1НАУЧНОМ ВЕЋУ МЕДИЦИНСКОГ ФАКУЛТЕТА
УНИВЕРЗИТЕТА У БЕОГРАДУ
На седници Научног већа Медицинског факултета Универзитета у Београду,
одржаног дана 03.11.2014. године, број 4600/11, именована је комисија за оцену
завршне докторске дисертације под насловом:
“ Псеудохипоксија у карциномима бубрега”
Кандидата мр др Бојане Б Белеслин Чокић, запослене у Генетској лабораторији на
Клиници за ендокринологију, дијабетес и болести метаболизма, Клиничког Центра
Србије. Ментор је Проф. др Светозар Дамјановић.
Комисија за оцену завршне докторске дисертације именована је у саставу:
1. Проф. др Цане Тулић, професор Медицинског факултета Универзитета у
Београду
2. Проф. др Јасмина Марковић Липковски,  професор Медицинског факултета
Универзитета у Београду
3. Проф. др Гордана Матић. професор Биолошког факултета у Београду
На основу анализе приложене докторке дисертације, комисија за оцену завршене
докторске дисертације једногласно подноси Научном већу Медицинског факултета
следећи:
ИЗВЕШТАЈ
А) Приказ садржаја докторске дисертације
Докторска дисертација мр сци Бојане Б. Белеслин Чокић написана је на 83
страна и подељена је на следећа поглавља: увод, циљеви рада, материјали и методе,
резултати, дискусија, закључци и литература. У дисертацији се налази укупно 16 слика
и 5 табела.  Докторска дисертација садржи сажетак на српском и енглеском језику,
биографију кандидата, податке о комисији и списак скраћеница коришћених у тексту.
2У Уводу је дефинисана класификација реналних тумора бубрега (RCC) на
основу важећих хистопатолошких критеријума и генетских карактеристика. Објашњена
је улога хипоксија индуцибилних фактора (HIFα) и гена које ови фактори индукују као
њихов значај у прогресији карцинома бубрега. Посебно место је дато према садашњем
схватању онкогенезе ових тумора еритропоетину (EPO), његовом рецептору (EPOR),
васкуларном фактору раста из ендотелијума (VEGF) и његовим рецепторима типа 1 и 2.
Експресија ових молекула је анализирна у докторској дисертацији и увод представља
извор информација који је битан за разумевање резултата докторске дисертације.
Циљеви рада су прецизно дефинисани. Испитиван је ефекат мутација у Von
Hippel-Lindau тумор супресорском гену (VHL) на експресију HIF-1α, пролил
хидроксилазе (PHD) тип 1 и 2, ЕРО, VEGF-а и њихових рецептора, протеинa топлотног
стреса 90 (Hsp90), митоген активирајуће протеин киназе (MAPK), фосфатидил-
инозитол 3 киназе (PI-3/Akt) и „Janus kinazе 2” и “Signal Transducer and Activator of
Transcription 5” (JAK2-STAT5) протена у узорцима спорадичних тумора бубрега и
здравог ткива. Обзиром на ефекте еритропоетина на ангиогенезу уопште, као сурогат
ефекта хипоксије на туморску ангиогенезу, анализира се и ефекат ЕРО на ендотелне
ћелије у условима нормоксије и хипоксије на активацију релевантних сигналних
путева.
У поглављу Материјали и методе наведено је да су целокупни
експериментални део обраде и припреме узорака тумора и здравог ткива за докторску
дисертацију урађени у генетској лабораторији, клинике за ендокринологију, дијабетес и
болести метаболизма, Клиничког центар Србије (КЦС). Сакупљање узорака тумора и
здравог ткива је урађено у сарадњи са клиником за урологију, Клиничког центра Србије
уз сагласност Етичког комитета. Експериментални део гајења ендотелних ћелијских
линија у нормалним и хипоксичним условима је урађен у Националном  Институту за
дијабетес, дигестивне болести и болести бубрега, Секцији за молекуларну биологију
ћелија при Националним институтима за здравље (NIDDK, Nationl Institutes of Helath,
NIH) у Бетезди, САД.
Детаљно је описана методологија изолације ДНК из крви, туморског и здравог
ткива као и метода секвенцирања свих узорака. Наведен је начин прикупљања узорака,
туморског и здравог ткива за РНК изолацију, ДНК третман, кДНК синтезу и генску
3експресију одређених гена путем Real time PCR методе. Такође је описана метода
изолације протеина и протеинска експресија у туморском и околном здравом ткиву.
Описан је начин гајења ендотелних ћелија у нормалним и хипоксичним
условима, наведена је метода изолације РНК и Real time PCR као и начин изолације и
мерења протеинске експресије ЕРОR, и сигналних протеина, MAPK и PI-3/Aкт, у
ендотелним ћелијама.
У поглављу Резултати детаљно и јасно су приказани и представљени сви
добијени резултати. У резултатима има 16 слика и 5 табела. Постоји значајна разлика у
екпресији VEGF иРНК, PHD1, PHD2 и MAPK између контролног здравог и туморског
ткива. За ове молекуле су дати и регресиони модели који их на специфичан начин
повезују у функцији присуства/одсуства мутација у VHL гену. Потпуно су нови подаци
о односу VEGF иРНК и ЕРО протеина у здравом ткиву који се иначе не могу
детектовати у туморском ткиву.
Дискусија је написана јасно и прегледно, уз приказ и поређење сопствених
резултата са подацима других истаживача. Обајшњени су ефекти мутација у VHL гену у
туморима бубрега и урађена је дисекција пролиферативних путева код тумора са и без
мутације. МАРК киназна акитвност је повећана, с тим што у овој активности вероватно
партиципира и адитивни ефекат VEGF-а, који је индукован туморском хипоксијом.
Такође су објашњени могући механизми стабилизације HIF-1α у туморском ткиву као и
могући механизми метаболичке адаптације туморског ткива у функцији мутација у
VHL гену, посебно у односу на појачану експресију PHD2.
Појашњени су и поређени ефекти ЕРО на ендотелне ћелије у условима
хипоксије и нормоксије на ЕPOR као и сигнални путеви преко преко којих ЕРО
остварује своје дејство.
Закључци укратко приказују најважније податке који су проистекли из
резултата рада. Коришћена литература садржи списак од 174 референци.
Б) Кратак опис постигнутих резултата
Ово истраживање је показало да су у туморском ткиву активирани различити
сигнални путеви у завиности од функционалног статуса VHL гена. У 58% узорака
4туморског ткива детектоване су соматске мутације у VHL гену. Иначе код свих
пацијената је искључено постојање герминалних мутација у конститутивној ДНК. У
нормалним условима убиквитинација HIF-1 протеина зависи од VHL протеина. У
туморском ткиву ова веза не постоји због реалне хипоксије, тако да фунционални стаус
VHL гена не утиче на експресију HIF-1α како на нивоу иРНК тако и на нивоу протеина.
С друге стране, активност пролил хидроксилаза, PHD1 и PHD2 које су одговорне
за хидроксилацију и убиквитинацију HIF-1α, је инверзно регулисана, PHD1 експресија
је смањена а PHD2 је повећана, посебно у туморима са мутираним VHL геном.
Експресија хипоксијом активираних гена, VEGF-а нарочито у туморима са мутацијом и
EPO, детектована је у 23/50 узорака, то указује на хипоксија-зависну регулацију за коју
је вероватно одговоран HIF-2, а не HIF1, и то потпуно независно од функционалног
стауса VHL гена.
Испитивани су пролиферативни путеви који могу бити одговорни за раст
тумора, а то су MAPK и PI-3/Акт пут. Јасно смо показали да је MAPK пут доминантано
активан у туморима бубрега, независно од присуства мутације у VHL гену. Активност
PI-3/Акт пута се не разликује између туморског и околног здравог ткива. Због повећане
експресије ЕРО у извесним узорцима тумора бубрега, испитивана је експресија и ЕРОR
и сигналног пута JAK2-STAT5 пута који настаје након стимулације рецептора и није
нађена повећана активност.
Коришћен је модел ендотелних ћелија за анализу понашања крвних судова у
условима хипоксије, имитирајући услове у туморском ткиву. Еритропоетин, активира
еритропоетински рецептор, али и његову транскрипцију у условима снижене
концентрације кисеоника. У ендотелним ћелијама за разлику од туморског ткива, ЕРО
преко свог рецептора активира PI3/Акт и МАРК сигналне путеве у условима хипоксије
и нормоксије.
Ц) Упоредна анализа докторске дисертације са резултатима из литературе
И наши резултати указују да је инактивација VHL гена битна за иницијацију
светлоћелијског тумора бубрега. Међутим досадашњи литературни подаци се углавном
темеље на in vitro резултатима добијеним у различитим ћелијским линијама, и ови
резултати се могу односити само на иницијацију тумора. Mали број радова указује на
више фокуса тумора са мутацијом и инактивацијом VHL гена у туморском ткиву
5(Clifford S et al.,1998)). И ми смо показали да велики проценат светлоћелијских тумора
(60%) има стечену соматску мутацију у VHL гена и ово је у 90% случајева праћено
биалелом инактивацијом (Kondo K et al., 2002., Banks RE, et al., 2006.; Young A et al.,
2009.).
Молекуларна онкогенеза код тумора са мутацијом и без мутације се значајно
разликују. Новина је у томе да смо показали да код клинички манифестног тумора
присуство мутације у тумору утиче на избор механизама прогресије тумора али не и на
стабилизацију HIF-α и о овоме нема литературних података. Постоји само податак о
карактеристикама тумора са инактивацијом VHL гена и без HIF-1α (Gordan et al. 2008.).
Такође смо показали да да у туморском ткиву долази до активације МАРК пута
независно од мутације у VHL гену, што су показали и други аутори (Huang D, et al.
2008.). Није јасно да ли је ово само последица активације VEGF-а u туморској
хипоксији, што је у складу са литературним подацима (Zhang Y, et al. 2010.) или je то
збирни ефект са другим пролиферативним путевима који укључују и НIF-2α/c-Myc пут
(Shen C, Kaelin W, 2013).
У великој већини тумора постоји повећана експресија ЕРО који се може
повезати са активацијом МАРК пута обзиром да је ово доказано у ендотелним
ћелијама. Како ЕРО може да има и системски ефекат, МАРК пут би могао да буде
медијатор биолошког ефекта и у ендотелним ћелијама, што смо и показали (Beleslin
Cokic B et al. 2011; Beleslin Cokic B et al. 2014). Наиме у ендотелним ћелијским
линијама ЕРО у нормоксичним и хипоксичним условима доводи до стимулације МАРК
и PI-3/Akt пута.
Д) Објављени радови који чине део докторске дисертације
1. Beleslin Cokic B, Cokic VP, Suresh S, Wirt S, Noguchi CT. Nitric oxide and
hypoxia stimulate erythropoietin receptor via MAPK kinase in endothelial cells.
Microvascular Research 2014; 92: 34-40.
2. Beleslin-Čokić BB, Cokić VP, Wang L, Piknova B, Teng R, Schechter AN,
Noguchi CT. Erythropoietin and hypoxia increase erythropoietin receptor and nitric oxide
levels in lung microvascular endothelial cells. Cytokine 2011; 54: 129-135.
6Е) Закључак (образложење научног доприноса)
Докторска дисертација под називом “Псеудохипоксија у карциномима бубрега”
др Бојане Белеслин Чокић представља оригинални научни допринос у разумевању
механизама који учествују у развоју тумора бубрега и крвних судова у условима
хипоксије. Овим истраживањима дат је допринос у расветљавању механизама
регулације гена и сигналних путева који учествују у промоцији карцинома бубрега и
пролиферације ендотелних ћелија. Неки од резултата овог истраживања су потпуно
нови могу да допринесу проналажењу ефективније терапијe у лечењу пацијената са
RCC-ом.
Ова докторска дисертација је урађена по свим принципима научног
истраживања. Циљеви су били прецизно дефинисани, научни приступ је био
оригиналан и пажљиво изабран, а методологија рада је била савремена. Резултати су
прегледно и систематично приказани и дискутовани, а из њих су изведени одговарајући
закључци.
На основу свега изведеног и имајући у виду досадашњи научни рад кандидата,
комисија предлаже Научном већу Медицинског факултета Универзитета у Београду да
прихвати докторску дисертацију др Бојане Белеслин Чокић и одобри њену јавну
одбрану титуле доктора медицине.
У Београду, 05.12.2014.
Чланови Комисије: Ментор:
Проф. др Цане Тулић Проф. др Светозар Дамјановић
Проф. др Јасмина Марковић Липковки
Проф. др Гордана Матић