UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Ina V. Gajić FENOTIPSKA I GENOTIPSKA KARAKTERIZACIJA I KLONSKA POVEZANOST FARINGEALNIH IZOLATA STREPTOKOKA GRUPE A REZISTENTNIH NA MAKROLIDE U SRBIJI Doktorska disertacija Beograd, 2014. godina UNIVERSITY OF BELGRADE MEDICAL FACULTY Ina V. Gajic PHENOTYPIC AND GENOTYPIC CHARACTERIZATION AND CLONAL RELATEDNESS OF PHARYNGEAL ISOLATES OF GROUP A STREPTOCOCCI RESISTANT TO MACROLIDES IN SERBIA Doctoral Dissertation Belgrade, 2014 Mentor: Prof. dr Nataša Vučković Opavski Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Komisija: Prof. dr Lazar Ranin Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Doc. dr Vera Mijač Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Prof. dr Marina Milenković Univerzitet u Beogradu, Farmaceutski fakultet Prof. dr Tanja Jovanović Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Prof. dr Branislava Kocić Univerzitet u Nišu, Medicinski fakultet Zahvaljujem se: mentoru, prof. dr Nataši Opavski, članovima komisije, prof. dr Lazaru Raninu, doc. dr Veri Mijač i prof. dr Marini Milenković, doc. dr Maji Stanojević i doc. dr Ivani Lazarević, dr Borisu Jegoroviću, Dušanu Ćurčiću, mojoj porodici. REZIME Uvod: S. pyogenes je najčešći bakterijski uzročnik akutnih tonzilofaringitisa. Iako su penicilinski preparati prva terapijska linija u lečenju streptokoknih faringitisa, u slučajevima preosetljivosti na penicilin, propisuju se makrolidi. Početkom 21. veka, uočen je porast rezistencije grupe A streptokoka (GAS) na eritromicin, širom sveta. Dva glavna mehanizma rezistencije S. pyogenes na makrolide su aktivni efluks antibiotika i izmena ciljnog mesta delovanja. Gen mefA, kodira proteine efluksne pumpe, koji dovode do umerenog stepena rezistencije na 14-člane i 15-člane makrolide (M fenotip). Drugi mehanizam rezistencije je metilacija ciljnog mesta delovanja makrolida. On se odlikuje ukrštenom rezistencijom na makrolide, linkozamide i streptogramine (MLS fenotip). Inducibilan MLS fenotip (iMLS) najčešće determiniše ermA, a konstitutivan MLS fenotip (cMLS) ermB gen. Najčešće korišćena metoda za tipizaciju GAS je emm tipizacija. Ova metoda se zasniva na sekvenciranju hipervarijabilnog dela emm gena, koji kodira M protein, glavni faktor virulencije GAS. MLST (engl. multilocus sequence typing) je metoda genotipizacije, koja se bazira na umnožavanju i sekvenciranju 7 visoko konzerviranih, tzv. „house-keeping” gena, koji kodiraju enzime od vitalnog značaja. RAPD (engl. random amplified polymorphic DNA) metoda se bazira na nasumičnom umnožavanju fragmenata DNK i elektroforetskom razdvajanju dobijenih produkata. Cilj ove studije je bio da se proceni učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolide u Srbiji, da se odrede fenotipovi rezistencije na makrolide, da se odredi distribucija gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline, da se utvrdi klonska distribucija i eventualna klonska veza među sojevima GAS rezistentnih na makrolide (MRGAS), kao i da se proceni osetljivost MRGAS sojeva na druge klase antibakterijskih lekova. Materijal i metode: Analizirani su podaci o rezistenciji 3893 sojeva izolovanih od pacijenata sa faringitisom, širom Srbije, u periodu od decembra 2007. do decembra 2008. godine. Sedamdeset sedam MRGAS izolata je poslato u Nacionalnu referentnu laboratoriju za streptokok radi daljih ispitivanja. Identifikacija je vršena na osnovu mikroskopskih, kulturelnih i biohemijskih osobina. Konzervacija je vršena u Todd Hewitt bujonu sa 10% sadržajem glicerola na -80°C. Trostruki disk difuzioni test i kombinovani difuziono-dilucioni test su korišćeni za određivanje fenotipova rezistencije na makrolide. Geni koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline su detektovani PCR metodom. Klonska veza među sojevima ispitivana je emm tipizacijom, MLST i RAPD metodama. Rezultati: Učestalost rezistencije sojeva S. pyogenes na makrolide, izolovanim u Srbiji tokom 2008. godine, iznosila je 12%. M fenotip rezistencije na makrolide je bio dominantan i detektovan je kod 56 izolata (72,7%). Inducibilan MLS fenotip je bio zastupljen kod 16 izolata (20,8%), a cMLS kod 5 sojeva (6,5%). Uočena je udruženost M fenotipa i mefA gena, iMLS fenotipa i ermA gena, cMLS fenotipa i ermB gen. Dva soja sa iMLS fenotipom su istovremeno imali mefA i ermA gen makrolidne rezistencije, a kod jednog izolata sa cMLS fenotipom nije detektovan nijedan gen koji kodira rezistenciju na makrolide. Od ispitivanih MRGAS izolata, 20 sojeva (26%) je bilo rezistentno na tetracikline. Kod 16 izolata je dokazan tetO gen (80% izolata), dok je kod samo 4 soja identifikovan tetM gen (20%). Svi sojevi sa tetO genom su imali ermA gen, dok su 3 od 4 soja sa tetM genom imali ermB gen. Identifikovano je ukupno 5 emm tipova: emm75 (41,6%), emm12 (35%), emm77 (20,8%), emm28 (1,3%) i emm118 (1,3%). MLST analizom su identifikovana 4 opisana ST i 2 nova: ST36 (36%), ST49 (40,3%), ST52 (1,3%), ST63 (20,8%), STN1 (1,3%) i STN2 (1,3%). STN1 se u odnosu na poznati ST167 razlikovao samo u genu gtr (gtr90). Novoopisani STN2 se od postojećeg ST49 razlikovao samo u genu yiql (yiql96). Dobijeni RAPD profili su se sastojali od 2 do 9 različitih produkata, veličine od od 150 do 2 000 baznih parova (bp). Identifikovano je ukupno 26 različitih profila, od kojih je najveći broj bio uočen kod samo jednog izolata (54% sojeva), dok je manji procenat RAPD profila bio detektovan kod više različitih uzoraka (46%). Ipak, 2 najrasprostranjenija RAPD obrasca su uočena kod čak 42% uzoraka. Diskriminativni indeks RAPD genotipizacije je bio 84% (CI 75,8-92,2), dok je indeks diverziteta MLST metode bio samo 68% (CI 59,26-76,74). Analizom MRGAS izolata identifikovana su tri dominantna klona makrolidne rezistencije: emm75/mefA/ST49 (40,3%), emm12/mefA/ST36 (36%) i emm77/ermA/tetO/ST63 (20,8%). Svi ispitivani sojevi su bili osetljivi na penicilin, vankomicin, ofloksacin i hloramfenikol. Učestalost rezistencije na klindamicin je bila 27,3%. Zaključak: Dobijeni rezultati predstavljaju prvu kompletnu fenotipsku i genotipsku analizu sojeva grupe A streptokoka rezistentnih na makrolide u Srbiji. Učestalost rezistencije GAS sojeva na makrolide u Srbiji, tokom 2008. godine je bila slična prosečnoj prevalenciji izolata MRGAS na nivou Evrope. Najzastupljeniji fenotip/genotip rezistencije na makrolide kod S. pyogenes je bio M fenotip/mefA gen, koga karakteriše umeren stepen rezistencije na makrolide. Uočena je dominacija tri rezistentna klona makrolidne rezistencije (emm75/mefA/ST49, emm12/mefA/ST36 i emm77/ermA/ tetO/ST63), koji ukazuju na visok stepen homogenosti MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji. Na osnovu prikazanih rezultata, zaključujemo da je propagacija rezistentnih klonova glavni faktor rezistencije izolata S. pyogenes na makrolide. Dobijeni rezultati ukazuju na potrebu za aktivnim nadzorom nad streptokoknim infekcijama u Srbiji. Ključne reči: Streptococcus pyogenes, rezistencija, makrolidi, tetraciklini, geni, MLST, RAPD, klon Naučna oblast: Molekularna medicina Uža naučna oblast: Mikrobiologija ABSTRACT Introduction: S. pyogenes is the most common causative agent of bacterial tonsillopharyngitis. Penicillin is a first choice therapy for infections caused by GAS, since penicillin resistance in streptococci has not yet emerged. Macrolides are preferred for treatment of GAS infections in patients with beta-lactam hypersensitivity. At the beginning of 2000s, significant increase in macrolide resistance has been reported from many countries. Two main well-described molecular mechanisms are responsible for macrolide resistance among streptococci: target site modification and antibiotic efflux. Target site modification due to methylase activity has been linked to the presence of erm gene. This mechanism confers cross-resistance to macrolides, lincosamides and streptogramin (MLS resistance). It can be constitutive (cMLS), usually mediated by the ermB gene or inducible (iMLS), mediated by the ermA gene. The other mechanism of resistance, macrolide efflux is encoded by mefA gene and confers low-level resistance to 14- and 15-membered macrolides. The most common tool used to characterize isolates of S. pyogenes today is emm typing, which is based on sequence at the 5’ end of emm gene that encode M protein, one of the major virulence factor in GAS. Multilocus sequence typing (MLST) is genotyping scheme based on nucleotide sequences of internal fragments of seven selected housekeeping loci. Randomly amplification of polymorphic DNA (RAPD) analysis is genotyping gel based method, with relatively high discriminatory index. The aim of this study was to asses prevalence of macrolide resistance group A streptococci (MRGAS) in Serbia, to determine genotypes and phenotypes of macrolide resistance, as well as to evaluate resistance to tetracycline and to determine tetracycline resistance genes. We were also investigated the clonal relatedness of macrolide resistance strains and their susceptibility to other antimicrobial agents. Material and methods: We evaluated resistance rate of MRGAS in Serbia by analyzing data of 3893 pharyngeal isolates of GAS. A total of 77 MRGAS isolates, originated from patients with pharyngitis, were collected from 7 regional laboratories between December 2007 and 2008. Strains were sent to the National Reference Laboratory for streptococci for further testing. GAS identification was done using classical bacteriological techniques, while preservation was done at -80°C, using Todd Hewitt Infusion Broth containing 10% glycerol. Triple disk diffusion test and E test were used to analyze resistance phenotypes. Resistant genes were detected by PCR. The clonal relationships among 77 macrolide resistant GAS isolates were studied using emm typing, MLST and randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Results: Overall, the prevalence of macrolide resistance among pharyngeal GAS isolates in Serbia in 2008 was 12%. M phenotype was detected in 56 strains (72,7%), while MLS phenotype was less frequent: iMLS phenotype was found in 16 (20,8%) and cMLS phenotype in only 5 isolates (6,5%). The mefA gene was found in all strains with M phenotype and in 2 strains with iMLS phenotype which carried also ermA gene. The ermA was detected in all strains with iMLS, while ermB was present in 4 out of 5 cMLS isolates. Overall frequency of tetracycline resistance GAS (TRGAS) was 26%. In all TRGAS either tetM (20%) or tetO gene (80%) were detected. Association of tetO and ermA, as well as tetM and ermB was observed. A total of 5 different emm types were identified among the 77 tested isolates: emm75 (41,6%), emm12 (35%), emm77 (20,8%), emm28 (1,3%) i emm118 (1,3%). MLST analysis revealed the presence of 4 previously described sequence types (STs): ST36, ST49, ST52, ST63, and two new STs (N1 and N2). The most common STs were ST36, ST49 and ST63, accounted for 36%, 40,3% and 20,8% of all sequence types, respectively. Amplification of genomic DNAs with a primer H2 resulted in RAPD patterns consisting of 2 to 9 distinct DNA fragments, generally ranging from approximately 150 to 2,000 bp. A total of 26 distinct RAPD profiles were found among the 77 GAS isolates studied. Most of the patterns were observed in a small number of strains: 12 (46%) were shared and 14 (54%) were unique. However, 2 RAPD profiles that were the most prevalent patterns, accounted for 32 (42%) out of 77 isolates. Three dominant resistant clones were detected among MRGAS isolates in Serbia: emm75/mefA/ST49, emm12/mefA/ST36 i emm77/ermA/ tetO/ ST63. Conclusion: In conclusion, our results show that there is a moderate level of macrolide resistance in Serbia among GAS isolates and that efflux-mediated mechanism is the most widespread. The dominance of 3 major resistant clones, emm75/mefA/ST49, emm12/mefA/ST36 and emm77/ermA/tetO/ST63 and the high genetic homogeneity characterize Serbian MRGAS population. These results demonstrate that macrolide resistance in Serbia is due to the spread of few widely disseminated clones. Key words: Streptococcus pyogenes, macrolide resistance, tetracycline resistance, genes, emm typing, MLST, RAPD, clone SADRŽAJ 1. Uvod ............................................................................................................................ 1 1.1. Istorijat...................................................................................................................... 1 1.2. Klasifikacija bakterija roda Streptococcus ............................................................... 2 1.2.1. Podela streptokoka na osnovu tipa hemolize ............................................... 2 1.2.2. Podela β hemolitičnih streptokoka prema grupno specifičnom antigenu .... 2 1.2.3. Podela streptokoka prema Šermanu ............................................................. 3 1.3. Streptococcus pyogenes (grupa A streptokoka)........................................................ 3 1.4. Faktori virulencije grupe A streptokoka................................................................... 3 1.4.1. Somatski faktori virulencije ......................................................................... 3 1.4.2. Ekstracelularni faktori virulencije ................................................................ 9 1.5. Patogeneza streptokoknih infekcija ........................................................................ 11 1.5.1. Adherencija i kolonizacija.......................................................................... 12 1.5.2. Intracelularna invazija ................................................................................ 12 1.6. Infekcije izazvane streptokokom grupe A .............................................................. 13 1.6.1. Tonzilofaringitis (Tonsylopharyngitis) ...................................................... 13 1.6.2. Streptokokni impetigo (Impetigo streptococcica)...................................... 14 1.6.3. Erizipel (Erysipelas) i celulitis (Celullitis)................................................. 14 1.6.4. Nekrotizirajući fascitis (Fasciitis necroticans) .......................................... 14 1.6.5. Šarlah (Scarlatina) ..................................................................................... 15 1.6.6. Streptokokni toksični šok sindrom (STŠS) ................................................ 15 1.6.7. Post-streptokokne sekvele .......................................................................... 15 1.7. Osetljivost S. pyogenes na antibiotike .................................................................... 17 1.7.1. Makrolidi, linkozamidi i streptogramini (MLS grupa antibiotika) ............ 17 1.7.2. Rezistencija S. pyogenes na antibiotike MLS grupe .................................. 18 1.7.3. Tetraciklini ................................................................................................. 20 1.7.4. Rezistencija S. pyogenes na tetracikline..................................................... 20 1.7.5. Genska osnova rezistencije S. pyogenes na antibiotike MLS grupe i na tetracikline.................................................................................................. 21 1.8. Tipizacija S. pyogenes ............................................................................................ 22 1.8.1. M tipizacija................................................................................................. 23 1.8.2. T tipizacija.................................................................................................. 24 1.8.3. emm tipizacija............................................................................................. 24 1.8.4. MLST (engl. multilocus sequence typing, MLST) .................................... 25 1.8.5. RAPD (engl. randomly amplified polymorphic DNA, RAPD) tipizacija.. 26 1.8.6. PFGE (engl. pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)................................ 26 1.8.7. Fagotipizacija ............................................................................................. 27 1.9. Vakcina................................................................................................................... 27 1.10. Radna hipoteza ....................................................................................................... 28 2. Ciljevi istraživanja................................................................................................... 29 2.1. Odrediti prevalenciju rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes u Srbiji na makrolidne antibiotike............................................................................................ 29 2.2. Odrediti fenotipove i genotipove rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide ................................................................................................................ 29 2.3. Proceniti učestalost rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na tetracikline i odrediti gene koji determinišu rezistenciju na tetracikline..................................... 29 2.4. Odrediti distribuciju emm tipova faringealnih izolata S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike i ispitati njihovu povezanost sa fenotipovima i genotipovima rezistencije na makrolide ................................................................. 29 2.5. Odrediti MLST i RAPD profile sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike i ispitati njihovu klonsku povezanost i klonsku distribuciju ................ 29 2.6. Ispitati osetljivost sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike na druge klase antimikrobnih agenasa......................................................................... 29 3. Materijal i metode ................................................................................................... 30 3.1. Bakterijski sojevi .................................................................................................... 30 3.1.1. Identifikacija i konzervisanje sojeva .......................................................... 30 3.2. Test osetljivosti na antibiotike................................................................................ 31 3.2.1. Disk difuzioni metod antibiograma............................................................ 31 3.2.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije ..................................... 32 3.3. Fenotipovi rezistencije na makrolide...................................................................... 32 3.4. Detekcija gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetraciklinske................. 34 3.4.1. Izolacija DNK ............................................................................................ 34 3.4.2. Kvantitacija DNK (merenje prinosa DNK)................................................ 35 3.4.3. Prajmeri korišćeni za umnožavanje gena koji kodiraju rezistenciju S. pyogenes na makrolidne antibiotike i tetracikline...................................... 35 3.4.4. Reakcija lančanog umnožavanja gena koji kodiraju rezistenciju S. pyogenes na makrolidne antibiotike i tetracikline...................................................... 36 3.4.5. Elektroforeza u agaroznom gelu ................................................................ 37 3.4.6. Vizualizacija PCR produkata ..................................................................... 38 3.5. emm tipizacija sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike ............ 38 3.5.1. Umnožavanje emm gena metodom PCR.................................................... 38 3.5.2. Prečišćavanje PCR produkta ...................................................................... 40 3.5.3. Reakcija cikličnog sekvenciranja ............................................................... 40 3.5.4. Precipitacija produkta cikličnog sekvenciranja izopropanolom................. 41 3.5.5. Denaturacija ............................................................................................... 42 3.5.6. Kapilarna elektroforeza .............................................................................. 42 3.5.7. Određivanje emm tipa, odnosno emm podtipa MRGAS sojeva ................. 42 3.6. MLST (engl. multilocus sequence typing) ............................................................. 43 3.6.1. Umnožavanje sedam visoko konzerviranih gena MRGAS sojeva metodom PCR ........................................................................................................ 43 3.6.2. Prečišćavanje PCR produkta ...................................................................... 44 3.6.3. Reakcija cikličnog sekvenciranja ............................................................... 44 3.6.4. Precipitacija i denaturacija produkta cikličnog sekvenciranja izopropanolom............................................................................................ 45 3.6.5. Kapilarna elektroforeza .............................................................................. 45 3.6.6. Određivanje tipa sekvence ......................................................................... 45 3.7. RAPD tipizacija...................................................................................................... 46 3.7.1. Nasumično umnožavanje fragmenata DNK............................................... 46 3.7.2. Vizualizacija RAPD produkata .................................................................. 46 3.8. Statistička obrada rezultata..................................................................................... 48 4. Rezultati.................................................................................................................... 49 4.1. Učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolidne antibiotike u Srbiji.... 49 4.2. Fenotipovi i genotipovi rezistencije na makrolide sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji ....................................................................................................................... 49 4.3. Osetljivost MRGAS sojeva na tetracikline i zastupljenost gena koji kodiraju rezistenciju na tetracikline ...................................................................................... 54 4.4. Distribucija emm tipova izolata GAS rezistentnih na makrolidne antibiotike ....... 56 4.5. Povezanost emm tipova i genotipova/fenotipova rezistencije na makrolide .......... 58 4.6. Povezanost emm tipova i gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline kod sojeva MRGAS rezistentnih na tetracikline .................................................... 60 4.7. Tipizacija MRGAS sojeva MLST metodom.......................................................... 61 4.8. Tipizacija sojeva RAPD metodom ......................................................................... 64 4.9. Poređenje diskriminativne moći RAPD i MLST metoda tipizacije ....................... 67 4.10. Klonska povezanost i klonska distribucija sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike............................................................................................ 67 4.11. Osetljivost MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji na druge klase antimikrobnih agenasa.................................................................................................................... 67 5. Diskusija ................................................................................................................... 68 5.1. Učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolidne antibiotike u Srbiji.... 68 5.2. Fenotipovi i genotipovi rezistencije sojeva S. pyogenes na makrolide .................. 72 5.3. Osetljivost MRGAS sojeva na tetracikline i zastupljenost tetO i tetM gena.......... 75 5.4. Distribucija emm tipova kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji.......................... 77 5.5. Udruženost pojedinih emm tipova i gena rezistencije na makrolide i tetracikline kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji ................................................................. 80 5.6. MLST genotipizacija .............................................................................................. 81 5.7. RAPD genotipizacija .............................................................................................. 84 5.8. emm, RAPD i MLST metode genotipizacije sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji. 85 5.9. Klonska veza između sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji .................................... 86 5.10. Osetljivost izolata MRGAS na druge antibakterijske agense................................. 87 5.11. Nadzor nad streptokoknim infekcijama.................................................................. 88 6. Zaključci ................................................................................................................... 90 7. Reference .................................................................................................................. 91 8. Skraćenice .............................................................................................................. 108 1. Uvod 11. Uvod Bakterije roda Streptococcus pripadaju familiji Streptococcaceae. Fakultativno su anaerobne, nepokretne i asporogene. Streptokoke su fermentativne, katalaza negativne Gram pozitivne koke, prečnika od 0,5-1μm. Raspoređuju se u kraćim ili dužim lancima ili u parovima, što je posledica paralelnih deobnih ravni i zakasnelog razdvajanja bakterijskih ćelija nakon deobe. Za kultivisanje zahtevaju obogaćene hranljive podloge. 1.1. Istorijat Hipokrat (Hippocrates), ”otac medicine”, je još u 4. v. p. n. e. opisao kliničke manifestacije streptokoknih infekcija. Aleksandar Gordon (Alexander Gordon) je 1795. godine sugerisao da je etiološki agens puerperalne groznice mikroorganizam sferičnog oblika (Denny, 2000.). Naziv roda Streptococcus je prvi upotrebio bečki hirurg Teodor Bilrot (Teodor Billroth) 1877. godine, iskoristivši grčke reči streptos za lanac i kokhos za zrno (Denny, 2000). Veruje se da je Fehleisen prvi izolovao streptokok, odnosno koke raspoređene u lancima 1883. godine, premda se u literaturi najčešće navodi da je prvu izolaciju obavio Luj Paster (Louis Pasteur) iz krvi pacijentkinje sa puerperalnom sepsom. Rozenbah (Rosenbach) je zaslužan za naziv vrste S. pyogenes. Streptokoke su ubzo dovedene u vezu sa brojnim infekcijama kao što su faringitis, šarlah, pneumonija, erizipel i impetigo. Početkom 20. v. Hugo Šotmiler (Hugo Schottmueller) i Braun (J. H. Brown) su izvršili podelu streptokoka na osnovu tipa hemolize, a tridesetih godina 20. v. Rebeka Lensfild (Rebecca Lancefield) je izvršila klasifikaciju β hemolitičkih streptokoka i opisala M protein, na osnovu koga će kasnije biti izvršena serotipizacija S. pyogenes. 21.2. Klasifikacija bakterija roda Streptococcus U nekim od najranijih klasifikacija streptokoka, ime bakterijske vrste je sadržalo i ime bolesti koju bakterija izaziva. Takav sistem klasifikacije je unosio brojne zabune, pa je vremenom sistematizacija unapređivana. Danas se najčešće koriste sledeće klasifikacije bakterija roda Streptococcus: prema tipu hemolize, podela na osnovu antigenskih osobina i kombinovana podela prema Šermanu (Sherman). 1.2.1. Podela streptokoka na osnovu tipa hemolize Šotmiler je izvršio prvu klasifikaciju streptokoka (Shottmuller, 1903). On je na osnovu tipa hemolize na krvnom agaru podelio streptokoke u tri kategorije: 1. alfa (α) hemolitične streptokoke, koje nepotpuno razgrađuju hemoglobin do biliverdina i na krvnom agaru stvaraju zelenu zonu hemolize oko kolonija, 2. beta (β) hemolitične streptokoke, koje potpuno razgrađuju hemoglobin do bilirubina, stvarajući prozračno-žutu zonu hemolize oko kolonija i 3. gama (γ) hemolitične streptokoke ili nehemolitične streptokoke. 1.2.2. Podela β hemolitičnih streptokoka prema grupno specifičnom antigenu Rebeka Lensfild je 1928. godine identifikovala grupno specifičan ugljeno- hidratni antigen, koji ulazi u sastav ćelijskog zida beta hemolitičkih streptokoka (Lancefield, 1933). Na osnovu građe polisaharida C, koji se sastoji iz N-acetil- glukozamina vezanog za polimer ramnoze, Lensfildova je beta hemolitične streptokoke (BHS) podelila na grupe, označene slovima - A, B, C, G i F. Kod grupe D streptokoka, nema polisaharida C, već je lipoteihoinska kiselina grupno specifični antigen. Do danas je definisano više od 20 grupa beta hemolitičnih streptokoka obeleženih slovima od A do V. 31.2.3. Podela streptokoka prema Šermanu Šerman je 1937. godine podelio streptokoke na četiri kategorije prema tipu hemolize, grupno specifičnom polisaharidu ćelijskog zida i fenotipskim karakteristikama na piogene, viridans, laktične i enterokoke (Sherman, 1937). Laktične koke i enterokoke su kasnije izdvojene u zasebne rodove Lactococcus i Enterococcus. 1.3. Streptococcus pyogenes (grupa A streptokoka) Streptococcus pyogenes je striktno patogeni, β hemolitički streptokok, koji pripada grupi A streptokoka po Lensfildovoj (engl. group A streptococci, GAS). Za razliku od ostalih β hemolitičkih streptokoka, GAS je osetljiv na bacitracin, pa se ova osobina koristi u diferencijaciji S. pyogenes od ostalih BHS. 1.4. Faktori virulencije grupe A streptokoka Svoj patogeni potencijal S. pyogenes ostvaruje posredstvom brojnih faktora virulencije. Oni učestvuju u procesima adhezije i kolonizacije, izbegavanju imunskog odgovora, ćelijskoj internalizaciji (LaPenta i sar., 1994), invaziji tkiva domaćina i produkciji toksina. Faktori virulencije se dele na somatske i ekstracelularne. 1.4.1. Somatski faktori virulencije Somatski faktori virulencije su eksprimirani na površini bakterijske ćelije. Najznačajniji su M protein, kapsula, teihoinske kiseline, fimbrije i drugi adhezioni molekuli. 41.4.1.1. M protein M protein je spoljašnji protein grupe A streptokoka i glavni faktor virulencije. Ime je dobio po mukoidnom izgledu kolonija inkapsuliranih sojeva, koji je Lensfildova inicijalno dovela u vezu sa M proteinom. Ovaj molekul je uključen u različite stadijume patogeneze streptokoknih bolesti, kao što su adhezija, internalizacija, izbegavanje imunskog odgovora i invazija. Deluje antifagocitno u odsustvu tipski specifičnih opsonizujućih antitela i time inhibira glavni odbrambeni mehanizam domaćina i obezbeđuje preživljavanje. Sprečava opsonizaciju, vezivanjem faktora H, faktora sličnom faktoru H, C4b-vezujućeg proteina, fibrinogena i drugih molekula koji preveniraju aktivaciju komplementa alternativnim putem (Bisno i sar., 2003). U mnogim studijama je dokazano da sojevi grupe A streptokoka bez M proteina bivaju uspešno opsonizovani i fagocitovani od strane polimorfonukleara (Bisno i sar., 2003; Peterson i sar., 1979). Utvrđeno je da i M protein može aktivirati koagulaciju i trombozu, a neki tipovi ovog proteina vezuju plazminogen, čime dovode do aktivacije plazmina i povećane fibrinolize, a samim tim i lakšeg širenja bakterija kroz tkiva. M protein reaguje sa leukocitima i monocitima, preko Toll-like receptora, te indukuje oslobađanje proinflamatornih citokina (IL-1, IL-6) i faktora nekroze tumora (engl. Tumor Necrosis Factor, TNFα), čime podstiče zapaljensku reakciju. (Metzgar i Zampolli, 2011). Ima značajnu ulogu i u adherenciji za epitel domaćina. Dokazano je da sojevi GAS sa M proteinom uspešnije adherišu za epitelne ćelije ždrela (Tylewska i sar., 1981). Opisan je i ćelijski receptor, CD46 na keratinocitima, za koji se S. pyogenes vezuje pomoću C ponavljajućeg segmenta M proteina (Okada i sar., 1995). Vezivanjem za laminin i fibronektin pokreću se različiti mehanizmi odgovorni za invaziju eukariotskih ćelija preko integrina (Cue i sar., 1998). M protein se sastoji od dva polipeptidna lanca, građena od ponavljajućih segmenata, koji su podeljeni u regione A, B, C i D. Region D se nalazi na visoko konzerviranom C terminalnom kraju, kojim je M protein vezan za ćelijsku membranu. Region A se nalazi na hipervarijabilnom N terminalnom kraju, koji je slobodan, formira fibrile i odgovoran je za serotipsku specifičnost. Iako su građa i veličina ovog homodimernog proteina različiti među sojevima GAS, osnovna građa M proteina je zajednička. Antitela na M protein su protektivna i tipski specifična. Alfa heliks M 5proteina umnogome podseća na građu pojedinih proteina u ljudskom organizmu, kao što je npr. miozin. Antitela specifična za pojedine tipove M proteina se kod predisponiranih osoba sa određenim antigenima klase II HLA kompleksa, ponašaju kao autoantitela, koja unakrsno reaguju sa proteinima srčanog mišića i drugih tkiva, čime se objašnjava patogeneza akutne reumatske groznice. Iako se za tipizaciju S. pyogenes koriste brojne procedure i različiti markeri, klasifikacija grupe A strepotokoka na osnovu razlika u građi hipervarijabilnog segmenta M proteina je ostala i dalje dominantna metoda. Pređašnja tehnika klasične serotipizacije, koja se bazirala na reakciji precipitacije sa specifičnim antitelima, je u potpunosti zamenjena novom metodom – sekvenciranjem emm gena koji kodira sintezu M proteina. GAS poseduje i grupu proteina, koji su strukturno slični M proteinu i nazivaju se proteini slični M proteinu (engl. M like proteins). Oni predstavljaju faktore virulencije, koji takođe imaju antifagocitnu ulogu. Njihova uloga u patogenezi infekcija se zasniva na sposobnosti da reaguju sa brojnim molekulima, kao što su plazminogen, albumin i fibrinogen (Frithzisar., 1989; Gomi i sar., 1990). Kodirani su genima koji pripadaju emm superfamliji: enn, mrp, fcrA, arp, protH i drugim. 6Slika 1: Struktura M proteina (preuzeto i modifikovano iz Fischetti, 2006) emm gen pripada superfamiliji emm gena, u čijem klasteru se nalazi više od 20 različitih gena (fcrA, mrp, emmL, sir, arp, enn, sph i drugi). Oni kodiraju površinske proteine sa antifagocitnim dejstvom, odnosno M protein i proteine slične M proteinu, kao i imunoglobulin vezujuće proteine (IgG i IgA vezujuće proteine). Postoji visok stepen homologije između gena unutar emm superfamilije, kao i njihovih produkata. Postoje četiri glavne subfamilije emm gena (SF1, SF2, SF3 i SF4). Međusobno se razlikuju po redosledu nukleotida na 3’ kraju, koji kodira konzervirani peptidoglikan- vezujući deo, odnosno karboksilni kraj M proteina. Na osnovu rasporeda gena emm subfamilije u hromozomu, identifikovano je pet glavnih emm profila, obeleženih slovima A, B, C, D, E. Navedeni hromozomski obrazci se međusobno razlikuju po broju i kombinacijama pojedinih emm subfamilija. 7emm obrazci A-C su najčešće uzročnici faringitisa, dok je obrazac D obično udružen sa impetigom (Dicuonzo i sar., 2001). Dakle, emm obrazac bi mogao da služi kao genotipski marker tkivnog afiniteta sojeva S. pyogenes. Svaki soj GAS ima 1, 2 ili 3 različita emm gena. Ukoliko soj ima tri emm gena, centralni emm lokus određuje pripadnost M/emm tipu. Slika 2: Obrazci M proteina: A, B, C, D i E (preuzeto i modifikovano iz Smeesters i sar., 2010) 1.4.1.2. Fibronektin vezujući proteini Fibronektin je glikoprotein koji se nalazi u pojedinim telesnim tečnostima i u ekstracelularnom matriksu. Prisutan je i na epitelnim ćelijama i ima ulogu receptora za vezivanje bakterija. Adhezioni molekuli streptokoka, koji imaju sposobnost visoko 8specifičnog ireverzibilnog vezivanja za fibronektin zovu se fibronektin vezujući proteini (Speziale i sar., 1984). Preko njihovog C terminalnog ponavljajućeg regiona streptokok adheriše za fibronektin. Kod grupe A streptokoka ulogu fibronektin vezujućih proteina ima: familija M proteina; lipoteihoinska kiselina, koja je glavni nosilac hidrofobnosti streptokoka; protein prtF1 ili SfbI (engl. streptococcal fibronectin binding protein I, SfbI) (Talay i sar., 1992); protein prtF2; fibronektin vezujući protein 54 (engl. fibronectin binding protein 54, FBP54) i serumski faktor zamućenja (engl. serum opacity factor, SOF). SOF ili SfbII protein se vezuje za fibronektin, fibrinogen i apolipoprotein AI (apoAI). Ovaj protein delimično razgrađuje lipoproteine i indukuje njihovu agregaciju, što dovodi do zamućenja seruma sisara, po čemu je i dobio naziv. Dokazano je da SfbI i SOF protein imaju značajnu ulogu i u intracelularnoj invaziji (Talay i sar., 2000). 1.4.1.3. Kapsula Kapsula grupe A streptokoka je građena od hijaluronske kiseline, odnosno polimera N-acetilglukozamina i glukuronske kiseline. Produkciju kapsule kodira operon koji se sastoji od hasA, hasB i hasC gena (Crater i Van de Rijn, 1995). Mukoidan izgled kolonija GAS potiče od voluminozne kapsule (Lancefield i Todd, 1928; Wilson, 1959). Sposobnost stvaranja kapsule se razlikuje među sojevima, ali je ustanovljeno da inkapsulirani sojevi poseduju veći patogeni potencijal (Stollerman i Dale, 2008). Hijaluronska kiselina kapsule grupe A streptokoka je strukturno veoma slična hijaluronatu koji ulazi u sastav vezivnog, epitelijalnog i nervnog tkiva čoveka. Iako je kapsula S. pyogenes slabo imunonogena, zbog sličnosti sa humanom hijaluronskom kiselinom, ona ima antifagocitno dejstvo i ulogu u adherenciji i invaziji (Cywes i Wessels, 2001). Jedan od opisanih receptora za hijaluronsku kiselinu je glikoproteinski receptor CD44, koji se nalazi na površini keratinocita (Schrager i sar., 1998). Kapsula S. pyogenes je, za razliku od većine drugih polisaharidnih kapsula, antigenski homogena, odnosno nema antigenskih varijabilnosti. 91.4.1.4. C5a peptidaza C5a peptidaza je proteolitički enzim, odnosno endopeptidaza, koja se nalazi u ćelijskom zidu streptokoka grupe A. Ona inhibiše hemotaksu polimorfonukleara (PMNL) na mesto infekcije, inaktivacijom C5a komponente komplementa (Cleary i sar., 1992). 1.4.2. Ekstracelularni faktori virulencije Najznačajniji ekstracelularni faktori virulencije streptokoka grupe A su streptokokni hemolizini - streptolizin S (SLS) i streptolizin O (SLO), kao i streptokokni pirogeni egzotoksini (Spe). Cistein proteaza (SpeB), kolagenaza, streptokinaza, DNaza, lipaza i hijaluronidaza predstavljaju ekstracelularne streptokokne enzime. 1.4.2.1. Streptolizin O i streptolizin S Streptolizini su citotoksini koji citolitičnu aktivnost ostvaruju formiranjem transmembranskih pora na različitim eukariotskim ćelijama, poput eritrocita, leukocita, trombocita, ali i na nekim subcelularnim membranskim strukturama, kao što su lizozomi i mitohondrije (Bisno i sar., 2003). Stvorene pore olakšavaju ulazak drugih bakterijskih toksina u eukariotsku ćeliju (Madden i sar., 2001). Retki su sojevi S. pyogenes koji ne produkuju ove toksine. Streptolizin O (SLO) je kiseonik labilan, što znači da svoju funkciju ostvaruje vezivanjem za holesterol, samo u anaerobnim uslovima, dok se u aerobnim uslovima reverzibilno inaktiviše. Gen slo, koji pripada hromozomskoj DNK, kodira ovaj citotoksin. SLO je veoma imunogen, pa se anti streptolizin O antitela koriste u serološkoj dijagnostici post-streptokoknih sekvela. Streptolizin S (SLS) je slabo imunogen, termolabilan i kiseonik stabilan. Kodira ga sagA gen. SLS je odgovoran za pojavu beta hemolize oko kolonija S. pyogenes, na krvnom agaru, inkubiranom u aerobnim uslovima. 10 1.4.2.2. Streptokokni pirogeni egzotoksini/superantigeni S. pyogenes produkuje 11 različitih, strukturno sličnih streptokoknih pirogenih egzotoksina (Spe): SpeA, SpeC, SpeF ili mitogeni faktor, SpeG, SpeH, SpeJ, SpeK, SpeL, streptokokni superantigen (SSA), streptokokni mitogeni egzoprotein Z (SMEZ) i SMEZ2. (Proft i sar., 1999). Postoje četiri alelske varijante SpeA toksina, označene brojevima od 1 do 4 (Nelson i sar., 1991). Spe su poznati i kao streptokokni superantigeni (SA), a nekad su se nazivali i eritrogeni toksini. Spe ne moraju biti obrađeni od strane antigen-prezentujućih ćelija (APC) i prezentovani limfocitima u okviru molekula druge klase glavnog kompleksa histokompatibilnosti (engl. major histocompatibility complex, MHC II). Za razliku od uobičajenih antigena, oni se bez prethodne obrade vezuju za varijabilni beta lanac (Vβ) T ćelijskog receptora (TCR) i za MHC molekul II klase, koji su eksprimirani na profesionalnim APC, kao što su B limfociti, monociti i dendritične ćelije (Kotb, 1995). Premošćavanjem T limfocita i APC, Spe mitogeni pokreću signalne puteve, koji dovode do nespecifične, masivne, poliklonske T ćelijske proliferacije, pri čemu aktiviraju čak do 20% klonova T limfocita. Jedan Spe može aktivirati sve T limfocite koji u TCR eksprimiraju Vβ lanac određene familije. Posledično, dolazi do prekomerne sekrecije proinflamatornih citokina (IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-6) (Bisno i sar., 2003). Bakteriofagi su nosioci gena za SpeA, SpeC i SpeH, ali i većine drugih Spe, pa ih sintetišu samo lizogeni sojevi GAS. Za razliku od njih, geni koji kodiraju SpeF, SpeG i SpeJ nalaze se na hromozomskim genima. Spe su odgovorni za patogenezu i manifestacije pojedinih teških streptokoknih bolesti kao što su šarlah, streptokokni toksični šok sindrom (STŠS) i reumatska groznica, pre svega indukcijom snažnog imunskog odgovora. Prekomerna sekrecija proinflamatornih citokina ima značajniju ulogu u razvoju stanja šoka i multiorganske disfunkcije, nego T ćelijska proliferacija (Cunningham, 2000). Razlike u kliničkoj slici pomenutih bolesti, objašnjavaju se individualnim razlikama u odgovoru organizma na superantigene. 11 1.4.2.3. Ostali streptokokni toksini Streptokinaze su značajni faktori virulencije, koji omogućavaju širenje streptokokne infekcije. Konverzijom plazminogena u plazmin dolazi do razlaganja fibrinskih niti i koaguluma. Neke studije su pokazale da streptokinaza može da aktivira samo humani plazminogen (Sun i sar., 2004). Streptokinaze se koriste u terapiji infarkta miokarda. Hijaluronidaza razgrađuje ekstracelularni matriks vezivnog tkiva i na taj način doprinosi širenju infekcije, te predstavlja faktor invazivnosti. DNA-ze A, B, C i D doprinose izbegavanju imunskog odgovora, odnosno izbegavanju destrukcije streptokoka od strane polimorfonuklearnih leukocita. Kodirane su od strane bakteriofaga. Streptokokni pirogeni egzotoksin B (SpeB) je cistein proteaza koja, iako nije superantigen, doprinosi izbegavanju imunskog odgovora i širenju infekcije (Lukomski i sar., 1999). Ovaj toksin razlaže brojne površinske proteine streptokoka, ali i humane proteine. Razgradnjom fibrinogen vezujućih proteina, odvaja streptokok od ćelija, ali i iseca receptor za opsonizujuća antitela, streptokokni IgG vezujući protein i druge molekule. 1.5. Patogeneza streptokoknih infekcija Inicijalni korak u patogenezi streptokoknih infekcija je adherencija. Da bi uspostavio kolonizaciju, GAS ima brojne mehanizme kojima izbegava dejstvo mehanizama imunskog odgovora domaćina. Za širenje infekcije odgovorni su faktori invazivnosti, a rekurentne infekcije i kliconoštvo se jednim delom mogu objasniti i internalizacijom bakterije. 12 1.5.1. Adherencija i kolonizacija Interakcija između patogena i domaćina počinje vezivanjem površinskih streptokoknih liganada za receptore na površini ćelija. Čvrsta adherencija streptokoka, umnožavanje i kolonizacija faringealnih i epidermalnih epitelnih ćelija onemogućava uklanjanje bakterija odbrambenim mehanizmima domaćina, kao što su spiranje pljuvačkom ili eksfolijacija (Cunningham, 2000). Adhezini se dele na polisaharidne (kapsula, lipoteihoinska kiselina) i proteinske (fimbrijalni i nefimbrijalni). Dosada je opisano najmanje 17 različitih streptokoknih adhezina (Bisno, 2003), od kojih su najbolje proučeni M protein, LTA, protein F/SfbI, FBP29 (Courtney,i sar., 1992), gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, galaktoza vezujući protein, vitronektin vezujući protein (Valentin-Weigand i sar., 1988), kolagen vezujući protein (engl. streptococcal collagen-like surface protein, Scl) (Visai i sar., 1995), SOF (Kreikmeyer i sar., 1995), FBP54 (Courtney i sar., 1994) i kapsula. Oni se vezuju za različite ekstracelularne molekule, ali i za integralne površinske ćelijske receptore: fibronektin, fibrinogen, kolagen, vitronektin, CD44, CD46. M protein je prvi opisan adhezioni molekul (Ellen i Gibbons, 1972). On prvenstveno ima ulogu u adherenciji za keratinocite, vezivanjem za molekul CD46. Svega nekoliko godina kasnije, opisan je još jedan adhezin, lipoteihoinska kiselina, koja je značajna u adherenciji za bukalnu sluznicu i najvećim delom je odgovorna za adherenciju streptokoka (Beachey i Ofek, 1976). 1.5.2. Intracelularna invazija Poslednjih godina brojni autori potvrđuju da streptokok grupe A pored adherencije za epitelne ćelije ima sposobnost i intracelularne invazije (LaPenta i sar., 1994). Utvrđeno je da stepen invazije zavisi od ekspresije M proteina i SfbI proteina, zbog čega se oni smatraju i invazinima. Visok stepen internalizacije uočen je kod serotipa M1 (Dombek i sar., 1999), koji se često povezuje sa invazivnim infekcijama. Tokom intracelularne invazije GAS dolazi do rearanžmana ćelijskog citoskeleta. Internalizacija delimično objašnjava terapijske neuspehe streptokoknih faringitisa, ali i dugotrajnu perzistenciju bakterija u guši pacijenata, odnosno kliconoštvo. 13 1.6. Infekcije izazvane streptokokom grupe A GAS se smatra humanim patogenom (Stevens, 2000). Rezervoar je bolesnik ili kliconoša. Ova bakterija se najčešće prenosi kapljičnim putem, a moguć je i direktni prenos, neposrednim kontaktom sa inficiranom ranom ili promenom na koži. S. pyogenes izaziva širok spektar infekcija. Od neinvazivnih piogenih infekcija, poput tonzilofaringitisa, do životno ugrožavajućih invazivnih gnojnih oboljenja, toksemičnih bolesti i post-streptokoknih sekvela. Ova bakterija najčešće izaziva neinvazivne bolesti respiratornog trakta, kože i mekih tkiva, ali visoko virulentni sojevi mogu dovesti do celulitisa, nekrotizirajućeg fascitisa (NF), sepse i streptokoknog toksičnog šok sindroma (STŠS). Prema rezultatima multicentričnih studija, procenjuje se da svake godine, širom sveta, više od 700 miliona ljudi oboli od infekcija izazvanih grupom A streptokoka, a više od 500 000 ljudi umre (Carapetis i sar., 2005). U razvijenim zemljama svake godine samo od faringitisa oboli oko 15% školske dece (Carapetis i sar., 2005). Streptokokno kliconoštvo je prilično često, posebno u zimskim mesecima, kod dece. Smatra se da je u zemljama sa umerenom klimom, 5-15% odraslih i čak do 30% dece asimptomatski kolonizovano ovom bakterijom (Kaplan, 1980). 1.6.1. Tonzilofaringitis (Tonsylopharyngitis) S. pyogenes je najčešći bakterijski uzročnik akutnih tonzilofaringitisa (Bisno, 1995). Javlja se obično kod dece školskog uzrasta. GAS izaziva 15-30% akutnih faringitisa (streptokoknih angina) kod dece uzrasta od 5-15 godina i oko 10% kod odraslih pacijenata (Pandey i sar., 2009). Bolest ima sezonski karakter i češće se javlja tokom jesenjih i zimskih meseci (Bisno, 2001; Stollerman, 1975). Tipični faringealni serotipovi su M1, M3, M5, M6, M14, M18, M19 i M24. Ipak, uočena je geografska i vremenska promenljivost distribucije serotipova (Cunningham, 2000). Iako streptokokni faringitis uglavnom spontano prolazi, terapija antibioticima, se preporučuje zbog mogućih komplikacija. 14 1.6.2. Streptokokni impetigo (Impetigo streptococcica) Impetigo je površna, lokalizovana, visoko kontagiozna, gnojna infekcija kože. Češće se javlja u dečijem uzrastu, od 2. do 5. godine života. Ima sezonski karakter, te je zastupljenija u letnjim mesecima i u predelima sa visokom temperaturom i vlagom (Chin, 2000). Kao komplikacija može nastati akutni glomerulonefritis, ukoliko je impetigo izazvan tzv. nefritogenim serotipovima, najčešće M49 (Bisno, 1995). 1.6.3. Erizipel (Erysipelas) i celulitis (Celullitis) Erizipel je akutna, lokalizovana infekcija epiderma i derma, sa izraženim limfedemom. Javlja se na licu u 85% slučajeva. Iako je bio relativno čest u 19. veku, danas je retka bolest, najčešće prisutna kod dece i starijih osoba, kod kojih postoji sklonost ponavljanju bolesti (Chin, 2000). Celulitis je akutno inflamatorno oboljenje derma i hipoderma. Može se komplikovati nekrotizirajućim fascitisom, miozitisom i sepsom, a u nekim okolnostima progredira u rekurentnu infekciju kože i potkožnog tkiva. 1.6.4. Nekrotizirajući fascitis (Fasciitis necroticans) Nekrotizirajući fascitis (NF) ili streptokokna gangrena je progresivna infekcija dubokih struktura potkožnog tkiva, fascija i masnog tkiva. U 50% slučajeva, infekcija može da zahvati mišićno tkivo, kada nastaje streptokokni miozitis (Stevens, 2000). Rizična subpopulacija za razvoj NF su pacijenti sa dijabetesom, malignim oboljenjima, gojazne i starije osobe. Bolest se razvija veoma brzo, a sepsa i cirkulatorni šok su komplikacije koje ugrožavaju život pacijenta. Bez adekvatne terapije, stopa smrtnosti od NF iznosi od 20-50%, a kod slučajeva koji se komplikuju miozitisom, čak i 100% (Stevens, 2000). 15 1.6.5. Šarlah (Scarlatina) Šarlah ili crvenka je toksemično oboljenje, uzrokovano sojevima S. pyogenes koji produkuju Spe. Incidencija šarlaha je u opadanju, ali je u preantibiotskoj eri bila vrlo visoka, sa mortalitetom od oko 20%. Najčešće nastaje kao komplikacija streptokokne angine, pa se poput nje, obično javlja kod dece školskog uzrasta, tokom jesenjih i zimskih meseci. 1.6.6. Streptokokni toksični šok sindrom (STŠS) Streptokokni toksični šok sindrom (STŠS) je progresivno, toksinom posredovano, multisistemsko oboljenje, koje nastaje kao posledica komplikacije streptokokne infekcije, obično nekrotizirajućeg fascitisa. U patogenezi STŠS su najznačajniji Spe. Klinički kriterijumi za dijagnozu STŠS, koje propisuje Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (engl. Centers for Disease Control and Prevention, CDC) su telesna temparatura ≥38.9°C, raš, hipotenzija i disfunkcija tri ili više organska sistema (CDC, 2014). Više od polovine pacijenata sa STŠS ima smrtni ishod (McCormick i sar., 2001; Davies i sar., 1996). Najčešći streptokokni tipovi koji uzrokuju STŠS su M1, M3, M12 i M28 (Stevens, 1992; Johnson i sar., 1992). U terapiji se koristi klindamicin, jer je uspešan supresor sinteze toksina i M proteina. 1.6.7. Post-streptokokne sekvele Post-streptokokne sekvele su imunopatološka stanja, koja nastaju kod 1-3% nelečenih ili neadekvatno lečenih pacijenata sa streptokoknim infekcijama i genetičkom predispozicijom. Kliničke manifestacije se javljaju 2-4 sedmice posle infekcije. Najčešće dijagnostikovane post-streptokokne sekvele su akutna rematska groznica i post-streptokokni glomerulonefritis. Pored toga, opisani su i post-streptokokni CNS sindrom (Sidenhajmova horea, PANDAS - engl. pediatrid autoimmune neuropsychiatric 16 disorders associated with streptococcus), post-streptokokni sistemski vaskulitis, post- streptokokne dermatološke manifestacije (Ivory i Folzenlogen, 2009). 1.6.7.1. Akutna reumatska groznica Akutna reumatska groznica (ARG) je sistemska inflamatorna bolest vezivnog tkiva, uzrokovana autoimunskom reakcijom na antigene BHS. Pretpostavlja se da je u osnovi patogeneze ove bolesti molekularna mimikrija između antigena streptokoka i pojedinih struktura u organizmu čoveka, te elementi humoralnog i ćelijskog imunskog odgovora, pokrenuti od strane GAS, unakrsno reaguju sa antigenima u tkivima i organima, kao što su srce, zglobovi, centralni nervni sistem, koža i potkožno tkivo. ARG se obično razvija 2 - 4 nedelje nakon streptokokne infekcije, i to najčešće nakon streptokoknog faringitisa. Najčešće obolevaju mlađe osobe, od 4. do 18. godine života. Bolest je znatno ređa u razvijenim zemljama, zbog pravovremene dijagnostike i adekvatnog lečenja streptokoknih infekcija. Pojedini tipovi GAS, kao što su M5, M14, M18 i M24 češće uzrokuju ARG (Markowitz, 1987) i stoga se nazivaju “reumatogeni tipovi”. 1.6.7.2. Akutni post-streptokokni glomerulonefritis Akutni post-streptokokni glomerulonefritis (APSGN) najčešće nastaje 1-4 nedelje nakon preležane streptokokne infekcije. Smatra se da je u osnovi APSGN deponovanje imunskih kompleksa na bazalnoj membrani glomerula, što dovodi do zapaljenske reakcije (Cronin i Lange, 1990). Nefritogeni serotipovi GAS koji izazivaju APSGN nakon streptokokne piodermije su M47, M49, M55, M2, M60 i M57, a nakon streptokokne upale guše, M1, M2, M4, M3, M25, M49 i M12. Poslednjih decenija uočen je pad incidencije ove bolesti širom sveta, posebno u razvijenim zemljama (Silva, 1998). 17 1.7. Osetljivost S. pyogenes na antibiotike Lek izbora za terapiju većine infekcija izazvanih streptokokom grupe A je i dalje penicilin. Uvođenje beta laktamskih antibiotika u terapijske protokole, dovelo je do značajnog smanjenja prevalencije streptokoknih infekcija, naročito početkom osamdesetih godina prošlog veka, u razvijenim zemljama. Rezistencija S. pyogenes na penicilin još uvek nije zabeležena in vitro. Ipak, lečenje penicilinom se pokazalo neuspešnim kod 5-20% osoba kod kojih je potvrđen streptokokni faringitis (Gatanaduy i sar., 1985; Huwe i sar., 1980; Brook, 1985). Neuspeh penicilinske terapije se objašnjava nedovoljnom koncentracijom leka u tkivu, intracelularnom lokalizacijom streptokoka, produkcijom beta laktamaza od strane kopatogena i nepridržavanjem režima primene leka od strane pacijenata (Brook, 2007). 1.7.1. Makrolidi, linkozamidi i streptogramini (MLS grupa antibiotika) Makrolidi, linkozamidi i streptogramini, pripadaju takozvanoj MLS grupi antibiotika. Iako hemijski nisu slični, sve tri klase lekova imaju isto vezno mesto i sličan mehanizam delovanja. Reverzibilno se vezuju za 23S ribozomalnu RNK (rRNK) u 50S podjedinici bakterijskog ribozoma, u blizini veznog mesta peptidil-transferaza. Kao posledica vezivanja MLS antibiotika dolazi do inhibicije faze translokacije tokom sinteze proteina, a samim tim i elongacije polipeptidnog lanca. Pored ometanja peptidil transferazne aktivnosti 23S rRNK, MLS antibiotici sprečavaju sklapanje 50S podjedinice ribozoma, čime dodatno prekidaju sintezu proteina. Najpoznatiji i najbolje proučen predstavnik makrolida je eritromicin, prirodni produkt aktinomicete Saccharopolyspora erythraea. Koristi se od 1952. godine. Hemijskom modifikacijom eritromicina, dobijeni su brojni derivati, koji su stabilniji, bolje penetriraju u ćelije i tkiva, bolje se apsorbuju, imaju manje neželjenih efekata i manje reaguju sa drugim lekovima. Prema broju C atoma u makrocikličnom prstenu, makrolidi se dele na 12-člane (metimicin), 14-člane (eritromicin i njegovi derivati roksitromicin, klaritromicin i diritromicin), 15-člane (azitromicin) i 16-člane (spiramicin, jozamicin, midekamicin i miokamicin). Od 14-članih makrolida su, 18 proizvedeni ketolidi. Oni se svojom keto grupom vezuju za dva vezna mesta na ribozomu, te im je aktivnost znatno veća u odnosu na klasične makrolide, a rezistencija sporije nastaje. Najznačajniji predstavnik ketolida je telitromicin. Prirodni linkozamid je linkomicin, od koga je izveden klindamicin. Linkomicin se danas retko koristi, zbog svoje toksičnosti, dok je klindamicin i dalje u upotrebi. Najčešće se primenjuje u terapiji STŠS i drugih toksemičnih streptokoknih oboljenja. Streptogramini predstavljaju mešavinu dva strukturno različita jedinjenja – streptogramina A i streptogramina B, koji deluju sinergistički. Vezivanje streptogramina A za 50S podjedinicu ribozoma dovodi do konformacionih promena ribozoma, koje olakšavaju vezivanje streptogramina B. Tip B streptogramina sprečava elonagaciju polipeptidnog lanca, te tako zaustavlja sintezu proteina. Najznačajnija je gotova kombinacija streptogramina B - kvinupristina (30%) i streptogramina A - dalfopristina (70%). 1.7.2. Rezistencija S. pyogenes na antibiotike MLS grupe Pojava rezistencije S. pyogenes na eritromicin je uočena još 1970. godine u Japanu. Tada je registrovana smanjena osetljivost na eritromicin kod čak 70% izolata GAS (Maruyama i sar., 1979), što je bila posledica intenzivnog korišćenja ovih antibiotika. Organizovano smanjenje upotrebe makrolida u Japanu je dovelo do izrazitog pada incidencije sojeva GAS rezistentnih na makrolide (engl. macrolide resistant group A streptococci, MRGAS) na 46%, 1981. godine, a potom na svega 3%, 1989. godine (Fujita i sar., 1994). Devedesetih godina prošlog veka sojevi S. pyogenes rezistentni na makrolide su se pojavili i u Finskoj i SAD (Seppala i sar., 1992; Martin i Green, 2002). U Finskoj je 1990. godine registrovana rezistencija na eritromicin kod 24% izolata GAS (Seppala i sar., 1992), dok je slična pojava uočena i u ostalim zemljama Evrope početkom 21. veka. Procentualna zastupljenost rezistencije GAS na makrolidne antibiotike u zemljama mediteranskog basena značajno je viša nego u zemljama severne Evrope. U Francuskoj je ona početkom dvehiljaditih godina iznosila 23%, a u Italiji 22% (Montagnani i sar., 2009). U istom periodu, u drugim delovima sveta, učestalost rezistencije S. pyogenes na makrolide je bila: 5,2% u SAD-u, 6,8% u 19 Turskoj, 14% u Južnoafričkoj republici (Green i sar., 2006; Colakoglu i sar., 2006; Liebowitz, 2003). Smatra se da su za pojavu MRGAS zaslužni nekritična upotreba makrolida, kao i širenje rezistentnih klonova (York i sar., 1999). Kod Gram pozitivnih bakterija, pa i streptokoka, postoje dva glavna mehanizma rezistencije na makrolide. Prvi je izmena ciljnog mesta vezivanja makrolida, odnosno enzimska metilacija adenina u 23S rRNK. Ovaj mehanizam rezistencije se manifestuje tzv. MLS fenotipom, odnosno ukrštenom rezistencijom na sve antibiotike koji pripadaju MLS grupi. Drugi je aktivno izbacivanje antibiotika iz ćelije – mehanizam efluksa. MLS rezistencija može biti inducibilna (iMLS) i konstitutivna (cMLS). Kod inducibilne rezistencije bakterija produkuje neaktivnu mRNK, koja kodira metilazu samo u prisustvu induktora - pojedinih makrolidnih antibiotika. U zavisnosti od toga koji su antibiotici induktori i koliki je nivo rezistencije na pojedine od njih, razlikuje se više iMLS subfenotipova (A, B i C). Oni se mogu razlikovati pomoću trostrukog disk difuzionog testa. Za razliku od M i cMLS fenotipa rezistencije na makrolide, koji pokazuju uniformni model rezistencije, sojevi GAS sa iMLS fenotipom pokazuju heterogenu rezistenciju na MLS antibiotike. iMLS-A sojevi su visoko rezistentni na 14-, 15- i 16-člane makrolide; iMLS-B sojevi su vrlo rezistentni na 14- i 15-člane, a osetljivi su na 16-člane makrolide bez indukcije. IMLS-C sojevi imaju niže nivoe rezistencije, odnosno osetljivi su na 14- i 15- i 16-člane makrolide pre indukcije i rezistentni su na iste antibiotike posle indukcije. Kod cMLS fenotipa rezistencije na makrolide, bakterija produkuje aktivnu metilazu, koja se neprekidno eksprimira. To je fenotip visokog nivoa rezistencije na sve MLS antibiotike. Iako se rezistencija na ketolide teže stiče, streptokok je poslednjih godina razvio rezistenciju i na ove antibiotike, mehanizmom dimetilacije 23s rRNK, odnosno izmenom oba vezna mesta za ketolide (Hansen i sar., 1999). Kod drugog mehanizma rezistencije GAS sintetiše transmembranski protein, koji formira tzv. “efluksnu pumpu”. Ona aktivnim transportom, uz utrošak energije, “ispumpava” antibiotik izvan bakterijske ćelije. Ovaj mehanizam rezistencije se odlikuje niskim ili srednjim stepenom rezistencije samo na 14- i 15-člane makrolide i predstavlja tzv. M fenotip rezistencije na makrolide. Nema rezistencije na 16-člane makrolide, klindamicin i streptogramin, čak ni posle indukcije. 20 Znatno ređe, uzrok rezistencije kod streptokoka mogu biti mutacije gena u 23S rRNK i promene ribozomalnih proteina L4 i L22. (Malbruny i sar., 2002). 1.7.3. Tetraciklini Tetraciklini su bakteriostatski antibiotici, sa širokim spektrom delovanja, koji se u velikoj meri koriste u humanoj, ali i veterinarskoj medicini. Prirodni tetraciklini su tetraciklin, hlortetraciklin, a polusintetski doksiciklin i minociklin. Poslednjih godina je iz tetraciklina izvedena nova grupa lekova – gliciklini, koji deluju i na sojeve bakterija koje su rezistentne na tetracikline. Ovi antibiotici se vezuju za 16S rRNK 30S subjedinice ribozoma i onemogućavaju vezivanje aminoacil-tRNK za ribozom, odnosno ugradnju novih aminokiselina u polipeptidni lanac (Schnappinger i Hillen, 1996). Time sprečavaju sintezu proteina u bakterijskoj ćeliji. 1.7.4. Rezistencija S. pyogenes na tetracikline Tetraciklini se ne koriste za lečenje streptokoknih infekcija, ali se, zbog česte kombinovane rezistencije GAS na makrolide i tetrackline, prati osetljivost sojeva S. pyogenes i na ove antibiotike. Izučavanje sojeva GAS rezistentnih na tetracikline (engl. tetracycline resistant GAS, TRGAS) ima pre svega, epidemiološki značaj. Rezistencija S. pyogenes na tetracikline nastaje na dva načina: putem efluksa antibiotika i izmenom ribozoma, odnosno ciljnog mesta delovanja tetraciklina. Opisani su brojni efluks proteini, označeni slovima (tetK, tetL), koji, u energetski zavisnom procesu, izbacuju antibiotik iz ćelije. Kod drugog mehanizma rezistencije na tetracikline, bakterija stvara proteine koji vrše tzv. “zaštitu“ ribozoma (engl. ribosomal protection proteins, RPPs). Konformacijskom promenom veznog mesta na ribozomu tetO proteinom, izostaje vezivanje tetraciklina ili dolazi do odvajanja prethodno već vezanog tetraciklina za ribozome tetM proteinom.. 21 Kod bakterija koje razvijaju rezistenciju izmenom ribozoma, nastaje viši nivo rezistencije na veći broj različitih tetraciklina, u odnosu na one sa mehanizmom efluksa. 1.7.5. Genska osnova rezistencije S. pyogenes na antibiotike MLS grupe i na tetracikline Rezistencija S. pyogenes na makrolidne antibiotike je kodirana genima mefA, ermA i ermB. Protein aktivnog efluksa makrolida (mefA) kodira mefA gen. erm geni kodiraju proteine (rRNA metilaza) koji dovode do izmena ribozoma. Ima ih više, a razlikuju se po regulaciji ekpresije fenotipa rezistencije na makrolide. CMLS i iMLS-A fenotip su obično determinisani ermB genom, a iMLS-B i iMLS-C fenotipovi obično ermA genom. Moguće je, takođe, da neki sojevi MLS fenotipa pored erm gena imaju i efluks pumpu, kodiranu mefA genom. Geni koji determinišu rezistenciju na makrolide se najčešće prenose putem plazmida (Horaud i sar., 1985). Geni koji determinišu proteine koji učestvuju u protekciji ribozoma od dejstva tetraciklina su tetM i tetO, dok efluksnu pumpu kodiraju tetK i tetL. Geni koji kodiraju rezistencije na makrolide i tetracikline se kod streptokoka najčešće nalaze na konjugativnim i nekonjugativnim transpozonima. Oni su obično smešteni na hromozomu, iako se mogu naći i na plazmidima. Transpozoni, pored erm gena često sadrže i gene koji kodiraju rezistenciju na druge antibiotike, obično tetracikline. Tako se ermB gen udružen sa tetM genom obično prenosi konjugativnim transferom, između bakterija istih ili različitih vrsta. Mobilni genski elementi odgovorni za transfer ovih gena kod grupe A streptokoka su Tn6002 i Tn3872 (Clewell i sar., 1995; Rice, 1998). Navedeni transpozoni nastaju insercijom DNK koja sadrži ermB gen u konjugativne transpozone Tn916 familije. Sojevi koji imaju ermB i tetM gen su češće rezistentni na tetraciklin, ali mogu biti i osetljivi (Amezaga i sar., 2002; Corso i sar., 1998; Marimo i sar., 2006; McDougal i sar., 1998; Porat i sar., 2000; Vilhelmsson i sar., 2000), što se objašnjava neeksprimiranim tetM genom (engl. silent). tetO gen može biti udružen sa mefA genom, što se najčešće dešava nakon insercije transpozona sličnom Tn1207.1 u bakteriofag Фм46.1 (Banks i sar., 2002; Giavanetti i sar., 2005). Ovaj vid horizontalnog transfera se obavlja transdukcijom. 22 1.8. Tipizacija S. pyogenes Tipizacija bakterija je metoda kojom se vrši karakterizacija sojeva unutar jedne bakterijske vrste. Tipizacijom bakterija se mogu odrediti izvor infekcije i putevi prenošenja uzročnika, što ima nesumnjiv epidemiološki značaj. Da bi metoda tipizacije bila uspešna, identifikovani tipovi bakterija bi trebalo da budu stabilni, tehnika bi trebalo da ima dovoljnu moć diskriminacije, da bude jednostavna, reproducibilna, a metod standardizovan velikim brojem ponovljenih testiranja. Klasične metode tipizacije koje se baziraju na fenotipskim osobinama (detekcija fenotipova), biohemijskim osobinama (detekcija biotipova), profilima rezistencije (detekcija rezistotipova) i drugim, sve više se zamenjuju metodama molekularne biologije, odnosno metodama genotipizacije. Tipizacija S. pyogenes se vrši radi praćenja učestalosti tipova rezistentnih na antibakterijske agense, tipova koji izazivaju invazivne bolesti ili su povezani sa post- streptokoknim sekvelama. Rezultati studija koje se bave praćenjem distribucije i promena učestalosti pojedinih tipova u populaciji su od velikog značaja u kreiranju različitih protokola, mera prevencije i istraživanjima vezanim za pravljenje vakcine. Tipizacija streptokoka grupe A se radi još od 1928. godine, kada je Rebeka Lensfild opisala i uvela tzv. M tipizaciju, koja je bazirana na varijabilnim antigenskim karakteristikama termostabilnog, površnog M proteina. Danas se kao klasične, odnosno konvencionalne metode tipizacije najčešće primenjuju: tipizacija M proteina, koja je dugogodišnji “zlatni standard”, zatim tipizacija T proteina i OF tipizacija. Ponovna pojava reumatske groznice i teških infekcija izazvanih streptokokom grupe A (NF, STŠS), početkom osamdesetih i tokom devedesetih godina prošlog veka, odlikovala se visokim procentom izolata S. pyogenes koji nisu pripadali nijednom opisanom M tipu. Zbog visoke cene antiseruma, ograničene dostupnosti i teškoća u interpretaciji M tipizacije, ukazala se potreba za uvođenjem novih metoda tipizacije GAS. U novije vreme su, pored klasičnih, dostupne i metode molekularne biologije, odnosno genotipizacije. Danas je “zlatni standard” u tipizaciji streptokoka grupe A tzv. emm tipizacija, koja je zapravo “molekularni ekvivalent” M tipizacije. Pored ove metode, postoje i mnoge druge koje se baziraju na metodama molekularne biologije, kao što su MLST (engl. multilocus sequence typing, MLST), PFGE (engl. pulsed-field 23 gel electrophoresis, PFGE), RAPD (engl. randomly amplified of polymorphic DNA, RAPD), MLEE (engl. multilocus enzyme electrophoresis, MLEE), vir tipizacija, fagotipizacija i druge (Borek i sar., 2012). 1.8.1. M tipizacija Tipizacija grupe A streptokoka na osnovu razlika u građi hipervarijabilnog segmenta M proteina vrši se još od tridesetih godina prošlog veka (Lancefield, 1933). Do danas su opisana 93 M serotipa (Facklam i sar., 2002). Broj serotipova je realno manji, s obzirom da je došlo do preklapanja nekih tipova ili se ispostavilo da su nađeni kod drugih grupa beta hemolitičnih streptokoka. M tipizacija se bazira na reakciji imunoprecipitacije bakterijskog ekstrakta i specifičnih antitela na određeni tip M proteina. Ova reakcija je inicijalno rađena u epruvetama, ali je zbog velikog utroška seruma, kasnije modifikovana u tzv. kapilarnu imunoprecipitaciju (Swift, 1943). Antitela specifična na određeni M tip se dobijaju imunizacijom kunića streptokoknom vakcinom. Dobijeni serum se najpre obrađuje u cilju eliminisanja antitela specifičnih za druge streptokokne antigene i deponuje u svojevrsne kontejnere. M protein se može ekstrahovati tretiranjem kulture streptokoka kipućom hlorovodoničnom kiselinom (Cunningham, 2000). Reakcija imuniprecipitacije se odvija u naročitoj kapilari, tako što se ona prvo uranja u serum, a zatim u ekstrakt ispitivanog izolata i posle inkubacije se očitava rezultat reakcije. Postupak se ponavlja sa različitim serumima, dok se ne uoči precipitaciona linija. Kako je procedura pripreme seruma veoma komplikovana, ova tehnika se primenjuje u svega nekoliko referentnih laboratorija u svetu. Zbog ograničene dostupnosti, visoke cene seruma i relativno visokog procenta sojeva koji se ne mogu tipizirati ovom metodom, u novije vreme se za tipizaciju S. pyogenes sve više primenjuju metode molekularne biologije. Iako je opisano preko 90 različitih M serotipova GAS, nisu svi jednako zastupljeni u populaciji. Procentualna zastupljenost pojedinih M tipova je različita u pojedinim regionima sveta. Takođe je utvrđeno da se pojedini M tipovi streptokoka izoluju češće kod nekih oboljenja. Najčešći M tipovi koji su uzrokovali faringitise u razvijenim zemljama sveta u prvoj dekadi dvehiljaditih godina su bili M12, M1, M4, 24 M28 i M3, dok su M53 i M81 najčešći izazivači infekcija kože (Cunningham, 2000). Invazivne infekcije obično uzrokuju M1 i M3, koji se povezuju sa višim procentom mortaliteta (Veasyi sar., 2004). Ipak, pojedini autori ukazuju da su određeni serotipovi, koji često uzrokuju invazivne infekcije, kao što je tip M1, visoko udruženi i sa faringealnim kliconoštvom (Rogers i sar., 2007), što ukazuje na pretpostavku da težina bolesti ne zavisi samo od serotipa, već i od virulencije soja i faktora vezanih za domaćina. 1.8.2. T tipizacija Fred Grifit (Fred Griffith) je na osnovu aglutinacije T antigena sa tipski specifičnim antitelima izvršio tipizaciju S. pyogenes. U testu aglutinacije koristio je ekstrakte streptokoka dobijene iz uzoraka pacijenata obolelih od različitih infekcija (Griffith, 1934). Grifitov test je bio jednostavniji od inicijalnog, koji je opisala Lensfildova, pa se nekada više koristio. Danas je identifikovano oko 30 različitih T tipova, pri čemu jedan GAS soj može imati više različitih T tipova. Na osnovu T profila se može predvideti M tip. 1.8.3. emm tipizacija Varijabilni segment emm gena se smatra sekvencom sa najvišim stepenom polimorfizma kod S. pyogenes. U postupku emm tipizacije se umnožava 5' sekvenca ovog gena, koja kodira hipervarijabilni deo M proteina. Potom se vrši sekvenciranje umnoženog 5' segmenta, a dobijena sekvenca se poredi sa sekvencama koje su dostupne u CDC bazi. Sličnost sekvenci od ≥92%, ukazuje na određeni emm tip, odnosno podtip. Ova baza se stalno uvećava, a do sada je identifikovano oko 150 emm tipova i preko 800 podtipova GAS, što govori o diverzitetu sojeva u okviru ove bakterijske vrste (web strana http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/assigning.htm). emm tipovi i podtipovi se obeležavaju arapskim brojevima. Ukoliko soj ima emm tip i podtip, nakon broja emm tipa i tačke, nadovezuje se broj emm podtipa. Geografska distribucija emm tipova nije 25 uniformna. U razvijenim zemljama sveta dominiraju tipovi emm12, emm1, emm28 i emm3 (Steer, 2009). Procentualna zastupljenost pojedinih emm tipova varira i u funkciji vremena. Najčešći faringealni emm tipovi u razvijenim zemljama su emm12 i emm1, najčešći kožni emm1, emm3 i emm28, a invazivni emm1 i emm3 (Steer, 2009; Luca- Harari i sar., 2009). emm sekvenciranje je danas najčešći metod koji se koristi u tipizaciji GAS (Facklami sar., 2002). M, T i OF tipovi međusobno koreliraju, a pojedine kombinacije su udružene sa određenim infekcijama. 1.8.4. MLST (engl. multilocus sequence typing, MLST) MLST je metoda genotipizacije, koja se bazira na umnožavanju i sekvenciranju sedam visoko konzerviranih, tzv. house-keeping gena, koji se nalaze u svakom bakterijskom hromozomu i kodiraju sintezu enzima od vitalnog značaja za bakterijsku ćeliju (Butte, 2001). Dobijene sekvence se porede sa referentnim sekvencama iz internet baze MLST (http://spyogenes.mlst.net), pa se na osnovu dobijenih alelnih profila (engl. sequence type, ST) može razmatrati klonska veza među sojevima. Bakterijski klonovi su sojevi koji imaju zajedničkog pretka i imaju iste alele u svakom house-keeping lokusu, odnosno imaju isti ST. MLST baza sadrži podatke o preko 1000 različitih sojeva izolovanih od pacijenata sa blagim infekcijama, poput faringitisa, do sojeva izolovanih od pacijenata sa invazivnim infekcijama. Takođe, sadrži i podatke o sojevima rezistentnim na makrolide. Osnovna prednost MLST metode u odnosu na molekularne metode koje se zasnivaju na razdvajanju fragmenata DNK u gelu, sastoji se u tome što se rezultati MLST, dobijeni u različitim laboratorijama, mogu lako upoređivati, korišćenjem elektronskih podataka i MLST baze, bez potrebe za poređenjem slika gelova. MLST metoda ima veliki značaj u dugotrajnom evolutivnom praćenju sojeva, jer se promene unutar sedam visoko konzerviranih gena akumuliraju veoma sporo. Rezultati MLST, ali i drugih metoda genotipizacija, se mogu prikazati grafički, korišćenjem dendrograma, pri čemu se na vertikalnoj osi prikazuju izolati, a na horozontalnoj genska udaljenost između sojeva. 26 1.8.5. RAPD (engl. randomly amplified polymorphic DNA, RAPD) tipizacija RAPD tipizacija se zasniva na upotrebi jednog prajmera, koji je nespecifičan i komplementaran sa ponavljajućim sekvencama grupe A streptokoka, što omogućava amplifikaciju više različitih produkata PCR metodom. U RAPD tipizaciji se koriste prajmeri koji imaju visoku diskriminativnu moć i koji pokazuju reproducibilnost u umnožavanju segmenata DNK. U reakciji lančanog umnožavanja prajmer se nasumično vezuje za komplementarne segmente DNK. Shodno tome, kod različitih sojeva, dolazi do umnožavanja različitog broja fragmenata, različite veličine. Nakon elektroforetskog razdvajanja dobijaju se određeni RAPD profili, koji se međusobno mogu porediti. RAPD tipizacija je ekonomična i veoma diskriminativna. Sa druge strane, poređenje rezultata dobijenih u različitim laboratorijama je problematično, jer je metoda vrlo osetljiva na temperaturne i druge promene uslova amplifikacije, što između ostalog utiče i na reproducibilnost (Seppala i sar., 1994; Bert i sar., 1996; Nandi i sar., 2006). 1.8.6. PFGE (engl. pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) PFGE je metoda kojom se DNK fragmenti razdvajaju gel-elektroforezom u pulsirajućem, odnosno promenljivom električnom polju. Nekoliko parova suprotno pozicioniranih elektroda obezbeđuju izmene električnog polja. Ovakva elektroforeza omogućava razdvajanje velikih molekula veličine i do 10 miliona bp (MB). Zbog stalnih promena smera električnog polja, DNK menja orijentaciju, okreće se u gelu, pa je na ovaj način moguće razdvojiti čak i pojedinačne hromozome. Najpre se bakterijski sojevi ukalupljuju u agarozni gel, a potom inkubiraju sa restrikcionim enzimom u cilju digestije i dobijanja fragmenata različitih dužina (20-800 kb). Restrikcioni enzimi koji se najčešće koriste u digestiji sojeva S. pyogenes su SmaiI i SfiI (Martin i Single, 1993), pri čemu broj dobijenih produkata varira od 15 do 20, a veličina fragmenata od 5 do 500kb. Enzim SmaiI se može koristi i u PFGE tipizaciji Streptococcus pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Borrelia burgdorferi itd. U zavisnosti od mesta i broja restrikcionih lokusa, u kojima enzim vrši isecanje (restrikcionih mesta), dobija se različit broj fragmenta, različite dužine. Potom se radi 27 elektroforeza u električnom polju sa promenljivim smerom struje. Nakon bojenja i vizualizacije proizvoda, pomoću kompjuterskog softvera ili golim okom se identifikuju PFGE profili. Dakle, na osnovu genskih razlika unutar bakterijske vrste, odnosno genskih polimorfizama, PFGE metodom se vrši identifikacija genotipova. Genske varijacije koje se registruju ovom metodom akumuliraju se u relativno kratkom vremenskom periodu, te je PFGE vrlo pogodan za kratkoročne epidemijske studije. 1.8.7. Fagotipizacija Lizogena konverzija je jedan od načina kojim GAS može steći faktore virulencije. Identifikacijom broja i vrste bakteriofaga koji su inkorporirani u bakterijski genom, moguće je izvršiti tipizaciju S. pyogenes. Sekvenciranje kompletnog genoma GAS je pokazalo da je oko 90% genoma relativno konzervirano i slično među sojevima, a da su sekvence profaga značajan izvor genskih različitosti (Fischetti, 2007). 1.9. Vakcina Aktuelna istraživanja iz oblasti vakcinologije, koja se bave zaštitom od infekcija izazvanih streptokokom grupe A, odnose se pre svega na ispitivanje M proteina i njegovih tipova. Brojni istraživači smatraju da bi korišćenje konzerviranog segmenta M proteina u kreiranju vakcine bilo korisno, jer je njegova struktura ista kod svih bakterija ove vrste (Fischetti, 2000), pa bi takva vakcina štitila od infekcija izazvanih svim serotipovima GAS. Vakcina koja bi sadržala konzervirani deo M proteina brzo bi stimulisala masovnu produkciju specifičnih antitela, koja bi potencijalno mogla dovesti do ukrštene reakcije sa pojedinim tkivima domaćina. Stoga se, zbog bezbednosnog aspekta vakcine, novija istraživanja sve više baziraju na ispitivanju pojedinih epitopa M proteina, koji su tipski specifični i za koje nije karakterističan fenomen molekularne mimikrije (Dale, 2000). Da bi se postigla imunost na različite serotipove S. pyogenes, neophodno je da vakcina bude napravljena od varijabilnih segmenata M proteina različitih serotipova, odnosno da bude polivalentna. Kako se distribucija serotipova 28 menja i sastav vakcine bi trebalo da se prilagođava aktuelnoj epidemiološkoj situaciji na određenoj teritoriji, u određenom vremenu. Pored M proteina i drugi streptokokni antigeni su potencijalni kandidati za kreiranje vakcine protiv streptokoka: C5a peptidaza (Chen i Cleary, 1990; Olive i sar., 2007), SpeA, SpeC, SpeB (Kapur i sar., 1994), SfbI (Schulze i sar., 2003) i drugi. Trenutno na tržištu nema dostupnih vakcina protiv infekcija izazvanih ovim patogenom, iako bi upotreba vakcine protiv GAS dovela ne samo do smanjenja incidencije streptokoknih invazivnih i neinvazivnih bolesti i kliconoštva, već i do smanjenja potrebe za antibioticima i redukcije rezistencije. 1.10. Radna hipoteza Postoji klonska povezanost sojeva streptokoka grupe A izolovanih u Srbiji, koji pripadaju istim emm tipovima i rezistentni su na makrolidne antibiotike. 2. Ciljevi istraživanja 2. Ciljevi istraživanja 2.1. Odrediti prevalenciju rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes u Srbiji na makrolidne antibiotike 2.2. Odrediti fenotipove i genotipove rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide 2.3. Proceniti učestalost rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na tetracikline i odrediti gene koji determinišu rezistenciju na tetracikline 2.4. Odrediti distribuciju emm tipova faringealnih izolata S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike i ispitati njihovu povezanost sa fenotipovima i genotipovima rezistencije na makrolide 2.5. Odrediti MLST i RAPD profile sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike i ispitati njihovu klonsku povezanost i klonsku distribuciju 2.6. Ispitati osetljivost sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike na druge klase antimikrobnih agenasa 29 3. Materijal i metode 30 3. Materijal i metode 3.1. Bakterijski sojevi Republika Srbija (RS) je zemlja sa oko 7 miliona stanovnika, od kojih, prema gruboj proceni, 2 miliona živi u Beogradu, 3 miliona u centralnoj Srbiji i 2 miliona u Vojvodini. Iz 13 regionalnih mikrobioloških laboratorija, koje obrađuju materijal sa preko 80% teritorije RS, su dobijeni podaci o ukupnom broju sojeva grupe A streptokoka izolovanih iz guše pacijenata obolelih od akutnog tonzilofaringitisa i podaci o broju sojeva GAS rezistentnih na makrolide, tokom 2008. godine (period decembar 2007. god. – decembar 2008. god.). Sedam laboratorija (tri sa područja grada Beograda i četiri regionalne laboratorije iz Vojvodine i centralne Srbije) dostavilo je 77 MRGAS izolata Nacionalnoj referentnoj laboratoriji (NRL) za streptokok, Instituta za mikrobiologiju i imunologiju, Medicinskog fakulteta u Beogradu. MRGAS izolati su dostavljeni referentnoj laboratoriji u transportnom medijumu (Copan, Italija), gde su dalje obrađivani. 3.1.1. Identifikacija i konzervisanje sojeva Identifikacija sojeva u regionalnim laboratorijama i potvrda identifikacije u NRL za streptokok je izvršena na osnovu morfoloških karakteristika bakterija (Gram pozitivne koke, raspoređene u lancima), kulturelnih osobina (prisustvo beta hemolize na krvnom agaru), osetljivosti na bacitracin, 0,04U, (BioRad, SAD), pozitivnog PYR testa (Rosco, Danska) i reakcije lateks aglutinacije sa grupno specifičnim antiserumom (Slidex Strepto Kit, bioMerieux, Francuska). GAS izolati su subkultivisani na Kolumbija (Columbia) krvnom agaru (KKA) sa 5% ovčije krvi i inkubirani 18-24h, na temperaturi od 36°C, u aerobnim uslovima. Sveža bakterijska kultura je subkultivisana u Tod Hevit (Todd Hewitt) bujonu (Biomedics, Španija) i inkubirana 20-24h u prethodno opisanim temperaturnim i atmosferskim uslovima. Dobijena bakterijska suspenzija je konzervirana sa 50% 31 glicerolom (finalna koncentracija 10%) u plastičnim mikro-epruvetama zapremine 1,5ml na temperaturi od -80°C. 3.2. Test osetljivosti na antibiotike Osetljivost sojeva na antibakterijske agense je ispitivana disk difuzionim metodom antibiograma i kombinovanim difuziono-dilucionim metodom, korišćenjem E test traka (bioMerieux, Francuska). 3.2.1. Disk difuzioni metod antibiograma Disk difuzioni metod antibiograma izveden je na osnovu preporuka CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute) (CLSI, 2011). Korišćeni su diskovi penicilina (10IU), eritromicina (15μg), klindamicina (2μg), tetraciklina (30μg), vankomicina (30μg) i ofloksacina (5μg) (BioRad,SAD). Pojedinačne kolonije GAS, sveže bakterijske kulture na KKA, suspendovane su u fiziološki rastvor (FR). Gustina inokuluma je bila ekvivalentna turbiditetu od 0,5 McFarland (McF). Tako pripremljen inokulum je, pomoću sterilnog brisa, zasejavan na Miler Hinton (Mueller Hinton) krvni agar (MHKA) sa 5% ovčije krvi (bioMerieux, France). Nakon aplikacije diskova impregniranih antibiotikom, izvršena je inkubacija u trajanju od 20-24 sata, na temperaturi od 36°C, u aerobnim uslovima. Prečnici zona inhibicije rasta su očitavani u milimetrima, a kategorije osetljivosti su interpretirane prema preporukama CLSI standarda. Rezistentni i intermedijarno osetljivi sojevi su tretirani kao izolati sa smanjenom osetljivošću na antibiotike. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 je korišćen kao kontrolni soj. 32 3.2.2. Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije Minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) za eritromicin i klindamicin su određivane kombinovanim difuziono-dilucionim metodom antibiograma, korišćenjem E test traka (bioMerieux, Francuska). Od sveže prekonoćne kulture je pravljena bakterijska suspenzija turbiditeta 0,5 McF, koja je zasejavana na MHKA sa 5% ovčije krvi (bioMerieux, France). Nakon inkubacije u trajanju od 20-24 sata na 36°C u aerobnim uslovima, očitavana je minimalna inhibitorna koncentracija antibiotika, Rezultati su interpretirani prema preporukama CLSI (CLSI, 2011). 3.3. Fenotipovi rezistencije na makrolide Fenotipovi rezistencije na makrolide su određeni korišćenjem modifikovanog trostrukog disk difuzionog testa (Seppala i sar., 1993; Giovanetti, 1999). Na MHKA je zasejana bakterijska suspenzija turbiditeta 0,5 McF, a zatim su naneti diskovi antibiotika: centralno disk eritromicina (15µg), a na rastojanjima od 15 do 20mm sa jedne strane disk klindamicina (2µg), a sa druge disk spiramicina (100μg) (bioRad, SAD). Ploče su inkubirane 20-24 sata na 36C u u aerobnim uslovima, nakon čega je određivan fenotip rezistencije na makrolide (slika 3). 33 Slika 3: Fenotipovi rezistencije S. pyogenes na makrolidne antibiotike; (levo) klindamicin – Kl, (u sredini) eritromicin – Er, (desno) spiramicin – Sp; fenotipovi sa leva na desno, odozgo na dole: cMLS, M, iMLS-A, iMLS-B, iMLS-C Rezltati su očitavani na osnovu prečnika i izgleda zone inhibicije rasta oko antibiotika. Kod sojeva sa M fenotipom, koji su rezistentni na 14- i 15-člane makrolide, prečnik zone inhibicije rasta oko eritromicina je do 15mm, dok su zone inhibicije rasta oko klindamicina i spiramicina široke. Kod cMLS fenotipa rezistencije na makrolide nema zona inhibicije rasta ni oko jednog diska. IMLS fenotip se karakteriše rezistencijom na eritromicin i smanjenom osetljivošću na klindamicin u prisustvu induktora (makrolida). Postoje tri subfenotipa iMLS rezistencije na makrolidne antibiotike. Na MHKA se iMLS-A subfenotip karakteriše odsustvom zona inhibicije rasta oko diskova eritromicina i spiramicina i zaravnjenom zonom oko diska klindamicina. iMLS-B subfenotip se, takođe, odlikuje odsustvom zone inhibicije rasta oko diska eritromicina, ali se može uočiti „D“ zone oko diskova klindamicina i spiramicina. Za razliku od prethodna dva subtipa, iMLS-C se karakteriše postojanjem 34 zone prečnika do 15mm oko diska eritromicina i „D“ zonom inhibicije rasta oko diskova spiramicina i klindamicina (slika 3). 3.4. Detekcija gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline Svi sojevi su testirani na prisustvo gena koji kodiraju rezistenciju na makrolidne antibiotike i tetracikline. Geni koji determinišu rezistenciju na ove antibiotike su detektovani reakcijom lančanog umnožavanja (engl. polymerase chain reaction, PCR), a dobijeni produkti su vizualizovani metodom horizontalne elektroforeze u agaroznom gelu i UV transiluminatorom. Korišćen je sistem za fotodokumentaciju. 3.4.1. Izolacija DNK Ekstrakcija bakterijske DNK je obavljena termičkom metodom. Puna eza sveže prekonoćne bakterijske kulture je suspendovana u 200μl puferovanog fiziološkog rastvora (engl. phosphate-buffered saline, PBS) u sterilnim plastičnima epruvetama, zapremine 1,5 ml (Eppendorf, Nemačka). Nakon homogenizacije suspenzije u vorteks aparatu (Vortex genius 3, Ika, Nemačka), dodato je još 800μl PBS. Posle centrifugiranja u trajanju od 2 min. na 20000 x g, supernatant je odbačen. Sediment je suspendovan u 200μl sterilne destilovane vode i homogenozovan. Epruvete su potom zagrevane u pećnici na 95-100°C, 10min, nakon čega su hlađene na ledu i centrifugirane na 16000 x g, 15min, na 4°C. Supernatant, koji sadrži izolovanu DNK je prebacivan u novu sterilnu plastičnu mikroepruvetu, zapremine 1,5ml. Izolovana DNK je bila odmah upotrebljena ili je čuvana u frižideru na temperaturi +4°C u periodu do 7 dana ili u zamrzivaču na - 20°C u dužem vremenskom periodu. 35 3.4.2. Kvantitacija DNK (merenje prinosa DNK) DNK kvantitacija je obavljena korišćenjem spektrofotometra (Biophotometer 8,5 Light Center Height, Eppendorf, Nemačka). Koncentracija izolovane DNK je izračunavana na osnovu absorpcije svetlosti određene talasne dužine (260nm) prema Lambert Beer zakonu. 3.4.3. Prajmeri korišćeni za umnožavanje gena koji kodiraju rezistenciju S. pyogenes na makrolidne antibiotike i tetracikline Geni koji determinišu rezistenciju na makrolide (mefA, ermA i ermB) su detektovani PCR metodom, korišćenjem prajmera, čije su sekvence prethodno publikovane (Sutcliffe i sar., 1996; Brandt, 2001; Weber, 2001). Geni koji kodiraju rezistenciju na tetracikline, tetO i tetM, su takođe identifikovani metodom PCR, prema prethodno objavljenom protokolu (Pe´rez-Trallero, 2007). Temperature topljenja (engl. melting temparature, TM) prajmera su određene korišćenjem PerlPrimer programa, na osnovu dužine sekvenci i procentualne zastupljenosti različitih nukleotida. U zavisnosti od TM Fw i Rev prajmera, dizajnirana je temperatura vezivanja prajmera (engl. annealing temperature, TA), koja je korišćena u protokolima za PCR (TA~TM-5°C). Eventualna međusobna komplementarnost prajmera proverena je korišćenjem web servera OligoCalc (http://www.basic.northwestern.edu/ biotools/oligocalc.html). Prajmeri (Invitrogen, SAD), su rastvoreni u koncentraciji od 100μM i čuvani na T=-20°C. Koncentracije radnih rastvora su bile 20μM i oni su čuvani na T=-20°C. 36 Tabela 1: Prajmeri koji su korišćeni za umnožavanje gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline metodom PCR Prajmer Sekvenca 5′ → 3′ Produkt (bp) Referenca mefA Fw mefA Rev ermA Fw ermA Rev ermB Fw ermB Rev tetO Fw tetO Rev tetM Fw tetM Rev CTA TGACAG CCT CAA TGC G ACC GAT TCT ATCAGC AAA G GCA TGA CAT AAA CCT TCA AGG TTA TAA TGA AAC AGA CGA GTG AAA AAG TAC TCA ACC GGC GTG TTT CAT TGC TTG ATG GCG GAA CAT TGC ATT TGA CGG CTC TAT GGA CAA CCC GAC AGA AG AGT TTT AGC TCA TGT TGA TG TCC GAC TAT TTG GAC GAC GG 1400 Brandt, 2001. 208 Weber, 2001. 617 Weber, 2001. 538 Pe´rez, 2007. 1862 Pe´rez, 2007. 3.4.4. Reakcija lančanog umnožavanja gena koji kodiraju rezistenciju S. pyogenes na makrolidne antibiotike i tetracikline Za PCR su korišćene sterilne plastične mikroepruvete, zapremine 0,2ml (Eppendorf, Nemačka). Reakcione smeše zapremine 25μl su činili 12μl Taq PCR MasterMix (Qiagen, Nemačka), po 2μl 20μM rastvora odgovarajućih prajmera (Invitrogen, SAD), 4μl dejonizovane vode (Qiagen, Nemačka) i 5μl bakterijske DNK. U reakcionoj smeši negativne kontrole, umesto bakterijske DNK, korišćena je destilovana voda. Pozitivnu kontrolu je predstavljao uzorak, kod koga je prethodno, metodom PCR, dokazano prisustvo gena. Mikroepruvete sa reakcionim smešama su stavljane u termoblok aparata (Mastercycler Gradient, Eppendorf), a uslovi pod kojima su se odvijale reakcije lančanog umnožavanja predstavljene su u tabeli 2. 37 Tabela 2: Uslovi izvođenja PCR za umnožavanje gena koji kodiraju rezistencije S. pyogenes na makrolidne antibiotike i tetracikline T (°C) Vreme (min.) 1. Inicijalna denaturacija 2. Denaturacija 3. Vezivanje prajmera 4. Ekstenzija 5. Finalna ekstenzija 95 5 95 1 50 1 72 1,5 72 10 Broj ciklusa (od 2-4) 30 3.4.5. Elektroforeza u agaroznom gelu Elektroforetsko razdvajanje PCR produkata, na osnovu veličine produkta i naelektrisanja, obavljeno je u 1,5% agaroznom gelu. Smeša TAE pufera (40mM TRIS, 20mM sirćetne kiseline, 1mM EDTA, pH=7,6) i agaroze je više puta kuvana do tačke ključanja radi homogenizacije, do postizanja bezbojnosti. U tečnu agarozu je sipan 0,01% etidijum bromid, interkalirajuća boja, radi vizualizacije produkta. Smeša je zatim razlivana u kalup za gel, u koji je prethodno učvršćen plastični češalj, koji služi za formiranje bunarčića. Nakon stezanja gela, češalj je izvađen, a ceo sistem je unošen u kadicu za elektroforezu u koju je sipan TAE pufer do granične linije. Bunarčići su punjeni mešavinom 8μl PCR produkta i 2μl pufera za punjenje koncentracije 5X (engl. loading buffer), odnosno rastvora bromfenol plavog (Fermentas, SAD). Pored ispitivanih PCR produkata na gel je nanošen i DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas, SAD), odnosno smeša DNK fragmenata poznatih veličina (engl. ladder) u zapremini od 5μl. Elektroforeza je obavljana pri naponu struje od 100V u trajanju od 60min. 38 3.4.6. Vizualizacija PCR produkata Vizualizacija je obavljana prosvetljavanjem gelova korišćenjem UV transiluminatora (Kodak Gel logic 200 imaging system, SAD). Pojava trake odgovarajućeg broja baznih parova ukazivala je na postojanje datog gena u ispitivanom uzorku, a izostanak trake na njegovo odsustvo. Sistem za fotodokumentaciju (Kodak, 1D 3.6, SAD) je korišćen za slikanje gelova i skladištenje dobijenih fotografija. 3.5. emm tipizacija sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike emm tipizacija predstavlja metodu genotipizacije, kojom se određuje emm tip odnosno podtip ispitivanog soja, poređenjem sekvenci nukleotida u delu ispitivanog emm gena i poznatih sekvenci emm gena iz baze sekvenci. Sekvenciranje emm gena, odnosno određivanje redosleda nukleotida u ispitivanom delu gena je obavljeno metodom završetka lanca (Sanger i sar., 1977). Metoda obuhvata umnožavanje emm gena metodom PCR, prečišćavanje dobijenog PCR produkta, reakciju cikličnog sekvenciranja, precipitaciju produkta cikličnog sekvenciranja i kapilarnu elektroforezu. Dobijena emm sekvenca je poređena sa CDC bazom sekvenci (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/assigning.htm), kao i sa BLAST (engl. Basic Local Alignment Search Tool) bazom sekvenci (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). 3.5.1. Umnožavanje emm gena metodom PCR emm gen je umnožen reakcijom lančanog umnožavanja po protokolu Podbielskog i saradnika (Podbielski i sar., 1991), korišćenjem prajmera (Invitrogen, SAD) prikazanih u tabeli 3. 39 Tabela 3: Prajmeri koji su korišćeni za amplifikaciju emm gena MRGAS sojeva Prajmer Sekvenca 5′→ 3′ Produkt (bp) Referenca emm Fw emm Rev ATA AGG AGC ATA AAA ATG GCT AGC TTA GTT TTC TTC TTT GCG 1200 Podbielski, 1991. N-terminalni hipervarijabilni region emm gena je amplifikovan metodom PCR u reakcionoj smeši zapremine 25μl. U sterilnim, plastičnim mikroepruvetama, zapremine 0,2ml (Eppendorf, Nemačka) pravljena je reakciona smeša, koju su činili 12μl Taq PCR MasterMix (Qiagen, Nemačka), po 2μl rastvora prajmera emm Fw i emm Rev, koncentracije 20 μM (Invitrogen, SAD), 4μl dejonizovane vode (Qiagen, Nemačka) i 5μl bakterijske DNK. Mikroepruvete sa reakcionim smešama su stavljane u termoblok aparata (Mastercycler Gradient, Eppendorf), pod uslovima opisanim u tabeli 4. Tabela 4: Uslovi izvođenja PCR metode za umnožavanje emm gena MRGAS sojeva T (°C) Vreme 1. Inicijalna denaturacija 2. Denaturacija 3. Vezivanje prajmera 4. Ekstenzija 5. Finalna ekstenzija 94 5 sek. 94 1 min. 50 1 min. 72 1 min. 72 10 min. Broj ciklusa (od 2-4) 30 Vizualizacija PCR produkata je vršena elektroforetskim razdvajanjem u 1,5% agaroznom gelu i prosvetljavanjem na UV transiluminatoru, kako je opisano u poglavljima 3.4.5. i 3.4.6. 40 3.5.2. Prečišćavanje PCR produkta Dobijeni amplikon je prečišćen komercijalnim setom (QIAquick PCR purification kit), prema preporuci proizvođača (Qiagen, Nemačka). U plastične mikroepruvete, zapremine 1,5ml je sipano 250µl PB pufera (pufer 1), nakon čega je dodato 50µl PCR produkta (preporučeni odnos zapremine pufera i uzorka je 5:1). Sadržaj je zatim prebacivan pipetom u spin kolone i centrifugiran 1 min na 17900 x g. Filtrat iz kolekcione epruvete je odstranjivan, a kolona je vraćana u istu epruvetu. Zatim je dodavano 750µl PE pufera (pufer 2) i sadržaj je opet centrifugiran 1min na 17900 x g. Dobijeni filtrat je odstranjen, a kolona vraćena u istu epruvetu. Nakon centrifugiranja u trajanju od 1min, pri brzini od 18000 x g, kolona je stavljena u čistu plastičnu mikroepruvetu zapremine 1,5ml. Tokom prethodnih postupaka, DNK je adherisala za silika gel membranu u prisustvu visokih koncentracija soli, uz istovremeno filtriranje drugih sastojaka PCR produkta. U poslednjoj fazi purifikacije, finalna elucija je postignuta dodavanjem 30µl EB pufera (pufer 3) u centar membrane. Kolone su ostavljane 1 min na sobnoj T, a nakon centrifugiranja u trajanju od 1min, kolone su bacane, a prečišćeni PCR produkt iz plastičnih epruvata je čuvan u frižideru na +4°C, do 7 dana, ili na -20°C u dužem vremenskom periodu. 3.5.3. Reakcija cikličnog sekvenciranja U reakciji cikličnog sekvenciranja (engl. cycle sequencing) amplifikovan i prečišćen PCR produkt predstavlja matricu za sintezu jednostrukih DNK lanaca, različitih dužina, komplementarnih matrici. U odnosu na PCR metodu, u reakciji cikličnog sekvenciranja se pored deoksiribonukleotida dodaju i dideoksiribonukleotidi, nakon čije ugradnje prestaje dalja elongacija lanca. Četiri različita dideoksiribonukleotida su obeležena sa četiri različite fluorescentne boje. Produkt reakcije čine proizvodi različitih dužina, koji su komplementarni matrici. Reakciona smeša zapremine 15μl se sastojala od 1μl komercijalne smeše Big Dye Terminator v3.1 CycleSequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, Applied Biosystems, SAD), 1μl 20μM emm Fw prajmera ATA AGG AGC ATA AAA ATG GCT, 3μl pufera (Applied 41 Biosystems, SAD), 9μl dejonizovane vode i 1μl prečišćenog PCR produkta. Plastične mikroepruvete zapremine 0,2ml (Eppendorf, Nemačka), u kojima su bile reakcione smeše, postavljane su u termoblok aparata (Mastercycler Gradient, Eppendorf) pod uslovima opisanim u tabeli 5. Tabela 5: Uslovi izvođenja reakcije cikličnog sekvenciranja amplifikovanog i prečišćenog emm gena T (°C) Vreme 1. Inicijalna denaturacija 2. Denaturacija 3. Vezivanje prajmera 4. Ekstenzija 96 1min. 96 10sek. 50 5sek. 60 4min. Broj ciklusa (od 2-4) 40 Dobijeni produkti su čuvani na T=+4°C ili na T=-20°C do faze prečišćavanja. 3.5.4. Precipitacija produkta cikličnog sekvenciranja izopropanolom Zamrznuti produkti cikličnog sekvenciranja su, neposredno pred precipitaciju, odmrzavani na sobnoj temperaturi (T=+25°C). U uzorke je dodavano 80µl 75% izopropanola. Nakon kratkog vorteksiranja uzorci su ostavljani 15min. na sobnoj temperaturi u mraku. Posle centrifugiranja u trajanju od 45min na 500 x g, mikroepruvete su okretane naopačke i postavljane na papirnatu vatu u cilju odstranjivanja supernatanta. Zatim su uzorci centrifugirani još 2min., na 300 x g u istom položaju i inkubirani u mraku 15-30min. Precipitirani produkti su denaturisani odmah ili su čuvani na T=-20°C do sledeće faze. 42 3.5.5. Denaturacija Nakon precipitacije, u uzorke cikličnog sekvenciranja je dodato 20µl formamida. U termobloku je vršena denaturacija na temperaturi od 94°C, u trajanju od 2min. Uzorci su prebacivani u plastične stripove (Eppendorf, Nemačka), koji su stavljani u automatizovani sekvenator (310 Genetic Analyser, Applied Biosystems) u kome se vrši kapilarna elektroforeza. 3.5.6. Kapilarna elektroforeza Prethodno pripremljeni produkti reakcije cikličnog sekvenciranja u procesu elektroforeze prolaze kroz kapilaru automatizovanog sekvenatora (ABI PRISM 310 Genetic Analyzer; Applied Biosystems). Na kraju svakog umnoženog fragmenta nalazi se dideoksinukleotid (DDN), koji je obeležen fluorescentnom bojom. Pri izlaganju snopu laserskih zraka, obeleženi DDN, biva ekscitiran, a kamera aparata detektuje svetlost određene talasne dužine. Dobijeni rezultati se obrađuju softverski (Sequences Analysis 5.1), nakon čega se konstruiše elektroferogram, odnosno skup sinusoidnih krivi, različitih boja, čiji vrhovi odgovaraju nukleotidima na odgovarajućim mestima. Vrhovi kriva su obeleženi slovima odgovarajućih nukleotida (A, T, G, C), a njihov redosled odgovara ispitivanoj sekvenci. Sekvence su obrađivane i analizirane BioEdit 7.0.1 i MEGA 5.0 softverima. 3.5.7. Određivanje emm tipa, odnosno emm podtipa MRGAS sojeva Dobijene sekvence emm gena su upoređivane sa sekvencama CDC baze (http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/strepblast.htm), kao i sa sekvencama BLAST baze (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). emm tip odnosno podtip je određen na osnovu visokog stepena homologije (≥92%) između sekvence ispitivanih sojeva i sekvenci iz baze podataka. Analizom ~90bp koji kodiraju 30 rezidua određen je emm tip, a analizom ukupno~150bp, koji kodiraju 50 rezidua, određivani su emm tip i podtip. 43 3.6. MLST (engl. multilocus sequence typing) 3.6.1. Umnožavanje sedam visoko konzerviranih gena MRGAS sojeva metodom PCR Tipizacija sojeva metodom MLST je izvršena prema metodologiji koju su opisali Enright i saradnici (Enright i sar., 2001). Prajmeri korišćeni u reakciji lančanog umnožavanja su prikazani u tabeli 7. PCR metodom je amplifikovano 7 visoko konzerviranih (engl. house-keeping) gena koji kodiraju: glukokinazu (gki), transporter glutamina (gtr), glutamat racemazu (murI), DNK reparacioni protein (mutS), transketolazu (recP), ksantin fosforibozil transferazu (xpt) i acetil CoA acetil- transferazu (yqiL) (tabela 7). PCR metoda je izvođena u sterilnim, plastičnim mikroepruvetama, zapremine 0,2ml (Eppendorf, Nemačka). Reakciona smeša zapremine 25μl, se sastojala od 12μl Taq PCR MasterMix (Qiagen, Nemačka), po 2μl 20μM rastvora Fw i Rev prajmera (Invitrogen, SAD), 4μl dejonizovane vode (Qiagen, Nemačka) i 5μl bakterijske DNK, pod uslovima opisanim u tabeli 6. Tabela 6: Uslovi izvođenja PCR metoda za umnožavanje 7 „house-keeping“ gena T (°C) Vreme (min.) Referenca 1. Inicijalna denaturacija 95 5 Enright i sar, 2001. 2. Denaturacija 95 1 3. Vezivanje prajmera 55 1 4. Ekstenzija 72 1 5. Finalna ekstenzija 72 10 Broj ciklusa (od 2-4) 28 44 Tabela 7: Prajmeri koji su korišćeni za umnožavanje gena u MLST metodi Prajmer Sekvenca 5′ → 3′ Produkt (bp) gki Fw GGC ATTG GAA TGG GAT CAC C gki Rev TCT CCT GCT GCT GAC AC gtr Fw GAG GTT GTG GTG ATT ATT GG gtr Rev GCA AAG CCC ATT TCA TGA GTC murl Fw TGC TGA CTC AAA ATG TTA AAA TGA TTG murl Rev GAT GAT AAT TCA CCG TTA ATG TCA AAA TAG mutS Fw GAA GAG TCA TCT AGT TTA GAA TAC GAT mutS Rev AGA GAG TTG TCA CTT GCG CGT TTG ATT GCT recP Fw GCA AAT TCT GGA CAC CCA GG recP Rev CTT TCA CAA GGA TAT GTT GCC xpt Fw TTA CTT GAA GAA CGC ATC TTA xpt Rev ATG AGG TCA CTT CAA TGC CC yiqL Fw TGC AAC AGT ATG GAC TGA CCA GAG AAC AAG ATG C yiqL Rev CAA GGT CTC GTG AAA CCG CTA AAG CCT GAG 498 450 438 405 459 450 434 (Enright i sar, 2001.) 3.6.2. Prečišćavanje PCR produkta PCR produkti su prečišćeni komercijalnim setom za purifikaciju (QIAquick PCR purification kit, Qiagen, Nemačka), prema preporuci proizvođača, kako je opisano u poglavlju 3.5.2. 3.6.3. Reakcija cikličnog sekvenciranja Reakcija cikličnog sekvenciranja (engl. cycle sequencing) je vršena prema prethodno objavljenom protokolu (Enright i sar., 2001), sa prajmerima koji su korišćeni i u PCR metodi. 45 3.6.4. Precipitacija i denaturacija produkta cikličnog sekvenciranja izopropanolom U produkte cikličnog sekvenciranja je dodavano 80µl 75% izopropanola nakon čega su obavljane procedure opisane u poglavlju 3.5.4. i denaturacija po metodi opisanoj u poglavlju 3.5.5. 3.6.5. Kapilarna elektroforeza Kapilarna elektroforeza je postupak u kome se prethodno prpremljeni produkti reakcije cikličnog sekvenciranja razvrstavaju prema veličini u kapilari automatizovanog sekvenatora i ekscitiraju laserskim snopom. Detalji postupka su opisani u poglavlju 3.5.6. Rezultat celog procesa predstavlja redosled nukleotida u umnoženoj sekvenci. 3.6.6. Određivanje tipa sekvence Dobijene sekvence sedam „house keeping“ gena streptokoka grupe A su upoređivane sa referentnim sekvencama baze na internet sajtu http://spyogenes.mlst.net/misc, pri čemu je svaka od 7 sekvenci, poređanih prema abecednom redu (gki, gtr, murl, mutS, recP, xpt, yiqL), dobila svoj alelni broj. Dakle, svaki izolat je definisan kombinacijom 7 brojeva, koji određuju njegov alelni profil, odnosno sequence type (ST). Izolati sa identičnim alelnim profilom pripadaju istom ST. Evolutivna srodnost sojeva je analizirana poređenjem alelnih profila. 46 3.7. RAPD tipizacija 3.7.1. Nasumično umnožavanje fragmenata DNK Nasumičnim vezivanjem jednog prajmera, za DNK matricu ispitivanih sojeva, umnožavane su genske sekvence, metodom PCR. U našem istraživanju je korišćen prajmer H2 (5’ CCT CCC GCC ACC 3’), koji je u brojnim studijama opisan kao najdiskriminativniji među ispitivanim u RAPD tipizaciji sojeva GAS (Seppala, i sar., 1994; Bert i sar., 1996). Umnožavanje fragmenata je vršeno u reakcionoj smeši zapremine 50µl, prema modifikovanom protokolu Sepale i saradnika (Seppala i sar., 1994), opisanom u tabeli 8. Tabela 8: Uslovi izvođenja PCR metode za umnožavanje fragmenata DNK S. pyogenes (RAPD tipizacija) T (°C) Vreme (min.) Referenca 1. Inicijalna denaturacija 94 0,5 Seppala i sar., 1994. 2. Denaturacija 94 0,5 3. Vezivanje prajmera 38 1 4. Ekstenzija 72 1 5. Finalna ekstenzija 72 10 Broj ciklusa (od 2-4) 40 3.7.2. Vizualizacija RAPD produkata Elektroforetsko razdvajanje RAPD produkata je vršeno na osnovu veličine produkata i naelektrisanja u 2% agaroznom gelu. Smeša TAE pufera i agaroze je više puta kuvana do postizanja tačke ključanja, radi homogenizacije. Nakon dodavanja 0,01% etidijum bromida, smeša je razlivana u prethodno pripremljen kalup. Nakon 47 stezanja gela, sistem u koji su specijalnim češljevima napravljeni bunarčići, je stavljan u kadicu za elektroforezu i punjen na sledeći način: 20μl PCR produkta i 4μl pufera za punjenje (loading buffer, Fermentas, SAD) konc. 10X. U najmanje jedan bunarčić je unošen DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas, SAD). Elektroforeza je obavljana pri naponu struje od 75V u trajanju od 120min. Vizualizacija produkata je vršena korišćenjem UV transiluminatora. Svi sojevi MRGAS su svrstani u određene RAPD profile na osnovu poređenja broja i veličine umnoženih produkata (Seppala i sar., 1994; Rogers, 2007). Vizualizovani RAPD profili su označeni slovima od A do Z i oni predstavljaju različite klonove izolata grupe A streptokoka. Identičan RAPD profil sojeva je ukazivao na zajedničko klonsko poreklo izolata. Ukupni broj različitih profila i broj sojeva unutar istog profila ukazivao je na heterogenost, odnosno homogenost (klonsku vezu) ispitivanih MRGAS. Kako je diskriminativna moć RAPD tipizacije veća od MLST i emm tipizacije, u okviru najčešćih ST i emm tipova, izvršeno je RAPD profilisanje sojeva MRGAS. Analiziran je broj i sličnost različitih RAPD profila unutar jednog emm tipa. RAPD profili koji su postojali kod samo jednog soja, označeni su kao jedinstveni, a oni koji su uočeni kod najmanje 2 izolata, svrstani su u ponavljajuće. Analizirana je i klonska povezanost sojeva u okviru istih fenotipova rezistencije na makrolide, ali i klonska veza sojeva izolovanih kod pacijenata iz istih regiona u zemlji. Analiza klastera je izvršena konstruisanjem grafičkog dijagrama u vidu stabla, dendrograma, pomoću programa Restdist i Neighbour iz Phylip paketa, pri čemu je korišćen metod prosečne udaljenosti između grupa (engl. unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA). 48 3.8. Statistička obrada rezultata U statističkoj obradi rezultata korišćene su metode deskriptivne statistike, pri čemu su izračunavane učestalosti fenotipova i genotipova. Za procenu značajnosti rezlike korišćen je χ2 test (P<0,05-statistički značajna razlika). Indeks diverziteta pojedinih fenotipova i emm tipova je izračunat korišćenjem Simpsonovog indeksa (engl. Sympsons Diversity Index) (Hunter, 1988). Diskriminativna moć RAPD metode u odnosu na MLST je procenjena korišćenjem istog indeksa diverziteta. 4. Rezultati 49 4. Rezultati 4.1. Učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolidne antibiotike u Srbiji U jednogodišnjem periodu, od decembra 2007. god. do decembra 2008. god. u 13 regionalnih laboratorija u Srbiji, iz brisa guše pacijenata obolelih od tonzilofaringitisa, izolovano je i identifikovano ukupno 3893 soja S. pyogenes, od čega je 484 bilo rezistentno na makrolide. To znači da je učestalost rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide u Srbiji u 2008. godini iznosila 12%. Na području grada Beograda procentualna zastupljenost rezistencije GAS na makrolide je bila 15%, dok je u Vojvodini bila samo 7%. U ostalim regionima, prevalencija rezistencije S. pyogenes na makrolide je odgovarala prosečnoj zastupljenosti rezistencije u Srbiji. Nije uočena statistički značajna razlika u procentualnoj zastupljenosti rezistencije (p>0,05) u različitim delovima zemlje. 4.2. Fenotipovi i genotipovi rezistencije na makrolide sojeva S. pyogenes izolovanih u Srbiji Dominantan fenotip rezistencije na makrolide je bio M fenotip, koji je identifikovan kod 56 sojeva (72,7%), dok je ukrštena rezistencija na MLS antibiotike bila zastupljena kod samo 21 izolata (27,3%) (slika 4). Među sojevima sa MLS fenotipom, iMLS rezistenciju je imalo 16 sojeva (20,8%), dok je 5 (6,5%) izolata posedovalo cMLS fenotip rezistencije na makrolide (tabela 9; grafik 1). Subfenotip iMLS-A je bio uočen kod 10 od 16 iMLS izolata, iMLS-B kod 6 od 16, dok subfenotip iMLS C nije bio detektovan među ispitivanim sojevima. Sojevi sa M fenotipom rezistencije na makrolidne antibiotike su se odlikovali umerenim stepenom rezistencije na eritromicin, pri čemu je MIK50 iznosio 8µg/ml i osetljivošću na klindamicin sa MIK50 od 0,047µg/ml. Izolati sa oba iMLS subfenotipa (iMLS A i iMLS B) su imali visoke MIK za eritromicin, MIK50 256µg/ml i istovremeno 50 su bili osetljivi na klindamicin u odsustvu induktora (MIK50 0,064µg/ml), dok je posle indukcije vrednost MIK porasla 4 puta (MIK50 0,25µg/ml). Najviše vrednosti MIK za eritromicin i klindamicin su imali sojevi sa cMLS fenotipom, kod kojih su vrednosti MIK50 za oba antibakterijska agensa iznosila >256µg/ml. a) M fenotip rezistencije S. pyogenes na makrolide b) iMLS-B subfenotip rezistencije S. pyogenes na makrolide c) cMLS fenotip rezistencije S. pyogenes na makrolide Slika 4: Fenotipovi rezistencije MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji na makrolide (a-M, b-iMLS-B, c-cMLS) 51 Tabela 9: Minimalne inhibitorne koncentracije eritromicina i klindamicina MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine fenotip rezistencije na makrolide broj izolata % antibiotik MIK (µg/ml) 50% 90% rang M 56 72,7 eritromicin 8 16 2-16 klindamicin 0,047 0,094 0,032-0,094 iMLS 16 20,8 eritromicin klindamicin >256 0,25 >256 0,25 128->256 0,25 cMLS 5 6,5 eritromicin klindamicin >256 >256 >256 >256 >256 >256 % - procenat izolata MIK – minimalna inhibitorna koncentracija Kod svih 56 sojeva sa M fenotipom rezistencije na makrolide je identifikovan mefA gen (slika 5). Svih 16 sojeva sa iMLS fenotipom je imalo ermA gen, dok je kod 2 izolata pored ermA gena, istovremeno bio prisutan i mefA gen. Četiri soja sa cMLS fenotipom rezistencije na makrolide je posedovalo ermB gen (slika 6), dok kod jednog izolata nije identifikovan nijedan od gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide (grafik 1). IMLS fenotip je bio dominantan među sojevima sa ukrštenom MLS rezistencijom na teritoriji naše zemlje (82,4%), osim na području grada Beograda, gde je uočen jednak broj sojeva sa iMLS i cMLS fenotipom rezistencije na makrolide. 52 Slika 5: Gel elektroforeza u agaroznom gelu; PCR metoda detekcije mefA gena kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji; mefA gen – 1400bp Traka 1 – negativna kontrola Traka 2 – pozitivna kontrola Trake 3-6 – pozitivni uzorci Traka 7 – negativan uzorak Traka L – DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas) 53 Slika 6: Gel elektroforeza u agaroznom gelu; PCR metoda detekcije ermB gena kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji; ermB gen – 617bp Traka 1 – pozitivna kontrola Traka 2 – pozitivan uzorak Trake 3 – negativan uzorak Traka L – DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas) Traka 4 – negativna kontrola 54 3 Bro jiz ola ta Grafik 1: Zastupljenost genotipova i fenotipova rezistencije na makrolide kod sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine 60 50 40 nema gena ermB 0 56 ermA mefA mefA+ermA 20 10 14 1 2 40 M fenotip iMLS fenotip cMLS fenotip 4.3. Osetljivost MRGAS sojeva na tetracikline i zastupljenost gena koji determinišu rezistenciju na tetracikline Više od dve trećine MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od decembra 2007. do decembra 2008. godine, odnosno 57 izolata (74%) je bilo osetljivo na tetracikline, dok je 20 sojeva (26%) bilo rezistentno na tetracikline, odnosno imali su udruženu rezistenciju na eritromicin i na tetracikline. Kod svih sojeva grupe A streptokoka koji su imali smanjenu osetljivost na tetraciklin je identifikovan neki od gena koji kodiraju rezistenciju na ove antibiotike 55 mehanizmom izmene ciljnog mesta delovanja (tetO; tetM gen). tetO gen (slika 7) je bio dominantan gen koji kodira rezistenciju GAS na tetracikline i identifikovan je kod 16 TRGAS izolata (80%). Svi sojevi sa tetO genom su imali iMLS fenotip rezistencije na makrolide i ermA gen. tetM gen je dokazan kod samo 4 TRGAS soja (20%), koji su svi imali cMLS fenotip. Kod 3 soja sa tetM genom je dokazano i prisustvo ermB gena, dok kod jednog izolata nije identifikovan nijedan gen koji determiniše rezistenciju na makrolide. Slika 7: Gel elektroforeza u agaroznom gelu; PCR metoda detekcije gena koji kodiraju rezistenciju na tetracikline (tetO i tetM) kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine Traka 1 – pozitivna kontrola za tetO gen Trake 2-10 – pozitivni uzorci za tetO gen Traka L – DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas) Traka 11 – pozitivna kontrola za tetM gen Traka 12 – negativna kontrola 56 4.4. Distribucija emm tipova izolata GAS rezistentnih na makrolidne antibiotike emm genotipizacijom je identifikovano 5 različitih emm tipova: emm75 (32 izolata, 41,6%), emm12 (27 izolata, 35%), emm77 (16 izolata, 20,8%), emm28 (1 izolat, 1,3%) i emm118 (1 izolat, 1,3%). Tri najčešća emm tipa, emm12, emm75 i emm77 su bila identifikovana kod najvećeg broja izolata, tj. kod 97% sojeva (grafik 2). U okviru tipa emm12, identifikovana su 2 podtipa, odnosno 2 alelne varijante emm tipa: emm12.0 i emm12.7, pri čemu je emm12,7 subtip nađen kod samo jednog od ukupno 27 sojeva emm12 tipa (tabela 10). Tabela 10: Zastupljenost različitih emm tipova i njihovih alelnih varijanti kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine emm tip emm podtip N % 12,0 26 33,8 12 12,7 1 1,3 28 28,0 1 1,3 75 75,0 32 41,6 77 77,0 16 20,8 118 118,0 1 1,3 Ukupno 5 6 77 100 N - broj izolata % - procenat izolata 57 Slika 8: Gel elektroforeza u agaroznom gelu; PCR metoda detekcije emm gena kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji; emm gen – 1200bp Traka 1 – pozitivna kontrola Trake 2-6 – pozitivni uzorci Traka L – DNK standard (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas) Nisu uočene statistički značajne razlike u geografskoj distribuciji emm tipova u Beogradu u odnosu na druge oblasti u Srbiji (p>0,05). Ipak, za razliku od ostalih delova zemlje, gde je identifikovan manji broj različitih emm tipova (od 1 do 3), na teritoriji grada Beograda su identifikovana četiri različita emm tipa (emm118, emm12, emm75 i emm77), među kojima je dominantan bio emm75 (64,7%). emm12 je identifikovan kod 3 od 17 izolata, emm77 kod 2 od 17, a emm118 kod samo jednog soja. Kao što je i očekivano, najveća raznolikost emm tipova je uočena u glavnom gradu. Najzastupljeniji emm tip u preostalom delu zemlje je bio emm12 (35%), koji je bio dominantan u regionu Kraljeva (67,7%). Drugi po zastupljenosti emm tip u unutrašnjosti zemlje, emm75, je bio dominantan u Leskovcu i okolini (100%), dok je emm77 bio najčešći u Šapcu (82,4%). Jedini soj emm28 je izolovan kod pacijenta iz Kraljeva. 58 Grafik 2: Geografska distribucija emm tipova sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine 100% emm118 90% emm77 emm77 80% 70% 60% emm75 50% 40% 30% emm75 emm28 emm118 emm77 emm75 emm28 emm12 20% emm12 10% emm12 0% Teritorija grada Beograda Centralna Srbija i Vojvodina 4.5. Povezanost emm tipova i genotipova/fenotipova rezistencije na makrolide Kod tri najčešća emm tipa uočen je visok stepen asocijacije sa fenotipovima i genotipovima rezistencije na makrolide. Svi testirani izolati genotipa emm75 su posedovali mefA gen i pokazivali su M fenotip rezistencije na makrolide. Sojevi sa 59 20 15Bro jiz ola ta genotipom emm12 su ispoljavali dva fenotipa rezistencije na makrolide (M i cMLS), pri čemu je M fenotip bio dominantan (88,9%). Svi sojevi tipa emm12 sa M fenotipom rezistencije na makrolide su imali mefA gen. Svih 16 izolata genotipa emm77 je imalo ermA gen i ispoljavali su iMLS fenotip, ali su 2 od 16 izolata pored ermA gena imali i mefA gen. Tip emm28, je imao cMLS fenotip i posedovao je ermB gen. Jedan izolat genotipa emm118 nije imao nijedan od tri ispitivana gena koji kodiraju rezistenciju na makrolidne antibiotike. Grafik 3: Distribucija emm tipova i genotipova sojeva MRGAS izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine 35 30 25 3 nema gena ermB ermA mefA 32 ermA+mefA 24 10 14 5 0 1 2 1 emm12 emm28 emm75 emm77 emm118 60 4.6. Povezanost emm tipova i gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline kod sojeva MRGAS rezistentnih na tetracikline Sojevi sa smanjenom osetljivošću na tetracikline su imali genotipove emm77 (16 sojeva; 80%), emm12 (3 soja; 15%) i emm118 (1 soj; 5%) (tabela 11). Dominantan emm tip među izolatima sa smanjenom osetljivošću na tetracikline je bio emm77 (tabela 11). Nijedan izolat ovog genotipa nije detektovan kod sojeva osetljivih na tetracikline. Genotip emm77 je bio povezan sa iMLS fenotipom i istovremenim prisustvom gena tetO i ermA. Tabela 11: Distribucija rezistencije na tetracikline kod pojedinih emm tipova MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine emm tip Osetljivi Smanjena osetljivost N % N % Ukupno N 12 24 88,9 3 11,1 27 28 1 100 0 0 1 75 32 100 0 0 32 77 0 0 16 100 16 118 0 0 1 100 1 N - broj izolata % - procenat izolata 61 4.7. Tipizacija MRGAS sojeva MLST metodom MLST metodom genotipizacije su identifikovana četiri do sada opisana tipa sekvenci (ST), kao i dva koja se nisu nalazila u bazi ST. Sedamdeset i pet izolata (97,4%) je pripadalo poznatim ST: ST36 (27 izolata, 36%), ST49 (31 izolat, 40,3%), ST52 (1 izolat, 1,3%), ST63 (16 izolata, 20,8%), dok je ukupno dva (2,6%) izolata imalo nove ST, koji su označeni kao STN1 i STN2. Novi ST su se u odnosu na postojeće ST razlikovali u samo jednom genskom alelu (tabela 12). Identifikovana su 2 nova alela: gena gtr (gtr90) i gena yiql (yiql96). Uočen je visok stepen korelacije između ST i emm tipova. ST36 je bio dominantan kod sojeva emm tipa 12, ST49 kod emm75, a ST63 kod emm77 (slika 9). Novi ST su nađeni kod emm tipa 118 (STN1) i emm75 (STN2). Ukupan broj alela po jednom house-keeping lokusu se kretao od 4 (gtr, murI, mutS i dxpt) do 6 (recP i yiqL) (tabela 12). Broj izolata po određenom ST se kretao od 1 (ST52, STN1, STN2) do 31 (ST49). Dakle, tri od šest različitih ST su bila zastupljena samo sa po jednim izolatom: emm28/ST52, emm75/STN1 i emm118/STN2. Na osnovu MLST tipizacije je izvršena klaster analiza ispitivanih izolata (slika 9), pri čemu su se sojevi sa istim emm/M tipom grupisali zajedno. Uočava se postojanje tri dominantna klastera, koji ukazuju na gensku srodnost sojeva unutar njih. Sojevi sa genotipovima emm28 i emm118 nisu bili obuhvaćeni ni jednim od pomenuta tri klastera, što ukazuje na relativnu gensku udaljenost od ostalih ispitivanih MRGAS izolata. Ipak, izolat sa tipom emm12 je genski srodniji izolatima sa genotipom emm77, nego sa ostalim ispitivanim MRGAS sojevima. 62 Slika 9: Klaster analiza MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji u periodu od 2007. do 2008. godine metodom MLST; sojevi sa istim emm tipom se grupišu u iste klastere, što ukazuje na gensku srodnost izolata 63 Tabela 12: Genotipizacija MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji metodom MLST; Alelske varijante sedam “house-keeping“ gena; tip sekvence (engl. ST) - alelni profil; STN1 i STN2 - novi tipovi sekvenci 64 4.8. Tipizacija sojeva RAPD metodom Dobijeni RAPD profili su se sastojali od 2 do 9 različitih produkata. Amplifikovane RAPD sekvence su bile veličine od 150 do 2 000 baznih parova (bp) (slika 10a). Identifikovano je ukupno 26 različitih profila, koji su obeleženi velikim slovima abecede od A do Z. Više od polovine sojeva je imalo jedinstvene RAPD profile, koji su se međusobno razlikovali (14 jedinstvenih RAPD obrazaca, 54% sojeva). Manji procenat RAPD profila bio je detektovan kod više različitih izolata (12 ponavljajućih RAPD obrazaca, 46%), što ukazuje na određeni stepen polimorfne prirode testiranih uzoraka. Ipak, dva najrasprostranjenija RAPD profila su bila uočena kod čak 42% uzoraka, što ukazuje da skoro polovina sojeva ima poreklo od svega dva klona. Tako je 96% sojeva sa genotipom emm12 imalo isti RAPD obrazac, a najčešći profil kod sojeva sa genotipom emm77 je bio zastupljen kod 67% izolata. Unutar tipa emm75 (N=30) je identifikovano čak 19 RAPD profila, od kojih je 13 bilo jedinstveno, odnosno bili su zastupljeni kod samo jednog soja. Genska srodnost među izolatima je predstavljena dendrogramom (slika 10b). Sedamdeset sedam izolata grupe A streptokoka rezistentnih na makrolidne antibiotike su pripadali jednom od 4 različita klastera, obeleženih malim slovima abecede, od a do d. Broj sojeva unutar klastera se kretao od 5 do 30. Svi sojevi unutar jednog klastera pokazuju određeni stepen genske srodnosti. Trideset sojeva je bilo grupisano unutar klastera a, što ukazuje da više od trećine MRGAS sojeva pripada jednom klonu. Klonalnost izolata sa genotipom emm12 je veoma izražena, jer se svi sojevi sa ovim genotipom grupišu zajedno, unutar jednog klastera (a). Soj S. pyogenes sa cMLS fenotipom reyistencije na makrolide i genotipom emm28 se sa još tri soja sa cMLS fenotipom grupisao u klasteru a, koji je relativno homogen u pogledu strukture emm tipova. Jedini izolat sa cMLS fenotipom, koji se grupiše odvojeno od ostalih sojeva sa ovim fenotipom, nema gene koji kodiraju rezistenciju na makrolide i grupiše se u klasteru d, koji je relativno heterogen. Nasuprot njemu, klaster c je u potpunosti homogen, jer svi sojevi imaju isti emm tip (emm75) i isti fenotip rezistencije na makrolide (M). Klaster b takođe predstavlja relativno homogen skup, jer 9 od 10 izolata ima genotip emm77 i iMLS fenotip rezistencije na makrolide (slika 10a). 65 Slika 10a: Gel elektroforeza u agaroznom gelu; RAPD tipizacija MRGAS sojeva, izolovanih u periodu od 2007. do 2008. godine u Srbiji; L – ladder (Gene Ruler, 100bp DNA Ladder plus, Fermentas) 66 Slika 10b: Klaster analiza RAPD profila MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji; klasteri a, b, c, d su definisani na osnovu prosečne udaljenosti između grupa (engl. Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, UPGMA); sojevi unutar klastera su genski visoko srodni 67 4.9. Poređenje diskriminativne moći RAPD i MLST metoda tipizacije Diskriminativni indeks RAPD genotipizacije je 84% (CI75,8-92,2), dok je Simpsonov indeks diskriminiteta MLST metode samo 68% (CI 59,26-76,74). Razlika u koeficijentu diskriminacije ukazuje na različitu razdvojnu moć korišćenih metoda genotipizacije. 4.10. Klonska povezanost i klonska distribucija sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike Analizom MRGAS izolata identifikovana su tri klona, koja su činila ukupno 97% izolata: emm75/mefA/ST49 (40,3%), emm12/mefA/ST36 (36%) i emm77/ermA/tetO/ST63 (20,8%). Klonovi emm75/mefA/ST49 i emm12/mefA/ST36 su bili osetljivi na tetraciklin, dok je klon emm77/ermA/tetO/ST63 bio rezistentan na ovaj antibiotik. Na teritoriji grada Beograda dominantan klon sojeva MRGAS je bio emm75/mefA/ST49, dok je u preostalom delu zemlje najrasprostranjeniji klon bio emm12/mefA/ST36. Među izolatima sa smanjenom osetljivošću na tetracikline, dominirao je klon emm77/ST63, sa iMLS fenotipom reyistencije na makrolide i istovremenim prisustvom gena ermA i tetO (16 sojeva; 80%). 4.11. Osetljivost MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji na druge klase antimikrobnih agenasa Svi ispitivani sojevi su bili osetljivi na penicilin, vankomicin, ofloksacin i hloramfenikol. Učestalost rezistencije na klindamicin je bila 27,3%. Svi multirezistentni sojevi su imali MLS fenotip rezistencije na makrolide (21 soj; 27%) i svi su bili istovremeno rezistentni na eritromicin, klindamicin i tetraciklin. 5. Diskusija 68 5. Diskusija 5.1. Učestalost rezistencije grupe A streptokoka na makrolidne antibiotike u Srbiji Streptococcus pyogenes izaziva širok spektar oboljenja, među kojima su piogene i toksemične infekcije i post-streptokokne sekvele. Procenjeno je da svake godine oko 700 miliona ljudi oboli od infekcija izazvanih grupom A streptokoka (Carapetis i sar., 2005). S. pyogenes uzrokuje 18 miliona slučajeva teških infekcija godišnje širom sveta, od čega 517 000 ima smrtni ishod (Cho i Caparon, 2008). Penicilin i drugi beta laktamski antibiotici i dalje predstavljaju prvu liniju izbora u lečenju većine infekcija izazvanih grupom A streptokoka. Makrolidi se koriste, kao alternativni antibiotici kod pacijenata alergičnih na peniciline (Bisno i sar., 2002), kao i kod neuspeha penicilinske terapije. Još od 1955. godine, kada je prvi put uočena rezistencija na makrolide, brojne studije su opisivale smanjenu osetljivost različitih patogena na eritromicin (Lowbury i sar., 1959). Interesantan je primer Japana, u kome je visok procenat sojeva S. pyogenes rezistentnih na eritromicin (70%) zabeležen još 1972. godine (Maruyama i sar., 1979). Krajem devedesetih godina 20. veka i početkom dvehiljaditih godina 21. veka, porast učestalosti rezistencije grupe A streptokoka na makrolide je detektovan i u zemljama Evrope, posebno mediteranske regije (Alos i sar., 2000; Bassetti i sar., 2000; Szczypa, 2004; Gattringer, 2004; Bingen i sar., 2004; Perez- Trallero i sar., 2007; Silva-Costa i sar., 2008; Michos i sar., 2009), ali i na američkom kontinentu (De Azavedo i sar., 1999; Green i sar., 2006). Najviše stope rezistencije su zabeležene u zemljama Azije i u Koreji su iznosile i do 78% (Koo i sar., 2002). U skandinavskim zemljama, sa izuzetkom Finske, zabeležene su niske učestalosti rezistencije, koje nisu prelazile 4% (Littauer i sar., 2006). Poslednjih godina je u pojedinim regionima sveta zabeleženo smanjenje rezistencije S. pyogenes na makrolide. Tako je zastupljenost MRGAS u Belgiji 1999. godine iznosila 13,5%, a 2006. godine samo 3,3% (Van Heirstraeten i sar., 2012). U Portugalu je u periodu od 1999. do 2006. godine zabeleženo smanjenje rezistencije S. pyogenes sa 20% na 12% (Silva-Costa i sar., 2008). Autori iz Koreje su, takođe, objavili 69 značajno smanjenje učestalosti rezistencije GAS na makrolide, pri čemu je ona 2002. godine iznosila 44,8%, a 2009. godine 4,6% (Koo i sar., 2004; Koh i sar., 2008; Koh i Kim, 2010). U skorije vreme je najdrastičniji pad rezistencije S. pyogenes na makrolide uočen u severoistočnom delu Italije (oblast Pordenone), gde je ograničenje upotrebe makrolida u periodu od 2000. do 2007. godine dovelo do izrazitog smanjenja učestalosti MRGAS sa 33,3% na čak 0,2% (De Rosa i sar., 2009). U našem istraživanju smo ustanovili da je učestalost rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide u periodu od decembra 2007. do decembra 2008. godine u Srbiji bila 12%. Ovolika zastupljenost MRGAS se smatra umerenom i odgovara prosečnoj učestalosti rezistencije u Evropi u istom vremenskom periodu - 11,6% (Richter i sar., 2008). Mogli smo da primetimo da su vrlo sličnu učestalost rezistencije S. pyogenes na eritromicin u to vreme prijavili autori iz Češke, u kojoj je 11% sojeva GAS bilo rezistentno na makrolide. U Sloveniji je prevalencija MRGAS izolata iznosila 12,5%, a u Poljskoj 17% (Urbaskova i sar., 2011; Cizman i sar., 2006; Gracia i sar., 2009). Zastupljenost rezistencije na makrolide kod GAS je u istom vremenskom periodu bila slična i u pojedinim azijskim zemljama, pa je u Koreji, iznosila 9,8%, a u Japanu 16% (Koh i sar., 2010; Wajima i sar., 2008). Visoka učestalost rezistencije GAS na makrolide (veća od 20%) je tokom prve dekade 21. veka zabeležena u mnogim zemljama širom sveta, uključujući i zemlje Mediterana. U Grčkoj je zastupljenost rezistencije, u periodu od 2007. do 2009. godine, iznosila 24%, u Italiji 23%, u Portugalu 21%, u Španiji 32,8%, a u Slovačkoj 34% (Grivea i sar., 2006; Montagnani i sar., 2009; Friaes i sar., 2012; Rubio-Lopez i sar., 2012; Gracia i sar., 2009). Veoma visoku učestalost, od skoro 100%, prijavili su autori iz Kine (Liu i sar., 2009). Sa druge strane, niske učestalosti makrolidne rezistencije su detektovane u Rumuniji 5%, Norveškoj 2,7%, Danskoj 3%, Holandiji 1,4%, Turskoj 6% i Izraelu 1,8 (Luca-Harari i sar., 2008; Littauer, 2006; Dundar i sar., 2010; Luca-Harari i sar., 2008; Buter i sar., 2010; Jasir i sar., 2000). Podaci o prevalenciji rezistencije streptokoka na makrolide u Srbiji su relativno oskudni. Ipak, rađeno je nekoliko istraživanja, te su Ranin i saradnici utvrdili da je prevalencija rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes, u periodu od 1991. do 1999. godine u Srbiji bila 2,41% (Ranin i sar., 2004). Pavlović i saradnici su na uzorku od 3188 sojeva grupe A streptokoka, izolovanih iz guše osoba sa kliničkom slikom akutnog 70 faringitisa, u periodu od 2006. god. do 2008. godine utvrdili da je rezistencija GAS u Srbiji iznosila 6,8% (Pavlović i sar., 2010). Sa druge strane, Mijač i saradnici su zaključili da je učestalost rezistencije na makrolide kod 145 sojeva GAS izolovanih iz faringsa, sa kožnih promena i iz primarno sterilnih regija, tokom prve dekade 2000-tih godina bila veoma niska i iznosila <1% (Mijač i sar., 2010.). U ovom radu su korišćeni podaci o prevalenciji rezistencije S. pyogenes na makrolide iz laboratorija sa većeg dela teritorije Republike Srbije, a u fenotipsku i genotipsku karakterizaciju je uključena kolekcija izolata GAS koja je reprezentativna za teritoriju cele zemlje. Naš podatak o rezistenciji faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide od 12% ukazuje da je u petnaestogodišnjem periodu došlo do porasta rezistencije izolata GAS na ove antibiotike od 2,41% (1991-1999. godine), preko 6,8% (2006-2008. godine), do 12% (2008. godine). Višestruki porast prevalencije MRGAS izolata u Srbiji je zabrinjavajući podatak s obzirom na činjenicu da su makrolidi alternativa beta laktamskim antibioticima, a ponekad i prvi izbor kod osoba alergičnih na penicilin (Bisno i sar., 2002). Značajan porast učestalosti rezistencije S. pyogenes na makrolide u sličnom vremenskom periodu je i do sada opisivan u mnogim zemljama. Tako je npr. u Španiji učestalost rezistencije S. pyogenes višestruko porasla u desetogodišnjem periodu od 1993/1994. godine do 2003/2004. godine, sa 0% na 35,7%. Međutim, u istoj zemlji je posle 2004. godine došlo do značajnog smanjenja rezistencije, i tokom 2007/2008. godine je ona snižena na 7,4% (Ardanuy i sar., 2010). Rezultati našeg istraživanja su pokazali da postoje regionalne razlike u prevalenciji rezistencije GAS na makrolide unutar zemlje: najviša učestalost je detektovana u glavnom gradu (15%), nešto niža u centralnoj Srbiji (14%), dok je najniža zabeležena u Vojvodini (7%). Postoje dokazi da razlozi porasta rezistencije streptokoka na eritromicin i druge makrolide leže u propagaciji rezistentnih klonova, izazvanoj nekritičnom upotrebom makrolidnih antibiotika, posebno onih sa dugim poluvremenom eliminacije (Goossens i sar., 2005; Malhotra-Kumar i sar., 2007). Rezultati studija sprovedenih u Finskoj i Belgiji, kao i iskustvo nekih zemalja, poput Japana, su pokazali da ograničenje potrošnje makrolida, linkozamida, streptogramina, ali i tetraciklina može dovesti do smanjenja učestalosti rezistencije GAS na MLS antibiotike (Seppala i sar., 1997; Van 71 Heirstraeten i sar., 2012). Ipak, ima i drugačijih iskustava, pa je u Sloveniji, uprkos smanjenju potrošnje makrolida od 21%, došlo do dupliranja rezistencije neinvazivnih izolata S. pyogenes na makrolide, što je objašnjeno pre svega fluktuacijama u klonskoj učestalosti MRGAS sojeva (Čizman i sar., 2006). Istraživači iz Koreje smanjenje rezistencije S. pyogenes na makrolide objašnjavaju prvenstveno promenom distribucije cirkulišućih emm tipova (Koh i Kim, 2010). Očigledno je da su razlozi izmena u učestalosti rezistencije streptokoka na makrolide multifaktorijalni – širenje gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide horizontalnim tansferom između bakterija i propagacija rezistentnih klonova, preterana upotreba makrolida i povremene varijacije u distribuciji pojedinih M/emm tipova. U Srbiji je do 2010. godine postojala mogućnost kupovine antibiotika bez lekarskog recepta. Dnevno definisana doza makrolida na 1000 stanovnika (DDD/1000 stanovnika) je u našoj zemlji, u periodu od 1998. do 2008. godine porasla sa 1,3 na 5,8 (Mijač i sar., 2014). Porast potrošnje ovih antibiotika se pre svega desio zahvaljujući porastu DDD/1000 stanovnika novijih makrolida, kao što su azitromicin i klaritromicin. Razlozi za njihovo češće propisivanje i nekritičnu upotrebu su bolje podnošenje i komforniji režim primene (jednom dnevno). Azitromicin pripada antibioticima koji se često primenjuju u lečenju faringitisa, otitisa, sinuzitisa, bronhitisa, pneumonija, ali i infekcija izazvanih mikoplazmama i u lečenju hlamidijalnih genitalnih infekcija. Međutim, zbog dugog poluvremena eliminacije, upotreba azitromicina povećava rizik od nastanka rezistencije bakterija na ovaj antibiotik, a samim tim i na druge makrolide 2,7 puta, što dovodi do selekcije rezistentnih sojeva (Granizo i sar., 2000). Kako se pojedini geni, koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline, mogu prenositi zajedno putem mobilnih genskih elemenata, upotreba tetraciklina, takođe može uticati na povećanje rezistencije na makrolide (Malhotra-Kumar i sar., 2007). Očigledno je da je incidencija rezistencije streptokoka na eritromicin i druge antibiotike iz ove grupe vrlo dinamična pojava, te bi, svakako trebalo nastaviti sa praćenjem incidencije MRGAS kod nas, kako bi se ustanovilo da li i u Srbiji, kao i u nekim drugim zemljama, dolazi do promene učestalosti rezistencije na makrolide, čime bi se mogao proceniti efekat novouvedenih mera, koje se odnose na kontrolu propisivanja i kupovinu antimikrobnih agenasa. 72 5.2. Fenotipovi i genotipovi rezistencije sojeva S. pyogenes na makrolide Rezultati ispitivanja osetljivosti GAS na makrolidne antibiotike pokazuju da je u našoj sredini najzastupljeniji bio M fenotip rezistencije na makrolide. Skoro tri četvrtine od ukupnog broja MRGAS je eksprimiralo ovaj tip rezistencije. MLS fenotip, koji se karakteriše višim stepenom rezistencije na makrolide, bio je zastupljen kod preostale četvrtine ispitivanih izolata. Unutar MLS fenotipa je dominirao iMLS fenotip, koji je bio zastupljen kod 20,8% svih MRGAS sojeva, dok je cMLS fenotip rezistencije na makrolide bio prisutan kod samo 6,5%. Sojevi sa M fenotipom su umereno rezistentni na eritromicin i druge 14- i 15-člane makrolide i osetljivi su na 16-člane makrolide, klindamicin i streptogramine. Kod naših MRGAS sojeva sa M fenotipom, vrednost MIK50 eritromicina je iznosila 8µg/ml, dok je vrednost MIK50 klindamicina bila u kategoriji osetljivih (0,047 µg/ml), što odgovara podacima iz literature (Rubio-Lopez i sar., 2012; Leclerq, 2002; Rubio-Lopez i sar., 2012). Svi sojevi sa MLS fenotipom su imali visoke vrednosti MIK eritromicina (MIK50≥256µg/ml). Vrednosti MIK klindamicina su bile niske kod iMLS fenotipa bez indukcije (MIK50 0,064 µg/ml), a visoke kod cMLS fenotipa (MIK50>256µg/ml). U okviru iMLS fenotipa nađeni su samo subfenotipovi iMLS-A i iMLS-B, koji se odlikuju visokim stepenom rezistencije na 14- i 15-člane makrolide. Nijedan ispitivani soj nije pripadao subfenotipu iMLS-C, za koji je tipična niska rezistencija na makrolide sa 14- i 15-članim prstenom. Među izolatima sa iMLS fenotipom nešto je češće bio zastupljen iMLS-A subfenotip (10 od 16 izolata), u odnosu na iMLS-B (6 od 16 izolata). Dominacija M fenotipa rezistencije na makrolide je već detektovana u Srbiji (Pavlović i sar., 2010), ali i u mnogim zamljama širom sveta, naročito tokom devedesetih godina prošlog veka. Aktivni efluks je bio dominantan mehanizam rezistencije na makrolide u Italiji, gde je 63% svih sojeva MRGAS eksprimiralo ovaj fenotip (Bassetti i sar., 2000). U Nemačkoj je taj procenat bio čak 93,9%, a u Grčkoj 50,9%. (Reinert i sar., 2004; Michos i sar., 2009). Najviši procenat zastupljenosti M fenotipa rezistencije na makrolide je zabeležen u Španiji, u kojoj su rađene brojne studije. U multicentričnoj studiji sprovedenoj 1998. godine u Španiji je registrovana zastupljenost M fenotipa od čak 95,6%, dok je u drugoj studiji iz 2006. i 2007. godine 73 taj procenat bio nešto manji – 64,5% (Rubio-Lopez i sar., 2012; Alos i sar., 2000; Perez- Trallero i sar., 2010). M fenotip je takođe bio najzastupljeniji fenotip rezistencije na makrolide u Austriji, Indiji, SAD i Meksiku (Eisner i sar., 2006; Capoor i sar., 2006; Green i sar., 2006; Villansenor-Sierra i sar., 2012). Za razliku od navedenih zemalja, u Francuskoj, Norveškoj i Bugarskoj je u prvoj dekadi dvehiljaditih godina zabeležena dominacija MLS fenotipa rezistencije na makrolide (Bingen i sar., 2004; Littauer i sar., 2006; Liu i sar., 2009). Ipak, novija istraživanja ukazuju da i u zemljama u kojima je M fenotip bio dominantan, dolazi do izmene u odnosima fenotipova, te je u Evropi uočen porast učestalosti ukrštene rezistencije na MLS antibiotike (Silva-Costa i sar., 2008; Richter i sar., 2008; Perez-Trallero i sar., 2010) i smanjenje zastupljenosti M fenotipa. Trend porasta cMLS fenotipa rezistencije na makrolide je opisan u mnogim evropskim zemljama, pri čemu je prosečna zastupljenost ovog fenotipa 2002/2003. godine u Evropi iznosila 29,3%, a 2004/2005. godine 45,7% (Richter i sar., 2008). Tako je u Nemačkoj učestalost cMLS fenotipa porasla na 34,5%, dok je u Francuskoj došlo do povećanja istog fenotipa na 52,6% (Bingen i sar., 2004). Zemlje u kojima među izolatima MRGAS poslednjih godina dominira cMLS fenotip su Koreja sa zastupljenošću od 62,5% (Koh i Kim, 2010), Kina sa zastupljenošću od 98% (Liu i sar., 2009) i Španija sa učestalošću od 40,4% (Ardanuy i sar., 2010). U pojedinim zemljama je uočen porast iMLS fenotipa rezistencije na makrolide. Autori iz Belgije su ustanovili da je u desetogodišnjem periodu zastupljenost iMLS fenotipa porasla sa 1,2%, koliko je iznosila 1999. god. na čak 76,6% u 2009. godini (Van Heirstraeten i sar., 2012). U pojedinim zemljama, poput Norveške je iMLS fenotip dominantan već godinama (Littauer i sar., 2006). Španski autori sugerišu da postoji veza između učestalosti rezistencije GAS na makrolide i fenotipova rezistencije na makrolide. Oni ukazuju da je visoka učestalost MRGAS često udružena sa MLS fenotipom (Perez-Trallero i sar., 2007; Ardanuy i sar., 2010). Sa druge strane, M fenotip je obično dominantan u zemljama sa niskom učestalošću rezistencije S. pyogenes na makrolide. Tako je u Rumuniji i SAD, polovinom prve dekade 21. veka, zastupljenost MRGAS bila niska, a M fenotip je bio dominantan (Luca-Harari i sar., 2008; Green i sar., 2006). Ipak, u pojedinim studijama je opisana udruženost visoke zastupljenosti rezistencije S. pyogenes na makrolide i 74 dominacije M fenotipa među MRGAS izolatima. U Portugalu je, u periodu od 2000. do 2005. godine, zastupljenost rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide bila 21%, ali je M fenotip bio zastupljen kod 55% sojeva (Friaes i sar., 2012). Očigledno je da postoje brojne varijacije u dominaciji određenih fenotipova i genotipova MRGAS između pojedinih zemalja. Bilo bi značajno ispitati da li se opisana zamena fenotipova rezistencije na makrolide desila i u Srbiji, odnosno da li možemo očekivati da je i među našim izolatima GAS došlo do porasta MLS fenotipa, a samim tim i viših nivoa rezistencije na makrolide. Dobijene vrednosti MIK za eritromicin u našoj studiji odgovaraju rezultatima koje su objavili drugi autori. Rezultati italijanske studije takođe ukazuju da su vrednosti MIK za eritromicin kod sojeva sa M fenotipom bile od 2 do 16µg/ml, a vrednosti MIK za sojeve sa MLS fenotipom, više od 128µg/ml (Montanari i sar., 2003). Rezultati dobijeni u našoj studiji su u skladu i sa rezultatima španskih autora, koji beleže slične vrednosti MIK za sva tri fenotipa rezistencije na makrolide (Rubio-Lopez i sar., 2012). Kod svih sojeva sa M fenotipom je dokazano prisustvo mefA gena, kod sojeva sa iMLS fenotipom identifikovan je ermA gen, a kod 4 od 5 izolata sa cMLS fenotipom rezistencije na makrolide je nađen ermB gen. Tipičnu udruženost M fenotipa i mefA gena, iMLS fenotipa i ermA gena i cMLS fenotipa i ermB gena, je uočio najveći broj istraživača (Sauermann i sar., 2003; Mendes i sar., 2003; Liu i sar., 2009). Za razliku od naših rezultata, pojedini autori su kod jednog broja izolata sa iMLS fenotipom, identifikovali ermB gen (Giovanetti i sar., 2009; Brenciani i sar., 2012; Koh i sar., 2008). Među ispitivanim izolatima u našoj studiji, dva soja sa iMLS fenotipom su, pored ermA, posedovala i mefA gen. Ovi nalazi odgovaraju literaturnim (Rubio-Lopez i sar., 2012; Malhotra Kumar i sar., 2009) i ukazuju da je moguće da ermA gen u tim slučajevima zapravo kodira konstitutivnu ukrštenu rezistenciju na MLS antibiotike, što je posledica promene u regulatornom regionu gena (Malhotra Kumar i sar., 2009). U literaturi je opisana i udruženost ermA i ermB gena (Portillo i sar., 2003), ali u našoj studiji nisu nađeni takvi izolati. Kod jednog izolata sa cMLS fenotipom nije identifikovan nijedan od gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide, što bi moglo ukazati da je kod ovog soja rezistencija na makrolide nastala kao posledica mutacije gena koji kodiraju ribozomalne proteine L4 ili L22 (Farrell i sar., 2006; Malbruny i sar., 75 2002; Nielsen i sar., 2004). Sojeve sa cMLS fenotipom, bez gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide, pominju i drugi autori (Portillo i sar., 2003; Rubio-Lopez i sar., 2012). Može se zaključiti da je kod naših sojeva MRGAS postojao visok stepen tipične korelacije između fenotipova i genotipova rezistencije na makrolide. Nađena je povezanost M fenotipa sa mefA genom, iMLS fenotipa sa ermA genom i cMLS fenotipa sa ermB genom. Među našim MRGAS sojevima nismo našli ermB gen koji se inducibilno eksprimira, niti ermA sa konstitutivnom ekpresijom, koje opisuju pojedini istraživači (Ardanay i sar., 2010). 5.3. Osetljivost MRGAS sojeva na tetracikline i zastupljenost tetO i tetM gena Iako se tetracklini ne preporučuju u terapiji streptokoknih infekcija, rezistencija GAS na ove antibiotike ima neosporan epidemiološki značaj. Udružena rezistencija na makrolidne antibiotike i tetracikline beleži se još od kraja devedesetih godina (Kataja i sar., 1999). Među ispitivanim izolatima MRGAS, uočena je relativno visoka učestalost rezistencije na tetracikline (26%). Ipak, udružena rezistencija na eritromicin i tetraciklin je prisutna u znatno većem procentu u Norveškoj, gde su objavljeni podaci o čak 70% MRGAS sojeva rezistentnih na tetracikline (Littauer, 2006). U Španiji je istovremena rezistencija na eritromicin i tetraciklin uočena kod 42,4% sojeva (Ardanuy i sar., 2010). Kako se tetraciklini ne primenjuju u terapiji streptokoknih tonzilofaringitisa, visoke učestalosti rezistencije kod GAS se ne mogu objasniti samo prekomernom upotrebom tetraciklina. Ipak, ovi lekovi se primenjuju u terapiji humanih infekcija izazvanih drugim patogenima, a značajno mesto imaju i u veterini. Takođe, geni koji kodiraju rezistenciju na tetracikline se horizontalnim genskim transferom prenose sa uslovno patogenih bakterija, koje su izložene selektivnom uticaju tetraciklina, na patogene bakterije, kao što je S. pyogenes (Bryskier i sar., 2002). Širom sveta je uočen visok stepen udružene rezistencije na makrolidne antibiotike i tetracikline. U osnovi ove pojave je horizontalni transfer mobilnih genskih elemenata, koji pored gena tetM i tetO, često poseduju i gene koji determinišu rezistenciju na makrolide (Varaldo i sar., 2009). 76 Zato se smatra da je rezistencija na tetracikline važan kofaktor u selekciji rezistencije grupe A streptokoka na makrolidne antibiotike (Ayeri sar., 2007; Nielsen i sar., 2004). Rezultati ispitivanja sojeva MRGAS u Srbiji tokom 2008. godine ukazuju da je rezistencija na tetracikline udružena isključivo sa MLS fenotipom rezistencije na makrolide, pri čemu su dominantni bili sojevi sa inducibilnom ekspresijom. Slične rezultate su objavili i autori iz Finske krajem devedesetih godina, u kojoj je iMLS fenotip kod izolata GAS rezistentnih na makrolide i tetracikline dostizao učestalost od čak 93% (Kataja i sar., 1999). Španski autori, su takođe potvrdili da su svi sojevi GAS koji su bili istovremeno rezistentni na tetracikline i makrolide imali MLS fenotip rezistencije na makrolide, ali je konstitutivna ekspresija među njihovim izolatima bila dominantna (Ardanuy i sar., 2010). Takođe je primećeno da i sojevi MRGAS sa M fenotipom rezistencije na makrolide mogu biti rezistentni na tetraciklin (Kataja i sar., 2002). U našoj studiji je prisustvo gena koji kodiraju rezistenciju na tetracikline ispitivano samo kod sojeva koji su, prema rezultatima disk difuzionog metoda antibiograma, pokazivali smanjenu osetljivost na tetraciklin, ali ne i kod sojeva koji su bili osetljivi na ovaj antibiotik. Kod TRGAS sojeva smo tražili samo najčešće genske determinante rezistencije S. pyogenes na tetracikline, tetM i tetO gene (Rubio-Lopez i sar., 2012). U okviru ove studije, nismo ispitivali prisustvo gena tetK i tetL, koji znatno ređe kodiraju rezistenciju S. pyogenes na tetracikline. Najzastupljeniji gen koji kodira rezistenciju na tetracikline kod ispitivanih sojeva je bio tetO, čije je prisustvo uočeno kod 80% TRGAS sojeva, dok je gen tetM bio prisutan kod samo 20% izolata. Distribucija tetO i tetM gena je različita u pojedinim delovima sveta u zavisnosti od geografske regije. Tako je u Turskoj, kao i kod nas, dominantan gen rezistencije na tetracikline tetO i u manjem procentu tetM, tetK i tetL. (Dundar i sar., 2010). Nasuprot tome, tetM je dominantan među MRGAS izolatima rezistentnim na tetracikline u Grčkoj i Španiji (Stathi i sar., 2008; Friaes i sar., 2012; Rubio-Lopez i sar., 2012). Kod naših sojeva je udružena rezistencija na makrolide i tetracikline najčešće bila kodirana ermA i tetO genima. Kod svih sojeva sa tetO genom (80% TRGAS), uočena je udruženost sa ermA genom. Svi sojevi sa genotipom ermA/tetO su, po pravilu, eksprimirali iMLS fenotip rezistencije na makrolide. Samo je kod četiri izolata sa cMLS 77 fenotipom rezistencije na makrolide nađen tetM gen. Kod tri soja je tetM bio udružen sa ermB genom, dok kod jednog izolata nije identifikovan nijedan gen koji kodira rezistenciju na makrolide. Slična su iskustva i španskih autora, koji navode da su svi sojevi S. pyogenes sa udruženom rezistencijom na tetracikline i makrolide imali MLS fenotip rezistencije na makrolide. Međutim, kod njihovih izolata je dominirao cMLS fenotip (Rubio-Lopez i sar., 2012). ermB i tetM geni se često prenose zajedno preko različitih transpozona Tn916 familije, što objašnjava visok stepen asocijacije ovih gena (Varaldo i sar., 2009). Ovu vrstu povezanosti smo našli kod 3 ispitivana MRGAS izolata sa cMLS fenotipom, dok kod jednog soja rezistentnog na tetracikline, sa istim fenotipom, nismo našli ni tetM, ni tetO gen. Udruženi prenos ermA i tetO gena, kao i ermB i tetM gena je već opisan (Brenciani i sar., 2007; Friaes i sar., 2012). U literaturi se, takođe navodi da je zabeležena udruženost M fenotipa rezistencije na makrolide, odnosno mefA i tetO gena, obično nakon insercije transpozona sličnog Tn1207.1 u bakteriofag Фм46.1 (Bacciaglia i sar., 2007; Giovanetti i sar., 2003). Udruženost ovih gena nismo potvrdili među našim izolatima. 5.4. Distribucija emm tipova kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji Među faringealnim izolatima S. pyogenes, rezistentnim na makrolide, izolovanim tokom 2008. godine u Srbiji je nađeno ukupno pet emm tipova. Ubedljivo su dominirala tri emm tipa – emm12, emm75 i emm77. Oni su nađeni kod čak 97% izolata. Najzastupljeniji je bio emm75, koji je bio prisutan kod 42% sojeva, potom emm12, identifikovan kod 35% izolata, dok je 21% MRGAS pripadalo emm tipu 77. Samo po jedan izolat je imao genotip emm28 i emm118. Samo su sojevi sa genotipom emm12 imali dva emm podtipa (emm12,0 i emm12,7). Ostali sojevi su detektovani u jednoj alelskoj varijanti. U našoj studiji nisu nađene nove alelske varijante emm gena, odnosno svi emm tipovi i podtpovi su već bili opisani i nalazili su se u bazi emm tipova. Naši rezultati ukazuju da su MRGAS izolati u Srbiji prilično homogeni i da je za nastanak rezistencije streptokoka na makrolide, u značajnoj meri, odgovorna propagacija nekoliko emm tipova rezistentnih na makrolide. 78 Brojni istraživači ističu da su sojevi rezistentni na makrolide homogeniji u odnosu na osetljive izolate (Silva-Costa i sar., 2012). Povezanost emm genotipova i rezistencije na antibiotike potvrdili su, do sada, mnogi autori (Alberti i sar., 2003; Zampaloni i sar., 2003; Creti i sar., 2007; Michos i sar., 2009; Nir-Paz i sar., 2006; Rivera i sar., 2006; Koh i sar., 2008). Rezultati brojnih studija ukazuju da je relativno mali broj emm tipova odgovoran za rezistenciju GAS na makrolidne antibiotike (Littauer i sar., 2006; Michos i sar., 2009; Nielsen i sar., 2004; Nir-Paz i sar., 2006; Reinert i sar., 2004). Tako je nađeno da su u Grčkoj u periodu od 2003. do 2006. godine dominirali emm12, emm77 i emm4 (Michos i sar., 2009), u sličnom periodu u Španiji su najčešći tipovi bili emm4, emm75, emm28, emm6, emm12 i emm11 (Rubio-Lopez i sar., 2012), a u Portugalu emm4 i emm77 (Silva-Costa i sar., 2012). Međutim, distribucija emm tipova rezistentnih na makrolide, se u određenoj geografskoj regiji, vremenom menja (Silva-Costa i sar., 2008; Koh i sar., 2008). Udruženost rezistencije na makrolide i tri dominantna emm tipa, identifikovana u Srbiji, već je uočena u različitim delovima sveta (Metzgar i Zampolli, 2011). emm75 je bio najzastupljeniji tip među MRGAS izolatima u Španiji i SAD (Ardanuy i sar., 2010; Green i sar., 2006), dok su emm12 i emm77 bili među dominantnim rezistentnim genotipovima u Nemačkoj, Francuskoj i Grčkoj (Reinert i sar., 2004; D Humieres i sar., 2012; Michos i sar., 2009). U Portugalu i Izraelu je takođe dominantan genotip bio emm12 (Silva Costa i sar., 2005; Nir Pazi sar., 2006). Green i saradnici su objavili da genotipovi emm75 i emm12 čine više od polovine izolata rezistentnih na makrolidne antibiotike (Green i sar., 2006), što potvrđuju i rezultati našeg istraživanja. Rubio-Lopez i saradnici takođe nalaze da su genotipovi emm75, emm12 i emm28 među šest najzastupljenijih emm tipova kod MRGAS sojeva u Španiji (Rubio-Lopez i sar., 2012). Nasuprot tome, autori iz Koreje su objavili da je 2002. godine 28% MRGAS izolata imalo genotiptip emm12, a 18,4% sojeva emm75. Sedam godina kasnije zastupljenost genotipa emm12 je bila samo 3,4%, a genotip emm75 nije bio prisutan među MRGAS sojevima izolovanim u Koreji (Kim i Lee, 2004; Koh i Kim, 2010). Opisanu pojavu, korejski autori objašnjavaju gubitkom gena rezistencije na makrolide kod sojeva sa tipom emm75 i njihovom genskom izmenom (Koh i Kim, 2010). Istraživači iz Španije, Finske i Kanade su identifikovali genotip emm28, kao odgovoran za porast učestalosti 79 rezistencije na makrolide u ovim zemljama (Perez-Trallero i sar., 2004; Bingen i sar., 2004). U našoj kolekciji ispitivanih sojeva, samo jedan izolat je imao genotip emm28. Kako je ovo prvo istraživanje genotipova MRGAS u našoj zemlji, uvid o eventualnim izmenama u distribuciji emm tipova u Srbiji će dati tek naredne studije. Jedina studija koja se bavila ispitivanjem distribucije emm tipova kod sojeva S. pyogenes u našoj zemlji je rađena za sojeve GAS izolovane u periodu od 2001. do 2007. godine, koji su poticali iz različitog kliničkog materijala i u najvećoj meri su bili osetljivi na makrolide (Mijač i sar., 2010). U našoj studiji je ispitivana distribucija emm tipova samo kod MRGAS izolata, a Mijač i saradnici su ispitivali sojeve koji su imali sve kategorije osetljivosti na makrolide. Jedini izolat koji je bio rezistentan na makrolide, u pomenutoj studiji, je imao genotip emm75 (Mijač i sar., 2010). U našem istraživanju je uočena razlika u distribuciji emm tipova u pojedinim delovima zemlje. U Beogradu je detektovan najveći broj emm tipova (četiri), pri čemu je najčešći bio emm75, zatim emm12 i emm77, dok je emm118 bio identifikovan kod samo jednog soja. U glavnom gradu je primećen i najveći diverzitet sojeva, što se može objasniti cirkulacijom ljudi i migracijama stanovništva u glavni grad iz drugih delova zemlje. Sa druge strane, u pojedinim gradovima je uočena relativna homogenost izolata, a najveća je primećena u Leskovcu, gde su svi MRGAS sojevi imali genotip emm75. I u drugim gradovima je uočena dominacija određenih genotipova, pa je u Kraljevu nejčešći tip bio emm12, a u Šapcu emm77. Dobijeni rezultati su u skladu sa očekivanjima, jer se distribucija emm tipova može razlikovati unutar različitih regiona iste zemlje. S obzirom na veoma mali broj podataka o zastupljenosti emm tipova GAS u Srbiji, naši rezultati mogu imati značaja u proceni efikasnosti potencijalnih vakcina protiv infekcija koje izaziva S. pyogenes. Svi emm tipovi, osim jednog (emm118), koji su opisani u našoj studiji, se nalaze u multivalentnoj emm vakcini koja je u kliničkoj fazi ispitivanja (McNeil i sar., 2005). Dakle, eventualna pokrivenost vakcinom MRGAS izolata u Srbiji bi bila viša od 98%. 80 5.5. Udruženost pojedinih emm tipova i gena koji kodiraju rezistenciju na makrolide i tetracikline kod MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji Među ispitivanim izolatima uočena je jasna povezanost genotipova rezistentnih na makrolide i emm tipova. Tako su svi MRGAS sojevi sa genotipom emm75 i 89% sojeva sa tipom emm12 imali mefA gen rezistencije na makrolide, dok je kod svih sojeva sa genotipom emm77 nađen ermA gen. Jedini izolat sa genotipom emm28 je posedovao ermB gen, dok soj sa genotipom emm118 nije imao nijedan gen koji kodira rezistenciju na makrolide. Sojevi sa genotipom emm75/mefA su već prepoznati u literaturi kao široko diseminovani klonovi S. pyogenes, koji su rezistentni na makrolide. Navedeni genotip je jedan od najčešćih među MRGAS izolatima u Španiji i SAD-u (Ardanuy i sar., 2010; Green i sar., 2006). Isti model povezanosti genotipa emm77 i ermA gena, emm12 i mefA gena, kao i emm28 i ermB gena su uočilii autori iz Belgije (Van Heirstraeten i sar., 2012). Genotip emm77 je bio udružen sa ermA genom i kod sojeva iz Grčke, Bugarske i Španije (Grivea i sar., 2006; Detcheva i sar., 2002; Rubio-Lopez i sar., 2012), dok su se u Italiji kod genotipa emm77 nalazila oba gena makrolidne rezistencije - ermA i ermB gen (Zampaloni i sar., 2003). Nasuprot našim rezultatima, u Japanu je početkom dvehiljaditih godina uočena udruženost genotipa emm12 i ermB gena (Murase i sar., 2000). Silva-Costa i saradnici su, takođe, objavili da je u Portugalu došlo do promene genotipa kod sojeva sa tipom emm12. Naime, početkom dvehiljaditih godina ovaj genotip je bio udružen sa mefA genom, a u periodu od 2004. do 2006. godine, izolati genotipa emm12 su imali isključivo ermB gen (Silva-Costa i sar., 2008). Naš jedini izolat tipa emm28 je imao cMLS fenotip i ermB gen. Da ova pojava nije retka, pokazuju podaci iz Koreje, gde su tokom 2009. godine svi sojevi sa cMLS fenotipom imali genotip emm28 (Koh i Kim, 2010). Ista povezanost genotipa emm28 sa ermB genom je nađena i u Francuskoj (Bingen i sar., 2004) i Španiji (Perez-Trallero i sar., 2004). Među našim sojevima MRGAS, koji su bili istovremeno rezistentni i na tetracikline, nađena su tri emm tipa: emm77, emm12 i emm118, od kojih je emm77 bio ubedljivo dominantan. Preko 80% sojeva je imalo ovaj emm tip. Za njega je bilo karakteristično da je udružen sa iMLS fenotipom i da poseduje ermA i tetO gene. Izolati 81 genotipa emm77/ermA/tetO su već prepoznati u Nemačkoj, Poljskoj i Italiji (Reinert i sar., 2004; Szcyzpa i sar., 2004; Palmieri i sar., 2006). Kod 20 TRGAS sojeva, tetM gen je bio manje zastupljen u odnosu na tetO i detektovan je kod sojeva sa ermB genom, cMLS fenotipom i genotipom emm12. Montes i saradnici su uočili drugačiju asocijaciju tet gena i genotipova. Oni su među ispitivanim izolatima rezistentnim na tetracikline našli značajan broj sojeva sa tipom emm77, koji su imali tetM gen (Montes i sar., 2006). Dominacija genotipa emm77 među TRGAS sojevima je zabeležena i u Španiji. Ipak, svi njihovi sojevi korezistentni na eritromicin i tetraciklin su imali tetM gen (100%), a samo 36,8% TRGAS sojeva je imalo istovremeno prisutan tetM i tetO (Rubio-Lopez i sar., 2012). Ovakvi rezultati samo potvrđuju činjenicu da sojevi rezistentni na antibiotike imaju različite emm tipove shodno geografskoj lokaciji, ali i periodu izolacije (Creti i sar., 2007; Grivea i sar., 2006). Takođe, u pojedinim regionima nije ustanovljena bilo kakva povezanost emm tipova i tetraciklinske rezistencije (Ayer i sar., 2005). Više od dve trećine TRGAS sojeva je pripadalo sojevima sa genotipom emm77/ermA/tetO. Na osnovu dobijenih rezultata, zaključili smo da je rezistencija MRGAS sojeva na tetracikline, izolovanih u Srbiji tokom 2008. godine, posledica monoklonske diseminacije tetO gena. 5.6. MLST genotipizacija MLST metoda genotipizacije, za razliku od emm tipizacije i većine drugih metoda, detektuje genske promene koje se akumuliraju u relativno dugom vremenskom periodu (McGregor i sar., 2004). Suprotno RAPD i PFGE metodama genotipizacije, koje detektuju promene na nivou cele DNK, metoda MLST identifikuje samo alelske varijacije sedam visoko konzerviranih gena. Rezultati MLST tipizacije se lako mogu porediti među laboratorijama, jer se alelski profili, odnosno tipovi sekvenci obeležavaju brojem, koji je lako porediv. Sa druge strane, poređenje rezultata metoda tipizacije koje se baziraju na profilima dobijenim elektroforetskim razdvajanjem u različitim laboratorijama nije moguće obaviti. 82 Trenutno su opisana 672 različita ST grupe A streptokoka (http:/ /spyogenes.mlst.net/sql/sthtml.asp). Interaktivna MLST baza omogućava unošenje novih tipova sekvenci, koje se sastoje od još neprepoznate kombinacije alela. Nakon provere i poređenja sa postojećim sekvencama, svaki novouneseni alelni profil dobija svoj ST broj. Među MRGAS sojevima izolovanim u Srbiji identifikovano je svega šest ST, od kojih su 4 tipa sekvenci već opisana i uvrštena u MLST bazu, dok su dva ST nova, do sada neopisana. Bez obzira na činjenicu da MLST metoda ima veću razdvojnu moć od emm tipizacije, među našim MRGAS izolatima smo našli relativno mali broj ST, svega šest, dok smo emm tipizacijom prepoznali pet emm tipova. Dobijeni rezultati se mogu objasniti činjenicom da MLST metoda identifikuje starije evolutivne promene i to na nivou visoko konzerviranih gena (McGregor i sar., 2004), te u ispitivanoj populaciji sojeva nije uočen veliki diverzitet. Tri najčešća ST (ST36, ST49 i ST63) su nađena kod 93% od 77 sojeva MRGAS u Srbiji. Većina autora je kod MRGAS izolata opisala relativno mali broj ST. Tako su poljski autori kod 98 izolata S. pyogenes rezistentnih na makrolide opisali svega 10 ST i 8 emm tipova (Szczypa i sar., 2004). Nasuprot našim rezultatima, D' Humieres i saradnici su kod samo 19 francuskih MRGAS izolata našli čak 7 različitih ST (D' Humieres i sar., 2012). Među ispitivanim izolatima smo našli visok stepen korelacije između ST i emm tipova. Svi naši sojevi genotipa emm12 su pripadali ST36, genotip emm77 je bio udružen isključivo sa ST63, a većina izolata tipa emm75 je imala ST49. Jedan soj genotipa emm75, koji je pripadao novoopisanom ST, označenom STN2 se od ST49 razlikovao u samo jednom genskom alelu. MRGAS izolati, koje su ispitivali Silva- Costa i saradnici, su takođe, uočili vezu pojedinih ST i emm tipova: emm12 i ST36; emm77 i ST63 (Silva-Costa i sar., 2012). Ipak, postoje studije u kojima je dokazano da različiti emm tipovi mogu imati isti ST (McGregor i sar., 2004). U istraživanju koje je obuhvatilo 220 izolata GAS iz različitih delova sveta, uočeno je npr. da su sojevi sa emm tipom 19, 29 i 30 imali ST65, a da su sojevi sa emm tipom 70, 80, 93, 98, 108 i 121 imali ST10. Uočen je visok stepen korelacije između ST i gena koji kodiraju rezistenciju na antibiotike. Većina sojeva sa ST36 i ST49 je imala mefA gen, a svi izolati sa ST63 ermA 83 gen. Jedan od sojeva sa novim ST (STN2) koji smo identifikovali nije imao nijedan gen rezistencije, a drugi izolat sa STN1 je imao mefA. Na osnovu dobijenih rezultata, mogli smo da sumiramo da je u našoj studiji najčešći klon među MRGAS izolatima bio emm75/mefA/ST49, koji je bio zastupljen kod 39% izolata. Ovaj klon se navodi kao najzastupljeniji među sojevima sa M fenotipom rezistencije na makrolide i u SAD (Green i sar., 2006) i kao jedan od najčešćih u Španiji (Ardanuy i sar., 2010). Klon emm12/mefA/ST36 je u Srbiji po učestalosti bio na drugom mestu, a široko je rasprostranjen i u drugim evropskim zemljama, kao što su Nemačka i Poljska (Reinert i sar., 2004; Szcyzpa i sar., 2004). Treći po zastupljenosti u Srbiji, klon emm77/ermA/tetO/ST63, takođe je opisan i široko diseminovan na evropskom kontinentu, u Nemačkoj, Poljskoj, ali i Španiji, Italiji i Norveškoj (Reinert i sar., 2004; Szcyzpa i sar., 2004; Montes i sar., 2006; Palmieri i sar., 2006). Među MRGAS sojevima izolovanim u Srbiji, klon emm28/ermB/ST52 je identifikovan kod samo jednog pacijenta. Ovaj klon, međutim, nije nepoznat. Njega su španski i nemački autori prethodno već identifikovali i utvrdili njegovu vezu sa sojevima rezistentnim na makrolidne antibiotike (Perez-Trallero i sar., 2007). U nekoliko različitih studija sprovedenih tokom prve polovine 2000 – ih godina u Španiji, Portugalu, Belgiji i Francuskoj je potvrđena veza između porasta učestalosti ukupne prevalencije rezistencije na makrolide i to konstitutivnog MLS fenotipa i propagacije ovog rezistentnog klona (Bingen i sar., 2004). Na osnovu prethodno navedenih rezultata, može se očekivati porast učestalosti, odnosno širenje ovog klona i u našoj zemlji. U Srbiji su identifikovana i dva nova ST (STN1, STN2), koji su bili udruženi sa genotipovima emm75 i emm118. Novoopisani ST (STN1 i STN2) su se razlikovali od postojećih tipova sekvenci u samo jednom genskom alelu. STN1 je u odnosu na postojeći ST167 imao drugi alel gena gtr (gtr 90), dok je STN2 u odnosu na već opisani ST49 imao drugačiji alel gena yiqL (yiql 96). MLST metodom genotipizacije je potvrđena relativna homogenost izolata unutar identifikovanih emm tipova. 84 5.7. RAPD genotipizacija RAPD genotipizacijom je identifikovano ukupno 26 različitih profila, označenih slovima od A do Z. Svaki profil ima jedinstvenu kombinaciju broja i veličine umnoženih produkata. U našoj studiji su genski srodni sojevi MRGAS grupisani zajedno prema sličnosti RAPD profila. Analizom dobijenih RAPD obrazaca u našoj studiji, utvrđeno je da se ispitani sojevi MRGAS, na osnovu genske sličnosti raspoređuju u više različitih klastera, odnosno grupa. Dobijeni RAPD klasteri su se međusobno razlikovali prema broju različitih emm tipova, odnosno prema emm diverzitetu. Distribucija RAPD profila kod naših MRGAS izolata nije bila uniformna među emm tipovima. Tako su, npr. kod 27 izolata genotipa emm12 nađena dva RAPD profila; kod 16 sojeva tipa emm77 tri RAPD profila, a od sojeva emm tipa 75, 32 je pokazivalo 19 RAPD profila. Samo tri različita RAPD profila su nađena kod skoro polovine ispitivanih sojeva (42%) što ukazuje na visok stepen genske srodnosti. Profili koji su se javljali kod većeg broja izolata su nazvani ponavljajući i jedan od najčešćih takvih RAPD profila je bio dominantan kod sojeva sa genotipom emm12 (96%), dok je drugi ponavljajući profil bio zastupljen kod većine izolata sa genotipom emm77 (67%). Ovakva distribucija RAPD profila među našim MRGAS izolatima ukazuje na relativnu homogenost izolata unutar datih emm tipova, odnosno zajedničko gensko poreklo. Naši rezultati pokazuju da su sojevi sa genotipom emm12 i emm77 činili izrazito homogen skup izolata. Najveća raznolikost je uočena kod sojeva sa tipom emm75, gde je postojalo čak 19 različitih RAPD profila. To je ujedno i emm tip koji je bio najčešće zastupljen na teritoriji grada Beograda. Ovakvi rezultati su očekivani jer u Beogradu živi skoro trećina stanovništva naše zemlje, a cirkulacija ljudi je intenzivnija nego u ruralnim srednama. Grupisanje u genske linije, odnosno u klastere, je izvršeno na osnovu sličnosti, odnosno razlika u RAPD profilima (broj i veličina umnoženih produkata na elektroforetskom gelu). Svih 77 ispitivanih MRGAS sojeva, je na osnovu genske srodnosti, podeljeno u samo četiri genske linije, što ukazuje na njihovu srodnost, odnosno zajedničko poreklo, naročito u okviru pojedinih emm tipova. 85 Četiri od pet izolata sa cMLS fenotipom, koji su imali ermB gen, je pokazalo visok stepen genske srodnosti. Jedan od izolata sa konstitutivnim MLS fenotipom, koji nije imao ermB gen, je bio klonski povezan sa sojevima sa genotipom emm75/mefA. Više od polovine sojeva sa iMLS fenotipom su imali zajedničko gensko poreklo. Najveću heterogenost su pokazali sojevi sa M fenotipom, posebno oni sa tipom emm75. Na osnovu dobijenih rezultata možemo zaključiti da je genska srodnost sojeva izraženija između sojeva sa istim emm tipom, nego između sojeva sa istim fenotipom rezistencije na makrolide. RAPD metoda se pokazala kao vrlo diskriminativna, jednostavna, finansijski i vremenski ekonomična. Ipak, osetljivost na suptilne promene PCR uslova (npr. promena PCR aparata), mogu dovesti do određenih promena u broju i veličini amplifikovanih RAPD profila. Zbog toga, brojni autori ističu da je metoda nedovoljno reproducibilna, što se može prevazići ukoliko se svi uzorci amplifikuju zajedno, pod istim uslovima i vizualizuju u istom gelu. 5.8. emm, RAPD i MLST metode genotipizacije izolata S. pyogenes emm tipizacija je najčešće korišćena metoda za tipizaciju sojeva S. pyogenes. Ona je relativno brza i reproducibilna metoda, koja omogućuje poređenje sojeva koji su tipizirani u različitim laboratorijama. Brojni autori potvrđuju značaj i kvalitet ove metode (Luca-Harari i sar., 2008). Ipak, za analizu genske srodnosti sojeva S. pyogenes i identifikaciju cirkulišućih klonova, neophodno je emm tipizaciju dopuniti sa MLST, RAPD ili nekom drugom diskriminativnom metodom genotipizacije (Carrico i sar., 2006). Mnogi istraživači su uočili povezanost emm tipova i rezistencije na makrolide (Alberti i sar., 2003; Zampaloni i sar., 2003; Creti i sar., 2007; Michos i sar., 2009; Nir- Paz i sar., 2006; Rivera i sar., 2006; Koh i sar., 2008), ali je karakterizacija MRGAS izolata u većini studija izvršena samo emm tipizacijom. U našoj studiji su korišćene metode RAPD i MLST, kao komplementarne emm tipizaciji, u cilju identifikovanja srodnih genskih linija. 86 S obzirom da je indeks diverziteta RAPD metode bio veći u odnosu na indeks diverziteta MLST, možemo zaključiti da je RAPD metoda diskriminativnija od MLST, odnosno da je moćnija u razlikovanju sojeva, čak i unutar istih ST. MLST genotipizacija je, iako manje razdvojne moći od RAPD metode, veoma reproducibilna metoda, koja se često koristi u ispitivanju distribucije klonova i klonske povezanosti S. pyogenes, jer su rezultati dobijeni ovom metodom lako poredivi. MLST tipizacija omogućava pouzdano predviđanje emm tipova, što su dokazali i drugi istraživači (Carrico i sar., 2006). RAPD metodom genotipizacije smo mogli da razlikujemo sojeve unutar određenog emm tipa, ali ne i da ga predvidimo. Naša iskustva potvrđuju da je RAPD metoda relativno jednostavna za izvođenje, jer se zasniva samo na reakciji amplifikacije. Za razliku od nje, MLST i emm metode genotipizacije se zasnivaju na reakciji sekvenciranja, pa je za izvođenje ovih metoda neophodna bolja opremljenost laboratorije i visoko obučen kadar. Ipak, iako je RAPD metoda jednostavna i finansijski povoljnija, pokazalo se da ponavljane reakcije RAPD tipizacije nisu dovoljno reproducibilne. Takođe, poređenje elektroforetskih gelova, odnosno dobijenih RAPD profila nije moguće ukoliko su rezultati dobijeni u različitim laboratorijama ili se rade u više navrata u istoj laboratoriji, što predstavlja veliki nedostatak. Slične ocene RAPD metode izneli su i drugi autori (Seppala i sar., 1994; Bert i sar., 1996; Nandi i sar., 2006). Uprkos navedenim manjkavostima, korišćenje RAPD metode se ipak preporučuje u zemljama u razvoju, u kojima metode tipizacije koje se baziraju na reakciji sekvenciranja često nisu dostupne. 5.9. Klonska veza između sojeva S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike izolovanih u Srbiji U našoj studiji su identifikovana tri diseminovana klona S. pyogenes rezistentna na makrolide: emm75/mefA/ST49, emm12/mefA/ST36 i emm77/ermA/tetO/ST63. Mnogi autori ističu da rezistentni klonovi S. pyogenes pripadaju relativno malom broju genskih linija, koje su veoma stabilne i široko diseminovane (Portillo i sar., 2003; Grivea i sar., 2006; Malhotra-Kumar i sar., 2005; Perez-Trallero i sar., 2004; Perez-Trallero i sar., 2007; Reinert i sar., 2004; Szczypa i sar., 2004). Weiss i saradnici su objavili da je 87 početkom 21. veka u Kvebeku (Kanada) ustanovljeno da 65% MRGAS sojeva pripada jednom klonu. U Španiji su, takođe, identifikovali tri klona rezistentna na makrolide (Rubio-Lopez i sar., 2012). I u našoj studiji rezultati pokazuju da je rezistencija S. pyogenes na makrolide u Srbiji u najvećoj meri posledica diseminacije rezistentnih klonova. Promene učestalosti MRGAS izolata, fenotipova i genotipova rezistencije na makrolide su obično praćene promenama u klonskom sastavu populacije S. pyogenes na određenoj teritoriji (Silva-Costa i sar., 2008; Silva-Costa i sar., 2012). Buduća istraživanja bi mogla da utvrde da li i kako se menja klonski sastav MRGAS izolata u Srbiji. 5.10. Osetljivost izolata MRGAS na druge antibakterijske agense Analizom 77 izolata S. pyogenes rezistentnih na makrolidne antibiotike, utvrđeno je da su svi u potpunosti bili osetljivi na penicilin. Još uvek nije zabeležena in vitro rezistencija grupe A streptokoka na penicilin, pa on ostaje lek izbora za terapiju većine infekcija izazvanih ovim patogenom. Učestalost rezistencije MRGAS izolata na klindamicin je bila 27,3%, što je znatno više nego u Španiji, gde je ona iznosila 6,5% (Rubi-Lopez i sar., 2012). Ipak, u Francuskoj i Norveškoj, gde je MLS fenotip rezistencije na makrolide dominantan, učestalost rezistencije na klindamicin je znatno veća (Bingen i sar., 2004; Littauer i sar., 2006). Svi sojevi su bili osetljivi na vankomicin, što je bio očekivan rezultat, ali i na druge antibiotike kao što su hloramfenikol i ofloksacin. Rezultati studije španskih autora, koja je takođe obuhvatila MRGAS izolate ukazuju da je 10,1% sojeva imalo udruženu rezistenciju na makrolide i ciprofloksacin (Ardanuy i sar., 2010). Pet od osam sojeva rezistentnih na fluorohinolone je imalo genotip emm6/ST382, što ukazuje na klonsko poreklo ovih sojeva, dok su ostali verovatno stekli rezistenciju mutacijom nakon terapije fluorohinolonima. Klonska propagacija sojeva GAS rezistentnih na fluorohinolone je već opisana (Malhotra-Kumar i sar., 2005). Potpuna osetljivost MRGAS sojeva izolovanih u Srbiji na fluorohinolone je od velikog značaja, s obzirom 88 na činjenicu da se novije generacije ovih antibiotika mogu upotrebljavati u terapiji infekcija izazvanih MRGAS sojevima, kod pacijenata alergičnih na penicilin. Rezistencija S. pyogenes na hloramfenikol je izuzetno retka (Szcypa i sar., 2006) i rezultati većine studija koje ispituju osetljivost faringealnih izolata S. pyogenes na ove antibiotike navode podatke da je osetljivost na hloramfenikol 100% (Liu i sar., 2009). Ipak, osamdesetih godina prošlog veka, rezistencija grupe A streptokoka je bila zastupljena u Japanu kod 57,9% izolata (Nakae i sar., 1977). 5.11. Nadzor nad streptokoknim infekcijama Naše istraživanje predstavlja prvu kompletnu fenotipsku i genotipsku analizu sojeva grupe A streptokoka rezistentnih na makrolide u Srbiji. Dobijeni rezultati predstavljaju epidemiološku bazu podataka, na osnovu kojih bi se dalje mogle pratiti promene učestalosti rezistencije GAS na makrolide, kao i eventualne promene u klonskoj strukturi MRGAS sojeva u Srbiji. Epidemiološki nadzor nad infekcijama izazvanim streptokokom grupe A sprovodi se kontinuirano u razvijenim zemljama. Nadzor obuhvata praćenje nekoliko epidemioloških markera GAS i bolesti koje oni izazivaju kao što su: praćenje incidencije i prevalencije obolevanja, rezistencije invazivnih i neinvazivnih izolata, praćenje cirkulacije rezistentnih klonova, detekciju mehanizama rezistencije na antibiotike, određivanje distribucije gena koji determinišu rezistenciju na antibakterijske agense. Početkom dvehiljaditih godina, objavljeno je više publikacija o porastu rezistencije S. pyogenes na makrolide u pojedinim regionima sveta, a poslednjih godina rezultati mnogih studija ukazuju na porast incidencije invazivnih oboljenja izazvanih grupom A streptokoka. Iako u Srbiji ne postoji kontinuirano praćenje streptokoknih infekcija, naši rezultati ukazuju da su učestalost rezistencije S. pyogenes na makrolide i distribucija emm tipova sojeva rezistentnih na ove antibiotike slični onima koji postoje u pojedinim mediteranskim zemljama. Ipak, za unapređenje mera prevencije, dijagnostičkih procedura i terapijskih opcija neophodno je uspostavljanje nacionalne mreže laboratorija i uvođenje aktivnog nadzora nad streptokoknim infekcijama. Rezultati 89 budućih istraživanja bi mogli da ukažu na promene u incidenciji rezistencije na makrolide među izolatima S. pyogenes, eventualne izmene u učestalosti pojedinih fenotipova rezistencije na makrolide, izmene u distribuciji emm tipova kod MRGAS sojeva i dalji trend u klonskoj propagaciji MRGAS izolata u Srbiji. 6. Zaključci 6. Zaključci Na osnovu dobijenih rezultata, mogu se izvesti sledeći zaključci:  Prevalencija rezistencije faringealnih izolata S. pyogenes na makrolide izolovanih u periodu od decembra 2007. do decembra 2008. godine u Srbiji je iznosila 12%  Dominantan fenotip rezistencije na makrolide je bio M fenotip (72,7%). CMLS fenotip je bio zastupljen kod 6,5%, a iMLS fenotip kod 20,8% MRGAS izolata. Potvrđena je udruženost mefA gena i M fenotipa; ermA gena i iMLS fenotipa, kao i ermB gena i cMLS fenotipa  Rezistencija na tetracikline je bila zastupljena kod 26% MRGAS izolata u Srbiji. Dominantan gen koji kodira rezistenciju na tetracikline je bio tetO, koji je bio prisutan kod 80% sojeva, dok je tetM bio zastupljen kod samo 20% izolata  emm genotipizacijom je među MRGAS izolatima identifikovano pet emm tipova: emm75 (41,6%), emm12 (35%), emm77 (20,8%), emm118 (1,3%) i emm28 (1,3%). Najćešča tri emm tipa: emm12, emm75 i emm77 su nađena kod 97% sojeva.  Utvrđeno je da postoji visok stepen asocijacije između genotipa emm75 i mefA gena, kao i udruženost genotipa emm77 i ermA gena  MLST tipizacijom je identifikovano 6 ST: ST49, ST36, ST63, ST52 i dva nova STN1 i STN2. Tri ST – ST49, ST36 i ST63 su nađena kod 97% sojeva  RAPD tipizacijom je identifikovano 26 profila, pri čemu su sojevi sa genotipom emm75 imali najveći broj profila, odnosno bili su najheterogeniji, dok su izolati sa emm12 i emm77 genotipom bili vrlo homogeni  Identifikovana su tri visoko rasprostranjena klona rezistencije na makrolide u Srbiji (emm75/mefA/ST49, emm12/mefA/ST36 i emm77/ermA/tetO/ST63), čime je dokazano postojanje klonske veze među sojevima grupe A streptokoka rezistentnim na makrolidne antibiotike  MRGAS sojevi su u potpunosti bili osetljivi na penicilin, vankomicin, ofloksacin i hloramfenikol 90 7. Reference 91 7. Reference 1. Alberti S, García-Rey C, Domínguez MA, Aguilar L, Cercenado E, Gobernado M, García-Perea A,6 and Spanish Surveillance Group for Respiratory Pathogens Survey ef emm gene sequences from pharyngeal Streptococcus pyogenes isolates collected in Spain and their relationship with erythromycin susceptibility. 2003; 41:2385-2390. 2. Alos JI, Aracil B, Oteo J, i sar. High prevalence of erythromycin-resistant, clindamycin/miocamycin-susceptible (M phenotype) Streptococcus pyogenes: results of a Spanish multicentre study in 1998. J Antimicrob Chemother. 2000; 45:605–609. 3. Amezaga MR, Carter PE, Cash P, and McKenzie H. Molecular epidemiology of erythromycin resistance in Streptococcus pneumoniae isolates from blood and noninvasive sites. J. Clin. Microbiol. 2002; 40:3313–3318. 4. Anthony BF. 2000. Streptococcal pyoderma, p. 144-151. In Stevens DL. and Kaplan EL. (ed.), Streptococcal Infections: Clinical Aspects, Microbiology, and Molecular Pathogenesis. Oxford University Press, New York. 5. Ardanuy C, Domenech A, Rolo D, calatayud L, Tubau F, Ayats J. i sar. Molecular characteriyation of macrolide-and multidrug-resistant Streptococcus pyogenes isolated from adult patients in Barcelona, spain (1993-2008). J Antimicrob Chemother. 2010; 65:634–643. 6. Ayer V, Tewodros W, Manoharan A, Skariah S, Luo F, Bessen DE. Tetracycline resistance in group A streptococci: emergence on a global scale and influence on multiple-drug resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51:1865–1868. 7. Bacciaglia A, Brenciani A, Varaldo PE i sar. SmaI typeability and tetracycline susceptibility and resistance in Streptococcus pyogenes isolates with efflux-mediated erythromycin resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51:3042-3043. 8. Banks DJ, Beres SB, and Musser JM. The fundamental contribution of phages to GAS evolution, genome diversification and strain emergence. Trends Microbiol. 2002; 10:515–521. 9. Barry AL, Fuchs PC, Brown SD. Macrolide resistance among Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes isolates from out-patients in the USA. J Antimicrob Chemother. 1997; 40(1):139-40. 10. Beachey EH and Ofek I. Epithelial cell binding of group A streptococci by lipoteichoic acid on fimbriae denuded of M protein. J. Exp. Med. 1976; 143:759–771. 11. Bert F, Picard B, Branger C, Lambert-Zechovsky. Analysis of genetic relationships among strains of groups A, C and G streptococci by random amplified polymorphic DNA analysis. J. Med. Microbiol. 1996; 45: 278-284. 92 12. Bingen E, Bidet P, Mihaila-Amrouche L i sar. Emergence of macrolide-resistant Streptococcus pyogenes isolates in French children. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48:3559-3562. 13. Bisno AL, Brito MO and Collins CM. Molecular basis of group A streptococcal virulence. Lancet Infect Dis. 2003; 3:191-200. 14. Bisno AL. 1995. Streptococcus pyogenes, p. 1786–1799. In Mandell GL, Bennett G, and Dolin R. (ed.), Principles and practice of infectious diseases, vol. 2. Churchill Livingstone, New York, N.Y. 15. Borek AL, Obszańska K, Hryniewicz W, Sitkiewicz I. Typing of Streptococcus pyogenes strains using the phage profiling method. Virulence. 2012; 3(6):534-538. 16. Brandt CM, Honscha M, Truong ND, Holland R, Hovener B, Bryskier A, Lütticken R, and Reinert RR. Macrolide resistance in Streptococcuspyogenes isolates from throat infections in the region of Aachen, Germany. Microb Drug Resist. 2001; 7:165-170. 17. Brenciani A, Bacciaglia A, Vecchi M, Vitali LA, Varaldo PE and Giovanetti E. Genetic elements carrying ermB in Streptococcus pyogenes and association with tetM tetracycline resistance gene. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51:1209-16. 18. Brook I. Overcoming penicillin failures in the treatment of Group A streptococcal pharyngo-tonsillitis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2007; 71(10):1501- 1508. 19. Brook I. Role of beta-lactamase-producing bacteria in the failure of penicillin to eradicate group A streptococci. Pediatr Infect Dis. 1985; 4:491-5. 20. Buter CC, Mouton JW, Klaassen CH, Handgraaf CM, Sunnen S, Melchers WJ i sar. Prevalence and molecular mechanism of macrolide resistance in β-heamolytic streptococci in the Netherlands. Int J Antimicrob Agents. 2010; 35:590-592. 21. Butte AJ i saradnici. Further defining housekeeping, or "maintenance," genes focus on 'a compendium of gene expression in normal human tissues'. Physiol Genomics. 2001; 7 (2): 95–96. 22. Capoor MR, Nair D, Deb M, Batra K, Aggarwa P. Resistance to erythromycin and rising penicillin MIC in Streptococcus pyogenes in India. Jpn J Infect Dis. 2006; 59:334-336. 23. Carapetis JR, Steer AC, Mulholland EK, Weber M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 2005; 5(11):685-94. 24. Carrico JA i sar. Illustration of a common framework for relating multiple typing methods by application to macrolide-resistant Streptococcus pyogenes J Clin Microbiol. 2006; 44:2524-2532. 93 25. Chen CC and Cleary PP. Complete nucleotide sequence of the streptococcal C5a peptidase gene of Streptococcus pyogenes. The Journal of biological chemistry. 1990; 265:3161-3167 26. Chin J. 2000. Streptococcal diseases caused by group A (beta-hemolytic) streptococci, p. 470-476. In J. Chin (ed.), Control of Communicable Diseases Manual, 17 ed. 27. Cizman M, Beovic B, Seme K, Paragi M, Strumbelj I, Muller-Premru M i sar. Macrolide resistance rates in respiratory pathogens in Slovenia following reduced macrolide use. Int J Antimicrob Agents. 2006; 28:537–542. 28. Cleary P, Prabu U, Dale J, Wexler D, and Handley J. Streptococcal C5a peptidase is a highly specific endopeptidase. Infect Immun. 1992; 60:5219–5223. 29. Clewell DB, Flannagan SE, and Jaworski DD. Unconstrained bacterial promiscuity: the Tn 916 –Tn 1545 family of conjugative transposons. Trends Microbiol. 1995; 3:229–236. 30. Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: Twenty-first informational supplement. CLSI document M100-S21. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne PA: CLSI; 2011. 31. Colakoglu S, Alacam R, Hascelik G. Prevalence and mechanisms of macrolide resistance in Streptococcus pyogenes in Ankara, Turkey. Scand J Infect Dis. 2006; 38(6- 7):456-9. 32. Corso A, Severina EP, Petruk VF, Mauriz YR, and Tomasz A. Molecular characterization of penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae isolates causing respiratory disease in the United States. Microb. Drug Resist. 1998; 4:325–337. 33. Courtney HS, Li Y, Dale JB, and Hasty DL. Cloning, sequencing and expression of a fibronectin/fibrinogen-binding protein from group A streptococci. Infect Immun. 1994; 62:3937–3946. 34. Courtney HA, Hasty DL, Dale JB and Poirer TP. A 29-kilodalton fibronectin binding protein of group A streptococci. Curr Microbiol. 1992; 25:245–250. 35. Creti R, Imperi M, Baldassarri L i sar. emm types, virulence factors and antibiotic resistance of invasive Streptococcus pyogenes isolates from Italy: what has changed in 11 years? J Clin Microbiol. 2007; 45:2249–2256. 36. Cronin WJ, and Lange K. Immunologic evidence for the in situ deposition of a cytoplasmic streptococcal antigen (endostreptosin) on the glomerular basement membrane in rats. Clin. Nephrol. 1990; 34:143. 94 37. Cue D, Dombek PE, Lam H and Cleary PP. Streptococcus pyogenes serotype M1 encodes multiple pathways for entry into human epithelial cells. Infection and Immunity. 1998; 66(10):4593–4601. 38. Cywes C, Wessels MR. Group A Streptococcus tissue invasion by CD44- mediated cell signalling. Nature. 2001; 414:648-52. 39. Dale JB. Multivalent Group A Streptococcal Vaccines. 2000;(20):390-401. 40. Davies HD, McGeer A, Schwartz B, Green K, Cann D, Simor AE, Low DE, and Ontario Streptococcal Study Group. 1996. Invasive group A streptococcal infections in Ontario, Canada. N. Engl. J. Med. 335:547–554. 41. De Aavedo JC, Yeung RH, Bast DJ i sar. Prevalence and mechanisms of macrolide resistance in clinical isolates of group A streptococci from Ontario, Canada. Antimicrob Agents Chemother. 1999; 43:2144-2146. 42. De Rosa R, Avolio M, Stano P, Luisa M, Camporese A. Disappearance of Streptococcus pyogenes macrolides resistance in an area of northeastern Italy: a possible link with rational long-acting macrolide consumption. Infezioni in medicina. 2009; 2(17):82-87. 43. Denny FW. Jr. 2000. History of hemolytic streptococci and associated diseases, p. 1-18. In D. L. Stevens and E. L. Kaplan (ed.), Streptococcal Infections: Clinical Aspects, Microbiology, and Molecular Pathogenesis. Oxford University Press, New York. 44. D’Humières C, Cohen R, Levy C, Bidet P, Thollot F, Wollner A, Bingen E. Decline in macrolide-resistant Streptococcus pyogenes isolates from French children. International Journal of Medical Microbiology. 2012; 7-8(302):300–303. 45. Dicuonzo G, Gherardi G, Lorino G, Angeletti S, DeCesaris M, Fiscarelli E, Bessen DE, and Beall B. Group A streptococcal genotypes from pediatric throat isolates in Rome, Italy. J Clin Microbiol. 2001; 39:1687–1690. 46. Dicuonzo G, Fiscarelli E, Gherardi G, Lorino G, Battistoni F, Landi S, et al. Erythromycin-resistant pharyngeal isolates of Streptococcus pyogenes recovered in Italy. Antimicrob Agents Chemother. 2002; 46:3987-90. 47. Dombek P, Cue D, Sedgewick J, Lam H, Ruschkowski B, Finlay B, and Cleary P. High frequency intracellular invasion of epithelial cells by serotype M1 group A streptococci: M1 mediated invasion and cytoskeletal rearrangements. Mol Microbiol 1999; 31:859–870. 48. Dundar D, Sayan M. and Tamer GS. Macrolide and tetracycline resistance and emm type distribution of Streptococcus pyogenes isolates recovered from Turkish patients. Microb Drug Resist. 2010; 16:279-84. 95 49. Eisner A, Leitner E, Feier G, Kessler HH, Marth E. Prevalence of emm types and antibiotic resistance of group A streptococci in Austria. Diagn Microbiol Infect Dis. 2006; 55:347-350. 50. Ellen RP, and Gibbons RJ. M protein-associated adherence of Streptococcus pyogenes to epithelial surfaces: prerequisite for virulence. Infect Immun. 1972; 5:826– 830. 51. Enright M, Spratt B, Kalia A, Cross J, Bessen D. Multilocus sequence typing of streptococcus pyogenes and the relationships between emm type and clone. Infect Immun. 2001; 69: 2416-2427. 52. Facklam RF, MartinDR, Lovgren M, Johnson DR, Efstratiou A, Thompson TA, Gowan S, Kriz P, Tyrrell GJ, Kaplan E, and Beall B.Extension of the Lancefield classification for group A streptococci by addition of 22 new M protein gene sequence types from clinical isolates: emm103 to emm124. Clin Infect Dis. 2002; 34:28–38. 53. Farell DJ, Shackcloth J, Barbadora KA, Green MD. Streptococcus pyogenes isolates with high level macrolide resistance and reduced susceptibility to telithromycin associated with 23S rRNA mutations. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50:817- 828. 54. Fischetti VA. Protection Against Group A Streptococcal Infection. 2000; (19):371-389. 55. Fischetti VA. Surface proteins on Gram-positive bacteria. In V. A. Fischetti, R. P. Novick, J. J. Ferreti, D. A. Portnoy, and J. I. Rood, editors, Gram positive pathogens, 12-25 (ASM, 2006), 2nd edition. 56. Fox MD, Schwartz RA. Erythema nodosum. Am Fam Physician.1992; 46:818– 822. 57. Friaes A, Pinto FR, Silva-Costa C, Ramirez M, Melo-Cristino J. Group A streptococci clones associated with invasive and pharyngitis in Portugal present differences in emm types, superantigen gene content and antimicrobial resistance. BMC Microbiology. 2012; 12:280. 58. Fujita K, Murono K, Yoshikawa M, Murai T. Decline of erythromycin resistance of group A streptococci in Japan. Pediatr Infect Dis J 1994; 13:1075-1078. 59. Gastanaduy AS, Kaplan EL, Huwe BB, McKay C, Wannamaker LW. Failure of penicillin to eradicate group A streptococci during an outbreak of pharyngitis. Lancet. 1980; 2:498-502. 60. Gatanaduy AS, Kaplan Kim KS, Kaplan EL. Association of penicillin tolerance with failure to eradicate group A streptococci from patients with pharyngitis. J Pediatr. 1985; 107:681-4. 96 61. Gattringer R, Sauermann R, Lagler H, Stich K, Buxbaum A, Graninger W Georgopoulos A. Antimicrobial susceptibility and macrolide resistance genes in Streptococcus pyogenes collected in Austria and Hungary. Int. J Antimicrob Agents. 2004; 24:290–293. 62. Giovanetti E, Brenciani A, Lupidi R i sar. Presence of the tetO gene in erythromycin- and tetracycline-resistant strains of Streptococcus pyogenes and linkage with either the mefA or the ermA gene. Antimicrob Agents Chemother. 2003; 47:2844– 2849. 63. Giovanetti E, Brenciani A, Vecchi M, Manzin A, and Varaldo PE. Prophage association of mef (A) elements encoding efflux-mediated erythromycin resistance in Streptococcus pyogenes. J. Antimicrob. Chemother. 2005; 55:445–451. 64. Giovanetti E, Montanari MP, Mingoia M. et al. Phenotypes and genotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes strains in Italy and heterogeneity of inducibly resistant strains. Antimicrob Agents Chemother. 1999; 43:1935–40. 65. Goossens H, Ferech M, Vander Stichele R, Elseviers M. Outpatient antibiotic use in Europe and association with resistance: a cross-national database study. Lancet. 2005; 365:579–587. 66. Granizio JJ, Aguilar L, casal J i sar. Streptococcus pyogenes resistance to erythromycin in relation to macrolide consumption in Spain (1986-1997). J Antimicrob Chemother. 2000; 46:959–964. 67. Green MD, Beall B, Marcon MJ, Allen CH, Bradley JS, Dashefsky B, Gilsdorf JR, Schutze GE,Smith C, Walter EB, Martin JM, Edwards KM, Barbadora KA, Wald ER. Multicentre surveillance of the prevalence and molecular epidemiology of macrolide resistance among pharyngeal isolates of group A streptococci in the USA. J. Antimicrob. Chemother. 2006; 57:1240–1243. 68. Griffith F. The serological classification of Streptococcus pyogenes. Journal of Hygiene. 1934; 34:542-584. 69. Grivea IN, Al-Lahham A, Katopodis GD, Syrogiannopoulos GA, Reinert RR. resistance to erythromycin and telithromycin in Streptococcus pyogenes isolates obtained between 1999 and 2002 from greek children with tonsillopharyngitis: phenotypic and genotypic analysis. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50:256–261. 70. Hansen LH, Mauvais P, Douthwaite S. The macrolide-ketolide antibiotic binding site is formed by structures in domains II and V of 23S ribosomal RNA. Mol Microbiol. 1999; 31:623-31. 71. Horaud T, Le Bouguenec C, Pepper K. Molecular genetics of resistance to macrolides, lincosamides and streptogramin B (MLS) in streptococci. J Antimicrob Chemother. 1985;16:Suppl A:111–35. 97 72. Hunter PR. and GastonMA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson’s index of diversity. J. Clin. Microbiol. 1988; 26:2465–2466. 73. Ivory D, Folzenlogen D. Post Streptococcal Syndromes, A Rheumatologist Perspective. The Internet Journal of Rheumatology. 2009; 6:2. 74. Jasir A, Tanna A, Noorani A, et al.: High rate of tetracycline resistance in Streptococcus pyogenes in Iran: an epidemiological study. J Clin Microbiol 2000; 38:2103-2107. 75. Johnson DR, Stevens DL, Kaplan EL. Epidemiologic analysis of group A streptococcal serotypes associated with severe systemic infections, rheumatic fever, or uncomplicated pharyngitis. J Infect Dis. 1992; 166:374-82. 76. Johnson D, Kaplan E, VanGheem A, Facklam R, Beall B. Characterization of group A streptococci (Streptococcus pyogenes): correlation of M protein and emm-gene type with T protein agglutination pattern and serum opacity factor. J Med Microbiol. 2006; 55:157-164. 77. Kakourou T, Drosatou P, Psychou F, Aroni K, Nicolaidou P. Erythema nodosum in children: a prospective study. J Am Acad Dermatol. 2001; 44:17–21. 78. Kapur V, Maffei JT, Greer RS, Li LL, Adams GJ and Musser JM. Vaccination with streptococcal extracellular cysteine protease (interleukin-1 beta convertase) protects mice against challenge with heterologous group A streptococci. Microbial pathogenesis. 1994; 16:443-450. 79. Kaplan EL. The group A streptococcal upper respiratory tract carrier state: an enigma. The Journal of pediatrics. 1980; 97:337-345. 80. Kataja J, Huovinen P, Efstratiou A i sar. Clonal relationships among isolates of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes of different geographical origin. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2002; 21:589–595. 81. Kataja J, Huovinen P, Skurnik M i sar. Erythromycin resistance genes in group A streptococci in Finland. Antimicrob Agents Chemother. 1999; 43:48–52. 82. Kotb M. Bacterial pyrogenic exotoxins as superantigens. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8:411–426. 83. Koh EH, Kim S, Lee NY. Decrease of erythromycin resistance in group A streptococci by change of emm distribution. Jpn J Infect Dis. 2008; 61:261–263. 84. Koh EH, Kim S. Decline in erythromycin resistance in group A streptococci from acute pharyngitis due to changes in the emm genotypes rather than restriction of antibiotic use. Korean J Lab. 2010; 30:485–490. 98 85. Koo HK, Baek SC, Ma SH, Lee HJ, Cha SH. Trends of incidence of erythromycin-resistant group A streptococci in Korea from 1998 through 2002. Infect Chemother. 2004; 36:75–82. 86. Kreikmeyer B, Talay SR, and Chhatwal GS. Characterization of a novel fibronectin- binding surface protein in group A streptococci. Mol. Microbiol. 1995; 17:137–145. 87. Kwinn LA. and Nizet V. How group A Streptococcus circumvents host phagocyte defenses. Future Microbiol.2007; 2:75-84. 88. Lancefield RC. A micro precipitin-tehnic for classifying hemolytic streptococci, and improved methods for producing antisera. Proc Soc Exp Biol Med. 1938; 38:473- 478. 89. Lancefield R and ToddE. Antigenic differences between matt hemolytic streptococci and their glossy variants. Journal of Experimental Medicine.1928; 48:769- 790. 90. Lancefield RC. A serological differentiation of human and other groups of streptococci. J. Exp. Med. 1933; 59:441–158. 91. Lancefield RC. Current knowledge of type-specific M antigens of group A streptococci. J Immunol. 1962; 89:307-313. 92. LaPenta D, Rubens C, Chi E, and Cleary PP. Group A streptococci efficiently invade human respiratory epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994; 91:12115– 12119. 93. Leclerq R. Mechanisms of resistance to macrolides and lincosamides: nature of the resistance elements and their clinical implications. Clin Infect Dis. 2002; 34:482– 492. 94. Liebowitz LD, Slabbert M, Huisamen A. National surveillance programme on susceptibility patterns of respiratory pathogens in South Africa: moxifloxacin compared with eight other antimicrobial agents. J Clin Pathol 2003; 56:344-347. 95. Lowbury EJ, Hurst L. The sensitivity of staphylococci and other wound bacteria to erythromycin, oleanomycin and spiramycin. J Clin Pathol. 1959; 12:163-169. 96. Luca-Harari B, Straut M, Cretoiu S, Surdeanu M, Ungureanu V, Van der Linden M, Jasif A. Molecular characterization of invasive and non-invasive Streptococcus pyogenes isolates from Romania. Journal of Medical Microbioloy. 2008; 57:1354–1363. 97. Luca-Harari B. et al. Clinical and Microbiological Characteristics of Severe Streptococcus pyogenes Disease in Europe. J Clin Microbiol. 2009; 47(4):1155–1165. 99 98. Littauer P, Caugant DA, Sangvik M, Hoiby EA, Sundsfjord A. and Simonsen GS. Macrolide-resistant Streptococcus pyogenes in Norway: population structure and resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50:1896-1899. 99. Liu X, Huang G, Fu Z, Zheng Y, Wang L, Li C, Liu L, Shen Y, Yang Y, Liu X, Shen X, Chang H, Huang G, Fu Z, Zheng Y, Wang L, Li C, Liu L, Shen Y, Yang Y. High macrolide resistance in Streptococcus pyogenes strains isolated from children with pharyngitis in China. Pediatric Pulmonology. 2009; 44(5):436 - 441. 100. Lukomski SC, Montgomery A, Rurangirwa J, Geske RS, Barrish JP, Adams GJ, and Musser JM. Extracellular cysteine protease produced by Streptococcus pyogenes participates in the pathogenesis of invasive skin infection and dissemination in mice. Infection and Immunity. 1999; 67:1779-1788. 101. Madden JC, Ruiz N, and Caparon M. Cytolysin-mediated translocation (CMT): a functional equivalent of type III secretion in Grampositive bacteria. Cell. 2001; 104:143-152. 102. Malbruny B, Nagai K, Coquemont M, Boydogan B, Andrasevic AT, Hupkova H i sar. Resistance to macrolides in clinical isolates of Streptococcus pyogenes due to ribosomal mutations. J Antimicrob Chemother. 2002; 49:935-949. 103. Malhotra-Kumar S, Lammens C, Coenen S, Van Herck K, Goossens H. Effect of azithromycin and clarithromycin therapy on pharyngeal carriage of macrolide- resistant streptococci in healthy volunteers: a randomised, double-blind, placebo- controlled study. Lancet. 2007; 369:482–90. 104. Malhotra-Kumar S, i sar. Macrolide- and telithromycin-resistant Streptococcus pyogenes, Belgium, 1999-2003. Emerg, Infect. Dis. 2005; 11:939-942. 105. Malhotra-Kumar S, Mazzariol A, Van Heirstraeten L i sar. Unusual resistance patterns in macrolide-resistant Streptococcus pyogenes harbouring ermA. J Antimicrob Chemother. 2009; 63:42–46. 106. -Trallero E, Ercibengoa M, Gonzalez A, Fenoll A, and the Spanish Pneumococcal Infection Study Network (G03/103). Molecular epidemiology and variants of the multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae Spain14-5 international clone among Spanish clinical isolates. J. Antimicrob. Chemother. 2006; 57:654–660. 107. Maripuu L, Eriksson Aand Norgren M. Superantigen gene profile diversity among clinical group A streptococcal isolates. FEMS Immunol Med Microbiol. 2008; 54:236–244. 108. Martin JM, Green M, Barbadora KA, Wald ER. Erythromycin-resistant group A streptococci in schoolchildren in Pittsburg. N Eng J Med 2002; 346:1200-1206. 100 109. Markowitz M. Rheumatic fever: Recent outbreaks of an old disease. Conn Med. 1987; 51:229. 110. Martin DR, Single LA. Molecular epidemiology of group A streptococcus M type 1 infections. J. Infect. Dis. 1993; 167:1112–1117. 111. Maruyama S, Yoshioka H, Fujita K, Takimoto M, Satake Y. Sensitivity of group A streptococci to antibiotics. Prevalence of resistance to erythromycin in Japan. 1979; 133(11):1143-5. 112. McDougal LK, Tenover F, Lee LN, Rasheed JK, Patterson JE, Jorgensen JH, and Leblanc DJ. Detection of Tn 917 -like sequences within a Tn 916 -like conjugative transposon (Tn 3872) in erythromycin-resistant isolates of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42:2312–2318. 113. McGregor KF, Spratt BG, Kalia A, Benett A, Bilek N, Beall B, Bessen DE. Multiloccus sequence typing of Streptococcus pyogenes representing most known emm types and distinctions among subpopulation genetic structures. J. Bacteriology. 2004; 186:4285–4294. 114. McCormick JK, Yarwood JM, Schlievert PM. Toxic shock syndrome and bacterial superantigens: an update. Annu Rev Microbiol. 2001; 55:77-104. 115. Meleney FI. Hemolytic streptococcus gangrene. Archives of Surgery. 1924; 9:317-364. 116. Mendes C, Marin ME, Quinones F, Sifuentes-Osornio J, Siller CC, Castanheira M i sar. Antibacterial resistance of community-acquired respiratory tract pathogens recovered from patients in Latin America: results from the PROTEKT surveillance study (1999-2000). Braz J Infect Dis. 2003; 7:44-61. 117. Mert A, Ozaras R, Tabak F, Pekmezci S, Demirkesen C, Ozturk R. Erythema nodosum: an experience of 10 years. Scand J Infect Dis. 2004; 36:424–7. 118. Metzgar D. and Zampolli A. The M protein of group A Streptococcus is a key virulence factor and a clinically relevant strain identification marker. Virulence. 2011; 2:402-12. 119. Michos AG, Bakoula CG, Braoudaki M, Koutouzi FI, Roma ES, Pangalis A, Nikolopoulou G, Kirikou E. and Syriopoulou VP. Macrolide resistance in Streptococcus pyogenes: prevalence, resistance determinants, and emm types. Diagn Microbiol Infect Dis. 2009; 64:295-299. 120. Mijač V, Ranin L, Marković M, Heeg C, Reinert RR, Opavski N. Distribution of emm types among group A streptococcal isolates from Serbia. Clin Microbiol Infect 2010; 16:295-298. 101 121. Mijač V, Opavski N, Marković M, Gajić I, Vasiljević Z, Šipetić T, Bajčetić M. Trends in macrolide resistance of respiratory tract pathogens in pediatric population in Serbia from 2004 to 2009. Epidemiology and Infection. 2014 (in press). 122. Montes M. Orden B. Tamayoa E. Alos J.I. Pérez-Trallero E. Characterisation of the main clones of Streptococcus pyogenes carrying the ermA (subclass TR) gene in Spain. Int. J. Antimicrob. Agents. 2006; 28:408–412. 123. Nakae M, Murai T, Kaneko Y, Mitsuhashi S. Drug resistance in Streptococcus pyogenes isolated in Japan (1974–1977) Antimicrob Agents Chemother. 1977;12:427– 428. 124. Nandi S, Ganguly NK, Kumar R, Bakshi DK, Sagar V, Chakraborti A. Genotyping of group A streptococcus by various molecular methods. Indian J Med Res. 2008; 127:71-77. 125. Nelson K, Schlievert PM, Selander RK, and Musser JM. Characterization and clonal distribution of four alleles of the speA gene encoding pyrogenic exotoxin A (scarlet fever toxin) in Streptococcus pyogenes. J. Exp. Med. 1991; 174:1271–1274. 126. Nielsen HU, Hammerum AM, Ekelund K, Bang D, Pallesen LV. and Frimodt- Moller N. Tetracycline and macrolide co-resistance in Streptococcus pyogenes: co- selection as a reason for increase in macrolide-resistant S. pyogenes? Microb Drug Resist. 2004; 10:231-238. 127. Nir-Paz R, Block C, Shasha D i sar. Macrolide, lincosamide and tetracycline susceptibility and emm characterisation of invasive Streptococcus pyogenes isolates in Israel. Int J Antimicrob Agents. 2006; 28:313-319. 128. Nir-Paz R, Korenman Z, Ron M, Michael-Gayego A, Cohen-Poradosu R, Valinsky L, Beall B. and Moses AE. Streptococcus pyogenes emm and T types within a decade, 1996-2005: implications for epidemiology and future vaccines. Epidemiol Infect. 2006; 138:53-60. 129. Oda T, Yamakami K, Omasu F, Suzuki S, Miura S, Sugisaki T, Yoshizawa N. Glomerular plasmin-like activity in relation to nephritis- associated plasmin receptor in acute poststreptococcal glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 2005; 16:247–254. 130. Okada N, Liszevski MK, Atkinson JP, Caparon M. Membrane cofactor protein (CD46) is a keratinocyte receptor for the M protein of the group A streptococcus. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92:2489-2493. 131. Olive C, Schulze K, Sun HK, Ebensen T, Horvath A, Toth I. and Guzman CA. Enhanced protection against Streptococcus pyogenes infection by intranasal vaccination with a dual antigen component M protein/SfbI lipid core peptide vaccine formulation. Vaccine. 2007; 25:1789-1797. 102 132. Palmieri C, Vecchi M, Littauer P i sar. Clonal spread of macrolide- and tetracycline-resistant (ermA tetO) emm77 Streptococcus pyogenes isolates in Italy and Norway. Antimicrob Agents Chemother. 2006; 50:4229–4230. 133. Pandey M, Sekuloski S. and Batzloff MR. Novel strategies for controlling Streptococcus pyogenes infection and associated diseases: from potential peptide vaccines to antibody immunotherapy. Immunology and cell biology. 2009; 87:391-399. 134. Pavlovic Lj, Grego E, and Sipetic-Grujicic S. Prevalence of Macrolide Resistance in Streptococcus pyogenes Collected in Serbia. Jpn. J. Infect. Dis. 2010; 63 (4):275-276. 135. Pe´rez-Trallero E, Martin Herrero M, Mayon A i sar. Antimicrobial resistance among respiratory pathogens in Spain: latest data and changes over 11 years (1996-1997 to 2006-2007). Antimicrob Agents Chemother. 2010; 54;2953-2959. 136. Pe´rez-Trallero E, Montes M, Orden B, Tamayo E, Jose´ M. Garcı´a-Arenzana, and Marimo´n JM. Phenotypic and Genotypic Characterization of Streptococcus pyogenes Isolates Displaying the MLSB Phenotype of Macrolide Resistance in Spain, 1999 to 2005. Antimicrob Agents Chemother. 2007; 51;1228–1233. 137. Peterson PK, Schmeling D, Cleary PP, Wilkinson BJ, Kim Y, Quie PG. Inhibition of alternative complement pathway opsonization by group A streptococcal M protein. J Infect Dis. 1979; 139(5):575–585. 138. Podbielski A, Melzer B, and Lu¨tticken R. Application of the polymerase chain reaction to study the M protein(-like) gene family in beta hemolytic streptococci. Med. Microbiol. Immunol. 1991; 180:213–227. 139. Poon-King R, Bannan J, Viteri A, Cu G, Zabriskie JB: Identification of an extracellular plasmin binding protein from nephritogenic streptococci. J Exp Med.1993; 178:759– 763. 140. Porat N, Leibowitz E, Dagan R, Coman G, Sfartz S, Peled N, Trefler R, and Tomasz A.. Molecular typing of Streptococcus pneumoniae in northeastern Romania: unique clones of S. pneumoniae isolated from children hospitalized for infections and from healthy and human immuno-deficiency virus-infected children in the community. J. Infect. Dis. 2000; 181:966–974. 141. Proft T, Moffatt SL, Berkahn CJ, and Fraser JD. Identification and characterization of novel superantigens from Streptococcus pyogenes. J. Exp. Med. 1999; 189:89–101. 142. Ranin L, Opavski N, Đukić S, Mijač V. Epidemiology of diseases caused by Streptococcus pyogenes in Serbia during a nine-year period (1991-1999). 2004; 119:155-159. 103 143. Reinert RR, Lutticken R, Sutcliffe JA, Tait-Kamradt A, Cil MY, Schorn HM, Bryskier A. and Al-Lahham A. Clonal relatedness of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes isolates in Germany. Antimicrob Agents Chemother. 2004; 48: 1369-73. 144. Reinert RR, Franken C, Van der Linden M, Lutticken R, Cil M, Al Lahham A. Molecular characterisation of macrolide resistance mechanisms of Streptococcus pneumoniae and Streptococcus pyogenes isolated in Germany, 2002–2003. Int. J. Antimicrob. Agents 2004; 24:43–47. 145. Rice LB. Tn916 family conjugative transposons and dissemination of antimicrobial resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother. 1998; 42:1871- 1877. 146. Richter SS, Heilmann KP, Dohrn CL, Beekmann SE, Riahi F, Garcia-de-Lomas J, Ferech M, Goossens H. and Doern GV. Increasing telithromycin resistance among Streptococcus pyogenes in Europe. J Antimicrob Chemother. 2008; 61:603-11. 147. Rivera A i sar. Superantigen gene profile, emm type and antibiotic resistance genes among group A streptococcal isolates from Barcelona, Spain. J. Med. Microbiol. 2006; 55:1115-1123. 148. Rogers S, Commons R, Danchin MH, Selvaraj G, Kelpie L, Curtis N, Robins- Brown R, Carapetis J. Strain prevalence, rather than innate virulence potential, is the major factor responsible for an increase in serious group A streptococcus infections. J Infect Dis. 2007; 195 (11): 1625-1633. 149. Rubio-Lopez V, Valdezate S, Alvarez D, Villalon P, Medina MJ, Salcedo C. and Saez-Nieto JA. Molecular epidemiology, antimicrobial susceptibilities and resistance mechanisms of Streptococcus pyogenes isolates resistant to erythromycin and tetracycline in Spain (1994-2006). BMC Microbiol. 2012; 12:215. 150. Sauermann R, Gattringer R, Graninger W, Buxbaum A, Georgopoulos A. Phenotypes of macrolide resistance of group A streptococci isolated from outpatient in Bavaria and susceptibility to 16 antibiotics. J Antimicrob Chemother. 2003; 51:53-57. 151. Schnappinger D, and W. Hillen. Tetracyclines: antibiotic action, uptake, and resistance mechanisms. Arch. Microbiol. 1996; 165:359–369. 152. Schrager HM, Alberti S, Cywes C, Dougherty GJ. and Wessels MR. Hyaluronic acid capsule modulates M protein-mediated adherence and acts as a ligand for attachment of group A streptococcus to CD44 on human keratinocytes. Journal of Clinical Investigation. 1998; 101(8):1708–1716. 153. Schulze K, Medina E, Chhatwal GS. and Guzman CA. Stimulation oflong- lasting protection against Streptococcus pyogenes after intranasal vaccination with non adjuvanted fibronectin-binding domain of the SfbI protein. Vaccine. 2003; 21:1958- 1964. 104 154. Schwartz M. 1996. Historical Streptococci, p. 1-2. In T. Horaud (ed.), Streptococci and the Host. 155. Seppala H, He Q, Osterblad M, and Huovinen P. Typing of group A streptococci by random amplified polymorphic DNA analysis. J. Clin. Microbiol. 1994; 32:1945– 1948. 156. Seppala H, Klaukka T, Vuopio-Varkila J, Muotiala A, Helenius H, Lager K, i sar. The effect of changes in the consumption of macrolide antibiotics on erythromycin resistance in group A streptococci in Finland. N Eng J Med. 1997; 337:441–446. 157. Seppälä H, Nissinen A, Järvinen H, Huovinen S, Henriksson T, Herva E, Holm SE, Jahkola M, Katila ML, Klaukka T, Klaukka T, Kontiainen S, Liimatainen O, Oinonen S, Passi-Metsomaa L, and Huovinen P. Resistance to erythromycin in group A streptococci. N Engl J Med. 1992; 30;326(5):292-7. 158. Seppala H, Qiushui He I, Osterblad M, Huovinen P. Typing of Group A Streptococci by Random Amplified Polymorphic DNA Analysis. Journal of clinical microbiology. 1994; 8 (32): 1945-1948. 159. Sherman JM. The streptococci. Bacteriol. Rev. 1937; 1:3–97. 160. Shottmuller H. Die Artunterscheidung der fur den menschen Pathogen Streptokokken durch Blutagar. Munch. Med. Wochenschr. 1903; 50:849-853. 161. Shulman S, Tanz R and Gerber M. Streptococcal Pharyngitis, 2000.p. 76-101. In D. Stevens and E. Kaplan (ed.), Streptococcal Infections. 162. Silva FG. 1998. Acute postinfectious glomerulonephritis and glomerulonephritis complicating persistent bacterial infection, p. 389–453. In J. C. Jennette, J. L. Olson, M. M. Schwartz, and F. G. Silva (ed.), Hepinstall’s pathology of the kidney, 5th ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa. 163. Silva-Costa C, Pinto FR, Ramirez M, Melo-Cristino J, study group. Decrease in macrolide resistance and clonal instability among Streptococcus pyogenes in Portugal. Clin Microbial Infect. 2008; 14:1152–1159. 164. Silva-Costa C, Ramirez M, Melo-Cristino J. Rapid inversion of the prevalences of macrolide resistance phenotypes paralleled by a diversification of T and emm types among Streptococcus pyogenes in Portugal. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49:2109–2111. 165. Smeesters PR, McMillan DJ, Sriprakash KS. The streptococcal M protein: a highly versatile molecule. Trends Microbiol.2010; 18:275–282. 166. Stathi A, Papaparaskevas J, Zachariadou L, Pangalis A, Legakis NJ, Tseleni- Kotsovili A. and Tassios PT. Prevalence of emm types 1 and 12 from invasive 105 Streptococcus pyogenes disease in Greece--results of enhanced surveillance. ClinMicrobiol Infect. 2008; 14: 808-12. 167. Stevens DL. Group A beta-hemolytic streptococci: virulence factors, pathogenesis, and spectrum of clinical infections. In: Stevens DL and Kaplan EL (ed.), Streptococcal infections: clinical aspects, microbiology, and molecular pathogenesis, Oxford University Press, 2000. p. 19-36. 168. Stevens DL. Invasive group A streptococcus infections. Clin Infect Dis. 1992; 14:2-13. 169. Stevens DL. 2000. Life-threatening streptococcal infections: scarlet fever, necrotizing fasciitis, myositis, bacteremia, and streptococcal toxic shock syndrome, p. 163-179. In D. L. Stevens and E. L. Kaplan (ed.), Streptococcal Infections: Clinical Aspects, Microbiology, and Molecular Pathogenesis. Oxford University Press, New York. 170. Steer AC, Law I, Matatolu L, Beall BW, Carapetis JR. Global emm type distribution of group A streptococci: systematic review and implications for vaccine development. Lancet Infect Dis. 2009; 9:611-616. 171. Stollerman GH. 1975. Rheumatic fever and streptococcal infection, p. 1–303. In G. H. Stollerman (ed.), Clinical cardiology monographs. Grune and Stratton, New York, N.Y. 172. Stollerman GH, Dale JB. The importance of the group a streptococcus capsule in the pathogenesis of human infections: a historical perspective. Clin Infect Dis. 2008; 46:1038-45. 173. Sun H, Ringdahl U, Homeister JW, Fay WP, Engleberg NC, Yang AY, Rozek LS, Wang X, Sjobring U, and Ginsburg D. Plasminogen is a critical host pathogenicity factor for group A streptococcal infection. Science. 2004; 305:1283-1286. 174. Szczypa K, Sadowy E, Izdebski R, Hryniewicz W. A rapid increase in macrolide resistance in Streptococcus pyogenes isolated in Poland during 1996–2002. J. Antimicrob. Chemother. 2004; 54:828–831. 175. Talay SR, Zock A, Rohde M, Molinari G, Oggioni M, Pozzi G, Guzman CA. and Chhatwal GS.Co-operative binding of human fibronectin to Sfbl protein triggers streptococcal invasion into respiratory epithelial cells. Cell Microbiol. 2000; 2:521–535. 176. Talay SR, Valentin-Weigand P, Jerlström PG, Timmis KN, Chhatwal GS Fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes: sequence of the binding domain involved in adherence of streptococci to epithelial cells. Infect Immun. 1992; 60(9):3837-44. 106 177. Tylewska S, Hjertén S, and Wadström T. Effect of subinhibitory concentrations of antibiotics on the adhesion of Streptococcus pyogenes to pharyngeal epithelial cells. Antimicrob Agents Chemother. 1981; 20(5):563–566. 178. Valentin-Weigand P, Grulich-Henn J, Chhatwal GS, Muller-Berghaus G, Blobel H, and Preissner KT. Mediation of adherence of streptococci to human endothelial cells by complement S protein (vitronectin). Infect. Immun. 1988; 56:2851–2855. 179. Van Heirstraeten L, Coenen S, Lammens C, Hens N, Goossens H. and Malhotra- Kumar S. Antimicrobial drug use and macrolide-resistant Streptococcus pyogenes, Belgium. Emerg Infect Dis. 2012; 18: 1515-8. 180. Varaldo PE, Montanari MP. and Giovanetti E. Genetic elements responsible for erythromycin resistance in streptococci. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53:343- 53. 181. Veasy LG, Tani LY, Daly JA, Korgenski K, Miner L, Bale J, Kaplan EL, Musser JM, and Hill HR. Temporal association of the appearance of mucoid strains of Streptococcus pyogenes with a continuing high incidence of rheumatic fever in Utah. Pediatrics. 2004; 113:168–172. 182. Vilhelmsson SE, Tomasz A, and Kristinsson KG. Molecular evolution in a multidrug-resistant lineage of Streptococcus pneumoniae: emergence of strains belonging to the serotype 6B Icelandic clone that lost antibiotic resistance traits. J. Clin. Microbiol. 2000; 38:1375–1381. 183. Visai L, Bozzini S, Raucci G, Toniolo A, and Speziale P. Isolation and characterization of a novel collagen-binding protein from Streptococcus pyogenes strain 6414. J. Biol. Chem. 1995; 270:347–353. 184. Weiss K, De Azavedo J, Restieri C. et al. Phenotypic and genotypic characterization of macrolide-resistant group A treptococcus strains in the province of Quebec, Canada. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2001; 47:345–348. 185. Weber P, Filipecki J, Bingen E, Fitoussi F, Goldfarb G, Chauvin JP, Reitz C. and Portier H. Genetic and phenotypic characterization of macrolide resistance in group A streptococci isolated from adults with pharyngo-tonsillitis in France. J Antimicrob Chemother. 2001; 48:291–294. 186. Wilson AT. The relative importance of the capsule and the M-antigen in determining colony form of group A streptococci. Journal of Experimental Medicine, 1959; 109(3):257–270. 187. Villasenor-Sierra A, Katahira E, Jaramillo-Valdivia AN, De los Angeles Barajas-Garcia M, Bryant A, Morfin-Otero R, Marquez-Diaz F, Tinoco HC, Sanchez- Corona J, Stevens DL. Phenotypes and genotypes of erythromycin-resistant Streptococcus pyogenes strains isolated from invasive and non-invasive infectious from Mexico and the USA during 1999-2010. Inf J Infect Dis. 2012; 16(3):178-181. 107 188. York MK, Gibbs L, Perdreau-Remington F, and Brooks GF. Characterization of antimicrobial resistance in Streptococcus pyogenes isolates from the San Francisco Bay Area of Northern California. J. Clin. Microbiol. 1999; 37:1727-1731. 189. Zampaloni C, Cappelletti P, Prenna M, Vitali LA, Rips S. emm gene distribution among erythromycin-resistant and –susceptible Italian isolates of Streptococcus pyogenes. 2003; 41:1307-1310. 8. Skraćenice 108 8. Skraćenice APC – antigen-prezentujuće ćelije APGN – akutni post-streptokokni glomerulonefritis apoAI – apolipoprotein AI ARG – akutna reumatska groznica ASO test – antistreptolizin O test ATCC – američka kolekcija kultura sojeva (engl. American type culture collection) bp – bazni parovi BHS – beta hemolitički streptokok CDC – Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (engl. Centers for disese control and prevention) CI – interval poverenja (engl. confidence interval) DNK – dezoksiribunukleinska kiselina EUCAST – evropsko udruženje za testiranje antimikrobne osetljivosti (engl. the european committee on antimicrobial susceptibility testing) FBP54 – fibronektin vezujući protein 54 (engl. fibronectin binding protein 54) GAS – grupa A streptokoka (engl. group A streptococci) IFN-γ – interferon gama IL – interleukin KKA – Kolumbija krvni agar McF – McFarland MHC – glavni kompleks histokompatibilnosti (engl. major histocompatibility complex) MHKA – Müller-Hinton krvni agar MIK – minimalna inhibitorna koncentracija MLS – makrolidi, linkozamidi i streptogramini MLST – tipizacija na osnovu sekvenci visoko konzerviranih lokusa (engl. multilocus sequence typing) μm – mikrometar MRGAS – grupa A streptokoka rezistentna na makrolidne antibiotike (engl. macrolide resistant group A streptococci) NAPlr – plazmin receptor udružen sa nefritisom (engl. nephritis associated plasmin receptor) NF – nekrotizirajući fascitis 109 PBS – fosforilisani fiziološki rastvor (engl. phosphated buffer saline) PCR – reakcija lančanog umnožavanja (engl. polimerase chain reaction) PFGE – elektroforeza u pulsirajućem električnom polju (engl. pulsed-field gel electrophoresis, PFGE) PYR – pirolidonil-arilamidaza (engl. pyrrolidonyl-arylamidase) RAPD – nasumično umnožavanje polimorfne DNK (engl. randomly amplified of polymorphic DNA, RAPD) rpm – broj obrtaja u minuti (engl. rotation per minute) SfbI – streptokokni fibronektin vezujući protein I (engl. streptococcal fibronectin binding protein I) SLO – streptolizin O SLS – streptolizin S SMEZ – streptokokni mitogeni egzoprotein Z SOF – factor zamućenja (engl. serum opacity factor) Spe – streptokokni pirogeni egzotoksin SSA – streptokokni superantigen (engl. streptococcal superantigen) ST – tip sekvence (engl. sequence type) STŠS – streptokokni toksični šok sindrom (engl. streptococcal toxic shock syndrome) TA – temperatura na kojoj se vezuju prajmeri za DNK(engl. annealing temperature) TAE pufer – rastvor pufera koji sadrži Tris baze, sirćetnu kiselinu i EDTA Taq polimeraza – termostabilna DNK polimeraza izolovana iz termofilne bakterije Thermus aquaticus TCR – T ćelijski receptor Tm – temperatura topljenja (engl. melting temperature) Tn – transpozon TNF – faktor nekroze tmora (engl. tumor necrosis factor) TRGAS – grupa A streptokoka rezistentna na tetracikline (engl. tetracycline resistant group A streptococci) V – volt BIOGRAFIJA Dr Ina Gajić je rođena 07.05.1980. godine u Beogradu. Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je 1999. godine, a diplomirala je 2006. godine sa srednjom ocenom 9,29. Dr Gajić je završila obavezni lekarski staž u KC Srbije. Od 2009. godine radi u Nacionalnoj laboratoriji za streptokok, Institutu za mikrobiologiju i imunologiju, Medicinskog fakulteta u Beogradu, gde pored konvencionalnih mikrobioloških tehnika primenjuje i metode molekularne biologije. Iste godine je upisala doktorske studije iz oblasti Molekularna medicina na Medicinskom fakultetu, pod mentorstvom prof. dr Nataše Opavski. Od januara 2011. godine radi kao istraživač-saradnik na projektu finansiranom od strane Ministarstva prosvete i nauke br. 175039 - Bakterije rezistentne na antibiotike u Srbiji: fenotipska i genotipska karakterizacija. Od novembra 2011. godine, uključuje se u nastavnu delatnost Instituta za mikrobiologiju i imunologiju, kao saradnik u nastavi u okviru predmeta Mikrobiologija i Klinička mikrobiologija. U isto zvanje ponovo je izabrana u novembru 2012. godine. Specijalističke studije iz Medicinske mikrobiologije je upisala 2012. godine. Iste godine je boravila u referentnoj laboratoriji za pneumokok u Ljubljani, u Institutu za javno zdravlje Slovenije, radi obuke za serotipizaciju pneumokoka. U zvanje asistenta je imenovana 2013. godine. Uključena je u redovan, konsultativni rad sa pacijentima u ambulanti Instituta, u domenu bakterijskih infekcija. Dr Gajić je bila predavač na stručnom sastanku u organizaciji SLD, pod nazivom „Fenotipovi makrolid-rezistentnih invazivnih sojeva Streptococcus pneumoniae“, i na kontinuiranoj medicinskoj edukaciji „Streptococcus pneumoniae – mikrobiološka dijagnostika i prevencija bolesti“. Dr Ina Gajić je autor i koautor pet originalnih radova objavljenih in extenso u časopisima sa JCR liste i brojnih radova koji su štampani u formi izvoda u zbornicima međunarodnih i nacionalnih naučnih skupova.