UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Dušan R. Mladenović DEJSTVO FINASTERIDA NA BIHEJVIORALNE, ELEKTROENCEFALOGRAFSKE I ĆELIJSKE PROMENE U HEPATIĈNOJ ENCEFALOPATIJI IZAZVANOJ TIOACETAMIDOM KOD PACOVA Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF MEDICINE Dušan R. Mladenović THE EFFECTS OF FINASTERIDE ON BEHAVIORAL, ELECTROENCEPHALOGRAPHIC AND CELLULAR CHANGES IN THIOACETAMIDE-INDUCED HEPATIC ENCEPHALOPATHY IN RATS Doctoral dissertation Belgrade, 2013 Mentor doktorske disertacije: Prof. dr TATJANA RADOSAVLJEVIĆ, redovni profesor na Institutu za patološku fiziologiju „Ljubodrag Buba Mihailović“, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu Komentor doktorske disertacije: Prof. dr OLIVERA STANOJLOVIĆ, redovni profesor na Institutu za medicinsku fiziologiju „Rihard Burijan“, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu KOMISIJA ZA OCENU ZAVRŠENE DOKTORSKE DISERTACIJE: 1. Prof. dr VLADIMIR TRAJKOVIĆ, predsednik, vanredni profesor na Institutu za imunologiju, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 2. Prof. dr NATAŠA PETRONIJEVIĆ, redovni profesor na Institutu za medicinsku i kliniĉku biohemiju, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 3. Prof. dr BRANKA ŠIKIĆ, redovni profesor u penziji, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu Zahvaljujem se mentoru Prof. dr Tatjani Radosavljević i komentoru Prof. dr Oliveri Stanojlović na pomoći, sugestijama i podršci u izradi doktorske disertacije DEJSTVO FINASTERIDA NA BIHEJVIORALNE, ELEKTROENCEFALOGRAFSKE I ĆELIJSKE PROMENE U HEPATIĈNOJ ENCEFALOPATIJI IZAZVANOJ TIOACETAMIDOM KOD PACOVA Hepatiĉna encefalopatija (HE) predstavlja neuropsihijatrijski sindrom, koji se razvija kao posledica akutne ili hroniĉne insuficijencije jetre. Za ispitivanje patogeneze HE koriste se razliĉiti eksperimentalni modeli, ukljuĉujući model izazvan portno-kavnim šantom, stenozom portne vene, modele izazvane hepatotoksiĉnim agensima (tioacetamid, D-galaktozamin, paracetamol, azoksimetan, ugljen-tetrahlorid) i modele ciroze jetre. U razvoju HE kljuĉnu ulogu ima hiperamonijemija, a mehanizmi ukljuĉeni u patogenezu HE ukljuĉuju: citotoksiĉni edem mozga, poremećaje neurotransmisije (preteţno glutamatergiĉke i GABA-ergiĉke), energetske poremećaje, oksidacijski stres, mitohondrijsku disfunkciju i neuroinflamaciju. U HE povećava se sinteza neurosteroida, koji pozitivnom alosternom modulacijom receptora za gama-aminobuternu kiselinu (GABAA receptora) pojaĉavaju efekte GABA u centralnom nervnom sistemu. Finasterid, inhibitor 5α-reduktaze i sinteze neurosteroida, potencijalno moţe menjati tok HE. Ciljevi ove disertacije su bili: da se ispitaju bihejvioralne i elektroencefalografske (EEG) promene u HE izazvanoj tioacetamidom kod pacova; da se odrede parametri oksidacijskog stresa i antioksidacijske zaštite, aktivnost acetilholinesteraze (AchE) i ekspresiju ćelijskih markera u razliĉitim moţdanim regionima u intoksikaciji tioacetamidom; da se ispita uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj tioacetamidom kod pacova. U cilju ispitivanja efekata tioacetamida (TAA) na ponašanje, EEG i ćelijske promene muţjaci Wistar pacova su podeljeni u sledeće grupe: 1. kontrolna grupa (n=8); 2. eksperimentalna grupa tretirana TAA na dozno zavisan naĉin: TAA300 (300 mg/kg, n=8), TAA600 (600 mg/kg, n=10) i TAA900 (900 mg/kg, n=18). Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su primenjene tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900). U cilju ispitivanja uticaja finasterida na HE izazvanu TAA-om, ţivotinje su podeljene u sledeće grupe: 1. kontrolna grupa (n=8); 2. TAA900 grupa tretirana TAA (900 mg/kg, n=18); 3. grupa tretirana finasteridom, FIN (150 mg/kg, n=8); 4. FIN+TAA900 grupa (n=10) tretirana finasteridom (150 mg/kg) i TAA (900 mg/kg). Dnevne doze TAA (300 mg/kg) i FIN (50 mg/kg) su administrirane tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN (50 mg/kg) je primenjen 2 h pre svake pojedinaĉne doze TAA (300 mg/kg). Sve supstance su primenjene intraperitonealno. U svim grupama bihejvioralne karakteristike su praćene 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon tretmana, dok je EEG registrovan u periodu 22-24 h nakon poslednje doze TAA i analiziran brzom Furijeovom transformacijom u vremenskim taĉkama 22,5 h, 23 h i 23,5 h nakon tretmana. Parametri oksidacijskog stresa i aktivnost AchE su odreĊeni u hipokampusu, moţdanoj kori, talamusu, nc. caudatusu i moţdanom stablu spektrofotometrijskom metodom 24 h nakon tretmana. Ekspresije NeuN kao markera neurona, MOG kao markera oligodendrocita, Iba 1 kao markera mikroglije i GFAP kao markera astrocita, kao i ekspresija subjedinica NADPH oksidaze i izoenzima superoksid dizmutaze (SOD) u hipokampusu i moţdanoj kori su odreĊene Western blot metodom. Vitalni refleksi (kornealni refleks, refleksi uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) su bili znaĉajno sniţeni u TAA600 grupi 24 h nakon primene druge doze TAA (p<0,05) i u TAA900 grupi 2 h nakon tretmana (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom. Refleksni trzaji glave, auditivni refleks, ekvilibrijumski test i refleks postavljanja su bili znaĉajno oslabljeni u TAA600 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01), dok su ovi refleksi bili ugašeni kod svih ţivotinja iz TAA900 grupe 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Opšta motorna aktivnost i eksplorativno ponašanje su bili znaĉajno niţi u TAA600 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01). Sa porastom doze TAA je izazvao izraţeniji pad motorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja i u TAA900 grupi ovi testovi su bili znaĉajno niţi u odnosu na TAA600 grupu (p<0,01). Srednja ukupna spektralna snaga je bila znaĉajno viša u TAA300 (p<0,01) i TAA600 grupi 23,5 h nakon tretmana (p<0,01) i znaĉajno niţa u TAA900 grupi (p<0,01) u svim vremenskim taĉkama u poreĊenju sa kontrolom. Srednja spektralna snaga beta i alfa talasa je bila znaĉajno viša u TAA300 grupi u poreĊenju sa kontrolom, dok je u TAA600 grupi uoĉen znaĉajan porast srednje snage beta talasa 23 h, a alfa i teta 23,5 h nakon tretmana u odnosu na kontrolu. Dok je srednja spektralna snaga delta talasa bila znaĉajno viša u TAA600 grupi (p<0,01), srednja snaga ovih talasa je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom. Relativna spektralna snaga beta i delta talasa je bila znaĉajno niţa, a alfa talasa znaĉajno viša u TAA300 grupi u odnosu na kontrolu. Dok je u TAA600 grupi uoĉen znaĉajan pad zastupljenosti delta talasa i porast zastupljenosti teta talasa 22,5 h nakon tretmana, u TAA900 grupi zastupljenost delta talasa je bila znaĉajno viša, a teta talasa znaĉajno niţa u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama. Nivo malondialdehida (MDA) u moţdanom korteksu je bio znaĉajno viši u TAA600 (p<0,05) i TAA900 grupi (p<0,01), a u moţdanom stablu u svim grupama tretiranim TAA- om u poreĊenju sa kontrolom. U hipokampusu nivo MDA je bio znaĉajno niţi u TAA300 (p<0,01), a znaĉajno viši u TAA900 grupi (p<0,01) u odnosu na kontrolu. Aktivnost katalaze u korteksu je bila znaĉajno viša u TAA300 (p<0,01) i znaĉajno niţa u TAA600 (p<0,01) i TAA900 grupi (p<0,01) u odnosu na kontrolu. Dok je TAA izazvao smanjenje aktivnosti katalaze u moţdanom stablu u TAA600 i TAA900 grupi, aktivnost ovog enzima u hipokampusu je bila znaĉajno viša u TAA300 (p<0,01) i TAA600 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom. Sliĉno kao u korteksu i moţdanom stablu, aktivnost katalaze u hipokampusu je bila znaĉajno niţa u TAA900 u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,01). Pretretman FIN-om je spreĉio slabljenje vitalnih refleksa kod svih ţivotinja iz FIN+TAA900 grupe. Uĉestalost oĉuvanih refleksnih trzaja glave, auditivnog refleksa, ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja, kao i motorna aktivnost i eksplorativno ponašanje su bili znaĉajno viši u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu. TakoĊe, srednja ukupna spektralna snaga EEG talasa je bila znaĉajno viša u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu (p<0,01). Pretretman FIN-om je izazvao znaĉajan porast srednje spektralne snage beta, alfa i delta talasa u odnosu na kontrolu. Zastupljenost beta, alfa i teta talasa je bila znaĉajno viša, a delta talasa znaĉajno niţa u FIN+TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom i TAA900 grupom. Pretretman FIN-om je smanjio lipidnu peroksidaciju u korteksu u odnosu na TAA900 grupu, dok se nivo MDA nije znaĉajno razlikovao u hipokampusu i nc. caudatusu ţivotinja iz FIN+TAA900 i TAA900 grupe. U talamusu nivo MDA bio znaĉajno viši u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu (p<0,01). Pretretman FIN-om je spreĉio pad ekspresije p22 i p67 subjedinice NADPH oksidaze u hipokampusu izazvan TAA-om, izazvao porast aktivnosti SOD1 i pad glutation reduktaze (GR). U korteksu nivo redukovanog glutationa (GSH) i aktivnost katalaze su bili znaĉajno viši u FIN+TAA900 u odnosu na kontrolnu grupu. Nivo GSH u nc. caudatusu je bio znaĉajno niţi u FIN+TAA900 u odnosu na kontrolnu i TAA900 grupu (p<0,01), dok je aktivnost SOD bila viša u FIN+TAA900 u poreĊenju sa kontrolom (p<0,05). U talamusu pretretman FIN-om spreĉava porast aktivnosti glutation peroksidaze (GPx) izazvan TAA-om, smanjuje aktivnost GR i katalaze. Aktivnost AchE u talamusu i nc. caudatusu je bila znaĉajno viša u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu (p<0,05), dok se u FIN+TAA900 grupi nije razlikovala u odnosu na kontrolu. Ekspresija NeuN u hipokampusu je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi (p<0,05), dok je ekspresija Iba1 bila znaĉajno viša u TAA900, FIN i FIN+TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom (p<0,05). Ekspresija GFAP u hipokampusu je bila znaĉajno viša u TAA900 (p<0,05) i znaĉajno niţa u FIN+TAA900 grupi (p<0,05) u odnosu na kontrolu. Bihejvioralne i EEG promene ukazuju da tioacetamid izaziva HE kod pacova na dozno-zavistan naĉin. Tioacetamid u dozi od 600 mg/kg se moţe koristiti za ispitivanje patogenetskih mehanizama motornih promena u HE, a u dozi od 900 mg/kg za ispitivanje patogeneze hepatiĉne kome. Tioacetamid izaziva lipidnu peroksidaciju u mozgu na dozno- zavistan naĉin, pri ĉemu je moţdano stablo najosetljivije, a talamus i hipokampus najmanje osetljivi na dejstvo slobodnih radikala. Patogenezi hepatiĉne kome u intoksikaciji tioacetamidom potencijalno doprinosi indukcija AchE u talamusu i nc. caudatusu. Pretretman finasteridom poboljšava motorne sposobnosti i EEG promene i spreĉava nastanak najteţih formi HE izazvane tioacetamidom kod pacova, ukljuĉujući hepatiĉnu komu. Jedan od potencijalnih mehanizama povoljnog dejstva finasterida na tok HE izazvane tioacetamidom je inhibicija AchE u talamusu i nc. caudatusu i modulacija holinergiĉke transmisije. Iako finasterid menja aktivnost antioksidacijskih enzima, smanjenje oksidacijskog stresa najverovatnije ne doprinosi znaĉajno neuroprotektivnim efektima finasterida u HE. Bihejvioralne i EEG promene ukazuju da se finasterid moţe koristiti kao potencijalno neuroprotektivno sredstvo u terapiji HE, ali njegova kliniĉka upotreba zahteva prethodna istraţivanja o štetnim efektima ove terapije. Kljuĉne reĉi: hepatiĉna encefalopatija, tioacetamid, bihejvioralne promene, elektroencefalografija, oksidacijski stres, acetilholinesteraza, finasterid, pacovi Nauĉna oblast: Molekularna medicina THE EFFECTS OF FINASTERIDE ON BEHAVIORAL, ELECTROENCEPHALOGRAPHIC AND CELLULAR CHANGES IN THIOACETAMIDE-INDUCED HEPATIC ENCEPHALOPATHY IN RATS Hepatic encephalopathy (HE) represents a neuropsychiatric syndrome, that appears as a consequence of acute or chronic liver failure. Various experimental models are used for the investigation of the pathogenesis of HE, including porto-caval shunt, portal vein stricture, models induced by hepatotoxic agents (thioacetamide, D-galactosamine, acetaminophen, azoxymethane, carbon tetrachloride) and models of liver cirrhosis. Hyperammonemia has a pivotal role in the development of HE, and mechanisms involved in the pathogenesis of HE include: cytotoxic brain edema, alterations in neurotransmission (especially glutamatergic and GABAergic), energy disturbances, oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neuroinflammation. The synthesis of neurosteroids is increased in HE and by positive allosteric modulation of gamma-aminobutyric acid (GABAA) receptors they potentiate the effects og GABA in the central nervous system. Finasteride, 5α-reductase and neurosteroid synthesis inhibitor, may potentially modulate the course of HE. The aims of this dissertation were: to investigate the behavioral and electroencephalographic (EEG) changes in thioacetamide-induced HE in rats; to determine the parameters of oxidative stress and antioxidative protection, the activity of acetylcholinesterase (AchE) and cellular marker expression in various brain regions; to investigate the effects of finasteride on behavioral, EEG and cellular changes in thioacetamide-induced HE in rats. In order to investigate the effects of thioacetamide (TAA) on the behavior, EEG and cellular changes male Wistar rats were divided into the following groups: 1. control; 2. experimental group treated with TAA in a dose-dependent manner: TAA300 (300 mg/kg; n=8), TAA600 (600 mg/kg; n=10) and TAA900 (900 mg/kg; n=18). Daily doses of TAA (300 mg/kg) were administered once (TAA300), twice (TAA600) or three times (TAA900) in subsequent days. In order to investigate the effects of finasteride on TAA-induced HE, the animals were divided into the following groups: 1. control (n=8); 2. TAA900 group treated with TAA (900 mg/kg; n=18); 3. FIN group treated with finasteride (150 mg/kg; n=8); 4. FIN+TAA900 group (n=10) treated with FIN (150 mg/kg) and TAA (900 mg/kg). The daily doses of FIN (50 mg/kg) and TAA (300 mg/kg) were administered in three subsequent days, and in FIN+TAA900 group FIN (50 mg/kg) was administered 2 h before each dose of TAA (300 mg/kg). All substances were administered intraperitoneally. In all groups behavioral changes were observed 0, 2, 4, 6 and 24 h after the treatment, while EEG was registered 22-24 h after last dose of TAA and analyzed by fast Fourier transformation at time points 22.5 h, 23 h and 23.5 h after the treatment. Oxidative stress parameters and AchE activity were determined in the hippocampus, cerebral cortex, thalamus, caudate nucleus and brainstem spectrophotometrically 24 h after the treatment. The expressions of neuronal marker NeuN, oligodendrocyte marker MOG, microglial marker Iba1 and astrocytic marker GFAP, as well as the expression of NADPH oxidase subunits and superoxide dismutase (SOD) izoenzymes in the hippocampus and cerebral cortex were determined by Western blot analysis. Vital reflexes (corneal, withdrawal, grasping and righting reflex) were significantly diminished in TAA600 group 24 h after the administration of the second dose of TAA (p<0,05) and in TAA900 group 2 h after the treatment (p<0,01) by comparison with control. Head shake, auditiory startle reflex, equilibrium and placement test were significantly lower in TAA600 vs. control group at all time points (p<0.01), while these reflexes were absent an all animals from TAA900 group 24 h after the administration of the last dose of TAA. general motor activity and exploratory behavior were significantly lower in TAA600 vs. control group at all time points (p<0.01). With increasing dose TAA caused a more prominent decline in motor activity and exploratory behavior and in TAA900 group these tests were significantly lower when compared with TAA600 group (p<0.01). Mean total power density was significantly higher in TAA300 (p<0.01) and TAA600 group 23.5 h after the treatment (p<0.01) and significantly lower in TAA900 group (p<0.01) vs. control at all time points. Mean power densities in beta and alpha band were significantly higher in TAA300 vs. control group, while in TAA600 group a significant increase in mean beta power was evident 23 h, and in mean alpha and theta power 23.5 h after the treatment when compared with control group. While the mean power density in delta band was significantly higher in TAA600 group (p<0.01), the mean delta density was significantly lower in TAA900 (p<0.01) vs. control group. The relative power density in beta and delta band was significantly lower and in alpha band significantly higher in TAA300 group vs. control. While a significant decline in relative delta power and a significant increase in relative theta power were evident in TAA600 group 22.5 h after the treatment, in TAA900 group the relative delta power was increased and the relative theta power was decreased at all time points when compared with control group. Malondialdehyde (MDA) level in the cerebral cortex was significantly higher in TAA600 (p<0.05) and TAA900 group (p<0.01), while in the brainstem MDA level was significantly higher in all TAA-treated groups vs. control. Hippocampal MDA level was significantly lower in TAA300 (p<0.01) and significantly higher in TAA900 (p<0.01) vs. control group. Cortical catalase activity was significantly higher in TAA300 (p<0.01) and significantly lower in TAA600 (p<0.01) and TAA900 groups (p<0.01) vs. control. While TAA caused a decline in brainstem catalase activity in TAA600 and TAA900 group, the activity of this enzyme in the hippocampus was significantly higher in TAA300 (p<0.01) and TAA600 group (p<0.01) vs. control. Similar to the cortex and brainstem, hippocampal catalase activity was significantly lower in TAA900 group vs. control (p<0.01). FIN pretreatment prevented a decline in vital reflexes in all animals from FIN+TAA900 group. Head shake, auditory startle reflex, equilibrium and placement test, as well as general motor activity and exploratory behavior were significantly higher in FIN+TAA900 by comparison with TAA900 group. Additionally, mean total power density was significantly higher in FIN+TAA900 vs. TAA900 group (p<0.01). FIN pretreatment induced a significant increase in mean power in beta, alpha and delta bands when compared with control. The relative power in beta, alpha and theta band was significantly higher, while the relative power in delta band was significantly lower in FIN+TAA900 by comparison with control and TAA900 group. FIN pretreatment decreased lipid peroxidation in the cortex vs. TAA900 group, while no difference in MDA level in the hippocampus and caudate nucleus was evident between FIN+TAA900 and TAA900 group. MDA level in the thalamus was significantly higher in FIN+TAA900 vs. TAA900 group (p<0.01). FIN pretreatment prevented a TAA-induced decline in the expression of p22 and p67 subunits of NADPH oxidase, caused an increase in SOD1 activity and a decrease in glutathione reductase (GR) activity. In the cortex reduced glutathione (GSH) level and catalase activity were significantly higher in FIN+TAA900 when compared with control group. GSH level in caudate nucleus was significantly lower in FIN+TAA900 vs. control and TAA900 group (p<0.01), while SOD activity was higher in FIN+TAA900 by comparison with control group (p<0.05). FIN pretreatment prevented a TAA-induced increase in glutathione peroxidase (GPx) activity in the thalamus and decreased GR and catalase activity. AchE activity in the thalamus and caudate nucleus was significantly higher in TAA900 vs. control group (p<0.05), while in FIN+TAA900 group the activity of this enzyme was not different when compared with control. Hippocampal NeuN expression was significantly lower in TAA900 group (p<0.05), while Iba1 expression was significantly higher in TAA900, FIN and FIN+TAA900 groups vs. control (p<0.05). Hippocampal GFAP expression was significantly higher in TAA900 (p<0.05) and significantly lower in FIN+TAA900 (p<0.05) vs. control. Behavioral and EEG changes indicate that TAA induces HE in a dose-dependent manner. TAA in a dose of 600 mg/kg may be used for the investigation of the pathogenesis of motor manifestations in HE, and in a dose of 900 mg/kg for the investigation of the pathogenesis of hepatic coma. TAA induces lipid peroxidation in the brain in a dose- dependent manner, with the brainstem being the most sensitive, and the thalamus and the hippocampus the least sensitive to the effects of reactive oxygen species. AchE induction in the thalamus and caudate nucleus may contribute to the pathogenesis of TAA-induced HE. FIN pretreatment improves motor performance and EEG changes and prevents the development of most severe forms of TAA-induced HE, including hepatic coma. One of potential mechanisms of beneficial effects of finasteride in HE may be inhibition of AchE and modulation of cholinergic transmission. Although FIN changed the antioxidative enzyme activity, alleviation of oxidative stress does not contribute to the neuroprotective effects of FIN in HE. Behavioral and EEG changes indicate that finasteride may be used as a potential neuroprotective device in the therapy of HE, but its side effects should be further investigated before clinical use. Key words: hepatic encephalopathy, thioacetamide, behavioral changes, electroencephalography, oxidative stress, acetylcholinesterase, finasteride, rats Research area: Molecular medicine SADRŽAJ 1. UVOD ........................................................................................................................ 1 1.1. Definicija i podela hepatiĉne encefalopatije (HE) .............................................. 2 1.2. Dijagnoza HE ..................................................................................................... 3 1.3. Patogeneza HE .................................................................................................... 6 1.3.1. Poremećaji neurotransmisije u HE ......................................................... 9 1.3.2. Oksidacijski stres, mitohondrijska disfunkcija i inflamacija u HE ....... 15 1.3.3. Uloga neuroinflamacije u patogenezi HE ............................................. 17 1.3.4. Uloga aminokiselina u patogenezi HE .................................................. 18 1.4. Eksperimentalni modeli HE.............................................................................. 19 1.5. Efekti finasterida na neurotransmisiju .............................................................. 22 2. CILJEVI .................................................................................................................. 24 3. MATERIJAL I METODE ....................................................................................... 26 3.1.Korišćene supstance .......................................................................................... 27 3.2. Eksperimentalne ţivotinje ................................................................................ 27 3.2.1. Uticaj TAA na ponašanje, EEG i parametre oksidacijskog stresa u mozgu ....................................................................................... 27 3.2.2. Uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj TAA-om .......................................................................... 28 3.3. Bihejvioralni testovi ......................................................................................... 29 3.4. Analiza EEG-a .................................................................................................. 31 3.5. Parametri oksidacijskog stresa i aktivnost acetilholinesteraze ......................... 32 3.6. Western blot analiza ............................................................................................... 34 3.7. Statistiĉka analiza ............................................................................................. 35 4. REZULTATI ................................................................................................................. 36 4.1. Uticaj TAA na ponašanje, EEG i parametre oksidacijskog stresa u mozgu..... 37 4.1.1. Histološka analiza ................................................................................. 37 4.1.2. Bihejvioralni testovi ............................................................................... 40 4.1.3. Analiza EEG-a ....................................................................................... 45 4.1.4. Uticaj TAA na oksidacijski stres ............................................................ 53 4.2. Uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj TAA ......................................................................................................... 58 4.2.1. Bihejvioralni testovi ............................................................................... 61 4.2.2. Analiza EEG-a ....................................................................................... 66 4.2.3. Uticaj finasterida na oksidacijski stres u mozgu izazvan TAA-om ........ 73 4.2.4. Uticaj finasterida i TAA na aktivnost acetilholinesteraze ..................... 83 4.2.5. Ćelijski markeri u mozgu ....................................................................... 83 5. DISKUSIJA ............................................................................................................. 86 6. ZAKLJUĈCI ......................................................................................................... 109 7. LITERATURA ...................................................................................................... 112 1 1. UVOD 2 1.1. Definicija i podela hepatiĉne encefalopatije (HE) Hepatiĉna encefalopatija (HE) predstavlja neuropsihijatrijski sindrom koji se javlja kod pacijenata sa akutnom ili hroniĉnom insuficijencijom jetre (1,2). Spektar kliniĉkih manifestacija u HE obuhvata: neuromišićne poremećaje, poremećaje senzibiliteta, emocionalne poremećaje, promene liĉnosti i svesti (loša koncentracija, konfuzija, oštećeno pamćenje i produţeno vreme reagovanja na spoljašnje draţi), koje su praćene promenama u EEG-u (3). Od motornih poremećaja najĉešće se javljaju rigidnost, hiperrefleksija i asteriksis (lepršavi tremor koji nastaje zbog oscilirajućih promena u aktivnosti neuronskih mreţa, a najĉešće se ispoljava na ekstremitetima i jeziku) (4,5). Asteriksis se moţe ustanoviti pri ispruţenim rukama pacijenta sa dorzifleksijom šaka, a u sluĉaju nemogućnosti podizanja ruku, moţe se uoĉiti na osnovu ritmiĉnih promena snage stiska šake (4). Ponekad kliniĉka slika podseća na parkinsonizam (5), dok su fokalni neurološki ispadi u HE retki. U svom najteţem obliku, HE moţe izazvati sopor i hepatiĉnu komu sa potencijalnim letalnim ishodom (3). Radna grupa za HE je predloţila klasifikaciju HE na osnovu kliniĉkih ispoljavanja i etiologije. Na osnovu ove klasifikacije HE se deli na: tip A (encefalopatija udruţena sa akutnom insuficijencijom jetre), tip B (encefalopatija udruţena sa portno-sistemskim šantom bez oboljenja jetre) i tip C (encefalopatija udruţena sa cirozom jetre). Tip C encefalopatije se dalje moţe ispoljiti u tri oblika: minimalna, epizodiĉna i manifestna HE (3,4,6). Minimalna HE se karakteriše kognitivnim poremećajima koji nisu uoĉljivi standardnim neurološkim pregledom niti neuropsihološkim ili neurofiziološkim testovima (3,7). Najĉešće promene u minimalnoj HE podrazumevaju suptilne poremećaje paţnje i finih motornih veština, kao i usporenu obradu informacija bez jasno uoĉljivih poremećaja pamćenja, jeziĉkog izraţavanja i prostorne percepcije (8). Epizodiĉna HE se karakteriše akutnim povremenim promenama mentalnog stanja, koje se mogu razviti spontano ili biti izazvane nekim provocirajućim ĉiniocem. Najĉešći provocirajući ĉinioci za pogoršanje epizodiĉne HE su: gastrointestinalno krvarenje, konstipacija, prekomeran unos proteina hranom, infekcije, bubreţna insuficijencija, dehidracija i elektrolitni poremećaji (npr. hiponatrijemija) (7). Spontana pogoršanja epizodiĉne HE (bez jasnih provocirajućih ĉinilaca) se viĊaju najĉešće kod pacijenata sa velikim portno-sistemskim šantovima 3 (nastalim spontano, hirurškim putem ili usled transjugularnih intrahepatiĉnih portno- sistemskih šantova). Perzistentna HE se karakteriše hroniĉnim kognitivnim i motornim poremećajima koji se odraţavaju na socijalne i profesionalne aktivnosti pacijenta i u najteţem obliku izazivaju zavisnost od tuĊe nege (7). 1.2. Dijagnoza HE Dijagnoza HE se zasniva na anamnestiĉkim podacima, kliniĉkoj slici, elektrofiziološkim, neuropsihološkim i neurofiziološkim ispitivanjima. Za uspešnu terapiju HE neophodna je precizna klasifikacija neuroloških i psihijatrijskih manifestacija kao prvi korak u dijagnostici. Standardizacija skala za evaluaciju neuroloških promena u HE je tek u razvoju, a najĉešće se u praksi koristi West Haven skala (4,7), koja HE deli u ĉetiri stadijuma na osnovu promena svesti, intelektualnih funkcija, ponašanja i neuroloških nalaza (Tabela 1.1). Ova skala je subjektivna, što je uslovilo uvoĊenje brojnih modifikacija. Tabela 1.1. West Haven kriterijumi za klasifikaciju HE na osnovu teţine kliniĉke slike (preuzeto iz Bajaj, 2010) Stadijum HE Stanje svesti Ponašanje, intelektualne funkcije Neurološki nalazi 0 Normalno Normalno Normalni (minimalna HE, ako su izmenjeni psihomotorni testovi) 1 Blagi poremećaji svesti Oslabljena paţnja, oteţano obavljanje matematiĉkih operacija Blagi asteriksis 2 Letargija Dezorijentacija, neprimereno ponašanje Izraţeni asteriksis, poremećaji govora 3 Somnolencija Izraţena dezorijentacija sa bizarnim ponašanjem Mišićna rigidnost i klonus, hiperrefleksija 4 Koma Koma Decerebracioni poloţaj 4 Jedna od skala kojom je objektivizirana klasifikacija HE jeste Algoritam za stepenovanje hepatiĉne encefalopatije (engl. Hepatic Encephalopathy Scaling Algorithm, HESA), koji koristi kliniĉke pokazatelje i rezultate neuropsiholoških testova za definisanje stadijuma HE (9). U praksi se koristi veći broj neuropsiholoških testova za evaluaciju HE (Tabela 1.2). Tabela 1.2. Neuropsihološki testovi za dijagnozu kognitivnih poremećaja kod pacijenata sa cirozom jetre (modifikovano prema Cόrdoba, 2011) Neuropsihološki test Karakteristike testa Validnost RBANS Kratka baterija Veliki normativi Dostupan na brojnim jezicima Malo podataka o validnosti u cirozi Uglavnom testiran na pacijentima sa Alchajmerovom bolešću PHES Kratka baterija Nekoliko studija o njegovoj primeni u cirozi CDR Kompjuterizovani neuropsihološki test Veliki normativi Malo podataka o primenljivosti u cirozi Kritiĉna frekvencija treptanja Psihofiziĉki test Nezavisan od uzrasta i obrazovanja Meri stepen budnosti Identifikuje pacijente sa izmenjenim PHES Inhibitorni kontrolni test Kompjuterizovani neuropsihološki test Veoma zahtevan test Zahteva standardizaciju za svaku populaciju U SAD dokazana njegova upotrebljivost za ispitivanje HE u cirozi RBANS (engl. Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status), Reproducibilna baterija za procenu neuropsihološkog statusa PHES (engl. Psychometric Hepatic Encephalopathy Score), Psihometrijska ocena hepatiĉne encefalopatije CDR (engl. Cognitive Drug Research), Kognitivno istraţivanje lekova 5 Test sindroma portno-sistemske encefalopatije (test PSE sindroma) prati šest psiholoških parametara, koji se ocenjuju poreĊenjem pacijentovih parametara sa proseĉnim rezultatima u zdravoj populaciji istog uzrasta i sliĉnog obrazovnog profila (4,10). Tako ocena 0 se dobija ukoliko je pacijentov parametar u intervalu od ±1 sd od proseĉnog; ocena -1: u intervalu od 1 do 2 sd ispod proseĉnog; ocena -2: u intervalu od 2 do 3 sd ispod proseĉnog; ocena -3: više od 3 sd ispod proseĉnog. Analogno, ocene od +1 do +3 se daju ukoliko su parametri ispitanika bolji od proseĉnih, tako da se ukupna ocena na svim testovima moţe kretati od +6 do -18. Ukupna ocena -4 predstavlja graniĉnu vrednost, koja sa senzitivnošću od 96% i specifiĉnošću od 100% ukazuje na HE (4). Ukoliko nije moguće izvoĊenje svih testova, dijagnoza HE se moţe postaviti i na osnovu dva testa, ukoliko su rezultati oba testa ispod nivoa od 2 sd u odnosu na proseĉne rezultate u zdravoj populaciji (3). Osim testa PSE sindroma, u praksi se za evaluaciju HE moţe koristiti i Reproducibilna baterija za procenu neuropsihološkog statusa (engl. Repeatable Battery for the Assessment of Neuropsychological Status, RBANS), koja podrazumeva grupu testova za ispitivanje kortikalnih i subkortikalnih funkcija (4,11). U HE dominantno su oštećene subkortikalne funkcije (11), ali upotrebljivost ovih testova u praćenju HE treba da bude predmet daljih istraţivanja, s obzirom da su ovi testovi najĉešće korišćeni u proceni kognitivnih poremećaja u Alchajmerovoj bolesti, shizofreniji i traumatskim ozledama mozga (4). Test PSE sindroma i RBANS zahtevaju uĉešće psihologa za pravilno izvoĊenje (4). Test koji ne zahteva prisustvo psihologa, a koji pruţa vaţne informacije o kognitivnim funkcijama u HE je kritiĉna frekvencija treptanja (12). Ovaj test se zasniva na odreĊivanju minimalne frekvencije treptanja svetlosnog izvora, pri kojoj pacijent gubi percepciju treptanja i doţivljava svetlost kao kontinuiranu. Poĉetna frekvencija treptanja svetlosti je 25 Hz, a potom se frekvencija povećava do trenutka gubitka percepcije treptanja. Isti test moţe zapoĉeti i primenom visokih frekvencija treptanja (oko 60 Hz), a potom se frekvencija smanjuje do trenutka kad pacijent uoĉava treptanje. Kritiĉna frekvencija treptanja se kod zdravih osoba kreće oko 38-39 Hz, a u HE ta frekvencija je 6 sniţena. Ovaj test je pogodan za utvrĊivanje manifestne, ali nije dovoljno senzitivan za dijagnozu minimalne HE (4). Inhibitorni kontrolni test je kompjuterizovani neuropsihološki test, kojim se ispituje tenacitet paţnje (13). Pacijentu se na ekranu prikazuju slova (stimulusi) i on treba da uoĉi naizmeniĉnu pojavu slova X i Y (mete). IzmeĊu njih se umeću razliĉita sliĉna slova (mamci), koja mogu izazvati neprimerenu reakciju ispitanika. Test ukupno sadrţi 1728 stimulusa, 40 mamaca i 212 slova meta, koji se ispitaniku prezentuju unutar 13 min od prvobitnog treninga (4,14). Smanjen broj uoĉenih meta i povećan broj reakcija na mamce ukazuje na HE i posebna pogodnost ovog testa je što je senzitivan za detekciju minimalne HE (14). Elektroencefalografija (EEG) predstavlja korisnu metodu, kako za praćenje toka tako i za odreĊivanje efikasnosti terapijskih procedura u HE (15). Razliĉite elektrofiziološke analize su raĊene u prethodnim studijama HE, ukljuĉujući vizuelnu analizu EEG-a (16,17), spektralnu analizu (16–18), merenje evociranih potencijala (15,19,20), kao i upotrebu veštaĉkih neuronskih mreţa (21). UtvrĊeno je da spektralna analiza EEG-a pruţa pouzdanije informacije od vizuelne analize, s obzirom da omogućava bolju reproducibilnost i objektivnije tumaĉenje rezultata. Iako su veštaĉke neuronske mreţe pokazale obećavajuće rezultate, spektralna analiza ipak ostaje pouzdan metod za analizu EEG-a u HE (21). Produţena latenca auditivnih evociranih potencijala moţe pomoći u dijagnozi HE (22), dok vizuelni i somatosenzorni evocirani potencijali imaju manju dijagnostiĉku vrednost (23,24). 1.3. Patogeneza HE Patogeneza HE još uvek nije u potpunosti rasvetljena. Poznato je da HE nastaje usled sinergistiĉkog dejstva akumuliranih toksina u organizmu (amonijak, mangan, kratkolanĉane masne kiseline, razgranate aminokiseline, merkaptani, lipopolisaharid i dr.), pri ĉemu kljuĉnu ulogu u razvoju HE ima hiperamonijemija. Amonijak lako prolazi krvno- moţdanu barijeru i u mozgu uzrokuje brojne poremećaje metabolizma, neurotransmisije i dr. (25). 7 Patogeneza HE u akutnoj i hroniĉnoj insuficijenciji jetre se delimiĉno razlikuju. U akutnoj HE/hiperamonijemiji dominantna morfološka promena je citotoksiĉni edem mozga nastao usled bubrenja astrocita. Edem mozga povećava intrakranijalni pritisak i moţe uzrokovati hernijaciju mozga sa potencijalnim smrtnim ishodom (26). Ranije se razvoj edema mozga u akutnoj HE/hiperamonijemiji objašnjavao osmotskim efektom glutamina. Prema ovoj teoriji, amonijak se u astrocitima prevodi u glutamin u reakciji amidacije glutamata pomoću glutamin sintetaze. Akumulacija glutamina uzrokuje povećanje osmolarnosti intracelularne teĉnosti, što dovodi do povlaĉenja vode iz ekstracelularnog prostora i bubrenja astrocita (25,26). MeĊutim, kako glutamin ĉini manji deo osmotski aktivnih ĉestica u astrocitima (27) i kako se bubrenje javlja tek po vraćanju nivoa glutamina na fiziološke vrednosti (28), ova teorija je osporena. Prema savremenoj teoriji glutamin samo prenosi amonijak kroz citoplazmu do mitohondrija astrocita, gde se pod dejstvom glutaminaze aktivirane fosfatima ponovo oslobaĊa amonijak (hipoteza „Trojanskog konja“) (29). Amonijak izaziva mitohondrijsku disfunkciju sa povećanim stvaranjem slobodnih radikala, smanjenim stvaranjem adenozin-trifosfata (ATP) i smanjenjem aktivnosti Na + /K + ATP-aze (30). Nakupljanje Na + u astrocitima uzrokuje nagomilavanje vode i bubrenje astrocita, a navodi se i povećana ekspresija akvaporina-4 kao mogući mehanizam njihovog bubrenja (31). Osim ovoga amonijak stimuliše i aktivaciju protein kinaza aktiviranih mitogenima (MAP kinaza), nuklearnog faktora kapa B (NF-κB) i p53 proteina koji doprinose bubrenju astrocita (32,33). Disfunkcija endotelnih ćelija izazvana amonijakom, citokinima, lipopolisaharidom takoĊe moţe dopinositi edemu mozga posredstvom slobodnih radikala i NF-κB, sliĉno kao i u astrocitima (34). Iako je edem mozga u akutnoj HE dominantno posledica bubrenja astrocita, edemu mozga doprinosi i povećanje propustljivosti krvno-moţdane barijere (vazogena komponenta). Prethodna istraţivanja ukazuju da hiperamonijemija uzrokuje aktivaciju matriks metaloproteinaze 9 (MMP-9), koja proteolizom aktivira receptor za epidermalni faktor rasta (EGFR). EGFR preko p38 MAP kinaznog puta i NF-κB smanjuje sintezu i ekspresiju okludina, proteina tesnih veza, u endotelnim ćelijama, ĉime se narušava integritet krvno-moţdane barijere (35–37). 8 Osim edema mozga, akutnu HE/hiperamonijemiju karakteriše i smrt neurona mehanizmom ekscitotoksiĉnosti usled povećanja glutamatergiĉke transmisije (38), kao i povećana ekspresija glukoznog transportera GLUT-1 u endotelnim ćelijama krvnih sudova u mozgu (39). Za razliku od akutne HE, u hroniĉnoj HE/hiperamonijemiji edem mozga nije izraţen, već je dominantna morfolološka promena Alchajmer (Alzheimer) tip II astrocitoza (40). Astrociti sa Alchajmer tip II fenotipom se mogu uoĉiti i u sivoj i u beloj masi mozga i njihov broj koreliše sa stepenom HE. Alchajmer tip II astrociti se karakterišu prominentnim jedarcima i krupnim svetlim jedrima, koja se mogu videti u paru i ĉiji oblik moţe da varira od okruglog u korteksu do nepravilnog u bazalnim ganglijama (41). Ove morfološke promene praćene su i promenama ekspresije gena za proteine koji regulišu volumen i energetsko stanje astrocita i neurotransmisiju (42). Patogenetski mehanizmi koji su ukljuĉeni u razvoj hroniĉne HE ukljuĉuju: poremećaje neurotransmisije sa prevagom inhibicijske neurotransmisije (38), oksidativni/nitrozativni stres (43), mitohondrijsku disfunkciju, energetske poremećaje (44), neuroinflamaciju (45) i promene aktivnosti Na + /K + ATPaze (46). Prvobitne teorije su naglašavale ulogu energetskih poremećaja u hiperamonijemiji kao kljuĉnih ĉinilaca u patogenezi hroniĉne HE (47,48). Pozitronskom emisionom tomografijom je kod pacijenata sa cirozom jetre i HE uoĉeno smanjeno iskorišćavanje glukoze u mozgu, najpre u gyrusu cinguli, regionu odgovornom za paţnju (49). Tokom progresije encefalopatije iskorišćavanje glukoze se smanjuje u celom korteksu, a povećava se u bazalnim ganglijama, hipokampusu i cerebelumu (50,51). Glavne mete amonijaka u mitohondrijama odgovorne za energetski deficit u ćelijama su enzimi ciklusa trikarboksilnih kiselina i malat-aspartat ĉunasti mehanizam (52). Amonijak u milimolarnim koncentracijama inhibiše α-ketoglutarat dehidrogenazu, jedan od kljuĉnih enzima u ciklusu trikarboksilnih kiselina, i izaziva manjak ATP-a u ćelijama (42,52). TakoĊe, usled inhibicije ovog enzima smanjen je i ulazak piruvata u ciklus trikarboksilnih kiselina, što povećava sintezu laktata u mozgu i njihovu koncentraciju u cerebrospinalnoj teĉnosti (53). Neke studije naglašavaju smanjenu ekspresiju citohrom c oksidaze u razliĉitim moţdanim regionima, što ukazuje na direktan nepovoljan uticaj amonijaka na transport elektrona u 9 mitohondrijama i ćelijsku respiraciju (54). MeĊutim, energetski deficit u hiperamonijemiji je uoĉen jedino u stadijumu kome, što ukazuje da ovo nije kljuĉni faktor u patogenezi blaţih oblika HE (42). 1.3.1. Poremećaji neurotransmisije u HE Savremena istraţivanja naglašavaju ulogu poremećaja neurotransmisije, prevashodno glutamatergiĉke i GABAergiĉke transmisije, u patogenezi svih stadijuma HE (55–57). U fiziološkim uslovima glutamat je neophodan za procese uĉenja. Glutamat nakon vezivanja za N-metil-D-aspartatne (NMDA) receptore omogućava ulazak Na+ i Ca2+ u neurone, što rezultuje vezivanjem Ca2+ za kalmodulin i aktivacijom neuronske azot monoksid sintaze (nNOS). Azot monoksid (NO) zatim aktivira guanilil-ciklazu i povećava sintezu cGMP u neuronima (58). cGMP aktivira protein kinazu G, koja potom fosforiliše fosfodiesterazu i omogućava razgradnju cGMP. Ovaj inicijalni porast sa sledstvenim smanjenjem nivoa cGMP u neuronima je odgovoran za dugotrajnu potencijaciju u CA1 regionu hipokampusa (59), što predstavlja sinaptiĉku osnovu uĉenja. U akutnoj HE/hiperamonijemiji dolazi do povećanja koncentracije ekstracelularnog glutamata u mozgu i pojaĉanja glutamatergiĉke transmisije (60,61). Prekomerna stimulacija NMDA receptora glutamatom uzrokuje nagomilavanje Ca 2+ u neuronima i aktivaciju Ca 2+ - zavisnih enzima (proteaze, fosfolipaze, endonukleaze, ATP-aze) (62,63), kao i povećanje propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane (64). Ovo rezultuje energetskim deficitom u neuronima (65), razgradnjom ćelijskih makromolekula (62), oksidativnim stresom (63) i u krajnjem ishodu nekrozom i apoptozom neurona (ekscitotoksiĉnost) (38). Povećanje glutamatergiĉke transmisije u akutnoj HE moţe se objasniti povećanim oslobaĊanjem glutamata iz neurona i/ili astrocita i njegovim smanjenim preuzimanjem u astrocite (40). Pokazano je na presecima moţdanog korteksa i hipokampusa da amonijak povećava oslobaĊanje glutamata egzocitozom zavisnom od Ca2+ (40,66), kao i da smanjuje ekspresiju glutamatskog transportera GLT-1 (EAAT-2) na membrani astrocita (67). TakoĊe, amonijak smanjuje i ekspresiju drugog glutamatskog transportera GLAST na kultivisanim cerebelarnim astrocitima novoroĊenih pacova (68,69). Smanjen transport glutamata smanjuje i mogućnost detoksikacije amonijaka, s obzirom da se glutamin 10 sintetaza, enzim koji u mozgu detoksikuje amonijak u reakciji sa glutamatom, preteţno nalazi u astrocitima (40,70). Glutamat svoje ekscitotoksiĉne efekte moţe ostvarivati i preko metabotropnih receptora (63). Pokazano je da stimulacija mGluR5 pojaĉava efekte glutamata preko NMDA receptora, tako što oslobaĊa voltaţno-zavisni magnezijumski blok jonskog kanala u okviru NMDA receptora (71). S druge strane, aktivacija NMDA receptora pojaĉava transmisiju preko mGluR5 receptora, spreĉavanjem desenzitizacije ovog receptora (72). Za razliku od akutne HE/hiperamonijemije, u hroniĉnoj HE dolazi do smanjenja glutamatergiĉke transmisije, pre svega na raĉun smanjenja aktivnosti glutamat-NMDA receptor-azot monoksid (NO)-cikliĉni guanozin monofosfat (cGMP) signalnog puta (61,73,74). Iako se ranije smatralo da hroniĉna hiperamonijemija smanjuje glutamatergiĉku transmisiju inhibicijom guanilil ciklaze (75), danas se zna da hiperamonijemija pre svega izaziva poremećaj glutamatergiĉke transmisije na nivou sinteze NO (73). Ustanovljeno je da dugotrajna aktivacija NMDA receptora u hroniĉnoj hiperamonijemiji uzrokuje aktivaciju kalcijum-kalmodulin-zavisne protein kinaze II (CaMKII), koja inaktiviše nNOS fosforilacijom na Ser847 (73). Inaktivacija nNOS smanjuje sintezu NO i cGMP i doprinosi kognitivnim poremećajima u HE (73,76). Osim smanjenja efekata glutamata preko NMDA receptora, u hroniĉnoj HE se menja i aktivnost metabotropnih glutamatskih receptora (mGluR). Ova modulacija aktivnosti mGluR uzrokuje disfunkciju bazalnih ganglija i odgovorna je za motorne promene u HE. U fiziološkim uslovima aktivacija mGluR u nc. accumbensu uzrokuje oslobaĊanje dopamina i gama-aminobuterne kiseline (GABA) u ventralnom palidumu. GABA inhibiše GABA-ergiĉke neurone u ventralnom palidumu, dovodeći na taj naĉin do dezinhibicije glutamatergiĉkih neurona u mediodorzalnom talamusu. Povećana glutamatergiĉka aktivnost rezultuje aktivacijom prefrontalnog korteksa i povećanjem motorne aktivnosti (77). Kod pacova sa HE izazvanom portno-kavnim šantom aktiviraju se alternativni neuronski krugovi u bazalnim ganglijama, što uzrokuje motorne poremećaje u HE. Aktivacija mGluR u hiperamonijemiji ne rezultuje oslobaĊanjem dopamina u nc. accumbens, već stimulacijom GABA-ergiĉkih neurona, koji iz nc. accumbensa seţu do pars reticulata substantiae nigrae. Oni inhibišu GABA-ergiĉke inhibitorne neurone u 11 substantia nigra, dovodeći na taj naĉin do dezinhibicije ventromedijalnog talamusa. Glutamatergiĉki neuroni iz ventromedijalnog talamusa sada snaţnije aktiviraju motorne zone u korteksu i dovode do pojave asteriksisa u HE (38,77). Modulacija glutamatergiĉke aktivnosti u pars reticulata substantiae nigrae je odgovorna i za nastanak hipokinezije u HE (78). Osim poremećaja glutamatergiĉke transmisije, patogenezi HE u velikoj meri doprinose i poremećaji GABA-ergiĉke transmisije, koji se uoĉavaju već u akutnoj, a znatno izraţeniji postaju u hroniĉnoj HE (38). Modulacija GABA-ergiĉke aktivnosti u HE se ostvaruje dominantno posredstvom neurosteroida, koji se vezuju za posebno neurosteroidno mesto na GABAA receptorskom kompleksu (slika 1.1) (79). Neurosteroidi su steroidna jedinjenja, koja se sintetišu u moţdanom tkivu iz holesterola, nezavisno od sinteze steroida u perifernim izvorima (gonade i nadbubreţne ţlezde) (80,81). Baulieu i sar. (82) su prvi pretpostavili da se steroidna jedinjenja sintetišu u mozgu, s obzirom da je koncentracija pregnenolona, dehidroepiandrosterona (DHEA) i njihovih sulfatnih estara znaĉajno viša u moţdanom tkivu nego u serumu. Kasnije je na homogenatima mozga i kulturama astrocita i neurona potvrĊeno da se u mozgu nalaze enzimi neophodni za steroidogenezu (83). Slika 1.1. Struktura GABAA receptora i vezna mesta za ligande koji modulišu GABA-ergiĉku transmisiju Benzodijazepinsko mesto Neurosteroidno mesto Hloridni kanal GABA vezno mesto Pikrotoksinsko mesto Barbituratno mesto 12 Prvi korak u sintezi neurosteroida predstavlja transport holesterola u mitohondrije astrocita. Holesterol se transportuje u mitohondrije pomoću multiproteinskog kompleksa, koji se sastoji od 5-7 subjedinica na spoljašnjoj i unutrašnjoj mitohondrijskoj membrani (79). U okviru ovog kompleksa nalazi se translokatorski protein (ranije poznat kao benzodijazepinski receptor perifernog tipa), koji je udruţen sa voltaţno-zavisnim anjonskim kanalom i translokatorom adeninskih nukleotida kao okosnicom ovog kompleksa. Translokatorski protein prenosi holesterol sa spoljašnje na unutrašnju mitohondrijsku membranu (84). Nakon transporta holesterol se u mitohondrijama prevodi u pregnenolon pod dejstvom citohrom P450-zavisne monooksigenaze, a pregnenolon se zatim u glatkom endoplazmatskom retikulumu pod dejstvom enzima 5α-reduktaze i 3α- hidroksisteroid dehidrogenaze konvertuje u neurosteroide alopregnanolon (ALLO), tetrahidrodeoksi-kortikosteron (THDOC) i tetrahidroksiprogesteron (84,85) (slika 1.2). Neurosteroidi uĉestvuju u regulaciji unosa hrane, seksualnog ponašanja, agresivnosti, anksioznosti, telesne temperature i arterijskog pritiska (83). UtvrĊeno je da se koncentracije ALLO i THDOC u mozgu povećavaju u HE pod uticajem hiperamonijemije i drugih neurotoksina (84,86). Hiperamonijemija sinergistiĉki sa manganom u hroniĉnoj HE (79,87) i proinflamatornim citokinima (interleukin 1β /IL-1β/ i faktor tumorske nekroze alfa /TNF-α/) u akutnoj HE (84,88) dovodi do ushodne regulacije translokatorskog proteina, što omogućava povećano preuzimanje holesterola u mitohondrije i povećanu sintezu ALLO i THDOC. Ovi neurosteroidi deluju kao pozitivni alosterni modulatori GABAA receptora, ĉime dovode do prevage inhibitorne aktivnosti u centralnom nervnom sistemu (CNS) i doprinose patogenezi HE (81,89) (slika 1.2). Povećanju inhibitorne transmisije u HE doprinosi i smanjenje koncentracije dehidroepiandrosteron sulfata, negativnog alosternog modulatora GABAA receptora (90). Efekti neurosteroida na GABA-ergiĉku transmisiju su, bar delimiĉno odgovorni za većinu znakova i simptoma u HE, ukljuĉujući poremećaje ciklusa budnost-spavanje (91), poremećaje pamćenja (92) i senzorne poremećaje (79). 13 Slika 1.2. Sinteza neurosteroida i njihova uloga u modulaciji GABA-ergiĉke transmisije i patogenezi HE (TSPO, translokatorski protein; VDAC, voltaţno-zavisni anjonski kanal; ANT, translokator adeninskih nukleotida; DOC, deoksikortikosteron; 5α-DHDOC, 5α-dihidrodeoksikortikosteron; THDOC, tetrahidro- deoksikortikosteron; 5α-DHPROG, 5α-dihidroprogesteron) (modifikovano prema Ahboucha i Butterworth, 2008). Spoljašnja mitohondrijska membrana Unutrašnja mitohondrijska membrana TSPO VDAC ANT Ushodna regulacija amonijakom, manganom i/ili proinflamatornim citokinima Holesterol Pregnenolon Progesteron DOC 5α-DHDOC THDOC 5α-DHPROG Alopregnanolon Citohrom P450 zavisna monoksigenaza 3β-hidroksisteroid dehidrogenaza 5α-reduktaza Citohrom P450 c21 5α-reduktaza 3α-hidroksisteroid dehidrogenaza 3α-hidroksisteroid dehidrogenaza Pojačanje GABA-ergičke transmisije i aktivacija jedarnih receptora u neuronima Hepatična encefalopatija Aktivacija inhibitorom vezivanja dijazepama (DPI) 14 Osim uticaja na GABA-ergiĉku transmisiju, neurosteroidi utiĉu i na gensku ekspresiju u mozgu. U akutnoj insuficijenciji jetre se smanjuje ekspresija gena za glijalni fibrilarni kiseli protein (engl. glial fibrillary acidic protein, GFAP), transporter za glukozu (GLUT-1), akvaporin IV, glutamatski (EAAT-2) i glicinski transporter u astrocitima (93), kao i gena za neuronske enzime monoaminooksidazu A (MAO-A) i nNOS (94). Taĉan posrednik u modulaciji genske ekspresije nije poznat, ali je uoĉeno da progesteron i njegovi metaboliti menjaju ekspresiju gena za GFAP (95) i akvaporin IV (96), dok aktivacija glukokortikoidnih receptora menja ekspresiju GLUT-1 (97) i MAO-A (98). ALLO moduliše gensku ekspresiju aktivacijom pregnan-X receptora u jedru (99). Ove promene genske ekspresije mogu potencijalno doprinositi bubrenju astrocita u akutnoj HE (100,101). Iako neurosteroidi imaju glavnu ulogu u modulaciji GABA-ergiĉke transmisije u HE, endogeni „benzodijazepini“ i amonijak direktno mogu doprinositi povećanju inhibicije u CNS-u (79). Do danas dokazani endogeni agonisti benzodijazepinskih receptora perifernog tipa (translokatorskog proteina) su inhibitor vezivanja dijazepama (engl. Diazepam Binding Inhibitor, DBI) i porfirini (102). DBI je polipeptid sastavljen od 86 aminokiselina, koji se sintetiše preteţno u glijalnim ćelijama, a u manjoj meri u neuronima (103) i koji aktivira translokatorski protein (slika 1.2) (79). Pokazano je da koncentracija ovog peptida u cerebrospinalnoj teĉnosti raste do pet puta u hepatiĉnoj komi i da koreliše sa stepenom HE (104). Njegovom razgradnjom nastaje oktadekaneuropeptid, koji takoĊe stimuliše sintezu neurosteroida aktivacijom translokatorskog proteina (101,102). Amonijak ne menja afinitet vezivanja GABA za svoje vezno mesto, ali zato deluje sinergistiĉki sa ALLO u promeni afiniteta benzodijazepinskog veznog mesta na GABAA receptorskom kompleksu (79). Uticaji hiperamonijemije na broj i strukturu GABA receptora su još uvek nedovoljno rasvetljeni. Dok su neke studije utvrdile ushodnu regulaciju GABAA receptora (105), druge nisu dokazale promenu broja ovih receptora u HE (106,107). TakoĊe, uoĉene su i povećana ekspresija gena za transporter GABA-e (GAT-2), kao i smanjena ekspresija gena za GABAB1D i β2 subjedinicu GABAA receptora (108). GABA, benzodijazepinsko i neurosteroidno vezno mesto na GABAA receptorskom kompleksu nisu funkcionalno izmenjeni u HE (107,109). 15 Osim poremećaja glutamatergiĉke i GABA-ergiĉke transmisije u HE su takoĊe uoĉeni poremećaji adrenergiĉke, holinergiĉke, dopaminergiĉke, serotoninergiĉke i purinergiĉke transmisije (110). Koncentracije noradrenalina u razliĉitim moţdanim regionima su povećane u eksperimentalnoj HE (111), dok je ekspresija α1 i β1 receptora u frontalnom korteksu i talamusu smanjena (112). TakoĊe, utvrĊeno je i povećanje nivoa acetilholina (113) i aktivnosti acetilholinesteraze u mozgu u HE (114). Na poremećaje dopaminergiĉke transmisije u HE ukazuje povećanje nivoa dopamina i njegovog prekursora 3,4-dihidroksifenilalanina u mozgu u akutnoj insuficijenciji jetre (111). U humanoj populaciji utvrĊeno je smanjenje broja dopaminskih D1 i D2 receptora u putamenu (110), a kod pacova smanjenje D4 receptora u cerebralnom korteksu (108). Poremećaji serotoninergiĉke aktivnosti u eksperimentalnoj i humanoj HE obuhvataju: povećanu ekspresiju gena za serotoninski transporter i serotoninski 5-HT5B receptor u cerebralnom korteksu (108), smanjenu ekspresiju 5-HT1A receptora u putamenu (110) i prolazno povećanje nivoa ekstracelularnog serotonina (112). Iako ondansetron, antagonist 5-HT3 receptora, poboljšava kliniĉku sliku HE (115), biohemijske studije su dvosmislene i ukazuju kako na povećanje, tako i na smanjenje serotoninergiĉke transmisije u HE (79). Adenozin kao neuromodulator pojaĉava disbalans izmeĊu ekscitacije i inhibicije u CNS-u u HE. Na uzorcima mozga dobijenim autopsijom pacijenata koji su umrli u hepatiĉnoj komi utvrĊeno je smanjenje ekspresije adenozinskih A1 receptora u korteksu i strijatumu i smanjenje ekspresije A2A receptora u strijatumu (110). Kod pacova sa portno-kavnim šantom uoĉeno je smanjenje ekspresije gena za A3 receptor u cerebralnom korteksu (108). 1.3.2. Oksidacijski stres, mitohondrijska disfunkcija i inflamacija u HE Mozak je veoma osetljiv na oksidacijski stres zbog velike potrošnje O2 (oko 20% ukupne potrošnje O2 u organizmu (116), visokog sadrţaja polinezasićenih masnih kiselina i gvoţĊa i niske aktivnosti antioksidacijskih i reparacionih enzima u mozgu (116,117). Povećana produkcija slobodnih radikala uoĉena je in vivo u mozgu pacova sa akutnom hiperamonijemijom, kao i in vitro u astrocitima izloţenim NH4Cl. Razvoju oksidacijskog stresa u HE doprinose: amonijak, povećanje intracelularne koncentracije Ca2+ i mitohondrijska disfunkcija, proinflamatorni citokini (TNF-α, interferoni), endogeni 16 benzodijazepini, kao i smanjenje redukovanog glutationa (GSH) (118). Glutamat preko NMDA receptora predstavlja vaţan primarni ĉinilac u razvoju oksidacijskog stresa preko povećanja koncentracije intracelularnog Ca2+ (118). Oksidacijski stres je tesno povezan sa nitrozativnim stresom u patogenezi HE. Slobodni radikali izazivaju aktivaciju NF-κB, koji zatim stimuliše transkripciju gena za inducibilnu NOS (iNOS) i povećava produkciju NO. Superoksidni anjon ulazi u reakciju sa NO, gradeći peroksinitrite, reaktivna azotna jedinjenja (43). Novija istraţivanja naglašavaju vezu izmeĊu bubrenja astrocita i oksidacijskog/nitrozativnog stresa (43,119). Bubrenje astrocita uzrokuje aktivaciju nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADPH) oksidaze, enzima koji povećava produkciju superoksidnog anjona. Reaktivna kiseoniĉna i azotna jedinjenja preko NF-κB doprinose bubrenju astrocita, stvarajući na taj naĉin circulus vitiosus u kome oksidacijski stres pogoršava edem mozga (43,119,120). Osim ovoga, slobodni radikali uzrokuju oštećenje makromolekula u astrocitima i neuronima, ukljuĉujući oksidaciju ribonukleinske kiseline (RNK), nitraciju tirozinskih ostataka u proteinima, promenu transkripcije gena, mobilizaciju cinka i promene u intracelularnoj (MAP kinazni signalni put) i intercelularnoj signalizaciji (43,119). Nitracija uzrokuje disfunkciju glutamin sintetaze, što predstavlja jedan od uzroka smanjene detoksikacije amonijaka u CNS-u (118). Oksidacijsko oštećenje proteina smanjuje efikasnost sinaptiĉke transmisije, što doprinosi oteţanom upamćivanju novih informacija u HE (43). Povećanje propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane je usko povezano sa oksidacijskim stresom u HE (46). Propustljivost unutrašnje mitohondrijske membrane se povećava zahvaljujući otvaranju specifiĉne pore (megakanala) sastavljene od većeg broja proteina na spoljašnjoj i unutrašnjoj mitohondrijskoj membrani, koja omogućava prolaz molekula molekulske mase do 1500 Da. Glavni proteini ove pore su translokator adeninskih nukleotida, periferni benzodijazepinski receptor (translokatorski protein) i voltaţno-zavisni anjonski kanal (porin), dok su pridruţeni proteini u okviru ovog kompleksa produkt tumor-supresorskog gena bcl-2, heksokinaza i kreatin kinaza (46). Stimulusi za formiranje ove pore su povećana mitohondrijska koncentracija Ca2+, oksidacijski stres (posebno redoks stanje tiola i piridinskih nukleotida) i visok pH u 17 mitohondrijskom matriksu (46,121), dok je najspecifiĉniji inhibitor ove pore ciklosporin A, koji spreĉava vezivanje ciklofilina D za proteinski kompleks pore (122,123). Posledice povećanja propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane su smanjenje transmembranskog potencijala kroz unutrašnju mitohondrijsku membranu (46), bubrenje mitohondrija (124) i difuzija jona, nukleotida i manjih proteina (46). Kao posledica difuzije H + jona iz meĊumembranskog prostora u matriks mitohondrija suprimirana je oksidativna fosforilacija, a povećano je stvaranje slobodnih radikala (46,125). Oksidacijski stres dalje dodatno povećava propustljivost unutrašnje mitohondrijske membrane i ćelijsku disfunkciju sa mogućnošću razvoja apoptoze i nekroze (125,126). Apoptoza se razvija kao posledica oslobaĊanja citohroma c iz meĊumembranskog prostora u citoplazmu (126) i aktivacije kaspaze 9. Studije na kulturi astrocita su pokazale da amonijak sniţava transmembransku razliku potencijala kroz unutrašnju mitohondrijsku membranu, kao i da pretretman ciklosporinom spreĉava ovu promenu i ublaţava bubrenje astrocita (127), što ukazuje da povećanje propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane doprinosi patogenezi HE. Povećanje propustljivosti mitohondrijske membrane u HE je posledica formiranja glutamina u astrocitima (127), povećanja intracelularnog Ca2+ usled stimulacije NMDA receptora (64), oksidacijskog stresa (125), dejstva citokina (128), energetskog deficita (46) i povećane ekspresije translokatorskog proteina (129). Moguće je i da hiperamonijemija doprinosi povećanju propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane alkalinizacijom mitohondrijskog matriksa (46). 1.3.3. Uloga neuroinflamacije u patogenezi HE Novija istraţivanja naglašavaju ulogu neuroinflamacije u patogenezi HE i njenu povezanost sa oksidacijskim stresom i mitohondrijskom disfunkcijom (128). Uoĉeno je povećanje nivoa IL-6 i TNF-α u serumu pacijenata sa minimalnom HE kao i njihova korelacija sa koncentracijom amonijaka u krvi i glutamina u mozgu (45). Postoje dve teorije kojima se objašnjava razvoj neuroinflamacije u HE. Prema jednoj teoriji neuroinflamacija se razvija kao posledica sistemskog zapaljenjskog odgovora u insuficijenciji jetre (130). Mehanizmi kojima citokini iz krvi podstiĉu zapaljenjski odgovor 18 u mozgu nisu potpuno rasvetljeni, ali navode se direktni i indirektni efekti. Direktne efekte citokini ostvaruju nakon aktivnog transporta kroz moţdane kapilare ili nakon vezivanja za receptore na endotelnim ćelijama u cirkumventrikularnim organima, a indirektne posredstvom aferentnih vlakana vagusa (130). Sistemska inflamacija moţe uzrokovati i povećanje propustljivosti krvno-moţdane barijere (131). Prema drugoj teoriji neuroinflamacija je posledica aktivacije mikroglije toksinima, koji se nakupljaju u mozgu u insuficijenciji jetre (amonijak, laktati, mangan, glutamat i neurosteroidi) (132). Aktivirana mikroglija sintetiše i oslobaĊa IL-1, TNF-α, IL-6 i hemokine, koji privlaĉe monocite kao dodatne izvore proinflamatornih citokina u moţdano tkivo (133–135). Ovi citokini sinergistiĉki sa amonijakom povećavaju propustljivost unutrašnje mitohondrijske membrane i aktivnost hem oksigenaze 1 (HO-1), markera oksidacijskog stresa, u astrocitima (128) i pogoršavaju energetske poremećaje u HE. Neuroinflamacija doprinosi pojavi kognitivnih i motornih poremećaja u HE, koji mogu da perzistiraju i posle transplantacije jetre (136). U akutnoj insuficijenciji jetre pretpostavlja se da proinflamatorni citokini doprinose razvoju vazogenog edema mozga posredstvom NO i prostaglandina, koji se sintetišu u endotelnim ćelijama krvnih sudova mozga (137). 1.3.4. Uloga aminokiselina u patogenezi HE Osim hiperamonijemiji, manganu i proinflamatornim citokinima uloga u patogenezi HE se pripisuje i aromatiĉnim aminokiselinama i triptofanu. Još James i sar. su ustanovili da se u HE povećava transport velikih neutralnih aminokiselina (npr. triptofana) kroz krvno-moţdanu barijeru (138). TakoĊe, u HE se povećava odnos koncentracija aromatiĉnih i razgranatih aminokiselina u mozgu (139). Iako znaĉaj ovih promena u patogenezi HE nije u potpunosti rasvetljen, pretpostavlja se da one doprinose poremećajima neurotransmisije (140). Povećanje nivoa triptofana u mozgu rezultuje povećanom sintezom serotonina i poremećajima serotoninergiĉke transmisije (141), a povećanje nivoa aromatiĉnih aminokiselina uzrokuje sintezu laţnih neurotransmitera, jedinjenja koja su neaktivna ili ĉiji se efekat u neurotransmisiji razlikuje od pravih transmitera (140). U laţne neurotransmitere ubrajaju se oktopamin, tiramin i feniletanolamin, koji nastaju modifikacijom tirozina i fenilalanina (142). Mehanizam povećanja koncentracije triptofana i aromatiĉnih 19 aminokiselina takoĊe nije potpuno poznat, ali se povezuje sa transportom glutamina iz moţdanog tkiva. Porast nivoa glutamina u mozgu usled detoksikacije amonijaka stimuliše transport glutamina kroz krvno-moţdanu barijeru u zamenu za triptofan i aromatiĉne aminokiseline preko L-transportnog sistema (140,143). 1.4. Eksperimentalni modeli HE Do danas nije utvrĊen idealan eksperimentalni model HE. U dosadašnjim istraţivanjima patogeneze HE korišćeni su psi (144), kunići (145), svinje (146), kao i sitnije ţivotinje (pacovi i miševi) (147,148). Prednost upotrebe velikih ţivotinja sastoji se u jednostavnijem prikupljanju uzoraka krvi, jetre, mozga i drugih organa za analize, kao i u lakšoj primeni neurofizioloških metoda u dijagnozi HE. TakoĊe, eksperimenti na velikim ţivotinjama omogućavaju i lakše izvoĊenje bihejvioralnih testova (149). Ipak najveći broj istraţivanja o HE se danas sprovodi na pacovima i miševima (120,150,151). Glodari su pogodne ţivotinje za ispitivanje patogeneze HE zbog dostupnosti podataka o biohemijskim, patoanatomskim i bihejvioralnim odlikama ovih ţivotinja, kao i zbog potpunog poznavanja njihovog genoma (149). Razvijeni su brojni modeli pogodni za istraţivanje akutne ili hroniĉne HE (149,152). Kriterijumi koje mora da zadovolji dobar model akutne HE (tip A HE) ukljuĉuju: razvoj hiperamonijemije, reproducibilnost kliniĉke slike, razvoj edema mozga i njegovih komplikacija, reverzibilnost promena sa mogućnošću ispitivanja efikasnosti terapijskih procedura, sliĉnost patoanatomskih promena u mozgu i jetri sa humanom HE i bezbednost za izvoĊaĉe eksperimenta (149). Modeli koji u velikoj meri zadovoljavaju ove kriterijume su: HE izazvana devaskularizacijom jetre (153), modeli HE izazvani D- galaktozaminom (154), acetaminofenom (155), azoksimetanom (156) i tioacetamidom (TAA) (157). Devaskularizacija jetre se postiţe formiranjem portno-kavnih anastomoza i podvezivanjem hepatiĉne arterije (149). Ova procedura rezultuje bubrenjem astrocita, edemom mozga i porastom intrakranijalnog pritiska, kao i razvojem EEG promena koje odgovaraju akutnoj HE u humanoj populaciji (149,153). Koncentracije amonijaka u krvi su sliĉne onima koje su izmerene kod ljudi u insuficijenciji jetre (158). Sliĉne promene se 20 uoĉavaju nakon hepatektomije (159). Ovaj model je korišćen za prouĉavanje energetskih poremećaja, poremećaja neurotransmisije i inflamacije u akutnoj HE (149,160). Glavni nedostatak ovog modela je ireverzibilnost encefalopatije (149). Modeli HE izazvani toksinima se ĉesto koriste u praksi zbog jednostavnosti primene supstanci. Administracija D-galaktozamina uzrokuje insuficijenciju jetre praćenu bubrenjem astrocita kod pacova i kunića (154,161). Bolje je okarakterisan model na kuniću gde je edem ograniĉen na sivu masu mozga (154). Propustljivost krvno-moţdane barijere se povećava u bazalnim ganglijama što nije ĉest nalaz u humanoj HE (162). Acetaminofen izaziva masivnu centrolobularnu nekrozu u jetri i encefalopatiju koja se karakteriše razliĉitim stepenom edema mozga (155). Patohistološke promene u mozgu na ovom modelu nisu dobro okarakterisane. Jedan od novijih modela je HE izazvana azoksimetanom, koji po patohistološkim karakteristikama odgovara promenama u humanoj HE. Ovaj model se koristi za ispitivanje genskih manipulacija koje potencijalno menjaju tok HE (156). Drugi toksini koji se koriste za indukciju akutne insuficijencije jetre su CCl4 (163), fosfor i nitrozamini (149), ali ovi modeli nisu dovoljno ispitani. Uoĉeno je da CCl4 menja transkripciju razliĉitih gena u astrocitima (163). Osnovne mane svih modela akutne HE su razvoj hipotermije, hipoglikemije, akutne bubreţne insuficijencije i drugih sistemskih komplikacija, koje se mogu spreĉiti odgovarajućim preventivnim merama (infuzija 0,9% rastvora glukoze, kontrola telesne temperature) (149). TAA je sumporno jedinjenje, koje se koristi u poljoprivredi kao pesticid i u industriji gume, papira i u metalurgiji. Hepatotoksiĉni efekti TAA su dokazani u razliĉitim ţivotinjskim vrstama i uglavnom se ispoljavaju premošćavajućom (engl. bridging) nekrozom i limfocitnim infiltratom bez holestaze (164). TAA svoje efekte izaziva indirektno posredstvom svojih metabolita i insuficijencija jetre izazvana TAA-om je pogodan model za ispitivanje patogeneze HE (157,165). Validnost eksperimentalnih modela hroniĉne HE se procenjuje na osnovu patohistoloških, bihejvioralnih i biohemijskih promena. Kriterijumi koje treba da zadovoljava dobar model hroniĉne HE obuhvataju: hiperamonijemiju, patohistološke promene u jetri koje ukazuju na hronicitet procesa (fibroza, regeneracija hepatocita) sa portno-sistemskim šantovima, bihejvioralne promene koje odgovaraju HE u humanoj 21 populaciji, razvoj Alchajmer tip II astrocitoze u komi, prisustvo provocirajućeg faktora za razvoj HE i ublaţavanje bihejvioralnih promena nakon primene utvrĊenih terapijskih sredstava u HE (149). Psi i maĉke sa kongenitalnim portno-kavnim šantom predstavljaju prirodne modele tipa B HE (149). Postepena stenoza portne vene i boĉna portno-kavna anastomoza kod pacova oponašaju tip B HE u eksperimentalnim uslovima (166). Portno- kavna anastomoza izaziva hiperamonijemiju, porast nivoa glutamina u mozgu, poremećaje spavanja i cirkadijalnog ritma, kognitivne poremećaje, slabljenje refleksa i atrofiju testisa, promene koje se javljaju i u humanoj populaciji. TakoĊe, ova eksperimentalna procedura je praćena i promenom odnosa aromatiĉnih i razgranatih aminokiselina u serumu, pojavom oksidacijskog i nitrozativnog stresa u mozgu i poremećajima neurotransmisije, što omogućava izuĉavanje kompleksnih patogenetskih mehanizama u HE (149,167,168). Za sada ne postoji dobar model tipa C HE. Jedan od prihvatljivih upotrebljavanih modela je podvezivanje holedohusa, koji se karakteriše razvojem sekundarne bilijarne ciroze (169). Na ovom modelu razvijaju se brojne promene koje karakterišu cirozu u humanoj populaciji, kao što su ţutica, portna hipertenzija (169), portno-sistemski šantovi (170), povećanje nivoa endotoksina u cirkulaciji i disfunkcija imunskog sistema (171). Primena amonijum soli kod ovih ţivotinja pogoršava bihejvioralne promene i predstavlja dobar model akutne HE, koja se nadovezuje na hroniĉnu, i karakteriše se Alchajmer tip II astrocitozom, niskostepenim edemom mozga i inflamacijom (172). TakoĊe, u praksi je korišćen i model ciroze jetre izazvan CCl4, koji je bolje opisan nego sliĉan model tipa A HE (152). Osim ovih modela u prouĉavanju patogeneze HE koriste se i hiperamonijemiĉne ţivotinje bez oštećenja jetre (173). Ovi modeli su pogodni za ispitivanje iskljuĉivo uticaja hiperamonijemije kao kljuĉnog poremećaja u HE na moţdanu funkciju. Mogu se koristiti za prouĉavanje poremećaja glutamatergiĉke i GABA-ergiĉke transmisije i drugih mehanizama razvoja kognitivnih poremećaja u HE (56,173). Za ispitivanje molekularnih mehanizama dejstva amonijaka i drugih toksina koriste se kultivisani astrociti (41), ćelije glioma (174), kao i preseci mozga (175). Na posebno pripremljenim vitalnim presecima mozga dobijenim od ţivotinja sa HE mogu se prouĉavati mehanizmi edema mozga (175), oštećenja neurona (176), signalni putevi (177) i karakteristike astrocita u HE (178). Glavna 22 mana korišćenja kultivisanih ćelija je nemogućnost integrativnog sagledavanja kompleksnosti mehanizama HE, a preseka mozga njihova kratkotrajna vijabilnost (149). 1.5. Efekti finasterida na neurotransmisiju Finasterid (FIN), inhibitor 5α-reduktaze, se koristi u terapiji androgene alopecije (179) i hiperplazije prostate (180). Osim u perifernim organima, FIN blokira 5α-reduktazu i u CNS-u, inhibiše sintezu ALLO i THDOC na dozno-zavistan naĉin i preusmerava progesteron u alternativne metaboliĉke puteve. Dok se nivo progesterona i deoksikortikosterona u mozgu ne menja nakon tretmana FIN, nivo 20α-dihidroprogesterona raste. Znaĉaj ovog preusmeravanja progesterona u 20α-redukciju nije poznat, ali pretpostavlja se da na ovaj naĉin nastaju neaktivni metaboliti neurosteroida (181). U humanoj populaciji je uoĉeno da aktivnost 20α-hidroksisteroid dehidrogenaze poseduje aldo-keto reduktaza 1C1, koja inaktiviše ALLO i preusmerava progesteron u kataboliĉke puteve (182). TakoĊe, nivo ALLO u mozgu se smanjuje i usled hidroksilacije progesterona pomoću izoforme 2D citohrom P450-zavisne monooksigenaze (183). Na ovaj naĉin FIN moduliše GABA-ergiĉku transmisiju i utiĉe na emocionalno stanje (184), tok epilepsije (185), transmisiju bola u CNS-u (186) i smanjuje unos etanola kod miševa (187). Iako FIN ne izaziva spontane epileptiĉke napade kod pacova (188), tretman FIN-om povećava uĉestalost konvulzija u litijum-pilokarpinskom modelu epilepsije (189). Pokazano je da su u bazalnim uslovima niske koncentracije neurosteroida dovoljne za modulaciju GABA- ergiĉke aktivnosti i prevenciju epileptiĉkih praţnjenja. U epilepsiji osetljivost GABAA receptora na neurosteroide se smanjuje, ĉime se objašnjava pogoršanje epilepsije nakon inhibicije sinteze neurosteroida FIN-om (190,191). FIN takoĊe izaziva hiperalgeziju kod pacova modulacijom transmisije bola u kiĉmenoj moţdini (192). Poznato je da neurosteroidi suprimiraju prenos bola u kiĉmenoj moţdini (192,193). Neuropatski bol izaziva povećanje aktivnosti citohrom P450-zavisne monooksigenaze i/ili 3α-hidroksisteroid oksidoreduktaze i porast nivoa neurosteroida, koji alosternom modulacijom aktivnosti GABAA receptora inhibišu transmisiju bola (194,195). Bol izazvan formalinom kod pacova takoĊe povećava aktivnost 5α-reduktaze i sintezu 23 ALLO (196). FIN pojaĉava ovaj bol, što ukazuje da se modulacija aktivnosti 5α-reduktaze moţe koristiti u terapiji bola (192). Efekti FIN na unos alkohola i razvoj zavisnosti kod miševa zavisi od reţima njegove primene. Akutna primena FIN smanjuje voljni unos etanola kod miševa kod kojih se prethodno razvila zavisnost. Ovo se moţe objasniti preklapanjem efekata neurosteroida i alkohola na GABA-ergiĉku transmisiju (187). Alkohol ima bifazni efekat na GABA- ergiĉku transmisiju sa direktnom aktivacijom GABAA receptora u prvom koraku i indirektnom aktivacijom posredstvom neurosteroida u drugom koraku (197). S druge strane hroniĉnom primenom se znaĉajno smanjuju efekti FIN na unos alkohola. Moguća objašnjenja za smanjenje efekata FIN mogu biti razvoj tolerancije na FIN i kompenzatorne promene u strukturi GABAA receptora, kojima se povećava osetljivost ovih receptora na etanol (187,198). Skorašnje studije su pokazale da FIN ima uticaja i na unos etanola kod ljudi. FIN smanjuje subjektivan osećaj prijatnosti nakon umerenog konzumiranja alkohola kod ljudi koji poseduju alel za α2 subjedinicu GABAA receptora (199). TakoĊe, uoĉeno je da je alkoholna apstinencija praćena smanjenjem nivoa ALLO u plazmi, koje koreliše sa anksioznošću i depresijom, što govori u prilog povoljnog uticaja FIN u alkoholnoj apstinenciji (200). Osim ovoga, FIN ispoljava i antipsihotiĉno dejstvo i predstavlja potencijalno pomoćno sredstvo u terapiji shizofrenije, maniĉnih poremećaja i Turetovog (Tourette) sindroma (201). FIN moduliše dopaminergiĉku transmisiju direktnim i indirektnim mehanizmima, koji još uvek nisu dovoljno rasvetljeni, s obzirom da FIN nespecifiĉno blokira redukciju androgena, progestagena i glukokortikoida (202). 24 2. CILJEVI 25 Efekti FIN na tok HE nisu utvrĊeni. S obzirom da FIN inhibiše sintezu ALLO i THDOC, neurosteroida koji doprinose povećanju inhibitorne transmisije u HE, moţe se pretpostaviti da bi FIN imao potencijalno neuroprotektivno i terapijsko dejstvo u HE. Stoga su ciljevi ove disertacije bili: Ispitati bihejvioralne odgovore u HE izazvanoj TAA kod pacova upotrebom baterije specifiĉnih testova Registrovati EEG promene: vizuelno i pomoću softvera odrediti spektralnu snagu kao i frekventni opseg dominirajućih talasa u HE izazvanoj TAA kod pacova Odrediti parametre oksidacijskog stresa i antioksidacijske zaštite i aktivnost acetilholinesteraze u hipokampusu, moţdanoj kori, talamusu, nc. caudatusu i moţdanom stablu u intoksikaciji TAA Odrediti ekspresiju ćelijskih markera u moţdanoj kori i hipokampusu u intoksikaciji TAA Ispitati uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj TAA kod pacova 26 3. MATERIJAL I METODE 27 3.1. Korišćene supstance Tioacetamid, finasterid i 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin su nabavljeni od Sigma Aldrich Co., SAD. Fenilmetilsulfonil fluorid (P7626), koktel inhibitora proteaza (P8340) i natrijum ortovanadat su nabavljeni od Sigma Aldrich Co., Nemaĉka, a NaF od Mercka, SAD. Poliklonsko kozje anti-SOD1, poliklonsko kozje anti-SOD2, poliklonsko zeĉje anti- p67-phox, poliklonsko zeĉje anti-p47-phox, poliklonsko zeĉje anti-p40-phox i poliklonsko zeĉje anti-p22-phox antitelo su nabavljena od Santa Cruz, Kalifornija, SAD. Monoklonsko mišje anti-NeuN antitelo je nabavljeno od Chemicon, SAD, poliklonsko zeĉje anti-GFAP od Dakko, Danska, a poliklonsko kozje anti-Iba1 i monoklonsko mišje anti-MOG antitelo su nabavljeni od Abcam, Velika Britanija. Sekundarna anti-zeĉja, anti-kozja i anti-mišja antitela su nabavljena od Southern Biotech SAD. 3.2. Eksperimentalne životinje Eksperimenti su sprovedeni na odraslim muţjacima pacova Wistar soja, mase 170- 200 g, koji su nabavljeni iz vivarijuma Vojnomedicinske akademije u Beogradu. Ţivotinje su ĉuvane pojedinaĉno, u kavezima od pleksiglasa (55x35x30cm) u standardnim laboratorijskim uslovima (temperatura 22 ± 2ºC, relativna vlaţnost vazduha 50%, 12/12 h ciklusi svetlost/tama, sa svetlom ukljuĉenim u 9 h), pri ĉemu su im voda i hrana bili dostupni ad libitum. Sve eksperimentalne procedure su bile u skladu sa Direktivom Evropskog parlamenta (2010/63/EU) i odobrene od strane Etiĉkog komiteta Univerziteta u Beogradu (dozvola broj 1891/2). 3.2.1. Uticaj TAA na ponašanje, EEG i parametre oksidacijskog stresa u mozgu U cilju ispitivanja encefalopatije izazvane TAA, ţivotinje (n=44) su nasumiĉno podeljene u sledeće grupe: 1. kontrolna grupa (n=8), tretirana fiziološkim rastvorom; 2. eksperimentalna grupa tretirana TAA na dozno zavisan naĉin: TAA300 (300 mg/kg, n=8), TAA600 (600 mg/kg, n=10) i TAA900 (900 mg/kg, n=18). Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su primenjene tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900) intraperitonealno. Pre administracije TAA je rastvoren u fiziološkom rastvoru u 28 koncentraciji od 100 mg/mL. Bihejvioralne manifestacije su praćene 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Neposredno pre izvoĊenja testova merena je rektalna temperatura pacova kako bi se uoĉila eventualna hipotermija kao neţeljeni efekat primene TAA. EEG je registrovan 22-24 h nakon tretmana, s obzirom da je u našoj pilot studiji uoĉeno da su bihejvioralne manifestacije encefalopatije izazvane TAA najizraţenije u periodu oko 24 h nakon tretmana. Uzorci krvi za odreĊivanje koncentracije amonijaka u plazmi su uzeti iz desne komore srca 24 h nakon primene poslednje doze TAA, a potom su ţivotinje ţrtvovane. Uzorci jetre su prikupljeni za patohistološku analizu, kao i uzorci mozga za odreĊivanje lipidne peroksidacije i aktivnosti katalaze. Koncentracija amonijaka u plazmi, kao pokazatelja insuficijencije jetre, je odreĊena enzimskim testom (BioMerieux Lab., France). Uzorci jetre za patohistologiju su fiksirani u 10% puferisanom formalinu i ukalupljeni u parafinu. Iseĉci tkiva debljine 5 μm su bojeni hematoksilinom i eozinom (HE bojenje) i posmatrani pod svetlosnim mikroskopom Olympus BX41. Lipidna peroksidacija i aktivnost katalaze su odreĊeni u moţdanoj kori, hipokampusu i moţdanom stablu. 3.2.2. Uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj TAA-om U cilju ispitivanja uticaja finasterida na HE izazvanu TAA-om, ţivotinje (n=44) su podeljene u sledeće grupe: 1. kontrolna grupa (n=8), tretirana 2-hidroksipropil-ß- ciklodekstrinom i fiziološkim rastvorom; 2. TAA900 grupa tretirana TAA (900 mg/kg, n=18); 3. grupa tretirana finasteridom, FIN (150 mg/kg, n=8); 4. FIN+TAA900 grupa (n=10) tretirana finasteridom (150 mg/kg) i TAA (900 mg/kg). Dnevne doze TAA (300 mg/kg) i finasterida (50 mg/kg) su administrirane tokom tri uzastopna dana. U FIN+TAA900 grupi finasterid (50 mg/kg) je primenjen 2 h pre svake pojedinaĉne doze TAA (300 mg/kg). Ova doza TAA je izabrana, jer je u našoj pilot studiji pokazano da ona izaziva izraţene manifestacije HE, ukljuĉujući i hepatiĉnu komu. Doza FIN je odreĊena na osnovu ranije studije koja je pokazala da ova doza sniţava nivo ALLO u plazmi i mozgu za 66% i 80% u toku 24 h (203). Pre primene TAA je rastvoren u fiziološkom rastvoru (0,9% NaCl) u 29 koncentraciji od 100 mg/mL, dok je finasterid rastvoren u 20% rastvoru 2-hidroksipropil-ß- ciklodekstrina u 0,9% NaCl. Sve supstance su primenjene intraperitonealno. Bihejvioralne karakteristike su praćene 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon tretmana, dok je EEG registrovan u periodu 22-24 h nakon tretmana. Krv iz desne polovine srca, kao i uzorci jetre za patohistološku analizu i uzorci mozga za odreĊivanje parametara oksidacijskog stresa, aktivnosti acetilholinesteraze i ekspresiju ćelijskih markera su uzeti 24 h nakon tretmana. Parametri oksidacijskog stresa i aktivnost acetilholinesteraze su odreĊeni u hipokampusu, moţdanoj kori, talamusu i nc. caudatusu. Ekspresije NeuN (engl. neuronal nuclear antigen) kao markera neurona, MOG (engl. myelin oligodendrocyte glycoprotein) kao markera oligodendrocita, Iba 1 (engl. ionized calcium binding adaptor molecule 1) kao markera mikroglije i GFAP (engl. glial fibrillary acidic protein) kao markera astrocita, kao i ekspresija subjedinica NADPH oksidaze i izoenzima superoksid dizmutaze u hipokampusu i moţdanoj kori su odreĊene Western blot metodom. 3.3. Bihejvioralni testovi Bihejvioralne promene su ispitivane korišćenjem baterije testova prema Nortonu i sar (204). Ova baterija sadrţi sledeće testove: refleks uklanjanja, auditivni refleks, refleksne trzaje glavom, kornealni refleks, ekvilibrijumski test, refleks hvatanja, refleks uspravljanja, refleks postavljanja, test opšte motorne aktivnosti i test eksplorativnog ponašanja. IzvoĊenje ekvilibrijumskog testa, kao i pojava refleksa uspravljanja, hvatanja i postavljanja su praćeni u periodu od 300 s. Refleks uklanjanja je ispitivan tako što je ţivotinji na ravnoj podlozi uštinut rep peanom. Kao fiziološki odgovor na bolnu draţ ţivotinja pomera rep ili se cela udaljava od izvora draţi. Auditivni refleks je ispitivan tako što se ţivotinja na ravnoj podlozi u mirovanju izloţi kratkotrajnom izvoru snaţnog zvuka. Fiziološki odgovor na ovakav zvuk podrazumeva trzaje tela i kratkotrajnu fleksiju kiĉmenog stuba sa zauzimanjem luĉnog poloţaja. 30 Refleksni trzaji glavom se ispituju laganim uduvavanjem vazduha u uho pacova. Fiziološki odgovor na ovu draţ je predstavljen trzajima glave, koji traju sve vreme trajanja draţi. Kornealni refleks je ispitan laganim dodirivanjem roţnjaĉe zašiljenim komadićem vate. Brzo spuštanje gornjeg kapka predstavlja fiziološki odgovor na ovu draţ. Ekvilibrijumski test zapoĉinje postavljanjem ţivotinje na horizontalnu podlogu, koja se potom iskosi za 30˚. Odgovor na iskošenje podloge treba da bude okretanje glave u pravcu kosine uz oĉuvanje ravnoteţe. Test traje najduţe 300 s, a tokom testa meri se vreme koje protekne od iskošenja podloge do okretanja glave. Za ispitivanje refleksa hvatanja ţivotinja se odvaja od podloge i potom se dodiruje šapa ĉvrstim predmetom. Fiziološki odgovor podrazumeva fleksiju prstiju i hvatanje predmeta. Sliĉno kao i u ekvilibrijumskom testu meri se vreme potrebno za hvatanje predmeta. Ispitivanje refleksa uspravljanja zapoĉinje postavljanjem ţivotinje na leĊa. Fiziološki odgovor podrazumeva trenutno okretanje ţivotinje i postavljanje na ekstremitete. Tokom testa prati se vreme potrebno za okretanje ţivotinje. Refleks postavljanja se izvodi na iskošenoj podlozi (30˚) priljubljenoj uz horizontalnu podlogu. Ţivotinji se zadnji ekstremiteti spuste na horizontalnu podlogu, a potom se prati vreme potrebno da ţivotinja spontano spusti prednje ekstremitete. Fiziološki odgovor je trenutno spuštanje ţivotinje na horizontalnu podlogu. Opšta motorna aktivnost i eksplorativno ponašanje su odreĊivani u posebnim kavezima (55x35x30 cm), ĉije dno je bilo podeljeno na devet jednakih pravougaonih polja. Opšta motorna aktivnost je izraţena kao broj prelazaka ţivotinje iz jednog u drugo polje u roku od 10 minuta, dok je eksplorativno ponašanje izraţeno kao broj propinjanja ţivotinje na zadnje ekstremitete u istom periodu. Za svaki pojedinaĉni test, ţivotinja je maksimalno mogla dobiti ocenu 4. Ţivotinja je dobijala ocenu 4, ukoliko je brzina izvoĊenja testa bila 75-100% kontrolne vrednosti; ocenu 3: 50-75% kontrolne vrednosti; ocenu 2: 25-50% kontrolne vrednosti; ocenu 1: 1- 25% kontrolne vrednosti, a ocenom 0 ocenjivane su ţivotinje koje nisu pokazivale nikakav 31 odgovor na testu. Kontrolna vrednost predstavlja brzinu izvoĊenja svakog pojedinaĉnog testa ţivotinja iz kontrolne grupe. Ukupna ocena na bihejvioralnim testovima (OBT) je izraţena kao zbir ocena svih pojedinaĉnih testova (maksimalna ukupna ocena = 40; minimalna ukupna ocena = 0) (204). 3.4. Analiza EEG-a - - -68 kar - . Graniĉna frekvencija za EEG-snimke je postavljena na 0,3 Hz i 100 Hz za visokopropusne (high-pass) i niskopropusne (low-pass) filtere, redom. Prikupljanje podataka i obrada signala izvršeni su pomoću LabVIEW softvera, koji je razvijen u laboratoriji NeuroSciLaBG (205,206). EEG zapis je analiziran svakih 30 minuta u periodu 22-24 h posle primene poslednje doze TAA (u vremenskim taĉkama 22,5, 23 i 23,5 h). Za svaki vremenski interval kada je EEG bio analiziran, deo snimka bez artefakta je bio podeljen u 8 epoha od kojih svaka traje 12 s, prema modifikovanoj metodi po Amodio i sar (21). Srednja . Srednja spektralna snaga odraţava srednju voltaţu EEG talasa, kako ukupnu, tako i u odreĊenim frekventnim opsezima (delta, 0,5-3 Hz; teta, 4-7 Hz; alfa, 8-13 Hz; beta, 14-30 Hz) i izraţena je u μV²/Hz. Relativna spektralna snaga predstavlja procentualnu zastupljenost pojedinih frekventnih opsega u ukupnoj spektralnoj snazi. Na osnovu spektralne analize EEG promene su gradirane prema Amodio i sar. (0-srednja dominantna frekvencija > 7.3 Hz i relativna zastupljenost θ talasa < 35%; 1-srednja dominantna frekvencija > 7.3 Hz i relativna zastupljenost θ talasa ≥ 35%; 2-srednja dominantna frekvencija ≤ 7.3 Hz i relativna zastupljenost δ talasa < 45%; 3-srednja dominantna frekvencija ≤ 7.3 Hz i relativna zastupljenost δ talasa ≥ 45%) (17). 32 Po završetku snimanja, ţivotinje su bile vraćene u svoj kavez. 3.5. Parametri oksidacijskog stresa i aktivnost acetilholinesteraze Za odreĊivanje uticaja TAA na lipidnu peroksidaciju i aktivnost katalaze glave ţivotinja (po 6 iz svake grupe) su trenutno zamrzavane u teĉnom azotu i ĉuvane na -85˚C. Nakon izolacije moţdani korteks, hipokampus i moţano stablo su homogenizovani u rastvoru koji sadrţi 0,05 M natrijum fosfatni pufer (pH 7,0) i 0,04 mM etilendiaminotetrasirćetnu kiselinu (EDTA) na temperaturi od 4˚C (konaĉna koncentracija 2 mg tkiva/mL). Stepen lipidne peroksidacije je procenjen odreĊivanjem nivoa malondialdehida (MDA) u moţdanim strukturama u reakciji sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA) metodom po Aruomi i sar (207). U 0,5 mL tkivnog homogenata je dodat 0,05 M rastvor NaOH i 0,5 mL HCl (25% rastvor) i potom je sadrţaj zagrevan u kljuĉaloj vodi 10 min. Nakon hlaĊenja hromogen je ekstrahovan u 3 mL n-butanola i centrifugiran na 2000xg 10 min u cilju izdvajanja organske faze. Apsorbancija organske faze je merena spektrofotometrijski na 532 nm. Nivo MDA je odreĊen na osnovu standardne krive 1,1,3,3-tetrametoksipropana i izraţen u nmol/mg proteina. Koncentracija ukupnih proteina je odreĊena Lorijevom (Lowry) metodom koristeći goveĊe serumske albumine kao standard (208). Aktivnost katalaze je odreĊena na osnovu brzine razgradnje H2O2 (209). U kvarcnu kivetu sa 2,975 mL 0,05 M rastvorom natrijum fosfatnog pufera (pH 7,0) i 0,4 mM rastvorom EDTA dodato je 50 µL tkivnog homogenata. Nakon pripreme u smešu je dodato 25 µL H2O2 i aktivnost katalaze je merena spektrofotometrijski na osnovu brzine promene apsorbancije (razgradnja H2O2) tokom 3 min na 240 nm. Aktivnost katalaze je izraţena u U/mg proteina, pri ĉemu jednoj jedinici (U) odgovara aktivnost koja razgradi 1 µmol H2O2/min. Za ispitivanje uticaja FIN na oksidacijski stres u mozgu izazvan TAA-om, glave ţivotinja (po 6 iz svake grupe) su trenutno zamrzavane u teĉnom azotu a zatim ĉuvane na - 85 C. Moţdane strukture (korteks, hipokampus, talamus i nc.caudatus) su preparisane na hladno i homogenizovane u hladnom puferisanom saharoznom medijumu (0,25 M saharoze, 10 mmol/L K/NaPO4 pufer pH 7.0 i 1 mmol/L EDTA) nakon ĉega je izdvojena 33 nepreĉišćena sinaptozomalna frakija po metodi Whittakera i Barkera (210). Homogenizacijom usitnjeno tkivo je potom centrifugirano na 1000xg 15 min. Supernatanti su centrifugirani 30 minuta na 20000xg. Ovako dobijeni supernatant predstavlja nepreĉišćenu sinaptozomalnu frakciju koja sadrţi membranske vezikule (mikrozome) nastale od glatkog i granulisanog endoplazmatiĉnog retikuluma, Goldţijevog aparata i plazma membrane kao i sve solubilne komponente citoplazme. Talog je resuspendovan u dejonizovanoj vodi i ostavljen 60 minuta na +4ºC uz povremeno mešanje. Ovako resuspendovan talog je zatim centrifugiran na 1700xg 15 minuta. Dobijeni supernatant predstavlja nepreĉišćenu mitohondrijsku frakciju i sadrţi mitohondrije, lizozome i peroksizome. Nepreĉišćena sinaptozomalna frakcija se ĉuva na -80 ºC. U uzorcima nepreĉišćene sinaptozomalne frakcije su spektrofotometrijskom metodom odreĊivani lipidna peroksidacija, nivo redukovanog glutationa (GSH), aktivnost superoksid dizmutaze (SOD), glutation peroksidaze (GPx), glutation reduktaze (GR), katalaze i acetilholinesteraze (AchE). Stepen lipidne peroksidacije je odreĊen merenjem koncentracije malondialdehida (MDA) u sinaptozomalnoj frakciji pojedinih struktura mozga (211). Tiobarbituratna kiselina (TBA) reaguje sa MDA stvarajući ţuto obojeni kompleks. Koliĉina stvorenog MDA meri se spektrofotometrijski na 533 nm. Sadrţaj GSH odreĊivan je spektofotometrijski upotrebom 5,5-ditiobis-2- nitrobenzoeve kiseline (DTNB). DTNB reaguje sa alifatiĉnim tiol jedinjenjima pri pH 8,0 stvarajući p-nitrofenol anjon ţute boje (212). Intenzitet boje se koristi za merenje koncentracije GSH oĉitavanjem na spektofotometru pri 412 nm. Aktivnost glutation peroksidaze (GPx) je odreĊena na osnovu oksidacije redukovanog glutationa (GSH) sa iskorišćavanjem NADPH u reakciji koju katalizuje enzim glutation reduktaza. Meru aktivnosti glutation peroksidaze u kuplovanoj reakciji sa glutation reduktazom, predstavlja promena ekstinkcije merena na 340 nm kao posledica potrošnje NADPH+H+ (213). Aktivnost glutation reduktaze (GR) je odreĊena po metodi Carlberga i Mannervika (214). Metoda se zasniva na reakciji oksidovanog glutationa sa NADPH u prisustvu GR iz 34 uzorka. Potrošnja NADPH je proporcionalna aktivnosti GR i prati se spektrofotometrijski na 340 nm. Aktivnost SOD je odreĊena kao procenat inhibicije autooksidacije adrenalina u baznoj sredini (215). Aktivnost ukupne SOD odreĊuje se kinetiĉki, kao promena ekstinkcije u vremenu (5 min) na talasnoj duţini od 480 nm. Katalaza razlaţe vodonik peroksid na vodu i molekulski kiseonik. Aktivnost katalaze je odreĊena na osnovu koliĉine nerazloţenog vodonik peroksida (supstrata), koji sa amonijum molibdatom gradi ţuto obojeno kompleksno jedinjenje. Intenzitet ţute boje se odreĊuje spektrofotometrijski na 405 nm (216). Aktivnost acetilholinesteraze je odreĊena na osnovu brzine razlaganja acetilholin jodida. Produkt razlaganja acetilholin jodida se vezuje za DTNB gradeći ţuto obojeni kompleks, ĉija se koliĉina meri spektrofotometrijski na 412 nm (217). 3.6. Western blot analiza Za Western blot analizu ţivotinje su ţrtvovane cervikalnom dislokacijom i dekapitacijom bez anestezije, nakon ĉega su glave trenutno zamrzavane u teĉnom azotu i ĉuvane na -85˚C. Dva moţdana regiona, dorzolateralni frontalni korteks i hipokampus, su izolovana i homogenizovana 30 minuta na ledu u litiĉkom puferu (50 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid (Sigma-Aldrich, P7626), koktel inhibitora proteaza (Sigma-Aldrich, P8340), 200mM natrijum ortovanadat (Sigma, Germany) and 1M NaF (Merck, USA)). Nakon homogenizacije uzorci su centrifugirani na 14000xg 15 minuta na 4˚C i izdvojeni su supernatanti kao ćelijski lizati. U supernatantima je odreĊena koncentracija proteina korišćenjem goveĊeg albumina kao standard (218). Jednake koliĉine proteina (50 µg) iz svakog uzorka su prenete na 10% i 12% SDS poliakrilamidni gel i razdvojene elektroforezom. Nakon transfera proteina sa gela na nitroceluloznu membranu, membrane su nespecifiĉno blokirane 1 h 5% nemasnim mlekom u prahu u Tris puferisanom NaCl/0,1% Tween 20 (TBST) i potom inkubirane sa primarnim antitelom preko noći. Primarna antitela korišćena u ovoj studiji su: poliklonsko kozje anti-SOD1 (1:500), polikonsko kozje anti-SOD2 (1:500), poliklonsko zeĉje anti-p67- phox (1:500), poliklonsko zeĉje anti-p47-phox (1:500), poliklonsko zeĉje anti-p40-phox 35 (1:500), poliklonsko zeĉje anti-p22-phox (1:500), monoklonsko mišje anti-NeuN (1:1000), poliklonsko zeĉje anti-GFAP (1:2000), poliklonsko ovĉije anti-Iba1 (1:250) i monoklonsko mišje anti-MOG antitelo (1:1000). Membrane su potom inkubirane sa sekundarnim anti- mišjim (1:2000), anti-zeĉjim (1:2000), anti-kozjim (1:2000) i anti-ovĉijim antitelima (1:2000) obeleţenim peroksidazom rena u TBST 1 h na sobnoj temperaturi. Posle svakog koraka membrane su ispirane 0,1% TBST-om. Po završenoj inkubaciji membrane su isprane od antitela i inkubirane sa mišjim monoklonskim antitelima na aktin (1:10000) u cilju dokazivanja jednakih koliĉina proteina u svim ispitivanim uzorcima. U foto-komori, rendgen film će biti izloţen membrani koja je tretirana sa Enhanced Chemiluminescence System (ECS) i razvijen. Blotovi će biti skenirani i semikvantitativna denzitometrijska analiza će biti vršena korišćenjem programa ImageQuant 5.2. 3.7. Statistiĉka analiza Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± standardna greška, dok su ukupne OBT izraţene u medijanama sa 25. i 75. percentilom u zagradi. Statistiĉka znaĉajnost razlika u koncentraciji amonijaka i rektalnoj temperaturi izmeĊu grupa je procenjena jednostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom. Za poreĊenje ukupne OBT korišćen je Fridmanov (Friedman) neparametarski test, dok je za poreĊenje opšte motorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja korišćena dvostruka ANOVA sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom. Znaĉajnost razlike u izvoĊenju ostalih bihejvioralnih testova je procenjena hi-kvadrat testom. Kako je Kolmogorov- Smirnovljevim testom utvrĊena normalna raspodela spektralnih snaga u svim uzorcima, statistiĉka znaĉajnost razlika u apsolutnoj i relativnoj spektralnoj snazi je procenjena dvostrukom analizom varijanse (ANOVA) sa Tuckeyevim post hoc testom. Za procenu statistiĉke znaĉajnosti razlika u parametrima oksidacijskog stresa, aktivnosti acetilholinesteraze i ekspresiji proteina dobijenih Western blot metodom korišćena je jednostruka ANOVA sa Fisherovim post hoc testom. Statistiĉka analiza vršena je kompjuterskim programom SPSS15.0, a razlika je smatrana statistiĉki znaĉajnom, ako je p<0,05. 36 4. REZULTATI 37 4.1. Uticaj TAA na ponašanje, EEG i parametre oksidacijskog stresa u mozgu Sve ţivotinje su preţivele 24 h nakon primene TAA u dozi od 300 mg/kg. Letalitet u TAA600 grupi je bio 10% (1/10), a u TAA900 grupi 50% (9/18). Rezultati studije su pokazali da koncentracija amonijaka u plazmi bila znaĉajno viša u svim TAA grupama u poreĊenju sa kontrolom (38,8 ± 5,1 µmol/L). TakoĊe, koncentracija amonijaka je bila znaĉajno viša u TAA600 (81,5 ± 5,9 μmol/L) i TAA900 grupi (86,7 ± 7,6 μmol/L) u odnosu na TAA300 grupu (51,4 ± 4,7 μmol/L) (p<0.01). Nije uoĉena znaĉajna razlika u koncentraciji amonijaka izmeĊu TAA600 i TAA900 grupe (Grafikon 4.1A). Iako je rektalna temperatura bila niţa u grupama tretiranim TAA-om u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama, ova razlika nije bila statistiĉki znaĉajna (p>0,05; Grafikon 4.1B). 4.1.1. Histološka analiza U kontrolnoj grupi nisu uoĉene nikakve patohistološke promene u jetri (Slika 4.1A). Nasuprot ovome, u TAA300 grupi uoĉena je akutna premošćavajuća (engl. bridging) centro- centralna nekroza sa izraţenijom eozinofilijom hepatocita i pojedinaĉnim apoptotskim telašcima (u proseku 2,5 na 1000 ćelija) 24 h nakon primene TAA. Portni prostori su normalne graĊe (Slika 4.1B). Akutna premošćavajuća nekroza bez vidljivih apoptotskih telašaca je uoĉena u TAA600 grupi 24 h nakon primene poslednje doze TAA (Slika 4.1C). Sliĉno kao u TAA600 grupi premošćavajuća nekroza je bila prisutna na svim iseĉcima jetre u TAA900 grupi, praćena zapaljenjskim infiltratom i fokalnim krvarenjem u nekrotiĉnim zonama. Apoptotska telašca nisu bila primetna u jetri u TAA900 grupi, ali se mogu uoĉiti mitoze (Slika 4.1D). 38 Grafikon 4.1. Uticaj tioacetamida (TAA) na koncentraciju amonijaka u plazmi (A) i rektalnu temperaturu pacova (B). Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900). Rektalna temperatura je merena 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA, dok je krv za odreĊivanje koncentracije amonijaka uzeta iz desne polovine srca 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike u koncentraciji amonijaka je procenjena primenom jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom, dok je znaĉajnost razlike u rektalnoj temperaturi procenjena primenom dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, †p<0,01 u odnosu na TAA300 grupu). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 K o n c e n tr a c ij a a m o n ij a k a u p la z m i (μ m o l/ L ) * ** † ** † A 30.0 31.0 32.0 33.0 34.0 35.0 36.0 37.0 38.0 0 2 4 6 24 R e k ta ln a t e m p e ra tu ra ( ºC ) Vreme (h) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 B 39 Slika 4.1. Patohistološke promene u jetri nakon intraperitonealne primene tioacetamida (TAA) (H&E bojenje). A. Jetra kontrolnih ţivotinja tretiranih fiziološkim rastvorom je normalne graĊe. B. Jetra pacova iz TAA300 grupe 24 h nakon primene TAA sa premošćavajućom (engl. brigding) centro- centralnom nekrozom, pojaĉanom eozinofilijom hepatocita, prisustvom pojedinaĉnih apoptotskih telašaca i oĉuvanim portnim prostorima. C. Jetra pacova iz TAA600 grupe 24 h bakon primene druge doze TAA sa akutnom premošćavajućom nekrozom i oĉuvanim portnim prostorima D. Jetra pacova iz TAA900 grupe 24 h nakon primene treće doze TAA sa akutnom premošćavajućom nekrozom, mestimiĉnim zapaljenjskim infiltratom i fokalnim krvarenjem u nekrotiĉnim zonama (p- portni prostor, strelica-nekroza) 40 4.1.2. Bihejvioralni testovi Ukupna OBT u TAA300 grupi se nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolnu grupu u svim vremenskim taĉkama (Tabela 4.1). S druge strane, ukupna OBT je bila znaĉajno niţa u TAA600 i TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim intervalima kada su izvoĊeni testovi (p<0,01). TakoĊe, ukupna OBT je bila znaĉajno niţa u TAA900 u odnosu na TAA600 grupu i najniţa ukupna OBT je uoĉena u TAA900 grupi 24 h nakon tretmana. Tabela 4.1. Uticaj tioacetamida (TAA) na ukupnu ocenu eksperimentalnih ţivotinja na bihejvioralnim testovima (OBT). Vreme (h) Ukupna ocena na bihejvioralnim testovima (OBT) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 0 40 (40,40) 40 (40, 40) 38 (38, 40) 15 (1, 22)** 2 40 (40,40) 40 (40, 40) 31 (27, 36)** 10 (1, 20)** # 4 40 (40,40) 40 (38, 40) 32 (32, 38)** 10 (1, 17)** # 6 40 (40,40) 40 (38, 40) 31 (27, 38)** 10 (1, 17)** # 24 40 (40,40) 40 (37, 40) 32 (29, 35)** 4 (0, 4)** # Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900). Bihejvioralni testovi su vršeni 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Na svakom testu ţivotinja je mogla dobiti maksimalnu ocenu 4 (ocena 4, ako je brzina izvoĊenja testa 75-100% kontrolnih vrednosti; ocena 3, 50-75% kontrolnih vrednosti; ocena 2, 25-50% kontrolnih vrednosti; ocena 1, 1-25% kontrolnih vrednosti, ocena 0 ukoliko ţivotinja ne izvodi test). Ukupna OBT je izraĉunata kao zbir ocena dobijenim na pojedinaĉnim bihejvioralnim testovima. Rezultati su prikazani kao medijane sa 25. i 75. percentilom u zagradi. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena Fridmanovim (Friedman) neparametarskim testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu). 41 Analiza pojedinaĉnih testova je pokazala da su vitalni refleksi (kornealni refleks, refleksi uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) bili oĉuvani kod svih ţivotinja iz TAA300 grupe u periodu od 24 h od tretmana. MeĊutim, u TAA600 grupi ovi refleksi su bili znaĉajno sniţeni (oĉuvani u 80% ţivotinja) u odnosu na kontrolu (oĉuvani u 100% ţivotinja) 24 h nakon primene druge doze TAA (p<0,05). Nasuprot ovome, vitalni refleksi su bili znaĉajno sniţeni u TAA900 grupi (oĉuvani u 25% ţivotinja) u poreĊenju sa kontrolom već 2 h nakon tretmana (p<0,01). Tokom vremena ovi refleksi su pokazalo dodatno smanjenje i 24 h nakon tretmana oni su bili oĉuvani u 10% ţivotinja iz TAA900 grupe (Grafikon 4.2). Refleksni trzaji glave, auditivni refleks, ekvilibrijumski test i refleks postavljanja su bili znaĉajno oslabljeni u TAA600 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01), dok su ovi refleksi bili najslabiji u TAA900 grupi. Ovi refleksi su bili ugašeni kod svih ţivotinja iz TAA900 grupe 24 h nakon primene poslednje doze TAA (Grafikon 4.3A i 4.3B). Opšta motorna aktivnost i eksplorativno ponašanje su bili znaĉajno niţi u TAA600 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01). Sa porastom doze TAA je izazvao izraţeniji pad motorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja i u TAA900 grupi ovi testovi su bili znaĉajno niţi u odnosu na TAA600 grupu (p<0,01). Motorna aktivnost je bila odsutna 24 h nakon tretmana u TAA900 grupi, dok eksplorativno ponašanje (propinjanje na zadnje noge) nije bilo uoĉljivo 4 h nakon primene poslednje doze TAA. Nije uoĉena znaĉajna razlika u motornoj i eksplorativnoj aktivnosti izmeĊu TAA300 i kontrolne grupe u periodu od 24 h nakon tretmana (Grafikon 4.4A i 4.4B). 42 Grafikon 4.2. Uticaj tioacetamida (TAA) na vitalne reflekse (kornealni refleks, refleks uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) eksperimentalnih ţivotinja. Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900). Vitalni refleksi su ispitivani 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA. a-trenutak ubrizgavanja prve doze TAA (300 mg/kg) u TAA900 grupi (48 h pre izvoĊenja testova) b-trenutak ubrizgavanja prve doze TAA (300 mg/kg) u TAA600 grupi (24 h pre izvoĊenja testova) 0-trenutak ubrizgavanja jedine doze TAA (300 mg/kg) u TAA300 grupi (neposredno pre izvoĊenja testova) Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem hi-kvadrat testa (* p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 a b 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im k o rn e a ln im r e fl e k s o m , re fl e k s im a u k la n ja n ja , h v a ta n ja i u s p ra v lj a n ja ( % ) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 * * ** ** ** ** # 43 Grafikon 4.3. Uticaj tioacetamida (TAA) na auditivni refleks, refleksne trzaje glave (A), refleks postavljanja i ekvilibrijumski test (B) eksperimentalnih ţivotinja. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem hi- kvadrat testa (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu, †p<0,01 u odnosu na istu grupu u prethodnoj vremenskoj taĉki). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.2. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 a b 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im r e fl e k s n im t rz a je v im a g la v e i a u d it iv n im r e fl e k s o m ( % ) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 **** ** ** ** # ** # ** # ** # ** # † A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 a b 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im r e fl e k s o m p o s ta v lj a n ja i e k v il ib ri ju m s k im t e s to m ( % ) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 ** ** ** ** †** # ** # ** # ** # ** # † B 44 Grafikon 4.4. Uticaj tioacetamida (TAA) na opštu motornu aktivnost (A) i eksplorativno ponašanje (B). Opšta motorna aktivnost je izraţena kao broj prelazaka ţivotinje iz jednog polja u drugo u periodu od 10 min, dok je eksplorativno ponašanje izraţeno kao broj propinjanja ţivotinje na zadnje ekstremitete u istom periodu. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.2. 0 10 20 30 40 50 60 a b 0 2 4 6 24 O p š ta m o to rn a a k ti v n o s t (b ro j p re la z a k a i z j e d n o g p o lj a u d ru g o /1 0 m in .) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 ** ** ** ** ** ** # ** # ** # ** # A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 a b 0 2 4 6 24 E k s p lo ra ti v n o p o n a š a n je (b ro j p ro p in ja n ja n a z a d n je e k s tr e m it e te /1 0 m in .) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 ** ** ** ** ** ** # ** # ** # ** # B ** # 45 4.1.3. Analiza EEG-a Srednja ukupna spektralna snaga je bila znaĉajno viša u TAA300 (1856,58 ± 644,17 μV2/Hz) (p<0,01) i TAA600 grupi (1907,62 ± 623,83 μV 2 /Hz) (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom (180,63 ± 66,45 μV2/Hz) 23,5 h nakon tretmana. U ostalim vremenskim taĉkama kada je EEG analiziran nije uoĉena znaĉajna razlika u srednjoj ukupnoj spektralnoj snazi izmeĊu TAA300, TAA600 i kontrolne grupe (p>0,05). S druge strane, srednja ukupna spektralna snaga je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu u periodu od 22,5-23,5 h nakon tretmana (Grafikon 4.5A). EEG promene u TAA900 grupi u svim vremenskim taĉkama odgovaraju oceni 3 (srednja dominantna frekvencija ≤ 7,3 Hz i zastupljenost δ talasa ≥ 45%). MeĊutim, nije uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika u EEG oceni izmeĊu grupa tretiranih TAA-om i kontrole (Grafikon 4.5B). Analizom srednjih spektralnih snaga po pojedinim frekventnim opsezima naša studija je pokazala da je srednja spektralna snaga beta talasa bila znaĉajno viša u TAA300 grupi u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama. Najizraţeniji porast je uoĉen 23,5 h nakon primene TAA. Dok je srednja spektralna snaga beta talasa bila znaĉajno viša u TAA600 grupi u odnosu na kontrolu 23 h (p<0,05) i 23,5 h nakon tretmana (p<0,01), nije uoĉena znaĉajna razlika u srednjoj snazi beta talasa izmeĊu TAA900 i kontrolne grupe (p>0,05; Tabela 4.2). Za razliku od srednje, relativna spektralna snaga beta talasa je bila znaĉajno niţa u TAA300 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01). Nisu uoĉene znaĉajne promene u relativnoj snazi beta talasa izmeĊu TAA600, TAA900 i kontrolne grupe (Tabela 4.2). Srednja spektralna snaga alfa talasa je bila znaĉajno viša u TAA300 i znaĉajno niţa u TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01). U TAA600 grupi srednja spektralna snaga alfa talasa je bila viša u odnosu na kontrolu samo 23,5 h nakon primene poslednje doze TAA (Tabela 4.3). Relativna spektralna snaga alfa talasa je bila znaĉajno viša u TAA300 grupi u svim vremenskim taĉkama, a u TAA600 samo 23,5 h nakon tretmana u poreĊenju sa kontrolnom grupom. U TAA900 grupi nije uoĉena znaĉajna razlika u relativnoj snazi alfa talasa u odnosu na kontrolu (Tabela 4.3). 46 Spektralna analiza je pokazala da je srednja spektralna snaga teta talasa bila znaĉajno viša u TAA300 i TAA600 grupi u poreĊenju sa kontrolom 23,5 h nakon tretmana (p<0,01). Nasuprot ovome, u TAA900 grupi srednja spektralna snaga teta talasa je bila znaĉajno niţa u svim vremenskim taĉkama u odnosu na kontrolu (p<0,01; Tabela 4.4). Relativna spektralna snaga teta talasa se nije znaĉajno promenila u TAA300 u odnosu na kontrolnu grupu. Veće doze TAA su uzrokovale znaĉajne promene relativne spektralne snage teta talasa u poreĊenju sa kontrolom: porast u TAA600 grupi 22,5 h nakon tretmana i pad u TAA900 grupi u svim vremenskim taĉkama kada je EEG analiziran (Tabela 4.4). Dok u TAA300 grupi nije uoĉena znaĉajna razlika u srednjoj spektralnoj snazi delta talasa u odnosu na kontrolu (p>0,05), srednja snaga delta talasa je bila znaĉajno viša u TAA600 u poreĊenju sa kontrolnom grupom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01). Istovremeno, u TAA900 grupi je uoĉen znaĉajan pad srednje spektralne snage delta talasa u odnosu na kontrolu (p<0,01; Tabela 4.5). Relativna spektralna snaga delta talasa je bila znaĉajno niţa u TAA300 (p<0,01) i TAA600 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom 22,5 h nakon tretmana. Ovaj pad se odţavao u TAA300 grupi 23 i 23,5 h nakon primene poslednje doze TAA, dok se u TAA600 grupi relativna snaga delta talasa vratila na kontrolne vrednosti. Nasuprot ovome, relativna spektralna snaga delta talasa je bila znaĉajno viša u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama (p<0,01; Tabela 4.5). 47 Grafikon 4.5. Uticaj tioacetamida (TAA) na srednju ukupnu spektralnu snagu (A) i EEG ocenu (B) pacova. EEG je registrovan u periodu od 22-24 h nakon tretmana i analiziran u intervalima od 30 minuta (u vremenskim taĉkama 22,5, 23 i 23,5 h). U svakoj taĉki deo EEG-a bez artefakta je podeljen na 8 epoha od po 12 s i analiziran brzom Furijeovom (Fourier) transformacijom. EEG ocena je odreĊena prema Amodio i sar. (1999)(0-srednja dominantna frekvencija > 7.3 Hz i relativna zastupljenost θ talasa < 35%; 1-srednja dominantna frekvencija > 7.3 Hz i relativna zastupljenost θ talasa ≥ 35%; 2-srednja dominantna frekvencija ≤ 7.3 Hz i relativna zastupljenost δ talasa < 45%; 3- srednja dominantna frekvencija ≤ 7.3 Hz i relativna zastupljenost δ talasa ≥ 45%). Statistiĉka znaĉajnost razlike srednjih ukupnih spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom, a EEG ocene Fridmanovim testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 22,5 23,0 23,5 S re d n ja u k u p n a s p e k tr a ln a s n a g a (μ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 ** ** ** ** A 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 22,5 23,0 23,5 E E G o c e n a Vreme (h) kontrola TAA300 TAA600 TAA900 B 48 Tabela 4.2. Uticaj tioacetamida (TAA) na srednju i relativnu spektralnu snagu beta talasa (14-30 Hz). Vreme nakon tretmana(h) Srednja spektralna snaga beta talasa (μV2/Hz) Relativna spektralna snaga beta talasa (%) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 22,5 23,32±6,01 39,81±10,17** 26,16±7,09 19,87±2,65 8,4±1,7 5,4±1,1** 7,3±0,2 8,9±0,3 23,0 23,65±6,03 37,15±9,52* 38,55±11,32* 24,12±4,45 8,6±1,6 4,4±1,1** 7,9±1,2 8,5±0,1 23,5 23,38±5,99 68,14±17,03** 61,34±13,87** 20,38±3,41 9,1±0,9 3,7±0,4** 8,2±1,9 9,4±0,5 EEG je registrovan u periodu od 22-24 h nakon tretmana i analiziran u intervalima od 30 minuta (u vremenskim taĉkama 22,5, 23 i 23,5 h). Srednja i relativna spektralna snaga su odreĊene pomoću posebnog softvera korišćenjem brze Furijeove (Fourier) transformacije. Statistiĉka znaĉajnost razlike srednjih ukupnih spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.5. 49 Tabela 4.3. Uticaj tioacetamida (TAA) na srednju i relativnu spektralnu snagu alfa talasa (8-13 Hz). Vreme nakon tretmana(h) Srednja spektralna snaga alfa talasa (μV2/Hz) Relativna spektralna snaga alfa talasa (%) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 22,5 80,76±25,46 161,05±46,73** 82,50±24,67 17,32±3,46** 11,9±1,0 22,0±2,9** 14,9±2,7 9,7±0,5 23,0 85,19±26,63 185,02±26,94** 131,21±43,86 24,07±4,13** 9,5±0,6 23,9±2,6** 9,9±1,8 9,2±0,8 23,5 79,90±22,83 270,73±42,21** 277,54±59,98** 22,75±3,49** 10,6±2,4 14,6±2,0* 14,5±1,9* 10,9±1,9 Statistiĉka znaĉajnost razlike srednjih ukupnih spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.5. 50 Tabela 4.4. Uticaj tioacetamida (TAA) na srednju i relativnu spektralnu snagu teta talasa (4-7 Hz). Vreme nakon tretmana(h) Srednja spektralna snaga teta talasa (μV2/Hz) Relativna spektralna snaga teta talasa (%) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 22,5 124,22±34,39 138,73±20,75 95,32±11,49 28,17±7,11** 18,3±0,8 18,9±1,3 26,5±1,9** 7,1±0,2** 23,0 134,39±41,24 93,60±28,10 184,66±85,80 30,32±6,24** 15,0±2,1 18,3±1,9 16,2±2,8 5,8±1,2** 23,5 140,81±37,46 308,37±25,17** 363,71±34,03** 29,86±6,99** 18,7±2,0 16,6±1,9 19,1±2,6 6,1±1,0** Statistiĉka znaĉajnost razlike srednjih ukupnih spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.5. 51 Tabela 4.5. Uticaj tioacetamida (TAA) na srednju i relativnu spektralnu snagu delta talasa (0,5-3 Hz). Vreme nakon tretmana(h) Srednja spektralna snaga delta talasa (μV2/Hz) Relativna spektralna snaga delta talasa (%) Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 Kontrola TAA300 TAA600 TAA900 22,5 447,34±76,23 391,61±124,86 855,91±156,10** 173,97±44,61** 66,2±0,6 53,5±1,9** 50,3±1,9** 78,5±0,2** 23,0 650,99±195,64 415,81±67,14 942,18±223,49** 193,08±50,75** 72,8±0,7 39,3±0,2** 71,0±2,6 79,9±1,5** 23,5 507,66±133,86 409,34±159,76 1205,02±210,93** 184,17±49,06** 67,5±0,9 55,1±2,6** 65,1±0,6 77,8±0,5** Statistiĉka znaĉajnost razlike srednjih ukupnih spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.5. 52 Slika 4.2. Reprezentativni EEG snimci eksperimentalnh ţivotinja A. EEG snimak ţivotinja iz TAA300 grupe B. EEG snimak ţivotinja iz TAA600 grupe sa dominantnom visokovoltaţnom aktivnošću u delta frekventnom opsegu (0,5-3 Hz) C. EEG snimak ţivotinja iz TAA900 grupe sa dominacijom niskovoltaţnih delta talasa Za detaljnije informacije videti grafikon 4.5. V o lt až a (µ V ) V o lt až a (µ V ) V o lt až a (µ V ) Vreme (s) Vreme (s) Vreme (s) 53 4.1.4. Uticaj TAA na oksidacijski stres Nivo MDA u moţdanom korteksu je bio znaĉajno viši u TAA600 (0,20 ± 0,04 nmol/mg prot.)(p<0,05) i TAA900 grupi (0,35 ± 0,04 nmol/mg prot.)(p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom (0,11 ± 0,03 nmol/mg prot.) 24 h nakon tretmana. Porast MDA je bio znaĉajno izraţeniji u TAA900 u odnosu na TAA600 grupu (p<0,01). U TAA300 grupi nivo MDA u korteksu se nije znaĉajno razlikovao u odnosu na kontrolnu grupu (p>0,05; Grafikon 4.6A). S druge strane, nivo MDA u moţdanom stablu je bio znaĉajno viši u svim grupama tretiranim TAA-om u odnosu na kontrolu (p<0,01). Sa povećanjem doze TAA je izazvao progresivan porast nivoa MDA u moţdanom stablu, pri ĉemu je najmanji porast uoĉen u TAA300 (0,25 ± 0,05 nmol/mg prot.), a najveći u TAA900 grupi (0,52 ± 0,05 nmol/mg prot.)(Grafikon 4.7B). Za razliku od korteksa i moţdanog stabla nivo MDA u hipokampusu je bio znaĉajno niţi u TAA300 grupi (0,11 ± 0,01 nmol/mg prot.) u poreĊenju sa kontrolom (0,31 ± 0,03 nmol/mg prot.) (p<0,01) 24 h nakon primene TAA. S druge strane nivo MDA je bio znaĉajno viši u TAA900 grupi (0,55 ± 0,03 nmol/mg prot.) u odnosu na kontrolu (p<0,01). Nije uoĉena znaĉajna razlika u nivou MDA u hipokampusu izmeĊu TAA600 (0,35 ± 0,02 nmol/mg prot.) i kontrolne grupe (p>0,05; Grafikon 4.8A). Aktivnost katalaze u korteksu je bila znaĉajno viša u TAA300 grupi (25,49 ± 2,28 U/mg prot.) u odnosu na kontrolu (11,85 ± 1,20 U/mg prot.)(p<0,01). Nasuprot ovome, u TAA600 (5,85 ± 0,20 U/mg prot.) i TAA900 grupi (4,78 ± 0,32 U/mg prot.) kortikalna aktivnost katalaze je bila znaĉajno niţa u poreĊenju sa kontrolnom grupom (p<0,01). Pad aktivnosti katalaze je bio izraţeniji u TAA900 u odnosu na TAA600 grupu (p<0,01; Grafikon 4.6B). U moţdanom stablu aktivnost katalaze je bila znaĉajno niţa u TAA600 (6,51 ± 0,59 U/mg prot.)(p<0,01) i TAA900 grupi (2,93 ± 0,20 U/mg prot.)(p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom (17,46 ± 2,02 U/mg prot.). Aktivnost ovog enzima u moţdanom stablu je bila znaĉajno niţa u TAA900 u poreĊenju sa TAA600 grupom 24 h nakon primene poslednje doze TAA (p<0,01). U TAA300 grupi (15,83 ± 0,92 U/mg prot.) aktivnost katalaze se nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolu (Grafikon 4.7B). 54 Aktivnost katalaze u hipokampusu je bila znaĉajno viša u TAA300 (17,56 ± 1,22 U/mg prot.)(p<0,01) i TAA600 grupi (38,95 ± 6,10 U/mg prot.)(p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom (12,72 ± 0,66 U/mg prot.). Izraţeniji porast aktivnosti katalaze je uoĉen u TAA600 u odnosu na TAA300 grupu (p<0,01). Nasuprot manjim dozama, TAA u dozi od 900 mg/kg je izazvao znaĉajan pad aktivnosti katalaze u hipokampusu (6,98 ± 1,31 U/mg prot.)(p<0,01) u odnosu na kontrolnu grupu (Grafikon 4.8B). 55 Grafikon 4.6. Uticaj tioacetamida (TAA) na nivo malondialdehida (MDA)(A) i aktivnost katalaze (B) u moţdanom korteksu pacova. Dnevne doze TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom jednog (TAA300), dva (TAA600) ili tri uzastopna dana (TAA900). Uzorci mozga za analizu su uzeti 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu). 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 N iv o M D A u k o rt e k s u (n m o l/ m g p ro t. ) ** * ** # A 0 5 10 15 20 25 30 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 A k ti v n o s t k a ta la z e u k o rt e k s u ( U /m g p ro t. ) ** ** ** # B 56 Grafikon 4.7. Uticaj tioacetamida (TAA) na nivo malondialdehida (MDA)(A) i aktivnost katalaze (B) u moţdanom stablu pacova. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu, †p<0,01 u odnosu na TAA300 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.6. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 N iv o M D A u m o ž d a n o m s ta b lu (n m o l/ m g p ro t. ) ** ** † ** † #A 0 5 10 15 20 25 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 A k ti v n o s t k a ta la z e u m o ž d a n o m s ta b lu ( U /m g p ro t. ) ** ** # B 57 Grafikon 4.8. Uticaj tioacetamida (TAA) na nivo malondialdehida (MDA)(A) i aktivnost katalaze (B) u hipokampusu pacova. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu, †p<0,01 u odnosu na TAA300 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.6. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 N iv o M D A u h ip o k a m p u s u ( n m o l/ m g p ro t. ) ** ** # A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 kontrola TAA300 TAA600 TAA900 A k ti v n o s t k a ta la z e u h ip o k a m p u s u ( U /m g p ro t. ) ** ** † ** B 58 4.2. Uticaj finasterida na bihejvioralne, EEG i ćelijske promene u HE izazvanoj TAA Koncentracija amonijaka u krvi je bila znaĉajno viša (p<0,01) kod pacova iz TAA900 (86,7 ± 7,6 µmol/L) i iz FIN+TAA900 grupe (79,3 ± 10,1 µmol/L) u odnosu na kontrolnu grupu (38,8 ± 5,1 µmol/L). Pacovi koji su dobijali samo FIN nisu pokazivali znaĉajnu promenu (p>0,05) u koncentraciji amonijaka u krvi u odnosu na kontrolu TakoĊe, nije postojala statistiĉki znaĉajna razlika izmeĊu pacova iz TAA900 i FIN+TAA900 grupe (Grafikon 4.9). FIN nije izazvao nikakve patološke promene u jetri, a lobularna organizacija i radijalni raspored hepatocita u jetri su bili potpuno oĉuvani (Slika 4.3C). Dok je TAA izazvao konfluentnu centrolobularnu ili premošćavajuću nekrozu sa zapaljenjskim infiltratom u jetri (Slika 4.3B), u FIN+TAA900 grupi balonska degeneracija hepatocita je bila izraţenija, a inflamacija u nekrotiĉnim zonama manje izraţena nego u TAA900 grupi. Duktusna proliferacija i mestimiĉne mitoze hepatocita su takoĊe uoĉljive u FIN+TAA900 grupi (Slika 4.3D). 59 Grafikon 4.9. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na koncentraciju amonijaka u plazmi. Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. Krv za analizu je uzeta iz desne polovine srca 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena jednostrukom ANOVA-om sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 K o n c e n tr a c ij a a m o n ij a k a u p la z m i (µ m o l/ L ) ** ** 60 Slika 4.3. Patohistološke promene u jetri izazvane tioacetamidom (TAA) i finasteridom (FIN) A. Normalna jetra kontrolnih ţivotinja B. Premošćavajuća nekroza sa zapaljenjskim infiltratom i fokalnim krvarenjem u jetri u TAA900 grupi C. Normalna jetra oĉuvane lobularne organizacije i radijalnog rasporeda hepatocita kod ţivotinja tretiranih FIN-om D. Konfluentna centrolobularna nekroza hepatocita u FIN+TAA900 grupi (H&E bojenje) 61 4.2.1. Bihejvioralni testovi Nijedna ţivotinja iz FIN i FIN+TAA900 grupe nije uginula 24 h nakon tretmana (0/8). Ukupna OBT je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu (p<0,01), sa najniţom vrednošću medijane 24 h nakon tretmana (4 (0, 4)). Iako je ukupna OBT bila znaĉajno niţa u FIN+TAA900 u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,05), ta ocena je bila znaĉajno viša u odnosu na ţivotinje iz TAA900 grupe tokom ĉitavog perioda od 24 h nakon primene poslednje doze TAA (p<0,01). Sam FIN nije izazvao znaĉajne promene u ukupnoj OBT u poreĊenju sa kontrolnom grupom (p>0,05) (Tabela 4.6). Tabela 4.6. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na ukupnu ocenu eksperimentalnih ţivotinja na bihejvioralnim testovima (OBT). Vreme (h) Ukupna ocena na bihejvioralnim testovima (OBT) Kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 0 40 (40,40) 40 (40, 40) 15 (1, 22)** 34 (34, 35,25)*# 2 40 (40,40) 40 (40, 40) 10 (1, 20)** # 33,5 (33, 34,25)*# 4 40 (40,40) 40 (40, 40) 10 (1, 17)** # 33,5 (32,25, 34,25)*# 6 40 (40,40) 40 (40, 40) 10 (1, 17)** # 34 (32.5, 35)* # 24 40 (40,40) 40 (40, 40) 4 (0, 4)** # 34 (33, 34)* # Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. Bihejvioralni testovi su vršeni 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Na svakom testu ţivotinja je mogla dobiti maksimalnu ocenu 4 (ocena 4, ako je brzina izvoĊenja testa 75-100% kontrolnih vrednosti; ocena 3, 50-75% kontrolnih vrednosti; ocena 2, 25-50% kontrolnih vrednosti; ocena 1, 1-25% kontrolnih vrednosti, ocena 0 ukoliko ţivotinja ne izvodi test). Ukupna OBT je izraĉunata kao zbir ocena dobijenim na pojedinaĉnim bihejvioralnim testovima. Rezultati su prikazani kao medijane sa 25. i 75. percentilom u zagradi. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena Fridmanovim (Friedman) neparametarskim testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA900 grupu). 62 Dok je uĉestalost oĉuvanih vitalnih refleksa (kornealni refleks, refleksi uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu tokom ĉitavog perioda praćenja (p<0,01) sa najniţom uĉestalošću 24 h nakon primene TAA (10%), ovi refleksi su bili oĉuvani kod svih ţivotinja iz FIN i FIN+TAA900 grupe (Grafikon 4.10). Refleksni trzaji glave i auditivni refleks su bili znaĉajno oslabljeni u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu tokom ĉitavog perioda praćenja (p<0,01) i ugašeni 24 h nakon primene TAA. Iako je uĉestalost oĉuvanih refleksnih trzajeva glave i auditivnog refleksa bila niţa u FIN+TAA900 nego u kontrolnoj grupi u periodu od 24 h nakon tretmana (p<0,01), oĉuvanost ovih refleksa je bila znaĉajno veća nego u TAA900 grupi (p<0,01). Najniţa uĉestalost refleksnih trzajeva glave i auditivnog refleksa u FIN+TAA900 grupi je bila zabeleţena 4, 6 i 24 h nakon tretmana (50%). Sve ţivotinje iz FIN grupe su imale potpuno oĉuvane ove reflekse (Grafikon 4.11A). Dok je oĉuvanost ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu tokom ĉitavog perioda praćenja (p<0,01), sve ţivotinje iz FIN+TAA900 grupe su izvodile ove testove u fiziološkim granicama 2 h nakon tretmana TAA-om. Tokom vremena oĉuvanost ovih testova je bila znaĉajno niţa 4, 6 i 24 h nakon tretmana u FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu (p<0,01). MeĊutim, tokom ĉitavog perioda, oĉuvanost ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja je bila znaĉajno viša u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu (p<0,01). Sve ţivotinje iz FIN grupe su normalno izvodile ove testove (Grafikon 4.11B). Opšta motorna aktivnost i eksplorativno ponašanje su bili znaĉajno niţi u TAA900 i FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu tokom ĉitavog perioda praćenja (p<0,01). MeĊutim, ţivotinje iz FIN+TAA900 grupe su imale znaĉajno bolju opštu motornu aktivnost u poreĊenju sa ţivotinjama iz TAA900 grupe 4, 6 i 24 h nakon aplikacije poslednje doze TAA (p<0,01; Grafikon 4.12A). Eksplorativno ponašanje, takoĊe je bilo znaĉajno izraţenije u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu 6 i 24 h nakon tretmana (p<0,01; Grafikon 4.12B). Nije postojala statistiĉki znaĉajna razlika (p>0,05) u izvoĊenju ovih testova izmeĊu ţivotinja iz FIN i kontrolne grupe. 63 . Grafikon 4.10. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na vitalne reflekse (kornealni refleks, refleks uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) eksperimentalnih ţivotinja. Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA su administrirane intraperitonealno tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. Vitalni refleksi su ispitivani 0, 2, 4, 6 i 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem hi-kvadrat testa (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im v it a ln im r e fl e k s im a (% ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** 64 Grafikon 4.11. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na refleksne trzaje glave, auditivni refleks (A), refleks postavljanja i ekvilibrijumski test (B) eksperimentalnih ţivotinja. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem hi-kvadrat testa (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA900 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.10. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im r e fl e k s n im t rz a ji m a g la v e i a u d it iv n im r e fl e k s o m ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** # ** # ** # ** # ** # A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 2 4 6 24 Ž iv o ti n je s a o č u v a n im e k v il ib ri ju m s k im t e s to m i r e fl e k s o m p o s ta v lj a n ja ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** # ** # ** # B 65 Grafikon 4.12. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na opštu motornu aktivnost (A) i eksplorativno ponašanje (B). Opšta motorna aktivnost je izraţena kao broj prelazaka ţivotinje iz jednog polja u drugo u periodu od 10 min, dok je eksplorativno ponašanje izraţeno kao broj propinjanja ţivotinje na zadnje ekstremitete u istom periodu. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA600 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.10. 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 24 O p š ta m o to rn a a k ti v n o s t (b ro j p re la z a u s u s e d n o p o lj e /1 0 m in .) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** ** # ** # ** # A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 2 4 6 24 E k s p lo ra ti v n o p o n a š a n je (b ro j p ro p in ja n ja n a z a d n je e k s tr e m it e te /1 0 m in ) Vreme (h) kontrola FIN TAA FIN+TAA ** ** ** ** ** ** ** # ** # B 66 4.2.2. Analiza EEG-a Dok je srednja ukupna spektralna snaga bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom 22,5 h, 23 h i 23,5 h nakon primene poslednje doze TAA (p<0,01), nisu uoĉene znaĉajne promene srednje spektralne snage u FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama (p>0,05). MeĊutim, sam FIN je izazvao znaĉajan porast srednje ukupne spektralne snage u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama (p<0,01; Grafikon 4.13). Dok u TAA900 grupi nisu naĊene znaĉajne promene u beta opsegu, u FIN i FIN+TAA900 grupi srednja spektralna snaga beta talasa je bila znaĉajno veća u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,01) u svim vremenskim taĉkama (Grafikon 4.14A). Dok se relativna spektralna snaga beta talasa nije razlikovala u TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom (p>0,05), u FIN+TAA900 grupi relativna snaga beta talasa je bila znaĉajno viša u odnosu na kontrolu (p<0,01). Nasuprot ovome, sam FIN je izazvao znaĉajno smanjenje relativne snage beta talasa u odnosu na kontrolnu grupu u svim vremenskim taĉkama (p<0,01; Grafikon 4.14B). Srednja spektralna snaga u alfa opsegu je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi (p<0,01) i znaĉajno viša u FIN (p<0,01) i FIN+TAA900 grupama (p<0,01) u odnosu na kontrolu (Grafikon 4.15A). Dok TAA nije izazvao znaĉajne promene relativne spektralne snage alfa talasa u odnosu na kontrolu (p>0,05), u FIN i FIN+TAA900 grupama zapazili smo znaĉajan porast relativne spektralne snage u alfa opsegu u poreĊenju sa kontrolom (Grafikon 4.15B). U teta opsegu uoĉen je znaĉajan porast srednje spektralne snage u FIN (p<0,01) i pad u TAA900 grupi (p<0,01) u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama. MeĊutim, u FIN+TAA900 grupi nije došlo do znaĉajne promene srednje spektralne snage teta talasa u poreĊenju sa kontrolnom grupom (p>0,05; Grafikon 4.16A). S druge strane, relativna spektralna snaga u teta opsegu je bila znaĉajno niţa u TAA900 grupi (p<0,01) i znaĉajno viša u FIN+TAA900 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom u svim vremenskim taĉkama. Sam FIN je takoĊe uzrokovao znaĉajan porast relativne snage u teta frekventnom opsegu u odnosu na kontrolu (p<0,01) ali se relativne spektralne snage nisu znaĉajno razlikovale u FIN i FIN+TAA900 grupi (p>0,05; Grafikon 4.16B). 67 Dominantna EEG aktivnost u svim grupama je uoĉena u delta frekventnom opsegu (EEG ocena 3). MeĊutim, apsolutna spektralna snaga u delta opsegu je bila znaĉajno niţa u grupi tretiranoj TAA-om (p<0,01) i znaĉajno viša u FIN (p<0,01) i FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu u svim vremenskim taĉkama (Grafikon 4.17A). S druge strane, dok je relativna spektralna snaga delta talasa bila znaĉajno viša u TAA900 grupi (p<0,01) u odnosu na kontrolu, relativna snaga u delta opsegu je bila znaĉajno niţa u FIN (p<0,01) i FIN+TAA900 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom. FIN u kombinaciji sa TAA-om je izazvao izraţeniji pad relativne spektralne snage delta talasa u odnosu na sam FIN 23 h (p<0,01) i 23,5 h (p<0,01) nakon tretmana (Grafikon 4.17B). 68 Grafikon 4.13. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na srednju ukupnu spektralnu snagu pacova. Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA (300 mg/kg) su administrirane intraperitonealno tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. EEG je registrovan u periodu od 22-24 h nakon primene poslednje doze TAA i analiziran u intervalima od 30 minuta (u vremenskim taĉkama 22,5, 23 i 23,5 h). U svakoj taĉki deo EEG-a bez artefakta je podeljen na 8 epoha od po 12 s i analiziran brzom Furijeovom (Fourier) transformacijom. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). 0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 3000.00 3500.00 4000.00 4500.00 22.5 23.0 23.5 S re d n ja u k u p n a s p e k tr a ln a s n a g a ( µ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** 69 Grafikon 4.14. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na srednju (A) i relativnu spektralnu snagu (B) beta talasa (14-30 Hz). Statistiĉka znaĉajnost razlike spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.13. 0 50 100 150 200 250 22.5 23.0 23.5 S re d n ja s p e k tr a ln a s n a g a u b e ta o p s e g u ( µ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** A 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 22.5 23.0 23.5 R e la ti v n a s p e k tr a ln a s n a g a u b e ta o p s e g u ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** B 70 Grafikon 4.15. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na srednju (A) i relativnu spektralnu snagu (B) alfa talasa (8-13 Hz). Statistiĉka znaĉajnost razlike spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.13. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 22.5 23.0 23.5 A p s o lu tn a s p e k tr a ln a s n a g a u a lf a o p s e g u ( µ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** ** ** ** A 0 5 10 15 20 25 22.5 23.0 23.5 R e la ti v n a s p e k tr a ln a s n a g a u a lf a o p s e g u ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** * ** ** B 71 Grafikon 4.16. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na srednju (A) i relativnu spektralnu snagu (B) teta talasa (4-7 Hz). Statistiĉka znaĉajnost razlike spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.13. 0 100 200 300 400 500 600 700 22.5 23.0 23.5 S re d n ja s p e k tr a ln a s n a g a u te ta o p s e g u ( µ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** A 0 5 10 15 20 25 30 35 22.5 23.0 23.5 R e la ti v n a s p e k tr a ln a s n a g a u t e ta o p s e g u ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** ** ** B 72 Grafikon 4.17. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na srednju (A) i relativnu spektralnu snagu (B) delta talasa (0,5-3 Hz). Statistiĉka znaĉajnost razlike spektralnih snaga je procenjena korišćenjem dvostruke ANOVE sa Takijevim (Tuckey) post hoc testom (**p<0,01 u odnosu na kontrolu, †p<0,01 u odnosu na FIN grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.13. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 22.5 23.0 23.5 S re d n ja s p e k tr a ln a s n a g a u d e lt a o p s e g u ( µ V 2 /H z ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** * ** ** ** ** A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 22.5 23.0 23.5 R e la tv n a s p e k tr a ln a s n a g a u d e lt a o p s e g u ( % ) Vreme (h) kontrola FIN TAA900 FIN+TAA900 ** ** ** ** ** ** ** † ** † B 73 4.2.3. Uticaj finasterida na oksidacijski stres u mozgu izazvan TAA-om Ekspresija p22-phox subjedinice NADPH oksidaze je bila znaĉajno niţa u hipokampusu ţivotinja iz TAA900 grupe u poreĊenju sa kontrolom 24 h nakon primene poslednje doze TAA (p<0,01). Nasuprot ovome, u korteksu nije naĊena znaĉajna promena u ekspresiji ove subjedinice izmeĊu TAA900 i kontrolne grupe (p>0,05). Sliĉno kao u TAA900 grupi, i u FIN grupi ekspresija p22-phox subjedinice je bila znaĉajno niţa u hipokampusu (p<0,01), dok se u korteksu nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolnu grupu (p>0,05). Ekspresija p22-phox u FIN+TAA900 grupi se nije razlikovala ni u korteksu ni u hipokampusu u poreĊenju sa kontrolom (p>0,05; Grafikon 4.18A). Ekspresija p40-phox subjedinice NADPH oksidaze je bila znaĉajno viša u korteksu ţivotinja iz TAA900 (p<0,05) i FIN+TAA900 grupe (p<0,05) u odnosu na kontrolu. U FIN grupi nije uoĉena znaĉajna razlika u kortikalnoj ekspresiji ove subjedinice u odnosu na kontrolu (p>0,05). U hipokampusu ekspresija p40-phox se nije razlikovala u eksperimentalnim grupama u poreĊenju sa kontrolom (Grafikon 4.18B). Ekspresija p47-phox subjedinice u korteksu se nije znaĉajno razlikovala u eksperimentalnim grupama u odnosu na kontrolu (p>0,05). MeĊutim, ekspresija ove subjedinice u hipokampusu je bila znaĉajno niţa u TAA900 (p<0,01), FIN (p<0,01) i FIN+TAA900 grupi (p<0,01) u poreĊenju sa kontrolom 24 h nakon tretmana (Grafikon 4.18C). Ekspresija p67-phox subjedinice NADPH oksidaze je bila znaĉajno niţa u korteksu (p<0,05) i hipokampusu ţivotinja iz TAA900 grupe (p<0,05) u poreĊenju sa kontrolom. Sam FIN nije izazvao znaĉajne promene u ekspresiji ove subjedinice u odnosu na kontrolu ni u korteksu ni u hipokampusu. U FIN+TAA900 grupi ekspresija p67-phox je bila znaĉajno niţa u korteksu u poreĊenju sa kontrolnom grupom (p<0,05), dok se ekspresija ove subjedinice nije znaĉajno razlikovala u hipokampusu ţivotinja iz FIN+TAA900 i kontrolne grupe (p>0,05; Grafikon 4.18D). Nivo MDA u korteksu, hipokampusu i nc. caudatusu je bio znaĉajno veći u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu 24 h nakon primene poslednje doze TAA (p<0,01). S druge strane, TAA nije izazvao znaĉajnu promenu nivoa MDA u talamusu (37,68 ± 6,08 nmol/mg prot.) u poreĊenju sa kontrolom (47,62 ± 4,42 nmol/mg prot.)(p>0,05). Sam FIN je smanjio 74 nivo MDA u korteksu (21,99 ± 3,84 nmol/mg prot.)(p<0,01), hipokampusu (29,53 ± 2,88 nmol/mg prot.)(p<0,01) i talamusu (34,82 ± 3,97 nmol/mg prot.)(p<0,01) i povećao nivo MDA u nc. caudatusu (40,93 ± 4,73 nmol/mg prot.)(p<0,05) u odnosu na kontrolu. U FIN+TAA900 grupi nivo MDA u korteksu (38,27 ± 4,74 nmol/mg prot.)(p>0,05) i talamusu (55,16 ± 7,56 nmol/mg prot.)(p>0,05) se nije znaĉajno razlikovao u odnosu na kontrolu (36,17 ± 5,74 nmol/mg prot. i 47,62 ± 4,42 nmol/mg prot. u korteksu i talamusu), dok je u hipokampusu (88,63 ± 13,03 nmol/mg prot.)(p<0,01) i nc. caudatusu (42,07 ± 2,26 nmol/mg prot.)(p<0,01) bio znaĉajno viši u poreĊenju sa kontrolnom grupom (60,20 ± 7,05 nmol/mg prot. i 32,40 ± 2,11 nmol/mg prot.). PoreĊenjem FIN+TAA900 i TAA900 grupe uoĉeno je da je nivo MDA bio znaĉajno veći u talamusu ţivotinja iz FIN+TAA900 grupe u odnosu na TAA900 grupu (p<0,01), dok znaĉajna razlika u nivou MDA izmeĊu TAA900 i FIN+TAA900 grupe nije uoĉena u hipokampusu i nc. caudatusu (p>0,05; Grafikon 4.19A). Aktivnost SOD je bila znaĉajno viša u korteksu ţivotinja iz TAA900 grupe (201,02 ± 35,93 U/mg prot.) u odnosu na kontrolu (123,32 ± 18,52 U/mg prot.)(p<0,01). Nasuprot ovome, u hipokampusu, talamusu i nc. caudatusu nije uoĉena znaĉajna razlika u aktivnosti ovog enzima izmeĊu TAA900 i kontrolne grupe (p>0,05). FIN je izazvao porast aktivnosti SOD u korteksu (241,65 ± 28,08 U/mg prot.)(p<0,01) i hipokampusu (145,68 ± 16,51 U/mg prot.)(p<0,05) u odnosu na kontrolu. Aktivnost SOD u korteksu (229,79 ± 68,35 U/mg prot.)(p<0,01), hipokampusu (137,06 ± 15,43 U/mg prot.)(p<0,05) i nc. caudatusu (129,57 ± 18,89 U/mg prot.)(p<0,05) je bila znaĉajno viša u FIN+TAA900 grupi u poreĊenju sa kontrolom. S druge strane, aktivnost ovog enzima u talamusu se nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolnu grupu. Ni u jednoj moţdanoj strukturi nije uoĉena znaĉajna razlika u aktivnosti SOD izmeĊu FIN+TAA900 i TAA900 grupe (p>0,05; Grafikon 4.19B). Ekspresija SOD1 u korteksu je bila znaĉajno viša u TAA900 grupi (p<0,05), dok se u hipokampusu ekspresija ovog enzima nije znaĉajno promenila u odnosu na kontrolu (p>0,05). Sam FIN je izazvao znaĉajan porast ekspresije SOD1 u korteksu (p<0,01) i hipokampusu (p<0,05) u poreĊenju sa kontrolom, koji je u korteksu bio izraţeniji nego u TAA900 grupi (p<0,01). U FIN+TAA900 grupi ekspresija SOD1 je bila znaĉajno viša u korteksu (p<0,01) i hipokampusu (p<0,05) u poreĊenju sa kontrolnom grupom. Dok u 75 hipokampusu nije postojala znaĉajna razlika u ekspresiji ovog enzima izmeĊu FIN+TAA900 i TAA900 grupe, ekspresija SOD1 u korteksu je bila znaĉajno viša u FIN+TAA900 u odnosu na TAA900 grupu (p<0,01). MeĊutim, ekspresija ovog izoenzima SOD je bila znaĉajno niţa u korteksu u FIN+TAA900 grupi u odnosu na FIN grupu (p<0,01; Grafikon 4.20). S druge strane, ekspresija SOD2 u korteksu i hipokampusu se nije znaĉajno razlikovala u eksperimentalnim grupama u odnosu na kontrolu (p>0,05; Grafikon 4.20). 76 Grafikon 4.18. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na ekspresiju p22-phox (A), p40-phox (B), p47-phox (C) i p67-phox subjedinice (D) NADPH oksidaze u korteksu (kort) i hipokampusu (hip) pacova. Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA (300 mg/kg) su administrirane tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. Uzorci mozga za analizu su uzeti 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Ekspresija subjedinica je odreĊivana korišćenjem poliklonskih zeĉjih anti-p67-phox (1:500), anti-p47-phox (1:500), anti-p40-phox (1:500) i anti-p22-phox (1:500) antitela. Nakon inkubacije sa primarnim antitelima membrane su inkubirane sa sekundarnim anti-zeĉjim (1:2000) antitelima obeleţenim peroksidazom rena. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu). 77 Grafikon 4.19. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na nivo malondialdehida (MDA)(A) i aktivnost superoksid dizmutaze (SOD)(B) u moţdanim strukturama pacova. Dnevne doze FIN (50 mg/kg) i TAA (300 mg/kg) su administrirane tokom tri uzastopna dana, a u FIN+TAA900 grupi FIN je primenjen 2 h pre svake doze TAA. Uzorci mozga za analizu su uzeti 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA900 grupu). 0 20 40 60 80 100 120 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 N iv o M D A u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a ( n m o l/ m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus ** ** ** ** ** # A ** ** ** * 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 A k ti v n o s t S O D (U /m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus ** ** * * B ** * 78 Grafikon 4.20. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na ekspresiju SOD1 i SOD2 u korteksu (A) i hpokampusu (B) pacova. Ekspresija SOD1 i SOD2 je odreĊivana korišćenjem poliklonskih kozjih anti-SOD1 (1:500) i anti-SOD2 (1:500) antitela. Nakon inkubacije sa primarnim antitelima membrane su inkubirane sa sekundarnim anti-kozjim (1:2000) antitelima obeleţenim peroksidazom rena. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA900 grupu, †<0,01 u odnosu na FIN grupu). 79 Nivo GSH je bio znaĉajno viši u korteksu ţivotinja tretiranih TAA-om (104,29 ± 29,87 nmol/mg prot.) u odnosu na kontrolnu grupu (43,98 ± 13,94 nmol/mg prot.)(p<0,01), dok je nivo GSH u hipokampusu (24,05 ± 7,84 nmol/mg prot.)(p<0,05) i nc. caudatusu (23,46 ± 3,19 nmol/mg prot.)(p<0,05) je bio znaĉajno niţi u TAA900 u poreĊenju sa kontrolnom grupom (39,67 ± 5,76 nmol/mg prot. i 34,70 ± 9,91 nmol/mg prot. u hipokampusu i nc. caudatusu). Sliĉno kao u TAA900 grupi, nivo GSH u korteksu (86,52 ± 26,60 nmol/mg prot.)(p<0,01) je bio znaĉajno viši, a u nc. caudatusu (13,18 ± 2,26 nmol/mg prot.)(p<0,01) znaĉajno niţi u FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu 24 h nakon primene poslednje doze TAA. TakoĊe, nivo GSH u nc. caudatusu je bio znaĉajno niţi u FIN+TAA900 u poreĊenju sa TAA900 grupom (p<0,01), dok se u korteksu nivo GSH nije znaĉajno razlikovao izmeĊu FIN+TAA900 i TAA900 grupe (p>0,05). Dok sam TAA nije uzrokovao promenu nivoa GSH u talamusu, nivo GSH u ovom regionu je bio znaĉajno niţi u FIN+TAA900 grupi (19,37 ± 2,33 nmol/mg prot.)(p<0,05) u poreĊenju sa kontrolom (28,76 ± 6,87 nmol/mg prot.) U hipokampusu ţivotinja iz FIN+TAA900 grupe nije uoĉena znaĉajna razlika u nivou GSH u odnosu na kontrolu (p>0,05). Sam FIN nije izazvao znaĉajnu promenu nivoa GSH u poreĊenju sa kontrolom ni u jednoj moţdanoj strukturi (p>0,05; Grafikon 4.21A). Aktivnost GPx je bila znaĉajno viša u talamusu (235,09 ± 44,91 U/mg prot.)(p<0,01) i nc. caudatusu (109,61 ± 16,11 U/mg prot.)(p<0,01) ţivotinja iz TAA900 grupe u odnosu na kontrolu (162,61 ± 18,72 U/mg prot. i 67,85 ± 12,97 U/mg prot. u talamusu i nc. caudatusu). Iako je postojala tendencija rasta aktivnosti ovog enzima u korteksu i hipokampusu, u ovim strukturama TAA nije izazvao znaĉajnu promenu aktivnosti GPx u poreĊenju sa kontrolom (p<0,05). S druge strane, FIN je izazvao pad aktivnosti GPx u korteksu (58,38 ± 14,48 U/mg prot.)(p<0,01) i talamusu (49,17 ± 10,67 U/mg prot.)(p<0,01) u odnosu na kontrolu. Aktivnost ovog enzima se nije razlikovala ni u jednoj ispitivanoj moţdanoj strukturi u FIN+TAA900 grupi u odnosu na kontrolu (p>0,05), ali je aktivnost GPx u talamusu (176,71 ± 23,68 U/mg prot.)(p<0,01) i nc. caudatusu (57,82 ± 12,43 U/mg prot.)(p<0,01) bila znaĉajno niţa u FIN+TAA900 grupi u poreĊenju sa TAA900 grupom (Grafikon 4.21B). 80 Iako je aktivnost GR pokazivala tendenciju porasta u svim moţdanim strukturama u TAA900 grupi, TAA je izazvao znaĉajan porast aktivnosti ovog enzima jedino u korteksu (9,74 ± 1,52 U/mg prot.) u poreĊenju sa kontrolnom grupom (6,23 ± 2,06 U/mg prot.)(p<0,05). Aktivnost GR se nije znaĉajno razlikovala ni u jednoj moţdanoj strukturi ţivotinja iz FIN+TAA900 grupe u odnosu na kontrolu (p>0,05). MeĊutim, aktivnost ovog enzima u korteksu (6,37 ± 2,55 U/mg prot.)(p<0,05), hipokampusu (10,61 ± 0,87 U/mg prot.)(p<0,05) i talamusu (7,44 ± 2,42 U/mg prot.)(p<0,05) je bila znaĉajno niţa u FIN+TAA900 u poreĊenju sa TAA900 grupom 24 h nakon tretmana. Sam FIN nije izazvao znaĉajnu promenu aktivnosti ovog enzima u odnosu na kontrolu ni u jednoj moţdanoj strukturi (Grafikon 4.22A). Dok FIN nije izazvao znaĉajne promene aktivnosti katalaze, aktivnost ovog enzima u korteksu (6,81 ± 1,58 U/mg prot.)(p<0,01), hipokampusu (3,06 ± 0,56 U/mg prot.)(p<0,01) i talamusu (1,96 ± 0,55 U/mg prot.)(p<0,01) je bila znaĉajno niţa u TAA900 u odnosu na kontrolnu grupu. U nc. caudatusu nije uoĉena znaĉajna razlika u aktivnosti ovog enzima izmeĊu TAA900 (2,94 ± 0,60 U/mg prot.) i kontrolne grupe (4,15 ± 1,72 U/mg prot.)(p>0,05). S druge strane, aktivnost katalaze je bila znaĉajno niţa u hipokampusu (2,54 ± 0,93 U/mg prot.)(p<0,01) i talamusu (2,52 ± 0,84 U/mg prot.)(p<0,01) ţivotinja iz FIN+TAA900 grupe u odnosu na kontrolu (6,13 ± 1,81 U/mg prot. i 5,53 ± 1,37 U/mg prot.), dok se aktivnost katalaze u korteksu i nc. caudatusu nije znaĉajno razlikovala izmeĊu FIN+TAA900 i kontrolne grupe (p>0,05). Ni u jednoj strukturi nije uoĉena znaĉajna razlika u aktivnosti ovog enzima izmeĊu FIN+TAA900 i TAA900 grupe 24h nakon tretmana (p>0,05; Grafikon 4.22B). 81 Grafikon 4.21. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na nivo redukovanog glutationa (GSH)(A) i aktivnost glutation peroksidaze (GPx)(B) u moţdanim strukturama pacova. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,01 u odnosu na TAA900 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.19. 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 140.00 160.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 N iv o G S H u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a (n m o l/ m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus ** ** * ** # A * * 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 A k ti v n o s t G P x u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a ( U /m g p ro t. ) Korteks hipokampus talamus nc. caudatus ** ** # # B ** ** 82 Grafikon 4.22. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na aktivnost glutation reduktaze (GR)(A) i katalaze (B) u moţdanim strukturama pacova. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu, #p<0,05 u odnosu na TAA900 grupu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.19. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 A k ti v n o s t G R u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a (U /m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus # # # * A 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 A k ti v n o s t k a ta la z e u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a ( U /m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus B ** ** ** ** ** 83 4.2.4. Uticaj finasterida i TAA na aktivnost acetilholinesteraze TAA je izazvao znaĉajan porast aktivnosti AchE u talamusu (24,16 ± 2,47 U/mg prot.) (p<0,05) i nc. caudatusu (54,10 ± 12,12 U/mg prot.) (p<0,05) u poreĊenju sa kontrolnom grupom 24 h nakon primene poslednje doze (20,31 ± 1,71 U/mg prot. i 38,20 ± 5,54 U/mg prot. u talamusu i nc. caudatusu). S druge strane, u korteksu i hipokampusu nije bilo znaĉajne promene u aktivnosti ovog enzima u TAA900 grupi u odnosu na kontrolu (p>0,05). Iako je sam FIN izazavao porast aktivnosti AchE u korteksu (9,53 ± 1,19 U/mg prot.) (p<0,01), hipokampusu (17,44 ± 1,74 U/mg prot.) (p<0,01) i nc. caudatusu (48,98 ± 9,27 U/mg prot.) (p<0,05) u odnosu na kontrolu, u FIN+TAA900 grupi aktivnost ovog enzima se nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolnu grupu u ispitivanim moţdanim strukturama (p>0,05; Grafikon 4.23). 4.2.5. Ćelijski markeri u mozgu Ekspresija NeuN je bila znaĉajno niţa u korteksu ţivotinja iz FIN grupe i u hipokampusu ţivotinja iz TAA900 grupe u poreĊenju sa kontrolom (p<0,05; Grafikon 4.24A). Ekspresija GFAP u korteksu je bila znaĉajno niţa u FIN u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,05), dok se u drugim eksperimentalnim grupama kortikalna ekspresija GFAP nije znaĉajno razlikovala u odnosu na kontrolu. Za razliku od korteksa, ekspresija GFAP je bila znaĉajno viša u TAA900 (p<0,05) i znaĉajno niţa u FIN+TAA900 grupi (p<0,05) u poreĊenju sa kontrolom (Grafikon 4.24B). Dok FIN i TAA pojedinaĉno i u kombinaciji nisu izazvali znaĉajne promene u ekspresiji Iba1 u hipokampusu, kortikalna ekspresija Iba1 je bila znaĉajno viša u TAA900, FIN i FIN+TAA900 grupama u poreĊenju sa kontrolom (p<0,05; Grafikon 4.24C). Ekspresija MOG se nije znaĉajno razlikovala u korteksu i hipokampusu eksperimentalnih ţivotinja u odnosu na kontrolu (p>0,05; Grafikon 4.24D). 84 Grafikon 4.23. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na aktivnost acetilholinesteraze (AchE) u moţdanim strukturama pacova. Uzorci mozga za analizu su uzeti 24 h nakon primene poslednje doze TAA. Statistiĉka znaĉajnost razlike izmeĊu grupa je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 i **p<0,01 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.19. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 Kontrola TAA900 FIN FIN+TAA900 A k ti v n o s t A c h E u m o ž d a n im s tr u k tu ra m a ( U /m g p ro t. ) korteks hipokampus talamus nc. caudatus * * * ** ** 85 Grafikon 4.24. Uticaj finasterida (FIN) i tioacetamida (TAA) na ekspresiju ćelijskih markera neurona (NeuN) (A), astrocita (GFAP) (B), mikroglije (Iba1) (C) i oligodendrocita (MOG) (D) u korteksu (kort) i hipokampusu (hip) pacova. Ekspresija markera je odreĊivana 24 h nakon tretmana korišćenjem monoklonskih mišjih anti-NeuN (1:1000), poliklonskih zeĉjih anti-GFAP (1:2000), poliklonskih kozjih anti-Iba1 (1:250) i monoklonskih mišjih anti- MOG (1:1000) primarnih antitela. Nakon inkubacije sa primarnim antitelima membrane su inkubirane sa sekundarnim anti-zeĉjim (1:2000), anti-kozjim (1:2000) ili anti-mišjim (1:2000) antitelima obeleţenim peroksidazom rena. Statistiĉka znaĉajnost razlike je procenjena korišćenjem jednostruke ANOVE sa Fišerovim (Fisher) post hoc testom (*p<0,05 u odnosu na kontrolu). Za detaljnije informacije videti grafikon 4.18. 86 5. DISKUSIJA 87 Kliniĉka slika i EEG analiza uz potvrdu oštećenja jetre predstavljaju osnovu dijagnoze HE. Patohistološka analiza (Slika 4.1) i koncentracija amonijaka u plazmi (Grafikon 4.1A) su potvrdile da se TAA moţe koristiti za indukciju akutne insuficijencije jetre. Fokalna krvarenja u nekrotiĉnim zonama uoĉena u TAA900 grupi su naĊena i u drugim modelima toksiĉnih hepatitisa (219). U prethodnim studijama korišćene su razliĉite skale za klasifikaciju EEG promena u HE u humanoj populaciji. Prva klasifikacija se zasnivala na kvalitativnoj vizuelnoj analizi EEG-a (220). Prema ovoj klasifikaciji lošu prognozu sa povećanom smrtnošću u jednogodišnjem periodu imaju pacijenti sa alfa ritmom prekinutim pojedinaĉnim teta talasima, kao i pacijenti sa osnovnom difuznom teta aktivnošću uz povremenu pojavu visokovoltaţnih delta talasa. Najgoru prognozu imaju pacijenti sa dezorganizovanom elektriĉnom aktivnošću mozga sa difuznim asinhronim teta i delta ritmom (21). Naši rezultati su u skladu sa ovim nalazima, s obzirom da je najveća smrtnost (50%) bila udruţena sa porastom zastupljenosti delta talasa u TAA900 grupi (Tabela 4.5). MeĊutim, ova klasifikacija nije pouzdana, jer nosi rizik subjektivne interpretacije nalaza (21). U cilju poboljšanja reproducibilnosti van der Rijt i sar. (18) su uveli spektralnu analizu kao metodu tumaĉenja EEG-a. Pored reproducibilnosti spektralna analiza omogućava utvrĊivanje parametara koji korelišu sa kliniĉkom slikom i prognozom HE (23). Spektralnom analizom EEG promene se mogu klasifikovati prema srednjoj dominantnoj frekvenciji i relativnoj zastupljenosti teta i delta talasa. Najteţi stadijum HE se karakteriše srednjom dominantnom frekvencijom ≤ 3 Hz i zastupljenošću delta talasa ≥ 45% (16–18). Iako se klasifikacija po van der Rijtu (18) moţe koristiti u humanoj populaciji, ona nije pogodna za evaluaciju EEG promena u HE izazvanoj TAA-om, s obzirom da je u svim grupama tretiranim TAA-om zastupljenost delta talasa bila veća od 45% (Tabela 4.5). Odgovarajuća klasifikacija za ovaj model bi trebalo da ukljuĉi i voltaţu delta talasa. Na modelu HE izazvanom TAA-om bihejvioralne i EEG promene ne korelišu precizno sa koncentracijom amonijaka u plazmi, što ukazuje na uticaj drugih toksina u patogenezi HE, kao i na moguće direktno neurotoksiĉno dejstvo TAA (221). U mozgu se nalazi izoenzim citohrom P450-zavisne monooksigenaze koji metaboliše TAA u neurotoksiĉne metabolite, koji potencijalno mogu doprinositi patogenezi encefalopatije 88 (221,222). Sinteza ovih metabolita je potvrĊena u mozgu pacova nakon intraperitonealne primene TAA (222), ali ne i nakon unosa TAA per os (223). MeĊutim, kako je TAA izazvao bihejvioralne i EEG promene na dozno-zavistan naĉin, analiza ponašanja ţivotinja i spektralna analiza EEG-a ostaju pogodne metode za praćenje toka HE izazvane TAA-om. Hipotermija, jedan od faktora koji moţe doprinositi razvoju encefalopatije u intoksikaciji TAA-om nije uoĉena u našoj studiji (Grafikon 4.1B). Iako TAA u dozi od 300 mg/kg nije izazvao znaĉajne bihejvioralne promene (Tabela 4.1), EEG analiza je potvrdila razvoj poĉetne HE. Ova doza TAA je izazvala porast srednje voltaţe na EEG-u, koji je pre svega izraţen u beta i alfa opsegu (Tabele 4.2 i 4.3), dok je u teta opsegu porast voltaţe uoĉen jedino 23,5 h nakon primene TAA (Tabela 4.4). Blaga HE u humanoj populaciji je praćena sliĉnim promenama u voltaţi EEG talasa, što se moţe objasniti povećanom GABA-ergiĉkom i glutamatergiĉkom aktivnošću u akutnoj HE (15,224). Primena malih doza benzodijazepina povećava voltaţu beta talasa u prednjim delovima korteksa, dok se sa povećanjem doze elektriĉna aktivnost mozga usporava sa pojavom alfa talasa (15). S druge strane, poĉetne promene u zastupljenosti EEG talasa variraju u humanoj populaciji. Dok neke studije naglašavaju dominaciju alfa talasa u frontalnim reţnjevima (225,226), druge studije (21,227) ukazuju na porast zastupljenosti beta talasa u blagoj HE (Tabela 4.2). TakoĊe, neke studije opisuju i niskovoltaţnu beta aktivnost u poĉetnim stadijumima HE kod ljudi (227). U našoj studiji uoĉen je porast zastupljenosti alfa i pad zastupljenosti beta talasa u blagoj HE izazvanoj TAA-om. Za razliku od 300 mg/kg, TAA je u dozi od 600 mg/kg izazvao pad ukupne OBT kod pacova (Tabela 4.1). MeĊutim, nisu svi bihejvioralni testovi podjednako osetljivi na dejstvo TAA. Dok su vitalni refleksi bili oĉuvani kod većine ţivotinja (80%)(Grafikon 4.2), TAA u dozi od 600 mg/kg je izazvao smanjenje opšte motorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja pacova, sa daljim progresivnim smanjenjem i gubitkom spontane motorne aktivnosti nakon primene 900 mg/kg TAA (Grafikon 4.4A i B). Kako bradikinezija, hiperrefleksija, lepršajući tremor, ĉesto udruţeni sa rigidnošću, predstavljaju najĉešće motorne manifestacije HE u humanoj populaciji (228), ovo ukazuje da se TAA u dozi od 600 mg/kg moţe koristiti za ispitivanje patogeneze motornih promena u HE. 89 Osim motorne aktivnosti, TAA je izazvao slabljenje refleksnih trzaja glave i auditivnog refleksa na dozno-zavistan naĉin (Grafikon 4.3A). Ovo slabljenje pratilo je i oteţano izvoĊenje ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja (Grafikon 4.3B). Dok refleksni trzaji glave i auditivni refleks nisu progresivno slabili u periodu od 6-24 h nakon primene druge doze TAA u TAA600 grupi, izvoĊenje ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja se dodatno pogoršavalo u ovom periodu. Ovo ukazuje da ekvilibrijumski test i refleks postavljanja imaju poseban znaĉaj u praćenju progresije HE izazvane TAA-om, dok u ranoj fazi HE ovi testovi nemaju nikakvu prednost u dijagnozi motornih promena u odnosu na refleksne trzaje glave i auditivni refleks. TAA se moţe koristiti i za indukciju ciroze jetre i tipa C HE sa izraţenim kognitivnim poremećajima, a bez izraţene anksioznosti (148,229). Na ovom modelu nije uoĉena promena lokomotorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja pacova (148), što ukazuje da se bihejvioralne karakteristike akutne i hroniĉne HE izazvane TAA-om razlikuju, sa izraţenim motornim promenama u akutnoj i dominacijom kognitivnih poremećaja u hroniĉnoj HE. Najraniji EEG znak pogoršanja HE u TAA600 grupi praćen razvojem kome i smrtnim ishodom (letalitet 10%) je bio porast voltaţe delta talasa (Tabela 4.5). Porast voltaţe alfa i teta talasa je uoĉen jedino 23,5 h nakon primene poslednje doze TAA, a beta talasa 23 i 23,5 h nakon tretmana (Tabele 4.2, 4.3 i 4.4). Iako je zastupljenost delta talasa bila niţa, a teta talasa znaĉajno viša 22,5 h nakon tretmana, ovi parametri nemaju prognostiĉku vrednost, zato što ove promene kasnije nisu bile uoĉljive, iako je koma bila prisutna. Ovo ukazuje da je prvi EEG znak pogoršanja HE izazvane TAA-om povećanje voltaţe delta talasa, a ne promena zastupljenosti pojedinih EEG talasa. Vitalni refleksi (kornealni refleks, refleksi uklanjanja, hvatanja i uspravljanja) su se istovremeno menjali, a znaĉajno smanjenje ovih refleksa je uoĉeno kod 75% ţivotinja nakon primene TAA u dozi od 900 mg/kg 2 h nakon tretmana (Grafikon 4.2). Gubitak vitalnih refleksa sa auditivnim refleksom i refleksnim trzajima glave definiše komu kod pacova i odgovara najteţem stadijumu HE (stadijum IV)(204). Na razvoj kome u TAA900 grupi ukazuju i EEG promene. Hepatiĉna koma u humanoj populaciji je udruţena sa razliĉitim promenama na EEG-u, od alfa ritma sa povremenom pojavom teta talasa u 90 poĉetnoj komi do difuzne pojave teta i delta talasa u terminalnoj komi. Trifaziĉni talasi mogu biti prisutni, ali nisu uvek uoĉljivi (230). Terminalna koma se karakteriše zaravnjenjem EEG-a sa dominacijom delta talasa (231). HE izazvana galaktozaminom i podvezivanjem hepatiĉne arterije kod pacova se takoĊe karakteriše niskofrekventnom EEG aktivnošću (232). Sliĉni nalazi su naĊeni i kod hepatektomisanih svinja sa fulminantnom insuficijencijom jetre (146). Kako je i u našoj studiji gubitak vitalnih refleksa bio udruţen sa smanjenjem voltaţe EEG-a uz izraţeniju dominaciju delta talasa nakon primene TAA u dozi od 900 mg/kg (Grafikon 4.2 i tabela 4.5), EEG analiza i analiza ponašanja ukazuju da je ova doza TAA pogodna za ispitivanje patogenetskih mehanizama hepatiĉne kome. Dok je u našoj studiji hepatiĉnu komu izazvao TAA u dozi od 900 mg/kg u periodu od 24 h, druge studije su ustanovile razvoj kome tek 64 h nakon tretmana većim dozama TAA (1200 mg/kg)(204). Ova razlika se moţe objasniti razliĉitim metabolizmom TAA u razliĉitim modelima. TAA se metaboliše u jetri u TAA-S-oksid pod uticajem citohrom P450-zavisne monooksigenaze (233,234). U sledećem koraku TAA-S-oksid se pretvara u acetamid i polarne produkte, koji se kovalentno i ireverzibilno vezuju za razliĉite makromolekule u hepatocitima, dovodeći do njihove nekroze (233). Kako su citohrom P450-zavisne monooksigenaze inducibilni enzimi, moţe se pretpostaviti da tri pojedinaĉne doze TAA od 300 mg/kg primenjene u našoj studiji uzrokuju veću produkciju citotoksiĉnih metabolita u jetri od dve doze od po 600 mg/kg (204). Povećana produkcija citotoksiĉnih metabolita moţe takoĊe biti uzrok brţe pojave ostalih bihejvioralnih promena u našoj studiji u odnosu na druge (204). Kvantitativna EEG analiza je pokazala porast zastupljenosti teta talasa u zadnjim odvodima kod 15-30% pacijenata sa cirozom jetre (23). Naši rezultati ne korelišu precizno sa ovim nalazima, najverovatnije zbog toga što TAA izaziva akutnu insuficijenciju, a ne cirozu jetre i zbog mogućih direktnih neurotoksiĉnih efekata TAA. Brojne eksperimentalne studije su pokazale razliĉitu osetljivost ţivotinjskih vrsta na efekte TAA. Baterijom testova SHIRPA je pokazano da TAA u dozi od 600 mg/kg izaziva znaĉajne motorne i kognitivne poremećaje kod C57BL/6 miševa (235), dok su znatno niţe doze TAA (200 mg/kg) dovoljne da izazovu motorne promene kod miševa Sabra soja (236). Nasuprot ovome, doza TAA od 1200 mg/kg je neophodna za razvoj motornih 91 promena kod Sprague-Dawley pacova (204). Ova doza nije pogodna za indukciju akutne insuficijencije jetre kod Wistar pacova, s obzirom da je već doza od 900 mg/kg uzrokovala visok mortalitet (50%) u našoj studiji. Poznato je da oksidacijski stres ima vaţnu ulogu u patogenezi HE izazvanoj TAA- om. Uoĉeno je da je nivo MDA u nesinaptiĉkim mitohondrijama kortikalnih neurona povišen 12 h nakon primene TAA, kao i da se antioksidacijski kapacitet mozga smanjuje (237). TakoĊe, antioksidansi kao što su vitamin E, L-karnitin i melatonin smanjuju hiperamonijemiju i lipidnu peroksidaciju u mozgu i spreĉavaju smanjenje antioksidacijskog kapaciteta neurona nakon izlaganja TAA (238). TAA inhibiše komplekse I i III respiracijskog lanca i piruvat dehidrogenazu u mitohondrijama, što doprinosi stvaranju slobodnih radikala i mitohondrijskoj disfunkciji (239). Slobodni radikali potencijalno doprinose smanjenju aktivnosti Na + /K + ATP-aze u mozgu (237). Naši rezultati takoĊe potvrĊuju ulogu oksidacijskog stresa u patogenezi HE. MeĊutim, iako je TAA izazvao lipidnu peroksidaciju u mozgu na dozno-zavistan naĉin, naša studija je pokazala da nisu sve moţdane strukture podjednako osetljive na oksidacijski stres. Moţdano stablo je osetljivije od korteksa i hipokampusa, dok je talamus najmanje osetljiv na lipidnu peroksidaciju. Dok je 300 mg/kg TAA bilo dovoljno da izazove lipidnu peroksidaciju u moţdanom stablu (Grafikon 4.7A), ĉak ni doza od 900 mg/kg nije bila dovoljna da izazove peroksidaciju lipida u talamusu (Grafikon 4.19A). Iako su i ranije studije pokazale razliĉitu osetljivost moţdanih struktura na oksidacijski stres, rezultati su delimiĉno kontradiktorni. Dok su neke studije utvrdile veću osetljivost ponsa, produţene moţdine i moţdanog korteksa na oksidacijski stres izazvan TAA-om od cerebeluma (240), in vitro studije su pokazale da su cerebelarne granularne ćelije i CA1 neuroni hipokampusa osetljiviji na oksidacijsko oštećenje parakvatom od kortikalnih i CA3 neurona hipokampusa (241). Ovo ukazuje da osim unutrašnjih svojstava samih neurona, supstanca korišćena u modelu odreĊuje stepen oksidacijskog oštećenja pojedinih moţdanih struktura. Selektivna vulnerabilnost neurona na oksidacijsko oštećenje je uoĉena i u Alchajmerovoj (Alzheimer) bolesti (242,243), Parkinsonovoj bolesti (244) i amiotrofiĉnoj lateralnoj sklerozi (245). Prema našoj studiji u patogenezi HE izazvane TAA-om oksidacijski stres je potencijalno vaţniji u moţdanom stablu i korteksu nego u hipokampusu i talamusu. 92 Mehanizmi razliĉite osetljivosti moţdanih regiona na oksidacijski stres su brojni i ukljuĉuju: razliĉitu brzinu metabolizma TAA u pojedinim regionima, razliĉite koncentracije gvoţĊa, razliĉitu ekspresiju antioksidacijskih enzima i gena ukljuĉenih u oksidacijski metabolizam, reparaciju DNK, obradu RNK transkripta i aktivaciju razliĉitih signalnih puteva (241). Naša studija takoĊe potvrĊuje da regionalne razlike u aktivnosti antioksidacijskih enzima mogu doprinositi razliĉitoj osetljivosti pojedinih moţdanih struktura na oksidacijsko oštećenje. GPx predstavlja potencijalno najvaţniji antioksidacijski enzim, koji odreĊuje otpornost talamusa na oksidacijsko oštećenje izazvano TAA-om, s obzirom da je, kako u bazalnim uslovima, tako i nakon primene 900 mg/kg TAA aktivnost ovog enzima bila najviša u talamusu (Grafikon 4.21B). Porast aktivnosti GPx nakon primene TAA moţe predstavljati adaptacioni odgovor talamusa na povećano stvaranje slobodnih radikala. Kao posledica veće aktivnosti GPx nivo GSH u talamusu je bio niţi u odnosu na ostale ispitivane strukture u bazalnim uslovima. MeĊutim, nivo GSH se nije dodatno smanjivao nakon primene TAA (Grafikon 4.21A). Aktivnost SOD u talamusu je takoĊe bila viša u odnosu na korteks i nc. caudatus, ali ovaj enzim najverovatnije nema tako vaţnu ulogu u odbrani talamusa od oksidacijskog oštećenja, s obzirom da primena TAA nije izazvala znaĉajnu promenu aktivnosti ovog enzima (Grafikon 4.19B). U korteksu TAA u dozi od 300 mg/kg nije izazvao lipidnu peroksidaciju, što se bar delimiĉno moţe objasniti porastom aktivnosti katalaze u ovom regionu (Grafikon 4.6A i B). Aktivnost katalaze je i u bazalnim uslovima viša u korteksu u odnosu na ostale ispitivane regione (Grafikon 4.22B), što dodatno ukazuje na vaţnu ulogu ovog enzima u zaštiti od oksidacijskog oštećenja kortikalnih neurona. MeĊutim, sa povećanjem doze TAA, lipidna peroksidacija u korteksu je rasla (Grafikon 4.6A), što moţe biti posledica povećanog stvaranja ili smanjene neutralizacije slobodnih radikala. Vaţan enzim u stvaranju slobodnih radikala u HE je NADPH oksidaza. Na modelu ciroze jetre izazvanom podvezivanjem holedohusa ustanovljen je porast ekspresije NADPH oksidaze u korteksu (246), u ĉijoj aktivaciji vaţnu ulogu ima NF-κB (120). NADPH oksidaza predstavlja multiproteinski kompleks, koji se sastoji od većeg broja membranskih i citoplazmatskih komponenti i ĉija aktivacija zahteva kompleksne proteinske interakcije (247). Aktivacija fagocitne NADPH oksidaze (NOX2) zapoĉinje fosforilacijom p47 93 subjedinice, koja uzrokuje njenu konformacionu promenu i vezivanje za membransku p22 subjedinicu (248). p47 zatim omogućava interakciju aktivacione subjedinice p67 i male p40 subjedinice sa NOX2 kompleksom (249). U završnom koraku GTP-aza Rac interreaguje sa NOX2, najpre direktno, a potom i indirektno preko p67 subjedinice (247). Ovako formirani kompleks je aktivan i prenosi elektron sa citosolnog NADPH na O2 gradeći superoksidni anjon. Na astrocitima u kulturi i presecima korteksa uoĉena je povećana ekspresija p47 subjedinice NADPH oksidaze u hiperamonijemiji kao posledica bubrenja ćelija (43,250), prekomerne aktivacije NMDA receptora (250) i nagomilavanja Ca 2+ u neuronima (251). Nasuprot ovome, u našoj studiji uoĉena je smanjena ekspresija p67 u korteksu, dok je ekspresija p40 bila povećana u terminalnoj HE izazvanoj TAA-om (Grafikon 4.18B i D). Ekspresija p47 subjedinice se nije menjala nakon primene TAA (Grafikon 4.18C). Razlika izmeĊu nalaza in vitro studija (250) i naših nalaza se moţe objasniti prisustvom većeg broja toksina koji in vivo utiĉu na tok HE, kao i nedovoljno razjašnjenim mehanizmom aktivacije neuronske NADPH oksidaze, ĉija ekspresija nije razdvojena od ekspresije fagocitne NADPH oksidaze u našoj studiji. NOX3 i NOX4 izoenzimi NADPH oksidaze su prisutni u neuronima (247). Za razliku od NOX2, aktivacija NOX3 ne zahteva prisustvo citosolnih subjedinica enzima (247), a uloga p47 i p67 u regulaciji aktivnosti NOX3 je još uvek nejasna. Iako ove subjedinice mogu da aktiviraju NOX3 (252), njihovo odsustvo ne uzrokuje nikakve fenotipske promene kod ljudi ili miševa (247). TakoĊe, uloga Rac još nije potpuno razjašnjena, a za aktivaciju NOX3 potrebna je NOXO1, subjedinica koja ne utiĉe na aktivaciju fagocitne NADPH oksidaze (253). S druge strane, za aktivaciju NOX4 nisu potrebne citosolne subjedinice (254). Upoznavanje mehanizama aktivacije ovih izoenzima NADPH oksidaze i ekspresije subjedinica odgovornih za ovu aktivaciju bi dodatno razjasnilo ulogu ovog enzima u patogenezi oksidacijskog stresa u HE. Dodatno objašnjenje za odsustvo porasta ekspresije p47 i p67 subjedinice NADPH oksidaze u našoj studiji moţe biti razvoj kome nakon primene TAA u dozi od 900 mg/kg. U komi se usporavaju metaboliĉki procesi, što moţe rezultovati i manjim stvaranjem slobodnih radikala. Iako naša studija ne negira ulogu NADPH oksidaze u patogenezi HE 94 izazvanoj TAA-om, vaţniju ulogu u razvoju oksidacijskog stresa u korteksu u terminalnoj HE verovatno ima smanjenje antioksidacijskog kapaciteta ćelija. U hepatiĉnoj komi izazvanoj TAA-om porast lipidne peroksidacije je bio udruţen sa opadanjem aktivnosti katalaze (Grafikon 4.22B). S druge strane, aktivnost drugih antioksidacijskih enzima kao što su SOD i GR je porasla u TAA900 grupi (Grafikon 4.19B i 4.22A), dok se aktivnost GPx nije znaĉajno promenila (Grafikon 4.21B). SOD svojom povećanom aktivnošću povećava stvaranje H2O2 u ĉijoj neutralizaciji u teškoj intoksikaciji TAA-om prema našoj studiji znaĉajniju ulogu ima GPx od katalaze. Uloga SOD i njenih izoenzima u vulnerabilnosti kortikalnih neurona na oksidacijski stres je nedovoljno rasvetljena. U in vitro studiji u kojoj je utvrĊena veća osetljivost cerebelarnih granularnih ćelija na oksidacijski stres od kortikalnih neurona, naĊena je 2,5 puta veća ekspresija mitohondrijskog izoenzima SOD2 u cerebelumu u odnosu na korteks u bazalnim uslovima (241). MeĊutim, paradoksalno veća ekspresija SOD2 u osetljivijim cerebelarnim ćelijama moţe se objasniti uzgajanjem ćelija u sredini sa povišenim pritiskom O2, što je upravo moglo uzrokovati indukciju SOD2 na mestu najvećeg stvaranja slobodnih radikala. U prilog ovoj teoriji govori i ĉinjenica da je parakvat izazvao porast SOD2 u cerebelarnim ćelijama, ali ne i u korteksu, iako je preţivljavanje kortikalnih neurona bilo znaĉajno veće (241). Ovo ukazuje da SOD ne doprinosi znaĉajno vulnerabinosti neurona na oksidacijski stres, već da porast aktivnosti ovog enzima predstavlja adaptacioni mehanizam neurona na povećano stvaranje slobodnih radikala. Manje doze TAA (2x300 mg/kg) takoĊe izazivaju porast aktivnosti SOD u korteksu, ali istovremeno smanjuju aktivnost GPx i GR. TakoĊe, manje doze TAA izazivaju porast SOD2 (240) za razliku od naše studije gde je naĊen porast ekspresije SOD1 u korteksu (Grafikon 4.20A). Odnos GSH/GSSG se smanjuje, dok nivo nitrita i nitrata, markera nitrozativnog stresa, raste, kako u korteksu, tako i u cerebelumu i moţdanom stablu pacova nakon primene manjih doza (240). Nasuprot ovome, u našoj studiji TAA je u dozi od 900 mg/kg izazvao porast nivoa GSH u korteksu (Grafikon 4.21A), što se moţe objasniti adaptivnim porastom aktivnosti GR bez prateće promene aktivnosti GPx, enzima koji izaziva oksidaciju GSH. 95 U drugim hiperamonijemiĉnim stanjima naĊeno je smanjenje aktivnosti MnSOD, GPx i GR (116,255), što ukazuje da izbor modela i stadijum HE utiĉe na aktivnost antioksidacijskih enzima u korteksu. U hroniĉnoj HE izazvanoj podvezivanjem holedohusa takoĊe je uoĉena lipidna peroksidacija u korteksu praćena smanjenjem aktivnosti antioksidacijskih enzima i ukupnih i neproteinskih tiola (256). Intoksikacija amonijakom izaziva porast nivoa superoksidnog anjona i pad H2O2 u nesinaptiĉkim mitohondrijama kortikalnih neurona. Porast nivoa superoksidnog anjona u izolovanoj hiperamonijemiji je posledica njegovog povećanog stvaranja tokom ćelijske respiracije i usled dejstva enzima ksantin oksidaze, dok je smanjenje nivoa H2O2 posledica smanjenja aktivnosti MnSOD (255). Prethodne studije (240) i naši rezultati ukazuju da se patogeneza oksidacijskog stresa u korteksu u HE izazvanoj TAA-om razlikuje od patogeneze u encefalopatiji izazvanoj intoksikacijom amonijakom. U blaţim oblicima HE izazvane TAA-om najpre se povećava aktivnost katalaze kao prva linija odbrane od oksidacijskog stresa u korteksu, da bi u umerenoj HE SOD2 (MnSOD) imala kljuĉnu ulogu u odbrani od slobodnih radikala. U najteţim stadijumima HE udruţenim sa komom povećava se aktivnost SOD1 (Cu/ZnSOD) i GR, što doprinosi porastu GSH, iako ovi enzimi ne mogu da spreĉe lipidnu peroksidaciju. SOD pretvara superoksidni anjon u H2O2, koji sa prelaznim metalima (npr. sa gvoţĊem u Fentonovoj reakciji) stvara visoko reaktivni hidroksilni radikal, koji najverovatnije uzrokuje lipidnu peroksidaciju u korteksu (257). Za spreĉavanje lipidne peroksidacije neophodna je indukcija GPx i katalaze, s obzirom da primena prirodnog antioksidansa C- fikocijanina izaziva porast aktivnosti ovih enzima i uz smanjenje lipidne peroksidacije smanjuje bubrenje astrocita i poboljšava tok HE (257). Razlika u patogenezi oksidacijskog stresa u korteksu u HE izazvanoj TAA-om i encefalopatiji izazvanoj intoksikacijom amonijaka se moţe objasniti ulogom većeg broja toksina u patogenezi HE i mogućim direktnim neurotoksiĉnim efektima TAA. Uloga ksantin oksidaze i nitrozativnog stresa u oksidacijskom oštećenju korteksa u HE bi dodatno objasnila ovu razliku i trebalo bi da bude predmet daljih istraţivanja. In vitro studije pokazuju da TAA izaziva promene u lipidnom sastavu i fluidnosti ćelijskih membrana u korteksu (258). Povezanost ovih promena sa oksidacijskim stresom 96 nije potpuno rasvetljena. TAA izaziva smanjenje nivoa holesterola, sfingomijelina i fosfatidilserina, kao i odnosa nezasićenih i zasićenih masnih kiselina u membranama kortikalnih neurona (258). Smanjenje nivoa holesterola i sfingomijelina utiĉe na formiranje lipidnih platformi, funkcije receptora i neurotransmitera, kao i na preuzimanje glutamata u kortikalne neurone (259). Na ovaj naĉin, smanjenje holesterola doprinosi povećanoj osetljivosti neurona na ekscitotoksiĉne efekte glutamata i time potencijalno na povećano stvaranje slobodnih radikala (260,261). TakoĊe, lipidna peroksidacija povećava fluidnost membrana, što je utvrĊeno i na modelu HE izazvanom TAA-om (258,262). TAA je u dozi od 900 mg/kg izazvao lipidnu peroksidaciju, dok je manja doza (300 mg/kg) ĉak redukovala nivo MDA u hipokampusu (Grafikon 4.8A). NADPH oksidaza najverovatnije ne doprinosi oksidacijskom oštećenju hipokampusa, s obzirom da je TAA u dozi od 900 mg/kg izazvao smanjenje ekspresije p22-phox, p47-phox i p67-phox subjedinice NADPH oksidaze (Grafikon 4.18A, C i D). Relativna otpornost hipokampusa na lipidnu peroksidaciju se moţe bar delimiĉno objasniti većom aktivnošću GR u odnosu na druge moţdane regione u bazalnim uslovima (Grafikon 4.22A). GPx najverovatnije ne doprinosi otpornosti hipokampusa, s obzirom da je aktivnost ovog enzima niţa u odnosu na talamus i korteks (Grafikon 4.21B). Sliĉno kao na modelu blage HE izazvane suţenjem portne vene (263), rezultati naše studije ukazuju da katalaza moţe imati vaţan uticaj na oksidacijsko oštećenje hipokampusa izazvano TAA-om. MeĊutim, blaga i umerena HE izazvana TAA-om u dozama od 300 mg/kg i 600 mg/kg je praćena porastom aktivnosti katalaze u hipokampusu (Grafikon 4.8B), što se moţe objasniti adaptacionim odgovorom neurona na povećano stvaranje slobodnih radikala. S druge strane, sa povećanjem doze TAA (900 mg/kg) aktivnost katalaze u hipokampusu se smanjuje, što ukazuje da u teškoj intoksikaciji TAA-om pad aktivnosti katalaze moţe doprinositi oksidacijskom oštećenju hipokampusa i pogoršanju kognitivnih poremećaja u HE. Za razliku od korteksa TAA u dozi od 900 mg/kg nije izazvao znaĉajnu promenu aktivnosti SOD i GR u hipokampusu (Grafikon 4.19B i 4.22A). Izostanak porasta aktivnosti SOD moţe biti znaĉajan u ublaţavanju oksidacijskog oštećenja hipokampusa, s obzirom da je zbog pada aktivnosti katalaze omogućeno nagomilavanje H2O2 u hipokampusu (257). 97 Pokazano je da N-acetilcistein, donor sulfhidrilnih grupa, ima protektivno dejstvo u encefalopatiji izazvanoj CCl4 i paracetamolom (264). Piramidne i granularne ćelije hipokampusa su posebno bogate kreatin kinazom, ĉiju aktivnost moduliše redoks stanje ćelija (265). Paracetamol izaziva oksidacijski stres i inhibiše kreatin kinazu u cerebelumu i hipokampusu, dok primena N-acetilcisteina spreĉava ove promene (264). Naša studija ukazuje na moguću protektivnu ulogu donora sulfhidrilnih grupa u modulaciji toka HE izazavne TAA-om, s obzirom da je TAA izazvao smanjenje nivoa GSH u hipokampusu (Grafikon 4.21A), iako aktivnost GPx i GR nije bila znaĉajno promenjena u TAA900 u odnosu na kontrolnu grupu (Grafikoni 4.21B i 4.22A). Blaga HE izazvana suţenjem portne vene je takoĊe praćena lipidnom peroksidacijom u hipokampusu, ali uz smanjenje aktivnosti GPx i SOD (263). Nasuprot ovome, utvrĊeno je da hroniĉna primena TAA tokom 3 meseca izaziva cirozu jetre praćenu porastom aktivnosti SOD u hipokampusu (148). Iako oksidacijski stres doprinosi patogenezi HE u akutnoj i hroniĉnoj insuficijenciji jetre, ovo ukazuje da redoks stanje hipokampusa zavisi od modela HE, kao i da je profil antioksidacijskih enzima u hipokampusu razliĉit u akutnoj i hroniĉnoj insuficijenciji jetre. Ova razlika potencijalno doprinosi razliĉitim bihejvioralnim promenama u akutnoj i hroniĉnoj HE izazvanoj TAA- om (148), ali precizniji znaĉaj ove razlike bi trebalo da bude predmet daljih istraţivanja. Nc. caudatus je kao komponenta dorzalnog strijatuma ukljuĉen u kontrolu motorike, dok je ventralni strijatum (nc. accumbens) odgovoran za nagradne efekte i motivaciono ponašanje (266). Sporije hodanje kod starijih osoba je udruţeno sa atrofijom nc. caudatusa (267), a sliĉne promene u ovom jedru su uoĉene i u prodromalnoj fazi Hantingtonove (Huntington) bolesti (268) i u multiploj sklerozi (269). TakoĊe je pokazano da disfunkcija nc. caudatusa rezultuje hiperaktivnošću orbitofrontalnog korteksa i prednjeg dela gyrusa cinguli, što doprinosi razvoju opsesivno-kompulzivnog poremećaja (270). Smanjena aktivnost levog nc. caudatusa i oslabljene veze izmeĊu njega i donje frontalne vijuge su povezane sa poremećajima mišljenja u shizofreniji (271). Disfunkcija nc. caudatusa i drugih bazalnih ganglija takoĊe doprinosi patogenezi HE. Magnetnom rezonancom je kod pacijenata sa minimalnom HE utvrĊen povećan protok krvi kroz levi globus pallidus, putamen i talamus, dok je srednje vreme prolaska kontrasta 98 skraćeno u desnom nc. caudatusu i obostrano u talamusu (272). U akutnoj HE izazvanoj primenom valproata uoĉene su promene u desnom putamenu i nc. caudatusu, koje su se povlaĉile nakon prestanka primene leka (273). Patogeneza disfunkcije nc. caudatusa u HE još uvek nije dovoljno rasvetljena. Još su Mousseau i sar. (274) na uzorcima mozga dobijenim nakon obdukcije pacijenata sa HE utvrdili da se broj veznih mesta za [3H] triptamin smanjuje u nc. caudatusu i pretpostavili da triptamin doprinosi disfunkciji ovog regiona i patogenezi HE. Kvantitativna analiza sadrţaja vode u razliĉitim moţdanim regionima pacijenata sa HE je utvrdila da se za razliku od drugih regiona u nc. caudatusu ne razvija niskostepeni edem mozga (275). Neke studije naglašavaju ulogu mangana u disfunkciji nc. caudatusa, s obzirom da je najveća akumulacija mangana kod pacijenata sa hroniĉnom HE naĊena u ovom jedru (276). Patogeneza neurotoksiĉnih efekata mangana nije dovoljno rasvetljena, ali se pretpostavlja da nakupljanje mangana u strijatumu doprinosi dopaminergiĉkoj disfunkciji i motornim poremećajima u HE (277). Naša studija je meĊu prvima koja sugeriše da i oksidacijsko oštećenje nc. caudatusa potencijalno doprinosi njegovoj disfunkciji i patogenezi motornih poremećaja. Lipidna peroksidacija u nc. caudatusu u TAA900 grupi je praćena porastom aktivnosti GPx, što najverovatnije predstavlja adaptacioni odgovor na povećano stvaranje slobodnih radikala (Grafikoni 4.19A i 4.21B). Kako se aktivnost GR nije znaĉajno menjala (Grafikon 4.22A), TAA je u terminalnoj HE izazavao smanjenje nivoa GSH u nc. caudatusu (Grafikon 4.21A). Ovo ukazuje da bi primena donora sulfhidrilnih grupa potencijalno ublaţila oksidacijsko oštećenje nc. caudatusa, što bi moglo uticati na tok HE, ali ovo treba da bude predmet daljih istraţivanja. Iako su u patogenezi HE najbolje ispitane uloge poremećaja glutamatergiĉke i GABA-egriĉke transmisije (38,55,77), poremećaji holinergiĉke transmisije takoĊe mogu doprinositi razvoju HE (114). Nivo Ach u mozgu zavisi od brzine njegove sinteze i njegove razgradnje pod dejstvom enzima holin acetiltransferaze i AchE. Dok je u nekim studijama naĊeno da se aktivnost AchE povećava u frontalnom korteksu pacijenata sa cirozom jetre, a aktivnost holin acetiltransferaze i butirilholinesteraze ne menja (114), druge studije nisu ustanovile promenu aktivnosti AchE u mozgu u cirozi (278). Porast aktivnosti AchE je 99 takoĊe naĊen i na eksperimentalnom modelu HE izazvanom podvezivanjem holedohusa bez ili u kombinaciji sa hiperamonijemijskom dijetom (114). MeĊutim, sama hiperamonijemijska dijeta ne izaziva promenu aktivnosti AchE, što ukazuje da aktivnost ovog enzima ne koreliše sa stepenom hiperamonijemije i da na aktivnost AchE utiĉu drugi toksini koji se nakupljaju u insuficijenciji jetre (114). Na modelu ciroze jetre izazvane TAA-om pokazano je povećanje aktivnosti AchE u entorinalnom korteksu, anterodorzalnom i anteroventralnom talamusu i nc. accumbensu, dok je smanjenje aktivnosti ovog enzima naĊeno u CA1, CA3 regionu i gyrusu dentatusu hipokampusa. Ove promene u aktivnosti AchE u delovima limbiĉkog sistema doprinose kognitivnim poremećajima i poremećajima paţnje u tipu C HE (279). Za razliku od tipa C HE izazvane TAA-om, u akutnoj HE nisu nedvosmisleno dokazane promene aktivnosti AchE u mozgu. Dok Zarros i sar. (237) nisu našli promenu aktivnosti AchE u mozgu, Swapna i sar. (280) su ustanovili pad aktivnosti ovog enzima u korteksu nakon primene TAA. Kinetiĉki parametri AchE u izolatima kortikalnih membrana su prema Swapni i sar. (280) takoĊe bili promenjeni: koncentracija supstrata pri kojoj je brzina enzimske reakcije jednaka polovini maksimalne (Km) je bila povećana, a maksimalna brzina enzimske reakcije (Vmax) sniţena. Promene kinetiĉkih parametara enzima su verovatno posledica promene lipidnog sastava ćelijske membrane u HE (280). Za razliku od prethodnih, u našoj studiji utvrĊen je porast aktivnosti AchE u talamusu i nc. caudatusu u TAA900 grupi, dok u korteksu i hipokampusu nisu uoĉene promene aktivnosti ovog enzima (Grafikon 4.23). Razlika izmeĊu rezultata drugih i naše studije se moţe objasniti primenom razliĉitih doza TAA, što potencijalno ukazuje da stadijum HE moţe uticati na aktivnost AchE. Aktivnost AchE i oksidacijski stres u mozgu su meĊusobno povezani. Pokazano je da produţena inhibicija AchE povećava aktivnost brojnih neurona i time smanjuje koliĉinu ATP-a i kreatin-fosfata u njima, inhibiše oksidativnu fosforilaciju i povećava stvaranje slobodnih radikala. Nedovoljno stvaranje energije rezultuje nagomilavanjem Ca 2+ i aktivacijom NOS, što uzrokuje sintezu NO i nitrozativno oštećenje neurona (281). Ovo ukazuje da porast AchE u talamusu naĊen u našoj studiji potencijalno doprinosi njegovoj manjoj osetljivosti na oksidacijsko oštećenje (Grafikon 4.23). 100 Svi terapijski pristupi za poboljšanje HE imaju ograniĉenu efikasnost i nose sa sobom brojne neţeljene efekte. Ublaţavanje toka HE je prvenstveno usmereno ka izbegavanju precipitirajućih faktora i primeni agenasa koji će smanjiti proizvodnju (npr. laktuloza, antibiotici) ili povećati preuzimanje amonijaka od strane jetre (npr. L-ornitin, L- aspartat) (282,283). Antibiotici i probiotici predstavljaju vaţnu komponentu terapije HE, s obzirom da crevne bakterije poseduju ureazu, koja povećava sintezu amonijaka (284). MeĊutim, ovi vidovi terapije imaju ozbiljna neţeljena dejstva. Neomicin moţe dovesti do gubitka sluha i bubreţne insuficijencije, a metronidazol ispoljava znaĉajne neurotoksiĉne efekte. Vankomicin potencira umnoţavanje bakterija u crevima i povećava rizik od bakterijske rezistencije na antibiotike, koji predstavljaju obaveznu terapiju u HE (282). Alternativni vidovi leĉenja pacijenata sa HE ukljuĉuju: antagoniste benzodijazepinskih receptora, aminokiseline razgranatog lanca, suplementaciju cinkom, natrijum benzoat, agoniste dopaminskih receptora, akarbozu i probiotike (282). Nove terapijske metode su usmerene ka uklanjanju amonijaka, ne samo iz jetre, već i iz drugih organa (285). Imajući u vidu ulogu poremećaja glutamatergiĉke transmisije u kognitivnim disfunkcijama, jedna od terapijskih strategija u HE podrazumeva i primenu antagonista fosfodiesteraze (zaprinast, sildenafil) (76). Antiinflamatorna terapija bi takoĊe potencijalno mogla biti korisna u poboljšanju toka HE, s obzirom na tesnu povezanost neuroinflamacije, oksidacijskog stresa i povećanja propustljivosti unutrašnje mitohondrijske membrane u patogenezi HE. Etanercept, antagonist receptora za TNF-α, i minociklin, inhibitor mikroglije, su se pokazali efikasnim u spreĉavanju inflamacije i ublaţavanju manifestacija HE (286). Rasvetljavanje uloge povećane GABA-ergiĉke transmisije u patogenezi HE je ukazalo da bi terapija HE potencijalno mogla biti usmerena na smanjenje efekata GABA u mozgu. Antagonisti GABAA receptora i parcijalni inverzni agonisti benzodijazepinskih receptora su dali kontradiktorne rezultate u pogledu terapijske efikasnosti u humanoj populaciji i eksperimentalnim modelima HE (38,287,288). Drugi potencijalni terapijski pristup moţe biti inhibicija sinteze neurosteroida u cilju spreĉavanja GABAergiĉke hiperaktivnosti. Ovo je prva studija koja je ispitivala efekte FIN na tok HE. Ova studija je jasno pokazala da FIN poboljšava motorne sposobnosti i EEG promene i spreĉava nastanak najteţih formi HE sa smrtnim ishodom nakon tretmana TAA- 101 om. Pretretman FIN-om je ublaţio smanjenje ukupne OBT u HE izazvanoj TAA-om (Tabela 4.6) i uzrokovao razliĉite promene u izvoĊenju pojedinih motornih testova. Najizraţeniji efekat FIN je prevencija kome kod pacova tretiranih TAA-om. Pretretman FIN-om je u potpunosti spreĉio gašenje kornealnog, auditivnog refleksa, refleksa uklanjanja i refleksnih trzajeva glave (Grafikon 4.10), što ukazuje da se FIN moţe koristiti u prevenciji razvoja najteţeg stadijuma HE (IV stadijum). EEG analiza je potvrdila protektivni efekat FIN u hepatiĉnoj komi izazvanoj TAA- om, s obzirom da je pretretman FIN-om spreĉio pad srednje ukupne voltaţe talasa i uzrokovao porast voltaţe delta talasa (Grafikon 4.13 i 4.17A). Dok je hepatiĉna koma izazvana TAA-om bila praćena smanjenjem zastupljenosti teta i povećanjem zastupljenosti delta talasa, pretretman FIN-om je doveo do reverzije ovih promena (Grafikon 4.16B i 4.17B). TakoĊe, FIN je izazvao povećanje voltaţe alfa i beta talasa i zastupljenosti alfa talasa (Grafikoni 4.14 i 4.15A), što odgovara blaţim oblicima HE u humanoj populaciji (15). Sliĉne promene voltaţe i zastupljenosti alfa i beta talasa naĊene su i u blagoj HE izazvanoj TAA-om (TAA300 grupa). FIN je takoĊe uticao na poboljšanje opšte motorne aktivnosti i eksplorativnog ponašanja 6 i 24 h nakon tretmana poslednjom dozom TAA (Grafikon 4.12A i B). Ovaj odloţeni efekat FIN moţe se objasniti njegovim mehanizmom dejstva, s obzirom da enzimski inhibitori zahtevaju odreĊeno vreme za svoju maksimalnu efikasnost. Tako je i porast ekspresije translokatorskog proteina uoĉen 24 h nakon portno-kavnog šanta kod pacova (79). Sa druge strane, poboljšanje izvoĊenja ekvilibrijumskog testa i refleksa postavljanja je bilo uoĉljivo neposredno nakon primene poslednje doze TAA (Grafikon 4.11B). Poboljšanje motornih promena u HE izazvanoj TAA-om, kao i odsustvo kome nakon pretretmana FIN-om ukazuje da FIN ima neuroprotektivno dejstvo i da se moţe koristiti kao potencijalno sredstvo za poboljšanje toka HE. Ipak, FIN nije omogućio kompletan oporavak motornih funkcija iz najmanje dva razloga. Prvo, porast ekspresije translokatorskog proteina u HE nije jednak u svim moţdanim strukturama, što ukazuje da FIN ima selektivno dejstvo na pojedine moţdane regione. Najveći porast ekspresije translokatorskog proteina uoĉen je u cerebelumu i ponsu, manji u talamusu, cerebralnom korteksu i hipokampusu, a najmanji u striatumu (101). Drugo, neurosteroidi na posredan 102 naĉin modulišu i aktivnost serotoninskih (5-HT3), NMDA glutamatskih, glicinskih, opioidnih i drugih receptora u CNS-u (101). Na aktivnost neuronskih krugova u frontalnom korteksu utiĉu GABA-ergiĉki interneuroni ĉiju aktivnost regulišu ascendentni serotoninergiĉki i adrenergiĉki neuroni (79). Serotonin, koji se oslobaĊa iz neurona ĉija se tela nalaze u raphe jedrima, preko 5-HT3 receptora stimulišu GABA-ergiĉke interneurone, koji zatim inhibišu glutamatergiĉke motoneurone (79,289). ALLO modulacijom GABAA receptora utiĉe na aktivnost ovih neuronskih krugova. S druge strane, smanjen nivo dehidroepiandrosteron sulfata, antagonista GABAA receptora, u mozgu u HE uzrokuje inhibiciju serotoninergiĉkih neurona u raphe jedrima, što takoĊe doprinosi motornim poremećajima u HE (101,290). TakoĊe, neurosteroidi promenom ekspresije MAO-A, enzima koji razgraĊuje kateholamine, modulišu adrenergiĉke ulazne signale u korteksu (94). Uticaj neurosteroida na ove neurotransmitere treba da bude predmet daljih istraţivanja, ali moţe se pretpostaviti da bi se terapijska efikasnost FIN potencijalno mogla povećati kombinacijom sa modulatorima efekata drugih neurotransmitera. UtvrĊeno je i da antagonisti GABAA receptora dovode do bihejvioralnih promena u HE. Bikukulin, lek iz ove grupe, uzrokuje poboljšanje kognitivnih sposobnosti pacova sa hiperamonijemijom (55), dok flumazenil dovodi do povećanja spontane motorne aktivnosti na modelu akutne insuficijencije jetre uzrokovane ishemijom (291). Iako flumazenil ima pozitivno dejstvo na tok HE kod pacova, ovaj lek nije našao svoju nedvosmislenu primenu u terapiji HE u humanoj populaciji (292). Ranije studije su pokazale da flumazenil poboljšava kliniĉki tok teţih oblika HE i ubrzava EEG aktivnost sa zamenom kontinuirane delta aktivnosti difuznom pojavom teta talasa (293–295). Ove promene na EEG-u su sliĉne promenama koje je izazvao FIN u HE izazvanoj TAA-om u našoj studiji. MeĊutim, kontrolisane kliniĉke studije su pokazale da flumazenil ne smanjuje smrtnost od HE, već da samo prolazno poboljšava tok HE kod jednog dela soporoznih pacijenata (295). Izostanak perzistentnog povoljnog uticaja flumazenila na tok HE se moţe objasniti odsustvom direktne modulacije aktivnosti GABAA receptora ovim lekom, s obzirom da on jedino onemogućava efekte benzodijazepina na ovaj receptor. Stoga su za potpunu efikasnost flumazenila neophodni neurosteroidi, koji povećavaju osetljivost GABAA receptorskog kompleksa na GABA i niske koncentracije benzodijazepina (84). Ovo jasno ukazuje da bi 103 terapiju HE trebalo prvenstveno usmeriti na blokadu efekata neurosteroida, a ne na blokadu GABAA receptora. U skladu sa ovim i sa nalazima naše studije, FIN bi mogao biti bolji izbor u terapiji HE od GABAA antagonista. Parcijalni inverzni agonisti benzodijazepinskih receptora, kao što su Ro15-4513 i sarmazenil, imaju potvrĊene povoljne efekte na tok HE, usled smanjenja modulatornog uticaja neurosteroida na GABAA receptore (288). Studije na kulturi hipokampalnih neurona potvrĊuju da Ro15-4513 smanjuje efekte neurosteroida na hloridne struje indukovane GABAom na dozno-zavistan naĉin (288). Pokazano je da Ro15-4513 u kratkom vremenskom periodu oporavlja pacove iz hepatiĉne kome i uspostavlja refleks uspravljanja efikasnije u odnosu na flumazenil (296). Sarmazenil poboljšava tok HE i povećava srednju dominantnu frekvenciju EEG talasa kod pasa sa portno-kavnim šantom (297). Neka istraţivanja su pokazala da nemaju svi parcijalni agonisti benzodijazepinskih receptora podjednake efekte na tok HE. Tako Ro15-3505, Ro15-4513 i CGS 8216 poboljšavaju HE u stadijumu III kod pacova tretiranih TAA-om, dok samo Ro15-3505 ima povoljan efekat na HE u stadijumu II (298). Ovi agonisti nisu korisni u terapiji HE kod ljudi, jer izazivaju ozbiljne neţeljene efekte, kao što su konvulzije i anksioznost (84). MeĊutim, njihov pozitivan efekat na tok HE ukazuje da terapijski pristup treba da bude direktno usmeren na modulaciju funkcije neurosteroida, što FIN ĉini potencijalnim kandidatom za terapiju HE. Mehanizmi protektivnog efekta FIN na HE nisu potpuno rasvetljeni. Iako je pretretman FIN-om ublaţio patohistološke promene u jetri (Slika 4.3D), naša studija ne ukazuje na hepatoprotektivan efekat FIN, s obzirom da se koncentracija amonijaka u plazmi nije razlikovala u FIN+TAA900 i TAA900 grupi (Grafikon 4.9). Ovo sugeriše da FIN najverovatnije ublaţava tok HE centralnim efektima, ali se ne moţe iskljuĉiti ni mogućnost periferne inhibicije sinteze neurosteroida kao dodatni mehanizam. Pretpostavlja se da bi FIN mogao spreĉiti porast nivoa cirkulišućih neurosteroida u HE, koji mogu da proĊu kroz krvno-moţdanu barijeru i doprinesu efektima lokalno sintetisanih neurosteroida u mozgu (79). Na osnovu ekspresije neuronskog markera NeuN moţe se pretpostaviti da FIN ublaţava oštećenje neurona u hipokampusu izazvano TAA-om (Grafikon 4.24A). Iako FIN dominantno moduliše GABA-ergiĉku transmisiju, još jedan mogući mehanizam protektivnog dejstva FIN u HE predstavlja modulacija holinergiĉke transmisije. 104 FIN je spreĉio porast aktivnosti AchE u talamusu i nc. caudatusu u HE izazvanoj TAA-om (Grafikon 4.23). Znaĉaj ovog efekta FIN nije potpuno rasvetljen, ali moţe doprinositi modulaciji neuroinflamacije u HE (299). Pokazano je da primena inhibitora acetilholinesteraze spreĉava neurodegeneraciju i porast nivoa IL-1β u korteksu i hipokampusu nakon laparotomije pacova kombinovane sa tretmanom lipopolisaharidom (299). Primena rivastigmina, inhibitora AchE, poboljšava kognitivne sposobnosti pacova, ali ne i motornu aktivnost u insuficijenciji jetre (114). Smanjenje oksidacijskog stresa u mozgu moţe biti još jedna potencijalna strategija u ublaţavanju toka HE. Antioksidans kurkumin smanjuje lipidnu peroksidaciju u hipokampusu i poboljšava tok HE (263). Novija istraţivanja ukazuju da hroniĉna suplementacija omega-3 polinezasićenim masnim kiselinama iz ribljeg ulja ublaţava oksidacijski stres i poboljšava kognitivne sposobnosti pacova u HE izazvanoj TAA-om (148). U prethodnim studijama pokazano je da FIN potencijalno ublaţava hiperplaziju prostate smanjenjem lipidne peroksidacije i nivoa nitrita u prostati (300), iako ovaj lek ne utiĉe na oksidacijsko oštećenje proteina (301). Naša studija ukazuje da FIN takoĊe moduliše oksidacijski stres u mozgu, ali znaĉaj ovog efekta u potencijalnim terapijskim efektima FIN u HE nije poznat. Pretretman FIN-om je ublaţio lipidnu peroksidaciju izazvanu TAA-om jedino u korteksu, dok je u talamusu nivo MDA bio ĉak i veći u FIN+TAA900 nego u TAA900 grupi (Grafikon 4.19A). Studije na ćelijama glioma su pokazale da palmitoiletanolamid redukuje lipidnu peroksidaciju, dok pretretman FIN-om ublaţava ovaj efekat palmitoiletanolamida (302). TakoĊe, progesteron smanjuje oksidacijsko oštećenje mozga u orofacijalnoj diskineziji, efekat koji je posredovan neurosteroidima i koji se ne ispoljava nakon pretretmana FIN-om (303). Ovo ukazuje da neurosteroidi doprinose smanjenju oksidacijskog stresa u mozgu, što delimiĉno moţe objasniti porast lipidne peroksidacije u talamusu nakon pretretmana FIN-om, naĊen u našoj studiji. Pogoršanje lipidne peroksidacije u talamusu nakon pretretmana FIN-om je udruţeno sa padom nivoa GSH (Grafikon 4.21A). Ovo se moţe objasniti smanjenjem aktivnosti katalaze i GR nakon primene FIN (Grafikon 4.22A i B). FIN takoĊe spreĉava porast 105 aktivnosti GPx indukovan TAA-om, što dodatno smanjuje efikasnost uklanjanja slobodnih radikala enzimom vaţnim za relativnu otpornost talamusa na oksidacijski stres (Grafikon 4.21B). Uticaj FIN na lipidnu peroksidaciju u moţdanim regionima postaje kompleksniji s ĉinjenicom da FIN spreĉava razvoj kome u HE izazvanoj TAA-om i time doprinosi ubrzanju metaboliĉkih procesa u mozgu. TakoĊe, uoĉeno je da FIN izaziva metaboliĉke promene u prostati, koje mogu uticati na stvaranje slobodnih radikala. FIN smanjuje ekspresiju α lanca ATP sintaze, farnezil difosfat sintaze (enzima neophodnog za sintezu holesterola i prenilaciju proteina) i fosfofruktokinaze 2/fruktozo-2,6-bifosfataze (enzima vaţnog u regulaciji glikolize i glukoneogeneze), a povećava ekspresiju transketolaze i tri glikolitiĉka enzima: aldolaze, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze i piruvat kinaze (304). Uticaj FIN na ekspresiju ovih enzima i njihovu povezanost sa oksidacijskim stresom u mozgu nije poznat i treba da bude predmet daljih istraţivanja. Iako FIN nije imao znaĉajan uticaj na lipidnu peroksidaciju u HE izazvanoj TAA- om u hipokampusu i nc. caudatusu, FIN je izazvao promene ekspresije subjedinica NADPH oksidaze i aktivnosti antioksidacijskih enzima. Pretretman FIN-om je spreĉio pad ekspresije p22-phox i p67-phox subjedinice NADPH oksidaze u hipokampusu, što potencijalno moţe doprinositi većoj aktivnosti ovog enzima (Grafikon 4.18A i D). Nagomilavanje superoksidnog anjona u hipokampusu nakon primene FIN ublaţio je porast aktivnosti citosolnog izoenzima SOD, SOD1 (Grafikoni 4.19B i 4.20B). Pretretman FIN- om je spreĉio pad nivoa GSH izazvan TAA-om (Grafikon 4.21A), iako je smanjio aktivnost GR u hipokampusu u odnosu na sam TAA (Grafikon 4.22A). Primena donora sulfhidrilnih grupa bi potencijalno doprinela poboljšanju redoks stanja u hipokampusu i povećanju efikasnosti FIN u terapiji HE. Kurkumin izaziva porast aktivnosti SOD, GR i GPx u hipokampusu pacova u blagoj HE izazvanoj suţenjem portne vene (263), što ga takoĊe ĉini potencijalnim kandidatom u povećanju terapijske efikasnosti FIN. U korteksu pretretman FIN-om je spreĉio pad katalaze izazvan TAA-om uz istovremeno smanjenje aktivnosti GR (Grafikon 4.22A i B). U odnosu na kontrolu nivo GSH je bio povišen u FIN+TAA900 grupi sliĉno kao u TAA900 grupi (Grafikon 4.21A), najverovatnije zbog odrţanja aktivnosti katalaze, koja redukuje H2O2. Na osnovu studija sa 106 C-fikocijaninom (257) moţe se pretpostaviti da bi porast katalaze mogao biti jedan od korisnih efekata FIN na oksidacijski stres u korteksu. Ekspresija subjedinica NADPH oksidaze u HE izazvanoj TAA-om se nije znaĉajno promenila nakon pretretmana FIN-om (Grafikon 4.18), što ukazuje da FIN najverovatnije nema znaĉajan uticaj na stvaranje superoksidnog anjona i potentnijih radikala u korteksu. U nc. caudatusu aktivnost SOD je bila povećana nakon pretretmana FIN-om, iako sam TAA nije izazvao znaĉajnu promenu aktivnosti ovog enzima (Grafikon 4.19B). MeĊutim, iako FIN nije imao znaĉajnog uticaja na aktivnost GPx i GR (Grafikoni 4.21B i 4.22A), redoks stanje nc. caudatusa u HE izazvanoj TAA-om, procenjeno na osnovu nivoa GSH, se pogoršava nakon primene FIN (Grafikon 4.21A). Pogoršanje redoks stanja moţe biti posledica povećane produkcije superoksidnog anjona pod uticajem SOD ili smanjene sinteze GSH. S obzirom na ulogu nc. caudatusa i putamena u motorici, ovo pogoršanje redoks stanja moţe biti jedan od uzroka samo delimiĉnog oporavka motorne aktivnosti u HE nakon primene FIN. Neke studije su pokazale da neurosteroidi mogu biti ukljuĉeni u razvoj neuroinflamacije u HE (84). Produkcija citokina i ekspresija markera mikroglije je povišena u eksperimentalnoj akutnoj insuficijenciji jetre izazvanoj ishemijom (135) ili primenom azoksimetana (133). TakoĊe, nivo cirkulišućih neurosteroida je povišen u kasnoj trudnoći (305), istovremeno sa porastom incidencije HE kod gravidnih ţena sa akutnom insuficijencijom jetre (306). Ovo je dovelo do razvoja teorije da periferni neurosteroidi potencijalno doprinose razvoju neuroinflamacije (84). Naši rezultati potvrĊuju da je HE izazvana TAA-om praćena povećanjem ekspresije mikroglijalnog markera Iba1 u korteksu (Grafikon 4.24C). MeĊutim, kako FIN nije spreĉio porast ekspresije ovog markera, naša studija ne podrţava teoriju o ulozi neurosteroida u patogenezi neuroinflamacije u HE i sugeriše da inhibicija neuroinflamacije ne predstavlja jedan od mehanizama neuroprotektivnog dejstva FIN u HE izazvanoj TAA-om (Grafikon 4.24C). TAA ima razliĉite efekte na ekspresiju astrocitnog markera GFAP u pojedinim moţdanim regionima. Dok se ekspresija GFAP u korteksu nije znaĉajno menjala, TAA je indukovao ekspresiju ovog markera u hipokampusu. Pretretman FIN-om je smanjio ekspresiju GFAP, što ukazuje na moguću protektivnu ulogu FIN na astrocite u 107 hipokampusu u HE (Grafikon 4.24B). Iako prethodne studije uglavnom naglašavaju smanjenje ekspresije GFAP u HE izazvanoj akutnom insuficijencijom jetre (94,95), postoje indicije o regionalnim razlikama u ekspresiji astrocitnog markera. Tako je na modelu HE izazvanom portno-kavnim šantom kod pacova pokazano povećanje imunoreaktivnosti na GFAP u Bergmanovoj gliji, specijalizovanim astrocitima cerebeluma (307), a smanjenje u frontalnom korteksu (308). S druge strane, ekspresija GFAP u cirozi jetre kod ljudi se ne menja u Bergmanovoj gliji (307), što ukazuje da i tok i hronicitet HE utiĉu na ekspresiju GFAP. TAA i FIN nisu izazvali znaĉajnu promenu ekspresije oligodendrocitnog markera MBP u korteksu i hipokampusu (Grafikon 4.24D), što nije iznenaĊujuće, s obzirom da demijelinizacija nije karakteristiĉna morfološka promena u mozgu u HE. Terapijska upotreba FIN bi mogla biti ograniĉena njegovim neţeljenim efektima. Neke studije su ustanovile trajno smanjenje libida, erektilnu disfunkciju i depresiju kod pojedinih pacijenata sa hiperplazijom prostate i androgenom alopecijom, koji se mogu pripisati efektima FIN (309–311). Tumor Lajdigovih (Leydig) ćelija i akutna lokalizovana egzantematozna pustuloza takoĊe mogu biti posledica dugotrajne upotrebe FIN (312,313). Eksperimentalne studije su pokazale da FIN smanjuje pokretljivost i integritet membrane spermatozoida, što narušava fertilitet pacova (314). U našoj studiji sam FIN je smanjio ekspresiju NeuN u korteksu, ali ne i u hipokampusu (Grafikon 4.24A), što ukazuje na potencijalno štetno dejstvo FIN na kortikalne neurone. TakoĊe, FIN je smanjio ekspresiju p22-phox i p47-phox subjedinice NADPH oksidaze (Grafikon 4.18A i C) i istovremeno povećao ekspresiju SOD1 u hipokampusu (Grafikon 4.20B) i na taj naĉin najverovatnije odrţava redoks stanje hipokampalnih neurona i ĉak smanjuje lipidnu peroksidaciju. Povećanje ekspresije SOD1 je bar delimiĉno odgovorno i za smanjenje lipidne peroksidacije u korteksu nakon primene FIN (Grafikon 4.20A). S druge strane sam FIN je pogoršao lipidnu peroksidaciju u nc. caudatusu, ali mehanizam ovog dejstva treba da bude predmet daljih istraţivanja. Iako sam FIN nije izazvao bihejvioralne promene kod pacova, EEG analiza je pokazala porast srednje voltaţe talasa nakon primene FIN (Grafikon 4.13), koja je bila izraţena u svim frekventnim opsezima. Ovo ukazuje da FIN povećava stepen sinhronizacije neurona, ali znaĉaj ovih promena treba da bude predmet daljih istraţivanja. Osim voltaţe, FIN je 108 uzrokovao i promene zastupljenosti EEG talasa uz smanjenje zastupljenosti delta i beta talasa (Grafikoni 4.14B i 4.17B) i povećanje zastupljenosti alfa i teta talasa (Grafikoni 4.15B i 4.16B). Odnos izmeĊu korisnih i štetnih efekata FIN će odrediti mogućnost terapijske primene ovog leka u HE. 109 6. ZAKLJUĈCI 110 Na osnovu rezultata ove disertacije moţe se zakljuĉiti da TAA izaziva HE kod pacova na dozno-zavistan naĉin. TAA u dozi od 300 mg/kg izaziva blagu HE praćenu porastom voltaţe beta i alfa talasa uz smanjenje zastupljenosti beta i delta i povećanje zastupljenosti alfa talasa. Ove EEG manifestacije nisu praćene bihejvioralnim promenama. Sa pogoršanjem HE smanjuje se motorna aktivnost pacova, a prvi znak pogoršanja na EEG- u je povećanje voltaţe delta talasa. U dozi od 900 mg/kg TAA izaziva hepatiĉnu komu sa zaravnjenjem EEG-a, povećanjem zastupljenosti delta i smanjenjem zastupljenosti teta talasa i ove EEG promene predstavljaju loš prognostiĉki znak u HE izazvanoj TAA-om. TAA u dozi od 600 mg/kg se moţe koristiti za ispitivanje patogenetskih mehanizama motornih promena u HE, a u dozi od 900 mg/kg za ispitivanje patogeneze terminalnih stadijuma HE, ukljuĉujući i hepatiĉnu komu. TAA izaziva lipidnu peroksidaciju u mozgu na dozno-zavistan naĉin, pri ĉemu je moţdano stablo najosetljivije, a talamus i hipokampus najmanje osetljivi na dejstvo slobodnih radikala. Relativnoj otpornosti talamusa na lipidnu peroksidaciju izazvanu TAA- om doprinosi GPx, a hipokampusa SOD i GR. U hepatiĉnoj komi TAA je izazvao pad ekspresije p67-phox i porast p40-phox subjedinice NADPH oksidaze u korteksu praćene porastom aktivnosti SOD1 i GR i padom aktivnosti katalaze. U hipokampusu uoĉen je pad jedino katalaze, dok se aktivnost SOD, GR i GPx ne menja. Lipidna peroksidacija u nc. caudatusu u hepatiĉnoj komi izazvanoj TAA-om je praćena porastom aktivnosti GPx i smanjenjem GSH. Patogenezi hepatiĉne kome u intoksikaciji TAA-om potencijalno doprinosi i indukcija AchE u talamusu i nc. caudatusu. Pretretman finasteridom poboljšava motorne sposobnosti i EEG promene i spreĉava nastanak najteţih formi HE izazvane TAA-om kod pacova, ukljuĉujući hepatiĉnu komu. Ovo poboljšanje toka HE se na EEG-u ogleda kroz povećanje voltaţe talasa uz smanjenje zastupljenosti delta i povećanje zastupljenosti beta, alfa i teta talasa. Jedan od potencijalnih mehanizama povoljnog dejstva finasterida na tok HE izazvane TAA-om je inhibicija AchE u talamusu i nc. caudatusu i modulacija holinergiĉke transmisije. Iako finasterid menja aktivnost antioksidacijskih enzima, smanjenje oksidacijskog stresa najverovatnije ne doprinosi znaĉajno neuroprotektivnim efektima finasterida u HE, s obzirom da primena finasterida ublaţava lipidnu peroksidaciju samo u korteksu. MeĊutim, finasterid spreĉava 111 pad ekspresije p22 i p67 subjedinice NADPH oksidaze u hipokampusu izazvan TAA-om, izaziva porast aktivnosti SOD1 i pad GR, dok u korteksu povećava nivo GSH i spreĉava pad aktivnosti katalaze. Redoks stanje nc. caudatusa u HE izazvanoj TAA-om se pogoršava nakon primene finasterida, iako finasterid povećava aktivnost SOD u ovom regionu, što se moţe bar delimiĉno objasniti smanjenjem aktivnosti GPx. U talamusu pretretman finasteridom spreĉava porast aktivnosti GPx izazvan TAA-om, smanjuje aktivnost GR i katalaze, što pogoršava lipidnu peroksidaciju. Finasterid spreĉava smanjenje ekspresije markera neurona u korteksu i povećanje markera astrocita u hipokampusu nakon tretmana TAA-om. Bihejvioralne i EEG promene ukazuju da se finasterid moţe koristiti kao potencijalno neuroprotektivno sredstvo u terapiji HE, ali njegova kliniĉka upotreba zahteva prethodna istraţivanja o štetnim efektima ove terapije. 112 7. LITERATURA 113 1. Bernuau J, Rueff B, Benhamou JP. Fulminant and subfulminant liver failure: definitions and causes. Semin Liver Dis 1986;6:97–106. 2. Gammal SH, Jones EA. Hepatic encephalopathy. Med Clin North Am 1989;73:793– 813. 3. Ferenci P, Lockwood A, Mullen K, Tarter R, Weissenborn K, Blei AT. Hepatic encephalopathy--definition, nomenclature, diagnosis, and quantification: final report of the working party at the 11th World Congresses of Gastroenterology, Vienna, 1998. Hepatology 2002;35:716–21. 4. Bajaj JS. Review article: the modern management of hepatic encephalopathy. Alimen Pharmacol Ther 2010;31:537–47. 5. Weissenborn K, Tietge UJF, Bokemeyer M, Mohammadi B, Bode U, Manns MP, et al. Liver transplantation improves hepatic myelopathy: evidence by three cases. Gastroenterology 2003;124:346–51. 6. Frederick RT. Current Concepts in the Pathophysiology and Management of Hepatic Encephalopathy. Gastroenterol Hepatol 2011;7:222–33. 7. Córdoba J. New assessment of hepatic encephalopathy. J Hepatol 2011;54:1030–40. 8. McCrea M, Cordoba J, Vessey G, Blei AT, Randolph C. Neuropsychological characterization and detection of subclinical hepatic encephalopathy. Arch Neurol 1996;53:758–63. 9. Hassanein TI, Hilsabeck RC, Perry W. Introduction to the Hepatic Encephalopathy Scoring Algorithm (HESA). Dig Dis Sci 2008;53:529–38. 10. Weissenborn K, Ennen JC, Schomerus H, Rückert N, Hecker H. Neuropsychological characterization of hepatic encephalopathy. J Hepatol 2001;34:768–73. 11. Sotil EU, Gottstein J, Ayala E, Randolph C, Blei AT. Impact of preoperative overt hepatic encephalopathy on neurocognitive function after liver transplantation. Liver Transplant 2009;15:184–92. 12. Kircheis G, Wettstein M, Timmermann L, Schnitzler A, Häussinger D. Critical flicker frequency for quantification of low-grade hepatic encephalopathy. Hepatology 2002;35:357–66. 114 13. Garavan H, Ross TJ, Stein EA. Right hemispheric dominance of inhibitory control: an event-related functional MRI study. Proc Nat Acad Sci USA 1999;96:8301–6. 14. Bajaj JS, Saeian K, Verber MD, Hischke D, Hoffmann RG, Franco J, et al. Inhibitory control test is a simple method to diagnose minimal hepatic encephalopathy and predict development of overt hepatic encephalopathy. Am J Gastroenterol 2007;102:754–60. 15. Guerit J-M, Amantini A, Fischer C, Kaplan PW, Mecarelli O, Schnitzler A, et al. Neurophysiological investigations of hepatic encephalopathy: ISHEN practice guidelines. Liver Inter 2009;29:789–96. 16. Amodio P, Del Piccolo F, Marchetti P, Angeli P, Iemmolo R, Caregaro L, et al. Clinical features and survivial of cirrhotic patients with subclinical cognitive alterations detected by the number connection test and computerized psychometric tests. Hepatology 1999;29:1662–7. 17. Amodio P, Marchetti P, Del Piccolo F, De Tourtchaninoff M, Varghese P, Zuliani C, et al. Spectral versus visual EEG analysis in mild hepatic encephalopathy. Clin Neurophysiol 1999;110:1334–44. 18. Van der Rijt CC, Schalm SW, De Groot GH, De Vlieger M. Objective measurement of hepatic encephalopathy by means of automated EEG analysis. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1984;57:423–6. 19. Mehndiratta MM, Sood GK, Sarin SK, Gupta M. Comparative evaluation of visual, somatosensory, and auditory evoked potentials in the detection of subclinical hepatic encephalopathy in patients with nonalcoholic cirrhosis. Am J Gastroenterol 1990;85:799–803. 20. Utku U, Asil T, Balci K, Uzunca I, Celik Y. Hepatic myelopathy with spastic paraparesis. Clin Neurol Neurosurg 2005;107:514–6. 21. Amodio P, Pellegrini a, Ubiali E, Mathy I, Piccolo F Del, Orsato R, et al. The EEG assessment of low-grade hepatic encephalopathy: comparison of an artificial neural network-expert system (ANNES) based evaluation with visual EEG readings and EEG spectral analysis. Clin Neurophysiol 2006;117:2243–51. 115 22. Bajaj JS, Hafeezullah M, Zadvornova Y, Martin E, Schubert CM, Gibson DP, et al. The effect of fatigue on driving skills in patients with hepatic encephalopathy. Am J Gastroenterol 2009;10:898–905. 23. Amodio P, Del Piccolo F, Pettenò E, Mapelli D, Angeli P, Iemmolo R, et al. Prevalence and prognostic value of quantified electroencephalogram (EEG) alterations in cirrhotic patients. J Hepatol 2001;35:37–45. 24. Montagnese S, Amodio P, Morgan MY. Methods for diagnosing hepatic encephalopathy in patients with cirrhosis: a multidimensional approach. Metab Brain Dis 2004;19:281–312. 25. Butterworth RF. Pathophysiology of hepatic encephalopathy: a new look at ammonia. Metab Brain Dis 2002;17:221–7. 26. Shawcross D, Jalan R. The pathophysiologic basis of hepatic encephalopathy: central role for ammonia and inflammation. Cell Mol Life Sci 2005;62:2295–304. 27. Pasantes-Morales H, Franco R, Ordaz B, Ochoa LD. Mechanisms counteracting swelling in brain cells during hyponatremia. Arch Med Res 2002;33:237–44. 28. Chaudhry FA, Reimer RJ, Krizaj D, Barber D, Storm-Mathisen J, Copenhagen DR, et al. Molecular analysis of system N suggests novel physiological roles in nitrogen metabolism and synaptic transmission. Cell 1999;99:769–80. 29. Albrecht J, Norenberg MD. Glutamine: a Trojan horse in ammonia neurotoxicity. Hepatology 2006;44:788–94. 30. Albrecht J, Zielińska M, Norenberg MD. Glutamine as a mediator of ammonia neurotoxicity: A critical appraisal. Biochem Pharmacol 2010;80:1303–8. 31. Rama Rao K V, Norenberg MD. Aquaporin-4 in hepatic encephalopathy. Metab Brain Dis 2007;22:265–75. 32. Rama Rao K V, Jayakumar AR, Norenberg MD. Glutamine in the pathogenesis of acute hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2012;61:575–80. 33. Panickar KS, Jayakumar AR, Rao KVR, Norenberg MD. Ammonia-induced activation of p53 in cultured astrocytes: role in cell swelling and glutamate uptake. Neurochem Inter 2009;55:98–105. 116 34. Jayakumar AR, Tong XY, Ospel J, Norenberg MD. Role of cerebral endothelial cells in the astrocyte swelling and brain edema associated with acute hepatic encephalopathy. Neurosci 2012;218:305–16. 35. Nguyen JH, Yamamoto S, Steers J, Sevlever D, Lin W, Shimojima N, et al. Matrix metalloproteinase-9 contributes to brain extravasation and edema in fulminant hepatic failure mice. J Hepatol 2006;44:1105–14. 36. Chen F, Ohashi N, Li W, Eckman C, Nguyen JH. Disruptions of occludin and claudin-5 in brain endothelial cells in vitro and in brains of mice with acute liver failure. Hepatology 2009;50:1914–23. 37. Chen F, Hori T, Ohashi N, Baine A-M, Eckman CB, Nguyen JH. Occludin is regulated by epidermal growth factor receptor activation in brain endothelial cells and brains of mice with acute liver failure. Hepatology 2011;53:1294–305. 38. Cauli O, Rodrigo R, Llansola M, Montoliu C, Monfort P, Piedrafita B, et al. Glutamatergic and gabaergic neurotransmission and neuronal circuits in hepatic encephalopathy. Metab Brain Dis 2009;24:69–80. 39. Bélanger M, Desjardins P, Chatauret N, Butterworth RF. Selectively increased expression of the astrocytic/endothelial glucose transporter protein GLUT1 in acute liver failure. Glia 2006;53:557–62. 40. Butterworth RF. Altered glial-neuronal crosstalk: cornerstone in the pathogenesis of hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2010;57:383–8. 41. Norenberg MD. The role of astrocytes in hepatic encephalopathy. Neurochem Pathol 1987;6:13–33. 42. Jalan R, Shawcross D, Davies N. The molecular pathogenesis of hepatic encephalopathy. Inter J Biochem Cell Biol 2003;35:1175–81. 43. Häussinger D, Görg B. Interaction of oxidative stress, astrocyte swelling and cerebral ammonia toxicity. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2010;13:87–92. 44. Rama Rao K V, Norenberg MD. Brain energy metabolism and mitochondrial dysfunction in acute and chronic hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2012;60:697–706. 117 45. Srivastava A, Yadav SK, Yachha SK, Thomas MA, Saraswat VA, Gupta RK. Pro- inflammatory cytokines are raised in extrahepatic portal venous obstruction, with minimal hepatic encephalopathy. J Gastroenterol Hepatol 2011;26:979–86. 46. Rama Rao K V, Jayakumar AR, Norenberg DM. Ammonia neurotoxicity: role of the mitochondrial permeability transition. Metab Brain Dis 2003;18:113–27. 47. Hindfelt B, Plum F, Duffy TE. Effect of acute ammonia intoxication on cerebral metabolism in rats with portacaval shunts. J Clin Invest 1977;59:386–96. 48. Lai JC, Cooper AJ. Brain alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex: kinetic properties, regional distribution, and effects of inhibitors. J Neurochem 1986;47:1376–86. 49. Lockwood AH, Weissenborn K, Butterworth RF. An image of the brain in patients with liver disease. Curr Opin Neurol 1997;10:525–33. 50. Lockwood AH, Yap EW, Wong WH. Cerebral ammonia metabolism in patients with severe liver disease and minimal hepatic encephalopathy. J Cereb Blood Flow Metab 1991;11:337–41. 51. Weissenborn K, Bokemeyer M, Ahl B, Fischer-Wasels D, Giewekemeyer K, Van den Hoff J, et al. Functional imaging of the brain in patients with liver cirrhosis. Metab Brain Dis 2004;19:269–80. 52. Hertz L, Kala G. Energy metabolism in brain cells: effects of elevated ammonia concentrations. Metab Brain Dis 2007;22:199–218. 53. Yao H, Sadoshima S, Fujii K, Kusuda K, Ishitsuka T, Tamaki K, et al. Cerebrospinal fluid lactate in patients with hepatic encephalopathy. Eur Neurol 1987;27:182–7. 54. Rao K V, Mawal YR, Qureshi IA. Progressive decrease of cerebral cytochrome C oxidase activity in sparse-fur mice: role of acetyl-L-carnitine in restoring the ammonia-induced cerebral energy depletion. Neurosci Lett 1997;224:83–6. 55. Cauli O, Mansouri MT, Agusti A, Felipo V. Hyperammonemia increases GABAergic tone in the cerebellum but decreases it in the rat cortex. Gastroenterology 2009;136:1359–67. 56. González-Usano A, Cauli O, Agustí A, Felipo V. Hyperammonemia alters the modulation by different neurosteroids of the glutamate-nitric oxide-cyclic GMP 118 pathway through NMDA- GABAA - or sigma receptors in cerebellum in vivo. J Neurochem 2013;125:133–43. 57. Llansola M, Montoliu C, Cauli O, Hernández-Rabaza V, Agustí A, Cabrera-Pastor A, et al. Chronic hyperammonemia, glutamatergic neurotransmission and neurological alterations. Metab Brain Dis 2012;28:151–4. 58. Llansola M, Hernandez-Viadel M, Erceg S, Montoliu C, Felipo V. Increasing the function of the glutamate-nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate pathway increases the ability to learn a Y-maze task. J Neurosci Res 2009;87:2351–5. 59. Monfort P, Muñoz M-D, Kosenko E, Llansola M, Sánchez-Pérez A, Cauli O, et al. Sequential activation of soluble guanylate cyclase, protein kinase G and cGMP- degrading phosphodiesterase is necessary for proper induction of long-term potentiation in CA1 of hippocampus. Alterations in hyperammonemia. Neurochem Inter 2004;45:895–901. 60. Michalak A, Rose C, Butterworth J, Butterworth RF. Neuroactive amino acids and glutamate (NMDA) receptors in frontal cortex of rats with experimental acute liver failure. Hepatology 1996;24:908–13. 61. Hermenegildo C, Monfort P, Felipo V. Activation of N-methyl-D-aspartate receptors in rat brain in vivo following acute ammonia intoxication: characterization by in vivo brain microdialysis. Hepatology 2000;31:709–15. 62. Yao H, Haddad GG. Calcium and pH homeostasis in neurons during hypoxia and ischemia. Cell Calcium 2004;36:247–55. 63. Rodriguez-Rodriguez P, Almeida A, Bolaños JP. Brain energy metabolism in glutamate-receptor activation and excitotoxicity: role for APC/C-Cdh1 in the balance glycolysis/pentose phosphate pathway. Neurochem Inter 2013;62:750–6. 64. Kosenko E, Kaminsky Y, Stavroskaya IG, Felipo V. Alteration of mitochondrial calcium homeostasis by ammonia-induced activation of NMDA receptors in rat brain in vivo. Brain Res 2000;880:139–46. 65. Kosenko E, Kaminsky Y, Grau E, Miñana MD, Marcaida G, Grisolía S, et al. Brain ATP depletion induced by acute ammonia intoxication in rats is mediated by 119 activation of the NMDA receptor and Na+,K(+)-ATPase. J Neurochem 1994;63:2172–8. 66. Rose C. Effect of ammonia on astrocytic glutamate uptake/release mechanisms. J Neurochem 2006;97 Suppl 1:11–5. 67. Norenberg MD, Huo Z, Neary JT, Roig-Cantesano A. The glial glutamate transporter in hyperammonemia and hepatic encephalopathy: relation to energy metabolism and glutamatergic neurotransmission. Glia 1997;21:124–33. 68. Butterworth RF. Glutamate transporters in hyperammonemia. Neurochem Inter 2002;41:81–5. 69. Chan H, Hazell AS, Desjardins P, Butterworth RF. Effects of ammonia on glutamate transporter (GLAST) protein and mRNA in cultured rat cortical astrocytes. Neurochem Inter 2000;37:243–8. 70. Swain MS, Bergeron M, Audet R, Blei AT, Butterworth RF. Monitoring of neurotransmitter amino acids by means of an indwelling cisterna magna catheter: a comparison of two rodent models of fulminant liver failure. Hepatology 1992;16:1028–35. 71. Bruno V, Battaglia G, Copani A, D’Onofrio M, Di Iorio P, De Blasi A, et al. Metabotropic glutamate receptor subtypes as targets for neuroprotective drugs. J Cereb Blood Flow Metab 2001;21:1013–33. 72. Alagarsamy S, Marino MJ, Rouse ST, Gereau RW, Heinemann SF, Conn PJ. Activation of NMDA receptors reverses desensitization of mGluR5 in native and recombinant systems. Nature Neurosci 1999;2:234–40. 73. ElMlili N, Boix J, Ahabrach H, Rodrigo R, Errami M, Felipo V. Chronic hyperammonemia induces tonic activation of NMDA receptors in cerebellum. J Neurochem 2010;112:1005–14. 74. Corbalán R, Hernández-Viadel M, Llansola M, Montoliu C, Felipo V. Chronic hyperammonemia alters protein phosphorylation and glutamate receptor-associated signal transduction in brain. Neurochem Inter 2002;41:103–8. 75. Hermenegildo C, Montoliu C, Llansola M, Muñoz MD, Gaztelu JM, Miñana MD, et al. Chronic hyperammonemia impairs the glutamate-nitric oxide-cyclic GMP 120 pathway in cerebellar neurons in culture and in the rat in vivo. Eur J Neurosci 1998;10:3201–9. 76. Chepkova AN, Selbach O, Haas HL, Sergeeva OA. Ammonia-induced deficit in corticostriatal long-term depression and its amelioration by zaprinast. J Neurochem 2012;122:545–56. 77. Cauli O, Mlili N, Llansola M, Felipo V. Motor activity is modulated via different neuronal circuits in rats with chronic liver failure than in normal rats. Eur J Neurosci 2007;25:2112–22. 78. Cauli O, Llansola M, Erceg S, Felipo V. Hypolocomotion in rats with chronic liver failure is due to increased glutamate and activation of metabotropic glutamate receptors in substantia nigra. J Hepatol 2006;45:654–61. 79. Ahboucha S, Butterworth RF. The neurosteroid system: implication in the pathophysiology of hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2008;52:575–87. 80. Paul SM, Purdy RH. Neuroactive steroids. FASEB J 1992;6:2311–22. 81. Lambert JJ, Belelli D, Peden DR, Vardy AW, Peters JA. Neurosteroid modulation of GABAA receptors. Prog Neurobiol 2003;71:67–80. 82. Baulieu EE. Neurosteroids: a novel function of the brain. Psychoneuroendocrinology 1998;23:963–87. 83. Do Rego JL, Seong JY, Burel D, Leprince J, Luu-The V, Tsutsui K, et al. Neurosteroid biosynthesis: enzymatic pathways and neuroendocrine regulation by neurotransmitters and neuropeptides. Front Neuroendocrinol 2009;30:259–301. 84. Ahboucha S, Gamrani H, Baker G. GABAergic neurosteroids: the “endogenous benzodiazepines” of acute liver failure. Neurochem Inter 2012;60:707–14. 85. Hu J, Zhang Z, Shen W-J, Azhar S. Cellular cholesterol delivery, intracellular processing and utilization for biosynthesis of steroid hormones. Nutr Metab 2010;7:47. 86. Norenberg MD, Itzhak Y, Bender AS. The peripheral benzodiazepine receptor and neurosteroids in hepatic encephalopathy. Adv Exp Med Biol 1997;420:95–111. 121 87. Hazell AS, Normandin L, Nguyen B, Kennedy G. Upregulation of “peripheral-type” benzodiazepine receptors in the globus pallidus in a sub-acute rat model of manganese neurotoxicity. Neurosci Lett 2003;349:13–6. 88. Bourdiol F, Toulmond S, Serrano A, Benavides J, Scatton B. Increase in omega 3 (peripheral type benzodiazepine) binding sites in the rat cortex and striatum after local injection of interleukin-1, tumour necrosis factor-alpha and lipopolysaccharide. Brain Res 1991;543:194–200. 89. Belelli D, Lambert JJ. Neurosteroids: endogenous regulators of the GABA(A) receptor. Nature Rev Neurosci 2005;6:565–75. 90. Ahboucha S, Talani G, Fanutza T, Sanna E, Biggio G, Gamrani H, et al. Reduced brain levels of DHEAS in hepatic coma patients: significance for increased GABAergic tone in hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2012;61:48–53. 91. Müller-Preuss P, Rupprecht R, Lancel M. The effects of the neuroactive steroid 3 alpha,5 alpha-THDOC on sleep in the rat. Neuroreport 2002;13:487–90. 92. Ladurelle N, Eychenne B, Denton D, Blair-West J, Schumacher M, Robel P, et al. Prolonged intracerebroventricular infusion of neurosteroids affects cognitive performances in the mouse. Brain Res 2000;858:371–9. 93. Desjardins P, Bélanger M, Butterworth RF. Alterations in expression of genes coding for key astrocytic proteins in acute liver failure. J Neurosci Res 2001;66:967– 71. 94. Butterworth RF. Alterations of neurotransmitter-related gene expression in human and experimental portal-systemic encephalopathy. Metab Brain Dis 1998;13:337–49. 95. Melcangi RC, Magnaghi V, Cavarretta I, Riva MA, Martini L. Corticosteroid effects on gene expression of myelin basic protein in oligodendrocytes and of glial fibrillary acidic protein in type 1 astrocytes. J Neuroendocrinol 1997;9:729–33. 96. Guo Q, Sayeed I, Baronne LM, Hoffman SW, Guennoun R, Stein DG. Progesterone administration modulates AQP4 expression and edema after traumatic brain injury in male rats. Exp Neurol 2006;198:469–78. 122 97. Guerin C, Wolff JE, Laterra J, Drewes LR, Brem H, Goldstein GW. Vascular differentiation and glucose transporter expression in rat gliomas: effects of steroids. Ann Neurol 1992;31:481–7. 98. Manoli I, Le H, Alesci S, McFann KK, Su YA, Kino T, et al. Monoamine oxidase-A is a major target gene for glucocorticoids in human skeletal muscle cells. FASEB J 2005;19:1359–61. 99. Lamba V, Yasuda K, Lamba JK, Assem M, Davila J, Strom S, et al. PXR (NR1I2): splice variants in human tissues, including brain, and identification of neurosteroids and nicotine as PXR activators. Toxicol Appl Pharmacol 2004;199:251–65. 100. Bender AS, Norenberg MD. Effect of benzodiazepines and neurosteroids on ammonia-induced swelling in cultured astrocytes. J Neurosci Res 1998;54:673–80. 101. Ahboucha S. Neurosteroids and hepatic encephalopathy: an update on possible pathophysiologic mechanisms. Curr Mol Pharmacol 2011;4:1–13. 102. Casellas P, Galiegue S, Basile AS. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function. Neurochem Inter 2002;40:475–86. 103. Alho H, Harjuntausta T, Schultz R, Pelto-Huikko M, Bovolin P. Immunohistochemistry of diazepam binding inhibitor (DBI) in the central nervous system and peripheral organs: its possible role as an endogenous regulator of different types of benzodiazepine receptors. Neuropharmacology 1991;30:1381–6. 104. Rothstein JD, McKhann G, Guarneri P, Barbaccia ML, Guidotti A, Costa E. Cerebrospinal fluid content of diazepam binding inhibitor in chronic hepatic encephalopathy. Ann Neurol 1989;26:57–62. 105. Dodd PR, Thomas GJ, Harper CG, Kril JJ. Amino acid neurotransmitter receptor changes in cerebral cortex in alcoholism: effect of cirrhosis of the liver. J Neurochem 1992;59:1506–15. 106. Mans AM, Kukulka KM, McAvoy KJ, Rokosz NC. Regional distribution and kinetics of three sites on the GABAA receptor: lack of effect of portacaval shunting. J Cereb Blood Flow Metab 1992;12:334–46. 107. Ahboucha S, Desjardins P, Chatauret N, Pomier-Layrargues G, Butterworth RF. Normal coupling of brain benzodiazepine and neurosteroid modulatory sites on the 123 GABA-A receptor complex in human hepatic encephalopathy. Neurochem Inter 2003;43:551–6. 108. Song G, Dhodda VK, Blei AT, Dempsey RJ, Rao VLR. GeneChip analysis shows altered mRNA expression of transcripts of neurotransmitter and signal transduction pathways in the cerebral cortex of portacaval shunted rats. J Neurosci Res 2002;68:730–7. 109. Butterworth RF, Lavoie J, Giguère JF, Pomier-Layrargues G. Affinities and densities of high-affinity [3H]muscimol (GABA-A) binding sites and of central benzodiazepine receptors are unchanged in autopsied brain tissue from cirrhotic patients with hepatic encephalopathy. Hepatology 1988;8:1084–8. 110. Palomero-Gallagher N, Bidmon H-J, Cremer M, Schleicher A, Kircheis G, Reifenberger G, et al. Neurotransmitter receptor imbalances in motor cortex and basal ganglia in hepatic encephalopathy. Cell Physiol Biochem 2009;24:291–306. 111. Hadesman R, Wiesner RH, Go VL, Tyce GM. Concentrations of 3,4- dihydroxyphenylalanine and catecholamines and metabolites in brain in an anhepatic model of hepatic encephalopathy. J Neurochem 1995;65:1166–75. 112. Michalak A, Rose C, Buu PN, Butterworth RF. Evidence for altered central noradrenergic function in experimental acute liver failure in the rat. Hepatology 1998;27:362–8. 113. McCandless DW, Looney GA, Modak AT, Stavinoha WB. Cerebral acetylcholine and energy metabolism changes in acute ammonia intoxication in the lower primate Tupaia glis. J Lab Clin Med 1985;106:183–6. 114. García-Ayllón M-S, Cauli O, Silveyra M-X, Rodrigo R, Candela A, Compañ A, et al. Brain cholinergic impairment in liver failure. Brain 2008;131(Pt 11):2946–56. 115. Piche T, Vanbiervliet G, Cherikh F, Antoun Z, Huet PM, Gelsi E, et al. Effect of ondansetron, a 5-HT3 receptor antagonist, on fatigue in chronic hepatitis C: a randomised, double blind, placebo controlled study. Gut 2005;54:1169–73. 116. Reddy PVB, Murthy CRK, Reddanna P. Fulminant hepatic failure induced oxidative stress in nonsynaptic mitochondria of cerebral cortex in rats. Neurosci Lett 2004;368:15–20. 124 117. Halliwell B. Reactive oxygen species and the central nervous system. J Neurochem 1992;59:1609–23. 118. Häussinger D, Görg B, Reinehr R, Schliess F. Protein tyrosine nitration in hyperammonemia and hepatic encephalopathy. Metab Brain Dis 2005;20:285–94. 119. Görg B, Schliess F, Häussinger D. Osmotic and oxidative/nitrosative stress in ammonia toxicity and hepatic encephalopathy. Arch Biochem Biophys 2013; doi: 10.1016/j.abb.2013.03.010.(in press) 120. Jayakumar AR, Bethea JR, Tong XY, Gomez J, Norenberg MD. NF-κB in the mechanism of brain edema in acute liver failure: studies in transgenic mice. Neurobiol Dis 2011;41:498–507. 121. Beatrice MC, Palmer JW, Pfeiffer DR. The relationship between mitochondrial membrane permeability, membrane potential, and the retention of Ca2+ by mitochondria. J Biol Chem 1980;255:8663–71. 122. Bernardi P. The permeability transition pore. Control points of a cyclosporin A- sensitive mitochondrial channel involved in cell death. Biochim Biophys Acta 1996;1275:5–9. 123. Crompton M, Virji S, Ward JM. Cyclophilin-D binds strongly to complexes of the voltage-dependent anion channel and the adenine nucleotide translocase to form the permeability transition pore. Eur J Biochem / FEBS 1998;258:729–35. 124. Gunter TE, Pfeiffer DR. Mechanisms by which mitochondria transport calcium. Am J Physiol 1990;258:C755–86. 125. Bernardi P, Colonna R, Costantini P, Eriksson O, Fontaine E, Ichas F, et al. The mitochondrial permeability transition. BioFactors 1998;8:273–81. 126. Bustamante J, Lores-Arnaiz S, Tallis S, Roselló DM, Lago N, Lemberg A, et al. Mitochondrial dysfunction as a mediator of hippocampal apoptosis in a model of hepatic encephalopathy. Mol Cell Biochem 2011;354:231–40. 127. Bai G, Rama Rao K V, Murthy CR, Panickar KS, Jayakumar AR, Norenberg MD. Ammonia induces the mitochondrial permeability transition in primary cultures of rat astrocytes. J Neurosci Res 2001;66:981–91. 125 128. Alvarez VM, Rama Rao K V, Brahmbhatt M, Norenberg MD. Interaction between cytokines and ammonia in the mitochondrial permeability transition in cultured astrocytes. J Neurosci Res 2011;89:2028–40. 129. Jayakumar AR, Panickar KS, Norenberg MD. Effects on free radical generation by ligands of the peripheral benzodiazepine receptor in cultured neural cells. J Neurochem 2002;83:1226–34. 130. Butterworth RF. Hepatic encephalopathy: a central neuroinflammatory disorder? Hepatology 2011;53:1372–6. 131. Shawcross DL, Shabbir SS, Taylor NJ, Hughes RD. Ammonia and the neutrophil in the pathogenesis of hepatic encephalopathy in cirrhosis. Hepatology 2010;51:1062– 9. 132. Van Rossum D, Hanisch U-K. Microglia. Metab Brain Dis 2004;19:393–411. 133. Bémeur C, Qu H, Desjardins P, Butterworth RF. IL-1 or TNF receptor gene deletion delays onset of encephalopathy and attenuates brain edema in experimental acute liver failure. Neurochem Inter 2010;56:213–5. 134. D’Mello C, Le T, Swain MG. Cerebral microglia recruit monocytes into the brain in response to tumor necrosis factoralpha signaling during peripheral organ inflammation. J Neurosci 2009;29:2089–102. 135. Jiang W, Desjardins P, Butterworth RF. Direct evidence for central proinflammatory mechanisms in rats with experimental acute liver failure: protective effect of hypothermia. J Cereb Blood Flow Metab 2009;29:944–52. 136. Rodrigo R, Cauli O, Gomez-Pinedo U, Agusti A, Hernandez-Rabaza V, Garcia- Verdugo J-M, et al. Hyperammonemia induces neuroinflammation that contributes to cognitive impairment in rats with hepatic encephalopathy. Gastroenterology 2010;139:675–84. 137. Licinio J, Wong ML. Pathways and mechanisms for cytokine signaling of the central nervous system. J Clin Invest 1997;100:2941–7. 138. James JH, Escourrou J, Fischer JE. Blood-brain neutral amino acid transport activity is increased after portacaval anastomosis. Science 1978;200:1395–7. 126 139. Smith AR, Rossi-Fanelli F, Ziparo V, James JH, Perelle BA, Fischer JE. Alterations in plasma and CSF amino acids, amines and metabolites in hepatic coma. Ann Surg 1978;187:343–50. 140. Skowrońska M, Albrecht J. Alterations of blood brain barrier function in hyperammonemia: an overview. Neurotox Res 2012;21:236–44. 141. Jessy J, Mans AM, DeJoseph MR, Hawkins RA. Hyperammonaemia causes many of the changes found after portacaval shunting. Biochem J 1990;272:311–7. 142. Hilgier W, Zitting A, Albrecht J. The brain octopamine and phenylethanolamine content in rats in thioacetamide-induced hepatogenic encephalopathy. Acta Neurol Scand 1985;71:195–8. 143. Cangiano C, Cardelli-Cangiano P, James JH, Rossi-Fanelli F, Patrizi MA, Brackett KA, et al. Brain microvessels take up large neutral amino acids in exchange for glutamine. Cooperative role of Na+-dependent and Na+-independent systems. J Biol Chem 1983;258:8949–54. 144. Gow AG, Marques AI, Yool DA, Crawford K, Warman SM, Eckersall PD, et al. Dogs with congenital porto-systemic shunting (cPSS) and hepatic encephalopathy have higher serum concentrations of C-reactive protein than asymptomatic dogs with cPSS. Metab Brain Dis 2012;27:227–9. 145. Hung K-C, Yong C-C, Chen Y-S, Eng H-L, Kuo F-Y, Lin C-C, et al. A surgical model of fulminant hepatic failure in rabbits. Liver Inter 2007;27:1333–41. 146. Frühauf NR, Radunz S, Grabellus F, Laube T, Uerschels AK, Kaiser GM. Neuromonitoring in a porcine model of acute hepatic failure. Lab Anim 2011;45:174–8. 147. Baine A-MT, Hori T, Chen F, Gardner LB, Uemoto S, Nguyen JH. Fulminant liver failure models with subsequent encephalopathy in the mouse. Hepatobil Pancr Dis Inter 2011;10:611–9. 148. Staziaki P V, Marques CM, Delattre AM, De Paula Cioni B, Rufino M, Dos Santos FV, et al. Fish oil has beneficial effects on behavior impairment and oxidative stress in rats subjected to a hepatic encephalopathy model. CNS Neurol Dis Drug Targ 2013;12:84–93. 127 149. Butterworth RF, Norenberg MD, Felipo V, Ferenci P, Albrecht J, Blei AT. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver Inter 2009;29:783–8. 150. Leke R, Bak LK, Iversen P, Sørensen M, Keiding S, Vilstrup H, et al. Synthesis of neurotransmitter GABA via the neuronal tricarboxylic acid cycle is elevated in rats with liver cirrhosis consistent with a high GABAergic tone in chronic hepatic encephalopathy. J Neurochem 2011;117:824–32. 151. Avraham Y, Grigoriadis N, Poutahidis T, Vorobiev L, Magen I, Ilan Y, et al. Cannabidiol improves brain and liver function in a fulminant hepatic failure-induced model of hepatic encephalopathy in mice. Br J Pharmacol 2011;162:1650–8. 152. Tuñón MJ, Alvarez M, Culebras JM G-GJ. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World J Gastroenterol 2009;15:3086–98. 153. Traber P, DalCanto M, Ganger D, Blei AT. Effect of body temperature on brain edema and encephalopathy in the rat after hepatic devascularization. Gastroenterology 1989;96:885–91. 154. Traber PG, Dal Canto M, Ganger DR, Blei AT. Electron microscopic evaluation of brain edema in rabbits with galactosamine-induced fulminant hepatic failure: ultrastructure and integrity of the blood-brain barrier. Hepatology 1987;7:1272–7. 155. Panatto JP, Jeremias IC, Ferreira GK, Ramos AC, Rochi N, Gonçalves CL, et al. Inhibition of mitochondrial respiratory chain in the brain of rats after hepatic failure induced by acetaminophen. Mol Cell Biochem 2011;350:149–54. 156. Bélanger M, Côté J, Butterworth RF. Neurobiological characterization of an azoxymethane mouse model of acute liver failure. Neurochem Inter 2006;48:434–40. 157. Mladenović D, Radosavljević T, Hrnĉić D, Rašić-Marković A, Puškaš N, Maksić N, et al. Behavioral and electroencephalographic manifestations of thioacetamide- induced encephalopathy in rats. Can J Physiol Pharmacol 2012;90:1219–27. 158. Swain M, Butterworth RF, Blei AT. Ammonia and related amino acids in the pathogenesis of brain edema in acute ischemic liver failure in rats. Hepatology 1992;15:449–53. 128 159. Potvin M, Finlayson MH, Hinchey EJ, Lough JO, Goresky CA. Cerebral abnormalities in hepatectomized rats with acute hepatic coma. Lab Invest 1984;50:560–4. 160. Chatauret N, Rose C, Therrien G, Butterworth RF. Mild hypothermia prevents cerebral edema and CSF lactate accumulation in acute liver failure. Metab Brain Dis 2001;16:95–102. 161. Dixit V, Chang TM. Brain edema and the blood brain barrier in galactosamine- induced fulminant hepatic failure rats. An animal model for evaluation of liver support systems. ASAIO transactions 1990;36:21–7. 162. Horowitz ME, Schafer DF, Molnar P, Jones EA, Blasberg RG, Patlak CS, et al. Increased blood-brain transfer in a rabbit model of acute liver failure. Gastroenterology 1983;84:1003–11. 163. Albrecht J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. J Neurosci Res 1981;6:553–8. 164. Zimmermann C, Ferenci P, Pifl C, Yurdaydin C, Ebner J, Lassmann H, et al. Hepatic encephalopathy in thioacetamide-induced acute liver failure in rats: characterization of an improved model and study of amino acid-ergic neurotransmission. Hepatology 1989;9:594–601. 165. Dyroff MC, Neal RA. Identification of the major protein adduct formed in rat liver after thioacetamide administration. Cancer Res 1981;41:3430–5. 166. Maddison JE, Dodd PR, Morrison M, Johnston GA, Farrell GC. Plasma GABA, GABA-like activity and the brain GABA-benzodiazepine receptor complex in rats with chronic hepatic encephalopathy. Hepatology 1987;7:621–8. 167. Hawkins PA, DeJoseph MR, Hawkins RA. Eliminating metabolic abnormalities of portacaval shunting by restoring normal liver blood flow. Am J Physiol 1996;270:E1037–42. 168. Butterworth RF, Girard G, Giguère JF. Regional differences in the capacity for ammonia removal by brain following portocaval anastomosis. J Neurochem 1988;51:486–90. 129 169. Kountouras J, Billing BH, Scheuer PJ. Prolonged bile duct obstruction: a new experimental model for cirrhosis in the rat. Br J Exp Pathol 1984;65:305–11. 170. Dunn CW, Horton JW, Megison SM, Vuitch MF. Contribution of portal systemic shunt to Kupffer cell dysfunction in obstructive jaundice. J Surg Res 1991;50:234–9. 171. Greve JW, Gouma DJ, Soeters PB, Buurman WA. Suppression of cellular immunity in obstructive jaundice is caused by endotoxins: a study with germ-free rats. Gastroenterology 1990;98:478–85. 172. Jover R, Rodrigo R, Felipo V, Insausti R, Sáez-Valero J, García-Ayllón MS, et al. Brain edema and inflammatory activation in bile duct ligated rats with diet-induced hyperammonemia: A model of hepatic encephalopathy in cirrhosis. Hepatology 2006;43:1257–66. 173. Llansola M, Rodrigo R, Monfort P, Montoliu C, Kosenko E, Cauli O, et al. NMDA receptors in hyperammonemia and hepatic encephalopathy. Metab Brain Dis 2007;22:321–35. 174. Haghighat N, McCandless DW, Geraminegad P. Responses in primary astrocytes and C6-glioma cells to ammonium chloride and dibutyryl cyclic-AMP. Neurochem Res 2000;25:277–84. 175. Ganz R, Swain M, Traber P, DalCanto M, Butterworth RF, Blei AT. Ammonia- induced swelling of rat cerebral cortical slices: implications for the pathogenesis of brain edema in acute hepatic failure. Metab Brain Dis 1989;4:213–23. 176. Pidoplichko VI, Dani JA. Acid-sensitive ionic channels in midbrain dopamine neurons are sensitive to ammonium, which may contribute to hyperammonemia damage. Proc Nat Acad Sci USA 2006;103:11376–80. 177. Rodrigo R, Erceg S, Rodriguez-Diaz J, Saez-Valero J, Piedrafita B, Suarez I, et al. Glutamate-induced activation of nitric oxide synthase is impaired in cerebral cortex in vivo in rats with chronic liver failure. J Neurochem 2007;102:51–64. 178. Zielińska M, Law RO, Albrecht J. Excitotoxic mechanism of cell swelling in rat cerebral cortical slices treated acutely with ammonia. Neurochem Inter 2003;43:299– 303. 130 179. Azzouni F, Zeitouni N, Mohler J. Role of 5α-reductase inhibitors in androgen- stimulated skin disorders. J Drugs Dermatol 2013;12:e30–5. 180. Rick FG, Saadat SH, Szalontay L, Block NL, Kazzazi A, Djavan B, et al. Hormonal manipulation of benign prostatic hyperplasia. Curr Opin Urol 2013;23:17–24. 181. Mukai Y, Higashi T, Nagura Y, Shimada K. Studies on neurosteroids XXV. Influence of a 5alpha-reductase inhibitor, finasteride, on rat brain neurosteroid levels and metabolism. Biol Pharm Bull 2008;31:1646–50. 182. Usami N, Yamamoto T, Shintani S, Ishikura S, Higaki Y, Katagiri Y, et al. Substrate specificity of human 3(20)alpha-hydroxysteroid dehydrogenase for neurosteroids and its inhibition by benzodiazepines. Biol Pharm Bull 2002;25:441–5. 183. Funae Y, Kishimoto W, Cho T, Niwa T, Hiroi T. CYP2D in the brain. Drug Metab Pharmacokin 2003;18:337–49. 184. Ugale RR, Sharma AN, Kokare DM, Hirani K, Subhedar NK, Chopde CT. Neurosteroid allopregnanolone mediates anxiolytic effect of etifoxine in rats. Brain Res 2007;1184:193–201. 185. Biagini G, Panuccio G, Avoli M. Neurosteroids and epilepsy. Curr Opin Neurol 2010;23:170–6. 186. Duborija-Kovacevic N, Jakovljevic V, Sabo A, Tomic Z. Anti-nociceptive and anti- inflammatory properties of 5alpha-reductase inhibitor finasteride in experimental animals. Eur J Drug Metab Pharmacokin 2008;33:181–6. 187. Ford MM, Nickel JD, Finn D a. Treatment with and withdrawal from finasteride alter ethanol intake patterns in male C57BL/6J mice: potential role of endogenous neurosteroids? Alcohol 2005;37:23–33. 188. Reddy DS, Kim HY, Rogawski MA. Neurosteroid withdrawal model of perimenstrual catamenial epilepsy. Epilepsia 2001;42:328–36. 189. Martin BS, Kapur J. A combination of ketamine and diazepam synergistically controls refractory status epilepticus induced by cholinergic stimulation. Epilepsia 2008;49:248–55. 131 190. Sun C, Mtchedlishvili Z, Erisir A, Kapur J. Diminished neurosteroid sensitivity of synaptic inhibition and altered location of the alpha4 subunit of GABA(A) receptors in an animal model of epilepsy. J Neurosci 2007;27:12641–50. 191. Lawrence C, Martin BS, Sun C, Williamson J, Kapur J. Endogenous neurosteroid synthesis modulates seizure frequency. Ann Neurol 2011;67:689–93. 192. Moradi-Azani M, Ahmadiani A, Amini H. Increase in formalin-induced tonic pain by 5alpha-reductase and aromatase inhibition in female rats. Pharmacol Biochem Behav 2011;98:62–6. 193. Peng H-Y, Chen G-D, Lee S-D, Lai C-Y, Chiu C-H, Cheng C-L, et al. Neuroactive steroids inhibit spinal reflex potentiation by selectively enhancing specific spinal GABA(A) receptor subtypes. Pain 2009;143:12–20. 194. Patte-Mensah C, Li S, Mensah-Nyagan AG. Impact of neuropathic pain on the gene expression and activity of cytochrome P450side-chain-cleavage in sensory neural networks. Cell Mol Life Sci 2004;61:2274–84. 195. Meyer L, Venard C, Schaeffer V, Patte-Mensah C, Mensah-Nyagan AG. The biological activity of 3alpha-hydroxysteroid oxido-reductase in the spinal cord regulates thermal and mechanical pain thresholds after sciatic nerve injury. Neurobiol Dis 2008;30:30–41. 196. Amini H, Ahmadiani A. Increase in testosterone metabolism in the rat central nervous system by formalin-induced tonic pain. Pharmacol Biochem Behav 2002;74:199–204. 197. Sanna E, Talani G, Busonero F, Pisu MG, Purdy RH, Serra M, et al. Brain steroidogenesis mediates ethanol modulation of GABAA receptor activity in rat hippocampus. J Neurosci 2004;24:6521–30. 198. Sundstrom-Poromaa I, Smith DH, Gong QH, Sabado TN, Li X, Light A, et al. Hormonally regulated alpha(4)beta(2)delta GABA(A) receptors are a target for alcohol. Nat Neurosci 2002;5:721–2. 199. Pierucci-Lagha A, Covault J, Feinn R, Nellissery M, Hernandez-Avila C, Oncken C, et al. GABRA2 alleles moderate the subjective effects of alcohol, which are attenuated by finasteride. Neuropsychopharmacol 2005;30:1193–203. 132 200. Romeo E, Brancati A, De Lorenzo A, Fucci P, Furnari C, Pompili E, et al. Marked decrease of plasma neuroactive steroids during alcohol withdrawal. Clin Neuropharmacol 1996;19:366–9. 201. Bortolato M, Frau R, Orrù M, Bourov Y, Marrosu F, Mereu G, et al. Antipsychotic- like properties of 5-alpha-reductase inhibitors. Neuropsychopharmacol 2008;33:3146–56. 202. Thigpen AE, Russell DW. Four-amino acid segment in steroid 5 alpha-reductase 1 confers sensitivity to finasteride, a competitive inhibitor. J Biol Chem 1992;267:8577–83. 203. Finn DA, Ford MM, Wiren KM, Roselli CE, Crabbe JC. The role of pregnane neurosteroids in ethanol withdrawal: behavioral genetic approaches. Pharmacol Ther 2004;101:91–112. 204. Norton NS, McConnell JR, Rodriguez-Sierra JF. Behavioral and physiological sex differences observed in an animal model of fulminant hepatic encephalopathy in the rat. Physiol Behav 1997;62:1113–24. 205. Hrncić D, Rasić-Marković A, Krstić D, Macut D, Djuric D, Stanojlović O. The role of nitric oxide in homocysteine thiolactone-induced seizures in adult rats. Cell Mol Neurobiol 2010;30:219–31. 206. Stanojlović O, Rasić-Marković A, Hrncić D, Susić V, Macut D, Radosavljević T, et al. Two types of seizures in homocysteine thiolactone-treated adult rats, behavioral and electroencephalographic study. Cell Mol Neurobiol 2009;29:329–39. 207. Aruoma OI, Halliwell B, Laughton MJ, Quinlan GJ, Gutteridge JM. The mechanism of initiation of lipid peroxidation. Evidence against a requirement for an iron(II)- iron(III) complex. Biochem J 1989;258:617–20. 208. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry [Internet]. 1951;193:265– 75. 209. Beutler E. Red Cell Metabolism, A Manual of Biochemical Methods. 3rd Ed. New York: Grune and Startton; 1984. 133 210. Whittaker VP. The subcellular fractionation of brain tissue with special reference to the preparation of synaptosomes and their component organelles. Methods Neuroch 1972;2:1–52. 211. Rehncrona S, Smith DS, Akesson B, Westerberg E, Siesjö BK. Peroxidative changes in brain cortical fatty acids and phospholipids, as characterized during Fe2+- and ascorbic acid-stimulated lipid peroxidation in vitro. J Neurochem 1980;34:1630–8. 212. Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups. Arch Biochem Biophys 1959;82:70–7. 213. Günzler WA, Kremers H, Flohé L. An improved coupled test procedure for glutathione peroxidase (EC 1-11-1-9-) in blood. Zeitsch Klin Chem Klin Biochem 1974;12:444–8. 214. Carlberg I, Mannervik B. Glutathione reductase. Methods Enzymol 1985;113:484– 90. 215. Sun M, Zigman S. An improved spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on epinephrine autoxidation. Anal Biochem 1978;90:81–9. 216. Góth L. Serum catalase: reversibly formed charge isoform of erythrocyte catalase. Clin Chem 1991;37:2043–7. 217. Ellman GL, Courtney KD, Andres V, Feather-Stone RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol 1961;7:88–95. 218. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248–54. 219. De Lima JM, De Freitas FJC, Amorim RNL, Câmara ACL, Batista JS, Soto-Blanco B. Clinical and pathological effects of Calotropis procera exposure in sheep and rats. Toxicon 2011;57:183–5. 220. Parsons-Smith BG, Summerskill WH, Dawson AM, Sherlock S. The electroencephalograph in liver disease. Lancet 1957;273:867–71. 221. Wu J-Y, Yue J, Feng Y-Q. Determination of brain cytochrome P450 2E1 activity in rat with the probe of chlorzoxazone by liquid chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr. B, Anal Tech Biomed Life Sci 2011;879:260–6. 134 222. Peeling J, Shoemaker L, Gauthier T, Benarroch A, Sutherland GR, Minuk GY. Cerebral metabolic and histological effects of thioacetamide-induced liver failure. Am J Physiol 1993;265:G572–8. 223. Méndez M, Méndez-López M, Lopez L, Aller MA, Arias J, Arias JL. Mammillary body alterations and spatial memory impairment in Wistar rats with thioacetamide- induced cirrhosis. Brain Res 2008;1233:185–95. 224. Hermenegildo C, Marcaida G, Montoliu C, Grisolía S, Miñana MD, Felipo V. NMDA receptor antagonists prevent acute ammonia toxicity in mice. Neurochem Res 1996;21:1237–44. 225. Montagnese S, Jackson C, Morgan MY. Spatio-temporal decomposition of the electroencephalogram in patients with cirrhosis. J Hepatol 2007;46:447–58. 226. Sagalés T, Gimeno V, De la Calzada MD, Casellas F, Dolors Macià M, Villar Soriano M. Brain mapping analysis in patients with hepatic encephalopathy. Brain Topogr 1990;2:221–8. 227. Kullmann F, Hollerbach S, Lock G, Holstege A, Dierks T, Schölmerich J. Brain electrical activity mapping of EEG for the diagnosis of (sub)clinical hepatic encephalopathy in chronic liver disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 2001;13:513– 22. 228. Albrecht J, Jones EA. Hepatic encephalopathy: molecular mechanisms underlying the clinical syndrome. J Neurol Sci 1999;170:138–46. 229. Méndez M, Méndez-López M, López L, Aller MA, Arias J, Cimadevilla JM, et al. Spatial memory alterations in three models of hepatic encephalopathy. Behav Brain Res 2008;188:32–40. 230. Amodio P, Gatta A. Neurophysiological investigation of hepatic encephalopathy. Metab Brain Dis 2005;20:369–79. 231. Hunter GRW, Young GB. Recovery of awareness after hyperacute hepatic encephalopathy with “flat” EEG, severe brain edema and deep coma. Neurocrit Care 2010;13:247–51. 135 232. Chamuleau RA, Deutz NE, De Haan JG, Van Gool J. Correlation between electroencephalographic and biochemical indices in acute hepatic encephalopathy in rats. J Hepatol 1987;4:299–306. 233. Hunter AL, Holscher MA, Neal RA. Thioacetamide-induced hepatic necrosis. I. Involvement of the mixed-function oxidase enzyme system. J Pharmacol Exp Ther 1977;200:439–48. 234. Porter WR, Gudzinowicz MJ, Neal RA. Thioacetamide-induced hepatic necrosis. II. Pharmacokinetics of thioacetamide and thioacetamide-S-oxide in the rat. J Pharmacol Exp Ther 1979;208:386–91. 235. Miranda AS de, Rodrigues DH, Vieira LB, Lima CX, Rachid MA, Vidigal PVT, et al. A thioacetamide-induced hepatic encephalopathy model in C57BL/6 mice: a behavioral and neurochemical study. Arq neuropsiqiatr 2010;68:597–602. 236. Avraham Y, Israeli E, Gabbay E, Okun A, Zolotarev O, Silberman I, et al. Endocannabinoids affect neurological and cognitive function in thioacetamide- induced hepatic encephalopathy in mice. Neurobiol Dis 2006;21:237–45. 237. Zarros A, Theocharis S, Skandali N, Tsakiris S. Effects of fulminant hepatic encephalopathy on the adult rat brain antioxidant status and the activities of acetylcholinesterase, (Na(+),K (+))- and Mg (2+)-ATPase: comparison of the enzymes’ response to in vitro treatment with ammonia. Metab Brain Dis 2008;23:255–64. 238. Túnez I, Muñoz MC, Medina FJ, Salcedo M, Feijóo M, Montilla P. Comparison of melatonin, vitamin E and L-carnitine in the treatment of neuro- and hepatotoxicity induced by thioacetamide. Cell Biochem Func 2007;25:119–27. 239. Chadipiralla K, Reddanna P, Chinta RM, Reddy PVB. Thioacetamide-induced fulminant hepatic failure induces cerebral mitochondrial dysfunction by altering the electron transport chain complexes. Neurochem Res 2012;37:59–68. 240. Sathyasaikumar K V, Swapna I, Reddy PVB, Murthy CRK, Dutta Gupta A, Senthilkumaran B, et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem Res 2007;32:517–24. 136 241. Wang X, Zaidi A, Pal R, Garrett AS, Braceras R, Chen X, et al. Genomic and biochemical approaches in the discovery of mechanisms for selective neuronal vulnerability to oxidative stress. BMC Neurosci 2009;10:12. 242. Hyman BT, Van Hoesen GW, Damasio AR, Barnes CL. Alzheimer’s disease: cell- specific pathology isolates the hippocampal formation. Science 1984;225:1168–70. 243. Terry RD, Masliah E, Salmon DP, Butters N, DeTeresa R, Hill R, et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer’s disease: synapse loss is the major correlate of cognitive impairment. Ann Neurol 1991;30:572–80. 244. Dauer W, Przedborski S. Parkinson’s disease: mechanisms and models. Neuron 2003;39:889–909. 245. Rowland LP, Shneider NA. Amyotrophic lateral sclerosis. New Engl J Med 2001;344:1688–700. 246. Balasubramaniyan V, Wright G, Sharma V, Davies NA, Sharifi Y, Habtesion A, et al. Ammonia reduction with ornithine phenylacetate restores brain eNOS activity via the DDAH-ADMA pathway in bile duct-ligated cirrhotic rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2012;302:G145–52. 247. Bedard K, Krause K-H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol Rev 2007;87:245–313. 248. Groemping Y, Lapouge K, Smerdon SJ, Rittinger K. Molecular basis of phosphorylation-induced activation of the NADPH oxidase. Cell 2003;113:343–55. 249. Han CH, Freeman JL, Lee T, Motalebi SA, Lambeth JD. Regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase. Identification of an activation domain in p67(phox). J Biol Chem 1998;273:16663–8. 250. Reinehr R, Görg B, Becker S, Qvartskhava N, Bidmon HJ, Selbach O, et al. Hypoosmotic swelling and ammonia increase oxidative stress by NADPH oxidase in cultured astrocytes and vital brain slices. Glia 2007;55:758–71. 251. Norenberg MD, Rama Rao K V, Jayakumar AR. Signaling factors in the mechanism of ammonia neurotoxicity. Metab Brain Dis 2009;24:103–17. 137 252. Bánfi B, Malgrange B, Knisz J, Steger K, Dubois-Dauphin M, Krause K-H. NOX3, a superoxide-generating NADPH oxidase of the inner ear. J Biol Chem 2004;279:46065–72. 253. Kiss PJ, Knisz J, Zhang Y, Baltrusaitis J, Sigmund CD, Thalmann R, et al. Inactivation of NADPH oxidase organizer 1 results in severe imbalance. Curr Biol 2006;16:208–13. 254. Martyn KD, Frederick LM, Von Loehneysen K, Dinauer MC, Knaus UG. Functional analysis of Nox4 reveals unique characteristics compared to other NADPH oxidases. Cell Signal 2006;18:69–82. 255. Kosenko E, Venediktova N, Kaminsky Y, Montoliu C, Felipo V. Sources of oxygen radicals in brain in acute ammonia intoxication in vivo. Brain Res 2003;981:193– 200. 256. Dhanda S, Kaur S, Sandhir R. Preventive effect of N-acetyl-L-cysteine on oxidative stress and cognitive impairment in hepatic encephalopathy following bile duct ligation. Free Rad Biol Med 2013;56:204–15. 257. Sathyasaikumar KV, Swapna I, Reddy PVB, Murthy CRK, Roy KR, Dutta Gupta A, et al. Co-administration of C-Phycocyanin ameliorates thioacetamide-induced hepatic encephalopathy in Wistar rats. J Neurol Sci 2007;252:67–75. 258. Swapna I, Sathyasaikumar K V, Murthy CRK, Dutta-Gupta A, Senthilkumaran B. Changes in cerebral membrane lipid composition and fluidity during thioacetamide- induced hepatic encephalopathy. J Neurochem 2006;98:1899–907. 259. Felipo V, Butterworth RF. Neurobiology of ammonia. Prog Neurobiol 2002;67:259– 79. 260. Chou Y-C, Lin S-B, Tsai LH, Tsai H-I, Lin CM. Cholesterol deficiency increases the vulnerability of hippocampal glia in primary culture to glutamate-induced excitotoxicity. Neurochem Inter 2003;43:197–209. 261. Kosenko E, Kaminski Y, Lopata O, Muravyov N, Felipo V. Blocking NMDA receptors prevents the oxidative stress induced by acute ammonia intoxication. Free Rad Biol Med 1999;26:1369–74. 138 262. Ghosh C, Dick RM, Ali SF. Iron/ascorbate-induced lipid peroxidation changes membrane fluidity and muscarinic cholinergic receptor binding in rat frontal cortex. Neurochem Inter 1993;23:479–84. 263. Roselló DM, Balestrasse K, Coll C, Coll S, Tallis S, Gurni A, et al. Oxidative stress and hippocampus in a low-grade hepatic encephalopathy model: protective effects of curcumin. Hepatol Res 2008;38:1148–53. 264. Pacheco GS, Panatto JP, Fagundes DA, Scaini G, Bassani C, Jeremias IC, et al. Brain creatine kinase activity is inhibited after hepatic failure induced by carbon tetrachloride or acetaminophen. Metab Brain Dis 2009;24:383–94. 265. Kaldis P, Hemmer W, Zanolla E, Holtzman D, Wallimann T. “Hot spots” of creatine kinase localization in brain: cerebellum, hippocampus and choroid plexus. Develop Neurosci 1996;18:542–54. 266. Ena S, De Kerchove d’Exaerde A, Schiffmann SN. Unraveling the differential functions and regulation of striatal neuron sub-populations in motor control, reward, and motivational processes. Front Behav Neurosci 2011;5:47. 267. Dumurgier J, Crivello F, Mazoyer B, Ahmed I, Tavernier B, Grabli D, et al. MRI atrophy of the caudate nucleus and slower walking speed in the elderly. NeuroImage 2012;60:871–8. 268. Unschuld PG, Joel SE, Liu X, Shanahan M, Margolis RL, Biglan KM, et al. Impaired cortico-striatal functional connectivity in prodromal Huntington’s Disease. Neurosci Lett 2012;514:204–9. 269. Horowski S, Zettl UK, Benecke R, Walter U. Sonographic basal ganglia alterations are related to non-motor symptoms in multiple sclerosis. J Neurol 2011;258:195– 202. 270. Del Casale A, Kotzalidis GD, Rapinesi C, Serata D, Ambrosi E, Simonetti A, et al. Functional neuroimaging in obsessive-compulsive disorder. Neuropsychobiol 2011;64:61–85. 271. Chen P-J, Fan L-Y, Hwang T-J, Hwu H-G, Liu C-M, Chou T-L. The deficits on a cortical-subcortical loop of meaning processing in schizophrenia. Neuroreport 2013;24:147–51. 139 272. Li T, Li X, Zhou W, Cui X, Ma L. Dynamic susceptibility contrast-enhanced first- pass perfusion MR imaging in patients with subclinical hepatic encephalopathy. Journal of neuroradiology. J neuroradiol 2012;39:290–4. 273. Joardar S, Das S, Chatterjee R, Guha G, Hasmi MA. Unilateral basal-ganglia involvement likely due to valproate-induced hyperammonemic encephalopathy. Neurol Sci 2012;33:919–22. 274. Mousseau DD, Layrargues GP, Butterworth RF. Region-selective decreases in densities of [3H]tryptamine binding sites in autopsied brain tissue from cirrhotic patients with hepatic encephalopathy. J Neurochem 1994;62:621–5. 275. Shah NJ, Neeb H, Kircheis G, Engels P, Häussinger D, Zilles K. Quantitative cerebral water content mapping in hepatic encephalopathy. NeuroImage 2008;41:706–17. 276. Krieger D, Krieger S, Jansen O, Gass P, Theilmann L, Lichtnecker H. Manganese and chronic hepatic encephalopathy. Lancet 1995;346:270–4. 277. Layrargues GP, Rose C, Spahr L, Zayed J, Normandin L, Butterworth RF. Role of manganese in the pathogenesis of portal-systemic encephalopathy. Metab Brain Dis 1998;13:311–7. 278. Rao VL, Therrien G, Butterworth RF. Choline acetyltransferase and acetylcholinesterase activities are unchanged in brain in human and experimental portal-systemic encephalopathy. Metab Brain Dis 1994;9:401–7. 279. Méndez M, Méndez-López M, López L, Aller MA, Arias J, Arias JL. Acetylcholinesterase activity in an experimental rat model of Type C hepatic encephalopathy. Acta histochem 2011;113:358–62. 280. Swapna I, SathyaSaikumar K V, Murthy CRK, Gupta AD, Senthilkumaran B. Alterations in kinetic and thermotropic properties of cerebral membrane-bound acetylcholineesterase during thioacetamide-induced hepatic encephalopathy: correlation with membrane lipid changes. Brain Res 2007;1153:188–95. 281. Milatovic D, Gupta RC, Aschner M. Anticholinesterase toxicity and oxidative stress. TheSciWorldJ 2006;6:295–310. 140 282. Phongsamran P V, Kim JW, Cupo Abbott J, Rosenblatt A. Pharmacotherapy for hepatic encephalopathy. Drugs 2010;70:1131–48. 283. Bismuth M, Funakoshi N, Cadranel J-F, Blanc P. Hepatic encephalopathy: from pathophysiology to therapeutic management. Eur J Gastroenterol Hepatol 2011;23:8–22. 284. Romero-Gómez M. Pharmacotherapy of hepatic encephalopathy in cirrhosis. Exp Opin Pharmacother 2010;11:1317–27. 285. Rose CF. Ammonia-lowering strategies for the treatment of hepatic encephalopathy. Clin Pharmacol Ther 2012;92:321–31. 286. Butterworth RF. Neuroinflammation in acute liver failure: mechanisms and novel therapeutic targets. Neurochem Inter 2011;59:830–6. 287. Ahboucha S, Araqi F, Layrargues GP, Butterworth RF. Differential effects of ammonia on the benzodiazepine modulatory site on the GABA-A receptor complex of human brain. Neurochem Inter 2005;47:58–63. 288. Ahboucha S, Coyne L, Hirakawa R, Butterworth RF, Halliwell RF. An interaction between benzodiazepines and neuroactive steroids at GABA A receptors in cultured hippocampal neurons. Neurochem Inter 2006;48:703–7. 289. Chameau P, Van Hooft JA. Serotonin 5-HT(3) receptors in the central nervous system. Cell Tissue Res 2006;326:573–81. 290. Gartside SE, Griffith NC, Kaura V, Ingram CD. The neurosteroid dehydroepiandrosterone (DHEA) and its metabolites alter 5-HT neuronal activity via modulation of GABAA receptors. J Psychopharmacol 2010;24:1717–24. 291. Yano M, Adachi N, Liu K, Arai T. Flumazenil-induced improvement of the central dopaminergic system in rats with acute hepatic failure. J neurosurg anesthesiol 2005;17:69–74. 292. Laccetti M, Manes G, Uomo G, Lioniello M, Rabitti PG, Balzano A. Flumazenil in the treatment of acute hepatic encephalopathy in cirrhotic patients: a double blind randomized placebo controlled study. Dig Liver Dis 2000;32:335–8. 141 293. Van der Rijt CC, Schalm SW, Meulstee J, Stijnen T. Flumazenil therapy for hepatic encephalopathy. A double-blind cross over study. Gastroentérol Clin Biol 1995;19:572–80. 294. Pomier-Layrargues G, Giguère JF, Lavoie J, Perney P, Gagnon S, D’Amour M, et al. Flumazenil in cirrhotic patients in hepatic coma: a randomized double-blind placebo- controlled crossover trial. Hepatology 1994;19:32–7. 295. Goulenok C, Bernard B, Cadranel JF, Thabut D, Di Martino V, Opolon P, et al. Flumazenil vs. placebo in hepatic encephalopathy in patients with cirrhosis: a meta- analysis. Alim Pharmacol Ther 2002;16:361–72. 296. Bosman DK, Van den Buijs CA, De Haan JG, Maas MA, Chamuleau RA. The effects of benzodiazepine-receptor antagonists and partial inverse agonists on acute hepatic encephalopathy in the rat. Gastroenterology 1991;101:772–81. 297. Meyer HP, Legemate DA, Van den Brom W, Rothuizen J. Improvement of chronic hepatic encephalopathy in dogs by the benzodiazepine-receptor partial inverse agonist sarmazenil, but not by the antagonist flumazenil. Metab Brain Dis 1998;13:241–51. 298. Yurdaydin C, Gu ZQ, Nowak G, Fromm C, Holt AG, Basile AS. Benzodiazepine receptor ligands are elevated in an animal model of hepatic encephalopathy: relationship between brain concentration and severity of encephalopathy. J Pharmacol Exp Ther 1993;265:565–71. 299. Kalb A, Von Haefen C, Sifringer M, Tegethoff A, Paeschke N, Kostova M, et al. Acetylcholinesterase inhibitors reduce neuroinflammation and -degeneration in the cortex and hippocampus of a surgery stress rat model. PloS One 2013;8:e62679. 300. Ali MI, Kondreddi HDP, Veeresh B. Protective effect of 2-hydroxy-4-methoxy benzoic acid on testosterone induced benign prostatic hyperplasia in Wister rats. Eur J Pharmacol 2013;698:397–403. 301. Hoque A, Ambrosone CB, Till C, Goodman PJ, Tangen C, Kristal A, et al. Serum oxidized protein and prostate cancer risk within the Prostate Cancer Prevention Trial. Cancer Prev Res 2010;3:478–83. 142 302. Raso GM, Esposito E, Vitiello S, Iacono A, Santoro A, D’Agostino G, et al. Palmitoylethanolamide stimulation induces allopregnanolone synthesis in C6 Cells and primary astrocytes: involvement of peroxisome-proliferator activated receptor-α. J Neuroendocrinol 2011;23:591–600. 303. Bishnoi M, Chopra K, Kulkarni SK. Progesterone attenuates neuroleptic-induced orofacial dyskinesia via the activity of its metabolite, allopregnanolone, a positive GABA(A) modulating neurosteroid. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psych 2008;32:451–61. 304. Cayatte C, Pons C, Guigonis J-M, Pizzol J, Elies L, Kennel P, et al. Protein profiling of rat ventral prostate following chronic finasteride administration: identification and localization of a novel putative androgen-regulated protein. Mol Cell Proteom 2006;5:2031–43. 305. Hirst JJ, Palliser HK, Yates DM, Yawno T, Walker DW. Neurosteroids in the fetus and neonate: potential protective role in compromised pregnancies. Neurochem Inter 2008;52:602–10. 306. Li X-M, Ma L, Yang Y-B, Shi Z-J, Zhou S-S. Clinical characteristics of fulminant hepatitis in pregnancy. World J Gastroenterol 2005;11:4600–3. 307. Kril JJ, Flowers D, Butterworth RF. Distinctive pattern of Bergmann glial pathology in human hepatic encephalopathy. Mol Chem Neuropathol 1997;31:279–87. 308. Bélanger M, Desjardins P, Chatauret N, Butterworth RF. Loss of expression of glial fibrillary acidic protein in acute hyperammonemia. Neurochem Inter 2002;41:155– 60. 309. Gur S, Kadowitz PJ, Hellstrom WJ. Effects of 5-alpha reductase inhibitors on erectile function, sexual desire and ejaculation. Exp Opin Drug Safety 2013;12:81– 90. 310. Mella JM, Perret MC, Manzotti M, Catalano HN, Guyatt G. Efficacy and safety of finasteride therapy for androgenetic alopecia: a systematic review. Arch Dermatol 2010;146:1141–50. 143 311. Traish AM, Hassani J, Guay AT, Zitzmann M, Hansen ML. Adverse side effects of 5α-reductase inhibitors therapy: persistent diminished libido and erectile dysfunction and depression in a subset of patients. J Sex Med 2011;8:872–84. 312. Berthold D, Lhermitte B, Uffer M, Doerfler A. Finasteride-related Leydig cell tumour: report of a case and literature review. Andrologia 2012;44 Suppl 1:836–7. 313. Tresch S, Cozzio A, Kamarashev J, Harr T, Schmid-Grendelmeier P, French LE, et al. T cell-mediated acute localized exanthematous pustulosis caused by finasteride. J Allergy Clin Immunol 2012;129:589–94. 314. Garcia PV, Barbieri MF, Perobelli JE, Consonni SR, Mesquita S de FP, Kempinas W de G, et al. Morphometric-stereological and functional epididymal alterations and a decrease in fertility in rats treated with finasteride and after a 30-day post-treatment recovery period. Fertil Steril 2012;97:1444–51. Biografija Dr Dušan Mladenović je roĊen 05. 12. 1980. godine u Beogradu. Medicinski fakultet u Beogradu upisao je 1998. godine, a diplomirao je 29. 11. 2004. godine sa proseĉnom ocenom 10 (deset). Tokom i nakon studiranja dobitnik je brojnih nagrada za uspeh ostvaren na studijama, meĊu kojima je i nagrada iz fonda “Borko Nikitović”, koja je namenjena najboljem studentu Univerziteta u Beogradu. Akademske specijalistiĉke studije iz oblasti Eksperimentalne fiziologije i patološke fiziologije upisao je školske 2005/2006. godine na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Završni akademski specijalistiĉki rad pod nazivom „Uticaj genetskog polimorfizma na metabolizam alkohola“ odbranio je 09. 10. 2007. godine. Školske 2006/2007. godine upisao je doktorske studije iz Molekularne medicine na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Odlukom Izbornog veća dr Dušan Mladenović je izabran u zvanje asistenta pripravnika na Medicinskom fakultetu u Beogradu za uţu nauĉnu oblast Patološka fiziologija u oktobru 2005. godine. U julu 2009. godine dr Dušan Mladenović je izabran za asistenta za istu nauĉnu oblast i u tom zvanju je i sada zaposlen na Institutu za patološku fiziologiju. Dr Dušan Mladenović je angaţovan kao istraţivaĉ saradnik na dva projekta finansirana od strane Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije: „Uloga neuroendokrino- inflamatorne osovine u patogenezi nealkoholne masne bolesti jetre“ (#175015), ĉiji je rukovodilac prof. dr Tatjana Radosavljević (6 meseci) i „Razvoj animalnih modela epilepsije i testiranje konvulzivnih i antikonvulzivnih supstanci“ (#175032), ĉiji je rukovodilac prof. dr Olivera Stanojlović (2 meseca). Do sada dr Dušan Mladenović je objavio 88 publikacija od ĉega 24 rada u ĉasopisima, koji su indeksirani u Current Contents-u i u Science Citation Index-u. Citiranost: 38.