UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Katarina R. Savić Vujović Efekti opioida i antagonista NMDA receptora na telesnu temperaturu i akutni nociceptivni bol kod pacova DOKTORSKA DISERTACIJA Beograd, 2014. godine UNIVERSITY OF BELGRADE MEDICAL FACULTY Katarina R. Savić Vujović The effects of opioids and NMDA receptor antagonists on the body temperature and acute nociceptive pain in rats Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Mentor: Članovi komisije: Prof. dr Sonja Vučković, Medicinski fakultet u Beogradu, _________________________________ Prof. dr Milica Prostran, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, predsednik komisije _________________________________ Prof. dr Dragan Đurić, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu, _________________________________ Prof. dr Miroslav Radenković, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu _________________________________ Prof. dr Dragan Milovanović, Medicinski fakultet , Univerzitet u Kragujevcu _________________________________ Doc. Maja Tomić, Farmaceutski fakultet, Univerzitet u Beogradu _________________________________ Zahvalnica Ova teza je urađena na Instituitu za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Sastavni je deo projekta Ministarstva nauke, prosvete i tehnološkog razvoja (br. 175023) pod nazivom: "Bazična i kliničko-farmakološka istraživanja mehanizama dejstva i interakcija lekova u nervnom i kardiovaskularnom sistemu”, čiji je rukovodilac prof. dr Milica Prostran. Posebnu zahvalnost dugujem prof. dr Milici Prostran na podršci, usmeravanju i veri u ono što radim. Zahvaljujem se svom mentoru prof. dr Sonji Vučković koja me je uvela u svet nauke i nesebično podelila svoja znanja sa mnom. Zahvaljujem se svim laborantima koji su mi pomogli u tehničkom delu eksperimenata za tezu. Zahvaljujem se svojoj porodici. Bez Vas ovo ne bi bilo moguće. Zahvaljujem se mom Filipu. Katarina Savić Vujović Efekti opioida i antagonista NMDA receptora na telesnu temperaturu i akutni nociceptivni bol kod pacova Uvod: Pored antinocicepcije, opioidi ispoljavaju značajne efekte i na telesnu temperaturu. Brojni dokazi podržavaju postojanje endogenog glutamatergičkog sistema koji moduliše telesnu temperaturu preko N-metil-D-aspartat (NMDA) receptora. Ketamin i magnezijum, NMDA antagonisti, su poznati po svojim anestetičkim, anagletičkim svojstvima, kao i dejstvu protiv drhtavice. Takođe, oni mogu povećati antinociceptivne efekte opioidnih analgetika u različitim modelima bola kod životinja, kao i kod ljudi. Cilj ispitivanja: Cilj ovog ispitivanja bilo je poređenje antinociceptivnih i hipertermnih odgovora između dve grupe agonista µ-opioidnih receptora: derivata fentanila (4-anilinopiperidinski tip) i morfina (fenantrenski tip) kod pacova. Takođe, ova studija imala je za cilj ispitivanje efekata ketamina i magnezijum sulfata na telesnu temperaturu i akutni nociceptivni bol kod pacova, da utvrdi tip interakcije između ova dva leka i da ispita da li magnezijum sulfat dodat ketaminu ili kombinaciji morfin-ketamin, povećava analgetički efekt ovih lekova i njihov efekt na telesnu temperaturu. Metode: Analgetička aktivnosti procenjivana je testom potapanja repa mužjaka Wistar pacova (200-250 g) u toplu vodu. Distalnih 5 cm repa stavljano je u toplu vodu (55 ± 0,5°C) i kao odgovor mereno je vreme za koje životinja povuče rep iz tople vode. Telesna temperatura je merena stavljanjem termometarske sonde u dužini od 5 cm u debelo crevo. Rezultati: Fentanil, (±)-cis-3-metil fentanil (CM), (±)-cis-3-karbometoksi fentanil, (±)- trans-3-karbometoksi fentanil i (±)-cis-3-butil- fentanil, kao i morfin, oksikodon (O), tebakon i 6,14-etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6-fluoro-3-hidroksi-,,17-trimetil-, (5,7) izazivali su dozno-zavisno povećanje antinocicepcije i hipertermije. Derivati morfina (fenantrenski tip) i fentanila (4-anilinopiperidinski tip) izazivali su hipertermiju kod pacova u dozama koje su oko 2 puta niže i 6-11 puta više od njihovih srednjih antinociceptivnih doza. Magnezijum sulfat (5 i 60 mg/kg, sc) nema uticaj ni na bazalnu telesnu temperaturu, ni na morfinsku hipertermiju. Subanestetičke doze ketamina (5-30 mg/kg), dovode do dozno- zavisnog sniženja bazalne telesne temperature, kao i morfinske hipertermije. Analizom krive doza-odgovor za efekte ketamina, kao i za kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat, utvrđeno je da postoji sinergistička interakcija, kao i da se doza ketamina smanjuje za 5,3 puta, kada se lekovi daju u fiksnoj kombinaciji (1:1). Mala fiksna doza magnezijum sulfata (5 mg/kg) povećava sniženje bazalne temperature izazvano ketaminom (1,25-10 mg/kg) za 2,5 puta, kao i sniženje morfinske hipertermije za 5,3 puta. Magnezijum sulfat (2,5-60 mg/kg, s.c.) i ketamin (2,5-30 mg/kg i.p.) primenjeni sami, nemaju nikakav antinociceptivni efekt. Postoji sinergistička interakcija između ketamina (2,5, 5 i 10 mg/kg) i magnezijum sulfata (5 mg/kg) u izazivanju antinocicepcije. Takođe i ketamin i magnezijum sulfat, kao i njihova kombinacija potenciraju antinociceptivne efekte morfina (2,6 mg/kg, i.p.). Veći efekt se postiže kada se ketamin primeni pre magnezijum sulfata. Zaključak: Ovo je prvo ispitivanje kojim je pokazana razlika između dve klase opioidnih lekova u jačini izazivanja hipertermije. U ovoj studiji je pokazano da magnezijum sulfat potencira analgetički efekt ketamina i morfin-ketamin kombinacije kod pacova u testu potapanja repa u toplu vodu, a veći efekt se postiže kada se ketamin primeni pre magnezijum sulfata. Ovo je prva studija kojom je pokazana sinergistička interakcija između magnezijum sulfata i ketamina u snižavanju telesne temperature i antinocicepciji, kao i statistička potvrda iste. Moguće je da bi sinergizam između ketamina i magnezijum sulfata mogao biti od kliničkog značaja. Ključne reči:NMDA antagonist, opioidi, telesna temperatura, akutni bol Naučna oblast: Farmakologija The effects of opioids and NMDA receptor antagonists on the body temperature and acute nociceptive pain in rats Introduction: In addition to producing antinociception, opioids exert profound effects on body temperature. A large body of evidence supports the existence of an endogenous glutamate system that tonically modulates body temperature viaN-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. Ketamine and magnesium, both NMDA receptor antagonists, are known for their anesthetic, analgesic and anti-shivering properties. They also enhance the antinociceptive effects of opioid analgesics in different animal models of pain, as well as in humans. Aim: This study aimed at comparing antinociceptive and hyperthermic responses between two groups of µ-opioid receptor agonists: fentanyl (4-anilinopiperidine-type) and morphine (phenanthrene-type) derivatives in rats. Also, study is aimed at evaluating the effects of ketamine and magnesium sulphate on body temperature and acute nociceptive pain in rats, to determine the type of interaction between them and at evaluating whether magnesium sulfate added to ketamine or morphine-ketamine combination produces higher level of analgesia and higher effect on body temperature. Methods: Analgesic activity was assessed by tail-immersion test in male Wistar rats (200- 250 g). The distal 5 cm of the tail was immersed in a warm water bath (55  0.5°C) and the time for tail-withdrawal was measured as a response latency. The body temperature was measured by insertion of a thermometer probe 5 cm into the colon of unrestrained rats. Results: Fentanyl, ()cis-3-methyl fentanyl, ()cis-3-carbomethoxy fentanyl, ()trans-3- carbomethoxy fentanyl and ()cis-3 butyl fentanyl and morphine, oxycodone, thebacon and 6,14-Ethenomorphinan-7-methanol, 4,5-epoxy-6-fluoro-3-hydroxy-,,17-trimethyl- , (5,7)produced dose-dependent increase in antinociception and hyperthermia. Morphine (phenanthrene-type) and fentanyl (4-anilinopiperidine-type) derivatives produced hyperthermia in rats at doses about 2 times lower, and 6 to 11 times higher, than their median antinociceptive doses. Magnesium sulphate (5 and 60 mg/kg, sc) showed influence neither on baseline, nor on morphine-evoked hyperthermic response. Subanesthetic doses of ketamine (5-30 mg/kg, ip) given alone, produced significant dose-dependent reduction in both baseline colonic temperature and morphine-induced hyperthermia. Analysis of the log dose–response curves for the effects of ketamine and ketamine-magnesium sulphate combination revealed synergistic interaction, and about 5.3 fold reduction in dosage of ketamine when the drugs were applied in fixed ratio (1:1) combinations. In addition, fixed low dose of magnesium sulphate (5 mg/kg, sc) enhanced the temperature lowering effect of ketamine (1.25-10 mg/kg, ip) on baseline body temperature and morphine-induced hyperthermia by factors of about 2.5 and 5.3, respectively. Magnesium sulfate (2.5-60 mg/kg, s.c.) and ketamine (2.5-30 mg/kg, i.p.) given alone did not produce any effect on antinociception. However, there is a synergistic interaction between ketamine (2.5, 5 and 10 mg/kg) and magnesium sulfate (5 mg/kg). Also, both ketamine and magnesium sulfate, as well as their combination potentiated the antinociceptive effect of morphine (2.6 mg/kg, i.p.). The greater response was obtained when ketamine is given before magnesium sulfate. Conclusion: This study is first to identify difference between these two classes of opioid drugs in their potencies in producing hyperthermia. This study revealed potentiation of ketamine and morphine-ketamine combination by magnesium sulfate in tail-immersion test in rats with higher activity when ketamine is given before magnesium sulfate. It is first time to demonstratethe synergistic interaction between magnesium sulphate and ketamine in lowering body temperature and in antinociception and its statistical confirmation. It is possible that the synergy between ketamine and magnesium may have clinical relevance. Keywords: NMDA antagonist, opioids, body temperature, acute pain Scientific area: Pharmacology SADRŽAJ: I UVOD.................................................................................................................................. 1 I.1. Patofiziologija bola ...................................................................................................... 1 I.2. Opioidni analgetici ....................................................................................................... 2 I.2.1. Opioidni receptori ................................................................................................. 4 I.2.2. Neželjena dejstva opioidnih analgetika ................................................................. 7 I.2.3. Uticaj opioida na telesnu temperaturu................................................................... 8 I.3. NMDA receptori .......................................................................................................... 8 I.3.1. Uloga NMDA receptora u nocicepciji ................................................................ 11 I.3.2. Ketamin i magnezijum u lečenju bola ................................................................. 11 I.3.3. Ketamin ............................................................................................................... 12 I.3.4. Magnezijum......................................................................................................... 13 I.3.5. Opioidi i antagonisti NMDA receptora u analgeziji ........................................... 14 I.3.6. Uticaj NMDA receptora na telesnu temperaturu................................................ 15 I.4. Hipotalamička regulacija telesne temperature ........................................................... 17 I.5. Uticaj različitih sistema u regulaciji telesne temperature........................................... 18 I.5.1. Uticaj adrenergičkog sistema u regulaciji telesne temperature ........................... 18 I.5.3. Uloga gabaergičkog sistema u regulaciji telesne temperature ............................ 19 I.5.4. Uloga NO u regulaciji telesne temperature ......................................................... 19 I.5.5. Uloga opioidergičkog sistema u regulaciji telesne temperature.......................... 20 I.5.6. Uloga ATP senzitivnih kalijumskih kanala u regulaciji telesne temperature ..... 20 II CILJEVI ISTRAŽIVANJA ........................................................................................... 22 III MATERIJAL I METODE ........................................................................................... 23 III.1. Eksperimentalne životinje ....................................................................................... 23 III.2. Supstance korišćene u eksperimentima: .................................................................. 23 III.3. Eksperimentalni protokol (1-5) ............................................................................... 25 III.4. Metode ..................................................................................................................... 26 III.4.1. Test potapanja repa u toplu vodu (eng. tail-immersion test) ............................ 26 III.4.2. Merenje telesne temperature............................................................................. 27 III.4.3. Rotarod test....................................................................................................... 27 III.5. Analiza rezultata ...................................................................................................... 28 III.5.1. Analiza dejstva analoga morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu................................................................................................................... 28 III.5.2. Analiza efekta morfina, ketamina i magnezijum sulfata na antinocicepciju .... 29 III.5.3. Analiza efekta morfina, ketamina i magnezijum sulfata na telesnu temperaturu ...................................................................................................................................... 31 III.5.4. Analiza dejstva antagonista na ketamin i na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat ............................................................................................................................. 34 III.6. Statistička analiza .................................................................................................... 35 IV REZULTATI ................................................................................................................. 36 IV.1. Uticaj derivata morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu kod pacova............................................................................................................................... 36 IV.1.1. Derivati fentanila: jačina u izazivanju antinocicepcije i hipertermije .............. 36 IV.1.2. Derivati morfina: jačina u izazivanju antinocicepcije i hipertermije ............... 38 IV.1.3.Veličina dejstva fentanila i morfina na telesnu temperaturu............................. 40 IV.1.4. Vreme postizanja maksimalnih antinociceptivnih i hipertermnih efekta derivata fentanila i morfinai dužina trajanja............................................................................... 40 IV.1.5. Efekt naloksona na antinociceptivne i hipertermne efekte derivata fentanila i morfina ......................................................................................................................... 40 IV.2. Antinociceptivni efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija ...................................................................................................................... 44 IV.2.1. Efekt magnezijuma sulfata na antinocicepciju izazvanu morfinom................. 44 IV.2.2. Efekt ketamina na antinocicepciju izazvanu morfinom ................................... 45 IV.2.3. Sinergizam između ketamina i magnezijum sulfata u testu potapanja repa u toplu vodu..................................................................................................................... 46 IV.2.4. Uticaj kombinacija ketamin-magnezijum sulfati magnezijum sulfat-ketamin na antinocicepciju izazvanu morfinom u testu potapanja repa u toplu vodu .................... 49 IV.2.5. Dejstvo naloksona na kombinaciju morfin-ketamin-magnezijum sulfat ......... 52 IV.2.6. Dejstvo kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat na motornu spretnost pacova........................................................................................................................... 54 IV.3. Efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija na telesnu temperaturu pacova........................................................................................................... 55 IV.3.1. Efekt magnezijum sulfata na bazalnu temperaturu i na morfinsku hipertermiju ...................................................................................................................................... 55 IV.3.2. Efekt ketamina na bazalnu temperaturu ........................................................... 56 IV.3.3. Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu pacova ...................................................................................................................................... 58 IV.3.4. Efekti ketamina i magnezijum sulfata na morfinsku hipertermiju ................... 64 IV.3.5. Nalokson antagonizuje dejstvo morfina i kombinacije morfin-ketamin i morfin-ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu kod pacova ..................... 69 IV.4. Mehanizam hipotermnog dejstva kombinacije ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg), rezultati ................................................................................................. 71 IV.4.1. Dejstvo johimbina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 71 IV.4.2. Dejstvo metizergida na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 73 IV.4.3. Dejstvo bikukulina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 74 IV.4.4. Dejstvo L-arginina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 76 IV.4.5. Dejstvo L-NAME na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 77 IV.4.6. Dejstvo naloksona na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)........................................................................................................................... 78 IV.4.7. Dejstvo glibenklamida na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) ...................................................................................................................... 80 IV.5. Mehanizam hipotermnog dejstva ketamina (10 mg/kg).......................................... 81 IV.5.1. Dejstvo johimbina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) ......................... 81 IV.5.2. Dejstvo metizergida na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg)....................... 82 IV.5.3. Dejstvo bikukulina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg)......................... 84 IV.5.4. Dejstvo L-arginina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg)......................... 85 IV.5.5. Dejstvo L-NAME na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) .......................... 86 IV.5.6. Dejstvo naloksona na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) ......................... 87 IV.5.7. Dejstvo glibenklamida na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg)................... 88 V DISKUSIJA..................................................................................................................... 89 V.1. Uticaj derivata morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu kod pacova............................................................................................................................... 89 V.2. Antinociceptivni efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija ...................................................................................................................... 91 V.3. Efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija na telesnu temperaturu pacova........................................................................................................... 95 V.4. Mehanizam hipotermnog dejstva ketamina (10 mg/kg)/kombinacije ketamin- magnezijum sulfat .......................................................................................................... 100 V.4.1. Dejstvo johimbina na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg)...................................................................................... 101 V.4.2. Dejstvo bikukulina na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg)...................................................................................... 103 V.4.3. Dejstvo metizergida na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg)...................................................................................... 104 V.4.4. Dejstvo L-arginina i L-NAME na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg)......................................................................... 106 V.4.5. Dejstvo naloksona na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg)...................................................................................... 108 V.4.6. Dejstvo glibenklamida na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg)...................................................................................... 110 VI ZAKLJUČCI ............................................................................................................... 112 VII LITERATURA ......................................................................................................... 115 1I UVOD Bol se definiše kao neprijatan osećaj i emocionalno iskustvo izazvano stvarnim ili potencijalnim oštećenjem tkiva (IASP – International Association for Study od Pain). Najčešći je simptom koji pacijenta dovodi do lekara. Prema mehanizmu nastanka bol može biti nociceptivni i neuropatski (Vučković i sar., 2012). Nociceptivni bol je posledica aktivnosti nervnog sistema kojom se mozak upozorava da na organizam deluje ugrožavajući bolni stimulus (noksa). Nokse mogu biti mehaničke, termičke i hemijske, a sa aspekta terapije bola najznačajnije su hemijske nokse, koje se oslobađaju iz ishemičnog ili povređenog tkiva (u procesu zapaljenja). Nokse deluju na specifične receptore za bol (nociceptore), ogoljene nervne završetke primarnih senzornih neurona, i prouzrokuju stvaranje bolnih impulsa. Nociceptivni bol može biti somatski i visceralni (Vučković i sar., 2012). I.1. Patofiziologija bola Oštećenje tkiva uzrokuje doživljaj bola u sadejstvu četiri fiziološka procesa: transdukcija, transmisija, percepcija i modulacija (Berry i sar., 2006). Transdukcija je proces konverzije mehaničke, termičke ili hemijske energije bolne draži u električnu energiju receptora za bol (Willis, 1985). Nociceptori su u vidu slobodnih nervnih završetaka, ne ispoljavaju spontanu aktivnost,ali za razliku od drugih receptora, podležu senzitizaciji. Transmisijom bola se označava proces prenosa generisanih akcionih potencijala iz nociceptora u kičmenu moždinu i mozak (Warren i sar., 2002). Percepcija bola je neprijatan osećaj u određenom delu tela praćen pretećim, negativnim emocijama (Merskey i Bugduk, 1994). Nociceptivne draži prenete neospinotalamičkim putem preko ventroposterolateralnih i ventroposteromedijalnih talamičkih jedara završavaju se u kontralateralnom primarnom somatosenzornom korteksu, gde se nadražaj somatotopski mapira, te se određuje mesto, intenzitet i kvalitet bola. 2Nociceptivne draži prenete spinoretikularnim, spinomezencefaličnim i spinohipotalamičkim putem završavaju se u limbičkom sistemu, insularnom i frontalnom korteksu i posreduju u nastanku afektivnog doživljaja bola (Wallace, 1992). Modulacijom bola označavamo descendentnu kontrolu nociceptivne transmisije koja se ostvaruje inhibitornim dejstvom descendentnih puteva iz somatosenzorne, frontalne i limbičke kore, kao i iz periventrikularnih jedara hipotalamusa, periakveduktalne sive mase i nuclei raphe na neurone zadnjih rogova kičmene moždine. Patofiziološka klasifikacija definiše postojanje nociceptivnog i neuropatskog bola (Warren i sar., 2002; Wallace, 1992). Nociceptivni bol je uzrokovan aktivacijom perifernih Aδ i C-nociceptivnih receptora pod dejstvom štetnih draži (povreda, bolest, inflamacija) i predstavlja normalni biološki odgovor, signal narušenog telesnog, anatomskog ili funkcionalnog integriteta. Lokalni mehanizmi u nastanku nociceptivnog bola podrazumevaju hiperekscitabilnost nociceptora pri svakom dejstvu mehaničke, termičke, hemijske ili neke druge štetne draži, što odgovara perifernoj senzitizaciji uzrokovanoj pojačanom ekspresijom jonskih kanala za natrijum u perifernim završecima nociceptora. U odnosu na dužinu trajanja, bol može biti akutan i hroničan. I.2. Opioidni analgetici Opioidni analgetici su lekovi koji se koriste u terapiji: jakih akutnih bolova (npr. opekotine, trauma, infarkt miokarda, hirurške intervencije i druge bolne procedure), umerenih do jakih bolova malignog porekla, umerenih do jakih hroničnih nemalignih bolova organskog porekla, jakih neuropatskih bolova. Opioidni analgetici se koriste neposredno pre ili za vreme anestezije jer smanjuju potrebe za drugim lekovima tokom anestezije, a mogu se koristiti i u velikim dozama kao samostalni anestetici za kardiovaskularne operacije. Takođe, koriste se za otklanjanje postoperativnog bola (Vučković, 2012). Predstavnik grupe jakih opioidnih analgetika je morfin. Morfin je 1806. godine izolovan kao najvažniji aktivni sastojak opijuma. Psihotropni efekti samog opijuma pominjani su još u starom veku, kada se verovatno koristio u ritualne svrhe i kao analgetik 3(Lehmann, 1997). Mada se morfin može dobiti i sintetskim putem u laboratoriji, on se i dalje dominantno proizvodi iz opijuma, zasecanjem nezrelih čaura maka, jer čini 10% od njegove ukupne mase. U svom molekulu morfin ima dve hidroksilne grupe i njihovom supstitucijom dobijaju se različiti polusintetski derivati morfina. Fentanil je sintetski opioidni analgetik sa brzim početkom i kratkim trajanjem dejstva. Jak je agonist μ-opioidnog receptora. Analgetičko dejstvo fentanila se najvećim delom ostvaruje stimulacijom supraspinalnih opioidnih receptora (Miaskowski i sar., 2005). Koristi se u anesteziji u preoperativnoj proceduri, u terapiji probojnog bola. Fentanil je oko 100 puta potentniji od morfina: 100 mikrograma fentanila je aproksimativno ekvivalentno sa 10 mg morfina (Vučković i sar., 2009). 4I.2.1. Opioidni receptori Dejstvo jakih opioidnih analgetika zasniva se na njihovoj sposobnosti da se vežu za opioidni receptor, da ga aktiviraju i pokrenu niz reakcija koje dovode do farmakološkog efekta tj. analgezije. Opioidni receptori (mu, kappa, delta) su membranski receptori vezani za G-protein. Po IUPHAR klasifikaciji postoje tri vrste opioidnih receptora i to MOP, DOP i KOP (Dietis i sar., 2011). Prema farmakološkom podtipu, opioidni receptori su podeljeni na mi (μ1, μ2 i μ3), deltaϭ(ϭ1 i ϭ2) i kapa (1a, 1b, 2a,2b i 3). Podela opioidnih receptora, kao i njihova distribucija i funkcija prikazana je u tabeli 1. Pre nekoliko decenija su rađene studije vezivanja i farmakološke studije podtipova opioidnih receptora. Međutim, kako eliminacija jednog jedinog gena koji kodira µ-opioidne receptore dovodi do prestanka funkcije µ- receptora (kako analgezije, tako i depresije disanja), dalje podklasifikovanje primarnih tipova opioidnih receptora nema smisla (Dietis i sar., 2011). Dalja ispitivanja eliminacije gena kod miševa ukazuju na to da su različiti efekti agonista µ-opioidnih receptora posredovani posebnim intracelularnim signalnim putevima (Davis, 2012). Standardni agonisti i antagonisti aktiviraju ili inaktiviraju celokupnu mrežu prenošenja signala receptora. Međutim, „pristrasni” ligandi selektivno aktiviraju neke signale, izbegavajući, ili čak inaktivirajući druge signale posredovane istim receptorom (Rives i sar., 2012; Rivero i sar., 2012; Nozaki i sar., 2012; Pradhan i sar., 2012). Na primer, morfin pre aktivira puteve posredovane beta-arestinom 2 in vivo, dok fentanil i metadon mogu da aktiviraju prenošenje signala posredovano i beta-arestinom 1 i beta-arestinom 2 (Groer i sar., 2011). 5Tabela 1. Podela, distribucija i funkcija opioidnih receptora Farma- kološki podtip Broj gena IUPHAR klasifikacija Rasprostranjenost Mogući diskriminator ni ligand Drugi relevantni ligandi Funkcija/efekt μ1 jedan MOP Mozak, kičmena moždina, periferija Naloksonazine (antagonist) Morfin (agonist), TRIMU-5 (antagonist), b-FNA (antagonist), Dihidromorfin (agonist), Nalokson (antagonist), Nalorfin (anagonist) Kodein (agonist), Oksikodon (agonist) Analgezija μ2 MOP Mozak, kičmena moždina, periferija TRIMU-5 (agonist), M6G (agonist) Morfin (agonist), nalokson (antagonist), Dihidromorfin (agonist), b-FNA (antagonist), M6G (agonist), heroin (agonist), Naloksonazin (antagonist) Analgezija, GI trakt, respiratorna depresija, svrab μ3 MOP Imune ćelije, amigdala, periferne neuralne, CV endotelne ćelije Nesenzitivnost opioidnog peptida Morfin (agonist), nalokson (antagonist), dihidromorfin (agonist), b-FNA (antagonist), M6G (agonist) Različite funkcije koje uključuju oslobađanje NO ϭ 1 jedan DOP Mozak, periferija DPDPE (agonist), BNTX (antagonist), DALCE (antagonist) Enkefalin (agonist), deltorfin-D (agonist), naltrekson (antagonist) Analgezija, kardioprotekcija 6ϭ 2 DOP Mozak i kičma Deltorfin-II (agonist), DSLET (agonist) 5- NTII (antagonist), Naltriben (antagonist) Enkefalin (agonist), deltorfin-D (agonist), naltrekson (antagonist), deltorfin-II (agonist) Analgezija, kardioprotekcija, termoregulacija 1a jedan KOP Mozak (nucleus accumbens, neocortex, cerebellum) Dinofin A (agonist), U50,488H (agonist) nor-BNI (antagonist), U69,593 (agonist) Analgezija, hranjenje 1b KOP Dinorfin B (agonist), a-neoendorfin (agonist) 2a KOP Mozak (hipokampus, talamus, moždano stablo) nor-BNI (antagonist), bremazocin (agonist) Analgezija, diureza, neuroendokrina funkcija 2b KOP Leu-enkefalin (antagonist), oksikodon (agonist) Nalorfin (agonist), nor-BNI (antagonist) 3 KOP Mozak NalBzOH Spinalna analgezija, periferni efekti Preuzeto iz: Dietis i sar., 2011 Opioidni analgetici se vezuju za presinaptičke opioidne receptore na centralnim nastavcima primarnih aferentnih neurona i smanjuju oslobađanje neurotransmitera u sinapsama u zadnjim rogovima kičmene moždina (Schumacher i sar., 2005). Sa druge strane, svojim dejstvom na postsinaptičke receptore na neuronima zadnjih rogova kičmene moždine, inhibišu postsinaptički neuron i transmisiju bolnog nadražaja. Osim u kičmenoj moždini, opioidni receptori nalaze se i na supraspinalnim mestima, u oblastima mozga koje učestvuju u procesu transmisije i modulacije bolnog nadražaja (periakveduktalna siva masa, locus coeruleus, nucleus raphe magnus) (Stannard i Booth, 2004). Vezivanje opioida za 7ove receptore pojačava aktivnost u descedentnim inhibitornim putevima mozga. Opisani su i periferni opioidni receptori koji se nalaze van centralnog nervnog sistema i koji se aktiviraju u području inflamacije. Vezivanje opioida za ove receptore inhibira process transdukcije bolnog nadražaja. I.2.2. Neželjena dejstva opioidnih analgetika Najveći broj opioidnih analgetika, koji je danas u kliničkoj primeni, relativno je selektivan za  opioidne receptore (agonisti) i ispoljava farmakološki profil sličan morfinu. To su najjači analgetici uopšte. Za razliku od neopioidnih analgetika, kao i slabih opioidnih analgetika, jaki opioidni analgetici nemaju gornju granicu efikasnosti tj. mogu da otklone i najjače bolove. Njihova efikasnost limitirana je samo pojavom neželjenih dejstava, pre svega depresijom disanja. Agonisti-antagonisti (agonisti  - antagonisti ) manje su efikasni u odnosu na  agoniste. U analgetičkim dozama mogu da izazovu jaku sedaciju, psihomimetske efekte (npr. halucinacije, noćne more i anksioznost), pokazuju nešto manju sklonost ka razvoju tolerancije i zavisnosti od  agonista i izazivaju depresiju disanja (Vučković, 2012). Opioidni analgetici ispoljavaju veliki broj neželjenih efekata. Najčešće neželjena dejstva su mučnina i povraćanje, opstipacija, suvoća usta, spazam žučnih puteva; veće doze mogu da izazovu rigiditet mišića, hipotenziju, kao i depresiju disanja. Ostala, česta neželjena dejstva su bradikardija, tahikardija, palpitacije, edemi, posturalna hipotenzija, halucinacije, vertigo, euforija, disforija, zavisnost, vrtoglavica, konfuzija, pospanost, poremećaj spavanja, glavobolja, seksualna disfunkcija, otežano mokrenje, retencija urina, spazam uretera, mioza, poremećaj vida, znojenje, crvenilo kože, ospa, urtikarija i svrab(Vučković, 2012). Upravo zbog velikog broja neželjenih dejstava, sve je češća kombinacija opioida sa drugim lekovima, npr. sa NMDA antagonistima, gde kombinujemo manje doze svakog od pojedinačno uzetog leka i time povećavamo efikasnost i smanjujemo neželjena dejstva. 8I.2.3. Uticaj opioida na telesnu temperaturu Endogeni opioidni peptidi i opioidni lekovi utiču na mnoge fiziološke procese, uključujući analgeziju, neuroendokrinu funkciju, unos hrane i regulaciju telesne temperature. µ-opioidi imaju ulogu i u kontroli procesa neuroinflamacije (Benamar i sar., 2007). Lipopolisaharidi i endogeni pirogeni (osim IL-1beta i prostaglandina), preko opioidnog sistema, mogu da izazovu groznicu (Fraga i sar., 2008). Pokazalo se da su efekti opioidnih lekova na telesnu temperaturu složeni i da zavise od mnogih faktora (vrste, soja, starosti životinje; doze, puta primene leka; specifičnosti receptora kao i od temperature okoline) (Adler i Geller, 1989; Vučković i sar., 1998; Rawls i Benamar, 2011). Međutim, smatra se da su najznačajniji, selektivnost jedinjenja prema opioidnom receptoru i primenjena doza. Kod pacova i miševa, manje doze centralno ili sistemski primenjenog morfina i drugih opioidnih analgetika izazivaju hipertermiju, a veće doze dovode do hipotermije pri standardnoj temperaturi okoline (Chen i sar., 2005). Mada se pretpostavlja da svi agonisti µ-opioidnih receptora izazivaju sličan efekt na telesnu temperaturu, neki podaci su oprečni. U ispitivanju Bakera i Meerta (2002), intraperitonealno (ip) primenjen morfin izazvao je hipertermiju kod miševa, dok ona nije bila primećena prilikom primene fentanila, koji je daleko selektivniji od morfina za µ-opioidne receptore. U nekim ispitivanjima na glodarima, fentanil je izazvao značajnu hipertermiju (Vučković i sar., 1998; Cao i Morison, 2005). Do sada nije urađeno nijedno ispitivanje u kome je poređena razlika između strukturno različitih serija µ agonista i njihovih efekta na telesnu temperaturu. Osim toga, niko nije direkno poredio hipertermički odgovor sa antinocicepcijom. I.3. NMDA receptori Jonotropni glutamatni receptori, kojih ima najmanje tri podtipa, farmakološki su izdvojeni na osnovu specifičnog vezivanja N-metil-D-aspartata (NMDA receptori), kainatne kiseline (kainatni receptori, KAI) i alfa-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazola 9(AMPA receptori). Oni spadaju u grupu voltažno zavisnih i voltažno nezavisnih receptora. Njima se reguliše protok jona kalcijuma, natrijuma i kalijuma. Kainatni i AMPA receptori čine grupu ne-NMDA receptora. Preko njih se ostvaruje brza ekscitatorna transmisija u sinapsama, koja je primarno vezana za voltažno-nezavisne kanale. Ovde se depolarizacija ostvaruje prvenstveno influksom jona natrijuma (Jelenković i sar., 2002). Od svih jonotropnih receptora najbolje je izučen NMDA receptor, koji predstavlja deo NMDA receptorsko-kanalskog kompleksa. Aktivnost ovog kompleksa regulišu četiri vezna mesta, od kojih su neka smeštena u samom kanalu (Davidson i Carlton, 1998). U prostim moždanim sinapsama NMDA receptori obično koegzistuju ili sa AMPA ili sa kainatnim receptorima. Na funkciju NMDA receptorskog kompleksa od svih jona najsnažniji uticaj imaju joni magnezijuma i cinka. U stanju mirovanja joni magnezijuma vrše fiziološku blokadu NMDA receptora. Da bi se oni odstranilii time omogućilo da NMDA receptori doprinesu električnom odgovoru ćelije, neophodna je depolarizacija postsinaptičke membrane, koja zavisi od AMPA/KA aktivacije i/ili drugih modulatornih postsinaptičkih signala. Depolarizacija i aktivacija NMDA receptora dovode do relativno spororastućih, dugotrajnih jonskih struja koje se primarno ostvaruju preko protoka jona kalcijuma (Michaelis, 1998). Pored glutamata ili NMDA, aktivnost NMDA receptora kontrolišu i druga regulacijska mesta. Jedno od njih je vezno mesto za glicin koji se ponaša kao koagonist, dovodeći do povećavanja frekvencije otvaranja kanala. Stoga bi lekovi koji blokiraju ovo mesto (nekompetitivni antagonisti NMDA receptora− kinurenska kiselina) mogli da smanje efekte NMDA agonista. U samom kanalu NMDA receptorskog kompleksa postoji tzv. fenciklidinsko mesto za koje se različitim afinitetom vezuju jedinjenja koja čine grupu nekompetitivnih antagonista NMDA receptora. U njih spadaju fenciklidin (PCP), dizocilpin (MK801), ketamin i drugi. Fenciklidin i MK-801 imaju visoki afinitet za ovo vezno mesto, a memantin, dekstrorfan i dekstrometorfan nizak (Wei i Petrovaara, 1999) (Slika I.3). 10 Slika I.3. NMDA receptor. U stanju mirovanja jonski kanal NMDA receptora blokira magnezijum. Usled depolarizacije ćelijske membrane dolazi do istiskivanja magnezijuma i ulaska jona natrijuma i kalcijuma u ćeliju. AMPA- alfa-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol KAI- kainatna kiselina NMDA- N-metil-D-aspartat CNQX- (6-ciano-7-nitrokvinoksaline-2,3-dion) - kompetitivni antagonist AMPA/kainatog receptora APV- (2R)-amino-5-fosfonovalerična kiselina; (2R)-amino-5-fosfonopentanoat)- selektivni kompetitivni antagonist NMDA receptora 11 I.3.1. Uloga NMDA receptora u nocicepciji Mnogi eksperimenti potvrdili su pretpostavku da stimulacija NMDA i ne-NMDA receptora dovodi do nastanka i održavanja bola. Mnogi od njih pokazuju da u tim procesima ključno mesto zauzimaju NMDA receptori u ganglionima zadnjih korenova kičmene moždine i u pojedinim delovima mozga, u kojima su oni veoma zastupljeni, kako pre-, tako i postsinaptički. Svojim ascendentnim i descendentnim aktivnostima ovi receptori modulišu prenošenje nociceptivnih stimulusa sa periferije (Wei i Petrovaara, 1999). Naime, nociceptivni impulsi koji se prenose u kičmenu moždinu nemijelinizovanim C vlakanima i mijelinizovanim A vlaknima dovode do osolobađanja glutamata u kičmenoj moždini i do pojave bola. Međutim, utvrđeno je da su u patogenezi bola od značaja i NMDA receptori lokalizovani na perifernim nervnim završecima. Tako su, na primer, Davidson i saradnici (1998) utvrdili da je prethodno davanje ketamina, memantina i dekstrometorfana uspešno suzbijalo efekte intraplantarno primenjenog formalina. U drugom eksperimentu ustanovljeno je da agonisti NMDA, AMPA i kainatnih receptora aplikovani na kožu, izazivaju alodiniju i mehaničku hiperalgeziju (Davidson i Carlton, 1998). Dodatnu potvrdu za svoje pretpostavke isti autori dobili su primenom antagonista ovih receptora i posledičnim smanjenjem mehaničke hiperalgezije izazvane agonistima. Osim ovoga, stimulacija zubne pulpe dovodi do aktiviranja jonotropnih receptora na periferiji i time doprinosi oslobađanju vazoaktivnih peptida koji učestvuju u inflamaciji (Jackson i Hargreaves, 1999). I.3.2. Ketamin i magnezijum u lečenju bola Eksperimentna istraživanja nedvosmisleno su utvrdila da su jonotropni receptori od neprocenjivog značaja u patogenezi bola. Na osnovu ovih istraživanja, rađena su klinička ispitivanja analgetičkih efekata pojedinih antagonista NMDA receptorskog kompleksa. U brojnim studijama ispitivan je njihov efekt u terapiji bola različite etiologije: neuropatski (Maurset i sar., 1989) i ishemijski bol (Stannad i Porter, 1993). I pored toga što rezultati još nisu usaglašeni, pojedini nalazi ohrabruju i upućuju na potrebu daljih istraživanja u istom 12 smeru. Od velikog broja ponuđenih antagonista jonotropnih receptora u kliničkim ispitivanjima bola najčešće se koriste ketamin, dekstrometorfan (antitusik sa svojstvima antagonista NMDA receptora), memantin i amantadin. I.3.3. Ketamin Ketamin je antagonist NMDA receptora, pogodan za kliničku upotrebu. Vezuje se za fenciklidinsko mesto u kanalu, kada je kanal otvoren (Øye, 1998) ili se može vezati za membransko mesto preko koga smanjuje frekvencu otvaranja kanala (Orser i sar., 1997a). Ketamin je disocijativni anestetik koji ima analgetička dejstva u subanestetičkim dozama (Persson, 2010). Kako ispoljava mali rizik za nastanak kardiorespiratorne depresije, odličan je lek za terapiju bola kod trauma (Hirota i Lambert, 2011). Međutim, neželjena dejstva ketamina nastaju već u terapijskim dozama i to su sedacija, poremećaj motorike, konfuzija, halucinacije i dr. Ketamin sprečava nastanak hiperalgezije i tolerancije izazvane opioidima i smanjuje potrebu za opioidima, a time i nastanak neželjenih dejstava (Laulin i sar., 2002; McCartney i sar., 2004; Bell i sar., 2006; Campos i sar., 2006; Holtman i sar., 2008; Carstensen and Møller, 2010; Hales i sar., 2011). Farmakološki profil dejstava ketamina ne može se objasniti samo jednim mehanizmom. Analgetičko, anestetičko i simpatikomimetsko dejstvo se ostvaruje antagonizmom NMDA receptora. Isti je mehanizam za neuroprotektivno dejstvo. Ketamin poseduje analgetička svojstva koja su posledica njegovih interakcija sa kalcijumskim i natrijumskim kanalima, dopaminskim, ali i sa opioidnim receptorima, kao i sa ponovnim preuzimanjem noradrenalina i serotonina. Takođe ketamin utiče na holinergičku transmisiju. Uvođenje u anesteziju, kao i nastanak halucinacija mogu se pripisti inhibiciji centralne i periferne holinergičke transmisije. Ima i antiinflamatorna svojstva (Hirota i Lambert, 1996). Simpatomimetička svojstva ostvaruje preko povećanja centralne i periferne monoaminergičke transmisije. Ketamin ima ulogu i u neuromuskularnoj transmisiji (Adams, 1998). Ketamin ima efekt na voltažno zavisne transmembranske jonske kanale, 13 receptore vezane za G-protein, transmitere kao i NO-cGMP sistem u neuronima (Kress, 1997). I.3.4. Magnezijum Magnezijum je fiziološki nekompetitivni N-metil-D-aspartat (NMDA) antagonist koji blokira jonski kanal na dozno-zavistan način (Na i sar., 2011). Nema mnogo dokaza da magnezijum, kada se primeni sam, ispoljava analgetsko dejstvo (Rondón i sar., 2010; Borazan i 2012; Yousef i Al-Deeb, 2013). Pokazano je da magnezijum može da poveća analgeziju izazvanu opioidima, opštim i lokalnim anesteticima u različitim modelima bola (Gupta i sar., 2011; Nechifor i sar., 2011). Veliki broj studija ispitivao je efekte magnezijuma kao adjuvantnog analgetika za postoperativni bol i dobijeni su oprečni rezultati. Na osnovu pregleda rezultata 14 studija, zaključeno je da nema ubedljivih dokaza da magnezijum može smanjiti postoperativni bol (Lysakowski i sar., 2007). Brojna nova randomizirana kontrolisana klinička ispitivanja pokazala su da magnezijum ipak smanjuje postoperativni bol, kao i potrebu za analgeticima nakon operacije (Herroeder i sar., 2011; Nechifor i sar., 2011). Postoji nekoliko teorija vezanih za mehanizam dejstva magnezijuma, kako u perifernim tkivima, tako i u centralnom nervnom sistemu (Murck, 2002; Siwek i sar., 2005; Soave i sar., 2009). Svoje efekte u centralnom nervnom sistemu ostvaruje posredstvom glutamatergičkog neurotransmiterskog sistema i to blokiranjem NMDA receptora, potenciranjem GABA-ergičke transmisije, a pri tome su ova dva neurotransmiterska sistema od izuzetnog značaja u regulaciji aktivnosti integrativnih funkcija CNS-a. Pokazano je da magnezijum blokira kalcijumove kanale vezane za NMDA receptore, pa se smatra da je to ključni mehanizam preko koga ostvaruje svoje centralne efekte (Siwek i sar., 2005; Decollogne i sar., 1997). Pokazano je da magnezijum smanjuje aktivnost ne samo NMDA receptora, već takođe redukuje aktivnost presinaptičkih i postsinaptičkih kalcijumskih kanala, modulira oslobađanje neurotransmitera. Ispoljava modulatorno dejstvo na natrijumske i kalijumske kanale, i tako može da utiče na membranski potencijal (Herroeder i sar., 2011). 14 U perifernim strukturama magnezijum utiče na Na+-K+-ATP-azu, ali i na funkciju kalcijum zavisne protein kinaze C (Murck, 2002). Magnezijum inhibira oslobađanje acetilholina (Ishizaki i sar., 1999). Magnezijum ima uticaj i na sve komponente osovine hipotalamus-hipofiza-nadbubrežna žlezda. Sistemska primena magnezijuma ispoljava miorelaksantni efekt, ima antiaritmijsko delovanje i pospešuje dilataciju koronarnih i perifernih krvnih sudova, a deluje i kao modulator dejstva kateholamina u centralnom i perifernom nervnom sistemu (Iannello i Belfiore, 2001). Literaturni podaci ukazuju na to da ketamin i magnezijum mogu stupati u interakciju i to na aditivan, supraaditivan i antagonistički način u izazivanju analgezije ili anestezije (Harrison i Simmonds, 1985; MacDonald i sar., 1991; Irifune i sar., 1992; Liu i sar., 2001; Orser i sar., 1997b; Queiroz-Castro i sar., 2006; DeRossi i sar., 2012). I.3.5. Opioidi i antagonisti NMDA receptora u analgeziji Poznato je da N-metil-D-aspartat (NMDA) receptori imaju ulogu u akutnom antinociceptivnom efektu morfina. Pretretman ili koadministracija NMDA antagonista može povećati antinociceptivni efekt morfina u različitim modelima termalne nocicepcije kod životinja (Allen i Dykstra, 2003; Nemmani i sar., 2004; Fischer i sar., 2005; Grisel i sar., 2005). Takođe je poznato da NMDA antagonisti mogu povećati morfinom izazvanu analgeziju kod ljudi pod određenim uslovima (Javery et al., 1996; Bossard et al., 2002). Manje je poznato da NMDA antagonisti mogu povećati antinociceptivne efekte slabo efikasnih opioida. Jedan od dokaza je i studija koja pokazuje da kompetitivni NMDA antagonist LY235959 može povećati antinociceptivnu aktivnost buprenorfina i butorfanola kod majmuna (Allen i sar., 2003). Na ovaj način bi možda mogli povećati kliničku efikasnost slabih opioida. Ovi podaci ukazuju i na to da NMDA receptorski sistem učestvuje u opioidnoj antinocicepciji, ali nije utvrđeno o kojoj interakciji se tačno radi, da li je to prosta aditivnost ili neka druga vrsta interakcije (Fischer i Dykstra, 2006). Poslednjih godina došlo je do značajnog napretka u razumevanju interakcije između ekscitatornih amino kiselina (EAK) i opioida. Došlo se do saznanja da glutamat koji se u kičmenoj moždini oslobodi pod dejstvom nociceptivnih stimulusa, smanjuje osetljivost 15 opioidnih receptora na dejstva opioidnih agonista (Bennett, 2000). Sugeriše se da se analgetički efekti NMDA antagonista jednim delom ostvaruju usled aktivacije endogenih opioida mozga (Forman, 1999). Pored ovoga, u in vitro uslovima ustanovljeno je da neki opioidni agonisti (metadon, ketobemidon, dekstropropoksifen) imaju izvesna, doduše slaba, svojstva antagonista NMDA receptora (Ebert i sar., 1998). Na moguću povezanost opioida i EAK ukazuje i kolokalizacija receptora za EAK i opioidnih receptora na postsinaptičkoj membrani, kao, na primer, u neuronima periakveduktne sive mase (Commons i sar., 1999). Sve je više pokazatelja da se dobri analgetički efekti u bolu različite etiologije postižu istovremenom primenom antagonista NMDA receptora sa drugim lekovima, u prvom redu sa opioidima, pri čemu doza opioida ostaje ista ili se, čak, smanjuje, čime se redukuju i neželjeni efekti analgetika (Adriaenssens i sar., 1999). Dokaza ima mnogo. U jednoj studiji kombinacija morfina i ketamina sa uspehom je suzbijala bol nakon operacije (Suzuki i sar., 1999). Drugo ispitivanje obuhvatilo je 140 bolesnika kod kojih su hirurški zahvati obavljeni ambulantno. Utvrđeno je da su analgetički efekti morfina potencirani malim dozama ketamina (Mercadante i sar., 1995). U lečenju jednog bolesnika sa kancerskim neuropatskim bolom koji nije adekvatno reagovao na ogromne doze morfina (pet grama dnevno), koadministracijom opioida i ketamina postignuti su izvanredni analgetički efekti uz smanjenje potrebe za opioidima (Eisenberg i sar., 1998). Uspeh je nastao usled sinergističkog efekta ketamina i opioida. Ako kombinacije opioida i ketamina i dalje budu dobijale slične potvrde, to bi moglo da znači dobar napredak u terapiji bola. Pored ketamina, ispituje se i uticaj drugih antagonista NMDA receptorskog kompleksa u lečenju bola. I.3.6. Uticaj NMDA receptora na telesnu temperaturu N-metil-D-aspartat (NMDA) receptori su ligand-zavisni jonski kanali koji regulišu fiziološke procese kao što su učenje i memorija, transmisija bola, ali imaju ulogu i u nastanku hroničnog bola, šizofrenije i neurodegenerativnih bolesti kao što su moždani udar i depresija. Pored toga, imaju ulogu u termoregulaciji (Kao i sar., 2007; Ogden i Traynelis, 2011; Murck, 2013). 16 Značajan broj studija ukazuje da antagonisti NMDA receptora mogu da izazovu hipotermiju ili pomažu održavanje hipotermije sprečavajući kompenzatorne termoregulacione mehanizme (Rawls i sar., 2002; Nisijima i sar., 2012). NMDA receptori su povezani sa termosenzitivnim neuronima u hipotalamusu i sa endogenim glutamatergičkim sistemom koji tonički modulira telesnu temperaturu preko ovih receptora (Kao i sar., 2007). Glutamat ima važnu ulogu i u hipertermiji izazvanoj morfinom (Rawls i sar., 2003 ). Ketamin je antagonist NMDA receptora. Vezuje se za fenciklidinsko mesto u kanalu, kada je kanal otvoren (Oye, 1998; Quibell i sar., 2011). Takođe se može vezati za membransko mesto preko koga smanjuje frekvencu otvaranja kanala (Orser i sar., 1997a). Magnezijum je nekompetitivni antagonist NMDA receptora koji blokira jonski kanal (Fawcet i sar., 1999; Herroeder i sar., 2011). I ketamin i magnezijum se koriste u anesteziji i analgeziji, ali i u smanjenju drhtavice nakon anestezije (Hirota i Lambert, 2011; Nechifor, 2011). Postoje podaci o uticaju ketamina na telesnu temperaturu (Fahim i sar., 1973; Pitsikas i Boultadakis, 2009), dok dejstvo magnezijuma na telesnu temperaturu nije ispitivano. U literaturnim podacima postoje značajna neslaganja u vezi interakcije između ketamina i magnezijuma u dejstvu na bol; sinergizam, aditivnost i antagonizam (Liu i sar., 2001; Orser i sar., 1997b; O'Flaherti i Lin, 2003; Stessel i sar., 2013), ali nema podataka o interakciji između ovih lekova i njihovog efekta na telesnu temperaturu. 17 I.4. Hipotalamička regulacija telesne temperature Termoregulacija kod ektotermnih i endotermnih životinja i čoveka je uglavnom pod kontrolom preoptičkog područja u prednjem delu hipotalamusa. Takva homeostatska kontrola je odvojena od osećaja temperature. Mehanizmi kontrole telesne temperature prikazani su na slici I.4. Slika I.4. Mehanizmi kontrole telesne temperature Mehanizmi kontrole telesne temperature Hipotalamus Autonomni nervni sistem Endokrini sistem Znojne žlezde Krvni sudovi Termogeneza drhtanjem Somatski nervni sistem Mrko masno Nadbub. žlezda Štitna žlezda Skeletni mišić Hemijska termogenezaEvaporacija 18 I.5. Uticaj različitih sistema u regulaciji telesne temperature I.5.1. Uticaj adrenergičkog sistema u regulaciji telesne temperature Centralna kontrola telesne temperature se dešava u hipotalamusu i neki amini kao što su adrenalin, noradrenali i serotonin su uključeni u tu regulaciju. Poznato je da noradrenalin ima ulogu u kontroli telesne temperature kod pacova. Još su Feldberg i Lotti (1967) pokazali da noradrenalin može izazvati i hipertermiju i hipotermiju u zavisnosti od doze.Dejstvom na presinaptičke receptore, može dovesti do povećanja oslobađanja noradrenalina (Langer, 1974). Takođe je poznato da prilikom delovanja α2 agonista dolazi do inhibicije oslobađanja neurotransmitera acetilholina. Johimbin je antagonist α2 receptora i lek koji povećava koncentraciju serotonina i smanjuje noradrenalin u mozgu (Freedmann i Giarman, 1962). I.5.2. Uticaj serotonergičkog sistema u regulaciji telesne temperature Serotonergički neuroni se nalaze širom CNS-a i utiču na brojne moždane funkcije. Posebno važnu, ali kontraverznu ulogu imaju u kontroli respiracije i termoregulacije (Hodges i sar., 2008). Jasno je definisana uloga i rasprostranjenost 5-HT neurona u regulaciji telesne temperature, naročito u uslovima smanjene telesne temperature. Odbrana organizma od hladnih spoljašnjih uslova jeste produkcija toplote (u obliku drhtavice i termogeneze). Svaki od ovih mehanizama je regulisan na različitim delovima CNS-a i pod uticajem je 5-HT (Morrison, 2004, Boulant 2006, Dimicco i Zeretsky, 2007). Neki od serotonergičkih neurona se projektuju u intermediolateralne ćelijske kolone hipotalamusa (Cano i sar., 2003), i dolazi do povećenja njihove aktivnosti kao odgovor na spoljašnje (Martin-Cora i sar., 2000) i na rashlađivanje hipotalamusa (Nason i Mason, 2006). Sistemska ili parapiramidalna aplikacija 8-hidroksi-2-di-N-propilamino tetralina, agoniste 5-HT1Areceptorautiče na temperaturu i izaziva drhtavicu (Hoffman i sar., 2007) i menjaleptinom izazvanu aktivaciju mrkog masnog tkiva (BAT) (Morrison, 2004). 19 Serotonergički sistem je uključen u regulaciju telesne temperature. Potvrđeno je kod pacova da 5-hidroksitriptamin dovodi do sniženja telesne temperature (Fahim i sar., 1973). Posebno je značajna uloga ovog sistema u stresom izazvanoj hipertermiji (Vinkers i sar., 2010). Postoji interakcija između α subjedinice GABAA receptora i 5-HT1A receptora u stresom izazvanoj hipertermiji. Benzodiazepini npr. deluju na serotonergički sistem preko α3 subjedinice GABAA receptora (Vinkers i sar., 2010). I.5.3. Uloga gabaergičkog sistema u regulaciji telesne temperature Pokazano je da GABA u rastućim dozama dovodi do dozno-zavisnog sniženja telesne temperature pri konstantnoj temperaturi okoline (Ishiwata i sar., 2005). Vinkers i saradnici (2010) su došli do zaključka da receptorska subjedinica α1 GABAA receptora ima ulogu u hipotermiji, a da α2/3 subjedinica ovih receptora ima ulogu u redukciji stresom izazvane hipertermije. Hipotermija koju izaziva GABA može nastati zbog oslobađanja serotonina, aktivacijom bikukulin-neosetljivih GABA receptora koji se nalaze na centralnim serotonergičkim neuronima (Dimicco i Zaretsky, 2007). Smatra se da GABA-ergički sistem utiče na preoptički/anteriorni hipotalamus PO/AH. Može se pretpostaviti da je GABAA–serotonin interakcija jako bitna za termoregulaciju i da postoji u preoptičkoj regiji ili u dorzomedijalnom hipotalamusu (Dimicco i Zaretsky, 2007) ili da projekcije dorzalnih i medijalnih vlakana različito utiču na bazalnu i stresom izazvanu telesnu temperaturu. Pokazano je da 5-HT inhibira oslobađanje GABA-e presinaptički u termoregulatornoj hipotalamičkoj medijalnoj preoptičkoj regiji, a ovaj efekt može biti blokiran antagonistom 5-HT1A receptora (Lee i sar., 2008). I.5.4. Uloga NO u regulaciji telesne temperature NO ima širok dijapazon različitih funkcija u organizmu. Jedna od funkcija je i uticaj na regulaciju telesne temperature, groznice i hipotermije. L arginin kao prekursor NO ne utiče na telesnu temperaturu pacova kada se primeni sam (Zarrindast i sar., 2002). Neki autori smatraju da NO ima antipiretička svojstva (Moncada i sar., 1991), a neki su pokazali 20 sa NO ima ulogu u hipotermiji (Steiner i sar., 1991; Almeida i Branco, 2001). Pokazano je i da NO ima ulogu u samoj groznici (Lin i Lin, 1996). Treba napomenuti da se sve ove studije razlikuju po sintezi NO, vrste životinje koja je korišćena u eksperimentima, načinu davanja pirogene supstance i dr. L-arginin povećava i produžuje hladnoćom izazvano stvaranje endotelijalna NOS, inducibilnu NOS i termogenetsku ekspresiju molekula, vaskularnost, hiperplaziju i remodelovanje mitohondrija u hladnim uslovima, dok L-NAME ima suprotne efekte. NO je jedan od glavnih regulatora termogeneze mrkog masnog tkiva (BAT) termogenetskog operativnog programa na nivou gena, proteina i tkiva (Petrović i sar., 2010.). I.5.5. Uloga opioidergičkog sistema u regulaciji telesne temperature Opioidi imaju efekt na telesnu temperaturu. Njihov efekt zavisi od vrste životinje, starosti, doze, puta primene, spoljašnje temperature. Kod odraslih pacova morfin izaziva hipertermiju u malim dozama, a hipotermiju u visokim dozama. Sputanost često utiče na opioidnu hipertermiju i povećava hipertermni raspon (Adler i Geller, 1989). Visoka spoljašnja temperatura povećava hipertermiju, dok niska povećava hipotermiju (Handler i sar., 1994). Opioidni receptori μ i  su uključeni u regulaciju telesne temperature. Naime obe vrste receptora se nalaze u preoptičkom delu hipotalamusa (Handler i sar., 1992). U hipotalamusu pacova μ agonisti blokiraju odgovor temperaturno osetljivih neurona preoptičkog/anteriornog hipotalamusa. Pretpostavlja se da se hipertermni odgovor opioida dešava preko μ receptora, a hipotermija dešava preko  receptora (Colman i sar., 2002). Jedna od studija je pokazala da μ1 receptori nisu uključeni u morfinsku hipertermiju (Pieppoen i sar., 1997). I.5.6. Uloga ATP senzitivnih kalijumskih kanala u regulaciji telesne temperature KATP senzitivni kanali imaju ulogu u brojnim funkcijama u organizmu. Jedna od uloga je i u regulaciji telesne temperature. Glibenklamid, kao blokator KATP senzitivnih kanala, primenjen u kombinaciji sa fiziološkim rastvorom ne utiče na rektalnu temperaturu pacova u poređenju sa kontrolnom grupom. Pokazano je i da glibenklamid dat 21 intracerebroventrikularno antagonizuje hipertermiju izazvanu supkutano datim morfinom na dozno-zavistan način. Na taj način je pokazano da KATP kanali imaju važnu ulogu kao modulatori hipertermnog efekta mi agonista (Narita i sar., 1992). 22 II CILJEVI ISTRAŽIVANJA 1. Ispitati efekte analoga morfina i fentanila na akutnu termičku nocicepciju (ATN)/telesnu temperaturu radi utvrđivanja odnosa između hemijske strukture i antinociceptivne/hipertermne aktivnosti i uporediti relativne jačine dve grupe analoga u izazivanju hipertermije u odnosu na antinocicepciju. 2. Ispitati efekte ketamina, magnezijuma i kombinacije ketamin-magnezijum na telesnu temperaturu pacova i ATN i utvrditi tip interakcije (antagonizam, aditivnost, sinergizam). 3. Ispitati efekte ketamina, magnezijuma i kombinacije ketamin-magnezijum na hipertermiju i ATN izazvanu morfinom. 4. Ispitati mehanizam dejstva ketamina i kombinacije ketamin-magnezijum na telesnu temperaturu pacova koristeći antagonist GABAA receptora (bikukulin), antagonist adrenergičkih α2 receptora (johimbin), neselektivni antagonist serotonergičkih (5- HT) receptora (metizergid), antagonist ATP-zavisnih kalijumskih kanala (glibenklamid), neselektivni antagonist sintaze azotnog oksida (L-NAME), prekursor sinteze azotnog oksida (L-arginin) i neselektivni antagonist opioidnih receptora (nalokson). 5. Ispitati efekt morfina i kombinacije ketamin-magnezijum-morfin na motornu koordinaciju pacova. 23 III MATERIJAL I METODE III.1. Eksperimentalne životinje Pre početka eksperimenata, dobijena je dozvola za rad sa životinjama. Eksperimenti su odobreni od strane Ministarstva poljoprivrede, šumarstva i vodoprivrede Republike Srbije, i u skladu su sa Zakonom o dobrobiti životinja u Republici Srbiji (dozvola broj 5057/2) i vodičem Internacionalnog udruženja za proučavanje bola (IASP). Eksperimenti su urađeni na mužjacima pacova soja Wistar albino, mase 200-250 grama (Vivarijum Vojnomedicinske akademije u Beogradu). Pacovi su bili smešteni u transparentnim kavezima od pleksiglasa (42,5 x 27 x 19 cm) obloženim šuškom. Hrana (specijalni briketi za ishranu eksperimentalnih životinja) i voda bili su dostupni 24h, bez ograničenja osim tokom trajanja eksperimenta. Svaka životinja je korišćena samo jednom. Nakon eksperimenta, životinje su žrtvovane akutnom intraperitonealnom primenom velike doze anestetika (tiopenton-natrijum). III.2. Supstance korišćene u eksperimentima:  fentanil-citrat (Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgija)  (±)-cis-3-metil fentanil oksalat (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija)  (±)-cis-3-butil-fentanil-oksalat (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija)  (±)-cis -3-karbometoksi-fentanil-oksalat (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija)  (±)-trans-3-karbometoksi-fentanil-oksalat (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija)  morfin hidrohlorid (Alkaloid Skoplje, Makedonija)  oksikodon hidrohlorid (poklon Univerziteta u Debrecinu, Mađarska) 24  tebakon hidrohlorid (poklon Univerziteta u Debrecinu, Mađarska)  6,14-etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6-fluoro-3-hidroksi-,α, α,17-trimetil-, (5α,7α) (poklon Univerziteta u Debrecinu, Mađarska)  ketamin (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Nemačka)  magnezijum sulfat (Zorka, Šabac, Srbija)  bikukulin (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  johimbin hidrohlorid (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  metizergid maleat (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  glibenklamid (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  L-NAME (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  L-arginin (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD)  nalokson hidrohlorid (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD). Primena leka Fentanil-citrat (Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgija) i (±)-cis-3-metil fentanil oksalat, (±)-cis-3-butil-fentanil-oksalat i (±)-cis i (±)-trans-3-karbometoksi- fentanil-oksalat (Hemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu, Beograd, Srbija) (Mićović et al., 1998; Ivanović et al., 2004) su rastvarani u fiziološkom rastvoru i ubrizgavani intraperitonealno u ukupnoj zapremini od 2 ml/kg. Analozi fentanila su ispitivani kao racemske smeše. Morfin (Alkaloid Skoplje, Makedonija), oksikodon (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD), tebakon (čistoće 98,56%; poklon Univerziteta u Debrecinu, Mađarska) i (6,14-etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6-fluoro-3-hidroksi-,α, α,17-trimetil-, (5α,7α) (čistoće 98,65%; poklon Univerziteta u Debrecinu, Mađarska) (Berenyi et al., 1995), u obliku soli hidrohlorida, su rastvarani u fiziološkom rastvoru i ubrizgavani intraperitonealno u konačnoj zapremini od 2 ml/kg. Doze lekova su računate u odnosu na slobodnu bazu. Nalokson-hidrohlorid (Sigma-Aldrich Chemical Co., St Louis, Mo., SAD) je takođe rastvaran u fiziološkom rastvoru i ubrizgavan supkutano (sc, 2 mg/kg) u leđa 15 min pre ip ubrizgavanja ispitivanog jedinjenja u istoj zapremini. U kontrolnoj grupi pacova je ip primenjen fiziološki rastvor (0,9% m/V rastvor natrijum hlorida u 25 redestilovanoj sterilisanoj vodi) u ukupnoj zapremini od 2 ml/kg, kako bi se ispitalo da li fiziološki rastvor ima bilo kakav uticaj na nocicepciju ili na telesnu temperaturu pacova. Ketamin (Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Nemačka) i magnezijum sulfat (Zorka Šabac, Srbija) su rastvarani u 0,9% NaCl i ubrizgani intraperitonealno (ketamin) ili supkutano (magnezijum sulfat) u ukupnoj zapremini od 2 ml/kg. Da bi se izvršilo testiranje da li ubrizgavanje 0,9 % NaCl ima bilo kakav efekt na telesnu temperaturu, ista zapremina 0,9 % NaCl je ubrizgana kontrolnoj grupi pacova. Svi antagonisti (johimbin, metizergid, bikukulin, L-arginin, L-NAME, nalokson, glibenklamid) su rastvarani u fiziološkom rastvoru u ukupnoj zapremini od 2 ml/kg, osim glibenklamida koji je rastvaran u alkoholu. III.3. Eksperimentalni protokol (1-5) 1. Adaptacija životinja na eksperimentalnu proceduru Svi eksperimenti su izvođeni u isto vreme (od 8-15h), kako bi se izbegle cirkadijalne varijacije u bihejvioralnim testovima. Eksperimenti su rađeni pri konstantnim spoljnim uslovima temperatura 21±1 ºC; vlažnost 55±5 %; ciklusom svetlo-tama na 12h. Tri uzastopna dana pre samog eksperimenta, životinje su se navikavale na eksperimentalnu proceduru tj. da ulaze u držače za pacove, gde su boravile pola sata dnevo. Životinje su se na dan eksperimenta unosile u laboratoriju jedan sat pre merenja antinocicepcije/temperature da bi se adaptirale na uslove okoline. Životinje nisu bile sputane, sem tokom merenja kada su boravile u hemicilindričnim držačima za pacove od pleksiglasa (19 x 6 x 5 cm) u trajanju od 15 sekundi. Eksperimentalne grupe su imale 6-8 životinja koje su se koristile samo jednom. Za svaku vrstu eksperimenta postojala je kontrolna grupa koja je u isto vreme dobijala fiziološki rastvor (0,9% m/V rastvor natrijum hlorida u redestilovanoj sterilisanoj vodi) ili alkohol kad je primenjivan glibenklamid. 2. Eksperimentalna procedura 26 Nakon navikavanja na laboratorijske uslove, merila su se dva kontrolna vremena povlačenja repa iz tople vode u razmaku od pola sata. U eksperimentima u kojima se ispituje telesna temperatura merenja su se vršila nekoliko puta u razmaku od pola sata, sve dok temperatura ne bude stabilna (u periodu oko 2h). Dva poslednja merenja (kada se dobiju slične vrednosti, jer se telesna temperatura stabilizovala) predstavljale su kontrolne vrednosti telesne temperature. Nakon toga životinje su dobijale lek i/ili rastvarač intraperitonealno ili supkutano i pristupalo se merenju dejstva leka na nocicepciju ili telesnu temperaturu. 3. Antinocicepcija je ispitivana metodom potapanja repa pacova u toplu vodu. 4. Promene u telesnoj temperaturi pacova merene su termometrom. 5. Dejstvo na motornu aktivnost pacova registrovano je rotarod testom. III.4. Metode III.4.1. Test potapanja repa u toplu vodu (eng. tail-immersion test) Antinociceptivna aktivnost određuje se pomoću testa potapanja repa u toplu vodu. Termički bolni stimulus je voda zagrejana na 55±0,5°C (vodeno kupatilo Memmert GmbH + Co.KG, Germany). Pacovi se stavljaju u predviđene držače tako da rep slobodno visi van držača. Rep (5 cm počev od vrha) se potapa u toplu vodu. Meri se dužina latentnog perioda od trenutka potapanja do naglog trzaja repa iz vode, pomoću digitalne štoperice sa preciznošću od 0,1 s. Postoji i vremensko ograničenje izlaganja repa toplotnom stimulusu od 10 sekundi, da bi se izbeglo oštećenja tkiva. Nakon dva kontrolna merenja daje se lek i/ili rastvarač i nastavlja se merenje dejstva leka posle 30, 60, 90, 120, 150, 180 i 210 minuta. Rezultati se izražavaju u sekundama. 27 III.4.2. Merenje telesne temperature Temperatura je merena termometrom (ALMEMO, Holzkirchen, Nemačka). Sonda termometra postavlja se u dužini od 5 cm u debelo crevo pacova. U cilju smanjenja mehaničke traume, sonda je bila obložena belim vazelinom pre svakog merenja. Temperatura je merena 30, 60, 90, 120, 150, 180 i 210 min, nakon ubrizgavanja supstanci. Životinje su boravile u laboratoriji oko 60 minuta pre prvog merenja temperature da bi se aklimatizovale. Bile su slobodne sve vreme, osim za vreme merenja telesne temperature. Tokom merenja pacovi su smeštani u držače od pleksiglasa u kojima su boravili oko 15 sekundi i odmah potom vraćani nazad u kaveze. U eksperimentalnoj grupi je bilo 6-8 pacova. Svaka životinja je korišćena samo jednom. Temperatura pacova je merena nekoliko puta i kada je primećeno da se temperatura stabilizuje za otprilike 2 sata, ubrizgavani su lekovi i/ili 0,9 % NaCl intraperitonealno ili supbkutano (Savić Vujović i sar., 2013). III.4.3. Rotarod test Da bi utvrdili da li ispitivane supstance remete motornu koordinaciju, koristili smo rotarod aparat za pacove (UgoBasile, Italija). Aparat se sastoji od rotirajućeg vretena prečnika 5 cm, podeljenog na pet odeljaka širine 8 cm. Tokom tri uzastopna dana pre eksperimenta, životinje su trenirane 5 minuta na rotarod cilindru pri brzini 10 obrtaja u minuti. Merilo se vreme koje pacovi provedu na cilindru od momenta postavljanja do pada životinje. Maksimalna dužina vožnje rotarod aparata (“cut- off”) bila je tri minuta. Samo oni pacovi koji nisu pali sa cilindra tokom 3 minuta vožnje na dan eksperimenta su uključeni u dalji eksperiment. Ispitivano je dejstvo morfina (2,6 mg/kg) kao i dejstvo kombinacije morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (5mg/kg)-magnezijum sulfat (5mg/kg) na motornu kordinaciju pacova. Pacovima su dati morfin i ketamin intraperitonealno, a nakon 15 minuta magnezijum sulfat 28 supkutano (slika III.4.3.). Kontrolna grupa životinja je dobijala fiziološki rastvor. Nakon ubrizgavanja supstanci, pacovi su postavljeni na cilindar koji se okreće 3 minuta sa ubrzanjem 2,5 do 25 obrtaja u minuti (Lai i sar., 2007). Merenja su vršena 30, 60, 90, 120 i 150 min od intraperitonealne primene leka/fiziološkog rastvora (po metodi Lai i sar., 2007) (III.slika 4.3.). Slika III.4.3. Eksperimentalni protokol za rotarod test III.5. Analiza rezultata III.5.1. Analiza dejstva analoga morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu Prvi deo rezultata odnosi se na efekte novosintetisanih derivata morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu kod pacova. Svi opioidni analgetici su dati intraperitonealno. Merene su vrednosti antinociceptivnog/hipertermnog efekta 30, 60, 90, 120, 150 i 180 minuta nakon davanja leka. Kako bi se direktno poredila različita jedinjenja i različiti efekti, korišćen je kvantalni odgovor za svaku životinju (prisustvo ili odsustvo očekivanog efekta leka). Maksimalni odgovor dobijen u toku merenja korišćen je za procenu svakog efekta i svake doze. Zatim je rađena statistička obrada podataka, korišćenjem komjuterskog programa Tallarida i Vreme 0 min 15 min 0-150 min Merenja pre davanja leka ip inj. sc inj. Merenja nakon davanja leka MR NaCl MR+KT NaCl NaCl MG 29 Murray (1986). Prvo je određen procenat životinja kod kojih je zabeležena reakcija, zatim je procenat preveden u probite i unet na grafikon u odnosu na logaritamsku vrednost doze. Korišćena je procedura Litchfielda i Wilcoxona kako bi se izračunala srednja efektivna doza, tj. AD50 (srednja efektivna antinociceptivna doza) ili HD50 (srednja efektivna hipertermička doza). Pored toga, kada su uneti podaci za drugu kvantalnu krivu odnosa doze i odgovora, istom procedurom je izračunat odnos jačina (u granicama poverenja od 95% (95% CL)) za odgovarajuće krive. Na taj način su izračunate relativne jačine jedinjenja fentanila i morfina za antinociceptivne i hipertermičke efekte. Relativne jačine su smatrane statistički značajnim kada granica poverenja od 95% nije prelazila 1,0. Takođe je za svaki lek određen odnos jačine između HD50 i AD50, označen kao terapijski indeks (TI). Ako granica poverenja od 95% za TI nije obuhvatala 1,0, onda je razlika između HD50 i AD50 bila značajna (Tomić i sar., 2010). Za određivanje vremena dostizanja maksimalne vrednosti, kao i za utvrđivanje trajanja efekta, korišćeni su izvorni podaci (temperatura u °C i latencija reakcije povlačenja repa u sekundama). Statistička značajnost (jednosmerna ANOVA analiza, praćena Tukey-evim HSD testom) ustanovljena je poređenjem sa kontrolama, tretiranim fiziološkim rastvorom. III.5.2. Analiza efekta morfina, ketamina i magnezijum sulfata na antinocicepciju Za ispitivanje efekta morfina, ketamina i magnezijum sulfata na antinocicepciju korišćen je sledeći eksperimentalni protokol: 30 Vreme -5 min 0 min 15 min 0-210 min Merenja pre davanja leka Inj. Inj. Inj. Merenja nakon davanja leka a MR NaCl MR NaCl NaCl MG MG NaCl b KT MR+KT NaCl NaCl c KT MG MG KT MR+KT MG MG MR+KT d NL NL MR+NaCl MR+KT NaCl MG Slika III.5.2. Eksperimentalni protokol. Efekt morfina (MR), magnezijum sulfata (MG), i njihove kombinacije (a), ketamina i kombinacije morfin-ketamin (b), kombinacije ketamin- magnezijum sulfat sa/bez morfina (c) i efekti naloksona (NL) na efekte morfina, i kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat (d) u testu povlačenja repa iz tople vode. Životinje u kontrolnoj grupi su primale 0,9% NaCl (NaCl) umesto testiranih supstanci. 31 U cilju da ispitamo da li magnezijum sulfat potencira antinociceptivno dejstvo ketamina i kombinacije morfin-ketamin prvo smo ispitivali koja je to najmanja doza ketamina i magnezijum sulfata koja potencira antinociceptivni efekt morfina. Nakon toga smo kombinovali lekove i ispitivali kombinaciju tri leka morfin-ketamin-magnezijum sulfat. U ovom delu su urađene tri serije eksperimenata. Prvo je ispitivan efekt morfina, magnezijum sulfata i njihove kombinacije (III.5.2 a). Nakon toga smo ispitivali uticaj ketamina kao i kombinaciju morfin-ketamin. Treća grupa eksperimenata se odnosi na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat (ketamin je dat pre magnezijum sulfata), kao i kombinaciju magnezijum sulfat-ketamin (ketamin je dat posle magnezijum sulfata). Ova kombinacija je nakon toga kombinovana sa morfinom (III.5.2 c). Na kraju je ispitivan efekt naloksona na kombinaciju morfin-ketamin-magnezijum sulfat u testu potapanja repa u toplu vodu (III.5.2 d). Lekovi su dati intraperitonealno(ketamin i morfin) ili subkutano (magnezijum i nalokson). III.5.2.1. Analiza dužine trajanja antinociceptivnog dejstva lekova kao i kombinacije lekova u testu potapanja repa pacova u vodu Trajanje efekta je definisano kao vreme u prvoj i poslednjoj tački u kojoj postoji statistički značajna razlika između grupa koje su primale lek i kontrolne grupe (0,9% NaCl). III.5.3. Analiza efekta morfina, ketamina i magnezijum sulfata na telesnu temperaturu Za ispitivanje kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu urađene su tri serije eksperimenata. Prvo smo ispitivali efekte morfina, magnezijum sulfata i njihove kombinacije (III.5.3. a). Nakon toga smo ispitivali uticaj ketamina i kombinacije ketamin-magnezijum sulfat (III.5.3. b). Treća grupa eksperimenata je imala za cilj da ispita efekt ketamina sa/ bez magnezijum sulfatom na morfinsku hipertermiju (III.5.3. c), kao i antagonizam naloksonom (III.5.3. d). 32 III.5.3. Eksperimentalni protokol ispitivanja efekta morfina (MR), magnezijum sulfata (MG), i njihove kombinacije (a), ketamina (KT) i kombinacije ketamin-magnezijum sulfat (b) kombinacija morfin-ketamin i morfin-ketamin-magnezijum sulfat (c) i efekt naloksona Vreme -5 min 0 min 15 min 0-210 min Merenja pre davanja leka sc inj. ip inj. sc inj. Merenja nakon davanja leka a MR NaCl MR NaCl NaCl MG MG NaCl b KT KT NaCl NaCl MG NaCl c MR+NaCl MR+KT MR+KT NaCl+NaCl NaCl NaCl MG NaCl d NL NL NL MR+NaCl MR+KT MR+KT NaCl NaCl MG 33 (NL) na efekte morfina, morfin-ketamin i morfin-ketamin-magnezijum sulfat (d) na telesnu temperaturu kod pacova. Životinje u kontrolonoj grupi su primale 0,9% NaCl (NaCl) umesto testiranih supstanci. Ip, intraperitonealno. Sc, supkutano. Inj., injekcija III.5.3.1. Analiza interakcija ketamina i magnezijuma na telesnu temperaturu pacova Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška srednje vrednosti ( engl. “SEM” ) telesne temperature za svako izmereno vreme. Vrednosti telesne temperaturne su statistički analizirane korišćenjem jednosmerne analize varijanse (jednosmerna ANOVA) i Tukey HSD post hoc testa. Da bi testirali interakcije između lekova, izračunata je veličina temperaturnog raspona kao srednja vrednost ± SEM maksimalne promene u telesnoj tempearuri (Δ T°C ) u odnosu na kontrolu ( 0,9 % NaCl ), merena u bilo kom trenutku (Rawls i sar., 2007). Zatim su nacrtane krive odnosa doze i efekta i upoređene testom za paralelizam i testom relativne jačine (Tallarida i Murray, 1986). Odnos jačina se smatra statistički značajnim kada se granica poverenja od 95 % (CL) nije prelazila 1,0 (p < 0,05). U svim testovima postoji statistički značajna razlika kada je p<0,05. III.5.3.2. Analiza interakcije između lekova u slučaju kada je jedan lek nedovoljno efikasan Srednja efektivna doza ED50 (sa granicom pouzdanosti u iznosu od 95 %) za ketamin (koji predstavlja aktivni agens) je izračunata na osnovu probit krive odnosa doze i efekta. Podaci su izraženi kvantalno kao broj životinja kod kojih je zabeležena hipotermija u odnosu na ukupan broja životinja koje su primale isti lek. Hipotermija je definisana kao temperatura manja za 4 standardne devijacije od srednje kontrolne vrednosti, tj. vrednosti dobijene pre primene leka kod 6-8 pacova (Savić Vujović i sar., 2013; Vučković i sar., 1998). Ketamin (aktivni agens) je kombinovan sa magnezijum sulfatom (neaktivno jedinjenje) u fiksnom masenom odnosu doza 1:1.Interakcija između komponenti je sinergistička ukoliko postoji značajno pomeranje ulevo krive odnosa doze i efekta za ketamin u prisustvu 34 magnezijum sulfata u odnosu na krivu odnosa doze i efekta za ketamin. Ako se krive preklapaju, postoji aditivna interakcija (Tallarida i sar., 2003, Tallarida, 2007). Sledeći korak je bio ispitivanje kombinacije fiksne doze ketamina i to srednje efektivne doze ketamina (ED50) sa 3 različite doze magnezijum-sulfata u masenom odnosu doza 1:0,5; 1:1 i 1:3 (Tallarida i sar., 2003, Tallarida, 2007). Ako je efekt testirane doze ketamina (ED50) u kombinaciji sa magnezijum sulfatom veći u poređenju sa efektom samog ketamina i postoji statistički značajna razlika, možemo reći da je interakcija između lekova sinergistička. Zatim je ketamin (aktivni agens) dat u rastućim dozama sa fiksnom dozom magnezijum sulfata (0,5:1; 1:1 i 2:1 maseni odnos doza leka). Ako postoji značajno pomeranje ulevo krive odnosa doze i efekta vrednosti za ketamin u prisustvu magnezijum sulfata u odnosu na krivu odnosa doze i efekta za ketamin, interakcija između komponenti je sinergistička. U cilju jačanja tumačenja interakcije lekova i njihovog uticaja na telesnu temperaturu, kao i da bi ispitali efekte ova dva NMDA antagonista na hipertemiju izazvanu morfinom, kombinovana je niska doza magnezijum sulfata (5 mg/kg, ip ) sa različitim dozama ketamina i ispitivan je njihov efekt na bazalnu telesnu temperature i na morfinsku hipertermiju. III.5.4. Analiza dejstva antagonista na ketamin i na kombinaciju ketamin- magnezijum sulfat Da bi ispitali mehanizam dejstva ketamina, kao i kombinacije ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu, koristili smo sledeće antagoniste:  bikukulin, antagonist gabergičkih GABAA receptora;  johimbin, antagonist adrenergičkih α2 receptora;  metizergid, neselektivni antagonist serotonergičkih (5-HT) receptora;  glibenklamid, antagonist ATP-zavisnih kalijumskih kanala;  L-NAME, neselektivni antagonist sintaze azotnog oksida;  L-arginin, prekursor sinteze azotnog oksida;  nalokson, neselektivni antagonist opioidnih receptora. 35 Svi antagonisti su dati supkutano 5 minuta pre ketamina/kombinacije ketamin-magneyijum sulfat. Za određivanje vremena dostizanja maksimalne vrednosti, kao i za utvrđivanje trajanja efekta, korišćeni su izvorni podaci (temperatura u °C).Trajanje efekta je definisano kao vreme u prvoj i poslednjoj tački u kojoj postoji statistički značajna razlika između grupa koje su primale lek i kontrolne grupe (0,9% NaCl). Za statističku analizu podataka korišćenjena je jednosmerna analize varijanse (jednosmerna ANOVA) i Tukey HSD post hoc test. Upoređivane su kombinacija antagonist-ketamin (10) sa ketaminom (10 mg/kg), kao i kombinacija antagonist-ketamin (5)-magnezijum sulfat (5) sa kombinacijom ketamin (5)-magnezijum sulfat (5). III.6. Statistička analiza Statističku značajnost razlike u registrovanim parametrima između eksperimentalnih grupa, procenjena je uz pomoć jednosturuke ANOVA i Tukey HSD post hoc testa. U rotarod testu, razlike između grupa su verifikovane Kruskal-Wallis testom iza koga sledi, Mann-Whitney U test. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± standardna greška. Koristio se i kompjuterski program Pharmacologic Calculation System (Tallarida i Murray, 1986). 36 IV REZULTATI IV.1. Uticaj derivata morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu kod pacova IV.1.1. Derivati fentanila: jačina u izazivanju antinocicepcije i hipertermije Fentanil (F; 0,0073-0,21 mg/kg; ip) i analozi fentanila: (±)-cis-3-metil fentanil (CM; 0,00065-0,022 mg/kg; ip), (±)-cis-3-karbometoksi fentanil (C; 0,016-0,48 mg/kg; ip), (±)- trans-3-karbometoksi fentanil (T; 0,08-2,18 mg/kg; ip) i (±)-cis-3-butil fentanil (B; 0,14- 3,24 mg/kg) su doveli do dozno-zavisnog povećanja antinocicepcije i hipertermije (Slika IV1.A.B). Za svaki ispitani efekt, nagibi probit kriva za F, CM, C, T i B nisu bili značajno različiti (p>0,05, test paralelizma, Tabela IV.1.1, slika IV.1) Srednje efektivne doze za antinocicepciju (AD50) i hipertermiju (HD50) i relativne jačine derivata fentanila su predstavljene u Tabeli IV.1.1. Među analozima fentanila, redosled relativnih jačina u izazivanju antinocicepcije bio je: CM [11,27 (6,23-20,40)] > F (1) > C [0,35 (0,17-0,72)] ≥ T [0,11 (0,07-0,17)] ≥ B [0,06 (0,01-0,45)]. Slično ovome, redosled relativnih jačina u izazivanju hipertermije bio je: CM [8,43 (3,94- 18,07)] > F (1) > C [0,46 (0,09-2,14)] ≥ T [0,11 (0,05-0,25)] ≥ B [0,08 (0,02-0,34)]. Doze jedinjenja fentanila koje izazivaju hipertermni odgovor su bile značajno veće (p<0,05) od antinociceptivnih doza. Odnosi između srednjih efektivnih doza za hipertermiju i srednjih antinociceptivnih doza (HD50/AD50 = TI) kretali su se od 6,53 (3,54- 12,06) do 11,76 (5,74-24,10). Terapijski indeksi statistički se nisu razlikovali (p>0,05) između analoga (Tabela IV.1.1). 37 Tabela IV.1.1. Srednje efektivne antinociceptivne i hipertermne doze (AD50 i HD50), koeficijent korelacije (r), nagib probit krive, relativna jačina, vreme dostizanja maksimalnog efekta, dužina trajanja efekta i terapijski indeksi za derivate fentanila kod pacova. Efekt (raspon doza) AD50 i HD50 (95% CL) r Nagib probit krive (95% CL) Relativna jačina (95% CL) Maks. efekt (min) Trajanje AD50 ili HD50 (min) Terapijski indeks HD50 / ED50 (95% CL) Fentanil Antinocicep. (0,007-0,016) 0,011 (0,008-0,015) 0,782 4,54 (-41,43-50,52) 1 10 50 8,80* (4,62-16,78) Hiperterm. (0,052-0,21) 0,094 (0,005-0,168) 0,988 3,34 (-3,17-9,86) 1 30 90 (±)-cis-3-Metil fentanil Antinocicep.. (0,00065-0,00205) 0,0009 (0,0006-0,0016) 1 3,43 (2,34-4,52) 11,27* (6,23-20,40) 10 90 11,76* (5,74-24,10) Hiperterm. (0,0055-0,022) 0,011 (0,007-0,018) 0,999 3,43 (1,78-5,09) 8.43* (3,94-18,07) 60 180 (±)-cis-3-Carbometoksi fentanil Antinocicep. (0,016-0,410) 0,031 (0,016-0,059) 1 2,43 (2,17-2,71) 0,35* (0,17-0,72) 10 30 6,72* (2,69-16,79) Hiperterm. (0,12-0,48) 0,206 (0,108-0,392) 0,997 2,72 (0,02-5,43) 0,46 (0,09-2,14) 10 60 (±)-trans-3-Carbometoksi fentanil Antinocicep. (0,08-0,169) 0,098 (0,071-0,137) 0,989 5,13 (-4,76-15,01) 0,11* (0,07-0,17) 10 20 8,79* (4,35-17,74) Hiperterm. (0,55-2,18) 0,866 (0,466- 1,608) 0,957 2,96 (-8,38-14,29) 0,11* (0,05-0,25) 10 60 38 (±)-cis-3-Butil fentanil Antinocicep. (0,14-0,40) 0,190 (0,143-0,254) 0,992 5,71 (-3,52-14,94) 0,06* (0,01-0,45) 20 50 6,53* (3,54-12,06) Hiperterm. (0,81-3,24) 1,244 (0,725-2,136) 0,979 3,03 (-4,95-11,01) 0,08* (0,02-0,34) 30 90 AD50=srednja efektivna doza (ED50) u izazivanju antinocicepcije. HD50 = srednja efektivna doza (ED50) u izazivanju hipertermije. Srednje efektivne doze za svaki efekt i svako jedinjenje, računato je korišćenjem 3 doze. Za svaku dozu korišćeno je po šest pacova. (Litchfield & Wilcoxon I test). * Relativna jačina i odnos HD50 / ED50 je statistički značajan kada 95% CL nije veći od 1,0 (p < 0,05, Litchfield & Wilcoxon II test). IV.1.2. Derivati morfina: jačina u izazivanju antinocicepcije i hipertermije Morfin (M; 1,053-3,165 mg/kg) i jedinjenja morfina: oksikodon (O; 0,258-0,601 mg/kg), tebakon (T; 0,4-1,084 mg/kg) i 6,14-etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6-fluoro-3- hidroksi-,α, α,17-trimetil-, (5α,7α) (E; 0,037-0,049 mg/kg) doveli su do dozno-zavisnog povećanja antinocicepcije i hipertermije (Slika IV.2.). Za svaki ispitivani efekt, nagibi probit kriva za M, O, T i E nisu bili značajno različiti (p>0,05, test paralelizma, Tabela IV.1.2, slika IV.2.). Srednje efektivne doze za antinocicepciju (AD50) i hipertermiju (HD50) i relativne jačine derivata morfina su predstavljene u Tabeli IV.1.2. Među analozima morfina, redosled relativne analgetičke jačine bio je: E [56 (40,54-78,09)] > O [5 (2,81-9,32)] ≥ T [2,6 (1,76-3,96)] > M [1]. Slično ovome, redosled relativne hipertermičke jačine bio je: E [37 (18,79-71,40)] > O [3 (1,47-6,18)] ≥ T [2,3 (1,05-5,19)] > M [1]. Među derivatima morfina, doze koje izazivaju hipertermni odgovor nisu bile statistički značajno različite (p>0,05) od antinociceptivnih doza, osim za morfin [HD50 /AD50 = 0,49 (0,24-0,99); p<0,05]. Terapijski indeksi (HD50 /AD50) su se kretali od 0,49 (0,24-0,99) do 0,83 (0,45-1,52) i nisu se statistički razlikovali između jedinjenja (Tabela IV.1.2). 39 Tabela IV.1.2.Srednje efektivne antinociceptivne i hipertermne doze (AD50 i HD50), koeficijent korelacije (r), nagib probit krive, relativna jačina, vreme dostizanja maksimalnog efekta, dužina trajanja efekta i terapijski indeksi za derivate fentanila kod pacova. Efekt (raspon doza) AD50 i HD50 (95% CL) r Nagib probit krive (95% CL) Relativna jačina (95% CL) Maks. efekt (min) Trajanje AD50 ili HD50 (min) Terapijski indeks HD50 / ED50 (95% CL) Morfin Antinocicep. (1,053-3,165) 2,59 (1,89-3,55) 0,997 5,84 (0,41-11,27) 1 60 120 0,49* (0,24-0,99) Hiperterm. (1,053-3,165) 1,27 (0,67-2,39) 0,787 2,35 (-21,09-25,81) 1 60 180 Oxikodon Antinocicep. (0,258-0,601) 0,51 (0,30-0,84) 0,956 3,62 (-10,55-17,77) 5* (2,81-9,32) 10 60 0,83 (0,45-1,52) Hiperterm. (0,258-0,601) 0,42 (0,30-0,59) 0,888 5,51 (-30,78-41,82) 3* (1,47-6,18) 30 90 Tebakon Antinocicep. (0,4-1,084) 0,98 (0,76-1,27) 0,996 7,12 (-1,15-15,40) 2,6* (1,76-3,96) 30 60 0,55* (0,32-0,96) Hiperterm. (0,4-1,084) 0,54 (0,33-0,89) 0,923 3,74 (-15,99-23,47) 2,3* (1,05-5,19) 30 120 6,14-Etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6-fluoro-3-hidroksi-,,17-trimetil-, (5,7) Antinocicep. (0,037-0,049) 0,046 (0,042-0,051) 0,988 19,75 (-19,98-59,48) 56* (40,54-78,09) 10 60 0,75* (0,60-0,95) Hiperterm. (0,037-0,049) 0,035 (0,028-0,043) 0,985 12,58 (-14,93-40,09) 37* (18,79- 71,40) 30 90 40 AD50=srednja efektivna doza (ED50) u izazivanju antinocicepcije. HD50 = srednja efektivna doza (ED50) u izazivanju hipertermije. Srednje efektivne doze za svaki efekt i svako jedinjenje, računato je korišćenjem 3 doze. Za svaku dozu korišćeno je po šest pacova. (Litchfield & Wilcoxon I test). * Relativna jačina i odnos HD50 / ED50 je statistički značajan kada 95% CL nije veći od 1,0 (p < 0,05, Litchfield & Wilcoxon II test). IV.1.3.Veličina dejstva fentanila i morfina na telesnu temperaturu Veličina hipertermnog odgovora bila je slična između dve serije derivata. Srednje efektivne doze za hipertermiju (HD50) za F (0,094 mg/kg), CM (0,011 mg/kg), C (0,206 mg/kg), T (0,866 mg/kg) i B (1,244 mg/kg) izazvale su porast telesne temperature u odnosu na početne kontrolne vrednosti za 1,19 ± 0,16, 0,94 ± 0,29, 1,10 ± 0,25, 1,14 ± 0,21 i 1,1 ± 0,07 °C, respektivno (nije prikazano). Srednje efektivne doze (HD50) za M (1,27 mg/kg), O (0,42 mg/kg), T (0,54 mg/kg) i E (0,035 mg/kg) povećale su telesnu temperaturu za 1,14 ± 0,09, 1,33 ± 0,07, 1,24 ± 0,06 i 0,91 ± 0,08 °C, respektivno (nije prikazano). IV.1.4. Vreme postizanja maksimalnih antinociceptivnih i hipertermnih efekta derivata fentanila i morfinai dužina trajanja Kod obe grupe jedinjenja vreme dostizanja maksimalnog antinociceptivnog efekta bilo je kraće od vremena dostizanja maksimalnog hipertermnog efekta, a antinocicepcija je trajala kraće od hipertermije (Tabela IV.1.1). Takođe, među derivatima fentanila efekti su počinjali brže i trajali kraće u poređenju sa derivatima morfina (Tabela IV.1.1). Hipertermija je trajala slično antinocicepciji u okviru svake serije derivata. IV.1.5. Efekt naloksona na antinociceptivne i hipertermne efekte derivata fentanila i morfina Nalokson-hidrohlorid (2 mg/kg; sc) dat 15 min pre ip injekcije opioida, poništavao je efekte svih ispitivanih supstanci (nije prikazano). 41 U grupama koje su dobijale analoge fentanila i morfina srednja vrednost početne telesne temperature bila je 38,24 ± 0,05 (n = 98) i 38,20 ± 0,04 (n = 72), respektivno. Srednja vrednost početne telesne temperature u kontrolnoj grupi (životinjama je dat fiziološki rastvor) bila je 38,21 ± 0,07 °C (n = 24). Nije bilo statistički značajne razlike u početnoj telesnoj temperaturi između eksperimentalnih grupa, kao ni između eksperimentalnih grupa i kontrola (p>0,05). Srednje početno latentno vreme u grupama koje su dobijale analoge fentanila i morfina, bilo je 1,48 ± 0,02 s (n = 90) i 1,49 ± 0,02 s (n = 72) respektivno. Srednja početna vrednost u kontrolnoj grupi bila je 1,50 ± 0,08 s (n = 20). Početna latentna vremena u testu povlačenja repa nisu se značajno razlikovala (p>0,05) između eksperimentalnih grupa, kao ni između eksperimentalnih grupa i kontrola. U kontrolnim grupama koje su dobijale fiziološki rastvor, ip injekcija fiziološkog rastvora (0,2 ml/kg) nije imala efekt ni na telesnu temperaturu, niti na latenciju kod potapanja repa (p>0,05). 42 Slika IV.1. Probit krive odnosa doze i efekta za antinocicepciju (A) i temperaturu (B) za fentanil (F), (±)-cis-3-metil fentanil (CM), (±)-cis-3-karbometoksi fentanil (C), (±)-trans- 3-karbometoksi-fentanil (T) i (±)-cis-3-butil-fentanil (B). Svaka tačka predstavlja rezultat dobijen na 6-8 životinja. 2 3 4 5 6 7 8 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Pr ob it Log doze, mg/kg F CM C T B A 2 3 4 5 6 7 8 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Pr ob it Log doze, mg/kg B 43 F Slika IV.2. Probit krive odnosa doze i efekta za antinocicepciju (A) i temperaturu (B) za morfin (M), oksikodon (O), tabakon (T), 6,14-etenomorfinan-7-metanol, 4,5-epoksi-6- fluoro-3-hidroksi-,α, α,17-trimetil-, (5α,7α) (E). Svaka tačka predstavlja rezultat dobijen na 6-8 životinja. 2 3 4 5 6 7 8 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Pr ob it Log doze, mg/kg M E O T A 2 3 4 5 6 7 8 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 Pr ob it Log doze, mg/kg B 44 IV.2. Antinociceptivni efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija IV.2.1. Efekt magnezijuma sulfata na antinocicepciju izazvanu morfinom Magnezijum sulfat (5 i 60 mg/kg, s.c.) nema antinociceptivni efekt u testu potapanja repa u toplu vodu. Magnezijum sulfat potencira efekt morfina. Doze magnezijum sulfata 5 i 60 mg/kg (s.c.) potenciraju antinocicepciju izazvanu morfinom (2,6 mg/kg, i.p.) (Slika IV.2.1.). Doza 0,5 mg/kg magnezijum sulfata nije imala efekt na morfinsku analgeziju. Maksimalni efekt samog morfina, kao i kombinacija morfin-magnezijum sulfat javlja se 30 minuta nakon davanja leka i traje 90 (MR+MG5) i 180 minuta (MR+MG60). Ne postoji razlika između testiranih grupa (p>0,05) u pogledu bazalnih latentnih vremena. Slika IV.2.1. Vremenski tok antinociceptivnog dejstva morfina, magnezijum sulfata i kombinacije morfin-magnezijum sulfat. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) 90 120 150 180 MR+MG(0.5) MR+MG(5) MR+MG(60) MR MG(5) MG(60) 0.9% NaCl 45 antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena u poređenju sa morfinom (*p<0,05, **p<0,01). IV.2.2. Efekt ketamina na antinocicepciju izazvanu morfinom U testu potapanja repa u toplu vodu, ketamin (5 i 30 mg/kg, i.p.), potencira antinocicepciju izazvanu morfinom (2,6 mg/kg, i.p.) (Slika IV.2.2.). Ketamin (5 i 30 mg/kg, i.p.) primenjen sam nema antinociceptivno dejstvo. Maksimalni efekt morfina kao i kombinacije morfin- ketamin, nastaje nakon 30-60 minuta nakon davanja leka i traje 90 minuta (morfin), 120 minuta (morfin-ketamin 5 mg/kg) i 150 minuta (morfin-ketamin 30 mg/kg) (Slika IV.2.2.). Pacovi su se kretali u krug i klatili glavu kada im je dat ketamin u dozi od 30 mg/kg. Ne postoji razlika između testiranih grupa u pogledu bazalnih latentnih vremena (p>0,05). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) 90 120 150 180 MR+KT(30) MR+KT(5) MR KT(5) KT(30) 0.9% NaCl 46 Slika IV.2.2. Vremenski tok antinociceptivnog dejstva morfina, ketamina i kombinacije morfin-ketamin. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena u poređenju sa morfinom (**p<0,01). Postoji i statistička značajnost između kombinacija sa različitom dozom ketamina, morfin-ketamin (5 mg/kg) i morfin-ketamin (30 mg/kg) (##p<0,01). IV.2.3. Sinergizam između ketamina i magnezijum sulfata u testu potapanja repa u toplu vodu Ispitivane su kombinacije različitih doza ketamina (2,5; 5; 10 mg/kg) i magnezijum sulfata (2,5; 5; 10 mg/kg) u različitim odnosima (0,5:1, 1:1 i 2:1). Sinergizam između ketamina i magnezijum sulfata u testu potapanja repa u toplu vodu, javlja se pri sledećim dozama ketamin-magnezijum sulfata: 2,5 : 5, 5 : 5 i 10 : 5 mg/kg (Slika IV.2.3.A-C). Nije utvrđena dozna-zavisnost između ovih kombinacija. Sam ketamin (2,5, 5 i 10 mg/kg) i sam magnezijum sulfat (5 mg/kg) nisu imali efekt u izazivanju antinocicepcije. Kombinacija ketamin (2,5 mg/kg) i magnezijum sulfat (5 mg/kg) (0,5:1) Kombinacija ketamina (2,5 mg/kg) i magnezijum sulfata (5 mg/kg) dovodi do značajnog antinociceptivnog dejstva, bez obzira da li je ketamin (2,5 mg/kg) dat pre ili posle magenzijuma (5 mg/kg) (IV.2.3.A). Redosled davanja lekova, nema uticaj na veličinu efekta kombinacije. Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat statistički je značajno veći u odnosu na sam ketamin u 30, 60, 90, 120 min (p<0,01). Efekt kombinacije ketamin- magnezijum sulfat je statistički značajno veći u odnosu na sam magnezijum sulfat u 30, 60, 90 i 120 min (p<0,01). Efekt kombinacije magnezijum sulfat-ketamin je značajno veći u odnosu na ketamin u 30, 90 i 120 min (p<0,05), a u odnosu na magnezijum sulfat u 90 i 120 min (nije prikazano) (p<0,05). Kombinacija ketamin (5 mg/kg) i magnezijum sulfat (5 mg/kg) (1:1) Bez obzira da li je ketamin primenjen pre ili posle magnezijum sulfata, statistički značajna razlika u antinocicepciji je postignuta u poređenju sa samim ketaminom ili magnezijum 47 sulfatom (IV.2.3.B). Statistički značajno veći antinociceptivni efekt se postiže kada se ketamin (5 mg/kg, i.p.) da pre magnezijum sulfata (5 mg/kg, s.c.) (p<0,01). Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat je statistički značajno veći u odnosu na ketamin u 30 min (p<0,01). Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat je statistički značajniji u odnosu na magnezijum sulfat u 30 i 150 min (p<0,01). Efekt kombinacije magnezijum sulfat-ketamin je statistički značajno veći u odnosu na ketamin u 90 (p<0,05), 120 i 150 min (p<0,01), a u odnosu na magnezijum sulfat u 90, 120 i 150 min (p<0,01). Kombinacija ketamin (10 mg/kg) i magnezijum sulfat (5 mg/kg) (2:1) Ne postoji razlika u maksimalnom antinociceptivnom efektu između kombinacija ketamin (10 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) i magnezijum sulfat (5 mg/kg)-ketamin (10 mg/kg)(IV.2.3.C). Obe kombinacije izazivaju statistički značajno veći efekt u poređenju sa ketaminom ili magnezijum sulfatom (p<0,05). Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat je statistički značajno veći u odnosu na ketamin u 30, 60, 90 (p<0,01) i 120 min (p<0,05). Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat je statistički značajno veći u odnosu na magnezijum sulfat u 30, 60, 90 (p<0,01), 120 i 150 min (p<0,05). Efekt kombinacije magnezijum sulfat-ketamin je statistički značajno veći u odnosu na ketamin u 60 i 90 min (p<0,05), a u odnosu na magnezijum sulfat u 60, 120 i 150 min (p<0,05). 48 0 1 2 3 4 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) A 0 1 2 3 4 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) ## B 90 120 150 KT(2.5)+MG(5) MG(5)+KT(2.5) KT(2.5) MG(5) 0.9% NaCl 90 120 150 KT(5)+MG(5) MG(5)+KT(5) KT(5) MG(5) 0.9% NaCl 49 Slika IV.2.3. A-C. Vremenski tok antinociceptivnog dejstva ketamina, magnezijum sulfata i kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena poređenjem kombinacije ketamin-magnezijum sulfata sa 0,9%NaCl (**p<0,01, *p<0,05). Postoji i statistička značajnost između kombinacija ketamin-magnezijum sulfat i magnezijum sulfat-ketamin (##p<0,01). IV.2.4. Uticaj kombinacija ketamin-magnezijum sulfati magnezijum sulfat-ketamin na antinocicepciju izazvanu morfinom u testu potapanja repa u toplu vodu Antinociceptivno dejstvo morfina (2,6 mg/kg) kao i kombinacije morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (5 mg/kg) može biti povećano dodavanjem magnezijum sulfata 15 minuta nakon davanja morfina i ketamina (p<0,01) (IV.2.4. A i B). Kada se kombinaciji morfina (2,6 mg/kg) i ketamina (5 mg/kg, i.p.) doda magnezijum sulfat (5 mg/kg, s.c.) 15 minuta kasnije, dobija se antinociceptivni efekt koji je statistički značajno veći u odnosu na efekt samog morfina (p<0,01) ili u odnosu na kombinaciju morfin-ketamin (p<0,01). Međutim, ne postoji statistički značajna razlika između ove kombinacije i kombinacije morfin-magnezijum sulfat (Slika IV.2.4. A-B). Antinocicepcija 0 1 2 3 4 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) C 90 120 150 KT(10)+MG(5) MG(5)+KT(10) KT(10) MG(5) 0.9% NaCl 50 izazvana kombinacijom morfin-ketamin-magnezijum sulfat je nešto veća, ali ne i statistički značajno veća od antinocicepcije izazvane kombinacijom morfin-magnezijum sulfat (p>0,05) (Slika IV.2.4.A). Magnezijum sulfat primenjen 15 minuta pre kombinacije morfin-ketamin nije statistički značajno povećao antinocicepciju u poređenju sa kombinacijom morfin-ketamin (p>0,05) (Slika IV.2.4.B). Efekt kombinacije male doze morfina (2,6 mg/kg), ketamina (2,5 ili 5 mg/kg) i magnezijum sulfata (5 mg/kg) zavisi od redosleda davanja injekcija ketamina i magnezijum sulfata (p<0,01) (Slika IV.2.4.C). Poređenjem maksimalne vrednosti antinocicepcije između kombinacija morfin-ketamin-magnezijum sulfat sa 2,5 i 5 mg/kg ketamina, nije utvrđena statistički značajna razlika (p>0,05). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) $ A 90 120 150 180 MR+KT(5)+MG(5) MG(5)+MR+KT(5) MR+MG(5) MR 0.9% NaCl 51 Slika IV.2.4. A-B. Vremenski tok antinociceptivnog dejstva kombinacije morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena poređem: (A) kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat i morfina (*p<0,05, **p<0,01), kao i poređenjem kombinacije magnezijum sulfat- morfin-ketamin i morfina (#p<0,05, ##p<0,01) i kombinacije magnezijum sulfat-morfin- ketamin i morfin-magnezijum sulfat ($p<0,05) (B) kombinacije morfin-ketamin- magnezijum sulfat i magnezijum sulfat-morfin-ketamin (**p<0,01), kao i morfin-ketamin- magnezijum sulfat i morfin-ketamin (##p<0,01). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) B 90 120 150 180 MR+KT(5)+MG(5) MG(5)+MR+KT(5) MR+KT(5) MR 0.9% NaCl 52 Slika IV.2.4.C. Vremenski tok antinociceptivnog dejstva kombinacije morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (2,5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5mg/kg). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena poređem kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat sa morfinom (**p<0,01, *p<0,05). Postoji i statistička značajnost između kombinacija morfin- ketamin-magnezijum sulfat kada se magnezijum sulfat primeni pre i posle ketamina (#p<0,05). IV.2.5. Dejstvo naloksona na kombinaciju morfin-ketamin-magnezijum sulfat Antinociceptivni efekt kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat antagonizovan je naloksonom. Nalokson u dozi od 1 mg/kg nije potpuno antagonizovao antinociceptivni 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) # 90 120 150 180 MR+KT(2.5)+MG(5) MG(5)+MR+KT(2.5) MR 0.9% NaCl * * 53 efekt kombinacije. Veće doze naloksona(3 mg/kg, s.c.) su bile potrebne da bi se antagonizovao efekt kombinacije (p<0,01) (Slika IV.2.5.) Slika IV.2.5. Vremenski tok antagonističkog dejstva naloksona (1 i 3 mg/kg) na kombinaciju morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5mg/kg). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM antinociceptivnog dejstva izraženog u sekundama na 6-8 životinja. Statistička značajnost je dobijena poređem kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat sa nalokson(3)-morfin-ketamin-magnezijum sulfat kombinacijom (**p<0,01, *p<0,05), kao i između morfina i morfin-nalokson kombinacije (#p<0.05, ##p<0.01). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 30 60 la te nt no v re m e (s ) vreme (min) ## 90 120 150 180 210 MR+KT(5)+MG(5) NL(1)+MR+KT(5)+MG(5) NL(3)+MR+KT(5)+MG(5) MR NL(1)+MR 0.9% NaCl 54 IV.2.6. Dejstvo kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat na motornu spretnost pacova Kombinacija male doze morfina (2,6 mg/kg), ketamina (5 mg/kg) i magnezijum sulfata (5 mg/kg) nije uticala na motornu spretnost pacova. Naime, vreme koje su pacovi (kojima je data ova kombinacija) proveli na rotarodu, nije se statistički značajno razlikovalo od kontrolne grupe životinja (IV.2.6). Vreme posmatranja bilo je 150 minuta. Slika IV.2.6. Efekt kombinacije morfin (2,6 mg/kg)- ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) na motornu koordinaciju, korišćenjem rotarod testa. Stubići predstavlja srednju vrednost ± SEM vremena koji pacovi provedu na rotarodu izraženog u sekundama na 8 životinja. Ne postoji statistička značajnost između grupa koje su ispitivane. 0 30 60 90 120 150 180 0 30 60 90 120 150vr em e pr ov ed en o na ro ta ro du (s ) vreme (min) MR+KT(5)+MG(5) MR 0.9% NaCl 55 IV.3. Efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija na telesnu temperaturu pacova IV.3.1. Efekt magnezijum sulfata na bazalnu temperaturu i na morfinsku hipertermiju Morfin (2,6 mg/kg, ip) značajno povećava telesnu temperaturu pacova (Slika IV.3.1). Efekt nastaje u 30 minutu, maksimalnu vrednost postiže u 60 minutu, a hipertermija traje 150 minuta nakon intraperitonealne injekcije morfina. Hipertermija izazvana morfinom je praćena „ rebound“ hipotermijom (Slika IV. 3.4.1). Magnezijum sulfat (5 i 60 mg/kg, sc), ne utiče na bazalnu temperaturu. Takođe, magnezijum ne utiče na hipertermiju izazvanu morfinom. Slika IV.3.1. Vremenski tok efekta morfina (MR, 2,6 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (MG, 5 i 60 mg/kg, sc) i njihove kombinacije na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka 37 38 39 40 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) 90 120 150 180 210 MR+MG(5) MR+MG(60) MR MG(60) MG(5) 0.9% NaCl 56 predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između morfina i 0,9% NaCl (**p<0.01) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.3.2. Efekt ketamina na bazalnu temperaturu Ketamin (5-30 mg/kg, ip) je dat u četiri doze. Sa povećanjem doze, dolazi do povećanja hipotermije. Ketamin smanjuje telesnu temperaturu na dozno-zavistan način (Slika IV.3.2). Ketamin u dozi 5 mg/kg nije uticao na telesnu temperaturu pacova (p0,05), dok su doze 10, 20 i 30 mg/kg (ip) značajno smanjile telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl, kao i u poređenju sa najnižom dozom ketamina (5 mg/kg) (p<0,01). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 10, 20 i 30 mg/kg ketamina maksimalno snižavaju telesnu temperaturu za 0,5, 0,8 i 1,0°C. Maksimalni efekt ketamina javlja se u 60-90 minutu, a trajanje hipotermnog efekta je 120 minuta. Srednja efektivna vrednost ketamina (ED50) je 10,5 (4,9-22,53) mg/kg, izračunata je na osnovu probit krive odnosa doze i efekta (nije prikazano). 57 Slika IV.3.2. Vremenski tok efekta ketamina (KT, 5, 10, 20 i 30 mg/kg, ip) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između ketamina i 0,9% NaCl (*p<0,05, **p<0,01), između KT(5) i KT(20)/KT(30) (#p<0,05, ##p<0,01), i između KT(10) i KT(20)/KT(30) ($$p<0,01)(One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) 90 120 150 180 210 KT(5) KT(10) KT(20) KT(30) 0.9% NaCl 58 IV.3.3. Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu pacova IV.3.3.1. Ketamin-magnezijum sulfat u masenom odnosu doza 1:1 (rastuće doze obe komponente u dozama 5, 7,5 i 10 mg/kg) Ispitivana je kombinacija ketamina i magnezijum sulfata u masenom odnosu doza 1:1. Kombinacija ovih lekova u masenom odnosu doza 1:1, pokazuje doznu-zavisnost u snižavanju telesne temperature. Slika IV.3.3.1.A. prikazuje vremenski tok dejstva kombinacije ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu pacova. Slika IV.3.3.1.B. predstavlja krivu odnosa doze i efekta tj. maksimalnu promenu telesne temperature usled dejstva kombinacije ketamin-magnezijum (u masenom odnosu doza 1:1). Doze od 5, 7,5 i 10 mg/kg obe komponente smanjile su telesnu temperaturu za 0,7, 0,9 i 1,7°C (Slika IV.3.3.1.A.). Kriva odnosa doze i efekta ketamina u prisustvu magnezijuma pomerena je ulevo, u odnosu na sam ketamin. Postoji značajno, neparalelno pomeranje krive kombinacije ketamin-magnezijum ulevo u poređenju sa krivom odnosa doze i efekta za ketamin (5, 10, 20 i 30 mg/kg) (p<0,05, test paralelizma) (p<0,05, test za ispitivanje relativne jačine). Ovi rezultati ukazuju da magnezijum sulfat potencira hipotermiju izazvanu ketaminom (Slika IV.3.3.1.B). Krive odnosa doze i efekta su divergentne i potenciranje efekta ketamina se jasno vidi u dozi od 5 mg/kg i više, ukazujući na potenciranje efekta ketamina u prisustvu magnezijum sulfata od 5,3 (3,2-58,2) puta (Slika IV.3.3.1.B.). 59 Slika IV.3.3.1. A) Vremenski tok efekta kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u masenom masenom odnosu doza 1:1 (rastuće doze 5, 7,5 i 10 mg/kg obe komponente) na 36 37 38 39 0 30 60 90 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) ## ## ## A 0.2 0.7 1.2 1.7 2.2 0.2 0.7 M ak si m al ni e fe kt Δ T( °C ) Log doza, Ketamin mg/kg B 120 150 180 210 KT(5)+MG(5) KT(7.5)+MG(7.5) KT(10)+MG(10) 0.9% NaCl # 1.2 1.7 KT KT+MG(1:1) 60 telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između kombinacija ketamin-magnezijum i 0,9% NaCl (*p<0,05, ** p <0,01), i između KT(5)+MG(5) i KT(10)+MG(10) (#<0,05, ##p<0,01)(One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). B) Krive odnosa doze i efekta za ketamin (KT, 5, 10, 20 i 30 mg/kg; ip) i kombinaciju ketamina (5, 7,5 i 10 mg/kg; ip) i magnezijum sulfata (MG, 5, 7,5 i 10 mg/kg; sc) u odnosu (1:1) na telesnu temperaturu kod pacova. Podaci su izraženi kao srednja vrednost maksimalne promene telesne temperature (Δ T °C) u odnosu na kontrolu (0,9% NaCl). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM Δ T (°C) dobijenu na 6-8 pacova. IV.3.3.2. Ketamin-magnezijum sulfat u odnosu doza 1: 0,5, 1:1 i 1:3 (fiksna doza ketamina 10 mg/kg sa rastućim dozama magnezijum sulfata 5, 10 i 30 mg/kg) U ovom delu eksperimenata, kombinovali smo fiksnu dozu ketamina i to srednju efektivnu dozu, ED50 (10 mg/kg, ip) sa tri različite doze magnezijum sulfata (5, 10 i 30 mg/kg, ip). Pokazali smo da magnezijum sulfat u dozi od 10 i 30 mg/kg (p<0,05) statistički značajno povećava hipotermni efekt ketamina za 1,2 i 0,8 °C. Ovi rezultati ukazuju da se sinergistička reakcija između ketamina i magnezijum sulfata pojavljuje u proporciji 1:1 i 1:3 (Slika IV.3.3.2). Izgleda da daljim povećanjem doze magnezijum sulfata ne dolazi da daljeg povećanja hipotermije. U nižoj proporciji 1:0,5, magnezijum sulfat nije statistički značajno uticao na ketamin (10 mg/kg), i ovaj rezultat nam ukazuje na prag efekta. U ovim eksperimentima, korišćen je fiksni odnos dve supstance, kako se radi u rigoroznim statističkim analizama za dokazivanje sinergizma (Tallarida i sar., 2003). Ovim eksperimentima je pokazano da kombinacija ketamin-magnezijum sulfat u odnosu 1:1 i kad je maseni udeo magnezijum sulfata veći, ispoljava sinergizam u dejstvu na telesnu temperaturu kod pacova. Pokazano je da postoji sinergizam na osnovu statistički većeg efekta ketamina (10 mg/kg) u kombinaciji sa magnezijum sulfatom u poređenju sa istom 61 dozom ketamina kada se primeni sam. Slika IV.3.3.2. Vremenski tok efekta kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u masenom odnosu doza 1: 0,5, 1:1 i 1:3 (fiksna doza ketamina 10 mg/kg sa rastućim dozama magnezijum sulfata 5, 10 i 30 mg/kg) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između kombinacija ketamin- magnezijum i 0,9% (*p<0,05, ** p <0,01), i između KT(10)+MG(5) i KT(10)+MG(10)/ KT(10)+MG(30) (#p<0,01) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) # 90 120 150 180 210 KT(10)+MG(5) KT(10)+MG(10) KT(10)+MG(30) KT(10) 0.9% NaCl # 62 IV.3.3.3. Ketamin-magnezijum sulfat u masenom odnosu doza 0,5:1, 1:1 i 2:1 (rastuće doze ketamina 2,5, 5 i 10 mg/kg sa fiksnom dozom magnezijum sulfata 5 mg/kg) Ketamin (2,5, 5 i 10 mg/kg, ip), kome je dodat megnezijum sulfat (5 mg/kg, sc), smanjuje telesnu temperaturu na dozno-zavistan način (Slika IV.3.3.3.A.). Doza od 2,5 mg/kg ketamina sa magnezijum sulfatom, nije dala statistički značajno različit efekt u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05). Međutim, ketamin (5 i 10 mg/kg), kome je dodat magnezijum sulfat smanjuje telesnu temperaturu za 0,7°C i 0,9°C(p<0,05) (Slika IV.3.3.3.A.). Maksimalni efekt kombinacije postiže se u 30 minutu. Efekti ketamina u dozama od 5 i 10 mg/kg, u kombinaciji sa magnezijum sulfatom traju 30 odnosno 60 minuta jedno za drugim. Krive odnosa doze i efekta za ketamin (5, 10, 20 i 30 mg/kg, ip) i ketamin (2,5, 5 i 10 mg/kg, ip) u kombinaciji sa fiksnom dozom magnezijum sulfata (5 mg/kg, sc) su nacrtane i upoređene (Slika IV.3.3.3.B.). Kriva odnosa doze i efekta za ketamin u prisustvu magnezijuma je pomerena ulevo u odnosu na krivu ketamina (p<0,05 test relativne jačine). Ovo ukazuje na potenciranje ekekta ketamina u prisustvu magnezijum sulfata u snižavanju telesne temperature kod pacova. Odnos jačina je 2,5 (CL 2,1-3,0), što ukazuje da se radi o sinergističkoj reakciji. Nagibi krivih se statistički ne razlikuju, što je utvrđeno testom paralelizma (p>0,05, test paralelizma). 63 37 38 39 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) $$ ** ** $ A 0.2 0.7 1.2 0.2 0.7 M ak si m al ni e fe kt Δ T (° C ) Log doza, Ketamin mg/kg B 90 120 150 180 KT(2.5)+MG(5) KT(5)+MG(5) KT(10)+MG(5) 0.9% NaCl 1.2 1.7 KT KT+MG(5) 64 Slika IV.3.3.3. A) Vremenski tok efekta kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u masenom odnosu doza 0,5:1, 1:1 i 2:1 (rastuće doze ketamina 2,5, 5 i 10 mg/kg sa fiksnom dozom magnezijum sulfata 5 mg/kg) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između kombinacija ketamin- magnezijum i 0,9% NaCl (*p<0,05, ** p <0,01), i između KT(2,5)+MG(5) i KT(5)+MG(5) (##p<0,01), i između KT(2,5)+MG(5) i KT(10)+MG(5) ($p <0,05, $$ p <0,01)(One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). B) Krive odnosa doze i efekta za ketamin (KT, 5, 10, 20 i 30 mg/kg; ip) i kombinaciju ketamina (2,5, 5 i 10 mg/kg; ip) i magnezijum sulfata (MG, 5 mg/kg; sc) na telesnu temperaturu kod pacova. Podaci su izraženi kao srednja vrednost promene maksimalne temperature (Δ T °C) u odnosu na kontrolu (0,9% NaCl). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM Δ T (°C) dobijenu na 6-8 pacova. IV.3.4. Efekti ketamina i magnezijum sulfata na morfinsku hipertermiju IV.3.4.1.Efekti ketamina na morfinsku hipertermiju Kod pacova ketamin (5, 20 i 30 mg/kg, ip) smanjuje morfinsku hipertermiju na dozno- zavistan način (Slika IV.3.4.1.A). Doze od 5, 20 i 30 mg/kg smanjuju morfinsku hipertermiju za 0,6, 0,9 i 1,8°C. Maksimalni efekt kombinacije ketamin (20 mg/kg)-morfin javlja se u 60 minutu nakon davanja morfina. Kombinacija ketamin (30 mg/kg)-morfin pretvara morfinsku hipertermiju u hipotermiju. Ova kombinacija postiže maksimalni efekt u 30 minutu i traje 90 minuta. Ketamin, kao i kombinacija ketamin-magnezijum prevenira hipotermiju koja prati morfinsku hipertermiju kod pacova (Slika IV.3.4.1.A i IV.3.4.1.B). 65 Slika IV.3.4.1.A.Vremenski tok efekta ketamina (KT, 5, 20 i 30 mg/kg, ip) na morfinom (MR, 2.6 mg/kg, ip) izazvanu hipertermiju kod pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između MR i MR+KT (**p<0,01), između MR+KT(20) i MR+KT(30) (##p<0,01), i između MR+KT(5) i MR+KT(30) ($$p<0,01)(One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). &(p<0,05) označava “rebound” hipotermiju koja se javlja prilikom davanja morfina. 37 38 39 40 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) ## $$ ## A 90 120 150 180 210 MR MR+KT(5) MR+KT(20) MR+KT(30) 0.9% NaCl & 66 Slika IV.3.4.1.B.Vremenski tok efekta kombinacije ketamin-magnezijum sulfat na morfinsku hipertermiju kod pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između MR i MR+KT(5) (**p<0,01), MR i MR+KT(5)+MG(5) (#p<0,05, ##p<0,01) i između MR+KT(5) i MR+KT(5)+MG(5) ($p<0,05, $$p<0,01) (One-Way ANOVA Tukey’s HSD test). &(p<0,05) označava “rebound” hipotermiju koja se javlja prilikom davanja morfina. 37 38 39 40 0 30 60 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) ## $$ $ B 90 120 150 180 210 MR MR+KT(5) MR+KT(5)+MG(5) 0.9%NaCl 67 IV.3.4.2. Efekti kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u masenim odnosima doza 0,25:1, 0,5:1, 1:1 i 2:1 (rastuće doze ketamina 1,25, 2,5, 5 i 10 mg/kg sa fiksnom dozom magnezijum sulfata 5 mg/kg) na morfinsku hipertermiju Magnezijum sulfat (5 mg/kg, sc) u kombinaciji sa ketaminom (5 mg/kg, ip) smanjuje morfinsku hipertermiju za 1°C (p<0,01) (Slika IV.3.4.1.B). Ketamin u dozama 1,25 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg i 10 mg/kg dat u kombinaciji sa fiksnom dozom magnezijum sulfata (5 mg/kg, sc) smanjuje hipertermni efekt morfina na dozno-zavistan način (Slika IV.3.4.2.A.). Kombinacija najveće doze ketamina (10 mg/kg, ip) sa magnezijum sulfatom (5 mg/kg, sc) menja morfinsku hipertermiju u hipotermiju, a efekt traje 90 minuta. Na slici IV.3.4.2.B. prestavljena je kriva odnosa doze i efekta kombinacije ketamina (1,25, 2,5, 5 i 10 mg/kg, ip) i fiksne doze magnezijuma (5 mg/kg) u prisustvu morfina, kao i kriva ketamin (5, 10 i 30 mg/kg)-morfin. Statističkom obradom podataka pokazano je značajno pomeranje krive kombinacije morfin-ketamin-magnezijum ulevo u odnosu na krivu morfin- ketamin. Ovo ukazuje da postoji potenciranje efekta ketamina u prisustvu magnezijuma na morfinsku hipertermiju. Odnos jačina je 5,3 (CL 2,5-13,1) (p<0,05, test za ispitivanje relativne jačine). Nagibi krivih statistički se ne razlikuju (p>0,05, test paralelizma). 68 37 38 39 40 0 30 60 90 120 150 180 210 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) MR MR+KT(1.25)+MG(5) MR+KT(2.5)+MG(5) MR+KT(5)+MG(5) MR+KT(10)+MG(5) 0.9% NaCl ** ** ** * * ** ** ** * A 0.2 0.7 1.2 1.7 2.2 2.7 0.2 0.7 1.2 1.7 M ak si m al ni e fe kt Δ T (° C ) Log doza, Ketamin mg/kg MR+KT MR+KT+MG B 69 Slika IV.3.4.2. A) Vremenski tok efekta ketamin-magnezijum sulfat u odnosima doza 0,25:1, 0,5:1, 1:1 i 2:1 (rastuće doze ketamina 1,25, 2,5, 5 i 10 mg/kg sa fiksnom dozom magnezijum sulfata 5 mg/kg) na morfinom (MR, 2,6 mg/kg, ip)-izazvanu hipertermiju kod pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između kombinacija morfin-ketamin-magnezijum i morfina (*p<0,05, **p<0,01). Postoji statistički značajna razlika i između samih kombinacija MR+KT(1,25)+MG(5) i MR+KT(2,5, 5 i 10)+MG(5), i između MR+KT(2,5)+MG(5) i MR+KT(10)+MG(5) (nije prikazano). &(p<0,05) označava “rebound” hipotermiju koja se javlja prilikom davanja morfina. B) Krive odnosa doze i efekta za morfin-ketamin (MR+KT) i morfin-ketamin–magnezijum sulfat kombinacija (MR+KT+MG) na telesnu temperaturu kod pacova. Podaci su izraženi kao srednja vrednost promene maksimalne temperature (Δ T °C) u odnosu na kontrolu (0,9% NaCl). Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM Δ T (°C) dobijenu na 6-8 pacova. IV.3.5. Nalokson antagonizuje dejstvo morfina i kombinacije morfin-ketamin i morfin-ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu kod pacova Nalokson hidrohlorid (1 mg/kg, sc), neselektivni antagonist opioidnih receptora, smanjuje efekt morfina (2,6 mg/kg, ip), kao i kombinacije morfin-ketamin i morfin-ketamin- magnezijum sulfat za 1,3, 1,4 i 0,9°C (p<0,01) (Slika IV.3.5). Sam nalokson ne utiče na bazalnu temperaturu, a i u kombinaciji sa ketaminom (5 mg/kg, ip) ne dovodi do promene telesne temperature (nije prikazano). Ipak, u prisustvu ketamina u dozi 5 mg/kg, koja sama ne utiče na telesnu temperaturu, nalokson značajno više smanjuje (p<0,05) morfinsku hipertermiju. 70 Slika IV.3.5. Vremenski tok efekta naloksona na kombinaciju morfin-ketamin-magnezijum sulfat na telesnu temperaturu kod pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistički značajna razlika između MR i NL+MR (*p<0,05, **p<0,01) između MR+KT(5) i NL+MR+KT(5) (#p<0,05, ##p<0,01), između MR+KT(5)+MG i NL+MR+KT(5)+MG ($p<0,05, $$p<0,01), između NL+MR i NL+MR+KT(5) (&p<0,05), između NL+MR i NL+MR+KT(5)+MG(5) (“p<0,05). 37 38 39 40 0 30 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) & * 60 90 120 150 180 MR MR+KT(5) MR+KT(5)+MG(5) NL+MR NL+MR+KT(5) NL+MR+KT(5)+MG(5) 0.9% NaCl ** * # $$ " 71 IV.4. Mehanizam hipotermnog dejstva kombinacije ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg), rezultati Ketamin (5 mg/kg) u kombinaciji sa magnezijum sulfatom (5 mg/kg) dovodi do značajnog sniženja telesne temperature u poređenju sa 0,9% NaCl (p<0,05). Maksimalno sniženje telesne temperature koju izaziva kombinacija ketamin(5)-magnezijum sulfat(5) iznosi 0,7 °C. Cilj ovog dela istraživanja bio je ispitivanje mehanizma hipotermnog dejstva kombinacije ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg). Koristili smo antagonist adrenergičkih α2 receptora (johimbin), neselektivni antagonist serotonergičkih (5-HT) receptora (metizergid), antagonist GABAA receptora (bikukulin), prekursor sinteze azotnog oksida (L-arginin), neselektivni antagonist sintaze azotnog oksida (L-NAME), neselektivni antagonist opioidnih receptora (nalokson) i antagonist ATP-zavisnih kalijumskih kanala (glibenklamid). IV.4.1. Dejstvo johimbina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) Johimbin (0,5, 1 i 3 mg/kg) ne utiče na telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.4.1.B). Doze 0,5 i 1 mg/kg johimbina ne utiču na hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, dok u dozi od 3 mg/kg johimbin produbljuje hipotermiju ove kombinacije. Kombinacija ketamin-magnezijum maksimalno snižava telesnu temperaturu za 0,7°C. Doze johimbina od 0,5, 1 i 3 mg/kg, zajedno sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat snižavaju telesnu temperaturu za 0,6, 0,7 i 1,8°C u poređenju sa 0,9% NaCl. U dozi od 3 mg/kg johimbin snižava hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat maksimalno za 0,9°C (u poređenju sa samom kombinacijom). Postoji statistički značajna razlika između kombinacija johimbin (1)-ketamin (5)-magnezijum sulfat (5) i johimbin (3)- ketamin (5)-magnezijum sulfat (5) (##p<0,01, #p<0,05), kao i razlika između kombinacija 72 johimbin (0,5)-ketamin (5)-magnezijum sulfat (5) i johimbin (3)-ketamin (5)-magnezijum sulfat (5) ($$p<0,01, $p<0,05) (slika IV.4.1.A). IV.4.1. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg), johimbina (JOH, 0,5,1 i 3 mg/kg, sc) i B) johimbina (JOH, 0,5,1 i 3 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između kombinacija: KT(5)-MG(5) i JOH(3)-KT(5)-MG(5) (**p<0,01, *p<0,05); JOH(1)-KT(5)-MG(5) i JOH(3)-KT(5)-MG(5) (##p<0,01, #p<0,05); JOH(0,5)- KT(5)-MG(5) i JOH(3)-KT(5)-MG(5) ($$p<0,01, $p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) JOH(0,5)+KT(5)+MG(5) JOH(1)+KT(5)+MG(5) JOH(3)+KT(5)+MG(5) A 180 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) JOH(0,5) JOH(1) JOH(3) 0,9% NaCl B 73 IV.4.2. Dejstvo metizergida na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) Metizergid (0,5 i 1 mg/kg, sc) primenjen sam ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu (p>0,05) u poređenju sa 0,9% NaCl, osim u 120 minutu kada u dozi od 1 mg/kg dovodi do hipertermije (slika IV.4.2.B). U dozi od 0,5 mg/kg metizergid antagonizuje efekt kombinacije ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) na telesnu temperaturu u 60 minutu (p<0,05). Efekt se pojavljuje u 60 minutu i istovremeno tada postiže maksimum dejstva. U dozi od 1 mg/kg metizergid redukuje hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, ali nije pokazana statistička značajnost, sem u 120 minutu kada kombinacija metizergid-ketamin-magnezijum sulfat dovodi do hipertermije (slika IV.4.2.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 0,5 i 1 mg/kg metizergida u kombinaciji sa ketamin-magnezijum sulfatom maksimalno snižavaju telesnu temperaturu za 0,6 °C (slika IV.4.2.A).U poređenju sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, doze od 0,5 i 1 mg/kg metizergida redukuju hipotermni efekt ove kombinacije maksimalno za 0,6 °C. 37 38 39 40 0 30 60 90 120 150 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) MET(0,5)+KT(5)+MG(5) MET(1)+KT(5)+MG(5) A 180 37 38 39 40 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) MET(0,5) MET(1) 0,9 %NaCl B 74 Slika IV.4.2. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg), metizergida (MET, 0,5 i 1 mg/kg, sc) i B) metizergida (MET, 0,5 i 1 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između KT(5)-MG(5) i MET(0,5)-KT(5)-MG(5) (*p<0,05); KT(5)-MG(5) i MET(1)-KT(5)-MG(5) (##p<0,01) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.4.3. Dejstvo bikukulina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) Bikukulin (1 mg/kg, sc) primenjen sam ne utiče na bazalnu temperaturu pacova (p>0,05). Bikukulin u dozi od 2 mg/kg dovodi do hipotermije u 90 minutu koja traje od 90-180 minuta u poređenju sa 0,9% NaCl (p<0,05) (slika IV.4.3.B). Maksimalno sniženje bazalne temperature do koje dovodi bikukulin (2 mg/kg) je 1,1°C u odnosu na 0,9% NaCl (p<0,05). Bikukulin (1 i 2 mg/kg) u kombinaciji sa ketaminom (5 mg/kg) i magnezijum sulfatom (5 mg/kg) statistički se ne razlikuje značajno u odnosu na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat (p>0,05) (slika IV.4.3.A). 75 Slika IV.4.3. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg), bikukulina (BIK, 1 i 2 mg/kg, sc) i B) bikukulina (BIK, 1 i 2 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između BIK(2) i 0,9% NaCl (**p<0,01, *p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) BIK(1)+KT(5)+MG(5) BIK(2)+KT(5)+MG(5) 180 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) BIK(1) BIK(2) 0,9% NaCl 76 IV.4.4. Dejstvo L-arginina na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) L-arginin (5 i 10 mg/kg, sc) primenjen sam ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.4.4.B). Doza od 5 mg/kg L-arginina ne utiče na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat (p>0,05). Doza od 10 mg/kg L-arginina antagonizuje efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u 90 minutu (p<0,05) (slikaIV.4.4.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 5 i 10 mg/kg L-arginina u kombinaciji sa ketamin-magnezijum sulfatom pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,6 i 0,3 °C. U poređenju sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, doze od 5 i 10 mg/kg L-arginina redukuju hipotermni efekt ove kombinacije maksimalno za 0,3 i 0,7°C. 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) L-ARG(5)+KT(5)+MG(5) L-ARG(10)+KT(5)+MG(5) A * 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) L-ARG(5) L-ARG(10) 0,9% NaCl B 77 Slika IV.4.4. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg), L arginina (L-ARG, 5 i 10 mg/kg, sc) i B) L arginina (L-ARG, 5 i 10 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između KT(5)-MG(5) i L-ARG(10)-KT(5)-MG(5) (*p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.4.5. Dejstvo L-NAME na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) L-NAME (2,5 i 5 mg/kg) ne utiče na telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.4.5.B). L-NAME u dozi od 2,5 mg/kg ne utiče na kombinaciju ketamin- magnezijum sulfat (p>0,05). U dozi od 5 mg/kg, L-NAME antagonizuje efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat u 60 (p<0,05) i 90 minutu (p<0,01) (slika IV.4.5.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 2,5 i 5 mg/kg L-NAME u kombinaciji sa ketamin- magnezijum sulfatom pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,7 i 0,1 °C. U poređenju sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, doze od 2,5 i 5 mg/kg L- NAME,redukuju hipotermni efekt ove kombinacije maksimalno za 0,2 i 0,9°C. 78 Slika IV.4.5. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (MG, 5 mg/kg) i L-NAME (L-NAME, 2,5 i 5 mg/kg, sc) i B) L-NAME (L-NAME, 2,5 i 5 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između L-NAME(5)-KT(5)-MG(5) i KT(5)-MG(5) (**p<0,01, *p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.4.6. Dejstvo naloksona na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) Nalokson (1 i 3 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.4.6.B). Ne postoji statistički značajna razlika između kombinacija nalokson-ketamin-magnezijum sulfat u odnosu na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat (p>0,05) (slika IV.4.6.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 1 i 3 mg/kg naloksona u kombinaciji sa ketamin-magnezijum sulfatom pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,9 i 0,6 °C. U poređenju sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra ( ºC ) vreme (min) KT(5)+MG(5) L-NAME(2,5)+KT(5)+MG(5) L-NAME(5)+KT(5)+MG(5) * ** A 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra ( ºC ) vreme (min) L NAME(2,5) L NAME(5) 0,9% NaCl B 79 nalokson u dozi od 1 mg/kg produbljuje hipotermiju kombinacije maksimalno za 0,2°C, dok u dozi od 3 mg/kgredukuje hipotermni efekt ove kombinacije maksimalno za 0,2 °C (p>0,05). Slika IV.4.6. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg) i naloksona (NL, 1 i 3 mg/kg, sc) i B) naloksona (NL, 1 i 3 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Ne postoji statistička značajnost između kombinacija NL-KT-MG u odnosu na kombinaciju KT-MG (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) NL(1)+KT(5)+MG(5) NL(3)+KT(5)+MG(5) A 36 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) NL(1) NL(3) 0,9% NaCl B 80 IV.4.7. Dejstvo glibenklamida na kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) Glibenklamid (3 i 6 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.4.7.B). Ne postoji statistički značajna razlika između kombinacija glibenklamid-ketamin-magnezijum sulfat u odnosu na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat (p>0,05) (slika IV.4.7.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 3 i 6 mg/kg glibenklamida u kombinaciji sa ketamin-magnezijum sulfatom pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,9 i 0,8 °C. U poređenju sa kombinacijom ketamin- magnezijum sulfat, doze od 3 i 6 mg/kg glibenklamida redukuju hipotermni efekt ove kombinacije maksimalno za 0,3 °C. 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) KT(5)+MG(5) GLIB(3)+KT(5)+MG(5) GLIB(6)+KT(5)+MG(5) 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) GLIB(3) GLIB(6) alkohol B 81 Slika IV.4.7. Vremenski tok efekta: A) ketamina (KT, 5 mg/kg, ip), magnezijum sulfata (5 mg/kg), glibenklamida (GLIB, 3 i 6 mg/kg, sc) i B) glibenklamida (GLIB, 3 i 6 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Ne postoji statistička značajnost između kombinacija GLIB-KT-MG u odnosu na kombinaciju KT-MG (One- Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.5. Mehanizam hipotermnog dejstva ketamina (10 mg/kg) Intraperitonealna injekcija ketamina (5-30 mg/kg) kod pacova dovodi do dozno zavisnog sniženja telesne temperature kod pacova (Vucković i sar., 2014.). Ketamin u dozi od 10 mg/kg dovodi do značajnog sniženja telesne temperature u poređenju sa 0,9% NaCl (p<0,05). Maksimalno sniženje telesne temperature iznosi 0,6 °C. Cilj ovog dela istraživanja bio je ispitivanje mehanizma hipotermnog dejstva ketamina. Koristili smo antagonist adrenergičkih α2 receptora (johimbin), neselektivni antagonist serotonergičkih (5-HT) receptora (metizergid), antagonist GABAA receptora (bikukulin), prekursor sinteze azotnog oksida (L-arginin), neselektivni antagonist sintaze azotnog oksida (L-NAME), neselektivni antagonist opioidnih receptora (nalokson) i antagonist ATP- zavisnih kalijumskih kanala (glibenklamid). IV.5.1. Dejstvo johimbina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) Johimbin (0,5 i 1 mg/kg, sc) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.5.1.B). Johimbin (0,5 i 1 mg/kg, sc) potencira hipotermiju izazvanu ketaminom (10 mg/kg)(p<0,01) (slika IV.5.1.A). Efekt se pojavljuje u 30 minutu, postiže maksimum u 60 minutu i traje 120 min nakon date intraperitonealne injekcije ketamina (p<0,01). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze 0,5 i 1 mg/kg johimbina u kombinaciji sa ketaminom (10 mg/kg) maksimalno snižavaju telesnu temperaturu pacova za 2,4 i 2,5°C, jedno za drugim. U poređenju sa ketaminom (10 mg/kg), johimbin maksimalno snižava telesnu temperaturu pacova za 2°C. 82 Slika IV.5.1. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i johimbina (JOH, 0,5 i 1 mg/kg, sc) i B) johimbina (JOH, 0,5 i 1 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između KT(10) i kombinacije JOH(0,5, 1)-KT(10) (**p<0,01, *p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). IV.5.2. Dejstvo metizergida na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) Metizergid (0,5 i 1 mg/kg, sc) primenjen sam ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu (p>0,05) u poređenju sa 0,9% NaCl, osim u 120 minutu kada u dozi od 1 mg/kg dovodi do hipertermije (slika IV.5.2.B). Kombinacija ketamina (10 mg/kg ip) sa metizergidom u dozi od 0,5 mg/kg, imala je sličan efekt kao kada se ketamin primeni sam (10 mg/kg) (p>0,05). Doza od 1 mg/kg metizergida potencira ketaminsku hipotermiju (10 mg/kg, ip) (p<0,05) (slika IV.5.2.A). Efekt se pojavljuje u 30 minuta nakon intraperitonealne injekcije ketamina i tada istovremeno postiže maksimum dejstva. U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 0,5 i 1 35 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) KT(10) JOH(0,5)+KT(10) JOH(1)+KT(10) A 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) JOH(0,5) JOH(1) JOH(3) 0,9% NaCl B 83 mg/kg metizergida u kombinaciji sa ketaminom (10 mg/kg) pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,6 i 1,2°C. U poređenju sa ketaminom (10 mg/kg), metizergid (1 mg/kg) maksimalno snižava telesnu temperaturu pacova za 0,7°C. Slika IV.5.2. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i metizergida (MET, 0,5 i 1 mg/kg, sc) i B) metizergida (MET, 0,5 i 1 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između KT(10) i kombinacije MET(1)-KT(10) (*p<0,05), kao i između MET(1) i 0,9% NaCl (##p<0,01)(One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 40 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) KT(10) MET(0,5)+KT(10) MET(1)+KT(10) A * 36 37 38 39 40 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) MET(0,5) MET(1) 0,9 %NaCl B ## 84 IV.5.3. Dejstvo bikukulina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) Bikukulin (1 mg/kg, sc) primenjen sam ne utiče na bazalnu temperaturu pacova u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05). Bikukulin u dozi od 2 mg/kg primenjen sam dovodi do hipotermije u 90 minutu (slika IV.5.3.B). Hipotermija koju daje bikukulin u dozi od 2 mg/kg, traje od 90-180 minuta u poređenju sa 0,9% NaCl (p<0,05). Doze od 1 i 2 mg/kg u kombinaciji sa ketaminom (10 mg/kg ip), nisu dale statistički različit efekt u poređenju sa samim ketaminom (p>0,05). U prisustvu ketamina (10 mg/kg), bikukulinom izazvana hipotermija se menja do vrednosti bazalne temperature (slika IV.5.3.A). Slika IV.5.3. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i bikukulina (BIK, 1 i 2 mg/kg, sc) i B) bikukulina (BIK, 1 i 2 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između BIK(2) i 0,9% NaCl (**p<0,01, *p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) KT(10) BIK(1)+KT(10) BIK(2)+KT(10) A 36 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) BIK(1) BIK(2) 0,9% NaCl B 85 IV.5.4. Dejstvo L-arginina na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) L-arginin (5 i 10 mg/kg) primenjen sam ne utiče na bazalnu temperaturu pacova u poređenju sa 0,9% NaCl (slika IV.5.4.B).L-arginin (5 i 10 mg/kg) u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg produbljuje ketamimom izazvanu hipotermiju, ali ne postoji statistička značajnost u odnosu na sam ketamin (p>0,05)(slika IV.5.4.A). U poređenju sa 0,9% NaCl, doze od 5 i 10 mg/kg L-arginina u kombinaciji sa ketaminom (10 mg/kg) pokazuju maksimalno sniženje telesne temperature za 0,9 i 0,7°C. U poređenju sa ketaminom (10 mg/kg), L-arginin (5 i 10 mg/kg) maksimalno snižava telesnu temperaturu pacova za 0,6°C. Slika IV.5.4. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i L- arginina (L-ARG, 5 i 10 mg/kg, sc) i B) L-arginina (L-ARG, 5 i 10 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Ne postoji statistička značajnost između KT i kombinacije L-ARG-KT (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(10) L-ARG(10)+KT(10) L-ARG(5)+KET(10) A 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) L-ARG(5) L-ARG(10) 0,9% NaCl B 86 IV.5.5. Dejstvo L-NAME na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) L-NAME (5 mg/kg) primenjen sam ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu pacova u poređenju sa 0,9% NaCl (slika IV.5.5.B). L-NAME (10 mg/kg) primenjen sam povećava telesnu temperaturu pacova u 30 min u odnosu na 0,9% NaCl (p<0,05). Ne postoji statistički značajna razlika između L-NAME (5 i 10 mg/kg) u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg u poređenju sa samim ketaminom (10 mg/kg) (p>0,05) (slika IV.5.5.A). Slika IV.5.5. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i L- NAME (L-NAME, 5 i 10 mg/kg, sc) i B) L-NAME (L-NAME, 5 i 10 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između L-NAME (10) i 0,9 % NaCl (*p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(10) L-NAME(5)+KT(10) L-NAME(10)+KT(10) A 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) L-NAME(5) L-NAME(10) 0,9% NaCl * B 87 IV.5.6. Dejstvo naloksona na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) Nalokson (1 i 3 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.5.6.B). Nalokson u dozi od 1 mg/kg u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg ne utiče na ketataminom izazvanu hipotermiju (p>0,05). Nalokson u dozi od 3 mg/kg u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg, produbljuje ketaminsku hipotermiju u 90 i 120 minutu (p<0,01) (slika IV.5.6.A). U odnosu na 0,9% NaCl, kombinacija nalokson (1 i 3 mg/kg)-ketamin snižava telesnu temperature maksimalno za 0,5 i 1,5 °C. U poređenju sa ketaminom (10 mg/kg), nalokson (3 mg/kg) maksimalno snižava telesnu temperaturu pacova za 1,5°C. Slika IV.5.6. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i naloksona (NL, 1 i 3 mg/kg, sc) i B) naloksona (NL, 1 i 3 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Statistička značajnost postoji između KT(10) i kombinacije NL(3)-KT(10) (**p<0,01) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) KT(10) NL(1)+KT(10) NL(3)+KT(10) A 36 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (º C ) vreme (min) NL(1) NL(3) 0,9% NaCl B 88 IV.5.7. Dejstvo glibenklamida na hipotermni efekt ketamina (10 mg/kg) Glibenklamid (3 i 6 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu u poređenju sa 0,9% NaCl (p>0,05) (slika IV.5.7.B). Ketaminom izazvana hipotermija je produbljena dejstvom glibenklamida (p<0,05) (slika IV.5.7.A). U odnosu na 0,9% NaCl, kombinacija glibenklamid (3 i 6 mg/kg)-ketamin snižava telesnu temperature maksimalno za 1,2 i 1,3 °C. U poređenju sa ketaminom (10 mg/kg), glibenklamid maksimalno snižava telesnu temperaturu pacova za 0,9°C (slika IV.5.7.A). Slika IV.5.7. Vremenski tok efekta: A) kombinacije ketamina (KT, 10 mg/kg, ip) i glibenklamida (GLIB, 3 i 6 mg/kg, sc) i B) glibenklamida (GLIB, 3 i 6 mg/kg, sc) na telesnu temperaturu pacova. Svaka tačka predstavlja srednju vrednost ± SEM telesne temperature izražene u stepenima Celzijusa (°C) na 6–8 pacova. Postoji statistička značajnost između KT(10) i kombinacije GLIB(3,6)-KT(10) (*p<0,05) (One-Way ANOVA, Tukey’s HSD test). 36 37 38 39 0 30 60 90 120 150 180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) KT(10) GLIB(3)+KT(10) GLIB(6)+KT(10) * * * A 36 37 38 39 0 30 60 90 120150180 te le sn a te m pe ra tu ra (° C ) vreme (min) GLIB(3) GLIB(6) 0,9% NaCl B 89 V DISKUSIJA V.1. Uticaj derivata morfina i fentanila na antinocicepciju i telesnu temperaturu kod pacova Dobro je poznato da i morfin i fentanil imaju slične zajedničke neželjene efekte (karakteristične za agoniste µ-opioidnih receptora) kao što su sedacija, mučnina, opstipacija, depresija disanja i, pri produženoj primeni, tolerancija i zavisnost koje se javljaju pri analgetičkim dozama. Kod ispitanika kojima su dati morfin ili fentanil primećeno je povećanje telesne temperature kao ređi neželjeni događaj, ali nema studija kojima se poredi incidenca pojave povišene telesne temperature između ova dva leka. Naši rezultati ukazuju na to da su terapijski indeksi (hipertermna doza HD50/antinociceptivna doza AD50) za derivate fentanila relativno visoki, dok su zaštitni indeksi za jedinjenja morfina ≤1. U ovom ispitivanju prvi put pokazana je razlika između dve glavne klase opioidnih lekova, derivata morfina (fenantrenski tip) i derivata fentanila (4-anilinopiperidinski tip) u jačini izazivanja hipertermije kod pacova. Do sada nije objavljeno ni jedno ispitivanje kojim bi bila utvrđena povezanost između strukture i temperaturnog odgovora agonista µ-opioidnih receptora. Derivati morfina i derivati fentanila su izazivali hipertermiju kod pacova u dozama koje su oko 2 puta niže, odnosno 6-11 puta više od njihovih srednjih efektivnih antinociceptivnih doza, respektivno. Antinociceptivni i hipertermni efekti derivata morfina (fenantrenski tip) i derivata fentanila (4-anilinopiperidinski tip) su dozno-zavisni. Redosled jačine u izazivanju hipertermije derivata fentanila je veoma sličan redosledu njihove antinociceptivne jačine. Jedinjenja morfina su takođe imala sličan redosled jačine u izazivanja hipertermije i antinocicepcije. Ako serija srodnih agonista pokaže istu relativnu jačinu u izazivanju različitih efekata, verovatno je da su ti efekti posredovani sličnim ili istim receptorima (Bourne i Zastrow, 2007). Ovo bi moglo da ukaže na to da slični receptori učestvuju u 90 ispoljavanju antinociceptivnih i hipertermnih efekata. Antinociceptivni i hipertermni efekti u obe serije su bili poništeni prethodnim davanjem naloksona, neselektivnog antagoniste opioidnih receptora, što ukazuje na to da se njihovi efekti ostvaruju preko opioidnih receptora. Ovi receptori najverovatnije pripadaju µ-opioidnim receptorima, s obzirom da je u ranijim studijama objavljeno da oni učestvuju u antinocicepciji (Kissin i sar., 1983) i hipertermiji (Baker i Meert, 2002; Cao i Morisson, 2005) izazivanim fentanilom/morfinom. Moglo bi se pretpostaviti da razlika u selektivnosti prema antinociceptivnom/temperaturnom odgovoru između opioidnih agonista derivata fentanila i morfina koja je otkrivena u ovom ispitivanju verovatno odražava različit afinitet i efikasnost agonista za različite podtipove opioidnih receptora (Yang i sar., 1992). Pre nekoliko decenija su rađene studije vezivanja i farmakološke studije podtipova opioidnih receptora, mada njihov značaj u pogledu termoregulacije nije bio u potpunosti proučen. Međutim, kako eliminacija jednog jedinog gena koji kodira µ-opioidne receptore dovodi do prestanka funkcije µ-receptora (kako analgezije, tako i depresije disanja), dalje podklasifikovanje primarnih tipova opioidnih receptora nema smisla (Dietis i sar., 2011). Dalja ispitivanja eliminacije gena kod miševa ukazuju na to da su različiti efekti agonista µ- opioidnih receptora posredovani posebnim intracelularnim signalnim putevima (Davis, 2012). Standardni agonisti i antagonisti aktiviraju ili inaktiviraju celokupnu mrežu prenošenja signala receptora. Međutim, „pristrasni” ligandi selektivno aktiviraju neke signale, izbegavajući, ili čak inaktivirajući druge signale posredovane istim receptorom (Rives i sar., 2012; Rivero i sar., 2012; Nozaki i sar., 2012; Pradhan i sar., 2012). Na primer, morfin pre aktivira puteve posredovane beta-arestinom 2 in vivo, dok fentanil i metadon mogu da aktiviraju prenošenje signala posredovano i beta-arestinom 1 i beta- arestinom 2 (Groer i sar., 2011). U tom pogledu, velika antinociceptivna i mala hipertermna jačina tj. veća selektivnost ka antinocicepciji, derivata fentanila u odnosu na morfin, otkrivena u ovom ispitivanju, može da predstavlja „pristrasni” agonizam prema µ- opioidnim receptorima. Ovo otkriće bi moglo da pomogne u boljoj karakterizaciji opioidnih receptora i sintezi selektivnijih opioida. Ovi rezultati bi takođe mogli da unaprede naše znanje o 91 mehanizmu hipertermije izazvane opioidima i pruže nova saznanja o ulozi opioidnog sistema u termoregulaciji. Ovim ispitivanjem je utvrđeno da su derivati morfina (fenantrenski tip) i derivati fentanila (4-anilinopiperidinski tip) izazivali hipertermiju kod pacova u dozama oko 2 puta manjim i 6-11 puta većim od njihove srednje efektivne antinociceptivne doze, respektivno. Potrebna su dalja ispitivanja kako bi se razjasnio značaj ovih saznanja. V.2. Antinociceptivni efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija Glavno otkriće ovog delaispitivanja je sinergizam između ketamina i magnezijum sulfata, NMDA antagonista, u modelu akutne termičke nocicepcije kod pacova. Ketamin i magnezijum sulfat su se pokazali neefikasanim kada se primenjuju sami u ovom modelu bola tj. u testu potapanja repa u toplu vodu. Kombinacijom ova dva leka dobija se statistički značajno veće produženje latentnog vremena u testu potapanja repa u toplu vodu, u poređenju sa pojedinačno datim lekovima, što je ukazalo na sinergističku interakciju. Po prvi put je dokazano da efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat zavisi od redosleda primene leka; veći antinociceptivni efekt se dobija kada se ketamin primeni pre magnezijum sulfata. Takođe, magnezijum sulfat povećava i efikasnost kombinacije ketamin-morfin u modelu akutnog nociceptivnog bola. Kombinacija ova tri leka nije ranije ispitivana. Doze magnezijum sulfata i ketamina su odabrane iz eksperimenata morfin- ketamin i morfin-magnezijum sulfat koji su prvo izvedeni i koji su pokazali da ketamin i magnezijum sulfat povećavaju antinociceptivni efekt morfina. Naši rezultati su u skladu sa prethodnim studijana (McCartney i sar., 2004; Nechifor i sar., 2011). Nasuprot našim rezultatima, Gupta (2011) je pokazao da magnezijum sulfat (5 mg⁄ kg), primenjen sam izaziva prolazno povećanje latence u tail flick testu kod miševa. Ove razlike su verovatno posledica korišćenja različitih testova za termičku nocicepciju (tail-flickvstail immersion test) kao i razlike između vrste životinja koje su korišćene u eksperimentima. 92 Pokazano je da ketamin samo u anestetičkim dozama povećava latencu u tail-flick testu na pacovima (Pekoe i Smith, 1982). Subanalgetičke doze ketamina potenciraju opioidnu analgeziju (Laulin i sar., 2002; Campos i sar., 2006; Holtman i sar., 2008; Carstensen i Møller, 2010). Magnezijum povećava analgeziju izazvanu opioidima (Gupta i sar., 2011; Nechifor i sar., 2011). Magnezijum je nekompetitivni antagonist NMDA receptora koji blokira jonski kanal (Fawcet i sar., 1999), dok se ketamin vezuje nekompetitivno za fenciklidinsko mesto NMDA receptora (Øye i sar., 1992) blokira otvaranje kanala i smanjuje frekvencu otvaranja kanala alosteričkim mehanizmom (Orser i sar., 1997a). Kako ketamin i magnezijum sulfat blokiraju NMDA receptor različitim mehanizmima, nije iznenađujuće da postoji sinergizam između ova dva leka. Kako ovi lekovi pojedinačno dati nemaju analgetičko dejstvo, izobolografska analiza nije mogla biti izvedena. Različite doze ketamina (2,5; 5; 10 mg) i magnezijum sulfata (2,5; 5; 10 mg) kombinovane su u različitim odnosima (0,5:1, 1:1 i 2:1). Ketamin-magnezijum sulfat u dozama 2,5 : 5, 5 : 5, i 10 : 5 mg/kg ispoljavaju sinergističko dejstvo, ali efekt nije dozno-zavisan. Nije jasno zašto je magnezijum sulfat samo u dozi od 5 mg/kg efektivan u kombinaciji sa ketaminom. Izgleda da je za interakciju sa ketaminom tj. za sinergizam bitnija doza magnezijum sulfata od relativne proporcije lekova u kombinaciji (0.5:1, 1:1, 2:1). Ketamin poseduje analgetska svojstva koja su posledica njegovih interakcija sa kalcijumskim i natrijumskim kanalima, dopaminskim ali i sa opioidnim receptorima, kao i sa ponovnim preuzimanjem noradrenalina i serotonina. Takođe ketamin utiče na holinergičku transmisiju, a ima i antiinflamatorna svojstva (Hirota i Lambert, 1996). Pokazano je da magnezijum smanjuje aktivnost ne samo NMDA receptora, već takođe redukuje aktivnost presinaptičkih i postsinaptičkih kalcijumskih kanala, modulira oslobađanje neurotransmitera. Ispoljava modulatorno dejstvo na natrijumske i kalijumske kanale, i tako može da utiče na membranski potencijal (Herroeder i sar., 2011). Farmakokinetska interakcija između ketamina i magnezijum sulfata je manje moguća, jer nema farmakokinetskih interakcija između sistemski datog magnezijuma i drugih lekova. 93 U nekoliko ranijih ex vivo studija ispitivana je interakcija između ketamina i magnezijuma i dobijeni su različiti rezultati. Harrison i Simmonds (1985) su pokazali aditivnu interakciju između ova dva leka na kortikalnim neuronima pacova. Na neuronima hipokampusa miševa, magnezijum smanjuje blokadu NMDA receptora izazvanu ketaminom (MacDonald i sar., 1991). U eksperimentima koji su izvođeni na Xenopus oocitima, kombinacija ketamina i magnezijuma inhibira NR1/NR2A i NR1/NR2B glutamatne receptore na sinergistički način (Liu i sar. , 2001). U nekoliko in vivo studija na životinjama dobijeni su oprečni rezultati. Na miševima, magnezijum dat intraperitonealno, potencira ketaminom izazvanu anesteziju na sinergističan način tj. povećava procenat gubitka refleksa uspravljanja, vreme spavanja i vremena oporavka (Irifune i sar., 1992). Douglas i Dagirmanfian, (1975) su u svojoj studiji pokazali da su mladi pacovi koji su koristili hranu sa manjkom magnezijuma, duže spavali pod dejstvom ketamina nego kontrolna grupa životinja koja je primala hranu sa normalnim sadržajem magnezijuma. Slične rezultate su dobili Orser i sar. (1997b) koji su pokazali da je hipomagnezijemija kod pacova povezana sa povećanjem osetljivosti na ketamin, što je pokazano u eksperimentima, kroz kraće vreme gubitka refleksa uspravljanja i produženje latentnog perioda povlačenja šape nakon stiskanja prsta. Ova dva istraživanja su delimično u skladu sa našim rezulatima da je efekt kombinacije veći kada se ketamin primeni pre magnezijuma. Moguće je da ako se magnezijum daje pre ketamina, magnezijum blokira kanale neko vreme i ne dozvoljava vezivanje ketamina. Kada se prvo ketamin veže za fenciklidinsko mesto, povećanje koncentracije magnezijuma može povećati blok. Ovaj mogući mehanizam može objasniti činjenicu da se u našoj studiji postiže bolji efekt kada se magnezijum da posle ketamina. Ne možemo da povežemo naše rezultate sa koncentracijom megnezijuma u serumu zato što ista nije merena. Takođe, u našoj studiji je pokazano da doza magnezijuma određuje da li će doći do interakcije ili ne. Nasuprot ovim rezultatima Queiroz-Castro i sar. (2006) su pokazli na kozama da ketamin u kombinaciji sa magnezijumom nije značajno smanjio minimalnu alveolarnu koncentraciju izoflurana u poređenju sa samim ketaminom. Kod ovaca, intravenski primenjena kombinacija ketamin-magnezijum izaziva značajno dužu analgeziju, a u 94 poređenju sa analgezijom kada je dat sam ketamin ili sam magnezijum (DeRossi i sar., 2012). Kombinacija ketamin-magnezijum ispitivana je i na ljudima u cilju smanjivanje postoperativnog bola. Randomizirane dvostruko-slepe, placebo-kontrolisane studije nisu pokazale da se bol/potrošnja analgetika nakon operacije krajnika kod dece smanjuje, kada se male doze ketamina i/ili magnezijum sulfata daju intravenski pre operacije (O'Flaherty i Lin, 2003). U dvostruko-slepoj randomiziranoj kontrolisanoj studiji na pacijentima kojima je tokom anestezije data kombinacija magnezijum sulfata i S(+)-ketamina, pokazano je da su nakon operacije, ti pacijenti koristili više opioidnog analgetika piritramida nego pacijenti koji su dobijali sam ketamin (Stessel i sar., 2013). Prema dostupnim literaturnim podacima, NMDA receptori imaju ulogu u akutnoj antinocicepciji izazvanoj morfinom. Lečenje opioidima dovodi do povećanja protein kinaze C (PKC) koja aktivira NMDA receptore i na taj način redukuje antinociceptivni efekt opioida (Mao, 1999). U eksperimentalnim modelima na životinjama pokazano je da dodavanje NMDA antagonista morfinu, može povećati efekte morfina u modelima termičke nocicepcije na životinjama (Allen i sar., 2003; Nemmani i sar., 2004; Fischer i sar., 2005; Grisel i sar., 2005). Postavlja se pitanje da li je razlika između naših rezultata i prethodnih studija, posledica primene različitih doza i redosleda primene ketamina i magnezijum sulfata. Naši rezultati mogu delimično objasniti zašto su prethodne studije, koje su proučavale kombinaciju ketamina i magnezijuma imale neusaglašene rezultate. Antinociceptivni efekti kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat su antagonizovani naloksonom (3 mg/kg, s.c.), neselektivnim antagonistom opioidnih receptora, ukazujući da se ova interakcija dešava preko opioidnih receptora. Ovo otkriće bi moglo biti od koristi u situacijama kada postoji predoziranje, iako su potrebne veće doze naloksona u odnosu na onu koja bi se upotrebila da se antagonizuje sam morfin. Ketamin ima nekoliko dobrih efekata zbog inhibicije NMDA signalnog puta (Persson, 2010). Međutim, primena ovih lekova u kliničkim uslovima povezana je sa dozno-zavisnim neželjenim dejstvima. 95 U našim eksperimentima mala doza morfina (2,6 mg/kg), ketamina (5 mg/kg) i magnezijum sulfata (5 mg/kg) primenjena zajedno, ne dovodi do poremećaja motorne koordinacije što je verifikovano rotarod testom. Ovi podaci ukazuju da kombinovana primena niskih doza ketamina i magnezijum sulfata može izazvati veći klinički efekt bez prekoračenja sigurne doze. Ova informacija može biti korisna za sprečavanje ili lečenje akutnog bola u nekoliko slučajeva. Ketamin, a moguće i magnezijum imaju neuroprotektivno dejstvo (Hudetz i Pagel, 2010; Sen i Gulati, 2010). Bilo bi dobro ispitati neuroprotektivno dejstvo kombinacije ketamin-magnezijum. V.3. Efekt magnezijum sulfata, ketamina, morfina i njihovih kombinacija na telesnu temperaturu pacova Glavno otkriće ovog dela ispitivanja je sinergistička interakcija između dva NMDA antagonista, ketamina i magnezijum sulfata u snižavanju telesne temperature kod pacova. Magnezijum sulfat ne utiče na telesnu temperaturu pacova, niti utiče na morfinsku hipertermiju, dok ketamin dovodi do smanjena telesne temperature primenjen sam, ali snižava i morfinsku hipertermiju u zavisnosti od doze. Međutim, subefektivne doze ketamina u kombinaciji sa neefektivnim magnezijum sulfatom dovele su do značajnog smanjenja telesne temperature, kako bazalne, tako i morfinske hipertermije. Magnezijum je nekompetitivni antagonist NMDA receptora koji blokira jonski kanal (Fawcet i sar., 1999), dok se ketamin vezuje nekompetitivno za fenciklidinsko mesto NMDA receptora (Øye i sar., 1992), blokira otvaranje kanala i smanjuje frekvencu otvaranja kanala alosteričkim mehanizmom (Orser i sar., 1997a). Kako ketamin i magnezijum blokiraju NMDA receptor različitim mehanizmima, nije iznenađujuće da postoji sinergizam između ova dva leka (Øye i saradnici, 1992). Farmakokinetska interakcija između ovih lekova izgleda manje moguće, jer nisu zabeležene farmakokinetske interakcije između sistemski datog magnezijuma i drugih lekova. Važno je napomenuti da su doze sistemskog magnezijuma i ketamina koje su korišćene u ovoj studiji one koje se 96 najčešće koriste u studijama na životinjama i da su u rasponu terapijskih doza koje se primenjuju na ljudima (Quibell i saradnici , 2011). U nekoliko ex vivostudija koje su ispitivale interakcije između ketamina i magnezijuma dobijeni su različiti rezultati. Harrison and Simmonds (1985) su pokazali aditivnu interakciju između ova dva leka na kortikalnim neuronima pacova. Na neuronima hipokampusa miševa, magnezijum smanjuje blokadu NMDA receptora izazvanu ketaminom (MacDonald i sar., 1991). U eksperimentima koji su izvođeni na Xenopus oocitima, kombinacija ketamina i magnezijuma inhibira NR1/NR2A i NR1/NR2B glutamatne receptore na sinergistički način (Liu i sar. , 2001). U in vivo studiji na pacovima, magnezijum dat intraperitonealno, potencira ketaminom izazvanu anesteziju na sinergističan način tj. povećava procenat gubitka refleksa uspravljanja, vreme spavanja i vremena oporavka (Irifune i sar., 1992). Nasuprot tome, Orser i sar. (1997b) pokazali da je hipomagnezijemija kod pacova povezana sa povećanjem osetljivosti na ketamin, što je pokazano u eksperimentima, kroz kraće vreme gubitka refleksa uspravljanja i produženje latentnog perioda povlačenja šape nakon stiskanja prsta. Queiroz-Castro i sar. (2006) su pokazali da na kozama ketamin u kombinaciji sa magnezijumom nije značajno smanjio minimalnu alveolarnu koncentraciju izoflurana u poređenju sa samim ketaminom. Međutim, kod ovaca, intravenski primenjena kombinacija ketamin-magnezijum izaziva značajno dužu analgeziju u poređenju sa analgezijom kada je primenjen sam ketamin ili sam magnezijum (DeRossi i sar., 2012). Svi ovi efekti na životinjama su pospešili istraživanja kominacije ketamin- magnezijum na ljudima za postoperativnu analgeziju. Randomizirane dvostruko-slepe, placebo-kontrolisane studije nisu pokazale da se bol/potrošnja analgetika nakon operacije krajnika kod dece smanjuje, kada se male doze ketamina i/ili magnezijum sulfata daju intravenski pre operacije (O'Flaherty i Lin, 2003). U dvostruko-slepoj randomiziranoj kontrolisanoj studiji na pacijentima kojima je tokom anestezije data kombinacija magnezijum sulfata i S(+)-ketamina, pokazano je da su nakon operacije ti pacijenti koristili više opioidnog analgetika piritramida nego pacijenti koji su dobijali sam ketamin (Stessel i sar., 2013). 97 Koliko je poznato, interakcije između ketamina i magnezijuma u smanjenju telesne temperature nisu ranije ispitivane. U ovoj studiji, intraperitonealno dat ketamin (5-30 mg/kg) dovodi do značajnog dozno-zavisnog smanjenja telesne temperature kod pacova. Analizom krivih odnosa doze i efekta na telesnu temperaturu ketamina kao i kombinacije ketamin-magnezijum sulfat, utvrđeno je da postoji sinergizam. Takođe je pokazano da je za isti efekt potrebno 5,3 puta smanjenje doze ketamina kada se lekovi daju u fiksnoj kombinaciji tj. masenom odnosu doza (1:1). Pored toga, mala doza magnezijum sulfata (5 mg/kg, sc) povećava efekt ketamina u snižavanju telesne temperature (1,25-10 mg/kg, ip), a takođe smanjuje i morfinsku hipertemiju za oko 2,5, odnosno 5,3 puta. Efekt ketamina na telesnu temperaturu dobijen u ovoj studiji u skladu je sa prethodnim eksperimentima (Fahim i sar., 1973; Pitsikas i Boultadakis, 2009). Kod životinja, drugi NMDA antagonisti kao što su MK-801, dekstrometorfan i LY 235959 daju blagu, ali značajnu hipotermiju, ukazujući na ulogu endogenog glutamatergičkog sistema koji dovodi do hipertermije aktivacijom NMDA receptora (Corbett i sar., 1990; Rawls i sar., 2002). Shodno činjenici da ketamin pri subanestetičkim dozama blokira NMDA receptore (Øye i sar., 1992), mehanizam kojim ketamin dovodi do hipotermije može se pripisati, bar delimično, blokadi NMDA receptora. Ketamin takođe stupa u interakcije sa kalcijumskim i natrijumskim kanalima, dopaminskim receptorima, kao i sa ponovnim preuzimanjem noradrenalina i serotonina. Takođe ketamin utiče na holinergičku transmisiju (Quibell i sar., 2011). Fahim i saradnici (1973) su pretpostavili da ketamin (50-100 mg/kg, ip ) dovodi do hipotermije kod pacova, oslobađanjem serotonina u hipotalamusu. Imajući u vidu da serotonin ima značajnu ulogu u termoregulaciji (Malone i Tailor, 2001), ne može se poreći učešće serotonergičkog sistema u hipotermiji izazvanoj ketaminom. U našoj studiji je po prvi put otkriveno da rastuće doze subanestetičkih doza ketamina dovode do dozno-zavisnog smanjenja morfinske hipertemije. Ovaj efekt je pojačan za oko 5,3 puta u prisustvu male doze magnezijum sulfata. Dobro je poznato da agonisti µ-opioidnih receptora dovode do dozno-zavisne hipertermije (Vučković i sar., 1998; Vučković i sar., 2009; Savić Vujović i sar., 2013). Morfin u dozi 10 98 mg/kg dovodi do hipertermije i izaziva nishodnu regulaciju podjedinice iRNA, NMDA receptora u hipotalamusu, glavnog termoregulatornog centra u mozgu (Le Greves i sar., 1998). In vivo studija mikrodijalize je pokazala da akutni tretman morfinom povećava nivo glutamata u striatumu, strukturi koja ima indirektnu ulogu u termoregulaciji (Huang i sar., 1997). Ovi rezultati ukazuju da je morfinska hipertermija delimično posredovana povećanjem glutamatergičke transmisije preko NMDA receptora koji se nalaze u regionima mozga koji regulišu telesnu temperaturu. U skladu sa ovim, morfinska hipertermija može da se smanji lekovima koji povećavaju preuzimanje glutamata (β-laktamski antibiotici), smanjuju oslobađanje glutamata (riluzol) i blokiraju glutamatergičku transmiju preko NMDA receptora (dekstrometorfan) (Rawls i sar., 2003; Rawls i sar., 2007). Dekstrometorfan smanjuje morfinsku hipertermiju, pa je ovo u skladu sa našim rezultatima da kombinacija ketamin i ketamin-magnezijum sulfat smanjuju morfinsku hipertermiju. Nalokson, neselektivni antagonist opioidnih receptora, utiče na morfinsku hipertermiju i potvrđuje dobro dokumentovanu ulogu µ-opioidnih receptora u morfinskoj hipertermiji (Savić Vujović i sar., 2013). Ketamin primenjen u dozi u kojoj sam ne daje značajan efekt, potencira efekt naloksona na morfinsku hipertermiju. Bliska rasprostranjenost NMDA i µ- opioidnih receptora je pronađena u gotovo svim delovima centralnog nervnog sistema (CNS) i najnovija istraživanja su pokazala da postoji direktna povezanost µ opioidnih i NMDA receptora (Rodriguez - Munoz i sar., 2012). Ispitivanja na životinjama su pokazala da hipotermija ima zaštitno dejstvo kod neuroloških povreda (van der Vorp i sar., 2007). Kod ljudi, neuroprotektivniefekt hipotermije pokazan je pri neuroloskom oporavku nakon zastoja srca koji se desio van bolnice (Peberdi i sar., 2010; Deakin i sar., 2010). Pod određenim uslovima, hipotermija se takođe koristi u lečenju teške traumatske povrede mozga, moždanog udara i infarkta miokarda (Bernard i Buist, 2003; Polderman, 2004; Polderman, 2008). Međutim, hipotermija kod budnih ili blago sediranih pacijenata je težak zadatak, dok god se aktiviraju mehanizmi termoregulacione odbrane tj. vazokonstrikcija i drhtavica. Takođe, opšta i neuroaksijalna anestezija dovode do smanjenja telesne temperature, izazivaju odbranu organizma, uključujući vazokonstrikciju i drhtavicu (Sessler, 2008). Najčešće ispitivani i 99 najefikasniji lekovi koji bi smanjili drhtavicu su klonidin, meperidin, tramadol, nefopam i ketamin (Mahmood i Zveifler, 2007; Nakasuji i sar., 2011; Park i sar., 2012). Magnezijum ispoljava sledeća dejstva: analgezija, mišićna relaksacija, vazodilatacija, sprečavanje eklampsije u trudnoći, lečenje aritmija i dr. (Herroeder i sar., 2011). Može da smanji prag drhtanja (Wadhwa i sar., 2005), ili da dovede do periferne vazodilatacije (Gozdemir i sar., 2010). Intravenskim dodavanjem magnezijum sulfata povećava se brzina hlađenja kod volonetra koji nisu pod anestezijom (Zweifler i sar., 2004). Magnezijum sulfat je efikasan protiv drhtavice u opštoj i lokalnoj anesteziji (Kizilirmak i sar., 1997; Gozdemir i sar., 2010). I niske vrednosti magnezijuma u serumu su povezane sa drhtavicom (Badjatia i sar., 2008). Na osnovu pregleda rezultata 14 studija, zaključeno je da perioperativna suplementacija magnezijumom sprečava postoperativnu hipomagnezijemiju i smanjuje učestalost postoperativne drhtavice (Lysakowski i sar., 2007). Magnezijum opušta mišiće, što dovodi do smanjenja intenziteta drhtanja. Nesedativno svojstvo magnezijuma je veoma značajno u potencijalnoj primeni ovog leka u terapiji drhtavice (Kizilirmak i sar., 1997; Lysakowski i sar., 2007; Badjatia i sar., 2008). Za razliku od magnezijuma, ketamin povećava arterijski pritisak i puls zbog direktne centralne simpatičke stimulacije i inhibicije preuzimanja norepinefrina na postganglijskim nervnim završecima simpatičkog sistema, a može dovesti do smanjenja osnovne i periferne preraspodele toplote (Ikeda i sar., 2001). Osim toga, i ketamin i magnezijum imaju potencijalne neuroprotektivne efekte (Jellish i sar., 2008; Hudetz i Pagel, 2010). Eksperimentalni podaci sugerišu da se neuroprotektivni efekt hipotermije može povećati dodavanjem magnezijum sulfata (Song i sar., 2013). Pitsikas i Boultadakis (2009) su pokazali na pacovima da je blaga hipotermija izazavana ketaminom imala zaštitnu ulogu kod životinja u testu prepoznavanja predmeta i smanjila deficit u pamćenju prilikom lokacije objekta. Boyko i saradnici (2013) su pokazali da blaga ( 33 do 36° C) i umerena (30 do 32°C) hipotermija dovode do smanjenja nivoa glutamata u krvi pacova, kao i da neuroprotektivna svojstva hipotermije mogu delimično biti posledica mehanizma koji uklanja glutamat iz krvi. 100 Ovi nalazi su u skladu sa našim prethodnim rezultatima koji su pokazali da visoka temperatura spoljašnje sredine povećava i telesnu temperaturu i neurotoksičnost fentanila kod pacova (Vučković i saradnici, 1998). V.4. Mehanizam hipotermnog dejstva ketamina (10 mg/kg)/kombinacije ketamin- magnezijum sulfat U našoj studiji je ispitivan hipotermni efekt kombinacije dva NMDA antagonista ketamina i magnezijum sulfata. Utvrđeno je da kombinacija ketamin-magnezijum sulfat dovodi do dozno-zavisnog sniženja telesne temperature kod pacova. Takođe, dokazan je sinergizam ketamina i magnezijum sulfata u snižavanju telesne temperature. Mehanizam hipotermnog dejstva kombinacije ketamin-magnezijum sulfat do sada nije ispitivan. Jedan od zadataka ove teze bio je ispitivanje upravo mehanizma dejstava kombinacije ova dva NMDA antagonista koristeći antagoniste različitih receptora i jonskih kanala koji imaju ulogu u termoregulaciji (tabela V.4). 101 Tabela V.4: Uticaj antagonista na hipotermni efekt ketamina(10) /kombinacije ketamin(5)- magnezijum sulfat(5) Antagonist Ketamin 10 mg/kg Ketamin 5 mg/kg + magnezijum sulfat 5 mg/kg Johimbin + + Metizergid + - Bikukulin ǿ ǿ L-arginin ǿ - L-NAME ǿ - Nalokson + ǿ Glibenklamid + ǿ + produbljuje hipotermiju; - smanjuje hipotermiju; ǿ nema uticaj V.4.1. Dejstvo johimbina na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg) Johimbin u malim dozama (0,5-3 mg/kg) primenjen sam ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu pacova što je u skladu sa rezultatima drugih autora (Degernes i sar., 1988). Primenjen u većim dozama 5-20 mg/kg, johimbin dovodi do dozno-zavisnog sniženja telesne temperature (Papeschi i sar., 1971). Johimbin (0,5 i 1 mg/kg) je produbio hipotermiju izazvanu ketaminom (10 mg/kg) za 2ºC. U ovim dozama johimbin nije uticao na hipotermni efekt kombinacije ketamin- 102 magnezijum sulfat. Primenjen u dozi od 3 mg/kg johimbin produbljuje hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Manje produbljivanje hipotermije ketamin-magnezijum sulfat kombinacije sa johimbinom, u odnosu na sam ketamin, verovatno je posledica dejstva magnezijuma. Moguće je da se magnezijum suprostavlja dejstvu johimbina u našim eksperimentima. Takođe je moguće da magnezijum smanjuje oslobađanje noradrenalina i 5- hidroksitriptamina, što je dovelo da johimbin u dozama 0,5 i 1 mg/kg ne utiče na hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Naši rezultati ukazuju da je hipotermija izazvana kombinacijom ketamin- magnezijum sulfat/ketaminom potencirana johimbinom, antagonistom alfa2 receptora. Poznato je da anestetici mogu stimulisati adrenoceptore direktnom interakcijom sa receptorima (što može biti slučaj sa ketaminom), ili mogu da aktivišu simpatički nervni sistem centralnim mehanizmom (što može biti slučaj sa tiopentalom) (Melamed i sar., 2003). Papeschi i saradnici su u svojim eksperimentima zaključili da povećanjem doze johimbina 5-20 mg/kg dolazi do povećanog oslobađanja serotonina. Sniženje telesne temperature može biti povezano sa stimulacijom serotonergičkih receptora putem johimbina, ali ni efekt posredovan dejstvom noradrenalina na mozak, ne može biti isključen. Johimbin antagonizuje ksilazin u anesteziji izazvanoj kombinacijom ketamin- ksilazin, čime je ubrzao oporavak od anestezije kod azijskih lavova, tigrova i leoparda (Sontakke i sar., 2009). U drugim studijama johimbin nije antagonizovao hipotermiju izazvanu anestezijom davanjem kombinacije ksilazin-ketamin (Komulainen i Olson, 1991), što je u skladu sa našim rezultatima. Johimbin se vezuje za 5-HT1A receptore i dovodi do hipotermije (Dilsaver i Davidson, 1989; Winter i Rabin, 1992). Zato što aktivacija 5-HT1A receptora dovodi do hipotermije (Li i sar., 2009), moguće je da je johimbin preko ovih receptora produbio hipotermiju kombinacije ketamin-magnezijum sulfat, kao i samog ketamina. Sam johimbin dovodi do hipotermije, koja je antagonizovana korišćenjem WAY 100135, selektivnog antagoniste 5-HT1A receptora (Przegalinski i sar., 1994). Kod krmača, johimbin dovodi do 103 brzog oporavka iz anestezije izazvanoj ksilazinom, ketaminom i telazolom. Upravo zbog toga ovaj lek može biti koristan u veterinarskoj medicini za brz oporavak iz anestezije (Monique i sar., 2014). V.4.2. Dejstvo bikukulina na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg) U našim eksperimentima bikukulin u dozi od 1 mg/kg ne utiče na bazalnu temperaturu pacova, dok u dozi od 2 mg/kg dovodi do hipotermije. Bikukulin u dozama od 1 i 2 mg/kg ne utiče na hipotermiju izazvanu ketaminom (10 mg/kg). Takođe, bikukulin ne utiče na hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat. Ishiwata i saradnici (2005) su pokazali da GABA (250-1000 mg/kg i.p.) dovodi do dozno- zavisnog pada telesne temperature sputanih pacova pri konstantnoj temperaturi okoline od 18-22 ºC. Pretretman propranololom (10 mg/kg, i.p.) ili bikukulinom (3 mg/kg, i.p.) potencira hipotermiju izazvanu GABA-om. Hipotermija koju izaziva GABA može nastati zbog oslobađanja serotonina, aktivacijom bikukulin-neosetljivih GABA receptora koji se nalaze na centralnim serotonergičkim neuronima. Ovo može objasniti i efekt bikukulina u dozi od 2 mg/kg na bazalnu telesnu temperaturu u našim eksperimentima. Razlike naših eksperimenata u odnosu na druge studije u dejstvu bikukulina na telesnu temperature mogu biti i posledica različitog načina primene ovog leka. Može se pretpostaviti da je GABAA–serotonin interakcija jako bitna za termoregulaciju i da postoji u preoptičkoj regiji ili u dorzomedijalnom hipotalamusu (Dimicco i Zaretsky, 2007) ili da projekcije dorzalnih i medijalnih vlakana različito utiču na bazalnu i stresom izazvanu telesnu temperaturu. Pokazano je da 5-HT inhibira oslobađanje GABA-e presinaptički u termoregulatornoj hipotalamičkoj medijalnoj preoptičkoj regiji, a ovaj efekt može biti blokiran antagonistom 5-HT1A receptora (Lee i sar., 2008). Ne može se isključiti ni mogućnost nishodne aktivacije hipotalamičkih 5-HT1A receptora, nakon direktne aktivacije GABAA receptora, koja je neophodna za održavanje telesne temperature. Hipoteza potencijalnih interakcija GABAA receptora i 5-HT1A receptora, tek treba detaljno da se ispita. 104 Van Bogaert i sar., (2006) ispitivali su hipertermiju izazvanu stresom. Ispitivana je uloga 5-HT1A receptora u stresom izazvanoj hipertermiji, a koristili su se 5-HT1A receptor knockout miševi. Pokazano je da GABA-ergički lekovi sa anksiolitičkim dejstvom stimulišu α2 subjedinicu GABAA receptora. Takođe je pokazano da je α1 subjedinica uključena u regulaciju bazalne telesne temperature i da njena stimulacija može izazvati hipotermiju. U našim eksperimentima je pokazano da GABAA receptori nemaju ulogu u hipotermiji izazvanoj kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, kao ni u ketaminom izazvanoj hipotermiji. V.4.3. Dejstvo metizergida na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg) Primenjen sam, metizergid (0,5 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu, dok u dozi od 1 mg/kg kada u 120 minutu dovodi do hipertermije. Komiskey i saradnici (1975) su u svojim eksperimentima takođe dobili hipertermiju nakon davanja metizergida, koja je verovatno posledica oslobađanja prostaglandina. Metizergid u dozi od 0,5 mg/kg ne utiče na hipotermni efekt ketamina u dozi od 10 mg/kg. U dozi od 1 mg/kg metizergid produbljuje hipotermiju izazvanu ketaminom 10 mg/kg (p<0,05). Znači da se preko serotonergičkih receptora ne antagonizuje efekt samog ketamina, već se produbljuje. Metizergid u dozi od 1 mg/kg smanjuje hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin(5)-magnezijum(5), ali bez statističke značajnosti. U ovoj dozi kombinacija metizergid-ketamin-magnezijum sulfat dovodi i do hipertermnog efekta u 120 minutu, što je verovatno rezultat oslobađanja protaglandina (Komiskey HL i Rudy TA, 1975). U dozi od 0,5 mg/kg metizergid antagonizuje hipotermni efekt izazvan kombinacijom ketamin- magnezijum sulfat. Svakako, možemo reći da se hipotermni efekt kombinacije ketamin- magnezijum sulfat dešava preko serotonergičkog sistema, što je potvrđeno korišćenjem antagoniste serotonergičkih receptora metizergida. Za određivanje podtipa serotoninskih receptora, bili bi potrebni selektivni antagonisti 5-HT receptora. 105 Razlike u dejstvu metizergida na ketamin (10 mg/kg) i kombinaciju ketamin(5)- magnezijum sulfat(5), mogu biti i posledica presinaptičke inhibicije 5-HT receptora. Poznato je da 5-hidroksitriptofan izaziva hipotermiju. Fahim i saradnici (1973) su u svojim eksperimentima na pacovima zaključili da ketamin dovodi do hipotermije verovatno preko oslobađanja 5-hidroksitriptamina u hipotalamusu i da je ovaj efekt sličan onom koji daje morfin kod netolerantnih pacova. U istraživanju Fahima i saradnika korišćene su rastuće doze ketamina 20-100 mg/kg. Međutim, hipotermni efekt samog ketamina u našim eksperimentima nije antagonizovan metizergidom. Razlika između naših eksperimenata i istraživanja Fahima i saradnika (1973) je verovatno posledica korišćenja različitih doza. Mi smo koristili dozu od 10 mg/kg koja je mnogo manja u odnosu na one koje su korišćene u njihovim eksperimentima (Fahim i sar., 1973). Lin i saradnici (1981) su zaključili da hipotermija izazvana natrijum pentobarbitalom ili ketaminom bila antagonizovana deplecijom nivoa serotonina u mozgu pomoću 5,7-dihidroksitriptamina ili p-hlorofenilalaninom. Anestetici, kao što su pentobarbital ili ketamin dovode do hipotermije povećavajući gubitak toplote i smanjenjem produkcije metaboličke toplote, verovatno oslobađanjem endogenog serotonina u mozgu (Lin i sar., 1981). Pokazano je da antagonisti 5-HT2 receptora-katanserin, ritanserin i DV-7028 ne utiču na hipotermiju izazvanu 5-hidroksitriptofanom, a da je neselektivni 5-HT antagonist- metizergid u dozi od 1 mg/kg smanjio ovu hipotermiju. Ovi rezultati su pokazali da 5- HT2receptori kod miševa nisu uključeni u 5-HT posredovanoj termoregulaciji (Morishima i Shibano, 1995). Ovo je u skladu sa našim rezultatima. Metizergid je antagonist 5-HT1A, 5- HT2A i 5-HT2C receptora. Naši rezultati su u skladu sa prethodnim studijama, i moguće je da se hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat dešava preko 5- HT1Areceptora. Međutim u jednoj od studija je pokazano da postoji funkcionalna povezanost i interakcija između 5-HT1A i 5-HT2A receptora na regulaciju telesne temperature kod pacova (Salmi i Ahlenius,1998). Aktivacija serotonergičkih receptora u preoptičkom prednjem delu hipotalamusa posreduje u termoregulaciji pacova. Aktivacija serotonergičkih receptora u hipotalamusu 106 smanjuje produkciju toplote i/ili povećava gubitak toplote, dok inhibicija serotonergičkih receptora u hipotalamusu povećava produkciju toplote i/ili smanjuje gubitak toplote kod pacova (Lin i sar., 1983). Ovo je u skladu sa našim eksperimentima i još jedna potvrda da se hipotermija izazvna kombinacijom ketamina i magnezijum sulfata dešava preko serotonergičkog sistema. Moguće je da je magnezijum sulfat smanjio oslobađanje serotonina, pa je metizergid uspeo da antagonizuje hipotermni efekt ove kombinacije. Cordeiro i saradnici (2014) su ispitivali efekte povećanog triptofana centralno na fizičku aktivnost i na termoregulaciju, kada je pacovima dat parahlorofenilalanin (p-CPA), inhibitor konverzije triptofana u serotonin. Davanje triptofana pacovima rezultiralo je većim skladištenjem toplote i redukcijom umora kod pacova koji su bili aktivni, dok je pretretman sa p-CPA blokirao efekte triptofana na termoregulaciju i aktivnost pacova. Takođe je utvrđeno da serotonin učestvuje u mehanizmu gubitka toplote tokom vežbanja. Aktivacija centralnih 5-HT3 receptora je efektivnija u indukciji hipotermije nego u smanjenju termogeneze i povećanju gubitka toplote (Voronova i sar., 2011). V.4.4. Dejstvo L-arginina i L-NAME na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)-magnezijum sulfat (5 mg/kg) L-arginin (5 i 10 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu pacova. L-arginin u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg, ne utiče na ketaminsku hipotermiju. Kada se primeni sa kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat, L-arginin u dozi od 5 mg/kg dovodi do smanjenja hipotermije, ali bez postojanja statističke značajnosti. U dozi od 10 mg/kg L-arginin smanjuje hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat za 0,7 ºC (postoji statistička značajnost p<0,05). Kada se kombinaciji L-arginin-ketamin- magnezijum sulfat doda L-NAME, dolazi do delimične redukcije hipotermnog efekta kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Naši rezultati ukazuju da NO ima dualno dejstvo u hipotermnom efektu kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. U našim eksperimentima L-NAME (2,5 i 5) primenjen sam ne utiče na bazalnu temperaturu pacova. Ulugol i saradnici (2000) su pokazali da visoke doze ketamina i N- 107 nitro-L-arginin metilestar mogu izazvati hipotermiju. Njihovi eksperimenti ukazuju da su NMDA receptori i azotni oksid uključeni u termoregulaciju. L-NAME u dozi od 10 mg/kg u kombinaciji sa ketaminom 10 mg/kg dovodi do produbljivanja ketaminske hipotermije, ali bez postojanja statističke značajnosti. U našim eksperimentima L-NAME nije uticao na ketaminsku hipotermiju. L-NAME u dozi od 2,5 mg/kg ne utiče na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat, dok u dozi od 5 mg/kg antagonizuje hipotermni efekt ove kombinacije u 60 i 90 minutu. Ovi rezultati ukazuju da je NO uključen u hipotermni efekt kombinacije ketamin(5)- magnezijum sulfat(5). Postoji povezanost između NMDA receptora i NO. Aktivacija NMDA receptora stimuliše azot oksid signalni put, za koji je pokazano da ima važnu ulogu u spinalnom nociceptivnom procesu. Intratekalna primena NMDA antagonista ili inhibicija NOS i solubilne gvanilat ciklaze, blokira NMDA izazvanu nocicepciju (Kawamata and Omote, 1999). U in vitro eksperimentima je pokazano da NMDA tretman dovodi do povećanja oslobađanja cGMP iz kičmene moždine odraslih pacova i ovo povećanje može biti blokirano inhibitorima NOS (Kawamata and Omote, 1999). Aktivacija spinalnih NMDA receptora može izazvati bol stimulišući NOS da dovede do stvaranja NO, koji dalje može aktivirati solubilnu gvanilat ciklazu da poveća cGMP (Ashina i sar., 1999; Lizarraga i sar., 2008). Blokada NMDA receptora ketaminom, blokira stimulaciju NO sintaze i inhibira stvaranje cGMP u kulturama cerebralnih neurona (Gonzales i sar., 1995). Ovo je u skladu sa našim rezultatima gde je pokazano da L-arginin kao prekursor NO, ne utiče na ketamin u dozi od 10 mg/kg. Očigledno je da L-arginin produkuje NO, a da ketamin inhibira njegovu sintezu, tako da L-arginin nije promenio hipotermni efekt ketamina. L-NAME nije uticala na hipotermni efekt ketamina, što je rezultat verovatno dvostruke inhibiije NO. Ketamin stimuliše L-arginin/NO/ciklični GMP put u izazivanju antinociceptivnih efekata i na taj način izaziva periferni antinociceptivni efekt kod pacova (Romero i sar., 2011). L- arginin u kombinaciji sa ketamin-magnezijum sulfatom dovodi do antagonizma 108 hipotermnog efekta ove kombinacije. L-arginin i magnezijum sulfat povećavaju oslobađanje NO (Houston,2011), dok ga ketamin blokira. Bulutcu i saradnici (2002) su pokazali da L-NAME, inhibitor azot oksid sintaze, antagonizuje antinociceptivne efekte ketamina kod miševa. Nasuprot ovome intavenski primenjen ketamin nije imao efekt na NOS aktivnost. U našim eksperimentima intraperitonealno dat ketamin je dao hipotermni efekt, dok supkutano dat L-NAME nije antagonizovao ovaj hipotermni efekt. L-NAME (1-3, ali ne u dozi od 10, mg/kg) smanjuje deficit memorije koju izaziva ketamin. Rezultati ukazuju da anestetičke doze ketamina popravljaju komponente memorije (skladištenje i/ili preuzimanje informacija) i da nitritni oksid modulira njihove efekte na ponašanje (Boultadakis i Pitsikas, 2011). L-NAME u dozi od 2,5 mg/kg potpuno blokira hipotermni efekt kombinacije ketamin- magnezijum sulfat. Očigledno da magnezijum koji utiče na povećanje produkcije NO, preovladava u ovom bloku. Svakako ovi rezultati ukazuju na uticaj NO u hipotermnom efektu kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. V.4.5. Dejstvo naloksona na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg) Neselektivni antagonist opioidnih receptora nalokson (1 i 3 mg/kg) nije uticao na bazalnu telesnu temperaturu pacova. U jednoj od studija je otkriveno da 30 mg/kg naloksona ili naltreksona dovodi do hipotermije i da je hipotermija izražena i u tamnom i u svetlom delu ciklusa (Eikelboom, 1987). Nalokson u dozi od 1 mg/kg nije uticao na hipotermiju izazvanu ketaminom (10 mg/kg). Nalokson u dozi od 3 mg/kg je produbio ketaminsku hipotermiju za maksimalno 1,5 ºC. Nalokson nije uticao na hipotermiju izazvanu kombinacijom ketamin-magnezijum sulfat. U našim eksperimentima (Vučković i sar., 2014) pokazano je da je nalokson u dozi od 3 mg/kg potpuno antagonizovao kombinaciju morfin (2,6 mg/kg)-ketamin (5mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg), što je ukazalo na posredovanje opioidnih receptora u ovoj 109 kombinaciji. Za razliku od tih eksperimenata, hipotermni efekt kombinacije ketamin- magnezijum sulfat nije antagonizovan naloksonom što je ukazalo na zaključak da se hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat najverovatnije ne ostvaruje putem opioidnih receptora. Na osnovu naših eksperimenata možemo zaključiti da se magnezijum u kombinaciji ketamin-magnezijum sulfat suprotstavlja dejstvu naloksona. Bhat i sar., (1998) su pokazali u svojim eksperimentima da NMDA tretman povećava NOS aktivnost u preoptičkom anteriornom i u medijalnom hipotalamusu in vitro. Efekt je bio potpuno antagonizovan davanjem MK-801. U in vivo studijama pokazano je da tretman naloksonom značajno povećava oslobađanje glutamata u preoptičkoj regiji kod neanesteziranih, slobodno pokretnih mužjaka pacova. Ovo može objasniti naše eksperimente. Nalokson u kombinaciji sa ketaminom produbljuje ketaminsku hipotermiju, što je verovatno rezultat dejstva naloksona koji povećava oslobađanje glutamata i povećava aktivnost NOS-a, nasuprot blokadi glutamata ketaminom, pa je rezultat produbljivanje ketaminske hipotermije. Možemo reći i da se preko opioidnih receptora produbljuje ketaminska hipotermija u našim eksperimentima, dok ovi receptori ne učestvuju u ketamin-magnezijum sulfat izazvanoj hipotermiji. Neselektivni antagonist opioidnih receptora nalokson (1,5 mg/kg, s.c.) potencira hipotermiju i blokira hipertermiju koju izaziva deltorfin II-selektivni agonist delta opioidnih receptora. Takođe nalokson potencira hipotermiju izazvanu malom dozom deltorfina II. Bifazni efekt deltorfina II ukazuje na interakciju između delta i mi opioidnih receptora u termoregulaciji kod pacova. Ovi rezultati ukazuju na dve centralne adaptacije koje se javljaju u hladnim okolnostima: non-mi opioidni process, koji povećava osetljivost na toplotu i mi-opioidni process koji potencira hipertermiju (Salmi i sar., 2003; Wilson i Howard, 1996). U našim eksperimentima moguće je da je nalokson u dozi od 3 mg/kg produbio ketaminsku hipotermiju upravo preko δ-opioidnih receptora. Pacheco i saradnici (2014) su u svojim eksperimentima pokazali da nalokson antagonizuje ketaminom izazvanu antinocicepciju na dozno-zavistan način. U njihovim eksperimentima je pokazano da su endogeni opioidi kao i μ- i δ-opioidni receptori uključeni u ketaminom 110 izazvanoj centralnoj antinocicepciji, dok κ-opioidni receptori nisu uključeni u ovaj efekt (Pacheco i sar., 2014). V.4.6. Dejstvo glibenklamida na ketamin (10 mg/kg) /kombinaciju ketamin (5 mg/kg)- magnezijum sulfat (5 mg/kg) Glibenklamid ( 3 i 6 mg/kg) ne utiče na bazalnu telesnu temperaturu pacova. Glibenklamid (3 i 6 mg/kg) produbljuje hipotermiju izazvanu ketaminom u dozi od 10 mg/kg. Za razliku od dejstva na ketamin, glibenklamid u ovim dozama ne utiče na hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Znači da KATP kanali nisu uključeni u hipotermni efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat. Verovatno se magnezijum sulfat suprotstavio efektu glibenklamida. Takođe, moguće je da magnezijum sulfat blokira blokadu glibenklamidom i da zato nema promene hipotermnog dejstva kombinacije ketamin-magnezijum sulfat prilikom delovanja glibenklamida. Rezultati Vastani i sar. (2013) ukazuju da vezivanje magnezijumovih jona zavisi od tipa i konformacijskog stanja voltažno-zavisnih natrijumskih kanala. Poznato je da magnezijum deluje i na kalijumove kanale. Magnezijum kao pozitivan jon možda sprečava prodiranje glibenklamida u KATP kanal, a ketamin u kanal NMDA receptora pa zbog toga u našim rezultatima glibenklamid ne utiče na kombinaciju ketamin-magnezijum sulfat. Ketamin inhibira aktivnost KATP kanala izazvanih nikorandilom na dozno-zavistan način. Povećanje intracelularnog MgADP smanjuje inhibitornu jačinu racemata ketamina na glatkim mišićima aorte pacova (Kawano i sar., 2010). Poznato je da Mg i NO imaju ulogu u regulaciji ćelijskog opstanka i smrti ćelije. Yamanaka i sar., (2013) su pokazali da je NO uključen u regulaciju Mg²⁺. Pokazano je da signalni put NO/cGMP/protein kinaza G (PKG) dovodi do povećanja Mg²⁺, a mobilizacija Mg²⁺ se dešava za vreme oslobađanja Mg²⁺ iz mitohondrija izazvan otvaranjem mitohondrijalnih KATP kanala (Yamanaka i sar., 2013). Glibenklamid dat intracerebroventrikularno antagonizuje hipertermiju izazvanu supkutano datim morfinom na dozno-zavistan način. Ovim rezultatima je pokazano da KATP kanali imaju važnu ulogu kao modulatori hipertermnog efekta mu agonista (Narita i sar., 111 1992). Efekt kombinacije ketamin-magnezijum sulfat se ne dešava preko opioidnih receptora. Takođe je pokazano da glibenklamid i nalokson produbljuju ketaminom izazvanu hipotermiju na sličan način. Moguće je da se magnezijum sulfat u našim eksperimentima suprotstavlja dejstvu kako glibenklamida, tako i naloksona. 112 VI ZAKLJUČCI 1. Antinociceptivni i hipertermni efekti derivata morfina (fenantrenski tip) su dozno- zavisni. 2. Antinociceptivni i hipertermni efekti derivata fentanila (4-anilinopiperidinski tip) su dozno-zavisni. 3. Redosled jačine u izazivanju hipertermije derivata fentanila je veoma sličan redosledu njihove antinociceptivne jačine. 4. Jedinjenja morfina su takođe imala sličan redosled jačine u izazivanja hipertermije i antinocicepcije. 5. Derivati morfina (fenantrenski tip) izazivaju hipertermiju kod pacova u dozama oko 2 puta manjim od njihove srednje efektivne antinociceptivne doze. 6. Derivati fentanila (4-anilinopiperidinski tip) izazivaju hipertermiju kod pacova u dozama 6-11 puta većim od njihove srednje efektivne antinociceptivne doze. 7. Razlika između dve glavne klase opioidnih lekova, derivata morfina (fenantrenski tip) i derivata fentanila (4-anilinopiperidinski tip) je u relativnoj jačini izazivanja hipertermije u odnodu na analgeziju. 8. Antinociceptivni i hipertermni efekti derivata morfina i derivata fentanila poništavaju se davanjem naloksona, neselektivnog antagoniste opioidnih receptora, što ukazuje na to da se njihovi efekti ostvaruju posredstvom opioidnih receptora. 9. Terapijski indeksi (srednja efektivna doza za hipertermiju (HD50)/srednja efektivna antinociceptivna doza (AD50), za derivate fentanila su relativno visoki, dok su za jedinjenja morfina manja ili jednaka jedinici (≤1). 10. Ketamin nema antinociceptivno dejstvo u testu potapanja repa u toplu vodu. 11. Magnezijum sulfat nema antinociceptivno dejstvo u testu potapanja repa u toplu vodu. 12. U akutnom nociceptivnom bolu kod pacova postoji sinergizam u antinociceptivnom dejstvu između ketamina i magnezijum sulfata datih u malim dozama i u određenim proporcijama doza. 113 13. Redosled davanja magnezijum sulfata i ketamina je važan u akutnom nociceptivnom bolu kod pacova, jer male doze magnezijum sulfata mogu značajno više da povećaju efekt ketamina ako se primene posle, nego ako se primene pre ketamina. 14. Male doze magnezijum sulfata mogu značajno povećati analgetički efekt kombinacije morfin-ketamin, pod uslovom da se magnezijum sulfat primeni posle ovih lekova. Ove kombinacije bi mogle smanjiti neželjena dejstva pojedinačno datih lekova. 15. Nalokson, neselektivni antagonist opioidnih receptora antagonizuje antinociceptivni efekt kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat, ukazujući da se efekt kombinacije dešava preko opioidnih receptora. 16. Kombinacija niskih doza morfina, ketamina i magnezijum sulfat ne remeti značajno motornu aktivnost pacova u odnosu na nisku dozu samog morfina. 17. Ketamin izaziva dozno-zavisno sniženje telesne temperature pacova. 18. Magnezijum sulfat ne utiče na telesnu temperaturu pacova. 19. Postoji sinergistička interakcija između magnezijum-sulfata i ketamina u dejstvu na telesnu temperaturu tj. izazivanju hipotermije. 20. Magnezijum sulfat povećava efekt ketamina u snižavanju telesne temperature za oko 2,5 puta. 21. Interakcija ketamin-magnezijum sulfat se najverovatnije odvija na nivou NMDA receptora, a glutamatergički sistem igra ključnu ulogu u regulaciji telesne temperature. 22. Magnezijum sulfat ne utiče na morfinsku hipertermiju. 23. Rastuće doze subanestetičkih doza ketamina dozno-zavisno smanjuju morfinsku hipertemiju. 24. Efekt ketamina u snižavanju morfinske hipertermije pojačan je za oko 5,3 puta u prisustvu male doze magnezijum sulfata. 25. Nalokson potpuno antagonizuje efekt kombinacije morfin-ketamin-magnezijum sulfat u dejstvu na telesnu temperaturu. 26. Hipotermija koju izaziva ketamin, može se produbiti blokadom adrenergičkog (alfa2 adrenergičkih receptora), serotonergičkog i opioidergičkog sistema, kao i blokadom ATP-senzitivnih K+ kanala. 114 27. U hipotermnom efektu ketamina ne učestvuje GABA-ergički, kao ni NO sistem. 28. U hipotermnom efektu kombinacije ketamin-magnezijum sulfat učestvuje i serotonergički sistem, ali ulogu ima i NO sistem. 29. Hipotermija koju izaziva kombinacija ketamin-magnezijum sulfat, može se produbiti blokadom adrenergičkog sistema (blokadom alfa2 adrenergičkih receptora). 30. U hipotermnom efektu kombinacije ketamin-magnezijum sulfat ne učestvuje GABA- ergički (GABAA receptori), opioidergički sistem, kao ni ATP-senzitivni K+ kanali. 115 VII LITERATURA 1. Adams HA. Abteilung Anästhesiologie I, Medizinischen Hochschule Hannover. Anaesthesiologie und Reanimation 1998; 23(3):60-63. 2. Adler MW, Geller EB. Thermoregulation and the opioid system. NIDA Res. Monogr 1989; 95:180-5. 3. Adriaenssens G, Vermeyen KM, Hoffmann VL, Mertens E, Adriaenssens HF. Postoperative analgesia with i.v. patient-controlled morphine: effect of adding ketamine. Br J Anaesth 1999; 83: 393-6. 4. Allen RM, Granger AL, Dykstra LA. The competitive N-methyl-D-aspartate receptor antagonist (-)-6-phosphonomethyl-deca-hydroisoquinoline-3-carboxylic acid (LY235959) potentiates the antinociceptive effects of opioids that vary in efficacy at the mu-opioid receptor. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 2003; 307:785-92. 5. Almeida MC, Branco LG. Role of nitric oxide in insulin-induced hypothermia in rats. Brain Res Bull 2001; 54(1):49-53. 6. Ashina M, Lassen LH, Bendtsen L, Jensen R, Olesen J. Effect of inhibition of nitric oxide synthase on chronic tension-type headache: a randomised crossover trial. Lancet 1999; 353: 287–289. 7. Badjatia N, Strongilis E, Gordon E, Prescutti M, Fernandez L, Fernandez A, Buitrago M, Schmidt JM, Ostapkovich ND, Mayer SA. Metabolic impact of shivering during therapeutic temperature modulation: the Bedside Shivering Assessment Scale. Stroke 2008; 39:3242-7. 8. Baker AK, Meert TF. Functional effects of systemically administered agonists and antagonists of mu, delta, and kappa opioid receptor subtypes on body temperature in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 302: 1253-64. 9. Bell RF, Dahl JB, Moore RA, Kalso E. Perioperative ketamine for acute postoperative pain. Cochrane Database Syst Rev 2006; 25:CD004603. 116 10. Benamar K, Yondorf M, Barreto VT, Geller EB, Adler MW. Deletion of mu-opioid receptor in mice alters the development of acute neuroinflammation. J. Pharmacol. Exp.Ther. 2007; 323:990-4. 11. Bennett GJ. Update on the neurophysiology of pain transmission and modulation: focus on the NMDAreceptor. J Pain Symptom Manage 2000; 19(1):S2-6. 12. Berenyi S, Toth Z, Sepsi A, Zekany A, Gyulai S, Makleit S. Synthesis and biological evaluation of some halogenated 6,14-ethenomorphinan derivatives. Med. Chem. Res. 1995; 5(1):26-32. 13. Bernard SA, Buist M. Induced hypothermia in critical care medicine: a review. Crit Care Med. 2003; 31:2041-51. 14. Berry PH, Convington EC, Dahl JL, Katz JA, Miaskowski C. Pain: Current underastanding of assessment management and treatments. Glenview: American Pain Society, 2006. 15. Bhat GK, Mahesh VB, Ping L, Chorich L, Wiedmeier VT, Brann DW. Opioid- glutamate-nitric oxide connection in the regulation of luteinizing hormone secretion in the rat. Endocrinology 1998;139(3):955-60. 16. Borazan H, Kececioglu A, Okesli S, Otelcioglu, S.. Oral magnesium lozenge reduces postoperative sore throat: a randomized, prospective, placebo-controlled study. Anesthesiology 2012; 117:512-8. 17. Bossard AE, Guirimand F, Fletcher D, Gaude-Joindreau V, Chauvin M, Bouhassira D. Interaction of a combination of morphine and ketamine on the nociceptive flexion reflex in human volunteers. Pain. 2002; 98(1-2):47-57. 18. Boulant JA. Neuronal basis of Hammel s model for set-point thermoregulation J Appl Physiol (1985). 2006; 100(4):1347-54. 19. Boultadakis A, Pitsikas N. Anesthetic ketamine impairs rats' recall of previous information: the nitric oxide synthase inhibitor N-nitro-L-arginine methylester antagonizes this ketamine-induced recognition memory deficit. Anesthesiology. 2011; 114(6):1345-53. 117 20. Bourne H, von Zastrow M. Drug receptors & pharmacodynamics. In: Katzung BG, editor, Basic and Clinical Pharmacology, New York: The McGraw-Hill Companies Inc, 2007;11-33. 21. Boyko M, Kuts R, Gruenbaum BF, Melamed I, Gruenbaum SE, Klein M, Shapira Y, Zlotnik A. The role of hypothermia in the regulation of blood glutamate levels in naive rats. J Neurosurg Anesthesiol 2013; 25:174-83. 22. Bulutcu F, Dogrul A, Güç MO. The involvement of nitric oxide in the analgesic effects of ketamine. Life Sci. 2002;71(7):841-53. 23. Campos AR, Santos FA, Rao VS. Ketamine-induced potentiation of morphine analgesia in rat tail-flick test: role of opioid-, alpha2-adrenoceptors and ATP- sensitive potassium channels. Biological & Pharmaceutical Bulletin 2006; 29:86–9. 24. Cano G, Passerin AM, Schiltz JC, Card JP, Morrison SF, Sved AF. Anatomical substrates for the central control of sympathetic outflow to interscapular adipose tissue during cold exposure J Comp Neurol. 2003; 460(3):303-26. 25. Cao WH, Morrison SF. Brown adipose tissue thermogenesis contributes to fentanyl- evoked hyperthermia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol 2005; 288:723- 32. 26. Carstensen M. Møller AM. Adding ketamine to morphine for intravenous patient- controlled analgesia for acute postoperative pain: a qualitative review of randomized trials. British Journal of Anaesthesia 2010; 104:401–6. 27. Chen X, McClatchy DB, Geller EB, Tallarida RJ, Adler MW. The dynamic relationship between mu and kappa opioid receptors in body temperature regulation. Life Sci 2005; 78:329-33. 28. Colman AS, Miller JH. mu- 1 opioid receptor stimulation decreases body temperature in conscious, unrestrained neonatal rats. Exp Biol Med (Maywood) 2002; 227(6):377-81. 29. Commons KG, van Bockstaele EJ, Pfaff DW. Frequent colocalization of mu and NMDA-type glutamate receptors at postsynaptic sites in periaqueductal gray neurons. J Comp Neurol 1999; 408:549-59. 118 30. Corbett D, Evans S, Thomas C, Wang D, Jonas RA. MK-801 reduced cerebral ischemic injury by inducing hypothermia. Brain Res 1990; 514:300-4. 31. Cordeiro LM, Guimarães JB, Wanner SP, La Guardia RB, Miranda RM, Marubayashi U, Soares DD. Inhibition of tryptophan hydroxylase abolishes fatigue induced by central tryptophan in exercising rats. Scand J Med Sci Sports. 2014; 24(1):80-8. 32. Davidson EM, Carlton SM. Intraplantar iwection of dextrorphan, ketamine or memantine attenuates formalininduced behaviours. Brain Res 1998; 785:136-42. 33. Davis MP. Evidence from basic research for opioid combinations. Expert. Opin. Drug Discov 2012; 7:165-78. 34. Deakin CD, Nolan JP, Soar J, Sunde K, Koster RW, Smith GB, Perkins GD, 2010. European Resuscitation Council Guidelines for Resuscitation. Adult advanced life support. Resuscitation. 2010; 81:1305-52. 35. Decollogne S, Tomas A, Lecerf C, Adamowicz E, Seman M. NMDA receptor complex blockade by oral administration of magnesium: comparison with MK-801. Pharmacol Biochem Behav. 1997; 58(1):261-8. 36. Degernes LA, Kreeger TJ, Mandsager R, Redig PT. Ketamine-xylazine anesthesia in red-tailed hawks with antagonism by yohimbine. J Wildl Dis. 1988; 24(2):322-6. 37. DeRossi R, Pompermeyer CT, Silva-Neto AB, Barros AL, Jardim PH, Frazílio FO. Lumbosacral epidural magnesium prolongs ketamine analgesia in conscious sheep. Acta Cirurgica Brasileira 2012; 27:137-43. 38. Dietis N, Rowbotham DJ, Lambert DG. Opioid receptor subtypes: fact or artifact? Br. J. Anaesth 2011; 107: 8-18. 39. Dilsaver SC, Davidson RK. Chronic treatment with amitriptyline produces subsensitivity to the hypothermic effects of yohimbine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 1989; 13:211–215. 40. Dimicco JA, Zaretsky DV. The dorsomedial hypothalamus: a new player in thermoregulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2007; 292(1):47-63. 119 41. Douglas BG, Dagirmanfian R. The effects of magnesium deficiency on ketamine sleeping times in the rat. British Journal of Anaesthesia 1975; 47:336-40. 42. Ebert B, Thorkildsen C, Andersen S, Christrup LL, Hjeds H. Opioid analgesics as noncompetitive N-methyl-Daspartate (NMDA) antagonists. Biochem Pharmacol 1998; 56: 553-9. 43. Eikelboom R. Naloxone, naltrexone and body temperature. Life Sciences 1987; 40(11):1027-32. 44. Eisenberg E, Kleiser A, Dortort A, Haim T, Yarnitsky D. The NMDA (N-methyl-D- aspartate) receptor antagonist memantine in the treatment of postherpetic neuralgia: a double-blind, placebo-controlled study. Eur J Pain 1998; 2: 321-7. 45. Fahim I, Ismail M, Osman OH. Role of 5-hydroxytryptamine in ketamine-induced hypothermia in the rat. Br J Pharmacol 1973; 48(4):570-6. 46. Fawcett WJ, Haxby EJ, Male DA. Magnesium: physiology and pharmacology. Br J Anaesth 1999; 83:302-20. 47. Feldberg W, Lotti VJ. Temperature responses to monoamines and an inhibitor of MAO injected into the cerebral ventricles of rats. Br J Pharmacol Chemother. 1967; 31(1):152-61. 48. Fischer BD, Carrigan KA, Dykstra LA. Effects of N-methyl-D-aspartate receptor antagonists on acute morphine-induced and l-methadone-induced antinociception in mice. Journal of Pain 2005; 6:425-33. 49. Fischer BD, Dykstra LA. Interactions between an N-methyl-D aspartate antagonist and low-efficacy opioid receptor agonists in assays of schedule- controlled responding and thermal nociception.J Pharmacol Exp Ther. 2006; 318(3):1300-6. 50. Forman LJ. NMDA receptor antagonism produces antinociception which is partially mediated by brain opioids and dopamine. Life Sci 1999; 64:1877-87. 51. Fraga D, Machado RR, Fernandes LC, Souza GE, Zampronio AR. Endogenous opioids: role in prostaglandin-dependent and -independent fever. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol 2008; 294:411-20. 120 52. Freedman DX, Giarman NJ. LSD-25 and the status and level of brain serotonin, Ann N Y Acad Sci 1962; 96:98-107. 53. Gonzales JM, Loeb AL, Reichard PS, Irvine S. Ketamine inhibits glutamate-, N- methyl-D-aspartate-, and quisqualate-stimulated cGMP production in cultured cerebral neurons. Anesthesiology 1995; 82(1):205-13. 54. Gozdemir M, Usta B, Demircioglu RI, Muslu B, Sert H, Karatas OF. Magnesium sulphate infusion prevents shivering during transurethral prostatectomy with spinal anesthesia: a randomized, double-blinded, controlled study. J Clin Anesth 2010; 22:184-9. 55. Grisel JE, Allen S, Nemmani KV, Fee JR, Carliss R. The influence of dextromethorphan on morphine analgesia in Swiss Webster mice is sex-specific. Pharmacology Biochemistry and Behavior 2005; 81:131-8. 56. Groer CE, Schmid CL, Jaeger AM, Bohn LM. Agonist-directed interactions with specific beta-arrestins determine mu-opioid receptor trafficking, ubiquitination, and dephosphorylation. J. Biol. Chem 2011; 286:31731–41. 57. Gupta LK, Gupta R, Tripathi CD. N-Methyl-D-aspartate receptor modulators block hyperalgesia induced by acute low-dose morphine. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology 2011; 38:592-7. 58. Hales TG. Arresting the development of morphine tolerance and dependence. British Journal of Anaesthesia 2011; 107: 653-5. 59. Handler CM, Geller EB, Adler MW. Effect of selective mu-, kappa- and delta selective opioid agonist on thermoregulation in the rat. Pharmacol Biochem Behav 1992; 43:1209-1216. 60. Handler CM, Piliero TC, Geller EB, Adler MW. Effect of ambient temperature on the ability of mu-, kappa- and delta-selective opioid agonists to modulate thermoregulatory mechanisms in the rat. J Pharmacol Exp Ther 1994; 268(2):847- 55. 61. Harrison NL, Simmonds MA. Quantitative studies on some antagonists of N- methyl-d-aspartate in slices of rat cerebral cortex. Br J Pharmacol 1985; 84:381–91. 121 62. Herroeder S, Schönherr ME, De Hert SG, Hollmann MW. Magnesium--essentials for anesthesiologists. Anesthesiology 2011; 114: 971-93. 63. Hirota K, Lambert DG. Ketamine: its mechanism(s) of action and unusual clinical uses. British Journal of Anaesthesia 1996; 77: 441–4. 64. Hirota K, Lambert DG. Ketamine: Ketamine: new uses for an old drug? British Journal of Anaesthesia 2011; 107:123–6. 65. Hodges MR, Tattersall GJ, Harris MB, McEvoy SD, Richerson DN, Deneris ES, Johnson RL, Chen ZF, Richerson GB. Defects in breathing and thermoregulation in mice with near-complete absence of central serotonin neurons. J Neurosci. 2008; 28(10):2495-505. 66. Hoffman JM, Brown JW, Sirlin EA, Benoit AM, Gill WH, Harris MB, Darnall RA. Activation of 5-HT1A receptors in the paragigantocellularis lateralis decreases shivering during cooling in the concious pigletAm J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007; 293(1):518-27. 67. Holtman JR Jr, Crooks PA, Johnson-Hardy J, Wala EP. Interaction between morphine and norketamine enantiomers in rodent models of nociception. Pharmacology Biochemistry and Behavior 2008; 90: 769-77. 68. Houston M. The role of magnesium in hypertension and cardiovascular disease. J Clin Hypertens (Greenwich). 2011; 13(11):843-7. 69. Huang NK, Tseng CJ, Wong CS, Tung CS. Effects of acute and chronic morphine on DOPAC and glutamate at subcortical DA terminals in awake rats. Pharmacol Biochem Behav 1997; 56:363-71. 70. Hudetz JA, Pagel PS. Neuroprotection by ketamine: a review of the experimental and clinical evidence. J Cardiothorac Vasc Anesth. 2010; 24:131-42. 71. Iannello S, Belfiore F. Hypomagnesemia. A review of pathophysiological, clinical and therapeutical aspects. Panminerva Med. 2001;43(3):177-209. 72. Ikeda T, Kazama T, Sessler DI, Toriyama S, Niwa K, Shimada C, Sato S. Induction of anesthesia with ketamine reduces the magnitude of redistribution hypothermia. Anesth Analg 2001; 93: 934–8. 122 73. Irifune M, Shimizu T, Nomoto M, Fukuda T. Ketamine-induced anesthesia involves the N-methyl-d-aspartate receptor-channel complex in mice. Brain Res. 1992; 596:1–9. 74. Ishiwata T, Saito T, Hasegawa H, Yazawa T, Kotani Y, Otokawa M, Aihara Y. Changes of body temperature and thermoregulatory responses of freely moving rats during GABAergic pharmacological stimulation to the preoptic area and anterior hypothalamus in several ambient temperatures. Brain Res 2005;1048(1-2):32-40. 75. Ishizaki K, Sasaki M, Karasawa S, Obata H, Nara T, Goto F. The effect of intrathecal magnesium sulphate on nociception in rat acute pain models. Anaesthesia 1999;54(3):241-6. 76. Ivanović MD, Mićović IV, Vučković S, Prostran M, Todorović Z, Kricojević VD, Djordjević JB, Došen-Mićović Lj. The synthesis and preliminary pharmacological evaluation of the racemic cis and trans 3-alkylfentanyl analogues. J. Serb. Chem. Soc 2004; 69:511–26. 77. Jackson DL, Hargreaves KM. Activation of excitatory amino acid receptors in bovine dental pulp evokes the release of iCGRP. J Dent Res 1999; 78:54-60. 78. Javery KB, Ussery TW, Steger HG, Colclough GW. Comparison of morphine and morphine with ketamine for postoperative analgesia. Can J Anaesth 1996; 43(3):212-5. 79. Jelenković A, Veskov R,Jovanović M, Raičević R, Bokonjić D,Vesna Vasilev V, Bošković B. Bol i ekscitatorne amino kiseline. Vojnosanitetski pregled 2002;59(1):49-58. 80. Jellish WS, Zhang X, Langen KE, Spector MS, Scalfani MT. Intrathecal magnesium sulphate administration at the time of experimental ischemia improves neurological functioning by reducing acute and delayed loss of motor neurons in the spinal cord. Anesthesiology 2008; 108:78-86. 81. Kao CH, Kao TY, Huang WT, Lin MT. Lipopolysaccharide- and glutamate-induced hypothalamic hydroxyl radical elevation and fever can be suppressed by N-methyl- D-aspartate-receptor antagonists. J Pharmacol Sci 2007; 104:130-6. 123 82. Kawamata T, Omote K. Activation of spinal N-methyl-D-aspartate receptors stimulates a nitric oxide/cyclic guanosine 3,5-monophosphate/glutamate release cascade in nociceptive signaling. Anesthesiology 1999; 91(5):1415-24. 83. Kawano T, Tanaka K, Yinhua, Eguchi S, Kawano H, Takahashi A, Nakaya Y, Oshita S. Effects of ketamine on nicorandil induced ATP-sensitive potassium channel activity in cell line derived from rat aortic smooth muscle. J Med Invest. 2010; 57(3-4):237-44. 84. Kissin I, Kerr R, Smith LR. Assessment of anaesthetic action of morphine and fentanyl in rats. Can. Anaesth. Soc. J. 1983; 30:623-628. 85. Kizilirmak S, Karakaş SE, Akça O, Ozkan T, Yavru A, Pembeci K, Sessler DI, Telci L. Magnesium sulphate stops postanesthetic shivering. Ann N Y Acad Sci 1997; 813:799-806. 86. Komiskey HL, Rudy TA. The involvement of methysergide-sensitive receptors and prostaglandins in the hyperthermia evoked by 5-HT in the cat. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1975;11(2):195-208. 87. Komulainen A, Olson ME. Antagonism of ketamine-xylazine anesthesia in rats by administration of yohimbine, tolazoline, or 4-aminopyridine. Am J Vet Res 1991; 52(4):585-8. 88. Kress HG. Abteilung für Allgemeine Anaesthesie und Intensivmedizin (B) der Universität Wien. Der Anaesthesist 1997; 46:8-19. 89. Lai CC, Kuo TI, Lin HH. The role of protein kinase A in acute ethanol-induced neurobehavioral actions in rats. Anesthesia & Analgesia 2007; 105:89-96. 90. Langer SZ. Presynaptic regulation of catecholamine release. Biochem Pharmacol. 1974; 23(13):1793-800. 91. Laulin JP, Maurette P, Corcuff JB, Rivat C, Chauvin M, Simonnet G. The role of ketamine in preventing fentanyl-induced hyperalgesia and subsequent acute morphine tolerance. Anesthesia & Analgesia 2002; 94:1263-9. 124 92. Le Grevès, P, Huang W, Zhou Q, Thörnwall M, Nyberg F. Acute effects of morphine on the expression of mRNAs for NMDA receptor subunits in the rat hippocampus, hypothalamus and spinal cord. Eur J Pharmacol 1998; 341:161-4. 93. Lee KS1, Han TH, Jo JY, Kang G, Lee SY, Ryu PD, Im JH, Jeon BH, Park JB. Serotonin inhibits GABA synaptic transmission in presympathetic paraventricular nucleus neurons. Neurosci Lett 2008; 439(2):138-42. 94. Lehmann KA. Opioids: overview on action, interaction and toxicity. Support Care Cancer 1997; 5:439-44. 95. Li JX, Koek W, France CP. Food restriction and streptozotocin differentially modify sensitivity to the hypothermic effects of direct- and indirect-acting serotonin receptor agonists in rats. Eur J Pharmacol 2009; 613:60–63. 96. Lin JH and Lin MT. Nitric oxide synthase, cyclooxygenase pathway in organum vasculosum laminae terminalis: possible role in pyrogenic fever in rabbits. Br J Pharmacol 1996; 118: 179-185. 97. Lin MT, Wu JJ, Tsay BL. Serotonergic mechanisms in the hypothalamus mediate thermoregulatory responses in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 1983; 322(4):271-8. 98. Lin MT. Effects of sodium pentobarbital on thermoregulatory responses in the rat. Neuropharmacology. 1981; 20(7):693-8. 99. Liu HT, Hollmann MW, Liu WH, Hoenemann CW, Durieux ME. Modulation of NMDA receptor function by ketamine and magnesium: Part I. Anesth Analg 2001; 92:1173-81. 100. Lizarraga I, Chambers JP, Johnson CB. Synergistic depression of NMDA receptor- mediated transmission by ketamine, ketoprofen and L-NAMEcombinations in neonatal rat spinal cords in vitro. Br J Pharmacol. 2008;153(5):1030-42. 101. Lysakowski C, Dumont L, Czarnetzki C, Tramèr MR. Magnesium as an adjuvant to postoperative analgesia: a systematic review of randomized trials. Anesth Analg 2007; 104:1532-9. 125 102. MacDonald fF, Bartlett MC, Mody I, Pahapill P, Reynolds JN, Salter MW, Schneiderman JH, Pennefather PS. Action of ketamine, phencyclidine and MK-801 on NMDA receptor currents in cultured mouse hippocampal neurones. The Journal of Physiology 1991; 432: 483-508. 103. Mahmood MA, Zweifler RM. Progress in shivering control. J Neurol Sci 2007; 261:47-54. 104. Malone DT, Taylor DA. Involvement of somatodendritic 5-HT(1A) receptors in Delta(9)-tetrahydrocannabinol-induced hypothermia in the rat. Pharmacol Biochem Behav 2001;69: 595–601. 105. Mao J. NMDA and opioid receptors: their interaction in antinociception, tolerance and neuroplasticity. Brain Research Reviews 1999; 30: 289–304. 106. Martín-Cora FJ, Fornal CA, Metzler CW, Jacobs BL. Single unit responses of serotonergic medullary and pontine raphe neurons to environmental cooling in freely moving catsNeuroscience. 2000; 98(2):301-9. 107. Maurset A, Skoglund LA, Hustveit O, Oye I. Comparison of ketamine and pethidine in experimental and postoperative pain. Pain 1989; 36(1):37-41. 108. McCartney CJ, Sinha A, Katz J. A qualitative systematic review of the role of N- methyl-D-aspartate receptor antagonists in preventive analgesia. Anesthesia & Analgesia 2004; 98: 1385-400. 109. Melamed R, Bar-Yosef S, Shakhar G, Shakhar K, Ben-Eliyahu S. Suppression of natural killer cell activity and promotion of tumor metastasis by ketamine, thiopental, andhalothane, but not by propofol: mediating mechanisms and prophylactic measures. Anesth Analg 2003; 97(5):1331-9. 110. Mercadante S, Lodi F, Sapio M, Calligara M, Serretta R. Long-term ketamine subcutaneous continuous infusion in neuropathic cancer pain. J Pain Symptom Manage 1995; 10:564-8. 111. Merskey H, Bugduk N. Classification of chronic pain. Descriptions of Chronic Pain Syndromes and Definitions of Pain Terms. 2nd ed. Seattle, WA: IASP Press; 1994. 126 112. Miaskowski C, Cleary J, Burney R, Coyne P, Finley R, Foster R, et al., Guidelines for the management of cancer pain in adults and children ( Clinical Practice Guidelines Series, No. 3). Glenville IL: American Pain Society, 2005. 113. Michaelis E. Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Progr Neurobiol 1998; 54: 415-569. 114. Mićović IV., Ivanović MD, Vučković S, Jovanović-Mićić D, Beleslin D, Došen- Mićović Lj, Kiricojević VD. 3-Carbomethoxy fentanyl: Synthesis, pharmacology and conformational analysis. Heterocycl. Commun. 1998; 4:171-9. 115. Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Rev 1991; 43(2):109-42. 116. Monique D, Patris-Garcia, DVM, Anna Johnson, Suzanne Millman, Kennetch Strakler, Locke Karrier. Effects of yohimbine, an alpha 2-antagonistic reversal agent on physiological recovery parameters of anesthetized sows. Journal of Swine Health AND production 2014; 22(1):16-23. 117. Morishima Y, Shibano T. Evidence that 5-HT2A receptors are not involved in 5- HT-mediated thermoregulation in mice. Pharmacol Biochem Behav 1995; 52(4):755-8. 118. Morrison SF. Central pathway controling brown adipose tissue. New Physiol Sci 2004; 19:67-74. 119. Morrison SF.Activation of 5-HT1A receptors in raphe pallidus inhibits leptin- evoked increases in brown adipose tissue thermogenesis Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2004; 286(5):832-7. 120. Murck H. Ketamine, magnesium and major depression-from pharmacology to pathophysiology and back. J Psychiatr Res 2013; 47:955-65. 121. Murck H. Magnesium and affective disorders. Nutr Neurosci. 2002; 5(6):375-89. 122. Na HS, Ryu JH, Do SH. The role of magnesium in pain. In: Vink R and Nechifor M (eds). Magnesium in the central nervous system. University of Adelaide Press, Adelaide, South Australia, 2011; pp 157-165. 127 123. Nakasuji M, Nakamura M, Imanaka N, Tanaka M, Nomura M. An intraoperative small dose of ketamine prevents remifentanil-induced postanesthetic shivering. Anesth Analg 2011; 113:484-7. 124. Narita M, Suzuki T, Misawa M, Nagase H. Role of central ATP-sensitive potassium channels in the hyperthermic effect of morphine in mice. Psychopharmacology (Berl) 1992; 109(1-2):239-40. 125. Nason MW Jr, Mason P. Medullary raphe neurons facilitate brown adipose tissue activationJ Neurosci. 2006; 26(4):1190-8. 126. Nechifor, M. Magnesium involvement in pain. Magnesium Research 2011; 24:220- 2. 127. Nemmani KV, Grisel JE, Stowe JR, Smith-Carliss R, Mogil JS. Modulation of morphine analgesia by site-specific N-methyl-D-aspartate receptor antagonists: dependence on sex, site of antagonism, morphine dose, and time. Pain 2004; 109:274-83. 128. Nisijima K, Kuboshima K, Shioda K, Yoshino T, Iwamura T, Kato S. Memantine attenuates 3,4-methylenedioxymethamphetamine-induced hyperthermia in rats. Neurosci Lett 2012; 531:198-203. 129. Nozaki C, Le Bourdonnec B, Reiss D, Windh RT, Little PJ, Dolle RE, Kieffer BL, Gavériaux-Ruff C. δ-Opioid Mechanisms for ADL5747 and ADL5859 Effects in Mice: Analgesia, Locomotion, and Receptor Internalization. J. Pharmacol. Exp. Ther 2012; 342: 799-807. 130. O'Flaherty JE, Lin CX. Does ketamine or magnesium affect posttonsillectomy pain in children? Paediatr Anaesth 2003; 13:413-21. 131. Ogden KK, Traynelis SF. New advances in NMDA receptor pharmacology. Trends Pharmacol Sci 2011; 32:726-33. 132. Orser B, Smith D, Henderson S, Gelb A. Magnesium deficiency increases ketamine sensitivity in rats. Canadian Journal of Anesthesia 1997b; 44:883–90. 133. Orser BA, Pennefather PS, MacDonald JF. Multiple mechanisms of ketamine blockade of N-methyl-D-aspartate receptors. Anesthesiology 1997a; 86:903-917. 128 134. Øye I, Paulsen O, Maurset A. Effects of ketamine on sensory perception: Evidence for a role of N-methyl-D-aspartate receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 1992; 260:1209–13. 135. Øye I. Ketamine analgesia, NMDA receptors and the gates perception. Acta Anaesthesiologica Scandinavica 1998; 42:747-9. 136. Pacheco Dda F, Romero TR, Duarte ID. Central antinociception induced by ketamine is mediated by endogenous opioids and μ- and δ-opioid receptors. Brain Res. 2014; 1562:69-75. 137. Papeschi R, Sourkes TL, Youdim MB. The effect of yohimbine on brain serotonin metabolism, motor behavior and body temperature of the rat. European Journal of Pharmacology 1971;15(3):318-26. 138. Park SM, Mangat HS, Berger K, Rosengart AJ. Efficacy spectrum of antishivering medications: meta-analysis of randomized controlled trials. Crit Care Med. 2012; 40:3070-82. 139. Peberdy MA, Callaway CW, Neumar RW, Geocadin RG, Zimmerman JL, Donnino M, Gabrielli A, Silvers SM, Zaritsky AL, Merchant R, Vanden Hoek TL, Kronick SL. Part 9: post-cardiac arrest care: 2010 American Heart Association Guidelines for Cardiopulmonary Resuscitation and Emergency Cardiovascular Care. Circulation. 2010; 122:768-86. 140. Pekoe GM, Smith DJ. The involvement of opiate and monoaminergic neuronal systems in the analgesic effects of ketamine. Pain. 1982 Jan;12(1):57-73. 141. Persson J. Wherefore ketamine? Current Opinion in Anaesthesiology 2010; 23:455– 60. 142. Petrović V, Buzadzić B, Korać A, Vasilijević A, Janković A, Korać B. NO modulates the molecular basis of rat interscapular brown adipose tissue thermogenesis. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol 2010; 152(2):147-59. 143. Piepponen TP, Kivastik T, Katajamäki J, Zharkovsky A, Ahtee L. Involvement of opioid mu 1 receptors in morphine-induced conditioned place preference in rats. Pharmacol Biochem Behav 1997; 58(1):275-9. 129 144. Pitsikas N, Boultadakis A. Pre-training administration of anesthetic ketamine differentially affects rats' spatial and non-spatial recognition memory. Neuropharmacology. 2009; 57: 1-7. 145. Polderman KH. Application of therapeutic hypothermia in the ICU: opportunities and pitfalls of a promising treatment modality. Part 1: Indications and evidence. Intensive Care Med. 2004; 30:556-75. 146. Polderman KH. Induced hypothermia and fever control for prevention and treatment of neurological injuries. Lancet. 2008; 371:1955-69. 147. Pradhan AA, Smith ML, Kieffer BL, Evans CJ. Ligand-Directed Signaling Within the Opioid Receptor Family. Br J Pharmacol 2012; 167:960-9. 148. Przegaliński E, Filip M, Chojnacka-Wójcik E, Tatarczyńska E. The role of 5- hydroxytryptamine1A (5-HT1A) receptors in the anticonflict activity of beta- adrenoceptor antagonists. Pharmacol Biochem Behav. 1994; 47(4):873-8. 149. Queiroz-Castro P, Egger C, Redua MA, Rohrbach BW, Cox S, Doherty T. Effects of ketamine and magnesium on the minimum alveolar concentration of isoflurane in goats. Am J Vet Res 2006; 67:1962-6. 150. Quibell R, Prommer EE, Mihalyo M, Twycross R, Wilcock A. Ketamine*. J Pain Symptom Manage 2011;41:640-9. 151. Rawls SM, Adler MW, Gaughan JP, Baron A, Geller EB, Cowan A. NMDA receptors modulate morphine-induced hyperthermia. Brain Res 2003; 984:76-83. 152. Rawls SM, Benamar K. Effects of opioids, cannabinoids, and vanilloids on body temperature. Front. Biosci. (Schol Ed). 2011; 3:822-45. 153. Rawls SM, Cowan A, Tallarida RJ, Geller EB, Adler MW. N-methyl-D-aspartate antagonists and WIN 55212-2[4,5-dihydro-2-methyl-4(4-morpholinylmethyl)-1-(1- naphthalenyl-carbonyl)-6H-pyrrolo[3,2,1-i,j]quinolin-6-one], a cannabinoid agonist, interact to produce synergistic hypothermia. J Pharmacol Exp Ther 2002; 303:395- 402. 130 154. Rawls SM, Tallarida R, Robinson W, Amin M. The beta-lactam antibiotic, ceftriaxone, attenuates morphine-evoked hyperthermia in rats. Br J Pharmacol 2007; 15:1095-102. 155. Rivero G, Llorente J, McPherson J, Cooke A, Mundell SJ, McArdle CA, Rosethorne EM, Charlton SJ, Krasel C, Bailey CP, Henderson G, Kelly E. Endomorphin-2: A Biased Agonist at the μ-Opioid Receptor. Mol. Pharmacol 2012; 82:178-88. 156. Rives ML, Rossillo M, Liu-Chen LY, Javitch J.A. 6'-Guanidinonaltrindole (6'- GNTI) Is a G Protein-biased κ-Opioid Receptor Agonist That Inhibits Arrestin Recruitment. J. Biol. Chem. 2012; 287:27050-4. 157. Rodríguez-Muñoz M, Sánchez-Blázquez P, Vicente-Sánchez A, Berrocoso E, Garzón J. The mu-opioid receptor and the NMDA receptor associate in PAG neurons: implications in pain control. Neuropsychopharmacology 2012; 37:338-49. 158. Romero TR, Galdino GS, Silva GC, Resende LC, Perez AC, Côrtes SF, Duarte ID. Ketamine activates the L-arginine/Nitric oxide/cyclic guanosine monophosphate pathway to induce peripheral antinociception in rats. Anesth Analg. 2011; 113(5):1254-9. 159. Rondón LJ, Privat AM, Daulhac L, Davin N, Mazur A, Fialip J, Eschalier A, Courteix C. Magnesium attenuates chronic hypersensitivity and spinal cord NMDA receptor phosphorylation in a rat model of diabetic neuropathic pain. The Journal of Physiology 2010; 588: 4205-15. 160. Salmi P, Ahlenius S. Evidence for functional interactions between 5-HT1A and 5- HT2A receptors in rat thermoregulatory mechanisms. Pharmacol Toxicol. 1998; 82(3):122-7. 161. Salmi P, Kela J, Arvidsson U, Wahlestedt C. Functional interactions between delta- and mu-opioid receptors in rat thermoregulation. Eur J Pharmacol. 2003; 458(1- 2):101-6. 162. Savić Vujović KR, Vučković S, Srebro D, Ivanović M, Došen-Mićović Lj, Vučetić C, Džoljić E, Prostran M. A comparison of the antinociceptive and temperature 131 responses to morphine and fentanyl derivatives in rats. Arch Pharm Res 2013; 36:501-8. 163. Schumacher MA, Basbaum AI, Way WL. Opioid analgesics & antagonists. In: Katzung BG, editor. Basic & Clinical Pharmacology, Ninth edition. New York: Lange Medical Books/McGraw Hill Medical Publishing Division; 2005. p. 497- 516. 164. Sen AP, Gulati A. Use of magnesium in traumatic brain injury. Neurotherapeutics 2010; 7:91-9. 165. Sessler DI. Temperature monitoring and perioperative thermoregulation. Anesthesiology 2008; 109:318-38. 166. Siwek M, Wróbel A, Dudek D, Nowak G, Zieba A. The role of copper and magnesium in the pathogenesis and treatment of affective disorders. Psychiatr Pol 2005; 39(5):911-20. 167. Soave PM, Conti G, Costa R, Arcangeli A. Magnesium and anaesthesia. Current Drug Targets 2009; 10:734-43. 168. Song W, Wu YM, Ji Z, Ji YB, Wang SN, Pan SY. Intra-carotid cold magnesium sulphate infusion induces selective cerebral hypothermia and neuroprotection in rats with transient middle cerebral artery occlusion. Neurol Sci 2013; 34:479-86. 169. Sontakke SD, Umapathy G, Shivaji S. Yohimbine antagonizes the anaesthetic effects of ketamine-xylazine in captive Indian wild felids. Vet Anaesth Analg 2009; 36(1):34-41. 170. Stannad CF, Porter GE. Ketamine hydrochloride in the treatment of phantom limb pain. Pain 1993; 54: 227-30. 171. Stannard C, Booth S. Pain. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; 2004 172. Steiner AA, Antunes-Rodrigues J, McCann SM, Branco LG. Antipyretic role of the NO-cGMP pathway in the anteroventral preoptic region of the rat brain. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2002; 282(2):584-93. 132 173. Stessel B, Ovink JK, Theunissen HM, Kessels AG, Marcus MA, Gramke H. Is s- ketamine with or without magnesium sulphate an alternative for postoperative pain treatment? Randomised study. Eur J Anaesthesiol 2013; 30:91-3. 174. Suzuki M, Tsueda K, Lansing PS, Tolan MM, Fuhrman TM, Ignacio CI, et al. Small-dose ketamine enhances morphine-induced analgesia after outpatient surgery. Anesth Analg 1999; 89:98-103. 175. Tallarida RJ, Cowan A, Raffa RB. Antinociceptive synergy, additivity, and subadditivity with combinations of oral glucosamine plus nonopioid analgesics in mice. J Pharmacol Exp Ther 2003; 307: 699-704. 176. Tallarida RJ, Murray RB. Manual of pharmacologic calculations with computer programs. 2nd ed. Springer Verlag, New York1986. 177. Tallarida RJ. Interactions between drugs and occupied receptors. Pharmacol Ther 2007; 113:197-209. 178. Tomić MA, Vučković SM, Stepanović-Petrović RM, Ugresić ND, Prostran MS, Bosković B. Synergistic interactions between paracetamol and oxcarbazepine in somatic and visceral pain models in rodents. Anesth. Analg 2010; 110:1198-205. 179. Ulugol A, Dost T, Dokmeci D, Akpolat M, Karadag CH, Dokmeci I: Involvement of NMDA receptors and nitric oxide in the thermoregulatory effect of morphine in mice. J Neural Transm 2000; 107:515–21 180. Van Bogaert M, Oosting R, Toth M, Groenink L, van Oorschot R, Olivier B. Effects of genetic background and null mutation of 5-HT1A receptors on basal and stress-induced body temperature: modulation by serotonergic and GABAA-ergic drugs. Eur J Pharmacol. 2006; 550(1-3):84-90. 181. van der Worp HB, Sena ES, Donnan GA, Howells DW, Macleod MR. Hypothermia in animal models of acute ischaemic stroke: a systematic review and meta-analysis. Brain 2007; 130: 3063-74. 182. Vastani N, Seifert B, Spahn DR, Maurer K. Sensitivities of rat primary sensory afferent nerves to magnesium: implications for differential nerve blocks. Eur J Anaesthesiol 2013; 30(1):21-8. 133 183. Vinkers CH, van Oorschot R, Korte SM, Olivier B, Groenink L. 5-HT1A receptor blockade reverses GABA(A) receptor alpha3 subunit-mediated anxiolytic effects on stress-induced hyperthermia. Psychopharmacology (Berl). 2010; 211(2):123-30. 184. Voronova IP, Naumenko VS, Khramova GM, Kozyreva TV, Popova NK Central 5- HT3 receptor-induced hypothermia is associated with reduced metabolic rate and increased heat loss. Neurosci Lett 2011; 504(3):209-14. 185. Vučković S, Ivanović M, Prostran M, Todorović Z, Ristović Z, Micović I, Beleslin D. Higher environmental temperature potentiates cataleptic effect of fentanyl in rats. Jpn. J. Pharmacol 1998; 78:523-7. 186. Vučković S, Prostran M, Ivanović M, Došen-Mićović Lj, Todorović Z, Nešić Z, Stojanović R,Divac N, Miković Ž. Fentanyl analogs: structure-activity-relationship study. Curr. Med. Chem 2009; 16:2468-74. 187. Vučković S, Savić Vujović K, Srebro D, Medić B, Vučetić Č, Prostran M, Prostran M. Synergistic interaction between ketamine and magnesium in lowering body temperature in rats. Physiology and Behaviour 2014; 127:45-53. 188. Vučković S. Farmakoterapija bola. U: Prostran M.urednik. Klinička farmakologija. Beograd: Medicinski fakultet, Univerziteta u Beogradu,2012; 103-124. 189. Wadhwa A, Sengupta P, Durrani J, Akça O, Lenhardt R. Magnesium sulphate only slightly reduces the shivering threshold in humans. Br J Anaesth 2005; 94:756–62. 190. Wallace K. The patophysiology of pain. Crit Care Nurs Q 1992; 15:1-13. 191. Warren S, Yezierski RP, Capra NE. The Somatosenzorz System II: Touch, Thermal Sense, and Pain. In: Haines DE, editor. Fundamental Neuroscience, Second edition. Philadelphia: Churchill Livingstone; 2002; 273-302. 192. Wei H, Petrovaara A. MK-801, an NMDA receptor antagonist, in the rostroventromedial medulla attenuates development of neuropathic symptoms inthe rat. Neroreport 1999; 10: 2933-7. 193. Willis WD. The Pain System: The Neural Basis of Nociceptive Transmission in the Mammalian. Basel: S Karger,1985 134 194. Wilson JR, Howard BA. Effects of cold acclimation and central opioid processes on thermoregulation in rats. Pharmacol Biochem Behav. 1996; 54(2):317-25. 195. Winter JC, Rabin RA. Yohimbine as a serotonergic agent: evidence from receptor binding and drug discrimination. J Pharmacol Exp Ther 1992; 263:682–689. 196. Yamanaka R, Shindo Y, Hotta K, Suzuki K, Oka K. NO/cGMP/PKG signaling pathway induces magnesium release mediated by mitoKATP channel opening in rat hippocampal neurons. FEBS Lett. 2013; 587(16):2643-8. 197. Yang PK, Weinger MB, Negus SS. Elucidation of dose-effect relationships for different opiate effects using alfentanil in the spontaneously ventilating rat. Anesthesiology 1992; 77:153-61. 198. Yousef AA, Al-Deeb AE. A double-blinded randomised controlled study of the value of sequential intravenous and oral magnesium therapy in patients with chronic low back pain with a neuropathic component. Anaesthesia 2013; 68:260-6. 199. Zarrindast MR, Karami M, Sepehri H, Sahraei H. Influence of nitric oxide on morphine-induced conditioned place preference in the rat central amygdala. Eur J Pharmacol 2002;453(1):81-9. 200. Zweifler RM, Voorhees ME, Mahmood MA, Parnell M. Magnesium sulfate increases the rate of hypothermia via surface cooling and improves comfort. Stroke. 2004; 35:2331-4. SPISAK SKRAĆENICA IASP - Internacionalno udruženje za ispitivanje bola μ receptor - mi receptor ϭ - delta ϰ - kapa IL-1 beta-interleukin 1 beta NMDA - N-metil-D-aspartat AMPA - alfa-amino-3-hidroksil-5-metil-4-izoksazol KAI - kainatna kiselina PCP - fenciklidin MK801 - dizocilpin CNQX - 6-ciano-7-nitrokvinoksalin-2,3-dion APV - (2R)-amino-5-fosfonovalerična kiselina; (2R)-amino-5-fosfonopentanoat GABA - gama aminobuterna kiselina EAK - ekscitatorna amino kiselina α receptor - alfa receptor 5-HT - 5 hidroksitriptamin BAT - mrko masno tkivo PO/AH - preoptički/anteriorni hipotalamus NO - azotni oksid NOS - sintaza azotnog oksida L-NAME - L-arginin metil ester hidrohlorid ATN - akutna termička nocicepcija ATP - adenozin trifosfat Ip - intraperitonealno Sc - subkutano Biografija Katarina Savić Vujović rođena je 12.09.1979. godine u Kruševcu. Medicinski fakultet u Beogradu završila je 2004. godine sa prosečnom ocenom 9,37. Specijalističke akademske studije iz Eksperimentalne fiziologije i patološke fiziologije završila je 2009. godine, odbranivši temu „ Poremećaj mehanizama citoprotekcije u ulcerogenezi“. Specijalizaciju iz Kliničke farmakologije završila je sa odličnim uspehom 2013. godine. Radi na Institutu za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu u zvanju asistenta. Na ovom Institutu zaposlena je od 2009. godine. Uža oblast njenog rada je farmakologija CNS-a, kao i farmakologija bola. Dobitnik je brojnih nagrada i stipendija u inostranstvu. Autor je i ko-autor u više poglavlja udžbenika, knjiga, monografija, šezdeset stručnih radova i publikacija, od kojih je deset radova in extenso u časopisima indeksiranim u CC/SCI bazi. Prilog 'N . lztava o autorstvu Potpisani-a Katarina SavicVuiovic broj upisa FN-02/09 lzjavljujem da je doktorska disertacija pod naslovom Efekti opioida i antagonista NMDA receptora na telesnu temperaturu i akutni nociceptivni bol kod pacova .. rezultat sopstvenog istraZivadkog rada, o da predloZena disertacija u celini ni u delovima nije bila predloZena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visoko5kolskih ustanova, . da su rezultati korektno navedeni i . da nisam kr5io/la autorska prava i koristio intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranda U Beograd u, 29.11 "2014. Katarina Savic Vujovic Prilog 2. llava o istovetnosti Stampane i elektronske verzije ' doktorskog rada lme i prezime autora Katarina Savi6 Vujovi6 Brojupisa FN-02/09 Studijski program Fiziolo5ke nauke Naslov rada - Efekti opioida iantagonista NMDA receptora na telesnu temperaturu i akutni nociceptivni bol kod pacova Mentor Prof. dr Sonja Vudkovi6 Potpisani _Katarina Savic Vujovic izjavljujem da je Stampana vezija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj veziji koju sam predao/la za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji lidni podaci vezani za dobijanje akademskog zvanja doktora nauka, kao Sto su ime i prezime, godina i mesto rodenja idatum odbrane rada. Ovi li6ni podaci mogu se objaviti na mreZnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i u publikacijama Univeziteta u Beogradu. Potpis doktoranda U Beogradu, 29.11 .2014. Kotorino Sovic Vujovic L - Y"r,r' qruryo; lu"&-l l\,1 I f Prilog 3. lilava o kori56enju Ovla56ujem Univezitetsku biblioteku ,,svetozar Markovi6" da u Digitalni repozitorijum Univeziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: Efektiopioido iontogonisto NMDA receptoro no telesnu iemperoturu iokutni nocicepiivni bol kod pocovo koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji po5tuju odredbe sadrZane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odlu6io/la. 1. Autorsfuo '\]tAutorstvo - nekomercijal no 3. Autorstvo - nekomercijalno - bez prerade 4. Autorstuo - nekomercijalno - deliti pod istim uslovima 5. Autorsfuo - bez prerade 6. Autorstvo - deliti pod istim uslovima (Molimo da zaokrulite samo jednu od Sest ponudenih licenci, kratak opis licenci dat je na poledini lista). Potpis doktoranda U Beogradu, 29.11 .2014. K-^tqu#$ u^t'l?iofi+ Kotorino Sovic Vujovic 1. Autorstvo - Dozvoljavate umno2avanje, distribuciju i javno saopStavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na naiin odreden od strane autora ili davaoca licence, iak i u komercijalne svrhe. Ovo je najslobodnija od svih licenci. 2. Autorstvo nekomercijalno. Dozvoljavate umnoZavanje, distribuciju i javno saop5tavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na nadin odreden od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. 3. Autorstvo - nekomercijalno - bez prerade. Dozvoljavate umnoZavanje, distribuciju i javno saop5tavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na na6in odreden od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. U odnosu na sve ostale licence, ovom licencom se ogranidava najveeiobim prava kori$Cenja dela. 4. Autorsfuo - nekomercijalno - deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnoZavanje, distribuciju i javno saop5tavanje dela, i prerade, ako se navede ime auiora na nadin odreden od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili slidnom licencom. Ova licenca ne dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada. 5. Autorstvo bez prerade. Dozvoljavate umno2avanje, distribuciju i javno saop5tavanje dela, bez promena, preoblikovanja ili upotrebe dela u svom delu, ako se navede ime autora na na6in odreden od strane autora ili davaoca licence. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela. 6. Autorstvo - deliti pod istim uslovima. Dozvoljavate umnoZavanje, distribuciju ijavno saop5tavanje dela, i prerade, ako se navede ime autora na nadin odreden od strane autora ili davaoca licence i ako se prerada distribuira pod istom ili slidnom licencom. Ova licenca dozvoljava komercijalnu upotrebu dela i prerada. Slicna je softverskim licencama, odnosno licencama otvorenog koda.