1NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU Odlukom Nastavno-naučnog veća Medicinskog fakulteta, koja je doneta na sednici održanoj 03.11.2014. godine, broj 4600/11, imenovana je Komisija za ocenu i odbranu završene doktorske disertacije kandidata mr Radmile Novaković, istraživača saradnika na Institutu za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu pod nazivom: „Uticaj polifenola prirodnog porekla i sintetskih otvarača kalijumovih kanala na kontraktilnost izolovanog uterusa“. Mentor je prof. dr Ljiljana Gojković-Bukarica, komentor je dopisni član SANU prof. dr Nebojša Radunović. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Prof. dr Dragan Obradović, profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu 2. Prof. dr Milica Bajčetić, profesor Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu 3. Nau. save. dr Melita Vidaković, naučni savetnik Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković", Univerziteta u Beogradu Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, Komisija za ocenu završene doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicinskog fakulteta sledeći IZVEŠTAJ A. Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija mr Radmile Novaković napisana je na 136 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: I Uvod, II Ciljevi rada, III Materijal i metode, IV Rezultati, V Diskusija, VI Zaključci, VII Literatura, VIII Dodatak, IX Prilozi. U disertaciji se nalazi ukupno 25 slika i četiri tabele. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U Uvodu je definisana građa i funkcija uterusa kao organa, prikazana je klasifikacija kalijumskih kanala, njihova zastupljenosti i uloga u kontraktilnosti miometrijuma. Dat je pregled najznačajnijih sintetskih otvarača kalijumskih kanala. Istaknut je značaj aberantne kontraktilnosti uterusa u poremećajima kao što su dismenoreja i prevremeni porođaj i označeno je moguće 2mesto modulatora kalijumskih kanala u njihovoj prevenciju i lečenju. Podvučen je značaj in vitro oplodnje, opisan proces. U delu o prirodnim polifenolima dat je temeljan prikaz aktuelnih literaturnih podataka koji se odnose na opis prirodnih polifenola, njihovu klasifikaciju i identifikaciju njihovog farmakološkog svojstva. Poseban osvrt je učinjen na rezveratrol i naringenin. Navedena je eventualna uloga rezveratrola i naringenina u terapiji hroničnih oboljenja u kojima bi njihov uticaj na membranske kalijumske kanale mogao biti i osnovni mehanizam njihovog dejstva. Ciljevi rada su precizno definisani. Ispitivao se uticaj rezveratrola i naringenina na više modela kontrakcija animalnog negravidnog i humanog gravidnog uterusa. Definisale su se uloge kalijumskih kanala u mehanizmu dejstva rezveratrola, kao i njihova ekspresija u navedenim tkivima. U poglavlju Materijal i metode opisan je model in vitro eksperimenata u kupatilu za izolovane organe uz detaljan opis pripreme animalnih i humanih uzoraka. Precizno je navedena eksperimentalna procedura, dat je pregled korišćenih supstanci i rastvora. Temeljno su objašnjene metode western blot i imunohistohemijsko bojenje specifičnim antitelima koje su korišćene za detekciju i identifikaciju kalijumskih kanala u glatkoj muskulaturi uterusa. Objašnjena je obrada podataka i primenjena statistička analiza. Eksperimenti su sprovođeni u skladu sa etičkim principima i smernicama za brigu o životinjama odobrenim od strane Etičke komisije za zaštitu dobrobiti oglednih životinja i Etičkog komiteta Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno, grafički i tekstualno predstavljeni svi dobijeni rezultati. U poglavlju Diskusija kandidatkinja je na sveobuhvatan i detaljan način povezala svoje rezultate sa postojećim rezultatima drugih autora i na osnovu toga donela odgovarajuće zaključke. U poglavlju Zaključci sažeto su navedeni najznačajniji nalazi koji su doneti na osnovu rezultata eksperimentalnog rada, a u skladu sa postavljenim ciljevima. U poglavlju Literatura navedeno je 202 reference koje su citirane vankuverskim stilom. Poglavlje Dodatak sadrži liste tabela i ilustracija koji dopunjuju rezultate ove doktorske disertacije, spisak radova publikovanih iz ove disertacije i biografiju autora. 3B. Kratak opis postignutih rezultata Ovo istraživanje je pokazalo u okviru farmakološke analize efekata rezveratrola i naringenina, da su oni vrlo jaki inhibitori spontanih i indukovanih kontrakcija negravidnog pacovskog i gravidnog humanog miometrijuma pacijenkinja iz programa vantelesne oplodnje. Način indukcije kontrakcija miometrijuma uticalo je različito na efekat rezveratrola , ali ne i na efekat naringenina. Ostvareni antagonism rezveratrola sa primenjenim blokatorima kalijumskih kanala, ukazuje na učešće ATP- zavisnih (KATP), kalcijum–zavisnih (BKCa) i voltažno-zavisnih (Kv) kalijumskih kanala u mehanizam dejstva i rezveratrola kod faznog tipa kontrakcija gravidnog i negravidnog miometrijuma. Međutim, kada se rezveratrol primenjuje u visokim koncentracijama, ali kod toničnog tipa kontrakcija, rezveratrol ima dodatne mehanizme delovanja koji su nezavisni od kalijumskih kanala. Pokazan je odnos ekspresije proteina KATP, BKCa, Kv kanala u tkivu glatke muskulature negravidnog uterusa pacova i gravidnog uterusa porodilja iz programa vantelesne oplodnje. Pokazano je da postoji razlika u ekspresiji raznih tipova K kanla u zavisnosti od fiziološkog stanja uterusa, odnosno negravidnog i gravidnog stanja. Ovo je prva studija koja je pokazala prisustvo proteina Kv2.1 podtipa Kv kanala i protein Kir6.1 i Kir6.2 subjedinica KATP kanala u tkivu glatke muskulature negravidnog uterusa pacova, kao i Kv4.2 u tkivu gravidnog humanog miometrijuma. Naringenin inhibira spontane i indukovane kontrakcije negravidnog i gravidnog uterusa. Rezveratrol znatno potentnije inhibira kontraktilnost uterusa od naringenina. Poređenjem efekata rezveratrola sa sintetskim otvaračima kalijumskih kanala, pinacidilom i NS1619 pokazano je da ovaj polofenol nema profil « klasičnog » sintetskog otvarača kalijumskih kanala. Rezveratrol ima veliki potencijal da se koristi u prevenciji i lečenju abnormalne i nepoželjne kontraktilnosti uterusa kao u slučaju dismenoreje, i prevremenih porođaja. C. Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature Polifenoli su sastavni deo mnogih biljnih namirnica koje se koriste u ishrani čoveka. Rezveratrol se nalazi u žiži kako naučne, tako i šire javnosti poslednjih deset godina. Za to vreme broj radova koji su ispitivali dejstvo rezveratrola na različitim modelima u in vitro i kliničkim 4ispitivanjima in vivo je porastao na približno 7000. Prvi radovi koji su pokazali njegovo vazorelaksantno dejstvo proizašli su iz naše laboratorije. Međutim, pored ovakve brojnosti radova, relaksantni efekti rezveratrola na glatku muskulaturu negravidnog pacovskog uterusa je opisan samo u jednom radu (Hsia i sar., 2011). Prema nama dostupnoj literaturi, ova studija je prva koja ispituje dejstvo ovog polifenola na kontraktilnost humane gravidne materice. Studija je pokazala da rezveratrol značajno smanjuje amplitude i frekvenciju faznih kontrakcija izazvanih niskom dozom oksitocina (0.2 nM) sa srednjom efektivnom koncentracijom (EC50) 29 μM i spontanih ritmičkih kontrakcija sa EC50 23 μM. U studiji Hsia i sar. (2011) kontrakcije izazvane oksitocinom su bile manje osetljive na rezveratrol nego što je ovde pokazano, tako 100 μM rezveratrola prouzrokovalo samo 40 % inhibicije kontrakcija. Uočeno je da su tonične kontrakcije izazvane većom koncentracijom oksitocina (20 nM) tri puta manje osetljive na rezverarol ( EC50 je 87 μM). Slično ovome, publikovano je da su fazne kontrakcije negravidnog uterusa miša izazvane malom koncentracijom oksitocina osetljivije na verapamil u odnosu na njihovu toničnu komponentu (Kawamata i sar., 2007). Naši nalazi su u skladu sa podacima dobijenim na eksperimentalnom modelu žučne kese zamorca gde je rezveratrol mnogo potentnije inhibirao fazne konrakcije u odnosu na bazalnu tenziju (Wang i sar., 2008). Sa druge strane, ako posmatramo relaksaciju toničnih kontrakcija aotre i arterije mezenterike pacova rezveratrol je bio mnogo potentniji (EC50 = 10 μM, oba), ali osetljivost mamilarne arterije je bila slična kao u ovoj studiji (EC50 = 30 μM) (Novakovic i sar., 2006 a,b, Gojkovic-Bukarica i sar., 2008). Na osnovu iznetih poređenja nameće se zaključak da postoje očigledne razlike u osetljivosti na rezveratrol među tipovima kontrakcija, tkivima i vrstama. Ovaj zaključak je u skladu sa istraživanjima na modelu glatkih mišića žučne kese zamorca (Wang i sar., 2008) . Posebni doprinos je i to što se ispitivanja iz ove teze odnose na grupu porodilja iz programa in vitro fertilizacije (IVF), jer su neželjeni ishodi, kao prevremeni porođaj, mnogo češći u ovoj populaciji u odnosu na porodilje sa spontanim graviditetom (Van Voorhis, 2007). Sagledavajući dosad dostupnu literaturu može se reći da je ovo prva studija koja prikazuje inhibitorne efekte rezveratrol na kontraktilnost ljudske gravidne materice. Pokazano je da rezveratrol statistički značajno smanjuje amplitudu faznih kontrakcija izazvanih oksitocinom IVF gravidnog humanog miometrijuma. Osetljivost gravidnog humanog miometrijuma na rezveratrol bila je slična kao osetljivost faznih kontrakcija indukovanih oksitocinom kod 5negravidnog uterusa pacova, ali i arterije uterine (Novaković i sar., 2013, Naderali i sar., 2000). Postoje razlike između EC50 vrednosti rezveratrola dobijene ovde i EC50 vrednosti dobijene na modelima rzličitih vrsta humanih i pacovskih krvnih sudova (Novaković i sar., 2006b, Gojković-Bukarica i sar., 2008, Nagaoka i sar., 2007) i glatkih mišića žučne kese ( Wang i sar., 2008). Prikazana razlika u dobijenim rezultatima na različitim eksperimentalnim modelima sugeriše tkivnu selektivnost rezveratrola. Farmakološka analiza supstancama za koje se zna da imaju sposobnost otvaranja tj. aktiviranja, odnosno blokiranja kalijumskih kanala, pokazala je da su KATP, BKCa i Kv kanali uključeni u dejstvo rezveratrola. Ranije je isto pokazano i na eksperimentalnim modelima krvnih sudova (Novaković i sar., 2006, Gojkovic-Bukarica i sar., 2008, Nagaoka i sar., 2007). Takođe, uočeno je i parcijalno dejstvo rezveratrola nezavisno od kalijumskih kanala što je u skladu sa nalazima Hsia i sar., (2011). Poređenje sa sintetskim otvaračima kalijumskih kanala je ukazalo na razlike između njih i rezveratrola u farmakološkim osobinama, tako da se može reći da rezveratrol nije klasični otvarač kalijumskih kanala. Kada se razmatra ekspresija kalijumskih kanala u prisutnoj literaturi, nađeno je da su KATP i BKCa kanali prisutni u negravidnom i gravidnom humanom i animalom miometrijumu (Karl i sar., 2002, Chanrachakul i sar., 2003, Lovasz i sar., 2011). Podaci u literaturi o miometrijskim Kv kanalima su retki. Nedavno, pokazano je na animalnom modelu prisustvo proteina podjedinica koje formiraju poru Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv4.2 i Kv4.3 kanala u miometrijumu miša. Za sada ne postoje nalazi molekularne ekspresije proteina Kv4.x kanala u glatkoj muskulaturi humane materice. Takođe, ovo je prva studija koja je pokazala prisustvo proteina Kv2.1 podtipa Kv kanala i protein Kir6.1 i Kir6.2 subjedinica KATP kanala u tkivu negravidnog uterusa pacova. Slična istraživanja sa naringeninom na glatko mišićnom tkivu uterusa, su retka. Zapravo, jedino je studija Hsia i sar. (2008) pokazala da ekstrat biljke Coix lachryma koji se inače, koristi u tradicionalnoj kineskoj medicini za lečenje dismenoreje, sadrži naringenin koji utiče na ihhibiciju kontrakcija negravidnog uterusa, kako je pokazano i u ovom radu. 6D. Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije Rad publikovan u istaknutom međunarodnom časopisu (M22) 1. Novakovic R, Ilic B, Beleslin-Cokic B, Radunovic N, Heinle H, Scepanovic R, Gojkovic- Bukarica L. The effect of resveratrol on contractility of non-pregnant rat uterus: the contribution of K(+)channels. J Physiol Pharmacol. 2013;64(6):795-805. (IF 2.72) Saopštenja sa skupa međunarodnog značaja štampana u celini (M33) 1. Novakovic Radmila, Protic Dragana, Radunovic Nebojsa, Heinle Helmut, Vladimir Kanjuh, Ida Leskosek-Cukalovic, Slobodan Jovic and Gojkovic-Bukarica Ljiljana. Resveratrol relaxes smooth muscles of rat uterus.Proceedings of 6th Central European Congress on Food, pp 2-3. 23- 26 May 2012, Novi Sad, Serbia. Saopštenja sa skupa međunarodnog značaja štampana u izvodu (M34) 1. Novakovic Radmila, Protic Dragana, Radunovic Nebojsa, Heinle Helmut, Cvejic Jelena, Gojkovic-Bukarica Ljiljana. Resveratrol Relaxes Smooth Muscles of Rat Uterus. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 2011; 109: 114-114. 2. Novakovic R, Protic D, Radunovic N, Kanjuh V, Gojkovic-Bukarica L. The relaxation of non-pregnant rat uterus by wine polyphenol resveratrol. Eur J Clin Invest 2012;42:86. 3. Novakovic R, Protic D, Radunovic NV, Heinle HH, Kanjuh VI, Gojkovic Bukarica LC. The wine polyphenol resveratrol relaxes smooth muscles of the non-pregnant rat uterus. 6th European Congress of Pharmacology - EPHAR 2012 Volume 10 - Issue 3 4. Radmila Novaković, Dragana D Protić, Nebojša V Radunović, Vladimir I Kanjuh, Ljiljana C Gojković-Bukarica. The relaxation of non-pregnant rat myometrium by resveratrol with participation of the NO–cGMP pathway. BMC Pharmacology and Toxicology 2012. 5. Novakovic R, Protic D, Radunovic N, Heinle H, Gojkovic-Bukarica L. The relaxation of non- pregnant rat uterus by wine polyphenol resveratrol. 6th Central European Congress on Food, May 23-26. 2012, Novi Sad, Serbia (apstract book pg 178). 76. Novakovic Radmila B, Beleslin-Cokic Bojana B, Ilic Bojana B, Radunovic Nebojsa V, Protic Dragana D, Hainle H, Scepanovic R, Gojkovic-Bukarica Ljiljana. Contribution of different K+ channels in the effects of resveratrol on the phasic and tonic contractions of non-pregnant rat uterus. European journal of clinical investigation 2013;43:102-103. Portugalija April 17-20 Organizator: Europian Society for Clinical Investigation ESCI. 7. Novakovic R, Beleslin-Čokić B, Ilić Bojana, Radunović N, Protić D, Heinle H, Šćepanović R, Gojković-Bukarica L. The relaxation of pregnant human myometrium by natural polyphenol resveratrol. Humboldt-Kolleg, Resources of Danubian region: The possibility of cooperation and utilization, Belgrade, June 12-15, 2013, Book of abstracts, P71. 8. Novakovic R, Cirovic S, Markovic-Lipkovski J, Radunovic N, Heinle H, Gojkovic-Bukarica Lj. Polyphenol resveratrol relaxes pregnant human myometrium. European Journal of Clinical Investigation. 2014; 44:85-85. Organizator: Europian Society for Clinical Investigation ESCI. 9. R. Novakovic, B. Beleslin-Cokic, B. Ilic, N. Radunovic, H. Heinle, L. Gojkovic-Bukarica. Antiimflammatory polyphenol resveratrol has potential to be used in prevention and treatment of primary dysmenorrhea . Symposium on occasion of 30 years of “Blaubeuren Conferences” of the Tübingen Institute of Physiology with special participation from Danubian countries. Blaubeuren. April 4th-5th, 2014. Saopštenja sa skupa nacionalnog značaja štampana u izvodu (M62) 1. Novaković Radmila, Protić Dragana, Radunović Nebojsa, Heinle Helmut, Gojković- Bukarica Ljiljana, Vladimir Kanjuh. Rezveratrol relaksira glatke mišiće uterusa pacova. 13. kongres farmakologa I 3. kongres kliničke farmakologije Srbije, sa međunarodnim učešćem. Palič, 05. - 08. oktobra 2011. 2. Novaković R, Radunović N, Marković-Lipkovski J, Ćirović S, Heinle H, Gojković-Bukarica Lj. POLYPHENOL RESVERATROL RELAXES PREGNANT HUMAN MYOMETRIUM. Treći kogres fiziologa Srbije sa međunarodnim učešćem. Abstract book: „Molecular, cellular and integrative basis of health, disease: transdisciplinary approach“. Beograd, Srbija. 29-31. Oct. 2014. 8E. Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija “Uticaj polifenola prirodnog porekla i sintetskih otvarača kalijumovih kanala na kontraktilnost izolovanog uterusa” mr Radmile Novaković predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju mehanizama dejstva rezveratrola i naringenina na kontraktilnost gravidnog i negravidnog uterusa, i uloge kalijumskih kanala u tim dejstvima. Takođe, pružene su jasne smernice za dalja istraživanja. Rezultati ove doktorske disertacije ukazuju na zaključak da rezveratrol i naringenin imaju veliki potencijal da se korisie u prevenciji i tretmanu patološke i nepoželjne kontraktilnosti uterusa kao u slučaju dismenoreje i prevremenih porođaja. Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci. Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata, Komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati ovaj Izveštaj i uputi ga Veću naučnih oblasti medicinskih nauka, radi dobijanja saglasnosti za javnu odbranu doktorske disertacije mr Radmile Novaković. 9U Beogradu, 02. 12. 2014. Članovi Komisije: Mentor: Prof. dr Dragan Obradović Prof. dr Ljiljana Gojković-Bukarica _______________________ _______________________ Prof. dr Milica Bajčetić Komentor: _______________________ Prof. dr Nebojša Radunović _______________________ Naučni savetnik dr Melita Vidaković ________________________