NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 31.01.2014. godine, broj 4600/7, imenovana je komisija za ocenu završene doktorske disertacije pod naslovom: „PROMENE AKTIVNOSTI ENZIMA ANTIOKSIDATIVNE ZAŠTITE U KRVI I TKIVU KOD BOLESNIKA SA GLIOBLASTOMOM I MENINGEOMOM“ kandidata mr dr Vojislava Bogosavljevića, zaposlenog u Kliničkom Centru Srbije u Beogradu na klinici za neurohirurgiju u zvanju kliničkog asistenta (ugovor u delu sa Medicinskim fakultetom u Beogradu). Mentor je Prof. dr Miodrag Rakić, komentor je Prof. dr Milica Bajčetić. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Prof. dr Vaso Antunović, profesor Medicinskog fakulteta u Beogradu 2. Doc. dr Miloš Joković, docent Medicinskog fakulteta u Beogradu 3. VNS dr Aleksandra Nikolić Kokić, IBISS Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicnskog fakulteta sledeći IZVEŠTAJ A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija mr sci Vojislava Bogosavljević napisana je na 99 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, pregled literature, cilj istraživanja, materijal i metode, rezultati, diskusija, zaključak i literatura. U disertaciji se nalazi ukupno 37 slika i 20 tabela.. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U uvodu je definisano da nivo oksidacije koji prevazilazi fiziološke granice se označava kao oksidativni stres. Dugo se smatralo da ROS (tkz. Reactive Oxygen Species - ROS) isključivo imaju negativne biološke efekte, odnosno da predstavljaju neku vrstu "neizbežnog zla", u poslednjoj dekadi je prikupljen veliki broj dokaza i o njihovoj pozitivnoj ulozi u raznim signalnim putevima. Sveukupno gledavši, ROS i redoks procesi učestvuju u nizu (pato)fizioloških procesa, kao što su : - ćelijska proliferacija i diferencijacija, prenos signala, regulacija metabolizma i međućelijska komunikacija - citoprotektivni mehanizmi (inflamacija, odbrana od mikroorganizama) - patofiziološki fenomeni (starenje, apoptoza, nekroza, kancerogenoza i dr.) U pregledu literature su predstavljena dosadašnja dostignuća gde je ukupni redoks status opšte prihvaćen kao glavni faktor u regulaciji kako normalne, tako i maligne ćelije. Pomeranje redoks ravnoteže ka oksidaciji može značajno povećati proliferativni kapacitet malignih ćelija. Ćelijsko redoks stanje ima značajan uticaj na kontrolu preživljavanja, apoptoze i ekspresiju tumor supesornih gena. Oksidaciono stanje u ćeliji pogoduje nastanku tumora, dok redukovano redoks okruženje pogoduje nastanku apoptoze. Poremećaj u redoks ravnoteži ćelije dovodi do oksidativnog stresa, što je zapaženo kod različitih tipova kancera. Smatra se da reaktivne forme imaju ključnu ulogu u razvoju karcinoma kod ljudi. Dobro je poznato da oksidativni stres može da konvertuje normalne ćelije u ćelije sa kancerskim fenotipom. Funkcija AOS je izmenjena u različitim tipovima kancera. AOS se sastoji od enzima superoksid dismutase (SOD), katalaze (CAT), glutation peroksidaze (GSH-Px) i glutation reduktaze (GR), dok je najvažnija ne-enzimska komponenta sam glutaion (GSH). Tumorsko tkivo indukuje oksidativni pritisak na krv, što se može videti kroz izmenjeni AOS profil onkoloških pacijenata. Ciljevi rada su precizno definisani. Ovo istraživanje je imalo cilj da utvrdi promene u aktivnostima enzima antioksidativne zaštite u eritrocitima i plazmi : a. pacijenata sa glioblastomom u odnosu na zdrave ispitanike b. pacijenata sa meningeomom u odnosu na zdrave ispitanike Da se utvrde promene u aktivnostima enzima antioksidativne zaštite u eritrocitima i plazmi pacijenta sa glioblastomom u odnosu na pacijente sa meningeomom. Da se utvrde promene u enzimima antioksidativne zaštite u tkivu glioblstoma u odnosu na tkivo meningeoma. Da se uporedi aktivnost antioksidativnog enzimskog zaštitnog sistema u krvi i tkivu pacijenata obolelih od glioblastoma i meningeoma. U poglavlju Materijal i metode navedeno je da je ovo prospektivno istraživanje obavljeno u period od 2004. do 2009. godine na Neurohirurškoj klinici Kliničkog Centra Srbije i u laboratoriji Instituta za farmakologiju, kliničku farmakologiju i toksikologiju Medicinskog fakulteta u Beogradu. U ovom istraživanju anlizirani su uzorci periferne venske krvi i tumorskog tkiva glioblastoma ili meningeoma 134 ispitanika oba pola, starosti od 18 do 70 godina. Na osnovu precizno postavljene dijagnoze (CT ili MRI i histopatološke analize tkiva) ispitanici su podeljeni u dve istraživane grupe operisanih pacijenata po 67 obolelih od malignog tumora mozga – glioblastoma i beningnog tumora mozga – meningeoma. Kontrolnu grupu je činilo 30 zdravih ispitanika, adekvatnog uzrasta i pola, nepušača koji u poslednjh 6 meseci nisu uzimali vitamine, dodatke u ishrani ili lekove sa antioksidativnim dejstvom. Odabir pacijenata izvršen je Neurohirurškoj klinici Kliničkog centra Srbije na osnovu kriterijuma za uključivanje u ispitivanje (CT ili MRI i histopatološka anliza tkiva) i kriterijuma za neuključivanje u ispitivanje ( hronična oboljenja koja mogu poremetiti redoks ravnotežu, virusna infekcija, terapija lekovima sa antioksidativnim dejstvom, kontinuirana suplementacija vitaminima pušenje), kao i tip operativnog lečenja glioblastoma i meningeoma (makroskopski totalna resekcija tumora, subtotalna resekcija tumora, biopsija tumora ). Kod svih operisanih pacijenata korišćene su najsavremenije neurohirurške procedure uključujući i elektrokortikostimulaciju. Svi pacijenti su operisani u opštoj intravenskoj anesteziji bez dodavanja isparljivih anestetika. Histopatološka klasifikacija svih ispitivanih tumora u ovoj studiji se zasniva na Klasifikaciji Svetske zdrastvene organizacije (WHO) iz 2002.godine. Biohemijskim procedurama odredjivana je aktivnost antioksidativnih enzima iz eritrocita, zatim iz tkiva glioblastoma i meningeoma. Statistička obrada rezultata je zasnovana na izračunavanju dovoljnog broja ispitanika u istraživanju sprovedeno na osnovu pilot studije kod 30 ispitanika : 15 sa glioblastomom i 15 sa meningeomom. Pri analizi podataka primenjene su osnovne metode deskriptivne statistike : srednja vrednost (X) sa merama disperzije (standardnom greškom (SE), standardnom devijacijom (SD), rasponom varijacije Min-Max i vrednostima medijane (Med) i moda (Mod)). Normalnost raspodele je testirana Kolmogorov-Smirnov i Shapiro-Wilk testom. Za testiranje statističke značajnosti i proveru hipoteza su korišćeni sledeći statistički testovi : Studentov t-test (parametrijski test) za zavisne i nezavisne uzorke, analiza varijanse (ANOVA), jednofaktorska i dvofaktorska sa pratećom a priori Boniferonijevom t procedurom i post hoc Tuckey HSD, LSD i Dunnett- ovim testom za višestruka poređenja među grupama. Kvalifikacija povezanosti između varijabli biće potveđena Pirsonovom linearnom korelacijom. Baza podataka i analiza rezultata je izvršena pomoću softverskog paketa SPSS 10.0 (SPSS, Inc, Chicago, Il, USA). U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati. Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada. Korišćena literatura sadrži spisak od 153 reference. B) Kratak opis postignutih rezultata Ovo istraživanje je pokazalo da je važno napomenuti da iako određena veoma mala količina podataka postoji na ovu temu, naša studija je prva koja se usresredila i jasno definisala kao cilj poređenje Glioblastoma multiforme (kao primera malignog tumor mozga) i meningeoma (primer benignog tumora mozga). Osim toga, naše studija jedina zadovoljava svojom sistematičnošću kao i statističkom snagom, gde je kada se uzmu u obzir sve dosadašnje redoks studije na bilo kom tipu tumora mozga, ovo najveća sistematska studija sa brojem učesnika/uzoraka dovoljnim da ispuni uslove stroge biostatističke analize, gde je na osnovu preliminarnih rezultata na po 15 uzoraka iz svake grupe utvrđeno da najmanji broj uzoraka po grupi neophodan za adekvanu statistiku iznosi 67, koliko učesnika smo i imali u studiji. Krv obolelih od Glioblastoma multiforme i meningeoma pokazuje očigledan otklon od fiziološkog redoks stanja. U oba slučaja je uočeno značajno smanjenje aktivnosti SOD i CAT, a povećan nivo GR i GSH. GSH-Px je pokazala identične aktivnosti u svim grupama uzoraka. Prvi zaključak koji se iz ovoga može izvesti je da u tumorskom tkivu postoje patološki redoks proces koji se reflektuju na eritrocite tokom kontakta u okviru tumorske cirkulacije. Analiza AOS eritrocita se razlikuje u odnosu na analizu u tkivima, jer eritrociti nemaju de novo sintezu enzima, te se svaka smanjena aktivnost primarno može pripisati direktnoj inhibiciji. Aktivacija enzima se može povezati sa deinhibicijom, ali se rezultati ne smeju posmatrati jednoznačno, odnosno moraju se postaviti u određeni (pato)fiziološki kontekst. U skladu sa navedenim, iz dobijenih rezultata se može izvesti da se tkiva glioblastoma i meningeoma karakterišu povećanom produkcijom H2O2 i NO, koji "cure" u cirkulaciju i utiču na AOS u eritrocitima. Konkretno, H2O2 je inhibitor SOD (i to specifično CuZn SOD koja je karakteristična za eritrocite), dok je NO inhibitor CAT. U ovakvim uslovima, sa inhibiranim enzimima zaduženim za zaštitu kako od endogenog oksidativnog stresa (kroz auto-oksidaciju oksiHb), tako i od H2O2 koji dolazi iz spoljne sredine (tj. tkiva), mora doći do kompenzacije. Kako razvoj tumora mozga nije akutni događaj, odnosno zahteva određen duži vremenski period, ima dovoljno vremena da promenjeni redoks uslovi u krvi utiču na proces eritropoeze, te da se eritrociti zamene novom generacijom koja je bolje opremljena za borbu sa tumor- indukovanim oksidativnim stresom. Ovde se vidi poštovanje određene fiziološke "logike". Naime, povećan nivo CAT ne bi imao efekta, jer bi i veće količine CAT bile barem delimično inhibirane. Zato se kompenzacija javlja u vidu povećanja GR aktivnosti, i sa tim u vezi višim nivoom GSH, koji može H2O2 da uklanja kroz aktivnost GSH-Px, ali i direktnim skevindžingom (ovo važi i za ROS, a i NO se može vezati za GSH). Važno je napomenuti da ONOO- koji je inhibitor GR ne može da napusti tkivo zbog negativne šarže. Veći nivo GR i GSH u krvi obolelih od Globlastoma multiforme u odnosu na meningeom jasno ukazuje da je kod glioblastoma neophodna jača kompenzacija, odnosno da je oksidativni pritisak koji ovo tumorsko tkivo vrši ne nivo eritrocita veći. Ukratko, u glioblastomu se produkuje više H2O2 (a verovatno i NO) u odnosu na tkivo meningeoma. Prepostavljeni veći oksidativni pritisak je u skladu i sa korelacionom analizom, koja je pokazala da je AOS sistem više narušen u krvi obolelih od Glioblastoma multiforme u odnosu ne meningeom. C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature Relativno mali broj radova je ispitivao promene aktivnosti enzima antioksidativne zaštite u krvi i tkivu bolesnika sa glioblastomom i meningeomom. Woźniak i kolege su našli povećanu SOD aktivnost u eritrocitima obolelih od glioblastoma (n = 9) u odnosu na zdrave kontrole (n = 20). Aktivnost CAT se nije razlikovala. Rao i saradnici su pokazali smanjenu SOD i GR aktivnost u eritrocitima obolelih od menigeoma (n = 28) u odnosu na kontrole (n = 48). CAT je bila niža u meningeomu, ali ne statistički signifikantno, dok GSH-Px nije pokazala nikakvu razliku u odnosu na kontrolne vrednosti. U kontekstu poređenja maligni vs. benigni tumori mozga, nisu uočene značajne razlike u AOS. Dakle po pitanju CAT i GSH-Px prethodni rezultati su slični našim. Rezultati za SOD se nisu slagali među studijama, što se može objasniti i malim brojem uzoraka i moguće neadekvatnom primenom biohemijskog eseja za SOD, gde se zahteva visoka stručnost i pažnja. Konačno razlike u nalazima za GR, s obzirom da je reč o kompenzatorskim procesima, mogu poticati od različitog perioda trajanja oboljenja. Što se tiče tkiva, ovde smo se ograničili na poređenje AOS sistema u timorskom tkivu Glioblastoma multiforme i meningeoma. Smatrali smo da kadaverično tkivo dobijeno autopsijom ne predstavlja adekvatnu kontrolu. Peritumorsko tkivo je predstavljalo moguću alternativu, ali s obzorom na blizinu tumora, verovatno je kao i krv izloženo oksidativnom pritisku, te bi korišćenjem vrednosti za AOS enzime moglo da dođe do pogrešne interpretacije. Dok se SOD i CAT nisu razlikovali u aktivnosti u glioblastomu i meningeomu, rezultati su pokazali da je GSH sistem, odnosno aktivnosti GSH-Px i GR kao i nivo GSH značajno šiftovan ka manjim vrednostima u glioblastomu. Korelaciona analiza je pokazala da u meningeomu ne postoji veza između bilo kog para AOS komponenata. U glioblastomu je uočena značajna negativna korelacija između SOD i CAT aktivnosti. Dakle veća SOD aktivnost za sobom povlači manju SOD aktivnost, i obratno manja SOD aktvnost ide u paru sa većom CAT aktivnošću. Ovo je jako zanimljiv nalaz u kontekstu studije koja je pokazala da se glioblastomi mogu podeliti u dve grupe prema sadržaju SOD koji su povezani sa "boljom" (manje SOD) i "lošijom" prognozom (više SOD). Naši rezultati pokazuju da je viša aktivnost SOD povezana sa smanjenom CAT aktivnošću, što jasno vodi do hiperprodukcije H2O2 u toj grupi (subtipu) glioblastoma. Ukratko, čini se da je veća produkcija H2O2 u glioblastomu povezana sa "lošijom" prognozom, odnosno kraćim periodom preživljavanja pacijenata obolelih od glioblastoma. Smanjena GR aktivnost u tkivu glioblastoma u odnosu na meningeom može da implicira povećanu produkciju ONOO-, GR inhibitora. Iako ovo može predstavljati jedan od osnova za uočenu razliku, čini se da nije dominantan jer kod glioblastoma nije reč o izolovnoj inhibiciji jednog enzima, već o sistemski supresovanom čitavom GSH sistemu, naravno relativno u odnosu na meningeom. Naš nalaz je u skladu sa ranijom studijom Tanriverdija i kolega koji su (na mnogo manjoj populaciji, oko 20 pacijenata po grupi) pokazali da glioblastom u odnosu na meningeom ima manju GSH-Px i GR aktivnost. Međutim aktivnosti su i dalje bile oko dva puta veće u odnosu na kontrolno tkivo. GSH-Px i GR i troše i obnavljaju GSH, ali velika produkcija H2O2 prevolađuje ovaj sistem, što rezultuje u tome da nivo GSH bude manji u glioblastomu u odnosu na normalno tkivo. Manja aktivnost GSH sistema u glioblastomu u odnosu na meningeom uočena ovde, implicira da maligni profil tumorskih ćelija koriguje svoj AOS u cilju promocije produkcije H2O2. Naravno, određeni nivo anti-H2O2 aktivnosti je neophodan kako bi se sprečila autodestrukcija. Drugi potencijalni uzrok manje aktivnosti GSH sistema u glioblastomu je preusmeravanje cisteina (GSH progenitora) u metabolički put za proizvodnju cisteinske sulfinične kiseline, koja je uključena u nastanak i rast tumorskih ćelija agresivnog profila. D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske disertacije 1. Vojislav Bogosavljević, Goran Tasić, Branislav Nestorović, Vladimir Jovanović, Miodrag Rakić, Miroslav Samardžić. Surgical Treatment of Glioblastoma Multiforme Localiyed in the Motor Area of the Brain Using the Tehnique of Cortical Electrostimulation. (rad je publikovan u Turkish Neurosurgery 2012, Vol:22, No:2,1-6 2. Vojislav Bogosavljević, Milica Bajčetić, Ivan Spasojević. Comparative analysis of antioxidative systems in malignant and brain tumours (rad je prihvaćen za publikovanje dana 16.09.2014. u Redox report-u). E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija „Promene aktivnosti enzima antioksidativne zaštite u krvi i tkivu bolesnika sa glioblastomom i meningeomom“ dr Vojislava Bogosavljević predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju mehanizama antioksidativne zaštite u krvi i tkivu bolesnika sa glioblastomom i meningeomom. Ovim istraživanjem rasvetljeni su neki mehanizmi antioksidativne zaštite u krvi i tkivu bolesnika sa tumorima mozga uopšte, kao i specifičnosti istih kod glioblastoma i meningeoma i pružene su smernice za dalje istraživanje. Rezultati ove doktorske disertacije bi mogli da pomognu u ranom prepoznavanju promena u eritrocitima kod pacijenta obolelih od tumora mozga jer su oni izloženi povišenom nivou oksidacije tj. oksidativnom stresu. Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a metodologija rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani, a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci. Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata, komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati doktorsku disertaciju dr Vojislava Bogosavljević i odobri njenu javnu odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka. U Beogradu, 01.10.2014. Članovi Komisije: Mentor: Prof. dr Vaso Antunović Prof. dr Miodrag Rakić _______________________ _______________________ Doc. dr Miloš Joković Komentor: _______________________ Prof. dr Milica Bajčetić _______________________ VNS Aleksandra Nikolić-Kokić ________________________