NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 25.12.2014. godine, broj 4600/12, imenovana je komisija za ocenu završene doktorske disertacije pod naslovom: „Uporedno ispitivanje klasičnih i molekularnih metoda u dijagnostici pneumonije izazvane bakterijom Mycoplasma pneumoniae kod dece“ kandidata mr dr Biljane Međo, zaposlene na Univerzitetskoj dečjoj klinici u Beogradu i na Medicinskom fakultetu u Beogradu kao klinički aistent na katedri za pedijatriju. Mentor je Prof. dr Slobodanka Đukić, a komentor je Doc. dr Marina Atanasković-Marković. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Doc. dr Dimitrije Nikolić docent Medicinskog fakulteta u Beogradu 2. Doc. dr Ivana Ćirković, docent Medicinskog fakulteta u Beogradu 3. Prof. dr Gordana Radosavljević-Ašić, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu, u penziji Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicnskog fakulteta sledeći IZVEŠTAJ A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija mr dr Biljana Međo napisana je na 126 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, ciljevi rada, materijal i metode, rezultati, diskusija, zaključci i literatura. U disertaciji se nalazi ukupno 35 grafikona i 2 tabele. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U uvodu su prikazane opšte osobine mikoplazmi, patogeneza respiratorne infekcije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae i imunski odgovor koji nastaje tokom infekcije. Navedene su epidemiološke karakteristike pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae, kliničke manifestacije, kao i vanplućne komplikacije. Detaljno je opisana dijagnostika pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Opisani su radiografski nalaz, laboratorijska dijagnostika i patološki nalaz kod bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom. Takođe, prikazana je mikrobiološka dijagnostika pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumonia: metoda kultivisanja, serološka metoda i reakcije lančane polimerizacije (PCR). Pored toga opisano je lečenje Mycoplasma pneumoniae pneumonije. Ciljevi rada su precizno definisani. Sastoje se određivanju proporcije pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae kod dece i utvrđivanju kliničkih, laboratorijskih i radiografskih karakteristika pneumonije uzrokovane ovom bakterijom. Pored toga ciljevima je obuhvaćeno određivanje nivoa IL-4 i IL-410 u krvi bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom i poređenje sa vrednostima citokina kod bolesnika koja imaju pneumoniju uzrokovanu drugim mikroorganizmima. Kao cilj navedeno je i utvrđivanje senzitivnosti i specifičnosti serološke metode, real-time PCR metode i metode kultivisanja bakterija u dijagnostici pneumonije izazvane bakterijom Mycoplasma pneumoniae. U poglavlju Materijal i metode navedeno je da je istraživanje obavljeno na Univerzitetskoj Dečjoj Klinici u Beogradu i u Institutu za mikrobiologiju i imunologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu. Precizno je navedeno koji su bolesnici uključeni u istraživanje i koje su laboratorijske i biohemijske analize učinjene kod bolesnika sa van bolnički stečenom pneumonijom. Detaljno je opisana mikrobiološka dijagnostika: izolacija i identifikacija bakterije Mycoplasma pneumoniae, real-time PCR metoda i serološka metoda - određivanje specifičnih IgM i IgG antitela. Jasno su definisani kriterijumi za dijagnozu akutne respiratorne infekcije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Pored toga opisana je metodologija određivanja IL-4 i IL-410 u krvi kod bolesnika sa pneumonijom. U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati. Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada. Korišćena literatura sadrži spisak od 187 referenci. B) Kratak opis postignutih rezultata Ovo istraživanje je pokazalo da je Mycoplasma pneumoniae uzročnik pneumonije kod 14,5% bolesnika sa van bolnički stečenom pneumonijom, kao i da je učestalost Mycoplasma pneumoniae pneumonije veća kod bolesnika uzrasta 5 do 15 godina, u odnosu na bolesnike uzrasta do pet godina i veća kod dečaka u odnosu na devojčice. Pokazano je da bolesnici sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom češće imaju kašalj, glavobolju i vizing u poređenju sa bolesnicima sa pneumonijom uzrokovanom drugim mikroorganizimima. Daljom analizom je utvrđeno da su glavobolja, vizing, muški pol i uzrast preko 5 godina značajno udruženi sa pneumonijom uzrokovanom bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Pored toga, ovo istraživanje je pokazalo da se laboratorijske analize i radiografski nalaz značajno ne razlikuju kod bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom u odnosu na bolesnike sa pneumonijom koja nije uzrokovana bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Takođe, pokazano je da povišena temperatura, kašalj i hospitalizacija značajno duže traju kod bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom u poređenju sa bolesnicima koji imaju pneumoniju uzrokovanu drugim mikroorganizmima. Ovim istraživanjem je utvrđeno da nema značajne razlike u vrednostima IL-4 u krvi kod bolesnika Mycoplasma pneumoniae pneumonijom i kod bolesnika sa pneumonijom koja nije uzrokovana bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Niije utvrđena ni značajna razlika u vrednostima IL-4 kod bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom u odnosu na prisustvo vizinga. Međutim, ovim istraživanjem je pokazano da bolesnici sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom imaju značajno više vrednosti IL-10 u krvi u odnosu na bolesnike sa pneumonijom uzrokovanom drugim mikroorganizmima, kao i da bolesnici sa Mycoplasma pneumoniae infekcijom i vizingom imaju značajno više vrednosti IL-10 u krvi u odnosu na bolesnike sa infekcijom koji nemaju vizing. U ovom istraživanju je utvrđeno da u poređenju sa IgG serološkom metodom u parnom serumu (zlatni standard), IgM serologija, real-time PCR metoda i kultura imaju jednaku senzitivnost od 82%, dok specifičnost svake od ovih metoda ima vrednost 100%, 99% i 100%. Pored toga pokazano je da se kombinacijom IgM serologije u serumu u akutnoj fazi bolesti i real-time PCR metodom dijagnostikuje 92% bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom. Navedeni podaci mogu biti od kliničkog značaja u smislu da pojedine kliničke karakteristike kao što su glavobolja i vizing kod bolesnika sa pneumonijom mogu da ukažu na Mycoplasma pneumoniae infekciju. Pored toga navedeni podaci pokazuju da kombinacija IgM serologije i real-time PCR metode omogućava ranu i pouzdanu dijagnozu Mycoplasma pneumoniae pneumonije kod bolesnika u akutnoj fazi bolesti. C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature U toku ovog istraživanja utvrđeno je da je Mycoplasma pneumoniae bila uzročnik pneumonije kod 14,5% pedijatrijskih bolesnika. Bolnička istraživanja sprovedena u drugim Evropskim zemljama takođe su pokazala da je Mycoplasma pneumoniae uzročnik pneumonije u 10-14% van bolnički stečenih pneumonija (Nadal D. i sar.,2001; Puljiz I. i sar., 2006; Defilippi A. i sar., 2008; Almasri M. i sar., 2011; Kicinski P. i sar., 2011). Rezultati u ovom istraživanju pokazuju da je tri četvrtine bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom bilo uzrasta pet do 15 godina. Autori drugih studija su takođe prikazali da je pneumonija uzrokovana bakterijom Mycoplasma pneumoniae češća kod bolesnika uzrasta starijeg od pet godina u odnosu na bolesnike mlađeg uzrasta (Defilippi A. i sar., 2008; Almasri M.i sar., 2011; Sidal M. i sar., 2007). U ovom istraživanju, utvrđeno je da je infekcija bakterijom Mycoplasma pneumoniae češća kod dečaka u odnosu na devojčice, a sličnim rezultati dobijeni su drugim studijama (Puljiz I. i sar., 2006; Lieberman D I sar., 1996) Klinička prezentacija bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom se u ovoj studiji nije značajno razlikovala u odnosu na druge studije (Defilippi A. i sar., 2008; Almasri M. i sar., 2011). Utvrđeno je da su glavobolja, vizing, muški pol i uzrast preko 5 godina značajno udruženi sa pneumonijom uzrokovanom bakterijom Mycoplasma pneumoniae, što su svijim zapažanjima potvrdili i drugi autori (Esposito S. i sar., 2000). Dobijeni rezultati u ovom istraživanju pokazuju da su laboratorijski i radiografski nalazi kod bolesnika sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom nespecifični. Do istog zaključka došli su i drugi autori (Esposito S. i sar., 2001; Almasri M. i sar., 2011). Rezultati in vitro studija u vezi sa sekrecijom citokina kod Mycoplasma pneumoniae infekcije su kontraverzni. Relativno mali broj kliničkih studija je ispitivao sekreciju citokina kod bolesnika sa pomenutom infekcijom. U ovom istraživanju je pokazano da nema značajne razlike u serumskim vrednostima IL-4 kod bolesnika Mycoplasma pneumoniae pneumonijom i kod bolesnika sa pneumonijom koja nije uzrokovana bakterijom Mycoplasma pneumoniae, što je do sada pokazano samo u studiji Michelowa i saradnika (Michelow IC. i sar., 2007). Pored toga, pokazano je da bolesnici sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom imaju značajno više vrednosti IL-10 u krvi u odnosu na bolesnike sa pneumonijom uzrokovanom drugim mikroorganizmima, Autori nedavno sprovedene studije su pokazali da bolesnici sa Mycoplasma pneumoniae pneumonijom u bronhoalveolarnom lavatu imaju veću koncentraciju IL-10 u odnosu na bolesnike koji nemaju pneumoniju, zaključujući da bi IL-10 mogao imati značajnu ulogu u patogenezi Mycoplasma pneumoniae pneumonije (Pang HG. i sar., 2011), što je takođe u saglasnosti sa rezultatima u ovom istraživanju. U ovom istraživanju dobijena je viša senzitivnost i specifičnost serološke metode u poređenju sa rezultatima drugih studija (Nadal D. i sar., 2001; Chang HY. i sar., 2014). Senzitivnost serologije u velikoj meri zavisi od vremena uzimanja uzorka, odnosno od toga da li je od početka infekcije prošlo dovoljno vremena za stvaranje antitela. Dobijena viša senzitivnost IgM serologije u ovoj studiji objašnjava se činjenicom da su serumi za IgM serologiju uzeti prosečno devetog dana od početka bolesti, kada su već nastala antitela. Prema podacima iz literature određivanje IgG antitela u parnom serumu je metod koji ima najvišu senzitivnost (Atkinson TP. i sar., 2008) što je i pokazano u ovoj studiji. Pored toga u ovom istraživanju pokazano je da real-ime PCR metoda takođe ima visoku senzitivnot i specifičnost. Rezultati prethodno sprovedenih studija su heterogeni (Morozumi M. i sar., 2006; Martinez MA. i sar., 2008; Qu. J i sar.2013) što može da se objasni ćinjenicom da senzitivnost ove metode zavisi od tipa PCR, gena koji se koriste kao prajmeri, vrste kliničkog uzroka koji se koristi za PCR i vremena uzimanja uzorka. Pored toga ovim istraživanjem je pokazano da određivanje IgM antitela u serumu u akutnoj fazi bolesti u kombinaciji sa real- time PCR metodom omogućavaju ranu i pouzdanu dijagnozu Mycoplasma pneumoniae pneumonije. U do sada publikovanim radovima mali broj autora ispitivao je kombinaciju dve metode u dijagnostici pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae. D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije 1. Medjo B, Atanaskovic-Markovic M, Radic S, Nikolic D, Lukac M, Djukic S. Mycoplasma pneumoniae as a causative agent of community-acquired pneumonia in children: clinical features and laboratory diagnosis. Ital J Pediatr. 2014 ;40:104. E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija „Uporedno ispitivanje klasičnih i molekularnih metoda u dijagnostici pneumonije izazvane bakterijom Mycoplasma pneumoniae kod dece“ dr Biljane Međo predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju kliničkih, laboratorijskih i radioloiških karakteristika pneumonije uzrokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae. Ovim istraživanjem prvi put je u Srbiji određena proporcija pneumonije urokovane bakterijom Mycoplasma pneumoniae kod pedijatrijskih bolesnika, a da su pri tome korišćene sve tri dijanostičke metode. Rezultati ove doktorske disertacije pokazuju da određivanje IgM antitela u serumu u akutnoj fazi bolesti u kombinaciji sa real-time PCR metodom omogućava ranu i pouzdanu dijagnozu Mycoplasma pneumoniae pneumonije kod bolesnika u akutnoj fazi bolesti, a samim tim blagovremeno započinjanje antibiotske terapije. Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci. Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata, komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati doktorsku disertaciju dr Biljana Međo i odobri njenu javnu odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka. U Beogradu, 15.02.2015. Mentor: Članovi Komisije: Prof. dr Slobodanka Đukić Doc. dr Dimitrije Nikolić _______________________ _______________________ Komentor: Doc. dr Ivana Ćirković Doc. dr Marina Atanasković-Marković _______________________ _______________________ Prof. dr Gordana Radosavljević-Ašić ________________________