 fiksnih mutacija (nukleotida). Pozicije odgovarajućih nukleotida su date u tabeli 18. Sekvence su date u prilogu 3. Tabela 18. Lista pozicija i odgovarajuće nukleotidne promene između izolata RS-68pl i ostalih ispitivanih PPV-D izolata Pozicija nukleotidac Pozicija nukleotidad RS-68-pl Ostali izolati 8486 21 T G 8541 76 A G 8621 156 T G 8622 157 G A 8843 378 C T cPozicija prema sekvenci kompletnog genoma izolata RS-68pl dPozicija prema sekvenci 427 bp fragmenta izolata RS-68pl Istraživanja epidemioloških osobina odabranih izolata koja su sprovedena u Francuskoj su pokazala visoku efikasnost prenošenja oba izolata na šljivu, kajsiju i breskvu lisnim vašima Myzus persicae Sulz. (Gerard Labonne i Sylvie Dallot, lična komunikacija). Dve nedelje po inokulaciji izvršena je provera prijema kalemljenja i utvrđeno je da je kalemljenje bilo uspešno. Do kraja vegetacije 2008. godine izvršena su još dva vizuelna pregleda svih stabala šljive u eksperimentalnom zasadu. Tokom pregleda nisu utvrđena stabla sa simptomima prisustva virusa šarke. REZULTATI 61 5.2.2. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u drugoj godini istraživanja (2009. godina) Vizuelni pregledi U eksperimentalnom zasadu je u prvoj dekadi juna 2009. godine sproveden vizuelni pregled svih stabala šljive. Prilikom pregleda su, osim na svih 8 inokulisanih, na još 3 stabla šljive uočeni simptomi virusa šarke. Ocena simptoma je data u tabeli 19. Tabela 19. Opisni rezultati vizuelnog pregleda stabala šljive u eksperimentalnom zasadu tokom 2009. godine Broj Pozicija Ocena simptoma Izgled simptoma Intenzitet simptoma 1 3/3 2 Mo, PP 3 2 12/7 2 Mo, PP 3 3 15/7 3 Mo, PP 3 4 9/13 2 Mo, PP 2 5 9/14 2 Mo, PP 3 6 9/15 3 Mo, PP 3 7 9/16 2 Mo, PP 3 8 10/13 2 Mo, PP 3 9 10/14 2 Mo, PP 3 10 10/15 2 Mo, PP 2 11 10/16 3 Mo, PP 3 Na stablima 3/3, 12/7 i 15/7 su uočeni izraženi simptomi šarke u vidu mozaika i prstenastih pega, uglavnom na nekoliko grančica na jednoj skeletnoj grani. Na inokulisanim stablima su simptomi bili ujednačeno izraženi na po nekoliko grančica na jednoj skeletnoj grani u vidi mozaika i prstenastih pega. Tokom jula i avgusta 2009. godine ponovljeni su vizuelni pregledi u kojima nisu utvrđena nova stabla sa simptomima šarke. ELISA test U prvoj dekadi jula 2009. godine ELISA testom su sva stabla šljive u eksperimentlnom zasadu ispitana na prisustvo virusa šarke šljive. Od svih analiziranih stabala virus šarke je, pored inokulisanih stabala, potvrđen i kod stabala 3/3, 12/7 i 15/7. Rezultati ELISA testa su u saglasnosti sa vizuelnim pregledima, jer je kod svih stabala sa simptomima potvrđeno prisustvo PPV. REZULTATI 62 IC-RT-PCR Radi utvrđivanja soja PPV prisutnog u uzorcima koji su dali pozitivnu reakciju u ELISA testu, sproveden je IC-RT-PCR test. Analiza je pokazala da je u stablu 3/3 prisutan PPV-D soj, a u stablima 12/7 i 15/7 PPV-Rec soj (Tabela 20, šema 3). Kod inokulisanih stabala tipiziranje je dalo očekivane rezultate saglasno inokulaciji odgovarajućim izolatom. Tabela 20. Rezultati tipiziranja PPV izolata iz eksperimentalnog zasada REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI Broj Pozicija stabla P4-P3M P4-P3D CIP-M CIP-D Soj Oznaka sekvence 1 3/3 - + - + D 3/3_09 2 12/7 + - - + Rec 12/7_09 3 15/7 + - - + Rec 15/7_09 4 9/13 + - - + Rec 9/13 5 9/14 - + - + D 9/14 6 9/15 + - - + Rec 9/15 7 9/16 - + - + D 9/16 8 10/13 - + - + D 10/13 9 10/14 + - - + Rec 10/14 10 10/15 - + - + D 10/15 11 10/16 + - - + Rec 10/6 Sekvencioniranje Svi pozitivni uzorci (Tabela 20) su dalje analizirani sekvencioniranjem C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma. Sekvence PPV-Rec i PPV-D izolata su date u prilozima 4 i 5. Kod svih stabala inokulisanih PPV-D izolatom RS-68pl, na poziciji 204 je C umesto T, koji je prisutan kod inokuluma RS-68pl (Prilog 5). Ova mutacija nije od značaja u daljoj analizi. TCS analiza Genealoška povezanost izolata koji su potvrđeni u eksperimentalnom zasadu, izolata sa inokulisanih stabala i izolata iz neposredne okoline izvršena je TCS analizom. Na slikama 33 i 34 date su mreže rodoslovne povezanosti sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona PPV-D i PPV-Rec izolata. TCS analiza ilustrativno pokazuje da zaražena stabla šljive iz eksperimentalnog zasada koja su detektovana u 2009. godini nisu zaražena izolatom sa inokulisanih stabala. Sekvence dva PPV-Rec izolata 12/7 i 15/7 takođe pokazuju znatnu divergentnost u odnosu na izolat sa inokulisanih stabala (10 i 12 nt razlike). REZULTATI 63 Međutim, sekvence ova dva izolata pokazuju veliku sličnost (3 i 1 nt razlike) sa sekvencama izolata iz neposredne okoline eksperimentalnog zasada (4/2exter, 4/11exter i RS-24pl) (slika 33). PPV-D izolat sa stabla 3/3 pokazuje veliku divergentnost u odnosu na izolat sa inokulisanih stabala (13 nt razlike), kao i u odnosu na PPV-D izolate iz obližnjeg zasada (19 nt razlike) (slika 34). 29 ○ ○ ○ ○ ○ ○ 28 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 27 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 26 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 25 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 24 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 23 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 22 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 20 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 19 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 18 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 17 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 16 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 15 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 14 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 13 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 12 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 11 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 10 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 9 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 8 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 7 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ● ○ 6 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 5 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 4 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 3 ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 2 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 Šema 3. Mapa eksperimentalnog zasada šljive sa pozicijama zaraženih stabala u 2009. godini ( - inokulisana stabla, ● - PPV-D, ● - PPV-Rec) REZULTATI 64 Slika 33. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-Rec izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni žuto), njegove okoline (označeni belo) i PPV-Rec izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo). Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. Slika 34. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-D izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni zeleno), njegove okoline (označeni belo) i PPV-D izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo) . Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. REZULTATI 65 Praćenje brojnosti i vrsta biljnih vaši Tokom 2009. godine prаćеnjе prisustva vrstа i brојnоsti lisnih vаši vršeno je u periodu od 4. maja do 9. oktobra. Tokom ovog perioda, primenom Sticky-shoot metode uhvaćeno je ukupno 708 krilatih jedinki preko 40 vrsta lisnih vaši samo na tretiranim listovima (Prilog 6). Najveća brojnost populacije lisnih vaši u prolećnom periodu bila je od 13‒19. maja, dok je jesenji pik bio u periodu od 12‒21. septembra (Grafikon 7). Najveći broj uhvaćenih vrsta pripada rodovima: Aphis (34%), Myzocallis (9%), Rhopalosiphum (9%) i Capitophorus (8,5%). Najveća brojnost vrsta lisnih vaši koje su opisane kao vektori prati trend brojnosti ostalih vrsta, osim u trećoj dekadi juna. Grafikon 7. Dinamika populacija krilatih formi lisnih vaši uhvaćenih primenom Sticky-shoot metode tokom 2009. godine 5.2.3. Ispitivanja prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u trećoj godini istraživanja (2010. godina) Vizuelni pregledi U prvoj dekadi juna 2010. godine sproveden je vizuelni pregled svih stabala šljive u zasadu. Prilikom detaljnog pregleda su, osim na 8 inokulisanih, na još 20 stabala uočeni simptomi virusa šarke šljive. Ocena simptoma je data u tabeli 21. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 4 -1 2 /0 5 /0 9 1 3 -1 9 /0 5 /0 9 2 0 -2 8 /0 5 /0 9 2 9 /0 5 /- 0 4 /0 9 /0 9 0 5 -1 1 /0 6 /0 9 1 2 -2 1 /0 6 /0 9 2 2 -2 9 /0 6 /0 9 3 0 /0 6 /- 1 4 /0 7 /0 9 1 5 -2 2 /0 7 /0 9 2 3 -3 1 /0 7 /0 9 0 1 -0 8 /0 8 /0 9 0 9 -1 8 /0 8 /0 9 1 9 -2 7 /0 8 /0 9 2 8 /0 8 -1 1 /0 9 /0 9 1 2 -2 1 /0 9 /0 9 2 2 -3 0 /0 9 /0 9 0 1 -0 9 /1 0 /0 9 b ro j u h va će n ih je d in ki intervali nanošenja aerosola sve vrste vektori REZULTATI 66 Na 9 stabala simptomi su bili prisutni na čitavoj kruni. Na 7 stabala simptomi su uočeni na grančicama jedne skeletne grane, dok su kod 3 stabla simptomi bili prisutni na grančicama dve skeletne grane. Kod stabla 12/18 primećeno je samo par listova sa simptomima. Intenzitet simptoma na stablima je varirao od 2‒4, odnosno od blagih do jako izraženih simptoma. Uočeni simptomi na stablima su bili u vidu prstenastih i poluprstenastih pega i mozaika. Na svim inokulisanim stablima simptomi su uglavnom bili ujednačeno izraženi na gotovo celoj kruni u vidi mozaika i prstenastih pega. Simptomi su bili izraženi do jako izraženi, osim na stablu 9/13 gde su primećeni blagi simptomi. Tokom jula i avgusta 2010. godine ponovljeni su vizuelni pregledi u kojima nisu utvrđena nova stabla sa simptomima šarke. Tabela 21. Opisni rezultati vizuelnog pregleda stabala šljive u eksperimentalnom zasadu tokom 2010. godine Broj Pozicija stabla Ocena simptoma Izgled simptoma Intenzitet simptoma 1 3/3 2 Mo, PP 3 2 3/21 3 Mo, PP 3 3 5/2 4 PP 2 4 5/29 4 Mo 3 5 6/1 2 Mo, PP 3 6 6/17 4 PP 2 7 6/23 4 PP 2 8 6/27 2 Mo, PP 3 9 7/1 2 Mo, PP 3 10 7/20 2 Mo, PP 3 11 10/11 2 PP 4 12 10/24 3 Mo, PP 4 13 12/7 3 Mo, PP 3 14 12/18 1 Mo, PP 3 15 13/20 4 PP 2 16 14/25 2 Mo, PP 3 17 15/3 4 PP 2 18 15/7 4 Mo, PP 4 19 15/15 4 Mo, PP 4 20 16/8 4 PP 2 21 9/13 3 Mo, PP 2 22 9/14 4 Mo, PP 4 23 9/15 4 Mo, PP 4 24 9/16 4 Mo, PP 4 25 10/13 4 Mo, PP 4 26 10/14 3 Mo, PP 3 27 10/15 4 Mo, PP 4 28 10/16 4 Mo, PP 4 REZULTATI 67 ELISA test Sva stabla šljive u eksperimentlnom zasadu su sredinom jula 2010. godine ELISA testom ispitana na prisustvo virusa šarke šljive. Od svih analiziranih stabala, virus šarke je utvrđen samo kod stabala koja su pokazivala simptome virusa šarke (Tabela 22). U stablima bez simptoma nije detektovan virus šarke. IC-RT-PCR Svi pozitivni uzorci iz ELISA testa su analizirani IC-RT-PCR metodom (Tabela 22). Analiza je pokazala da je u 2 stabla (3/3 i 3/21) prisutan PPV-D soj, a u 18 stabala (5/2, 5/29, 6/1, 6/17, 6/23, 6/27, 7/1, 7/20, 10/11, 10/24, 12/7, 12/18, 13/20, 14/25, 15/3, 15/7, 15/15 i 16/8) PPV-Rec soj (Šema 4). Kod inokulisanih stabala rezultati su potvrdili održavanje pojedinačne infekcije odgovarajućim sojem. Tabela 22. Rezultati tipiziranja PPV izolata iz eksperimentalnog zasada REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI Broj Pozicija stabla P4-P3M P4-P3D CIP-M CIP-D Soj Oznaka sekvence 1 3/3 - + - + D 3/3_10 2 3/21 - + - + D 3/21_10 3 5/2 + - - + Rec 5/2_10 4 5/29 + - - + Rec 5/29_10 5 6/1 + - - + Rec 6/1_10 6 6/17 + - - + Rec 6/17_10 7 6/23 + - - + Rec 6/23_10 8 6/27 + - - + Rec 6/27_10 9 7/1 + - - + Rec 7/1_10 10 7/20 + - - + Rec 7/20_10 11 10/11 + - - + Rec 10/11_10 12 10/24 + - - + Rec 10/24_10 13 12/7 + - - + Rec 12/7_10 14 12/18 + - - + Rec 12/18_10 15 13/20 + - - + Rec 13/20_10 16 14/25 + - - + Rec 14/25_10 17 15/3 + - - + Rec 15/3_10 18 15/7 + - - + Rec 15/7_10 19 15/15 + - - + Rec 15/15_10 20 16/8 + - - + Rec 16/8_10 21 9/13 + - - + Rec 9/13 22 9/14 - + - + D 9/14 23 9/15 + - - + Rec 9/15 24 9/16 - + - + D 9/16 25 10/13 - + - + D 10/13 26 10/14 + - - + Rec 10/14 27 10/15 - + - + D 10/15 28 10/16 + - - + Rec 10/16 REZULTATI 68 Sekvencioniranje Svih 20 pozitivnih uzoraka je sekvencionirano u C-tеr NIb―N-tеr regionu genoma. Dobijene sekvence PPV-Rec i PPV-D izolata su međusobno uparene i date u prilozima 7 i 8. U prilozima su navedene oznake sekvenci zaraženih stabala iz 2009. godine jer su sekvence izolata sa istih stabala iz 2010. godine identične. 29 ○ ● ○ ○ ○ ○ 28 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 27 ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 26 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 25 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ 24 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 23 ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 22 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21 ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 20 ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ 19 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 18 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ 17 ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 16 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 15 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ● ○ 14 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 13 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 12 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 11 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 10 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 9 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 8 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● 7 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ● ○ 6 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 5 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 4 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 3 ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ 2 ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 Šema 4. Mapa eksperimentalnog zasada šljive sa pozicijama zaraženih stabala u 2010. godini ( - inokulisana stabla, ● - PPV-D, ● - PPV-Rec) REZULTATI 69 TCS analiza Genealoška povezanost izolata koji su detektovani u eksperimentalnom zasadu tokom 2009 i 2010. godine, izolata sa inokulisanih stabala i izolata iz neposredne okoline izvršena je TCS analizom. Na slikama 35 i 36 date su mreže genealoške povezanosti sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona PPV-D i PPV-Rec izolata. Analiza pokazuje da izolati sa novozaraženih stabala ne potiču sa inokulisanih stabala. Slika 35. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-D izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni zeleno), njegove okoline (označeni belo) i PPV-D izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo) . Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. REZULTATI 70 Slika 36. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-Rec izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni žuto), njegove okoline (označeni belo) i PPV-Rec izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo) . Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. Praćenje brojnosti i vrsta biljnih vaši Tokom 2010. godine prаćеnjе prisustva vrstа i brојnоsti lisnih vаši vršeno je u periodu od 29. aprila do 21. septembra. Primenom Sticky-shoot metode je tokom ovog perioda uhvaćeno ukupno 1289 krilatih jedinki preko 30 vrsta lisnih vaši na tretiranim listovima (Prilog 9). Najveća brojnost populacije lisnih vaši u prolećnom periodu bila je od 4‒9. juna, dok jesenji pik nije bio izražen. Najveći broj uhvaćenih vrsta pripada rodovima Myzocallis (82,6%) i Aphis (7,4%). Brojnost vrsta koje su opisane kao vektori je bila veoma niska u odnosu na ostale uhvaćene vrste (Grafikon 8). REZULTATI 71 Grafikon 8. Dinamika populacija krilatih formi lisnih vaši uhvaćenih primenom Sticky-shoot metode tokom 2010. godine 5.2.4. Ispitivanja prisutva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u četvrtoj godini istraživanja (2011. godina) Vizuelni pregledi Tokom prve dekade juna 2011. godine sproveden je prvi vizuelni pregled stabala šljive u zasadu. Tokom pregleda su na 45 stabala (uključujući 8 inokulisanih) uočeni simptomi virusa šarke šljive. Ocena simptoma je data u tabeli 23. Na znatnom broju stabala simptomi su bili lokalizovani. Na 8 stabala primećeno je tek po par listova sa veoma blagim do blagim simptomima. Kod 12 stabala simptomi su bili lokalizovani na nekoliko grančica jedne skeletne grane, dok je na 10 stabala bilo simptoma na više skeletnih grana. Svega 7 stabala je bilo sa simptomima sistemično izraženih po čitavoj kruni. Intenzitet simptoma na listovima se kretao od jako blagih do jako izraženih u vidu mozaika i prstenastih pega. Na inokulisanim stablima su simptomi bili ujednačeno izraženi na gotovo celoj kruni u vidi mozaika i prstenastih pega, a po prvi put su primećeni simptomi 0 100 200 300 400 500 600 b ro j u h va će n ih je d in ki intervali nanošenja aerosola sve vrste vektori REZULTATI 72 tipa prosvetljavanja glavnog i bočnih lisnih nerava. Simptomi su bili izraženi do jako izraženi. Tabela 23. Opisni rezultati vizuelnog pregleda stabala šljive u eksperimentalnom zasadu u 2011. godini Broj Pozicija stabla Ocena simptoma Izgled simptoma Intenzitet simptoma 1 3/3 3 Mo 3 2 3/19 1 Mo 1 3 3/21 4 PP, Mo 4 4 4/2 1 Mo, PP 1 5 4/10 1 Mo 1 6 5/2 3 Mo, PP, PN 2 7 5/5 2 Mo, PP 2 8 5/29 4 Mo, PP 3 9 6/1 1 PP 1 10 6/17 4 Mo, PP 4 11 6/23 4 Mo, PP 3 12 6/27 4 Mo 3 13 7/1 2 Mo, PP 2 14 7/3 1 Mo 2 15 7/8 1 Mo, PP 2 16 7/20 4 Mo, PP 3 17 8/4 2 Mo 2 18 8/8 1 Mo 2 19 9/29 2 Mo, PP 2 20 10/8 2 Mo 2 21 10/9 2 Mo, PP 2 22 10/11 2 Mo 3 23 10/22 2 Mo 2 24 10/24 3 Mo, PP, PN 3 25 10/28 2 Mo, PN 2 26 11/20 3 Mo, PP 2 27 12/7 3 Mo, PP 2 28 12/18 1 Mo 1 29 13/3 2 Mo 3 30 13/20 3 Mo, PP 3 31 13/25 2 PP, Mo 2 32 14/25 3 PP, Mo 4 33 15/1 2 Mo 3 34 15/3 3 Mo 2 35 15/7 3 Mo, PP 3 36 15/15 4 Mo 3 37 16/8 3 PP, Mo 3 38 9/13 3 Mo, PP 3 39 9/14 3 Mo 3 40 9/15 3 Mo, PP 4 41 9/16 3 Mo, PN 3 42 10/13 3 Mo, PP, PN 3 43 10/14 3 Mo, PP 3 44 10/15 3 Mo, PN 3 45 10/16 3 Mo, PP 4 Tokom jula i avgusta 2011. godine ponovljeni su vizuelni pregledi u kojima nisu utvrđena nova stabla sa simptomima šarke. Tokom ovih pregleda na nekim REZULTATI 73 stablima je bilo teško uočiti simptome virusa šarke. Radi se o stablima 3/19, 4/2, 4/10, 6/1, 7/3, 7/8, 8/8 i 12/18, gde je tokom prvog pregleda uočeno samo par listova sa simptomima. Neposredno po pregledu stabala šljive u eksperimentalnom zasadu, pregledana su i sva stabla šljive iz obližnjeg malog zasada i uzeti su uzorci sa svih 38 stabala za IC-RT-PCR test. ELISA test U prvoj dekadi jula 2011. godine ELISA testom su sva stabla šljive u eksperimentlnom zasadu ispitana na prisustvo virusa šarke šljive. Od svih analiziranih stabala, virus šarke je utvrđen kod svih stabala koja su pokazivala simptome virusa šarke (Tabela 23). U ostalim stablima bez simptoma nije detektovan virus šarke. IC-RT-PCR Svi pozitivni uzorci iz ELISA testa su dalje analizirani IC-RT-PCR testom (tabela 24). Analiza je pokazala da je u 5 stabаla (3/3, 3/19, 3/21, 9/29 i 13/3) prisutan PPV-D soj, a u 32 stabla (4/2, 4/10, 5/2, 5/5, 5/29, 6/1, 6/17, 6/23, 6/27, 7/1, 7/3, 7/8, 7/20, 8/4, 8/8, 10/8, 10/9, 10/11, 10/22, 10/24, 10/28, 11/20, 12/7, 12/18, 13/20, 13/25, 14/25, 15/1, 15/3, 15/7, 15/15 i 16/8) prisutan je PPV-Rec soj (Šema 5). Kod inokulisanih stabala rezultati su i tokom ove godine potvrdili održavanje pojedinačne infekcije odgovarajućim sojem. REZULTATI 74 Tabela 24. Rezultati tipiziranja PPV izolata iz eksperimentalnog zasada REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI Broj Pozicija stabla P4-P3M P4-P3D CIP-M CIP-D Soj Oznaka sekvence 1 3/3 - + - + D 3/3_11 2 3/19 - + - + D 3/19_11 3 3/21 - + - + D 3/21_11 4 4/2 + - - + Rec 4/2_11 5 4/10 + - - + Rec 4/10_11 6 5/2 + - - + Rec 5/2_11 7 5/5 + - - + Rec 5/5_11 8 5/29 + - - + Rec 5/29_11 9 6/1 + - - + Rec 6/1_11 10 6/17 + - - + Rec 6/17_11 11 6/23 + - - + Rec 6/23_11 12 6/27 + - - + Rec 6/27_11 13 7/1 + - - + Rec 7/1_11 14 7/3 + - - + Rec 7/3_11 15 7/8 + - - + Rec 7/8_11 16 7/20 + - - + Rec 7/20_11 17 8/4 + - - + Rec 8/4_11 18 8/8 + - - + Rec 8/8_11 19 9/29 - + - + D 9/29_11 20 10/8 + - - + Rec 10/8_11 21 10/9 + - - + Rec 10/9_11 22 10/11 + - - + Rec 10/11_11 23 10/22 + - - + Rec 10/22_11 24 10/24 + - - + Rec 10/24_11 25 10/28 + - - + Rec 10/28_11 26 11/20 + - - + Rec 11/20_11 27 12/7 + - - + Rec 12/7_11 28 12/18 + - - + Rec 12/18_11 29 13/3 - + - + D 13/3_11 30 13/20 + - - + Rec 13/20_11 31 13/25 + - - + Rec 13/25_11 32 14/25 + - - + Rec 14/25_11 33 15/1 + - - + Rec 15/1_11 34 15/3 + - - + Rec 15/3_11 35 15/7 + - - + Rec 15/7_11 36 15/15 + - - + Rec 15/15_11 37 16/8 + - - + Rec 16/8_11 38 9/13 + - - + Rec 9/13 39 9/14 - + - + D 9/14 40 9/15 + - - + Rec 9/15 41 9/16 - + - + D 9/16 42 10/13 - + - + D 10/13 43 10/14 + - - + Rec 10/14 44 10/15 - + - + D 10/15 45 10/16 + - - + Rec 10/16 REZULTATI 75 29 ○ ● ○ ○ ○ ● 28 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ 27 ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 26 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 25 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ 24 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 23 ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 22 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 21 ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 20 ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ● ○ ● ○ ○ ○ 19 ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 18 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ 17 ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 16 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 15 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ● ○ 14 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 13 ○ ○ ○ ○ ○ ○   ○ ○ ○ ○ ○ ○ 12 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 11 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 10 ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 9 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ 8 ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ● 7 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ● ○ 6 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 5 ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 4 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 3 ○ ○ ● ○ ○ ○ ● ○ ○ ○ ○ ○ ● ○ ● ○ 2 ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 1 ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ○ ○ ○ ● ○ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 Šema 5. Mapa eksperimentalnog zasada šljive sa pozicijama zaraženih stabala u 2011. godini ( - inokulisana stabla, ● - PPV-D, ● - PPV-Rec) IC-RT-PCR analizom su tokom 2011. godine ispitana i sva stabla iz malog zasada šljive iz neposredne blizine eksperimentalnog zasada. Ispitano je svih 38 stabala iz zasada i rezultati su dati u tabeli 25. REZULTATI 76 Tabela 25. Rezultati analize uzoraka iz malog zasada šljive REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI Broj Pozicija stabla P4-P3M P4-P3D CIP-M CIP-D Soj Oznaka sekvence 1 4/13 + - - + Rec 4/13exter 2 3/3 + - - + Rec 3/3exter 3 3/1 - - - - NEGa - 4 4/3 + - - + Rec 4/3exter 5 3/2 - + - + D 3/2exter 6 4/7 + - - + Rec 4/7exter 7 3/6 - - - - NEG - 8 2/8 + - - + Rec 2/8exter 9 3/8 + - - + Rec 3/8exter 10 3/4 + - - + Rec 3/4exter 11 2/3 + - - + Rec 2/3exter 12 2/2 - - - - NEG - 13 3/12 - - - - NEG - 14 2/10 - - - - NEG - 15 2/1 + - - + Rec 2/1exter 16 3/13 - - - - NEG - 17 2/5 + - - + Rec 2/5exter 18 4/6 - - - - NEG - 19 3/11 - - - - NEG - 20 4/5 - - - - NEG - 21 3/5 - - - - NEG - 22 3/9 + - - + Rec 3/9exter 23 4/1 - - - - NEG - 24 4/4 - + - + D 4/4exter 25 2/4 + - - + Rec 2/4exter 26 2/6 - - - - NEG - 27 3/7 + - - + Rec 3/7exter 28 4/12 - + - + D 4/12exter 29 2/11 - - - - NEG - 30 3/10 - - - - NEG - 31 4/9 - + - + D 4/9exter 32 2/13 + - - + Rec 2/13exter 33 2/9 - - - - NEG - 34 2/12 + - - + Rec 2/12exter 35 4/11 + - - + Rec 4/11exter 36 1/1 - - - - NEG - 37 4/2 + - - + Rec 4/2exter 38 2/7 - - - - NEG - a - negativan rezultat Od 38 stabala šljive u malom zasadu, kod 21 stabla je utvrđen PPV. Kod 17 stabala je utvrđen PPV-Rec soj, kod 4 stabla PPV-D soj. Sekvencioniranje Izolati sa novozaraženih stabala iz eksperimentalnog zasada su sekvencionirani u C-tеr NIb―N-tеr regionu genoma. Sekvence su date u prilozima 10 i 11. REZULTATI 77 Iz malog zasada šljive sekvencioniran je C-tеr NIb―N-tеr region genoma 10 novozaraženih stabala: 2/3, 2/4, 2/5, 2/13, 3/2, 3/3, 3/4, 3/7, 3/8 i 4/7. Sekvence ovih izolata su date u prilogu 12. TCS analiza Genealoška povezanost izolata koji su detektovani u eksperimentalnom zasadu u periodu 2009-2011. godine, izolata sa inokulisanih stabala i izolata iz neposredne okoline izvršena je TCS analizom. Na slikama 37 i 38 date su mreže genealoške povezanosti sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona PPV-D i PPV-Rec izolata. Slika 37. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-D izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni zeleno), njegove okoline (označeni belo) i PPV-D izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo) . Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. TCS analiza PPV-D izolata pokazuje da postoji velika divergentnost posmatranih izolata. Nijedan od izolata sa novozaraženih stabala u REZULTATI 78 eksperimentalnom zasadu ne potiče sa inokulisanih stabala, a ovi izolati takođe pokazuju veliku različitost nukleotidnih sekvenci u odnosu na izolate iz obližnjeg malog zasada. Slika 38. Mreža genealoške povezanosti analiziranih PPV-Rec izolata iz eksperimentalnog zasada (označeni žuto), njegove okoline (označeni belo) i PPV-Rec izolata sa inokulisanih stabala (označen plavo) . Svaka linija predstavlja pojedinačnu mutaciju između dva izolata sa pozicijom mutacije. Nedostajuće (hipotetičke) sekvence su predstavljene kružićima. TCS analiza PPV-Rec izolata je pokazala da samo jedan izolat (11/20_11) potiče sa inokulisanih stabala u eksperimentalnom zasadu. Sekvence većine izolata iz zasada su identične ili veoma slične sa sekvencama pojedinih izolata iz obližnjeg malog zasada. Praćenje brojnosti i vrsta biljnih vaši Tokom 2011. godine prаćеnjе prisustva vrstа i brојnоsti lisnih vаši vršeno je u periodu od 28. aprila do 23. septembra. Tokom ovog perioda uhvaćeno je samo REZULTATI 79 290 krilatih jedinki preko 40 vrsta lisnih vaši na tretiranim listovima (Prilog 13). Tokom 2011. godine brojnost lisnih vaši je bila na niskom nivou, tako da pikovi brojnosti nisu bili izraziti kao tokom 2009. i 2010. godine. Najveći broj uhvaćenih vrsta pripada rodovima: Aphis (49%), Therioaphis (6%), Pemphigus (9%), Brachicaudus (4,5%) i Rhopalosiphum (4%). Najveća brojnost vrsta lisnih vaši koje su opisane kao vektori prati trend brojnosti ostalih vrsta, osim u intervalu kraj juna-početak jula (Grafikon 9). Grafikon 9. Dinamika populacija krilatih formi lisnih vaši uhvaćenih primenom Sticky-shoot metode tokom 2011. godine 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 b ro j u h va će n ih je d in ki intervali nanošenja aerosola sve vrste vektori DISKUSIJA 80 6. DISKUSIJA 6.1. Rasprostranjenost sojeva šarke šljive u Srbiji 6.1.1. Rasprostranjenost sojeva šarke u zasadima šljive i kajsije u Srbiji Tokom izrade ove disertacije sprovedeno je najobimnije ispitivanje raširenosti sojeva virusa šarke u zasadima šljive i kajsije kod nas. Rezultati istraživanja pokazuju da je u gotovo svim (278 od 283) analiziranim uzorcima potvrđeno prisustvo PPV. Vizuelnim pregledima su ciljana stabla sa jasnim simptomima prisustva šarke, što je i potvrđeno laboratorijskim analizama. Kod 5 uzoraka šljive sa veoma jasnim i karakterističnim simptomima, nalik onima koje izaziva virus šarke, IC-RT-PCR metodom nije utvrđeno prisustvo ovog virusa. Ovi uzorci su ELISA metodom analizirani i na prisustvo virusa hlorotične lisne pegavosti jabuke (Apple chlorotic leaf spot virus -ACLSV) i virusa prstenaste pegavosti paradajza (Tomato ring spot virus -ToRSV). Navedeni virusi mogu izazvati simptome nalik šarki, ali ELISA testom nije potvrđeno prisustvo niti ACLSV ni ToRSV. U analiziranim uzorcima dominantno je utvrđen rekombinantni soj virusa šarke (55,7%). U ranije sprovedenom istraživanju raširenosti sojeva virusa šarke šljive u Srbiji, sa nešto drugačijom strategijom uzimanja uzoraka, rekombinantni soj je utvrđen u 20,5% analiziranih uzoraka (Jevremović, 2008). Tada je analiziran i znatan broj uzoraka breskve i nektarine (oko polovina analiziranih uzoraka), ali ukoliko se posmatraju samo uzorci šljive i kajsije, PPV-Rec soj je utvrđen u 36,4% uzoraka. U strukturi gajenja koštičavih voćaka (računajući šljivu, kajsiju i breskvu) 6 DISKUSIJA 81 u Srbiji, šljiva ima dominantno mesto sa skoro 41 milion rodnih stabala, što je udeo od oko 89% (Republički zavod za statistiku RS). Breskva i kajsija su zastupljene sa po 3,8 i 1,5 miliona rodnih stabala. Uzimajući u obzir ovu proporciju zastupljenosti Prunus vrsta domaćina PPV u Srbiji, može se zaključiti da je generalno kod nas dominantno prisutan PPV-Rec soj. Nakon samo nekoliko godina od potvrde prisustva rekombinantnih izolata u Srbiji (Glasa et al., 2005) i prve studije prisustva i raširenosti ovog soja (Jevremović, 2008), rezultati pokazuju da je ovaj soj značajno prisutan u zasadima šljive i kajsije. PPV-Rec soj je ustanovljen tek 2004. godine zahvaljujući razvoju molekularnih metoda karakterizacije. Istraživanja koja su u Srbiji ranije sprovođena serološkim metodama su ukazivala samo na prisustvo PPV-M i PPV-D izolata (Dulić, 2003; Paunović i Jevremović, 2003). Visok procenat zastupljenosti rekombinantnog soja potvrđuje ranije pretpostavke o njegovom dugogodišnjem prisustvu na teritoriji Srbije (Jevremović, 2008). Glasa et al., (2005) su na bazi analize nekoliko PPV-Rec izolata iz Srbije izneli hipotezu da ovaj soj potiče sa teritorije bivše Jugoslavije. Široka rasprostranjenost rekombinantnih izolata je rezultat njihovog uspešnog prilagođavanja uslovima u prirodi i vrlo efikasnog mehanizma širenja. Sa 26,3% prisustva, PPV-D soj zauzima drugo mesto po zastupljenosti u zasadima šljive i kajsije u Srbiji. U ranije sprovedenom istraživanju, Jevremović (2008) navodi približan procenat zastupljenosti PPV-D soja u uzorcima šljive i kajsije -23,8%. PPV-M soj je tokom sprovedenih ispitivanja utvrđen u svega 5,4% uzoraka, što ga stavlja na poslednje mesto po zastupljenosti kod šljive i kajsije u Srbiji. PPV- M soj se u literaturi označava kao soj koji se u zasadima brzo širi, pre svega kod breskve (Quiot et al., 1995; Dallot et al., 1998, 2004). Rezultati ove disertacije pokazuju da je kod kajsije i šljive u Srbiji, PPV-M soj potpuno potisnut od strane druga dva utvrđena soja. DISKUSIJA 82 6.1.2. Sojevi virusa šarke u zasadima šljive Rezultati ispitivanja pokazuju da su sva tri soja virusa šarke prisutna u uzorcima šljive. Dominantno je zastupljen PPV-Rec soj (53,5%), što potvrđuje rezultate ranijih istraživanja (Jevremović, 2008). Visok procenat zastupljenosti rekombinantnog soja potvrđuje pretpostavke o njegovom dugom prisustvu u zasadima šljive u Srbiji. Pored Srbije, PPV-Rec izolati na šljivi su potvrđeni u još 14 zemalja, ali za svega nekoliko zemalja postoje podaci o njegovoj raširenosti. U Bosni i Hercegovini je PPV-Rec utvrđen u 29% ispitivanih uzoraka šljive (Matić et al., 2006). Nedavnim istraživanjima, Jevremović et al., (2010) su u 87% analiziranih uzoraka šljive iz BiH potvrdili prisustvo rekombinantnog soja. U Bugarskoj, PPV- Rec soj je zastupljen 18%, a u Slovačkoj 49% (Dallot et al., 2008). Zagrai et al., (2010) navode da je PPV-Rec soj u Rumuniji prisutan u niskom procentu (14%). Visok procenat zastupljenosti PPV-Rec soja kod šljive je utvrđen i u Crnoj Gori (Viršček-Marn et al., 2012). Tokom istraživanja raširenosti sojeva šarke u Češkoj, Polak i Kominek (2009) nisu potvrdili prisustvo PPV-Rec soja u uzorcima šljive (P. domestica), već samo u 3% uzoraka dženarike. Drugi soj po zastupljenosti u zasadima šljive u Srbiji je PPV-D soj (27,9%). Ovaj soj je prevalentan u zemljama zapadne i centralne Evrope. Dominantno je prisutan u zasadima u Austriji (89%), Češkoj (95%), Nemačkoj, Poljskoj i Rumuniji (73%) (Polak i Kominek, 2009; Malinowski, 2006; Jaraush, 2006, Zagrai et al., 2010). U literaturi se navodi da je PPV-D soj neepidemični soj, ali obimna istraživanja koja su sprovedena u Češkoj ukazuju da i ovaj soj može izazvati epidemije kod šljive i dženarike (Polak, 2002; Polak i Kominek, 2009). PPV-M soj je utvrđen u svega 5,4% uzoraka šljive. U odnosu na ranije saopštene podatke o 23,5% zastupljenosti kod šljive (Jevremović, 2008), ovo je oko 4 puta manja zastupljenost PPV-M soja. Sa povećanjem broja analiziranih uzoraka šljive došlo je do smanjenja udela PPV-M soja, dok je povećan udeo PPV-Rec soja. PPV-M soj se u Srbiji uglavnom vezuje za breskvu gde je dominantno prisutan sa 99% (Jevremović, 2008). DISKUSIJA 83 Kod šljive su utvrđene i mešane infekcije kod 13,2% uzoraka. Dominantan je broj uzoraka gde su u mešanoj infekciji utvrđeni PPV-D i PPV-Rec soj. Po prvi put je potvrđena infekcija stabla šljive sa sva tri ispitivana soja PPV (PPV-M, PPV-D i PPV-Rec). Ovakva trostruka prirodna infekcija sojevima PPV u prirodi do sada nije opisana u literaturi. Mešane infekcije predstavljaju preduslov za pojavu novih rekombinanata i šljiva predstavlja „idealnog“ domaćina za ispoljavanje ovog fenomena. Dobijeni rezultati pokazuju da su PPV-Rec i PPV-D soj u Srbiji veoma dobro adaptirani na ovu Prunus vrstu i da su gotovo potpuno potisnuli PPV-M soj iz zasada šljive. Visok procenat zaraze šljive ovim sojevima ukazuje na njihovo dugotrajno prisustvo u zasadima, kao i postojanje kompeticije između ova dva soja, gde prezentovani rezultati pokazuju „superiornost“ PPV-Rec soja. 6.1.3. Sojevi virusa šarke u zasadima kajsije Broj analiziranih uzoraka kajsije je relativno mali (20 uzoraka), ali odnos uzoraka šljiva/kajsija odgovara njihovoj zastupljenosti u zasadima u Srbiji. U analiziranim uzorcima dominantno je utvrđen PPV-Rec soj (85%), dok su ostala dva soja (PPV-M i PPV-D) utvrđeni u svega po 5% uzoraka. Simptomi šarke na listovima kajsije su slabije izraženi i uglavnom lokalizovani na unutrašnje delove krune. Prilikom obilaska zasada kajsije i uzimanja uzoraka utvrđena su dva različita slučaja. Prvi, gde je u zasadima bilo veoma lako uočiti simptome na listovima i gde je procenat zaraze u zasadima visok. U drugom slučaju, u zasadima je bilo veoma teško locirati zaražena stabla jer su simptomi veoma blagi ili simptoma nije bilo. U literaturi se navodi da rekombinantni soj pre svega zaražava šljivu, dok je kod kajsije ređa pojava (Kollerova et al., 2008). Rezultati dosadašnjih istraživanja sojeva PPV u Institutu za voćarstvo – Čačak su pokazali da je PPV-Rec soj u visokom procentu prisutan kod kajsije u Srbiji. Takođe, Jevremović et al., (2010) su PPV-Rec soj detektovali u većini ispitivanih uzoraka kajsije iz Bosne i Hercegovine. Osim Srbije i Bosne i Hercegovine, PPV-Rec je na kajsiji utvrđen i u Bugarskoj, DISKUSIJA 84 Češkoj, Italiji, Mađarskoj, Slovačkoj i Pakistanu, ali bez preciznijih podataka o njegovoj raširenosti u okviru ove Prunus vrste (Glasa et al., 2004; Kollerova et al., 2006; Szathmáry i Palkovics, 2010). 6.1.4. Zastupljenost sojeva na nivou zasada Analiza rezultata rasprostranjenosti sojeva šarke na nivou zasada pokazuje veliku heterogenost ispitivanih zasada u pogledu prisustva sojeva PPV. Procentualno su najzastupljeniji zasadi u kojima je utvrđen samo PPV-Rec soj (34%) i zasadi u kojima su utvrđena dva soja: PPV-D i PPV-Rec soj (36%). Sa druge strane, u svega 1% zasada utvrđeno je prisustvo samo PPV-M soja. U više od polovine analiziranih zasada (53%) utvrđeno je prisustvo dva ili sva tri soja. Prisustvo više sojeva u zasadu predstavlja preduslov za pojavu mešanih infekcija koje potencijalno mogu dovesti do stvaranja de novo rekombinantnih izolata. 6.1.5. Geografska distribucija sojeva šarke Rezultati ispitivanja uzoraka iz 12 okruga Srbije pokazuju da ne postoji striktna geografska lokalizacija pojedinačnih sojeva šarke na teritoriji Srbije. Rekombinantni soj je utvrđen u svim ispitivanim okruzima, bilo u pojedinačnoj ili mešanim infekcijama, a dominantno je raširen u 8 okruga. PPV-D soj je takođe utvrđen u svim okruzima, a prevalentan je u 4 okruga (Nišavski, Pirotski, Rasinski i Zaječarski). Za razliku od PPV-Rec i PPV-D soja, PPV-M soj nije utvrđen u svim okruzima. Ovaj soj nije utvrđen u uzorcima iz Jablaničkog, Kosovsko-Mitrovačkog, Pirotskog i Rasinskog okruga. Ovaj rezultat ne znači da PPV-M soj nije prisutan u ovim okruzima, već da nije raširen u zasadima šljive i kajsije. Jevremović (2008) navodi da je PPV-M soj prisutan u analiziranim uzorcima breskve iz nekoliko lokaliteta u ovim okruzima. Uzrok ovakve distribucije sojeva šarke na teritoriji Srbije je promet zaraženog sadnog materijala, koji do pre nekoliko godina nije strogo kontrolisan po važećim zakonima i pravilnicima. Sadni materijal zaražen lokalnim izolatima je unošen u nove lokalitete, gde je nastavljeno širenje izolata putem lisnih vaši. Karakterističan primer za ovaj način disperzije izolata je situacija u Zaječarskom DISKUSIJA 85 okrugu, gde su u zasadima starosti 10‒27 godina utvrđeni samo PPV-D i PPV-M soj (Prilog 1). U izolovanom zasadu šljive, starosti 2 godine, potvrđene su mešane infekcije tipa PPV-D+PPV-Rec koje nesumnjivo potiču od zaraženog sadnog materijala. Kao rezultat, u skorijoj budućnosti treba očekivati PPV-Rec soj u izvesnom procentu i u ovom lokalitetu. 6.1.6. Analiza nukleotidnih sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona Tokom izrade ovog rada određene su nukleotidne sekvence 41 odabranog izolata PPV. Osim PPV-Rec (23 izolata) i PPV-D (15 izolata), radi upoređivanja su odabrana i 3 PPV-M izolata. CP region genoma Potyvirus-a (naročito N-terminalni deo), pored P1 regiona, predstavlja najvarijabilniji region genoma i iz tog razloga se sekvence ovog regiona genoma često koriste za filogenetske analize (Aleman- Verdaguer et al., 1997; Glasa et al., 2007). Osim toga, u C-terminalnom delu NIb regiona se nalazi tačka rekombinacije koja je karakteristična za PPV-Rec izolate (Glasa et al., 2004). Rekonstruisano filogenetsko stablo od 467 bp fragmenta iz C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma jasno pokazuje tri klastera izolata koji odgovaraju ispitivanim PPV sojevima. Rezultati filogenetske analize potvrđuju rezultate IC-RT-PCR tipiziranja i daju nova saznanja o izolatima/sojevima. Na rekonstruisanim filogenetskim stablima (Slike 22 i 23) nema atipičnog grupisanja pojedinačnih izolata unutar klastera, što pokazuje da su svi izolati tipični predstavnici odgovarajućih sojeva. Procenjena vrednost genetičkog diverziteta u okviru PPV-Rec izolata ispitivanih u ovom radu je niska 0,017±0,003 i viša od vrednosti za PPV-M izolate 0,012±0,004. Vrednost genetičkog diverziteta za PPV-M izolate je urađena za samo tri analizirana izolata, pa ovu vrednost treba uslovno i razmatrati. Za razliku od PPV-M i PPV-Rec izolata, proračunata vrednost genetičkog diverziteta za PPV-D izolate je viša i iznosi 0,026±0,004 (Tabela 10). DISKUSIJA 86 Rezultat TCS analize PPV-D sekvenci, kojom se procenjuje njihova genealoška povezanost, jasno pokazuje jednu mrežu sekvenci (Slika 24). Zadati limit parsimonije je 94%, gde se sekvence razlikuju u najviše 8 mutacija. Ukoliko se limit parsimonije poveća na 95%, takođe se dobija jedna mreža sekvenci (19 sekvenci), dok su van mreže sekvence izolata RS-46pl i RS-55pl (Slika nije prikazana). Pri ovom limitu parsimonije maksimalan broj mutacionih promena je 7, dok su najbliže konekcije sekvencama izolata 46pl i RS-55pl na 8 mutacija. TCS analiza pokazuje da ne postoji povezanost srodnih sekvenci sa geografskim poreklom izolata niti sa vrstom domaćina. Ovo se može objasniti distribucijom zaraženog sadnog materijala u geografski udaljene regione i okruge. TCS analiza 46 sekvenci PPV-Rec izolata takođe pokazuje jednu mrežu sekvenci (Slika 25). Pri zadatom limitu parsimonije 95%, limit konekcije izolata je 7 mutacija. Ne prikazanoj mreži koja povezuje PPV-Rec izolate zapaža se da se većina sekvenci koje se razlikuju u samo jednom nukleotidu nalaze na velikoj geografskoj udaljenosti. Tipični primeri su izolati: RS-10pl (Valjevo) i RS-47pl (Štrpce); RS-47pl (Štrpce) i RS-56pl (Šabac); RS-10pl (Valjevo) i RS-63pl (Vučje); RS-09pl (Topola) i RS-52pl (Jarinje). Povezanost sekvenci izolata koji su geografski blisko locirani uočava se kod izolata RS-32pl, RS-33ap i RS-25ap. Izolati RS-32pl i RS-33ap uzeti su sa stabala udaljenosti od 96m koja se nalaze u dva susedna voćnjaka, a oba izolata su udaljena oko 4,6 km od izolata RS-25ap. Sa povećanjem limita parsimonije na 96% i 97%, takođe se dobija jedna mreža sekvenci, ali u ovom slučaju izolat D76 nije povezan u rekonstruisanoj mreži (slike nisu prikazane). Najbliža konekcija sekvenci izolata D76 je na 7 mutacija (D115), dok je maksimalan broj mutacija 6 (96%) i 5 mutacija (97%). U poređenju sa TCS analizom sekvenci PPV-D izolata, za PPV-Rec izolate se zapaža manja divergentnost izolata. Kao i za PPV-D izolate, TCS analiza pokazuje da generalno ne postoji povezanost srodnih sekvenci sa geografskim poreklom izolata niti sa vrstom domaćina. Uzrok ovakvih rezultata filogeografske analize se takođe može objasniti nekontrolisanim širenjem izolata putem zaraženog sadnog materijala. Filogenetska analiza 90 PPV izolata iz Srbije (46 PPV-Rec, 21 PPV-D i 23 PPV-M izolata) daje slične rezultate kao i analiza 41 izolata opisanih u ovoj DISKUSIJA 87 disertaciji. Najveću vrednost genetičkog diverziteta pokazuje klaster PPV-D izolata 0,028±0,004, slede klaster PPV-M izolata 0,020±0,003 i klaster rekombinantnih izolata 0,017±0,003 (Tabela 11). U ovoj analizi vrednosti genetičkog diverziteta unutar PPV-M i PPV-Rec izolata je približna. Ovi rezultati su u potpunim saglasnostima sa ranijim istraživanjima genetičke strukture virusa šarke šljive u Srbiji (Jevremović, 2008; Jevremović et al., 2009). Više autora navodi da populacije virusa koje pokazuju veću vrednost genetičkog diverziteta treba smatra starijim (Moya i Garcia-Arenal, 1995; Azzam et al., 2000; Glasa et al., 2007; Wei et al., 2009). Na bazi ovog stanovišta populaciju izolata koji pripadaju PPV-D soju u Srbiji treba smatrati starijom u odnosu na PPV- M i PPV-Rec soj. PPV-D soj je prevalentan u okruzima koji se nalaze istočno od Velike i Južne Morave, a to su upravo lokaliteti gde je šarka po prvi put opisana u Srbiji (Josifović, 1941). Uzimajući u obzir sve ove navode, može se predpostaviti da je PPV-D soj „najstariji“ soj šarke prisutan Srbiji. Podatak da je procenjena vrednost genetičkog diverziteta PPV-Rec izolata najniža, sugeriše da ovaj soj treba smatrati „najmlađim“ i da je on proizvod rekombinacije, kao što navode i Glasa et al., (2004). Neke pojave, kao što je genetičko usko grlo (genetic bootleneck), koje se javljaju nakon pojave rekombinacije, mogu uticati na ovaj način identifikacije „starijih“ i „mlađih“ izolata i sojeva (Glasa et al., 2004). Prolazak populacije kroz usko grlo smanjuje genetičku varijabilnost unutar populacije i povećava genetičke razlike u odnosu na druge populacije. Uzimajući u obzir i ove fenomene, moguć je i potpuno drugačiji scenario da je PPV-Rec soj „predak“, a da PPV-M ili PPV-D soj predstavljaju rekombinante koji potiču od pojave rekombinacije u NIb genu (Glasa et al., 2004, Glasa et al., 2005). Vrednosti genetičkog diverziteta između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata pokazuju više vrednosti u odnosu na proračunati genetički diverzitet unutar pojedinih klastera PPV sojeva. Diverzitet između PPV-Rec i PPV-M izolata iznosi 6,7%. Ovaj rezultat je u potpunoj saglasnosti sa tipom genoma rekombinantnih i PPV-M izolata nizvodno od tačke rekombinacije. Diverzitet između PPV-D i PPV-Rec, odnosno PPV-D i PPV-M je znatno veći i iznosi 25‒27%. DISKUSIJA 88 Filogenetska analiza nukleotidnih sekvenci 46 PPV-Rec izolata iz Srbije sa još 160 dostupnih sekvenci PPV-Rec izolata iz drugih zemalja pokazala je da ne postoji specifično grupisanje izolata iz Srbije u odnosu na PPV-Rec izolate iz drugih zemalja (Slika 26). Procenjena vrednost genetičkog diverziteta u okviru svih PPV- Rec izolata iznosi 0,021±0,003. Ukoliko se posmatraju samo PPV-Rec izolati iz Srbije ova vrednost je nešto niža i iznosi 0,018±0,003, dok je za izolate iz ostalih zemalja 0,022±0,003. Ovaj rezultat je u potpunoj suprotnosti sa navodima koje su izneli Glasa et al., (2005) analizirajući 7 PPV-Rec izolata iz Srbije, gde je na bazi proračunatih vrednosti genetičkog diverziteta izneta hipoteza da je bivša Jugoslavija centar disperzije PPV-Rec izolata. Rezultati izneti u ovoj disertaciji pokazuju da je odstupanje u vrednosti genetičkog diverziteta PPV-Rec izolata iz Srbije u odnosu na izolate iz ostalih zemalja na nivou statističke greške (0,004). Šta više, rekombinantni izolati iz Srbije pokazuju nižu vrednost genetičkog diverziteta u odnosu na ostale izolate, što je potpuno suprotan rezultat u odnosu na analizu malog broja uzoraka koji navode Glasa et al., (2005). Rezultati analize PPV-Rec izolata prikazani u ovoj disertaciji potvrđuju da je za pouzdane statističke proračune i dobijanje pouzdanih rezultata potrebno analizirati veliki broj izolata. To dokazuju i rezultati analize genetičkog diverziteta PPV-M izolata iz Srbije (Tabele 10 i 11). Vrednost genetičkog diverziteta PPV-M izolata iz ove disertacije (3 izolata) je 0,012±0,004, dok je ta vrednost za 23 izolata 0,020±0,003, što je statistički značajna razlika. Analiza nukleotidnih sekvenci PPV-D izolata obuhvatala je 369 izolata, od čega 21 izolat iz Srbije. Kao i kod PPV-Rec izolata i kod filogenetske analize PPV-D izolata nema grupisanja izolata iz Srbije (Slika 27). Procenjena vrednost genetičkog diverziteta za izolate iz Srbije je 0,026±0,006. Vrednost genetičkog diverziteta za PPV-D izolate iz ostalih zemalja (348 izolata) je identična kao i vrednost genetičkog diverziteta svih analiziranih 369 PPV-D izolata i iznosi 0,031±0,006 (Tabela 13). Ukoliko se uporede vrednosti genetičkog diverziteta, uočava se da je ova vrednost za PPV-D izolate značajno viša (0,031±0,006) u odnosu na vrednost za PPV-Rec izolate (0,021±0,003). PPV-D izolati su utvrđeni u svim zemljama gde je DISKUSIJA 89 potvrđen virus šarke, dok su rekombinantni izolati utvrđeni u znatno manjem broju zemalja. 6.1.7. Analiza nukleotidnih sekvenci P3-6K1 regiona Osim C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma, kod svih odabranih izolata izvršeno je i sekvencioniranje fragmenta od 788 bp lociranog u C-ter P3, 6K1 i N- ter CI regionu genoma. N-tеr CP, P1 i P3 su najvarijabilniji regioni genoma u okviru virusa iz roda Potyvirus, dok P3 region pokazuje najmanju varijabilnost između različitih sojeva jednog virusa (Aleman-Verdaguer et al., 1997). Upoređujući sekvence kompletnog genoma virusa šarke više autora je utvrdilo da su najvarijabiniji regioni genoma: N-ter CP, P1, P3 i C-ter HC (Palkovics et al., 1993; Myrta et al., 2006). Na bazi dobijenih nukleotidnih sekvenci 41 izolata rekonstruisano je filogenetsko stablo koje jasno pokazuje tri klastera izolata koji odgovaraju PPV-M, PPV-D i PPV-Rec soju (Slika 28). Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima tipiziranja izolata IC-RT-PCR metodom i analizom sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma. Filogenetsko grupisanje izolata je nezavisno od analiziranog regiona genoma (Candresse et al., 1995; Glasa et al., 2002b). Različiti regioni genoma virusa šarke ponašaju se kao odvojene celine i razlike u sekvencama između sojeva su prisutne duž čitavog genoma, iako vrednosti genetičkog diverziteta u okviru različitih regiona nisu jednake (Glasa et al., 2002b). Vrednost genetičkog diverziteta u okviru PPV-Rec izolata je najviša 0,020±0,002, nešto manja u okviru PPV-D izolata 0,013±0,002, a najmanja u okviru PPV-M izolata 0,006±0,002 (Tabela 14). U analizi 69 PPV izolata iz Srbije (35 PPV-Rec, 18 PPV-D i 26 PPV-M izolata) dobijeni su analogni rezultati (Slika 29). Najvišu vrednost genetičkog diverziteta pokazuje klaster PPV-Rec izolata 0,019±0,002, sledi klaster PPV-D izolata 0,015±0,002 i na kraju klaster PPV-M izolata 0,006±0,001 (Tabela 15). U ovom analiziranom regionu genoma klaster PPV-M izolata pokazuje najnižu vednost genetičkog diverziteta koja je 2,5‒3 puta niža u odnosu na PPV-D i PPV-Rec izolate. DISKUSIJA 90 Kao što je i očekivano, vrednosti genetičkog diverziteta između klastera PPV-M, PPV-D i PPV-Rec izolata pokazuju više vrednosti u odnosu na proračunati genetički diverzitet unutar pojedinih klastera PPV sojeva. Diverzitet između PPV- Rec i PPV-D izolata iznosi 3,0%. Diverzitet između PPV-M i PPV-D, odnosno PPV-M i PPV-Rec je gotovo isti i iznosi 15,3‒15,5%. Filogenetska analiza P3-6K1 sekvenci 131 PPV-Rec izolata iz 12 zemalja (uključujući Srbiju) pokazala je izvesno grupisanje većine PPV-Rec izolata iz Srbije sa nekim izolatima iz Bosne i Hercegovine (Slika 30). Ovo grupisanje nije podržano visokim bootstrap vrednostima. Grupisanje izolata iz ostalih zemalja je takođe prisutno, ali bez visokih bootstrap vrednosti (osim za pojedine izolate iz Italije i Bugarske). Vrednost genetičkog diverziteta za izolate iz Srbije, kao i za izolate iz ostalih zemalja je identično (0,018±0,002) i ne daje preciznije objašnjenje parcijalnog grupisanja izolata. Filogenetska analiza P3-6K1 sekvenci 224 PPV-D izolata iz preko 20 zemalja pokazala je posebno grupisanje gotovo svih izolata iz Srbije (osim izolata RS-46pl, RS-59pl i RS-60pl) među kojima se nalazi i jedan izolat iz Slovačke (SK-226pl) (Slika 31). Bootstrap vrednost za ovu grupu izolata je svega 34%. Kao opšte pravilo, ukoliko je bootstrap vrednost za zadatu granu filogenetskog stabla 95% ili viša, onda se topologija te grane smatra ispravnom (Nei i Kumar, 2000). U brojnim filogenetskim analizama koje se sprovode u virusologiji, bootstrap vrednost koja je 75% ili viša smatra se značajnom. Vrednost genetičkog diverziteta za izolate iz Srbije, kao i za izolate iz ostalih zemalja je identična (0,014±0,002). Delimično grupisanje PPV-Rec i PPV-D izolata koje se uočava na rekonstruisanim filogenetskim stablima od 723 bp fragmenta iz C-ter P3, 6K1 i N- ter CI regiona (Slike 30 i 31) uslovljeno je pre svega manjom varijabilnošću unutar ovog regiona genoma virusa šarke u odnosu na N-ter CP region. DISKUSIJA 91 6.2. Dinamika širenja sojeva šarke šljive, prisustvo i brojnost lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu šljive Pionirska istraživanja prostornog i vremenskog širenja virusa šarke na šljivi kod nas je započeo Jordović još pre 60 godina i bila su bazirana uglavnom na ekspresiji simptoma (Jordović, 1965, 1975, 1976). U vreme ovih istraživanja, kada sojevi šarke nisu bili poznati i kada je dominantna sorta u našim voćnjacima bila Požegača, primenjivan je samo vizuelni metod inspekcije stabala u zasadu koji ne može da pruži sliku širenja pojedinih izolata (Jordović, 1975). U dvadesetogodišnjem istraživanju širenja virusa šarke u zasadu Požegače, Jordović je utvrdio je da su u prve dve godine ispitivanja zaražena stabla u zasadu bila nasumično locirana u zasadu bez ikakve regularnosti, što je ukazivalo da zaraza uglavnom potiče iz eksternih izvora. U narednim godinama, novozaražena stabla su skoncentrisana oko stabala koja su zaražena u prethodnim godinama. Slične rezultate širenja virusa šarke u kasnijim godinama infekcije navode Paunović et al., (2008) tokom ispitivanja brzine širenja virusa šarke u zasadu šljive sorte Čačanska rodna. Ispitivanja prostornog i vremenskog širenja virusa šarke šljive su sprovedena u zasadima kajsije, breskve i šljive u Španiji, Francuskoj, Grčkoj i Češkoj (Llácer et al., 1992; Gotwald et al., 1995; Dicenta et al., 1999; Martínez- Gómez et al., 2003; Dallot et al., 2004; Varveri et al., 1999; Blazek et al., 2003). Međutim, agroekološki uslovi, prisustvo i rasprostranjenost sojeva, kao i epidemiološka situacija u ovim zemljama su potpuno drugačiji od uslova u Srbiji. Ispitivanja u eksperimentalnom zasadu šljive koja su sprovedena tokom izrade ove disertacije predstavljaju prva istraživanja praćenja brzine širenja pojedinih sojeva virusa šarke bazirana na analizi sekvenci i izradi rodoslovne povezanosti izolata detektovanih u zaraženim stablima. Sprovedeni eksperiment obuhvatao je kompleksnu primenu više metoda detekcije i karakterizacije virusa šarke. Pored nezaobilaznih vizuelnih pregleda, sprovedeni su serološki ELISA test i molekularna IC-RT-PCR metoda. Sekvencioniranjem dela genoma detektovanih DISKUSIJA 92 izolata i analizom sekvenci, primenom više softvera baziranih na različitim statističkim modelima omogućeno je praćenje prostornog i vremenskog širenja pojedinačnih izolata. Prilikom planiranja eksperimenta sa ciljem utvrđivanja intenziteta širenja i kompeticije PPV-D i PPV-Rec sojeva u zasadu šljive, idealna lokacija za podizanje eksperimentalnog zasada bila bi potpuno izolovana parcela bez Prunus vrsta u bližoj i daljoj okolini. Na taj način, širenje izolata sa inokulisanih stabala ne bi bilo ometano iz eksternih izvora. U našoj zemlji, gde je virus šarke endemično prisutan, veoma je teško naći takav lokalitet. U nekim regionima (Vojvodina) postoje ovakvi izolovani lokaliteti gde se na velikim površinama gaje ratarske kulture. Međutim, u ovakvoj sredini problem bi bilo prisustvo/odsustvo populacija određenih vrsta lisnih vaši koje su opisane kao vektori šarke, čije je prisustvo esencijalno za sprovođenje eksperimenta. Lokalitet koji je odabran za podizanje eksperimentalnog zasada nalazi se u selu Ostra kod Čačka, u Moravičkom okrugu, na lokalitetu sa idealnim agroekološkim uslovima za gajenje šljive. „Otežavajuća“ okolnost pri izboru lokacije predstavljala su zaražena stabla koja se nalaze u okolini zasada. Iz tog razloga, sva stabla koja se nalaze u neposrednoj blizini zasada su uključena u istraživanje i analizirana su zajedno sa svim stablima u eksperimentalnom zasadu. Uslovi koji su vladali tokom eksperimenta predstavljaju realne uslove (endemična raširenost virusa šarke šljive) u kojima se gaji šljiva i ostale Prunus vrste u Srbiji. Obzirom da je zasad lociran u regionu sa velikim brojem stabala šljive, kajsije i ostalih domaćina šarke nesumnjivo je da su lisne vaši prisutne, a naročito vrste koje su opisane kao vektori. Radi potvrde ove pretpostavke, tokom poslednje tri godine istraživanja, praćena je dinamika brojnosti populacija lisnih vaši koje su posećivale eksperimentalni zasad. 6.2.1. Ispitivanje prisustva virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u prvoj godini istraživanja (2008. godina) Ispitivanja u prvoj godini istraživanja imala su za cilj proveru zdravstvenog statusa posađenih sadnica i ispitivanje biljaka iz okoline zasada – potencijalnih DISKUSIJA 93 izvora infekcije. Tokom vizuelnih pregleda i sprovedenog ELISA testa ni u jednom stablu u zasadu nije utvrđeno prisustvo virusa šarke šljive. Ukoliko se za podizanje zasada koristi zaražen sadni materijal, simptomi se u najvećem broju slučajeva na posađenim biljkama javljaju odmah u prvoj godini. Međutim, zaraza može biti latentna i više godina (najčešće 3 godine), a da nakon tog perioda dođe do pojave prvih simptoma. To potvrđuju i rezultati ispitivanja sadnica kajsije i breskve koje su prikazali Quiot et al., (1995). U okolini eksperimentalnog zasada su na početku ogleda locirana dva potencijalna eksterna izvora infekcije na razdaljini od 40 m (2 zaražena stabla) i 70 m (11 zaraženih od ukupno 38 stabala). Obzirom da se radi o stablima šljive koja su starosti 5 godina i koja imaju veliku lisnu masu, ona predstavljaju značajan izvor inokuluma koji se lisnim vašima može preneti u eksperimentalni zasad. Strukturu inokuluma čine 3 PPV-D i 8 PPV-Rec izolata u malom zasadu šljive, tako da je na početku eksperimenta odnos PPV-D:PPV-Rec (eksterni izvor infekcije) u malom zasadu jednak 1:2,67. Uzimajući u obzir i 2 stabla Crvene ranke odnos PPV-D:PPV- Rec u neposrednoj okolini eksperimentalnog zasada je 1:3,3. Izbor izolata za inokulaciju je sproveden analizom sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma PPV izolata iz okoline eksperimentalnog zasada i više PPV-D i PPV-Rec izolata - potencijalnih inokuluma. Za inokulaciju su odabrana dva izolata (RS-67pl i RS-68pl) koji se od svih ostalih izolata iz okoline zasada razlikuju u 5, odnosno 2 fiksne mutacije (prilozi 2 i 3). Istraživanja epidemioloških osobina odabranih izolata u kontrolisanim uslovima, koja su pokazala visoku efikasnost prenošenja oba izolata na šljivu, kajsiju i breskvu lisnim vašima Myzus persicae Sulz., potvrđuju da su odabrani adekvatni izolati za ovaj ogled (Gerard Labonne i Sylvie Dallot, lična komunikacija). Inokulacija odabranih biljaka je uspešno sprovedena, što je potvrđeno proverom prijema kalemljenja, tako da je u eksperimentalnom zasadu odnos PPV- D:PPV-Rec inokuluma (interni izvor infekcije) na početku eksperimenta 1:1. DISKUSIJA 94 6.2.2. Ispitivanje prisustva i distribucije virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u drugoj godini istraživanja (2009. godina) Vizuelnim pregledom biljaka u drugoj godini istraživanja utvrđeni su simptomi virusa šarke na listovima svih 8 inokulisanih biljaka, kao i na još tri stabla (3/3, 12/7 i 15/7). Simptomi na svim stablima su bili lokalizovani na jednoj ili dve skeletne grane i jasno izraženi. ELISA testom je potvrđeno prisustvo virusa šarke u svim stablima koja su pokazivala simptome. Karakterizacija sojeva urađena je IC-RT-PCR testom i dopunjena je analizom sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma. Upoređivanjem sekvenci detektovanih izolata sa sekvencama inokuluma utvrđeno je da nijedno od tri novozaražena stabla nije zaraženo izolatom koji potiče sa inokulisanih stabala (Prilozi 4 i 5). Ovakav rezultat je očekivan, jer su odgovarajuća stabla inokulisana prethodne godine i neophodan je izvestan period za umnožavanje virusa u domaćinu, da se razviju simptomi i biljka postane značajan izvor inokuluma. Analiza sekvenci dva PPV-Rec izolata sa novozaraženih stabala (12/7_09 i 15/7_09) i izolata iz okoline eksperimentalnog zasada pokazala je da su novoutvrđeni izolati veoma slični PPV-Rec izolatima 4/2exter, 4/11exter i RS-24pl. Ova tri izolata predstavljaju ustvari jedan isti izolat koji je utvrđen u tri stabla u okolini eksperimentalnog zasada. Izolat 15/7_09 pokazuje samo 1 nt razlike u odnosu ove eksterne izolate, dok se izolat 12/7_09 razlikuje u 3 nt (Slika 33). U jednom zaraženom stablu koegzistira veliki broj sekvencionih varijanti istog izolata, odnosno prisutan je značajan genetički diverzitet virusa šarke unutar domaćina (Jridi et al., 2006; Predajna et al., 2012). Sekvencioni varijanti mogu biti različito distribuirani u stablu, a njihov diverzitet se povećava idući od osnove stabla (deblo) ka najmlađim organima (listovi i plodovi) (Jridi et al., 2006). Pri uzorkovanju stabala u eksperimentalnom zasadu, kao i u njegovoj okolini, uzorci listova su uzimani sa svih delova krune. Na taj način detektovan je dominantan varijant izolata koji je prisutan u stablu. Ova činjenica je od posebnog značaja pri analizi izolata iz malog zasada šljive. Ova stabla su na početku eksperimenta bila DISKUSIJA 95 starosti 5 godina i sistemično zaražena virusom šarke. Pri prenošenju virusnih čestica na zdrava stabla, lisne vaši su na neperzistentan način prenele upravo onaj sekvencioni varijant koji je prisutan u listu na kome se lisna vaš hranila ili samo izvršila probne ubode koji su dovoljni da virus dospe u stilet. Uzimajući u obzir sve ove navode, sa velikom verovatnoćom se može tvrditi da izvor zaraze stabala 12/7 i 15/7 predstavljaju stabla sorte Stenley 4/2, 4/11 iz obližnjeg malog zasada šljive ili stablo Crvene ranke (RS-24pl) (Slika 18, šema 2). Analizirani PPV-D izolati pokazuju znatno veću divergentnost. Novootkriveni izolat 3/3_09 ne potiče sa inokulisanih stabala (13 nt razlike), niti sa stabala iz obližnjeg malog zasada (po 19 nt razlike) (Slika 34). Postoje dva moguća izvora zaraze ovim PPV-D izolatom. Prvi, da je stablo 3/3 bilo latentno zaraženo sa PPV (zaražen sadni materijal), pri čemi je infekcija bila lokalizovana koja nije utvrđena ELISA testom, a simptomi su se ispoljili tek nakon godinu dana. I drugi, da izvor zaraze potiče sa nekog nepoznatog stabla koje se nalazi na većoj udaljenosti od eksperimentalnog zasada. Pojava prenošenja PPV na veće udaljenosti odavno je poznata, a to potvrđuju i istraživanja u Francuskoj (Labonne i Dallot, 2006). Ispitivanje prisustva vrsta i brojnosti lisnih vaši koje su posećivale eksperimentalni zasad pokazuje značajna kolebanja brojnosti populacija lisnih vaši tokom vegetacionog perioda. Jasno su izražena dva pika brojnosti (prolećni i jesenji), pri čemu je brojnost vrsta koje su opisane kao vektori gotovo dvostruka u prolećnom, negu u odnosu na jesenji pik (Grafikon 7). Tokom 2009. godine najveću brojnost su imale vrste iz roda Aphis, koje su značajni vektori PPV. 6.2.3. Ispitivanje širenja virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u trećoj godini istraživanja (2010. godina) U trećoj godini istraživanja utvrđeno je 20 stabala sa simptomima PPV. Ocena simptoma je varirala od 1‒4, odnosno od stabala sa 2‒3 listа sа simptоmimа, do stabala sa simptоmimа nа listоvima nа kоmplеtnој kruni. Iako je DISKUSIJA 96 do zaraze većine stabala došlo u prethodnoj godini postoji velika varijabilnost u intenzitetu i izgledu simptoma (Tabela 21). Ova varijabilnost nije uslovljena sortom jer se radi o istoj sorti (Čačanska lepotica), niti sojem virusa (Tabela 22). U odnosu na 2009. godinu kada su utvrđena samo 3 stabla zaražena sa PPV, tokom 2010. godine je utvđeno još 17 novozaraženih stabala, što ukupno čini 5% od svih biljaka u zasadu. Od 20 stabala, kod 2 je utvrđen PPV-D, a kod 18 PPV-Rec soj. U odnosu na prethodnu godinu broj stabala zaraženih PPV-D sojem povećan je 2 puta, dok je broj stabala sa PPV-Rec sojem uvećan 9 puta. Analiza sekvenci C-tеr NIb―N-tеr CP regiona genoma novozaraženih stabala i sekvenci izolata inokuluma pokazuje da nijedno od novozaraženih stabala nije zaraženo izolatom sa inokulisanih stabala (Prilozi 7 i 8). Analiza sekvenci PPV-Rec izolata sa novozaraženih stabala i izolata iz okoline eksperimentalnog zasada ukazuje na postojanje divergentnosti detektovanih izolata (Slika 36). TCS analiza ukazuje na povezanost nt sekvenci izolata i nekoliko mogućih izvora infekcije. Izolat 15/15_10 ima 100% identičnu nukleotidnu sekvencu sa izolatima 2/8exter i 4/13exter što nesumnjivo potvrđuje da potiče sa nekog od ova dva stabla. Izolati 7/20_10 i 6/17_10 imaju samo 1 nt razlike u odnosu na navedene izolate, što navodi na zaključak da takođe potiču sa istih ovih stabala. U pogledu divergentnosti, ovim izolatima iz eksternog izvora bliski su i izolati 6/1_10, 6/27_10 (5 nt razlike), 16/8_10 (6 nt razlike), a najveću divergentnost pokazuje izolat 7/1_10 (7 nt razlike). Izolati 15/3_10, 6/23_10, 10/24_10, 13/20_10 i 14/25_10 pokazuju 4 nt razlike; izolat 10/11_10 5 nt razlike; a izolat 5/2_10 6 nt razlike u odnosu na izolate 4/2exter, 4/11exter i RS-24pl što ukazuje da svi ovi izolati mogu poticati sa ovih stabala iz okoline eksperimentalnog zasada. Izolati 5/29_10 i 12/18_10 pokazuju 3, odnosno 5 nt razlike u odnosu na izolat 3/9exter, što ga označava kao mogući izvor infekcije. PPV-D izolati iz eksperimentalnog zasada i iz eksternih izvora pokazuju visoku divergentnost. Izolat 3/21_10 pokazuje 16 nt razlike u odnosu na izolate 4/4exter, 4/9exter i 4/12 exter. Kao i izolat 3/3_09, koji je utvrđen prethodne DISKUSIJA 97 godine, ne postoji značajna povezanost izolata 3/21_10 sa izolatima iz eksternog izvora, kao ni sa sekvencom izolata inokuluma. Tokom 2010. godine zabeležena je nešto veća brojnost uhvaćenih krilatih formi lisnih vaši u odnosu na prethodnu godinu. Međutim, brojnost vrsta koje su opisane kao vektori je znatno niža u odnosu na 2009. godinu (Grafikon 8). Pik brojnosti svih vrsta bio je u prvoj dekadi juna (prolećni pik) zahvaljujući velikoj brojnosti vrsta roda Myzocallis, naročito vrste M. boerneri čiji je domaćin hrast, a koja nije opisana kao vektor PPV. 6.2.4. Ispitivanje dinamike širenja i prostorne distribucije virusa šarke u eksperimentalnom zasadu u četvrtoj godini istraživanja (2011. godina) U poslednjoj godini istraživanja u eksperimentalnom zasadu utvrđeno je ukupno 37 zaraženih stabala (ne računajući 8 inokulisanih), što predstavlja povećanje broja zaraženih stabala od 85% u odnosu na prethodnu godinu. U 2011. godini kod ukupno 9,25% stabala u zasadu utvrđen je PPV. U vizuelnim pregledima, kao i u 2010. godini, ocena simptoma je varirala od 1‒4, odnosno od stabala sa 2‒3 listova sа simptоmimа do stabala sa simptоmimа nа kоmplеtnој kruni. Pored uobičajenih simptoma koji su do sada primećeni na listovima šljive (mozaik i prstenaste pege), po prvi put su na pojedinim stablima primećeni simptomi u vidu prosvetljavanja nerava. Prisutna je velika varijabilnost u intenzitetu simptoma, ali su na najvećem broju stabala primećeni blagi do jaki simptomi (ocena 2‒3) (Tabela 23). Obzirom na visoke temperature koje su bile prisutne tokom čitave vegetacije, simptomi su tokom jula i avgusta bili teško uočljivi na stablima gde je primećena izrazito lokalna infekcija (par listova sa simptomima). Strukturu detektovanih izolata čini 5 PPV-D izolata i 32 PPV-Rec izolata. U odnosu na prethodnu godinu broj stabala zaraženih PPV-D sojem povećan je 2,5 puta, dok je broj stabala zaraženih PPV-Rec sojem uvećan 1,8 puta. Ukoliko se DISKUSIJA 98 uporedi broj zaraženih stabala sa 2009. godinom, broj stabala zaraženih PPV-D sojem povećan je 5 puta, a broj stabala zaraženih PPV-Rec sojem povećan je 16 puta. U 2011. godini analizom stabala iz malog zasada šljive utvrđeno je prisustvo 4 stabla zaraženih PPV-D sojem i 17 stabala zaraženih PPV-Rec sojem. Broj zaraženih biljaka u malom zasadu se u periodu 2008‒2011. godina povećao 1,9 puta. Ovim povećanjem izmenjen je i odnos PPV-D:PPV-Rec u malom zasadu sa 1:2,67 u 2008. godini, na 1:4,25 u 2011. godini. Ukoliko se u analizu uključe i 2 stabla Crvene ranke odnos PPV-D:PPV-Rec (eksterni izvor infekcije) je 1:4,75. Interni izvor infekcije, koji predstavljaju inokulisana stabla PPV-D i PPV-Rec izolatima je tokom čitavog eksperimenta ostao nepromenjen 1:1. U eksperimentalnom zasadu je u 2011. godini utvrđeno 5 PPV-D izolata i 32 PPV-Rec izolata, što predstavlja odnos 1:6,4. Upoređujući podatke o broju zaraženih stabala PPV-D i PPV-Rec sojem u eksperimentalnom zasadu i njegovoj okolini primećuje se nešto efikasnije širenje PPV-Rec soja u odnosu na PPV-D soj tokom trajanja ogleda. Za donošenje konačnog zaključka o „superiornosti“ PPV-Rec soja u pogledu brzine širenja u odnosu na PPV-D soj u našim agroekološkim uslovima neophodno je sprovesti još nekoliko godina istraživanja, što je planirano i nakon izrade ove disertacije. Podaci o raširenosti sojeva virusa šarke u zasadima šljive u Srbiji koji su izneti u prvom delu rezultata disertacije, idu u prilog „superiornosti“ PPV-Rec soja koji ima skoro dvostruko veću zastupljenost u analiziranim zasadima u odnosu na PPV-D soj. TCS analiza svih sekvenci PPV-Rec izolata iz eksperimentalnog zasada, njegove okoline i izolata inokuluma detaljno pokazuje povezanost sekvenci sa tačnim pozicijama mutacionih promena između izolata (Slika 38). Po prvi put je u eksperimentalnom zasadu utvrđen izolat sa sekvencom bliskom izolatu inokuluma. Sekvenca izolata 11/20_11 se razlikuje u samo 4 nt od sekvence PPV-Rec inokuluma RS-67pl. Ono što potvrđuje da izolat 11/20_11 potiče sa inokulisanih stabala je posedovanje A na poziciji 183 i T na poziciji 188 (Prilog 10), što je upravo bila osnova za razlikovanje PPV-Rec izolata inokuluma od svih DISKUSIJA 99 ostalih izolata iz okoline eksperimentalnog zasada. Svi ostali PPV-Rec izolati poseduju T na poziciji 183 i C na poziciji 188. Analiza pokazuje da je došlo i do sekundarnog širenja izolata u zasadu. Izolat koji je utvrđen na stablu 10/8 potiče sa stabla 12/7 kod koga je zaraza utvrđena 2009. godine, dok je na stablu 10/9 potvrđen izolat sa stabla 15/15 koji je potvrđen u 2010. godini. TCS analiza je takođe pokazala visoku identičnost nekoliko nukleotidnih sekvenci PPV-Rec izolata iz 2011. godine i 2010. godine. Sekvence izolata 7/8_11, 8/8_11 i 15/1_11 pokazuju samo 2‒4 nt razlike u odnosu na izolate 15/3_10, 13/20_10, 6/23_10, 10/24_10 i 10/11_10 iz 2010. godine, što je za 2‒4 nt manje u odnosu na sličnost sa nekim izolatima iz okoline eksperimentalnog zasada. Takođe, sekvenca izolata 13/25_11 se razlikuje samo u 2 nt u odnosu na sekvencu izolata 16/8_10, a sekvenca izolata 7/3_11 u 3 nt od sekvence 12/7_09. Ova konstatacija navodi na zaključak, da infekcija kod ovih stabala koja je utvrđena 2011. godine, potiče od stabala iz samog zasada koja su zaražena u prethodne dve godine. U prilog ovoj konstataciji ide i podatak da su sva navedena stabla tokom 2010. godine bila sistemično zaražena i predstavljala odličan izvor inokuluma (Tabela 21). TCS analiza takođe pokazuje nekoliko mogućih izvora infekcije ostalih novozaraženih stabala u eksperimentalnom zasadu. Sekvence izolata 4/10_11 i 8/4_11 se razlikuju u samo 1 nt u odnosu na novootkriveni izolat 4/7exter iz malog zasada šljive, što navodi na zaključak da je on izvor infekcije ovih stabala. Sekvenca izolata 5/2_11 pokazuje 4 nt razlike u odnosu na izolate 4/10_11 i 8/4_11, odnosno 5 nt razlike u odnosu na sekvencu njihovog izvora zaraze 4/7exter. Sekvenca izolata 10/22_11 je bliska sekvencama izolata 3/8exter, 4/2exter, 4/11exter i RS-24pl iz okoline eksperimentalnog zasada (6 nt razlike). Sekvenca izolata 10/28_11 je bliska sekvencama 2/3exter, 2/4exter, 2/8exter i 4/13exter iz malog zasada šljive (4 nt razlike). Sekvence izolata 4/10_11, 8/4_11 i 5/5_11 pokazuju 6 nt razlike u odnosu na navedene eksterne izolate. U TCS analizi sekvenci PPV-D izolata iz eksperimentalnog zasada, njegove okoline i inokuluma, jasno se uočava viša varijabilnost sekvenci nego što je to slučaj sa PPV-Rec izolatima (slike 37 i 38). Nijedan od izolata iz eksperimentalnog DISKUSIJA 100 zasada ne potiče sa inokulisanih stabala. Najbliža konekcija sekvenci PPV-D izolata postoji između izolata kod stabala 3/21 i 13/3. Sekvence ovih izolata se razlikuju u 4 nt. Infekcija stabla 3/21 je potvrđena 2010. godine i simptomi su bili prisutni gotovo na čitavoj kruni stabla. Infekcija kod stabla 13/3 je potvrđena 2011. godine, što navodi na predpostavku da je njegov izvor zaraze stablo 3/21. Takođe, sličnost nukleotidnih sekvenci pokazuju i sekvence izolata 9/29_11 i 4/4exter (6 nt razlike). Sekvence ostalih izolata (3/3_09 i 3/19_11) iz eksperimentalnog zasada pokazuju veliku divergentnost u odnosu na sve ostale izolate. Sekvence izolata 3/21_10 i 3/19_11 pokazuju veliku divergentnost (15 nt razlike), iako se stabla nalaze na udaljenosti od svega 9 m. Visoke stope mutacija RNK virusa jesu posledica potrebe brze replikacije njihovog hemijski nestabilnog RNK genoma, pre nego evolutivna strategija (Drake i Holland, 1999). Visoka stopa mutacija koja se dešava pri replikaciji RNK virusa je osnovni izvor varijacija u populaciji virusa u nekom lokalitetu/oblasti ili u samom domaćinu. U svom radu, Predajna et al., (2012) navode značajnu intra-izolat varijabilnost koja je utvrđena u stablu šljive starosti 7 godina. Od 105 pojedinačnih PPV-M sekvenci utvrdili su postojanje 51 haplotipa, a najveća varijabilnost je utvrđena u listovima, gde maksimalna razlika u sekvenci haplotipova iznosi 9 nt. Sličan rezultat navode i Jridi et al., (2006), gde je u stablu breskve (starosti 13 godina zaraženom PPV-M izolatom) utvrđeno 33 haplotipova sa maksimalnom razlikom sekvenci od 15 nt. U oba rada, u rekonstruisanim mrežama povezanosti haplotipova primenom TSC programa prisutni su i nedostajući (hipotetički) haplotipovi. Genetički diverzitet PPV-D i PPV-Rec sojeva u jednom stablu do sada nije opisan u literaturi. Obzirom na postojanje značajne intra-izolat varijabilnosti virusa koji se na neperzistentan prenosi lisnim vašima, veoma je teško decidno utvrditi egzaktne puteve prostornog širenja pojedinačnih izolata. Još uvek ne postoje podaci o ispitivanjima divergentnosti sekvenci izolata domaćina i divergentnosti sekvenci zaražene biljke Prunus vrste, koja je zaražna putem lisnih vaši u kontrolisanim uslovima. Istraživanja koja su sprovedena u eksperimentalnom zasadu šljive su pokazala da osnovni izvor zaraze u prvim godinama od zasnivanja zasada DISKUSIJA 101 predstavljaju zaražena stabla koja se nalaze u okolini zasada, što potvrđuje navode Jordovića (1975). Novozaražena stabla su nasumično raspoređena po zasadu bez ikakvog pravila, što je uslovljeno samim letom lisnih vaši. U četvrtoj godini po sadnji je došlo do pojave sekundarnih infekcija u zasadu, odnosno prenošenja zaraze sa stabala koja su zaražena u prethodnim godinama. Sa vegetativnim porastom stabala lisna masa se znatno povećava i predstavlja ogroman izvor inokuluma, naročito kod sistemično zaraženih stabala. Hraneći se, a što je još značajnije vršeći probne ubode, lisne vaši prenose virus šarke na stabla u zasadu ili van njega. Gotwald et al., (1995) navode da lisne vaši, koje u stiletu nose virus šarke radije sleću na stabla breskve koja su nešto udaljenija, nego na susedna stabla u zasadu. Pojava sekundarnih infekcija je potvrđena tokom izrade ove disertacije, ali one ne potiču sa stabala koje se nalaze u neposrednoj blizini, već sa nešto udaljenijih stabala. Rezultati ove disertacije takođe pokazuju, da do veoma efikasnog prenošenja PPV-Rec i PPV-D sojeva virusa putem lisnih vaši dolazi iz susednog voćnjaka koji se nalazi na 70 m od ispitivanog zasada, što je u skladu sa novodima Labonne i Dallot (2006). Brojnost uhvaćenih lisnih vaši primenom Sticky-shoot metode je tokom 2011. godine bila na izrazito niskom nivou, 2 puta niža u odnosu na 2009. godinu i 4 puta niža u odnosu na 2010. godinu. Pikovi brojnosti nisu bili jasno izraženi kao prethodnih godina (Grafikon 9). Tokom sve tri godine ispitivanja utvrđen je veliki broj vrsta vrsta lisnih vaši koje se javljaju na šljivi (prilozi 6, 9 i 13), znatno više nego u navodima Petrović- Obradović (2003). Ispitivanja su pokazala da su vrste iz roda Aphis (A. craccivora Koch., A. spiraecola Pag., A. fabae Scop., i A. gossypii Glover) najbrojnije vrste lisnih vaši koje posećuju zasad šljive (uzimajući u obzir samo vektore). Osim ovih vrsta, u manjem procentu je potvrđeno i prisustvo: Brachycaudus helichrysi Kalt., B. cardui L., Hyalopterus pruni Geofrr., Macrosiphum rosae L., Metopolophium dirhodum Walk., Myzus persicae Sulz., Phorodon humuli Schr. i Rhopalosiphum padi L. Sve navedene vrste su u literaturi opisane kao prenosioci virusa šarke. Iako prikazani rezultati prikazuju niske brojčane vrednosti uhvaćenih lisnih vaši u eksperimentalnom zasadu, treba imati u vidu da su one uhvaćene na samo 40 DISKUSIJA 102 listova u celom zasadu. Prema procenama koje se navode u literaturi, jedno stablo u toku godine poseti između 50.000 i 300.000 lisnih vaši (loc. cit. Gianessi et al., 2002). Tretiranje zasada pesticidima rešava problem vaši koje su u zasadu, ali one jedinke koje u zasad dolete iz okoline potencijalno i jednim probnim ubodom mogu preneti virus. Redovna primena pesticida smanjuje brojnost lisnih vaši u zasadu, ali nema velikog uticaja na sprečavanje širenja virusa šarke šljive (Labonne Gerard, Dallot Sylvie i Candresse Thierry, lična komunikacija). Osim teoretskog značaja, prikazani rezultati ispitivanja brojnosti populacija lisnih vaši imaju i praktični značaj, jer mogu poslužiti za planiranje optimalnih rokova primene pesticida u cilju njihovog suzbijanja. ZAKLJUČAK 103 7. ZАKLJUČАK Rezultati prikazani u uvoj disertaciji donose nova saznanja o rasprostranjenosti PPV-D i PPV-Rec sojeva virusa šarke šljive u zasadima šljive i kajsije u Srbiji, kao i osnovnim karakteristikama širenja ovih sojeva u zasadu šljive u početnim godinama infekcije. Istraživanja su potvrdila široku rasprostranjenost virusa šarke u ispitivanim regionima gajenja koštičavih voćaka. Zahvaljujući primenjenoj metodologiji izvršena je uspešna karakterizacija prisutnih sojeva u ispitivanim uzorcima. Kod obe ispitivane gajene kulture (šljiva i kajsija) potvrđeno je prisustvo sva tri soja virusa šarke. U više od polovine ispitivanih uzoraka (55,7%) utvrđeno je prisustvo PPV-Rec soja, pa se obzirom na strukturu gajenja koštičavog voća kod nas, može zaključiti da je rekombinantni soj najrasprostranjeniji soj virusa šarke u Srbiji. U Srbiji su kod šljive značajno rašireni PPV-Rec (53,5%) i PPV-D (27,9%) sojevi, dok je PPV-M soj utvrđen kod svega 5,4% uzoraka. Kod šljive je utvrđen i značajan procenat mešanih infekcija (13,2%), gde dominiraju uzorci istovremeno zaraženi PPV-D i PPV-Rec sojem. Po prvi put je potvrđeno prisustvo PPV-M, PPV-D i PPV-Rec soja u jednom stablu u prirodi. U relativno malom ispitivanom broju uzoraka kajsije dominantno je utvrđeno prisustvo PPV-Rec soja (85%), što potvrđuje dobru adaptabilnost rekombinantnog soja ovoj Prunus vrsti. 7 ZAKLJUČAK 104 Analiza geografske rasprostranjenosti sojeva pokazala je da je u centralnim i zapadnim delovima Srbije dominantno prisutan PPV-Rec soj, dok u jugoistočnim delovima dominira PPV-D soj. Sprovedena filogenetska i analiza genealoške povezanosti sekvenci je pokazala da su ispitivani izolati tipični predstavnici odgovarajućeg soja i da ne postoji povezanost srodnih sekvenci sa geografskim poreklom izolata niti sa vrstom domaćina. Uzrok ovakvih rezultata filogeografske analize se može objasniti nekontrolisanim širenjem izolata putem zaraženog sadnog materijala u ranijem višegodišnjem periodu. Zahvaljujući kompleksnoj primeni vizuelnih pregleda, seroloških i molekularnih testova, koji su dopunjeni analizom sekvenci hipervarijabilnog regiona genoma PPV i genealoškom analizom, dobijeni su podaci o karakteristikama širenja PPV-Rec i PPV-D sojeva šarke u eksperimentalnom zasadu šljive. Ispitivanja su pokazala da do zaraze stabala u novozasnovanim zasadima najpre dolazi putem prenošenja virusa lisnim vašima sa okolnih zaraženih stabala, i pored postojanja izvora infekcije u samom zasadu. U novopodignutom zasadu utvrđena su stabla zaražena PPV-Rec i PPV-D izolatima virusa šarke iz okolnog zaraženog zasada, ali i sa nepoznatih stabala u okolini. U periodu od 4 godine, lisnim vašima je zaraženo 9,25% od ukupnog broja biljaka u zasadu. Do pojave sekundarnih infekcija u zasadu dolazi u kasnijim godinama, sa vegetativnim porastom stabala i sistemičnom infekcijom, ali bez pravilnosti u lokaciji novozaraženih stabala u odnosu na izvor infekcije. U četvrtoj godini po sadnji u eksperimentalnom zasadu je kod 5 stabala utvrđen PPV-D soj, a kod 32 stabla PPV-Rec soj. Uzimajući u obzir broj stabala zaraženih PPV-D i PPV-Rec sojevima u neposrednoj okolini zasada, dobijeni rezultati pokazuju nešto efikasnije širenje PPV-Rec soja u odnosu na PPV-D soj, ali će se konačan sud o ovoj hipotezi doneti nakon još nekoliko godina ispitivanja. Istraživanja su dopunjena i rezultatima o prisustvu vrsta i brojnosti lisnih vaši u zasadu šljive. Utvrđeno je da oko 50 različitih vrsta lisnih vaši posećuje zasad šljive, od kojih je značajan udeo vrsta koje su potvrđeni vektori PPV. Od vrsta ZAKLJUČAK 105 koje su opisane kao vektori, u zasadu je potvrđeno prisustvo: Aphis craccivora Koch., A. spiraecola Pag., A. fabae Scop., A. gossypii Glover, Brachicaudus helicrysi Kalt., B. cardui L., Hyalopterus pruni Geofrr., Macrosiphum rosae L., Metopolophium dirhodum Walk., Myzus persicae Sulz., Phorodon humuli Schr. i Rhopalosiphum padi L. Brojnost populacija lisnih vaši tokom ispitivanog perioda je značajno varirala. Termini najveće brojnosti su: maj-jun (u prolećnom periodu) i avgust- septembar (u jesenjem periodu). Sa stanovišta prakse, podaci o terminima najveće brojnosti populacija lisnih vaši su značajni radi planiranja optimalnih rokova primene pesticida. LITERATURA 106 8. LIТЕRАТURА Anonymous (2001): Certification scheme for almond, apricot, peach and plum. OEPP/EPPO Bulletin 31: 463‒478. Anonymous (2004): Plum pox potyvirus. Diagnostic protocols for regulated pests. OEPP/EPPO Bulletin 34: 247‒256. Adams M.J., Zerbini F.M., French R., Rabenstein F., Stenger D.C., Valkonen J.P.T. (2011): Potyviridae. In: King A.M.Q. Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J., (eds.). Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses. Ninth Repport of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier/Academic Press, London, UK: 1069‒1089. Aleman-Verdaguer., Goudou-Urbino C., Dubern J., Beachy R.N., Fauquet C. (1997): Analysis of the sequence diversity of P1, HC, P3 NIb and CP genomic regions of several Yam mosaic potyvirus isolates: implications for the intraspecies molecular diversity of potyviruses. Journal of General Virology 78: 1253‒ 1264. Atanasoff D. (1932). Plum pox. A new virus disease. Yearbook University of Sofia, Faculty of Agriculture 11: 49‒69. Avinent L., Hermoso de Mendosa A., Llacer G. (1993): Comparison of sampling methods to evaluate aphid populations (Homoptera Aphidinae) alighting on apricot trees. Agronomie 13: 609‒613. Azzam O., Arboleda M., Umadhay K.M.L., de los Reyes J.B., Cruz F.S., Mackenzie A., McNally K.L. (2000): Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-endemic and outbreak rice sites. Archives of Virology 145: 2643‒2657. 8 LITERATURA 107 Bhardway S.V., Thakur P.D., Kohosla K., Sharma D.R. (1995): Detecton of Plum pox virus in India. Acta Horticulturae 386: 237‒240. Blanc S., Lopez-Moya J.J., Wang R., Garcia-Lampasona S., Thornbury D., Pirone T. (1997): A specific interaction between coat protein and helper component correlates with aphid transmission of a potyvirus. Virology 231: 141‒147. Blazek J., Paprstein F., Karesová R. (2003): Spread of Plum pox virus in new plum orchards of the Czech Republic and cultivar resistance. Acta Horticulturae 622: 359‒364. Blystad D.R., Haugslien S., Orstad K., Munthe T., Knudsen R., Hjeltnes S.H. (2007): An outbreak of Plum pox virus in Norway. Acta Horticulturae 734: 93‒99. Boscia D., Zeramdini H., Cambra M., Potere O., Gorris M.T., Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (1997): Production and characterization of a monoclonal antibody specific to the M serotype of Plum pox potyvirus. European Journal of Plant Pathology 103: 477‒480. Bodin M., Glasa M., Verger D., Costes E., Dosba F. (2003): Distribution of the sour cherry isolate of Plum pox virus in infected Prunus rootstocks. Journal of Phytopathology 151: 625‒630. Boulila M., Briard P., Ravelonandro M. (2004): Plum pox virus in Tunsia: Sources and preliminary characteristics. Acta Horticulturae 657: 189‒193. Cambra M., Asensio M., Gorris M.T., Perez E., Camarasa E., Garcia J.A., Moya J.J., Lopez-Abela D., Vela C., Sanz A. (1994): Detection of Plum pox potyvirus using monoclonal antibodies to structural and non-structural proteins. OEPP/EPPO Bulletin 24: 585‒595. Cambra M., Gorris M.T., Marroquín C., Román M.P., Olmos A., Martínez M.C., Hermoso de Mendoza A., López A., Navarro L. (2000): Incidence and epidemiology of Citrus tristeza virus in the Valencian Community of Spain. Virus Research 71: 75‒85. Cambra M., Capote N., Myrta A., Llácer G. (2006): Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. OEPP/EPPO Bulletin 36: 202‒204. Candresse T., Macquaire G., Lanne M., Bousalem M., Quiot- Douine L., Quiot J.B., Dunez J. (1995): Analysis of Plum pox virus variability and development of strain-specific PCR assays. Acta Horticulturae 386, 357‒369. LITERATURA 108 Candresse T., Cambra M., Dallot S., Lanneau M., Asensio M., Gorris M.T., Revers F., Macquaire G., Olmos A., Boscia D., Quiot J.B., Dunez J. (1998): Comparison of monoclonal antibodies and polymerase chain reaction assays for the typing of isolates belonging to the M and D serotypes of Plum pox potyvirus. Phytopathology 88: 198‒204. Candresse T., Svanella-Dumas L., Gentit P., Caglayan K., Cevik B. (2007): First report of the presence of Plum pox virus Rec strain in Turkey. Plant Disease 91: 331 Cervera M.T., Riechmann J.L., Martin M.T., Garcia J.A. (1993): 3'-Terminal sequence of the Plum pox virus PS and ŏ6 isolates: evidence for RNA recombination within the Potyvirus group. Journal of General Virology 74. 329‒334. Clark M.F., Adams A.N. (1977): Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology 34: 475‒483. Clement M., Posada D., Crandall K. (2000): TCS: a computer program to estimate gene genealogies. Molecular Ecology 9, 10: 1657‒1660. Crescenzi A., Nuzzaci M., Levy L., Piazzolla P., Hadidi A. (1995): Plum pox virus (PPV) in sweet cherry. Acta horticulturae 386: 219‒225. Crescenzi A., d'Aquino L., Comes S., Nuzzaci M., Oiazzola P. (1997): Characterization of the sweet cherry isolate of Plum pox virus. Plant Disease 81 (7): 711‒714. Dal Zotto A., Ortego J.M., Raigón J.M., Caloggero S., Rossini M., Ducasse D.A. (2006): First Report in Argentina of Plum pox virus causing Sharka disease in Prunus. Plant Disease 90: 523. Dallot S., Labonne G., Boeglin M., Quiot-Douine L., Quiot J.B., Candresse, T. (1998): Peculiar Plum pox potyvirus D-populations are epidemic in peach trees. Acta Horticulturae 472: 355‒366. Dallot S., Gottwald T., Labonne G., Quiot J.B. (2004): Factors affecting the spread of Plum pox virus strain M in peach orchards subjected to roguing in France. Phytopathology 94: 1390‒1398. LITERATURA 109 Dallot S., Kamenova V., Glasa M., Pittnerova S., Kominek P., Paunović S., Jevremović D., Virscek-Marn M., Mavric Plesko I., Milusheva S. (2008): Prevalence and genetic structure of PPV-M in six European countries. Acta Horticulturae 781: 227‒234. Dallot S., Glasa M., Jevremovic D., Kamenova I., Paunovic S., Labonne G. (2011): Mediterranean and central-eastern European countries host viruses of two different clades of Plum pox virus strain M. Archives of virology 156, 3: 539‒ 542. Damsteegt V., Waterworth H.E., Mink G.I., Howell W.E., Levy L. (1997): Prunus tomentosa as a diagnostic host for detection of Plum pox virus and other Prunus viruses. Plant Disease 81: 329‒332. Damsteegt V.D., Scorza R.A., Stone A.L., Schneider W.L., Webb K., Demuth M., Gildow F.E. (2007): Prunus host range of Plum pox virus (PPV) in the United States by aphid and graft inoculation. Plant Disease 91: 18‒23. Davis K., Rodoni B., Knox C., Sarec R., Moran J. (2002): Detection of Plum pox potyvirus in illegally imported plums intercepted at Sydney International Airport. Australasian Plant Pathology 31, 3: 313‒314. Deborre G., Maiss E., Jelkmann W. (1995): Biological and molecular investigations of several Plum pox virus (PPV) isolates. Acta Horticulturae 386: 253‒262. Desvignes J.C. (1999): Virus diseases of fruit trees. Centre Technique Interprofessoinenel des Fruits et Legumes, Paris, France. Dicenta F., Pérez-Campoy P.J., Martínez-Gómez P., García-Brunton J., Botella M.A. (1999): Natural spread of sharka disease in orchards in Murcia (Spain). Acta Horticulturae 488: 775–778. Dombrovsky A., Huet H., Chejanovsky N., Raccah B. (2005): Aphid transmission of a Potyvirus depends on suitability of the helper component and the N terminus of the coat protein. Archives of Virology 150: 287–298. Drake J.W., Holland J.J. (1999): Mutation rates among RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America 96: 13910– 13913. Dulić I., Šarić A. (1986): Outbreak of Plum pox virus on peaches in Yugoslavia. Acta Horticulturae 193: 161‒165. LITERATURA 110 Dulić-Marković I. (2003): Plum pox virus strains in Yugoslavia. In: Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (eds.). Virus and Virus-Like Diseases of Stone Fruits, with Particular Reference to the Mediterranean Region. Option Méditerranéennes Sér. B/No. 45. Bari, Italy. Mediterranean Agronomic Institute: 61–63. FAOSTAT (2011). http://faostat.fao.org/default.aspx. Gentit P. (2006): Detection of Plum pox virus: biological methods. OEPP/EPPO Bulletin 36: 251‒253. Gianessi L.P., Silvers C.S., Sankula S., Carpenter J.E. (2002): Plant biotechnology: current and potential impact for improving pest management in U.S. agriculture. An analysis of 40 case studies. NCFAP, Washington, USA. Gildow F., Damsteegt V., Stone A., Schneider W., Luster D., Levy L. (2004): Plum pox in North America: Identification of aphid vectors and potential role for fruit in virus spread. Phytopathology 94: 868‒874. Glasa M., Kúdela O., Marie-Jeanne V., Quiot J.B. (2001): Evidence of a naturally occurring recombinant isolate of Plum pox virus from Slovakia. Plant Disease 85: 920. Glasa M., Marie-Jeanne V., Labonne G., Šubr Z., Kúdela O., Quiot J.B. (2002a): A natural population of recombinant Plum pox virus is viable and competitive under field conditions. European Journal of Plant Pathology 108: 843‒853. Glasa M., Marie-Jeanne V., Moury B., Kúdela O., Quiot J.B. (2002b): Molecular variability of the P3–6K1 genomic region among geographically and biologically distinct isolates of Plum pox virus. Archives of Virology 147: 563‒575. Glasa M., Palkovics L., Komínek P., Labonne G., Pittnerová S., Kúdela O., Candresse T., Šubr Z. (2004): Geographically and temporally distant natural recombinant isolates of Plum pox virus are genetically very similar and form a unique PPV subgroup. Journal of General Virology 85: 2671‒2681. Glasa M., Candresse T. (2005): Plum pox virus. In: Jones A.T., Robinson D.J., Boonham N., Mumford R. (eds.). CMI/AAB Description of plant viruses no. 410. Association of Applied Biologists, Wellesbourne, UK. http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=410. LITERATURA 111 Glasa M., Paunović S., Jevremović D., Myrta A., Pittnerova S., Candresse T. (2005): Analysis of recombinant Plum pox virus (PPV) isolates from Serbia confirms genetic homogeneity and supports a regional origin for the PPV-Rec subgroup. Archives of Virology 150, 10: 2051‒2060. Glasa M., Svoboda J., Novakova S. (2007): Analysis of molecular and biological variability of Zuccini yellow mosaic virus isolates from Slovakia and Chech Republic. Virus Genes 35: 415‒421. Glasa M., Malinowski T., Predajňa L., Pupola N., Dekena D., Michalczuk L., Candresse T. (2011): Sequence variability, recombination analysis, and specific detection of the W strain of Plum pox virus. Phytopathology 101, 8: 980‒ 985. Gottwald T.R., Avinent L., Llacer G., Hermoso de Mendosa A., Cambra M. (1995): Analysis of the spatial spread of sharka (Plum pox virus) in apricot and peach orchards in eastern Spain. Plant Disease 79: 266‒278. Hristov A. (1965): Reaction of thirty plum varieties infected by Plum pox virus. Horticultural and Viticultural Sciences II, 5: 573‒580. Isac M., Preda S., Marcu M. (1998): Aphid species - vectors of Plum pox virus. Acta Virologica 42: 233‒234. Isac M., Zagrai I. (2006): Plum pox virus (PPV) in Romania. EPPO/OEPP Bulletin 36: 213. James D., Varga A. (2005): Nucleotide sequence analysis of Plum pox virus isolate W3174: Evidence of a new strain. Virus Research 110: 143‒150. Jaraush W. (2006): Plum pox virus (PPV) in Germany. OEPP/EPPO Bulletin 36: 209. Jevremović D., Dallot S., Paunović S. (2007): Typing, distribution and genetic structure of Plum pox virus in Serbia. European meeting on plum pox 2007, Pula, Croatia: 11. Jevremović D. (2008): Molekularna karakterizacija i genetička struktura izolata virusa šarke šljive (Plum pox virus) u Srbiji. Magistarska teza. Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu. Beograd-Zemun. LITERATURA 112 Jevremović D., Paunović S., Dallot S. (2009): Assesment of the genetic structure of Plum pox virus (PPV) in Serbia. 21st International conference on virus and other graft transmissible diseases of fruit crops, July 5-10, Neustadt, Germany. Berichte aus dem Julius Kuhn-Institut 148: 73. Jevremović D., Delić D., Lolić B., Paunović S. (2010): Assesment of the diversity of PPV-Rec strain in Bosnia and Herzegovina. SharCo Research Workshop, September 6-7, Sofia, Bulgaria. Book of abstracts: 24. Jordović M. (1961): Nove indikator biljke pogodne za ispitivanje šarke šljive. Zaštita bilja 63‒64: 100‒103. Jordović M., Janda LJ. (1963): Morfološko-anatomske i hemijske promene na plodovima nekih sorata šljiva zaraženih virusom šarke šljive. Zaštita bilja 76: 653‒670. Jordović M. (1965): The rate of spread šarka (plum pox) virus on some plum varieties in nature. Zaštita bilja 85‒88: 353‒355. Jordović M. (1975): Study of sharka spread pattern in some plum orchards. Acta Horticulturae 44: 147‒154. Jordović M (1976): Situation of sharka disease on some experimental plum orchards after twenty years of the investigation. Acta Horticulturae 67: 159‒163. Josifović M. (1941): Bolesti voćaka. Srpska kraljevska akademija. Beograd. Jridi C., Martin J.F., Marie-Jeanne V., Labonne G., Blanc S. (2006): Distinct viral populations differentiate and evolve independently in a single perennial host plant. Journal of Virology 80, 5: 2349‒2357. Kalashyan Y.A., Bilkey N.D., Verderevskaya T.D., Rubina E.V. (1994): Plum pox potyvirus on sour cherry in Moldova. OEPP/EPPO Bulletin 24: 645‒650. Kamenova I., Milusheva S. (2005): Sharka disease in Bulgaria: past, present and future. Biotechnology and Biotechnology Equipement, 19/special issue: 22‒ 40. Kamenova I., Dallot S., Bozkova V., Milusheva S. (2011): First report of the Plum pox virus recombinant strain on peach in Bulgaria. Plant Disease 95, 10: 1320. LITERATURA 113 Kegler H., Hartmann W. (1998): Present status of controlling conventional strains of Plum pox virus. In: Hadidi A., Khetarpal R.K., Koganezawa H. (eds.). Plant Virus Disease Control. APS Press, St Paul, USA: 616–628. Kerlan C., Dunez J. (1979): Differenciation biologique et serologique de souches du virus de la sharka. Annales de Phytopathologie 11: 241‒250. Kimura M. (1980): A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16: 111‒120. Kollerova E., Novakova S., Šubr Z., Glasa M. (2006): Plum pox virus mixed infection detected on apricot in Pakistan. Plant Disease 90: 1108. Kollerova E., Glasa M., Šubr Z.W. (2008): Western blotting analysis of the Plum pox virus capsid protein. Journal of Plant Pathology, 90, S1.19‒22. Kunze L., Krczal H. (1971): Transmission of sharka virus by aphids. Annales de Phytopathologie, hors serie: 255‒260. Hall T.A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleid Acids Symposium Series 41: 95‒98. Labone G., Yvon M., Quiot J.B., Avinert L., Llácer G. (1995): Aphids as a potential vectors of Plum pox virus: Comparison of methods of testing and epidemiological consequences. Acta Horticulturae 386: 207‒217. Labonne G., Dallot S. (2006): Epidemiology of sharka disease in France. OEPP/EPPO Bulletin 36: 267–270. Levy L., Damsteegt V., Scorza R., Kölber M. (2000a): Plum pox potyvirus disease of stone fruits. APSnet Features. Online. doi: 10.1094/APSnetFeature-2000- 0300. Levy L., Damsteegt V., Welliver R. (2000b): First report of Plum pox virus (Sharka disease) in Prunus persica in the United States. Plant Disease 84: 202. Llácer G., Avinent L., Hermoso de Mendoza A. (1992): Epidemiology of Plum pox (sharka) virus in Valencia (Spain). Acta Horticulturae 309: 129–134. Llácer G. (2006): Hosts and symptoms of Plum pox virus: Herbaceous hosts. OEPP/EPPO Bulletin 36: 227‒228. LITERATURA 114 Lopez-Moya J.J., Wang R.Y., Pyrone T.P. (1999): Context of the coat protein DAG motif affects Potyvirus transmissibility by aphids. Journal of General Virology, 80: 3281‒3288. Maejima K., Hoshi H., Hashimoto M., Himeno M., Kawanishi T., Komatsu K., Yamaji Y., Hamamoto H., Namba S. (2010): First report of Plum pox virus infecting Japanese apricot (Prunus mume Sieb. Et Zucc.) in Japan. Journal of General Plant Pathology, 76: 229‒231. Malinowski T. (2006): Plum pox virus (PPV) in Poland. OEPP/EPPO Bulletin 36: 212. Manachini B., Casati P., Aliverti I., Cinanni L. (2004): Transmission of PPV-M to Prunus persica by Brachycaudus schwartzi and Phorodon humuli (Hem., Aphididae). Journal of Applied Entomology 128: 677‒680. Marroquin C., Olmos A., Gorri M.T., Bertolini E., Martinez C., Carbonell E.A., Hermoso de Mendoza A., Cambra M. (2004): Estimation of the number of aphids carrying Citrus tristeza virus that visit adult citrus trees. Virus Research 100: 101‒108. Martínez-Gómez P., Dicenta F., Egea J. (2003): Effect of a traditional control method (tree removal) on the spread of sharka in an apricot orchard in Southeastern Spain. Phytopathologia Mediterranea 42: 161‒166. Matić S., Al-Rwahnih M., Myrta A. (2006): Diversity of Plum pox virus in Bosnia and Hercegovina. Plant Pathology 55: 11–17. Mavrodieva V.A., Levy L. (2004): Real-time RT-PCR of PPV with R.A.P.I.D. a field field-hardened PCR unit for in-field detection. Acta Horticulturae 657: 141‒ 147. Moya A., Garcia-Arenal F. (1995): Population genetics of viruses: an introduction. In: Gibbs A.J., Calisher C.H., Garcia-Arenal F. (eds) Molecular basis of evolution. Cambridge University Press, Cambridge, UK: 181–191. Myrta A., Al Rwahnih M., Savino V. (2005): Presence of a recombinant isolate of Plum pox virus in Apulia. Journal of Plant Pathology 87, 2: 127‒130. Myrta A., Potere O., Boscia D., Candresse T., Cambra M., Savino V. (1998): Production of a monoclonal antibody specific to the El Amar strain of Plum pox virus. Acta Virologica 42, 4: 248‒251. LITERATURA 115 Myrta A., Potere O., Crescenzi A., Nuzzaci M., Boscia D. (2000): Properties of two monoclonal antibodies specific to the cherry strain of Plum pox virus. Journal of Plant Pathology 82: 95‒101. Myrta A., Boscia D., Potere O., Kolber M., Nemeth M., Di Terlizzi B., Cambra M., Savino V. (2001): Existence of two serological subclusters of Plum pox virus, strain M. European Journal of Plant Pathology 107: 845‒848. Myrta A., Varga A., James D. (2006): The complete genome sequence of an El Amar isolate of Plum pox virus (PPV) and its phylogenetic relationship to other PPV strains. Archives of Virology, 151: 1189-1198. NCBI-National Center for Biotechnology Information. Bethesda MD, 20894 USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Navratil M., Safarova D., Karesova R., Petrzik K. (2005): First incidence of Plum pox virus on apricot trees in China. Plant Disease 89: 338. Nei M., Kumar S. (2000): Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York, USA. Nemchinov L., Hadidi A. (1996): Characterization of the sour cherry strain of Plum pox virus. Phytopathology 86: 575‒580. Nemchinov L., Hadidi A., Maiss E., Cambra M., Candresse T., Damsteegt V. (1996): Sour cherry ctrain of Plum Pox Potyvirus (PPV): Molecular and serological evidence for a new subgroup of PPV strains. Molecular Plant Pathology 86 (11): 1215‒1221. Nemchinov L., Kölber M., Nemeth M., Hadidi A. (1998): Molecular evidence of Plum pox virus-C subgroup in Hungary. Acta Horticulturae 472: 503‒508. Németh M. (1986): Virus, mycoplasma and rickettsia diseases of fruit trees. Academia Kiado, Budapest. Olmos A., Dasi M.A., Candresse T., Cambra M. (1996): Print-capture PCR: a simple and high sensitive method for the detection of Plum pox virus (PPV) in plant tissues. Nucleic Acid Research 24, 11: 2192‒2193. Olmos A., Cambra M., Dasi M.A., Candresse T., Esteban O., Gorris M.T., Asensio M. (1997): Simultaneous detection and typing of Plum pox potyvirus (PPV) isolates by heminested-PCR and PCR-ELISA. Journal of Virological Methods 68: 127‒137. LITERATURA 116 Olmos A., Cambra M., Esteban O., Gorris M.T., Terrada E. (1999): New device and method for capture, reverse-transcription and nested PCR in a single closed-tube. Nucleic Acid Research 27, 6: 1564‒1565. Olmos A., Bertolini E., Cambra M. (2002): Simultaneous and co-operational amplification (Co-PCR): A new concept for detection of plant viruses. Journal of Virological Methods 106: 51‒59. Olmos A., Bertolini E., Gil M., Cambra M. (2004): Real-time RT-PCR for quantitative detection of Plum pox virus. Acta Horticulturae 657: 149‒153. Palkovics L., Burgyán J., Ballázs E. (1993): Comparative sequence analysis of four complete primary structures of Plum pox virus. Virus Genes, 7: 339–347. Pasquini G., Simeone A.M., Conte L., Barba M. (2000): RT-PCR evidence of the non- transmission through seed of Plum pox virus strains D and M. Journal of Plant Pathology, 82, 3: 221‒226. Paunović S., Jevremović D. (2002): Reakcija hibrida šljive 36/114/87 na različite sojeve virusa šarke. Zbornik rezimea XII Simpozijuma o zaštiti bilja i savetovanja o primeni pesticida, Zlatibor: 77. Paunović S., Jevremović D. (2003): Detekcija i diferenciranje izolata virusa šarke. Zbornik naučnih radova XVIII savetovanja o unapređenju proizvodnje voća i grožđa Grocka, 9, 2: 67‒74. Paunović S., Jevremović D., Srećković M., Popović B. (2008): Praćenje brzine širenja virusa šarke u oglednom zasadu šljive Čačanska rodna. Zbornik rezimea IX Savetovanja o zaštiti bilja, Zlatibor: 132‒133. Paunović S., Jevremović D. (2009): Ispitivanje prisustva C-soja virusa šarke šljive u Srbiji. Zbornik rezimea VI Kongresa o zaštiti bilja sa Simpozijumom o biološkom suzbijanju invazivnih organizama, Zlatibor: 70. Petrović-Obradović O. (2003): Biljne vaši (Homoptera:Aphididae) Srbije. Poljoprivredni Fakultet Univerziteta u Beogradu. Beograd. Polak J. (2001): European spindle tree and common privet are new natural hosts of Plum pox virus. Acta Horticulturae 550: 125‒128. Polak J. (2002): Distribution of Plum pox virus in the Czech Republic. Plant Protection Science 38: 98‒102. LITERATURA 117 Polak J. (2006): Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and ornamental species of Prunus. EPPO Bulletin 36: 225‒226. Polak J., Kominek P. (2009): Distribution of Plum pox virus strains in natural sources in Czech Republic. Plant Protection Science 45: 144‒147. Predajňa L, Šubr Z, Candresse T, Glasa M. (2012): Evaluation of the genetic diversity of Plum pox virus in a single plum tree. Virus Research 167 (1): 112-117. Pribek D., Palkovics L., Gaborjanyi R. (2001): Molecular characterization of Plum pox virus almond isolate. Acta Horticulturae 550, 1: 91‒95. Quiot J.B., Boeglin M., Adamolle C., Candresse T., Labonne G., Renauld L.Y. (1995): Behaviour of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees: first results. Acta Horticulturae 386: 290‒297. Raccah B., Hueth H., Blanc S. (2001): Potyviruses. In: Haris K. F., Smith O.P., Duffus J.E. (eds.). Virus-insect-plant interactions, APS Press, St Paul, USA: 181‒206. Ranković M., Jordović M. (1970): Neka iskustva u izolaciji virusa šarke mehaničkim prenošenjem na zeljaste biljke. Zaštita bilja 108: 157‒163. Ranković M. (1974): Prečišćavanje virusa šarke i neke njegove osobine. Doktorska disertacija, Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu, Zemun. Ranković M. (1975): Pouzdanost nekih indikator biljaka za dokazivanje sojeva virusa šarke šljive. Zaštita bilja 26, 133: 275‒284. Ranković, M. (1980): Use of Prunus tomentosa for the detection and differentiation of Sharka and other viruses of plum. Acta Phytopatologica Academiae Scientiarium Hungaricae 15, 1‒4: 303‒308. Ranković M., Paunović S., Dulić-Marković I. (1994): Current situation and future trends in solving Sharka problem in FR Yugoslavia. Acta Horticulturae 386: 241‒247. Ranković M., Paunović S., Dulić-Marković I. (1998): Deformacije grana i propadanje stabla šljive kao specifična reakcija na virus šarke. Zaštita bilja 49, 1, 224: 181‒187. Republički zavod za statistiku Republike Srbije. Beograd. http://webrzs.stat.gov.rs/WebSite/ LITERATURA 118 Roy A.S., Smith I.M. (1994): Plum pox situation in Europe. OEPP/EPPO Bulletin 24: 515‒523. Rwahnih M.Al, Myrta A., Terlizzi B.Di, Boscia D. (2000): First record of Plum pox virus in Jordan. Journal of Plant Pathology 82 (3): 243‒244. Salemi M., Vandamme A.M. (2004): The Phylogenetic Handbook. A practical approach to DNA and protein Phylogeny. Cambridge University Press, UK. Salvador B., Garcia J.A., Simón-Mateo C. (2006): Casual agent of Sharka disease: Plum pox virus genome and function of gene products. EPPO/OEPP Bulletin, 36: 229‒238. Schade C. (1969): Characteristics and serology of sharka virus in plum. Zentralblatt Fuer Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene 123: 299–303. Serçe C.U., Candresse T., Svanella-Dumas L., Krisbai L., Gazel M., Caglayan K. (2009): Further characterisation of a new recombinant group of Plum pox virus isolates, PPV-T, found in orchards in the Ankara province of Turkey. Virus Research 142: 121‒126. Shalaby A.A., Sahar Youssef A., Mazyad H. (2003): Occurence and molecular detection of Plum pox virus strains in Egypt. In: Myrta A., Di Terlizzi B., Savino V. (eds.). Virus and Virus-Like Diseases of Stone Fruits, with Particular Reference to the Mediterranean Region. Option Méditerranéennes Sér. B/No. 45. Bari, Italy. Mediterranean Agronomic Institute: 89–93. SharCo PPV database: http://w3.pierroton.inra.fr:8060/users/login. Schneider W.L., Sherman D.J., Stone A.L., Damsteegt V.D., Frederick R.D. (2004): Specific detection and quantification of Plum pox virus by real-time fluorescent reverse transcription-PCR. Journal of Virological Methods 120, 1: 97‒105. Scholthof K.G., Adkins S., Czosnek H., Palukaitis P., Jacquiot E., Hohn T., Hohn B., Saunders K., Candresse T., Ahlquist P., Hemenway C., Foster G.D. (2011): Top 10 plant viruses in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology 12, 9: 938‒954. LITERATURA 119 Spiegel S., Kovalenko E.M., Varga A., James D. (2004): Detection and partial molecular characterization of two Plum pox virus isolates from plum and wild apricot in southeast Kazakhstan. Plant Disease 88: 973‒979. Stobbs L.W., Van Driel L., Whybourne K., Carlson C. (2005): Distribution of Plum pox virus in residential sites, commercial nurseries and native plant species in the Niagara Region, Ontario, Canada. Plant Disease 89, 8: 822‒827. Szemes M., Kalman M., Myrta A., Boscia D., Nemeth M., Kölber M., Dorgai L. (2001): Integrated RT-PCR/nested PCR diagnosis for differentiating between subgroups of Plum pox virus. Journal of Virological Methods 92: 165‒175. Szathmáry E., Palkovics L. (2010): Natural deletion is not unique in the coat protein (CP) of recombinant Plum pox virus (PPV) isolates in Hungary. Julius-Kuhn-Archiv 427: 151‒155. Šubr Z., Pittnerova S., Glasa M. (2004): A simplified RT-PCR-based detection of recombinant Plum pox virus isolates. Acta virologica 48: 173‒176. Šutić D., Jordović M., Ranković M., Festić H. (1971): Comparative studies of some sharka (plum pox) virus isolates. Annales de Phytopathologie (hors. ser): 185‒192. Šutić D. (1995): Viroze biljaka. Institut za zaštitu bilja i životnu sredinu, Beograd. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. (2011): MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731‒2739. Templeton A.R., Crandall K.A., Sing C.F. (1992): A cladistic analysis of phenotypic associations with haplotypes inferred from restriction endonuclease mapping and DNA sequence data. III. Cladogram estimation. Genetics 132: 619‒633. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994): CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22: 4673‒4680. LITERATURA 120 Thompson D., McCann M., MacLeod M., Lye D., Green M., James D. (2001): First report of Plum pox virus in Ontario, Canada. Plant Disease 85: 97. Thompson, D. (2009): First Report of Plum pox virus Recombinant Strain on Prunus spp. in Canada. Plant Disease 93: 674 Topchiiska, M. (1994): Plum pox virus in sweet and sour cherry in Bulgaria. Доклада на Българската академия на науките, 47 (1): 85‒87. Urcuqui-Inchima S., Haenni A., Bernardi F. (2001): Potyvirus proteins: a wealth of functions. Virus Research 74: 157‒175. Varga A., James D. (2005): Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time Multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis: a rapid method for strain typing. Journal of Virological Methods 123: 213‒ 220. Varveri C., Dimou D., Di Terlizzi B. (1999): Preliminary data of monitoring of natural spread of sharka in commercial orchards in Greece. Acta Horticulturae 488: 793–796. Viršček Marn M., Mavrič Pleško I., Zindović J. (2008): The discovery and characterization of Plum pox virus (PPV) isolates in Montenegro. Plant Pathology 57: 393. Virscek Marn M., Mavric Plesko I., Zindovic J., Miladinovic Z. (2012): Diversity of Plum pox virus isolates in Montenegro. Journal of Plant Pathology 94, 1: 201‒204. Wei T., Yang J., Liao F., Gao F., Lu L., Zhang X., Li F., Wu Z., Lin Q., Xie L., Lin H. (2009): Genetic diversity and population structure of Rice stripe virus in China. Journal of General Virology 90: 1025‒1034. Wetzel T., Candresse T., Ravelonandro M., Delbos R.P., Mazyad H., Aboul-Ata A.E., Dunez J. (1991a): Nucleotide sequence of the 3'-terminal region of the RNA of the El Amar strain of Plum pox potyvirus. Journal of General Virology 72: 1741‒1746. Wetzel T., Candresse T., Ravelonandro M., Dunez J. (1991b): A polymerase chain reaction assay adapted to Plum pox potyvirus detection. Journal of Virological Methods 33: 355‒365. LITERATURA 121 Wetzel T., Candresse T., Macquaire G., Ravelonandro M., Dunez J. (1992): A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for Plum pox potyvirus detection. Journal of Virological Methods 39: 27‒37. Zagrai L., Zagrai I. (2008): Non-transmission of Plum pox virus D and Rec strains through seeds in plum. Bulletin UASVM, Horticulture 65: 523. Zagrai I., Zagrai L., Kelemen B., Petricele I., Pamfil D., Popescu O., Preda S., Briciu A. (2010): Typing and distribution of Plum pox virus isolates in Romania. Julius-Kuhn-Archiv 427: 342‒346. Zamharir M.G., Bashir N.S., Khakvar R. (2006): Plum pox virus (PPV) in Iran. OEPP/EPPO Bulletin 36: 210. Zawadska B. (1982): The virus isolated from declining plum trees primarily inoculated with Plum pox virus. Acta Horticulturae 130: 73‒79. LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJc 1 Moravički Ivanjica 1 P. domestica Stenley intenzivan 5 40 +a -b - + Rec 2 Moravički Ivanjica P. domestica Stenley + - - + Rec 3 Moravički Ivanjica P. domestica Stenley + - - + Rec 4 Moravički Ivanjica 2 P. domestica Crvena ranka poluintenzivan 18 10 - + - + D 5 Moravički Ivanjica P. domestica Crvena ranka - + - + D 6 Moravički Ivanjica P. domestica Crvena ranka - + - + D 7 Moravički Ivanjica 3 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 6 90 + - - + Rec 8 Moravički Ivanjica P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 9 Moravički Ivanjica P. domestica Stenley + - - + Rec 10 Moravički Ivanjica 4 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 6 90 + - - + Rec 11 Moravički Ivanjica P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 12 Moravički Ivanjica P. domestica Stenley + - + + M+Rec 13 Zlatiborski Arilje 5 P. domestica Stenley intenzivan 17 90 + - + - M 14 Zlatiborski Arilje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 15 Zlatiborski Arilje P. domestica Stenley + - - + Rec 16 Zlatiborski Arilje 6 P. domestica Stenley poluintenzivan 15 90 + - + + M+Rec 17 Zlatiborski Arilje P. domestica Stenley + - - + Rec 18 Zlatiborski Arilje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 19 Zlatiborski Arilje 7 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 13 100 + - + - M 20 Zlatiborski Arilje P. domestica Stenley + + + + M+D+Rec 21 Zlatiborski Arilje P. domestica Bluefree + + - + D+Rec 22 Zlatiborski Požega 8 P. domestica Čačanska lepotica intenzivan 6 20 + + - + D+Rec 23 Zlatiborski Požega P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 24 Zlatiborski Požega P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 25 Zlatiborski Požega 9 P. domestica Čačanska lepotica intenzivan 5 40 + - - + Rec 26 Zlatiborski Požega P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 27 Zlatiborski Požega P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 28 Šumadijski Kragujevac 10 P. domestica Stenley poluintenzivan 12 90 + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 29 Šumadijski Kragujevac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 30 Šumadijski Kragujevac P. domestica Stenley + + + + M+D 31 Šumadijski Kragujevac 11 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 6 80 - + - + D 32 Šumadijski Kragujevac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 33 Šumadijski Kragujevac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 34 Šumadijski Kragujevac 12 P. armeniaca Hungarian best intenzivan 5 5 + - - + Rec 35 Šumadijski Kragujevac P. armeniaca Hungarian best + - - + Rec 36 Šumadijski Kragujevac P. domestica Čačanska rodna - + - + D 37 Šumadijski Topola 13 P. domestica Čačanska lepotica intenzivan 5 50 + - - + Rec 38 Šumadijski Topola P. domestica Čačanska lepotica - + - + D 39 Šumadijski Topola P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 40 Kolubarski Ljig 14 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 7 5 + - - + Rec 41 Kolubarski Ljig P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 42 Kolubarski Ljig P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 43 Kolubarski Ljig 15 P. domestica Požegača ekstenzivan 20 90 + - - + Rec 44 Kolubarski Ljig P. domestica Stenley + - - + Rec 45 Kolubarski Ljig P. domestica Požegača + - - + Rec 46 Kolubarski Ljig 16 P. domestica Crvena ranka intenzivan 15 90 + - + - M 47 Kolubarski Ljig P. domestica Čačanska rodna + - + + M+Rec 48 Kolubarski Ljig P. domestica Čačanska rodna - + - + D 49 Kolubarski Mionica 17 P. domestica Požegača ekstenzivan 30 80 + - - + Rec 50 Kolubarski Mionica P. domestica Požegača + - - + Rec 51 Kolubarski Mionica P. domestica Požegača + - - + Rec 52 Kolubarski Mionica 18 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 6 40 + - - + Rec 53 Kolubarski Mionica P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 54 Kolubarski Mionica P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 55 Kolubarski Ljig 19 P. domestica Požegača napušten 35 50 + - - + Rec 56 Kolubarski Ljig P. domestica Požegača + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 57 Kolubarski Ljig P. domestica Požegača + - - + Rec 58 Kolubarski Lajkovac 20 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 6 80 + - - + Rec 59 Kolubarski Lajkovac P. domestica Čačanska rodna + + - + D+Rec 60 Kolubarski Lajkovac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 61 Kolubarski Lajkovac 21 P. domestica Požegača ekstenzivan 20 60 - + - + D 62 Kolubarski Lajkovac P. domestica Požegača + - - + Rec 63 Kolubarski Lajkovac P. domestica Požegača + + - + D+Rec 64 Kolubarski Ub 22 P. armeniaca / intenzivan 5 20 + - - + Rec 65 Kolubarski Ub P. domestica Stenley - + - + D 66 Kolubarski Ub P. domestica Stenley + + - + D+Rec 67 Kolubarski Ub 23 P. domestica Stenley intenzivan 10 60 + + - + D+Rec 68 Kolubarski Ub P. domestica Valjevka + - - + Rec 69 Kolubarski Ub 24 P. domestica Stenley intenzivan 10 90 + - + - M 70 Kolubarski Ub P. domestica Čačanska rodna + - + + M+Rec 71 Kolubarski Ub P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 72 Moravički Gornji Milanovac 25 P. domestica Stenley intenzivan 10 80 - + - + D 73 Moravički Gornji Milanovac P. domestica Stenley + - - + Rec 74 Moravički Gornji Milanovac P. domestica Stenley + - - + Rec 75 Mačvanski Koceljeva 26 P. domestica Stenley poluintenzivan 15 50 + - - + Rec 76 Mačvanski Koceljeva P. domestica Stenley + - - + Rec 77 Mačvanski Koceljeva P. domestica Stenley + - - + Rec 78 Kolubarski Osečina 27 P. domestica Stenley intenzivan 10 20 - + - + D 79 Kolubarski Osečina P. domestica Stenley - + - + D 80 Kolubarski Osečina P. domestica Stenley + - - + Rec 81 Kolubarski Osečina 28 P. domestica Čačanska rodna poluintenzivan 7 70 + + + + M+D 82 Kolubarski Osečina P. domestica Čačanska rodna + + - + D+Rec 83 Kolubarski Osečina P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 84 Kolubarski Osečina 29 P. domestica Požegača ekstenzivan 10 25 + - - + Rec 85 Kolubarski Osečina P. domestica Požegača - + - + D 86 Kolubarski Valjevo 30 P. domestica Požegača poluintenzivan 5 30 + + - + D+Rec 87 Kolubarski Valjevo P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 88 Kolubarski Valjevo P. domestica Požegača + + - + D+Rec 89 Moravički Čačak 31 P. armeniaca / poluintenzivan 18 60 + - - + Rec 90 Moravički Čačak P. armeniaca / + - - + Rec 91 Moravički Čačak P. armeniaca / + - - + Rec 92 Moravički Čačak 32 P. domestica Stenley poluintenzivan 10 40 + - - + Rec 93 Moravički Čačak P. domestica Čačanska najbolja - + - + D 94 Moravički Čačak P. domestica Stenley + + - + D+Rec 95 Zaječarski Zaječar 33 P. domestica Čačanska rana intenzivan 2 5 + + - + D+Rec 96 Zaječarski Zaječar P. domestica Čačanska rana + + - + D+Rec 97 Zaječarski Zaječar P. domestica Čačanska rana + + - + D+Rec 98 Zaječarski Zaječar 34 P. domestica Stenley poluintenzivan 10 100 - + - + D 99 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 100 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley + + - + D+Rec 101 Zaječarski Zaječar 35 P. domestica Požegača poluintenzivan 15 50 - + - + D 102 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 103 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 104 Zaječarski Zaječar 36 P. domestica Stenley poluintenzivan 12 90 - + - + D 105 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 106 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 107 Zaječarski Zaječar 37 P. domestica / napušten 27 70 + - + - M 108 Zaječarski Zaječar P. domestica / + - + - M 109 Zaječarski Zaječar P. domestica / + - + - M 110 Zaječarski Zaječar P. domestica / + + + + M+D 111 Zaječarski Zaječar 38 P. domestica Stenley napušten 27 100 + - + - M LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 112 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley + - + - M 113 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley + - + - M 114 Zaječarski Zaječar 39 P. domestica Čačanska najbolja ekstenzivan 15 50 - + - + D 115 Zaječarski Zaječar P. domestica Čačanska najbolja - + - + D 116 Zaječarski Zaječar P. domestica Stenley - + - + D 117 Zaječarski Knjaževac 40 P. domestica Stenley intenzivan 15 50 + - + - M 118 Zaječarski Knjaževac P. domestica Stenley - + - + D 119 Zaječarski Knjaževac P. domestica Stenley - + - + D 120 Šumadijski Knić 41 P. domestica Čačanska lepotica intenzivan 5 15 + - - + Rec 121 Šumadijski Knić P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 122 Šumadijski Knić P. domestica Čačanska lepotica - + - + D 123 Zlatiborski Požega 42 P. domestica Crvena ranka napušten 50 ? - - - - NEGd 124 Zlatiborski Požega P. domestica Crvena ranka - - - - NEG 125 Zlatiborski Požega P. domestica Crvena ranka - - - - NEG 126 Moravički Ivanjica usamljeno P. cerasifera 6 - - + - + D 127 Šumadijski Kragujevac usamljeno P. domestica Crvena ranka 10 - + - - + Rec 128 Kolubarski Lajkovac usamljeno P. domestica Crvena ranka 4 - + - - + Rec 129 Kolubarski Lajkovac usamljeno P. domestica Stenley 15 - + - - + Rec 130 Kolubarski Valjevo usamljeno P. domestica Čačanska rodna 2 - + + - + D+Rec 131 Zaječarski Knjaževac usamljeno P. domestica Crvena ranka 15 - - + - + D 132 Moravički Čačak 43 P. armeniaca Hungarian Best intenzivan 10 5 + - - + Rec 133 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 134 Moravički Čačak 44 P. armeniaca Hungarian Best intenzivan 15 60 + - - + Rec 135 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - + - M 136 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 137 Moravički Čačak 45 P. armeniaca Hungarian Best intenzivan 10 60 + - - + Rec 138 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 139 Moravički Čačak 46 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 13 100 + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 140 Moravički Čačak P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 141 Moravički Čačak P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 142 Moravički Čačak 47 P. armeniaca Hungarian Best intenzivan 5 50 + - - + Rec 143 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + + - + D+Rec 144 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 145 Moravički Čačak 48 P. armeniaca Hungarian Best intenzivan 8 50 + - - + Rec 146 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 147 Moravički Čačak P. armeniaca Hungarian Best + - - + Rec 148 Rasinski Trstenik 49 P. domestica Čačanska rana poluintenzivan 8 80 - + - + D 149 Rasinski Trstenik P. domestica Čačanska rana - + - + D 150 Rasinski Trstenik P. domestica Stenley - + - + D 151 Rasinski Trstenik 50 P. domestica Stenley poluintenzivan 12 50 - + - + D 152 Rasinski Trstenik P. domestica Stenley - + - + D 153 Rasinski Trstenik P. domestica Stenley - + - + D 154 Rasinski Aleksandrovac 51 P. domestica Stenley intenzivan 15 80 + + - + D+Rec 155 Rasinski Aleksandrovac P. domestica Stenley + - - + Rec 156 Rasinski Aleksandrovac P. domestica Stenley + + - + D+Rec 157 Rasinski Brus 52 P. domestica Čačanska rana poluintenzivan 20 90 + - - + Rec 158 Rasinski Brus P. domestica Čačanska rana + - - + Rec 159 Rasinski Brus P. domestica Stenley + + - + D+Rec 160 Rasinski Brus 53 P. domestica Stenley ekstenzivan 30 80 + - - + Rec 161 Rasinski Brus P. domestica Stenley + - - + Rec 162 Rasinski Brus P. domestica Stenley + - - + Rec 163 Rasinski Brus 54 P. domestica Crvena ranka ekstenzivan 30 90 + - - + Rec 164 Rasinski Brus P. domestica Crvena ranka - + - + D 165 Rasinski Brus 55 P. domestica Stenley intenzivan 10 80 - + - + D 166 Rasinski Brus P. domestica Stenley - + - + D 167 Rasinski Brus P. domestica Stenley + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 168 Rasinski Brus 56 P. domestica Belošljiva ekstenzivan 50 20 - + - + D 169 Rasinski Brus P. domestica Belošljiva - + - + D 170 Rasinski Brus P. domestica Belošljiva - + - + D 171 Toplički Blace 57 P. domestica Stenley intenzivan 7 80 + - - + Rec 172 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 173 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 174 Toplički Blace P. cerasifera Krimska žuta - + - + D 175 Toplički Blace 58 P. domestica Stenley intenzivan 8 10 + - - + Rec 176 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 177 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 178 Toplički Blace 59 P. domestica Stenley intenzivan 8 90 + - - + Rec 179 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 180 Toplički Blace P. domestica Stenley + - - + Rec 181 Toplički Blace 60 P. domestica Čačanska lepotica intenzivan 4 70 + - - + Rec 182 Toplički Blace P. domestica Moravka + + - + D+Rec 183 Toplički Blace P. domestica Čačanska lepotica + - - + Rec 184 Toplički Kuršumlija 61 P. domestica Stenley intenzivan 12 100 + - - + Rec 185 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec 186 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec 187 Toplički Kuršumlija 62 P. domestica Stenley intenzivan 15 80 + - + - M 188 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - + - M 189 Toplički Kuršumlija P. domestica Čačanska rodna - + - + D 190 Toplički Kuršumlija 63 P. domestica Stenley intenzivan 10 60 + - - + Rec 191 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec 192 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec 193 Toplički Prokuplje 64 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 4 90 - + - + D 194 Toplički Prokuplje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 195 Toplički Prokuplje P. domestica Čačanska rodna - + - + D LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 196 Toplički Prokuplje 65 P. domestica Stenley intenzivan 10 80 + - - + Rec 197 Toplički Prokuplje P. domestica Stenley - + - + D 198 Toplički Prokuplje P. domestica Stenley + - - + Rec 199 Toplički Prokuplje 66 P. domestica Stenley intenzivan 12 60 + - - + Rec 200 Toplički Prokuplje P. domestica Stenley + - - + Rec 201 Toplički Prokuplje P. domestica Stenley - + - + D 202 Kosovo Leposavić 67 P. domestica Čačanska rodna ekstenzivan 6 40 + - - + Rec 203 Kosovo Leposavić P. domestica Čačanska rodna - + - + D 204 Kosovo Leposavić P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 205 Macvanski Vladimirci 68 P. domestica Požegača poluintenzivan 15 50 + + - + D+Rec 206 Macvanski Vladimirci P. domestica Požegača + - - + Rec 207 Macvanski Vladimirci P. domestica Požegača + - - + Rec 208 Macvanski Vladimirci 69 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 4 5 - - - - NEG 209 Macvanski Vladimirci P. domestica Čačanska rodna - - - - NEG 210 Macvanski Šabac 70 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 10 70 + - + + M+Rec 211 Macvanski Šabac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 212 Macvanski Šabac P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 213 Macvanski Šabac 71 P. domestica Stenley intenzivan 12 60 + - + + M+Rec 214 Macvanski Šabac P. domestica Stenley + + + + M+D 215 Macvanski Šabac P. domestica Stenley - + - + D 216 Nisavski Aleksinac 72 P. domestica Crvena ranka ekstenzivan 15 100 - + - + D 217 Nisavski Aleksinac P. domestica Crvena ranka - + - + D 218 Nisavski Aleksinac P. domestica Crvena ranka + - - + Rec 219 Nisavski Aleksinac 73 P. domestica Stenley intenzivan 12 100 + - - + Rec 220 Nisavski Aleksinac P. domestica Stenley + - - + Rec 221 Nisavski Aleksinac P. domestica Stenley + - - + Rec 222 Nisavski Aleksinac 74 P. domestica Stenley poluintenzivan 8 90 + - + - M 223 Nisavski Aleksinac P. domestica Stenley - + - + D LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 224 Nisavski Aleksinac P. domestica Stenley - + - + D 225 Pirotski Babušnica 75 P. domestica Crvena ranka poluintenzivan 8 70 - + - + D 226 Pirotski Babušnica P. domestica Stenley + + - + D+Rec 227 Pirotski Babušnica P. domestica Čačanska lepotica - + - + D 228 Nis Niška banja 76 P. domestica Stenley ekstenzivan 15 80 + + - + D+Rec 229 Nis Niška banja P. domestica Stenley - + - + D 230 Nis Niška banja P. domestica Stenley + + - + D+Rec 231 Pirotski Niška banja 77 P. domestica Stenley ekstenzivan 30 100 - + - + D 232 Pirotski Niška banja P. domestica Stenley - + - + D 233 Pirotski Niška banja P. domestica Stenley - + - + D 234 Pirotski Bela Palanka 78 P. domestica Belošljiva ekstenzivan 2 60 - + - + D 235 Pirotski Bela Palanka P. domestica Belošljiva - + - + D 236 Pirotski Bela Palanka P. domestica Belošljiva - + - + D 237 Pirotski Pirot 79 P. domestica Stenley intenzivan 8 80 - + - + D 238 Pirotski Pirot P. domestica Stenley - + - + D 239 Pirotski Pirot P. domestica Stenley - + - + D 240 Pirotski Pirot 80 P. domestica Stenley intenzivan 12 100 - + - + D 241 Pirotski Pirot P. domestica Stenley - + - + D 242 Pirotski Pirot P. domestica Stenley - + - + D 243 Pirotski Pirot 81 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 8 90 + - - + Rec 244 Pirotski Pirot P. domestica Stenley - + - + D 245 Pirotski Pirot P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 246 Pirotski Pirot P. armeniaca / - + - + D 247 Jablanicki Vlasotince 82 P. domestica Požegača napušten 50 60 + - - + Rec 248 Jablanicki Vlasotince P. domestica Požegača + - - + Rec 249 Jablanicki Vlasotince P. domestica Požegača - + - + D 250 Toplički Kuršumlija 83 P. domestica Stenley intenzivan 6 90 + - - + Rec 251 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 252 Toplički Kuršumlija P. domestica Stenley + - - + Rec 253 Jablanicki Leskovac 84 P. domestica Stenley napušten 40 80 + - - + Rec 254 Jablanicki Leskovac P. domestica Stenley + - - + Rec 255 Jablanicki Leskovac P. domestica Stenley + - - + Rec 256 Zlatiborski Užice 85 P. domestica Crvena ranka ekstenzivan 10 70 + - - + Rec 257 Zlatiborski Užice P. domestica Crvena ranka + - - + Rec 258 Zlatiborski Užice P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 259 Zlatiborski Nova Varoš 86 P. domestica Požegača ekstenzivan 30 100 + - - + Rec 260 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 261 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 262 Zlatiborski Nova Varoš 87 P. domestica Požegača ekstanzivan 40 80 + - - + Rec 263 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 264 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 265 Zlatiborski Nova Varoš 88 P. domestica Crvena ranka ekstenzivan 20 80 + - - + Rec 266 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Crvena ranka + - - + Rec 267 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Crvena ranka + - - + Rec 268 Zlatiborski Nova Varoš 89 P. domestica Čačanska rodna poluintenzivan 20 70 - + - + D 269 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 270 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 271 Zlatiborski Nova Varoš 90 P. domestica Požegača napušten 50 50 + - - + Rec 272 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 273 Zlatiborski Nova Varoš P. domestica Požegača + - - + Rec 274 Zlatiborski Prijepolje 91 P. domestica Čačanska rodna intenzivan 10 90 + - - + Rec 275 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 276 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec 277 Zlatiborski Prijepolje 92 P. domestica Stenley poluintezivan 15 50 + - - + Rec 278 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Derosavka + - - + Rec 279 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Čačanska rodna + - - + Rec LEGENDA: a + pozitivna reakcija b - negativna reakcija c M – PPV-M soj; D – PPV-D soj; Rec – PPV-Rec soj; NEG – nije detektovan virus šarke PRILOG 1 REZULTATI PCR ANALIZA N-ter CP CI REDNI BROJ OKRUG LOKALITET BROJ ZASADA DOMAĆIN SORTA TIP ZASADA STAROST ZASADA (god.) PROCENJENI % ZARAZE U ZASADU P3M -P4 P3D- P4 CIP M CIP D SOJ 280 Zlatiborski Prijepolje 93 P. domestica Požegača napušten 60 80 + - - + Rec 281 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Požegača + - - + Rec 282 Zlatiborski Prijepolje P. domestica Požegača + - - + Rec 283 Zlatiborski Nova Varoš 94 P. domestica Derosavka napušten 20 5 + - - + Rec PRILOG 2 PRILOG 2: Sekvence izolata RS-67pl i PPV-Rec izolata iz okoline eksperimentalnog zasada 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AAGAAACTCTATACTGATTCTGAAGCGTCTGAGACGGAAATTGAGAGATATCTTGAAGCATTTTACAATGATATTGATGATAGCCTTGACTCCAACATTG 2/1exter .....G.............................................................................................. 2/8exter .....G.............................................................................................. 2/12exter ...................T............A................................................................... 3/9exter ............................................................................C....................... 4/2exter ......................................G............................................................. 4/3exter .....G.............................................................................................. 4/11exter ......................................G............................................................. 4/13exter .....G.............................................................................................. RS-23pl .....G.............................................................................................. RS-24pl ......................................G............................................................. 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl TTATACACCAGGCTGGTGAAAAGGAGGACGATGAAGAAGTTGATGCAGGAAAACCCACTGCGGTAACTGCACCGGCAGCAACAGTGGTAACAACTCAACC 2/1exter ...............A..................................................................T....C............ 2/8exter ...............A..................................................................T....C............ 2/12exter ...............A..................................................................T...AC............ 3/9exter ............................................................T.....................T....C...........T 4/2exter ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 4/3exter ...............A..................................................................T....C..........T. 4/11exter ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 4/13exter ...............A..................................................................T....C............ RS-23pl ...............A..................................................................T....C............ RS-24pl ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AGCTCCAGTGATACAACCTGCAATTCAAGCCACAACACCAATGTTCAACCCCATTTTCACTCCAGCAACAACTCAGCCTGCGATAAGACCAGTTTCTCCA 2/1exter .............................................T...................................................... 2/8exter .................................................................................................... 2/12exter ............................A....................................................................... 3/9exter ............................A.....................................G.........................C....... 4/2exter ............................A....................................................................... 4/3exter .................................................................................................... 4/11exter ............................A....................................................................... 4/13exter .................................................................................................... RS-23pl .................................................................................................... RS-24pl ............................A....................................................................... 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl ATTTCAGGGGCCACACCGCAGTCTTTTGGCGTTTATGGAAATGAGGATGCATCACCTAGCACCTCAAACACTTTGGTGAACACAGGAAGGGATAGGGACG 2/1exter .................................................................................................... 2/8exter .................................................................................................... 2/12exter ...........T.................A...................................................................... 3/9exter ........A....................A...................................................................... 4/2exter .............A...............A...................................................................... 4/3exter ..................................................................................................T. 4/11exter .............A...............A...................................................................... 4/13exter .................................................................................................... RS-23pl ..................................................................................................T. RS-24pl .............A...............A...................................................................... 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-67pl TCGATGCAGGATCGATTGGAACTTTCG 2/1exter ........................... 2/8exter ........................... 2/12exter ......................C.... 3/9exter ........................... 4/2exter ........................... 4/3exter ........................... 4/11exter ........................... 4/13exter ........................... RS-23pl ........................... RS-24pl ........................... PRILOG 3 PRILOG 3: Sekvence izolata RS-68pl i PPV-D izolata iz okoline eksperimentalnog zasada 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl AAGAAGCTTTACACTGACACTGAAGCGTCTGAGACAGAAATTGAGCGATATCTTGAAGCTTTTTACAACGACATTAACGATGATGGTGAGTCCAACGTTG 4/4exter ....................G.................G....................................G........................ 4/9exter ....................G......................................................G.T...................... 4/12exter ....................G......................................................G.T...................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl TTGTGCACCAAGCTGACGAAAGAGAAGACGAGGAAGAAGTTGACGCAGGCAAGCCTGTTGTAGTTACTGCACCGGCAGCAACTAGCCCAATACTTCAACC 4/4exter .......................................................GA........................................... 4/9exter .....................................G.................GA.........................................T. 4/12exter .....................................G.................GA.........................................T. 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ACCCCCAGTCATACAGCCTGCACCCCGGACTACGGCGCCAATGCTCAACCCCATTTTCACGCCAGCAACAACTCAACCAGCAACAAAACCAGTTTCACCG 4/4exter ...T...A.....................................T.C.................................................... 4/9exter ...T....................T............G.............................................................. 4/12exter ...T....................T............T.............................................................. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ATGTCAAGACCTCAACTGCAAACTTTTGGAACACATGGTAATGAGGATGCCTCACCTAGCAACTCAAACGCGCTAGTCAACACAAACAGAGACAGGGACG 4/4exter .....................................AC......................................T.......G.............. 4/9exter ............................................T................................T...................... 4/12exter ............................................T................................T...................... 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-68pl TCGATGCAGGATCAATTGGAACTTTCA 4/4exter ........................... 4/9exter ...............C........... 4/12exter ...............C........... PRILOG 4 PRILOG 4: Sekvence PPV-Rec izolata sa inokulisanih i novozaraženih stabala iz 2009. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-67pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AAGAAACTCTATACTGATTCTGAAGCGTCTGAGACGGAAATTGAGAGATATCTTGAAGCATTTTACAATGATATTGATGATAGCCTTGACTCCAACATTG 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ...........................A..........G............................................................. 15/7_09 ......................................G............................................................. 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl TTATACACCAGGCTGGTGAAAAGGAGGACGATGAAGAAGTTGATGCAGGAAAACCCACTGCGGTAACTGCACCGGCAGCAACAGTGGTAACAACTCAACC 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 15/7_09 ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AGCTCCAGTGATACAACCTGCAATTCAAGCCACAACACCAATGTTCAACCCCATTTTCACTCCAGCAACAACTCAGCCTGCGATAAGACCAGTTTCTCCA 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ............................A....................................................................... 15/7_09 ............................A........T.............................................................. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl ATTTCAGGGGCCACACCGCAGTCTTTTGGCGTTTATGGAAATGAGGATGCATCACCTAGCACCTCAAACACTTTGGTGAACACAGGAAGGGATAGGGACG 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 .............................A...................................................................... 15/7_09 .............A...............A...................................................................... 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-67pl TCGATGCAGGATCGATTGGAACTTTCG 9/13 ........................... 9/15 ........................... 10/14 ........................... 10/16 ........................... 12/7_09 .......................C... 15/7_09 ........................... PRILOG 5 PRILOG 5: Sekvence PPV-D izolata sa inokulisanih i novozaraženog stabla iz 2009. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-68pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl AAGAAGCTTTACACTGACACTGAAGCGTCTGAGACAGAAATTGAGCGATATCTTGAAGCTTTTTACAACGACATTAACGATGATGGTGAGTCCAACGTTG 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ...........................................................................G.T...................... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl TTGTGCACCAAGCTGACGAAAGAGAAGACGAGGAAGAAGTTGACGCAGGCAAGCCTGTTGTAGTTACTGCACCGGCAGCAACTAGCCCAATACTTCAACC 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ...................C..............G....................GA........................................... 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ACCTCCAGTCATACAGCCTGCACCCCGGACTACGGCGCCAATGCTCAACCCCATTTTCACGCCAGCAACAACTCAACCAGCAACAAAACCAGTTTCACCG 9/14 ...C................................................................................................ 9/16 ...C................................................................................................ 10/13 ...C................................................................................................ 10/15 ...C................................................................................................ 3/3_09 ..........................A.......A........T.......A..............G................................. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ATGTCAAGACCTCAACTGCAAACTTTTGGAACACATGGTAATGAGGATGCCTCACCTAGCAACTCAAACGCGCTAGTCAACACAAACAGAGACAGGGACG 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ................................G...A............................................................... 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-68pl TCGATGCAGGATCAATTGGAACTTTCA 9/14 ........................... 9/16 ........................... 10/13 ........................... 10/15 ........................... 3/3_09 ........................... PRILOG 6 PRILOG 6: Broj uhvaćenih krilatih formi različitih vrsta lisnih vaši primenom Sticky-shoot metode u eksperimentalnom zasadu šljive u 2009. godini Intervali nanošenja aerosola Vrsta lisnih vaši 0 4 /0 5 -1 2 /0 5 1 3 /0 5 -1 9 /0 5 2 0 /0 5 -2 8 /0 5 2 9 /0 5 -0 4 /0 6 0 5 /0 6 -1 1 /0 6 1 2 /0 6 -2 1 /0 6 2 2 /0 6 -2 9 /0 6 3 0 /0 6 -1 4 /0 7 1 5 /0 7 -2 2 /0 7 2 3 /0 7 -3 1 /0 7 0 1 /0 8 -0 8 /0 8 0 9 /0 8 -1 8 /0 8 1 9 /0 8 -2 7 /0 8 2 8 /0 8 -1 1 /0 9 1 2 /0 9 -2 1 /0 9 2 2 /0 9 -3 0 /0 9 0 1 /1 0 -0 9 /1 0 U K U P N O Acyrthosiphon pisum 1 1 2 4 Acyrthosiphon spp. 1 1 1 3 Anoecia corni 1 1 4 2 1 1 2 12 Anoecia spp. 2 1 1 4 Aphididae 2 1 1 1 1 6 Aphis craccivora 1 1 1 5 1 4 13 Aphis fabae 10 5 8 5 3 3 1 1 3 39 Aphis pomi/spiraecola 2 7 2 6 7 1 1 3 2 1 32 Aphis spp. 9 30 24 11 29 10 4 5 1 2 9 5 3 1 14 2 159 Atheroides serrulatus 1 2 1 4 Aulacorthum solani 1 1 Brachycaudus cardui 2 4 1 2 9 Brachycaudus helychrisi 1 1 2 Brachycaudus spp. 3 6 5 1 4 1 2 2 1 25 Capitophorus eleagni 58 58 Capitophorus spp. 1 1 2 Cavariella spp. 2 2 Chaitophorus spp. 4 4 Cinara sp. 1 1 Dysaphis spp. 3 3 Eulachnus sp. 1 1 Hyadaphis foeniculi 1 8 1 10 Hyadaphis polonica 2 2 Hyalopterus pruni 1 1 1 1 1 1 2 2 10 Hyperomyzus sp. 1 1 Lipaphis erysimi 1 2 3 Macrosiphum rosae 1 1 2 Macrosiphoniella spp. 1 1 2 Macrosiphini 1 1 2 Metopolophium dirhodum 1 1 Myzocallis spp. 1 44 8 2 5 1 1 1 63 Myzodium modestum 2 2 Myzus persicae 1 1 1 3 Pemphigidae 3 3 Pemphigus spp. 2 2 3 13 20 Periphyllus spp. 1 1 Phorodon humuli 4 15 1 20 Phyllaphis fagi 1 2 1 2 6 Rhopalomyzus poae 1 1 Rhopalosiphum maidis 3 1 1 1 1 7 Rhopalosiphum nymphaeae 1 1 Rhopalosiphum padi 1 1 1 1 23 5 8 14 3 1 58 Schizaphis graminum 3 1 1 2 3 2 1 13 Semiaphis spp. 1 1 6 7 1 16 Sipha maydis 1 2 3 Sipha spp. 1 1 1 1 1 2 7 Sitobion avenae 1 2 1 4 Tetraneura spp. 1 1 1 1 3 1 8 Thelaxes spp. 1 1 Therioaphis spp. 1 1 1 3 6 Therioaphis trifolii 2 3 1 1 3 9 4 22 1 46 Uroleucon spp. 1 1 2 UKUPNO 25 135 84 30 72 26 74 18 7 7 17 55 13 18 92 25 10 708 PRILOG 7 PRILOG 7: Sekvence PPV-Rec izolata sa inokulisanih, kao i zaraženih stabala iz 2010. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-67pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AAGAAACTCTATACTGATTCTGAAGCGTCTGAGACGGAAATTGAGAGATATCTTGAAGCATTTTACAATGATATTGATGATAGCCTTGACTCCAACATTG 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ...........................A..........G............................................................. 6/17_10 .....G.............................................................................................. 7/20_10 .....G....................A......................................................................... 15/7_09 ......................................G............................................................. 5/2_10 ......................................G............................................................. 5/29_10 ...................................T........................................C....................... 6/1_10 ...........C........................................................................................ 6/23_10 ......................................G..C.......................................................... 6/27_10 ...................T................................................................................ 7/1_10 ..................................................................................A................. 10/11_10 ......................................G.................................G........................... 10/24_10 ......................................G............................................................. 12/18_10 .........................................................................C..C....................... 13/20_10 ...................................T..G............................................................. 14/25_10 ................................A.....G............................................................. 15/3_10 ......................................G............................................................. 15/15_10 .....G.............................................................................................. 16/8_10 ..............C...................................................................................C. 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl TTATACACCAGGCTGGTGAAAAGGAGGACGATGAAGAAGTTGATGCAGGAAAACCCACTGCGGTAACTGCACCGGCAGCAACAGTGGTAACAACTCAACC 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 6/17_10 ...............A..................................................................T....C............ 7/20_10 ...............A..................................................................T....C............ 15/7_09 ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 5/2_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 5/29_10 ...............A............................................T.....................T....C............ 6/1_10 ...............A.......................................................A..........T....C............ 6/23_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 6/27_10 ...............A............................................T...................G.T....C............ 7/1_10 ...............A..................................................................T....C.........G.. 10/11_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 10/24_10 ...............A...G.....................................T..T...G.................T....C............ 12/18_10 ...............A............................................T.....................T....C.G.......... 13/20_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 14/25_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 15/3_10 ...............A.........................................T..T...G..C..............T....C............ 15/15_10 ...............A..................................................................T....C............ 16/8_10 ..............AA...G..............................................................T....C............ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AGCTCCAGTGATACAACCTGCAATTCAAGCCACAACACCAATGTTCAACCCCATTTTCACTCCAGCAACAACTCAGCCTGCGATAAGACCAGTTTCTCCA 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 ............................A....................................................................... 6/17_10 .................................................................................................... 7/20_10 .................................................................................................... 15/7_09 ............................A........T.............................................................. 5/2_10 ............................A.T.....G...........T................................................... 5/29_10 ............................A.....................................G.........................C....... 6/1_10 ...........................................................................................A........ 6/23_10 ............................A.................................................C..................... 6/27_10 .................................................................................................... 7/1_10 ............................A....................................................................T.. 10/11_10 ............................A................T................................C..................... 10/24_10 ............................A.................................................C..................... 12/18_10 ............................A............................T........G.........................C....... 13/20_10 ............................A.................................................C..................... 14/25_10 ............................A....................................................................... 15/3_10 ............................A.................................................C..................... 15/15_10 .................................................................................................... 16/8_10 .................................................................................................... PRILOG 7 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl ATTTCAGGGGCCACACCGCAGTCTTTTGGCGTTTATGGAAATGAGGATGCATCACCTAGCACCTCAAACACTTTGGTGAACACAGGAAGGGATAGGGACG 9/13 .................................................................................................... 9/15 .................................................................................................... 10/14 .................................................................................................... 10/16 .................................................................................................... 12/7_09 .............................A...................................................................... 6/17_10 .................................................................................................... 7/20_10 .................................................................................................... 15/7_09 .............A...............A...................................................................... 5/2_10 ............C................A...................................................................... 5/29_10 ........A....................A...................................................................... 6/1_10 .............................A...................................................................... 6/23_10 .............................A...................................................................... 6/27_10 .............................A...................................................................... 7/1_10 .............................A...................................................................... 10/11_10 .............................A...................................................................... 10/24_10 .............................A...................................................................... 12/18_10 ........A....................A...................................................................... 13/20_10 .............................A...................................................................... 14/25_10 .............................A......................................................A............... 15/3_10 .............................A...................................................................... 15/15_10 .................................................................................................... 16/8_10 .............................A...................................................................... 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-67pl TCGATGCAGGATCGATTGGAACTTTCG 9/13 ........................... 9/15 ........................... 10/14 ........................... 10/16 ........................... 12/7_09 ........................... 6/17_10 ................C.......... 7/20_10 ........................... 15/7_09 ........................... 5/2_10 ........................... 5/29_10 ........................... 6/1_10 ........................... 6/23_10 ........................... 6/27_10 ........................... 7/1_10 .............A............. 10/11_10 ........................... 10/24_10 ........................... 12/18_10 ........................... 13/20_10 ........................... 14/25_10 ........................... 15/3_10 ........................... 15/15_10 ........................... 16/8_10 ........................... PRILOG 8 PRILOG 8: Sekvence PPV-D izolata sa inokulisanih, kao i zaraženih stabala iz 2010. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-68pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl AAGAAGCTTTACACTGACACTGAAGCGTCTGAGACAGAAATTGAGCGATATCTTGAAGCTTTTTACAACGACATTAACGATGATGGTGAGTCCAACGTTG 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ...........................................................................G.T...................... 3/21_10 ...........................................................................G........A............... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl TTGTGCACCAAGCTGACGAAAGAGAAGACGAGGAAGAAGTTGACGCAGGCAAGCCTGTTGTAGTTACTGCACCGGCAGCAACTAGCCCAATACTTCAACC 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ...................C..............G....................GA........................................... 3/21_10 .......................................................G............................................ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ACCTCCAGTCATACAGCCTGCACCCCGGACTACGGCGCCAATGCTCAACCCCATTTTCACGCCAGCAACAACTCAACCAGCAACAAAACCAGTTTCACCG 9/14 ...C................................................................................................ 9/16 ...C................................................................................................ 10/13 ...C................................................................................................ 10/15 ...C................................................................................................ 3/3_09 ..........................A.......A........T.......A..............G................................. 3/21_10 ....................................A......T........................................................ 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ATGTCAAGACCTCAACTGCAAACTTTTGGAACACATGGTAATGAGGATGCCTCACCTAGCAACTCAAACGCGCTAGTCAACACAAACAGAGACAGGGACG 9/14 .................................................................................................... 9/16 .................................................................................................... 10/13 .................................................................................................... 10/15 .................................................................................................... 3/3_09 ................................G...A............................................................... 3/21_10 ..A............T...................................................................................A 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-68pl TCGATGCAGGATCAATTGGAACTTTCA 9/14 ........................... 9/16 ........................... 10/13 ........................... 10/15 ........................... 3/3_09 ........................... 3/21_10 ........................... PRILOG 9 PRILOG 9: Broj uhvaćenih krilatih formi različitih vrsta lisnih vaši primenom Sticky-shoot metode u eksperimentalnom zasadu šljive u 2010. godini Intervali nanošenja aerosola Vrsta lisnih vaši 2 9 /0 4 -0 6 /0 5 0 6 /0 5 -1 2 /0 5 1 3 /0 5 -1 9 /0 5 2 0 /0 5 -2 6 /0 5 2 7 /0 5 -0 2 /0 6 0 4 /0 6 -0 9 /0 6 1 0 /0 6 -2 0 /0 6 2 1 /0 6 -2 8 /0 6 2 9 /0 6 -0 5 /0 7 0 6 /0 7 -1 5 /0 7 1 6 /0 7 -2 2 /0 7 2 3 /0 7 -3 0 /0 7 3 1 /0 7 -1 0 /0 8 1 1 /0 8 -3 0 /0 8 3 1 /0 8 -1 4 /0 9 1 5 /0 9 -2 1 /0 9 U K U P N O Acyrthosiphon pisum 1 1 Anoecia corni 1 2 3 4 10 Aphis craccivora 1 3 1 2 1 1 1 1 3 14 Aphis fabae 2 6 6 1 1 1 1 5 23 Aphis gossypi 1 1 1 1 4 Aphis pomi/spiraecola 1 1 2 4 8 Aphis spp. 2 5 7 9 7 4 1 4 2 5 46 Atheroides serrulatus 2 2 Aulacorthum solani 1 1 2 Brachycaudus spp. 1 1 1 3 Chaitophorus sp. 1 1 Cheitosiphon sp. 1 1 Dysaphis sp. 1 1 Hyalopterus pruni 3 1 1 2 3 10 Macrosiphini 1 1 Macrosiphum sp. 1 1 Metopolophium dirhodum 1 1 Myzocallis boerneri 9 26 55 101 294 3 1 489 Myzocallis coryli 5 3 8 Myzocallis spp. 1 31 37 22 125 181 156 18 1 1 1 2 576 Myzus cerasi 1 1 Myzus persicae 1 4 4 9 Pemphigus spp. 1 5 1 1 8 Peryphyllus sp. 1 1 Phorodon humuli 3 1 4 Phyllaphis fagi 2 3 1 1 7 Rhopalomyzus spp. 2 1 3 Rhopalosiphum maidis 1 1 Rhopalosiphum nymphaeae 1 1 Rhopalosiphum padi 1 6 7 Rhopalosiphum sp. 1 1 Schizaphis graminum 2 1 2 1 1 7 Semiaphis sp. 1 1 Sipha sp. 1 1 Sitobion avenae 1 1 2 Tetraneura spp. 3 1 1 1 1 7 Thelaxes spp. 1 1 1 3 Therioaphis spp. 1 1 1 1 3 7 Therioaphis trifolii 8 1 1 2 5 17 Ukupan broj 10 59 73 97 256 507 170 36 10 15 12 4 0 1 24 16 1289 PRILOG 10 PRILOG 10: Sekvence PPV-Rec izolata sa zaraženih stabala iz 2011. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-67pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AAGAAACTCTATACTGATTCTGAAGCGTCTGAGACGGAAATTGAGAGATATCTTGAAGCATTTTACAATGATATTGATGATAGCCTTGACTCCAACATTG 12/7_09 ...........................A..........G............................................................. 15/7_09 ......................................G............................................................. 5/2_10 ......................................G............................................................. 5/29_10 ...................................T........................................C....................... 6/1_10 ...........C........................................................................................ 6/17_10 .....G.............................................................................................. 6/23_10 ......................................G..C.......................................................... 6/27_10 ...................T................................................................................ 7/1_10 ..................................................................................A................. 7/20_10 .....G....................A......................................................................... 10/11_10 ......................................G.................................G........................... 10/24_10 ......................................G............................................................. 12/18_10 .........................................................................C..C....................... 13/20_10 ...................................T..G............................................................. 14/25_10 ................................A.....G............................................................. 15/3_10 ......................................G............................................................. 15/15_10 .....G.............................................................................................. 16/8_10 ..............C...................................................................................C. 11/20_11 .............A...........T.......................................................................... 10/8_11 ...........................A..........G............................................................. 10/9_11 .....G.............................................................................................. 4/10_11 ......................................G...............................G.....................T....... 13/25_11 ..............C..................................................................................... 4/2_11 .................................................................................................... 7/3_11 ......................................G............................................................. 7/8_11 ......................................G............................................................. 8/4_11 ......................................G...............................G.....................T....... 8/8_11 ......................................G............................................................. 10/22_11 ..................................T...G.................................G........................... 10/28_11 .................................................................................................... 15/1_11 ...................T..................G............................................................. 5/5_11 ......................................G.....................................................T....... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl TTATACACCAGGCTGGTGAAAAGGAGGACGATGAAGAAGTTGATGCAGGAAAACCCACTGCGGTAACTGCACCGGCAGCAACAGTGGTAACAACTCAACC 12/7_09 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 15/7_09 ..G............A.........................................T..T...G.................T....C............ 5/2_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 5/29_10 ...............A............................................T.....................T....C............ 6/1_10 ...............A.......................................................A..........T....C............ 6/17_10 ...............A..................................................................T....C............ 6/23_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 6/27_10 ...............A............................................T...................G.T....C............ 7/1_10 ...............A..................................................................T....C.........G.. 7/20_10 ...............A..................................................................T....C............ 10/11_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 10/24_10 ...............A...G.....................................T..T...G.................T....C............ 12/18_10 ...............A............................................T.....................T....C.G.......... 13/20_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 14/25_10 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 15/3_10 ...............A.........................................T..T...G..C..............T....C............ 15/15_10 ...............A..................................................................T....C............ 16/8_10 ..............AA...G..............................................................T....C............ 11/20_11 .......T.......A.................................................................................... 10/8_11 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 10/9_11 ...............A..................................................................T....C............ 4/10_11 ...............A..................................................................T....C............ 13/25_11 ..............AA..................................................................T....C............ 4/2_11 ...............A............................................T.....................T....C...........A 7/3_11 ...............A...............................A.........T..T...G.................T....C............ 7/8_11 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 8/4_11 ...............A..................................................................T....C............ 8/8_11 ...............A.........................................T..T...G.................T....C............ 10/22_11 ...C...........A.........................................T..T...G.................T....C............ 10/28_11 ...............A.........................................T........................T....C............ 15/1_11 ...............A.........................................T..T...G.................T....C..........T. 5/5_11 ...............A.............................................A....................T....CT........... PRILOG 10 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl AGCTCCAGTGATACAACCTGCAATTCAAGCCACAACACCAATGTTCAACCCCATTTTCACTCCAGCAACAACTCAGCCTGCGATAAGACCAGTTTCTCCA 12/7_09 ............................A....................................................................... 15/7_09 ............................A........T.............................................................. 5/2_10 ............................A.T.....G...........T................................................... 5/29_10 ............................A.....................................G.........................C....... 6/1_10 ...........................................................................................A........ 6/17_10 .................................................................................................... 6/23_10 ............................A.................................................C..................... 6/27_10 .................................................................................................... 7/1_10 ............................A....................................................................T.. 7/20_10 .................................................................................................... 10/11_10 ............................A................T................................C..................... 10/24_10 ............................A.................................................C..................... 12/18_10 ............................A............................T........G.........................C....... 13/20_10 ............................A.................................................C..................... 14/25_10 ............................A....................................................................... 15/3_10 ............................A.................................................C..................... 15/15_10 .................................................................................................... 16/8_10 .................................................................................................... 11/20_11 .................................................................................................... 10/8_11 ............................A....................................................................... 10/9_11 .................................................................................................... 4/10_11 .................................................................................................... 13/25_11 .................................................................................................... 4/2_11 ............................A....................................................................... 7/3_11 ............................A....................................................................... 7/8_11 ............................A.................................................C..................... 8/4_11 .................................................................................................... 8/8_11 ............................A................T.................G..............C..................... 10/22_11 ............................A....................................................................... 10/28_11 ......................................................................................A............. 15/1_11 ............................A.................................................C..................... 5/5_11 .................................................................................................... 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-67pl ATTTCAGGGGCCACACCGCAGTCTTTTGGCGTTTATGGAAATGAGGATGCATCACCTAGCACCTCAAACACTTTGGTGAACACAGGAAGGGATAGGGACG 12/7_09 .............................A...................................................................... 15/7_09 .............A...............A...................................................................... 5/2_10 ............C................A...................................................................... 5/29_10 ........A....................A...................................................................... 6/1_10 .............................A...................................................................... 6/17_10 .................................................................................................... 6/23_10 .............................A...................................................................... 6/27_10 .............................A...................................................................... 7/1_10 .............................A...................................................................... 7/20_10 .................................................................................................... 10/11_10 .............................A...................................................................... 10/24_10 .............................A...................................................................... 12/18_10 ........A....................A...................................................................... 13/20_10 .............................A...................................................................... 14/25_10 .............................A......................................................A............... 15/3_10 .............................A...................................................................... 15/15_10 .................................................................................................... 16/8_10 .............................A...................................................................... 11/20_11 .................................................................................................... 10/8_11 .............................A...................................................................... 10/9_11 .................................................................................................... 4/10_11 ............C................A...................................................................... 13/25_11 .............................A...................................................................... 4/2_11 .............................A...................................................................... 7/3_11 ..........................C..A...................................................................... 7/8_11 .............................A.....................G................................................ 8/4_11 ............C................A...................................................................... 8/8_11 .............................A...................................................................... 10/22_11 .............................A...................................................................... 10/28_11 .............................A...................................................................... 15/1_11 .C...........................A...................................................................... 5/5_11 .............................A...................................................................... PRILOG 10 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-67pl TCGATGCAGGATCGATTGGAACTTTCG 12/7_09 ........................... 15/7_09 ........................... 5/2_10 ........................... 5/29_10 ........................... 6/1_10 ........................... 6/17_10 ................C.......... 6/23_10 ........................... 6/27_10 ........................... 7/1_10 .............A............. 7/20_10 ........................... 10/11_10 ........................... 10/24_10 ........................... 12/18_10 ........................... 13/20_10 ........................... 14/25_10 ........................... 15/3_10 ........................... 15/15_10 ........................... 16/8_10 ........................... 11/20_11 ........................... 10/8_11 ........................... 10/9_11 ........................... 4/10_11 ........................... 13/25_11 ........................... 4/2_11 ........................... 7/3_11 ........................... 7/8_11 ........................... 8/4_11 ........................... 8/8_11 ........................... 10/22_11 .............A............. 10/28_11 ........................... 15/1_11 ........................... 5/5_11 ........................... PRILOG 11 PRILOG 11: Sekvence PPV-D izolata sa zaraženih stabala iz 2011. godine upoređene sa sekvencom izolata RS-68pl 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl AAGAAGCTTTACACTGACACTGAAGCGTCTGAGACAGAAATTGAGCGATATCTTGAAGCTTTTTACAACGACATTAACGATGATGGTGAGTCCAACGTTG 3/3_09 ...........................................................................G.T...................... 3/21_10 ...........................................................................G........A............... 9/29_11 ....................G.................G....................................G........................ 3/19_11 ....................G......................................................G........................ 13/3_11 .........................................................................C.G........A............... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl TTGTGCACCAAGCTGACGAAAGAGAAGACGAGGAAGAAGTTGACGCAGGCAAGCCTGTTGTAGTTACTGCACCGGCAGCAACTAGCCCAATACTTCAACC 3/3_09 ...................C..............G....................GA........................................... 3/21_10 .......................................................G............................................ 9/29_11 .......................................................GA........................................... 3/19_11 ...............................---.....................G............................................ 13/3_11 .......................................................G............................................ 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ACCTCCAGTCATACAGCCTGCACCCCGGACTACGGCGCCAATGCTCAACCCCATTTTCACGCCAGCAACAACTCAACCAGCAACAAAACCAGTTTCACCG 3/3_09 ..........................A.......A........T.......A..............G................................. 3/21_10 ....................................A......T........................................................ 9/29_11 .............................................T.C.................................................... 3/19_11 ................................................A....................G...............G.............. 13/3_11 ...........................................T........................................................ 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| RS-68pl ATGTCAAGACCTCAACTGCAAACTTTTGGAACACATGGTAATGAGGATGCCTCACCTAGCAACTCAAACGCGCTAGTCAACACAAACAGAGACAGGGACG 3/3_09 ................................G...A............................................................... 3/21_10 ..A............T...................................................................................A 9/29_11 ........G....................................................................T........T............. 3/19_11 .............................................................................T..............T....... 13/3_11 ..A............T.................................................G.................................. 410 420 ....|....|....|....|....|.. RS-68pl TCGATGCAGGATCAATTGGAACTTTCA 3/3_09 ........................... 3/21_10 ........................... 9/29_11 ........................... 3/19_11 ........................... 13/3_11 ........................... PRILOG 12 PRILOG 12: Sekvence PPV izolata novozaraženih stabala šljive iz obližnjeg malog zasada 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 2/3exter AAGAAGCTCTATACTGATTCTGAAGCGTCTGAGACGGAAATTGAGAGATATCTTGAAGCATTTTACAATGATATTGATGATAGCCTTGACTCCAACATTG 2/4exter .................................................................................................... 2/5exter .....A.....................A..........G............................................................. 3/3exter .....A................................G............................................................. 3/4exter ........................................................................G.........A................. 3/7exter .........................T.......................................................................... 3/8exter .....A................................G............................................................. 4/7exter .....A................................G...............................G.G...................T....... 2/13exter .....A................................G.....................................G....................... 3/2exter ........T..C.....CA................A.........C.............T..C.....C..C...T.C..AGATAG...G......G... 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 2/3exter TTATACACCAGGCTGATGAAAAGGAGGACGATGAAGAAGTTGATGCAGGAAAACCCACTGCGGTAACTGCACCGGCAGCAACTGTGGCAACAACTCAACC 2/4exter .................................................................................................... 2/5exter ............................................................T...G................................... 3/3exter ..G......................................................T......G................................... 3/4exter .................................................................................................... 3/7exter ...................................R................................................................ 3/8exter ..G......................................................T..T...G................................... 4/7exter .................................................................................................... 2/13exter ..G......................................................T..T...G................................... 3/2exter ..G.G...........C....GA..A.....G...........C.....C..G..GGT..TA..T..................AGCC...T.CT...... 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 2/3exter AGCTCCAGTGATACAACCTGCAATTCAAGCCACAACACCAATGTTCAACCCCATTTTCACTCCAGCAACAACTCAGCCTGCGATAAGACCAGTTTCTCCA 2/4exter .................................................................................................... 2/5exter ............................A....................................................................... 3/3exter ............................A....................................................................... 3/4exter .................................................................................................... 3/7exter ...................................................T................................................ 3/8exter ............................A....................................................................... 4/7exter .................................................................................................... 2/13exter ............................A....................................................................... 3/2exter .C.......C.....G......CCC.GGA.T..GG.G.......................G..............A..A..A.C..A.........A..G 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| 2/3exter ATTTCAGGGGCCACACCGCAGTCTTTTGGCGTTTATGGAAATGAGGATGCATCACCTAGCACCTCAAACACTTTGGTGAACACAGGAAGGGATAGGGACG 2/4exter .................................................................................................... 2/5exter .............................A...................................................................... 3/3exter .............A...............A...................................................................... 3/4exter ...........T.................T...................................................................... 3/7exter ......................................................................................G............. 3/8exter .............A...............A...................................................................... 4/7exter ............C................A...................................................................... 2/13exter .........A...A...............A...................................................................... 3/2exter ..A...A.AC.TCA.TT...AA.......AACAC....T...........C..........A.......G.GC.A..C......AAC..A..C....... 410 420 ....|....|....|....|....|.. 2/3exter TCGATGCAGGATCGATTGGAACTTTCG 2/4exter ........................... 2/5exter ........................... 3/3exter ........................... 3/4exter ........................... 3/7exter ........................... 3/8exter ........................... 4/7exter ........................... 2/13exter ........................... 3/2exter .T...........A............A PRILOG 13 PRILOG 13: Broj uhvaćenih krilatih formi različitih vrsta lisnih vaši primenom Sticky-shoot metode u eksperimentalnom zasadu šljive u 2011. godini Intervali nanošenja aerosola Vrsta lisnih vaši 2 8 /0 4 -0 8 /0 5 0 9 /0 5 -1 6 /0 5 1 7 /0 5 -2 7 /0 5 2 8 /0 5 -0 3 /0 6 0 3 /0 6 -1 0 /0 6 1 0 /0 6 -2 0 /0 6 2 0 /0 6 -2 7 /0 6 2 7 /0 6 -0 5 /0 7 0 5 /0 7 -1 4 /0 7 1 4 /0 7 -2 2 /0 7 2 2 /0 7 -0 2 /0 8 0 2 /0 8 -1 1 /0 8 1 1 /0 8 -1 8 /0 8 1 8 /0 8 -2 9 /0 8 2 9 /0 8 -0 9 /0 9 0 9 /0 9 -2 3 /0 9 U K U P N O Acyrthosiphon pisum 1 1 2 Anoecia corni 1 1 1 2 2 7 Anoecia spp. 2 2 Aphis craccivora 1 2 1 3 2 1 3 1 14 Aphis fabae 2 1 1 5 2 11 Aphis gossypi 1 1 Aphis pomi/spiraecola 3 6 1 2 1 13 Aphis spp. 7 12 3 11 8 6 4 9 3 8 18 9 2 4 104 Atheroides serrulatus 1 1 2 Betulaphis sp. 1 1 Brachycaudus helychisi 1 1 2 2 2 4 12 Brachycaudus sp. 1 1 Brevicoryne brassicae 1 3 4 Capitophorus horni 6 6 Capitophorus spp. 1 2 1 4 Cavariella aegopodii 1 1 Chaitophorus hippophaes 1 1 Dysaphis sp. 1 1 Hyadaphis sp. 1 1 Hyalopterus pruni 1 1 1 3 6 Hyperomyzus lactucae 3 3 Hyperomyzus sp. 1 1 Macrosiphum spp. 2 1 1 4 Macrosiphini 1 1 1 3 Myzocallis spp. 1 2 3 6 Pemphigus spp. 1 1 1 2 1 1 1 4 5 17 Phorodon humuli 2 6 8 Rhopalosiphum maidis 1 1 Rhopalosiphum nymphaeae 2 2 Rhopalosiphum padi 1 2 1 2 2 1 9 Saltusaphis sp. 1 1 Schizaphis graminum 1 1 1 1 1 5 Semiaphis spp. 1 1 2 Sipha maydis 3 3 Sipha sp. 1 2 3 Sitobion avenae 2 2 Tetraneura spp. 1 1 2 Thelaxes spp. 1 1 1 2 5 Therioaphis spp. 1 2 3 Therioaphis trifolii 1 2 3 2 4 1 2 15 Tinocallis platani 1 1 UKUPNO 1 17 29 12 25 30 23 39 10 7 14 26 16 17 15 9 290 BIOGRAFIJA AUTORA Dаrkо Јеvrеmоvić је rоđеn 28. mаrtа 1977. gоdinе u Ćupriјi. Pо zаvršеnој Gimnаziјi u Јаgоdini upisао је Аgrоnоmski fаkultеt u Čаčku gdе је diplоmirао 2002. gоdinе sа prоsеčnоm оcеnоm 9,33 i stеkао zvаnjе diplоmirаni inžеnjеr аgrоnоmiје оpštеg smеrа. Маgistаrsku tеzu pоd nаslоvоm „Моlеkulаrnа kаrаktеrizаciја i gеnеtičkа strukturа izоlаtа virusа šаrkе šlјivе (Plum pox virus) u Srbiјi“ оdbrаniо је 2008. gоdinе nа Pоlјоprivrеdnоm fаkultеtu u Zеmunu i stеkао zvаnjе mаgistаr biоtеhničkih nаukа – оblаst аgrоnоmskih nаukа – fitоpаtоlоgiје. Оd 2003. gоdinе zаpоslеn је u Institutu za voćarstvo u Čačku. Obavio je kratke specijalizacije u: Institutu zа vinоgrаdаrstvо u Kоnеlјаnu u Itаliјi (2005. gоdine), INRА Institutu u Моnpеlјеu, Frаncuska (2006. i 2010. godine) i IVIА Institutu u Vаlеnsiјi, Špаniја (2008. godine). Učеstvovao je na 4 prојеktа finаnsirаnih оd strаnе Мinistаrstvа prosvete i nauke, a trenutno je angažovan na realizaciji aktivnosti dva projekta: „Stvаrаnjе i оčuvаnjе gеnеtičkоg pоtеnciјаlа kоntеnintalnih vrstа vоćаkа“ i „Uticај sоrtе i uslоvа gајеnjа nа sаdržај biоаktivnih kоmpоnеnti јаgоdаstоg i kоštičаvоg vоćа i dоbiјаnjе biоlоški vrеdniјih prоizvоdа pоbоlјšаnim i nоvim tеhnоlоgiјаmа“. Učеstvovao je nа realizaciji 6 prојеkata finаnsirаnih оd strаnе Мinistаrstvа pоlјоprivrеdе, trgovine, šumаrstvа i vоdоprivrеdе. Mr Jevremović je do sada učеstvovao i na tri mеđunаrоdna prојеktа: ECONET (2005-2006): Evaluation des risques epidemiologiques lies a l'emergence de variants du Plum pox virus (virose de la Sharka) en Europe; SHARCO FP7 (2008- 2012): Containment of Sharka virus in view of EU-expansion; i EXCHANGE 3 (2010-2011): The development of an integrated pest, disease and natural hazard management system in agricultural crops. Rukovodilkac je bilatelalnog projekta sa Republikom Francuskom „Risk assessment of the emergence and further spreading of new Plum pox virus recombinants (Sharka disease)“ (2012-2013). Do sada je u saradnji sa drugim autorima objavio preko 60 bibliografskih jedinica.