UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Bojana G. Banović Molekularna osnova auto-inkompatibilnog sistema heljde (Fagopyrum esculentum Moench) doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Bojana G. Banović Molecular basis of self-incompatibility system in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) PhD Thesis Belgrade, 2013 Mentori: viši naučni saradnik dr Jovanka Miljuš-Đukić Univerzitet u Beogradu Institut za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo redovni profesor dr Svetlana Radović Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Član komisije: redovni profesor, naučni savetnik dr Gordana Matić Univerzitet u Beogradu Institut za biološka istraživanja "Siniša Stanković" Datum odbrane: 30.09.2013. Eksperimentalni deo ove disertacije urađen je u Laboratoriji za molekularnu biologiju biljaka, Instituta za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo i u Laboratoriji za molekularnu biologiju, Instituta za biološka istraživanja "Siniša Stanković", Univerziteta u Beogradu dr Jovanki Miljuš-Đukić se zahvaljujem na stručnim savetima i pomoći u izradi ove disertacije, a pre svega na neposustajanju pred preprekama i na njenom vedrom duhu dr Svetlani Radović se zahvaljujem na tome što se uz brojne druge obaveze prihvatila i obaveze komentorstva u izradi ove disertacije i na svesrdnoj pomoći u uobličavanju ove teze dr Vesni Maksimović se zahvaljujem na tome što me je srdačno primila u Lab 08 još kao diplomca, a zatim mi omogućila i izradu ove disertacije i njeno dovršavanje, uprkos promeni orijentacije Laboratorije u odabiru dalje istraživačke problematike dr Miroslavu Konstantinoviću hvala na pomoći i strpljenju za sva poravnanja sekvenci i dizajniranje prajmera koja je radio za mene u mojim početničkim danima u Labu 08 dr Jeleni Samardžić hvala što je sa puno razumevanja i predusretljivosti omogućila dovršavanje ove teze dr Gordani Matić hvala na tome što mi je omogućila korišćenje opreme za proteomiku u IBISSu, kao i na tome što se prihvatila obaveze članstva u komisiji za odbranu teze dr Goranu Poznanoviću hvala na pruženom znanju iz proteomike, kao i na tome što mi je omogućio da deo svoje teze uradim u Laboratoriji za molekularnu biologiju IBISSa dr Svetlani Dinić veliko hvala na pruženom znanju, savetima i pomoći u savladavanju osnova proteomike, kako u teoriji, tako i u praksi svim kolegama u Labu 08 hvala na korisnim savetima i pomoći u eksperimentalnom radu Džu, Žiks i Joko, vama posebno hvala na tome što radne dane uvek bojimo smehom mojoj porodici, prijateljima i S., jednostavno - Hvala vam... Molekularna osnova auto-inkompatibilnog sistema heljde (Fagopyrum esculentum Moench) REZIME Heljda (fam. Polygonaceae) je heteromorfna biljna vrsta koja sadrži cvetove dve morfologije: "pin" (dugačak stubić tučka, kratke antere, manja polenova zrna) i "tram" (kratak stubić tučka, dugačke antere, veća polenova zrna). Oplođenje je dozvoljeno samo između cvetova različite morfologije, dok je sprečeno između cvetova iste morfologije delovanjem sistema auto-inkompatibilnosti (AI), koji ne dozvoljava ukrštanje u srodstvu. Heljda se zbog svojih dobrih nutritivnih osobina gaji širom sveta, a osnovni problem u njenom uzgajanju predstavljaju nizak i nepouzdan prinos i visoka otpornost na introgresiju novih osobina iz srodnih vrsta, što su direktne posledice njene AI. Ovakvo delovanje AI sistema može predstavljati prepreku u uzgajanju i oplemenjivanju poljoprivredno značajnih vrsta (npr. badem, heljda, itd.), odatle i veliki interes za proučavanje ovih sistema. Kroz njihovo upoznavanje može se omogućiti proizvodnja samooplodnih i hibridnih linija željenih svojstava, kao i razvijanje novih markera, pomoću kojih se ubrzava proces selekcije, što bi dovelo do povećanja prinosa uz snižavanje troškova gajenja. Ono što je poznato o heljdinom AI odgovoru jeste da predstavlja genetički determinisanu kaskadu biohemijskih reakcija, koja dovodi do zaustavljanja rasta polenove cevi ako je polen prepoznat kao sopstveni. Rast sopstvene polenove cevi se zaustavlja na spoju žiga i stubića "tram" tučka, odnosno na 2/3 dužine stubića "pin" tučka. Ova reakcija je pod kontrolom S- supergena, koji pored AI gena sadrži i gene koji određuju dužinu stubića tučka, visinu antera i veličinu polenovog zrna, koji se zajedno vezano nasleđuju. Između alela AI gena postoji dominantno-recesivan odnos, u kom su "pin" biljke recesivni homozigoti za AI gen, ss, dok su "tram" biljke dominantni heterozigoti, Ss. Pošto se pri oplođenju "tram" polen ponaša u skladu sa diploidnim genotipom roditeljske biljke, a ne sopstvenim haploidnim genotipom, zaključeno je da kod heljde postoji sporofitna determinacija AI. Poslednjih godina razvijeni su molekularni markeri za fino mapiranje S-lokusa heljde, a sekvenciran je i transkriptom cveta heljde, što omogućuje detekciju novih S-sekvenci. Identifikovan je i prvi kandidat gena S-lokusa heljde, gen S-ELF3, koji najverovatnije određuje "tram" fenotip tučka. Cilj ovog istraživanja bio je ispitivanje molekularne osnove AI odgovora heljde na dva nezavisna načina: metodom polimeraznog lančanog umnožavanja uz upotrebu prajmera karakterističnih za sekvencu blisku S-lokusu, odnosno prajmera specifičnih za AI gene Prunus i Brassica (čija fiziologija AI odgovora podseća na AI odgovor dva morfa heljde) i metodom 2D-PAGE za razdvajanja ukupnih proteina polena, neoprašenih i inkompatibilno/kompatibilno oprašenih tučkova oba morfa. Na ovaj način dobijeno je 14 novih genomskih sekvenci bliskih S-lokusu heljde, a analiza njihovih otvorenih okvira čitanja ukazala je na postojanje homologije sa proteinima uključenim u signalnu transdukciju i regulaciju transkripcije. Pokazano je da u genomu heljde nema gena homolognih S-RNaznim i SFB genima (AI geni roda Prunus), kao ni SRK, SLG i SP11 genima (AI geni roda Brassica), ali da postoji homolog MLPKf2 genu Brassica. Ovaj gen kodira M-lokus vezanu protein kinazu izoforme 2, koja je pozitivni medijator signala u AI ogovoru kupusa. Izvedena aminokiselinska sekvenca MLPKFe heljde pokazala je 80% homologije sa MLPKf2 Brassica. Grupa miristilovanih protein kinaza C (npr. za membranu vezne Ca2+/kalmodulin-zavisne protein kinaze) nema ulogu u AI odgovoru heljde, što je utvrđeno primenom inhibitora ovih kinaza. 2D-PAGE analizom detektovano je preko 200 reproducibilnih proteina po uzorku i uočena je visoka sličnost sastava proteoma među uzorcima, što ukazuje da najveći relativni udeo u proteomima svih uzoraka imaju proteini opšte uloge u polen-tučak interakciji. Detektovano je preko 100 proteina različitih među uzorcima, od kojih je 21 morf-specifično ili specifično za AI odgovor. Istraživanje bi trebalo nastaviti kroz identifikaciju/sekvenciranje detektovanih specifičnih proteina i kroz dalje sekvenciranje regiona bliskog S-lokusu, pomoću prajmera dizajniranih iz novih 14 S- sekvenci, kao i prajmera dizajniranih na osnovu dobijenih proteinskih sekvenci. Ključne reči: heljda, auto-inkompatibilnost, S-lokus, S-gen, S-alel, oplemenjivanje, pin, tram. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Molekularna biologija biljaka UDK broj: [577.21:581.162]:633.12 (043.3) Molecular basis of self-incompatibility system in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) ABSTRACT Buckwheat (fam. Polygonaceae) is heteromorphic species with two flower morphs: "pin" (long style, short anthers, and smaller pollen grains) and "thrum" (short style, long anthers, and larger pollen grains). Fertilization is allowed only between flowers of different morphology, while it is prevented between flowers of the same morphology, trough self- incompatibility (SI) system, which prevents inbreeding. Buckwheat is grown worldwide due to its good nutritive characteristics, but the main issue in its breeding is low and uncertain yield and high resistance of buckwheat to introgression of new characteristics from related wild species, all of which are direct cosequences of buckwheat's SI. These effects of SI systems may present obstacles in breeding of agriculturally important species (i.e. almond, buckwheat, etc.), hence the interest in SI system studies. The aim of SI systems studies is to provide self-fertile and hybrid lines of desired characteristics, as well as to provide new markers for marker-assisted selections, all of which would improve the yield, while lowering the costs of breeding. Current understanding of buckwheat SI system considers SI response as genetically determined cascade of biochemical reactions that lead to pollen tube arrest when pollen has been recognized as self. The site of self-pollen tube arrest is different in two morphs: in "thrum" morph it occurs at the stigma-style junction, while in "pin" it takes place at 2/3 of style’s length. This reaction is under the control of the S-supergene which comprises SI genes and closely linked genes that determine style’s length, anthers’ height and pollen grain size, inherited as a single unit. Between SI alleles there is a dominant-recessive relationship, in which “pin” plants act as recessive homozygotes, ss, while “thrum” plants act as dominant heterozygotes, Ss. Since “thrum” pollen behaves in accordance with a diploid genotype of its parental plant and not its own haploid genotype, it was concluded that SI in buckwheat is sporophytically determined. Recently, molecular markers for fine mapping of S-locus were developed, and flower transcriptome was sequenced, which enables detection of new S-sequences. First buckwheat S-gene was identified as S-ELF3 gene, which is the most probable candidate for the "thrum" pistil phenotype determinant. The aim of this research was to analyze molecular basis of buckwheat’s SI response in two independent ways: trough PCR by using primers specific for S-linked region and primers specific for SI genes of Prunus and Brassica (species in which SI response resembles SI response observed in two buckwheat morphs) as well as trough 2D-PAGE separation of total protein extracts isolated from pollen, unpollinated, self- and cross-pollinated pistils of both morphs. In this way 14 new genomic sequences, closely linked to S-locus, were obtained and open reading frame analysis suggested their homology to proteins involved in signal transduction and transcription regulation. No genes homologous to S-RNase and SFB genes (SI genes in Prunus) or to SRK, SLG and SP11 genes (SI genes in Brassica) were found in buckwheat genome, but a gene homologous to Brassica’s MLPKf2 was found. It codes for M-locus protein kinase isoform 2 involved in Brassica’s SI response as a positive mediator of SI signal. MLPKFe showed 80% homology with Brassica’s MLPKf2 at deduced amino acid sequence level. Test involving inhibitor of myristoylated protein kinases C showed these kinases (i.e. Ca2+/calmoduline-dependant protein kinase) have no role in buckwheat’s SI response. 2D-PAGE proteome analysis revealed over 200 reproducible proteins in each sample and high overall similarity of proteome composition between samples, suggesting most proteins are shared in all samples and have general roles in pollen-pistil interactions. Over 100 proteins were found to be different between samples. Among them 21 were found to be specific to the particular morph or its SI response. This research should be continued trough identification/sequencing of these specific proteins and also trough further sequencing of S-locus linked region by using primers designed form 14 new S-sequences as well as primers designed according to obtained specific protein sequences. Key words: buckwheat, self-incompatibility, S-locus, S-gene, S-allele, breeding, pin, thrum. Scientific field: Biology Specific scientific field: Plant molecular biology UDC number: [577.21:581.162]:633.12 (043.3) SADRŽAJ: 1. UVOD...................................................................................................................................1 1.1. Auto-inkompatibilnost cvetnica............................................................................4 1.2. Pojave koje podsećaju na auto-inkompatibilnost cvetnica...................................6 1.3. Evolucija auto-inkompatibilnih sistema cvetnica.................................................9 1.4. Auto-inkompatibilni sistemi homomorfnih cvetnica.............................................11 1.4.1. Homomorfna sporofitna auto-inkompatibilnost Brassicaceae........................12 1.4.2. Homomorfna gametofitna na S-RNazama zasnovana auto-inkompatibilnost Rosaceae......................................................................................................14 1.4.3. Homomorfna gametofitna auto-inkompatibilnost Poaceae............................17 1.5. Auto-inkompatibilni sistemi heteromorfnih cvetnica...........................................18 Heteromorfna sporofitna auto-inkompatibilnost Primula..............................20 1.6. Heljda (Fagopyrum esculentum Moench)...........................................................21 Heteromorfna sporofitna auto-inkompatibilnost heljde...................................23 1.7. Značaj proučavanja auto-inkompatibilnih sistema u poljoprivredi.....................27 2. CILJEVI..............................................................................................................................28 3. MATERIJAL I METODE.................................................................................................30 3.1. Biljni materijal......................................................................................................30 3.2. Bakterijske procedure..........................................................................................30 3.2.1. Medijumi za uzgajanje bakterija....................................................................30 3.2.2. Bakterije i plazmidi..........................................................................................31 3.2.3. Uzgajanje i održavanje bakterija....................................................................31 3.2.4. Transformacija E.coli toplotnim šokom........................................................31 3.3. Osnovne procedure rada sa DNK.......................................................................32 3.3.1. Izolovanje biljne genomske DNK...................................................................32 3.3.2. Izolovanje plazmida iz bakterija....................................................................32 3.3.3. Prečišćavanje umnoženih fragmenata DNK nakon reakcije umnožavanja.......33 3.3.4. Elektroforeza na gelu od agaroze..................................................................34 3.3.5. Prečišćavanje fragmenata DNK sa gela od agaroze........................................34 3.3.6. Digestija DNK restrikcionim enzimima.......................................................35 3.3.7. Ligacija DNK sa plazmidnim vektorima......................................................35 3.3.8. Sekvenciranje DNK....................................................................................35 3.3.9. Kompjuterska analiza sekvenci...................................................................36 3.4. Reakcija lančanog umnožavanja segmenata DNK.............................................36 3.4.1. Umnožavanje homologa AI gena homomorfnih AI sistema Brassicaceae......36 3.4.2. Umnožavanje homologa AI gena homomorfnih gametofitnih AI sistema Prunus (Rosaceae).......................................................................................37 3.4.3. Umnožavanje segmenata genomske DNK heljde blisko vezanih sa S-lokusom....................................................................................................38 3.5. Osnovne procedure rada na fluorescentnom mikroskopu...................................40 3.5.1. Tretman tučkova inhibitorom protein kinaza C..............................................40 3.5.2. Priprema preparata za fluorescentno mikroskopiranje.....................................40 3.6. Osnovne procedure rada sa proteinima..................................................................41 3.6.1. Priprema proteinskih izolata.........................................................................41 3.6.2. Precipitacija proteina TCA/acetonom..........................................................41 3.6.3. Jednodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE).............42 3.6.4. Dvodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza (2D-PAGE)..................42 3.6.5. Kompjuterska analiza 2D-PAGE proteinskih profila......................................44 4. REZULTATI.....................................................................................................................45 4.1. Ispitivanje prisustva gena homolognih AI genima drugih biljnih vrsta u genomu heljde....................................................................................................45 4.2. Ispitivanje učestvovanja protein kinaza C u AI odgovoru heljde.......................46 4.3. Umnožavanje i sekvenciranje segmenta genomske DNK u neposrednoj blizini S-lokusa heljde i analiza sekvenci........................................................................48 4.4. 2D-PAGE razdvajanje ukupnih proteina polena i tučkova heljde.......................52 5. DISKUSIJA.......................................................................................................................57 5.1. Ispitivanje prisustva gena homolognih AI genima drugih biljnih vrsta u genomu heljde.....................................................................................................................57 5.2. Tretman inhibitorom protein kinaza C....................................................................59 5.3. Sekvence segmenata genomske DNK blisko vezane S-lokusu heljde.................60 5.4. 2D-PAGE razdvajanje ukupnih proteina polena i tučkova heljde.......................62 5.5. Perspektiva istraživanja molekularne osnove AI odgovora heljde.....................65 6. ZAKLJUČCI..........................................................................................................................67 7. LITERATURA..................................................................................................................72 8. DODATNI MATERIJAL...................................................................................................99 7.1. PRILOG A............................................................................................................99 7.2. PRILOG B..................................................................................................,..........102 Biografija.................................................................................................................................109 Prilog 1. Izjava o autorstvu Prilog 2. Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Prilog 3. Izjava o korišćenju SKRAĆENICE AI, auto-inkompatibilnost SAI, sporofitna auto-inkompatibilnost GAI, gametofitna auto-inkompatibilnost UI, unilateralna inkompatibilnost SRK, S-lokus receptor kinaza SLG, S-lokus glikoprotein SP11, S-lokus protein 11 MLPK, M-lokus protein kinaza S-RNaza, S-protein sa ribonukleaznom funkcijom SLF/SFB, S- lokus F boks protein DNK, dezoksiribonukleinska kiselina AFLP marker, marker polimorfizama dužina umnoženih fragmenata DNK SCAR marker, marker sekvencom okarakterisanog umnoženog regiona DNK PKC, protein kinaza C TCA, trihlorsirćetna kiselina pI, izoelektrična tačka SDS-PAGE, sodijum dodecil sulfat poliakrilamidna gel elektroforeza IEF, izoelektrično fokusiranje 2D-PAGE, dvodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza CRP, cisteinom bogat protein 1 1. UVOD Biljno carstvo čini vegetacioni pokrivač planete Zemlje, koji prema podacima iz 2010 god. sadrži između 310,000 i 315,000 vrsta (Chapman, 2009), a obuhvata veoma raznovrsne predstavnike, od algi do viših biljaka. Idući kroz vreme, od postanka prvih biljaka do sastava i izgleda flore danas, možemo primetiti na osnovu fosilnih ostataka da se kompleksnost novonastalih biljnih vrsta postepeno povećavala, kao i da su nove, složenije, vrste postajale vremenom uspešnije od svojih prethodnika, a samim tim i brojnije. Tako su se kroz određena razdoblja istorije Zemlje među dominantnim biljnim vrstama smenjivale briofite (ordovik), likopode (silur, devon, karbon, perm, trijas), paprati (devon, karbon, perm, trijas), sve do složenijih golosemenica (kraj perma, trijas, jura, kreda) i skrivenosemenica (od kraja krede do danas) (Behrensmeyer i sar., 1992). Navedene promene u sastavu i izgledu flore dešavale su se (i dalje se dešavaju) pod uticajem ekoloških promena na Zemlji (klimatske, geološke, geografske), ali takođe i pod uticajem hromozomskih rearanžmana, kao i promena u načinu razmnožavanja biljaka, koje utiču ne samo na reproduktivni uspeh i opstanak vrste, nego i na genetičku varijaciju, specijaciju i evolucionu diverzifikaciju vrsta (Barrett, 1998; Rieseberg, 2001; Widmer i sar., 2009). Smatra se da su se prvi predstavnici biljaka, alge, pojavile pre 1,200 miliona godina, a prve kopnene biljke pre oko 450 miliona godina, u ordoviku (Rensing i sar., 2008; Kato, 2010), a da se njihova diverzifikacija odigrala pre oko 418-407 miliona godina, u kasnom siluru-ranom devonu (Kenrick i Crane, 1997; Gensel, 2008). Za cvetnice, najbrojnije biljne vrste savremene flore, smatra se da su nastale pre oko 180-132 miliona godina (Soltis i Soltis, 2004; Bell i sar., 2005) i da je njihova brojnost porasla zbog niza karakteristika koje su im pružile evolutivnu prednost. U te karakteristike ubrajamo prisustvo perfektnih cvetova (koji svojom građom osiguravaju razmnožavanje tako što pored atraktivnosti za oprašivače sadrže i "nagradu" za njih, a time obezbeđuju i manju količinu polena potrebnu za oprašivanje kroz smanjenje njegovog nasumičnog rasipanja), proizvodnju zaštićenog 2 semena (kao glavnog sredstva razmnožavanja i rasejavanja), kao i prisustvo razvijenijeg vaskularnog sistema (Crepet i Niklas, 2009). Uprkos njihovoj sadašnjoj premoći, cvetnice se takođe suočavaju sa raznim izazovima u opstanku i produženju vrste. Pre svega, pošto su sve biljke sesilni organizmi njima su potrebni nosioci polena tj. oprašivači (insekti, vetar, voda), koji će preneti polen do odgovarajućeg partnera, što nekada može biti otežano, ili čak i sprečeno, postojanjem fizičkih barijera (npr. planinski venci, okean i dr.) ili nedostatkom oprašivača (Klein i sar., 2007). Pored toga, pri pronalaženju partnera poželjno je izbeći ukrštanje u srodstvu, a kod cvetnica koje poseduju hermafroditne cvetove, tj. i muške i ženske polne organe u istom cvetu, kakvo je oko 70% cvetnica danas (Ming i sar., 2007) i samooplođenje. Iako se ukrštanje u srodstvu i samooplođenje (inbriding) javljaju i održavaju u nekim uslovima u prirodi, poželjno je izbeći ih kad je to moguće, zbog toga što imaju negativan efekat na fitnes populacije/vrste, tj. njenu sposobnost da preživi i reprodukuje se. Naime, potomstvo nastalo kroz niz generacija inbridinga najčešće će ispoljiti negativne promene kao što su: manji rast u zrelom dobu, smanjenje broja cvetova po biljci, smanjenje vijabilnosti polena, smanjen broj ovula po cvetu, smanjeno plodonošenje i/ili smanjen broj semena, što se naziva inbriding depresijom (Darwin, 1876; Charlesworth i Charlesworth, 1987; Keller i Waller, 2002). Inbriding depresija se može ispoljiti u ranim i/ili kasnim fazama životnog ciklusa biljaka, ali vrlo često se značajno ispoljava u reproduktivnom stadijumu (Husband i Schemske, 1996; Goodwillie, 2000). Smatra se generalno da do ovih posledica dolazi usled smanjenja heterozigotnosti potomstva u populacijama (Falconer i MacKay, 1996), ali postoje podeljena mišljenja o tome šta izaziva negativni fitnes. Prema nekim autorima negativni fitnes se javlja zbog toga što za posmatrani genski lokus heterozigoti imaju veći fitnes od homozigota, dok drugi autori smatraju da se sa povećavanjem homozigotnosti povećava i verovatnoća fiksiranja i ispoljavanja recesivnih i delecionih mutacija prisutnih u roditeljskim individuama, što dovodi do negativnog fitnesa i može u nekom trenutku opteretiti vrstu i ugroziti njen opstanak (Charlesworth i Charlesworth, 1987; Lynch, 1991; Kärkkäinen i sar. 1999; Keller i Waller, 2002; Reed i Frankham, 2003). 3 Upravo zbog selektivnog pritiska da se održi visoka genetička varijabilnost vrsta, zato što ona povećava fitnes, mnoge biljne vrste razvile su različite načine kojima se sprečava ukrštanje u srodstvu i samooplođenje. U nekim biljnim vrstama tako mogu postojati samo muški ili samo ženski cvetovi unutar vrste, koji mogu biti na različitim biljkama (npr. topola - Populus trichocarpa) ili na različitim delovima iste biljke (npr. kukuruz - Zea mays) ili imati različito vreme sazrevanja u istom cvetu (npr. štitasti vodoljub - Butomus umbellatus) (Bawa i Beach, 1981; Charlesworth i Charlesworth, 1987; Bhardwaj i Eckert, 2001; Zluvova i sar., 2006; Jansson i Douglas, 2007), a mnoge cvetnice čiji su cvetovi hermafroditni imaju sposobnost auto-inkompatibilnosti (AI), kojom se sprečava oplođenje sopstvenim i/ili srodnim (tj. inkompatibilnim) polenom (Silva i Goring, 2001; Takayama i Isogai, 2005). Ipak, neosporno je da ima slučajeva ukrštanja u srodstvu i samooplođenja među različitim biljnim vrstama, zato što samooplodnost osigurava reproduktivni uspeh (primeri samooplodnih vrsta: suncokret, pšenica, paradajz, kikiriki, soja, orhideje, itd.). Tako u slučajevima vrsta čije populacije kratko žive (kakve su npr. mnoge jednogodišnje biljke) ili su izložene periodičnim izumiranjima ili nepovoljnim ekološkim faktorima (npr. suša, velika vlaga, nedostatak oprašivača, mala veličina populacije, izolovanost populacije, itd.), kao i pri osnivanju novih populacija od strane jedne ili malog broja jedinki, strategija samooplođenja obezbeđuje sigurnu reprodukciju, čak i po cenu smanjenja fitnesa, jer je na kraju to manja cena koja se plaća, u poređenju sa potpunim izostankom reprodukcije (Stebbins, 1957; Jain, 1976; Lande i Schemske, 1985; Barrett, 1998). Samooplodnost i stranooplodnost zapravo predstavljaju dva alternativna stabilna stanja sistema za razmnožavanje (od kojih je stranooplodnost potrebna da održava genetsku varijabilnost i obezbedi dugoročno održavanje evolutivnog potencijala vrste, dok je samooplodnost potrebna da osigurava reprodukciju u uslovima u kojima je stranooplodnost smanjena ili sprečena), a koje od dva stanja će prevagnuti zavisi od neposrednih ekoloških faktora i održavanja balansa između cene reproduktivnog uspeha i cene održavanja genetske raznovrsnosti (Jain, 1976; Solbrig, 1976; Lande i Schemske, 1985; Frankham, 2003). 4 1.1. Auto-inkompatibilnost cvetnica Auto-inkompatibilnost (AI) cvetnica predstavlja genetički determinisan kompleksni kaskadni sistem biohemijskih reakcija, kojim se sprečava oplođenje u slučaju da polen ima isti inkompatibilni fenotip kao i tučak koji oprašuje (Barrett, 1992; Schopfer i Nasrallah, 2000; Kao i Tsukamoto, 2004; Takayama i Isogai, 2005; Wheeler i sar., 2009; Klaas i sar., 2011). AI odgovor kod svih auto-inkompatibilnih cvetnica uključuje prepoznavanje inkompatibilnog polena, koje pokreće prenos signala i sprečava oplođenje inkompatibilnim polenom (Matton i sar., 1994; Cock i sar., 2000; Hiscock, 2002; Takayama i Isogai, 2005). Iako je ovakav tok AI odgovora univerzalan, svaka od tri navedene faze može biti ostvarena na različite načine i u skladu sa tim mnogi autori (Barrett, 1988; Cornish i sar., 1988; Clarke i Newbigin, 1993; Dixit i Nasrallah, 2001; Allen i Hiscock, 2008) klasifikuju AI sisteme na četiri načina: 1) U zavisnosti od načina na koji je određen inkompatibilni fenotip polena, AI sistemi se mogu klasifikovati na sporofitne i gametofitne sisteme. Kod sporofitnih AI sistema (SAI) inkompatibilni fenotip polena određen je diploidnim genotipom majke biljke (npr. Brassica, Parthenium argentium, Crepis foetida, Ipomoea trifida, Senecio squalidus, itd.), dok je kod gametofitnih AI sistema (GAI) određen haploidnim genotipom samog polena (npr. Prunus, Petunia, Nicotiana, Papaver, Solanum, itd.). Zbog takve determinacije AI fenotipa kod sporofitnih vrsta polen će se ponašati kao diploidan, pri čemu će ispoljavanje inkompatibilnog fenotipa zavisiti od odnosa među alelima diploidnog genotipa majke biljke (razmotreno pod tačkom 4), dok će se kod gametofitnih vrsta ponašati u skladu sa sopstvenim haploidnim genotipom tj. jednom jedinom alelskom varijantom koju je dobio rekombinacijom alela prisutnih kod roditelja (Heslop-Harrison, 1975; Gaude i Dumas, 1987). 2) U zavisnosti od prisustva cvetova iste ili različite morfologije unutar jedne vrste, AI sistemi se mogu klasifikovati na homomorfne ili heteromorfne. AI sistemi cvetnica koje unutar vrste imaju samo cvetove iste morfologije nazivaju se homomorfni (npr. Brassica, 5 Nicotiana, Prunus, itd.), dok se oni prisutni u cvetnica koje unutar vrste imaju morfološki različite cvetove nazivaju heteromorfni (npr. Fagopyrum esculentum Moench, Primula spp., Linum spp., itd.). Heteromorfne vrste cvetnica se odlikuju heterostilijom tj. tučkovi i antere unutar cvetova te vrste su različite dužine/visine. Heterostilija se može javiti u obliku distilije (dva morfa cveta, tj. dve dužine tučka i dve visine antera u cvetovima date vrste, npr. Hedyotis acutangula, Primula vulgaris, Fagopyrum esculentum Moench) ili tristilije (tri morfa cveta, tj. tri dužine tučka i dve visine antera u cvetovima date vrste, npr. Lythrum salicaria) (Wu i sar., 2010; Bawa i Beach, 1981; Charlesworth i Charlesworth, 1987; Matsui i sar., 2004) Do sada su kod homomorfnih AI sistema zabeleženi i sporofitni (npr. Brassica, Senecio squalidus) i gametofitni tip (npr. Prunus, Nicotiana) determinacije AI fenotipa polena, dok je kod heteromorfnih AI sistema zabeležen samo sporofitni tip (npr. Fagopyrum esculentum Moench, Primula spp., Linum spp.) (Silva i Goring, 2001; Takayama i Isogai, 2005; Brennan i sar., 2011). 3) U zavisnosti od mesta na kom se zaustavlja rast inkompatibilne polenove cevi, AI sistemi se klasifikuju na sisteme u kojima do zaustavljanja dolazi na žigu tučka (npr. kod homomorfne SAI Brassica, GAI trava i kod nekih heteromorfnih SAI), u stubiću tučka (npr. kod GAI zasnovanoj na S-RNazama u rodovima Prunus, Nicotiana, Solanum i kod nekih heteromorfnih SAI) ili u ovarijumu tučka (npr. kod kasne AI Narcissus, Lilium, Borago officinalis, Gasteria verucosa). Takođe, kod heteromorfnih sporofitnih AI sistema mesto zaustavljanja rasta inkompatibilne polenove cevi može biti isto ili različito u cvetovima različite morfologije (npr. kod heteromorfnih vrsta Fagopyrum esculentum Moench i Primula spp. mesto zaustavljanja rasta polenove cevi razlikuje se između cvetova različite morfologije, dok je kod heteromorfne vrste Linum spp. mesto zaustavljanja rasta polenove cevi isto kod cvetova različite morfologije) (Franklin-Tong i sar., 1990; Haring i sar., 1990; Barrett i Cruzan, 1994; Geitmann i sar., 2001; Miljuš-Ðukić i sar., 2003; McCubbin, 2008; Klein i sar., 2009). 4) U zavisnosti od broja genskih lokusa, koji određuju fazu prepoznavanja u auto- inkompatibilnom odgovoru, AI sistemi se klasifikuju na one u kojima je prepoznavanje 6 inkompatibilnog polena pod kontrolom jednog lokusa (npr. S-lokus kod homomorfne SAI Brassica i GAI Prunus) ili dva (npr. S-lokus i Z-lokus kod GAI trava) i više nevezanih lokusa (kod homomorfne i heteromorfne SAI). Takođe, geni sadržani u ovim lokusima mogu biti višealelski (npr. slučaj kod homomorfnih SAI i GAI, ali i kod nekih heteromorfnih SAI) ili bialelski (dominantan i recesivan alel) (uglavnom se javljaju kod heteromorfnih SAI). Pored učestvovanja više od jednog genskog lokusa, arhitektura AI se dodatno usložnjava time što odnosi među alelima istog lokusa mogu biti kodominantni (GSI, homomorfna SSI, i to najčešće među S-alelima tučka) ili dominantno-recesivni (homomorfna SSI, i to najčešće među S-alelima polena, dok se u heteromorfnoj SSI ovakav odnos očekuje među S-alelima i tučka i polena; pri tome odnos dominantnosti među alelima može biti linearan i nelinearan), a ponekad njihov odnos može biti i kompetitivna interakcija (npr. kod tetraploidnih heterozigota GSI vrsta u heteroalelskom polenu) (Thompson, 1972; Hatakeyama i sar., 1998; Golz i sar., 1999, 2001; Brennan i sar., 2011). Nasuprot tome, među alelima nezavisnih lokusa postoji komplementarna interakcija (npr. Guadinia fragilis, Beta vulgaris L.) (Lundqvist, 1964; Larsen, 1977; Baumann i sar., 2000). 1.2. Pojave koje podsećaju na auto-inkompatibilnost cvetnica Klasifikacija AI sistema, navedena u poglavlju 1.1., predstavlja najčešći način predstavljanja ovih sistema i iako je zasnovana na njihovim najšire rasprostranjenim odlikama, ona i dalje nije sveobuhvatna. Naime, postoji još nekoliko pojava koje nisu svrstane ni u jednu od postojećih klasifikacija, a koje po nekim svojim osobinama podsećaju na AI sisteme i to su: 1) Kasna auto-inkompatibilnost, koja se manifestuje u ovarijumu tučka neposredno pre ili posle oplođenja, dovodeći ili do sprečavanja nastajanja embriona (usled ovularne inhibicije koja se može odigrati pre ili posle pristizanja sopstvene/srodne polenove cevi do ovule) ili do odbacivanja embriona odmah posle njegovog nastajanja. Do sada je zabeležena kod vrsta: Asclepias syriaca, Beta vulgaris, Cyrtanthus breviflorus, Dalbergia retusa, Dipteryx 7 panamensis, Gasteria verrucosa, Jacaranda racemosa, Lilum candidum, Liquidambar styraciflua, Myrospermum frutescens, Physalis ixocarpa, Pseudowintera axillaris, Theobroma cacao i drugim vrstama (Pandey, 1960; Seavey i Bawa, 1986; Sage i Sampson, 2003; Bittencourt i Semir, 2006; Vaughton i sar., 2010). Međutim, istraživanje ovog fenomena znatno je otežano time što je eksperimentalno često teško razlikovati kasnu AI od posledica inbriding depresije ispoljenih u ranoj fazi razvića, tako da su uočeni mehanizmi kasne auto-inkompatibilnosti do danas ostali nerasvetljeni. 2) Unilateralna inkompatibilnost (UI) sprečava hibridizaciju srodnih vrsta u jednom smeru tj. polinacija između dve srodne vrste kompatibilna je u jednom smeru, dok je inkompatibilna u obrnutom smeru (npr. kad su u pitanju vrste Erythronium americanum i Erythronium albidum (Liliaceae), polenove cevi auto-inkompatibilne vrste E. americanum rastu nesmetano na tučkovima samooplodne vrste E. albidum, dok polinacija u obrnutom smeru dovodi do inkompatibiline reakcije; Harder i sar., 1993). UI najčešće dozvoljava oplođenje samooplodne vrste polenom srodne auto-inkompatibilne vrste, dok polinacija u obrnutom smeru dovodi do inkompatibilne reakcije (mada ima i izuzetaka od pravila gde polen samooplodne vrste može da oplodi srodnu auto-inkompatibilnu vrstu; Lewis i Crowe, 1958). Takođe, UI se može javiti i između dve auto-inkompatibilne ili između dve auto- kompatibilne vrste (Brandvain i Haig, 2005). UI je zabeležena kod rodova: Brassica, Capsicum, Eucalyptus, Leavenworthia, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum i drugih (Martin, 1964; Lloyd, 1968; Gore i sar., 1990; Hancock i sar., 2003; Onus i Pickersgill, 2004; Covey i sar., 2010). Kod nekih vrsta komponente AI sistema su uključene i u UI odgovor (npr. kod Nicotiana u UI odgovor uključene su S-RNaze, a razlika između AI i UI sistema leži u ne-S-RNaznim faktorima koji su uključeni u proces, Hancock i sar., 2003; dok kod Solanum u UI odgovor nisu uključene S-RNaze, ali jesu neke druge ne-S-RNazne komponente poput HT-A gena, Covey i sar., 2010; takođe je i kod Brassica uočeno da u UI nisu uključeni produkti S-lokusa već M-lokusa, konkretno MLPK gen, Takada i sar., 2013). Neki autori smatraju da se UI javlja kao slučajna posledica postojanja AI sistema (Martin, 1964), drugi smatraju da ima za cilj da zaštiti AI vrste od hibridizacije sa srodnim 8 samooplodnim vrstama, kao vid prevencije samooplođenja/ukrštanja u srodstvu (Grun i Radlow, 1961), a postoji i mišljenje da je UI sporedna pojava divergencije vrsta unutar istog roda (Onus i Pickersgill, 2004). Potrebno je ipak sakupiti još podataka o molekularnoj osnovi UI, kao i o evoluciji, promenama i održavanju AI sistema, da bi bilo moguće izvesti pouzdanije zaključke. 3) Prikrivena auto-inkompatibilnost podrazumeva pojavu da je u vrsti prisutno uspešno i stranooplođenje i samooplođenje, ali kada se u isto vreme na istom žigu tučka nađu srodni i nesrodni polen, onda će pri oplođenju nesrodni polen imati kompetitivnu prednost nad srodnim polenom (usled brže germinacije polena i/ili bržeg rasta polenovih cevi) (Jesson i sar., 2006). Zabeležena je u vrstama: Amsinckia grandiflora, Cheiranthus cheiri L., Clarkia unguiculata, Decodon verticillatus, Echium vulgare, Eichhornia paniculata, Hedyotis acutangula, Silene vulgaris i drugim (Bateman, 1956; Weller i Ornduff, 1977; Bowman, 1987; Cruzan i Barrett, 1993; Eckert i Allen, 1997; Korbecka i sar., 2003; Wu i sar., 2010; Smith-Huerta i Vasek Madroño, 2011). Neki autori smatraju da predstavlja strategiju kojom se osigurava reproduktivni uspeh vrste, tako što se u slučaju prisustva nesrodnog polena povećava udeo plodova nastalih stranooplođenjem, dok se u vremenima kada nema nesrodnog polena (npr. zbog odsustva polinatora) favorizuje plodonošenje samooplođenjem (Kalisz i sar., 2004; Jesson i sar., 2006). Drugi autori smatraju da predstavlja tranzijentnu fazu AI vrste ka samooplodnosti (Mable i sar., 2005; Liu i sar., 2007). 4) Mentor efekat, koji podrazumeva indukovanje samooplođenja u inače auto- inkompatibilnim individuama pod uticajem polena iz drugih vrsta i javlja se najčešće u zonama hibridizacije dve vrste (npr. u Hieracium s.str., Lotus corniculatus, Paspalum notatum, Ranunculus auricomus i dr.) (Mráz, 2003; Hörandl i Temsch, 2009). Kad se na tučku nadje mešavina sopstvenog i stranog polena druge vrste, mentor efekat sprečava stranooplodnju favorizujući samooplođenje, čak i po cenu rizikovanja inbriding depresije, a sve u cilju sprečavanja nastajanja sterilnog potomstva, koje bi se aseksualno reprodukovalo. Iako mentor efekat dovodi do sloma auto-inkompatibilnosti, smatra se da ima važnu ulogu 9 u reproduktivnoj izolaciji i specijaciji hibrida, uglavnom u zonama hibridizacije dve vrste, gde se mešavine polena najčešće pojavljuju i da otežava/sprečava nastajanje primarnih hibrida. Mehanizam mentor efekta do danas nije rasvetljen. U naučnoj javnosti se mnogo diskutuje o tome gde nabrojane četiri pojave treba svrstati, tj. da li su sve ili barem neke od njih AI sistemi sensu stricto ili su sporedne/dodatne manifestacije AI sistema ili su možda tranzijentne forme reproduktivnih sistema, ali svi se slažu u jednom, a to je da se javljaju kao deo strategije cvetnica za osiguravanjem reprodukcije u stalno promenljivoj životnoj sredini. 1.3. Evolucija auto-inkompatibilnih sistema cvetnica Na osnovu opštih podataka kojima se za sada raspolaže o AI sistemima sensu stricto (kojima se smatraju samo AI sistemi koji predstavljaju postpolinacione, prezigotske barijere) smatra se da ovi sistemi imaju polifiletsko poreklo, tj. da su evoluirali više puta nezavisno unutar klase cvetnica (Igic i sar., 2008). Prema sadašnjim filogenetskim i molekularnim podacima o AI sistemima, ispostavilo se da su gametofitni AI sistemi zasnovani na S-RNazama filogenetski najrasprostranjeniji od svih AI sistema sensu stricto, zbog čega neki autori smatraju da su upravo oni predačko stanje prvih cvetnica (Igic i Kohn, 2001). Smatra se da su gametofitni AI sistemi postojali u centru porekla vrsta, dok se u perifernim zonama centra porekla pojavljivala samooplodnost, kao izvedeno stanje (Stebbins, 1957; Kusaba i sar., 2001). Takođe, pretpostavlja se da su se sporofitni AI sistemi tek kasnije razvili, nastajući iz auto-kompatibilnih linija poteklih od predaka koji su imali gametofitni AI sistem (Allen i Hiscock, 2008). Predloženo je i da sporofitni AI sistemi mogu evoluirati i održavati se i u prisustvu sistema prikrivene gametofitne auto- inkompatibilnosti, pošto su zabeleženi podaci o postojanju zajedničke gametofitne/sporofitne AI kontrole kod vrsta Theobroma cacao (Sterculiaceae), Cerastium arvense (Caryophyllaceae) i Stellaria holostea (Caryophyllaceae), za koje se smatra da predstavljaju primere tranzicije AI gena između gametofitne i sporofitne kontrole (Allen i 10 Hiscock, 2008). Za sada najviše podataka ide u prilog tome da je GSI nastala više puta nezavisno u najranijim linijama cvetnica pre njihove dalje diverzifikacije, ali da je ipak kasna AI najverovatnije bila osnovno stanje prvih cvetnica, pa da je posle nastala GAI, pa da su onda nastali heteromorfni AI sistemi, dok su homomorfni sporofitni AI sistemi najmlađi. Nasuprot ovom mišljenju ima i autora koji smatraju da je najverovatnije ancestralno stanje bila auto-kompatibilnost iz koje su kasnije evoluirali prvo sporofitni AI sistemi, a onda iz njih i gametofitni, kroz odlaganje vremena ekspresije S alela. Kada je reč o poreklu heteromorfnih AI sistema, smatra se da su evoluirali više puta nezavisno tokom diverzifikacije cvetnica, i da iako su sporofitnog karaktera, poput homomorfnih sporofitnih AI sistema, da su ova dva sistema suštinski različita i stoga nezavisnog porekla, što podržavaju i skorije molekularne i filogenetske analize (Allen i Hiscock, 2008). Sakupljanjem više podataka o postojeće tri forme AI sistema sensu stricto (prikazanih ponaosob u poglavljima 1.4. i 1.5.), uočeno je da sva tri tipa AI sistema imaju određene zajedničke odlike. Pre svega, svaki od tri tipa AI sistema je prilično plastičan, zato što: 1) Pokazuje dinamiku zavisnu od razvojnog stadijuma cveta, u kojoj AI sistem tokom sazrevanja cveta postepeno postaje aktivan i postiže punu aktivnost dan-dva pre otvaranja cveta (Kusaba i sar., 2001; Chalivendra i sar., 2013); 2) Postoji određena propustljivost reproduktivnih barijera tj. kvantitativne razlike u snazi odgovora AI sistema između vrsta, kao i između genotipova jedne vrste, za koje se smatra da predstavljaju deo reproduktivnih strategija u suočavanju AI vrsta sa variranjem u dostupnosti nesrodnog polena (Vallejo-Marin i Uyenoyama, 2004; Porcher i Lande, 2005). Takođe, primećeno je da se kod sva tri tipa AI vrsta cvetnica dešavaju i česti prelazi na samooplodnost, što nije samo posledica smanjenja broja S alela u populaciji (do kog može doći usled genetičkog drifta, efekta osnivača, efekta uskog grla, itd.), već da zavisi i 11 od drugih genetičkih (npr. mutacije u AI genima ili genima modifikatorima AI odgovora i dr.) i negenetičkih faktora (npr. nedostatak polinatora, izolovanost populacije, itd.) (Busch, 2005; Mable i sar., 2005; Mable, 2008; Navascués i sar., 2010) i da su takvi prelazi nepovratni (Igic i sar., 2004, 2006). Dakle, na osnovu svih dosadašnjih saznanja o AI sistemima sensu stricto možemo zaključiti da se u stalno promenljivom okruženju unutar različitih taksonomskih kategorija (npr. vrste, roda) dešavaju tranzicije sa stranooplodnih (auto-inkompatibilnih) na samooplodne (auto-kompatibilne) načine reprodukcije, a u isto vreme se dešava i de novo pojava AI sistema i njihova dalja evolucija. Ovakav dinamičan skup reproduktivnih strategija održava balans između cene reproduktivnog uspeha i cene genetičke varijabilnosti vrsta, između kojih je vrsta primorana da stalno odlučuje u zavisnosti od spoljašnjih uslova. Takođe, kao što je objašnjeno, AI sistemi u sadejstvu sa ekološkim faktorima utiču i na specijaciju i diverzifikaciju vrsta, a time posredno i na smene dominantnih biljnih vrsta u Zemljinoj vegetaciji od postanka tih vrsta do danas. Zato je upoznavanje AI sistema od velike važnosti za razumevanje evolucije reproduktivnih sistema biljaka, zatim i evolucije, specijacije i diverzifikacije cvetnica, ali takođe i za upoznavanje i razumevanje nekih univerzalnih pojava u molekularnoj genetici svih eukariotskih vrsta, kao što su sticanje i održavanje visoke varijabilnosti alela u određenom genskom lokusu, smanjivanje rekombinacija u određenim regionima genoma, ciljana inaktivacija alela, različite interakcije među alelima, kao i koevolucija interaktivnih faktora. 1.4. Auto-inkompatibilni sistemi homomorfnih cvetnica Vrste koje poseduju hermafroditne cvetove identične morfologije su najbrojniji predstavnici cvetnica. Kod takvih homomorfnih vrsta karakteristike cvetova (poput dužine tučkova, visine antera i veličina polenovih zrna) identični su među svim cvetovima te vrste. Auto-inkompatibilnost je prisutna u više od 94 familije homomorfnih cvetnica 12 (Gibbs, 1990; Weller i sar., 1995; Steinbachs i Holsinger, 2002) i javlja se ili kao sporofitna AI ili kao gametofitna AI. Za razliku od heteromorfnih AI sistema, homomorfni AI sistemi su znatno bolje proučeni, a njihova molekularna osnova je do sada najbolje razjašnjena kod familija Brasicaceae (kupusnjača), Solanaceae, Rosaceae i Scrophulariaceae (krompira, ruža i zevalica) i Poaceae (trava). 1.4.1. Homomorfna sporofitna auto-inkompatibilnost Brassicaceae Familija Brassicaceae (kupusnjača) sadrži preko 330 rodova sa ukupno oko 3,700 vrsta (prema Royal Botanic Gardens, Kew) i smatra se da je u ovoj familiji AI nezavisno nastala 9 do 10 puta (Igic i sar., 2008). Do sada sve ispitane AI vrste kupusnjača pokazale su sporofitnu AI, u kojoj se rast sopstvene polenove cevi zaustavlja na žigu tučka, a detaljnija istraživanja su pokazala da je AI kupusnjača pod kontrolom dva genska lokusa, S i M. Dok je S-lokus višealelski i odgovoran za sintezu SRK, SLG, SP11 proteina, koji obezbeđuju specifično razlikovanje sopstvenog polena od stranog, M-lokus je odgovoran za sintezu M-lokus protein kinaze (MLPK), koja ima ulogu pozitivnog medijatora signala u kaskadi događaja koji vode zaustavljanju rasta cevi polena prepoznatog kao sopstvenog. Proteini koji direktno određuju specifičnost AI prepoznavanja kod kupusnjača su S- lokus receptor kinaza (SRK), transmembranska serin/treonin kinaza prisutna u epidermalnim ćelijama žiga tučka (Stein i sar., 1991,1996; Takasaki i sar., 2000) i S-lokus protein 11 (SP11), cisteinom bogat mali protein prisutan u omotaču polena (Schopfer i sar., 1999; Shiba i sar., 2001). Mehanizam interakcije funkcioniše poput receptor-ligand kompleksa, u kom se SP11 kao ligand vezuje za vanćelijski domen SRK i ukoliko dođe do njihovog prepoznavanja aktivira se receptorski kompleks (koji pored SRK čini i SLG, S- lokus glikoprotein, koji stabilizuje SRK na haplotip-specifičan način, mada ima i haplotipova kojima uopšte ne treba SLG), kroz autofosforilaciju SRK, čime se pokreće signalna kaskada koja će dovesti do zaustavljanja rasta inkompatibilne polenove cevi 13 (Takasaki i sar., 2000; Takayama i Isogai, 2003; Chookajorn i sar., 2004; Kemp i Doughty, 2003; 2007; Shimosato i sar., 2007). Neki od molekula signalne kaskade AI odgovora kupusnjača su identifikovani i uključuju, redom kojim se pojavljuju kao akteri u prenošenju signala: 1) dva tioredoksin h proteina, nazvanih THL1 i THL2, koji negativno regulišu SRK, a i sam AI odgovor, tako što održavaju SRK u neaktivnom stanju (u neoprašenim tučkovima) (Bower i sar., 1996; Cabrillac i sar., 2001; Haffani i sar., 2004); 2) MLPK, za membranu vezanu M-lokus serin/treonin protein kinazu, koja je neophodna za AI odgovor i direktno interaguje sa SRK, iako se još uvek ne zna njihova tačna fiziološka veza (Murase i sar., 2004; Kakita i sar., 2007a; 2007b); 3) ARC1 (ARM-Repeat Containing-1), E3 ubikvitin ligaza, koja je lokalizovana u proteazomima i signalozomima na SRK zavisan način (Stone i sar., 2003); 4) Exo70A1, protein koji ulazi u sastav oktamerskog proteinskog kompleksa, koji učestvuje u transportu vezikula i drugom polarizovanom unutarćelijskom transportu (Samuel i sar., 2009). Na osnovu do danas sakupljenih podataka najverovatniji model AI odgovora Brassica podrazumeva da nakon vezivanja SP11 za SRK prestaje inhibicija SRK (koja je bila ostvarena tioredoksinima), čime se dozvoljava autofosforilacija SRK, što aktivira ovu kinazu omogućujući joj da dalje aktivira MLPK (koja se nalazi neposredno pored SRK u membrani). Na taj način se pokreće složena nizvodna kaskada događaja, u kojoj se fosforiliše ARC1, koji interaguje sa Exo70A1 i pokreće njegovu degradaciju, sprečavajući na taj način stvaranje kompatibilnih faktora, koji su neophodni za rast polenove cevi, što na kraju dovodi do zaustavljanja rasta tube polena prepoznatog kao sopstvenog (Haasen i Goring, 2010; Kitashiba i sar., 2011). 14 Pored velikog broja molekula potrebnih za realizaciju AI odgovora, složenost AI sistema još više je uvećana kompleksnim interakcijama između S alela Brassica. Thompson i Taylor (1966) su primetili da postoji dominantno-recesivna interakcija među S- haplotipovima kupusnjača. Utvrđeno je da je AI fenotip polena određen odnosom S- haplotipova nasleđenih od roditelja, koji može biti kodominantan ili dominantno-recesivan. Pri tom se odnosi dominantnosti u tučku razlikuju od onih u polenu, a svi odnosi dominantnosti su nelinearni (Hatakeyama i sar., 1998). Takođe, nedavno je ustanovljeno da kod kupusnjača postoji epigenetska regulacije monoalelske ekspresije u polenu kroz monoalelsku metilaciju. U ovom procesu se posredstvom malih RNK, kodiranih u oivičavajućim regionima dominantnog SP11 alela (klasa I S-haplotipova), ostvaruje in trans transkripciono utišavanje recesivnog SP11 alela (klasa II S-haplotipova) putem metilacije njegovog promotora (Tarutani i sar., 2010; Shiba i Takayama, 2012). Pri tome SP11 aleli klase I ispoljavaju međusobnu kodominantnost, dok među SP11 alelima klase II postoji linearna dominantnost i aleli klase I su uvek dominantni nad alelima klase II. Nasuprot tome, ispostavilo se da je dominantnost haplotipova u tučkovima svojstvo same SRK i da nije povezano sa promenom nivoa transkripcije SRK (Hatakeyama i sar., 2001). Za sada se ne zna tačan mehanizam regulacije dominantnosti među SRK alelima, ali uopšteno gledano on može uključivati interakciju između dve SRK, kompeticiju za nizvodne signalne komponente ili post-transkripcionu regulaciju dominantnosti (Kemp i Doughty, 2003). 1.4.2. Homomorfna gametofitna na S-RNazama zasnovana auto-inkompatibilnost Rosaceae Sledeća po redu, kad je reč o stepenu poznavanja molekularne osnove AI odgovora, jeste na S-RNazama zasnovana gametofitna AI, koja je prisutna u familijama Solanaceae, Rosaceae i Scrophulariaceae (krompira, ruža i zevalica), koje zajedno obuhvataju više od 300 rodova i više od 8,500 vrsta (Olmstead i Bohs, 2007; http://www.theplantlist.org, 15 2010). Kod svih ispitivanih AI vrsta ovih familija pokazano je da se rast sopstvene polenove cevi zaustavlja na 2/3 dužine stubića tučka i da je pod kontrolom jednog višealelskog S-lokusa. S-lokus kod ovih vrsta odgovoran je za sintezu proteina S-RNaza i SLF/SFB, koji predstavljaju žensku i mušku komponentu specifičnosti prepoznavanja sopstvenog i nesopstvenog polena. S-RNaza je S-protein sa ribonukleaznom funkcijom i prisutna je samo u vanćelijskom matriksu sprovodnog tkiva tučka gde degraduje RNK sopstvenog polena, dok je SLF/SFB, S-lokus F boks protein (F boks je strukturni motiv proteina karakterističan za proteine koji odvode druge proteine u degradaciju u proteazomima), prisutan isključivo u polenu (Kao i Tsukamoto, 2004; McClure, 2004). Kada se S-haplotip polena podudari sa bilo kojim od dva S-haplotipa tučka, ispoljiće se citotoksična aktivnost S-RNaze, kojom će se zaustaviti dalji rast polenove cevi. Iako su sam korak prepoznavanja i degradacije sopstvenog polena ostvareni zahvaljujući delovanju S-proteina, za potpuno ispoljavanje AI odgovora zasnovanog na S- RNazama potrebno je i delovanje drugih, nezavisnih genskih lokusa, nazvanih modifikujućim lokusima, za koje je pokazano da mogu da utiču na nivo ekspresije S-gena. Istraživanja in vitro omogućila su identifikaciju nekoliko ne-S komponenti tučka za koje se smatra da su potrebni za AI odgovor, kao što su: 120K (vanćelijski arabinogalaktan, koji može da se veže za S-RNazu), NaStEP (kiseli protein iz grupe Kunitz-tipa proteinaznih inhibitora, prisutan na površini žiga tučka i u manjoj količini u stubiću tučka), NaTrh (protein tioredoksin h podgrupe II, prisutan u vanćelijskom matriksu provodnog tkiva tučka) i HT-B (mali vanćelijski protein bogat asparaginom/aspartatom) (Puerta i sar., 2009; McClure i sar., 2011). Takođe su identifikovane i ne-S komponente polena poput: Sli faktora (S-lokus inhibitor, koji deluje kao dominantni faktor koji uzrokuje sporofitnu inhibiciju AI odgovora, tako što potiskuje polenovu funkciju na za sad nepoznat način; zahvaljujući njemu polen može savladati citotoksičnost S-RNaze nezavisno od svog S- genotipa), SBP1 (protein sa RING domenom, koji nije specifičan samo za polen, nego se javlja i u drugim tkivima, a za koji je pokazano da se in vitro vezuje za S-RNazu, 120K, SLF i neke transkripcione faktore), brojni SLF-vezujući proteini kao što je protein nalik 16 SCF (Skp1-Cullin-F-box) E3 kompleks (koji vezuje SLF i vodi nesopstvenu S-RNazu do ubikvitinacije), SSK1 (Skp1-nalik protein, koji vezuje SLF i protein nalik kulin-1 proteinu (Cullin1), stvarajući na taj način tročlani kompleks proteina za koji se smatra da učestvuje u AI odgovoru) (McClure i sar., 2011). Tačna uloga nabrojanih ne S-faktora AI odgovora zasnovanog na S-RNazama za sada je nerazjašnjena, ali su ispitivanja njihovih uloga u toku, pa možemo očekivati prve odgovore uskoro. Što se tiče biohemijskog modela AI odgovora zasnovanog na S-RNazama, predložena su dva: S-RNaza degradujući model i kompartmentalizacioni model. Ono što je za ova dva modela zajedničko jeste da oba podrazumevaju da interakcija S-RNaze sa SLF određuje da li je polinacija inkompatibilna ili kompatibilna, kao i da nakon prepoznavanja polena kao sopstvenog dolazi do degradacije polenove RNK, što izaziva opštu inhibiciju sinteze proteina neophodnih za kontinuiran rast polenove cevi. Ono u čemu se ova dva modela razlikuju jeste način na koji polen izbegava citotoksičan efekat S-RNaza, ali modeli nisu uzajamno isključivi. U S-RNaza degradujućem modelu predloženo je da različiti SLF proteini (najmanje tri klase SLF proteina, prema Kubo i sar., 2010) sarađuju na tome da ostvare rezistenciju na S-RNaze, tako što u kompatibilnoj polinaciji vezuju nesopstvenu S-RNazu i vode je u ubikvitinaciju i proteozomalnu degradaciju, sprečavajući tako degradaciju RNK polena, dok u inkompatibilnoj polinaciji ne mogu da se vežu za sopstvenu S-RNazu, tako da ona ispoljava svoje citotoksično dejstvo, degraduje polenovu RNK i zaustavlja rast polenove cevi. U kompartmentalizacionom modelu predloženo je da se rezistencija na S-RNaze ostvaruje tako što se nesopstvene S-RNaze transportuju u vakuole kompatibilne polenove cevi, čime je sprečeno njihovo citotoksično delovanje, dok u inkompatibilnoj polinaciji 17 nema kompartmentalizacije sopstvene S-RNaze, tako da ona ostvaruje svoje citotoksično dejstvo i dovodi do zaustavljanja rasta tube polena prepoznatog kao sopstvenog (McClure i sar., 2011). Iako se već dosta zna o ovim sistemima, potrebno je još dosta istraživanja da bi se razjasnili genetički i biohemijski putevi gametofitne AI zasnovane na S-RNazama (npr. koji sve geni učestvuju u AI i koje uloge imaju, kako se transportuje S-RNaza iz vanćelijskog matriksa tučka u vakuole polenove cevi, koji su tačno ciljni proteini SLF kompleks, itd.). 1.4.3. Homomorfna gametofitna auto-inkompatibilnost Poaceae Na trećem mestu, kad je reč o stepenu poznavanja molekularne osnove AI odgovora, jeste familija Poaceae (trava), koja sadrži otprilike 700 rodova sa ukupno oko 10,000 vrsta (Watson i Dallwitz, 1992), a barem 16 rodova sadrži AI vrste (Connor, 1979). Iako sve do sad ispitane AI vrste trava imaju gametofitnu AI, kod većine vrsta do zaustavljanja rasta inkompatibilne polenove cevi dolazi na žigu tučka (npr. Guardinia fragilis) (što više podseća na ponašanje vrsta sa sporofitnom AI), mada ima i nekih kod kojih se rast zaustavlja u stubiću tučka (npr. Cynodon dactylon), što može biti posledica variranja intenziteta AI odgovora između različitih vrsta, kao i različitih genotipova jedne vrste (Thomas i Murray, 1975; Shivanna i sar., 1982). Poznato je da je gametofitna AI kontrola trava ostvarena pomoću dva nezavisna, višealelska lokusa S i Z. Komplementarnom interakcijom alela ova dva genska lokusa ostvaruje se AI reakcija, ali samo u slučaju kada se aleli oba genska lokusa u inkompatibilnim fenotipovima polena i tučka podudaraju (Hayman, 1992). Pored S - i Z- lokusa izgleda da je i treći, T-lokus, uključen u AI odgovor trava, ali je ili u aktivnom ili u neaktivnom stanju i ne pokazuje alelsku varijabilnost kao S - i Z-lokusi, pa je moguće da je 18 nekad bio varijabilan, a onda postao fiksiran za jedan alel ili da uopšte ne učestvuje u specifičnom prepoznavanju, nego u prenosu signala u AI odgovoru (Hayman, 1992). Mehanizam AI trava je najbolje proučen kod Papaver rhoeas gde je pokazano da PrpS, mali transmembranski protein polena (oko 20 kDa) i PrsS, mali cisteinom bogati protein tučka interaguju i pokreću Ca2+ zavisan signalni put, koji dovodi do zaustavljanja rasta polenove cevi, izmena u citoskeletu i programirane ćelijske smrti inkompatibilnog polena (Franklin-Tong i sar., 1993; 2002; Wheeler i sar., 2009; Klaas i sar., 2011; Wu i sar., 2011; de Graaf i sar., 2012). 1.5. Auto-inkompatibilni sistemi heteromorfnih cvetnica Heteromorfnost je znatno ređa osobina od homomorfnosti, javlja se u otprilike 28 biljnih familija sa nekoliko rodova (Ganders, 1979; Gibbs, 1990; Barrett i sar., 2000; Steinbachs i Holsinger, 2002). Kod svih do danas zabeleženih heteromorfnih AI vrsta sprečavanje ukrštanja u srodstvu/samooplođenja ostvareno je kombinacijom genetski determinisanog polimorfizma cvetova i dialelskog sporofitnog AI odgovora. Za razliku od homomorfnih AI vrsta kod kojih postoji i gametofitna i sporofitna determinacija AI (pogledati pod 1.1.1.), među heteromorfnim AI vrstama do danas su identifikovane jedino sporofitne AI vrste. Kao jedini u literaturi predloženi kandidati za S-faktore heteromorfnog sporofitnog AI odgovora za sad su spomenuti fitohemaglutinini i peroksidaza apoplasta tučka (Golynskaya i sar., 1976; Carraro i sar., 1996). Međutim, ne postoje još nikakvi eksperimentalni dokazi o njihovoj uključenosti u AI odgovor, a takođe ih treba uzeti sa rezervom budući da su, u to isto vreme početaka istraživanja AI sistema, za kandidate sporofitnih i gametofitnih homomorfnih AI sistema predložene peroksidaze i lektini, što su rezultati skorijih istraživanja opovrgli. Iako je do danas prikupljeno dosta podataka o genima i proteinima uključenim u homomorfne sporofitne i gametofitne AI sisteme 19 cvetnica, proučavanje heteromorfnih sporofitnih AI sistema tek je otpočelo i za sada nema konkretnijih podataka o njihovoj molekularnoj osnovi. Istraživanja molekularne osnove heteromorfne AI započela su u rodovima Turnera (Athanasiou i Shore, 1997; Shore i sar., 2006; Safavian i Shore, 2010), Primula (Manfield i sar., 2005; Li i sar., 2007; McCubbin, 2006; 2008) i Fagopyrum (Miljuš-Đukić i sar., 1998, 2003; Jotaro i sar., 1999; Matsui i sar., 2004, 2007), ali za sada je sakupljeno vrlo malo podataka o njima. Za početak je poznato da svi predstavnici ispoljavaju sporofitnu determinaciju AI i da se mesto zaustavljanja rasta sopstvene polenove cevi razlikuje između dva morfa kod proučavanih Turnera joelii, T. scabra, Primula vulgaris i Fagopyrum essulentum Moench. Kod svih "tram" cvetova do zaustavljanja rasta inkompatibilne polenove cevi dolazi na žigu tučka ili spoju žiga i stubića tučka, dok kod "pin" cvetova do zaustavljanja dolazi kasnije, na otprilike 2/3 dužine stubića tučka. Pošto je kod heteromorfnih sporofitnih AI sistema genetska determinacija morfa cveta kombinovana sa AI odgovorom, pretpostavljeno je da kod takvih AI vrsta postoji S-supergen, lociran blizu centromere hromozoma kao regiona u kom su suprimirane rekombinacije, koji sadrži veći broj alela koji se vezano nasleđuju, a koji određuju više osobina cveta, kao što su dužina stubića tučka, visina antera, veličina polenovih zrna i auto-inkompatibilnost. Za razliku od homomorfne sporofitne AI, koja ima više različitih S-alela uključenih u AI odgovor, S-gen zadužen za heteromorfni AI odgovor postoji samo u vidu dva alela, od kojih S pokazuje potpunu dominantnost nad s (Matsui i sar., 2004). I kod Primula i kod Fagopyrum dominantni alel je prisutan u "tram" morfu, koji genotipski predstavlja dominanti heterozigot (Ss), dok je "pin" recesivni homozigot (ss) (Kurian i Richards, 1997; McCubbin, 2008; Matsui i sar., 2004; 2007). Za dominantnost S nad s je pokazano da je potpuna i u tučku i u polenu, kao i da opstaje čak i kod tetraploidnog genotipa Ssss (Dowrick, 1956). Iako se ne zna kako je dominantnost postignuta u heteromorfnoj AI, smatra se da se ona najverovatnije ostvaruje putem utišavanja recesivnog alela, kao i da je to utišavanje reverzibilno (npr. reverzibilna DNK metilacija), budući da su aleli funkcionalni u "pin" potomstvu "tram" biljaka. 20 Heteromorfna sporofitna auto-inkompatibilnost Primula Prvi molekularni podaci o auto-inkompatibilnosti Primula (Primulaceae) tj. jagorčevina uključuju sekvencu 8,8 kb dugog fragmenta genomske DNK, koji se nalazi u blizini S-lokusa i za koji je ustanovljeno da je repetitivne strukture i da sadrži dosta sekvenci nalik retrotranspozonu. Time podseća na strukturu sekvenci blisko vezanih S- lokusu homomorfnih AI vrsta, a uočena akumulacija navedenih strukturnih elemenata je saglasna sa izveštajima o smanjenoj rekombinaciji unutar S-lokusa ili njemu bliskog regiona (Manfield i sar., 2005). Najnoviji podaci o AI Primula uključuju identifikaciju dva fragmenta komplementarne DNK, koji su povezani sa S-lokusom. Geni koji određuju ove komplementarne DNK nazvani su PvSLL1 i PvSLL2. Analiza sekvenci otkrila je da PvSLL2 pokazuje homologiju sa Arabidopsis "Constans-like" genskom familijom, dok je PvSLL1 potencijalno potreban za sintezu malog transmebranskog molekula sličnog At1g72020 proteinu Arabidopsisa za sada neutvrđene funkcije (Li i sar., 2007). Pored toga, identifikovana su tri PvSLL1 alela (dva recesivna i jedan dominantan), što je interesantno jer tradicionalni model dialelskog lokusa heteromorfnih AI sistema predviđa samo dva. Ovo može ukazivati na akumuliranje polimorfizama u alelima koji imaju istu funkciju, ali budući da je analiza sekvenci pokazala različita vremena divergencije recesivnih i dominantnog alela, to dovodi u sumnju uključenost ovih gena u heteromorfnu AI jagorčevine. Iako do sada sakupljeni podaci nisu pružili odgovore na ključna pitanja o heteromorfnoj sporofitnoj AI (npr. koji geni su nosioci S-specifičnosti razlikovanja sopstvenog i nesopstvenog polena, koji proteini učestvuju u odbacivanju polena prepoznatog kao sopstvenog i na koji način), istraživanja su nastavljena, tako da možemo očekivati nove podatke uskoro, a moguće i neke odgovore o molekularnoj osnovi ovih sistema. 21 1.6. Heljda (Fagopyrum esculentum Moench) Heljda (Fagopyrum esculentum Moench) pripada familiji Polygonaceae i prema jedinim podacima dostupnim u literaturi vodi poreklo od divljeg srodnika Fagopyrum esculentum iz provincije Junan u južnoj Kini (Ohnishi, 1991). Rod Fagopyrum pored heljde uključuje još oko 14 vrsta, većinom diplodne vrste poput F. tataricum, F. urophyllum, F.gracilipes, F. leptopodum, ali i F. cymosum i F. esculentum, koje su autotetraploidi (Woo i sar., 2008). Kao dimorfna biljna vrsta, heljda ima dva morfološki različita tipa cveta nazvanih "pin" (dugačak stubić tučka, kratke antere, sitnije polenovo zrno) i "tram" (kratak stubić tučka, dugačke antere, krupnije polenovo zrno) (Slika 1). A, "Pin" cvet heljde B, "Tram" cvet heljde Slika 1. Morfološki izgled dva tipa cveta heljde (Fagopyrum esculentum Moench): A,"pin" cvet; B, "tram" cvet (slika je preuzeta iz Marshall, 1980). Usled delovanja heteromorfne sporofitne AI kod heljde do oplođenja može doći samo između "pin" i "tram" cvetova (kompatibilno oprašivanje), dok je između cvetova iste morfologije sprečeno oplođenje (inkompatibilno oprašivanje) (Miljuš-Đukić i sar., 1998; 2003; Jotaro i sar., 1999). 22 Slika 2. Rast polenovih cevi nakon inkompatibilne i kompatibilne polinacije dva morfa tučkova heljde (Fagopyrum esculentum Moench) posmatran pod fluorescentnim mikroskopom: A, auto-inkompatibilna polinacija "pin" tučka; B, kompatibilna polinacija "pin" tučka; C, auto-inkompatibilna polinacija "tram" tučka; D, kompatibilna polinacija "tram" tučka. 23 Fluorescentnim mikroskopiranjem vizuelizovan je rast polenovih cevi nakon inkompatibilnih i kompatibilnih oprašivanja tučkova oba morfa heljde. Ustanovljeno je da se nakon inkompatibilne polinacije rast polenove cevi zaustavlja na 2/3 dužine stubića tučka kod "pin" cveta (Slika 2A), dok se kod "tram" cveta zaustavlja na samom žigu tučka (Slika 2C). U slučaju kompatibilnih oprašivanja i kod "pin" i kod "tram" cvetova heljde polenove cevi rastu čitavom dužinom stubića tučka do plodnika gde će doći do oplođenja (Slika 2B, 2D). Heteromorfna sporofitna auto-inkompatibilnost heljde Analizom rezultata ukrštanja AI heljde sa samooplodnim linijama heljde (dobijenim spontanim prirodnim mutacijama ili mutacijama izazvanim zračenjem), kao i ukrštanja heljde sa njenim samooplodnim divljim srodnikom F. homotropicum, uz spašavanje embriona, zaključeno da je heljdin AI sistem pod kontrolom S-supergena. Ovaj supergen sadrži više blisko vezanih gena koji se zajedno nasleđuju, a to su geni koji određuju morfološke karakteristike cveta (dužinu tučka, visinu antera, veličinu polenovog zrna) i bialelski S-gen odgovoran za AI fenotip polena i tučka (Matsui i sar., 2003). Među alelima gena koji određuju AI fenotip polena i tučka, postoji dominantno-recesivan odnos u kom je alel S dominantan nad s (tako su "tram" biljke dominantni heterozigoti za S-alel tj. Ss, dok su "pin" biljke recesivni homozigoti, ss). Takođe, rezultati ukrštanja su ukazali na to da je alel Sh (poreklom iz F. homotropicum), odgovoran za auto-kompatibilnost heljde, isti kao i gen koji je odgovoran za inkompatibilnost, samo da je nastao rekombinacijom unutar S-supergena, pri čemu inkompatibilni S-aleli stoje u sledećem odnosu prema njemu: S > Sh > s (Tabela 1) (Woo i sar., 1999; Matsui i sar., 2003). A pošto se "tram" polen, nezavisno od svog haploidnog genotipa, u svim ukrštanjima uvek ponašao kao da ima dominantni S-fenotip, zaključeno je da je AI fenotip polena heljde sporofitno determinisan. 24 Pored toga, predloženo je da heljda, kao i Primula, najverovatnije sadrži poligene izvan S-lokusa, koji kontrolišu intenzitet AI odgovora (Mather i de Winton, 1941). Smatra se da ovi geni, nazvani modifikatori, imaju zajedničke tri glavne karakteristike: 1) polen je kompatibilan sa tučkovima svih tipova cvetova, a njegova kompatibilnost je pod uticajem genetske osnove biljaka na koje dospeva; 2) morfologija cvetova F1 generacije pod kontrolom je genotipa S-lokusa; 3) F1 biljke imaju visoku auto-kompatibilnost, mada je nivo kompatibilnosti pod uticajem njihovog genetskog porekla (Matsui i sar., 2007). Tabela 1. Prikaz očekivanih odnosa dominantnosti između alela S, s, Sh (Sh označava S-alel srednje dužine tučka, tj. duži od "tram", ali kraći od pin "tučka"). Prikazani odnosi S-alela zasnovani su na odnosima dominantnosti između alela koji određuju dužinu tučka (g) i visinu antera (a) (preuzeto iz Matsui i sar., 2003). S-genotip s/s Sh/Sh S/s Sh/s S/ Sh Genotip dužine stubića tučka (g) i visine antera (a) ggaa ggAA GgAa ggAa GgAA Fenotip dužine stubića tučka (g) i visine antera (a) ga gA GA gA GA Morf cveta pin Tučak srednje dužine tram Tučak srednje dužine tram Odnos S-alela / / S>s Sh >s S>Sh Do nedavno jedini dostupni podaci o S-lokusu heljde uključivali su potvrdu da se nalazi blizu centromere hromozoma, na šta su ukazivali markeri S-regiona koji su sadržali repetitivne sekvence, od kojih su neke pokazivale homologiju sa centromernim regionom Arabidopsis i pirinča (Aii i sar., 2004). Zatim je objavljena mapa genoma heljde kroz osam grupa vezanosti markera različitih gena, u kojima je pokazano da je marker za distilnu auto- 25 inkompatibilnost blisko vezan markeru za rasejavanje semena i da su oba smeštena blizu centra grupe vezanosti 1 (Yasui i sar., 2004). Ubrzo su konstruisane i biblioteke F. homotropicum (Nagano i sar., 2005) i F. esculentum Moench u veštačkim bakterijskim hromozomima (Yasui i sar., 2008), koje su bile namenjene razvijanju markera za poziciono kloniranje S-lokusa heljde sa ciljem analize S-supergena, a onda je u poslednjih pet godina i razvijen niz molekularnih markera koji segregiraju sa određenim osobinama heljde, uključujući tu i auto-inkompatibilnost. U međuvremenu je sekvenciran i transkriptom cveta dve vrste heljde, Fagopyrum esculentum i F. tataricum, što je pružilo značajan set novih sekvenci koje omogućavaju detekciju novih gena heljde (Logacheva i sar., 2011). Autori su objavili da su detektovali gene koji su različito eksprimirani između ove dve vrste među kojima se nalaze geni retrotranspozona i geni uključeni u biosintezu i metabolizam šećera, kao i rezultate filogenetske analize zasnovane na genima koji su bili prisutni u jednoj kopiji po genomu, ali za sada ništa o genima potencijalnog S-supergena heljde. Nezavisno od istraživanja transkriptoma cveta heljde, druga grupa autora je ispitivala razlike u ekspresiji gena u tučkovima dva morfa heljde i tako identifikovala gen eksprimiran samo u "tram" tučkovima, koji je bio u potpunosti vezan za S-lokus, a pokazivao je homologiju sa grupom gena odgovornih za rano cvetanje ("EARLY FLOWERING 3"), zbog čega je nazvan S- ELF3. Rezultati ispitivanja idu u prilog tome da je ovaj gen najverovatniji kandidat za gen koji kontroliše fenotip kratkog stubića tučka kod heljde (Yasui i sar., 2012). Kada je reč o ostalim molekulima nizvodne kaskade AI odgovora heljde, za sada jedini podaci dostupni u literaturi su rezultati proistekli iz tretmana "pin" i "tram" tučkova heljde fosfataznim inhibitorima i antagonistima kalcijuma, koji su doveli do sprečavanja inhibicije rasta polenovih cevi, ukazujući na to da su protein fosfataze i kalcijumom posredovani signalni putevi neophodna komponenta AI odgovora heljde (Miljuš-Ðukić i sar., 2003). Nakon toga detektovano je i specifično prisustvo proteina od 50 kDa u proteinskim izolatima auto-inkompatibilno oprašenih "tram" tučkova, međutim identitet ovog proteina ostao je nepoznat (Miljuš-Ðukić i sar., 2004). Podaci o proteinima heljde koji postoje u literaturi do danas uključuju samo proteine semena (Radović i sar., 1996; Watanabe i sar., 1998; Momma, 2009; Katsube-Tanaka i sar., 2011) i proteine lista heljde (Shin i sar., 2010), 26 među kojima ne očekujemo prisustvo proteina koji učestvuju u AI odgovoru, jer traženi S- proteini imaju tkivno-specifičnu ekspresiju ograničenu samo na tučkove odnosno polen heljde. Heljda je izabrana kao model organizam za istraživanje AI sistema zbog toga što predstavlja poljoprivredno značajnu biljnu vrstu, vrlo dobrih nutritivnih karakteristika, koja se koristi za ishranu ljudi i životinja, kao i za pravljenje farmaceutskih proizvoda. Njena vrednost u ishrani je visoka, jer pored toga što ima dobro izbalansirani sadržaj esencijalnih aminokiselina i što sadrži antioksidant rutin, ona sadrži i druge biološki aktivne proteine, koji npr. snižavaju holesterol i hipertenziju (Woo i sar., 2008). Gaji se širom sveta (Kina, Japan, Brazil, SAD, Rusija, Poljska, Francuska, Slovenija, itd.), ali njen nizak i nestabilan prinos, niska proizvodnja semena, kao i otpornosti na introgresiju drugih gena iz srodnih vrsta, što je sve uglavnom posledica delovanja AI sistema, doveli su do potrebe razvijanja različitih strateških programa za oplemenjivanje heljde (Woo i sar., 1999a). Svi programi za oplemenjivanje heljde imaju za cilj uvođenje kompatibilnosti ili nekih drugih poljoprivredno poželjnih osobina (iz heljdinih divljih srodnika) u postojeće AI linije heljde i stvaranje fertilnog hibridnog potomstva poboljšanih osobina. Neki ovakvi pokušaji ukrštanja su bili uspešni, ali mnogi su uspešno ostvareni samo uz spašavanje embriona (Samimy i sar., 1996; Campbell, 1997; Chen, 1999; Woo i sar., 1999b; 2008; Aii i sar., 2001; 2004; Ölschhläger i sar., 2004; Konishi i Ohnishi, 2006; Pan i Chen, 2010). Upravo zbog toga je i upoznavanje molekularne osnove auto-inkompatibilnog sistema heljde od interesa, jer bi moglo da doprinese postojećim programima oplemenjivanja tako što bi olakšalo proces dobijanja samooplodnih i drugih hibridnih linija, kao i kroz dizajn novih markera za efikasniju markerima posredovanu selekciju hibrida željenih osobina. Pored značaja za poljoprivredu, prikupljeni podaci doprineli bi i boljem razumevanju heteromorfnih sporofitnih auto-inkompatibilnih sistema, koji su za sada najslabije proučeni AI sistemi cvetnica. 27 1.8. Značaj proučavanja auto-inkompatibilnih sistema u poljoprivredi Iako su mnoge poljoprivredno značajne biljne vrste samooplodne (npr. suncokret, pšenica), ima i onih koje su auto-inkompatibilne (npr. badem, kajsija, kruška, heljda, itd.). Da bi ove vrste, koje imaju aktivne AI sisteme, plodonosile, one moraju biti zasejane sa kompatibilnim partnerima, a takođe su im neophodni i oprašivači, pri čemu ni plodonošenje ni prinos nisu zagarantovani. Budući da samooplodnost osigurava plodonošenje, uklanjajući potrebu za identifikacijom i testiranjem kompatibilnih partnera, kao i potrebu za oprašivačima, što sve snižava cenu uzgajanja, ona se pojavljuje kao vrlo poželjna osobina u poljoprivredi (Dicenta i Gracia, 1993; Nomura i sar., 2002; Niroula i sar., 2006; Hafizi i sar., 2013). Zato je i proučavanje AI sistema od velikog interesa za poljoprivredu, jer se upoznavanjem ovih sistema može omogućiti i kreiranje samooplodnih linija, bilo kroz selekciju spontano nastalih samooplodnih jedinki (nastalih spontanim mutacijama S- gena/modifikujućih gena), bilo kroz ciljano ukidanje AI odgovora metodama genetičkog inženjerstva. Iako je samooplodnost cenjena osobina u poljoprivredi, zbog problema inbriding depresije koji se može javiti posle nekoliko generacija samooplodnje, potrebno je proizvoditi i nove samooplodne linije, u cilju izbegavanja negativnih efekata inbridinga (npr. smanjenje prinosa i kvaliteta ploda). U prirodi se spontano dešavaju mutacije koje dovode do samooplodnosti tj. slamanja auto-inkompatibilnosti, npr. kroz poliploidiju, kroz mutacije u genima koji determinišu AI fenotipove polena ili tučka, itd. Oplemenjivači izdvajaju te jedinke i koriste ih u različito dizajniranim ukrštanjima, a sve sa ciljem da obezbede fertilno potomstvo koje će naslediti kombinaciju željenih osobina roditelja. Ovo je dugotrajan proces, koji bi se mogao značajno ubrzati razvojem markera koji segregiraju sa poželjnim osobinama, pomoću kojih bi proces identifikacije jedinki koje nose željene osobine i potomstva koje je nasledilo te osobine bio ubrzan. Proučavanje AI sistema upravo omogućuje razvijanje takvih markera, što je još jedan od poloprivredno značajnih doprinosa istraživanja ovog tipa. 28 2. CILJEVI RADA Cilj istraživanja bio je da se ispita molekularna osnova heteromorfnog sporofitnog auto- inkompatibilnog sistema heljde kroz: Ø Ispitivanje prisustva gena homolognih genima za koje je poznato da su uključeni u auto-inkompatibilni odgovor drugih biljnih vrsta upotrebom prajmera specifičnih za AI gene drugih biljnih vrsta na genomskoj DNK heljde u polimeraznoj lančanoj reakciji umnožavanja i sekvenciranje produkata umnožavanja; Ø Umnožavanje regiona genomske DNK heljde u neposrednoj blizini S-lokusa upotrebom prajmera specifičnih i poluspecifičnih za sekvencu blisko vezanu heljdinom S-lokusu u asimetričnoj polimeraznoj lančanoj reakciji umnožavanja i sekvenciranje produkata umnožavanja; Ø Analizu sekvenci genomske DNK heljde u programima koji omogućavaju predviđanje otvorenih okvira čitanja, egzon-intron struktura i iz njih izvedenih aminokiselinskih sekvenci, kao i poređenje sa DNK i aminokiselinskim sekvencama prisutnim u bazama podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije; Ø Ispitivanje potencijalne uloge za membranu vezanih Ca2+ zavisnih protein kinaza C (PKC) u auto-inkompatibilnom odgovoru heljde, kroz praćenje efekta tretmana tučkova oba morfa PKC-inhibitorom na rast polenovih cevi nakon inkompatibilnih i kompatibilnih polinacija tretiranih i netretiranih tučkova; Ø Izolaciju ukupnih proteina polena, neoprašenih, kompatibilno i auto-inkompatibilno oprašenih tučkova "pin" i "tram" cvetova heljde i njihovo 2D-PAGE razdvajanje; 29 Ø Detekciju proteina koji su specifično prisutni u 2D proteinskim profilima "pin" ili "tram" tučkova i polena, odnosno u profilima njihovih auto-inkompatibilnih odgovora. 30 3. MATERIJAL I METODE 3.1. Biljni materijal Heljda (Fagopyrum esculentum Moench) je gajena u stakleniku Instituta za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, u optimalnim uslovima. Neposredno po dostizanju reproduktivne zrelosti biljaka i započinjanju perioda cvetanja, u periodu od 14 dana, sakupljani su listovi i cvetovi sa "pin" i "tram" biljaka. Listovi su upotrebljavani sveži za izolaciju genomske DNK, dok su iz cvetova izolovani tučkovi i polen. Postupak sakupljanja biljnog materijala ponovljen je pet puta. Izolovanim neoprašenim tučkovima plodnici su uklonjeni odmah po izolaciji (sterilnim skalpelom), dok su tučkovima koji su ručno inkompatibilno i kompatibilno oprašivani (pod binokularnim mikroskopom-lupom PXS-V1) plodnici uklonjeni tek 1,5 h nakon polinacije, a u međuvremenu su držani na podlogama za germinaciju polena (1% agar, 15% saharoza, 100 mg/l H3BO3, 300 mg/l Ca(NO3)2x4H2O, 200 mg/l MgSO4x7H2O, 100 mg/l KNO3) (Brewbaker i Kwack, 1963). Sakupljeno je ukupno osam klasa uzoraka: "pin" i "tram" polen, neoprašeni "pin" i "tram" tučkovi, inkompatibilno oprašeni "pin" i "tram" tučkovi (1.5 h nakon polinacije), kompatibilno oprašeni "pin" i "tram" tučkovi (1.5 h nakon polinacije). Uzorci su uskladišteni na -80°C do upotrebe. 3.2. Bakterijske procedure 3.2.1. Medijumi za uzgajanje bakterija LB: 1% (w/v) Tripton; 1% (w/v) NaCl; 0,5% (w/v) ekstrakt kvasca, pH podešen na 7,5 pomoću 10N NaOH (Sambrook i sar., 1989). 31 LA: Čvrsti LB medijum, napravljen dodavanjem 1,5% (w/v) agara i 100 µg/ml ampicilina u tečni LB medijum (Sambrook i sar., 1989). 3.2.2. Bakterije i plazmidi Korišćen je soj bakterija E.coli DH5α K12, genotipa F- 80dlacZ M15 (lacZYA- argF) U169 recA1 endA1hsdR17(rk-, mk+) phoAsupE44 -thi-1 gyrA96 relA1. Plazmid korišćen za kloniranje produkata lančanog umnožavanja DNK bio je pJET vektor (CloneJet PCR Cloning kit, Fermentas). Ovaj vektor kao selektivni marker poseduje gen za rezistenciju na ampicilin. 3.2.3. Uzgajanje i održavanje bakterija Transformisane bakterije uzgajane su preko noći na 37°C na čvrstom ili tečnom LB medijumu uz dodatak ampicilina. Za dugoročnu upotrebu, kulture transformisanih bakterija zamrzavane su na -80°C u 15% (v/v) glicerolu. 3.2.4. Transformacija E.coli toplotnim šokom Transformacija kompetentnih ćelija E.coli DH5α K12 toplotnim šokom podrazumevala je da se bakterije i ligaciona smeša inkubiraju zajedno 10 min na ledu, a zatim prebace 45 sekundi u vodeno kupatilo na 42°C i vrate na led 2 min. U 100 µl transformisanih E.coli DH5α K12 ćelija dodavano je po 900 µl LB medijuma i bakterije su inkubirane 1h na 37°C uz intenzivno mešanje, nakon čega su razmazivane na LA podloge sa ampicilinom. Posle prekonoćnog rasta na 37°C pojedinačne kolonije su prebacivane u tečni LB medijum, u kom su ostavljene preko noći na 37°C uz intenzivno mešanje. Dobijene prekonoćne kulture, poreklom od pojedinačnih bakterijskih klonova, korišćene su za dalje analize prisustva inserta očekivane dužine. 32 3.3. Osnovne procedure rada sa DNK 3.3.1. Izolovanje biljne genomske DNK Listovi "pin" i "tram" biljaka heljde su neposredno nakon uzimanja sa biljaka preneti u avane i uz dodatak tečnog azota mehaničkim usitnjavanjem samleveni u fini prah. Izolacija genomske DNK iz sprašenih listova rađena je po protokolu Doyle i Doyle (1987). Po 100 mg uzorka prebačeno je u plastične tube u koje je dodavano 750 µl CTAB (cetil-trimetil-amonijum bromid) pufera (2% CTAB; 1.4M natrijum hlorid; 20 mM EDTA; 100 mM Tris pH 8, 2% PVP 40, 1% β-merkaptoetanol) zagrejanog na 65°C. Uzorak je inkubiran 3 min na 65°C u vodenom kupatilu uz povremeno mešanje uzorka obrtanjem tube. Zatim je u uzorak dodavano po 750 µl SEVAG rastvora (hloroform i izoamil alkohol u zapreminskom odnosu 24:1), uzorci su mešani 3 min obrtanjem tube i centrifugirani 10 min na 13,000 obrt/min (Minispin, Eppendorf). Gornja faza uzorka preneta je u novu plastičnu tubu. Ponovljen je korak ispiranja SEVAG rastvorom. Nakon dodavanja hladnog izopropanola (na -20°C) supernatantu, u zapremini jednakoj 2/3 zapremine uzorka, uzorak je promešan obrtanjem tube i centrifugiran 5 min na 13,000 obrt/min. Nakon toga, gornja faza je odbačena, a talog ispran sa 500 µl hladnog 70% etanola (na -20°C) obrtanjem tube i centrifugiranjem 5 min na 13,000 obrt/min. Posle centrifugiranja, etanol je odbačen, a talog osušen 10 min u rotavaporu (Concentrator 5301, Eppendorf). Suv talog rastvoren je u 50 µl vode i posle dodavanja RNaze A (10 µg/ml) inkubiran 30 min na 30°C da se ukloni RNK iz izolata. Koncentracija i čistoća izolovane genomske DNK proverene su na aparatu "Nanovue" (GE Healthcare). Izolati genomske DNK, koji nisu odmah korišćeni, skladišteni su na -20°C. 3.3.2. Izolovanje plazmida iz bakterija Plazmidi su iz prekonoćnih bakterijskih kultura izolovani na dva načina, u zavisnosti od namene izolovanih plazmida. 33 Prvi način predstavlja izolaciju plazmida u cilju analize dobijenih klonova (koji se ne mogu koristiti za sekvenciranje) i izvodi se po brzoj proceduri na sledeći način: 1,5 mL prekonoćne bakterijske kulture je centrifugirano 2 min na 13,000 obrt/min i talog je resuspendovan u 300 µl TENS pufera (1M Tris-HCl, pH 8,0; 0,5M EDTA, pH 8,0; 10M NaOH; 20 % SDS). Smeši je dodavano 150 µl 3M Na-acetata pH 5,2 nakon čega je tuba snažno promešana i centrifugirana 2 min na 13,000 obrt/min. Supernatant je prebačen u nove tube u koje je dodavano po 1 ml hladnog 96% etanola (-20°C). Nakon centrifugiranja 10 min na 13,000 obrt/min talog je ispran 70% etanolom, osušen u rotavaporu i rastvoren u 20 µl bidestilovane vode. Drugi način predstavlja izolacija plazmida za preparativne svrhe (npr. za sekvenciranje plazmida), koja je urađena pomoću kita za izolaciju plazmida iz bakterija (GeneJET Plasmid Miniprep Kit, Thermo Scientific) prema uputstvu proizvođača. Prema proceduri 1,5 mL prekonoćne bakterijske kulture centrifugirano je 2 min na 13,000 obrt/min, a talog je resuspendovan u 250 µl rastvora za resuspenziju, 250 µl rastvora za liziranje ćelija i 350 µl rastvora za neutralizaciju, uz snažno mešanje uzorka nakon dodavanja svakog narednog rastvora. Nakon centrifugiranja 5 min na 13,000 obrt/min, supernatant je prebačen u GeneJET kolonice, centrifugiran 1 min, ispran sa po 500 µl rastvora za ispiranje dva puta (Centrifugiranje 1 min, eluat odbačen). Dodatnim centrifugiranjem kolonice pod istim uslovima eliminisani su tragovi etanola koji bi mogli da inhibiraju enzimske reakcije na prečišćenim plazmidima. DNK je zatim eluirana sa kolonice u 50 µl elucionog pufera. Ovako prečišćeni plazmidi korišćeni su za sekvenciranje ukloniranih fragmenata DNK. 3.3.3. Prečišćavanje umnoženih fragmenata DNK nakon reakcije umnožavanja Produkti umnožavanja su nakon reakcije lančanog umnožavanja prečišćavani od zaostalih prajmera, kratkih oligonuklotida i soli upotrebom kita za prečišćavanje produkata lančane reakcije umnožavanja (PCR Purification Kit, Qiagen) prema uputstvu proizvođača. 34 Prema protokolu u produkte umnožavanja dodavan je PB1 pufer (u odnosu 5 puta većem od zapremine uzorka), uzorak je snažno promešan i prebačen u QIAquick kolonice, centrifugiran 1 min na 13,000 obrt/min. Eluat je odbačen, a kolonica isprana sa 750 µl PE pufera, centrifugirana 1 min uz odbacivanje eluata. Dodatnim centrifugiranjem kolonice pod istim uslovima eliminisani su tragovi etanola koji bi mogli da inhibiraju enzimske reakcije na prečišćenim DNK fragmentima. DNK je zatim eluirana sa kolonice u 50 µl bidestilovane vode. 3.3.4. Elektroforeza na gelu od agaroze Produkti umnožavanja polimerazne lančane reakcije elektroforetski su razdvojeni na 1,5% (w/v) agaroznom gelu (od SeaKem GTG agaroze, FMC BioProducts, koja ne inhibira enzimske reakcije). U gel je dodato 0,5 µg/ml etidijum bromida. Za elektroforezu je korišćen TAE pufer (40mM Tris, 20mM sirćetna kiselina, 1mM EDTA) i raspon napona 5- 10 V/cm gela (Sambrook i sar., 1989). Nakon elektroforeze DNK je vizualizovana na UV transiluminatoru na talasnoj dižini od 266 nm. Kao standard za određivanje dužina umnoženih fragmenata DNK korišćen je 1kb Gene ruler (Thermo Scientific). 3.3.5. Prečišćavanje fragmenata DNK sa gela od agaroze Nakon elektroforeze fragmenti DNK isečeni su sa gela i prečišćeni upotrebom kita za ekstrakciju DNK iz gela (GeneJET Gel Extraction Kit, Thermo Scientific) prema uputstvu proizvođača. U tube sa isečcima gela dodavan je pufer za vezivanje za kolonicu (w:v=1:1) i tube su inkubirane 10 min na 60°C uz povremeno mešanje. Uzorak je zatim prebačen u GeneJET kolonice za prečišćavanje i centrifugiran 1min. Eluat je odbačen, a kolonice isprane sa 700 µl pufera za ispiranje, centrifugirane 1 min, uz odbacivanje eluata. Dodatnim centrifugiranjem kolonice pod istim uslovima eliminisani su tragovi etanola koji bi mogli da inhibiraju enzimske reakcije na fragmentima DNK ekstrahovanim sa gela. DNK je zatim eluirana sa kolonice u 50 µl elucionog pufera. 35 3.3.6. Digestija DNK restrikcionim enzimima Provera plazmida za inserte očekivanih dužina podrazumevala je parcijalne endonukleazne restrikcione digestije (za pJET plazmidni vektor dvostruku digestiju upotrebom restrikcionih enzima HindIII i XhoI). Digestije su postavljene prema uputstvu proizvođača 3h na 37°C i zaustavljene inkubacijom na 65°C. Restrikcionih fragmenti su razdvojeni elektroforezom na 1% agaroznom gelu sa etidijum bromidom u TAE puferu i vizualizovani pod UV svetlom. Plazmidi za koje je potvrđeno da sadrže insert DNK očekivane veličine korišćeni su za sekvenciranje. 3.3.7. Ligacija DNK sa plazmidnim vektorima Prečišćeni DNK fragmenti su pripremljeni za ligaciju tako što su prvo tretirani enzimom za poravnanje krajeva fragmenta. Smeša je sdražala: 1 X pufera, 1 µl DNK enzima za poravnanje krajeva inserta, 1µl eluata i sterilne vode do 17 µl. Sastojci su kratko promešani, preneti na 70°C u trajanju od 5 min i zatim prebačeni na led. U smešu za ligaciju dodati su 1µl vektora i 1µl T4 DNK ligaze i smeša je inkubirana 15 min na sobnoj temperaturi. Sve komponente smeše za ligaciju sadržane su u kitu za kloniranje (CloneJet PCR Cloning kit, Fermentas). 3.3.8. Sekvenciranje DNK Kapilarno sekvenciranje transformisanih plazmida urađeno je pomoću para pJET 1.2 prajmera za pJET plazmidni vektor na ABI3730XL DNK analizatoru (Applied Biosystems) od strane kompanije "Macrogen" (http://www.macrogen.com). 36 3.3.9. Kompjuterska analiza sekvenci Nukleotidne sekvence umnoženih segmenata heljdine DNK prečišćene su od kontaminacije vektorskom sekvencom upotrebom programa "Vecscreen", koji identifikuje nizove nukleotida visoko sličnih sekvenci plazmidnog vektora koji je upotrebljen za kloniranje segmenta DNK (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/). Pomoću programa "ORF Finder" i "GENESCAN" sekvence su analizirane za prisustvo otvorenih okvira čitanja i egzon-intron struktura, respektivno. Sekvence su ispitivane i za prisustvo repetitivnih elemenata ("REPFIND") i različitih DNK motiva ("MelinaII"), a određen je i procentualni udeo dezoksiguanozina i dezoksicitozina (GC% sadržaj) sekvenci upotrebom programa za GC% izračunavanje dostupnog na Internetu (http://www.molbiol-tools.ca/). Predviđena je i aminokiselinska sekvenca koju parcijalne nukleotidne sekvence kodiraju (automatska funkcija programa "ORF Finder" i "GENESCAN" ili "ExPASy"). Upotrebom "BLASTN" i "BLASTP" programa pretraživane su nukleotidne i aminokiselinske sekvence prijavljene u bazama podataka Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 3.4. Reakcija lančanog umnožavanja segmenata DNK 3.4.1. Umnožavanje homologa AI gena homomorfnih AI sistema Brassicaceae Izrođeni prajmeri dizajnirani su na osnovu evolutivno očuvanih regiona SRK, SLG, SP11 i MLPK sekvenci Brassica rapa, dostupnih u DNK bazama podataka (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sekvence prajmera i njihove optimalne temperature sparivanja date su u Tabeli 2. 37 Smeša za reakciju lančanog umnožavanja sadržala je: 1X pufer; 2 µl rastvora Q; 1mM MgCl2; 0.2 mM smeše dezoksiribonukleotida; 0.25 µM svakog prajmera; 0.5 jedinica Taq polimeraze; 100 ng genomske DNK heljde (kit Taq DNK polimeraza, Qiagen). Uslovi lančanog umnožavanja za AI gene Brassica bili su sledeći: 1. Inicijalna denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 2 min; 2. 34 ponavljanja ciklusa: denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 1 min; T sparivanja u trajanju od 1 min, polimerizacija na 72ºC u trajanju od 1 min; 3. Finalna elongacija produkta umnožavanja na 72ºC u trajanju od 10 min. 3.4.2. Umnožavanje homologa AI gena homomorfnih gametofitnih AI sistema Prunus (Rosaceae) Ispitivanje prisustva homologa S-RNaza i SFB gena roda Prunus sprovedeno je upotrebom specifičnih prajmera za ove gene (Sonneveld i sar., 2003; Ortega i sar., 2005; Vaughan i sar., 2006). Sekvence prajmera, kao i temperature sparivanja date su u Tabeli 2. Smeša za reakciju lančanog umnožavanja bila je ista kao za umnožavanje homologa AI gena Brassica. Uslovi lančanog umnožavanja za S-RNazni gen bili su sledeći: 1. Inicijalna denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 2 min; 2. 34 ponavljanja ciklusa: denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 1 min; T sparivanja u trajanju od 2 min, polimerizacija na 68ºC u trajanju od 4 min; 3. Finalna elongacija produkta umnožavanja na 68ºC u trajanju od 10 min. Uslovi lančanog umnožavanja za SFB gen bili su sledeći: 1. Inicijalna denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 2 min; 2. 29 ponavljanja ciklusa: denaturacija DNK na 94ºC u trajanju od 45 sec; T sparivanja u trajanju od 1 min, polimerizacija na 68ºC u trajanju od 3 min; 3. Finalna elongacija produkta umnožavanja na 68ºC u trajanju od 10 min. 38 Produkti umnožavanja su razdvojeni elektroforezom na 2% agaroznom gelu u TAE puferu (0,04M Tris-acetat, 1 mM EDTA), obojeni etidijum bromidom i vizualizovani pod UV svetlom (Biodoc Analyze, Biometra). Tabela 2. Nukleotidne sekvence prajmera specifičnih za AI gene rodova Brassica (Brassicaceae) i Prunus (Rosaceae) i njihove optimalne temperature sparivanja, koji su korišćeni za ispitivanje prisustva homologa ovih gena u genomu heljde reakcijom polimeraznog lančanog umnožavanja. 3.4.3. Umnožavanje segmenata genomske DNK heljde blisko vezanih sa S- lokusom Smeša za reakciju lančanog umnožavanja sadržala je: 1X pufer; 1 mM MgCl2; 0.2 mM svakog dezoksiribonukleotida; 0.25 µM svakog prajmera; 0.5 jedinica Taq polimeraze; 100 ng genomske DNK heljde (Taq DNK polimeraza, Fermentas). Prajmer Sekvenca prajmera T (ºC) SRK_f 5'-TCITT(C/T)GA(C/T)TA(C/T)CCICANGA(C/T)-3 62 SRK_r 5'-CATICC(A/G)AA(A/G)TCIG(A/T)DAT(C/T)TTN-3' 62 SLG_f 5'-GG(A/T)GATGT(C/T)TT(C/T)GA(A/G)(C/T)TNGG-3' 63 SLG_r 5'-(A/G)AAICC(C/T)TG(A/G/T)AT(A/G)CA(A/G)TT(A/G)CA-3' 63 SP11_f 5'-TAACTAA(A/G)AT(A/C/T)CA(C/T)TA(C/T)(C/T)TNTG-3' 62 SP11_r 5'-TAIGA(C/T)TTIAC(C/T)TT(A/G)CA(A/G)CA(A/G)TA(A/G)C-3' 62 MLPK_f 5’-T(A/T)(C/T)AA(A/G)GG(A/G/T)TGGAT(C/G/T)GATG-3’ 52.6 MLPK_r 5'-GT(A/G)GA(A/C/T)AC(A/G)TG(A/G)CT(A/C/T)TT(A/C/G)TC(A/G)CC-3’ 52.6 S-RNaza_f 5’-(C/A)CTTGTTCTTG(C/G)TTT(T/C)GCTTTCTTC-3’ 50 S-RNaza_r 5’-CAAAATACCACTTCATGTAACA(A/G)C-3’ 50 SFB_f 5'-(C/T)GACATCCTAG(C/T)AAGACT(A/G/T)(A/C)C(A/T)G-3' 51 SFB_r 5'-AC(C/T)TG(C/T)TT(A/G)GATTC(A/G)TAAT(C/T)(A/C)C(A/C)CAA-3' 51 39 Prajmeri koji su upotrebljeni za umnožavanje kraćih fragmenata genomske DNK u neposrednoj blizini S-lokusa heljde razvijeni su iz N7 AFLP markera, blisko vezanog Sh alelu heljde (Nagano i sar., 2001). Nukleotidne sekvence prajmera navedene su u Tabeli 3. Tabela 3. Nukleotidne sekvence specifičnih (N7F1, N7F2, N7F3, N7R1, N7R2, N7R3 i N7- Eco+710 ) i arbitrarnih prajmera (AD1, AD2 i AD3) za fino mapiranje S-lokusa razvijene iz N7-AFLP markera, koji je blisko vezan Sh alelu S-lokusa heljde (Nagano i sar., 2001). Za umnožavanje nepoznatih sekvenci bliskih S-lokusu korišćena je reakcija termalnog asimetričnog lančanog umnožavanja, zasnovana na principu upotrebe jednog specifičnog i jednog kraćeg izrođenog arbitrarnog prajmera, u kojoj je relativna efikasnost umnožavanja specifičnih i nespecifičnih produkata temperaturno kontrolisana naizmeničnim smenjivanjem strožijih i manje strogih ciklusa umnožavanja. Uslovi reakcije, adaptirani iz Liu i Whittier (1995), navedeni su u Tabeli 4. Prajmer Sekvenca N7F1 5'-G A A A T C A C C C A T G G A G T A A G T G-3' N7F2 5'-(G/C) A C C C A T G G A G T A A G T G T T T C C-3' N7F3 5'-G G A G A C C A T G C G C T C T A C A A-3' N7R1 5'-G C C A A A C A T C T C G C G T A C C A G-3' N7R2 5'-T C G C G T A C CA G A G G G T G T G C-3' N7R3 5'-C C T T T G T G A A T G A G G T A C C C A C-3' AD1 5'-N G T C G A (G/C) (A/T) G A N A (A/T) G A A-3' AD2 5'-G T N C G A (G/C) (A/T) C A N A (A/T) G T T-3' AD3 5'-(A/T) G T G N A G (A/T) A N C A N A G A-3' N7-Eco+710 5'-C A C G C A A C C A G G T G A A C C T A C C-3' 40 Tabela 4. Uslovi reakcije termalnog asimetričnog polimeraznog lančanog umnožavanja i sekvenciranje produkata umnožavanja su adaptirani iz Liu i Whittier (1995). 3.5. Osnovne procedure rada na fluorescentnom mikroskopu 3.5.1. Tretman tučkova inhibitorom protein kinaza C Izolovani tučkovi iz oba morfa cvetova heljde ostavljeni su 24h na podlogama za germinaciju polena (Brewbacker i Kwack, 1963), u koje je dodato 100 µM i 200 µM inhibitora protein kinaza C (PKC) ili su bile bez inhibitora (kontrolne polinacije). Nakon isteka 24h tučkovi su uzeti sa podloga, inkompatibilno i kompatibilno oprašivani i ostavljeni još 24h na podlogama istog sastava bez inhibitora. Nakon toga tučkovi su uklonjeni sa podloge i pripremljeni za mikroskopiranje. 3.5.2. Priprema preparata za fluorescentno mikroskopiranje Priprema preparata za mikroskopiranje podrazumevala je fiksiranje tučkova u 25% sirćetnoj kiselini u etanolu u periodu od 48h, nakon čega su ispirani vodom i ostavljeni u Redni broj ciklusa Broj ponavljanja Uslovi reakcije asimetričnog lančanog umnožavanja 1 1 92°C (2 min), 95°C (1 min) 2 5 94°C (15 sek), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 3 1 94°C (15 sek), 30°C (3 min), 72°C (2 min) 4 10 94°C (5 sek), 44°C (1 min), 72°C (2 min) 5 12 94°C (5 sek), 63°C (1 min), 72°C (2 min) 94°C (5 sek), 63°C (1 min),72°C (2 min) 94°C (5 sek), 44°C (1 min), 72°C (2 min) 6 1 72°C (5 min) 41 7N NaOH naredna 24h. Sutradan su prvo ispirani u vodi i 50 mM kalijum fosfatnom puferu, a zatim preneti u rastvor anilin plave boje u kom su ostavljeni narednih 48h. Nakon toga, tučkovi su preneti na mikroskopske pločice, uz kap anilin plave boje, prekriveni pokrovnim staklom i ostavljeni 24h pre mikroskopiranja na 4°C. Za posmatranje pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51, CytoVision 3.1) korišćen je filter za anilin plavo. 3.6. Osnovne procedure rada sa proteinima 3.6.1. Priprema proteinskih izolata Postupak izolacije proteina podrazumevao je prvo mehaničko usitnjavanje tkiva polena/tučkova u plastičnim tubama uz dodavanje tečnog azota. U tube je dodat Lemlijev pufer (285 mM Tris, 20% glicerol, 1% Triton X-100) i mala količina polivinilpolipirolidona (PVPP) i nastavljeno je sa mehaničkim usitnjavanjem sve dok uzorci nisu bili homogenizovani. Nakon toga uzorci su centrifugirani 45 min u hladnoj centrifugi na 4°C 13,000 obrt/min (Centrifuge 5417R, Eppendorf). Posle centrifugiranja tečna faza koja je sadržala ukupne proteine polena/tučkova prebačena je u nove tube, a talog je odbačen. 3.6.2. Precipitacija proteina TCA/acetonom U proteinske izolate dodavano je 10% trihlorsirćetne kiseline u acetonu i tube su ostavljene na -20°C preko noći. Sutradan nakon centrifugiranja 1h u hladnoj centrifugi na 4°C 13,000 obrtaja tečna faza je odbačena, a talog ispiran acetonom dva puta (1h na -20°C i centrifugiranje 1h u hladnoj centrifugi na 4°C 13,000 obrtaja). Posle ispiranja acetonom talog je osušen 10 min u rotavaporu (Concentrator 5301, Eppendorf), a zatim rastvoren u puferu za izoelektrično fokusiranje (IEF pufer) (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 40 mM DTT) i ostavljen 2h na sobnoj temperaturi da se potpuno resolubilizuje, uz kratko 42 povremeno mešanje. Koncentracija proteina u svakoj od klasa uzoraka odredjena je kolorimetrijskom metodom prema Bradford (1976). 3.6.3. Jednodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-PAGE) Proteinski izolati vizuelizovani su SDS-PAGE metodom u diskontinuiranom sistemu gelova (modifikacija metode Laemmli, 1970). Proteinski uzorci su pripremljeni za elektroforezu tako što su rastvoreni u puferu za uzorak (125mM Tris, pH 6,8; 4% SDS; 20% glicerol;0,025% bromfenol plavo; 4% β-merkaptoetanol) i kuvani 3 min na 100°C. Gel za koncentrovanje sadržavao je 125mM Tris, pH 6,8; 0,1%SDS; 12% akrilamid (akrilamid:bisakrilamid=29:1). Gel za razdvajanje sadržavao je 375mM Tris, pH 8,8; 0,1% SDS; 5% akrilamid. Kao inicijator polimerizacije dodavan je 10% amonijum persulfat. Dimenzije gela bile su 8x5cm, a debljina 1 mm. Elektroforeza je vršena u TGB puferu (25mM Tris, 250mM glicin, 0.1% SDS) pri konstantnoj struji od 25 mA u sistemu za vertikalnu elektroforezu Biometra tip G42. Po završenoj elektroforezi gelovi su bojeni srebrom upotrebom kita Plus One Silver Staining ( GE Healthcare) prema uputstvu proizvođača. 3.6.4. Dvodimenzionalna poliakrilamidna gel elektroforeza (2D-PAGE) Protokol za 2D-PAGE bio je sledeći: Rehidratacija gel-stripa pasivnom difuzijom uzorka u gel je urađena tako što je gel- strip inkubiran sa uzorkom na sobnoj temperaturi preko noći. Uzorak za rehidrataciju sadržao je 20 µg proteina u ukupnoj zapremini od 200 µl IEF pufera, a uzorku su 43 neposredno pre rehidratacije dodati amfoliti (0.25%) i 1 µl 0.1% brom fenol plavo. U posudu za rehidrataciju prvo je nanet uzorak, onda je preko njega spušten gel-strip tako da bude celom površinom u kontaktu sa uzorkom i na kraju je gel-strip prekriven tankim slojem mineralnog ulja. Razdvajanje proteina po izoelektričnim tačkama izvedeno je u aparatu IPGphor 3 (GE Healthcare) na gel-stripovima dužine 11 cm (pH 3-10) (GE Healthcare) u programu za izoelektrično fokusiranje (IEF) proteina: 500 V u trajanju od 500 Vh; 1,000 V u trajanju od 800 Vh (gradijent napona); 6000 V u trajanju od 7,000 Vh (gradijent napona) i finalno fokusiranje proteina na 6000 V u trajanju od 2,200 Vh. Nakon izoelektričnog fokusiranja, gel-stripovi su prebacivani prvo u pufer za redukciju uzorka (6 M urea, 30% glicerol, 2% SDS, 0.05 M Tris pH 8.8, 15 mM DTT), a zatim u pufer za alkilaciju uzorka (6 M urea, 30% glicerol, 2% SDS, 0.05 M Tris pH 8.8, 250 mg IAA) i ispirani u svakom od pufera po 15 min, uz neprekidnu rotaciju uzoraka na vertikalnom rotatoru. Nakon ekvilibracije gel-stripova u puferima za redukciju i alkilaciju uzorka, gel- stripovi su postavljani na 12% SDS poliakrilamidne gelove tako da čitavom svojom dužom ivicom budu u kontaktu sa gelom. Da bi se osiguralo da se gel-stripovi ne pomeraju tokom elektroforeze, zatopljeni su u 1% agaroznom puferu (50 mM Tris, pH 6,8; 0.1% SDS; 0.01% brom-fenol plavo). Razdvajanje proteina prema molekulskoj masi (SDS-PAGE) rađeno je u TGB puferu na 150 V, 25 mA u sistemu za vertikalnu elektroforezu SE 600 (Amersham Biosciences). Nakon završetka elektroforeze gelovi su bojeni srebrom pomoću odgovarajućeg kita (Plus One Silver Staining kit, GE Healthcare) i posle bojenja su skenirani. 44 3.6.5. Kompjuterska analiza 2D-PAGE proteinskih profila Fotografije srebrom obojenih skeniranih 2D-gelova (tiff format, rezolucija 300 dpi) analizirane su u programu Image Master 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare). Prvo su identifikovani individualni proteini na svim gelovima, prema sledećim zadatim parametrima: 2 za parametar glatkosti, 2 za parametar ispupčenja i 5 za parametar minimalne površine. Zatim su triplikati gelova unutar svake klase uzorka međusobno upoređivani (uz obeležavanje po dva do tri zajednička proteina, kao tačaka oslonca za poređenje gelova), nakon čega je izabran najreprezentativniji tj. najinformativniji gel (koji je sadržavao sve odlike date grupe uzorka) koji je predstavljao datu klasu uzorka u međusobnom poređenju između klasa. Poređenje klasa uzoraka takođe je uključivalo obeležavanje dva do tri zajednička proteina u klasama koje su upoređivane, koji su predstavljali tačke oslonca na osnovu kojih program može da sprovede automatsko poređenje gelova. Iz izveštaja koji su automatski kreirani za svaki gel ponaosob, kao i za svako poređenje unutar i između klasa, može se steći uvid u stepen sličnosti, odnosno različitosti 2D-profila uzoraka dve klase. Na ovaj način moguće je detektovati proteine specifične za određenu klasu uzorka, čak i kad su prisutni u relativno maloj količini. Određivanje pI vrednosti u odsustvu pI markera rađeno je pomoću lenjira, tako što je izmerena udaljenost položaja detektovanog proteina od ivica gela i onda preračunata njegova pI na osnovu grafikona linearnog gradijenta pH vrednost u gel-stripovima od 11 cm. Određivanje molekulskih masa urađeno je direktnim upoređivanjem položaja detektovanog proteina na 2D-gelu u odnosu na položaje proteina poznatih masa, sadržanih u proteinskom markeru Page Ruler Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific). 45 4. REZULTATI 4.1. Ispitivanje prisustva gena homolognih AI genima drugih biljnih vrsta u genomu heljde U genomskoj DNK heljde je metodom lančanog umnožavanja upotrebom gen- specifičnih prajmera za SRK, SLG, SP11 i MLPK gene roda Brassica, kao i prajmera specifičnih za S-RNazne i SFB gene roda Prunus, ispitivano prisustvo njihovih homologa. Rezultati lančanog umnožavanja DNK upotrebom izrođenih prajmera specifičnih za AI gene roda Prunus pokazali su da heljda ne sadrži homologe S-RNaznih i SFB gena. Rezultati lančanog umnožavanja DNK upotrebom izrođenih prajmera specifičnih za AI gene roda Brassica pokazali su da heljda ne sadrži homologe SRK, SLG i SP11 gena, ali da sadrži homolog MLPKf2 gena kupusa, koji je nazvan MLPKFe. Umnoženi fragment imao je 728 nukleotida (prijavljen u DNK bazu podataka pod identifikacionim brojem FJ858190) i sadržao je 4 egzona, koji su odgovarali kinaznom regionu MLPK gena. Izvedena MLPKFe aminokiselinska sekvenca pokazala je visoku homologiju sa protein kinazama drugih biljnih vrsta, krećući se od 81% u Trifolium pratense do 89% u Populus trichocarpa. Takođe, sekvenca je pokazala 80% sličnosti sa MLPKf2 sekvencom Brassica rapa (AB121973) i APK1A Arabidopsis thaliana (AT1G07570) (Slika 3). 46 Slika 3. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci koje su izvedene iz nukleotidnih sekvenci MLPK homologa kod heljde (MLPKFe), arabidopsisa (APK1A) i kupusa (MLPKBr). Zatamnjeni regioni predstavljaju segmente aminokiselinskih MLPK sekvenci koji su potpuno identični između tri vrste. 4.2. Ispitivanje učestvovanja protein kinaza C u AI odgovoru heljde Vizuelizacijom rasta polenovih cevi pod fluorescentnim mikroskopom, nakon kompatibilnih i auto-inkompatibilnih polinacija netretiranih i inhibitorom miristilovanih protein kinaza C tretiranih "pin" i "tram" tučkova, ustanovljeno je da tretman PKC inhibitorom nije ni u jednoj od primenjenih koncentracija na bilo kakav vidljiv način uticao na rast polenovih tuba u inkompatibilnim ili kompatibilnim polinacijama (Slika 4). 47 Slika 4. Rast polenovih cevi posmatran pod fluorescentnim mikroskopom 24 h nakon polinacija tučkova koji su pre polinacija tretirani inhibitorom miristilovanih protein kinaza C: A, auto-inkompatibilno oprašen "pin" tučak; B, auto-inkompatibilno oprašen "tram" tučak; C, kompatibilno oprašen "pin" tučak; D, kompatibilno oprašen "tram" tučak. 48 4.3. Umnožavanje i sekvenciranje segmenta genomske DNK u neposrednoj blizini S- lokusa heljde i analiza sekvenci U asimetričnoj lančanoj reakciji umnožavanja upotrebom prajmera koji su specifični i poluspecifični za DNK sekvencu u neposrednoj blizini heljdinog S-lokusa, na genomskoj DNK heljde iz listova "pin" i "tram" biljaka kao matrici, umnoženo je jedan ili više produkata po paru prajmera, od kojih je 14 sekvencirano (Slika 5). Dobijene sekvence su navedene u Prilogu A. Slika 5. Produkti umnožavanja segmenata genomske DNK "pin" i "tram" biljaka heljde u neposrednoj blizini S-lokusa razdvojeni na 1.5% agaroznom gelu (prajmeri dati u Tabeli 3). 49 Dužina sekvenciranih produkata kretala se u opsegu od 255 do 875 baznih parova DNK, a njihov GC sadržaj kretao se između 35% i 44.7% (u proseku je iznosio 40.24%). Osim toga, sekvence su pokazivale prisustvo repetitivnih elemenata. Upoređivanje dobijenih sekvenci sa sekvencama dostupnim u nukleotidnim bazama podataka upotrebom "BLASTN" programa za pretragu nije otkrilo sličnost ni sa jednom od sekvenci prijavljenim u NCBI bazi podataka do danas. Međusobno poređenje sekvenci "pin" i "tram" klasa, otkrilo je da se najveći broj sekvenci unutar jedne klase, kao i između dve klase, ne preklapaju međusobno. Jedino se sekvenca dobijena pomoću N7R1 i AD1 seta prajmera pokazala kao identična između dva morfa (99% sličnosti sekvence P212 i T22; sekvence su date u Prilogu A). U pitanju je kratka sekvenca od 255 baznih parova, čija egzon-intron struktura ukazuje na mogućnost kodiranja proteina sličnog LRR receptoru-nalik serin/treonin protein kinazi GSO2 ili histon-acetil transferazi HAC2 Arabidopsis thaliana. Analiza preostalih 13 sekvenci u programima koji identifikuju otvorene okvire čitanja i prisustvo egzon-intron struktura pokazala je sledeće rezultate: za tri sekvence (P134, P333 i P533) nisu pronađene egzon-intron strukture ni otvoreni okvir čitanja, dok je za 9 sekvenci uočen određen stepen homologije sa sekvencama proteina koji imaju prepoznatljive strukture i uloge poput regulacije transkripcije, fosforilacije proteina, modifikacije hromatina, remodelovanja citoskeleta, itd. Rezultati kompjuterske analize sekvenci sumirani su u Tabeli 5. 50 Tabela 5. Prikaz rezultata analize genomskih sekvenci "pin" i "tram" biljaka heljde, dobijenih pomoću prajmera izvedenih iz AFLP N7 markera blisko vezanog Sh alelu S-lokus heljde, u programima "ORF Finder", "GENESCAN" i "BLASTP" (nazivi potencijalnih homologa i biljne vrsta kojoj pripadaju, oznaka homologne sekvence u proteinskoj bazi podataka i % homologije izražen prema ukupnom % preklapanja dve sekvence). Heljda Homologna sekvenca i biljna vrsta kojoj pripada ID sekvence u NCBI bazi podataka % homologije od % preklapanja sekvenci P11 acil-koenzim A sintetaza 5 iz Arabidopsis thaliana NP_176482.1 48% od 81% P125 protein sa PWWP domenom iz A.lyrata ssp. lyrata XP_002873347.1 31% od 89% P212 LRR receptor-nalik serin/treonin kinaza GSO2 iz A.thaliana NP_199283.1 34% od 68% P43 hipotetički protein ARALYDRAFT_480018 iz A. lyrata ssp. lyrata XP_002883574.1 48% od 61% Superfamilija proteina nalik homeodomenu iz A.thaliana NP_175020.1 30% od 66% Predviđeni protein A. lyrata ssp. lyrata XP_002875362.1 38% od 91% TIR-NBS-LRR klasa proteina za rezistenciju na bolesti iz A. thaliana NP_176571.1 33% od 87% ATCHX1 iz Arabidopsis lyrata ssp. lyrata XP_002892905.1 40% od 61% P21 fitohrom C iz A. thaliana NP_198433.1 25% od 93% hipotetički protein ARALYDRAFT_897410 iz A. lyrata ssp.lyrata XP_002871878.1 26% od 82% T11 Protein 2 koji se vezuje za oštećenu DNK iz A. thaliana NP_200684.2 37% od 52% T22 histon acetil transferaza HAS2 iz A. thaliana NP_564891.4 34% od 78% T31 WRKY DNK-vezujući protein 40 iz A. lyrata ssp. lyrata XP_002889272.1 40% od 81% 51 Tabela 5. Prikaz rezultata analize genomskih sekvenci "pin" i "tram" biljaka heljde, dobijenih pomoću prajmera izvedenih iz AFLP N7 markera blisko vezanog Sh alelu S-lokus heljde, u programima "ORF Finder", "GENESCAN" i "BLASTP" (nazivi potencijalnih homologa i biljne vrsta kojoj pripadaju, oznaka homologne sekvence u proteinskoj bazi podataka i % homologije izražen prema ukupnom % preklapanja dve sekvence). Heljda Homologna sekvenca i biljna vrsta kojoj pripada ID sekvence u NCBI bazi podataka % homologije od % preklapanja sekvenci Protein iz familije kinaza iz A. lyrata ssp. lyrata XP_002889521.1 29% od 95% Tirozin kinaza sa PB1 domenom iz A. thaliana NP_171964.1 29% od 95% T31 Protein trasducinske familije sa WD40 iz A. lyrata ssp. lyrata i A. thaliana ssp. thaliana XP_002869159.1= NP_195154.2 36% od 85% protein 713 asociran sa membranom vezikula iz A.thaliana NP_196676.1 30% od 97% UDP-glukoziltransferaza 91B1 iz A.thaliana NP_201358.1 37% od 86% T44 kinazna familija iz A.lyrata ssp. lyrata XP_002876502.1 32% od 73% NRT1.1 iz Arabidopsis lyrata ssp. lyrata XP_002889915.1 27% od 72% T313 Protein iz familije transducina iz A. lyrata ssp. lyrata = Protein koji sadrži WD40 domen iz A.thaliana XP_002869159.1= NP_195154.2 36% od 85% Vakuolarni sortirajući protein 39 iz A. haliana NP_173699.5 39% od 76% Nitratni transporter iz A.lyrata ssp. lyrata XP_002885459.1 38% od 91% T55 CESA10 iz A.lyrata ssp. lyrata XP_002880684.1 47% od 61% 52 4.4. 2D-PAGE razdvajanje ukupnih proteina polena i tučkova heljde Ukupni proteinski izolati "pin" i "tram" polena, kao i neoprašenih, kompatibilno i inkompatibilno oprašenih "pin" i "tram" tučkova heljde, razdvojeni su prema izoelektričnim tačkama i molekulskim masama upotrebom 2D-PAGE. Proteinski 2D-profili otkrili su prisustvo više od 200 visoko reproducibilnih proteina u svakom od izolata. Regioni gelova, u kojima je rezolucija razdvajanja bila manjeg kvaliteta i onemogućavala pouzdanu detekciju individualnih proteina (pH 3-5.5; 55-110 kDa), bili su izuzeti iz analize u svim uzorcima. U proteomima svih uzoraka preovlađivali su kiseli i neutralni proteini (pH 3.5-7), praćeni manjim brojem baznih proteina (pH 7.5-9). Proteini su bili raspoređeni u širokom opsegu molekulskih masa (10-130 kDa) (Slika 6). Sastav proteina u neoprašenim tučkovima/polenu oba morfa, kao i u inkompatibilno i kompatibilno oprašenim tučkovima oba morfa, bio je u visokom stepenu sličan, ali u svakom uzorku detektovani su i proteini specifični za dati uzorak (između tri i 15 proteina po gelu, obeleženi crvenim kvadratima, Slika 6). Opšte karakteristike oko 100 proteina (pI, molekulska masa i udeo u ukupnoj zapremini proteina detektovanih na gelu), koji su detektovani kao specifični za određeni uzorak ili grupu uzoraka, navedene su u Prilogu B. Oni su detektovani kao različiti među ukupno najmanje 2000 proteina, koliko je detektovano u svim uzorcima zajedno, što govori u prilog tome da proteini specifični za uzorak/grupu uzoraka predstavljaju najmanje 5% ukupno detektovanih proteina. Upoređivanjem 2D-profila "pin" i "tram" uzoraka uočeno je da su se izolati neoprašenih "pin" i "tram" tučkova razlikovali u minimum 19 proteina, od kojih je 7 proteina bilo specifično prisutno u "pin" (identifikacioni brojevi ovih proteina u Prilogu B su: 462, 1414, 1415, 1417, 1421, 1423, 1428), dok je 12 proteina bilo specifično prisutno u "tram" morfu tučka (njihovi identifikacioni brojevi u Prilogu B su: 216, 244, 263, 269, 285, 332, 355, 357, 367, 370, 376, 386). Proteinski 2D-profili "pin" i "tram" polenovih zrna 53 razlikovali su se u minimum 15 proteina, od kojih je 8 proteina bilo specifično prisutno u "pin" polenovim zrnima (identifikacioni brojevi ovih proteina u Prilogu B su: 233,235,273, 501,514,540,564,569), dok je 7 proteina bilo specifično prisutno u "tram" polenovim zrnima (njihovi identifikacioni brojevi u Prilogu B su: 142, 155, 159, 177, 435, 455, 457). Pored toga, uočena je i grupa od 12 proteina, koja je bila prisutna samo u neoprašenim "pin" tučkovima, a odsutna u neoprašenim "tram", kao i inkompatibilno i kompatibilno oprašenim "pin" tučkovima (u Prilogu B pod identifikacionim brojevima: 277, 322, 326, 1417, 1419, 1421, 1423, 1427, 1428, 1429, 1434, 1435). U neoprašenim "tram" tučkovima nije uočena slična grupa proteina ili neka druga grupa proteina slične specifičnosti ekspresije. Što se tiče sastava proteoma nakon polinacija, primećeno je da se nakon inkompatibilnih polinacija u obe morfološke klase tučkova pojavljuju de novo kiseli i neutralni proteini manje molekulske mase (pI 4-7.5; 13-28 kDa). Nakon kompatibilnih polinacija u "tram" tučkovima pojavljuje se de novo grupa baznih proteina (pI 8-9.9; 35-43 kDa) i dva neutralna proteina (~32 kDa), dok u kompatibilno oprašenim "pin" tučkovima nije uočena pojava njima slične grupe proteina, ali je primećeno da se de novo pojavljuje grupa manjih, kiselih proteina (pI 4-5; 9-12 kDa). Na ovaj način analize se među 100 proteina detektovanih kao različitih između uzoraka, izdvojilo njih 21, koji su bili prisutni isključivo u jednoj klasi uzorka (Tabela 6). Kao što se može primetiti iz Tabele 6, u pitanju su proteini manje molekulske mase (11-35kDa), koji pokazuju širok opseg pI (4.3-9). 54 Tabela 6. Prikaz proteina čije je prisustvo detektovano isključivo u jednoj klasi uzoraka. Za svaki protein navedene su njegove osnovne karakteristike dostupne iz 2D-profila: izoelektrična tačka, molekulska masa, identifikacioni broj i relativna zapreminska zastupljenost na gelu (udeo zapremine individualnog proteina u ukupnoj zapremini svih proteina na gelu), kao i vrsta uzorka u kojoj je detektovan. Redni broj Id. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 1 1421 17 8.7 0.79 Neoprašeni "pin" tučak 2 1423 17 8.5 0.76 Neoprašeni "pin" tučak 3 1434 11 7.7 0.12 Neoprašeni "pin" tučak 4 94 22 6.5 0.24 Neoprašeni "tram" tučak 5 514 28 5.7 1.01 "Pin" polen 6 569 26 7 0.04 "Pin" polen 7 435 35 4.3 0.04 "Tram" polen 8 140 14 5.9 3.45 AI oprašen "pin" tučak 9 127 17 4.75 1.04 AI oprašen "pin" tučak 10 221 16 5.1 0.24 AI oprašen "pin" tučak 11 155 13 5.8 2.78 AI oprašen "pin" tučak 12 220 13 7.5 0.15 AI oprašen "pin" tučak 13 257 14 6.2 0.38 AI oprašen "pin" tučak 14 111 20 6 2.02 AI oprašen "pin" tučak 15 231 14 4.3 0.72 AI oprašen "tram" tučak 16 194 19 6.8 0.71 AI oprašen "tram" tučak 17 182 15 5.55 1.84 AI oprašen "tram" tučak 18 281 15 9 0.61 AI oprašen "tram" tučak 19 181 13 5.65 3.00 AI oprašen "tram" tučak 20 183 22 7.3 2.34 AI oprašen "tram" tučak 21 64 30 6.6 0.77 AI oprašen "tram" tučak 55 Slika 6. 2D-PAGE profili totalnih proteinskih izolata iz: A, neoprašenih "pin" tučkova; B, neoprašenih "tram" tučkova; C, inkompatibilno oprašenih "pin" tučkova; D, inkompatibilno oprašenih "tram" tučkova. Crvenim kvadratima su uokvireni regioni gela u kojima se nalaze proteini specifični za datu klasu uzorka. 56 Slika 6. 2D-PAGE profili totalnih proteinskih izolata iz: E, kompatibilno oprašenih "pin" tučkova; F, kompatibilno oprašenih "tram" tučkova; G, "pin" polena; H, "tram" polena. Crvenim kvadratima su uokvireni regioni gela u kojima se nalaze proteini specifični za datu klasu uzorka. 57 5. DISKUSIJA 5.1. Ispitivanje prisustva gena homolognih AI genima drugih biljnih vrsta u genomu heljde Iako još uvek ne postoji kompletna filogenetska i filogeografska analiza auto- inkompatibilnih sistema, najveći broj savremenih autora smatra da su AI sistemi evoluirali više puta nezavisno u različitim linijama cvetnica, kao i da su geni koji su uključeni u AI odgovore različitih vrsta nesrodni (detaljnije objašnjeno u Uvodu, poglavlje 1.3). U prilog nezavisnog porekla AI sistema, pored postojanja suštinskih razlika u do sada zabeleženim tipovima AI sistema (čak i sistema koji su pod istom vrstom genetičke kontrole, bilo sporofitne, bilo gametofitne), govore i savremeni molekularni i filogenetski podaci sakupljni o AI sistemima cvetnica. Takođe, opšte zapažanje molekularne biologije i teorije evolucije, koje ukazuje da slični fiziološki procesi ne moraju nužno imati zajedničko poreklo, već mogu biti različitog porekla i pod kontrolom različitih genetičkih faktora (konvergentna evolucija), čini to stanovište održivim. Nasuprot iznad iznetom stanovištu, zabeleženi su i nalazi koji potvrđuju da je među AI sistemima prisutna takozvana "trans-specijska evolucija" (Sutherland i sar., 2008), termin skovan da ukaže na to da evolutivno udaljene AI vrste mogu posedovati iste ili slične predačke AI gene (npr. vrlo izraženo u homomorfnoj gametofitnoj AI zasnovanoj na S-RNazama roda Prunus). Pored toga, nedavno je objavljen i primer sekundarne evolucije AI lokusa kod Leavenworthia, za koji se smatra da pripada liniji koja se odvojila od linije predačkih gena S-lokusa Brassicaceae pre diverzifikacije S-alela, jer pokazuje domensku strukturu, sekvence i filogenetsku istoriju sličnu genima S-lokusa, ali ne učestvuje u razlikovanju sopstvenog od stranog polena. Pretpostavlja se da je u liniji Leavenworthia došlo do sticanja nove funkcije ovih S-lokus nalik genima, što je dovelo do evolucije odvojenog ligand-receptor sistema AI (Chantha i sar., 2013). 58 Osim toga, postoji opšta fiziološka sličnost AI odgovora "tram" i "pin" morfa heljde sporofitnom AI odgovoru Brassica (Brassicaceae) i gametofitnom AI odgovoru Prunus (Rosaceae), respektivno, što može podsećati na situaciju u kojoj u jednoj vrsti deluju sporofitna i gametofitna kontrola (detaljnije objašnjeno u Uvodu, poglavlje 1.3). Takvi slučajevi zabeleženi su u literaturi kod vrsta Theobroma cacao (Sterculiaceae), Cerastium arvense (Caryophyllaceae) i Stellaria holostea (Caryophyllaceae), za koje se smatra da predstavljaju primere tranzicije gena između gametofitne i sporofitne kontrole (Allen i Hiscock, 2008). Zbog svega navedenog, zaključili smo da postoji opravdana osnova za ispitivanje prisustva gena homolognih AI genima rodova Brassica i Prunus u genomu heljde metodom polimeraznog lančanog umnožavanja upotrebom gen-specifičnih prajmera (dizajniranih ili preuzetih iz literature). Odabran je pristup koji koristi izrođene prajmere za umnožavanje genske sekvence, jer su ovi prajmeri dovoljno specifični za datu sekvencu, ali i dovoljno nespecifični tako da mogu da detektuje grupu srodnih sekvenci, pa je na ovaj način moguće otkriti prisustvo homologa, čak i ukoliko su vremenom akumulirali razlike u odnosu na AI gene Brassica i Prunus sa kojima bi mogli da dele zajedničko poreklo. Ispitivanje prisustva gena homologih SRK, SLG, SP11 i MLPK genima Brassica, kao i SRNaznim i SFB genima Prunus, pokazalo je da u genomu heljde nema homologa SRK, SLG, SP11 genima, kao ni SRNaznim i SFB genima, ali da postoji homolog MLPKf2 genu Brassica. Značajna homologija MLPKFe sa MLPKf2 Brassica (80%), za koju je poznato da ima ulogu pozitivnog medijatora signala u AI odgovoru kupusnjača, može, ali ne mora značiti da MLPKFe ima ulogu u AI heljde. Pošto proteinska MLPK familija obuhvata brojne proteine koji su prenosioci signala u različitim fiziološkim procesima, moguće je da MLPKFe učestvuje u nekom sasvim drugom fiziološkom procesu heljde. Do zaključka da li MLPKFe učestvuje u AI odgovoru heljde mogli bismo doći posredno, tako što bismo pratili gensku ekspresiju MLPKFe u tkivima lista, cveta, polena/antera, tučka, kao i u različitim 59 razvojnim stadijumima tučka. Ukoliko MLPKFe učestvuje u AI odgovoru heljde, očekivali bismo da se primeti razlika u njenoj ekspresiji u različitim tkivima, tako što bi najviši nivo ekspresije imala u tučkovima, značajno niži nivo ekspresije u listovima, dok ne bi bila eksprimirana uopšte u polenu/anterama, slično shemi ekspresije njenog homologa MLPKf2 kod Brassica (Kakita i sar., 2007a). Takođe, očekivali bismo da se u toku sazrevanja tučka, njen nivo ekspresije postepeno povećava i da je najviši pred samo otvaranje cveta. 5.2. Tretman inhibitorom protein kinaza C Kako je ranije uočeno, kalcijum ima važnu ulogu u AI odgovoru heljde (Miljuš- Ðukić i sar., 2003), što je potvrđeno i za neke druge AI sisteme poput gametofitne AI Poaceae (videti pod 1.4.3.), međutim nije poznata njegova konkretna uloga u AI heljde. Imajući u vidu različite izveštaje koji govore u prilog tome da protein kinaze mogu učestvovati u AI odgovoru (npr. MLPKf2 Brassica je receptoru nalik kinaza), kao i da protein kinaze C aktivirane Ca2+ jonima (npr. Ca2+/kalmodulin-zavisna kinaza) imaju važnu ulogu u procesima signalne transdukcije eukariota (i da u tom signalnom putu mogu biti kuplovane sa receptoru nalik kinazama), odlučili smo da testiramo kakav efekat na AI odgovor heljde ima tretman inhibitorom miristilovanih protein kinaza C (za membranu vezanih kalcijum- i fosfolipid-zavisnih protein kinaza). Na ovaj način želeli smo da testiramo potencijalnu ulogu kalcijum-zavisnih protein kinaza vezanih za membranu, poput Ca2+/kalmodulin zavisne kinaze, u AI odgovoru heljde i time posredno ispitamo jedan od mogućih načina angažovanja kalcijuma u heljdinom AI sistemu. Ukoliko bi Ca2+ zavisne PKC bile zaista deo AI odgovora heljde, očekivali bismo da tretman ovim inhibitorom dovede do narušavanja signalnog puta u inkompatibilnoj reakciji, što bi dovelo do narušavanja kaskade neophodne za realizaciju AI odgovora i rast sopstvene polenove cevi ne bi bio zaustavljen na 2/3 dužine stubića "pin" tučka ili na spoju žiga i stubića tučka "tram" morfa. 60 Rezultati tretiranja tučkova PKC inhibitorom pre polinacije, pokazali su da inhibitor nije na vidljiv način uticao na rast polenovih tuba u inkompatibilnim polinacijama ni kod "pin" ni kod "tram" morfa. Dakle, za membranu vezane kalcijum- i fosfolipid-zavisne protein kinaze C nemaju ulogu u AI odgovoru heljde, tako da kalcijum svoju ulogu u AI sistemu heljde ostvaruje na neki drugi način. 5.3. Sekvence segmenata genomske DNK blisko vezane S-lokusu heljde Do sada ne postoji ni jedan podatak o genima uključenim u sporofitni heteromorfni AI odgovor heljde. Ipak, razvijeni su markeri iz kojih su izvedeni prajmeri za umnožavanje sekvenci u blizni S-lokusa ili u samom S-lokusu, što čini mogućim njegovo fino mapiranje (Nagano i sar., 2001). Upotrebom prajmera izvedenih iz AFLP N7 markera u reakciji termalnog asimetričnog lančanog umnožavanja, dobijeno je u nekim reakcijama i više od dva produkta umnožavanja. To nije neočekivano budući da se ova reakcija umnožavanja upravo koristi kombinacijom specifičnih i poluspecifičnih prajmera uz variranje temperature da poveća prinos specifičnog umnoška u odnosu na nespecifične (koji su neminovno prisutni usled samog dizajna ovakve reakcije umnožavanja) i na taj način dok se oslanja na jednu poznatu sekvencu omogućuje umnožavanje do tad nepoznatog susednog regiona genoma. Takođe, može se primetiti da je u svim reakcijama po prinosu dominirao najmanje jedan, a najviše dva produkta, što može odgovarati situacijama homozigot/heterozigot za analizirani region. Sekvence koje su proizašle kao rezultat ovog istraživanja, pružile su uvid u nukleotidni sastav regiona bliskog S-lokusu i ono što je prvo vidljivo jeste njihova repetitivna struktura, što je upravo i odlika S-lokusa i njemu bliskog regiona DNK. Dalje, međusobnim upoređivanjem dobijenih sekvenci ustanovljeno je da se najveći broj sekvenci unutar jedne klase ("pin"/"tram" klase) međusobno ne preklapa, što ukazuje da su 61 sekvencirani fragmenti poreklom sa različitih mesta bliskih S-lokusu, ali ne znamo koliko su ta mesta međusobno udaljena. Da bi se ostvarilo preklapanje tj. povezivanje u niz sekvenciranih fragmenata može se probati lančano umnožavanje sa prajmerima dizajniranim iz dobijenih sekvenci ili prajmerima dostupnim iz literature, npr. onim koji su izvedeni iz drugih markera bliskih S-lokusu kao što je npr. sht1 marker za rasejavanje semena (Matsui i sar., 2004). Međusobno upoređivanje sekvenci između "pin" i "tram" biljaka pokazalo je da među sekvencama nema preklapanja, izuzev jedne sekvence, koja je umnožena pomoću N7R1 i AD1 seta prajmera, i koja je pokazala identičnost analiziranog fragmenta genomske DNK u "pin" i "tram" biljkama (sekvence P212 i T22, Prilog A). U pitanju je kratka sekvenca od 255 baznih parova, čija egzon-intron struktura ukazuje na mogućnost kodiranja aminokiselinske sekvence, koja pokazuje homologiju sa LRR receptor-nalik serin/treonin protein kinazom GSO2 ili kodiranja aminokiselinske sekvence koja pokazuje homologiju sa histon-acetil transferazom HAC2. Ukoliko razmotrimo uloge ova dva proteina, oba imaju ulogu koja je dovoljno opšta i neophodna za reprodukciju da se opravdano bilo koji od njih može naći lociran u regionu bliskom S-lokusu oba morfa. Što se tiče LRR receptoru-nalik serin/treonin protein kinaze GSO2, poznato je da je locirana u membrani i da zajedno sa GSO1 omogućuje razvoj epidermalne površine embriona i kotiledona, a uključena je i u fazu jedarne deobe u procesu megagametogeneze. Uglavnom je eksprimirana u silikama, semenima, kotiledonima, embrionima, cvetnom pupoljku, ali nije primećena njena ekspresija u listu, korenu i stem tkivima (Pagnussat i sar., 2005; Tsuwamoto i sar., 2008). Takođe, histon-acetil transferaza HAC2 je protein koji acetiluje histone, obeležavajući ih za transkripcionu aktivaciju. Prisutan je u jedrima ćelija rozeta listova, stem tkiva i cvetova. Sadrži repetitivni motiv cinkanih prstiju i učestvuje u procesima modifikacije hromatina, DNK-zavisne transkripcije i njene regulacije (Pandey i sar., 2002). Pored sekvence P212 tj. T22, analiza otvorenih okvira čitanja i egzon-intron struktura je dovela do zanimljivih predloga mogućih uloga i za većinu ostalih sekvenci (Tabela 5), 62 od kojih ću prodiskutovati samo nekoliko mogućnosti za sekvence P125, T31, T313. Izvedena aminokiselinska sekvenca za P125 segment DNK može pripadati grupi proteina koji sadrže PWWP domen; izvedena aminokiselinska sekvenca za T31 pokazuje sličnost sa WRKY DNK-vezujućim proteinom 40 ili tirozin kinazom sa PB1 domenom, dok izvedena aminokiselinska sekvenca za T313 podseća na familiju transducina, proteina koji sadrže WD40 domen. Proteini sa PWWP domenom pripadaju nuklearnim proteinima, koji imaju ulogu u rastu i diferencijaciji ćelija. Predloženo je da je PWWP domen omogućuje protein- protein interakcije između nuklearnih proteina uključenih u diferencijaciju (Stec i sar., 2000). Što se tiče WRKY DNK-vezujućeg proteina 40, on pripada velikoj familiji transkripcionih faktora, koji učestvuju u prenošenju signala u toku razvoja, dormantnosti i germinaciji semena, razvojnim procesima, starenju, biotičkom/abiotičkom stresu, a može delovati i kao aktivator i kao represor transkripcije (Rushton i sar., 2010). Zanimljivo je da i svi ostali predloženi proteini imaju uloge u prenošenju signala: npr. tirozin kinaza sa PB1 domenom (karakteristika mnogih signalnih citoplazmatskih proteina eukariota) učestvuje u složenoj transdukciji signala, ili familije transducina/WD40 domen proteina (karakteristični za proteine eukariota, familija ima širok spektar uloga, od signalne transdukcije, preko procesovanja prekursora iRNK, do sastavljanja citoskeleta) (Xu i Min, 2011). Za tri sekvence, P134, P333 i P533, za koje nisu pronađene egzon-intron strukture ni otvoreni okviri čitanja, njihovo odsustvo može ukazivati ili da su tako pozicionirane da iako su kodirajuće strukture njihov umnoženi segment ne omogućuje detekciju egzon-intron struktura ili na to da su navedene tri sekvence deo nekodirajućeg regiona DNK, što se može ustanoviti umnožavanjem pomoću prajmera dizajniranih specifično za ove sekvence. 5.4. 2D-PAGE razdvajanje ukupnih proteina polena i tučkova heljde Nakon izolacije i polinacije tučkova, a pre ekstrakcije proteina, uklonjeni su plodnici tučkova zbog toga što su bogati rezervnim proteinima, koji bi mogli da otežaju detekciju proteina žiga i stubića tučkova, među kojima očekujemo da se nađu proteini koji učestvuju 63 u AI odgovoru heljde. Pored toga, još jedan kritičan momenat bio je odabir vremena izolacije proteina u odnosu na trenutak inkompatibilne polinacije. Poznato je da je AI odgovor cvetnica generalno brz odgovor i da pokazuje izraženu vremensku dinamiku, kao i da kod heljde "tram" morf ima značajno bržu AI reakciju nego "pin" morf (na šta ukazuje mesto zaustavljanja rasta sopstvene polenove cevi). Zato je odabrano vreme AI reakcije (od trenutka polinacije do trenutka izolacije proteina) iznosilo 1,5h, jer je protumačeno da pruža dovoljno vremena da se uključi niz nizvodnih učesnika AI odgovora, bez da su neki od njih već intenzivno degradovani u proteazomima. Da bismo stekli uvid u sastav proteoma tučkova i polena dva cvetna morfa heljde, a bez dostupnih podataka o njihovom sastavu iz literature, odlučili smo se za razdvajanje proteina prema izoelektričnoj tački na najširem opsegu pH, 3-10. Odabrani opseg rezultovao je 2D- PAGE proteinskim profilima solidne rezolucije, omogućavajući detektovanje preko 200 individualnih proteina po uzorku/gelu, kao i uočavanje proteina specifično prisutnih u "pin" i "tram" profilima, kao i u profilima inkompatibilnih i kompatibilnih polinacija. Ipak, ostvarena rezolucija bi mogla biti još poboljšana u kiselim regionima gela (pH 3- 5) u zoni proteina molekulskih masa od 55 do 130 kDa. Za sada su ovi regioni gelova u svim uzorcima isključeni iz analize, iz razloga što su u svim uzorcima najviše zastupljeni proteini navedenih karakteristika, što otežava pouzdanu identifikaciju pojedinačnih proteina u tom regionu. Za potrebe inicijalnog istraživanja sastava proteoma i sticanja prvih opštih informacija o sličnostima i razlikama proteoma analiziranih uzoraka, izuzimanje ovog regiona iz analize uzoraka ne predstavlja poseban problem. Međutim, kada dođe na red faza sakupljanja ukupnih podataka koje pružaju 2D-PAGE proteinski profili uzoraka biće potrebno da se upotrebe sve informacije koje 2D gel pruža, što se može postići upotrebom stripova užeg opsega pH, npr. 3-7, koji bi značajno poboljšati rezoluciju 2D profila proteina u naznačenom regionu. Analiza 2D proteinskih profila osam klasa uzoraka (totalnih proteinskih izolata "pin" i "tram" polena, neoprašenih, inkompatibilno i kompatibilno oprašenih "pin" i "tram" 64 tučkova), pokazala je da postoji visok stepen sličnosti između proteina prisutnih u "pin" i u "tram" klasi, kao i između klasa inkompatibilnih i kompatibilnih polinacija. Ovaj nalaz potvrđuje da proteomi analiziranih reproduktivnih tkiva u svom sastavu sadrže veliki broj zajedničkih proteina, što je i bilo očekivano, jer ipak najveći relativni udeo u proteomu reproduktivnih tkiva svih vrsta cvetnica, bile one AI ili ne, imaju proteini koji imaju opšte uloge u cvetu (npr. za opšte polen-tučak interakcije). U prilog tome govore i rezultati istraživanja u divljem paradajzu (Solanum pennellii), koji su pokazali da u proteomu nezrelih tučkova (5 dana pre otvaranja cveta) najveću relativnu zastupljenost imaju histoni i ribozomalni proteini, što je u skladu sa fazom povišene stope ćelijskih deoba i ubrzanim metabolizmom, ali kasnije, sa sazrevanjem tučkova i sticanjem pune AI odnosi relativne zastupljenosti se menjaju u korist proteina povezanih sa metabolizmom i transportom lipida (Chalivendra i sar., 2013). Zanimljivo je to da se većina ovih proteina može klasifikovati u CRP grupu proteina (proteini bogati cisteinom). Upravo za tu grupu proteina su Marshal i sar. (2011) pokazali da je uključena u opšte polen-tučak interakcije, kao što su: formiranje eksudata na žigu tučka, adhezija i rast polenove cevi, odbrani tučka od patogena ili u interakcije polena i tučka (remodelovanje ćelijskog zida, pektinaze, poligalakturonaze, ekspanzini), itd. I pored visokog stepena sličnosti sastava proteoma analiziranih klasa uzoraka, zahvaljujući visokoj osetljivosti 2D-PAGE metode omogućena je i detekcija vrlo male količine specifično eksprimiranih proteina, koji su vezani za određeni tip morfa cveta ili njegov AI sistem. Na taj način u osam analiziranih uzoraka detektovali smo 21 protein jedinstveno prisutan samo u jednoj klasi uzorka. Za sada znamo samo njihove opšte karakteristike, poput izoelektrične tačke, molekulske mase i njegove relativne zapreminske zastupljenosti u uzorku. U nastavljanju istraživanja specifični proteini bi trebalo da budu identifikovani/sekvencirani, čime će se steći i uvid u njihovu potencijalnu ulogu. Grupa proteina identifikovana kao specifična za 2D-profile "pin" neoprašenih tučkova (njihovi identifikacioni brojevi u Prilogu B su: 187, 230, 277, 322, 326, 344, 1417, 1418, 1419, 1421, 1423, 1427, 1428, 1429, 1435) (tj. odsutna u 2D-profilima "tram" 65 neoprašenih tučkova, inkompatibilno i kompatibilno oprašenih "pin" tučkova), najverovatnije ukazuje na proteine koji su zaduženi za opšti odgovor "pin" tučka pri oprašivanju, nezavisno od toga da li je polen sopstveni/srodan ili ne, ali nije specifična za AI odgovor "pin" tučkova. Proteini koji se pojavljuju de novo u 2D-profilima auto-inkompatibilnih i kompatibilnih polinacija mogu se javiti ili kao rezultat de novo sinteze proteina u signalnoj kaskadi događaja izazvanoj polinacijom sopstvenim/nesrodnim polenom ili nastati degradacijom proteina prisutnih u 2D-profilima neoprašenih tučkova. Iako uzrok može varirati od slučaja do slučaja, da bismo mogli da zaključimo koji od ova dva događaja je uzrok pojave određenog de novo proteina, potrebno je da uradimo identifikaciju/sekvenciranje barem proteina navedenih u Tabeli 6, ako ne i svih proteina navedenih u Prilogu B. 5.5. Perspektiva istraživanja molekularne osnove AI odgovora heljde Na osnovu iznetih rezultata istraživanja možemo zaključiti da je specifičnost prepoznavanja sopstvenog polena kod heljde pod kontrolom gena koji se razlikuju od gena uključenih u sporofitni auto-inkompatibilni odgovor Brassica i gametofitni auto- inkompatibilni odgovor Prunus. Dobijene nove genomske sekvence bliske S-lokusu nisu pokazale homologiju sa bilo kojom od nukleotidnih sekvenci u bazama podataka, ali nakon analize u programima za identifikaciju otvorenih okvira čitanja i egzon-intron struktura pronađene su potencijalne homologne aminokiselinske sekvence u proteinskim bazama podataka, čije su predložene uloge uglavnom obuhvatale prenošenje signala i regulaciju transkripcije. Da bismo razjasnili koje od mnogobrojnih predloženih uloga mogu zaista da se odnose na analizirane sekvence, potrebno je analizirati duže fragmente DNK bliske S- lokusu. Te duže fragmente možemo dobiti npr. lančanim umnožavanjem sa prajmerima dizajniranim iz novih sekvenci ili pak prajmerima dostupnim iz literature, ali izvedenim iz 66 drugih markera bliskih S-lokusu, kao što su npr. SCAR markeri (Jotaro i sar., 1999) ili markeri novijeg datuma poput sht1 markera kojim se prati rasejavanje semena, a koji je blisko vezan S-lokusu (Matsui i sar., 2004). Takođe, još jedna mogućnost je da se (ne)radioaktivno obeleži jedan od produkata umnožavanja N7 prajmerima i upotrebi kao S- lokus specifična proba u blotovanju po Southern-u, a zatim da se restrikcioni fragment genomske DNK sa kojim proba bude hibridizujovala uklonira i sekvencira. Uporedo sa daljim sekvenciranjem segmenata genomske DNK bliskih S-lokusu, do proteina kandidata za učesnike u AI odgovoru heljde možemo doći i direktnim pristupom, kroz analiziranje proteoma inkompatibilnog i kompatibilnog odgovora oba morfa. Trenutno najbolji kandidati za proteine učesnike AI sistema su upravo proteini detektovani kao specifično prisutni u auto-inkompatibilno oprašenim "pin"/"tram" tučkovima. Iako spomenuti proteini mogu imati i neku drugu ulogu, kao npr. u determinaciji morfologije cveta ili sl., njihova identifikacija ili sekvenciranje ne samo da bi pružili uvid u njihovu potencijalnu ulogu, već bi pružili i uvid u nukleotidnu sekvencu na kojoj počiva njihova sinteza, na osnovu koje bismo se mogli još više približiti genima S-lokusa, među kojima su zasigurno i AI geni. Rezultati dosadašnjeg istraživanja ukazuju da bi dalje nastavljanje sa istraživanjem zaista moglo dovesti do značajnog pomaka u rasvetljavanju molekularne osnove heteromorfnog sporofitnog AI sistema heljde. Upoznavanje genetičke i biohemijske osnove AI sistema imale bi veliki praktični značaj u programima oplemenjivanja heljde, kao i u produbljivanju znanja o slabo proučenim sporofitnim hetermorfnim AI sistemima cvetnica. 67 6. ZAKLJUČCI v Nije pronađen dokaz prisustva homologa S-RNaza i SFB, gena za koje je poznato da kontrolišu homomorfni gametofitni AI odgovor roda Prunus (Rosaceae), u genomu heljde. v Nije pronađen dokaz prisustva homologa SRK, SLG, SP11, gena za koje je poznato da kontrolišu homomorfni sporofitni AI odgovor roda Brassica (Brasicaceae), u genomu heljde. v Specifično prepoznavanje sopstvenog od stranog polena kod heljde je pod kontrolom gena koji se razlikuju od gena odgovornih za specifično prepoznavanje sopstvenog od stranog polena u sporofitnom auto-inkompatibilnom sistemu Brassica (Brasicaceae) i gametofitnom auto-inkompatibilnom sistemu Prunus (Rosaceae). v Identifikovano je prisustvo homologa M-lokus protein kinaze izoforme 2 (MLPKf2) Brassica (koja ima ulogu pozitivnog medijatora signala u AI odgovoru Brassica) u genomu heljde i heljdin homolog nazvan je MLPKFe. v Parcijalna nukleotidna sekvenca MLPKFe dugačka je 728 nukleotida i sadrži 4 egzona, koji odgovaraju kinaznom regionu gena. 68 v Izvedena aminokiselinska sekvenca MLPKFe pokazala je visok stepen homologije sa protein kinazama drugih biljnih vrsta, krećući se od 81% u Trifolium pratense do 89% u Populus trichocarpa. Takođe, sekvenca je pokazala 80% homologije sa MLPKf2 sekvencom Brassica rapa i APK1A Arabidopsis thaliana. v Tretman tučkova oba morfa heljde inhibitorom miristilovanih protein kinaza C pre polinacija tučkova nije uticao na bilo kakav vidljiv način na rast inkompatibilnih polenovih cevi ni kod "pin" ni kod "tram" morfa, što ukazuje da za membranu vezane kalcijum- i fosfolipid-zavisne protein kinaza C ne učestvuju u AI odgovoru heljde. v Umnožavanje DNK segmenata vezanih za S-lokus heljde upotrebom prajmera dizajniranih iz N7 AFLP markera (blisko vezanog Sh alelu S-lokusa heljde), omogućilo je dobijanje 14 novih sekvenci genomske DNK heljde. v Dužina 14 novih nukleotidnih sekvenci heljde kretala se u opsegu od 255 do 875 baznih parova DNK, a njihov GC sadržaj između 35% i 44.7% (u proseku 40.24%). v Sekvence su pokazivale repetitivnu strukturu (karakteristika S-lokusa mnogih AI cvetnica), što ide u prilog fizičkoj bliskosti ovih sekvenci i S-lokusa. v Sekvence P212 i T22, umnožene pomoću N7R1 i AD1 seta prajmera, bile su identične: dužine 255 baznih parova sa egzon-intron strukturom koja ukazuje na sličnost sa LRR receptor-nalik serin/treonin protein kinazom GSO2 ili sa histon-acetil transferazom HAC2; 69 v Analiza otvorenih okvira čitanja i egzon-intron struktura za 9 sekvenci ukazala je na sličnost sa različitim grupama proteina koji uglavnom imaju uloge u transdukciji signala i regulaciji transkripcije. v Za tri sekvence (P134, P333 i P533) nisu pronađene egzon-intron strukture ni otvoreni okvir čitanja. v 2D-PAGE profili totalnih proteinskih izolata "pin" i "tram" polena, neoprašenih, kompatibilno i inkompatibilno oprašenih "pin" i "tram" tučkova heljde, otkrili su preko 200 visoko reproducibilnih proteina u svakom od izolata. v Proteini su bili raspoređeni u širokom opsegu molekulskih masa (10-130 kDa), uz preovlađivanje kiselih i neutralnih proteina (pH 3.5-7), praćenih dosta manjim brojem baznih proteina (pH 7.5 - 9) u svakom od izolata. v Uočen je visok stepen sličnosti proteoma "pin" i "tram" polena odnosno neoprašenih "pin" i "tram" tučkova, kao i proteoma inkompatibilne/kompatibilne polinacije "pin" i "tram" tučkova, što ukazuje da najveći relativni udeo u svim uzorcima imaju proteini sa opštim ulogama u cvetu. v Detektovali smo oko 100 proteina različitih među klasama, što čini ~5% ukupno detektovanih proteina. Među 100 različitih proteina, detektovali smo 21 protein prisutan isključivo samo u jednom uzorku, tj. vezan specifično za određeni morf cveta ili njegov inkompatibilni odgovor. 70 v 2D-profili "pin" i "tram" neoprašenih tučkova razlikuju se u najmanje 19 proteina, od kojih je 7 proteina specifično prisutno u "pin", a 12 proteina u "tram" morfu tučka. v 2D-profili "pin" i "tram" polena razlikuju u najmanje 15 proteina, od kojih je 8 proteina specifično prisutno u "pin", a 7 proteina u "tram" polenu. v Identifikovana je grupa baznih proteina srednje molekulske mase (pI 8-9.25; 39-55 kDa) i dva mala bazna proteina (pI 8,5-8,8; 17 kDa) koji su specifični za "pin" neoprašene tučkove, a koji nestaju iz 2D-profila nakon polinacije, nezavisno od toga da li je polinacija bila inkompatibilna ili kompatibilna. U "tram" neoprašenim tučkovima nije detektovana slična grupa proteina. v Detektovana grupa baznih proteina neoprašenih "pin" tučkova je specifična za "pin" morf cveta i sadrži proteine uključene u opšti odgovor "pin" morfa na oprašivanje. v U 2D-profilima inkompatibilnih polinacija "pin" i "tram" tučkova uočeno je de novo pojavljivanje kiselih i neutralnih proteina manje molekulske mase (pI 4-7.5; 13-28 kDa). v Nakon kompatibilnih polinacija u "tram" tučkovima pojavljuje se de novo grupa baznih proteina srednje molekulske mase (pI 8-9.9; 35-43 kDa) i dva neutralna proteina (~32 kDa). U kompatibilno oprašenim "pin" tučkovima nije uočena pojava njima slične grupe proteina, ali je primećeno de novo pojavljivanje grupe manjih kiselih proteina (pI 4-5; 9-12 kDa). 71 v Rezultati istraživanja otvaraju niz novih mogućnosti i ukazuju da bi nastavljanje istraživanja moglo dovesti do značajnog pomaka u rasvetljavanju molekularne osnove heteromorfnog sporofitnog AI sistema heljde. 72 7. LITERATURA Aii, J., Nagano, M., Kuroda, M., Campbell, C., Adachi, T. (2001) Characterization of AFLP markers linked to the Sh allele in buckwheat. The proceeding of the 8th ISB, National Institute of Agrobiological Sciences, str. 470-474. Aii, J., Nagano, M., Kawasaki S., Adachi T. (2004) Centromeric location of the S- locus in buckwheat. Fagopyrum 21:21-25. Allen, A.M., Hiscock, S.J. (2008) Evolution and phylogeny of self-incompatibility systems in angiosperms. U: Franklin-Tong, V.E. (ed.) Self-incompatibility in flowering plants - Evolution, diversity and mechanisms. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, str.73- 101. Athanasiou, A., Shore J.S. (1997) Morph-specific proteins in pollen and styles of distylous Turnera (Turneraceae). Genetics 146:669-679. Bateman, A.J. (1956) Cryptic self-incompatibility in the wallflower: Cheiranthus cheiri L. Heredity 10: 257–261. Barrett, S.C.H. (1988) The evolution, maintenance, and loss of self-incompatibility systems. U: Doust, J.L., Doust L.L. (eds.) Plant reproductive ecology: patterns and strategies. Oxford University Press, New York, str. 98-124. Barrett, S.C.H. (1992) Heterostylous genetic polymorphisms: model systems for evolutionary analysis. U: Barrett, S.C.H. (ed.) Evolution and function of heterostyly. Monographs on theoretical and applied genetics. Springer, Berlin, str. 1-29. 73 Barrett, S.C.H., Cruzan M.B. (1994) Incompatibility in heterostylous plants. U: Williams, E.G., Clarke, A.E., Konx, R.B. (eds.) Genetic control of self-incompatibility and reproductive development in flowering plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,Boston, London, str. 189-219. Barrett, S.C.H. (1998) The evolution of mating strategies in flowering plants. Trends in Plant Science 3: 335-341. Barrett, S.C.H., Jesson, L.K., Baker, A.M. (2000) The evolution and function of stylar polymorphisms in flowering plants. Annals of Botany 85:253-265. Baumann, U., Juttner, J., Bian, X., Langridge, P. (2000) Self-incompatibility in the grasses. Annals of Botany 85: 203-209. Bawa, K.S., Beach, J.H. (1981) Evolution of Sexual Systems in Flowering Plants. Annals of the Missouri Botanical Garden 68: 254-274. Behrensmeyer, A.K., Damuth, J.D., DiMichele, W.A., Potts, R., Sues, H.D., Wing, S.L. (eds.) (1992) Terrestrial Ecosystems through Time: the Evolutionary Paleoecology of Terrestrial Plants and Animals. Chicago, London: University of Chicago Press. Bell, C.D., Soltis, D.E., Soltis P.S. (2005) The age of the Angiosperms: a molecular timescale without a clock. Evolution, 59: 1245-1258. Bhardwaj M., Eckert C.G. (2001) Functional analysis of synchronous dichogamy in flowering rush, Butomus umbellatu (Butomaceae). American Journal of Botany 88: 2204– 2213. 74 Bittencourt, N. S., Semir J. (2006) Floral biology and late-acting self- incompatibility in Jacaranda racemosa (Bignoniaceae). Australian Journal of Botany 54: 315-324. Bower, M.S., Matias, D.D., Fernandes-Carvalho, E., Mazzurco, M., Gu, T., Rothstein, S.J., Goring, D.R. (1996) Two members of the thioredoxin-h family interact with the kinase domain of a Brassica S locus receptor kinase. Plant Cell 8: 1641-1650. Bowman R.N. (1987) Cryptic self-incompatibility and the breeding system of Clarkia unguiculata (Onagraceae). American Journal of Botany 74: 471-476. Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254. Brandvain, Y., Haig, D. (2005) Divergent mating systems and parental conflict as a barrier to hybridization in flowering plants. American Naturalist 166: 330–338. Brennan, A.C., Tabah, D.A., Harris, S.A., Hiscock, S.J. (2011) Sporophytic self- incompatibility in Senecio squalidus (Asteraceae): S allele dominance interactions and modifiers of cross-compatibility and selfing rates. Heredity 106: 113–123. Brewbaker, J.L., Kwack, B.H. (1963) The essential role of calcium ions in pollen germination and pollen tube growth. American Journal of Botany 50: 859-865. Busch, J.W. (2005) The evolution of self-compatibility in geographically peripheral populations of Leavenworthia alabamica (Brassicaceae). American Journal of Botany 92: 1503–1512. 75 Cabrillac, D., Cock, J. M., Dumas, C., Gaude, T. (2001) The S-locus receptor kinase is inhibited by thioredoxins and activated by pollen coat proteins. Nature 410: 220- 223. Campbell, C.G. (1997) (ed.) Buckwheat, Fagopyrum esculentum Moench. Promoting the conservation and use of underutilized and neglected crops 19, International Plant Genetic Resources Institute. Carraro, L., Lombardo, G., Gerola, P. (1996) Style peroxidase and heteromorphic incompatibility reactions in Primula acaulis Hil ("thrum morph"). Caryologica 49:101-112. Chalivendra, S.C., Lopez-Casado, G., Kumar, A., Kassenbrock, A.R., Royer, S., Tovar-Mèndez. A., Covey, P.A, Dempsey, L.A., Randle, A.M., Stack. S.M., Rose, J.K.C., McClure, B., Bedinger, P.A. (2013) Developmental onset of reproductive barriers and associated proteome changes in stigma/styles of Solanum pennellii. Journal of Experimental Botany 64: 265–279. Chantha, S.-C., Herman, A.C., Platts, A.E., Vekemans, X., Schoen D.J. (2013) Secondary evolution of a self-incompatibility locus in the Brassicaceae genus Leavenworthia. PLoS Biology 11: e1001560. Chapman, A.D. (2009) Numbers of Living Species in Australia and the World, 2nd edition. Australian Biological Resources Study, Canberra. Charlesworth, D., Charlesworth B. (1987) Inbreeding depression and its evolutionary consequences. Annual Review of Ecology and Systematics 18: 237-268. Chen, Q.F. (1999) Hybridization between Fagopyrum (Polygonaceae) species native to China. Botanical Journal of the Linnean Society 131:177–185. 76 Chookajorn, T., Kachroo, A., Ripoll, D.R., Clark, A.G., Nasrallah, J.B. (2004) Specificity determinants and diversification of the Brassica self-incompatibility pollen ligand. Proceedings of the National Academy of Science USA 101: 911-917. Clarke, A.E., Newbigin E. (1993) Molecular aspects of self-incompatibility in flowering plants. Annual Review of Genetics 27:257-279. Cock, J. M., Cabrillac, D., Giranton, J.-L., Pastuglia, M., Ruffio-Chable, V., Miege, C., Dumas, C., Gaude, T. (2000) Investigating the molecular mechanism of the self- incompatibility response in Brassica. Annals of Botany 85: 147-153. Connor, H.E. (1979) Breeding systems in the grasses: a survey. New Zealand Journal of Botany 17: 547-574. Cornish, E.C., Pettitt, J.M., Clarke, A.E. (1988). Self-incompatibility genes in flowering plants. U: Verma D.P.S., Goldberg R.B. (eds.) Temporal and spatial regulation of plant genes. New York, Springer-Verlag, str. 117-130. Covey, P.A., Kondo, K., Welch, L., Frank, E., Sianta, S., Kumar, A., Nuñez R., Lopez-Casado, G., van der Knaap, E., Rose, J.K.C., McClure B.A., Bedinger P.A. (2010) Multiple features that distinguish unilateral incongruity and self-incompatibility in the tomato clade. The Plant Journal 64: 367–378. Crepet, W.L., Niklas K.J. (2009) Darwin’s second “Abominable mystery”: Why are there so many angiosperm species? American Journal of Botany 96: 366–381. Cruzan, M.B., Barrett, S.C.H. (1993) Contribution of cryptic incompatibility to the mating system of Eichhornia paniculata (Pontederiaceae). Evolution, 47: 925-934. 77 Darwin, C.R. (1876) The Effects of Cross and Self-fertilization in the Vegetable Kingdom. London. John Murray. Dicenta, F., Gracia, J.E. (1993) Inheritance of self-incompatibility in almond. Heredity 70:313–317. Dixit, R., Nasrallah J. B. (2001) Recognizing self in the self-incompatibility response. Plant Physiology, 125:105–108. Dowrick, V.P.J. (1956) Heterostyly and homostyly in Primula obconica. Heredity 10:219-236. Eckert C., Allen M. (1997) Cryptic self-incompatibility in tristylous Decodon verticillatus (Lythraceae). American Journal of Botany 84:1391-1397. Falconer, D. S., Mackay, T. F. C. (1996). Introduction to quantitative genetics. Longman, Essex, UK, 4th ed. edition. Frankham R. (2003) Genetics and conservation biology. Comptes Rendus Biologies 326 :S22–S29. Franklin-Tong, V.E., Lawrence. M. J., Franklin. F.C.H. (1990) Self-incompatibility in Papaver rhoeas L.: inhibition of incompatible pollen tube growth is dependent on pollen gene expression. New Phytologist 116: 319–324. Franklin-Tong, V.E., Ride, J.P., Read, N.D., Trewavas, A.J., Franklin, F.C.H. (1993) The self-incompatibility response in Papaver rhoeas is mediated by cytosolic-free calcium. The Plant Journal 4:163–177. 78 Franklin-Tong, V.E., Holdaway-Clarke, T.L., Straatman, K.R., Kunkel, J.G., Hepler, P.K. (2002) Involvement of extracellular calcium influx in the self-incompatibility response of Papaver rhoeas. The Plant Journal 29: 333–345. Ganders, F.R. (1979) The biology of heterostyly. New Zealand Journal of Botany 17: 607–635. Gaude, T., Dumas, C. (1987) Molecular and cellular events of self-incompatibility. Interantional Review of Cytology 107:333-366. Geitmann, A., Emons, A.M.C., Franklin-Tong, V.E. (2001). Early cellular events in pollen tubes during the self-incompatibility reaction. U: Geitmann, A., Cresti, M., Heath, I.B. (eds.) Cell Biology of Plant and Fungal Tip Growth, IOS Press, str. 203-219. Gensel, P.G. (2008) The earliest land plants. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics 39:459-477. Gibbs, P.E. (1990) Self-incompatibility in flowering plants: a Neotropical perspective. Revista Brasiliera de Botanica 13: 125–136. Goodwillie, C. (2000) Inbreeding depression and mating systems in two species of Linanthus (Polemoniaceae). Heredity 84: 283-293. Golynskaya, E.L., Bashrikova, N.V., Tonchuk, N.N. (1976) Phytohaemaglutinins of the pistil of Primula as possible protiens of generative incompatibility. Soviet Plant Physiology 23:169-176. Golz, J.F., Su, V., Clarke, A.E., Newbigin, E. (1999) A molecular description of mutations affecting the pollen component of the Nicotiana alata S locus.Genetics 152: 1123-1135. 79 Golz, J.F., Oh, H.Y., Su, V., Kusaba, M., Newbigin, E. (2001) Genetic analysis of Nicotiana pollen-part mutants is consistent with the presence of an S-ribonuclease inhibitor at the S locus. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98: 15372- 15376. Gore, P.L., Potts, B.M., Volker, P.W., Megalos, J. (1990) Unilateral cross- incompatibility in Eucalyptus: the case of hybridisation between E. globulus and E. nitens. Australian Journal of Botany 38: 383 - 394. de Graaf, B.H.J., Vatovec, S., Juárez-Díaz, J.A., Chai, L., Kooblall, K., Wilkins, K.A., Zou, H., Forbes, T., Franklin, F.C.H., Franklin-Tong V.E. (2012) The Papaver self- incompatibility pollen S-determinant, PrpS, functions in Arabidopsis thaliana. Current Biology 22: 154–159. Grun, P., Radlow A. (1961) Evolution of barriers to crossing of self-incompatible with self-compatible species of Solanum. Heredity 16: 137-144. Haasen, K.E., Goring D.R. (2010) The recognition and rejection of self- incompatible pollen in the Brassicaceae. Botanical Studies 51: 1-6. Haffani, Y., Gaude, T., Cock, J., Goring, D. (2004) Antisense suppression of thioredoxin h mRNA in Brassica napus cv. Westar pistils causes a low level constitutive pollen rejection response. Plant Molecular Biology 55: 619-630. Hafizi, A., Shiran, B., Maleki, B., Imani, A., Banovic, B. (2013) Identification of new S-RNase self-incompatibility alleles and characterization of natural mutations in Iranian almond cultivars. Trees Structure and Function 27:497–510. 80 Hancock, N. C., Kondo, K., Beecher, B., McClure B. (2003) The S-locus and unilateral incompatibility. Philosophical Transactions of the Royal Society London Biological Sciences 358: 1133–1140. Haring, V., Gray, J.E., McClure, B. A., Anderson, M. A., Clarke, A.E. (1990) Self- Incompatibility: A Self-Recognition System in Plants. Science 250:937-941. Hatakeyama, K., Watanabe, M., Takasaki, T., Ojima, K., Hinata, K. (1998) Dominance relationships between S-alleles in self-incompatible Brassica campestris L. Heredity 80:241–247. Hatakeyama, K., Takasaki, T., Suzuki, G., Nishio, T., Watanabe, M. Isogai A. Hinata, K. (2001) The S receptor kinase gene determines dominance relationships in stigma expression of self-incompatibility in Brassica. The Plant Journal 26:69-76. Harder, L.D., Cruzan, M.B., Thomson, J.D. (1993) Unilateral incompatibility and the effects of interspecific pollination for Erythronium americanum and Erythronium albidum (Liliaceae). Canadian Journal of Botany 71: 353-358. Hayman, D.L. (1992) The S-Z incompatibility system. In: Chapman, G.P. (ed.) Grass evolution and domestication. Cambridge University Press, Cambridge, str. 117-137. Heslop-Harrison, J. (1975) Incompatibility and the pollen-stigma interaction. Annual Review Plant Physiology 26:403-425. Hiscock, S.J. (2002) Pollen recognition during the self-incompatibility response in plants. Genome Biology 3:1004.1–1004.6. 81 Hörandl, E., Temsch, E.M. (2009) Introgression of apomixis into sexual species is inhibited by mentor effect and ploidy barriers in the Ranunculus auricomus complex. Annals of Botany 104: 81-89. http://www.theplantlist.org (2010) Royal Botanic Gardens, Kew, Missouri Botanical Garden. Hua, Z.-H., Fields, A., Kao, T.-H. (2008) Biochemical models for S-RNase-based Self-incompatibility. Molecular Plant 1: 575–585. Husband, B.C., Schemske D. W. (1996) Evolution of the magnitude and timing of inbreeding depression in plants. Evolution 50: 54-70. Igic, B., Kohn, J.R. (2001) Evolutionary relationships among self-incompatibility RNases. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 98:13167–13171. Igic, B., Bohs, L., Kohn, J.R. (2004) Historical inferences from the self- incompatibility locus. New Phytologist 161: 97–105. Igic, B., Bohs, L., Kohn, J.R. (2006) Ancient polymorphism reveals unidirectional breeding system shifts. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 103: 1359– 1363. Igic, B., Lande, R., Kohn, J.R. (2008) Loss of self-incompatibility and its evolutionary consequences. International Journal of Plant Sciences 169: 93-104. Jain, S.K. (1976) The evolution of inbreeding in plants. Annual Review of Ecology and Systematics 7: 469-495. 82 Jansson, S., Douglas, C.J. (2007) Populus: A model system for plant biology. Annual Review of Plant Biology 58: 435-458. Jesson, L.K., Milicich, L.D., Newman, S.C. (2006) Competition-dependent incompatibility in Phormium tenax: does self-fertilisation provide reproductive assurance? New Zealand Journal of Botany 44: 249–259. Joshi, B.K., Okuno, K., Ohsawa, R., Hara, T. (2006) Common buckwheat-based EST primers in the genome of other species of Fagopyrum. Nepal Agricultural Research Journal 7: 27-36. Jotaro, A., Nagano, M., Woo, S.H., Campbell, C. (1999) Development of SCAR markers linked to the Sh gene in buckwheat. Fagopyrum 16:19-22. Kao, T.-H., Tsukamoto, T. (2004) The molecular and genetic bases of S-RNase- based self-incompatibility. The Plant Cell 16: S72–S83. Kakita, M., Murase, K., Iwano, M., Matsumoto, T., Watanabe, M., Shiba, H., Isogai, A., Takayama, S. (2007a). Two distinct forms of M-locus protein kinase localize to the plasma membrane and interact directly with S-locus receptor kinase to transduce self- incompatibility signaling in Brassica rapa. The Plant Cell 19: 3961-3973. Kakita, M., Shimosato, H., Murase, K., Isogai, A., Takayama, S. (2007b) Direct interaction between the S-locus receptor kinase and M-locus protein kinase involved in Brassica self-incompatibility signaling. Plant Biotechnology 24:185-190. Kalisz, S., Vogler, D.W., Hanley, K.M. (2004) Context-dependent autonomous self- fertilization yields reproductive assurance and mixed mating. Nature 430: 884–887. 83 Kärkkäinen, K., Kuittinen, H., van Treuren, R., Vogl, C., Oikarinen, S., Savolainen, O. (1999) The genetic basis of inbreeding depression in Arabis petraea. Evolution 53: 1354-1365. Kato, M. (2010) Evolution of Primitive Land Plants: A Review. Bulletin of the National Museum of Nature and Science, Series B, 36:1–11. Katsube-Tanaka, T. , Khan, N., Takahashi, Y., Nakagawaa, M. (2011) Analysis of the major seed storage protein, 13S globulin, in common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). Proceedings of The 7th ACSA Conference, str. 349-353. Keller, L.F., Waller, D.M. (2002) Inbreeding effects in wild populations. Trends in Ecology and Evolution 17: 230-241. Kemp, B.P., Doughty, J. (2003) Just how complex is the Brassica S-receptor complex? Journal of Experimental Botany (Plant Reproductive Biology Special Issue), 54:157-168. Kemp, B.P., Doughty, J. (2007) S cysteine-rich (SCR) binding domain analysis of the Brassica self-incompatibility S-locus receptore-kinase. New Phytologist 175:619-629. Kenrick, P., Crane, P.R. (1997) The origin and early evolution of plants on land. Nature 389: 33-39. Kitashiba, H., Liu, P., Nishio,T., Nasrallah, J.B., Nasrallah, M.E. (2011) Functional test of Brassica self-incompatibility modifiers in Arabidopsis thaliana. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 108:18173–18178. Klaas, M., Yang, B., Bosch, M., Thorogood, D., Manzanares, C., Armstead I.P., Franklin, F.C.H., Barth, S. (2011) Progress towards elucidating the mechanisms of self- 84 incompatibility in the grasses: further insights from studies in Lolium. Annals of Botany 108: 677–685. Klein, A.-M., Vaissière, B. E., Cane, J.H., Steffan-Dewenter, I., Cunningham, S.A., Kremen, C., Tscharntke, T. (2007) Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proeedings of the. Royal Society Biological Sciences 274: 303–313. Klein, D. E., Freitas, L., Da Cunha, M. (2009) Self-incompatibility in a distylous species of Rubiaceae: is there a single incompatibility response of the morphs? Sexual Plant Reproduction 22:121-131. Konishi, T., Ohnishi, O. (2006) A linkage map for common buckwheat based on microsatellite and AFLP markers. Fagopyrum 23: 1-6. Korbecka, G., Vrieling, K., Squirrell, J., Hale, M. L., Wolff, K. (2003) Characterization of six microsatellite loci in Echium vulgare (Boraginaceae). Molecular Ecology Notes 3:274–276. Kubo, K.-I., Entani, T., Takara, A., Wang, N., Fields, A.M., Hua, Z., Toyoda, M., Kawashima, S.-I., Ando, T., Isogai, A., Kao, T.-H., Takayama, S. (2010) Collaborative non- self recognition system in S-RNase–based self-incompatibility. Science 330:796-799. Kurian, V., Richards, A. J. (1997) A new recombinant in the heteromorphy 'S' supergene in Primula. Heredity 78: 383–390. Kusaba, M., Dwyer, K., Hendershot, J., Vrebalov, J., Nasrallah, J.B., Nasrallah, M.E. (2001) Self-incompatibility in the genus Arabidopsis: characterization of the S locus in the outcrossing A. lyrata and its autogamous relative, A. thaliana. The Plant Cell 13: 627–643. 85 Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685. Lande, R., Schemske, D.W. (1985) The evolution of self-fertilization and inbreeding depression in plants. I. Genetic models. Evolution 39: 24-40. Larsen K. (1977) Self-incompatibility in Beta vulgaris L. I. Four gametophytic, complementary S-loci in sugar beet. Hereditas 85: 227-248. Lewis, D., Crowe, L.K. (1958) Unilateral interspecific incompatibility in flowering plants. Heredity 12: 233–256. Li, J., Webster, M., Furuya, M., Gilmartin, P.M. (2007) Identification and characterization of pin and thrum alleles of two genes that co-segregate with the Primula S locus. The Plant Journal 51:18-31. Liu, Y.G., Whittier, R.F. (1995) Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics 25:674-681. Liu, P., Sherman-Broyles, S., Nasrallah, M.E., Nasrallah, J.B. (2007) A cryptic modifier causing transient selfincompatibility in Arabidopsis thaliana. Current Biology 17: 734–740. Lloyd, D.G. (1968) Partial unilateral incompatibility in Leavenworthia (Cruciferae). Evolution 22: 382-393. Logacheva, M.D., Kasianov, A.S., Vinogradov, D.V., Samigullin, T.H., Gelfand, M.S., Makeev, V.J., Penin, A.A. (2011) De novo sequencing and characterization of floral transcriptome in two species of buckwheat (Fagopyrum). BMC Genomics 12:30. 86 Lundqvist, A. (1964) The nature of the two-loci incompatibility system in grasses III. Frequency of specific incompatibility alleles in a population of Festuca pratensis huds. Hereditas 52: 189–196. Lynch, M. (1991) The genetic interpretation of inbreeding depression and outbreeding depression. Evolution 45: 622-629. Mable, B.K., Robertson, A.V., Dart,S., Di Berardo, C., Witham, L. (2005) Breakdown of self-incompatibility in the perennial Arabidopsis lyrata (Brassicaceae) and its genetic consequences. Evolution 59: 1437–1448. Mable, B.K. (2008) Genetic causes and consequences of the breakdown of self- incompatibility : case studies in the Brassicaceae. Genetics Research (Camb) 90: 47–60. Manfield, I.W., Pavlov, V.K., Li, J., Cook, H.E., Hummel, F., Gilmartin, P.M. (2005) Molecular characterization of DNA sequences from the Primula vulgaris S-locus. Journal of Experimental Botany 56:1177-1188. Marshall, H.G. (1980) Buckwheat. U: Fehr W.R., Hadley H.H. (ed.) Hybridization of crop plants. American Society of Agronomy, Crop Science Society of America, str. 215- 224. Marshall, E., Costa, L.M., Gutierrez-Marcos, J. (2011) Cysteine-rich peptides (CRPs) mediate diverse aspects of cell–cell communication in plant reproduction and development. Journal of Experimental Botany 62: 1677–1686. Martin, F.W. (1964) The inheritance of unilateral incompatibility in Lycopersicon Hirsutum. Genetics 50: 459-469. 87 Mather, K., de Winton, D. (1941) Adaptation and counter-adaptation of breeding system in Primula. Annals of Botany 5: 297-311. Matton, D.P, Nass, N., Clarke, A.E., Newbigin, E. (1994) Self-incompatibility - how plants avoid illegitimate offspring. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 91:1992-1997. Matsui, K., Tetsuka, T., Nishio, T., Hara, T. (2003) Heteromorphic incompatibility retained in self-compatible plants produced by a cross between common and wild buckwheat. New Phytologist 159:701-708. Matsui, K., Nishio, T., Tetsuka, T. (2004) Genes outside the S supergene suppress S functions in buckwheat (Fagopyrum esculentum). Annals of Botany. 94:805-809. Matsui, K., Nishio, T., Tetsuka, T. (2007) Use of self-compatibility and modifier genes for breeding and genetic analysis in common buckwheat (Fagopyrum esculentum). Japan Agricultural Research Quarterly 41:1-5. McClure, B.A. (2004) S-RNase and SLF determine S-haplotype-specific pollen recognition and rejection. The Plant Cell 16: 2840-2847. McClure, B., Cruz-García, F., Romero, C. (2011) Compatibility and incompatibility in S-RNase-based systems. Annals of Botany (Review: part of a special issue on sexual plant reproduction): 1-12. McCubbin, A. G., Lee, C., Hetrick, A. (2006) Identification of genes showing differential expression between morphs in developing flowers of Primula vulgaris. Sexual Plant Reproduction19:63-72. 88 McCubbin, A. (2008) Heteromorphic self-incompatibility in Primula: twenty-first century tools promise to unravel a classic nineteenth century model system. U: Franklin- Tong, V.E. (ed.) Self-incompatibility in flowering plants - Evolution, diversity and mechanisms. Springer-Verlag Berlin Heidelberg, str. 289-308. Miljuš-Đukić, J., Ninković, S., Maksimović, V., Radović, S., Brkljačić,J., Nešković, M. (1998) Effects of protein metabolism inhibitors on SI reaction in buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench). U: Campbell, C., and Przybylski, R. (ed.). Proceedings of the VII International Symposium on Buckwheat V, International Buckweat Research Association, Winnipeg, str. 9-18. Miljuš-Ðukić, J., Ninković, S., Nešković, M. (2003) Effects of protein phosphatase inhibitors and calcium antagonists on self-incompatible reaction in buckwheat. Biologia Plantarum 46: 475–478. Miljuš-Đukić, J., Ninković, S., Radović, S., Maksimović, V., Brkljačić, J., Nešković, M. (2004) Detection of proteins possibly involved in self-incompatibility response in distylous buckwheat. Biologia Plantarum 48:293-296. Momma, M. (2009) Detection of dehydrin-like proteins in buckwheat by immunoblotting with an antibody against the lysine-rich sequence. Reports of the National Food Research Institute 7: 1-6. Ming, R., Wang, J., Moore, P. H., Paterson A. H. (2007) Sex chromosomes in flowering plants. American Journal of Botany 94: 141–150. Mráz, P. (2003) Mentor effects in the genus Hieracium s.str. (Compositae, Lactuceae). Folia Geobotanica 38: 345-350. 89 Murase, K., Shiba, H., Iwano, M., Che, F. S., Watanabe, M., Isogai A., Takayama, S. (2004) A membrane-anchored protein kinase involved in Brassica self-incompatibility signaling. Science 303: 1516-1519. Nagano, M., Aii, J., Kuroda, M., Campbell, C., Adachi, T. (2001) Conversion of AFLP markers linked to the Sh allele at the S locus in buckwheat to a simple PCR based marker form. Plant Biotechnology 18:191-196. Nagano, M., Aii, J., Campbell, C., Adachi, T., Kawasaki, S. (2005) Construction of BAC library for the investigation of the S locus in buckwheat. Fagopyrum 22:13-19. Navascués, M., Stoeckel, S., Mariette, S. (2010) Genetic diversity and fitness in small populations of partially asexual, self-incompatible plants. Heredity (Edinb) 104: 482– 492. Niroula, R.K., Bimb, H.P., Sah, B.P. (2006) Interspecific hybrids of buckwheat (Fagopyrum spp.) regenerated through embryo rescue. Scientific World 4:74-77. Nomura, Y., Hatashita, M., Inoue, M. (2002) Production of self-compatible common buckwheat by ion exposure. Fagopyrum 19: 43-48. Ohnishi, O. (1991) Discovery of the wild ancestor of common buckwheat. Fagopyrum II: 5-10. Olmstead, R.G., Bohs, L. (2007) A Summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae (ISHS) 745:255-268. Ölschhläger, C., Treutter, D., Zeller, F.J. (2004) Breeding Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) for flavonoids. Proceedings of the 9th International Symposium on Buckwheat, Prague. 90 Onus, N.A., Pickersgill, B. (2004) Unilateral Incompatibility in Capsicum (Solanaceae): Occurrence and Taxonomic Distribution. Annals of Botany 94: 289–295. Ortega, E., Sutherland, B.G., Dicenta, F., Bošković, R., Tobutt, K.R. (2005) Determination of incompatibility genotypes in almond using first and second intron consensus primers: detection of new S-alleles and correction of reported S-genotypes Plant Breeding 124:188–196. Pagnussat, G.C., Yu, H.-J., Ngo, Q.A., Rajani, S., Mayalagu, S., Johnson, C.S., Capron, A., Xie, L.-F., Ye, D., Sundaresan, V. (2005) Genetic and molecular identification of genes required for female gametophyte development and function in Arabidopsis. Development 132:603-614. Pan, S.-J., Chen, Q.-F. (2010) Genetic mapping of common buckwheat using DNA, protein and morphological markers. Hereditas 147: 27–33. Pandey, K.K. (1960) Evolution of gametophytic and sporophytic systems of self- incompatibility in angiosperms. Evolution 14: 98-115. Pandey, R., Mueller, A., Napoli, C.A., Selinger, D.A., Pikaard, C.S., Richards, E.J., Bender, J., Mount, D.W., Jorgensen, R.A. (2002) Analysis of histone acetyltransferase and histone deacetylase families of Arabidopsis thaliana suggests functional diversification of chromatin modification among multicellular eukaryotes. Nucleic Acids Research 30:5036- 5055. Porcher, E., Lande, R. (2005) Loss of gametophytic self-incompatibility with evolution of inbreeding depression. Evolution 59: 46–60. 91 Puerta, A.R., Ushijima, K., Koba, T., Sassa, H. (2009) Identification and functional analysis of pistil self-incompatibility factor HT-B of Petunia. Journal of Experimental Botany 60:1309–1318. Radović S.R., Maksimović V.R., Varkonji-Gašić E.I. (1996) Characterization of buckwheat seed storage proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry 44: 972−974. Reed D.H., Frankham R. (2003) Correlation between fitness and genetic diversity. Conservation Biology 17:230–237. Rensing, S.A., Lang, D., Zimmer, A.D., Terry, A., Salamov, A., Shapiro, H., Nishiyama, T., Perroud, P.-F., Lindquist. E.A., Kamisugi, Y., Tanahashi, T.,Sakakibara K., Fujita, T., Oishi, K., Shin-I, T., Kuroki, Y., Toyoda, A., Suzuki, Y., Hashimoto, S.-I., Yamaguchi, K., Sugano, S., Kohara, Y., Fujiyama. A., Anterola, A., Aoki, S., Ashton, N., Barbazuk, B.W., Barker, E., Bennetzen, J. L., Blankenship, R., Cho, S. H., Dutcher, S. K., Estelle, M., Fawcett, J.A., Gundlach, H., Hanada, K., Heyl, A., Hicks, K.A., Hughes, J., Lohr, M., Mayer, K., Melkozernov, A., Murata, T., Nelson, D. R., Pils, B., Prigge, M., Reiss, B., Renner, T., Rombauts, S., Rushton, P. J., Sanderfoot, A., Schween, G., Shiu, S.-H., Stueber, K., Theodoulou, F. L., Tu, H., Van de Peer, Y., Verrier, P.J., Waters, E., Wood, A., Yang, L., Cove, D., Cuming, A. C., Hasebe, M., Lucas, S., Mishler, B. D., Reski, R., Grigoriev, I.V., Quatrano R. S., Boore J. L. (2008). The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants. Science 319: 64–69. Rieseberg, L.H. (2001) Chromosomal rearrangements and speciation. Trends in Ecology and Evolution 16: 351-358. Rushton, P.J., Somssich, I.E., Ringler, P., Shen, Q.J. (2010) WRKY transcription factors. Trends in Plant Sciences 15:247-258. 92 Safavian, D., Shore, J.S. (2010) Structure of styles and pollen tubes of distylous Turnera joelii and T. scabra (Turneraceae): are there different mechanisms of incompatibility between the morphs? Sexual Plant Reproduction 23:225–237. Sage, T.L., Sampson B.F. (2003) Evidence for ovarian self-incompatibility as a cause of self-sterility in the relictual woody angiosperm, Pseudowintera axillaris (Winteraceae). Annals of Botany 91: 807-816. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Samimy, C., Bjorkman, T., Siritunga, D., Blanchard, L. (1996) Overcoming the barrier to interspecific hybridization of Fagopyrum esculentum with Fagopyrum tataricum Euphytica 91: 323-330. Samuel, M.A., Chong, Y.T., Haasen, K.E., Aldea-Brydges, M.G., Stone, S.L., Goring, D.R. (2009) Cellular pathways regulating responses to compatible and self- incompatible pollen in Brassica and Arabidopsis stigmas intersect at Exo70A1, a putative component of the exocyst complex. The Plant Cell 21:2655–2671. Schopfer, C. R., Nasrallah, M.E., Nasrallah, J. B. (1999) The male determinant of self-incompatibility in Brassica. Science 286:1697-1700. Schopfer, C.R., Nasrallah, J.B. (2000) Self-Incompatibility. Prospects for a Novel Putative Peptide-Signaling Molecule. Plant Physiology 124:935-940. Seavey, S.R., Bawa, K.S. (1986) Late-acting self-incompatibility in angiosperms. The Botanical Review 52: 195-219. 93 Shiba, H., Takayama, S., Iwano, M., Shimosato, H., Funato, M., Nakagawa, T., Che, F.-S., Suzuki, G., Watanabe, M., Hinata, K., Isogai, A. (2001) A pollen coat protein, SP11/SCR, determines the pollen S specificity in the self-incompatibility of Brassica species. Plant Physiology 125: 2095–2103. Shiba, H., Takayama, S. (2012) Epigenetic regulation of monoallelic gene expression. Development, Growth and Differentiation 54:120–128. Shimosato, H., Yokota, N., Shiba, H., Iwano, M., Entani, T., Che, F., Watanabe, M., Isogai, A., Takayama, S. (2007) Characterization of the SP11/SCR high affinity binding site involved in self/nonself recognition in Brassica self-incompatibility. The Plant Cell 19:109-117. Shin, D.H., Kamal, A.H.M., Suzuki, T., Yun, U.H., Lee, M.S., Chuang, K.Y., Jeong, H.S., Park, C.H., Choi, J.S., Woo, S.H. (2010) Reference proteome map of buckwheat (Fagopyrum esculentum and Fagopyrum tataricum) leaf and stem cultured under light or dark. Australian Journal of Crop Sciences 4:633-641. Shivanna, K.R., Heslop-Harrison, Y., Heslop-Harrison, J. (1982) The pollen-stigma interaction in the grasses. III. Features of the self-incompatibility response. Acta Botanica Neerlandica 31: 307-319. Shore, J.S., Arbo, M.M., Fernández A. (2006) Breeding system variation, genetics and evolution in the Turneraceae. New Phytologist 171:539–551. Silva, N.F, Goring, D.R. (2001) Mechanisms of self-incompatibility in flowering plants. Cellular and Molecular Life Sciences 58:1988-2007. Smith-Huerta, N.L., Vasek Madroño, F.C. (2011) Pollen siring success in the California wildflower Clarkia unguiculata (Onagraceae). Madroño 58: 78-85. 94 Solbrig, O.T. (1976) On the relative advantages of cross and self- fertilization. Annals of the Missouri Botanical Garden 63: 262-276. Soltis, P.S, Soltis D.E. (2004) The origin and diversification of angiosperms. American Journal of Botany 91: 1614–1626. Sonneveld, T., Tobutt, K.R., Robbins, T.P. (2003) Allele-specific PCR detection of sweet cherry self-incompatibility (S) alleles S1 to S16 using consensus and allele-specific primers. Theoretical and Applied Genetics 107: 1059–1070. Stebbins, G.L. (1957) Self fertilization and population variability in the higher plants. The American Naturalist 861: 337-354. Stec, I., Nagl, S.B., van Ommen, G.J., den Dunnen, J.T. (2000) The PWWP domain: a potential protein-protein interaction domain in nuclear proteins influencing differentiation? FEBS Letters 473:1-5. Stein, J.C., Howlett, B., Boyes, D.C., Nasrallah, M.E., Nasrallah, J.B. (1991) Molecular cloning of a putative receptor protein kinase gene encoded at the self- incompatibility locus of Brassica oleracea. The Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88: 8816–8820. Stein, J.C., Dixit, R., Nasrallah, M.E., Nasrallah, J.B. (1996). SRK, the stigma- specific S locus receptor kinase of Brassica, is targeted to the plasma membrane in transgenic tobacco. The Plant Cell 8:429–445. Steinbachs, J.E., Holsinger, K.E. (2002) S-RNase-mediated gametophytic self- incompatibility is ancestral in eudicots. Molecular Biology and Evolution 19: 825–829. 95 Stone, S.L., Anderson, E.M., Mullen, R.T., Goring, D.R. (2003) ARC1 is an E3 ubiquitin ligase and promotes the ubiquitination of proteins during the rejection of self- incompatible Brassica pollen. The Plant Cell 15:885–898. Sutherland, B.G., Tobutt, K. R., Robbins, T. P. (2008) Trans-specific S-RNase and SFB alleles in Prunus self-incompatibility haplotypes. Molecular Genetics and Genomics 279: 95-106. Takada, Y., Sato, T., Suzuki, G., Shiba, H., Takayama, S. Watanabe, M. (2013) Involvement of MLPK pathway in intraspecies unilateral incompatibility regulated by a single locus with stigma and pollen factors. G3: Genes, Genomes, Genetics 3: 719-726. Takasaki, T., Hatakeyama, K., Suzuki, G., Watanabe, M., Isogai, A., Hinata, K. (2000) The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigmas. Nature 403: 913-916. Takayama, S., Isogai, A. (2003) Molecular mechanism of self-recognition in Brassica self-incompatibility. Journal of Experimental Botany (Plant Reproductive Biology Special Issue) 54: 149-156. Takayama, S., Isogai, A. (2005) Self-incompatibility in plants. Annual Review of Plant Biology 56:467-89. Tarutani, Y., Shiba, H., Iwano, M., Kakizaki, T., Suzuki, G., Watanabe, M., Isogai, A., Takayama, S. (2010) Trans-acting small RNA determines dominance relationships in Brassica self-incompatibility. Nature 466:983–986. Thomas, S.M., Murray, B.G. (1975) A new site for the self-incompatibility reaction in the Gramineae. Incompatibility Newsletter 6: 22-23. 96 Thompson, K.F., Taylor, J.P. (1966) Non-linear relationships between S alleles. Heredity 21:345–362. Thompson, K.F. (1972) Competitive interaction between two S alleles in a sporophytically-controlled incompatibility system. Heredity 28:1-7. Tsuwamoto, R., Fukuoka, H., Takahata, Y. (2008) GASSHO1 and GASSHO2 encoding a putative leucine-rich repeat transmembrane-type receptor kinase are essential for the normal development of the epidermal surface in Arabidopsis embryos. The Plant Journal 54:30-42. Vaughan, S.P., Russell, K., Sargent, D.J., Tobutt, K.R. (2006) Isolation of S-locus F- box alleles in Prunus avium and their application in a novel method to determine self- incompatibility genotype. Theoretical and Applied Genetics 112: 856–866. Vaughton, G., Ramsey, M., Johnson S.D. (2010) Pollination and late-acting self- incompatibility in Cyrtanthus breviflorus (Amaryllidaceae): implications for seed production. Annals of Botany 106: 547 –555. Vallejo-Marin, M., Uyenoyama, M.K. (2004) On the evolutionary costs of self- incompatibility: incomplete reproductive compensation due to pollen limitation. Evolution 58:1924–1935. Watson, L., Dallwitz, M. J. (1992) The grass genera of the world. CAB International, Wallingford. Watanabe, K., Shimizu, M., Adachi, T., Yoshida, T., Mitsunaga, T. (1998) Characterization of thiamin-binding protein from buckwheat seeds. Journal of the Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo) 44:323-328. 97 Weller, S.G., Ornduff, R. (1977) Cryptic self-incompatibility in Amscinkia grandiflora. Evolution 31: 47-51. Weller, S.G., Donoghue, M.J., Charlesworth, D. (1995) The evolution of self- incompatibility in flowering plants: a phylogenetic approach. U: Hoch, P.C., Stephenson, A.G. (eds.) Experimental and molecular approaches to plant biosystematics, 53. Missouri Botanical Garden, St. Louis, str. 355–382. Wheeler, M.J., de Graaf, B.H.J., Hadjiosif, N., Perry, R.M., Poulter, N.S., Osman, K., Vatovec, S., Harper, A., Franklin, F.C.H., Franklin-Tong, V.E. (2009) Identification of the pollen self-incompatibility determinant in Papaver rhoeas. Nature 459: 992–995. Widmer, A., Lexer, C., Cozzolino, S. (2009) Evolution of reproductive isolation in plants. Heredity 102: 31-38. Woo, S.-H., Adachi, T., Jong, S.K., Campbell, C.G. (1999a) Inheritance of self- compatibility and flower morphology in an inter-specific buckwheat hybrid. Canadian Journal of Plant Sciences 79:483-490. Woo, S.H., Wang, Y.J., Campbell, C.G. (1999b) Interspecific hybrids with Fagopyrum cymosum in the genus Fagopyrum. Fagopyrum 16: 13-18. Woo, S.-H., Kim, S.-H., Tsai, K.S., Chung, K.-Y., Jong, S.-K., Adachi, T., Choi, J.-S. (2008) Pollen tube behavior and embryo develompment in interspecific crosses among genus Fagopyrum. Journal of Plant Biology 51:302-310. Wu, X., Li, A., Zhang, D. (2010) Cryptic self-incompatibility and distyly in Hedyotis acutangula Champ. (Rubiaceae). Plant Biology 12:484-494. 98 Wu, J., Wang, S., Gu, Y., Zhang, S., Publicover, S.J., Franklin-Tong, V.E. (2011) Self-incompatibility in Papaver rhoeas activates nonspecific cation conductance permeable to Ca2+ and K+[W]. Plant Physiology 155: 963–973. Xu, C., Min, J. (2011) Structure and function of WD40 domain proteins. Protein Cell 2: 202-214. Yasui, Y., Wang, Y., Ohnishi, O., Campbell, C.G. (2004) Amplified fragment length polymorphism linkage analysis of common buckwheat (Fagopyrum esculentum) and its wild self-pollinated relative Fagopyrum homotropicum. Genome 47:345-351. Yasui, Y., Mori, M., Matsumoto, D., Ohnishi, O., Campbell, C.G., Ota, T. (2008) Construction of a BAC library for buckwheat genome research - an application to positional cloning of agriculturally valuable traits. Genes and Genetics Systematics 83:393- 401. Yasui, Y., Mori, M., Aii, J., Abe, T., Matsumoto, D., Sato, S., Hayashi, Y., Ohnishi, O., Ota, T. (2012) S-locus early flowering 3 is exclusively present in the genomes of short- styled buckwheat plants that exhibit heteromorphic self-incompatibility. PlosOne 7: 1-8. Zluvova. J., Nicolas, M., Berger, A., Negrutiu, I., Monéger F. (2006) Premature arrest of the male flower meristem precedes sexual dimorphism in the dioecious plant Silene latifolia. The Proceedings of the National Academy of Sciences USA 103: 18854– 18859. 99 8. DODATNI MATERIJAL PRILOG A. Genomske sekvence heljde bliske S-lokusu dobijene umnožavanjem pomoću prajmera izvedenih iz AFLP N7 markera (pogledati u Tabeli 2), koji je blisko vezan Sh alelu S-lokusa heljde (P, sekvence genomske DNK "pin" biljke; T, sekvence genomske DNK "tram" biljke). P11> 704bp GAAATCACCCATGGAGTAAGTGTGCTAGGATAGTTGCTTAGAACTTCCCTTTCCGAGACTTACCCGGTAAGGA TAGGTTAGACCTCTAGGCAACAAATCCGGTTTGTGTAGAATTCCAATCCTTAGGTTCTTAGAGACTTACCCGG TAACGAGACCTTAAGAATGGATTAGCGGACCATGAGACTTACCAGGTGATTGATCCCACTTCATAAACACTTA CTCCCGACATATCATAGATCACCCAAGGAATGATTAGATAGCTTGAGTCCTATGCCATAATCGGAATTTCCAA CCCCTAGAATCCGTTTCTCTCTTTTGATTCATATCTCGTGTTTAGCTTGTTTCTTTGTTTTGATTCATTAGCT TAGTTGATTGCTTACTTTTACATGAATTGTGATCCTTGATTGATCACTTAAAACCAACCAAAAACAATTGAGA TTTTCATTTCTTTATTTCTTTCTCATTTCTTAACTTAGATCTTCACTAGACTTAATCATAAACCGAATCAATC TCACCTTAGTCTTTGTGTTCGACCTCGGAATACTATCCACACTACGAACGTCCCGTACACTGCGGGTGCGCTA GGAGTTAGGAGAAATATAACGAGTATAAATTTAAGACTTATTGTGCACACATCCTGAGCGTAACAAGACCTAC CCGGTGATTAATCCCAATCTAGAAACACTTACTCCATGGGTGATTTC P125> 397bp CACCCATGGAGTAAGTGTTTCCAAAGGACGTTTATAATCATACTTGTAATGATTGAATTTGCACATGACACAA ACTTAATAATTTAGAAGCTCATGTGACATTTTATTCTAAAATCAGTCAATAATGTGTTTGTTATTCCGTTTTA GTTGTGGATTCGAGGTAATATTATTTCGCCTCATTTTTATAATAACTTTTGTACGTGGAGTGATTTTTTTAGT GGACTTGAAGTGGCGGAACGAGATGATTTTTCAGCATGCGTCTTTTGTCGGGGATTGACATCGGCACATGCTT GCTACGGCTAATGAGTATTGTTAAGCTTGGAATAAGAAGCATCTTATGAGAACTTCACGACGTCGGATTACTT TGATGGCTTGGGAAACACTTACTCCATGGGTG P134> 255bp GAAATCACCCATGGAGTAAGTGTGCTAGGATAGTTGCTTAGAACTTCCCTTTCCGGGACTTACCCGGTAAGGA TAGGTTAGACCTCTAGGCAACAAATCCGGTTTGTGTAGAATTCCATTCCTTAGGTTCTTAGAGACTTACCCGG TAACGAGACCTTAAGAATGGATTAGCGGACCATGAGACTTACCAGGTGATTGATCCCAATCTAGAAACACTCA CTCCCAACATATTGCACTTACTCCATGGGTGATTTC P21> 875bp CACCCATGGAGTAAGTGTTTCCCCAACAACCAAAGTTATATCCTCGTCAAAATTAAAATCATCTTCTACAATA GTTATACAACCAGAATCCTGCGATTTCATCTTTTTAGGACATTCGTTATTTCAATGCCTTTTTTCCTTACAAT AGTTACAAACATCATTCAGCTTATGACCTTTTGAAGAAGACAATTTATTGTCCTTCTTCTTCCTTGATTTTTC TTGTTCCTTGCCTTCACTTGTAAACATTCCATATGCTTGATTGTCCTTTACCTATACCACTTTCATTCACCCT GTGGCATAGTTCCCTTGTATGAAGGGCAAACTTGATGTCTACTAGAATAATAGTATCTTTTCCAACAATATAT 100 TATTGAACGAAGTTTTTATATGATGACGGTAGAGATACCAACATATTAATCAACGAAACATCCTTGTCCTCAA CCTTAACCTTAATATTCAAATCTAGAAGAATTGTGTTCAAGTGATCTAAGTGTTCACGAAATTGCGTACCTTC TTCCATTCGAAGGTTGAACATAAGCTACTTTAGAAGTTAATATGAGACTTCATCGTGTAGAGGCTCTCCAACT TCAACCATAGTTTGGTTACGATGTCTTGATCTGAAACCTCACATAAGACATCATTTGTGAGAAACATCATGAT GGTTGAATGTACCTTGTCCTCCTTAGTGACCATCTCAACAACATCGTCCTTTTCCTTATCGGATTCTTTTTTG ACAATAAACCCGTAAGCATTGTTGTTTCTACAAAGCTAACATCTTGATTTACCATATACTGAAACTGTCCTCT TTGTGAACTTCTCGATCTTCATGTTGAAAGAAGACATATTTCTCCTAGATTACAGAATACAAAAAAAAAGAC P212> 375bp CACCCATGGAGTAAGTGTTTCCATAAGCATCTTAACTGTAGGGCATAACCACGTCTTATTACAAATCGATCTT ATCTTCTTTGCTCTCCCGGTCATCCCAACATGTTGGGGGAGTTCTTTGTATTCCACCTAAGCTTGCATCATTC CTTCGAGTACGTGTAGAACTACTTCATTTCCTTATGTAACATCAATCCGACCGTAGAGGTTCTAGCCTCAATC TTTTATATGCTTCTTGTACATCTCATATCGACATCATACTTCAAGACTTCAGTCTTCTCTTACTCTGGTTGGT CGCCATATACATCTCTCGGTATCCCATAAACAACTCCATAACCGTACCAGTATGCCCTGTGGGAAACACTTAC TCCATGGGTG P333> 255bp GAAATCACCCATGGAGTAAGTGTGCTAGGATAGTTGCATAGAACTTCCCTTTCCGAGACTTACCCGGTAAGGA TAGGTTAGACCTCTAGGCAACAAATCCGGTTTGTGTAGAATTCCAATCCTTAGGTTCTCAGAGACTTACCCGG TGATAAGATCTTAGGAACGGATTAGTGGATCATGAGACCTACCCGGTGATTGATCCCAATCTAGAAACACTCA CTCCCAACATATTGCACTTACTCCATGGGTGATTTC P43> 292bp GCCAAACATCTCGCGTACCAGAAAACCTAGAAGATGATAACTTTAGTAGATGAATCAAAGCTGTACCATTTTG TATGCATGATTTATTGGATCAACTTAGGGTGGAAACCATGATTTTACTGCAAATTAGTACTATTTATCATGAA AGGAAATAAAATCTGAAATACATGAATTGTGATTAGCATTCGTTGACATTAGACGCAACAAATCTAGCCAAAA ACTTGATATGTTCTTTCCTGTTTTCTCATGGCTTCTCCTTCTTCTTTCTCGCCTGGTACGCGAGATGTTTGGC P53> 274bp TCGCGTACCAGAGGGTGTGCAAACCATAAAAAGGAGCAATTTGGCTGCCATGCATGAATTTCAAACTAAAGCA CAAATGATTTGATCCTACCAAAACCAAATCAAAGTGTTTCACAAACACTCTTCCTTTAGTTTTAGTGATTCTT GATATTAAATTAGGTAATGCCACAAGAAATCAAGTAAATGGAATTAATTCATAGGTAATAGATACATGCGTCA GCTTGTGTCTATTAGACTCCTTTTTATCCCCTTAGGCACACCCTCTGGTACGCGA T11> 782bp GAAATCACCCATGGAGTAAGTGGAGCAAATTGGATAGTTAGTTAGGAAGAAGATCCTAGAAGGAGGTGATTCA GAAACTCGACGTAGAGCTACCTCGAGTGGGTTGTCTTCCTTGGTTGAGTGAGCTTCTCGTGAGCCTCGAGTTG TTCCACCGATTATTCTTGTACTCTTTGCTCGAGTGTCTTGTCTTCTTCTCTCGAGTTTTTGTGTCTTGTTTGC TCAAGTAATGATGTAAACTCGAGAGATGTGGATAAATATGGACTTTGGGCTTCTTTGCTCGAGTGGATGTGTA CTCTTTGCTCGAGTGAAAAGTCACTTGGGGTACCACTCAAGCAACGCTGAATTTTCTACAGCTCATGTCTTAT TTGGTAGAGTGAAGTGTCTTCGTTGCTCGAGTGATGATGTAAACTCGAGCTTAGTCGAGAAATTCCTCTCCGA TGCTTCTTTTCTCGAGTCAAACCTTCCTCTTTGCTCGAGTTTGGCTTCACTTAATGCTCCAACCTTCGGGTTT CCTTAGCTCCATCGTCTCAAGTGATGATGTAAACTCAAGCTTAGTTGAAAAATATTTTCTTCCCCACAAGACT GTTAAAATATGGAGAAGATTTCTCACTTCGACATGGAGGATGGTGAGAATATCTACTCAGAATGGGAGATATT 101 TAATGACCTATTGCATTCTTGTCCTCACCGTGGATTTGAAATGGGAGCAATTCTTGAATATATTTATAGTGGT TTGAATGACACTACAAGAAATCGTTTTTATACCACTTACTCCATGGGTGATT T22> 375bp CACCCATGGAGTAAGTGTTTCCATAAGCATCTTAACTGTAGGGCATAACCACGTCTTATTACAAATCGATCTT ATCTTCTTTGCTCTCCCGGTCATCCCAACATGTTGGGGGAGTTCTTTGTATTCCACCTAAGCTTGCATCATTC CTTCGAGTACGTGTAGAACTACTTCATTTCCTTATGTAACATCAATCCGACCGTAGAGGTTCTAGCCTCAATC TTTTATATGCTTCTTGTACATCTCATATCGACATCATACTTCAAGACTTCAGTCTTCTCTTACTCTGGTTGGT CACCATATACATCTCTCGGTATCCCATAAACAACTCCATAACCGTACCAGTATGCCCTGTGGGAAACACTTAC TCCATGGGTG T31> 876bp GGAGACCATGCGCTCTACAACCAAGGACTTTATCCACCTGTGTTGCATATGGACAAAAACAATTTCAATTAGA ACAACCTCGAAGCATTTCGTTGCCAAAACAGAAGCACAAAGGTGTATAAAGATAGAATTATGTACTTGGAAGG CTAAAACAGATAACACAGGAAATGGTATTAGATTCTAAAAGTGTGAATGATTAATCTGCACAAATATGTATAG AAGAATTTCTTTGTGCCTGTGTTAGGCCTCACAGAAGAACTTTAGCTTCTTAGTGGCGAAAGGAAAGAGCGTA CAAAGATAGACTGCTTTGTTTTTAAAATTTGGCATCACCAAATGAGTAGGTTGGTGAATCTACCTGCAGAGAA TCTTCAAGAGAAATCACTTCAGACAAAGACTGTTTTTCAGCTCTAACTCTTCGGACCAATCCATGTGACGGAT TCTCTTCTTGAATAACCTTCAATGCGAAAAGAAACAGTTGTCCATGTGACCATATTAATCAAACAGGAGAAAA CCAATTGTGAATAAAAACGATTTCACTTTTTGAAGAGCTAGCTAATGACAGATAGGCAGAGAACAGAAATGAT GACATGTAAACCTCTCTTCGGACTACCAAATTCACACATTTGGAGCCTTATGCTTTTTCATCTATCTTCCTCG TCCTTACTACTCCTAAAATAGAGAAGACTGAACATCCACATCCTCATTTTCCAGATTGGAAAAGAACAAAATG GAAAACCATGAACAAGTGAACTACGTGGCACTCTATGTTTGATGCAGCACTATCAAATTAAACATGCAAAGGC ATTGAAACAATAAGCCTCTTATAAATAGTGGTCAAAATCATTTTGTAGAGCGCATGGTCTCCAATCACTAGTG T313> 328bp GGAGACCATGCGCTCTACAAGAGATTGGGAGGTGCTCTTGCGACCAGACCCACTAGTAACGGATAGATGCATA TGATCTATTCATGTCGGTAAAGGGGACAAGGGCGAGTTTCGGAATATTCCCGTGTCAGAAAATAAGTTGAATT AGTAATCTGGATAACCTAATGAAAGATAATAACCGGATGTTGTGTGAGCATGCTAGGTGTTTTATGTTAGCTT ATGTGTGTATGTGTTATTGTTGTTATTCTGATATATGGAACGTTAGCTAACGGTTTATCCGCCGTTGTAGATG TCTTGCAGGTTAAGAGTTGTAGAGCGCATGGTCTCC T44> 340bp TGTCGACTGAGATGAACAGAAATGGTAGAACATTGAGATTCAGATCACAAAACAAGCAATCACGCGAAATAAA CCAATCAAAATCCAACCTCTCTCTCAATTTCTCTCTCCATTCTTCGAAAAACCGAAAACACCTTTGCCATCAA CCCTAAGCAAAGATCTCTTCTTAACTACTCAAACTTCATCTTATTGATTTTCACTCTCTTTCTCCTACCCACC GACGATTCTGGATCTGCACTGGTGGTACACTTTCTTCCCCTACTCAACTCGTTTTACTTTTTTTTCTTCTAGT TCTTACGATTTGGATTGGATCTGGTTTCTGGTACGCGAGATGTTTGGC T55> 448bp CCAGAGGGTGTGCTAGTTTGAGGTTATAGTTCTAAAGCATGATTCCTTGAGACTTACCCGGTAATAGGAGTTA CGGTTTAGGATTAGTGTGTAGTGAGACTTACCCGGTGATCTACTCCACTTTAGTAACACCTTCCCCACGCAAA AATCTCAGCTTTGTCCGCTTATCTATAGATCTTGAGTTGGAACCACAACTAGATGCTTTAATCCCTAGAATTG CATGTTTGCTTTATTGACTTCTTATTCATCTTTGATTGTGTTAATCGCTCTTGTGGTTAGAATTAACGTAGCA TACCGTATTGACTCTGTTTCACCGAGTCCCTGTGATCGACCCCTGGAATTTTCTTGCTTTTACTACGATTGAC CCGTACACTGCGGGTTCGCATCCTTGTTTTAAGCTTAAGTCTAGGGTTATAAATTTAAAGCTTGCACACCCTC TGGTACGCGA 102 PRILOG B. Pregled proteina koji su u 2D-profilima detektovani kao specifični za "pin"/"tram" polen, "pin"/"tram" neoprašene tučkove, odnosno specifični za inkompatibilno/kompatibilno oprašene "pin"/"tram" tučkove. Za svaki protein navedene su njegove osnovne karakteristike dostupne iz 2D-profila: izoelektrična tačka, molekulska masa, identifikacioni broj i relativna zapreminska zastupljenost u uzorku, kao i vrsta uzorka u kojoj je detektovan. Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 1 1423 ~17 ~8.40 0.76 Neoprašeni "pin" tučak 2 1421 ~17 ~8.70 0.79 Neoprašeni "pin" tučak 3 1434 ~11 ~7.70 0,20 Neoprašeni "pin" tučak 4 1417 ~41 ~9.25 0,79 Neoprašeni "pin" tučak 5 1428 ~39 ~9.28 0,54 Neoprašeni "pin" tučak 6 1419 ~45 ~8.27 0.03 Neoprašeni "pin" tučak 7 1435 ~45 ~8.40 0.10 Neoprašeni "pin" tučak 8 326 ~41 ~8.00 0.36 Neoprašeni "pin" tučak 9 322 ~41 ~8.10 0.16 Neoprašeni "pin" tučak 10 1429 ~39 ~8.20 0.30 Neoprašeni "pin" tučak 11 277 ~45 ~8.60 0.36 Neoprašeni "pin" tučak 12 1427 ~41 ~8.90 0.41 Neoprašeni "pin" tučak 103 Redni broj Šifra proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 13 344 ~39 ~8.50 0.10 Neoprašeni "pin" tučak 14 1418 ~55 ~8.60 0.06 Neoprašeni "pin" tučak 15 462 ~31 ~8.80 0.10 Neoprašeni "pin" tučak 16 1414 ~29 ~8.40 0.95 Neoprašeni "pin" tučak 17 1415 ~29 ~8.75 0.79 Neoprašeni "pin" tučak 18 569 ~26 ~7.00 0.04 "Pin" polen 19 564 ~26 ~5.40 0.12 "Pin" polen 20 540 ~27 ~5.50 0.08 "Pin" polen 21 501 ~30 ~6.00 0.40 "Pin" polen 22 235 ~44 ~8.20 0.31 "Pin" polen 23 233 ~44 ~8.45 0.22 "Pin" polen 24 273 ~43 ~8.30 0.17 "Pin" polen 25 514 ~28 ~5.70 1.01 "Pin" polen 26 355 ~16 ~7.41 0.08 Neoprašeni "tram" tučak 27 357 ~16 ~7.20 0.09 Neoprašeni "tram" tučak 28 367 ~25 ~5.30 0.14 Neoprašeni "tram" tučak 104 Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 29 285 ~20 ~5.90 0.35 Neoprašeni "tram" tučak 30 370 ~16 ~5.70 0.29 Neoprašeni "tram" tučak 31 263 ~22 ~5.40 2.10 Neoprašeni "tram" tučak 32 269 ~22 ~5.80 0.42 Neoprašeni "tram" tučak 33 244 ~26 ~6.50 0.04 Neoprašeni "tram" tučak 34 216 ~28 ~6.65 1.31 Neoprašeni "tram" tučak 35 386 ~24 ~5.50 0.03 Neoprašeni "tram" tučak 36 252 ~24 ~5.30 0.01 Neoprašeni "tram" tučak 37 249 ~24 ~6.40 0.007 Neoprašeni "tram" tučak 38 245 ~25 ~6.50 0.04 Neoprašeni "tram" tučak 39 376 ~35 ~6.40 0.04 Neoprašeni "tram" tučak 40 455 ~23 ~7.30 0.02 "Tram" polen 41 435 ~29 ~6.75 0.04 "Tram" polen 42 177 ~31 ~8.30 0.19 "Tram" polen 43 159 ~32 ~7.50 0.40 "Tram" polen 44 155 ~32 ~7.65 0.20 "Tram" polen 45 142 ~32 ~7.70 0.16 "Tram" polen 105 Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 46 457 ~22 ~7.70 0.04 "Tram" polen 47 170 ~12 ~4.90 1.23 "Pin" AI 48 160 ~12 ~4.70 1.08 "Pin" AI 49 126 ~17 ~9.20 12.14 "Pin" AI 50 257 ~14 ~6.20 0.24 "Pin" AI 51 220 ~13 ~7.50 0.15 "Pin" AI 52 155 ~13 ~5.80 2.78 "Pin" AI 53 111 ~20 ~6.00 2.02 "Pin" AI 54 191 ~18 ~5.75 0.92 "Pin" AI 55 238 ~26 ~7.00 0.65 "Pin" AI 56 204 ~23 ~5.80 0.11 "Pin" AI 57 189 ~21 ~5.70 1.02 "Pin" AI 58 186 ~28 ~7.00 0.31 "Pin" AI 59 221 ~16 ~5.10 0.24 "Pin" AI 60 127 ~17 ~4.75 1.04 "Pin" AI 61 140 ~14 ~5.90 3.45 "Pin" AI 106 Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 62 231 ~14 ~4.30 0.72 "Tram" AI 63 183 ~22 ~7.30 2.30 "Tram" AI 64 192 ~23 ~6.30 0.70 "Tram" AI 65 193 ~22 ~6.13 0.76 "Tram" AI 66 284 ~19 ~7.80 0.22 "Tram" AI 67 286 ~22 ~6.65 0.23 "Tram" AI 68 281 ~15 ~9.00 0.32 "Tram" AI 69 282 ~16 ~9.00 0.17 "Tram" AI 70 294 ~14 ~8.90 0.30 "Tram" AI 71 258 ~15 ~8.00 0.37 "Tram" AI 72 181 ~13 ~5.65 3.00 "Tram" AI 73 293 ~13 ~4.10 0.29 "Tram" AI 74 182 ~15 ~5.60 1.84 "Tram" AI 75 194 ~19 ~6.80 0.71 "Tram" AI 76 190 ~22 ~4.80 1.02 "Tram" AI 77 269 ~22 ~4.70 0.46 "Tram" AI 107 Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 79 202 ~20 ~4.50 0.75 "Tram" AI 80 180 ~17 ~4.25 5.10 "Tram" AI 81 179 ~20 ~5.25 5.37 "Tram" AI 82 223 ~21 ~5.30 0.38 "Tram" AI 83 206 ~15 ~5.30 1.03 "Tram" AI 84 247 ~15 ~4.90 0.36 "Tram" AI 85 2701 ~11 ~3.80 0.07 Kompatibilno oprašen"pin" 86 3324 ~10 ~4.15 0.20 Kompatibilno oprašen"pin" 87 3328 ~10 ~4.20 0.91 Kompatibilno oprašen"pin" 88 3327 ~10 ~4.58 2.50 Kompatibilno oprašen"pin" 89 3326 ~9 ~5.00 0.98 Kompatibilno oprašen"pin" 90 747 ~43 ~9.25 0.28 Kompatibilno oprašen"pin" 91 745 ~43 ~9.35 0.23 Kompatibilno oprašen"pin" 92 744 ~37 ~9.90 0.11 Kompatibilno oprašen"pin" 93 3305 ~10 ~8.50 0.80 Kompatibilno oprašen"pin" 94 784 ~39 ~8.30 0.18 Kompatibilno oprašen"pin" 108 Redni broj Identif. br. proteina Molekulska masa (kDa) Izoel. tačka Relativna zastupljenost proteina (% ukupne zapremine) Uzorak/gel 95 815 ~37 ~9.10 0.11 Kompatibilno oprašen"tram" 96 800 ~37 ~8.80 0.11 Kompatibilno oprašen"tram" 97 828 ~36 ~8.40 0.11 Kompatibilno oprašen"tram" 98 801 ~36 ~8.00 0.06 Kompatibilno oprašen"tram" 99 748 ~36 ~7.80 0.10 Kompatibilno oprašen"tram" 100 760 ~34 ~5.75 0.17 Kompatibilno oprašen"tram" 101 333 ~30 ~5.90 1.66 Kompatibilno oprašen"tram" 102 335 ~32 ~6.80 0.72 Kompatibilno oprašen"tram" 103 336 ~32 ~7.00 1.11 Kompatibilno oprašen"tram" Biografija Bojana G. Banović, rođena je 1979. god. u Beogradu, gde je završila osnovnu školu i gimnaziju. Diplomirala je 2005. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, studijska grupa Molekularna biologija i fiziologija, odsek Genetičko inženjerstvo i biotehnologija, sa temom: "Kloniranje i sekvenciranje gena S-RNaze Prunus webbii". Za diplomski rad dobila je 2005 god. i nagradu "Fondacije Goran Ljubijankić" za najbolji diplomski rad. Eksperimentalni deo diplomskog rada uradila je u Laboratoriji za molekularnu biologiju biljaka Instituta za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, u kojoj je i je zaposlena od 2006 god. kao istraživač-pripravnik. Iste godine upisala je postdiplomske studije iz Molekularne biologije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu. Zvanje istraživač-saradnik stiče 2009 god. Do sada je objavila osam radova, od toga tri u vrhunskim međunarodnim časopisima, dva u tematskim zbornicima od međunarodnog značaja i tri u međunarodnim časopisima. Pored toga angažovana je i na planu popularizacije nauke, kroz saradnju sa Regionalnim centrom za Talente Beograd II i manifestaciju Noć istraživača. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Бановић Г. Бојана ____ број уписа _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Молекуларна основа ауто-инкомпатибилног система хељде (Fagopyrum esculentum Moench) · резултат сопственог истраживачког рада, · да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, · да су резултати коректно наведени и · да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, _________________ _________________________ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора ______ Бојана Г. Бановић__________________________ Број индекса _________________IO 060036__________________________________ Студијски програм _____Молекуларна биологија______________________________ Наслов рада ___Молекуларна основа ауто-инкомпатибилног система хељде (Fagopyrum esculentum Moench)_____________________________________________ Ментори др Јованка Миљуш-Ђукић виши научни сарадник, Институт за молекуларну генетику и генетичко инжењерство и др Светлана Радовић, редовни професор Биолошког факултета Универзитета_у Београду____________________________ Потписани/а __________Бојана Г. Бановић__________________ Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, ________________________ _________________________ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Молекуларна основа ауто-инкомпатибилног система хељде (Fagopyrum esculentum Moench)______________________ _______________________ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, ________________________ ____________________ 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.