UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Nebojša Đ. Miletić ISPITIVANJE KORELACIJE EKSPRESIJE HER-2 ONKOPROTEINA U PRIMARNOM TUMORU SA KLINIČKIM I PATOLOŠKIM STADIJUMOM REGIONALNIH LIMFNIH ČVOROVA U AKSILI KOD BOLESNICA SA OPERABILNIM KARCINOMOM DOJKE Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE SCHOOL OF MEDICINE Nebojša Đ. Miletić EXAMINATION OF THE CORRELATION OF EXPRESSION OF HER-2 ONCOPROTEIN IN THE PRIMARY TUMOR WITH CLINICAL AND PATHOLOGICAL STAGING OF REGIONAL LYMPH NODES IN THE AXILLA IN PATIENTS WITH OPERABLE BREAST CANCER Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. Mentor: dr Ivana Golubičić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet Komentor: dr Svetislav Jelić, naučni savetnik, Institut za onkologiju i radiologiju Srbije Komisija u sastavu: dr Radan Džodić, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet dr Svetislav Tatić, vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet dr Snežana Vidaković, vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet dr Srbislav Knežević, vanredni profesor, Univerzitet u Beogradu, Medicinski fakultet dr Zora Nešković-Konstatinović , naučni savetnik, Institut za onkologiju i radiologiju Srbije Datum odbrane doktorske disertacije: Z a h v a lj u j e m: svom mentoru Prof. Univ. dr Ivani Golubičić, profesoru Medicinskog fakulteta u Beogradu, na podršci i korisnim savetima kojima me je usmeravala u izradi doktorske teze i bez čije bi velike pomoći izrada teze bila mnogo teža. Trud uložen u ovaj rad posvećujem uspomeni na oca. SAŽETAK Cilj: Određivanje povezanosti statusa humanog epidermalnog faktora rasta (HER-2) onkoproteina, potvrđene metodom hromogene in situ hibridizacije (CISH), sa starosnom dobi, menstrualnim statusom, porodičnom anamnezom, lokalizacijom tumora, kao i kliničkom i patološkom Tumor, Nodus, Metastaza, klasifikacijom tumora (TNM), histopatološkim tipom, histološkim i nuklearnim gradusom, nalazom steroidnih receptora i vrstom sprovedenog hiruškog lečenja, kod primarno operabilnog unicentričnog karcinoma dojke, u određivanju strategije inicijalnog lečenja. Metode: Poređeni su klinički TNM nalazi i opšte karakteristike bolesnica kod kojih je lečenje započeto inicijalnim operativnim zahvatom u periodu 2006-2009. godine, sa definitivnim HP nalazom kojim je određivan tip tumora, veličina, patološki pT i pN, histološki i nuklearni gradus, nalaz steroidnih receptora i CISH amplifikacija. Rezultati: U osnovnoj grupi analizirano je 346 bolesnica sa duktalnim (DC), lobularnim (LC) i drugim tipovima karcinoma dojke. U osnovnoj grupi amplifikacija HER-2 receptora pokazala se kod 72 (20,81%) bolesnica. Za potrebe ovog istraživanja poređene su grupe sa i bez CISH amplifikacije. U odnosu na starosnu dob (p=0.41) i menstrualni status (p=0.54) nije utvrđena statistički značajna razlika. Statistčka značajnost nije dobijena ni u odnosu na lokalizaciju tumora (p=0.65), kao ni prema opštoj i porodočnoj anamnezi vezanoj za maligne bolesti dojke (p=0.77 i p=0.5). U odnosu na HP nalaz, utvrđena je statistički značajna razlika. Sa CISH amplifikacijom je bilo DC - 55 (76,39%), kod LC - 11 (15,28%), ostalo 4 (5,56%), mešoviti karcinomi - 2 (2,78%), p=4.22·10-5 Značajna statistička razlika dobijena je u odnosu na histološki gradus (p=0.015), nuklearni gradus (p=0.00135), kao i na odnos prema steroidnim receptorima (ER p=3⋅10 . Prema kliničkom nodalnom statusu (p=0.78), i patološkom nodalnom statusu (p=0.81), nije utvrđena statistička značajnost. -5, PR p=4⋅10-5). Narednu analizu smo radili po PH tipu karcinoma unutar kategorija pT. Podatke o pT i CISH je imalo 337/346 (97.4%) bolesnica, od čega je sa DC ukupno 183/346 (52.89%) bolesnica, dok je LC imalo 118/346 (34.1%) pacijentkinja. U formiranoj podgrupi samo duktalih i lobularnih karcinoma, analizirani su nalazi 301 bolesnice. Amplifikacija HER-2 onkoproteina pokazala se kod 66 (21,93%) bolesnica. Za potrebe ovog istraživanja poređene su grupa sa i bez CISH amplifikacije. U odnosu na starosnu dob (p=0.08) i menstrualni status (p=0.68), nije utvrđena statistički značajna razlika. Prema lokalizaciji tumora (p=0.82), i kliničkom T (p=0.21) i N statusu (p=0.95), nije utvrđena statistička značajnost. U odnosu na HP nalaz DC vs LC, utvrđena je statistički značajna razlika. Sa CISH amplifikacijom je bilo DC 55 (83,33%) a kod LC 11 (16,67%) (p=2·10-5). Statistička značajnost nije utvrđena kod patološkog pT (p=0.17) ni kod patološkog pN (p=0.95). U ovoj podgrupi potvrđeni su nalazi dobijeni i u osnovnoj grupi sa neznatno izmenjenim vrednostima. Statistička značajnost potvrđena je i za histološki (p=0.079) i nuklearni gradus (p=0.00371). Intrigirani dobijenim nalazima dalju analizu smo radili po PH tipu karcinoma unutar kategorija pT. Podatke o pT i CISH je imalo 293/301 (98.34%) pacijenata od čega je sa DC ukupno 178/183 (97.27%) bolesnica, dok je LC imalo 115/115 (100%) pacijentkinja. Kod pacijentkinja sa DC u odnosu na LC pokazana je statistički značajno veća učestalost CISH amplifikacije. Ova značajnost iskazana je i kod poređenja veličine tumora pT1 (p=4.9·10-4 ), u odnosu na pT2+3 (p=0.019). Zaključak: Shodno dobijenim rezultatima zaključili smo da nema statistički značajne korelacije sa kliničkim i patološkim nodalnim statusom i HER-2 amplifikacije određene CISH metodom kod karcinoma dojke. Potvrdili smo da se kod duktalnih karcinoma statistički značajno obrnuto češće javlja CISH amplifikacija nego kod lobularnih karcinoma. Takođe je potvrđena i statistički veća učestalost CISH amplifikacije u odnosu na manje vrednosti steroidnih receptora, kao i direktno proporcionalna statistička značajnost sa CISH amplifikacijom u odnosu na histološki i nuklearni gradus. Potvrdili smo veću učestalost CISH ampifikacije kod duktalnih nego kod lobularnih karcinoma. Utvrdili smo da je amplifikacija statistički značajno veća kod manjih tumora (pT1) nego kod većih (pT2+3). Ovaj nalaz ukazuje na veću biološku agresivnost manjih tumora, pogotovo duktalnih karcinoma, u odnosu na veće tumore. Iako nije jedini prognostički i prediktivni faktor, amplifikacija HER-2 onkoproteina prema PH tipu i veličini tumora može uticati na buduću strategiju inicijalnog lečenja primarno operabilnih karcinoma dojke kliničkog stadijuma I i II. Ključne reči: dojka, karcinom, duktalni, lobularni, TNM, HER-2 SUMMARY Purpose: To determine the association of status of human epidermal growth factor (HER- 2) oncoprotein, chromogene confirmed using in situ hybridization (CISH), with age, menstrual status, family history, tumor localization and the clinical and pathological tumor, nodes, metastasis, the classification of tumors (TNM), histopathological type, histological and nuclear grade, steroid receptor findings and type of surgical treatment carried out, the primary operable breast cancer unicentric, in determining initial treatment strategies. Methods: The comparison of the clinical TNM and general characteristics of patients in whom treatment was started with initial surgical procedure in the period of 2006 to 2009, with definite findings that HP was determined by tumor type, size, pathological pT and pN, histologic and nuclear grade, a finding steroid receptors and CISH amplification. Results: The primary group analyzed 346 patients with ductal (DC), lobular (LC) and other brest carcinoma. The amplification of the fundamental group of HER-2 receptor is shown in 72 (20.81%) patients. For the purposes of this study group were compared with and without CISH amplification. In relation to age (p=0.41) and menstrual status (p=0.54) was not statistically significant difference. Statistically significance was not obtained even in relation to the localization of the tumor (p=0.65), as well as the general anamnesis and family anamnesis related to malignant breast disease (p=0.77 and p=0.5). Compared to the HP findings, a statistically significant difference. With CISH amplification was DC - 55 (76.39%), with LC - 11 (15.28%), other - 4 (5.56%), two mixed carcinomas (2.78%) , p=4.22·10-5. According to the clinical nodal status (p=0.78), and pathologic nodal status (p=0.81), not statistically significant. Statistically significant difference was observed in relation to histological grade (p=0.015), nuclear grade (p=0.00135), and the relationship to steroid receptors (ER p=3⋅10-5, PR p=4⋅10-5). Subsequent analysis we did for PH type of cancer within the pT category. Data on pT and CISH had the 337/346 (97.4%) patients, of which the total DC 183/346 (52.89%) patients, while LC had a 118/346 (34.1%) patients. In the subgroup formed only DC/LC were analyzed the results of 301 patients. Amplification of HER-2 oncoprotein is shown in 66 (21.93%) patients. For the purposes of this study group were compared with and without CISH amplification. In relation to age (p=0.08) and menstrual status (p=0.68), there isn`t statistically significant difference. According to the localization of the tumor (p=0.82), and clinical T (p=0.21) and N status (p=0.95), there isn`t statistically significant difference. Compared to the HP DC/LC findings, there is a statistically significant difference. CISH with DC amplification was 55 pathients (83.33%) and the LC 11 patients (16.67%) (p=2·10-5). The statistical significance was not found in pathological pT (p=0.17) or in pathological pN (p=0.95). In this subgroup confirmed the findings obtained in the primary group with slightly altered values. Statistical significance was confirmed histologically and for (p=0.079) and nuclear grade (p=0.00371). Intrigued by these findings, we did further analysis on PH type of cancer within the pT category. Data on pT and CISH had the 293/301 (98.34%) patients, of which the total DC 178/183 (97.27%) patients, while LC had a 115/115 (100%) patients. In patients with DC in relation to the LC demonstrated a statistically significantly higher incidence of CISH amplification. This significance is presented and comparisons with pT1 tumor size (p=4.9·10-4 ), compared to pT2+3 (p=0.019). Conclusion: According to the results, we concluded that there was no statistically significant correlation with clinical and pathological nodal status and HER-2 amplification determined using CISH methods in breast cancer. We have confirmed that in ductal carcinoma significantly more frequently than CISH amplification lobular cancer. It was also confirmed by the statistically inversely higher frequency of CISH amplification compared to the low value of steroid receptors, and directly proportional to the statistical significance of the CISH amplification with respect to histologic and nuclear grade. We confirmed a higher frequency of CISH amplification in ductal carcinomas than in lobular. We found that amplification was significantly higher in small tumors (pT1) than in larger (pT2+3). This finding suggests a greater biological aggressiveness of smaller tumors, particularly ductal carcinoma, as compared to larger tumors. Although that is not the only prognostic and predictive factor, amplification of HER-2 oncoprotein by PH type and size of the tumor, may affect the future strategy of initial treatment of primary operable breast cancer clinical stage I and II. Key words: breast cancer, ductal, lobular, TNM, HER-2 SADRŽAJ 1. UVOD 1 1.1. ISTORIJAT LEČENJA PRIMARNO OPERABILNIH KARCINOMA DOJKE ............................................................................................................. 1 1.2. EMBRIOLOGIJA DOJKE .............................................................................. 4 1.3. ANATOMIJA DOJKE .................................................................................... 6 1.4. PATOMORFOLOŠKI ASPEKT KARCINOMA DOJKE ............................. 7 1.5. EPIDEMIOLOGIJA KARCINOMA DOJKE ................................................. 8 1.6. KARCINOM DOJKE KAO SOCIJALNO MEDICINSKI PROBLEM ......... 11 1.7. KARCINOM DOJKE KAO SISTEMSKA BOLEST ..................................... 12 1.8. OPERATIVNI PRISTUP U LEČENJU MALIGNIH TUMORA DOJKE ..... 15 2. CILJEVI RADA .................................................................................................. 17 2.1. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ............................................................................. 17 2.2. RADNA HIPOTEZA ...................................................................................... 18 3. MATERIJAL I METODOLOGIJA ................................................................... 19 3.1. MATERIJAL ................................................................................................... 19 3.2. METODOLOGIJA HER-2 TESTIRANJA ..................................................... 20 3.3. METODOLOGIJA ODREĐIVANJA STEROIDNIH RECEPTORA............ 21 3.4. METODOLOGIJA ODREĐIVANJA HISTOLOŠKOG I NUKLEARNOG GRADUSA ...................................................................................................... 21 3.5. STATISTIČKA OBRADA I TEKSTOVI ...................................................... 21 4. REZULTATI ........................................................................................................ 23 4.1. OPŠTE KARAKTERISTIKE BOLESNICA, OBOLJENJA I LEČENJA (N=346) ........................................................................................................... 23 4.1.1. Karakteristike bolesnica ......................................................................... 23 4.1.2. Kliničke karakteristike oboljenja ........................................................... 25 4.1.3. Karakteristike hirurškog lečenja ............................................................ 29 4.1.4. Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa ....................... 30 4.1.5. Status steroidnih receptora i HER-2 status određen CISH metodom .... 34 4.2.HER-2 STATUS ODREĐEN CISH METODOM I OPŠTE KARAKTERISTIKE BOLESNICA I OBOLJENJA ..................................... 37 4.2.1. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica 37 4.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i karakteristike oboljenja ......... 38 4.2.2.1. Povezanost kliničkih i histopatoloških karakteristike oboljenja ......... 38 4.2.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike oboljenja .............................................................................................. 40 4.2.2.3. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike oboljenja ....................................................................... 41 4.2.2.4. HER-2 status određen CISH metodom i histološki i nuklearni gradus tumora ................................................................................................. 42 4.2.2.5. HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori ............... 44 4.2.2.6. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološki tipovi tumora 45 4.3.HER-2 STATUS ODREĐEN CISH METODOM U PODGRUPI BOLESNICA SA DUKTALNIM I LOBULARNIM KARCINOMOM DOJKE (N=301) ............................................................................................. 46 4.3.1. Opšte karakteristike bolesnica, oboljenja i lečenja ................................ 46 4.3.1.1. Karakteristike bolesnica ...................................................................... 46 4.3.1.2. Kliničke karakteristike oboljenja ........................................................ 47 4.3.1.3. Karakteristike hirurškog lečenja ......................................................... 48 4.3.1.4. Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa .................... 49 4.3.1.5. Status steroidnih receptora i HER-2 status određen CISH metodom 51 4.3.2. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica i oboljenja ............................................................................... 52 4.3.2.1. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica ............................................................................................. 52 4.3.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i karakteristike bolesnica ...... 53 4.3.2.2.1. Povezanost kliničkih i histopatoloških karakteristike bolesnica ...... 53 4.3.2.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike bolesnica .......................................................................................... 55 4.3.2.2.3. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike bolesnica ................................................................... 56 4.3.2.2.4. HER-2 status određen CISH metodom i histološki i nuklearni gradus tumora .................................................................................. 57 4.3.2.2.5. HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori ............ 59 4.3.2.2.6. HER-2 status određen CISH metodom i pT vrednosti histopatoloških tipova tumora (DC/LC) .......................................... 60 5. DISKUSIJA ........................................................................................................... 62 6. ZAKLJUČAK ....................................................................................................... 70 7. LITERATURA ..................................................................................................... 72 8. SKRAĆENICE KORIŠĆENE U TEKSTU ....................................................... 85 9. BIOGRAFIJA ....................................................................................................... 86 1 1. UVOD 1.1. ISTORIJAT LEČENJA PRIMARNO OPERABILNIH KARCINOMA DOJKE Karcinom dojke predstavlja jednu od najrasprostranjenijih bolesti na osnovu brojnih sprovedenih naučnih, kliničkih, eksperimentalnih i epidemioloških studija. Globalne statističke analize urađene još 80-ih godina prošlog veka, nažalost i danas nisu bitno promenjene. Karcinom dojke je i dalje jedno od najučestalijih malignih oboljenja i vodeći je uzrok smrti kod žena obolelih od malignih bolesti [1]. Svake godine se otkrije više od milion novoobolelih u celom svetu. Kod muškaraca se javlja retko i odnos je 1:100 [2]. Uprkos sve ranijoj dijagnostici, u svetskim razmerama oko 40-60% bolesnica u vreme postavljanja dijagnoze ima zahvaćene regionalne limfne čvorove u homolateralnoj aksili [3]. Iako je u trenutku otkrivanja bolest moguće već metastazirala u regionalne limfne noduse, u ovu grupu spadaju i bolesnice kliničkog stadijuma I i II, koje su primarno operabilne. U podacima razvijenih zemalja sa organizovanim skrining programima, navodi se da se udeo lokalizovane bolesti (klinički i patološki stadijum I) u novotkrivenim slučajevima raka dojke kreće i do 80%. Zbog verovatnog postojanja udaljenih mikrometastaza, oko 50%-70% bolesnica će u narednih 10 godina dobiti recidiv bolesti [4]. Iako je podatak iznet unazad 34 godina, a i pre definisanja standardne adjuvantne hemio-hormono terapije, procenat bolesnica koje umiru zbog relapsa bolesti je i dalje relativno visok, a pitanje mogućnosti trajnog izlečenja čak i ranog karcinoma dojke je i dalje nejasno [5,6,7,8,9]. Uz kvalitet inicijalnog hiruškog lečenja, do sada poznati i definisani osnovni parametri prognoze su određeni veličinom tumora (T), histološkim i nuklearnim gradusom, statusom aksilarnih limfnih nodusa (N), prisustvom udaljenih metastaza (M) kao i stausom estrogenskih, progesteronskih i HER-2 receptora i Ki67 nuklearnim proteinom u samom tumoru. HER-2 (human epidermal growth-factor receptor) pripada grupi transmembranskih receptora za faktore rasta. U ovoj grupi od do sada otkrivenih 4 receptora koji učestvuju u međućelijskoj komunikaciji (HER-1-4), HER-2 predstavlja 2 složeni protein koji se nalazi na površini ćelije i u normalnim uslovima kontroliše rast i deobu ćelije. Kodiran je protoonkogenom cerB-2, lokalizovanom na 17 hromozomu koji se u literaturi se nalazi pod imenima HER-2/neu, HER-2 onkoprotein, onkogen i protoonkogen [10]. Određivanje ekspresije i amplifikacije HER-2 u karcinomu dojke postalo je neophodan vodič za svakodnevnu kliničku praksu. Osnovne metode testiranja su: 1. imunohistohemijska metoda(IHH), kojom se identifikuje povećana proteinska ekspresija na ćelijskoj membrani i 2. metoda in situ hibridizacija (ISH), bilo fluorescenta in situ hibridizacija (FISH) ili hromogena in situ hibridizacija (CISH), kojoma se determinišu postojanje genske amplifikacije. HER grupu receptora čine četiri membranska proteina: receptor humanog epidermalnog faktora rasta HER1 (EGFR), HER2 (poznat i kao neu/c-erb B2), HER3 (c-erb-B3) i HER4 (c-erb-B4). Strukturno, HER receptori se sastoje od tri regiona: 1. ekstracelularnog dela za vezivanje liganda, 2. transmembranskog glikoproteinskog dela u kome se receptor vezuje za ćelijsku membranu i 3. intracelularnog područja (izuzev HER3) koji određuje aktivnost tirozin-kinaze. U inaktivnom stanju HER receptori su monomeri. Vezivanjem liganda i aktivacijom receptora dolazi do njihove homo i heterodimerizacije i aktivacije enzima tirozin-kinaze. Na taj način aktivira se kaskadni mehanizam biohemijskih promena u samoj ćeliji, što dovodi do ćelijske proliferacije, apoptoze, angiogeneze, promena u adhezivnosti i motilitetu ćelija. Poremećaj bilo koje faze ovog mehanizma može da dovede do prekomerne proliferacije, migracije ćelija i njihovog metastaziranja [11,12,13]. Klinički značaj amplifikacije gena receptora humanog epidermalnog faktora rasta HER2, lokalizovanog na hromozomu 17, u karcinomu dojke je ustanovljen pre više od dve decenije, kada je Slamon sa saradnicima objavio rezultate svojih istraživanja [14]. Od tada je u brojnim studijama dokazano da HER2 genska amplifikacija i/ili povećana proteinska ekspresija predstavljaju faktor loše prognoze udružen sa rapidnim tumorskim rastom, povećanim rizikom za pojavu recidiva nakon hirurškog tretmana, slab odgovor na konvencionalnu hemioterapiju i hormonsku terapiju i kraće preživljavanje [15,16,17,18,19]. 3 Povećana ekspresija HER2 može, ali i ne mora biti udružena sa drugim faktorima loše prognoze, kao što su veličine tumora, visok gradus histološke i nuklearne diferencijacije, negativan status steroidnih receptora (SR) estrogen (ER) i progesteron (PR) i visok proliferativni indeks [20,21]. HER2 genska amplifikacija ili povećana proteinska ekspresija viđa se kod 10- 34% karcinoma dojke [11]. Amplifikacija ovog gena (više od deset kopija) dovodi do izrazito povećane (over) ekspresije HER-2 receptora (povećana sinteza membranskog glikoproteina – receptora). Ovo podrazumeva HER-2 pozitivan tumorski status kod karcinoma dojke, a za rezultat ima nekontrolisan rast i deobu ćelija što predstavlja osnovu tumorske transformacije [22]. U poslednjih dvadeset godina otkriven je i definisan značaj HER-2 receptora, koji pokazuje overekspresiju u primarnom tumoru u 10-34% bolesnica sa karcinomom dojke. Pozitivnost HER-2 ima ne samo prognostički, već i prediktivni značaj, jer se na taj način mogu selektovati bolesnice koje su kandidati za primenu trastuzumab-a, monoklonskog antitela koje se vezuje za HER-2 receptore, dovodeći do ciljanog uništavanja tumorskih ćelija. Već prvi rezultati potvrdili su značajno veću terapijsku efikasnost kombinacije hemioteapije sa trastuzumab-om u odnosu na samo hemioterapiju [23,24]. Više studija pokazalo je da je petogodišnje preživljavanje kod većine ostalih maligniteta samo interval, nakon koga je recidiv izuzetno redak, a smrtni ishod veoma izvestan. Za karcinom dojke rizik od recidiva (kao lokalne ponovne pojave bolesti), traje godinama, pa čak i decenijama od inicijalne dijagnoze i sprovedenih modaliteta lečenja. Ovo se posebno odnosi na bolesnice kod kojih je karcinom dojke dijagnostikovan pre 50-te godine starosti, (oko 1/4 svih bolesnica), i kod kojih se karcinom dojke skoro može smatrati hroničnom bolešću. Naime, desetogodišnje preživljavanje za bolesnice sa ranim stadijumima bolesti iznosi 80-90% [8,9]. Takav tok bolesti opravdava tezu da je karcinom dojke od početka sistemska bolest sa mikrometastazama koje mogu "mirovati" godinama, a zatim preći u klinički manifestnu bolest. Konsenzus o izboru najsvrsihodnije terapije u različitim stadijumima i fazama kliničke evolucije karcinoma dojke na osnovu HER-2 statusa je u stalnim dopunjavanjima, a pojedine dileme perzistiraju (najadekvatnija hemioterapijska 4 kombinacija u adjuvantnom pristupu, izbor hormonoterapije u SR+ i HER-2 3+ statusu, broj linija hemioterapije u kojima istu treba kombinovati sa Trastuzumab-om, primena Trastuzumab-a u karcinomu dojke koji pokazuje HER-2 pozitivnost ali ne i 3+ hiperekspresiju), kao i primena Trastuzumab-a u neodjuvantom pristupu. Poslednjih desetak godina u literaturi je publikovan veći broj radova u kojima su istraživani različiti aspekti prediktivne i prognostičke značajnosti ekspresije HER-2 onkoproteina u karcinomu dojke kao i overekspresije HER-2 kao faktora nepovoljne prognoze. Međutim, podaci vezani za međuzavisnost HER-2 statusa prema položaju, veličini, tipu tumora, njegovog histološkog i nuklearnog gradusa, zahvaćenosti regionalnih limfnih nodusa kao i drugih faktora rizika, ne daju odgovore na sva pitanja [25,26,27,28,29,30,31,32,33]. 1.2. EMBRIOLOGIJA DOJKE Prvi embrionalni začeci dojki vide se u toku pete nedelje embrionalnog razvića a ispoljavaju se u vidu primitivne ektodermalne trake ili “mlečne linije” koja se pruža od aksile pa do sredine ingvinalnog predela. U grudnom delu od ove trake nastaje mlečni greben dok ostali deo mlečne linije podleže regresiji. Nekompletna regresija ili nekompletno iščezavanje primitivne mlečne trake osnov je za pojavu akcesornog tkiva dojke koje srećemo kod 2-6 % odraslih žena. Između 7 i 8 nedelje gestacije javlja se zadebljanje mamarnog začetka (stadijum mlečnog brežuljka), nakon čega sledi invaginacija u mezenhim zida grudnog koša (diskoidni stadijum) i trodimenzionalni rast (globularni stadijum). Dalja invazija mezenhima grudnog koša rezultira u spljoštavanju mlečne brazde (konusni stadijum) koji se vidi između desete i četrnaeste nedelje gestacije. Između 12-te i 16-te nedelje, mezenhimske ćelije se diferenciraju u glatke mišiće ćelije bradavice i areole. Zatim se razvijaju epitelni pupoljci (stadijum pupljenja), a onda se isti granaju stvarajući 15-250 epitelnih pruga (16-ta nedelja, stadijum grananja). Ove epitelne trake predstavljaju buduće sekretorne alveole dojke. Zatim nastaje sekundarni mamarni začetak sa diferencijacijom folikula dlaka, lojnih žlezda i znojnih žlezda ali su samo znojne žlezde vidljive u ovom periodu. Veruje se da se filogenetski paranhim dojke razvija od znojnih 5 žlezda od kojih nastaju Montgomery-eve žlezde ove bradavice. Ovaj razvoj nije pod hormonskim uticajem. Za vreme trećeg trimestra trudnoće, placentarni seksualni hormoni ulaze u fetalnu cirkulaciju i indukuju tunelizaciju razgranatog epitelnog tkiva (kanalikularni stadijum). Proces traje od 32 do 40-te nedelje razvića. U vreme termina za porođaj formirana su 15-25 duktusa koji se spajaju sa duktusima lojnih žlezda u blizini epiderma. Paranhimska diferencijacija ispoljava se izmedju 32 i 40-te nedelje kada se vide lobulo-alveolarne strukture koje sadrže kolostrum (terminalni vezikularni stadijum). U ovom stadijumu se vidi četvorostruko uvećanje mase mlečnih žlezda a istovremeno se razvija i bradavica – areolarni kompleks sa naglašenijom pigmentacijom. Kod neonatusa oba pola stimulirano tkivo dojke luči kolostrum koji se istiskuje iz dojke u toku 4-7 postpartalnih dana. Lučenje kolostruma regresira izmedju 3-4 nedelje kada dolazi i do involucije dojki zbog nestanka placentarnih hormona. Najčešće, pubertet kod devojčica počinje između desete i dvanaeste godine kao rezultat delovanja hipotalamičnih hormona koji se luče u hipotalamično-hipofizni portalni venski sistem. Bazofilne ćelije oslobađaju folikulostimulirajući i lutenizirajući hormon koji utiču na primarne ovarijalne folikule da sazrevaju u grafove folikule. Oni dalje luče estrogene najčešće u obliku 17-beta estradiola. Ovi hormoni indukuju rast i maturaciju dojki i genitalnih organa. U toku 1-2 godine posle menarhe hipotalamično hipofizna funkcija nije izbalansirana. U ovom periodu je sinteza estrogena izraženija od sinteze progesterona. Estrogeni izazivaju uzdužni rast duktusa dojki i rast duktalnog epitela. Terminalni duktuli, takođe, stvaraju pupoljke koji su prethodnici lobula dojki. Simultano se razvija periduktalno vezivno tkivo sa pojačanom vaskularnošću i razvojem masnog tkiva. Ove su promene indukovane estrogenima, sintetisanim u nezrelim overijalnim folikulima koji su anovulatorni. Kasnije folikuli ovuliraju i žuta tela stvaraju progesteron. Relativna uloga ovih hormona nije u potpunosti razjašnjena. Sam estrogen indukuje naglašeno povećanje duktusa dok progesteron to ne čini. Oba hormona indukuju duktulo-lobulo-alveolarni rast [34]. 6 1.3. ANATOMIJA DOJKE Dojka je modifikovana znojna žlezda čiji se začeci javljaju u šestoj nedelji fetalnog razvoja iz zadebljanja epiderma na ventralnoj strani tela. Posle rođenja kod muškaraca ostaje rudimentirani organ, a kod žena se progresivno razvija u pubertetu, da bi u trudnoći dostigla svoju punu morfološku zrelost i funkcionalnu aktivnost. U menopauzi dolazi do njene involucije i atrofije. Dojka se nalazi na prednjem zidu grudnog koša, izmedju II i V rebra, prednje aksilarne i parasternalne linije. Sastoji se od strome i žlezdanog tkiva. Stromu čini masno tkivo koje obavlja mlečnu žlezdu i fibrozno tkivo. Površna (potkožna) fascija kao i duboka koja pokriva m. pactoralis major obavijaju tkivo dojke i povezane su fibroznim trakama - Kuperovi ligamenti - čije zatezanje objašnjava retrakcija kože prilikom ravoja malignog tumora u dojci. Žlezdanih režnjeva dojke ima 15-20, i oni su međusobno odvojeni stromom. Svaki režanj ima veći broj režnjića (lobulusa), a svaki od lobulusa ima 10-100 acinusa. Lobulus je strukturna jedinica mlečne žlezde. Acinusi su obloženi kockastim epitelom i izlivaju se u mamilu preko mlečnih kanalića koji su obloženi cilindričnim epitelom. Ovakvnih mlečnih kanalića (duktusa) ima oko 20 i oni se na putu prema bradavici proširuju u ampule koje su obložene pločastoslojevitim epitelom. Kako dojka predstavlja target tkivo, ciklično se odigravaju histološke promene u njoj pod dejstvom ovarijalnih hormona, estrogena i progesterona. Pod dejstvom estrogena proliferiše eptiel duktusa i acinusa, a pod dejstvom progesterona dolazi do rasta i edema strome, do pojačane sekretorne aktivnosti acinusa i do proširenja duktusa. U daljem toku odigrava se skvrčavanje duktusa, deskvamiraju ćelije i nestaje edem. Vaskularizacija dojke ima sledeću anatomsku šemu: • medijalni deo dojke ishranjuje se preko rami perforantes-a. a. mamariea interne • duboka strana dojke vaskularizovana je bočnim probojnim granama interkostalnih arterija • najveći deo tkiva dojke, oko 80% irigira a. axillaris i njene grane: a. thoracoacromialis, a. thoracica lateralis i a. thoraco dorsalis. 7 Vene prate istoimene arterije a njihov je značaj u rasejavanju malignih ćelija iz tumora dojke u opštu cirkulaciju. Razlikuju se sledeće grupe vena: • aksilarna vena sa pritokama odvodi krv direktno u desno srce što objašnjava veliki procenat metastaza u plućima • površne (potkožne) vene dojke • grane v. mammariae interne takodje preko v. anonime odvode krv u plućnu cirkulaciju • Interkostalne vene komuniciraju sa vertebralnim venskim pleksusom koji nema valvula pa je moguća retrogradna cirkulacija pri promeni intraabdominalnog pritiska. To favorizuje diseminaciju malignih ćelija u kičmu, lobanju, karlicu, femur. Limfna drenaža dojke: Putem difuznog kutanog limfnog pleksusa i dubokog, subareolarnog (intramamarnog) pleksusa više od 85% limfne drenaže odvija se preko aksilarnih limfnih sudova i nodusa. U manjoj meri limfa ide u noduse mammariae interne (parasternalno), u paravertebralne limfne noduse, pozadi, preko interkostalnih limfnih sudova, kao i u infra i supraklavikularne limfne noduse. Komunikacije limfnog sistema dojke sa suprotnom dojkom postoji preko retromanubrijalnih limfnih nodusa kao i sa subdijafragmalnim nodusima i jetrom preko limfnih sudova mišića prednjeg trbušnog zida [34]. 1.4. PATOMORFOLOŠKI ASPEKT KARCINOMA DOJKE Maligni tumori dojke mogu biti porekla kože, masnog tkiva, mezenhimalnog tkiva i u najvećem procentu epitelnih struktura. Karcinom dojke potiče iz epitela kanalića (duktalni) i acinusa (lobularni). Klasifikacija karcinoma dojke – prema UICC I Neinvazivni karcinomi 1. duktalni in situ (intraductale) 2. lobularni in situ 8 II Invazivni karcinomi 1. duktalni - papilarni - tubularni - medularni - mucinozni - Mb. Paget 2. lobularni 3. adenocistični - sekretorni (juvenilni) - apokrini Duktalni karcinomi su najčešći i čine 70%- 80% svih malignih tumora dojke, pri čemu je najviše zastupljen histološki oblik, invazivni duktalni karcinom (2/3 svih duktalnih). Lobularni karcinom je zastupljen u manjem procentu [35]. 1.5. EPIDEMILOGIJA KARCINOMA DOJKE Karcinom dojke je bolest žena. Kod muškaraca se javlja retko i odnos je 1:100 [36]. U mnogim razvijenim zemljama kao i u zemljama u razvoju karcinom dojke je najčešće maligno oboljenje i vodeći je uzrok smrti kod žena obolelih od malilgnih bolesti [2,37]. Procenjuje se da je rak dojke u porastu kako zbog uticaja različitih faktora rizika, tako i zbog produženja životnog veka, bolje dijagnostike, tačnijih statističkih podataka i dr. Incidenca raka dojke varira širom sveta: ona je najniža u manje razvijenim zemljama a najveća u razvijenim zemaljama. U dvanaest svetskih regiona, godišnje standardizovane stope incidencije na 100.000 žena su: u istočnoj Aziji 18, južna i središnja Azija 22, podsaharska Afrika 22, jugoistočne Azija 26, severna Afrika i zapadna Azija 28, južna i srednja Amerika 42, istočna Evropa 49, južna Evropa 56, severna Evropa 73, okeanija 74, zapadna Evropa 78, u severnoj Americi 90. 9 Porast incidence karcinoma dojke je u razvijenim zemljama je delimično objašnjiv modernim načinom života i većim mogućnostima rane dijagnostike. U ovim zemljama u starosnoj strukturi samo 5% žena oboljeva od raka dojke u dobi ispod 40 godina. Kod žena u Srbiji, rak dojke je najčešći maligni tumor odgovoran za više od četvrtine svih malignih bolesti. Procenjuje se da svake godine otkrije oko 4000 novih slučajeva raka dojke. Ovaj karcinom je ujedno i vodeći uzrok smrti medju malignim tumorima kod žena. U Srbiji su od raka dojke 2006. godine umrle 1574 žene, što čini oko 18% smrtnosti od kancera u ženskoj populaciji. Incidenca raka dojke u Srbiji je u neprekidnom porastu (Slika 1). Sirova stopa mortaliteta se od 1970. godine povećala 4 puta, sa 10 na 100,000 žena na 40 u 2004. godini (Slika 2). Standardizovana stopa mortaliteta povećala se u istom periodu 2,5 puta (sa 8,3 na 20,7) [38]. Slika 1. Stope incidence raka dojke kod žena u centralnoj Srbiji i Vojvodini (sirove stope incidence na 100 000 žena, Registar za rak centralne Srbije, 2004. godina) 0 20 40 60 80 100 120 197 8 198 0 198 2 198 4 198 6 198 8 199 0 199 2 199 4 199 6 199 8 200 0 200 2 200 4 Sir ov a s top a i nc ide nc e n a 1 00 ,00 0 ž en a Vojvodina C Srbija 10 Slika 2. Stopa mortaliteta vodećih malignih bolesti kod žena u Srbiji (sirova stopa mortaliteta na 100 000 žena, Registar za rak centralne Srbije, 2004. godina) Učestalost raka dojke počinje naglo da raste nakon 40. godine života (Slika 3). Prema podacima za centralnu Srbiju za 2004. godinu, kod 22% žena je rak dojke dijagnostikovan pre 50. godine starosti. Slika 3. Uzrasno-specifične stope incidence raka dojke u centralnoj Srbiji (stope incidence na 100,000 žena, Registar za rak centralne Srbije, 2004. godina). 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00 40,00 45,00 19 70 19 73 19 76 19 79 19 82 19 85 19 88 19 91 19 94 19 97 20 00 20 03 Si ro va s to pa m or ta lit et a na 1 00 ,0 00 Pluca Kolorektum Dojka Grlić m. 0,0 0,6 3,8 10,2 18,5 45,8 96,5 135,5 172,5 212,4 212,0 205,6 185,9 172,2 0,0 50,0 100,0 150,0 200,0 250,0 0-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75+ Starosne grupe St op a in ci de nc e 11 1.6. KARCINOM DOJKE KAO SOCIJALNO MEDICINSKI PROBELM Dojka je organ pristupačan pregledu. Sam pregled je jednostavan i bezbolan ali pravovremeno javljanje žena obolelih od malignih tumora dojke lekaru nije zadovoljavajuće. Razlozi za to mogu biti subjektivni i objektivni. Strah od bolesti, smrti, svesno skrivanje bolesti, nivo zdrvstvene kulture i vaspitanje kao i podmukli razvoj bolesti u najvećem broju slučajeva (bezbolni tumori), najčešće su uzrok kasnijeg javljanja obolelih lekaru. Zbog svoje učestalosti i posledica karcinom dojke je veliki socijalno medicinski problem. Pre svega zbog toga što u značajnom broju pogađa žene u rano produktivnom periodu života, tako da pored fizičkih i psiholoških postoje i društveno ekonomske posledice [39]. To su odsustvovanja sa posle, nastanak invalidnosti, cena lečenja kao i prerana smrt obolelih. Iz tog razloga svetska zdravstvena organizacija (WHO) nacionalne programe za dojku različitih zemalja usmerava tako da podstakne pacijente kako bi dijagnostičko terapijski tretman započeo u ranoj fazi bolesti. Uprkos savremenom pristupu o sistemskom karakteru humanog karcinoma dojke, detekcija u ranom stadijumu znači dobru prognozu. U našim uslovima većina bolesnica otkriva tumor u dojci sama, najčešće slučajno. Iz tog razloga je razumljiva preporuka WHO da je neophodno edukovati žene i ukazati im na bitne simptome kako mogu prepoznati bolest u ranoj fazi. A to su: • tvrdina u dojci • otekline • izrasline • uvučene bradavice • ranice • sukrvica iz bradavice Nadalje, potrebno je sprovoditi selektivni skrining za žene sa visokim rizikom za oboljenje od karcinoma dojke. Hagenssen je sugerisao još pedesetih godina prošlog veka da je značajnije obučavanje žena za vršenje samopregleda nego edukacija lekara tehnici pregleda dojki [40]. 12 Dosadašnji rezultati nesumnjivo ukazuju da se žene od 40-65 godina starosti, osposobljene za samopregled u većoj meri javljaju lekaru sa nekim od obolenja dojke. 1.7. KARCINOM DOJKE KAO SISTEMSKA BOLEST U poslednjih pet decenija promenilo se shvatanje o biologiji i evoluciji karcinoma dojke. Novija saznanja o biologiji malignih tumora u suprotnosti su sa nekadašnjim stavom koji je ukazivao da je maligna bolest postepeni, kaskadni proces, u kome hematogeno rasejavanje malignih ćelija po organizmu nastaje nakon invazije regionalnih limfnih čvorića. Prema savremenim saznanjima karcinom dojke je sistemska bolest, a diseminacija malignih ćelija nastaje u najranijoj fazi razvoja tumora. To znači da zahvatanje regionalnih limfnih žlezda malignim ćelijama već predstavlja manifestaciju opšteg rasejavanja. Ovakva priroda maligne bolesti je najbolje proučena na primeru karcinoma dojke, medjutim, sve je više dokaza da se i karcinom jetre, pluća, kolona, kao i maligni melanom ponašaju na isti način. Mehanička teorija Virhovljevog shvatanja razvoja malignog procesa u tri faze: T – tumor, N – region, nodusi, M – udaljene metastaze (TNM) T N M 13 Savremeni pristup: Karcinom dojke počinje da metastazira u predkliničkoj fazi razvoja. To je period kada je tumor dijagnostički nedostupan. U momentu postavljanja dijagnoze započinje klinička faza razvoja karcinoma dojke, koja traje kraće, u poređenju sa vremenom proteklim od nastanka tumora, do prepoznavanja bolesti [41]. Rasejavanje malignih ćelija iz primarnog tumora odigrava se između desete i dvadesete deobe i to limfogeno, hematogeno i per continuitatem, mada je osnovni put kojim se prenose ćelije do vitalnih organa hematogeni. Maligne ćelije prodiru u krvne sudove direktno unutar tumora ili kroz limfatikovenske kanale limfnih nodusa. Utvrdjeno je da tumorska masa do 2mm u dijametru može u dužem periodu da se ishranjuje putem difuzije. Dalji razvoj tumora praćen je urastanjem novoformiranih kapilara u tumorsku masu te ovaj proces neovaskularizacije putem angiogeneze favorizuje rasejavanje malignih ćelija [42,43,44]. T N M 14 Smatra se da limfni nodusi ne predstavljaju mehanički mikrofilter, već su sedište imunološkog nadzora. Kancerske ćelije se mogu zadržati i razvijati unutar njih formirajući sekundarni depozit, da prolaze bez reakcije ili mogu biti uništene. Sistem limfnih sudova i vaskularna mreža čine usko povezani cirkulatorni sistem tako da maligne ćelije višestruko prelaze iz jednog sistema u drugi i formiraju mikrometastatska ognjišta koja se sadašnjim dijagnostičkim metodama ne mogu otkriti. Evolucija maligne bolesti nije samo posledica agresivnosti i malignog potencijala tumora, već je u sprezi sa otpornošću obolelog domaćina [45,46]. Nezahvaćenost regionalnih – aksilarnih limfnih nodusa metastazama karcinoma dojke je bitan, ali ne i isključivi pokazatelj povoljne prognoze obolelih. Dugoročne kliničke studije ukazuju na veliku smrtnost obolelih od karcinoma dojke sa negativnim limfnim nodusima u aksili nakon 30 i 40 godina od operacije [47]. Adair-ovo 30-godišnje praćenje pokazuje da samo 20% obolelih živi bez znakova bolesti [48]. Ovaj podatak ukazuje da uništavanje malignih ćelija rasejanih u ranoj fazi razvoja karcinoma dojke može poboljšati dugoročno preživljavanje i pokreće pitanje primene sistemske terapije u obolelih sa negativnim aksilarnim statusom: citotoksične hemioterapije, hormonske ili neke druge terapije koja bi povećala imunološki kapacitet obolele osobe. Avgusta 1981. godine National Surgical Adjuvant Breast Project (NSABP) je započeo randomizirani trajal B-13 kod obolelih od karcinoma dojke sa negativnim (histološki) limfnim nodusima u aksili i negativnim ER receptorskim statusom tumora (ER < 10 fmol/mg prot.). Rezultat ovog trajala je sledeći: preživljavanje bez znakova bolesti je značajno duže u bolesnica koje su nakon operacije (mastektomije) primale sistemsku hemoterapiju (Metotrexat i Fluorouracil) [49,50]. Milanski trajal za istu kategoriju bolesnica (negativni nodalni status i negativni ER receptorski status tumora) uvodi i Ciklofosfamid uz Metotrexat i Fluorouracil. Izveštaj ovog trajala ukazuje na duže preživljavanje, ukupno i bez znakova bolesti ovih bolesnica [51]. 15 1.8. OPERATIVNI PRISTUP LEČENJU MALIGNIH TUMORA DOJKE Prve kriterijume operabilnosti karcinoma dojke postavio Haagensen još 1943.godine [40]. Od tada se oni neprekidno menjaju [52]. Protokolom za dijagnostiku i lečenje malignih tumora dojke, predviđeno je operativno lečenje bolesnika sa mobilnim tumorom, bez znakova biološke agresivnosti i bez udaljenih metastaza. Indikaciono područje za primarni hirurški tretman obuhvata tumore klasifikovane prema TNM sistemu kao T1-3N0-1M0. Uslovno inoperabilni tumori klasifikovani su kao T1-4b, N2, M0 bez ili sa znacima biološke agresivnosti. Uz prethodnu biopsiju radi patohistološke verifikacije maligniteta i preoperativnu neoadjuvantnu i/ili zračnu terapiju, mogu se lečiti odgovarajućom hiruškom procedurom. Operativno lečenje tumora dojke započinje 1868. godine kada Pauer tumorektomijom pokušava da oslobodi žene ove opake bolesti. Krajem devetnaestog veka (1894. god.) Halsted uvodi radikalnu mastektomiju sa disekcijom aksile i ova operacija ostaje do danas prisutna u lečenju malignih tumora dojke. Primena ove operativne metode zasnivala se na shvatanju da je karcinom dojke u početku lokoregionalni proces, koji se širi striktno limfogeno, najpre u limfne žlezde istostrane aksile. Iz tog razloga se pretpostavljalo da se širokom ekscizijom kože dojke, uklanjanjem tkiva dojke, dezinsercijom velikog i malog grudnog mišića i evakuacijom (disekcijom) limfnih čvorova i masnog tkiva aksile, može postići eradikacija svih malignih ćelija. Hematogena diseminacija tada nije bila poznata. Prevazilaženjem shvatanja o razvoju maligne bolesti kao postepenom, kaskadnom procesu, sužava se indikaciono područje za primenu Halsted-ove operacije na tumore koji fiksiraju pektoralni mišić. Manje radikalne, tzv. modifikovane radikalne mastektomije koje se primenjuju, uz eventualnu adjuventnu terapiju, jesu operacije po Patey-u i po Madden-u. Operacija po Patey-u obuhvata amputaciju dojke, dezinserciju malog grudnog mišića i blok disekciju limfnih čvorića i masnog tkiva čitave aksile. Manje radikalna je operacija po Madden-u kojom se uklanja dojka, donja i srednji sprat aksile. Fisher i Veronesi 1976. godine započinju nezavisno, randomizirane trajale čiji nalazi dovode do promene u radikalnosti hiruškog pristupa u lečenju malignih tumora dojke. Naime, trajal 16 NSABP i trajal Nacionalnog kancer instituta – Milano, pokazali su da se tumori dijametra do 2 cm, sa klinički negativnim (neopipljivim) nodusima u aksili, mogu lečiti segmentnom resekcijom dojke i disekcijom aksile uz primenu postoperativne zračne terapije, kao i adjuvantne hemio i/ili hormono terapije shodno definitivnom histopatološkom nalazu. Kako nije utvrđena statistički značajna razlika u preživljavanju u odnosu na radikalnu mastektomiju, Unija za Međunarodnu Kontrolu Raka (UICC) prihvata i promoviše stav da se tumori klasifikovani kao T1 N0 M0, mogu lečiti kvadrantektomijom uz disekciju aksile i primenu postoperativne zračne terapije i/ili adjuvantne hemio i hormono terapije [53,54,55]. Trend u konzervativnom odnosno poštednom lečenju karcinoma dojke, malog dijametra, niskog histološkog i nuklearnog gradusa, ide u pravcu lampektomije.Tom prilikom se uklanja segment dojke sa tumorom. U poslednjih 20 godina poštedne operacije su od slobodnih ivica resekcije tumora, koje su se u početku kretale od 2 do 5 cm, promenile, tako da je danas adekvatna tumorektomija ona kod koje su ivice resekcije slobodne a da su pri tome u samom hiruškom radu te distance svedene na 1 do 2 mm [56,57] . Takođe je i obim disekcije istostrane pazušne jame sveden na minimum uvođenjem sentil provere i odstranjivanjem samo pozitivnih stražarskih limfnih nodusa [34,58,59,60,61,62,63]. Ovo napredovanje se i dalje nastavlja uz prateće novine hemio, hormono i zračne terapije. 17 2. CILJEVI RADA 2.1. CILJEVI ISTRAŽIVANJA 2.1.1. Određivanje ekspresije HER-2 receptora u primarnom tumoru bolesnica sa inicijalno operabilnim karcinomom dojke kliničkog stadijuma I i IIA i IIB. 2.1.2. Ispitivanje povezanosti HER-2 statusa u primarnom tumoru sa: a. kliničkim stadijumom regionalnih limfnih čvorova u aksili prema TNM klasifikaciji (N0 i N1); b. patološkim stadijumom regionalnih limfnih čvorova u aksili prema pTNM klasifikaciji (pN0, pN1, pN2) i brojem zahvaćenih regionalnih limfnih čvorova u aksili u slučaju patološkog pN stadijuma; c. lokalizacijom primarnog tumora u odnosu na kvadrante dojke (lateralna, medijana i centralna); d. veličinom primarnog tumora prema TNM i pTNM klasifikaciji (T1-T3; pT1- pT3). e. vrednostima histološkog i nuklearnog gradusa tumora 2.1.3. Analiza povezanosti sledećih faktora rizika: a. pozitivna vs negativna porodična i lična anamneza b. starosti bolesnica pri postavljanju inicijalne dijagnoze (≤45 vs >45); c. menstrualnog statusa bolesnica (premenopauzne vs postmenopauzne); d. ekspresije/amplifikacije HER-2 u primarnom tumoru potvrđena CISH analizom; e. statusom estrogenskih receptora u primarnom tumoru (Er scor ≤3 vs Er scor >3); f. statusom progesteronskih receptora u primarnom tumoru (Pgr scor ≤3 vs Pgr scor >3); g. vrednostima histološkog i nuklearnog gradusa tumora; h. kliničkog statusa regionalnih limfnih čvorova u aksili (N0 vs N1); i. patološkog statusa regionalnih limfnih čvorova (pN0 vs pN1-2); j. brojem zahvaćenih regionalnih limfnih čvorova u aksili kod lateralne, medijalne i centralne lokalizacije primarnog tumora (≥4 vs <4); 18 2.2. RADNA HIPOTEZA Naša radna hipoteza polazi od pretpostavke da postoji korelacija između over ekspresije HER-2 onkoproteina u primarnom tumoru i metastatski zahvaćenih regionalnih limfnih nodusa u istostranoj aksili, kod bolesnica sa inicijalno operabilnim karcinomom dojke, uzimajući u obzir lokalizaciju primarnog tumora (lateralni, medijalni, centralni kvadrant dojke) i broj zahvaćenih pozitivnih regionalnih limfnih nodusa u aksili. Kod medijalne i centralne lokalizacije primarnog tumora u dojci nepovoljan faktor prognoze je zahvaćenost jednog ili više limfnih čvorova, a kod lokalizacije u lateralnim kvadrantima pozitivan nalaz u najmanje četiri od deset ili više limfnih čvorova. Dalje smo pretpostavili da postoji zavisnost između amplifikacije HER-2 onkoproteina i veličine primarnog tumora u dojci (T1-T3 i pT1-pT3), patohistološkog nalaza tipa tumora, histološkog i nuklearnog gradusa tumora, i kliničkog i patološkog stadijuma bolesti (klinički stadijum I vs II, patološki stadijum I vs II). S obzirom da je overekspresija HER-2 onkoproteina faktor nepovoljne prognoze, takođe smo pretpostavili da postoji korelacija sa drugim faktorima nepovoljne prognoze u ličnoj anamezi (rana menarha, kasna menopauza, bez trudnoće i porođaja, starosno doba, hormonska nezavisnost karcinoma dojke, benigne bolesti dojke, prethodna endokrina terapija) i porodičnoj anamnezi (karcinom dojke, ovarijuma i ostali karcinomi u prvoj i drugoj liniji srodstva). 19 3. MATERIJAL I METODOLOGIJA 3.1. MATERIJAL Naše naučno istraživanje je eksperimentalno-klinička studija sprovedena u Institutu za onkologiju i radiologiju u Beogradu (IORS), u periodu od 2006 do 2009. godine, u koju su bile uključene 346 bolesnice sa inicijalno operabilnim karcinomom dojke. Kriterijumi za uključivanje u studiju su bili: 1. patološki dokazan karcinom dojke, 2. klinički stadijum I i II, 3. ženski pol, 4. starosna dob (od 24 do 84 godina starosti), 5. bez prethodne maligne bolesti u ličnoj anamnezi. Kod svih bolesnica je, osim incijalnog određivanja HER-2 statusa IHH metodom, rađena i dopunska provera CISH metodom, a čiji su nalazi uzimani kao definitivni. Obrađivani su svi podaci. U daljoj analizi evaluirani su podaci za duktalni invazivni (DC) i lobularni invazivni karcinom (LC), dok pacijentkinje sa mešovitim, in situ ili drugim tipovima karcinoma dojke, nisu uzimane u obradu. Za donošenje konzilijarne odluke u preoperativnoj pripremi uz klinički pregled rađeni su mamografija, ehosonografja dojki i abdomena, nativni Rtg pluća i osnovne laboratorijske analize sa biohemijom. U pojedinim slučajevima, a zbog nalaza prethodnih analiza, rađene su i dodatne analize poput MRI dojki, scintigrafija skeleta, Rtg koštanog sistema i određivanje Tu markera CEA i CA 15-3 [64]. Medicinska dokumentacija je u formi istorije bolesti u kojoj su sadržani podaci potrebni za statističke analize rezultata: a. pozitivna vs negativna porodična i lična anamneza; b. starost; c. menstrualni status bolesnica; d. klinički i patološki stadijum regionalnih limfnih nodusa iz disektata istostrane aksile; e. lokalizacija primarnog tumora u odnosu na kvadrante dojke; f. veličina primarnog tumora; g. histološki i nuklearni gradus tumora; h. status steroidnih receptora određenih patološki imunohistohemijskom metodom (IHH); i. HER-2 status iz primarnog tumora će se inicijalno određivati IHH metodom a potvrđivati i uzimati kao definitivni rezultat dobijen korišćenjem CISH metode. 20 3.2. METODOLOGIJA HER-2 TESTIRANJA Osnovne metode testiranja koje se koriste za određivanje HER2 statusa jesu: 1. imunohistohemijska (IHH), za povećanu membransku ekspresiju i 2. in situ hibridizacija (ISH), korišćenjem bilo fluorescencije (FISH) iIi hromogena (CISH), kojima se određuje genska amplifikacija. Važnost ranog testiranja je u tome da se HER2 pozitivnost razvija u ranom stadijumu kancerogeneze, kao i da HER2 status primarnog tumora korelira sa metastatskim žarištima [13]. Imunohistohemija je primarna metoda utvrđivanja HER2 statusa kojom se, primenom anti-HER2 antitela, u svrhu terapijskog tretmana, odvajaju jasno pozitivni (skor 3+) od negativnih (skor 0/1+) slučajeva i, takođe, vrši trijaža graničnih (skor 2+) slučajeva koji zahtevaju dalje ispitivanje FISH ili CISH tehnikom, kako bi se utvrdilo da li pokazuju gensku amplifikaciju. Godine 1969 Gall i Pardue su predstavili stručnoj javnosti tehniku poznatu kao in situ hibridizacija (ISH), kojom je omogućeno lokalizovanje nukleinskih kiselina u pojedinacnim ćelijama [65]. Ova metoda se do danas razvila u standardno primenjivu fluorescentnu in situ hibridizaciju (FISH) koja koristi fluorohrom-konjugovane nucleotide, i sve šire korišćenu hromogenu in situ hibridizaciju (CISH) [13, 66,67,68,69]. Alternativna metoda FISH tehnici za utvrđivanje broja kopija HER2 gena i njihove moguće polizomije, jeste CISH metoda koja koristi hromogeni metod detekcije [70,71,72,73,74,75,76]. Za razliku od već potvrđene FISH metode u kojoj se koriste dve boje, CISH se bazira na kolorimetrijskoj detekciji samo jedne probe. Nakon detaljne i pažljive optimizacije metode, kao tačka koja označava graničnu vrednost za definisanje HER2 amlifikacije prihvaćeno je šest ili više kopija. Tipična genska amplifikacija CISH predstavlja peroksidaza-pozitivne grupe (klastere) multiplih kopija gena, koji se lako identifikuju na mikroskopu sa 40 puta objektivskim povećanjem. U slučajeve sa visokom amplifikacijom gena ubrajaju se oni sa deset i više kopija po ćeliji, u više od 50% tumorskih ćelija. Slabom amplifikacijom smatraju se oni sa 6-9 kopija po ćeliji u više od 50% tumorskih ćelija. Bez amplifikacije su oni sa 1-5 kopija po ćeliji u više od 50% tumorskih ćelija. 21 Kao najveća prednost CISH metode smatra se to što se rezultati mogu očitavati na standardnom svetlosnom mikroskopu, bez upotrebe objektiva sa uljnom imerzijom. FISH metoda, sa druge strane, zahteva skupi fluorescentni mikroskop snabdeven sistemom za snimanje slike. Takođe, FISH pločice se teško mogu arhivirati, dok je čuvanje CISH pločica jednostavno izvodljivo [77]. 3.3. METODOLOGIJA ODREĐIVANJA STEROIDNIH RECEPTORA Za određivanje statusa steroidnih receptora ER i PR u primarnom tumoru korišćena je IHH metoda monoklonskim antitelima. Dobijene vrednosti su interpretirane prema skoring sistemu 0-8. Skor 4 je granična vrednost. Za skor 3 i manje tumorski receptori se smatraju negativnim a skor 4 i više pozitivnim. 3.4. METODOLOGIJA ODREĐIVANJA HISTOLOŠKOG I NUKLEARNOG GRADUSA Interpretacija vrednosti histološkog i nuklearnog gradusa se izražava u 3 kategorije (gradusa). Za ocenjivanje se koriste arhiktetura tumorskog tkiva, oblik i veličina ćelija i jedra, tip i raspored hromatina i broj uočenih mitoza. Gradus I izražava dobru diferentovanost, gradus II umerenu a gradus III slabu diferentovanost. 3.5. STATISTIČKA OBRADA I TEKSTOVI Statistička metodologija je obuhvatala: • ispitivanje saglasnosti uzoračkih raspodela sa normalnom raspodelom (grafici: Normal Q-Q Plot i Histogram; testovi: Kolmogorov-Smirnov i Shapiro-Wilk) • opis parametara od značaja pomoću mera deskriptivne statistike (frekvencije, procenti, srednja vrednost (prosek), medijana, standardna devijacija (SD) i opseg). 22 • testiranje razlika između ispitivanih parametara, pomoću testova: Pearson χ 2 • Za nivo statističke značajnosti usvojena je vrednost p=0.05 test; Fisher exact test i Wilcoxon rank sum test with continuity correction. • Analiza podataka je rađena u statističkom programu R version 2.8.1 (2008-12-22) Copyright (C) 2008 The R Foundation for Statistical Computing; ISBN 3-900051- 07-0. • Za grafički prikaz podataka korišćen je Microsoft Office Excel 2007. 23 4. REZULTATI 4.1. OPŠTE KARAKTERISTIKE BOLESNICA, OBOLJENJA I LEČENJA 4.1.1. Karakteristike bolesnica U analizu je uključeno ukupno 346 bolesnica. Starosna dob je određivana u vreme postavljanja dijagnoze i početka inicijalnog lečenja. Srednja vrednost (SD) je 56,23 (12.63%). Medijana starosti je 56 godina sa rasponom od 24-84 godina. Granična vrednost za analizu je starost do 45 godina i 45 i više godina. Menstrualni status je određivan kao premenopauzne, perimenopauzne i postmenopauzne bolesnice. Pozitivna porodična anamneza za sve malignitete je nađena kod 93 bolesnice (26,88%), a za maligne bolesti dojke kod 29 bolesnica (8,38%). Osnovne karakteristike bolesnica prikazane su u tabeli 1 i na grafikonima 1, 2 i 3. Tabela 1 – Opšte karakteristike bolesnica Karakteristike N (%) Ukupno bolesnica Starost (godine) Srednja vrednost (SD) Medijana (opseg) Starost – kategorije od ≤45 od >45 Menostatus Premeno Perimeno Menopauza Porodična anamneza Ne Da Bez podataka Porodična anamneza –dojka Dojka Drugo Bez podataka 346 (100%) 56.23 (12.63) 56 (24-84) 71 (20.52%) 275 (79.48%) 91 (26.3%) 23 (6.65%) 232 (67.05%) 198 (57.23%) 93 (26.88%) 55 (15.9%) 29 (8.38%) 64 (18.5%) 253 (73.12%) Kao što je prikazano u tabeli 1, bolesnice su uglavnom starosti preko 45 godina, prosečna starost iznosi 56 godina (grafikon 1), u najvećem broju menopauzne (grafikon 2) i bez pozitivne porodične anamneze (grafikon 3). 24 Grafikon 1. Starost bolesnica Grafikon 2. Menstrualni status bolesnica 20,52% 79,48% Starost ≤ 45 god. Starost ≥ 45 god. 26.3 6.65 67.05 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Premeno Perimeno Menopauzna % 25 Grafikon 3. Porodična anamneza bolesnica 4.1.2. Kliničke karakteristike oboljenja U studiju su uključene bolesnice sa kliničkom veličinom tumora kategorija T1 (0- 2cm), T2 (2-5cm) i T3 (preko 5cm), kao i sa kategorijama limfnih nodusa N0 (nepalpabilni) i N1 (palpabilni lifni nodusi) u istostranoj aksili. Sve bolesnice su bile bez verifikovanih metastastaza - M0. Klinički stadijum bolesti je obuhvatao karegorije: klinički stadijum I (T1N0M0), klinički stadijum IIA (T0N1M0 ili T1N1M0 ili T2N0M0) i klinički stadijum IIB (T2N1M0 ili T3N0M0), dok je lokalizacija tumora (određivana u odnosu na kvadrant dojke) bila centralna, lateralna ili medijalna. Za nepalpabilne tumore, lokalizacija je kategorisana kao nepoznata. Osnovne kliničke karakteristike oboljenja su prikazane u tabeli 2 i na grafikonima 4, 5, 6 i 7. 57,23%26,88% 15,90% Negativna porodična anamneza Pozitivna porodična anamneza Bez podataka 26 Tabela 2 – Kliničke karakteristike oboljenja Karakteristike N (%) Klinički stadijum bolesti I (T1N0) IIA (T0N1 ili T1N1 ili T2N0 ) IIB (T2N1 ili T3N0) 90 (26.01%) 124 (35.84%) 132 (38.15%) Klinički stadijum bolesti – kategorije I IIA IIB 90 (26.01%) 124 (35.84%) 132 (38.15%) T u TNM klasifikaciji T0 T1 T2 T3 6 (1.73%) 128 (36.99%) 193 (55.78%) 19 (5.49%) N u TNM klasifikaciji N0 N1 189 (54.62%) 157 (45.38%) Lokalizacija tumora – kvadrant dojke Centralni kvadrant Lateralni Medijalni Nepoznato (nepalpabilni) 33 (9.54%) 244 (70.52%) 58 (16.76%) 11 (3.18%) Kao što se vidi iz tabele 2, klinički stadijumi IIA i IIB su slične učestalosti, dok je najmanje zastupljen bio klinički stadijum I (grafikon 4). U TNM klasifikaciji, najučestalija veličina tumora je bila T2 (grafikon 5), dok su u nodalnom statusu N0 i N1 vrednosti bile slične učestalosti (grafikon 6). Prema položaju lateralna lokalizacija tumora je bila najfrekventnija (grafikon 7). 27 Grafikon 4. Klinički stadijum bolesti – kategorije Grafikon 5. T u TNM klasifikaciji 26,01% 35,84% 38,15% Klinički stad. I Klinički stad. IIA Klinički stad. IIB 1.73%5.49% 36.99% 55.78% T0 T1 T2 T3 28 Grafikon 6. N u TNM klasifikaciji Grafikon 7. Lokalizacija tumora – kvadrant dojke 54.62% 45.38% N0 N1 70.52 16.76 9.54 3.18 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Lateralni Medijalni Centralni kvadrant Nepoznato (nepalpabilni) % 29 4.1.3. Karakteristike hirurškog lečenja Sprovedeno operativno lečenje je svrstano u dve osnovne kategorije. Poštedne operacije i modifikovane radikalne operacije. Njihova učestalost je prikazana u tabeli 3 i grafikonu 8. Tabela 3 – Karakteristika hiruškog lečenja Karakteristike N (%) Tip hiruške intervencije Poštedna operacija 169 (48.84%) Radikalne/modifikovane radikalne 177 (51.16%) Grafikon 8. Tip hirurške intervencije 48,84% 51,16% Poštedna operacija Radikalne/modifikovane radikalne 30 4.1.4. Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa U definitivnom histopatološkom nalazu, određeni su tipovi tumora kao: duktalni invazivni, lobularni invazivni, mešani duktalno-lobularni karcinomi i ostali tipovi tumora (svi drugi tipovi). Od strane patologa određivana je veličina tumora pT čije su kategorije bile: pT1 - tumori veličine do 2cm, pT2 - tumori veličine od 2 do5cm i pT3- tumori veličine više od 5cm, dok su bez podataka kategorisane one bolesnice kod kojih patolog nije mogao da odredi veličinu karcinoma. Histološki i nuklearni gradusi su obeležavani na isti način: 0 - kada se gradus nije mogao odrediti, 1 - najveći stepen diferencijacije, 2 - srednji stepen, 3 - najmanji stepen diferencijacije. Nodalni status određivan od strane patologa prikazan je kroz ukupan broj odstranjenih limfnih nodusa istostrane aksile, bez metastaza i sa metastazama. Za određivanje postoperativnog stadijuma bolesti korišćen je pT, pN sistem stadiranja u okviru patološke TNM klasifikacije. Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 4 i na grafikonima 9, 10, 11, 12, 13 i 14. Tabela 4 – Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa Patohistološke karakteristike N (%) Patohistološke karakteristike N (%) Tip tumora Duktalni Lobularni Ostali Duktalni + lobularni 183 (52.89%) 118 (34.10%) 23 (6.65%) 22 (6.36%) Patološki N u celoj grupi pacijenata Bez zahvaćenih nodusa Sa zahvaćenim nodusima Nema podataka 171 (49.42%) 149 (43.06%) 26 (7.51%) pT tumora pT1 pT2 pT3 Bez podataka 193 (55.78%) 142 (41.04%) 5 (1.45%) 6 (1.73%) Lgl ekstirpirane Srednja vrednost (SD) Medijana (Opseg) Bez podataka 16.03 (5.41) 15 (1-43) 26 Histološki gradus 1 2 3 Bez podataka 16 (5.32%) 262 (87.04%) 11 (3.99%) 12 (4.62%) Lgl pozitivne Srednja vrednost (SD) Medijana (Opseg) Bez podataka 1.94 (3.63) 0 (0-31) 26 Nuklearni gradus 1 2 3 Bez podataka 26 (8.64%) 242 (80.4%) 27 (8.97%) 6 (1.99%) Postoperativni stadijum I IIA IIB Bez podataka 115 (33.24%) 117 (33.82%) 82 (23.70%) 32 (9.25%) 31 Kao što se vidi iz tabele 4, najučestaliji je duktalni tip tumora (grafikon 9), patohistološka pT1 pa pT2 kategorija (grafikon 10), dok je najučestaliji histološki gradus 2 (grafikon 11), i nuklearni gradus 2 (grafikon 12). Slična je učestalost patološki zahvaćenih i nezahvaćenih limfnih nodusa (grafikon 13), dok su postoperativni stadijumi I i IIA slične frekventnosti (grafikon 14). Grafikon 9. Patohistološke karakteristike – Tip tumora Grafikon 10. Patohistološke karakteristike – pT tumora 52.89 34.1 6.65 6.36 0 10 20 30 40 50 60 Duktalni Lobularni Ostali Duktalni + Lobularni % 55.78 41.04 1.45 1.73 0 10 20 30 40 50 60 pT1 pT2 pT3 Bez podataka % 32 Grafikon 11. Patohistološke karakteristike – Histološki gradus tumora Grafikon 12. Patohistološke karakteristike – Nuklearni gradus tumora 5,32% 87,04% 3,99% 4,62% Histološki gradus 1 Histološki gradus 2 Histološki gradus 3 Bez podataka 8,64% 80,40% 8,97% 1,99% Nuklearni gradus 1 Nuklearni gradus 2 Nuklearni gradus 3 Bez podataka 33 Grafikon 13. Patohistološke karakteristike – Patološki N Grafikon 14. Patohistološke karakteristike – Postoperativni stadijum 49.42% 43.06% 7.51% Bez zahvaćenih nodusa Sa zahvaćenim nodusima Nema podataka 33,24% 33,82% 23,70% 9,25% Postop. stad. I Postop. stad. IIa Postop. stad. IIb Bez podataka 34 4.1.5. Status steroidnih receptora i HER-2 status određen IHH i CISH metodom Estrogenski i progesteronski receptori određivani su IHH metodom i njihove kategorije su bile: ER+ tj. PR+ (skor 4 i više), odnosno ER- tj. PR- (skor 3 i manje). Istom (IHH) metodom, kao početni nalaz, određivana je i HER-2 ekspresija, odnosno njene kategorije: 1+ (negativna), 2+ (granična) i 3+ (pozitivna). Definitivni nalaz HER-2 statusa određivan je CISH metodom, a dobijene kategorije su bile: CISH- (bez amplifikacije) i CISH+ (sa amplifikacijom). Karakteristike steroidnih receptora prikazane su u tabelama 5 i 6 i grafikonima 15, 16 i 17. Tabela 5 – Status steroidnih receptora odredjen IHH metodom Steroidni receptori N (%) Estrogen Srednja vrednost (SD) Medijana (opseg) Bez podataka 4.1 (3.47) 6 (0-8) 0 Estrogen pozitivnost u celoj grupi bolesnika ER negativno (≤3) ER granična vrednost (=4) ER pozitivno (>4) 150 (43.35%) 7 (2.02%) 189 (54.62%) Estrogen pozitivnost – kategorije ER negativno (≤3) ER (≥4) 150 (43.35%) 196 (56.65%) Progesteron Srednja vrednost (SD) Medijana (opseg) Bez podataka 3.47 (3.38) 4 (0-8) 0 Progesteron pozitivnost u celoj grupi pacijenata PR negativno (≤3) PR granicna vrednost (=4) PR pozitivno (>4) Progesteron pozitivnost – kategorije PR negativno (≤3) PR (≥4) 170 (49.13%) 19 (5.49%) 157 (45.38%) 170 (49.13%) 176 (50.87%) Kao što se vidi iz tabele 5, prosečni skor progesterona je bio nešto niži nego kod estrogena. Pozitivne kategorije i ER i PR (skor ≥ 4) su neznatno učestalije od negativnih (grafikon 15 i 16). 35 Grafikon 15. Steroidni receptori: Estrogen - kategorije Grafikon 16. Steroidni receptori: Progesteron - kategorije 43.35% 56.65% ER- ER+ 49.13% 50.87% PR- PR+ 36 Tabela 6 – Prikaz parametra HER-2 ekspresije i HER-2 amplifikacije određen CISH metodom u celoj grupi bolesnika Status N (%) HER2 status HER2 + (negativno) HER2 ++ HER2 +++ CISH status CISH- CISH+ Bez podataka 218 (63.01%) 76 (21.97%) 52 (15.03%) 270 (78.32%) 72 (20.81%) 3 (0.87%) Kao što se vidi iz tabele 6, najučestalije su negativne kategorije i HER2 i CISH statusa (grafikon 17). Grafikon 17. CISH status 78.32 20.81 0.87 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + Bez podataka % 37 4.2. HER-2 STATUS ODREĐEN CISH METODOM I OPŠTE KARAKTERISTIKE BOLESNICA I OBOLJENJA 4.2.1. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica Prema amplifikaciji c-erbB-2 gena određenoj po CISH metodi, bolesnice su podeljene u dve grupe: CISH+ (sa amplifikacijom) i CISH- (bez ampifikacije). Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 7. Tabela 7 - HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike obolelih Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Starost (godine) Prosek(SD) Medijana (opseg) 56.86 (12.61) 30-84 53.15 (12.12) 24-80 3 3 Wilcoxon rank sum* W=11280; p=0.41 Starost – kategorije od ≤45 godina od >46 godina 53 (19.56%) 218 (80.44%) 18 (25%) 54 (75%) 0 (0%) 3 (100%) Pearson χ2 test χ21 Menstrualni status Premeno Perimeno Menopauza =1.03; p=0.31 69(25.46%) 20(7.38%) 182(67.16%) 22(30.56%) 3(4.17%) 47(65.28%) (0%) 0(0%) 3(100%) Fisher Exact test p=0.54 Porodična anamneza negativna pozitivna Bez podataka 150(55.35%) 73(26.94%) 48(17.71%) 45(62.5%) 20(27.78%) 7(9.72%) 3(100%) 0(0%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Porodična anamneza - dojka Dojka + Drugo + Bez podataka =0.09; p=0.77 24(8.86%) 49(18.08%) 198(73.06%) 5(6.94%) 15(20.83%) 52(72.22% 0(0%) 0(0%) 3(100%) Pearson χ2 test χ21=0.45; p=0.5 *Wilcoxon rank sum test with continuity correction Kao što se vidi iz tabele 7, CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su homogene po svim navedenim parametrima (starosna dob - godine i kategorije, menstrualni status, opšta porodična anamneza i porodična anamneza vezano za maligne bolesti dojke). 38 4.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i karakteristike oboljenja 4.2.2.1. Povezanost kliničkih i histopatoloških karakteristika oboljenja Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije veličina tumora u tabeli 8. Tabela 8 – T u TNM klasifikaciji u odnosu na patološki T Klinički T u TNM Patološki T - N(%) Total pT1 pT2 pT3 Bez podataka T0 T1 T2 T3 5(1.45%) 109(31.5%) 79(22.83%) 0(0%) 0(0%) 19(5.49%) 109(31.5%) 14(4.05%) 0(0%) 0(0%) 2(0.58%) 3(0.87%) 1(0.29%) 0(0%) 3(0.87%) 2(0.58%) 6(1.73%) 128(36.99%) 193(55.78%) 19(5.49%) Kao što se vidi iz tabele 8, adekvatno je stadirana veličina tumora kod 221/346 (63,87%) bolesnice. Od toga je T1=pT1 kod 109 bolesnica (31,5%), T2=pT2 takođe kod 109 bolesnica (31,5%) i T3=pT3 kod 3 bolesnice (0,87%). Podstadirano je 26/346 (7,51%) bolesnica. Od toga je kod 5 (1,45%) bolesnica stadiran T0 a potvrđen pT1, kod 19 (5,49%) bolesnica stadiran je T1 a potvrđen pT2, dok je kod 2 (0,58%) bolesnice stadiran T2 a potvrđen pT3. Prestadirano je ukupno 93/346 (26,88%) bolesnice, a od toga je kod 79 (22,83%) bolesnica stadiran T2 a potvrđen pT1 i kod 14 (4,05%) bolesnica je stadiran T3 a potvrđen pT2. Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije nodalnog statusa u tabeli 9. Tabela 9 – N u TNM klasifikaciji u odnosu na patološki N Klinički N u TNM Zahvaćenost nodusa - N(%) Total Nezahvaćeni Zahvaćeni Bez podataka N0 106(30.64%) 68(19.65%) 15(4.34%) 189(54.62%) N1 65(18.79%) 81(23.41%) 11(3.18%) 157(45.38%) 39 Kao što se vidi iz tabele 9, po nodalnom statusu adekvatno je stadirano 187/346 (53,95%) bolesnica. Od toga N0=pN0 106 (30,64%) i N1=pN1 81 (23,41%). Podstadirano je 65 bolesnica(19,65%) a prestadirano 65 (18,79%). Na osnovu dobijenih nalaza kliničkog i patološkog T i N, određivani su klinički i postoperativni (patološki) stadijumi bolesti. Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije stadijuma bolesti u tabelama 10 i 11. Tabela 10 – Klinički i postoperativni stadijum Klinički stadijum Postoperativni stadijum N (%) I II Bez podataka Klinički stadijum I Klinički stadijum II 55(15.9%) 60(17.34%) 31(8.96%) 168(48.55%) 4(1.16%) 28(8.09%) Kao što se vidi iz tabele 10, adekvatno su stadirani stadijumi bolesti kod 223/346 (64.45%) bolesnica. Podstadirano je 31/346, a prestadirano je 60/346. Tabela 11 – Klinički i postoperativni stadijum (detaljno) Klinički stadijum Postoperativni stadijum Bez podataka I IIA IIB Klinički stadijum I Klinički stadijum IIA Klinički stadijum IIB 55(15.9%) 45(13.01%) 15(4.34%) 27(7.8%) 40(11.56%) 50(14.45%) 4(1.16%) 27(7.8%) 51(14.74%) 4(1.16%) 12(3.47%) 16(4.62%) Adekvatno su stadirani stadijumi bolesti kod 146/346 (42.2%) bolesnica. Podstadirano je 58/346 (16.76%), a prestadirano je 110/346 (31.8%). 40 4.2.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike oboljenja Za potrebe ovog istraživanja bilo je od značaja ispitivanje razlika između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica po karakteristikama oboljenja. Rezultati analize prikazani su u tabeli 12. Tabela 12 - HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike oboljenja Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Kvadrant dojke centralni lateralni medijalni nepoznato (nepalpabilni) 25(9.23%) 195(71.96%) 43(15.87%) 8(2.95%) 8(11.11%) 47(65.28%) 14(19.44%) 3(4.17%) 0(0%) 2(66.67%) 1(33.33%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.65 T u TNM klasifikaciji T0 T1 T2 T3 3(1.11%) 104(38.38%) 147(54.24%) 17(6.27%) 3(4.17%) 24(33.33%) 43(59.72%) 2(2.78%) 0(0%) 0(0%) 3(100%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.17 N u TNM klasifikaciji N0 N1 148(54.61%) 123(45.39%) 38(52.78%) 34(47.22%) 3(100%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Klinički stadijum detaljno I IIA IIB =0.08; p=0.78 70(25.83%) 98(36.16%) 103(38.01%) 20(27.78%) 23(31.94%) 29(40.28%) 0(0%) 3(100%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Klinički stadijum I II =0.45; p=0.8 70(25.83%) 201(74.17%) 20(27.78%) 52(72.22%) 0(0%) 3(100%) Pearson χ2 test χ21=0.11; p=0.73 CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su homogene po svim karakteristikama oboljenja (lokalizacija tumora, veličina, nodalni status i klinički stadijumi bolesti). Statistička značajnost nađena je samo kod veličine tumora (p=0.17) 41 4.2.2.3. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike oboljenja Za potrebe ovog istraživanja bilo je od značaja ispitivanje razlika između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica po histopatološkim karakteristikama oboljenja. Rezultati analize prikazani su u tabeli 13. Tabela 13 - HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike oboljenja Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Patološki T pT1 pT2 pT3 Bez podataka 149(54.98%) 117(43.17%) 3(1.11%) 2(0.74%) 41(56.94%) 25(34.72%) 2(2.78%) 4(5.56%) 3(100%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.28 Patološki N bez zahvaćenih nodusa sa zahvaćenim nodusima Bez podataka 132(48.71%) 118(43.54%) 21(7.75%) 37(51.39%) 31(43.06%) 4(5.56%) 2(66.67%) 0(0%) 1(33.33%) Pearson χ2 test χ21 Postoperativni stadijum postop. stadijum I postop. stadijum IIA postop. stadijum IIB Bez podataka =0.05; p=0.81 92(33.95%) 89(32.84%) 67(24.72%) 23(8.49%) 21(29.17%) 28(38.89%) 15(20.83%) 8(11.11%) 2(66.67%) 0(0%) 0(0%) 1(33.33%) Pearson χ2 test χ21=1.34; p=0.51 Kao što se vidi iz tabele 13, između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica nema statistički značajne razlike u odnosu na kategorije patološkog T, patološkog N i postoperativnih stadijuma. 42 4.2.2.4. HER-2 status određen CISH metodom i histološki i nuklearni gradus tumora U daljem toku istraživanja bilo je od značaja ispitivanje razlika između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica po histološkim i nuklearnim gradusima tumora. Rezultati analize prikazani su u tabeli 14 i na grafikonima 18 i 19. Tabela 14 – Histološki i nuklearni gradus tumora Gradusi CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Histološki gradus Hist. gradus 1 Hist. gradus 2 Hist. gradus 3 Bez podataka 17(6.27%) 233(85.98%) 8(2.95%) 13(4.8%) 1(1.39%) 61(84.72%) 7(9.72%) 3(4.17%) 1(33.33%) 2(66.67%) 0(0%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.015 Nuklearni gradus Nuk.gradus 1 Nuk.gradus 2 Nuk.gradus 3 Bez podataka 26(9.59%) 221(81.55%) 19(7.01%) 5 (1.85%) 2(2.78%) 53(73.61%) 15(20.83%) 2 (2.78%) 1(33.33%) 1(33.33%) 1(33.33%) 0 (0%) Fisher Exact Test p=0.00135 Analizirajući povezanost CISH statusa sa histološkim i nuklearnim gradusom tumora dobijene su statistički značajne razlike (tabela 14). Histološki gradus 2 je najzastupljeniji u obe podgrupe. U CISH- je učestaliji histološki gradus 1, dok je u CISH+ učestaliji histološki gradus 3 (grafikon 18). Nuklearni gradus 2 je najzastupljeniji u obe podgrupe. U CISH- je učestaliji nuklearni gradus 1, dok je u CISH+ učestaliji nuklearni gradus 3 (grafikon 19). 43 Grafikon 18. Histološki gradus tumora Grafikon 19. Nuklearni gradus tumora 6,27 1,39 85,98 84,72 2,95 9,72 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + % Histološki gradus 1 Histološki gradus 2 Histološki gradus 3 p<0,05* * Fisher Exact Test 9,59 2,78 81,55 73,61 7,01 20,83 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + % Nuklearni gradus 1 Nuklearni gradus 2 Nuklearni gradus 3 p<0,01* * Fisher Exact Test 44 4.2.2.5. HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori Rezultati testiranja steroidnih receptora u odnosu na CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su prikazani u tabeli 15 i na grafikonu 20. Tabela 15 - HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori Steroidni receptori CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Estrogen Prosek (SD) Medijana (opseg) 4.56 (3.42) 6 (0-8) 2.25 (3.02) 0 (0-8) 3/346 (0.87%) Wilcoxon rank sum* W=13511; p=1.77⋅10- 7 Estrogen pozitivnost ER negativno (≤3) ER granicna vrednost (=4) ER pozitivno (>4) 103(38.01%) 4(1.48%) 164(60.52%) 47(65.28%) 3(4.17%) 22(30.56%) 3(100%) Fisher Exact Test p=1.5⋅10 Estrogen kategorije (poz./neg.) ER negativno (≤3) ER ≥4 -5 103(38.01%) 168(61.99%) 47(65.28%) 25(34.72%) 0(0%) 3(100%) Pearson χ2 test χ21=17.19; p=3⋅10 Progesteron Prosek(SD) Medijana (opseg) -5 3.88 (3.41) 5 (0-8) 1.83 (2.77) 0 (0-8) 3/346 (0.87%) Wilcoxon rank sum* W=13006; p=4.57⋅10 Progesteron pozitivost PR negativno (≤3) PR granicna vrednost (=4) PR pozitivno (>4) - 6 118(43.54%) 14(5.17%) 139(51.29%) 51(70.83%) 5(6.94%) 16(22.22%) 1(33.33%) 0(0%) 2(66.67%) Pearson χ2 test χ21=19.56; p=6⋅10 Progesteron kategorije (poz./neg.) PR negativno (≤3) PR ≥4 -5 118(43.54%) 153(56.46%) 51(70.83%) 21(29.17%) 1(33.33%) 2(66.67%) Pearson χ2 test χ21=16.95; p=4⋅10-5 *Wilcoxon rank sum test with continuity correction Analizirajući povezanost CISH statusa sa steroidnim receptorima dobijene su statistički značajne razlike (tabela 15). U CISH+ u odnosu na CISH- podgrupu vrednosti estrogena i progesterona su značajno niže i značajno su frekventnije ER- i PR- kategorije (grafikon 20). 45 Grafikon 20. ER i PR vrednosti u odnosu na CISH metodu 4.2.2.6. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološki tipovi tumora Rezultati testiranja PH tipova tumora u odnosu na CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su prikazani u tabeli 16 i na grafikonu 21. Tabela 16 – PH tip tumora PH tip tumora CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Duktalni Lobularni Ostalo Duktalni+lobularni 125(46.13%) 107(39.48%) 19(7.01%) 20(7.38%) 55(76.39%) 11(15.28%) 4(5.56%) 2(2.78%) 3(100%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) Fisher Exact Test p=4.22⋅10-5 Analizirajući povezanost CISH statusa sa PH tipovima tumora dobijena je statistički značajna razlika (tabela 16). Naime, u obe podgrupe dominira duktalni tip tumora, pri čemu je njegova učestalost značajno veća u CISH+ nego u CISH- podgrupi, dok je lobularni tip značajno učestaliji u CISH- nego u CISH+ podgrupi. 38,01 65,28 61,99 34,72 43,54 70,83 56,46 29,17 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CISH - CISH + % ER negativno (≤3) ER ≥4 PR negativno (≤3) PR ≥4 46 Grafikon 21. PH tip tumora 4.3. HER-2 STATUS ODREĐEN CISH METODOM U PODGRUPI BOLESNICA SA DUKTALNIM I LOBULARNIM KARCINOMOM DOJKE (N=301) 4.3.1. Opšte karakteristike bolesnica, oboljenja i lečenja 4.3.1.1. Karakteristike bolesnica Starosna dob formirane podgrupe DC/LC od 301 bolesnice je prikazana kroz srednju vrednost (SD) 55,93 (12,48) i medijanu(opseg) 56 (24-83). Granična vrednost za analizu je starost do 45 godina i 45 i više godina. Menstrualni status je određivan kao premenopauzne, perimenopauzne i postmenopauzne bolesnice. Pozitivna porodična anamneza za sve malignitete je nađena kod 78 (25,91%) bolesnice a za maligne bolesti dojke kod 24 (7,97%) bolesnica. Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 17. 46,13 76,39 39,48 15,28 7,01 5,567,38 2,78 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + % Duktalni Lobularni Ostalo Duktalni + Lobularni p<0,01* * Fisher Exact Test 47 Tabela 17 – Opšte karakteristike bolesnica Karakteristike N (%) Starost (godine) Prosek(SD) Medijana (opseg) Starost – kategorije od ≤45 od >45 Menstrualni status Premeno Perimeno Menopauza Porodična anamneza Ne Da Bez podataka Porodična anamneza –dojka Dojka Drugo Bez podataka Ukupno bolesnica 55.93 (12.48) 56 (24-83) 61 (20.27%) 240 (79.73%) 79 (26.25%) 21 (6.98%) 201 (66.78%) 177 (58.8%) 78 (25.91%) 46 (15.28%) 24 (7.97%) 54 (17.94%) 223 (74.09%) 301 (100%) Kao što se u tabeli 17 vidi, bolesnice su uglavnom starosti preko 45 godina (prosečna starost iznosi 56 godina), menopauzne i bez pozitivne porodične anamneze. 4.3.1.2. Kliničke karakteristike oboljenja U studiju podgrupe DC/LC su uključene bolesnice sa kliničkom veličinom tumora kategorija T1 (0-2cm), T2 (2-5cm) i T3 (preko 5cm), kao i sa kategorijama limfnih nodusa N0 (nepalpabilni) i N1 (palpabilni lifni nodusi) u istostranoj aksili. Sve bolesnice su bile bez verifikovanih metastastaza - M0. Ovo je podrazumevalo kliničke stadijume bolesti I i IIA i IIB. Lokalizacija tumora (određivana u odnosu na kvadrant dojke) bila je centralna, lateralna ili medijalna, dok je za nepalpabilne tumore lokalizacija kategorisana kao nepoznata. Osnovne kliničke karakteristike oboljenja prikazane su u tabeli 18. 48 Tabela 18 – Kliničke karakteristike oboljenja Karakteristike N (%) Klinički stadijum bolesti I (T1N0) IIA (T0N1 ili T1N1 ili T2N0 ) IIB (T2N1 ili T3N0) 79 (26.25%) 110 (36.54%) 112 (37.21%) Klinički stadijum bolesti – kategorije I IIA i IIB 79 (26.25%) 222 (73.75%) T u TNM klasifikaciji T0 T1 T2 T3 6 (1.99%) 114 (37.87%) 167 (55.48%) 14 (4.65%) N u TNM klasifikaciji N0 N1 162 (53.82%) 139 (46.18%) Lokalizacija tumora – kvadrant dojke Centralni kvadrant Lateralni Medijalni Nepoznato (nepalpabilni) 30 (9.97%) 212 (70.43%) 50 (16.61%) 9 (2.99%) Dobijeni rezultati pokazuju da su klinički stadijumi IIA i IIB slične učestalosti, dok je najmanje zastupljen bio I klinički stadijum. U TNM klasifikaciji, najučestalija vrednost je bila T2 zatim T1, dok su N0 i N1 bili slične učestalosti. Lateralna lokalizacija tumora je bila najfrekventnija. 4.3.1.3. Karakteristike hirurškog lečenja Sprovedeno operativno lečenje je svrstano u dve osnovne kategorije. Poštedne operacije i modifikovane radikalne operacije. Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 19. 49 Tabela 19 – Karakteristika hiruškog lečenja N (%) Tip hiruške intervencije Poštedna operacija 150 (49.83%) Radikalne/modifikovane radikalne 151 (50.17%) Kao što se vidi iz tabele 19, učestalost radikalnih tipova operacija je nešto malo veća od poštednih operacija. 4.3.1.4. Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa U definitivnom histopatološkom nalazu, određeni su tipovi tumora kao: duktalni invazivni, lobularni invazivni, mešani duktalno-lobularni karcinomi i ostali tipovi tumora (svi drugi tipovi). Od strane patologa određivana je veličina tumora pT čije su kategorije bile: pT1 - tumori veličine do 2cm, pT2 - tumori veličine od 2 do5cm i pT3- tumori veličine više od 5cm, dok su bez podataka kategorisane one bolesnice kod kojih patolog nije mogao da odredi veličinu karcinoma. Histološki i nuklearni gradusi su obeležavani na isti način: 0 - kada se gradus nije mogao odrediti, 1 - najveći stepen diferencijacije, 2 - srednji stepen, 3 - najmanji stepen diferencijacije. Nodalni status određivan od strane patologa prikazan je kroz ukupan broj odstranjenih limfnih nodusa istostrane aksile, bez metastaza i sa metastazama. Za određivanje postoperativnog stadijuma bolesti korišćen je pT, pN sistem stadiranja u okviru patološke TNM klasifikacije. Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 20. 50 Tabela 20 – Patohistološke karakteristike tumora i nodalnog statusa Patohistološke karakteristike N (%) Tip tumora Duktalni Lobularni 183 (60.8%) 118 (39.2%) pT tumora pT1 pT2 pT3 Bez podataka 171 (56.81%) 121 (40.2%) 4 (1.33%) 5 (1.66%) Histološki gradus 1 2 3 Bez podataka 16 (5.32%) 262 (87.04%) 11 (3.65%) 12 (3.99%) Nuklearni gradus 1 2 3 Bez podataka 26 (8.64%) 242 (80.4%) 27 (8.97%) 6 (1,99%) Patološki N Bez zahvaćenih nodusa Sa zahvaćenim nodusima Nema podataka 149 (49.5%) 131 (43.52%) 21 (6.98%) Lgl ekstirpirane Prosek(SD) Medijana (Opseg) Bez podataka 16.13 (5.55) 15 (1-43) 21 Lgl pozitivne Prosek(SD) Medijana (Opseg) Bez podataka 2.06 (3.83) 0 (0-31) 21 Postoperativni stadijum I IIA IIB Bez podataka 100 (33.22%) 104 (34.55%) 71 (23.59%) 26 (8.64%) Najučestaliji je duktalni tip tumora. Najučestaliji pT je pT1 (171 bolesnica), zatim pT2 (121 bolesnica) i najmanje pT3 (4 bolesnice). Bez podataka je bilo 5 bolesnica. Histološki i nuklearni gradus 2 su najučestaliji. Slična je učestalost patološki zahvaćenih i nezahvaćenih limfnih nodusa, dok su postoperativni stadijumi I i IIA slične frekventnosti. 51 4.3.1.5. Status steroidnih receptora i HER-2 status određen CISH metodom Estrogenski i progesteronski receptori određivani su IHH metodom i njihove kategorije su bile: ER+ tj. PR+ (skor 4 i više), odnosno ER- tj. PR- (skor 3 i manje). Istom (IHH) metodom, kao početni nalaz, određivana je i HER-2 ekspresija, odnosno njene kategorije: 1+ (negativna), 2+ (granična) i 3+ (pozitivna). Definitivni nalaz HER-2 statusa određivan je CISH metodom, a dobijene kategorije su bile: CISH- (bez amplifikacije) i CISH+ (sa amplifikacijom). Osnovne karakteristike steroidnih karakteristike prikazane su u tabelama 21 i 22. Tabela 21 – Status steroidnih receptora određen IHH metodom Steroidni receptori N (%) Estrogen - vrednosti Prosek (SD) Medijana (opseg) Bez podataka 4.05 (3.44) 6 (0-8) 0 Estrogen pozitivnost ER negativno (≤3) ER granična vrednost (=4) ER pozitivno (>4) 132 (43.85%) 7 (2.33%) 162 (53.82%) Estrogen – kategorije (poz./neg.) ER negativno (≤3) ER (≥4) 132 (43.85%) 169 (56.15%) Progesteron - vrednosti Prosek(SD) Medijana (opseg) Bez podataka 3.52 (3.38) 4 (0-8) 0 Progesteron pozitivnost PR negativno (≤3) PR granicna vrednost (=4) PR pozitivno (>4) 147 (48.84%) 17 (5.65%) 137 (45.51%) Progesteron – kategorije (poz./neg.) PR negativno (≤3) PR (≥4) 147 (48.84%) 154 (51.16%) Kao što se vidi iz tabele 21, prosečni skor progesterona je bio nešto niži nego kod estrogena. Pozitivne kategorije i ER i PR (skor ≥ 4) su neznatno učestalije od negativnih. 52 Tabela 22 – Prikaz parametra HER-2 ekspresije i HER-2 amplifikacije (CISH) Status N (%) HER2 status HER2 + (negativno) HER2 ++ HER2 +++ CISH status CISH- CISH+ Bez podataka 187 (62.13%) 66 (21.93%) 48 (15.95%) 232 (77.08%) 66 (21.93%) 3 (1.00%) Rezultati prikazani u tabeli 22 pokazuju da su najučestalije kategorije HER-2 i CISH statusa. 4.3.2. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica i oboljenja 4.3.2.1. HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike bolesnica Prema amplifikaciji HER-2 onkoproteina određenoj po CISH metodi, bolesnice su podeljene u dve grupe: CISH+ (sa amplifikacijom) i CISH- (bez amplifikacije). Osnovne karakteristike prikazane su u tabeli 23. Tabela 23 - HER-2 status određen CISH metodom i opšte karakteristike obolelih Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Starost (godine) Prosek(SD) Medijana (opseg) 56.51 (12.43) 57 (30-83) 53.12 (12.11) 53 (24-80) 3 3 Wilcoxon rank sum* W=8737; p=0.08 Starost – kategorije od ≤45 godina od >46 godina 46 (19.83%) 186 (80.17%) 15 (22.73%) 51 (77.27%) 0 (0%) 3 (100%) Pearson χ2 test χ21 Menstrualni status Premeno Perimeno Menopauza =0.27; p=0.61 60(25.86%) 18(7.76%) 154(66.38%) 19(28.79%) 3(4.55%) 44(66.67%) (0%) 0(0%) 3(100%) Fisher Exact test p=0.68 Porodična anamneza negativna pozitivna Bez podataka 131(56.47%) 61(26.29%) 48(17.24%) 43(65.15%) 17(25.76%) 6(9.09%) 3(100%) 0(0%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Porodična anamneza Dojka + Drugo + Bez podataka =0.25; p=0.61 20(8.62%) 41(17.67%) 171(73.71%) 4(6.06%) 13(19.7%) 49(74.24%) 0(0%) 0(0%) 3(100%) Fisher Exact test p=0.56 *Wilcoxon rank sum test with continuity correction 53 Kao što se vidi iz tabele 23, CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su homogene po svim navedenim parametrima (starosna dob – godine i kategorije, menstrualni status, opšta porodična anamneza i porodična anamneza vezana za maligne bolesti dojke). Nije nađena statisčka značajna razlika u analiziranim kategorijama. 4.3.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i karakteristike oboljenja 4.3.2.2.1. Povezanost kliničkih i histopatoloških karakteristike oboljenja Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije veličina tumora u tabeli 24. Tabela 24 – T u TNM klasifikaciji u odnosu na patološki T Klinički T u TNM Patološki T - N(%) Total pT1 pT2 pT3 Bez podataka T0 T1 T2 T3 5 (1.66%) 98 (32.56%) 68 (22.59%) 0 (0%) 0 (0%) 16 (5.32%) 95 (31.56%) 10 (3.32%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (0.66%) 2 (0.66%) 1 (0.33%) 0 (0%) 2 (0.66%) 2 (0.66%) 6 (1.73%) 128 (36.99%) 193 (55.78%) 19 (5.49%) Adekvatno je stadirana veličina tumora kod 195/301 (64,78%) bolesnice. Od toga je T1=pT1 kod 98 bolesnica (32,56%), T2=pT2 kod 95 bolesnica (31,56%) i T3=pT3 kod 2 bolesnice (0,66%). Podstadirano je 23/301 (7,64%) bolesnica. Od toga T0 vs pT1 5 (1,66%), T1 vs pT2 16 (5,32%) i T2 vs pT3 2 (0,66%). Prestadirano je ukupno 78/301 (25,91%) bolesnica, a od toga T2 vs pT1 68 (22,59%) i T3 vs pT2 10 (3,32%). 54 Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije nodalnog statusa u tabeli 25. Tabela 25 – N u TNM klasifikaciji u odnosu na patološki N Klinički N u TNM Zahvaćenost nodusa - N(%) Total Nezahvaćeni Zahvaćeni Bez podataka N0 91(30.23%) 59(19.6%) 12(3.99%) 162(53.82%) N1 58(19.27%) 72(23.92%) 9(2.99%) 139(46.18%) Prema nodalnom statusu adekvatno je stadirano 163/301 (54,15%) bolesnica. Od toga N0=pN0 91 (30,23%) i N1=pN1 72 (23,92%). Podstadirano je 59 bolesnica (19,6%), a prestadirano 58 (19,27%). Na osnovu dobijenih nalaza kliničkog i patološkog T i N, određivani su klinički i postoperativni (patološki) stadijumi bolesti. Za potrebe ovog istraživanja prikazane su kliničke i patohistološke kategorije stadijuma bolesti u tabelama 26 i 27. Tabela 26 – Klinički i postoperativni stadijum Klinički stadijum Postoperativni stadijum N (%) I II Bez podataka Klinički stadijum I Klinički stadijum II 49(16.28%) 51(16.94%) 26(8.64%) 149(49.5%) 4(1.33%) 22(7.31%) Kao što se vidi iz tabele 26, adekvatno su stadirani stadijumi bolesti kod 198/301 (65,78%) bolesnica, podstadirano je 26/301 (8,64%) a prestadirano je 51/301 (16,94%) bolesnica. 55 Tabela 27– Klinički i postoperativni stadijum(detaljno) Klinički stadijum Postoperativni stadijum Bez podataka I IIA IIB I IIA IIB 49(16.28%) 39(12.96%) 12(3.99%) 23(7.64%) 35(11.63%) 46(15.28%) 3(1%) 25(8.31%) 43(14.29%) 4(1.33%) 11(3.65%) 11(3.65%) Kao što se vidi iz tabele 27, adekvatno su stadirani stadijumi bolesti kod 127/301 (42,20%) bolesnica, podstadirano je 51/301 (16,95%) a prestadirano je 97/301 (32,23%) bolesnica. 4.3.2.2.2. HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike oboljenja Ispitujući razlike između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica po karakteristikama oboljenja, nismo dobili statističku značajnost. Rezultati analize su prikazani u tabeli 28. Tabela 28 - HER-2 status određen CISH metodom i kliničke karakteristike oboljenja Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Kvadrant dojke centralni lateralni medijalni nepoznato (nepalpabilni) 23(9.91%) 166(71.55%) 36(15.52%) 7(3.02%) 7(10.61%) 44(66.67%) 13(19.7%) 2(3.03%) 0(0%) 2(66.67%) 1(33.33%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.82 T u TNM klasifikaciji T0 T1 T2 T3 3(1.29%) 93(40.09%) 124(53.45%) 12(5.17%) 3(4.55%) 24(31.82%) 40(60.61%) 2(3.03%) 0(0%) 0(0%) 3(100%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.21 N u TNM klasifikaciji N0 N1 124(53.45%) 108(46.55%) 35(53.02%) 31(46.97%) 3(100%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Klinički stadijum detaljno I IIA IIB =0.004; p=0.95 62(26.72%) 84(36.21%) 86(37.07%) 17(25.76%) 23(34.85%) 26(39.39%) 0(0%) 3(100%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21 Klinički stadijum I II =0.12; p=0.95 62(26.72%) 170(73.28%) 17(25.76%) 49(74.24%) 0(0%) 3(100%) Pearson χ2 test χ21=0.024; p=0.87 56 Kao što se vidi iz tabele 28, CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su homogene po svim karakteristikama oboljenja (lokalizacija tumora, veličina, nodalni status i klinički stadijumi bolesti). 4.3.2.2.3. HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike oboljenja Analizom histopatološki određene veličine tumora, zahvaćenosti limfnih nodusa i postoperativnim/patološkim stadijumom bolesti i poređenjem sa CISH vrednostima, nismo dobili statičku značajnost koja bi ukazivala na njihovu međuzavisnost. Rezultati su prikazani na tabeli 29. Tabela 29 - HER-2 status određen CISH metodom i histopatološke karakteristike oboljenja Karakteristike CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Patološki T pT1 pT2 pT3 Bez podataka 129(55.6%) 99(42.67%) 2(0.86%) 2(0.86%) 39(59.09%) 22(33.33%) 2(3.03%) 3(4.55%) 3(100%) 0(0%) 0(0%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.17 Patološki N bez zahvaćenih nodusa sa zahvaćenim nodusima Bez podataka 114(49.14%) 102(43.97%) 16(3.9%) 33(50%) 29(43.94%) 4(6.06%) 2(66.67%) 0(0%) 1(33.33%) Pearson χ2 test χ21 Postoperativni stadijum postop. stadijum I postop. stadijum IIA postop. stadijum IIB Bez podataka =0.004; p=0.95 78(33.62%) 80(34.48%) 56(24.14%) 18(7.76%) 20(30.3%) 24(36.36%) 15(22.73%) 7(10.61%) 2(66.67%) 0(0%) 0(0%) 1(33.33%) Pearson χ2 test χ21=1.34; p=0.51 57 4.3.2.2.4. HER-2 status određen CISH metodom i histološki i nuklearni gradus tumora Za potrebe ovog istraživanja bilo je od značaja ispitivanje razlika između CISH- i CISH+ podgrupa bolesnica po histološkim i nuklearnim gradusima tumora. Rezultati analize su prikazani u tabeli 30 i na grafikonima 22 i 23. Tabela 30 – Histološki i nuklearni gradus tumora Gradusi CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Histološki gradus Hist. gradus 1 Hist. gradus 2 Hist. gradus 3 Bez podataka 14(6.03%) 201(86.64%) 6(2.59%) 11(4.74%) 1(1.52%) 59(89.39%) 5(7.58%) 1(1.52%) 1(33.33%) 2(66.67%) 0(0%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.079 Nuklearni gradus Nuk.gradus 1 Nuk.gradus 2 Nuk.gradus 3 Bez podataka 23(9.91%) 191(82.33%) 14(6.03%) 4(1.72%) 2(3.03%) 50(75.76%) 12(18.18%) 2(3.03%) 1(33.33%) 1(33.33%) 1(33.33%) 0(0%) Fisher Exact Test p=0.00371 Analizirajući povezanost CISH statusa sa histološkim i nuklearnim gradusom tumora dobijene su statistički značajne razlike za nuklearni ali ne i histološki gradus (tabela 30). Histološki gradus 2 je najzastupljeniji u obe podgrupe. U CISH- je učestaliji histološki gradus 1, dok je u CISH+ učestaliji histološki gradus 3 (grafikon 22). Nuklearni gradus 2 je najzastupljeniji u obe podgrupe. U CISH- je učestaliji nuklearni gradus 1, dok je u CISH+ učestaliji nuklearni gradus 3 (grafikon 23). 58 Grafikon 22. Histološki gradus tumora Grafikon 23. Nuklearni gradus tumora 6,03 1,52 86,64 89,39 2,59 7,58 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 CISH - CISH + % Histološki gradus 1 Histološki gradus 2 Histološki gradus 3 p=0.079* * Fisher Exact Test 9,91 3,03 82,33 75,76 6,03 18,18 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + % Nuklearni gradus 1 Nuklearni gradus 2 Nuklearni gradus 3 p<0,01* * Fisher Exact Test 59 4.3.2.2.5. HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori Statisičke značajnosi su dobijene i poređenjem CISH statusa sa vrednostima estrogenskih i progesteronskih receptora. Za testiranje su korišćene srednja vrednost (SD) i medijana (opseg) i vrednosti receptora po grupama i kategorijama. Rezultati su prikazani u tabeli 31. Tabela 31 - HER-2 status određen CISH metodom i steroidni receptori Steroidni receptori CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Estrogen Prosek (SD) Medijana (opseg) 4.49 (3.41) 6 (0-8) 2.36 (3.06) 0 (0-8) 3/346 (0.87%) Wilcoxon rank sum* W=10391; p=4.18⋅10-6 Estrogen pozitivnost ER negativno (≤3) ER granicna vrednost (=4) ER pozitivno (>4) 90(38.79%) 4(1.71%) 138(59.48%) 42(63.64%) 3(4.55%) 21(31.82%) 3(100%) Fisher Exact Test p=0.00017 Estrogen kategorije (poz./neg.) ER negativno (≤3) ER ≥4 90(38.79%) 142(61.21%) 42(63.64%) 24(36.36%) 0(0%) 3(100%) Pearson χ2 test χ21 Progesteron Prosek(SD) Medijana (opseg) =12.85; p=0.00034 3.94 (3.41) 5 (0-8) 1.92 (2.82) 0 (0-8) 3/346 (0.87%) Wilcoxon rank sum* W=10192; p=1.55⋅10 Progesteron pozitivost PR negativno (≤3) PR granicna vrednost (=4) PR pozitivno (>4) -6 100(43.1%) 12(5.17%) 120(51.72%) 46(69.7%) 5(7.58%) 15(22.73%) 1(33.33%) 0(0%) 2(66.67%) Pearson χ2 test χ21 Progesteron kategorije(poz./neg.) PR negativno (≤3) PR ≥4 =17.47; p=0.00016 100(43.1%) 132(56.9%) 46(69.7%) 20(30.3%) 1(33.33%) 2(66.67%) Pearson χ2 test χ21=14.54; p=0.00014 *Wilcoxon rank sum test with continuity correction U CISH+ u odnosu na CISH- podgrupu vrednosti estrogena i progesterona su značajno niže i značajno su frekventnije ER- i PR- kategorije. 60 4.3.2.2.6. HER-2 status određen CISH metodom i pT vrednosti histopatoloških tipova tumora (DC/LC) Rezultati testiranja PH tipova tumora u odnosu na CISH- i CISH+ podgrupe bolesnica su prikazani u tabelama 32 i 33 i na grafikonima 24 i 25. Tabela 32 – PH tip tumora PH tip tumora CISH status - N(%) Test CISH- CISH+ Bez podataka Duktalni Lobularni 125(53.88%) 107(46.12%) 55(83.33%) 11(16.67%) 3(100%) 0(0%) Pearson χ2 test χ21=18.64 p=2⋅10-5 Analizirajući povezanost CISH statusa sa PH tipovima tumora dobijena je statistički značajna razlika (tabela 32). Naime, u obe podgrupe dominira duktalni tip tumora, pri čemu je njegova učestalost značajno veća u CISH+, nego u CISH- podgrupi, dok je lobularni tip značajno učestaliji u CISH-, nego u CISH+ podgrupi. Grafikon 24. PH tip tumora 53.88 83.33 46.12 16.67 0 20 40 60 80 100 CISH - CISH + % Lobularni Duktalni 61 Analiza CISH amplifikacije u odnosu na tipove tumora pokazala je značajnu statističku razliku i to najviše kod duktalnog karcinoma 55 bolesnica (83,33%) a kod lobularnih karcinoma 11 bolesnica (16,67%). Daljom analizom ustanovljena je značajna statistička razlika i u veličini tumora u odnosu na CISH ampifikaciju. Naime pT1, posebno duktalni karcinomi, pokazali su znatno veću statističku razliku amplifikacije HER-2 onkoproteina u odnosu lobularne karcinome iste ili veće patološki merene veličine. Tabela 33- CISH+ u odnosu na kategorije PH tipa karcinoma i pT Grafikon 25. CISH+ u odnosu na PH tip Ca i kategorije pT1 i pT2+3 67.65 90.91 73.68 91.84 32.35 9.09 26.32 8.16 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% DC LC DC LC pat.T=1 pat.T=2+3 CISH + CISH - p=0.00049 p=0.019 Karakteristika DC LC Test pT1 CISH- CISH+ 102 (100%) 69 (67.65%) 33 (32.35%) 66 (100%) 60 (90.91%) 6 (9.09%) Pearson χ2 test χ21=12.16; p=4.9*10-4 pT2 CISH- CISH+ 73 (100%) 55 (75.34%) 18 (24.66%) 48 (100%) 44 (91.67%) 4 (8.33%) Fisher exact test p=0.0294 pT3 CISH- CISH+ 3 (100%) 1 (33.33%) 2 (66.67%) 1 (100%) 1 (100%) - Fisher exact test p=1 N (%) 178 (100%) 115 (100%) - 62 5. DISKUSIJA S obzirom na specifičnost problematike, većina do sada objavljenih studija u ovoj oblasti su retrospektivne, najčešće bazirane na hospitalnim serijama i relativno velikim brojem bolesnika. Nedostatak prospektivnih studija je što zahtevaju izuzetno dugi, praktično neograničeni period istraživanja. Do sada sprovede neprospektivne studije su ograničene kratkim vremenom praćenja (1-5 godina od postavljanja dijagnoze) i nedovoljne da daju odgovore na kompeksnu povezanost prognostičkih i prediktivnih faktora rizika za karcinom dojke. Pre 25 godina Salamon i autori su otkrili da je amplifikacija HER-2 onkoproteina udružena sa lošijim ishodom bolesti [14]. Jedna od najvećih meta analiza koje je objavio Ross sa saradnicima obuhvatala je više od 27000 bolesnica sa karcinomom dojke. Analizirani su rezultati 81 studije, univarijantnom ili multivarijantnom metodom. U više od polovine studija potvrđeno je da je pozitivni HER-2 status nezavisni faktor loše prognoze. Ovakvi rezultati su dobijeni bez obzira na metodologiju određivanja HER-2 statusa, koja se u međuvremenu menjala i usavršavala [22]. Učestalost HER-2 amplifikacije (c-erbB-2 gena) potvrđena CISH metodom u grupi naših bolesnica iznosi 20,81%, što je za više od 5% u odnosu na HER-2 overekspresiju utvrđenu IHH metodom (15,03%). Ovi nalazi se uklapaju sa objavljenim rezultatima koji daju razlike u HER-2 overeksprisiji utvrđivanoj IHH metodom sa HER- 2 amplifikacijom utvrđenom FISH ili u našem radu CISH metodom, gde od većine objavljenih i u uvodu navedenih, izdvajamo radove Achima sa saradnicima i Bharagve sa saradnicima [78,79]. Poredeći godine starosti i starosnu dob kroz kategorije (granična vrednost je iznosila 45), kao i menstrualni status i opštu i porodičnu anamnezu vezanu za dojku, nismo dobili značajnost statističke razlike u odnosu na CISH pozitivnost. Godine starosti (p=0.41). Starosna dob (p=0.31). Menstrualni status (p=0.54). Porodična anamneza opšta (p=0.77), vezano za dojku (p=0.5). Ovim smo potvrdili da se opšti prognostički faktori ne mogu dovesti u direktu vezu sa c-erb-B-2 genskom amplifikacijom, iako su značajni faktori rizika, a što su svojim radovima pokazali i drugi istraživači (Dirier, El Sagfir i Finek sa saradnicima) [27,80,81]. U daljim analizama testirali smo specifične faktore rizika koji su i prognostički ali 63 i prediktivni faktori. Najčešća lokalizacija tumora je bila u lateralnim kvadrantima 244 bolesnice (70,52%), u medijalnim kvadrantima kod 58 bolesnica (16,76%) a u centralnom kvadrantu najmanja 33 bolesnice (9,54%). Testirajući njihovu međuzavisnost sa CISH pozitivnošću nismo došli do statistički značajne razlike (p=0.65). Time smo utvrdili da lokalizaja tumora nije u međuzavisnosti sa HER-2 amplifikacijom. U kliničkoj TNM klasifikaciji najveći je broj T2 tumora 193 (55,78%), potom T1 128 (36,99%), T3 19 (5,49%) i T0 6 (1,73%). Klinički N0 status je imalo 189 bolesnica (54,62%), N1 157 bolesnica (45,38%). Iz ovih rezultata proistekli su i nalazi kliničkih stadijuma. U inicijalnom kliničkom stadijumu I je bilo 90 bolesnica (26,01%) a u stadijumu II 256 bolesnica (73,99%). Testirajući njihovu međuzavisnost u odnosu na HER-2 amplifikaciju nismo utvrdili statistički značajnu međuzavisnost Klinički T (p=0.17). Klinički N (p=0.78) Klinički stadijum bolesti (p=0.73). Svakako, nodalni status je važan u prognozi bolesti (Andrulis sa saradnicima), ali u odnosu na postavljene ciljeve, bitan zaključak je da nismo dokazali korelaciju kliničkog regionalnog aksilarnog nodalnog statusa sa HER-2 amplifikacijom utvrđenu CISH metodom [82,83]. Tip hiruške intervencije u inicijalnom lečenju karcinoma dojke nije se mogao predvideti unapred u odnosu na HER-2 amplifikaciju. HER-2 status je određivan postoperativno a tip hiruške intervencije je bio determinisan preoperativnim i intraoperativnim (EX tempore) nalazima. Poštednih operacija je bilo 169 (48,84%) a radikalnih 177 (51,16%). Analizirajući patološki T i patološki N uključujući u analizu i broj odstranjenih limfnih nodusa, kao i postoperativni (patološki) stadijum bolesti koji je proistekao iz patološkog T i N, nismo dobili statistički značajnu razliku u odnosu na CISH amplifikaciju. Patološki T (p=0.28), patološki N (p=0.81), patološki stadijum bolesti (p=0.51). Značajan zaključak ovih analiza u odnosu na postavljene ciljeve, je da i patološki N, kao i klinički, ne korelira sa CISH amplifikacijom. Do ovog zaključka došli smo uzimajući u obzir i poređenje stadiranja kliničkog T i N i kliničkog stadijuma bolesti sa patološkim pT i pN i patološkim stadijumom bolesti. Nalazi adekvatno stadiranih bolesnica po stadijumima bolesti 243 (64,45%), podstadiranih 31 (8,96%) i prestadiranih 60 (17,34%), nisu uticali na rezultat statističke analize. 64 Po tipu tumora najzastupljeniji su bili duktalni karcinomi 183 (52,89%), lobularni 118 (34,10%) a ostalih 45 (13,01%). Koristeći Fisher Exact Test dobili smo statistički značajnu razliku u odnosu na tip tumora prema CISH pozitivnosti (p=4.22∙ 10−5). Iako se ovakvi nalazi podudaraju sa većinom sličnih dobijenih nalaza, a među kojima su bila prva istraživanja Harrisa i saradnika još 1984. godine, to je bio i glavni povod da u sledećoj fazi formiramo podgrupu samo duktalnih i lobularnih karcinoma [84]. Pre formiranja podgrupe DC/LC uradili smo analize ostalih faktora rizika u osnovnoj grupi. Testirajući vrednosti steroidnih receptora u odnosu na CISH pozitivnost koristili smo srednju vrednost i medijanu (opseg). Estrogen i progesteron vrednosti po skorovima smo određivali u grupama. Skor 3 i manje je negativan (prva grupa), skor 4 je granična vrednost (druga grupa) a više od 4 je smatran pozitivnim nalazom (treća grupa). Zbog lakšeg testiranja, a u neposrednoj vezi radi primene ovih nalaza u kliničkoj praksi, estrogen i progesteron vrednosti smo podelili u dve kategorije. Skor manji od 3 je smatran negativnim a skor 4 i više pozitivnim nalazom. Posle analiziranja dobili smo statistički značajnu razliku za obe kategorije u odnosu na CISH vrednosti. Naime, estrogen pozitivna kategorija je bila zastupljena u 61,21% bolesnica (p=3 ∙ 10−5), progesteron pozitivna kategorija je bila zastupljena kod 56,9% bolesnica (p=4 ∙ 10−5). Vrednosti za obe kategorije su dobijene u grupi bez CISH amplifikacije. Ovo se podudara sa nalazima Cianfroccae i Joensuua sa saradnicima i uklapa se u većinu nalaza sličnih istraživanja [85,86]. Analizirajući histološke i nuklearne graduse kao klasične faktore rizika, koje je Bloom prezentovao još davne 1957. godine, a dopunio Fisher B. 1969. godine, dobili smo sledeće rezultate. Histološki gradus 2 je imalo 262 bolesnica (87,04%), gradus 1 je imalo 16 bolesnica (5,32%) a gradus 3 11 bolesnica (3,99%). Nuklearni gradus 2 je takođe imao najveći broj bolesnica 242 (80,4%), gradus 3 je imalo 27 bolesnica (8,97%) i gradus 1 je imalo 26 bolesnica (8,64%). U odnosu na CISH pozitivnost dobili smo statistički značajnu razliku za nuklearni (p=0.00135) i za histološki gradus (p=0.015). CISH pozitivnost je bila značajno prisutnija kod većih gradusa [87]. Zbog dobijenih statističkih značajnosti odlučili smo da formiramo podgrupu samo duktalnih i lobularnih karcinoma i izvršimo retestiranje po svim parametrima. Formirana podgrupa je imala 301 bolesnicu. 65 Učestalost HER-2 amplifikacije (c-erbB-2 gena) potvrđena CISH metodom u formiranoj podgrupi 301 bolesnica (DC/LC), iznosi 21,93%, što je za više od 5% u odnosu na HER-2 overekspresiju utvrđenu IHH metodom (15,95%). Ovi nalazi dobijeni u podgrupi se bitno ne razlikuju u odnosu na one dobijene u osnovnoj grupi. Poredeći godine starosti i starosnu dob kroz kategorije (granična vrednost je iznosila 45), kao i menstrualni status, porodičnu anamnezu za druge malignne bolesti i porodičnu i ličnu anamnezu vezanu za dojku, nismo dobili značajnost statističke razlike u odnosu na CISH pozitivnost, što se takođe slaže sa rezultatima u osnovnoj grupi. Najčešća lokalizacija tumora je bila u lateralnim kvadrantima 212 bolesnica, u medijalnim kvadrantima kod 50 bolesnica, a u centralnom kvadrantu najmanja, 30 bolesnica. Testirajući njihovu međuzavisnost sa CISH pozitivnošću nismo došli do statistički značajne razlike, koja se nije pokazala ni u osnovnoj grupi. Time smo utvrdili da lokalizaja DC/LC tumora nije u međuzavisnosti sa HER-2 amplifikacijom. U kliničkoj TNM klasifikaciji najveći je broj bolesnica su imale tumor T2 (167), potom T1 (114), T3 (14) i T0 (6). Klinički N0 status je imalo 162 bolesnica a N1 139 bolesnica. Iz ovih rezultata proistekli su i nalazi kliničkih stadijuma. U inicijalnom kliničkom stadijumu I je bilo 79 bolesnica, a u stadijumu II 222 bolesnica. Testirajući njihovu međuzavisnost u odnosu na HER-2 amplifikaciju nismo utvrdili statistički značajnu međuzavisnost, što je sličan nalaz kao i za osnovnu grupu. Tip hiruške intervencije u inicijalnom lečenju karcinoma dojke nije se mogao predvideti unapred u odnosu na HER-2 amplifikaciju. HER-2 status je određivan postoperativno a tip hiruške intervencije je bio determinisan preoperativnim i intraoperativnim (EX tempore) nalazima. Poštednih operacija je bilo 150 (49,83%) a radikalnih 151 (50,17%). Analizirajući patološki T i patološki N uključujući u analizu i broj odstranjenih limfnih nodusa, kao i postoperativni (patološki) stadijum bolesti koji je proistekao iz patološkog T i N, nismo dobili statistički značajnu razliku u odnosu na CISH amplifikaciju, što je takođe bio nalaz i u osnovnoj grupi. Značajan zaključak ovih analiza u odnosu na postavljene ciljeve, je da i patološki N ne korelira sa CISH amplifikacijom. Do ovog zaključka došli smo uzimajući u obzir i poređenje stadiranja kliničkog T i N i kliničkog stadijuma bolesti sa patološkim pT i pN i patološkim stadijumom bolesti. Razlike u kliničkom i patološkom stadiranju bolesti odgovaraju 66 nalazima u osnovnoj grupi. Slične nalaze, čak favorizujući veće tumore (pT3), dobili su Ake i saradnici 1990. godine, kao i Toikkanen sa saradnicima 1992. godine. Ovi nalazi su u suprotnosti sa rezultatima koje smo mi dobili u daljim analizama samo CISH pozitivnih karcinoma analizirajući ih po PH tipu unutar pT kategorija (veličina) [88,89]. Po tipu tumora najzastupljeniji su bili duktalni karcinomi kod 183 bolesnica (60,8%) a lobularni znatno manje kod 118 bolesnica (39,2%). Testirajući nalaze dobili smo statistički značajnu razliku u odnosu na tip tumora prema CISH pozitivnosti (p=2∙ 10−5). Rezultati naše studije su u saglasnosti sa većinom podataka iz literature. Referentna literatura je navedena u prethodnim poglavljima, a načešće citirani su rezultati istraživanja Lewisa i saradnika, Prati i saradnika, Huang i saradnika, Diriera i saradnika, Aksu i saradnika, Dowsettta i saradnika, Slamona i saradnika [13,20,21,27,90,91,92]. Testirajući vrednosti steroidnih receptora u odnosu na CISH pozitivnost koristili smo srednju vrednost i medijanu (opseg). Estrogen i progesteron vrednosti po skorovima smo određivali u u grupama. Skor 3 i manje je negativan, skor 4 je granična vrednost a više od 4 je smatran pozitivnim nalazom. Zbog lakšeg testiranja, a u neposrednoj vezi radi primene ovih nalaza u kliničkoj praksi, estrogen i progesteron vrednosti smo podelili u dve kategorije. Skor manji od 3 je smatran negativnim a skor 4 i više pozitivnim nalazom. Posle analiziranja dobili smo statistički značajnu razliku za sve kategorije u odnosu na CISH pozitivnost, što se podudara sa nalazima dobijenim u osnovnoj grupi. Analizirajući histološke i nuklearne graduse kao klasične faktore rizika dobili smo sledeće rezultate. Histološki gradus 2 je imalo 262 bolesnica (87,04%), gradus 1 je imalo 16 bolesnica (5,32%) a gradus 3 11 bolesnica (3,99%). Nuklearni gradus 2 je, takođe, imao najveći broj bolesnica 242 (80,4%), gradus 3 je imalo 27 bolesnica (8,97%) i gradus 1 je imalo 26 bolesnica (8,64%). Ovi su nalazi identični za oba gradusa u odnosu na osnovnu grupu od 346 bolesnica. U odnosu na CISH pozitivnost dobili smo za oba gradusa statistički značajnu razliku. CISH pozitivnost je bila značajno prisutnija kod većih gradusa (gradus 2 i 3). Zbog sve većeg broja publikovanih radova koji sa dilemom upoređuju veličinu primarnog karcinoma dojke sa HER-2 amplifikacijom, kao i drugim faktorima rizika, 67 odlučili smo da dalju analizu uradimo po PH tipu karcinoma unutar kategorija pT po CISH amplifikaciji. Utvrdili smo da je statistički značajno veća učestalost CISH amplifikacije kod duktalnih karcinoma, a naročito kod onih do 2cm. (pT1) u odnosu na lobularne karcinome. Slične nalaze dobili su i Allred sa saradnicima 1992. godine, kao i Junnan sa saradnicima koji je svoje nalaze publikovao 2012. godine. Potvrdu rezultata našeg istraživanja pronašli smo i u zaključcima radova Ana i saradnika i Harolda i saradnika [93,94,95,96]. Radovi Parise i saradnika, Kelly i saradnika i Roisina i saradnika, istovremeno analiziraju više faktora rizika. Veličinu i HP tumora, nodalni status, status steroidnih receptora i status HER-2 onkoproteina. Bez decidnih zaključaka, u njihovim istraživanjima se nameće sve prisutnija dilema: koji je faktor rizika važniji u adjuvantnom pristupu lečenja [97,98,99]. Iako to nije tema ovog istraživanja, nemoguće je bilo ignorisati. Možda najbolji prikaz ovako različitih stavova koji određuju vrstu lečenja i prognozu bolesti, daje Diana Crivellari, iznoseći rezultate dve velike slične retrospektivne studije [100]. Sličnu dilemu u svojim radovima iznose i Swede i saradnici, Curigliano i saradnici i Azizun-Nisa i saradnici Trastuzumab deluje na više različitih načina, ali jedan od najznačajnijih mehanizama dejstva je aktivacija imunog odgovora organizma, koji putem antitelo- zavisne ćelijski posredovane citotoksičnosti (ADCC, antibody-dependent cellular [101,102,103]. Kako su poštedne operacije kod ranog karcinoma dojke, već dugo standard u lečenju, adjuvantni pristup zavisi od procene nalaza dobijenih u standardnoj HP analizi [104,105,106,107,108]. Mišljenja smo da svaka poštedna operacija u toku preparisanja tkiva – tumorektomije, stvara mogućnost za lokalnu diseminaciju. Takođe, i sentinel biopsija, ukoliko su stražarski limfni nodusi pozitivni, stvara mogućnost za lokalnu diseminaciju. Imajući u vidu mogućnost preoperativne HP dijagnostike core biopsijom, kao i određivanje, histološkog i nuklearnog gradusa, nalaza steroidnih i HER-2 receptora, nameće se zaključak da se i kod malih tumora kliničkog stadijuma I i II, pogotovo za duktalni karcinom, inicijalno lečenje može započeti primenom neoadjuvantne hemioterapije, kao i primenom monoklonskog antitela Trastuzumab-a [25, 26,109,110,111,112]. 68 cytotoxicity) dovodi do smrti tumorskih ćelija zaostalih ili diseminovanih u toku inicijalnog hiruškog lečenja [113]. Efikasnost ovog leka u tretmanu bolesnica sa agresivnom formom HER2 pozitivnih karcinoma dojke prvi put je dokazana 1998. godine, u klinickoj studiji u kojoj je Herceptin korišcen kao druga i treća linija monoterapije kod žena sa metastatskom bolesću koje su prethodno bile tretirane hemioterapijom [13]. Primenjen u prvoj liniji metastatskog karcinoma dojke u kombinaciji sa taksanima Herceptin, dokazano je, poboljšava sve parametre klinickog odgovora uključujući i preživljavanje [114,115]. U skorije vreme, prospektivne randomizirane studije koje je sproveo u Americi National Surgical Adjuvant Breast Project (NSABP) B-31 i Breast Cancer Intergroup Study (N-9831), a u Evropi Herceptin Adjuvant trial (HERA), dokazale su da adjuvantna primena trastuzumaba u trajanju od 1 godine, nakon primenjene standardne hemioterapije, dovodi do smanjenja rizika od recidiva i smanjenja mortaliteta kod bolesnica sa HER2 pozitivnim ranim stadijumom karcinoma dojke [116,117,118,119,120] Ispitivanjem međuzavisnosti ekspresije HER-2 onkoproteina u primarnom tumoru i drugih (klasičnih) faktora prognoze (vrednosti steroidnih receptora, histološkog i nuklearnog gradusa), uz očekivane korealacije, mogla bi se preciznije odrediti biološka agresivnost tumora i time, verovatno, uticati na postojeće modalitete lečenja. Naučni doprinos doktorske teze, a iz koga će proizaći i klinički doprinos, će se odnositi na mogućnost redefinisanja indikacija za sve modalitete lečenja, a naročito za primenu adjuvantne/neoadjuvantne zračne i hemio/hormono terapije kao i terapije monoklonskim antitelom – trastuzumab-om [18,121,122,123]. Bolesnice sa HER-2 overekspresijom (3+) imaju lošiji terapijski odgovor na hormonoterapiju tamoksifenom, a bolji terapijski odgovor na primenu lekova iz grupe inhibitora aromataze treće generacije. Takođe, overekspresija HER-2 u primarnom tumoru može uticati na izbor hemioterapije, (antraciklinska ili neantraciklinska hemioterapija ili taksanske kombinacije) ili kombinaciju sa trastuzumab-om [124,125]. Ispitivanje povezanosti ekspresije HER-2 sa kliničkim i patološkim stadijumom lokalne i regionalne bolesti prema TNM i pTNM klasifikaciji, kao i ostalim definisanim 69 faktorima rizika, opravdava određivanje HER-2 statusa u inicijalnoj patološkoj dijagnostici operabilnog karcinoma dojke, kliničkog stadijuma I i II [126,127]. 70 6. ZAKLJUČAK Naše naučno istraživanje je eksperimentalno-klinička studija, sprovedena u Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije u periodu 2006.-2009. godine, u koju je bilo uključeno 346 bolesnica kliničkog stadijuma I i II, a na osnovu dobijenih rezultata izveli smo sledeće zaključke: 1. U osnovnoj grupi od 346 bolesnica, u odnosu na starosnu dob, porodičnu i ličnu anamnezu, menstrualni status, veličinu i lokalizaciju tumora, nismo dobili statistički značajnu korelaciju sa HER-2 ampifikacijom potvrđenom CISH metodom. 2. Klinički i patološki stadijum istostranih aksilarnih limfnih nodusa, prema kliničkom i patološkom TNM stadiranju bolesti, kod unicentričnog primarno operabilnog karcinoma dojke, nije u statistički značajnoj korelaciji sa HER-2 ampifikacijom potvrđenom CISH metodom. 3. Potvrdili smo statistički značajnu učestalost HER-2 amplifikacije određene CISH metodom kod duktalnih karcinoma kliničkog i patološkog stadijuma 1,2 i 3 u odnosu na druge karcinome istih stadijuma bolesti prema TNM klasifikaciji (p=4.22∙ 10−5). 4. Potvrdili smo obrnuto srazmernu korelaciju steroidnih receptora sa HER-2 amplifikacijom potvrđenom CISH metodom. ER (p=3 ∙ 10−5), PR (p=4 ∙10−5). 5. Potvrdili smo statistički značajnu korelaciju histološkog (p=0.015) i naročito nuklearnog gradusa (p=0.00135), sa HER-2 amplifikacijom utvrđenu CISH metodom. 6. Zbog dobijenih statističkih značajnosti odlučili smo da formiramo podgrupu samo duktalnih i lobularnih karcinoma i izvršimo retestiranje po svim parametrima. Formirana podgrupa je imala 301 bolesnicu. Nalazima dobijenim u podgrupi u odnosu na starosnu dob, porodičnu i ličnu anamnezu, menstrualni status, veličinu i lokalizaciju tumora, nismo dobili statistički značajnu korelaciju sa HER-2 ampifikacijom potvrđenom CISH metodom. Takođe, klinički i patološki stadijum istostranih aksilarnih limfnih nodusa, prema kliničkom i patološkom TNM stadiranju bolesti, kod unicentričnog 71 primarno operabilnog karcinoma dojke, nije u statistički značajnoj korelaciji sa HER-2 ampifikacijom potvrđenom CISH metodom. 7. Potvrdili smo statistički značajnu učestalost HER-2 amplifikacije određene CISH metodom kod duktalnih karcinoma kliničkog i patološkog stadijuma 1,2 i 3 u odnosu na lobularne karcinome istih stadijuma bolesti prema TNM klasifikaciji (p=2∙ 10−5). 8. Potvrdili smo obrnuto srazmernu korelaciju steroidnih receptora sa HER-2 amplifikacijom potvrđenom CISH metodom. ER (p=0.00034), PR (p=0.00014). 9. Potvrdili smo statistički značajnu korelaciju histološkog (p=0.079) i nuklearnog gradusa (p=0.00371) , sa HER-2 amplifikacijom potvrđenu CISH metodom. 10. Upoređujući po CISH amplifikaciji karcinome unutar podgrupe DC/LC, sa njihovom veličinom po pTNM stadiranju, došli smo do zaključka da je kod malih DC (pT1) u odnosu na male LC (pT1), pokazana je statistički značajno veća učestalost CISH amplifikacije. pT1 DC/LC (p=4.9∙10-4 11. Zaključili smo da mali duktalni karcinomi (T1/pT1), imaju statistički značajnije veću učestalost HER-2 amplifikacije, da su obrnuto proporcionalni vrednostima steroidnih receptora i da su u direktnoj korelaciji sa histološkim i nuklearnim gradusom tumora. ), kao i na pT2 DC/LC (p=0.019). Grupa pT3 DC/LC tumora nije pokazala statistički značajnu razliku najverovatnije zbog malog broja bolesnica (4). 12. Na osnovu našeg naučnog istraživanja smatramo da je potrebno sprovesti studije na većim kohortama bolesnica sa inicijalno operabilnim karcinomom dojke, u cilju istraživanja povezanosti amplifikacije HER-2 onkoproteina i veličine kao i HP tipa primarnog tumora dojke, koje će ukazati na to da li je potrebno ili ne, kod malih primarnih tumora veličine do 2cm. duktalnog tipa i višeg histološkog i nuklearnog gradusa, primeniti neoadjuvantu terapiju Herceptinom ili ne. 72 7. LITERATURA 1. Stanly K. Women and cancer. World Health Stat. Q. 1987; 40, p.267. 2. Ferlay J, Bray F, Pisani P, and Parkin D.M. GLOBOCAN 2002. Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide. IARC CancerBase No. 5, version 2.0. IARCPress, Lyon, 2004. 3. Ranaboldo CJ, Mithchel A, Boyle GT, et al. Axillary nodal status in women with screendetected breast cancer.Eur J Surg Oncol 1993; 19:130-133. 4. Valagussa P, Bonadonna G, Veronesi V. Patterns of relapse and survival following radical mastectomy. Cancer 1978; 41:1170-1178. 5. Rosen P, Groshen S, Kinne D, et al. Prognosis in T2N0M0 stage I breast carcinoma: a 20 year follow-up study. J Clin Oncol 1991; 9:1650-1661. 6. Rosen P, Groshen S, Siago P, et al. Pathological prognostic factors in stage I (T1N0M0) and stage II (T1N1M0) breast carcinoma. A study of 644 patients with median follow- up of 18 years. J Clin Oncol 1989; 7:1239-1251. 7. Joensuu H, Taikkanen S. Cured of breast cancer? J Clin Oncol 1995; 13:62-69. 8. Saphner T, Torney D, Gray R. Annual hazard rates of recurrence for breast cancer after primary therapy. J Clin Oncol 1996; 14:2738-2746. 9. Brenner H, Hakulinen T. Are patients with breast cancer before age 50 years ever cured ?J Clin Oncol 2002; 22: 432-438. 10. Hudis CA. Tratuzumab- Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. N Engel J Med 2007; 357:39-51. 11. Ross JS. Fletcher .TA. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: prognostic factor, predictive factor, and target for therapy. Oncologist 1998;3 :237-252. 12. Sehnitt SJ. Breast cancer in the 21st century: neu opportunities and neu challenges. Mod Pathol 2001;14(3):213-218. 73 13. Lewis F, Jackson P. Lane S, Coast G, Hanby AM. Testing fot HER2 in breast cancer. Histopathology 2004;45 :207-217. 14. Slamon DJ, Clarc GM, Wong SG et al. Human breast cancer. Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 1987;235:177-182. 15. Slamon DJ, Clark GM. Amplification of C-ERB-B2 and aggressive breast tumors? Science 1998;240: 1795-1798. 16. De Potter CR. The neu oncogene: more than a prognosticindicator? Hum Pathol 1994;25: 1264-1268. 17. Heintz NH, Leslie KO, Rogers LA, et al. Amplificationof the c-erb B-2 oncogene in prognosis of breast adenocarcinoma.Arch Pathol Lab Med 1990:114:160-163. 18. Paik S, Brayant J, Park C, et al. ErbB-2 and response to doxorubicin in patients with axillary lymph-node positive, hormone receptor-negative breast cancer. J Natl Cancer inst 1998;90: 1361-1370. 19. Carlomagno C, Perone F, Gallo C, et al. C-erbB-2 overexpression decreases the benefit of adjuvant tamoxifen in early-stage breast cancer without axillary lymph node metastasis. J Clin Oncol 1996: 14: 2702-2708. 20. Prati R, Apple SK, He J, Gornbei JA, Chanh HR. Histopathologic characteristics predicting HER-2/neu amplification in breast cancer. Breast J 2005; 11(6):433- 439. 21. Huang HJ, Neven P, Drijkoningen R, et al. Association between tumor characteristics and HER-2/neu by immunohistochemistry in 1362 women with primary breast cancer. J Clin Pathol 2005; 58:611-616. 22. Ros JS, Fletcher JA, Linette GP . The HER-2/neu Gene and Protein in Breast Cancer2003: Biomarker and Target of Therapy. The Onkologist 2003; 8:307-325. 74 23. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER-2 for metastatic breast cancer that overexpress HER-2. N Engl J Med 2001; 344:183-792. 24. Viani G, Alfonso S, Stefano E, et al. Adjuvant trastuzumab in the tretment of her- 2 positive early breast cancer: a meta-analysis of published randomized trials. BMC Cancer 2007; 7:153. 25. Dinh P, Sotiriou C, Piccart MJ. The evolution of treatment strategies: aiming at the target. The Breast 2007; 16: 10-16. 26. Dowsett M et al. Benefit from adjuvant tamoxifen therapy in primary breast cancer patients according oestrogen receptor, progesterone receptor, EGF receptor and HER2 status. Annals of Oncology 2006; 17: 818–826. 27. Dirier A, Burhanedtin-Zincircioglu S, Karadayi B, Isikdogan A, Aksu R. Characteristics and prognosis of breast cancer in younger women. J BUON 2009; 14: 619-623. 28. Hamaker ME, Schreurs WH, Uppelschoten JM, Smorenburg CH. Breast cancer in the elderly: retrospective study on diagnosis and treatment according to national guidelines. Breast J 2009; 15:26-33. 29. Menard S, Balsari A, Tagliabue E et al. On behalf of the OMERO group. Biology, prognosis and response to therapy of the breast carcinomas according to HER2 score. Ann Oncol 2008; 19: 1706-1712. 30. Meng S, Tripathy D, Shete S, et al. HER-2 gene amplification cen be acquired as breast cancer progresses. National Academy of Science of the USA(PNAS) 2004; 25:9393-9398. 31. Sjorgen S, Inganas M, Lindgren A, et al. Prognostic and predictive value of c- erbB-2 over expression in primary breast cancer, alone and in combination with other prognostic markers. J Clin Oncol 1998; 16:462-469. 32. Tendon A, Clarc G, Chamness G, et al. HER-2/neu oncogene protein and prognosis in breast cancer. J Clin Oncol 1998; 7:1120-1128. 75 33. Van de Vijver MJ, He YD, Van't Veer LJ, et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N Engl J Med 2002; 347:1999-2009. 34. Džodić R. Hirurgija raka dojke. Beograd: Dosije 2005; ISBN-7738-020-5 35. Oprić M, Granić M. editors. Tumori dojke. Beograd: Institut za onkologiju i radiologiju Srbije 1996; ISBN-86-7240-003-1. 36. Hill TD, Khanis HJ, Tyczynski JE, Berkel HJ. Comparison of male and female breast cancer incidence trends, tumor characteristics, and survival. Ann Epidemiol 2005; 15/10: 773-780. 37. Parkin DM. Global Cancer Statistics in the year 2000. Lancet Oncol 2001; 2:533- 543. 38. Jovićević-Bekić A. Epidemiologija i prevencija raka dojke. In: Nešković- Konstantinović Z, Borojević N, Vučković-Dekić Lj editors. Novine u dijagnostici i terapiji karcinoma dojke. Beograd: Akademija medicinskih nauka SLD i Institut za onkologiju i radiologiju Srbije; 2008; Serija B, vol 2(1):p 11-24. ISBN 978-86- 85313-84-4. 39. Waljee JF, Hu ES, Ubel PA et al. Effect of esthetic outcome after breast conserving surgery on psycho social functioning and quality of life. J Clin Oncol 2008; 26: 3331−3337. 40. Haagensen CD, Stout AP. Carcinoma of the breast: Criteria of operability. Ann Surg 1943;118:859-870. 41. Bugarski M. Karcinom dojke. Beograd: 1981. Savremena administracija 42. Norton L. A gompertzian model of human breast cancer growth. Cancer Res 1988; 48:7067-7071. 43. Susan E Clare, Faina Nakhlis, John Carl Panetta. Molecular biology of breast metastasis. The use of mathematical models to determine relapse and to predict response to chemotherapy in breast cancer. Breast Cancer Res 2000; 2:430-435. 76 44. Kocic B, Filipovic S, Petrovic B, Mijalkovic D, Rancic N, Poultsidi A. Clinical and biological characteristics of breast cancer. J BUON 2010; 15: 660-667. 45. Bloom H, Ricardson W, Harries E. Natural history of antreated breast cancer (1805-1933). Comparasion of antreated and treated cases according to histological grade of malignacu. BMJ 1962; 2: 213-221. 46. Park S, Jiang Z, Mortenson ED et al. The therapeutic effect of anti-HER2/neu antibody depends on both innate and adaptive immunity. Cancer Cell 2010; 18:160−170. 47. Giuliano AE, Hunt KK, Ballman KV et al. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis. JAMA 2011; 305:569-575. 48. Adair F, Berg J, Joubertl, et al. Long-term follow-up of breast cancer patients. The 30- year report. Cancer 1974; 33: 1145-1150. 49. Fisher B, Redmond C, Elias EG, Evans J, Foster R, Jochimsen P, Lawrence W, Lerner H, LiCalzi N, Margolese R, et al. Adjuvant chemotherapy for breast cancer: an overview of NSABP findings. Int Adv Surg Oncol. 1982;5:65–90. 50. Fisher ER, Redmond C, Fisher B. Pathologic findings from the National Surgical Adjuvant Breast Project. VIII. Relationship of chemotherapeutic responsiveness to tumor differentiation. Cancer. 1983 Jan 15;51(2):181–191. 51. Bonadonna G, Valagussa P, Zambetti M, Bozzoni R, Moliterni A. Milan adjuvant trials for stage I and II breast cancer. In Adjuvant Therapy of Cancer V, Salmon, S.E. (ed.). Grune & Stratton: Orlando, FL.1987; p:211 52. Goldhirsch A. Glick JH, Gelber RD et al. Meeting Highlights: International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2005. Ann Oncol 2005;16:1569-1583. 53. Fisher B, Fisher ER, Redmond C. Ten-year results from the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) clinical trial evaluating the use of L- 77 phenylalanine mustard (L-PAM) in the management of primary breast cancer. J Clin Oncol. 1986 Jun;4(6):929–941. 54. Fisher B, Redmond C, Fisher ER, Wolmark N. Systemic adjuvant therapy in treatment of primary operable breast cancer: National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project experience. NCI Monogr. 1986;(1):35–43. 55. Veronesi U, Salvadori B, Luini A et al. Breast conservation is a safe method in patients with small cancer of the breast. Long-term results of three randomized trials on 1973 patients. Eur J Cancer 1995; 31: 1574-1579. 56. Renton SC, Gazet JC, Ford HT, Corbishley C, Sutcliffe R.: The importance of the resection margin in conservative surgery for breast cancer. Eur J Surg Oncol. 1996; 22(1):17-22. 57. Olsha O, Shemesh D, Carmon M et al. Resection Margins in Ultrasound-Guided Breast-Conserving Surgery. Ann Surg Oncol 2011;18:447-452. 58. McMasters KM, Tuttle TM, Carlson DJ, et al: Sentinel lymph node biopsy for breast cancer: A suitable alternative to routine axillary dissection inmulti- institutional practice when optimal techniqueis used. J Clin Oncol 2000; 18:2560- 2566. 59. Veronesi U, Paganelli G, Viale G, et al: Arandomized comparison of sentinel-node biopsy with routine axillary dissection in breast cancer.N Engl J Med 2003; 349:546-553. 60. Miller AR, Thomason VE, Yeh IT, et al:Analysis of sentinel lymph node mapping with immediate pathologic review in patients receiving preoperative chemotherapy for breast carcinoma.Ann Surg Oncol 2002; 9: 243-247. 61. Tafra L, Lannin DR, Swanson MS, et al: Multicenter trial of sentinel node biopsy for breast cancer using both technetium sulfur colloid and isosulfan blue dye. Ann Surg 2001; 233:51-59. 78 62. Zirngibl C, Steinfeld-Birg D, Vogt H, et al: Sentinel lymph node biopsy before neoadjuvant chemotherapy—Conservation of breast and axilla. Br Ca Res Treat 2002; (suppl 1; abstr 516) :76:S129. 63. Fisher B, Gebardt MC. The evolution of breast cancer surgery: past, present and future. Semmin Oncol 1978; 5:385-394. 64. Hossami N, Hayes D. Review of pre-operative magnetic resonace imaging (MRI) in breast cancer: should MRI be performed on all women with newly diagnosed, early stage breast cancer? CA Cancer J Clin 2009; 59:290-302. 65. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 Jun;63(2):378–383. 66. Di Palma S, Collins N, Bilous M et al. A quality assurance exercise to evaluate the accuracy and reproducibility of chromogenic in situ hybridization for HER2 analysis in breast cancer. J Clin Pathol 2008;61:757-760. 67. Walker RA, Bartlett MS, Dowsett M, et al. HER2 testing in the UK: further update to recommendations. J Clin Pathol 2008; 61: 818-824. 68. Persos DL, Bui MM, Lowery MC, et al. Fluorescence in situ hibridization (FISH) for determination of HER-2/neu amplification in breast cancer: a multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci 2000;30:41-48. 69. Bartlett JMS, Forsyth A. HER2 FISH in breast cancer. Chapter 7. In: Roulston JE. Bartlett ./MS. eds. Methods in molecular medicine: molecular diagnosis of cancer. Vol. 79. Totowa. N./: Humana Press; 2004. 70. Ma Y, Lespagnard L, Durbecq V, et al. Polysomy 17 in HER-2/neu status elaboration in breast cancer: effect on daily practice. Clin Cancer Res 2005; II (12): 4393-4399. 71. Hyun CL, Lee HE, Kim KS, et al. The effect of chromosome 17 polysomy on HER-2/ncu status in breast cancer. J Clin Pathol 2008; 6 1:317-321. 79 72. Isola T, Tanner M. Chromogenic in situ hybridization in tumor pathology. Chapter 10. In: Roulston JE, Bartlett .JMS, eds. Methods in molecular medicine: molecular diagnosis of cancer. Vol. 79. Totowa, NJ: Humana Press; 2004. 73. Saez A, Andreu FJ, Segui MA, et al. HER-2 gene amplification by chromogenic in situ hybridisation (CISH) compared with fluorescence in situ hybridization (FISH) in breast cancer: a study of two hundred cases. Breast 2006;15:519-527. 74. Marquez A, Wu R, Zhao T, Yu Y, Tao T, Shi Z. Detection of EGFR gene amplification and protein expression by chromogenic in situ hybridization (CISH) and immunohistochemistry (IHC) in a series of archival human cancers. Diagn Mol Pathol 2004; 13: 1-8. 75. Zhao T, Wu R, Au A, MArquerz A, Yibing Y, Zuorong S. Determination of HER2 gene amplification by chromogenic in situ hybridization (CISH) in archival breast carcinoma. Mod Pathol 2002; I 5(6):657-665. 76. Hanna WM, Kwok K. Chromogenic in-situ hybridization: a viable alterantive to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm. Mod Pathol 2006; 19:48 I -48 77. Ivković-Kapicel T, Knežević-Ušaj S.Testiranje receptora humanog epidermalnog faktora rasta 2 u karcinomu dojke. Med Preg1 2010; LXIII (1-2): 69-74. 78. Achim W, Christian K, Verena G et al. Effects of guideline adherence in primary breast cancer- A 5- year multi-center cohort study of 3976 patients. The Breast 2010; 19: 120-127. 79. Bhargava R, Lal P, Chen B. Chromogenic in situ hybridization for the detection of HER-2/neu gene amplification in breast cancer with an emphasis on tumors with borderline and low-level amplification. Am J Pathol 2005; 123:237-243. 80. El Saghir NS, Seoud M, Khalil MK et al. Effects of young age at presentation on survival in breast cancer. Bio Med Central Cancer 2006; 6:194. DOI: 10.1186/1471-2407-6-194. 80 81. Finek J, Holubec L Jr, Topolacan O, Elgrova L, Skalova A, Pecen L. The importance of prognostic factors in premenopausal women with breast cancer. Anticancer Res 2007; 27:1893-1896. 82. Andrulis I, Bull s, Blackstein M, et al. Neu/erb/B-2 amplification identifies a poor- prognosis group of women with node negative breast cancer. J Clin Oncol 1998; 16: 1340-1349. 83. Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, et al. HER-2/neu oncogene amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res 1990; 50:4332- 4337. 84. Harris M, Howell A, Chrissohou M, et al. A comparasion of the metastatic pattern of infiltrating lobular carcinoma and infiltrating ductal carcinoma of the breast.BrJ Cancer 1984; 50:23-26. 85. Cianfrocca M, GoldsteinL. Prognostic and predictiv factors in early breast carcinoma. Oncologist 2004; 9: 606-616. 86. Joensuu H, Jorma I, Lundin M, et al. Amplification of erbB2 expression are superior to estrogen receptor status as risk factors for distant recurrence in pT1N0M0 breast cancer. A nation widw population-based study. Clin Cancer Res 2003; 9:923-930. 87. Bloom H, Richardson W. Histological grading and prognosis in breast cancer. A study of 1409 cases of which 359 have been followed for 15 years. BrJ Cancer 1957; 11: 359-377. 88. Åke B, Atul K. T, Helgi S,at al. HER-2/neu Amplification Predicts Poor Survival in Node-positive Breast Cancer. Cancer Res July 15, 1990 50; 4332. 89. Toikkanen S, Helin H, Isola J, Joensuu H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: a 30-year follow-up. JCO 1992; 10: 90. Aksu G, Duman C, Gurbuz Y et al. Correlation between c-erbB2 expression, lymphovascular invasion and other biological and clinical prognostic factors and 1044- 1048. 81 preoperative tumor markers in patients with early-stage and locally advanced breast cancer. J BUON 2011; 16: 52-57. 91. Dowsett M et al. Relationship between quantitative estrogen and progesterone receptor expression and human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) status with recurrence in the arimidex, tamoxifen, alone or in combination trial. Journal of Clinical Oncology 2008; 26: 1059–1065. 92. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V. Bajamonde A, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;15:344(11):783-792. 93. Harold J. Burstein andEric P. Winer.Refining Therapy for Human Epidermal Growth Factor Receptor 2–Positive Breast Cancer: T Stands for Trastuzumab, Tumor Size, and Treatment Strategy JCO Dec 1, 2009:5671-5673; 94. Ana M. Gonzalez-Angulo, Jennifer K. Litton, Kristine R. Broglio at al, High Risk of Recurrence for Patinets With Breast Cancer Who Have Human Epidermal Growth Factor Receptor 2–Positive, Node-Negative Tumors 1 cm or Smaller. J Clin Oncol 2009; 27:5700-5706. 95. Allred D.C, Clark G.M, Tandon A.K, at al HER-2/neu in node-negative breast cancer: prognostic significance of overexpression influenced by the presence of in situ carcinoma. JCO April 1992;vol. 10 no. 4: 96. Junnan Li 599-605. , Xiaodong Liu and Zhongsheng Tong*.Clinical Features and Survival Analysis of T1mic, a, bN0M0 Breast Cancer J. Clin. Oncol.2012; 42 (6): 97. Roisin M. Connolly 471-476. and Aditya Bardia.Trastuzumab for Small HER-2+ Breast Cancer: Small Tumor, Big Decision The Oncologist Apr 1, 2012:508-511. 98. KellyC. M,*PritchardK. I, TrudeauM, AndreopoulouE, HessK, PusztaiL.Coping with uncertainty: T1a,bN0M0 HER2-positive breast cancer, do we have a treatment threshold? Ann Oncol 2011; 22 (11): 99. Parise C, Bauer K, Caggiano V. Is tumor size important in HER2-positive breast cancer? J Clin Oncol 28:15s, 2010 (suppl; abstr 1582) 2387-2393. 82 100. Diana Crivellari. Small Tumor Size and Node-Negative HER2-Positive Breast Cancer: A Step Forward for a Better Treatment? JCO 2009; Vol.28, No 16: p257 101. Azizun-Nisa, Bhurgri Y, Raza F, Kayani N. Comparison of ER, PR and HER- 2/neu (C-erb B 2) reactivity pattern with histologic grade, tumor size and lymph node status in breast cancer.Asian Pac J Cancer Prev. 2008 Oct-Dec;9(4):553-556. 102. Swede H, Moysich KB, Winston JS, et al. Variation of the prognostic significance of HER-2 expression in breast cancer according to tumor size.Breast J. 2003; 9(2): 98-105. 103. Curigliano G, Viale G, Bagnardi V, et al.Clinical relevance of HER2 overexpression/amplification in patients with small tumor size and node-negative breast cancer. J Clin Oncol 2009; 27:5693–5699. 104. Lialiaris TS, Georgiou G, Sivridis E et al. Prognostic and predictive factors of invasive ductal breast carcinomas. J BUON 2010; 15: 79-88. 105. Kaplan HG, Malmgren JA. Impact of triple negative phenotype on breast cancer prognosis. Breast J 2008;14:456-463. 106. Khatcheressian JL, Wolff AC, Smith TJ, et al. American Society of Clinical Oncology. Updates of the breast cancer follow-up and menagement guedlines in the adjuvant setting. J Clin Oncol 2006; 24:5091-5097. 107. Masood S, Bui MM. Prognostic and predictive value of HER-2/neu oncogene in breast cancer. Microsc Res Tech 2002; 59:102-108. 108. Baselga J, Bradbury I, Eidtmann H et al. First results of the NeoALTTO trial (BIG 01-06 / EGF 106903): A phase III, randomized, open label, neoadjuvant study of lapatinib, trastuzumab, and their combination plus paclitaxel in women with HER2-positive primary breast cancer. 33rd Annual San Antonio Breast Cancer Symposium, 2010 (abstr S3-3). 109. Dowsett M et al.Disease-free survival according to degree of HER2 amplification for patients treated with adjuvant chemotherapy with or without 1 83 year of trastuzumab: the HERA trial. Journal of Clinical Oncology 2009; 27: 2962–2969. 110. Dowsett M et al. Relationship between quantitative estrogen and progesterone receptor expression and human epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) status with recurrence in the arimidex, tamoxifen, alone or in combination trial. Journal of Clinical Oncology 2008; 26: 1059–1065. 111. Ramond EH, Perez EA, Bryant J, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemoterapy for operabile HER-2 positive breast cancer. N Engl J Med 2005; 353:1673-1684. 112. Smith IE, Lipton L. Preoperative neoadjuvant medical therapy for early breast cancer. Lancet Oncol 2001; 2:561-570. 113. Nahta R, Esteva FJ. Molecular mechanisms of trastuzumab resistance. Breast Cancer Res 2006;8:215. 114. Marty M, Cognetti F, Maraninchi 0, Snuder R, Mauriac L Taubiana-Hulin M, et al. Randomized phase II trial of the efficacyand safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment. J Clin OncoI 2005;23:4265-4274. 115. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V. Bajamonde A, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001;15:344(11):783-792. 116. Romond EH, Perez EA, Bryant J, Suman VJ, Geyer CE, Davidson NE, et al. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353: 1673-1684. 117. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B. GoldhirschA, Untch M, Smith I, et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherpy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005:353: 1659-1672. 118. Badve SS. Standardisation of HER2 testing-inconsistency raises questions. Connect Dako 2008;II :58-60. 84 119. Dhesy-Thind B. Pritchard Kl. Messersmith H. O'Malley F, Elavathil L, Trudeau M. HER2/neu in sistematic therapy for women with breast cancer: a systematic review. Breast Cancer Res Treat 2008; 109:209-229. 120. Yeon C, Pegram MD. Anti-erbB-2 antybody trastuzumab in the treatment of HER2-amplified breast cancer. Invest New Drugs 2005;23:391-409. 121. Ellis P, Smith I, Ashley S, et al: Clinical prognostic and predictive factors for primary chemotherapy in operable breast cancer. J Clin Oncol 1998; 16:107-114. 122. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER-2 for metastatic breast cancer that overexpress HER-2. N Engl J Med 2001; 344:183-792. 123. Konecny G, Pauletti G,Pegram M. Qantitative association between HER-2/neu and steroid hormone receptors in primary breast cancer. J Natl Cancer Ins 2003; 95:142-153. 124. Wang Y, Klijn JGM, Zhang Y, et al. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymh-node negative primary breast cancer. Lancet 2005; 365:671- 679. 125. Winer E, Piccart-Gebhart M, Rugo H, et al. Menagement of HER2-positive breast cancer. In: ASCO Educional Book 2006; 3-14. 126. Aksu G, Duman C, Gurbuz Y et al. Correlation between c-erbB2 expression, lymphovascular invasion and other biological and clinical prognostic factors and preoperative tumor markers in patients with early-stage and locally advanced breast cancer. J BUON 2011; 16: 52-57. 127. Aldred DC, Clarc GM, Tandon AK et al. HER-2/neu in node negative breast cancer. Prognostic significance of overexpression influenced by the presence of in situ carcinoma. J Clin Oncol 1992; 10: 599-605. 85 8. SKRAĆENICE KORIŠĆENE U TEKSTU TNM – Tumor, Nodus, Metastaza UICC - Unija za Međunarodnu Kontrolu Raka WHO - Svetska Zdravstvena Organizacija HER 2 - hyman epidermal growtel factor receptor 2 (humani epidermalni faktor rasta) HER 2 - neu kod miševa koji su imali neuroblastom EGF - epidermalni faktor rasta ili erb B za celu grupu Her 2 - neu erb B2 humani EGF HER - receptor za humani epiderrnalni faktor rasta EGFR - receptor za epidermalni faktor rasta DC - duktalni karcinom LC - lobularni karcinom ADCC - antitelo-zavisna ćelijski posredovana citotoksicnost NSABP - National Surgical Adjuvant Breast Project HERA - HERceptin® Adjvant trial IHH - imunohistohemija ISH - in situ hibridizacija FISH - fluorescentna in situ hibridizacija CISH - hromogena in situ hibridizacija UK NEQAS - United Kingdom National External Quality Assessment Service NordiQC - Nordic imunochistochemtcal Quality Control USCAP - United Stales and Canadian Academy of Pathology 86 9. BIOGRAFIJA Dr Nebojša Đ. Miletić je rođen u Nišu, aprila 1960. godine. Oženjen je i otac je dvoje dece. Diplomirao je 1985. godine na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Specijalistički ispit iz opšte hirurgije položio je 1992. godine na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Odbranio je magistarsku tezu “Postoperativna psihogena trauma kod amputacije dojke” u Centru za multidisciplinarne studije Univerziteta u Beogradu 2000. godine, pod mentorstvom Prof. Univ. dr Ivane Golubičić. Zvanje “Primarijus“ stekao je odlukom Ministarstva zdravlja Republike Srbije, 2004. godine. Na Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije zaposlen je od 1989. godine. Trenutno je na funkciji načelnika operacionih sala sa Dnevnom hiruškom bolnicom. Učestvovao je u projektu br. 1649 Ministarstva za nauku Srbije 2002-2004. Dr Nebojša Đ. Miletić je 1997. godine boravio na tomesečnom stručnom usavršavanju u Evrposkom Institutu za Onkologiju u Milanu - „Škola rekonstruktivne hirurgije dojke“. U okviru stručnog usavršavanja iz oblasti onkologije učestvovao je na veše domaćih i stranih kurseva i kongresa. U toku profesionalne karijere objavio je, kao autor ili koaoutor, 51 stručni rad u domaćim i stranim časopisima, knjigama sažetaka i zbornicima radova. Od toga jedan rad je objavljen u međunarodnom časopisu, štampan u celini, referisan u indeksnim bazama Current Contents (CC) ili Science Citation Index-u (SCI) M21=8 bodova, impact factor 7,178. Jedan rad je objavljen u međunarodnom časopisu, štampan u celini, referisan u indeksnim bazama SCI expanded M23=3 boda, impact factor 0,6. Tri rada objavljena su u domaćim časopisima, štampani u celini, koji nisu indeksirani u pomenutim indeksnim bazama, ali se nalaze u MEDLINE M51=2 boda. Jedan rad objavljen je u domaćem časopisu nacionalnog značaja, u celini M52=1,5 boda. Jedan rad saopšten je na međunarodnom skupu, štampan u celini M33=1 bod. 18 radova je saopšteno na međunarodnim skupovima, štampanih u izvodu M34=0,5 boda. 25 rada je saopšteno na domaćim skupovima, štampanih u izvodu M64=0,2 boda. Prilog 1. lzjava o autorstvu Neboj5a D. MileticPotpisani-a Broj upisa lzjavljujem Da je doktorska disertacija pod naslovom ,,lspitivanje korelacije ekspresije her-2 onkoproteina u primarnom tumoru sa klinidkim i patolo5kim stadijumom regionalnih limfnih dvorova u aksili kod bolesnica sa operabilnim karcinomom dojke" rezultat sopstvenog istraZivackog rada, da predlolena disertacija u celini ni u delovima nije bila predloZena za dobijanje bilo koje diplome prema studijskim programima drugih visoko5kolskih ustanova, da su rezultati korektno navedeni i da nisam kr5io/la autorska prava ikoristio intelektualnu svojinu drugih lica. Potpis doktoranta U Beogradu, 16.08.2012. a o a O Prilog 2. llava o istovetnosti Stampane i elektronske verzije doktorskog rada lme i prezime autora Broj upisa Neboi5a D. Miletic Studijski program Naslov rada ,,lspitivanje korelacije ekspresije her-2 onkoproteina u primarnom tumoru sa klinidkim i patolo5kim stadijumom regionalnih limfnih dvorova u aksili kod bolesnica sa operabilnim karcinomom dojke" Mentor dr lvana Golu[idic, redovni profesor, Univerzitet u Beogradu,ffi Komentor dr Svetislav Jelic, naudni savetnik, Institut za onkologiju i radiol Srbii Potpisani Neboj5a D. Miletic lzjavljujem da je Stamp ana verzija mog doktorskog rada istovetna elektronskoj verziji koju sam predao/l a za objavljivanje na portalu Digitalnog repozitorijuma Univerziteta u Beogradu. Dozvoljavam da se objave moji licni podaci vezani za dobijanje akademskog zvania doktora nauka, kao 5to su ime i prezime, godina i mesto rodenja i datuma odbrane rada. Ovi licni podaci mogu se objaviti na mreZnim stranicama digitalne biblioteke, u elektronskom katalogu i publikacijama Univerziteta u Beogradu. Potpis doktoranta U Beogradu, 16.08.2012. Prilog 3. lzjava o kori5cenju Ovla5cujem Univerzitetsku biblioteku ,,Svetozar Markovic" da u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu unese moju doktorsku disertaciju pod naslovom: ,,lspitivanje korelacije ekspresije her-2 onkoproteina u primarnom tumoru sa klinidkim i patoloSkim stadijumom regionalnih limfnih dvorova u aksili kod bolesnica sa operabilnim karcinomom dojke" koja je moje autorsko delo. Disertaciju sa svim prilozima predao/la sam u elektronskom formatu pogodnom za trajno arhiviranje. Moju doktorsku disertaciju pohranjenu u Digitalni repozitorijum Univerziteta u Beogradu mogu da koriste svi koji po5tuju odredbe sadrlane u odabranom tipu licence Kreativne zajednice (Creative Commons) za koju sam se odludio/la. 1 . Autorstvo 2. Autorstvo - nekomercijalno 3. Autorstvo - nekomercijalno -bez prerade 4. Autorstvo - nekomercijalno - deliti pod istim uslovima 5. Autorstvo -bez prerade t"'an(i A. nutorstvo - deliti pod istim uslovima (Mof imo da zaokruZite samo jednu od Sest ponudenih licenci, kratak opis licenci dat je na poledini lista). U Beogradu, 16.08.2012. Potpis doktoranta t' , ,'''t'// .t/ ,r'/ /' / -// ,'i/ ,.'L Lr-=---=--.-.--//' t .-------. I t ,l