NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 25.12.2014. godine, broj 4600/12, imenovana je komisija za ocenu završene doktorske disertacije pod naslovom: „ Oksidativni stres i hemodinamski parametri kod bolesnika sa hroničnom srčanom insuficijencijom“ kandidata mr dr Dejana Simeunovića, zaposlenog na Medicinskom fakultetu u Beogradu kao aistenta na katedri za internu medicinu i u Kliničkom Centru Srbije u Beogradu na klinici za kardiologiju. Mentor je Prof. dr Petar Seferović, komentor je Prof. dr Milica Bajčetić. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Prof. dr Siniša Pavlović, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu 2. Doc. dr Arsen Ristić, docent Medicinskog fakulteta u Beogradu 3. Prof. dr Jovan Peruničić, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu, u penziji Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicnskog fakulteta sledeći IZVEŠTAJ A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija mr sci Dejana Simeunovića napisana je na 105 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, ciljevi rada, materijal i metode, rezultati, diskusija, zaključci i literatura. U disertaciji se nalazi ukupno 26 slika. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U uvodu je detaljno i jasno istaknut značaj srčane insuficijencije (SI) kod bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom, kao i činjenica da je ovaj sindrom osnovni element u postavljanju dijagnoze ovog oboljenja Ukazano je na moguće faktore rizika za nasanak SI, uticaj genetske predispozicije, kao i uloga oksidativnog stresa kao jednog od potencijalnih uzročnika ove bolesti. Prikazane su epidemiološke karakteristike SI i posebno je naznačeno da je incidencija u porastu, što je rezultat pada stope smrtnosti od akutnih srčanih epizoda, poboljšanja prognoze svih hroničnih kardiovaskularnih oboljenja kao i povećanju broja starijeg stanovništva u društvu. Opisana je simptomatologija ove bolesti, kao i moderna klasifikacija i dijagnostika koja podrazumeva korišćenje savremenih dijagnostičkih metoda kao što su elektrokardiografija, radiografija, ehokardiografija, ergospirometrija i kateterizacija srca. Poseban osvrt je dat na ulogu oksidativnog stresa u patogenezi hronične srčane insuficijencije (HIS) i u progresiji ove bolesti. Takodje, pokazano je da kod bolesnika sa HSI tokom testa fizičkim opterećenjem dolazi do promena enzimskih i neenzimskih parametara antioksidacione zaštite i nivoa kateholamina. Istovremeno, pokazano je da tokom fizičkog opterećenja, dolazi i do značajnih promena u vrednostima hemodinamskih parametara, kao što su plućni kapilarni pritisak, pritisak u plućnoj arteriji, desnoj pretkomori i komori. Istaknuto je da ovakve promene parametara oksidativne zaštite, nivoa kateholamina i hemodinamskih parametara, pre i nakon testa fizičkim opterećenjem, su klinički veoma važni jer mogu da odrede težinu oboljenja i dugotrajnu prognozu bolesnika sa HSI. Dat je i dosadašnji pregled literature koji nedvosmisleno ukazuje da oksidativni stres učestvuje u patogenezi HSI, i da slobodni kiseonični radikali stvoreni u srčanoj insuficijencijiu uzrokuju oštećenja kardiomiocita. Ciljevi rada su precizno i jasno definisani. Sastoje se u utvrđivanju promena u aktivnosti enzimskih i neenzimskih parametara antioksidativne zaštite u eritrocitima i plazmi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom pre i nakon testa fizičkim opterećenjem, zatim u utvrđivanju promena u aktivnosti kateholamina u plazmi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom pre i nakon testa fizičkim opterećenjem. Takodje, sledeći cilj rada je bio da se ustanovi korelacija između pomenutih promena u aktivnosti parametara antioksidacione zaštite i nivoa kateholamina kod bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom pre i nakon testa fizičkim opterećenjem. Na kraju, kao cilj je postavljeno da se utvrdi korelacija izmedju kliničkih, elektrokardiografskih, ehokardiografskih, hemodinamskih parametara i aktivnosti parametara antioksidativne zaštite bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom pre i nakon testa fizičkim opterećenjem. U poglavlju Materijal i metode navedeno je da je klinička studija uključivala 82 bolesnika sa primarnom dilatativnom kardiomiopatijom i kontrolnu grupu koju je činilo 45 zdravih ispitanika. Bolesnici su regrutovani uzastopno, tokom ambulantnih pregleda na Odeljenju za srčanu slabost Klinike za kardiologiju Kliničkog Centra Srbije. Svim bolesnicima uključenim u studiju prethodno je postavljena dijagnoza primarne dilatativne kardiomiopatije na osnovu kliničke slike, ehokardiografskog nalaza i nalaza normalnog angiograma na koronarografiji. U Poliklinici KCS bolesnicima je radjena dvodimenzionalna doppler ehokardiografija kojom su izmereni end-sistolni i end-dijastolni dijametri leve komore i njena ejekciona frakcija. Takodje, svim bolesnicima je pre uključenja u studiju u Poliklinici KCS u sali za kateterizacije srca uradjena selektivna koronarografija sa levom i desnom kateterizacijom srca, a hemodinamski parametari mereni su standardnom metodom pomoću Swan-Ganz katetera. Na taj način odredjene su vrednosti plućnog kapilarnog pritiska, pritiska u plućnoj arteriji, pritiska u desnoj pretkomori i komori. Pošto je utvrdjeno da ispunjavaju kriterijume za uključivanje u studiju, bolesnicima je u Poliklinici KCS, u kabinetu za ergospirometriju, radjen test fizičkim opterećenjem na ergobiciklu po standardnom protokolu za bolesnike sa DCM. Uzorci iz krvi uzimani su bolesnicima u ležećem položaju, pre početka i nakon maksimalnog kardiopulmonalog testa. Iz izdvojenih opranih eritrocita određivane su enzimske komponente: superoksid dismutaza (SOD) (po metodi McCord i Fridovich), katalaza (CAT) (po m. Beutlera), glutation reduktaza (GR)(po m. Glatzle), glutation (GSH) i glutation peroksidaza (GSH-Px) (po m. Paglia i Valentine). U izdvojenoj plazmi određivane su neenzimske komponente: vitamin C (po m.Okamure) i mokraćna kiselina (po m. Fossati i sar.). U serumu su određene koncentracija glukoze (po m. Barham iTrinder) i ukupnog (po m. Malloy-Evelyn) i direktnog bilirubina (metoda diazo sa sulfanilnom kiselinom)-ne- enzimskih komponenti sistema antioksidacione zaštite. Rezultati parametara oksidativnog stresa su obradjeni u laboratoriji Instituta za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu. U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati. Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada. Korišćena literatura sadrži spisak od 190 referenci. B) Kratak opis postignutih rezultata Ovo istraživanje je pokazalo da su vrednosti sledećih enzimskih parametara oksidativnog stresa: superoksid dismutaza, glutation reduktaza, glutation peroksidaza bile statistički značajno veće kod bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom u odnosu na ispitivanu kontrolnu grupu zdravih volontera kako pre tako i nakon testa fizičkim opterećenjem. Jedino su vrednosti katalaze više porasle nakon testa fizičkim opterećenjem u grupi zdravih nego u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom. Takodje, dobijena je visoko statistički značajna razlika u vrednostima ne-enzimskog parametra oksidativnog stresa vitamina C između ispitivanih grupa pre i posle testa fizičkim opterećenjem. Prosečne vrednosti vitamina C su bile niže u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom nego u grupi zdravih ispitanika pre i nakon testa fizičkim opterećenjem, ali nema većih promena prosečnih vrednosti vitamina C nakon testa fizičkim opterećenjem ni u jednoj od ispitivanih grupa. Što se tiče ispitivanih kateholamina, prosečne vrednosti adrenalina pre testa su bile slične u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom i u grupi zdravih. Dobijena je visoko statistički značajna razlika u vrednostima adrenalina posle testa i u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom i u grupi zdravih ispitanika. Što se tiče noradrenalina vrednosti pre merenja su bile slične u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom i u grupi zdravih. Nakon testa izmerene su veće vrednosti noradrenalina u obe ispitivane grupe. Takodje, dobijena je visoko statistički značajna razlika u vrednostima dopamina pre i posle testa i u grupi bolesnika sa dilatativnom kardiomiopatijom i u grupi zdravih. Što se tiče kliničkih parametara koji su poredjeni sa parametrima oksidativnog stresa studentovim t-testom dobijena je visoko statistički značajna razlika u vrednostima superoksid dismutaza koja je bila je veća u grupi bolesnika koji su imali komorske ekstrasistole u odnosu na bolesnike koji nisu imali komorske ekstrasistole. Kod bolesnika koji su imali otežano disanje i gušenje nadjene su niže vrednosti superoksid dismutaze i glutation peroksidaze, a povišene vrednosti katalaze u odnosu na bolesnike koji nisu imali pomenute tegobe. Takodje, kod bolesnika sa preležanim miokarditisom nadjene su niže vrednosti katalaze i povišene vrednosti adrenalina u odnosu na bolesnike koji nisu preležali miokarditis. Kod bolesnika koji su imali ascites nadjene su niže vrednosti nordrenalina u odnosu na bolesnike koji nisu imali ascites. Bolesnici sa patološkim nalazom glikemije u krvi imali su niže vrednosti dopamina u odnosu na bolesnike koji su imali normalnu glikemiju u krvi. Takodje, bolesnici sa uvećanom dimenzijom leve pretkomore imali su veće vrednosti adrenalina u odnosu na bolesnmike sa normalnom dimenzijom leve pretkomore. Bolesnici koji su imali ejekcionu frakciju leve komore manju od 30% imali su povišene vrednosti glutation reduktaze u odnosu na bolesnike sa ejekcionom frakcijom leve komore većom od 40%. Što se tiče hemodinamskih parametara koji su poredjeni sa enzimskim i neenzimskim parametrima oksidativnog stresa kao i sa vrednostima kateholamina, jednofaktorskom analizom varijanse nije dobijena statistički značajna razlika ni u jednom od ispitivanih obeležja. Navedeni podaci mogu biti od kliničkog značaja u smislu korišćenja navedenih parametara oksidativnog stresa i kateholamina u proceni težine oboljenja i dugotrajne prognoze bolesnika sa hroničnom srčanom insuficijencijom. C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature Prisustvo slobodnih radikala (SR) u biološkom materijalu otkriveno je još 1950 godine, a kasnija hipoteza Denhama Harmana bila je da kiseonični radikali verovatno nastaju kao sporedni produkti u enzimski kontrolisanim reakcijama i nazvao ih "Pandorinom kutijom zla" smatrajući da su odgovorni za velika ćelijska oštećenje, mutagenezu, degenerativne procese, čak i razvoj karcinoma različitih organa. Unazad više decenija započelo se sa proučavanjem uloge slobodnih radikala kao finalnih medijatora oštećenja ćelijske morfologije i funkcije, brojnih patofizioloških zbivanja, kao i starenja organizma (Paglia DE i sar. 1967, Misra HIF i sar 1972, Okamura M i sar. 1980). Upravo ta narušena ravnoteža između produkcije slobodnih radikala i antioksidantnih odbrambebih mehanizama se definiše kao oksidativni stres. Kiseonični slobodni radikali i reaktivne kiseonične vrste se u biološkim tkivima formiraju putem velikog broja specifičnih molekularnih i ćelijskih mehanizama a dalje se transformišu iz jednog oblika u drugi putem antioksidantnih enzima. Neuspeh u eliminisanju ovih aktivnih vrsta dovodi do oštećenja ćelija. U toku evolucije aerobni organizmi su razvili enzimski i ne-enzimski antioksidantni sistem, kao i mehanizme za popravku oksidativno oštećenih makromolekula (Gopal DM i sar. 2001, Korantzopoulos P i sar. 2003). Progresija hronične srčane insuficijencije (HSI) je kompleksan proces u kome se remodelovanje miokarda smatra najznačajnijom determinantom u tom procesu a predpostavlja se da slobodni radikali preko direktnog štetnog efekta na metabolizam miocita i /ili na ekstracelularni matriks i aktivnost fibroblasta, učestvuju u patogenezi remodelovanja ( Kono Y i sar. 2006). S druge strane uz miokardni odgovor u HSI, remodelovanje krvnih sudova, odnosno endotelna disfunkcija, koja predhodi tom vidljivom remodelovanju, koje menjajući regionalnu preraspodelu ionako nedovoljnog minutnog volumena koje je oslabljeno srce u stanju da obezbedi, predstavlja važnu odrednicu intolerancije na napor kod bolesnika sa HSI. Sve to zajedno podstiče hroničnu aktivaciju kompenzatornih, neurohumoralnih mehanizama mehanizama (adrenergičku aktivaciju, aktivaciju renin-angiotenzin-aldosteronskog sistema-RAAS, endotelina, citokina) koji sada pored kompenzatornih efekata imaju i prooksidativne, kojim doprinose još većoj produkciji slobodnih radikala. Povećana produkcija slobodnih radikala dalje pogoršava endotel zavisnu vazodilataciju, smanjenjem količine azot oksida. To može biti posledica smanjene sinteze ovog jedinjenja u endotelnim ćelijama ili smanjnja antioksidativne aktivnosti ekstracelularnih enzima, superoksid dismutaze (SOD) i glutation peroksidaze (GPX) koji svojim sinhronizovanim delovanjem, indirektno, sprečavaju prevođenje NO u toksične metabolite. Naime, kliničkim studijama je pokazano da se SOD takmiči sa NO za vezivanje sa superoksid anjanonom. Tako narušena ravnoteža između produkcije slobodnih radikala i antioksidantnih odbrambenih mehanizama dovodi do oksidativnog stresa (Agarwal AK i sar., Wijeysundera HC i sar. 2003). Superoksid dizmutaza je prvi u kaskadi antioksidantnih enzima i zajedno sa glutation peroksidazom i katalazom čini prvu liniju odbrane učestvujući u eliminaciji primarnih proizvoda parcijalne redukcije molekulskog kiseonika. Superoksid dizmutaza prevodi superoksid anjon u vodonik peroksid, dok se vodonik peroksid katalitičkom aktivnošću glutation peroksidaze ili katalaze redukuje u vodu. S obzirom da superoksid dizmutaza redukuje superoksid anjon u vodonik peroksid, koji može biti preveden u toksični hidroksil radikal, neophodno je da superoksid dizmutaza, s jedne strane i glutation peroksidaza ili katalaza, s druge strane deluju sinhronizovano. U slučaju da je povećana aktivnost superoksid dizmutaze u odnosu na aktivnost glutation peroksidaze i/ili katalaze dolazi do nagomilavanja vodonik peroksida. Posledica smanjene aktivnost superoksid dizmutaze u odnosu na aktivnost glutation peroksidaze i/ili katalaze je nagomilavanje superoksid anjona. Ova smanjena aktivnost superoksid dizmutaze pokazana je i u rezultatima naše studije što je u jasnoj komparaciji sa rezultatima iz literature. Inače, svaki poremećaj ravnoteže izmedju ovih antioksidantnih enzima je opasan i nepoželjan (Castro PF i sar.2003, Sam F i sar. 2013), Aktivnost enzimskih komponenti antioksidantnog kapaciteta kod bolesnika sa hroničnom srčanom insuficijencijom je do sada vema retko određivan a stiče se utisak da je značaj enzimske antioksidativne zaštite od neprocenjivog značaja za očuvanje endotelne funkcije i prognozu bolesnika sa srčanom insuficijencijom. D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije Dejan Simeunovic, Petar M. Seferovic, Arsen D. Ristic, Dejan Nikolic, Dijana Risimic, Jelena Seferovic, Ruzica Maksimovic, Ivana Nedeljkovic, Radmila Karan, Milica Bajcetic. Evaluation of oxidative stress markers and catecholamines changes in patients with dilated cardiomyopathy before and after cardiopulmonary exercise tests. (rad je prihvaćen za publikovanje dana 07.01.2015 u Hellenic J Cardiol). E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija „ Oksidativni stres i hemodinamski parametri kod bolesnika sa hroničnom srčanom insuficijencijom“ dr Dejana Simeunovića predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju mehanizama koji učestvuju u patogenezi hronične srčane insuficijencije. Ovim istraživanjem pokazano je da promene parametara oksidativne zaštite, nivoa kateholamina i hemodinamskih parametara, pre i nakon testa fizičkim opterećenjem, su klinički veoma važni jer mogu da odrede težinu oboljenja i dugotrajnu prognozu bolesnika sa hroničnom srčanom insuficijencijom. Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci. Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata, komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati doktorsku disertaciju dr Dejana Simeunovića i odobri njenu javnu odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka. U Beogradu, 04.03.2015. Članovi Komisije: Mentor: Prof. dr Siniša Pavlović Prof. dr Petar Seferović _______________________ _______________________ Doc. dr Arsen Ristić Komentor: _______________________ Prof. dr Milica Bajčetić _______________________ Prof. dr Jovan Peruničić ________________________