UNIVERZITET U BEOGRADU POLJOPRIVREDNI FAKULTET mr Danijela T. Ristić KARAKTERIZACIJA VRSTA RODA Fusarium PATOGENA SIRKA [Sorghum bicolor (L.) Moench] U SRBIJI I UTVRĐIVANJE OSETLJIVOSTI GENOTIPOVA doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF AGRICULTURE Danijela T. Ristić, MsC CHARACTERIZATION OF Fusarium SPECIES PATHOGEN FOR SORGHUM [Sorghum bicolor (L.) Moench] IN SERBIA AND GENOTYPE SUSCEPTIBILITY Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 Komisija za ocenu i odbranu: Mentor: dr Aleksandra Bulajić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet Članovi komisije: dr Mirko Ivanović, redovni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet dr Janoń Berenji, naučni savetnik Institut za ratarstvo i povrtarstvo, Novi Sad dr Branka Krstić, redovni profesor Univerzitet u Beogradu−Poljoprivredni fakultet dr Jelena Lević, naučni savetnik Institut za kukuruz „Zemun Polje“, Beograd Datum odbrane: _____________________ Posebnu zahvalnost želim da izrazim svom mentoru, dr Aleksandri Bulajić, vanr. prof. koja mi je pružila neizmernu podršku, znanje i iskustvo, ne samo u izradi doktorske disertacije, već uopšte u naučnom radu. Zbog velikodušne mudrosti i neprocenjive pomoći i podrške veliku zahvalnost dugujem dr Branki Krstić, red. prof. Zahvaljujem i dr Janošu Berenjiju, naučnom savetniku na pomoći i korisnim savetima tokom realizacije eksperimentalnog dela i završne verzije teksta. Posebnu zahvalnost dugujem dr Mirku Ivanoviću, red. prof. i dr Jeleni Lević, naučnom savetniku na korisnim savetima i sugestijama koji su doprineli poboljšanju kvaliteta završne verzije teksta. Zahvalnost dugujem mr Dragosavu Mutavdžiću, istraživaču saradniku za pruženu pomoć pri obradi statističkih podataka. Takođe, želim da izrazim svoju zahvalnost dr Ivani Stanković, doc., Ani Vučurović, dipl. inž., Katarini Milojević, dipl. inž., Dušanu Nikoliću, dipl. inž. i Dragani Đurić, teh. saradniku zbog njihove podrške i pomoći koju su pružili mom istraživanju i stvaranju ove disertacije. Beskrajno sam zahvalna svojoj porodici, koja je uvek uz mene i čija ljubav i podrška ne znaju za granice. KARAKTERIZACIJA VRSTA RODA Fusarium PATOGENA SIRKA [Sorghum bicolor (L.) Moench] U SRBIJI I UTVRĐIVANJE OSETLJIVOSTI GENOTIPOVA Rezime. Tokom trogodińnjeg perioda od 2009. do 2011. godine, pregledom četiri lokaliteta gajenja sirka u Vojvodini, zabeleņena je pojava intenzivnih simptoma truleņi korena i stabla. Intenzitet zaraze useva sirka, bio je veoma visok, a suńenje i brzo propadanje zaraņenih biljaka rezultiralo je procenjenim gubicima od preko 90%. Sa ciljem da se dobije uvid u prisustvo vrsta roda Fusarium i tako rasvetli etiologija oboljenja u Srbiji, obavljena je identifikacija na osnovu proučavanja morfolońkih svojstava i molekularne karakterizacije izolata dobijenih iz zaraņenih biljaka u polju i semena. Na osnovu obavljenih istraņivanja ustanovljeno je da odabrani izolati pripadaju vrstama roda Fusarium: F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i F. thapsinum, kao i vrsti Epicoccum nigrum. Proučavana svojstva ispitivanih izolata analizirana su kao mogući taksonomski kriterijum za razlikovanje vrsta roda Fusarium i preporučuje se korińćenje najmanje dva taksonomska kriterijuma i to morfolońkih svojstava i molekularne karakterizacije. Analize nukleotidnih sekvenci pet genomnih regiona, DNK iz ITS regiona, gena koji kodiraju elongacioni faktor TEF−1α, β−tubulin i calmodulin, kao i mitohondrijalne male podjedinice ribozomske DNK, pokazale su različite potencijale za preciznije razdvajanje vrsta roda Fusarium. Rekonstrukcijom filogenetskih stabala dat je doprinos u rasvetljavanju evolutivne meĎupovezanosti različitih vrsta, kao i izolata u okviru jedne vrste i pruņilo je uvid u prisustvo i rasprostranjenost vrsta Fusarium u nańoj zemlji. Ispitivanja u okviru ove disertacije ukazala su na postojanje različitih vidova osetljivosti komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala in vitro i u poljskim ogledima u uslovima prirodne zaraze i veńtačke inokulacije sa prevalentnim vrstama F. equiseti i F. proliferatum. Dobijeni rezultati dalje će se koristiti u programima oplemenjivanja gajenog sirka na otpornost. Ključne reči: gajeni sirak, fuzariozna truleņ, taksonomski kriterijumi, osetljivost genotipova Naučna oblast: Biotehničke nauke Uţa naučna oblast: Fitopatologija UDK: 632.95:633.17(043.3) CHARACTERIZATION OF Fusarium SPECIES PATHOGEN FOR SORGHUM [Sorghum bicolor (L.) Moench] IN SERBIA AND GENOTYPE SUSCEPTIBILITY Abstract. Intensive symptoms of root and stem rot of sorghum were recorded in four sorghum growing localities in the province of Vojvodina, during a three year investigation period from 2009 to 2011. Estimated loss of inspected crops was over 90%, because of drying and deterioration of infected sorghum plants in highly infected crops. In order to get better insight into the presence of Fusarium species and to clarify etiology of the disease in Serbia, the identification was carried out based on the study of morphological properties and molecular characterization of isolates originating from infected plants in the field and seeds. On the basis of the investigations it was found that the selected isolates belong to the species of the genus Fusarium: F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum and F. thapsinum, as well as, to the species Epicoccum nigrum. Studied properties of selected isolates were analyzed as a possible taxonomic criterion for distinguishing species of the genus Fusarium. Utilization of at least two taxonomic criteria in particular/as follows morphological properties and molecular characterization are recommended. Nucleotide sequences analysis of five genomic regions of DNA from the ITS region, genes encoding elongation factor TEF−1α, β−tubulin and calmodulin, as well as, the mitochondrial small subunit ribosomal DNA showed different potentials for delineation of Fusarium species. Contribution in clarifying evolutionary interlinkage/interconnections of different species, and strains within a species was given by reconstruction of phylogenetic trees which provided insight into the presence and distribution of Fusarium species in our country. The existence of various forms of susceptibility of commercial varieties and breeding materials were revealed, both in vitro and in field experiments, to natural infection and artificial inoculation with F. equiseti and F. proliferatum. Results obtained in this study will contribute in the deployment of sorghum breeding programs for resistance to these important pathogens. Keywords: cultivated sorghum, fusarious rot, taxonomic criteria, genotype susceptibility Scientific field: Biotechnical Science Scientific discipline: Phytopathology UDC: 632.95:633.17(043.3) SADRŢAJ 1. UVOD…………………………………………………………………………….. 1 2. PREGLED LITERATURE…………………………………………………….. 3 2.1. Privredni značaj i botanička klasifikacija gajenog sirka………........................... 3 2.2. Najznačajnije agronomske forme gajenog sirka……........................................... 5 2.3. Bolesti gajenog sirka u svetu................................................................................ 7 2.4. Bolesti gajenog sirka u Srbiji................................................................................ 11 2.5. Gljive roda Fusarium i njihov značaj................................................................... 12 2.5.1. Značajne vrste roda Fusarium opisane na gajenom sirku u svetu…................. 13 2.5.2. Značajne vrste roda Fusarium opisane na gajenom sirku u Srbiji..................... 14 2.6. Klasifikacija i taksonomija roda Fusarium........................................................... 16 2.7. Najznačajnije Fusarium vrste kao patogeni gajenog sirka................................... 20 3. CILJEVI ISTRAŢIVANJA……………………………………………………. 27 4. MATERIJAL I METOD RADA………………………………………………. 28 4.1. Sakupljanje uzoraka obolelih biljaka………........................................................ 28 4.2. Izolacija patogena………..................................................................................... 28 4.3. Dobijanje čistih kultura monosporijalnih izolata i njihovo čuvanje……............. 29 4.4. Provera patogenosti i izbor izolata za dalja ispitivanja…………......................... 30 4.5. Morfolońka svojstva anamorfa………….............................................................. 32 4.6. Morfolońka svojstva teleomorfa (peritecija)………............................................. 34 4.7. Molekularna detekcija i identifikacija………...................................................... 34 4.7.1. Ekstrakcija DNK…………............................................................................... 35 4.7.2. Lančana reakcija polimeraze (PCR)…….......................................................... 38 4.7.3. Vizuelizacija i analiza produkata PCR reakcija……......................................... 40 4.7.4. Prečińćavanje PCR produkta i sekvencioniranje…............................................ 41 4.7.5. Molekularna identifikacija i karakterizacija…................................................... 42 4.8. Ocenjivanje nivoa osetljivosti različitih genotipova sirka prema Fusarium spp….................................................................................................................... 44 4.8.1. Ocenjivanje nivoa osetljivosti klijanaca sirka prema Fusarium spp. u uslovima staklenika…........................................................................................ 44 4.8 4.8.2. Ocenjivanje nivoa osetljivosti stabla sirka prema Fusarium spp. u poljskim uslovima............................................................................................................. 45 5. REZULTATI.......................................................................................................... 50 5.1 5.1. Simptomi bolesti na biljkama u polju.................................................................... 50 5.2 5.2. Izolacija patogena i dobijanje monosporijalnih izolata......................................... 52 5.3 5.3. Izolati odabrani za dalja proučavanja.................................................................... 53 5.4 5.4. Provera patogenosti............................................................................................... 55 5.5 5.5. Morfolońka svojstva anamorfa.............................................................................. 57 5.6 5.6. Morfolońka svojstva teleomorfa (peritecija)......................................................... 68 5.7 5.7. Molekularna detekcija gljiva................................................................................. 69 5.7 5.7.1. Molekularna identifikacija vrsta detektovanih na sirku..................................... 74 5.7 5.7.2. Molekularna karakterizacija Fusarium spp...................................................... 86 5.8. Osetljivost različitih genotipova sirka prema Fusarium spp................................ 102 5.8 5.8.1. Osetljivost klijanaca sirka prema Fusarium spp. u uslovima staklenika........... 102 5.8 5.8.2. Osetljivost stabla sirka prema Fusarium spp. u poljskim uslovima.................. 106 6. DISKUSIJA………………………………………………………………………. 127 6.1 6.1. Simptomi bolesti na biljkama u polju................................................................... 127 6.2 6.2. Test patogenosti.................................................................................................... 129 6.3 6.3. Morfolońka svojstva anamorfa i teleomorfa......................................................... 130 6.4 6.4. Molekularna detekcija i identifikacija.................................................................. 132 6.5 6.5. Molekularna karakterizacija Fusarium spp......................................................... 140 6.6 6.6. Ocenjivanje nivoa osetljivosti različitih genotipova sirka................................... 145 7. ZAKLJUČAK........................................................................................................ 153 8. LITERATURA………………………………………………………………….. 157 BIOGRAFIJA PRILOG IZJAVE 1 1. UVOD Sirak (Sorghum bicolor (L.) Moench.) spada meĎu najstarije gajene biljke. Po povrńinama i značaju četvrto je gajeno ņito u svetu, odmah posle pirinča, pńenice i kukuruza (Islam, 2009). Različiti načini upotrebe zrna, zelene mase ili njihove kombinacije za ljudsku i stočnu ishranu, industriju i specifične namene, ukazuju na to da gajeni sirak ima veliku perspektivu kod nas i očekuje se da povrńine pod ovom značajnom gajenom vrstom nastave da rastu (Sikora i Berenji, 2005). Vińe vrsta roda Fusarium patogene su za gajeni sirak u svetu i imaju sposobnost da potpuno unińte potencijalno visokoprinosne useve najčeńće nekoliko nedelja pre ņetve, prouzrokujući ekonomske gubitke usled smanjenja tehnolońkog kvaliteta semena i prinosa (Chelkowski, 1998; Brennan et al., 2005). Zaraze stabla ili korena mogu da smanje prinos i kvalitet zrna, dok poleganje moņe značajno da oteņa ili čak onemogući ņetvu. Agroekolońki uslovi u Srbiji pogoduju pojavi toksikogenih vrsta roda Fusarium kao patogena brojnih gajenih biljaka, u ńirim razmerama i ukupno je do sada identifikovano 63 vrste, 35 varijeteta i 19 specijalizovanih formi osnovnih vrsta (Lević i sar., 2009). Mada su vrste roda Fusarium na različitim kulturama dosta proučavane, o kompleksu vrsta patogenih za gajeni sirak u Srbiji ima malo podataka, naročito o njihovoj varijabilnosti i patogenosti. Ispitivanja u okviru ove doktorske disertacije obuhvatila su utvrĎivanje prisustva fitopatogenih gljiva iz roda Fusarium na biljkama u polju kao i na semenu, u nekoliko lokaliteta gajenja sirka; njihovu izolaciju iz biljnih delova sa simptomima bolesti i iz komercijalnog semena i semena sakupljenog sa zaraņenih biljaka; proveru patogenosti na klijancima odgajenim u zańtićenom prostoru, kao i ispitivanje morfolońkih svojstava izolata poreklom iz Srbije i njihovo poreĎenje sa referentnim izolatima vrsta poreklom iz Australije. Analize sekvenci vińe odgovarajućih delova genoma nuklearne i mitohondrijalne DNK pokazale su različite potencijale za preciznije razdvajanje vrsta roda Fusarium, u cilju njihove identifikacije. Uspeńna primena protokola za molekularnu identifikaciju vrsta kompleksa Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw., F. graminearum Schwabe i F. equiseti (Corda) Sacc. na osnovu sekvenci TEF gena koji kodira translacioni faktor izduņivanja 1−alfa, gena za β−tubulin i calmodulin predstavljaju početak i osnovu 2 proučavanja filogeografske distribucije ovih značajnih vrsta u Srbiji. Dobijeni rezultati predstavljaju uvod u bliņu genetičku karakterizaciju, i sluņe za brzo i lako razlikovanje ovih vrsta od morfolońki sličnih vrsta iz G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti kompleksa. Sekvencioniranje većeg broja izolata, uključivanje dodatnih delova genoma, njihovo poreĎenje i odreĎivanje njihovog meĎuodnosa i odnosa sa drugim izolatima u svetu doprinose poznavanju strukture populacije vrsta G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti kompleksa iz čega jedino i moņe da proizaĎe uspeńna strategija kontrole ovih veoma ńtetnih patogena. Tokom dve uzastopne godine ispitivana je osetljivost različitih genotipova komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala gajenog sirka u kontrolisanim uslovima, u stakleniku na klijancima i u polju u uslovima veńtačke inokulacije i prirodne zaraze, uz primenu odgovarajuće statističke obrade dobijenih rezultata. Rezultati ovih ispitivanja ukazali su na različit stepen osetljivosti komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala gajenog sirka prema prevalentnim Fusarium spp. Ovi rezultati mogu se dalje koristiti u programima oplemenjivanja gajenog sirka na otpornost prema ovim patogenima, a samim tim dobijeni su realni podaci o potencijalu genofonda gajenog sirka u agroekolońkim uslovima Srbije. 3 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Privredni značaj i botanička klasifikacija gajenog sirka Sirak (Sorghum bicolor L. Moench) spada meĎu najstarije gajene biljne vrste. Potiče iz centralne Afrike gde se uzgaja preko 5 000 godina. Odatle je trgovačkim putevima dalje prenet u Indiju i Kinu, ńto je bio ključni faktor kasnije prirodne meĎuvrsne hibridizacije izmeĎu afričkih i azijskih sirkova (Rooney and Smith, 2000). Region rasprostranjenosti gajenih sirkova nalazi se od ekvatora do 45° severne, odnosno 35º juņne geografske ńirine, ńto se podudara sa trajanjem toplog letnjeg perioda, perioda bez mrazeva, pribliņno 125 dana (Dogget, 1982; loc. cit. Sikora, 2005). Poreklo specijalne forme gajenog sirka, sirka metlańa vezuje se za region Mediterana (Ball, 1910; loc. cit. Dahlberg et al., 2011a). Ova forma sirka se iz Italije, počev od XVI veka ńirila u Ńpaniju, Francusku i Podunavske zemlje, Austro−Ugarsku i Nemačku. Smatra se da je u Panonsku niziju stigla polovinom XVII veka (Sávoly, 1921; loc. cit. Dahlberg et al., 2011a). Danas je sirak jedna od najznačajnijih prosolikih ņita, a po povrńinama i značaju zauzima četvrto mesto u svetu, posle pirinča, pńenice i kukuruza (Islam, 2009). Oko 500 miliona ljudi u preko 30 zemalja smeńtenih u semiaridnim tropskim oblastima Azije i Afrike koriste sirak kao osnovnu namirnicu u ishrani (Gassem, 1999; Dahlberg et al., 2011a). U 2009. godini 82% proizvodnih useva sirka nalazilo se u Africi i Aziji. Prosečan prinos na Afričkom kontinentu iznosio je 904 kg/ha, dok je u Aziji neńto vińi i iznosio je 1 096 kg/ha. Iste godine je gajeni sirak u SAD−u posejan na 2,2 miliona ha, a u Evropi na 151 526 ha, a ostvaren prosečan prinos zrna, pojedinačno posmatrano, bio je 4 355 odnosno 4 451 kg/ha (FAO, 2011). Sirak ńećerac i sudanska trava pokazuju tendenciju porasta prinosa, a prosečan prinos useva krmnog sirka u Nebraski (SAD) dostigao je 23 t/ha za poslednjih 10 godina (USDA, 2011). U literaturi postoje podaci koji ukazuju da prinosi biomase mogu biti veći i od 35 t/ha (Worker and Marble, 1968). Privredni značaj sirka proizilazi pre svega iz njegove vińestruke upotrebe. Zrno sluņi za ishranu krupne stoke i ņivine (u razvijenim područjima sveta), ali i kao ljudska hrana u najvećem delu Afrike i delovima Indije i Kine. Zelena masa koristi se za ishranu stoke u sveņem stanju i kao silaņa, a pri blagovremenom końenju moņe da se koristi kao 4 seno. Silaņa od sirka je neńto manje hranljive vrednosti od kukuruzne silaņe. Zrno sirka je visokokvalitetna stočna hrana čijom se preradom dobija skrob, glukoza, gluten, alkohol i drugi proizvodi (Sikora i Berenji, 2005). Po hemijskom sastavu slično je zrnu kukuruza koje sadrņi 72−76% skroba, 8−12% proteina, 3,2% masti, 1,5% sirove celuloze i 1,6% mineralnih materija (Čobić i sar., 1987; Bačvanski i sar., 1988). Od stabla sirka ńećerca dobija se ńećerni sirup koji sadrņi 13−17% saharoze. Metlice sirka metlańa su osnovna sirovina u metlarstvu, za proizvodnju sirkovih metli (Sikora i Berenji, 2010). Velika prednost sirka je da se ovakva vrsta proizvodnje moņe uspeńno organizovati i u uslovima postrne setve (Kunc i sar., 1991). Gajeni sirak je jedinstven meĎu mnogim usevima koji se koriste kao sirovinska baza za obnovljive izvore energije i moņe se koristiti u različitim procesima proizvodnje biogoriva (skrob za etanol, ńećer za etanol i celuloza za biogas). Dahlberg et al. (2011a) objavili su istraņivanje o agronomskoj proceni sirka za biomasu, pri čemu je zabeleņeno da sirak kao krmna biljka moņe da postigne visok prinos biomase kroz duņi niz godina. Teoretski, moņe se koristiti i za proizvodnju etanola sa prosečnim prinosom od 6 146 l/ha obnovljivih izvora energije. Sa najboljim hibridima moņe se postići prinos od 8 422 l/ha. Ova otkrića i raznolikost gajenog sirka kao sirovine za obnovljive izvore energije predstavljaju veliki potencijal za Evropu koja nastoji da formira strategiju primene alternativnih izvora bioenergije (Dahlberg et al., 2011b). Slični rezultati su dobijeni i u nańim uslovoma (Kišgeci et al., 1983; 1988; Berenji, 1994). Botanička klasifikacija. Sirak je monokotiledona, jednogodińnja zeljasta biljka reda Glumiflorae, porodice Poaceae, podporodice Andropogon, rod Sorghum. Ovaj rod prvi je opisao joń Linnaeus 1753. godine pod imenom Holcus. Naziv Sorghum potiče od Adansona (1763), a od roda Holcus odvojio ga je Moench (1774), (loc. cit. Sikora, 2005). Bez obzira ńto se sirak gaji od davnina, u poljoprivredi do sada nema jedinstvene naučne klasifikacije ovog polimorfnog roda, koji ima vińe od 34 vrste. Klasifikacija gajenog sirka oteņana je ne samo zbog njegovog polimorfizma, već i zbog velike geografske rasprostranjenosti. De Wet i Huckabay (1967) i de Wet (1978) su unutar podroda Sorghum izdvojili tri vrste i to dve tetraploidne (2n=40) vińegodińnje vrste Sorghum halepense i Sorghum propinquum i jednu diploidnu vrstu (2n=20) Sorghum bicolor, koja obuhvata 5 jednogodińnje divlje, korovske i sve gajene sirkove. Ovakva klasifikacija pored morfolońkih veliku paņnju poklanja i genetskim svojstvima pojedinih taksona. Prema sistematizaciji koja se koristi danas, botanička pripadnost gajenog sirka je sledeća: porodica trava (familia Poaceae), rod sirak (genus Sorghum), vrsta (species) bicolor (Dahlberg, 2000). Po agronomskoj klasifikaciji zasnovanoj na načinu gajenja i upotrebe, vrsta S. bicolor deli se na takozvane agronomske forme (Berenji and Dahlberg, 2004): sirak za zrno (S. vulgare var. frumentaceum); sirak metlań (raniji naziv: tehnički sirak) (S. vulgare technicum); sirak ńećerac ili silaņni sirak (S. vulgare var. saccharatum); sudanska trava (S. vulgare var. sudanensis). Po agronomskoj podeli gajenih formi sirka, baziranoj na načinu korińćenja, sirak metlań ubraja se u industrijsko bilje, a ostali gajeni sirkovi meĎu krmno bilje (Berenji i Mijavec, 1992). 2.2. Najznačajnije agronomske forme gajenog sirka Sirak za zrno. Sirak za zrno spada meĎu vodeće kulture u svetu, a i u nańim uslovima sve vińe poprima na značaju, zato ńto je gajenje sirka za zrno moguće i tamo gde proizvodnja kukuruza nije ekonomična. Različiti načini upotrebe zrna, zelene mase ili njihove kombinacije za ljudsku i stočnu ishranu, industriju i specifične namene, kao i prisutni uslovi potrebni za gajenje, ukazuju na to da sirak za zrno ima značajnu perspektivu i u Srbiji (Sikora i Berenji, 2005). Mesto sirka za zrno u ratarskoj proizvodnji odreĎeno je tolerantnońću prema nepovoljnim uslovima spoljne sredine (marginalna zemljińta, suńa, viske temperature). Ova tolerantnost je kod sirka izraņena vińe u poreĎenju sa kukuruzom (Berenji, 1996; Starčević i Berenji, 1994). Proizvodnja sirka za zrno pruņa mogućnost za ublaņavanje ńtetnih posledica suńe u ratarstvu (Berenji i sar., 2004) i na tome se najvećim delom i zasniva perspektiva proizvodnje sirka za zrno kod nas (Berenji i Sikora, 2004). Sirak za zrno se po povrńinama ubraja meĎu pet najznačajnijih ratarskih biljaka u svetu (FAO, 2004). Najveće povrńine pod sirkom za zrno nalaze se u Africi, a najveći prinosi zrna postiņu se u Evropi (3 614 kg/ha) i Severnoj Americi (3 751 kg/ha). U 6 nańim agroekolońkim uslovima, u sortnim ogledima, postiņu se veoma visoki prinosi zrna (preko 10 000 kg/ha), mada su u praksi prinosi neńto niņi (Sikora i Berenji, 2005). Privredni značaj sirka za zrno proizilazi iz hemijskog sastava zrna, koji je sličan drugim ņitima (sirovi proteini 12,54%; sirova mast 3,48%; sirova vlakna 2,48%; pepeo 1,55%; skrob 81,65%; svarljivi sirovi proteini 99,95 g/ha). Zrno sirka sadrņi vińe proteina, a manje skroba u odnosu na zrno kukuruza. Energetska vrednost i sadrņaj svarljivih proteina ukazuju da je zrno sirka izuzetno energetsko zrnasto hranivo (Clark et al., 1980; Berenji i Kunc, 1995). Sirak metlaš. Sirak metlań je industrijska biljka koja se prvenstveno gaji radi metlice sastavljene od dugačkih elastičnih peteljki na čijim se vrhovima nalazi seme. Tokom ņetve metlice se sa drńkom, koju predstavlja terminalnu internodiju stabla, ručno odsecaju od ostatka stabla. Nakon suńenja neovrńenih metlica seme se vrńi vrńilicom, a ovrńene metlice, nakon odsecanja drńke daju sirkovu slamu koja sluņi kao sirovina za proizvodnju sirkovih metli (Berenji and Kišgeci, 1996). Finalni proizvod, sirkova metla je u pravom smislu reči biorazgradivi, ekolońki artikal, koji se u potpunosti uklapa u moderne trendove upotrebe prirodnih sirovina umesto veńtačkih (Berenji, 2008). U Jugoistočnoj Evropi sirak metlań čini deo specijalizovanog trņińta prirodnih, biorazgradivih metli izraĎenih od metlica sirka (Berenji et al., 2011). Vińe od 90% ukupne proizvodnje sirkovih metli se izvozi na zapadnoevropsko trņińte. Stoga su gajenje sirka metlańa i metlarstvo od velikog značaja sa stanovińta izvoza i ostvarivanja finansijske dobiti (Sikora i Berenji, 2011). U svetskim razmerama se najveće povrńine pod sirkom metlańem kao i najobimnija proizvodnja sirkovih metli nalazi u Evropi, gde u tom pogledu pored MaĎarske, Rumunije, Turske i Ukrajine, Srbija zauzima značajno mesto (Berenji and Dahlberg, 2004). Po povrńinama na kojima se sirak metlań gaji, Srbija se ubraja meĎu vodeće proizvoĎače ove biljke u Evropi pa i u svetu. Zahvaljujući sigurnom plasmanu i povoljnostima u pogledu gajenja ove biljke, proizvodnja sirka metlańa je relativno stabilna i ekonomična. Na ovim činjenicama se zasniva opravdanost gajenja sirka metlańa i njegovog unapreĎivanja putem oplemenjivanja (Berenji i Sikora, 2006). Tokom prvih 35 godina rada na programu oplemenjivanja sirka metlańa u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo u Novom Sadu formirana je kolekcija od preko 400 7 genotipova poreklom iz celog sveta (Sikora, 2005; Sikora, 2006; Sikora and Berenji, 2006). Pored starih i sada gajenih domaćih sorti u kolekciji su zastupljene i strane sorte, lokalne populacije i linije proizińle iz različitih programa oplemenjivanja. Pońto se radi o relativno malom programu u okviru koga fizički nije bilo moguće uključenje kompletne kolekcije, iz nje je formirano jezgro od 157 genotipova koji se koriste u ukrńtanjima radi rekombinacije svojstava i povećanja varijabilnosti (Berenji, 1996; Sikora and Berenji, 2006; Sikora i Berenji, 2007; Berenji et al., 1987). 2.3. Bolesti gajenog sirka u svetu Gajeni sirak se meĎu ņitima ističe neobično velikim brojem bolesti. Zbog ńiroke upotrebe i različitih prirodnih uslova u kojima se gaji, stalno je pod negativnim uticajem biotskih i abiotskih činioca. U oblastima gde se tradicionalno gaji, sirak je osetljiv prema velikom broju prouzrokovača različitih bolesti koji uglavnom pripadaju gljivama, virusima, bakterijama i fitoplazmama (Frederiksen and Odvody, 2000). Tabela 1. Bolesti gajenog srka koje u svetu prouzrokuju gljive* R.br. Ime bolesti/Simptomi Patogen/Patogeni 1. Siva pegavost lista Exserohilum turcicum (Pass.) K. J. Leonard & E. G. Suggs; Drechslera turcica (Pass.) Subramanian & P. C. Jain); Cercospora sorghi Ellis & Everh.; C. fusimaculans Atk. 2. Ovalna pegavost lista Ramulispora sorghicola E. Harris 3. Zonirana lisna pegavost Gloeocercospora sorghi (Bain & Edgerton) 4. Lezije na listu Phoma insidiosa Tassi; Phyllosticta sorghiphila Saccas; Hadrotrichum sorghi (Pass.) Ferraris & Massa; Septoria pertusa Heald & F.A. Wolf; Leptosphaeria sp., Ascochyta sorghi Sacc.; Coniothyrium sorghi Saccas; Botryodiplodia sorghi Henn. 5. Bolest epidermisa lista Rhizoctonia sp.; Sclerotium rolfsii Sacc.; Ophiobolus spp. 6. ČaĎava prugavost lista Ramulispora sorghi (Ellis & Everh.) L. S. Olive & Lefebvre 7. „Gruba“ pegavost Ascochyta sorghina Sacc. i A. sorghi Sacc. 8. Antraknoza Colletotrichum graminicola (Ces.) Wilson; C. gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. 9. Truleņ korena Pythium arrhenomanes Drechsler; P. graminicola Subram.; P. myriotylum Drechs.; P. periplocum Drechs.; 8 10. Truleņ korena i stabla Fusarium equiseti, F. graminearum, F. verticillioides (Sacc.) Nirenb.; F. napiforme Marasas, Rabie, Lubber, Nelson, Toussoun & Van Wyk; F. nygamai Burgess & Trimboli; F. oxysporum Schlecht.; F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg; F. semitectum Berk. & Rav.; F. solani (Martius) Appel & Wollenweber emend. Snyder & Hansen; F. subglutinans (Wollenw. and Reinking) Nelson, Toussoun and Marasas; F. thapsinum Klittich, Leslie, Nelson & Marasas; F. tricinctum (Corda) Saccardo 11. Ugljenasta truleņ korena i stabla Macrophomina phaseolina (Tassi) G. Goidanich 12. Plesnivost zrna Alternaria alternata (Fries) Keissler, Beih; Aspergilus flavus van Tieghem; A. fumigatus Fresenius; A. niger Link; Cladosporium sp., C. graminicola; Curvularia lunata (Wakk.) Boedijn; Epicoccum nigrum Link; F. semitectum; F. thapsinum; F. verticillioides; F. oxysporum; Drechslera tetramera (McKinney) Subram. & B.L. Jain; Phoma sorghina (Sacc.) Boerema, Dorenbosch & van Kesteren; Nigrospora sp.; Aspergillus sp.; Penicillium spp.; Rhizopus sp.; Claviceps 13. Pokrivena gar Sporisorium sorghi Link in Willd. 14. Prańna gar Sporisorium reilianum (Kühn) Langdon & Fullerton; Sporisorium cruentum (Kühn) K. Vánky 15. „Dugačka“ gar Sporisorium ehrenbergii Vánky 16. RĎe Puccinia purpurea Cooke; P. prunicolor Sydow; P. jaagii Boedijin; P. cesatii J. Schröt.; Uredo geniculata Cummins 17. Plamenjača Sclerophthora macrospora (Sacc.) Thirum., C.G. Shaw & Naras.; Peronosclerospora sorghi (Weston & Uppal) C.G. Shaw.; Sclerospora graminicola (Sacc.) Schroet. 18. Glavnica Claviceps sorghi B.G.P. Kulk., Seshadri & Hegde; C. africana Freder., Mantle & De Milliano; C. sorghicola *Podaci prema: Mughogho and Pande, 1983; Frederiksen, 1986; Ivanović i Ivanović, 2001; Tsukiboshi et al., 1999; Bogo and Mantle, 1999; Paţoutová and Bogo, 2001; Johnson and Rajasab, 2003; Fakhrunnisa and Ghaffar, 2006; Gwary et al., 2006; Muthusubramanian et al., 2006; Tooley et al., 2006; Johnson et al., 2008; Yassin et al., 2010 Prisustvo različitih patogenih gljiva na semenu sirka, koje je poslednjih godina sve čeńće utvrĎeno, moņe biti značajno sa stanovińta smanjenja prinosa i kvaliteta zrna, u pogledu kontaminacije ńtetnim mikotoksinima, a takoĎe moņe dovesti i do indirektnih gubitaka smanjujući klijavost i energiju klijanja semena (Dawson and Bateman, 2001; 9 Singh and Navi, 2001; Erpelding and Prom, 2006). Vińe fitopatogenih gljiva koje se prenose semenom kao ńto su A. alternata, A. flavus, A. fumigatus, A. niger, Cladosporium sp., C. sublineolum, Curvularia spp., F. moniliforme, F. oxysporum, F. pallidoroseum, D. tetramera, Nigrospora sp., Penicillium spp., Phoma sp. i Rhizopus sp. često su izolovane sa zrna sirka (Fakhrunnisa and Ghaffar, 2006; Gwary et al., 2006). Kao patogen semena sirka opisana je i visoko varijabilna vrsta E. nigrum (syn. E. purpurascens Ehrenb. ex Schlecht.) (Yassin et al., 2010). Prouzrokovače plesnivosti zrna čine gljive iz oko 40 rodova, meĎu kojima su najznačajnije F. thapsinum, F. semitectum, C. lunata, C. graminicola, A. alternata i P. sorghina (Frederiksen and Odvody, 2000). Plesan ili truleņ zrna sirka u skladińtu prouzrokuju najčeńće gljive iz roda Aspergillus i Penicillium koje opstaju u zrnu sa relativno niskom vlaņnońću. MeĎu potencijalne prouzrokovače plesni svrstavaju se i vrste rodova Alternaria, Claviceps i Fusarium koje biosintetińu mikotoksine i mogu značajno smanjiti kvalitet zrna ili ga potpuno unińtiti (Frederiksen and Odvody, 2000). Siva pegavost lista predstavlja jednu od najznačajnijih bolesti lista gajenog sirka koju prouzrokuju E. turcicum i C. sorghi koja je često udruņena sa C. fusimaculans, prouzrokovačem uzduņne pegavosti lista. Mnoge druge gljive mogu prouzrokovati razvoj pege na listu sirka, kao ńto su: P. insidiosa, P. sorghiphila, H. sorghi, S. pertusa, Leptosphaeria sp., A. sorghi, C. sorghi, B. sorghi. Mali broj ovih patogena ima ekonomski značaj, ali treba ih razmatrati kao potencijalno opasne i ńtetne (Frederiksen and Odvody, 2000). Vrste roda Fusarium parazitiraju gajeni sirak od klijanja semena do ņetve, prouzrokujući truleņ zrna, klijanaca, korena i stabla. Fuzariozna truleņ korena i stabla gajenog sirka, koja utiče na prevremeno sazrevanje i poleganje biljaka, moņe prouzrokovati ńtete i do 100% (Frederiksen and Odvody, 2000). Fusarium spp. koje naseljavaju tkivo korena i stabla gajenog sirka obuhvataju: F. equiseti, F. graminearum, F. moniliforme, F. napiforme, F. nygamai, F. oxysporum, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. subglutinans, F. thapsinum, F. tricinctum i druge. Ugljenastu truleņ korena i stabla sirka prouzrokuje gljiva M. phaseolina (syn. M. phaseoli (Maubl.) S. Ashby) koja se javlja u uslovima tropske klime (Mughogho and Pande, 1983; Frederiksen, 1986). Polifagne vrste, uglavnom u područjima sa umerenom klimom, P. arrhenomanes i P. graminicola značajni su prouzrokovači truleņi 10 korena sirka. Dokazano je prisustvo i drugih manje značajnih vrsta roda Pythium: P. myriotylum i P. periplocum. Gljive Rhizoctonia spp., Sclerotium rolfsii, Ophiobolus spp. i G. sorghi manjeg su ekonomskog značaja, a njihovo prisustvo ograničeno je na tropske oblasti, u kojima prouzrokuju primarne ńtete na epidermisu lista sirka (Frederiksen and Odvody, 2000). Glavnica sirka je vaņna i preteća bolest koja prouzrokuje znatne gubitke na globalnom nivou (Frederickson et al., 1991; Bandyopadhyay et al., 1998; loc. cit. Tooley et al., 2010). Za ovu bolest odgovorne su tri različite vrste iz roda Claviceps: C. sorghi, C. africana ustanovljene u Indiji i Africi (Bogo and Mantle, 1999; Paţoutová and Bogo, 2001; Johnson and Rajasab, 2003; Muthusubramanian et al., 2006; Tooley et al., 2006; Johnson et al., 2008) i C. sorghicola, koja je opisana samo u Japanu (Tsukiboshi et al., 1999). Prouzrokovači rĎe sirka P. purpurea i P. prunicolor rasprostranjeni su u celom svetu u područjima gajenja sirka, pri čemu smanjuju kvalitet i kvantitet prinosa. TakoĎe, druge gljive rĎa, P. jaagii, P. cesatii i U. geniculata napadaju i zaraņavaju gajeni sirak meĎutim, ńtete koje one nanose su neznatne (Frederiksen and Odvody, 2000). Plamenjaču („ludi vrh“) gajenog sirka prouzrokuje S. macrospora, pri čemu nastaju veoma značajne ńtete, koje dovode i do potpunog unińtenja prinosa (Frederiksen and Odvody, 2000). Gar klasa i metlice sirka ili tzv. prańna gar tipična je bolest generativnih organa gajenog sirka koju prouzrokuje S. reilianum. Pokrivena gar sirka predstavlja ekonomski značajnu bolest, a prouzrokovač je S. sorghi, dok je prouzrokovač otkrivene gari S. cruentum manje rasprostranjen (Frederiksen and Odvody, 2000). Viroze gajenog sirka rasprostranjene su ńirom sveta i prouzrokuju značajne ekonomske ńtete u epidemijskim razmerama na svim kontinentima (Frederiksen, 1982; Toler, 1985; Toler and Giorda, 1992; Ivanović i Berenji, 1996). Prema Doggett (1988) dosad je opisano 17 virusa koji mogu prouzrokovati oboljenja na gajenom sirku. MeĎu njima su najznačajniji virusi iz familije Potyviridae i to: Maize dwarf mosaic virus (MDMV), Sugar cane mosaic virus (SCMV), Sorghum mosaic virus (SrMV) i Johnsongrass mosaic virus (JgMV) (Frederiksen and Odvody, 2000). Ńtete usled zaraza sirka sa virusima iz roda Potyvirus su brojne i značajne jer utiču na smanjenje prinosa (30−100%) i visine zaraņenih biljaka (do 50%). 11 Gajeni sirak je osnovni prirodni domaćin virusa iz roda Furovirus i to: Sorghum chlorotic spot virus (SgCSV) i Peanut clump (PCV). Predstavnici familije Rhabdoviridae koji zaraņavaju ņita u SAD, a takoĎe i gajeni sirak, čine relativno veliki kompleks virusa koji uključuje Maize mosaic virus (MMV), Wheat American striate mosaic virus (WASMV), Oat striate mosaic virus (OSMV) i Sorghum stunt mosaic virus (SSMV). Tri predstavnika familije Reoviridae, roda Fijivirus infektivni su za gajeni sirak i to Maize rough dwarf virus (MRDV), Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) i Fiji disease virus (FDV), mada njihova učestalost i ńtetnost u svetu nije rasvetljena. Maize streak virus (MSV) odrņava se u sirku ukoliko se gaji blizu kukuruza koji je osnovni domaćin (Frederiksen and Odvody, 2000). Pored pomenutih virusa sirka vrlo su značajni i Barley yellow dwarf virus (BYDV), Panicum mosaic virus (PMV) i Brome mosaic virus (BMV) zbog njihove rasprostranjenosti i potencijalne ńtetnosti (Frederiksen and Odvody, 2000). Fitopatogene bakterije takoĎe na gajenom sirku u pojedinim područjima prouzrokuju ekonomski značajne ńtetne bolesti. Prouzrokovač bakteriozne crtičavosti sirka Xanthomonas campestris pv. holcicola (Elliott) Dye jedna je od najńtetnijih bakterioza gajenog sirka. Bakterioznu crtičavost i prugavost lińća prouzrokuje Acidovorax avenae subs. avenae Manns, pegavost lińća Pseudomonas syringae pv. syringae van Hall, a krņljavost, vlaņnu truleņ i uvelost biljaka prouzrokuje Erwinia chrysanthemi Burkholder, McFadden & Dimock. (Frederiksen and Odvody, 2000). Jedina opisana fitoplazmoza na ńećernom sirku je Yellow Sorghum Stunt (YSS) (Frederiksen and Odvody, 2000). 2.4. Bolesti gajenog sirka u Srbiji Patogeni gajenog sirka u nańoj zemlji malo su proučavani. MeĎu fitopatogenim gljivama ističu se varijeteti vrste F. roseum Link (F. roseum var. culmorum, F. roseum var. avenaceum i F. roseum var. scirpi−acuminatum), prouzrokovači pega na korenu, stablu, lisnom rukavcu, listu, metlici i zrnu gajenog sirka (Martinović, 1969). „Crnu truleņ“ stabla gajenog sirka prouzrokuje C. graminicola, pri čemu nastaju značajne ńtete koje dovode do smanjenja prinosa i lomljenja stabla (Vilmoš, 1991). U nas je M. phaseolina posebno značajna kao patogen gajenog sirka, koji prouzrokuje ugljenastu truleņ korena i stabla (Ivanović i Ivanović, 2001). Gar sirka čiji je prouzrokovač 12 Sphacelotheca sorghi (Link.) Clint u nańoj zemlji ne predstavlja ekonomski značajnu bolest, iz razloga ńto se sirak gaji na manjim povrńinama. Bolest sniņava kvalitet sirka ńećerca, zatim krmnog sirka, ali i sirka metlańa, pońto se dobija loń kvalitet metlica (Ivanović i Ivanović, 2001). Truleņ stabla gajenog sirka prouzrokuju F. verticillioides, F. subglutinans i F. graminearum (Balaţ i sar., 1996; Balaţ et al., 1997). Iz semena sirka u Srbiji izolovane su i mnoge vrste roda Fusarium, i to F. equiseti, F. langsethiae, F. proliferatum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichioides, F. thapsinum i F. verticillioides, zatim vrste roda Alternaria, Aspergillus, Mucor i Penicillium. U proseku, značajno manji intenzitet pojave je utvrĎen za vrste Cladosporium spp., Epicoccum spp., Gonatobotrys spp. i Rhizopus spp. (Lević i sar., 2008). Virus mozaične krņljavosti kukuruza (Maize mosaic virus, MMV), virus mozaika ńećerne trske (Sugar cane mosaic virus, SCMV), virus mozaika divljeg sirka (Johnsongrass mosaic virus, JgMV) i virus mozaika sirka (Sorghum mosaic virus, SrMV), detektovani su kao prouzrokovači viroza gajenog sirka u Vojvodini (Mijavec et al., 1991; Berenji et al., 1993; Ivanović i Berenji, 1996; Bagi i sar., 2004; Bagi, 2006). Bakterioznu pegavost lińća prouzrokuje Pseudomonas syringae pv. syringae (Panić and Arsenijević, 1966). U Institutu za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad koncipiran je program oplemenjivanja sirka metlańa na otpornost prema prevalentnim bolestima ove kulture (Berenji, 2000). 2.5. Gljive roda Fusarium i njihov značaj Vrste roda Fusarium prisutne su u svim delovima sveta, pojedine vrste su kosmopoliti, druge preovlaĎuju u tropskim i suptropskim regionima ili u umerenom klimatu ili su ograničene u specifičnim oblastima i zdruņene sa odreĎenim zajednicama biljaka (Burgess et al., 1994). Vitalnost odrņavaju u različitim supstratima, a izolovane su iz večitog leda na Arktiku, peska u Africi (Booth, 1971; Kommedahl et al., 1988; Burgess et al., 1994; Sangalang et al., 1995), konzervisane hrane, uskladińtenih hemikalija, avionskog goriva (Booth, 1971), kao i iz maltera graĎevina starih preko 100 godina (Kwasa, 1997; loc. cit. Lević, 2008). Vrste roda Fusarium poznate su kao patogeni brojnih biljnih vrsta, neńto manje infektivne i manje proučene kao patogeni ljudi i znatno manje kao patogeni ņivotinja. 13 Konidije vrsta roda Fusarium ńiroko su rasprostranjene u spoljańnjoj sredini i čovek je svakodnevno i na svakom mestu u kontaktu s njima (Zapater and Arrechea, 1975; Lieberman et al., 1979). Sekundarni metaboliti koje stvaraju ove vrste gljiva mogu da prouzrokuju poremećaje metabolizma domaćih ņivotinja sa smrtnim ishodom, a zbog svog kancerogenog dejstva sve veću opasnost predstavljaju i za zdravlje ljudi (Marasas, 2000). Vesonder and Golinski (1989) navode različite grupe metabolita, hormone, pigmente, mikotoksine, antibiotike, fitotoksine, steroide i različite derivate ovih metabolita koji prouzrokuju fiziolońke reakcije u biljkama, bakterijama i algama, a takoĎe u telu ņivotinja i ljudi. Dokazano je da od 61 identifikovane vrste roda Fusarium, njih 35 stvara ukupno 137 mikotoksina, od kojih 79 pripada grupi trihotecena (De Nijs et al., 1997). Sa stanovińta etiologije mikotoksikoza ljudi i ņivotinja, od značaja su tri grupe mikotoksina zearalenoni, trihoteceni i fumonizini, koje sintetińu najtoksigenije vrste F. sporotrichioides Sherb., F. graminearum i F. verticillioides (syn. F. moniliforme) (Marasas, 2000). Brojne bolesti ljudi i ņivotinja nastaju kao posledica konzumiranja plesnive hrane, posebno ņita. Toksičnost kukuruza kontaminiranog sa F. verticillioides poznata je joń od sredine XIX veka i značajna je u etiologiji bolesti konja, poznate kao konjska leukoencefalomalacija (Gelderblom et al., 1988). Rod Fusarium zauzima značajno mesto u literaturi posvećenoj gljivama, ali i pored toga postoji relativno malo saznanja o primarnim ńtetama koje vrste ovog roda nanose pojedinim gajenim biljkama. U literaturi se vińe navodi učestalost pojave parazita, a manje intenzitet bolesti, vińe se ukazuje na morfolońka svojstva i brojnost vrsta, a manje na njihovu patogenost i obim prouzrokovanih ńteta. U brojnim publikacijama najčeńće se navodi da je vińe vrsta roda Fusarium zdruņeno u etiologiji bolesti, posebno tipa truleņi, kao i da je intenzivnija pojava bolesti biljaka koje su pod stresom (Lević, 2008). 2.5.1. Značajne vrste roda Fusarium opisane na gajenom sirku u svetu Vińe vrsta roda Fusarium patogene su za gajeni sirak u svetu i imaju sposobnost da potpuno unińte potencijalno visokoprinosne useve najčeńće nekoliko nedelja pre ņetve, prouzrokujući ekonomske gubitke usled smanjenja tehnolońkog kvaliteta semena i prinosa (Chelkowski, 1998; Brennan et al., 2005). Zaraze stabla ili korena mogu da 14 smanje prinos i kvalitet zrna, dok poleganje moņe značajno da oteņa ili čak onemogući ņetvu. Uslovi spoljańnje sredine često dovode do stresa biljke, pri čemu se povećava osetljivost sirka prema bolestima, kao ńto su truleņ korena i stabla (Burgess et al., 1981; Ryley et al., 2002). U Australiji F. verticillioides se javlja kao glavni prouzrokovač truleņi korena i osnove stabla, a povremeno i paleņi klasa (Trimboli and Burgess, 1983; Trimboli and Burgess, 1985; Ryley et al., 2002; loc. cit. Petrović et al., 2009). MeĎutim nedavna istraņivanja polne kompatibilnosti i molekularna karakterizacija pokazuju da ova vrsta nije najrasprostranjeniji prouzrokovač, već se javlja najmanje ńest vrsta, od kojih je nekoliko morfolońki veoma slično (Leslie and Marasas, 2002). Istraņivanja uglavnom ukazuju na joń jednu vrstu F. thapsinum, mada su verovatno pored nje prisutne i F. andiyazi Marasas et al., F. nygamai, F. proliferatum i F. verticillioides (Leslie and Marasas, 2002). Nedavno je F. andiyazi opisan kao prouzrokovač bolesti gajenog sirka u Africi i Severnoj Americi (Marasas et al., 2001). MeĎutim, podaci o učestalosti i rasprostranjenosti ove vrste u svetu su malobrojni. Poznato je da klimatski uslovi utiču na geografsku rasprostranjenost, raznovrsnost i učestalost izolata Fusarium vrsta na biljkama i u zemljińtu (Burgess et al., 1988; Burgess and Summerell, 1992; Backhouse et al., 2001; Backhouse and Burgess, 2002). TakoĎe, klima utiče i na ulogu Fusarium vrsta u etiologiji pojedinih bolesti (Backhouse and Burgess, 2002; Pettitt et al., 2003; Waalwijk et al., 2003; Backhouse et al., 2004) i na biosintezu mikotoksina u zaraņenim biljkama (Logrieco et al., 2002). 2.5.2. Značajne vrste roda Fusarium opisane na gajenom sirku u Srbiji Prva pojava vrsta roda Fusarium na teritoriji Srbije zapaņena je u vidu teleomorfa (Gibberella pulicaris Fries Sacc., Nectria episphaeria Tode, Gibberella saubinetii Mont. Sacc.) krajem XIX veka, a početkom XX veka uočen je i njihov stadijum anamorfa (F. roseum Link) na ostacima kukuruzovine (Ranojević, 1914; loc.cit. Lević i sar., 2008). Njihova sve veća rasprostranjenost i ńtetnost ispoljena tokom druge polovine XX veka uslovljena je gajenjem visokorodnih hibrida kukuruza i sorti pńenice koji su zahtevali intezivniju primenu agrotehničkih mera i drugih savremenih mera gajenja. U Srbiji vrste roda Fusarium identifikovane su kao patogeni 15 ratarskih, povrtarskih, ńumskih, ukrasnih i korovskih biljaka, ali i kao paraziti gljiva, parazitnih cvetnica i insekata (Lević, 2008). Agroekolońki uslovi u Srbiji pogoduju pojavi patogenih i toksigenih vrsta roda Fusarium u ńirim razmerama, koje u pojedinim godinama mogu prouzrokovati značajno smanjenje prinosa i povećanu kontaminaciju zrna kukuruza i pńenice mikotoksinima (Lević i sar., 2004; Stanković i sar., 2006). Ukupno je do sada identifikovano 63 vrste, 35 varijeteta i 19 specijalizovanih formi osnovnih vrsta, posebno vrste F. oxysporum (4 var. i 12 f. sp.) i F. solani (7 var. i 3 f. sp.). F. langsethiae Torp & Nirenberg i F. thapsinum su novoidentifikovane vrste izolovane sa zrna pńenice, odnosno sirka. Fuzarioze industrijskih biljaka malo su proučavane u Srbiji. Prisustvo vrsta roda Fusarium na semenu industrijskih biljaka, koje je poslednjih godina sve čeńće utvrĎeno, ukazuje da ove patogene gljive u Srbiji mogu biti značajne sa stanovińta smanjenja prinosa i kvaliteta zrna, posebno u pogledu kontaminiranosti mikotoksinima (Lević, 2008). U Srbiji su vrste roda Fusarium izolovane sa preko 100 biljnih vrsta, a sa ekonomskog aspekta, bile su i ostale najznačajnije kao prouzrokovači truleņi zrna kukuruza i pńenice (Lević, 2008). Od ovih vrsta F. graminearum je najznačajnija patogena vrsta, koja prouzrokuje truleņ korena, stabla i klipa kukuruza. Vrste iz sekcije Liseola, kao ńto su F. verticillioides, F. subglutinans i F. proliferatum značajni su patogeni kukuruza i sirka, mada je poslednjih godina utvrĎena sve čeńća pojava ovih vrsta na zrnu pńenice i ječma (Lević i sar., 2009; Tančić, 2009; loc. cit. Tančić i sar., 2009). U Srbiji je period jun−oktobar najkritičniji za očuvanje kvaliteta uskladińtenog kukuruza, jer su brojnost i učestalost toksigenih vrsta roda Fusarium u tom periodu najveće (43,5−62,5%) (Lević i sar., 2009). Tokom skladińtenja kukuruza F. gramineraum je u najvećem procentu (5,0−11,0%) prisutna u periodu jun−septembar, F. verticillioides u periodu februar−oktobar (22,0−39,5%), a F. subglutinans od aprila do oktobra (8,0−12,5%) (Krnjaja i sar., 2007). Pojava fuzarioza sirka u Srbiji prvi put je zabeleņena 1959. godine u okolini Beograda, a potom 1967. i 1968. godine u Vrbasu i Obrenovcu. Tri varijeteta vrste F. roseum Link identifikovana su kao prouzrokovači bolesti gajenog sirka: F. roseum var. culmorum, F. roseum var. avenaceum i F. roseum var. scirpi−acuminatum (Martinović, 1969). Ovi patogeni varijeteti prouzrokovali su pojavu pega na korenu, stablu, lisnom 16 rukavcu, listu, metlici i zrnu gajenog sirka (Martinović, 1969). Sva tri varijeteta F. roseum ispoljila su patogena svojstva prema drugim biljkama domaćinima, pńenici i kukuruzu. Proučavajući osetljivost sirka metlańa prema vrstama roda Fusarium, Balaţ i sar. (1996) ustanovili su da truleņ stabla sirka najčeńće prouzrokuje F. verticillioides, a potom i vrste F. subglutinans i F. graminearum. Paraziti semena sirka u nańoj zemlji su malo proučavani, ali se moņe pretpostaviti na osnovu literaturnih podataka (McGee, 1988) da su slični kao i na semenu kukuruza (Lević i sar., 2003). Zajedničko za seme kukuruza i sirka jeste da su za obe gajene vrste najznačajniji patogeni gljive iz roda Fusarium, i to često iste vrste. Razlike mogu da postoje u specijalizaciji sojeva koji mogu biti virulentni prema sirku ali ne i prema kukuruzu, kao ńto je primer vrsta F. moniliforme, za koju je utvrĎeno da neki sojevi poreklom iz kukuruza pripadaju vrsti F. verticillioides (F. moniliforme), a drugi iz sirka vrsti F. thapsinum. F. moniliforme prouzrokuje truleņ embriona i suvu truleņ semena sirka, bolest klijanaca pre i posle nicanja, drńke i rahisa. Infekcija sirka ostvaruje se nekoliko dana posle metličenja, a razvoju pogoduju visoke temperature i vlaņniji uslovi u periodu metličenja i vońtane zrelosti, ńto rezultira 65% zaraņenosti semena (Lević i sar., 2003). Iz semena sirka u Srbiji izolovane su i druge vrste roda Fusarium, i to F. equiseti (1,3%), F. proliferatum (1,3−8,8%), F. semitectum (1,3%), F. solani (2,5%), F. sporotrichioides (1,3%), F. subglutinans (1,3−2,5%), F. thapsinum (1,3−11,3%) i F. verticillioides (1,3−7,5%), (Lević et al., 2006; Lević i sar., 2008). 2.6. Klasifikacija i taksonomija roda Fusarium Rod Fusarium ispoljava visok stepen biodiverziteta, odnosno varijabilnosti u pogledu morfolońkih, fiziolońkih i ekolońkih svojstava, ńto predstavlja poteńkoću pri stvaranju stabilne i ńiroko prihvatljive taksonomije ovih vrsta (Burgess et al., 1997; Summerell et al., 2003). Klasifikacija vrsta u odreĎene podgrupe joń uvek je nepotpuno reńena i zato je neophodno stvoriti pouzdan i jedinstven sistem koji će odreĎivanje vrste kombinovati na morfolońkom, biolońkom i filogenetskom nivou (Leslie et al., 2001). Taksonomija roda Fusarium prońla je kroz niz promena tokom poslednjih 100 godina. Iako je joń od XIX veka za vrste roda Fusarium poznat dvostruki modalitet razmnoņavanja, istorija taksonomije anamorfa mnogo je bogatija nego istorija 17 taksonomije teleomorfa za koji se moņe reći da nije proučavan sve do pred kraj XX veka. Rod Fusarium je heterogen, obuhvata veoma različite vrste u pogledu njihovih morfolońkih svojstava i taj broj varira od 9 do 78 (Nelson, 1991). Klasični taksonomski sistemi bazirani su na morfolońkim svojstvima kao ńto su oblik i veličina makrokonidija, prisustvo ili odsustvo mikrokonidija i hlamidospora, kao i struktura konidiofora (Windels, 1992). Mnogi pokuńaji učinjeni su da se stvori jedinstveni postupak za identifikaciju vrsta roda Fusarium. Svi dosadańnji pristupi identifikaciji vrsta zasnovani na morfolońkim svojstvima, imaju svojih prednosti, ali i nedostatke. Kao rezultat različitih sistema taksonomije i nomenklature, postoji velika konfuzija ńto se tiče identifikacije vrsta ovog roda. Pouzdano utvrĎivanje brojnosti i taksonomije vrsta roda Fusarium biće moguće tek nakon detaljnih filogenetskih proučavanja na molekularnom nivou. Novija proučavanja osnovne organizacije genoma vrsta roda Fusarium i njihovih morfolońkih i metaboličkih svojstava, koja su izloņena na Ńestom evropskom seminaru o vrstama roda Fusarium (Berlin, septembar 2000), ukazuju da će se filogenetsko stablo roda Fusarium razlikovati od filogenetskog stabla koje je za ovaj rod prikazao Booth (1971). Prema tome, tek se očekuju novi rezultati i definisanje odgovarajućih morfolońkih i drugih kriterijuma potrebnih za pravilnu identifikaciju i klasifikaciju vrsta ovog značajnog roda (loc. cit. Lević, 2008). Počev od septembra 2003. godine Gen Bank baza podataka sadrņi TEF sekvence poreklom od 463 izolata Fusarium spp. Od pomenutih i drugih sekvenci oformljena je prva generacija FUSARIUM−ID v. 1.0 baze podataka koja je 2004. godine sadrņala 175 sekvenci koje predstavljaju filogenetski različite TEF sekvence ovog roda (Geiser et al., 2004). Sekvencama se moņe pristupiti preko BLAST servera (http://fusarium.cbio.psu.edu). Postojeće grupe dobro su zastupljene u FUSARIUM−ID v. 1.0 bazi podataka, a posebno kompleks vrsta F. oxysporum, F. solani, G. fujikuroi i vrste koje biosintetińu trihotecen B−tip, kao ńto su G. zeae (Schw.) Petch kompleks, F. graminearum i njegovih 8 srodnih vrsta zajedno sa F. culmorum (W.G. Smith) Sacc., F. cerealis (Cooke) Sacc., F. lunulosporum Gerlach i F. pseudograminearum O‟Donnell &T. Aoki (O'Donnell et al., 1998a, 1998c; O'Donnell, 2000; O'Donnell et al., 2000a, 2000b; Geiser et al., 2001; Ward et al., 2002). Njima se pridruņuju grupe uzorkovane manje 18 puta koje su sposobne da biosintetińu trihotecen A−tip, uključujući F. lateritium Nees i srodnici. Ovde su prisutne i manje detaljno opisane vrste kao ńto su F. equiseti i F. longipes Wollenweber & Reinking. Vrste nalik pomenutim, koje nisu detaljno opisane predstavljene su u bazi podataka kao „Fusarium sp. cf“, zato ńto njihova identifikacija nije pouzdana i zahteva dodatna morfolońka i filogenetska istraņivanja. TakoĎe, desetine vrsta koje se filogenetski svrstavaju kao F. solani i F. oxysporum očekuju taksonomsko odreĎivanje (Geiser et al., 2004). Taksonomija anamorfa roda Fusarium. Vrste roda Fusarium dobile su naziv po fuzoidnom (vretenastom) obliku makrokonidija koji je opisao Link 1809 (loc. cit. Samuels et al., 2001). Prema najprihvaćenijoj klasifikaciji carstva Fungi, rod Fusarium je svrstan u razdeo Ascomycota, klasu Sordariomycetes, red Hypocreales i familiju Nectriaceae (Seifert and Lévesque, 2004). Makrokonidije sa bazalnom ćelijom u obliku stopala smatraju se stabilnom osobinom i čine osnovni kriterijum za klasifikaciju vrsta roda Fusarium. Taksonomija ovih vrsta je sve do 1900. godine bila zasnovana na proučavanju sporonosnih struktura, sporodohija koje su se obrazovale na biljnom materijalu i taksonomski kriterijum za vrstu je često bio opis vezan za pojedine domaćine (Nelson et al., 1983; loc. cit. Edel et al., 2001). Wollenweber and Reinking (1935) započeli su rad sa pribliņno 1000 naziva ovih gljiva koje su svrstali u 65 vrsta, 55 varijeteta i 22 specijalizovane forme, a sve to u 16 podgenetičkih sistema ili sekcija (loc. cit. Leslie et al., 2007). U razdvajanju sekcija Wollenweber and Reinking (1935) koristili su vaņne morfolońke kriterijume uključujući oblik makrokonidija i mikrokonidija, oblik (stopala) bazalne ćelije makrokonidija, prisustvo ili odsustvo hlamidospora, kao i mesto obrazovanja hlamidospora (interkalarno ili terminalno na hifi). Vrste, varijetete i specijalizovane forme podelili su u sekcije na osnovu boje stroma, prisustva ili odsustva sklerocija, broja poprečnih pregrada (septi), duņine i ńirine makrokonidija. Do sedamdesetih godina XX veka u Srbiji se najvińe primenjivao sistem Bilaieve (1955), posebno kod utvrĎivanja varijeteta i specijalizovanih formi. Prema ovom taksonomskom sistemu, rod Fusarium obuhvata 26 vrsta i 29 varijeteta rasporeĎenih u devet sekcija, pri čemu je sekcija Liseola kombinovana sa sekcijom Elegans, a sekcija Gibbosum sa Discolor. Danas se pri identifikaciji vrsta roda 19 Fusarium najńire koriste primarni taksonomski kriterijumi koje su opisali Booth (1971). Upotreba konidiogeneze ili prirode konidiogenih ćelija iz kojih se obrazuju mikrokonidije, omogućila je bolje razdvajanje vrsta u okviru sekcija Liseola i Sporotrichiella. Prema sistemu na osnovu kojeg je Booth (1971) opisao vrste i izvrńio njihovu klasifikaciju, rod Fusarium obuhvata 45 vrsta, ńest varijeteta i 100 specijalizovanih formi, uglavnom za vrste F. oxysporum (77) i F. solani (19), klasifikovanih u 12 sekcija. Za svrstavanje vrsta roda Fusarium u odreĎene taksone danas se sve čeńće koristi sistem koji su opisali Nirenberg and O'Donnell (1998). Prema ovom sistemu izolati gljiva gaje se na sintetičkoj nisko hranljivoj podlozi (SNA), a zatim se izolati liofilizuju i konzerviraju u tečnom azotu i deponuju u nekoj od poznatih meĎunarodnih kolekcija. Deponovanje kultura doprinosi zajedničkom saznanju o ovom kompleksnom rodu gljiva i doprinosi pouzdanijem razvoju strategije suzbijanja Fusarium spp. kao prouzrokovača brojnih bolesti biljaka (Summerell et al., 2003). Taksonomija teleomorfa roda Fusarium. Prema nomenklaturi koju su opisali Rossman et al. (1999), rod Fusarium se na osnovu teleomorfa klasifikuje u razdeo Ascomycota, klasu Sordariomycetes, red Hypocreales i familiju Nectriaceae. Vrste roda Fusarium polno se razmnoņavaju obrazujući teleomorfe svrstane u rodove Albonectria, Cosmospora, Gibberella i Haematonectria. Najveći broj vrsta pripada rodu Gibberella, obuhvatajući ekonomski značajne patogene i to G. zeae (anamorf F. graminearum), G. moniliformis Wineland (anamorf F. verticillioides) i kompleks vrste G. fujikuroi koji obuhvata 11 vrsta od kojih je za devet definisana polna populacija, koje su označene slovima od MP−A do MP−I (Samuels et al., 2001). Rezultati polnog ukrńtanja u skladu sa morfolońkim ispitivanjima i molekularnim podacima dobijenim sekvencioniranjem DNK, pokazali su usku povezanost (O'Donnell et al., 1998a). MeĎutim, O'Donnell et al. (1998a) sproveli su filogenetske analize koristeći nekoliko gena, meĎu kojima su β−tubulin i calmodulin i otkrili su 46 vrsta u kompleksu G. fujikuroi, od kojih su 23 nove za nauku (Moretti, 2009), a 11 vrsta je identifikovano primenom biolońkog i molekularnog koncepta i filogenetski predstavljaju sinonimne vrste, ńto ukazuje da filogenetski pristup moņe da obezbedi iste informacije kao biolońka načela i da druge polne populacije treba dalje identifikovati. 20 Peritecije vrsta roda Gibberella su pojedinačne ili na manjim stromama izbijaju kroz epidermis, povrńinske, okruglaste, plavičasto purpurne do tamno purpurne boje. Blago su neravnih zidova i bez izrańtaja. Askusi su uski, oblika palice, često s prstenom na vrhu i sadrņe 4 ili 8 askospora. Askospore su neseptirane ili sa 1−3 poprečne pregrade, elipsaste i prozirne. Oblik i broj poprečnih pregrada osnovni su metod za identifikaciju vrsta roda Gibberella. Prave askospore sa jednom poprečnom pregradom svojstvene su za populacije kompleksa vrste G. fujikuroi (sekcija Liseola i Dlaminia), zatim preovlaĎuju prave askospore sa 1 ili 3 poprečne pregrade za sekcije Lateritium, Roseum i Sporotrichiella, dok blago savijene askospore sa najčeńće 3 poprečne pregrade karakterińu sekcije Discolor i Gibbosum (Samuels et al., 2001). 2.7. Najznačajnije Fusarium vrste kao patogeni gajenog sirka Fusarium graminearum Schwabe [teleomorfni stadijum Gibberella zeae (Schwein.) Petch] jedan je od najdominantnijih, ńiroko rasprostranjenih i destruktivnih patogena koji prouzrokuje fuzarioznu plesnivost klasa (Fusarium head blight, FHB) strnih ņita ńirom sveta. Fuzarioza klasa (FHB) prvi put je opisana pre vińe od jednog veka i smatrana je glavnom pretnjom pńenici i ječmu tokom ranih godina XX veka (Dickson and Mains, 1929). Tokom poslednjih decenija dońlo je do pojave FHB u SAD i Kanadi, gde su zabeleņeni gubici od 3 milijarde dolara (McMullen et al., 1997; Windels, 2000). Fuzariozna plesnivost klasova moņe značajno smanjiti prinos i tehnolońki kvalitet zrna, a takoĎe moņe dovesti do indirektnih gubitaka, smanjujući klijavost semena i prouzrokujući plesnivost semena (Gilbert and Tekauz, 1995; Chongo et al., 2001). Pored toga inficirana zrna mogu sadrņati značajne količine mikotoksina kao sto su deoksinivalenol (DON) i zearalenon (ZEA) koji predstavljaju opasnost po zdravlje ņivotinja i ljudi, kao i bezbednosti hrane (McMullen et al., 1997). Dve prirodne i morfolońki različite populacije u okviru F.graminearum prvobitno su opisane od strane Purss (1969; 1971) i Francis and Burgess (1977) kao grupa 1 i grupa 2, na osnovu simptoma bolesti koje prouzrokuju i sposobnosti kultura da formiraju peritecije (Francis and Burgess, 1977). Uporedna analiza zasnovana na morfolońkim ispitivanjima i DNK sekvencioniranju dovela je do preimenovanja Grupe 1 F. graminearum u F. 21 pseudograminearum (telemorfni stadijum: Gibberella coronicolla Aoki and O'Donnell) (Aoki and O'Donnell, 1999a, 1999b). Populacija bivńe Grupe 2, danas klasifikovana kao F. graminearum (G. zeae), ima polni i bespolni stadijum, i makrokonidije i askospore mogu inficirati klasove ņita (Sutton, 1982). Heterogenost vste F. graminearum dokazuju i istraņivanja o stvaranju mikotoksina različitih izolata. Prinos i sadrņaj mikotoksina su kvantitativne odlike koje su pod znatnim uticajem i genetičkih i ekolońkih faktora (Wiśniewska et al., 2004). U pogledu biosinteze trihotecena, prethodno su opisana dva hemotipa F. graminearum: hemotip I koji biosintetińe DON i njegove derivate (3−AcDON, 15−AcDON) i hemotip II koji biosintetińe nivalenol (NIV) i fuzarenon−X (Fus−X). Kolonija F. graminearum na PDA podlozi obrazuje gustu, pamučastu miceliju ņute do ruņičaste boje sa belom do karmin crvenom ivicom. Pigment u podlozi je karmin crven sa smeĎom nijansom. Sporodohije su ņute, narandņaste ili crvenosmeĎe u starijim kulturama. Makrokonidije su prave do umereno srpaste, skoro prave ventralne i savijene dorzalne strane, sa četiri do ńest poprečnih pregrada. Vrńne ćelije su kupaste ili suņene u vidu kuke, dok su bazalne karakterističnog oblika stopala (Leslie and Summerell, 2006). Bezbojne do bledosmeĎe loptaste hlamidospore obrazuju se pojedinačno ili u nizovima, dok mikrokonidije nisu utvrĎene (Pitt and Hocking, 2009). Peritecije su ovalne, tamnoplave ili crne, u kojima se formiraju izduņeni i zaobljeni askusi koji sadrņe 4−6 askospora poreĎanih u dva ili jednom redu. Askusi su bezbojne ili svetlosmeĎe boje, savijene i zaobljenih krajeva sa jednom do tri poprečne pregrade (Leslie and Summerell, 2006). Geografska rasprostranjenost F. graminearum u vezi je sa temperaturnim zahtevima. U toplijim delovima sveta, uključujući delove SAD, Kanade, Australije i Centralne Evrope, F. graminearum je najznačajnija vrsta koja prozroukuje fuzarioznu plesnivost klasova (FHB) strnih ņita ńirom sveta. U hladnijim regionima Severozapadne Evrope, F. culmorum je najdominantnija vrsta, ali i F. poae (Peck) Wollenw. i Microdochium nivale (Fr.) Samuel et Hallet imaju veliki značaj. Na povrńinama gde je pńenica sa visokom incidencom fuzarioza klasa bila predusev, utvrĎeno je da stablo gajenog sirka parazitira F. graminearum, ńto moņe imati značajnu ulogu u odrņavanju vitalnosti ove gljive u Australiji (Burgess et al., 1996). 22 Prethodni usev i ņetveni ostaci osnovni su izvori inokuluma, pa setva ņita u infestirano zemljińte moņe dovesti do zaraze biljaka, razvoja paleņi klijanaca ili truleņi korena i prizemnog dela stabla (Dill−Macky and Jones, 2000). Kasnije u toku vegetacije, inokulum iz vazduha, obično u obliku konidija ili askospora, moņe inficirati klas biljke, prouzrokujući fuzarioznu plesnivost klasova. U uslovima visoke vlaņnosti vazduha (RH) ili kińe, na inficiranim klasovima moņe da se formira ruņičasta micelija i sporodohije, ńto dovodi do stvaranja makrokonidija, koje mogu inficirati sekundarne izdanke. Zaraņena zrna iz klasova, ako se koriste kao semenski materijal, mogu postati izvor inokuluma za razvoj paleņi klijanaca koji zavrńava ciklus bolesti (Parry et al., 1994). Drugi izvori inokuluma uključuju biljne domaćine kao ńto su soja (Martinelli et al., 2001), trave i ńirokolisne korove (Inch and Gilbert, 2003; Parry et al., 1995), ostatke uljane repice i stočnog grańka (Gilbert et al., 2003). MeĎutim, značaj korova kao izvora Fusarium inokuluma joń nije potvrĎen (Jenkinson and Parry, 1994). Česte padavine, visoka vlaņnost vazduha i jaka rosa u periodu cvetanja i ranog nalivanja klasa u usevu, pogoduju infekciji i razvoju bolesti (Lacey et al., 1999). Donekle olakńavajuća okolnost je da je zbog kratkog perioda osetljivosti, gljiva ograničena na jedan infekcioni ciklus u toku vegetacije (Bai and Shaner, 1994). Peritecije sazrevaju za devet do 10 dana u jako povoljnim uslovima (optimalna temperatura 29°C), a askospore se ńire vetrom, uglavnom noću, pri relativnoj vlaņnosti od 95 do 100% i temperaturama od 13 do 22°C. Za obrazovanje makrokonidija potrebne su vińe temperature nego za obrazovanje peritecija i askospora (28−32°C), ali one zahtevaju vlaņne uslove, te se uglavnom ńire spiranjem tokom padavina ili vetrom (Caron, 2000). Vetar je dugo bio smatran glavnim načinom prenońenja askospora i proučavanja pokazuju da moņe imati vaņnu ulogu u raznońenju inokuluma vrsta roda Fusarium (Parry et al., 1995; Gilbert and Tekauz, 2000). Kińa je joń jedan faktor koji igra vaņnu ulogu u prenońenju inokuluma, naročito makrokonidija (Parry et al., 1995; Fernando et al., 2000; Horberg, 2002), dok je svetlost takoĎe neophodan abiotski faktor za stvaranje peritecija i oslobaĎanje askospora G. zeae (Anderson, 1948; Tschanz et al., 1976; Caron, 1993). Izgleda da proces oslobaĎanja askospora ne zahteva direktnu svetlost, zato ńto se askospore oslobaĎaju noću (izmeĎu 16 h i ponoći) sa povećanjem RH vazduha, odnosno sniņavanjem temperature (Paulitz, 1996; Inch et al., 2000; 23 Schmale et al., 2002). MeĎutim, Trail et al. (2002) objavili su da je u laboratorijskim uslovima oslobaĎanje askospora bilo za 8−30% veće na svetlosti nego u potpunom mraku. Proučavanja na molekularnom nivou ukazuju na to da je F. graminearum genetski veoma heterogena vrsta, za koju se dugo smatralo da je u pitanju jedna vrsta koja se javlja na ńest kontinenata (Taylor et al., 2000; O’Donnell et al., 2000b; Ward et al., 2002). Rezultati filogenetske analize dobijeni korińćenjem DNK sekvenci ńest nuklearnih gena (7.1 kb) 99 izolata F. graminearum sakupljenih iz različitog biljnog materijala ńirom sveta, doveli su do otkrića sedam biogeografski različitih vrsta unutar klastera F. graminearum (Fg klaster) (O’Donnell et al., 2000b). Ward et al. (2002) predloņili su novu osmu vrstu, označenu kao vrsta 8 unutar Fg klastera. Nastavljajući istraņivanja koja su uključila 11 nuklearnih gena (13.6 kb) i O’Donnell et al. (2004) identifikovali su osam ranije poznatih i novu filogenetski različitu vrstu i dodelili im nova imena: [1] Fusarium austroamericanum, [2] Fusarium meridionale, [3] Fusarium boothi, [4] Fusarium mesoamericanum, [5] Fusarium acacie−mearnsii, [6] Fusarium asiaticum, [7] Fusarium graminearum, [8] Fusarium cortaderie i [9] Fusarium brasilicum (O'Donnell et al., 2004). Dalja istraņivanja Starkey et al. (2007), O’Donnell et al. (2008) i Yli−Mattila et al. (2009) pokazala su da je „Grupa 2‟ identifikovana kao F. graminearum sensu stricto i da sadrņi najmanje 13 odvojenih vrsta, koje imaju različitu geografsku rasprostranjenost, različitu sposobnost stvaranja trihotecena, i različitu postojanost na pojedinim usevima (O’Donnell et al., 2000b; Cumagun et al., 2004; O’Donnell et al., 2004). Fusarium equiseti (Corda) Saccardo [teleomorfni stadijum Gibberella intricans Wollenweber.] kosmopolit je, ńiroko rasprostranjen od Aljaske do tropskog pojasa, gde ga karakterińe saprobni porast i odrņavanje u zemljińtu i često se javlja kao patogen slabosti koji prouzrokuje truleņ stabla i korena različitih vrsta biljaka (Domsch et al., 1980; loc. cit. Pitt and Hocking, 2009). Izolovan je iz velikog broja biljaka, posebno iz semena ņita (Leslie and Summerell, 2006), kukuruza (Desjardins, 2006), ječma, raņi, pirinča, kikirikija, oraha, soje, sirka, raznih korova (Pitt and Hocking, 1997), paprike 24 (Shukla and Sharma, 2000), banane (Jiménez et al., 1993), tikava (Burgess et al., 1994), krompira (El−Hassan et al., 2004) i bundeve (Elmer, 1996). Za F. equiseti utvrĎeno je da biosintetińe brojne sekundarne metabolite i mikotoksine. Iako su produkti trihotecena koje biosintetińe F. equiseti varijabilni, zastupljena su oba tipa trihotecena: trihotecen tip A (diacetoksiscirpenol, T−2 toksin, HT−2 toksin i neosolaniol) i trihotecen tip B (DON, 15−AcDON, fuzarenon−X i nivalenol). TakoĎe biosintetińe i ZEA, moniliformin, bovericin, fuzarohromanon, dok biosintezu butenolida treba tek potvrditi (Desjardins, 2006). Kolonija F. equiseti na PDA podlozi obrazuje gustu, pamučastu miceliju bele do dim ruņičaste, koja postaje beņ do ņutosmeĎe boje u starijim kulturama. U sredińnjem delu kolonije obrazuju se narandņaste do smeĎe sporodohije, koje su slabo vidljive jer su prekrivene micelijom, a sa naličja podloge uočava se smeĎa centralna povrńina, odnosno tamnosmeĎe mrlje. Makrokonidije su izraņeno savijene, srpaste sa pet do sedam poprečnih pregrada. Vrńne ćelije su vińe ili manje izduņene, suņene i ńiljaste prema kraju, dok su bazalne karakterističnog oblika stopala. Brojne loptaste hlamidospore obrazuju se veoma brzo, dok mikrokonidije nisu utvrĎene (Pitt and Hocking, 2009). F. equiseti ispoljava veoma brz porast na 30°C (Burgess et al., 1994), dok su zapaņanja u laboratorijskim uslovima pokazala da većina izolata raste slabo ili čak uopńte ne raste na 37°C (Tripathi et al., 1999). Ńto se tiče ostalih ekolońkih svojstava, Pitt and Hocking (2009) zabeleņili su porast kolonija izmeĎu pH 2 i 11. Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg [teleomorfni stadijum Gibberella intermedia (Kuhlman) Samuels] ima heterotalusan način polnog razmnoņavanja i pripada populaciji D u okviru kompleksa vrste G. fujikuroi. Mada do obrazovanja peritecija retko dolazi u prirodi (Bowden and Leslie, 1999), upravo je test ukrńtanja polnih tipova podrņao razdvajanje kompleksa vrste G. fujikuroi na 9 populacija ili biolońki različitih vrsta (Samuels et al., 2001; Gordon et al., 2001; Zeller et al., 2003). F. proliferatum prvi put je opisana od strane Matsushima (1971) kao vrsta roda Cephalosporium, a kasnije je Nirenberg (1976) svrstava meĎu vrste roda Fusarim (Leslie and Summerell, 2006). PronaĎena je na biljkama kukuruza ńirom sveta, a sve vińe je značajan patogen u Evropi kao prouzrokovač truleņi klipa kukuruza (Desjardins, 2006; Leslie and Summerell, 2006). Javlja se na gajenom sirku u Nigeriji (Onyike and 25 Nelson, 1992) i leńniku u Ńpaniji (Marin et al., 2007). U Jugoistočnoj Aziji velike ńtete prouzrokuje na kukuruzu, pasulju, pirinču i ponekad na gajenom sirku (Pitt et al., 1998). F. proliferatum takoĎe je prouzrokovač crne pegavosti pńenice (Conner et al., 1996; Desjardins et al., 2007). Značajan je patogen banana (Jiménez et al., 1993), crnog luka (Toit et al., 2003; Stanković et al., 2007), belog luka (Dugan et al., 2003, 2007; Stanković et al., 2007) i asparagusa (Elmer et al., 1997). Ńirok krug domaćina proizilazi iz njegove sposobnosti da biosintetińe fumonizin koji je izolovan iz naizgled neočekivanih uzoraka, kao ńto su beli luk i asparagus (Logrieco et al., 1998; Seefelder et al., 2002; Stanković et al., 2007). Izolati F. proliferatum sintetińu visok nivo fumonizina u kulturama (Leslie et al., 2005), a dodatno biosintetińu i niz drugih sekundarnih metabolita, kao ńto su moniliformin, bovericin, enijatin i fuzarin (Desjardins, 2006). Kolonija F. proliferatum na PDA podlozi obrazuje pamučastu miceliju bele do ruņičaste i mrkoņute boje. Pigment u podlozi je ljubičast ili skoro crn, a zbog velikog broja obrazovanih sklerocija, kolonija ima tamnoplavu boju. Sporodohije su bledonarandņaste do mrke boje, prisutne kao odvojena celina ili su skoro sastavljene iznad dela kolonije. Makrokonidije su blago srpaste, skoro prave ńto je tipično za vrste kompleksa G. fujikuroi, sa tri do pet poprečnih pregrada. TakoĎe obrazuje mikrokonidije iz monofijalida i polifijalida u vidu laņnih glavica i kraćih ili dugih nizova. F. proliferatum ne obrazuje hlamidospore (Leslie and Summerell, 2006). Fusarium thapsinum Klittich, Leslie, Nelson & Marasas [teleomorfni stadijum Gibberella thapsina Klittich, Leslie, Nelson & Marasas] ima heterotalusan način razmnoņavanja i pripada populaciji F u okviru kompleksa vrste G. fujikuroi. Prvi put je opisana od strane Klittich et al. (1997), a pre toga je poznata kao F. verticillioides (Leslie and Summerell, 2006). Razdvajanje vrste F. thapsinum učinjeno je na osnovu detekcije i svojstava teleomorfa G. thapsina, kao i na osnovu polne izolovanosti i brojnih fiziolońkih svojstava, uključujući krug domaćina i biosintezu toksina (Klittich et al., 1992). Malo je podataka o tome da li su F. thapsinum i F. verticilliodes izolovane iz gajenog sirka (Leslie et al., 1990; Petrović et al., 2009). F. thapsinum prouzrokovač je truleņi stabla i plesnivosti zrna sirka i ispoljava izraņenu patogenost za klijance sirka u in vitro uslovima (Leslie et at., 2005). 26 Uglavnom kolonizira metlicu biljke ńto indukuje sintezu 3'−deoksiantocijanina, jedinjenja odgovornog za stres biljke (Little and Magill., 2004). U slučaju niņeg intenziteta plesnivosti, seme sirka moņe imati značajno smanjenu klijavost (Prom et al., 2003). Osim sa gajenog sirka F. thapsinum izolovana je iz banane, kukuruza i kikirikija (Klittich et al., 1997; Leslie, 1991) i sa stepskih trava Severne Amerike (Leslie et al., 2004). Ova vrsta geografski je ńiroko rasprostranjena, pronaĎena je u Africi, Aziji i Severnoj Americi. F. thapsinum moņe da sintetińe visok nivo moniliformina, neńto manje u tragovima fumonizin, a takoĎe i fuzarinsku kiselinu (Porter et al., 2000; Porter et al., 2002). Kolonija F. thapsinum na PDA podlozi obrazuje miceliju bele do bledonarandņaste boje. Pigmentacija u podlozi je veoma varijabilna, većina izolata proizvodi krakterističan ņut pigment, dok ostali izolati luče pigment ljubičaste boje ili pigmenti čak nisu prisutni. Sporodohije mogu da budu bledonarandņaste boje, ali najčeńće nisu prisutne. F. thapsinum obrazuje mikrokonidije iz monofijalida u vidu laņnih glavica ili nizova, ovalnog do jajastog oblika, i prave ili blago savijene makrokonidije, najčeńće sa tri do pet poprečnih pregrada. Hlamidospore kod F. thapsinum nisu utvrĎene (Leslie and Summerell, 2006). 27 3. CILJEVI ISTRAŢIVANJA Istraņivanja u okviru ove doktorske disertacije obuhvatila su utvrĎivanje prisustva i rasprostranjenosti gljiva iz roda Fusarium patogena gajenog sirka [Sorghum bicolor (L.) Moench] u Srbiji. Mada su vrste roda Fusarium na različitim kulturama ranije proučavane, o kompleksu vrsta patogenih za gajeni sirak u Srbiji ima malo podataka, naročito o njihovoj varijabilnosti i patogenosti. Osnovni cilj istraņivanja u okviru ove doktorske disertacije bio je rasvetljavanje etiologije prouzrokovača truleņi korena i prizemnog dela stabla i propadanja klijanaca sirka, kao i pouzdana identifikacija i karakterizacija izolovanih gljiva do nivoa vrste, ispitivanjem morfolońkih i patogenih svojstava, kao i primenom molekularnih metoda. Razvijanje i primena protokola za molekularnu identifikaciju prouzrokovača pruņa osnovu za brzu i preciznu identifikaciju, kao i odreĎivanje tačne taksonomske pozicije prouzrokovača kroz rekonstrukciju filogenetskog stabla na osnovu vińe gena uključenih u ispitivanja. Od velikog značaja je i to ńto će dobijeni rezultati predstavljati uvod u bliņu genetičku karakterizaciju, kao i brzo i lako razlikovanje morfolońki sličnih vrsta roda Fusarium. Sekvencioniranje vińe odgovarajućih delova genoma dobijenih izolata, njihovo meĎusobno poreĎenje i odreĎivanje filogenetskog meĎuodnosa sa drugim izolatima u svetu, doprinose poznavanju strukture populacije vrsta roda Fusarium a kroz to doprinose razvijanju uspeńne strategije suzbijanja ovih veoma ńtetnih patogena. Rezultati ovih ispitivanja ukazuju i na postojanje različitih vidova osetljivosti komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala prema prevalentnim vrstama Fusarium spp., koji će se dalje koristiti u programima oplemenjivanja sirka na osetljivost. Od naročitog značaja je i uporedno ispitivanje osetljivosti genotipova u eksperimentalnim uslovima, u stakleniku, kao i u uslovima veńtačke inokulacije i prirodne zaraze, čime će se dobiti realni podaci o potencijalu ovih genotipova u agroekolońkim uslovima Srbije. 28 4. MATERIJAL I METOD RADA 4.1. Sakupljanje uzoraka obolelih biljaka Sakupljanje početnog materijala za ispitivanja obavljeno je tokom trogodińnjeg perioda 2009−2011. na četiri lokaliteta gajenja sirka u Vojvodini, Bački Petrovac (rejon Juņna Bačka), Senta (rejon Severni Banat), Novi Ņednik i Čantavir (rejon Severna Bačka). Na oglednoj parceli gajenog sirka u Bačkom Petrovcu i proizvodnom usevu u Čantaviru obavljeno je prikupljanje uzoraka biljaka sirka dve različite gajene forme, sirak za zrno (F1 hibridi 'Alba' i 'Gold') i sirak metlań (sorte 'Prima' i 'Reform') tokom tri godine istraņivanja. Kao izvorni materijal za izolaciju patogena korińćene su biljke sa simptomima fuzariozne truleņi prizemnog dela stabla i korena, kao i zaraņeno seme prikupljeno sa poleglih biljaka. Kako Fusarium spp. mogu da se odrņe i prenesu zaraņenim semenom, početni materijal predstavljao je i seme sirka, komercijalno prisutno na trņińtu ili dobijeno u razmeni sa naučno istraņivačkom organizacijom, Institutom za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac. Ukupno je analizirano 16 uzoraka semena četiri različite sorte sakupljeno tokom tri godine, a sve u cilju izdvajanja patogenih izolata Fusarium za dalja istraņivanja. U cilju pronalaņenja plodonosnih tela (peritecija) vrsta roda Fusarium na prezimelim zaraņenim ostacima i preliminarne identifikacije patogena, tokom proleća 2011. godine vrńen je detaljan pregled prezimelih zaraņenih biljnih ostataka sirka od prethodne godine kada je zabeleņen visok nivo prirodnih zaraza i veliki broj poleglih biljaka sirka u proizvodnom usevu u Čantaviru. Nakon sakupljanja, zaraņen biljni materijal je pakovan u papirne kese, obeleņen i transportovan do Laboratorije Katedre za fitopatologiju, Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu, gde je dalje ispitivan. Svaki prikupljen uzorak detaljno je pregledan vizuelno i pod stereo mikroskopom, radi utvrĎivanja prisustva sporodohija, peritecija ili prisustva hifa u obolelom tkivu. 4.2. Izolacija patogena Sa prizemnog dela stabla prikupljenih uzoraka obavljena je izolacija na krompir−dekstroznu podlogu (potato dextrose agar, PDA) (Kiraly et al., 1970) prema standardnim fitopatolońkim metodama. Podloga je pripremana od 200 g krompira, 29 17−20 g dekstroze (Dectrose, Torlak, Institut za imunobiologiju i virusologiju, Beograd), 17−20 g agara (Agar−agar, Torlak, Institut za imunobiologiju i virusologiju, Beograd) i 1 l destilovane vode. Pre sterilizacije, pH vrednost podloge je podeńena na 5.5−6.0 (Muntanola−Cvetković, 1987), a sterilizacija je obavljena autoklaviranjem na 121°C i pri pritisku od 121,6 Pa. Sterilnim skalpelom isečeni su fragmenti tkiva sa uzduņnog preseka stabla, sa prelaza izmeĎu zdravog i obolelog, a potom su povrńinski sterilisani u 2% rastvoru natrijum−hipohlorita (NaOCl, komercijalna varikina) u trajanju od tri minuta i ispirani u sterilnoj vodi. Povrńinski sterilisani i usitnjeni fragmenti stabla postavljeni su na hranljivu podlogu PDA i inkubirani 7−10 dana u termostatu pri temperaturi 25°C, u uslovima mraka. Izdvajanje čistih kultura gljiva koje su se razvijale oko fragmenata biljnog materijala izvrńeno je u aseptičkim uslovima presejavanjem fragmenata podloge sa micelijom na sveņu podlogu, sedam dana posle inkubacije. Iz 12 uzoraka zaraņenog semena gajenog sirka, dva hibrida ('Alba' i 'Gold') i dve sorte ('Prima' i 'Reform') prikupljenih odmah nakon berbe sa obolelih biljaka i četiri uzorka komercijalnog semena obavljena je izolacija metodom naklijavanja semena na hranljivu PDA podlogu. Svaki od odabranih uzoraka analiziran je u četiri ponavljanja, od po 100 semena u ponavljanju. Prikupljeni uzorci semena najpre su ispirani 2 h pod mlazom česmenske vode, a potom povrńinski sterilisani u 2% rastvoru natrijum−hipohlorita (NaOCl, komercijalna varikina) u trajanju od dva minuta (Singh et al., 1991) i ispirani dva puta u sterilnoj vodi. Sterilisana zrna su osuńena na sterilnom filter papiru, a zatim su rasporeĎena na povrńinu PDA podloge i inkubirana sedam dana pri 25°C i fotoperiodu u trajanju od 12 h. U svaku Petri kutiju postavljano je po pet semena koja su bila pravilno rasporeĎena da bi se izbegla kontaminacija. Iz ruba kolonije obrazovane oko semena izvrńeno je presejavanje fragmenata podloge sa micelijom na sveņu podlogu. Kolonije koje su se razvile oko semena nakon inkubacije preliminarno su identifikovane do nivoa roda na osnovu makroskopskih i mikroskopskih svojstava, ńto je posluņilo za odreĎivanje nivoa zaraze i učestalosti njihovog prisustva. 4.3. Dobijanje čistih kultura monosporijalnih izolata i njihovo čuvanje U cilju dobijanja uniformnih i čistih kultura, sedam dana nakon razvoja inicijalnih kolonija izvrńena je monosporijalna izolacija gljive na selektivnu podlogu sa 30 sterilnim fragmentima lista karanfila (carnation leaf piece agar, CLA) (Fisher et al., 1982). Ova podloga stimulativno deluje na sporulaciju i pripremana je od 15−20 g agara (Agar−agar, Torlak, Institut za imunobiologiju i virusologiju, Beograd), 1 l destilovane vode i nekoliko sterilnih listova karanfila (5 komadića na 10 ml podloge). U razvijene čiste kulture dodato je po 10 ml sterilne vode i blagim struganjem pomoću staklenog ńtapića obavljeno je osloboĎanje micelije i konidija od podloge. Po 1 ml tako dobijene suspenzije spora koncentracije (1x10 -3) razliveno je na povrńinu podloge od vodenog agara (water agar, WA) (Dhingra and Sinclair, 1986). Ova podloga pripremana je od 17 g agara (Torlak, Institut za imunobiologiju i virusologiju, Beograd) i 1 l destilovane vode. Nakon inkubacije u termostatu pri temperaturi 25°C u trajanju od 18−20 h, pri direktnim mikroskopiranjem, obeleņavane su i izdvajane pojedinačne proklijale konidije svakog izolata, a zatim su sterilnom iglom prenete na novu CLA podlogu (Burgess et al., 1994). Razvojem ovako presejanih pojedinačnih klijalih konidija dobijeno je vińe monosporijalnih kultura svakog pojedinačnog izolata. Dobijeni monosporijalni izolati gljive presejani su u epruvete sa zakońenom CLA podlogom, a nakon razvoja kultura čuvani u friņideru na 4°C. Na ovaj način formirana je kolekcija izolata koja je presejevana svakih ńest meseci i korńćena za dalji rad. 4.4. Provera patogenosti i izbor izolata za dalja ispitivanja U cilju provere patogenosti svih dobijenih monosporijalnih izolata gljive iz zaraņenog stabla i semena sirka uraĎene su veńtačke inokulacije biljke domaćina. Test provere patogenosti odabranih izolata obavljen je na dva načina, direktnom inokulacijom klijanaca sirka u uslovima staklenika (Chambers et al., 1988), kao i inokulacijom klijanaca in vitro (Mesiaen et al., 1959). U ispitivanja je uključeno svih 13 izolata odabranih za dalja istraņivanja poreklom iz Bačkog Petrovca i Čantavira, 8 izdvojenih iz prizemnog dela stabla sirka i 5 sa semena. Prvi način provere patogenosti svih dobijenih monosporijalnih izolata obavljen je u uslovima staklenika na klijancima hibrida sirka za zrno ('Alba', 'Gold') i sorti sirka metlańa ('Prima', 'Reform') u fenofazi bokorenja. Inokulacija biljaka obavljena je injektiranjem sterilnim ńpricem suspenzije konidija gljive u stablo klijanaca sirka 1 cm iznad nivoa zemljińta. Suspenzija konidija pripremljena je od kultura odabranih izolata starih sedam dana, koje su odgajane na PDA podlozi pri temperaturi od 25ºC i 31 fotoperiodu u trajanju od 12 sati. U razvijene kolonije naliveno je 5 ml sterilne vode i micelija je odvajana od podloge staklenim ńtapićem u cilju oslobaĎanja formiranih konidija. Koncentracija dobijene suspenzije podeńena je pomoću hemocitometra na 1x10 3 konidija/ml. Tako pripremljenom supenzijom konidija svakog izolata inokulisano je po 10 biljaka, a kao negativna kontrola korińćeni su klijanci sirka inokulisani sterilnom vodom. U cilju obezbeĎenja uslova povińene vlaņnosti, biljke su po inokulaciji pokrivane PVC folijom koja je nakon dva dana uklonjena. Pojava simptoma posmatrana je svakodnevno do dve nedelje posle inokulacije. Sa prizemnog dela stabla svih biljaka na kojima su se razvili simptomi, izvrńena je reizolacija korińćenjem istih metoda kao pri izolaciji. Ceo ogled ponovljen je dva puta. Test provere patogenosti postavljen je i u laboratorijskim uslovima, na klijancima razvijenim u epruvetama sa Knopovom podlogom (Knop agar) koja je pripremana od 0,8 g Ca (NO3)2 x 4H2O; 0,2 g KNO3; 0,2 g KH2PO4; 0,2 g MgSO4 x 7 H2O; u tragovima FeSO4; 20 g agara i 500 ml destilovane vode (Tuite, 1969). Na dnu epruvete zakońene Knopove podloge postavljen je fragment kolonije gljive, a povrńinski sterilisano i prosuńeno seme sirka, paņljivo je utisnuto u podlogu 2 cm iznad mesta postavljenog inokuluma (Mesiaen et al., 1959). Kao negativna kontrola posluņilo je seme sirka postavljeno na podlogu bez inokuluma. Zasejano je pet epruveta, odnosno ponavljanja po svakom izolatu uključenom u ispitivanja. Potom su epruvete postavljene vertikalno i dve nedelje odrņavane u laboratoriji pri sobnoj temperaturi (21−25ºC) i prirodnim uslovima smene dana i noći. Ocena uspeha inokulacije vrńena je vizuelno na osnovu pojave simptoma u vidu nekroze na korenu i stablu klijanaca. Sa klijanaca na kojima su se razvili simptomi, izvrńena je reizolacija korińćenjem istih metoda kao pri izolaciji. Ceo ogled ponovljen je dva puta. Nakon dobijanja većeg broja izolata Fusarium spp. iz biljaka sa simptomima u polju ili semena, i potvrĎivanja njihove patogenosti na klijancima sirka, pristupilo se izboru izolata čija će svojstva biti detaljnije proučavana i na osnovu čega će biti obavljena njihova identifikacija. Izolati dokazane patogenosti grupisani su prema osnovnim morfolońkim kriterijumima (izgledu i boji kolonije, brzini porasta na PDA podlozi i obliku makrokonidija) i odabrani su reprezentativni predstavnici. Za ispitivanja patogenih, morfolońkih i molekularnih svojstava ukupno je odabrano 13 izolata Fusarium spp. različitog porekla (tabela 2). U komparativna proučavanja 32 uključena su i četiri referentna izolata: F. andiyazi (RBG5287), F. equiseti (RBG851), F. proliferatum (RBG5349) i F. thapsinum (RBG5255) iz kolekcije Botanic Gardens Trust, Plant Pathology, Sydney, Australia. Tabela 2. Poreklo izolata Fusarium spp. odabranih za dalja proučavanja Grupa Oznaka izolata Lokalitet Biljka domaćin Sorta/ hibrid I 286−09 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (prizemni deo stabla) 'Reform' II 297a−09 Čantavir sirak (prizemni deo stabla) 'Alba' 13−10 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (seme) 'Reform' 521−10 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (prizemni deo stabla) 'Gold' 522−10 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (prizemni deo stabla) 'Reform' 530−10 Čantavir sirak (prizemni deo stabla) 'Prima' III 532−10 Čantavir sirak (prizemni deo stabla) 'Reform' 535−10 Čantavir sirak (prizemni deo stabla) 'Gold' 536−10 Čantavir sirak (prizemni deo stabla) 'Alba' IV 808−11 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (seme) 'Gold' V 291−09 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (seme sa zaraņene metlice) 'Gold' 315−09 Institut za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac sirak (seme) 'Alba' 539−10 Čantavir sirak (seme sa zaraņene metlice) 'Gold' 4.5. Morfološka svojstva anamorfa Kako vrste roda Fusarium imaju sposobnost da variraju u morfolońkim svojstvima (oblik i veličina makrokonidija, način obrazovanja mikrokonidija, obrazovanje hlamidospora ili boja kolonija), pouzdana morfolońka identifikacija vrsta zahteva razvoj kultura na najmanje dve ili tri hranljive podloge. Preliminarna identifikacija obavljena je na osnovu proučavanja morfolońkih makroskopskih i mikroskopskih svojstava odabranih monosporijalnih izolata istovremeno na tri hranljive 33 podloge PDA, CLA i sintetičkoj nisko hranljivoj podlozi SNA (Spezieler Nährstoffarmer agar) prema kriterijumima Summerell et al. (2003). SNA pripremana je od 1 g KNO3; 1 g KH2PO4; 0,5 g MgSO4 x 7H2O; 0,5 g KCl; 0,6 ml 1M NaOH; 0,2 g glukoze; 0,2 g saharoze; 15 g agara i 1 l destilovane vode. Na povrńinu podloge, koja joń nije u potpunosti ņelatinizirana, prema periferiji kutije stavljen je komadić (2x3 cm) sterilnog filter papira, koji stimulińe sporulaciju gljiva (Nirenberg, 1976). Filter papir se sterilińe tako ńto se 50 listića filter papira (2x3 cm) stavi u Erlenmajerovu bocu od 100 ml i jedan papirni tampon natopljen u destilovanoj vodi, a potom se boca zatvara zapuńačem i sterilińe u autoklavu. Kao standardna podloga za utvrĎivanje makroskopskih svojstava gljiva, (intenziteta rasta kolonije, obrazovanje boje kolonije i pigmenta u podlozi) korińćena je PDA podloga (Nelson et al., 1983; Burgess et al., 1994). Za utvrĎivanje mikroskopskih svojstava, monosporijalne kulture odabranih izolata gajene su na prirodnoj nisko hranljivoj podlozi CLA koja stimulińe sporulaciju i obrazovanje uniformnih makrokonidija (Burgess et al., 1994) i na sintetičkoj SNA podlozi na kojoj se obrazuju obilne mikrokonidije različitih oblika, kao i hlamidospore (Nirenberg and O'Donnell, 1998). Prema Burgess et al. (1994) makroskopska svojstva (izgled i boja kolonija, pigmentacija podloge) proučavane su u monosporijalnim kulturama gajenih sedam dana na PDA u mraku, pri 25ºC. Ispitivanje mikroskopskih morfolońkih svojstava reproduktivnih organa obuhvatilo je utvrĎivanje tipa konidiofora ili fijalida (konidiogene ćelije s jednim − monofijalida ili vińe otvora − polifijalida), oblika i dimenzija makrokonidija, kao i prisustva ili odsustva mikrokonidija i hlamidospora (Burgess et al., 1994; Nirenberg and O'Donnell, 1998). Kulture izolata starosti 10−14 dana, odgajene na CLA i SNA podlozi, pri cikličnom smenjivanju svetlosti i tame u intervalima od po 12 h direktno su pregledane pomoću mikroskopa (in situ) pri uvećanju od 100x. Od kultura svih izolata pripremani su i nativni preparati za odreĎivanje izgleda konidiofora i konidija. Nativni preparat pripreman je u kapi sterilne vode u koju je sterilnom iglom nanet fragment kolonije, a potom prekriven pokrovnim staklom i posmatran uz pomoć optičkog mikroskopa Olympus CX41, pod direkntim uvećanjima od 40x do 100x. Prosekom obračunatim za najmanje 100 ponovljenih merenja, odreĎivana je veličina konidija. Sve dimenzije su merene na slučajno odabranim, potpuno formiranim i zrelim konidijama u vidnom polju nativnog preparata. 34 Pońto se hlamidospore često obrazuju u starijim kulturama, mesec dana stare kulture su ponovo pregledane, kako bi se definitivno utvrdilo njihovo prisustvo. 4.6. Morfološka svojstva teleomorfa (peritecija) Pored proučavanja anamorfa prouzrokovača fuzarioze sirka, u toku vegetacije, kao i u toku zimskog mirovanja u usevima sirka u lokalitetu Čantavir vrńen je pregled, odnosno ispitivano je prisustvo teleomorfnih struktura ovih gljiva. Zaraņeni ostaci sirka prezimeli na povrńini zemljińta u prirodnim uslovima sakupljeni su u proleće, tokom marta 2011. godine kada je ispitivano prisustvo peritecija na donjim nodusima i osnove zaraņenog stabla. Morfolońka svojstva teleomorfa ispitivana su iz prikupljenih peritecija gljive koje su bile formirane na prirodno zaraņenim stablima sirka. Posmatranjem pod binokularom (Leica WILD M3Z), uočene peritecije na osnovi inficiranog stabla, uz pomoć sterilne kopljaste igle izdvojene su i prenete u kap tečnosti na mikroskopskoj pločici. Nakon nekoliko minuta su smrvljene iglom radi ispitivanja prisustva reproduktivnih tvorevina koje su direktno posmatrane pod optičkim mikroskopom Olympus CX41, pod direktnim uvećanjima od 40x do 100x koristeći svetla i tamna polja i fazni kontrast. Direktnim mikroskopiranjem ustanovljeni su izgled i svojstva askospora: oblik, boja, broj poprečnih pregrada i merena je veličina. Za odreĎivanje veličine mereno je po 20 peritecija kao i 100 slučajno odabranih askospora, u dva ponavljanja. 4.7. Molekularna detekcija i identifikacija Molekularna detekcija i identifikacija ispitivanih izolata Fusarium spp., obavljena je selektivnim umnoņavanjem pet genskih segmenata DNK iz ITS (Internal transcribed spacer) regiona jedarne DNA (deo 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 i deo 28S rRNA), tri različita regiona proteinskih nuklearnih gena, elongacioni faktor TEF−1α; β−tubulin i calmodulin, kao i mtSSU rDNK mitohondrijalnog gena (mitohondrijalna mala podjedinica ribozomske DNK), primenom metode lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR). Analizom introna proteinskih gena (TEF−1α, β−tubulin i calmodulin) moguće je dobiti potrebne informacije za razlikovanje izolata do nivoa vrste. Ovi geni su manje univerzalni nego ribozomski, a prajmeri su ograničeni na region introna (Zeller and Geiser, 2003). Nakon 35 sekvencioniranja amplifikovanih fragmenata, utvrĎena je njihova nukleotidna sličnost sa sekvencama dostupnim u GenBank bazi podataka (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland, USA). U molekularna ispitivanja uključeno je 13 odabranih izolata (286−09, 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10, 532−10, 535−10, 536−10, 808−11, 291−09, 315−09 i 539−10), koji su dobijeni izolacijom iz biljaka sa simptomima truleņi prizemnog dela stabla sirka i iz zaraņenog semena kojima je potvrĎena patogenost, a koji su prethodno okarakterisani na morfolońkom nivou. U ispitivanja su uključeni i izolati tri referentne vrste F. equiseti (RBG851), F. proliferatum (RBG5349) i F. thapsinum (RBG5255), kao i jedan uzorak (14−11) iz prezimele zaraņene stabljike sirka sa formiranim peritecijama. 4.7.1. Ekstrakcija DNK U cilju iznalaņenja najbolje i najosetljivije procedure za molekularnu detekciju gljiva iz roda Fusarium patogena gajenog sirka, molekularna detekcija odabranih izolata Fusarium spp. uraĎena je primenom dve različite procedure ekstrakcije ukupne količine dezoksiribonukleinskih kiselina (DNK) i to pomoću: DNeasy Plant Mini Kit−a (Qiagen, Hilden, Germany) i standardne CTAB (Cetyltrimethylamonium bromide) metode (O’Donnell et al., 1998a). Primenom obe metode, ekstrakcija je vrńena iz različito pripremljenog početnog materijala ispitivanih izolata. Ekstrakcija DNK pomoću DNeasy Plant Mini Kit−a (Qiagen, Hilden, Germany). Korińćenjem komercijalnog kita DNeasy Plant Mini Kit, primenom postupka po uputstvima proizvoĎača, ukupne DNK ekstrahovane su iz početnog materijala pripremljenog na tri načina: iz micelije čistih kultura patogena odgajenih na tečnoj PDB podlozi (zamrznute na −80ºC), iz vazduńne micelije sakupljene direktno iz kolonija odgajenih na PDA podlozi, i iz peritecija formiranih na prezimelim zaraņenim stabljikama sirka. Odabrani izolati su gajeni u tečnoj krompir dekstroznoj čorbi (PDB, potato dextrose broth, Konstantinova et al., 2002), pripremljenoj od 200 g krompira i 20 g dekstroze. U Erlenmajer kolbe razliveno je 150 ml PDB, sterilisane i zasejane sa pet fragmenata kolonije (1 cm 2 ) iz kultura starih sedam dana, odgajenih na PDA pri 24ºC, u 36 mraku. Zasejane Erlenmajer kolbe inkubirane su 15 dana u mraku, pri 24ºC, uz povremeno meńanje horizontalnom rotacijom. Tečne kulture odabranih izolata filtrirane su preko sloja filter papira, a micelija sakupljena i osuńena pod vakumom. Osuńena micelija podeljena je u porcije od 100 mg i zamrznuta na –80ºC i tako čuvana do korińćenja. Drugi način pripreme uzoraka za ekstrakciju ukupnih DNK obuhvatio je direktno sakupljanje vazduńne micelije sterilnim skalpelom sa kolonija ispitivanih izolata starih sedam dana odgajenih na PDA, pri 24ºC, u mraku. Micelija je sakupljena paņljivo da se izbegne unońenje fragmenata podloge u početni materijal za ekstrakciju. Zaraņeni biljni materijal označen kao uzorak 14–11 sastojao se od gomilica peritecija na stablu sirka. Ekstrakcija je obavljena tako ńto su peritecije sterilnim skalpelom direktno sakupljane sa biljnog materijala i nanońene u mikrotubicu neposredno pre ekstrakcije i kao takve posluņile kao početni materijal za ekstrakciju ukupnih DNK. Odmerena količina prethodno zamrznute micelije (100 mg), sveņa vazduńna micelija direktno sakupljena iz kultura izolata, ili peritecije, prebačeni su u mikrotubicu zapremine 1,5 ml, gde je uz dodavanje tečnog azota vrńena homogenizacija tučkom za jednokratnu upotrebu. Homogenizacija je nastavljena dodavanjem u svaku mikrotubicu po 400 μl AP1 pufera i 4 μl enzima RNase A da bi se eliminisale ukupne ribonukleinske kiseline (RNK) koje bi mogle da ometaju dalje analize. Nakon toga, sadrņaj tubice kratko je promeńan na Vortexu. Dobijena suspenzija inkubirana je u vodenom kupatilu na 65°C u trajanju od 20 min. Uz povremeno snaņno meńanje tokom inkubacije na povińenoj temperaturi dońlo je do razgradnje ćelijskog zida i oslobaĎanja ćelijskog sadrņaja, kao i razlaganja RNK pomoću enzima RNase A. Potom je u svaku mikrotubicu dodavano po 130 μl AP2 pufera koji je omogućio taloņenje proteina i polisaharida. Tubice su potom inkubirane 5 min na ledu, a zatim 5 min centrifugirane na 14 000 rpm. Po zavrńenom procesu, lizat bez taloga pipetiran je iz mikrotubica u QIAshredder Mini spin kolone sa filterom, koje se nalaze u kolektorskim tubicama zapremine 2 ml. Kolektorske tubice su centrifugirane 2 min na 14 000 rpm. Nakon centrifugiranja rastvor koji je propuńten kroz filter prebačen je u tubice zapremine 2 ml i uz neprestano meńanje u svaku tubicu dodato je po 675 μl pufera AP3/E. Potom je prvi deo od 650 μl ove suspenzije prebačen u DNeasy Mini spin kolone sa filterom. Filter u 37 Mini spin kolonama u procesu ekstrakcije ima ulogu da veņe molekule DNK i na taj način omogućava njihovo izdvajanje. Nakon centrifugiranja u trajanju od 1 min na 10 000 rpm odstranjena je tečna faza koja je prońla kroz filter, dodata je preostala količina suspenzije iz tubice i ponovljen je isti proces centrifugiranja i odbacivanja tečne faze. Nakon ovog procesa u DNeasy Mini spin kolone u dva navrata dodato je po 500 μl AW pufera u cilju ispiranja i uklanjanja nečistoća koje su se, pored DNK, vezale za filter, a potom su Dneasy Mini spin kolone centrifugirane, 1 min na 10 000 rpm a zatim 2 min na 14 000 rpm da se otklone ostaci tečnosti. Nakon centrifugiranja, Dneasy Mini spin kolona sa filterom prebačena je u mikrotubicu sa poklopcem i na filter je sipano 100 μl AE pufera. Uzorci su zatim inkubirani na sobnoj temperaturi 5 min da bi se omogućilo oslobaĎanje i rastvaranje DNK sa filtera, a potom su tubice centrifugirane 1 min na 10 000 rpm. Tečna faza koja je prońla kroz filter predstavljala je ukupnu ekstrahovanu DNK i tako dobijeni uzorci čuvani su na −80°C do dalje upotrebe. Ekstrakcija DNK pomoću CTAB metode. Ekstrakcija DNK iz micelije ispitivanih izolata uraĎena je po metodi Day and Shattock (1997). Po preporučenom postupku, 100 mg micelije zamrznute na −80°C, pripremljene na napred opisan način, homogenizovano je uz dodatak 800 μl ekstrakcionog pufera (Ekstrakcioni CTAB pufer, priprema se od 100 mM Tris HCl, pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA i 2% CTAB, cetiltrimetilamonijum bromid, pH 8,0). Dobijena suspenzija prebačena je u mikrotubu zapremine 2 ml i inkubirana u vodenom kupatilu na 65°C u trajanju od 1 h. Svakih 15 min sadrņaj je snaņno promeńan. Tokom ovog dela ekstrakcije dolazi do razgradnje ćelijskih zidova i oslobaĎanja sadrņaja ćelije. Nakon 1 h, u svaku mikrotubu dodavano je 600 μl hloroforma i promeńano na Vortexu 10 s, a zatim centrifugirano 10 min na 13 000 rpm u centrifugi Eppendorf 5804 R. Posle centrifugiranja jasno su se razdvojile dve faze. Gornji sloj, pribliņne zapremine oko 500 μl, pipetiran je u novu mikrotubu u koju je zatim dodato 300 μl izopropanola. Ovako pripremljene mikrotube potom su inkubirane 10 min na sobnoj temperaturi, posle čega su ponovo centrifugirane 10 min na 13 000 rpm. Supernatant je paņljivo odliven, u mikrotube je dodato 600 μl 70% etanola i ponovo centrifugirano 10 min na 13 000 rpm. Etanol je paņljivo odbačen, a mikrotube ostavljene otvorene na sobnoj temperaturi da bi vińak etanola ispario. Dobijeni talog je resuspendovan u 50 μl TE pufera (TE pufer se priprema od 10 mM 38 Tris pH 8.0 i 1 mM EDTA). Dobijeni ekstrakt predstavljao je ukupnu DNK, koja je do upotrebe čuvan na −80°C. 4.7.2. Lančana reakcija polimeraze (PCR) Metoda lančane reakcije polimeraze (PCR) primenjena je u cilju molekularne detekcije gljiva patogena gajenog sirka i potvrde prethodne identifikacije obavljene konvencionalnim fitopatolońkim metodama na osnovu njihovih morfolońkih svojstava, i to molekularna PCR metoda korińćena je za identifikaciju prouzrokovača bolesti, umnoņavanjem ukupno pet različitih genomnih regiona ispitivanih izolata. Odabrani izolati patogena okarakterisani su umnoņavanjem odgovarajućeg segmenta DNK iz ITS regiona, regiona proteinskih nuklearnih gena (elongacioni faktor TEF−1α; β−tubulin i calmodulin) i mtSSU rDNK mitohondrijalnog gena (mitohondrijalna mala podjedinica ribozomske DNK) uz primenu odgovarajućih prajmera koji omogućavaju amplifikaciju navedenih gena (O’Donnell et al., 2000a). Umnoņavanje različitih delova genoma svih 13 ispitivanih izolata Fusarium spp. obavljeno je korińćenjem različitih parova prajmera prikazanih u tabeli 3. PCR reakcije obavljene su u radnoj zapremini od 25 μl, korińćenjem 12,5 μl 2X PCR Master miksa (K071, Fermentas, Lithuania), 9 μl RNase−free vode, po 1,25 μl svakog prajmera (100 pmol/μl, Metabion International, Deutschland) i 1 μl ekstrahovane ukupne DNK. U svim reakcijama negativnu kontrolu je predstavljao uzorak sa svim reagensima potrebnim za umnoņavanje DNK u koju je umesto DNK uzorka dodavana molekularna RNase−free voda (Molecular Biology Grade Water, Eppendorf). PCR reakcija izvedena je u termosajkleru (Thermocycler T–1, Biometra, UK) pri različitim uslovima zavisno od korińćenih prajmera. (1) PCR sa parom univerzalnih prajmera ITS1/ITS4. Ovaj par univerzalnih prajmera omogućava umnoņavanje i kasnije sekvencioniranje ITS regiona ribozomalne DNK Eukariota. ITS region je visoko varijabilan izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva i sa druge strane konzervativan na nivou vrste i kod mnogih rodova fitopatogenih gljiva koristi se za filogenetske analize. Kako je ITS1/ITS4 par prajmera koji moņe da amplifikuje ITS region svih Eukariota, koristi se i za proveru uspeńnosti ekstrakcije DNK. Pored toga ovi prajmeri su uključeni u istraņivanja u cilju ispitivanja njihove pogodnosti za korińćenje u okviru protokola za identifikaciju sekvencioniranjem 39 dobijenih produkata vrsta roda Fusarium. PCR umnoņavanje obavljeno je u termosajkleru pri sledećim uslovima reakcije: inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 60 s pri 94°C; 35 ciklusa koji se sastoje od denaturacije 35 s pri 94°C, hibridizacije (annealing) 35 s pri 57°C, elongacije prajmera 1 min pri 72°C i finalna elonagacija 10 min pri 72°C (Takamatsu and Kano, 2001; Cunnington et al., 2003). Pozitivnom reakcijom smatrana je pojava traka produkta očekivane veličine od 500−600 bp. (2) PCR sa parom prajmera ef1/ef2 koji omogućavaju amplifikaciju gena za TEF−1α, koji je uključen u sloņeni mehanizam translacije proteina u ćelijama gljiva prilikom rasta i izduņivanja ćelija. Ovaj gen pokazuje visok polimorfizam sekvenci izmeĎu blisko srodnih vrsta, odnosno sekvenca ovog dela genoma smatra se visoko informativnom na nivou vrste za ceo rod Fusarium (Summerell et al., 2003; Geiser et al., 2004; Kristensen et al., 2005). PCR umnoņavanje izvedeno je pri sledećim uslovima: inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 2 min pri 94ºC; 35 ciklusa koji se sastoje od denaturacije 1 min pri 94ºC, hibridizacije 1 min pri 53ºC, elongacije 2 min pri 72ºC i finalna elongacija pri 72ºC u trajanju od 10 min (O’Donnell et al., 1998c). Prajmeri ef1/ef2 umnoņavaju segment DNK finalne duņine ~700 bp. (3) PCR sa parom prajmera T1/T22 koji omogućavaju amplifikaciju gena za β−tubulin do čije ekspresije dolazi tokom vegetativnog porasta kao i tokom klijanja konidija, izveden je pri sledećim uslovima: inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 3 min pri 95ºC; 35 ciklusa koji se sastoje od denaturacije 30 s pri 94ºC, hibridizacije 30 s pri 58ºC, elongacije 1 min pri 72ºC i finalna elongacija pri 72ºC u trajanju od 5 min (Walsh et al., 2010). Pozitivnom reakcijom smatrana je pojava traka produkta očekivane veličine od ~1 300 bp. (4) PCR sa parom prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena za calmodulin koji pokazuje visoku pouzdanost filogenetskih analiza unutar kompleksa G. fujikuroi i vrsta roda Fusarium (O’Donnell et al., 2000a), a takoĎe je i pretendent za analize genetičkih populacija (Geiser et al., 2000), izveden je pri sledećim uslovima: inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 5 min pri 94ºC; 30 ciklusa koji se sastoje od denaturacije 30 s pri 94ºC, hibridizacije 1 min pri 55ºC, elongacije 2 min pri 72ºC i finalna elongacija pri 72ºC u trajanju od 10 min (Mulé et al., 2004). Prajmeri CL1/CL2A umnoņavaju segment DNK finalne duņine 700–800 bp. 40 (5) PCR sa parom prajmera MS1/MS2 koji omogućavaju amplifikaciju mitohondrijalne male podjedinice ribozomske DNK. Umnoņavanje DNK obavljeno je u 20 μl PCR smeńe koja je sadrņavala: 2 μl 10 x PCR pufera (Fermentas, Lithuania), 2,4 μl MgCl2 (25 mM, Fermentas, Lithuania), 0,4 μl dNTPs (10 mM, Fermentas, Lithuania), 5,95 μl RNase−free vode, po 2 μl oba prajmera (100 pmol/μl, Metabion International, Deutschland), 0,25 U Taq polimeraze (Fermentas, Lithuania) i 5 μl ekstrahovane DNA. PCR umnoņavanje obavljeno je pri sledećim uslovima: inicijalna denaturacija nukleinskih kiselina 2 min pri 95ºC; 35 ciklusa koji se sastoje od denaturacije 30 s pri 95ºC, hibridizacije 30 s pri 50ºC, elongacije 90 s pri 72ºC i finalna elongacija pri 72ºC u trajanju od 10 min (White et al., 1990). Pozitivnom reakcijom smatrana je pojava traka produkta očekivane veličine od 716 bp. Tabela 3. Pregled prajmera primenjenih za detekciju Fusarium spp. 4.7.3. Vizuelizacija i analiza produkata PCR reakcija Vizuelizacija umnoņenih produkata PCR reakcija obavljena je elektroforetskim razdvajanjem nukleinskih kiselina u 1% agaroznom gelu u 1 x TBE puferu, bojenjem etidijum bromidom i posmatranjem pod UV–transiluminatorom. Agarozni gel pripremljen je rastvaranjem 1,20 g agaroze u 120 ml 1 x TBE pufera i zagrevanjem do temperature ključanja u mikrotalasnoj pećnici. Nakon hlaĎenja do temperature od pribliņno 60°C, gel je razliven u kalup za horizontalnu elektroforezu u koji su prethodno Ciljna sekvenca Naziv prajmera Sekvenca 5'-3' Veličina fragmenta Literaturni izvor ITS Eukariota ITS1 ITS4 TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC 500–600 bp Takamatsu and Kano (2001) TEF–1α ef1 ef2 ATGGGTAAGGAGGACAAGAC GGAAGTACCAGTGATCATGTT ~700 bp Geiser et al. (2004) β–tubulin T1 T22 AACATGCGTGAGATTGTAAGT TCTGGATGTTGTTGGGAATCC ~1300 bp O’Donnell and Cigelnik (1997) calmodulin CL1 CL2A GA(GA)T(AT)CAAGGAGGCCTTCTC TTTTTGCATCATGAGTTGGAC 700–800 bp O’Donnell et al. (2000a) mtSSU MS1 MS2 CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG GCGGATTATCGAATTAAATAAC 716 bp White et al. (1990) 41 postavljeni separatori i čeńljevi, nakon čega je ostavljen na sobnoj temperaturi 30 min da se ohladi i polimerizuje. Posle polimerizacije gela i uklanjanja čeńljeva, kalup je uranjan u kadicu za horizontalnu elektroforezu sa 1 x TBE puferom. Uzorci su pripremljeni tako ńto je na parafilmu pomeńano 5 µl produkta PCR reakcije i 1 µl boje 6x Loading dye (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania) i odmah su unońeni u bunarčiće po odgovarajućem rasporedu. Pri svakoj elekroforezi korińćen je marker MassRuler TM DNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmbH, Lithuania) radi odreĎivanja veličine produkta poreĎenjem sa poznatom veličinom DNK fragmenata markera. Elekroforeza je izvedena pri konstantnoj struji od 120 V u trajanju od oko 40 min u aparatu za horizontalnu elekroforezu (BlueMarine 100, Serva electrophoresis GmbH, UK). Posle zavrńene elektroforeze gel je bojen u rastvoru etidijum bromida (destilovana voda i etidijum bromid u finalnoj koncentraciji od 0,5 μg/ml) u trajanju od 20 min. Amplifikovani fragmenti posmatrani su u mračnoj komori pomoću UV svetla na transiluminatoru (Biometra, UK). Prisustvo DNK fragmenata očekivane duņine označeno je kao pozitivna reakcija. U metodi je korińćen 1 x TBE pufer koji sadrņi: 90 mM Tris; 90 mM borna kiselina i 1 mM Na2EDTA. Dobijeni rezultati dokumentovani su fotografisanjem agaroznog gela i korińćenjem ņutog filtera. 4.7.4. Prečišćavanje PCR produkta i sekvencioniranje Nakon uspeńne amplifikacije, PCR produkti uzoraka odreĎenih za sekvencioniranje prečińćeni su pomoću QIAquick PCR Purification Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany), prateći upustvo proizvoĎača. Jedna zapremina reakcione smeńe i PCR produkta nakon reakcije pomeńana je sa pet zapremina PBI pufera, a zatim prebačena u QIAquick kolonu smeńtenu u kolekcionu tubicu i centrifugirana 1 min na maksimalnom broju obrtaja (13 000 rpm) u cilju vezivanja DNK za filter. Tečna faza je odbačena, a u QIAquick kolonu je pipetirano 750 µl PE pufera u cilju ispiranja nečistoća, posle čega je tubica sa uzorkom centrifugirana 1 min na 13 000 rpm. Nakon centrifugiranja, tečna faza je odbačena, a QIAquick kolona vraćena u istu kolekcionu tubicu i centrifugurana 1 min na 13 000 rpm da bi se uklonili ostaci pufera. U cilju rastvaranja DNK u QIAquick kolonu smeńtenu u novu tubicu od 1,5 ml pipetirano je 50 42 µl EB pufera i centrifugirano 1 min na 13 000 rpm. Tako dobijena DNK čuvana je na 4ºC do kvantifikacije i pripreme za slanje na usluņno sekvencioniranje. Nakon prečińćavanja uzorci su elektroforetski razdvojeni na 1% agaroznom gelu da bi se proverila čistoća amplikona, procenila molekularna teņina i odredila količina sintetisane DNK. Količina umnoņenih fragmenata u svakom uzorku odreĎena je poreĎenjem dobijenih produkata sa fragmentima komercijalnog markera 100 bp DNA Ladder (Serva GmbH, UK) sa poznatim količinama svih frakcija u markeru. Umnoņeni fragmenti ispitivanih izolata, nakon prečińćavanja pomoću QIAquick PCR Purification Kit–a (Qiagen, Hilden, Germany) poslati su na usluņno sekvencioniranje u oba smera na ABI 3730XL Automatic Sequencer u Macrogen, Inc (http://dna.macrogen.com, Korea). Dobijene sekvence obraĎene su u programu FinchTV Version 1.4.0., posle čega su im odreĎene konsenzus nukleotidne sekvence i podnete u GenBank bazu podataka u okviru National Center for Biotechnology Information (NCBI), gde im je dodeljen pristupni broj (GenBank Accession Number). 4.7.5. Molekularna identifikacija i karakterizacija Molekularna identifikacija odabranih izolata Fusarium spp., poreklom iz Srbije obavljena je, nakon sekvencioniranja četiri nuklearna i jednog mitohondrijalnog dela genoma, vińestrukim uparivanjem sa sekvencama drugih gljiva dostupnih u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti. Nakon dobijanja sekvenci gena za TEF−1α 11 ispitivanih izolata (286−09, 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10, 532−10, 535−10, 536−10, 14−11, 808−11), sekvenci ITS genomnog regiona ńest ispitivanih izolata (286−09, 297a−09, 535−10, 808−11, 291−09, 315−09) i četiri sekvence izolata (286−09, 297a−09, 535−10, 808−11) gena za β−tubulin, calmodulin i mtSSU rDNK kao i njihove obrade, meĎusobno su uporeĎivane sa odgovarajućim sekvencama koje su dostupne u internacionalnoj GenBank bazi podataka. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) analizom i vińestrukim poreĎenjem dobijenih sekvenci sa dostupnim sekvencama odgovarajućih regiona genoma gljiva u GenBank bazi podataka (http://blast.GenBank.nlm.nih.gov/Blast.cgi) pomoću CLUSTAL W programa (Thompson et al., 1994), obavljena je potvrda identifikacije dobijenih sekvenci. Za proračun genetičke udaljenosti i najvińi stepen 43 nukleotidne sličnosti, nakon trimovanja sekvenci na duņinu najkraće sekvence upotrebljen je softverski paket MEGA verzija 5.0. (Tamura et al., 2011). Dalja molekularna karakterizacija ispitivanih izolata obavljena rekonstrukcijom filogenetskih stabala pruņila je uvid u tačno taksonomsko mesto svakog od prouzrokovača u okviru kompleksa fuzariozne truleņi sirka i ukazala na evolutivnu srodnost sa drugim značajnim vrstama u okviru roda Fusarium. Kod proučavanja genetičke identičnosti i filogenetskih analiza, sekvence su svedene na odgovarajuću duņinu u skladu sa duņinom najkraće sekvence. Filogenetska analiza unutar kompleksa G. fujikuroi zasnovana je na kombinaciji DNK sekvenci informativnih za četiri različita gena regiona TEF−1α, β−tubulin, calmodulin i mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK, kao i na kombinaciji DNK sekvenci ITS regiona. Za filogenetske analize odabrane su sekvence izolata 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10, koji su identifikovani kao F. proliferatum i izolata 808−11 identifikovanim kao F. thapsinum. UporeĎivanje je vrńeno sa 50 filogenetski odvojenih vrsta kompleksa G. fujikuroi (prilog 1). Filogenetska stabla rekonstruisana su korińćenjem Maximum Parsimony metode, integrisane unutar programa MEGA verzija 5.0. i bootstrap analize sa 1000 ponavljanja. Filogenetska stabla svih različitih delova genoma rutovana su sa dve autgrupe, vrstama F. oxysporum i F. inflexum kompleksa F. oxysporum za koji se smatra da je sestrinska grupa kompleksa G. fujikuroi (O’Donnell et al., 1998a). Filogenetska analiza unutar F. graminearum klastera (Fg klaster) obavljena je na osnovu proučavanja DNK sekvenci gena za TEF−1α i β−tubulin, kao i na kombinaciji DNK sekvenci ITS regiona. Za ova istraņivanja odabrane su sekvence izolata 532−10, 535−10, 536−10 i 14−11 koje su identifikovane kao F. graminearum. Za filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu DNK sekvenci ITS regiona uključeno je 54 izolata grupisanih u 11 filogeografskih linija unutar F. graminearum kompleksa poreklom iz Severne i Juņne Hemisfere (prilog 2). Sekvence vrste F. pseudograminearum i Fusarium sp. NRRL 29380 i NRRL 29298 korińćene su kao autgrupe za rutovanje stabla, a korińćenjem Maximum Parsimony metode, integrisane unutar programa MEGA verzija 5.0. i bootstrap analize sa 1000 ponavljanja rekonstruisano je stablo. Za filogenetsku analizu DNK sekvenci gena za TEF−1α i β−tubulin uključeno je 33 izolata različitih filogenetskih vrsta unutar F. graminearum kompleksa poreklom iz različitih delova sveta (prilog 3). Filogenetsko stablo je rutovano sa F. 44 pseudograminearum kao autgrupom (Aoki and O’Donnell, 1999a), a rekonstruisano je korińćenjem Maximum Parsimony metode, integrisane unutar programa MEGA verzija 5.0. i bootstrap analize sa 1000 ponavljanja. Upotrebom softverskog paketa MEGA verzija 5.0. (Tamura et al., 2011), obavljena je Maximum Parsimony filogenetska analiza delimičnih DNK sekvenci gena za TEF−1α vrste F. equiseti. Za ova istraņivanja odabrana je sekvenca izolata 286−09 identifikovana kao F. equiseti. UporeĎivanje je vrńeno sa 54 izolata vrste F. equiseti i četiri sekvence blisko srodne vrste F. scirpi (prilog 4). Filogenetsko stablo je rutovano sa autgrupom, vrstom F. graminearum (NRRL 29169). 4.8. Ocenjivanje nivoa osetljivosti različitih genotipova sirka prema Fusarium spp. U cilju utvrĎivanja nivoa osetljivosti gajenog sirka prema ekononomski najznačajnijim gljivama iz roda Fusarium, ispitivana je osetljivost sedam različitih genotipova komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala Instituta za ratarstvo i povrtarsto Novi Sad, Odeljenje Bački Petrovac, od toga dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform') i pet genotipova sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold' i sorte označene ńiframa A28, A73, parc. 262/2010). TakoĎe u istraņivanja je uključeno i četiri genotipa sirka za zrno dobijena u razmeni iz SAD (linije PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD) koji su opisani kao otporni na vrste i forme roda Fusarium. Osetljivost ispitavanih genotipova gajenog sirka ocenjena je na osnovu: (a) veńtačke inokulacije klijanaca u uslovima staklenika, (b) veńtačke inokulacije biljaka u poljskim uslovima Bačkog Petrovca u 2010. i 2011. godini i (c) prirodne zaraze u lokalitetu Čantavir u 2010. i 2011. godini. 4.8.1. Ocenjivanje nivoa osetljivosti klijanaca sirka prema Fusarium spp. u uslovima staklenika Ispitivanje osetljivosti različitih genotipova sirka obavljeno je 2011. u uslovima staklenika, veńtačkim inokulacijama 11 navedenih genotipova sirka. U ova ispitivanja uključeno je 12 izolata gljiva grupisanih u četiri morfolońke grupe. U ispitivanja su uključeni izolat 286−09 morfolońke grupe I (F. equiseti), izolati 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10 grupe II, (F. proliferatum), izolati 532−10, 535−10 i 536−10 grupe III (F. graminearum) i izolati 291−09, 315−09 i 539−10 grupe V (E. nigrum). 45 Predstavnik IV morfolońke grupe, izolat 808−11 identifikovan kao F. thapsinum nije uključen jer je izolovan po zavrńetku ogleda osetljivosti i biće predmet posebnih ispitivanja. Inokulacija klijanaca sirka obavljena je u fenofazi bokorenja, injektiranjem sterilnim ńpricem 2–3 ml suspenzije konidija, 1 cm iznad nivoa zemlje. Suspenzija konidija pripremljena je od kultura ispitivanih izolata, koje su gajene sedam dana na PDA podlozi pri temperaturi od 25ºC i fotoperiodu u trajanju od 12 sati. Test osetljivosti genotipova izveden je u plastičnim saksijama prečnika 10–15 cm sa pet biljaka po saksiji. Ogled je izveden u četiri ponavljanja, četiri saksije sa po pet biljaka u saksiji koje su bile sejane u isto vreme i uniformne fenofaze razvoja. Za svaki izolat inokulisano je ukupno 20 biljaka, a kao negativna kontrola klijanci sirka inokulisani su sterilnom vodom. U cilju obezbeĎenja uslova povińene vlaņnosti, biljke su po inokulaciji pokrivane PVC folijom koja je nakon 2 dana uklonjena. Pojava simptoma posmatrana je do dve nedelje od inokulacije. Ogled je ponovljen dva puta, a ocena intenziteta zaraņenosti klijanaca sirka izvrńena je prema skali od 0 do 5: 0 – nema simptoma 1 –sitne pege na osnovi stabla 2 – duge pege na osnovi stabla 3 – jaka nekroza osnove stabla 4 – nekroza celog stabla 5 – uvenuće i suńenje celih klijanaca Svi dobijeni rezultati statistički su obraĎeni dvofaktorskom analizom varijanse po potpuno slučajnom planu sa četiri ponavljanja od po pet biljaka, dok je statistička značajnost odreĎena Duncan testom (Duncan, 1955). Prvi faktor činili su genotipovi sirka sa 11 tretmana odnosno sorti ili genotipova, a drugi faktor činili su ispitivani izolati sa 13 tretmana odnosno ispitivanih izolata svrstanih u četiri morfolońke grupe. 4.8.2. Ocenjivanje nivoa osetljivosti stabla sirka prema Fusarium spp. u poljskim uslovima Ispitivanje osetljivosti različitih genotipova sirka obavljeno je 2010. i 2011. godine u poljskim ogledima, i to na dva načina: veńtačkom inokulacijom biljaka svakog genotipa na oglednoj parceli u Bačkom Petrovcu i izlaganjem biljaka sirka prirodnim izvorima inokuluma (infestirano zemljińte, zaraņene biljke ili biljni delovi) na 46 proizvodnom usevu u Čantaviru. Na osnovu intenziteta zaraze ocenjivana je otpornost, odnosno osetljivost ispitivanih genotipova sirka. Veštačka inokulacija. U prvoj godini ispitivanja osetljivosti genotipova sirka, u toku 2010. godine, na parceli u Bačkom Petrovcu, u ogled je uključeno četiri različita genotipa komercijalnih sorti sirka, dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform') čija je reakcija ispitivana u uslovima veńtačkih inokulacija. Potom, u drugoj godini ispitivanja, obavljenim 2011. godine pored navedena četiri genotipa, dodatno su uključena joń četiri genotipa sirka za zrno dobijena u razmeni iz SAD (linije PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD), koji su opisani kao otporni na vrste i forme roda Fusarium. Za ova dvogodińnja ispitivanja korińćeni su izolati dve različite vrste iz roda Fusarium, koje su redovno bile izolovane iz zaraņenog materijala sirka u Srbiji i to: F. equiseti (286–09) i F. proliferatum (297a–09). Setva gajenog sirka obavljena je 25.04.2010. u prvoj godini ispitivanja i 28.04.2011. u drugoj godini, na meĎurednom rastojanju 70 cm, sa razmakom izmeĎu biljaka u redu kod sirka za zrno 8 cm, a kod sirka metlańa 12 cm. Za postavljanje ogleda u polju svaka sorta sejana je po tri reda, duņine 20 m, u tri ponavljanja. Priprema zemljińta i nega useva u toku vegetacije obavljena je prema uobičajenim agrotehničkim merama i svodila se na redovnu meĎurednu obradu i hemijsko suzbijanje korova. Veńtačka inokulacija sirka zasnivala se na povreĎivanju stabla direktnim unońenjem patogena u tkivo domaćina ubodom inokulisanih čačkalica. Prema modifikovanoj metodi koju je opisao Chambers (1988) okrugle, drvene čačkalice najpre su prokuvane 20 min u vodi i prosuńene, a potom su potopljene u buljon (20 g sveņe očińćenog krompira; 20 g mrkve i 1 l destilovane vode) u trajanju od 12 h. Nakon toga, čačkalice su sloņene u čańu i sterilisane autoklaviranjem pri 121°C i pritisku od 121,6 Pa. Po hlaĎenju, sterilisane čačkalice inokulisane su fragmentima kolonija odgovarajućih vrsta i inkubirane 14 dana pri temperaturi od 25ºC i fotoperiodu u trajanju od 12 sati. Tako pripremljenim inokulumom obavljene su veńtačke inokulacije po 20 biljaka svakog ispitivanog genotipa u tri ponavljanja (ukupno 60 biljaka) sa svakim od dva ispitivana izolata. Za inokulacije su odabrane biljke sirka ujednačenog porasta i iste fenofaze razvoja. Kod kontrolnih biljaka primenjen je isti postupak, a 47 inokulacije su obavljene samo sterilisanim čačkalicama. Inokulacija stabla sirka obavljena je dva dana nakon metličenja (23.07.2010. odnosno 15.07.2011.) unońenjem inokuluma u sredinu druge internodije iznad povrńine zemljińta. Ocenjivanje stepena osetljivosti izvrńeno je 60 dana od inokulacije (27.09.2010. odnosno 09.09.2011.), na osnovu prisustva i veličine povrńine tkiva zahvaćenog nekrozom. U fazi tehnolońke zrelosti sirka inokulisani prizemni delovi stabla su sakupljeni, obeleņeni i transportovani u laboratoriju Katedre za Fitopatologiju, Univerziteta u Beogradu–Poljoprivredni fakultet gde je ocenjen intenzitet zaraze genotipova. Inokulisane biljke sirka prvo su ocenjene prema stepenu zaraņenosti povrńine stabla, a potom uzduņno presečene i ocenjene prema povrńini nekroze, odnosno prema skali od 0 do 5 (slika 1 i 2), (Hooker, 1957): 0 – bez ńirenja nekroze 1 – nekroza manja od 1 cm 2 – nekroza zahvata 1/3 internodije 3 – nekroza zahvata 1/2 internodije 4 – cela internodija je nekrotirana 5 – nekroza prelazi u okolne internodije Svi dobijeni rezultati statistički su obraĎeni dvofaktorskom analizom varijanse po potpuno slučajnom planu sa tri ponavljanja od po 20 biljaka po svakom genotipu, dok je statistička značajnost odreĎena Duncan testom (Duncan, 1955). U prvoj godini postavljanja ogleda (2010.), prvi faktor činio je genotip sirka sa četiri tretmana, odnosno genotipa, a drugi faktor činio je ispitivani izolat gljive sa tri tretmana, odnosno dve vrste F. equiseti (286–09) i F. proliferatum (297a–09) i kontrola. U drugoj godini, prvi faktor činio je genotip sirka sa osam tretmana odnosno genotipova, a drugi faktor ispitivani izolat gljive sa tri tretmana, odnosno izolati vrste F. equiseti (286–09) i F. proliferatum (297a–09) i kontrola. 48 Slika 1. Spoljańnji izgled inokulisane internodije i skala od 0 do 5 za ocenjivanje osetljivosti stabla gajenog sirka prema Fusarium spp. Slika 2. Uzduņni presek inokulisane internodije i skala od 0 do 5 za ocenjivanje osetljivosti stabla gajenog sirka prema Fusarium spp. Prirodna zaraza. U polju na lokalitetu Čantavir, u toku dve proizvodne vegetacije (2010. i 2011. godine), u uslovima prirodne infekcije ocenjivana je osetljivost dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform'). Ovo polje je odabrano jer je u toku 2009. godine, zabeleņena intenzivna pojava truleņi korena i prizemnog dela stabla gajenog sirka sa učestalońću pojave i ńtetama koje su procenjene na oko 90%. Na odabranom delu parcele, cele zaraņene biljke sirka su usitnjene i tako dobijeni biljni ostaci ostavljeni da prezime u prirodnim 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 49 uslovima. Na zemljińtu pripremljenom na uobičajen način, setva sirka obavljena je 25.04.2010. u prvoj godini ispitivanja, odnosno 28.04.2011. u drugoj godini, na meĎurednom rastojanju 70 cm, sa razmakom izmeĎu biljaka u redu kod sirka za zrno 8 cm, a kod sirka metlańa 12 cm. Svaka sorta sejana je po tri reda, duņine 20 m. Priprema zemljińta i nega useva u toku vegetacije obavljena je prema uobičajenim agrotehničkim merama i svodila se na redovnu meĎurednu obradu i hemijsko suzbijanje korova. U fazi tehnolońke zrelosti (27.09.2010. godine, odnosno 09.09.2011.godine), od svakog genotipa i sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') i sirka metlańa ('Prima' i 'Reform'), sakupljeno je 60 slučajno odabranih stabala kretanjem po eksperimentalnom polju po ”cik–cak“ modelu. Od sakupljenih biljaka svakog genotipa, odvojen je prizemni deo stabla, obeleņen i transportovan u laboratoriju Katedre za Fitopatologiju, Univerziteta u Beogradu–Poljoprivredni fakultet gde je ocenjivana reakcija genotipova na uslove prirodne zaraze. Biljke sirka prvo su vizuelno ocenjene prema stepenu zaraņenosti povrńine stabla, a potom uzduņno presečene i ocenjene prema povrńini nekroze, odnosno prema skali od 0 do 5 (Hooker, 1957): 0 – bez ńirenja nekroze 1 – nekroza manja od 1 cm 2 – nekroza zahvata 1/3 internodije 3 – nekroza zahvata 1/2 internodije 4 – cela internodija je nekrotirana 5 – nekroza prelazi u druge internodije Svi dobijeni rezultati statistički su obraĎeni dvofaktorskom analizom varijanse po potpuno slučajnom planu sa ukupno 60 biljaka, odnosno ponavljanja po svakom genotipu, dok je statistička značajnost odreĎena Duncan testom (Duncan, 1955). U obe godine postavljanja ogleda (2010. i 2011.), prvi faktor činila je godina ispitivanja, a drugi faktor činio je genotip sirka sa četiri tretmana odnosno genotipa uključena u ispitivanja. 50 5. REZULTATI 5.1. Simptomi bolesti na biljkama u polju Prikupljanje uzoraka biljaka gajenog sirka, obavljeno je tokom trogodińnjeg perioda od 2009. do 2011. godine. Tokom pregleda četiri lokaliteta gajenja sirka u Vojvodini, ogledne parcele sirka u Bačkom Petrovcu i proizvodnih useva u Senti, Novom Ņedniku i Čantaviru u 2009. i 2010. godini zabeleņena je intenzivna pojava simptoma fuzariozne truleņi korena i stabla. Intenzitet zaraze pregledanih useva sirka, sorti 'Prima' i 'Reform' u Čantaviru bio je veoma visok, a suńenje i brzo propadanje zaraņenih biljaka rezultiralo je procenjenim gubicima od preko 90%. Usled jake pojave bolesti dońlo je do prevremenog sazrevanja, lomljenja i poleganja biljaka ńto je oteņalo ili potpuno onemogućilo ņetvu (slika 3). Zaraņene biljke ispoljavale su simptome prvenstveno na prizemnom delu stabla u vidu mrkih pega, koje su se dalje ńirile na okolne internodije, a u okviru pega ponegde su se javljali koncentrični krugovi. Na glavnom korenu i bočnim korenčićima simptomi su se ispoljavali pojavom ruņičaste boje, dok je kod jačih zaraza korenov sistem u većoj meri bio razoren. Takve biljke su se lako čupale iz zemlje. Na uzduņnom preseku obolelog tkiva uočena je dezorganizovana srņ tamnomrke ili ruņičaste boje (slika 4). Pri jačem napadu nekroza je zahvatila veći broj nodusa, pa čak i celo stablo koje je izgubilo čvrstinu i poleglo. Brojne crvene pege uočene su na lisnom rukavcu, listu, metlici i zrnu gajenog sirka. Na zaraņenim metlicama i zrnu hibrida 'Alba' i 'Gold', kao i sorti 'Prima' i 'Reform' uočena je nekroza tkiva prekrivena micelijskom prevlakom tamnoņute do narandņaste ili crvenkaste boje. Zaraņena zrna su smeņurana, proņeta micelijom i slabije klijavosti (slika 5). Slika 3. Izgled zaraņenih i poleglih biljaka sirka 51 Slika 4. Fusarium spp.: Koren i prizemni deo stabla zaraņenih biljaka sirka za zrno Slika 5. Fusarium spp.: Metlice i zrno zaraņenih biljaka sirka za zrno hibrida 'Alba' (levo) i 'Gold' (desno) 52 5.2. Izolacija patogena i dobijanje monosporijalnih izolata Izolacijom fitopatogenih gljiva iz zaraņenih biljaka i iz semena izdvojen je veći broj izolata koji su grupisani po poreklu i posluņili su za dobijanje monosporijalnih izolata sa kojima je nastavljen dalji rad. Posle inkubacije u trajanju od 7−10 dana, oko fragmenata su se razvijale kolonije gljiva koje su presejavane na CLA i posluņile za dobijanje monosporijalnih izolata. Iz čistih kultura gljiva, pripremane su suspenzije konidija i obavljeno je zasejavanje na WA podlogu. U 16 pregledanih uzoraka semena, ustanovljene su meńane zaraze gljivama iz rodova Fusarium, Alternaria i Epicoccum, koji su bili prisutni u svim uzorcima, dok je prosečan nivo zaraze bio 8,82; 5,03 odnosno 2,0% (tabela 4). U po pet uzoraka detektovane su i vrste iz rodova Aspergillus u prosečnom nivou zaraze od 0,78% i Penicillium 1,62%. Zaraza semena sirka sa Fusarium spp. kretala se od 2,3−19,7%, ili u proseku 8,82%. Ovim postupkom dobijeno je ukupno 48 monosporijalnih izolata Fusarium spp., i to iz prizemnog dela stabla sirka 27 i iz semena 21. Tabela 4. Intenzitet zaraze semena različitih sorti sirka u periodu od 2009−2011. godine Lokalitet Sorta Godina Alternaria spp. Aspergillus spp. Epicoccum spp. Fusarium spp. Penicillium spp. B. Petrovac 'Alba' 2009 2,0* 0 2,0 3,6 0 B. Petrovac 'Gold' 2009 2,0 0 2,0 6,0 0 B. Petrovac 'Prima' 2009 4,0 0 2,4 17,9 0 B. Petrovac 'Reform' 2009 5,0 0 3,0 7,5 0 Čantavir 'Alba' 2009 12,6 1,5 2,6 8,8 6,9 Čantavir 'Gold' 2009 6,4 1,8 2,1 6,0 11,2 B. Petrovac 'Alba' 2010 1,3 0 1,2 2,3 0 B. Petrovac 'Gold' 2010 2,7 0 2,0 13,8 0 B. Petrovac 'Prima' 2010 6,2 0 2,0 3,0 0 B. Petrovac 'Reform' 2010 5,3 0 1,7 2,5 0 Čantavir 'Alba' 2010 2,0 2,4 2,1 3,6 0,9 Čantavir 'Gold' 2010 3,0 3,8 1,9 12,2 2,7 B. Petrovac 'Alba' 2011 8,8 0 2,0 19,7 0 B. Petrovac 'Gold' 2011 7,6 0 0,6 15,2 0 Čantavir 'Prima' 2011 2,4 3,0 2,0 11,3 4,2 Čantavir 'Reform' 2011 9,2 0 2,4 7,8 0 Prosek: 5,0 0,8 2,0 8,8 1,6 *Prosečan % zaraze semena sirka odreĎen iz četiri ponavljanja po 100 semena po uzorku 53 5.3. Izolati odabrani za dalja proučavanja Izolacijom fitopatogenih gljiva iz zaraņenih biljaka sirka u polju i iz zaraņenog semena, izdvojeno je ukupno 48 izolata Fusarium spp. kojima je potvrĎena patogenost veńtačkim inokulacijama klijanaca sirka. Tokom izolacije i gajenja za proveru patogenosti uočena su izvesna morfolońka svojstva (tip konidiofora ili fijalida, oblik konidija i broj pregrada) koja su bila zajednička za pojedine izolate, na osnovu čega su oni grupisani (tabela 5). Kako dalja proučavanja nije bilo moguće nastaviti sa svim izolatima zbog njihovog velikog broja, pristupilo se odabiru pojedinih koji su razvrstani po poreklu i sličnosti sa standardnim izolatima iz kolekcije poreklom iz Australije (Botanic Gardens Trust, Plant Pathology, Sydney) u pet osnovnih morfolońkih grupa. Od 48 izolata, odabrano je 10 izolata karakterističnih za Fusarium spp. i tri izolata slična Fusarium vrstama. Izolati su podeljeni u pet morfolońkih grupa: Fusarium spp. grupa I sa jednim izolatom (286−09); Fusarium spp. grupa II sa pet izolata (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10); Fusarium spp. grupa III sa tri izolata (532−10, 535−10 i 536−10); Fusarium spp. grupa IV sa jednim izolatom (808−11) i tri izolata slična Fusarium spp. grupa V (291−09, 315−09 i 539−10). Odabrani izolati meĎusobno su uporeĎivani u cilju pravilne identifikacije i odreĎivanja njihovog taksonomskog meĎuodnosa. 54 Tabela 5. Grupisanje ispitivanih izolata Fusarium spp. na osnovu morfolońkih svojstava G ru p a Tip fijalida Tip konidija H la m id o sp o re Mikrokonidije Makrokonidije Oznaka izolata Deo biljke sirka iz koje je gljiva izolovana Boja kolonije m o n o fi ja li d e p o li fi ja li d e O b li k i b ro j p re g ra d a O b li k i b ro j p re g ra d a I 286−09 RBG851* prizemni deo stabla / bela do ņutosmeĎa bela do ņutosmeĎa + + - - - - srpaste, 3−7 srpaste, 3−7 + + II 297a−09 13−10 521−10 522−10 530−10 RBG5349* prizemni deo stabla seme prizemni deo stabla prizemni deo stabla prizemni deo stabla / bela do ruņičasta bela do ruņičasta bela do ruņičasta bela do ruņičasta bela do ruņičasta bela do ruņičasta + + + + + + + + + + + + ovalne, 0−1 ovalne, 0−1 ovalne, 0−1 ovalne, 0−1 ovalne, 0−1 ovalne, 0−1 duge, blago srpaste, 3−5 duge, blago srpaste, 3−5 duge, blago srpaste, 3−5 duge, blago srpaste, 3−5 duge, blago srpaste, 3−5 duge, blago srpaste, 3−5 - - - - - - - III 532−10 535−10 536−10 prizemni deo stabla prizemni deo stabla prizemni deo stabla ruņičasta ruņičasta ruņičasta + + + - - - - - - prave do umereno srpaste, 4−5 prave do umereno srpaste, 4−5 prave do umereno srpaste, 4−5 + + + IV 808−11 RBG5255* seme / bledonarandņasta bledonarandņasta + + - - ovalne do jajaste, 0−2 ovalne do jajaste, 0−2 prave do blago savijene, 3−5 prave do blago savijene, 3−5 - - V 291−09 315−09 539−10 seme seme seme ņutosmeĎa do narandņasta ņutosmeĎa do narandņasta ņutosmeĎa do narandņasta - - - - - - - - - sferične, brojne septe sferične, brojne septe sferične, brojne septe - - - *Referentni izolati Fusarium spp. 55 5.4. Provera patogenosti Infektivnost 13 odabranih monosporijalnih izolata Fusarium spp. ispitana je na osnovu veńtačke inokulacije klijanaca obe gajene forme, sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform') u uslovima staklenika, kao i inokulacije klijanaca u epruvetama u laboratorijskim uslovima. Ispitivani izolati ispoljili su sposobnost da ostvare zaraze sirka čime je potvrĎena njihova patogenost u obe metode veńtačkih inokulacija. Provera patogenosti odabranih izolata obavljena je tako ńto su u uslovima postavljenog eksperimenta reprodukovani simptomi prirodne infekcije. Svih 13 ispitivanih izolata podeljenih u pet grupa: grupa I (286−09); grupa II (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10); grupa III (532−10, 535−10 i 536−10); grupa IV (808−11) i grupa V (291−09, 315−09 i 539−10) prouzrokovalo je reakciju na klijancima sirka metlańa sorte 'Prima' i 'Reform', ali ne i na klijancima hibrida za zrno 'Alba' i 'Gold', kod kojih nije dońlo do pojave simptoma (tabela 6). Prve promene tkiva na stablu sirka, koje je veńtački inokulisano suspenzijom konidija, uočene su oko mesta inokulacije već nakon 3−5 dana. U početku razvoja simptoma uočena je pojava crvenkastosmeĎih sitnih pega u osnovi stabla (slika 6). Jasno vidljive promene boje vaskularnog tkiva, primarnog korena i čvora bokorenja uočene su sedam dana nakon inokulacije (slika 7a). Nakon dve nedelje izolati I, II, III i IV grupe prouzrokovali su potpuno suńenje i propadanje inokulisanih klijanaca sorte 'Prima' i 'Reform', dok su izolati V grupe takoĎe prouzrokovali potpuno suńenje klijanaca sorte 'Reform', a slabiju nekrozu u vidu sitnih do dugih pega oko mesta inokulacije na klijancima sorte 'Prima'. Na biljkama koje su kao negativna kontrola tretirane sterilnom vodom, nije dońlo do pojave simptoma, niti bilo kakvih promena (slika 7b). Reizolacija patogena sa svih veńtački inokulisanih biljaka na kojima su reprodukovani simptomi, obavljena je istim metodama kao i pri izolaciji, čime su zadovoljeni osnovni Kohovi postulati. Dobijeni reizolati po izgledu micelije i morfologiji reproduktivnih organa u potpunosti su odgovarali izvornim izolatima. 56 Tabela 6. Grupisanje ispitivanih izolata Fusarium spp. na osnovu ocene patogenosti u uslovima staklenika Grupa Genotip Izolat 'Alba' 'Gold' 'Prima' 'Reform' I 286−09 - - + + II 297a−09 - - + + 13−10 - - + + 521−10 - - + + 522−10 - - + + 530−10 - - + + III 532−10 - - + + 535−10 - - + + 536−10 - - + + IV 808−11 - - + + V 291−09 - - ± + 315−09 - - ± + 539−10 - - ± + kontrola - - - - (+) pozitivna reakcija, pojava crvenkastosmeĎih pega u osnovi stabla ili suńenje klijanaca; (-) negativna reakcija, na inokulisanom stablu nisu se pojavile pege; (±) pojava pojedinačnih pega na inokulisanom stablu Test provere patogenosti na klijancima sirka u uslovima in vitro, u epruveti sa Knopovom podlogom takoĎe je obavljen uspeńno. Svih 13 ispitivanih izolata podeljenih u pet grupa: grupa I (286−09); grupa II (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10); grupa III (532−10, 535−10 i 536−10); grupa IV (808−11) i grupa V (291−09, 315−09 i 539−10) prouzrokovalo je reakciju na klijancima sirka metlańa sorte 'Prima' i 'Reform', a b Slika 6. Izolat 297a−09: CrvenkastosmeĎe pege u osnovi stabla sirka sorte 'Prima' nakon veńtačke inokulacije u stakleniku Slika 7. Izgled nekroze primarnog korena (a) i negativna kontrola (b) u testu patogenosti 57 kao i na klijancima hibrida za zrno 'Alba' i 'Gold'. Nakon pet dana od inokulacije izolati I, II, III, IV i V grupe prouzrokovali su promenu boje tkiva i pojavu nekrotičnih pega na korenu i prizemnom delu stabla sorte 'Prima' i 'Reform', koje su se ńirile prema listovima i gornjem delu stabla (slika 8). Koren, stablo i list bili su potpuno zahvaćeni micelijom gljive, nakon 10 dana. Ispitivani izolati prouzrokovali su slabiju nekrozu u vidu crvenkastosmeĎih sitnih pega na korenu i u osnovi stabla klijanaca hibrida 'Alba' i 'Gold'. Na klijancima koji su posluņili kao negativna kontrola koji su postavljeni na čvrstu podlogu bez gljive, nije dońlo do pojave simptoma. Slika 8. Izolat 297a−09: Izgled nekrotičnih klijanaca sirka u in vitro uslovima 5.5. Morfološka svojstva anamorfa Morfolońka svojstva fitopatogenih gljiva predstavljaju vaņan taksonomski karakter i koriste se u njihovoj identifikaciji. U okviru proučavanja morfolońkih svojstava kolonija svih 13 odabranih izolata, proučavana su njihova makroskopska (izgled i boja kolonija, pigmentacija podloge) i mikroskopska svojstva (utvrĎivanje tipa konidiofora ili fijalida, oblik i dimenzija makrokonidija, prisustvo ili odsustvo mikrokonidija i hlamidospora). 58 Makroskopska svojstva. Tokom ispitivanja morfolońkih makroskopskih svojstava 13 izolata Fusarium spp. poreklom iz sirka, pokazalo se da se izolati po vaņnijim svojstvima mogu grupisati u pet grupa. Posle sedam dana porasta na podlozi PDA pri temperaturi 25°C, izgled kolonija ispitivanih izolata značajno se razlikovao (tabela 7). Tabela 7. Grupisanje ispitivanih izolata Fusarium spp. na osnovu vaņnijih morfolońkih makroskopskih svojstava G ru p a Oznaka izolata Tip porasta Izgled površine kolonije Pigmentacija podloge Prečnik kolonija (cm) nakon 7 dana I 286−09 RBG851* Porast brz i ravnomeran Obilna, pamučasta, bela do ņutosmeĎa Luči pigment beņ boje 7 cm II 297a−09 13−10 521−10 522−10 530−10 RBG5349* Porast brz i ravnomeran Pamučasta, bela do ruņičasta, a tamno ljubičasta u starijim kulturama Luči pigment narandņaste, tamnoljubičaste ili crne boje 7 cm III 532−10 535−10 536−10 Porast brz i ravnomeran Gusta, pamučasta, ruņičaste do ljubičastoņućkaste boje s belom do crvenom ivicom Luči pigment karmin crvene boje 8 cm IV 808−11 RBG5255* Porast srednje brz i ravnomeran Pamučasta, bela do bledonarandņasta Luči pigment narandņaste boje 6 cm V 291−09 315−09 539−10 Porast brz i ravnomeran Gusta, pamučasta, ņutosmeĎe do narandņaste boje Luči pigment narandņaste boje 6 cm *Referentni izolati Fusarium spp. Na osnovu vaņnijih morfolońkih makroskopskih svojstava prvu grupu čini izolat 286−09 koji morfolońki odgovara referentnom izolatu F. equiseti (RBG851). Kolonije ovog izolata ispoljile su brz i ravnomeran porast, prečnika 7 cm nakon sedam dana inkubacije u tami pri 25°C. Vazduńna micelija je obilna, ujednačeno pamučasta, bela do ņutosmeĎe boje (slika 9). Ovaj izolat lučio je u podlogu pigment beņ boje i obično je formirao tamnosmeĎe mrlje u kulturama starijim od 15 dana. 59 Slika 9. Fusarium spp. grupa I: Izgled kolonije Izolati druge grupe (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10) po svojim makroskopskim svojstvima ispoljili su najveću sličnost sa izolatom (RBG5349), koji je prethodno identifikovan od strane Summerell (lična komunikacija) kao F. proliferatum i posluņio je kao standard u ovim ispitivanjima. Micelija izolata ove grupe rasla je veoma brzo i obrazovala je na PDA podlozi kolonije prečnika 7 cm nakon sedam dana inkubacije u tami pri 25°C. Vazduńna micelija je pamučasta, bela do ruņičasta, a tamno ljubičasta u starijim kulturama (slika 10). Ovi izolati lučili su pigment i bojili podlogu nakon 10 dana. Pigment u podlozi je narandņast, tamnoljubičast ili skoro crn. Slika 10. Fusarium spp. grupa II: Izgled kolonija Po svojim morfolońkim svojstvima izdvojila se i treća grupa izolata, i to 532−10, 535−10, 536−10 koja je morfolońki slična literaturnim navodima za vrstu F. graminearum. Kolonije reprezentativnih izolata ispoljile su brz i ravnomeran porast na PDA podlozi, prečnika 8 cm nakon sedam dana inkubacije u tami pri 25°C. Vazduńna 60 micelija je gusta, pamučasta, ruņičasta do ljubičastoņućkasta s belom do crvenom ivicom (slika 11). Ovi izolati obično su lučili pigment karmin crvene boje u podlogu, nakon 10 dana. Slika 11. Fusarium spp. grupa III: Izgled kolonija U četvrtu grupu svrstan je izolat 808−11 koji je morfolońki nasličniji standardu F. thapsinum (RBG5255) i od svih ostalih grupa izolata razlikuje se po specifičnom tipu porasta na PDA i ņutim pigmentom podloge (slika 12). Micelija ovog izolata raste srednje brzo i obrazuje kolonije prečnika 6 cm nakon sedam dana inkubacije u tami pri 25°C. Bela do bledonarandņasta vazduńna micelija prekriva polovinu sredińnjeg dela kolonije. Ovaj izolat luči karakterističan ņuti i narandņast pigment nakon sedam dana i obrazuje kratke i mrke pruge, koje se radijalno ńire od sredińta kolonije. Slika 12. Fusarium spp. grupa IV: Izgled kolonije 61 Petu grupu čine izolati sa oznakama 291−09, 315−09 i 539−10 (izolati slični Fusarium spp.) koji su se izdvojili od ostalih proučavanih izolata formirajući grupu koja je morfolońki po izgledu i boji kolonija dovedena u vezi sa izgledom kolonija vrsta Fusarium spp. Kolonija sva tri izolata je gusta, vunasta, intenzivno ņute boje sa lica i narandņaste do tamno crvene boje sa naličja, okruņena belom kompaktnom micelijom nepravilnih margina (slika 13). Porast kolonije na PDA podlozi bio je brz i ravnomeran i nakon sedam dana inkubacije u tami pri 25°C, veličina kolonije je iznosila 6 cm. Posle inkubacije u trajanju od 3−5 dana, kod svih izolata uočeno je da luče ņuti pigment i eksudat, tako da podloga poprima ņutu boju. Slika 13. Izolati slični Fusarium spp. grupa V: Izgled kolonija Mikroskopska svojstva. Proučavanje morfolońkih mikroskopskih svojstava pojedinih struktura gljiva, odnosno utvrĎivanje tipa konidiofora ili fijalida (monofijalida i polifijalida), oblika i dimenzija makrokonidija, kao i prisustva ili odsustva mikrokonidija i hlamidospora koje formiraju ispitivani izolati, ukazalo je na grupisanje svih 13 odabranih izolata Fusarium spp. u pet morfolońkih grupa (tabela 8). Uporedne prosečne dimenzije merenih parametara na konidijama svih izolata uključenih u ispitivanja prikazane su u tabeli 9. 62 Tabela 8. Grupisanje ispitivanih Fusarium spp. na osnovu morfolońkih mikroskopskih struktura *Referentni izolati Fusarium spp. **Nizovi mikrokonidija: (-) odsutni; (+) obilni G ru p a O zn a k a i zo la ta Raspored konidija Tip fijalida Tip konidija H la m id o sp o re Nizovi konidija** Mikrokonidije Makrokonidije k ra tk i (< 1 5 ) d u g i (> 3 0 ) li n ea rn i g la v ic e la ţn e g la v ic e m o n o fi ja li d e p o li fi ja li d e o b li k i b ro j p re g ra d a o b li k i b ro j p re g ra d a I 286−09 - - - - - + - - srpaste, 3−7 + RBG851* - - - - - + - - srpaste, 3−7 + II 297a−09 - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - 13−10 - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - 521−10 - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - 522−10 - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - 530−10 - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - RBG5349* - + - - + + + ovalne, 0−1 blago srpaste, 3−5 - III 532−10 - - - - - + - - prave do umereno srpaste 4−5 + 535−10 - - - - - + - - prave do umereno srpaste 4−5 + 536−10 - - - - - + - - prave do umereno srpaste 4−5 + IV 808−11 - + - - + + - ovalne do jajaste, 0−2 prave do blago savijene, 3−5 - RBG5255* - + - - + + - ovalne do jajaste, 0−2 prave do blago savijene, 3−5 - V 291−09 - - - - - - - - sferične, brojne septe - 315−09 - - - - - - - - sferične, brojne septe - 539−10 - - - - - - - - sferične, brojne septe - 63 Tabela 9. Grupisanje ispitivanih izolata Fusarium spp. na osnovu uporednih morfolońkih mikroskopskih svojstava G ru p a Oznaka izolata Makrokonidije Mikrokonidije Duţina (µm) Širina (µm) Duţina (µm) Širina (µm) min prosek max min prosek max min prosek max min prosek max I 286−09 12,50 22,54 40,00 2,50 4,10 5,00 - - - - - - II 297a−09 20,00 34,00 50,00 3,75 3,90 5,00 5,00 7,90 12,50 2,50 3,86 5,00 13−10 20,00 35,55 47,50 2,50 4,15 7,50 5,00 8,00 10,00 2,50 2,50 2,50 521−10 20,00 34,10 50,00 3,75 4,11 5,00 5,00 7,80 12,50 2,50 4,30 2,50 522−10 22,50 29,05 40,00 3,75 3,95 5,00 5,00 8,05 12,50 2,50 4,21 5,00 530−10 20,00 32,50 42,50 3,75 4,10 5,00 5,00 8,85 12,50 2,50 3,16 5,00 III 532−10 22,50 35,63 52,50 2,50 4,56 - - - - - - - 535−10 25,00 33,85 50,00 2,50 5,18 - - - - - - - 536−10 30,00 39,10 50,00 2,50 4,80 - - - - - - - IV 808−11 35,00 20,90 87,50 2,50 2,03 7,50 7,50 12,25 18,75 2,50 4,45 7,50 V 291−09 12,50 17,35 27,50 12,50 17,97 30,00 - - - - - - 315−09 12,50 14,92 25,07 12,81 16,98 29,01 - - - - - - 539−10 12,50 15,49 25,64 14,16 17,72 29,75 - - - - - - 64 Izolat 286−09, predstavnik prve morfolońke grupe u okviru proučavanih izolata, nasličniji je po mikroskopskim svojstvima standardnom izolatu RBG851, koji je determinisan kao F. equiseti. Kulture izolata starosti pet dana, formirale su makrokonidije. Ispitivani izolat obrazovao je konidiogene ćelije na konidioforama tipa monofijalida, kratke i u osnovi prońirene. Mikrokonidije se nisu formirale, dok su obrazovane vińećelijske makrokonidije srpastog oblika, karakteristične savijenosti, debelih zidova, najčeńće sa 3−7 poprečnih pregrada, dimenzija 12,50−40,00 x 2,50−5,00 µm. Vrńne ćelije su suņene ili ńiljaste prema kraju, dok su bazalne karakterističnog oblika stopala (slika 14a). Ovaj izolat je nakon 10 dana inkubacije na CLA formirao i brojne loptaste, svetlosmeĎe hlamidospore u nizovima i grupama u makrokonidijama ili u hifama vazduńne i supstratne micelije (slika 14b). Slila 14. Fusarium spp. grupa I: Makrokonidije (a) i hlamidospore u makrokonidijama (b) U drugu morfolońku grupu svrstani su izolati 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10, koji su bili različiti u odnosu na ostale izolate i morfolońki su bili slični referentnom izolatu RBG5349, koji je prethodno identifikovan kao F. proliferatum. Ovi izolati su nakon pet dana razvoja na SNA podlozi formirali mikrokonidije, a na CLA podlozi makrokonidije. Konidiofore na vazduńnoj miceliji su uspravne i simpodijalno razgranate tipa monofijalida i polifijalida (slika 15a, b, c). Kod ovih izolata mikrokonidije su obrazovane iz monofiljlida i polifijalida u vidu laņnih glavica ili dugih nizova. a b 65 Mikrokonidije su oblika palice, u osnovi suņene, a pri vrhu prońirene, jednoćelijske ili sa jednom septom (slika 15d) i njihove dimenzije su se kretale od 5,00−12,50 x 2,50−5,00 µm. Makrokonidije su blago srpaste, duge i uske sa 3−5 poprečnih pregrada, dimenzija 20,00−50,00 x 2,50−5,00 µm. Vrńne ćelije su savijene, dok su bazalne slabo razvijenog oblika stopala (slika 15e). Ovi izolati nisu formirali hlamidospore. Slika 15. Fusarium spp. grupa II: Mikrokonidije u nizu (a), polifijalida (b), monofijalida (c), mikrokonidije (d) i mikro− i makrokonidije (e) Izolati 532−10, 535−10 i 536−10 sačinjavaju treću morfolońku grupu u okviru proučavanih izolata koja je slična literaturnim navodima za vrstu F. graminearum. Kulture izolata starosti pet dana formirale su makrokonidije. Konidiofore na vazduńnoj miceliji su tipa monofijalida razgranate u sporodohijama (slika 16a). Ovi izolati formirali su prozirne a b c d e 66 makrokonidije, prave do umereno srpaste, debelih zidova sa četiri poprečne pregrade (slika 20), dimenzija 22,50−52,50 x 2,50−7,50 μm. Vrńne ćelije su kukaste, dok su bazalne karakterističnog oblika stopala (slika 16b). Prisustvo mikrokonidija nije ustanovljeno, dok su se okrugle i bledosmeĎe hlamidospore formirale u nizovima, nakon 10 dana inkubacije na CLA podlozi. Slika 16. Fusarium spp. grupa III: Makrokonidije u sporodohijama (a) i makrokonidije (b) Četvrta morfolońka grupa izolata 808−11 jasno se razlikovala od ostalih proučavanih izolata iz roda Fusarium, a odgovara opisu F. thapsinum (RBG5255). Ispitivani izolat je nakon pet dana razvoja na SNA podlozi formirao mikrokonidije, a na CLA podlozi makrokonidije. Konidiofore su tipa monofijalida, razgranati u sporodohijama i nerazgranati na hifi. Mikrokonidije su obrazovane iz monofijalida u vidu laņnih glavica ili niza (slika 17a, b), različitog oblika, ovalne do jajaste, bezbojne, neseptirane ili sa 1−2 poprečne pregrade (slika 17c), dimenzija 7,50−18,75 x 2,50−7,50 μm. Makrokonidije su prave do blago savijene, sa 3−5 poprečnih pregrada, dimenzija 35,00−87,50 x 2,50−7,50 μm. Vrńne ćelije su blago savijene, dok su bazalne karakterističnog oblika stopala (slika 17d). U kulturama, starim mesec dana nije utvrĎeno prisustvo hlamidospora. a b 67 Slika 17. Fusarium spp. grupa IV: Mikrokonidije u nizu (a), monofijalide (b), mikrokonidije (c) i mikro− i makrokonidije (d) Peta grupa izolata sa oznakama 291−09, 315−09 i 539−10 značajno se razlikovala od ostalih proučavanih izolata iz roda Fusarium. Konidije su formirane na kratkim konidioforama koje se uzdiņu sa diskretnih sporodohija (slika 18a). Konidje su gusto zbijene, sferičnog oblika i suņene pri osnovi. Potpuno razvijene konidije su smeĎe boje, neravne episporije sa slabo izraņenim brojnim septama (slika 18b), dimenzija 12,5−27,5 x 12,5−30 µm. a b c d 68 Slika 18. Grupa V: Izgled kolonije in situ (a) i konidije (b) 5.6. Morfološka svojstva teleomorfa (peritecija) Tokom ispitivanja morfolońkih svojstava Fusarium spp. in situ, direktno na zaraņenim ostacima biljaka sirka u polju, ustanovljeno je prisustvo tvorevina polnog razmnoņavanja, peritecija, formiranih u grupama na tankim stromama na povrńini osnove zaraņenog stabla sirka (slika 19a). U dozrelim peritecijama formirali su se izduņeni i zaobljeni askusi koji najčeńće sadrņe 4−6 askospora poreĎanih u nizu (slika 19b). Askospore su prozirne, savijene i zaobljenih krajeva, veličine 17,5−30 x 5−7,5 μm, sa 1−3 septe. Slika 18. G. zeae (uzorak 14−11): Peritecije u grupama na stablu gajenog sirka (a) i oslobaĎanje askospora iz peritecije (b) a b b a 69 5.7. Molekularna detekcija gljiva Molekularna metoda lančane reakcije polimeraze (PCR) i sekvencioniranje umnoņenih fragmenata DNK, uspeńno je primenjena za identifikaciju i karakterizaciju ispitivanih izolata Fusarium spp. prouzrokovača fuzariozne truleņi korena i prizemnog dela stabla gajenog sirka. Nakon ekstrakcije ukupne količine DNK ispitivanih izolata prouzrokovača fuzariozne truleņi sirka, obavljene su PCR reakcije sa parovima univerzalnih ili specifičnih prajmera u cilju ispitivanja pogodnosti za dobijanje specifičnog fragmenta DNK koji obuhvata ITS genomni region (deo 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2 i deo 28S rRNA), tri različita regiona proteinskih nuklearnih gena (elongacioni faktor TEF−1α; β−tubulin i calmodulin) i mitohondrijalni deo genoma (mtSSU rDNK). Primenom različitih prajmera prilikom izvoĎenja PCR metode, razlika u specifičnosti i pogodnosti detekcije sekvenci svih pet različitih delova genoma iz ispitivanih izolata bila je izraņena. Molekularna detekcija 13 odabranih izolata Fusarium spp. poreklom iz sirka, kao i tri referentna izolata F. equiseti (RBG851), F. proliferatum (RBG5349) i F. thapsinum (RBG5255) obavljena je korińćenjem univerzalnih prajmera ITS1/ITS4, koji omogućavaju umnoņavanje ITS regiona ribozomalne DNK Eukariota. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata ispitivanih izolata sirka, prisustvo fragmenta očekivane veličine 500–600 bp utvrĎeno je kod svih izolata (slika 19). Do amplifikacije nije dońlo kod negativne kontrole. Slika 19. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera ITS1/ITS4. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286–09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4– izolat 13–10; 5– izolat 521–10; 6– izolat 522–10; 7– izolat 530–10; 8– referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 9– izolat 532–10; 10– izolat 535–10; 11– izolat 536–10; 12– izolat 808–11; 13– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 14– izolat 291–09; 15– izolat 315–09; 16– izolat 539–10; 17– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) 70 Primenom para univerzalnih prajmera ef1/ef2 koji omogućavaju amplifikaciju gena TEF−1α i poreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranih izolata, sa korińćenim markerom (M), ustanovljeno je prisustvo fragmenta očekivane veličine oko 700 bp kod izolata I, II, III i IV morfolońke grupe (slika 20). Do amplifikacije nije dońlo kod izolata V morfolońke grupe (291−09, 315−09, 539−10) i negativne kontrole. Slika 20. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera ef1/ef2. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286–09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4– izolat 13–10; 5– izolat 521–10; 6– izolat 522–10; 7– izolat 530–10; 8– referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 9– izolat 532–10; 10– izolat 535–10; 11– izolat 536–10; 12– izolat 808–11; 13– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 14– izolat 291–09; 15– izolat 315–09; 16– izolat 539–10; 17– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) Molekularna detekcija odabranih izolata izvrńena je primenom para prajmera T1/T22 koji omogućavaju amplifikaciju dela gena β−tubulin. Pomoću ovih prajmera uspeńno je amplifikovan gen β−tubulin duņine oko 1300 bp kod 13 od 16 ispitivanih izolata (slika 21). Prinosi ovih reakcija bili su niņi kod izolata I grupe (286–09, F. equiseti RBG851) i III grupe (532–10, 535–10, 536–10), ńto se ogledalo u vidu prisustva tanjih traka. Do amplifikacije nije dońlo kod izolata V grupe (291−09, 315−09, 539−10) i negativne kontrole. 71 Slika 21. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera T1/T22. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286–09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4– izolat 13–10; 5– izolat 521–10; 6– izolat 522–10; 7– izolat 530–10; 8– referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 9– izolat 532–10; 10– izolat 535–10; 11– izolat 536–10; 12– izolat 808–11; 13– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 14– izolat 291–09; 15– izolat 315–09; 16– izolat 539–10; 17– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) U PCR reakciji korińćenjem para prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena za protein calmodulin, dobijeni su amplikoni očekivane veličine 700– 800 bp kod 13 ispitivanih izolata Fusarium spp. (slika 22). Do amplifikacije nije dońlo kod izolata V grupe (291−09, 315−09, 539−10) i negativne kontrole. Slika 22. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera CL1/CL2A. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286–09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4– izolat 13–10; 5– izolat 521–10; 6– izolat 522–10; 7– izolat 530–10; 8– referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 9– izolat 532–10; 10– izolat 535–10; 11– izolat 536–10; 12– izolat 808–11; 13– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 14– izolat 291–09; 15– izolat 315–09; 16– izolat 539–10; 17– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) 72 Detekcija Fusarium spp. uz korińćenje prajmera MS1/MS2 koji omogućavaju amplifikaciju mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) ribozomske DNK uspeńno je primenjena. Kod svih ispitivanih izolata, rezultati dobijeni PCR reakcijom potvrĎuju prisustvo trake procenjene veličine 716 bp (slika 23). Kod izolata I grupe (286−09, F. equiseti RBG851), IV grupe (808−11, F. thapsinum RBG5255) i V grupe (291−09, 315−09, 539−10) reakcija je bila slabog intenziteta, u vidu tanjih traka očekivane veličine. Do amplifikacije nije dońlo kod negativne kontrole. Slika 23. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera MS1/MS2. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286–09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4– izolat 13–10; 5– izolat 521–10; 6– izolat 522–10; 7– izolat 530–10; 8– referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 9– izolat 532–10; 10– izolat 535–10; 11– izolat 536–10; 12– izolat 808–11; 13– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 14– izolat 291–09; 15– izolat 315–09; 16– izolat 539–10; 17– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) Kao pogodan način izolacije ukupne DNK pokazala se i standardna CTAB (hexadecyltrimethylammonium−bromide) metoda za ekstrakciju nukleinskih kiselina u kombinaciji sa PCR reakcijom, koja je takoĎe primenjena za molekularnu detekciju izolata Fusarium spp. Molekularna detekcija pet odabranih reprezentativnih izolata Fusarium spp. iz svake od pet grupa (286−09, 297a−09, 535−10, 808−11 i 291−09), poreklom iz sirka, kao i tri referentna izolata F. equiseti (RBG851), F. proliferatum (RBG5349) i F. thapsinum (RBG5255) poreklom iz Australije, obavljena je korińćenjem univerzalnih prajmera ef1/ef2. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata ispitivanih izolata sirka, prisustvo fragmenta očekivane veličine oko 700 bp utvrĎeno je kod izolata I, II, III i IV grupe (slika 24). Do amplifikacije nije dońlo kod izolata V grupe (291−09) i negativne kontrole. 73 Slika 24. Ciljana DNK izolovana korińćenjem CTAB protokola. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera ef1/ef2. Kolone: M– MassRuler TM DNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 286– 09; 2– referentni izolat F. equiseti (RBG851); 3– izolat 297a–09; 4–referentni izolat F. proliferatum (RBG5349); 5– izolat 535–10; 6– izolat 808–11; 7– referentni izolat F. thapsinum (RBG5255); 8– izolat 291–09; 9– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase– free vodom) PCR metoda primenjena je u cilju molekularne detekcije i identifikacije F. graminearum poreklom iz peritecija uzorka 14−11 formiranih na prezimelim zaraņenim stabljikama sirka, sa lokaliteta Čantavir. PCR reakcija obavljena je korińćenjem univerzalnih prajmera ef1/ef2, koji omogućavaju amplifikaciju gena TEF−1α. PoreĎenjem amplifikovanih fragmenata testiranog uzorka sirka i pozitivne kontrole (izolat 535–10 iz S. bicolor, hibrid 'Gold') sa korińćenim markerom (M), utvrĎeno je prisustvo fragmenta očekivane veličine oko 700 bp (slika 25). Do amplifikacije nije dońlo kod negativne kontrole. Slika 25. Elektroforetska analiza PCR proizvoda dobijenih korińćenjem para prajmera ef1/ef2. Kolone: M– MassRulerTMDNA ladder, Mix (Fermentas Life Sciences GmgH, Lithuania); 1– izolat 14–11 iz peritecija; 2– pozitivna kontrola (izolat 535–10 iz S. bicolor, sorta 'Gold'); 3– B–negativna kontrola (PCR smeńa sa RNase–free vodom) 74 5.7.1. Molekularna identifikacija vrsta detektovanih na sirku Tokom molekularne identifikacije ispitivanih izolata poreklom iz biljaka sirka sa simptomima truleņi prizemnog dela stabla i iz zaraņenog semena, uspeńno je sekvencionirano vińe genomnih regiona ukupno 13 izolata, podeljenih u pet grupa i okarakterisanih na morfolońkom nivou. Sekvencionirani su PCR produkti dobijeni korińćenjem prajmera koji omogućavaju amplifikaciju gena za TEF−1α, a koji je visoko informativan na nivou vrste za rod Fusarium. Pored toga, za sekvencioniranje i proračun genetičke sličnosti sekvenci izolata korińćeni su PCR produkti dobijeni primenom prajmera koji omogućavaju amplifikaciju ITS regiona rDNK, proteinskih gena (β−tubulin i calmodulin) i mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK. Za ova ispitivanja odabran je po jedan reprezentativni predstavnik svake grupe, ukupno četiri izolata i to: (286−09, I grupa); (297a−09, II grupa); (535−10, III grupa) i (808−11, IV grupa). Predstavnici V grupe (291−09 i 315−09) sekvencionirani su primenom prajmera koji omogućavaju amplifikaciju ITS regiona rDNK. Tabela 10. Pregled sekvenci ispitivanih izolata Fusarium spp. dobijenih u ovom radu /− nije sekvencionirano Grupa Oznaka izolata Vrsta GenBank pristupni broj ITS TEF−1α β−tubulin calmodulin mtSSU I 286−09 F. equiseti JQ412109 JQ412101 JQ717201 JQ423934 JQ717202 II 297a−09 F. proliferatum JQ412110 JQ412110 JQ412112 JQ412114 JQ717203 13−10 F. proliferatum / JQ412102 / / / 521−10 F. proliferatum / JQ412104 / / / 522−10 F. proliferatum / JQ412105 / / / 530−10 F. proliferatum / JQ412106 / / / III 532−10 F. graminearum / JQ412107 / / / 535−10 F. graminearum JQ412111 JF747146 JQ412113 JQ412115 JQ717204 536−10 F. graminearum / JQ412108 / / / 14−11 F. graminearum / JQ862471 / / / IV 808−11 F. thapsinum JQ717206 JQ717205 JQ717207 JQ717208 JQ717209 V 291−09 E. nigrum JQ619838 / / / / 315−09 E. nigrum JQ619839 / / / / 75 Identifikacija odabranih izolata izvrńena je vińestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti dobijenih sekvenci meĎusobno, kao i sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Primenom morfolońkih i molekularnih metoda utvrĎeno je da odabrani izolati pripadaju vrstama roda Fusarium, i to: F. equiseti (grupa I), F. proliferatum (grupa II), F. graminearum (grupa III) i F. thapsinum (grupa IV), kao i vrsti iz roda Epicoccum: E. nigrum (grupa V). U tabeli 10 nalaze se podaci o sekvencama navedenih vrsta gljiva kojima je dodeljen pristupni broj (GenBank Accession number) u GenBank bazi podataka. Molekularna identifikacija Fusarium equiseti. Molekularna identifikacija F. equiseti izvrńena je vińestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti sekvenci odabranih izolata sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Za ova ispitivanja odabran je izolat 286−09 sa lokaliteta Bački Petrovac, predstavnik morfolońke grupe I. Amplifikovani fragmenti odabranog izolata, nakon prečińćavanja podvrgnuti su sekvencioniranju u cilju utvrĎivanja sekvence svih pet umnoņenih genomnih regiona: ITS regiona rDNK, proteinskih gena TEF−1α, β−tubulina i calmodulina, kao i mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK. Nakon sekvencioniranja PCR produkta dobijenog amplifikacijom iz micelije uzorka 286−09, korińćenjem para prajmera ITS1/ITS4 koji omogućavaju amplifikaciju ITS regiona rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka i dodeljen joj je pristupni broj JQ412109 (tabela 10). BLAST analiza sekvence produkta duņine 545 bp, pokazala je 99% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama 15 izolata vrste F. equiseti i 13 izolata Fusarium spp. Proračun genetičke sličnosti odabranih sekvenci obavljen je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 538 bp. Najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivan izolat pokazao je sa izolatom F. equiseti iz Kine (AB470890), a najniņi stepen identičnosti od 99,4% sa razlikom u tri nukleotida, sa sekvencama 9 izolata različitog porekla, od čega su četiri izolata prijavljena kao F. equiseti iz Australije (GQ505694, GQ505743), Francuske (GQ505690) i Kine (EU326202), dok je ostalih pet izolata prijavljeno kao Fusarium spp. poreklom iz različitih delova sveta, 76 Australije (GQ505679), Kenije (GQ505684), Engleske (GQ505737), Sudana (GQ505741) i sa Havaja (GQ505745). Nakon sekvencioniranja PCR produkta dobijenog amplifikacijom gena TEF−1α, korińćenjem para prajmera ef1/ef2, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka i dodeljen joj je pristupni broj JQ412101 (tabela 10). BLAST analiza sekvence produkta u duņini od 678 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa sekvencama 27 izolata F. equiseti deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 595 bp. Proračunom genetičke sličnosti izolata 286−09 pokazao je najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sa sekvencama sedam izolata različitog porekla, od čega su četiri izolata prijavljena kao F. equiseti iz Kanade (EF526111, DQ842088, DQ842097, DQ842099), dva izolata F. equiseti iz Ńpanije (JF496570 i JF496571), kao i sa sekvencom jednog izolata iz SAD (FJ939676). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,5% sa razlikom u tri nukleotida ispitivani izolat ispoljio je sa sekvencama (DQ842056, FJ939674, FJ939686) iz Kanade, Francuske i Italije. Nakon sekvencioniranja fragmenta umnoņenog u PCR reakciji korińćenjem prajmera T1/T22, dobijena je delimična sekvenca gena β−tubulina i dodeljen joj je pristupni broj JQ717201. Molekularna identifikacija odabranog izolata obavljena je BLAST analizom sekvence produkta u duņini od 883 bp i pokazala je 99 do 100% identičnosti sa pet sekvenci izolata F. equiseti deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 866 bp. Najvińi stepen identičnosti od 100%, sekvenca odabranog izolata pokazala je sa izolatom F. equiseti iz SAD (GQ915441). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 98,7% sa razlikom u 11 nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatima F. equiseti pod pristupnim brojevima AB587036 i GQ915444 iz Japana i SAD. Za sekvencioniranje korińćen je amplifikovan PCR produkt dobijen pomoću para prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena calmodulina i deponovan je u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ423934 (tabela 10). Dobijena sekvenca uparena je sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Molekularna identifikacija sekvence produkta u duņini od 703 bp, pomoću BLAST analize pokazala je 77 98 do 100% identičnosti sa 13 sekvenci izolata F. equiseti deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 630 bp. Izvrńen je proračun genetičke sličnosti i najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivani izolat 286–09 pokazao je sa izolatom F. equiseti iz Nemačke (GQ505509), a najniņi stepen identičnosti (97,6%) sa razlikom u 15 nukleotida pokazao je sa izolatom F. equiseti iz SAD (GQ857062). Nakon sekvencioniranja PCR produkta izolata 286−09 dobijenog amplifikacijom mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ717202. Dobijena sekvenca ispitivanog izolata prethodno okarakterisana kao F. equiseti, uporeĎivana je sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. S obzirom da u GenBank bazi podataka ne postoji prijavljena sekvenca izolata F. equiseti umnoņena na osnovu mitohondrijalnog dela genoma (mtSSU) rDNK, ispitivani izolat pokazao je nizak stepen identičnosti od 98% sa 67 sekvenci izolata različitih Fusarium vrsta. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 611 bp, a proračunom genetičke sličnosti potvrĎen je nizak stepen identičnosti od 97,1% sa razlikom u 18 nukleotida sa F. oxysporum i njenih 17 specijalizovanih formi (F. oxysporum f. sp. asparagi, F. oxysporum f. sp. batatas, F. oxysporum f. sp. callistephi, F. oxysporum f. sp. cepae, F. oxysporum f. sp. fabae, F. oxysporum f. sp. heliotropii, F.oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum f. sp. matthiolae, F. oxysporum f. sp. phaseoli, F.oxysporum f. sp. rhois i F. oxysporum f. sp. vasinfectum). Molekularna identifikacija Fusarium proliferatum. Vińestrukim poreĎenjem sekvenci odgovarajućih delova nuklearne i mitohondrijalne DNK, kao i tri proteinska gena (TEF−1α, β−tubulin i calmodulin) sa dostupnim sekvencama gljiva u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti, obavljena je potvrda identifikacije odabranih izolata sirka (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10) poreklom iz Bačkog Petrovca i Čantavira. Za identifikaciju na osnovu sekvence ITS regiona odabran je reprezentativni predstavnik II grupe, izolat 297a−09 poreklom sa lokaliteta Čantavir, koji je prethodno okarakterisan na morfolońkom nivou kao F. proliferatum. Nakon sekvencioniranja PCR 78 produkta dobijenog amplifikacijom iz micelije uzorka 297a−09, korińćenjem para prajmera ITS1/ITS4, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka i dodeljen joj je pristupni broj JQ412110 (tabela 10). BLAST analiza sekvence produkta duņine 540 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama 34 izolata iz GenBank baze podataka, od čega su 22 izolata vrste F. proliferatum, sedam izolata G. moniliformis, jedan izolat F. subglutinans i četiri izolata Fusarium spp., ńto potvrĎuje visoku homologiju ITS regiona izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva. Proračun genetičke sličnosti odabranih sekvenci obavljen je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 528 bp. Najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivan izolat pokazao je sa sekvencama 19 izolata različitog porekla, od čega je devet izolata prijavljeno kao F. proliferatum i to poreklom iz Italije (EU151484, EU151486, EU151488, EU151489, EU151490), Kine (HQ113948, FJ040179), SAD (AF291061) i Indije (GU363955); četiri izolata prijavljena kao G. moniliformis iz Kine (HQ176444, HQ176445, EU364864, JF499678); četiri izolata prijavljena kao Fusarium spp. iz Kine (FJ360899, EU117221), SAD (F589878) i Ekvadora (JN662475), kao i po jednim izolatom G. intermedia (AB470869) iz Kine i F. subglutinans (JF499679) iz Indije. Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,4% sa razlikom u tri nukleotida ispitivani izolat ispoljio je sa sekvencom izolata F. proliferatum (GU066627) iz Malezije. Nakon sekvencioniranja PCR produkata dobijenih amplifikacijom iz micelije svih odabranih uzoraka, korińćenjem para prajmera ef1/ef2 koji omogućavaju amplifikaciju gena TEF−1α, konsenzus nukleotidne sekvence deponovane su u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojevima JQ412110 (izolat 297a−09), JQ412102 (izolat 13−10), JQ412104 (izolat 521−10), JQ412105 (izolat 522−10) i JQ412106 (izolat 530−10) (tabela 10). Proračunom genetičke sličnosti sekvenci dobijenih u ovom radu utvrĎeno je da izolat 297a−09 ima 99,5% sličnosti sa druga dva izolata, odnosno 13−10 i 521−10 koja su identična, zatim 99,6% sličnosti sa izolatom 522−10, a 99,8% sa izolatom 530−10. BLAST analiza sekvenci produkata u duņini od 658 do 675 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa sekvencama 98 izolata F. proliferatum deponovanih u GenBank bazi podataka. Za proračun genetičke sličnosti sve sekvence su svedene na duņinu od 567 bp, koliko je iznosila duņina najkraće sekvence korińćene u analizi, a svi ispitivani izolati 79 pokazali su najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sa sekvencama 10 izolata različitog porekla, od čega je pet izolata prijavljeno kao Gibberella fujikuroi var. intermedia poreklom iz Ńpanije (AM404158, AM397466, AM397467, AM397469, AM397470), dva izolata iz Francuske (JF278584, JF278609) i jednim izolatom iz Kanade (AM404121). Ostale dve sekvence koje su pokazale visok nivo homologije, prijavljene su kao F. proliferatum pod pristupnim brojevima EU220405 (Holandija) i EU220406 (Argentina). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 98,6% sa razlikom u osam nukleotida ispitivani izolati ispoljili su sa sekvencom izolata F. proliferatum (HQ176427) iz Kine. Nakon sekvencioniranja fragmenta umnoņenog u PCR reakciji korińćenjem prajmera T1/T22, dobijena je delimična sekvenca gena za β−tubulin izolata 297a−09 i prijavljena je u GenBank bazu podataka (JQ412112). Molekularna identifikacija odabranog izolata obavljena je BLAST analizom sekvence produkta u duņini od 1294 bp i pokazala je 99 do 100% identičnosti sa tri sekvence izolata F. proliferatum deponovane u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 1 279 bp. Najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sekvenca odabranog izolata pokazala je sa izolatom F. proliferatum iz SAD (AF291055). Razlika u samo jednom nukleotidu (99,9%) pokazala se poreĎenjem sa sekvencom izolata F. proliferatum iz Ńpanije (AF336910). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,3% sa razlikom u 9 nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatom G. intermedia pod pristupnim brojem AB587055 iz Japana. Za sekvencioniranje korińćen je amplifikovan PCR produkt izolata 297a−09 dobijen pomoću para prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena calmodulina i dobijena sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ412114 (tabela 10). Molekularna identifikacija sekvence produkta u duņini od 700 bp, pomoću BLAST analize pokazala je 99 do 100% identičnosti sa 10 sekvenci izolata F. proliferatum deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 655 bp i najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivani izolat 297a–09 pokazao je sa dva izolata F. proliferatum iz Italije (EU430620 i AJ560771), a najniņi stepen identičnosti 80 (99,2%) sa razlikom u 5 nukleotida pokazao je sa izolatom F. proliferatum takoĎe iz Italije (AJ560772). Nakon sekvencioniranja PCR produkta izolata 297a−09 dobijenog amplifikacijom mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ717203. Dobijena sekvenca izolata (duņine 686 bp) prethodno okarakterisana kao F. proliferatum, uporeĎivana je sa sekvencama drugih izolata F. proliferatum dostupnih u GenBank bazi podataka. BLAST analiza pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti ispitivanog izolata sa odgovarajućim sekvencama svih drugih izolata prijavljenih u GenBank bazi podataka kao F. proliferatum, F. oxysporum, F. concentricum, F. annulatum, F. globosum, F. sacchari, F. udum i Fusarium sp. Nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 632 bp, izvrńen je proračun genetičke sličnosti i najvińi nivo homologije od 100% ispitivani izolat 297a–09 pokazao je sa sekvencama 10 izolata različitih Fusarium vrsta, od čega su pet izolata prijavljena kao F. proliferatum iz SAD (AF291056, DQ016189, DQ016190, Q831947) i iz Ńpanije (AF336911), dva izolata F. oxysporum f. sp. lilii (EF437314) i F. oxysporum f. sp. tulipae iz Holandije, jedan izolat F. oxysporum f. sp. phaseoli (DQ016187) iz SAD, kao i sa sekvencama izolata F. concentricum (AF333941 i AF333943) iz Japana. BLAST analizom najniņi stepen homologije nukleotidnih sekvenci (98,7%) sa razlikom u osam nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatom F. udum pod pristupnim brojem U34517 iz SAD i sa izolatom Fusarium sp. (AF158293) iz Tanzanije. Molekularna identifikacija Fusarium graminearum. Molekularna identifikacija odabranih izolata F. graminearum obavljena je, nakon sekvencioniranja i proračuna genetičke sličnosti sekvenci izolata, dobijenih primenom prajmera koji omogućavaju amplifikaciju ITS regiona rDNK, proteinskih gena (TEF−1α, β−tubulin i calmodulin) i mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK. Za sekvencioniranje proteinskog gena TEF−1α odabrani su amplifikovani fragmenti tri izolata iz morfolońke grupe III (532−10, 535−10, 536−10) poreklom iz Čantavira, dok za ostale umnoņene genomne regione odabran je izolat 535−10, izolovan iz prizemnog dela stabla sirka, hibrida 'Gold', takoĎe iz 81 Čantavira. Pored navedenih, u ispitivanja je uključen i uzorak 14−11 dobijen iz prezimele zaraņene stabljike sirka sa formiranim peritecijama, poreklom iz Čantavira. Molekularna identifikacija odabranog izolata obavljena je nakon sekvencioniranja ITS regiona rDNK reprezentativnog predstavnika III grupe (izolat 535−10), koji je prethodno okarakterisan na morfolońkom nivou kao F. graminearum. Konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka i dodeljen joj je pristupni broj JQ412111 (tabela 10). BLAST analiza sekvence produkta duņine 528 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama 67 izolata deponovanih u GenBank bazu podataka, od čega je 31 izolat vrste G. zeae, a preostalih 36 vrsta pripadaju kompleksu F. graminearum ńto potvrĎuje visoku homologiju ITS regiona izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva. Proračun genetičke sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 500 bp. Najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivan izolat pokazao je sa sekvencama 9 izolata različitog porekla, od čega su četiri izolata prijavljena kao G. zeae iz Japana (AB289548, AB289549, AB289551, AB289553), dva izolata G. zeae iz Ekvadora (JN417227, JN589807), kao i sa sekvencom po jednog izolata G. zeae iz Kolumbije (HQ248200), Kine (GQ466391) i Francuske (AY188924). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,6% sa razlikom u dva nukleotida, ispitivani izolat ispoljio je sa sekvencom F. asiaticum (DQ459834) iz Japana, F. brasilicum (DQ459861) iz Brazila i F. cerealis (DQ459869) iz SAD. Nakon sekvencioniranja PCR produkata dobijenih amplifikacijom iz micelije svih odabranih uzoraka, korińćenjem para prajmera ef1/ef2 koji omogućavaju amplifikaciju gena TEF−1α, konsenzus nukleotidne sekvence deponovane su u GenBank bazu podataka i dodeljeni su im pristupni brojevi JQ412107 (izolat 532−10), JF747146 (izolat 535−10) i JQ412108 (izolat 536−10) (tabela 10). PoreĎenjem sekvenci TEF−1α gena, ispitivani izolati pokazali su visok stepen homologije, pri čemu izolat 532−10 ima 99,7% sličnosti sa druga dva izolata koja su meĎusobno potpuno identična. BLAST analiza sekvenci produkata u duņini od 676 do 678 bp, pokazala je 98 do 99% nukleotidne identičnosti sa sekvencama 64 izolata G. zeae deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 576 bp. Proračunom genetičke sličnosti ispitivani izolati 82 pokazali su najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 99,8% sa razlikom u jednom nukleotidu, sa sekvencama 41 izolata različitog porekla, od čega su 22 izolata prijavljena kao F. graminearum iz Norveńke (AJ543575−96), osam izolata G. zeae poreklom iz SAD (AF212455−59, AJ452957, AF107883, GU116585), četiri izolata G. zeae iz Francuske (JF278571−72, JF278591−92), dva izolata G. zeae iz Italije (GQ848544−45), dva izolata G. zeae iz Kine (HQ176419 i HQ176421), kao i sa sekvencom po jednog izolata G. zeae iz Australije (GU370497), Danske (AJ601394) i Finske (HM744693). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 98,8% sa razlikom u sedam nukleotida, ispitivani izolati ispoljili su sa sekvencom G. zeae (GU370499) iz Australije. Nakon sekvencioniranja fragmenta umnoņenog u PCR reakciji korińćenjem prajmera T1/T22, dobijena je delimična sekvenca gena za β−tubulin izolata 535−10 (pristupni broj JQ412113). Molekularna identifikacija odabranog izolata obavljena je BLAST analizom sekvence produkta u duņini od 1027 bp i pokazala je 99 do 100% identičnosti sa 18 sekvenci izolata G. zeae deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 703 bp. Najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sekvenca odabranog izolata pokazala je sa sekvencama osam izolata različitog porekla, od čega su pet izolata prijavljeni kao G. zeae iz SAD (DQ459630−31, DQ459634−36), dva izolata G. zeae iz Japana (FJ536851−52), kao i sa sekvencom jednog izolata G. zeae iz Rusije (HQ141668). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,3% sa razlikom u pet nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatom pod pristupnim brojem AY303689 iz Kine. Za sekvencioniranje korińćen je amplikon izolata 535−10 dobijen pomoću para prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena za calmodulin i dobijena sekvenca je deponovana u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ412115 (tabela 10). Molekularna identifikacija sekvence produkta u duņini od 713 bp, pomoću BLAST analize pokazala je 99% identičnosti sa jedinom sekvencom izolata G. zeae deponovanom u GenBank bazi podataka. Nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 703 bp, proračnato je da ima 99,7% nukleotidne sličnosti, sa razlikom u dva nukleotida sa izolatom G. zeae iz Kine (HQ412343). 83 Nakon sekvencioniranja PCR produkta izolata 535−10 dobijenog amplifikacijom mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojem JQ717204. BLAST analiza produkta u duņini 638 bp pokazala je 99% nukleotidne identičnosti ispitivanog izolata sa odgovarajućim sekvencama svih drugih izolata prijavljenih u GenBank bazi podataka kao G. zeae, F. culmorum, F. cerealis i F. lunulosporum. Nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 528 bp, izvrńen je proračun genetičke sličnosti i najvińi nivo homologije od 99,8%, sa razlikom u jednom nukleotidu, ispitivani izolat 535−10 pokazao je sa sekvencama ńest izolata različitih Fusarium vrsta, od čega su dva izolata prijavljena kao G. zeae iz Finske (AF406627) i SAD (DQ364632), a četiri izolata F. culmorum iz Velike Britanije (EU744732−35). Najniņi stepen homologije nukleotidnih sekvenci (99,6%) sa razlikom u dva nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa sekvencom po jednog izolata G. zeae (U34520), F. culmorum (U85552), F. cerealis (U85551) i F. lunulosporum (U85554) iz SAD. Nakon sekvencioniranja PCR produkta dobijenog amplifikacijom iz peritecija uzorka 14−11, korińćenjem para prajmera ef1/ef2 koji omogućavaju amplifikaciju gena TEF−1α, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka (JQ862471). BLAST analiza sekvence produkta u duņini od 674 bp, pokazala je 99 % nukleotidne identičnosti sa sekvencama 72 izolata G. zeae deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 582 bp. Proračunom genetičke sličnosti uzorak 14−11 pokazao je najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sa sekvencama 49 izolata različitog porekla, od čega su 34 izolata prijavljena kao G. zeae iz SAD (JF270169, JF270171−73, JF270180, JF270185, JF270189−90, JF270196, JF270203, JF270206−08, JF270210, JF270239, JF270241, JF270247, JF270252, JF270263, JF270270, JF270274, JF270276−77, JF270279, JF270282, JF270284−85, JF270292−95, JF270297, GU116585, HM744693), devet izolata F. graminearum iz Norveńke (AJ543588−96), tri izolata G. zeae iz Francuske (JF278571−72, JF278591), kao i sa po jednom sekvencom izolata G. zeae iz Australije (GU370497), Kine (HQ176421) i Italije (GQ848545). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,6% sa razlikom u dva 84 nukleotida, ispitivani izolat ispoljio je sa 11 sekvenci izolata G. zeae različitog porekla, od čega su 9 iz SAD (JF270176, JF270188, JF270195, JF270199, JF270213, JF270219, JF270228, JF270309−10), kao i sa po jednom sekvencom iz Nemačke (FJ939688) i Kanade (GU370498). Molekularna identifikacija Fusarium thapsinum. Molekularna identifikacija F. thapsinum izvrńena je vińestrukim uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti sekvence odabranog izolata sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Za ova ispitivanja odabran je izolat 808−11 iz morfolońke grupe IV, izolovan iz semena sirka hibrida 'Gold', a koji je prethodno okarakterisan na morfolońkom nivou kao F. tahapsinum. Uspeńno je sekvencionirano pet umnoņenih genomnih regiona: ITS regiona rDNK, proteinskih gena za TEF−1α, β−tubulin i calmodulin, kao i mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK odabranog izolata. Nakon sekvencioniranja PCR produkta uzorka 808−11, korińćenjem para prajmera ITS1/ITS4 koji omogućavaju amplifikaciju ITS regiona rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka i dodeljen joj je pristupni broj JQ717206 (tabela 10). BLAST analiza sekvence produkta duņine 506 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa ITS rDNK sekvencama sedam izolata G. thapsina prijavljenih u GenBank bazi podataka. Proračunom genetičke sličnosti odabranih sekvenci, najvińi stepen identičnosti od 100% ispitivan izolat pokazao je sa ukupno ńest izolata G. thapsina iz SAD (EF152433), Kine (HQ176442) i Indije (GU257894, GU257897, GU257901−02), a najniņi stepen identičnosti od 99,6% sa razlikom u dva nukleotida pokazao je sa sekvencom izolata F. thapsinum (U34560) iz Juņne Afrike. Nakon sekvencioniranja PCR produkta dobijenog amplifikacijom gena TEF−1α korińćenjem para prajmera ef1/ef2, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka (JQ717205). BLAST analiza sekvence produkta u duņini od 680 bp, pokazala je 99 do 100% nukleotidne identičnosti sa sekvencama 17 izolata G. thapsina deponovanih u GenBank bazi podataka. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti odabranih sekvenci obavljeno je nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 530 bp. Nakon proračuna genetičke sličnosti, izolat 808−11 pokazao je najvińi stepen nukleotidne 85 identičnosti od 100% sa sekvencama 14 izolata različitog porekla, od čega je 10 izolata prijavljeno kao G. thapsina iz SAD (JF270217, JF270220, JF270238, JF270251, JF270301, JF270311, GU116573, GU116586, EF152428, AF160270) i četiri izolata G. thapsina iz Indije (FJ603488, FJ603498, FJ603506−07). Najniņi stepen nukleotidne identičnosti od 99,4% sa razlikom u tri nukleotida ispitivani izolat ispoljio je sa sekvencom HQ176429 iz Kine. Nakon sekvencioniranja fragmenta umnoņenog u PCR reakciji korińćenjem prajmera T1/T22, dobijena je delimična sekvenca gena za β−tubulin i prijavljena je u GenBank bazu podataka (JQ717207). Molekularna identifikacija odabranog izolata obavljena je BLAST analizom sekvence produkta u duņini od 543 bp i pokazala je 100% identičnosti sa sekvencom izolata G. thapsina (U34502) iz Juņne Afrike. Za sekvencioniranje korińćen je amplifikovan PCR produkt dobijen pomoću para prajmera CL1/CL2A koji omogućavaju amplifikaciju gena za calmodulin, a sekvenca je deponovana u GenBank bazu podataka (JQ717208). Molekularna identifikacija dobijene sekvence u duņini od 558 bp, pomoću BLAST analize pokazala je 100% identičnosti sa jedinom sekvencom izolata G. thapsina (AF158323) iz SAD. Nakon sekvencioniranja PCR produkta izolata 808−11 dobijenog amplifikacijom mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) rDNK, konsenzus nukleotidna sekvenca deponovana je u GenBank bazu podataka (JQ717209). BLAST analiza sekvence ispitivanog izolata duņine 651 bp, pokazala je 99% nukleotidne identičnosti sa odgovarajućom sekvencom G. thapsina (U34502) iz Juņne Afrike, koji je takoĎe izolovan iz S. bicolor. Proračunom genetičke sličnosti nakon trimovanja sekvenci na duņinu od 635 bp izmeĎu ispitivanog izolata 808−11 i G. thapsina (U34502) ustanovljena je identičnosti od 99,8%, sa razlikom u jednom nukleotidu. Molekularna identifikacija Epicoccum nigrum. Nakon identifikacije primenom konvencionalnih morfolońkih i molekularnih metoda, amplifikacijom ITS regiona rDNK izvrńena je karakterizacija izolata V morfolońke grupe (291−09 i 315−09) iz zrna gajenog sirka hibrida 'Alba' i 'Gold', poreklom iz Bačkog Petrovca. Molekularna identifikacija odabranih izolata obavljena je nakon sekvencioniranja ITS regiona rDNK, vińestrukim 86 uparivanjem i proračunom genetičke sličnosti dobijenih sekvenci sa sekvencama drugih izolata dostupnih u GenBank bazi podataka. Sekvencioniranjem dva odabrana PCR produkta uzoraka 291−09 i 315−09, korińćenjem para prajmera ITS1/ITS4, konsenzus nukleotidne sekvence deponovane su u GenBank bazu podataka pod pristupnim brojevima JQ619838 i JQ619839 (tabela 10). BLAST analiza sekvenci produkata u duņini od 546 bp, pokazala je 99% do 100% nukleotidne identičnosti sa sekvencama 31 izolata E. nigrum. Vińestruko uparivanje i proračun nukleotidne sličnosti sekvenci izolata 291−09 i 315−09, nakon trimovanja na duņinu od 533 bp pokazalo je najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% sa sekvencama 23 izolata različitog porekla prijavljena kao E. nigrum. Od toga je 17 izolata iz Ńpanije (FN868456, FJ424232−37, FJ424242−45, FJ424250, FJ424251, FJ424256, FJ424257, FJ424263, FJ424264), tri iz Kine (GU586847, AB470875, AB470889), dva iz Italije (EU232716, EU529998) i jedan izolat iz Kanade (JN689342). 5.7.2. Molekularna karakterizacija Fusarium spp. Za filogenetske analize kompleksa vrsta Fusarium patogenih za gajeni sirak u Srbiji korińćene su delimične nukleotidne sekvence dobijene amplifikacijom pet različitih genomnih regiona: ITS rDNK, TEF−1α, β−tubulin, calmodulin i mitohondrijalni mtSSU rDNK. U ova ispitivanja uključene su sekvence izolata identifikovanih vrsta F. equiseti (286−09), F. proliferatum (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10), F. graminearum (532−10, 535−10, 536−10, 14−11) i F. thapsinum (808−11). Dobijene sekvence vrsta F. proliferatum i F. thapsinum su uparene sa odabranim odgovarajućim sekvencama vrsta kompleksa G. fujikuroi dostupnim u GenBank bazi podataka i rekonstruisano je pet filogenetskih stabala na osnovu odgovarajućih delova genoma, primenom Maximum Parsimony metode i bootstrap podrńkom od 1000 ponavljanja. Filogenetska stabla svih gena rutovana su sa F. oxysporum i F. inflexum iz kompleksa F. oxysporum kao autgrupom. Dobijene sekvence vrste F. graminearum su uparene sa odabranim odgovarajućim sekvencama 33 vrste kompleksa F. graminearum dostupnim u GenBank bazi podataka i 87 rekonstruisana su tri filogenetska stabla na osnovu delova genoma ITS regiona rDNK, TEF−1α i β−tubulina uz primenu Maximum Parsimony metode i bootstrap podrńke od 1000 ponavljanja. Filogenetska stabla rutovana su sa F. pseudograminearum, kao autgrupom. Dobijena sekvenca vrste F. equiseti je uparena sa odabranim odgovarajućim sekvencama 54 vrste F. equiseti dostupnim u GenBank bazi podataka i rekonstruisano je jedno filogenetsko stablo na osnovu gena TEF−1α uz primenu Maximum Parsimony metode i bootstrap podrńke od 1000 ponavljanja. Filogenetsko stablo je rutovano sa F. graminearum, kao autgrupom. Filogenetska analiza F. proliferatum i F. thapsinum. Sekvence ITS regiona rDNK izolata 297a−09 (F. proliferatum) i 808−11 (F. thapsinum) iz sirka poreklom iz Srbije, i 49 dostupnih sekvenci vrsta kompleksa G. fujikuroi meĎusobno su uparene i rekonstruisano je filogenetsko stablo. Analizom filogenetskog stabla (slika 26) rekonstruisanog na osnovu sekvenci ITS regiona rDNK uočljiva je podela na dva delimično definisana klastera ili dve grupe. UtvrĎeno je da su ispitivani izolati 297a−09 (F. proliferatum) i 808−11 (F. thapsinum) smeńteni unutar drugog klastera. U okviru ovog klastera meĎu izolatima različitih vrsta kompleksa G. fujikuroi, grupisan je izolat vrste F. proliferatum iz orhideje poreklom iz Nemačke i izolat vrste F. thapsinum iz S. bicolor poreklom iz Juņne Afrike. Pored ovih vrsta u drugi klaster grupisali su se izolati vrste F. acutatum, F. concentricum, F. dlaminii, F. fujikuroi, F. nygamai, F. phyllophilum, F. udum i druge Fusarium sp. ukazujući na njihovu veću srodnost na osnovu ovog dela genoma. U prvom, većem klasteru koji sadrņi oko 30 vrsta, izmeĎu ostalih, nalaze se vrste F. anthophilum, F. bactridioides, F. circinatum, F. denticulatum, F. guttiforme, F. napiforme, F. pseudoanthophilum, F. pseudocircinatum, F. pseudonygamai, F. ramigenum, F. sacchari, F. subglutinans, F. succisae, F. verticillioides i druge Fusarium sp. 88 Slika 26. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci ITS regiona rDNK 51 izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 89 Filogenetsko stablo rekonstruisano iz fragmenta TEF nuklearnog gena pokazalo je jasno razdvajanje odabranih izolata vrsta G. fujikuroi kompleksa u četiri klastera (slika 27). Sekvenca izolata 808−11 (F. thapsinum) grupisana je u prvi klaster sa većinom vrsta kompleksa G. fujikuroi, meĎu kojima je i sekvenca izolata F. thapsinum iz S. bicolor poreklom iz Juņne Afrike, kao i vrste F. acutatum, F. brevicatenulatum, F. denticulatum, F. napiforme, F. nygamai, F. pseudoanthophilum, F. pseudocircinatum, F. pseudonygamai, F. udum, F. verticillioides i druge Fusarium sp. Sekvence izolata 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10 (F. proliferatum) grupisane su u treći klaster zajedno sa vrstom F. proliferatum iz orhideje poreklom iz Nemačke, kao i sa vrstama F. concentricum, F. fujikuroi, F. globosum, F. sacchari i drugim Fusarium sp. Grupisanje u okviru oba klastera snaņno je podrņano sa “bootstrap” vrednostima od 100%. U drugom klasteru grupisane su vrste F. anthophilum, F. bactridioides, F. begoniae, F. bulbicola, F. circinatum, F. guttiforme, F. succisae, F. subglutinans i druge Fusarium sp., dok unutar četvrtog klastera nalazi se vrsta F. dlaminii i dve Fusarium sp. 90 Slika 27. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein elongacioni faktor TEF−1α 55 izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. oxysporum i F.inflexum. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 91 Na osnovu delimičnih nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za β−tubulin izolata 297a−09 (F. proliferatum) i 808−11 (F. thapsinum) iz sirka poreklom iz Srbije, kao i 52 dostupne sekvence vrsta kompleksa G. fujikuroi rekonstruisano je filogenetsko stablo koje je pokazalo razdvajanje odabranih izolata u tri klastera (slika 28). Sekvenca izolata 808−11 (F. thapsinum) grupisana je u prvi klaster sa većinom vrsta kompleksa G. fujikuroi, meĎu kojima je i sekvenca izolata F. thapsinum iz S. bicolor poreklom iz Juņne Afrike, kao i vrste F. acutatum, F. brevicatenulatum, F. denticulatum, F. dlaminii, F. napiforme, F. nygamai, F. pseudoanthophilum, F. pseudocircinatum, F. pseudonygamai, F. udum, F. verticillioides i druge Fusarium sp., dok je sekvenca izolata 297a−09, (F. proliferatum) grupisana u treći klaster zajedno sa vrstom F. proliferatum iz orhideje poreklom iz Nemačke, kao i sa vrstama F. concentricum, F. fujikuroi, F. globosum, F. sacchari i drugim Fusarium sp. Grupisanje u okviru oba klastera snaņno je podrņano sa “bootstrap” vrednostima od 100%. U drugom klasteru grupisane su vrste F. anthophilum, F. bactridioides, F. begoniae, F. bulbicola, F. circinatum, F. guttiforme, F. succisae, F. subglutinans i druge Fusarium sp. Rezultati filogenetske analize 49 nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za calmodulin takoĎe su pokazali da izolat 808−11 (F. thapsinum) pripada prvom klasteru, dok se izolat 297a−09 (F. proliferatum) grupińe u odvojeni klaster (slika 29). U okviru prvog klastera sa ispitivanim izolatom 808−11, pored sekvence izolata F. thapsinum iz S. bicolor poreklom iz Juņne Afrike, smeńtene su i srodnije vrste F. acutatum, F. brevicatenulatum, F. denticulatum, F. dlaminii, F. napiforme, F. nygamai, F. pseudoanthophilum, F. pseudocircinatum, F. pseudonygamai, F. udum, F. verticillioides i druge Fusarium sp. U okviru drugog klastera sa ispitivanim izolatom 297a−09 grupisana je vrsta F. proliferatum iz orhideje poreklom iz Nemačke, kao i vrste F. concentricum, F. fujikuroi, F. globosum, F. sacchari i druge. Grupisanje u okviru oba klastera snaņno je podrņano sa “bootstrap” vrednostima od 100%. U trećem klasteru grupisane su sekvence izolata F. anthophilum, F. bactridioides, F. begoniae, F. bulbicola, F. circinatum, F. guttiforme, F. succisae, F. subglutinans i druge Fusarium sp. 92 Filogenetsko stablo rekonstruisano iz fragmenta mitohondrijalnog gena za malu podjedinicu ribozomske DNK, pokazalo je jasno razdvajanje 54 odabrana izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi u tri klastera (slika 30). Sekvenca izolata 808−11 grupisana je u prvi klaster sa većinom vrsta G. fujikuroi kompleksa, meĎu kojima je i sekvenca izolata F. thapsinum iz S. bicolor poreklom iz Juņne Afrike, kao i vrste F. acutatum, F. brevicatenulatum, F. denticulatum, F. dlaminii, F. napiforme, F. nygamai, F. pseudoanthophilum, F. pseudocircinatum, F. pseudonygamai, F. udum, F. verticillioides i druge Fusarium sp. Sekvenca izolata 297a−09 grupisana je u drugi klaster zajedno sa vrstom F. proliferatum iz orhideje poreklom iz Nemačke, kao i sa vrstama F. concentricum, F. fujikuroi, F. globosum, F. sacchari i drugim Fusarium sp. Grupisanje u okviru oba klastera snaņno je podrņano sa “bootstrap” vrednostima od 100%. U trećem klasteru grupisane su sekvence izolata F. anthophilum, F. bactridioides, F. begoniae, F. bulbicola, F. circinatum, F. guttiforme, F. succisae, F. subglutinans i druge Fusarium sp. 93 Slika 28. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein β−tubulin 52 izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. oxysporum i F.inflexum. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 94 Slika 29. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein calmodulin 47 izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. oxysporum i F.inflexum. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 95 Slika 30. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci mitohondrijalnog gena mtSSU rDNK 52 izolata vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. oxysporum i F.inflexum. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 96 Filogenetska analiza F. graminearum. Sekvenca ITS regiona rDNK izolata 535−10 (F. graminearum) iz prizemnog dela stabla sirka poreklom iz Čantavira i 54 dostupne sekvence podeljene u 11 ranije opisanih filogeografskih linija unutar F. graminearum kompleksa, poreklom iz Severne i Juņne Hemisfere odabrane su za filogenetsku analizu. Analizom filogenetskog stabla rekonstruisanog na osnovu sekvenci ITS regiona rDNK, nije dobijeno očekivano razdvajanje (slika 31). Zbog visoke homologije sekvenci ITS regiona svi izolati F. graminearum kompleksa grupisani su u jedan zajednički klaster, u koji je izmeĎu ostalog grupisana i sekvenca ispitivanog izolata 535−10 (F. graminearum). Najvińi stepen homologije odabranih sekvenci kretao se 99,9−100%, a razlika u samo jednom nukleotidu pokazala se kod sekvenci izolata F. austroamericanum (DQ459838), F. boothii (DQ459845−48) i F. brasilicum (DQ459861). Razlika u tri nukleotida (99,4%) pokazala se kod sekvenci izolata F. acaciae−mearnsii (DQ459849, DQ459851, DQ459853−54), koje su se izdvojile u zaseban klaster. Filogenetska analiza unutar Fg klastera obavljena na osnovu sekvenci gena za TEF−1α uključila je 33 izolata odabrana iz svetske kolekcije, koji su genetički raznovrsni za ovaj takson, zajedno sa četiri ispitivana izolata. Rekonstruisano stablo pokazalo je izdvajanje sedam klastera unutar kompleksa F. graminearum koji su označeni sa oznakama vrsta od 1−7. Ispitivani izolati 532−10, 535−10, 536−10 (F. graminearum) i 14−11 (teleomorf G. zeae) izolovani iz prizemnog dela stabla sirka poreklom iz Čantavira grupisani su u klaster sa oznakom 7, zajedno sa ostalim predstavnicima vrste F. graminearum (slika 32). Za vrste ovog klastera karakteristično je da preovlaĎuju u Severnoj hemisferi, poreklom su iz MaĎarske, Holandije, Irana i Srednje Amerike. Grupisanje u okviru klastera podrņano je sa “bootstrap” vrednostima od 95%. Na osnovu delimičnih nukleotidnih sekvenci gena za β−tubulin izolata 535−10 (F. graminearum), kao i 27 dostupne sekvence vrsta kompleksa F. graminearum, rekonstruisano je filogenetsko stablo koje je pokazalo razdvajanje odabranih izolata vrsta kompleksa F. graminearum u sedam klastera (slika 33). Sekvenca izolata 535−10 grupisala se u sedmi klaster zajedno sa ostalim izolatima vrste F. graminearum. Ovi izolati preovlaĎuju u Severnoj hemisferi, poreklom su iz MaĎarske, Holandije i Srednje Amerike. Grupisanje u okviru klastera podrņano je sa “bootstrap” vrednostima od 85% 97 Slika 31. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci ITS regiona rDNK 55 izolata vrsta kompleksa F. graminearum korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. pseudograminearum i Fusarium sp. NRRL 29380 i NRRL 29298. Izolat iz gajenog sirka iz Srbije označen je crvenom bojom 98 Slika 32. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein elongacioni faktor TEF−1α 37 izolata vrsta kompleksa F. graminearum korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. pseudograminearum. Izolati iz gajenog sirka iz Srbije označeni su crvenom bojom 99 Slika 33. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein β−tubulin 28 izolata vrsta kompleksa F. graminearum korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. pseudograminearum. Izolat iz gajenog sirka iz Srbije označen je crvenom bojom 100 Filogenetska analiza F. equiseti. Delimična nukleotidna sekvenca nuklearnog gena za elongacioni faktor TEF−1α izolata 286−09 (F. equiseti) iz prizemnog dela stabla sirka poreklom iz Bačkog Petrovca, kao i 54 dostupne sekvence vrste F. equiseti, zajedno sa četiri izolata vrste F. scirpi koje su blisko povezane, odabrane su za filogenetsku analizu. Rekonstruisano filogenetsko stablo pokazalo je jasno razdvajanje odabranih izolata vrste F. equiseti u tri klastera (slika 34). Sekvenca izolata 286−09 grupisana je u drugi klaster sa sekvencama 12 izolata vrste F. equiseti, poreklom iz Ńpanije, dok je ostalih 20 sekvenci izolata vrste F. equiseti, poreklom iz Severne Evrope grupisano u prvi klaster. Ostalih ńest sekvenci izolata vrste F. equiseti različitog porekla, iz Malte, Norveńke, SAD i Kanade, smeńtene su u treći klaster sa sekvencama blisko srodne vrste, F. scirpi. Grupisanje u okviru oba klastera snaņno je podrņano sa “bootstrap” vrednostima od 100%. 101 Slika 34. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci nuklearnog gena za protein elongacioni faktor TEF−1α 55 izolata vrste F. equiseti i četiri izolata vrste F. scirpi korińćenjem MEGA 5 softvera upotrebom Maximum Parsimony metode sa bootrstrap analizom u 1000 ponavljanja gde su bootstrap vrednosti (>50%) prikazane pored odgovarajućih grana. Stablo je rutovano sa F. graminearum. Izolat iz gajenog sirka iz Srbije označen je crvenom bojom 102 5.8. Osetljivost različitih genotipova sirka prema Fusarium spp. Rezultati utvrĎivanja reakcije različitih genotipova sirka prema prevalentnim vrstama Fusarium spp. ukazali su na postojanje različitih nivoa osetljivosti klijanaca komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala. Uporednim ispitivanjem osetljivosti 11 različitih genotipova sirka u uslovima staklenika i biljaka u polju (veńtačka inokulacija i prirodna zaraza stabla), dobijeni su značajni podaci o potencijalu genotipova sirka u agroekolońkim uslovima u Srbiji. 5.8.1. Osetljivost klijanaca sirka prema Fusarium spp. u uslovima staklenika Za ispitivanje stepena osetljivosti 11 različitih genotipova sirka u eksperimentalnim uslovima staklenika odabrano je 12 izolata Fusarium spp., za koje je prethodno uraĎena karakterizacija na morfolońkom i molekularnom nivou. Svih 12 izolata, 286−09 (F. equiseti), 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10 (F. proliferatum), 532−10, 535−10, 536−10 (F. graminearum) i 291−09, 315−09, 539−10 (E. nigrum) izazvalo je reakciju na klijancima ńest različitih genotipova, sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') i sirka za zrno ('Alba', A28, parc.262/2010, PI534163 02 SD, PI656114 01 i SD PI576382 03 SD) u vidu nekroze različitog intenziteta, koja je ocenjena na osnovu skale stepena zaraņenosti klijanaca sirka od 0 do 5 (tabela 11). Na genotipovima sirka za zrno 'Gold', kao i na A73 i PI595720 02 SD ispitivani izolati, odnosno četiri različite vrste kompleksa gljiva nisu prouzrokovali patolońke promene ili razvoj simptoma na klijancima sirka. 103 Tabela 11. Prosečne ocene intenziteta zaraze klijanaca različitih genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. i Epicoccum nigrum *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) Genotip sirka Vrste/Izolati F. equiseti F. proliferatum F. graminearum E. nigrum K 286-09 297a-09 13-10 521-10 522-10 530-10 532-10 535-10 536-10 291-09 315-09 539-10 'ALBA' 0,00* 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 'GOLD' 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 'PRIMA' 4,90 4,90 4,95 5,00 4,90 5,00 5,00 5,00 5,00 1,55 1,60 1,60 0,00 'REFORM' 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 0,00 A28 0,00 0,25 0,65 1,00 1,00 0,90 0,15 0,25 0,25 0,00 0,00 0,00 0,00 A73 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 parc.262/2010 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 0,00 0,00 0,00 0,00 PI534163 02 SD 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 2,75 2,75 3,15 0,00 PI576382 03 SD 0,00 0,15 0,20 0,00 0,15 0,20 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 PI595720 02 SD 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 PI656114 01 SD 4,10 4,15 4,00 4,10 3,95 3,90 0,25 0,25 0,25 1,70 1,30 1,00 0,00 104 Ispitivani izolati po tipu simptoma, koje su prouzrokovali na klijancima 11 različitih genotipova sirka, mogu se podeliti u četiri meĎusobno različite grupe. Prvu grupu činio je izolat 286−09 (F. equiseti), koji je prouzrokovao potpuno suńenje i propadanje inokulisanih klijanaca sorte 'Prima', 'Reform', parc.262/2010 i američke linije PI534163 02 SD, dok je nekrozu celog stabla prouzrokovao na liniji PI656114 01 SD (slika 35a). Drugu grupu činili su izolati 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10 (F. proliferatum), koji su takoĎe prouzrokovali potpuno suńenje klijanaca sorte 'Prima', 'Reform', parc.262/2010 i američke linije PI534163 02 SD, a neńto slabiju nekrozu u vidu sitnih pega na klijancima sorte A28 i linije PI576382 03 SD. MeĎutim, uočena je varijabilnost unutar vrste, gde je od pet izolata F. proliferatum, samo jedan (530−10) prouzokovao simptome na klijancima hibrida 'Alba'. Treću grupu sačinjavali su izolati 532−10, 535−10 i 536−10 (F. graminearum), koji su u poreĎenju sa prethodne dve grupe prouzrokovali slične simptome na klijancima sorte 'Prima', 'Reform', parc.262/2010 i američke linije PI534163 02 SD, dok su na klijancima sorte A28 i linije PI656114 01 SD prouzrokovali slabiju nekrozu u vidu sitnih pega. Izolati četvrte grupe, 291−09, 315−09 i 539−10 (E. nigrum) prouzrokovali su potpuno suńenje klijanaca sorte sirka metlańa 'Reform', a slabiju nekrozu u vidu sitnih do dugih pega na klijancima sorte 'Prima' i američkim linijama PI656114 01 SD i PI534163 02 SD. U uslovima postavljenog eksperimenta izolati sve četiri grupe nisu prouzrokovali nekrozu na genotipovima sirka za zrno 'Alba' (osim izolata 530−10), Gold i A73, kao i na američkim linijama PI595720 02 SD i PI576382 03 SD (slika 35b). Slika 35: Osetljivost klijanaca sirka u uslovima staklenika: reakcije klijanaca sorte 'Reform' (a) i sorte A73 (b) izazvane različitim ispitivanim izolatima 105 Na osnovu dvofaktorijalne analize varijanse (ANOVA) za stepen zaraze klijanaca u kontrolisanim uslovima utvrĎene su statistički vrlo značajne razlike (P<0,001), kako izmeĎu genotipova i izolata, tako i njihove interakcije (tabela 12). Tabela 12. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za osetljivost klijanaca različitih genotipova sirka prema Fusarium spp. Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Genotip 9889,780 10 988,978 4965,450 <0,001 Izolat 1415,741 12 117,978 592,345 <0,001 Genotip x Izolat 2667,529 120 22,229 111,609 <0,001 Greška 541,150 2717 0,199 Ukupno 14514,200 2859 Parna poreĎenja osetljivosti genotipova prema Fusarium spp. pokazala su da izmeĎu genotipova 'Gold', A73, PI595720 02 SD, PI576382 03 SD i 'Alba' ne postoji statistički značajna razlika (tabela 13). Razlike izmeĎu ove homogene grupe i drugih ispitivanih genotipova (sorte 'Prima', 'Reform', parc. 262/2010 i A28; linije PI656114 01 SD i PI534163 02 SD) statistički su vrlo značajne. Tabela 13. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu stepena osetljivosti klijanaca prema Fusarium spp. Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 4 5 6 7 'Gold' 0,0000 A73 0,0000 PI595720 02 SD 0,0000 PI576382 03 SD 0,0538 'Alba' 0,0769 A28 0,3423 PI656114 01 SD 2,2269 parc. 262/2010 3,4615 'Prima' 3,800 PI534163 02 SD 4,1269 'Reform' 4,6154 P vrednost 0,500 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa 106 Parna poreĎenja izolata i njihovo razvrstavanje u homogene grupe ukazuju da su ispitivani izolati prouzrokovali četiri različita tipa simptoma na klijancima sirka, zavisno od genotipa, uključujući i kontrolu (tabela 14). Grupa izolata 286−09 (F. equiseti), 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10, 530−10 (F. proliferatum) reagovala je homogeno jer su izolati prouzrokovali potpuno suńenje i propadanje klijanaca sirka. Ovi izolati nisu se meĎusobno statistički značajno razlikovali, ali jesu od svih ostalih izolata i od kontrole. Drugu homogenu grupu sačinjavali su izolati 532−10, 535−10 i 536−10 (F. graminearum) koji su prouzrokovali slične simptome kao i prethodna grupa, ali neńto slabijeg intenziteta na sorti A28 i liniji PI656114 01 SD, i nisu se meĎusobno statistički značajno razlikovali. Treća grupa izolata 291−09, 315−09 i 539−10 (E. nigrum) statistički se razlikovala od ostalih grupa i od kontrole, jer su izolati prouzrokovali niņi nivo nekroze. Tabela 14. Razvrstavanje izolata u homogene grupe na osnovu prosečnih ocena osetljivosti genotipova sirka prema ispitivanim izolatima gljiva Vrsta Izolat Homogene grupe* 1 2 3 4 Kontrola 0,0000 E. nigrum 291–09 0,9682 E. nigrum 315–09 0,9773 E. nigrum 539–10 1,0000 F. graminearum 532–10 1,8545 F. graminearum 535–10 1,8636 F. graminearum 536–10 1,8636 F. equiseti 286–09 2,1818 2,1818 F. proliferatum 297a–09 2,2227 2,2227 F. proliferatum 13–10 2,2545 2,2545 F. proliferatum F. proliferatum F. proliferatum 521–10 522–10 530–10 2,2727 2,2818 2,2727 2,2818 2,3636 P vrednost 1,000 0,885 0,075 0,449 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa 5.8.2. Osetljivost stabla sirka prema Fusarium spp. u poljskim uslovima Osetljivost stabla različitih genotipova sirka ocenjena je u 2010. i 2011. godini na lokalitetu Bački Petrovac (veńtačka inokulacija stabla) i Čantavir (prirodna zaraza). Na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) povrńinskog tkiva i tkiva na uzduņnom preseku 107 oko mesta inokulacije ocenjena je osetljivost ispitivanih genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije stabla izolatima Fusarium spp. U prvoj godini, na oglednoj parceli u Bačkom Petrovcu, ispitivana je osetljivost stabla četiri genotipa komercijalnog sirka, dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform'). U drugoj godini ispitivanja, pored navedena četiri, uključena su joń četiri genotipa sirka za zrno dobijena u razmeni iz SAD (linije PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD), koja su opisani kao otporni na vrste i forme roda Fusarium. Za ova ispitivanja korińćeni su izolati dve različite vrste iz roda Fusarium, koje su redovno bile izolovane iz zaraņenog materijala sirka u Srbiji, i to: F. equiseti (286–09) i F. proliferatum (297a–09). U uslovima prirodne zaraze ocenjena je osetljivost stabla dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform') na lokalitetu Čantavir. Osetljivost sirka prema Fusarium spp. u uslovima veštačke inokulacije stabla. Na oglednoj parceli u Bačkom Petrovcu tokom 2010. i 2011. godine u poljskim uslovima ocenjena je osetljivost genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije stabla, koja se zasnivala na povreĎivanju biljnog tkiva direktnim unońenjem patogena u tkivo domaćina metodom inokulisanih čačkalica. Jasno vidljive promene boje tkiva uočene su oko mesta inokulacije, u vidu crvenkastomrkih pega, a kasnije se nekroza intenzivno ńirila na susedne internodije (slika 36). U nekim slučajevima, nekroza stabla nije bila vidljiva spolja već na uzduņnom preseku stabla. 108 Slika 36. Simptomi na stabu: Nekroza tkiva na povrńini stabla oko mesta inokulacije, (levo); nekroza tkiva na uzduņnom preseku stabla (sredina) i kontrola (desno) a) Osetljivost sirka ocenjena na osnovu intenziteta površinske zaraze stabla oko mesta inokulacije. U zavisnosti od izolata, prosečna ocena intenziteta razvoja nekroze povrńine stabla u 2010. godini varirala je od 1,37 (F. equiseti, izolat 286–09) do 2,56 (F. proliferatum, izolat 297a–09) (tabela 15). U proseku, najmanju osetljivost prema Fusarium spp. ispoljili su hibridi sirka za zrno 'Alba' (prosečna ocena 1,19) i 'Gold' (prosečna ocena 1,39), a veću osetljivost sorte sirka metlańa 'Reform' (prosečna ocena 2,68) i 'Prima' (prosečna ocena 2,60). Rezultati u kontroli ukazuju da je sorta 'Reform' značajnije reagovala na mehaničku povredu stabla (ocena 1,17) u odnosu na druge genotipove sirka (ocene 0,13–0,89). Tabela 15. Prosečne ocene intenziteta zaraze povrńinskog tkiva stabla sirka u uslovima vetačke inokulacije izolatima 286–09 (Fusarium equiseti) i 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Fusarium spp. Kontrola F. equiseti (izolat 286–09) F. proliferatum (izolat 297a–09) Prosek 'Alba' 0,85* 1,53 1,19 0,43 'Gold' 0,65 2,13 1,39 0,13 'Prima' 2,08 3,12 2,60 0,89 'Reform' 1,90 3,45 2,68 1,17 Prosek 1,37 2,56 1,96 0,66 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) 109 U toku prve godine (2010) ispitivanja uočen je slab razvoj simptoma tipa nekroze u uslovima veńtačke inokulacije stabla. Iz ovih biljaka nisu reizolovane vrste roda Fusarium već gljive koje su opisane kao sekundarni saprobi iz rodova Alternaria, Penicillium i Aspergillus. Verovatno zbog izuzetnih vremenskih uslova, u vidu neobično visoke relativne vlaņnosti vazduha i jake rose u momentu inokulacije svi ispitivani genotipovi ispoljili su odreĎenu osetljivost na mehaničke povrede ńto je rezultiralo koloniziranjem povreĎenog tkiva sekundarnim mikroorganizmima i pojavom niskog nivoa reakcije. MeĎutim, bez obzira na nekrozu na biljkama u negativnoj kontroli ona je bila statistički vrlo značajno različita od reakcije biljaka u tretmanima sa obe vrste Fusarium, tako da je bilo moguće tačno oceniti delovanje ispitivanih vrsta. U poreĎenju sa F. equiseti, vrsta F. proliferatum prouzrokovala je intenzivniju pojavu nekroze povrńinskog tkiva stabla sorte 'Prima' i 'Reform', slabiju hibrida 'Gold' i veoma slabu hibrida 'Alba'. Vrsta F. equiseti prouzrokovala je veoma slabu nekrozu povrńine stabla sorti metlańa ('Prima' i 'Reform') dok je na stablu hibrida 'Alba' bila vidljiva tek na uzduņnom preseku. Dvofaktorijalnom analizom varijanse (ANOVA) za intezitet zaraze povrńinskog tkiva stabla dobijena je P vrednost od <0,001. Ovi rezultati ukazuju da se srednje vrednosti intenziteta zaraze stabla sirka u 2010. godini statistički vrlo značajno razlikuju, posmatrajući genotipove i ispitivane izolate vrsta F. equiseti i F. proliferatum, kao i interakcije izolat x genotip (tabela 16). Tabela 16. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intenzitet zaraze povrńinskog tkiva stabla sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. (Bački Petrovac, 2010) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Izolat 468,236 2 234,18 140,579 <0,001 Genotip 230,543 3 76,848 46,144 <0,001 Izolat x Genotip 72,650 6 12,108 7,271 <0,001 Greška 1437,220 863 1,665 Ukupno 2219,387 874 110 Parna poreĎenja intenziteta zaraze (nekroza) povrńinskog tkiva stabla ili osetljivosti genotipova sirka prema F. equiseti u 2010. godini pokazala su da izmeĎu hibrida 'Gold' i 'Alba' ne postoji statistički značajna razlika, kao i izmeĎu dve sorte sirka metlańa 'Prima' i 'Reform' (tabela 17). MeĎutim, razlike izmeĎu ove dve homogene grupe statistički su vrlo značajne. Tabela 17. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) povrńinskog tkiva stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 286–09 (Fusarium equiseti) (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 'Gold' 0,65 'Alba' 0,85 'Reform' 1,90 'Prima' 2,08 P vrednost 0,328 0,379 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Na osnovu Duncanovog testa za prosečne ocene intenziteta zaraze povrńinskog tkiva stabla, u uslovima veńtačke inokulacije izolatima F. proliferatum u 2010. godini, utvrĎene su tri homogene grupe genotipova sirka. Prvu grupu čini hibrid 'Alba', drugu hibrid 'Gold' i treću sorte 'Prima' i 'Reform' (tabela 18). Sorte treće homogene grupe nisu se meĎusobno statistički značajno razlikovale po intenzitetu zaraze povrńinskog tkiva stabla. MeĎutim, od ove homogene grupe statistički su se značajno razlikovali hibridi 'Alba' i 'Gold', koji su ispoljili manju osetljivost prema F. proliferatum. Parna poreĎenja izolata u 2010. godini ukazuju da su razlike u odnosu na kontrolu, statistički veoma značajne, odnosno da su izolati 286–09 i 297a–09 prouzrokovali veće promene na povrńini stabla hibrida 'Gold' i sorti 'Prima' i 'Reform' u poreĎenju sa kontrolom (tabela 18). MeĎutim, F. equiseti i F. proliferatum prouzrokovale su istu promenu na uzduņnom preseku stabla hibrida 'Alba' u poreĎenju sa kontrolom, zapravo nije postojala statistička razlika, ńto je posledica osetljivosti na mehanička ońtećenja. 111 Tabela 18. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) povrńinskog tkiva stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 'Alba' 1,53 'Gold' 2,13 'Prima' 3,12 'Reform' 3,45 P vrednost 1,000 1,000 0,196 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Parna poreĎenja reakcije stabla genotipova ('Alba', 'Gold', 'Prima' i 'Reform') u kontroli pokazala su da je u 2010. godini hibrid 'Gold' ispoljio najmanju osetljivost u odnosu na druge genotipove (tabela 19). Nekroza slabog intenziteta utvrĎena je kod hibrida 'Alba' i sorti 'Prima' i 'Reform', koji su predstavljali homogenu grupu sa statistički značajnim razlikama od hibrida 'Gold'. Tabela 19. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu reakcije na mehaničke povrede sterilisanom čačkalicom u kontroli (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 'Gold' 0,43 'Alba' 0,83 'Prima' 0,89 'Reform' 1,17 P vrednost 1,000 0,056 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Rezultati ispitivanja osetljivosti sirka u uslovima veńtačke inokulacije stabla u 2011. godini ukazuju na značajne razlike izmeĎu različitih genotipova i izolata Fusarium spp. (tabela 20). Na osnovu ocene intenziteta povrńinske zaraze stabla oko mesta inokulacije većina ispitivanih genotipova ispoljilo je veću osetljivost prema izolatu F. proliferatum, a manju prema F. equiseti. Pojedinačno, najveću osetljivost ispoljila je sorta 'Reform' (3,63) prema izolatu 297a–09 (F. proliferatum), a najmanju američka linija PI576382 03 SD prema izolatu 286–09 (F. equiseti). Prosečni rezultati za oba patogena ukazuju da su hibridi sirka za zrno 'Alba' i 'Gold' ispoljili isti nivo otpornosti (prosečna ocena 1,15), dok su te vrednosti bile 1,42 za sortu 'Prima' i 2,49 za sortu 'Reform'. U proseku, nizak intenzitet povrńinske zaraze stabla utvrĎen je kod 112 američkih linija PI576382 03 SD (0,84), PI656114 01 SD (0,91), PI534163 02 SD (0,97) i PI595720 02 SD (1,02). U zavisnosti od izolata, prosečno niņi nivo intenziteta zaraze prouzrokovao je izolat 286–09 F. equiseti (0,97) u poreĎenju sa izolatom 297a– 09 F. proliferatum (1,53). Tabela 20. Prosečne ocene intenziteta zaraze povrńinskog tkiva stabla sirka u uslovima vetačke inokulacije izolatima 286–09 (Fusarium equiseti) i 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Fusarium spp. Kontrola F. equiseti (izolat 286–09) F. proliferatum (izolat 297a–09) Prosek 'Alba' 0,83* 1,48 1,15 0,00 'Gold' 1,03 1,27 1,15 0,00 'Prima' 1,04 1,81 1,42 0,00 'Reform' 1,35 3,63 2,49 0,00 PI656114 01 SD 0,95 0,88 0,91 0,00 PI534163 02 SD 0,88 1,07 0,97 0,00 PI595720 02 SD 0,93 1,11 1,02 0,00 PI576382 03 SD 0,72 0,96 0,84 0,00 Prosek 0,97 1,53 1,24 0,00 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) . U drugoj godini istraņivanja (2011) nije bilo vidljivih reakcija genotipova sirka na mehanička ońtećenja od veńtačke inokulacije stabla. F. proliferatum prouzrokovala je intenzivan razvoj nekroze na povrńini stabla sorti 'Prima' i 'Reform', a neńto slabiju na hibridima 'Alba' i 'Gold'. Spoljni izgled reakcije povrńine stabla američkih linija (PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD) ukazivao je na veoma slab razvoj nekroze, koja je bila vidljiva tek na uzduņnom preseku. F. equiseti prouzrokovala je slabiju nekrozu na povrńini stabla hibrida sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') i sorti sirka metlańa ('Prima' i 'Reform'). Vidljivi simptomi na povrńini stabla američkih linija nisu bili prisutni ili je nekroza zahvatila povrńinu manju od 1 cm od mesta inokulacije izolatom F. equiseti. Na osnovu dvofaktorijalne analize varijanse (ANOVA) za intenzitet zaraze povrńinskog tkiva stabla u 2011. godini utvrĎene su statistički vrlo značajne razlike (P<0,001) izmeĎu genotipova, izolata Fusarium spp. i interakcije izolat x genotip (tabela 21). 113 Tabela 21. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intenzitet zaraze povrńinskog tkiva stabla različitih genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. (Bački Petrovac, 2011) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Izolat 195,849 2 97,924 502,839 <0,001 Genotip 298,690 7 42,670 219,109 <0,001 Izolat x Genotip 146,213 7 20,888 107,257 <0,001 Greška 244,987 1258 0,195 Ukupno 893,384 1274 Na osnovu parnog poreĎenja osetljivosti sirka, ocenjene na osnovu intenziteta povrńinske zaraze stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom F. equiseti u 2011. godini, izdvojene su četiri homogene grupe (tabela 22). Statistički značajne razlike nisu ustanovljene izmeĎu četiri američke linije (PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD, PI576382 03 SD) i genotipa sirka za zrno ('Alba'), kao i izmeĎu PI595720 02 SD, PI656114 01 SD, 'Gold' i 'Prime'. MeĎutim, od ovih grupa statistički se značajno razlikovala sorta sirka metlańa 'Reform'. Tabela 22. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) povrńinskog tkiva stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 286–09 (Fusarium equiseti) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 4 PI576382 03 SD 0,72 'Alba' 0,83 0,83 PI534163 02 SD 0,88 PI595720 02 SD 0,93 0,93 PI656114 01 SD 0,95 0,95 'Gold' 1,03 'Prima' 1,04 'Reform' 1,35 P vrednost 0,105 0,097 0,141 1,000 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa U 2011. godini izdvojeno je ńest homogenih grupa na osnovu parnog poreĎenja osetljivosti osam genotipova sirka prema F. proliferatum (tabela 23). Grupa genotipova PI656114 01 SD i PI576382 03 SD bila je homogena u pogledu najniņih intenziteta povrńinske zaraze (nekroze) stabla, koji se statistički značajno nisu meĎusobno razlikovali. Neńto vińi intenzitet zaraze ispoljili su genotipovi druge homogene grupe 114 (američke linije PI534163 02 SD i PI595720 02 SD), koja se statistički nije značajno razlikovala od treće homogene grupe ('Gold'). Od ovih homogenih grupa statistički su se značajno razlikovali genotipovi 'Alba' (četvrta homogena grupa) i 'Prima' (peta homogena grupa), koji su ispoljili jaču nekrozu na povrńini stable. Najveću osetljivost prema F. proliferatum ispoljio je genotip ńeste homogene grupe (sorta sirka metlańa, 'Reform'). Tabela 23. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) povrńinskog tkiva stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 297a–09 ( Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 4 5 6 PI656114 01 SD 0,88 PI576382 03 SD 0,96 0,96 PI534163 02 SD 1,07 PI595720 02 SD 1,11 1,11 'Gold' 1,27 'Alba' 1,48 'Prima' 1,81 'Reform' 3,63 P vrednost 0,329 0,091 0,051 1,000 1,000 1,000 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa (b) Osetljivost sirka ocenjena na osnovu intenziteta zaraze na uzduţnom preseku od mesta inokulacije. Primenom druge metode ocenjivanja, intenziteta zaraze na uzduņnom preseku inokulisanih biljaka, utvrĎene su, takoĎe, različite reakcije genotipova prema Fusarium spp. u 2010. godini (tabela 24). Genotip 'Alba' ispoljio je najmanju osetljivost prema izolatima F. equiseti i F. proliferatum, jer su ocene intenziteta zaraze (0,47 i 0,43) bile na nivou kontrole (0,44). Najveću osetljivost ispoljile su sorte 'Prima', prema obe vrste (ocene 2,45 i 3,07), i 'Reform' (ocena 3,13) prema F. proliferatum. U kontroli je intenzitet zaraze uzduņnog preseka stabla sorte 'Reform' (ocena 1,77) bio veći u poreĎenju sa rezultatima inokulacije stabla izolatom F. equiseti. Na osnovu ukupnih prosečnih ocena uočljiva je mala razlika izmeĎu izolata F. equiseti (1,28) i F. proliferatum (1,87). 115 Tabela 24. Prosečne ocene intenziteta zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima vetačke inokulacije izolatima 286–09 (Fusarium equiseti) i 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Fusarium spp. Kontrola F. equiseti (izolat 286–09) F. proliferatum (izolat 297a–09) Prosek 'Alba' 0,47* 0,43 0,44 0,44 'Gold' 0,55 0,85 0,11 0,11 'Prima' 2,45 3,07 2,76 1,48 'Reform' 1,66 3,13 2,40 1,77 Prosek 1,28 1,87 1,58 0,95 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) Dobijena P vrednost (<0,001), primenom dvofaktorijalne analize varijanse (ANOVA) za intezitet zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla različitih genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije (Fusarium spp.) u 2010. godine, ukazuje na statistički vrlo značajne razlike izmeĎu genotipova, ispitivanih izolata i interakcije izolat x genotip (tabela 25). Tabela 25. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intezitet zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. (Bački Petrovac, 2010) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Izolat 111,810 2 55,905 30,795 <0,001 Genotip 662,703 3 220,901 121,684 <0,001 Izolat x Genotip 87,080 6 14,513 7,995 <0,001 Greška 1566,660 863 1,815 Ukupno 2453,207 874 Parna poreĎenja reakcije genotipova na inokulaciju izolatom F. equiseti u vidu nekroze na uzduņnom preseku stabla pokazala su da u 2010. godini nije postojala statistički značajna razlika izmeĎu hibrida sirka za zrno 'Alba' i 'Gold'. MeĎutim, ova homogena grupa statistički se značajno razlikovala od druge (sorta 'Prima') i treće homogene grupe (sorta 'Reform'), koje su ispoljile veću osetljivost prema F. equiseti (tabela 26). 116 Tabela 26. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) na uzduņnom preseku stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 286–09 (Fusarium equiseti) (Bački Petrovac, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 'Alba' 0,47 'Gold' 0,55 'Reform' 1,66 'Prima' 2,45 P vrednost 0,731 1,000 1,000 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Rezultati Duncan testa za intenzitet zaraze na uzduĎnom preseku stabla od mesta inokulacije izolatom F. proliferatum u 2010. godini pokazuju da postoje dve homogene grupe (tabela 27). Najveću osetljivost ispoljile su dve sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') u drugoj homogenoj grupi koje se nisu meĎusobno statistički značajno razlikovale (ocene 3,07 i 3,13). Genotipovi prve homogene grupe ('Alba' i 'Gold') ispoljili su znatno manju osetljivost (ocene 0,43 i 0,85) prema F. proliferatum u poreĎenju sa genotipovima druge grupe. Tabela 27. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) na uzduņnom preseku stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2010) Genotip Homogene grupe* 1 2 'Alba' 0,43 'Gold' 0,85 'Prima' 3,07 'Reform' 3,13 P vrednost 0,070 0,776 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Parna poreĎenja reakcije kontrolnih biljaka sva četiri genotipa ('Alba', 'Gold', 'Prima' i 'Reform') pokazala su da su genotipovi podeljeni u dve homogene grupe (tabela 28). Prvu grupu sačinjavali su hibridi 'Alba' i 'Gold' koji se nisu meĎusobno statistički značajno razlikovali, a ispoljili su manju osetljivost na mehanička ońtećenja stabla. Nekrozu slabog intenziteta ispoljile su sorte 'Prima' i 'Reform' koje su predstavljale homogenu grupu koja se statistički značajno razlikovala od prve grupe genotipa 'Alba' i 'Gold'. 117 Tabela 28. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu reakcije na mehaničke povrede sterilisanom čačkalicom u kontroli (Bački Petrovac, 2010) Genotip Homogene grupe* 1 2 'Alba' 0,41 'Gold' 0,44 'Prima' 1,48 'Reform' 1,77 P vrednost 0,897 0,154 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Ocene intenziteta zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u 2011. godini ukazuju na varijabilnost osetljivosti sirka prema F. equiseti i F. proliferatum (tabela 29). Hibridi sirka ispoljili su veću osetljivost prema F. proliferatum (ocena 3,54–4,77) i F. equiseti (ocena 1,76–4,25) u poreĎenju sa američkim linijama (ocene 1,09–2,24; 1,28– 1,69). U proseku, najveću osetljivost prema Fusarium spp. ispoljila je sorta 'Reform' (ocena 4,51), a najmanju američka linija PI656114 01 SD (ocena 1,25). Ispitivani genotipovi nisu ispoljili reakciju tkiva na uzduņnom preseku na mehaničko ońtećenje stabla u kontroli. Tabela 29. Prosečne ocene intenziteta zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima vetačke inokulacije izolatima 286–09 (Fusarium equiseti) i 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Fusarium spp. Kontrola F. equiseti (izolat 286–09) F. proliferatum (izolat 297a–09) Prosek 'Alba' 1,76 2,52 2,14 0,00 'Gold' 2,00 2,37 2,18 0,00 'Prima' 3,96 4,43 4,19 0,00 'Reform' 4,25 4,77 4,51 0,00 PI656114 01 SD 1,41 1,09 1,25 0,00 PI534163 02 SD 1,60 1,44 1,52 0,00 PI595720 02 SD 1,69 2,24 1,96 0,00 PI576382 03 SD 1,28 2,03 1,65 0,00 Prosek 2,24 2,61 2,42 0,00 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) 118 Dvofaktorijalna analiza varijanse (ANOVA) za intenzitet zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. u 2011. godini ukazuje na statistički vrlo značajne razlike (P<0,001), izmeĎu genotipova i ispitivanih izolata i interakcije izolat x genotip (tabela 30). Tabela 30. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intezitet zaraze tkiva na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima veńtačke inokulacije izolatima Fusarium spp. (Bački Petrovac, 2011) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Izolat 919,536 2 459,768 634,049 <0,001 Genotip 1593,517 7 227,645 313,937 <0,001 Izolat x Genotip 41,773 7 5,965 8,230 <0,001 Greška 912,213 1258 0,725 Ukupno 3004,082 1274 Parna poreĎenja izolata ukazuju da su ispoljene razlike u odnosu na kontrolu, statistički veoma značajne, odnosno da su izolati 286–09 i 297a–09 izazvali veće promene na uzduņnom preseku stabla sirka različitih genotipova u poreĎenju sa kontrolom. F. proliferatum prouzrokovala je intenzivniji razvoj nekroze na uzduņnom preseku stabla hibrida sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') i sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') (slika 37), a neńto slabiji na američkim linijama PI656114 01 SD i PI534163 02 SD (slika 38a, b), u poreĎenju sa F. equiseti. Slika 37. Fusarium proliferatum: Uzduņni presek stabla sorte 'Prima' i rastuće ocene reakcije od 1 do 5 1 2 3 4 5 119 Slika 38. Uzduņni presek stabla linije PI656114 01 SD i reakcija na inokulacije sa Fusarium proliferatum (a) i Fusarium equiseti (b) Parnim poreĎenjem osetljivosti genotipova na osnovu intenziteta zaraze sirka na uzduņnom preseku stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom Fusarium equiseti u 2011. godini izdvojeno je pet homogenih grupa (tabela 31). MeĎutim, od ovih grupa statistički su se značajno razlikovale sorte 'Prima' i 'Reform', koje su ispoljile najveću osetljivost prema F. equiseti, odnosno jači intenzitet razvoja nekroze na uzduņnom preseku stabla. IzmeĎu svih američkih linija i genotipa sirka za zrno, hibrida 'Alba' i 'Gold' nisu ustanovljene statistički značajne razlike. 0 1 2 2 3 1 2 3 3 4 a b 120 Tabela 31. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) na uzduņnom preseku stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 286–09 (Fusarium equiseti) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 4 5 PI576382 03 SD PI656114 01 SD 1,28 1,41 1,41 PI534163 02 SD 1,60 1,60 PI595720 02 SD 1,69 1,69 1,69 'Gold' 1,76 1,76 'Alba' 2,00 'Prima' 3,96 'Reform' 4,25 P vrednost 0,376 0,078 0,319 0,053 0,052 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Na osnovu parnog poreĎenja osetljivosti genotipova sirka u uslovima veńtačke inokulacije stabla izolatom F. proliferatum u 2011. godini, genotipovi su razvrstani u ńest homogenih grupa (tabela 32). IzmeĎu dve američke linije (PI576382 03 SD i PI595720 02 SD) i dva genotipa sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') nisu ustanovljene statistički značajne razlike. MeĎutim, od ovih grupa statistički su se značajno razlikovale sorte 'Prima' i 'Reform' koje su ispoljile najveću osetljivost, kao i dve američke linije PI656114 01 SD i PI534163 02 SD koje su ispoljile najniņu osetljivost prema F. proliferatum. Tabela 32. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta zaraze (nekroze) na uzduņnom preseku stabla u uslovima veńtačke inokulacije izolatom 297a–09 (Fusarium proliferatum) (Bački Petrovac, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 4 5 6 PI656114 01 SD PI534163 02 SD 1,09 1,44 PI576382 03 SD 2,03 PI595720 02 SD 2,24 2,24 'Gold' 2,37 'Alba' 2,52 'Prima' 4,43 'Reform' 4,77 P vrednost 1,000 1,000 0,117 0,051 1,000 1,000 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa 121 Osetljivost stabla sirka u uslovima prirodne zaraze. Na oglednoj parceli u Čantaviru tokom 2010. i 2011. godine, u uslovima prirodne zaraze sirka ispitivana je osetljivost dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform'). Simptomi zaraze ispoljeni su prvenstveno na prizemnom delu stabla, na prvom i drugom nodusu, u vidu mrkih pega, koje su se dalje ńirile na internodije. Na uzduņnom preseku stabla na donjim internodijama uočena je promena boje tkiva od smeĎe do bordo crvene, dok je srņ bila razorena. Na uzduņnom preseku stabla donjih nodusa vidljiva je bila ruņičasta ili beličasta micelijska prevlaka. Tipični simptomi za fuzariozna oboljenja pojavili su se i na korenu, na glavnim i bočnim ņilama u vidu tamno ruņičaste boje, a pri jačem napadu koren je bio potpuno razoren. U prvoj godini (2010) ispitivanja ocenjujući reakciju na osnovu vidljive nekroze na povrńini stabla, hibridi sirka za zrno 'Alba' i 'Gold' reagovali su na prirodnu zarazu prosečnim ocenama 0,11 odnosno 1,07 a sorte sirka metlańa 'Prima' i 'Reform' ocenama 3,58 odnosno 3,77. U drugoj godini (2011) ispitivanja ista metoda ocenjivanja takoĎe je ukazala na različite reakcije genotipova sa ukupnim prosečnim ocenama 'Alba' (2,92), 'Gold' (3,92), 'Prima' (4,05) i 'Reform' (3,97), (tabela 33). Prema oceni intenziteta zaraze povrńine stabla, najosetljivije su bile sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform'), pri čemu su simptomi u drugoj godini proizvodnje bili znatno izraņeniji, ńto se ogledalo u lomljenju i masovnom poleganju biljaka (slika 39). Znatno manju osetljivost ispoljila su dva hibrida sirka za zrno ('Alba' i 'Gold'). Tabela 33. Prosečne vrednosti ocene intenziteta zaraze na povrńini stabla četiri različita genotipa sirka u uslovima prirodne zaraze tokom 2010. i 2011. godine Godina Genotip sirka 'Alba' 'Gold' 'Prima' 'Reform' 2010 0,11 1,07 3,58 3,77 2011 2,92 3,92 4,05 3,97 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) 122 Slika 39. Čantavir: Poleganje biljaka sorte sirka metlańa 'Reform' Dvofaktorijalna analiza varijanse (ANOVA) za intenzitet razvoja nekroze na povrńini stabla sirka u uslovima prirodne zaraze u 2010. i 2011. godini ukazala je na statistički vrlo značajne razlike (P<0,001) izmeĎu godina, genotipova i interakcije godina x genotip (tabela 34). Tabela 34. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intenzitet razvoja nekroze na povrńini stabla sirka u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2010–2011) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Godina 303,02 1 303,02 80,69 <0,001 Genotip 473,32 3 157,77 42,01 <0,001 Godina x Genotip 189,81 3 63,27 16,85 <0,001 Greška 1791,25 477 3,76 Ukupno 2782,425 484 Na osnovu intenziteta razvoja nekroze na povrńini stabla u prirodnim uslovima zaraze u 2010. godini, ispitivani genotipovi sirka su razvrstani u tri homogene grupe (tabela 35). Prvu grupu čini hibrid 'Alba', drugu hibrid 'Gold', a treću sorte 'Prima' i 'Reform'. Sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') ispoljile su najveću osetljivost stabla i meĎusobno nije bilo statistički značajnih razlika. Za razliku od ove homogene grupe, hibridi 'Alba' i 'Gold' ispoljili su znatno manji intenzitet razvoja nekroze na povrńini stabla sirka i njihove meĎusobne razlike statistički su značajne. 123 Tabela 35. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta razvoja nekroze na povrńini stabla sirka u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 'Alba' 0,11 'Gold' 1,07 'Prima' 3,58 'Reform' 3,77 P vrednost 1,000 1,000 0,564 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Na osnovu intenziteta razvoja nekroze na povrńini stabla sirka u uslovima prirodne zaraze u 2011. godini ispitivani genotipovi su svrstani u dve homogene grupe (tabela 36). Prvu grupu čini hibrid 'Alba', a drugu hibrid 'Gold' i sorte 'Prima' i 'Reform'. Druga grupa delovala je homogeno, ispoljavajući jaku nekrozu na povrńini stabla, i genotipovi se nisu meĎusobom statistički značajno razlikovali. MeĎutim, od ove grupe statistički se značajno razlikovao genotip 'Alba', koji je ispoljio znatno niņi nivo nekroze na povrńini stabla. Tabela 36. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta razvoja nekroze na povrńini stabla sirka u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 'Alba' 2,92 'Gold' 3,92 'Prima' 3,97 'Reform' 4,05 P vrednost 1,000 0,747 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Različita osetljivost genotipova sirka utvrĎena je u 2010. godini i na osnovu ocene intenziteta razvoja nekroze tkiva na uzduņnom preseku stabla u uslovima prirodne zaraze (tabela 37). Sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') ispoljile su veću osetljivost u odnosu na hibride sirka za zrno ('Alba' i 'Gold'), ńto je utvrĎeno na osnovu ocena 3,77 ('Reform'), 3,40 ('Prima'), 1,03 ('Gold') i 0,11 ('Alba'). Na uzduņnom preseku obolelog tkiva sorte 'Reform', uočena je dezorganizovana srņ tamnomrke ili ruņičaste boje, a pri jačem napadu nekroza je zahvatila veći broj nodusa, pa čak i celo stablo koje je izgubilo čvrstinu (slika 40). U drugoj godini (2011) proizvodnje sirka, prema oceni 124 zaraņenosti uzduņnog preseka stabla simptomi su bili znatno izraņeniji kod hibrida 'Alba' (prosečna ocena 2,98) i Gold (prosečna ocena 3,92), pri čemu je tkivo duņ svih internodija bilo zahvaćeno nekrozom. Tabela 37. Prosečne vrednosti ocene intenziteta zaraze na uzduņnom preseku stabla četiri različita genotipa sirka u uslovima prirodne zaraze tokom 2010. i 2011. godine Godina Genotip sirka 'Alba' 'Gold' 'Prima' 'Reform' 2010 0,11 1,03 3,40 3,77 2011 2,98 3,92 4,15 3,97 *Skala ocene intenziteta zaraze od 0 do 5 (Hooker, 1957) Slika 40. Prirodna zaraza: Uzduņni presek stabla sorte 'Reform' sa simptomima razorene srņi (levo); uzduņni presek stabla hibrida sirka za zrno 'Gold' sa simptomima ruņičaste nekroze srņi (desno) Primenom dvofaktorijalne analize varijanse (ANOVA) za srednje vrednosti intenziteta razvoja nekroze na uzduņnom preseku stabla u obe godine ispitivanja, dobijena je P vrednost (<0,001) koja ukazuje na statistički vrlo značajne razlike, posmatrajući godine i genotipove, kao i interakciju godina x genotip (tabela 38). 125 Tabela 38. Rezultati dvofaktorijalne analize varijanse za intenzitet razvoja nekroze na uzduņnom preseku stabla u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2010–2011) Izvor varijacije Suma kvadrata Stepeni slobode Varijanse F količnik P vrednost Godina 340,855 1 340,855 92,883 <0,001 Genotip 454,644 3 151,548 41,297 <0,001 Godina x Genotip 179,691 3 59,897 16,322 <0,001 Greška 1750,463 477 3,670 Ukupno 2750,763 484 Na osnovu rezultata ocenjivanja intenziteta zaraze na uzduņnom preseku stabla u prirodnim uslovima u 2010. godini, ispitivani genotipovi sirka ('Alba', 'Gold', 'Prima' i 'Reform') razvrstani su u tri homogene grupe. Prvu grupu čini hibrid 'Alba', drugu hibrid 'Gold', a treću sorte 'Prima' i 'Reform' (tabela 39). Najveću osetljivost ispoljile su sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform'), koje se nisu meĎusobno statistički značajno razlikovale, ali jesu od hibrida ('Alba' i 'Gold'). Druga grupa je ispoljila znatno manju osetljivost stabla u uslovima prirodne zaraze, a genotipovi su se meĎusobno statistički značajno razlikovali. Tabela 39. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta razvoja nekroze na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2010) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 3 'Alba' 0,11 'Gold' 1,03 'Prima' 3,40 'Reform' 3,77 P vrednost 1,000 1,000 0,246 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa Ispitivani hibridi su razvstani u manji broj homogenih grupa u 2011. nego u 2010. godini. U 2011. godini genotipovi su, na osnovu intenziteta zaraze na uzduņnom preseku stabla u uslovima prirodne zaraze, razvrstani u dve homogene grupe. Prvu grupu čini hibrid 'Alba', a drugu hibrid 'Gold' i sorte 'Prima' i 'Reform' (tabela 40). Druga grupa je bila homogena, ispoljavajući jaku nekrozu celog stabla na uzduņnom preseku, a izmeĎu genotipova nije bilo statistički značajnih razlika. MeĎutim, od ove 126 grupe statistički se značajno razlikovao hibrid 'Alba', koji je ispoljio znatno niņi nivo osetljivosti, a nekrotirano tkivo zahvatalo je u proseku 1/3 internodije. Tabela 40. Razvrstavanje genotipova sirka u homogene grupe na osnovu intenziteta razvoja nekroze na uzduņnom preseku stabla sirka u uslovima prirodne zaraze (Čantavir, 2011) Genotip sirka Homogene grupe* 1 2 'Alba' 2,98 'Gold' 3,92 'Prima' 3,97 'Reform' 4,15 P vrednost 1,000 0,566 *Homogene grupe utvrĎene na osnovu Duncan testa 127 6. DISKUSIJA Gajeni sirak je jedna od veoma značajnih gajenih biljaka iz porodice trava, sedmo najčeńće gajeno ņito (Alves dos Reis et al., 2010). Svetska proizvodnja gajenog sirka pokazuje trend porasta i samo u 2009. godini pribliņila se količini od 62 miliona tona (USDA, 2009). U Brazilu ukupan prinos gajenog sirka 2006−2007 bio je preko 1,5 milion tona, na skoro 750 000 ha obradivog zemljińta (Conab, 2009). Epidemije fuzariozne plesnivosti klasa (FHB) poslednje dve decenije imale su razarajući uticaj na svetsku poljoprivrednu ekonomiju (Goswami and Kistler, 2004). Sa ekonomske tačke gledińta, pribliņno 25% svetskog prinosa zrna kontaminirano je mikotoksinima (CAST, 2003). U Severnoj Americi tokom 1990. godine gubici se procenjuju na preko 3 milijarde dolara (Windels, 2000), zbog značajnog smanjenja prinosa i kvaliteta ņita, kao i pada cene zbog kontaminacije zrna mikotoksinima. Epidemije u Aziji, Kanadi, Evropi i Juņnoj Americi ukazuju na sve veću opasnost od FHB koja ugroņava svetsku proizvodnju ņita (Chelkowski, 1998; Goswami and Kistler, 2004; Brennan et al., 2005). Pripadnici komleksa F. graminearum primarni su etiolońki prouzrokovači FHB ńirom sveta (O’Donnell et al., 2000b, 2004; Starkey et al., 2007), i svaka vrsta unutar kompleksa sposobna je da produkuje trihotecene tipa B i estrogena jedinjenja (Kim et. al., 2005). Kao najznačajniji prouzrokovači fuzarioza useva ņita opisuju se različite vrste u pojedinim proizvodnim područjima, pa tako Summerell and Leslie (2011) navode da je u Australiji F. thapsinum najčeńća vrsta na gajenom sirku. 6.1. Simptomi bolesti na biljkama u polju Tokom vińekratnih pregleda četiri lokaliteta gajenja sirka u Vojvodini, u periodu od 2009. do 2011. godine zabeleņena je pojava velike učestalosti intenzivnih simptoma fuzariozne truleņi korena i stabla. Intenzitet zaraze useva sirka, bio je veoma visok, a suńenje i lomljenje zaraņenih biljaka rezultiralo je procenjenim gubicima od preko 90%. Brojni autori saopńtavaju o direktnim ńtetama i ekonomskom značaju zaraza različitih useva sa Fusarium vrstama (Aoki and O´Donnell, 1999a; Burlakoti et al., 2008; Vogelgslang et al., 2009; Alvarez et al., 2010). Zaraņene biljke ispoljavale su simptome prvenstveno na prizemnom delu stabla u vidu mrkih pega, koje su se dalje ńirile na internodije, dok je korenov sistem u većoj meri bio razoren, kao ńto opisuju 128 brojni autori, meĎu kojima su Tesso et al. (2010). Na uzduņnom preseku obolelog tkiva uočena je dezorganizovana srņ tamnomrke ili ruņičaste boje. Patogeni truleņi stabla sirka utvrĎeni su u različitim fenofazama domaćina, ali su simptomi bolesti bili uočljivi tek nakon metličenja i u toku potpune zrelosti zrna (Mughogho and Pande, 1984; Tesso et al., 2010). Tokom ustraņivanja, Alvarez et al. (2010) su u prikupljenim uzorcima sirka različite fenolońke zrelosti, poreklom iz Brazila dokazali prisustvo vrsta iz najmanje osam rodova gljiva, uključujući Fusarium, Epicoccum, Alternaria, Aspergillus i Penicillium. Unutar roda Fusarium, ustanovili su prisustvo vrsta sekcije Liseola, mada bez F. thapsinum, slično kao i u ovom radu. Slične rezultate dobili su da Silva et al. (2000), uporedo analizirajući sveņe poņnjeveno i uskladińteno seme sirka. Detekcija F. thapsinum tek u trećoj godini istraņivanja ukazuje da njeno prisustvo i rasprostranjenost u uslovima Srbije zasluņuje nastavak istraņivanja i posebne detaljnije analize. Prisustvo različitih patogenih gljiva na semenu sirka, koje je poslednjih godina sve čeńće utvrĎeno, moņe biti značajno sa stanovińta smanjenja prinosa i kvaliteta zrna u pogledu kontaminacije ńtetnim mikotoksinima, a takoĎe moņe dovesti i do indirektnih gubitaka smanjujući klijanje semena (Dawson and Bateman, 2001; Singh and Navi, 2001; Erpelding and Prom, 2006). Tokom pregleda oglednih parcela sirka na zaraņenim metlicama i zrnu gajenog sirka uočena je nekroza tkiva prekrivena micelijskom prevlakom tamnoņute do narandņaste ili crvenkaste boje. Zaraņena zrna su smeņurana i proņeta micelijom i slabije klijavosti. U 16 pregledanih uzoraka semena, ustanovljene su meńane zaraze gljivama iz rodova Fusarium, Alternaria i Epicoccum, koji su bili prisutni u svim uzorcima. Zaraza semena sirka sa Fusarium spp. kretala se od 2,3 do 19,7%, u proseku 8,82%, ńto je u skladu sa rezultatima Lević i sar. (2008). Za razliku od dobijenih rezultata, Lević i sar. (2008) su identifikovali prisustvo F. thapsinum (11,3%) na semenu gajenog sirka u Srbiji. Razlika u dobijenim rezultatima u pogledu prisustva F. thapsinum moņe biti posledica različitih faktora, kao ńto su razlike u genotipu sirka, području obuhvaćenom ispitivanjima, ali i moguće promene u strukturi populacije Fusarium spp. na gajenom sirku u Srbiji. 129 6.2. Test patogenosti Izolacijom iz zaraņenih biljaka gajenog sirka u polju i iz zaraņenog semena dobijeno je ukupno 48 izolata, a za dalji rad odabrano je 13 izolata Fusarium spp. koji su svrstani u pet morfolońkih grupa. Infektivnost 13 odabranih monosporijalnih izolata Fusarium spp. proverena je primenom dve metode, koje su se pokazale podjednako uspeńne. Ipak, inokulacije u in vitro uslovima mogu se preporučiti kao brņe i jednostavnije, pri čemu pruņaju podjednako pouzdane rezultate. Svih 13 ispitivanih izolata uticali su na smanjenje rasta i mase korena, kao i na pojavu jakih simptoma truleņi korena klijanaca kod osetljivih genotipova sirka metlańa, sorte 'Prima' i 'Reform'. Suprotno tome, na klijancima otpornih genotipova sirka za zrno nije bilo vidljivih simptoma bolesti. Prve promene tkiva na stablu sirka, u vidu crvenkastosmeĎih sitnih pega u osnovi stabla koje je veńtački inokulisano suspenzijom konidija patogena, uočene su već 3−5 dana od inokulacije, ńto je ukazalo na značajnu agresivnost ovih izolata. Nakon dve nedelje izolati F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i F. thapsinum prouzrokovali su potpuno suńenje i propadanje inokulisanih klijanaca sorte 'Prima' i 'Reform', dok su izolati E. nigrum takoĎe prouzrokovali potpuno suńenje klijanaca sorte 'Reform', a slabiju nekrozu na klijancima sorte 'Prima'. Tesso et al. (2010) su u svojim istraņivanjima dokazali različitu infektivnost osam Fusarium vrsta (F. verticillioides, F. thapsinum, F. andiyazi, F. proliferatum, F. nyagamai, F. pseudoanthophilum, F. brevicatenulatum i F. pseudonygamai) i osetljivost različitih genotipova sirka u uslovima zańtićenog prostora. Test provere patogenosti na klijancima sirka u uslovima in vitro, u epruvetama sa Knopovom podlogom, takoĎe je obavljen uspeńno, pri čemu su svi izolati prouzrokovali pojavu nekroze nakon pet dana i zahvatali čitave klijance nakon 10 dana. U ovom testu ispitivani izolati prouzrokovali su pojavu simptoma i na otpornijim genotipovima za zrno ukazujući na to da ovaj test moņe da pruņi rezultate patogenosti bez obzira na sortu koja se odabere za ispitivanja. Na ovaj način verovatno se moņe pokazati podeljenost i slabije agresivnih vrsta i izolata. Leslie et al. (2005) su utvrdili da F. thapsinum, prouzrokovač truleņi stabla i plesnivosti zrna sirka ispoljava izraņenu patogenost za klijance sirka u in vitro uslovima. 130 Rezultati testa patogenosti klijanaca sirka u potpunosti su se podudarili sa rezultatima dobijenim u uslovima veńtačke inokulacije, kako u stakleniku tako i u laboratoriji, u in vitro uslovima. Relativnim poreĎenjem reakcije genotipova sirka vidi se da su u oba uslova postavljenog eksperimenta genotipovi sirka metlańa bili značajno osetljiviji u poreĎenju sa hibridima sirka za zrno. Obe metode za inokulaciju korińćene u ovom radu imaju odreĎene prednosti u poreĎenju sa poljskim ogledima, jer se do rezultata dolazi brņe, koristi se uniformna i tačno odreĎena količina inokuluma, ńto omogućava tačnije poreĎenje, ponovljivost ogleda i otvara mogućnost da se metode koriste za preliminarno ocenjivanje osetljivosti genotipova sirka. 6.3. Morfološka svojstva anamorfa i teleomorfa Proučavana morfolońka svojstva izolata Fusarium spp. izolovanih sa gajenog sirka u Srbiji, pruņila su stabilnu mogućnost za njihovo razlikovanje. Svi proučavani izolati, poreklom sa prizemnog dela stabla i semena gajenog sirka, svrstani u pet grupa ispoljili su različita morfolońka svojstva. Kako vrste roda Fusarium variraju u morfolońkim svojstvima, naročito po obliku i veličini makrokonidija, načinu obrazovanja mikrokonidija, obrazovanju hlamidospora ili boji kolonija, u istraņivanja su uključene tri hranljive podloge u cilju proučavanja njihove promenljivosti. Predstavnik morfolońke grupe I, izolat 286−09 koji ispoljava ista svojstva kao referentni izolat F. equiseti (RBG851) imao je brz i ravnomeran porast, krem ņutu, pamučastu vazduńnu miceliju, beņ pigmentaciju podloge i tamnosmeĎe mrlje u supstratnoj miceliji. Stepień et al. (2012) ispitali su brzinu porasta 25 izolata F. equiseti poreklom iz Poljske i Italije. Većina italijanskih izolata rasla je sporije, formirajući nakon četiri dana prečnik kolonija pribliņno od 2,5 do 3 cm, u odnosu na poljsku grupu izolata, kod kojih je prečnik kolonija varirao od 4 do 5,5 cm. Po ovim svojstvima izolati F. equiseti razlikovali su se od svih drugih Fusarium spp. izolovanih tokom izrade ove disertacije. Izolat F. equiseti poreklom iz Srbije, ispoljio je brņi porast od druge dve grupe ispitivanih izolata, ńto je u saglasnosti sa svojstvima referentnog izolata RBG851 determinisanog od strane Summerell (lična komunikacija). Isto tako, mikroskopska svojstva izolata F. equiseti, poreklom iz Srbije, kratke i u osnovi prońirene konidiofore tipa monofijalida, formirane vińećelijske makrokonidije odgovarajućeg oblika i veličine i loptaste, svetlosmeĎe hlamidospore u nizovima, u potpunoj su saglasnosti sa 131 literaturnim navodima od strane Leslie and Summerell (2006) i Chehri et al. (2011), kao i svojstva referentnog izolata RBG851. Svi izolati druge grupe (297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10) ispoljili su najveću morfolońku sličnost sa referentnim izolatom RBG5349, identifikovanim kao F. proliferatum, Summerell (lična komunikacija). Ovi izolati su se po brzini porasta i morfolońkim svojstvima razlikovali od svih drugih ispitivanih izolata u ovom radu. Tokom ispitivanja morfolońkih svojstava izolata F. proliferatum iz drveta mangrove, poreklom iz Kine, Cheng et al. (2008) opisali su veoma slična morfolońka svojstva, kako po izgledu kolonija i prisustva pigmenata, tako i po obliku i veličini mikrokonidija formiranih iz monofiljlida i polifijalida u vidu laņnih glavica ili dugih nizova. Prisustvo hlamidospora nije ustanovljeno ni kod jednog izolata, ńto je prema navodima literature karakteristično za vrstu F. proliferatum (Lević, 2008). Kolonije reprezentativnih izolata morfolońke grupe III, 532−10, 535−10 i 536−10 identifikovanih kao F. graminearum ispoljila su sva morfolońka svojstva karakteristična za ovu vrstu, uključujući izgled micelije i prisustvo i odsustvo tvorevina za razmnoņavanje. Obim i veličina formiranih makrokonidija i hlamidospora u potpunosti odgovaraju opisima Aoki and O´Donnell. (1999a), Schmale et al. (2005, 2006) i Lević (2008). Peritecije formirane na ostacima biljaka sirka, za koje je dokazano da pripadaju teleomorfu F. graminearum, vrsti G. zeae, kao i askusi i askospore po izgledu i veličini slaņu se sa navodima Seifert (1995) i Aoki and O´Donnell (1999a). Izolat 808−11 iz četvrte morfolońke grupe čija su svojstva u saglasnosti sa referentnim izolatom RBG5255 vrste F. thapsinum, Summerell (lična komunikacija), razlikovao se od ostalih grupa izolata po specifičnom tipu porasta na PDA podlozi i karakterističanom ņuto−narandņastom pigmentu. Istraņujući do tada malo poznate vrste Fusarium spp. na gajenom sirku, Klittich et al. (1997) su najpre izolate razlikovali na osnovu lučenja ņutog pigmenta i relativno sporog porasta, a kasnije opisali kao posebnu vrstu, F. thapsinum. Izolat F. thapsinum iz Srbije formirao je mikro i makrokonidije odgovarajućeg oblika i veličine i nije formirao hlamidospore, ńto odgovara navodima Leslie and Summerell (2006). Klittich et al. (1997) navode da njihovi izolati formiraju mikro i makrokonidije neńto manjih prosečnih dimenzija ńto moņe biti posledica gajenja u nestandardizovanim laboratorijskim uslovima, ili varijabilnosti koja se moņe javiti u populacijama gljiva iz specifičnih područja. 132 Mada su na osnovu makroskopskih svojstava donekle podsećali na Fusarium spp. tri izolata morfolońke grupe V, 291−09, 315−09 i 539−10, identifikovani su kao E. nigrum. Prosečni dnevni porast ispitivanih izolata, kao i izgled kolonija, u potpunosti odgovara navodima Fávaro et al. (2011) za Grupu 1 izolata E. nigrum. Kolonija sva tri ispitivana izolata je gusta i vunasta, okruņena belom kompaktnom micelijom nepravilnih margina, vazduńna micelija je intenzivno ņuta, narandņasta do tamno crvena. Mnogi izolati Epicoccum vrsta često su dovedeni u vezu sa vrstama Fusarium spp., ili čak identifikovani i kao Ustilaginales (Navi et al., 1999). Sva morfolońka makroskopska i mikroskopska svojstva, kao i prisustvo jednoćelijskih konidija formiranih na diskretnim sporodohijama, u potpunoj su saglasnosti sa identifikacijom E. nigrum od strane Mims and Richardson (2005) i Pitt and Hocking (2009). 6.4. Molekularna detekcija i identifikacija Molekularne metode kao savremen pristup u identifikaciji biljnih patogena imaju veliku prednost u primeni za preciznu identifikaciju, karakterizaciju, utvrĎivanje strukture populacije, odreĎivanje puteva introdukcije i drugih brojnih aspekata filogeografije i molekularne epidemiologije različitih patogena. Zbog visoke osetljivosti i specifičnosti, ove metode predstavljaju značajno poboljńanje u dijagnostici oboljenja koje prouzrokuju fitopatogene gljive. PCR tehnika primenjena je u ovim istraņivanjima u cilju molekularne detekcije kompleksa gljiva prouzrokovača fuzariozne truleņi korena, prizemnog dela stabla i semena gajenog sirka i potvrde identifikacije obavljene na osnovu njihovih morfolońkih svojstava i testova patogenosti, kao i u cilju ispitivanja pogodnosti različitih parova prajmera za detekciju i identifikaciju izolata ekonomski najvaņnijih gljiva sirka poreklom iz Srbije. Pored toga, značajan doprinos molekularnih metoda ogleda se u brņoj i lakńoj identifikaciji i razlikovanju srodnih i morfolońki sličnih vrsta koje je teńko razlikovati na drugi način. Zbog svoje jednostavnosti i pouzdanosti PCR metoda postala je jedna od najčeńće korińćenih metoda u detekciji fitopatogenih gljiva. Molekularna detekcija odabranih izolata Fusarium spp. obavljena je primenom dva različita načina izolacije ukupne DNK i to primenom DNeasy Plant Mini Kit−a i standardne CTAB metode. Dobijeni rezultati bili su veoma slični u svim ponavljanjima. Ekstrahovana DNK bila je intaktna i pogodna za dalje uspeńno umnoņavanje u PCR reakciji, omogućujući uspeńnu detekciju svih izolata odabranih za 133 rad. Ipak, primena komercijalnog DNeasy Plant Mini Kita omogućila je da se ukupna DNK prečisti iz biljnog tkiva i ćelija gljiva brzo, lako i pouzdano. Primena komercijalnog kita je i bezbednija jer se ne koristi ekstrakcija sa fenolom ili hloroformom ili precipitacija sa alkoholom ńto čini postupak lakńim za istovremeni rad sa vińe uzoraka. Primenom različitih prajmera prilikom izvoĎenja PCR metode zabeleņena je razlika u specifičnosti i pogodnosti detekcije sekvenci svih pet različitih delova genoma, ITS region, geni za TEF−1α, β−tubulin i calmodulin i mtSSU rDNK, gljiva prouzrokovača fuzariozne truleņi sirka. Univerzalni par prajmera ITS1/ITS4 koji amplifikuje ITS region svih Eukariota, pokazao se pogodnim za proveru uspeńnosti ekstrakcije DNK, a takoĎe i za korińćenje u okviru protokola za identifikaciju sekvencioniranjem dobijenih produkata vrsta roda Fusarium. ITS region je visoko varijabilan izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva nekih rodova, a sa druge strane konzervativan na nivou vrste, tako da su ovi opńti prajmeri omogućili prepoznavanje svih ispitivanih izolata. Mirhendi et al. (2010) uspeńno su razlikovali 16 Fusarium vrsta primenom univerzalnih prajmera ITS1/ITS4 sekvencioniranjem produkata veličine oko 550 bp kod svih ispitivanih izolata. Univerzalni prajmeri ef1/ef2 koji amplifikuju barkoding region TEF−1α gena kod svih poznatih vrsta roda Fusarium (Summerell et al., 2003; Geiser et al., 2004; Kristensen et al., 2005), pokazali su se najpogodnijim za identifikaciju i karakterizaciju ispitivanih izolata, kao i kod mnogih drugih rodova fitopatogenih gljiva. Gen za β−tubulin visoko je konzervativan i pokazao se uspeńnim za razlikovanje blisko povezanih vrsta, koje je ranije bilo teńko razdvojiti na osnovu morfolońkih svojstava (Geiser et al., 2004). Primenom para prajmera T1/T22 (O’Donnell and Cigelnik, 1997) uspeńno je amplifikovan gen za β−tubulin duņine oko 1300 bp kod 13 od 16 ispitivanih izolata. MeĎutim, kod izolata ispitivanih standarda F. equiseti i F. graminearum reakcija je bila slabog inteziteta ńto se ogledalo u pojavi tanjih traka u vińe ponovljenih PCR reakcija. Gen za calmodulin, amplifikovan uz pomoć prajmera CL1/CL2A, koji se pokazao informativnim za filogenetske analize kompleksa G. fujikuroi, kao i vrsta roda Fusarium (O’Donnell et al., 2000a), smatra se najboljim kandidatom i za analize strukture populacije (Geiser et al., 2000). U ovom radu, gen za calmodulin pokazao se odgovarajućim za identifikaciju i filogenetske analize izolata svrstanih u četiri morfolońke grupe, ali ne i za amplifikaciju tri izolata 134 pete morfolońke grupe (E. nigrum). Detekcija i identifikacija ispitivanih izolata obavljena je i primenom prajmera MS1/MS2 (White et al., 1990) koji omogućavaju amplifikaciju mitohondrijalne male podjedinice (mtSSU) ribozomske DNK. Primenom ovih prajmera prisustvo fragmenta veličine oko 716 bp ustanovljeno je kod predstavnika svih pet morfolońkih grupa ispitivanih izolata. MeĎutim, kod izolata F. equiseti (286−09, RBG851), F. thapsinum (808−11, RBG5255) i E. nigrum (291−09, 315−09, 539−10) reakcija je bila slabog intenziteta, sa pojavom tanjih traka očekivane veličine u svim ponovljenim PCR reakcijama. Molekularna detekcija, sekvencioniranje i filogenetske analize DNK sekvenci odgovarajućih delova genoma pruņile su mogućnost da se preciznije proučava razdvajanje vrsta roda Fusarium, da se identifikuju nepoznati izolati, da se ustanove meĎuodnosi izmeĎu poznatih vrsta, kao i da se izvrńi mapiranje toksikogenih profila vrsta ili grupa vrsta (O´Donnell et al., 1998a). Kako populacija Fusarium spp. iz stabla i semena gajenog sirka poreklom iz Srbije do sada nije ispitivana na molekularnom nivou, nije poznata genetička struktura, kao ni variranje srpskih izolata u odnosu na izolate Fusarium spp. poreklom iz Evrope i drugih delova sveta, molekularna ispitivanja su, osim detekcije bila usmerena i na njihovu identifikaciju i karakterizaciju. Dobijeni rezultati predstavljaju prvu detaljniju karakterizaciju jednog ovako sloņenog kompleksa gljiva sa gajenog sirka u Srbiji. Vińestrukim poreĎenjem sekvenci odgovarajućih delova nuklearne i mitohondrijalne DNK, kao i sekvencioniranjem tri proteinska gena (TEF−1α, β−tubulin, calmodulin) sa dostupnim sekvencama odgovarajućih regiona genoma gljiva u GenBank bazi podataka i proračunom genetičke sličnosti, obavljena je potvrda identifikacije svih odabranih izolata poreklom sa gajenog sirka. Analizom nukleotidnih sekvenci različitih genoma utvrĎeno je da odabrani izolati pripadaju vrstama F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i F. thapsinum, kao i vrsti E. nigrum. Rezultati dobijeni u ovim istraņivanjima, uspeńna primena protokola za molekularnu identifikaciju F. graminearum na osnovu sekvence TEF gena koji kodira translacioni faktor izduņivanja 1−alfa, predstavljaju početak i osnovu proučavanja filogeografske distribucije ove značajne vrste u Srbiji. Naročito je značajno ńto dobijeni rezultati predstavljaju uvod u bliņu genetičku karakterizaciju, kao i brzo i lako razlikovanje ove vrste od morfolońki sličnih vrsta iz Fg kompleksa (Ristić i sar., 2011). 135 Molekularna identifikacija odabranih izolata obavljena BLAST analizom sekvenci produkata svih pet gena pojedinačno, pokazala je visok stepen nukleotidne identičnosti (99−100%) sa sekvencama odgovarajućih gena izolata F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i F. thapsinum, kao i E. nigrum deponovanih u GenBank bazi podataka. Genetička sličnost izolata 286−09 sa lokaliteta Bački Petrovac, koji je prethodno okarakterisan na morfolońkom nivou kao predstavnik morfolońke grupe I, sa ostalim izolatima F. equiseti poreklom iz različitih delova sveta, ispitivana je analizom sekvenci svih pet različitih delova genoma koji su se pokazali značajnim za karakterizaciju F. equiseti. Izraņena uniformnost sekvenci TEF−1α gena potvrĎena je visokim stepenom identičnosti sekvence izolata iz Srbije i izolata F. equiseti iz drugih delova sveta. Homologija sekvenci TEF−1α gena kretala se od 99,5 do 100%, a razliku u samo tri nukleotida ispitivani izolat ispoljio je sa sekvencama (DQ842056, FJ939674, FJ939686) iz Kanade, Francuske i Italije. Na osnovu analize delimične sekvence TEF−1α gena, Stepień et al. (2012) procenili su varijabilnost 27 izolata F. equiseti poreklom iz Italije i Poljske. Analizom polimorfizma ovog regiona od ukupno 27 izolata, 22 pokazala su visok nivo nukleotidne identičnosti od 99%. Molekularna identifikacija na osnovu analize sekvence ITS regiona, potvrdili su pripadnost ispitivanog izolata (286−09) vrsti F. equiseti, a homologija sekvenci u okviru vrste kretala se od 99,4 do 100%. Razlika u samo tri nukleotida (99,4%) pokazala se kod sekvenci izolata F. equiseti poreklom iz Australije, Francuske i Kine, a najmanju homologiju od 98,7% sa razlikom u 11 nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatima F. equiseti iz Japana i SAD. Na osnovu ovih dostupnih sekvenci nije bilo moguće uočiti varijabilnost ispitivanih izolata povezanu sa njihovim geografskim poreklom. Na osnovu analize sekvenci gena za β−tubulin nije ispoljena visoka varijabilnost u okviru vrste F. equiseti. Nukleotidnu sličnost od 100% ispitivani izolat ispoljio je sa izolatom F. equiseti (GQ915441) iz SAD. Moņe se uočiti da na osnovu sekvenci gena za calmodulin postoji varijabilnost izmeĎu izolata u okviru jedne vrste, jer je najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% ispitivani izolat 286–09 pokazao sa izolatom F. equiseti iz Nemačke (GQ505509), a najniņi stepen identičnosti (97,6%) sa razlikom u 15 nukleotida pokazao je sa izolatom F. equiseti iz SAD (GQ857062). 136 Sekvenca mitohondrijalnog dela genoma (mtSSU) rDNK izolata 286–09 poreklom iz prizemnog dela stabla, iz Srbije, prva je sekvenca ovog dela genoma prijavljena u GenBank bazi podataka, tako da nije bilo moguće napraviti poreĎenje, niti oceniti varijabilnost na osnovu ovog dela genoma u okviru ove vrste. Stepen nukleotidne sličnosti mtSSU gena ispitivanog izolata sa izolatima dostupnim u GenBank bazi podataka pokazao je nizak stepen identičnosti od 97,1% sa razlikom u 18 nukleotida sa 67 sekvenci različitih specijalizovanih formi F. oxysporum. Genetička sličnost izmeĎu izolata 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10, predstavnika morfolońke grupe II i sa ostalim izolatima F. proliferatum poreklom iz različitih delova sveta takoĎe je ispitivana analizom sekvenci pet različitih delova genoma. Na osnovu sekvenci TEF−1α gena pet ispitivanih izolata pokazuje izuzetno visok stepen meĎusobne homologije (99,5%−99,8%), ńto ukazuje tako da na osnovu sekvenci TEF−1α gena postoji mala varijabilnost izmeĎu ovih izolata. Sampietro et al. (2010) takoĎe su utvrdili visok stepen nukleotidne sličnosti izmeĎu izolata bez obzira na poreklo, tako da je čak četiri izolata bilo identično sa izolatima iz pńenice. Slično tome, homologija sekvenci ITS regiona ispitivanih izolata kretala se od 99,4 do 100%. Sekvence ITS regiona su generalno konzervativne ili pokazuju jako male razlike u okviru vrsta roda Fusarium, ńto je potvrĎeno visokom homologijom ITS regiona izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva, pa je tako na osnovu nukleotidne identičnosti ispitivan izolat (297a−09) pokazao 100% sličnosti sa sekvencama izolata prijavljenih pod potpuno različitim imenima (F. proliferatum, G. moniliformis, G. intermedia, F. subglutinans i Fusarium spp.). Slično tome, Cheng et al. (2008) su sekvencu ITS regiona izolata iz Juņne Kine uporedili sa vrstama G. fujikuroi kompleksa i rezultati su pokazali 100% nukleotidne identičnosti sa sekvencama izolata različitih vrsta F. proliferatum i G. fujikuroi. Istraņivanja Stanković et al. (2007) potvrĎuju ove rezultate, meĎutim prema predlogu Waalwijk's (1996), identičnost ITS sekvenci F. proliferatum i G. fujikuroi ne moņe biti prihvaćena kao odgovarajuća slika njihove morfolońke i genetičke različitosti kakva postoji u prirodi. Ovo potvrĎuju filogenetske analize i rekonstruisana filogenetska stabla, koja se potpuno razlikuju u odnosu na filogenetske analize na osnovu egzona i introna gena za β−tubulin (O’Donnell and Cigelnik, 1997). Neophodna je obazrivost pri filogenetskoj interpretaciji ITS sekvenci roda Fusarium. Kao ńto su i rezultati dobijeni u ovom radu potvrdili, pravilna identifikacija ipak zahteva 137 analiziranje drugih delova genoma, kao ńto je TEF−1α gen koji je visoko informativan na nivou vrste za rod Fusarium, i koji pokazuje visok polimorfizam sekvenci izmeĎu blisko srodnih vrsta, čak i u poreĎenju sa intronom kodirajućih gena, kao ńto su β−tubulin, calmodulin i histon H3 (Geiser et al., 2004). Na osnovu analize sekvenci gena za β−tubulin i calmodulin, takoĎe nije ispoljena visoka varijabilnost u okviru vrste F. proliferatum. Stepen nukleotidne sličnosti gena za β−tubulin ispitivanog izolata (297a−09) sa izolatima iz ostalih delova sveta pokazala je visoku homologiju (99,3 do 100%), sa razlikom u samo jednom nukleotidu (99,9%) u odnosu na F. proliferatum iz Ńpanije i 9 nukleotida sa izolatom iz Japana. Homologija sekvenci gena za calmodulin takoĎe je bila visoka i kretala se od 99,2 do 100%. Najvińi stepen identičnosti (100%) pokazao je sa dva izolata F. proliferatum iz Italije, a najniņi stepen identičnosti (99,2%) sa razlikom u 5 nukleotida pokazao je sa F. proliferatum iz Italije. Kwon et al. (2001) su analizom sekvenci četiri lokusa gena F. proliferatum, dokazali visok stepen homologije izmeĎu izolata ove gljive poreklom iz pńenice i ńumskog zemljińta iz Ńpanije. Stepen nukleotidne sličnosti gena za calmodulin ova dva izolata pokazala je potpunu identičnost sekvenci, dok na osnovu gena za TEF−1α i mtSSU rDNK zabeleņena je razlika u dva nukleotida, i kod gena za β−tubulin razlika u tri nukleotida. PotvrĎena je visoka homologija mitohondrijalnog dela genoma (mtSSU) rDNK izmeĎu morfolońki različitih vrsta gljiva i tako je na osnovu sekvenci ovog dela genoma najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% ispitivan izolat (297a−09) pokazao sa sekvencama izolata prijavljenih kao F. proliferatum i najmanje četiri različite gljive, ńto ukazuje da ni ovaj genski lokus nije u potpunosti pogodan za molekularnu identifikaciju. Genetička sličnost izolata 532−10, 535−10 i 536−10 iz morfolońke grupe III identifikovane kao F. graminearum meĎusobno i sa ostalim izolatima F. graminearum poreklom iz različitih delova sveta, analizirana je na osnovu sekvenci gena za TEF−1α. Ispitivani izolati pokazali su izraņenu uniformnost, pri čemu izolat 532−10 ima 99,7% nukleotidne sličnosti sa druga dva izolata, koja su meĎusobno potpuno identična. Homologija sekvenci ovog gena bila je veoma visoka, kretala se od 98 do 99% sa sekvencama 64 izolata G. zeae iz drugih delova sveta. Kako se radi o barkoding regionu 138 ne postoji varijabilnost sekvenci TEF−1α gena unutar vrste, s obzirom da su izraņen stepen identičnosti od 99,8%, sa razlikom u samo jednom nukleotidu ispitivani izolati pokazali sa sekvencom 41 izolata različitog porekla, iz Norveńke, USA, Francuske, Danske, Finske, Italije, Kine i Australije. Rezultati molekularne identifikacije na osnovu analize sekvence gena za TEF−1α, potvrdili su da izolovane peritecije (uzorak 14−11) pripadaju vrsti G. zeae. Slično tome, Sampietro et al. (2010) utvrdili su visok stepen identičnosti od 100% izmeĎu izolata G. zeae iz kukuruza i pńenice iz Buenos Ajresa sa izolatima iz MaĎarske, Irana i SAD, a Scott and Chakraborty (2006) potvrdili su identifikaciju 47 izolata ove vrste poreklom iz pńenice iz Australije. UtvrĎena nukleotidna sličnost predstavnika grupe III, (535−10) sa ostalim F. graminearum izolatima potvrĎuje njegovu identifikaciju kao F. graminearum i na osnovu homologije sekvenci ITS regiona. Najvińi stepen nukleotidne identičnosti od 100% ispitivan izolat pokazao je sa sekvencama 9 izolata G. zeae različitog porekla, iz Japana, Ekvadora, Kolumbije, Kine i Francuske. Visok stepen homologije nukleotidnih sekvenci (99,6%) sa razlikom u dva nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatom F. graminearum izolovanog iz Rumohra adiantiformis iz Floride, SAD. Analizom sekvenci ITS1 i 5.8S rDNK regiona izolata kompleksa F. graminearum i F. culmorum, Chung et al. (2008) dokazali su visoku homologiju sekvenci. MeĎutim, dońlo je do substitucije u dve nukleotidne pozicije ITS1 i ITS2 regiona izmeĎu izolata F. graminearum kompleksa i F. culmorum. Slično tome, razna istraņivanja navode da ITS1 i 5.8S rDNK region nije pogodan za identifikaciju kompleksa F. graminearum i F. culmorum zbog niskog polimorfizma nukleotidnih sekvenci (Bateman et al., 1996; Shilling et al., 1996; Edel et al., 1997; Yli−Mattila et al., 2004). Na osnovu analize sekvenci gena za β−tubulin, 100% nukleotidne sličnosti ispitivani izolat 535−10 ispoljio je sa sekvencom izolata G. zeae iz SAD, Japana i Rusije, a neńto niņi stepen nukleotidne identičnosti (99,3%) sa razlikom u pet nukleotida pokazao je sa izolatom G. zeae iz Kine. Slično tome, vrlo nizak stepen sličnosti gena za calmodulin, sa razlikom u dva nukleotida ispitivani izolat pokazao je sa izolatom G. zeae iz Kine. Proračunom genetičke sličnosti na osnovu mitohondrijalnog dela genoma (mtSSU) rDNK, najvińi nivo homologije od 99,8%, sa razlikom u jednom nukleotidu, ispitivani izolat pokazao je sa sekvencama ńest izolata različitih Fusarium vrsta, od čega su dva izolata prijavljena kao G. zeae iz Finske i SAD, a četiri izolata F. culmorum iz 139 Velike Britanije. Ovi rezultati ukazuju na ograničeni značaj ovog gena za molekularnu identifikaciju vrste i ograničen značaj ovog dela genoma za razlikovanje blisko srodnih vrsta. Na osnovu sekvenci pet genomnih delova potvrĎeno je da izolat 808−11 pripada vrsti F. thapsinum, ńto je preliminarno utvrĎeno na osnovu morfolońkih svojstava. Homologija sekvenci gena za TEF−1α izolata iz Srbije i iz drugih delova sveta bila je visoka a najveća razlika od svega tri nukleotida ustanovljena je sa F. thapsinum iz Kine. Slično tome, Sampietro et al. (2010) utvrdili su veliku sličnost izmeĎu izolata iz sirka iz Argentine i iz SAD, a Rahjoo et al. (2008) identifikovali su 140 izolata dobijenih iz klipa kukuruza, poreklom iz 11 različitih klimatskih oblasti Irana. Zbog izuzetnog značaja ovog dela genoma u identifikaciji, proglańen je barkoding regionom i u okviru FUSARIUM−ID baze podataka (Benson et al., 2007), stavljen na raspolaganje istraņivačima ńirom sveta. Na osnovu analize sekvenci ITS regiona, nije ispoljena visoka varijabilnost u okviru vrste F. thapsinum, tako da je ispitivani izolat 808−11 bio identičan sa ńest izolata F. thapsinum iz SAD, Kine i Indije, a razlikovao se samo u dva nukleotida sa izolatom iz Juņne Afrike. Na osnovu analize sekvenci gena za β−tubulin i calmodulin, takoĎe je uočena visoka uniformnost sekvenci. U regionu sekvence gena za β−tubulin, ispitivani izolat 808−11 bio je identičan sa izolatom F. thapsinum iz Juņne Afrike, dok je sekvenca gena za calmodulin bila identična sa izolatom iste vrste iz SAD. Na osnovu sekvence mitohondrijalnog dela genoma (mtSSU) rDNK, izolat iz Srbije razlikovao se samo u jednom nukleotidu od izolata G. thapsina iz Juņne Afrike, koji je takoĎe izolovan iz S. bicolor. Primena molekularnih metoda i identifikacije na osnovu sekvencioniranja odgovarajućeg dela genoma pokazala se veoma korisnim u slučaju morfolońke grupe V ispitivane u ovom radu. Po morfologiji kolonije, pigmentu i neobičnom izgledu konidija, pojedini izolati pogreńno su dovedeni u vezu sa Fusarium sp. Tek je primena molekularnih metoda identifikacije i karakterizacije na osnovu sekvenci ITS regiona rDNK dovela izolate 291−09 (JQ619838) i 315−09 (JQ619839) u vezu sa vrstom Epiccocum nigrum jer je ustanovljena potpuna nukleotidna sličnost sa sekvencama 23 izolata različitog porekla koji su prijavljeni kao E. nigrum. 140 Kako populacija E. nigrum iz semena sirka poreklom iz Srbije do sada nije ispitivana na molekularnom nivou, nije poznata genetička struktura, kao ni variranje srpskih izolata u odnosu na izolate E. nigrum poreklom iz Evrope i drugih delova sveta. Iz ovih razloga, molekularna ispitivanja su, osim detekcije bila usmerena i na njihovu identifikaciju i karakterizaciju, a dobijeni rezultati predstavljaju prvu detaljniju karakterizaciju E. nigrum u Srbiji. Kilpatrick and Chilvers (1981) ispitali su varijabilnost 2000 izolata Epicoccum i zaključili da pripadaju genetski varijabilnoj vrsti, ńto je kasnije potvrĎeno i analizom 5.8S i ITS regiona rDNK (Wang and Guo, 2004). Na osnovu poreĎenja sekvenci u području ITS regiona, ustanovljena je značajna sličnost sa vrstom Cerebella andropogonis (Paţoutová end Kolínská, 2003) ńto ukazuje da su ovi rodovi sinonimni, kao ńto je i ranije bilo predloņeno (Schol−Schwarz, 1959). Na osnovu morfolońkih zapaņanja i ITS analiza predloņeno je da Phoma epicoccina, joń jedna srodna vrsta, i E. nigrum predstavljaju iste biolońke vrste (Arenal et al., 2004), mada su izolati E. nigrum izgubili sposobnost da formiraju piknide za razliku od izolata P. epicoccina. Dalja istraņivanja Fávaro et al. (2011) dokazala su genetičku povezanost izmeĎu izolata E. nigrum poreklom sa različitih biljaka domaćina, korińćenjem sekvenci ITS regiona rDNK i β−tubulin gena, a filogenetske analize pokazale su da izolati E. nigrum mogu biti razdvojeni u dve odvojene grupe. Pomenuta istraņivanja ukazuju na činjenicu da su obe grupe ńiroko rasprostranjene u svetu. Primenjujući sloņenije analize, kombinujući morfolońke, fiziolońke i molekularne analize, Fávaro et al. (2011) razlikuju dva klastera i postavljaju hipotezu da isolate E. nigrum treba razdvojiti u dve vrste. Dalja istraņivanja ukazaće na opravdanost razdvajanja ovih izolata u zasebne vrste, a time i preciznije mesto koje pripada analiziranim izolatima sa sirka u Srbiji. U isto vreme, dobijeni rezultati predstavljaju prvu karakterizaciju izolata E. nigrum u Srbiji, ńto s obzirom na specifičnu ulogu ove vrste u prirodi otvara mogućnost za dalja istraņivanja, naročito metabolita i njihove uloge u patogenezi i epidemiologiji. 6.5. Molekularna karakterizacija Fusarium spp. Filogenetska analiza nukleotidnih sekvenci različitih delova genoma (ITS region; TEF−1α; β−tubulin; calmodulin i mtSSU rDNK) potvrdila je genetsku heterogenost ispitivanih izolata gljiva prouzrokovača fuzariozne truleņi sirka. U ovom 141 radu, ukupno je rekonstruisano devet filogenetskih stabala koja su dala doprinos razumevanju meĎusobnih odnosa ispitivanih vrsta roda Fusarium. Rasvetljavanje evolutivne meĎupovezanosti različitih izolata pruņilo je uvid u prisustvo i rasprostranjenost vrsta ovog veoma značajnog roda u nańoj zemlji i njihovo mesto u odnosu na ostale vrste u svetu. Raznolikost sekvence ITS1 rDNK moņe ilustrovati sličnosti izmeĎu mnogih vrsta jedne sekcije, dok se na osnovu sekvenci ITS2 Fusarium spp. mogu grupisati u dva glavna klastera (tip I i tip II), koja su podudarna ili odstupaju od granica sekcija (Waalwijk et al., 1996). S obzirom da sekvence regiona ITS2 obuhvataju dve divergentne i neortologe kopije, celokupan ITS region koji je puno korińćen u filogenetskim analizama brojnih drugih rodova gljiva, prema navodima O’Donnell et al. (2000a) nije dobar izbor za filogenetske analize vrsta roda Fusarium jer ustanovljene razlike nisu evolutivno informativne. Da bi se dońlo do pouzdanih zaključaka potrebno je prema Waalwijk et al. (1996) kombinovati morfolońke i molekularne metode bazirane na filogenetskoj analizi drugih lokusa. Slično tome filogenetskim stablom rekonstruisanim na osnovu sekvenci ITS regiona rDNK, F. proliferatum (297a−09) i F. thapsinum (808−11) iz Srbije, smeńteni su unutar drugog klastera zajedno sa drugim srodnim vrstama. Isti način grupisanja vrsta unutar G. fujikuroi kompleksa iz različitih delova sveta, utvrdili su i O’Donnell et al. (2000a), mada ih nisu dalje analizirali. Ove dve vrste ispoljavaju morfolońku sličnost, mada F. thapsinum formira mikrokonidije u vidu laņnih glavica ili nizova samo iz monofijalida, dok F. proliferatum iz monofijalida i polifijalida (Leslie and Summerell, 2006). TakoĎe, zajedno formiraju blago srpaste do skoro prave makrokonidije, sa tri do pet poprečnih pregrada, ńto je tipično za vrste G. fujikuroi kompleksa. Sva ova svojstva podrņavaju filogenetsko grupisanje ukazujući na bliņi odnos ove dve vrste unutar roda Fusarium. MeĎutim, različito opisana toksikogena svojstva, F. proliferatum koja sintetińe visok nivo fumonizina (Desjardins, 2006), i F. thapsinum koja luči visok nivo moniliformina (Porter et al., 2000; Porter et al., 2002), podrņavaju rezultate dobijene filogenetskom analizom. Kombinacija sekvenci različitih genskih regiona i njihova analiza prońirila su saznanja o vrstama unutar G. fujikuroi kompleksa (O’Donnell and Cigelnik, 1997; O’Donnell et al., 1998a, 2000a; Steenkamp et al., 1999, 2000; Aoki et al., 2001; Geiser et al., 2005). Prema trenutnim saznanjima, smatra se da G. fujikuroi kompleks 142 obuhvata najmanje 50 različitih vrsta ili filogenetskih linija, koje pribliņno odgovaraju onim vrstama koje su priznate korińćenjem morfolońkog i biolońkog koncepta klasifikacije. Korińćenje sekvenci različitih gena za sistematiku na nivou vrste, takoĎe je pruņilo uvid u filogenetski meĎuodnos unutar kompleksa G. fujikuroi, odredivńi preciznije mesto mnogim prethodno nedovoljno precizno klasifikovanim izolatima. Uopńteno govoreći, molekularna filogenetska analiza pruņa neophodni taksonomski okvir potreban za proučavanje granice izmeĎu vrsta i veze izmeĎu areala rasprostranjenja, kruga domaćina, biogeografije i potencijala za biosintezu mikotoksina (O´Donnell et al., 1998a). Brojna proučavanja uporednih konvencionalnih i molekularnih svojstava ukazala su na evolutivne veze izmeĎu vrsta G. fujikuroi kompleksa koje se grupińu u tri velika klastera. Iako nisu formalno imenovani, figuriraju oznake koje se odnose na geografsko poreklo biljke domaćina iz koje su Fusarium vrste izolovane, tako da se često označavaju kao “Afrički”, “Američki” i “Azijski”. Mada se ovi nazivi ńiroko upotrebljavaju, nisu retka ni osporavanja (Kvas et al., 2009). Ova biogeografska hipoteza izgleda pouzdana i primenljiva za većinu Fusarium vrsta unutar kompleksa G. fujikuroi. Prema biogeografskom razdvajanju F. proliferatum iz Srbije, pripada “Azijskom” klasteru zajedno sa izolatom F. proliferatum iz orhideje iz Nemačke, dok je F. thapsinum iz Srbije smeńten u “Afrički” klaster sa većinom vrsta kompleksa Gibberella fujikuroi, meĎu kojima je i sekvenca izolata F. thapsinum iz S. bicolor iz Juņne Afrike. Ovako razdvajanje F. proliferatum i F. thapsinum iz Srbije u dva odvojena klastera povezano sa uočenim morfolońkim razlikama i po svemu sudeći dobro ilustruje njihovu evolutivnu udaljenost. Prema tome, filogenetske analize na osnovu TEF−1α regiona najbolje ilustruju meĎusobne odnose ove dve vrste, ističući njihove razlike unutar kompleksa vrsta G. fujikuroi u svetu. “Afrički” klaster je najveći sa 21 filogenetskom vrstom, od kojih četiri predstavljaju biolońke vrste ili populacije sa polnim načinom razmnoņavanja (Klittich and Leslie, 1992; Leslie, 1995; Klaasen and Nelson, 1996; Klittich et al., 1997; Geiser et al., 2005; Lepoint et al., 2005). Morfolońki, ovaj klaster karakterińu ovalne do izduņene mikrokonidije u dugim nizovima formirane iz monofijalida, ńto u potpunosti odgovara svojstvima koja je ispoljio izolat 808−11 slično drugim srodnim 143 vrstama kao ńto su F. dlaminii, F. napiforme, F. nygamai, F. acutatum, F. pseudoanthophilum i F. udum. Nasuprot tome, F. proliferatum iz Srbije, karakterińe prisustvo mikrokonidija iz polifijalida u vidu dugih lanaca, ńto je u saglasnosti sa svojstvima vrsta iz “Azijskog” klastera, kao ńto su ostali izolati vrsta F. proliferatum i F. fujikuroi. “Azijski” klaster je najmanji, sadrņi 10 morfolońki opisanih vrsta, od kojih je za tri vrste poznato da formiraju i polni stadijum (Kuhlman, 1982; Leslie, 1991, 1995; Samuels et al., 2001; Leslie et al., 2005). “Američki” klaster, gde nema predstavnika iz Srbije poreklom iz sirka, obuhvata 18 filogenetskih vrsta ili linija u kome je većina pokazala morfolońka svojstva slična F. subglutinans koji formira ovalne mikrokonidije na laņnim glavicama iz mono− i polifijalida (Nelson et al., 1983). Na osnovu ispitivanja vrsta roda Fusarium, poreklom sa sirka u Srbiji, utvrĎeno je prisustvo vrste iz F. graminearum kompleksa (Fg kompleks), koji predstavlja drugi značajan kompleks gljiva u okviru ovog roda. DNK sekvence ńest gena 99 izolata F. graminearum sakupljenih iz različitog biljnog materijala ńirom sveta O´Donnell et al. (2000b) su razdvojili (Fg kompleks) u sedam različitih filogenetskih linija porekla. Posle dodatnih ispitivanja, pre svega toksikogenih svojstava, ove linije su podignute na nivo vrsta koje ispoljavaju različitu rasprostranjenost i učestalost (O´Donnell et al., 2004). Do sličnih zaključaka dońli su i Zeller et al. (2004) primenom polimorfizma duņine amplifikovanih fragmenata (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism) i analizom 30 lokusa. Jedna od vrsta iz Fg kompleksa, koja je na osnovu sekvenci introna i egzona β−tubulin gena i heterotalusnog ponańanja u testovima ukrńtanja, meĎu prvima izdvojena je F. pseudograminearum (nekada poznata kao F. graminearum Grupa1) (Aoki and O´Donnell., 1999a). Schmale et al. (2006) smatraju da su ove poljske populacije deo jedne velike regionalne populacije koja nije polno izolovana, da njihove askospore predstavljaju osnovni inokulum koji se vetrom prenosi na velike udaljenosti omogućavajući efikasno ńirenje i doprinoseći razmeni genetičkog materijala. Ovakve rezultate potvrdili su Burlakoti et al. (2008) i Vogelgsang et al. (2009), navodeći da ove filogenetske linije porekla ipak predstavljaju pre genetički i geografski razdvojene populacije koje nisu polno izolovane, a koje su deo jedne velike populacije koja se ne razlikuje u odnosu na biljke domaćine sa kojih su izolovane. Alvarez et al. (2010) navode da je u Argentini, u Fg kompleksu, prisutna samo predominantna F. 144 graminearum sensu stricto, meĎutim, novija istraņivanja dovode u pitanje ovakve rezultate. Dalja brojna istraņivanja ovog Fg kompleksa doprinose opisivanju novih vrsta ili novih saznanja o njihovim odnosima (O’Donnell et al., 2000b; Cumagun et al., 2004; O’Donnell et al., 2004; Starkey et al., 2007; O’Donnell et al., 2008; Yli−Mattila et al., 2009). Analizom filogenetskog stabla rekonstruisanog na osnovu sekvenci ITS regiona rDNK, odabrani izolati Fg kompleksa nisu se grupisali prema očekivanoj evolutivnoj srodnosti. Zbog visoke homologije sekvenci ITS regiona svi izolati Fg kompleksa grupisani su u jedan zajednički klaster, gde spada i ispitivani izolat 535−10. MeĎutim, filogenetska analiza unutar Fg klastera obavljena na osnovu DNK sekvenci gena za TEF1−α i β−tubulin, pokazala je da su izolati 532−10, 535−10, 536−10 i 14−11, identifikovani kao F. graminearum svrstani u klaster 7, zajedno sa ostalim izolatima iste vrste, koje preovlaĎuju u Severnoj hemisferi. Na osnovu ovog filogenetskog stabla O´Donnell et al. (2000b) zaključili su da je evolutivna povezanost izmeĎu sedam linija Fg klastera dosta slaba, izuzev izmeĎu sestrinske grupe linija porekla 1 i 2 (F. austroamericanum i F. meridionale). Ove linije unutar Fg klastera razlikuju se izmeĎu ostalog i po svojoj rasprostranjenosti, nastanjujući različite kontinente. Filogenetsko stablo rekonstruisano iz fragmenta gena za elongacioni faktor TEF−1α 54 dostupnih sekvenci F. equiseti izolata iz Severne i Juņne Evrope pokazalo je jasno razdvajanje u tri klastera. Istraņivanja u okviru ove doktorske disertacije potvrdila su postojanje navedenih tipova u okviru vrste F. equiseti, pri čemu je populacija u Srbiji po prvi put molekularno okarakterisana na nivou niņem od vrste. Sekvenca izolata 286−09 iz Srbije grupisana je u drugi klaster, koji odgovara tipu II, zajedno sa sekvencama 12 izolata F. equiseti iz Ńpanije. Filogenetska analiza na osnovu gena za elongacioni faktor (TEF−1α) izolata F. equiseti i F. acuminatum iz ječma i pńenice, iz Ńpanije i drugih delova sveta ukazuje na postojanje ńiroke genetičke varijabilnosti izolata iz Severne i Juņne Evrope podeljenih u dva klastera, koji odgovaraju populacijama označenim kao tip I i tip II (Marín et al., 2012). Ove dve populacije, odnosno tipovi, razlikuju se prema toksikogenoj aktivnosti (Adejumo et al., 2007; Kosiak et al., 2005; Marín et al., 2012). Slične rezultate dobili su i Jurado et al. (2006). Četiri od pet izolata iz Severne Evrope koje su opisali Kosiak et al. (2005) 145 pripadaju tipu I, dok su preostali svrstani unutar klastera F. scirpi. Postojanje dve različite populacije u okviru vrste moņe da objasni njihovo prisustvo u značajno različitim klimatima. TakoĎe, ņivotni ciklus F. equiseti podrazumeva i polni stadijum Gibberella intrincans (Leslie and Summerell, 2006) a peritecije su do sada proučavane samo u in vitro uslovima. Stoga, kao zastupljeniji način razmnoņavanja F. equiseti smatra se bespolni stadijum. Buduća istraņivanja mogu biti od koristi za karakterizaciju dve populacije, uključujući istraņivanje ekofiziolońkih karakteristika pojedinih izolata iz obe grupe i njihov meĎusobni odnos u okviru različitih klimatskih uslova. Rezultati dobijeni u istraņivanjima u okviru ove doktorske disertacije, uspeńna primena protokola za molekularnu identifikaciju kompleksa vrsta G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti predstavljaju početak i osnovu proučavanja filogeografske rasprostranjenosti ovih značajnih vrsta u Srbiji. Dobijeni rezultati predstavljaju uvod u bliņu genetičku karakterizaciju, kao i brzo i lako razlikovanje ovih vrsta od morfolońki sličnih vrsta. Sekvencioniranje većeg broja izolata, uključivanje dodatnih delova genoma, njihovo poreĎenje i odreĎivanje njihovog meĎuodnosa i odnosa sa drugim izolatima u svetu doprinosi poznavanju strukture populacije vrsta G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti kompleksa iz čega jedino i moņe da proizaĎe uspeńna strategija kontrole ovih veoma ńtetnih patogena. 6.6. Ocenjivanje nivoa osetljivosti različitih genotipova sirka Vrste roda Fusarium su jedna od naznačajnijih grupa patogena koja napada preteņno useve različitih ņita, uključujući i gajeni sirak, prouzrokujući najčeńće veoma značajne ekonomske ńtete (Nirenberg and O’Donnell, 1998; Leslie et al., 1992; Leslie, 1995). Problemi sa bolestima sirka metlańa koje se u nańim uslovima mogu sporadično pojaviti poput antraknoze čiji je prouzrokovač Colletotrichum graminicola i virusa mozaične krņljavosti kukuruza (Maize Dwarf Mosaic Virus, MDMV) u velikoj meri reńeni su selekcijom otpornih sorti (Mijavec, 1993; Maćko, 1995). U uslovima veńtačke inokulacije izdvojeno je nekoliko genotipova od kojih su primenom metode pojedinačne selekcije (pedigre metoda selekcije) formirane dve linije otporne na antraknozu i tri otporne na MDMV. Ove linije ispoljavaju relativno dobre agronomske karakteristike, a njihovo testiranje u svojstvu roditelja eksperimentalnih hibrida je u toku (Sikora i Berenji, 2010). Vrńena su preliminarna istraņivanja i u pogledu 146 osetljivosti sirka na truleņ stabla koju prouzrokuje Fusarium sp. (Balaţ et al., 1996; 1997). Dva pravca unapreĎenja proizvodnje gajenog sirka su metlań i sirak za zrno. Kod sirka metlańa oplemenjivanje je usmereno na stvaranje F1 hibridnih sorti, dok se hibridi sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') ističu poboljńanom tolerantnońću prema nepovoljnim uslovima spoljne sredine (Berenji i sar., 2008). Upravo zbog toga, ova dva genotipa su uključena u oglede veńtačke inokulacije i prirodne zaraze, u cilju odreĎivanja nivoa osetljivosti prema odabranim Fusarium spp. Oplemenjivanje na otpornost prema bolestima obuhvata dve faze. Najpre je potrebno dobro proučiti patogena, etiologiju bolesti, genetičku prirodu reakcije zaraņenih biljaka, razviti odgovarajuće metode poljske inokulacije i identifikovati efikasne izvore otpornosti. U drugoj fazi se geni za otpornost inkorporiraju u lokalne adaptirane ali osetljive genotipove (Berenji i Sikora, 2006). Tokom dugogodińnjeg rada na programu oplemenjivanja i unapreĎenja proizvodnje sirka metlańa u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo u Novom Sadu razraĎena je tehnologija proizvodnje i stvoreno je ukupno 11 sorti. Sadańnji sortiment čine sorte 'Prima', 'Tan Sava' i 'Reform' koje u potpunosti zadovoljavaju potrebe proizvoĎača u pogledu prinosa, a i preraĎivača (metlara) u pogledu kvaliteta sirkove slame (Sikora i Berenji, 2010). Truleņ stabla prouzrokuju mnogobrojni mikroorganizmi, mnoge vrste jednog roda, različiti genotipovi iste vrste, prisutna je interakcija prouzrokovača, poligeno se nasleĎuje, a značajan je uticaj stresa i drugih faktora na pojavu ovog oboljenja (Penčić i Lević, 1994; Nastasić i sar., 2001). Metode veńtačkog zaraņavanja stabla su destruktivne i nisu u potpunosti odgovarajuće prirodnim zarazama. Ovo se pokazalo kao jedan od elemenata koji je komplikovao tumačenje rezultata poljskih ogleda za osetljivost primenom veńtačkih inokulacijama obavljenim u toku izrade ove disertacije u kojima se u prvoj godini istraņivanja pojavio odreĎeni niņi nivo nekroze nakon inokulacije sterilisanim čačkalicama. Bez obzira na to, nekroza prouzrokovana od strane oba izolata Fusarium spp. bila je značajno različita i vińa, ńto je moglo razdvojiti delovanje patogena od osetljivosti genotipova na mehanička ońtećenja. Na ovaj način, primenom veńtačkih inokulacija bilo je moguće uporediti genotipove sirka na osnovu njihove reakcije bez obzira na destruktivnost same metode. 147 Ocenjivanje osetljivosti na osnovu veńtačke inokulacije i prirodne zaraze stabla sirka sa Fusarium spp. moņe dati različite rezultate (Jocković i sar., 2008). Jedan od doprinosa ove disertacije je uporedno ispitivanje reakcije istih genotipova sirka na veńtačke inokulacije i prirodne zaraze istom grupom prouzrokovača truleņi stabla. Iz biljaka u okviru ogleda za ispitivanje osetljivosti sirka u prirodnim uslovima (Čantavir), prethodno su izolovane prevalentne Fusarium spp. sa kojima su u drugom lokalitetu (Bački Petrovac) bez istorije pojave oboljenja vrńene veńtačke inokulacije. Na taj način omogućeno je direktno poreĎenje reakcije genotipova. Ono ńto je od naročitog interesa jeste da su genotipovi sirka najotporniji u uslovima veńtačke zaraze ('Alba' i 'Gold'), ispoljili najvińu otpornost i u uslovima prirodnih zaraza. Na taj način, ilustrovana je jasna reakcija genotipova i dobijeni su realni podaci o nivou otpornosti, nezavisno od metode inokulacije. Istovremeno, rezultati su pokazali da se veńtačke inokulacije mogu primeniti i da u uslovima postavljenog eksperimenta, pruņaju pouzdane podatke. Kako je organizovanje poljskog ogleda za ocenu osetljivosti najčeńće teńko, skupo i dugotrajno, postoji potreba da se preliminarno testiranje obavi u uslovima koji su kontrolisani i u kojima je moguće doći do rezultata brņe a pri tome obuhvatiti veći broj genotipova sirka i patogena. Zbog toga, ocena nivoa osetljivosti genotipova sirka za zrno i sirka metlańa u kontrolisanim uslovima (stakleniku) uz veńtačku inokulaciju obezbeĎuje brņi uspeh u preliminarnom pronalaņenju otpornih genotipova. Veńtačke inokulacije imaju i veliku prednost, u tome ńto se koristi precizno odreĎena i uniformna količina inokuluma (fragment kolonije odreĎene veličine, suspenzija spora odreĎene koncentracije ili inokulisane čačkalice) identifikovanog prouzrokovača. Sve ovo obezbeĎuje ponovljivost ogleda i preciznije odreĎivanje potencijala u pogledu osetljivosti ispitivanih genotipova. Uporednim ispitivanjem osetljivosti 11 različitih genotipova sirka u različitim uslovima zaraze, dobijeni su značajni podaci o potencijalu ovih genotipova u agroekolońkim uslovima u Srbiji. Osetljivost genotipova sirka je ocenjena na osnovu rezultata iz tri uporedna ogleda: (a) veńtačka inokulacija klijanaca sirka u uslovima staklenika; (b) inokulacija stabla sirka u poljskim uslovima u 2010. i 2011. godini na lokalitetu Bački Petrovac; (c) prirodna zaraza stabla u uslovima 2010. i 2011. godine na lokalitetu Čantavir. U svetu postoji ograničen broj sličnih uporednih testiranja na osetljivost u različitim sistemima inokulacija (Tesso et al., 2010). 148 Prilikom ispitivanja nivoa osetljivosti klijanaca 11 različitih genotipova sirka u eksperimentalnim uslovima staklenika, ispitivane vrste F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i E. nigrum, meĎusobno su se razlikovale po patogenosti. F. equiseti i F. proliferatum bile su najpatogenije, zatim F. graminearum neńto slabije patogenosti, a najslabije E. nigrum. U uslovima postavljenog eksperimenta, sve četiri vrste gljiva nisu prouzrokovale pojavu nekroze na genotipovima sirka za zrno 'Alba', 'Gold' i A73, kao i na američkim linijama PI595720 02 SD i PI576382 03 SD. MeĎutim, unutar vrste F. proliferatum dokazana je varijabilnost u patogenosti na nivou niņem od vrste, ńto je od velikog značaja. Od sve četiri ispitivane vrste, samo jedan izolat F. proliferatum bio je patogen za genotip 'Alba'. Na ovaj način, ispitivanjem u ranijim fenofazama razvoja biljaka sirka moguće je odrediti nivo osetljivosti genotipova neposredno posle nicanja, ńto je čest slučaj u prirodi jer se vrste roda Fusarium mogu prenositi iz godine u godinu i u nova područja pomoću zaraņenog semena (Tesso et al., 2010). Tesso et al. (2010) su u svojim istraņivanjima uporedili patogenost osam Fusarium vrsta i otpornost različitih genotipova sirka u uslovima zańtićenog prostora. Istraņivanja patogenosti pokazala su da je F. thapsinum najpatogeniji na gajenom sirku, kako u zańtićenom prostoru, tako i na otvorenom polju. F. verticillioides je pokazala veći nivo patogenosti u zańtićenom prostoru i pribliņno isti nivo kao i ostale Fusarium spp. u poljskim uslovima. Istraņivanja koja su sproveli Leslie et al. (2005) ističu F. thapsinum kao patogeniju vrstu u odnosu na ostale proučavane vrste. Mada se F. verticillioides smatra primarnim patogenom kukuruza, Leslie et al. (1992) su dokazali prisustvo u tkivu sirka, ali je intenzitet zaraze bio značajnije niņi u poreĎenju sa F. thapsinum (Jardine and Leslie, 1992; Mansuetus et al., 1997). Tokom preliminarnih ispitivanja prisustva i rasprostranjenosti vrsta roda Fusarium na gajenom sirku, kao prevalentne na semenu i u usevu sirka u Srbiji izolovane su F. equiseti i F. proliferatum. Mada se u literaturi vrsta F. thapsinum često navodi kao najznačajnija na sirku (Summerell and Leslie, 2011), ona je izolovana tek u uzorcima prizemnog dela stabla i semena sirka tokom 2011. godine i bila je mnogo manje zastupljena u odnosu na vrste F. equiseti i F. proliferatum. Upravo zbog toga, za oglede utvrĎivanja osetljivosti genotipova sirka odabrana su dva izolata F. equiseti i F. proliferatum. MeĎutim, u testu provere patogenosti u uslovima staklenika, utvrĎeno je da je F. thapsinum patogena za klijance sirka obe gajene forme, sirka za zrno (hibridi 149 'Alba' i 'Gold') i sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform'). Nakon dve nedelje F. thapsinum prouzrokovala je potpuno suńenje i propadanje inokulisanih klijanaca sorte 'Prima' i 'Reform', dok na hibridima 'Alba' i 'Gold' nije prouzrokovala pojavu bolesti klijanaca. Buduća istraņivanja uključiće, pored F. equiseti i F. proliferatum kao prevalentnih tokom dve godine istraņivanja i vrste F. thapsinum i F. graminearum, kao dva svakako vrlo značajna patogena sirka za uporedno ispitivanje osetljivosti genotipova u eksperimentalnim uslovima, u stakleniku, kao i u uslovima veńtačke inokulacije i prirodne zaraze. Očitavanje rezultata u toku prve godine ispitivanja (2010) osetljivosti stabla sirka na osnovu veńtačke inokulacije u polju, oteņavala je činjenica da su svi ispitivani genotipovi ispoljili odreĎenu osetljivost na mehaničke povrede ńto je rezultiralo koloniziranjem povreĎenog tkiva sekundarnim saprobima. Do ovakve reakcije verovatno je dońlo zbog specifičnih uslova spoljańnje sredine i izuzetne vlage koja je bila prisutna na biljkama u vidu vodenog filma u momentu inokulacije. MeĎutim, F. proliferatum prouzrokovala je statistički značajno veću nekrozu na povrńini i uzduņnom preseku stabla sorte 'Prima' i 'Reform', a neńto slabiju na hibridu 'Gold'. Povrńina stabla hibrida 'Alba' takoĎe je bila zahvaćena slabom nekrozom, koja je bila vidljiva tek na uzduņnom preseku. Vrsta F. equiseti prouzrokovala je slabiju nekrozu na povrńini i uzduņnom preseku stabla sorti sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') u poreĎenju sa F. proliferatum. Razlike u intenzitetu bolesti izmeĎu otpornih i osetljivih genotipova jasno su se uočavale. Najvińi nivo otpornosti u uslovima veńtačke inokulacije u polju ispoljio je genotip sirka za zrno, hibrid 'Alba', zatim hibrid 'Gold', a najmanju tolerantnost sorte 'Prima' i 'Reform'. Sve reakcije bile su statistički vrlo značajno vińe od nivoa nekroze koji je zabeleņen u kontrolnim biljkama. U drugoj godini (2011) su u ispitivanja bila uključena i četiri genotipa sirka za zrno dobijena u razmeni iz SAD (linije PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD). TakoĎe su za inokulaciju korińćene dve prevalentne vrste F. equiseti i F. proliferatum, koje su se po patogenosti meĎusobno razlikovale. U ovoj godini istraņivanja nije bilo vidljive reakcije genotipova sirka na mehanička ońtećenja do kojih je dolazilo prilikom veńtačkih inokulacija. F. proliferatum prouzrokovala je snaņniju nekrozu kako na povrńini tako i na uzduņnom preseku stabla sorti 'Prima' i 'Reform', a neńto slabiju na hibridima 'Alba' i 'Gold'. Spoljni izgled reakcije povrńine 150 stabla američkih linija (PI656114 01 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI576382 03 SD) ukazivao je na joń slabiju nekrozu, koja je bila vidljiva tek na uzduņnom preseku. Vrsta F. equiseti prouzrokovala je slabiju nekrozu na povrńini i unutrańnjosti stabla hibrida sirka za zrno ('Alba' i 'Gold') i sorti sirka metlańa ('Prima' i 'Reform') u poreĎenju sa F. proliferatum. Simptomi na povrńini stabla američkih linija nisu bili prisutni ili je nekroza zahvatila manje od 1 cm oko mesta uboda. Ovom metodom inokulacije potvrĎena je otpornost američkih linija prema vrstama F. equiseti i F. proliferatum. U uslovima postavljenog eksperimenta, moņe se zaključiti da su najveću otpornost prema uticaju F. equiseti i F. proliferatum ispoljili hibrid 'Alba' i američke linije PI576382 03 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI656114 01 SD, zatim 'Gold' i 'Prima', a najmanju ispoljila je sorta sirka metlańa, 'Reform'. U literaturi su malobrojni podaci o proučavanjima patogenosti F. equiseti za različite genotipove sirka, ńto verovatno proizilazi iz činjenice da je u svetu ova vrsta retko identifikovana na stablu i zrnu sirka, za razliku od F. andiyazi, F. thapsinum i F. proliferatum koje dominiraju u hladnijim i vetrovitim oblastima ńirom Australije (Petrović et al., 2009). U ovom radu utvrĎeno je da je F. equiseti manje patogena vrsta za sirak u poreĎenju sa F. proliferatum. Predmet istraņivanja Tesso et al. (2004) bio je da ispitaju otpornost devet roditeljskih linija i 18 F1 hibrida sirka za zrno na fuzarioznu truleņ stabla u uslovima veńtačkih inokulacija, pri čemu je nivo otpornosti hibrida uglavnom bio vińi nego kod roditeljskih linija. TakoĎe su utvrdili da je izolat F. proliferatum srednje patogenosti za različite linije sirka i njihove hibride Tokom 2010. i 2011. godine ispitivana je u Čantaviru u uslovima prirodne zaraze sirka osetljivost dva genotipa sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i dva genotipa sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform') na truleņ stabla. Zaraņene biljke ispoljavale su simptome prvenstveno na prizemnom delu stabla u vidu mrkih pega, koje su se dalje ńirile na internodije. Prema intenzitetu zaraze povrńine stabla i unutrańnjeg tkiva najosetljivije su bile sorte sirka metlańa ('Prima' i 'Reform'), pri čemu su simptomi u drugoj godini ispitivanja bili znatno izraņeniji, zbog čega je dolazilo do lomljenja i poleganja biljaka. Znatno manju osetljivost ispoljila su dva hibrida sirka za zrno ('Alba' i 'Gold'), meĎutim u prvoj godini nekroza na povrńini stabla bila je u vidu sitnih, mrkih pega, dok je u drugoj godini nekroza zahvatala vińe od 1/2 internodije. Rezultati ocene osetljivosti genotipova sirka u potpunosti su se podudarili sa rezultatima dobijenim u 151 veńtačkim inokulacijama, i to kako u stakleniku tako i u polju. PoreĎenjem reakcije genotipova sirka vidi se da su i u uslovima prirodne zaraze genotipovi iz grupe metlańa bili značajno osetljiviji u poreĎenju sa hibridima iz grupe sirka za zrno. Izlaganje biljaka prirodnim izvorima inokuluma najčeńće nije dovoljno pouzdano za ocenu patogenosti Fusarium spp. zbog variranja brojnih činilaca u interakciji patogen–biljka domaćin– spoljańnja sredina (Lević, 2008). Rezultati dobijeni dvogodińnjim ispitivanjima u okviru ove disertacije pokazali su da je zbog značajnih razlika u reakciji dve gajene forme sirka, bilo moguće napraviti istovetnu gradaciju i vrednovanje sorti i hibrida na osnovu njihove osetljivosti. Sa druge strane, Fusarium spp. se u prirodi najčeńće nalaze u vidu kompleksa od vińe vrsta i verovatno kao takve učestvuju u patolońkim procesima prouzrokujući meńane infekcije. Na ovaj način, ispitivanja koja su prethodno obezbedila odreĎivanje prisustva prevalentnih vrsta u nekom polju a potom veńtačke inokulacije istim vrstama u drugom neinfestiranom polju, kako je to uraĎeno u okviru ove disertacije, dala su stvarne podatke o nivou osetljivosti genotipova sirka. Tome u prilog govori i slična reakcija svih ispitivanih genotipova i isto grupisanje bez obzira na to da li su zaraze bile veńtačke ili prirodne, i to u obe godine ispitivanja. Sorte sirka metlańa 'Prima' i 'Reform' bile su osetljivije bez obzira na metodu, čak su bili osetljiviji i na sama mehanička ońtećenja ńto po svemu sudeći moņe da predstavlja osnovu njihove osetljivosti. U zavisnosti od metode ocenjivanja intenziteta zaraze Fusarium spp. u uslovima prirodne zaraze, svi genotipovi su se različito grupisali, mada se ocena preseka stabla pokazala kao bolja i pouzdanija metoda, jer su simptomi nekroze bili vidljivi i intenzivniji tek na uzduņnom preseku stabla. Rezultati ovih ispitivanja ukazali su na postojanje različitih vidova osetljivosti komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala prema prevalentnim Fusarium spp., koji će se dalje koristiti u programima oplemenjivanja gajenog sirka na otpornost prema ovim patogenima. Od naročitog značaja je i uporedno ispitivanje osetljivosti genotipova u uslovima veńtačke inokulacije i prirodne zaraze, kao i u eksperimentalnim uslovima, u stakleniku, čime su dobijeni realni podaci o potencijalu ovih genotipova u agroekolońkim uslovima Srbije. U svim postavljenim uslovima eksperimenta, najveću osetljivost prema prouzrokovačima truleņi stabla ispoljile su dve sorte sirka metlańa 'Prima' i 'Reform'. Značaj utvrĎenih rezultata, odnosno visoke korelacije izmeĎu nivoa osetljivosti genotipova u poljskim, odnosno kontrolisanim uslovima, ogleda se u 152 mogućnosti brņeg oplemenjivačkog rada, čiji je vaņan deo ocenjivanje reakcije genetičkog materijala prema Fusarium spp. U uslovima staklenika moguće je joń pre početka vegetacije ispitati nivo osetljivosti genotipova i za dalji rad u polju odabrati genotipove koji ispoljavaju otpornost. TakoĎe buduća istraņivanja treba da uključe i vrstu F. thapsinum i da se detaljnije ispita njena učestalost i značaj u proizvodnim područjima gajenog sirka, posebno u Vojvodini, i to severni (okolina Kanjiņe, Sente i Bačke Topole) i juņni rejon (ńira okolina Bačkog Petrovca, Selenče i Pivnica). 153 7. ZAKLJUČAK Na osnovu obavljenih trogodińnjih istraņivanja fuzariozne truleņi gajenog sirka u Srbiji i kompleksa gljiva koji je prouzrokuju, rodova Fusarium i Epicoccum, dobijen je niz značajnih rezultata i izvedeni su sledeći zaključci. Pregledom useva sirka u četiri različita lokaliteta gajenja u Vojvodini, zabeleņena je pojava intenzivnih simptoma fuzariozne truleņi korena, prizemnog dela stabla i semena. Procenjena zaraņenost pregledanih useva sirka, bila je veoma visoka, a suńenje i brzo propadanje zaraņenih biljaka rezultiralo je gubicima od preko 90%. U pregledanim uzorcima semena, ustanovljene su meńane zaraze gljivama iz rodova: Fusarium, Alternaria, Epicoccum, Aspergillus i Penicillium. Zaraza semena sirka sa Fusarium spp. kretala se od 2,3 do 19,7%, u proseku 8,82%. Izolacijom fitopatogenih gljiva iz zaraņenih biljaka sirka u polju i iz zaraņenog semena, izdvojeno je ukupno 48 izolata Fusarium spp. kojima je potvrĎena patogenost veńtačkim inokulacijama klijanaca sirka. Tokom izolacije i gajenja kultura Fusarium spp. i Epicoccum za proveru patogenosti, uočena su izvesna morfolońka svojstva na osnovu kojih je izvrńeno njihovo grupisanje. Za nastavak istraņivanja, odabrano je 13 izolata, 8 izdvojenih iz prizemnog dela stabla sirka i 5 sa semena, koji su meĎusobno uporeĎivani u cilju pravilne identifikacije i utvrĎivanja njihovog taksonomskog meĎuodnosa. U ispitivanja su uključena i četiri referentna izolata iz Australije. Odabrani izolati svrstani su u pet morfolońkih grupa na osnovu meĎusobne sličnosti i sličnosti sa standardima. Prvu grupu činio je izolat 286−09 koji je morfolońki odgovarao referentnom izolatu F. equiseti (RBG851). Izolati 297a−09, 13−10, 521−10, 522−10 i 530−10 formirali su drugu grupu koja je ispoljila sličnost sa referentnim izolatom (RBG5349) identifikovanim kao F. proliferatum. Treću grupu činili su izolati 532−10, 535−10 i 536−10 koji su ispoljili sličnost sa morfolońkim svojstvima navedenim u literaturi za vrstu F. graminearum. izolat 808−11, predstavnik četvrte grupe sličan je referentnom izolatu (RBG5255) koji je identifikovan kao F. thapsinum. Izolati 291−09, 315−09 i 539−10 koji su se izdvojili od ostalih proučavanih izolata formirali su petu grupu koja je morfolońki, po izgledu i boji kolonija, dovedena u vezu sa izgledom kolonija vrsta Fusarium spp. 154 Testovi patogenosti provereni primenom veńtačkih inokulacija klijanaca sirka dve gajene forme, sirka za zrno (hibridi 'Alba' i 'Gold') i sirka metlańa (sorte 'Prima' i 'Reform'), u uslovima staklenika, kao i inokulacijom klijanaca u epruvetama, u in vitro uslovima, obavljeni su uspeńno reprodukovanjem simptoma prirodne infekcije. Proučavana makroskopska i mikroskopska morfolońka svojstva odabranih izolata gljiva iz gajenog sirka iz Srbije, a koje pripadaju kompleksu vrsta Fusarium, pruņile su stabilnu karakteristiku za njihovo razlikovanje. S obzirom da vrste roda Fusarium imaju sposobnost da variraju u morfolońkim osobinama (oblik i veličina makrokonidija, način obrazovanja mikrokonidija, obrazovanje hlamidospora ili boja kolonija), različite hranljive podloge uključene u istraņivanja omogućile su razlikovanje i grupisanje svih odabranih izolata i njihovu identifikaciju do vrste, ńto je nadalje i potvrĎeno molekularnim metodama identifikacije. Tokom ispitivanja morfolońkih svojstava, koje je obavljeno in situ direktno u kolonijama izolata, kao i na izvornim zaraņenim ostacima biljaka sirka, ustanovljeno je i prisustvo tvorevina polnog razmnoņavanja, peritecija, koje su se formirale povrńinski oko osnove inficiranog stabla sirka. Imajući u vidu poznatu varijabilnost, odnosno mogućnost postojanja različitih morfolońkih varijanti u okviru pojedinih vrsta roda Fusarium, ipak neophodna je oprezna primena morfolońkih kriterijuma u taksonomske svrhe. Reakcijom umnoņavanja ciljne DNK patogena, prouzrokovača fuzariozne truleņi sirka uz primenu različitih prajmera utvrĎena je razlika u specifičnosti i pogodnosti detekcije sekvenci svih pet različitih delova genoma (ITS region, TEF−1α, β−tubulin, calmodulin i mtSSU rDNK) ispitivanih izolata. MeĎutim, primenjene PCR reakcije i korińćeni prajmeri uspeli su da dokaņu prisustvo nukleinskih kiselina odgovarajućih vrsta i tako su ujedno i potvrdili razlikovanje i formiranje morfolońkih grupa unutar ispitivanih Fusarium spp. Molekularna detekcija, sekvencioniranje i filogenetske analize DNK sekvenci odgovarajućih delova genoma pruņile su mogućnost da se preciznije proučava razdvajanje vrsta roda Fusarium, da se identifikuju nepoznati izolati i da se ustanove meĎuodnosi izmeĎu poznatih vrsta. Vińestrukim poreĎenjem sekvenci dobijenih sekvencioniranjem odgovarajućih delova nuklearne i mitohondrijalne DNK, kao i sekvencioniranjem tri proteinska gena (TEF−1α, β−tubulin, calmodulin) sa dostupnim sekvencama odgovarajućih regiona genoma gljiva u GenBank bazi podataka i 155 proračunom genetičke sličnosti, obavljena je potvrda identifikacije svih dobijenih sekvenci odabranih izolata sirka. Analizom nukleotidnih sekvenci različitih genoma utvrĎeno je da odabrani izolati pripadaju vrstama roda Fusarium: F. equiseti, F. proliferatum, F. graminearum i F. thapsinum, kao i vrsti iz roda Epicoccum: E. nigrum. Tokom preliminarnih ispitivanja prisustva i rasprostranjenosti vrsta roda Fusarium na gajenom sirku, kao prevalentne na semenu i u usevu sirka u Srbiji izolovane su F. equiseti i F. proliferatum. Rekonstrukcijom filogenetskih stabala dat je doprinos u rasvetljavanju evolutivne meĎupovezanosti različitih izolata i pruņilo je uvid u prisustvo i rasprostranjenost vrsta Fusarium u nańoj zemlji. Uspeńna primena protokola za molekularnu identifikaciju vrsta G. fujikuroi i F. graminearum i F. equiseti kompleksa na osnovu sekvenci TEF gena koji kodira translacioni faktor izduņivanja 1−alfa, β−tubulina i calmodulina, predstavljaju početak i osnovu proučavanja filogeografske distribucije ovih značajnih vrsta u Srbiji. Dobijeni rezultati predstavljaju uvod u bliņu genetičku karakterizaciju, kao i brzo i lako razlikovanje ovih vrsta od morfolońki sličnih vrsta iz G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti kompleksa. Sekvencioniranje većeg broja izolata, uključivanje dodatnih delova genoma, njihovo poreĎenje i odreĎivanje njihovog meĎuodnosa i odnosa sa drugim izolatima u svetu doprinosi poznavanju strukture populacije vrsta G. fujikuroi, F. graminearum i F. equiseti kompleksa iz čega jedino i moņe da proizaĎe uspeńna strategija suzbijanja ovih veoma ńtetnih patogena. Rezultati ispitivanja u okviru ove disertacije ukazali su na postojanje različitih vidova osetljivosti komercijalnih sorti i oplemenjivačkog materijala prema prevalentnim vrstama Fusarium spp., koji će se dalje koristiti u programima oplemenjivanja gajenog sirka na otpornost prema ovim patogenima. U uslovima postavljenog eksperimenta, moņe se zaključiti da su najveću otpornost prema F. equiseti i F. proliferatum ispoljili hibrid 'Alba' i američke linije PI576382 03 SD, PI534163 02 SD, PI595720 02 SD i PI656114 01 SD, zatim hibrid 'Gold' i sorta 'Prima', a najmanju sorta sirka metlańa, 'Reform'. Značaj rezultata dobijenih istraņivanjem osetljivosti sirka na Fusarium spp., odnosno visoka korelacija izmeĎu nivoa otpornosti genotipova u poljskim, kao i kontrolisanim uslovima, ogleda se u mogućnosti brņeg oplemenjivačkog rada, čiji je vaņan deo ocenjivanje reakcije genetičkog materijala prema Fusarium spp. 156 Morfolońka i molekularna karakterizacija različitih izolata Fusarium kompleksa iz Srbije, obavljena u okviru ove doktorske disertacije, pruņila je uvid u prisustvo i rasprostranjenost vrsta Fusarium kompleksa u nańoj zemlji. Taksonomski kriterijumi, razvijeni molekularni protokoli i potpuno okarakterisani izolati Fusarium kompleksa u Srbiji predstavljaju osnovu koja se moņe primeniti za razlikovanje novih izolata gljiva ovog kompleksa. TakoĎe, rezultati ovih istraņivanja pruņili su neke od odgovora o postojanju osetljivosti genotipova prema predominantnim vrstama Fusarium spp. u Srbiji, ukazali na najpogodnije metode za ispitivanje osetljivosti, a sve u cilju reńavanja problema u programima selekcije na otpornost prema ovim patogenim vrstama. 157 8. LITERATURA Adejumo, T. O., Hettwer, U., Karlovsky, P. (2007): Survey of maize from south– western Nigeria for zearalenone, α– and β–zearalenols, fumonisin B1 and enniatins produced by Fusarium species. Food Additives & Contaminants, 24: 993–1000. Alvarez, L. C., Somma, S., Moretti, A., Fernandez Pinto, V. (2010): Agressivness of Fusarium graminearum sensu stricto isolates in wheat kernels in Argentina. Journal of Phytopathology, 158: 173–181. Alves dos Reis, T., Zorzete, P., Pozzi, C. R., Nascimento da Silva, V., Ortega, E., Corrêa, B. (2010): Mycoflora and fumonisin contamination in Brazilian sorghum from sowing to harvest. Journal of the Science of Food and Agriculture, 90: 1445–1451. Amatulli, M. T., Spadaro, D., Gullino, M. L., Garibaldi, A. (2010): Molecular identification of Fusarium spp. associated with bakanae disease of rice in Italy and assessment of their pathogenicity. Plant Pathology, 59: 839–844. Andersen, A. L. (1948): The development of Gibberella zeae headblight of wheat. Phytopathology, 38: 595–611. Aoki, T., O´Donnell, K. (1999a): Morphological and molecular characterization of Fusarium pseudograminearum sp. nov., formerly recognized as the Group 1 population of Fusarium graminearum. Mycologia, 91: 597–609. Aoki, T., O'Donnell, K. (1999b): Morphological characterization of Gibberella coronicola sp. nov., obtained through mating experiments of Fusarium pseudograminearum. Mycoscience, 40: 443–453. Aoki, T., O'Donnell, K., Ichikawa, K. (2001): Fusarium fractiflexum sp. nov. and two other species within the Gibberella fujikuroi species complex recently discovered in Japan that form aerial conidia in false heads. Mycoscience, 42: 461–478. Arenal, F., Platas, G., Peláez, F. (2004): Taxonomic reconsideration of Epicoccum nigrum and Phoma epicoccina based on DNA sequences and morphological observations. Mycotaxon, 89: 465–471. Backhouse, D., Abubakar, A. A., Burgess, L. W., Dennis, J. I., Hollaway, G. J., Wildermuth, G. B., Wallwork, H., Henry, F. J. (2004): Survey of Fusarium species associated with crown rot of wheat and barley in eastern Australia. Australasian Plant Pathology, 33: 255–261. Backhouse, D., Burgess, L. W. (2002): Climatic analysis of the distribution of Fusarium graminearum, F. pseudograminearum and F. culmorum on cereals in Australia. Australasian Plant Pathology, 31: 321–327. 158 Backhouse, D., Burgess, L. W., Summerell, B. A. (2001): Bibliography of Fusarium. 122–137. Summerell, B. A., Leslie, J. F., Backhouse, D., Bryden, W. L., Burgess, L. W. (eds), Fusarium–Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, Minnesota, 392. Bačvanski, S., Kunc, V., Berenji, J., Makević, S. (1988): Proučavanje hibridnih sirkova za proizvodnju zelene mase. Savremena poljoprivreda, 36: 193–288. Bagi, F. (2006): Viroze gajenog sirka u Vojvodini. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 38: 5–28. Bagi, F., Berenji, J., Jasnić, S., Stojńin, V. (2004): Otpornost genotipova sirka metlańa prema virusu mozaične krņljavosti kukuruza. Pesticidi i fitomedicina, 19: 167– 172. Bai, G. H., Shaner, G. E. (1994): Wheat scab: respective and control. Plant Disease, 78: 760–766. Balaņ, F., Berenji, J., Bagi, F. (1997): Reaction of different broomcorn (Sorghum bicolor (L.) Moench.) genotypes to stalk rot (Gibberella fujikuroi (Sow.) Wollenw). Proceedings of the “10th Congress of the Mediterranean Phytopathological Union, Montpellier – Le Corum (France), 541–545. Balaņ, F., Berenji, J., Bagi, F., Maleńević, S. (1996): Osetljivost različitih genotipova sirka metlańa (Sorghum bicolor L.) Moench. prema prouzrokovaču truleņi stabla (Gibberella fujikuroi (Saw.) Wollenw.). Deseti jugoslovenski simpozijum o zańtiti bilja sa meĎunarodnim učeńćem, Budva, 30. septembar – 4. oktobar 1996. Zbornik rezimea, 75. Bateman, G. L., Kwasna, H., Ward, E. (1996): Relationships among Fusarium spp. estimated by comparing restriction fragment length polymorphisms in polymerase chain reaction–amplified nuclear rDNA. Canadian Journal of Microbiology, 42: 1232–1240. Benson, D. A., Karsch–Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. (2007): GenBank. Nucleic Acids Research, 35: 21−25. Berenji, J. (1994): Bioalkohol od sirka i čičoke. Revija agronomska saznanja, 4: 19–21. Berenji, J. (1993): Mesto sirka za zrno u ratarskoj proizvodnji. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, 21: 427–438. Berenji, J. (1996): Dostignuća u oplemenjivanju sirka metlańa i sirka za zrno. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, 25: 435–444. 159 Berenji, J. (2000): Broomcorn breeding for disease resistance. Abstracts of the Maize and Sorghum EUCARPIA XVIIth International Conference on Maize and Sorghum Genetics and Breeding at the end of the 20 th Century, Belgrade, 62. Berenji, J. (2008): Scopaeologija – prońlost, sadańnjost i budućnost metli. Zbornik radova XV MeĎunarodni kongres poljoprivrednih muzeja, (CIMA XV), Novi Sad–Kulpin, 22–26. septembar, 40–46. Berenji, J., Adamović, D., Sikora, V., Sabo, J. (2008): Dostignuća u unapreĎenju proizvodnje i korińćenja alternativnih kultura u odeljenju za hmelj, sirak i lekovito bilje Instituta za ratarstvo i povrtarstvo. Zbornik radova, Sveska 45: 145–158. Berenji, J., Dahlberg, J. (2004): Perspectives of Sorghum in Europe. Journal of Agronomy and Crop Science, 1905: 332−338. Berenji, J., Dahlberg, J., Sikora, V. (2004): Sirak za zrno – mogućnost za ublaņavanje ńtetnih posledica suńe. Zbornik referata 37. Seminara agronoma Naučnog instituta za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, 151–158. Berenji, J., Dahlberg, J., Sikora, V., Latković, D. (2011): Origin, History, Morphology, Production, Improvement, and Utilization of Broomcorn [Sorghum bicolor (L.) Moench] in Serbia. Economic Botany, 65: 190–208. Berenji, J., Kińgeci, J. (1996): Broomcorn−classical example of industrial use of sorghum. 1 European seminar on sorghum for energy and industry, Toulouse, 43−48. Berenji, J., Kunc, V. (1995): Prinos i kvalitet sirka za zrno. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, 23: 309–318. Berenji, J., Mijavec, A. (1992): Sirkovi. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje 23/24: 53– 65. Berenji, J., Mijavec, A., Kińgeci, J. (1987): Broomcorn (Sorghum bicolor (L.) Moench.) breeding in Yugoslavia. Proceedings of the 16 th Conference of the EUCARPIA Maize and Sorghum Section, Nitra. Berenji, J., Mijavec, A., Tońić, M. (1993): Broomcorn breeding for MDMV and anthracnose resistance. 16 th Conference of EUCARPIA Maize and Sorghum Section, Bergamo. Berenji, J., Sikora, V. (2004): Perspektive proizvodnje sirka za zrno kod nas. Acta Agriculturae Serbica, 9: 501–507. Berenji, J., Sikora, V. (2006): Dostignuća u oplemenjivanju sirka metlańa. Zbornik radova Instituta za ratarsvo i povrtarstvo Novi Sad, 42: 79–89. 160 Bilai, V. I. (1955): Fuzarii. Izd. Akad. Nauk. Ukrain SSR (Published by the Academy of Sciences of the Ukrainian SSR), Kiev, 320. Bogo, A., Mantle, P. G. (1999): Claviceps africana discovered in India. Plant Disease, 83: 79. Booth, C. (1971): The Genus Fusarium. Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 237. Bowden, R. L., Leslie, J. F. (1999): Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology, 89: 182–188. Brennan, J. M., Egan, D., Cooke, B. M., Doohan, F. M. (2005): Effect of temperature on head blight of wheat caused by Fusarium culmorum and F. graminearum. Plant Pathology, 54: 156–160. Burgess, L. W., Backhouse, D., Swan, L. J., Esdaile, R. J. (1996): Control of Fusarium crown rot of wheat by late stubble burning and rotation with sorghum. Australasian Plant Pathology, 25: 229–233. Burgess, L. W., Dodman, R., Mayers, P., Pont, W. (1981): Fusarium diseases of wheat, maize and grain sorghum in eastern Australia. In 'Fusarium: Diseases, Biology and Taxonomy'. (Eds Nelson, P., Toussoun, T., Cook, R.) Pennsylvania State University Press, University Park, 64–76. Burgess, L. W., Summerell, B. A. (1992): Mycogeography of Fusarium: Survey of Fusarium species in subtropical and semi–arid grassland soils from Queensland, Australia. Mycological Research 96: 780–784. Burgess, L. W., Summerell, B. A., Backhouse, D., Benyon, F., Levic, J. (1997): Biodiversity and population studies in Fusarium. Sydowia, 48: 1–11. Burgess, L. W., Summerell, B. A., Bullock, S., Gott, K. P., Backhouse, D. (1994): Laboratory Manual for Fusarium Research, 3rd ed. University of Sydney/Royal Botanic Gardens, Sydney, Australia. Burlakoti, R. R., Ali, S., Secor, G. A., Neate. S. M., McMullen, M. P., Adhikari, T. B. (2008): Genetic relationships among populations of Gibberella zeae from barley, wheat, potato and sugar beet in upper midwest of United States. Phytopathology 98: 969–976. Caron, D. (1993): Les Fusarioses, in: Maladies des bles et orges. Institut technique des céréales et des fourrages (ITCF), 30–39. Caron, D. (2000): Fusarioses des epis – Sain–on pr ´evoir leur´ developpement. Perspectives Agricoles, 253: 56–62. 161 CAST (2003): Mycotoxins: risks in plant, animal and human systems. Task Force Report 139, Council for Agricultural Science and Technology, Ames, IA. Chambers, K. R. (1988): Effect of time of inoculation on Diplodia stalk and ear rot of maize in South Africa, Plant Disease, 72: 529–531. Chehri, K., Salleh, B., Yli–Mattila, T., Reddy, K. R. N., Abbasi, S. (2011): Molecular characterization of pathogenic Fusarium species in cucurbit plants from Kermanshah province, Iran. Saudi Journal of Biological Sciences, 18: 341–351. Chelkowski, J. (1998): Distribution of Fusarium species and their mycotoxins in cereals grains. In: Sinha KK, Bathnagar D (eds), Mycotoxins in Agriculture and Food Safety, New York, NY, Dekker, 45–64. Cheng, Z., Tang, W., Su, Z., Cai, Y., Sun, S., Chen, Q., Wang, F., Lin, Y., She, Z., Vrijmoed, L. L. P. (2008): Identification of mangrove endophytic fungus 1403 (Fusarium proliferatum) based on morphological and molecular evidence. Journal of Forestry Research, 19: 219−224. Chongo, G., Gossen, B. D., Kutcher, H. R., Gilbert, J., Turkington, T. K., Fernandez, M. R., McLaren, D. (2001): Reaction of seedling roots of 14 crop species to Fusarium graminearum from wheat heads. Canadian Journal of Plant Pathology, 23: 132–137. Chung, W. –H., Ishii, H., Nishimura, K., Ohshima, M., Iwama, T., Yoshimatsu, H. (2008): Genetic analysis and PCR-based identification of major Fusarium species causing head blight on wheat in Japan. Journal of General Plant Pathology, 74: 364–374. Clark, J. W., Miller, F. R., Creelman, R. (1980): Utilisation of grain sorghum biomass for energy. Sorghum Newsletter, 23: 44–45. Čobić, T., Kunc, V., Berenji, J. (1987): Ispitivanje hemijskog sastava i hranljive vrednosti zrna sirka nemenjenog za ishranu preņivara. Savremena poljoprivreda, 35: 361−368. Conab (Companhia Nacional de Abastecimento), Quarto Levantamento de Avaliação da Safra 2006/2007. [Online]. Available:http://www.conab.gov.br/conab– web/index.pdf [30 September 2009]. Conner, R. L., Hwang, S. F., Stevens, R. R. (1996): Fusarium proliferatum: a new causal agent of black point in wheat. Canadian Journal of Plant Pathology, 18: 419–423. Cumagun, C. J. R., Rabenstein, F., Miedaner, T. (2004): Genetic variation and covariation for aggressiveness deoxynivalenol production and fungal colonization among progeny of Gibberella zeae in wheat. Plant Pathology, 53: 446–453. 162 Cunnington, J. H., Takamatsu, S., Lawrie, A. C., Pascoe, I. G. (2003): Molecular idenfication of anamorphic powdery mildews (Erysiphales). Australasian Plant Pathology, 32: 421−428. da Silva, J. B., Pozzi, C. R., Mallozzi, M. A. B., Ortega, E. M., Corrêa, B. (2000): Mycoflora and occurrence of aflatoxin B1 and fumonisin B1 during storage of Brazilian sorghum. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48: 4352–4356. Dahlberg, J. A. (2000): Classification and characterization of sorghum. In: Smith, C. W. and Frederiksen, R. A. (eds), Sorghum: Origin, History, Technology, and Production. John Wiley & Sons Inc., New York, 99−130. Dahlberg, J. A., Wolfrum, E., Bean, B., Rooney, L. (2011a): Compositional and agronomic evaluation of sorghum biomass as a potential feedstock for renewable fuels. Journal of Biobased Materials and Bioenergy, 5: 507−513. Dahlberg, J., Berenji, J., Sikora, V., Latković, D. (2011b): Assessing sorghum [Sorghum bicolor (L) Moench] germplasm for new traits: food, fuels & unique uses. Maydica, 56: 165–172. Dawson, W. A. J. M., Bateman, G. L. (2001): Fungal communities on roots of wheat and barley and effects of seed treatments containing fluquinconazole applied to control take–all. Plant Pathology, 50: 5−82. Day, J. P., Shattock, R. C. (1997): Agressiveness and other factors relating to displacement of population of Phytophthora infestans in England and Wales. European Journal of Plant Pathology, 103: 379–391. De Nijs, M., Van Egmond, H. P., Rombouts, F. M., Notermans, S. H. W. (1997): Identification of hazardous Fusarium secondary metabolites occurring in food raw materials. Journal of Food Safety, 17: 161–191. de Wet, J. M. J. (1978): Systematics and evolution of sorghum Sect. Sorghum (Gramineae). American Journal of Botany, 65: 477–484. de Wet, J. M. J., Huckabay, J. P. (1967): The origin of Sorghum bicolor. II. Distribution and domestication. Evolution, 21: 787–802. Desjardins, A. E. (2006): Fusarium Mycotoxins: Chemistry, Genetics, and Biology. American Phytopathological Society, St. Paul, MN. Desjardins, A. E., Busman, M., Muhitch, M. J., Proctor, R. (2007): Complementary host–pathogen genetic analyses of the role of fumonisins in the Zea mays– Gibberella moniliformis seedling interaction. Physiological and Molecular Plant Pathology, 70: 149–160. 163 Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. (1986): Basic Plant Pathology Methods. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA, 1–355. Dickson, J. G., Mains, E. B. (1929): Scab of wheat and barley and its control. USDA Farmers‟ Bulletin 1599, 1–18. Dill−Macky, R., Jones, R. K. (2000): The effect of previous crop residues and tillage on fusarium head blight of wheat. Plant Disease, 84: 71–76. Doggett, H. (1988): Sorghum. Second edition. Longman Scieentific & Technical, 344. Dugan, F. M., Hellier, B. C., Lupien, S. L. (2003): First report of Fusarium proliferatum causing rot of garlic bulbs in North America. Plant Pathology, 52: 426. Dugan, F. M., Hellier, B. C., Lupien, S. L. (2007): Pathogenic fungi in garlic seed cloves from the United States and China, and efficacy of fungicides against pathogens in garlic germplasm in Washington State. Journal of phytopathology, 155: 437–445. Duncan, D. B. (1955): Multiple–rang and multiple F test. Biometrics, 11: 1–42. Edel, V., Steinberg, C., Gautheron, N., Alabouvette, C. (1997): Evaluation of restriction analysis of polymerase chain reaction (PCR) –amplified ribosomal DNA for the identification of Fusarium species. Mycological Research, 101: 179–187. Edel, V., Steinberg, C., Gautheron, N., Recorbet, G., Alabouvette, C. (2001): Genetic diversity of Fusarium oxysporum populations isolated from different soils in France. FEMS Microbiology Ecology, 36: 61–71. El–Hassan, K. I., El–Saman, M. G., Mosa, A. A., Mostafa, M. H. (2004): Interaction between non–pathogenic Fusarium isolates and Fusarium species causing dry rot of potato tubers. Annals of Agricultural Science, 49: 759–771. Elmer, W. H. (1996): Fusarium fruit rot of pumpkin in Connecticut. Plant Disease, 80: 131–135. Elmer, W. H., Summerell, B. A., Burgess, L. W., Backhouse, D., Abubaker, A. A. (1997): Fusarium species associated with asparagus crowns and soil in Australia and New Zealand, Autralas. Plant Pathology, 26: 255–261. Erpelding, J. E., Prom, L. (2006): Seed mycoflora for grain mold from natural infection in sorghum germplasm grown at Isabela, Puerto Rico and their association with kernel weight and germination. Plant Pathology Journal, 5: 106–112. Fakhrunnisa, M. H. H., Ghaffar, A. (2006): Seed–borne mycoflora of wheat, sorghum and barly. Pakistan Journal of Botany, 38: 185–192. 164 FAO (2004): Production year book, vol 58. FAO Statistical Series, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. Fávaro, L. C. dL., de Melo, F. L., Aguilar–Vildoso, C. I., Araújo, W. L. (2011): Polyphasic Analysis of intraspecific Diversity in Epicoccum nigrum Warrants Reclassification into Separate Species. PloS ONE 6 (8): e14828. doi:10.1371/journal.pone.0014828 Fernando, W. G. D., Miller, J. D., Seaman, W. L., Seifert, K., Paulitz, T. C. (2000): Daily and seasonal dynamics of airborne spores of Fusarium graminearum and other Fusarium species sampled over wheat fields. Canadian Journal of Botany, 78: 497–505. Fisher, N. L., Burgess, L. W., Toussoun, T. A. and Nelson, P. E. (1982): Carnation leaves as a substrate and for preserving cultures of Fusarium species. Phytopathology, 72: 151–153. Food and Agricultural Organization of the United Nations (2011): FAOSTAT ProdSTAT, Production Crops. http://faostat.fao.org/site/567/default.aspx#ancor (accessed June 23, 2011). Francis, R. G., Burgess, L.W. (1977): Characteristics of two populations of Fusarium roseum „Graminearum‟ in eastern Australia. Transactions of the British Mycological Society, 68: 421–427. Frederiksen, R. A. (1982): Disease problems in Sorghum. In: Sorghum in the eihties. Proceedings of the International Symposium on Sorghum, 2−7, Nov. 1981, India, Patancheru, 263–271. Frederiksen, R. A. (1986): Compendium of Sorghum Diseases. St. Paul, Minnesota, USA: The American Phytopathological Society, Aps Press, 82. Frederiksen, R. A., Odvody, G. N. (2000): Compendium of Sorghum Diseases. St. Paul, Minnesota, USA: The American Phytopathological Society, Aps Press, 1–75. Gassem, M. A. A. (1999): Study of the micro–organisms associated with the fermented bread (khamir) produced from sorghum in Gizan region, Saudi Arabia. Journal of Applied Microbiology, 86: 221–225. Geiser, D. G., Lewis–Ivey, M. L., Hazika, G., Juba, J. H., Miller, S. A. (2005): Gibberella xylarioides (anamorph: Fusarium xylarioides), a causative agent of coffee wilt disease in Africa, is a previously unidentified member of the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 97: 191–201. Geiser, D. M., Dorner, J.W., Horn, B. W., Taylor, J. W. (2000): The phylogenetics of mycotoxin and sclerotium production in Aspergillus flavus andAspergillus oryzae. Fungal Genetics and Biology, 31: 169–179. 165 Geiser, D. M., Jimenz Gasco, M. M., Kang, S., Mkalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward, T. J., Zhang, N., Kuldau, G. A., O‟Donnell, K. (2004): FUSARIUM– IDv.1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology, 110: 473–479. Geiser, D. M., Juba, J. H., Wang, B., Jeffers, S. N. (2001): Fusarium hostae sp nov., a relative of F. redolens with a Gibberella teleomorph. Mycologia, 93: 670–678. Gelderblom, W. C. A., Jaskiewicz, K., Marasas, W. F. O., Thiel, P. G., Horak, R. M., Vleggaar, R., Kriek, N. P. J. (1988): Fumonisins – novel mycotoxins with cancer–promoting activity produced by Fusarium moniliforme. Applied and Environmental Microbiology, 54: 1806–1811. Gilbert, J., Conner, R. L., Fernandez, M. R., McLaren, D., Woods, S. M. (2003): Role of spring wheat seed infested with Fusarium graminearum in spread and development of fusarium head blight and effects on agronomic performance. Canadian Journal of Plant Pathology, 25: 73–81. Gilbert, J., Tekauz, A. (1995): Effects of fusarium head blight and seed treatment on germination, emergence, and seedling vigour of spring wheat. Canadian Journal of Plant Pathology, 17: 252–259. Gilbert, J., Tekauz, A. (2000): Review: recent developments in research on fusarium head blight of wheat in Canada. Canadian Journal of Plant Pathology, 22: 1–8. Gordon, T. R., Storer, A. J., Wood, D. L. (2001): The pitch canker epidemic in California. Plant Disease, 85: 1128–1139. Goswami, R. S., Kistler, H. C. (2004): Heading for disaster: Fusarium graminearum on cereal crops. Molecular Plant Pathology, 5: 515–525. Gwary, D. M., Mailafiya, D. M., Jibrin, T. J. (2006): Survival of Colletotrichum sublineolum and other seed–borne fungi in sorghum seeds after twenty months of storage. International Journal of Agriculture and Biology, 8: 676–679. Hooker, A. L. (1957): Factors affecting the spread of Diplodia zeae in inoculated corn stalks. Phytopathology, 47: 196–199. Hörberg, H. M. (2002): Patterns of splash dispersed conidia of Fusarium poae and Fusarium culmorum. European Journal of Plant Pathology, 108: 73–80. Inch, S. A., Gilbert, J. (2003): Survival of Gibberella zeae on Fusarium–damaged kernels of spring wheat. Plant Disease, 87: 282–287. Inch, S., Fernando, D., Gilbert, J., Tekauz, A. (2000): Temporal aspects of ascospore and macroconidia release by Gibberella zeae and Fusarium graminearum. Canadian Journal of Plant Pathology, 22: 186. 166 Islam, S. M. M., Masum, M. M. I., Fakir, M. G. A. (2009): Prevalence of seed–borne fungi in sorghum of different locations of Bangladesh. Scientific Research and Essay, 4: 175–179. Ivanović, D., Berenji, J. (1996): Reakcija sirka metlańa (Sorghum bicolor (L.) Moench) na zarazu virusom mozaične krņljavosti kukuruza (MDMV). Deseti Jugoslovenski simpozijum o zańtiti bilja, Budva, 30.09–04.10.1996, Zbornik rezimea, 98. Ivanović, M., Ivanović, D. (2001): Mikoze i pseudomikoze biljaka. Poljoprivredni fakultet, Beograd, 1–547. Jardine, D. J., Leslie, J. F. (1992): Aggressiveness of Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme) isolates to grain sorghum under greenhouse conditions. Plant Disease, 76: 897–900. Jenkinson, P., Parry, D. W. (1994): Splash dispersal of conidia of Fusarium culmorum and Fusarium avenaceum. Mycological Research, 98: 506–510. Jimenez, M., Logrieco, S., Bottalico, A. (1993): Occurrence and pathogenicity of Fusarium species in banana fruits. Journal of Phytopathology, 137: 214–220. Jocković, Đ., Bekavac, G., Purar, B., Nastasić, A., Stojaković, M., Ivanović, M., Latković, D., Boćanski, J. (2008): Oplemenjivanje kukuruza u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo danas i sutra. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo, 45: 5–13. Johnson, N., Kartik, S., Rajasab, A. H. (2008): Occurrence of Sphacelia sorghi on grass hosts in Karnataka, India. Journal of Mycology and Plant Pathology, 38: 500– 503. Johnson, N., Rajasab, A. H. (2003): Prevalence of Claviceps sorghi on sorghum in Karnataka, India. International Sorghum and Millets Newsletter, 44: 93–95. Jurado, M., Vázquez, C., Callejas, C., González–Jaén, M. T. (2006): Occurrence and variability of mycotoxigenic Fusarium species associated to wheat and maize in the South of Spain. Mycotoxin Research, 22: 87–91. Kilpatrick, J. A., Chilvers, G. A. (1981): Variation in a natural population of Epicoccum purpurascens. Transactions of the British Mycological Society, 77: 497–508. Kim, Y. –T., Lee, Y. –R., Jin, J., Han, K. –H., Kim, H., Kim, J. –C., Lee, T., Yun, S. H., Lee, Y. –W. (2005): Two different polyketide synthase genes are required for synthesis of zearalenone in Gibberella zeae. Molecular Microbiology, 58: 1102– 1113. Kiraly, Z., Klement, Z., Solymosy, F., Voros, J. (1970): Methods in Plant Pathology. Ed. By Z. Kiraly, Academiai Kiado, Budapest, 237–477. 167 Kińgeci, J., Berenji, J., Pejin, D., Razmovski, R., Ruņić, N. (1988): Bio–alcohol production from sorghum and Jerusalem artichoke. CNRE Bulletin, 20: 113– 121. Kińgeci, J., Mijavec, A., Berenji, J. (1983): Growing sorghum on marginal lands as raw material for the production of fuel alcohol. CNRE Bulletin, 2: 26–29. Klaasen, J. A., Nelson, P. E. (1996): Identification of a mating population, Gibberella nygamai sp. nov., within the Fusarium nygamai anamorph. Mycologia, 88: 965– 969. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. (1992): Identification of a second mating population within the Fusarium moniliforme anamorph of Gibberella fujikuroi. Mycologia, 84: 541–547. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F., Nelson, P. E., Marasas, W. F. O. (1997): Fusarium thapsinum (Gibberella thapsina): A new species in section Liseola from sorghum. Mycologia, 89: 643–652. Kommedahl, T., Abbas, H. K., Burnes, P. M., Mirocha, C. J. (1988): Prevalence and toxygenicity of Fusarium species from soils of Norway near Arctic Circle. Mycologia, 80: 790–794. Konstantinova, P., Bonants, P. J. M., van Gent–Pelzer, M. P. E., van der Zouwen, P., van den Bulk, R. (2002): Development of specific primers for detection and identification of Alternaria spp. in carrot material by PCR and comparation with blotter and plating assays. Mycological Research, 106: 23–33. Kosiak, E. B., Holst–Jensen, A., Rundberget, T., Gonzalez Jaen, M. T., Torp, M. (2005): Morphological, chemical and molecular differentiation of Fusarium equiseti isolated from Norwegian cereals. International Journal of Food Microbiology, 99: 195–206. Kristensen, R., Torp, M., Kosiak, B., Holst–Jensen, A. (2005): Phylogeny and toxigenic potential is correlated in Fusarium species as revealed by partila translation elongation factor 1 alpha gene sequences. Mycological Research, 109: 173–186. Krnjaja, V., Lević, J., Tomić, Z., Neńić, Z., Stojanović, Lj., Trenkovski, S. (2007): Dynamics of incidence and frequency of populations of Fusarium species on stored maize grain. Biotehnology in Animal Husbandry, 23: 589–600. Kuhlman, E. G. (1982): Varieties of Gibberella fujikuroi with anamorphs in Fusarium section Liseola. Mycologia, 74: 759–768. Kunc, V., Bačvanski, S., Berenji, J., Čobić, T. (1991): Proizvodnja zelene mase kukuruza, krmnog sirka i sudanske trave u postrnoj setvi. Savremena poljoprivreda, 39: 41–44. 168 Kvas, M., Marasas, W. F. O., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J., Steenkamp, E. T. (2009): Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex. Fungal Diversity, 34: 1–21. Kwon, S. –I., van Dohlon, C. D., Anderson, A. J. (2001): Gene sequence analysis of an opportunistic wheat pathogen, an isolate of Fusarium proliferatum. Canadian Journal of Botany, 79: 1115–1121. Lacey, J., Bateman, G. L., Mirocha, C. J. (1999): Effects of infection time and moisture on development of ear blight and deoxynivalenol production by Fusarium spp. in wheat. Annals of Applied Biology, 134: 277–283. Lepoint, P. C. E., Munaut, F. T. J., Maraite, H. M. M. (2005): Gibberella xylarioides sensu lato from Coffea canephora: A new mating population in the Gibberella fujikuroi species complex. Applied and Environmental Microbiology, 71: 8466– 8471. Leslie, J. F. (1995): Gibberella fujikuroi: available populations and variable traits. Canadian Journal of Botany, 73: 282–291. Leslie, J. F. (1991): Mating populations in Gibberella fujikuroi (Fusarium section Liseola). Phytopaihology, 81: 1058–60. Leslie, J. F., Anderson, L. L., Bowden, R. L. and Lee, Y. W. (2007): Inter– and intra– specific genetic variation in Fusarium. International Journal of Food Microbiology, 119: 25–32. Leslie, J. F., Doe, F. J., Plattner, R. D., Shackelford, D. D., Jonz, J. (1992): Fumonisin B1 production and vegetative compatibility of strains from Gibberella fujikuroi mating population A (Fusarium moniliforme). Mycopathologia, 117: 37–45. Leslie, J. F., Marasas, W. F. O. (2002): Will the real “Fusarium moniliforme” please stand up! In „Sorghum and Millets Diseases‟. (Ed. Leslie, J. F). (Iowa State University Press: Ames, Iowa, USA), 201–209. Leslie, J. F., Pearson, C. A. S., Nelson, P. E., Toussoun, T. A. (1990): Fusarium species from corn, sorghum, and soybean fields in the central and eastern United States. Phytopathology, 80: 343–350. Leslie, J. F., Summerell, B. A. (2006): The Fusarium Laboratory Manual, 1 st edition. Blackwell Publishing, Ames, Iowa, USA, 1–369. Leslie, J. F., Zeller, K. A., Lamprecht, S. C., Rheeder, J. P., Marasas, W. F. O. (2005): Toxicity, pathogenicity, and genetic differentiation of five species of Fusarium from sorghum and millet. Phytopathology, 95: 275–283. Leslie, J. F., Zeller, K. A., Logrieco, A., Mulè, G., Moretti, A., Ritieni, A. (2004): Species diversity and toxin production by strains in the Gibberella fujikuroi 169 species complex isolated from native prairie grasses in Kansas. Applied and Environmental Microbiology, 70: 2254–2262. Leslie, J. F., Zeller, K. A., Summerell, B. A. (2001): Icebergs and species in populations of Fusarium. Physiological and Molecular Plant Pathology, 59: 107–117. Lević, J. (2008): Vrste roda Fusarium u oblasti poljoprivrede, veterinarske i humane medicine. Cicero, Beograd, 1226. Lević, J., Ivanović, D., Stanković, S. (2003): Paraziti kukuruza, sirka i prosa koji se prenose semenom. Biljni lekar, 6: 570–577. Lević, J., Kovačević, T., Stanković, S., Ivanović, D., Berenji, J. (2006): The first report on Fusarium thapsinum on sorghum grains in Serbia. In: Book of Abstracts, European Fusarium Seminar, Wageningen, The Nederlands, 19–22 September, 52. Lević, J., Kovačević, T., Vukojević, J., Stanković, S. (2008): Mikobiota semena sirka. in: Savetovanje o zańtiti bilja (IX), 24–28 novembar, Zlatibor, Zbornik rezimea, 48–49. Lević, J., Stanković, S., Bočarov–Stančić, A., Ńkrinjar, M., Mańić, Z. (2004): The Overview on Toxigenic Fungi and Mycotoxins in Serbia and Montenegro. In: An Overview on toxigenic fungi and mycotoxins in Europe, (Logrieco, A., Visconti, A. eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, 201–218. Lević, T. J., Stanković, Ņ. S., Krnjaja S. V., Bočarov–Stančić S. A. (2009): Fusarium species: The occurrence and the importance in agriculture of Serbia. Zbornik Matice srpske za prirodne nauke, 116: 33–48. Lieberman, T. W., Ferry, A. P., Bottone, E. J. (1979): Fusarium solani endophthalmitis without primary corneal involvement. American Journal of Ophthalmology, 88: 764–767. Little, C. R., Magill, C. W. (2004): Colonization of sorghum peduncles by Fusarium thapsinum and Curvularia lunata: Subsequent pigment accumulation. International Sorghum and Millets Newsletter, 45: 28–30. Logrieco, A., Moretti, A., Castella, G., Kostecki, M., Golinski, P., Ritieni, A., Chelkowski, J. (1998): Beauvericin production by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 64: 3084–3088. Logrieco, A., Mule, G., Moretti, A., Bottalico, A. (2002): Toxigenic Fusarium species and mycotoxins associated with maize ear rot in Europe. European Journal of Plant Pathology, 108: 597–609. 170 Maciá–Vicente, J. G., Jansson, H. B., Abdullah, S. K., Descals, E., Salinas, J., Lopez– Llorca, L. V. (2008): Fungal root endophytes from natural vegetation in Mediterranean environments with special reference to Fusarium spp. FEMS Microbiology Ecology, 64: 90–105. Maćko, V. (1995): Osetljivost sirka metlańa prema prouzrokovaču antraknoze. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 27/28: 5–108. Mansuetus, A. S. B., Odvody, G. N., Frederiksen, R. A., Leslie, J. F. (1997): Biological species in the Gibberella fujikuroi species complex (Fusarium section Liseola) recovered from sorghum in Tanzania. Mycological Research, 101: 815–820. Marasas, W. F. O. (2000): Fusarium mycotoxins in the third millennium. 42. The 6 th European Fusarium Seminar and Third COST 835 Workshop of Agriculturally Important Toxigenic Fungi. Berlin, Germany, 11–16 September 2000. Marasas,W. F. O., Rheeder, J. P., Lamprecht, S. C., Zeller, K. A., Leslie, J. F. (2001): Fusarium andiyazi sp. nov., a new species from sorghum. Mycologia, 93: 1203– 1210. Marín, P., Moretti, A ., Ritieni, A ., Jurado, M., Vázquez , C., González–Jaén, M. T. (2012): Phylogenetic analyses and toxigenic profiles of Fusarium equiseti and Fusarium acuminatum isolated from cereals from Southern Europe. Food Microbiology, 31: 229–237. Marín, S., Ramos, A. J., Vázquez, C., Sanchis, V. (2007): Contamination of pine nuts by fumonisin produced by strains of Fusarium proliferatum isolated from Pinus pinea. Letters in Applied Microbiology, 44: 68–72. Martinelli, J., Bocchese, C., Rosewich Gale, L., Xie, W., O‟Donnell, K., Kistler, H. C. (2001): Soybean is a host for Fusarium graminearum [online]. In 2001 National Fusarium Head Blight Forum Proceedings. 8–10 December 2001, Holiday Inn Cincinnati–Airport, Erlanger, Ky. Compiled by S.M. Canty, J. Lewis, L. Siler, and R.Ward, Michigan State University, East Lansing, Mich. Organized by US Wheat and Barley Scab Initiative. Printed by Kinko‟s, Okemos, Mich. Available from http://www.scabusa.org/pdfs/forum_01_proc.pdf [accessed October 2004], 136. Martinović, M. (1969): Fusarium roseum (L.K) Snyder et Hansen – parazit sirka (Sorghum technicus Körn). Poljoprivreda, 5: 53–59. McGee, D.C. (1988): Maize diseases. A reference source for seed technologists. St. Paul, Minnesota, USA; APS Press, 149. McMullen, M., Jones, R., Gallenberg, D. (1997): Scab od wheat and barley: A reemerging disease of devastating impact. Plant Disease, 81: 1340–1348. 171 Mesiaen, C. M., Lafon, R., Molot, P. (1959): Necroses de racines, purritures de tiges et verse parasitaire du mais. Annals Epiphyties, 4: 441–471. Mijavec, A. (1993): Proučavanje otpornosti genotipova sirka prema virusu mozaične krņljavosti kukuruza. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 25/26: 7–111. Mijavec, A., Tońić, M., Berenji, J. (1991): Breeding of broomcorn for resistance to MDMV. 6 th Conference on virus diseases of Gramineae in Europe, Torino 19. Mims, C. W., Richardson, E. A. (2005): Ultrastructure of sporodochium and conidium development in the anamorphic fungus Epicoccum nigrum. Canadian Journal of Botany, 83: 1354−1363. Mirhendi, H., Ghiasian, A., Vismer, H. F., Asgary, M. R., Jalalizand, N., Arendrup, M. C., Makimura, K. (2010): Preliminary Identification and Typing of Pathogenic and Toxigenic Fusarium Species Using Restriction Digestion of ITS1−5.8S rDNA−ITS2 Region. Iranian Journal of Public Health, 39: 35−44. Moretti, A. N. (2009): Taxonomy of Fusarium genus, a continuous fight between lumpers and splitters. Zbornik Matice srpske za prirodne nauke, 117: 7–13. Mughogho, L. K., Pande, S. (1983): Charcoal rot of sorghum. In L. K. Mughogho and G. Rosenberg, eds. Sorghum root and stalk rots. Acritical review. Patancheru, India: International Crop Research Institute for the Semi–Arid Tropics, 11–24. Mughogho, L. K., Pande, S., (1984): Charcoal rot of sorghum. In: Mughogho, L. K. (Ed.), Sorghum Root and Stalk Rots: A Critical Review. Proceedings of the Consultative Group discussion on Research needs and Strategies for Control of Root and Stalk rot Diseases. ICRISAT, Bellagio, Italy/Patancheru, India, 11–24. Mulé, G., Susca, A., Stea, G., Moretti, A. (2004): A species-specific PCR assay based on the calmodulin partial gene for identification of Fusarium verticillioides, F. proliferatum and F. subglutinans. European Journal of Plant Pathology, 110: 495–502. Muntanola–Cvetković, M. (1987): Opńta mikologija, Niro Knjiņevne novine, Beograd, 13–320. Muthusubramanian, V., Bandyopadhyay, R., Rajaram Reddy, D., Tooley, P. W. (2006): Cultural characteristics, morphology, and variation within Claviceps africana and C. sorghi from India. Mycological Research, 110: 452–464. Nalim, F. A., Elmer, W. H., McGovern, R. J., Geiser, D. M. (2009): Multilocus phylogenetic diversity of Fusarium avenaceum pathogenic on lisianthus. Phytopathology, 99: 462–468. Nastasić, A., Stojaković, M., Jocković, Đ., Bekavac, G., Vasić, N., Petrović, Z. (2001): Ef fect of S1 re cur rent se lec tion on the occurence of stalk, ear and root rot 172 (Fusarium graminearum) in the sznthetic corn pop u la tion NSB. Genetika, 32: 181–188. Navi, S. S., Bandyopadhyay, R., Hall, A. J., Bramel–Cox, P. J. (1999): A pictorial guide for the identification of mold fungi on sorghum grain. Information Bulletin no. 59 (In En. Summaries in En, Fr). Patancheru 502 324, Andhra Pradesh, India: International Crops Research Institute for the Semi–Arid Tropics. 118 pp. ISBN 92–9066–416–9. Order code IBE 059. Nelson, P. E. (1991): History of Fusarium systematics. Phytopathology, 81: 1045–1051. Nelson, P. E., Toussoun, T. A., Marasas, W. F. O. (1983): Fusarium species: an illustrated manual for identification. The Pennsylvania State Univ., Press, University Park. Nirenberg, H. I. (1976): Untersuchungen über die morphologische und biologische Differenzierung in der Fusarium Sektion Liseola. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt Für Land– und Forstwirtschaft (Berlin – Dahlem), 169: 1–117. Nirenberg, H. I., O‟Donnell, K. (1998): New Fusarium species and combinations within the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 90: 434–458. Nitschke, E., Nihlgard, M., Varrelmann, M. (2009): Differentiation of eleven Fusarium spp. isolated from sugar beet, using restriction fragment analysis of a polymerase chain reaction–amplified translation elongation factor 1 alpha gene fragment. Phytopathology, 99: 921–929. O‟Donnell, K., Cigelnik, E. (1997): Two divergent intragenomic rDNA ITS2 types within a monophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonorthologous. Molecular Phylogenetics and Evolution, 7: 103–116. O‟Donnell, K., Cigelnik, E., Casper, H. H. (1998b): Molecular phylogenetic, morphological, and mycotoxin data support reidentification of the Quorn mycoprotein fungus as Fusarium venenatum. Fungal Genetics and Biology, 23: 57–67. O‟Donnell, K., Cigelnik, E., Nirenberg, H. I. (1998a): Molecular systematics and phylogeography of the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 90: 465–493. O‟Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelink, E., Ploetz, R. C. (1998c): Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Science USA, 95: 2044–2049. O‟Donnell, K., Kistler, H. C., Tacke, B. K. Caspar, H. H. (2000b): Gene genealogies reveal global phylogeographic structure and reproductive isolation among 173 lineages of Fusarium graminearum, the fungus causing wheat scab. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97: 7905– 7910. O‟Donnell, K., Nirenberg, H. I., Aoki, T., Cigelnik, E. (2000a): A multigene phylogeny of the Gibberella fujikuroi species complex: Detection of additional phylogenetically distinct species. Mycoscience, 41: 61–78. O‟Donnell, K., Sutton, D. A., Rinaldi, M. G., Gueidan, C., Crous, O. W., Geiser, D. M. (2009): Novel multilocus sequence typing scheme reveals high genetic diversity of human pathogenic members of the Fusarium incarnatum–F. equiseti and F. chlamydosporum species complexes within the United States. Journal of Clinical Microbiology, 47: 3851–3861. O‟Donnell, K., Sutton, D. A., Rinaldi, M. G., Sarver, B. A., Balajee, S. A., Schroers, H. J., Summerbell, R. C., Robert, V. A., Crous, P. W., Zhang, N., Aoki, T., Jung, K., Park, J., Lee, Y. H., Kang, S., Park, B., Geiser, D. M. (2010): An internet– accessible DNA sequence database for identifying Fusaria from human and animal infections. Journal of Clinical Microbiology, 48: 3708–3718. O‟Donnell, K., Ward, T. J., Aberra, D., Kistler, H. C., Aoki T., Orwig, N., Kimura, M., Bjonnstad, A., Klemsdal, S. S. (2008): Multilocus genotyping and molecular phylogenetics resolve a novel head blight pathogen within the Fusarium graminearum species complex from Ethiopia. Fungal Genetics and Biology, 45: 1514–1522. O‟Donnell, K., Ward, T. J., Geiser, D. M., Kistler, C. H., Aoki, T. (2004): Genealogical concordance between the mating type locus and seven other nuclear genes supports formal recognition of nine phylogenetically distinct species within the Fusarium graminearum clade. Fungal Genetics and Biology, 41: 600–623. O'Donnell, K. (2000): Molecular phylogeny of the Nectria haematococca–Fusarium solani species complex. Mycologia, 92: 919–938. Onyike, N. B. N., Nelson, P. E. (1992): Fusarium species associated with sorghum grain from Nigeria, Lesotho and Zimbabwe. Mycologia, 84: 452–458. Panić, M., Arsenijević, M. (1966): Contribution to the study of Pseudomonas syringae van Hall as a parasite of Sorghum spp. in Yugoslavia. Prilog proučavnju Pseudomonas syringae van Hall kao parazita Sorghum spp. u Jugoslaviji. Arhiv za poljoprivredne nauke, Beograd, 64: 151–166. Parry, D. W., Pettitt, T. R., Jenkinson, P., Lees, A. K. (1994): The cereal Fusarium complex. In: Blakeman, J. P., Williamson, B. (eds) Ecology of Plant Pathogens CAB International, Wallingford, U.K., 301–320. Parry, D.W., Jenkinson, P., McLeod, L. (1995): Fusarium ear blight (scab) in small grains–a review. Plant Pathology, 44: 207–238. 174 Paulitz, T. C. (1996): Diurnal release of ascospores by Gibberella zeae in inoculated wheat plots. Plant Disease, 80: 674–678. Paņoutová, S., Bogo, A. (2001): Rediscovery of Claviceps sorghi (Ascomycotina: Clavicipitaceae) in India. Mycopathologia, 153: 99–101. Paņoutová, S., Kolínská, R. (2003): Relationship of Cerebella to Epicoccum and their closest relatives among Dothideales. Czech Mycology, 54: 155–160. Penčić, V., Lević, J. (1994): Pregled identifikovanih gljiva na semenu i zrnu kukuruza u Jugoslaviji. Selekcija i semenarstvo, 1: 173–177. Petrović, T., Walsh, J. L., Burgess, L. W., Summerell, B. A. (2009): Fusarium species associated with stalk rot of grain sorghum in the northern grain belt of eastern Australia. Australasian Plant Pathology, 38: 373–379. Pettitt, T., Xu, X., Parry, D. (2003): Association of Fusarium species in the wheat stem rot complex. European Journal of Plant Pathology, 109: 769–774. Pitt, J. I., Hocking, A. D. (1997): Fungi and food spoilage. Second edition, Published by Blackie Academic and Professional. Gjertsen, P., Trolle B., and Anderson, K. (1963). Journal of the Institute of Brewing, 291. Pitt, J. I., Hocking, A. D. (2009): Fungy and Food Spoilage, 3rd Edition. Dordrecht, Springer, 1–519. Pitt, J. I., Hocking, A. D., Miscamble, B. F., Dharmaputra, O. S., Kuswanto, K. R., Rahayu, E. S., Sardjono (1998): The mycoflora of food commodities from Indonesia. Journal of Food Microbiology, 1: 41–60. Porter, J. K., Bacon, C. W., Norred, W. P., Wray, E. M., Kuldau, G. A., Glenn, A. E., Leslie, J. F. (2002): Mycotoxins from fungal–infected sorghum: Claviceps vs. Fusarium and the Striga connection. In J. F. Leslie (ed.), Sorghum and Millets Pathology. Iowa State Press, Ames, Iowa, 229–235. Porter, J. K., Bacon, C. W., Wray, E. M., Kuldau, G. A., Leslie, J. F. (2000): Fusaric acid (FA), other alkylpyridinecarboxylic acids (APAs), and fumonisin (FB1) by Fusarium thapsinum and F. moniliforme: GC/MS analysis. In W. J. de Koe, R. A. Samson, H. P. van Egmond, J. Gilbert, and M. Sabino (eds.), Mycotoxins and Phycotoxins in Perspective at the Turn of the Millennium. W. J. de Koe, Wageningen, The Netherlands, 41–47. Prom, L. K., Waniska, R. D., Kollo, A. I., Rooney, W. L. (2003): Response of eight sorghum cultivars inoculated with Fusarium thapsinum, Curvularia lunata, and a mixture of the two fungi. Crop Protection, 22: 623–628. 175 Purss, G., S. (1969): The relationship between strains of Fusarium graminearum Schwabe causing crown rot of various gramineous hosts and stalk rot of maize in Queensland. Australian Journal of Agricultural Research, 20: 257–264. Purss, G., S. (1971): Pathogenic specialization in Fusarium graminearum. Australian Journal of Agricultural Research, 22: 553–561. Rahjoo, V., Zad, J., Javan–Nikkhah, M., Mirzadi Gohari, A., Okhovvat, S. M., Bihamta, M. R., Razzaghian, J., Klemsdal, S. S. (2008): Morphological and molecular identification of Fusarium isolated from maize ears in Iran. Journal of Plant Pathology, 90: 463–468. Ristić, D., Vučurović, A., Stanković, I., Nikolić, D., Berenji, J., Krstić, B., Bulajić, A. (2011): Molekularna identifikacija izolata Fusarium graminearum, patogena sirka u Srbiji. Ratarstvo i povrtarstvo, 48: 347–352. Rooney, W. L., Smith, C. W. (2000): Techniques for developing new cultivars. In: Smith, C. W., Frederiksen, R. A. (eds), Sorghum: Origin, History, Technology, and Production. John Wiley & Sons Inc., New York, 689–729. Rossman, A. Y., Samuels, G. J., Rogerson, C. T., Lowen, R. (1999): Genera of Bionectriaceae, Hypocreaceae, and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes). Studies in Mycology, 42: 1–248. Ryley, M. J., Persley, D. M., Jordan, D. R., Henzell, R. G. (2002): Status of sorghum and pearl millet diseases in Australia. In „Sorghum and Millets Diseases‟. (Ed. Leslie, J. F.). (Iowa State University Press: Ames, Iowa, USA), 441–448. Sampietro, D. A., Marín, P., Iglesias, J., Presello, D. A., Vattuone, M. A., Catalan, C. A. N., Gonzalez Jaen, M. T. (2010): A molecular based strategy for rapid diagnosis of toxigenic Fusarium species associated to cereal grains from Argentina. Fungal Biology, 114: 74–81. Samuels, G. J., Nirenberg, H. I., Seifert, K. A. (2001): Perithecial species of Fusarium. In: Summerell, B. A., Leslie, J. F., Backhouse, D., Bryden, W. L., Burgess, L. W. (eds). Fusarium: Paul E. Nelson memorial symposium. St. Paul, Minnesota: APS Press, 1–14. Sangalang, A. E., Burgess, L. W., Backhouse, D., Duff, J., Wurst, M. (1995): Micogeography of Fusarium species in soils from tropic, arid and mediterranean regions of Australia. Mycological Research, 99: 523–528. Schilling, A. G., Moller, E. M., Geiger, H. H. (1996): Polymerase chain reaction–based assays for species-specific detection of Fusarium culmorum, F. graminearum, and F. avenaceum. Phytopathology, 86: 515–522. 176 Schmale, D. G., III, Leslie, J. F., Zeller, K. A., Saleh, A. A., Shields, E. J., Bergstrom, G. C. (2006): Genetic structure of Atmospheric populations of Gibberella zeae. Phytopathology 96: 1021–1026. Schmale, D. G., Shah, A. A., Bergstrom, G. C. (2005): Spatial patterns of viable spore depositions of Gibberella zeae in wheat fields. Phytopathology, 95: 472–479. Schmale, D. G., Shields, E. J., Bergstrom, G. C. (2002): Airborne populations of Gibberella zeae: spatial and temporal dynamics of spore deposition in a localized fusarium head blight epidemic [online]. In 2002 National Fusarium Head Blight Forum Proceedings. 7–9 December 2002, Holiday Inn CincinnatiAirport, Erlanger, Ky. Compiled by S.M. Canty, J. Lewis, L. Siler, and R. Ward, Michigan State University, East Lansing, Mich. Organized by US Wheat and Barley Scab Initiative. Printed by Kinko‟s, Okemos, Mich. Available from http:// www.scabusa.org/pdfs/forum_02_proc.pdf [accessed October 2004], 178. Schol–Schwarz, M. B. (1959): The genus Epicoccum Link. Transactions of the British Mycological Society, 42: 149–173. Scott, J. B., Chakraborty, S. (2006): Multilocus sequence analysis of Fusarium pseudograminearum reveals a single phylogenetic species. Mycological Research, 110: 1413–1425. Seefelder, W., Gossmann, M., Humpf, H. U. (2002): Analysis of fumonisin B1 in Fusarium proliferatum–infected asparagus spears and garlic bulbs from Germany by liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 2778–2781. Seifert, K. A. (1995): Notes on the typification of Gibberella zeae. Sydowia, 48: 83–89. Seifert, K. A., Lévesque, C. A. (2004): Phylogeny and molecular diagnosis of mycotoxigenic fungi. European Journal of Plant Pathology, 110: 449–471. Shukla, A., Sharma, R. L. (2000): Incidence of soft rot of bell pepper in Himachal Pradesh. Journal of Mycology and Plant Pathology, 30:107–109. Sikora, V. (2005): Varijabilnost germplazme sirka metlańa. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje, 37: 6−99. Sikora, V. (2006): Varijabilnost germplazme sirka metlańa. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje 38: 6−105. Sikora, V., Berenji, J. (2005): Perspektiva gajenja sirka za zrno u nas. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, 41: 451−458. 177 Sikora, V., Berenji, J. (2006): Variability in germplasm of broomcorn. XX International Conference of the EUCARPIA Maize and sorghum section, Budapest, Hungary, 119. Sikora, V., Berenji, J. (2007): Formiranje jezgra kolekcije sirka metlańa. Bilten za hmelj, sirak i lekovito bilje 39: 5−15. Sikora, V., Berenji, J. (2010): Razvoj sortimenta sirka metlańa u Institutu za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad. Ratarstvo i Povrtarstvo / Field and Vegetable Crops Research, 47: 363−369. Sikora, V., Berenji, J. (2011): Sirak za zrno i sirak metlań kao alternativne kulture. Zbornik referata, 45 Savetovanje agronoma Srbije, 30.01−05.02.2011. Zlatibor, 171−180. Singh, K., Frisvad, J. C., Thrane, U., Mather, S. B. (1991): An Illustrated Manual on Identification of Some Seed−borne Aspergillus, Fusaria, Penicillium and their mycotoxins. Jordbugsforlaget Frederiksberg, Denmark, 133. Singh, S. D., Navi, S. S. (2001): An in vitro screening technique for the identification of grain mold resistance in sorghum. Indian Phytopathology, 54: 35–39. Stanković, S., Lević, J., Petrović, T., Logrieco, A., Moretti, A. (2007): Pathogenicity and mycotoxin production by Fusarium proliferatum isolated from onion and garlic in Serbia. European Journal of Plant Pathology, 118: 165–172. Stanković, S., Lević, J., Tančić, S., Kovačević, T., Bočarov–Stančić, A. (2006): Učestalost toksikogenih vrsta roda Fusarium i fuzariotoksina u zrnu pńenice. Zbornik rezimea III simpozijuma o zańtiti bilja u BiH, Neum, BiH, 64–65. Starčević, Lj., Berenji, J. (1994): Mesto i uloga prosolikih ņita u proizvodnji hrane. Savremena poljoprivreda, 42: 7–11. Starkey, D. E., Ward, T. J., Aoki, T., Gale, L. R., Kistler, C. H., Geiser, D. M., Suga, H., Toth, Beata, Varga, J., O´Donnell, K. (2007): Global molecular surveillance reveals noves Fusarium head blight species and trichothecene toxin diversity. Fungal genetics and biology, 44: 1191–1204. Steenkamp, E. T., Wingfield, B. D., Coutinho, T. A, Wingfield, M. J., Marasas, W. F. O. (1999): Differentiation of Fusarium subglutinans f. sp. pini by histone gene sequence data. Applied and Environmental Microbiology, 65: 3401–3406. Steenkamp, E. T., Wingfield, B. D., Coutinho, T. A., Zeller, K. A., Wingfield, M. J., Marasas, W. F. O., Leslie, J. F. (2000): PCR-based identification of MAT–1 and MAT–2 in the Gibberella fujikuroi species complex. Applied and Environmental Microbiology, 66: 4378–4382. 178 Stępień, Ł., Gromadzka, K., Chełkowski, J. (2012): Polymorphism of mycotoxin biosynthetic genes among Fusarium equiseti isolates from Italy and Poland. Journal of Applied Genetics, 53: 227–236. Summerell, B. A., Leslie, J. F. (2011): Fifty years of Fusarium: how were 9 species ever enough? Fungal Diversity, 50: 135–144. Summerell, B. A., Salleh, B., Leslie, J. F. (2003): A utilitarian approach to Fusarium identification. Plant Disease, 87: 117–128. Sutton, J. (1982): Epidemiology of wheat head blight and maize ear rot caused by Fusarium graminearum. Canadian Journal of Plant Pathology, 4: 195–209. Takamatsu, S., Kano, Y. (2001): PCR primers useful for nucleotide sequencing of rDNA of the powdery mildew fungi. Mycoscience, 42: 135–139. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., Kumar, S. (2011): MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, 28: 2731–2739. Tančić, S., Stanković, S., Lević, J. (2009): Varijabilnost patogenih svojstava Fusarium spp. poreklom iz zrna kukuruza i pńenice. Pesticidi i fitomedicina, 24: 259–269. Taylor, J. W., Jacobson, D. J., Kroken, S., Kasuga, T., Geiser, D. M., Hibbett, D. S., Fisher, M. C. (2000): Phylogenetic species recognition and species concepts in Fungi. Fungal Genetics and Biology, 31: 21–31. Tesso, T., Claflin, L. E., Tuinstra, M. R. (2004): Estimation of combining ability for resistance to Fusarium stalk rot in grain sorghum. Crop Science, 44: 1195–1199. Tesso, T., Ochanda, N., Little, C. R., Claflin, L. E., Tuinstra, M. R. (2010): Analysis of host plant resistance to multiple Fusarium species associated with stalk rot disease in sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench]. Field Crops Research, 118: 177–182. Thompson, J., Higgins, D., Gibson, T. (1994): ClustalW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position– specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4690. Toit, L. J., Inglis, D. A., Pelter, G. Q. (2003): Fusarium proliferatum pathogenic on onion bulbs in Washington. Plant Disease, 87: 750. Toler, R. W. (1985): Maize dwarf mosaic, the most important virus disease of sorghum. Plant Disease, 69: 1011–1015. 179 Toler, R. W., Giorda, L. M. (1992): Detection and identification of viruses and virus diseases of sorghum. In: Sorghum and millets diseases, a second world review. Ed.: de Milliano, W. A. J., Frederiksen, R. A. and Bengston, G. D. ICRISAT, Patancheru, Andhra Pradesh, India, 153–159. Tooley, P. W., Bandyopadhyay, R., Carras, M. M., Paņoutová, S. (2006): Analysis of Claviceps africana and C. sorgi from India using AFLPs, EF–1a gene intron 4, and b-tubulin gene intron 3. Mycological Research, 110: 441–451. Tooley, P. W., Carras, M. M., Sechler, A., Rajasab, A. H. (2010): Real–time PCR Detection of Sorghum Ergot Pathogens Claviceps africana, Claviceps sorghi and Claviceps sorghicola. Journal of Phytopathology, 158: 698–704. Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. (2002): Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Mycologia, 94: 181–189. Tripathi, M. N., Shukla, D. N., Dwivedi, B. K. (1999): Effect of aqueous extracts of leaves of some medicinal plants on spore germination of Fusarium spp. Bioved, 10: 43–44. Tschanz, A. T., Horst, R. K., Nelson, P. E. (1976): The effect of environment on sexual reproduction of Gibberella zeae. Mycologia, 68: 327–340. Tsukiboshi, T., Shimanuki, T., Uematsu, T. (1999): Claviceps sorghicola sp. nov., a destructive ergot pathogen of sorghum in Japan. Mycological Research, 103: 1403–1408. Tuite, J. (1969): Plant pathological methods. Fungi and Bacteria. Burgess Publishing Company, Minneapolis, MN, 239. United States Department of Agriculture National Agricultural Statistics Service (2011): USDA–NASS Quick Stats. http://quickstats.nass.usda.gov/ (accessed June 23, 2011). USDA (2009): United States Department of Agriculture), World Agricultural Production. Available:http://ffas.usda.gov/wap/circular/2008/08–09/toc.asp [30 September 2009]. Vesonder, R. F., Golinski, P. (1989): Metabolites of Fusarium. 1–39. Chelkowski, J. (ed.), Fusarium – Mycotoxins, Taxonomy and Pathogenicity. Elsevier, Amsterdam–Oxford–New York–Tokyo, 492. Vilmoń, M. (1991): Osetljivost sirka Sorghum bicolor (L.) Moench. prema prouzrokovaču antraknoze Colletotrichum graminicola (Ces.) Doktorska disertacija. Univerzitet, Novi Sad. 180 Vogelgslang, S., Widmer, F., Jenny, E., Enkerli, J. (2009): Characterization of novel Fusarium graminearum microsatelite markers in different Fusarium species from various countries. European Journal of Plant Pathology, 123: 477–482. Waalwijk, C., de Koning, J. R. A., Baayen, R. P., Gams, W. (1996): Discordant groupings of Fusarium spp. from Elegans, Liseola and Dlaminia based on ribosomal ITS1 and ITS2 sequences. Mycologia, 88: 361–368. Waalwijk, C., Kastelein, P., de Vries, I., Kerenyi, Z., van der Lee, T., Hesselink, T., Kohl, J., Kema, G. (2003): Major changes in Fusarium spp. in wheat in the Netherlands. European Journal of Plant Pathology, 109: 743–754. Walsh, J. L., Laurence, M. H., Liew, E. C. Y., Sangalang, A. E., Burgess, L. W., Summerell, B. A., Petrovic, T. (2010): Fusarium: two endophytic novel species from tropical grasses of northern Australia. Fungal Diversity, 44: 149–159. Wang, Y., Guo, L. D. (2004): Morphological and molecular identification of an endophytic fungus Epicoccum nigrum. Mycosystema, 23: 474–479. Ward, T. J., Bielawski, J. P., Kistler, H. C., Sullivan, E., O‟Donnell, K. (2002): Ancestral polymorphism and adaptive evolution in the trichothecene mycotoxin gene cluster of phytopathogenic Fusarium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99: 9278–9283. White, T. J., Bruns, T. D., Lee, S., Taylor, J. (1990): Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. In: PCR Protocols: A guide to methods and application. Eds., Innis, M. A., Gelfrand, D. H., Sninsky, J. J. and White, T. J. Academic Press, San Diego, California, 315– 322. Windels, C. E. (1992): Fusarium. In Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. Singleton, L. L., Mihail, J. D., Rush, C. M. (eds.) APS Press, St. Paul, MN. 115–128. Windels, C. E. (2000): Economic and social impacts of Fusarium head blight: Changing farms and rural communities in the northern Great Plains. Phytopathology, 90: 17–21. Wiśniewska, H., Perkowski, J., Kaczmarek, Z. (2004): Scab response and deoxynivalenol accumulation in spring wheat kernels of different geographical origins following inoculation with Fusarium culmorum. Journal of Phytopathology, 152: 613–621. Wollenweber, H. W., Reinking, O. A. (1935): Die Fusarien, ihre Beschreibung, Schadwirkung und Bekámpfung. Berlin: Paul Parey, 355. Worker, G. F., Marble, V. L. (1968): Comparisons of growth stages of sorghum forage types as to yield and chemical compositions. Agronomy Journal, 60: 669. 181 Yassin, M. A., El–Samawaty, A. R., Bahkali, A., Moslem, M., Abd–Elsalam, K. A., Hyde, K. D. (2010): Mycotoxin–producing fungi occurring in sorghum grains from Saudi Arabia. Fungal Diversity, 44: 45–52. Yli–Mattila, T., Gagkaeva, T., Ward, J. T., Aoki, T., Kistler, H. C., O‟Donnell, K. (2009): A novel Asian clade within the Fusarium graminearum species complex includes a newly discovered cereal head blight pathogen from the Russian Far East. Mycologia, 101: 841–852. Yli–Mattila, T., Paavanen–Huhtala, S., Parikka, P., Konstantinova, P., Gagkaeva, T. (2004): Molecular and morphological diversity of Fusarium species in Finland and northwestern Russia. European Journal of Plant Pathology, 110: 573–585. Zapater, R. C., Arrechea, A. (1975): Mycotic keratitis by Fusarium. A review and report two cases. Ophthalmologica, 170: 1–12. Zeller, K. A., Bowden, R. L., Leslie, J. F. (2004): Population differentiation and recombination in wheat scab populations of Gibberella zeae from United States. Molecular Ecology, 13: 563–571. Zeller, K. A., Geiser, D. M. (2003): Molecular identification of Fusarium. KSU Laboratory Workshop on Fusarium, Kansas Sate University Manhatten, KS, USA, June 22–27. Zeller, K. A., Summerell, B. A., Bullock, S., Leslie, J. F. (2003): Gibberella fujikuroi (Fusarium konzum) sp. nov. from prairie grasses, a new species in the Gibberella fujikuroi species complex. Mycologia, 95: 943–954. BIOGRAFIJA Ristić Danijela roĎena je 15. avgusta 1977. godine u Trsteniku. Osnovnu ńkolu zavrńila je u MedveĎi, a Hemijsko–tehnolońku ńkolu u Kruńevcu. Poljoprivredni fakultet, Odsek za zańtitu bilja i prehrambenih proizvoda, Univerziteta u Beogradu zavrńila je 2004. godine. Odbranila je diplopmski rad pod nazivom: „Efikasnost novijih fungicida u suzbijanju Uncinula necator (Schw.) Burr., prouzrokovača pepelnice vinove loze”. Poslediplomske studije na istom fakultetu, na grupi Fitopatologija, upisala je 2005/06, a magistarski rad pod nazivom: „Proučavanje kompleksa čaĎave mrljavosti i tačkaste zonalne pegavosti plodova jabuke u Srbiji”, odbranila je 2009. godine. Na Institutu za zańtitu bilja i ņivotnu sredinu u Beogradu 16.03.2012. izabrana je u zvanje istraņivač–saradnik. Član je Druńtva za zańtitu bilja Srbije, Srpskog mikrobiolońkog druńtva i Druńtva virusologa Srbije. Do sada je objavila i saopńtila ukupno 40 naučnih radova, od čega 12 objavljenih u meĎunarodnim časopisima, 8 u nacionalnim časopisima, 19 saopńtenih na meĎunarodnim i domaćim skupovima, a jedan literaturni navod je magistarski rad. Prilog 1. Sekvence ITS regiona rDNK, proteinskih gena (TEF−1α, β−tubulin i calmodulin) i mtSSU rDNK vrsta kompleksa G. fujikuroi korińćene za filogenetske analize Vrsta Domaćin Poreklo Kolekcijaa GenBank pristupni broj b ITS TEF−1α β−tubulin calmodulin mtSSU F. acutatum / Indija NRRL 13308 1 U34573 3 AF160276 2 U34431 3 AF158329 2 U34515 F. anthophilum Hippeastrum sp. Nemačka NRRL 13602 2U61671 3AF160292 2U61541 3AF158345 2U61593 F. bactridioides Cronartium conigenum SAD NRRL 20476 1 U34576 3 AF160290 2 U34434 3 AF158343 2 U34518 F. begoniae Begonia elatior Nemačka NRRL 25300 2U61673 3AF160293 2U61543 3AF158346 2U61595 F. brevicatenulatum Striga asiatica Madagaskar NRRL 25446 2 U61675 3 AF160265 2 U61545 3 AF158318 2 U61597 F. bulbicola Nerine bowdenii Holandija NRRL 13618 2 U61676 3 AF160294 2 U61546 3 AF158347 2 U61598 F. circinatum Pinus radiata SAD NRRL 25331 2 U61677 3 AF160295 2 U61547 2 AF158348 2 U61599 F. concentricum Musa sapientium Kostarika NRRL 25181 2 U61678 3 AF160282 2 U61548 3 AF158335 2 U61600 F. denticulatum Ipomoea batatas SAD NRRL 25302 2 U61680 3 AF160269 2 U61550 3 AF158322 2 U61602 F. dlaminii Zea mays Juņna Afrika NRRL 13164 1U34572 3AF160277 2U34430 / 2U34514 F. fujikuroi Oryza sativa Tajvan NRRL 13566 1 U34557 3 AF160279 2 U34415 3 AF158332 2 U34499 F. guttiforme Ananas comosus Engleska NRRL 22945 1 U34562 3 AF160297 2 U34420 3 AF158350 2 U34504 F. globosum Zea mays Juņna Afrika NRRL 26131 / 3AF160285 2U61557 3AF158338 2U61609 F. inflexum Vicia faba Nemačka NRRL 20433 1U34577 3AF008479 2U34435 3AF158366 2U34519 F. lactis Ficus carica SAD NRRL 25200 2 U61681 3 AF160272 2 U61551 3 AF158325 2 U61603 F. napiforme Pennisetum typhoides Juņna Afrika NRRL 13604 1U34570 3AF160266 2U34428 3AF158319 2U34512 F. nygamai Sorghum bicolor Australija NRRL 13488 1 U34568 3 AF160273 2 U34426 3 AF158326 2 U34510 F. oxysporum Pseudotsuga menziesii SAD NRRL 22902 1 U34566 3 AF160312 2 U34424 3 AF158365 2 U34508 F. phyllophilum Dracaena deremensis Italija NRRL 13617 1 U34574 3 AF160274 2 U34432 3 AF158327 2 U34516 F. proliferatum Cattleya sp. Nemačka NRRL 22944 1U34558 3AF160280 2U34416 3AF158333 2U34500 F. pseudoanthophilum Z. mays Zimbabve NRRL 25206 2 U61683 3 AF160264 2 U61553 / 2 U61605 F. pseudocircinatum Solanum sp. Gana NRRL 22946 1 U34569 3 AF160271 2 U34427 3 AF158324 2 U34511 F. pseudonygamai Pennisetum typhoides Nigerija NRRL 13592 1 U34563 3 AF160263 2 U34421 3 AF158316 2 U34505 F. ramigenum Ficus carica SAD NRRL 25208 2 U61684 3 AF160267 2 U61554 3 AF158320 2 U61606 Fusarium sp. drvo Venecuela NRRL 25195 2 U61688 3 AF160298 2 U61558 3 AF158351 2 U61610 Fusarium sp. palma Venecuela NRRL 25204 2 U61689 3 AF160299 2 U61559 3 AF158352 2 U61611 Fusarium sp. Z. mays Zimbabve NRRL 25221 2 U61690 3 AF160268 2 U61560 3 AF158321 2 U61612 Fusarium sp. Mangifera indica Indija NRRL 25226 2 U61691 3 AF160281 2 U61561 3 AF158334 2 U61613 Fusarium sp. O. sativa Japan NRRL 25303 2 U61692 3 AF160283 2 U61562 3 AF158336 2 U61614 Fusarium sp. Triticum aestivum Japan NRRL 25309 2 U61693 3 AF160284 2 U61563 3 AF158337 2 U61615 Fusarium sp. Ipomoea batatas Peru NRRL 25346 2 U61694 3 AF160296 2 U61564 3 AF158349 2 U61616 Fusarium sp. O. sativa Nigerija NRRL 25615 3 AF158308 3 AF160304 3 AF160320 3 AF158357 3 AF158295 Fusarium sp. Z. mays Juņna Afrika NRRL 25622 3AF158306 3AF160301 3AF160317 3AF158354 3AF158292 Fusarium sp. mango Juņna Afrika NRRL 25623 3AF158305 3AF160300 3AF160316 3AF158353 3AF158291 Fusarium sp. ńumsko zemljińte Australija NRRL 25807 2U61672 3AF160305 2U61542 3AF158358 2U61594 Fusarium sp. Striga hermonthica Madagaskar NRRL 26061 / 3 AF160303 3 AF160319 / 3 AF158294 Fusarium sp. S. bicolor Tanzanija NRRL 26064 3 AF158307 3 AF160302 3 AF160318 3 AF158355 3 AF158293 Fusarium sp. Striga hermonthica Nigerija NRRL 26152 3 AF158309 3 AF160306 3 AF160321 / 3 AF158296 Fusarium sp. ńumsko zemljińte Nova Gvineja NRRL 26427 3AF158302 3AF160286 3AF160313 3AF158339 3AF158288 Fusarium sp. ukrasna trava Juņna Afrika NRRL 26756 3AF158310 3AF160307 3AF160322 3AF158360 3AF158297 Fusarium sp. ukrasna trska Juņna Afrika NRRL 26757 3AF158311 3AF160308 3AF160323 3AF158361 3AF158298 Fusarium sp. S. hermonthica Sudan NRRL 26793 3 AF158312 3 AF160309 3 AF160324 3 AF158362 3 AF158299 Fusarium sp. Cymbidium sp. Japan NRRL 26794 3 AF158303 3 AF160287 3 AF160314 3 AF158340 3 AF158289 Fusarium sp. Cymbidium sp. Japan NRRL 28852 3 AF158304 3 AF160288 3 AF160315 3 AF158341 3 AF158290 Fusarium sp. Bidens pilosa SAD NRRL 29123 3 AF158313 3 AF160310 3 AF160325 3 AF158363 3 AF158300 Fusarium sp. B. pilosa SAD NRRL 29124 3 AF158314 3 AF160311 3 AF160326 3 AF158364 3 AF158301 F. sacchari Saccharum officinarum Indija NRRL 13999 1 U34556 / 2 U34414 3 AF158331 2 U34498 F. subglutinans Z. mays SAD NRRL 22016 1 U34559 3 AF160289 2 U34417 / 2 U34501 F. succisae Succisa pratensis Nemačka NRRL 13613 1U34561 3AF160291 2U34419 3AF158344 2U34503 F. thapsinum S. bicolor Juņna Afrika NRRL 22045 1U34560 3AF160270 2U34418 3AF158323 2U34502 F. udum / Nemačka NRRL 22949 1U34575 3AF160275 2U34433 3AF158328 2U34517 F. verticillioides Z. mays Nemačka NRRL 22172 1U34555 3AF160262 2U34413 3AF158315 2U34497 F. proliferatum S. bicolor Srbija 297a−09 4JQ412110 4JQ412103 4JQ412112 4JQ412114 4JQ717203 F. proliferatum S. bicolor Srbija 13−10 / 4JQ412102 / / / F. proliferatum S. bicolor Srbija 521−10 / 4JQ412104 / / / F. proliferatum S. bicolor Srbija 522−10 / 4JQ412105 / / / F. proliferatum S. bicolor Srbija 530−10 / 4JQ412106 / / / F. thapsinum S. bicolor Srbija 808−11 4JQ717206 4JQ717205 4JQ717207 4JQ717208 4JQ717209 aSkraćenice kolekcije kultura: NRRL–National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, USA bIstraņivanja gde su objavljene DNK sekvence: 1O‟Donnell and Cigelnik (1997); 2O‟Donnell et al. (1998a); 3O‟Donnell et al. (2000a); i 4Ova istraņivanja Prilog 2. Sekvence ITS regiona rDNK vrsta kompleksa F. graminearum korińćene za filogenetske analize Vrsta Domaćin Poreklo GenBank pristupni broj b Kolekcija a ITS F. acaciae−mearnsii Acacia mearnsii Juņna Afrika NRRL 26752 1DQ459849 F. acaciae−mearnsii A. mearnsii Juņna Afrika NRRL 26754 1DQ459850 F. acaciae−mearnsii A. mearnsii Juņna Afrika NRRL 26755 1DQ459851 F. acaciae−mearnsii zemljińte Australija NRRL 34197 1DQ459852 F. acaciae−mearnsii zemljińte Juņna Afrika NRRL 34461 1DQ459853 F. acaciae−mearnsii zemljińte Australija NRRL 34207 1DQ459854 F. asiaticum Hordeum vulgare Japan NRRL 6101 1 DQ459833 F. asiaticum H. vulgare Japan NRRL 13818 1 DQ459834 F. asiaticum Triticum spp. Kina NRRL 26156 1 DQ459835 F. asiaticum Z. mays Nepal NRRL 28720 1 DQ459836 F. austroamericanum pečurka Brazil NRRL 2903 1DQ459837 F. austroamericanum puzavica Venecuela NRRL 28585 1 DQ459839 F. austroamericanum Zea mays Brazil NRRL 28718 1 DQ459838 F. boothii Z. mays Juņna Afrika NRRL 29020 1DQ459847 F. boothii Z. mays Juņna Afrika NRRL 26916 1DQ459845 F. boothii / Juņna Afrika NRRL 29011 1DQ459846 F. boothii Z. mays Nepal NRRL 29105 1 DQ459848 F. brasilicum Avena sativa Brazil NRRL 31238 1 DQ459860 F. brasilicum Avena sativa Brazil NRRL 31281 1 DQ459861 F.cortaderiae Cortaderia selloana Novi Zeland NRRL 29306 1 DQ459855 F.cortaderiae C. selloana Novi Zeland NRRL 29297 1 DQ459856 F.cortaderiae C. selloana Novi Zeland NRRL 31205 1 DQ459857 F.cortaderiae C. selloana Novi Zeland NRRL 31171 1 DQ459858 F.cortaderiae C. selloana Novi Zeland NRRL 31185 1 DQ459859 F. gerlachii Triticum spp. Minesota, SAD NRRL 36905 1 DQ459862 F. gerlachii Arundo donax Viskonsin, SAD NRRL 38380 1 DQ459863 F. gerlachii Triticum spp. Dakota, SAD NRRL 38405 1 DQ459864 F. graminearum Z. mays Ohajo, SAD NRRL 5883 1 DQ459817 F. graminearum Z. mays Mičigen, SAD NRRL 28063 1DQ459818 F. graminearum Panicum milliaceum MaĎarska NRRL 6394 1DQ459819 F. graminearum Triticum spp. Ohajo, SAD NRRL 28336 1 DQ459820 F. graminearum Z. mays Iran NRRL 13383 1 DQ459821 F. graminearum Triticum spp. Kanzas, SAD NRRL 29169 1 DQ459822 F. graminearum Z. mays Mičigen, SAD NRRL 31084 1DQ459823 F. graminearum Triticum spp. Minesota, SAD NRRL 34097 1 DQ459824 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38369 1 DQ459825 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38381 1 DQ459826 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38395 1 DQ459827 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38383 1 DQ459828 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38393 1 DQ459829 F. graminearum Triticum spp. Luizijana, SAD NRRL 38371 1 DQ459830 F. graminearum Rumohra adiantiformis Florida, SAD NRRL 28439 1 DQ459831 F. graminearum R.adiantiformis Florida, SAD NRRL 29149 1 DQ459832 F. meridionale narandņa Nova Kaledonija NRRL 28436 1DQ459840 F. meridionale zemljińte Juņna Afrika NRRL 29010 1DQ459841 F. meridionale Zea mays Nepal NRRL 28723 1 DQ459842 F. mesoamericanum Musa sapientium Honduras NRRL 25797 1 DQ459843 F. mesoamericanum brńljan Pensilvanija NRRL 29148 1DQ459844 F. vorosii Triticum spp. MaĎarska NRRL 37605 1DQ459865 F. vorosii Triticum spp. Japan NRRL 38208 1 DQ459866 F. vorosii Triticum spp. Japan NRRL 38207 1 DQ459867 F. cerealis zemljińte Kolumbija NRRL 25805 1DQ459869 F. culmorum H. vulgare Danska NRRL 25475 1 DQ459870 F. lunulosporum Citrus paradisi Juņna Afrika NRRL 13393 1DQ459868 F. pseudograminearum H. vulgare Australija NRRL 28062 1 DQ459871 Fusarium sp. / / NRRL 29380 1 DQ459872 Fusarium sp. / / NRRL 29298 1 DQ459873 F. graminearum S. bicolor Srbija 535−10 2JQ412111 aSkraćenice kolekcije kultura: NRRL–National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, USA; bIstraņivanja gde su objavljene DNK sekvence: 1Starkey et al. 2007 i 2Ova istraņivanja Prilog 3. Sekvence proteinskih gena (TEF−1α i β−tubulin) vrsta kompleksa F. graminearum korińćene za filogenetske analize Vrsta Domaćin Poreklo GenBank pristupni broj b Kolekcija a TEF−1α β−tubulin F. acaciae−mearnsii Acacia mearnsii Juņna Afrika NRRL 26752 2AF212447 2AF212741 F. acaciae−mearnsii A. mearnsii Juņna Afrika NRRL 26754 2AF212448 2AF212742 F. acaciae−mearnsii A. mearnsii Juņna Afrika NRRL 26755 2AF212449 2AF212743 F. asiaticum Hordeum vulgare Japan NRRL 6101 2 AF212450 2 AF212744 F. asiaticum H. vulgare Japan NRRL 13818 2 AF212451 2 AF212745 F. asiaticum Triticum spp. Kina NRRL 26156 2 AF212452 / F. asiaticum Z. mays Nepal NRRL 28720 2 AF212453 2 AF212746 F. austroamericanum pečurka Brazil NRRL 2903 2AF212438 2AF212733 F. austroamericanum puzavica Venecuela NRRL 28585 2 AF212439 2 AF212734 F. austroamericanum Zea mays Brazil NRRL 28718 2 AF212440 2 AF212735 F. boothii Z. mays Juņna Afrika NRRL 29020 2AF212443 2AF212737 F. boothii Z. mays Juņna Afrika NRRL 26916 2AF212444 2AF212738 F. boothii / Juņna Afrika NRRL 29011 2AF212445 2AF212739 F. boothii Z. mays Nepal NRRL 29105 2 AF212446 2 AF212740 F. meridionale narandņa Nova Kaledonija NRRL 28436 2AF212435 2AF212730 F. meridionale Zea mays Nepal NRRL 28723 2 AF212436 2 AF212731 F. meridionale zemljińte Juņna Afrika NRRL 29010 2AF212437 2AF212732 F. meridionale Z. mays Nepal NRRL 28721 2 AF212454 2 AF212747 F. mesoamericanum Musa sapientium Honduras NRRL 25797 2 AF212441 1 AF006364 F. mesoamericanum brńljan Pensilvanija NRRL 29148 2AF212442 2AF212736 F. graminearum Z. mays Ohajo, SAD NRRL 5883 2 AF212455 / F. graminearum Panicum milliaceum MaĎarska NRRL 6394 2AF212456 2AF212748 F. graminearum Z. mays Iran NRRL 13383 2 AF212457 / F. graminearum Z. mays Mičigen, SAD NRRL 28063 2AF212458 / F. graminearum Triticum spp. Ohajo, SAD NRRL 28336 2 AF212459 2 AF212749 F. graminearum Rumohra adiantiformis Florida, SAD NRRL 28439 2 AF212460 2 AF212750 F. graminearum Triticum spp. Kanzas, SAD NRRL 29169 2 AF212461 2 AF212751 F. cerealis Solanum tuberosum Poljska NRRL 13721 2 AF212464 / F. cerealis Iris hollandica Holandija NRRL 25491 2 AF212465 1 AF006360 F. cerealis zemljińte Kolumbija NRRL 25805 2AF212466 1AF006361 F. culmorum / / NRRL 3288 2 AF212462 / F. culmorum H. vulgare Danska NRRL 25475 2 AF212463 1 AF006362 F. lunulosporum Citrus paradisi Juņna Afrika NRRL 13393 2AF212467 1U85571 F. pseudograminearum H. vulgare Australija NRRL 28062 2 AF212468 2 AF107867 F. pseudograminearum Medicago sp. Juņna Afrika NRRL 28065 2 AF212469 2 AF107870 F. pseudograminearum Medicago sp. Juņna Afrika NRRL 28334 2AF212470 2AF107880 F. pseudograminearum zemljińte Australija NRRL 28338 2AF212471 2AF107882 F. graminearum Sorghum bicolor Srbija 532−10 3JQ412107 / F. graminearum S. bicolor Srbija 535−10 3JF747146 3JQ412113 F. graminearum S. bicolor Srbija 536−10 3JQ412108 / F. graminearum S. bicolor Srbija 14−11 3JQ862471 / aSkraćenice kolekcije kultura: NRRL–National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, Illinois, USA bIstraņivanja gde su objavljene DNK sekvence: 1O‟Donnell et al. 1998b; 2O‟Donnell et al. 2000b i 3Ova istraņivanja Prilog 4. Sekvence proteinskog gena TEF−1α vrste F. equiseti korińćene za filogenetske analize Oznaka izolata Domaćin Poreklo GenBank pristupni broj 1 Kolekcija TEF−1α F. equiseti EQU1 Hordeum vulgare Ńpanija H3SA.042 JF496568j EQU2 H. vulgare Ńpanija C1SA.060 JF496569j EQU3 H. vulgare Ńpanija C1SA.063 JF496570j EQU4 H. vulgare Ńpanija C3RA.065 JF496571j EQU5 H. vulgare Ńpanija C1SA.073 JF496568−1j EQU6 H. vulgare Ńpanija D24SZ.090 JF496572j EQU7 H. vulgare Ńpanija C1SA.102 JF496573j EQU8 H. vulgare Ńpanija C3SH.103 JF496574j EQU9 Triticum durum Ńpanija H2−2−5B JF496575a EQU10 T. durum Ńpanija L1−2−2 JF496575−1a EQU11 T. durum Ńpanija L3−1−2J JF496576a EQU12 T. durum Ńpanija U6−1−1 JF496577a EQU13 zemljińte Malta VI01066 AJ543571b EQU14 Beta vulgaris Danska VI01067 AJ543558 b EQU15 H. vulgare Ńvedska VI01068 AJ543557b EQU16 Allium cepa Danska VI01069 AJ543561 b EQU17 A. cepa Danska VI01070 AJ543562 b EQU18 Triticum spp. Danska VI01071 AJ543563 b EQU19 H. vulgare Danska VI01072 AJ543559 b EQU20 Triticum spp. Norveńka VI01079 AJ543564b EQU21 Avena sativa Norveńka VI01084 AJ543565b EQU22 Triticum spp. Norveńka VI01087 AJ543570b EQU23 H. vulgare Norveńka VI01093 AJ543566b EQU24 H. vulgare Norveńka VI01095 AJ543560b EQU25 H. vulgare Norveńka VI01096 AJ543567b EQU26 Triticum spp. Norveńka VI01104 AJ543568b EQU27 A. sativa Norveńka VI01105 AJ543569b EQU30 zemljińte Kanada 11_ZP_2 DQ842055 EQU31 Macrochloa tenacissima Ńpanija 34/2.1.1 DQ854854c EQU33 Triticum spp. Kanada DAOM194187 DQ842084 EQU35 H. vulgare Kanada DAOM232362 DQ842096 EQU36 Triticum spp. Kanada DAOM236361 DQ842099 EQU38 Glycine max Kanada G4_2_QC_ND DQ842101 EQU43 ginseng −zemljińte Kanada 11_ZP_1 DQ842054 EQU44 Triticum spp. Kanada 16_ZP_2 DQ842058 EQU46 slama Kanada 22_ZP_2 DQ842061 EQU48 slama Kanada 2_ZP_2 DQ855945 EQU49 ginseng−koren Kanada 7_ZP_1 DQ842078 EQU50 B. vulgaris Francuska 60 FJ939674 d EQU52 B. vulgaris SAD 113 FJ939678 d EQU53 B. vulgaris Ńvedska 90 FJ939675d EQU58 B. vulgaris Nemačka 157 FJ939684d EQU60 B. vulgaris Nemačka 149 FJ939680d EQU61 B. vulgaris Italija 174 FJ939686 d EQU62 Triticum spp. Kanada DAOM194188 DQ842085 EQU64 Zea mays Kanada DAOM215463 DQ842094 EQU65 Triticum spp. Kanada DAOM232364 DQ842098 EQU66 Oryza sativa Italija GLS2 GQ848542 e EQU68 B. vulgaris Čile NRRL20697 GQ505594f EQU69 zemljińte Nemačka NRRL26419 GQ505599f EQU70 / / NRRL36136 GQ505644 f EQU71 zemljińte Holandija NRRL36321 GQ505647f EQU72 Solanum tuberosum Danska NRRL36466 GQ505356 f EQU73 / SAD NRRL43636 GQ505663 f 286−09 S. bicolor Srbija / JQ412101k F. scirpi SCI1 pańnjak Australija NRRL36478 GQ505654f SCI2 pańnjak Australija NRRL29134 GQ505605f SCI3 zemljińte Francuska NRRL26922 GQ505601f SCI4 ńumsko zemljińte Australija NRRL13402 GQ505592f F. graminearum GRA1 Triticum spp. SAD NRRL29169 AF212461 g 1Istraņivanja gde su objavljene DNK sekvence: aJurado et al. 2006; bKristensen et al. 2005; c Maciá−Vicente et al. 2008; dNitschke et al. 2009; eAmatulli et al. 2010; fO‟Donnell et al. 2009; gO‟Donnell et al. 2000b; hNalim et al. 2009; iO‟Donnell et al. 2010; jMarín et al. 2012 i kOva istraņivanja Izjava o autorstvu Potpisani-a ______________Danijela Ristić_____________ broj indeksa ______________________________________ Izjavljujem da je doktorska disertacija pod naslovom __ Karakterizacija vrsta roda Fusarium patogena sirka [Sorghum bicolor (L.) Moench] u Srbiji_i utvrĎivanje osetljivosti genotipova__ rezultat sopstvenog istraņivačkog rada, da predloņena disertacija u celini ni u delovima nije bila predloņena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visokońkolskih ustanova, da su rezultati korektno navedeni i da nisam krńio/la autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranta U Beogradu, __08.10.2012. godine_____ _________________________ Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Ime i prezime autora _________Danijela Ristić______________ Broj indeksa _________________________________________ Studijski program _____Poljoprivredne nauke______________ Naslov rada Karakterizacija vrsta roda Fusarium patogena sirka [Sorghum bicolor (L.) Moench] u Srbiji i utvrĎivanje osetljivosti genotipova Mentor __prof. dr Aleksandra Bulajić, vanredni profesor_______________________ Potpisani/a _________ Danijela Ristić__________________ Izjavljujem da je ńtampana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lični podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao ńto su ime i prezime, godina i mesto roĎenja i datum odbrane rada. Ovi lični podaci mogu se objaviti na mreņnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univerziteta u Beogradu. Potpis doktoranta U Beogradu, __08.10.2012. godine_____ _________________________ Izjava o korišćenju Ovlańćujem Univerzitetsku biblioteku „Svetozar Marković“ da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: __ Karakterizacija vrsta roda Fusarium patogena sirka [Sorghum bicolor (L.) Moench] u Srbiji_i utvrĎivanje osetljivosti genotipova________________________ koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji pońtuju odredbe sadrņane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlučio/la. 1. Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno 3. Autorstvo – nekomercijalno – bez prerade 4. Autorstvo – nekomercijalno – deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo – bez prerade 6. Autorstvo – deliti pod istim uslovima (Molimo da zaokruņite samo jednu od ńest ponuĎenih licenci, kratak opis licenci dat je na poleĎini lista). Potpis doktoranta U Beogradu, __08.10.2012. godine_____ _________________________