1НАУЧНОМ ВЕЋУ МЕДИЦИНСКОГ ФАКУЛТЕТА УНИВЕРЗИТЕТА У БЕОГРАДУ На седници Научног већа Медицинског факултета у Београду, одржаној дана 25. 12. 2014. године, број 4600/12, именована је комисија за оцену завршене докторске дисертације под насловом: „ МОРФОЛОШКЕ И БИОХЕМИЈСКЕ ПРОМЕНЕ У АЛОКОРТЕКСУ И НЕОКОРТЕКСУ МОЗГА ПАЦОВА УСЛОВЉЕНЕ МАТЕРНАЛНОМ ДЕПРИВАЦИЈОМ“ кандидата др Милана Аксића, запосленог на Медицинском факултету у Београду у звању асистента на катедри за ужу научну област Анатомија. Ментор ове докторске тезе је проф. др Бранислав Филиповић, коментор је проф. др Наташа Петронијевић. Комисија за оцену завршене докторске дисертације именована је у саставу: 1. Проф. др Видосава Радоњић, професор Медицинског факултета у Београду 2. Проф. др Александра Исаковић, професор Медицинског факултета у Београду 3. Проф. др Маја Вуловић, професор на Факултету медицинских наука у Крагујевцу На основу анализе приложене докторске дисертације, комисија за оцену завршене докторске дисертације једногласно подноси Научном већу Медицнског факултета следећи ИЗВЕШТАЈ А) Приказ садржаја докторске дисертације Докторска дисертација др Милана Аксића написана је на 100 страна и подељена је на следећа поглавља: увод, циљеви рада, материјал и методе, резултати, дискусија, закључци и литература. У дисертацији се налази укупно 19 слика и 22 графикона. 2Докторска дисертација садржи сажетак на српском и енглеском језику, биографију кандидата, податке о комисији и списак скраћеница коришћених у тексту. У уводу је широко приказана етиопатогенеза схизофреније са посебним освртом на структурне промене у мозгу. Дат је опис и значај анималних модела у проучавању психијатријских обољења са посебним освртом на матерналну депривацију као једног од потенцијалних узрока у развоју схизофреније у каснијем периоду живота. Детаљно су описана предилекциона места у алокортексу и неокортексу у којима долази до промена у току настанка схизофреније. Посебан осврт је дат на активност GABA- ергичких неурона (интернеурона) који експримирају калцијум везујуће протеине, парвалбумин (PV), калретинин (CR) и калбиндин (CB). Такође, приказан је значај рилина као гликопротеина екстрацелуларног матрикса који помаже процесе миграције неурона и њихово позиционирање у мозгу током развоја. Описана је и улога неурексина и неуролигина који повезују пре и постсинаптичке неуроне посредујући транссинаптичку сигнализацију. У уводу је описан и значај неурегулина као генетског фактора за настанак овог психијатријског обољења. Циљеви рада су прецизно дефинисани. Састоје се у испитивању дуготрајног утицаја матерналне депривације на морфолошке промене, експресију NeuN протеина, одговор микроглије, астроглије и олигодендроглије у алокортексу и неокортексу мозгова пацова. Као циљ рада наведено је и испитивање дуготрајног утицаја матерналне депривације на GABA-ергички систем одређивањем броја интернеурона који се позитивно боје на парвалбумин, калретинин, калбиндин и рилин у алокортексу и неокортексу мозга пацова, као и испитивање дуготрајног утицаја матерналне депривације на неурогенезу у хилусу gyrus dentatus-a (активна зона неурогенезе). Такође, међу циљевима је наведено испитивање дуготрајног утицаја матерналне депривације на експресију неурегулина 1 и неуролигина у алокортексу и неокортексу мозгова пацова. У поглављу Материјал и методе наведено је да су експерименти рађени на животињама које су добијене из узгајалишта Института за биомедицинска истраживања Галеника у Београду. Описан је експериментални модел матерналне депривације 3пацова уз детаљан опис услова њиховог чувања. Експерименти су спровођени у складу са етичким принципима и смерницама за бригу о животињама одобреним од Управе за ветерину Министарства пољопривреде и заштите животне средине и Медицинског факултета Универзитета у Београду. Прецизно су наведени начин одвајања младунаца од мајке као и временски интервали подвргивања животиња експерименту и њиховог жртвовања. Детаљно је описана методологија припреме узорака за имунохистохемијско бојење. као и начин морфолошких испитивања на микрографијама, која подразумевају одређивање волумена хипокампуса, кортикалне дебљине и квантификација величине и густине тела неурона у алокортексу и неокортексу мозга пацова. Такође, техником Western blot-a описано је одређивање експресије протеина специфичних за микроглију, астроглију и олигодендроглију. У поглављу Резултати детаљно су описани и јасно представљени сви добијени резултати. Дискусија је написана јасно и прегледно, уз приказ података других истраживања са упоредним прегледом добијених резултата истраживања. Закључци сажето приказују најважније налазе који су проистекли из резултата рада. Коришћена литература садржи списак од 210 референци. Б) Кратак опис постигнутих резултата Ово истраживање је показало да рани стрес изазван матерналном депривацијом проузрокује дуготрајне промене у алокортексу и неокортексу мозга што може бити значајан етиолошки фактор за настанак схизофреније. Првенствено стрес проузрокован раним одвајањем младунаца од мајке доводи до укупног смањења волумена хипокампуса, као и смањења волумена пирамидалног слоја хипокампуса и грануларног слоја gyrus dentatus-a. Поред тога у резултатима је приказано и смањење површине пирамидалних и грануларних неурона у овим деловима алокортекса. Матернална 4депривација доводи до смањења кортикалне дебљине у префронталном (PFCX), ретроспленијалном (RSCX) и моторном (MCX) делу коре, као и променама у густини неурона у овим деловима коре, док је површина самих неурона смањена у префронталном и ретроспленијалном делу коре. Дуготрајни утицај матерналне депривације доводи до смањене експресије NeuN протеина у префронталном кортексу и хипокампусу што је у корелацији са смањењем густине неурона. Такође, приказана је смањена експресија GFAP протеина у хипокампусу, који представља значајан маркер за астроглију. Стрес попут матерналне депривације доводи и до смањене густине парвалбумин, калбиндин, калретинин и рилин позитивних неурона у одређеним субјединицама хипокампуса и кортекса. Матернална депривација утиче и на смањење експресије MOG и повећање експресије Iba1 протеина у алокортексу, који представљају маркере за олигодендроглију и микроглију. Повећана експресија неурегулина 1 у префронталном кортексу и хипокампусу након матерналне депривације показује да стрес у раном добу повећава ризик од активирања генетских фактора. Матернална депривација изазива смањење неуролигина у префронталном кортексу, али и његово повећање у хипокампусу мозга пацова, док је густина неурона у пролиферацији у хилусу gyrus dentatus-a хипокампуса непромењена. Наведени подаци могу бити од значаја у смислу сагледавања и разумевања етиопатогенетских механизама схизофреније, као и у развоју нових експерименталних модела и стратегија у лечењу ове болести. Ц) Упоредна анализа докторске дисертације са резултатима из литературе Стресни животни догађаји имају кључну улогу у етиопатогенези психијатријских обољења као што су схизофренија, хронична анксиозност и депресија (Muscatell i sar., 2009). Стрес је неизбежан фактор током људског живота, а екстремни 5облици акутног и хроничног стреса представљају ризик за развој психијатријских обољења (Roberts, 1994). Мајка може бити кључни разлог за настанак стреса током живота са трајним последицама у развоју мозга (Francis i Meaney, 1999). Стрес у раном периоду живота као што је матернална депривација представља један од актуелних анималних модела схизофреније. Досадашња испитивања су показала да стрес у раном периоду живота изазива комплексно дејство на различите неуротрансмитерске системе, док дуготрајни утицаји нарочито код матерналне депривације као модела раног стреса још увек нису довољно познати. Испитивање хипокампуса је од посебног значаја у схизофренији, где су промене у волумену хипокампуса један од најконзистентнијих налаза у схизофренији. Смањење волумена хипокампуса повезано је и са клиничким знацима схизофреније посебно оштећењима радне и вербалне меморије (Bogerts i sar., 1997), што је у корелацији са смањемњем волумена хипокампуса у овој докторској дисертацији. Стереолошка испитивања су поготову довела у питање смањење укупног броја неурона у хипокампусу. У приказаном истраживању је стереолошки одређиван волумен str.pyramidale CA1 и CA3 хипокампуса и str.granulare gyrus dentatus-a, при чему је показано статистички значајно смањење волумена у овим деловима алокортекса у односу на контролну групу. Истраживањима је потврђена повећана активност микроглије у алокортексу што је потврђено и позитронском емисионом томографијом у мозгу код особа са почетним симптомима схизофреније (Frik i sar., 2013; Monji i sar., 2009). Губитак олигодендроцита и дисфункција метаболичке активности идентификовани су код схизофреније (Bernstein i sar., 2014) што су показали и резултати овог истраживања смањеном експресијом MOG протеина у хипокампусу. Иако је веза између Nrg1 и схизофреније показана (Chohan i sar., 2014), до сада није проучавана експресија неурегулина у матерналној депривацији као анималном моделу схизофреније. Резултати приказаних истраживања показују повишен ниво експресије неурегулина у хипокампусу и префронталном кортексу као дугорочни ефекат стреса изазваног матерналном депривацијом. Такође, новија истраживања су показала повећану експресију Nrg1 код перинаталне примене фенциклидина као анималног модела (Radonjić i sar., 2013). Проучавање неуролигина на анималном моделу схизофреније показало је смањење овог протеина у префронталном кортексу код 6адолесцентних али не и одраслих пацова (Mordalska i sar., 2011). Резултати овог истраживања су показали смањен ниво експресије у префронталном кортексу, док је експресија у хипокампусу била повишена што говори у прилог да је као последица матерналне депривације нарушен однос између ексцитације и инхибиције неурона. Резултати приказани овим истраживањима показују значајно смањење густине парвалбумин (CA1 регион), калретинин (CA1 и CA3 регион), рилин (CA1 и CA3 регион) субпопулације интернеурона у наведеним субрегионима хипокампуса. Ранија студија (Giachino i sar., 2007) је показала да трочасовно раздвајање од мајке током прве две недеље живота утиче на смањење густине калретинин, калбиндин и парвалбумин интернеурона у хипокампусу и амигдали што је у корелацији са нашим резултатима. Сличан налаз показују и нове студије у смањеном укупном броју парвалбумин и соматостатин позитивних интернеурона in vivo (Konradi i sar., 2011). Д) Објављени радови који чине део докторске дисертације 1. Aksić M, Radonjić NV, Aleksić D, Jevtić G, Marković B, Petronijević N, Radonjić V, Filipović B. Long-term effects of the maternal deprivation on the volume and number of neurons in the rat neocortex and hippocampus. Acta Neurobiologiae Experimentalis 2013; 73: 394-403. M23, IF=2.244 2. Aksić M, Radonjić NV, Aleksić D, Jevtić G, Marković B, Petronijević N, Radonjić V, Filipović B. Long-term effects of maternal deprivation on the neuronal soma area in the rat neocortex. Biomed Res Int. (formerly titled Journal of Biomedicine and Biotechnology) 2014;2014:235238. M22. IF=2.706 7E) Закључак (образложење научног доприноса) Докторска дисертација „Морфолошке и биохемијске промене у алокортексу и неокортексу мозга пацова условљене матерналном депривацијом“ др Милана Аксића представља оригинални научни допринос у расветљавању утицаја раног стреса на дуготрајне промене у мозгу експерименталних животиња. Комисији је задовољство да истакне да је по први пут у овој докторској тези свеобухватно проучен рани утицај стреса на експресију неурегулина 1. Такође, су приказани дуготрајни ефекти у мозгу пацова након матерналне депривације на GABA-ергички систем. На основу добијених резултата у овом истраживању, може се закључити да утврђене промена које настају у мозгу експерименталних животиња као последица матерналне депривације могу допринети сагледавању патогенетских механизама схизофреније, као и развоју нових потенцијалних терапијских стратегија у лечењу ове болести. Докторска дисертација је урађена према свим принципима научног истраживања. Циљеви су били прецизно дефинисани, научни приступ је био оригиналан и пажљиво изабран, а методологија рада је била савремена. Резултати су прегледно и систематично приказани и дискутовани, а из њих су изведени одговарајући закључци. На основу свега наведеног и имајући у виду досадашњи научни рад кандидата, комисија предлаже Научном већу Медицинског факултета Универзитета у Београду да прихвати докторску дисертацију др Милана Аксића и одобри њену јавну одбрану ради стицања академске титуле доктора медицинских наука. У Београду, 23. 02. 2015. Чланови Комисије: Ментор: ______________________ _______________________ Проф. др Видосава Радоњић Проф. др Бранислав Филиповић Коментор: ______________________ Проф. др Александра Исаковић _______________________ Проф. др Наташа Петронијевић _______________________ Проф. др Маја Вуловић