UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Nela S. Maksimović ANALIZA POLIMORFIZAMA GENA ZA APOE, BDNF, BCHE I KIBRA I NJIHOVA KORELACIJA SA MEMORIJSKIM SPOSOBNOSTIMA U POPULACIJI STUDENATA DOKTORSKA DISERTACIJA Beograd, 2014 Mentor: Prof. dr Ivana Novaković Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu Članovi komisije za odbranu doktorske disertacije: 1. Prof. dr Ljiljana Luković Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 2. Prof. dr Elka Stefanova Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 3. Doc. dr Branka Popović Stomatološki fakultet Univerziteta u Beogradu Zahvaljujem: Mojoj mentorki, profesorki dr Ivani Novaković, na ukazanom poverenju, na velikoj i nesebičnoj stručnoj pomoći i razumevanju tokom izvoĎenja molekularno-genetičkih analiza, obrade rezultata, pisanja i finalnog oblikovanja rada; Profesorki dr Elki Stefanovoj na velikoj pomoći i podršci prilikom sprovoĎenja ovog istraţivanja; Osoblju Instituta za humanu genetiku Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu na savetima i stručnoj pomoći u laboratorijskom radu; Profesorki dr Jeleni Marinković na dragocenim sugestijama i statističkoj obradi rezultata; Beskrajno, svojoj porodici na razumevanju, strpljenju i podršci SAŢETAK Memorija predstavlja sposobnost privremenog ili trajnog skladištenja i prizivanja informacija stečenih iskustvom ili aktivnim učenjem i ima multifaktorsku osnovu. Procenjuje se da heritabilnost memorijskih sposobnosti iznosi oko 50% što ukazuje na značajan uticaj genetske osnove na individualnu varijabilnost u memorijskim sposobnostima. U ovom radu analizirali smo polimorfizme: rs6265 u genu za moţdani faktor rasta (BDNF), rs7412/rs429358 u genu za apolipoprotein E (APOE), rs1803274 u genu za butirilholin esterazu (BCHE) i rs17070145 u genu za protein KIBRA. Cillj istraţivanja bio je da utvrdimo učestalost odgovarajućih genotipova i alela, analiziramo da li postoji statistički značajna povezanost utvrĎenih genotipova sa podacima dobijenim iz upitnika (demografski i socioekonomski podaci, uspeh tokom školovanja) i analiziramo da li postoji statistički značajna povezanost genotipova sa rezultatima testova opštih kognitivnih sposobnosti, paţnje, radne i epizodičke memorije. Studija je obuhvatila ukupno 560 studenata Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Za detekciju genskih polimorfizama u APOE, BDNF i BCHE genu primenili smo PCR-RFLPs metodu. Detekcija genotipova polimorfizma u genu za protein KIBRA izvršena je primenom standardizovanog TaqMan SNP Genotyping eseja. Baterija neuropsiholoških testova obuhvatila je Raven-ove standardne progresivne matrice, test ponavljanja cifara, Rey-ov test auditivno-verbalnog učenja, i Vekslerovu revidiranu skalu pamćenja-subtest logičke memorije. Dobijeni rezultati pokazali su da nosioci A alela (tj. K varijante) BCHE rs1803274 polimorfizma postiţu značajno bolje rezultate na testu paţnje/radne memorije (p=0.019). TakoĎe, uočeno je i da nosioci A alela (tj. Met alela na nivou proteina) BDNF polimorfizma rs6265 postiţu značajno bolje rezultate na subtestu logičke memorije (p=0.039). Nije uočena asocijacija BCHE i BDNF polimorfizma sa drugim tipovima memorije kao ni sa podacima dobijenim iz upitnika. Analiza polimorfizama u KIBRA i APOE genu nije pokazala statistički značajnu povezanost sa rezultatima ostvarenim na testovima memorijskih sposobnosti, niti uspehom ostvarenim tokom školovanja. Kljuĉne reĉi: polimorfizmi gena, APOE, KIBRA, BDNF, BCHE, epizodička memorija, paţnja, radna memorija, opšte kognitivne sposobnosti Nauĉna oblast: medicina; uţa nauĉna oblast: molekularna medicina Analysis of polymorphisms in APOE, BDNF, BCHE and KIBRA genes and their correlation with memory performance in the population of students ` ABSTRACT Human memory represents the capability of temporary or permanent storage and retrieval of informations. Memory is multifactorial trait with heritabilty around 50%. High heritability shows the improtance of genetic basis of individual differences in memory performance. In our research we analysed rs6265 polymorphism in gene encoding brain derived neuritrophic factor (BDNF), rs7412/rs1803274 in gene coding for apolipoprotein E (APOE), rs1803274 in butyrylcholineseterase (BCHE) gene and rs17070145 in the gene coding for KIBRA protein. The aim of our research was to detect the frequency of genotypes and alleles of analysed polymorphisms, to analyse the association between genotypes and demografic and socioeconomic data obtained from the questionary and to analyse the association between genotypes and results of battery of neuropsychological tests. Our study included population of 560 students of Faculty of Medicine, University of Belgrade. For detection of APOE, BDNF and BCHE polymorphism genotypes we used PCR/RFLPs method and for KIBRA polymorphism TaqMan SNP Genotyping assay. Battery of neuropsychological test included Raven standard progressive matrices, Digit ordering test, Rey auditory verbal learning test and Wechsler revised subtest of logical memory. Our results showed that there was no correlation between genotypes of analysed polymorphisms and demografic and socioeconomic data. Carriers of A alelle (or K variant) of BCHE rs1803274 polymorphism achieved significantly better results on Digit ordering test (p=0.019) while carriers of A allele (or Met allele on protein level) of BDNF rs6265 polymorphism had significantly better results on Wechslers subtest of logical memory (p=0.039). We found no association between APOE and KIBRA polymorphism and memory performance or results obtained from the questionary. Key words: gene polymorphism, APOE, KIBRA, BDNF, BCHE, episodic memory, attention, working memory scientific area: medicine; narrow area of expertise: molecular medicine SADRŢAJ UVOD 1 1. MEMORIJA 1 1.1. Faktori koji utiču na memorijske sposobnosti 9 2. GENETIĈKI FAKTORI KOJI UTIĈU NA MEMORIJSKE SPOSOBNOSTI 12 2.1. Poligenska osnova memorijskih sposobnosti 12 2.1.1. Polimorfizmi DNK- genski polimorfizmi 12 2.1.2. Tipovi polimorfizama i mehanizam njihovog nastanka 13 2.1.3. Primena DNK polimorfizama u identifikaciji gena odgovornih za poligenska svojstva kod čoveka 15 3. MOŢDANI FAKTOR RASTA (BDNF) 20 3.1. Struktura BDNF gena i proteina 20 3.2. Polimorfizmi gena za BDNF 22 3.3. Funkcija BDNF-a 24 4. KIBRA 29 4.1. Struktura gena i proteina 29 4.2. Polimorfizam u genu za KIBRA protein 30 4.3. Funkcija KIBRA proteina 30 5. APOLIPOPROTEIN E (APOE) 35 5.1. Struktura gena i proteina 35 5.2. Polimorfizmi APOE gena 36 5.3. Funkcija APOE proteina 37 5.4. Uloga APOE u memorijskim procesima 40 5.5. Uloga APOE u Alchajmerovoj bolesti 41 6. BUTIRILHOLIN ESTERAZA - BCHE 45 6.1. Struktura gena i proteina 45 6.2. Polimorfizmi BCHE gena 46 6.3. Funkcija BChE 48 6.4. Uloga BChE u Alchajmerovoj bolesti 50 CILJEVI RADA 52 ISPITANICI I METODE 53 7. ISPITANICI 53 8. METODE MOLEKULARNO-GENETIČKE ANALIZE 54 8.1. Izolacija DNK iz limfocita periferne krvi 54 8.2. PCR metoda i restrikciona digestija PCR produkata (PCR- RFLPs metoda) 55 8.2.1. Analiza polimorfizma G196A (rs6265) gena za BDNF 56 8.2.2. Analiza polimorfizama 128/158 (rs7412/rs429358) gena za APOE 58 8.2.3. Analiza polimorfizma rs1803274 gena za BCHE 60 8.3. PCR u realnom vremenu (Real Time PCR) 61 8.3.1. Analiza polimorfizma rs 17070145 gena za KIBRA protein 63 9. NEUROPSIHOLOŠKA BATERIJA TESTOVA 64 10. STATISTIČKE METODE 66 REZULTATI 67 11.. Analiza podataka dobijenih iz upitnika 67 12. Analiza rezultata testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti 70 12.1. Rezultati molekularno-genetičkih analiza – BDNF rs6265 genotip 71 12.2. Rezultati molekularno-genetičkih analiza-KIBRA rs17070145 genotip 78 12.3 Rezultati molekularno-genetičkih analiza APOE genotip rs7412/rs429358 90 12.4. Rezultati genetičkih analiza-BCHE rs1803274 genotip 97 DISKUSIJA 110 13. Analiza BDNF Val66Met polimorfizma u populaciji studenata 112 14. Analiza KIBRA polimorfizma u populaciji studenata 117 15. Analiza APOE polimorfizama u populaciji studenata 121 16. Analiza BCHE polimorfizma u populaciji studenata 127 ZAKLJUĈAK 131 LITERATURA 134 1 UVOD 1. MEMORIJA Memorija je osnovni dinamični kognitivni sistem koji predstavlja sposobnost privremenog ili trajnog skladištenja i prizivanja informacija stečenih iskustvom ili aktivnim učenjem. To je fundamentalna kognitivna sposobnost koja ljudskom ţivotu daje smisao, kontinuitet i kontekst (1). Vaţno je napomenuti da se u srpskom jeziku pored pojma memorija koristi i pojam pamćenje. Neki autori prave razliku izmeĎu ova dva pojma. Po njima, pojam pamćenja obuhvata proces zapamćivanja-učenja, prisećanja-izvlačenja sadrţaja memorije, proces autobiografskog sećanja itd., dok se terminom memorija označavaju strukturni aspekti funkcije pamćenja. Ova pojmovna dihotomija nije načelna jer je razmatranje procesa pamćenja odvojeno od strukture memorije praktično nemoguće pa stoga korišćenje ovih termina na predloţeni način nije uvek dosledno (2). MeĎu istraţivačima je postignut koncenzus da memoriju ne treba posmatrati kao jedan entitet već kao grupu odvojenih memorijskih sistema koji meĎusobno interaguju. Stiven Rous (Steven Rous) ukazuje da je nemoguće ispitati koji deo mozga je odgovoran za memoriju, jer je pamćenje vlasništvo mozga kao celine, a ne nekog odreĎenog područja (3). Današnja saznanja o neuroanatomskim osnovama memorije zasnivaju se na rezultatima neuropsiholoških studija na pacijentima sa fokalnim lezijama mozga, neuroanatomskih studija na ljudima i ţivotinjama, eksperimenata na ţivotinjama, rezultata dobijenih primenom pozitronske emisione tomografije, funkcionalne magnetne rezonance i evociranih potencijala. Analiza dobijenih rezultata pokazala je da funkcionisanje različitih memorijskih sistema zavisi od različitih neuroanatomskih struktura. Duţina trajanja informacije uskladištene u memorijskim sistemima varira u rasponu od delova sekunde do ţivotnog veka a kapacitet, kako se čini moţe prevazilaziti i najmoćnije danas napravljene računare. Savremena psihologija pravi razliku izmeĎu psihološki i neurofiziološki različitih tipova pamćenja u odnosu na duţinu čuvanja informacija u pojedinim memorijskim sistemima (grafikon 1.): 2  Senzorno pamćenje - traje samo onoliko koliko i senzorni procesi prilikom doţivljavanja sadrţaja, sastavni je deo procesa opaţanja  Kratkotrajno pamćenje - traje nešto duţe - do nekoliko minuta, sluţi za brzo kodiranje i selekciju informacija, ograničenog je kapaciteta i  Dugotrajno pamćenje - trajno ili bar relativno trajno, neograničenog kapaciteta, predstavlja skladište informacija povezanih u sistem uglavnom po smislu ili značenju. Senzorno pamćenje Informacije iz spoljašnje sredine najpre stiţu u skladišta senzornog pamćenja (vidnog - ikoničkog, slušnog – ehoičkog, taktilnog - haptičkog pamćenja), gde se zadrţavaju svega nekoliko milisekundi. U vizuelnom modalitetu informacija se zadrţava oko 250 msec., a u akustičkom oko 2 sec. pa se ova komponenta pamćenja naziva još i ultrakratkoročnim pamćenjem (4). Ispoljava se kao postojanje kratke naknadne slike, zvuka ili nekog drugog osećaja (ukus, miris, dodir) nakon što je draţ već prestala da deluje na odgovarajuće čulo (2). Senzorna memorija predstavlja jednu od raskrsnica, budući da se informacija ili gubi ili u zavisnosti od vaţnosti prenosi u kratkoročno pamćenje. S obzirom na to da se senzorno pamćenje brzo gasi, interval u kome se informacija mora prepoznati, klasifikovati i odrediti joj smisao da ne bi zauvek bila izgubljena je izuzetno kratak. Ovaj vid pamćenja najbrţe i najlakše prelazi u zaboravljanje i samo mali deo memorisanog sadrţaja prelazi u kratkotrajno pamćenje. Kratkoroĉno (kratkotrajno) pamćenje U kratkoročnom pamćenju informacija se zadrţava 30-45 sekundi, nakon čega se ili gubi ili prenosi u dugoročno pamćenje i tamo pretvara u trajni memorijski zapis. Od naročite je vaţnosti istaći činjenicu da od ponavljanja primljenih informacija zavisi da li će se sadrţaj izgubiti (zaboraviti) ili trajno zadrţati u pamćenju. Ponavljanje mora biti na ''dubinski'' i smislen način jer pasivno ponavljanje ne dovodi do dugoročnog upamćivanja. Što su sloţenije intelektualne operacije kojima se informacije u 3 kratkoročnom pamćenju obraĎuju, to će te informacije biti bolje zapamćene u dugoročnom pamćenju. Kratkoročno pamćenje izvršava sledeće funkcije: 1. Kratko zadrţava sadrţaje koji su nam potrebni u nepromenjenom obliku; 2. Omogućava kodiranje sadrţaja za uspešno čuvanje na duţi rok; 3. Omogućava vraćanje sadrţaja iz dugoročnog pamćenja sačuvanog na duţi rok, pomoću pronalaţenja i prisećanja (5). Radna memorija Još uvek nema opšte saglasnosti meĎu autorima kada je u pitanju definicija radne memorije. Jedni je poistovećuju sa kratkoročnom memorijom (6,7) dok drugi autori odvajaju ova dva pojma (8). Radna memorija predstavlja sistem za privremeno zadrţavanje i manipulaciju informacijom, koji učestvuje u izvoĎenju niza različitih, vrlo vaţnih kognitivnih zadataka, poput učenja, rezonovanja i razumevanja. Radna memorija ima ograničen kapacitet i kratko trajanje (nekoliko minuta) i odnosi se na odrţavanje i manipulisanje informacijama koje se nalaze u fokusu paţnje, kao i na sadrţaje za koje je neophodno da se zna njihov trenutni status radi donošenja odluke (9). Brojne studije su pokazale da radna memorija koristi mreţu kortikalnih i subkortikalnih regiona u zavisnosti od tipa zadatka (10). Tako fonološki zadaci uključuju više regione leve strane mozga dok prostorna radna memorija u većoj meri uključuje regione desne strane mozga (11). TakoĎe, pokazano je da teţi zadaci zahtevaju bilateralnu aktivaciju mozga bez obzira na prirodu materijala kojim se manipuliše (12). Šta više, sa povećanjem sloţenosti zadatka povećava se i broj aktiviranih regiona u prefrontalnom korteksu (13). Dugoroĉno (dugotrajno) pamćenje Dugoročno pamćenje, često nazvano sekundarnom memorijom (14) obuhvata kodiranje, konsolidaciju, skladištenje i prizivanje sadrţaja i traje od 45 sec. pa nadalje, 4 godinama, decenijama odnosno ceo ţivot. U dugoročnom pamćenju sadrţaji se trajno zadrţavaju u ovom sistemu koji je neograničenog kapaciteta (3). Najšira podela dugoročnog pamćenja izvršena je na skorašnje, u kome se informacije zadrţavaju nekoliko minuta i davnašnje dugotrajno pamćenje, koje obuhvata stečena iskustva i znanja tokom čitavog ţivota. Proces dugotrajnog pamćenja se odvija kroz tri stadijuma:  upamćivanje koji se odnosi na unošenje u skladište, odnosno, sticanje, kodiranje, stvaranje zapisa (tragovi pamćenja, engram=memorijski zapis)  pamćenje, čuvanje u skladištu, odnosno retencija.  prisećanje, odnosno, aktivacija tj. dekodiranje engrama (15). Prizivanje informacija moţe biti putem prepoznavanja (rekognicije) upamćenih sadrţaja u trenutku njegovog ponovnog izlaganja i putem slobodnog prisećanja prethodno naučenog materijala (3). Ovi procesi se nadovezuju, odnosno odvijaju se paralelno i u meĎuzavisnosti su sa kratkoročnim pamćenjem (16). Grafikon 1. Podela memorijskih sistema 5 Druga podela zasniva se na tome da li se mi svesno sećamo informacija- činjenica i dogaĎaja ili pak pamćenje nije dostupno našoj svesti. Eksplicitno pamćenje stiče se svesnim naporom i nazvano je deklarativnim jer se stečena znanja mogu iskazati rečju, pismom ili nekim drugim simboličkim sredstvom i odnosi se na sve informacije koje su dostupne našem svesnom prisećanju. (17). Eksplicitno pamćenje u kome su sačuvani ţivotni dogaĎaji i za njih vezane ţivotne uspomene nazvano je pamćenjem epizoda, odnosno, epizodičko pamćenje (18). Epizodiĉko pamćenje je značajan neurokognitivni sistem koji omogućava svesno prisećanje prošlih dogaĎaja (autobiografskih dogaĎaja, naučenog materijala) u kontekstu prostora i vremena. Epizodička memorija je pod kontrolom široke mreţe kortikalnih i subkortikalnih regiona mozga, jedinstvena u odnosu na druge tipove memorije i najverovatnije specifična samo za ljudski rod. UtvrĎeno je da funkcionisanje epizodičke memorije zavisi od medijalnog temporalnog reţnja (19). Strukture medijalnog temporalnog reţnja bitne su za uspostavnjanje dugoročnog eksplicitnog pamćenja, ali nisu skladište tog pamćenja. Ove strukture potrebne su za učenje i postupno upamćivanje naučenog, ali jednom učvršćeno trajno pamćenje sačuvano je najverovatnije u neokortikalnim područjima moţdane kore. Hipokampusna formacija, po mnogim istraţivanjima, predstavlja deo medijalnog temporalnog lobusa koji je najvaţniji za memorijske procese. Corpus amigdaliodeum tj. amigdala (amigdaloidni kompleks) zauzima sledeće mesto po vaţnosti naročito kada su u pitanju asocijativna i emocionalna memorija. Najnovija istraţivanja ukazuju na činjenicu da vaţnu ulogu u identifikaciji stimulusa i memoriji ima i rinalni korteks. Studije su pokazale da sistem epizodičke memorije uključuje i frontalne lobuse (20,21) koji imaju ulogu u primanju, obradi i kodiranju informacija (22), sećanju na izvor informacija, prisećanju bez navoĎenja (23) i prisećanju vremenskog sleda dogaĎaja (24). TakoĎe, pokazano je da su levi medijalni temporalni i levi frontalni lobus aktivni prilikom učenja reči dok je desni medijalni temporalni i desni frontalni lobus aktivan prilikom pamćenja vizuelnih scena. Značaj frontalnih lobusa potiče od činjenice da oni omogućavaju osobi da se fokusira na informaciju koju treba da zapamti i da aktivira temporalne lobuse. 6 Semantiĉko pamćenje (značenjsko pamćenje) je kao i epizodičko pamćenje deklarativni, eksplicitni memorijski sistem čiji je centar u inferolateralnim temporalnim lobusima. Predstavlja onaj deo eksplicitnog pamćenja koji se tiče pojmova i simbola i odnosi na osnovne informacije, činjenice i pravila koja su neophodna za njihovu upotrebu. To su gramatička pravila, matematičke formule, iskazi koji označavaju različite zakonitosti i slično. Najčešće, poremećaj semantičke memorije posledica je Alchajmerove bolesti usled promena u inferolateralnim temporalnim lobusima i frontalnom korteksu što dovodi do slabe aktivacije ovih regiona mozga i slabog prisećanja semantičkih informacija (25). Vaţno je istaći da se u Alchajmerovoj bolesti propadanje epizodičke i semantičke memorije odvija nezavisno što ukazuje da su u pitanju dva odvojena memorijska sistema (26). U tabeli 1. prikazani su i drugi poremećaji koji se odlikuju promenama u različitim memorijskim sistemima. Implicitno pamćenje obuhvata mnoga znanja i veštine stečene tokom ţivota kojih nismo svesni, odnosno ne znamo kako je do tih znanja došlo. Ovaj vid pamćenja sastoji se u pamćenju postupaka ili procedura, načina kako se neka radnja obavlja da bi se postigao odreĎeni cilj. Proceduralna memorija odnosi se na učenje i sticanje senzormotornih veština, kao što su hodanje, skijanje, voţenje automobila ali sadrţi i kognitivne veštine: poznavanje pravila igranja šaha, izvoĎenje računskih operacija i dr. Primenom metoda funkcionalnog imidţinga zapaţeno je da se prilikom učenja novog zadatka aktiviraju bazalne ganglije i cerebellum (27). Dokazi koji podrţavaju ovo otkriće su da lezije bazalnih ganglija i cerebeluma dovode do narušavanja sposobnosti učenja proceduralnih veština (28). Na grafikonima 2. i 3. prikazane su anatomske strukture neokorteksa i subkortikalnih regiona odgovorne za funkcije različitih tipova memorijskih sistema. Grafikon 2. Strukture neokorteksa značajne za memorijske funkcije 7 Grafikon 3. Subkortikalne strukture značajne za memorijske funkcije Podela na senzorno i motorno pamćenje izvršena je prema mnestičkom materijalu, a u odnosu na senzorni kanal pamćenje moţe biti: vizuelno (slike, boje, oblici), auditivno (govor, tonovi, zvukovi...), olfaktorno (mirisi), gustativno (ukusi) i taktilno (dodir, bol). U odnosu na vrstu informacija koje se pamte pamćenje se deli na: verbalno – reči, imena, informacije zableţene rečima i neverbalno – slike, prostorni rasporedi, geografske lokacije, melodije. TakoĎe postoji i podela pamćenja na anterogradno-sposobnost učenja novih informacija i retrogradno koje se odnosi na prizivanje ranije uskladištenih informacija. 8 Tabela 1. Poremećaji koji se odlikuju i promenama u memorijskim sposobnostima Epizodiĉka memorija Semantiĉka memorija Proceduralna memorija Radna memorija Alchajmerova bolest Alchajmerova bolest Parkinsonova bolest Vaskularna demencija Blagi kognitivni poremećaj Semantička demencija Hantingtonova bolest Frontalna varijanta frontotemporalnih demencija Demencija sa Luijevim telima Traumatske povrede mozga Progresivna supranuklearna paraliza Alchajmerova bolest Encefalitis (herpes simplex) Encefalitis (najčešće herpes simplex) Olivopontocerebelarna degeneracija Demencija sa Luijevim telima Frontalna varijanta frontotemporalnih demencija Depresija Multipla skleroza Korsakovljev sindrom Opsesivno-kompulsivni poremećaj Traumatske povrede mozga Privremena globalna amnezija Neţeljeni efekti lekova Kontuzija mozga ADHD Traumatske povrede mozga Opsesivno-kompulsivni poremećaj Epi napadi Shizofrenija Hipoksična-ishemijska povreda Parkinsonova bolest Neţeljeni efekti lekova Progresivna supranuklearna paraliza Deficijencija vitamina B12 Kardiopulmonarni bajpas Hipoglikemija Deficijencija vitamina B12 Anksioznost Hirurgija temporalnih lobusa Vaskularna demencija Multipla skleroza 9 1.1. Faktori koji utiĉu na memorijske sposobnosti Brojne bihevioralne, genetičke i eksperimentalne studije ukazuju na kompleksnost memorijskih sistema koja potiče od sadejstva različitih faktora. Do danas, identifikovani su brojni demografski, socioekonomski i psihološki faktori koji dovode do individualnih razlika u memorijskim sposobnostima ljudi. Ipak, njihov uticaj je još uvek nedovoljno razjašnjen. Demografski faktori koji utiču na individualne razlike u memorijskim sposobnostima su: Starenje –Napredak u medicini, farmakologiji, genetici, javnom zdravlju, promovisanju zdravih stilova ţivota ukazuje da će se ţivotni vek produţavati, a populacija starih se povećavati. Tako projekcije za 2050. predviĎaju da će u svetu udeo starijih od 65 godina biti 16,2%, a u razvijenim zemljama 25,7% (29). Populacija starih se u svetu sve više deli na tri podgrupe: "mlado staro" stanovništvo (young old) od 65 do 74 godine, staro stanovništvo od 75 do 84 godine, i "najstarije staro" stanovništvo (oldest old) preko 85 godina (30). Iako većina starih osoba ne razvije demenciju, u odmaklim godinama dolazi do odreĎenog stepena kognitivnog propadanja. Na osnovu studija sprovedenih na starijim osobama koje nemaju demenciju došlo se do zaključka da različite komponente memorijskog sistema ne stare istom brzinom tj. da pokazuju različitu osetljivost na procese starenja. Mnoge starije osobe ţale se na poteškoće u prisećanju ličnih imena, imena predmeta i dr. Uprkos subjektivnim ţalbama semantička memorija je meĎu stabilnijim komponentama memorijskog sistema. Semantička memorija pokazuje vrlo slab pad, čak je pokazano da semantičko znanje i memorija rastu do šeste-sedme decenije ţivota nakon čega sledi postepeno slabo opadanje u njihovoj funkciji. Uticaj starenja na proceduralnu memoriju je znatno manje izučavan ali postoji konsenzus meĎu naučnicima da starije osobe imaju trajno očuvanu proceduralnu memoriju. Ono što se menja sa godinama jeste brzina kojom mogu da izvrše odreĎene radnje. Za razliku od semantičke memorije epizodička memorija značajno slabi sa godinama. TakoĎe, sve je više dokaza da i radna memorija značajno opada sa godinama. Smatra se da je upravo pad u funkcionisanju radne memorije uzrok 10 propadanja drugih kognitivnih sposobnosti. Uočeno je da se performanse radne i epizodičke memorije smanjuju linearno još od dvadesetih godina i blagi pad se nastavlja tokom celog ţivota. Brojne studije ukazuju na značajan pad u memorijskim sposobnostima epizodičke i radne memorije nakon šezdesete godine ţivota (31). Pol – UtvrĎeno je da postoji razlika meĎu polovima u epizodičkoj memoriji i da ţene postiţu bolje rezultate na neuropsihološkim testovima (32). Razlike meĎu polovima u drugim tipovima memorije nisu uočene ili su pak dobijeni rezultati kontradiktorni. Socioekonomski faktori za koje je poznato da utiču na memorijske sposobnosti su: Nivo obrazovanja – Ovaj parametar obično je izraţen kroz godine formalnog obrazovanja. Pokazano je da nivo obrazovanja utiče na memorijske sposobnosti i u mlaĎem i u starijem ţivotnom dobu (33). Nekoliko studija je pokazalo da nivo obrazovanja utiče na rezultate testova semantičke memorije ali da ima vrlo malo uticaja na epizodičku memoriju (34). Uslovi ţivota su pokazali značajnu korelaciju sa memorijskim sposobnostima samo u kombinaciji sa nivoom obrazovanja. Životni stil - Uočena je pozitivna asocijacija memorijskih sposobnosti sa socijalnim angaţovanjem, kognitivnim i fizičkim aktivnostima kao i sa intelektualno stimulativnim aktivnostima i na svim uzrastima (35). Psihološki faktori za koje je potvrĎeno da utiču na memorijske sposobnosti su: Pažnja – Paţnja označava usmeravanje psihičke i psihomotoričke aktivnosti prema odreĎenim sadrţajima. Kroz modernu istoriju psihologije i neuronauka, paţnja i memorija zauzimaju centralno mesto kao fundamentalni procesi u kognitivnim (intelektualnim) funkcijama. Ipak, najveći broj istraţivanja je usmeren na ove procese kao zasebne jedinice. Studije memorije nisu ispitivale ulogu paţnje u modulaciji i kodiranju memorije, dok su studije paţnje zanemarivale prošlo iskustvo i znanje (36). Paţnja i memorija ne mogu funkcionisati jedna bez druge. Kratkotrajna memorija ima ograničen kapacitet i paţnja vrši selekciju materijala koji će biti upamćen (37). Podela paţnje tokom procesa kodiranja sprečava formiranje svesne memorije. Informacije mogu biti upamćene i kada postoji konkurentni zadatak ali tada stimulus koji treba da 11 bude kodiran (zapamćen) mora biti izabran meĎu ostalim stimulusima. Iako se obično smatra da paţnja utiče na memoriju, sve više je dokaza da prisećanje prošlih doţivljaja utiče na to na koje od postojećih stimulusa treba obratiti paţnju (36). Regioni mozga koji su značajni za memoriju, kao što su hipokampus i medijalni temporalni reţanj su takoĎe aktivni u procesu paţnje što govori u prilog tome da se memorija i paţnja moraju zajedno proučavati. Motivacija – Ovaj faktor utiče na memorijske sposobnosti prilikom procesa kodiranja tj. utiče na aktivnu fazu pamćenja ali ne utiče na proces prisećanja. Razlikujemo spoljašnju (ekstrinzičku) i unutrašnju (intrinzičku) motivaciju. Spoljašnja motivacija se odnosi na sve one motive koji nisu vezani direktno za sadrţaj koji se pamti. Tu ubrajamo lične motive koji imaju za cilj da povećaju ili istaknu vrednosti sopstvene ličnosti kako u očima drugih tako i u sopstvenim očima, kao što su: ţelja za uspehom, strah od neuspeha, podsticaji (takmičenja, nagrade, kazne, pohvale i pokude), motiv postignuća. Sa druge strane unutrašnja (intrinzička) motivacija se zasniva na interesovanju za materiju koja se pamti. Pokazano je da motivacija znatno utiče na uspeh prilikom rešavanja neurokognitivnih testova na osnovu kojih sudimo o nečijim memorijskim sposobnostima (38). Emocionalno stanje - Do skora emocije nisu uzimane u obzir prilikom analize i razumevanja kognitivnih sposobnosti kao što je memorija. Ipak, postalo je jasno da ne moţemo isključiti uticaj emocija koje su retko kada odsutne iz naših svakodnevnih aktivnosti. Primećeno je da se dogaĎaji koji su praćeni jakim emocijama bolje pamte. Interakcija emocija i pamćenja potiče od uticaja amigdale na procese obrade informacija koji zavise od funkcije hipokampusa i prefrontalnog korteksa, od kodiranja i skladištenja informacija pa do prisećanja (39). 12 2. GENETIĈKI FAKTORI KOJI UTIĈU NA MEMORIJSKE SPOSOBNOSTI 2.1 Poligenska osnova memorijskih sposobnosti Kao što je već spomenuto, memorijske sposobnosti ljudi imaju poligensku, tj. multifaktorsku osnovu. To znači da na njihovo ispoljavanje utiču kako genetički faktori tako i faktori sredine. Relativni udeo genetičkih faktora u ispoljavanju odreĎene osobine naziva se heritabilnost. Na osnovu dosadašnjih studija procenjeno je da heritabilnost memorijskih sposobnosti iznosi oko 50% što ukazuje na značajan uticaj genetske osnove na individualnu varijabilnost u memorijskim sposobnostima (40). Heritabilnost kompleksnih osobina kao što je memorija zavisi od varijacija u velikom broju gena sa relativno malim pojedinačnim aditivnim uticajem. Pitanje koje se postavlja je kako i koje varijacije u našim genima utiču na individualne razlike u memorijskim sposobnostima. Uprkos velikom broju sprovedenih istraţivanja i primeni savremenih metoda molekularne genetike veliki deo heritabilnosti multifaktorskih osobina ostaje i dalje neobjašnjen. Ovaj fenomen označava se kao „missing heritability― (41). U najvećem broju studija varijacije u genima analiziraju se pojedinačno, pa se u analizi ne uzimaju u obzir interakcije meĎu genima kao što je npr. epistaza. Smatra se da bi istovremenom analizom većeg broja gena i uzimanjem u obzir interakcije meĎu genima bio objašnjen veći procenat heritabilnosti multifaktorskih osobina pa meĎu njima i memorije (41). 2.1.1. Polimorfizmi DNK-genski polimorfizmi U genetici, polimorfizam je pojava dve ili više genetički odreĎene forme (alela, varijanti, sekvenci) u populaciji s takvom učestalošću da se ni najreĎa meĎu njima ne bi mogla objasniti samo novim mutacijama. Dogovoreno je da je polimorfni DNK lokus mesto na kome postoje najmanje dva alela, pri čemu najreĎi ima frekvenciju veću od 1%. Aleli s frekvencijama manjim od 1 % označeni su kao retke varijante. Genom čoveka se sastoji od 3,2x109 nukleotidnih (baznih) parova a smatra se da je u proseku bar svaki 1000. nukleotid polimorfan, tj. da se ili razlikuje izmeĎu dva lokusa ili dve osobe u opštoj populaciji. Proučavanja varijabilnosti enzima i proteina pokazala su da je kod ljudi najmanje 30 % strukturnih gena (tj. gena za polipeptide) polimorfno, a da je svaka osoba heterozigotna za 10 % do 20 % svih strukturnih gena (42). 13 2.1.2. Tipovi polimorfizama i mehanizam njihovog nastanka DNK polimorfizam je posledica mutacija koje se kreću u rasponu od zamene samo jedne baze do variranja u segmentu od nekoliko stotina pa i hiljada baza. Postoje tri osnovna tipa polimorfizama: polimorfizam pojedinačnih nukleotida (SNP - single nucleotide polymorphism), polimorfizam broja uzastopnih ponovaka (VNTR - variable number tandem repeats i STRPs - short tandem repeat polymorphism) i inserciono- delecioni polimorfizam. Polimorfizam pojedinaĉnih nukleotida (SNP) najčešći je izvor genetičke varijabilnosti u humanom genomu i obuhvata oko 80% svih polimorfizama (43). Nastaje usled mutacija tipa supstitucije. Supstitucije jedne baze bazom istog tipa (purinska baza purinskom G → A ili A → G, pirimidinska baza pirimidinskom: C → T ili T → C) nazivaju se tranzicije, dok transverzije predstavljaju zamenu baze bazom drugog tipa (purin u pirimidin ili obrnuto). Obilje podataka koji su prikupljeni poslednjih godina dovelo je do potrebe za sistematizacijom obeleţavanja (nomenklature) samih polimorfizama kao i njihovih fenotipskih – funkcionalnih efekata. Za SNP-ove je uveden univerzalan način obeleţavanja, u vidu takozvanog rs broja. Skraćenica „rs― potiče od „reference SNP number―, a broj koji se dodeljuje datom polimorfizmu je jedinstven i kao takav se registruje u bazama podataka. Pored toga, zadrţalo se i obeleţavanje prema poloţaju polimorfnog – varijabilnog nukleotida u genu. TakoĎe, oznake koje se odnose na fenotipski efekat SNP-a, tj. njegov uticaj na strukturu proteina, se vrlo često koriste, budući da imaju veliki praktični značaj. U literaturi se sve češće upravo aminokiselinske varijante pominju kao „aleli―, što (po nama) moţda nije do kraja ispravno, na primer polimorfizam rs6265 u genu za moţdani faktor rasta (BDNF) vrlo često se označava kao Val66Met iako je obeleţavanje G196A prema poloţaju varijabilnog nukleotida u genu pravilnije. Kao što je pomenuto, fenotipski efekat datog SNP-a je uvek vrlo interesantan, jer on omogućava procenu njegovog funkcionalnog efekta. Raznolikost poloţaja i vrste SNP-ova (unutargenski, vangenski, u kodirajućem regionu, u nekodirajućem delu gena) čini da jednostavna sistematizacija nije moguća. 14 Ako bazna supstitucija dovede do zamene kodona za jednu aminokiselinu kodonom za drugu u pitanju je misens (''missense'') mutacija koja rezultuje sintezom izmenjenog proteina. Ukoliko se usled bazne supstitucije kodon za jednu aminokiselinu zameni stop kodonom onda je to besmislena mutacija (''nonsense'' mutacija), koja za posledicu ima prekid sinteze polipeptidnog lanca. Unutar samog kodona mnogo češće se javljaju sinonimne ili tihe (''silent'') mutacije koje ne dovode do promene aminokiseline. To je prevashodno zbog toga što promena aminokiseline moţe uticati na funkciju proteina pa je polimorfizam koji ovo uslovljava pod pojačanim selekcionim pritiskom. Sa druge strane ne znači da su ''silent'' mesta u kodirajućim sekvencama u potpunosti bez efekta. Alternativni tripleti koji kodiraju iste aminokiseline mogu imati različitu brzinu transkripcije, a iRNK moţe imati različitu brzinu translacije zbog limitiranog pula dostupnih tRNK (44). Ukoliko se polimorfizam nalazi u promotoru, intronu, 5' regulatornom regionu ili 3' regionu koji se ne prevodi (5'UTR odnosno 3'UTR) on neće direktno uticati na strukturu proteina ali moţe imati regulatornu ulogu. U promotorskom regionu funkcionalna posledica bilo koje tačkaste mutacije (supstitucije ili insercije/delecije) zavisi od njene lokacije i od toga da li ona ometa interakciju odgovarajuće DNK sekvence sa odreĎenim proteinom (transkripcionim faktorom ili RNK polimerazom). Mutacije koje ometaju ove veze imaju potencijal za menjanje ekspresionog obrasca gena što moţe dovesti do smanjene količine odgovarajućeg proteinskog produkta ili pak do njegove prekomerne sinteze, što takoĎe moţe imati značajne posledice. Pored toga ovaj tip mutacija moze da dovede do aktiviranja gena u pogrešno vreme ili u pogrešnom tkivu. Inserciono-delecioni polimorfizmi predstavljaju prisustvo (inserciju) ili odsustvo (deleciju) odreĎene sekvence nukleotida u molekulu DNK. Najčešće, nukleotidna sekvenca je duţine od nekoliko do nekoliko stotina nukleotida ali su zabeleţene i duplikacije od nekoliko stotina kilobaza. Inserciono-delecioni polimorfizmi su kao i SNP-ovi dialelni polimorfizmi a kroz generacije se stabilno prenose s obzirom na to da su nastali nakon jednog mutacionog dogaĎaja u evoluciji (45). 15 Polimorfizmi broja uzastopnih ponovaka (STRP i VNTR) STRP označavaju varijaciju u broju ponovaka duţine 1-10bp (najčešće 2-4bp) koji se ponavljaju 10-50 puta. Ovaj tip polimorfizama identifikovan je uglavnom van gena ili u okviru introna a njihova uloga za sada nije poznata. Zbog velike raznolikosti u broju ponovaka danas se široko koriste u identifikaciji osoba putem DNK otiska tj. DNK profila . VNTR označavaju varijaciju u broju ponovaka duţine 9-64bp, dok je ukupna duţina niza 100 do 20000bp. Predstavljaju takoĎe značajne markere u forenzici i utvrĎivanju očinstva. Polimorfizmi broja uzastopnih ponovaka u odnosu na SNP-ove i inserciono- delecione polimorfizme imaju značajno veću stopu mutacija i najčešće je nemoguće utvrditi izvorni, ancestralni alel. Zastupljenost i rasprostranjenost genskih alela u populaciji moţe da varira kako u prostoru tako i u vremenu. Decenijama evolucioni biolozi pokušavaju da razumeju evolucione sile koje utiču na genetičku varijabilnost. Smatra se da je kada je polimorfizam neutralan, bez uticaja na reproduktivni fitnes, učestalost alela odreĎena genetičkim driftom odnosno, slučajnošću. Učestalost neutralnih polimorfizama je relativno visoka kada je populacija velika a stopa mutacija visoka. Nasuprot tome, smatra se da aleli koji prouzrokuju smanjeni reproduktivni fitnes u populaciji opstaju usled de novo mutacija ili imigracijom iz susednih populacija a bivaju eliminisani prirodnom selekcijom. Ipak, neophodno je još istraţivanja kako bi se razumeli svi mehanizmi koji dovode do genetičke varijabilnosti humanih populacija (46). 2.1.3. Primena DNK polimorfizama u identifikaciji gena odgovornih za poligenska svojstva kod ĉoveka Tradicionalno, dve osnovne strategije u istraţivanjima koja imaju za cilj identifikaciju gena asociranih sa poligenskim tj. multifaktorskim osobinama su: studije analize vezanosti i studije asocijacije. Preduslov za uspešno sprovoĎenje ovakvih studija jeste postojanje visokog stepena heritabilnosti osobine koja se prati. TakoĎe, potrebni su i pouzdani i validni instrumenti za procenu fenotipa, kontrola drugih faktora 16 koji mogu uticati na fenotip (u slučaju memorije: paţnja, koncentracija, motivacija i radna memorija) i mogućnost nezavisne replikacije dobijenih rezultata. Analiza vezanosti U studijama analize vezanosti, analizira se vezanost genetičkih markera- polimorfnih DNK sekvenci (najčešće STRP ili VNTP) poznate lokacije na hromozomu, sa posmatranim svojstvom, obično u porodicama sa velikim brojem članova. Kao mera vezanosti posmatranog svojstva i markera koristi se LOD skor (logarithm of the odds), koji se izračunava na bazi rezultata genetičke analize, prema odreĎenoj formuli. LOD skor jednak +3 ili veći ukazuje na visoku verovatnoću vezanosti markera i posmatranog svojstva (>1:1000), dok LOD skor manji od -2 ukazuje da analizirani marker i svojstvo najverovatnije nisu vezani (<100:1) (42). Ako se uoči da postoji vezanost markera sa osobinom koja se ispituje primenjuju se metode kao što su poziciono kloniranje, fino mapiranje i dubinsko resekvenciranje kako bi se otkrio odgovorni gen i njegove varijante. Ova strategija je bila, i još uvek je posebno pogodna za monogenske osobine i bolesti ali je takoĎe primenljiva i u izučavanju kompleksnih osobina. Kada je u pitanju memorija, studije analize vezanosti markera omogućile su identifikaciju varijanti gena odgovornih za poremećaje u epizodičkoj memoriji kod Alchajmerove bolesti i drugih neurodegenerativnih oboljenja (47). Studije asocijacije U studijama asocijacije ispituje se udruţenost genskih polimorfizama sa nekim od poligenskih svojstava tako što se analizira učestalost datog polimorfizma u grupi obolelih (osoba sa odreĎenim svojstvom) i uporeĎuje sa podacima u zdravoj populaciji (osoba koje nemaju ispoljenu tu osobinu). Takvo istraţivanje često se naziva i proučavanje „slučaj  kontrola―. Ako se učestalost u tim dvema grupama bitno razlikuje, potvrĎuje se pozitivna ili negativna asocijacija. Dve osnovne strategije koje se primenjuju u studijama asocijacije jesu analiza asocijaciije gena kandidata i studije asocijacije čitavog genoma. Studije gena kandidata Studije gena kandidata mogu se primeniti u slučaju da postoji dovoljno znanja o biološkim mehanizmima koji su u osnovi fiziologije (u slučaju da je u pitanju oboljenje 17 - patofiziologije) odreĎene osobine. Geni kandidati biraju se na osnovu saznanja dobijenih istraţivanja na animalnim modelima, rezultata analize vezanosti ili na osnovu saznanja o biohemijskim procesima koji leţe u osnovi osobine ili bolesti koja se ispituje. Brojne studije na ţivotinjama, kako beskičmenjacima tako i kičmenjacima, tokom prethodne tri decenije otkrile su gene i signalne molekule značajne za memorijske procese u mozgu, uključujući protein kinaze, fosfataze, transkripcione faktore, faktore rasta i komplekse ligand-receptor (48-52). Ove studije ukazuju da su mnogi molekularni mehanizmi koji su u osnovi memorijskih sposobnosti konzervirani meĎu vrstama. Molekuli uključeni u sinaptičku plastičnost, dugotrajnu potencijaciju, dugotrajnu depresiju i aktivnost struktura mozga kao što su hipokampus, parahipokampalni girus i amigdala mogu predstavljati idealne biološke kandidate za studije asocijacije. Iako rezultati većine studija tek treba da budu nezavisno potvrĎeni, podaci ukazuju da fokusiranje na postojeće, dobro proučene biološke mehanizme vode identifikaciji gena značajnih za memorijske sposobnosti ljudi (41). Tako naprimer, pokazalo se da su za memorijske sposobnosti od značaja geni za: serotoninski receptor 2A (HTR2A), prionski protein (PRNP), prodinorfin (PDYN), dopaminski receptor (DRD2), kateholamin-0-metil transferazu (COMT) i drugi (53). Studije asocijacije celokupnog genoma (GWAS) Postojeća saznanja o biološkim mehanizmima značajnim za memorijske procese jasno ukazuju na gene kandidate, ali sa druge strane ograničavaju potencijal studija da identifikuju nove gene i molekularne puteve. Skorija dostignuća u razvoju metoda molekularne genetike omogućila su analizu asocijacije osobine ili bolesti sa stotinama hiljada genskih varijanti rasporeĎenih po celom genomu. Takve studije su poznate kao studije asocijacije celokupnog genoma (engl. Genome wide association studies, GWAS). Kompanije kao što su Affimetrix i Illumina razvile su tehnologiju mikročipova (microarray) na kojima se moţe analizirati po jedan SNP na svakih 5kb do čak 1kb genoma čoveka, čime se ispitivanjem obuhvata 600 000 do 3 000 000 SNP- ova. Ovakve studije sprovode se na velikom broju ispitanika a do rezultata se dolazi primenom visoko specifičnih statističkih metoda. U prvoj publikovanoj GWA studiji epizodičke memorije analizirano je 500 000 polimorfnih markera i identifikovani su polimorfizmi u dva gena, KIBRA (kidney and brain expressed protein) i CLSTN2 (calsyntenin2) koji su asocirani sa epizodičkom memorijom (54). U narednim 18 studijama identifikovani su još i geni za calmodulin-binding transcription activator 1 (CAMTA1) (55) i neurexin1 (NRXN1) (56). Vaţno je naglasiti da su geni otkriveni ovim studijama uključeni u molekularne puteve značajne za memorijske procese kao što su fosforilacija proteina, aktivacija transkripcije zavisna od kalcijuma i sinaptička plastičnost. Ipak, malo je verovatno da bi ovi geni bili izabrani a priori kao geni kandidati jer se vrlo malo znalo o njihovoj biološkoj relevantnosti pre studija asocijacije celokupnog genoma. To ukazuje na moćan potencijal ovog pristupa u identifikaciji novih gena i molekularnih puteva značajnih za memorijske sposobnosti. Imidţing genetika U asocijativnim studijama mogućnost reprodukcije dobijenih rezultata je od izuzetnog značaja. Reproducibilnost studije podrazumeva njeno ponavljanje primenom istih metoda ali od strane drugih istraţivača i/ili na različitim uzorcima. Osnovni cilj replikacije jeste potvrda rezultata i zaključaka prvobitne studije pa se ovakav pristup smatra zlatnim standardom u nauci uopšte. Kada se jednom ustanovi asocijacija genskog polimorfizma sa posmatranim svojstvom, neophodno je sprovesti funkcionalna ispitivanja koja će potvrditi ovu vezu i objasniti njenu (pato)fiziološku osnovu. Što se tiče ispitivanja genetičke osnove memorije, u poslednjih nekoliko godina brain-imaging tehnike tj. metode za vizuelizaciju mozga, kao što su pozitronska emisiona tomografija (PET) i funkcionalna magnetna rezonanca (fMRI) postale su izuzetno popularne (54). Ove metode pruţaju uvid u razlike aktivnosti odreĎenih regiona mozga tokom različitih faza memorijskih procesa. Aktivnost regiona se meri praćenjem regionalnog krvotoka u mozgu. Primenom i molekularno genetičkih i imaging metoda nastala je hibridna disciplina koja se naziva „imaging genetics― tj. imidţing genetika. Kada se uoči statistički značajna razlika u memorijskim sposobnostima u zavisnosti od genotipa, postavlja se hipoteza da će u grupi ispitanika sa boljim memorijskim sposobnostima i ―povoljnim― genotipom biti registrovana veća moţdana aktivnost (57). Ukoliko se pak, suprotno očekivanju, veća moţdana aktivnost registruje kod ispitanika sa rizičnim genotipom, smatra se da to ukazuje na postojanje kompenzatorne aktivnosti u mozgu (54). Interpretacija rezultata je sloţenija kada uprkos tome što meĎu osobama različitih genotipova nema razlike u memorijskim sposobnostima fMRI pokazuje razliku u moţdanoj aktivnosti. Moguće je da je neuronska aktivnost podloţnija direktnom uticaju funkcionalnih varijanti gena pa samim tim osetljivija na efekat 19 različitih genotipova u poreĎenju sa testovima memorijskih sposobnosti. Ipak, još uvek takve rezultate treba uzimati sa rezervom (53). Potrebna su dodatna istraţivanja na većem broju pacijenata kako bi sa sigurnošću tumačili dobijene rezultate. Do sada, većina „imaging genetic― studija ispitivalo je asocijaciju pojedinačnih genskih markera sa moţdanom aktivnošću. Uzimajući u obzir genetsku i fenotipsku kompleksnost memorije biće potrebno istovremeno analizirati markere u većem broju gena. Pored izučavanja polimorfizama u razumevanju genetičke osnove kompleksnih svojstava vaţnu ulogu imaju i jasno definisani monogenski poremećaji koji svojim fenotipskim odlikama i molekularnim mehanizmima takoĎe ukazuju na moguće gene kandidate. Kada se govori o genetici memorijskih sposobnosti, dobri modeli su poznate monogenske bolesti koje uključuju i opadanje memorijskih sposobnosti. Ovde spadaju fenilketonurija (gen PHA) (58, 59, 60), sindrom fragilnog X (geni FRAX) (61), DiGeorge-ov sindrom (gen COMT) (62) i dr. 20 MOLEKULARNE OSNOVE PAMĆENJA Kao što je već navedeno, poslednjih godina su prikupljeni brojni podaci o molekularnim mehanizmima pamćenja i genetičkoj kontroli memorijskih sposobnosti. Ipak, dobijeni rezultati u mnogim slučajevima nisu konzistentni i zahtevaju kritičko preispitivanje. U našoj studiji odabrali smo da analiziramo četiri gena koji reprezentuju različite aspekte i modele genetičke kontrole pamćenja: BDNF, KIBRA, APOE i BCHE. 3. MOŢDANI FAKTOR RASTA (BDNF) 3.1. Struktura BDNF gena i proteina U naslednoj osnovi čoveka gen za BDNF (engl. Brain derived neurotrophic factor) lokalizovan je na kratkom kraku hromozoma 11, u regionu 11p.14. Gen je duţine ~70kb i sastoji se od 11 egzona od kojih je samo egzon IX (koji se nalazi na 3' kraju gena) kodirajući egzon. Egzon IX pokazuje izuzetnu kompleksnost, sastoji se od 4 regiona: a, b, c, d i podleţe unutargenskom splajsovanju čime nastaju transkripti koji sadrţe različite regione egzona. Do sada je otkriveno 9 različitih promotora, alternativna donorska i akceptorska mesta splajsovanja u egzonima II, V i VI i dva alternativna mesta poliadenilacije u okviru egzona IX. Alternativno splajsovanje omogućava izuzetnu heterogenost ekspresije BDNF-a u različitim tkivima i regionima mozga. Devet različitih promotora inicira transkripciju brojnih različitih transkripata iRNK. Svaki transkript se sastoji od jednog od alternativnih 5’ egzona i zajedničkog 3’ kodirajućeg egzona IX koji sadrţi ceo otvoreni okvir čitanja za BDNF protein (63). Upotrebom alternativnih promotora, mesta splajsovanja i poliadenilacije sintetiše se bar 34 različitih zrelih transkripata koji kodiraju četiri različita proteinska produkta BDNF (Slika1.). 21 Slika 1. Struktura BDNF gena i transkripata (64) Iako je značaj ove sloţene transkripcione organizacije i dalje zagonetka, jedna od hipoteza je da se kroz upotrebu alternativnih promotora, različitu stabilnost iRNK ili različitu subcelularnu lokalizaciju iRNK i proteina obezbeĎuje više nivoa regulacije sinteze i funkcije BDNF-a. U korteksu promotor IV-zavisna transkripcija čini najveći deo ekspresije BDNF indukovane neuronskom aktivnošću (65). UvoĎenjem knock-in mutacije u promotor IV i praćenjem ekspresije BDNF-a pokazano je da neuroni ţivotinja formiraju manje inhibitornih sinapsi i da ţivoitnje imaju poremećaj u ekspresiji BDNF-a indukovanoj senzornim iskustvom. TakoĎe, uočena je smanjena ekspresija inhibitornih postsinaptičkih markera u korteksu. To ukazuje na značaj kontrole BDNF ekspresije zavisne od aktivnosti neurona u razvoju kortikalne inhibicije (65). Poliadenilacija BDNF transkripata se odvija na dva različita mesta. Time nastaju dve populacije iRNK: iRNK sa kratkim 3’ UTR regionom i iRNK sa dugim 3’ UTR regionom (66). Ova dva tipa iRNK se javljaju u različitim subćelijskim odeljcima neurona. Duge 3’ UTR iRNK su više zastupljene u dendritima kortikalnih neurona dok su kratke 3’UTR iRNK više zastupljene u somi. Miševi bez dugih 3’UTR iRNK proizvode normalne količine iRNK i BDNF proteina u mozgu ali su dendritski trnovi njihovih CA1 piramidalnih neurona gušći i tanji a hipokampalna dugotrajna potencijacija redukovana (67). To ukazuje na značaj lokalne translacije BDNF u dendritima. Studije su pokazale da specifični UTR regioni BDNF gena sluţe za 22 usmeravanje transkripata ka dendritima gde nakon stimulacije aktivnošću neurona dolazi do lokalne translacije koja stimuliše remodelovanje dendritskih trnova u postnatalnom razvoju. Kao i drugi članovi familije neurotrofina BDNF se sintetiše u formi proBDNF od 32 kDa koja podleţe N-glikozilaciji i glikosulfataciji. Pro domen duţine je 112 aminokiselina a zreli BDNF pribliţno149 aminokiselina. Uprkos izuzetnoj kompleksnosti gena za BDNF do sada su otkrivene samo četiri proteinske varijante. Najviše je zastupljena proBDNF1 varijanta proteina. U odnosu na proBDNF1, proBDNF2 varijanta ima 8 aminokiselina više na N-terminusu a proBDNF3 još sedam aminokiselina više. ProBDNF4 u odnosu na ostale varijante ima deleciju 48 aminokiselina (od 154. aminokiseline do 201.) koja je posledica alternativnog splajsovanja (Slika 2.) (68). Još uvek nije poznato da li postoji razlika u lokalizaciji i funkciji ovih proteinskih varijanti. Slika 2. Varijante BDNF proteina (68) 3.2. Polimorfizmi gena za BDNF U genu za BDNF otkriveno je više polimorfnih mesta ali je do sada najviše izučavan polimorfizam rs6265 koji nastaje supstitucijom guanina (G) adeninom (A) na 196-om nukleotidu i dovodi do zamene aminokiseline valina metioninom na poziciji 66 (Val66Met). Supstitucija se javlja u prodomenu, u regionu koji se kasnije iseca ali se smatra da je od velikog značaja za transport BDNF-a. Zamena valina metioninom PRO REGION 23 narušava ćelijsku obradu, transport i sekreciju BDNF-a. Studije na neurosekretornim ćelijama i primarnim neuronima u kulturi pokazale su da Met supstitucija dovodi do tri poremećaja u transportu: (1) smanjene distribucije u dendrite, (2) smanjenog pakovanja u sekretorne granule, i (3) promene u sekreciji BDNF-a (69). Primećeno je takoĎe da kada se u ćeliji eksprimiraju obe varijante BDNFMet utiče na transport BDNFVal formiranjem heterodimera koji se sa manjom efikasnošću transportuju sekretornim vezikulama. Ovaj polimorfizam je prva varijacija u genu za bilo koji neurotrofin koji je asociran sa odreĎenom kliničkom patologijom. Do sada nije potvrĎeno postojanje ovog polimorfizma kod drugih kičmenjaka. Jedna od osnovnih posledica zapaţenih kod nosilaca Met alela jeste razlika u morfologiji korteksa i hipokampusa. Magnetna razonanca je pokazala da nosioci Met alela imaju manju zapreminu hipokampusa u odnosu na Val/Val homozigote (70). Smatra se da ova razlika moţe poticati od uloge BDNF-a u razvoju i odrţavanju plastičnosti mozga (71, 72, 73). Kod heterozigotnih nosilaca Met alela zapaţena je i smanjena zapremina dorzolateralnog prefrontalnog korteksa, regiona značajnog za planiranje i više kognitivne funkcije kao i smanjena zapremina subkortikalnih regiona kao što su jedra kaudatuma. (74). TakoĎe, primećeno je da su nosioci Met alela postizali lošije rezultate na memorijskim testovima koji zavise od funkcija hipokampusa. Pozitivne i negativne asocijacije uočene su sa testovima inteligencije, drugim kognitivnim funkcijama, karakterom i memorijom, Parkinsonovom bolešću, bolestima zavisnosti, šizofrenijom, Alchajmerovom bolešću, bipolarnim poremećajem, depresijom, opsesivno-kompulsivnim poremećajem i anoreksijom. C270T je drugi čest polimorfizam je u 5' nekodirajućem regionu introna 1 čiji efekat na ekspresiju BDNF-a još uvek nije poznat. Do sada najviše je ispitivana njegova asocijacija sa Parkinsonovom bolešću, Alchajmerovom bolešću i shizofrenijom ali potrebna su dodatna istraţivanja kako bi se objasnila njegova uloga u ovim bolestima (75,76). Polimorfizam broja ponovaka (GT)n lociran u intronu 10, 1040bp uzvodno od mesta početka transkripcije. Novije studije su pokazale da je ovaj region visoko polimorfan i da ne obuhvata samo od GT ponovke već i od inserciono/delecione segmente i supstitucije nukleotida koji zajedno daju 23 različite alelne varijante. Na 24 neuronima pacova u kulturi pokazano je da su u pitanju funkcionalni polimorfizmi. Do sada uticaj ovih polimorfizama na kognitivne sposobnosti nije ispitivan (77). 3.3. Funkcija BDNF-a BDNF pripada familiji neurotrofina koja obuhvata još i nervni faktor rasta (NGF), neurotrofin 3 (NT3) i neurotrofin 4/5 (NT4/5). Tokom razvića, BDNF omogućava preţivljavanje i diferencijaciju neurona u perifernom i centralnom nervnom sistemu, utiče na izrastanje aksona i usmeravanje njihovog rasta kao i na izrastanje i morfologiju dendrita. BDNF ima značajnu ulogu i u kasnijim fazama razvoja nervnog sistema i regulaciji sinaptičke transmisije i plastičnosti (78). Sinaptička plastičnost predstavlja selektivno jačanje i slabljenje pojedinačnih sinapsi, u zavisnosti od aktivnosti neurona što omogućava da odreĎena informacija bude predstavljena, obraĎena i sačuvana u kompleksnim neuronskim mreţama. BDNF se eksprimira i u tkivima izvan centralnog nervnog sistema: timusu, jetri, slezini, srcu i plućima (79). Tokom razvića, ekspresija BDNF proteina je mnogo izraţenija u nervnom sistemu u poreĎenju sa drugim tkivima i koncentracija BDNF-a u mozgu značajno raste tokom postnatalnog razvića. U nervnom sistemu adultne osobe, BDNF ima široku ekspresiju a najveća koncentracija iRNK i proteina uočena je u neuronima hipokampusa, amigdale, cerebralnog korteksa i hipotalamusa (80). Aktivnost neurona utiče na transkripciju BDNF-a, transport iRNK i proteina u dendrite i sekreciju proteina. BDNF se inicijalno sintetiše na endoplazmatičnom retikulumu kao prekursorni protein (preproBDNF). Nakon sečenja signalnog peptida, proBDNF se transportuje u Goldţijev kompleks gde se rasporeĎuje u konstitutivne ili regulisane sekretorne vezikule. ProBDNF se konvertuje u zreli BDNF intraćelijski u trans-Goldţi kompleksu pripadnicima subtilisin-keksin familije endoproteaza kao što je furin ili u nezrelim sekretornim granulama proprotein konvertazama (81). Dugo vremena se smatralo da je samo zreli sekretovani BDNF biološki aktivan a da je proBDNF isključivo lokalizovan unutar ćelija i da sluţi kao neaktivni prekursor. Ipak, skorija zapaţanja proBDNF sekrecije i konverzije u zreli BDNF ukazuje da proBDNF moţe biti biološki aktivan (75). U periodu detinjstva ekspresija BDNF-a i njegovog receptora u hipokampusu 25 raste paralelno sa sposobnošću ovog dela regiona mozga da podleţe LTP-u istovremeno sa napredovanjem sposobnosti učenja i pamćenja. Produkti BDNF gena se pakuju u vezikule, oslobaĎaju depolarizacijom neurona (82) i vezuju se za receptore visokog afiniteta-tirozin kinaze (posebno trkB) i receptore niskog afiniteta p75 (Slika3.) (83). Slika 3. Obrada BDNF preproproteina (68) Ovo vezivanje stimuliše dimerizaciju i autofosforilaciju receptora, promene u unutarćelijskim signalima kao što je MAP kinazni put i promene u osobinama neurona od amplitude postsinaptičke struje do mehanizama koji uključuju povećanje aktivnosti NMDA receptora (84). Pored uloga sličnih neuropeptidima-neurotransmiterima, BDNF ima i značajnu trofičku aktivnost. Omogućava preţivljavanje neurona i otpornost na stres npr. kod dopaminergičkih neurona koji eksprimiraju i BDNF i trkB receptore. Ekspresija BDNF-a je redukovana u supstantia nigri pacijenata sa Parkinsonovom bolešću i u zahvaćenim kortikalnim regionima pacijenata sa Alchajmerovom bolešću (85,86). 26 Pokazano je da se u zavisnosti od aktivnosti neurona, BDNF oslobaĎa i sa presinaptičke i sa postsinaptičke membrane (87) kao i da je njegov receptor TrkB lokalizovan na obe ove membrane (88). Nekoliko unutarćelijskih proteina šaperona, uključujući karboksipeptidazu E (89) koji se vezuju za domene zrele BDNF i sortilin koji se vezuje za prodomen BDNF-a (90) identifikovani su kao proteini kandidati koji regulišu unutarćelijsku lokalizaciju BDNF-a u neuronima. Interakcija sortilina sa BDNF je od značaja u usmeravanju unutarćeljskog transporta jer je uočeno da ekspresija dominantno negativne forme sortilina dovodi do preusmeravanja BDNF-a sa regulisanog sekretornog puta na konstitutivni put (90). Pokazano je da BDNF moduliše proces sinaptogeneze in vivo i ima ulogu u ekspresiji dugotrajne potencijacije (LTP-a) u hipokampusu. Dugotrajna potencijacija (LTP) odnosi se na jačanje sinapsi što znači da svaki naredni stimulus brţe izaziva postsinaptički odgovor. Najviše je izučavan NMDAR zavisni LTP na sinapsama izmeĎu Šaferovih kolaterala i komisuralnih neurona u CA1 regionu hipokampusa i predstavlja osnovni eksperimentalni model za izučavanje učenja i pamćenja kod kičmenjaka. LTP se deli na dve uzastopne faze: rani LTP (E-LTP) i kasni LTP (L-LTP). Rana faza traje 1- 2 h i zavisi od modifikacije i translokacije već postojećih proteina (91) dok L-LTP traje danima i mesecima (92) i zavisi od de novo sinteze proteina i promena u genskoj ekspresiji (93). Analiza sinaptičke transmisije pre i posle LTP-a navela je na zaključak da je povećanje sinaptičke snage koje nastaje po indukciji LTP-a rezultat povećanog oslobaĎanja neurotransmitera. To znači da se dugotrajna potencijacija indukuje u postsinaptičkim neuronima ali se ispoljava presinaptički. Po ovoj hipotezi, presinaptička ćelija prima signal iz postsinaptičke ćelije (retrogradni signal) koji ukazuje da se dešava indukcija LTP-a i dovodi do povećanog oslobaĎanja transmitera sa presinaptičke ćelije. BDNF reguliše E-LTP i L-LTP različitim mehanizmima. Indukciju E-LTP-a olakšava tako što pojačava sinaptički odgovor na tetaničku stimulaciju najverovatnije tako što utiče na mobilizaciju i vezivanje sinaptičkih vezikula regulisanjem distribucije i fosforilacije sinaptičkih proteina. BDNF takoĎe ima i vaţnu ulogu u odrţavanju (ekspresiji) E-LTP-a aktiviranjem tihih (silent) sinapsi. Pokazano je da je sekrecija BDNF-a zavisna od aktivnosti neurona ključna za kratkotrajnu hipokampus zavisnu epizodičku memoriju. 27 Sa druge strane saznanja o ulozi BDNF-a u indukciji i ekspresiji dugotrajne memorije odnosno L-LTP-a su još uvek nedovoljna. Uočeno je da BDNF utiče na E- LTP oslobaĎanjm postojećih presinaptičkih BDNF pulova i modifikacijom postojećih pre- i postinaptičkih proteina preko TrkB receptora (94). Nasuprot tome, postoje dokazi da indukcija L-LTP-a zahteva sintezu i oslobaĎanje proBDNF-a i njegovu ekstracelularnu konverziju u BDNF (82) a zatim BDNF stimuliše de novo sintezu proteina značajnih za odrţavanje L-LTP-a (95). BDNF osloboĎen tokom L-LTP je najverovatnije nastao pojačanom translacijom već postojećih iRNK kao i novih iRNK. Pokazano je da se BDNF transkripti trasnportuju u dendrite neurona hipokampusa u kulturi kao odgovor na KCl-indukovanu depolarizaciju (96). Translacija iRNK lokalizovanih u dendritima sluţi kao izvor BDNF-a potrebnog za ekspresiju L-LTP-a. Funkcije BDNF-a mogu takoĎe biti izmenjene i na proteinskom nivou. BDNF i aktivator tkivnog plazminogena (tPA, serin proteaza) učestvuju u mehanizmima odgovornim za kasnu fazu dugotrajne potencijacije (L-LTP) i dugotrajnu memoriju. In vitro, proBDNF moţe biti konvertovan u zreli BDNF plazminom kroz tPA zavisnu aktivaciju plazminogena. U elektrofiziološkim studijama, zreli BDNF, ali ne i proBDNF, omogućava L-LTP kod tPA i plazminogen knock-out miševa (82). Ove studije pokazuju da konverzija proBDNF u zreli BDNF omogućava L-LTP ekspresiju u hipokampusu i obezbeĎuje mehanističku vezu izmeĎu tPA i BDNF, dva proteina uključena u dugotrajnu memoriju (Slika 4.). 28 Slika4. Ekstraćelijska konverzija proBDNF u BDNF (72) Proneurotrofini, uključujući i proBDNF, vezuju se i aktiviraju p75NTR receptor (97). Studija Woo i sar., 2005 pokazala je da proBDNF i zreli BDNF imaju suprotne sinaptičke efekte kroz aktivaciju dva različita receptora; p75NTR i Trk receptor tirozin kinase (73). Da bi se bolje razumeo mehanizam koji kontroliše konverziju proBDNF u BDNF dizajnirani su eksperimenti sa ciljem da otkriju koji su to fiziološki relevantni uslovi koji dovode do sekrecije specifičnih izoformi endogenog BDNF. Pokazalo se da je u uslovima stimulacije niskom frekvencijom koja indukuje pojavu dugotrajne depresije (LTD-a), najvećim delom sekretovan proBDNF (98). Nasuprot tome, kada su neuroni izloţeni stimulaciji visoke frekvencije (HFS) koja dovodi do LTP-a detektovane su značajne količine sekretovanog BDNF-a. Interesantno je da je tPA sekretovana samo u slučaju HFS. Dakle, aktivnosti i niske i visoke frekvencije povećavaju proBDNF u ekstraćelijskoj sredini ali samo sekrecija tPA indukovana visokom frekvencijom dovodi do ekstraćelijske konverzije proBDNF u BDNF. Ovi rezultati pokazuju kako HSF aktivnost neurona moţe regulisati suprotne funkcije izoformi BDNF-a. Primena različitih promotorskihh elemenata, selektivna upotreba 3’ UTR regiona da bi se usmerio transport, regulacija sazrevanja proBNDF-a isecanjem i korišćenje različitih unutarćelijskih šaperona da usmeravaju unutarćelijski transport pruţa raznovrsni repertoar mogućnosti centralnom nervnom sistemu da brzo i precizno moduliše ekspresiju, lokalizaciju i sinaptiču isporuku BDNF-a. 29 4. KIBRA 4.1. Struktura gena i proteina Joachim Kremerscothen otkrio je 2003.god. citoplazmatski protein KIBRA ( engl. Kidney brain protein) kao jedan od molekula koji interaguje sa humanim postsinaptičkim proteinom dendrinom. KIBR-u kodira gen WWC1 lociran na dugom kraku hromozoma broj 5 (5q35.1) (99). Gen čini 4 promotora, 23 egzona, 5 alternativnih krajnjih egzona i 4 alternativna mesta poliadenilacije. Transkripcijom nastaje 16 različitih zrelih iRNK koje se meĎu sobom razlikuju po 5’ kraju, 3’ kraju i 3 preklapajuća egzona. Njih 14 nastaje alternativnim splajsovanjem dok dve varijante nisu obraĎene splajsovanjem. Gen se predominantno eksprimira u bubrezima i mozgu i kodira citoplazmatski protein od 125kDa, duţine 1113 aminokiselina koji sadrţi dva amino-terminalna WW domena, unutrašnji motiv sličan C2 domenu sinaptotagmina, karboksi-terminalni nastavak bogat glutaminskim ostacima i PDZ vezujući motiv (99). Analize su pokazale da prvi WW domen učestvuje u interakciji KIBRA-e sa PPxY motivima ciljnih polipeptida. WW domen je najmanji globularni domen koji ostvaruje interakcije sa ciljnim proteinima tako što se vezuje za sekvence bogate prolinima. (Slika 5.) WW domeni su pronaĎeni kod citoplazmatskih i nuklearnih proteina koji učestvuju u brojnim ćelijskim funkcijama kao što su: degradacija proteina, regulacija transkripcije, splajsovanje RNK i clustering (grupisanje) proteina. U mozgu sisara WW domene sadrţi i familija membranskih guanilat kinaza za koje se predpostavlja da funkcionišu kao regulatori neurotransmisije i sinaptičke plastičnosti. Prisustvo unutrašnjeg C2 nalik domena ukazuje da je KIBRA i Ca2+ vezujući protein (99). Molekuli KIBRA-e organizovani su kao antiparalelni homodimeri. 30 Slika 5. Struktura KIBRA proteina (114) 4.2. Polimorfizam u genu za KIBRA protein Papasotiropulos i saradnici su po prvi put primenili pristup studije asocijacije čitavog genoma i ispitivali asocijaciju 500000 SNP-ova sa memorijskim sposobnostima. Najjača asocijacija uočena je za polimorfizam rs17070145 koji nastaje supstitucijom timina (T) citozinom (C) u devetom intronu gena za KIBRA protein. U tri nezavisna uzorka osoba mlaĎe i srednje ţivotne dobi uočeno je da nosioci CC genotipa imaju lošije rezultate u testovima verbalne i vizuelne epizodičke memorije u poreĎenju sa nosiocima T alela (54). Uočena je i asocijacija T alela sa povećanim rizikom od Alchajmerove bolesti kod osoba starijih od 86 godina (100).Za sada, koliko je nama poznato, nema podataka o tome da li i na koji način analizirani polimorfizam utiče na ekspresiju gena, strukturu ili funkciju KIBRA proteina. 4.3. Funkcija KIBRA proteina Imunohistohemijskim metodama pokazano je da se KIBRA eksprimira prevashodno u neuronima telencefalona, posebno u hipokampusu i korteksu (101). Ova otkrića podrţavaju studije koje ukazuju na specifičnu funkciju KIBRA-e u neuronima bitnu za odvijanje memorijskih procesa. Značajna ekspresija KIBRA-e otkrivena je u Purkinje ćelijama odgovornim za kontrolu implicitnog i asocijativnog učenja. TakoĎe, domeni domen PDZ vezujući motiv Glu- bogati domen P-Ser mesto Signal za nuklearnu lokalizacij u 31 uočeno je da distribucija KIBRA-pozitivnih neurona odgovara distribuciji magnocelularnih hipotalamičkih neurona koji eksprimiraju vazopresin i oksitocin što ukazuje da funkcija KIBRA-e nije ograničena samo na procese formiranja memorije i učenje već je bitna i za funkcionisanje neuroendokrinog sistema (101). Na subcelularnom nivou lokalizacija KIBRA proteina odgovara lokalizaciji dendrina i sinaptotagmina i smatra se da ih KIBRA regrutuje zajedno sa drugim postsinaptičkim molekulima u postsinaptičku gustinu time regulišući arhitekturu postsinaptičkog citoskeleta (101). Dok se ekspresija KIBRA-e povećava u ranim fazama sinaptogeneze u adultnom mozgu je pronaĎen nizak nivo ovog proteina. Ova saznanja ukazuju da KIBRA ima ulogu ne samo u morfološkim promenama postojećih sinapsi već je i od ključnog značaja u početnim fazama neuro- i sinapto-geneze. Dosadašnji rezultati ukazuju da KIBRA direktno interaguje sa protein kinazom Cδ (PKCδ) koja vrši fosforilaciju njegovog WW domena (99). U perinuklearnim regionima ćelija uočena je jasna kolokalizacija KIBRA-e i PKCδ. PKCδ je član familije atipičnih protein kinaza C koje se po svojoj strukturi izdvajaju prisustvom samo jednog zinc finger modula (102, 103, 104). Brojne studije su pokazale da je ova PKC uključena u procese signalne transdukcije koji regulišu različite ćelijske procese kao što su rast i diferencijacija ćelija (105). Glavni put aktivacije PKC zavisi od fosfatidil inozitol-3,4,5-trifosfata (PIP3) koji proizvodi PI-3 kinaza (102, 103). Nakon aktivacije PKC interaguje se drugim signalnim molekulima i povezujućim proteinima i formira velike komplekse. Novije studije pokazale su da je aktivnost PKC kritična za konsolidaciju dugotrajne potencijacije i formiranje memorije (106,107). TakoĎe je primećena i interakcija KIBRA-e sa PKMδ, konstitutivno aktivnom kinazom koja se eksprimira samo u mozgu. Biohemijska posledica fosforilacije KIBRA-e za sada je nepoznata. Za sada se zna samo da fosforilacija ne utiče na lokalizaciju proteina. Fragment od 44kDa koji sadrţi mesto fosforilacije je deo domena za dimerizaciju pa se pretpostavlja da fosforilacija reguliše formiranje dimera KIBRA- e. Fosforilacija KIBRA-e moţe uticati na kapacitet za vezivanje ili na specifičnost WW domena pa time i na asocijaciju KIBRA-e sa drugim signalnim molekulima (105). Interakcija sa postsinaptičkim proteinom dendrinom ukazuje na moguću strukturnu ulogu KIBRA-e. Dendrin se sintetiše sa iRNK lokalizovanih u dendritima i 32 interaguje sa α-aktininom i sinaptičkim povezujućim molekulom S-SCAM (108). Pretpostavlja se da KIBRA učestvuje u procesima koji se odvijaju u postsinaptičkoj gustini (PSD), što je potvrĎeno identifikacijom druga dva proteina koji interaguju sa KIBRA a to su sinaptopodin i PKCδ (105, 109-135). Kao i dendrin i sinaptopodin se vezuje za PPxY motiv u okviru WW domena KIBRA-e. Oba proteina su lokalizovana u dendritima i imaju vaţnu ulogu u organizaciji citoskeleta (99, 109). Uloga sinaptopodina u dendritičnim trnovima uočena je kod knock-out miševa kod kojih odsustvo sinaptopodina dovodi do poremećaja u dugotrajnoj sinaptičkoj plastičnosti graĎi dendritskih trnova (110, 111). Na subćelijskom nivou gust sloj citoskeletnih proteina, povezujućih molekula, jonskih kanala i transmembranskih receptora formira postsinaptičku gustinu neurona. Smatra se da PSD ostvaruje brojne funkcije u formiranju memorije. Najbitnije je da deluje kao organizator mašinerije za postsinaptičku transdukciju signala koji povezuju regulatorne molekule sa njihovim metama, koordiniše promene tokom razvoja i kontroliše remodelovanje postsinaptičkih struktura u zavisnosti od njihove aktivnosti. Najnovija otkrića ukazuju da su posebno povezujući proteini, u koje se ubraja i KIBRA, bitne komponente PSD jer interaguju i povezuju različite proteine bitne za formiranje memorije na vremenski i prostorno regulisan način (112). Još jedan od proteina koji interaguje sa KIBRA-om a od značaja je za kognitivne procese je KIAA0513. Ekspresija KIAA0513 je povećana u mozgu pacijenata sa šizofrenijom, ali ćelijska funkcija ovog proteina je nepoznata (113). Moţe se predpostaviti da bi interakcija KIAA0513 sa KIBRA-om mogla biti još jedna karika u objašnjenju kognitivnog deficita u ovoj bolesti (114). KIBRA direktno interaguje sa PICK1 kao i sa GluA1, GluA2 i drugim sinaptičkim proteinima formirajući proteinski kompleks. Pokazano je da odsustvo KIBRA-e značajno ubrzava stepen recikliranja GluA2. Na osnovu toga moţemo zaključiti da KIBRA ima vaţnu ulogu u regulaciji transporta AMPA receptora u procesu učenja i sinaptičke plastičnosti (115). Otkrićem proteina sa kojima KIBRA interaguje pokazano je da KIBRA učestvuje u i u drugim vaţnim ćelijskim funkcijama kao što su ćelijska polarnost i migracija, transport vezikula, regulacija transkripcije i sinaptogeneza (109). 33 Identifikacija proteina PATJ (PALS1-associated tight junction protein) kao molekula koji interaguje sa PDZ-vezujućim regionima KIBRA ukazuje na moguću ulogu KIBRA u ćelijskoj polarnosti. PATJ pripada kompleksu evolutivno očuvanih multiproteinskih kompleksa koji regulišu ćelijsku polarnost u podocitima i neuronima kao i subćelijsku lokalizaciju atipičnih PKC i Par3 u epitelnim ćelijama (116, 117). Uzevši sve u obzir ove sličnosti ukazuju na preklapajuće funkcije KIBRA i PATJ u modulaciji ćelijske plastičnosti i migracije ćelija koje su ektodermalnog porekla. Identifikacija KIBRA-e u PSD, interakcija sa proteinima ćelijske polarnosti i uloga u migraciji ćelija ukazuje na centralnu ulogu KIBRA-e u rearanţmanu ćelijskog citoskeleta. Druga veza KIBRA-e sa ćelijskim citoskeletom potiče od njegove interakcije sa dineinskim kompleksom. Pokazano je da sorting nexin 4 (SNX4) interaguje sa kompleksom dineina, motora mikrotubula i KIBRA-om i da ovaj kompleks reguliše usmeravanje transferinskog receptora (TfnR) ne ka degradaciji, već ka putu za recikliranje. Nishodna regulacija SNX4, KIBRA ili dineinskih proteina narušava transport TfnR i povećava lizozomima posredovanu degradaciju receptora (118). Opisana je i istovremena interakcija KIBRA-e sa histonom H3 i lakim lancem dineina 1 (DLC1). Vezivanje KIBRA-e za histon 3 ostvaruje se preko regiona bogatog glutaminima u blizini C terminusa (Slika 6.). Delecija histon vezujućeg regiona KIBRA-e dovodi do inhibicije transaktivacije estrogenskog receptora α u ćelijama humanog karcinoma dojke (119). Iako se KIBRA vezuje za histon i zadrţava u jedru mehanizam transaktivacije ostaje nejasan. Da KIBRA učestvuje u regulaciji transkripcije potvrĎeno je i u studiji koja pokazuje da postoji ushodna regulacija KIBRA-e primenom progesterona i da se KIBRA vezuje za diskoidni domen receptora 1 (DDR1) tirozin kinaze vaţne za razvoj mlečnih ţlezdi (120). KIBRA i DDR1 interaguju zajedno sa PKCδ u kompleksu uključenom u kolagenom regulisani MAP signalni put. 34 Slika 6. Proteini koji interaguju sa KIBRA-om (114) Postoje eksperimentalni dokazi koji povezuju KIBRA-u sa Alchajmerovom bolešću. Ekspresija KIBRA-e je znatno izmenjena u neuronima koji sadrţe neurofibrilarnu klubad u ključnim regionima mozga pacijenata sa AB. U neuronima disekovanim laserom iz hipokampusa, srednjeg temporalnog girusa i zadnjeg cinguluma koncentracija iRNK KIBRA-e povećana je 2.4-3 puta dok je iRNK PKC u istim regionima mozga smanjena 2.3-3.3 puta. Značajne razlike nisu primećene u primarnom vizuelnom korteksu, regionu koji nije pogoĎen sa AB (121). 35 5. APOLIPOPROTEIN E (APOE) 5.1. Struktura gena i proteina Gen za APOE (apolipoprotein E) nalazi se na dugom kraku hromozoma 19 (19q13.2) i obrazuje klaster zajedno sa APOC1, pseudo APOC1, APOC2 i APOC4 genima (122,123). Gen sadrţi 3597 nukleotida i sastoji se od 4 egzona duţine 44, 66,193 i 860 bp (124). Zreo transkript je duţine 1163 nukleotida. APOE se sintetiše kao polipeptid od 317 aminokiselina koji podleţe post-translacionoj obradi i isecanju signalnog peptida od 18 aminokiselina pa zreli protein sadrţi 299 aminokiselina. Eksprimira se u različitim organima uključujući jetru, mozak, bubrege i srţ nadbubreţne ţlezde (125). Tkivno specifična ekspresija pod kontrolom je elemenata rasporeĎenih po celom genskom C1-C1-C2-C4 klasteru (126-127). APOE je jednolančani glikoprotein od pribliţno 34.2 kDa. Nakon in vitro digestije trombinom razdvaja se na dva domena: amino-terminalni, globularni, domen od 22kDa od 1. do 191. aminokiseline i C-terminalni, fibrilarni, domen od 10 kDa koji se pruţa od 216-te do 299-te aminokiseline (128,129). Ova dva domena su rezistentna na proteolizu i razdvojena su regionom koji je podloţan proteolizi. C-terminalni deo proteina je organizovan u vidu 4 α-heliksa i sadrţi heparin-vezujuće mesto izmeĎu aminokiselina 214 i 223 (130) i mesto za vezivanje lipida izmeĎu aminokiselina 245 i 266 (131). NH2-terminalni deo proteina sadrţi domen za vezivanje receptora od 130-te do 150-te aminokiseline (132). Pozitivno naelektrisani aminokiselinski ostaci receptor- vezujućeg domena interaguju sa negativno naelektrisanim ostacima prisutnim na ligand-vezujućem domenu receptora. (Slika 7.) 36 Slika 7. Struktura APOE proteina (148) 5.2. Polimorfizmi APOEgena APOE gen javlja se u vidu tri glavne alelne forme: E2, E3 i E4 koje obrazuju 6 različitih genotipova (E3/E3, E3/E4, E3/E2, E2/E2, E2/E4, E4/E4). Aleli E2, E3 i E4 su definisani haplotipom na pozicijama 7903 i 8041 u četvrtom egzonu gena. Ovaj haplotip odreĎuje aminokiselinski sastav na poloţaju 112 i 158 u proteinu. Supstitucija timina (T) u citozin (C) u kodonu 112 dovodi do zamene Cys sa Arg (rs429358) dok supstitucija C u T u kodonu 158 dovodi do zamene Arg sa Cys (rs7412). E3 varijanta na poziciji 112 ima Cys, a na poziciji 158 Arg. E2 varijanta na obe pozicije ima Cys, a E4 na obe pozicije Arg. (122,133,134) (Slika 8.) TakoĎe, detektovana je i izuzetno retka varijanta E1 (samo 4 zabeleţena slučaja) kod koje se na poziciji 112 nalazi Arg a na poziciji 158 Cys. Smatra se da je E4 divlji, ancestralni alel u humanim populacijama ali je tokom evolucije postojala jaka negativna selekcija protiv E4 i favorizovan je E3. Tri glavne izoforme proteina označene kao ApoE2, ApoE3 i ApoE4 razlikuju se po poloţaju nakon izoelektričnog fokusiranja: E2 je najbaznija dok je E4 najkiselija izoforma. Domen za vezivanje receptora Domen za vezivanje lipida 37 Slika 8. Struktura APOE gena, sekvenca u donjem redu definiše E3 alel Uključujući i najčešću varijantu APOE3 do sada je opisano 30 različitih varijanti APOE proteina. Različite APOE varijante dele se na: uobičajene (česte) varijante u koje spadaju APOE3, APOE4 i APOE2; APOE varijante povezane sa familijarnom disbetalipoproteinemijom (FD); APOE varijante povezane sa drugim hiperlipidemijama i retke varijante koje nisu povezane sa hiperlipidemijama (132). Četiri varijante APOE daju protein čija se veličina razlikuje od APOE3 najčešće usled pojave mutacija koje dovode do prerane pojave stop kodona i to su: APOE3-Leiden, APOE3 Washington, APOE0 (ΔG2919/2920/2921-stop60), APOE0 (A3592G) (135,136). 5.3 Funkcija APOE proteina APOE je apolipoprotein čija ključna uloga u mozgu je transport holesterola meĎu ćelijama. U mozgu APOE se sintetiše prevashodno u astrocitima i deo je lipoproteinskih čestica koje sadrţe holesterol i fosfolipide. Holesterol spada u molekule ključne za razvoj i normalno funkcionisanje centralnog nervnog sistema (CNS-a) (137). Holesterol igra vaţnu ulogu u razvoju i odrţavanju plalstičnosti nervnog sistema (138,139,140), transportu sinaptičkih vezikula duţ mikrotubula (141) i oslobaĎanju neurotransmitera (140). Membrana sinaptičkih vezikula sadrţi veliku količinu holesterola i proteina koji interaguju sa holesterolom pa je on neophodan za nihovu 38 biogenezu. Nedostatak holesterola onemogućava neurotransmisiju i narušava sinaptičku plastičnost. Krvno-moţdana barijera sprečava import lipoproteina plazme u mozak. Usled toga mozak ima svoj nezavisan transportni sistem u okviru kojeg glijalne ćelije proizvode lipoproteine koji neuronima dostavljaju holesterol neophodan za izrastanje neurita i popravljanje oštećenja na neuronima (142) (Slika 9.). Slika 9. Transport holesterola od astrocita do neurona (145) U neuronima se pod odreĎenim uslovima takoĎe odvija sinteza holesterola i to u telu neurona odakle se zatim transportuje do aksona anterogradnim transportom. Iako se holesterol sintetiše i u neuronima postoji dovoljno dokaza o tome da rast neurona i efikasno formiranje sinapsi zavisi od holesterola poreklom iz astrocita. Kako neuroni sazrevaju i smanjuju endogenu sintezu holesterola sve više zavise od egzogenog holesterola (143). APOE ulazi u sastav VLDL (lipoproteini vrlo male gustine) čestica sintetisanih u jetri a prisutan je i u hilomikronima, hilomikronskim ostacima i HDL (lipoproteini velike gustine) česticama. U cerebrospinalnoj tečnosti APOE-lipoproteinske čestice su veličine i gustine HDL čestica plazme, sferične su i sadrţe esterifikovani holesterol Astrocit Modifikacija ? Holesterol Estri holesterola Fosfolipidi APO E CSF 39 (144). APOE-lipoproteinske čestice se vezuju za familiju lipoproteinskih receptora male gustine (LDLR) (145). Identifikovano je više od 10 članova ove receptorske familije. Za sve je karakteristično prisustvo ligand-vezujućih ponovaka, EGF- nalik ponovaka, b-propeler nalik strukture sa YWDT motivom (Slika 10.). Glavni receptori za APOE u mozgu su LDLR i LRP1. Iako oba receptora imaju ulogu u metabolizmu lipoproteina njihove uloge su različite. LRP1 se eksprimira u većoj meri na neuronima a manje na ćelijama glije dok se LDLR eksprimira u većoj meri na ćelijama glije a manje u neuronima (146,147). Pokazano je da delecija LRP1 gena dovodi do redukcije nivoa holesterola u mozgu dok delecija LDLR gena nema takav efekat (148,149). Na kraju, pokazano je da se APOE lipoproteinske čestice vezuju za LDLR sa većim afinitetom (149). Iako receptor vezujući domen (136-150 ak.) ne obuhvata aminokiseline na 112-oj i 158-oj poziciji vezivanje za LDL receptor zavisi od izoformi APOE. Afinitet E2 za LDLR je 100 puta manji nego afinitet E3 i E4 što narušava metabolizam lipida i vodi aterosklerozi (150). Slika 10. Receptori sa kojima APOE interaguje (146) Transmembranski domen NPxY motiv EGF ponovak Ligand vezujući ponovak YWTD β-propeler 0-vezani šećer 40 5.4. Uloga APOE u memorijskim procesima Najviše informacija o ulozi APOE u memorijskim procesima potiče iz eksperimenata na miševima koji eksprimiraju humane varijante APOE. Ovi eksperimenti pokazalii su da postoji razlika u uticaju APOE izoformi na dugotrajnu potencijaciju (LTP) i prostornu memoriju (151). Miševi koji su eksprimirali E3 izoformu imali su iste rezultate i podjednaku indukciju LTP-a kao i WT miševi. Za razliku od njih, kod miševa koji su eksprimirali E4 izoformu došlo je do narušavanja indukcije LTP-a i prostornog učenja. Defekt u memoriji bio je izraţeniji kod ţenki što odgovara rezultatima studija na ljudima koje pokazuju da su štetni efekti E4 forme izraţeniji kod ţena (152). Skorija istraţivanja William-a, Rebeck-a i kolega pokazala su da je APOE uključen u najmanje tri puta signalne transdukcije: ERK, c-jun N- terminalna kinaza (JNK) i Disabled-1 (Dab-1). Svaki od ovih puteva značajno utiče na sinaptičko pojačavanje indukovano aktivnošću neurona. U kulturi primarnih neurona aplikacija APOE pune duţine ili samo peptida koji sadrţi receptor vezujući domen povećava stepen aktivacije ERK i Dab-1 a sniţava aktivaciju JNK. TakoĎe, primećeno je da su APOE indukovana fosforilacija ERK1/2 i regulacija Dab-1 puta zavisne od funkcije NMDA receptora. Interesantno je da APOE zavisna regulacija JNK uključuje i aktivnost γ-sekretaze koja seče odreĎene transmembranske proteine uključujući i amiloidni prekursorni protein (APP) i LDLR (153). Na osnovu navedenih rezultata vidi se da je APOE vaţan modulator sinaptičke plastičnosti i formiranja memorije. Iako se smatra da je APOE prevashodno molekul čija je uloga transport lipida, skorija otkrića ukazuju na dodatne uloge APOE u mozgu uključujući regulaciju funkcije astrocita i neurona. U nekoliko studija pokazano je da APOE ima vaţnu ulogu u regulaciji homeostaze Ca 2+ čime moţe uticati na regulaciju funkcije različitih jon- zavisnih receptora uključujući i K+ antiportere (154, 155). Brojne studije su pokazale i ulogu APOE u modulaciji oslobaĎanja neurotransmitera povećanjem stepena uklanjanja glutamata čime se sprečava njegova ekscitotoksičnost (156). APOE takoĎe povećava efekat nekih faktora rasta kao što je cilijarni trofički faktor (CNTF) koji stimuliše preţivljavanje i grananje neurona (157). TakoĎe, štiti neurone od oksidativnog stresa, redukcijom toksičnosti hidrogen peroksida što je pokazano na ćelijskim linijama glijalnih ćelija. Pokazano je da E3 pruţa bolju zaštitu od oksidativnog stresa u poreĎenju sa E2 i E4. APOE ima ulogu i u regulaciji uroĎenog i stečenog imunog 41 odgovora tako što inhibira proliferaciju neutrofila i limfocita kao i aktivaciju T- limfocita (158). Sinteza APOE je regulisana citokinima pa je moguće da APOE putem mehanizama negativne ili pozitivne povratne sprege reguliše transdukciju signala citokina. Pokazano je da makrofagi i astrociti menjaju sekreciju APOE nakon primene različitih inflamatornih stimulusa što potvrĎuje ulogu APOE u imunološkim reakcijama (159). 5.5. Uloga APOE u Alchajmerovoj bolesti Zapaţanje da se APOE vezuje za amiloid β (Aβ) u cerebrospinalnoj tečnosti učinilo je APOE glavnim kandidatom za studije asocijacije sa Alchajmerovom bolešću (AB). E4 alel kao faktor koji utiče na vreme i brzinu progresije AB otkrili su 1993. Strittmatter, Roses i saradnici. Nakon prvobitnog otkrića njegova uloga je potvrĎena u brojnim asocijativnim studijama. Efekat E4 alela najizraţeniji je u periodu izmeĎu 60 i 70 god. ţivota kada je prevalenca E4 alela meĎu obolelima veća od 50% (145). Pokazano je da ovaj alel povećava rizik i od ishemijskih cerebrovaskularnih bolesti što takoĎe moţe doprineti kognitivnom deficitu povezanom sa godinama starosti. Različite studije su pokazale da E4 alel predstavlja i faktor rizika za aterosklerozu, progresiju HIV-a, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, demenciju sa Luijevim telima, Parkinsonovu bolest i multiplu sklerozu (160). Ova zapaţanja ukazuju da E4 alel moţe biti asociran sa ubrzanom neurodegeneracijom. Akumulacija, oligomerizacija i skladištenje Aβ u mozgu je centralni dogaĎaj u patogenezi AB. Akumulacija Aβ posledica je njegove prekomerne produkcije i nedovoljnog uklanjanja iz mozga. Sve više je dokaza da APOE i njegovi receptori imaju vaţnu ulogu u oba ova procesa (145). Nekoliko tipova APOE receptora moţe se direktno vezati za APP i modulisati njegov transport i obradu do Aβ (161). Pokazano je da APOE izoforme različito regulišu obradu APP-a do Aβ preko mehanizama koji zavise od funkcije LRP1. Na osnovu dosadašnjih saznanja smatra se da APOE4 povećava produkciju Aβ za razliku od APOE3 alela (162). Postoje dva glavna puta kojima se Aβ uklanja iz mozga: receptorima posredovano uklanjanje u ćelijama moţdanog parenhima (mikroglija, astrociti, neuroni) i uklanjanje kroz krvno-moţdanu barijeru. Receptorima posredovano uklanjanje se odvija preko APOE receptora: LDLR, 42 LRP1 i VLDLR koji se eksprimiraju u neuronima, astrocitima i mikrogliji moţdanog parenhima kao i endotelijalnim ćelijama, astrocitima i glatkim mišićnim ćelijama u nivou krvno-moţdane barijere i cerebralnih arterija. APOE receptori mogu vezivati Aβ direktno ili indirektno preko Aβ šaperona. APOE je najbolje okarakterisan šaperon za Aβ do sada (145). Region za vezivanje Aβ je u C-terminalnom domenu APOE i preklapa se sa regionom za vezivanje lipida. Zaista, vezivanje Aβ za APOE kompromituje njegovu ulogu u transportu lipida. Ovi rezultati pokazuju da Aβ peptidi onemogućavaju normalno funkcionisanje APOE u metabolizmu lipida u mozgu i time doprinose patogenezi AB. APOE3 čestica vezuje se za Aβ sa većim afinitetom u poreĎenju sa APOE4. Shodno tome E3 uklanja Aβ preko APOE receptora efikasnije nego APOE4 (163). Post.mortem studije pokazale su da nosioci E4 alela i kod sporadičnih (164) i kod naslednih formi bolesti imaju više amiloidnih plakova (165). Uočeno je da vezivanje Aβ za APOE4 preusmerava uklanjanje sa LRP1 na VLDLR koji internalizuje Aβ-APOE4 komplekse na krvno-moţdanoj barijeri sporije od LRP1 (166). Sa druge strane Aβ-APOE2 i Aβ-APOE3 kompleksi se ukanjaju preko oba tipa receptora znatno brţe. Receptorima posredovano uklanjanje je efikasan mehanizam za redukciju Aβ jer se Aβ internalizovan APOE receptorima šalje u lizozome gde se razgraĎuje. Ipak, moguće je da receptorima posredovano uklanjanje u neuronima moţe dovesti do intraneuronalne akumulacije što je toksično za ćelije (167).Aβ se u ćelijama uklanja proteolitičkom degradacijom. Aβ proteaze koje se eksprimiraju u neuronima i vaskularnim ćelijama su neprilisin (membranska metaloendopeptidaza) i insulin- degradujući enzim (IDE). Pokazano je da aktivnost oba ova enzima redukovana kod nosilaca APOE4 alela (145). Postavljena je hipoteza o asocijaciji metabolizma holesterola i rizika od AB. Nivo holesterola u mozgu osoba obolelih od AB je niţi nego u mozgu zdravih osoba (168). Pokazalo se da APOE4 miševi imaju niţi nivo holesterola u mozgu čak iako su vrednosti perifernog holesterola povišene (169). Postoje i dokazi da je APOE4 manje efikasan od APOE3 u transportu holesterola. Pokazano je da je potrebno manje E3 nego E4 molekula za formiranje lipidnih čestica. Astrociti koji eksprimiraju APOE3 mogu da snabdeju neurone sa više holesterola nego što je to slučaj sa onima koji eksprimiraju APOE4. Uprkos ovim interesantnim zapaţanjima potrebna su dodatna istraţivanja o uticaju različitih izoformi APOE na metabolizam holesterola u mozgu. Pored 43 holesterola APOE vrši transport i drugih lipida u mozgu od kojih se neki ne sintetišu u astrocitima. Na primer sulfatid koji se sintetiše u oligodendrocitima a koji je ključan za integritet neuronskih trnova i mijelinskog omotača. Sulfatid je i potencijalni biomarker za AB jer se njegova koncentracija smanjuje u mozgu osoba sa AB. Propadanje sinapsi je rana patološka promena u AB. APOE- i APOE receptorima- posredovana redistribucija lipida i signaling imaju vaţnu ulogu u integritetu sinapsi i plastičnosti nervnog sistema. Sve je više dokaza da različite izoforme različito regulišu sinaptičku plastičnost i popravku oštećenih sinapsi (Slika 11.). Primarna uloga APOE prilikom njegove traumom indukovane ekspresije je redistribucija lipida i jačanje APOE posredovane transmisije signala za popravku neurona i sinapsi. Pokazano je da APOE3 stimuliše izrastanje neurita dok E4 smanjuje ili pak nema efekta (170). Slično tome, APOE3 lipoproteinske čestice su efikasnije u zaštiti neurona od apoptoze (171). Ove studije ukazuju da je APOE4 manje efikasan u odrţavanju i popravljanju sinapsi i neurona što moţe da objasni zašto u slučaju oštećenja neurona prilikom povreda mozga ili šloga osobe sa APOE4 imaju lošiji ishod. Slika 11. Razlike u funkcijama APOE4 i APOE3 (145) 44 Moguće je da je AB posledica kumulacije oštećenja od Aβ i drugih stresora kao što je oksidacija i inflamacija. APOE izoforme različito regulišu i izrastanje dendritskih trnova. Kod AB pacijenata i kontrola APOE4 je u obrnutoj korelaciji sa gustinom dendritskih trnova. Razlike u funkcionisanju APOE3 i APOE4 varijante prikazane su na slici 11. 45 6. BUTIRILHOLIN ESTERAZA (BCHE) 6.1. Struktura gena i proteina Gen za butirilholin esterazu nalazi se na dugom kraku hromozoma broj 3 (3q26.1-3q26.2), (172) duţine je oko 70kb i sastoji se od četiri egzona i tri velika izrazito dugačka introna (173). Humana butirilholin esteraza (BChE) je enzim, glikoprotein, koji pripada familiji serin esteraza. Kao i AChE, BChE pripada klasi α/β fold proteina koji sadrţe centralnu β ploču okruţenu α heliksima (174). Ova struktura je pronaĎena i kod drugih proteina, uključujući prekursore hormona kao što je tireoglobulin i ćelijske adhezione molekule (npr. neuroligin). Kompleksni ugljeni hidrati su u molekulu AChE kovalentno vezani za tri, dok su u molekulu BChE vezani za devet aminokiselinskih ostataka. Smatra se da glikozilacija utiče na savijanje, sekreciju, stabilnost i funkciju proteina (174). Veći broj mesta glikozilacije produţava poluţivot BChE u odnosu na AChE. BChE se javlja u vidu različitih molekularnih formi - monomera i oligomera izgraĎenih od identičnih subjedinica. Simetrična monomerna forma naziva se G1 globularna forma. Dimerna forma - G2, sastoji se od dva monomera povezana disulfidnim mostom. Dve dimerne forme povezane hidrofobnim interakcijama formiraju tetramer - G4 globularnu formu. Ove tri simetrične, hidrofobne i globularne molekularne forme javljaju se uglavnom u solubilnom obliku. Postoje i asimetrične tetramerne forme vezane za membranu kolagenskim sidrom ili membranskim sidrom bogatim prolinom- PRIMA (Slika 12) (175). 46 Slika 12. Molekularne forme BCHE proteina (175) 6.2. Polimorfizmi BCHE gena U okviru gena nalazi se čak 40 polimorfnih mesta. Najčešći polimorfizam u BCHE genu je K varijanta (rs1803274) koja nastaje baznom supstitucijom A u G na 1699-om nukleotidu i dovodi do zamene alanina treoninom u 539-om kodonu, 36 aminokiselina uzvodno od C terminusa (176) (Slika 13.). BChE K varijanta ima smanjenu aktivnost za oko 30 % u poreĎenju sa wt varijantom enzima (176). Poloţaj polimorfizma daleko od hidrolitičkog mesta ukazuje da supstitucija dovodi do smanjene stabilnosti enzima što za posledicu ima i njegovu smanjenu aktivnost. Smatra se da će nosioci K varijante imati i zadrţati bolju holinergičku transmisiju tokom godina u poreĎenju sa nosiocima normalnog alela što korelira sa boljom paţnjom i manjim kognitivnim propadanjem sa godinama (177). Sa druge strane nosioci K varijante su refraktorni na terapiju inhibitorima holinesteraze, trenutno vodećom terapijom AB. To povlači pitanje da li BChE K varijanta predstavlja faktor rizika ili protektivni faktor za AB (178). Dosadašnja istraţivanja pokazuju da moţe biti protektivni faktor ali i faktor rizika u zavisnosti od uticaja ostalih varijabli. PRIMA sidro Kolagen Q G4 -usidren 47 Slika 13.Struktura i polimorfne varijante BCHE gena (175) Atipiĉna varijanta BChE A – nastaje supstitucijom A u G u 209 nukleotidu što dovodi do zamene aminokiseline asparagina treoninom na poziciji 70 (Slika 13.). Ova varijanta dovodi do smanjene aktivnosti enzima usled smanjenog afiniteta za estre holina. Učestalost homozigota za ovu varijantu je 1:3000. Nosioci ove varijante imaju problema nakon ingestije inhibitora holinesteraze-rostigmina. Efekti uključuju depresiju, nesanicu, gubitak teţine promene u centralnom i perifernom nervnom sistemu. Fluorid rezistentne varijante: Thr247Met i Gly390Val dovode do produţene apnee prilikom primene sukcinilholina. Homozigoti za ove varijente javljaju se sa učestalošću od 1:150000. BChE J varijanta- dovodi do zamene glutamina valinom na poziciji 497. Posledica je sniţena koncentracija a samim tim i sniţena aktivnost enzima za 66%. Učestalost homozigota za ovu varijantu je 1:150000. Osobe sa ovom varijantom podloţne su prolongiranoj apnei prilikom primene sukcinilholina. BChE H varijanta - dovodi do smanjene aktivnosti enzima za 90%. Cynthiana varijanta - dovodi do povećane koncentracije BChE Johannesburg varijanta - dovodi do povećane aktivnosti enzima dok njegova koncentracija ostaje nepromenjena. Postoji još oko 20 opisanih varijanti koje dovode do smanjene aktivnosti enzima na 0-2% od normalne aktivnosti. Kodirajući regioni Supstitucija G>A (A539T) K varijanta Supstitucija A>G (D70G) Atipiĉna varijanta 48 6.3. Funkcija BChE Biološka funkcija BChE nije u potpunosti razjašnjena. Za sada se zna da ovaj enzim katalizuje hidrolizu endogenih estara holina kao što su acetilholin, propionilholin i butirilholin kao i sekretagoga hormona rasta-oktanoil grelin (179). Pokazano je da BChE vrši hidrolizu i drugih estara kao što je kokain, acetilsalicilna kiselina i heroin. U plazmi BChE deaktivira nekoliko klasa jedinjenja koja su potencijalno štetna za normalne fiziološke funkcije. U ta jedinjenja spadaju estri, karbamati i glukoalkaloidi otkriveni u biljkama kao što su krompir, paradajz i plavi patlidţan (175). TakoĎe, detoksifikuje izuzetno otrovna sintetička jedinjenja kao što su različiti organofosfati. BChE je uključena i u metabolizam različitih lekova i vrši deaktivaciju sukcinilholina i konverziju bambutenola u aktivnu formu. BChE takoĎe ima i aril acilamidaznu aktivnost i katalizuje hidrolizu acil amida i aromatičnih amina (175). Mnogo godina interesovanje za BChE poticalo je iz oblasti anestezije, nakon uvoĎenja mišićnog relaksanta sukcinilholina tokom hirurških intervencija. Otkriveno je da je BchE ključni enzim koji učestvuje u metabolizmu sukcinilholina i da osobe koje doţivljavaju prolongiranu apneu imaju varijante ovog enzima sa sniţenom katalitičkom aktivnošću (180). Postojanje "silent" formi enzima kod kojih BChE nema svoju tipičnu enzimsku aktivnost bez očiglednih štetnih efekata nije činilo ovaj enzim interesantnim za detaljnija istraţivanja. Termin "silent" opisuje nesposobnost te varijante da katalizuje hidrolizu estara holina. Ni jedna od studija nije ispitivala da li takvim enzimima nedostaju i druge funkcije kao što je aril acilamidazna aktivnost(175). BChE se eksprimira u hipokampalnim, talamičkim i kortikalnim regionima za koje je poznato da imaju holinergičku inervaciju i vaţnu ulogu u kognitivnim funkcijama. Unutarćelijska distribucija je različita u odnosu na acetilholin esterazu. BChE se predominantno eksprimira u telu neurona i proksimalnim dendritima dok je ekspresija AChE otkrivena u jedru i aksonima. Ekspresija BChE koja se odvija na jedinstven i precizan način u odreĎenim strukturama mozga ukazuje da bi ovaj enzim mogao imati vaţnu ulogu u moţdanim funkcijama (179). Pokazano je da BChE ima više specifičnih funkcija nego što se ranije verovalo. Smatra se da je BChE uključen u neke aspekte razvoja nervnog sistema i da deluje kao 49 koregulator holinergičke neurotransmisije (181). Strukturna sličnost izmeĎu AChE i BChE sa molekulima koji učestvuju u ćelijskoj adheziji ukazuje da ovi proteini moţda mogu imati i neku ne enzimsku aktivnost što bi moglo da objasni njihovu ulogu u razvoju nervnog sistema (179). TakoĎe, biohemijske osobine BChE se menjaju u bolestima kao što je AB. Moguća uloga u normalnim fiziološkim procesima kao i u neurodegenerativnim bolestima sve više privlači paţnju. Primećena je ekspresija BChE u aksonima, nervnim završecima, rastućim konusima i ćelijama koje okruţuju aksone što ukazuje na moguću ulogu ovog enzima u izrastanju neurita. BChE se eksprimira u velikim populacijama neurona tokom ograničenog perioda postnatalnog razvoja mozga kod nekoliko vrsta uključujući ptice, glodare, majmune i ljude. Ova privremena ekspresija u nervnim i potpornim ćelijama smatra se dokazom za ulogu ovog enzima u razvoju nervnog sistema kako svojim katalitičkim aktivnostima tako i preko sposobnosti da regulišu funkcije drugih proteina. Smatra se da AChE učestvuje u razvoju nervnog sistema i tako što povećava holinergičku transmisiju. Tek treba potvrditi da li je to slučaj i sa BChE (175). Tradicionalna istraţivanja sinaptičke plastičnosti usumerena su na promene u glutamatergičkoj transmisiji. Ipak, interakcije sa drugim tipovima neurotransmiterskih sistema kao što su holinergički, dopaminergički i GABA-ergički mogu modulirati različite aspekte plastičnosti, kao što su njen smer, trajanje i magnituda. Holinergički sistem ima ključnu ulogu u regulaciji sinaptičke transmisije i plastičnosti. Transmisija signala preko različitih subtipova muskarinskih i nikotinskih receptora, svakog sa različitim osobinama i nishodnim signalnim putevima, postavljenih na pre- i post- sinaptičkim regionima kao i van sinapsi na različitim tipovima neurona dozvoljava širok spektar modulacija. Acetilholin (Ach) je esencijalni ekscitatorni neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu koji ima vaţnu ulogu u kognitivnim funkcijama. U hipokampusu Ach pojačava i inhibira sinaptičku transmisiju, olakšava i pojačava LTP i LDP i indukuje plastičnost u zavisnosti od regiona u okviru hipokampusa i uslova aktivacije receptora. Postoji nekoliko dokaza koji potvrĎuju da BchE moţe biti koregulator aktivnosti neurotransmitera acetilholina. Regulatorna uloga BchE u hidrolizi acetilholina se primećuje kada usled inhibicije BChE dolazi do dozno zavisnog povećanja koncentracije acetilholina u mozgu (182). U slučaju odsustva AChE, BChE moţe da kompenzuje neke od njenih funkcija. Npr. AChE null miševi 50 mogu da preţive uz posebnu negu i da zadrţe svoje holinergičke neurone u slučaju da imaju normalnu aktivnost BChE (183). Uzevši u obzir činjenicu da je inhibicija i BChE i AChE letalna usled holinergičke prekomerne aktivnosti smatra se da Bche ima ključnu ulogu u hidrolizi acetilholina kod AChE null ţivotinja (183). Pokazalo se da postoji asocijacija BchE sa drugim proteinima kao što je albumin, transferin i peptidaze. Noviji rezultati ukazuju da postoji asocijacija izmeĎu BChE i tripsina i da BChE značajno povećava proteolitičku aktivnost tripsina. na dozno-zavisan način. Ova zapaţanja su od značaja za razumevanje funkcionisanja nervnog sistema jer tripsin ima vaţnu ulogu u normalnim moţdanim funkcijama a smatra se da moţe biti uključen i u patologiju AB (184). Na osnovu neuroanatomskih i neurohemijskih saznanja moţemo pretpostaviti da izmeĎu osoba sa normalnom i osoba sa smanjenom aktivnošću ovog enzima moţe postojati razlika u kognitivnim sposobnostima.(179) Inhibicija BChE rivastigminom asocirana je sa poboljšanjem paţnje i epizodičke memorije. Izmenjen nivo aktivnosti BChE inhibitorima ili usled postojanja odreĎenih polimorfizama mogu uticati na kognitivne funkcije kod AB ili demencije sa Lewy-evim telima. 6.4. Uloga BChE u Alchajmerovoj bolesti Vaţna uloga Ach u memorijskim funkcijama je najbolje ilustrovana kod AB, gde je deficit u paţnji, učenju i radnoj memoriji praćen redukcijom holinergičkih projekcija i receptora u korteksu i hipokampusu. Za razliku od AChE, aktivnost BChE raste sa godinama kao i kod pacijenata sa AB. Visoka koncentracija ovog enzima uočena je u neurofibrilarnim klubadima i amiloidnim plakovima (185). Interesantno je zapaţanje da molekularna forma BChE koja se javlja u AB odgovara onoj koja postoji tokom embrionalnog razvića. Predominantna forma tokom razvića mozga je G1 dok je u adultnom mozgu zastupljena forma G4. Nivo G1 forme se značajno povećava u cerebralnom korteksu osoba sa AB i uočena je pozitivna korelacija sa brojem plakova u korteksu. Moguće je da reverzija u G1 formu sa izmenjenim biohemijskim osobinama moţe imati ulogu u ovom neurodegenerativnom poremećaju (186). BChe istih osobina kao enzim prisutan u neurofibrilarnim klubadima i plakovima prisutan je u glijalnim ćelijama (187) što ukazuje da je ovaj tip ćelija značajno uključen u procese koji su 51 karakteristični za ovo neurodegenerativno stanje i mogu biti izvor ovog enzima. U korteksu osoba obolelih od AB broj BChE pozitivnih plakova značajno je veći nego u korteksu zdravih starijih osoba koje imaju mali broj difuzno rasporeĎenih plakova. Aktivnost BChE uočena je samo u zrelim plakovima. To je navelo na pretpostavku da BChE ima značajnu ulogu u sazrevanju plakova od difuznih, benignih formi do kompaktnih, patoloških formi (188). Polimorfizmi u BChE su takoĎe istraţivani u AB. Inicijalni izveštaji ukazuju da osobe koje nose K varijantu BChE gena i imaju ApoE4 alel imaju veći rizik da obole od AB i imaju značajno veći broj plakova u korteksu (189). Nekoliko studija je potvrdilo ove rezultate kod AB starije ţivotne dobi dok su druge studije dobile oprečne rezultate u kojima BChE K varijanta predstavlja protektivan faktor zbog njene smanjene hidrolitičke aktivnosti (190). 52 CILJEVI RADA Ispitivanje je sprovedeno sa ciljem da se u populaciji studenata:  utvrdi učestalost alela i odgovarajućih genotipova odabranih polimorfizama gena za: APOE (rs7412/rs429358), BDNF (rs6265), KIBRA (rs17070145) i BCHE (rs1803274)  analizira da li postoji statistički značajna povezanost utvrĎenih genotipova (APOE, BDNF, KIBRA, BCHE) sa podacima dobijenim putem upitnika (uspeh u srednjoj školi i na fakultetu, lična procena o brzini pamćenja)  analizira da li postoji statistički značajna povezanost utvrĎenih genotipova (APOE, BDNF, KIBRA, BCHE) sa rezultatima testova opštih kognitivnih sposobnosti, paţnje, radne memorije i epizodičke memorije. 53 ISPITANICI I METODE 7. ISPITANICI U ispitivanje je uključeno 560 studenata Medicinskog fakuteta, Univerziteta u Beogradu. Za sprovedeno ispitivanje dobijena je saglasnost Etičkog komiteta Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu, br. 29/VI-14. Za sve studente putem upitnika su prikupljeni podaci o godinama, polu, obrazovanju, akademskim dostignućima, obrazovanju roditelja i uslovima ţivota. Studenti su takoĎe testirani primenom baterije neuropsiholoških testova koja obuhvata test opštih kognitivnih sposobnosti-Ravenove progresivne matrice (RavenPM), testove epizodičke memorije-Rejov auditivno verbalni test (RAVLT) i Wekslerova skala pamćenja, subtest logičke memorije (WMS-R) i test paţnje i radne memorije-Test ponavljanja cifara (TRC). Kriterijumi za isključivanje iz studije bili su: -postojanje neuroloških ili psihijatrijskih stanja koja utiču na strukturu ili funkciju mozga, -traume glave, -anamnestički podatak o gubitku svesti duţem od 5 min, -korišćenje antidepresiva, anksiolitika, sedativa, antikonvulzanata, opijatnih analgetika u prethodnih 6 meseci, -dijabetes, -hipertenzija i -zloupotreba psihoaktivnih supstanci. 54 8. METODE MOLEKULARNO-GENETIĈKE ANALIZE U ovom radu molekularno-genetičko ispitivanje obuhvata izolaciju ukupne genomske DNK, analizu polimorfizama gena za APOE, BDNF i BCHE primenom reakcije lančane polimerizacije (PCR) i restrikcione digestije PCR produkata (PCR – RFLPs metoda) dok je polimorfizam u genu za KIBRA protein analiziran primenom PCR-a u realnom vremenu standardizovanim TaqMan SNP esejom za genotipizaciju. 8.1. Izolacija DNK iz limfocita periferne krvi Pri radu je upotrebljena DNK izolovana iz limfocita periferne krvi studenata. Za izolaciju je primenjena metoda isoljavanja ("salting out") po Milleru (191). Uzorak od 5-10 ml venske krvi sa antikoagulansom (Na-citrat, EDTA) se pomeša sa istom količinom pufera za lizu i 15 do 20 minuta drţi na + 4 0C. Potom se centrifugira 15 min na 2000 obrtaja, supernatant se odbaci, a talog se resuspenduje u 5-10 ml fiziološkog pufera. Uzorak se potom centrifugira 15 min na 2000 obrtaja, a postupak ponavlja 2-3 puta dok talog ne pobeli. Nakon poslednjeg "ispiranja" supernatant se odbaci, a talogu doda 3 ml pufera A, 50 μl 10% proteinaze K i 200 μl 10% SDS (Na- dodecisulfat). Uzorak se dobro resuspenduje i inkubira preko noći na 37 0C. Sledećeg dana se doda 1ml 6M NaCl, dobro promućka i centrifugira 15 minuta na 3000 obrtaja. Supernatant se prenosi u čistu epruvetu i centrifugira 15 minuta na 4000 obrtaja. Supernatant se paţjivo preliva u čistu graduisanu epruvetu, a zatim se doda isti volumen izopropanola. Paţljivim mućkanjem izdvaja se beličasti končić DNK. Končić se paţljivo pokupi staklenim štapićem i potopi 30 sekundi u 70 % etanolu. DNK se osuši na vazduhu, a zatim se rastvori u 300 μl redestilovane vode. Tabela 2. Sastav navedenih pufera Pufer za lizu* Fiziološki pufer Pufer A TE pufer 0.32M SAHAROZA 0,075 M NaCl 10 mM TRIS HCl # 10 mM TRIS HCl# 10 mM TRIS HCl # 0,025 M EDTA pH 8 400 ml NaCl 1mM EDTA 1% TRITON x 100 2 mM EDTA 5 mM MgCl2 *Autoklavirati i čuvati na +4 0C, # pH 7.5 55 Koncentracija DNK u uzorku merena je spektrofotometrom na 260 nm, a čistoća DNK odreĎivana ja na osnovu apsorbance uzorka na 260 i 280 nm. 8.2. PCR metoda i restrikciona digestija PCR produkata (PCR-RFLPs metoda) PCR je jednostavna, brza i prilagodljiva metoda za amplifikaciju definisane ciljne DNK sekvence u uzorku ukupne genomske DNK ili heterogene cDNK. Da bi se ostvarila selektivna amplifikacija neophodno je poznavati nukleotidni redosled ciljnog segmenta, radi sinteze specifičnih jednolančanih oligonukleotidnih graničnika- prajmera. Prajmeri su nizovi nukleotida veličine 20-30 nukleotida, komplementarni terminalnim delovima analiziranog regiona. Nakon denaturacije DNK, pošto se ostvare uslovi za hibridizaciju, prajmeri se specifično vezuju za komplementarne sekvence i ograničavaju ciljni region (ponašaju se kao RNK početnica). Prajmeri su tako konstruisani da u uslovima neophodnim za sintezu DNK i u prisustvu termostabilne DNK polimeraze i slobodnih dNTPs, iniciraju sintezu novih DNK lanaca. PCR je lančana reakcija jer novo sintetisani lanci postaju matrice za sintezu DNK u narednim ciklusima denaturacije, hibridizacije prajmera i sinteze DNK. Reakciona smeša za PCR sadrţi H2O, dezoksinukleotid trifosfate (dNTP), pufer 10X , jone Mg++, prajmer 1 i 2, DNK i Taq polimerazu. Pri analizi svih polimorfizama u ovom radu 25 μl reakcione smeše za svaki uzorak sadrţi: -2,5 μl 10 x PCR pufera -1,5 μl 25 mM MgCl2 -0,5 μl 10 mM dNTP (smeša, 10mM svaki) -0,5 μl prim 1 (300 ng / μl ) -0,5 μl prim 2 (300 ng / μl ) -2 μl DNK (100 ng / μl ) -0, 2 μl Taq polimeraze ( 5U/ μl ) -H20 (REDE ampulirane) ad 25 μl 56 Reakcija se odvija kroz cikluse: a) Denaturacije (95oC) b) Hibridizacije prajmera (aniling od 52-70 oC) c) Sinteze novih lanaca (elongacija 72oC) Nakon 35-40 ciklusa sinteze dobija se 10 5 ciljne sekvence, količina koja se lako vizuelizuje kao jedna traka definisane duţine nakon gel-elektroforeze. PCR reakcije su izvršene u aparatu Applied Biosystems Thermal Cycler 2720. Provera ispitivanih PCR produkata vršena je nakon elektroforeze na 8% poliakrilamidnom gelu (PAA) ili 2% agaroznom gelu. Za bojenje DNK je korišćen etidijum-bromid, a gelovi su prosvetljavani na UV- transiluminatoru. 8.2.1. Analiza polimorfizma G196A (rs6265) gena za BDNF U PCR reakciji pri ovom ispitivanju korišćeni su prajmeri koji ograničavaju region od 171bp. Sekvenca prajmera je: Fw prajmer 5’-ACT CTG GAG AGC GTG AAT GG-3’ Rev-prajmer 5’-ACT ACT GAG CAT CAC CCT GGA-3’ Uslovi amplifikacije su:  početna denaturacija 5 min na 95 0C  35 ciklusa od tri koraka -denaturacija 1 min na 94 0 C - vezivanje prajmera 30 sec na 55 0 C - ekstenzija prajmera i polimerizacija DNK 1 min na 72 0 C.  završna ekstenzija 7 min na 72 0C. Digestija PCR produkata vršena je restrikcionim enzimom EcoRI koji prepoznaje restrikciono mesto 5’...C T T A A↓G ...3’ a dobijen je iz bakterije Escherichia coli RY13. Restrikcija enzimom EcoRI se odvijala u smeši koja sadrţi: 57 -5 μl PCR produkta -5 U enzima (0.5 μl) - 1,5 μl 10 X pufera EcoRI - 8 μl H2O. Inkubacija je trajala 3 sata na 37 0 C u termostatu. U okviru amplifikovanog dela gena za BDNF duţine 171 bp prisutno je jedno restrikciono mesto za enzim EcoRI, koje se kreira u slučaju varijante G, pa se nakon restrikcije i elektroforeze mogu uočiti fragmenti sledećih duţina: 171bp, 99 bp i 72 bp. Vizuelizacija restrikcionih fragmenata vršena je vertikalnom elektroforezom na 8 % nedenaturišućem poliakrilamidnom gelu. Za 25 ml ovog gela neophodno je: -6 ml H20 -2 ml TBE pufera -2 ml 40% akrilamida -70 µl APS-a (amonium persulfat) -13 µl TEMED-a Vertikalna elektroforeza odvija se pri konstantnoj jačini struje (45 mA) i traje oko 45 minuta. Slika 14. Raspored traka PCR produkta nakon digestije restrikcionim enzimom na 8% PAA gelu AA AG GG 171bp 99bp 72bp 58 Na slici 14. je prikazan raspored elektroforetski razdvojenih restrikcionih fragmenata PCR produkata dela gena za BDNF nakon digestije restrikcionom endonukleazom EcoRI. 8.2.2. Analiza polimorfizama 128/158 (rs7412/rs429358) gena za APOE Pri PCR reakciji u ovom ispitivanju korišćeni su prajmeri koji ograničavaju region od 247 bp u kome se nalaze dva polimorfna mesta, u okviru tripleta za 112. i 158. aminokiselinu. Sekvenca prajmera je: Fw prajmer 5’-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3’ Rev prajmer 5’-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3’ Uslovi amplifikacije su:  početna denaturacija 5 min na 94 0C  35 ciklusa od tri koraka -denaturacija 1 min na 94 0 C - vezivanje prajmera 1 min na 65 0 C - ekstenzija prajmera i polimerizacija DNK 1 min na 72 0 C.  završna ekstenzija 7 min na 72 0C. Digestija PCR produkata je vršena restrikcionim enzimom Hha I (Hin 6I), koji je izolovan je iz Haemophilus influenzae. Enzim prepoznaje niz nukleotida 5’...G↓C G C...3, i vrši presecanje lanca na naznačenom mestu. Restrikcija enzimom Hha I se odvijala u restrikcionoj smeši koja sadrţi: -20 μl PCR produkta -5 U enzima (0.5 μl) - 2 μl 10 X pufera Tango i vode 7.5 μl. Inkubacija je trajala 16 sati na 37 0 C u termostatu. U okviru 247 bp amlifikovanog dela gena za apoE nalazi se veći broj restrikcionih mesta, ali su samo dva polimorfna. Nakon restrikcije i elektroforeze mogu 59 se uočiti fragmenti sledećih duţina: 91 bp, 83 bp, 72 bp i 48 bp. Fragmenti duţine 19 bp i 16 bp će izaći sa gela tokom elektroforeze, a fragment duţine 35 bp se moţe uočiti ali nije značajan za detekciju analiziranih alela. Alel APOE2 91 bp, 83 bp (38, 19 i 16 bp) Alel APOE3 91 bp, 48bp, 35 bp (38, 19 i 16 bp) Alel APOE4 72 bp, 48bp 35 bp (38, 19 i 16 bp) Vizuelizacija fragmenata dobijenih digestijom vrši se elektroforezom na 10% nedenaturišućem poliakrilamidnom gelu. Za 35 ml ovog gela neophodno je: -19.25 ml H20 -7 ml TBE pufera -8.75 ml 40% akrilamida Vertikalna elektroforeza odvija se pri konstantnoj jačini struje (45 mA) i traje oko 3 sata. 91bp 83bp 72bp 48bp 2/2 2/3 3/3 3/4 4/4 2/4 Slika 15. Raspored traka nakon digestije restrikcionim enzimom na 10% PAA gelu Na slici 15. je prikazan raspored elektroforetski razdvojenih PCR produkata dela gena za apo E nakon digestije restrikcionom endonukleazom Hha I. 60 8.2.3. Analiza polimorfizma rs1803274 gena za BCHE U ovom ispitivanju za PCR reakciju upotreljeni su prajmeri koji ograničavaju region od 381 bp u kome se nalaze dva restrikciona mesta (jedno polimorfno). Sekvenca prajmera je: Fw-prajmer 5’-AAG TGG GTC AAG AAA AGA GCA-3’ Rev-prajmer 5’-TGC TTT CCA CTC CCA TTC AG-3’ Uslovi amplifikacije su:  početna denaturacija 3 min na 95 0C  35 ciklusa od tri koraka -denaturacija 1 min na 94 0 C - vezivanje prajmera 1 min na 55 0 C - ekstenzija prajmera i polimerizacija DNK 1 min na 72 0 C.  završna ekstenzija 7 min na 72 0C. Digestija PCR produkata je vršena restrikcionim enzimom AluI, izolovanim iz bakterije Arthrobacter luteus. Ovaj enzim prepoznaje restrikciono mesto koje sadrţi 5’..A G.↓C T ...3’ redosled nukleotida. Reakciona smeša za digestiju se sastoji od: -10 μl PCR produkta -5 U enzima (0.5μl) - 1.5 μl 10X pufera Tango i 8 μl vode. Inkubacija je trajala 3 sata na 37 0 C u termostatu. U okviru 381 bp amplifikovanog dela gena za BCHE nalazi se polimorfno restrikciono mesto. Nakon restrikcije i elektroforeze mogu se uočiti fragmenti sledećih duţina: 202 bp, 179 bp, 159 bp i 20 bp. Analiza produkata digestije usledila je nakon elektroforeze u 8% PAA gelu, imajući u vidu da: Homozigoti genotipa GG poseduju tri fragmenta - 202 bp, 159 bp i 20 bp; 61 heterozigoti genotipa GA, poseduju četiri fragmenta- 202 bp, 179 bp, 159 bp i 20 bp; homozigoti za BCHE K varjantu, genotipa AA, poseduju dva fragmenta-202bp i 179 bp. Slika 16. Raspored traka nakon digestije restrikcionim enzimom na 8% PAA gelu 8.3. PCR u realnom vremenu (Real Time PCR) Jedna od metoda za detekciju SNP-ova jeste i PCR u realnom vremenu sa primenom TaqMan eseja. PCR u realnom vremenu (kvantitativni PCR) predstavlja modifikaciju konvencionalnog PCR-a u gde se dinamika amplifikacije meri u realnom vremenu nakon svakog PCR ciklusa. U PCR reakciji koriste se, pored prajmera, i alel specifične oligonukleotidne probe koje su na 5‘ kraju obeleţene različitim fluorescentnim bojama (reporter boje npr. VIC, FAM) dok se na njihovom 3‘ kraju nalazi prigušivač (quencher) koji blokira emisiju fluorescencije. Tokom PCR reakcije u fazi vezivanja prajmera po principu komplementarnosti se za ciljnu sekvencu DNK vezuje i jedna od proba. Nakon toga, u fazi kada Taq polimeraza dodaje nove nukleotide dolazi do uklanjanja probe 5‘-3‘ egzonukleaznom aktivnošću enzima. Kako se najpre odvaja 5’ nukleotid sa reporterom, usled njegovog udaljavanja od prigušivača boja počinje da fluorescira, što aparat registruje. Iz ciklusa u ciklus raste intenzitet fluorescencije, što omogućava da se u realnom vremenu prati dinamika PCR reakcije. Na kraju PCR reakcije detektovano značajno povećanje fluorescencije samo jedne od boja ukazuje na homozigotno stanje za dati alel, dok povećanje fluorescencije obe boje GG AG AA 202bp 159bp 20bp 179bp 62 ukazuje na heterozigotno stanje. Prednost ove metode leţi u činjenici da se celokupna analiza obavlja u jednoj tubi tokom jedne PCR reakcije bez potrebe za daljom obradom uzorka. Istovremeno se moţe vršiti analiza 96 ili 384 uzorka u zavisnosti od tipa nosača. Rezultate obraĎuje softver i prikazuje ih u vidu tabele. Slika 17. Komponente TaqMan eseja i ciklusi RT-PCR-a (192) 63 Slika 18. Rezultati SNP analize primenom TaqMan eseja 8.3.1. Analiza polimorfizma rs 17070145 gena za KIBRA protein Za analizu ovog polimorfizma 25 μl reakcione smeše za svaki uzorak sadrţi: -12,5 μl TaqMan Universal PCR Master mix (2X) No AmpErase UNG -1,25 μl 20X SNP Genotyping Assay -1 μl DNK (1-20 ng / μl ) -H20 (REDE ampulirane) do 25 μl Uslovi amplifikacije su:  aktivacija AmpliTaq Gold enzima 10 min na 95 0C  40 ciklusa od dva koraka -denaturacija 15sec na 92 0 C - vezivanje prajmera, ekstenzija prajmera i polimerizacija DNK 1 min na 60 0 C  završna ekstenzija 7 min na 72 0C. Real-Time PCR reakcije su izvršene u aparatu 7300 Applied Biosystems. 64 9. NEUROPSIHOLOŠKA BATERIJA TESTOVA Testovi epizodiĉke memorije Rey-ov test audio-verbalnog uĉenja (Rey AVLT) (193) je mera neposrednog pamćenja verbalnog nepovezanog materijala. Sastoji se od liste od 15 reči koja se ispitaniku čita 5 puta. Nakon svakog čitanja ispitanik treba da ponovi što veći broj reči sa liste. Rezultat u svakom pokušaju je broj tačno reprodukovanih reči na osnovu čega se izračunava ukupan broj ponovljenih reči kroz 5 pokušaja (Reycum). Na ovaj način dobija se skor neposrednog upamćivanja. Nakon 30 min ispitanici još jednom ponavljaju reči. Broj ponovljenih reči predstavlja skor odloţenog slobodnog prisećanja (Reydel). Wechslerova skala pamćenja, revidirana forma (WMS-R) subtest logiĉke memorije – Standardizaciju za našu populaciju izvršili su 1991. god. Berger, Mirković i Matić. Subtest se sastoji od dve kratke priče (A i B) koje ispitivač čita ispitaniku a kojima se meri neposredno pamćenje logički povezanog materijala. Nakon čitanja jedne priče ispitanik ponavlja sve pojmove kojih se moţe setiti. Izračunava se zajednički skor za obe price neposredno nakon čitanja (A&Bimm) i zajednički skor odloţenog prisećanja pojmova nakon 30 min (A&Bdel) (194). Test paţnje/radne memorije Test merenja raspona cifara (TRC)– Ispitaniku se prezentuju nizovi cifara koje on treba da poreĎa po rastućem redosledu. Nizovi cifara koji treba da se zapamte povećavaju se za jednu cifru od 2 do 8. Za svaku duţinu niza cifara postoje dva pokušaja. Ispitivanje se prekida kada ispitanik ne reprodukuje ispravno niz iz dva pokušaja iz bilo koje serije. Pokušaj pri odreĎenoj duţini niza ocenjen je sa 1 za jedan uspešno ponovljen niz odnosno sa 2 za dva ponovljena niza odreĎene duţine. Broj poena koje ispitanik postigne tretira se kao njegova mera raspona za cifre (Digit span- OT).TakoĎe izračunava se maksimalni raspon kao duţina poslednjeg reprodukovanog niza umanjena za 0.5 ukoliko je samo jedan pokušaj bio uspešan (Digitmax-OT) (195). 65 Test za procenu opštih kognitivnih sposobnosti Ravenove progresivne matrice (RavenPM) su neverbalni test za ispitivanje inteligencije. Autor testa je J. C. Raven, a test je konstruisan 1936. godine. Sastoji od 60 zadataka koji su podijeljeni u pet serija (A, B, C, D i E) sa po dvanaest zadataka, koji unutar svake serije idu od lakših ka teţim. Ukupno ima 60 zadataka s maksimalnim brojem bodova 60. Moţe se primjenjivati individualno ili grupno, a namijenjen je populaciji od 10 godina na dalje (196). 66 10. STATISTIĈKE METODE Atributivne varijable prikazane su brojevima i procentima a kontinualne varijable srednjim vrednostima i standardnim devijacijama. Χ2 test korišćen je za procenu razlika u polu, obrazovanju roditelja, uslovima ţivota i sposobnosti učenja u zavisnosti od genotipa. Studentov t-test ili Mann-Withney U test; one-way ANOVA ili Kruskal-Wallis test korišćeni su za procenu razlike u godinama, rezultatima testova kognitivnih sposobnosti i prosečne ocene u srednjoj školi i na fakultetu u zavisnosti od genotipova. Za izbor jedne varijable (predstavnika) kognitivnog testa koristili smo faktorsku analizu sa metodom glavnih komponenata kao metodom ekstrakcije i Pirsonove koeficijente linearne korelacije. Kriterijumi su bili jaka korelacija i distribucija u jednoj ključnoj komponenti. Za predviĎanje rezultata testova u zavisnosti od genotipa sa i bez prilagoĎavanja na osnovne demografske i socioekonomske varijable korišćena je linearna analiza. Multipla linearna regresiona analiza je korišćena za ispitivanje linearne asocijacije izmeĎu rezultata testova memorijskih sposobnosti kao zavisnih varijabli i genotipa kao nezavisnih varijabli sa prilagoĎavanjem na pol, obrazovanje roditelja i uslova ţivota.Odnos izmeĎu prosečne ocene u srednjoj školi i na fakultetu kao zavisne varijable i rezultata testova memorijskih sposobnosti kao i genotipa kao nezavisnih varijabli procenjena je multiplim linearnim regresionim modelom. Multipla logistička regresija korišćena je za procenu odnosa izmeĎu sposobnosti učenja kao zavisne varijable i rezultata testova memorijskih sposobnosti i genotipova kao nezavisnih varijabli.Primenjena su dva modela regresije, "genotipski" i "alelski". Genotipski omogućava procenu efekata genotipa, a alelski procenu efekata pojedinačnih alela na variranje u rezultatima testova memorijskih sposobnosti. Za sve statističke analize korišćen je SPSS softver, verzija 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA, 2009). P vrednosti <0.05 smatrane su statistički značajnim. 67 REZULTATI Ispitivanje je obuhvatilo 560 studenata Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Na osnovu kriterijuma za isključivanje 12 studenata je isključeno iz studije. MeĎu 548 studenata 366 (66.8%) je devojaka i 182 (33.2%) mladića, prosečne starosti 20±0.86 god. Za sve studente putem upitnika prikupljeni su podaci o uslovima ţivota, obrazovanju oca i majke, uspehu u srednjoj školi i na fakultetu, o tome koliko puta ponavljaju gradivo pre izlaska na ispit kao i o ličnoj proceni brzine kojom pamte gradivo. TakoĎe, analizirani su i rezultati koje su studenti postigli na testu Ravenovih progresivnih matrica za procenu opštih kognitivnih sposobnosti i testovima memorijskih sposobnosti: TRC za procenu paţnje/radne memorije i Rey-AVLT i WMS-R subtest logičke memorije za procenu epizodičke memorije. Dobijeni rezultati analizirani su ukupno za sve studente i po polovima. Testovi memorijskih sposobnosti: TRC, Rey-AVLT i WMS-R subtest logičke memorije podrazumevaju veći broj merenja. U cilju dobijanja odgovarajuće vrednosti koja najbolje predstavlja sva izvršena merenja primenjena je faktorska analiza sa metodom glavnih komponenata i koeficijenti Pirsonove linearne korelacije. Za sve subtestove odreĎena je jedna komponenta koja objašnjava 92.2% varijanse u slučaju TRC testa, 62.9% za Rey-AVLT test i 91.5% varijacije u WCH-R subtestu logičke memorije. Pirsonovi koeficijenti korelacije kreću se izmeĎu 0.601-0.841 za Rey- AVLT, 0.96 za TRC i 0.83 za subtest logičke memorije. Na osnovu dobijenih rezultata, merenja koja reprezentuju svaki od primenjenih testova su: TRCmax (r=0.960), REYcumm (r=0.986) i WMS-R ABimm (r=0.956) i uključena su u dalju analizu. 11. ANALIZA PODATAKA DOBIJENIH IZ UPITNIKA Podaci dobijeni putem upitnika pokazuju da je najveći broj studenata svoje uslove ţivota procenio kao vrlo dobre (42.8%). Najveći broj majki studenata ima završenu srednju školu (42.5%) dok je najveći broj očeva fakultetski obrazovan (46.7%). 60.9% studenata je svoju sposobnost učenja procenilo kao brzu. Prosečna ocena studenata ostvarena u srednjoj školi je izuzetno visoka i iznosi 4.81 ± 0.41 dok prosečna ocena postignuta na fakultetu iznosi 8.49±1.06. Studenti su procenili da materijal za ispit u proseku prelaze 2.88±1.04 puta. Dobijeni podaci o obrazovanju 68 roditelja i uslovima ţivota studenata na osnovu njihove lične procene ukupno i grupisani po polovima prikazani su u tabeli 3. Tabela 3. Obrazovanje roditelja i uslovi ţivota studenata ukupno i po polovima devojke mladići ukupno znaĉajnost razlike obrazovanje majke Χ2=8.032 df=3 p=0.045 osnovna škola 15 (4.2%) 3 (1.7%) 18 (3.3%) srednja škola 164 (45.6%) 66 (36.5%) 230 (42.5%) viša škola 53 (14.7%) 29 (16.0) 82 (15.2%) fakultet 128 (35.6%) 83 (45.9%) 211 (39.0%) obrazovanje oca Χ2=2.132 df=3 p=0.546 osnovna škola 9 (2.5%) 2 (1.1%) 11 (2.0%) srednja škola 134 (37.3%) 60 (33.5%) 194 (36.1%) viša škola 53 (14.8%) 29 (16.2%) 82 (15.2%) fakultet 163 (45.4%) 88 (49.2%) 251 (46.7%) uslovi ţivota Χ2=0.751 df=3 p=0.861 loši 15 (4.2%) 7 (3.9%) 22 (4.1%) dobri 91 (25.3%) 47 (26.4%) 138 (25.7%) vrlo dobri 158 (44.0%) 72 (40.4%) 230 (42.8%) odliĉni 95 (26.5%) 52 (29.2%) 147 (27.4%) Statistička analiza podataka primenom Χ2 testa pokazala je da: -postoji statistički značajna razlika izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u obrazovanju njihovih majki (p=0.045). Statistički značajno više obrazovanje imaju majke mladića u odnosu na majke devojaka. -nema statistički značajne razlike izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u obrazovanju njihovih očeva - nema statistički značajne razlike izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u uslovima ţivota U tabeli 4. prikazani su podaci o uspehu studenata u srednjoj školi i na fakultetu izraţeni u vidu prosečne ocene±SD kao i prosečan broj ponavljanja gradiva±SD prilikom priremanja ispita. 69 Tabela 4. Prosečna ocena±SD studenata postignuta u srednjoj školi i na fakultetu i prosečan broj ponavljanja materijala za ispit±SD ukupno i po polovima broj pol znaĉajnost razlike uspeh u srednjoj školi 543 U 4.81±0.41 p=0.000 180 M 4.70±0.50 363 Ţ 4.86±0.35 uspeh na fakultetu 548 U 8.49±1.06 p=0.816 182 M 8.53±0.99 366 Ţ 8.49±1.06 broj ponavljanja 531 U 2.88±1.04 p=0.801 176 M 2.85±1.04 355 Ţ 2.90±1.04 Analiza uspeha postignutog u srednjoj školi i na fakultetu primenom Mann-Whitney testa pokazala je da: -postoji statistički značajna razlika izmeĎu analiziranih grupa devojaka i mladića u prosečnoj oceni postignutoj tokom srednje škole (p=0.000). Prosečna ocena u srednjoj školi bila je statistički značajno viša kod devojaka nego kod mladića. - nema statistički značajne razlike izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u prosečnoj oceni postignutoj na fakultetu niti u broju ponavljanja materijala prilikom pripremanja ispita. U tabeli 5. prikazana je lična procena studenata o brzini njihovog učenja. Tabela 5. Lična procena studenata o brzini pamćenja gradiva devojke mladići ukupno znaĉajnost razlike Uĉenje brzo 216 (60.0%) 111 (62.4%) 327 (60.8%) p=0.598 sporo 144 (40.0%) 67 (37.6%) 211 (39.2%) 70 Statistička analiza je pokazala da: - nema statistički značajne razlike izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u njihovoj proceni brzine učenja. 12. ANALIZA REZULTATA TESTOVA OPŠTIH KOGNITIVNIH I MEMORIJSKIH SPOSOBNOSTI U tabeli 6. prikazani su rezultati koje su studenti postigli na testovima memorijskih sposobnosti TRCmax, Reycumm, ABimm i testu opštih kognitivnih sposobnosti RavenPM. Razultati su prikazani za celu populaciju studenata i po polovima. Tabela 6. Prosečne vrednosti ± SD rezultata postignutih na testovima opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti ukupno i po polovima broj pol znaĉajnost razlike TRCmax 545 U 7.35±0.77 p=0.034 181 M 7.42±0.76 364 Ţ 7.31±0.78 Reycumm 543 U 61.27±6.17 p=0.000 180 M 59.73±6.63 363 Ţ 62.05±5.66 RavenPM 548 U 49.67±5.36 p=0.018 182 M 50.47±5.34 366 Ţ 49.28±5.34 ABimm 545 U 36.25±5.53 p=0.347 180 M 36.06±5.77 365 Ţ 36.41±5.40 Analiza rezultata postignutih na testovima memorijskih sposobnosti prikazanih u tabeli 6. primenom Mann-Whitney testa pokazala je da: - postoji statistički značajna razlika izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u prosečnim rezultatima postignutim na testu TRCmax (p=0.034). Mladići su postigli statistički značajno bolje rezultate na TRCmax testu u poreĎenju sa devojkama. 71 - postoji statistički značajna razlika izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u prosečnim rezultatima postignutim na REYcum testu (p=0.000). Devojke su postigle statistički značajno bolje rezultate. - postoji statistički značajna razlika izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u prosečnim rezultatima postignutim na testu opštih kognitivnih sposobnosti (p=0.018). Mladići su postigli statistički značajno bolje rezultate na RavenPM testu. - nema statistički značajne razlike izmeĎu analiziranih grupa mladića i devojaka u rezultatima postignutim na testu epizodičke memorije WMS-R ABimmed 12.1. Rezultati molekularno-genetiĉkih analiza – BDNF rs6265 genotip Učestalost BDNF (Val66Met) genotipova Analizom je obuhvaćeno 530 studenata. UtvrĎeno je da je 370 studenata tj. 69.8% homozigot za češći alel G (genotip GG), 143-oro tj. 27.0% su heterozigoti (genotip GA) a svega njih 17 (3.2%) je homozigot za reĎi alel A (genotip AA). Dobijeni rezultati prikazani su na grafikonu 4. Grafikon 4. Učestalost BDNF genotipova u populaciji studenata Na slici 19. je prikazana fotografija gela nakon digestije PCR produkata restrikcionim enzimom. 72 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GG AG GG AG GG AG AG GG GG GG Slika 19. Polimorfizam BDNF (Val66Met)-izgled traka na gelu nakon digestije restrikcionim enzimom Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su učestalosti alela G i A. Učestalost alela G je 83.3%, a alela A 16.7%. Kod mladića učestalost GG genotipa je 70.0%, GA genotipa 28.3% a AA genotipa 1.7%. Učestalost GG genotipa kod devojaka je 69.7%, GA genotipa 26.3% a AA genotipa 4%. Razlika učestalosti genotipova izmeĎu devojaka i mladića nije statistički značajna (p=0.543). Učestalost genotipova prema polu prikazana je na grafikonu 5. Grafikon 5. Učestalost BDNF genotipova po polu 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% 70.00% 80.00% GG GA AA mladići devojke 73 Tabela 7. Demografske, socioekonomske i memorijske karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od njihovog BDNF genotipa. GG GA AA Ukupno p N 370 143 17 530 Starost (godine) 20.2 ± 0.83 20.4 ± 0.82 20.2 ± 0.66 20.3 ± 0.82 Ţene / Muškarci 246/124 93/50 14/3 353/177 0.543 Obrazovanje majke (%) osnovna škola 12 (3.2) 4 (2.8) 1 (5.9) 17 (3.2) srednja škola 164 (44.3) 53 (37.1) 9 (52.9) 226 (42.6) viša škola 53 (14.3) 28 (19.6) 1 (5.9) 82 (15.5) fakultet 140 (37.8) 58 (40.6) 6 (35.3) 204 (38.5) Obrazovanje oca (%) osnovna škola 8 (2.2) 3 (2.1) 1 (5.9) 12 (2.3) srednja škola 132 (35.7) 51 (35.7) 7 (41.2) 190 (35.8) viša škola 54 (14.6) 24 (16.8) 2 (11.8) 80 (15.1) fakultet 173 (46.8) 64 (44.8) 7 (41.2) 244 (46.0) Uslovi ţivota loši 15 (4.1) 7 (4.9) 0 (0.0) 22 (4.2) dobri 84 (22.7) 50 (35.0) 3 (13.7) 137 (25.8) vrlo dobri 157 (42.4) 57 (39.9) 8 (47.1) 222 (41.9) odliĉni 110 (29.7) 29 (20.3) 6 (35.3) 145 (27.3) Proseĉna ocena u srednjoj školi 4.79±0.43 4.83±0.37 5.00±0.00 4.81±0.41 0.108 Proseĉna ocena na fakultetu 8.50±1.06 8.47±1.04 8.25±1.09 8.49±1.05 0.823 Broj ponavljanja gradiva 2.93±1.08 2.80±1.00 2.76±0.90 2.89±1.05 0.556 Sposobnost uĉenja brza 226 (61.1) 86 (61.0) 10 (58.8) 321 (60.9) 0.744 spora 144 (38.9) 55 (39.0) 7 (41.2) 206 (39.1) Opšte kognitivne sposobnosti RavenPM 49.53±5.52 49.85±5.88 49.47±4.59 49.61±5.58 0.488 Paţnja/radna memorija TRC 9.99 ± 1.84 9.94 ±1.92 10.05± 1.29 9.98± 1.84 0.661 Epizodiĉka memorija Reycumm 61.05±6.02 61.61±6.65 62.82±6.37 61.26±6.20 0.125 WMS-R ABimm 35.97±5.56 36.96±5.39 36.47±5.88 36.26±5.53 0.092 74 U Tabeli 7. prikazani su demografske, socioekonomske i memorijske karakteristike studenata u zavisnosti od BDNF genotipa. Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -nema statistički značajne razlike u demografskim, socioekonomskim varijablama, brzini učenja kao i rezultatima postignutim na testovima opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti Nakon ove analize rezultate opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti grupisali smo po polovima i u zavisnosti od prisustva alela A (Tabela 8.). Tabela 8. Rezultati testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnostiu zavisnosti od prisustva A alela grupisani po polovima genotip broj mladići p broj devojke p TRCmax GG 125 7.43±0.74 249 7.29±0.80 GA 52 7.38±0.82 0.311 103 7.34±0.78 0.557 RavenPM GG 125 50.38±5.18 149 49.22±5.23 GA 52 50.65±5.90 0.474 104 49.37±5.73 0.719 REYcumm GG 125 60.11±6.39 248 61.63±5.59 GA 52 59.19±7.46 0.561 103 63.14±5.68 0.022 ABimm GG 125 35.89±5.62 249 36.13±5.39 GA 52 36.47±5.67 0.589 104 37.21±5.18 0.102 Analiza dobijenih rezultata primenom Mann-Whitney testa je pokazala da: -postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na Reycumm testu u grupi devojaka (p=0.022). Devojke nosioci A alela (GA genotipa) postigle su bolje rezultate u poreĎenju sa nosiocima GG genotipa. -ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na drugim testovima ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. Multipla linearna regresiona analiza Multipla linearna regresiona analiza primenjena je u cilju ispitivanja uticaja BDNF genotipa kao nezavisne varijable na rezultate koje studenti postiţu na testovima memorijskih sposobnosti i opštih kognitivnih sposobnosti, kao zavisnih varijabli. 75 Analiza je izvršena bez prilagoĎavanja (tabela 9.) i nakon prilagoĎavanja na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota studenata (tabela 10). Tabela 9. Rezultati regresione analize uticaja BDNF genotipa kao nezavisne varijable na rezultate postignutih na testovima kao zavisnih varijabli Zavisne varijable BDNF val/val vs val/met constant b beta p 95% CI TRCmax 7.26 0.002 0.001 0.973 -0.08 – 0.09 REYcumm 70.38 -0.28 -0.04 0.356 -0.88 – 0.32 RAVENPM 54.79 -0.16 -0.02 0.562 -0.70 – 0.38 ABimm 52.27 -0.49 -0.08 0.070 -1.03 - 0.04 Analiza je pokazala da: -postoji trend po kome studenti nosioci A tj. Met alela (GA genotipa) postiţu bolje rezultate na Abimmed testu u odnosu na studente GG tj. Val/Val genotipa. -ne postoji statistički značajna povezanost Met alela i rezultata koje su studenti postigli na TRCmax, REYcumm i RavenPM testovima Tabela 10. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja BDNF genotipa kao nezavisne varijable prilagoĎene na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja na rezultate postignutih na testovima kao zavisnih varijabli. Zavisne varijable BDNF val/val vs val/met prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCmax 7.30 -0.008 -0.008 0.862 -0.098 – 0.082 REYcumm 68.10 -0.38 -0.05 0.203 -0.98 – 0.21 RAVENPM 54.20 -0.18 -0.03 0.527 -0.72 – 0.37 ABimm 53.64 -0.57 -0.09 0.039 -1.11 - -0.03 Analiza dobijenih rezultata pokazala je da: - postoji statistički značajna povezanost Met alela sa boljim rezultatima na ABimmed testu kada su rezultati prilagoĎeni na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja 76 -ne postoji statistički značajna povezanost Met alela sa postignutim rezultatima studenata na ostalim testovima. Tabela 11. Rezultati analize uticaja BDNF genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa TRCmax kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 7.043 .000 6.592-7.494 BDNF GG/GA 0.022 0.013 0.775 -.127-0.170 pol -0.097 -0.058 0.184 -.241-0.046 uslovi ţivota 0.090 0.094 0.039 .004-0.175 obrazovanje majke 0.022 0.027 0.616 -.065-0.109 obrazovanje oca 0.037 0.045 0.412 -.051-0.125 Analiza je pokazala da samo uslovi ţivota studenata statistički značajno utiču na rezultate postignute na TRCmax testu. Uticaj BDNF genotipa i drugih nezavisnih varijabli nije statistički značajan. Tabela 12. Rezultati analize uticaja BDNF genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa REYcumm kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 54.117 0.000 50.647-57.586 BDNF GG/GA 1.029 0.078 0.076 -.109-2.167 pol 2.151 0.167 0.000 1.051-3.252 uslovi ţivota 0.798 0.109 0.017 .146-1.450 obrazovanje majke 0.002 0.000 0.995 -.663-0.667 obrazovanje oca -0.019 -0.003 0.956 -.696-0.658 Analiza je pokazala da samo pol i uslovi ţivota studenata statistički značajno utiču na rezultate postignute na Reycumm testu. Uticaj BDNF genotipa i drugih nezavisnih varijabli nije statistički značajan. 77 Tabela 13. Rezultati analize uticaja BDNF genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa RavenPM kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 48.639 0.000 45.533-51.744 BDNF GG/GA 0.353 0.030 0.497 -0.668-1.374 pol -1.154 -0.101 0.022 -2.141-(-0.167) uslovi ţivota 0.397 0.061 0.183 -0.189-0.983 obrazovanje majke 0.254 0.045 0.403 -0.342-0.850 obrazovanje oca 0.180 0.032 0.559 -0.426-0.787 Analiza je pokazala da samo pol statistički značajno utiče na rezultate postignute na RavenPM testu. Uticaj BDNF genotipa i drugih nezavisnih varijabli nije statistički značajan. Tabela 14. Rezultati analize uticaja BDNF genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa ABimmed kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 35.215 0.000 30.951-37.241 BDNF GG/GA -0.57 -0.09 0.039 -1.11 - -0.03 pol 0.266 0.023 0.601 -.733-1.265 uslovi ţivota 0.466 0 .071 0.123 -.126-1.058 obrazovanje majke -0.224 -0.040 0.466 -.828-0.380 obrazovanje oca -0.116 -0.020 0.709 -.729-0.497 Analiza je pokazala da postoji statistički značajna povezanost BDNF genotipa i rezultata postignutih na Abimmed testu. Nosioci GA genotipa postiţu statistički značajno bolje rezultate na ovom testu. Nije uočen statistički značajan uticaj ostalih varijabli. 78 12.2. Rezultati molekularno-genetiĉkih analiza-KIBRA rs17070145 genotip Analizom je obuhvaćeno 538 studenta. UtvrĎeno je da je 260 studenata tj. 48.3% homozigot za češći alel C (genotip CC), 231-oro tj. 42.9% su heterozigoti (genotip CT) a njih 47 (8.7%) je homozigot za reĎi alel T (genotip TT). Dobijeni rezultati prikazani su na grafikonu 6. i na slici 20. Grafikon 6. Učestalost KIBRA genotipova u populaciji studenata 48% 43% 9% CC CT TT 79 Slika 20. Rezultati genotipizacije primenom TaqMan eseja Učestalost genotipova prema polu prikazana je na grafikonu 7. Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su učestalosti alela C i T. Učestalost alela C je 69.8%, a alela T 30.2%. Grafikon 7. Učestalost KIBRA genotipova po polu 0.00% 10.00% 20.00% 30.00% 40.00% 50.00% 60.00% CC CT TT mladići devojke 80 Kod mladića učestalost CC genotipa je 44.1%, CT genotipa 45.3% a TT genotipa 10.6%. Učestalost CC genotipa kod devojaka je 50.4%, CT genotipa 41.8% a TT genotipa 7.8%. Razlika učestalosti genotipova izmeĎu devojaka i mladića nije statistički značajna (p=0.907). 81 Tabela 15. Demografske, socioekonomske i kognitivne karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od njihovog KIBRA genotipa CC CT TT Ukupno p N 260 231 47 538 Starost (godine±SD) 20.25 ± 0.81 20.28 ± 0.83 20.25 ± 0.89 20.26 ± 0.83 0.907 Ţene / Muškarci 181/79 150/81 28/19 359/179 Obrazovanje majke (%) osnovna škola 11 (4.2) 6 (2.6) 1 (2.1) 18 (3.4) srednja škola 112 (43.2) 101 (43.7) 18 (38.3) 231 (43.0) viša škola 33 (12.7) 39 (16.9) 8 (17.0) 80 (14.9) fakultet 103 (39.8) 85 (36.8) 20 (42.6) 208 (38.7) Obrazovanje oca (%) osnovna škola 7 (2.7) 4 (1.7) 1 (2.2) 12 (2.2) srednja škola 92 (35.7) 86 (37.4) 7 (37.0) 195 (36.5) viša škola 40 (15.6) 34 (14.8) 2 (13.0) 80 (15.0) fakultet 119 (46.1) 106 (46.1) 7 (47.8) 247 (46.31) Uslovi ţivota (%) loši 24 (9.4) 30 (13.2) 8 (17.4) 62 (11.7) dobri 75 (29.4) 59 (25.9) 7 (15.2) 137 (26.7) vrlo dobri 62 (24.3) 59 (25.9) 15 (32.6) 222 (25.7) odliĉni 94 (36.9) 80 (35.1) 16 (34.8) 145 (35.9) Proseĉna ocena u srednjoj školi 4.82±0.38 4.77±0.45 4.80±0.41 4.80±0.41 0.378 Proseĉna ocena na fakultetu 8.52±1.08 8.52±1.06 8.49±0.94 8.52±1.06 0.240 Sposobnost uĉenja (%) brza 164 (63.3) 134 (58.5) 28 (60.9) 326 (61.0) 0.554 spora 95 (36.7) 95 (41.5) 18 (39.1) 208 (39.0) Ponavljanje gradiva 2.92±1.05 2.82±0.98 2.91±0.73 2.88±0.99 0.383 Opšte kognitivne sposobnosti RavenPM 49.36±5.55 49.92±5.20 49.66±5.08 49.63±5.36 0.669 Paţnja/radna memorija TRCmax 7.35±0.80 7.35±0.73 7.32±0.93 7.35±0.78 0.649 Epizodiĉka memorija Reycumm 61.68±6.07 60.78±6.16 61.83±6.00 61.31±6.11 0.092 WMS-R ABimm 36.48±5.34 36.22±5.50 35.94±6.09 36.32±5.47 0.597 82 Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -nema statistički značajne razlike u demografskim, socioekonomskim varijablama, brzini učenja kao i rezultatima postignutim na testovima opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti U tabeli 16. Prikazani su rezultati dobijeni putem upitnika kao i rezultati testova memorijskih sposobnosti grupisani u zavisnosti od prisustva T alela. Tabela 16. Demografske, socioekonomske i kognitivne karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od prisustva T alela CC CT+TT P N 260 278 Starost (godine±SD) 20.25 ± 0.81 20.28 ± 0.84 0.696 Ţene / Muškarci 181/79 178/100 0.169 Proseĉna ocena u srednjoj školi±SD 4.82±0.38 4.79±0.44 0.420 Proseĉna ocena na fakultetu 8.52±1.06 8.51±1.06 0.925 Sposobnost uĉenja (%) brza 164 (63.3) 162 (58.5) 0.296 spora 95 (36.7) 113 (41.5) Ponavljanje gradiva 2.92±1.05 2.84±0.94 0.739 Opšte kognitivne sposobnosti Raven- SPM 49.36±5.55 49.87±5.17 0.471 Paţnja/radna memorija TRCmax 7.35±0.80 7.35±0.76 0.988 Epizodiĉka memorija Reycumm 61.68±6.07 60.78±6.16 0.092 WMS-R ABimm 36.48±5.34 36.17±5.59 0.918 Zatim smo analizirali rezultate dobijene na testu opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti u zavisnosti od KIBRA genotipa odvojeno po polovima (Tabela 17.). 83 Tabela 17. Srednje vrednosti rezultata testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti±SD u zavisnosti od KIBRA genotipa grupisani po polovima genotip broj mladići značajnost razlike broj devojke značajnost razlike TRCmax CC 78 7.42±0.78 1.914 0.384 180 7.32±.81 0.540 0.763 CT 81 7.44±0.78 149 7.30±0.74 TT 19 7.32±0.96 28 7.32±0.92 Raven PM CC 79 49.18±6.25 4.517 0.105 181 49.45±5.22 0.423 0.809 CT 81 51.42±4.42 150 49.11±5.41 TT 19 50.63±3.23 28 49.27±5.35 Reycumm CC 78 59.24±6.64 1.069 0.586 179 62.74±5.50 8.822 0.012 CT 80 60.06±6.84 149 61.16±5.76 TT 19 60.74±6.57 28 62.57±5.58 ABimm CC 78 35.73±5.70 0.437 0.804 180 36.80±5.15 1.165 0.558 CT 80 36.30±5.54 150 36.18±5.49 TT 19 36.27±5.55 28 35.78±6.42 Analiza dobijenih rezultata primenom Kruskall-Wallis testa pokazala je da: -postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na testu Reycumm u grupi devojaka. -ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na drugim testovima memorijskih sposobnosti kao ni na testu opštih kognitivnih sposobnosti ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. TakoĎe, izvršena je i analiza rezultata po polovima u zavisnosti od prisustva alela T. Dobijene vrednosti prikazane su u tabeli 18. 84 Tabela 18. Rezultati testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti u zavisnosti od prisustva T alela grupisani po polovima genotip broj mladići p broj devojke p TRCmax CC 78 7.42±0.78 180 7.32±0.81 CT+TT 100 7.41±0.75 0.456 177 7.31±0.77 0.659 RavenPM CC 79 49.18±6.25 181 49.45±5.22 CT+TT 100 51.27±4.22 0.053 178 49.09±5.49 0.522 Reycumm CC 78 59.24±6.64 179 62.74±5.50 CT+TT 99 60.19±6.76 0.363 177 61.38±5.74 0.009 ABimm CC 78 35.73±5.70 180 36.80±5.15 CT+TT 99 36.27±5.55 0.567 178 36.12±5.63 0.357 Analiza dobijenih rezultata primenom Mann-Whitney testa pokazala je da: -postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na testu Reycumm u grupi devojaka. Devojke nosioci CC genotipa postigle su bolje rezultate na Reycumm testu u poreĎenju sa devojkama nosiocima T alela (CT + TT genotipa). -postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na testu RavenPM u grupi mladića. Mladići nosioci T alela (CT i TT genotipa) postigli su statistički značajno bolje rezultate na RavenPM testu u poreĎenju sa nosiocima CC genotipa. -ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na drugim testovima memorijskih sposobnosti kao ni na testu opštih kognitivnih sposobnosti ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. Multipla linearna regresiona analiza Multipla linearna regresiona analiza primenjena je u cilju ispitivanja uticaja KIBRA genotipa ili alela kao nezavisne varijable na rezultate koje studenti postiţu na testovima memorijskih sposobnosti kao zavisnih varijabli. Analiza je izvršena bez prilagoĎavanja (tabela 19.) i nakon prilagoĎavanja na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota studenata (tabela 20.). 85 Tabela 19. Rezultati multiple linearne regresione analize povezanosti rezultata postignutih na testovima kao zavisnih varijabli i KIBRA genotipa kao nezavisne varijable Zavisne varijable KIBRA genotip constant b beta p 95% CI TRCMax 7.36 -0.01 -0.05 0.909 -0.11 – 0.10 REYcumm 61.83 -0.32 -0.03 0.430 -1.13 – 0.48 RAVENPM 49.13 0.31 0.04 0.387 -0.39 – 1.02 ABimm 36.75 -0.26 -0.03 0.470 -0.99 - 0.46 Analiza rezultata je pokazala da: -ne postoji statistički značajna povezanost izmeĎu KIBRA genotipa i rezultata postignutih na primenjenim testovima Tabela 20. Rezultati multiple linearne regresione analize povezanosti rezultata postignutih na testovima kao zavisnih varijabli i BCHE genotipa kao nezavisne varijable prilagoĎeno na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota Zavisne varijable KIBRA genotip, prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCmax 7.06 0.01 0.00 0.920 -0.99 – 0.11 REYcumm 56.10 -0.14 -0.01 0.733 -0.94 – 0.66 RAVENPM 48.75 0.30 0.03 0.417 -0.42 – 1.01 ABimm 36.43 -0.17 -0.02 0.650 -0.90 – 0.56 Analiza rezultata dobijenih nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja pokazala je da: -ne postoji statistički značajna povezanost izmeĎu KIBRA genotipa i rezultata postignutih na ostalim testovima TakoĎe, izvršena je i analiza uticaja T alela na rezultate postignute na testovima. 86 Tabela 21. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja T alela kao nezavisne varijable na rezultate postignute na testovima koji predstavljaju zavisne varijable Zavisne varijable KIBRA CC/CT+TT constant b beta p 95% CI TRCMax 7.35 -0.00 -0.00 0.996 -0.13 – 0.13 REYcumm 62.41 -0.72 -0.06 0.172 -1.76 – 0.32 RAVENPM 48.86 0.50 0.05 0.275 -0.40 – 1.41 ABimmed 36.78 -0.30 -0.03 0.519 -1.23 - 0.62 Tabela 22. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja A alela kao nezavisne varijable, prilagoĎene na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja, na rezultate postignute na testovima koji predstavljaju zavisne varijable Zavisne varijable KIBRA CC/CT+TT, prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCMax 7.05 0.01 0.01 0.859 -0.12 – 0.15 REYcumm 56.82 -0.57 -0.05 0.275 -1.60 – 0.46 RAVENPM 48.45 0.49 0.05 0.291 -0.42 – 1.41 ABimmed 36.17 -0.21 -0.02 0.664 -1.15 – 0.73 Analiza rezultata dobijenih nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja pokazala je da: -ne postoji statistički značajna povezanost izmeĎu KIBRA genotipa i rezultata postignutih na ostalim testovima Izvršena je i analiza uticaja modifikujućih varijabli na postignute rezultate na testovima memorijskih i opštih kognitivnih sposobnosti. 87 Tabela 23. Rezultati multiple linearne regresione analize u kojoj su rezultati testa TRCmax zavisne varijable a KIBRA genotip, pol, uslovi ţivota, obrazovanje roditelja nezavisne varijable Nezavisne varijable TRCmax zavisna varijabla b beta p 95% CI constant 7.064 0.000 6.620-7.507 KIBRA 0.005 0.004 0.920 -0.099-0.110 pol -0.095 -0.057 0.196 -0.238-0.049 uslovi ţivota 0.096 0.101 0.025 0.012-0.180 obrazovanje majke 0.014 0.017 0.756 -0.072-0.099 obrazovanje oca 0.037 0.046 0.399 -0.049-0.124 Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -postoji statistički značajan uticaj uslova ţivota na rezultate postignute na testu TRCmax. Studenti koji imaju bolje uslove ţivota ostvarili su bolje rezultate na testu TRCmax. -ne postoji statistički značajan uticaj pola i obrazovanja roditelja na rezultate postignute na testu TRCmax Tabela 24. Rezultati multiple linearne regresione analize u kojoj su rezultati testa REYcumm zavisne varijable a pol, uslovi ţivota, obrazovanje roditelja nezavisne varijable Nezavisne varijable REYcumm zavisna varijabla b beta p 95% CI constant 56.100 0.000 52.683-59.516 KIBRA -0.139 -0.015 0.733 -0.941-0.662 pol 2.174 0.169 0.000 1.073-3.275 uslovi ţivota 0.676 0.092 0.040 0.031-1.321 obrazovanje majke 0.004 0.001 0.990 -0.654-0.662 obrazovanje oca -0.063 -0.10 0.854 -0.732-0.606 88 Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -postoji statistički značajna uticaj uslova ţivota na rezultate postignute na testu Reycumm. Studenti koji imaju bolje uslove ţivota ostvarili su bolje rezultate na testu Reycumm. -postoji statistički značajan uticaj pola na rezultate postignute na testu Reycumm. Devojke su postigle statistički značajno bolje rezultate u poreĎenju sa mladićima. -ne postoji statistički značajan uticaj obrazovanja roditelja sa rezultatima postignutim na Reycumm testu. Tabela 25. Rezultati multiple linearne regresione analize u kojoj su rezultati testa RavenPM zavisne varijable a pol, uslovi ţivota, obrazovanje roditelja nezavisne varijable Nezavisne varijable RavenPM zavisna varijabla b beta p 95% CI constant 48.749 0.000 45.717-51.781 KIBRA 0.296 0.035 0.417 -0.418-1.009 pol -1.047 -0.092 0.036 -2.026—0.068 uslovi ţivota 0.317 0.049 0.278 -0.257-0.891 obrazovanje majke 0.244 0.044 0.412 -0.341-0.829 obrazovanje oca 0.163 0.029 0.590 -0.431-0.757 Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -postoji statistički značajan uticaj pola na rezultate ostvarene na RavenPM testu. Mladići su postigli statistički bolje rezultate na ovom testu u poreĎenju sa devojkama. -ne postoji statistički značajan uticaj uslova ţivota studenata i obrazovanja roditelja sa rezultatima ostvarenim na RavenPM testu. 89 Tabela 26. Rezultati multiple linearne regresione analize u kojoj su rezultati testa ABimmed zavisne varijable a pol, uslovi ţivota, obrazovanje roditelja nezavisne varijable Nezavisne varijable ABimmed zavisna varijabla b beta p 95% CI constant 36.428 0.000 33.311-39.545 KIBRA -0.169 -0.020 0.576 -0.900-0562 pol 0.234 0.020 0.750 -0.772-1.240 uslovi ţivota 0.353 0.053 0.205 -0.236-0.942 obrazovanje majke -0.258 -0.046 0.371 -0.859-0.343 obrazovanje oca -0.161 -0.028 0.705 -0.770-0.449 Analiza dobijenih rezultata je pokazala da: -ne postoji statistički značajan uticaj pola, uslova ţivota studenata i obrazovanja njihovih roditelja sa rezultatima koje ostvaruju na ABimmed testu. 90 12.3. Rezultati molekularno-genetiĉkih analiza APOE genotip rs7412/rs429358 Analizom je obuhvaćeno 548 studenata. U ispitivanoj populaciji detektovano je 5 različitih genotipova. UtvrĎeno je da su 426 (77.7%) studenta homozgoti za alel E3 (genotip 3/3), njih 55 (10.1%) su heterozigoti genotipa 2/3, 57-oro (10.4%) heterozigoti genotipa 3/4 a svega 4 (0.7%) su homozigoti genotipa 4/4. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 33 33 33 23 33 33 33 33 24 33 34 34 34 33 33 44 44 34 33 Slika 21. Polimorfizam APOE (112/158) genotipa-izgled traka nakon restrikcione digestije. Na slici 21. je prikazan poliakrilamidni gel nakon restrikcione analize na kome se moţe uočiti svih pet detektovanih genotipova. Učestalost genotipova ukupno i po polovima prikazana je u tabeli 27. kao i na grafikonu 8. Razlika učestalosti genotipova po polovima nije statistički značajna (p=0.520). Tabela 27. Učestalost genotipova ApoE ukupno i po polovima Genotipovi APOE Ukupno uĉestalost % mladići uĉestalost % Devojke uĉestalost % 3/3 426 77.7 148 81.3 278 76.0 3/4 57 10.4 20 11.1 37 10.0 2/3 55 10.1 13 7.1 42 11.5 2/4 6 1.1 1 0.5 5 1.4 4/4 4 0.7 0 0.0 4 1.1 ukupno 548 100.0 182 100.0 366 100.0 91 Grafikon 8. Učestalost genotipova u celoj populaciji studenata i po polovima izraţena u %. Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su učestalosti alela E2, E3 i E4. Učestalost E3 alela je 87.9%, E2 alela 5.6% a E4 alela 6.5%. Dobijene vrednosti prikazane su na grafikonu 9. Grafikon 9. Učestalost APOE alela u populaciji studenata U daljem radu smo prema njihovom genotipu studente razvrstali u dve grupe. Prvu grupu čine studenti čiji je genotip E3/E4 ili E4/E4 i označeni su sa E4+. Drugu grupu čine studenti sa genotipom E3/E3 ili E3/E2 i označeni su sa E4-. Studenti sa genotipom E2/E4 (6 ispitanika) isključeni su iz daljeg ispitivanja zbog suprotnog dejstva alela E2 i E4. 92 Tabela 28. Demografske, socioekonomske i memorijske karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od njihovog APOE genotipa. E4+ E4- Ukupno p N 61 481 542 Starost (godine) 20.16 ± 0.78 20.27 ± 0.83 20.26 ± 0.82 0.309 Ţene / Muškarci 41/20 320/161 361/181 0.520 Obrazovanje majke (%) osnovna škola 1 (1.6) 17 (3.5) 18 (3.3) srednja škola 25 (41.0) 205 (42.7) 230 (42.5) viša škola 12 (19.7) 70 (14.6) 82 (15.2) fakultet 23 (37.7) 188 (39.2) 211(39.0) Obrazovanje oca (%) osnovna škola 0 (0.0) 11 (2.3) 11 (2.0) srednja škola 24(39.3) 170 (35.6) 194 (36.1) viša škola 10 (16.4) 72 (15.1) 82 (15.2) fakultet 27 (44.3) 224 (47.0) 251 (46.7) Uslovi ţivota loši 2 (3.3) 20 (4.2) 22 (4.1) dobri 18 (30.0) 120 (25.2) 138 (25.7) vrlo dobri 25(41.7) 205 (43.0) 230 (42.8) odliĉni 15 (25.0) 132 (27.7) 147 (27.4) Proseĉna ocena u srednjoj školi 4.80±0.41 4.81±0.41 4.80±0.41 0.744 Proseĉna ocena na fakultetu 8.29±1.11 8.53±1.05 8.51±1.06 0.145 Sposobnost uĉenja brza 32 (52.5) 295 (61.8) 327 (60.8) 1.999 spora 29 (47.5) 182 (38.2) 211 (39.2) 0.102 Broj ponavljanja 3.0±1.09 2.87±1.03 2.89±1.04 0.430 Opšte kognitivne sposobnosti RavenPM 48.75±5.90 49.86±5.26 49.67±5.37 0.368 Paţnja/radna memorija TRCmax 9.99 ± 1.84 9.94 ±1.92 10.02± 1.70 0.150 Epizodiĉka memorija Rey cumm 60.03±6.72 61.57±6.09 61.27±6.17 0.092 WMS-R ABimm 35.76±5.51 36.39±5.53 36.25±5.53 0.630 93 U Tabeli 28. prikazani su demografske, socioekonomske i memorijske karakteristike studenata u zavisnosti od prisustva E4 alela. Analiza dobijenih rezultata pokazala je da: - nije uočena statistički značajna razlika ni u jednoj analiziranoj karakteristici Nakon ove analize rezultate opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti grupisali smo po polovima i u zavisnosti od prisustva E4 alela (tabela 29.). Tabela 29. Rezultati testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnostiu zavisnosti od prisustva E4 alela grupisani po polovima genotip broj mladići p broj devojke p TRCmax E4+ 20 7.25±0.80 0.289 40 7.27±0.75 0.418 E4- 160 7.44±0.75 319 7.32±0.79 Raven PM E4+ 20 49.70±6.80 0.803 41 49.19±5.90 0.354 E4- 161 51.53±5.15 320 49.41±5.26 Reycumm E4+ 20 58.35±7.21 0.303 41 60.80±6.41 0.157 E4- 160 59.90±6.79 317 62.21±5.55 ABimm E4+ 20 35.00±5.75 0.453 41 36.32±5.41 0.934 E4- 160 36.05±5.78 319 36.42±5.41 Statistička analiza primenom Mann-Withney testa pokazala je da: - Ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima testova u zavisnosti od prisustva E4 alela ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. Ipak, iako nije dostignuta statistički značajna razlika moţe se uočiti da i u grupi mladića i u grupi devojaka nosioci E4 alela postiţu lošije rezultate na svim primenjenim testovima. Multipla linearna regresiona analiza Multipla linearna regresiona analiza primenjena je u cilju ispitivanja uticaja APOE genotipa kao nezavisne varijable na rezultate koje studenti postiţu na testovima memorijskih sposobnosti koji predstavljaju zavisne varijable. Analiza je izvršena bez prilagoĎavanja (tabela 30.) i nakon prilagoĎavanja na demografske i socioekonomske karateristike: pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota studenata (tabela 31.). 94 Tabela 30. Rezultati linearne regresione analize uticaja APOE genotipa kao nezavisne varijable na rezultate postignute na testovima kao zavisne varijable Zavisne varijable APOE E4+ vs E4- constant B beta p 95% CI TRCMax 7.27 0.10 0.04 0.368 -0.11 – 0.30 REYcumm 60.00 1.43 0.07 0.090 -0.21 – 3.08 RAVENPM 48.69 1.10 0.06 0.131 -0.33 –2.53 ABimm 35.88 0.41 0.02 0.588 -1.07 - 1.88 Linearna regresiona analiza rezultata testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti pokazali su da APOE genotip studenata ne utiče na rezultate postignute na testovima opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti. Tabela 31. Rezultati multiple regresione analize u kojoj su testovi zavisne varijable a APOE genotip nezavisna varijabla uz prilagoĎavanje na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja Zavisne varijable APOE E4+ vs E4- prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCMax 6.99 0.10 0.04 0.336 -0.12 – 0.31 REYcumm 54.42 1.51 0.08 0.069 -0.12 – 3.13 RAVENPM 48.32 1.15 0.07 0.118 -0.29 – 2.58 ABimm 35.21 0.49 0.03 0.520 -1.00 – 1.98 Multipla linearna regresiona analiza je pokazala da uticaj APOE genotipa na rezultate testova nije statistički značajan ni nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja. Ipak, moţe se uočiti trend po kome bolje rezultate na REYcumm testu postiţu studenti koji nisu nosioci APOE4 alela (p=0.069). Iz prikazanih tabela (32, 33, 34, 35) vidi se i uticaj ostalih varijabli: pola, obrazovanja roditelja i uslova ţivota na rezultate postignute na testovima. 95 Tabela 32. Rezultati analize uticaja APOE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa TRCmax kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 6.992 0.000 6.559-7.426 APOE Е4+/Е4- 0.103 0.042 0.336 -0.107-0.312 pol -0.096 -0.058 0.182 -0.237-0.045 uslovi ţivota 0.086 0.092 0.042 -0.003-0.170 obrazovanje majke 0.015 -0.019 0.727 -0.069-0.990 obrazovanje oca 0.044 0.053 0.321 -0.043-0.930 Analiza je pokazala da uslovi ţivota studenata statistički značajno utiču na rezultate testa TRCmax. Studenti koji imaju bolje uslove ţivota postigli su bolje rezultate na primenjenom testu. Tabela 33. Rezultati analize uticaja APOE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa REYcumm kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 54.423 0.000 51.031-57.814 APOE Е4+/Е4- 1.508 0.078 0.069 -0.119-3.135 pol 2.255 -0.173 0.000 1.152-3.358 uslovi ţivota 0.567 0.076 0.087 -0.082-1.217 obrazovanje majke -0.028 -0.004 0.934 -0.689-0.633 obrazovanje oca 0.054 0.008 0.876 -0.623-0.731 Analiza je potvrdila statistički značajan uticaj pola na rezultate studenata postignute na REY cumm testu. Studentkinje postiţu statistički značajno bolje rezultate na ovom testu u poreĎenju sa kolegama muškog pola. 96 Tabela 34. Rezultati analize uticaja APOE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa RavenPM kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 48.317 0.000 45.327-51.306 APOE Е4+/Е4- 1.146 0.067 0.118 -0.292-2.584 pol -1.110 -0.097 0.025 -2.082-(-0.137) uslovi ţivota 0.305 0.047 0.297 -0.268-0.878 obrazovanje majke 0.263 0.047 0.375 -0.319-0.846 obrazovanje oca 0.161 0.028 0.596 -0.435-0.757 Analiza je potvrdila da pol statistički značajno utiče na rezultate postignute na RavenPM testu. Studenti muškog pola postiţu bolje rezultate u poreĎenju sa studentkinjama. Tabela 35. Rezultati analize uticaja APOE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa ABimmed kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI constant 35.215 0.000 32.115-38.315 APOE E4+/E4- 0.488 0.028 0.520 -1.000-1.976 pol 0.358 0.031 0.486 -0.651-1.368 uslovi ţivota 0.396 0.059 0.191 -0.198-0.990 obrazovanje majke -0.207 -0.036 0.502 -0.812-0.398 obrazovanje oca -0.177 -0.031 0.574 -0.795-0.441 Analiza je pokazala da ni jedna od analiziranih varijabli ne utiče na rezultate postignute na ABimmed testu. 97 12.4. Rezultati genetiĉkih analiza-BCHE genotip Analizom je obuhvaćeno 543 studenta. UtvrĎeno je da je 363 studenata tj. 66.8% homozigot za češći alel G (genotip GG), 159-oro tj. 29.3% su heterozigoti (genotip GA) a svega njih 21 (3.9%) je homozigot za reĎi alel A (genotip AA). Dobijene vrednosti prikazane su i na grafikonu 10. Grafikon 10. Učestalost BCHE genotipova u populaciji studenata M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 AA GA AA GG GG GG GA GG GG Slika 22. Polimorfizam BCHE (rs1803274) - izgled traka na gelu nakon restrikcione digestije. 98 Na slici 22 je prikazana fotografija gela nakon digestije PCR produkata restrikcionim enzimom. Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su učestalosti alela G i A. Učestalost alela G je 81.5%, a alela A 18.5%. Kod mladića učestalost GG genotipa je 73.3%, GA genotipa 23.9% a AA genotipa 2.8%. Učestalost GG genotipa kod devojaka je 63.6%, GA genotipa 31.9% a AA genotipa 4.5%. Razlika učestalosti genotipova izmeĎu devojaka i mladića je statistički značajna (p=0.013). Grafikon 11. Učestalost BCHE genotipova u zavisnosti od pola U tabeli 36. prikazani su demografske, socioekonomske i memorijske karakteristike studenata u zavisnosti od BDNF genotipa. 99 Tabela 36. Demografske, socioekonomske i kognitivne karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od njihovog BCHE genotipa G/G G/A A/A Ukupno p N 363 159 21 543 Starost (godine±SD) 20.26±0.86 20.20±0.68 20.76±0.94 20.26±0.82 Ţene / Muškarci 231/132 116/43 16/5 363/180 0.013 Obrazovanje majke (%) osnovna škola 13 (3.6) 3 (1.9) 2 (9.5) 18 (3.3) srednja škola 162 (44.6) 64 (40.5) 7 (33.3) 233 (43.0) viša škola 48 (13.2) 28 (17.7) 5 (23.8) 81 (14.9) fakultet 140 (38.6) 63 (39.9) 7 (33.3) 210 (38.7) Obrazovanje oca (%) osnovna škola 10 (2.8) 1 (0.6) 0 (0.0) 11 (2.0) srednja škola 135 (37.5) 48 (30.4) 13 (61.9) 196 (36.4) viša škola 57 (15.8) 23 (14.6) 2 (9.5) 82 (15.2) fakultet 158 (43.9) 86 (54.4) 6 (28.6) 250 (46.40) Uslovi ţivota (%) loši 12 (3.3) 8 (5.0) 2 (9.5) 22 (4.1) dobri 96 (26.7) 38 (23.9) 5 (23.8) 139 (25.8) vrlo dobri 151 (42.1) 65 (40.9) 13 (61.9) 229 (42.5) odliĉni 100 (27.9) 48 (30.2) 1 (4.8) 149 (27.6) Proseĉna ocena u srednjoj školi±SD 4.79±0.42 4.83±0.41 4.81±0.40 4.80±0.41 0.673 Proseĉna ocena na fakultetu 8.57±1.08 8.42±1.04 8.20±0.73 8.51±1.06 0.130 Sposobnost uĉenja (%) Brza 221 (61.2) 96 (60.8) 12 (60.9) 329 (61.0) 0.990 Spora 140 (38.8) 62 (39.2) 8 (39.1) 210 (39.0) Ponavljanje gradiva 0.806 Opšte kognitivne sposobnosti RavenPM 49.68±5.38 49.68±5.07 48.71±6.99 49.64±5.36 0.920 Paţnja/radna memorija TRCmax 7.30±0.82 7.45±0.68 7.45±0.83 7.35±0.78 0.117 Epizodiĉka memorija Reycumm 61.12±6.20 61.71±5.89 61.86±6.43 61.32±6.12 0.600 WMS-R ABimm 0.953 100 Analiza rezultata prikazanih u tabeli 38. je pokazala da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od BCHE genotipa ni u jednoj od analiziranih karakteristika. U tabeli 37. Prikazani su rezultati dobijeni putem u pitnika kao i rezultati testova memorijskih sposobnosti grupisani u zavisnosti od prisustva A alela. Tabela 37. Demografske i kognitivne karakteristike u populaciji studenata u zavisnosti od prisustva K varijante (A alela) GG GA +AA p N 363 180 Starost (godine±SD) 20.26±0.86 20.20±0.68 Ţene / Muškarci 231/132 132/48 0.024 Proseĉna ocena u srednjoj školi±SD 4.79±0.42 4.83±0.41 0.386 Proseĉna ocena na fakultetu 8.57±1.08 8.39±1.01 0.130 Sposobnost uĉenja (%) Brza 221 (61.2) 108 (60.7) 0.903 Spora 140 (38.8) 70 (39.3) Ponavljanje gradiva 2.89±1.00 2.87±1.14 0.675 Opšte kognitivne sposobnosti Raven- SPM 49.68±5.38 49.57±5.32 0.704 Paţnja/radna memorija TRCmax 7.30±0.82 7.45±0.96 0.041 Epizodiĉka memorija Reycumm 61.12±6.20 61.73±5.94 0.313 WMS-R ABimm 36.20±5.69 36.42±5.00 0.762 Analiza rezultata je pokazala da: - je učestalost K varijante (A alela) statistički značajno veća u populaciji devojaka u poreĎenju sa populacijom mladića 101 - postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na TRCmax testu u zavisnosti od prisustva A alela (p=0.041). Nosioci K varijante (A alela) postiţu statistički značajno bolje rezultate na TRCmax testu u odnosu na studente GG genotipa. -ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na drugim testovima memorijski sposobnosti i testu opštih kognitivnih sposobnosti. Zatim smo analizirali rezultate dobijene na testu opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti u zavisnosti od BCHE genotipova odvojeno po polovima (tabela 38.). Tabela 38. Srednje vrednosti rezultati testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti±SD u zavisnosti od BCHE genotipa grupisani po polovima genotip broj mladići p broj devojke p TRCmax GG 131 7.39±0.79 F=0.848 p=0.655 230 7.25±0.83 F=4.632 p=0.099 GA 43 7.46±0.71 115 7.44±0.67 AA 5 7.70±0.27 16 7.37±0.94 RavenPM GG 132 50.61±5.40 F=1.923 p=0.382 231 49.14±5.31 F=0.548 p=0.760 GA 43 49.93±4.65 116 49.59±6.85 AA 5 48.00±8.21 16 48.94±6.85 REYcumm GG 131 59.42±6.65 F=1.542 p=0.462 229 62.09±5.72 F=0.031 p=0.985 GA 42 60.71±6.69 115 62.08±5.56 AA 5 60.60±8.44 16 62.09±5.66 Abimm GG 131 35.96±5.81 F=0.161 p=0.923 230 36.43±4.95 F=0.071 p=0.965 GA 42 36.28±4.94 116 36.94±5.71 AA 5 35.60±5.81 16 36.94±5.70 Analiza rezultata primenom Kruskal-Wallis testa pokazala je da nema statistički značajne razlike u rezultatima postignutim na testovima memorijskih i opštih kognitivnih sposobnosti u zavisnosti od BCHE genotipa ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. TakoĎe, izvršena je i analiza rezultata po polovima u zavisnosti od prisustva A alela. Dobijene vrednosti prikazane su u tabeli 39. 102 Tabela 39. Rezultati testova opštih kognitivnih i memorijskih sposobnosti u zavisnosti od prisustva K varijante (A alela) grupisani po polovima genotip broj mladići p broj devojke p TRCmax GG 131 7.39±0.79 0.899 230 7.25±0.83 0.034 GA+AA 48 7.49±0.68 131 7.43±0.70 RavenPM GG 132 50.61±5.40 0.171 231 49.14±5.31 0.459 GA+AA 48 49.73±5.04 132 49.51±5.43 REYcumm GG 131 59.42±6.65 0.218 229 62.09±5.72 0.929 GA+AA 47 60.70±6.79 131 62.09±5.58 Abimm GG 131 35.96±5.81 0.805 230 36.43±4.95 0.893 GA+AA 47 36.21±4.98 132 36.49±5.03 Analiza dobijenih rezultata pokazala je da: -postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na testu TRCmax u grupi devojaka. Devojke nosioci A alela postigle su bolje rezultate na testu u odnosu na devojke nosioce GG genotipa. U grupi mladića uočen je isti trend ali statistička značajnost nije dostignuta. -ne postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na drugim testovima memorijskih sposobnosti kao ni na testu opštih kognitivnih sposobnosti ni u grupi mladića ni u grupi devojaka. Multipla linearna regresiona analiza Multipla linearna regresiona analiza primenjena je u cilju ispitivanja uticaja BCHE genotipa ili alela kao nezavisne varijable na rezultate koje studenti postiţu na testovima memorijskih sposobnosti kao zavisnih varijabli. Analiza je izvršena bez prilagoĎavanja (tabela 40.) i nakon prilagoĎavanja na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota studenata (tabela 41.). 103 Tabela 40. Rezultati multiple linearne regresione analize povezanosti rezultata postignutih na testovima kao zavisnih varijabli i BCHE genotipa kao nezavisne varijable Zavisne varijable BCHE genotip constant b beta p 95% CI TRCMax 7.19 0.12 0.08 0.05 -0.00 – 0.24 REYcumm 60.63 0.50 -0.05 0.289 -0.43 – 1.43 RavenPM 49.91 -0.20 -0.02 0.637 -1.01 – 0.62 ABimm 36.01 0.20 0.02 0.642 -0.63 - 1.03 Analiza rezultata je pokazala da: -postoji statistički značajan uticaj (granična značajnost) BCHE genotipa na rezultate postignute na TRCmax testu (p=0.05). -ne postoji statistički značajan uticaj BCHE genotipa na rezultate postignute na ostalim primenjenim testovima Tabela 41. Rezultati multiple linearne regresione analize povezanosti rezultata postignutih na testovima kao zavisnih varijabli i BCHE genotipa kao nezavisne varijable prilagoĎeno na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota Zavisne varijable BCHE genotip, prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCMax 6.90 0.14 0.10 0.019 0.02 – 0.26 REYcumm 55.38 0.38 0.03 0.419 -0.54 – 1.30 RavenPM 49.38 -0.07 -0.01 0.865 -0.89 – 0.75 ABimm 35.75 0.24 0.02 0.576 -0.60 – 1.08 Analiza rezultata dobijenih nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja (tabela 41.) pokazala je da: -postoji statistički značajna povezanost BCHE genotipa i rezultata postignutih na TRC max testu. 104 -ne postoji statistički značajna povezanost izmeĎu BCHE genotipa i rezultata postignutih na ostalim testovima. Tabela 42. Rezultati analize uticaja BCHE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa TRCmax kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI Constant 6.895 0.000 6.477-7.313 BCHE 0.142 0.101 0.019 0.023-0.260 Pol -0.113 -0.068 0.118 -0.255-0.029 uslovi ţivota 0.100 0.106 0.018 -0.018-0.183 obrazovanje majke 0.012 0.015 0.781 -0.073-0.097 obrazovanje oca 0.040 0.048 0.368 -0.047-0.126 Analiza rezultata prikazanih u tabeli 42. je pokazala da: -BCHE genotip statistički značajno utiče na rezultate koje studenti postiţu na testu TRCmax (p=0.019). -postoji statistički značajan uticaj uslova ţivota studenata na rezultate testa TRCmax. Studenti koji imaju bolje uslove ţivota postigli su bolje rezultate na primenjenom testu (p=0.018). - ne postoji statistički značajan uticaj ostalih analiziranih varijabli na postignute rezultate. Tabela 43. Rezultati analize uticaja BCHE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa REYcumm kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI Constant 55.383 0.000 52.133-58.632 BCHE 0.379 0.035 0.419 -0.541-1.299 Pol 2.189 0.170 0.000 1.088-3.290 uslovi ţivota 0.685 0.093 0.036 0.044-1.325 obrazovanje majke 0.031 -0.005 0.926 -0.626-0.689 obrazovanje oca -0.108 -0.017 0.752 -0.781-0.564 105 Analiza rezultata prikazanih u tabeli 43. je potvrdila statistički značajan uticaj pola na rezultate studenata postignute na REY cumm testu (p=0.000). Studentkinje postiţu statistički značajno bolje rezultate na ovom testu u poreĎenju sa studentima. TakoĎe, pokazano je da i uslovi ţivota studenata statistički značajno utiču na rezultate postignute na REYcumm testu (p=0.036). Tabela 44. Rezultati analize uticaja BCHE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa RavenPM kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI Constant 49.385 0.000 46.499-52.271 BCHE -0.071 -0.007 0.865 -0.890-0.747 Pol -1.091 -0.096 0.029 -2.070-(-0.112) uslovi ţivota 0.318 0.049 0.274 -0.252-0.889 obrazovanje majke 0.229 0.041 0.441 -0.355-0.814 obrazovanje oca 0.183 0.032 0.547 -0.414-0.781 Analiza rezultata (tabela 44.) je potvrdila uticaj pola na rezultate postignute na RavenPM testu. Studenti postiţu bolje rezultate u poreĎenju sa studentkinjama. Tabela 45. Rezultati analize uticaja BCHE genotipa, pola, uslova ţivota i obrazovanja roditelja kao nezavisnih varijabli na rezultate testa ABimmed kao zavisne varijable Nezavisne varijable b beta p 95% CI Constant 35.754 0.000 32.781-38.711 BCHE 0.239 0.025 0.576 -0.600-1.078 Pol 0.164 0.014 0.750 -0.843-1.170 uslovi ţivota 0.378 0.057 0.205 -0.208-0.963 obrazovanje majke -0.274 -0.049 0.371 -0.875-0.327 obrazovanje oca -0.118 -0.021 0.705 -0.731-0.495 106 Analiza rezultata prikazanih u tabeli 45. je pokazala da ni jedna od analiziranih varijabli ne utiče na rezultate postignute na ABimmed testu. TakoĎe, izvršena je i analiza po alelskom modelu koja ispituje uticaj K varijante (A alela) na rezultate primenjenih testova. Tabela 46. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja A alela kao nezavisne varijable na rezultate postignute na testovima koji predstavljaju zavisne varijable Zavisne varijable BCHE GG/GA+AA constant b beta p 95% CI TRCMax 7.15 0.15 0.09 0.038 -0.00 – 0.29 REYcumm 60.51 0.61 0.05 0.276 -0.49 – 1.71 RavenPM 49.79 -0.11 -0.01 0.820 -1.07 – 0.85 ABimm 35.99 0.21 0.02 0.667 -0.77 - 1.20 Tabela 47. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja A alela kao nezavisne varijable, prilagoĎene na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja, na rezultate postignute na testovima koji predstavljaju zavisne varijable Zavisne varijable BCHE GG/GA+AA prilagoĊeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja constant b beta p 95% CI TRCMax 6.87 0.17 0.10 0.017 0.03 – 0.31 REYcumm 55.34 0.44 0.03 0.425 -0.65 – 1.54 RavenPM 49.29 -0.01 -0.01 0.983 -0.96 – 0.98 ABimm 35.73 0.24 0.02 0.588 -0.72 – 1.27 Analiza dobijenih rezultata bez prilagoĎavanja i nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja (tabele 46, 47) je pokazala da: -postoji statistički značajna povezanost BCHE genotipova kao i prisustva A alela (K varijante) i rezultata postignutih na testu paţnje/radne memorije. Povezanost je statistički značajna i nakon prilagoĎavanja na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja. Studenti nosioci K varijante postigli su bolje rezultate na testu TRCmax. -ne postoji statistički značajna povezanost BCHE K alela sa rezultatima postignutim na testovima opštih kognitivnih sposobnosti i epizodičke memorije 107 Multiplom linearnom regresionom analizom analizirali smo da li i kako rezultati koje su studenti postigli na testovima TRCmax, REYcumm, RavenPM i ABimmed predviĎaju njihov uspeh tokom školovanja. Tabela 48. Rezultati multiple linearne regresione analize u kojoj je uspeh u učenju zavisna varijabla a rezultati testova kognitivnih sposobnosti nezavisne varijable Nezavisne varijable Zavisne varijable Proseĉna ocena u srednjoj školi Proseĉna ocena na fakultetu Koliko puta se ponavlja gradivo B Beta P B Beta p B Beta p Konstanta 4.754 0.000 4.907 0.007 0.075 0.968 TRCMAX 0.003 0.006 0.887 0.012 0.011 0.809 0.092 0.082 0.072 REYcumm 0.007 0.102 0.040 0.008 0.046 0.355 -0.008 -0.047 0.355 RAVENPM -0.003 -0.045 0.338 0.027 0.143 0.003 0.000 -0.001 0.978 A+Bimmed 0.000 0.000 0.998 0.014 0.072 0.115 0.004 0.021 0.647 Analiza rezultata prikazanih u tabeli 48. je pokazala da: - Prosečna ocena u srednjoj školi je statistički značajno povezana sa rezultatima postignutim na REYcumm testu. Studenti koji su postizali bolje rezultate na REYcumm testu imali su i veću prosečnu ocenu u srednjoj školi. - Prosečna ocena na fakultetu statistički značajno je povezana sa rezultatima postignutim na testu RavenPM. Studenti koji su postizali bolje rezultate na testu opštih kognitivnih sposobnosti RavenPM imaju veću prosečnu ocenu na fakutetu. - Uočava se trend da više puta materijale za ispit prelaze studenti koji su postigli bolje rezultate na TRCmax testu ali statistička značajnost nije dostignuta. TakoĎe smo primenom logističke regresione analize analizirali da li rezultati testova kognitivnih sposobnosti kao nazavisne varijable predviĎaju brzinu učenja studenata. 108 Tabela 49. Rezultati logističke regresione analize u kojoj je brzina učenja zavisna varijabla a rezultati testova kognitivnih sposobnosti nezavisne varijable Analiza rezultata (tabela 49) je pokazala da: - Postoji statistički zanačajana povezanost brzine učenja sa rezultatima postignutim na testu RAVENPM. Brţe, po sopstvenom iskazu, uče oni sa postignutim boljim rezultatima na testu RAVENPM. Ispitivan je i uticaj svih analiziranih polimorfizama na rezultate postignute u srednjoj školi i na fakultetu kao i na broj ponavljanja gradiva pre izlaska na ispit. Ispitivanje je vršeno po genotipskom i alelskom modelu. Rezultati su prikazani u tabeli 50. Tabela 50. Rezultati multiple linearne regresione analize uticaja analiziranih genotipova na postignut uspeh tokom školovanja Nezavisne varijable Brzina uĉenja B P OR 95% CI Konstanta 3.126 0.415 22.78 TRCmax -0.001 0.993 0.99 0.85 – 1.22 REYcumm 0.014 0.447 1.01 0.98 – 1.05 RavenPM -0.056 0.004 0.94 0.91 - 0.98 ABimmed -0.009 0.636 0.99 0.95 – 1.03 Nezavisne varijable Zavisne varijable Proseĉna ocena u srednjoj školi Proseĉna ocena na fakultetu Broj ponavljanja B Beta p B Beta p B Beta p Konstanta 4.754 0.000 4.907 0.007 0.075 0.968 APOE E4+/E4- 0.009 0.007 0.870 -0.245 0.073 0.091 -0.131 -0.040 0.361 BNDF GG/GA -0.024 -0.053 0.220 0.043 0.036 0.404 0.062 0.053 0.234 BCHE 0.011 0.015 0.729 -0.161 0.085 0.051 -0.001 -0.001 0.987 BCHE GG/GA+AA 0.014 0.016 0.719 -0.181 -0.081 0.064 -0.014 -0.007 0.884 KIBRA -0.003 -0.005 0.903 -0.017 -0.010 0.815 -0.036 -0.023 0.599 KIBRA CC/CT+TT -0.022 -0.026 0.540 -0.010 -0.005 0.916 -0.075 -0.037 0.401 109 Analiza je pokazala da analizirani genotipovi ne utiču statistički značajano na prosek ocena u srednjoj školi i na fakultetu kao i ličnu procenu studenata o brzini učenja. Primenom logističke regresione analize ispitan je uticaj analiziranih genotipova i alela na brzinu savladavanja gradiva studenata. Dobijeni rezultati prikazani su u tabeli 51. Tabela 51. Rezultati logističke regresione analize uticaja analiziranih genotipova na brzinu učenja prilagoĎeno na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja Nezavisne varijable Brzina uĉenja zavisna varijabla B p OR 95% CI Konstanta 3.126 0.415 22.78 APOE -0.325 0.242 1.37 0.42-1.25 BNDF GG/GA 0.014 0.901 1.01 0.89-1.25 BCHE 0.022 0.891 1.02 0.75-1.40 BCHE GG/GA+AA 0.023 0.903 1.02 0.71-1.48 KIBRA 0.114 0.410 1.12 0.85-1.47 KIBRA CC/CT+TT 0.186 0.296 1.20 0.85-1.71 Analiza je pokazala da ne postoji statistički značajan uticaj analiziranih genotipova i alela na procenu studenata o brzini učenja. 110 DISKUSIJA Memorija predstavlja sposobnost privremenog ili trajnog skladištenja i prizivanja informacija stečenih iskustvom ili aktivnim učenjem. Memorijske sposobnosti ljudi imaju poligensku, tj. multifaktorsku osnovu koja uključuje genetičke faktore predispozicije i činioce iz spoljne sredine. Heritabilnost kompleksnih osobina kao što je memorija zavisi od varijacija u velikom broju gena sa relativno malim pojedinačnim efektom. Osnovno pitanje koje se postavlja je kako i koje varijacije u našim genima utiču na individualne razlike u memorijskim sposobnostima. U ispitivanju udela nasledne komponente kod poligenih svojstava aktuelne su analize genskih polimorfizama. Da bi se utvrdilo da li neki polimorfizam predstavlja predispoziciju za ispoljavanje datog svojstva primenjuju se studije asocijacije u kojima se analizira udruţenost ispitivanog svojstva sa odreĎenim genskim varijantama. Genetička ispitivanja tog tipa omogućavaju nam otkrivanje gena odgovornih za individualne varijacije u našim memorijskim sposobnostima. Dosadašnja istraţivanja (142, 189) odnosila su se preteţno na ispitivanja uticaja genskih polimorfizama kod starijih osoba sa ili bez kognitivnih poremećaja. U svetu kao i kod nas, mali broj istraţivanja usmeren je na ispitivanje asocijacije polimorfizama sa memorijskim sposobnostima zdravih osoba mlaĎe ţivotne dobi. Praktični cilj proučavanja gena koji utiču na naše memorijske sposobnosti jeste otkrivanje novih strategija za terapiju različitih kognitivnih poremećaja kako tokom normalnog procesa starenja tako i kod bolesti kao što su Alchajmerova bolest i drugi tipovi demencija. Rano otkrivanje genotipa sa predispozicijom za neki od kognitivih poremećaja omogućava blagovremenu primenu preventivnih mera kojima se utiče na promenljive faktore rizika. Ovakav pristup je od velikog značaja jer se sa starenjem svetske populacije sve više uvećava broj dementnih osoba. Naša studija predstavlja populaciono genetičko ispitivanje sprovedeno na populaciji studenata. Kvalitet populaciono genetičke studije u mnogome zavisi od veličine uzorka i načina njegove selekcije. Ispitivanjem smo obuhvatili 548 studenata Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Većina studenata pripada istoj 111 generaciji i ima isti nivo obrazovanja (12 godina školovanja, završena četvorogodišnja srednja škola) što analiziranu populaciju čini izuzetno homogenom. Podaci dobijeni putem upitnika pokazuju da najveći broj studenata svoje uslove ţivota procenjuje kao vrlo dobre (42.8%). Studenti potiču iz porodica u kojima najveći broj majki ima završenu srednju školu (42.5%) dok su očevi fakultetski obrazovani (46.7%). Studenti su takoĎe davali i ličnu procenu brzine pamćenja pa je većina (60.9%) svoju sposobnost učenja procenilo kao brzu. Prosečna ocena u srednjoj školi je izuzetno visoka i iznosi 4.81 ± 0.41 dok prosečna ocena postignuta na fakultetu iznosi 8.49±1.06. Rezultati testova memorijskih sposobnosti ukazuju na statistički značajne razlike srednjih vrednosti pojedinih testova izmeĎu mladića i devojaka. Mladići imaju statistički značajno bolje rezultate na testovima opštih kognitivnih sposobnosti i radne memorije dok devojke pokazuju statistički značajno bolje rezultate na testu epizodičke memorije - Rey AVLT. Studentkinje su pokazale bolje rezultate i na Wechsler-ovom subtestu logičke memorije ali ta razlika nije dostigla statističku značajnost. Naši rezultati koji ukazuju na razliku meĎu polovima u memorijskim sposobnostima u saglasnosti su sa ranijim studijama. Meta analiza Lynna i Irwing iz 2004. godine koja je obuhvatila 57 studija standardnih i naprednih progresivnih matrica na opštoj populaciji pokazala je da kod dece starosti 6 do 14 godina ne postoji razlika meĎu polovima ali da od 15. godine muškarci postiţu bolje rezultate na ovim testovima. Ova razlika se uvećava do perioda od 20. do 29. godine i zatim se odrţava sve do perioda izmeĎu 80. i 89. godine kada se razlika meĎu polovima više ne uočava (197). Decenije istraţivanja, od empirijskih do bihevioralnih, ukazuju na snaţnu asocijaciju radne memorije i opštih kognitivnih sposobnosti. Rezultati brojnih studija zasnovanih na Bedlijevom modelu radne memorije, ukazuju da postoje velike individualne razlike u kapacitetu radne memorije. Smatra se da je upravo kapacitet radne memorije u stvari faktor X koji se nalazi u osnovi individualnih razlika u nivou intelektualnog funkcionisanja (198). MeĎutim, ovakvo viĎenje još uvek nije univerzalno prihvaćeno. Smatra se da značajna asocijacija radne memorije i inteligencije potiče od mehanizama na kojima se ovi procesi zasnivaju a koji se odvijaju u dorzolateralnim prefrontalnim regionima mozga. Otuda muškarci koji 112 postiţu bolje rezultate na testovima inteligencije postiţu bolje rezutate i u testovima radne memorije, što je uočeno i u našoj studiji. Istraţivanja Herlitz i sar. pokazala su da razlika meĎu polovima postoji i u funkcionisanju epizodičke memorije i da zavisi prevashodno od vrste materijala koji se pamti. Ţene postiţu bolje rezultate na testovima verbalne epizodičke memorije kao što su RAVLT i WCHR subtest logičke memorije dok muškarci postiţu bolje rezultate na testovima pamćenja prostorno-vizuelnog materijala. U testovima koji obuhvataju oba tipa materijala i prepoznavanje lica pokazano je da ţene postiţu bolje rezultate (199). Ova zapaţanja su takoĎe u saglasnosti sa našim rezultatima. Dobijeni rezultati su nam ukazali da dalju analizu ispitivanih polimorfizama moramo vršiti ne samo u celokupnom uzorku već i po polovima kako bi smo došli do adekvatnih zaključaka. 13. ANALIZA BDNF VAL66MET POLIMORFIZMA U POPULACIJI STUDENATA BDNF pripada familiji neurotrofina čija je osnovna uloga regulacija diferencijacije, proliferacije i preţivljavanja neurona. BDNF je uključen u odrţavanje dugotrajne potencijacije (LTP) modulacijom postsinaptičkih receptora za glutamat a kao retrogradni glasnik reguliše oslobaĎanje transmitera sa presinapse (200). Polimorfizam rs6265 u genu za BDNF dovodi do zamene valina metioninom u kodonu 66 u regionu proteina ključnom za njegov unutarćelijski transport. Iako ova supstitucija ne utiče na samu aktivnost proteina narušava se njegova sekrecija odnosno pakovanje u odgovarajuće transportne vezikule što za posledicu ima nakupljanje proteina u perinuklearnom prostoru i njegovo nedovoljno prisustvo u dendritima. Usled toga, smatra se da je BDNF Met alel manje efikasan u modulaciji nervne plastičnosti (201). 113 Tabela 52. Učestalost Val i Met alela u različitim populacijama sveta (202) Populacija Val (G) Met (A) Srbija-studenti 0.833 0.167 Poljska 0.820 0.180 Nemaĉka 0.810 0.190 Rusija 0.900 0.100 Afrika 0.986 0.014 Kina 0.510 0.490 Japan 0.580 0.420 SAD 0.788 0.212 U tabeli 52. Prikazane su učestalosti alela Val i Met u populacijama Evrope, SAD, Azije i Afrike (202). U našem ispitivanju učestalost genotipova je Val/Val 69.8%, Val/Met 27% a Met/Met 3.2%. a učestalost polimorfnih alela: Val 83.3% a Met 16.7%. Dobijene učestalosti alela i genotipova u saglasnosti su sa rezultatima objavljenim za druge evropske populacije. Populacione studije su pokazale da je pribliţno 30-50% ljudi u svetu heterozigot (Val/Met) ili homozigot za Met alel. (203). Vaţno je napomenuti da učestalost Met alela značajno varira u različitim populacijama u zavisnosti od porekla i etničke pripadnosti i kreće se izmeĎu 0 i 70 %. Nosioci Met alela čine pribliţno 30% populacije SAD i najčešće su indo-evropskog porekla. U Japanu i Kini učestalost Met alela je znatno veća i kreće se do skoro 60% u zavisnosti od analizirane populacije. Kognitivni i bihevioralni efekti asocirani sa prisustvom Met alela ispoljavaju se u većoj meri kod kavkazoida. Stoga, većina do danas sprovedenih studija isključuje ispitanike koji nisu evropskog porekla. Moguće je da u ne-evropskim populacijama postoje kompenzatorni mehanizmi koji neutrališu štetan efekat Met alela što bi moglo da objasni tako veliku razliku u učestalosti alela izmeĎu evropskih i azijskih (drugih) populacija. 114 Rezultati naše studije pokazuju da je efekat analiziranog polimorfizma specifičan samo za odreĎene memorijske sisteme, posebno epizodičku memoriju. Uticaj na paţnju, radnu memoriju i opšte kognitivne sposobnosti nije uočen. Analiza povezanosti rezultata testova memorijskih sposobnosti i BDNF polimorfizma prilagoĎeno na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota, pokazala je da, nasuprot našim očekivanjima, nosioci Met alela postiţu statistički značajno bolje rezultate na Vekslerovom subtestu logičke memorije u poreĎenju sa ispitanicima Val/Val genotipa. U drugom testu epizodičke memorije koji je primenjen- Rey AVLT uočena je statistički značajna razlika u prosečnim vrednostima rezultata testova ali samo kod devojaka. Devojke nosioci Met alela postigle su bolje rezultate na testu dok kod mladića nije uočena statistički značajna razlika. Multipla linearna regresiona analiza u kojoj su kao kovarijate korišćeni pol, uslovi ţivota i obrazovanje roditelja pokazala je da ta uočena razlika zapravo ne potiče od analiziranog genotipa već od uticaja drugih faktora. Nije utvrĎena statistički značajna povezanost BDNF polimorfizma sa sposobnošću učenja studenata kao i sa njihovim uspehom u srednjoj školi i na fakultetu. Sve veći broj studija ukazuje na značajnu ulogu BDNF-a na funkcionisanje memorije, posebno epizodičke (80). Na osnovu rezultata različitih memorijskih testova studije Egan, Dempster i Goldberga ukazuju da nosioci jednog Met alela ili Met homozigoti imaju lošiju verbalnu memoriju u poreĎenju sa Val homozigotima (201, 204, 205). U prvoj objavljenoj studiji Egan i sar. 2003. godine pokazano je da osobe Val/Val genotipa postiţu bolje rezultate na subtestu logičke memorije ali dobijeni rezultati nisu bili prilagoĎeni na pol i socioekonomski status ispitanika. Studija je obuhvatila 203 osobe obolele od shizofrenije, 303 brata ili sestre obolelih i 133 zdravih kontrola (starosti 18-60 godina). U kontrolnoj grupi pokazano je da su Met homozigoti imali statistički značajno lošije rezultate na Wechsler-ovom subtestu logičke memorije dok na Kalifornijskom testu verbalnog učenja (CVLT) nije uočena značajna razlika. TakoĎe, nije uočena asocijacija sa semantičkom ili radnom memorijom kao ni sa rezultatima testova opštih kognitivnih sposobnosti. Ovi rezultati ukazuju da analizirani polimorfizam najveći efekat ostvaruje na epizodičku memoriju. Rezultati rada Egan i sar. potvrĎeni su u studiji Dempster i sar. 2005. god. i Goldberg i sar. Ove tri grupe su objavile asocijaciju izmeĎu Met alela i redukovane radne memorije (206). Značajna asocijacija uočena je i izmeĎu Met alela i sporije obrade informacija (207). U studiji na 115 kohorti osoba starije ţivotne dobi primećeno je da je prisustvo Met alela asocirano sa lošijim rezultatima kognitivnih testova (208). Statistička značajnost je postignuta za testove odloţene memorije, brzine procesovanja i opšte inteligencije što potvrĎuje rezultate većine studija u kojima je pronaĎena asocijacija izmeĎu ovog gena i kognitivnih sposobnosti. U studiji Tsai i sar. sprovedenoj na kineskoj populaciji uočeno je da meĎu osobama sa niţim koeficijentom inteligencije (IQ) ima značajno više nosiolaca Met alela (209). Studija Harris i sar. na zdravim starijim osobama nije uočila navedenu razliku u memorijskim sposobnostima dok su za fluidnu inteligenciju dobijeni rezultati suprotni od ocekivanih: nosioci Met alela postigli su bolje rezultate od nosilaca Val alela (210). Studija je sprovedena na 893 starije osobe škotskog porekla i pokazala je da nosioci Met alela imaju bolje sposobnosti rezonovanja asocirane sa godinama koje su u bliskoj korelaciji sa opštom inteligencijom (210). Hansell u svojoj studiji sprovedenoj na velikom uzorku mlaĎih adolescenata nije našao razliku u prostornoj memoriji. U jednom uzorku, Met homozigoti su imali bolje rezultate u fluidnoj inteligenciji, verbalnom rezonovanju ali ne u verbalnoj fluentnosti. Ipak, veličina uzorka u ove tri studije bila je 54 do 233 ispitanika. Nasuprot njima mnogo veća studija sa 785 ispitanika nije potvrdila ascocijaciju sa radnom memorijom (211). Autori su predloţili da je Val alel moţda asociran sa boljim kognitivnim sposobnostima rano tokom ţivota ali da u starijem ţivotnom dobu doprinosi brţem kognitivnom propadanju. Razlog za ovako oprečne rezultate još uvek je nepoznat. Smatra se da su faktori kao što su starost analizirane populacije, pol, sociodemografski faktori, tip testova i etnička pripadnost značajno različiti u navedenim studijama. Novije studije pokazale su i uticaj Val66Met polimorfizma na varijaciju u morfologiji hipokampusa i parahipokampalnog girusa kod normalnih osoba i osoba obolelih od shizofrenije. (212). Kod nosilaca Met alela primećena je razlika u morfologiji hipokampusa i korteksa. Pokazano je da kod se kod kod njih javlja smanjena zapremina dorzolateralnog prefrontalnog korteksa, regiona odgovornog za planiranje i više kognitivne funkcije kao i subkortikalnih regiona kao što je jedro 116 kaudatuma (74). Kod zdravih odraslih osoba, nosilaca Met alela, uočena je 4% do 11% manja zapremina hipokampusa (208, 213). Rezultati funkiconalne magnetne rezonance još uvek su kontraverzni. U pomenutoj studiji Egan i sar. iz 2003. god. Met alel asociran je sa abnormalnom aktivacijom hipokampusa (201). Nasuprot njima studija Dennis i sar. je obuhvatila 22 osobe mlaĎe ţivotne dobi (prosečne starosti 22.5 god.) a ispitivana je neuralna aktivnost tokom procesa epizodičke memorije u zavisnosti od BDNF genotipa (214). Nakon što su isključene razlike u kognitivnim sposobnostima i zapremini medijalnog temporalnog lobusa dobijeni rezultati bili su oprečni rezultatima Hairiri i saradnika iz 2003. god (57). U poreĎenju sa Val homozigotima nosioci Met alela su imali značajno veću aktivnost u medijalnom temporalnom lobusu (MTL). Ovo je posebno izraţeno u levom anteriornom parahipokampalnom girusu (PHG) i desnom hipokampusu/PHG tokom procesa kodiranja i desnom posteriornom hipokampusu/PHG tokom procesa prisećanja dogaĎaja. Odnos izmeĎu rezultata dobijenih primenom testova memorijskih sposobnosti i unutrašnjih kognitivnih procesa (neuronska aktivnost) još uvek je teško interpretirati. Jedno od mogućih objašnjenja je da nosioci Met alela moraju da uloţe veći napor kako bi postigli iste rezultate na testovima memorijskih sposobnosti kao i Val/Val homozigoti. Nasuprot tome moguće je da povećana aktivacija u MTL zapravo predstavlja bolju epizodičku memoriju koja nije detektovana testovima memorijskih sposobnosti. Na kraju, moguće je da je ova povećana aktivacija MTL posledica nedovoljne efikasnosti neurona što ne daje nikakvu prednost u epizodičkoj memoriji već dovodi do istih rezultata. Buduće studije treba da otkriju da li je povećana aktivnost u MTL, posebno u hipokampusu, prednost ili kompenzatorni mehanizam i da razjasni funkcionalnost ovog mehanizma tokom ţivota zdravih osoba i pacijenata koji pokazuju kompromitovanu aktivnost MTL-a. Za dalja razmatranja razlika u kognitivnim funkcijama potrebno je imati veći broj osoba koje su homozigoti za Met alel a koje predstavljaju samo oko 4% populacije. 117 14. ANALIZA KIBRA POLIMORFIZMA U POPULACIJI STUDENATA KIBRA protein se predominantno eksprimira u mozgu i bubrezima. U mozgu njegova ekspresija je posebno izraţena u regionima povezanim sa memorijskim sposobnostima kao što su hipokampus, korteks, cerebelum i hipotalamus. KIBRA učestvuje u brojnim ćelijskim funkcijama: migraciji ćelija, vezikularnom transportu, regulaciji transkripcije i sinaptogenezi (215). Pokazano je da interaguje sa postsinaptičkim proteinima dendrinom i sinaptopodinom koji učestvuju u organizaciji citoskeleta u dendritima (216). Najjači dokaz o ulozi KIBRA u memorijskim procesima potiče od interakcije sa protein kinazom Cδ, molekulom ključnim u procesu dugotrajne potencijacije. TakoĎe, dokazana je i interakcija sa PKMδ, koja se konstitutivno eksprimira u hipokampusu (217). Pokazano je da su oba ova proteina prisutna u hipokampusu i dentatnom girusu koji su od ključnog značaja za procese učenja i pamćenja. U nasem ispitivanju analizom je obuhvaćeno 538 studenta. UtvrĎeno je da je 260 studenata tj. 48.3% homozigot za češći alel C (genotip CC), 231-oro tj. 42.9% su heterozigoti (genotip CT) a njih 47 (8.7%) je homozigot za reĎi alel T (genotip TT). Naši rezultati su u saglasnosti sa rezultatima učestalosti genotipova i alela u drugim evropskim populacijama. Primećeno je da se učestalost C i T alela značajno razlikuju meĎu svetskim populacijama. Učestalost T alela je veća u afričkim populacijama u odnosu na evropske a znatno veća u japanskoj populaciji ( Tabela 53.). 118 Tabela 53. Učestalost C i T alela u populacijama sveta (202) Populacija Alel C Alel T Srbija-studenti 0.698 0.302 Evropa-ukupno 0.649 0.351 Italija-Toskana 0.648 0.352 Španija 0.643 0.357 Japan 0.152 0.848 Afrika 0.400 0.600 SAD 0.494 0.506 U našoj studiji nije uočena asocijacija KIBRA genotipa sa radnom memorijom, paţnjom, i opštim kognitivnim sposobnostima kao i testovima epizodičke memorije čak i kada su rezultati prilagoĎeni na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota. Primena multiple linearne regresione analie pokazala je da statistički značajna razlika koja je uočena u rezultatima RavenPM kod muškaraca i RAVLT kod ţena ne potiče od genotipa već od uticaja drugih kovarijata. Ispitivana je i asocijacija KIBRA genotipa sa postignutim uspehom tokom školovanja (prosečna ocena u srednjoj školi i na fakultetu), ličnom procenom o brzini pamćenja i brojem ponavljanja gradiva prilikom pripremanja ispita i nije uočena statistički značajna povezanost. U GWA studiji Papasotiropulosa i saradnika po prvi put je polimorfizam rs17070145 koji predstavlja supstituciju T u C u devetom intronu gena za KIBRA protein asociran sa epizodičkom memorijom (54). Studija Papasotiropoulos-a i sar. najpre je sprovedena na 351 osoba starosti 18-48 godina koji su deo švajcarske kohorte i uočena je asocijacija T alela sa boljim rezultatima testova verbalne memorije. Drugu grupu ispitanika činilo je 256 odraslih osoba iz SAD i pokazano je da nosioci T alela imaju bolje rezultate na RAVLT testu epizodičke memorije i Buschke testu selektivnog prisećanja. Treći uzorak obuhvatio je novu grupu od 424 osobe iz Švajcarske, starosti od 18 do 28 godina kod kojih je uočeno da nosioci T alela pokazuju bolje rezultate na testu semantički nepovezanih slika ali samo prilikom testiranja odloţenog pamćenja. Ni 119 u jednoj kohorti nije uočena asocijacija sa procesima paţnje, radne memorije niti neposrednog prisećanja informacija. Rezultati dobijeni u ovoj studiji ukazali su da je KIBRA specifičan protein za koji je moguće da utiče na procese zadrţavanja informacija ali koji ne utiče na kratkotrajno pamćenje. Sa KIBRA genotipom bilo je asocirano učenje i verbalnih i vizuelnih nepovezanih informacija. To je navelo na zaključak da funkcija KIBRA-e ne zavisi od prirode stimulusa. Rezultati funkcionalne magnetne rezonance (fMRI) pokazali su da je moţdana aktivnost tokom testova epizodičke memorije bila značajno veća u regionima mozga ključnim za prizivanje informacija kod CC homozigota u poreĎenju sa nosiocima T alela. Nakon studije Papassotiropoulos-a i sar. objavljena je studija Schaper i saradnika na malom uzorku od 64 osobe u kojoj je uočen trend ka boljim rezultatima odloţenog prisećanja u nemačkoj verziji AVLT kao i značajna asocijacija KIBRA genotipa sa neposrednim i odloţenim pamćenjem (218). Sledile su brojne studije u kojima je takoĎe uočena asocijacija sa odloţenim pamćenjem kao što su studije Almeida i sar., 2008., Preuschof i sar., 2010. i Vassos i sar., 2010 (219, 220, 221). Studija Nacmias i sar. 2010. dobila je suprotne rezultate ali analiziranu grupu činile su osobe sa subjektivnim ţalbama na pamćenje (222). To je ukazalo na mogućnost da KIBRA genotip moţe na memoriju da utiče različito kod osoba koji imaju deficit u memorijskim sposobnostima u odnosu na osobe normalnih memorijskih sposobnosti. Sa druge strane, Need i saradnici su pokušali da reprodukuju studiju Papassotiropulosa i sar. na dve kohorte ispitanika evropskog porekla koje je činilo 319 i 365 osoba (223). U svojoj studiji primenili su regresioni model u kome su kovariate bile rs17070145 genotip, pol, godine i obrazovanje i nisu potvrdili asocijaciju KIBRA genotipa sa verbalnom memorijom u grupi od 319 ispitanika. TakoĎe, isti rezultat su dobili i podgrupi od 76 ispitanika koji su radili test neposrednog i odloţenog pamćenja (prisećanja) priče nisu otkrili statistički značajnu asocijaciju. Ispitivanja epizodičke memorije sprovedena na prvoj kohorti nisu pokazala asocijaciju sa KIBRA genotipom ali nisu bili egzaktna replikacija studije Papasotiropulosa i sar. Zbog toga je u drugoj kohorti koju je činilo 365 osoba nemačkog porekla primenjen AVLT. Ponovo nije uočena asocijacija epizodičke memorije sa KIBRA genotipom. Analizirano je još 39 120 polimorfizma u KIBRA genu: samo jedan je dosegao nominalnu značajnost i nije u LD (neravnoteţa vezanosti, engl. linkage disequilibrium) sa rs17070145. Bates i sar. 2009.god. su sproveli istraţivanje na dve grupe (224). Jednu je činilo 2091 osoba opšte populacije koja je učestvovala u kliničkoj studiji koja predstavlja repliku studije Papassotiropoulos-a i sar. dok je drugu grupu činilo 542 ispitanika, učesnika studije o normalnom starenju koji su radili Wechslerov subtest logičke memorije. Ovakav pristup omogućio je ispitivanje trenutne i odloţene memorije za nepovezane i povezane informacije. Ispitanici su takoĎe radili i RavenPM test opštih kognitivnih sposobnosti. Njihovi rezultati nisu pokazali asocijaciju rezultata subtesta logičke memorije sa KIBRA genotipom ni kada su rezultati prilagoĎeni na pol i neposredno upamćivanje. Dobijene vrednosti prilagoĎene su i na COMT Val158Met polimorfizam i KLOTHO, nicastrin (NCSTN) i APOE genotip i rezultati su ostali nepromenjeni. TakoĎe, nije uočena ni asocijacija izmeĎu KIBRA genotipa i rezultata testa inteligencije što je u saglasnosti sa našim rezultatom. Ispitivanje asocijacije genotipa sa rezultatima AVLT otkrilo je statističku značajnost asocijacije genotipa i odloţenog prisećanja informacija nakon 30 minuta kada su rezultati prilagoĎeni na pol, starost i neposredno upamćivanje. Dobijeni rezultati ukazuju da je efekat KIBRA-e na memorijske sposobnosti skroman i specifičan za odreĎene kognitivne komponente memorije. Milnik i sar. 2012. god. su u meta analizu uključili sve dostupne studije asocijacije koje su ispitivale efekat rs17070145 polimorfizma na epizodičku i radnu memoriju (225). Obuhvaćeno je sedamnaest studija sa ukupno 8909 ispitanika koje su ispitivale efekat na epizodičku memoriju i 9 studija sa ukupno 4696 ispitanika u kojima je ispitivana radna memorija. Dobijeni rezultati pokazali su da postoji statistički značajna asocijacija analiziranog polimorfizma i sa epizodičkom i sa radnom memorijom. Rezultati ukazuju da rs17070145 polimorfizam objašnjava 0.5% varijanse u zadacima epizodičke memorije i 0.1% varijanse u zadacima radne memorije kod ispitanika prevashodno kavkazoidnog porekla. Studija Burgess i sar. sprovedena je na 2571 pacijenata sa AB kasnog početka i 2842 kontrole koja je obuhvatila osobe evropskog i afro-američkog porekla (226). U kontrolnom uzorku nije uočena asocijacija sa epizodičkom memorijom primenom 121 RAVLT i Wekslerovog subtesta logičke memorije. TakoĎe meta analiza sa preko 8000 ispitanika pokazala je da T alelima protektivni efekat od AB. Pored toga, pokazano je da postoji prekomerna ekspresija KIBRA-e u temporalnom korteksu pacijenata sa AB ali ne i u cerebelumu. 15. ANALIZA APOE POLIMORFIZAMA U POPULACIJI STUDENATA Apolipoprotein E (ApoE) je strukturni protein LDL čestica i sluţi kao ligand za LDL receptor. U mozgu se sintetiše primarno u astrocitima i učestvuje u transportu holesterola izmeĎu ćelija glije i neurona pa ima značajnu ulogu u odrţavanju sinapsi i nervnoj plastičnosti (227). Smatra se da se u gliji holesterol reciklira, kombinuje sa ApoE i šalje neuronima gde se koristi u remodeliranju sinapsi i izrastanju dendrita. U humanoj populaciji prisutna su tri uobičajena kodominantna alela: E2, E3, i E4 koji kodiraju glavne proteinske izoforme apoE (E2, E3 i E4). Opisane alelne varijante su uslovljene baznim supstitucijama u kodonima 112 i 158 egzona 4 i njihovim kombinacijama (122). APOE E4 je dobro poznat faktor rizika za Alchajmerovu bolest kod koje je jedan od simptoma i memorijski deficit (229). Najveći broj studija uticaja APOE E4 alela na memorijske sposobnosti sproveden je na populaciji dementnih osoba i zdravih osoba starije ţivotne dobi. U brojnim radovima kod osoba srednje ili starije ţivotne dobi APOE E4 je asociran sa slabijim memorijskim sposobnostima čiji je mogući uzrok izmenjeni metabolizam holesterola (230). Mnogo manje je podataka o njegovom uticaju na zdrave mlade osobe. 122 Tabela 54. Učestalost E2, E3 i E4 alela u različitim populacijama sveta (202) Populacija E2 E3 E4 Srbija-studenti 0.056 0.879 0.065 Srbija-JUSAD 0.067 0.863 0.070 Srbija (228) 0.147 0.742 0.111 Hrvatska 0.069 0.787 0.144 MaĊarska 0.064 0.807 0.129 Finska 0.039 0.807 0.129 Francuska 0.087 0.782 0.131 Nemaĉka 0.082 0.782 0.136 Španija 0.075 0.849 0.075 Turska 0.061 0.860 0.079 SAD (Framingam) 0.072 0.786 0.140 Japan 0.023 0.891 0.086 Kina 0.124 0.806 0.070 U tabeli 54. prikazane su učestalosti alela e2, e3 i e4 u populacijama Evrope, SAD i Azije. U našem ispitivanju redosled učestalosti polimorfnih alela je E3 (87.9%)>E4 (6.5%)>E2 (5.6%) dok je učestalost genotipova je E3/E3 (77.7%)> E3/E4+E4/E4 (11.1%)>E2/E3 (10.1%). Dobijeni redosled genotipova i alela u našoj studiji u saglasnosti je sa redosledom opisanim u populacijama belaca. Učestalost alela i genotipova takoĎe je u skladu sa rezultatima JUSAD studije (Jugoslovenska studija prekursora ateroskleroze kod školske dece) sprovedene na 530 učenika osmog razreda iz različitih regiona Srbije (231). Dobijeni rezultati obe studije najviše su u skladu sa rezultatima objavljenim za Tursku populaciju. Dobijena učestalost E4 alela je niţa od učestalosti u Mediteranskim zemljama i vrlo bliska učestalosti u azijskim populacijama. 123 Rezultati naše studije pokazali su da ne postoji statistički značajna razlika u memorijskim i opštim kognitivnim sposobnostima studenata (ukupno i po polovima) u zavisnosti od njihovog APOE genotipa. MeĎutim, moţemo uočiti da su, iako nije dostignuta statistička značajnost, studenti nosioci e4 alela postigli lošije rezultate u svim testovima memorijskih sposobnosti kao i testu opštih kognitivnih sposobnosti. TakoĎe, primenom multiple linearne regresije nije uočena asocijacija izmeĎu APOE genotipa i memorijskih i opštih kognitivnih sposobnosti ni kada su rezultati prilagoĎeni na pol, uslove ţivota i obrazovanje roditelja. U našoj studiji primenom multiple linearne i logističke regresione analize ispitivali smo i uticaj APOE genotipa na uspeh u srednjoj školi i fakultetu kao i na ličnu procenu brzine pamćenja i broj ponavljanja materijala pre izlaska na ispit i nismo uočili statistički značajnu asocijaciju sa APOE genotipom. U studiji Mondadori i sar. uočena je asocijacija E4 alela sa boljim memorijskim sposobnostima u mlaĎem ţivotnom dobu, posebno sa epizodičkom memorijom (232). TakoĎe u studiji Hubachek i sar. uočeno je da osobe nosioci E4 alela postiţu viši nivo obrazovanja (233) dok rezultati Yu, Lin,2000 ukazuju da oni čak imaju i bolje opšte kognitivne sposobnosti (234). U radu Han, Drake i saradnika ukazano da mlaĎe osobe koje su nosioci E4 alela imaju bolju paţnju, egzekutivne funkcije i epizodičku memoriju u poreĎenju sa osobama koje nemaju E4 alel. Iako su ispitanici u okviru ove studije imali blagu do umerenu traumu mozga rezultati su ostali neizmenjeni i kada je uzeta u obzir teţina povrede (235). Na osnovu navedenih rezultata u kojima nosioci APOE4 alela u mlaĎoj ţivotnoj dobi imaju bolje memorijske sposobnosti Han i Bondi (236) su predloţili koncept antagonističke plejotropije. Ovaj koncept odnosi se na gene koji pokazuju pozitivne efekte rano tokom ţivota čime doprinose pozitivnoj selekciji i preţivljavanju ali tokom kasnijeg perioda ţivota imaju negativan efekat. Han i Bondi smatraju da je APOE4 alel u mladosti asociran sa boljim kognitivnim sposobnostima, u srednjem ţivotnom dobu varijacija izmeĎu nosilaca E4 alela i onih koji nemaju ovaj alel je minimalna dok je u starijem ţivotnom dobu asocijacija obrnuta i APOE4 alel postaje faktor rizika za poremećaje u kognitivnim sposobnostima i pojavu demencije. MeĎu navedenim studijama na kojima ovaj koncept počiva samo studija Mondadori i saradnika je 124 uključila 340 ispitanika dok su ostale studije imale mali broj ispitanika, uključivale su ispitanike sa nekom vrstom patologije a umesto direktne procene memorijskih sposobnosti nekim od odgovarajućih testova mnoge su koristile nivo obrazovanja ili temperament za meru kognitivnih sposobnosti. Danas su sve brojnije studije u kojima se došlo do oprečnih rezultata. Jorm i sar. nisu uočili razliku u asocijacije izmeĎu APOE genotipa i kognitivnih sposobnosti u kohortama od 20-24, 40-44 60-64 godina starosti (237). U studiji Liu i sar. 2010 analizirano je 2208 ispitanika koji su podeljeni u grupe mlaĎih i starijih od 50 godina (238). Rezultati ove studije pokazali su da je E4 alel udruţen sa lošijim rezultatima AVLT testa u grupi osoba strarijih od 50 godina. Prvi, rani efekti uočeni su kod homozigota, genotipa E4/E4 starosti 40 godina. Prilikom istraţivanja u obzir su uzeti i kardiovaskularni faktori i uočena je jaka asocijacija izmeĎu APOE4 alela i viših vrednosti ukupnog holesterola, triglicerida i HDL. Debljina tunike intime i tunike medije karotidne arterije (intima media thickness, IMT) i sistolni krvni pritisak su takoĎe asocirani sa kognitivnim funkcijama. Ipak, prilagoĎavanje na ove faktore u multiploj regresionoj analizi nije imalo uticaja na asocijaciju APOE4 sa kognitivnim funkcijama što ukazuje da je uticaj APOE4 alela nezavisan od kardiovaskularnih faktora. Najveća do sada sprovedena studija je studija Bunce i saradnika iz 2011. godine koja je obuhvatila 5445 ispitanika svrstanih u tri starosne kategorije 20-24, 40-44 i 60- 64 godine (239). U ovoj studiji nije uočena asocijacija E4 alela sa boljim kognitivnim funkcijama mladih i sredovečnih osoba i nakon što su rezultati prilagoĎeni na pol i godine obrazovanja. Ihle i sar. su 2012 objavili rezultate meta analize koja je obuhvatila 20 studija u kojima je ispitivan uticaj APOE4 alela na kognitivne sposobnosti dece, adolescenata i mladih odraslih osoba (240). Analizom dobijenih rezultata nije uočeno postojanje kognitivnog benefita kod mladih osoba adolescenata i dece koja su nosioci E4 alela i zaključuju da se hipoteza o antagonističkoj plejotropiji treba uzeti sa rezervom. Rezultati obe studije su u saglasnosti sa našim rezultatima. Sprovedena je i opseţna studija na uzorku od 5995 dece (241). Opšte kognitivne sposobnosti odreĎivane su na uzrastu od 8 godina, memorijske sposobnosti u starosti od 125 8 i 10 godina a takoĎe je analiziran i lipidni status dece. Dok je lipidni status pokazivao istu zavisnost od APOE genotipa kao i kod odraslih asocijacija sa opštim kognitivnim sposobnostima i rezultatima testova memorijskih sposobnosti nije uočena. Mali broj istraţivanja sproveden je u cilju proučavanja uticaja APOE genotipa na strukturu i funkciju mozga zdravih mladih osoba. Studije funkcionalnih, strukturnih i bihevioralnih razlika asociranih sa APOE genotipom fokusirane su na proučavanje medijanog temporalnog lobusa kao regiona mozga koji je značajan za funkcionisanje epizodičke memorije i koji je prvi zahvaćen AB. Pokazano je da kod starijih osoba dolazi do progresivnog smanjenja zapremine hipokampusa, s tim što je ono najmanje izraţeno kod osoba koje nemaju demenciju, nešto više prisutno kod onih sa blagim kognitivnim poremećajem, a najizraţenije je kod obolelih od AB. U svakoj od analiziranih grupa ispitanici sa E4 alelom imali su statistički značajno manju zapreminu hipokampusa u poreĎenju sa onima koji nemaju E4 alel. Ovi rezultati u saglasnosti su sa radovima u kojima je uočena redukcija u zapremini hipokampusa i debljini korteksa nosilaca E4 alela u populaciji zdravih sredovečnih i starijih osoba. Kod dece i adolescenata uočena je povezanost E4 alela sa manjom debljinom entorinalnog korteksa. Iako nisu sve studije pokazale da postoji povezanost izmeĎu E4 alela i redukcije zapremine hipokampusa meta analiza koja je obuhvatila 84 studije došla je do zapaţanja da je kod zdravih odraslih osoba zapremina desne strane veća od zapremine leve strane hipokampusa (243). Kod zdravih starijih nosilaca E4 alela uočeno je da dolazi do narušavanja asimetrije hipokampusa (244) usled smanjenja zapremina desne strane hipokampusa. (245) Predloţeno je da promene u normalnoj asimetriji mogu biti potencijalni indikator rane patologije karakteristične za AB. Dobijeni rezultati istraţivanja sprovedenog na osobama mlaĎe ţivotne dobi ukazuju da i kod mladih nosilaca E4 alela postoji smanjenje zapremine hipokampusa i da je desna strana podloţnija atrofiji u poreĎenju sa levom. Razlika u zapremini uočena je i kod desne amigdale ali nije dostigla statističku značajnost. U zapremini sive mase drugih struktura mozga nije uočena razlika. Zajedno ovi rezultati ukazuju da prisustvo E4 alela nema globalni uticaj već specifično deluje na strukture hipokampusa. Uprkos negativnim efektima E4 alela na zapreminu hipokampusa E4 nosioci postiţu iste rezultate na testovima verbalnog učenja, vizuelne memorije, radne memorije i paţnje kao i osobe koje nemaju E4 alel. To znači da iako je prisutna rana atrofija u strukturama za koje je 126 poznato da su zahvaćene u ranoj fazi AB memorijske sposobnosti još uvek nisu narušene odnosno, mozak ima dovoljno kapaciteta da spreči kognitivni pad uprkos razlikama u strukturi hipokampusa. Deficit asociran sa E4 alelom postaje uočljiv u starijem ţivotnom dobu kada je kod nosilaca E4 alela tanjenje korteksa primećeno u AB izraţenije pa brţe dolazi do pada ispod kritične anatomske granice i disfunkcija postaje klinički uočljiva. U studiji Dennis i sar. 2010. godine koja je obuhvatila 24 mlade odrasle osobe (12 nosilaca E4 alela) ispitivana je aktivacija hipokampusa ESA (engl. encoding success activity) (246). Dobijeni rezultati pokazali su da nosioci E4 alela imaju veću aktivnost u medijalnom temporalnom lobusu, posebno hipokampusu i parahipokampalnom girusu (PGH) ali da se globalno uočava redukovana konektivnost sa drugim kortikalnim regionima mozga koji se aktiviraju prilikom izvoĎenja odgovarajućeg zadatka. Treba imati u vidu da nije postojala razlika u memorijskim sposobnostima izmeĎu analiziranih grupa. Ovi rezultati nisu u saglasnosti sa postavljenom hipotezom o antagonističkoj plejotropiji i ulozi APOE4 alela u kognitivnim sposobnostima mladih zdravih osoba. Smatra se da pojačana aktivacija kod nosilaca APOE4 alela (u odsustvu bihevioralnih i strukturnih razlika) zapravo predstavlja kompenzatorni mehanizam. Dodatna aktivacija kod nosilaca e4 alela reflektuje dodatni kognitivni napor prilikom izvršenja memorijskih zadataka kako bi se ostvario isti nivo funkcionisanja kao kod onih osoba koje nisu nosioci E4 alela. Povećana aktivacija u medijalnom temporalnom lobusu koja je detektovana u ovoj studiji odraţava uroĎenu razliku u funkcionisanju ovog regiona mozga izmeĎu onih koji imaju E4 alel i onih koji ga nemaju ili se pak objašnjava kao predklinički stadijum Alchajmerove bolesti (230). I dalje nema odgovora da li je u pitanju drugačiji kognitivni fenotip kod mladih osoba nosilaca APOE E4 alela ili razlike u memorijskim sposobnostima ukazuju na predklinički stadijum AB. U studiji Reiman i sar. 2003. godine primenom fluorodeoksiglukoza pozitronske emisione tomografije ispitivan je metabolizam glukoze u mozgu u zavisnosti od ApoE genotipa kod zdravih osoba starosti 20-39 godina (247). Kao i u prethodnim studijama sprovedenim na ispitanicima srednjeg ţivotnog doba i pacijentima sa mogućom dijagnozom AB pokazano je da i mlade osobe nosioci E4 alela imaju abnormalno nizak nivo metabolizma glukoze bilateralno u zadnjem cingulumu, parietalnom, temporalnom 127 i prefrontalnom korteksu. Kognitivno normalni nosioci E4 alela imaju funkcionalne abnormalnosti u mladosti nekoliko decenija pre moguće pojave demencije. Ove abnormalnosti su detektovane kod nosilaca samo jednog E4 alela kod kojih se AB tipično javlja u sedmoj deceniji ţivota, četiri decenije više u odnosu na prosečno godište ispitanika uključenih u studiju. Moguće je da je redukcija u metabolizmu glukoze kod mladih nosilaca APOE4 genotipa najranija promena u mozgu osoba koje imaju rizik za oboljevanje od AB. 16. ANALIZA BCHE POLIMORFIZMA U POPULACIJI STUDENATA BCHE pripada familiji serin proteaza i katalizuje hidrolizu endogenih estara holina kao što su acetilholin, propionilholin i butirilholin. U CNS-u se eksprimira u korteksu, hipokampusu i talamusu, regionima mozga značajnim za ostvarivanje različitih kognitivnih funkcija za koje je poznato da imaju holinergičku inervaciju. Brojna jedra talamusa, uključujući anteroventralno, mediodorzalno i pulvinarno sadrţe veliki broj neurona koji predominantno eksprimiraju BchE (175). Ova jedra deo su talamokortikalnih kola koja su od značaja za više kognitivne funkcije, uključujući brzinu obrade informacija, memoriju i vizuospacijalne funkcije (248). Smatra se da BCHE učestvuje u koregulaciji holinergičke transmisije zajedno sa AchE ali i da ima ulogu u regulaciji ne-holinergičke transmisije. U okviru gena za BCHE nalazi se čak 40 polimorfnih mesta za koje je pokazano da dovode do smanjene aktivnosti enzima u poreĎenju sa wt BCHE. Najčešća je BCHE-K varijanta (rs1803274) koja nastaje baznom supstitucijom A u G na poziciji 1699 i dovodi do zamene alanina treoninom u 539-om kodonu. Posledica ove supstitucije je smanjena hidrolitička aktivnost enzima za 30% usled narušavanja njegove stabilnosti (249). Funkcionalni značaj BCHE je dugo godina bio potcenjen zbog njegove relativno niske ekspresije u poreĎenju sa ACHE. Od svih polimorfizama u BCHE genu K varijanta privukla je najviše paţnje kada su Lehmann i sar. 2001. god. ukazali na mogućnost da ova varijanta predstavlja faktor rizika za AB (180). Smatra se da smanjena hidrolitička aktivnost BchE vodi boljoj holinergičkoj transmisiji što utiče na bolje memorijske sposobnosti, paţnju, manje kognitivno propadanje tokom godina i odlaganja početka AB (250). Kod pacijenata sa AB ekspresija BCHE znatno raste u hipokampusu i temporalnom korteksu u poreĎenju 128 sa normalnim osobama (251). S druge strane BChE-K favorizuje stvaranje neurofibrilarnih klubadi tokom rane faze AB i ukazuje na uticaj BChE-K još tokom rane, asimptomatske faze bolesti (252). Dosadašnja istraţivanja ukazuju da BChE-K moţe imati i protektivnu ulogu ali i biti faktor rizika za AB u zavisnosti od delovanja ostalih varijabli. Poznato je da Ach učestvuje u sinaptičkoj plastičnosti hipokampusa, učenju i memorijskim procesima. Greig i saradnici su 2005. godine ispitivali efekat inhibicije BChE na procese učenja i kognicije na sinaptičkom i bihevioralnom nivou kao i uticaj na neuropatološke markere AB i nivo Ach (253). Njihovi rezultati su pokazali da inhibicija BChE povećava nivo Ach u parijetalnom korteksu pacova, pojačava LTP u hipokampusu, poboljšava nivo kognitivnih sposobnosti kod starijih pacova i redukuje nivo APP i Aβ in vitro i in vivo. Promene u koncentraciji Ach utiču na dugotrajnu potencijaciju modulacijom glutamatergičke neurotransmisije. Iako je LTP pojava koja se najčešće ostvaruje na glutamatergičkim sinapsama savremene studije ukazuju da na holinergičkim neuronima postoji slična plastičnost (jačanje sinapsi holinergičkih neurona). Smatra se da uticaj holinergičkih neurona na procese učenja i pamćenja moţe biti i direktan i da se ne ostvaruje samo putem modulacije glutamatergičkih sinapsi. Za sada nije potpuno jasno da li uloga BChE u kognitivnim sposobnostima potiče samo od njene holinergičke ili ne-holinergičke funkcije. Novije studije na ljudima podrţavaju moguću ulogu BChE u kognitivnim funkcijama. Uočeno je da pacijenti sa demencijom, nosioci K varijante, imaju bolju paţnju i sporiju progresiju bolesti. TakoĎe, kod demencije sa Lewijevim telima uočena je visoko značajna asocijacija izmeĎu niţe aktivnosti Bche u temporalnom korteksu i sporijeg kognitivnog propadanja. BChe pozitivni neuroni koji se projektuju specifično na frontalni korteks mogu imati vaţnu ulogu u paţnji, egzekutivnim funkcijama, emocionalnoj memoriji i ponašanju. Uticaj BChE na memorijske sposobnosti osoba mlaĎe ţivotne dobi još uvek nije ispitivan. Prema našim saznanjima naša studija je prva koja se bavila ispitivanjem uticaja K varijante na memorijske sposobnosti mladih, zdravih osoba. 129 Tabela 55. Učestalost G i A alela (K varijante) u različitim populacijama sveta (202) populacija G alel A alel (K varijanta) Srbija-studenti 0.815 0.185 Evropa-ukupno 0.813 0.187 Finska 0.855 0.145 Španija 0.857 0.143 Velika Britanija 0.798 0.202 Afrika 0.860 0.140 Japan 0.792 0.208 Kina 0.840 0.160 SAD 0.870 0.130 U tabeli 55. prikazana je učestalost alela ispitivanog BCHE polimorfizma. Moţe se primetiti da ne postoji značajna razlika u učestalosti K varijante u različitim populacijama u svetu. U našoj studiji kojom je obuhvaćeno 543 studenta utvrĎeno je da je 363 studenata tj. 66.8% homozigot za češći alel G (genotip GG), 159-oro tj. 29.3% su heterozigoti (genotip GA) a svega njih 21 (3.9%) je homozigot za reĎi alel A (genotip AA). Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa rezultatima objavljenim za ostale populacije u svetu. Rezultati naše studije pokazali su da studenti nosioci K varijante postiţu statistički značajno bolje rezultate na testu paţnje/radne memorije u poreĎenju sa homozigotima genotipa GG. U testovima opštih kognitivnih sposobnosti i epizodičke memorije nije uočena asocijacija sa BCHE genotipom niti prisustvom K alela. Kada je analizirana asocijacija BCHe genotipa sa uspehom postignutim u srednjoj školi i na fakultetu pokazalo se da i kada je analiza vršena po genotipskom i po alelskom modelu, nosioci K varijante imaju višu prosečnu ocenu tokom studiranja. TakoĎe, ispitivali smo asocijaciju BCHE genotipa i sa ličnom procenom studenata o brzini učenja kao i koliko puta prelaze gradivo za ispit i nismo uočili statističku značajnost. 130 Značajno je pomenuti i rezultate Manahoran i sar. koji su ispitivali uticaj silent varijante enzima L307P na kognitivne sposobnosti (254). U studiji su primenili bateriju testova ANAM (engl. Automated Neuropsychological Assesment matrices). Njihovi rezultati pokazali su da su nosioci silent varijante bili bolji u testovima ’’simple reaction time’’ ali sporiji u ’’visual perceptual matching task’’. Potrebne su dodatne studije na većem broju ispitanika kako bi se rezultati naše studije i potvrdili. Dosadašnji rezultati ukazuju da fokusiranje na postojeće, dobro proučene biološke informacije vode identifikaciji gena značajnih za memorijske sposobnosti ljudi. Postojeće biološke informacije značajno olakšavaju potragu za genima kandidatima ali sa druge strane ograničavaju potencijal studija da identifikuju nove gene i molekularne puteve. Skorija dostignuća u tehnološkom razvoju omogućila su analizu asocijacija izmeĎu odreĎenih osobina i miliona genetskih varijanti rasporeĎenih po celokupnom genomu primenom studija asocijacije celokupnog genoma (GWAS). Pored izuzetnog značaja replikacije rezultata dobijenih asocijativnim studijama potrebno je uzeti u obzir i dodatne metode koje bi dalje mogle potvrditi i omogućiti bolje razumevanje dobijenih rezultata. Jedna od tih metoda je i primena imidţing studija. Do sada, većina ovih studija ispitivala je asocijaciju pojedinačnih genskih markera sa moţdanom aktivnošću. Ipak, uzimajući u obzir genetičku i fenotipsku kompleksnost memorije biće potrebno istovremeno analizirati markere u većem broju gena. TakoĎe, od velikog je značaja uzeti u obzir i interakcije meĎu genima. Pored molekularno-genetičkih ispitivanja o ulozi gena u individualnim razlikama u memorijskim sposobnostima ljudi vaţno je i razumevanje efekta demografskih i socioekonosmkih faktora na razvoj i funkciju memorijskih sposobnosti. Poznato je da uslovi ţivota, obrazovanje ispitanika, ţivotni stil bitno utiču na nivo memorijskih sposobnosti. TakoĎe, vaţno je imati u vidu i emocionalno stanje ispitanika prilikom izvoĎenja testova memorijskih sposobnosti kao i stepen njihove motivacije jer mogu bitno uticati na postignute rezultate. 131 ZAKLJUĈAK U ispitivanom uzorku od 548 studenata, izmeĎu mladića i devojaka su uočene razlike u rezultatima koje su postigli prilikom rešavanja baterije neuropsiholoških testova. Mladići su postigli statistički značajno bolje rezultate na testu opštih kognitivnih sposobnosti – RavenPM kao i na testu paţnje/radne memorije TRCmax dok su devojke postigle statistički značajno bolje rezultate na testu epizodičke memorije REYcumm. Ispitivanjem BDNF rs6265 polimorfizma pokazano je:  da je učestalost GG homozigota 69.8%, heterozigota GA 27.0 % i AA homozigota 3.2%. IzmeĎu mladića i devojaka nije uočena statistički značajna razlika u učestalosti genotipova. Učestalost alela G je 83.3%, a alela A 16.7%.  da je uočena statistički značajna povezanost A alela sa boljim rezultatima postignutim na ABimmed testu epizodičke memorije nakon prilagoĎavanja na pol, obrazovanje roditelja i uslove ţivota studenata.  da izmeĎu nosilaca GG i GA genotipa nije uočena statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na testovima: RavenPM, TRCmax i REYcumm  da izmeĎu nosilaca GG i GA genotipa nije uočena statistički značajna razlika u prosečnoj oceni postignutoj tokom srednje škole i prosečnoj oceni na fakultetu  da izmeĎu nosilaca GG i GA genotipa nije uočena statistički značajna razlika u ličnoj proceni o brzini pamćenja i tome koliko puta student ponavljaju gradivo pre izlaska na ispit. Ispitivanjem KIBRA rs17070145 polimorfizma pokazano je:  da je 48.3% steudenata homozigot za češći alel C (genotip CC), 42.9% su heterozigoti (genotip CT) a njih 8.7% je homozigot za reĎi alel T (genotip TT). IzmeĎu mladića i devojaka nije uočena statistički značajna razlika u učestalosti genotipova. Učestalost alela C je 69.8%, a alela T 30.2%. 132  da ne postoji statistički značajna razlika u zavisnosti od KIBRA genotipa u rezultatima postignutim na testovima memorijski sposobnosti i testu opštih kognitivnih sposobnosti: REYcumm, ABimmed TRCmax i RavenPM.  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od KIBRA genotipa u prosečnoj oceni postignutoj tokom srednje škole i prosečnoj oceni na fakultetu  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od KIBRA genotipa u ličnoj proceni o brzini pamćenja i tome koliko puta student ponavljaju gradivo pre izlaska na ispit. Ispitivanjem APOE rs7412/rs429358 polimorfizma pokazano je:  da je 77.7% studenta homozgoti za alel Ɛ3 (genotip 3/3), 10.1% su heterozigoti genotipa 2/3, 10.4% heterozigoti genotipa 3/4 a svega 0.7% su homozigoti genotipa 4/4. IzmeĎu mladića i devojaka nije uočena statistički značajna razlika u učestalosti genotipova. Učestalost Ɛ3 alela je 87.9%, e2 alela 5.6% a e4 alela 6.5%.  da ne postoji statistički značajna razlika u zavisnosti od prisustva APOE4 alela u rezultatima postignutim na testovima memorijski sposobnosti i testu opštih kognitivnih sposobnosti: REYcumm, ABimmed TRCmax i RavenPM.  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od prisustva APOE4 alela u prosečnoj oceni postignutoj tokom srednje škole i prosečnoj oceni na fakultetu  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od prisustva APOE4 alela u ličnoj proceni o brzini pamćenja i tome koliko puta student ponavljaju gradivo pre izlaska na ispit. Ispitivanjem BCHE rs1803274 polimorfizma pokazano je:  da je 66.8% studenata homozigot za alel G (genotip GG), 29.3% su heterozigoti (genotip GA) a svega njih 3.9% je homozigot za reĎi alel A (genotip AA). IzmeĎu mladića i devojaka nije uočena statistički značajna razlika u učestalosti genotipova. Učestalost alela G je 81.5%, a alela A 18.5%.  da postoji statistički značajna razlika u rezultatima postignutim na TRCmax testu u zavisnosti od prisustva A alela (p=0.041). Nosioci K varijante (A alela) 133 postiţu statistički značajno bolje rezultate na TRCmax testu u odnosu na studente GG genotipa.  da ne postoji statistički značajna razlika u zavisnosti od BCHE genotipa u rezultatima postignutim na drugim testovima memorijski sposobnosti i testu opštih kognitivnih sposobnosti: REYcumm, ABimmed i RavenPM.  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od BCHE genotipa u prosečnoj oceni postignutoj tokom srednje škole i prosečnoj oceni na fakultetu  da nema statistički značajne razlike u zavisnosti od BCHE genotipa u ličnoj proceni o brzini pamćenja i tome koliko puta student ponavljaju gradivo pre izlaska na ispit. 134 LITERATURA 1. Pavlović D. Demencije, neurološki i psihološki vodič. Kaligraf. 2008. 2. Bradly A. Ljudsko pamćenje teorija i praksa. Zavod za udţbenike i nastavna sredstva. Beograd. 2004. 3. Rose S. The making of memory: From molecules to mind. 2003. 4. Ocić G.: Klinička neuropsihologija, Zavod za udţbenike i nastavna sredstva, Beograd, 1998 5. Pastuović N.: Edukologija, Znamen, Zagreb, 1999 6. Diklić V.: Primena magnetno-rezonantne spektroskopije in vivo u izučavanju poremećaja memorije, Acta Facultatis Medicale Naissensis, Edukativni članak 16 (3), str. 180-185, 1999. 7. Trebješanin B.: Udţbenik i savremene koncepcije obrazovanja, Sabor psihologa Srbije, Simpozijum ''Psihologija u vaspitanju i obrazovanju'', Subotica, 2001. 8. ĐorĎević J.: Enigma frontalnih reţnjeva - klinički neuropsihološki pristup, CIBIF, Beograd, 1997. 9. Japundza-Milisavljevic, M. Oblici ispoljavanja kognitivnih smetnji u obrazovnom procesu dece s lakom mentalnom retardacijom. Doktorska disertacija, Beograd: Univerzitet u Beogradu, Fakultet za specijalnu edukaciju i rehabilitaciju. 2007. 10. Rowe JB, Toni I, Josephs O, Frackowiak RS, Passingham RE. The prefrontal cortex: response selection or maintenance within working memory? Science 2000;288:1656-60. 11. Fletcher PC, Henson RN. Frontal lobes and human memory: insights from functiohnal neuroimiging. Brain. 2001;124:849-881. 12. Newman SD, Carpenter PA, Varma S, Just MA. Frontal and parietal participation in problem solving in the Tower of London: fMRI and computational modeling of planning and high-level perception. Neuropsychologia 2003;41:1668-82 135 13. Jaeggi SM, Seewer R, Nirkko AC, et al. Does excessive memory load attenuate activation in the prefrontal cortex? Load-dependent processing in single and dual tasks: functional magnetic resonance imaging study. Neuroimage 2003;19:210-25. 14. James, W: Principles of psychology, New York, Holt, 1980. 15. Judaš M., Kostović I.: Temelji neuroznanosti, Medicinska naklada Zagreb, Zagreb, 1998. 16. Krstić N., Gojković M.: Uvod u neuropsihološku dijagnostiku, Savez društva 17. Krstić N.: Osnove razvojne neuropsihologije, Institut za mentalno zdravlje, Beograd, 1999. 18. Tulving, E. (1972). Episodic and semantic memory. In E. Tulving, & W. Donaldson (Eds.), Organization of memory. New York: Academic Press. 19. Budson AE, Price BH. Memory: clinica disorders. In: Encyclopedia of life sciences. Vol.11. London: Nature publishing group. 2002:529-536. 20. Fletcher PC, Henson RN. Frontal lobes and human memory: insights from functiohnal neuroimiging. Brain. 2001;124:849-881. 21. Simons JS, Spiers HJ. Prefrontal and medial temporal lobe interactions in long-term memory. Nat Rev Neurosci. 2003;4:637-648. 22.Wagner AD, Schacter DL, Rotte M et al. Building memories: remembering and forgetting of verbal experiance will be remembered. Science.1998;281:1185-1187. 23. Petrides M. The mid-ventrolateral prefrontal cortex and active mnemonic retrieval. Neurobiol Learn Mem. 2002;78:528-538. 24. Kopelman MD, Stanhope N, Kingsley D. Temporal and spatial context memory in patients with focal frontal, temporal lobe, anddiencephalic lesions. Neuropsychologia.1997;35:1533-1545. 25. Balota DA, Watson JM, Duchek JM, Ferraro FR. Cross-modal semantic and homographic priming in healthy young, healthy old, and in Alzheimer’s disease individuals. J Int Neuropsychol Soc 1999;5:626-40. 136 26. Green JD, Hodges JR. Identification of famous faces and famous names in early Alzheimer’s disease: relationship to anterograde episodic and general semantic memory. Brain 1996;119:111-28. 27. Daselaar SM, Rombouts SA, Veltman DJ, Raaijmakers JG, Jonker C. Similar network activated by young and old adults during the acquisition of a motor sequence. Neurobiol Aging 2003;24:1013-9. 28. Exner C, Koschack J, Irle E. The differential role of premotor frontal cortex and basal ganglia in motor sequence learning: evidence from focal basal ganglia lesions. Learn Mem 2002;9:376-86. 29. Population Division of the Department of Economic and Social Affairs of the United Nations Secretariat, World Population Prospects: The 2010 Revision, http://esa. un. org/unpd/wpp/index. htm; 1:45-68. 30. Dvedzic M, Stoilkovic J. Novo poimanje starosti-prospektivna starost. Stanovništvo. 2012. 31.Brickman AM, Stern Y. Aging and Memory in Humans. Encyclopedia of Neuroscience. 2009;1:175-180. 32. Herlitz A, Nilsson LG, Backman L. Gender differences in episodic memory. Mem Cogn.1997;25:801-811. 33. Nilsson LG, Nyberg L, Backman L. Genetic variation in memory functioning. Neuroscience and Biobihevioral Reviews. 2002;26:841-848. 34.Backman L, Nilsson LG. Semantic memory functioning across the adult life span. Eur Psychol 1996;1:27-33. 35. Christensen H, Korten A, Jorm AF, Henderson AS, Scott R, Mackinnon AJ. Activity levels and cognitive functioning in an elderly community sample. Age Ageing. 1996;25:72-80. 36.Chun MM, Turk-Browne NB. Interactions between attention and memory.Ccurrent Opinion in Neurobiology. 2007;17:177-184. 137 37.Jiang Y, Chun MM. Selective attention modulates implicit learning. Q J Exp Psychol A. 2001;54A:1105-1124. 38.Radonjić S. Psihologija II. Centar za primenjenu psihologiju Društva psihologa Srbije. 1992. Beograd 39. LaBar KS, Cabeza R. Cognitive neuroscience of emotional memory. Nature reviews Neuroscience. 2006;7:54-64. 40. Bouchard TJ. Et al. Genetic and environmental influences on special mental abilities in a sample of twins reared apart. Acta Genet Med Gemellol (Roma).1990;39:193-206. 41. Papassotiropoulos A, quervain D. Genetics of human episodic memory: dealing with complexity. Trends in cognitive sciences. 2011;15:381-387. 42. Turnpenny P, Ellard S. Emery’s elements of medical genetics. 13th eds. Churchill Livingstone Elsavier; 2007. 43. Novaković I, Maksimović N, Cvetković S, Cvetković D. Gene polymorphisms as markers of disease susceptibility. J Med Biochem. 2010;29:135 –138. 44. Griffiths A, Miller J, Suzuki D, Lewontin R, Gelbart W. An introduction to genetic analysis. 7 th eds. New York: W. H. Freeman and company. 2000. 45. Kidd KK. Normal DNA sequence variations in humans. Introductory Review. Yale University New Haven, USA. 46. Mitchell-Ods T, Willis JH, Goldstein DB. Which evolutionary processes influence natural genetic variation for phenotypic traits? Nature Reviews. Genetics.2007; 8:845- 47. Papassotiropoulos A. et al. Genetics, transcriptomics, and proteomics of Alzheimer’s disease. J. Clin. Psychiatry. 2006;67:652-670. 48. Dudai Y. Molecular bases of long-term memories: a question of persistance. Curr Opin.Neurobiol. 2002;12:211-216. 49. Kendel ER. The molecular biology of memory storage: a dialogue between genes and synapses. Science.2001; 294:1030-1038. 138 50 Shobe J. the role of PKA, CaMKII, and PKC in avoidance conditioning: permissive or instructive? Neurobiol. Learn. Mem. 2002;77:291-312. 51. Tonegawa S. et al. Genetic neuroscience of mammalian learning and memory. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B: Biol. Sci. 2003;358:787-795. 52. Waddell S, Quinn WG. What can we teach Drosophila? What we can teach us? Trends genet. 2001;17:719-726 53. Dempster EL. Et al. Episodic memory performance predicted by the 2bp deletion in exon 6 of the alpha 7-like nicotinic receptor subunit gene. Am J Psychiatry 2006;163:1832-1834. 54. Papassotiropoulos A et al. Common KIBRA alleles are associated with human memory perfromance. Science. 2006;314:475-478. 55. Huentelman MJ, et al. Calmodulin-binding transcription activator 1 (CAMTA1) alleles predispose human episodic memory performance. Hum. Mol. Genet. 2007;16:1469-1477. 56. Need AC et al. A genome-wide study of common SNPs and CNVs in cognitive performance in the CANTAB. Hum. Mol. Gent. 2009;18:4650-4661. 57. Hairiri AR et al. Brain-derived neurotrophic factor val66met polymorphism affects human memory-related hippocampal activity and predicts memory performance. J. Neurosci. 2003;23:6690-6694. 58. Welsh MC, Pennington BF, Ozonoff S, Rouse B, McCabe Er. Neuropsychology of early- treated phenylketonuria: specific executive function deficits. Child Dev. 1990;61:1697-1713. 59. Bik-Multanowski M, Pietrzyk JJ, Mozrzymas R. Routine use of CANTAB system for detection of neuropsychological deficits in patients with PKU. Mol. Genet. Metab. 2011;102:210-213. 60. Topakas E, Kyriakopoulos S, Biely P, Hirsch J, Vafiadi C, Christakopoulos P. Carbohydrate esterases of family 2 are 6-O-deacetylases. FEBS Lett. 2010;584:543- 548. 139 61. Cornish Km, Kogan CS, Li L, Turk J, Jacquemont S, Hagerman RJ. Lifespan changes in working memory in fragile X premutation males. Brain Cogn. 2009;69:551- 558 62. Vered Y, Spivak B, Nechmad A, Schlapnikov N, Graff E, Feinberg I, et al. Plasma serotonin response to carbohydrate rich proof in chronic schizophrenic patients: clozapine versus classic antipsychotic agents. Hum Psychopharmacol. 2001;16:403- 407. 63. Aid T, Kazantseva A, Piirsoo M, Palm K, Timmusk T. Mouse and rat BDNF gene structure and expression revisited. J Neurosci Res. 2007;85(3):525-35. 64. Baj G, Tongiorgi E. BDNF splice variants from the second promoter cluster support cell survival of differentiated neuroblastoma upon cytotoxic stress. Journal of cell science. 2009;122:36-43. 65. Hong EJ, McCord AE, Greenberg ME. A biological function for the neuronal activity-dependent component of Bdnf transcription in the development of cortical inhibition. Neuron.2008;60(4):610-624. 66. Timmusk T, Palm K, Metsis M, Reintam T, Paalme V, Saarma M, Persson H. Multiple promoters direct tissue-specific expression of the rat BDNF gene. Neuron.1993;10(3):475-89. 67. An JJ, Gharami K, Liao GY, Woo NH, Lau AG, Vanevski F, Torre ER, Jones KR, Feng Y, Lu B, Xu B. Distinct role of long 3' UTR BDNF mRNA in spine morphology and synaptic plasticity in hippocampal neurons. Cell.2008;134(1):175-87. 68. Carlino D. BDNF as a biomarker in psychiatry. PhD thesis. University of Trieste. 2010. 69. Chen ZY, Patel PD, Sant G, Meng CX, Teng KK, Hempstead BL, Lee FS.Variant brain-derived neurotrophic factor (BDNF) (Met66) alters the intracellular trafficking and activity-dependent secretion of wild-type BDNF in neurosecretory cells and cortical neurons. J Neurosci.2004;24(18):4401-4411. 140 70. Szeszko PR, Lipsky R, Mentschel C, Robinson D, Gunduz-Bruce H, Sevy S, Ashtari M, Napolitano B, Bilder RM, Kane JM, Goldman D, Malhotra AK. Brain- derived neurotrophic factor val66met polymorphism and volume of the hippocampal formation. Mol Psychiatry. 2005;10(7):631-6. 71. Lu Y, Christian K, Lu B. BDNF: A Key Regulator for Protein-synthesis Dependent LTP and Long-term Memory? Neurobiol Learn Mem. 2008 ; 89(3): 312–323. 72. Pang PT, Lu B. Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF. Ageing Research Reviews. 2004;3: 407–430.2005 73. Woo NH, Teng HK, Siao CJ, Chiaruttini C, Pang PT, Milner TA, Hempstead BL, Lu B. Activation of p75NTR by proBDNF facilitates hippocampal long-term depression. Nat Neurosci. 2005;8(8):1069-1077. 74. Pezawas L, Verchinski BA, Mattay VS, Callicott JH, Kolachana BS, Straub RE, Egan MF, Meyer-Lindenberg A, Weinberger DR. The brain-derived neurotrophic factor val66met polymorphism and variation in human cortical morphology. J Neurosci. 2004;24(45):10099-102. 75. Watanabe Y, Nunokawa A, Someya T. Association of the BDNF C270Tpolymorphism with schizophrenia: updated meta-analysis.Psychiatry Clin Neurosci. 2013;67(2):123-5. 76. Huang R, Huang J, Cathcart H, Smith S, Poduslo SE. Genetic variants in brain- derived neurotrophic factor associated with Alzheimer's disease. J Med Genet. 2007;44(2):e66. 77. Schumacher J, Jamra RA, Becker T, Ohlraun S, Klopp N, Binder EB, Schulze TG, Deschner M, Schmäl C, Höfels S, Zobel A, Illig T, Propping P, Holsboer F, Rietschel M, Nöthen MM, Cichon S. Evidence for a relationship between genetic variants at the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) locus and major depression. Biol Psychiatry. 2005;58(4):307-14. 141 78. Nakajo Y, Miyamoto S, Nakano Y, Xue JH, Hori T, Yanamoto H. Genetic increase in brain-derived neurotrophic factor levels enhances learning and memory. Brain Res. 2008;1241:103-9. 79. R. Katoh-Semba, I.K. Takeuchi, R. Semba, K. Kato, Distribution of brainderived neurotrophic factor in rats and its changes with development in the brain, J. Neurochem. 1997; 69:34–42. 80. Bath K, Lee F. Variant BDNF (Val66Met) impact on brain structure and function. Cognitive, Affective and Behavioral Neuroscience. 2006;6(1):79-85. 81. Lee R, Kermani P, Teng KK, Hempstead BL. Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins. Science 2001;294:1945-1948. 82.Mowla SJ, Pareek S, Farhadi HF, Petrecca K, Fawcett JP, Seidah NG, Morris SJ, Sossin WS, Murphy RA. Differential sorting of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in hippocampal neurons. J. Neurosci. 1999;19:2069–2080. 83. Binder DK, Croll SD, Gall CM, Scharfman HE. BDNF and epilepsy: too much of a good thing? Trends Neurosci. 2001;24(1):47-53. 84. Levine ES, Crozier RA, Black IB, Plummer MR. Brain-derived neurotrophic factor modulates hippocampal synaptic transmission by increasing N-methyl-d-aspartic acid receptor activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998;95:10235–10239. 85. Holsinger RM, Schnarr J, Henry P, Castelo VT, Fahnestock M. Quantitation of BDNF mRNA in human parietal cortex by competitive reverse transcription- polymerase chain reaction: decreased levels in Alzheimer's disease. Brain Res Mol Brain Res. 2000;76(2):347-54. 86. Howells DW, Porritt MJ, Wong JY, Batchelor PE, Kalnins R, Hughes AJ, Donnan GA. Reduced BDNF mRNA expression in the Parkinson's disease substantia nigra. Exp Neurol. 2000;166(1):127-135. 87. Hartmann M, Heumann R, Lessmann V. Synaptic secretion of BDNF after high- frequency stimulation of glutamatergic synapses. EMBO J. 2001;20:5887–5897. 142 88. Drake CT, Milner TA, Patterson SL. Ultrastructural localization of full-length trkB immunoreactivity in rat hippocampus suggests multiple roles in modulating activity- dependent synaptic plasticity. J Neurosci 1999;19:8009–8026. 89. Lou H, Kim SK, Zaitsev E, Snell CR, Lu B, Loh YP. Sorting and activity-dependent secretion of BDNF require interaction of a specific motif with the sorting receptor carboxypeptidase e. Neuron.2005; 20;45(2):245-55. 90. Chen ZY, Ieraci A, Teng H, Dall H, Meng CX, Herrera DG, Nykjaer A, Hempstead BL, Lee FS. Sortilin controls intracellular sorting of brain-derived neurotrophic factor to the regulated secretory pathway. J Neurosci.2005;25(26):6156-166. 91. Malenka RC, Bear MF. LTP and LTD: an embarrassment of riches. Neuron 2004;44:5–21. 92. Abraham WC. How long will long-term potentiation last? Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2003;358:735–744. 93. Kelleher RJ 3rd, Govindarajan A, Tonegawa S. Translational regulatory mechanisms in persistent forms of synaptic plasticity. Neuron 2004;44:59–73. 94. Gartner A, Staiger V. Neurotrophin secretion from hippocampal neurons evoked by long-term-potentiation-inducing electrical stimulation patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:6386–6391. 95. Schratt GM, Nigh EA, Chen WG, Hu L, Greenberg ME. BDNF regulates the translation of a select group of mRNAs by a mammalian target of rapamycin- phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway during neuronal development. J Neurosci. 2004;24(33):7366-7377. 96. Tongiorgi E, Righi M, Cattaneo A. Activity-dependent dendritic targeting of BDNF and TrkB mRNAs in hippocampal neurons. J Neurosci 1997;17:9492–9505. 97. Tong L, Balazs R, Thornton PL, Cotman CW. Beta-amyloid peptide at sublethal concentrations downregulates brain-derived neurotrophic factor functions in cultured cortical neurons. J Neurosci. 2004 Jul 28;24(30):6799-809. 143 98. Nagappan G, Zaitsev E, Senatorov VV Jr, Yang J, Hempstead BL, Lu B. Control of extracellular cleavage of ProBDNF by high frequency neuronal activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(4):1267-72. 99. Kremerskothen J, Plaas C, Büther K, Finger I, Veltel S, Matanis T, Liedtke T, Barnekow A. Characterization of KIBRA, a novel WW domain-containing protein. Biochem Biophys Res Commun. 2003; 300(4):862-867. 100. Rodríguez-Rodríguez E, Infante J, Llorca J, Mateo I, Sánchez-Quintana C, García- Gorostiaga I, Sánchez-Juan P, Berciano J, Combarros O. Age-dependent association of KIBRAgenetic variation and Alzheimer's disease risk. Neurobiol Aging. 2009;30(2):322-324. 101. Johannsen S, Duning K, Pavenstädt H, Kremerskothen J, Boeckers TM. Temporal- spatial expression and novel biochemical properties of the memory-related protein KIBRA. Neuroscience. 2008; 155(4):1165-1173. 102. Toker A. Signalnig through protein kinases C. Front Biosci. 1998;3:1134-1147. 103. Moscat J, Diaz-Meco MT. The atypical protein cinase Cs. EMBO Rep. 2000;1:399-403. 104. Hirai T, Chida K. Protein kinase C zeta: activation mechanisms and cellular functions. J Biochem. 2003;1-7. 105. Büther K, Plaas C, Barnekow A, Kremerskothen J. KIBRA is a novel substrate for protein kinase Czeta. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 317(3):703-707. 106. Sacktor TC, Osten P, Valsamis H, Jiang X, Naik M, Sublette E. Persistent activation of the zeta isoform of protein kinase C in the maintetnance of long term potentiation. Proc Natl Acad Sci. USA 1993;90:8342-8346. 107. Drier DA, Tello MK, Cowan M, Wu P, Blace N, Sacktor TC, Yin JCP. Memory enhancemenet and formation by atypical PKM activity in Drosophila melanogaster. Nat Neurosci. 2002;5:316-324. 144 108. Kremerskothen, J., Plaas, C., Kindler, S., Frotscher, M., and Barnekow, A. Postsynaptic recruitment of dendrin depends on both dendritic mRNA transport and synaptic anchoring. J. Neurochem. 2006;96: 1659–1666. 109. Duning, K., Schurek, E. M., Schluter, M., Bayer, M., Reinhardt, H. C., Schwab, A., Schaefer, L., Benzing, T., Schermer, B., Saleem, M. A., Huber, T. B., Bachmann, S., Kremerskothen, J., Weide, T., and Pavenstadt, H. KIBRA modulates directional migration of podocytes. J. Am. Soc. Nephrol. 2008;19:1891–1903. 110. Asanuma, K., Kim, K., Oh, J., Giardino, L., Chabanis, S., Faul, C., Reiser, J., and Mundel, P. Synaptopodin regulates the actin-bundling activity of alpha-actinin in an isoform-specific manner. J. Clin. Invest. 2005;115:1188–1198. 111. Deller, T., Korte, M., Chabanis, S., Drakew, A., Schwegler, H., Stefani, G. G., Zuniga, A., Schwarz, K., Bonhoeffer, T., Zeller, R., Frotscher, M., and Mundel, P. Synaptopodin-deficient mice lack a spine apparatus and show deficits in synaptic plasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003;100:10494–10499. 112. Boeckers TM. The postsynaptic density. Cell Tssue Res. 2006; 326:409-422. 113. Lauriat, T. L., Dracheva, S., Kremerskothen, J., Duning, K., Haroutunian, V., Buxbaum, J. D., Hyde, T. M., Kleinman, J. E., and McInnes, L. A. Characterization of KIAA0513, a novel signaling molecule that interacts with modulators of neuroplasticity, apoptosis, and the cytoskeleton. Brain Res. 2006;1121:1–11. 114. Schneider A, Huentelman MJ, Kremerskothen J, Duning K, Spoelgen R, Nikolich K. KIBRA: A New Gateway to Learning and Memory? Front Aging Neurosci. 2010;2:4. 115. Makuch L, Volk L, Anggono V, Johnson RC, Yu Y, Duning K, Kremerskothen J, Xia J, Takamiya K, Huganir RL. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 2011; 71(6):1022-9. 116. Shin, K., Straight, S., and Margolis, B. PATJ regulates tight junction formation and polarity in mammalian epithelial cells. J. Cell Biol. 2005;168:705–711. 145 117. Shin, K., Wang, Q., and Margolis, B. PATJ regulates directional migration of mammalian epithelial cells. EMBO Rep. 2007;8:158–164. 118. Traer, C. J., Rutherford, A. C., Palmer, K. J., Wassmer, T., Oakley, J., Attar, N., Carlton, J. G., Kremerskothen, J., Stephens, D. J., and Cullen, P. J. SNX4 coordinates endosomal sorting of TfnR with dynein-mediated transport into the endocytic recycling compartment. Nat. Cell Biol. 2007;9:1370–1380. 119. Rayala, S. K., den Hollander, P., Manavathi, B., Talukder, A. H., Song, C., Peng, S., Barnekow, A., Kremerskothen, J., and Kumar, R. Essential role of KIBRA in co- activator function of dynein light chain 1 in mammalian cells. J. Biol. Chem. 2006;281:19092–19099. 120. Hilton, H. N., Stanford, P. M., Harris, J., Oakes, S. R., Kaplan, W., Daly, R. J., and Ormandy, C. J. KIBRA interacts with discoidin domain receptor 1 to modulate collagen-induced signalling. Biochim.Biophys. Acta 2008;1783:383–393. 121. Corneveaux JJ, Liang WS, Reiman EM, et al. Evidence for an association between KIBRA and late-onset Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 2010; 31(6):901-909. 122. Das HK, McPherson J, Bruns GAP, Karathanasis SK, Breslow JL.Isolation, characterization, and mapping to chromosome 19 of the human apolipoprotein E gene. J Biol Chem. 1985;260:6240-6247. 123. Olaisen B, teisberg P, Gedde-Dahl T Jr. The locus for apolipoprotein E (apoE) is linked to the complement component C3 (C3) locus in chromosome 19 in man. Hum Genet. 1982;62:233-236. 124. Paik YK, Chang DJ, Reardon CA, Davies GE, Mahley RW, Taylor JM. Nucleotide sequence and structure of the human apolipoprotein E gene. Proc NAtl Acad Sci USA. 1985;82:3445-3449. 125. Blue ML, Williams DL, Zuecker S, Khan SA, Blum CB. Apolipoprotein E synthesis in human kidney, adrenal gland and liver. Proc Natk. Acad. Sci USA. 1983;80:283-287. 146 132. Knijff P, van den Maagdenberg A, Frants R, Havekes L. Genetic heterogeneity of APolipoprotein E and its influence on plasma lipid and lipoprotein levels. Human mutation. 1994;4:178-194. 133. Weisgraber KH, Rall SC, Mahley RW.Human E apoprotein heterogeneity. Cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apoE-isoforms. J Biol Chem 256;9077-9083. 134. Rall SC, Weisgraber KH, Mahley RW. Human apolipoprotein E.The complete amino acid sequence. J Biol CHem. 1982;257:4171-4178. 137. Pfrieger FW. Cholesterlo homeostasis and function in neurons of the central nervous system. Cell Mol Life Sci. 2003;60:1158-1171. 138. Goritz C, Mauch DH, NAgler K, Pfrieger FW. Role of glia-derived cholesterol in synaptogenesis: new revelations in the synapse-glia affair. J. Physiol. Paris.2002;96:257-263. 139. Koudinov AR, Berezov TT. Cholesterol, statins, and Alzheimer’s disease. PLoS Med. 2005;2:E81. 140. Mauch DH, Nagler K, Schumacher S et al. CNS synaptogenesis promoted by glia- derived neurons may outsource the cholesterol delivery function for synaptogenesis to the astrocytes. Science. 2001;294:1354-1357. 141. Klopfenstein DR, Tomishige M, Stuurman N, Vale RD. Role of phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate organization in membrane transport by the Unc104 kinesin motor. Cell.2002; 109:347-358. 142. Chaves EP, Narayanaswami V. Apolipoprotein E and cholesterol in aging and disease in the brain. Future Lipidol. 2008;3(5):505-530. 143. Posse De Chaves EI, Vance DE, Campenot RB, Kiss RS, Vance JE. Uptake of lipoproteins for axonal growth of sympathetic neurons. J Biol Chem. 2000;275:19883– 19890. 147 144. 19. Pitas RE, Boyles JK, Lee SH, Hui D, Weisgraber KH. Lipoproteins and their receptors in the central nervous system. Characterization of the lipoproteins in cerebrospinal fluid and identification of apolipoprotein B, E(LDL) receptors in the brain. J Biol Chem. 1987;262:14352–14360. 145. Bu G. Apolipoprotein E and its receptors in Alzheimer’s disease: patways, pathogenesis and therapy. Nature Reviews. 2009;10:333-344. 146. Rebeck GW, Reiter JS, Strickland DK, Hyman BT. Apolipoprotein E in sporadic Alzheimer’s disease: allelic variation and recepror interactions. Neuron. 1993;11:575- 580. 147. Rapp A, Gmeiner B, Huttinger M. Implication of apoE isoforms in cholesterol metabolism by primary rat hippocampal neurons and astrocytes.Biochimie. 2006;88:473-483. 148. Liu Q, et al. Amyloid precursor protein regulates brain apolipoprotein E and cholesterol methabolism through lipoprotein receptor LRP1. Neuron. 2007;56:66-78. 149. Fryer JD, etal. The low density lipoprotein receptor regulates the level of central nervous system human and murine apolipoprotein E but does not modify amyloid plaque pathology in PDAPP mica. J. Biol. Chem. 2005;280:25754-25759. 150. Strittmatter WJ, Hill CB. Molecular biology of apolipoprotein E. Current opinion in lipidology. 2002;13:119-123. 151. Grootendorst J, Bour A, Vogel E, Kelche C, Sullivan PM, Dodart JC. Human apoE targeted replacement mouse lines: h-apoE4 and h-apoE3 mice differ on spatial memory performance and avoidance behavior. Behavioural and brain research. 2005;159(1):1-14. 152. Qiu S, Korwek KM, Weeber EJ. A fresh look at an ancient receptor family: Emerging roles for low density lipoprotein receptors in synaptic plasticity and memory formation. Neurobiology of learning and memory.2006; 85:16-29. 153. Hoe HS, Harris DC, Rebeck GW. Multiple patways of apolipoprotein E signaling in primary neurons. J. Neurochem. 2005;93:145-155. 148 154. Misra UK, Adlakha CL, Gawdi G, McMillian MK, Pizzo SV, Laskowitz DT. Apolipoprotein E and mimetic peptide initiate a calcium dependent signaling response in macrophages. Journal of Leukocyte biology. 2001;70:677-683. 155. Muller W, Meske V, Baerlin K, Schrangl H, Marz W, Ohm TG. Apolipoprotein E isoforms increase intracellular Ca 2+ differentialy through a omega-agatoxin IVa- sensitive Ca 2+ channel. Brain pathology. 1998;8:641-653. 156. Lee Y, Aono M, LaskowitzD, Warner DS, Pearlstein RD. Apolipoprotein E protects against oxidative stress in mixed neuronal-glial cell cultures by reducing glutamate toxicity. Neurochemistry International. 2004;44:107-118. 157. Gutman CR, Strittmater WJ, Weisgraber KH, Matthew WD. Apolipoprotein E binds to and potentiates the biological activity of ciliary neurotrophic factor. Journal of Neuroscience. 1997;17:6114-6121. 158. Curtiss LK, Boisvert WA. Apolipoprotein E and atherosclerosis.Current opinions in lipidology. 200;11:243-251. 159. Gee JR, Keller GN. Astrocytes: regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. Int J Biochem Cell Biol. 2005;37:1145-1150. 160. Masterman T, Hillert J. The telltale scan: APOE4 in multiple sclerosis. Lancet Neurol. 2004;3:331. 161. Kounnas MZ et al. LDL receptor-related protein, a multifunctional APOE recetor, binds secreted β-amyloid precursor protein and mediates its degradation. Cell. 1995;331-340. 162. Ye S, et al. Apolipoprotein (apo) E4 enhances amyloid β peptide production in cultured neuronal cells: apoE structure as potential therapeutic target. 2005; Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102:18700-18705. 163. LaDu MJ.et al. Isoform-specific binding of apolipoprotein E to β-amyloid. J Biol Chem.1994;269:23403-23406. 164. Schmechel DE et al. Increased amyloid β-peptide deposition in cerebral cortex as a consequence of apolipoprotein E genotype in late-onset Alzheimer disease.Proc Natl Acad Sci. USA. 1993;90:9649-9653. 149 165. Bogdanovic N, Corder E, Lannfelt L, Winblad B. APOE polymorphism and clinical duration determine regional neuropathology in Swedish APP (670, 671) mutation carriers: implications for late-onset Alzheimer’s disease. J Cell Mol Med. 2002;6:199-214. 166. Deane R et al. ApoE isoform-specific disruption of amyloid β clearance from mouse brain.J Clin. Invest. 2008; 118:4002-4013. 167. Billings LM, Oddo S, Green KN, McGaugh JL Early Alzheimer’s disease-related cognitive deficits in transgenic mice. Neuron. 2005;45:675-688. 168. Ledesma MD et al. Raft disorganization leads to reduced plasmin activity in Alzheimer’s disease brains. EMBO Rep. 2003;4:1190-1196. 169. Hamanaka H et al. Altered cholesterol metabolism in human apolipoprotein E4 knock-in mice. Hum Mol Genet. 2000;9:353-361. 170. Holtzman DM et al. Low density lipoprotein receptor related protein mediates apolipoprotein E-dependent neurite outgrowth in central nervous system derived neuronal cell line. Proc Natl Acad Sci USA.1995;92:9480-9484. 171. Hayashi H, Campenot RB, Vance DE, Vance JE. Apolipoprotein E containing lipoproteins protect neurons from apoptosis via a signaling pathway involving low- density lipoprotein receptor-related protein 1. J. Neurosci. 2007;27:1933-1941. 172. Allderdice PW et al. The cloned butyrylcholinesterase (BCHE) gene maps to a single chromosome site, 3q26. Genomics.1991;11:452-454. 173. Arpagaus M. et al Structure of the gene for human butyrylcholinesterase.Evidence for a single copy. Biochemistry.1990;9:124-131. 174. Millard CB, Bromfield CA. A computer model of glycosylated human butyrylcholinesterase.Biochem.Biophys. Res. Commun.1992;189:1280-1286. 175. Darvesh S, Hopkins D, Geula C. Neurobiology of butyrylcholinesterase. Nature Reviews. Neuroscience. 2003;4:131-138. 176. Bartels CF, Jensen FS, Lockridge O, van der Spek AF, Rubinstein HM, Lubrano T, La Du N. Am J Hum Genet. 1992;50:1086-1103. 150 177. O’Brien KK, Sawby BK, Ballard CG, Grace J, Harrington F, Ford GA, O’Brien JT, Swan AG, Fairbairn AF, Wesnes K, et al. Pharmacogenetics. 2003;13:231-239. 178. Lopez OL, Becker JT, Wisniewski S et al. J. Neurol. Neurosurg. Psychitry. 2002;72:310-314. 179. Manoharan I, Kuznetsova A, Fisk JD, et al. Comparison of cognitive functions between people with silent and wild-type butyrylcholinesterase. J Neural Transm. 2007;114:939-945. 180. Lehmann H, Ryan E. The familial incidence of low pseudocholinesterase level. Lancet.1956;2:124. 181. Robertson RT, Mostamand F. Development of non-specific cholinesterase- containing neurons in dorsal thalamus of the rat. Brain Res Dev Brain Res.1988;41:43- 60. 182. Giacobini E. Cholinesterases and cholinesterase inhibitors. ed Giacobini E. Martin Dunitz Ltd London.2000:181-226. 183. Mesulam MM. et al. Acetycholinesterase knockouts establish central cholinergic pathways and can use butyrylcholinesterase to hydrolyze acetylcholine. Neuroscience. 2002;110:627-639. 184. Katona G, Berglund GI, Hajdu J, Graf L, Szilagyi L. Crystal structure reveals basis for the inhibitor resistance of huam brain trypsin. J Mol Biol. 2002;315:1209- 1218. 185. Geula C, Mesulam MM. Special properties of cholinesterases in cerebral cortex of Alzheimer’s disease. Brain Res. 1989;185-189. 186. Arendt T, Bruckner MK, Lange M, Bigl V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development- a study of molecular forms. Neurochem. Int. 1992;21:381-396. 187. Wright CI, Geula C, Mesulam MM. Neuroglial cholinesterases in the normal brain and in Alzheimer’s disease: relationship to plaques, tangles, and patterns of selective vulnerability. Ann. Neurol. 1993;34:373-384. 151 188. Mesulam MM, Geula C. Butyrylcholinesterase reactivity differentiates the amyloid plaques of aging from those of dementia. Ann Neurol. 1994;36:722-727. 189. Lehmann DJ, Johnston C, Smith AD. Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late-onset confirmed Alzheimer’s disease. Hum. Mol. Genet. 1997;6:1933-1936. 190. Alvarez-Arcaya A. et al. The butyrylcholinesterase K variant is a protective factor for sporadic Alzheimer’s disease in women. Acta Neurol Scand. 2000;102:350-353. 191. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):1215. 192. www.lifetechnologies.com 193. Rey, A. L'examen clinique en psychologic. Paris: Presses Universitaires de France. 1964. 194. Wechsler, D. Wechsler Memory Scale - Revised Edition. Manual. New York: The Psychological Corporation. 1987. 195. Cooper, J. A., Sagar, H. J., Jordan, N., Harvey, N. S., & Sullivan, E. V. Cognitive impairment in early, untreated Parkinson’s disease and its relationship to motor disability. Brain. 1991;114:2095-2122. 196. Raven, J., Raven, J.C., & Court, J.H. Manual for Raven's Progressive Matrices and Vocabulary Scales. San Antonio, TX: Harcourt Assessment. 2004. 197. Lynna R, Irwing P, Sex differences on the progressive matrices: A meta-analysis. Intelligence. 2004;32:481–498. 198. Buha N, Gligorovic M. Povezanost radne memorije i intelektualnog funkcionisanja kod dece sa lakom intelektualnom ometenošcu. Specijalna edukacija i rehabilitacija. 20012;11(1):21-38. 199.Herlitz A, Nilsson LG, Backman L. Gender differences in episodic memory. Mem Cogn. 1997;25:801-811. 152 200. Poo M. Neurotrophins as sinaptic modulators. Nat Rev Neurosci. 2001; 2:24-32. 201. Egan MF, Kojima M, Callicott JH, et al. The BDNF val66met polymorphism affects activity-dependent secretion of BDNF and human memory and hippocampal function. Cell. 2003; 112:257-269. 202. The allele frequency database. A resource of gene frequency data on human populations supported by the U. S. National Science Foundation. U. S. National Science Foundation. 203. Shimizu E, Hashimoto K, Iyo M. Ethnic difference of the BDNF 196G/A [val66met] polymorphism frequencies: The possibility to explain ethnic mental traits. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2004;126B:122–123. 204. Dempster, E., Toulopoulou, T., McDonald, C., Bramon, E., Walshe, M., Filbey, F., Wickham, H., Sham, P.C., Murray, R.M. and Collier, D.A. Association between BDNF val66met genotype and episodic memory. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2005;134B, 73–75. 205. Goldberg TE, Iudicello J, Russo C, Elvevåg B, Straub R, Egan MF, Weinberger DR. BDNF Val66Met polymorphism significantly affects d′ in verbal recognition memory at short and long delays. Biological Psychology. 2008;77:20–24. 206. Echeverria, D., Woods, J.S., Heyer, N.J., Rohlman, D.S., Farin, F.M., Bittner, A.C.J., Li, T. and Garabedian, C. Chronic lowlevel mercury exposure, BDNF polymorphism, and associations with cognitive and motor function. Neurotoxicol Teratol. 2005;27, 781–796. 207. Miyajima F, Ollier W, Mayes A, Jackson A, Thacker N, Rabbitt P, Pendleton N, Horan M, Payton A. Brain-derived neurotrophic factor polymorphism Val66Met influences cognitive abilities in the elderly. Genes Brain Behav. 2008;7:411–417. 208. Miyajima F, Quinn JP, Horan M, Pickles A, Ollier WE, Pendleton N, Payton A. Additive effect of BDNF and REST polymorphisms is associated with improved general cognitive ability. Genes Brain Behav. 2008;7:714–719. 153 209. Tsai S-J, Hong C-J, Yu YWY, Chen T-J. Association study of a Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Val66Met polymorphism and personality trait and intelligence in healthy young females. Neuropsychobiology. 2004;49:13–16. 210. Harris SE, Fox H, Wright AF, Hayward C, Starr JM, Whalley LJ, Deary IJ. The brain-derived neurotrophic factor Val66Met polymorphism is associated with age- related change in reasoning skills. Mol Psychiatry. 2006;11:505–513. 211. Hansell NK, James MR, Duffy DL, Birley AJ, Luciano M, Geffen GM, Wright MJ, Montgomery GW, Martin NG. Effect of the BDNF V166M polymorphism on working memory in healthy adolescents. Genes Brain Behav. 2007;6:260–268. 212. Nemoto, K., Ohnishi, T., Mori, T., Moriguchi, Y., Hashimoto, R., Asada, T., et al.. The Val66Met polymorphism of the brain-derived neurotrophic factor gene affects age- related brain morphology. Neuroscience Letters. 2006;397, 25–29. 213. Bueller JA, Aftab M, Sen S, Gomez-Hassan D, Burmeister M, Zubieta JK. BDNF Val(66)Met Allele Is Associated with Reduced Hippocampal Volume in Healthy Subjects. Biol Psychiatry 2006;59:812–815. 214. Dennis NA, Cabeza R, Need AC, Waters-Metenier S, Goldstein DB, LaBar KS. Brain-derived neurotrophic factor val66met polymorphism and hippocampal activation during episodic encoding and retrieval tasks. Hippocampus. 2011;21(9):980-9. 215. Schneider A, Huentelman MJ, Kremerskothen J, et al. KIBRA: a new getaway to learning and memory? Frontiers in aging neuroscience. 2010; 2:41-49. 216. Johannsen S, Duning K, Pavenstadt H, et al. Temporal-spatial expression and novel biochemical properties of the memory-related protein KIBRA. Neuroscience. 2008; 155:1165-1173. 217. Buther K, Plaas C, Barnekow A, and Kremerskothen J. KIBRA is a novel substrate for protein kinase Cδ. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2004; 317:703-707. 218. Schaper K, Kolsch H, Popp J et al. KIBRA gene variants are associated with episodic memory in healthy elderly. Neurobiol Aging. 2008;29:1123-1125. 154 219. Almeida OP, Schwab SG, Lautenschlager NT, Morar B, Greenop KR, Flicker L, Wildenauer D KIBRA genetic polymorphism influences episodic memory in later life, but does not increase the risk of mild cognitive impairment. J Cell Mol Med. 2008. 220. Preuschof C, Heekeren HR, Li SC et al. KIBRA and CLSTN2 polymorphisms exert interactive effects on human episodic memory. Neuropsyschologia. 2010;48:402- 408. 221. Vassos E, Bramon E, Picchioni M et al. Evidence of association of KIBRA genotype with episodic memory in families with psychotic patients and controls. J Psychiatr Res. 2010;44:795-798. 222. Nacmias B, Bessi V, Bagnoli S, Tedde A, Cellini E, Piccini C, Sorbi S, Bracco L KIBRA gene variants are associated with episodic memory performance in subjective memory complaints. Neurosci Lett. 2008; 436:145–147. 223. Need AC, Attix DK, McEvoy JM, Cirulli ET, Linney KN, Wagoner AP, Gumbs CE, Giegling I, Möller HJ, Francks C, Muglia P, Roses A, Gibson G, Weale ME, Rujescu D, Goldstein DB. Failure to replicate effect of kibra on human memory in two large cohorts of European origin. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2009;147: 667–668. 224. Bates TC, Price JF, Hariss SE et al. Association of KIBRA and memory. Neurosci Lett. 2009;458:140-143. 225. Milnik A, Heck A, Vogler C, Heinze HJ, de Quervain DJ, Papassotiropoulos A. Association of KIBRA with episodic and working memory: a meta-analysis. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2012;159B(8):958-69. 226. Burgess Jd, Pedraza O, Graff-Radford NR et al. Association of common KIBRA variants with episodic memory and AD risk. Neurobiol Aging. 227. Boyles JK, Pitas RE, Wilson E et al. Apolipoprotein E associated with astrocytic glia of the central nervous system and with non-myelinating glia of the peripheral nervous system. J Clin Invest. 1985; 76:1501-1513. 155 228. Stanković S, Glišić S, Alavantić D. The effect of a gender difference in apolipoprotein E gene DNA polymorphism on serum lipid levels in Serbian haealthy population. Clin Chem Lab Med. 2000;38:539-544. 229. Saunders AM, Strittmatter WJ, Schmechel D, et al. Association of apolipoprotein E allele ε4 wth late-onset familial and sporadic Alzheimer’s disease. Neurology. 1993; 43:1467-1472. 230. Tuminello ER, Han SD. The apolipoprotein E antagonistic pleiotropy hypothesis: review and recommendations. International Journal of Alzheimer’s disease. 2011. 231. Damnjanović T. Ispitivanje polimorfizama gena i drugih faktora rizika za razvoj ateroskleroze u populaciji školske dece. Doktorska disertacija. 2009. 232. Mondadori CRA, de Quervain DJ-F, Buchmann A, Mustovic H, Wollmer MA, Schmidt CF, et al. Better memory and neural efficiency in young apolipoprotein E epsilon4 carriers. Cereb Cortex 2007;17: 1934–47. 233. Hubacek JA, Pitha J, Skodova Z, Adamkova V, Lanska V, Poledne R. A possible role of apolipoprotein E polymorphism in predisposition to higher education. Neuropsychobiology 2001;43:200 –3. 234. Yu YW, Lin CH, Chen SP, Hong CJ, Tsai SJ. Intelligence and event-related potentials for young female human volunteer apolipoprotein E epsilon4 and non- epsilon4 carriers. Neurosci Lett 2000; 294:179–81. 235. Han SD, Drake AI, Cessante LM, Jak AJ, Houston WS, Delis DC, et al. APOE and recovery from TBI in a U.S. military population: evidence for a compensatory mechanism? J Neurol Neurosurg Psychiatry 2007;78: 1103–8. 236. Han S, Bodi M. Revision of the apolipoprotein E compensatory mechanism recruitment hypothesis. 2008;4(4):251-254. 237. Jorm AF, Mather KA, Butterworth P, Anstey KJ, Christensen H, Easteal S. APOE genotype and cognitive functioning in a large age-stratified population sample. Neuropsychology 2007;21:1–8. 156 238. Liu F, Pardo L, Schuur M. et al. The apolipoprotein E and its age-specific effects on cognitive function. Neurobiology of aging. 2010;31:1831-1833. 239. Bunce D, Anstey K, Burns R et al. Does possession of apolipoprotein E e4 benefit cognitive function in healthy young adults? Neuropsychologia. 2011;49:1693-1697. 240. Ihle A, Bunce D, Kliegel M. APOE e4 and cognitive function in early life: a meta- analysis. 2012;26(3):267-277. 241. Teylor AE, Guthrie PA, Smith GD et al. IQ, educational attainement, memory and plasma lipids: Associations eith apoliporpteinE genotype in 5995 children. Biol Psychiatry. 2011;70(2):152-158. 242. O Dwyer L, Lamberton F, Matura S et al. Reduced hippocampal volume in ealthy young apoe4 carriers: an MRI study. Plos/one 2012;7(11):e48895. 243. Pedraza O, Bowers D, Gilmore R Asymmetry of the hippocampus and amygdala in MRI volumetric measurements of normal adults. J Int Neuropsychol Soc. 2004;10:664–678. 244. Soininen H, Partanen K, Pitka¨nen A, Hallikainen M, Ha¨nninen T, et al. Decreased hippocampal volume asymmetry on MRIs in nondemented elderly subjects carrying the apolipoprotein E epsilon 4 allele. Neurology. 1995;45:391–392. 245. Tohgi H, Takahashi S, Kato E, Homma A, Niina R, et al. Reduced size of right hippocampus in 39- to 80-year-old normal subjects carrying the apolipoprotein E epsilon4 allele. Neurosci Lett. 1997;236:21–24. 246. Dennis N, Browndyke J, Stokes J et al. Temporal lobe functional activity and connectivity in young adult APOE e4 carriers. Alzheimers dement 2010;6(4):303-311. 247. Reiman EM, Chen K, Alexander GE, Caselli RJ, Bandy D, et al. Functional brain abnormalities in young adults at genetic risk for late-onset Alzheimer’s dementia. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:284-289. 248. Mesulam, M.-M. Neuroanatomy of cholinesterases in the normal human brain and in Alzheimer’s disease. In: Cholinesterases and Cholinesterase Inhibitors (E. Giacobini, Ed.), 2000;121–138. Martin Dunitz, London. 157 249. Bartels CF, Jensen FS, Lockridge O, et al. DNA mutation associated with the human butyrylcholinesterase K-variant and its linkage to the atypical variant mutation and other polymorphic sites. Am J Hum Genet. 1992; 50:1086-1103. 250. Perry EK, Perry RH, Blessed G, et al. Changes in brain cholinesterases in senile dementia of Alzheimer type. Neuropathol Appl Neurobiol. 1978; 4:273-277. 251. Podoly E, Shalev D, Shenhar-Tsarfaty S, et al. The butyrylcholinesterase K variant confers structurally-derived risks for Alzheimer’s pathology. Journal of biological chemistry. 2009; 284(25):17170-17179. 252. Ghebremedin E, Thal DR, Schultz C, et al. Homozygosity for the K variant of BCHE gene increases the risk for development of neurofibrillary pathology but not amiloid deposits at young ages. Acta Neuropathologica. 2007; 114(4):359-363. 253. Greig NH, Utsuki T, Ingram DK. Selective butyrylcholinesterase inhibition elevates brain acetylcholine, augments learning and lowers Alzheimer β -amyloid peptide in rodent. PNAS. 2005;102(47):17213-17218. 254. Manoharan, I., Wieseler, S., Layer, P.G., Lockridge, O. and Boopathy, R. Naturally occurring mutation Leu307Pro of human butyrylcholinesterase in the Vysya community of India. Pharmacogenetics and Genomics. 2006;16:461-468. 158 SPISAK SKRAĆENICA  AB – Alchajmerova bolest  Aβ – amyloid beta  ACh – acetilholin  AChE – acetilholin esteraza  APOE – apolipoprotein E  APP – amiloidni prekursorni protein  BChE – butirilholin esteraza  BDNF (brain derived neurotrphic factor) – moţdani faktor rasta  CAVLT (Californian auditory verbal learning test) – Kalifornijski test auditorno verbalnog učenja  COMT – katehol O-metil transferaza  GWAS – (genome wide association study) - studija asocijacije celokupnog genoma  KIBRA – kidney brain protein  LDLR – receptor za lipoprotein male gustine  LDP – dugotrajna depresija  LTP – dugotrajna potencijacija  MTL – medijalni temporalni lobus  PAA – poliakrilamid  PCR-RFLPs metoda – reakcija lančane polimerizacije – polimorfizam duţine restrikcionih fragmenata  PKC – protein kinaza C  PKMδ – protein kinaza Mδ  RAVENPM – Ravenove progresivne matrice  RAVLT – Rey-ov auditivno verbalni test učenja 159  SNP – polimorfizam pojedinačnih nukleotida  TRC – test reĎanja cifara  VNTR – polimorfizam broja uzastopnih ponovaka  WCHR – Vekslerova revidirana skala pamćenja 160 BIOGRAFIJA Nela Maksimović je Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu upisala 1999/00god. Diplomirala molekularnu biologiju i fiziologiju 2005.-e god., smer eksperimentalna biomedicina. Diplomski rad na temu "Indirektna genska analiza distrofinopatija" radila na Institutu za biologiju i humanu genetiku Medicinskog fakulteta u Beogradu i odbranila sa ocenom 10, 27. 12. 2005. 2006/07 upisala doktorske studije na Medicinskom fakultetu u Beogradu studijska grupa Molekularna medicina. Od 01.06.2006. angaţovana kao istraţivač pripravnik za rad na projektu br. 145025 koji finansira Ministarstvo nauke Srbije, čiji je rukovodilac prof. dr Nadeţda Čovičković-Šternić. Od 01.10. 2006. učestvovala u praktičnoj nastavi Katedre za biologiju i humanu genetiku kao volonter. Od 01. 11.2008. radi kao asistent za uţu naučnu oblast Humana genetika na Medicinskom fakultetu u Beogradu. U okviru poslediplomskog usavršavanja boravila maja 2007.god. u laboratoriji Sluţbe za medicinsku genetiku Kliničkog centra u Ljubljani. TakoĎe, završila poslediplomski tečaj: Aspekti genetskog savjetovanja odrţan na Hrvatskom institutu za istraţivanje mozga u Zagrebu jula 2007.god. U periodu od 01.08.2009.god. do 30.01.2010.god bila na stručnom usavršavanju na Institutu za humanu genetiku, Univerzitetska klinika Ependorf, Hamburg, Nemačka. 2011- učestvuje u projektima,, Analiza genetičkih markera mišićne distonije,, ( ev. br. 175091, rukovodilac Prof dr Ivana Novaković) i ,,Ispitivanje molekularno-genetskih, patohistoloških i biohemijskih karakteristika neuromišićnih bolesti,, (ev. br. 175083, rukovodilac Prof dr Vidosava Rakočević – Stojanović). Tečno govori engleski jezik, sluţi se francuskim i španskim. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Максимовић Нела број уписа 06-ДС-ММ-5 Изјављујем да је докторска дисертација под насловом ''Анализа полиморфизама гена за АПОЕ, БДНФ, БЦХЕ и КИБРА и њихова корелација са меморијским способностима у популацији студената''  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, 05.01.2014. ____ __ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора __Нела Максимовић________________________________ Број уписа ____06-ДС-ММ-05___________________________________________ Студијски програм _____молекуларна медицина___________________________ Наслов рада __''Анализа полиморфизама гена за АПОЕ, БДНФ, БЦХЕ и КИБРА и њихова корелација са меморијским способностима у популацији студената'' Ментор _______Проф. др Ивана Новаковић_______________________________ Потписани _____Нела Максимовић_____________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, ____05.01.2014._______ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: ''Анализа полиморфизама гена за АПОЕ, БДНФ, БЦХЕ и КИБРА и њихова корелација са меморијским способностима у популацији студената'' која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, _____05.01.2014.__________