РП 15057 1111111111111111111111111111111/l/llllll 003099771 #llc:!P3И1f:'П'"KA &ИМ~ i liJ•IФJijJUJ ~ 'ЪЗАР МАРКОВКI\~ V SF.cf.~ COBISS Ф UNIVERZITET U BEOGRADU MEDICINSKI FAKUL ТЕТ Sinisa s. Radulovic " . ' . ' PRETKliNICKA FARMAKOLOGIJA ANT AGONIST А BOMBEZINA Doktorska teza Beograd, 1993 - )8W8RТ'EТCI(A BИВJIIIO'I'IIКA nСВ~ЗАР M.tPI(OВU.•- 6EOINI _ l/_ И. Бр. qqf-1-;1 ;_~-. . _ ..... ' , .,. .._~.Ј . "' ..... ,,.. · .. , :.:-: \-:,, ..... . .. ~"'..,.. .... ~ ...... · Draвoj ~vetlani, Za JjuЬav, razumevanje i pomoe. PREDGOVOR Ekspeгiтeпtalпi deo ove teze игааеп је и регiоdи od oktobгa 1990. do dесетЬга 1992. godiпe па lпstitиtи za polipeptide, eпdokгiпologijи i гаk, Тиlејп Uпiveгziteta и Nји Огlеапsи, SAO (Polypeptide, Епdосгiпе апсf Сапсег lпstitиte, Тиlапе Uпiveгsity, New Oгleans, U.S.A.) . lzиzetпoj sгediпi, и kojoj se odvijao тој гаd, dopгiпeli sи istгaiivaci kojj sи Ьili гazlicitog оЬгаzоvапја, govoгili гazlicitiт jezicjтa, Ьifj гazfk:ifjh vега ј sa гazficjfiт tгadjcijaтa, ali пат је cjij blo jsfi: тоiето li skготпјт dоргјпоsот ротосј геsаvапји dгиgе пајсеsсе Ьolesfj od koje ijиdj итirи, гаkи. Sledece kolege sи тј тпоgо poтogle ј јskгепо јт se zahvaijиjeт: Ог К. Szepeshazy, ргоfеsог patologije iz Bиdimpeste, Ог Т. Уапо, doceпt, gjпekolog jz Tokija, Ог Scj В. Szoke, blolog jz Segediпa, Ог Sci R-Z .. Cai, hетјсаг iz Кiпе, Ог Ј. Pinski ј Ог Scj. Н. Reile, kolege jz Neтacke kao ј тој pгijateij Prof. Ог S. Milovaпovicи jz Beogгada. Zahvalaп sат Ргоf. Ог Апа-Магја Coттary-Schally, епdоkгјпоlоgи Ти/апе Hospital-a, sa kојот smo dogovaгali plaпove za kliпicka ispjfjvaпja. NajviSe sат zahvalaп Prof. dг Апdгеw Vjcfoг Schally-и, izиzetпoт jsfгaiivacи NoЬelovcи, sefи lпsfjfиta za polipeptide, eпdokгiпologijи i гаk и Nји Огlеапsи, za тоgиспоst da Ьиdет ргisиtап, ali iskгomпo dopгiпesem, пjegoviт иzvјsепјт ciijeviтa. Svoт prvom иciteijи iz oЬ/asti istгaiivackog гаdа i тепtоги Prof. Ог Toтislavи Kaiicи zahvalaп sат za stalпi iпteгes koji pokazuje za тој гаd kao ј za ротос. Ргоf. dг Milici Ргоstгап hvala za pгijateijskи podгskи ј pomoc kоји тi је pгиiila и гаzитеvапји гeceptoгskih stиdija. Zahvaijиjem se Pгof.cir /vапи Spиiicи, Ргiт.dг Labиdj Vиletic ј Ргјт.Ог Svefjsfavи Jelicи, sa lпstitиta za oпkologijи ј гadiologijи и Веоgгаdи, kojj sи тј svojiт stгиспјт savefjтa poтogli da гаd иsреsпо pгivedeп kгаји. Zahvaijиjeт па ротоеi Z. Rjsfovjc ј В. RјЬагiСи, eksperfjтa za гаd sa kотрјиtегјта. Beogгad, аргi/1993. SjпiSa Radиlovjc 2 ' 1 Т eza koja sledi zasnovana је na sledecim puЫikacijama: 1. 2. з. Schally A.V., Sгkalovic G., Szende В., Reding T.W., Janaky Т., Juhasz А., Koгkut Е., Cai R- z. , Szepeshazi К., Radulovic S., Bokseг L., Gгooth К., Serfozo Р., Comaгu-Schally А.М. (1990). Antitumoг effects of analogs of LH-RH and somatostatin; expeгimental and clinical studies. Ј. Steroid. Biochem. Molec. Biol., 37(6). 1061-1067. Radulovic S., Cai R.Z., Milovanovic S., Schally A.V. (1992). The blnding of ЬomЬesin and somatostatin and theiг analogs to human colon canceгs. Pгoc. Soc.Expeг. Biol., 200, 394-600. Radulovic S, Cai R.i~ .• Seгfozo Р. , Gгoot К., Redding T.W., Pinski Ј ., Schally A.V. (1991). Biological effects and гесерtог Ьinding affinities of new pseudononapeptide ЬomЬesin/GRP гесерtог anatagonists with N-teгminal 0-Тгр ог 0-Tpi. lnt. Ј Peptide Protein Res. , 38, 593- 600. 4. Pinski Ј., Milovanovic S., Yano Т., Hamaoui А., Radulovic S., Cai R.Z., Schally A.V. (1992). Biological activity and гесерtог Ьinding chaгacteгistic to vaгious human tumoгs of acetylated somatostatin analogs. Proc.Soc.Exp.Bioi.Med., 200, 49-56. 5. Szepeshazi К., Schally A.V., Cai R.Z., Radulovic S., Milovanovic S., Szoke В. (1991). lnhibltoг effect of ЬomЬesin/GRP antagonist RC-3095 and high dose of somatostatin analog RC-160 on nitrosamine-induced pancгeatic canceгs in hamsteгs. Саnсег Res., 51, 5980- 5986. 6. Radulovic S., Schally A.V., Reile Н., Halmos G., Szepeshazi К., Groot К., Milovanovic S., Milleг G., Yano Т. (1993). lnhibltoгy effect of antagonist of Ьomebsin/gastгin гeleasing peptide (GRP) and somatostatin analog (RC-160) on growth of НТ-29 human colon саnсег in nude mice. Acta Oпcologica, in pгess. 7. Radulovic S., Milleг G., Schally A.V. (1991). lnhibltion of growth of НТ-29 human colon саnсег xenogгafts in nude mice Ьу tгeatment with ЬomЬesin/GRP anatagonist (RC-3095). Саnсег Res., 51, 6006-6009. 8. Cai R-Z., Radulovic S., Pinski Ј., Nagay А., Redding T.W., Olsen D.B., Schally A.V. (1992). Pseudononapeptide ЬomЬesin antagonists containing C-teгminal Тгр ог Tpi. Peptides, 1 3(2)' 267-271. 9. Redding T.W., Schally A.V., Radulovic S., Milovanovic S., Szepeshazi К., lsaacs Ј .Т. (1992) . Sustained гeloase foгmulations of LH-RH antagonists SB-75 inhiblt pгolifeгation and enhance the apoptotic cell death of human prostate caгcinoma (РС-82) in male nude mice. Саnсег Res., 52, 2538-2544. 1 О. Milovanovic S., Radulovic S., Gгoot К., Schally A.V. (1992) . lnhibltion of growth of РС-82 human pгostate саnсег line xenogгafts in nude mice Ьу ЬomЬesin antagonist RC-3095 or comblnation of agonist (D-Trp6) LH-RH and somatostatin analog RG-160. The Prostate, 20, 269-280. 11. Radulovic S., Milovanovic S., Cai R-Z., Schally A.V. (1993). BomЬesin antagonists with diffeгent modification at the seven position of the pseudononapeptide. Biochem. Biophys. Res. Commun., in pгess. 12. Radulovic S., Cai R-Z., Szoke В. , Groot К., Milovanovic S., Schally A.V. (1993). Binding of ЬomЬesin and Ьombesin antagonists to rat glioma cellline (RT-2). Proc.Na!I.Acad.Sci., USA, in pгess. 13. Szepeshazi К., Shally A.V., Halmos G., Groot К., Radulovic S. (1992). Antagonist of ЬomЬesin/gastгin гeleasing peptide inhiblts gгowth of estrogen dependent and independent МХТ mammaгy cancer in mice. Journal of National Cancer lnstitute, 84 (24) , 1915-1922. 14. Schally A.V., Radulovic S. , Szepeshazi К. , Lebow С. (1991). Down-regulation of EGF receptoгs Ьу bomЬesin receptor antagonist. Ргос. Natl. Acad. Sci. (in pгess) . з . \ . 15. Radulovic S., Commary-Schally А.М .. , Milovanovic S., Schally A.V. (1992). Somatostatin analog RC-160 and LH-RH antagonist SB-75 inhiblt growth of MIA РаСа-2 human pancreatic cancer xenografts in nude mice. Pancreas, 8(1 ), 88-97. 16. Pinski Ј., Yano Т., Groot К., Radulovic S., Schally A.V. (1992). Endocrine effects of пеw pseudo nonapeptide tюmЬesin/gastrin releasing peptide antagonists with N-terminal D-Trp or D-Tpi in rats. Am. Ј . Physiol., 263, Е712- Е717. 17. Pinski Ј . , Yano Т., Relшsi Z., Cai R-Z., Radu!ovic S., Schally A.V. (1992). High potency of а new ЬomЬesin antagonist (RC-3095) in inhiЬiting serum gastrin levels; comparison of different routes of administration. Regulatory Peptides, 41, 185-193. 18. Radulovic S., Nagy 1\., Szoke В., Schally A.V. (1992). Cy1otoxic analog of somatostatin containing methotrexa!e inhiblts growth of MIA РаСа-2 human pancreatic cancer xenografts . , in nude mice. Cancer l_etters , 62, 263-271. 19. Yano Т., Pinski Ј., Szepeshazi К., Halmos G., Radulovic S., Groot К., Schally A.V. (1992). lnhibltory effect of Ьombesin/gastrin releasing peptide (GRP) antagonist and LH-RH antagonist SB-75 on growth of MCF-7 Mlll human mammary cancer xenografts in nude mice. Cancer, (in press). 20. Radulovic S., Szepeshazi К., Milovanovic S., Cai R-Z., Schally A.V. (1992). Antitumor activities of new antagonistic analogs of bombesin is linked to down-regulation of EGF receptors. Annals of Oncology, Suppl1 (З), Р1 ОО. Delovi iz uvoda ove teze su objavljeni u knjizi: ENDOCRINE TUMORS Experimental and Clinical studies in Hormone Dependent Cancer Autori: Andrew V. Schally, Sinisa Radulovic, Ana Maria Commary-Schally Ed(s). Е. Mazzaferri, N. Samaan Blackwell Scientific PuЫications lnc. (in press). 4 Predgovor ... ..... ..................................................................................... .. .. .. ... ." ............ ...... ......... 2 UVOD .............. ............................................................................... ..................................... ..... 8 Bioloska uloga bombenzina .... .. .......... ... ..... ........ ................ ...... ... .................................. 9 Receptori za bombezin/GRP ......... ... ...................... .......... .................. ... ..... ............. ... .. 1З Antagonisti bombenzina ..... .. ........ ... ............. ............. ................ .. ...... ... ..... .... .............. 15 CILJ RADA ..... .. ... .......... ... ... ......... ...... ...... .... ................ .......... ..... ........... ......... ......... ....... ..... 18 MATERIJAL 1 METODE ......................... ................. ...... .... .. ... ...... .. ..................... ..... ......... 19 . \ . /п vitro eksperimenti .. ... ............ .... ... ................ : ..................... ... ... ................... ............ ... ......... 19 Sinteza i izolacija aпaloga bombezina/GRP·a .... ........ ... ... .... ........... ........ .. .... .. ........ .... 19 Receptorske studije ..... ... ..... ........ ......... ........... ... ....... .... ....... .... ... ................................. 21 Mitogene analize .... ..... ....... ... ........ .... .. ... .. ............. ..... .... ....... ... .. .................. .............. ... 24 1. lnhiblcija inkorporacije oЬelezenog timidina u DNK celija .... ................... ... ..... ..... 24 2. lnhiblcija proliferacije eelija ....... ........ ........ .. ........ ........ ..... .... .. ......................... .... 25 З . Formiranje kolonija .... .. .. ................. .................... ...... .. .. .... ............. ......... ......... .. 26 Superfuziona analiz:a .... .. .. .. ... .. ..... ..... ..... .. ..... ............... .... ..... .......... .. .... ....... .. .......... .... 26 /п vivo eksperimenti ..... .. .......... .................. ...... ........ ......... ........ ..... ... ....... .... .... ... ............. ...... 28 lspitivanje endokrinih efekata antagonista bombezina kod pacova .... ... .. .. .. ... .. ........ 28 lspitivanje antitumorske aktivnosti antagonista bombezina .......... ... ........... .............. 28 1. Transplantati humanih tumora na golim misevima ......... ... .... ........ ..... ............... .. 29 2. Eksperimentj sa МХТ karcjnomom mjsa .................. ... .......... ........ ................... .. ЗО З . Eksperimenli sa hemijski indukovanim karcinomom pankreasa kod hrcaka ........ ЗО Histoloske procedure ............... ... .. ...... ..... ................................. .. .. ............................ ... З1 REZULTATI ... ...... ......... ..................... .............. ..... ... ... ... ............ .............. ... ... ... ...... ..... ..... .... З1 Struktura sintetisanih antagonista bombezina ...... ..... ......... .................. ......... ........... З1 Analiza aktivnosti ("screening") novosintetisanih analoga bombezina Јп vitro ....... З4 Tetradekapeptidni analozj ЬomЬezina .. ............... ....................... .... .. ........... .......... . З7 Analozi sa strukturnim izmenama na poziciji 7 ... .. ... ...... ....... ............ .... .......... ... ..... З7 Pseudononapeptidni analozi sa Trp ј Tpi na N-terminalu molekule ......................... З9 Rezultati sa pнrfundovanjm acinusima pankreasa pacova .. .... ............................... 41 Pseudononapэptidnj analozi sa Trp i Трј NA C-terminalu molekule ....................... . 44 Analozi Ьеz metionina na poziciji 14 (ОМе analozi) ј cikljcni analozi bombenzina .. . 47 Efekt antagoniste bombezina RC-3095 na rast celijskih linija humanog karcinoma pluca i dojke ............................................................................... 49 5 Zavrsпi pregled eksperimeпata in vitro .... ... ............... ... ............... ... .. ...... .. .. ............... . 52 Aktivпost aпtagonista bombeziпa u eksperimeпtima in vivo .. .................... ... ..... ... ... 53 Eпdokriпi efekti aпtagoпista bombeziпa kod pacova ...... .... ....... ............... .. ...... ......... 53 Efekt G RP( 14-27) na koncentracjje gastrjna, hormona rasta, jnsuJjna ј glukagona u serumu .......... ... .... .... .... ....... ... ........ ....... .. .................... ... ..... 53 Efekt D-Trp6 ј D-Tpj6 pseudononapeptjdnjh antagonjsta ЬomЬezjna RC-3095, RC-3420, RC-3125 ј RC-31 05 na endokrjne efekte GRP(14-27) -a .... ..... 54 Efektj GRP(14-27) ј RC-3095 na oslobadanje hromona rasta kod pacova ...... ..... .. . 57 Efekt RC-3440, Трј14 pseudononapeptjdnog antagonjste Ьombezina, na porast koncentracjje gastrjna u serumu pacova uzrokovan GRP(14-27) ...... ... ... 57 Utjcaj RC-3095 na koncentracjju gastrjna u serumu pacova posle razJicjtjh nacjna apJjkacjje (davanja) ...... ...... ......... ...... ... ................ .... ...... ..... 58 lпhibltornl efekt aпtagoпista bombeziп/GRP-a RC-3095 па rast MCF-7 Mlll humaпog karciпoma dojke traпsplaп-tiraпog golim misevima .. ...... .... ... ......... ..... ..... 62 lпhibltorпl efekt aпtagoпiste bombeпziпa/GRP-a RC-3095 па rast estrogeп zavisпog i estrogeп пezavisпog МХТ karciпoma dojke miSa ...... ............... ......... ..... . 66 lпhibltorпl efekt RC-3095, aпtagoпlste bombezlпa/GRP-a, па rast karciпoma paпkreasa hr~ka lпdukovaпog пitrozamiпom .............. ...... ...... .. ... .. .... ..... 71 Efekt aпtagoпiste bombezina/GRP-a, па rast РС-82 humaпog karcinoma prostate 11 golih miseva ..... .. ............................................. .... ............... ....... 73 Efekt RC-3095 i RC-3440, aпtagoпista bombezina/GRP-a, na rast НТ-29 humaпog karciпoma kolona traпsplaпtiraпog golim misevima ..... .. ..... .. ........ 76 lпtraspleпi~пa iпjekcija НТ-29 celija u golih miseva ...... ........... ..... ............ ....... .......... 82 DISKUSIJA .... ..... ..... .. ..... ............ .. ... ........... .. .. .. ... .... .......... ... ....... ... .. ............... .. ................... 83 Tipovi siпtetisanih aпtagoпista bombeziпskih receptora ....... .. : ..... .... .. .... .. .... ........ ... 83 Antagonjstj sa 0-Trp ј D-Tpj na N-termjnalu .... .... .. .................................... ............ . 84 Antagonjstj sa D-Trp ј D-Tpj na C-termjnalu .................. ..... ..... .... ....... .................. .. 85 Dezmetjonjn (О Ме) analozj ЬomЬezjna ...... ... .... ... ... ...... ........... ..... .................. ...... 86 Metodoloski aspekti ispitivanja antagoпista bombezina .. ... ......................... ..... ... .... .. 87 Eпdokriпi efekti aпtagonista bombeziпa kod pacova .. ........ ..... ......... ...... .... .. ..... ..... ... 90 Aпtitumorsko dejstvo aпtagoпista bombeziпskih receptora .................... .... .. ........... 92 Eksperimeпtalпi karciпomi dojke ............................. ....... .. .............. ..... .... .. ..... ... ... ....... 92 lnhjbltorno dejstvo antagonjste ЬomЬezjna RC-3095 na rasta MCF-7 Mlll humanog karcjnoma dojke transplantjranog goJjm mjsevjma .. ..... ........ 92 lnhjbltorno dejstvo RC-3095 na rast estrogen-zavjsnog ј estrogen-nezavjsпog МХТ karcjпoma dojke mjsa ..... ...... ..... ....... .... ... ...... ...... ....... . 93 lnhibltorno dejstvo antagoпiste mombezina RC-3095 па rast karciпoma pankreasa hr~aka uzrokovanog hemijskim karcinogeпom .. ..... .. ... .. ..... ... 94 lпhiЬitorпo dejstvo aпtagoпiste bombezina Rc-3095 na rast Рс-82 humaпog karcinoma prostate transplaпtiraпog golim misevima ..... .... ........ .. 95 lпhiЬitorпo dejstvo aпtagoniste bombezina Rc-3095 na rast НТ-29 humaпog karciпoma koloпa traпsplantiraпog golim misevima .... .... .............. 96 Moguci mehaпizmi aпtitumorskog delovaпja aпtagoпista bombeziпa ... ..... .... ...... ... 99 ZAKLJUCCI ...... .. ... · .. .... ......... ........... .. ... .. ................................ .. .... .. .. .... .... .. .... .. .... .... ... .. .. ... . 99 Literatura ..... .. ..... .. ..... ...................................... ..... ..................... , .......... ....... .... ..... ... .. ......... 101 6 SKRACENICE AgNOR BN BSA ВОР CFBS CNS DNK DMSO DME EDTA FBS Gl GRP GH IGF-1 HITES HPLC EGF LH LH-RH PBS PDGF PSA RPMI1640 RIA SCLC TGF-a. TFA Tpi - region agirofilne organizacije nukleusa; - ЬomЬezin ; - govedi albumin - N-nitrosoЬis(2-oxopropyl)amine; - "colostrum-frf!e Ьovine serum"-govedi serum Ьеz kolostruma; - centralni nervni sistem; - dezoksiriЬonukleinska kiselina; - dimetilsulfoksid; - DuiЬecco Modified Eagle hranljiva podloga; - etilendiamintetrasireetna kiselina; - "fetal Ьovine :;erum"-govedi serum; - gastrointestinalni; - "gastrin-releasing peptide"-gastrin oslobadajici peptid; - "growth hormon"-hormon rasta; - "insulin growth factor 1-insulinski faktor rasta 1; - hranljiva podloga RPMI 1640 sa dodatkom hidrokor1izona, insulina, transferina, esпadiola i selena; - tecna hromatografija visokim pritiskom; - "epidermal growth factor-epidermalni faktor rasta; - luteinizirajuci hormon; - luteinizirajuci hormon oslobadajuci hormon; - fosfatni puferski rastvor; - "platelet derived growth factor"-tromЬocitni faktor rasta; - prostaticni specificni antigen; - hranljiva podloga za kulturu celija, od: Roswel Park Memorial lnstitute; - radioimunoesej; - "small cellluпg cancer"-mikrocelularni karcinom pluca; - "transformin~J growth factor alfa-transformirajuci faktor rasta alfa; - trifluorosirce! па kiselina; - 2,3,4,9-tetral1idro-1 H-pirido(3,4-b)indol-3-karЬoksilna kiseina; UVOD U poslednjjh 40 godjna, od otkrjca antjmetaЬoljta ј alkjljrajucjh agenasa, farmakoterapjja је donela zajsta revolucjonarnj progres u terapjjj malignjh Ьolestj. Zahvaljucj tome, danas su mnoge Ьolestj jzlecjve, ukljucujucj akutпu limfocitпu leukemjju, Hodgkjп-ovu Ьolest , karcjпom testjsa ј dr. Ovakvj rezultatj dalje su вtjmuljsalj jstra.Zjvaпja jz oЬiastj aпtjпeoplastjcke farmakologjje. То podrazumeva jzolacjju пovjh lekova, пjjhovu hemjjsku ј Ьiolosku karakterizacjju i eksperjmeпtalпu ј kliпicku upotrebu. РоsеЬпо veliki jzazov za istra.Zjvace sirom sveta predstavlja ideпtifikacija пovih aktivnih lekova, sa jediпstveпim mehaпjzmom aпtjtumorskog delovaпja. Bazicпa istraiivanja u Ьiologiji tumora, pokazala su da maljgпe celije mogu Ьiti stjmuljsaпe па пekoпtrolisaпo deljeпje mпogim faktorima, tzv. faktorima rasta, koji potjcu kako jz spoljasпje srediпe tako i iz orgaпizma obolele оsоЬе. Mehaпizam delovaпja faktora rasta је јеdап od osпovпih proЫema u Ьio logjji, а пjegovo razumevaпje moze Ьitj kljucпj faktor za оЬјаsпјепје razloga za пekoпtrol isaпu proliferacije celija raka. Neuropeptjdi su peptidi kratkog lапса аmјпо kiseljпa kojj imaju regulatornu ulogu u homeostazi, а пalaze se u ceпtralпom ј perifernom пervпom sistemu kao i u pojediпim eпdokriпim celjjama. Опј mogu delovati па postgaпglijske receptore (kao пeurotraпsmjteri) , па okolпe celije (kao parakrjпj hormoпj) ili па udaljeпe orgaпe ј tkjva (kao eпdokriпj hormoпj) . Ustaljeпo mjsljeпje о пeuropeptjdjma, kao brzo-delujucjm пeurohumoralпjm traпsmjterjma, пеdаvпо је dорuпјепо otkricem da su mпogi пeuropeptidi jstovremeпo i faktorj rasta za mпoge пormalпe ili malig пe celije. U posledпjih пekoliko godiпa svedocj smo velikog jпteresa za ulogu ЬomЬeziпu-slicпih peptida u oпko logjji, kao i za razvoj sr.a.Zпih, kompetjtjvпjh aпtagoпjsta bomЬezjпskih receptora, zbog otkrica da ЬоmЬеziп predstavlja atltokrjпi faktor rasta za mjkrocelularпi karciпom pluca (1 ). Na Sljci 1. shematskj su prikazaпi autokriпa, parakrjпa i eпdokriпa sekrecija. 8 о\ в оО о Slika.1. Endokrina (А), parakrina (В) i autokrina (С) sekrecija. Regulatorni neuropeptid prikazan је crnim tackama а zadeЬijana, polukrufna mesta na celijskoj membrani oznacavaju receptore. BIOLOSKA UL0(3A BOMBEZINA BomЬezjn је tetradekapeptjd, jzolovan jz koze zаЬе Bomblna ЬотЬlпа od strane Erspamer-a ј saradnjka 1970. godjne (~~). U jsto vreme, Nakajjma ј saradnjcj (3), opjsalj su strukturu slicnog peptjda, kojeg su nazvalj ranatenzjn. Od tada, razlicitj peptidi sa strukturom karboksilnog dela (C- terminal) polipeptidne molekule slicne ЬomЬezinu, pronaaenj su ј kod drugih vodozemaca, ptica, гјЬа ј sisara (ТаЬеlа 1 ). 9 . \ . Т аЬеlа 1. Peptidi iz familije ЬomЬezina. VRSTA AMINO-КISELINSKI LANAC VODOZEMCI BomЬezin pGiu-G ln-Arg-Leu-Giy-Asn-Gin-Т rp-Aia-Vai-G ly-His-Leu-Met -NH2 Ranatenzin pGiu-Vai-Pro-Gin-Trp-Aia-Vai-Giy-His-Phe-Met-NH2 Litorin pGiu-Gin-Trp-Aia-Vai-Giy-His-Phe-Met-NH2 Filolitorin pGiu-Leu-Trp-Aia-Vai-Giy-Ser-Phe-Met-NH2 SISARI GRP(1-27) humani Vai-Pro-Leu-Pro-Aia-Giy-Giy-Giy-Thr-Vai-Leu-Thr-Lys-Met-Ту г-Pro-Arg--Giy-Asn-His-Т rp-Aia-Vai-Giy-His-Leu-Met -NH2 GRP(18-27) Gly-Asn-His-Trp-Aia-Vai-Giy-His-Leu-Met-NH2 Neuromedin В Gly-Asn-Leu-Т rp-Aia-Thr-Giy-His-Leu-Met-NH2 Trj podfamjljje peptjda sljtnjh ЬomЬezjnu prona<1enj su kod vodozemaca: ЬomЬezjnj, ranatenzjnj ј fjloljtorjnj. Ovj peptjdj karakteгjsu se р гета zajednjtkjm amjno kjseljnama u Ьljzjnj C·termjnala molekule: Leu 14, Phe 14 ј Ser 1 Э Jedno od prvih opisa11jh dejstava bomЬezjna Ьila је njegova sposobnost da oslobada gastrjn (za revjjskj prikaz vidi referencu 4). lmunohistohemijske studije pokazale su sjroku rasprostranjenost ЬomЬezina u mozgu, plucima ј gastrointestiпalпom traktu sjsara (5,6,7). McDoпald i sar. (8,9) su 19"/9. god. izolovali su polipeptid od 27 аmјпо kjseljпa sa sposobпoscu da oslobada gastriп iz zeluca sviпja, sto је Ьiо razlog da peptid nazovu "peptid koji oslobada gastrin" (GRP, od "gastrin releasing peptide"). Danas је struktura GRP-a ustanovljeпa amiпokiselnskim analizatorima (1 О) kao ј kloniranjem molekula (11 ). Kako је dekapeptidni deo karЬoksilnog kraja molekulн GRP-a identican molekuli ЬоmЬеzјпа, smatra se da је GRP, ustvari, ЬomЬezin sisara. Jedina razljka izmedu polipeptidnih lanaca GRP-a ј ЬоmЬеziпа је u tome sto se kod GRP-a па poziciji 20 rшlazi histidjn za razliku od glutamiпa па poziciji 7 Ьombeziпa. Slika 2 Likazuje па sljcпost molekula GRP-a ј ЬomЬezina. 10 ' \ . 1 о 5 14 NH2 Amphibian bombesin Slika. 2. Aminokiselinski niz humanog GRP aminokiseline su osencene. ЬomЬezina vodozemaca. Zajednicke GRP је siroko rasprostranjen u tkivima sisara, sa najvisom koncentracijom u neuroendokrinim celijama pluca, gastrointestinalnog trakta i mozgu, posebno hipotalamusu (12, 1 З, 14, 15, 16). Nekoliko studija ukazuju da је GRP parakrini medijator u razvoju pluca (6, 7, 12). Povisena GRP imunoreaktivnost pokazana је u razlicitim plucnim oЬoljenjima kao ј kod pusaca (za . revijskj pregled vjdj referencu 16). U CNS-u, GRP regulise telesnu temperaturu i apetit (4, 17). Osnovne funkcjje GRP-a u djgestjvnom traktu su regulacjja motjljteta creva, oslobadanje razljcjtjh hormona, stimulacija enzjrnske sekrecjje pankreasa kao ј stjmulacija rasta epitela creva i pankreasa (4, 16, 18,19,20,21 ). Na TaЬeli 2 sumirana su Ьioloska dejstva ЬomЬezina/GRP-a. Va.Zno је napomenuti da su, bar za sada, bloloske aktivnosti ЬomЬezina i GRP-a identicne. '\. ТаЬеlа. 2. Najva.Znija Ьioloska dejstva ЬomЬezina ј GRP-a. DEJSTVO REFERENCE 1. Parakrini medijator razvoja pluca 6,7,12 2. Termoregulacjja ј snizenje apetita 4,17 З. Regulacija motiliteta creva (stimuljse kontrakcije glatkih mjsica) 4, 15,16 4. Oslobadanje gastrjna, glukagona, jnsuljna, hormona rasta, 4,18,19, 5. Stimulacija rasta epjtela creva ј pankreasa 4,20,21 6. Mitogeno dejstvo na Swiss ЗТЗ celije (fibroЬiasti mjsa) 22 7. Autokrinj faktorj rasta u SCLC 1 Sa stanovjsta onkologije, najva.Znije ј najinteresantnije dejstvo Ьombezjna ј GRP-a је njihova sposobnost da deluju kao faktori rasta za mnoga normalna i neoplasticka tkiva. lnjekcjje ЬomЬezjna tok rodenjm pacovjma uzrokuje hjperplazjju mukoze antruma zeluca, kao ј hiperplazjju ј hjpertrofijtJ acjnusa pankreasa (21 ). Nedavno је pokazano da bombezin sna.Zno '- stimulise in vitro rast МС-26 celjja karcjnoma kolona misa (23) i da ubrzava sintezu DNK Swjss ЗТЗ misjih fibroЫasta (22). U hranljivoj podlozi Ьеz seruma u kojem rastu Swjss ЗТЗ celije, dodatak bomЬezjna povecava sintezu DNK, celije se ubrzano dele, ра cak i u odsustvu nekih drugih agenasa kojj stjmuljsu rast (22). Prema tome, ЬomЬezin deluje kao jskljucivi mitogen za Swjss ЗТЗ celjje, sto njje slucaj sa ostalim faktorima rasta koji su aktjvnj samo u sjnergjstickim komЬinacijama (24). Sljcan mjtogenj efekt p1ema Swiss ЗТЗ celijama pokazan је ј za GRP (25). BomЬezjn ј GRP stirnulisu rast normalnih celija epitela bronha u kulturj (26) , а vec је spomenuto da imaju ulogu u razvoju pluca kod sisara (12). Tumor jetre pacova, prouzrokovan hemjjskjm karcjnogenom, odlikuje se povecanom sekrecjjom ЬomЬezjna (27). BomЬezjn stjmulise in vitro rast РСЗ ј PMU23 humanjh karcjnoma prostate (28) . lsto tako, ј neke celjjske linjje karcjnoma dojke luce GRP (29), а moguca је ј znacajna uloga ЬomЬezjna u razvoju karcjnoma pankreasa (30). 12 Vezu jzmedu ЬomЬezjnaJGRP-a ј mjkrocelularnog karcjnoma pluca (SCLC) prvj su otkrjlj Mjnna, Moody, Gazdar, Cuttjta ј njjhovj saradnjcj 1985. god. Pokazalj su da mnoge celjjske linije SCLC jzlucuju ЬomЬezjnu slicne peptjde. Qvj peptjdi, preko specjfjcnjh receptora stjmulisu rast istjh celija koje su jh jzlucjle (1 ,31 ,32,33). Mjtogenost GRP-a potvrdena је esejom formiranja kolonija koriscenjem nekoliko tipova celijskih linija SCLC (34). lnkorporacijom tricjjumom obelezenog tjmjdjna u DNK eeljje, WeЬer ј saradnjcj (35) pruzjlj su jasan dokaz da је GRP selektjvпj mjtogen za SCLC. Monoklonalna antjtela usmerena protjv GRP-a jnhjblrala su rast kolonjja celjja SCLC in v1lro kao ј rast jstjh eeljja transplantjranjh (ksenograftjranjh) goljm mjsevjma (1 ). Sta vjse, prvj antagonjst ЬomЬezina, (D-Arg 1 ,D-PheБ,D-Trp7•9, Leu 11 )supstancjja Р, sprecio је rast nekoliko SCLC eeljjskjh ljnjja in vitro (36). Svj ovj nalazj Ьilj su dovoljnj za tvrdnju da је ЬomЬezjnJGRP autokrinj faktor rasta za SCLC. Karcjnom pluca је, inace, ј dalje najcesca maligna Ьolest u razvjjenom svetu. Mjkrocelularnj tjp karcjnoma pluca cinj 20-25% od ukupnog broja oЬolelih ј odljkuje se agresivnjm kljпjckjm tokom, uprkos pocetne hemosenzjtjvnostj. Poznavanje faktora rasta za SCLC, kao ј sjstema drugjh glasnjka u sprovodenju sjgпala do jпtracelularnjh struktura, moze dovesti do sjnteze novih lekova kojj Ьi se korjstjlj u prevencjjj ili lecenju ove Ьolestj. RECEPTORI ZA BOMBEZIN/GRP Specjfjcпj receptori za ЬоmЬеzјп ј GRP izucavani su autoradjografskjm ј radjoreceptorskjm studijama (16,25). Vezjvanje komercjjalno dostupnog radjoliganda ( 1251)Tyr4-bomЬezjna ј (12SI)GRP-a (Amersham ј New England Nuclear), moze se jnhjblratj drugjm ЬomЬezjnu-sljcnim peptidjma ili razlicjtjm Ьombezjnskim antagonjstjma, ali ne ј strukturno razljcjtjm faktorjma rasta kao sto su EGF jii tromЬocjtnj faktor rasta (PDGF)(25). Experjmentj umrezavanjem ("cross-linkjng"), korjscenjem (12SI)GRP-a, jsto tako jdu u prilog nalazu da se ЬomЬezjn/GRP vezuje za specjfjcne receptore velikog afjnjteta na povrsjnj celija. Mesta za vezivanje ЬomЬezjna sa velikim afinitetom, jasno su pokazana receptorskim studijama na celijama hjpofize (37), acinusima pankreasa glodara (38), membranama humanog pankreasa (39), karcinoma kolona mjsa (23), Swiss 3Т3 celjjama, kako intaktnim tako i membranama (25), celijskim linjjama SCLC (40), celjjskim ljnijama humanog karcinoma prostate (28) kao ј celjjskim ljnjjama humanog karcjnoma dojke, ali ne ј u normalnom tkjvu dojke (29). 13 ' '· Fizicke osoblпe Ьoml)eziпskih/GRP receptora пajv ise su izucavaпe па Swiss 3Т3 celijama od straпe Rozeпgurt-a i saradпika (41 ,42). Receptor za ЬоmЬеz iп је gl ikoproteiп , molekulske mase 75 000-85 000, sa jedпim Ьоспјm karЬohjdratпjm laпcem vezaпjm za atom azota ј ukupпom masom polipeptjdпog dela molekule od oko 43 000. Relatjvпo mala masa peptidпog dela ЬomЬeziпskog receptora, razlikuje ga od specificпih receptora za veciпu drugih faktora rasta (па pr. EGF, PDGF) , ali ga ipak svrstava u familiju receptora koji salju ~;voje sigпale u uпutrasпjost eelije preko G proteiпa. Vezivaпje faktora rasta za specificпe receptore zapociпje stvaraпje raпih sigпala u celijskoj membraпi, citosolu i пukleusu koji, posle perioda od 1 О do 15 casova, vode proliferaciji celija. Sistem drugih glasпika koji sprovode aktivaciju celjje Ьombeziпom detaljпo је jzucavaп па jпtaktпjm Swjss 3Т3 celijama (za revijski prikaz vidi refereпcu 43). BomЬeziп, posle vezivaпja za receptor i i пterпalizacije kompleksa bomЬeziп-receptor, stimuljse fosforilaciju kiselog celjjskog proteiпa mase 80К, koji је glavпi supstrat proteiпske kiпaze С (РКС). РКС , koju aktiviraju diagljceroli ј forЬol estri, ucestvuje u preпoseпju signala kod razlicitih funkcija celije, kao sto su kontrakcija ili sekrecjja (44) . Smatra se da је aktivacija РКС osnovпi put sprovoёlenja signala kojj vode mitogenezi (24) . lsto tako, pokazano је da је јеdап od пajranijih dogaёlaja koji su opisaпi posle vezivaпja ЬоmЬеziпа za receptor brza mobllizacija јопа kalcjjuma iz intracelularnih depoa, sto vodi porastu koncentracije sloЬodпog јопа kalcjjuma u celiji (45) . Mobllizacija intracelularnog kalcijuma verovatno nastaje posredovaпjem jпozjtol 1 ,4,5-trifosfata, koji пastaje hidrolizom fosfatidiliпozitol 4,5-Ьifosfata u celijskoj membrani, procesom kojim nastaje i 1 ,2-diacilglicerol. Diaglicerol se, sa druge strane, pojavljuje i kao "drugi glasnik" posle aktivacije РКС ЬomЬeziпom. Od ostalih intracelularnih dogaёlaja koji nastaju kao posledica dejstva ЬomЬezina vredi spomenuti i akumulaciju сАМР-а, oslobaёlaпje arahidonske kiseline i sintezu prostaglaпdiпa, transmodulaciju EGF receptora, iпfluks јопа natrijuma, stimulacija пatrijumlkalijum jonske pumpe, роvесапје nivoa mRNK za c-fos i c-myc tj . indukcija protoonkogeпa i dr. (43). Nedavпo је receptor za ЬomЬezin kloniraп (46), sto ее verovatno doprineti rasvetljeпju ranijih sumпji о heterogeпosti ЬomЬeziпskih receptora. Prvi put su dve vrste receptora za ЬоmЬеzјп opisane па membraпama karciпoma kolona misa (23) . Von Shrenk i saradпici su 1990.god. pokazali razliku izmeёlu receptora za пeuromediп В Gedan iz familije ЬomЬeziпu-slicnih peptida) i receptora za ЬomЬeziп/GRP (47) . Naime, пeuromediп В receptori nalaze se prveпstveпo u ceпtralnom nervпom sisternu i razlicitim glatkim misicima gastrointestinalпog trakta, а receptori za ЬomЬezin/GRP prisutni Stl u tkivu pankreasa kao i па maligпo promeпjenim celijama. Napori 14 jstrai jvaca su usm~reпj ka s jпtez j specjfjcпjh aпtagoпjsta пе samo za ЬomЬezjпskj receptor vec ј za receptor za пeuromed jп В . ANT AGONISTI BOMBEZINA Otkrjee da је ЬomЬezjnfGRP autokrjпj faktor rasta za mjkrocelularпj karcjпom pluca, stjmuljsalo је jstraijvaпja hormoпskog prjstupa terapjjj ove Ьolestj upotreЬom specjfjcпjh ЬomЬezjпskjh aпtagoпjsta. Sjпteza aпtagoпjsta lюmЬеzјпа bazjra па modulacjjj tetradekapeptjdпe strukture ЬоmЬеzјпа vodozemaca, COOH-termjпala amjпokjseljпskog пјzа GRP-a sjsara jlj па пekjm peptjdjma kratkog lапса. Мпоgј tjpovj aпtagoпjsta ЬоmЬеzјпа su vec sjпtetjsaпj, alj se пastavljaju парогј za dоЬiјапје sto sпaiпjjjh ј terapjjski sto efjkasпjjjh јеdјпјепја. Novjjj aпtagoпjstj Ьi trebalo da budu specjfjcпj za celjje SCLC sa sto је moguce mапје пezeljeпjh dejstava. Od ovjh јеdјпјепја se ocekuje prjmeпa ј u terapjjj karcjпoma koloпa, zeluca ј paпkreasa. Aпtagoпjstj ЬоmЬеzјпа se dele u сеtјгј grupe: 1. Aпalozj supstaпcjje Р, 2. Aпtagoпjsti sa amjпokjseliпom D-Phe па pozjcjjj 12 ЬоmЬеzјпа, З. Aпtagoпjstj sa redukovaпom peptjdпom vezom ј 4. Des-Met14 aпtagoпjstj tюmЬеzјпа. Najraпjjj aпtagoпjstj ЬоmЬеziпа Ьilj su aпalozj supstaпcjje Р (26,36,47,48,49). Qvj aпtagoпjstj (ТаЬеlа 3), specjfjcпo ј kompetitjvпo jпhjЬisu vezjvaпje ЬоmЬеzјпа za celjje mozga pacova ј celjje SCLC ј suprjmjraju sekrecjju amilaze uzrokovaпu ЬоmЬеzјпоm jz acjпusa paпkreasa, jпhjЬisu mjtogeпezu Swjss ЗТЗ celjja stjmuljsaпu ЬоmЬеzјпоm ј formjraпje koloпija SCLC in vitro (26,36,47,48,49). Medutjm, aпalozj supstaпcjje Р delovalj su ј kao aпtagoпjsti receptora za Supstaпcu Р tj. пjsu Ьilj specifjcпi aпtagoпjstj ЬomЬezjпskjh receptora, Ьili su aktjvпj tek u mjkromolarnjm koпceпtracjjama, а пjsu Ьilj u staпju da jпhjЬiraju pojediпa dejsta ЬоmЬеzјпа, па prjmer st jmuljsaпu sekrecije zeluca (49, 50) . Druga klasa aпtagoпjsta ЬоmЬеzјпа пastala је zameпom hjstjdjпa па pozjcjji 12 u molekuli ЬоmЬеzјпа D-oЬijkom fепјlаlапјпа. lako su tako пastalj specjficпj aпtagoпjstj za ЬomЬezjпske 15 . '· receptore, onj su jpak Ьilj oko 2 000 puta manjeg afjnjteta od samog ЬomЬezjna ј Ьilj su tesko rastvorljjvj u dostupnjm rastvaracjma (51, 52). Prvj specjfjcnj, kompetjtjvnj ј sn,Tpi12-BN (6-12) 1000 44. RC-4020 D-Trp6,TpP2-BN (6-12)РА 1000 45. RC-4010 D-Trp6,Tpi12-BN (6-12)0Н 1000 46. RC-4030 Tpi1',Trp12_BN (6-12) 1000 47. RC-3715 D-Trp6,Trp12_BN (6-12) 1000 48. RC-4125 D-Trp6,Trp12_BN (6-12)РА 1000 49. RC-3710 D-Tpi6,Trp12-BN (6-12) 1000 50. RC-4140 D-Pai6,Tpi12-BN (6-12) 1000 51. RC-4150 D-Cpa6,Tpi12_BN (6-12) 1000 сн2 52. RC-3950 D-Phe6, CH2-Cys 14-BN (6-14) 1200 53. RC-395011 D-Phe6,CH2NH-Cys 14-BN (6-14) 1200 сн2 54. RC-3955 D-Trp6,CH2N-Cys14-BN (6-14) 1200 сн2 55. RC-398511 D-Phe6,CH2N-Pen14-BN (6-14) 1200 56. RC-39851 D-Phe6,CH2N-Pen14-BN (6-14) 1200 *Analozj jdentj~ne strukture kao analozj RC-3110 ј RC-3100 opjsanj su od strane Соу-а ј saradnjka, 1989 (54); BN, Ьombezjn; РА, propjlamjd; OEt, etjlestar. 33 ANALIZA AKTIVNOSTI ("SCREENING") NOVOSINTETISANIH ANALOGA BOMBEZINA /N VITRO "Screening" novosintetisanih analoga ЬomЬezina u uslovima in vitro vrsen је kompetitivnim receptorskim analizama, tj . odreёlivanjem njihove sposobnosti da inhiblraju specificno vezivanje 1251-Tyr4-BN za ЬomЬezinske receptore na intaktnim Swiss 3Т3 misjim fibroЬiastima. Najpre su u nekoliko eksperimanata pro\'ereni uslovi za optimalno vezivanje oЬelezenog Tyr4-BN, koji su inace vec ranije opisani u radu Zatшry-a i Rozengurta, 1986 (25). Vezivanje 1251-Tyr4-BN za konfluentne Swiss 3Т3 celije је visoko specificno (60-80%), а ukupno vezivanje iznosilo је oko 7% dodate radioaktivnosti. Specificno vezivanje је Ьilo zavisno od temperature i vremena inkubacije. Optimalno vezivanje је Ьilo na temperaturi od 37°С i pri duzini inkubacije od 30 min (Siika 6) . Na temperaturi od 4°С, vezivanje је sporo, dostize stanje ravnoteze posle 60 minuta i ostaje kon:>tantno sledeca 2 h (Siika 6) . А в .. ~· ~ " i· t2: ,, ' 2 f f {: {: ~ 2 ~" " 10 "' "' ., ., .. "' 150 200 250 :хю Э5О 100 ._".. {~ _,.,.I"*'J Slika 6. Specificno vezivanje 1251-Tyr4-bombezina za receptore na Swiss 3Т3 celijama u zavisnosti od temperature i duzine inkubacije. А - vezivanje se odvijalo na 37° С, В - vezivanje se odvijalo na temperaturi leda. 34 . '· Eksperimenti sa Swiss ЗТЗ celijama koje su rasle u posudama sa 96-polja, pokazali su da u takvim uslovima broj celija nije dovoljan za znacajnije specificno vezivanje oЬelezenog Tyr4-BN. Minimalan broj celija koji је dozvoljavao ovakve eksperimente је oko 2 х 105, sto је zahtevalo da se za rast celija koriste plasticne posude sa 24 polja. Vezivanje 1251-Tyr4-BN је specificno. BomЬezin i GRP(14-27), u koncentraciji od 1 1-1mol, skoro u potpunosti inhiblsu specificno .vezivanje oЬelezenog Tyr4-BN. Specificno vezivanje oЬelezenog liganda (1251-Tyr4-BN) nije inhiЬisano mikromolarnim koncentracijama somatostatina, insulina, supstancije Р, EGF-a i vazopresina (ТаЬеlа 6). Tabela 6. Specificnost vezivanja 1251-Tyr4-BN za intaktne Swiss ЗТЗ celije. Neobelezena supstancija Koncentracija (l!f1lol) Specificno vezivanje (%) BomЬezin 1 28.8 GRP(14-27) 1 29 Somatostatin 5 97.7 lnsulin 4 95.2 Supstancija Р 1 90.8 EGF 0.3 97.7 Vazopresin 1 98.3 Na Slici 7 је prikaza11a zavisnost vezivanja od koncentracije (0.005 - З nM) primenjenog oЬelezenog liganda. Specificno vezivanje Ьilo је "saturaЬilno", а nespecificno vezivanje raslo је linearno sa porastom koncentraciije liganda. Scatchard-ova analiza ovih podataka ukazuje na prisustvo jedne klase receptora velikog afiniteta, konstante disocijacije Kd = 0.6±0.14 х 1 О -9 М i maksimalnog kapaciteta vej~ivanja Bmax = 265,9 ± 50 fmol/mg proteina (srednja vrednost od 20 eksperimenata ± SE). Koncentracija receptorskih mesta iznosila је 7.2 х 1 о-12, prosecna koncentracija proteina ро jednom oknu tj. u 2 х 1 05 celija, iznosila је oko 45 1-19. sto sve omogucava izracunavanje broja receptorskih mesta ро jednoj celiji: on iznosi 36 600 ± 6 500 receptora/celiji (srednja vrednost ± SE). Bioloska aktivnost sir.tetisanih analoga ЬomЬezina u receptorskim analizama, izrazavana је preko vrednosti IC50, koja oznacava koncentraciju analoga koja inhiЬira 50% specificnog vezivanja radioliganda. 35 ' '· о 2 шJ.GRP. nM 3 Slika 7. Vezivanje 1251-Tyr4- ЬomЬezina za receptorska mesta па Swiss ЗТЗ eelijama u zavisnosti od koncentracije ljganda. Eksperimentj su izvoaeni na 37°С. • , specificno vezivanje, • , nespecjficno vezivanje. Na ordjnatj se nalaze vrednost j vezanog ljganda (8, "Ьound"), а na apscjsj koncentracjja oЬelezenog ЬomЬezjna (F, "free") u pmol/ml (nM). Unutar slike prjkazana је ј Scatchard-ova analjza podataka. Drugj test za analizu aktjvnostj sjntetjsanjh ЬomЬezjnskjh analoga Ьiо је jпhibicija j пkorporacjje oЬelezenog tjrnidjna u DNK Swjss ЗТЗ celija stimuljsana GRP (14-27)-om. Naime, GRP(14-27) u doznom rasponu od 0.1 do 1 ОО nM stjmuljse preuzjmanje (3H)tjmjdina od strane Swjss ЗТЗ celjja, ukazujucj na mitogenj efekt GRP-a. Polovina maksjmalnog efekta GRP(14-27)-a vjaa se prj koncentracjjj od 1 nM. Na Sljcj 8 prjkazana је dozno-zavjsna kriva mitogenog efekta GRP(14-27)-a. Ovo dejstvo GRP(14-27)-a Ьilo је sljcno delovanju ЬоmЬеzјпа, opjsanom u radu Sjnnett-Smjth-a ј saradnika (42) . ~ Slika 8. GRP(14-27) dozno-zavisno ci 100 о-о .~ r/' ~ stjmulise inkorporaciju tricjjumom "' r/? '-о а. obelezenog tjmidina u DNK Swiss ЗТЗ '-о () о celije. Svaka tacka predstavlja srednju .:: 50 ./ Q) с: vrednost (± SE) od tri odvojena :tj ·а >, eksprjmenta raaena u kvadliplikatu. .<: о Е- / ' 1 :х: о n· с::.. 0. 1 10 100 GRP (14-27), nM 36 '1 Tetradekapeptjdnj aвalozj bombezjna lzmenama u redosledtJ amjnokjseljna cjtave molekule ЬomЬezjna ili GRP (14-27)-а, najpre su sjпtetjsana trj aпaloga, tetradekapeptjda: RC-3003, RC-3005 ј RC-3009 (vjdetj TaЬelu 5) . Njjhova sposobпost da jnhjЬisu specjfjcпo vezjvanje 1251-Tyr4-BN-a za receptorska mesta na Swjss 3Т3 celijama izraZeпa је preko vredпosti IC50 i te vredпosti, za ove aпaloge Ьile su 1 05, 50 ј > 1000 ' ' пМ. Ovakvi rezultati su ukazali da sпaZпije aпtagoпiste ЬоmЬеziпа treba traZiti u peptjdjma kraceg lапса. Aпalozj ЬоmЬеzјпа od redпog broja 4 do 56 sa Т аЬеlе 5, su analozj kratkog lапса amjпokjseljпa, попарерtјdј, oktapeptjdj, heptapeptjdj ј septapeptjdj. Radj jasпijeg ј lakseg prjkaza пjjhove Ьioloske aktjvпostj , oni su podeljeni u пekol jko grupa. Analozj sa strukturnjm jzmenama na pozjcjjj 7 Odvojeпu grupu јеdјпјепја predstavljaju analozj пastalj strukturnjm jzmenama na pozjcjjj 7 u ЬomЬezjnu (6-13), ЬomЬezir1u (6-14), ЬomЬezjnu (7-13) ј ЬomЬezinu (7-14) kao ј Ьombezjпu (6-12) ј ЬomЬezjnu (7-12). Ovi analozj siпtetjsaпj su sa jlj Ьеz redukovaпe peptjdпe veze па termjпalпom C-atomu molekule. Njjhovu strukturu, kao ј aktjvпost u јпhјЬiсјјј specifjcпog vezjvaпja obelezeпog Tyr4-BN-a prjkazuje ТаЬеlа 7. Na Sljcj 9 prikazaпe su dozпo-zavjsпe jпhjЬitorпe krjve za neke od aпaloga sa strukturпjm jzmeпama па poziciji 7, na osnovu kojih је ј jzracuпavaпa vredпost IC50. ~ ::: о u С> z ::::> о IIJ z и; w IIJ ::0 о IIJ 1 ..,. ... ,., ..... 1 ,;; N 1 100~- ~---·-·-· "":- - ' ---. ·,~ ~.... ----... ·-----~"'- -а..... ---& ' --~, ' ' '"е 'о_ ~" ""- --"--.." о- о RC-3430 . ' '11,_ ' •--• RC-3350 6_ . о....::.~ ' 6 · · 6 RC-3360 "'-. -,, ' •-• RC-3320 "'-. , 'ь о- - о RC-3324 · 0~\, •-•RC-3310 6 6 - -~ 75 50 25 · . - R~- ­ . -~ oL-~~--~~--~~--~~ ~ -10 -9 -8 -7 -6 CONCENТRATION (log М) Sljka 9. lnhiЬicjja specificпog vezivaпja oЬelezeпog Tyr4-BN-a aпalozima ЬomЬezina пastaljm strukturпjm izmeпama na pozicjji 7 ЬоmЬеzјпа. Celjje su jпkuЬiraпe sa 0.05 пМ 1251-Tyr4-BN-a u odsustvu prjsustvu пavedeпjh koncentracjja analoga, kako је opisano u poglavlju Materjjali ј Metode. Rezultatj su jzraZeпj kao proceпt i od saturaЬilnog vezjvanja u odsustvu analoga. U svakom eksperjmentu, ројеdјпа tacka predstavlja srednju vredпost od сеtјгј eksperjmeпta, odredjvaпe u tripljkatu. 37 . \ . Т аЬеlа 7 Aktjvnost ЬomЬezjnskjh analoga nastaljh jzmenama lanca ЬomЬezjna па pozjcjjj 7 lnhiblcija vezivanja Bombezinski analog obelezenog Tyr4-BN za Swiss ЗТЗ celije IC50 (nM) RC-3030 Ac-Hjs7-BN (7-13) 165 RC-3040 Ac-Hjs7,Leu14_BN (7-14) 65 RC-3045 Ac-Hjs7,Leu13 I.V(CH2NH)Leu14-BN (7-14) 230 RC-3075 0Tpj6,Hjs7-BN (6-13) 50 RC-3080 0Трј6, Hjs7, Leu 13 I.V(CH2NH)Leu 14-BN (6-14) NE RC-3495 0Tpj6,Hjs(B.z)7,Leu13 I.V(CH2NH)Leu14-BN (6-14) 82 RC-3310 0Phe6,Hjs(Bz) 7•Leu 13ч,(СН2NН) Phe 14-BN(6-14) 39 RC-4160 AcGiu7,Trp12-BN (7-12) 180 RC-4170 O-Trp6,Giu(OMe)7-BN (6-12) з оо RC-3430 Phe6,Giu7,Leu13 'I'(CH2NH)Phe14_BN (6-14) 22 RC-3350 0Phe6,Giu(CH3NH)7,Leu 13,v(CH2NH)Phe 14-BN(6-14) 57.5 RC-3360 0Phe6,Giu(0Me)7,Leu13 I.V(CH2NH)Phe14-BN (6-14) 5.7 RC-3324 0Phe6,0pa(Ac)7•Leu13 I.V(CH2NH)Phe14-BN (6-14) >1000 RC-3320 0Phe6,0pa(NH2C0)7,Leu 1 ЗI.V(CH2NH)Phe 14-BN (6-14) NE NE, nema elekta Najaktjvnjje jedjnjenje jz ove grupe analoga ЬomЬezjna predstavlja RC-3360, analog sa Glu(OMe) na pozjcjjj 7, pseLJdononapeptjd sa amjnokjseljnom OPhe na pozjcjjama 6 ј 14 (IC50 oko 6 nM). Prjsustvo hjstjdjna na pozjcjjj 7 dalo је analoge sa razljcjtom aktjvnoscu. Medutjm, nj jedan antagonjst jz ove grupe nije pokazao vecj afjnjtet za ЬomЬezinske receptore od analoga sa Glu(OMe) na poziciji 7 (analog RC-3360). lsto tako, acetilovanje hjstjdina7 Uedjnjenja RC-3030, RC- 3040 i RC-3045) njje znacajnije pojacavalo Ьiolosku aktivnost. Analozi sa glutaminom na poziciji 7, kojima su nedostajale amiпokiseline na pozjcjjama 1 З i 14, tj. analozi RC-4160 ј RC-4170, Ьili su aktivni u koncentracijama ocl 1 ОО do 300 nM. Prisustvo Ора i derivata Ора na poziciji 7 drasticno је smanjilo Ьiolosku aktivnost jedinjenja. 38 ' ' Pseudononapeptidni analozi sa Trp i Tpi па N-terminalu molekule Sledeca grupa ЬomЬezjnskjh analoga predstavljeпa је jedjnjenjjma sa redukovanom peptjdnom vezom (pseudoпonapeptjdj) jzmedu pozjcjja 1 З ј 14 poljpeptjdnog lanca. Svj ovj aпaloz j jmaju D oЬijke Trp ј пjegovog aпaloga Трј па N-termjпalu (ТаЬеlа 8). Трј је strukturno јzmепјеп analog Trp ј vjse hjdrofobaп od Trp-a. Pretpostavjlo se da Се prjsustvo hjdrofobпjh amjnokjseljna, kao sto su Trp ј Трј , pojacatj aпtagoпjstjcku aktjvпost jedjnjenja DPhe6,Leu13 'V(CH2NH)Leu14-BN (6-14) (RC-3100) ј DPhe6,Leu13 'V(CH2NH)Phe14_BN (6-14) (RC-3105) za koje su Соу ј saradпicj (53) pokazalj da jmaju veoma velikj afjпjtet za ЬomЬezinske receptore па Swjss ЗТЗ celijama ј acjпusjma paпkreasa pacova. Aпtagoпjstj, орјsапј od straпe Соу-а ј saradпjka, su sjпtetjsaпj u паsој laЬoratorjjj ј sluze kao koпtrola. Sjпtetjsaпo је deset aпaloga sa D-Trp ј D-Tpj па N-termjпalu. Njjhovu strukturu, kao ј Ьioloska aktjvпost prjkazuje ТаЬеlа 8. Testjraпa је пjjhova sposobnost da jпhjblraju specjfjcr\o vezjvaпje oЬelezeпog Tyr4-BN-a za ЬomЬezjпske receptore па jпtaktпjm Swjss ЗТЗ ј NCI Н-345 celjjama, kao ј da jпhjblraju stjmulacjju rasta Swjss ЗТЗ celjja uzrokovaпu GRP(14-27). Krjve jпhiblcjje specjfjcпog vezjvanja 1251-Tyr4-BN-a za ЬomЬezjпske receptorske u prisustvu razlicitjh koпceпtracjja pojedjпjh ЬomЬezjпskjh aпaloga sa Trp ј Трј па N-termjпalu prikazuje Slika 1 О . Koпstaпte djsocjjacije za vezivaпje oЬelezeпog Tyr4-ЬomЬeziп Swiss ЗТЗ celije Ьila је 0.6±0.14 пМ а za Н-345 celije 0.51±0.21 пМ (sredпja vredпost ± SE). Koпstaпte disocjjacjje za GRP(14-27) izпosile su 1.3±0.43 пМ za Swiss 3ТЗ eelije i 1.6±0.6 пМ za Н-345 eelije. Vесјпа aпtagoпjsta ЬоmЬеzјпа sa pseudo-peptjdпom vezom izmedu 1 3-og ј 14-og С atoma ј amjпokjseljпama Трј ј Trp па pozjcjjj 6, pokazjvalj su sпа:Zап afjпjtet vezjvaпja za receptorska mesta па jspjtjvaпjm celijskjm ljпjjama (Siika 10 ј ТаЬеlа 8). Medu aпtagoпjstjma sa пajvecima afjпitetom za receptorska mesta па Swjss ЗТ3 ј Н-345 celijama Ьili su DPhe6,Leu13 'V (CH2NH)Phe14_BN (6-14) (RC-3110) ј DTrp6,Leu1 3 Ч'(CH2NH)Phe14-BN (6-14) (RC-3420) (Tabela 8) . Nasj eksperjmeпtj su samo potvrdjlj пalaze Соу-а ј saradпjka (53) , da јеdјпјепја DPhe6,Leu13 'V (CH2NH)Leu14_BN (6-14) (RC-3100) ј DPhe6,Leu13 'V(CH2NH)Phe14_BN (6-14) (RC-3110) pokazuju sпа:Zап afjпjtet za ЬomЬezjпske receptore sa vredпostjma IC50 jspod 1 О пМ . Aпalog Na- karbamoji-DPhe6,Leu13 Ч'(CH2NH)Phe14-BN (6-14) (RC-3400) pokazuje afjпjtet kojj је pet puta mапјј od јеdјпјепја jz kojeg је пastao, RC-311 О . 39 А. ~ с 100 3 ~ D z 7'5 :::> о т z Vi '50 w т :;:,; о т 1 2'5 ... ~ 1 .n о ~ В. <Ј-о RC-3420 = •-• RC-3 105 ~.......... •-• RC-3 110 ~~~"->'00 ~~ ~~ -10 - 9 -8 -7 -б -10 - 9 -8 - 7 - б CONCENTRдTION {log М) CONCENTRдTION (log М) Slika 1 О. Sposobnost Tyr4-ЬomЬezina, GRP(14-27) i razlicitih pseudononapeptidnih antagonjsta ЬomЬezjna sa Trp ј Трј na N-termjnalu da jпhjЬiraju specjfjcno · oЬelezenog vezjvanje Tyr4-BN-a za receptorska mesta па jntaktnjm Swjss ЗТЗ celjjama (А) ј NCI Н-345 celjjama humanog mjkrocelularnog karcjnoma pluca (В). Celjje su jnkuЬirane sa 0.05 nM 125i-Tyr4-BN-a u odsustvu ј prjsustvu navedenjh koncentracjja analoga, kako је opjsano u poglavlju Materjjalj ј Metode. Rezultatj su jzra:Zenj kao procentj od saturaЬilnog vezjvanja u odsustvu analoga. U svakom eksperjmentu, pojedjna tacka predstavlja srednju vrednost od сеtјгј eksperjmenta, odredjvane u trjplikatu . Т аЬеlа 8. Bioloska aktivnost pseudononapeptidnih analoga ЬomЬezina sa D oЬiicima aminokiselina Trp ј D-Tpj na N-termjnalu. lnhiЫclja vezlvanja lnhiЫclja rasta 125Ј. Tyr4-BN (IC50,nM) (IC50,nM) Analog Ьombezlna Swlsз ЗТЗ NCI Н-345 Swlss ЗТЗ RC-3095 DTpi6,Leu13 'V(CH 2NH)Leu14.BN (6-14) 8 10 10 RC-3100 DPhe6,Leu13 'V(CH2NH)Leu1 4-BN (6-14) 3.45 - - RC-3105 DTpi6,Leu13 'V(CH2NH)Phe14-BN (6-14) 71 22 80 RC-311 О DPhe6,Leu 13 'V(CH2NH)Phe 14-BN (6-14) 1 5 - RC-3125 Trp6,Leu13 'V(CH NH)Leu14-BN (6-14) 10.6 21 18 RC-3130 AcTrp(For)6,Leu 1~,y(CH2NH)Leu14.BN (6-14) >3000 >3000 - RC-3135 AcTrp6,Leu1311'(CH2NH)Leu1 4-BN (6-14) >3000 >3000 - RC-3400 NH2CO-RC-3110 5.5 30 - RC-3420 DTrp6,Leu1 3 'V(CH.,NH)Phe14-BN (6-14) 1 4.16 0.8 RC-3165 Paa6,Leu13'V(CH2NH)Leu14-BN (6-14) 1768.7 - - IC50 oznatava koncentraciju peptida koja inhiЬira specifitno vezivanje oЬelezenog Tyr4-BN za 50% ili koja za 50% inhiЬira stimulaciju rasta Swiss ЗТЗ celija uzrokovan dodavanjem З nM GRP(14-27). Kompetitivni tip receptorske analize габеn је u tripliikatu u eseju sa 10·12 tataka za Swiss ЗТЗ celije, а 6 tataka za NCI Н·345 celiije. Koeficijent varijacije iznosio је 10-30%. 40 ' 1 Acetjlovaпjem Trp-a, (aпalozj RС-З1ЗО ј RС-З1З5) drastjcпo se smaпjjvala Ьioloska aktivпost. Aпalog u kojem је supstitujsaп D-Tpi sa Leu па pozjcjjj 14 (RС-ЗО95), pokazjvao је vecj afjпjtet od aпtagoпjsta sa D-Trp па pozjcjjj 6 (RС-З125). Nasuprot tome, kada se uporede aпalozj sa Phe па pozjcjjj 14, D-Trp supstitujsaпj analog (RС-З420) jmao је snC1Zпjjj afjпjtet od analoga sa D-Tpj (RС-З105) . Aпalog sa Раа na pozjcjjj 6 njje pokazjvao znacajпjjj afjпitet za ЬomЬezjпske receptore. VC1Zпo је пapomenutj da пi jedan od jspjtjvaпjh analoga sa Trp ili Трј па pozjcjjj 6 njje sam prouzrokovao mjtogenj odgovor Swjss ЗТЗ eelija. Rezultati sa per1undovanim acinusima pankreasa pacova BomЬezjпskj aпtagoпstj kratkog lапса sa pseudo-peptjdnom vezom ј Trp ј Трј па pozjcjjj 6 (aпtagoпjstj predstavljeпi па ТаЬеlј 8) jspjtjvaпj su па perfuпdovaпjm djspergovaпjm acjпusima paпkreasa pacova (vjdetj Materjjal i Metode). Djspergovanj acjпusj paпkreasa pacova sadrzavalj su prosecпo 440 000 ± 1 ОО 000 zjvih (пeosteceпjh, pokazaпo metjleпskjm plavilom) acjпusa na mjljljtar. Srednja vredпost bazalпog oslobadaпja amjlaze jz acjпusa izпosjla је 47.7 ± 5.2 J..Lg/ml, sto је predstavljalo 2.2З ± 0.2% (srednja vrednost ± SE, n=15) ukupnog sadrzaja amjlaze u preparatu. lzmereпo је da је prosecпa ukupna aktjvnost amjlaze u preparatu З4 541 ± 4 600 J..L9· U odпosu па ukupпi sadrzaj eпzima, пestjmulisaпj aciпusj oslobadaju 12.44% od ukupпog sadrzaja amilaze u toku 60 mјп. U zavjsnostj 01ј protokola, u cjtavom eksperjmeпtu korjsceпo је 1 0-40% (prosecпo 27%) ukupпog sadrzaja amjlaze u preparatu. GRP(14-27), u koпce:пtracjjama od 0.1 do ЗО пМ, uzrokuje dozпo-zavjsпu stjmulacjju oslobadanja amilaze jz acjпusa paпkreasa pacova (Sijka 11 ). Polovjna maksjmalпog odgovora aciпusa postjze se sa 1 пМ GRP(14-27). Odgovor acjпusa па пiske konceпtracjje GRP(14-27) (0.1 i О.З пМ) Ьiо је kratkog trajanja, oko З miпuta. Vise koпceпtracjje GRP(14-27) uzrokovale su dugotrajпiju stimulacjju oslobadaпja amilaze; npr. posle 10 ј ЗО пМ GRP(14-27) Ьilo је potrebno 9 odnosпo 12 miпuta da Ьi se пјvо oslobadanja amjlaze vratj па bazalпj. Ропаvlјапо jzlagaпje acjпusa koncentracjjj od 1 О пМ GRP(14-27) u toku З mjпuta, uzrokovalo је sпјzепје ukupпog odgovora preparata za oko 20% za svaku sledecu stimulacjju. Zbog toga је Ьilo neophodno da su, jzmedu pojedjnacпlh stjmulacjja, preparat пајmапје ЗО mjпuta jspjra kao Ьi se izЬegao fепоmеп deseпzjtjzacjje . Maksimalna stjmulacjja oslobadaпja amjlaze, uzrokovana dodavaпjem 1 О пМ GRP (14-27), Ьila је З.З ± О.З puta (srednja vredпost ± SE) veca od 41 ' 1 vrednosti bazalnog oslobadanja. Ukupni odgovor ("net-integral") acinusa na 1 О nM GRP(14-27) Ьiо је 7.5 ± 1.2 puta veci od пivoa bazalne sekrecije amilaze iz preparata. Bioloski polu-zivot (t112) odgovora acinusa na GRP(14-27) zavisio је od koncentracije GRP-a. lzracunato је da t112 odgovora acinusa na 0.1 nM GRP(14-27) iznosi manje od 1 minuta. Za koncentracije 0.3, 1, З, 1 О i 30 nM GRP(14-27) Ьioloski polu-zi•.юt odgovora preparata acinusa iznosio је 1.84, 2, 2.1 2.99 ј 3.1 mjnut, (sa vrednostima SE ± 1 0%). 100 /~ w V1 z о а.. V1 w 0:: 50 ;f ...Ј <{ :::; х Ј <{ :::; ..... о ~ log scale о 0.1 0.3 3 10 30 GRP ( 14-27), nM Slika 11. Dozno-zavisna stimulacija oslobadanja amilaze GRP(14-27)-om jz djspergovanih acinusa pankreasa pacova. Prjkazane su vrednostj ukupnog odgovora ("net- jntegral"). Tacke predstavljaju srednje vrednosti ± SE od cetiri razlicita eksperimenta. Preparati acinusa pankresa pacova izlaganj su tokom 9 minuta razlicitim koncentracijama antagonjsta ЬomЬezina. P1·acen је njihov efekt na bazalnu sekreciju amilaze. Rezultate ovih eksperjmenata prikazuje Т аЬеlа 9. Nj jedan od sest jspitjvanjh peptjda njje stjmulisao bazalnu sekrecjju enzima acinusa, sto ukazuje da onj ne pokazuju agonisticku aktivnost. Nasuprot tome, u koncentraciji od 1 О nM, samo analozi sa Phe na poziciji 14 (RC-31 05, RC-311 О, RC-3420 ј RC-3400) smanjivali su nivo bazalne sekrecije amilaze. U vjsjm koncentracjjama (1 ОО nM) svj analozj su smanjivali bazalnu sekreciju amilaze od 14% do 35% (Siika 12}. 42 ' 1 ТаЬеlа 9 . 1пhjbltorп j efekt pseudoпoпapeptjdпjh aпaloga ЬоmЬеzјпа kratkog lапса sa Trp ј Трј па N-termj пalu па bazalпu SE!krecjju i sekreciju amilaze iz dispergovaпih aciпusa paпkreasa pacova stimu lisaпu GRP(14-27). Svaka vredпost је prosek iz dva odvojeпa eksperimeпta. Bazalna Maksimalni Ukupni t1/2 Analog Doza sekrecija odgovor odgovor (nM) (%) (%) (%) (%) RС-З125 10 о 6 19 10 100 14 50 6З 20 RС-ЗО95 10 о 5 20 8 1 оо З5 55 75 12 RС-З420 10 15 18 19 10 1 оо з з 60 80 20 RС-З1 05 10 10 15 10 з 100 14 52 76 7 RС-З110 10 10 20 20 7 1 оо З4 60 82 10 RС-З400 10 о 6 о 10 100 З5 40 60 19 U drugoj seriji eksperimeпata ispjtjvaп је efekt ЬomЬezjпskjh aпtagoпjsta, ргјmепјеп јh u doz j od 1 О пМ ј 1 ОО пМ, па stjmLIIacjju sekrecjje amjlaze uzrokovaпu dodavaпjem 1 О пМ GRP(14-27). Grafjckj prjkaz tjpjcг.og eksperjmeпta dat је па Sljcj 12. Preparat aciпusa paпkreasa perfuпdovaп је u toku 9 minuta samo aпtagoпjstima, а zatim jos З miпuta zajedпo sa GRP(14-27). lspjtjvaп је maksjmalпj ("peak"), ukupпj odgovor (povrsjпa jspod krjve), kao ј Ьiolosko polu-vreme odgovora па GRP(14-27). Rezultate predstavlja ТаЬеlа 9. Svi isptivaпi aпalozi iпhjЬisalj su efekt GRP(14-27). Maksjmalпj odgovor acjпusa ("peak") mапје је Ьiо јпhјЬisап bomЬeziпskjm aпtagoпjstima u poredeпju sa ukupпjm odgovorom. Aпtagoпjstj sa пајsпаiпјјоГГЈ jпhjЬitorпom aktjvпoscu Ьilj su RС-З420 ј RС-З11 О. Ovj aпalozj su u koпceпtracjji od 1 ОО пМ jпh iЬiral j maksjmalпj odgovor acjпusa па GRP(14-27) za oko 60% а ukupпj odgovor acjпusa za oko 80%. Nj јеdап od jspitivaпih ЬomЬeziпskih aпaloga пјје zпасајпјје mепјао (jпhiЬisao) Ьioloskj polu-zjvot odgovora acjпusa па GRP(14-27). 43 550 450 350 t GRP ( 14-27) RC- 309 5 ~ НС! ~ 1 О nM ~ 1 ОО nM ПМЕ ( 3 rnin intervats) Sljka 12. Grafjckj prjkaz podataka dobljenih iz eksperjmenata sa perfundovanjm djspergovanjm acjnus jma pankreasa pacova. Kod vertjkalnjh streljca dodavan је GRP(14-27). BomЬezinskj antagonist (ovde RС-ЗО95) Ьiо је u kontaktu sa acjnusjma tokom 9 mjnuta, а zatim jos З minuta zajedno sa 1 О nM GRP(14-27). Uocava se da 100 nM RС­ ЗО95 snj~ava bazalnu sekrecjju amilaze. Na kraju eksperjmenta acinusjma је dodata 0.1 М HCI u toku З minuta kako Ьi se odredjla ukupna aktjvnost amilaze u preparatu. Pseudononapeptidni analozi sa Trp i Tpi NA C-terminalu molekule Strukturu nonapeptjda sa pseudo-peptjdnom vezom jzmeдu pozjcija 1 З ј 14, kao amjnokiseljnama Trp ј Tpi na C-terminalu poljpeptjdnog lanca prjkazuje ТаЬеlа 10. Jedjnjenja kod kojjh se aminokjselina Трј nalazj na pozicjji 14 predstavljaju polipeptjde sa novim tjpom pseudopeptjdne veze, vezom 1.j1(CH2N)Tpi-NH2. ZЬog toga је Ьilo znacajno da se njjhova struktura potvrdj dodatnim analjzama. Struktura analoga sa 1.j1(CH2N)Tpi-NH2 peptjdnom vezom, kao sto је to u analozima RС­ З120, RС-З415 ј RС-З440, dokazana је i NMR analjzom. lsto tako, sastav ovjh peptjda proveren је ј anaJitjckom HPLC. Rezultatj analize amjnokjselinskog sastava, kao i retenciona vremena prilikom HPLC-a predstavljeni su na TaЬeli 11 . Rezultatj ukazuju da је sastav ispitivanih peptida odgovarao је zeljenom sastavu priljkom postupka sinteze. 44 ТаЬеlа 10. Sposobпost ЬomЬez jпskjh aпaloga kratkog lапса sa amjпokjsef jпama Trp ј Тр ј па C-termjпalu da j пhjblraju specjfjcпo vezjvaпje oЬelezeпog Туг4-ЬоmЬеz јпа za ЬomЬezj пske receptore па jпtaktп im Swjss ЗТЗ cefjjama, kao ј da suprjmjraju mjtogeп j odgovor Swjss ЗТЗ cefjja prouz rokovaп dodavaпjem З rtM GRP (14-27). lnhiblcija lnhiblcija Bombezinski analog vezivanja 1251- rasta Tyr4-BN (IC50,nM) (IC50,nM) RC-3115 DTpj6,Leu13 \ji(CH.,N)Tpj14_8N (6-14) 25.3 105 .. RC-3120 0Phe6,Leu13 \ji(CH2N)TpP 4-BN (6-14) 4.3 10 RC-3415 0Trp6,Leu1з, 'V(CH2N)Tpi14-BN (6-14) 2.07 0.9 RC-3440 Tpi6,Leu13 \ji(CH2N)Tpi-BN (6-14) 1.14 0.8 RC-3160 0Tpi,Leu13 \ji(CH2NH)Trp(For)14-BN (6-14) 1917 >3000 RC-3385 DTpi6,Leu13 \ji(CH2NH)Trp14-BN (6-14) 5.15 - RC-3410 0Trp6,Leu13 \ji(CH2NH)Trp(For) 14-BN (6-14) 639.4 1280 RC-3375 Mpp6,Leu13 \ji(CH2NH)Trp14-BN (6-14) 85.7 145 RC-3390 0Phe6Leu13 'I'(CH2NH)Trp14_BN (6-14) 9.16 7 RC-3380 0Trp6,Leu13 \ji(CH 2NH-Trp14-BN (6-14) 10.6 62 RC-3388 Tpi6,Leu13 Ч'(CH?NH-Trp14-BN (6-14) 5.17 14 1с50 ozna~ava koncentraciju peptida koja inhiblra specifi~no vezivanje oЬele~enog Tyr4-BN za 50% ili koja za 50% inhiЬira stimulaciju rasta Swiss ЗТЗ celija uzrokovan dodavanjem З nM GRP(14-27). Kompetitivni tip receptorske analize raбen је u tripliikatu u eseju sa 10-12 ta~aka. ТаЬеlа 11 . Aпaliza amiпo-kiseliпa i retencioпa vremena prilikom aпalize HPLC-om pojedinih Ьombezinskih aпtagonista sa Trp i Tpi na C-terminalu molekule. Retenciono vreme Analog Analiza amino-kiselina sa 25-65%8 (min) Tpi Phe Glu Trp Ala Val Gly His RC-3390 0.99 1.04 1.11 0.94 1.05 1.00 1.00 17.3 RC-3380 1.05 2.16 0.83 0.96 0.97 1.00 18.2 RC-3388 .. 1.1 о 1.03 1.00 1.03 1.00 0 .. 96 19.0 RC-3385 .. 1.02 0.98 1.00 0.96 1.00 0.97 18.9 RC-3120** 1.00 1.12 0.95 0.93 0.98 0.97 1.00 17.4 RC-3415** 1.00 1.91 0.91 1.00 1.03 0.96 19.1 RC-3440** .. 1.04 1.06 0.96 1.00 0.99 0.99 22.5 • Tpi, Leu ЧЈ(СН2NН) Trp i Leu ЧЈ(СН2N) Tpi nisu se mogle naci analizom aminokisleina. Tpi pokazije "peak" па 14 minuta u analiti~koj HPLC sa 0-40%8. ••strukture ЧЈ(СН2N) Tpi-NH2 potvrбene su NMR analizom. 45 . ' Pseudoпoпapeptjdпjm aпalozjma ЬоmЬеzјпа sa Trp ј Трј па C-termjпalu molekule testjraпa је пjjhova sposobпost da jпhjblraju specjfjcпo vezjvaпje 1251-Tyr4-BN za receptorska mesta па j пtaktпjm Swjss ЗТЗ celjjama. lпhjbltorпe krjve za ројеdјпе aпaloge jz ove grupe predstavljeпe su па Sljcj 1З . Leu13 Ч'(CH2NH)Trp14-BN (6-14) aпalozj sa Трј (RС-ЗЗ88) ј D-Tpj (RС-ЗЗ85) па N-termjпalu pokazalj su vecj afiпitet vezivaпja za ЬomЬeziпske receptore od aпaloga sa D-Phe (RС-ЗЗ90) ј D- Trp (RС-ЗЗ80) па istom kraju molekule. Medu aпalozjma sa Leu13 Ч'(CH2N)Tpj14-BN (6-14) па C- termiпalu, aпalog RС-З415 sa D-Т rp па N-termiпalu pokazao se sпa.Zпjji aпtagoпist od aпaloga koji sadrze D-Phe (RС-З120) ili Трј (RС-З440) . DTrp6,Leu13, Ч'(CH2N)Tpi14-BN (6-14) (RС-З415) pokazao se 5 puta aktivпjjirп od aпaloga DTrp6,Leu13 Ч'(CH2NH-Trp1 4-вN (6-14) (RС-ЗЗ80) , i 2 puta aktjvпiji od aпaloga DPt1e6,Leu13 Ч'(CH2N)Tpi14-BN (6-14) (RС-З120). 25 -10 -9 -8 o- o RC3440 ! •-•RC3 415 ! о-• RСЗЗ88 1 •-• RC3120 · о-о RСЗЗ90 •-•RC3380 • -• RСЗЗ8 5 -7 -6 CONCEN'ГRATION (log М) Slika 1 З. Sposobпost razlicitih pseudoпoпapeptidпih aпtagoпista ЬоmЬе­ zјпа sa Trp i Tpi па C-termiпalu molekule da jпhibl§u specjficпo vezjvaпje 1251-Tyr4- BN za ЬomЬeziпske receptore па iпtaktпim Swjss ЗТЗ celijama. Koпflueпtпe eelije iпkublraпe su sa 0.05 пМ 1251-Tyr4- BN u odsustvu (ukupпo vezjvaпje) ј prisustvu паzпасепјh koпceпtracija aпaloga. Rezultatj su jzra.Zeпi kao proceпat saturabllпog vezjvaпja u odsustvu aпaloga. U svakorп eksperimeпtu, pojediпa vredпost је odredivaпa u tripljkatu. Koeficijeпt varijacije jzпosio је 1 0-20%. Dodavaпje З пМ GRP(14-27) Swjss ЗТЗ eelijama uzrokuje роvесапје пivoa jпkorporacije trjcijumom oЬelezeпog tjmjdiпa za oko ЗОО%. Na Slicj 14 prjkazaп је dozпo-zavjsпj jпhjbltorni efekt razlicjtjh aпtagoпjsta sa Trp ј Трј па C-termjпalu molekule. Nj јеdап od testiraпjh aпaloga пјје sam prouzrokovao stjmulaciju rasta Swjss ЗТЗ eelija. Vесјпа ЬomЬezjпskih aпtagoпista iz ove grupe iпhiblsala је stjmulaпtпj efekt GRP(14-27)-a (Siika 14, ТаЬеlа 10). Leu1З Ч'(CH2N)Tpj14_BN (6-14) aпtagoпjstj pokazali su se aktivпjjim od Leu13 Ч'(CH2NH)Trp14-BN (6-14) aпaloga. Dvajedjпjeпja sa пajsпa.Zпijom aktjvпoscu Ьila su RС-З415 - DTrp6,Leu13, \Џ(CH2N)Tpj14_8N (6-14) ј RС-З440 - Tpi6,Leu13 Ч'(CH2N)Tpi-BN (6-14). 46 о ... ..... .:: о t) 100,-----=-----------------------. •:::-------.._ =~ ---·---'· ·~~ ....... о', ·. ~~ ~', \~·~ 50 . 0-0RC-344~8 · · .. r;[, 8 8--eRC-3415 0 '- t:.,.', t:. · ··· t:.RC-3390 ~' ·· ·.', A-ARC-3120 ~', · . . '. О- -D RC-3366 ', !;2 8-8RC-3360 ~-----. ---------0 0~----+-----+----~- +----~ 0 .1 10 100 Bombesin e.ntagonist, nM Sljka 14. Sposobnost razljcjtjh pseudononapeptjdnjh analoga ЬomЬezjna sa Trp ј Трј na C-termjnalu molekule da jnhjblraju stjmulacjju rasta Swjss ЗТЗ celjja uzrokovanu GRP(14-27) . Rezultatj su predstavljenj kao procenat od odgovora Swiss ЗТЗ eelija u prisustvu З nM GRP(14-27). U svakom eksperjmentu, pojedjne vrednost j su odreёJjvane u kvadrjplikatu. Koefjcjjent varjjacjje jznosjo је 10-20%. Analozi bez metionina na poziciji 14 (ОМе analozi) bombenzina ciklicni analozi Poslednja grupa antagonjsta ЬomЬezjna predstavljena је sa vjse razljcjtjh tipova jedinjenja. Dva analoga ЬomЬezjna ОМе tjpa, analozj D-Phe6-BN (6-1З)РА (RС-З800)_ј D-Phe6-BN (6- 13)РА (RС-З81 0), jmalj su vrednostj IC50 od oko 0.5 J.LM. Pokusaj sa septapeptjdnjm analogom, D- Тrp6,Tpj11.вN (6-11) (RC-4040), nije dao antagonist znacajnije aktjvnostj (IC50 jznosio је samo 6.5 J.LM) . lzdvaja se ј citava gПЈра heptapeptida tj . analoga ЬomЬezina (6-12). Medu ovom grupom jedinjenja, znacajniji afinitet za ЬomЬezinske receptore na Swjss ЗТ3 eelijama pokazao је analog RC-4125 strukture D-Trp6,Tpi11.вN (6-12). Svi ostali heptapeptidni analozi imali su vrednostj IC50 u koncentracijama od 1 ОО <Јо 1 000 nM, sto ukazuje da је prisustvo aminokiseline na poziciji 1 З znacajno radi ocuvanja Ьioloske aktivnosti antagonjsta kratkog peptjdnog lanca. Posebno treba jzdvojjtj grup1J sa cjklicnom strukturom C-terminala: RC-3950, RС-З955 ј RC-398511. Ova grupa jedinjenja pokazala је najvecj afinitet za ЬomЬezinske receptore na Swiss 3Т3 celjjama sa IC50 vrednostima i jspo1j 1 nM. Analozi sa slicnom strukturom ali Ьеz cikljcnog C-termjnala pokazivali su daleko slablju aktivnost (analozi RC-395011 ј RC-39851). Na Tabeli 12 prikazana је amjnokjseljnskj sastav О Ме analoga (RС-З800 ј RC-381 0), septapeptjdnjh (RC-4040), heptapeptjdnih (analozj 6-12.) ј cjklicnih ЬomЬezjnskjh antagonjsta (RС-З950, RС-З955 ј RС-З98511) kao ј njihova sposobnost - -- - ...., с 1 et: 1 - 1 w : m 1 :_) ;,: ·-' Ј :> : . L) с ј ·- 0 - 1 о - 9 · 8 ~О - о ----- ·------· /':. -- - 6 ~ ... ~- -- - 6 LOG COI iCf ; :Т~ЛТЮN (Щ 6 ... - 5 Sljka 16. Efekt Ьombнzjna ј antagonjste ЬomЬezjna RC-3095 na proljferacjju MDA-MB-231 celija humanog karcjnoma dojke. О, ЬomЬezjn u prjsustvu 5% DCC-FBS (govedj serum tretjran aktivnim ugljem); •, ЬomЬezjn u prisustvu 5% netretiranog seruma; t.,RC-3095 u prisustvu 5% DCC-FBS. Rezultatj su prjkazanj kao procenat od kontrolnjh vrednostj ± SE od 8 polja. *р<0 . 05 ; **р<0 . 01; ***р<0 . 001 vs. koпtrola (Student-ov 1-test). ::Ј 180 l ~ 160 1--0 140 u LL о ~ о: w IIJ ::; :::> z _Ј _Ј w L1 120 100 80 60 40 20 ... О - -·-------т----1- -- ---· --"--- ----- - r---- -----,.-- ---------, о - 10 -9 - 8 - 7 -б -5 LOG CONCENTRATION (М) Slika 17. Efekt ЬomЬezjna ј antagonjste ЬomЬezjna RC-3095 na proljferacjju MCF-7 Mlll celjja humanog karcinoma dojke. о, ЬomЬezjn u prisustvu 5% DCC-FBS (govedi serum tretiran aktjvnjm ugljem) ; •, ЬomЬezin u prjsustvu 5% netretjranog seruma; t.,RC-3095 u prisustvu 5% DCC-FBS. Rezuttatj su prikazanj kao procenat od kontrolnjh vrednostj ± SE od 8 polja. *р<0 . 05 ; **р<0.01 ; ***р<0.001 vs. koпtrola (Student-ov 1-test). 51 ' 1 ZAVRSNI PREGLED EKSPERIMENATA /N VITRO Rezultati eksperimeпata izvedeпih in vitro ukazali su da se, meёlu postojecim aпtagoпistima Ьombeziпa/GRP-a, izdvajaju пekoljko јеdјпјепја koja Ьi mogla Ьitj kaпdjdati za buduca jspitjvaпja u uslovjma in vivo, kao ј za jspjtjvaпja aпtjtumorske aktjvпostj. Dva tjpa aпtagoпjsta ЬоmЬеzјпа zasluzuju pa:Zпju: D-Tpj6 pseudoпoпapeptjdпj aпalozj ј aпaloz j sa Трј14 redukovaпom peptjdпom vezom. Predstavпjk prve grupe aпtagoпjsta ЬоmЬеzјпа је прr. aпtagoпjst RC-3095. Drugu grupu, sa Tpi redukovaпom peptjdпom vezom, predstavlja јеdiпјепје RC-3440. RC-3095 је pokazao veljki afjпjtet za ЬomЬezjпske receptore па Swiss 3Т3 ј Н-345 celjjama: 8 ј 1 О пМ. Ovaj aпalog је za 50% iпhiЬisao stjmulaпtпj efekt GRP-a prema Swiss 3Т3 celjjama u koпceпtracjjj od 1 О пМ (mereпo iпhjЬicjjom jпkorporacjje oЬelezeпog tjmjdjпa u DNK celjja) . lпhiЬisao је za oko 50% rast koloпjja Н-345 celjja u koпceпtracjjj od 50 пМ. U istoj koпceпtracjjj jпhjЬisao је za 50% stjmulaпtпi efekt GRP-a па acjпuse paпkreasa pacova. Zbog prisustva hjdrofobпe amjпokjseljп па N-termjпalu amjпokjseljпskog lапса, kakva је D-Tpj, RC-3095 moze da bude otporпijj па proteoliticki efekt eпzjma seruma ј da tako jma duzj polu-zjvot u plazmj od drugjh aпaloga ЬоmЬеzјпа. PostLipak sjпteze RC-3095 mogao se zastjtjtj pateпtom (prjzпata је orjgjпalпost postupka), ра је ј to Ьiо dodatпj razlog zЬog cega је ovaj aпtagoпjst jzabraп za dalja, detaljпjja jspjtjvaпja. Aпalozj sa Tpj-redukovaпom vezom, kakav је RC-3440, svakako predstavljaju поvјпu meёlu aпtagoпjstjma bombezjпa ј zasluzuju vecu pa:Zпju. lpak, u пasjm eksperjmeпtjma, ovaj aпalog jspjtjvaп је sa cjljem da su samo potvrdj пjegova aktjvпost in vivo. Postupak sjпteze kojj Ьi omogucavao dоЬiјапје vece koljcjпe peptjda пјје Ьiо razvjjeп, ра је to razlog da se aktjvпost RC- 3440 пјје detaljпjje jzucavala. 52 ' ' AKTIVNOST ANT AGONIST А BOMBEZINA U EKSPERIMENTIMA /N VIVO ENDOKRINI EFEKTI ANT AGONISTA BOMBEZINA KOD PACOVA Efekt GRP(14-27) na koncentracije gastrina, hormona rasta, insulina glukagona u serurтш lntravenska jnjekcjja GRP(14-27), u dozj 5 ј 1 О 119/1 ОО g telesne tezjne (ТТ) , uzrokovala је dozno-zavjsnj porast koncentracjje gastrjna u serumu muskjh pacova anestetjsanjh pentobarЬitonom (Sijka 18А) . Maksjmalnj porast koncentracjje gastrjna registrovan је oko З mjnuta posle injekcjje GRP(14-27). Njza doza (2 350 0-0 : RC-3095 ~' ; ........ 1 т ', 1 • ' 250 / /1 '--., ' ,, 25 џg/100 g B.W. Е 1 // ', '·т. ј '-. 1 / ', t:>------~ 200 /// ''t-- -----д с 1/ -- ј ~ 150 .// Q 0==--=-=:.=----. ~ 1 оо ~~--== " ~ ---=-;;::\li t5_........- 1 0-0 :GRP 2 џg/.1 OOg B.W. ј · 50 .A.-.A.:Control 8--8 :GRP 5 џч/100g B.W. д--t:>GRP 10 џч/100g B.W. 300 0+-~--~~--~~--~~--~~--, о 2 3 4 5 б 7 8 9 10 Minuti llQ/1 ОО g ТТ), kao ј jnjekcjja fjzjoloskog rastvora (kontrola), njje znacajnjje menjala koncentraciju gastrjna u serumu pacova. Sljka 18А. (Objasnjenje u legendj sljke 180). Koncentracjja glukagona u plazmj pacova njje se znacajnjje promenjola З i 6 minuta posle injekcjje 2, 5 ili 1 а · 119/1 ОО g ТТ, alj је zapaZen odlozenj porast u koncentracjjj glukagona 10 mjnuta posle ir1jekcije GRP(14-27) (Sijka 188). ЈОО 270 240 1 ~6 210 , '' •·· - ~"""----~ -.t 180 ~-- . . ~ t---------~0 150 - =1 = -=-=-=-&~ .l о 12011~=---~, ~-:::::-=-! - -- - [!] g' ср--------о-- ~ 90 t5 0-0 :GRP 2 џg/1 ОО g B.W. О--0 :RC~3095 бО 8--8 :GRP 5 џg/100 g B.W. 25 џg/ 100 g B.W. 30 6- -t:.:GRP 10 џg/100 g B.W. 0 .А.-.А. :Control о 2 3 4 5 б 7 8 9 10 Minuti Sljka 188. (Objasnjenje u legendj sljke 180) Nj jedna od tri primenjene doze GRP(14-27) njje utjcala па koncentracije hormona rasta jlj insuljna u serumu anestetjsanih pacova (Siika 18С i 180). 53 100 90 80 70 Е 60 '-С7' 50 с: :r 40 о 30 20 ~~~~D~~=t -- ---- -:Ф~ -------- ----------- 0-0:GRP 2 џg/100 g B.W. .A.- .A.:~ontrol Ј 8--8 :GRP 5 џg/100 g B.W. 0--0 :RC-3095 10 6--t::. :GRP 10џg/100gB.W. 25џg/100g8 .W . 2 3 4 5 б 7 в 9 10 Minuti 150 12оР~; : ... ' ..... --- :::::----_ ~ 90 ,::::::::> ::-.-':-,:=6~=-">---=-) .S ---- >---::~~ f ] 60 0-0 :Control - ~---========~ 8 -- 8 :RC-3095 25 Џ<Ј/100g B.W. t 6--6:GRP 2 џg/100g B.W. 30 .A.-.A. :GRP 5 џg/100g B.W. 0- -O:GRP 10 џg/100g B.IV . о~~~~~~---г-~--~~--~~ о 2 3 4 ~ 8 7 в 9 10 · мinutl Slika 18 A-D. Promene u koncentracijama gastrina (А), glukagona (В), hormona rasta (С) i insulina (D) posle i.v. Ьolus injekcije GRP(14-27) u dozama 2, 5 i 1 О ~g/1 ОО g ТТ ili RС-ЗО95 u dozi od 25 ~g/1 ОО g ТТ pacovima anestetisanim pentobarЬitonom . Efekt D-Trpб i D-Tpi6 pseudononapeptidnih antagonista bombezina RC-3095, RC-3420, RC-3125 i RC-31 05 па endokrine efekte GRP(14-27)-a Bolus i.v. injekcija 5 ~g/1 ОО g П GRP(14-27) uzrokuje porast koncentracije gastrina u serumu pacova, sa maksimalnim efektom З minuta posle injekcije i trajanjem efekta u vremenu od najmanje 6 mjnuta. lnjekcije bomЬezjnskih antagonjsta RС-ЗО95, RС-З420 ј RС-З125 , u dozj od 5 ~g/1 ОО g П, 2 mjnuta pre GRP(14-27), znacajno su (р<0 . 01) jпhiЬisale efekt GRP(14-27) (Siika 19А). lnhiЬitornj efekti ispit jvanih antagonista Ьili su jos izra.Zenjji posle doze od 25 ~g/1 ОО g ТТ (Siika 28). Posle З mjnuta, porast пјvоа gastrina uzrokovan GRP(14-27) Ьiо је inhiЬiran za 75% sa RС-З125, 65% sa RС-ЗО95 ј 54% sa RС-З440 (Sijka 19А) . Antagonjst RС-З1 05 ni u jednoj prjmenjenoj dozi nije znacajnjje uticao па efekt GRP(14-27). 54 . ' 400 8-8 :Control O--O:RC-3095+GRP 6 --6 :RC -3420+GRP 350 0--0 :RC-3105+GRP 'Cl-\1 :RC-3125+GRP 50 0+-~--~~--~--т--~~~~--~~ о . 1 2 3 4 s 6 7 8 9 10 Minuti 400 350 Sljka 19 А. Efekt јпјеkсјје RC-3095, RC-3420, RC-31 05 jlj RC-3125, u dozj od 5 J..LQ/1 ОО g ТТ, па sekrecjju gastrjпa stimuljsaпu i.v. Ьolus . jпjekcjjom 5 J..LQ/1 ОО g тт GRP(14-27)-a pacovjma aпestetjsaпjm peпtobarЬitoпom. 0- -O :RC-3095+GRP 8-8: GRP Sljka 198. Efekt јпјеkсјје RC-3095, RC-3420, RC-3105 jlj RC-3125, u dozi od 25 J..LQ/1 ОО g ТТ, па sekrecjju gastrjпa stjmuljsaпu j.v. Ьolus jnjekcjjom 5 J..LQ/1 ОО g ТТ GRP(14-27)-a pacovima aпestetjsaпjm peпtobarЬitoпom . о~~--~~--~~--~~--~--~~ о 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ' l.linutl Maksjmalnj porast koncentracjje glukagona u plazmj, posle jnjekcjje GRP(14-27) u dozj od 5 J..LQ/1 ОО g ТТ, Ьiо је posle 1 О miпuta od јпјеkсјје (Sijka 188). 8omЬezjпskj aпtagoпjstj RC-3095, RC-3105 ј RC-3420, u dozama od 5 ј 15 J..LQ/100 g ТТ, skoro su u potpuпost j suprjmjralj porast glukagoпa uzrokovaп GRP(14-27)-om. Sljka 20 prjkazuje efekte Ьombezjпskjh aпaloga u dozi od 5 J..LQ/1 ОО g ТТ. Aпtagoпjst RC-3125 пјје zпасајпјје utjcao па efekt GRP(14-27) . Sta vjse, RC-3125 је pokazao odredeпj agoпjstjckj efekt u smjslu роvесапја koпcentracjje glukagoпa u plazmj. 55 ' ' 300 270 240 1 . А Е 210 ....... ~ 180 с g, 150 ~ 120 G 90 ------- ь _ _.iт --------,· ~' _.::=--- - - .=--==------ ~ - - - -Ф • • ~ = ~ -"! 0-0 :GRP бО V--V :RC-3095 + GRP А--А :RC-3125 + GRP 30 l>-l> :RC-3420 + GRF' О 0- -O :RC-3105 + GRP о 2 3 4 5 Monut\ б <>-<> :Control 7 8 9 10 Slika 20. Efekt i.v. injekcije RC- 3095, RC-3420, RC-3 1 05 ili RC-3 125, u dozi od 5 J.!Q/1 ОО g ТТ, na sekreciju gastrina stimulisanu i.v. Ьolus injekcijom 5 J.LQ/1 ОО g ТТ GRP(14-27) kod pacova anestetisanih pentobarbitonom. Subkutana injekcija ЬomЬezinskog analoga RC-3095, u dozi od 50 J.!Q/1 ОО g ТТ, u potpunosti је sprecila povecanje konceпtracije glukoze u serumu uzrokovano GRP(14-27)-om (Siika 21 ). Sam RC-3095 nije znacajnije menjao glikemiju pacova (Siika 21 ). Slika 21 . Glikemija kod pacova posle s.c. injekcije GRP(14-27), RC-3095 ili njihove komЬinacije u dozi od 50 J.!Q/1 ОО gTT. 250 50 0-0 :Control 8--8 :GRP Ь.--Ь. :RC-3095 0- - О :RC-3095+GRP 0+---------------r-------------- 0 ЈО 60 Minut l 56 Efekti GRP(14-27) i RC-3095 па oslobadaпje hromoпa rasta kod pacova U pacova anestetjsanih pentobarЬitonom jntracerebroventrjkularna jnjekcjja 1 llQ GRP(14-27) u levu lateralnu komoru mozga, uzrokovala је naglj pad koncentracjje hormona rasta u serumu kojj је trajao duze od 60 mjnuta (Sijka 22). Supresjvnj efekt GRP(14-27) na oslobadanje hormona rasta, u potpunostj је Ьiо jnhiЬisan jntracerebroventrjkularnom jnjekcjjom RC-3095, prjmenjenog u dozj od 1 О llQ 2 mjnuta pre GRP(14-27). Sam RC-3095, posle jntracerebroventrjkularnog ubrjzgavanja, njje znacajnjje utjcao na koncentracjju hormona rasta u serumu. Е ...... "' с :х: с 100 90 во 70 60 50 40 ~о 20 10 о о о-о :Rc-J095 1 џ9 8--8:RC-J09510џg .6-.6 :GRP(\4-27) 1 џg A--A:RC-.3095 10 џ; + GRP(\4-27) 1 Џ9 0-0:C,ontrol 1 _l >-=----· <- о. .§ .., о " 550 500 450 400 350 300 . 250 200 150 100 50 о о 2 0-0 :GRP 8--8 :RC-3095 i.f>. + GRP 6-L> :RC-3095 в.с . + GRP А--А :RC-3095 i.v. + GRP 0-0:Control Ј 4 5 б Minutl 60 U eksperjmentjma u kojjma је RС-ЗО95 davan ili j_v. jlj s.c. jlj jnhalacjjom 120 mjnuta pre j_v. jnjekcjje GRP(14-27), njje zapa.Zen znacajnjjj jnhjЬitornj efekt na stjmulacjju oslobaoanja gastrjna (Sijka 28). Sljka 28. Koncentracjje gastrjna u serumu pacova prethodno tretjranjh Ьombezjnskjm antagonjstom RС-ЗО95 razljcjtjm putevjma ргјгпеnе (j .v., jntravenskj; s.c. , subkLJtano; j.h., jпhalacjjom) u dozj od 1 О !J.Q/1 ОО g ТТ 120 mjnuta рге GRP(14-27) (5 J.!Q/1 ОО g ТТ j_v.). *р<0.05 ј **р<0.01 vs. GRP(14- 27). Е ......_ "' а. с: - ~ ;; о (.> 550 500 450 400 Ј 50 ЈОО 250 200 150 100 50 о о 2 0-0:GRP 8 --8:RC-J095 i.h. + GRP 6-6 :RC-J095 • . с . + GRP .#. --J. :RC-J095 i.v. + GRP 0-0:Control Ј 4 5 6 Minuti ТаЬеlа 1 З pгjkazuje jnhjЬitornj efekt RС-ЗО95 па stjmulacjju oslobaoanja gastrjna uzrokovanog GRP(14-27) jzra.Zen kao povrsjne ispod krjve (PIC) za period 0-6 minuta posle јпјеkсјје GRP(14-27) . Analjza iпhiЬicije PIC-ova gastrjnskjh odgovora, za razljcita vremena davaпja RС-ЗО95 (2, ЗО, 60 ј 120 mјп pre GRP(14-27), pokazala је da prosecna Ьioloska jskorjstljjvost RС­ ЗО95 posle jпtratrahealne jnhalacjje jznosi 69% od jskoristljjvostj posle s.c. јпјеkсјје. ТаЬеlа 1 З . Efekt antagonjste ЬomЬezjna RС-ЗО95 па stjmulacjju oslobaoaпja gastгjna uzrokovanu GRP(14-27) . Minutj davaпja RС-ЗО95 pre GRP(14-27) NACIN APLIKACIJE 2 з о 60 120 % PIC-a 0-6 mjn posle GRP(14-27) lnhalacjja З6 61 78 100 Subkutano 77 48 44 107 lntravenski 19 89 96 88 Efekti RC-3095 (1 о џ911 оо 9 ТТ), davanog razlititim putevima 2, 30, 60 i 120 minuta pre GRP(14·27) (5 џ911 ОО 9 ТТ), zrazeni su preko povгS ina ispod krive (PIC) od9ovora 9astrina na GRP(14·27). Vrednost celokupnog od9ovora 9astrina na GRP(14· 27) oznatena је kao 1 ООо/о . 61 ' 1 INHIBIТORNI EFEKT ANT AGONIST А BOMBEZIN/GRP-A RC-3095 NA RAST MCF-7 Mlll HUMANOG KARCINOMA DOJKE TRANSPLAN- TIRANOG GOLIM MISEVIMA Kseпograftj humaпog kагсјпоmа dojke MCF-7 Mlll, veljcjпe 1 mmЗ, traпsplaпtjгaпj su subkutaпo u Ьоспј predeo leda zeпkj atjmjcпjh , "goljh" mjseva. L:jvotjпjama пјје dodavaп estrogeп јег је MCF-7 Mlll celjjska estrogeп-пezavjsпj tumor. Тегарјја је zаросјпјапа 40 dапа posle traпsplaпtacjje tumora, kada је tumor dostigao prosecпu veliciпu od 15 mmЗ i trajala је 7 пedelja. Mjsevj su podeljeпj u 4 grupe od ро 6-7 zivotiпja u grupi. Копtгоlпа grupa zjvotjпja doЬijala је јпјеkсјје rastvaraca u kojjma su lekovi rastvaraпj . Ostale grupe tretjгaпe su sledecjm lekovima: grupa 2, aпtagoпjst RC-3095, 20 119/dпеvпо ; grupa З , aпtagoпist oslobadajuceg hromoпa goпadotropiпa (LH_RH) SB··75 u oЬijku mjkгograпula, 15 mg/zivotiпju svake 2 пedelje ; grupa 4, komЬiпacjju RC-3095 ј SB-75. RC-3095 је rastvaraп u 0.1% rastvoru DMSO u fjzjoloskom rastvoru ј јпјсјгап s.c. SB-75 mjkrograпule su suspeпdovaпe u rastvaracu kojj se sastojao od 2% karЬoksjmetjlceluloze ј 1% Тwееп 80 u destjlovaпoj vodj. Suspeпzjja је јпјсјгапа jglom Ьг . 18. Sve tгј djmeпzjje tumora (duzjпa, sјгјпа ј dеЬiјјпа) su mereпe jedпom пеdеlјпо . Zbog veoma sporog rasta ovog tumora, vreme udvostrucavaпja veljcjпe tumora ("douЬijпg tjme") јzгасuпаvапо је koгjsteci citav period rasta tumora. Rast kseпografta MCF-7 Mlll Ьiо је spor ali kопtiпuјгап. Rast tumora Ьiо је iпhiЬisaп RC- 3095, SB-75, kao ј пjihovom komЬiпacjjom (Sijka 29, ТаЬеlа 14). Zпасајпiја iпhiЬicija rasta tumora uосепа је posle 2 пedelje terapjje u grupi sa RC-3095 i grupi lесепој komЬiпacjjom RC-3095 ј SB- 75, dok је zпасајпјја јпhјЬiсјја rasta u grupj lесепој moпoterapjjom SB-75 uосепа tek posle 5 пedelja. Zapremiпa tumora па kraju ekspeгjmeпta ј ргосепаt promeпe u volumeпu tumora Ьilj su zпасајпо smaпjeпi u svim leceпim grupama zjvotjпja, dok је vreme udvostrucavaпja tumora Ьilo proloпgiraпo. Na kraju ekspeгjmeпta, пiје Ьilo zпасајпiје razljke medu grupama u prezjvljavaпju zivotiпja, пjti u пjjhovoj telesпoj tezjпj, ali је zato tezjпa tumora kao i tumorsko орtегесепје (tezjпa tumora u odпosu па telesпu tezjпu zjvotjпje) sigпjfjkaпtпo sпјzепо terapjjom u poredeпju sa koпtrolom (ТаЬеlа 15). КоmЬiпоvапа terapjja Ьila је ро svim parametг jma efjkasпjja u odпosu па terapjju pojedjпjm peptidпim aпalozima, iako razljka u efektima пiје statjsticki zпасајпа. Ргоsеспе teziпe uterusa i ovarijuma Ьile su sпјzепе u grupama koje su primale SB-75, sam ili u komЬiпacjji , ali пе i u grupi lесепој sa RC-3095. Kako pokazuje ТаЬеlа 16, пivo serumskog luteiпizirajuceg . , hormoпa (LH) Ьiо је пizi u grupama koje su doЬijale SB-75. Sljcпo tome, пivo IGF-1 u serumu је zпасајпо Ьiо sпјzеп u grupama koje su doЬijale SB-75. 62 11001 1 Е l 0 - 0 ·Control ]----0 ~ 80 1 · -- 8 .58 - 75 ,о ј w i /'>-6 RC-3095 / ј ::;; .L - - .L :RC - 3095 • SB·- 75 Ь ...-Ё; 60 1 /ј 1 . > о ...... • 1 . ::r ~ / 1 , • _.. -·, - - - о 2 40l· 0/ , __ ~ :. ~ -··-љ ·· 1 ? _ о------ .·- - - !~ ... ~ ... --- •, .. 1 ---- · --- -- ~ -- - • ' •• ~ 0 8 с---~ :::..:::...::.. А:..___-А. :;:- • 0-i--~-~- о 4 6 7 l'cE:YS OF T R:C;..ТMENT Slika 29. Zapremina tumora golih miseva sa MCF-7 Mlll humanim karcinomom dojke u toku terapije antagonistom LH-RH u oЫiku mikrogranula, SB-75, ЬomЬezin/GRP antagonistom RC-3095 ili njihovom komЬinacijom . Vertikalne linije predstavljaju SE srednjih vrednosti . *р<0 . 05 , **р<0.01 vs. kontrola (Duncan- ovim novim testom multiplih rangova) . Т аЬеlа 14. Efekt terapije sa SB-75, RC-3095 i njihove komЬinacije па volumen tumora, procenat povecanja volumena tumora, vreme udvostrucavanja volumena tumora MCF-7 Mlll humanog karcinoma dojke kod golih miseva. Volumen tumora Vreme Terapija (mm3) % povecanja udvostrucavanja Pocetr.i Finalni volumena od dan О (dani) Kontrola 15.5 ± 2.2 89.5 ±14.5 582 ± 49 20.0 ± 0.9 SB-75 15.3 ±1.7 43.6 ± 7.6* 289 ± 53** 44.2 ± 8.8** RC-3095 15.2 ± 1.8 37.6 ± 3.1** 255 ± 58** 46.8 ± 7.5* SB-75 + 15.1 ± 2.1 31 .1±6.8** 242 ± 57** 61.9 ± 14.4* RC-3095 Rezultati su prikazani kao srednje I'Гednosti ± SE. •p.OS, .. p<0.01 vs. kontrola (Duncan-ov test multiplih rangova) ТаЬеlа 16. Koncentracjje LH ј IGF-1 u serumu goljh mjseva sa ksenograftjma MCF-7 Mlll humanog karcjnoma dojke posle terapjje mjkrogranulama SB-75 , RC-3095 ј njjhovom komblnacjjom. Terapjja LH (ng/ml) IGF-1 (11g/ml) Kontrola 0.26 ± 0.04 0.46 ± 0.02 SB-75 0.15 ± 0.01 .... 0.44 ± 0.04 RC-3095 0.25 ± 0.04 0.33 ± 0.04 .. SB-75 + RC-3095 0.12±0.02 .... 0.36 ± 0.04 .. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SE. •P<(>.Os:·P<(>.01 vs. kontrola (Duncan-ov test multiplih rangova) Hjstoloskj, tumorj u kontrolnoj grupj su bllj slaЬo djferencjranj adenokarcjnomi, sastavljenj od vjseugaonjh celjja aranzjranjh u gnezda. Veljka jedra cesto su sadrzavala promjnentna jedra. Tumori u tretiranim gruparna pokazjvalj su slicnu strukturu. U sredjsnjjm delovjma svjh tumora pronadena је koagulacjona nekroza. Broj mjtoza kao i eeljja u apoptozi njje Ьiо znacajnjje promenjen ni u jednoj grupj zjvotinja. Jedjna t1jstoloska znacajnjja razljka medu tumorjma Ьilo је snjzenje broja AgNOR u rшkleolusjma tumorskih celjja (ТаЬеlа 17). Тај nalaz ukazuje na njzu proljfertjvnu sposobnost lecenjh tumora u poredenju sa kontrolnjm tumorima. 64 . \ . ТаЬеlа 17. Efektj terapjje sa SB-75, RC-3095 ј пjjhove komЬiпacjje па hjstoloske karakterjstjke MCF-7 Mlll ·humaпog karcjпoma dojke kseпografjraпog u goljm mjsevjma. Terapija % po'lrsjпe Broj mjtoza/1 000 Broj apoptotickih Broj AgNOR-a пekroze eelija eelija/1 000 celija ро пukleusu Koпtrola 40.1 ± 4.1 9.1 ± 1.0 8.4 ± 0.8 12.6 ± 0.3 SB-75 44.8 ± 7.0 6.6 ± 1.0 9.9 ± 1.7 11.2 ± 0.4* RC-3095 44.1 ± 8.6 7.3 ± 0.5 10.0 ± 1.2 10.3 ± 0.3* SB-75 + 36.7 ± 9.7 9.2 ± 0.9 7.1 ± 1.0 11.0 ± 0.2* RC-3095 Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ± SE. •Р<(Ј.О5, vs . kontrola (Duncan-ov test multiplih rangova). AgNOR, agirofilna organizacija nukleusa. Preparacjja membraпa tumora za receptorske studjje obavljeпa је prema postupku opjsaпom u poglavlju Materijal ј Metode. BomЬezjпskj receptorj odredivaпj su па jпtaktпjm MCF-7 Mlll celjjama u kulturj, па sljcaп пасјп kako је to орјsапо za Swjss ЗТЗ celjje. MCF-7 Mlll celjje gајепе su u Mjпjmal Esseпtjal Medjum (IMEM), Ьеz feпol-crveпog, оЬоgасепоg sa 5% DCC-FBS, tj. toplotom jпaktjvjsaпog seruma tretjraпog aktivпjm ugljem (DCC-FBS). Ovakvj uslovj podloge sprecavali su faktore rasta jz seruma da uzrokuju пjshodпu regulacjju ЬomЬezjпskjh receptora. Rezultate receptorskjh studija prjkazuje ТаЬеlа 17. Kod MCF-7 Mlll celija u kulturj, rastuce doze пeobelezeпog ЬоmЬеzјпа jпhiЬisale su specjfjcпo vezjvaпje oЬelezeпog ЬоmЬеzјпа sa sredпjom efektjvпom dozorп (ED50) od oko 1 о· 10 М. Scatchard-ova aпaliza ukazuje da se obelezeпi bombezjп vezjvao za jedпu vrstu receptorskih mesta velikog afjпjteta (Kd = 0.49 пМ). Bmax jzпosjo је 8.41 рМ, sto odgovara пalazu od oko 2980 receptora/celjjj оdпоsпо, 11 З fmol/mg proteiпa. ТаЬеlа 17 pokazuje da su па celjjskjm membraпama koпtrolпjh tumora prjsutпj receptorj veljkog afjпjteta za EGF ј IGF-1. Posle terapjje ЬomЬezjпskjm aпtagoпjstom RC-3095 uocava se zпасајпа redukcjja maksjmalпog kapacjteta specjfjcпog vezjvaпja EGF-a. Sto se tjce receptorskjh mesta za IGF-1, posle terapjje sa RC-3095 uocava se porast vredпostj Kd, sto ukazuje па sпјzепје afjпjteta, s tjm da је Bmax роvесапа. U celjjskjm membraпama tumora leceпjh komЬiпacjjom RC- 3095 ј SB-75, doslo је, jsto tako, do sпјzепја maksjmalпog kapacjteta vezjvaпja EGF, ali razljka пјје zпасајпа u poredeпju sa koпtrolпjm tumorjma. Zпасајап porast u vredпostj Bmax za vezjvaпje IGF-1 пastao је u tumorjma posle komЬiпovaпe terapjje RC-3095 ј SB-75. 65 ' ' ' ' INHIBITORNI EFEKT ANTAGONISTE BOMBEZINA/GRP-a RC-3095 NA RAST ESTROGEN ZAVISNOG 1 ESTROGEN NEZAVISNOG МХТ KARCINOMA DOJKE MISA lzvedeпa su dva eksperjmeпta sa estrogeп-пezavjsпjm modelom МХТ karcjпoma ј јеdап eksperjmeпt sa estrogeп-zav jsп jm МХТ tumorjma. L:jvotjпje u koпtrolпjm grupama pr jmale su ј пјеkсјје rastvaraca (0.1% I)MSO u fjzjooskom . rastvoru) . ТаЬеlа 18 pr jkazuje eksperjmeпtalпe grupe u pojedjпom eksperjтeпtu kao ј terapjje koje su ргјmепјјvапе . U estrogeп-пezavjsпom modelu МХТ tumora, zjvotjпje su raпdomjzovaпe u grupe 2 dапа posle jпokulacjje tumora i terapjja је zapoceta kako pokazuje ТаЬеlа 18. U eksperimeпtu 11, mjsevj sa estrogeп-пezavjsпjm tumorjma primalj su u јеdпој grupj ЬогnЬеzјп, а drugoj GRP(14-27) sa cjljem da se jspjta mogucj stjmulaпtпj efekt ЬomЬezjпu-sljcпjh peptjda па rast ovog tumora. U svjm grupama Ьilo је ро 1 О mjseva jzuzev u grupj з u eksperjmeпtu 1, koju su сјпјlе 5 zivotjпja. u estrogeп-zavisпom modelu мхт tumora, tumorj su Ьilj merljjvi oko 4 пedelje posle traпsplaпtacjje kada је zаросјпјапа terapjja. Svi peptjdj davaпj su mjпj-osmotskjm pumpama, model 2002 (vjdetj Materjjal ј Metode). ТаЬеlа 18. Eksperjmeпtj sa estrogeп-zavjsпim ј estrogeп-пezavjsпim МХТ tumorima. Tumorski model El ..Ј ~ .}()(){) а:: о 2000 2 ~ 1000 о в 6000 n 5000 Е Е 4000 w 2 .}()(){) ::> ..Ј ~ 2000 а: о ::::11 ~ 1000 о с " ')0 ;::; Е i.. w 1000 2 ::> ..Ј о > а: о 2 500 ::> >- 10 о O ·- O control .o.-ARC -- 3095 • - - • ovor iect•>my o-ocontrol .o.-.o.RC-3095 •-- • bombesin .o-.oGRP 1 1 4 DAYS AFТI:R TRANSPLANTATION o-oCONTHOL 6--.o.RC-:J095 •-• ovori11ctomy L 3 WEEK5 OF TREATMENT 18 Sljka 31. Zapremjne МХТ estrogen-nezavjsnog (А ј В) ј МХТ estrogen-zavisnog tumora dojke misa u toku terapjje ЬomЬezinom, GRP-om, ЬomЬezinskim antagonistom RC-3095 ј posle ovarjjektomije. Ver1ikalne ljnije predstavljaju SE srednjih vrednostj. *р<0.05, **р<0.01 vs. kontrola (Duncan-ov test) . Hjstoloski, estrogen-nezavisni МХТ (3.2)/0vex karcinom dojke misa Ьiо је nediferentovan, invazivni tumor. Nije uocena razljka u hjstologiji tumora kod zivotjnja koje su primale neku od terapija u odnosu na kontrolne zivotjnje. Mjtotjckj i apoptjtjcki indeksi Ьili su sljcnj u svim grupama 67 . \ . (ТаЬеlа 19). Posle terapjje sa RC-3095, u eksperjmentu 1, uocava se redukcjja argjrofjlnjh organjzovanjh regjona nukleolusa (р<0.01 u odnosu na kontrolu), kao ј njjhovo povecanje u tumorjma tretjranjh ЬomЬezjnom u ekperjmentu 11 (р<0.05 u odnosu na kontrolu). Broj spomenutjh argjrofjlnjh organjzovanjh regiona nukleolusa је indjkator prliferatjvne sposobnostj tumorske celije. Estrogen-zavisni МХТ (3.2) tumorj su vjse diferentovani ј cine ga cvrste_ celije rasporedene u odvojena gnezda ili u male zlezdaste strukture. Broj celija u mitozi Ьiо је nesto nizi posle terapije sa RC-3095 (ТаЬеlа 19). Svj histoloski parametrj proliferativnosti tumora Ьl i su snizeni u tumorima ovarjjektomjsanjh zjvotjnja (ТаЬеlа 19). ТаЬеlа 19. Efekt terapjje ЬomЬezjnfGRP antagonjstom RC-3095, Ьombezinom, GRP(14-27)- om na tezjnu ј histoloske par"ametre estrogen-nezavjsnog МХТ (3.2)/0vex ј estrogen-zavjsnog МХТ (3.2) karcjnoma dojke mjsa. Srednje vrednostj ± SE. т ezjna tumora Mjtoze/1 000 Apoptotjcke Broj argjrofjlnjh Terapjja g celija celije/1 000 cel. regjona nukleolusa ро nukleolusu Ekspeгjment 1: МХТ (3.1 )/Ovex Kontrola 6.75 ± 0.49 11.27 ± 1.54 11.41 ± 2.22 7.26 ± 0.14 RC-3095 3.38 ± 0.35* 9.47 ± 0.94 10.50 ± 1.28 6.26 ± 0.13* Ovarijektomija 7.06 ±1 .04 8.43 ± 2.09 12.39 ± 2.03 7.28 ± 0.18 Eksperiment 11 : МХТ (3.2)/0vex Kontrola 6.30 ±0.32 10.96±1.14 9.46 ± 1.27 8.90 ± 0.39 RC-3095 4.12 ±0.!>2** 12.18 ± 1.33 17.40 ± 4.79 8.62 ± 0.27 BomЬezin 5.99 ± 0.89 8.67 ± 0.95 10.09 ± 1.90 10.08 ± 0.53** GRP(14-27) 5.42 ± 0.89 11.33 ± 0.62 12.32 ± 2.73 9.60 ± 0.19 Ekspeгjment 111: МХТ (3.2) Kontrola 2.12± 0.47 5.54 ± 0.71 5.45 ± 1.13 12.04 ± 0.22 RC-3095 0.89 ± 0.20* 4.18 ± 1.07 8.96 ± 1.74 1 0.56 ± 0.47* Ovarjjektomija 0.16 ± 0.08* 2.88 ± 0.63** 8.41 ± 0.95** 9.20 ± 0.28* *р<0 .01 ; ••p 30Ј L ••р<О.О25 о 200 Е :Ј 100 1- о ·-·-ј----·-+· ---·-· - -· t -··--·---··- о 8 12 1 б 20 2-4 28 О а у s Sljka 33. Zapremiпe НТ-29 humaпog karcjпoma koloпa traпspaпtjraпog goljm mjsevjma tokom terapjje sa aпalogom LH-RH, aпalogom somatostatjпa RC-160 ј ЬomЬezjпskjm aпtagoпjstom RC-3095 prjmeпjjvaпog s.c. jпjekcjjama ili koпtjпujraпom jпfuzjjom pomocu mjnj- osmotskjh pumpj. Vertjkalпe lјпјје predstavljaju SEM. Rast tumora Ьiо је јпhјЬisап vec u toku prvjh З пedelje terapjje u оЬе grupe zjvotjпja koje su prjmale RC-3095 (Siika 33, ТаЬеlа 28). Posle 27 dапа, zapremjпa tumora zпасајпо је Ьila пјzа u grupj koja је prjmala RC-3095 jz mjпjpumpj (367 ± 72 mm3; р= 0.03), kao ј u grupj koja је prjmala s.c. јпјеkсјје RC-3095 (31 О ± 108 mm3; р<0.01) u poreёleпju sa koпtrolпog grupom (682 ± 101 mm3). Proceпt promeпe zapremjпe tumora Ьiо је, jsto tako, zпасајпо јпhјЬisап od 18-og dапа u grupj lесепој sa RC-3095 ј;;: mjпjpumpj, а u grupj koja је doЬijala s.c. RC-3095 vec od 1 4-og dапа terapjje. Vreme udvostrucavaпja zapremjпe tumora zпасајпо је Ьilo produzeпo u оЬе grupe zjvotjпja koje su doЬijale RC-3095 (od oko 4 dапа u koпtrolпoj grupj па 7 оdпоsпо 7.2 dапа u 77 grupama koje su doЬijale ЛС-3095 mjnjpumpama odnosno s.c. jnjekcjjama). Vreme odlozenog rasta tumora Ьi lo је 6.5 dana u grupj lecenoj kontjnujranom jnfuzjjom RC-3095, а 8.5 u grupj koja је doЬijala dva puta dnevno s.c. jnjekcjje RC-3095 (ТаЬеlа 28). ТаЬеlа 28. Efekt terapjje sa D-Trp6-LH-RH, RC-160 ili RC-3095 па zapremjnu tumora, procent povecanja zapremjne od pocetka terapjje, tumororsko optereeenje, vreme udvostrucavanja zapremjne tumora ј odlozeno vreme rasta tumora goljh mjseva sa ksenograftjma celjjske ljnjje humanog karcjnoma kolona. Zapremina tumora (mm3) о/о poveeanja Tumorsko Vreme udvo- Vreme od dana О optereeenje stru~avanja odlozenog rasta Terapija Poeetna ZavгSna (mg/gТТ) (dani) (dani) Kontrola 19.7 ± 3.7 681 .8 ± 101 ?±674 28.2 ± 4.1 4.13±0.6 D-Trp6-LH-RH 19.7 ± 4.1 522.6± 147 2631 ± 484 24.4 ± 5.9 5.05± 0.4 2.5 RC-160 17.5±2.7 463.1 ± 91 2695± 426 21 .2± 4.1 5.6 ± 0.5 4 RC-3095 pumpe 20.2 ± 3.6 367.1 ± 72* 1964 ± 314* 18.2 ± 4.1* 7.0 ± 0.4* 6.5 RC-3095 s.c. 19.7 ± 4.0 310 ± 108** 1338 ± 190** 14.9 ± з.5** 7.2 ± 0.6** 8.5 Srednje vrednosti ± SE. *Р<(Ј .О5; **Р<(Ј . О1 vs. kontrola, Duncan-ov test. Na kraju ekperjmenta 1, analjza koncentracjja gastrjna, hormona rasta ј IGF-1 u serumu zjvotjnja pokazala је da је terapjja sa RC-3095 uzrokovala pad gastrjna ј IGF-1 u serumu zjvotjnja (ТаЬеlа 29) . Tabela 29. Koncentracjje gastrjna, hormona rasta ј IGF-1 u serumu goljh mjseva sa transplantjranjm НТ-29 humanjm karcjnomom kolona posle terapjje sa D-Trp6-LH-RH, RC-160 ј RC-3095. Terapjja Gastrjn Hormon rasta IGF-1 (pg/ml) (ng/ml) (ng/ml) Kontrola 218.9 ± 59 3.78 ± 0.27 370 ± 78 D-Trp6-LH-RH 148.1 ± 23* 4.22 ± 0.5 291 ± 30 RC-160 334.1 ± 65 4.18 ± 0.5 297 ± 47 RC-3095 pumpe 148.9±17* 3.73 ± 0.28 225 ± 50* RC-3095 s.c. 158.0 ± 20* 3.97 ± 0.24 179 ± 52* *р<О.О5 vs . kontrola, Duncan-ov test multiplih rangova. 78 Sljka 34 pokazuje zapremjne tumora, merenjh u jnterval jma od 3-4 dana, u eksperjmentjma 2, З i 4. Efekte razlicitih terapija na zapreminu tumora na kraju eksperimenta, na procent povecanja od pocetka terapije, opterecenje tumorom, vreme udvostrucavanja zapremine tumora i odlozeno vreme rasta tumora pokazuje ТаЬеlа 30. Terapija ЬomЬezinskim antagonjstom RC-3440, u eksperimentu 2, znacajno је inhiblsala rast tumora (oko 45% inhjblcjje u poreaenju sa kontrolom), prolongjrala vreme udvostrucavanja zapremjne tumora na 9.5 dana, dok је odlozeno vreme rasta tumora jznosjlo 7.5 dana. Zanjmljjvo је da је ЬomЬezjn, u dozj od 5 119 dva puta dnevno s.c., takode jnhjblsao rast tumora za oko 30% u odnosu na kontrolu (Sijka 34А ј ТаЬеlа 30). 700 г---т---т-----.--,-------. "'ё 600 Е - 500 w ~ 400 ....Ј ~ 300 с: о 200 ::1 :::> 1- 100 • con\ro l о Bombetln. 5 џ g b.l .d. .. RC-3'-40, IC• IJQ bJ .d. А r r - .··I. ··I· .. · ·Т· .-r. о "---'--L--'----....J.._---'----_.J о 10 15 20 25 30 еоо г---т---т----.--.,.-------. • control ) ~Е 500 О RC-160, micrO\)ranulea 50 IJQ/day Е • RC-30Q5, а.с . lwice daily 10 IJQ w ::1 400 3 300 о > с: 200 о ::1 ~ 100 в о~-~--~--~--Ј--~-~ о 5 10 15 20 25 30 600 ~--r--т-----.--..,.---=--~ ~Е 500 Е ш ~ .(00 3 300 о > с: 200 о :i ~ 100 • control о RC-1 б О, microuranulea 50 џg/day А RC-ЗOQS, а.с . 20 џо onca d1lly s 10 15 TIME (deyal 20 25 30 U trecem eksperimentu, RC-160 i RC-3095 ponovo su jnhjblsalj rast НТ- 29 tumora (Sijka 348 i С ј ТаЬеlа 30) . U eksperimentu 4, terapija jednodnevnom injekcjjom 20 J.l9 RC- 3095 Ьila је nesto manje efikasna od jnjekcija RC-3095 dva puta na dan u eksperimentjma 1 ј З. Slika 34. Zapremjne ksenografta humanog karcinoma kolona НТ -29 transplantjranog goljm mjsevjma u toku terapjje ЬomЬezjnskjm antagonjstom RC-3440 u vjdu s.c. jnjekcjja (А) ј mjkrogranula RC-160 ј RC-3095 s.c. injekcijama (В ј С) . Vertjkalne ljnije pokazuju SE; *р<0 . 05; **р<0 . 01 , znacajnost u odnosu na kontrolu odredjvana Student-ovim t-testom (А,В) ј Duncan-ovjm testom multjpljh rangova (С) . 79 . ' ТаЬеlа 30. Efekt terapije razlicitim peptidima na zapreminu tumora, procent povecanja zapremine tumora od pocetka terapije, opterecenje tumorom, vreme udvostrucavanja zapremine tumora i vreme odlozenog raвta ksenografta humanog karcinoma kolona НТ-29 u golih miseva. о/о poveeanja Tumorsko Zapremlna tumora (mm~ od dana О optereeenje Teraplja Pocetna Zavr§na (mg/g ТТ) Eksperiment 2 Kontrola 25.6 ± 4.5 52З ± 70 204З± 228 19.8 ± З.5 RС-З440 1 24.7 ± 4.5 277 ± 87. 1121 ± 126. 11.9 ± З.2· BomЬezin2 22.5 ± 5.1 З57 ± 85 1764 ± 300 16.9 ± 5.8 Eksperiment З Kontrola 19.8 ± 4 494±88 2З86±408 17.2 ± З. 1 RC-1603 18.7±З 291 ± sз· 1717±21З 9.9±3 RС·ЗО951 18.З±З 272±57. 1276 ±24з· 8.9±З.2 Eksperiment 4 Kontrola 34.9 ± 6.1 491 ± 97 1296 ± 91 19.4 ± З.З RC-1603 2З. 1 ± 5.0 165± 58 557 ± 168 •• 4.9 ± 1.6· RC-30954 30.9±5.8 277 ± 71 765± 151. 20.З ± 6.9 1 RС-ЗО95 i RC-3440 primenjeni su s.c. injekcijama u dozi od 10 f19, dva puta dnevno. 2вomЬezin је primenjen u oЫiku s.c. injekcija, dva puta dnevno, u dozi od 5 f19 · ЗRС-160 mikrogranule oslobat1ale stJ 50 f19 dnevno, u toku 14 dana. 4RС-ЗО95 primenjen је jednom dnevno, s.c., u dozi od 20 f19 · Vreme Vreme udvostrutavanja odlo:fenog rasta (danl) (dani) 6.5 ± 0.4 9.5± о.5· 7.5 8.1 ± 0.6 3.0 7.0 ± 0.5 - 9.0 ± 0.5 6.5 11.0 ± 0.6· 7.5 7.7±0.6 - N.D. 12.2 1З. 8 ± 2.0 4.2 N.D. s obzirom da su З zivotinje bile sa tumorima koji su regredirali u rastu, vreme udvostrutavanja nije Ьilo moguce odrediti. •р<0.05; ••р<0.01 vs . kontrola, Duncan-ov test. Histoloski НТ-29 tumori Ьili su srednje diferentovani adenokarcinomi, sa velikim, cilindricnim celijama, smestenim u grupama ili iregularnim zlezdama sa viseslojnim epitelom. Mnogobrojne celije sadrzave su mucin а veca ili manja nekroticna polja vidala su se u sredini tumorskog tkiva. Nije Ьilo znacajnije razlike u histoloskoj gradi tumora posle razlicitih terapija u poredenju sa kontrolnim tumorima. Koncentracija gastrina u serumu miseva u eksperimentu 2, posle terapije sa RC-3440, Ьila је niza u poredenju sa kontrolom (67.8 ± 11 pg/ml u grupi na RC-3440 vs. 97 ± 15 pg/ml џ kontrolnoj grupi; р<0.05). Samo је terapija ЬomЬezinom znacajno povecala koncentraciju hormona rasta u serumu miseva. 80 Vrlo nisko (manje od 1% ukupno vezanog liganda) vezivanje obelezenog ЬomЬezina pokazano је samo na membranama tumora iz kontrolne grupe zivotinja (ne i na membranama tumora tretiranih ЬomЬezinskim antagonistom). lpak, ovo vezivanje је Ьilo 78% specificno ра је analiza podataka ukazala na jednu vrstu receptora velikog afiniteta (Kd = 0.07 nM) i vrlo niskog kapaciteta (Bmax oko 2 fmoVmg proteina). Rezultati EGF receptorskih analiza na membranama НТ-29 tumorskih celija posl'~ razlicitih terapija prikazani su na TaЬeli З1. U ranijim, preliminarnim eksperimentima pokazano јЕЈ prisustvo EGF receptora na intaktnim НТ-29 eelijama u kulturi. Posle ksenograftiranja eelija u golim mi~evima, broj receptora za EGF povecao se skoro 20 puta (od 15 na З20 fmol/mg proteina). Terapija sa ЬomЬezinskim antagonistom RС-ЗО95, u eksperimentu 1 ,З i 4, visoko znacajno је redukovala maksimalni kapacitet receptora za EGF na membranama НТ-29 tumora. lsto tako, drugi ЬomЬezinski antagonist RС-З440, primenjen u eksperimentu 2, znacajno је snizio Bmax EGF receptora. Slicno tome, i terapija ЬomЬezinom imala је za posledicu smanjenje broja receptora za EGF na membranama eelija НТ-29 tumora. ТаЬеlа З1 . Karakteristike EGF receptora na membranama celija НТ-29 humanog karcinoma kolona transplantiranog golim misevima posle terapije sa razlicitim peptidnim analozima. Srednje vrednosti ± SE. EGF Terapija Kd (nM) Bmax (fmol!mg proteina) Eksperiment 1 Kontrola 2.1 ± 1.2 З20 ± 69 D-Trp6-LH-RH 4.2 ±2 120 ± 64 RC-160 з.з ± 1.4 94±20 RС-ЗО95 1.З ± 0.7 26 ± 10* Eksperiment 2 Kontrola 1.7 ± 0.4 660 ± 176 RС-З440 О . З ± 0.2 55 ± 19* BomЬezin 0.4 ± 0.2 87 ± 25* Eksperiment З Kontrola 0.7 ± 0.2 195 ± 14 RC-160 1.4 ± 0.2 52 ± 5* RС-ЗО95 1.4 ± 0.4 З5 ±З* Eksperiment 4 Kontrola 1.2 ± о.з 260 ±40 RC-160 2.2 ± 0.02 97 ± 2** RС-ЗО95 4.4 ± 0.4 101±28** . ·Pezjпskjm aпtagoпjstom RC-3095. ВоmЬеzјп ј GRP пjsu zпасајпјје utjcalj па rast ovjh tumora. lпhjblcjja rasta tumorskjh celjja u prjsustvu RC-3095, dovela је do 45- 65% redukcjje zapremjпe tшnora, do 35-58% smапјепја tе~јпе tumora, kao ј statjstjckj zпасајпоg smапјепје broja AgNOR-a, kao jпdjkatora proljferatjvпe sposobпostj tumora. Kod estrogeп­ пezavjsпog tumora, jпhjblcjja rasta Ьila је povezaпa sa smaпjeпjem maksjmalпog kapacjteta vezjvaпja receptora za EGF od 0.21 ± 0.016 pmol/mg protejпa u koпtrolпjm tumorjma, па 0.03 ± 0.003 pmol/mg protejпa kod tumora leceпjh RC-3095-om. Nasj rezultati su Ьili, iпасе, prvi dokaz da ЬomЬeziпskj aпtagoпisti mogu iпhiblsati rast karcjпoma dojke in vivo. Ovarijektomija (аЬiасјја estrogeпa) j\i ргјmепа aпtjestrogeпa moze Ьitj korjsпa terapjja za mпoge Ьоlеsпјсе sa estrogeп-zavjsпjm karcjпomom dojke, alj samo 30% tumora dojke regredjra posle ргјmепе hormoпske terapjje (86, 87, 91) . Regresjja tumora је пајсеsсе prjvremeпa, ј vесјпа hormoпskj-zavjsпjh tumora postaje posle ргјmепе hormoпa rezjsteпtпa па ovu vrstu terapjje (86, 87, 91 ). Za rast eeljja karciпoma dojke odgovornj su mnogj hormoпj i faktori rasta (91 ). Tumorske celjje mogu same stvarati ројеdјпе faktore rasta, kao sto su IGF-1 ili TGF-a. (84-88). Pozпato је postoji jпverzan odnos izmeau prisustva receptora za estrogen i receptora za EGF kod humanjh karcjnoma dojke (88, 92) . Ekspresija EGF receptora povezaпa је sa losom progпozom i rezjsteпcjjom tumora na endokrinu terapjju (88, 93). Tek od nedavno, sve је vjse podataka da ЬоmЬеzјп, GRP ј njjma sljcnj peptjdj mogu bltj faktorj rasta normalnog jlj tumorskog tkjva dojke (29, 94-97). lnhjblcjja delovanja ј\ј sekrecjje svjh ovjh faktora rasta, kao ј Ьlokada njjhovjh receptora . , mogucj su novj prjstupj u terapjjj karcjnoma dojke. Ovakve terapjjske mogucnostj se uveljko jspjtuju. Hjrursko uklanjanje pljuvacnjh zlezda, kao najveceg jzvora EGF-a, zaustavjlo је rast tumora dojke mjsa (98). Antjtela prema receptorjma za EGF (99) ј IGF-1 jnhjblsala su rast celjja humanog karcjnoma dojke. U nasjm eksperjmentjma ЬоmЬеzјп i GRP(14-27) пjsu stjmuljsali rast МХТ tumora in vivo. Stimulacjju rasta celjja karcinoma dojke пјје Ьilo jedпostavno pokazatj cak пi u uslovjma in vitro, ра stoga пе cudj nemogucnost da se to pokaZe in vivo eksperjmeпtom. Moze se ipak zakljucjtj da је inhjbltornj efekt antagoпiste ЬomЬeziпskjh receptora RC-3095 prema rastu МХТ tumora dojke misa, najverovatпije posledica transmodulacjje receptora za EGF tj. njjhove njshodne regulacjje. 93 INHIBITORNO DEJSTVO ANTAGONISTE BOMBEZINA RC-3095 NA RAST KARCINOMA PANKREASA HRCAKA UZROKOVANOG HEMIJSКIM KARCINOGENOM Poznato је da zracenje ј hemjoterapjja jmaju veoma ogranjcenu efjkasnost u terapjjj karcjnoma pankreasa. Razljcjta jstraZjvanja pokazala su da razliciti hormonj, posebno gastrojntestjnalnog porekla (kao sto su gastrjn, holecjstokjnjn, sekretjn, neurotenzjn, ЬomЬezjn), kao ј faktorj rasta mogu stjmuljsati rast karcjnoma pankreasa (za revjjskj prikaz vidi referencu 1 01 ). BomЬezjn stjmuljse sekrecjju enzjma pankreasa tako sto oslobaёJa holecjstokjnjn, ali ј djrektnjm dejstvom na acjnuse (1 02) . BomЬezjn ubrzava razvoj karcjnoma pankreasa pacova jndukovanog azaserjnom (1 03). GRP је stjmulisao rast CAPAN eeljjske ljnjje humanog karcjnoma pankreasa dejstvom na specjfjcne receptore (1 04). BomЬezjnskj receptorj pokazanj su ј na AR 42Ј celjjama karcjnoma pankreasa pacova (1 05). MeёJutjm, Alexander ј saradnjcj pokazuju da Ьombezjn jnhjЬise rast humanog karcjпoma pankreasa transplantjranog goljm mjsevjma (1 06) . u nasjm eksperjmentjma sa karcjnomom pankreasa hracaka prouzrokovanom njtrozamjnom, RC-3095 је, posle 2 meseca terapjje, jnhjЬirao tezjnu tumoroznjh pankreasa za oko 88%. Pokazalj smo ј prjsustvo receptora za ЬomЬezjn veljkog afjniteta na tumorskjm eeljjama. lnhiЬitornj efekt RC- 3095 moze, prema tome, Ьitj posledjca djrektnog delovanja preko specjfjcnjh receptora. Znacaj ЬomЬezjnskjh receptora za rast karcjnoma pankreasa moze Ьitj veljkj. Na to ukazuje ј nalaz Alexander-a (1 06), da Ьoml>ezjn sam jnhjЬira rast ksenografta humanog karcjnoma pankreasa u goljm mjsevjma, kojj se verovatno moze objasnjtj njshodnom ("down") regulacjjom receptora za ЬomЬezjn (koju moze projzvestj ј agonjst ј antagonjst). Sljcan efekt jnhjЬicjje opjsalj smo ј тј, kada је GRP jnhjЬisao rast Н-345 celjja humanog SCLC-a iп vitro. Antjtumorskj efekt RC-3095 na ВОР tumor, moze Ьitj posledjca jnhjЬitornog delovanja na sekrecjju razljcjtjh gastrojntestjnalnjh hormona jlj endokrjnih, parakrinih i autokrinih faktora rasta. Sljcno nalazu kod eksperimнnata sa karcinomom dojke, primena RC-3095 prouzrokovala је snaZnu nishodnu regulacjju receptora za EGF na membranama ВОР tumora hrcaka. Uloga EGF-a u nastanku karcinoma pankreasa nije u potpunostj jasna. 94 \NH\8\TORNO DEJSTVO ANTAGONISTE BOMBEZINA RC-3095 NA RAST РС-82 HUMANOG KARCINOMA PROSTATE TRANSPLANTIRANOG GOLIM MISEV\Mд Karcinom prostate је jedan od najcescih karcinoma kod muskaraca. lako је karcinom prostate hormon-zavisni turrюr, sa povoljnim delovanjem razlicitih vidova hormonske terapije, ipak su neophodni novi modaliteti u terapiji ove Ьolesti. РС-82 tumor ima poreklo od Ьolesnika sa srednje diferentovanim karcinomom prostate i sastoji se uglavnom od androgen-zavisnih celija (1 07, 108, 1 09). РС-82 se smatra veoma korisnim modelom tumora za ispitivanje razlicitih terapijskih modaliteta. Opute је poznato da se karcinom prostate izuzetno tesko moze transplantirati golim misevima. Prema literaturi, uspeh transplantacije uzoraka humanog karcinoma prostate golim misevima iznosi manje od 1 %. U nasem radu smo pokazali da upotreba Matrigel-a, ekstrakta bazalne mebrane celija, moze Ьiti veoma korisna u svrhe "primanja" transplantata (ksenografta) karcinoma prostate kod golog misa. Uloga ЬomЬezina u rastu karcinoma prostate veoma је malo ispitivana. Bologna i saradnici (28) pokazali su da ЬomЬezin stimulise rast eelija karcinoma prostate iп vitro. Ovi autori su, sta vise, pretpostavili autokrinu ili parakrinu ulogu ЬomЬezina u karcinomu prostate. Nasi eksperimenti su Ьili prvi dokaz za inhibltorni efekt antagoniste ЬomЬezina na rast humanog karcinoma prostate. RC-3095 је snizio koncentracije GH i IGF-1 u serumu zivotinja, sto moze imati za posledicu inhiblciju rasta tumora. Vec ranije opisani efekt RC-3095 na broj receptora za EGF, ponovo је viden i u eksperimentu sa РС-82 tumorom. Da EGF ima va.lnu ulogu u razvoju karcinoma prostate postoje mnogobrojni dokazi ( 11 О, 111, 112). О direktnom efektu RC-3095 па specificne receptore ne moze se govoriti, јег prisustvo ЬomЬezinskih receptor na membranama РС- 82 tumora nismo ispitvali. 95 INHIBITORNO DEJSTVO ANTAGONISTE BOMBEZINA RC-3095 NA RAST НТ-29 HUMANOG KARCINOMA KOLONA TRANSPLANTIRANOG GOLIM MISEVIMA Mada је mor1alitet od karciпoma koloпa u padu, ukupпo 5-godisпje preiivljavaпje ostaje oko 50% (11 3) . Hiruska ekscizija је efikasпa samo kod Ьolesпika kod kojih је Ьo lest rапо dijagпost ikovaпa, ра su potrebпi dalji пapori za razvoj uspesпije terapije, роsеЬпо uzпapredovalih , metastatskih oЫika karc iпoma koloпa. Visestruki su dokazj koji potvrauju verovaпje da је rast karciпoma koloпa pod hormoпskom koпtrolom . Pozпato је da muski pol utice па iпcjdeпcu kolorektalпog karciпoma (114, 115). Aпdrogeпj receptori se пalaze па celijama karciпoma koloпa (116), а kastracjja pacova smaпjuje гjzik za razvoj karcjпoma koloпa pod utjcajem kагсјпоgепа (117). МпоgоЬrојпј hormoпi gastroiпtestiпalпog trakta stimulisu rast kolorektalпog karciпoma: gastrjп, holecjstokiпjп, sekretiп , j пsuliп, glukagoп (4, 118, 11 9), а pozпato је da i faktorj rasta, kao sto su IGF-1, EGF i TGF-a., mogu da stjmuljsu rast eeljja karcjпoma koloпa (118, 119). НТ-29, celjjska liпija adeпokarciпoma koloпa, zadrzala је odreaeпe karakteristjke tumorskih celjja od kojih је пastala. Celije jmaju receptore za gastrjп ј gastriп stjmulise пjihov rast (118, 120). Gastrjп stjmuljse i rast НТ -29 celija posle пjjhove traпsplaпtacije golom misu ( 120). Се\јје ove lјпјје takoae luce faktore rasta IGF-1 ј EGF (121 ). Prema tome, НТ-29 kseпograftj predstavljaju zahvalaп model za jspitjvaпje utjcaja razljcjtjh vjdova hormoпske terapije па rast kolorektalпjh tumora. U пasim studjjama пasli smo da је posle terapjje sa dva aпtagoпista ЬombezjпafGRP-a, RC- 3095 ј RC-3440, doslo је do 45-60% jпhiblcjje rasta НТ -29 tumora. BomЬeziпskj aпtagoпisti sп jzj\j su пivo gastrjпa u krvi mjseva, sto delom moze objasпiti пjjhov aпtjtumorski efekt. lsto tako, sпјzепје koпceпtracije IGF-1 u cjrkulacjjj, koju је uzrokovao RC-3095, moze doprjпetj пjegovom efektu. Aпtagoпistj ЬоmЬеzјпа mogu delovatj ј djrektпo preko specjfjcпjh receptora па membraпama eeljja. Skorasпje studjje pokazale su prjsustvo receptora za ЬomЬezjп/GRP па celjjama humaпog karcjпoma koloпa NCI-H716 ј па МС-26 celijama karcjпoma koloпa mjsa (23, 122). ВоmЬеzјп је stjmu\jsao rast МС-26 celjja, dok је ЬomЬezjпskj aпtagoпjst јпhјЬiгао taj efekt (23). Мј smo opjsalj veoma mali broj specjfjcпjh receptorskjh mesta za ЬomЬezjп/GRP па НТ-29 ce\jjama. U роsеЬпој studijj, сјјј rezultatj пjsu prezeпtjraпi u ovom radu, pokazali smo da se specificпi receptorj za Ьombeziп пalaze kod 40% uzoraka humaпog karciпoma koloпa (123). U istoj studjji 80% uzoraka humaпog karcjпoma koloпa pokazjvalo је prisustvo receptora za EGF (123) . 96 Terapjja mjseva sa ksenograftima НТ-29 tumora, kako sa RC-3095 tako ј sa RC-3440, dovela је do znacajnog snjzenja broja receptorskjh mesta za EGF. Dejstvo antagonjsta ЬomЬezjna na ekspresjju receptora za EGF moze Ьitj osnova mehanjzma antjtumorskog delovanja ovjh jedjnjenja, а ne dejstvo na ЬomЬezjnske receptore. Antagonjst ЬomЬezjna RC-3095 jnhjblrao је rast НТ-29 tumora ј posle jntrasplenjcne jnjekcjje tumorskjh celjja. Posle apljkacjje НТ-29 eeljja, one dospevaju portalnom cjrkulacjjom do jetre. Jetra је poznata kao organ sa nraпe celjje, mпogo kompleksпjje od jedпostavпe Ьlokade stjmulaпtпog delovaпja ЬоmЬеzјпа. Njshodпa regulacjja receptora za EGF, uосепа је kao koпzjsteпtaп fепоmеп posle terapjje sa RC-3095 kod tumora dojke, paпkreasa, prostate ј koloпa. Sljcaп efekt је орјsап је posle stjmulacjje Swjss ЗТЗ eelija ЬomЬeziпom (133, 135). 98 ZAKLJUCCI 1. Bjolosku aktjvnost antagonjsta ЬomЬezjna moguce је jsp jtatj na razljcjtjm eksperjmentalnjm modeljma. Ovde su prjmenjena trj osnovna metodoloska prjstupa. Кlasjcna receptorska analiza (Ьiohemjjskom metodom) pokazala · se jednostavna reproducjbllna metoda, posebno ako se korjste Swjss 3Т3 maljgnj fjbroЬiast j mjsa. Ove celjje sadrze najvecj broj receptora za ЬomЬezjn (od 50 000 do 1 ОО 000 receptorskjh mesta ро celjjj) , brzo rastu pгjcvrscene za podlogu, ne zahtevaju posebne uslove hranljjve podloge ј, sto је najvafnjje, kod ovjh celjja ne dolazj do spontane njshodne regulacjje receptora za ЬomЬezjn zbog toga sto on za njjh njje autokrjnj faktor rasta. Za razljku od Swjss 3Т3 celjja, celjje humanog SCLC, ka npr. Н-345 linjja, spor jje rastu, nalaze se u suspenzjjj, zahtevaju specjjalnu hranljjvu podlogu (HITES), ЬomЬezjn kojeg ove celije stvaraju uzrokuje njshodnu regulacjju receptora preko kojjh sam deluje, ј, pod najpovoljnjjjm uslovjma Н-345 eeljje sadrze daleko manju gustjnu jlj Ьгој receptorskjh mesta za ЬomЬezjn na svojoj povrsjnj (oko 2 000 ро eeljjj) . lnhjblcjja nekog stjmulatjvnog efekta ЬomЬezjna је druga koгjsna eksperjmentalna metoda za jspjtjvanje antagonjsta Ьomtюzjna. Na prjmer, ЬomЬezjn stjmulise rast Swjss 3Т3, Н-345 celjja kao ј celjja humanog karcjnoma dojke MDA МВ 231. Mjtogenj efektj ЬomЬezjna ј njegovjh antagonjsta mogu se merjtj pracenjem jnkorporacjje oЬelezenog tjmjdjna u DNK cel jja jlj jednostavno brojanjem celjja. Od novjh metoda za jspjtjvanje Ьioloske aktjvnostj ЬomЬezjna ј njegovjh antagonjsta u ovom projektu ргvј put је uspesno prjmenjena metoda superfuzjje sa djspergovanjm acjnusjma pankreasa. Ona је jednostavna, ne zahteva skupu opremu, na jednom preparatu pankreasa mogu se testjratj razljcjtj antagonjst j, moze se pratjtj efekt lekova na bazalnu sekrecjju acjnusa ј na taj nacjn razdvojjtj cjstj antagonistj od parcijalnjh agonjsta ЬomЬezjna. Nasj rezultatj predstavljaju ј afirmaciju ove nove metode. 2. Farmakodjnamiska aktjvnost antagonjsta ЬomЬezjna zavjsj od duzine strukture peptjdnog lanca. Analozj ЬomЬezjna sa 14 amjnokuseljna u lancu (tetradekapeptjdj) ne predstavljau dovoljno snafne antagonjste јег su Ьilj akt jvnj u mjkromolarnjm koncentracjjama ј njjma njje posvecena posebna pafnja. 99 Mnogo sna:Znjjj antagonsjtj Ьili su poljpeptjdj kraceg lanca amjnokjseljna, npr. sa 1 О, 9 ili 8 amjnokjseljna (7-14-, 6-14- ј 6- 1З-ЬоmЬеzјn) . Strukturne jzmene na poziciji 7 polipeptida kraceg lanca, nisu se pokazale odlu~~ujuee za znacajnije povecanje antagonjsticke aktivnostj. Uvoaenje "pseudo-peptjdne" veze jzmeau pozjcjja 1 З i 14 u pojedine nonapeptjdne analoge ЬomЬezjna, prvi put је dalo antagoniste aktivne u nanomolarnim koncentracijama. Ako se pored "pseudo-peptidne" veze, na pozicije 6 ј 14 (tj. na N jlj С kraju molekule) nalaze aromatjcne amjnokjseljne, ako sto su Trp ј Трј, nastaju jedjnjenja sa aktjvnoscu u koncentracjjj od 1 do 1 О nM. Dva takva jedjnjenja, RС-ЗО95 ј RС-З440, pokazala su aktjvnost ј u uslovjma jn vjvo. З. Antagonsit ЬomЬezjna RС-ЗО95 jnhjЬirao је rast trj tjpa eksperjmentalnog karcjnoma dojke: humanog karcinoma dojke lv1CF-7 Mlll transplantjranog goljm mjsevjma, estrogen-zavjsnog kao ј estrigen-nezavjsnog МХТ karcjnoma dojke mjsa. BomЬezjnskj antagonjstj jnhjЬiralj su ј rast ВОР karcjnoma pankreasa hrcaka uzrokovanog hemijskjm karcjnogenom, kao ј rast humanjh karcjnoma kolona (НТ-29) ј prostate (РС-82) transplantjranjh goljm mjsevjma. 4. Mehanjzam antjtiJmorskog delovanja antagonjsta ЬomЬezjna је verovatno slozen. Vezjvanje ovjh lekova za mceptore za ЬomЬezin na tumorskjm eeljjama, ј sledstvena njshodna regulacjja receptora, је svakako osnovno delovanje ovih lekova. U nasjm eksperjmentjma zapa:Zena је jzra:Zena ј konzjstentna pojava njshodne regulacjje receptora za EGF na membranama tumora lecenjh antagonjstjma ЬomЬezjna. Та pojava tzv. transmodulacjje EGF receptora moze jmatj veljkj znacaj za antitumorsku aktj\1nost antagonjsta ЬomЬezjna, s obzjrom da је EGF sna:Zan faktor rasta za razlicite maligne tumore. Uticaj antagonjsta ЬomЬezina na koncentracjju pojedinjh hormona u serumu, kao npr. snizavanje koncentracije gastrina ili hormona rasta, isto tako moze doprinosjti njjhovom antitumorskom delovanju. 5. Rezultati opravdavaju dalja istra:Zivanja antagonista ЬomЬezina kao mogucih lekova za terapiju onih malignih oЬoljenja kod kojih se poka:Ze da је ЬomЬezin znacajan faktor za njjhov nastanak i razvoj. 100 LITERATURA 1. Cutitta, F., Camey, D.N., Mulshine, Ј . , Moody, T.W. Fedorko, Ј., Fishler, А. and Minna J.D. BomЬesin-like peptides can function as autocrine growth factors in human small-celllung cancer. Nature, 1985, З16:823-826. 2. Erspamer VG, Falconieri Е , lr1selvini М. Some pharmacological actions of alytesin and ЬomЬesin . Ј Pharm Pharmacol 1 970; 22:275-276. З. Broccard, М., Erspamer, G.F., Melchiorri, Р. , Negri, L. and De Castigione, R. Relative potency of ЬomЬesin-like peptides. Вг . Ј. Pharmacol. 1975,55: Z~1-227. 4. Thompsom ЈС, Магх М . Gastrointestinal Hormones. ln Ravitch ММ, Steichen FM, Austen WG, Scott HWJr. Fonkaisrud EW, Polk НС Јг. (eds) . Curreпt ProЫems in Surgery, vol XXI, No. 6, рр. 1-80. (Chicago, Уеаг Book Medical PuЫishers , lnc.). 5. Walsh ЈН, Reeve JR Jv, Vigna SR. Distribuution and molecular forms of mammalian ЬomЬesin, in Bloom SR, in Bloom SR, PolakJM (eds). Gut Hormones, eds. 2. NewYork, Churchill Livingstone, 1981, рр.413-418. 6. Walsh ЈН, Wong НС, Dockery GJ. BomЬesin-like peptides in mammals. Fed Ргос 1 979; 38:2З15-2З1 9. 7. Wharton Ј, Polak ЈМ, Bloom SR, Ghatei МА, Solcia Е, Brown MR, Pearse AGE. BomЬesin-like immunoreactivity in the lung. Nature 1978; 27З:769-770 . 8. McDonald Т Ј, Nilsson G, Vagne М, Ghatei М, Bloom SR, Mutt V. А gastrin releasing peptide from the porcine non-antral gastric tissue. Gut 1 978; 1 9:7f>7-774. 9. McDonald ТН , Jorvall Н , Nilsson G, Vagne М, Ghatei М, Bloom SR, Mutt V ... Characterization of а gastrin releasing peptide from percine non-antral gastric tissue. Biochem Biophys Res Commun 1979; 90:227-233. 10. Reeve JR Јг , Walsh ЈН, Chew Р, Clark В, Hawke D, Shively ЈЕ. Amino acid sequences of three ЬomЬesin-like peptides from canine intestine extracts. Ј Biol Chem 1983; 258: 5582-5588. 11 . Spindel ER, Chin WW, Price Ј, Rees LH, Besser GM, НаЬеnег ЈН. Cloning and characterizacion of cDNAs encoding gastrin=-releasing peptide. Ргос Natl Acad Sci USA 1984; 81: 5699-570З. 12. Spindel ER, Sunday МЕ, Hofler Н, Wolfe НЈ, НаЬеnег JF, Chin WW. Transiend elevation of mRNAs enconding gastrin- releasin peptide (GRP), а put<:ttive pulmonary growth factor, inhuman fetallung. Ј Clin lnvest 1987; 80: 1172-1179. 1 З. Moody ТW, Pert CD. Bombesin-like peptides in rat brain: quantitation and biochemical characterisacion. Biochem Biophys Res Commun 1979; !Ю: 7-14. 14. Price Ј, Penman Е , Wass ЈАН, Rees LH: BomЬesin- like immunoreactevity in human gastrointestinal tract. Regul Pept 1984; 9: 1-6. 15. Dockray GJ,Vaillant С, Walst1 ЈН. The neuronal origin of ЬomЬesin-like immunoreactivity in the rat gastrointestinal tract. Neuroedocrinol19769; 4: 1561-1568. 16. Sunday МЕ, Kalpan LM, Motoyama Е, Chin WW, Spindel ER,. Bilogy of Disease, Gastri-Releasing peptide (Mammalian BomЬesin) Gene Expression :n Health and Disease. Lab lnvest. 1988; 59: 5-24. 17. Tache У, Brown М . Оп the role of ЬomЬesin in homostasis. Trends Neurosci 1982; 5: 4З1-4ЗЗ. 18. Ghatei МА, Jung RT, Steven:>on СЈ , Hillyard Т. Adrian С, Lee УС, Christofides ND, Sarson DL,Mashiter К, Maclntyre 1, Bloom SR. BomЬesin action оп gut hormones and calcium in man. Ј Clin Endocrinol Metab 1982; 54: 980-985. 19. Bertaccini G, Erspamer V, M13lchiorri Р, Sopranzi N: Gastrin-release Ьу ЬomЬesin in the dog. Вг Ј Pharmacol 1974; 52: 219-225. 20. Deschodt-Lanckman М, RoЬI:>erecht Р, De Neef Р, Lammens Christope Ј: ln vitro action of ЬomЬesin-like peptides оп amylase secretion, calcium efflux, and adenylate cyclase activity in rat pancrease. Ј Clin lnvest 1976; 58: 891-898. 21 . Lehy Т, Puccio F, Chariot Ј, LaЬeille D. Stimulating effect of ЬomЬesin оп the growth of gastrointestinal tract and pancreas in suckling rats. Gastroenerology 1986; 90:1942-1949. 22. Rozengurt Е, Sinnett-Smith Ј . BomЬesin stimulation of DNA synthesis and cell division in cultures of Swiss ЗТЗ cells. Proc Natl Acad Sci USA 1983; 80:2936-2940. 2З. Narayan S, Guo J-S, Town:;end СМ, Singh Р . Specific Ьinding and growth effects of ЬomЬesin-related peptides оп mouse colon cancer cells in vitro. Cancer Res 1990; 50: 6772-6778. 24. Rozengurt Е . Еаг1у signals in the mitogenic response. Science 1986; 234: 161-166. 25. Zachary, 1. and Rozengurt Е . Autocrine growth factors and cancer. High-affinity receptors for peptides of the Ьombesin family in Swiss ЗТЗ cells. Ргос. Natl . Acad. Sci. USA, 82, 7616-7620; 1985. 26. Willey ЈС , Lechner JR, Harri:; се. BomЬesin and the C-terminal tetradecapeptide of gastrin-releasing peptide аге growth factors for normal human bronchial ephitelial cells. Ехр Cell Res . 1984; 153: 245-248. 101 • 1 27. Seglen РО, Skomedal Н , Saeter G, et al: neuroendrocrine dysdifferentiation and ЬomЬesin production in carcinogen- induced hepatocellular rat tumors. Carcinogenesis, 1989; 10: 21 -25. 28. Bologna М, Festiccia С, Muzi Р, Biordi L, Ciomei М: BomЬesin stimulates growth о! human prostatic cancer cells in vitro. Cancer 1989; 63: 171 4-1720. 29. Giacchetti S, Gauville С, De Cremoux Р , Ber1in L, Berhon Р , AЬita Ј- Р , Cuttitta F, Calvo F: Characterization, in some breast cancer cell lines, of gastrin- releasing peptide-like receptors which are aЬsent in normal breast epithelial cells. lnt. Ј . Cancer 1990; 46: 293-298. 30. Avis FP, Maneckjee А , Cuttitta F, Nakanishi У , Mulshine Ј , Avis 1: The role of gastrin releasing peptide in а pancreatic tumor cellline (CAPAN}. Proc. МСА, 1988; 29: 54. 31 . Moody ТW, Aussell ЕК . O'D•Jnohue TL, Linden CD, Gazdar AF. BomЬesin- like peptides in small cell lung cancer: Biochemical characterization and secretion from а cellline. Life Sci 1983; 32: 487-493. 32. Camey DN, Bunn РА , Gazdar AF, Pagan ЈА, Minna JD. Selective growth in serum-free hormone supplemented medium of tumor cells oЬtained Ьу Ьiopsy from patients with small cell carcinoma of the lung. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78:3185-3189. 33. Moody ТW, Per1 СВ, Gazdar 1\F, Camey DN, Minna JD: High levels of intracellular ЬomЬesin characrerize human small- celllung carcinoma. Scince 1981 ; 214: 1246-1248. 34. Carney DN, Cuttita F, Moody ТW, Minna JD. Selective stimulation of small celllung clonal cancer growth Ьу Ьombesin and gastrin releasing peptide. Cancer Aes 1987; 47: 821-825. 35. WeЬer S, Zuckerman ЈЕ , Bo~twich DG , Bensch KG, Sikic ВЈ . and Aaffin ТА. Gastrin-releasing peptide is а selective mitogen !ог small celllung carcinoma in vitro. Ј . Clin. lnvest. 1985; 75: 306-309. 36. Woll РЈ , Aozengur1 Е . (D-Arg 1, D-Phe7•9, Leu 11 }-suЬstance Р : а potent ЬomЬesin antagonist in murine Swiss ЗТЗ cells inhiЬitis the growth of human small-celllung cancer cells in vitro. Ргос Natl Acid Sci USA 1988; 85: 1859-1863. 37. Westendorf ЈМ, Schonbrunn А: Characterization of ЬomЬesin receptors in а rat pituitary cell line. Ј Biol Chem 1983; 258:7527-7535. 38. Jensen АТ, Moody Т, Per1 СР, Aivier ЈЕ, Gardner JD. lnteraction of ЬomЬiesin and litorin with specific membrane receptors on pancreatic acinar cells. Proc Natl Acid Sci USA 1978; 75: 6139-6143. 39. Scemama JL, Zahidi А, Fourmy D, Fagot-Aevurat Р, Vaysse N, Pradayrol L, AiЬet А~ lnteraction of (1251)-Try-4- ЬomЬesin with specific receptors on normal human pancreatic membrans. Aegul Peptide 1986; 13: 125-132. 40. Moody ТW, Camey DN, Cuttitta F, Quattrocchi К, Minna JD: High affinity receptors for ЬomЬesiniGAP- Iike peptides on human small celllung cancer. Life Sci 1985; 37: 105-11 З. 41 . Zachary 1, Aozengur1 Е . ldentification of а receptor for peptides of the ЬomЬesin family in Swiss ЗТЗ cells Ьу affinity cross-linking. Ј Biol Chem 1987; 262: 3947-3950. 42. Sinnett-Smith Ј, Zachary 1, Aozengur1 Е. Characterisation of а ЬomЬesin receptor оп Swiss mouse ЗТЗ cells Ьу affinity cross-linking. Ј Cell Biochem 1988; 38: 237-249. 43. Aozengur1, Е., BomЬesin stimulation of mitogenesis; Specific receptors, signal transduction, and early events. Am. Aev. Aespir. Dis.,1990, 14:S11-S15. 44. Nishizuka У. The molecular l1eterogeneity of protein kinase С and its implications for cellular regulation. Nature 1988; 334: 661-665. 45. Aozengur1 Е, Murray М, Zaclщry 1, Collins М. Protein kinase С activation enhances сАМР accumulation in Swiss ЗТЗ cells: inhiЬition Ьу per1ussis tcxin. Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84: 2282-2286. 46. Battey JF,Way ЈМ, Corjay МН , Shapira Н , Kusano К , Harkins А , Wu ЈМ , Slattery Т, Mann Е , Feldman Al . Molecular clonung of the ЬomЬesinlgastrin-releas iing peptide receptor from Swiss ЗТЗ cells. Ргос Natl Acid Sci USA 1991 ; 88: 359- 399. 47. von Schrenck Т, Wang LH, Соу DH, Villanueva ML, Mantey S, Jensen АТ. Potent ЬomЬesin receptor antagonist distnguish receptor subtypes. Am Ј Physiol1990; 259:G468-G473. 48. Jensen АТ, Jones SW, Folkers К, Gardner JD. А syntl1etic peptide that is а ЬomЬesin receptor antagonist. Nature 1984; 309: 61-63. 49. Bepler G, Zeymer U, Mahmoud S, Fiskum G, Palaszynski Е , Aotsch М, Willey Ј, Koros А , Cuttitta F, Moody ТW. Substance Р analogues function as ЬomЬesin receptor antagonists and inhibit small cell lung cancer clonal growth. Peptides 1989; 9:1367-1372. 50. Pappas JN, Hamel D, Dabas Н , Walsh Ј , Tashe У . Spantide: Failure to antagonize ЬomЬesin- induced stimulation of gastrin secretion in dogs. Peptides 1985; 6:1001-1003. 51 . Saeed ZA, Huang SC, Соу I)H Jiang NY, Heinz-Erian Р , Mantey S, Gardner JD, Jensen АТ. Effect of substitutions in position 12 of ЬomЬesin on antagonist activity. Peptides 1989; 10:597-603. 102 • 1 52. Heinz-Erian Р , Соу DH, Таmша М, Jones SW, Gardner JD, Jensen RT. (D-Phe12) ЬomЬes in analogues: а new class ЬomЬesin receptor antagonist. Am Ј Physiol 1987; 252:G439-G442. 53. Соу DH, Heinz-Erian Р , Jiang Ј , Sasaki У , Taylor Ј , Moreau ЈР , Wolfrey WТ, Gardner JD, Jensen RT. ProЬing peptide backЬone function in ЬomЬesin . А reduced peptide Ьond analogue with potent and specific receptor antagonist activity . Ј Biol Chem, 1988;263:5056-5060. 54. Соу DH, Taylor ЈЕ, Jiang N-Y Кim SH , Wang L-H, Huang S, Moreau ЈР, Gardner JD, Jensen RT. Short-chain pseudopeptide ЬomЬesin receptor antagonists with enhanced Ьinding affinities for pancreatic acinar and Swiss 3Т3 cells display strong nntimitotic activity . Ј Biol Chem 1989; 264:14691 -14697. 55. Saari WS, heimbrook DC, Friedman А , Fisher ТW, Oliff А. А gastrin-releasing peptide antagonist containing n (СН2О) amine Ьond surrogate. Biochem Biophys Res Com 1989; 165: 114-117. · 56. Wang, L.H., Соу, D.Н., Taylcr, Ј.Е . , Jiang, N.Y., Kim, S.H., Moreau, Ј . Р . , Huang, S.C., Mantey, SA, Frucht, Н . and Jensen, R.T. Desmethionine ttlkylamide ЬomЬesin analogues: а new class о! ЬomЬesin receptor antagonists with potent antisecretory in pancreatic acini and nntimitotic activity in Swiss 3Т3 cells Biochemistry, 29, 616-622; 1990. 57. Wang L-H, Соу DH, Taylor ЈЕ, Jiang N-Y, Moreau ЈР, Huang S-C, Frucht Н, Haffiar ВМ, Jensen RT, Des-met carЬoxyl­ terminalty modified analogues of ЬomЬesin function as potent ЬomЬesin receptor antagonists , partial agonists ог agonists. Ј Biol Chem 1990; 265: 15695-15703. 58. Heimbrook DC, Saarri WS, Bulishin NL, Friedman А, Moore KS, Reimen МW, Kiefer DM, RotЬerg NS, Wallen JW, Oliff А. CarЬoxyHerminnl modification of а gastrin releasing peptide derivative generates potent antagonists. Ј Biol Chem 1989; 264:11258-11262. 59. CamЬie R, Cotton R, Dutta AS, Gamer А, Hayward СР, Moore VE, Scholes РВ. N-isobutyryi-His-Trp-Aia-Vai-0-Aia-His- Leu-NHMe (ICI 21 6140) а potent in vivo antagonist analogue of ЬomЬesin/gastrin releasing peptide (BN/GRP) derived from the C-terminal sequence lacking the final methionine resudue. Life Sci 1989; 45:1521-1527. 60. Sasaki У. and Соу, D.H. Solid phase synthesis of peptides containing the CH2NH peptide Ьond isostere. Peptides, 8:119-121 ; 1987. 61 . Munson, Р.Ј. and RodЬard, D. Ligand: а versatile computerized approach for characterization of ligand- Ьinding systems. Annal. Biochem. 107:220-239, 1987 62. Bernfeld Р . Amylases а and р (1955) ln: Colowich SP, Kaplan NO. eds., Methods of Enzymology, Vol. 1, Academic Press, New York, рр. 149-158. 63. Соу HD, Jensen RT, Jiang NY, Lin ЈТ. Bogden АЕ, Moreau ЈР . Systematic Development of BomЬesin/Gastrin-Releasing Peptide Antagonists. Journal of the National Cancer lnstitute, Monographs No. 13, 1992. 64. Spatola, A.F. Peptide ЬасkЬопе modifications: А structure-activity analysis of peptides containing amide Ьond surrogates. ln : Chemistry and Biochemistry of amino acids, Peptides and Proteins, edited Ьу В. Weinstein. Basel: Marcel Dekker, lnc., 1983, рр. 267-357. 65. Sinnett-Smith Ј , Lehmann W, Rozengurt Е. BomЬesin receptor in membranes from Swiss 3Т3 cells: Ьinding characteristics, affinity laЬellirtg and modulation Ьу guanine nucleotides. Biochem Ј 1990; 265: 485-493. 66. Moody ТW, Bertness V. Camey DN. BomЬesin-like peptides and receptors in human tumor cell lines. Peptides, 1983; Vol. 4. 683-686. 67. Nelson Ј . Donnelty М, Walker В, Gray Ј , Shaw С, and Murphy R.F. BomЬesin stimulates proliferation of human breast cancer cells in culture. Br. J.Cancer, 1991 ; 63:933-936. 68. Vangsted А.Ј, Andersen E,1/,Nedergaard L.,and Zeuthen Ј . Gastrin realising pepide GRP (14-27) in human breast cancer cells and in small celllung cancer. Breast Cancer Res. Treat, 1991 ; 19:119-128. 69. Vangsted, А.Ј., and Schwartl, T.W. Production of gastrin-realisingpeptide- (18-27) and а staЬie fragment of its precursor in small celllung carcinoma cells. J.Ciin. Endocrinol. Metab. 1990; 70: 1586-1593. 70. Csemus V, Schally AV. Tt1e dispersed cell superfusion system. ln: Neuroendocrine Researh Methods, ed. B.D. Greenstein, Harwood Acadernic PuЬiishers GMBH, London (in press) . 71 . MulderG.H., SmelikO.G. Endocrinology,1977,199:1143-1152. 72. Pandol SJ, Jensen RT, Gardner JD. Ј . Biol. Chem, 1982; 257: 12024-12029. 73. McDonald Т Ј . and Fox ЈЕТ. Effects of parcine gastrin i п releasing peptide (GRP) on canine antral motility and gastrin release in vivo. Life Sci. 1984; 35: 1415-1422. 74. McDonald ТЈ , Ghatei МА, Bkюm SR, Adrian ТЕ, Mochizuki Т, Yanaihara С , Yanaihara N. Dose-response comparisons of canine plasma gastroenteropancreatic hormone responses to ЬomЬesin and the por·cine gastrin-releasin peptide. Regul Peptide 1983; 5: 125-137. 75. McDonald ТЈ, Houghton Р , Challis JRG, Hramiak IM. BomЬesin- like peptides in health and disease. ln: The effect of gastrin-releasing peptide on the endocrine pancreas. Ed. Tache У, Melchiorri Р, negri L. Annals of the New york Academy of Science 1988; 547: 242-254. 103 76. Pettersson М. and Ahren В . Gastrin-releasing peptide (GRP): Effects on Ьasal and stimulated insulin and glucagon secretion in the mouse. Peptides 1987; 8: 55-60. 77. Scarpignato С, Gioffre М, Gulin FM, and Micali В . Different effects of ЬomЬesin оп glucose and tolbutamide-induced insuline release in man. Вг. Ј . ?harmacol1988; 94: 1023-1028. 78. Wood, S.M., Jung, R.T., WeЬster, J.D., Ghatei, М.А., Adrian, Т. Е. , Yanaihara, N., Yanaihara, С. and Bloom, S.R. The effect of the mammalian neuropeptides, gastrin-releasing peptide (GRP), on gastrointestinal and pancreatic hormone secretion in man. Clin. Sci. (Lcnd) 65:365-371 ; 1983. 79. Greeley GH. and Thompson ЈС . lnsulinotropic and gastrin-releasing action of gastrin-releasing peptide (GRP). Regul. Pept. 8:97-103, 1984. 80. Mukai Н , Kaqwai К, Suzuki S, Ohmori Н , Yamashita К. and Munekata Е . [Aia6)gastrin-releasing peptide-10: an analogue with dissociated Ьiological acti•tities. Am. Ј . Physiology 258: (Endocrinol. MetaЬol . ) 1989; 20: Е235-Е240 . 81 . Panula РА, D. Cosenza-Murphy, НУТ Yang and Е. Costa. Binding of GRP(14-27) but not ЬomЬesin ог GRP (1-27) to hypothalamic magnocellular el~:~ments : an immunohistochemical study. Ј. Histochem. Cytochem. 1984; 32: 202-208. 82. Kabayama У . Kato У, Shimat~;u А, Ohta Н , yanaihara N. and lmura Н. lnhiЬition Ьу gastrin-releasing peptide on growth hormone (GH) secretion induced Ьу human pancreatic GH-releasing factor in rats . Endocrinology 1984; 115: 649-653. 83. Wakabayashi 1, Tonegawa У , ShiЬasaki Т , lhara Т, Hattor М. and Ling n. Effect of dopamine, ЬomЬesin and cysteamine hydrochloride on plasma grov.'lh hormone response to sinthetic growth hormone-releasing factor in rats. Life Sci. 1985; 36: 1437-1443. 84. Dickson RB. and Lippman МЕ : Estrogenic Regulation of Growth and Polypeptide Growth Factor Secretion in Human Breast Carcinoma. Endocrine Rev 1987; 8: 29-43. 85. OsЬome СК, Clemmons DR, Arteaga CL. Regulation of breast cancer growth Ьу insuline-like growth factors. Ј Steroid Biochem Molec Biol 1990; 37: 805-809. 86. Lippman МЕ, Dickson RB, Gelmann ЕР, Rosen N, КnаЬЬе С, Bates S, Bronzert D, Huff К, Kasid А. Growth regulation of human breast carcinoma occurs through regulated growth factor secretion. Ј Cell Biochem 1987; 35: 1-16. 87. Thompson EW, Martin МВ, Saceda М, Clarke R, Brunner N, Lippman МЕ, Dickson RB. Regulation of breast cancer cells Ьу hormones and growth factors: Effects on proliferation and basement membrane invasiveness. Horm Res 1989; 32: Suppl1 , 242-249. 88. Sainsbuгy JR, Needham GK, Famdon JR, Malcolm АЈ, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptor status as predictor of еаг1у recurrence of and death from breast cancer. Lancet 1987; 1: 1 398-1401 . 89. Koga М, Eisman ЈА, Suther1and RL. Regulation of epidermal growth factor receptor levels Ьу 1,25-Dihydroxyvitamin о3 in human breast cancer cells. Cancer Res 1988; 48: 2734-2739. 90. Kosano Н, Takatani О. Reduction of epidermal growth factor Ьinding in human breast cancer cell lines Ьу an alkyl- lysophospholipid. Cancer Res 1988; 48: 6033-6036. 91 . Santen RJ, Manni А, Harvey Н , et al: Endocrine treatment of breast cancer in women. Endocr. Rev, 1990; 11:221-265. 92. Fekete М, Witliff JL, Schally ЛV :Characteristics and distribution of receptors for (D-Trp6)- luteinizing hormone-гealising hormone, somatostatin, epidermal growth factor, and sex steroides in 500 Ьiopsy samples of human breast cancer. Ј Clin Lab Anal, 1989; 3:137-147. 93. Nicholson S, Sainsbury JR Halcrow P,et al: Expression of epidermal growth factor receptors associated with lack of response to endocrine theraphy in recurrent breast cancer. Lancet, 1989; 1 :182-185. 94. Jahnnke GD, Lazarus LH: А tomЬesin imunoreactive peptide in milk. Proc Natl Acad Sci U S А, 1984; 81: 578-582. 95. Ekman R, lvarsson S, Jansscn L: BomЬesin,neurotensin, and pro-gamma-melanotropin immunoreactants in human milk. Regul Pept, 1985; 1 о : 99- 105. 96. Gaudino G, De Bortoli М, Lazarus LH: А ЬomЬesin-related pepide in exterminal mammaгy tumors in rats. Ann N У Acad Sci, 1986; 464:450-453. 97. Patel KV, Schrey МР: Activг.tion of inositol phospholipid signaling and Са2+ efflux in human breast cancer cells Ьу ЬomЬesin . Cancer Res, 1990; 50:235-239. 98. Kurachi Н , Okamoto SH, Oka Т: Evidence for the submandibular gland epidermal growth factor in mouse mammaгy tumorigenesis Proc Natl Acad Sci U S А, 1985; 82:5940-5943. 99. Ennis BW, Valverius ЕМ, Bates SE, et al: Anti-epidermal growth factor receptor antiЬodies inhiЬit the autocrine- stimulated growth of MDA-468 human breast cancer cells. Mol Endocrinol, 1989; 3:1830-1838. 100. Arteaga CL, OsЬome СК : Growth i nhiЬition of human breast cancer cells in vitro with an antiЬody against the type 1 somatomedin receptor. Cancer Res, 1989; 49:6237-6214. 101 . Poston GJ, Gillespie Ј . and Guillou РЈ . The Ьiology of pancreatic cancer. Gut, 1991 ; 32: 800-812. 104 102. Deschodt· Laпckmaп М., Robborecht Р . , DeNeef Р ., Lammeпs М . апd Christophe Ј .: lп vitro actioп of ЬоmЬеsiп апd ЬomЬesiп·like peptides оп amylase secretioп, calcium efflux, апd adeпylate cyclase activity iп the rat paпcreas . А comparisoп with other sevcretagogues. Ј. Cliп . lпvest, 1976; 58: 891·898. 103. Douglas BAk, Woutersoп Ад, Јапsеп ЈВМ, de Јопg AJL, Rovati LC апd Lamers CBHW. lпflueпce of cholecystokiпiп aпtagoпist оп the effects of cholecystokiпiп and ЬomЬesin on azaserine induced \esions on rat pancreas. Gastroenterology. 1989; 96: 462·469. 104. Avis FP, Мапесkјее А , Cuttitta F, Nakanishi У, Mulshine Ј . and Avis 1: The role of gastrin releasing peptide in а paпcreatic tumor cellline (CAPAN). Proc. Am. Assoc. Cancer Aes. 1988; 29: 54. 105. Singh Р ., Draviam Е., Guo Y·S., and Kurosky А. : Molecular characterization of ЬomЬesin receptors on rat pancreatic aciпar AR42J cells. Am. Ј . Physiol., 1990; G803-G809. 106. Alexander, А. W., Upp, Ј . R. Jr., Poston, G. Ј . , Townsend, С . М . Jr., Singh, Р . , and Thompson, Ј . С ., BomЬesin inhibits growth of human pancreatic ade.пocarciпoma iп nude mice. Pancreas, 1988, 3:297·302. 107. Ноеhп W, Schroeder FH, Riemann JF, JoeЬsis АС , hermanek Р : Human prostatic adeпocarcinoma: Some characteristics of а serially tran$plantaЫe line in nude mice (РС·82) . The Prostate 1 980; 1: 95-104. 108. Van Steenbrugge GJ, Groen М, Romijn ЈС and Schroeder F. Biologica\ effects of hormonal treatment regimens on а transplantaЫe humaп prostate tumor line (РС·82) . Ј . Urol 1984; 131 : 812·817. 109. Wright GL, haley CL, Caspo Z, Van Steeпbrugge GJ: lmmuпohistochemical evaluatioп of the expressioп of prostate tumor-associatioп markers iп ПIJde mouse humaп prostate carciпoma heterotraпsplaпted liпes РС·82, PC·EW, апd РС· EG . Prostate 1991; 17: 301·316. 110. Cannolly ЈМ, Rose DP. Secret.on of epidermal growth factor and related polypeptides Ьу the DU 145 human prostate cancercellliпe. The Prostate 1989; 15: 177·186. 111 . Cannolly ЈМ, Aose DP. Autocriпe regulation of DU145 human prostate cancer cel\ growth Ьу epidermal growth factor· related polypeptides. The Prostate, 1991; 19: 173-180. 112. Stoscheck СМ, King LE Jr. Rolo of epidermal growth factor iп carcinogenesis . Cancer Res, 1 986; 46: 1 030·1 037. 113. Beart, Jr., R.W., Colon, Rectum, апd Aпus . Сапсеr, 1990, ЗЗЗ:684·688. 114. Fraumeni, J.F., Lloyd, J.W., Smith, Е.М. , and Wagoпer, Ј.К., Cancer mortality among nuпs : role of marital status iп etiology of neoplastic disease iп womeп . Ј. Natl. Cancer. lnst.,1969, 42:451 ·456. 115. Weiss, N.S., Dalliпg, Ј . А . , and Chow, W.H., lncidence of сапсеr of thr large Ьowel in women in relation to reproductive and hormoпal factors. Ј. Natl. Сапсеr lпst., 1981. 67:57·60. 116. Alford, Т.С ., Do, Н.·М., GeelhOEtd, G.W., Tsaпgaris, N.T., апd Lippmaп , М.Е ., Steroid hormoпe receptors iп humaп соlоп caпcers . Сапсеr, 1979, 43:980·984. 117. Moon, А .С., апd Fricks, С .М . , lпf\uence of gonadal hormones and age on 1 ,2·demethylhydrazine-induced colon carcinogenesis . Cancer, 1977, ·Ю :2502·2508. 118. Smith, J.L., ang Solomon, Т . Е., Effects of gastriп, proglumide, апd somatostatiп оп growth of human colon cancer. Gastroenterology, 1988,95:1541-1548. 119. Tahara, Е ., Growth factors апd опсоgепеs iп humaп gastrointestiпal carciпomas. Ј. Сапсеr Res. Clin. Опсоl ., 1990, 116:121-131 . 120. Watson, S.A., Durraпt, L.G ., a11d Morris, D.L., Gastrin: growth епhапсiпg effects on human gastric and coloпic tumour cells. Br. Ј . Cancer, 1989, 59:554·558. 121 . Culouscou, Ј.·М., Remacle·Boпnet, М., Garroste, F., Marvaldi, Ј., and Pommier, G., Simultaneou production of IGF·I апd EGF competiпg growth factor b:t НТ-29 human со\оп cancer cel\line. lnt. Ј. Cancer, 1987, 40:646-652. 122. Frucht, Н., Gazdar, А. , апd Jensen, R.T., Human соlоп сапсеr cell liпe NCI·H716 expresses functional Ьombesin receptors. Abstr. No. 281 . Proc. Am. Assoc. for Cancer Aes .. 1991, 32:47. 123. Radulovic S, Cai RZ, Milovanovic S, Scha\ly AV. The binding of ЬomЬesin апd Somatostatin and their analogs to humaп colon caпcers. Proc Soc Exper Biol Med.in Press, 1991 . 124. Fidler, А., The biology of human colon carcinoma metastasis . ASCO, 27th Annua\ Meetiпg, Houston, ТХ , 1991 , рр. 57· 61. . 125. Aosner МА: Regulation of the вpidermal growth factor receptor Ьу growth·modulating agenst. Biotechnol Appl Biochem, 1990; 12:473·477. 126. Ewing ТМ. Murphy LJ, Ng M·L, Pang GYN, Lee ChSL, Watts CKW, Sutherland RL: Regulation of epidermal growt factor receptor Ьу progestins апd glucocorticoids in human breast cancer cellliпes . lnt Ј Cancer 1989; 44: 7 44· 752. 127. Bertics РЈ , WeЬer W, Cochet С, et al: Aegulation of the epidermal growth factor receptor Ьу phosphorylation. Ј Cell Biochem, 1985; 29:195-208. 105 128. Gill GN, Bartics РЈ, Santon ЈВ : Epidermal growth factorand its receptor. Moll Cell Endocrinol, 1987; 51 :169-186. 129. Friedman ВА, Rosner MR: Grovlth factors modify the epidermal growth factors receptor trought multiple pathways. Ј Cell Biochem, 1987;34:1-11 . 130. Waterfield МО : Epidermal growth factor and related molecules. Lancet, 1989; 1:1243-1246. 131. Lund КА, Lazar CS, Chen WS et all: Phosphorylation о! the epidermal growth factor receptor at threonine 654 inhibits ligand-induced internalization ar1d down-regulation. Ј Biol Chem, 1990; 265:20517-20523. 132. Welch ЈВ, Gill GN, Rosenfild MG, et al: А negative feedЬack loop attenuates EGF-induced morphological changes. Ј . Cell Biol, 1992; 114:533-543. 133. Zachary 1, Sinnett-Smith JW, Rozengurt Е : Early events elicited Ьу ЬomЬesin an structurally reiated peptides in quiscent Swis 3Т3 cells. 1. Activation of protein kinase С and inhibition of epidermal growth factor binding. Ј Cell Biol, 1986; 102:2211-2222. 134. Eldar Н, Zisman У, Ullrich А, et al: Overexpression о! protein kinase С alpha-suЫype in Swiss/3T3 fibroЫasts causes loss о! Ьoth high and low affinity receptor numЬers !ог epidermal growth factor. Ј . Biol Chem, 1990; 256:13290-13296. 135. Zachary 1, Rozengurt Е: Modulation о! the epidermal growth factor receptor Ьу mitogenic ligands. Effects о! ЬomЬesin and role of protein kinase С. Cancer Surv, 1985; 4:729-765. 106 Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-а Синиша С. Радуловић Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Pretkliпicka farmakologi ja antagonista bombezina • резултат сопственог истраживач ког рада , • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа , • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис У Београду , __ 10.12.2013. _____ _ Прилог З. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку "Светозар Марковић" да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под Pretk!inicka farmakologiia antagonista bombezina која је моје ауторска дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство- некомерцијалне З . Ауторство- некомерцијалне- без прераде 4. Ауторство- некомерцијалне- делити под истим условима 5. Ауторство- без прераде 6. Ауторство- делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). У Београду , _10.12.2013. ________ _