NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRAD Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 25.12.2014.godine, broj 4600/12, imenovana je komisija za ocenu završene doktorske disertacije pod naslovom: ,,Značaj određivanja koncentracije osteopontina u plazmi kao pokazatelja prisustva malignih tumora jajnika’’ kandidata Prim mr sci ph Mirjane Milivojević, specijaliste medicinske biohemije zaposlene u Centru za medicinsku biohemiju, Kliničkog centra Srbije. Mentor je Prof. dr Nataša Petronijević, komentor je Prof. dr Biljana Kastratović-Kotlica. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Prof. dr Lidija Tasić, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu 2. Doc. dr Vesna Dragutinović, docent Medicinskog fakulteta u Beogradu 3. Prof. dr Vladimir Bošković, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu, u penziji Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicinskog fakultet IZVEŠTAJ A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija mr sci ph Mirjane Milivojević napisana je na 137 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, ciljevi rada, materijal i metode, rezultati, diskusija, zaključci i literatura. U disertaciji se nalazi 40tabela i 27 grafikona. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U uvodu su definisane neoplazme ovarijuma, nabrojane njihove klasifikacije i faktori rizika za njihov nastanak. Opisani su dijagnostički testovi i prognostički modeli koji se danas koriste u predikciji ovarijalnih kancera sa posebnim osvrtom na tumor markere. Detaljno su opisana dosadašnja saznanja o fosfoglikoproteinu osteopontinu (OPN), njegova uloga u fiziološkim i patološkim procesima u organizmu. OPN koji pripada familiji hemokina učestvuje u brojnim inflamatornim i imunološkim procesima, u vaskularnoj kalcifikaciji i restenozi, angiogenezi i remodeliranju koštanog skeleta, formiranju dentina i dr. Ovaj protein, koji postoji u intracelularnoj i ekstracelularnoj formi, igra krucijalnu ulogu u regulisanju tumorskih metastaza. Opisana je sposobnost OPN-a da se veže za CD44 – ERM receptore kao i za neke integrinske receptore (αVβ1, αVβ3 i αVβ5) što dovodi do aktivacije nishodnih signalnih puteva (Ras, PI3k, Akt, MAPK i NF-kB i mTOR) koji vode ka promenama u tumorskim ćelijamaː invaziji u ekstracelularni matriks regulacijom matriks metaloproteinaza (MMP) i urokinaza plazminogen aktivatora (uPAs), povećanoj migraciji i adheziji tumorskih ćelija i inhibiciji apoptoze i progresiji tumora. Detaljno je opisana njegova uloga u regulisanju ćelijskih signala koji kontrolišu tumorsku progresiju i nastajanje metastaza. Ciljevi rada su precizno definisani. Sastoje se u ispitivanju značaja određivanja OPN-a u predikciji epitelnih kancera ovarijuma. Ispitano je da li postoje uslovi da se OPN ispituje kao marker ovarijalnih kanceraː da li postoji povišena koncentracija ovog proteina u krvi bolesnica sa ovarijalnim kancerom, da li postoji razlika u koncentraciji ovog proteina između ispitivanih grupa (grupe zdravih ispitanica, bolesnica sa benignim bolestima ovarijuma i bolesnica sa epitelnim ovarijalnim karcinomima). Određena je korelacija OPN- a u grupi ispitivanih bolesnica prema histološkom tipu tumora, stadijumu tumorske bolesti, histološkom i nuklearnom gradusu. Kao cilj rada navedeno je i ispitivanje kliničke efikasnosti OPN testa, njegove specifičnosti, senzitivnosti, pozitivne i negativne prediktivne vrednosti u detekciji benignih i malignih tumora ovarijuma. Određene su i cut- off vrednosti koje omogućavaju preciznu trijažu bolesnica sa cistama na jajniku i njihovo adekvatno zbrinjavanje. OPN je upoređen sa još četiri danas najčešće korišćena tumor markeraː CA125, HE4, CA19.9, CEA i sa ROMA indeksom. Ispitana je njegova prognostička uloga praćenjem bolesnica u periodu od 60 meseci i definisana u odnosu na ishod bolesti. U poglavlju Materijal i metode navedeno je da je ovaj rad urađen na Klinici za Ginekologiji i akušerstvo, KCS i u Centru za medicinsku biohemiju, KCS. Ispitivanje je sprovedeno prema odlukama Etičkog odbora Kliničkog centra Srbije u Beogradu. Ispitanice obuhvaćene ovom studijom (n=157) podeljene su u tri grupe, pedantno su uzeti anamnestički i demografski podaci, podaci dobijeni UZ pregledom i izvađeni uzorci krvi za laboratorijska ispitivanja. U serumu ispitanica CMIA tehnikom, određene su osnovne biohemijske analize i tumor markeri, a u plazmi ELISA tehnikom određene su koncentracije OPN. Detaljno je opisana metodologija određivanja OPN-a ELISA testom u plazmi pacijentkinja. U poglavlju Rezultatidetaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati. Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Zaključcisažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada. Korišćena literatura sadrži spisak od 210 referenci. B) Kratak opis postignutih rezultata Osteopontin kao marker transformacije epitelnih ćelija i protein čije se koncentracije u plazmi povećavaju 4 do 10 puta u zavisnosti od stadijuma i vrste epitelnog ovarijalnog tumora, može da pruži korisne informacije kliničaru o tipu prisutne adneksalne mase. Posle određivanja bazalnih nivoa OPN kod zdravih ispitanica, određene su vrednosti OPN u grupi bolesnica sa benignim bolestima jajnika i u grupi bolesnica sa epitelnim karcinomima. Statistički značajna razlika koja je dobijena između ispitivanih grupa ukazuje da se OPN može koristiti u predikciji ove bolesti. Poređenjem vrednosti preoperativnog OPN kod bolesnica sa malignim tumorima u odnosu na kontrolnu grupu dobijena je dijagnostička korisnost testa (AUC = 0.946), koja ukazuje da bolesnice sa EOC imaju 94,6 puta veću šansu nego zdrave ispitanice da imaju povišene vrednosti OPN-a. Izborom cut-off vrednosti OPNa od 240µg/L, dobijenasenzitivnosttesta je 91,2%, a specifičnost 78%što sa ovakvim svojstvima obezbeđuje je mogućnost blagovremenog zbrinjavanja bolesnica sa malignim bolestima jajnika. U predikciji benignih formi ovarijalnih tumora OPN testom dobija se niža specifičnost (62,2%) i senzitivnost (88%) i za odabranu cut-off vrednost od 110µg/Lpostoji mogićnost da 37,8% rezultata bude lažno pozitivno. Kako se radi o benignim formama bolesti koja neposredno ne ugrožavaju život ili znatno ne umanjuju kvalitet života prihvatljiva je ova karakteristika markera. Jedan od najvažnijih kriterijuma u ispitivanju performansi tumor markera je njegova sposobnost da odvoji benigne od malignih bolesnica. Dijagnostička snaga testa dobijana ROC anlizom za diferencijalnu dijagnostiku bolesnica sa cistama jajnika iznosila je 87,1% (AUC=0,871).Za bolesnice čije su vrednosti OPN iznadgraničnevrednosti od 340 µg/L, sasenzitivnošću od 80,7%, može se tvrditi da je u pitanjumaligna forma tumoraepitelaovarijuma. Ovako dobre perfomanse OPN-a kao markera podržava i dokaz da koncentracija OPN-a u krvi korelira sa napretkom bolesti.Rezultatidobijeni u našemraduukazujunačinjenicu da se naosnovuvisinepreoperativnog OPN-a,bolesnicemogusvrstati u one kodkojih je bolest u ranojfazikadasumogućnostilečenjabolje, i one kodkojih je bolestuznapredovalaikada je lečenjeneizvesnije. Poređenjem OPN sa tumor markermakoji se danasnajčešćekoriste u kliničkojprakizapredikcijuovarijalnihkancera (CA125 i HE4) nijedobijenaznačajnarazlika. Znači da se primena bilo koga od nabrojenih markera, kao i ROMA indeksa, u dijagnostičkoj proceduri može se smatrati jednako pouzdanom. Udruženimodređivanjem OPN sa CA125,ilisa HE4 povećava se dijagnostičkasnaga OPN testa, štogovori u prilogpotrebeformiranjamarkerskihpanelau ciljudobijanjaboljesenzitivnostiispecifičnosti. OPN injegovakliničkaprimenadobijajunadijagnostičkojkorisnostiuzlaboratorijskenalaze u kojimasu CRP isedimentacijaeritrocitaistovremenoiznadreferentnihvrednosti, kada se OPN može smatrati nezavisnim prognostičkim faktorom. C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature Mali broj radova ispitivao je značaj određivanja proteina OPN u predikciji ovarijalnih kancera. Mnogo češće su određivane osobine ovog markera kod drugih kancera; prostate, dojke, jetre itd. U jednom od najpoznatijih radova (Kim i saradnici) prvi su opisali osobine OPN-a kao dijagnostičkog biomarkera u detekciji ovarijalnih kancera na više načina: dokazali su da postoji pojačana ekspresija DNK OPN-gena microarray tehnikom u obolelom tkivu jajnika, RT-PCR tehnikom povišen nivo mRNK OPN-gena u pojedinačnim ćelijskim kulturama kancera jajnika, histohemijskim bojenjem uzoraka tkiva jajnika i potvrdili povezanost nivoa OPN-a u plazmi ELISA testom kod 144 bolesnice sa postojanjem bolesti. Ovi rezultati su u skladu sa našim rezultatima dobijenim primenom istog ELISA testa. U radu mr Milivojević je dokazano da nivo OPN u plazmikorelirasastadijumomtumorskebolesti. U plazmibolesnicakojesuobuhvaćeneovomstudijompostojistatističkiznačajnarazlika u nivoimaosteopontinakodbolesnicakojesu u ranim, početnimstadijumimabolesti (FIGO I-II) ionihkojesu u uznapredovalimstadijumimabolesti (FIGO III-IV) p<0,01. Sanašim rezultatima slažu se Coppola i saradnici. Oni su u svojim radovima potvrdili da pored povišenog nivoa OPN u tumorskom tkivu postoji i korelacija između nivoa OPN-a i stadijuma tumorske bolesti.Nakaeisaradnici, kaoi Kim isaradnicisu precizirali da se svaki FIGO stadijum može okarakterisati sa odgovarajućom koncentracijom OPN , p<0,05, ali su takođe došli do zaključka da povišen nivo OPN ne zavisi od histopatološkog tipa kancera jajnika.NasuprotovomeTiniakosisaradnici su mišljenja da ni histološki tip bolesti, ni klinički stadijum nisu u korelaciji sa koncentracijom OPN. Poznato da OPN inhibira apoptozu i dovodi do aktivacije signalnih puteva u ćeliji koji povećavaju migraciju i adheziji tumorskih ćelija a time i progresiju tumora (Wai i saradnici, Rangaswami i saradnici, Hiss i saradnici). Zato su mnoge studije pokazale značaj ovog markera u praćenju bolesti i u pojavi racidiva (Brakora i saradnici,Nakaeisaradnici). Takođe je dokazano da se OPN možeprimenitikaoneinvazivniskrining test u ranojdijagnosticijerpovišenekoncentracije OPN mogu da se odrede u urinu (Ye isaradnici). Većina autora smatra da senzitivnost koju ima OPN 81,3% (Nakaeisaradnici ) kada se koristi samostalno, njega čini slabijim u poređenju sa tumor markerom CA125 udetekciji prisustva ovarijalnih kancera. U rezultatima ovog rada dobijena je identična senzitivnost za OPN, ali je sličan potencijal imao i CA125. Pacijenti sa značajno većim vrednostima nivoa OPN imaju lošiju prognozu i to su dokazali mnogi autori (Bao i saradnici), a to je u saglasnosti sa rezultatima dobijenim u ovom radu. D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije 1. Milivojević M, Bošković B, Atanacković J, Milićević S, Ražić S, Kastratovic Kotlica B. Evaluation of osteopontin and CA125 in detection of epithelial ovarian carcinoma. European Journal of gynaecological oncology (EJGO) 2013;1:83-85. E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija ,,Značaj određivanja koncentracije osteopontina u plazmi kao pokazatelja prisustva malignih tumora jajnika’’ mr sci ph Mirjane Milivojević predstavlja originalan naučni doprinos u ispitivanju hemokina, fosfoglikoproteina osteopontina u detekciji epitelnih tumora jajnika. Ovim kliničkim istraživanjem jasno je dokazana dijagnostička korisnost ovog testa u predikciji benignih i malignih tumora jajnika.Klinčki značaj OPN markerau trijaži bolesnica sa ovarijalnim cistama posebno dolazi do izražaja kod mucinoznog histološkog tipa epitelnih ovarijalnih kancera. Udružen sa drugim tumor markerima (CA125 ili HE4) OPN može da popravi njihovu osetljivost i specifičnost i zato ga treba uključiti u multimarkerske panele. OPN je dobar prediktivni marker i najbolju prediktivnu vrednost na ishod bolesti imaju povišene vrednosti OPN-a (>240 µg/L) i FIGO stadijum bolesti. Klinička primena cut-offvrednosti OPN-a kao markera maligniteta epitela ovarijuma dobija na dijagnostičkoj korisnosti uz laboratorijski nalaz u kome su CRP i sedimentacija eritrocita istovremeno iznad referentnih vrednosti. Ova doktorska disertacija urađena prema svim principima naučnog istraživanja.Tema ovog rada je aktuelna, ciljevi su precizno definisani, metodologija rada je bila savremena, a dobijeni rezultati su pregledno i sistematski prikazani i diskutovani. Izvedeni zaključci su dragoceni jer pružaju smernice za dalja istraživanja ovog i drugih markera čija je primena u predikciji ovarijalnih kancera.Karcinom jajnika je najsmrtonosniji ginekološki malignitet, zato su istraživanja posvećena identifikaciji dijagnostičkih i prognostičkih biomarkera raka jajnika danas vrlo značajna. U eri personalizovane medicine kada se postojeće terapije širokog spektra menjaju individualnim pristupom ka ciljnim molekulama, izbor lekova je povezan sa novim saznanjima o markerima kancera jajnika. Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata, komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati doktorsku disertaciju mr sci ph Mirjane Milivojević i odobri njenu javnu odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka. U Beogradu, 13.3.2015. Članovi Komisije: Mentorː Prof. drLidijaTasić Prof. dr Natraša Petronijević __________________________ __________________________ Doc. dr Vesna Dragutinović Komentor: __________________________ Prof. dr Biljana Kastratović Kotlica __________________________ Prof. dr Vladimir Bošković __________________________