NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA
UNIVERZITETA U BEOGRADU
Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana
25.12.2014. godine, broj 4600/12 , imenovana je komisija za ocenu završene doktorske
disertacije pod naslovom: „PROGNOSTIČKI ZNAČAJ IMUNOHISTOHEMIJSKIH
PARAMETARA I HISTOMORFOLOSKOG SKORA U PROCENI TEŽINE
DISPLAZIJE EPITELA GRLIĆA MATERICE“kandidata mr dr Biserke
Vukomanović Đurđević, zaposlene na Vojnomedicinskoj akademiji u Beogradu kao lekar
specijalista patolog i asistent na katedri za Histologiju i embriologiju. Mentor je Prof. dr
Gordana Basta Jovanović, komentor je Prof. dr Milica Berisavac u penziji.
Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu:
1. Prof. dr Darko Plećaš, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu
2. Doc. dr Sanja Radojević Škodrić, docent Medicinskog fakulteta u Beogradu
3. Prof. dr Dragan Velimirović, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu, u penziji
Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene
doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicnskog fakulteta sledeći
IZVEŠTAJ
A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije
Doktorska disertacija mr sci Biserke Vukomanović Đurđević napisana je na 93
strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, ciljevi rada, materijal i metode, rezultati,
diskusija, zaključci i literatura. U disertaciji se nalazi ukupno7 slika,21 tabela i 18
grafikona. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju
kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu.
U uvodu su jasno definisane patohistološke karakteristike displazije epitela grlića
materice, opisan njihov medicinski značaj i značaj njihove dijagnostike. Navedeni su
patofiziološki procesi nastanka displazije, etiološki faktori i epidemiološke karakteristike
ove bolesti.Poseban osvrt je učinjen na Humane papiloma viruse (HPV) kao najznačajniji
etiološki faktor bolesti.Opisani su ćelijski mehanizmi kontrole ćelijskog ciklusa i
apoptoze i uloga tumor supresornih gena. Detaljno su opisani p16,p63, ciklin d1 i
survin,njihova uloga u patogenezi displazije radi razumevanja primene ovih
imunohistohemijskih markera.
Opisana je morfometrijska analiza,njena uloga i mogućnosti u dijagnostici ćelijske
displazije.Takodje je opisan histomorfološki skor, kao zbirna evaluacija
imunohistohemijskih analiza i morfometrijske analize.Dat je pregled literature u vezi
dijagnostičkih kriterijuma displazije grlića materice uzrokovane HPV infekcijom i
njihove dosadasnje primene.
Ciljevi rada su precizno definisani. Sastoje se u ispitivanju dijagnostičkog značaja
imunohistohemijskih metoda markerima p16, p63, ciklin d1 i survivin u epitelnim
displazijama grlića materice, nastalim pod uticajem infekcije visokorizičnim tipovima
humanih papiloma virusa, u odnosu na metodu standardne analize biopsijskih uzoraka
bojenih Hematoksilin-Eozin (H&E) metodom.Takođe se sastoje i u ispitivanju značaja
histomorfološkog skora displazije epitela grlica materice, kod pacijentkinja sa
verifikovanim prisustvom visokorizičnih humanih papiloma virusa reakcijom lančane
polimerizacije, koga zbirno čine imunohistohemijske analize (p16, p63, ciklin d1 i
survivin) i morfometrijska analiza, kao pokazatelja biološkog ponasanja u odnosu na
metodu standardne analize biopsijskih uzoraka bojenih H&E metodom.
U poglavlju Materijal i metode navedeno je da je studija rađena na Institutu za
patologiju i sudsku medicinu Vojnomedicinske akademije, a da su ispitanice klinički bile
pregledane na Ginekološkom odeljenju Vojnomedicinske akademije u trogodišnjem
vremenskom intervalu. Jasno su opisani kriterijumi za ulazak u studiju, kriterijumi za
isključenje iz studije i kontrolna grupa.Precizno su navedene dijagnostičke metode
sprovedene na pacijentkinjama radi zadovoljavanja kriterijuma za odluku o prvom i
ponovljenom bioptiranju.Detaljno je opisana metodologija isptivanja koja je
podrazumevala histopatološku obradu i dijagnostikovanje standardnom H&E metodom,
imunohistohemijske metode bojenja p16,p63,ciklin d1 i survivin sa tumačenjem
dobijenog nalaza i dodatnim gradiranjem imunoreaktivnosti svetlosnim mikroskopom i
određivanje površine jedara morfometrijskom, kompjuterskom metodom sa izražavanjem
u numeričkim vrednostima.Takođe su detaljno objašnjene komponente histomorfološkog
skora u prvoj i ponovljenoj biopsiji.Opisane su statističke metode obrade dobijenih
podataka.
U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati.
Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa
uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije.
Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada.
Korišćena literatura sadrži spisak korišćenih referenci.
B) Kratak opis postignutih rezultata
Ovo istraživanje je pokazalo da je najveći broj pacijentkinja sa displazijom, sa
ekspresijom p16 nakon prve biopsije bio u grupi sa displazijom teškog stepena (High-
grade squamous intraepithelial lesion-HSIL), a najmanji broj u kontrolnoj grupi bez
displazije. Sličan rezultat je bio i nakon ponovljene biopsije, ali sa nešto većim brojem
pacijentkinja sa ekspresijom u grupi sa HSIL.Semikvantitativna metoda analize je
pokazala da je nakon prve biopsije najveći broj pacijentkinja bio u grupi sa HSIL i
srednje izraženom ekspresijom.Kod ponovljenih biopsija su bili slični rezultati i takođe
je bio najveći broj pacijentkinja u toj grupi.
Ova studija je pokazala da je ekspresija p63 nakon prve biopsije kod pacijentkinja sa
displazijom, bila najveća u grupi pacijentkinja sa HSIL, a da je najmanji broj
pacijentkinja bio u kontrolnoj grupi bez displazije.Nakon ponovljene biopsije broj
pacijentkinja sa pozitivnom ekspresijom p63 je bio približan u grupama sa displazijom
lakog stepena (Low-grade squamous intraepithelial lesion-LSIL) i displazijom teškog
stepena sa nešto većim brojem pacijentkinja u grupi sa LSIL. Semikvantitativna metoda
analize nakon prve biopsije pokazala je da je najveći broj pacijentkinja bio u grupi sa
HSIL i blago izraženom ekspresijom p63. Kod ponovljenih biopsija bio najveći broj
pacijentkinja u grupi.LSIL i srednjim stepenom ekspresije.
Nalaz ekspresije ciklina d1 nakon prve biopsije je bio sa najvećim brojem pacijentkinja u
grupi sa HSIL, a najmanji broj u kontrolnoj grupi bez displazije.Pozitivna ekspreseija
ciklina d1 je bila podjednaka kod pacijentkinja sa LSIL I HSIL nakon ponovljene
biopsije. Semikvantitativna metoda analize je pokazala da je nakon prve biopsije najveći
broj pacijentkinja bio u grupi sa HSIL i blago izraženom ekspresijom. Kod ponovljenih
biopsija, najveći broj pacijentkinja je bio u grupi LSIL i blagim stepenom ekspresije.
Rezultati ovog istraživanja su pokazali da je najveći broj pacijentkinja sa displazijom i sa
ekspresijom survivina nakon prve biopsije bio u grupi HSIL, a najmanji broj u
kontrolnoj grupi bez displazije.U ponavljanoj biopsiji ekspresija survivina u grupi
pacijentkinja sa HSIL je bila nesto veća u odnosu na grupu sa LSIL. Odredjena
semikvantitativnom metodom, ekspresija survivina u prvoj biopsiji je bila
najzastupljenija u grupi sa HSIL i blagom ekspresijom.U ponovljenoj biopsiji to je bila
grupa pacijentkinja sa LSIL i blagom ekspresijom.
Morfometrijska analiza je pokazala da je u prvoj biopsiji kod pacijentkinja HSIL, bila
više nego dvostruka vrednost ranga površine jedara nego kod pacijentkinja sa LSIL, a
više nego deset puta veća vrednost u odnosu na kontrolnu grupu, bez displazije.Slični
rezultati su dobijeni i nakon ponovljenih biopsija.
Uticaj histomorfološkog skora sa pet nezavisnih promenljivih (p16,p63,ciklin d1,survivin
i površina jedara) je bio statistički značajan, šta je pokazalo da model razlikuje ispitanike
u pogledu težine displazije i tačno klasifikuje 99% slučajeva.Površina jedra je dala
jedinstven statistički značajan doprinos modelu.Kod naših ispitanica je nađeno da porast
površine jedra za jednu mernu jedinicu (mikrometar kvadratni) povećava verovatnoču za
teši stepen displazije za 1,19 puta.
C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature
Relativno mali broj radova, vezanih za najsavremeniju patohistološku
dijagnostiku displazije epitela grlića materice,je objavljeno u našoj zemlji.Ispitivanje
značaja primene više imunohistohemijskih markera pojedinačno i zajedno, kompjuterska
morfometrijska analiza i analiza značaja dijagnostičkog skora displazije pokazuje svoju
vrednost u Srbiji specijalno kada se zna da je incidenca oboljevanja od karcinoma grlića
dvostruko veća u odnosu na Evropski prosek. Osim toga, na našim terenima nisu rađena
istraživanja vezana za patohistološku dijagnostiku displazije grlića sa dokazanom
infekcijom Humanim papiloma virusima, sa primenom imunohistohemijskih markera
p16,p63, ciklin d1, survivin, morfometrijske analize i histomorfološkog skora kod
pacijentkinja u ponovljenim biopsijama.
Naša studija je pokazala statistički visoko značajnu razliku u ekspresiji p16 kod
pacijentkinja bez displazije epitela grlića, sa LSIL i sa HSIL. Kod ponovljenih biopsija
nije postojala statistički značajna razlika u ekspresiji p16 kod HSIL i LSIL.Iako nije
veliki broj autora analizirao primenu p16 imunohistohemijskog bojenja u ponavljanim
biopsijama, naši rezultati su saglasni sa podatcima iz studija u kojima je zaključak da je
ekspresija p16 vezana za stepen displazije i stepen progresije bolesti (Bose i saradnici
2005,Liao i saradnici 2014.).
Procena značaja semikvantitativne analize ekspresije p16 u cervikalnoj displaziji je
rađena od autora sa drugih epidemioloških područija.Naši rezultati analize p16 pokazuju
statistički značajnu povezanost ekspresije p16 semikvantitativno analizirane kod
pacijentkinja sa displazijom u prvoj i ponavljanoj biopsiji slično rezultatima nekih
autora (Lesnikova i saradnici 2009.).
Ekspresija p63 nakon prve biopsije je bila sa statistički visoko značajnom razlikom kod
kontrolne grupe, pacijentkinja sa LSIL i HSIL za razliku od ekspresije kod ponovljene
biopsije gde nije postojala statistički značajna razlika izmeću grupa LSIL i HSIL.Iako
nema mnogo studija u kojima je ekspresija p63 analizirana u ponavljanim biopsijama,
naši rezultati su generalno slični rezltatima nekih autora (Gailley i saradnici
2013,Vasilescu i saradnici 2009.).
Slični rezultati nakon prve biopsije su pokazani semikvantitativnom analizom ekspresije
p63 sa statistički značajnom razlikom između pacijentkinja sve tri grupe; bez statistički
značajne razlike semikvantitativno analizirane ekspresije p63 između pacijentkinja dve
grupe (HSIL i LSIL) nakon ponovljene biopsije.Naša studija je imala u značajnoj meri
slične rezultate kao u objavljenim radovima (Houghton i saradnici 2009, Nekulova i
saradnici 2013).
Analizirajući ekspresiju ciklina d1 nakon prve biopsije pokazano je da je bila sa
statistički značajnom razlikom kod kontrolne grupe, pacijentkinja sa LSIL I HSIL;što
nije bio slučaj kod ekspresije u ponovljenoj biopsiji gde nije postojala statistički značajna
razlika izmeću grupa LSIL i HSIL.U nešto većem broju studija je analizirana
povezanost ciklina d1 sa karcinomom grlića u odnosu na analizu njegove ekspresije u
displazijama. Međutim, povezanost ekspresije ovog imunohistohemijskog markera i
cervikalne displazije je kod nekih autora slična našim nalazima (Carreras i saradnici
2007, Das i saradnici 2011).
Semikvantitativna analiza ekspresije ciklina d1 nakon prve biopsije je pokazala
statistički značajnu razliku između pacijentkinja sve tri grupe; nije bilo statistički
značajne razlike semikvantitativno analizirane ekspresije ciklina d1 između pacijentkinja
dve grupe (HSIL i LSIL) nakon ponovljene biopsije.Nasa studija je imala,u značajnoj
meri, slične rezultate sa studijama drugih autora uz sva ograničenja laboratorije .
Ekspresija survivina nakon prve biopsije je bila sa statistički visoko značajnom
razlikom kod kontrolne grupe, pacijentkinja sa LSIL i HSIL, za razliku od ispoljene
ekspresije kod ponovljene biopsije gde nije postojala statistički značajna razlika izmeću
grupa LSIL i HSIL.Analiza ekspresije survivina u cervikalnoj displaziji je kod najvećeg
broja objavljenih radova vršena bez analize praćenja pacijentkinja, odnosno isključivo
nakon prvog bioptiranja. Generalno gledano naši rezultati su kompatibilni sa zapažanjima
u okviru tih studija.Ovo se odnosi i na semikvantitativnu analizu, gde ni nakon prvog niti
ponovljenog bioptiranja nije pokazana statistički značajna razlika u grupama poređenja
(Barbosa i saradnici 2011).
Postojala je statistički visoko značajna razlika u površini jedara displastičnih ćelija
grlića analiziranih morfometrijskom metodom između ispitivanih grupa kako u prvoj,
tako i u ponovljenoj biopsiji. Iako nije objavljen veći broj radova sa ovom analizom, naši
rezultati su saglasni činjenici da je veličina jedra osnovni parametar za zadovoljenje
kriterijuma dijagnoze displazije i rangiranje njenog stepena(Hwang i saradnici 2012.).
Rezultati studije u proceni značaja i uticaja histomorfološkog skora sa pet nezavisnih
promenljivih (p16,p63,ciklin d1, survivin i poršina jedra) pokazuju statistički značajan
rezultat,sa tačnom klasifikacijom 99% slučajeva i sa količnikom verovatnoće 1,19 šta
ukazuje da pacijentkinje sa površinom jedra većom za jednu mernu jedinicu imaju 1,19
puta veću verovatnoću za teži oblik displazije.Nisu objavljeni radovi na nasim terenima
sa zbirnom analizom svih parametra opisanog histomorfološkog skora kod displazija
uzrokovanih HPV infekcijom.Analizirajući druge studije i njihove rezultate analize
pojedinačnih dijagnostičkih metoda (kao i manji broj udruženih) koje su pokazivale
značajnost u dijagnostici ovih displazija i korelirajući sa našim rezultatima, utvrđen je
značajan stepen sličnosti generalnih smernica sa našim rezultatima.(Razmpoosh i
saradnici 2014,Romus i saradnici 2013,Waxman i saradnici 2012).
D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije
1. Vukomanović-Đurđević B. et al. Significance of survivin immunoreactivity and
morphometric analysis of HPV-induced cervical dysplasia.Arch.biol.sci.2014.66(1)429-
436.
E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa)
Doktorska disertacija “Prognostički značaj imunohistohemijskih parametara i
histomorfološkog skora u proceni težine displazije epitela grlića materice” dr Biserke
Vukomanović Đurđević predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju
metodologije savremene dijagnostike displazija epitela grlića materice, uzrokovanih
humanim papiloma virusima. Ovim istraživanjem je pokazana pojedinačna i zbirna
efikasnost upotrebe imunohistohemijskih markera p16, p63, ciklin d1 i survivina,
morfometrijske kompjuterske metode i njihovog zajedničkog histomorfološkog skora u
dijagnostici cervikalnih displazija.Upotreba ovih metoda poboljšava preciznost
dijagnostike, a samim tim i efikasnost trijaže pacijentkinja kako kod prve, tako i kod
ponovljene biopsije. Rezultati ove doktorske disertacije bi mogli da pomognu u dodatnoj
objektivizaciji patohistološke dijagnostike displazije uzrokovane infekcijom Humanim
papiloma virusima sa konkretizacijom informacija bitnih za kliničko lečenje i dinamiku
praćenja pacijentkinja.
Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja.
Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a
metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i
diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci.
Na osnovu svega navedenog i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata,
komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da
prihvati doktorsku disertaciju dr Biserke Vukomanović Đurđević i odobri njenu javnu
odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka.
U Beogradu, 08.02.2015.
Mentor:Prof.dr Gordana Basta Jovanović
Komentor :Prof. dr Milica Berisavac
Članovi Komisije:
Prof.dr Darko Plećaš
Doc.dr Sanja Radojević Škodrić
Prof.dr Dragan Velimirović