NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA UNIVERZITETA U BEOGRADU Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana 25.12.2014. godine, broj 4600/12, imenovana je Komisija za ocenu završene doktorske disertacije pod nazivom: „Imunohistohemijski prognostički biomarkeri u difuznom B krupnoćelijskom limfomu“ kandidata mr sci dr Maje Peruničić Jovanović, zaposlene u kabinetu za hematopatologiju, Službe za patohistologiju, Kliničkog Centra Srbije u Beogradu. Mentor doktorske disertacije je Prof. dr Biljana Mihaljević, redovni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu: 1. Prof. dr Ivan Boričić – redovni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu 2. Prof. dr Milena Todorović – vanredni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu 3. Prof. dr Slavica Knežević Ušaj - vanredni profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Novom Sadu Na osnovu analize priložene doktorske disertacije, komisija za ocenu završene doktorske disertacije podnosi Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu sledeći I Z V E Š T A J A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije Doktorska disertacija dr Maje Peruničić Jovanović, pod nazivom „Imunohistohemijski prognostički biomarkeri u difuznom B krupnoćelijskom limfomu“, napisana je na 95 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: uvod, ciljevi istraživanja, materijal i metode, rezultati, diskusija, zaključak i literatura. Disertacija sadrži 11 tabela, 24 slike i 37 grafikona. Doktorska disertacija sadrži sažetak na srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i spisak skraćenica korišćenih u tekstu. U uvodu se razmatra aktuelnost teme, posebno u odnosu na studije koje su ispitivale prognostičke faktore koji bi predvideli preživljavanje i optimizovale terapijsku strategiju kod pacijenata sa Difuznim B krupnoćelijskim limfomom. Data je definicija bolesti u skladu sa najnovijom klasifikacijom Svetske Zdravstvene Organizacije (SZO), kao i istorijski osvrt na klasifikaciju limfoproliferativnih bolesti koja je stalno evoluirala, počevši od ranih godina 19. veka pa do danas. Objašnjava se poreklo zrelih B ćelijskih neoplazmi kao osnov za klasifikaciju i opisane su morfološke, biološke i kliničke karakteristike pojedinih tipova DBKL. Detaljno se objašnjava princip dijagnostike DBKL, na osnovu imunohistohemijskih i molekularnih karakteristika ovih tumora. Posebno detaljno su prikazani molekularni biomarkeri koji su obuhvaćeni daljim istraživanjem u radu, a u cilju izdvajanja pacijenata sa većim rizikom za progresiju bolesti, što bi bilo od značaja za terapijsku strategiju. Naznačena je važnost biopsije kostne srži, koja se rutinski primenjuje u određivanju kliničkog stadijuma kao i procene stanja kostne srži nakon primenjene terapije kod pacijenata sa non-Hodgkin limfomom. Detaljno je dat opis osnovnih kliničkih parametara koji se koriste za predviđanje ishoda bolesti kao i standardni terapijski pristup za pacijenata sa DBKL. Ciljevi istraživanja su precizno definisani i primereno obrazlažu istraživanje. Cilj rada je bio da se utvrdi klinički značaj i prognostičke vrednosti imunofenotipskih podtipova DBKL: GCB i non-GCB, kao i korelacija ovih podtipova sa Internacionalnim prognostičkim indeksom (IPI). Osim toga, cilj je bio analiza ekspresije onkogenih, proliferativnih, i markera uključenih u apoptozu i korelacija sa podtipovima DBKL i ishodom bolesti. U poglavlju Materijal i Metode navedeno je da je za istraživanje korišćen biopsijski materijal 115 bolesnika sa dijagnozom DBKL koji su dijagnostikovani i lečeni na Klinici za Hematologiju Kliničkog Centra Srbije u Beogradu, u periodu od 2000-2006. godine. Predstavljen je postupak dijagnostike DBKL, odnosno histopatološke i imunohistohemijske analize uzoraka limfnog tkiva dobijenog biopsijom limfnog čvora, kostne srži ili drugih ekstranodalnih lokalizacija, prema kriterijumima klasifikacionog sistema Svetske Zdravstvene Organizacije. Opisana je imunohistohemijska analiza, sprovedena korišćenjem sledećih monoklonskih antitela: CD20, CD79α, CD3, CD5, CD10, bcl-2, bcl-6, MUM-1, CD138, CD30, HLA-DR, Survivin, BAX, p53, myc i Ki67. Takođe opisana je metoda metode tkivnog mikroniza (tissue microarray -TMA), koja je sprovedena kod 67 pacijenata, za koje je bio dostupan arhivirani biopsijski materijal adekvatan za dalju analizu. Osim imunohistohemijske analize na ovim uzorcima urađena je i metoda fluorescentne in situ hibridizacije i to za MYC i BCL2. Opisan je način obrade kliničkih podataka kao i način lečenja. Metodološki pristup objašnjen je posebnim odeljcima: Histološka i imunohistohemijska analiza, Tkivni mikroniz, Imunohistohemijski algoritmi, Metoda Fluorescentne in situ hibridizacije, Klinički parametri i Statistička obrada rezultata. U poglavlju Rezutati su izneti originalni podaci koji su dobijeni u ovom istraživanju, pregledno i sistematično predstavljeni, a sistematizovani su u skladu sa postavljenim ciljevima. Diskusija dobijenih rezultata napisana je jasno i pregledno, uz integrativni pristup problematici definisanja nezavisnih kliničkih, patohistoloških i imunohistohemijskih prognostičkih parametara koji bi izdvojili visoko rizičnu grupu pacijenata pre otpočinjanja terapije i kandidovale je za dodatne terapijske modalitete. Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada. Korišćena literatura, sadrži spisak od 171 referenci. B) Kratak opis postignutih rezultata Ovo istraživanje je pokazalo da je Internacionalni prognostički indeks nezavisan prognostički parametar ishoda bolesti kod pacijenata sa difuznim B krupnoćelijskim limfomom. Petogodišnje ukupno preživljavanje kao i period bez neželjenog događaja, u grupi pacijenata koji su lečeni hemioterapijom i Rituximab-om, bilo je značajno bolje u odnosu na pacijente koji su lečeni standardnom hemioterapijom bez Rituximab-a. Imunohemioterapija je značajno poboljšala preživljavanje pacijenata koji su imali Bcl-2 pozitivan, kao i Bcl-6 negativan DBKL, ali nije imala uticaj na preživljavanje Bcl-2 negativnih, a ni Bcl-6 pozitivnih slučajeva. Imunohistohemijski algoritam subtipizacije, bazirane na poreklu ćelije (COO), u skladu sa Hans i saradnicima, nije bio prediktor preživljavanja pacijenata sa DBKL bez obzira na primenjenu terapiju. Učestalost non GCB podtipa u analiziranoj grupi bolesnika je znatno veća nego u drugim objavljenim studijama. Ekspresija nijednog imunohistohemijskog markera nije imala značajan uticaj na preživljavanje kao ni na postizanje kompletne remisije, međutim, utvrđena je korelacija između pojedinih imunohistohemijskih biomarkera i kliničkih parametara. Značajna pozitivna korelacija je postojala između Ki67>60% tumorskih ćelija i visokog IPI skora, ekspresije survivina i Bcl-6 i voluminozne tumorske mase, kao i ekspresije BAX, p53 i visokog kliničkog stadijuma. Ne postoje kliničke, morfološke ili imunofenotipske karakteristike koje bi identifikovale postojanje genetskih aberacija, pa je neophodno uraditi FISH analizu u cilju njihove identifikacije i korelirati ih sa imunohistohemijskom ekspresijom proteina. Navedeni podaci mogu biti od kliničkog značaja, jer mogu lako biti primenjeni u svakodnevnoj rutinskoj praksi u smislu klasifikacije DBKL i neophodnog biološkog uvida u prilagođen terapijski pristup. C) Uporedna analiza rezultata doktorske disertacije sa rezultatima iz literature U doktorskoj disertaciji pregledno i temeljno su upoređivani rezultati ovog istraživanja sa relevantnim nalazima drugih autora koji se bave kliničko-patološkim analizama difuznog B krupnoćelijskog limfoma. Pregled literature daje vrlo heterogene podatke o prognostičkom značaju pojedinih kliničko-patoloških i imunohistohemijskih parametara. Internacionalni prognostički indeks je prognostički model koji se koristi u predviđanju terapijskog odgovora i ishoda bolesti kod pacijenata sa DBKL , tako sa većina autora tvrdi da samo IPI skor ima važnu ulogu u prognozi preživljavanja pacijenata sa DBKL (Sehn i sar. 2007; Barton i sar.2012.). U skladu sa rezultatima drugih autora, u našoj studiji, visok IPI (>2) je identifikovan kao nezavisan prognostički faktor koji utiče na ukupno preživljavanje pacijenata lečenih samo hemioterapijom tako i onih koji su lečeni imunohemioterapijom. Odkako je rituximab dodat CHOP protokolu, postignut je značajan napredak u preživljavanju, tako da je R CHOP postao standardni terapijski protokol u lečenju pacijenata sa DBKL (Coiffier i sar., 2002; Fu i sar. 2008). GELLA (Groupe d’Etude des Lymphomes de l’Adulte) grupa je prvi put objavila randomizovanu studiju, koja je pokazala da dodavanje anti-CD20 monoklonskog antitela CHOP hemioterapiji, kod starijih pacijenata (>60 godina) sa DBKL, značajno poboljšava ishod bolesti. U našoj grupi bolesnika, petogodišnje ukupno preživljavanje pacijenata koji su lečeni hemioterapijom i rituximab-om, bilo značajno bolje u odnosu na pacijente koji su lečeni standardnom terapijom bez rituximab-a (61% vs 38%, log rank p=0,007). S obzirom na to da GEP nije deo rutinske dijagnostičke procedure, predloženo je nekoliko IHH algoritama koji mogu poslužiti kao surogat za GEP analize, ali sa različitim nivoom uspešnosti (Hans i sar. 2004; Colomo 2003; Choi i sar. 2009.). Studija Garcia i saradnika je pokazala da nijedan od 5 analiziranih IHH algoritama baziranih na GCB i non GCB podtipu, nije u mogućnosti da predvidi ukupno preživljavanje i preživljavanje do progresije bolesti. U našoj studiji, GCB versus non GCB imunofenotip u skladu sa algoritmom Hans i saradnika nije imao prognostički uticaj na ukupno preživljavanje ni u CHOP ni u RCHOP terapijskoj grupi, što je u saglasnosti sa nalazima većine autora (Garcia 2011). Rezultati GEP studija su u saglasnosti sa imunohistohemijskim studijama koje su identifikovale Bcl-6 kao prognostički faktor (Winter i sar. 2006; Lossos i sar. 2001; Imhoff i sar. 2006.). Nekoliko različitih grupa autora je pokazalo da je ekspresija Bcl-6 proteina sama po sebi, ili u kombinaciji sa drugim markerima germinativnog centra, prediktor boljeg ishoda bolesti pacijenata s DBKL lečenih hemioterapijom sa antraciklinom (Lossos i sar. 2006; Barrans i sar. 2002; Hans i sar. 2004.). Winter i saradnici su u svojoj studiji pokazali, da je ekspresija Bcl-6 proteina snažan prediktor ishoda bolesti pacijenata sa DBKL lečenih hemoterapijom, ali da Bcl-6 status nije prognostički marker kod pacijenata sa DBKL lečenih imunohemioterapijom. Osim toga ista grupa autora je pokazala da Bcl-6 negativni slučajevi lečeni R CHOP-om imaju duže preživljavanje od onih koji su lečeni samo CHOP terapijom. Naša studija je pokazala da pacijenti sa Bcl-6 negativnim DBKL su imali značajno bolje preživljavanje u R CHOP grupi nego u grupi pacijenata lečenih samo standardnom terapijom. Dodavanje Rituximab-a standardnoj terapiji značajno poboljšava ishod bolesti kod Bcl-6 negativnih, ali ne i kod Bcl-6 pozitivnih slučajeva, što je u saglasnosti sa većinom studija. Prognostički značaj Bcl-2 ekspresije je takođe kontroverzan i poređenje između različitih studija je otežano pre svega zbog izbora različitih graničnih vrednosti pozitivnosti ćelija, ali i različitih terapijskih tretmana (de Jong i sar. 2007; Saez i sar. 2004, Tzankov i sar. 2010.). Iako su u različitim studijama korišćeni različiti procenti koji definišu Bcl-2 pozitivnost, procenat pozitivnih slučajeva (45-66%) u većini objavljenih studija je u saglasnosti sa procentom korišćenim u našoj studiji (50%). U studiji GELLA grupe je pokazano da je ekspresija Bcl-2 proteina prognostički faktor kod pacijenata sa DBKL lečenih CHOP ali ne i u grupi pacijenata lečenih R CHOP terapijom. U studiji Visco i saradnika ekspresija Bcl-2 je bila udružena sa značajno lošijim ishodom posmatrano na celoj grupi pacijenata uniformno lečenih R CHOP, ali kada se pacijenti podele u grupe u skladu sa GEP, primećeno je da je veća ekspresija Bcl-2 udružena sa lošijim PFS u GCB podgrupi ali ne i u ABC podgrupi. Takođe, ista grupa autora je pokazala da je prognostički efekat ekspresije Bcl-2 proteina vezan za istovremeno prisustvo BCL2 translokacije. U studiji Winter i saradnika kao i Hans i saradnika Bcl-2 ekspresija nije bila prognostički parametar. U nekim studijama je pokazano da dodavanje rituximab-a eliminiše negativan uticaj ekspresije Bcl-2 (Mounier i sar. 2003; Iqbal i sar. 2006.). Naša studija je pokazala da ekspresija Bcl-2 proteina nije imala uticaj na ukupno preživljavanje ni u grupi pacijenata lečenih R CHOP-om, ni u grupi koja je lečena samo standardnom hemioterapijom bez rituximab-a. Dalje, potvrdili smo da rituximab značajno poboljšava ishod bolesti kod Bcl-2 pozitivnih, ali ne i kod Bcl-2 negativnih slučajeva, što je u saglasnosti sa skorije objavljenim studijama. Incidenca genetskih promena, kao i MYC i BCL2 proteinska ekspresija u našoj grupi bolesnika bila je slična podacima drugih autora (Green i sar. 2012; Johnson i sar. 2009.). Nije uočena korelacija između BCL2 i MYC rearanžmana ili MYC proteinske ekspresije u odnosu na postizanje kompletne remisije ili ukupno preživljavanje. Mali broj uniformno tretiranih pacijenata sa genskim alteracijama i imunohistohemijskom ekspresijom MYC proteina u našoj studiji, ograničio je statističku korelaciju sa ishodom. Neke studije su utvrdile da je preživljavanje značajno kraće kod pacijenata sa nuklearnom ekspresijom Ki 67 u 60% ili 80% i više tumorskih ćelija (Lossos i sar. 2006. Tzankov i sar. 2010.). Studije većine autora nisu utvrdile prognostički značaj Ki 67 (Colomo i sar. 2003; Saez i sar. 2004; Winter i sar. 2006.). U našoj studiji smo pokazali statistički značajnu pozitivnu korelaciju između Ki67>60% tumorskih ćelija i visokog IPI skora, ali ekspresija Ki 67 nije uticala na ukupno preživljavanje. U pojedinim studijama je pokazan uticaj P53 mutacije i ekspresije p53 na preživljavanje (Kramer i sar. 1996; Chang i sar. 2000.), dok neki autori nisu našli značajnu povezanost između p53 ekspresije i bilo koje od kliničkih varijabli i ishoda (Visco i sar. 2006.). Naša studija je pokazala da ekspresija p53 korelira sa kliničkim manifestacijama bolesti, posebno visokim kliničkim stadijumom i nodalnim poreklom DBKL. U studiji Bai i saradnika ekspresija BAX gena je češće bila udružena GCB podtipom, dok je u našoj studiji većina pacijenata sa ekspresijom Bax, bila iz non GCB grupe. Gaskoyne i saradnici nisu dokazali prognostički značaj ekspresije Bax proteina u DBKL, ali su uočili da su pacijenti iz Bcl2-/Bax- grupe pacijenata imali nešto kraće ukupno preživljavanje od pacijenata iz bcl-2-/Bax+ grupe. U našoj grupi pacijenata, velika većina (88%) je imala koekspreiju bcl-2 i Bax, i korelirala je sa visokim IPI i kliničkim stadijumom bolesti, ali takođe nismo uspeli da dokažemo prognostički značaj ekspresije Bax proteina. Ekspresija survivina je uočena kod 83,56% ispitivanih pacijenata u našoj studiji što je u saglasnosti sa nalazom drugih autora (Adida i sar. 2000; Liu i sar. 2007.). Dok su Adida i saradnici utvrdili da ekspresija survivina lošije utiče na ukupno preživljavanje pacijenata sa DBKL, u našoj studiji, kao i u studijama korejskih i kineskih autora nije utvrđen prognostički značaj ekspresije survivina (Liu i sar. 2007; Sung i sar. 2010.). D) Objavljeni radovi koji čine deo doktorske teze Maja Perunicic Jovanovic, Biljana Mihaljevic, Ljubomir Jakovic, Vesna Cemerikic Martinovic, Marija Dencic Fekete, Bosko Andjelic, Darko Antic, Andrija Bogdanovic, Novica Boricic, Tatjana Terzic, Jelena Jelicic, Sanja Milenkovic. BCL2 positive and BCL6 negative diffuse large B cell lymphoma patients benefit from R-CHOP therapy irrespective of germinal and non germinal center B cell like subtypes. (rad je prihvaćen za objavljivanje dana 07.10.2014. i biće objavljen u J BUON Vol.20,no3,2015.) E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa) Doktorska disertacija „Imunohistohemijski prognostički biomarkeri u difuznom B krupnoćelijskom limfomu“ kandidata mr sci dr Maje Peruničić Jovanović, predstavlja originalni naučni doprinos istraživanjima u oblasti hematopatologije, posebno difuznog B krupnoćelijskog limfoma. Reklasifikacija DBKL u skladu sa najnovijom klasifikacijom SZO, kao i sveobuhvatna imunohistohemijska analiza u skladu sa predloženim algoritmima, FISH analiza kao i ispitivanje kliničko-patoloških parametara značajnih za prognozu i terapiju DBKL, sprovedeno je po prvi put na ovaj način u našoj zemlji. Ova doktorska disertacija urađena je prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan, a metodologija rada je bila kompleksna i savremena, uz integrisan kliničko-patološki pristup problemu. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani a iz njih su izvedeni odgovarajući zaključci. Na osnovu navedenog, Komisija smatra da doktorska disertacija „Imunohistohemijski prognostički biomarkeri u difuznom B krupnoćelijskom limfomu“ kandidata mr sci dr Maje Peruničić Jovanović, predstavlja originalni naučni doprinos i predlaže Naučnom veću da prihvati priloženu disertaciju i odobri njenu javnu odbranu. U Beogradu, 27.02.2015. godine Mentor Članovi Komisije: _________________________ _______________________________ Prof. Dr Biljana Mihaljević, redovni profesor Prof. dr Ivan Boričić, redovni profesor ___________________________ Prof. dr Milena Todorović, vanredni profesor ________________________________ Prof. dr Slavica Knežević Ušaj, vanredni profesor