UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKULTET Aleksandra V. Kezić Dejstvo mTOR inhibitora everolimusa na aktivnost NF-κB, inflamaciju i ishod ishemijsko/reperfuzionog oštećenja bubrega kod miševa Doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE SCHOOL OF MEDICINE Aleksandra V. Kezić The effect of mTOR inhibitor everolimus on NF-κB activity, inflammation and outcome of kidney ischemia/reperfusion injury in mice Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 PODACI O MENTORU I KOMISIJI Mentor Prof. dr Višnja Ležaić, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu Komentor Prof. dr Friedrich Thaiss, Univezitetska klinika Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Nemačka KOMISIJA 1. Prof. dr Milica Bajčetić, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 2. Doc. dr Miloš Marković, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu 3. Prof. dr Ljubica Đukanović, Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu, profesor u penziji REZIME DEJSTVO mTOR INHIBITORA EVEROLIMUSA NA AKTIVNOST NF-kB, IINFLAMACIJU I ISHOD ISHEMIJSKO/REPERFUZIONOG OŠTEĆENJA BUBREGA KOD MIŠEVA Ishemijsko-reperfuziono (I/R) oštećenje bubrega klinički se manifestuje akutnom bubrežnom insuficijencijom. Javlja se u mnogim patološkim stanjima meĎu kojima je i transplantacija bubrega nakon koje I/R oštećenje produžava period nefunkcionisanja grafta. Dva glavna procesa u patogenezi I/R oštećenja bubrega su apoptoza/nekroza i inflamacija. Jedan od glavnih medijatora inflamacije je NF-kB. Oporavak bubrežne funkcije nakon I/R ostećenja zavisi od brzine regeneracije tubularnih epitelnih ćelija u kojoj aktivacija mTOR puta ima važnu ulogu. Kliničke studije su pokazale odloženu funkcija grafta pacijenata lečenih mTOR inhibitorom rapamicinom nakon transplantacije bubrega, dok je kod pacova tretiranih rapamicinom i podvrgnutih I/R oštećenju bubrega naĎena povećana apoptoza i odložena regeneracija tubularih epitelnih ćelija sa odloženim oporavkom bubrežne funkcije. Cilj ovog istraživanja je bio da se ispita uticaj mTOR inhibitora everolimusa na tok i ishod I/R oštećenja bubrega miševa, kao i efekat imunomodulatornog svojstva everolimusa na razvoj inflamacije u bubrezima nakon I/R oštećenja ispitijući istovremeno aktivnost NF- kB. I/R oštećenje izazivano je postavljanjem atraumatskih klema na vaskularne peteljke oba bubrega miševa soja C57 BL/6N u trajanju od 45 min. Eksperimentalne životinje podvrgnute I/R oštećenju bile su podeljene na grupu netretiranih i grupu životinja tretiranih everolimusom. Po sedam životinja iz svake grupe žrtvovano je nakon 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h i jednog dana, dva dana, tri dana i sedam dana od trenutka započinjanja reperfuzije. Everolimus je aplikovan životinjama jednom dnevno subkutano u dozi od 0,25mg/kg telesne težine. Prvo doza everolimusa davana je 24 h pre izazivanja I/R oštećenja bubrega. U momentu žrtvovanja uzorkovana je krv za odreĎivanje uree i kreatinina i tkivo bubrega za PAS bojenje i bojenje na F4/80 i CD3 markere, spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti enzima antioksidacione zaštite kao i za odreĎivanje proinflamatornih i antiinflamatornih citokina, hem oksigenaze- 1 (HO-1) i komponenti NF-κB familije transkripcionih faktora primenom kvantitativnog PCR-a, Western blota i EMSA metoda. Naše istraživanje je pokazalo da tretman mTOR inhibitorom everolimusom prouzrokuje prolazno pogoršanje patohistoloških promena u tkivu bubrega u ranom periodu I/R oštećenja, nakon čega sledi brža rezolucija tkivnog oštećenja u kasnoj fazi I/R oštećenja u kojoj je primećena značajno manja infiltracija makrofaga u poreĎenju sa netretiranim životinjama. Uočena je bifazna ekspresija iRNK za hemokine (CCL2, CCL3, CCL5, CXCL10) koja pokazuje prvi maksimum ekspresije u ranoj fazi a drugi maksimum ekspresije na početku reparacione faze I/R oštećenja. Everolimus ne menja uočenu kinetiku ekspresije, ali značajno smanjuje njen intenzitet. Netretirane životinje pokazuju i treći porast ekspresije iRNK za CCL3, CCL5 i CXCL10 sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja. Dejstvom everolimusa ekspresija mRNK za TNF-α, IL-1ß i iNOS je povećana, dok je ekspresija HO-1 smanjena u bubrezima u ranoj fazi I/R oštećenja u poreĎenju sa netretiranim životinjama. Everolimus povećava aktivnost NF-κB pokazujući skoro kontinuirano povećanu aktivnost vezivanja NF-κB za DNK za razliku od netretiranih životinja koje pokazuju cikličnu aktivnost NF-κB. Everolimus stimuliše pored klasičnog i alternativni put aktivacije NF-κB koji se manifestuje povećanom ekspresijom RelB u jedru naročito u reparacionoj fazi I/R oštećenja bubrega. U zaključku se može reći da tretman everolimusom povećava oksidativni i nitrozativni stres i stimuliše uroĎeni imunski odgovor u ranoj fazi I/R oštećenja bubrega, dok se u reparacionoj fazi I/R oštećenja uočava imunomodulatorni efekat everolimusa manifestovan smanjenom infiltracijom makrofaga i smanjenom produkcijom hemokina. Navedeni podaci mogu biti od kliničkog značaja u smislu odreĎivanja povoljnog trenutka nakon transplantacije bubrega kada treba započeti imunosupresivnu terapiju m-TOR inhibitorima. Ključne reči: ishemijsko/reperfuziono oštećenje, mTOR inhibitor, everolimus, inflamacija, hemokini, NF-κB Naučna oblast: Nefrologija i imunofarmakologija SUMMARY THE EFFECT OF mTOR INHIBITOR EVEROLIMUS ON NF-kB ACTIVITY, INFLAMMATION AND OUTCOME OF KIDNEY ISCHEMIA/REPERFUSION INJURY IN MICE Kidney ischemia/reperfusion (I/R) injury is clinically manifested by acute renal failure and is found in a numerous pathological conditions including kidney transplantation as one of very important, since I/R injury causes delayed graft function (DGF). Two key features of I/R injury are apoptosis/necrosis and inflammation. One of the most important mediators of inflammation is NF-kB. The recovery of renal function after I/R injury depends on tubular epithelial cell regeneration in which mTOR pathway activation plays an important role. Clinical studies reported increasing number of DGF in the patients who were treated by mTOR inhibitor rapamycin after kidney transplantation, while rapamycin treatment in a rat model of kidney I/R injury increased tubular epithelial cells apoptosis and delayed tubular epithelial cell regeneration and recovery of kidney function. The aim of this study was to investigate the influence of mTOR inhibitor everolimus on course and outcome of kidney I/R injury, and also the effect of immunomodulatory properties of everolimus on kidney inflammation after I/R injury investigating contemporary NF-kB activity. I/R injury was induced in C57 BL/6N mice by occlusion of both renal pedicles with microvascular clamps for 45 minutes. Mice subjected to I/R injury were divided in two experimental groups, a group of non-treated and group of everolimus-treated animals. Seven animals in each group and each time point were sacrificed at the following time points: T = 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h, 1, 2, 3 and 7 days after IRI induction. Everolimus was administered subcutaneously in a dose of 0.25mg/kg b.w. once daily, starting one day before I/R injury induction. At the moment of sacrifice the blood for BUN and creatinine determination was taken. Part of kidney tissue was used for PAS method and immunohistochemistry staining of F4/80 and CD3 markers. In other parts of kidney tissue the activity of enzymes of anti-oxidative defense was determined using spectrophotometry as proinflammatory and anti-inflammatory cytokines, heme oxygenase- 1 (HO-1) and proteins belonging NF-κB transcription family using real time PCR, Western blot and EMSA . Our investigation showed that treatment with mTOR inhibitor everolimus caused transient deterioration of kidney pathohistology changes in early period of I/R injury, followed by faster resolution in late phase of I/R injury, characterized by significantly decreased macrophage infiltration comparing to non-treated animals. Kidney I/R injury in mice is characterized by biphasic chemokine (CCL2, CCL3, CCL5, CXCL10) mRNA expression showing first peak of expression in early, inflammatory phase and second peak at the beginning of reparatory phase of I/R injury. Everolimus does not change observed kinetic of expression, but decreases it's intensity. Non-treated animals show even third peak of CCL3, CCL5 and CXCL10 mRNA expression on day 7 after I/R injury induction. The expression of TNF-α, IL-1ß and iNOS mRNA is increased, while HO-1 expression is decreased in kidneys of everolimus-treated animals in early phase of kidney I/R injury, comparing to non-treated animals. Everolimus increases NF-κB activity showing almost continued nuclear NF-κB/DNA binding activity, differing from cyclic NF-κB/DNA binding activity observed in non-treated animals. Except of the classical, everolimus stimulates also alternative way of NF-κB activation which is manifested by increased nuclear RelB expression especially in reparatory phase of kidney I/R injury. In conclusion, everolimus increases oxidative and nitrosative stress and stimulates innate immune response in early, inflammatory phase of kidney I/R injury, while in reparatory phase of I/R injury everolimus exerts immunomodulatory effect manifested by decreased macrophage infiltration and decreased . These data might be of clinical relevance in making decision when to start the treatment with mTOR inhibitors after kidney transplantation. Key words: ischemia/reperfusion injury, mTOR inhibitor, everolimus, inflamamation, chemokines, NF-κB Scientific field: Nephrology and Immunopharmacology SADRŽAJ: 1. UVOD ..............................................................................................................................1 1.1. Definicija i medicinski značaj ishemijsko/reperfuzionog oštećenja .........................1 1.2. Patofiziološki mehanizmi I/R oštećenja ....................................................................1 1.2.1. Promene u cirkulaciji i ćelijskoj morfologiji i funkciji u I/R oštećenju bub- rega ...................................................................................................................1 1.2.2. Funkcija mitohondrija i uloga oksidativnog stresa u I/R oštećenju ................3 1.2.3. Uloga NF-κB u patogenezi I/R oštećenja .........................................................5 1.2.4. Uloga inflamacije u patogenezi I/R oštećenja bubrega ....................................9 1.3. Uticaj imunosupresivne terapije na I/R oštećenje bubrega .....................................13 1.4. Aktivacija i uloga mTOR receptora u fiziologiji ćelije ...........................................14 1.5. Dejstvo mTOR inhibitora u ćelijama imunskog sistema ........................................17 1.6. Primena everolimusa ...............................................................................................18 2. CILJEVI RADA ..........................................................................................................20 3. MATERIJAL I METODE ........................................................................................21 3.1. Eksperimentalne životinje .......................................................................................21 3.2. Lekovi ......................................................................................................................21 3.3. Izazivanje I/R oštećenja ..........................................................................................22 3.4. Eksperimentalni dizajn ............................................................................................22 3.5. OdreĎivanje uree i kreatinina u serumu ..................................................................23 3.6. OdreĎivanje everolimusa u krvi ..............................................................................23 3.7. Izolacija proteina iz tkiva bubrega ..........................................................................24 3.8. Izolacija RNK iz tkiva bubrega upotrebom trizola .................................................24 3.9. Sinteza komplementarne DNK (cDNK) od ukupne RNK ......................................25 3.10. Kvantitativni PCR .................................................................................................26 3.11. Western blot ..........................................................................................................28 3.12. „Electrophoretic mobility shift assay“ (EMSA) ....................................................31 3.13. Metoda optičke mikroskopije i imunohistohemijsko bojenje ...............................33 3.13.1. „Periodic acid-Schiff“ (PAS) protokol bojenja tkiva ................................33 3.13.2. Imunohistohemijsko bojenje .....................................................................33 3.14. Metode za odreĎivanje aktivnosti enzima aktioksidacione zaštite iz tkiva bub – rega .......................................................................................................................34 3.14.1. OdreĎivanje aktivnosti superoksid dismutaze (SOD) ...............................34 3.13.2. OdreĎivanje aktivnosti katalaze (CAT) .....................................................36 3.14.3. OdreĎivanje aktivnosti glutation peroksidaze (GSH-Px) ..........................37 3.14.4. OdreĎivanje aktivnosti glutation reduktaze (GR) .....................................38 3.15. Statistička obrada podataka ...................................................................................39 4. REZULTATI ...............................................................................................................40 4.1. mTOR inhibicija ......................................................................................................40 4.2. Nivo everolimusa u krvi ..........................................................................................41 4.3 Analiza preživljavanja u I/R oštećenju bubrega .......................................................42 4.4. Bubrežna funkcija posle indukcije I/R oštećenja ....................................................43 4.5. Indeks tubulointersticijumskog oštećenja ...............................................................45 4.6. Ekspresija iRNK za hemokine i proinflamatorne citokine u tkivu bubrega posle indukcije I/R oštećenja ...........................................................................................47 4.6.1. Ekspresija hemokina ....................................................................................48 4.6.2. Ekspresija TNF-α i IL-1β .............................................................................51 4.7. Ekspresija iRNK za antiinflamatorne citokine u I/R oštećenju bubrega .................53 4.8. Dejstvo everolimusa na prisustvo F4/80 pozitivnih ćelija u I/R oštećenja bubrega miševa .....................................................................................................................55 4.9. Ekspresija iRNK za CXCR3 u bubregu posle indukcije I/R oštećenja ...................58 4.10. Infiltracija T-limfocita u tkivu bubrega posle indukcije I/R oštećenja .................59 4.11. Nuklearna translokacija p65 i fosfo-Ser536-p65 u I/R oštećenju bubrega ...........61 4.12. OdreĎivanje ekspresije IκBα i fosfo-(Ser32/Ser36)-IκBα u bubrezima posle induk- cije I/R oštećenja ....................................................................................................64 4.13. Aktivnost vezivanja NF-κB za DNK u I/R oštećenju bubrega .............................67 4.14. Nuklearna ekspresija RelB u I/R oštećenju bubrega .............................................69 4.15. Nuklearna ekspresija p52 u I/R oštećenju bubrega ...............................................70 4.16. Uticaj everolimusa na aktivnost enzima antioksidacione zaštite u I/R oštećenju bubrega .................................................................................................................71 4.16.1. Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) ........................71 4.16.2. Aktivnost glutation reduktaze (GR) i glutation peroksidaze (GSH-Px) ...73 4.17. Produkcija iRNK za iNOS u I/R oštećenju bubrega .............................................75 4.18. Ekspresija hem oksigenaze-1 (HO-1) u I/R oštećenju bubrega ............................77 5. DISKUSIJA .................................................................................................................79 6. ZAKLJUČAK ..............................................................................................................96 7. LITERATURA ............................................................................................................98 1 1. UVOD 1.1. Definicija i medicinski značaj ishemijsko/reperfuzionog oštećenja Ishemijsko/reperfuziono (I/R) oštećenje predstavlja najĉešći uzrok akutnog oštećenja bubrega i poslediĉno akutne bubreţne insuficijencije (1). U osnovi reperfuzionog fenomena leţi niz dogaĊaja koji paradoksalno nastavljaju da oštećuju tkivo uprkos uspostavljenoj cirkulaciji i dopremanju kiseonika u tkivo koje je prethodno bilo pod uticajem ishemije. Posebno je znaĉajno I/R oštećenje koje nastaje u toku transplantacije bubrega i dovodi do odloţene funkcije grafta što je povezano sa većom frekvencom akutnog odbacivanja i nastankom hroniĉne alograft nefropatije (2, 3). I/R oštećenje moţe rezultovati razvojem sistemskog inflamatornog odgovora i disfunkcije brojnih organa sa poslediĉnom visokom stopom mortaliteta (4, 5, 6, 7). Sprovedena brojna istraţivanja za sada ne daju usaglašen stav u vezi leĉenja i/ili spreĉavanja akutnog ishemijsko/reperfuzionog oštećenja bubrega. 1.2. Patofiziološki mehanizmi I/R oštećenja 1.2.1. Promene u cirkulaciji i ćelijskoj morfologiji i funkciji u I/R oštećenju bubrega Nakon uspostavljanja reperfuzije, postishemijski bubreg pokazuje znaĉajne promene u hemodinamici koje se ogledaju u uspostavljenoj kortikalnoj cirkulaciji i kongestiji peritubularnih kapilara u spoljašnjoj meduli koja se karakteriše leukocitnom akumulacijom i oštećenjem endotela što dovodi do nastavka hipoperfuzije tog regiona, ĉime se ishemijsko oštećenje bubrega moţe nazvati kao vazomotorna nefropatija (7, 8). Postishemijska kongestija ovog regiona pogoršava već postojeću relativnu hipoksiju koja se i u normalnim uslovima nalazi u zoni spoljašnje medule, što dovodi do apoptoze i nekroze epitelnih ćelija tubula koji se nalaze u ovoj regiji. U osnovi cirkulatorne disfunkcije je oštećenje endotela sa lokalnom neravnoteţom koja se karakteriše povećanom produkcijom vazokonstriktornih supstanci kao što je endotelin i smanjenom 2 produkcijom vazodilatatornih supstanci u endotelu kao što je azot-monoksid NO (1, 9, 10). Faza ishemije dovodi do hipoksemiĉnog oštećenja endotela koje se morfološki manifestuje oštećenjem aktinskog skeleta ćelija, bubrenjem ćelija, slabljenjem meĊućelijskih veza i odlubljivanjem ćelija, koje se kao slobodne mogu naći i u cirkulaciji (1, 8). Ogoljena mesta u krvnom sudu su sklona izrazitoj vazokonstrikciji koja u fazi reperfuzije moţe dovesti ĉak i do reverzije toka krvi u peritubularnim kapilarima (11). Na endotelu se uoĉava povećana ekspresija adhezivnih molekula kao što je intercelularni adhezivni molekul-1 („intercellular adhesion molecule 1“ ‒ ICAM- 1) već 1 sat nakon I/R oštećenja koji ubrzava adheziju leukocita za endotel i njihovu migraciju u perivaskularno tkivo sa zapoĉinjanjem inflamacije (12). U prilog takvoj ulozi ICAM-1 govore i rezultati da su miševi koji nemaju ICAM-1 zaštićeni od I/R oštećenja (13). Endotelne ćelije povećavaju i ekspresiju hemokina fraktalkina (CX3CL1) koji predstavlja ligand za CX3CR1, receptor znaĉajno eksprimiran na makrofagama i bitan za migraciju makrofaga iz krvnih sudova u okolni intersticijum (14). U procesima agregacije leukocita u peritubularnim kapilarima uĉestvuju i trombociti preko P-selektina što dovodi do stvaranja agregata neutrofila i trombocita u peritubularnim kapilarima sa dodatnim kompromitovanjem cirkulacije (12, 15). Produbljenje lokalne hipoksije u toku reperfuzije dovodi do promena metabolizma u tubularnim epitelnim ćelijama sa padom adenozin trifosfata (ATP) rezultirajući u gubitku polarnosti bazolateralne Na+/K+-ATPaze i prekidu aktina u apikalnim delovima ćelije sa redistribucijom aktina iz apikalnih delova u citoplazmu i β1 integrina iz bazalnih u apikalne delove ćelije (16, 17) (Slika 1). Posledice navedenih procesa su povećane propustljivosti membrana sa otokom ćelija, smanjena reapsorpcija Na sa povećanjem frakcione ekskrecije Na uz odlubljivanje tubularnih epitelnih ćelija i stvaranje cilindara, dok se na mestima odlubljenih tubularnih epitelnih ćelija uoĉava povratni tok tubularne teĉnosti iz tubula u intersticijum („back leak“ fenomen) (1, 10). U poĉetnoj fazi optiĉkom mikroskopijom uoĉava se gubitak ĉetkastog pokrova tubularnih epitelnih ćelija. Kako promene napreduju uoĉavaju se pojedinaĉna polja dilatacije proksimalnih tubula sa poljima gubitka tubularnih epitelnih ćelija i pojavom cilindara u distalnim tubulima uz vrlo mala 3 Slika 1. Prikaz promena na tubularnim epitelnim ćelijama u I/R oštećenju (modifikovano iz reference br. 1) polja nekroze koja se skoro iskljuĉivo nalaze u spoljašnjem regionu medule bubrega. U proksimalnim tubulima se uoĉava kako, odlubljivanje vijabilnih ćelija tako i procesi apoptoze i sekundarno nekroze, dok se u distalnim tubulima uoĉava skoro iskljuĉivo apoptoza (10). Sve navedene morfološke promene su praćene izraţenom inflamatornom reakcijom koja pored apoptoze i nekroze predstavlja bitnu karakteristiku I/R oštećenja. 1.2.2. Funkcija mitohondrija i uloga oksidativnog stresa u I/R oštećenju Jedna od glavnih promena u I/R oštećenju dešava se na nivou mitohondrija koja menja energetski naboj ćelije, povećava produkciju slobodnih kiseoniĉnih radikala (SKR) i utiĉe na sistem zaštite protiv štetnog dejstva oksidativnog stresa. Ćelijska hipoksija inhibira ekspresiju multikomponentne citohrom oksidaze (kompleks IV) koja predstavlja finalno mesto oksidativne fosforilacije u mitohondrijama (18). Gubitak 4 aktivnosti citohrom oksidaze dovodi do oštećenja ćelija za vreme reoksigenacije zato što odsustvo finalnog akceptora elektrona povećava produkciju superoksidnog anjona na kompleksima koji prtehode u respiratornom lancu (18, 19). U toku hipoksije respiratorni lanac u mitohondrijama preuzima elektrone i prelazi u redukovano stanje što potencira nastanak superoksidnog anjona (O2 - ). U toku reoksigenacije mitohondrijalni respiratorni lanac nastavlja da stvara O2 - koji dejstvom superoksid-dismutaze (SOD) prelazi u vodonik peroksid (H2O2), koji kasnije reagujući sa Fe formira hidroksilne radikale (·OH). Neutralizaciju štetnog dejstva H2O2 vrši katalaza (CAT) i glutation-peroksidaza (GSH-Px) uz utrošak glutationa (GSH) koji prelazi u oksidovanu formu (GSSG). Glutation-reduktaza (GR) regeneriše GSH iz GSSG uz utrošak nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADPH). Navedeni enzimi predstavljaju parametre antioksidantne zaštite. Antioksidantni sistem zaštite na ĉelu sa SOD znaĉajno smanjuje svoju aktivnost kao i ekspresiju putem smanjene stabilnosti iRNK u toku hipoksije, nastavljajući svoju smanjenu aktivnost i u toku reoksigenacije (20, 21). Osim mitohondrijalnog respiratornog lanca postoje i drugi odeljci u ćeliji gde mogu nastati SKR kao što je citoplazma u kojoj SKR nastaju aktivnošću ksantin- dehidrogenaze koja je uĉestvuje u oksidativnom metabolizmu purina (22). SKR osim direktnog oštećenja proteina, DNK i lipidnih struktura u ćeliji, reaguju sa slobodnim azotnim radikalom (·NO) dovodeći do nastanka peroksinitritnog anjona (ONOO-) koji moţe oštetiti brojne proteine u ćeliji nitrozilacijom tirozinskih rezidua (23, 24). U mnogim ćelijskim tipovima dokazana je indukcija inducibilne NO-sintaze (iNOS) koja dovodi do nastanka ·NO. Nitrozilacijom se mogu inhibirati enzimi respiratornog lanca a isto tako i enzimi antioksidativne odbrane kao što je SOD (25). MeĊutim, postoje dokazi koji ukazuju na protektivno dejstvo ·NO u toku I/R oštećenja i ono se zasniva na povećanju ćelijskog cikliĉnog guanozin monofosfata (cGMP) i parcijalnoj inhibiciji ćelijske respiracije sa poslediĉnim smanjenim preuzimanjem O2 i smanjenjem produkcije O2 - (26). Osim smanjene ekspresije kompleksa IV, u toku reoksigenacije hipoksijskih mitohondrija uoĉava se i disfunkcija kompleksa I, što dovodi do smanjene produkcije energije u tubularnim epitelnim ćelijama (22, 27). Anaerobni metabolizam sukcinata i metabolita ciklusa trikarbonskih kiselina generiše dovoljno adenozin trifosfata (ATP) i 5 štiti proksimalne tubularne epitelne ćelije od otećenja nastalog reoksigenacijom (28). Ukoliko doĊe do većeg influksa Ca u mitohondrije sa aktivacijom pora koje povećavaju propustljivost mitohondrijalne membrane („mitochondrial permeability transition pores“ ‒ MPTP), sa poslediĉnom mitohondrijalnom depolarizacijom i gubitkom citohroma C iz mitohondrija dolazi do aktivacije kaspaza i programa ćelijske smrti sa razvojem apoptoze (22, 29, 30). SKR ne samo što direktno uĉestvuju u oštećenju proteina i lipidnih struktura u ćeliji peroksidacijom (31), već i direktno uĉestvuju u aktivaciji odreĊenih signalnih transdukcionih puteva kao što su nuklearni faktor-kapa B („nuclear factor-kappa B“ ‒ NF-κB), faktor indukovan hipoksijom („hypoxia-inducible factor“ ‒ HIF-1), aktivirajući protein 1 („activator protein 1“ ‒ AP-1), i nekih protein kinaza aktiviranih mitogenom („mitogen activated protein kinase“ ‒ MAPK) (32, 33), a mogu i direktno aktivirati programe ćelijske smrti (30, 34). Pojaĉana ekspresija antiapoptotskog proteina zvanog „B cell lymphoma-2“ (Bcl-2) spreĉava oslobaĊanje citohroma C iz mitohondrija i poslediĉnu aktivaciju kaspaze 3 i kaspaze 9, kao i produkciju O2 -, što sve zajedno spreĉava proces apoptoze (22, 35). 1.2.3. Uloga NF-κB u patogenezi I/R oštećenja NF-κB se javlja kao jedan od kljuĉnih faktora u regulaciji dogaĊaja koji leţe u osnovi I/R oštećenja. On predstavlja glavni transkripcioni faktor koji je ukljuĉen u regulaciju imunskog odgovora, posreduje inflamaciju, reguliše citoprotektivne tj. antiapoptozne puteve ali, paradoksalno, i proapoptozne puteve (36, 37, 38, 39). Uporedo sa produkcijom SKR u vaskularnom endotelu registruje se povećana aktivnost NF-κB i povećana ekspresija ICAM-1 (40). Apoptoza u endotelijalnom reperfuzionom modelu zahteva aktivaciju NF-κB koji smanjuje ekspresiju Bcl-2, dok je u drugim studijama naglašena antiapoptotska uloga NF-κB (41, 42). Davanje sintetskih oligonukleotida koji oponašaju komplementarne sekvence nukleinskih kiselina za koje se vezuje NF-κB (NF-kB „decoy oligonucleotides“), kompetitivnim putem spreĉava vezivanje NF-κB za ciljne promoterske regione gena i dovodi do znaĉajno smanjenog oštećenja u I/R modelu oštećenja bubrega što se manifestuje pre svega u smanjenju inflamacije u bubrezima (43). Sem proinflamatorne uloge dokazana je i uloga NF-κB u rezoluciji 6 inflamacije, što ukazuje na postojanje bifaznog odgovora NF-κB kod inflamatornih oboljenja (44). Pod uticajem hipoksije preusmerava se transkripciona aktivnost ćelije u cilju veće produkcije citoprotektivnih i proinflamatornih komponenti (36). Taj proces je u najvećoj meri kontrolisan dejstvom NF-κB. Nakon reperfuzije i dalje se odrţava prethodno indukovana promena transkripcione aktivnosti ćelija ishemijskog tkiva kao odgovor na novonastale uslove. Ovaj odgovor pre svega podrazumeva produkciju HIF- 1, heterodimera koji se sastoji od konstitutivno eksprimiranog HIF-1ß i inducibilnog HIF-1α (45). Nakon indukcije HIF kao odgovora na hipoksiju, u ćelijama se beleţi i porast ekspresije NF-κB i IκBα, inhibitora NF-κB (46). NF-κB svojim dejstvom reguliše nivo iRNK za HIF-1α, mada je stabilnost tj. duţina dejstva HIF-1α najviše uslovljena parcijalnim pritiskom kiseonika. Ovim svojim dejstvom NF-κB utiĉe na odgovor ćelije na hipoksiju a sa druge strane HIF-1 „priprema“ ćeliju koja se već nalazi u uslovima hipoksije za poslediĉne puteve inflamacije i opstanka koji su posredovani dejstvom NF- κB. NF-κB se pojavljuje kao homodimer ili heterodimer. Homodimernu ili heterodimernu formu ĉine dva proteina koji pripadaju Rel familiji proteina. Rel familija se sastoji od sledećih proteina: RelA (p65), RelB, cRel, p105/p50 (NF-kB1) i p100/p52 (NF-kB2) (47). Svih pet proteina imaju Rel homologni domen koji sadrţi sekvencu koja vezuje DNK i nuklearni lokalizacioni signal (48). Nakon aktivacije NF-kB dolazi do ekspozicije nuklearnog lokalizacionog signala koji ubrzava translokaciju NF-kB kompleksa u jedro gde se moţe vezati za κB „konsenzus“ sekvencu 5'GGGRNNYYCC3' (47). Kompletno vezivanje za κB sekvencu na DNK se ostvaruje samo ako je uĉestvovao ceo NF-κB kompleks što znaĉi da oba proteina Rel familije uĉestvuju u vezivanju za DNK. U citoplazmi ćelija inaktivna forma NF-κB kompleksa postoji kao trimerna forma koja se sastoji od već spomenute homodimerne ili heterodimerne forme za koju je vezan jedan od inhibitornih proteina klase „kappa“-B proteina: IκBα, IκBβ, IκBγ, IκBε ili B-ćelijski limfom-3 protein („B cell lymphoma-3“ ‒ Bcl-3) (49, 50). U sluĉaju NF-κB kompleksa koji sadrţe p100 ili p105, inhibicija se ostvaruje putem aktivnosti karboksiterminalnog kraja koji ima znaĉajan stepen homologije sa IκB proteinima (49). Homodimerna ili heterodimerna forma se 7 dezinhibira i premešta u jedro nakon aktivacije jednog od tri sledeća puta: kanoniĉki ili klasiĉni put, alternativni put i hibridni put (51, 52, 53, 54) (Slika 2). Slika 2. Putevi aktivacije NF-κB (modifikovano iz reference br. 54) Kanoniĉki tj. klasiĉni put aktivacije NF-κB je najĉešći. U ovom putu stimulusi kao što su interleukin-1 (IL-1) i faktor nekroze tumora-alfa („tumor necrosis factor- alpha“ ‒ TNF-α) nakon vezivanja za specifiĉne ćelijske receptore preko niza kaskadnih reakcija aktiviraju IκB kinazni kompleks (IKK) koji se sastoji od IKKα, IKKβ i regulatorne subjedinice NEMO/IKKγ. Aktivacija se sastoji u fosforilaciji IKKβ nakon ĉega fosforilisana forma IKKβ fosforiliše serin na poziciji 32 (ser32) i serin na poziciji 36 (ser36) na N-terminalnom kraju IκBα (49, 51). Nakon fosforilacije sledi 8 poliubikvitinilacija (lizin 21 i 22 u IκBα) i na kraju degradacija IκBα putem aktivnosti 20S/26S proteazoma kojom se NF-κB dimerna forma oslobaĊa i transportuje u jezgro gde se vezuje za genom i reguliše transkripciju odreĊenih gena (49, 51). Dezinhibicija NF-κB kompleksa koji sadrţe p100 ili p105 se ostvaruje nakon proteolitiĉke degradacije karboksiterminalnog kraja kojom nastaju p52 i p50 (55). Dominantna izoforma NF-κB u humanim tkivima se sastoji od p65 i p50. Ekspresija RelB je uglavnom ograniĉena na limfoidno i hematopoezno tkivo. Asocijacija odreĊenih IκB proteina sa Rel dimerima je visoko specifiĉna implicirajući ulogu tipa ćelije i stimulusa u aktivaciji odreĊenih puteva koji delujući na odreĊene IκB forme proteina rezultiraju aktivacijom taĉno odreĊenih NF-κB homo ili heterodimernih formi sa odreĊenom duţinom delovanja. Nakon dejstva TNF-α nastaje degradacija IκBα sa poslediĉnom kratkotrajnom aktivnošću NF-κB, dok se dejstvo lipopolisaharida (LPS) ili IL-1 karakteriše degradacijom i IκBα i IκBβ i duţim dejstvom NF-κB koje traje nekoliko sati do nekoliko dana (56). Dodatna modifikacija aktivnosti NF-κB u cilju povećanja njegove transkripcione aktivnosti se ostvaruje fosforilacijom transaktivacionih domena p65 i acetilacijom njegovih perifernih rezidua, promenama hromatinske strukture, istovremenim vezivanjem za DNK nekih od IκB proteina kao što je Bcl3 ili vezivanjem dodatnih transkripcionih faktora na κB „konsenzus“ sekvencu (54, 57, 58). Dodatno stimulisanje specifiĉnog vezivanja NF-κB homo ili heterodimera za ciljne gene obezbeĊuje ribozomalni protein S3 koji se moţe naći vezan za NF-κB dimere u citoplazmi i drugaĉije je nazvan „specifier“ (54). U klasiĉnom putu IKK-β je kljuĉni molekul sa efektorskim dejstvom pri ĉemu je uloga IKK-α dodatna i sastoji se u modifikaciji histonske strukture i intranuklearne NF-κB aktivnosti (54, 59). Odgovor akutne faze se završava kada se pod uticajem NF-κB sintetiše dovoljna koliĉina IκBα koja će vezivanjem sa aktivnom homodimernom ili heterodimernom formom ponovo uspostaviti trimernu formu kao inaktivni oblik NF-κB. Osim IκBα, najvaţniji ciljni geni ĉiju transkripciju reguliše NF-κB su geni za proinflamatorne produkte kao što su IL-1α i β, TNF-α, interleukin 8 (IL-8), hemokinski ligandi 2 i 5 sa CC motivom (CCL2 i CCL5), vaskularni ćelijski adhezivni molekul („vascular cell adhesion molecule“ ‒ VCAM-1), ICAM-1, ciklooksigenaza-2 (COX-2), iNOS, p53, antiapoptozni proteini (cIAP-1, cIAP-2, XIAP, A1, c-FLIP) i brojni drugi (54, 60). 9 U alternativnom putu aktivnošću IKK-α i kinaze koja indukuje NF-κB („NF-κB inducing kinase“ ‒ NIK) vrši se posttranslaciona razgradnja p100 iz koje nastaje p52 sa generacijom RelB/p52 heterodimera (54, 61). Fosforilisanu formu p100 prepoznaje E3 ligaza i zatim je ubikvitiniliše, a zatim fosfo-ubikvitinilisana forma p100 reaguje se S9 podjedinicom 19S proteazoma gde se razgradi do nastanka p52 (61). Genetska istraţivanja su pokazala da u citoplazmi egzistiraju kompleksi koji sadrţe samo IKK-α. Glavni inhibitor RelB je p100 i stvaranje p52/RelB rezultira proteolitiĉkom razgradnjom pula p100/RelB (62). Ovi kompleksi se ne zadrţavaju u citoplazmi već ubrzo ulaze u jedro i vezuju se za ciljne gene da bi pokrenuli transkripciju. Za razliku od njih p52/p65 i p52/cRel nastali nakon proteolitiĉke razgradnje p100/p65 i p100/c-Rel ostaju u citoplazmi vezujući se za jedan od inhibitornih IκB proteina, ĉija je degradacija indukovana aktivacijom IKK kompleksa klasiĉnim putem (63). To znaĉi da aktivacija heterodimera p52/RelB zahteva samo aktivnost alternativnog puta, dok aktivacija p52/p65 ili p52/cRel ukljuĉuje „hibridne puteve“ tj. kombinaciju klasiĉnog i alternativnog puta koja se u stvari ogleda u osobini da aktivatori alternativnog puta istovremeno aktiviraju i klasiĉni put. To dejstvo ostvaruju citokini koji pripadaju TNF superfamiliji kao što su ligand za CD40 (CD40L), B- ćelijski aktivirajući faktor („B-cell activating factor“ ‒ BAFF), slab induktor apoptoze koji je sliĉan TNF („TNF related weak inducer of apoptosis“ ‒ Tweak), ligand za receptor kiji aktivira NF-κB („Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand“ ‒ RANKL), limfotoksin alfa1beta2 (LTα1β2) itd. (64, 65). 1.2.4. Uloga inflamacije u patogenezi I/R oštećenja bubrega U I/R oštećenju duţina i ozbiljnost primarne ishemije odreĊuje krajnji intenzitet imunskog odgovora a samim tim i stepen oštećenja tkiva. Kada je period ishemije kratak, onda se putem dejstva hipoksije i SKR indukuje samo manji stepen NF-κB aktivnosti koji podstiĉe sintezu citoprotektivnih komponenti. Ovaj fenomen predstavlja osnovu pristupa u pokušaju prevencije razvoja I/R oštećenja brojnih organa u kojem se putem nekoliko kratkih faza ishemije od 5 do 10 min „priprema“ tkivo za duţi period ishemije koji naknadno sledi, te se ceo proces naziva ishemijsko prekondicioniranje (66, 10 67). MeĊutim, kada je period ishemije znatno produţen, masivno oslobaĊanje komponenti iz nekrotiĉnih ćelija kao što su protein toplotnog šoka 70 („heat shock protein“ ‒ HSP70) i proinflamatorni citokini (TNFα i IL-1), rezultira u infiltraciji i aktivaciji neutrofila i makrofaga (68, 69). Vaţnu ulogu u ovom procesu igra aktivacija preko receptora sliĉnih toll-u („toll-like receptors“ ‒ TLR) 2, 4, 5. TLR predstavljaju evoluciono konzerviranu familiju transmembranskih receptora ĉija se aktivacija ostvaruje putem vezivanja liganda nastalih nakon oštećenja sopstvenog tkiva kao što su hijaluronska kiselina, fibronektin, HSP i DNK (70). TLR se ne nalaze samo na ćelijama koje uĉestvuju u uroĊenom imunskom odgovoru kao što su makrofagi, već se nalaze i na tubularnim epitelnim ćelijama (71). Transdukcija signala nakon aktivacije TLR je zavisna od nekoliko adaptornih proteina meĊu kojima je najvaţniji MyD88, a rezultira aktivacijom NF-κB i produkcijom proinflamatornih citokina kao što su IL-1, CCL2, makrofagni inflamatorni protein-2 („macrophage inflammatory protein-2“ ‒ MIP-2), hemokin kojeg produkuju keratinociti (KC) i interleukin 6 (IL-6) (71, 72, 73). TLR-2 i TLR-4 su konstitutivno eksprimirani na tubularnim epitelnim ćelijama u bubrezima i njihova ekspresija se pojaĉava u toku I/R oštećenja (71, 72). Normalno, tubularne epitelne ćelije eksprimiraju inhibitor komplementa nazvan Crry na bazolateralnoj membrani. U toku I/R oštećenja dolazi do redistribucije Crry što omogućava depoziciju C3 komponente komplementa i aktivaciju komplementa alternativnim putem (74). Kao posledica ovih dogaĊaja tubularne epitelne ćelije produkuju navedene proinflamatorne citokine i zapoĉinju inflamatornu reakciju što dovodi do privlaĉenja neutrofila i makrofaga u tkivo bubrega. Makrofagi infiltriraju bubreg odmah nakon neutrofila. Infiltracija je posredovana signalnim putevima preko receptora tip 1 i tp 2 za hemokine sa CC motivom (CCR1 i CCR2) i CX3CR1 (75, 76). Protoĉnom citofluorimetrijom je dokazano da su ovi makrofagi znaĉajan izvor sekretovanih proinflamatornih citokina kao što su IL-1α, IL-6, TNF-α, interleukin-12 (IL-12) i da poseduju izraţenu fagocitnu aktivnost (76, 77). Deplecija bubreţnih i slezinskih makrofaga putem lipozomalnog klodronata pre izazivanja I/R oštećenja spreĉava akutno oštećenje bubrega (78). Znaĉajnu stimulaciju makrofagi dobijaju od interferona-gama (IFN-γ) kojeg sekretuju neutrofili i takozvane invarijantne T-ćelije prirodne ubice („invariant natural killer T 11 cells“- iNKT), koje se smatraju pored dendritskih ćelija najznaĉajnijom vezom izmeĊu uroĊene i steĉene imunosti (79) (Slika 3). Sl. 3. Šematski prikaz patogeneze inflamacije u I/R oštećenju (modifikovano iz reference br 77) iNKT-ćelije su jedinstvena populacija T-limfocita sa ćelijskim receptorima koji su karakteristiĉni kako za T ćelije tako i za ćelije prirodne ubice („natural killer cells“ – NK) (79). Na njima se moţe naći T ćelijski receptor („T cell receptor“ ‒ TCR) zajedno sa NK ćelijskim markerom NK1.1. TCR ne prepoznaje peptide u sklopu MHC I ili II klase, već prepoznaje glikolipide koji su prezentovani u sklopu CD1d, molekula sliĉnih molekulima MHC I klase. Jedan do dva sata nakon prepoznavanja iNKT-ćelije produkuju znaĉajnu koliĉinu citokina Th1 tipa (IFN-γ, TNF-α) kao i Th2 tipa (IL-4, IL- 13). Infiltracija ovih ćelija u bubrezima poĉinje već nakon 30 min od I/R oštećenja, a maksimum infiltracije i produkcije IFN-γ se ostvaruje već 3 h nakon I/R oštećenja (80). Svojim dejstvom ove ćelije ne samo što regulišu funkciju dendritskih ćelija već mogu i amplifikovati njihovo dejstvo a posredno i funkciju T-ćelija, regulatornih T-ćelija (Treg- 12 ćelije), B-ćelija i NK-ćelija povezujući uroĊenu i steĉenu imunost. U prilog vaţne uloge iNKT-ćelija govore i rezultati da blokada iNKT-ćelija upotrebom anti-CD-1d antitela ili anti-NK1.1 antitela spreĉava nastanak akutnog oštećenja bubrega nakon izazivanja I/R oštećenja (80). Osim iNKT-ćelija i dendritske ćelije se javljaju kao jedna od vaţnih spona izmeĊu uroĊene i steĉene imunosti. U normalnim uslovima u bubrezima se mogu naći CD11c + MHCII + dendritske ćelije (76, 81). Njihov broj se povećava u I/R oštećenju transplantiranog bubrega što je pokazano kako na pacovskom eksperimentalnom modelu (82), tako i u humanoj populaciji, ukazujući na njihivu ulogu u odloţenoj funkciji i akutnom odbacivanju grafta (83). Nakon stimulacije, dendritske ćelije povećavaju ekspresiju MHC molekula II klase i kostimulatornih molekula dok istovremeno smanjuju svoju fagocitnu aktivnost. Prezentacijom antigena T-ćelijama kao profesionalne antigen prezentujuće ćelije one uĉestvuju u aktivaciji T-ćelija posredujući u razvoju steĉene imunosti. Dokazana je migracija dendritskih ćelija iz bubrega u lokalne limfne ĉvorove u toku I/R oštećenja gde indukuju proliferaciju T ćelija u antigen specifiĉnom odgovoru (84). Interreakcijom sa iNKT-ćelijama putem CD40-CD40L i prezentacijom glikolipida preko CD1d molekula aktiviraju iNKT-ćelije, a produkcijom proinflamatornih citokina kao što su TNF-α, IL-6, CCL2, CCL5, IL-12, interleukin-23 (IL-23), amplifikuju već zapoĉeti imunski odgovora (80, 85). Brojne studije pokazuju znaĉaj T-ćelija u I/R oštećenju. Atimiĉni „nu/nu“ miševi kojima nedostaju CD4 + i CD8 + T-ćelije rezistentni su na I/R oštećenje bubrega, ali se oštećenje izaziva ukoliko se prethodno izvrši transfer CD4+ T-ćelija (86). Kinetiĉke analize su pokazale znaĉajnu infiltraciju CD4+ T-limfocita u bubregu već 1 h od izazivanja I/R oštećenja. Znaĉaj kostimulatornog puta CD28-B7-1 za T-ćelijsku adherenciju i aktivaciju, je potvrĊen nalazom ekspresije B7-1 na endotelniim ćelijama ascedentnog dela vasa recta u humanim bubrezima posle ishemije (87). U patogenezi I/R oštećenja veliki znaĉaj imaju Th1 ćelije koji produkuju IFN-γ (88). Citofluorimetrijska analiza infiltrišućih limfocita u ishemijskom bubregu detektuje 24 h nakon I/R oštećenja povećan broj T-limfocita koji sekretuju IFN-γ i TNF-α (89). Kada se „nu/nu“ miševima i miševima kojima nedostaje gen koji kodira enzim koji uĉestvuje u rekombinaciji gena za T-ćelijski receptor i imunoglobuline („recombinasa activating 13 gene“-RAG1) izvrši transfer CD4+-T-ćelija koje su deficitarne u ekspresiji CD28 ili sekreciji IFN-γ, ne dolazi do I/R oštećenja bubrega (86). Za razliku od Th1 ćelija, Th2 ćelije su se pokazale kao protektivne u I/R oštećenju bubrega. Nedavna istraţivanja su pokazala da su miševima koji nemaju IL-4 izazvana znaĉajno intenzivnija I/R oštećenja u odnosu na divlje sojeve, što ukazuje na protektivnu ulogu Th2 ćelija (90). Protektivnu ulogu u I/R oštećenju bubrega su pokazale i Treg-ćelije koje se karakterišu CD25 markerom na ćelijskoj membrani i transkripcionim faktorom koji pripada FOX familiji proteina i ima karakteristiĉni raĉvasti oblik domena kojim se vezuje za DNK („forkhead box P3“-FoxP3). Treg-ćelije produkuju antiiflamatorne citokine ako što su interleukina 10 (IL-10) i faktora transformacije rasta-beta („transforming growth factor- ß“-TGF-β). Jedna studija je pokazala da deplecija CD4+CD25+ regulatornih T-ćelija putem anti-CD25 antitela ima malo uticaja na ranu fazu I/R oštećenja, ali dovodi do većeg stepena nekroze 3 dana nakon I/R oštećenja (91). Navedeni podaci ukazuju na sloţenu ulogu T-ćelija u razliĉitim fazama I/R oštećenja, naroĉito ako se uzme u obzir da se T-ćelije mogu aktivirati i u odsustvu antigena putem dejstva SKR, IFN-γ, interleukin-2 (IL-2), CCL5 (88). Iznete ĉinjenice ukazuju na kompleksnu vezu izmeĊu uroĊene i steĉene imunosti u patogenezi I/R oštećenja ukazujući na znaĉajnu ulogu inflamacije i razvoja antiinflamatornih strategija u prevenciji i leĉenju I/R oštećenja. 1.3. Uticaj imunosupresivne terapije na I/R oštećenje bubrega S obzirom da je inflamacija bitan faktor u patogenezi I/R oštećenja, to se jasno uviĊa i mogući znaĉaj antiinflamatornog efekta imunosupresivne terapije u transplantaciji bubrega. Broj pacijenata kojima je potrebna transplantacija bubrega je godinama sve veći, što je uslovilo razvoj transplantacije bubrega sa kadavera. Po svojoj definiciji proces skidanja bubrega sa kadavera i kasnija transplantacija podrazumeva da su ti bubrezi podvrgnuti razliĉitim periodima hladne i tople ishemije. I/R oštećenje koje nastaje u manjem ili većem stepenu kod svih pacijenata podvrgnutih transplantaciji bubrega sa kadavera nije samo povezano sa odloţenom funkcijom grafta već predstavlja i najvaţniji antigen-nezavisni faktor u kasnijem razvoju hroniĉne alograft nefropatije (92). Ovde je vaţno napomenuti da je I/R oštećenje samo po sebi dodatni faktor u 14 pojaĉanju imunogeniĉnosti tkiva što povećava rizik za akutno odbacivanje koje je takoĊe faktor u razvoju hroniĉne alograft nefropatije (93). Efekat razliĉitih imunosupresiva na tok I/R oštećenja u transplantaciji bubrega varira. Ciklosporin usporava oporavak funkcije grafta u ranom postransplantacionom periodu verovatno svojim vazokonstriktornim efektom (94, 95). Za mikofenolat mofetil je pokazano u animalnom modelu da ublaţava promene nastale u toku I/R oštećenja (96). U cilju izbegavanja neţeljenih štetnih efekata terapije ciklosporinom, proteklih godina su se razvile nove imunosupresivne strategije uvoĊenjem mTOR inhibitora, pre svega rapamicina i u nešto manjoj meri everolimusa. Rapamicin, makrocikliĉni laktonski antibiotik sa antifungalnim dejstvom, suprimira prenos signala od receptora za IL-2 blokirajući mTOR signalni put (97). Kliniĉki podaci naglašavaju njegovu ulogu u spreĉavanju odbacivanja bubrega, oĉuvanju funkcije bubrega tj. grafta kod hroniĉne nefrotoksiĉnosti indukovane ciklosporine i spreĉavanju rasta tumora (98, 99). Nekoliko kliniĉkih studija je pokazalo i neţeljene efekte rapamicina u usporavanju uspostavljanja funkcije grafta kod odloţene funkcije grafta nakon transplantacije bubrega sa kadavera, ali je jednogodišnje preţivljavanje grafta bilo isto kao i kod pacijenata koji su bili leĉeni drugim imunosupresivima (100, 101). U pacovskom modelu I/R oštećenja pokazano je da je tretman rapamicinom odloţio oporavak bubreţne funkcije pre svega usporavajući regeneraciju tubularnih epitelnih ćelija i povećavajući apoptozu, ali je oporavak bubreţne funkcije ipak postignut (102). 1.4. Aktivacija i uloga mTOR receptora u fiziologiji ćelije Put mTOR receptora moţe se aktivirati razliĉitim stimulusima: ovaj put registruje nivo energije u ćeliji konstantnim nadzorom odnosa ATP i adenozin monofosfata (AMP) u ćeliji, preko njega svoje dejstvo ostvaruju insulin, amino kiseline, faktori rasta, pa ĉak i signali koji stiţu putem aktivacije TLR. mTOR je serin, treonin-protein-kinaza i moţe se naći u dva kompleksa: mTOR kompleks 1 (mTORC1) i mTOR kompleks 2 (mTORC2) (103). mTORC1 direktno kontroliše sintezu proteina i sastoji se od mTOR, regulatornog proteina udruţenim sa mTOR-om („regulatory-associated protein of mTOR“ ‒ Raptora) i podjedinice nazvane 15 LST8 (104) (Slika 4). Njega mogu inhibirati rapamicin i everolimus koji vezivanjem za imunofilinski protein koji vezuje takrolimus koji je ranije nazivan FK506 („FK506 binding protein“ ‒ FKBP12), grade kompleks koji se potom vezuje za kinazno mesto na mTOR molekulu zvano FRB domen ĉime inhibiraju funkciju mTOR. mTORC2 se sastoji od mTOR, LST8, proteina pridruţenog mTOR-u koji je nesenzitivan na dejstvo rapamicina („Rapamycin-insensitive companion of mTOR“ ‒ Rictor) i proteina koji interreaguje sa protein-kinazama kije su aktivirane stresom („stress- activated protein kinase (SAPK)-interacting protein 1“ ‒ SIN1) (103). Slika 4. Aktivacija mTOR receptora (modifikovano iz reference br. 116) Fosfotransferazna aktivnost mTORC1 stimulisana je malim G proteinom koji je homologan Ras-u i znaĉajno je zastupljen u mozgu („Ras homolog enriched in brain“ ‒ RHEB), za koji je vezan guanozin trifosfat (GTP) (105). Regulisan je heterodimernim tumor supresorom koji se sastoji od tuberozne skleroze 1 (TSC1) i tuberozne skleroze 2 (TSC2) (105). TSC2 ostvaruje svoj supresorni efekat na m-TOR prevodeći RHEB u inaktivni oblik vezan za guanozin dofosfat (GDP). Glavni cilj delovanja mTORC1 su 16 komponente translacione mašinerije ĉijom se aktivacijom zapoĉinje translacija proteina a to su 40S ribozomalni protein S6 kinaza (S6K1) i protein koji vezuje eukariotski translacioni inicijacioni faktor 1 („Eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1“ ‒ 4E-BPs) (106). Jasno je dakle da mTOR igra jednu od centralnih uloga u ćeijskom rastu. Faktori rasta delujući na tirozin kinazne receptore i receptore kuplovane sa G-proteinom aktiviraju nekoliko signalnih puteva meĊu kojima su najznaĉajniji put aktivacije fosfatidilinozitol 3-kinaze (PI3K) i serin-treonin specifiĉne kinaze zvane Akt, kao i put preko aktivacije kinaza regulisanih ekstracelularnim signalom („Extracellular signal-regulated kinases“ ‒ ERK) koje interreaguju sa proteinom koji pripada familiji proteina, takozvanim „malim GTP-azama“ i zove se Ras. Oba navedena puta stimulišu mTORC1 prethodno inhibirajući TSC1-TSC2 kompleks koji je negativni regulator mTORC1 (106). Akt fosforiliše TSC2 na pozicijama Ser 939 i Ser 981, a moguća je i fosforilacija putem aktivnosti S6K1 (107). PI3K-Akt put je aktiviran insulinom i najnovija istraţivanja pokazuju da je receptorski supstrat za insulin 1 („insulin receptor substrate 1“ ‒ IRS1) fosforilisan dejstvom S6K1 ĉime se ostvaruje negativna povratna veza (108). Mitogenom aktivirani Ras-ERK put takoĊe fosforiliše TSC2 i time dezinhibira mTORC1, ali je moguća i direktna fosforilacija Raptora pri ĉemu se podstiĉe kinazna aktivnost mTORC1 (109). TNF-α u svojim signalnim putevima takoĊe moţe aktivirati mTORC1 aktivirajući IKKβ koja fosforiliše TSC1 na pozicijama Ser487 i Ser511, ili TNF-α direktno aktivira Akt koji onda indukuje IKKα da se asocira sa mTORC1 u Akt i time aktivira mTORC1 (110, 111). Pokazano je takoĊe da ova mTOR- IKKα interreakcija koja je regulisana dejstvom Akt-a stimuliše NF-κB aktivnost, ali je vaţno napomenuti da je dokaz izveden na ćelijskim linijama kancera prostate koje se karakterišu konstitutivnom ekspresijom Akt molekula (111). mTORC1 predstavlja mesto gde se odluĉuje da li će ćelija ući u deobu i pokrenuti neophodnu sintezu proteina, predstavljajući stecište brojnih puteva koji prenose informacije od senzora kako spoljašnje okoline tako i unutrašnjih dogaĊanja u ćeliji. Ukoliko nema dovoljno nutrijenata i energije u ćeliji, neće se zapoĉeti sinteza proteina. Protein kinaza aktivirana adenozin monofosfatom („AMP-activated protein kinase“ ‒ AMPK) je senzor nivoa energije u ćeliji i kada je nivo energije niţi ona fosforiliše Raptor, što rezultuje u inhibiciji aktivnosti mTORC1 (112). Putem dejstva HIF-1α u hipoksiĉnim uslovima preko proteina koji nastaje u odgovoru ćelije na stres kao što su hipoksija i oštećenje 17 DNK („regulated in development and DNA damage responses 1“ ‒ REDD1), omogućena je inhibitorna funkcija TSC2 na mTORC1 (113). 1.5. Dejstvo mTOR inhibitora u ćelijama imunskog sistema mTOR inhibitori inhibiraju fagocitozu, ometaju preuzimanje antigena u dendritskim ćelijama i smanjuju ekspresiju MHC molekula II klase (114, 115). Oni koĉe sazrevanje dendritskih ćelija i njihovu sposobnost da stimulišu nastanak efektorskih T- ćelija (116). U ćelijama mijeloidne fagocitne loze mTOR inhibitori aktiviraju NF-κB i tako povećavaju sintezu IL-12 i IL-23, dok inhibicijom transduktora signala i aktivatora transkripcije („Signal transducer and activator of transcription 3“ ‒ STAT3) smanjuju sintezu IL-10 a inhibicijom faktora 5 i 7 koji regulišu interferon („interferon regulatory factor“ ‒ IRF-5 i 7) smanjuju produkciju interferona tip I (117, 118, 119). U T-ćelijama aktivacija mTOR receptora povećava aktivnost NF-κB. mTOR inhibitori zaustavljaju progresiju u ćelijskom ciklusu T-limfocita nakon aktivacije receptora za IL-2 (120), blokiraju proliferaciju T efektorskih ćelija i proliferaciju ćelija u pravcu razvoja Th1/Th17 profila usled smanjenja produkcije IFN-γ nakon aktivacije receptora za IL-12 na površini T‒ćelija (121, 122). Postoji znatan broj dokaza da mTOR inhibitori stimulišu razvoj Treg-ćelija (123, 124). Treg-ćelije imaju sposobnost da suprimiraju proliferaciju efektorskih T ćelija (124). Kod pacijenata tretiranih rapamicinom u duţem periodu, naĊen je veći procenat Treg-ćelija u odnosu na ukupan broj T-limfocita (125). Njihova regulatorna funkcija se manifestuje povećanom sekrecijom IL-10 i TGF-β i smanjenom aktivnošću kako ćelija Th1 tako i ćelija Th2 profila što u osnovi stvara uslove za toleranciju tj. nereagovanje na antigen (126). Pokazano je da rapamycin indukuje produkciju TGF-ß i time podstiĉe „de novo“ konverziju alloantigen-specifiĉnih CD4+ T-ćelija u Treg-ćelije (112). Ovaj proces u T-ćelijama se odvija povećanjem sekundarng glasnika koji pripada familiji proteina koji modulira dejstvo TGF-ß i homologan je proteinu naĊenom u Drozofili („Mothers against decapentaplegic homolog 3“ ‒ SMAD3). SMAD3 uz nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija („nuclear factor of activated T-cells“ ‒ NFAT) nastalim nakon aktivacije TCR i receptora za IL-2, dovodi do povećane transkripcije FoxP3. 18 Dakle, inhibicija mTOR receptora u T-ćelijama inhibira razvoj specifiĉnog imuniteta blokirajući proliferaciju T-ćelija, suprimirajući razvoj Th1 odgovora i pospešujući nastanak Treg-ćelija koje imaju kljuĉnu ulogu u nastanku imunološke tolerancije. Uzevši u obzir dejstvo mTOR inhibitora na funkciju makrofaga, krajnji rezultat ovakvog dejstva mTOR inhibitora je stimulacija uroĊene i blokada steĉene imunosti. 1.6. Primena everolimusa Nakon uvoĊenja u praksu rapamicina sintetisana su još tri mTOR inhibitora: temsirolimus, deforolimus i everolimus (127). Evedrolimus (C53H83NO14, molekularna masa-958,2) predstavlja semisintetiĉki makrolidni derivat nastao uvoĊenjem 2- hidroksietil grupe na poziciju 40 molekulske strukture sirolimusa. Time je postignuta veća solubilnost everolimusa u organskim rastvaraĉima. Everolimus je hidroksietil-etar derivat rapamicina koji ostvaruje isto dejstvo kao i rapamicin, uz naglašen antiproliferativni efekat (128). Lek je postao dostupan na evropskom trţištu od 2010. godine od kada je njegova upotreba odobrena za spreĉavanje odbacivanja organa nakon transplantacije bubrega, što je prethodno potvrĊeno u velikim kliniĉkim studijama (129, 130). Ukoliko se izuzmu neki neţeljeni efekti everolimusa kao što su usporeno zarastanje rana, hiperlipidemija i porast proteinurije, u pravilno selektovanih pacijenata sa transplantiranim bubregom everolimus se sve više koristi u protokolima imunosupresivne terapije. Rana eliminacija kalcineurinskih inhibitora uvoĊenjem imunosupresivnih protokola baziranih na everolimusu poboljšala je funkciju transplantiranog bubrega 12 meseci nakon transplantacije, ali je bila praćena većim brojem epizoda odbacivanja grafta dokazanih biopsijom grafta u grupi pacijenata leĉenih everolomusom (131, 132). Oralni everolimus je takoĊe vrlo uspešan u spreĉavanju nastanka vaskulopatije grafta i u ograniĉavanju nastanka plaka u intimi koronarnih arterija kod pacijenata sa transplantiranim srcem (129, 133). Pokazano je da everolimus osim svog antiproliferativnog dejstva na tumorske ćelije ima i inhibitorni efekat na angiogenezu tako što inhibira ekspresiju HIF-1α (134). Uzimajući u obzir navedena antitumorska 19 dejsta everolimusa i pokazanu sigurnost i efikasnost everolimusa u leĉenju pacijenata sa uznapredovalim karcinomom bubrega („renal cell carcinoma“) kod kojih je bilo neuspešno leĉenje sunitinibom i sorafenibom, Uprava za hranu i lekove („Food and drug administration“ ‒ FDA) u Sjedinjenim ameriĉkim drţavama (SAD) je 2009. godine odobrila everolimus u leĉenju uznapredovalog tj. metastatskog karcinoma bubrega kod pacijenata kod kojih je bilo neuspešno leĉenje sunitinibom i sorafenibom (135, 136). Dosadašnja ispitivanja su pokazala da postoje odreĊene interreakcije mTOR i NF-κB, ali je nedovoljno jasno meĊusobno dejstvo ovih puteva u patogenezi I/R oštećenja odnosno u kojoj meri mTOR inhibicija inhibira poĉetno citoprotektivno dejstvo NF-kB ili eventualno pojaĉava njegovo proapoptotsko i proinflamatorno dejstvo. Naroĉito je nerazjašnjen uticaj modifikacije inflamacije na oporavak bubreţne funkcije nakon I/R oštećenja. 20 2. CILJEVI RADA Polazeći od pretpostavke da postoji veza izmeĊu aktivacije m-TOR receptora i aktivnosti NF-kB i imajući u vidu ulogu NF-κB u razvoju inflamacije i znaĉaj inflamacije u patogenezi I/R oštećenja, ovo istraţivanje ima za cilj da utvrdi:  Da li imunosupresivno dejstvo mTOR inhibitora everolimusa utiĉe na razvoj inflamacije u bubrezima nakon I/R oštećenja i u kojem stepenu se taj uticaj ostvaruje putem promena u aktivnosti NFkB?  Da li imunomodulatorno dejstvo mTOR inhibitora everolimusa utiĉe na tok i ishod I/R oštećenja bubrega? 21 3. MATERIJAL I METODE Ovo istraţivanje je sprovedeno u laboratoriji Istraţivaĉkog centra Univerzitetske klinike Eppendrof u Hamburgu, odsek nefrologija, pod rukovodstvom Prof. dr Friedrih Thaiss-a i laboratoriji Instituta za farmakologiju, kliniĉku farmakologiju i toksikologiju, Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, pod rukovodstvom Prof. dr Milica Bajĉetić u periodu od septembra 2009. do aprila 2011. godine. 3.1. Eksperimentalne životinje Za ovo istraţivanje korišćeni su miševi soja C57 BL/6N uzgojenih na farmi Charles River, Sulcberg, Nemaĉka. Eksperimentom su obuhvaćeni miševi muškog pola, starosti od 8 do 12 nedelja, teţine od 22 do 28g. Ţivotinje su ĉuvane u sterilnim kavezima u grupama od po 5 u dvanaestoĉasovnom dnevno-noćnom reţimu, sa slobodnim pristupom hrani i vodi i adaptacionim periodom od 5 dana do poĉetka eksperimenta, na proseĉnoj ambijentalnoj temperaturi od 24±2°C. Eksperimenti su sprovoĊeni u skladu sa etiĉkim principima i smernicama za brigu o ţivotinjama odobrenim od Veterinarske agencije i komiteta za brigu o ţivotinjama SR Nemaĉke i Medicinskog fakulteta Univerziteta u Beogradu. 3.2. Lekovi U eksperimentima je korišćen everolimus (RAD, 2% mikroemulzija, Novartis). Neposredno pre korišćenja rastvaran je u 5%-nom rastvoru glukoze i kao takav aplikovan eksperimentalnim ţivotinjama jednom dnevno subkutano (s.c.) u dozi od 0,25 mg/kg telesne teţine. Prva doza je davana 24 h pre izazivanja I/R oštećenja bubrega, druga doza 30 min do sat vremena pre izazivanja I/R oštećenja. Svaka sledeća doza je aplikovana jednom dnevno do dana kada je bilo predviĊeno ţrtvovanje ţivotinja. Ţivotinjama koje su ţrtvovane prvog, drugog, trećeg i sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja na dan ţrtvovanja nije davan lek. Raspored davanja everolimusa je sproveden 22 prema sliĉnom eksperimentalnom dizajnu I/R oštećenja na miševima pod tretamanom rapamicinom publikovanom u radu Lui i saradnika (137). Netretiranim ţivotinjama davan je samo 5% rastvor glukoze . 3.3. Izazivanje I/R oštećenja I/R oštećenje je izazivano postavljanjem atraumatskih klema na vaskularne peteljke oba bubrega miševa u uslovima opšte anestezije. Miševi su uvoĊeni u opštu anesteziju intraperitonealnim (i.p.) ubrizgavanjem 1 ml smeše koja se sastoji od ketamin hidrohlorida (Ketanest® S, Pfizer) u dozi 100 mg/kg i ksilazin hidrohlorid (Rompun®, Bayer) u dozi 8 mg/kg. Miševi su postavljani na grejnu ploĉu. Operativni rez je uĉinjen po središnjoj liniji abdomena. Nakon paţljive preparacije organa abdomena u cilju pristupa organima retroperitoneuma, odvojene su obostrano, uz paţljivu preparaciju, vaskularne peteljke bubrega i na njih su postavljene atraumatske kleme, istovremeno i na arteriju i na venu. Visceralni sadrţaj abdomena je vraćen na svoje mesto i abdomen je prekriven gazom. Od momenta stavljanja vaskualrnih klema, mereno je vreme ishemije koje je iznosilo taĉno 45 min. U tom periodu je ubrizgavan fiziološki rastvora i.p. u cilju spreĉavanja dehidratacije ţivotinja. Nakon perioda ishemije od 45 min skidane su kleme. Sutura abdomena je uĉinjena po uoĉavanju makroskopskog fenomena reperfuzije. Ţivotinje su po buĊenju iz anestezije nadgledane i drţane na toploj podlozi u kavezima još 2 h. 3.4. Eksperimentalni dizajn Eksperimentalne ţivotinje su podeljene u dve osnovne grupe: - grupa netretiranih ţivotinja: ţivotinje (n=63) podvrgnute I/R oštećenju bubrega - grupa ţivotinja tretiranih everolimusom: ţivotinje (n=63) podvrgnute I/R oštećenju bubrega i tretirane everolimusom 23 Ţivotinje obe eksperimentalne grupe bile su razvrstane po principu sluĉajnosti u 9 podgrupa od po 7 ţivotinja koje su ţrtvovane nakon 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 12 h , jednog dana, dva dana, tri dana i sedam dana od trenutka zapoĉinjanja reperfuzije. Od svih ţrtvovanih ţivotinja uzorkovano je po 500 µl krvi iz koje su odreĊivani urea i kreatinin. Potom su hiruškim zahvatom odstranjeni bubrezi. Iz 2/3 tkiva jednog bubrega uraĊena je izolacija nuklearnih i citoplazmtskih proteina, Ostatak bubreţnog tkiva bio je zamrznut u teĉnom azotu a zatim smešten u zamrzivaĉ na -85°C. Iz njega je kasnije odrĊivana aktivnost enzima antioksidantne zaštite. Iz jedne polovine drugog bubrega uraĊena je izolacija RNK, a preostala polovina drugog bubrega posluţila je za histološku analizu I/R oštećenja primenom tehnike „Periodic acid Schiff“ (PAS) bojenja za optiĉku mikroskopiju i imunohistohemijskog bojenja. Kao kontrola sluţile su laţno operisane ţivotinje („Sham“- operisane ţivotinje) koje su bile podrvgavane anesteziji i operativnoj proceduri, ali bez stavljanja klema na vaskularnu peteljku bubrega, kao i potpuno zdrave ţivotinje (intaktna kontrola), koje uopšte nisu bile podvrgavane operativnoj proceduri. „Sham“- operisane ţivotinje su bile podeljene na grupu koja nije primala everolimus i grupu koja je primala everolimus. 3.5. OdreĎivanje uree i kreatinina u serumu Serumski kreatinin i urea odreĊivani su spektrofotometrijski (Heλios ß, Termo Spectronic). Vrednosti uree i kreatinina su izraţavane u mg/dl. 3.6. OdreĎivanje everolimusa u krvi Koncentracija everolimusa u krvi odreĊivana je putem metode teĉne hromatografije jedan dan, tri dana i sedam dana nakon poĉetka aplikacije leka i izraţavana je u ng/ml. 24 3.7. Izolacija proteina iz tkiva bubrega ProizvoĊaĉ svih supstanci upotrebljenih u ovoj metodi je Sigma. Rastvori potrebni za ovu metodu su: 1. Hipotoni pufer A 2. Hipertoni pufer B 3. 10%NP40 - 10 mM HEPES pH 7,9 - 20 mM HEPES pH 7,9 - 10 mM KCl - 400 mM NaCl - 0,1 mM EDTA pH 8 - 1 mM EDTA - 0,1 mM EGTA pH 8 - 1mM EGTA Pre upotrebe u pufere A i B je dodat sveţe pripremljen ditiotreitol (DTT) tako da finalna koncentracija DTT u rastvorima bude 1 mM i miks inhibitora proteaze u razblaţenju 1:100. U rastvore pufera A i pufera B se zatim dodaje natrijum vanadat tako da finalna koncentracija natrijum vanadata bude 100 mM. Rastvori pufera A i pufera B se zatim dobro vorteksiraju nakon ĉega se upetrebljavaju u daljoj proceduri. Tkivo bubrega je nakon dodatka 1 ml hipotoniĉnog pufera A homogenizovano u staklenom tubusu snaţnim, gnjeĉećim pokretima uz pomoć staklenog tuĉka. Homogenizovan sadrţaj je prenesen u Eppendorf epruvetu i inkubiran 15 min na ledu. Zatim je dodato 100 µl 10%-nog NP40 i sadrţaj je vorteksiran 15-20 min, nakon ĉega je odmah centrifugiran na 13000 rpm, na temperature od 4°C (t-4°C), u trajanju od 30 min. Dobijeni supernatant predstavlja citoplazmatsku frakciju proteina. Talog je resuspendovan u 200 µl hipertonog pufera B, vorteksiran i inkubiran 15-20 min na rotirajućoj mešalici u hladnoj sobi (t-4° C). Nakon inkubacije uzorci su centrifugirani 5 min na 13000 rpm i t-4° C. Supernatant koji predstavlja rastvor nuklearnih proteina, prenet je u nove Eppendorf epruvete i ĉuvan za duţi period na -80° C. 3.8. Izolacija RNK iz tkiva bubrega upotrebom trizola U ovoj metodi sve posuĊe, Eppendorf epruvete i nastavci za pipette moraju biti sterilni tj. osloboĊeni od RNK-aze, što se postiţe suvom sterilizacijom na t od 200° C u 25 trajanju od 2 h. Polovina bubrega je u Petrijevoj šolji upotrebom pincete i skalpela osloboĊena kapsule i masnog tkiva i zatim stavljena u epruvetu (Eppendorf) od 1,5 ml. Dodato je 200 µl Trizola (Gibco) i tkivo je homogenizovano upotrebom plastiĉnih štapića koji su prethodno oprani u 80%-nom etanolu (Sigma) i osušeni na vazduhu na sobnoj temperaturi. Nakon homogenizacije dodato je još 800 µl Trizola u svaki uzorak, uzorci su dobro vorteksirani, nakon ĉega su inkubirani 10 min na sobnoj temperaturi. U uzorke je zatim dodato 200 µl hloroforma (Sigma), nakon ĉega su vorteksirani intenzivno tokom 15 s, inkubirani 3 min na sobnoj temperaturi a zatim centrifugirani na 10000 rcf i t-4° C u trajanju od 10 min. Supernatant je prebaĉen u novu epruvetu (Eppendorf), dodato je 500 µl 2-propanola (Sigma) i epruvete su vorteksirane i zatim inkubirane 30 min na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije uzorci su centrifugirani 15 min na 10000 rcf i t-4° C. Posle centrifugiranja sledeći koraci su sprovoĊeni na ledu. Supernatant je odbaĉen. Talog je ispiran tri puta uz dodatak 500 µl 80%-nog etanola u vodi kojoj je dodat dietilpirokarbonat (DEPC, Sigma) i dobro vorteksiran. DEPC ima svojstvo da inhibira RNK-azu. IzmeĊu ispiranja, uzorci su centrifugirani 5 min na 10000 rcf i t-4° C. Nakon poslednjeg centrifugiranja supernatant je odbaĉen, a epruvete sa talogom koji predstavlja RNK su postavljene u rotirajući „speed vac“ koncentrator na t do 4°C u trajanju od 5 min radi dodatnog isušivanja i koncentrovanja materijala. Ukoliko talog nije potpuno bio suv, procedura je ponovljena još jednom u trajanju od 2 min. Talog je zatim rastvaran u 50 µl vode koja je osloboĊena od RNK-aze, i uzorci su za dalje analize ĉuvani na -80° C. 3.9. Sinteza komplementarne DNK (cDNK) od ukupne RNK Za ovu metodu je neophodno da sav materijal koji se upotrebljava (nastavci za pipete i epruvete) bude sterilisan. Pre pristupanja sintezi cDNK izmerena je koncentracija RNK u uzorcima spektrofotometrijskom metodom. U toku merenja uzorci RNK su drţani na ledu. Za dalji rad pripremljeni su sledeći rastvori Mastermix I i Mastermix II. Sve supstance potrebne za pravljenje oba rastvora su dobavljene od proizvoĊaĉa Invitrogen. 26 1. Mastermix I (date su mere po jednom uzorku): - 2 μl prajmera (heksamer) koncentracije 100 ng/μl - 2 μl dNTP (10 mM) - 16 μl vode za PCR Voda za PCR predtstavlja visoko preĉišćenu vodu koja je testirana na sadrţaj eukariotske i prokariotske DNK bez endonukleazne, egzonukleazne i RNK-zne aktivnosti. 2. Mastermix II (date su mere po jednom uzorku): - 8 μl FS pufera (5 X first strand buffer) - 4 μl DTT (100 mM) - 2 μl RNase Out (rekombinantni nekompetitivni inhibitor ribonukleaze) - 2 μl M-MLV reverzne transkriptaze (rekombinantna DNK polimeraza koja sisntetiše komplementarnu DNK od jednolanĉane RNK i DNK). Nakon merenja koncentracije RNK uzeto je iz svakog uzorka po 1 μl i dodato mu je onoliko vode za PCR tako da novodobijeni rastvori uzoraka imaju koncentraciju RNK od 100 ng/μl. Od novodobijenih rastvora uzimano je 4 μl (ukupno 400 ng RNK) u koje je dodavanoo 20 μl rastvora mastermix I. Tako pripremljeni uzorci su stavljani u aparat za umnoţavanje („cycler“) na 65º C da se inkubiraju 5 min, a zatim je u njih dodavano 16 μl rastvora mastermix II. Nakon dodavanja rastvora mastermix II uzorci su ponovo inkubirani u „cycler“-u po sledećem programu: 50 min na 37º C, zatim 15 min na 37º C i na kraju su uzorci ostavljani na t od 4º C. Ukoliko se metoda kvantitativni PCR („real-time“ PCR- rtPCR) nije radila odmah, uzorci su ĉuvani za kraći period na ˗20º C ili na ˗80º C za duţi period. 3.10. Kvantitativni PCR Ova metoda kvantifikacije RNK je zasnovana na upotrebi boje SYBRE Green (Invitrogen) i prajmera za specifiĉnu informacionu RNK (iRNK), koji dovode do njene 27 sinteze iz prethodno dobijene DNK od nativne RNK. Neophodno je voditi raĉuna da sav material, ukljuĉujući nastavke za pipetu, epruvete i ploĉe za PCR mora biti sterilan kao i u sintezi cDNK, uz uslov da se u ovoj metodi koriste specijalni nastavci za pipete koji onemogućavaju aspiraciju DNK iz drugih izvora s obzirom na mogućnost kontaminacije analiziranog materijala. Pre zapoĉinjanja metode pripremljen je rastvor (Realtime Mastermix). Mere su date za jedan uzorak. Svaki uzorak je raĊen u duplikatu. Negativna kontrola nije sadrţavala uzorak DNK. Rastvor (Realtime Mastermix): -6,25 μl SYBRE Green mix -1,25 μl „sense“ prajmera (0,9 μM) -1,25 μl „antisense“ prajmera (0,9 μM) -2,25 μl vode za PCR Od svakog uzorka uzimano je dva puta po 1,5 μl DNK i stavljano u udubljenje na PCR ploĉi (ukupno dva udubljenja po uzorku uz utrošak 3 μl rastvora DNK uzorka). Istovremeno je za svaki uzorak raĊen i rtPCR za 18S rRNK, takoĊe u duplikatu, s tim što je prethodno DNK uzorka razblaţena vodom za PCR u odnosu 1:500 i od tog rastvora je uzimano dva puta po 1,5 μl i stavljano u udubljenja na ploĉi za rtPCR. U svako udubljenje je zatim dodavano po 11 μl rastvora (Realtime Mastermix) za odreĊenu informacionu RNK ĉiju smo kvantifikaciju ţeleli da odredimo. Za pripremanje Realtime Mastermix za svaki od ispitivanih informacionih RNK za citokine, upotrebljavani su sledeći prajmeri: CCL2 („sense“:3'-ggctcagcccagatgcagttaa- 5'; „antisense“: 3'-cctactcattgggatcatcttgct-5'), hemokinski ligand 3 sa CC motivom (CCL3) („sense“: 3'-tgaaaccagcagcctttgct-5'; „antisense“: 3'-gatctgccggtttctcttagtca-5'), CCL5 („sense“: 3'- gcaagtgctccaatcttgca-5'; „antisense“: 3'-cctctctgggttggcacaca-5'), CXCL10 („sense“: 3'- gccgtcattttctgcctcat-5'; „antisense“: 3'-tgcagcggaccgtcctt-5'), TNF-α („sense“: 3'-aaatggcctccctctcatcagt-5'; „antisense“: 3'-gcttgtcactcgaattttgagaag- 5'), IL-1ß („sense“: 3'-ccttccaggatgaggacatga-5'; „antisense“: 3'- tcatcccatgagtcacagaggat-5'), IL-10 („sense“: 3'-gctgcggactgccttcag-5'; „antisense“: 3'- 28 aggagtcggttagcagtatgttgtc-5'), TGF-ß („sense“: 3'- cgaagcggactactatgctaaaagag-5'; „antisense“: 3'-gttttctcatagatggcgttgttg-5'), CXCR3 („sense“:3'-tcacacaatcctgaacccaacgt- 5' ; „antisense“:3'-tgaatgggtattgaaacgacgacc-5'), iNOS („sense“: 3'-gctgttctcagcccaacaat- 5'; „antisense“: 3'-ttctgtgctgtcccagtgag-5') i 18S prajmeri („sense“: 3'- cacggccggtacagtgaaac5'; „antisense“: 3'-agaggagcgagcgaccaaa-5'). Ploĉe su zatim prekrivane sterilnom folijom i centrifugirane 30 s na 1000 G, a zatim stavljane u mašinu (AbiPrism NN8650) uz aktiviranje programa u trajanju od 2 h i 30 min. Relativna kvantifikacija genske ekspresije izraĉunavana je primenom ΔΔCT metode. 3.11. Western blot Pre izvoĊenja elektroforeze odreĊivana je koncentracija proteina spektrofotometrijski po modifikovanoj metodi Lowry-ja. Pripremljen je rastvor goveĊeg serumskog albumina (Sigma) u koncentracijama 10 mg/ml, 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml i 0,625 mg/ml. U posebna udubljenja na ploĉi sipano je po 5 μl standardnih uzoraka i uzoraka ĉiju proteinsku koncentraciju smo odreĊivali, a zatim je u svako udubljenje dodavano po 25 μl rastvora LB-A/S (Bio-Rad) i 200 μl LB-B (Bio-Rad) koji su već fabriĉki pripremljeni. Ploĉa sa uzorcima je inkubirana 15 min u mraku a zatim je merena apsorpcija na 550 nm u „ELISA ĉitaĉu“, nakon prethodnog odreĊivanja standardizovane krive proteinskih koncentracija. Za izvoĊenje Western blot procedure prethodno su pripremljeni rastvori za koje su sve korišćene supstance dobavljene od proizvoĊaĉa Sigma, osim CDP-Star i NitroBlock-II (Invitrogen). Rastvori potrebni za izviĊenje Western blota su: 1. 10XTBS (1 l) 2. Transfer pufer (1 l) - 80 g NaCl - Tris 3g - 24,2 g Tris - Glicin 15g - upotrebiti 25% HCl radi postizanja pH-7,6 - Metanol 29 3. TBS-T (1 l) 4. Blokirajući pufer - 100 ml 10XTBS - 5% rastvor mleka u prahu u TBS-T - 1 ml Tween - dopuniti dejonizovanom vodom do 1 l 5. Esej puffer (200 ml) 6. Rastvor za detekciju - 1 ml 1 M Tris/HCl pH 9,5 - 0,5 ml CDP-Star - 4 ml 5 M NaCl - 25 μl NitroBlock-II - 10 ml 1 M MgCl2 Eksperimentalna procedura Uzeta je izraĉunata zapremina uzorka u kojoj se nalazi 50 µg proteina i dodata joj je odreĊena zapremina pufera B ili pufera A u zavisnosti od toga da li je odreĊivan protein iz nuklearne ili citoplazmatske frakcije, tako da ukupna zapremina bude 16 µl. U svaki uzeti uzorak je zatim dodato po 8 µl pufera (NuPAGE® LDS Sample Buffer (4X), Invitrogen) u cilju optimalne pripreme proteinskih uzoraka za elektroforezu koja zahteva denaturaciju proteina i redukciju disulfidnih veza. Ukupna zapremina uzorka bila je 24 µl. Tako spremljeni uzorci su zagrevani 10 min na 95° C u bloku za grejanje. Dok su uzorci zagrevani pripreman je gel za elektroforezu. Komercijalni gel, 10%-ni poliakrilamidni gel (NuPAGE, Novex, Invitrogen), stavljen je u pripremljeno leţište u kadu za elektroforezu u koje je zatim sipano 400 ml pufera za elektroforezu koji je pripremljen od 20 ml koncentrovanog rastvora za elektroforezu koji sadrţi 3-(N- morfolin) propansulfonsku kiselinu (MOPS) i natrijum dodecil sulfat (SDS) (NuPAGE MOPS SDS „Running buffer“, Invitrogen) i 380 ml dejonizovane vode. Uzorci su pojedinaĉno nanošeni upotrebom specijalnih nastavaka za pipete. U prvu kolonu je nanešeno 4 µl markera koji predstavlja smesu razliĉitih peptida koji na 30 kraju elektroforeze ostavljaju vizuelnu identifikaciju separacije (Amersham TM Rainbow TM Marker, GE Healthcare Life Science). Elektroforeza je sprovoĊena na 200 V pribliţno 40 min. Nakon završene elektroforeze, pristupilo se „blotovanju“ tj. transferu razdvojenih proteina sa gela na membranu. Paţljivo je izvaĊen gel iz leţišta i stavljen na tri Whatmanova papira dimenzija 9X9 cm koji su prethodno bili natopljeni u Transfer puferu i zatim stavljeni u aparat za transfer, vodeći raĉuna da nema mehurića vazduha. Na gel je stavljena poliviniliden difluorid-na membrana (Immobilon-P PVDF, Merck Millipore) dimenzija 8X8 cm koja je prethodno aktivirana ispiranjem 10 s u metanolu (Sigma) a zatim 5 min u Transfer puferu. Na kraju je na postavljenu membranu stavljeno još 6 Watmanovih papira dobro natoplejnih u Transfer puferu. Transfer je obavljen tokom 90 min pri jaĉini struje od 80 mA. Nakon transfera, membrane su blokirane 2-3 h u blokirajućem puferu na sobnoj temperaturi. Blokirajući pufer je odliven i dodat je rastvor primarnih antitela u blokirajućem puferu u razblaţenjima u zavisnosti od proizvoĊaĉa antitela: 1:500 (Santa Cruz), 1:1000 (Cell Signaling i Assay Designs) i 1:3000 (Sigma). Membrana u rastvoru primarnog antitela je ostavljena na 4° C preko noći na platformi sa podešenim blagim rotirajućim pokretima. Primarna antitela korišćena u ovom istraţivanju su: antitelo za p65 (Cell Signaling), antitelo za fosfo-p65(Ser 536 ) (Cell Signaling), antitelo za IκBα (Cell Signaling), antitelo za fosfo- IκBα(Ser32/36) (Cell Signaling), antitelo za RelB (Santa Cruz), antitelo za hem-oksigenazu 1 (HO-1) (Assay Designs), antitelo za β-aktin (Sigma). Sledećeg dana rastvor primarnog antitela u blokirajućem puferu je odliven i ĉuvan na t od -20°C (dozvoljena je njegova primena još ĉetiri puta). Membrana je zatim ispirana na sobnoj t dva puta po 10 min u rastvoru TBS-T. Zatim je dodavano sekundarno antitelo rastvoreno u blokirajućem puferu u koncentraciji od 1:5000. Membrana je u ovom rastvoru inkubira 1 h na sobnoj t, a zatim je rastvor sekundarnog antitela odliven i membrane su ispirane u rastvoru TBS-T tri puta po pola sata. Membrana je zatim ispirana dva puta po 5 min u esej puferu. Na kraju se pristupilo detekciji tako što je na membranu koja je prethodno stavljena na plastiĉnu foliju, dodat rastvor za detekciju i zatim je prekrivena plastiĉnim filmom, vodeći raĉuna da se izbegne stvaranje mehurića izmeĊu membrane i plastiĉnog 31 filma. Izlaganje membrane rastvoru za detekciju je trajalo 5 min. Višak rastvora za detekciju je uklonjen Whatmanovim papirom natopljenim u esej puferu. Membrana je uvijena u providnu plastiĉnu foliju i izloţena rendgen filmu (x-OMAT AR Film; Kodak) od 5 do 7 min, koji je zatim razvijan upotrebom ECL SuperSignal (Pierce) detekcionog sistema. Denzitometrijska analiza je vršena upotrebom softverskog programa Adobe Photoshop CS2. 3.12. „Electrophoretic Mobility Shift Assay“ (EMSA) Metoda se zasniva na elektroforezi proteinskog materijala i DNK koji je obeleţen radioaktivnim obeleţivaĉem što predstavlja osnov kasnije detekcije. Traţeni kompleksi koji se sastoje od proteinske komponente (transkripcionog faktora) vezanog za specifiĉni promoterski region DNK se u toku elektroforeze najsporije kreću. Oligonukleotidne sekvence za NF-κB (DNK sekvenca koja predstavlja mesto vezivanja NF-κB) se moraju pre zapoĉinjanja eksperimenta obeleţiti radiokativnim fosforom {32-P}-γdATP. U tom cilju se priprema mastermiks u zapremini od 20 µl koji se satoji od: 6 µl NF-κB konsenzus oligonukleotida (Promega), 2 µl 10 X T4- Polinukleotidkinaze pufera (New England BioLabs), 1 µl T4-Polinukleotidkinaze (New England BioLabs), 8.5 µl H2O, 2.5 µl {32-P}-γdATP (radioaktivnost rastvora iznosi 0.925 MBq). Pripremljeni rastvor je inkubiran 30 min u vodenom kupatilu na 37° C, a zatim u cilju toplotne inaktivacije enzima inkubiran je 10 min u vodenom kupatilu na 70° C. U rastvor je zatim dodato 30 µl vode koja se koristi i za kvantitativni PCR. Kolona za centrifugiranje je pripremljena tako što je skinut poklopac i odlomljen vrh, a zatim je centrifugirana 1 min na 3000 rpm. U tako pripremljenu kolonu sipan je mastermiks u koliĉini od 50 μl i kolona je stavljena u epruvetu od 2 ml i centrifugirana 2 min na 3000 rpm. Kolona je odbaĉena u za to specijalno pripremljen kontejner za radioaktivni otpad dok je radiokativna teĉnost koja je centrifugirana u koloni i sakupljena u epruveti ĉuvana na 4° C u specijalnoj olovnoj boĉici. Pre izvoĊenja EMSA procedure neophodno je da se pripremi aparatura od stativa i drţaĉa sa strane. Transparentni poliesterski film na kojem će stajati akrilamidni gel (Gelbond R PAG film, Lonza) je stavljen na veće staklo i zalepljen po donjoj ivici 32 selotejp trakom. Na tako pripremljeno staklo su sa strane zalepljene silikonskim lepkom trake na ĉijim je drugim stranama stavljena manja koliĉina silikonskog lepka preko kojeg je stavljeno manje staklo, ĉime je formirana kapilarna šupljina izmeĊu zadnje površine manjeg stakla i filma u koju će se sipati gel za elektroforezu. Pripremljena stakla su stavljena u drţaĉe i stativ u vertikalni poloţaj. Pre pravljena gela napravljen je rastvor 10X TBE koji u 5 l sadrţi 540 g Tris baze (Sigma), 275 borne kiseline (Sigma) i 200 ml 0,5M EDTA (Sigma). Pripremljena je smeša za poliakrilamidni gel koja se sastoji od 2,21 g glicerola (Sigma), 51,3 ml destilovane vode, 7 ml 10X TBE, 9,33 ml 30% (w/v) Akrilamid-Bis (29:1) (Sigma), 525 μl 10%-nog amonijum persulfata (Sigma) i 58,3 μl TEMED (Bio-Rad) i sipana je u već pripremljeni kapilarni prostor izmeĊu manjeg stakla i filma postavljenog na većem staklu. Posle 3-4 h koliko je potrebno da se gel stegne i postane suv, pristupilo se elektroforezi. Dok se gel sušio odreĊivana je koncentracija proteina u uzorcima spektrofotometrijski po Lowry-ju kako je već opisano i iz svakog uzorka je odmereno 30 μg proteina. Teĉnost u komori za elektroforezu je prvo ohlaĊena na 8°C. U komori za elektroforezu je fiksiran gel za elektroforezu i sipano 2 l pufera 1XTBE (200 ml 10XTBE i 1800 ml dejonizovane vode). Prethodno je izmerena radioaktivnost pripremljenog mastermiksa tako što je odmerenih 1 μl pripremeljnog mastermiksa sa radioaktivnim obeleţivaĉem stavljeno u „Rotiszint“ boĉicu zapremine 3 ml koja je zatim postavljena u kontejner ß-brojaĉa. Posle izmerene radiokativnosti odmerenih 30 μg proteina iz svakog uzorka je pomešno sa 2 μl poly(dI-dC) (Affymetrix), 4 μl vezujućeg pufera koji se sastoji od 90 mM HEPES pH-7,9 (Sigma), 1 mM EDTA pH-8 (Sigma), 0,5 mM EGTA pH-8 (Sigma), 200 mM NaCl (Sigma), 1 mM DTT (Sigma), 0,5 mM PMSF (Sigma), 15%-ni glycerol (Sigma), zapreminom mastermixa koja ima izmerenu radioaktivnost od 100000 cpm, 1 μl „loading“ pufera koji se sastoji od 10mM Tris-HCl pH-7,6 (Sigma), 0,03% plavog bromfenola (Sigma), 0,03% ksilen cianola FF (Sigma), 60% glicerola (Sigma), 60mM EDTA (Sigma). Smeša se dopuni destilovanom vodom do zapremine od 17 μl. Dobijen rastvor predstavlja probu koja je nanošena na gel u jednu kolonu nakon inkubacije na sobnoj temperature u trajanju od 30 min. U toku inkubacije uzoraka na sobnoj t, uraĊeno je kondicioniranje tj. aktiviranje gela na 200 V u trajanju od 30 min, nakon ĉega su nanošeni uzorci a zatim je 33 sprovoĊena elektroforeza 30 min na 200 V, a zatim 120 min na 250 V. Nakon završene elektroforeze, gel je sušen preko noći i zatim stavljan na film (Kodak) u olovnu kasetu u kojoj je ekspozicija trajala najmanje sedam dana na -80° C. Posle ekspozicije razvijan je film koristeći ECL SuperSignal (Pierce) detekcioni sistem. Denzitometrijska analiza je vršena upotrebom softverskog programa Adobe Photoshop CS2. 3.13. Metoda optičke mikroskopije i imunohistohemijsko bojenje 3.13.1. „Periodic acid-Schiff“ (PAS) protokol bojenja tkiva PAS metoda se zasniva na detekciji glikogena u tkivu koje je prethodno fiksirano u formalinu i ukalupljeno u parafinu. Glikogen se boji u ljubiĉasto, a jedra u plavo. Iseĉci bubreţnog tkiva miševa su fiksirani u 4%-nom rastvoru formalina, a zatim su kalupljeni u parafinu. Za bojenje su korišćeni parafinski iseĉci debljine 5 μm. 0.5% PAS rastvor: PAS (Sigma) ------------------------- 0.5 g Destilovana voda -------------------- 100 ml 3.13.2. Imunohistohemijsko bojenje Posle deparafinizacije u ksilenu i etanolu u razliĉitim koncentracijama, ploĉice su sa iseĉcima tkiva inkubirane 20 min na 95°C u citratnom puferu pH 6,0. Ploĉice su zatim ĉuvane u 3%-nom vodonik-peroksidu rastvorenom u 70%-nom etanolu 10 min da bi se blokirala endogena peroksidaza. Nakon toga preparati su inkubirani 30 min u rastvoru primarnih pacovskih antimišjih F4/80 antitela u razblaţenju od 1:400 (klon A3:1, # AM19001PU-N, Acris Antibodies). Posle inkubacije sa primarnim antitelom uĉinjena je inkubacija sa sekundarnim antitelom primenom zeĉjeg antipacovskog IgG (H+L) (# 312-005-045, Dianova) u razblaţenju od 1:200. Potom su ploĉice inkubirane sa polimerom konjugovanim sa peroksidazom koji sluţi kao detekcioni sistem 34 (ZytochemPlus HRP Polymer kit, POLHRP-006, Zytomed Systems) 30 min. Vezano antitelo je vizualizovano u braon boji sa DAB supstrat kompletom (DAB057, ZytomedSystems). Inkubaciono vreme je bilo 10 min. Imunoperoksidazno bojenje na CD3 raĊeno je u BOND III automatizovanom aparatu za bojenje (Leica Microsystems) upotrebom BOND Polimera Refine detekcionog kompleta (Leica Microsystems). Zeĉje poliklonsko anti-CD3 antitelo (ab5690, abcam) korišćeno je kao primarno antitelo u razblaţenju od 1:100. Za svaki uzorak bubrega od svake ţivotinje i svako bojenje, ĉetiri mikrofotografije su uraĊene na uvećanju od 200 puta. Na njima je raĊeno prebrojavanje F4/80 i CD3 pozitivnih ćelija i grafiĉki je predstavljan proseĉan broj ćelija. Svaka fotografija je bila površine 326589 µm2. 3.14. Metode za odreĎivanje aktivnosti enzima antioksidacione zaštite iz tkiva bubrega Homogenizovanje tkiva bubrega je raĊeno po metodi Rossi-ja, DeWaziersa i Albrechta (138, 139). Posle homogenizacije uraĊena je sonifikacija uzoraka po metodi Takade i saradnika (140). Za odreĊivanje koliĉine glutationa iz sonifikata vršeno je taloţenje proteina sulfosalicilnom kiselinom uz centrifugiranje 10 min na 5000 rpm. Preostali sonifikat je centrifugiran 90 min u ultracentrifugi na 37500 rpm na 4°C. Iz izdvojenog supernatanta odreĊivana je koncentracija proteina i enzimska aktivnost SOD, CAT, GPX, GR. Koncentracija proteina u tkivima odreĊivana je po metodi Lowry-ja (141), 3.14.1. Određivanje aktivnosti supeoksid dismutaze (SOD) Metoda koju smo koristili u našem radu pripada grupi metoda „negativnog“ tipa, jer se prati smanjenje brzine autooksidacije adrenalina u alkalnoj sredini, koja je zavisna od O2 - . Ovu metodu su postavili Misra i Fridovich, 1972. godine (142). Prisutna SOD uklanja O2 - i pri tome inhibira reakciju autooksidacije adrenalina. Brzina autooksidacije adrenalina prati se spektrofotometrijski preko promene apsorbance na 480 nm. Porast apsorbance na 480 nm potiĉe od akumulacije adrenohroma. Brzina autooksidacije adrenalina jednaka je 35 nagibu linearnog dela porasta apsorbcije. Procenat inhibicije koristi se kao mera katalitiĉke aktivnosti enzima. Brzina autooksidacije adrenalina u odsustvu enzima uzima se kao referentna (kontrolna), a brzina autooksidacije u prisustvu SOD, odnosno proteina u citosolu predstavlja deo referentne vrednosti. Rastvori: 1. Adrenalin (Sigma) 3x10 -4 M u 0,1 M HCl (Sigma) (rastvor se priprema neposredno pre merenja) 2. Karbonatni pufer, pH-10,2 koji se sastoji od 0,05 M Na2CO3 (Sigma) i 1X10 -4 EDTA (Sigma) Eksprimentalni postupak: U 3,2 ml reakcione smeše koju ĉine: 3ml karbonatnog pufera, pH 10,2 i 0,1 ml rastvora adrenalina, dodavano je 0,01 ml ranije pripremljenog supernatanta. Autooksidacija adrenalina praćena je u toku ĉetiri minuta na 480 nm. Reakcija je stabilna u temperaturnom opsegu od 26-30 oC. Uporedo je raĊena i kontrolna reakcija. Procenat inhibicije autooksidacije adrenalina u prisustvu SOD iz uzorka, u odnosu na kontrolnu reakciju autooksidacije adrenalina korišćen je za izraĉunavanje SOD aktivnosti. Koliĉina SOD izraţena je u jedinicama SOD aktivnosti po mg proteina. Jedinica SOD aktivnosti definisana je kao zapremina, odnosno koliĉina proteina koja uzrokuje 50% inhibicije brzine autooksidacije adrenalina u linearnom delu porasta apsorpcije. Izraĉunavanje je uraĊeno po sledećoj jednaĉini: KVxLawx xRAK SOD    )(2 1  K ‒ promena apsorpcije kontrolne reakcije u minuti  A ‒ promena apsorpcije reakcije sa uzorkom u minuti  V ‒ zapremina uzorka koji se sipa u reakcionu smešu (ml)  Law ‒ količina proteina (mg / ml lizata)  R ‒ razblaženje 36 3.14.2. Određivanje aktivnosti katalaze (CAT) Aktivnost katalaze u sonifikatu odreĊivana je po metodi Beutler-a iz 1982. god (143). Metoda se sastoji u spektrofotometrijskom paraćenju brzine razgradnje vodonik- peroksida u prisustvu katalaze na 230 nm. Na toj talasnoj duţini vodonik-peroksid apsorbuje svetlost. Rastvori: 1. Pufer, pH-8,0 koji sadrţi 1 M Tris HCl (Sigma) i 5 mM EDTA (Sigma) 2. 10 mM H2O2 (Sigma) Taĉna koncentracija vodonik-peroksida odreĊivana je na sledeći naĉin: u odnosu na apsorpciju razblaţenog rastvora pufera (1:10), kao nula, oĉitavana je apsorpcija rastvora sastavljenog od 0,9 ml razblaţenog pufera i 0,1 ml razblaţenog 30%-nog rastvora H2O2 (1:100). Koncentracija vodonik-peroksida izraĉunavana je na osnovu ekstinkcionog koeficijenta, koji je za H2O2 na 230 nm 0,071, po formuli: C = Δ A/0,071 Dobijena koncentracija je potom razblaţivana do 10 mM. Eksperimentalni postupak: U kvarcnu kivetu u kojoj se nalazi 50 l pufera dodavano je izmeĊu 5 i 50 l uzorka (zavisno od aktivnosti katalaze). Reakcija poĉinje dodatkom 1ml 10 mM-nog rastvora vodonik-peroksida. Pad apsorbance praćen je na 230 nm u toku 3 minuta. Aktivnost je izraţavana u jedinica po mg (jed/mg proteína) odnosno jed/g vlaţne mase, a jedinica je definisana kao koliĉina redukovanog H2O2, izraţena u M, u minuti. Izraĉunavanje je vršeno prema sledećoj jednaĉini: CAT = (Δ A x R)/( 0,071 x Low x V) * ΔA ‒ promena absorbance u minuti * R ‒ razblaţenje * V ‒ zapremina uzorka (ml) * Low ‒ koliĉina proteina ( mg/ml sonifikata ) 37 3.14.3. Određivanje aktivnosti glutatión peroksidaze (GSH-Px) Aktivnost GSH-Px odreĊivana je po metodi Tamure i saradnika iz 1982. god (144). Metoda se zasniva na sledećoj reakciji: GSH-Px GR 2 GSH + H2O2 -------------> H2O + GSSG ----------> 2GSH NADPH+H + NADP + Ovom metodom se prati potrošnja NADPH, odnosno oksidacija NADPH uz glutation reduktazu (GR) na 340 nm. Ova indirektna metoda koja meri promenu proizvoda reakcije pokazala se veoma reproduktivnom u poreĊenju sa drugim metodama odreĊivanja GSH- Px aktivnosti. Rastvori potrebni za ovu proceduru su: -0,5M fosfatni pufer pH-7,0, 1mM EDTA, 0,2mM NADPH u 1% NaHCO3, 0,03M t- butilhidroperoksid, 1 mM GSH, GR ( TYPE II spec. akt. 105 IU/mg proteina), 1mM NaN3 Eksperimentalni postupak: U staklenu kivetu spektrofotometra dodaje se 1.5ml vode, 0,3 ml rastvora GSH (Sigma), 0,6 ml rastvora NADPH (Sigma), 0.,1 ml NaN3 (Sigma), 0,1 ml EDTA (Sigma), 0,3 ml fosfatnog pufera, 0,1 ml t-butilhidroperoksida (Sigma) i oko 0,05 ml uzorka. Reakcija otpoĉinje dodatkom 105 IU/mg proteina GR (oko 5μl). Reakcija se odvija na temperaturi 37 oC. Absorpcija se oĉitava na 340 nm, a reakcija traje 150 sekundi. Uporedo se radi i kontrolna reakcija. U kiveti kontrolne reakcije nalaze se svi reagensi osim uzorka. Aktivnost GSH-Px se izraĉunava na sledeći naĉin: GSH-Px= [(ΔA - ΔB ) x 3x10³]/(6,22 x V x Low) * ΔA ‒ promena apsorbance/min za uzorak * ΔB ‒ promena apsorbance/min za kontrolnu reakciju. * V ‒ zapremina uzorka u ml * Low ‒ koncentracija proteina u mg/ml 38 Rezultati su izraţeni u nmol NADPH/min/mg proteina, odnosno nmol NADPH/min/g vlaţne mase. 3.14.4. Određivanje aktivnosti glutation reduktaze (GR) OdreĊivanje aktivnosti GR raĊeno je po metodi Glatzle-a i saradnika iz 1974. god (145). Metoda se zasniva na praćenju oksidacije NADPH na 340 nm, u reakciji u kojoj enzim katalizuje redukciju oksidovanog u redukovani glutation. NADPH + H + + GSSG ---------> NADP + + 2GSH Oksidacija NADPH se prati merenjem promene apsorbance na 340nm. Rastvori: 1. Fosfatni pufer pH 7,4...............0,5 M 2. EDTA........................................0,5 mM 3. GSSG........................................2 mM 4. NADPH.....................................0,1 mM. Eksperimentalni postupak: U spektrofotometrijsku kivetu sipa se 0,6 ml fosfatnog pufera, 0,1 ml GSSG, 0,1 ml uzorka i vode do 3 ml. Reakcija otpoĉinje dodatkom 0,1 ml NADPH. Optimalna temperatura reakcije je 37 o C. Prati se promena apsorbance u toku 3 minuta, a aktivnost izraĉunava pomoću jednaĉine: GR= [( ΔA - ΔB )x 3 x 103]/ (6,22 x V x Low) * ΔA ‒ promena absorbance/minuti u uzorku * ΔB ‒ promena absorbance/minuti u kontrolnom uzorku * V ‒ zapremina uzorka (ml) * Low ‒ koliĉina proteina ( mg/ml sonifikata) 39 Aktivnost je izraţena u nmol NADPH/min/mg proteina, odn. nmol NADPH/min/g vlaţne mase. 3.15. Statistička obrada podataka Izraĉunavanje dovoljnog broja eksperimentalnih ţivotinja u istraţivanju sprovedeno je na osnovu preliminarnog eksperimenta sa 14 ţivotinja: 7 iz grupe podvrgnute samo I/R oštećenju i 7 iz grupe podvrgnute I/R oštećenju I tretirane everolimusom. Pri analizi podataka primenjene su osnovne metode deskriptivne stastistike: srednja vrednost (X) sa merama disperzije standardnom greškom (SE), standardnom devijacijom (SD), rasponom varijacije Min-Max i vrednostima medijane (Med) i moda (Mod). Normalnost raspodele testirana je Kolmogorov-Smirnov i Shapiro-Wilk testom. Za testiranje statistiĉke znaĉajnosti i proveru hipoteza korišćeni su sledeći statistiĉki testovi: Studentov t-test (parametrijski test), Mann-Whitney U-test (neparametrijski test), Kruskal-Wallis H test i jednofaktorska analiza varijanse (ANOVA) sa pratećom a priori Boniferonijevom t procedurom i post hoc Tuckey HSD, Dunnett T3, Tamhane T2 i Games-Howell testovima za višestruka poreĊenja meĊu grupama. Kvantifikacija povezanosti izmeĊu varijabli utvrĊivana je Pirsonovom linearnom korelacijom. Baza podataka i analiza rezultata izvršena je pomoću softverskog paketa SPSS 10.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, SAD). 40 4. REZULTATI 4.1. mTOR inhibicija Da bi se proverila efikasnost mTOR inhibicije, odreĊena je ekspresija S6 ribozomalnog proteina i fosfo-S6 ribozomalnog proteina (Ser 235/236). Ukoliko je aktiviran mTOR oĉekuje se povećan nivo ekspresije fospho-S6 ribozomalnog proteina (Ser 235/236). U poreĊenju sa „Sham“-operisanim ţivotinjama koje nisu bile tretirane everolimusom naĊen je niţi nivo ekspresije fosfo-S6 ribozomalnog proteina (Ser 235/236) kod ţivotinja tretiranih everolimusom u svim vremenskim taĉkama (Slika 5). Nije bilo promena u ekspresiji S6 ribozomalnog proteina. eve-tretirane netretirane K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh Fosfo-S6 ribozomalni protein eve-tretirane netretirane K Sh 0.5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh S6 ribozomalni protein eve-tretirane netretirane K Sh 0.5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh β-aktin Slika 5. Ekspresija fosfo-S6 ribozomalnog proteina (Ser235/236) kao dokaz mTOR inhibicije. (K ‒ intaktna kontrola; Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan) 41 4.2. Nivo everolimusa u krvi Nivo everolimusa odreĊivan je u punoj krvi ţivotinja spektrofotometrijski jedan dan, tri dana i sedam dana nakon poĉetka aplikacije leka, a pre davanja sledeće doze. Vrednosti koncentracija su se kretale oko 20 ng/ml što je i bio ţeljeni ciljni nivo (Slika 6). Slika 6. Nivo everolimusa u krvi životinja. Nivo leka je odreĊivan 1 dan, 3 dana i 7 dana nakon poĉetke aplikacije leka. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (d ‒ dan). 42 4.3. Analiza preživljavanja u I/R oštećenju bubrega Ţivotinje su praćene sedam dana. Većina smrtnih ishoda se dogodila drugog i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja. Zabeleţen je samo jedan smrtni ishod u grupi netretiranih ţivotinja ĉetvrtog dana nakon indukcije I/R oštećenja. Sve ţivotinje koje su preţivele do ĉetvrtog dana praćenja, bile su ţive i sedmog dana nakon izazivanja I/R oštećenja. Na Slici 7 prikazan je grafik preţivljavanja uraĊen Kaplan-Mayer-ovom analizom. Ţivotinje tretirane everolimusom imale su ukupno veći mortalitet u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama (62,96% prema 51,52%), ali nije uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika u preţivljavanju. Slika 7. Uticaj treatmana everolimusom na preživljavanje posle indukcije I/R oštećenja bubrega u miševa. Ţivotinje su praćene sedam dana. (eve ‒ everolimus) 43 4.4. Bubrežna funkcija posle indukcije I/R oštećenja Već 2 h posle izazivanja I/R oštećenja u obe grupe miševa, tretiranih everolimusom i netretiranih, zabeleţen je porast kreatinina (Slika 8A). Porast vrednosti serumskog kreatinina se odrţavao 2 dana posle izazivanja I/R oštećenja bez znaĉajne statistiĉke razlike meĊu grupama. Trećeg dana posle izazivanja I/R oštećenja u grupi miševa tretiranih everolimusom uoĉava se i dalje porast kreatinina (1,33±0,19mg/dl), dok se u grupi netretiranih miševa beleţi pad serumskog kreatinina (0,75±0,13mg/dl), što izmeĊu ove dve grupe ĉini statistiĉki znaĉajnu razliku (p<0,05) (Slika 8A). Do sedmog dana nakon izazivanja I/R oštećenja, nivo serumskog kreatinina je u obe eksperimentalne grupe bio skoro isti u poreĊenju sa kontrolnom grupom i „Sham“- operisanim ţivotinjama. Sliĉan trend se uoĉava i kod serumske uree (Slika 8B). Do drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja primetan je ravnomerni porast uree u obe eksperimentalne grupe. Trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja, analogno kinetici izmerenih vrednosti kreatinina, u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom uoĉava se dalji rast serumske uree, dok se u grupi netretiranih ţivotinja primećuje poĉetak oporavka bubreţne funkcije mereno padom vrednosti uree u serumu koja je statistiĉki znaĉajno manja od vrednost izmerene u grupi netretiranih ţivotinja (p<0,05) (Slika 8B). Vrednosti uree izmeĊu netretiranih i ţivotinja tretiranih everolimusom izmerene sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja se ne razlikuju meĊusobno kao ni u odnosu na vrednosti kod „Sham“-operisanih ţivotinja. Vrednosti kreatinina i uree kod intaktnih kontrola bile su redom 0,087±0,01 mg/dl i 26,36±1,27 mg/dl i nisu se znaĉajno razlikovale od vrednosti izmerenih kod „Sham“-operisanih ţivotinja, te nisu predstavljene na graficima. 44 A) B) Slika 8. Uticaj tretmana everolimusom na bubrežnu funkciju merene vrednostima (A) kreatinina i (B) uree u I/R oštećenju bubrega kod miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; * p<0,05). 45 4.5. Indeks tubulointersticijumskog oštećenja Uzorci tkiva bubrega su bojeni PAS tehnikom. Na Slici 9 prikazani su reprezentativni uzorci uraĊeni u razliĉitim vremenskim intervalima nakon indukcije I/R oštećenja. Histopatološke promene uzrokovane I/R oštećenjem tkiva bubrega u miševa gradirane su odreĊivanjem indeksa tubulointersticijumskog oštećenja, na osnovu intenziteta promena u tkivu bubrega koje su stepenovane od 0 do 3. Promene koje su stepenovane su vakuolizacija, stanjivanje tubularnog epitela, gubitak ĉetkastog pokrova, prisustvo nekroze/apoptoze i detritus. Izraţena polja nekroze uoĉavaju se u obe grupe ţivotinja već šestog sata reperfuzije, a najizraţenija su drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja. Sedam dana posle indukcije I/R oštećenja u grupi netretiranih ţivotinja se i dalje uoĉavaju manja polja nekroze, stanjivanje epitela sa vakuolizacijom i gubitkom ĉetkastog pokrova, za razliku od everolimusom tretiranih ţivotinja u kojih se uoĉava samo hipocelularnost sa mestimiĉnim stanjivanjem epitela. Semikvantitativna analiza je pokazala pojavu znakova tkivnog oštećenja već 30 min nakon indukcije I/R oštećenja. Šest sati nakon indukcije I/R oštećenja u obe eksperimentalne grupe registruje se znaĉajan porast vrednosti indeksa tubulointersticijumskog oštećenja koji se odrţava do trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja s tim da ţivotinje tretirane everolimusom imaju znaĉajno veći indeks tkivnog oštećenja u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama drugog dana posle indukcije I/R oštećenja (2,6±0,03 prema 1,81±0,12; p<0.01) i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja (2,25±0,13 prema 1,5±0,08; p<0.01) (Slika 10). Sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja netretirane ţivotinje pokazuju i dalje znaĉajno tubulointersticijumsko oštećenje ĉiji je indeks znaĉajno veći ne samo u poreĊenju sa „Sham“-operisanim ţivotinjama (p<0,01), već i u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom (p<0,05) (Slika 10). MeĊusobno poreĊenje vrednosti indeksa tubulointersticijumskog oštećenja kod ţivotinja tretiranih everolimusom sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja i „Sham“-operisanih ţivotinja pokazuje takoĊe znaĉajnu razliku (p<0,05). 46 Slika 9. Reprezentativne fotografije tkiva bubrega miševa nakon I/R oštećenja. PAS bojenje, 400X. (E ‒ everolimus; d ‒ dan; Sh ‒ „Sham“- operisane ţivotinje) 6h 6h E 2d 2d E 7d 7d E Sh Sh E sdSs gfdS hSEE EEE E 47 Vrednosti indeksa tubulointersticijumskog oštećenja kod intaktnih ţivotinja nisu se znaĉajno razlikovale od vrednosti naĊenih kod „Sham“-operisanih ţivotinja, kako netretiranih tako i tretiranih everolimusom. Slika 10. Uticaj everolimusa u I/R oštećenju bubrega na indeks tubularnog oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; # p<0,05 u poreĊenju sa „Sham“ grupom; ǂ p<0,01 u poreĊenju sa „Sham“ grupom; *p<0,05, **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7). 4.6. Ekspresija iRNK za hemokine i proinflamatorne citokine u tkivu bubrega posle indukcije I/R oštećenja Uzimajući u obzir da I/R oštećenje indukuje snaţnu ekspresiju proinflamatornih citokina i hemokina koja moţe biti promenjena antiinflamatornim dejstvom mTOR inhibitora, ispitali smo hemokinski i citokinski odgovor pod mTOR inhibicijom koristeći se metodom kvantitativnog PCR-a u analizi ekspresije iRNK u tkivu bubrega. 48 4.6.1. Ekspresija hemokina Uoĉava se bimodalna ekspresija iRNK za hemokine koja se karakteriše pojavom maksimalnih vrednosti („pikova“) ekspresije kako u ranoj inflamatornoj fazi I/R oštećenja, tako i u reparacionoj fazi I/R oštećenja. Prvi „pik“ ekspresije iRNK za CCL2 uoĉen je u obe eksperimentalne grupe 6 h nakon indukcije I/R oštećenja uz veći porast ekspresije kod netretiranih ţivotinja (p<0,01) (Slika 11). Tokom prvog dana nakon indukcije I/R oštećenja, ekspresija CCL2 snaţno opada u obe grupe vraćajući se skoro na normalne vrednosti tj. na vrednosti uoĉene kod „Sham“-operisanih ţivotinja i intaktnih kontrola. Drugog i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja ekspresija iRNK za CCL2 ponovo raste, dostiţući znaĉajno veće vrednosti kod netretiranih ţivotinja trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja (p<0,01), nakon ĉega sledi pad ekspresije CCL2. Slika 11. Produkcija iRNK za CCL2 u tkivu bubrega miševa posle indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 49 Povećana ekspresija iRNK za CCL3 detektuje se već posle 30 min reperfuzije u obe grupe, nakon ĉega sledi pad u ekspresiji, koji je kod ţivotinja tretiranih everolimusom brţi što rezultuje znaĉajno manjom vrednošću drugog sata reperfuzije u odnosu na vrednost izmerenu kod netretiranih ţivotinja (p<0,01) (Slika 12). Sledeće povećanje ekspresije iRNK za CCL3 uoĉava se u obe grupe drugog dana posle indukcije I/R oštećenja i znaĉajno je veće u grupi netretiranih ţivotinja (p<0,05). Kod ţivotinja tretiranih everolimusom ekspresija pada do kraja perioda posmatranja, dok se kod netretiranih ţivotinja registruje stagnacija ekspresije iRNK za CCL3 sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja, tako da razlika izmeĊu tretiranih i netretiranih ţivotinja postaje znaĉajna (p<0,01). Slika 12. Produkcija iRNK za CCL3 u tkivu bubrega miševa posle indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0.05, **p<0.01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 50 Ekspresija iRNK za CCL5 pokazuje u obe eksperimentalne grupe prvi porast 2 h posle indukcije I/R oštećenja, i drugi porast drugog dana posle indukcije I/R oštećenja (Slika 13). Ekspresije CCL5 je 2h nakon indukcije I/R oštećenja znaĉajno niţa u grupi miševa koji su bili tretirani everolimusom (p<0,05). Kod netretiranih ţivotinja uoĉava se nov porast ekspresije iRNK za CCL5 sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja, znaĉajno veći nego kod ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,01). Slika 13. Produkcija iRNK za CCL5 u tkivu bubrega miševa posle indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0.05, **p<0.01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) Sliĉna distribucija izmerenih nivoa ekspresije uoĉena je i za iRNK za CXCL10 uz veći porast ekspresije 2 h nakon indukcije I/R oštećenja kod netretiranih miševa u odnosu na miševe tretirane everolimusom (p<0.01) (Slika 14). Drugo povećanje ekspresije iRNK za CXCL10 javlja se u obe eksperimentalne grupe drugog dana posle 51 indukcije I/R oštećenja, ali bez statistiĉki znaĉajne razlike. Sedam dana nakon indukcije I/R oštećenja registruje se nov porast ekspresije iRNK za CXCL10 kod netretiranih ţivotinja, statistiĉki znaĉajno veći nego vrednost izmerena u grupi tretiranih ţivotinja (p<0.05). Slika 14. Produkcija iRNK za CXCL10 u tkivu bubrega miševa posle indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0.05, **p<0.01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 4.6.2. Ekspresija TNF-α i IL-1β Tokom celog perioda ispitivanja uoĉena su u obe eksperimentalne grupe dva perioda povećane ekspresije iRNK za TNF-α; prvi do šestog sata reperfuzije i drugi od prvog do trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja (Slika 15). U prvom satu reperfuzije 52 ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću ekspresiju iRNK za TNF-α u odnosu na netretirane ţivotinje (p<0,01). Sl 15. Kinetika produkcije iRNK za TNF-α u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) Prvog dana nakon indukcije I/R oštećenja ekspresija iRNK za TNF-α je znaĉajno veća kod netretiranih ţivotinja (p<0,05), ali se drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja uoĉava znaĉajan porast ekspresije iRNK za TNF-α kod ţivotinja tretiranih everolimusom u odnosu na netretirane (p<0,01). Povećana ekspresija iRNK za IL-1β beleţi se već 30 min posle indukcije I/R oštećenja u obe eksperimentalne grupe odrţavajući plato povećane ekspresije u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom prvih 6 sati reperfuzije (Slika 16). Za razliku od njih, netretirane ţivotinje pokazuju pad u ekspresiji iRNK za IL-1β 2 h nakon indukcije I/R 53 oštećenja koji je znaĉajan u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom (p<0.05). Ponovan porast ekspresije iRNK za IL-1β registruje se drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja, i on se statistiĉki znaĉajno razlikuje u odnosu na vrednosti registrovane kod netretiranih ţivotinja (p<0,05) (Slika 16). Slika 16. Ekspresija iRNK za IL-1β u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0.05, netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 4.7. Ekspresija iRNK za antiinflamatorne citokine u I/R oštećenju bubrega Fiziološki odgovor na povećanu produkciju proinflamatornih medijatora je povećana produkcija citokina sa antiinflamatornim svojstvima kao što su IL-10 i TGF-β. U obe eksperimentalne grupe registrovana je sliĉna kinetika ekspresije iRNK za IL-10, 54 pri ĉemu su najveće vrednosti registrovane 6 h posle indukcije I/R oštećenja (Slika 17). Povećana ekspresija iRNK za IL-10 se odrţava i sedmog dana posle indukicje I/R oštećenja koja je kod netretirane ţivotinje veća, ali bez statistiĉke znaĉajnosti u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom. Slika 17. Kinetika produkcije iRNK za IL-10 u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; n=7) Neznatan porast ekspresije iRNK za TGF-β je uoĉiv u prvim satima reperfuzije u obe eksperimentalne grupe bez znaĉajnih meĊusobnih razlika (Slika 18). Posle dvanaestog sata reperfuzije zapaţa se nov porast ekspresije iRNK za TGF-β, koji se kod ţivotinja tretiranih everolimusom drugog dana posle indukcije I/R oštećenja normalizuje na vrednosti koje se uoĉavaju kod Sham-operisanih i intaktnih ţivotinja i kao takve ostaju do kraja perioda ispitivanja (Sl. 18). Za razliku od ţivotinja tretiranih everolimusom, netretirane ţivotinje pokazuju drugog i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja umereno povećanu ekspresiju iRNK za TGF-β koja je u poreĊenju sa 55 vrednostima registrovanim u tom periodu kod ţivotinja tretiranih everolimusom znaĉajno veća (p<0,01) (Slika 18). Sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja ekspresija iRNK za TGF-β znaĉajno raste u grupi netretiranih ţivotinja i dostiţe najveće vrednosti izmerene u celom period ispitivanja (p<0,01 u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom). Slika 18. Ekspresija iRNK za TGF-ß u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 4.8. Dejstvo everolimusa na prisustvo F4/80 pozitivnih ćelija u I/R oštećenju bubrega miševa Na Slici 19 prikazane su mikrofotografije bubreţnog tkiva u I/R oštećenju posle bojenja na F4/80, koji predstavlja specifiĉni marker mononuklearnih fagocita kod miševa. Znaĉajno veće prisustvo F4/80 pozitivnih ćelija se uoĉava u obe eksperimentalne grupe već u prvom satu reperfuzije u poreĊenju sa „Sham“-operisanim 56 ţivotinjama. Sedam dana nakon indukcije I/R oštećenja kod miševa tretiranih everolimusom uoĉava se manje prisustvo F4/80 pozitivnih ćelija u odnosu na netretirane ţivotinje. Slika 19. Reprezentativne fotografije F4/80 pozitivnih ćelija u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Imunohistohemijsko bojenje na F4/80, 200X. (E ‒ everolimus; d ‒ dan). 1h 1h E 7d 7d E 57 Preciznijom procenom, prebrojavanjem ćelija pozitivnih na F4/80 marker, uoĉava se da se njihovo znaĉajno povećano prisustvo u odnosu na „Sham“-operisane ţivotinje odrţava poĉev od prvog sata reperfuzije (p<0,01) pa sve do drugog dana posle indukcije I/R oštećenja kada je broj F4/80 pozitivnih ćelija najmanji u obe eksperimentalne grupe (Slika 20). Slika 20. Prikaz infiltracije F4/80 + ćelija u tkivu bubrega miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti broja F4/80+ pozitivnih ćelija izbrojanih u vidnom polju ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; # p<0,05 u poreĊenju sa „Sham“-operisanim ţivotinjama; ǂ p<0,01 u poreĊenju sa „Sham“-operisanim ţivotinjama; * p<0,05 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; ** p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7). 58 Drugog dana posle indukcije I/R oštećenja broj F4/80 pozitivnih ćelija kod netretiranih ţivotinja se ne razlikuje znaĉajno od broja uoĉenog kod „Sham“-operisanih ţivotinja, dok je broj F4/80 pozitivnih ćelija kod ţivotinja tretiranih everolimusom ĉak manji nego štoj je broj kod „Sham“-operisanih ţivotinja (p<0,05). Poĉev od trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja broj F4/80 pozitivnih ćelija se ponovo povećava u grupi netretiranih ţivotinja i postaje znaĉajno veći u odnosu na broj F4/80 pozitivnih ćelija kod „Sham“-operisanih ţivotinja sa odrţavanjem statistiĉke znaĉajnosti i sedmog dana posle indukcije I/R oštećeenja (p<0,01). Povećanje broja F4/80 pozitivnih ćelija uoĉava se i kod ţivotinja tretiranih everolimusom u periodu od trećeg do sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja, ali se on ne razlikuje znaĉajno od broja uoĉenog kod „Sham“-operisanih ţivotinja. Uoĉava se da u periodu od 12 h posle indukcije I/R oštećenja pa sve do kraja ispitivanja, netretirane ţivotinje pokazuju znaĉajno veći broj F4/80 pozitivnih ćelija u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom (p<0,05 12 h posle indukcije I/R oštećenja; p<0,01 u periodu od prvog do sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja) (Slika 20). 4.10. Ekspresija iRNK za CXCR3 u bubregu posle indukcije I/R oštećenja CXCR3 predstavlja receptor za hemokin CXCL10 i eksprimiran je skoro iskljuĉivo na aktiviranim T limfocitima, ali se moţe naći i na odreĊenoj populaciji aktiviranih makrofaga. Korišćenjem metode kvantitativvnog PCR-a naĊena je znaĉajno povećana ekspresija iRNK za CXCR3 tek sedmog dana reperfuzije u grupi netretiranih ţivotinja u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom (p<0,01) (Slika 21). U svim ostalim vremenskim taĉkama ispitivanja nije zabeleţen porast ekspresije iRNK za CXCR3 ni u jednoj eksperimentalnoj grupi. 59 Slika 21. Ekspresija iRNK za CXCR3 u bubregu miševa nakon indukcije I/R oštećenja. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) 4.9. Infiltracija T-limfocita u tkivu bubrega posle indukcije I/R oštećenja Imunohistohemijsko bojenje na CD3, specifiĉan marker T-ćelija, nije pokazalo znaĉajnu infiltraciju T-limfocita u tkivu bubrega, kako netretiranih, tako i ţivotinja tretiranih everolimusom u poreĊenju sa „Sham“-operisanom grupom mereno u svim vremenskim taĉkama ispitivanja. Sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja nalaze se pojedinaĉne CD3+ pozitivne ćelije, ali nedovoljno za kvantifikaciju (Slika 22). 60 Slika 22. Reprezentativne fotografije tkiva bubrega nakon uraĎenog imunohistohemijskog bojenja na CD3 marker. 200X. (E ‒ everolimus; d ‒ dan; Sh ‒ „Sham“- operisane ţivotinje). ShE SSh E Sh SS hE 7dE SSh E 7d SS hE 61 4.11. Nuklearna translokacija p65 i fosfo-Ser536-p65 u I/R oštećenju bubrega S obzirom na aktivaciju p65 u I/R oštećenju korišćenjem Western blota analizirana je ekspresija p65 kao i fosfo-p65 u nuklearnoj proteinskoj frakciji tkiva bubrega nakon indukcije I/R oštećenja. Denzitometrijska analiza p65 i fosfo-p65 uraĊena je na odvojenim nuklearnim frakcijama 4 ţivotinje za svaku vremensku taĉku ispitivanja. Na Slici 23A prikazani su reprezentativni imunoblotovi za p65 u obe eksperimentalne grupe. Denzitometrijska analiza je pokazala inicijalno povećanu nuklearnu ekspresiju p65 u obe grupe. U grupi ţivotinja tretiranih everolimusom se potom beleţi dalji rast nuklearne ekspresije p65 u periodu izmeĊu 1 h i 2 h posle indukcije I/R oštećenja dostiţući drugi „pik“ ekspresije drugog dana posle indukcije I/R oštećenja, statistiĉko znaĉajno veći u odnosu na izmerenu ekspresiju p65 istog dana u grupi netretiranih ţivotinja (p<0,01) (Sl. 23B). Posle 6 h reperfuzije, netretirane ţivotinje dostiţu maksimum nuklearne ekspresije p65 koja znaĉajno veća nego vrednost ekspresije p65 kod ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,05). Plato povećane ekspresije p65 u grupi netretiranih ţivotinja se odrţava zakljuĉno sa prvim danom nakon indukcije I/R oštećenja, da bi se drugog dana posle indukcije I/R oštećenja detektovao znaĉajan pad u nuklearnoj ekspresiji. Vaţno je istaći povećanu translokaciju p65 u jedro kod netrtetiranih ţivotinja ne samo trećeg (p<0,05) već i sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja (p<0,01) u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom (Sl. 23B). 62 A) netretirane eve tretirane K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d p65 ß-aktin B) Slika 23. Ekspresija p65 u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativni imunoblotovi ukupnog p65 odreĊenih u nuklearnom proteinskom izolatu. Kao kontrola sluţio je ß- aktin. (B) Denzitometrijska analiza ekspresije p65 uraĊena je na 4 imunoblota i vrednosti su prikazane kao procenat od izmerene ekspresije kod „Sham“-operisanih ţivotinja. (K ‒ intaktna kontrola; Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05; **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom). Ekspresija fosforilisane forme p65 (fosfo-Ser536-p65) pokazuje sliĉnu vremensku raspodelu kao i p65 u obe eksperimentalne grupe (Slika 24A i 24B). Uoĉava 63 se tokom celog perioda praćenja povećana ekspresija fosforilisane forme p65 (fosfo- Ser536-p65) kod ţivotinja tretiranih everolimusom bez znaĉajnijih „pikova“ koji se izdvajaju, za razliku od netretiranih ţivotinja koje pokazuju sliĉan oblik krive kao i nuklearna ekspresija p65 sa „pikovima“ ekspresije registrovanim 30 min posle indukcije I/R oštećenja, u periodu izmeĊu 6 h i jednog dana posle indukcije I/R oštećenja i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja (Slika 24B). A) netretirane eve-tretirane K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d p-p65 β-aktin B) Slika 24. Ekspresija fosforilisane forme p65 (fosfo-Ser536-p65) u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativni imunoblotovi fosfo-p65 odreĊenih u nuklearnom proteinskom izolatu tkiva bubrega nakon indukcije I/R oštećenja. Kao kontrola sluţio je ß-aktin. (B) Denzitometrijska analiza ekspresije fosfo-p65 uraĊena je na 4 imunoblota. Vrednosti su prikazane kao procenat od izmerene ekspresije kod „Sham“-operisanih ţivotinja. (K ‒ intaktna kontrola; Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; **p<0.01 eve-tretirane u odnosu na netretirane). 64 Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću ekspresiju fosfo- Ser536-p65 prvog i drugog sata kao i drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja u odnosu na netretirane ţivotinje (p<0,01). U kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja, trećeg i sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja, nema znaĉajnih razlika u ekspresiji fosfo-Ser536-p65 izmeĊu netretiranih ţivotinja i ţivotinja tretiranih everolimusom (Sl. 24B). 4.12. OdreĎivanje ekspresije IκBα i fosfo-(Ser32/Ser36)-IκBα u bubrezima posle indukcije I/R oštećenja Da bi ispitali i odredili znaĉaj aktivacije NF-κB kanoniĉkim putem u patogenezi I/R oštećenja bubrega, analizirana je ekspresija IκBα i fosfo-(Ser32/Ser36)-IκBα u citoplazmatskoj proteinskoj frakciji Western blot tehnikom. Imunoblotna kvantifikacija je uraĊena na odvojenim citoplazmatskim frakcijama proteina bubrega 4 ţivotinje po svakoj vremenskoj taĉki. U poreĊenju sa intaktnim i Sham-operisanim ţivotinjama, povećana ekspresija fosfo-IκBα bila je detektovana u obe eksperimentalne grupe u svim vremenskim taĉkama (Slika 25A). U toku celog perioda ispitivanja u obe grupe se uoĉava sliĉna kinetika ekspresije fosfo-IκBα, sa izdvajanjem dva znaĉajna „pika“ ekspresije prvog i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja, ali se u ranom period posle indukcije I/R oštećenja beleţi veća ekspresija u grupi netretiranih ţivotinja. U odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom, netretirane ţivotinje pokazuju znaĉajno veću ekspresiju fosfo-IκBα posle 30 min reperfuzije (p<0,01) i 12 h reperfuzije (p<0,01) (Slika 25B). Za razliku od netretiranih ţivotinja, ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju inicijalni porast ekspresije fosfo- IκBα 1 h nakon indukcije I/R oštećenja i sledeća dva „pika“ ekspresije 1 dan i 3 dana nakon indukcije I/R oštećenja (Slika 25B). 65 A netretirane eve tretirane K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d p-IκBα ß-aktin B) Slika 25. Ekspresija fosfo-(Ser32/Ser36)-IκBα u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativni imunoblotovi fosfo-IκBα odreĊenih u citoplazmatskom proteinskom izolatu tkiva bubrega nakon indukcije I/R oštećenja. Kao kontrola sluţio je ß-aktin. (B) Denzitometrijska analiza ekspresije fosfo-IκBα uraĊena je na 4 imunoblota i vrednosti su prikazane kao procenat od izmerene ekspresije kod „Sham“-operisanih ţivotinja. (K ‒ intaktna kontrola; Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; **p<0,01 netretirane u odnosu na tretirane everolimusom). 66 Uporedo sa rastom ekspresije fosfo-IκBα u ranim satima reperfuzije uoĉava se pad ekspresije IκBα u obe eksperimentalne grupe (Slika 26A). Denzitometrijska analiza je pokazala da u grupi netretiranih ţivotinja ekspresija IκBα dostiţe vrednosti kao kod A netretirane eve tretirane K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d K Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d IκBα ß-aktin B) Slika 26. Ekspresija IκBα u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativni imunoblotovi IκBα odreĊenih u citoplazmatskom proteinskom izolatu tkiva bubrega nakon indukcije I/R oštećenja. Kao kontrola sluţio je ß-aktin. (B) Denzitometrijska analiza ekspresije IκBα uraĊena je na 4 imunoblota i vrednosti su prikazane kao procenat od izmerene ekspresije kod „Sham“-operisanih ţivotinja. (K ‒ intaktna kontrola; Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0.01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom). 67 „Sham“-operisanih ţivotinja ili intaktnih kontrola već 2 h posle indukcije I/R oštećenja, da bi posle 6 h reperfuzije ona bila znaĉajno veća nego ekspresija IκBα kod ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,05), ostajući do kraja perioda posmatranja znaĉajno veća (Slika 26B). Normalizacija vrednosti ekspresije IκBα kod ţivotinja tretiranih everolimusom uoĉava se tek u period izmeĊu 12 h i jednog dana nakon indukcije I/R oštećenja (Slika 26B). 4.13. Everolimus menja kinetiku vezivanja NF-κB za DNK u I/R oštećenju bubrega EMSA metod je uraĊen u cilju odreĊivanja kinetike vezivanja NF-κB za DNK. Netretirane ţivotinje pokazuju cikliĉnu aktivnost NF-κB sa „pikovima“ aktivnosti tj. vezivanja NF-κB za DNK 30 min, 6 h, 3 dana i 7 dana nakon indukcije I/R oštećenja i izmeĊu njih manju aktivnost vezivanja. Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju povećano vezivanje NF-κB za DNK u skoro svim vremenskim taĉkama perioda observacije, pokazujući kontinuiranu aktivnost NF-κB (Slika 27A i 27B). Kod ţivotinja tretiranih everolimusom nakon inicijalnog porasta 30 min posle indukcije I/R oštećenja i pada aktivnosti vezivanja NF-κB za DNK posle prvog sata reperfuzije, sledi dalji porast u aktivnosti vezivanja koji se odrţava izmeĊu 6 h i 3 dana posle indukcije I/R oštećenja i nastavlja se i sedmog dana praćenja. Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću aktivnost vezivanja NF-κB za DNK 30 min i 2 h posle indukcije I/R oštećenja (p<0,05), kao i u periodu od 12 h do 2 dana posle indukcije I/R oštećenja (p<0,01) (Slika 27B). 68 A netretirane eve-tretirane Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d B Slika 27. Aktivnost vezivanja NF-κB za DNK u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativne autografije vezivanja NF-κB za DNK odreĊenog putem metoda EMSA u nuklearnoj ptoteinskoj frakciji tkiva bubrega nakon indukcije I/R oštećenja. (B) Denzitometrijska analiza vezivanja NF-κB za DNK odreĊena na autografijama 4 posebnih ţivotinja za svaku vremensku taĉku ispitivanja. Vrednosti su prikazane kao procenti aktivnosti vezivanja NF-κB za DNK u „Sham“ grupi. (Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0.01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom) 69 4.14. Nuklearna ekspresija RelB u I/R oštećenju bubrega U cilju ispitivanja aktivacije NF-κB alternativnim putem, ispitana je ekspresija RelB u nuklearnoj proteinskoj frakciji tkiva bubrega putem Western blota. Uoĉiva je veća ekspresija RelB kod ţivotinja tretiranih everolimusom, naroĉito u kasnoj fazi I/R oštećenja (Slika 28A). A) netretirane eve-tretirane Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d Sh 0,5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d RelB ß-aktin Slika 28. Ekspresija RelB u I/R oštećenju bubrega. (A) Reprezentativni imunoblotovi RelB odreĊenih u nuklearnom proteinskom izolatu. Kao kontrola sluţio je ß-aktin. (B) Denzitometrijska analiza ekspresije RelB uraĊena je na 4 imunoblota i vrednosti su prikazane kao procenat od izmerene ekspresije kod „Sham“-operisanih ţivotinja. (Sh ‒ „Sham“-operisane; eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05,**p<0,01 netretirane u odnosu na tretirane everolimusom). 70 Denzitometrijska analiza pokazuje porast ekspresije RelB od prvog do sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja kod ţivotinja tretiranih everolimusom, dok netretirane ţivotinje pokazuju znaĉajan pad nuklearne RelB ekspresije na skoro nedetektabilne nivoe sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja (p<0,01) (Slika 28B). U ranom reperfuzionom periodu nije bilo znaĉajnih razlika u ekspresiji RelB izmeĊu eksperimentalnih grupa osim 2 h posle indukcije I/R oštećenja kada ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću ekspresiju RelB (p<0,05) (Slika 28B). 4.15. Nuklearna ekspresija p52 u I/R oštećenju bubrega S obzirom da je p52 konstituent RelB/p52 heterodimera te da se moţe vezivati za DNK i u homodimernom obliku kada ostvaruje inhibiciju prethodnog transkripcionog dejstva NF-κB, uraĊena je nuklearna ekspresija p52 poĉev od drugog dana posle indukcije I/R oštećenja ispitijući u kasnijim vremenskim taĉkama reparacionu fazu I/R oštećenja. Uoĉava se konstantno prisutna ekspresija p52 kod ţivotinja tretiranih everolimusom i skoro potpuno inhibirana ekspresija drugog dana posle indukcije I/R oštećenja kod netretiranih ţivotinja (Slika 29). netretirane eve-tretirane 2d 3d 7d 2d 3d 7d Slika 29. Reprezentativni imunoblotovi p52 odreĎenih u nuklearnom proteinskom izolatu bubrega. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan;). 71 4.16. Uticaj everolimusa na aktivnost enzima antioksidacione zaštite u I/R oštećenju bubrega Merenjem aktivnosti enzima antioksidacione zaštite, koji su aktivirani u I/R oštećenju u cilju neutralizacije dejstva slobodnih kiseoniĉnih radikala, posredno dobijamo uvid u intenzitet oksidativnog stresa. Promene aktivnosti enzima antioksidantne zaštite pod uticajem everolimusa prikazane su na slikama 30 i 31. 4.16.1. Aktivnost superoksid-dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) Netretirane ţivotinje pokazuju raniji i izraţeniji pad u SOD aktivnosti u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom (Slika 28A). Slika 30. Uticaj tretmana everolimusom na aktivnost superoksid-dismutaze (SOD) u I/R oštećenju bubrega miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0,01 u odnosu na „Sham“ grupu; # p<0,01, netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7). 72 Trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja netretirane ţivotinje pokazuju najmanju SOD aktivnost koja je znaĉajno manja od SOD aktivnosti izmerene tog dana u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,01). Znaĉajan pad u aktivnosti SOD kod ţivotinja tretiranih everolimusom u poreĊenju sa vrednostima izmerenim kod „Sham“- operisanih ţivotinja detektuje se tek prvog dana posle indukcije I/R oštećenja i dostiţe najmanje vrednosti drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja (p<0,01) (Slika 30). Smanjenje aktivnosti CAT, statistiĉki znaĉajno u poreĊenju sa „Sham“- operisanim ţivotinjama, registruje se tek drugog dana posle indukcije I/R oštećenja (p<0,01 za netretirane i p<0,05 za ţivotinje tretirane everolimusom) (Slika 31). Odrţaavanje znaĉajno smanjene aktivnosti uoĉava se do kraja opservacionog perioda (p<0,01 za obe eksperimentalne grupe) bez znaĉajnih razlika izmeĊu eksperimentalnih grupa. Slika 31. Uticaj tretmana everolimusom na aktivnost katalaze (CAT) u I/R oštećenju bubrega miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; **p<0,01 u odnosu na „Sham“ grupu; n=7). 73 4.15.2. Aktivnost glutation-reduktaze (GR) i glutation peroksidaze (GSH-Px) U poreĊenju sa „Sham“-operisanim ţivotinjama znaĉajan pad aktivnosti GR detektuje se u grupi netretiranih ţivotinja poĉev od 2 h (p<0,01) pa sve do 12 h posle indukcije I/R oštećenja (Slika 32). U navedenim vremenskim taĉkama aktivnost GR je znaĉajno niţa i od aktivnosti GR detektovane u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,01). Tokom celog perioda ispitivanja nije uoĉen znaĉajan pad aktivnosti GR u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom. Slika 32. Uticaj tretmana everolimusom na aktivnost glutation-reduktaze (GR) u I/R oštećenju bubrega miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0,01 u odnosu na „Sham“ grupu; # p<0,01, netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7). S obzirom da GR prevodi oksidovanu formu glutationa (GSSG) nastalog dejstvom GSH-Px u njegov redukovan oblik (GSH), to se pad aktivnosti ovog enzima oĉekuje nešto kasnije u odnosu na pad aktivnosti GSH-Px. Zaista, GSH-Px pokazuje 74 pad aktivnosti u obe eksperimentalne grupe u poreĊenju sa aktivnošću merenom u grupi Sham-operisanih ţivotinja već 30 min posle indukcije I/R oštećenja (p<0,01 za netretirane i p<0,05 za ţivotinje tretirane evrolimusom) (Slika 33). Smanjena GSH-Px aktivnost odrţava se prvih 12 h reperfuzije u grupi netretiranih ţivotinja i 6 h posle indukcije I/R oštećenja u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom. Posle poĉetnog perioda sniţenja aktivnosti GSH-Px sledi porast njegove aktivnosti u obe eksperimentalne grupe, a zatim ponovni pad aktivnosti u poreĊenju sa Sham-operisanim ţivotinjama drugog dana posle indukcije I/R oštećenja kod ţivotinja tretiranih everolimusom (p<0,05) i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja kod netretiranih ţivotinja (p<0,05). Slika 33. Uticaj tretmana everolimusom na aktivnost glutation-peroksidaze (GSH- Px) u I/R oštećenju bubrega miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednja vrednost ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0,01 u odnosu na „Sham“ grupu; n=7). 75 4.16. Produkcija iRNK za iNOS u I/R oštećenju bubrega Putem metode kvantitativnog PCR-a kvantifikovana je ekspresija iRNK za iNOS u tkivu bubrega miševa s obzirom da prooksidativni intracelularni milje dovodi do povećane ekspresije inducibilne NO-sintaze (iNOS). Netretirane ţivotinje pokazuju konstantan porast ekspresije iRNK za iNOS do kraja perioda ispitivanja (Slika 34). Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju sliĉan trend u porastu ekspresije iRNK za iNOS do drugog dana posle indukcije I/R oštećenja, kada dostiţe znaĉajno veću vrednost u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama (p<0,05). (Slika 34). Slika 34. Ekspresija iRNK za iNOS u I/R oštećenju bubrega miševa. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti povećanja ekspresije merene u odnosu na nivo ekspresije iRNK u „Sham“ grupi ± SE. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0,01 netretirane u poreĊenju sa tretiranim everolimusom; n=7) Sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja ekspresija iRNK za iNOS kod ţivotinja tretiranih everolimusom pokazuje skoro normalizovane vrednosti, znaĉajno manje u odnosu na vrednosti detektovane u grupi netretiranih ţivotinja (p<0,01) (Slika 76 34). Negativna korelacija izmeĊu ekspresije iRNK za iNOS i aktivnosti SOD naĊena je u obe eksperimentalne grupe (p<0,05, R= -0,667, za netretirane ţivotinje; p<0,01, R= - 0,894 za ţivotinje tretirane everolimusom) (Slika 35). Slika 35. Uporedni prikaz aktivnosti SOD i ekspresije iRNK za iNOS kao i meĎusobne negativne korelacije. (E – everolimus). 77 4.17. Ekspresija hem oksigenaze-1 (HO-1) u I/R oštećenju bubrega Vaţnu citoprotektivnu ulogu u I/R oštećenju igra hem oksigenaza-1 (HO-1), koja sem svojstva da smanji produkciju superoksidnog anjona, pokazuje i antiinflamatorno i antiapoptotsko dejstvo (146). Putem degradacije hema, HO-1 dovodi do produkcije CO koji utiĉe na oĉuvanje tkivne cirkulacije u toku reperfuzije (146). Uzevši u obzir citoprotektivno dejstvo HO-1, odreĊena je ekspresija HO-1 u citoplazmatskoj frakciji proteina tkiva bubrega putem Western blota. U grupi netretiranih ţivotinja ekspresija HO-1 je umereno povećana u prvim reperfuzionim satima, da bi 6 h posle indukcije I/R oštećenja ekspresija HO-1 pokazala nagli porast i nastavila da raste kontinuirano do trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja (Slika 36A). Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju smanjenje ekspresije HO-1 u ranim reperfuzionim satima ali već 6 sati posle indukcije I/R oštećenja, kao i kod netretiranih ţivotinja, porast ekspresije HO-1 se detektuje sve do kraja perioda observacije (Slika 36A). Denzitometrijska analiza pokazuje znaĉajno veću ekspresiju HO-1 u grupi netretiranih ţivotinja u poreĊenju sa nalazom HO-1 ekspresije kod ţivotinja tretiranih everolimusom u prvom satu reperfuzije (p<0,05), 2 h posle indukovanog I/R oštećenja (p<0,01) i drugog i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja (p<0,01) (Slika 36B). Sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju veću ekspresiju HO-1 u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama, ali ta razlika nije statistiĉki znaĉajna. 78 A) netretirane eve-tretirane Sh 0.5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d Sh 0.5h 1h 2h 6h 12h 1d 2d 3d 7d HO-1 β-aktin B) Slika 36. Ekspresiju hem-oksigenaze 1 (HO-1) u I/R oštećenju bubrega u miševa. (A) Prikaz reprezentativnih imunoblotova HO-1 netretiranih i ţivotinja tretiranih everolimusom. (B) Denzitometrijska analiza imunonoblotova HO-1 uraĊena je na odvojenim citoplazmatskim frakcijama 4 ţivotinje za svaku vremensku taĉku ispitivanja. Vrednosti ekspresije su prikazane u procentima u odnosu na vrednosti izmerene „Sham“ grupi. (eve ‒ everolimus; d ‒ dan; *p<0,05, **p<0.01, netretirane ţivotinje u poreĊenju sa tretiranim everolimusom). 79 5. DISKUSIJA U našem radu je uoĉeno da primena imunosupresiva mTOR inhibitora everolimusa utiĉe znaĉajno na razvoj, tok i ishod inflamacije u bubrezima eksperimentalnih ţivotinja nakon indukcije I/R oštećenja. Poslediĉno, dolazi i do promena funkcije bubrega mereno vrednošću uree i kreatinina. Eksperimentalni model I/R oštećenja pokazuje znaĉajno smanjenje bubreţne funkcije kako kod netretiranih ţivotinja, tako i kod ţivotinja tretiranih everolimusom, ali kod ţivotinja tretiranih everolimusom oporavak bubreţne funkcije kasni. Sedam dana posle indukcije I/R oštećenja vrednosti bubreţne funkcije kod ţivotinja tretiranih everolimusom se ne razlikuju znaĉajno od vrednosti izmerenih kako kod netretiranih ţivotinja, tako i kod intaktnih kontrola i „Sham“-operisanih ţivotinja. S obzirom da oporavak bubreţne funkcije kasni kod ţivotinja tretiranih everolimusom, moţe se zakljuĉiti da se posle trećeg dana oporavak bubreţne funkcije razvija brţe nego kod netretiranih ţivotinja. Uporedna analiza bubreţne funkcije i preţivljavanja pokazuje da se sedmodnevni period moţe podeliti na dva perioda: prvi koji obuhvata period do prva 2-3 dana i drugi period do kraja praćenja. Ovakva podela je primenjiva i kada se prati patohistološki nalaz tkiva bubrega posle I/R oštećenja gde se u prva 2-3 dana vidi najveća nekroza tkiva sa inflamatornom reakcijom, nakon ĉega zapoĉinju regenerativne i reparativne promene uz mogući razvoj fibroze (147). Najveća smrtnost se u obe grupe registruje drugog i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja kada se uoĉavaju i najveće vrednosti uree i kreatinina i najveće oštećenje tkiva na patohistologiji. Ţivotinje tretirane everolimusom imale su veću ukupnu smrtnost, ali se uporednom analizom preţivljavanja nije našla znaĉajna razlika. Ukoliko se izuzme jedan smrtni ishod uoĉen ĉetvrtog dana posle indukcije I/R oštećenja samo u grupi netretiranih ţivotinja, posle trećeg dana nije viĊen nijedan smrtni ishod u obe eksperimentalne grupe. Moţe se zakljuĉiti da je nešto nepovoljniji uticaj everolimusa uoĉen samo u ranoj, inflamatornoj fazi I/R oštećenja dok se u reparacionoj fazi oĉituje povoljan efekat everolimusa. Analizirajući moguće uzroke ovakvog efekta, uoĉena je bifazna ekspresija iRNK za hemokine, kako u grupi netretiranih, tako i u grupi ţivotinja tretiranih mTOR inhibitorom everolimusom, uz nalaz veće ekspresije iRNK za CCL3, CCL5 i CXCL10 u reparacionoj fazi kod netretiranih ţivotinja. Tretman everolimusom nije promenio 80 znaĉajno oblike ekspresije iRNK za hemokine CCL2, CCL3, CCL5 i CXCL10, ali je smanjio intenzitet njihove ekspresije. Prvi „pik“ ekspresije iRNK za hemokine predstavlja sam poĉetak rane faze koja se karakteriše zapaljenskom reakcijom u tkivu bubrega, i koja je u našem eksperimentalnom modelu pre svega reprezentovana znaĉajnim prisustvom F4/80 pozitivnih ćelija i povećanom ekspresijom iRNK za proinflamatorne citokine. Drugi „pik“ ekspresije korelira sa krajem rane, inflamatorne faze i poĉetkom faze reparacije oštećenog tkiva što daje jedno novo svetlo funkciji hemokina. U ranijim studijama uloga zapaljenja u I/R oštećenju je uglavnom ispitivana u prvih 24 do 72 h, potencirajući ne samo ulogu hemokina već i proinflamatornih citokina i ćelija zapaljenskog infiltrata (14, 68, 69, 76, 85, 86, 148, 149). Manji je broj radova koji prikazuje ulogu odreĊenih hemokina i ćelija, naroĉito makrofaga, u patogenezi I/R oštećenju bubrega 7 i 14 dana nakon izazvane ishemije (75, 150). Ukoliko se ispitivanje hemokinske ekspresije obavi u kasnijoj fazi, tj. nakon prvih 48 h reperfuzije moţe se uoĉiti da postoji drugi „pik“ ekspresije hemokina. U našem radu je pokazano ponovno povećanje broja F4/80 pozitivnih ćelija trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja kojem delimiĉno prethodi povećanje ekspresije iRNK za CCL3, a jednim delom i koincidira sa drugim „pikom“ ekspresije iRNK za CCL2. Postavlja se pitanje porekla F4/80 pozitivnih ćelija. Ranije se smatralo da je to bio marker makrofaga, ali je jasno pokazano da se on nalazi i na dendritskim ćelijama koje su inaĉe prisutne u tkivu zdravog bubrega (151). Fenotipska determinacija ćelija mononuklearno/fagocitnog sistema je priliĉno komplikovana i za sada nedovoljno jasna ukazujući na prisustvo heterogenih populacija. Monociti u krvi predstavljaju heterogenu grupu ćelija koje su prekursori tkivnih makrofaga i dendritskih ćelija. Mikrookolina unutar tkiva igra kljuĉnu ulogu u odreĊivanju fenotipa t.j. polarizacije ka makrofagima ili dendritskim ćelijama i promenama njihovog fenotipa u zavisnosti od promena uslova mikrookoline kao što je na primer prisustvo inflamacije i menjanje njenog toka i intenziteta (152). S obzirom da je znaĉajno povećanje broja F4/80 pozitivnih ćelija u tkivu bubrega već u prvim satima nakon indukcije I/R oštećenja asocirano sa povećanom ekspresijom iRNK za CCL2 i CCL3, te da je migracija monocita/makrofaga u inflamirano tkivo delom posredovana preko CCR2, receptora za CCL2 (152), moţe se indirektno zakljuĉiti da znaĉajno povećan broj F4/80 pozitivnih ćelija koji je uoĉen predstavlja makrofage. Veća 81 ekspresija CCL2 i CCL3 u ranim satima reperfuzije kod netretiranih ţivotinja je asocirana i sa većim brojem makrofaga u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom. Veći broj F4/80 pozitivnih ćelija u tkivu bubrega u grupi netretiranih ţivotinja u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom se odrţava do kraja ispitivanja tj. sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja, ali broj F4/80 pozitivnih ćelija kod ţivotinja tretiranih everolimusom se ne razlikuje znaĉajno od broja F4/80 pozitivnih ćelija uoĉenog kod „Sham“-operisanih ţivotinja. U radu Stroo i saradnika pokazano je takoĊe u mišjem modelu I/R oštećenja da postoji bifazna ekspresiju hemokina sa znaĉajnom infiltracijom makrofaga sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja (153). Za makrofage se veruje da igraju dvostruku ulogu u I/R oštećenju bubrega, kako proinflamatornu, tako i reparatornu. U ranoj fazi I/R oštećenja bubrega njihova infiltracija je uglavnom posredovana putem receptora CCR1, CCR2 i CX3CR1. Makrofagi u toj fazi uĉestvuju u zapaljenskom procesu i oštećenju tkiva produkujući proinflamatorne citokine kao što su TNF-α, IL-1α, IL-6, IL-12, favorizujući Th1 profil imunskog odgovora. Miševi kojima je genetskom manipulacijom uklonjen gen za CCR2 („knock-out“ za CCR2) imaju manji broj infiltrišućih F4/80 pozitivnih ćelija i znaĉajno manji stepen akutne tubulske nekroze (76, 148). Davanje u ranoj fazi I/R oštećenja bubrega antagonista za CCL2 koji predstavlja jedan od najpotentnijih hemokina za monocitno/makrofagnu liniju, u ranijoj nomenklaturi nazivan monocitno hemotaktiĉki protein-1 („monocyte chemotactic protein-1“ ‒ MCP-1), pokazalo se uspešnim u terapiji I/R oštećenja bubrega a rezultiralo je smanjenom infiltracijom CCR2 pozitivnih makrofaga (148). Za razliku od CCR2, miševi koji su „knock-out“ za CCR1 pokazuju znaĉajno manju infiltraciju makrofaga u I/R oštećenju bubrega miševa, ali se to nije odrazilo i na znaĉajno bolju funkciju bubrega niti na znaĉajno manji stepen tubulske nekroze. Pokazano je da preko aktivacije CCR1 makrofagi produkuju CCL3 i CCL5 što amplifikuje nov influks makrofaga u tkivo, ukazujući na pozitivnu povratnu spregu CCR1 zavisne infiltracije makrofaga u oštećeno tkivo bubrega (75). Prvi „pik“ ekspresije iRNK za hemokine je bio izmeĊu drugog i šestog sata reperfuzije sa izuzetkom CCL3, liganda za CCR1, kod koga je „pik“ uoĉen već 30 min nakon indukcije I/R oštećenja. Šest sati kasnije ekspresija iRNK za hemokine znaĉajno pada i odrţava se niskom sve do drugog i trećeg dana reperfuzije kada ponovo raste u 82 obe eksperimentalne grupe, što korelira sa novim influksom makrofaga. Drugog i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja beleţi se i porast ekspresije iRNK za ostale ispitivane hemokine uz napomenu da je ta ekspresija samo za CCL2 znaĉajno veća kod netretiranih ţivotinja u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom. Treći „pik“ ekspresije iRNK za CCL3, CCL5 i CXCL10 se u grupi netretiranih ţivotinja javlja u jasno definisanoj reparacionoj fazi, sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja. Odrţavanje znaĉajno veće ekspresije iRNK za CCL3, CCL5 i CXCL10 u kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja samo u grupi netretiranih ţivotinja korelira sa odrţavanjem povećanog broja makrofaga u tkivu bubrega koje mogu biti izvor produkcije navedenih hemokina. CXCL10 mogu da produkuju monociti/makrofagi, endotelne ćelije, fibroblasti. Pokazano je da CXCL10 kojeg produkuju makrofagi uĉestvuje u procesima reparacije tako što suprimira ekscesivnu proliferaciju tubularnih epitelnih ćelija (154). CXCL10 pored hemotaktiĉkog dejstva na T-limfocite i makrofage, pokazuje i angiostatski efekat (155, 156). Pokazano je da CXCL10 ispoljava suprotan efekat angiogenom dejstvu TGF-β, uĉestvujući tako u efikasnoj regeneraciji i utiĉući na process remodeliranja srĉanog tkiva nakon ishemijskog oštećenja (157). Receptor za CXCL10 je CXCR3 i moţe se naći kako na aktiviranim Th1 ćelijama, tako i na makrofagima i manjim delom na endotelnim ćelijama, a njegovom aktivacijom se podstiĉe zapaljenska reakcija i razvoj Th1 odgovora (158, 159). Već je pokazano da su „knock-out“ miševi za CXCR3 koji su podvrgnuti I/R oštećenju bubrega imali u poreĊenju sa divljim tipom miševa bolje preţivljavanje, manji porast serumskog kreatinina, manji zapaljenski infiltrat i manji stepen tubulske nekroze (149). U obe grupe ţivotinja nije uoĉena povećana ekspresija CXCR3 sve do sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja kada se uoĉava porast ekspresije iRNK za CXCR3 koji je znaĉajno veći u grupi netretiranih ţivotinja. S obzirom da u našem eksperimentalnom modelu imunohistohemijsko bojenje na CD3 marker nije pokazalo znaĉajno prisustvo T-limfocita u tkivu bubrega tokom celog perioda ispitivanja, moţe se indirektno zakljuĉiti da uoĉena povećana ekspresija CXCR3 sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja pripada makrofagima i delom endotelnim ćelijama. Uoĉen fenomen verovatno predstavlja homeostazni mehanizam u reparaciji tkiva u kojem makrofagi imaju znaĉajnu ulogu implicirajući razliĉite uloge 83 makrofaga i fenotipske polarizacije u zavisnosti od lokalne sredine (160, 161). Na osnovu fenotipskih markera do sada je diferencirano tri tipa makrofaga, M1, M2, M3, od kojih je M1 tip proinflmatorni, M2 tip antiinflamatorni dok M3 tip uĉestvuje u procesima reparacije i remodelovanja tkiva, ali su mogući i meĊutipovi (162, 163). U kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja makrofagi mogu dodatno štetno ili pozitivno uticati na krajnji ishod uĉestvujući kako u razvoju fibroze i znaĉajnoj produkciji ekstracelularnog matriksa sa tkivnim remodelovanjem, tako i u produkciji odreĊenih faktora rasta. Pokazano je da je adoptivni transfer makrofaga u regenerativnoj fazi I/R oštećenja uticao ne samo na bolje oĉuvanje tkiva već i na povećanje stepena regeneracije (164). SprovoĊenje razliĉitih procedura u ranoj fazi I/R oštećenja ima za cilj promenu broja i funkcije makrofaga u reparacionoj fazi I/R oštećenja. Ukoliko se nakon indukcije I/R oštećenja da lipozomalni klodronat, supstanca koja dovodi do deplecije makrofaga, dolazi do znatno sporijeg oporavka funkcije bubrega i duţeg trajanja procesa reparacije oštećenog tkiva (165). Suprotan efekat tj. povoljan uticaj smanjenog broja makrofaga na ishod I/R oštećenja pokazan je kod ţivotinja kojima je u ranoj fazi I/R oštećenja divan antagonista za CCL2 (166) . Makrofagi koji se uoĉavaju u reparacionoj fazi imaju antiiflamatorni fenotip (M2) a funkcionalno se karakterišu time da nakon aktivacije produkuju ekstracelularni matriks i antiiflamatorne citokine kao što su IL-10 i TGF-ß. Isto tako TGF-ß utiĉe da se makrofagi diferenciraju u tip M2. Povećana produkcija TGF-ß i faktora rasta kojeg produkuju trombociti („platelet derived growth factor“ ‒ PDGF) podstiĉe fibrozu što u krajnjem ishodu dovodi do smanjenja funkcije organa. Furuichi i koautori su pokazali da je blokada CX3CR1, receptora za fraktalkin CX3CL1, dovela ne samo do smanjenja infiltracije makrofaga već i do smanjenja fibroze tkiva bubrega (150). Ekspresija iRNK za TGF-ß u našem eksperimentalnom modelu znaĉajno raste u reparaciornoj fazi I/R oštećenja u grupi netretiranih ţivotinja, za razliku od ţivotinja tretiranih everolimusom kod kojih je skoro potpuno inhibirana njena ekspresiju. TGF-ß je citokin kojeg mogu sintetisati skoro svi tipovi ćelija i osim svog profibrotskog efekta pokazuje i proapoptozna svojstva, ali moţe i da stimuliše epitelno- mezenhimalnu tranziciju (167). Pokazana je povećana ekspresija TGF-ß kao i receptora za TGF-ß u regenerišućim tubularnim epitelnim ćelijama nakon I/R oštećenja (168, 84 169). To bi moglo znaĉiti da izvor TGF-ß u našem eksperimentalnom modelu sem makrofaga mogu biti i regenerišuće tubularne epitelne ćelij. Ukoliko su infiltrišući makrofagi glavni izvor produkovanog TGF-ß sedmog dana reperfuzije u našem eksperimentalnom modelu, moţe se indirektno zakljuĉiti da se razliĉita makrofagna polarizacija odigrava kod netretiranih u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom, te da je moguć i kasniji razvoj fibroze kod netretiranih ţivotinja. Obrnuto, ukoliko su regenerišuće tubularne epitelne ćelije glavni izvor produkcije TGF-β, onda je smanjeni stepen regeneracije tubularnih epitelnih ćelija koji se oĉekuje u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom na osnovu prethodno iznetih podataka iz radova drugih autora, u korelaciji sa smanjenom ekspresijom TGF-ß. Radi preciznijeg tumaĉenja neophodno je uraditi dodatna imunohistohemijska bojenja u cilju identifikacije izvora TGF-β, stepena fibroze i stepena proliferacije, odnosno regeneracije tubularnih epitelnih ćelija kao i dalju analizu ekspresije iRNK za TGF-ß u kasnijem periodu nakon 2-4 nedelje. Analiza ekspresije drugog antiinflamatornog citokina IL-10 pokazuje takoĊe dva „pika“ ekspresije u ranom periodu I/R oštećenja sa kasnijim odrţavanjem nešto veće ekspresije u grupi netretiranih ţivotinja sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja, te se stiĉe utisak da je kriva ekspresije IL-10 odgovor na prethodnu produkciju i dejstvo proinflamatornih citokina. IL-10 inhibira ranu fazu inflamacije blokirajući produkciju brojnih hemokina, proinflamatornih citokina, ekspresiju adhezivnih molekula i aktivacije makrofaga i neutrofila. Luĉe ga T-limfociti i makrofagi. U radu Denga i autora pokazano je da egzogeno dodavanje IL-10 inhibira ekspresiju iRNK za ICAM-1, TNF-α i iNOS i smanjuje oštećenja bubrega u mišjem modelu I/R oštećenja i akutnog oštećenja bubrega uzrokovanog dejstvom cisplatina (170). U istom radu je pokazano da je IL-10 znaĉajno smanjio i ekspresiju markera apoptoze dokazane imunohistohemijskim TUNEL bojenjem kao i markera progresije u ćelijskom ciklusu, nuklearnog antigena proliferišućih ćelija („proliferating cell nuclear antigen“ ‒ PCNA). Miševi tretirani anti-IL10 antitelima u modelu I/R oštećenja pokazuju znaĉajno veće oštećenje bubreţne funkcije izraţene vrednošću uree u serumu u odnosu na kontrolnu grupu ţivotinja podvrgnutih samo I/R oštećenju, dok se u njihovim bubrezima nalazi povećana ekspresija TNF-α, zapaljenska reakcija i indeks apoptoze (171). U istom radu je detektovana i povećana ekspresija iRNK za IL-10 u bubrezima miševa povrgnutih I/R oštećenju, što je pokazano i u našem radu. 85 Ukoliko se TNF-α shvati kao jedan od glavnih proinflamatornih citokina, onda je i povećana ekspresija iRNK za IL-10 logiĉan odgovor antiinflamatornih mehanizama. U reparatornoj fazi I/R oštećenja ekspresija iRNK za IL-10 nije takvog intenziteta kao u inflamatornoj fazi, ali je ipak veća u grupi netretiranih ţivotinja, što moţe biti posledica makrofagne polarizacije u pravcu M2 tipa. Istovremeno, ţivotinje tretirane everolimusom ne pokazuju povećanje produkcije iRNK za IL-10 što moţe biti posledica smanjene makrofagne produkcije IL-10 pod uticajem mTOR inhibicije, kako je već pokazano u radovima drugih autora (118, 172). Mišji i humani makrofagi pod uticajem mTOR inhibitora sirolimusa nakon stimulacije lipopolisaharidom (LPS) znaĉajno smanjuju produkciju IL-10 a povećavaju produkciju IL-12 (117, 121). mTOR inhibicija štiti miševe od infekcije Listeriom monocytogenes tako što podstiĉe makrofage da produkuju IL-12, IL-23, TNF-α i IL-6 (118). Povećana makrofagna produkcija TNF-α pod dejstvom mTOR inhibitora sirolimusa se ostvaruje posredstvom povećane aktivnosti transkripcionog faktora NF-κB, dok je smanjena produkcija IL-10 posledica smanjene aktivnosti STAT3 (118, 121). U našem radu je uoĉena bimodalna ekspresija iRNK za TNF-α. Prvi „pik“ ekspresije javlja se u prvim reperfuzionim satima u obe grupe i znaĉajno je veći u samom poĉetku reperfuzije kod ţivotinja tretiranih everolimusom. Ponovni porast iRNK za TNF-α se uoĉava prvog, drugog i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja pri ĉemu drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja on dostiţe najveću vrednost u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom, što korelira sa znaĉajno povećanim indeksom tubulointersticijumskog oštećenja tj. stepenom nekroze/apoptoze. Netretirane ţivotinje pokazuju znaĉajno veću ekspresiju iRNK za TNF-α u odnosu na ţivotinje tretirane everolimusom jedino prvog dana posle indukcije I/R oštećenja. Pokazano je da u uslovima ishemije tubularne epitelne ćelije povećavaju produkciju TNF-α što dovodi do TNF-α-zavisne apoptoze (171, 173), te se indirektno moţe zakljuĉiti da su pored makrofaga i tubularne epitelne ćelije izvor TNF-α. Sliĉna situacija se moţe uoĉiti i kod ekspresije iRNK za IL-1ß. Ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću ekspresiju iRNK za IL-1β u ranim reperfuzionim satima, kao i drugog dana posle indukcije I/R oštećenja. Izvor produkcije IL-1ß mogu biti kako tubularne epitelne ćelije tako i infiltrišući makrofagi. Pokazano je 86 da se u uslovima mTOR inhibicije aktivira kaspaza-1 koja oslobaĊa IL-1ß (172). U našem radu nije odreĊivana koncentracija bioaktivnog proteina IL-1ß već je dokazana povećana transkripcija tj. sinteza iRNK za IL-1ß u uslovima m-TOR inhibicije, što je moguće posledica dokazane povećane aktivnosti NF-κB. Ĉinjenica koja se ne moţe zanemariti je povećani stepen apoptoze/nekroze u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom koji korelira sa povećanom ekspresijom iRNK za TNF-α i IL-1ß. Zaista, ćelije u procesu umiranja mogu da aktiviraju uroĊenu imunost i sterilni inflamatorni odgovor aktivirajući Nlrp 3 inflamazome što rezultuje povećanim oslobaĊanjem IL-1ß (174). MeĊutim, kako je već naglašeno, drugog dana posle indukcije I/R oštećenja, nismo registrovali znaĉajnu makrofagnu infiltraciju te se tubularne epitelne ćelije nameću kao glavni izvor povećane sinteze IL-1ß a ne makrofagi. To je i pokazano u radu Wu i koautora gde je uoĉeno da je aktivacija proinflamatornog fenotipa tubularnih epitelnih ćelija preko TLR-4 jedan od kljuĉnih fenomena u razvoju I/R oštećenja u bubrezima (73). Tubularne epitelne ćelije se preko aktiviranih TLR-4 javaljaju kao znaĉajan izvor proinflamatornih citokina i hemokina a samim tim i regulatora inflamatornog odgovora u bubrezima u toku I/R oštećenja (73, 175). Tubularne epitelne ćelije kojima nedostaje TLR-4 su zaštićene i od procesa apoptoze, a miševi koji imaju kompetetne leukocite i tubularne epitelne ćelije bez TLR-4 pokazuju znatno manji stepen oštećenja bubrega u I/R oštećenju nego što to pokazuju miševi na ĉijim tubularnim epitelnim ćelijama se moţe naći TLR-4 ekspresija, ali na leukocitima nedostaju TLR-4 (73). Prethodno navedene ĉinjenice ukazuju na potencijal mTOR inhibicije u kreiranju proinflamatornog miljea koji se ogleda u sposobnosti aktivacije uroĊene imunosti, što je poţeljan efekat u antitumorskoj odbrani. Sa druge strane mTOR inhibitori koĉe sazrevanje dendritskih ćelija, vaţnih inicijatora steĉenog imunskog odgovora. Moguće je i da je manji broj F4/80 pozitivnih ćelija u reparacionoj fazi I/R oštećenja bubrega kod ţivotinja tretiranih everolimusom posledica smanjenog prisustva aktiviranih dendritskih ćelija, ali je neophodno specifiĉno bojenje na CD11c marker u cilju preciznijeg odreĊivanja broja dendritskih ćelija. Imunosupresivne efekte mTOR inhibitori ostvaruju blokadom ili aktivacijom razliĉitih sekundarnih glasnika, meĊu kojim se nalazi i NF-κB. U našem radu smo 87 definitivno pokazali u proteinskom nuklearnom izolatu tkiva bubrega miševa tretiranih everolimusom povećanu aktivnost NF-κB koja u stvari znaĉi povećano vezivanje NF- κB za specifiĉni, promoterski region genoma. Kriva aktivnosti pokazuje konstantan porast aktivnosti NF-κB nakon drugog sata reperfuzije u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom, za razliku od ţivotinja koje nisu bile tretirane everolimusom i kod kojih je takoĊe pokazano povećano vezivanje NF-κB za genom, ali sa jasno izdvojenim „pikovima“, pokazujući cikliĉnu aktivnost. U brojnim radovima je pokazana povećana aktivnost NF-κB u I/R oštećenju bubrega, kao i pozitivan uticaj blokade aktivnosti NF- κB na ishod I/R oštećenja mereno oporavkom bubreţne funkcije, histopatološkim promenama i parametrima zapaljenske reakcije (36, 37, 43, 176, 177, 178). Kao što je već reĉeno u uvodu, NF-κB je jedan od kljuĉnih transkripcionih faktora koji uĉestvuje u regulaciji zapaljenja i mogu ga aktivirati slobodni kiseoniĉni radikali, endogeni ligandi za TLR, IL-1ß, TNF-α. Vaţi i obratno, tj. NF-κB povećava transkripciju gena za TNF-α, IL-1ß, IL-6, CCL2, CCL5, iNOS, ICAM-1 itd. Kao dokaz klasiĉnog puta aktivacije NF-κB ispitivana je ekspresija fosfo-IκBα u citoplazmatskoj proteinskoj frakciji. Denzitometrijskom analizom se nalazi sliĉna kriva u obe eksperimentalne grupe sa dva izraţenija „pika“ ekspresije; prvog dana i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja. U periodu od 6 h do prvog dana nakon indukcije I/R oštećenja, beleţi se konstantan porast u ekspresiji fosfo-IκBα. Bez obzira što je u meĊusobnom poreĊenju naĊena u odreĊenim vremenskim taĉkama statistiĉki znaĉajno veća ekspresija kod ţivotinja koje nisu bile tretirane everolimusom, moţe se reći da su i ţivotinje tretirane everolimusom imale znaĉajno veću ekspresiju u odnosu na Sham- operisane ţivotinje i intaktnu kontrolu. Mereno ekspresijom p65 u nuklearnoj proteinskoj frakciji ţivotinje tretirane everolimusom pokazuju znaĉajno veću translokaciju p65 u jedro u toku prva dva sata reperfuzije kao i drugog dana posle indukcij I/R oštećenja. Vaţno je napomenuti da znaĉajno veća nuklearna ekspresije p65 i vezivanje NF-κB za DNK kod ţivotinja tretiranih everolimusom drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja koincidira sa nalazom najvećeg tubulointersticijumskog oštećenja i povećane ekspresije iRNK za TNF-α. Nasuprot njima, netretirane ţivotinje ne pokazuju jasnu asociranost translokacije p65 u jedro sa povećanom ekspresijom iRNK za TNF-α s obzirom da se uoĉava povećana nuklearna ekspresija p65 i trećeg i sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja kada ekspresija iRNK za TNF-α znaĉajno 88 pada. Moguće objašnjenje treba traţiti u sloţenoj dinamici i regulaciji aktivnosti transkripcionih faktora NF-κB familije koja je dodatno modifikovana mTOR inhibicijom. Istovremenim praćenjem intenziteta aktivnosti vezivanja NF-κB i nuklearne translokacije p65 ne nalazi se u svim vremenskim taĉkama pozitivna korelacija, što ukazuje i na aktivnosti drugih komponenti NF-κB. Diskrepanca se naroĉito uoĉava trećeg i sedmog dana nakon indukcije I/R oštećenja kada se kod ţivotinja tretiranih everolimusom beleţi pad u nuklearnoj ekspresiji p65 uz istovremeni porast aktivnosti vezivanja NF-κB za DNK. Moţe se zakljuĉiti da postoji i alternativni put aktivacije NF-κB u našem eksperimentalnom modelu I/R oštećenja, koja je pokazana izmerenom povećanom ekspresijom RelB u nuklearnoj frakciji kod ţivotinja tretiranih everolimusom u reparatornoj fazi I/R oštećenja. Sloţena dinamika promena aktivnosti NF-κB i njegovih specifiĉnih komponenti ukazuje na priliĉno kompleksnu ulogu NF-κB. Većina dosadašnjih radova se bavila ispitivanjem aktivnosti NF-κB i uticajem inhibicije aktivnosti NF-κB na ishod I/R oštećenja bubrega merenjem ekspresije komponenti NF-κB familije transkripcionih faktora, intenziteta vezivanja NF-κB za DNK, stepena oštećenja tkiva i zapaljenja, ali uglavnom ispitujući prvi dan nakon indukcije I/R oštećenja (43, 176, 178). Zakljuĉak u svim navedenim eksperimentalnim studijama je da inhibicija NF-κB aktivnosti smanjuje intenzitet zapaljenja i tubularnog oštećenja. U našem radu je praćen period od sedam dana, jasno pokazujući aktivaciju NF- κB i translokaciju u jedro aktiviranjem i klasiĉnog i alternativnog puta, kako u ranoj tako i u kasnoj reparaciornoj fazi. Talasi NF-κB aktivnosti odreĊuju razliĉite vremenski kodirane molekularne profile sa razliĉitim funkcijama. Kako je već naglašeno u uvodu rada, u razliĉitim vremenskim taĉkama aktivira se transkripcija razliĉitih gena u zavisnosti od vrste i koncentracije hetero ili homodimera koji pripada NF-κB familiji, duţini njegovog delovanja, prisutnih koaktivatora, korepresora, posttranslacione modifikacije koja obuhvata fosforilaciju i acetilaciju uglavnom p65 i hromatinske modifikacije koja odreĊuje pristup specifiĉnim, prepoznatljivim κB motivima u promoterskom regionu, kao i od prisutnosti drugih transkripcionih faktora koji su nastali u unakrsnom razgovoru drugih signalnih puteva aktiviranih stimulusom koji je aktivirao i NF-κB (54). Rani geni koji su aktivirani dejstvom NF-κB su negativni 89 regulatori NF-κB aktivnosti (IκBα, IκBε) i inflamatorni citokini kao što su IL-6, CCL2, IL-8, CXCL-10 (54, 179, 180). Transkripcija kasnih gena se odigrava kada aktivacija NF-κB traje najmanje 1 h, i to su geni za odreĊene ćelijske receptore, adhezivne molekule, signalne adaptere (181). Kasni talas genske transkripcije moţe zavisiti od alternativnog puta koji rezultuje ulaskom u jedro heterodimera RelB/p52 i aktiviranjem širokog spektra gena (182). Analiziranjem genske ekspresije unutar prvih nekoliko sati od aktivacije ustanovljava se da je većina gena regulisana heterodimerom p65/p50. MeĊutim, RelB/p52 heterodimer moţe u kasnijem period imati širi spektar u aktiviranju genske ekspresije, pošto se RelB/p52 heterodimeri osim vezivanja za klasiĉne κB motive, vezuju i za jedinstvenu klasu genskih sekvenci prisutnih u promoterskim regionima izvesnih hemokina koja sadrţe κB mesta razliĉita od klasiĉnih κB motiva, kao što su hemokinski ligand 19 sa CC motivom (CCL19) i hemokinski ligand 21 sa CC motivom (CCL21) (65, 182). TNF superfamilija citokina predstavlja jedan od najvaţnijih aktivatora NF-κB. Dva najznaĉajnija predstavnika ove familije su TNF-α i Tweak (183). TNF-α uglavnom aktivira kanoniĉki NF-κB put koji se karakteriše prisustvom p65 u heterodimernim kompleksima, dok Tweak aktivira kako kanoniĉki put, tako i alternativni NF-κB put koji se karakteriše prisustvom RelB/p52 u jedru (65, 184). Oba citokina dovode do povećane transkripcije gena za CCL2 i CCL5, ali samo Twak indukuje kasnu transkripciju CCL19 i CCL21, koja je posredovana aktivnošću NIK (65). Dokazana je uloga Tweak u eksperimentalnom modelu akutnog endotoksemijskog oštećenja bubrega (65). U našem eksperimentalnom modelu porast vezivanja NF-kB za DNK kod ţivotinja tretiranih everolimusom bio je udruţen sa konstantnim porastom u fosforilaciji p65, koja kulminira drugog dana reperfuzije i sa povećanom ekspresijom RelB u nuklearnoj proteinskoj frakciji koja se nastavlja i u kasnoj fazi I/R oštećenja. S obzirom da je povećano prisustvo RelB u jedru posledica aktivacije alternativnog puta u kojem NIK i IKKα igraju bitnu ulogu, moţe se zakljuĉiti da aktivacija IKKα moţe biti asocirana sa povećanim vezivanjem NF-kB za DNK kod ţivotinja tretiranih everolimusom u eksperimentalnom modelu I/R oštećenja. Uloga RelB u finom moduliranju NF-κB aktivnosti je još nedovoljno ispitanja u eksperimentalnim modelima bubreţnog oštećenja, ali je u do sada sprovedenim studijama pokazana antiinflamatorna uloga RelB kao i regulatorna uloga RelB u tranziciji uroĊenog u steĉeni imunski 90 odgovor (185, 186). Miševi koji su bili "knock-out" za RelB imali su multifokalnu inflamatornu bolest (187). Moguće je da je povećno prisustvo i dejstvo RelB u jedru u našem eksperimentalnom modelu kod ţivotinja tretiranih everolimusom nastalo kao posledica izraţene aktivacije uroĊenog imunskog odgovora merenog povećanom ekspresijom iRNK za IL-1β i TNF-α, i da je dovelo do smanjene transkripcije gena za ispitivane hemokine u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama. Fosforilacija p65 na mestu Ser 536 znaĉajno povećeva transkripcionu aktivnost heterodimera p65/p50. Zbog toga je uraĊeno odreĊivanje eskpresije fosfo-p65(Ser536) koja u obe grupe ţivotinja pokazuje sliĉnu krivu ekspresije kao i ekspresija p65 u odgovarajućoj eksperimantalnoj grupi. Fosfo-p65(Ser536) ekspresija u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom pokazuje znaĉajno veću ekspresiju u ranima satima (prvi i dugi sat reperfuzije), kao i drugog dana nakon indukcije I/R oštećenja kada korelira i sa znaĉajno većim indeksom tubulointersticijumskog oštećenja i sa većom ekspresijom iRNK za TNF-α i IL-1β. Postoje dokazi da je nuklearna fosforilacija p65 na poziciji Ser 536 posredovana dejstvom IKKß i kontrolisana funkcijom molekula zvanog Akt (188, 189, 190), mada se ne moţe zanemariti i uloga IKKα u fosforilaciji transaktivacionog domena p65 (191). TNF-α i IL-1ß mogu koristiti ovaj alternativni put u ostvarivanju svojih dejstava u ćeliji (189). Poznato je da mTOR inhibicija povratnim mehanizmom dovodi do smanjene fosforilacije Akta i samim tim njegove aktivacije (103, 192), te da je povećana translokacija Akta u jedro viĊena u uzorcima biopsije transplantiranog bubrega kod pacijenata sa odloţenom funkcijom grafta („delayed graft function“‒ DGF) koji su bili leĉeni rapamicinom, ali takoĊe i u svinjskom modelu I/R oštećenja bez tretmana m-TOR inhibitorima (193). Indirektno se moţe zakljuĉiti da je u I/R oštećenju pod mTOR inhibicijom funkcija Akt-a povećana te je samim tim i fosforilacija p65 na poziciji Ser 536 povećana pod mTOR inhibicijom, što dodatno modifikuje transkripcionu aktivnost NF-κB. Navedeni podaci ukazuju na ulogu TNF-α i IL-1ß u povećanju transkripcione aktivnosti NF-κB aktiviranjem IKKβ koja sem kljuĉne uloge u kanoniĉkom putu dodatno fosforiliše transaktivacioni domen p65 na poziciji Ser536. Povećana aktivnost IKKß merena povećanom ekspresijom fosfo-IκBα(Ser32/36) u citoplazmatskoj proteinskoj frakciji u obe grupe ţivotinja uoĉena je tokom celog perioda praćenja, ali nije uoĉena direktna korelacija sa ekspresijom fosfo-p65(Ser536) u svim 91 vremenskim taĉkama što ukazuje na dodatne mehanizme regulacije fosforilacije p65, moguće putem direktne fosforilacije posredovane aktivnošću IKKα. Samoograniĉavanje prvobitne proinflamatorne uloge, NF-κB postiţe povećanom transkripcijom gena za IκBα koji vezivanjem za NF-κB heterodimer u citoplazmi dovodi do njegove inaktivacije kao i povećanim vezivanjem u jedru homo- ili heterodimera p50 i p52 koji vrše represiju κB-zavisne transkripcije, ostvarujući na taj naĉin antiinflamatorni efekat (44, 54). Do sada je uglavnom dokazivana antiinflamatorna uloga homodimera p50. U našim rezultatima pokazana je znaĉajno veća ekspresija IκBα kod netretiranih ţivotinja u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom što se moţe tumaĉiti kao izraz kompenzatorne reakcije u cilju smanjenja intenziteta transkripcije proinflamatornih gena. S obzirom da je već pokazana povećana ekspresija RelB kod ţivotinja tretiranih everolimusom i naglašena njegova moguća antiinflamatorna uloga te da se RelB vezuje u jedru uglavnom preko heterodimera RelB/p52, uraĊena je nuklearna ekspresija p52 poĉev od drugog dana posle indukcije I/R oštećenja kada se uoĉava najznaĉajnije tubulointersticijumsko oštećenje, pa do kraja ispitivanja. Uoĉena je konstantno prisutna ekspresija p52 kod ţivotinja tretiranih everolimusom. Za razliku od njih, netretirane ţivotinje su imale skoro potpuno inhibiranu ekspresiju drugog dana i znaĉajnu ekspresiju trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja. Uoĉena kinetika ekspresije nije bila u korelaciji sa naĊenom ekspresijom RelB, te se indirektno moţe zakljuĉiti da postoji nuklearno prisustvo p52 nezavisno od RelB. Radi preciznog utvrĊivanja, neophodno je uraditi „superšift“ eseje upotrebom specifiĉnih antitela za odreĊene komponente NF-κB familije transkripcionih faktora. Jedan od prvih ĉinioca koji pokreće aktivnost NF-κB su slobodni kiseoniĉni radikali, ĉija produkcija zanaĉajno raste već u prvim minutima reperfuzije. Pokazano je da se I/R oštećenje karakteriše smanjenim sadrţajem GSH i povećanim sadrţajem GSSG (194), što uz smanjenje NADPH predstavlja markere izraţene oksidacije i oksidativnog stresa koji dovodi do aktivacije brojnih puteva koji uĉestvuju u oštećenju ćelija u I/R fenomenu. Prooksidativni efekat everolimusa moţe biti povezan sa primarnom funkcijom mTOR inhibitora s obzirom da mTOR inhibitori predisponiraju ćeliju za smanjenu produkciju NADPH. Navedeno tvrĊenje proistiĉe iz ĉinjenica da aktivacija mTORC1 stimuliše anaboliĉke procese i meĊu njima pentozo-monofosfatni 92 put koji predstavlja jedan od glavnih izvora NADPH te da rapamicin blokira insulinom indukovanu ekspresiju glukozo-6-fosfat-dehidrogenaze, kljuĉnog enzima pentozo- monofosfatnog puta (195, 196, 197). Dodatno se prooksidativni efekat everolimusa ogleda i u tome što inhibicija mTOR rezultuje u inhibiranoj respiraciji u mitohondrijama koja podstiĉe produkciju superoksida (198, 199). Dakle, smanjujući potrošnju kiseonika, mitohondrijalne respiracije i preuzimanje nutrijenata, mTOR inhibitori smanjuju oksidativnu fosforilaciju i preusmeravaju metabolizam piruvata iz mitohodrija u citoplazmatski prostor sa porastom glikolitiĉkih intermedijarnih produkata i laktata. Jedna studija je pokazala da je tretman ţivotinja everolimusom podvrgnutih I/R oštećenju bubrega doveo do znaĉajnijeg oštećenja bubreţne funkcije koja je merena 24 h nakon indukcije I/R oštećenja uz smanjenje lipidne peroksidacije (200). Ovde je vaţno napomenuti da nije superoksidni anjon direktno ukljuĉen u lipidnu peroksidaciju s obzirom da je negativno naelektrisan. Moguće je da everolimus dovodi do produkcije hidroksilnog radikala putem helacije gvoţĊa i poslediĉne supresije Fentonove reakcije. Izmerena aktivnost antoksidantnih enzima u I/R oštećenju implicira da I/R oštećenje suprimira aktivnost SOD što ĉini priliĉno štetnu kombinaciju koja promoviše prooksidativni milje, s obzirom da je smanjena efikasnost odbrane. Nasuprot tome, tretman everolimusom delimiĉno spreĉava navedene efekte I/R oštećenja s obzirom da istovremeno promoviše oksidativni stres ali ne redukuje znaĉajno aktivnost SOD. Sliĉno je zapaţeno i sa aktivnošću GR koja nije bila znaĉajno sniţena kod ţivotinja tretiranih everolimusom. Efekti everolimusa na aktivnost GR moţe da predstavlja eho dejstva everolimusa na nivo GSH. Naime, deplecija GSH stimulisana everolimusom moţe aktivirati ćelijski odgovor koji se ogleda u odrţavanju povećane aktivnosti GR u cilju regeneracije GSH iz akumuliranog GSSG. Iz dobijenih rezultata aktivnosti antioksidantnih enzima moţe se zakljuĉiti da I/R oštećenje suprimira njihovu aktivnost što delom predstavlja uzrok oštećenja bubreţnog tkiva oksidativnim stresom u uslovima I/R oštećenja. Sa druge strane jasno je da prooksidativni efekat everolimusa u I/R oštećenju bubrega nije povezan sa efektima everolimusa na antioksidantne enzime. Vremenski zavisna kinetika enzima koja pokazuje pad aktivnosti SOD, CAT i GSH-Px drugog i trećeg dana posle indukcije I/R oštećenja ukazuje na veliku aktivnost 93 oksidativnog stresa koja se dešava upravo kada se uoĉava i najveće tkivno oštećenje izraţeno indeksom tubularnog oštećenja tj. nekroze kod obe grupe ţivotinja. Detektovana sniţena aktivnost SOD moţe biti uzrokovana i direktnim toksiĉnim dejstvom peroksinitrita koji nastaju kombinovanom produkcijom NO i superoksidnog anjona. Peroksinitriti oštećuju proteine i DNK i utiĉu na funkciju mitohondrija. Negativna asocijacija izmeĊu iNOS i aktivnosti SOD pokazana je u sluĉaju direktne nitrozilacije tirozinskih rezidua u molekulu SOD (25). Negativna korelacija vrednosti iRNK za iNOS i SOD pokazana je u obe eksperimentalne grupe ukazujući na potencijalnu ulogu peroksinitrita u smanjenju aktivnosti SOD. Znaĉaj iNOS u I/R oštećenju se ogleda u ĉinjenicama da inhibicija transkripcije iRNK za iNOS upotrebom „antisense“ oligodeoksinukleotida ili upotreba specifiĉnih inhibitora iNOS smanjuje stepen akutne bubreţne insuficijencije kod pacova podvrgnutih I/R oštećenju (24, 201). U normalnom tkivu nivo iNOS je skoro nula, meĊutim kada je znaĉajno eksprimiran kao u I/R oštećenju tkivne koncentracije NO se mere u mM. NF-κB se javlja kao jedan od glavnih transkripcionih faktora za iNOS. NO nastaje iz L-arginina dejstvom NO- sintaza. Postoje tri forme NO-sintaza: neuronalna (nNOS), endotelna (eNOS) i inducibilna (iNOS). Sve tri forme su eksprimirane u razliĉitim delovima tkiva bubrega, ali se ekspresija iNOS znaĉajno povećava u I/R oštećenju doprinoseći ukupnom oštećenju tkiva s obzirom da NO u velikoj koncentraciji osim citotoksiĉnog ima i proinflamatorno dejstvo (202, 203, 204, 205). Izvor iNOS mogu biti kako epitelne ćelije proksimalnih tubula, tako i makrofage koje infiltrišu ishemijski bubreg. Postoje podaci koji pokazuju ekspresiju iRNK za iNOS u bazalnim uslovima u tubularnim epitelnim ćelijama, koja je homologna makrofagnoj iRNK za iNOS (macNOS) (203, 206). Inhibiranjem macNOS upotrebom specifiĉnih antisense nukleotida, Noiri i saradnici su pokazali u pacovskom modelu I/R oštećenja ublaţavanje funkcionalnih i histoloških promena (201). NO inhibira transport elektrona u mitohondrijama što rezultuje u povećanoj produkciji superoksidnog anjona. Superoksid se prevodi u H2O2 koji lako difunduje iz mitohondrija (199). Navedeni podaci ukazuju na efekat I/R oštećenja na povećane aktivnosti iNOS, što je everolimusom bilo dodatno potencirano. Mi smo detektovali povećanu transkripciju iRNK za iNOS u obe eksperimentalne grupe, ali znaĉajno veću u grupi ţivotinja tretiranih everolimusom drugog dana I/R oštećenja što je korespondiralo i sa znaĉajno većim oštećenjem tkiva u istoj grupi ţivotinja, 94 povećanom nuklearnom ekspresijom p65 i povećanim intenzitetom vezivanja NF-κB za DNK u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama. U kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja, ekspresija iRNK za iNOS poĉinje da opada kod ţivotinja tretiranih everolimusom, dok netretirane ţivotinje pokazuju konstantan porast u ekspresiji iRNK za iNOS. Porast ekspresije iRNK za iNOS kod netretiranih ţivotinja u reparatornoj fazi koincidira sa povećanom infiltracijom makrofaga u bubregu koje bi mogle biti izvor povećane produkcije NO na kraju perioda posmatranja. U našem eksperimentalnom modelu I/R oštećenja naĊena je povećana ekspresija HO-1 koja predstavlja komponentu antioksidantne zaštite. HO-1 se javlja kao jedan od najvaţnijih citoprotektivnih molekula u ćelijskom stresu izazavnim razliĉitim stimulusima kao što su I/R oštećenje i radijacija, ostvarujući svoje antioksidantno i antiapoptotsko dejstvo (207). HO-1 katabolizuje hem uz oslobaĊanje biliverdina i CO koji imaju imunomodulatorno, antiapoptotsko, a u sluĉaju CO i vazoaktivno dejstvo (208). Postoje dokazi da u tkivu podvrgnutom I/R oštećenju nastali azot monoksid (NO) podstiĉe gubitak transkripta za HO-1 (209). Pokazano je takoĊe da NO ostvaruje i suprotan efekat dovodeći do povećane ekspresije HO-1, ukazujući na kompleksne nivoe regulacije NO i HO-1 (210, 211). Sa druge strane, indukcija ekspresije HO-1 pokazuje koristan efekat u bubreţnom oštećenju nastalom nakon ishemije zato što smanjuje produkciju NO, nakon ĉega dolazi do smanjene produkcije peroksinitrita (212). Navedeni efekat povećanja ekspresije HO-1 u I/R oštećenju bio je suprimiran kod ţivotinja tretiranih everolimusom u prva dva sata reperfuzije potvrĊujući da everolimus promoviše pad redoks statusa u tkivu bubrega u I/R oštećenju. Ovo je u suprotnosti sa rapamicinom za koji je pokazano da povećava ekspresiju HO-1 (213, 214). Razliĉiti efekti navedena dva mTOR inhibitora ukazuju da mTOR receptor ne mora biti ukljuĉen u regulaciju HO-1 ekspresije, ili da everolimus i/ili rapamicin mogu uticati na HO-1 ekspresiju drugim putevima. Dodatni uzrok smanjene aktivnosti i ekspresije HO-1 kod ţivotinja podvrgnutih I/R oštećenju bubrega i tretmanu everolimusom bi mogao biti i deficit NADPH kojeg HO-1 koristi u degradaciji hema (215, 216). Od znaĉaja je podatak objavljen u jednoj studiji I/R oštećenja jetre da je povećana ekspresija iRNK za HO-1 kao i ekspresija proteina HO-1 naĊena već u samom poĉetku reperfuzione faze (217). Moţe se spekulisati da i I/R oštećenje bubrega utiĉe na ekspresiju HO-1 na sliĉan naĉin. Vaţno je napomenuti da je 6 h nakon indukcije I/R oštećenja kod ţivotinja 95 tretiranih everolimusom poĉela znaĉajno da raste ekspresija HO-1 koja je ponovo drugog i trećeg dana nakon indukcije I/R oštećenja znaĉajno manja u odnosu na netretirane ţivotinje što koincidira i sa znaĉajno većim oštećenjem tkiva. Navedeni nalazi ukazuju da everolimus podstiĉe oksidativni i nitrozativni stres u ranoj fazi I/R oštećenja. Naglašena oksidacija izgleda ne nastaje usled obstruirane aktivnosti antioksidantnih enzima-SOD, CAT, GSH-Px i GR, već je posledica suprimirane ekspresije i aktivacije HO-1 koja se inaĉe javlja kao citoprotektivni odgovor u uslovima I/R oštećenja kao i povećanja ekspresije iRNK za iNOS, odgovorne za nitrozativni stres. Analiza dobijenih rezultata dovodi do osnovnog zakljuĉka da tretman everolimusom u I/R oštećenju bubrega pokazuje negativno dejstvo u ranoj fazi i pozitivan efekat u kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja. mTOR inhibicija u ranoj fazi I/R oštećenja povećava ekspresiju proinflamatornih citokina, oksidativni i nitrozativni stres i poslediĉno, povećava tkivno oštećenje. U kasnoj fazi I/R oštećenja mTOR inhibicija smanjuje inflamaciju, pre svega odreĊenu smanjenim brojem makrofaga i smanjenom ekspresijom hemokina i ubrzava procese reparacije. Moguće objašnjenje pozitivnog efekta everolimusa u kasnoj fazi I/R oštećenja bi bilo da menjajući svojim imunomodulatornim dejstvom inflamatorni milje i fenotipsku polarizaciju makrofaga a samim tim i njihivu funkciju uz efekat na druge ćelije imunskog sistema, everolimus moţe uticati na procese reparacije u kasnoj fazi I/R oštećenja. Navedeni nalazi mogu imati kliniĉke implikacije u transplantaciji bubrega, uzevši u obzir negativno proapoptotsko dejstvo mTOR inhibitora i razliĉitu regulaciju uroĊene i steĉene imunosti posle indukcije I/R oštećenja. Kliniĉki znaĉaj se ogleda u odreĊivanju najpovoljnijeg trenutka nakon transplantacije bubrega kada treba zapoĉeti imunosupresivnu terapiju mTOR inhibitorima da bi se izbegli negativni efekti mTOR inhibicije u ranoj fazi I/R oštećenja i postigla ţeljena imunomodulatorna dejstva što u krajnjem cilju dovodi do duţeg preţivljavanja grafta. 96 6. ZAKLJUČAK  Tretman mTOR inhibitorom everolimusom prouzrokuje znaĉajno oštećenje tubulointersticijuma bubrega u ranoj fazi I/R oštećenja bubrega, koje je praćeno i većim porastom uree i kreatinina u odnosu na netretirane ţivotinje. Oporavak bubreţne funkcije kasni kod ţivotinja tretiranih everolimusom, ali sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja nema razlika u bubreţnoj funkciji.  Znaĉajno manje prisustvo oštećenja tkiva bubrega sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja kod ţivotinja tretiranih everolimusom u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama ukazuje na efikasniju rezoluciju tkivnog oštećenja u kasnoj, reparacionoj fazi I/R oštećenja pod mTOR inhibicijom.  Veće oštećenje tkiva bubrega za kojim sledi bolji patohistološki nalaz u fazi reparacije kod ţivotinja tretiranih everolimusom, samo je na prvi pogled paradoksalan i moţe biti posledica već poznatog proapoptotskog i antiproliferativnog dejstva mTOR inhibitora u ranoj fazi I/R oštećenja, nakon ĉega sledi specifiĉno imunomodulatorno dejstvo m-TOR inhibitora koje se manifestuje smanjenom makrofagnom infiltracijom u kasnoj fazi I/R oštećenja.  I/R oštećenje indukuje ekspresiju iRNK za proinflamatorne citokine TNF-α i IL- 1ß u bubrezima koja je dodatno stimulisana dejstvom everolimusa u ranoj fazi I/R oštećenja.  Tretman everolimusom podstiĉe oksidativni i nitrozativni stres u ranoj fazi I/R oštećenja koji su posledica smanjene ekspresije i aktivacije HO-1 i povećanja transkripcije iRNK za iNOS.  I/R oštećenje bubrega miševa karakteriše se bifaznom ekspresijom hemokina, kako u ranoj fazi, tako i u reparacionoj fazi I/R oštećenja. Everolimus ne menja znaĉajno uoĉenu kinetiku ekspresije, ali smanjuje njen intenzitet.  Sedmog dana posle indukcije I/R oštećenja netretirane ţivotinje u poreĊenju sa ţivotinjama tretiranim everolimusom pokazuju nov porast ekspresije iRNK za 97 hemokine CCL3, CCL5 i CXCL10, odrţavaju znaĉajno veću ekspresiju iRNK za iNOS, veći broj makrofaga i veću nuklearnu ekspresiju p65 ukazujući na odrţavanje proinflamatonog miljea.  Everolimus znaĉajno smanjuje ekspresiju iRNK za TGF-ß u reparacionoj fazi I/R oštećenja što moţe u daljem toku reparacije tkivnog oštećenja dovesti do smanjene fibroze u tubulointersticijumu bubrega.  Tretman everolimusom povećava aktivnost NF-κB pokazujući skoro kontinuirano prisustvo NF-κB u jedru za razliku od netretiranih ţivotinja koje pokazuju cikliĉnu aktivnost NF-κB. Everolimus stimuliše pored klasiĉnog i alternativni put aktivacije NF-κB koji se manifestuje povećanom ekspresijom RelB u jedru naroĉito u reparacionoj fazi I/R oštećenja bubrega.  Povećana nuklearna ekspresija p52 u reparacionoj fazi I/R oštećenja kod ţivotinja tretiranih everolimusom u poreĊenju sa netretiranim ţivotinjama moţe ukazati na antiinflamatorni efekat everolimusa.  UroĊena i steĉena imunost posle indukcije I/R oštećenja mogu biti razliĉito regulisani mTOR inhibitorima, što je od kliniĉkog znaĉaja u smislu odreĊivanja povoljnog trenutka nakon transplantacije bubrega kada treba zapoĉeti imunosupresivnu terapiju m-TOR inhibitorima. 98 7. LITERATURA 1. Schrier RW, Wang W, Poole B, Mitra A. Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest 2004; 114(1):5-14. 2. Perico N, Cattaneo D, Sayegh MH, Remuzzi G. Delayed graft function in kidney transplantation. Lancet 2004; 364(9447):1814-27. 3. Boletis J, Balitsari A, Filiopoulos V, Stamataki E, Lionaki S, Zavos G, Kostakis A. Delayed renal graft function: the influence of immunosuppression. Transplant Proc 2005; 37(5):2054-9. 4. Hoste EA, Schurgers M. Epidemiology of acute kidney injury: how big is the problem? Crit Care Med 2008; 36(4 Suppl):S146-51. 5. Chertow GM, Burdick E, Honour M, Bonventre JV, Bates DW. Acute kidney injury, mortality, length of stay, and costs in hospitalized patients. J Am Soc Nephrol 2005; 16(11):3365-70. 6. Xue JL, Daniels F, Star RA, Kimmel PL, Eggers PW, Molitoris BA, Himmelfarb J, Collins AJ. Incidence and mortality of acute renal failure in Medicare beneficiaries, 1992 to 2001. J Am Soc Nephrol 2006; 17(4): 1135-24. 7. Carden DL, Granger DN. Pathophysiology of ischaemia-reperfusion injury. J Pathol 2000; 190(3):255-66. 8. Devarajan P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J Am Soc Nephrol 2006; 17(6):1503-20. 9. Molitoris BA, Sutton TA. Endothelial injury and dysfunction: Role in the extension phase of acute renal failure. Kidney Int 2004; 66(2):496-9. 10. Bonventre JV, Yang L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest 2011; 121(11):4210-21. 11. Yamamoto T, Tada T, Rodsky SV, Tanaka H, Noiri E, Kajiya F, Goligorsky MS. Intravital videomicroscopy of peritubular capillaries in renal ischemia. Am J Physiol Renal Physiol 2002; 282(6):F1150-5. 12. Bonventre JV, Zuk A. Ischemic acute renal failure: an inflammatory disease? Kidney Int 2004; 66(2):480-5. 99 13. Kelly KJ, Williams WW Jr, Colvin RB, Meehan SM, Springer TA, Gutierrez- Ramos JC, Bonventre JV. Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice are protected against ischemic renal injury. J Clin Invest 1997; 97(4):1056-63. 14. Oh DJ, Dursun B, He Z, Lu L, Hoke TS, Ljubanovic D, Faubel S, Edelstein CL. Fractalkine receptor (CX3CR1) inhibition is protective against ischemic acute renal failure in mice. Am J Physiol Renal Physiol 2008; 294(1):F264-71. 15. Singbartl K, Green SA, Ley K. Blocking P-selectin protects from ischemia/reperfusion-induced acute renal failure. FASEB J 2000; 14(1):48-54. 16. Molitoris BA. Aktin cytoskeleton in ischemic acute renal failure. Kidney Int 2004; 66(2):871-83. 17. Molina A, Ubeda M, Escribese MM, García-Bermejo L, Sancho D, Pérez de Lema G, Liaño F, Cabañas C, Sánchez-Madrid F, Mampaso F. Renal ischemia/reperfusion injury: functional tissue preservation by anti-activated {beta}1 integrin therapy. J Am Soc Nephrol 2005;16(2):374-82. 18. Murphy BJ, Robin ED, Tapper DP, Wong RJ, Clayton DA. Hypoxic coordinate regulation of mitochondrial enzymes in mammalian cells. Science 1984; 223(4637):707-9. 19. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. Science 1978; 201(4359):875-80. 20. Kirshenbaum LA, Singal PK. Changes in antioxidant enzymes in isolated cardiac myocytes subjected to hypoxia-reoxygenation. Lab Invest 1992; 67(6):796-803. 21. Jackson R, Parish G, Ho YS. Effects of hypoxia on expression of superoxide dismutases in cultured ATII cells and lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 1996; 271(6 Pt 1):955-62. 22. Li C, Jackson RM. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury. Am J Physiol Cell Physiol 2002; 282(2):C227-41. 23. Gadelha FR, Thomson L, Fagian MM, Costa ADT, Radi R, Vercesi AE. Ca2+ - independent permeabilization of the inner mitochondrial membrane by peroxynitrite is mediated by membrane protein thiol cross-linking and lipid peroxidation. Arch Biochim Biophys 1997; 345(2):243-50. 24. Noiri E, Nakao A, Uchida K, Tsukahara H, Ohno M, Fujita T, Brodsky S, Goligorsky MS. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am J Physiol Renal Physiol 2001; 281(5):F948-57. 100 25. Macmillan-Crow LA, Crow JP, Kerby JD, Beckman JS, Thompson JA. Nitration and inactivation of manganese superoxide dismutase in chronic rejection of human renal allografts. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93(21):11853-8. 26. Agullo L, Garcia-Dorado D, Inserte J, Paniagua A, Pyrhonen P, Lievadot J, Soler- Soler J. L-Arginie limits myocardial cell death secondary to hypoxia-reoxygenation by cGMP-dependent mechanism. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1999; 276(5):H1574- 80. 27. Kowaltowski AJ, Verecesi AE. Mitochondrial damage induced by conditions of oxidative stress. Free Radic Biol Med 1999; 26(3:4):463-71. 28. Weinberg JM, Venkatachalam MA, Roeser NF, Nissim I. Mitochondrial dysfunction during hypoxia/reoxygenation and its correction by anaerobic metabolism of citric acid cycle intermediates. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(6):2826-31. 29. Declamp TJ, Dales C, Ralenkotter L, Cole PS, Hadley RW. Intramitochondrial [Ca2+] and membrane potential in ventricular myocites exposed to anoxia- reoxygenation. Am J Physiol Heart Circ Physiol 1998; 275(2 Pt 2):H484-94. 30. Cai J, Jones DP. Superoxide in apoptosis. Mitochondrial generation triggered by cytochrome c loss. J Biol Chm 1998; 273(14):11401-4. 31. Marnett LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis 2000; 21(3):361-70. 32. Whitmaarsh AJ, Davis RJ. Transcripition factor AP-1 regulation by mitogen- activated protein kinase signal transduction pathways. J Mol Med 1996; 74(10):589- 607. 33. Park JH, Okayama N, Gute D, Krsmanovic A, Battarbee H, Alexander JS. Hypoxia/aglycemia increases endothelial permeability: role of second messengers and cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol 1999; 277(6 Pt 1):C1066-74. 34. McGowan AJ, Ruiz-Ruiz MC, Gorman AM, Lopez-Rivas A, Cotter TG. Reactive oxygen intermediate(s) (ROI): common mediator (s) of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) cleavage and apoptosis. FEBS Lett 1996; 392(3):299-303. 35. Esposti MD, Hatzinisiriou I, McLennan H, Ralph S. Bcl-2 and mitochondrial oxygen radicals. New approaches with reactive oxygen species-sensitive probes. J Biol Chem 1999; 274(42):29831-37. 36. Latanich CA, Toledo-Pereira LH. Searching for NF-kB-based treatments of ischemia reperfusion injury. Journal of Investigative Surgery 2009; 22(4):301-15. 101 37. Nichols TC. NF-kappaB and reperfusion injury. Drug News Perspect 2004;17(2):99-104. 38. Hacker H, Karin M. Is NFkappaB2/p100 direct activator of programmed cell death? Cancer Cell 2002; 2(6):431-3. 39. Aggarwal BB. Apoptosis and nuclear factor-κB: a tale od association and dissociation. Biochem Pharmacol 2000; 60(8):1033-9. 40. Rahman A, Anwar KN, True AL, Malik AB. Thrombin-induced p65 homodimer binding to downstream NF-kappaB site of the promoter mediates endothelial ICAM- 1 expression and neutrophil adhesion. J Immunol 1999;162(9):5466-76. 41. Matsushita H, Morishita R, Nata T, Aoki M, Nakagami H, Taniyama Y, Yamamoto K, Higaki J, Yasufumi K, Ogihara T. Hypoxia-induced endothelial apoptosis through nuclear factor-κB (NF-κB)-mediated bcl-2 supression: in vivo evidence of the importance of NF- κB in endothelial cell regulation. Circ Res 2000; 86(9):974-81. 42. Karin M, Lin A. NF-κB at the crossroads of life and deaths. Nat Immunol 2002; 3(3):221-6. 43. Cao CC, Ding XQ, Ou ZL, Liu CF, Li P, Wang L, Zhu CF. In vivo transfection of NF-kB decoy oligodeoxynucleotides attenuate renal ischemia/reperfusion injury in rats. Kidney International 2004; 65(3):834-45. 44. Panzer U, Steinmetz OM, Turner JE, Meyer-Schwesinger C, von Ruffer C, Meyer TN, Zahner G, Gómez-Guerrero C, Schmid RM, Helmchen U, Moeckel GW, Wolf G, Stahl RA, Thaiss F. Resolution of renal inflammation: a new role for NF-kappaB1 (p50) in inflammatory kidney diseases. Am J Physiol Renal Physiol 2009; 297(2):F429-39. 45. Uden P, Kenneth NS, Rocha S. Regulation of hypoxia-inducible factor-1α by NF- κB. Biochem J 2008; 412(3):477-84. 46. Rius J, Guma M, Schachtrup C, Akassoglou K, Zinkernagel AS, Nizet V, Johnson RS, Haddad GG, Karin M. NF-κB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1α. Nature 2008; 453(7196): 807-11. 47. Karin M, Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF- κB activity. Annu Rev Immunol 2000; 18:621-63. 48. May MJ, Ghosh S. Rel/NF-κB and IκB proteins: an overview. Semin Cancer Biol 1997; 8(2):63-73. 102 49. Ghosh S, May MJ, Kopp EB. NF-κB and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Ann Rev Immunol 1998; 16:225-60. 50. Whiteside ST, Epinat JC, Rice NR, Israël A. I kappa B epsilon, a novel member of the IκB family, controls RelA and cRel NF-κB activity. EMBO J 1997; 16(6):1413-26. 51. Bonizzi G, Karin M. The two NF-κB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol 2004; 25(6):280-8. 52. Wan F, Lenardo MJ. Specification of DNA binding activity of NF-kappaB proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol 2009; 1(4):a000067. 53. Hayden MS, Ghosh S. Shared principles in NF-kappaB signaling. Cell 2008; 132(3):344–62. 54. Sanz AB, Sanchez-Niño MD, Ramos AM, Moreno JA, Santamaria B, Ruiz-Ortega M, Egido J, Ortiz A. NF-κB in renal inflammation. J Am Soc Nephrol 2010; 21(8):1254-62. 55. Xiao G, Harhaj EW, Sun SC. NF-κB-inducing kinase regulates the processing of NF-κB2 p100. Mol Cell 2001; 7(2):401-9. 56. Karin M. The beginning of the end: IκBkinase (IKK) and NF-κB activation. J Biol Chem 1999; 274(39): 27339-42. 57. Chen Lf, Fischle W, Verdin E, Greene WC. Duration of nuclear NF-κB action regulated by reversible acetylation. Science 2001; 293(5535):1653-7. 58. Vermeulen L, De Wilde G, Notebaert S, Vanden Berghe W, Haegeman G. Regulation of the transcriptional activity of the nuclear factor-kappaB p65 subunit. Biochem Pharmacol 2002; 64(5-6):963-70. 59. Tergaonkar V, Perkins ND. p53 and NF-κB crosstalk: IKKα tips the balance. Mol Cell Biol 2007; 26(2):158-9. 60. Pahl HL. Activators and target genes of Rel/NF-κB transcription factors. Oncogene 1999; 18(49):6853-66. 103 61. Dejardin E. The alternative NF-kappaB pathway from biochemistry to biology: Pifalls and promises for future drug development. Biochem Pharmacol 2006; 72(9):1161-79. 62. Senftleben U, Cao Y, Xiao G, Greten FR, Krahn G, Bonizzi G, Chen Y, Hu Y, Fong A, Sun SC, Karin M. Activation by IKKalpha of a second, evolutionary conserved, NF- kappaB signaling pathway. Science 2001; 293(5534):1495-9. 63. Basak S, Shih VF, Hoffmann A. Generation and activation of multiple dimeric transcription factors within the NF-kappaB signaling system. Mol Cell Biol 2008; 28(10):3139-50. 64. Dejardin E, Droin NM, Delhase M, Haas E, Cao Y, Makris C, Li ZW, Karin M, Ware CF, Green DR. The lymphotoxin-beta receptor induces different patterns of gene expression via two NF-kappaB pathways. Immunity 2002; 17(4):525-35. 65. Sanz AB, Sanchez-nino MD, Izquierdo MC, Jakubowsky A, Justo P, Blanco-Colio LM, Ruiz-Ortega M, Selgas R, Egido J, Ortiz A. TWEAK activates the non-canonical NF-kappaB pathway in murine renal tubular cells: modulation of CCL21, PLoS One 5 2010; e8955. 66. Li XC, Ma YF, Wang XH. Role of NF-κB as effector of IPC in donor livers before liver transplantation in rats. Transplant Proc 2006; 38(5):1584-7. 67. Morgan EN, Boyle EM Jr, Yun W, Griscavage-Ennis JM, Farr AL, Canty TG Jr, Pohlman TH, Verrier ED. An essential role for NF-kappaB in the cardioadaptive response to ischemia. Ann Thorac Surg. 1999; 68(2):377-82. 68. Donnahoo KK, Meng X, Ayala A, Cain MP, Harken AH, Meldrum DR. Early kidney TNF-alpha expression mediates neutrophil infiltration and injury after renal ischemia-reperfusion. Am J Physiol 1999; 277(3 Pt 2):R922-9. 69. Jo SK, Sung SA, Cho WY, Kim HK. Macrophages contribute to the initiation of ischaemic acute renal failure in rats. Nephrol Dial Transplant 2006; 21(5):1231-9. 70. Beg AA. Endogenous ligands of Toll-like receptors: implications for regulating inflammatory and immune responses. Trends Immunol 2002; 23(11):509-12. 104 71. Wolfs TG, Buurman WA, van Schadewijk A, de Vries B, Daemen MA, Hiemstra PS, van 't Veer C. In vivo expression of Toll-like receptor 2 and 4 by renal epithelial cells: IFN-gamma and TNF-alpha mediated up-regulation during inflammation. J Immunol 2002; 168(3):1286-93. 72. Shigeoka AA, Holscher TD, King AJ, Hall FW, Kiosses WB, Tobias PS, Mackman N, McKay DB. TLR2 is constitutively expressed within the kidney and participates in ischemic renal injury through both MyD88-dependent and -independent pathways. J Immunol 2007; 178(10): 6252-8. 73. Wu H, Chen G, Wyburn KR, Yin J, Bertolino P, Eris JM, Alexander SI, Sharland AF, Chadban SJ. TLR4 activation mediates kidney ischemia/reperfusion injury. J Clin Invest 2007; 117(10):2847-59. 74. Thurman JM, Ljubanović D, Royer PA, Kraus DM, Molina H, Barry NP, Proctor G, Levi M, Holers VM. Altered renal tubular expression of the complement inhibitor Crry permits complement activation after ischemia/reperfusion. J Clin Invest 2006; 116(2):357-68. 75. Furuichi K, Gao JL, Horuk R, Wada T, Kaneko S, Murphy PM. Chemokine receptor CCR1 regulates inflammatory cell infiltration after renal ischemia-reperfusion injury. J Immunol 2008; 181(12):8670-6. 76. Li L, Huang L, Sung SS, Vergis AL, Rosin DL, Rose CE Jr, Lobo PI, Okusa MD. The chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 mediate monocyte/macrophage trafficking in kidney ischemia-reperfusion injury. Kidney Int 2008; 74(12):1526-37. 77. Jang HR, Rabb H. The innate immune response in ischemic acute kidney injury. Clin Immunol 2009; 130(1):41-50. 78. Day YJ, Huang L, Ye H, Linden J, Okusa MD. Renal ischemia-reperfusion injury and adenosine 2A receptor-mediated tissue protection: role of macrophages. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 288(4):F722-31. 79. Kinsey GR, Li L, Okusa MD. Inflammation in acute kidney injury. Nephron Exp Nephrol 2008; 109(4):102-7. 105 80. Li L, Huang L, Sung SS, Lobo PI, Brown MG, Gregg RK, Engelhard VH, Okusa MD. NKT cell activation mediates neutrophil IFN-gamma production and renal ischemia-reperfusion injury. J Immunol 2007; 178(9):5899-911. 81. Soos TJ, Sims TN, Barisoni L, Lin K, Littman DR, Dustin ML, Nelson PJ. CX3CR1+ interstitial dendritic cells form a contiguous network throughout the entire kidney. Kidney Int 2006; 70(3):591-6. 82. Penfield JG, Wang Y, Li S, Kielar MA, Sicher SC, Jeyarajah DR, Lu CY. Transplant surgery injury recruits recipient MHC class II-positive leukocytes into the kidney. Kidney Int 1999; 56(5):1759-69. 83. Loverre A, Capobianco C, Stallone G, Infante B, Schena A, Ditonno P, Palazzo S, Battaglia M, Crovace A, Castellano G, Ranieri E, Schena FP, Gesualdo L, Grandaliano G. Ischemia-reperfusion injury-induced abnormal dendritic cell traffic in the transplanted kidney with delayed graft function. Kidney Int 2007; 72(8):994-1003. 84. Dong X, Swaminathan S, Bachman LA, Croatt AJ, Nath KA, Griffin MD. Antigen presentation by dendritic cells in renal lymph nodes is linked to systemic and local injury to the kidney. Kidney Int 2005; 68(3):1096-108. 85. Dong X, Swaminathan S, Bachman LA, Croatt AJ, Nath KA, Griffin MD. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia- reperfusion injury. Kidney Int 2007; 71(7):619-28. 86. Burne MJ, Daniels F, El Ghandour A, Mauiyyedi S, Colvin RB, O'Donnell MP, Rabb H. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest 2001; 108(9):1283-90. 87. Ysebaert DK, De Greef KE, De Beuf A, Van Rompay AR, Vercauteren S, Persy VP, De Broe ME. T cells as mediators in renal ischemia/reperfusion injury. Kidney Int 2004; 66(2):491-6. 88. Huang Y, Rabb H, Womer KL. Ischemia-reperfusion and immediate T cell responses. Cell Immunol 2007;248(1): 4-11. 106 89. Ascon DB, Lopez-Briones S, Liu M, Ascon M, Savransky V, Colvin RB, Soloski MJ, Rabb H. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J Immunol 2006; 177(5):3380-7. 90. Marques VP, Gonçalves GM, Feitoza CQ, Cenedeze MA, Fernandes Bertocchi AP, Damião MJ, Pinheiro HS, Antunes Teixeira VP, dos Reis MA, Pacheco-Silva A, Saraiva Câmara NO. Influence of TH1/TH2 switched immune response on renal ischemia-reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol 2006; 104(1):48-56. 91. Monteiro RM, Camara NO, Rodrigues MM, Tzelepis F, Damião MJ, Cenedeze MA, Teixeira Vde P, dos Reis MA, Pacheco-Silva A. A role for regulatory T cells in renal acute kidney injury. Transpl Immunol 2009; 21(1):50-5. 92. Tilney NL, Guttmann RD. Effect of initial ischemia/reperfusion injury on the transplanted kidney. Transplantation 1997; 64(7):945-7. 93. Peeters P, Terryn W, Vanholder R, Lameire N. Delayed graft function in renal transplantation. Curr Opin Crit Care 2004; 10(6):489-98. 94. Olyaei AJ, de Mattos AM, Bennett WM. Immunosuppressant-induced nephropathy: pathophysiology, incidence and management. Drug Saf 1999; 21(6):471-88. 95. Novick AC, Hwei HH, Steinmuller D, Streem SB, Cunningham RJ, Steinhilber D, Goormastic M, Buszta C. Detrimental effect of cyclosporine on initial function of cadaver renal allografts following extended preservation. Results of a randomized prospective study. Transplantation 1986; 42(2):154-8. 96. Chávez-Velásquez M, Pons H, Medina M, Quiroz Y, Parra G, Herrera J. Effects of mycophenolate mofetil in ischemic acute renal failure in rats. Nefrologia 2007; 27(4):448-58. 97. Yakupoglu YK, Kahan BD. Sirolimus: a current perspective. Exp Clin Transplant 2003; 1(1):8-18. 98. Nankivell BJ, Chapman JR. Chronic allograft nephropathy: current concepts and future directions. Transplantation 2006; 81(5):643-54. 107 99. Inman SR, Davis NA, Olson KM, Lukaszek VA, McKinley MR, Seminerio JL. Rapamycin preserves renal function compared with cyclosporine A after ischemia/reperfusion injury. Urology 2003; 62(4):750-4. 100. Boratyńska M, Banasik M, Patrzalek D, Szyber P, Klinger M. Sirolimus delays recovery from posttransplant renal failure in kidney graft recipients. Transplant Proc 2005; 37(2):839-42. 101. Stallone G, Di Paolo S, Schena A, Infante B, Battaglia M, Ditonno P, Gesualdo L, Grandaliano G, Schena FP. Addition of sirolimus to cyclosporine delays the recovery from delayed graft function but does not affect 1-year graft function. J Am Soc Nephrol 2004; 15(1):228-33. 102. Lieberthal W, Fuhro R, Andry CC, Rennke H, Abernathy VE, Koh JS, Valeri R, Levine JS. Rapamycin impairs recovery from acute renal failure: role of cell-cycle arrest and apoptosis of tubular cells. Am J Physiol Renal Physiol 2001; 281(4):F693-706. 103. Ma XM, Blenis J. Molecular mechanisms of mTOR-mediated translational control. Nat Rev Mol Cell Biol 2009; 10(5):307-18. 104. Jacinto E, Hall MN. Tor signalling in bugs, brain and brawn. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4(2):117-26. 105. Kwiatkowski DJ, Manning BD. Tuberous sclerosis: a GAP at the crossroads of multiple signaling pathways. Hum Mol Genet 2005; 14(2):R251-8. 106. Hay N, Sonenberg N. Upstream and downstream of mTOR. Genes Dev 2004; 18(16):1926-45. 107. Potter CJ, Pedraza LG, Huang H, Xu T. The tuberous sclerosis complex (TSC) pathway and mechanism of size control. Biochem Soc Trans 2003; 31(3):584-6. 108. Um SH, D'Alessio D, Thomas G. Nutrient overload, insulin resistance, and ribosomal protein S6 kinase 1, S6K1. Cell Metab 2006; 3(6):393-402. 108 109. Roux PP, Ballif BA, Anjum R, Gygi SP, Blenis J. Tumor-promoting phorbol esters and activated Ras inactivate the tuberous sclerosis tumor suppressor complex via p90 ribosomal S6 kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(37):13489-94. 110. Lee DF, Kuo HP, Chen CT, Hsu JM, Chou CK, Wei Y, Sun HL, Li LY, Ping B, Huang WC, He X, Hung JY, Lai CC, Ding Q, Su JL, Yang JY, Sahin AA, Hortobagyi GN, Tsai FJ, Tsai CH, Hung MC. IKK beta suppression of TSC1 links inflammation and tumor angiogenesis via the mTOR pathway. Cell 2007; 130(3):440- 55. 111. Dan HC, Adli M, Baldwin AS. Regulation of mammalian target of rapamycin activity in PTEN-inactive prostate cancer cells by I kappa B kinase alpha. Cancer Res 2007; 67(13):6263-9. 112. Liu L, Cash TP, Jones RG, Keith B, Thompson CB, Simon MC. Hypoxia- induced energy stress regulates mRNA translation and cell growth. Mol Cell 2006; 21(4):521– 31. 113. Sofer A, Lei K, Johannessen CM, Ellisen LW. Regulation of mTOR and cell growth in response to energy stress by REDD1. Mol Cell Biol 2005; 25(14):5834–45. 114. Hackstein H, Taner T, Logar AJ, Thomson AW. Rapamycin inhibits macropinocytosis and mannose receptor-mediated endocytosis by bone marrow-derived dendritic cells. Blood 2002; 100(3):1084-7. 115. Monti P, Mercalli A, Leone BE, Valerio DC, Allavena P, Piemonti L. Rapamycin impairs antigen uptake of human dendritic cells. Transplantation 2003; 75(1):137-45. 116. Thomson AW, Turnquist HR, Raimondi G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nat Rev Immunol 2009; 9(5):324-37. 117. Ohtani M, Nagai S, Kondo S, Mizuno S, Nakamura K, Tanabe M, Takeuchi T, Matsuda S, Koyasu S. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood 2008; 112(3):635-43. 118. Weichhart T, Costantino G, Poglitsch M, Rosner M, Zeyda M, Stuhlmeier KM, Kolbe T, Stulnig TM, Hörl WH, Hengstschläger M, Müller M, Säemann MD. The TSC-mTOR signaling pathway regulates the innate inflammatory response. Immunity 2008; 29(4):565-77. 109 119. Honda K, Yanai H, Negishi H, Asagiri M, Sato M, Mizutani T, Shimada N, Ohba Y, Takaoka A, Yoshida N, Taniguchi T. IRF-7 is the master regulator of type-I interferon-dependent immune responses. Nature 2005; 434(7034):772-7. 120. Mondino A, Mueller DL. mTOR at the crossroads of Tcell proliferation and tolerance, Semin Immunol 2007; 19(3):162-72. 121. Säemann MD, Haidinger M, Hecking M, Hörl WH, Weichhart T. The multifunctional role of mTOR in innate immunity: implications for transplant immunity. Am J Transplant 2009; 9(12):2655-61. 122. Kusaba H, Ghosh P, Derin R, Buchholz M, Sasaki C, Madara K, Longo DL. Interleukin-12-induced interferon-gamma production by human peripheral blood T cells is regulated by mammalian target of rapamycin (mTOR). J Biol Chem 2005; 280(2):1037-43. 123. Coenen JJ, Koenen HJ, van Rijssen E, Kasran A, Boon L, Hilbrands LB, Joosten I. Rapamycin, not cyclosporine, permits thymic generation and peripheral preservation of CD4+ CD25+ FoxP3+ T cells. Bone Marrow Transplant 2007; 39(9):537-45. 124. Battaglia M, Stabilini A, Migliavacca B, Horejs-Hoeck J, Kaupper T, Roncarolo MG. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J Immunol 2006; 177(12):8338-47. 125. Segundo DS, Ruiz JC, Izquierdo M, Fernández-Fresnedo G, Gómez-Alamillo C, Merino R, Benito MJ, Cacho E, Rodrigo E, Palomar R, López-Hoyos M, Arias M. Calcineurin inhibitors, but not rapamycin, reduce percentages of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in renal transplant recipients. Transplantation 2006; 82(4):550-7. 126. Vignali DA, Collison LW, Workman CJ. How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol 2008; 8(7):523-32. 127. Tsang CK, Qi H, Liu LF, Zheng XF. Targeting mammalian target of rapamycin (mTOR) for health and diseases. Drug Discov Today 2007; 12(3-4):112-24. 128. Schuler W, Sedrani R, Cottens S, Häberlin B, Schulz M, Schuurman HJ, Zenke G, Zerwes HG, Schreier MH. SDZ RAD, a new rapamycin derivative: pharmacological properties in vitro and in vivo. Transplantation 1997; 64(1):36-42. 129. Eisen HJ, Tuzcu EM, Dorent R, Kobashigawa J, Mancini D, Valantine-von Kaeppler HA, Starling RC, Sørensen K, Hummel M, Lind JM, Abeywickrama KH, 110 Bernhardt P; RAD B253 Study Group. Everolimus for the prevention of allograft rejection and vasculopathy in cardiac-transplant recipients. N Engl J Med 2003; 349(9):847-58. 130. Webster AC, Lee VW, Chapman JR, Craig JC. Target of rapamycin inhibitors (sirolimus and everolimus) for primary immunosuppression of kidney transplant recipients: a systematic review and meta-analysis of randomized trials. Transplantation 2006; 81(9):1234-48. 131. Budde K, Becker T, Arns W, Sommerer C, Reinke P, Eisenberger U, Kramer S, Fischer W, Gschaidmeier H, Pietruck F. ZEUS Study Investigators. Everolimus-based, calcineurin-inhibitor-free regimen in recipients of de-novo kidney transplants: an open- label, randomised, controlled trial. Lancet 2011; 377(9768):837-47. 132. Mjörnstedt L, Sørensen SS, von Zur Mühlen B, Jespersen B, Hansen JM, Bistrup C, Andersson H, Gustafsson B, Undset LH, Fagertun H, Solbu D, Holdaas H. Improved Renal Function After Early Conversion From a Calcineurin Inhibitor to Everolimus: a Randomized Trial in Kidney Transplantation. Am J Transplant 2012; 12(10):2744-53. 133. Viganò M, Tuzcu M, Benza R, Boissonnat P, Haverich A, Hill J, Laufer G, Love R, Parameshwar J, Pulpón LA, Renlund D, Abeywickrama K, Cretin N, Starling RC, Eisen HJ. RAD B253 Study Group. Prevention of acute rejection and allograft vasculopathy by everolimus in cardiac transplants recipients: a 24-month analysis. J Heart Lung Transplant 2007; 26(6):584-92. 134. Lane HA, Wood JM, McSheehy PM, Allegrini PR, Boulay A, Brueggen J, Littlewood-Evans A, Maira SM, Martiny-Baron G, Schnell CR, Sini P, O'Reilly T. mTOR inhibitor RAD001 (everolimus) has antiangiogenic/vascular properties distinct from a VEGFR tyrosine kinase inhibitor. Clin Cancer Res 2009;15(5):1612-22. 135. Motzer RJ, Escudier B, Oudard S, Hutson TE, Porta C, Bracarda S, Grünwald V, Thompson JA, Figlin RA, Hollaender N, Urbanowitz G, Berg WJ, Kay A, Lebwohl D, Ravaud A; RECORD-1 Study Group. Efficacy of everolimus in advanced renal cell carcinoma: a double-blind, randomised, placebo-controlled phase III trial. Lancet. 2008; 372(9637):449-56. 136. Atkins MB, Yasothan U, Kirkpatrick P. Everolimus. Nat Rev Drug Discov. 2009; 8(7):535-6. 111 137. Lui SL, Chan KW, Tsang R, Yung S, Lai KN, Chan TM. Effect of rapamycin on renal ischemia-reperfusion injury in mice. Transplant Int 2006; 19(10):834-9. 138. Rossi M, Grivetta SA, Dianzani MA. Gluthatione peroxidase,gluthatione reductase and gluthatione transferase in regenerating rat liver Med Sci Res 1987; 15:109-14. 139. De Waziers I, Albrecht R. The effects of vitamin A,nutritional status ongluthtione transferase and gluthation peroxidase activities in rat intenstine. Experientia1987; 43(4):394-5. 140. Takada Y, Noguchit T, Okabe T, Kayiyama M. Superoxide dismutase in varios tissues from rabbit bearing the Vx-2 carcinoma in the maxillary sinus. Cancer Res 1982; 42(10):4233-5. 141. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein mesurment with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193(1):265-75. 142. Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the auto-oxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem 1972; 247(10):3170-5. 143. Claiborne A. Assay for catalase. In: Greenwald RA, editor. Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton, Fl: CRC Press; 1985.p. 283-284. 144. Paglia DE, Valentine WN. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70(1):158- 69. 145. Glatzle D, Vuilleumier JP, Weber F, Decker K. Glutathione reductase test with whole blood a convenient procedure for the assessment of the riboflavin status in humans. Experientia 1974; 30(6):665-7. 146. Akagi R, Takahashi T, Sassa S. Fundamental role of heme oxygenase in the protection against ischemic acute renal failure. Jpn J Pharmacol 2002; 88(2):127-32. 147. Furuichi K, Kaneko S, Wada T. Chemokine/chemokine receptor mediated inflammation regulates pathologic changes from acute kidney injury to chronic kidney disease. Clin Exp Nephrol 2009; 13(1):9-14. 112 148. Furuichi K, Wada T, Iwata Y, Kitagawa K, Kobayashi K, Hashimoto H, Ishiwata Y, Asano M, Wang H, Matsushima K, Takeya M, Kuziel WA, Mukaida N, Yokoyama H. CCR2 signaling contributes to ischemia-reperfusion injury in kidney. J Am Soc Nephrol 2003; 14(10): 2503-15. 149. Fiorina P, Ansari MJ, Jurewicz M, Barry M, Ricchiuti V, Smith RN, Shea S, Means TK, Auchincloss H Jr, Luster AD, Sayegh MH, Abdi R. Role of CXC chemokine receptor 3 pathway in renal ischemic injury. J Am Soc Nephrol 2006; 17(3):716-23. 150. Furuichi K, Gao JL, Murphy PM. Chemokine receptor CX3CR1 regulates renal interstitial fibrosis after ischemia-reperfusion injury. Am J Pathol 2006; 169(2):372-87. 151. Krüger T, Benke D, Eitner F, Lang A, Wirtz M, Hamilton-Williams EE, Engel D, Giese B, Müller-Newen G, Floege J, Kurts C. Identification and functional characterization of dendritic cells in the healthy murine kidney and in experimental glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol 2004; 15(3):613-21. 152. Li L, Okusa MD. Macrophages, dendritic cells, and kidney ischemia-reperfusion injury. Semin Nephrol. 2010; 30(3):268-77. 153. Stroo I, Stokman G, Teske GJ, Raven A, Butter LM, Florquin S, Leemans JC. Chemokine expression in renal ischemia/reperfusion injury is most profound during the reparative phase. Int Immunol 2010; 22(6):433-42. 154. Furuichi K, Wada T, Kitajikma S, Toyama T, Okumura T, Hara A, Kawachi H, Shimizu F, Sugaya T, Mukaida N, Narumi S, Matsushima K, Kaneko S. IFN- inducible protein 10 (CXCL10) regulates tubular cell proliferation in renal ischemia- reperfusion injury. Nephron Exp Nephrol 2008; 109(1):c29-c38. 155. Romagnani P, Annunziato F, Lasagni L, Lazzeri E, Beltrame C, Francalanci M, Uguccioni M, Galli G, Cosmi L, Maurenzig L, Baggiolini M, Maggi E, Romagnani S, Serio M. Cell cycle-dependent expression of CXC chemokine receptor 3 by endothelial cells mediates angiostatic activity. J Clin Invest 2001; 107(1):53-63. 113 156. Keane MP, Belperio JA, Arenberg DA, Burdick MD, Xu ZJ, Xue YY, Strieter RM. IFN-gamma-inducible protein-10 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis via inhibition of angiogenesis. J Immunol 1999; 163(10):5686-92. 157. Bujak M, Dobaczewski M, Gonzalez-Quesada C, Xia Y, Leucker T, Zymek P, Veeranna V, Tager AM, Luster AD, Frangogiannis NG. Induction of the CXC chemokine interferon-gamma-inducible protein 10 regulates the reparative response following myocardial infarction. Circ Res 2009; 105(19):973-83. 158. Taub DD, Lloyd AR, Conlon K, Wang JM, Ortaldo JR, Harada A, Matsushima K, Kelvin DJ, Oppenheim JJ. Recombinant human interferon-inducible protein 10 is a chemoattractant for human monocytes and T lymphocytes and promotes T cell adhesion to endothelial cells. J Exp Med 1993; 177(6):1809-14. 159. Luster AD. The role of chemokines in linking innate and adoptive immunity. Curr Opin Immunol 2003; 14(1):129-35. 160. Zhou J, Tang PC, Qin L, EA, Gayed PM, Li W, Skokos Kyriakides TR, Pober JS, Tellides G. CXCR3-dependent accumulation and activation of perivascular macrophages is necessary for homeostatic arterial remodeling to hemodynamic stresses. J Exp Med 2010; 207(9):1951-66. 161. Kakuta Y, Okumi M, Miyagawa S, Blocking of CCR5 and CXCR3 suppresses the infiltration of macrophages in acute renal allograft rejection. Transplantation 2012; 93(1):24-31. 162. Kluth DC. Pro-resolution properties of macrophages in renal injury. Kidney Int 2007; 72(3):234-6. 163. Mantovani A, Sica A, Locarti M. New vistas on macrophage differentiation and activation. Eur J Immunol 2007; 37(1): 14-6. 164. Vinuesa E, Hotter G, Jung M, Herrero-Fresneda I, Torras J, Sola A. Macrophage involvement in the kidney repair phase after ischemia/reperfusion injury. J Pathol 2008; 214(1):104-13. 114 165. Jang HS, Kim J, Park YK, Park KM. Infiltrated macrophages contribute to recovery after ischemic injury but not to ischemic preconditioning in kidneys. Transplantation 2008; 85(3):447-55. 166. Furuichi K, Wada T, Iwata Y, Kitagawa K, Kobayashi K, Hashimoto H, Ishiwata Y, Tomosugi N, Mukaida N, Matsushima K, Egashira K, Yokoyama H. Gene therapy expressing amino-terminal truncated monocyte chemoattractant protein-1 prevents renal ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol 2003; 14(4):1066-71. 167. Heldin CH, Landstrom M, Moustakas A. Mechanism of TGF-beta signaling to growth arrest, apoptosis, and epithelial-mesenchimal transition. Curr Opin Cell Biol 2009; 21(2):166-76. 168. Guan Q, Nguan CY, Du C. Expression of transforming growth factor-β1 limits renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation 2010; 89(11):1320-7. 169. Spurgeon KR, Donohoe DL, Basile DP. Transforming growth factor-beta in acute renal failure: receptor expression, effects on proliferation, cellularity, and vascularization after recovery from injury. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 288(3):F568-77. 170. Deng J, Kohda Y, Chiao H, Wang Y, Hu X, Hewitt SM, Miyaji T, McLeroy P, Nibhanupudy B, Li S, Star RA. Interleukin-10 inhibits ischemic and cisplatin- induced acute renal injury. Kidney Int 2001; 60(6):2118-28. 171. Daemen MA, van de Ven MW, Heineman E, Buurman WA. Involvement of endogenous interleukin-10 and tumor necrosis factor-alpha in renal ischemia- reperfusion injury. Transplantation. 1999; 67(6):792-800. 172. Schmitz F, Heit A, Dreher S, Eisenächer K, Mages J, Haas T, Krug A, Janssen KP, Kirschning CJ, Wagner H. Mammalian target of rapamycin (mTOR) orchestrates the defense program of innate immune cells. Eur J Immunol 2008; 38(11):2981-92. 173. Meldrum KK, Meldrum DR, Hile KL, Yerkes EB, Ayala A, Cain MP, Rink RC, Casale AJ, Kaefer MA. p38 MAPK mediates renal tubular cell TNF-alpha production and TNF-alpha-dependent apoptosis during simulated ischemia. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 281(2):C563-70. 115 174. Iyer SS, Pulskens WP, Sadler JJ, Butter LM, Teske GJ, Ulland TK, Eisenbarth SC, Florquin S, Flavell RA, Leemans JC, Sutterwala FS. Necrotic cells trigger a sterile inflammatory response through the Nlrp3 inflammasome. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(48):20388-93. 175. Pulskens WP, Teske GJ, Butter LM, Roelofs JJ, van der Poll T, Florquin S, Leemans JC. Toll-like receptor-4 coordinates the innate immune response of the kidney to renal ischemia/reperfusion injury. PLoS One 2008; 3(10):e3596. 176. Wan X, Fan L, Hu B, Yang J, Li X, Chen X, Cao C. Small interfering RNA targeting IKKβ prevents renal ischemia-reperfusion injury in rats. Am J Physiol Renal Physiol 2011; 300(4):F857-63. 177. Moss NC, Stansfield WE, Willis MS, Tang RH, Selzman CH. IKKbeta inhibition attenuates myocardial injury and dysfunction following acute ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 293(4):H2248-53. 178. Feng B, Chen G, Zheng X, Sun H, Zhang X, Zhang ZX, Xiang Y, Ichim TE, Garcia B, Luke P, Jevnikar AM, Min WP. Small interfering RNA targeting RelB protects against renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation 2009; 87(9):1283-9. 179. Nelson DE, Ihekwaba AE, Elliott M, Johnson JR, Gibney CA, Foreman BE, Nelson G, See V, Horton CA, Spiller DG, Edwards SW, McDowell HP, Unitt JF, Sullivan E, Grimley R, Benson N, Broomhead D, Kell DB, White MR. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science 2004; 306(5696):704-8. 180. Ashall L, Horton CA, Nelson DE, Paszek P, Harper CV, Sillitoe K, Ryan S, Spiller DG, Unitt JF, Broomhead DS, Kell DB, Rand DA, Sée V, White MR. Pulsatile stimulation determines timing and specificity of NF-kappaB-dependent transcription. Science 2009; 324(5924):242-6. 181. Hoffmann A, Levchenko A, Scott ML, Baltimore D. The IkappaB-NF-kappaB signaling module: temporal control and selective gene activation. Science 2002; 298(5596):1241-5. 116 182. Fusco AJ, Huang DB, Miller D, Wang VY, Vu D, Ghosh G. NF-kappaB p52:RelB heterodimer recognizes two classes of kappaB sites with two distinct modes. EMBO Rep 2009; 10(2):152-9. 183. Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology. Cell 2001; 104(4):487–501. 184. Saitoh T, Nakayama M, Nakano H, Yagita H, Yamamoto N, Yamaoka S. TWEAK induces NF-kappaB2 p100 processing and long lasting NF-kappaB activation. J Biol Chem 2003; 278(38):36005-12. 185. Xia Y, Pauza M, Feng L, Lo D. Rel B regulation of chemokine expression modulates local inflammation. Am J Pathol 1997; 151(2):375-87. 186. Burkly L, Hession C, Ogata L, Reilly C, Marconi LA, Olson D, Tizard R, Cate R, Lo D. Expression of RelB is required for the development of thymic medulla and dendritic cells. Nature 1995; 373(6514):531-6. 187. Weih F, Carrasco D, Durham SK, Barton DS, Rizzo CA, Ryseck RP, Lira SA, Bravo R. Multiorgan inflammation and hematopoietic abnormalities in mice with a targeted disruption of RelB, a member of the NF-kappa B/Rel family. Cell 1995; 80(2):331-40. 188. Sakurai H, Chiba H, Miyoshi H, Sugita T, Toriumi W. IkappaB kinases phosphorylate NF-kappaB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain. J Biol Chem 1999; 274(43):30353-6. 189. Yang F, Tang E, Guan K, Wang CY. IKK beta plays an essential role in the phosphorylation of RelA/p65 on serine 536 induced by lipopolysaccharide. J Immunol 2003; 170(11):5630-5. 190. Madrid LV, Mayo MW, Reuther JY, Baldwin AS Jr. Akt stimulates the transactivation potential of the RelA/p65 subunit of NF-κB through utilization of the IκBkinase and activation of the mitogen-activated protein kinase p38. J Biol Chem 2001; 276(22):18934-40. 117 191. Sizemore N, Lerner N, Dombrowski N, Sakurai H, Stark GR. Distinct roles of the Ikappa B kinase alpha and beta subunits in liberating nuclear factor kappa B (NF-kappa B) from Ikappa B and in phosphorylating the p65 subunit of NF-kappa B. J Biol Chem 2002; 277(6):3863-9. 192. Dan HC, Cooper MJ, Cogswell PC, Duncan JA, Ting JP, Baldwin AS. Akt- dependent regulation of NF-kB is controlled by mTOR and Raptor in association with IKK. Genes Dev 2008; 22(11):1490-1500. 193. Loverre A, Ditonno P, Crovace A, . Ische Gesualdo L, Ranieri E, Pontrelli P, Stallone G, Infante B, Schena A, Di Paolo S, Capobianco C, Ursi M, Palazzo S, Battaglia M, Selvaggi FP, Schena FP, Grandaliano G. Ischemia-reperfusion induces glomerular and tubular activation of proinflamatory and aniapoptotic pathways: differential modulation by Rapamycin. J Am Soc Nephrol. 2004; 15(10):2657-86. 194. Dhalla NS, Elmoselhi AB, Hata T, Makino N. Status of myocardial antioxidants in ischemia-reperfusion injury. Cardiovasc Res 2000; 47(3):446-56. 195. Düvel K, Yecies JL, Menon S, Raman P, Lipovsky AI, Souza AL, Triantafellow E, Ma Q, Gorski R, Cleaver S, Vander Heiden MG, MacKeigan JP, Finan PM, Clish CB, Murphy LO, Manning BD. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Mol Cell 2010; 39(2): 171. 196. Edinger AL, Thompson CB. Akt maintains cell size and survival by increasing mTOR-dependent nutrient uptake. Mol Biol Cell 2002; 13(7): 2276-88. 197. Wagle A, Jivraj S, Garlock GL, Stapleton SR. Insulin regulation of glucose-6- phosphate dehydrogenase gene expression is rapamycin-sensitive and requires phosphatidylinositol 3-kinase. J Biol Chem 1998; 273(24):14968-74. 198. Schieke SM, Phillips D, McCoy JP Jr, Aponte AM, Shen RF, Balaban T, Finkel T. The mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway regulates mitochondrial oxygen consumption and oxidative capacity. J Biol Chem 2006; 28(37):27643-52. 199. Murphy MP. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J 2009; 417(1):1-13. 200. Suyani E, Derici UB, Sahin T, Ofluoglu E, Pasaoglu H, Erdem O, Barit G, Reis KA, Erten Y, Arinsoy T,Sindel S. Effects of everolimus on cytokines, oxidative stress and renal histology in ischemia-reperfusion injury of the kidney. Ren Fail 2009; 31(8):698-703. 118 201. Noiri E, Peresleni T, Miller F, Goligorsky MS. In vivo targeting of inducible NO sinthase with oligodexynucleotides protects rat kidney against ischemia. J Clin Invest 1996; 97(10):2377-83. 202. Bachmann S, Bosse HM, Mundel P. Topography of nitric oxide synthesis by localizing constitutive NO synthases in mammalian kidney. Am J Physiol 1995; 268(5 Pt 2):F885-98. 203. Mohaupt MG, Elzie JL, Ahn KY, Clapp WL, Wilcox CS, Kone BC. Differential expression and induction of mRNAs encoding two inducible nitric oxide synthases in rat kidney. Kidney Int 1994; 46(3):653–65. 204. Lieberthal W. Biology of ischemic and toxic renal tubular cell injury: role of nitric oxide and the inflammatory response. Curr Opin Nephrol Hypertens 1998; 7(3):289-95. 205. Blantz RC, Munger K. Role of nitric oxide in inflammatory conditions. Nephron 2002; 90(4):373-8. 206. Ahn KY, Mohaupt MG, Madsen KM, Kone BC. In situ hybridization localization of mRNA encoding inducible nitric oxide synthase in rat kidney. Am J Physiol 1994; 267(5 Pt 2):748-57. 207. Akagi R, Takahashi T, Sassa S. Fundamental role of heme oxygenase in the protection against ischemic acute renal failure. Jpn J Pharmacol 2002; 88(2):127-32. 208. Ryter SW, Otterbein LE, Morse D, Choi AM. Heme oxygenase/carbon monoxide signaling pathways: regulation and functional significance. Mol Cell Biochem 2002; 234-235(1-2):249-63. 209. Mayer RD, Wang X, Maines MD. Nitric oxide inhibitor N omega -nitro-l-arginine methyl ester potentiates induction of heme oxygenase-1 in kidney ischemia/reperfusion model: a novel mechanism for regulation of the oxygenase. J Pharmacol ExpTher 2003; 306(1):43-50. 210. Zuckerbraun BS, Billiar TR, Otterbein SL, Kim PK, Liu F, Choi AM, Bach FH, Otterbein LE. Carbon monoxide protects against liver failure through nitric oxide- induced hemeoxygenase 1. J Exp Med 2003;198(11):1707-16. 211. Motterlini R, Foresti R, Intaglietta M, Winslow RM. NO-mediated activation of heme oxygenase: endogenous cytoprotection against oxidative stress to endothelium. Am J Physiol 1996; 270(1 Pt 2):107-14. 119 212. Salom MG, Cerón SN, Rodriguez F, Lopez B, Hernández I, Martínez JG, Losa AM, Fenoy FJ. Heme oxygenase-1 induction improves ischemic renal failure: role of nitric oxide and peroxynitrite. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 293(6): H3542-9. 213. Gonçalves GM, Cenedeze MA, Feitoza CQ, Wang PM, Bertocchi AP, Damião MJ, Pinheiro HS, Antunes Teixeira VP, dos Reis MA, Pacheco-Silva A, Câmara NO. The role of heme oxygenase 1 in rapamycin-induced renal dysfunction after ischemia and reperfusion injury. Kidney Int 2006; 70(10):1742-9. 214. Visner GA, Lu F, Zhou H, Liu J, Kazemfar K, Agarwal A. Rapamycin induces heme oxygenase-1 in human pulmonary vascular cells: implications in the antiproliferative response to rapamycin. Circulation 2003; 107(6):911-6. 215. Kitamuro T, Takahashi K, Ogawa K, Udono-Fujimori R, Takeda K, Furuyama K, Nakayama M, Sun J, Fujita H, Hida W, Hattori T, Shirato K, Igarashi K, Shibahara S. Bach1 functions as a hypoxia inducible repressor for the heme oxygenase-1 gene in human cells. J Biol Chem 2003; 278(11):9125-33. 216. Sikorski EM, Hock T, Hill-Kapturczak N, Agarwal A. The story so far: Molecular regulation of the heme oxygenase-1 gene in renal injury. Am J Physil Renal Physiol 2004; 286(3):F425-41. 217. Yun N, Eum HA, Lee SM. Protective role of heme oxygenase-1 against liver damage caused by hepatic ischemia and reperfusion in rats. Antioxid Redox Signal 2010; 13(10):1503-12. 120 PRILOG A LISTA SKRAĆENICA A1 ‒ antiapoptotski protein AMPK ‒ protein kinaza aktivirana adenozin monofosfatom („AMP-activated protein kinase“) AP-1 ‒ aktivirajući protein 1 („activator protein 1“) ATP ‒ adenozin trifosfat B7-1 ‒ protein na aktiviranim antigen-prezentujućim ćelijama preko kojeg se ostvaruje kostimulatorni signal za aktivaciju T-ćelija putem interreakcije sa CD28 koji je eksprimiran na membrani T-ćelija BAFF ‒ B ćelijski aktivirajući faktor („B-cell activating factor“) Bcl-2 ‒ B-ćelijski limfom-2, regulatorni protein ćelijske smrti ‒ apoptoze („B-cell lymphoma 2“) Bcl-3 ‒ B-ćelijski limfom-3, regulatorni protein ćelijske smrti ‒ apoptoze („B-cell lymphoma 3“) CAT ‒ katalaza CCL19 ‒ hemokinski ligand 19 sa CC motivom CCL2 ‒ hemokinski ligand 2 sa CC motivom CCL21 ‒ hemokinski ligand 21 sa CC motivom CCL3 ‒ hemokinski ligand 3 sa CC motivom CCL5 ‒ hemokinski ligand 5 sa CC motivom CCR1 ‒ receptor tip 1 za hemokine sa CC motivom CCR2 ‒ receptor tip 2 za hemokine sa CC motivom CD 11c ‒ protein na površini denditskih ćelija, ranije nazivan Integrin alfa X (INTGAX) CD1d ‒ glikoprotein koji prezentuje lipide („cluster of differentiation“ 1) CD25 ‒ alfa lanac receptora za IL-2 CD28 ‒ kostimulatorni molekul eksprimiran na aktiviranim T-ćelijama CD3 ‒ antigen eksprimiran na površini T-ćelija kao deo T-ćelijskog receptorskog kompleksa CD4 ‒ marker pomoćničkih T- ćelija CD40L ‒ ligand za CD40 CD8 ‒ koreceptor za T-ćelijski receptor eksprimiran uglavnom na citotoksičnim T- limfocitima c-FLIP ‒ antiapoptozni protein ( „cellular FLICE-like inhibitory protein“) cGMP ‒ ciklični guanozin monofosfat cIAP ‒ inhibitor apoptoze koji interferira sa kaspazama („Cellular inhibitor of apoptosis protein 1“) cIAP-2 ‒ inhibitor apoptoze koji interferira sa kaspazama („Cellular inhibitor of apoptosis protein 2“) CO ‒ ugljen monoksid COX-2 – ciklooksigenaza 2 cRel ‒ transkripcioni faktor koji sadrži Rel homologni domen i pripada NF-κB transkripcionoj familiji CX3CL1 ‒ hemokinski ligand 1 sa C-X3-C motivom, drugačije zvan fraktalkin CX3CR1 ‒ receptor za CX3CL1 CXCL10 ‒ hemokin sa CXC motivom 10, ranije znan kao protein kojeg indukuje iterferon gama 10 (IP10) CXCR3 ‒ receptor za CXCL10 DEPC ‒ dietil pirokarbonat dNTP ‒ deoksinukleozid trifosfat DTT ‒ ditiotreitol 4E-BPs ‒ protein koji vezuje eukariotski translacioni inicijacioni faktor 1 i tako formira kompleks koji učestvuje u regulaciji translacije („eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1“) EDTA ‒ etilendiaminotetrasirćetna kiselina EGTA ‒ etilen glikol tetrasircetna kiselina eNOS ‒ endotelijalna azotmonoksid-sintaza ERK ‒ kinaza regulisana ekstracelularnim signalom („extracellular signal-regulated kinase“) F4/80 ‒ antigenski marker mišjih makrofaga FKBP12 ‒ imunofilinski protein koji vezuje takrolimus, ranije poznat kao FK506 („FK506 binding protein“) FoxP3 ‒ transkripcioni faktor koji pripada FOX familiji proteina i ima karakteristični račvasti oblik domena kojim se vezuje za DNK („forkhead box P3“); bitan je za razvoj regulatornih T-ćelija GR ‒ glutation reduktaza GSH ‒ glutation GSH-Px ‒ glutation peroksidaza GSSG ‒ redukovana forma glutationa H2O2 ‒ vodonik peroksid HCl ‒ hlorovodonična kiselina HEPES ‒ 4-(2-hidroksietl)-1-piperacinetansulfonska kiselina HIF-1 ‒ faktor indukovan hipoksijom 1 („hypoxia-inducible factor“) HO-1 ‒ hem okisigenaza-1 I/R ‒ ishemijsko/reperfziono ICAM-1 ‒ intercelularni adhezivni molekul-1 IFN-γ ‒ interferon gama IKKα ‒ podjedinica IκB kinaznog kompleksa IKKβ ‒ podjedinica IκB kinaza kompleksa IL-10 ‒ interleukin-10 IL-12p40/70 – interleukin-12 IL-13 ‒ interleukin 13 IL-1β ‒ interleukin-1 beta IL-2 ‒ interleukin-2 IL-23 ‒ interleukin-23 IL-4 ‒ interleukin-4 IL-8 ‒ interleukin-8 iNKT ‒ invarijantne T-ćelijske prirodne ubice („invariant natural killer T cells“) iNOS ‒ inducibilna azotmonoksid-sintaza IRF-5 i 7 ‒ faktori 5 i 7 koji regulišu interferon („interferon regulatory factor“) IRS1 ‒ receptorski supstrat za insulin 1 („insulin receptor substrate 1“) IκBα- jedan od kappa-B proteina IκBβ- jedan od kappa-B proteina IκBγ- jedan od kappa-B proteina IκBε- jedan od kappa-B proteina KC ‒ hemokin kojeg produkuju keratinociti LPS ‒ lipopolisaharid LST8 ‒ protein koji je deo mTOR kompleksa sa ulogom da poveća njegovu kinaznu aktivnost LTα1β2 ‒ limfotoksin alfa1, beta2 macNOS ‒ makrofagna azotmonoksid-sintaza MAPK ‒ protein kinaza aktivirana mitogenom („mitogen activated protein kinase“) MCP-1 ‒ monocitno hemotaktički protein-1 („monocyte chemotactic protein-1“) MHC ‒ geni (proteini) glavne histokompatibilnosti („major hystocompatibility complex“) MIP-2 ‒ makrofagni inflamatorni protein-2 („macrophage inflammatory protein-2“) MOPS ‒ 3-(N-morfolin) propansulfonska kiselina; ima puferska svojstva i deo je rastvora koji se koristi u elektroforezi proteina MPTP ‒ pore koje povećavaju propustljivost mitohondrijalne membrane („mitochondrial permeability transition pores“) mTOR ‒ „mammalian target of rapamycin“ MyD88 ‒ mijeloidni diferencijacioni protein primarnog odgovora 88 („myeloid differentation primary response gene (88)“) Na+/K+-ATPaza ‒ natrijum, kalijum-ATPaza NADPH ‒ nikotinamid adenin dinukleotid fosfat NaN3 ‒ natrijum azid NFAT ‒ nuklearni faktor aktiviranih T ćelija („nuclear factor of activated T-cells“) NF-κB ‒ nuklearni faktor kapa B NIK ‒ kinaza koja indukuje NF-κB („NF-κB inducing kinase“) NK 1.1- marker T-ćelija prirodnih ubica kod miševa soja C57 nNOS ‒ neuronalna azotmonoksid-sintaza NO ‒ azot monoksid ·NO ‒ slobodni azotni radikal NP40 ‒ nonil fenoksipolietoksiletanol; ima funkciju deterdženta u destrukciji citoplazmatske membrane u cilju dobijanja intracelularnog sadržaja „nu/nu" ‒ oznaka za miševe kojima zbog određene genetske mutacije nedostaje timus O2 - ‒ superoksidni anjon p100/p52 (NF-kB2) ‒ transkripcioni faktor koji sadrži Rel homologni domen i pripada NF- κB transkripcionoj familiji p105/p50 (NF-kB1) ‒ transkripcioni faktor koji sadrži Rel homologni domen i pripada NF- κB transkripcionoj familiji PAS- „Periodic acid-Schiff“; histološki metod bojenja koji detektuje polisaharide i mukozne supstance kao što su glikoproteini PCNA ‒ nuklearni antigen proliferišućih ćelija („proliferating cell nuclear antigen“) PCR ‒ „polimerasa chain reaction“ PDGF ‒ faktor rasta kojeg produkuju trombociti („platelet derived growth factor“) PI3K ‒ fosfatidilinozitol 3 kinaza PMSF ‒ fenilmetansulfonilfluorid; ima svojstvo da inhibira serinske proteaze Poly(dI-dC) ‒ poli deoksiinozinska-deoksicitidilična kiselina PVDF ‒ poliviniliden fluorid RAD ‒ mikroemulzija everolimusa RAG1 ‒ gen koji kodira enzim koji učestvuje u rekombinaciji gena za T ćelijski receptor i imunoglobuline („recombinasa activating gene“) RANKL ‒ ligand za receptor kiji aktivira NF-κB („Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand“) Raptor ‒ regulatorni protein udružen sa mTOR-om („regulatory-associated protein of mTOR“) Ras ‒ signalni intraćelijski protein sa GTP-aznom aktivnošću koji interreaguje sa ERK REDD1 ‒ protein koji nastaje u odgovoru ćelije na stres kao što su hipoksija i oštećenje DNK („regulated in development and DNA damage responses 1“) RelA (p65) ‒ transkripcioni faktor koji sadrži Rel homologni domen i pripada NF-κB transkripcionoj familiji RelB ‒ transkripcioni faktor koji sadrži Rel homologni domen i pripada NF-κB transkripcionoj familiji RHEB ‒ protein koji je homologan Ras-u i značajno je zastupljen u mozgu („Ras homolog enriched in brain“); vezuje GTP i ima GTP-aznu aktivnost; učestvuje u insulin/mTOR/S6K1 signalnom putu Rictor ‒ protein pridružen mTOR-u koji je nesenzitivan na dejstvo rapamicina („Rapamycin-insensitive companion of mTOR“) 20S/26S ‒ podjedinice proteazoma S6K1 ‒ ribozomalni protein S6 kinaza 1 SDS ‒ natrijum dodecil sulfat (sodium dodecyl sulphate) SIN1 ‒ protein koji interreaguje sa protein-kinazama kije su aktivirane stresom („stress- activated protein kinase (SAPK)-interacting protein 1“) SKR ‒ slobodni kiseonični radikali SMAD3 ‒ sekundarni glasnik koji pripada familiji proteina koji modulira dejstvo TGF-ß i homologan je proteinu nađenom u Drozofili („Mothers against decapentaplegic homolog 3“) SOD ‒ superoksid dismutaza STAT3 ‒ transduktor signala i aktivator transkripcije („Signal transducer and activator of transcription“) TCR ‒ T-ćelijski receptor TGF-β ‒ faktor transformacije rasta-beta („transforming growth factor-ß“) TLR ‒ receptori slični toll-u („toll-like receptors“) TNF-α ‒ faktor nekroze tumora-alfa („tumor necrosis factor-alpha“) Treg-ćelija ‒ regulatorna T-ćelija Tweak ‒ slab induktor apoptoze koji je sličan TNF-α („TNF related weak inducer of apoptosis“) VCAM-1 ‒ vaskularni ćelijski adhezivni molekul 1 („vascular cell adhesion molecule“) XIAP ‒ X-vezani inhibitorni protein apoptoze BIOGRAFIJA Aleksandra V. Kezić je rođena 28.11.1968. godine u Raški. Osnovnu i srednju školu završila je u Mladenovcu. Diplomirala je na Medicinskom fakultetu Univerziteta u Beogradu 1994. godine sa prosečnom ocenom 9,55 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Od 1997. do 1998. godine radila je u Centru za imunološka istraživanja „Branislav Janković“ u Beogradu. Magistrirala je na Imunologiji odbranom teze pod nazivom „Dejstvo lezije preoptičke oblasti hipotalamusa na primarni humoralni imunski odgovor pacova“ 2000. godine, od kada je zaposlena u Kliničkom centru Srbije na Klinici za nefrologiju. Specijalistički ispit iz Interne medicine položila je 2001. godine sa odličnim uspehom i stekla zvanje specijaliste interne medicine. Od 2004. godine radi kao asistent na predmetu interna medicina na Medicinskom fakultetu u Beogradu. Subspecijalistički rad pod nazivom „Uticaj rezidualne bubrežne funkcije na stanje kardiovaskularnog sistema i regulaciju hipertenzije“ odbranila je 2006. godine i time stekla zvanje subspecijaliste nefrologa. Pohađala je školu nefrologije, dijalize i transplatacije u organizaciji „Evropskog Udruženja za Dijalizu i Transplantaciju“. Jednomesečno stručno usavršavanje na odeljenju nefrologije i transplantacije Univerzitetske klinike Eppendorf u Hamburgu obavila je 2005. godine. Od 2009. do 2010. godine radila je na naučnom projektu nefrološkog istraživačkog tima Univerzitetske klinike Eppendorf u Hamburgu šest meseci. Dr Aleksandra Kezić je učestvovala kao autor radova na nekoliko domaćih i međunarodnih kongresa. Nosilac je prve nagrade za poster prezentaciju na XVIII nefroloskom kongresu podunavskih zemalja u Novom Sadu 2006. godine. Autor je nekoliko radova štampanih u domaćim i časopisima od međunarodnog značaja.