1NAUČNOM VEĆU MEDICINSKOG FAKULTETA
UNIVERZITETA U BEOGRADU
Na sednici Naučnog veća Medicinskog fakulteta u Beogradu, održanoj dana
03.11.2014. godine, broj 4600/11, imenovana je komisija za ocenu završene doktorske
disertacije pod naslovom:
“Ekspresija neuralnih adhezionih molekula (NCAM)
u zdravom i obolelom bubrežnom tkivu”
("Expression of neural adhesion molecules (NCAM)
in healthy and diseased renal tissue")
kandidata Sanje Ćirović, diplomiranog molekularnog biologa i fiziologa, zaposlene na
Institutu za patologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu kao stručni saradnik.
Mentor je prof. dr Jasmina Marković-Lipkovski.
Komisija za ocenu završene doktorske disertacije imenovana je u sastavu:
1. Prof. dr Claudia Müller, profesor Medicinskog fakulteta Eberhard Karl Univerziteta,
Tübingen, SR Nemačka,
2. Prof. dr Jovan Vasiljević, profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu,
3. Prof. dr Svetislav Tatić, profesor Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu.
Na osnovu analize priloženog rukopisa doktorske disertacije, komisija za ocenu završene
doktorske disertacije jednoglasno podnosi Naučnom veću Medicnskog fakulteta sledeći
IZVEŠTAJ
A) Prikaz sadržaja doktorske disertacije
Doktorska disertacija diplomiranog molekularnog biologa i fiziologa Sanje Ćirović,
napisana je na 106 strana i podeljena je na sledeća poglavlja: Uvod, Ciljevi rada, Materijal i
metode, Rezultati, Diskusija, Zaključci i Literatura. Disertacija sadrži ukupno 38 slika, 5
2shema i 12 tabela. Doktorska disertacija je napisana na engleskom jeziku i sadrži sažetak na
srpskom i engleskom jeziku, biografiju kandidata, podatke o komisiji i jedan prilog
(CodonCod Aligner software).
U Uvodu su definisane različite patološke promene u bubrezima koje vode ka
bubrežnoj intersticijskoj fibrozi i tubulskoj atrofiji, što predstavlja morfološki supstrat
hronične bubrežne insuficijencije. Epitelno-mezenhimna transformacija je delom odgovorna
za nastanak hronične bubrežne insuficijencije, ali i za nastanak malignih tumora bubrega
porekla tubulskog epitela. Detaljno je opisan neuralni ćelijski adhezioni molekul (NCAM),
njegova genska i proteinska struktura kao i različite NCAM izoforme. Zatim je prikazana
uloga NCAM-a u medijaciji homofilne i heterofilne ćelijske adhezije.
Istaknut je značaj NCAM-a za diferencijaciju bubrega tokom embrionalnog i fetalnog
razvoja. Dat je kratak osvrt na mezenhimalno-epitelnu transformaciju tokom razvoja nefrona,
osnovne jedinice građe bubrega. Ukazano je da bi NCAM mogao biti marker fetalnih
renalnih stem/progenitorskih ćelija. U Uvodu je izneta mogućnost da eventualno aberantno
ispoljavanje NCAM molekula u adultnom bubregu kao i u tumorima porekla tubulskog
epitela zapravo predstavlja marker dediferencijacije.
Ciljevi rada su precizno definisani. Sastoje se u ispitivanju ekspresije NCAM
izoformi u: fetalnom bubrežnom tkivu, adultnom zdravom tkivu bubrega, adultnom
bubrežnom tkivu sa početnom intersticijskom fibrozom, karcinomu bubrežnih ćelija i
renalnim ćelijskim kulturama. Dalja imunomorfološka karakterizacija NCAM+ ćelija sa
drugim dobro definisanim markerima imala je za cilj da se utvrdi eventualna uloga NCAM+
ćelija u intersticijskoj fibrozi ili NCAM+ ćelije kao potencijalne renalne progenitorske ćelije.
Zatim se težilo ka identifikaciji i karakterizaciji novih markera - antitela na renalnom tkivu,
upotrebom novih monoklonskih antitela W5C4C5, W8B2 - potencijalnih mezenhimalnih
markera kao i novog potencijalnog antitela za NCAM, W1C3 (dobijenih u laboratoriji prof. dr
J.H. Bühringa, Univerzitet u Tübingen-u) sa ciljem bolje karakterizacije NCAM+ renalnih
ćelija.
3U poglavlju Materijal i metode navedeno je da su eksperimenti rađeni u Centru za
medicinska istraživanja (ZMF) Eberhard Karl Univerziteta u Tübingen-u i na Institutu za
patologiju Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Eksperimenti su sprovođeni u
skladu sa etičkim principima Medicinskog fakulteta u Beogradu (odluka br. 29/VI-7).
Detaljno je opisana metodologija imunohistohemijskog bojenja renalnog fetalnog, fibrotičnog
i tumorskog tkiva upotrebom više različitih NCAM klonova (antitela) u cilju detektovanja
NCAM izoformi. Korišćeni su i drugi markeri: CDH9, CD34 i W1C3. Dvostruka
imunofluorescentna tehnika upotrebljena je radi ispitivanja kolokalizacije NCAM-a sa drugim
markerima kao na primer: CD24, CD133, PSA-NCAM, Ki-67, FGFR1, integrin α5β1,
EpCAM, Six2 i dr. Opisana je i priprema ćelijskih kultura za protočnu citometriju (FACS),
izolacija proteina iz tkiva bubrega upotrebom RIPA lizacionog pufera, kao i dalje određivanje
specifičnih NCAM izoformi putem Western blot-a i imunoprecipitacijskih analiza, zatim
izolacija RNK iz tkiva bubrega, reverzna transkripcija i sinteza cDNK, kao i RT-PCR
amplifikacija specifičnih NCAM izoformi i sekvencionisanje dobijenih RT-PCR produkata.
Semikvantitativnom metodom određivan je broj NCAM+FGFR1+ ćelija u tumorima bubrega,
kao i broj NCAM+ ćelija u tkivu sa početnom intersticijskom fibrozom. Prilikom statističke
obrade podataka korišćen je IBM SPSS softver.
U poglavlju Rezultati detaljno su opisani i jasno predstavljeni svi dobijeni rezultati.
Poglavlje sadrži 38 slika i 3 tabele, koje precizno prikazuju kolokalizaciju NCAM-a i markera
renalnih progenitora, kao i prisustvo posttranslacione modifikacije NCAM molekula u
indukovanim mezenhimalnim ćelijama. Takođe je jasno dokumentovana aberentna ekspresija
NCAM i FGFR1 u renalnim tumorima. Pronađeno je statistički značajno povećanje broja
NCAM+ intersticijskuh ćelija u početnoj intersticijskoj fibrozi, ali i heterogenost NCAM+
intersticijskih ćelija.
Diskusija je napisana jasno i pregledno, uz prikaz podataka drugih istraživanja sa
uporednim pregledom dobijenih rezultata doktorske disertacije. Poglavlje Diskusija podeljeno
je u 3 dela: a) diskusija fokusirana na ko-ekspresiju i ko-lokalizaciju NCAM-a u fetalnom i
neonatalnom tkivu; b) diskusija vezana za ekspresiju NCAM molekula u renalnim tumorima i
4c) diskusija vezana za heterogenost populacije NCAM+ renalnih intersticijskih ćelija i
njihovu ulogu u intersticijskoj fibrozi.
Zaključci sažeto prikazuju najvažnije nalaze koji su proistekli iz rezultata rada.
Korišćena Literatura sadrži spisak od 119 referenci.
B) Kratak opis postignutih rezultata
Ovo istraživanje je primenom specifičnih prajmera za RT-PCR pokazalo prisustvo
NCAM-120/-140/-180 izoformi u zdravom i obolelom bubrežnom tkivu. Takođe je primećeno
da NCAM ekspresija na renalnim ćelijskim linijama zavisi od gustine ćelija u kulturi, naime
pri gustini između 40-50% ćelije ne eksprimiraju NCAM, dok je prisustvo NCAM-a
detekrovano tek ako je gustina u kulturi veća od 70%.
Dvostrukim imunofluorescentnim bojenjem na fetalnim bubrezima pokazana je
kolokalizacija NCAM-a sa markerom adultnih renalnih progenitora CD24, na ćelijama
prekursorima nefrona, ali ne i koekspresija CD133, takođe sa markerom adultnih stem ćelija,
sa NCAM-om na istim prekursorima, kao i koekspresija NCAM-a sa markerom epitelijalnih
ćelija (EpCAM, CD326), kako bi lakše bile identifikovane ćelije kod kojih je došlo do
završetka mezenhimalno-epitelne transformacije. Interesantno je istaći da je NCAM molekul
koji je prisutan na ćelijama kondenzovanog mezenhima i njegovim derivatima (pretubulski
agregat, renalna vezikula, ”Comma” i ”S-shaped body”) tj. prekursorskim ćelijama nefrona
posttranslaciono modifikovan polisijalinskom kiselinom (eng. PSA). Rezultati koeskpresije
NCAM-a i navedenih markera ukazuju na to da humani fetalni prekursori mogu biti podeljeni
u najmanje 2 populacije: a) PSA-NCAM+CD24+CD326- tj. nefron progenitorske ćelije i b)
NCAM+PSA-NCAM-CD24-CD326- potencijalne prekursorske ćelije bubrežne strome.
Rezultati ove disertacije takođe su pokazali i aberantnu ekspresiju NCAM molekula u
tumorskom bubrežnom tkivu, kao i u tkivu sa intersticijskom fibrozom. Kod oba navedena
tkiva uočena je koekspresija NCAM-a i tirozin kinaznog receprora FGFR1 odgovornog za
ćelijsku proliferaciju i agresivno ponašanje u nekim tumorima epitelijalnog porekla. Prisustvo
membranoznog i citoplazmatskog NCAM/FGFR1 ispoljavanja detektovano je u karcinomima
5bubrežnih ćelija (eng. RCC), kako u svetloćelijskom, papilarnom, tako i u hromofobnom, dok
je u onkocitomu lokalizacija NCAM/FGFR1 interakcija bila isključivo citoplazmatska.
Imajući u vidu činjenicu da je RCC maligni tumor, a onkocitom benigni, različita lokalizacija
NCAM i FGFR1 molekula sugeriše na multifunkcionalnu ulogu NCAM/FGFR1 interakcija u
tumorima bubrega.
Značajan rezultat ove disertacije predstavlja i detekcija povećanog ispoljavanja
NCAM na intersticijskim ćelijama u ranoj fazi bubrežne intersticijske fibroze. Takođe je
konstatovana povećana koekspresija NCAM+ ćelija sa nekim markerima relevantnim za
razvoj fibroze, kao što su integrin α5β1 i FGRF1. Kakva je tačna uloga NCAM+ pozitivnih
renalnih intersticijskih ćelija ostaje još nerazjašnjeno.
C) Uporedna analiza doktorske disertacije sa rezultatima iz literature
Relativno mali broj radova je ispitivao ekspresiju NCAM izoformi u bubrežnom tkivu.
Jedan od prvih koji je opisao NCAM ekspresiju bio je rad na mišjim embrionima (Klein i sar.,
1988), koji je pokazao prisustvo tri NCAM izoforme, NCAM-120, NCAM-140 i NCAM-180,
koje nestaju posle rođenja. Rezultati prikazani u ovoj disertaciji su u saglasnosti sa
istraživanjem Klein-a i sar. Interesantno je istaći da rezultati Western blota i
imunoprecipitacije prikazani u ovom radu pokazuju i prisustvo NCAM molekula većih od 180
kDa, tj. u rasponu od 140-250 kDa, sugerišući da je u humanom fetalnom bubrežnom tkivu
NCAM molekul posttranslaciono modifikovan polisijalinskom kiselinom (PSA). Prisustvo
PSA-NCAM-a pokazano je i u radovima drugih autora, dodatno ukazujući na specifičnosti
PSA modifikacije NCAM molekula (Omer i sar., 2013)
Prisustvo NCAM-a u humanim renalnim progenitorima ispitivano je uglavnom na
ćelijskim kulturama. Upotrebom FACS analize pokazano je postojanje različitih populacija
renalnih progenitora koje eksprimiraju NCAM (Metsuyanim i sar., 2009). Znatno manji broj
radova je ispitivao ulogu NCAM+ ćelija u renalnim progenitorima in vitro tj. u samom
fetalnom tkivu bubrega. U ovoj disertaciji dvostrukom imunofluorescencom detektovani su
PSA-NCAM+EpCAM+ progenitori, prekursori nefrona, kao i NCAM+EpCAM- ćelije,
najverovatnije progenitorske ćelije strome, što je u korelaciji sa rezultatima Metsuyanim i sar.
6Takođe je pokazana koekspresija NCAM-a i CD24 markera renalnih progenitora, ali i
ekspresija CD133 (Ivanova i sar., 2010; Bussolati i sar., 2005), kao i stem ćelijskog markera
TRA-160 (Fesenko i sar., 2010) u fetalnom renalnom tkivu. Za razliku od adultnih renalnih
progenitora koji eksprimiraju i CD24 i CD133 (Lindgren i sar., 2011; Sagrinati i sar., 2006),
ćelije koje bi bile pozitivne na CD24, CD133 i NCAM nisu detektovane u fetalnom tkivu.
U ovoj disertaciji pokazano je prisustvo specifičnih NCAM isoformi u tumorima
bubrega, što je u korelaciji sa radovima drugih autora (Gattenlöhner i sar., 2009). Takođe je
potvrđena značajna uloga aberantne re-ekspresije NCAM molekula u tumorima bubrega
(Daniel i sar., 2003; Ćirović i sar., 2012), kao i ekspresija FGFR1 (Tsimafeyeu i sar., 2011).
Zatim, funkcionalna interakcija NCAM/FGFR1, inače dobro proučena u nervnim ćelijama
(Francavilla i sar., 2009; Kiselyov i sar., 2005; Kiselyov i sar., 2003) i ovarijalnim tumorima
(Zecchini i sar., 2011), u ovoj disertaciji je po prvi put detektovana u tumorima bubrega.
Specifične NCAM izoforme (120, 140, 180) detektovane su RT-PCR analizom u
adultnom tkivu bubrega (Gattenlöhner i sar., 2009) kao i u ovoj disertaciji. U ovom radu je
pokazana povećana ekspresija NCAM+ intersticijskih ćelija u ranoj fazi intersticijske fibroze
(Marković-Lipkovski i sar., 2009), kao i heterogenost NCAM+ intersticijskih ćelija, koje
koeksprimiraju FGFR1 (Kochoyan i sar., 2008) ali i integrin α5β1 (Schmid i sar., 2009;
Takagi i sar., 2003).
D) Objavljeni rad koji čini deo doktorske disertacije
1. Sanja Ćirović, Jelena Vještica, Claudia A Mueller, Svetislav Tatić, Jovan Vasiljević, Sanja
Milenković, Gerhard A Mueller, Jasmina Marković-Lipkovski. NCAM and FGFR1 coexpression and
colocalization in renal tumors. Int J Clin Exp Pathol 2014;7(4):1402-1414.
E) Zaključak (obrazloženje naučnog doprinosa)
Doktorska disertacija “Ekspresija neuralnih adhezionih molekula (NCAM) u zdravom
i obolelom bubrežnom tkivu” kandidata Sanje Ćirović, diplomiranog molekularnog biologa
i fiziologa, predstavlja originalni naučni doprinos u razumevanju uloge NCAM molekula u
fetalnom, adultnom fibrotičnom, kao i tumorskom tkivu bubrega. Ovim istraživanjem
7rasvetljena je ekspresija specifičnih NCAM izoformi u fetalnom i adultnom bubrežnom tkivu.
Takođe je detektovano prisustvo posttranslacione modifikacije NCAM molekula (PSA-
NCAM) u fetalnom tkivu u toku diferencijacije bubrega. Pokazana je kolokalizacija NCAM-a
sa drugim markerima kao što su FGFR1, CD24, CD326, α5β1-integrin. Rezultati ove
doktorske disertacije mogu biti korisni u daljem istraživanju i identifikaciji fetalnih i adultnih
renalnih progenitora. Takođe rezultati dobijeni na tumorima bubrega mogu da pomognu u
rasvetljavanju uloge NCAM/FGFR1 interakcija u tumorskim ćelijama.
Ova doktorska disertacija je urađena prema svim principima naučnog istraživanja. Ciljevi
su bili precizno definisani, naučni pristup je bio originalan i pažljivo izabran, a metodologija
rada je bila savremena. Rezultati su pregledno i sistematično prikazani i diskutovani, a iz njih
su izvedeni odgovarajući zaključci.
Na osnovu svega navedenog, i imajući u vidu dosadašnji naučni rad kandidata,
komisija predlaže Naučnom veću Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu da prihvati
doktorsku disertaciju diplomiranog molekularnog biologa i fiziologa Sanje Ćirović i odobri
njenu javnu odbranu radi sticanja akademske titule doktora medicinskih nauka (oblast-
molekularna medicina).
U Beogradu, 20.11.2014.
Članovi Komisije: Mentor:
Prof. dr Claudia Müller Prof. dr Jasmina Marković-Lipkovski
___________________ ______________________________
Prof. dr Jovan Vasiljević
____________________
Prof. dr Svetislav Tatić
___________________