UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ljiljana S. Stojković Uloga polimorfizama i ekspresije gena za hemokine CX3C ligand 1 i CXC ligand 16 i njihove receptore u nastanku i progresiji multiple skleroze u Srbiji doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Ljiljana S. Stojković Roles of Polymorphisms and Expression of Genes Coding for Chemokines CX3C Ligand 1 and CXC Ligand 16 and Their Receptors in the Development and Progression of Multiple Sclerosis in Serbia Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentori dr Maja Ţivković, viši nauĉni saradnik Instituta za nuklearne nauke “Vinĉa” dr Dušanka Savić Pavićević, vanredni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu Ĉlanovi komisije dr Evica Dinĉić, vanredni profesor Medicinskog fakulteta Vojnomedicinske akademije Univerziteta odbrane u Beogradu Datum odbrane: __________________ Ova doktorska disertacija je urađena u Laboratoriji za radiobiologiju i molekularnu genetiku Instituta za nuklearne nauke „Vinča“, kao deo projekata čiji su rukovodioci dr Dragan Alavantić i dr Aleksandra Stanković, kojima se zahvaljujem što su mi pružili priliku da se bavim istraživanjima u oblasti molekularne genetike. Dr Aleksandri Stanković se zahvaljujem na entuzijazmu, stručnoj pomoći i pruženoj podršci u toku izrade doktorske disertacije. Mentoru dr Maji Živković se zahvaljujem na osmišljavanju i realizaciji ove doktorske disertacije, na stručnim savetima i sugestijama koje mi je davala prilikom izrade disertacije. Mentoru dr Dušanki Savić Pavićević se zahvaljujem na pregledu i oceni doktorske disertacije. Zahvaljujem se dr Tamari Đurić Delić na saradnji i pomoći u statističkoj obradi rezultata. Mr Olji Stančić hvala na pomoći u eksperimentalnom delu izrade disertacije. Zahvaljujem se saradnicima Klinike za neurologiju Vojnomedicinske akademije u Beogradu, posebno dr Evici Dinčić, na saradnji u prikupljanju i kliničkoj karakterizaciji uzoraka koji su analizirani u okviru ove doktorske disertacije. Svim kolegama iz Laboratorije za radiobiologiju i molekularnu genetiku se zahvaljujem na podršci i uspešnom timskom radu. Porodici i prijateljima hvala što su uz mene. Mojim roditeljima hvala za sve što mi pružaju. Uloga polimorfizama i ekspresije gena za hemokine CX3C ligand 1 i CXC ligand 16 i njihove receptore u nastanku i progresiji multiple skleroze u Srbiji Rezime Multipla skleroza je hroniĉna inflamatorna, autoimunska, demijelinizaciona i neurodegenerativna bolest centralnog nervnog sistema (CNS-a). Hemokini i njihovi receptori predstavljaju znaĉajne medijatore inflamacije koji uĉestvuju u patogenezi odreĊenih hroniĉnih inflamatornih i autoimunskih bolesti meĊu kojima je i multipla skleroza. Ciljni hemokini u ovoj studiji, CX3C ligand 1 (CX3CL1) i CXC ligand 16 (CXCL16), specifiĉni su po tome što postoje u dve forme - kao transmembranski adhezivni molekuli i kao solubilni hemoatraktanti koji nastaju nakon proteolitiĉkog seĉenja vanćelijskih hemokinskih domena njihovih transmembranskih formi. U toku inflamatornog odgovora, na membrani endotelnih vaskularnih ćelija eksprimirani su CX3CL1 i CXCL16, a na membrani leukocita receptori za CX3CL1 (CX3CR1) i CXCL16 (CXCR6), te ovi hemokini i njihovi receptori posreduju u prodiranju leukocita iz krvi u tkivo zahvaćeno inflamacijom, podsticanjem hemotaksije i adhezije leukocita za aktivirani endotel krvnog suda. Ova studija obuhvata genetsko-epidemiološku analizu polimorfizama zamena pojedinaĉnih nukleotida u kodirajućim regionima gena, koje rezultuju zamenama aminokiselina. To su polimorfizmi V249I i T280M u genu za CX3CR1, i I123T i A181V u genu za CXCL16. U prethodnim studijama je pokazano da ovi genski polimorfizmi menjaju funkcionalna svojstva CX3CR1 i CXCL16, kao i da su asocirani sa patogenezom odreĊenih hroniĉnih inflamatornih bolesti. Uzimajući to u obzir, ova studija je imala za cilj da po prvi put ispita asocijaciju navedenih polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 sa nastankom i progresijom multiple skleroze. Primenom alel-specifiĉne PCR metode i PIRA PCR-RFLP metode detektovani su genotipovi polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1, kod zdravih kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom. UtvrĊeno je da haplotip I249T280 u genu za CX3CR1 ima znaĉajno veću uĉestalost kod pacijenata sa relapsno-remitentnom (RR) formom, u odnosu na pacijente sa sekundarno-progresivnom (SP) formom multiple skleroze, što znaĉi da ovaj haplotip ima protektivni efekat na progresiju RR u SP formu bolesti. U bioinformatiĉkoj analizi informacionih spektara CX3CL1 i CX3CR1 je utvrĊeno da upravo haplotip I249T280 kodira varijantu CX3CR1 koja moţe znaĉajno da menja interakciju receptora sa CX3CL1, u odnosu na najĉešću, referentnu varijantu (V249T280) CX3CR1. Metodom real-time PCR koja podrazumeva primenu TaqMan® eseja za diskriminaciju alela detektovani su genotipovi polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16. Pokazano je da su frekvencije alela T i V, genotipova koji sadrţe alele T i V, kao i haplotipa T123V181, znaĉajno više u grupi pacijenata u odnosu na kontrolnu grupu, a takoĊe i u grupi obolelih ţena kada je ona uporeĊena sa grupom ţena kontrola. To znaĉi da su reĊi aleli, T i V, i haplotip T123V181 polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze i da je ova asocijacija genetskih faktora sa nastankom bolesti polno specifiĉna. Bioinformatiĉka analiza informacionih spektara CXCL16 i CXCR6 pokazala je da haplotip T123V181, koji predstavlja genetski faktor rizika za nastanak multiple skleroze, kodira varijantu CXCL16 koja moţe znaĉajno menjati njegovu interakciju sa CXCR6, u poreĊenju sa referentnom varijantom (I123A181) CXCL16. Ekspresija CX3CL1 i CXCL16 i njihovih receptora moţe biti konstitutivna ili inducibilna u neuronima i glijalnim ćelijama CNS-a. To ukazuje na znaĉaj ovih molekula za normalno funkcionisanje CNS-a u bazalnim uslovima, a takoĊe i na njihovu moguću ulogu u patogenezi neuroinflamatornih bolesti. Dosadašnje studije ukazuju na ulogu hemokina CX3CL1 i CXCL16 i njihovih receptora u patogenezi ţivotinjskog eksperimentalnog modela multiple skleroze. Stoga, pretpostavljeno je da je obrazac ekspresije humanih gena koji kodiraju ove molekule, kako u ćelijama tkiva CNS-a tako i u leukocitima periferne krvi, asociran sa patogenezom multiple skleroze. U odnosu na ciljno tkivo humanog CNS-a, periferna krv je lako dostupna i predstavlja izvor potencijalnih sistemskih markera. U skladu sa tim, cilj ove studije je bio da se utvrdi da li obrazac genske ekspresije ispitivanih hemokina i hemokinskih receptora u mononuklearnim leukocitima periferne krvi moţe biti molekularni pokazatelj nastanka i progresije multiple skleroze. Metodom Real-time PCR, u uzorcima perifernih mononuklearnih leukocita zdravih kontrola i pacijenata sa RR formom multiple skleroze detektovana je i kvantifikovana ekspresija gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, na nivou njihovih iRNK, dok ekspresija gena za CX3CL1 nije detektovana u ispitivanim uzorcima. UtvrĊeno je da postoji znaĉajno povišena ekspresija gena za CX3CR1 u celoj analiziranoj grupi pacijenata sa RR formom multiple skleroze i u svakoj pojedinaĉnoj podgrupi pacijenata (u fazi relapsa tj. fazi remisije), u odnosu na grupu zdravih kontrola. To znaĉi da povišeni nivo CX3CR1 iRNK u perifernim mononuklearnim leukocitima moţe biti molekularni marker nastanka RR forme multiple skleroze. U poreĊenju sa pacijentima u fazi relapsa, pacijenti u fazi remisije su imali znaĉajno višu ekspresiju gena za CXCL16 i znaĉajno niţu ekspresiju gena za CXCR6. Ovaj rezultat ukazuje da promene nivoa CXCL16 i CXCR6 iRNK u perifernim mononuklearnim leukocitima mogu biti molekularni markeri za razlikovanje faza relapsa i remisije u kliniĉkom toku RR forme multiple skleroze. Kljuĉne reĉi: multipla skleroza, gen, polimorfizam, ekspresija, hemokin, CX3CL1, CXCL16, CX3CR1, CXCR6 Nauĉna oblast: Molekularna biomedicina Uža nauĉna oblast: Molekularna genetika multiple skleroze UDK broj: [575.113::[612.112:612.124]]:616.83-004 (043.3) Roles of Polymorphisms and Expression of Genes Coding for Chemokines CX3C Ligand 1 and CXC Ligand 16 and Their Receptors in the Development and Progression of Multiple Sclerosis in Serbia Abstract Multiple sclerosis is a chronic inflammatory, autoimmune, demyelinating and neurodegenerative disease of the central nervous system (CNS). Chemokines and their receptors are important mediators of inflammation, which are involved in pathogenesis of certain chronic inflammatory and autoimmune diseases including multiple sclerosis. Chemokines of interest in this study, CX3C ligand 1 (CX3CL1) and CXC ligand 16 (CXCL16), are specific in that they can exist either as transmembrane adhesion molecules or soluble chemoattractants being generated by proteolytic cleavage of their transmembrane forms’ extracellular domains. During the inflammatory response, CX3CL1 and CXCL16 are expressed on the surface of vascular endothelium, while the leukocytes produce membrane receptors for CX3CL1 (CX3CR1) and CXCL16 (CXCR6). Therefore, these chemokines and their receptors mediate the infiltration of leukocytes from blood into the inflamed tissue areas, by stimulation of both chemotaxis and adhesion of leukocytes to the activated endothelium of blood vessels. This study is based on genetic epidemiological analysis of single nucleotide polymorphisms, which are located in the coding regions of genes and result in amino acids’ substitutions. These are V249I and T280M substitutions in the gene coding for CX3CR1, and I123T and A181V substitutions in the gene coding for CXCL16. In previous studies these polymorphisms have been associated with the functional properties of CX3CR1 and CXCL16 as well as the pathogenesis of certain chronic inflammatory diseases. Therefore, this study aimed to investigate the association of the polymorphisms in CX3CR1 and CXCL16 genes with the development and progression of multiple sclerosis. Using the allele-specific PCR and PIRA PCR-RFLP methods, genotypes of CX3CR1 V249I and T280M polymorphisms were detected in healthy controls and patients with multiple sclerosis. Following statistical analysis showed significantly higher frequency of CX3CR1 I249T280 haplotype in patients with relapsing- remitting (RR) form, compared to patients with secondary-progressive (SP) form of multiple sclerosis, so this haplotype had a protective effect on progression of RR to SP form of the disease. By bioinformatic analysis of CX3CL1 and CX3CR1 information spectra, a CX3CR1 variant encoded by the I249T280 haplotype was shown to significantly alter CX3CL1-CX3CR1 interaction, compared to the most common, referent (V249T280) CX3CR1 variant. Real-time PCR method based on use of TaqMan® allelic discrimination assays enabled detection of genotypes of CXCL16 I123T and A181V polymorphisms. Statistical analysis pointed out the significantly higher frequencies of: T and V alleles, genotypes containing T and V alleles, and T123V181 haplotype, in patients’ group compared to controls’ group as well as in subgroup of female patients compared to female controls. Thus, the rare T and V alleles and T123V181 haplotype of I123T and A181V polymorphisms in CXCL16 gene represent genetic risk factors for multiple sclerosis, whereby the association of these genetic factors with disease onset is gender-specific. Bioinformatic analysis of CXCL16 and CXCR6 information spectra showed that the T123V181 haplotype encoded a CXCL16 variant, which could significantly change CXCL16-CXCR6 interaction, compared with the referent (I123A181) CXCL16 variant. Expression of CX3CL1 and CXCL16 and their receptors may be constitutive or inducible in neurons and glial cells of the CNS. This indicates importance of these molecules for normal functioning of the CNS in basal conditions as well as their possible roles in pathogenesis of neuroinflammatory diseases. Previous studies indicated the roles of chemokines CX3CL1 and CXCL16 and their receptors in pathogenesis of the animal experimental model of multiple sclerosis. Therefore, it was assumed that the expression patterns of human genes coding for these molecules, in the cells of CNS as well as in peripheral leukocytes, were associated with pathogenesis of multiple sclerosis. In contrast to human CNS tissue, peripheral blood is available and represents the source of potential systemic markers. Accordingly, the aim of this study was to determine whether the gene expression patterns of the chemokines and chemokine receptors in peripheral blood mononuclear leukocytes might be associated with the onset and progression of multiple sclerosis. By Real-time PCR method, the expression of CX3CR1, CXCL16 and CXCR6 mRNAs was detected and quantified whereas expression of CX3CL1 gene was not detected, in peripheral mononuclear leukocytes of healthy controls and patients with RR form of multiple sclerosis. Significant increase in CX3CR1 gene expression was found in patients with RR form of multiple sclerosis and also in each subgroup of patients (in relapse/remission), compared to healthy controls. This means that the elevated level of CX3CR1 mRNA in peripheral mononuclear leukocytes may be a molecular marker of the onset of RR multiple sclerosis. In comparison with patients in phase of relapse, patients in remission phase had significantly higher CXCL16 gene expression level and significantly lower CXCR6 gene expression level. This result suggests that changes in CXCL16 and CXCR6 mRNAs’ levels in peripheral mononuclear leukocytes may represent molecular markers for distinguishing between phases of relapse and remission in the clinical course of RR form of multiple sclerosis. Keywords: multiple sclerosis, gene, polymorphism, expression, chemokine, CX3CL1, CXCL16, CX3CR1, CXCR6 Scientific field: Molecular biomedicine Special topic: Molecular genetics of multiple sclerosis UDC number: [575.113::[612.112:612.124]]:616.83-004 (043.3) SKRAĆENICE 1,25(OH)2D3 - 1,25-dihidroksi vitamin D3 18S rRNK - 18S ribozomalna RNK 25(OH)D3 - 25-hidroksi vitamin D3 A181V (Ala181Val) - polimorfizam zamene alanina u valin na poziciji 181 u polipeptidnom lancu ADAM (engl. Disintegrin And Metalloproteinase domain-containing protein) - protein koji sadrţi domene disintegrina i metaloproteinaza AIDS (engl. Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) - steĉeni sindrom imunodeficijencije AK - aminokiselina ANOVA (engl. Analysis Of Variance) - analiza varijanse AP-1 (c-Jun) - aktivatorni protein-1 APC (engl. Antigen Presenting Cell) - antigen-prezentujuća ćelija ApoE - apolipoprotein E ApoE-/- - jedinka sa izbaĉenim genom za ApoE ARMS (engl. Amplification Refractory Mutation System) - PCR metoda zasnovana na korišćenju alel-specifiĉnih amplimera koji omogućavaju amplifikaciju sekvence DNK samo kada je ciljni alel prisutan u toj sekvenci bp - bazni par c (engl. complementary) DNK - jednolanĉana komplementarna DNK Ca ++ - jon kalcijuma CCL - CC ligandi (podfamilija hemokina sa CC- strukturnim motivom) CCR - receptori za podfamiliju hemokina CCL CD (engl. Cluster of Differentiation) - klaster diferencijacije CI (engl. Confidence Interval) - interval pouzdanosti c-Jun (AP-1) - aktivatorni protein-1 CL - C ligandi (podfamilija hemokina sa C- strukturnim motivom) CLEC16A (engl. C-type Lectin domain family 16) - C-tip lektina 16A CNS - centralni nervni sistem CNTF (engl. Ciliary Neurotrophic Factor) - cilijarni neurotrofni faktor CR - receptori za podfamiliju hemokina CL CS (engl. Cross-Spectrum) - „kros-spektralni” (oznaĉava ukrštanje spektara) Ct (engl. treshold Cycle) - broj ciklusa PCR na kome se detektuje fluorescentni signal koji prelazi prag CX3CL - CX3C ligandi (podfamilija hemokina sa CX3C- strukturnim motivom) CX3CL1 - CX3C ligand 1 CX3CR - receptori za podfamiliju hemokina CX3CL CX3CR1 - CX3C receptor 1; receptor za CX3CL1 CXCL - CXC ligandi (podfamilija hemokina sa CXC- strukturnim motivom) CXCL16 - CXC ligand 16 CXCR - receptori za podfamiliju hemokina sa CXC- strukturnim motivom CXCR6 - CXC receptor 6; receptor za CXCL16 CYCLA (PPIA) (engl. Cyclophilin A) - ciklofilin A CYP27B1 (engl. Cytochrome P450 family 27 subfamily B peptide 1) - 25-OHD3-1alfa hidroksilaza DAG - diacilglicerol DARC (engl. Duffy blood group, Chemokine receptor) - nespecifiĉni receptor za hemokine DEPC (engl. Diethylpyrocarbonate) - dietilpirokarbonat DNK - dezoksiribonukleinska kiselina DNKazaI - dezoksiribonukleaza I dNTP (engl. deoxyribonucleotide triphosphate) - dezoksiribonukleotid-trifosfat dUTP (engl. deoxyuridine triphosphate) - dezoksiuridin-trifosfat E - efikasnost EAE (engl. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis) - eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis EBV - Epstein-Barr virus EDSS (engl. Expanded Disability Status Scale) - kliniĉki parametar stepena invaliditeta EDTA (engl. Ethylenediaminetetraacetic acid) - etilen-diamin-tetra-sirćetna kiselina EIIP (engl. Electron-Ion Interaction Potential) - potencijal interakcije elektron-jon EM (engl. Expectation Maximization) - makismalno predviĊanje EtBr - etidijum bromid FI (engl. Forward Inner) primer - sens unutrašnji amplimer FO (engl. Forward Outer) primer - sens spoljašnji amplimer GABA (engl. Gamma-Aminobutyric Acid) - gama-aminobuterna kiselina GAPDH (engl. Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase) - gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza gDNK - genomska DNK GDP (engl. Guanosine Diphosphate) - guanozin-difosfat GPCR (engl. G-Protein-Coupled Receptor) - receptor kuplovan/spregnut sa G- proteinom GR - glukokortikoidni receptor GTP (engl. Guanosine Triphosphate) - guanozin-trifosfat GWAS (engl. Genome Wide Association Study) - studija asocijacije na osnovu pretraţivanja sekvenci celog genoma HIF1 (engl. Hypoxia Inducible Factor 1) - faktor 1 indukovan hipoksijom HIV (engl. Human Immunodeficiency Virus) - humani virus imunodeficijencije HLA - humani leukocitni antigeni HSP (engl. Heat Shock Protein) - protein toplotnog stresa HW - Hardy-Weinberg I123T (Ile123Thr) - polimorfizam zamene izoleucina u treonin na poziciji 123 u polipeptidnom lancu ICAM-1 (engl. Intercellular Adhesion Molecule-1) - intercelularni adhezivni molekul-1 IFNG - interferon-gama IgG - imunoglobulin G IL - interleukin IL2RA - alfa-lanac receptora za IL-2 IL7R - receptor za IL-7 IP - indeks progresije IP3 (engl. Inositol trisphosphate) - inozitol trifosfat IRAK1 (engl. Interleukin-1 Receptor-Associated Kinase) - kinaza asocirana sa receptorom za IL-1 IRF - interferonski regulatorni faktor iRNK - informaciona ribonukleinska kiselina IS - informacioni spektar ISM (engl. Information Spectrum Method) - metod informacionih spektara JAK1 - Janus kinaza 1 JNK (engl. c-Jun N-terminal Kinase) - c-Jun N-terminalna kinaza kDa - kilodalton KMB - krvno-moţdana barijera LD (engl. Linkage Disequilibrium) - neravnoteţa vezanosti LDL (engl. Low Density Lipoprotein) - lipoprotein male gustine LDLR-/- - jedinka sa izbaĉenim genom za receptor za LDL LPS - lipopolisaharid LSM (engl. Lymphocyte Separation Medium) - medijum za razdvajanje limfocita MAPK - mitogenom aktivirana protein-kinaza MBP - mijelinski bazni protein MCP (engl. Monocyte Chemotactic Protein) - protein koji stimuliše hemotaksiju monocita Mg ++ - jon magnezijuma MHC (engl. Main Histocompatibility Complex) - glavni kompleks histokompatibilnosti misRFLP (engl. mismatch Restriction Fragment Lenght Polymorphism) primer - amplimer sa nekomplementarnom bazom, koji uvodi novo restrikciono mesto, u analizi RFLP MMP (engl. Matrix Metalloproteinase) - metaloproteinaza matriksa MNE (engl. Mean Normalized Expression) - srednja normalizovana ekspresija MOG - mijelinski oligodendrocitni glikoprotein MS - multipla skleroza MSSS (engl. Multiple Sclerosis Severity Score) - parametar teţine kliniĉke slike multiple skleroze MYD88 (engl. Myeloid Differentiation primary response 88) - faktor 88 primarne diferencijacije ćelija mijeloidne loze n - broj Na + - jon natrijuma NEAT1 (engl. Nuclear Enriched Abundant Transcript 1) - jedarni obilni transkript 1 (duga nekodirajuća jedarna RNK) NFAT - nuklearni faktor aktiviranih T-limfocita NF-kB - nuklearni faktor-kB NINJ1 (engl. Nerve Injury-induced Protein-1) - neuronski faktor rasta indukovan povredom NK (engl. Natural Killer) cells - ćelije prirodne ubice NMRI (engl. Nuclear Magnetic Resonance Imaging) - nuklearno-magnetna rezonanca NO - azot-oksid O2 - molekulski kiseonik oligo(dT)18 - oligonukleotid koji se sastoji od 18 timinskih nukleotida OR (engl. Odds Ratio) - odnos šansi oxLDL (engl. oxidized Low Density Lipoprotein) - oksidovani lipoprotein male gustine p (engl. probability) - verovatnoća PAA - poliakrilamid PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) - lanĉana reakcije polimeraze PI (engl. Phosphoinositide) - fosfoinozitol PIP2 (engl. Phosphatidylinositol bisphosphate) - fosfatidil-inozitol difosfat PIRA (engl. Primer-Introduced Restriction Analysis) - analiza amplimerom uvedenog restrikcionog mesta PKC - protein-kinaza C PLA2 (engl. Phospholipase A2) - fosfolipaza A2 PLC (engl. Phospholipase C) - fosfolipaza C PLD (engl. Phospholipase D) - fosfolipaza D PLP - proteolipidni protein poli(A)+ - 3’ terminalni niz od 100-200 adeninskih nukleotida (u molekulima iRNK) PP MS - primarno-progresivna forma multiple skleroze PPAR (engl. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) - receptor aktiviran proliferatorom peroksizoma PPIA (CYCLA) - peptidilprolil izomeraza A PTK - protein-treonin-kinaza PTX (engl. Pertussis Toxin) - pertuzijski toksin RFLP (engl. Restriction Fragment Lenght Polymorphism) - polimorfizam duţine restrikcionog fragmenta RFX4_v3 (engl. Regulatory Factor X4 variant transcript 3) - transkripciona varijanta 3 regulatornog faktora X4 RI (engl. Reverse Inner) primer - antisens unutrašnji amplimer RIN (engl. RNA Integrity Number) - numeriĉki parametar integriteta RNK Rn - normalizovani reporter RNK - ribonukleinska kiselina RO (engl. Reverse Outer) primer - antisens spoljašnji amplimer RR MS - relapsno-remitentna forma multiple skleroze RT - reverzna transkripcija SD - standardna devijacija SDS (engl. Sodium Dodecyl Sulfate) - natrijum dodecil sulfat SE (engl. Standard Error) - standardna greška SEM (engl. Stochastic Expectation Maximization) - stohastiĉko makismalno predviĊanje SNP (engl. Single Nucleotide Polymorphism) - polimorfizam pojedinaĉnog nukleotida SP MS - sekundarno-progresivna forma multiple skleroze Sr - srednja vrednost SR-PSOX (engl. Scavenger Receptor that binds Phosphatidyl-Serine and Oxidized lipids) - receptor “ĉistaĉ” koji vezuje fosfatidil-serin i oksidovane lipide STAT (engl. Signal Transducer and Activator of Transcription) - transduktor signala i aktivator transkripcije Stdev - Standardna devijacija Stgr - Standardna greška T280M (Thr280Met) - polimorfizam zamene treonina u metionin na poziciji 280 u polipeptidnom lancu TAE - tris baza-acetat-EDTA TaiI (MaeII) - naziv restrikcionog enzima dobijenog iz bakterije Thermus aquaticus Taq - lat. Thermus aquaticus TBE - tris baza-borat-EDTA Tc (engl. T-cytotoxic) cells - citotoksiĉni T-limfociti TCR (engl. T-Cell Receptor) - T-ćelijski receptor TE - tris-EDTA TEMED - tetrametiletilendiamin TGFB (engl. Transforming Growth Factor Beta) - transformišući faktor rasta beta Th (engl. T-helper) cells - pomoćniĉki T-limfociti TIMP1 (engl. Tissue Inhibitor of Metalloproteinases1) - tkivni inhibitor metaloproteinaza 1 TLR (engl. Toll-Like Receptor) - receptor sliĉan Toll-u TM - transmembranski domen Tm (engl. Temperature of melting) - temperatura topljenja TNF(A) (engl. Tumor Necrosis Factor (Alpha)) - faktor nekroze tumora(-alfa) TNFR (engl. Tumor Necrosis Factor Receptor) - receptor za faktor nekroze tumora TNFRSF1A (engl. Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily member 1A) - receptor p55 za TNFA TRAF6 (engl. Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor 6) - faktor 6 asociran sa receptorom za faktor nekroze tumora TREG - regulatorni T-limfociti TRI (engl. Total RNA Isolation) - izolacija ukupne ćelijske RNK Tris - tris(hidroksimetil)aminometan TWEAK (engl. Tumor necrosis factor-like Weak inducer of apoptosis) - faktoru nekroze tumora sliĉan slabi induktor apoptoze TX527 - analog vitamina D TYK2 - tirozin-kinaza 2 UNG - uracil-N-glikozilaza UV zraĉenje - ultravioletno zraĉenje V249I (Val249Ile) - polimorfizam zamene valina u izoleucin na poziciji 249 u polipeptidnom lancu V28 receptor - CX3CR1 VCAM-1 (engl. Vascular Cell Adhesion Molecule-1) - vaskularni adhezivni molekul-1 ΔA - razlika vrednosti amplitude ΔCt - razlika vrednosti Ct SADRŽAJ 1. UVOD ...........................................................................................................................1 1.1. Patogeneza multiple skleroze ................................................................................1 1.2. Kliniĉki tok multiple skleroze ...............................................................................7 1.3. Faktori rizika za nastanak multiple skleroze .......................................................11 1.3.1. Faktori sredine .............................................................................................12 1.3.1.1. Geografski faktori i vitamin D ............................................................12 1.3.1.2. Infekcije ...............................................................................................13 1.3.2. Individualni faktori rizika: starost i pol .......................................................14 1.3.2.1. Starost ..................................................................................................14 1.3.2.2. Pol ........................................................................................................14 1.3.3. Genetski faktori rizika .................................................................................15 1.3.3.1. Genski polimorfizmi u patogenezi multiple skleroze ..........................16 1.3.3.2. Genska ekspresija u patogenezi multiple skleroze ..............................18 1.4. Uloga hemokina i hemokinskih receptora u patogenezi multiple skleroze .................................................................................................21 1.4.1. Klasifikacija hemokina i hemokinskih receptora ........................................21 1.4.2. Hemokini u mehanizmu inflamacije ...........................................................23 1.4.3. Strukturno-funkcionalne karakteristike krvno-moţdane barijere ...............23 1.4.4. Hemokini i hemokinski receptori u krvno-moţdanoj barijeri, leukocitima i ćelijama centralnog nervnog sistema tokom patogeneze multiple skleroze ......................................................................25 1.5. Hemokin CX3CL1 (CX3C ligand 1) i njegov receptor CX3CR1 (CX3C receptor 1) ...............................................................................................28 1.5.1. Dve forme hemokina CX3CL1: struktura i funkcija ...................................28 1.5.2. Regulacija odnosa nivoa transmembranske i solubilne forme CX3CL1 ............................................................................................31 1.5.3. Struktura gena za CX3CL1 .........................................................................32 1.5.4. Polimorfizmi u genu za CX3CL1 ................................................................32 1.5.5. Regulacija transkripcije gena za CX3CL1 ..................................................33 1.5.6. Receptor CX3CR1: struktura i funkcija ......................................................34 1.5.7. Struktura gena za CX3CR1 .........................................................................38 1.5.8. Polimorfizmi V249I i T280M u genu za CX3CR1 .....................................38 1.5.9. Regulacija transkripcije gena za CX3CR1 ..................................................40 1.6. Hemokin CX3CL1 i njegov receptor CX3CR1 u centralnom nervnom sistemu i patogenezi neuroinflamatornih bolesti .................................40 1.7. Hemokin CXCL16 (CXC ligand 16) i njegov receptor CXCR6 (CXC receptor 6) .................................................................................................43 1.7.1. Dve forme hemokina CXCL16: struktura i funkcija ...................................43 1.7.2. Struktura gena za CXCL16 .........................................................................46 1.7.3. Polimorfizmi I123T i A181V u genu za CXCL16 ......................................46 1.7.4. Regulacija transkripcije gena za CXCL16 ..................................................48 1.7.5. Receptor CXCR6: struktura i funkcija ........................................................48 1.7.6. Struktura gena za CXCR6 ...........................................................................50 1.7.7. Polimorfizmi u genu za CXCR6 .................................................................50 1.7.8. Regulacija transkripcije gena za CXCR6 ....................................................51 1.8. Hemokin CXCL16 i njegov receptor CXCR6 u centralnom nervnom sistemu i patogenezi neuroinflamatornih bolesti .................................51 2. HIPOTEZA I CILJEVI ...........................................................................................53 3. MATERIJAL I METODE .......................................................................................54 3.1. Materijal ..............................................................................................................54 3.1.1. Uzorak .........................................................................................................54 3.1.2. Aparatura .....................................................................................................55 3.2. Metode ................................................................................................................56 3.2.1. Izolacija DNK iz ćelija krvi, metodom po Kunkel-u i saradnicima ...............................................................................................56 3.2.2. Izolacija DNK iz ćelija pune krvi, na aparatu ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation ...................................................................58 3.2.3. Merenje koncentracije i provera kvaliteta izolovane DNK .........................60 3.2.4. Genotipizacija polimorfizama DNK, V249I i T280M, u genu za CX3CR1 reakcijom amplifikacije DNK in vitro (PCR) ........................60 3.2.5. Alel-specifiĉna metoda PCR za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 ..........................................................61 3.2.6. Provera sinteze i veliĉine sintetisanih fragmenata DNK elektroforezom na agaroznom gelu ............................................................64 3.2.7. Metoda za determinaciju genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1, zasnovana na PIRA PCR-RFLP analizi ....................65 3.2.7.1. Protokol za PIRA PCR .......................................................................66 3.2.7.2. Restrikciona analiza PIRA PCR produkta (RFLP analiza) ................67 3.2.8. Analiza digestiranih fragmenata DNK elektroforezom na poliakrilamidnom (PAA) gelu ....................................................................69 3.2.9. Genotipizacija polimorfizama DNK, I123T i A181V, u genu za CXCL16 lanĉanom reakcijom polimeraze (PCR) uz primenu TaqMan® eseja za diskriminaciju alela ......................................................70 3.2.10. Izdvajanje mononuklearnih leukocita iz pune periferne krvi ....................74 3.2.11. Izolacija ukupne RNK iz mononuklearnih leukocita krvi primenom reagensa TRI Reagent Solution ...............................................75 3.2.12. Merenje koncentracije i provera kvaliteta izolovane RNK .......................76 3.2.13. Obrada uzoraka RNK dezoksiribonukleazom I (DNKazaI) .....................77 3.2.14. Reverzna transkripcija (RT) uzoraka RNK, nakon tretmana DNKazomI ...............................................................................................78 3.2.15. OdreĊivanje nivoa relativne ekspresije gena za hemokine CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore, CX3CR1 i CXCR6, metodom PCR u realnom vremenu (Real-time PCR) ..............................80 3.2.16. Statistiĉka obrada podataka ......................................................................83 4. REZULTATI ............................................................................................................88 4.1. Asocijacija polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 sa nastankom i progresijom multiple skleroze .......................................................88 4.1.1. Detekcija genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 ......................................................................................88 4.1.2. Analiza efekata genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na nastanak i progresiju multiple skleroze ..............................90 4.1.3. Analiza efekata haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na nastanak i progresiju multiple skleroze ..............................94 4.1.4. Bioinformatiĉka analiza predviĊanja efekata polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na interakciju CX3CR1-CX3CL1 ......................................................................................96 4.1.5. Detekcija genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 ......................................................................................98 4.1.6. Analiza efekata genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na nastanak i progresiju multiple skleroze ............................100 4.1.7. Analiza efekata haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na nastanak i progresiju multiple skleroze ............................105 4.1.8. Bioinformatiĉka analiza predviĊanja efekata polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na interakciju CXCL16-CXCR6 ......................................................................................107 4.2. Ekspresija gena za CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima, u patogenezi multiple skleroze ........................109 4.2.1. Izbor optimalne endogene kontrole za normalizaciju rezultata ekspresije ispitivanih ciljnih gena .............................................................109 4.2.2. OdreĊivanje relativne ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze ...............117 5. DISKUSIJA ............................................................................................................125 5.1. Polimorfizmi u genima za CX3CR1 i CXCL16 u nastanku i progresiji multiple skleroze ............................................................................125 5.1.1. Polimorfizmi V249I i T280M u genu za CX3CR1 ..................................125 5.1.2. Polimorfizmi I123T i A181V u genu za CXCL16 ...................................128 5.2. Relativna ekspresija gena za CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore, CX3CR1 i CXCR6, u patogenezi relapsno-remitentne forme multiple skleroze ...............................................................................................133 5.2.1. Relativna ekspresija gena za CX3CL1 i CX3CR1 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata ..................................133 5.2.2. Relativna ekspresija gena za CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata ..................................137 6. ZAKLJUĈCI ...........................................................................................................141 7. LITERATURA ........................................................................................................143 1 1. UVOD 1.1. Patogeneza multiple skleroze Multipla skleroza (MS) je hroniĉna inflamatorna i autoimunska bolest centralnog nervnog sistema (CNS) i jedan od najĉešćih uzroĉnika neurološkog deficita kod mladih odraslih osoba (Compston i Coles, 2002). Francuski neurolog J. Charcot prvi je opisao multiplu sklerozu, 1868. godine, primetivši akumulaciju inflamatornih ćelija u perivaskularnim delovima nervnog tkiva mozga i kiĉmene moţdine pacijenata sa periodiĉnim epizodama neurološke disfunkcije. Tada je uveden termin skleroza diseminovanih plakova, ili multipla skleroza (Charcot, 1868). E. Kabat je 1948. godine otkrio povišeni nivo imunoglobulina u cerebrospinalnoj teĉnosti (likvoru) pacijenata sa multiplom sklerozom, što je predstavljalo još jedan dokaz inflamatorne prirode bolesti (Kabat i sar., 1948). Danas se u svetu multipla skleroza javlja sa uĉestalošću od oko 2- 150 na 100 000 osoba, najĉešće zapoĉinje u periodu izmeĊu 20. i 40. godine ţivota i znaĉajno je uĉestalija kod ţena nego kod muškaraca (Compston i Coles, 2002). Kljuĉni procesi u nastanku i progresiji multiple skleroze su: inflamacija, demijelinizacija, neurodegeneracija i glioza (stvaranje oţiljaka) u tkivu CNS-a (Hauser i sar., 2001). Histopatološko obeleţje multiple skleroze su plakovi koji predstavljaju inflamatorne lezije bele mase CNS-a i koji dinamiĉno evoluiraju tokom progresije bolesti (Lucchinetti i sar., 2000). Usled narušavanja krvno-moţdane barijere, koje izmeĊu ostalih ĉinilaca mogu prouzrokovati i neke vrste infekcija, leukociti periferne krvi prodiru kroz zid krvnih sudova u nervno tkivo i indukuju inflamaciju i demijelinizaciju (Feuerstein i sar., 1994; Raine, 1994). Na ovaj naĉin nastaju plakovi koji predstavljaju akutne inflamatorne i demijelinizacione lezije u multiploj sklerozi. Studije na ţivotinjskim modelima multiple skleroze pokazale su da autoreaktivni T-limfociti (CD4+ ili CD8+) specifiĉni za odreĊene antigene mijelina imaju kljuĉnu ulogu u inflamatornoj demijelinizaciji u CNS-u (Pettinelli i McFarlin, 1981; Ando i sar., 1989; Huseby i sar., 2001). Patogeneza inflamatornih plakova u multiploj sklerozi prevashodno je posredovana proinflamatornim CD4+ pomoćniĉkim T-limfocitima tipa 1 (Th1) koji produkuju interferon-gama (Ando i sar., 1989; Crawford i sar., 2004; 2 Traugott i Lebon, 1988; Olsson i sar., 1990; Link i sar., 1992). Interferon-gama (IFNG) ima višestruke proinflamatorne i patogene efekte u CNS-u, a to su: indukcija molekula humanih leukocitnih antigena (HLA) (opšti naziv za HLA: proteini glavnog kompleksa histokompatibilnosti - od engl. Main Histocompatibility Complex, skr. MHC; prisutni kod svih sisara) i stimulacija produkcije azot-oksida (NO) od strane makrofaga (Misko i sar., 1995), stimulacija transporta T-limfocita u tkivo CNS-a (Navikas i Link, 1996) i inicijacija ćelijske smrti oligodendrocita (Vartanian i sar., 1975). Th1 limfociti imaju jedinstvenu sposobnost da prodiru u delove zdravog tkiva CNS-a, uĉestvuju u iniciranju inflamacije i potpomaţu naknadnu infiltraciju Th17 limfocita u nervno tkivo (O’Connor i sar., 2008). Th17 limfociti produkuju interleukin-17 (IL-17) koji ima vaţnu ulogu u indukciji eksperimentalnog modela multiple skleroze - eksperimentalnog autoimunskog encefalomijelitisa (EAE) (Komiyama i sar., 2006). U lezijama pacijenata sa multiplom sklerozom pokazana je povišena ekspresija IL-17, što je potvrda uĉešća Th17 limfocita u mehanizmu inflamatorne demijelinizacije (Lock i sar., 2002). Posle susreta sa antigenom, u limfnim organima, neki autoreaktivni T-limfociti mogu da se diferenciraju u regulatorne T-limfocite (TREG) ĉija je funkcija da spreĉe ili suprimiraju aktivaciju drugih potencijalno štetnih autoreaktivnih T-limfocita. Pretpostavka da TREG limfociti spreĉavaju oštećenje struktura u CNS-u tokom inflamacije i autoimunskog odgovora podrţana je znaĉajnim brojem studija na modelu EAE-a (McGeachy i sar., 2005; Yu i sar., 2005; Zhang i sar., 2004; Hori i sar., 2002). Kod pacijenata sa multiplom sklerozom je utvrĊeno da CD4+CD25+ TREG mogu biti funkcionalno deficitarni, imati poremećenu maturaciju ili migraciju iz timusa (Haas i sar., 2005; Viglietta i sar., 2004; Hug i sar., 2003; Kumar i sar., 2006). Kod zdravih osoba, autoreaktivni T-limfociti specifiĉni za antigene mijelina se nalaze pod kontrolom regulatornih T-limfocita. Jedna od vodećih hipoteza koja objašnjava narušavanje ove imunološke regulacije i neadekvatnu aktivaciju naivnih autoreaktivnih T-limfocita u autoimunskim bolestima, zasnovana je na “molekularnoj mimikriji” (Abbas i Lichtman, 2006). Infekcija tkiva moţe da indukuje uroĊeni imunski odgovor koji je posredovan fagocitozom mikroba od strane antigen-prezentujućih ćelija (engl. Antigen Presenting Cells, skr. APC) - makrofaga i dendritskih ćelija. Aktivirane tkivne APC, putem prezentacije mikrobnog antigena, mogu da aktiviraju naivne autoreaktivne T-limfocite koji prepoznaju sopstveni antigen u tom tkivu. To se dešava kada postoji sliĉnost izmeĊu peptidnog antigena 3 mikroorganizma i sopstvenog antigena ćelija domaćina i ta sliĉnost se definiše kao “molekularna mimikrija”. U sluĉaju “molekularne mimikrije”, imunski odgovor na antigen mikroorganizma dovodi do imunskog odgovora na sopstveni antigen, tj. do autoimunske reakcije. Fenomen „molekularne mimikrije“ u patogenezi lezija CNS-a u multiploj sklerozi podrazumeva postojanje stranog antigena koji oponaša antigen CNS-a (Libbey i sar., 2007). U plakovima su detektovana autoantitela specifiĉna za antigene mijelina. Više od 50% demijelinizacionih lezija odlikuje se depozicijom autoantitela i proteina sistema komplementa (Lucchinetti i sar., 2000). Deponovana autoantitela su specifiĉna za mijelinske proteine, prvenstveno one lako dostupne na spoljašnjoj površini mijelinskog omotaĉa, kao što su mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (engl. Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, skr. MOG) i vanćelijski domeni proteolipidnog proteina (engl. Proteolipid Protein, skr. PLP). U modelu EAE-a u kome se za imunizaciju koristi MOG, dolazi do indukcije odgovora autoreaktivnih T-limfocita i B-limfocita (Genain i sar., 1995; Stefferl i sar., 1991; ’t Hart i Massacesi, 2009). Dezintegracija mijelina dovodi do otkrivanja epitopa proteina unutrašnje površine omotaĉa, npr. mijelinskog baznog proteina (engl. Myelin Basic Protein, skr. MBP), koji naknadno mogu biti mete antitela (Lalive, 2008). Antitela specifiĉna za mijelinske proteine su najviše zastupljena, ali je prisustvo antitela na ćelijske komponente neurona takoĊe potvrĊeno (Vyshkina i Kalman, 2008). Intratekalna sinteza imunoglobulina je karakteristiĉna za pacijente sa multiplom sklerozom, a potvrĊuje se detekcijom oligoklonalnih IgG traka i povišenim indeksom IgG u likvoru. Dokaz prisustva B-limfocita u likvoru, uz odsustvo odgovarajućih klonova u perifernoj cirkulaciji, sugeriše da se proliferacija i odgovor B- limfocita na specifiĉni antigen odigravaju upravo u CNS-u (Qin i sar., 1998; Owens i sar., 2003). Kontinuirana aktivacija i proliferacija mijelin-reaktivnih T-limfocita koji sekretuju medijatore inflamacije u lezijama, dovodi do aktivacije mikroglije (rezidualni makrofazi CNS-a), monocitnih makrofaga i astrocita (glijalne ćelije koje odgovaraju na povredu) i deponovanja autoantitela. Svi ovi procesi rezultuju demijelinizacijom i gubitkom aksona usled njihovog oštećenja, što se odraţava kroz odreĊeni stepen neurološkog deficita pacijenata (Zamvil i Steinman, 2003). Kasnije tokom evolucije plakova, intenzitet inflamacije opada, a astrociti proliferišu stvarajući oţiljno tkivo. 4 Pojedini oligodendrociti (glijalne ćelije koje produkuju mijelin) bivaju uništeni usled inflamacije i glioze, dok izvestan broj prekursora oligodendrocita biva regrutovan u oblasti plakova gde ove ćelije proliferišu i uĉestvuju u procesu remijelinizacije aksona. Razliĉiti molekuli kao što su citokini, adhezivni molekuli, metaloproteinaze matriksa, slobodni radikali i faktori rasta uĉestvuju u regulaciji procesa koji uzrokuju nastanak i evoluciju plakova u CNS-u (Frohman i sar., 2006). Shematski prikaz patogeneze inflamatornog plaka u multiploj sklerozi dat je na slici U1 (Frohman i sar., 2006). 5 Slika U1. Patogeneza plaka u multiploj sklerozi. Preuzeto iz: Frohman i sar., 2006. Gornja polovina slike: Adhezivni molekuli endotela postkapilarne venule interaguju sa receptorima na mononuklearnim leukocitima (T- i B- limfociti, makrofazi). 6 Metaloproteinaze matriksa (MMP) degradiraju proteine bazalne membrane i time potpomaţu migraciju mononukleara u tkivo CNS-a. B-limfociti prodiru i oslobaĊaju imunoglobuline. Mikroglija oslobaĊa interleukine, IL-12 i IL-23, koji stimulišu pomoćniĉke T-limfocite da produkuju interferon-gama i IL-17. Makrofazi fagocituju mijelin (ostavljajući ogoljene površine aksona ) i oslobaĊaju štetne agense: NO, O2 i glutamat. Influks kalcijuma u aksone moţe izazvati dalje oštećenje aksona i neurodegeneraciju. Protein Nogo (inhibitor rasta aksona) interaguje sa svojim receptorom, spreĉavajući regeneraciju aksona. Oligodendrocitni protein LINGO-1 je negativni regulator aktivnosti oligodendrocita, kada interaguje sa receptorom za Nogo. Donja polovina slike: Periferno, duţ oboda plaka koja predstavlja granicu izmeĊu plaka i normalnog tkiva, nalaze se mikroglija i regrutovani prekursori oligodendrocita. Prekursori oligodendrocita mogu da uĊu u zonu plaka, diferenciraju se u oligodendrocite i uĉestvuju u procesu remijelinizacije. Regrutovanje prekursora oligodendrocita je omogućeno interakcijom izmeĊu CXC- hemokina (CXCL) koje sintetišu astrociti, i receptora za ove hemokine (CXCR) eksprimiranih na samim prekursorima oligodendrocita. Interakcija proteina „Jagged“ (na astrocitima) i „Notch“ (na oligodendrocitima) inhibira aktivnost oligodendrocita u procesu remijelinizacije. U demijelinizovanim aksonima prenos impulsa je znaĉajno usporen i iznosi svega 5-15% normalne brzine (Rusić-Stojiljković, 1998). Sa ciljem da se normalizuje brzina prenosa impulsa, duţ ogoljenog dela aksona dolazi do abnormalne ekspresije Na+ kanala na membrani, pojaĉanog ulaza Na+ u aksoplazmu, što izaziva dodatno usporavanje kondukcije impulsa i mogući kondukcioni blok (Waxman i sar., 2004). Za ovim sledi efluks Na + u vanćelijski prostor, koji je praćen influksom kalcijuma u aksoplazmu. Porast koncentracije jona Ca ++ moţe pokrenuti unutarćelijsku kaskadu koja konaĉno rezultuje neurodegeneracijom. Direktna posledica demijelinizacije je nemogućnost adekvatnog, tzv. skokovitog (saltatornog), provoĊenja nervnog impulsa duţ aksona i njome se objašnjavaju kliniĉki simptomi i znaci multiple skleroze (Compston i Coles, 2002). Jedna od glavnih odlika multiple skleroze je diseminacija inflamatornih lezija CNS-a u prostoru i vremenu. Da bi se postavila dijagnoza multiple skleroze, neophodno je da ispitanik ima najmanje dva kliniĉka dogaĊaja i prisustvo najmanje dve lezije u 7 CNS-u, pri ĉemu druga lezija ne mora biti kliniĉki eksprimirana (Compston i Coles, 2002). Dijagnostikovanje ove bolesti se bazira na rezultatima kliniĉkih i laboratorijskih analiza, koji podrazumevaju: 1) detektovane lezije bele mase u razliĉitim delovima CNS-a primenom nuklearno-magnetne rezonance (engl. Nuclear Magnetic Resonance Imaging, skr. NMRI), 2) detektovane dve ili više oligoklonalnih IgG traka u likvoru kojih nema u serumu i povišen nivo IgG u likvoru, kao pokazatelji intratekalne sinteze IgG antitela tj. inflamatornog i autoimunskog procesa u CNS-u i 3) detektovane produţene latencije evociranih potencijala u CNS-u, usled demijelinizacije (McDonald i sar., 2001). Multipla skleroza je hroniĉna neizleĉiva bolest. Ipak, u savremenoj medicini postoji nekoliko vidova terapije za ovu bolest. Primena visokih doza kortikosteroida predstavlja rutinsku terapiju akutnog neurološkog pogoršanja u relapsu (Compston i Coles, 2008; Burton i sar., 2009). Dejstvo kortikosteroida je antiinflamatorno i ostvaruje se putem inhibicije transkripcije proinflamatornih citokina- interleukina-1 (IL-1) i faktora nekroze tumora-alfa (TNFA), kao i inhibicijom aktivacije T-limfocita i njihovog transporta u CNS (Sloka, 2005). Do 2011. godine, u Evropi i Sjedinjenim Ameriĉkim Drţavama (SAD) je odobreno šest vrsta tretmana za multiplu sklerozu koji se sprovode primenom odgovarajućih imunomodulatornih agenasa (Compston i Coles, 2008). Dva osnovna mehanizma delovanja imunomodulatornih lekova podrazumevaju: uticaj na aktivaciju i/ili tkivnu migraciju autoreaktivnih T-limfocita, i uticaj na meĊućelijske interakcije T-limfocita i ćelija u CNS-u (Compston i Coles, 2002). Svaki imunomodulatorni agens ima odreĊenu efikasnost u pogledu smanjenja broja relapsa i spreĉavanja progresije neurološkog deficita (Johnson, 2007). 1.2. Kliniĉki tok multiple skleroze Na osnovu kliniĉkog toka, definisane su dve osnovne forme bolesti: relapsno- remitentna i primarno-progresivna multipla skleroza (Lublin i sar., 1996; Confavreux i Vukusic, 2002). Oko 85% pacijenata od poĉetka bolesti ima relapsno-remitentnu (RR) formu multiple skleroze, za koju su karakteristiĉni jasno definisani periodi relapsa 8 (egzacerbacija) tj. pogoršanja neuroloških simptoma, koji traju najmanje 24 sata. Period izmeĊu dva relapsa definiše se kao period remisije. Remisija traje najmanje 30 dana, tokom kojih dolazi do potpunog oporavka od posledica relapsa ili oporavka sa rezidualnim neurološkim deficitom. U prvim godinama bolesti, povećana uĉestalost relapsa uz nepotpun oporavak predviĊa lošiji kliniĉki ishod (Weinshenker, 1994). Ukoliko je na prvom NMRI pregledu detektovan veći broj lezija koje ukazuju na akutnu inflamaciju, prvenstveno gadolinijum-pozitivnih T1 lezija, utoliko se lošiji ishod bolesti oĉekuje. Oko 40-50% pacijenata sa RR formom multiple skleroze ulazi u sekundarno- progresivnu fazu nakon 10 godina od poĉetka bolesti, a ĉak oko 70% pacijenata nakon 20 godina trajanja bolesti. Sekundarno-progresivna (SP) faza multiple skleroze definisana je kao postepeno kontinuirano ireverzibilno pogoršanje neurološkog deficita nakon prethodne faze remisije, sa superponiranim relapsima ili bez njih. U odnosu na RR formu, SP faza asocirana je sa smanjenjem broja gadolinijum-pozitivnih T1 lezija na raĉun porasta stepena neurodegeneracije (Khoury i sar., 1994; Filippi i sar., 1995). U skladu sa tim, ranije faze relapsno-remitentne multiple skleroze odlikuju se osetljivošću na imunosupresivnu terapiju, koja se sa vremenom smanjuje i moţe se potpuno izgubiti u kasnijoj fazi sekundarno-progresivne multiple skleroze (Hohol i sar., 1999). Oko 15% ukupnog broja pacijenata ima primarno-progresivnu (PP) formu multiple skleroze, koja se odlikuje kontinuiranom postepenom progresijom neurološkog deficita od poĉetka bolesti, sa relapsima ili bez njih. Da bi se ustanovila kontinuitrana progresija, neophodan je period praćenja od godinu dana. Kod primarno-progresivnih pacijenata lezije su najĉešće detektovane u kiĉmenoj moţdini, a znatno reĊe u mozgu, u poreĊenju sa sekundarno-progresivnim pacijentima koji imaju pribliţno isti stepen neurološkog deficita (Compston i Coles, 2002). Za primarno-progresivnu multiplu sklerozu karakteristiĉno je odsustvo odgovora na imunomodulatornu terapiju (Hohol i sar., 1999). Prikaz klasifikacije toka multiple skleroze dat je na slici U2 (Confavreux i Vukusic, 2008). 9 Slika U2. Klasifikacija kliniĉkog toka multiple skleroze. Preuzeto iz: Confavreux i Vukusic, 2008. Uopšteno, za relapsno-remitentnu formu prognoza toka bolesti je dobra, uz veliku verovatnoću potpunog oporavka posle pojedinaĉnih relapsa, ukoliko kod pacijenta dominiraju senzorni ili vizuelni simptomi. Prognoza je loša ako dominiraju motorni simptomi, naroĉito ako su koordinacija i balans poremećeni, a upravo to je tipiĉno za progresivnu multiplu sklerozu (Compston i Coles, 2002). Ireverzibilni (trajni) neurološki deficit u multiploj sklerozi objašnjavaju dva mehanizma: nepotpuni oporavak od relapsa i progresija bolesti (Compston i Coles, 2002). Neurološki deficit je posledica ireverzibilne demijelinizacije, oštećenja i gubitka aksona. Od poĉetka bolesti, kod pacijenata sa RR formom multiple skleroze on se sporije akumulira nego kod PP pacijenata. Trajni neurološki deficit moţe biti predstavljen preko vrednosti kliniĉkog parametra stepena invaliditeta, EDSS (skr. od engl. Expanded Disability Status Scale) (Kurtzke, 1983), koja se postiţe i odrţava najmanje narednih 6 meseci, pri ĉemu svaka sledeća vrednost EDSS mora biti veća od 10 prethodne. Vrednost EDSS definiše stepen invaliditeta na osnovu kvantifikacije neurološkog deficita u funkcionalnim sistemima CNS-a: piramidalnom, cerebelarnom, senzornom, sistemu moţdanog stabla, sistemu inervacije creva i bešike, vizuelnom, cerebralnom, i dr. Vrednosti EDSS imaju raspon od 0,0 do 10,0. Vrednost 0,0 odgovara normalnom neurološkom nalazu, vrednosti 1,0-4,5 imaju pacijenti sa multiplom sklerozom koji su pokretni, 5,0-9,5 imaju pacijenti sa odgovarajućim stepenom nepokretnosti, a EDSS vrednost 10,0 definiše smrt kao posledicu multiple skleroze (Kurtzke, 1983). Pacijenti sa RR formom bolesti ĉesto ulaze u sekundarno-progresivnu fazu kada EDSS dostigne vrednost oko 4,5. MeĊutim, u cilju procene progresije bolesti potrebno je znati za koliki je vremenski period od poĉetka bolesti postignuta data vrednost EDSS. Korelisanje EDSS sa vremenom trajanja bolesti definiše vrednost parametra teţine kliniĉke slike multiple skleroze, MSSS (skr. od engl. Multiple Sclerosis Severity Score). Algoritam za odreĊivanje MSSS je primenjen na grupu od 9 892 pacijenta iz 11 drţava i tako je dobijen tzv. globalni MSSS (Roxburgh i sar., 2005). Vrednosti globalnog MSSS kreću se od 0,01 do 9,99 i prikazane su u referentnoj tabeli (tabela U1) (Roxburgh i sar., 2005). Na osnovu tabele svakom pacijentu sa poznatim EDSS i trajanjem bolesti izraţenim u godinama, dodeljuje se odgovarajući MSSS. Vrednost MSSS od 5,00 ukazuje na srednju brzinu progresije bolesti, vrednost 9,00 na brzu progresiju (progredira brţe od 90% pacijenata), a 1,00 na sporu progresiju (progredira brţe od 10% pacijenata). Delovi tabele U1 (Roxburgh i sar., 2005) koji su obojeni razliĉitim bojama predstavljaju tzv. decile. Svaka decila definiše jedan obrazac progresije multiple skleroze za odgovarajuće vrednosti EDSS i razliĉite duţine trajanja bolesti. 11 Tabela U1. Vrednosti globalnog MSSS. Preuzeto iz: Roxburgh i sar., 2005. 1.3. Faktori rizika za nastanak multiple skleroze Multipla skleroza je kompleksna bolest u ĉijoj patogenezi uĉestvuju brojni faktori. Oni se dele u dve osnovne grupe, a to su genetski faktori i faktori sredine. U kliniĉkim istraţivanjima su pokazani trendovi da odreĊeni pacijenti (ţene i svi oboleli pre 35. godine), sa odreĊenim tokom bolesti (RR sa dugim intervalima izmeĊu relapsa i potpunim oporavkom posle relapsa) i odreĊenim simptomima bolesti (senzorni umesto motornih simptoma tokom relapsa) imaju bolju prognozu. Buduća istraţivanja nastaviće da se bave identifikacijom genetskih i sredinskih faktora i njihovih mogućih interakcija u patogenezi multiple skleroze. To će omogućiti potpunije razumevanje ove bolesti, sa 12 krajnjim ciljem poboljšanja terapijskih tretmana kod obolelih ili spreĉavanja nastanka bolesti (Compston i Coles, 2002; Noseworthy i sar., 2000). 1.3.1. Faktori sredine Faktori sredine koji su do sada najĉešće asocirani sa rizikom za multiplu sklerozu su: geografski faktori, unos vitamina D i infekcije odreĊenim patogenima. 1.3.1.1. Geografski faktori i vitamin D Multipla skleroza je bolest tipiĉna za regione sa umerenom klimom. Severna Evropa, Kanada, SAD, Izrael, Novi Zeland i delovi Australije predstavljaju oblasti visokog rizika, gde uĉestalost bolesti iznosi 0.1-0.2 %. Uopšteno, stanovnici u regionima iznad 40° geografske širine imaju veći rizik za oboljevanje od multiple skleroze u odnosu na stanovnike u drugim regionima. Ekvatorijalne oblasti Azije, Afrike i juţne Amerike su niskog rizika, sa uĉestalošću oboljevanja od oko 0.005% (Kantarci i Wingerchuk, 2006). Pretpostavlja se da razliĉit intenzitet sunĉevog zraĉenja kome su ljudi u oblastima razliĉitih geografskih širina izloţeni moţe uticati na rizik za oboljevanje, pri ĉemu je smanjeni intenzitet zraĉenja asociran sa povećanim rizikom. Pored geografske širine, nadmorska visina je povezana sa intenzitetom sunĉevog zraĉenja, a uĉestalost multiple skleroze je obrnuto proporcionalna nadmorskoj visini (Ascherio i Munger, 2007). Izlaganje sunĉevom UV zraĉenju je vaţno za sintezu vitamina D3 u koţi. TakoĊe, forme (D2 i D3) vitamina D se unose putem hrane. Nivo vitamina D moţe da utiĉe na rizik za nastanak multiple skleroze (Ebers 2008; Cantorna 2008). Vitamin D3 se hidroksilacijom u jetri i bubrezima prevodi u fiziološki aktivan 1,25(OH)2 vitamin D3 koji se transportuje u razliĉite ciljne ćelije gde aktivira ili inhibira transkripciju odgovarajućih ciljnih gena. Preko aktivnosti produkata ciljnih gena, vitamin D uĉestvuje u resorpciji kalcijuma iz creva u krv i njegovoj ugradnji u kosti, a takoĊe i u unutarćelijskom transportu kalcijuma ĉime ostvaruje ulogu u regulaciji proliferacije i diferencijacije ćelija (Holick, 2004). Prekursorni oblik aktivnog vitamina D (25(OH)D3) je lako merljiv u serumu, a njegova koncentracija varira u zavisnosti od godišnjeg doba (intenziteta sunĉevog zraĉenja) i naĉina ishrane (Munger i sar., 2004; 13 Munger i sar., 2006). Pokazana je korelacija izmeĊu smanjenja rizika za nastanak multiple skleroze i porasta nivoa 25(OH)D3 u serumu (Munger i sar., 2004; Munger i sar., 2006). Kod obolelih koji su tretirani visokim dozama vitamina D, došlo je do poboljšanja kliniĉke slike u pogledu smanjenja uĉestalosti relapsa i redukcije proliferacije T-limfocita (Burton i sar., 2010). Pretpostavka o ulozi 1,25(OH)2 vitamina D3 u nastanku i progresiji multiple skleroze podrţana je ĉinjenicom da ovaj vitamin ostvaruje antiinflamatorne i antiautoimunske efekte, posredstvom regulacije uroĊenog i steĉenog imunskog odgovora (Hewison, 2010). 1.3.1.2. Infekcije Postoje dve glavne hipoteze o infekcijama kao potencijalnim faktorima rizika za nastanak multiple skleroze: „virusna hipoteza” i „hipoteza rasprostranjenosti” (Zuvich i sar., 2009). Prema virusnoj hipotezi, osoba ima povećan rizik za oboljevanje samo ukoliko je inficirana odreĊenim virusom u periodu puberteta/adolescencije, dok ista infekcija tokom ranog detinjstva smanjuje rizik. Hipoteza rasprostranjenosti podrazumeva postojanje još neidentifikovanog patogena asociranog sa multiplom sklerozom, koji je visoko rasprostranjen u regionima visokog rizika za bolest. I prema ovoj hipotezi, ţivotno doba u kome doĊe do infekcije odreĊuje stepen rizika za oboljevanje od multiple skleroze. Jedan od mikroorganizama koji se najĉešće dovode u vezu sa multiplom sklerozom je Epstein-Barr virus (EBV). On pripada familiji herpesvirusa, inficira B- limfocite i epitelne ćelije farinksa, u njima se replikuje i izaziva akutnu infektivnu mononukleozu. Nakon akutne infekcije, EBV se trajno zadrţava u B-limfocitima domaćina (Epstein i Crawford, 1999). Uoĉeno je da kasna virusna infekcija praćena mononukleozom doprinosi znaĉajno većem riziku za multiplu sklerozu, u odnosu na asimptomatsku infekciju u ranom detinjstvu ili seronegativnost na EBV (Ascherio i Munger, 2007). U moţdanim opnama pacijenata sa sekundarno-progresivnom multiplom sklerozom otkriveno je prisustvo ektopiĉnih folikula koji sadrţe dendritske ćelije, T-limfocite i proliferišuće B-limfocite u kojima je detektovana latentna infekcija EB virusom (Franciotta i sar., 2008). Prisustvo folikula je asocirano sa ranijom pojavom bolesti, većim oštećenjem korteksa i ranijom smrću (Serafini i sar., 2004). U kontekstu 14 infekcije EBV-om, autoimunski napad usmeren na mijelinske i/ili neuronske antigene moţe biti lokalnog karaktera (iz folikula) ili moţe biti posledica sistemskog imunskog odgovora na virusnu infekciju B-limfocita pozicioniranih u folikulima CNS-a. 1.3.2. Individualni faktori rizika: starost i pol 1.3.2.1. Starost Za razliku od hroniĉnih inflamatornih i autoimunskih bolesti ĉija uĉestalost raste sa starenjem (Ebers, 2008), multipla skleroza se javlja najĉešće kod mladih odraslih ljudi i stoga dugotrajno narušava kvalitet ţivota. Ona tipiĉno poĉinje u periodu izmeĊu 20. i 40. godine ţivota (Hauser i Goodkin, 1998). Rizik za oboljevanje je veoma nizak u detinjstvu, najviši je oko 25. godine, dok izraţeno opada posle 50. godine (Ascherio i Munger, 2007). Starost na poĉetku bolesti je asocirana sa tokom i prognozom bolesti - kasnije oboljevanje se povezuje sa brţom progresijom multiple skleroze. Pokazano je da pacijenti koji su kao mlaĊi oboleli imaju sporiju progresiju bolesti, ali i da ranije dostiţu EDSS vrednost od 6 (Tremlett i sar., 2006). Razlike u kliniĉkom toku su najuoĉljivije na poĉetku bolesti, a kada EDSS preĊe vrednost 4, starosno doba u kome se javlja trajna onesposobljenost nije odreĊeno inicijalnim tokom bolesti (Confavreux i Vukušić, 2006). 1.3.2.2. Pol Uĉestalost multiple skleroze je znaĉajno veća kod ţena nego kod muškaraca. Godišnje u svetu oboli oko 3,6/100 000 ţena i 2,0/100 000 muškaraca (Alonso i Hernan, 2008). Iako ţenski pol nosi veći rizik za oboljevanje, rezultati velikog broja studija pokazuju da obolele ţene imaju bolju prognozu i ĉešći benigni tok bolesti nego muškarci (Bergamaschi, 2007; Glad i sar., 2009). Ţene sa relapsno-remitentnim tokom multiple skleroze imaju duţi period dostizanja vrednosti EDSS od 4 (Koutsis i sar., 2010) ili prelaska u sekundarno-progresivnu formu bolesti (Koch i sar., 2010). Osim toga, ţene i muškarci se razlikuju i prema odgovoru na terapiju (Trojano i sar., 2009; Li i sar., 2001). 15 Polne razlike koje se tiĉu uĉestalosti multiple skleroze, njenog kliniĉkog toka i odgovora na terapiju mogu biti prouzrokovane razlikama koje su uoĉene izmeĊu polova na funkcionalnom nivou: imunskog sistema, CNS-a i gena lociranih na polnim hromozomima (Greer i McCombe, 2011). 1.3.3. Genetski faktori rizika Rizik za oboljevanje od multiple skleroze odreĊivan je za ĉlanove uţe i šire porodice. Pokazan je viši rizik za oboljevanje kada su uporeĊivani roditelji i deca (2%), i braća i sestre (3%), nego kada su meĊusobno uporeĊivane osobe koje su u daljem srodstvu (Compston i Coles, 2002). TakoĊe, znaĉajno viši rizik od oboljevanja imaju deca ĉija su oba roditelja obolela (20%), u poreĊenju sa decom ĉiji je jedan roditelj oboleo (2%). Maksimalni rizik za oboljevanje postoji kod monozigotnih blizanaca. Ukoliko je jedan monozigotni blizanac oboleo, rizik da i drugi blizanac oboli iznosi oko 30%. Osobe usvojene od strane porodica ĉiji je ĉlan oboleo od multiple skleroze nemaju povećan rizik za oboljevanje (Compston i Coles, 2002). Svi ovi podaci ukazuju na znaĉaj genetske komponente u patogenezi multiple skleroze. Ne postoji jasan mehanizam nasleĊivanja multiple skleroze. Ipak, jasno je da postoji nelinearna veza izmeĊu rizika za oboljevanje i stepena srodstva u porodicama (Compston i Coles, 2002; Hoppenbrouwers i Hintzen, 2011). Multipla skleroza je kompleksna poligenska bolest (Compston, 1999). Genetski faktori odgovorni za nastanak poligenskih bolesti nisu pojedinaĉne genske mutacije koje prouzrokuju sintezu aberantnih proteinskih proizvoda, već su to mnogobrojni prirodni genski polimorfizmi. Oni deluju pojedinaĉno ili putem epistaze, a svaki genski polimorfizam moţe dati mali doprinos nekom poznatom ili još uvek nedefinisanom strukturnom ili funkcionalnom entitetu. Preko prisustva ĉestih genskih polimorfizama, ĉija je uĉestalost veća od 5% u populaciji, mogu se objasniti prevalenca i heritabilnost multiple skleroze (Hoppenbrouwers i Hintzen, 2011). TakoĊe je moguće da retke alelske varijante, sa uĉestalošću od 1% do 5% u populaciji, imaju naroĉitog uticaja na heritabilnost u porodicama sa više od dva obolela ĉlana (Yang i sar., 2005). Genski polimorfizmi kao faktori rizika za nastanak bolesti mogu biti identifikovani u porodiĉnim studijama vezanosti ili studijama asocijacije, na osnovu pretraţivanja 16 sekvenci gena kandidata ili celog genoma (engl. Genome Wide Association Study, skr. GWAS). U genetskim studijama, najĉešći tip polimorfizama koji se izuĉavaju kao potencijalni faktori rizika za patogenezu bolesti predstavljaju polimorfizmi pojedinaĉnih nukleotida (engl. Single Nucleotide Polymorphism, skr. SNP) u genima ili regulatornim regionima u blizini gena. Za mnoge od ovih gena tek treba da se razotkrije njihova uloga u nastanku ili progresiji bolesti. Ipak, za znaĉajan broj novootkrivenih genskih lokusa asociranih sa rizikom za multiplu sklerozu pokazano je da imaju ulogu u imunskom odgovoru (Hoppenbrouwers i Hintzen, 2011). 1.3.3.1. Genski polimorfizmi u patogenezi multiple skleroze S obzirom na visoku polimorfnost gena koji kodiraju molekule humanih leukocitnih antigena (HLA) i na vaţnu ulogu ovih molekula u adekvatnoj aktivaciji ćelijskog i humoralnog imunskog odgovora (Abbas i Lichtman, 2006), polimorfizmi u hromozomskom regionu HLA (6p21.3) (slika U3) do sada su asocirani sa većinom humanih autoimunskih bolesti meĊu kojima je i multipla skleroza (Shiina i sar., 2004). Slika U3. Tri klase gena u regionu HLA, na hromozomu 6p21.3, i asocijacija lokusa HLA-DRB1 sa rizikom za nastanak multiple skleroze. Preuzeto iz: Oksenberg i sar., 2008. 17 Asocijacija gena u regionu HLA sa multiplom sklerozom otkrivena je 1972. godine (Jersild i sar., 1972; Naito i sar., 1972). Procenjeno je da genski polimorfizmi u HLA regionu ĉine oko 20-60% genetske osnove rizika za oboljevanje od ove bolesti (Haines i sar., 1998). Postoje dokazi da mehanizam koji leţi u osnovi asocijacije regiona HLA sa patogenezom multiple skleroze podrazumeva prezentaciju specifiĉnog peptida mijelinskog proteina (kao što je MBP), posredstvom njegovog vezivanja za molekule II klase HLA, specifiĉnim mijelin-reaktivnim T-limfocitima koji se ovim putem aktiviraju (Hohlfeld i Vekerle, 2001; Sospedra i Martin, 2005; McFarland i Martin, 2007). U dosadašnjim GWAS studijama, odreĊeni aleli lokusa HLA-DRB1 (pojedinaĉni ili u haplotipu) su istaknuti kao faktori rizika za multiplu sklerozu sa izuzetnom statistiĉkom znaĉajnošću (Baranzini SE, 2011). Njihova asocijacija sa rizikom za nastanak multiple skleroze je utvrĊena u gotovo svim evropskim populacijama, sa izuzetkom nekih mediteranskih, a najjaĉa je u populacijama severne Evrope. Postojanje cis- i/ili trans- efekata alela HLA-DRB1 lokusa sugeriše na uspostavljanje genetskog gradijenta rizika za nastanak multiple skleroze (slika U3) (Barcellos i sar., 2006; Dyment i sar., 2005; Oksenberg i sar., 2008). Postoje dokazi o asocijaciji izmeĊu alela HLA-DRB1*15 i odreĊenih faktora sredine, kao što su unos vitamina D (Ramagopalan i sar., 2009) i infektivna mononukleoza prouzrokovana EB virusom (Nielsen i sar., 2007). Asocijacija regiona HLA (polimorfizam rs3135388) sa rizikom za oboljevanje od multiple skleroze potvrĊena je i u Srbiji (Ţivković i sar., 2009). Nakon otkrića regiona HLA, prošao je dug period pre nego što su otkriveni drugi genetski faktori rizika za multiplu sklerozu. Jedan od razloga za to je što je, u odnosu na HLA, doprinos ostalih genetskih varijanti riziku za oboljevanje relativno mali. TakoĊe, u genetske studije su ĉesto ukljuĉene heterogene populacije, te je statistiĉka moć studija nedovoljna. Od nedavno, istraţivanja u oblasti genetike multiple skleroze fokusirana su na pristup GWAS. Do sada su objavljeni rezultati samo nekoliko GWASs (Hafler i sar., 2007; Comabella i sar., 2008; Baranzini i sar., 2008; ANZgene, 2009; Jakkula i sar., 2010; Sanna i sar., 2010; Nischwitz i sar., 2010). Ovi rezultati, zajedno sa dosadašnjim replikativnim studijama (Rubio i sar., 2008; Ban i sar., 2009; D’Netto i sar., 2009; Hoppenbrouwers i sar., 2008; Hafler i sar., 2009) i meta-analizom (De Jager i sar., 2009), dali su dokaze o postojanju oko desetak genskih lokusa izvan regiona HLA, koji utiĉu na rizik za oboljevanje od multiple skleroze. MeĊu ovim lokusima, ĉiji su 18 polimorfizmi kao faktori rizika dostigli znaĉajnost na nivou genoma, nalaze se geni koji kodiraju: receptor za IL-7 (IL7R), alfa-lanac receptora za IL-2 (IL2RA) ili CD25, C-tip lektina 16A (CLEC16A) (Hoppenbrouwers i sar., 2009), CD58 (Hoppenbrouwers i sar., 2009), CD226 (IMSGC, 2009), kinezinu sliĉan protein KIF21B (IMSGC, 2010), CD6 (De Jager i sar., 2009), interferonski regulatorni faktor 8 (IRF8) (De Jager i sar., 2009), receptor p55 za TNFA (TNFRSF1A) (De Jager i sar., 2009), 25-OHD3-1alfa hidroksilazu (CYP27B1, skr. od engl. Cytochrome P450 family 27 subfamily B peptide 1) (ANZgene, 2009; Sundqvist i sar., 2010), tirozin-kinazu 2 (TYK2) i transkripcioni faktor STAT (skr. od engl. Signal Transducer and Activator of Transcription) 3 (Jakkula i sar., 2010). Većina navedenih genskih produkata uĉestvuje u funkcionisanju imunskog sistema. 1.3.3.2. Genska ekspresija u patogenezi multiple skleroze U studijama u kojima su ispitivani profili genske ekspresije u multiploj sklerozi uraĊena je analiza tkiva mozga i periferne krvi, sa ciljem definisanja novih dijagnostiĉkih i prognostiĉkih biomarkera bolesti, kao i odgovora na odreĊene vrste terapije. Do sada je objavljeno više studija u kojima su analizirani profili ekspresije gena u lezijama bele mase, beloj masi normalnog izgleda i sivoj masi mozga pacijenata sa multiplom sklerozom, koji su uporeĊivani sa ekspresionim profilima odgovarajućih kontrolnih tkiva (Whitney i sar., 1999; Whitney i sar., 2001; Lock i sar., 2002; Tajouri i sar., 2003; Mycko i sar., 2003; Mycko i sar., 2004; Lindberg i sar., 2004; Graumann i sar., 2003; Zeis i sar., 2008; Dutta i sar., 2006). U moţdanom tkivu pacijenata, u odnosu na kontrole, pokazana je razliĉita ekspresija gena ĉiji produkti uĉestvuju u regulaciji uroĊenog i steĉenog imunskog odgovora, a to su: interferonski regulatorni faktor 2 (IRF2), TNFA (Mycko i sar., 2003; Mycko i sar., 2004), receptor za TNFA i nespecifiĉni receptor za hemokine DARC (engl. Duffy blood group, Chemokine receptor) (Whitney i sar., 1999), 5-lipoksigenaza (Whitney i sar., 2001), transkripcioni faktori STAT4 i STAT6 (Zeis i Schaeren-Wiemers, 2008), inflamatorni citokini (IL-6 i IL-17) i molekuli II klase HLA i sistema komplementa (Lock i sar., 2002) i imunoglobulinski Fc receptor (Lock i sar., 2002). MeĊu diferencijalno eksprimiranim 19 genima u mozgu pacijenata, nalaze se i geni ukljuĉeni u regulaciju neuronske homeostaze. To su geni koji kodiraju: MBP i neuronski faktor rasta indukovan povredom (engl. Nerve Injury-induced protein 1, skr. NINJ1) (Tajouri i sar., 2003), transkripcioni faktor indukovan hipoksijom (engl. Hypoxia Inducible Factor 1, skr. HIF1) (Graumann i sar., 2003) i cilijarni neurotrofni faktor (engl. Ciliary Neurotrophic Factor, skr. CNTF) (Dutta i sar., 2006). Dosadašnje studije u kojima su izuĉavani transkripcioni profili u moţdanom tkivu obolelih od multiple skleroze i odgovarajućih kontrola izvedene su na uzorcima dobijenim obdukcijom ili biopsijom tkiva. Zbog toga, glavna prepreka u izvoĊenju ovih studija je ograniĉena dostupnost ciljnih uzoraka. S obzirom da je multipla skleroza inflamatorna i autoimunska bolest, odreĊivanje profila ekspresije gena u leukocitima periferne krvi predstavlja vaţan pristup za izuĉavanje imunološkog aspekta patogeneze bolesti na molekularnom nivou. Do sada je objavljeno nekoliko ovakvih studija u multiploj sklerozi (Ramanathan i sar., 2001; Bomprezzi i sar., 2003; Mandel i sar., 2004; Mayne i sar., 2004; Satoh i sar., 2005; Infante-Duarte i sar., 2005). Vaţna prednost studija koje ispituju ekspresiju gena u perifernim leukocitima jeste dostupnost uzoraka periferne krvi. PoreĊenjem profila ekspresije gena u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata i zdravih kontrola, utvrĊene su razlike u ekspresiji gena funkcionalno povezanih sa regionom HLA, kao što su gen za dugu nekodirajuću jedarnu RNK- NEAT1 (skr. od engl. Nuclear Enriched Abundant Trsanscript 1), i gen za protein toplotnog stresa HSPA1A (skr. od engl. Heat Shock 70kDa Protein 1A) (Kemppinen i sar., 2011). Kod pacijenata su bili visoko eksprimirani geni za alfa-subjedinicu T-ćelijskog receptora (TCR-alfa, koji je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule HLA), TNFR i IL7R (Bomprezzi i sar., 2003). Gen za cistein proteazu L lizozoma (katepsin L), koja reguliše proces aktivacije autoreaktivnih T-limfocita specifiĉnih za antigene mijelina, bio je povišeno eksprimiran tokom faze relapsa bolesti (Achiron i sar., 2004). Transkripcioni faktor STAT3 koji deluje kao koaktivator signalnog puta glukokortikoidnog receptora i molekuli ukljuĉeni u puteve transdukcije signala preko interleukina IL-4, IL-6 i IL-17, imali su razliĉitu gensku ekspresiju kod pacijenata i kontrola (Kemppinen i sar., 2011). Aktivacija procesa remodelovanja vanćelijskog matriksa kod pacijenata je bila evidentna na osnovu pojaĉane ekspresije metaloproteinaze 19 matriksa (engl. Matrix Metalloproteinase-19, skr. MMP-19) i smanjene ekspresije tkivnog inhibitora 20 metaloproteinaza 1 (engl. Tissue Inhibitor of Metalloproteinases 1, skr. TIMP1) (Bomprezzi i sar., 2003). Geni za proteine koji stimulišu hemotaksiju monocita (engl. Monocyte Chemotactic Protein-1 i -2, skr. MCP1 i MCP2) su bili povišeno eksprimirani tokom faze relapsa bolesti (Achiron i sar., 2004). Meta-analiza je pokazala da se u grupi gena, ĉija je diferencijalna ekspresija u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata replikovana in silico u dve ili više analiziranih pojedinaĉnih studija (Kemppinen i sar., 2011), nalaze geni (NEAT1, HSPA1A) funkcionalno povezani sa HLA- hromozomskim regionom ĉiji polimorfizmi predstavljaju glavne genetske faktore rizika za nastanak multiple skleroze (Jersild i sar., 1972; Naito i sar., 1972; Haines i sar., 1998; Sawcer i sar., 2005). TakoĊe, ovde pripadaju i diferencijalno eksprimirani geni koji su ukljuĉeni u puteve transdukcije signala preko glukokortikoidnog receptora (STAT3) i interleukina (IL-4, IL-6 i IL-17) u T-limfocitima (Kemppinen i sar., 2011). Prethodno je u lezijama mozga pacijenata detektovana diferencijalna ekspresija gena za interleukine (IL-6 i IL-17) (Lock i sar., 2002), što zajedno sa diferencijalnom ekspresijom gena signalnih puteva ovih interleukina u perifernim T-limfocitima (Kemppinen i sar., 2011) predstavlja primer promena u imunskom sistemu koje se detektuju u ćelijama periferne krvi, a odraţavaju patološke promene u glavnom ciljnom tkivu (CNS) kod obolelih od multiple skleroze. IzvoĊenje funkcionalnih studija je potrebno kako bi se razjasnila veza izmeĊu promena u ekspresiji gena u analiziranim tkivima i patogeneze multiple skleroze, odnosno da li su ove promene uzrok ili posledica bolesti. Integracija rezultata GWASs sa podacima iz oblasti transkriptomike, proteomike i drugih (kliniĉki podaci, NMRI, izloţenost sredinskim faktorima rizika i/ili familijarnom riziku za oboljevanje), neophodna je za dalji napredak u razumevanju genetske osnove patogeneze multiple skleroze. 21 1.4. Uloga hemokina i hemokinskih receptora u patogenezi multiple skleroze 1.4.1. Klasifikacija hemokina i hemokinskih receptora Hemokini predstavljaju familiju citokina. To su solubilni proteini malih molekulskih masa (8-14 kDa) koji imaju esencijalnu ulogu u stimulaciji migracije ćelija i meĊućelijskoj komunikaciji (Rossi i Zlotnik, 2000). Osnovna klasifikacija hemokina je napravljena prema njihovim strukturnim karakteristikama i specifiĉnom delovanju na populacije imunskih ćelija koje eksprimiraju hemokinske receptore (IUIS/WHO Subcommittee on Chemokine Nomenclature, 2002; Rollins, 1997; Mantovani, 1999). Prema strukturi konzervisanog N-terminalnog motiva sa cisteinskim (C) reziduama, tj. prisustvu ili odsustvu aminokiselina izmeĊu prve dve cisteinske rezidue na N- terminusu, familija hemokina je podeljena na ĉetiri podfamilije, a to su: C- (motiv sadrţi samo jednu cisteinsku reziduu), CC-, CXC- i CX3C- hemokini (X oznaĉava aminokiselinu razliĉitu od cisteina). C- hemokini (CL1 i CL2) specifiĉno privlaĉe T- limfocite. CC- hemokini deluju na bazofile, eozinofile, monocite, NK-(skr. od engl. Natural Killer) ćelije, dendritske ćelije i T-limfocite. CXC- hemokini stimulišu migraciju neutrofila, monocita i limfocita. Jedini ĉlan CX3C- podfamilije, CX3CL1, je jedinstven po tome što moţe postojati u formi tipiĉnog solubilnog hemokina ili membranskog adhezivnog molekula, a deluje na monocite, NK-ćelije, dendritske ćelije i T-limfocite. Na osnovu ekspresije i funkcije in vivo, hemokini se mogu podeliti u dve kategorije: konstitutivne (homeostatske), koji su odgovorni za transport leukocita u bazalnim uslovima, razviće i strukturno-funkcionalnu organizaciju limfoidnih i nelimfoidnih organa, i inducibilne (inflamatorne) hemokine koji su produkovani u odgovoru na inflamaciju i omogućavaju pojaĉanu migraciju leukocita u tkivo zahvaćeno inflamacijom. Ekspresiju inflamatornih hemokina podstiĉu proinflamatorni stimulusi kao što su citokini IL-1, TNFA i IFNG, virusni antigeni i bakterijski lipopolisaharid (LPS), a inhibiraju je endogeni antiinflamatorni medijatori: citokini IL-10 i TGF-beta (skr. od engl. Transforming Growth Factor-beta), i glukokortikoidi. Podela na konstitutivne i inducibilne hemokine je gruba, s obzirom na to da izvesni konstitutivni 22 hemokini pokazuju i inducibilnu ekspresiju, i obrnuto. Regulacija funkcije hemokina moţe da se ostvari na nivou alternativne obrade njihovih primarnih transkripata koja rezultuje biosintezom razliĉitih izoformi hemokina (Colobran i sar., 2007), i/ili putem posttranslacionih modifikacija kao što su glikozilacija, citrulinacija i proteoliza (Mortier i sar., 2008; Proost i sar., 2008; Mortier i sar., 2011). Mnogi inflamatorni hemokini su supstrati za razliĉite proteaze, a proteolitiĉkoj obradi podleţu predominantno N- terminalni regioni hemokina. Hemokini ostvaruju dejstvo na ciljne ćelije posredstvom vezivanja za hemokinske receptore koji pripadaju familiji receptora sa sedam transmembranskih domena, kuplovanih sa G-proteinom (Bajetto i sar., 2002; Thelen, 2001). Hemokinski receptori su klasifikovani prema tipu liganda (hemokina) koji vezuju i na koji odgovaraju u ĉetiri kategorije: CR1 (receptor za CL1 i CL2), receptore za CC- hemokine (CCR), receptore za CXC- hemokine (CXCR) i CX3CR1 (receptor za CX3CL1) (IUIS/WHO Subcommittee on Chemokine Nomenclature, 2002). Interakcije hemokina i njihovih receptora predstavljaju kompleksnu mreţu, a definisane su preteţno na osnovu izuĉavanja efekata hemokina na ćelije imunskog sistema (Mantovani, 1999). Identifikovano je više od 50 humanih hemokina i oko 20 hemokinskih receptora (Charo i Ransohoff, 2006). Sa nekim izuzecima, pojedinaĉni hemokinski receptori mogu da odgovore na više od jednog hemokina, a pojedinaĉni hemokini mogu angaţovati više od jednog receptora (Rossi i Zlotnik, 2000). Svojstvo da jedna ćelija proizvodi više razliĉitih hemokina je naroĉito izraţeno kod ćelija uroĊenog imunskog odgovora (mononuklearni fagociti i dendritske ćelije) koje su direktno izloţene infektivnim agensima, a obezbeĊuje adekvatnu odbranu domaćina (Mantovani, 1999). Uprkos kompleksnosti njihovih interakcija, blokiranje aktivnosti odreĊenih hemokina i hemokinskih receptora ili ekspresije gena koji ih kodiraju moţe da modifikuje ishod eksperimentalno indukovanih inflamatornih bolesti, što ukazuje na to da se terapija odreĊenih humanih bolesti moţe sprovoditi na nivou regulacije aktivnosti hemokina (Gerard i Rollins, 2001). 23 1.4.2. Hemokini u mehanizmu inflamacije Nakupljanje leukocita u tkivu (na mestu infekcije), koje je praćeno vazodilatacijom i povećanim vaskularnim permeabilitetom definiše se kao inflamacija (zapaljenje) (Abbas i Lichtman, 2006). Neuroinflamacija zapoĉinje infiltracijom leukocita u tkivo CNS-a i predstavlja suštinski korak u patogenezi multiple skleroze. Ekstravazacija leukocita iz krvotoka je proces koji se odvija u nekoliko koraka i obuhvata: 1) kotrljanje leukocita po površini endotela malih krvnih sudova (postkapilarnih venula), uslovljeno slabom adhezijom izmeĊu leukocita i P- i E- selektina na endotelnim ćelijama (selektini su indukovani inflamatornim citokinima TNF i IL-1 koje produkuju aktivirani tkivni makrofazi), 2) ĉvrstu adheziju posredovanu vezivanjem aktiviranih integrina na leukocitima za odgovarajuće ligande na endotelnim ćelijama (ekspresiju liganada stimulišu TNF i IL-1) i 3) transendotelnu migraciju leukocita u tkivo (Abbas i Lichtman, 2006). Vaţan korak u ovoj kaskadi je sinteza hemokina od strane aktiviranih tkivnih makrofaga i endotelnih ćelija. Sintetisani hemokini se nagomilavaju na luminalnoj površini endotela, u asocijaciji sa glikozaminoglikanima, i na taj naĉin u visokoj koncentraciji bivaju izloţeni leukocitima koji se kotrljaju po endotelu. Tada dolazi do vezivanja hemokina za njihove receptore koji su eksprimirani na površini cirkulišućih leukocita, što dovodi do iniciranja prenosa unutarćelijskih signala u leukocitima i rezultuje aktivacijom membranskih integrina koja omogućava ĉvrstu adheziju leukocita za endotel. Hemokini stimulišu ĉvrsto vezane leukocite da migriraju kroz zid krvnog suda, duţ gradijenta koncentracije hemokina, do ciljnog mesta u tkivu (Abbas i Lichtman, 2006). 1.4.3. Strukturno-funkcionalne karakteristike krvno-moždane barijere Delovanje homeostatskih i/ili inflamatornih hemokina odreĊuje koje će subpopulcije leukocita migrirati iz krvi u periferna tkiva. U centralnom nervnom sistemu postoje specifiĉne barijere koje dodatno regulišu infiltraciju leukocita i drugih ćelija, solubilnih molekula i makromolekula u parenhimsko tkivo i na taj naĉin doprinose odrţanju homeostaze u CNS-u. Dve glavne anatomski specijalizovane barijere su: barijera izmeĊu krvi i likvora i krvno-moţdana barijera. Barijera izmeĊu 24 krvi i likvora spreĉava slobodnu razmenu rastvorenih materija izmeĊu njih. U formiranju ove barijere uĉestvuje epitel horoidnog pleksusa, preko koga komponente likvora dospevaju u moţdane komore i u kome su ćelije povezane ĉvrstim meĊućelijskim vezama (Ransohoff i sar., 2003; Johanson i sar., 2008). Krvno-moţdana barijera (KMB) se sastoji od endotela malih krvnih sudova mozga, pericita i terminalnih proširenja citoplazmatskih nastavaka astrocita (“stopala”) koji okruţuju krvne sudove (slika U4) (Abbott i sar., 2006). Ova barijera omogućava selektivni transport ćelija i molekula izmeĊu krvi i moţdanog parenhima. Iako su osnovne strukturne komponente krvno-moţdane barijere uniformne, postoje dokazi o heterogenosti KMB-e zavisno od vaskularne osnove i anatomske lokacije krvnih sudova (Ge i sar., 2005). UtvrĊeno je da se ekspresija odreĊenih transportera razlikuje izmeĊu cerebralnih krvnih sudova razliĉitog dijametra (Virgintino i sar., 2002; Ge i sar., 2005). Ĉvrste meĊućelijske veze u endotelu cerebralnih postkapilarnih venula su diskontinuirane i manje kompleksne u odnosu na kapilarne (Nagy i sar., 1984), a to moţe biti jedan od razloga zašto se transmigracija leukocita odigrava iskljuĉivo na nivou postkapilarnih venula (Ge i sar., 2005; Owens i sar., 2008). Regionalne razlike u KMB-i se ispoljavaju i na nivou razlika u ekspresiji adhezivnih molekula (Kivisakk i sar., 2003) i hemokina (McCandless i sar., 2008; McCandless i sar., 2006), koji direktno utiĉu na ekstravazaciju leukocita. Tokom ranih faza EAE-a, dolazi do aktivacije CD4+ T-limfocita prilikom interakcije sa APC u subarahnoidnom prostoru, a to je praćeno njihovom proliferacijom i akumulacijom u subarahnoidnom prostoru (Kivisakk i sar., 2009). Ovi rezultati sugerišu da rani dogaĊaj tokom inflamacije i imunskog odgovora u CNS-u moţe biti usmerena transmigracija leukocita kroz subarahnoidne krvne sudove u subarahnoidni prostor, koja je posledica diferencijalne ekspresije adhezivnih molekula na vaskularnom endotelu (Bartholomaus i sar., 2009; Ransohoff, 2009). 25 1.4.4. Hemokini i hemokinski receptori u krvno-moždanoj barijeri, leukocitima i ćelijama centralnog nervnog sistema tokom patogeneze multiple skleroze Izuĉavanje uloge hemokina u centralnom nervnom sistemu datira od poĉetka 1990-ih. Znaĉaj hemokina u mehanizmu neuroinflamacije je otkriven u studijama na ţivotinjskom modelu multiple skleroze (EAE), u kojima je nastanak bolesti asociran sa povećanom produkcijom odreĊenih hemokina u tkivu CNS-a (Ransohoff i sar., 1993; Hulkower i sar., 1993). Konstitutivno eksprimirani (homeostatski) hemokini u CNS-u su: CXCL1, CXCL12, CX3CL1 i neki CC- hemokini. Oni posreduju u migraciji neuronskih i glijalnih progenitora, proliferaciji glijalnih ćelija, neurogenezi, preţivljavanju neurona, komunikaciji izmeĊu neurona i ćelija glije i neurotransmisiji (Ambrosini i Aloisi, 2004). Neke homeostatske hemokine, kao što su CXCL12, CCL19 i CCL21, eksprimiraju endotelne ćelije krvnih sudova u CNS-u (Holman i sar., 2011). Promene ekspresije ovih hemokina su asocirane sa promenama odlika krvno-moţdane barijere i njenim narušavanjem u toku neuroinflamacije i patogeneze multiple skleroze (Holman i sar., 2011). Na krvno-moţdanoj barijeri CXCL12 ima izuzetno vaţnu ulogu u regulaciji transendotelne migracije leukocita u tkivo CNS-a, što je potvrĊeno u patogenezi EAE-a (McCandless i sar., 2006) i multiple skleroze (McCandless i sar., 2008). Osim što je detektovana povišena ekspresija CXCL12 u endotelu krvnih sudova KMB-e kod obolelih od multiple skleroze (Krumbholz i sar., 2006), otkrivena je i promena lokalizacije ovog hemokina na endotelnim ćelijama (slika U4) (McCandless i sar., 2006; McCandless i sar., 2008). Tokom neuroinflamacije CXCL12 se translocira sa abluminalne na luminalnu površinu endotelnih ćelija postkapilarnih venula, ĉime se stimulišu migracija CXCR4+ monocita i limfocita iz perivaskularnog prostora u moţdani parenhim i njihovo ragrutovanje iz krvi (slika U4). UtvrĊeno je da proinflamatorni citokin IL-1 stimuliše endotelnu translokaciju CXCL12 u toku inflamacije (McCandless i sar., 2009). 26 Slika U4. Krvno-moţdana barijera: uloga hemokina CXCL12 u regulaciji migracije leukocita u tkivo centralnog nervnog sistema. Preuzeto iz: Holman i sar., 2011. Više hemokina uĉestvuje u transmigraciji ćelija uroĊenog imunskog odgovora u CNS, putem aktivacije odgovarajućih hemokinskih receptora eksprimiranih na ovim ćelijama - neutrofilima (CXCR1 i CXCR2) (Carlson i sar., 2008), NK-ćelijama (CXCR4, CCR4, CCR7 i CX3CR1) (Maghazachi, 2003) i monocitima (CCR2) (Mahad i sar., 2006). Znaĉajno povišeni nivoi ekspresije hemokinskih receptora CXCR3 i CCR5 na Th1 limfocitima periferne krvi su detektovani kod pacijenata sa multiplom sklerozom, u odnosu na kontrole (Mahad i sar., 2003; Nakajima i sar., 2004; Uzawa i sar., 2010). Odnosi nivoa ekspresije receptora CD4+CXCR3+/CD4+CCR3+ (Th1/Th2) i CD8+CXCR3+/CD8+CCR4+ (T-citotoksiĉni limfociti 1/T-citotoksiĉni limfociti 2) su bili znaĉajno viši kod pacijenata nego kod zdravih kontrola, a to je bilo naroĉito izraţeno u toku relapsa (Uzawa i sar., 2010). Ovi rezultati sugerišu da promene nivoa ekspresije hemokinskih receptora CXCR3 i CCR5 u limfocitima periferne krvi mogu 27 biti validni periferni markeri patogeneze multiple skleroze i da antagonisti ovih receptora imaju potencijalni znaĉaj u terapiji bolesti. Analizom tkiva CNS-a obolelih od multiple skleroze utvrĊeno je da reaktivni astrociti i aktivirana mikroglija unutar lezija proizvode ligande za receptore CCR2 (CCL2/MCP-1), CXCR3 (CXCL9, CXCL10) i CCR5 (CCL3, CCL4, CCL5, CCL8) (Ambrosini i Aloisi, 2004), koji su prevashodno eksprimirani na monocitima i Th1 limfocitima kao subpopulacijama proinflamatornih ćelija sa kljuĉnom ulogom u patogenezi multiple skleroze (Mahad i sar., 2003; Nakajima i sar., 2004; Uzawa i sar., 2010). TakoĊe, na reaktivnim astrocitima i aktiviranoj mikrogliji unutar lezija je detektovana i ekspresija samih receptora CXCR3, CCR2 i CCR5. Signalizacija koja se ostvaruje putem parakrine ili autokrine aktivacije ovih receptora utiĉe na proliferaciju i migraciju glijalnih ćelija i proizvodnju medijatora inflamacije u njima (Sorensen i sar., 1999; Balashov i sar., 1999; Simpson a i sar., 2000; Simpson b i sar., 2000). Aktivirana mikroglija proizvodi hemokine CCL22 i CCL1 koji se vezuju za receptore (CCR4 i CCR8) eksprimirane na antiinflamatornim Th2 limfocitima. Dokazano je da CCL22 proizveden in vitro od strane aktivirane mikroglije promoviše migraciju Th2, ali ne i Th1 limfocita (Columba-Cabezas i sar., 2002). Ovi rezultati ukazuju na znaĉajnu ulogu mikroglijalnih hemokina u regulaciji regrutovanja funkcionalno razliĉitih subpopulacija T-limfocita tokom inflamacije u CNS-u. Dva strukturno i funkcionalno specifiĉna hemokina, CX3CL1 i CXCL16, od kojih se svaki visoko-specifiĉno vezuje samo za jedan receptor (CX3CL1 za CX3CR1, CXCL16 za CXCR6), do sada nisu u velikoj meri izuĉeni u patogenezi multiple skleroze. 28 1.5. Hemokin CX3CL1 (CX3C ligand 1) i njegov receptor CX3CR1 (CX3C receptor 1) 1.5.1. Dve forme hemokina CX3CL1: struktura i funkcija Godine 1997. otkriven je hemokin CX3CL1 (CX3C ligand 1, drugi naziv: fraktalkin) (Bazan i sar., 1997). Otkrićem strukturnih svojstava ovog hemokina definisana je nova CX3C- podfamilija hemokina, ĉiji je CX3CL1 i jedini ĉlan (Zlotnik i Yoshie, 2000). CX3CL1 se sintetiše kao polipeptidni lanac duţine 397 aminokiselina (AK) (42.2 kDa) koji podleţe posttranslacionom unutarćelijskom proteolitiĉkom seĉenju. Seĉenjem se uklanja N-terminalni signalni peptid sastavljen od prve 24 AK-e, što rezultuje dobijanjem polipeptidnog lanca od 373 AK-e. On se zatim ugraĊuje u ćelijsku membranu i, kao monomerni membranski protein I tipa, predstavlja transmembransku formu CX3CL1. Transmembranski CX3CL1 se sastoji od ĉetiri domena: vanćelijskog N-terminalnog hemokinskog domena (rezidue 1-76), domena sliĉnog mucinu (rezidue 77-317), transmembranskog domena koji formira alfa-heliks (rezidue 318-336) i citoplazmatskog domena (rezidue 337-373) (slika U5) (Umehara i sar., 2004). Domen sliĉan mucinu je najveći i ima specifiĉan oblik drške (slika U5), a u njegov sastav ulaze glicin, prolin, serin i treonin. Serinske i treoninske rezidue su u visokom stepenu glikozilovane, što verovatno spreĉava “folding” (savijanje) mucincke “drške” i ograniĉava pristup proteolitiĉkim enzimima (Matloubian i sar., 2000). To omogućava da domen sliĉan mucinu ostvaruje ulogu u eksponiranju hemokinskog domena na površini ćelije (Haskell i sar., 2000). 29 Slika U5. Shematski prikaz strukture transmembranske forme CX3CL1. Preuzeto iz: Jones i sar., 2010. Transmembranska forma CX3CL1 je inducibilno eksprimirana na površini primarnih endotelnih ćelija, pod uticajem inflamatornih citokina (Garcia i sar., 2000). Transmembranski CX3CL1 je adhezivni molekul koji se brzo i sa visokim afinitetom vezuje za CX3CR1 na leukocitima (monocitima, NK-ćelijama i T-limfocitima), u statiĉkim uslovima i tokom fiziološkog protoka krvi (Umehara i sar., 2004). Zbog toga asocijacija drugih endotelnih adhezivnih molekula sa membranskim proteinima leukocita (integrinima) nije neophodna za njihovu adheziju, kada je ostvarena veza: membranski CX3CL1-CX3CR1. TakoĊe, asocijacija izmeĊu CX3CR1 i integrina leukocita, koja se ostvaruje putem koekspresije CX3CL1 i integrinskih liganada (intercelularni adhezivni molekul/ICAM-1 i vaskularni adhezivni molekul/VCAM-1) na endotelu, znaĉajno pojaĉava meĊućelijsku adheziju u poreĊenju sa svakim od ova dva adhezivna sistema ponaosob (Umehara i sar., 2004). Membranski CX3CL1 moţe da stimuliše i transendotelnu migraciju leukocita (Umehara i sar., 2004). U zidu krvnih sudova CX3CL1 je lokalizovan na površini endotelnih i glatkih mišićnih ćelija (Lucas i sar., 2003), a u oba tipa ćelija je indukovan proinflamatornim medijatorima in vitro (Imaizumi i sar., 2004). MeĊu ovim medijatorima glavni su TNFA, IL-1 i LPS (Garcia i sar., 2000). Citokini TNFA i IFNG sinergistiĉki indukuju CX3CL1, dok IL-4 i IL-6 mogu delovati kao njegovi supesori (Fraticelli i sar., 2001; Imaizumi i sar., 2000; Matsumiya i sar., 2001; Yoshida i sar., 2001). Endotelni CX3CL1 stimuliše produkciju IFNG od strane CX3CR1+ NK-ćelija, što moţe biti mehanizam povratne sprege za porast ekspresije endotelnog CX3CL1 posredstvom IFNG (Yoneda i sar., 2003). 30 Endotelni CX3CL1 moţe da stimuliše oslobaĊanje sadrţaja granula NK-ćelija i tako da posreduje u inflamatornom oštećenju vaskularnog tkiva (Yoneda i sar., 2000). U aterosklerotskim lezijama je otkriveno da monociti/makrofazi eksprimiraju CX3CL1 (Greaves i sar., 2001). TakoĊe, u monocitima periferne krvi obolelih od reumatoidnog artritisa detektovana je ekspresija CX3CL1 (Ruth i sar., 2001). Rezultati studija na ţivotinjskim eksperimentalnim modelima su, takoĊe, pokazali da CX3CL1 i CX3CR1 stimulišu inflamaciju u razliĉitim organima (Combadiere i sar., 2003; Teupser i sar., 2004; Furuichi i sar., 2006; Soriano i sar., 2002). U modelu ateroskleroze kod jedinki kod kojih je izbaĉen gen za CX3CL1 ili za CX3CR1, vaskularne lezije su bile manje i sadrţale znaĉajno manji broj monocita. Ovo sugeriše da u toku progresije bolesti regrutovanje monocita posredovano molekulima CX3CL1 i CX3CR1 predstavlja proces koji je kljuĉan za rast inflamatornih aterosklerotskih lezija (Combadiere i sar., 2003; Teupser i sar., 2004). Pored toga što je CX3CL1 inducibilni hemokin u uslovima inflamacije, studije su pokazale da razliĉiti tipovi ćelija eksprimiraju CX3CL1/CX3CR1 i u odsustvu infamatornih stimulusa. Konstitutivna ekspresija CX3CL1 u neuronima je znaĉajna za uspostavljanje meĊućelijskih interakcija neurona i mikroglijalnih ćelija (Harrison i sar., 1998) i za preţivljavanje neurona (Meucci i sar., 2000). CX3CL1 konstitutivno eksprimiran na površini epitelnih ćelija creva reguliše pozicioniranje dendritskih ćelija (Niess i sar., 2005), dok u vaskularnom sistemu reguliše angiogenezu (Lee i sar., 2006). Aktivacijom metaloproteinaza ADAM (engl. A Disintegrin And Metalloproteinase domain-containing protein)10 i ADAM17 (Garton i sar., 2001; Hundhausen i sar., 2003), na ćelijskoj površini dolazi do proteolitiĉkog seĉenja transmembranske forme CX3CL1. Tom prilikom se sa površine ćelija oslobaĊa solubilna forma CX3CL1, koja se sastoji od vanćelijskog N-terminalnog hemokinskog domena i domena sliĉnog mucinu (slika U5). Solubilni CX3CL1 deluje kao tipiĉni hemokin, stimulišući migraciju CX3CR1+ monocita, NK-ćelija, T-limfocita (Bazan i sar., 1997) i glatkih mišićnih ćelija (Lucas i sar., 2003). Prisutan je u plazmi/serumu, likvoru i sinovijalnoj teĉnosti (Ludwig i Weber, 2007). Povišeni nivoi solubilnog CX3CL1 su detektovani u: serumu pacijenata sa aterosklerozom koronarnih arterija (Damas i sar., 2005), sinovijalnoj teĉnosti pacijenata sa reumatoidnim artritisom (Ruth i sar., 2001), bronhoalveolarnoj teĉnosti pacijenata sa astmom (Rimaniol i sar., 2003), 31 serumu pacijenata sa sistemskim lupusom (Yajima i sar., 2005) i likvoru pacijenata sa neuroinflamatornim bolestima (Kastenbauer i sar., 2003). 1.5.2. Regulacija odnosa nivoa transmembranske i solubilne forme CX3CL1 Konverzija transmembranske u solubilnu formu CX3CL1 je regulisana procesom proteolize transmembranskog CX3CL1, posredstvom metaloproteinaza ADAM10 i ADAM17 (Chapman i sar., 2000; Ludwig i sar., 2002). Postoje podaci da ADAM10 prevashodno uĉestvuje u seĉenju konstitutivno eksprimiranog CX3CL1, dok ADAM17 seĉe inducibilno eksprimirani CX3CL1 (Hundhausen i sar., 2003; Garton i sar., 2001). Još uvek se ne zna taĉan mehanizam kako metaloproteinaze prepoznaju hemokin i koje je taĉno mesto proteolitiĉkog seĉenja, ali je to mesto najverovatnije pozicionirano u neposrednoj blizini ćelijske membrane unutar domena sliĉnog mucinu. Seĉenjem se generišu C-terminalni fragmenti razliĉite duţine, koji su vezani za membranu (Hundhausen i sar., 2003; Garton i sar., 2001), što ukazuje na postojanje bar dva razliĉita mesta seĉenja. Ove membranske fragmente uklanja gama-sekretaza putem njihove proteolize unutar membrane, a to rezultuje stvaranjem unutarćelijskih peptidnih fragmenata koji mogu uĉestvovati u transdukciji signala (Reiss i sar., 2006). Predloţen je model uloge ADAM proteinaza u regrutovanju leukocita u vaskularnoj inflamaciji (Ludwig i Weber, 2007). Tokom inflamacije, pod uticajem inflamatornih medijatora u endotelnim ćelijama prvo dolazi do indukcije ekspresije CX3CL1 koji se intenzivno ugraĊuje u ćelijsku mebranu. To rezultuje pojaĉanom adhezijom CX3CR1+ leukocita za endotel. U sledećoj fazi dolazi do pojaĉanog proteolitiĉkog seĉenja membranskog CX3CL1, a nastali solubilni CX3CL1 formira koncentracioni gradijent, stimulišući hemotaksiju CX3CR1+ leukocita iz krvi. Tom prilikom moţe da doĊe i do raskidanja prethodno formiranih adhezivnih veza izmeĊu CX3CR1+ leukocita i CX3CL1+ endotelnih ćelija. S obzirom na postojeći gradijent solubilnog CX3CL1, raskidanje ovih adhezivnih veza ne dovodi do vraćanja leukocita nazad u krvotok, već omogućava dijapedezu regrutovanih leukocita kroz endotel (Ludwig i Weber, 2007). Prilikom interakcije leukocita i endotela, seĉenje transmembranskog CX3CL1 se najĉešće realizuje kao cis- (enzim i hemokin su 32 eksprimirani od strane iste ćelije), ali je pokazano da je moguće i trans- seĉenje (enzim i hemokin su eksprimirani od strane dveju razliĉitih ćelija) (Janes i sar., 2005). Bez obzira da li je cis- ili trans-, proteolitiĉko seĉenje transmembranskog hemokina moţe da olakša raskidanje adhezivne veze i podstakne migraciju leukocita kroz vaskularni endotel. TakoĊe, unutar tkiva aktivnost ADAM10 i ADAM17 rezultuje stvaranjem gradijenta koncentracije solubilnog CX3CL1, ĉime se dalje stimuliše privlaĉenje leukocita na mesto inflamacije u tkivu. Dakle, metaloproteinaze ADAM10 i ADAM17 uĉestvuju u regulaciji adhezije leukocita za zid krvnog suda, njihove transendotelne migracije i migracije u deo tkiva zahvaćen inflamacijom, upravo putem regulacije seĉenja transmembranskog CX3CL1 tj. regulacije odnosa nivoa membranske i solubilne forme ovog hemokina (Ludwig i Weber, 2007). Odavde proizilazi jedan od mogućih pristupa u supresiji inflamacije, koji bi podrazumevao blokadu ADAM10 i ADAM17. MeĊutim, pritom bi se morali uzeti u obzir i svi potencijalni dodatni efekti, s obzirom da inhibicija ovih metaloproteinaza ne utiĉe samo na aktivnost CX3CL1, već i razliĉitih drugih citokina i adhezivnih molekula (Garton i sar., 2006). 1.5.3. Struktura gena za CX3CL1 Humani gen za CX3CL1 se nalazi na hromozomu 16q13. Duţine je 12 591 bp i sastoji se od 3 egzona i 2 introna. Genski transkript (iRNK) sadrţi otvoreni okvir ĉitanja duţine 1 194 baze, koji kodira polipeptidni lanac CX3CL1 od 397 AK-a (Bazan i sar., 1997; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6376; GeneCardsIDentifier: GC16P057406). 1.5.4. Polimorfizmi u genu za CX3CL1 Do sada je detektovan veliki broj polimorfizama u humanom genu za CX3CL1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CX3CL1%20homo%20sapiens). Izvesni polimorfizmi su asocirani sa nastankom i/ili progresijom odreĊenih inflamatornih i infektivnih bolesti. ReĊi aleli polimorfizama rs170364 (G/T) i rs614230 (T/C) su asocirani sa većim zadebljanjem zida karotidne arterije kod pacijenata sa karotidnom aterosklerozom (Debette i sar., 2009). Polimorfizmi u 3’ netranslatiranom regionu gena 33 za CX3CL1, T2999C i T3042C, su asocirani sa rizikom za infekciju virusom HIV-1 (skr. od engl. Human Immunodeficiency Virus-1): uĉestalosti reĊih alela oba polimorfizma su znaĉajno veće kod inficiranih, u odnosu na zdrave kontrole i osobe koje su više puta bile izloţene virusu ali nisu inficirane (Peraire i sar., 2007). 1.5.5. Regulacija transkripcije gena za CX3CL1 S obzirom da ekspresija znaĉajnog broja hemokina i adhezivnih molekula raste pod uticajem inflamatornih stimulusa, i CX3CL1 je identifikovan kao faktor indukovan delovanjem TNFA, IL-1 i LPS (Bazan i sar., 1997). Ovi inflamatorni stimulusi ostvaruju dejstvo na ciljne ćelije putem vezivanja za svoje receptore i pokretanja unutarćelijske transdukcije signala, uz aktivaciju puta nuklearnog faktora-kB (NF-kB) i mitogenom aktiviranih protein-kinaza (MAPKs). U promotorskom regionu gena za CX3CL1 se nalaze vezivna mesta za transkripcione faktore NF-kB i STAT1 (Nomiyama i sar., 1998). Pokazano je da se NF-kB vezuje za proksimalni promotor CX3CL1, pri ĉemu se koliĉina vezanog NF-kB povećava i do pet puta u odgovoru na stimulaciju posredstvom IFNG i TNFA. Ovaj efekat na nivou NF-kB se poništava dejstvom deksametazona, preko mehanizma zavisnog od aktivacije glukokortikoidnog receptora (Bhavsar i sar., 2008). U vaskularnim endotelnim ćelijama, indukcija ekspresije gena za CX3CL1 posredstvom IL-1, TNFA i LPS je zavisna od NF-kB (Garcia i sar., 2000), dok IFNG indukuje gensku ekspresiju CX3CL1 preko aktivacije Janus kinaze 1 (JAK1) i STAT1 (Garcia i sar., 2000; Imaizumi i sar., 2000; Isozaki i sar., 2011). Prilikom indukcije ekspresije gena za CX3CL1 sinergistiĉkim delovanjem TNFA i IFNG, u vaskularnim endotelnim ćelijama TNFA uĉestvuje u stabilizaciji CX3CL1 iRNK tako što se vezuje za element bogat AU-dinukleotidom u 3’ netranslatiranom regionu iRNK (Matsumiya i sar., 2010). CX3CL1 iRNK je konstitutivno eksprimirana u razliĉitim humanim organima: mozgu, srcu, plućima, bubregu, crevima, skeletnim mišićima (Bazan i sar., 1997), a nivoi iRNK su povišeni u uslovima inflamacije (Muehlhoefer i sar., 2000; Fujimoto i sar., 2001; Cockwell i sar., 2002). U CNS-u, gen za CX3CL1 je konstitutivno eksprimiran u olfaktornom bulbusu, cerebralnom korteksu, hipokampusu i drugim regionima (Nishiyori i sar., 1998). Pokazano je da se u toku embrionalnog razvića 34 mozga miša varijanta 3 regulatornog faktora X4 (RFX4_v3, koji predstavlja bitan faktor u morfogenezi mozga) vezuje za proksimalni promotor CX3CL1 i stimuliše njegovu ekspresiju (Zhang i sar., 2006). Medijatori inflamacije, TNFA i IFNG, sinergistiĉki indukuju ekspresiju gena za CX3CL1 u humanim astrocitima (Yoshida i sar., 2001). 1.5.6. Receptor CX3CR1: struktura i funkcija Hemokin CX3CL1 ostvaruje svoje efekte vezivanjem za receptor CX3CR1 (CX3C receptor 1) na ciljnim ćelijama. CX3CR1 je visoko-specifiĉan i jedini receptor za CX3CL1 i koreceptor za HIV (Combadiere i sar., 1998). Kao i svi ostali hemokinski receptori, i CX3CR1 pripada tipu receptora kuplovanih/spregnutih sa G-proteinom (engl. G-Protein-Coupled Receptors, skr. GPCRs). G-proteini su heterotrimeri sastavljeni od subjedinica: G-alfa, G-beta i G-gama. Receptori kuplovani sa G- proteinom saĉinjavaju najveću superfamiliju humanih integralnih membranskih proteina (Flower, 1999; Takeda i sar., 2002). Zajedniĉka strukturna karakteristika ovih receptora je hidrofobno jezgro sastavljeno od 7 transmembranskih domena/alfa-heliksa (7TM), koji su povezani preko 3 unutarćelijska i 3 vanćelijska hidrofilna domena u obliku petlji (Strader i sar., 1994; Pierce i sar., 2002). GPCRs funkcionišu kao membranski receptori koji vanćelijske stimuluse pretvaraju u unutarćelijske signale, kao rezultat vezivanja razliĉitih vanćelijskih liganada. Pored receptora za hemokine, u grupu GPCRs spadaju: receptori retine, mirisni receptori, receptori za neurotransmitere i peptidne hormone (alfa- i beta- adrenergiĉki receptori). S obzirom da imaju ulogu u brojnim biološkim procesima (memorija, funkcija ĉula vida i mirisa, regulacija krvnog pritiska) (Neves i sar., 2002; Sodhi i sar., 2004), GPCRs su atraktivne terapeutske mete. Znaĉajan broj farmaceutskih agenasa utiĉe na aktivnost ovih receptora (Flower, 1999). Opšti model mehanizma aktivacije hemokinskih receptora i transdukcije signala unutar ciljnih ćelija prikazan je na slici U6 (Murdoch i Finn, 2000). Kada je hemokinski receptor u neaktivnom stanju, heterotrimer Gi je vezan za unutarćelijski C-terminalni domen receptora. Vezivanje hemokina za receptor prouzrokuje da GDP, koji je vezan za G-alfa-i subjedinicu u neaktivnom stanju, bude zamenjen GTP-om. Ovo rezultuje disocijacijom G-alfa-i od dimera G-beta/gama. Zatim G-beta/gama aktivira fosfolipazu C (PLC-beta) koja degradira membranski fosfatidil-inozitol difosfat (PIP2) do molekula 35 sekundarnih glasnika: diacilglicerola (DAG) i inozitol trifosfata (IP3). DAG aktivira protein-kinazu C (PKC-beta), a IP3 prouzrokuje oslobaĊanje Ca++ iz unutarćelijskih depoa. Brzi porast nivoa Ca ++ aktivira fosfolipazu D (PLD). Paralelno, G-alfa-i subjedinica direktno aktivira protein-treonin-kinazu (PTK). PTK aktivira MAPKs, a one dalje aktiviraju fosfolipazu A2 (PLA2). DAG, PKC, Ca ++ i PLA2 uĉestvuju u specifiĉnim mehanizmima aktivacije ciljnih ćelija, koji konaĉno rezultuju: ćelijskom hemotaksijom, adhezijom, degranulacijom, oslobaĊanjem superoksidnih anjona (slika U6) (Murdoch i Finn, 2000). TakoĊe, PTK fosforiliše serinske i treoninske rezidue C-terminalnog domena receptora i tako izaziva desenzitizaciju i inaktivaciju receptora. Slika U6. Model mehanizma aktivacije hemokinskog receptora i unutarćelijske transdukcije signala. Preuzeto iz: Murdoch i Finn, 2000. Receptor CX3CR1 je otkriven 1997. godine, kada je uoĉeno da se CX3CL1 vezuje sa visokim afinitetom za receptor V28 na monocitima i limfocitima periferne krvi (Imai i sar., 1997). V28 je ubrzo preimenovan u CX3CR1. Struktura CX3CR1 ima opšte odlike strukture hemokinskih receptora tj. GPCRs (Murdoch i Finn, 2000) i ilustrovana je na slici U7. CX3CR1 je monomer od 355 AK-a (40.4 kDa), a saĉinjavaju ga sledeći domeni: kratki vanćelijski N-terminalni domen sastavljen predominantno od 36 kiselih AK-a (rezidue 1-31), 7 hidrofobnih transmembranskih domena u vidu alfa- heliksa (rezidue: 32-59, 70-90, 104-125, 143-167, 196-215, 232-256, 274-297), 3 unutarćelijske (rezidue: 60-69, 126-142, 216-231) i 3 vanćelijske (rezidue: 91-103, 168- 195, 257-273) hidrofilne petlje koje povezuju transmembranske domene i unutarćelijski C-terminalni domen (rezidue 298-355) koji sadrţi serinske i treoninske rezidue kao mesta fosforilacije tokom regulisanja aktivnosti receptora. Disulfidni most se formira izmeĊu visoko-konzervisanih cisteinskih rezidua na pozicijama 102 u prvoj vanćelijskoj petlji i 175 u drugoj vanćelijskoj petlji (P49238 (CX3C1_HUMAN) Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot). Slika U7. Prikaz strukture CX3CR1: 7 transmembranskih domena (ilustrovani su kao cilindriĉni aranţmani aminokiselina), 3 vanćelijske i 3 unutarćelijske petlje, vanćelijski N-terminus i unutarćelijski C-terminus. Preuzeto iz: Chen i sar., 2006. Uspostavljanje interakcije ligand-receptor je kljuĉno u ostvarivanju efekata liganda na ciljnu ćeliju. Na osnovu informacije o strukturi hemokinskog domena i analize mutanata CX3CL1, utvrĊeno je da su konzervisane bazne rezidue, lizin na poziciji 7 i arginin na poziciji 47, vaţne za interakciju sa receptorom (Harrison i sar., 2001). Za mutirane molekule CX3CL1 kod kojih su izmenjene ove dve aminokiseline, pokazani su redukovani afinitet za CX3CR1 i neefikasna adhezija CX3CR1+ ćelija. TakoĊe, mutirani CX3CL1 sa zamenom arginina na poziciji 47 (Arg47) prouzrokovao 37 je poremećenu transdukciju signala uz neefikasnu mobilizaciju unutarćelijskog Ca++, dok mutacija lizina na poziciji 7 (Lys7) nije uticala na transdukciju signala preko CX3CR1 (Harrison i sar., 2001). Ciljanim zamenama aminokiselina u receptoru CX3CR1, pokazano je da su predominantno kisele aminokiseline (aspartat i glutamat) koje ulaze u sastav N-terminalnog domena i treće vanćelijske petlje receptora odgovorne za afinitet vezivanja liganda (Asp25 i Glu254) i aktivaciju receptora (Glu13, Asp16, Asp266) (Chen i sar., 2006). CX3CR1 je eksprimiran na: monocitima, T-limfocitima, NK-ćelijama, dendritskim ćelijama, mikroglijalnim ćelijama, neuronima, glatkim mišićnim ćelijama, endotelnim ćelijama i trombocitima (Harrison i sar., 1998; Imai i sar., 1997; Schafer i sar., 2004; Schafer i sar., 2007; Nishimura i sar., 2002; Lucas i sar., 2003). Konstitutivna ekspresija CX3CR1 u glijalnim ćelijama je znaĉajna za uspostavljanje komunikacije izmeĊu neurona i mikroglije i odrţavanje homeostaze u CNS-u (Harrison i sar., 1998). Praćenjem distribucije CX3CR1 na monocitima miša, utvrĊeno je da monociti sa nisko-eksprimiranim CCR2 i GR1 (glukokortikoidni receptor) eksprimiraju više CX3CR1 i ĉešće postaju rezidentni tkivni makrofazi, nego efektorski makrofazi (Jung i sar., 2000; Geissmann i sar., 2003). U humanim monocitima visoka ekspresija CX3CR1 je asocirana sa prisustvom CD16 (Ancuta i sar., 2003). Pokazano je da u NK- ćelijama ekspresiju CX3CR1 moţe stimulisati IL-15, a inhibirati IL-2 (Barlic i sar., 2003). Povišena ekspresija CX3CR1, naroĉito na monocitima, asocirana je sa nastankom i progresijom nekih hroniĉnih inflamatornih bolesti. U perifernoj krvi i sinovijalnoj teĉnosti pacijenata sa reumatoidnim artritisom veliki udeo monocita (~80%) eksprimira CX3CR1 (Ruth i sar., 2001). U eksperimentalnom modelu ateroskleroze, kod jedinki kod kojih je izbaĉen gen za CX3CR1 vaskularne lezije su bile manje i sadrţale znaĉajno manji broj monocita (Combadiere i sar., 2003). S obzirom na znaĉaj CX3CL1 i CX3CR1 u patogenezi inflamatornih bolesti, inhibicija receptora CX3CR1 je jedan od mogućih vidova terapije ovih bolesti u budućnosti. Do sada je pokazano da: sintetiĉki biološki analozi CX3CL1 blokiraju CX3CR1 i tako spreĉavaju hemotaksiju CX3CR1+ ćelija (Inoue i sar., 2005), baklofen (agonist receptora za gama- aminobuternu kiselinu (GABA)) indukuje desenzitizaciju CX3CR1 (Duthey i sar., 2010), a rosiglitazon (agonist receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma-gama (PPAR-gama)) suprimira ekspresiju CX3CL1 i spreĉava njegovu translokaciju u 38 ćelijsku membranu i na taj naĉin suprimira signalizaciju preko CX3CL1-CX3CR1 (Wan i Evans, 2010). 1.5.7. Struktura gena za CX3CR1 Humani gen za CX3CR1 se nalazi na hromozomu 3p21.3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1524). Gen za CX3CR1 je dug preko 18 kb i saĉinjavaju ga 4 egzona i 3 introna. Tri transkripta nastaju alternativnim spajanjem svakog od tri netranslatirana egzona (1, 2 i 3) sa 4. egzonom koji sadrţi kompletan otvoreni okvir ĉitanja i kodira polipeptid od 355 AK (Garin i sar., 2002). U leukocitima se predominantno nalazi transkript koji nastaje spajanjem 2. i 4. egzona, znatno manje je zastupljen transkript koji nastaje spajanjem 1. i 4. egzona, a najmanje transkript sastavljen od 3. i 4. egzona. Nivoi svake od tri transkripcione varijante CX3CR1 su regulisani od strane jednog od tri promotorska regiona ĉiju aktivnost regulišu njihovi odgovarajući netranslatirani egzoni. Ova kompleksna regulacija omogućava preciznu i visoko-specifiĉnu ekspresiju gena za CX3CR1 u razliĉitim tipovima ćelija (Garin i sar., 2002). 1.5.8. Polimorfizmi V249I i T280M u genu za CX3CR1 U humanom genu za CX3CR1 su detektovani brojni polimorfizmi (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CX3CR1%20homo%20sapiens). Neki od njih su povezani sa nastankom i/ili progresijom odreĊenih bolesti u ĉijoj patogenezi je poremećeni imunski odgovor. Uspostavljena je asocijacija CX3CR1 polimorfizama sa rizikom za: astmu (rs938203, rs2669849, rs1050592) (Tremblay i sar., 2006), psorijazu (hCV11578468, c_5687_1) (Plant i sar., 2006) i infekciju HIV-om (G744A) (Parczewski i sar., 2009). Dve ĉeste nesinonimne zamene pojedinaĉnih nukleotida, rs3732379 (V249I/Val249Ile) i rs3732378 (T280M/Thr280Met), su identifikovane u ĉetvrtom egzonu gena za CX3CR1 (Faure i sar., 2000). Zamena V249I je locirana u šestom, a T280M u sedmom transmembranskom domenu CX3CR1. Ova dva polimorfizma 39 odlikuje jak “linkage disequilibrium” (Faure i sar., 2000) koji rezultuje formiranjem tri ĉesta haplotipa u populaciji: V249T280 (“wild-type”), I249T280 i I249M280. Polimorfizmi V249I i T280M su asocirani sa patogenezom odreĊenih hroniĉnih inflamatornih/autoimunskih bolesti. Ĉešći aleli oba polimorfizma nose veći rizik za astmu (Tremblay i sar., 2006). Alel I249 je asociran sa pojaĉanom fibrostenozom u Kronovoj bolesti (Sabate i sar., 2008). NaĊena je veza alela I249 i haplotipa I249T280 sa povećanim rizikom za prelazak u završni stadijum bubreţne bolesti kod obolelih od hroniĉne insuficijencije bubrega (Borkar i sar., 2011). Smanjena uĉestalost alela M280 je nezavisni faktor rizika za karotidnu aterosklerozu (Zhao i sar., 2010) i koronarnu bolest (Apostolakis i sar., 2007), dok je kod obolelih homozigota MM naĊeno veće zadebljanje arterijskog zida (Debette i sar., 2009). Sugerisana je protektivna uloga haplotipa I249M280 u patogenezi ateroskleroze (Moatti i sar., 2001; McDermott i sar., 2001; Apostolakis i sar., 2009). Funkcionalna analiza je pokazala da leukociti homozigota IIMM (tj. nosilaca haplotipa I249M280) za CX3CR1, imaju znaĉajno manji broj vezivnih mesta za CX3CL1 i redukovan afinitet vezivanja liganda, u odnosu na “wild-type” VVTT ćelije (Faure i sar., 2000). U naknadnoj studiji je pokazano da zamena T280M ne menja afinitet vezivanja CX3CL1, ali da usporava kinetiku vezivanja liganda (McDermott i sar., 2003). Leukociti homozigota MM koji su istovremeno nosioci alela I, imaju defektnu hemotaksiju u odgovoru na solubilni CX3CL1 (McDermott i sar., 2003), dok je adhezivni potencijal receptorske varijante I249M280 veći nego varijante V249T280 (Lavergne i sar., 2005; Daoudi i sar., 2004). Navedene funkcionalne studije sugerišu da polimorfizmi V249I i T280M mogu uticati na aktivnost receptora CX3CR1. Strukturna analiza je pokazala da ovi polimorfizmi indukuju detektabilne konformacione promene u receptorskim domenima TM6 i TM7, kao i trećoj vanćelijskoj petlji koja ih spaja (Darbandi-Tehrani i sar., 2010). Dosadašnji rezultati ukazuju da polimorfizmi V249I i T280M prouzrokuju promene u strukturi i funkciji CX3CR1. S obzirom na strukturno- funkcionalne promene u CX3CR1 koje su posledica aminokiselinskih zamena V249I i T280M i na postojanje asocijacije ovih genskih polimorfizama sa patogenezom odreĊenih hroniĉnih inflamatornih i autoimunskih bolesti (Tremblay i sar., 2006; Sabate i sar., 2008; Zhao i sar., 2010; Apostolakis i sar., 2009), u našoj studiji cilj je bio 40 ispitivanje asocijacije polimorfizama V249I i T280M sa nastankom i progresijom multiple skleroze. 1.5.9. Regulacija transkripcije gena za CX3CR1 U humanim perifernim mononuklearnim leukocitima je detektovan region uzvodno od mesta poĉetka transkripcije gena za CX3CR1, duţine 433 bp, koji u ovim ćelijama ima ulogu konstitutivnog promotora (Barlic i sar., 2004). Ovaj region sadrţi vezivno mesto za proteine koji pripadaju familiji transkripcionih faktora pod nazivom nuklearni faktori aktiviranih T-limfocita (NFAT). Analizom in vitro i in vivo otkriveno je da IL-15 promoviše vezivanje NFAT1 (ali ne i NFAT2) za CX3CR1 promotor, dok IL-2 ima suprotan efekat. Ovi rezultati sugerišu da jedan vid regulacije ekspresije gena za CX3CR1 u leukocitima moţe biti odreĊen balansom aktivnosti NFAT1 i NFAT2 (Barlic i sar., 2004). U eksperimentalnom modelu u kome je indukovana povreda tkiva CNS-a, detektovana je povišena ekspresija CX3CR1 i TGFB1 (Chen i sar., 2002). U ovim uslovima TGFB1 dovodi do porasta nivoa CX3CR1 iRNK u mikroglijalnim ćelijama, kao i porasta broja molekula CX3CR1 na njihovoj površini. Prilikom indukcije ekspresije gena za CX3CR1 u prisustvu TGFB1, identifikovana su dva potencijalna vezivna elementa za transkripcioni faktor SMAD u promotoru gena za CX3CR1 (Chen i sar., 2002). 1.6. Hemokin CX3CL1 i njegov receptor CX3CR1 u centralnom nervnom sistemu i patogenezi neuroinflamatornih bolesti U CNS-u ekspresija CX3CL1 je prvo detektovana u neuronima (Nishiyori i sar., 1998; Harrison i sar., 1998). UtvrĊena je konstitutivna ekspresija ovog hemokina u neuronima (ali ne i u vaskularnim endotelnim ćelijama) mozga (Nishiyori i sar., 1998; Harrison i sar., 1998; Hughes i sar., 2002) i kiĉmene moţdine (Verge i sar., 2004; 41 Lindia i sar., 2005; Clark i sar., 2009). CX3CL1 je eksprimiran i u humanim i pacovskim astrocitima in situ i in vitro (Hulshof i sar., 2003; Hatori i sar., 2002; Maciejewski-Lenoir i sar., 1999). Najviši nivoi ovog hemokina su detektovani u moţdanim strukturama: hipokampusu, korteksu i strijatumu (Tarozzo i sar., 2003). Uopšteno, CX3CL1 je konstitutivno eksprimiran preteţno u neuronima, a inducibilno u astrocitima - delovanjem proinflamatornih citokina na astrocite u kulturi (Hulshof i sar., 2003; Yoshida i sar., 2001; Maciejewski-Lenoir i sar., 1999) i u astrocitima inflamatornih lezija CNS-a u modelu EAE-a (Sunnemark i sar., 2005). Konstitutivna produkcija CX3CL1 u neuronima sugeriše na njegovu homeostatsku ulogu, dok inducibilna ekspresija ovog hemokina u astrocitima ukazuje da upravo ona moţe imati naroĉiti znaĉaj u neuroinflamaciji. U neuronima, delovanje forbol-estara i eksperimentalna indukcija moţdanog udara ne utiĉu na ekspresiju CX3CL1 iRNK, ali pojaĉavaju luĉenje solubilnog CX3CL1 iz neurona (Hatori i sar., 2002; Chapman i sar., 2000) putem indukcije proteolitiĉkog seĉenja membranskog CX3CL1. TakoĊe, solubilni CX3CL1 je znaĉajno povišen u mozgu miševa sa EAE-om, dok se nivo CX3CL1 iRNK ne menja, u odnosu na kontrolno tkivo (Huang i sar., 2006). Ovo sugeriše da se solubilni CX3CL1 intenzivno oslobaĊa sa membrana neurona tokom EAE-a. Inhibitori metaloproteinaza efikasno redukuju inducibilno seĉenje membranskog CX3CL1 (koje je posredovano metaloproteinazama ADAM10 i ADAM17) u kulturi nervnih ćelija (Chapman i sar., 2000). U kulturi humanih vaskularnih endotelnih ćelija mozga tretman TNF-om dovodi do znaĉajnog porasta nivoa CX3CL1 iRNK i proteina, što je asocirano sa pojaĉanim seĉenjem membranskog CX3CL1 na površini ovih ćelija (Hurst i sar., 2009). Nivo solubilnog CX3CL1 u likvoru zdravih osoba je nizak, ali se on znaĉajno povećava u toku inflamatornih i autoimunskih oboljenja nervnog sistema (Kastenbauer i sar., 2003; Sporer i sar., 2003). U mozgu CX3CR1 je prvi put detektovan u mikroglijalnim ćelijama (Nishiyori i sar., 1998; Harrison i sar., 1998). S obzirom na tipiĉan ekspresioni profil CX3CL1 i CX3CR1 u CNS-u u bazalnim uslovima, ova dva molekula uĉestvuju u signalizaciji izmeĊu neurona i mikroglijalnih ćelija. Ekspresija CX3CR1 detektovana je, takoĊe, u astrocitima (Maciejewski-Lenoir i sar., 1999; Luo i sar., 2002) i neuronima (Hughes i sar., 2002; Hattori i sar., 2005; Sunnemark i sar., 2005) CNS-a ĉoveka i glodara. Tokom inflamacije, u delovima tkiva mozga inficiranog prionom detektovan je porast nivoa 42 mikroglijalnog CX3CR1 (Hughes i sar., 2002). Molekularni mehanizmi koji leţe u osnovi odgovora mikroglije na CX3CL1, posredstvom aktivacije mikroglijalnog CX3CR1, podrazumevaju stimulaciju transporta unutarćelijskog kalcijuma, fosforilaciju proteina, aktivaciju enzima i hemotaksiju mikroglijalnih ćelija (Maciejewski-Lenoir i sar., 1999). Delovanje CX3CL1 štiti mikrogliju od Fas-om posredovane ćelijske smrti in vitro (Boehme i sar., 2000). Otkriveno je da CX3CL1 stimuliše produkciju MMP-2 i MMP-9 u kultivisanim mikroglijalnim ćelijama (Cross i Woodroofe, 1999). CX3CL1 delimiĉno blokira LPS-om indukovanu sekreciju TNFA (Zujovic i sar., 2000) i smanjuje produkciju proinflamatornih citokina (TNFA i IL-6) i NO (Mizuno i sar., 2003), od strane aktivirane mikroglije in vitro, što ukazuje na moguće neuroprotektivne efekte koji se ostvaruju posredstvom aktivacije mikroglijalnog CX3CR1 u toku neuroinflamacije. Jedan od mogućih mehanizama putem kojih CX3CL1 suprimira produkciju inflamatornih citokina u mikroglijalnim ćelijama podrazumeva supresiju aktivacije transkripcionog faktora NF-kB (Zujovic i sar., 2000). Ekspresija CX3CR1 u astrocitima je niska u bazalnim uslovima, povećava se delovanjem TNFA i IL1B (Maciejewski-Lenoir i sar., 1999) a smanjuje delovanjem CCL5 (Luo i sar., 2002). Aktivacija CX3CR1 verovatno ne posreduje u hemotaksiji astrocita, mada izaziva promenu nivoa intracelularnog kalcijuma u ovim ćelijama (Maciejewski-Lenoir i sar., 1999). Indukcija EAE-a je praćena akumulacijom ćelija koje eksprimiraju CX3CR1 iRNK u inflamatornim lezijama mozga. Najvećim brojem su to mikroglijalne ćelije, ali se meĊu njima nalaze i periferni leukociti (Sunnemark i sar., 2005). CX3CR1 je odgovoran za selektivno regrutovanje NK-ćelija u CNS. Tokom EAE-a, miševi kod kojih je izbaĉen gen za CX3CR1 imali su znaĉajno redukovan broj NK-ćelija u inflamatornim lezijama CNS-a, što je bilo asocirano sa teţom kliniĉkom slikom i većim mortalitetom (Huang i sar., 2006). Otkriveno je da CX3CR1 posreduje i u regrutovanju citotoksiĉnih CD4+CD28− T-limfocita u moţdano tkivo pacijenata sa multiplom sklerozom (Broux i sar., 2012). 43 1.7. Hemokin CXCL16 (CXC ligand 16) i njegov receptor CXCR6 (CXC receptor 6) 1.7.1. Dve forme hemokina CXCL16: struktura i funkcija Godine 2000. identifikovan je novi receptor “ĉistaĉ” koji vezuje oksidovane lipoproteine male gustine (oxLDL, skr. od engl. oxidized Low Density Lipoprotein) i koji je zato nazvan SR-PSOX (skr. od engl. Scavenger Receptor that binds Phosphatidyl-Serine and Oxidized lipids) (Shimaoka i sar., 2000). Neposredno posle ovog otkrića identifikovan je i novi hemokin koji se vezuje za specifiĉni receptor CXCR6 (drugi nazivi receptora: Bonzo, STRL33 ili TIMSTR) i na taj naĉin posreduje u migraciji T-limfocita (Wilbanks i sar., 2001). Ovaj hemokin je nazvan CXCL16 (CXC ligand 16) i ispostavilo se da ima identiĉnu aminokiselinsku sekvencu kao SR-PSOX (Wilbanks i sar., 2001). Dakle, reĉ je o jednom molekulu, CXCL16/SR-PSOX, koji se u ćelijama sintetiše kao polipeptid od 254 aminokiseline (30 kDa). Unutarćelijskim proteolitiĉkim seĉenjem se uklanja N-terminalni signalni peptid (prvih 29 AK-a), što rezultuje dobijanjem polipeptidnog lanca od 225 AK-a. On se zatim ugraĊuje u ćelijsku membranu i, kao monomerni membranski protein I tipa, predstavlja transmembransku formu CXCL16. Strukturne karakteristike transmembranskog CXCL16 su veoma sliĉne karakteristikama CX3CL1. One ĉine jedinstvenim ova dva hemokina, izdvajajući ih od svih ostalih. Poput CX3CL1, i transmembranski CXCL16 se sastoji od ĉetiri domena: vanćelijskog N-terminalnog hemokinskog domena (rezidue 1-78), domena sliĉnog mucinu (rezidue 79-176), transmembranskog domena koji formira alfa-heliks (rezidue 177-197) i citoplazmatskog domena (rezidue 198-225) (slika U8) (Ludwig i Weber, 2007). Domen sliĉan mucinu je najveći i ima specifiĉan oblik drške (slika U8). Njegove serinske i treoninske rezidue su izrazito glikozilovane što, kao i u sluĉaju CX3CL1, verovatno spreĉava savijanje mucincke “drške” i omogućava eksponiranje hemokinskog domena na površini ćelije (Matloubian i sar., 2000; Haskell i sar., 2000). 44 Slika U8. Prikaz strukture transmembranske forme CXCL16. Preuzeto iz: Petit i sar., 2011. Jedna od glavnih funkcionalnih odlika transmembranskog CXCL16, po kojoj se on razlikuje od CX3CL1, jeste upravo funkcija receptora “ĉistaĉa”. Iako nema strukturnu homologiju sa drugim receptorima “ĉistaĉima”, kao i većina ovih receptora i CXCL16/SR-PSOX je eksprimiran na makrofazima (Shimaoka i sar., 2000; Minami i sar., 2001; Tabata i sar., 2005), uĉestvuje u vezivanju i endocitozi lipoproteina male gustine (tj. fosfatidilserina i oxLDL) (Shimaoka i sar., 2000), kao i u adheziji i fagocitozi Gram(-) i Gram(+) bakterija (Shimaoka i sar., 2003). Mutacije u hemokinskom domenu CXCL16/SR-PSOX narušavaju njegovu funkciju receptora “ĉistaĉa”, a takoĊe i njegovo vezivanje za CXCR6 (Shimaokaa i sar., 2004). Primena anti-CXCL16/SR-PSOX monoklonskog antitela rezultuje znaĉajnom inhibicijom fagocitoze bakterija od strane humanih antigen-prezentujućih ćelija, a specifiĉnost u prepoznavanju bakterija je determinisana iskljuĉivo preko hemokinskog domena CXCL16/SR-PSOX (Shimaoka i sar., 2003). Sliĉno kao CX3CL1, transmembranski CXCL16 moţe da funkcioniše kao adhezivni molekul za ćelije koje eksprimiraju CXCR6, pri ĉemu je adhezija nezavisna od aktivacije integrina (Shimaokab i sar., 2004). Postoji i solubilni oblik CXCL16 koji ima ulogu hemoatraktanta za CXCR6+ ćelije. TakoĊe, in vitro je pokazano da solubilni CXCL16 stimulatorno deluje na proliferaciju i meĊućelijsku adheziju glatkih mišićnih ćelija (Chandrasekar i sar., 2004), i na proliferaciju i hemotaksiju endotelnih ćelija (Zhuge i sar., 2005). Solubilni CXCL16 45 predominantno nastaje na isti naĉin kao i solubilni CX3CL1: proteolitiĉkim seĉenjem transmembranske forme molekula. Metaloproteinaza ADAM10 posreduje u konstitutivnom i inducibilnom seĉenju (Abel i sar., 2004; Gough i sar., 2004; Hundhausen i sar., 2007), a ADAM17 samo u inducibilnom seĉenju CXCL16 (Ludwiga i sar., 2005). Precizno mesto proteolitiĉkog seĉenja membranskog CXCL16 nije utvrĊeno, ali je poznato da se nalazi u mucinskom domenu u blizini ćelijske membrane (Matloubian i sar., 2000) i da moţe da varira pod uslovima konstitutivnog i inducibilnog seĉenja (Hundhausen i sar., 2007). Mehanizam proteolitiĉkog seĉenja i regulacija odnosa nivoa transmembranske i solubilne forme CXCL16 su u osnovi isti kao i za CX3CL1 i detaljno su opisani u poglavlju: 1.5.2. Regulacija odnosa nivoa transmembranske i solubilne forme CX3CL1. CXCL16 je eksprimiran predominantno u makrofazima (Shimaoka i sar., 2000; Minami i sar., 2001; Tabata i sar., 2005), dendritskim ćelijama (Shimaokab i sar., 2004; Tabata i sar., 2005), B-limfocitima (Wilbanks i sar., 2001) i glatkim mišićnim ćelijama (Abel i sar., 2004; Hofnagel i sar., 2002; Wagsater i sar., 2004). T-limfociti (Shashkin i sar., 2003) i endotelne ćelije (Abel i sar., 2004; Hofnagel i sar., 2002) takoĊe eksprimiraju detektabilne nivoe CXCL16. Otkriveno je da proinflamatorni citokini IFNG i TNFA indukuju ekspresiju CXCL16 u vaskularnim ćelijama i monocitima in vitro (Abel i sar., 2004; Wagsater i sar., 2004; Wuttge i sar., 2004), a sam CXCL16 stimuliše produkciju proinflamatornih Th1 citokina (Gursel i sar., 2006). Kada je reĉ o patogenezi hroniĉnih inflamatornih bolesti, CXCL16 je najviše izuĉavan u aterosklerozi. Visoka ekspresija CXCL16 iRNK i proteina je detektovana u koronarnim i karotidnim aterosklerotskim plakovima, u odnosu na intaktnu kontrolnu arteriju, pri ĉemu je CXCL16 bio predominantno eksprimiran u makrofazima lezija (Minami i sar., 2001). U eksperimentalnom modelu ateroskleroze, miševi sa izbaĉenim genima za apolipoprotein E (ApoE-/-) (Wuttge i sar., 2004) i receptor za LDL (LDLR-/-) (Aslanian i Charo, 2006) i koji su bili na reţimu ishrane bogate lipidima, imali su znaĉajno povišenu ekspresiju gena za CXCL16 u plakovima (u odnosu na tkivo zdrave arterije) što je bilo u korelaciji sa duţinom trajanja lipidne dijete. Ovi rezultati ukazuju da uloga CXCL16 kao receptora “ĉistaĉa” moţe imati naroĉiti znaĉaj tokom patogeneze ateroskleroze (Minami i sar., 2001; Wuttge i sar., 2004; Aslanian i Charo, 2006). Kod miševa deficijentnih za CXCR6 aterogeneza je bila sporija, uz prisustvo redukovanog 46 broja T-limfocita i makrofaga u aterosklerotskim lezijama (Galkina i sar., 2007). Dakle, u patogenezi ateroskleroze uloga CXCL16 je dvojaka: kao receptor “ĉistaĉ” on vezuje oxLDL i tako moţe da ostvaruje ateroprotektivne efekte, dok kao hemoatraktant stimuliše regrutovanje leukocita u zid arterija i tako stimuliše aterogenezu. U patogenezi EAE-a je pokazano da CXCL16 ima vaţnu ulogu da stimuliše diferencijaciju antigen- specifiĉnih T-limfocita i regrutovanje mononuklearnih leukocita u CNS (Fukumoto i sar., 2004). Solubilni CXCL16 deluje kao hemoatraktant za većinu CXCR6+ ćelija imunskog sistema, olakšavajući njihovu migraciju u sekundarne limfoidne organe (Hara i sar., 2006; Hase i sar., 2006) i na mesta inflamacije u tkivima (Sato i sar., 2005; van der Voort i sar., 2005). Povišeni nivoi solubilnog CXCL16 su detektovani u: plazmi pacijenata sa stenozom koronarnih arterija (Yi i sar., 2008), serumu pacijenata sa akutnim koronarnim sindromom (Sun i sar., 2008), plazmi pacijenata sa akutnim infarktom mozga (Ueland i sar., 2012), sinovijalnoj teĉnosti pacijenata sa reumatoidnim artritisom (van der Voort i sar., 2005), plazmi pacijenata sa hroniĉnom insuficijencijom bubrega (Lin i sar., 2011) i likvoru pacijenata sa multiplom sklerozom i drugim neuroinflamatornim bolestima (le Blanc i sar., 2006). Rezultati dosadašnjih studija ukazuju na to da je proteolitiĉko seĉenje transmembranske forme CXCL16, kao i CX3CL1, asocirano sa mehanizmom inflamacije i stoga solubilne forme ovih hemokina mogu biti markeri inflamatornog procesa u patogenezi odreĊenih humanih bolesti. 1.7.2. Struktura gena za CXCL16 Humani gen za CXCL16 se nalazi na hromozomu 17p13, duţine je 6 283 bp i sastoji se od 5 egzona i 4 introna. Kodira polipeptidni lanac CXCL16 duţine 254 AK-e (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58191). 1.7.3. Polimorfizmi I123T i A181V u genu za CXCL16 U humanom genu za CXCL16 je detektovan veliki broj polimorfizama tipa SNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CXCL16%20homo%20sapiens). Do sada je uspostavljena asocijacija polimorfizama u 4. egzonu i 4. intronu sa nastankom i/ili 47 progresijom odreĊenih bolesti. Polimorfizam rs3744700 (T/G) u 4. intronu gena za CXCL16 je asociran sa rizikom za nastanak koronarne bolesti (Huang i sar., 2010). Ĉeste nesinonimne zamene pojedinaĉnih nukleotida, rs1050998 (I123T/Ile123Thr) i rs2277680 (A181V/Ala181Val), identifikovane su u ĉetvrtom egzonu gena za CXCL16. One su u izuzetno jakom “linkage disequilibrium”-u, što rezultuje prisustvom dva predominantna haplotipa: I123A181 (“wild-type”) i T123V181 (Petit i sar., 2011; International HapMap Consortium, 2003). Kod pacijenata sa koronarnom bolešću, nosioci alela V181 imaju povećan stepen stenoze koronarnih arterija (Lundberg i sar., 2005). Genotip VV je asociran sa ranijim oboljevanjem od Kronove bolesti i teţom kliniĉkom slikom (Seiderer i sar., 2008). Iako prethodne studije sugerišu na ulogu CXCL16 u patogenezi multiple skleroze (Fukumoto i sar., 2004; le Blanc i sar., 2006), do sada nije uraĊena ni jedna studija asocijacije polimorfizama I123T i A181V sa nastankom i progresijom ove bolesti. Polimorfizmi I123T i A181V su locirani na suprotnim krajevima mucinskog domena transmembranskog CXCL16. Pozicija A181V, u neposrednoj blizini ćelijske membrane, ukazuje da ovaj polimorfizam potencijalno utiĉe na proteolitiĉko seĉenje membranske forme CXCL16. U jednoj studiji su analizirani efekti genskih polimorfizama I123T i A181V na funkcionalna svojstva CXCL16 in vitro i ex vivo (Petit i sar., 2011). Ustanovljeno je da su obe proteinske varijante CXCL16, I123A181 (“wild-type”) i T123V181, sliĉne u pogledu funkcije receptora “ĉistaĉa” i hemotaksije in vitro. MeĊutim, za razliku od I123A181, T123V181 varijanta CXCL16 ne moţe da promoviše adheziju CXCR6+ ćelija in vitro. U ex vivo analizi je potvrĊeno da monociti donora homozigotnih za alele T123 i V181 ne mogu da posreduju u adheziji ćelija koje eksprimiraju CXCR6. S obzirom da je u istoj studiji utvrĊeno da aleli T123 i V181 nisu asocirani sa rizikom za nastanak koronarne bolesti i da varijantu T123V181 odlikuje odsustvo svojstva adhezije (Petit i sar., 2011), sledi da su hemotaksija i funkcija receptora “ĉistaĉa” svojstva CXCL16 koja prevashodno doprinose patogenezi odreĊenih hroniĉnih inflamatornih bolesti kao što je ateroskleroza. 48 1.7.4. Regulacija transkripcije gena za CXCL16 Jedan od transkripcionih faktora koji uĉestvuje u regulaciji ekspresije gena za CXCL16 je aktivatorni protein-1 (AP-1). U cis-regulatornom regionu gena za CXCL16 je identifikovano vezivno mesto za AP-1 (Chandrasekar i sar., 2005). Ustanovljeno je da u glatkim mišićnim ćelijama aorte pacova IL-18 indukuje gensku ekspresiju CXCL16, putem unutarćelijske transdukcije signala preko: faktora 88 primarnog odgovora na diferencijaciju ćelija mijeloidne loze (engl. Myeloid Differentiation primary response 88, skr. MYD88), kinaze asocirane sa receptorom za IL-1 (engl. Interleukin-1 receptor-associated kinase, skr. IRAK1), faktora 6 asociranog sa TNFR (engl. Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor 6, skr. TRAF6), proto- onkogena tirozin kinaze c-Src, PI3 kinaze, proto-onkogena serin-treonin kinaze Akt, c- Jun (AP-1) N-terminalne kinaze (engl. c-Jun N-terminal kinase, skr. JNK) i AP-1 (Chandrasekar i sar., 2005). U eksperimentalnom modelu inflamacije bubrega, u ćelijama bubreţnih tubula TWEAK (skr. od engl. Tumor necrosis factor-like Weak inducer of apoptosis) indukuje ekspresiju CXCL16 iRNK, koja je posredovana transkripcionim faktorom NF-kB i rezultuje porastom nivoa membranskog i solubilnog CXCL16 (Izquierdo i sar., 2012). 1.7.5. Receptor CXCR6: struktura i funkcija Efekti hemokina CXCL16 se ostvaruju putem njegovog vezivanja za specifiĉni i jedini receptor, CXCR6 (CXC receptor 6; drugi nazivi: Bonzo, STRL33, TYMSTR), na ciljnim ćelijama. CXCR6 je otkriven 1997. godine, kao koreceptor za HIV na T- limfocitima (Liao i sar., 1997; Deng i sar., 1997). CXCR6, poput CX3CR1 i drugih hemokinskih receptora, pripada tipu receptora kuplovanih/spregnutih sa G-proteinom (GPCRs). Opšte strukturne i funkcionalne odlike GPCRs i hemokinskih receptora su opisane u poglavlju: 1.5.6. Receptor CX3CR1: struktura i funkcija. CXCR6 je monomer sastavljen od 342 AK-e (39,3 kDa). Poput ostalih GPCRs, CXCR6 se sastoji od sledećih domena: vanćelijski N-terminalni domen (rezidue 1-32), 7 hidrofobnih transmembranskih domena u vidu alfa-heliksa (rezidue: 33-59, 69-89, 104-125, 144-164, 188-215, 232-259, 276-293), 3 unutarćelijske (rezidue: 60-68, 126- 49 143, 216-231) i 3 vanćelijske (rezidue: 90-103, 165-187, 260-275) hidrofilne petlje koje povezuju transmembranske domene, i unutarćelijski C-terminalni domen (rezidue 294- 342). Disulfidni most se formira izmeĊu visoko-konzervisanih cisteinskih rezidua na pozicijama 102 u prvoj vanćelijskoj petlji i 180 u drugoj vanćelijskoj petlji (O00574 (CXCR6_HUMAN) Reviewed, UniProtKB/Swiss-Prot). Na osnovu analize mutanata CXCL16 koji su konstruisani zamenom pojedinaĉnih baznih aminokiselina alaninom u nekonzervisanom regionu hemokinskog domena, utvrĊeno je da mutanti sa zamenama His80Ala, His85Ala i Lys105Ala imaju znaĉajno povećanu aktivnost preuzimanja oxLDL-a i fagocitoze bakterija, u poreĊenju sa nemutiranim CXCL16. Bilo koja od ove tri aminokiselinske zamene znaĉajno smanjuje meĊućelijsku adheziju posredovanu preko CXCL16, što sugeriše da su bazne aminokiseline u nekonzervisanom regionu hemokinskog domena CXCL16 vaţne za uspostavljanje interakcije CXCL16 sa CXCR6 (Liu i sar., 2011). Zamene kiselih aminokiselina u 2. i 3. vanćelijskoj petlji receptora CXCR6, Asp176Asn i Glu274Lys, rezultuju nemogućnošću interakcije receptora sa solubilnim CXCL16, što ukazuje na kljuĉnu ulogu Asp176 i Glu274 u vezivanju liganda. MeĊutim, iako nije u stanju da interaguje sa solubilnim CXCL16, mutant CXCR6 sa zamenom Glu274Lys moţe da promoviše snaţnu adheziju sa membranskim CXCL16, a to sugeriše da solubilni i membranski CXCL16 mogu imati razliĉite aktivne konformacije (Petit i sar., 2008). Transmembranski CXCL16 posreduje u integrin-nezavisnoj adheziji ćelija koje eksprimiraju CXCR6, a solubilni oblik CXCL16 ima ulogu hemoatraktanta za CXCR6+ ćelije (Shimaokab i sar., 2004). Inhibitor G-alfa-i subjedinice, pertuzijski toksin (PTX), efikasno suprimira hemotaksiju CXCR6+ ćelija koju indukuje CXCL16 (Shimaokab i sar., 2004). Ekspresija CXCR6 je detektovana na: CD4+ Th1 limfocitima, CD8+ Tc1 limfocitima i regulatornim T-limfocitima (Tabata i sar., 2005; Sharron i sar., 2000; Kim i sar., 2001; Sato i sar., 2005), glatkim mišićnim ćelijama (Chandrasekar i sar., 2004), dendritskim ćelijama (Ignatius i sar., 2000), B-limfocitima (Sharron i sar., 2000; Nakayama i sar., 2003), makrofazima (Gaina i sar., 2007) i pojedinim subpopulacijama T-limfocita prirodnih ubica (Kim i sar., 2002; Thomas i sar., 2003; Johnston i sar., 2003). Pokazano je da citokini IL-2 i IL-15 indukuju ekspresiju CXCR6 u memorijskim T-limfocitima (Unutmaz i sar., 2000). T-limfociti koji eksprimiraju CXCR6 su prisutni u velikom broju u inflamatornim lezijama zglobova i jetre (Kim i sar., 2001). U 50 eksperimentalnom modelu ateroskleroze aterogeneza je bila sporija kod ţivotinja deficijentnih za CXCR6, što je bilo povezano sa redukcijom broja T-limfocita i makrofaga u aterosklerotskim lezijama (Galkina i sar., 2007). U ćelijskim linijama MBP-specifiĉnih T-limfocita, ekspresija CXCR6 je kljuĉni marker konverzije ovih ćelija u memorijske T-limfocite (Calabresi i sar., 2002). S obzirom da navedene studije (Kim i sar., 2001; Galkina i sar., 2007; Calabresi i sar., 2002) pokazuju da CXCR6, poput CX3CR1, uĉestvuje u patogenezi inflamatornih bolesti, specifiĉna blokada receptora CXCR6 ili blokada oba receptora predstavljaju jedan od potencijalnih budućih vidova terapije ovih bolesti. 1.7.6. Struktura gena za CXCR6 Humani gen za CXCR6 je lociran na hromozomu 3p21. Duţine je 4 872 bp, sastoji se od 2 egzona i 1 introna i kodira polipeptidni lanac CXCR6 duţine 342 AK-e (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10663). 1.7.7. Polimorfizmi u genu za CXCR6 U humanom genu za CXCR6 je detektovan znaĉajan broj polimorfizama (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CXCR6%20homo%20sapiens). S obzirom da CXCR6 ima ulogu koreceptora za HIV, do sada su polimorfizmi u genu za CXCR6 u nekoliko studija asocirani sa nastankom i progresijom AIDS-a (skr. od engl. Acquired Immuno-Deficiency Syndrome). ReĊi alel polimorfizma rs2234358 (G/T), pozicioniranog u 3’ netranslatiranom regionu gena, je asociran sa brţim nastankom AIDS-a kod inficiranih HIV-om i većom smrtnošću kao posledicom ovog sindroma (Limou i sar., 2010). Polimorfizam rs2234355 (G/A) rezultuje zamenom aminokiseline Glu3Lys, u N-terminalnom domenu CXCR6. U okviru populacije Afro-Amerikanaca, u kojoj je frekvencija alela Lys3 visoka (44%), osobe sa AIDS-om homozigotne ili heterozigotne za alel Glu3 su imale višestruko veću smrtnost usled pneumonije, u odnosu na obolele homozigote Lys3Lys (Duggal i sar., 2003). 51 1.7.8. Regulacija transkripcije gena za CXCR6 Do sada je identifikovano nekoliko transkripcionih faktora koji uĉestvuju u regulaciji ekspresije gena za CXCR6. Bakterijski LPS aktivira receptor sliĉan Toll-u (engl. Toll-Like Receptor, skr. TLR) 4 i, putem transdukcije signala preko MYD88, TRAF6, MAPK1 i JNK, dovodi do aktivacije transkripcionog faktora AP-1 koji indukuje ekspresiju gena za CXCR6 u glatkim mišićnim ćelijama humane aorte (Patel i sar., 2006). Transkripcioni faktor T-bet je eksprimiran u alveolarnim makrofazima i limfocitima obolelih od sarkoidoze pluća. Povišena ekspresija T-bet iRNK koreliše sa povišenom ekspresijom gena za IFN-gama, odreĊene citokine/hemokine i njihove receptore meĊu kojima je i CXCR6, a koji su ukljuĉeni u patogenezu ove bolesti (Kriegova i sar., 2011). U humanim CD4+CD25+ regulatornim T-limfocitima, analog vitamina D (TX527) indukuje gensku ekspresiju CXCR6 i drugih hemokinskih receptora (CCR5, CXCR3) koji omogućavaju migraciju ovih regulatornih T-limfocita na mesto inflamacije (Baeke i sar., 2011). 1.8. Hemokin CXCL16 i njegov receptor CXCR6 u centralnom nervnom sistemu i patogenezi neuroinflamatornih bolesti U normalnom tkivu CNS-a ekspresija CXCL16 je niska. Za razliku od CX3CL1, u bazalnim uslovima CXCL16 nije eksprimiran u neuronima, već preteţno u endotelnim ćelijama (Ludwigb i sar., 2005). Prvi pokazatelj da CXCL16 moţe imati ulogu proinflamatornog hemokina u patologiji CNS-a, su rezultati studije o ekspresiji CXCL16 tokom eksperimentalnog autoimunskog encefalomijelitisa (Fukumoto i sar., 2004). U modelima akutnog i adoptivnog EAE-a primena monoklonskog antitela na CXCL16 rezultovala je smanjenom uĉestalošću bolesti, smanjenom infiltracijom mononuklearnih leukocita u CNS, opadanjem nivoa serumskog IFNG i smanjenom produkcijom mijelin-specifiĉnih T-limfocita. TakoĊe, histopatološka analiza je pokazala da teţina kliniĉke slike u EAE-u pozitivno koreliše sa nivoom ekspresije CXCL16 u CNS-u (Fukumoto i sar., 2004). CXCL16 je detektovan u astrocitima, gde njegova 52 ekspresija moţe da bude povišena pod uticajem medijatora inflamacije kao što su IFNG i TNFA (Ludwig b i sar., 2005). Solubilni CXCL16 se konstitutivno oslobaĊa sa površine astroglijalnih ćelija, putem proteolitiĉkog seĉenja transmembranskog CXCL16 koje katalizuje ADAM10, dok je u reaktivnim astrocitima produkcija solubilnog CXCL16 stimulisana aktivnošću ADAM17 (Ludwigb i sar., 2005). Inducibilna proizvodnja i proteolitiĉko seĉenje CXCL16 u mozgu su pokazani analizom profila ekspresije proteina, otkrivajući znaĉajni porast nivoa CXCL16 u mozgu miševa sa pneumokoknim meningitisom (Klein i sar., 2006). Nivoi solubilnog CXCL16 u serumu i likvoru su znaĉajno povišeni u multiploj sklerozi i drugim neuroinflamatornim autoimunskim oboljenjima (le Blanc i sar., 2006). Pritom, kod pacijenata su detektovani i znaĉajno viši nivoi CXCL16 u likvoru nego u serumu. To potvrĊuje lokalnu produkciju CXCL16 u CNS-u tokom patogeneze neuroinflamatornih bolesti, najverovatnije preteţno od strane reaktivnih astrocita i aktivirane mikroglije. CXCR6 je detektovan u kultivisanim astrocitima i mikroglijalnim ćelijama (Ludwig b i sar., 2005). Ćelijska linija prekursora astrocita takoĊe eksprimira CXCR6, ĉak više nego zreli astrociti (Hattermann i sar., 2008). Stimulacija ovih ćelija solubilnim CXCL16 aktivira signalni put preko PI3 kinaze i Akt-a koji rezultuje aktivacijom transkripcionog faktora AP-1 i indukcijom migracije i proliferacije ovih astroglijalnih ćelija. Pošto se CXCL16 eksprimira u astrocitima, a CXCR6 i u prekursorima astrocita, oĉekivano je da interakcija CXCL16-CXCR6 moţe doprinositi pozicioniranju astroglijalnih prekursora u CNS-u, naroĉito u neuroinflamatornim i drugim patološkim stanjima kada je produkcija CXCL16 u astrocitima inducibilna (Ludwig b i sar., 2005). Tada osloboĊeni CXCL16 moţe da stimuliše migraciju i proliferaciju CXCR6+ astroglijalnih ćelija, što doprinosi astrogliozi u delovima tkiva CNS-a koji su oštećeni tokom neuroinflamatornog procesa. U patogenezi EAE-a je otkriveno da je CXCR6 tipiĉno eksprimiran na mijelin-reaktivnim CD4+ Th1 limfocitima koji produkuju IFNG (Calabresi i sar., 2002; Fukumoto i sar., 2004). Buduće funkcionalne studije koje koriste model ţivotinja deficijentnih za CXCL16/CXCR6 ili primenjuju odgovarajuća neutrališuća antitela za ove molekule imaće za cilj da detaljnije rasvetle ulogu CXCL16 i CXCR6 u patogenezi hroniĉnih inflamatornih bolesti meĊu kojima je i multipla skleroza. 53 2. HIPOTEZA I CILJEVI Ova studija obuhvata genetsko-epidemiološku analizu polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 i analizu ekspresije gena za: CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, u patogenezi multiple skleroze, u okviru ciljne grupe ispitanika iz Srbije. Studija se bazira na sledećoj hipotezi: geni ukljuĉeni u procese inflamacije i autoimunskog odgovora (CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6) su potencijalni pokazatelji nastanka i/ili progresije multiple skleroze. Hipoteza će biti proverena na dva naĉina: 1) analizom asocijacije alela, genotipova i haplotipova polimorfizama u egzonima gena za CX3CR1 i CXCL16 sa nastankom i kliniĉkim parametrima multiple skleroze; 2) analizom asocijacije nivoa ekspresije gena za CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, u mononuklearnim leukocitima periferne krvi, sa nastankom i kliniĉkim parametrima bolesti. U ovoj studiji postavljeni su sledeći ciljevi: 1. Utvrditi frekvencije alela, genotipova i haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 i polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16, u kontrolnoj grupi zdravih osoba i grupi pacijenata sa multiplom sklerozom. 2. Utvrditi da li su ispitivani genski polimorfizmi asocirani sa nastankom multiple skleroze. 3. Utvrditi da li su ispitivani genski polimorfizmi asocirani sa kliniĉkim tokom i progresijom multiple skleroze. 4. Uraditi bioinformatiĉku analizu predviĊanja efekata haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na interakciju CX3CL1-CX3CR1 i predviĊanja efekata haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na interakciju CXCL16-CXCR6. Ispitati vezu izmeĊu rezultata bioinformatiĉke analize i eksperimentalne analize ciljnih polimorfizama, u okvirima patogeneze multiple skleroze. 5. Uraditi relativnu kvantifikaciju ekspresije gena za CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 na nivou iRNK, u mononuklearnim leukocitima periferne krvi zdravih osoba i pacijenata sa multiplom sklerozom i na osnovu dobijenih rezultata utvrditi da li su relativni nivoi ispitivanih iRNK, u datom perifernom tkivu, molekularni markeri nastanka, kliniĉkog toka i progresije multiple skleroze. 54 3. MATERIJAL I METODE 3.1. MATERIJAL 3.1.1. Uzorak Genetsko-epidemiološka studija u kojoj se ispituju asocijacija polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 i asocijacija ekspresije gena za CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore sa nastankom i progresijom multiple skleroze, obuhvatila je ciljnu grupu pacijenata kod kojih su postavljanje dijagnoze i praćenje toka bolesti, uz odgovarajuće kliniĉke i biohemijske analize, obavljeni u periodu 2008-2012. godine na Klinici za neurologiju Vojnomedicinske akademije (VMA), Beograd, Srbija. Kod svih pacijenata kojima je postavljena dijagnoza multiple skleroze, obavljen je kliniĉki neurološki pregled i odreĊene su vrednosti kliniĉkih parametara: EDSS (status ekspanzije trajnog invaliditeta) (Kurtzke, 1983), IP (indeks progresije, predstavlja koliĉnik vrednosti EDSS i trajanja bolesti izraţenog u godinama) i MSSS (EDSS korigovan na trajanje bolesti) (Roxburgh i sar., 2005). Na osnovu kliniĉkog toka, definisane su dve osnovne forme bolesti: relapsno-remitentna forma (sa sekundarno- progresivnom fazom kao kontinuumom) i primarno-progresivna forma (Lublin i sar., 1996). Definisani su prvi kliniĉki simptomi u inicijalnoj manifestaciji bolesti na osnovu kojih su oformljene tri simptomatske grupe: MC grupa (sa motornim slabostima po tipu oštećenja centralnog motornog neurona i cerebelarne disfunkcije), S grupa (sa senzornim smetnjama) i RB grupa (sa retrobulbarnim neuritisom). Za genetske analize, od svakog pacijenta uzeta su po dva uzorka pune krvi: iz jednog je izolovana ćelijska jedarna DNK za analizu polimorfizama, a iz drugog uzorka izdvojeni su mononuklearni leukociti i zatim iz njih izolovana ukupna RNK za analizu genske ekspresije. Od svake osobe ukljuĉene u ovu studiju uzeti su liĉni i anamnestiĉki podaci obuhvaćeni upitnikom. Kontrolna grupa je obuhvatila zdrave pripadnike srpske populacije koji su dobrovoljno ukljuĉeni u studiju prilikom kontrolnog zdravstvenog pregleda na teritoriji Beograda, kod kojih su uraĊene standardne biohemijske analize krvi. Za genetsku 55 studiju, od svakog ĉlana kontrolne grupe uzeta su po dva uzorka pune krvi: jedan za izolaciju ćelijske DNK za analizu polimorfizama, a drugi za izdvajanje mononuklearnih leukocita i izolaciju ukupne RNK iz ovih ćelija u cilju analize genske ekspresije. Etiĉki komitet je odobrio studiju, a informativni pristanak je dobijen od svih uĉesnika studije. Genetsko-epidemiološka analiza polimorfizama DNK i genske ekspresije uraĊena je u Laboratoriji za radiobiologiju i molekularnu genetiku Instituta za nuklearne nauke „Vinĉa”, Beograd, Srbija. 3.1.2. Aparatura Prilikom izrade teze korišćena je sledeća aparatura: - ABI PRISM TM 6100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems) - Spektrofotometar BioSpec-nano (Shimadzu Biotech) - 2100 Bioanalyzer (Agilent) - PCR aparat: ABI GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) - Real-time PCR sistem: Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems) - Sistem za horizontalnu elektroforezu (IBI- International Biotechnologies Inc,Model HRH, OWL Scientific, Model B3 , Inc. Woburn, MA , SAD) - Sistem za vertikalnu elektroforezu (Eletrofor VP-80, Rovigo, Italy, Bio Rad, SAD) - Sistem za snimanje i analizu gelova GDS8000 (UVP Inc, Upland, CA , SAD): mraĉna komora sa UV/belom svetlošću, CCD kamera, transluminator, procesor (PC), program za obradu podataka - Mikrocentrifuga (Eppendorf 5417R) - Cenrifuga ("Super Speed" Sorvall Inc, Norwalk Conn USA) - Ispravljaĉi (LKB Bromma 2197 Power supply, LKB Bromma 2297 Macro drive 5 constant power supply, Atiocross power 150) - Vodeno kupatilo (Termomedicinski aparati, Bodalec i Havoić, YU) - Vaga (Tehtnica ET 111, YU) - Analitiĉka vaga (Mettler, Switzerland) - pH metar (Iskra MA 5730, YU). 56 3.2. METODE 3.2.1. Izolacija DNK iz ćelija krvi, metodom po Kunkel-u i saradnicima Metoda izolacije DNK po Kunkel-u i saradnicima (1977) rezultuje visokim prinosom i kvalitetom izolovane DNK a, takoĊe, omogućava i dugotrajno i jednostavno ĉuvanje uzoraka izolovanih na ovaj naĉin. Metoda podrazumeva izdvajanje DNK iz 3-5 ml pune krvi uzete sa antikoagulansom. U ovom radu, za analizu polimorfizama DNK, svim ispitanicima uzimano je po 3 ml krvi iz kubitalne vene i puna krv sa antikoagulansom EDTA ĉuvana je na -20°C, do procedure izolacije ćelijske DNK. Reagensi Etanol (C2H5OH, min 95%, Mr=46,07, Zorka Pharma) Etilendiamin tetrasirćetna kiselina, dinatrijumova so, dihidrat (EDTA, Mr=372,24, Sigma) Ekvilibrisani fenol, pH=6,7 (C6H6O, Mr=94,11, USB) Hloroform (CHCl3,Mr=119,38,1l=1,47 kg, Kemika) Izoamilalkohol (C5H12O, Mr=88,15,1l=0,81 kg, Merk) Magnezijum hlorid (MgCl2 × 6H2O, Mr=203,3, Sigma) Natrijum acetat (C2H3O2Na × H2O , Mr=136,08, Zorka Pharma) Natrijum dodecil sulfat (SDS, C12H25O4S×Na, Mr=288,4, Sigma) Natrijum hlorid (Zorka Pharma) Proteinaza K (Sigma) Saharoza (C12H22O11, Mr=342,30, Sigma) Sirćetna kiselina (CH3COOH,min 99%, Mr=60,05,1l=0,05kg, Zorka Pharma) Tris (trihidroksimetil) aminometan (C4H11NO3, Mr=121,14,Sigma) Triton X-100 (t-oktilfenoksipolietoksietanol, Sigma) Rastvori 1. Lizogeni rastvor: 0,32 mol/l saharoza 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5 57 5 mmol/l MgCl2 1% Triton X-100 2. Rastvor II: 0,024 mmol/l EDTA, pH 8,0 0,075 mmol/l NaCl 3. 10 mg/ml, proteinaza K 4. 3 mmol/l, ph 5,0, Na-acetat 5. TE (Tris-EDTA) pufer: 10 mmol/l Tris, pH 7,6 1 mmol/l EDTA Protokol 1) Uzorku od 3 ml krvi dodato je 24 ml hladnog lizogenog rastvora. 2) Smeša je homogenizovana u homogenizeru 3-5 min, na ledu. (Tokom homogenizacije degradiraju se ćelije, a jedra ostaju cela.) 3) Smeša je zatim centrifugirana na 800 rcf, 10 min, 4oC. 4) Supernatant je odliven, a talogu je dodato 125 l rastvora II u kome je talog zatim resuspendovan. 5) Smeši je dodato 62,5 μl 10% SDS-a, snaţnog deterdţenta koji razlaţe sve ćelijske membrane pa, prema tome, i jedarnu. 6) Zatim je dodato 50 μl proteinaze K (10 mg/ml) i smeša je inkubirana 12h na 37 oC, jer je to optimalna temperatura na kojoj proteinaza razlaţe sve proteine i sebe samu. 7) Posle inkubacije u smešu je dodato 0,5 ml ekvilibrisanog fenola pH 7,8 i ona je centrifugirana na 10800 rpm, 19 min, 18 oC. Ekstrakcija fenolom omogućava razdvajanje velike koliĉine proteina od DNK. 8) Nakon centrifugiranja gornja faza je izvuĉena širokim nastavkom, dodata joj je ista zapremina smeše fenol:hloroform (1:1) i centrifugirana je na 10800 rpm, 19 min, 18 o C. 9) Nakon centrifugiranja izvuĉena je gornja faza, dodata joj je ista zapremina smeše hloroform:izoamilalkohol (24:1) i ponovljeno je centrifugiranje na 10800 rpm, 19 min, 18 o C. Hloroform uklanja fenol, a izoamilalkohol smanjuje penu koja potiĉe od SDS-a. 58 10) Sledi precipitacija DNK: izvaĊenoj gornjoj fazi dodat je ledeni 96% etanol i 3M natrijum acetat pH 5,0 (2 zapremine 96% C2H5OH i 1/10 zapremine 3M CH3COONa pH 5,0). DNK se pojavila u vidu konĉaste strukture. 11) DNK je staloţena na dnu mikroepruvete, centrifugiranjem na 11900 rcf, 19 min, 4 oC. Preostali sadrţaj je odliven iz mikroepruvete, a talog DNK ispran u 70% C2H5OH i rastvoren u 200 μl TE pufera pH 8,0. 12) Uzorci DNK su ĉuvani na +4 oC. 3.2.2. Izolacija DNK iz ćelija pune krvi, na aparatu ABI PRISMTM 6100 Nucleic Acid PrepStation Izolacija DNK primenom kita DNA BloodPrep TM , na aparatu ABI PRISM TM 6100, je brza metoda izolacije DNK iz male zapremine pune krvi (150 μl) uzete sa antikoagulansom (EDTA). Nakon ekstrakcije i preĉišćavanja, DNK se eluira sa filter- membrane. Jedan postupak izolacije omogućava istovremeno izolovanje DNK iz 94 uzorka. Reagensi Proteinaza K (Sigma) Digestioni pufer za proteinazu K: PK Digestion Buffer (DNA BloodPrep TM , Applied Biosystems) Rastvor za preĉišćavanje DNK: BloodPrep DNA Purification Solution (DNA BloodPrep TM , Applied Biosystems) Rastvor za ispiranje DNK: BloodPrep DNA Wash Solution (DNA BloodPrep TM , Applied Biosystems) Rastvor 1 za eluciju DNK: Elution Solution 1 (DNA BloodPrep TM , Applied Biosystems) Rastvor 2 za eluciju DNK: Elution Solution 2 (DNA BloodPrep TM , Applied Biosystems) Materijal Plastiĉni nosaĉ: ABI PRISMTM Splash Guard (Applied Biosystems) Nosaĉ sa filter-membranama za ekstrakciju i preĉišćavanje DNK: DNA Purification Tray II (Applied Biosystems) 59 Mikroploĉa: 96-Well Reaction Plate with Barcode (Applied Biosystems) Protokol 1) U mikroepruvetu zapremine 1,5 ml sipano je 15 μl rastvora proteinaze K (20mg/ml) i 85 μl digestionog pufera (PK Digestion Buffer). 2) Smeši je dodato 150 μl pune krvi i dobro je promešana provlaĉenjem kroz nastavak mikropipete. 3) Smeša je inkubirana na 58°C 10 min, kako bi se postigla degradacija proteina. 4) Zatim je dodato 500 μl rastvora za preĉišćavanje DNK (BloodPrep DNA Purification Solution) i smeša je dobro promešana provlaĉenjem kroz nastavak mikropipete. Na aparatu je podešen program za izolaciju DNK iz pune krvi, postavljeni su plastiĉni nosaĉ (ABI PRISMTM Splash Guard) i nosaĉ sa filter-membranama za ekstrakciju i preĉišćavanje DNK (DNA Purification Tray II) u poziciju „waste“ na aparatu, i izvedeni su sledeći postupci: 5) U bunare na nosaĉu sa filter-membranama (DNA Purification Tray II) sipano je po 650 μl smeše svakog pripremljenog uzorka i aktiviran je vakuum 80% u trajanju od 300 sec. 6) U svaki bunar dodato je po 650 μl rastvora za preĉišćavanje DNK (BloodPrep DNA Purification Solution) i aktiviran je vakuum 80% u trajanju od 400 sec. 7) U svaki bunar dodato je po 650 μl rastvora za ispiranje DNK (BloodPrep DNA Wash Solution) i aktiviran je vakuum 80% u trajanju od 60 sec. 8) U svaki bunar dodato je po 600 μl rastvora za ispiranje DNK (BloodPrep DNA Wash Solution) i aktiviran je vakuum 80% u trajanju od 60 sec. 9) U svaki bunar dodato je po 300 μl rastvora za ispiranje DNK (BloodPrep DNA Wash Solution) i aktiviran je vakuum 80% u trajanju od 60 sec. 10) Aktiviran je „pre-elution“ vakuum 100% u trajanju od 120 sec. Mikroploĉa (96-Well Reaction Plate with Barcode) je postavljena u poziciju „collection“ na aparatu i izvedeni su sledeći postupci: 11) U svaki bunar dodato je po 100 μl rastvora 1 za eluciju DNK (Elution Solution 1) i aktiviran je vakuum 60% u trajanju od 120 sec, ĉime je omogućena elucija najvećeg dela izolovane DNK sa membrane. 60 12) U svaki bunar dodato je po 100 μl rastvora 2 za eluciju DNK (Elution Solution 2) i aktiviran je vakuum 60% u trajanju od 120 sec. Elution Solution 2 ima sastav koji obezbeĊuje odgovarajući pH za ĉuvanje DNK u rastvoru. 13) Uzorci DNK su ĉuvani na +4 oC. 3.2.3. Merenje koncentracije i provera kvaliteta izolovane DNK Koncentracija i ĉistoća uzoraka DNK odreĊene su spektrofotometrijski, na aparatu BioSpec-nano. Koncentracija uzoraka je izmerena i vrednosti su izraţene u ng/μl. Merenjem apsorbancije DNK na 260nm i 280nm utvrĊeno je da uzorci imaju zadovoljavajuću ĉistoću, pošto je odnos A260/A280 bio u opsegu 1,8-2,0. Kao rezultat elektroforeze uzoraka DNK, koja traje 1h u elektriĉnom polju jaĉine 7,5 V/cm duţine gela na 1% agaroznom gelu obojenom sa 0,5 µg/ml EtBr, dobijena je jedna jasna traka (>40 kb), što ukazuje na zadovoljavajući kvalitet izolovanih uzoraka DNK. 3.2.4. Genotipizacija polimorfizama DNK, V249I i T280M, u genu za CX3CR1 reakcijom amplifikacije DNK in vitro (PCR) Lanĉana reakcije polimeraze, engl. Polymerase Chain Reaction (skr. PCR), je metoda enzimske amplifikacije specifiĉnih fragmenata DNK in vitro. Reakcija zahteva vrlo male koliĉine poĉetnog materijala DNK a izvodi se pomoću enzima Taq polimeraze, termostabilne DNK polimeraze izolovane iz bakterije Thermus Aquaticus. Umnoţeni fragmenti DNK mogu se dalje obraĊivati upotrebom komercijalno dostupnih enzima restikcionih endonukleaza koje prepoznaju specifiĉne sekvence DNK, tzv. restrikciona mesta, i seku ih. Ukoliko se u okviru restrikcionog mesta nalazi polimorfno mesto, to omogućava razlikovanje genotipova polimorfizma u ciljnom genu metodom RFLP (skr. od engl. Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Dosadašnje metode za detekciju genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za receptor za fraktalkin, CX3CR1, bazirane su na klasiĉnoj PCR-RFLP analizi: fragment DNK koji sadrţi oba polimorfna mesta amplifikuje se PCR reakcijom, a zatim se PCR produkt digestira korišćenjem dva razliĉita restrikciona enzima- jedan 61 specifiĉno seĉe sekvencu koja sadrţi polimorfizam V249I, a drugi seĉe sekvencu koja sadrţi polimorfizam T280M (Moatti i sar., 2001; McDermot i sar., 2001). U ovom radu, za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1, primenjene su dve novodizajnirane metode: alel-specifiĉna PCR metoda i metoda zasnovana na PIRA PCR-RFLP analizi. 3.2.5. Alel-specifiĉna metoda PCR za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 Alel-specifiĉna PCR metoda dizajnirana je tako da se na osnovu dobijenih PCR produkata moţe izvršiti brza detekcija ĉešćih genotipova, VV u kodonu 249 i TT u kodonu 280, zastupljenih kod oko 50% individua u populaciji, i prisustvo reĊih alela, I249 i M280. Metoda je dizajnirana po uzoru na tetra-primer ARMS PCR metodu (Ye i sar., 2001) koja kombinuje princip ARMS (engl. Amplification Refractory Mutation System) PCR, sa PCR sa ĉetiri amplimera (engl. tetra-primer PCR) (Newton i sar., 1989). Ova metoda omogućava genotipizaciju odmah nakon PCR reakcije, bez primene restrikcionih enzima ili sekvenciranja. Amplimeri su dizajnirani tako da 2 spoljašnja („outer“) obuhvataju oba polimorfna mesta ciljnog regiona DNK, a 2 unutrašnja („inner“) su alel-specifiĉni koji, radi povećanja specifiĉnosti hibridizacije sa DNK matricom, poseduju: a) veštaĉki uvedenu pogrešnu nukleotidnu bazu na poziciji -3 na 3’ kraju, b) sekvencu duţu od 26 bp, i c) koncentraciju u reakcionoj smeši 8-10 puta veću u odnosu na koncentraciju spoljašnjih („outer“) amplimera (slika M1, tabela M1). Slika M1. Shematski prikaz pozicije amplimera u okviru ciljne sekvence DNK, za alel- specifiĉni PCR i PIRA PCR-RFLP. Spoljašnji amplimeri, FO i RO, ograniĉavaju sekvencu gena za CX3CR1 za alel-specifiĉni PCR; unutrašnji amplimer RI RI misRFLP T280M (C/T) FO RO RI FI V249I 62 komplementaran je reĊem alelu I249 polimorfizma V249I, a unutrašnji amplimer FI komplementaran je reĊem alelu M280 polimorfizma T280M. Amplimer RI misRFLP uvodi de novo restrikciono mesto i sa amplimerom FO amplifikuje sekvencu gena za metodu PIRA PCR-RFLP. Tabela M1. Sekvence oligonukleotidnih amplimera za alel-specifiĉnu PCR metodu. Oznaka alela polimorfizma Sekvenca amplimera Oznaka amplimera V249 i T280 5’GCAATGTGGAAACAAATTTTCTTGGCTT3’ FO Sens spoljašnji 5’CACACAGGACAGCCAGGCATTTCCC3’ RO Antisens spoljašnji M280 5’TCTGAGGCTGGCCCTCAGTGTGACTGATAT3’ FI Sens unutrašnji I249 5’GCTTAAGCGTCTCCAGGAAAATCATCAT3’ RI Antisens unutrašnji Istaknuti su nekomplementarni nukleotidi veštaĉki uvedeni u sekvencu unutrašnjih amplimera, na poziciji -3 na 3’ kraju, radi povećanja specifiĉnosti reakcije amplifikacije. Sekvence amplimera (tabela M1) dizajnirane su korišćenjem programa koji su osmislili autori tetra-primer ARMS metode (Ye i sar., 2001; http://cedar.genetics.soton.ac.uk/publichtml/primer1.html). Ovaj program kao rezultat prikazuje nekoliko parova amplimera za specifiĉni region, pa je odgovarajući set dizajniranih amplimera odabran dodatnom analizom sekvence gena CX3CR1 i sekvence amplimera, korišĉenjem dostupnog kompjuterskog programa: PerlPrimer, http://perlprimer.sourceforge.net. Za analizu sekvence transkripta gena CX3CR1 63 korišćena je sekvenca dostupna u bazi podataka NCBI-Entrez Nucleotide sa pristupnim brojem NM_001337 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/68348719). Optimizacija uslova za PCR reakciju uraĊena je podešavanjem finalnih koncentracija komponenti koje se koriste u reakciji i podešavanjem temperaturnih uslova (na osnovu temperature topljenja, Tm, amplimera). Reagensi Nukleotidi (Fermentas): 2 '- deoksiadenozin 5'-trifosfat 2 '- deoksitimidin 5'-trifosfat 2'-deoksiguanozin 5'-trifosfat 2'-deoksicitidin 5'-trifosfat Amplimeri, oligonukleotidi (MWG – Biotech AG) 10 × PCR pufer (Fermentas) MgCl2 (Fermentas) Taq DNK-polimeraza (Fermentas) Protokol za alel-specifiĉnu PCR metodu Amplimeri korišćeni za detekciju ĉešćih homozigota (VV u kodonu 249, TT u kodonu 280) i reĊih alela (I249 i M280) u genu CX3CR1, prikazani su u tabeli M1. Komponente alel-specifiĉne PCR reakcije prikazane su u tabeli M2. 64 Tabela M2. Komponente alel-specifiĉne reakcije PCR za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1. Komponente za PCR Finalna koncentracija Zapremina (µl) Pufer za PCR (10x) 1x 2,0 MgCl2 1,5 mM 1,2 dNTP 0,2 mM 0,8 Amplimer FO 0,1 µM (2 pmol) 0,2 Amplimer RO 0,1 µM (2 pmol) 0,2 Amplimer FI 0,8 µM (16 pmol) 1,6 Amplimer RI 0,8 µM (16 pmol) 1,6 Genomska DNK 200 ng 0,8 Taq polimeraza 0,5 U 0,1 ddH2O 11,5 µl Ukupno 20 µl Temperaturni uslovi za alel-specifiĉnu PCR su bili sledeći: inicijalna denaturacija 95°C 5 min, sledi 30 ciklusa: denaturacije na 95°C 1 min, hibridizacije amplimera na 64°C 1 min i elongacije na 72°C 1 min, i finalna ekstenzija na 72°C 2 minuta. 3.2.6. Provera sinteze i veliĉine sintetisanih fragmenata DNK elektroforezom na agaroznom gelu Za proveru sinteze i analizu sintetisanih fragmenata DNK, raĊena je horizontalna elektroforeza na agaroznom gelu, koja omogućava razdvajanje sintetisanih fragmenata DNK. Razdvajanje se postiţe na osnovu razliĉite pokretljivosti fragmenata kroz podlogu u elektriĉnom polju, u zavisnosti od njihove duţine, primarne i sekundarne strukture. Reagensi Agaroza NA (LKB) 65 Etidijum bromid (Sigma) Etilendiamin tetrasirćetna kiselina, dinatrijumova so, dihidrat (EDTA, Mr=372,24, Sigma) Sirćetna kiselina (CH3COOH,min 99%, Mr=60,05,1l=0,05kg, Zorka Pharma) Tris (trihidroksimetil) aminometan (C4H11NO3, Mr=121,14, Sigma) Protokol za elektroforezu DNK Analiza produkata alel-specifiĉne PCR reakcije uraĊena je na 1,8% (w/v) agaroznim gelovima, sa 0,5 µg/ml EtBr u 1x Tris-acetatnom puferu (TAE), u trajanju od 1h u elektriĉnom polju jaĉine 7,5 V/cm duţine gela. Detektovan je jedan fragment DNK ukoliko je na oba polimorfna mesta prisutan ĉešći alel (kombinacija genotipova VV/TT), odnosno dva ili tri fragmenta ukoliko je na bar jednom ili na oba polimorfna mesta prisutan reĊi alel (I249 i/ili M280) (tabela M3). Tabela M3. Veliĉina produkata alel-specifiĉne reakcije PCR. Sintetisani fragmenti Amplimeri Dužina fragmenata, bp VV249 i TT280, dvostruki homozigot FO-RO 378 bp Alel I249 FO-RI 201 bp Alel M280 FI-RO 140 bp 3.2.7. Metoda za determinaciju genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1, zasnovana na PIRA PCR-RFLP analizi Primenom alel-specifiĉne metode omogućena je brza detekcija VV i TT genotipova ispitivanih polimorfizama, kao i pregled prisustva reĊih alela. Za uzorke kod kojih je detektovan barem jedan reĊi alel (I249 i/ili M280), genotipovi oba polimorfizma utvrĊuju se novodizajniranom PCR-RFLP metodom (engl. Restriction Fragment Lenght Polymorphism, odnosno polimorfizam duţine restrikcionih fragmenata). Naime, u RFLP analizi genotipovi oba polimorfizma, V249I i T280M, 66 odreĊeni su korišćenjem restrikcionog enzima TaiI (MaeII) koji prepoznaje sekvencu 5’...ACGT↓...3’. Kodon 249 predstavlja prirodno polimorfno mesto seĉenja kada je prisutan alel V249, tj. G nukleotid u restrikcionoj sekvenci. De novo veštaĉko mesto seĉenja u kodonu 280 uvedeno je primenom PIRA (skr. od engl. Primer-Introduced Restriction Analysis) PCR metode (Haliassos i sar., 1989) koja se bazira na dizajniranju modifikovanog amplimera sa pogrešno sparenom bazom na poziciji -2 na 3’ kraju, neposredno uz polimorfno mesto. Pritom, veštaĉko mesto seĉenja u kodonu 280 dobijeno je promenom sekvence DNK ACGG u sekvencu ACGT koja se nalazi u PCR produktu, tako da enzim TaiI prepoznaje mesto seĉenja ukoliko je u prisutan alel T280 tj. C nukleotid u restrikcionoj sekvenci. Na ovaj naĉin, prisustvom prirodnog mesta seĉenja u kodonu 249, uz uvoĊenje de novo veštaĉkog mesta seĉenja za isti restrikcioni enzim u kodonu 280, omogućena je istovremena genotipizacija oba polimorfizma pod istim uslovima reakcije (slika M1, slika M2). Za dizajn amplimera za PIRA PCR korišćen je komercijalno dostupni kompjuterski program (Ke i sar. , 2001; http://cedar.genetics.soton.ac.uk/publichtml/primer2.html). Ovaj program kao rezultat prikazuje nekoliko setova amplimera, a odgovarajući set odabran je dodatnom analizom sekvence gena CX3CR1 i sekvence amplimera, primenom komercijalno dostupnog kompjuterskog programa PerlPrimer (http://perlprimer.sourceforge.net). Pri tome, sense amplimer uzet je iz prethodno definisanog seta (sense spoljašnji, FO), a novodizajnirani je antisens amplimer, RI misRFLP, koji ima veštaĉki ubaĉenu bazu nekomplementarnu sekvenci DNK i ĉime se formira veštaĉko restrikciono mesto za enzim TaiI (MaeII) u PCR produktu (tabela M4). Definisanje optimalnih uslova za PIRA PCR reakciju vršeno je podešavanjem finalnih koncentracija komponenti koje se koriste u reakciji i podešavanjem temperaturnih uslova (na osnovu temperature topljenja, Tm, amplimera). 3.2.7.1. Protokol za PIRA PCR Oligonukleotidni amplimeri korišćeni za detekciju genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 metodom PIRA PCR-RFLP, prikazani su u tabeli M4. Komponente PIRA PCR reakcije prikazane su u tabeli M5. Za svaku PCR reakciju korišćeni su prethodno navedeni reagensi. 67 Tabela M4. Sekvence amplimera korišćenih za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 metodom PIRA PCR-RFLP. Istaknuta je pogrešno sparena baza u antisens amplimeru, radi uvoĊenja de novo restrikcionog mesta u kodonu 280. Tabela M5. Komponente PIRA PCR za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1. Komponente za PCR Finalna koncentracija Zapremina (µl) Pufer za PCR (10x) 1x 2,5 MgCl2 2 mM 2,0 dNTP 0,2 mM 1,0 Amplimer FO 0,5 µM (12,5 pmol) 1,25 Amplimer RI misRFLP 0,5 µM (12,5 pmol) 1,25 Genomska DNK 200 ng 0,8 Taq polimeraza 0,5 U 0,1 ddH2O 16,1 µl ukupno 25 µl Temperaturni uslovi za PIRA PCR su bili sledeći: inicijalna denaturacija 95°C 5 min, sledi 30 ciklusa denaturacije na 95°C 1 min, hibridizacije amplimera na 58°C 1 min i elongacije na 72°C 1 min, i finalna ekstenzija na 72°C 2 minuta. 3.2.7.2. Restrikciona analiza PIRA PCR produkta (RFLP analiza) Za odreĊivanje genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu CX3CR1 korišćen je restrikcioni enzim TaiI (MaeII), koji prepoznaje sekvencu 5’...ACGT↓...3’. Prikaz duţine restrikcionih fragmenata nakon digestije PIRA PCR produkta enzimom Oznaka amplimera Sekvenca amplimera FO 5’GCAATGTGGAAACAAATTTTCTTGGCTT3’ RI misRFLP 5’TCAGGCAACAATGGCTAAATGCAAAC3’ 68 TaiI (MaeII), dat je na slici M2. Duţine restrikcionih fragmenata i odgovarajući genotipovi polimorfizama V249I i T280M prikazani su u tabeli M6. Slika M2. Shematski prikaz duţine restrikcionih fragmenata nakon digestije produkta PIRA PCR reakcije enzimom TaiI (MaeII). Tabela M6. Duţine restrikcionih fragmenata DNK i njima odgovarajuće kombinacije genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1. Genotipovi V249I i T280M Dužine restrikcionih fragmenata, bp II / MM (PCR produkt) 294 II / TM 294 + 270 II / TT 270 VV / TT 175 + 95 VV / TM 175 + 119 + 95 VV / MM 175 + 119 VI / MM 294 + 175 + 119 VI / TT 270 + 175 + 95 VI / TM 294 + 270 + 175 + 119 + 95 enzim seče T280 enzim seče V249 5' 3' 175 bp 95 bp 24 bp 270 bp 294 bp PCR produkt 119 bp 69 Reagensi Restrikciona endonukleaza TaiI (MaeII) (Fermentas) 10x crveni digestioni pufer (Fermentas) Protokol za digestiju restrikcionom endonukleazom Inkubirano je 10 µL PCR produkta sa 5U restrikcione endonukleaze TaiI (MaeII) i 1 µL crvenog digestionog pufera, na 65°C preko noći. 3.2.8. Analiza digestiranih fragmenata DNK elektroforezom na poliakrilamidnom (PAA) gelu Provera sinteze PIRA PCR produkta raĊena je elektroforezom na 1,8% agaroznom gelu. Produkt PCR reakcije je fragment duţine 294 baznih parova. Za razdvajanje digestiranih fragmenata DNK korišćena je vertikalna elektroforeza na 8% poliakrilamidnom (PAA) gelu, ĉija je koncentracija podešena prema oĉekivanoj duţini fragmenata. Reagensi za pripremu i bojenje poliakrilamidnog (PAA) gela Akrilamid (Sigma) Amonijum persulfat (Serva) Azotna kiselina (Kemika) Etanol (Zorka Pharma) Formaldehid (Sigma) Natrijum karbonat, Na2CO3 (Sigma) N,N’-metilenbisakrilamid (Sigma) N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin (TEMED; Bio-Rad) Rezin IR-120, BDH Srebro nitrat, AgNO3 (Sigma) Boratna kiselina, H3BO3 (USB Corporation, SAD) Etilendiamin tetrasirćetna kiselina, dinatrijumova so, dihidrat (EDTA, Mr=372,24, Sigma) 70 Sirćetna kiselina (CH3COOH, min 99%, Mr=60,05,1l=0,05kg, Zorka Pharma) Tris (trihidroksimetil) aminometan (C4H11NO3, Mr=121,14, Sigma) Protokol za elektroforezu DNK na PAA gelu Za pripremu 8% nedenaturišućeg poliakrilamidnog gela potrebne komponente su: štok akrilamida 40% (akrilamid i bisakrilamid u odnosu 19:1), 10x Tris-boratni pufer (TBE), 10% amonijum persulfat i TEMED. Vertikalna elektroforeza za razdvajanje fragmenata DNK trajala je 1h 15min, u elektriĉnom polju jaĉine 5V/cm. Po završetku elektroforeze fragmenti su vizuelizovani bojenjem gela srebronitratom. Postupak bojenja PAA gela: 1) gel je potopljen u 10% etanol, 10 min 2) gel je potopljen u 1% rastvor azotne kiseline, 3 min 3) gel je ispran destilovanom vodom i ostavljen u rastvoru 12 mmol/l srebronitrata, 15-30 min 4) gel je ispran destilovanom vodom dva puta 5) gel je potopljen u rastvor 0,28 mol/l natrijum karbonata sa 0,018% formaldehida i ostavljen da stoji do pojave traka 6) nakon pojavljivanja traka reakcija je prekinuta dodavanjem 10% sirćetne kiseline 7) gel je ispran destilovanom vodom. Za snimanje i analizu gelova korišćen je sistem GDS8000 (UVP Inc, Upland, SAD). 3.2.9. Genotipizacija polimorfizama DNK, I123T i A181V, u genu za CXCL16 lanĉanom reakcijom polimeraze (PCR) uz primenu TaqMan® eseja za diskriminaciju alela Applied Biosystems 7500 Real-time PCR sistem omogućava kvantitativnu detekciju sekvenci nukleinskih kiselina lanĉanom reakcijom polimeraze u realnom vremenu (Real-time PCR), i kvalitativnu detekciju sekvenci nukleinskih kiselina u tzv. 71 “end-point” analizi, tj. samo na osnovu podataka prikupljenih na kraju PCR reakcije. Metoda za diskriminaciju alela je tip “end-point” analize za detekciju razliĉitih alelskih varijanti ispitivane sekvence nukleinske kiseline. U ovom radu, za detekciju polimorfizama DNK, I123T i A181V, u genu za CXCL16 korišćeni su komercijalni TaqMan® eseji za diskriminaciju alela polimorfizma zamene pojedinaĉnog nukleotida (SNP). Svaki esej ĉini par specifiĉnih amplimera koji okruţuju polimorfno mesto i par TaqMan® alel-specifiĉnih proba koje imaju identiĉnu sekvencu, osim razlike na mestu ispitivanog SNP: jedna proba sadrţi nukleotid komplementaran ĉešćem alelu, a druga proba sadrţi nukleotid komplementaran reĊem alelu. TakoĊe, svaka TaqMan® alel- specifiĉna proba je obeleţena specifiĉnom fluorescentnom bojom na 5’ kraju. Dakle, hibridizacija odgovarajuće alel-specifiĉne probe sa sekvencom DNK koja sadrţi ispitivani SNP, omogućava detekciju odreĊenog alela (slika M3). Tom prilikom, na osnovu detekcije intenziteta signala koji potiĉe samo od jedne ili samo od druge fluorescentne boje odreĊuju se homozigoti za ĉešći ili reĊi alel, dok detekcija oba fluorescentna signala podjednakog intenziteta ukazuje da je prisutan heterozigotni genotip. Slika M3. Hibridizacija alel-specifiĉnih proba TaqMan® eseja za diskriminaciju alela, sa ciljnom sekvencom DNK koja sadrţi ispitivani SNP. Proba specifiĉna za alel 1 obeleţena je bojom VIC (V) na 5’ kraju, a proba specifiĉna za alel 2 obeleţena je bojom FAM (F) na 5’ kraju. Prilikom amplifikacije DNK, kada Taq polimeraza ugraĊuje komplementarne nukleotide u delu sekvence koja je hibridizovala sa specifiĉnom probom, proba se degradira, oslobaĊa se boja koja emituje fluorescentni signal i tako se detektuje prisustvo odgovarajućeg alela. - VIC boja - FAM boja - “Quencher” - AmpliTaq Gold® DNK polimeraza Alel 1 Alel 2 72 Reagensi - Komercijalni setovi amplimera i alel-specifiĉnih proba za genotipizaciju: TaqMan® SNP Genotyping Assay C__8718197_20 (40x) i TaqMan® SNP Genotyping Assay C__15885167_10 (40x) (Applied Biosystems) - Smeša komponenata reakcije: TaqMan® Genotyping Master Mix (2x) (AmpliTaq Gold® DNK polimeraza, dNTPs bez dUTP, pasivna referenca Rox) (Applied Biosystems) - Voda bez nukleaza: Nuclease-Free Water (Ambion) Protokol Determinacija genotipova polimorfizma DNK I123T (rs1050998) u genu za CXCL16 uraĊena je primenom TaqMan® komercijalnog eseja za genotipizaciju, C__8718197_20, koji se sastoji od para amplimera i para alel-specifiĉnih proba dizajniranih u okviru ciljne (kontekst) sekvence DNK : AGATGCCCCCTCTGAGGCCTGAGAA[A/G]TTGGGGGGCTGGTAGGAAGTAAATG . [VIC/FAM] Proba specifiĉna za alel I123 (nukleotid A) obeleţena je na 5’ kraju fluorescentnom bojom VIC, a proba specifiĉna za alel T123 (nukleotid G) bojom FAM. Determinacija genotipova polimorfizma DNK A181V (rs2277680) u genu za CXCL16 uraĊena je korišćenjem TaqMan® komercijalnog eseja za genotipizaciju, C__15885167_10, koji se sastoji od para amplimera i para alel-specifiĉnih proba dizajniranih u okviru ciljne (kontekst) sekvence DNK : CTGGTTCTCCCCAGCCTCAGGCCCA[A/G]CTGCCAGACTGTGGCCCGCAGTGTG. [VIC/FAM] Proba specifiĉna za alel A181 (nukleotid G) obeleţena je na 5’ kraju fluorescentnom bojom FAM, a proba specifiĉna za alel V181 (nukleotid A) bojom VIC. Komponente PCR reakcije prikazane su u tabeli M7. U svakoj reakciji, finalne koncentracije TaqMan PCR smeše (TaqMan® Genotyping Master Mix) i TaqMan eseja (TaqMan® SNP Genotyping Assay C__8718197_20 ili C__15885167_10) bile su 1x. Amplifikacija je izvedena na aparatu 7500 Real-time PCR sistem uz primenu kompjuterskog programa SDS Software v1.4.0., a temperaturni profil reakcije prikazan je u tabeli M8. 73 Tabela M7. Komponente PCR reakcije za genotipizaciju svakog pojedinaĉnog polimorfizma DNK, I123T ili A181V, u genu za CXCL16. Komponente za PCR Zapremina, µl TaqMan® Genotyping Master Mix (2x) 6,25 (1x) TaqMan® SNP Genotyping Assay (20x) C__8718197_20 ili C__15885167_10 0,625 (1x) razblazenje gDNK 5,625 (125 ng DNK) Ukupno 12,5 µl Tabela M8. Temperaturni profil PCR reakcija za genotipizaciju polimorfizama DNK, I123T i A181V, u genu za CXCL16. Broj ciklusa Faza reakcije Temperatura (C) Vreme trajanja faze (min) 1 “Pre-read run” (determiniše poĉetni nivo fluorescence koja potiĉe od komponenata reakcije pre amplifikacije) 60 1 1 Inicijalna denaturacija 95 10 40 Denaturacija + 95 0,25 Hibridizacija amplimera i proba, i elongacija 60 1 1 “Post-read run” (nakon amplifikacije poništava poĉetni nivo fluorescence izmerene u toku “Pre-read run”, i omogućava determinaciju alela) 60 1 74 3.2.10. Izdvajanje mononuklearnih leukocita iz pune periferne krvi Za analizu genske ekspresije u ovom radu, od svih ispitanika uzimano je po 3 ml krvi iz kubitalne vene, i puna krv sa antikoagulansom EDTA odmah je iskorišćena za izdvajanje mononuklearnih ćelija i izolaciju ukupne RNK iz njih. Princip procedure razdvajanja ćelija krvi zasniva se na primeni medijuma za separaciju limfocita (Lymphocyte Separation Medium), ĉija je osnovna komponenta Ficoll. Ficoll je polisaharidni agens (polimer sukroze) za agregaciju eritrocita. Njegova mala viskoznost ĉini ga pogodnim za izdvajanje limfocita iz krvi, pri malim brzinama centrifugiranja. Diferencijalna migracija ćelija krvi u toku centrifugiranja u medijumu za separaciju limfocita, rezultuje formiranjem slojeva koji sadrţe razliĉite tipove ćelija, zavisno od njihove gustine (slika M4). Slika M4. Diferencijalna migracija ćelija krvi u toku centrifugiranja u medijumu za separaciju limfocita (Lymphocyte Separation Medium). Zbog relativno male gustine (<1,077 g/ml), limfociti i monociti se nalaze u interfazi izmeĊu plazme i reagensa za separaciju, dok se na dnu epruvete nalazi sloj potpuno sedimentisanih eritrocita sa granulocitima (slika M4). Ovom procedurom dobija se oko 60% od ukupnog broja mononukleara iz originalnog uzorka krvi, tj. oko 1,5 x 10 6 po 1 ml krvi. Reagensi Lymphocyte Separation Medium, LSM 1077 (PAA) Fiziološki rastvor (0,9% NaCl) (Hemofarm) plazma limfociti, monociti; trombociti Lymphocyte Separation Medium eritrociti, granulociti 75 Protokol 1) Uzorak od 3 ml sveţe krvi sa antikoagulansom (EDTA) razblaţen je dodavanjem iste zapremine (3 ml) 0,9% NaCl. 2) U epruvetu (preĉnika 12-15 mm) je prvo sipano 3 ml Lymphocyte Separation Medium-a (LSM), pa je zatim paţljivo dodato 6 ml razblaţene krvi, tako da nije došlo do mešanja krvi i LSM. 3) Uzorak je centrifugiran na 800 x g, 20 min, na sobnoj temperaturi. 4) Nakon centrifugiranja, mononuklearne ćelije su se nalazile u interfazi (slika M4). Interfaza je izdvojena Pasterovom pipetom i preneta je u sterilnu epruvetu. 5) Izdvojena frakcija mononukleara je isprana sa 6 ml 0,9% NaCl i ćelije su precipitirane centrifugiranjem na 250 x g, 10 min. 3.2.11. Izolacija ukupne RNK iz mononuklearnih leukocita krvi primenom reagensa TRI Reagent Solution Nakon izdvajanja limfocita i monocita iz uzoraka od 3 ml krvi, iz precipitata ovih ćelija izolovana je ukupna RNK korišćenjem reagensa TRI Reagent Solution, prema protokolu proizvodjaĉa (Ambion). Ovaj reagens je industrijski pripremljena smeša koja omogućava primenu modifikovane metode izolacije RNK po autorima Chomczynski i Sacchi (1987), u jednom koraku, te je pogodan za brzu izolaciju ukupne ćelijske RNK uz dobijanje zadovoljvajućeg kvantiteta i kvaliteta izolovane RNK. Reagensi TRI Reagent Solution (Ambion) Hloroform (CHCl3, Mr=119,38, 1l=1,47 kg, Kemika) Izopropanol (C3H8O, Mr=60,10, 1l=0,78kg, LachNer) Etanol (C2H5OH, min 95%, Mr=46,07, Zorka Pharma) Voda tretirana DEPC-om 76 Protokol 1) Precipitat mononuklearnih ćelija krvi je liziran dodavanjem 1 ml TRI Reagent Solution-a (dovoljno za lizu 5-10 x 10 6 ćelija) i sadrţaj je sipan u mikroepruvetu 1,5 ml. 2) Uzorak je inkubiran 5 min na sobnoj temperaturi, kako bi se postigla potpuna liza ćelija. 3) Uzorku je dodato 200 μl hloroforma (na 1ml TRI Reagent Solution), dobro je promućkan 15 sec i inkubiran 15 min na sobnoj temperaturi. 4) Uzorak je centrifugiran na 12 000 x g, 15 min, 4°C i zatim je vodena faza, koja sadrţi RNK, preneta u novu mikroepruvetu. 5) Vodenoj fazi je dodato 500 μl izopropanola (na 1 ml TRI Reagent Solution), uzorak je vorteksovan umerenom brzinom 10 sec i inkubiran na sobnoj temperaturi 10 min, kako bi RNK precipitirala. 6) Uzorak je centrifugiran na 12 000 x g, 8 min, 4°C i zatim je odbaĉen supernatant: na dnu mikroepruvete je zapaţen beli talog RNK. 7) Talog RNK je ispran dodavanjem 1 ml 75% etanola (na 1 ml TRI Reagent Solution- a) pripremljenog sa vodom tretiranom DEPC-om. 8) Uzorak je centrifugiran na 7 500 x g, 5 min, 4°C. 9) Uklonjen je sav etanol, pomoću mikropipete sa tankim nastavkom. 10) Talog RNK je osušen na vazduhu, 5-10 min. 11) Talog RNK je rastvoren u 20 μl vode tretirane DEPC-om, provlaĉenjem sadrţaja nekoliko puta kroz nastavak mikropipete i inkubacijom 10 min na 55-60°C. 12) Uzorci izolovane RNK su ĉuvani na -70°C. 3.2.12. Merenje koncentracije i provera kvaliteta izolovane RNK Koncentracija i ĉistoća uzoraka ukupne ćelijske RNK odreĊene su spektrofotometrijski, na aparatu BioSpec-nano. Koncentracija uzoraka RNK je izmerena i vrednosti su izraţene u ng/μl. Merenje apsorbancije RNK na 260nm i 280nm korišćeno je za utvrĊivanje ĉistoće uzoraka. Ĉistoća uzoraka RNK je bila zadovoljavajuća, jer su imali odnos A260/A280 u opsegu 1,8-2,2. Kvalitet i integritet ukupne ćelijske RNK provereni su elektroforezom uzoraka na ĉipu, primenom kita 77 RNA 6000 Nano Kit (Agilent) na aparatu 2100 Bioanalyzer (Agilent). Kvalitet testiranih uzoraka je bio zadovoljavajući, pošto su na elektroforetogramima bile jasno uoĉljive frakcije ukupne ćelijske RNK a vrednosti parametra RIN (skr. od engl. RNA Integrity Number), koji je pokazatelj integriteta RNK, iznosile proseĉno 8-9 u ukupnom opsegu vrednosti od 0 do 10. 3.2.13. Obrada uzoraka RNK dezoksiribonukleazom I (DNKazaI) Uzorci izolovane RNK su obradjeni dezoksiribonukleazom I pre reakcije reverzne transkripcije, kako bi se uklonili jednolanĉani i dvolanĉani molekuli DNK. DNKazaI je endonukleaza koja se aktivira u prisustvu jona Mg ++ i, seĉenjem lanaca, digestira jednolanĉane i dvolanĉane molekule DNK. Reagensi DNAseI (DNKaza I) (Fermentas) 10x DNAseI reakcioni pufer sa MgCl2 (100mM Tris-HCl (pH 7.5 na 25 °C), 25mM MgCl2, 1mM CaCl2) (Fermentas) 25mM EDTA (Fermentas) Voda tretirana DEPC-om Protokol 1) Za svaki uzorak RNK napravljena je smeša prikazana u tabeli M9, na ledu. U svakoj seriji uzoraka bila je prisutna negativna kontrola koja sadrţi sve komponente iz tabele M9 osim RNK umesto koje je dodata odgovarajuća zapremina vode tretirane DEPC-om. Tabela M9. Komponente reakcione smeše za tretman RNK enzimom DNKaza I. 10 x DNAseI Buffer 1 μl RNK 0,5 μg * DNAseI (1U/μl) 1 μl (1U) Voda tretirana DEPC-om do ukupne zapremine smeše 10 μl 78 * Zapremina uzorka RNK koja sadrţi 0,5 μg izraĉunava se kao: 0,5 μg / [RNK] (μg/μl). 2) Smeša je inkubirana na 37°C, 30 min (optimalni uslovi za digestiju DNK). 3) Smeši na ledu je dodato 1 μL 25mM EDTA, u cilju hemijske inaktivacije DNKazeI. 4) Smeša je inkubirana na 65°C, 10 min, radi termiĉke inaktivacije DNKazeI. 5) Smeša je ostavljena na ledu 1 min. 6) Smeša je kratko centrifugirana i dalje korišćena za reverznu transkripciju. 3.2.14. Reverzna transkripcija (RT) uzoraka RNK, nakon tretmana DNKazomI Reverzna transkripcija (RT) je reakcija katalizovana enzimom reverznom transkriptazom koja sintetiše molekule jednolanĉane DNK (cDNK), koristeći molekul RNK kao matricu. Poput DNK polimeraza, i ovaj enzim sintetiše lanac nukleinske kiseline (cDNK) dodavanjem nukleotida na oligonukleotidni amplimer koji je komplementaran lancu nukleinske kiseline molekula matrice (RNK) sa kojim hibridizuje. Za RT u ovom radu korišćen je oligo-dT amplimer, zato što omogućava selektivnu reverznu transkripciju poli(A)+ frakcije RNK, koja je od interesa za dalju kvantitativnu analizu genske ekspresije Real-time PCR metodologijom. Reagensi Oligo(dT)18 amplimer (0,5 g/l) (Fermentas) dNTP mix (10 mM) (Fermentas) RiboLock (40U/l) (Fermentas) 5x RT Buffer (Fermentas) RevertAid Premium Reverse Transcriptase (200 U/l) (Fermentas) Voda tretirana DEPC-om Protokol Reakciona smeša je pripremljena na ledu, a njene komponente su prikazane u tabeli M10. 79 Tabela M10. Komponente smeše za reakciju reverzne transkripcije. 1) Smeši sa RNK (11 μl uzorka iz tretmana DNKazomI) dodat je amplimer oligo(dT)18, promešana je i kratko centrifugirana. 2) Smeša je inkubirana na 70°C 5 min (pogodno za RNK koje su GC-bogate ili sa sekundarnom strukturom), pa stavljena na led. 3) Smeši su dodate ostale komponente reakcije: 5x reakcioni pufer, 10mM dNTPs, ribonukleazni inhibitor, DEPC-om tretirana voda i reverzna transkriptaza. Sve zajedno je promešano i kratko centrifugirano. 4) Smeša je inkubirana na 50°C 30 min (optimalni uslovi za reakciju reverzne transkripcije). 5) Reakcija je zaustavljena zagrevanjem smeše na 85°C 5 min, pa zatim hlaĊenjem na ledu. 6) Dobijeni produkt cDNK je odmah korišćen za Real-time PCR, ili je ĉuvan na -20°C ili dugotrajno na -70°C, pre analize. Komponente smeše za reverznu transkripciju Zapremina Smeša posle tretmana 0,5 g totalne RNK enzimom DNKaza I (prikazana u protokolu za obradu RNK dezoksiribonukleazom I) 11 l Oligo(dT)18 amplimer (0,5 g/l) 1 l (100 pmol) Reakcioni pufer, 5x RT buffer 4 l dNTPs (10 mM) 1 l (0,5 mM) Ribonukleazni inhibitor, RiboLock (40U/l) 0,5 l (20U) Reverzna transkriptaza, RevertAid Premium RT (200 U/l) 1 l (200U) DEPC-om tretirana voda 1,5 l Ukupno 20 l 80 3.2.15. OdreĊivanje nivoa relativne ekspresije gena za hemokine CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore, CX3CR1 i CXCR6, metodom PCR u realnom vremenu (Real-time PCR) PCR u realnom vremenu (engl. Real-time PCR) je kvantitativna PCR metoda koja omogućava najpreciznije odreĊivanje koliĉine prisutnih cDNK dobijenih reverznom transkripcijom odgovarajućih iRNK. Precizna kvantifikacija je rezultat praćenja toka PCR reakcije, pri ĉemu se koliĉina ciljne cDNK odreĊuje na osnovu vremenskog trenutka detektovanja njene amplifikacije, a ne na osnovu koliĉine produkta na kraju PCR reakcije. Vremenski trenutak detektovanja amplifikacije ciljne sekvence odgovara ulasku u eksponencijalnu fazu reakcije PCR, tj. onom broju ciklusa na kome se detektuje fluorescentni signal koji prelazi prag (engl. treshold) i koji se oznaĉava kao Ct (engl. treshold Cycle). Relativna kvantifikacija genske ekspresije definiše razliku nivoa ekspresije ciljne iRNK (cDNK) u ispitivanom uzorku u odnosu na odgovarajući kontrolni uzorak. Pritom se nivoi ekspresije ciljnog gena u ispitivanom uzorku u odnosu na kontrolni normalizuju na izmerene nivoe odgovarajućeg stabilno eksprimiranog kontrolnog gena (endogene kontrole) u njima. U ovom radu, za odreĊivanje nivoa relativne ekspresije gena za hemokine i njihove receptore korišćeni su odgovarajući TaqMan® komercijalni eseji za gensku ekspresiju, ĉije su karakteristike prikazane u tabeli M11. TaqMan® eseji za gensku ekspresiju bazirani su na 5’ nukleaznoj hemiji koja koristi TaqMan® MGB probe. Svaki esej ĉine set amplimera i specifiĉna TaqMan® MGB proba obeleţena fluorescentnom bojom na 5’ kraju i dizajnirana tako da se za ciljnu sekvencu vezuje izmeĊu mesta vezivanja dva specifiĉna amplimera. Na taj naĉin se postiţe maksimalna specifiĉnost detektovanja amplifikacije sekvence od interesa. Merenjem povećanja fluorescence nakon dostizanja ciklusa na kome se detektuje fluorescentni signal koji prelazi prag (Ct), procenjuje se koliĉina sintetisanog amplikona. Dizajn i validacija eseja uraĊeni su od strane proizvoĊaĉa (Applied Biosystems). Reagensi - Komercijalni eseji za gensku ekspresiju: TaqMan® Gene Expression Assay (20x) (Applied Biosystems) (Tabela M11) 81 - Smeša komponenata reakcije: TaqMan® Gene Expression Master Mix (2x) (AmpliTaq Gold® DNK polimeraza, uracil-DNK glikozilaza, dNTPs sa dUTP, pasivna referenca Rox) (Applied Biosystems) - Voda bez nukleaza: Nuclease-Free Water (Ambion) Tabela M11. Karakteristike eseja korišćenih za detekciju i kvantifikaciju transkripata ciljnih gena. Oznaka gena Oznaka eseja NCBI pristupni br. sekvence transkripta Granica egzona (pozicija probe) Dužina amplikona, bp CX3CL1 Hs00171086_m1 NM_002996.3 1-2 72 CXCL16 Hs01055223_g1 NM_001100812.1 NM_022059.2 2-3 62 CX3CR1 Hs01922583_s1 NM_001171174.1 NM_001171172.1 NM_001171171.1 NM_001337.3 2-2 162 CXCR6 Hs01890898_s1 NM_006564.1 2-2 152 GAPDH Hs99999905_m1 NM_002046.3 3-3 122 PPIA (CYCLA) Hs99999904_m1 NM_021130.3 4-4 98 18S rRNK Hs99999901_s1 X03205.1 - 187 Oznaka eseja: Hs: vrsta za koju je dizajniran esej (Hs - Homo sapiens), Broj od 8 cifara: identifikacija eseja, _m1: esej koji pokriva granicu izmedju dva egzona, visokospecifiĉan za ciljnu iRNK _g1: esej kojim se pored ciljne iRNK mogu detektovati i sekvence genomske DNK (ukoliko nije uraĊen tretman DNKazom) _s1: esej koji se nalazi u okviru jednog egzona- pored ciljne iRNK mogu se detektovati i sekvence genomske DNK (ukoliko nije uraĊen tretman DNKazom) 82 Protokol Za svaki od analiziranih gena za hemokine, njihove receptore i endogene kontrole, komponente za Real-time PCR prikazane su u tabeli M12. U svakoj reakciji, finalne koncentracije TaqMan PCR smeše (TaqMan® Gene Expression Master Mix) i odgovarajućeg TaqMan eseja (TaqMan® Gene Expression Assay) bile su 1x. Sinteza amplikona je definisana ciklusom u kome je prvi put detektovan fluorescentni signal koji prelazi prag (Ct). Svaki uzorak analiziran je u duplikatu. Temperaturni uslovi Real- time PCR za svaki analizirani gen prikazani su u tabeli M13. Kao endogene kontrole korišćeni su geni za: gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH), peptidilprolil izomerazu A/ ciklofilin A (PPIA/CYCLA) i 18S ribozomalnu RNK (18S rRNK). Od tri analizirane, za normalizaciju rezultata relativne ekspresije ciljnih gena iskorišćena je ona endogena kontrola koja je najstabilnije eksprimirana unutar i izmeĊu ispitivanih ciljnih grupa kontrola i pacijenata. Tabela M12. Komponente Real-time PCR za relativnu kvantifikaciju transkripata ciljnih gena. Komponente za Real-time PCR Zapremina, µl TaqMan® Gene Expression Master Mix (2x) 6,25 (1x) TaqMan® Gene Expression Assay (20x) 0,625 (1x) Razblaţenje cDNK (produkt RT razblaţen u odnosu 1:2,5, za reakciju RT iz 0,5 µg RNK) 2,5 Voda bez nukleaza (Nuclease-Free Water) 3,125 Ukupno 12,5 µl 83 Tabela M13. Temperaturni uslovi Real-time PCR za relativnu kvantifikaciju transkripata ciljnih gena. Broj ciklusa Faza reakcije Temperatura (C) Vreme trajanja faze (min) 1 UNG aktivacija 50 2 1 Inicijalna denaturacija 95 10 40 Denaturacija + 95 0,25 Hibridizacija amplimera i probe, i elongacija 60 1 3.2.16. Statistiĉka obrada podataka Frekvencije genotipova i alela odreĊene su metodom prebrojavanja (engl. gene counting method). Za ispitivanje slaganja distribucija dobijenih frekvencija genotipova u populaciji, sa oĉekivanim vrednostima po Hardy-Weinberg (HW) ravnoteţi, primenjen je 2 test. Analiza razlike u distribuciji genotipova i alela izmeĊu posmatranih grupa uraĊena je Pearsonovim χ2 testom. Normalna distribucija vrednosti kontinualnih varijabli testirana je Kolmogorov-Smirnovim testom. Relacija izmeĊu vrednosti kategorijskih i kontinualnih varijabli testirana je analizom varijanse (ANOVA) ukoliko su vrednosti kontinualnih varijabli bile u normalnoj raspodeli, ili primenom Kruskal-Wallis neparametrijske ANOVA-e ukoliko vrednosti kontinualnih varijabli nisu bile u normalnoj raspodeli. Za utvrĊivanje razlike srednjih vrednosti kontinualnih varijabli koje su bile u normalnoj raspodeli korišćen je Studentov t–test za nezavisne uzorke, ili neparametrijski Mann-Whitney U test za kontinualne varijable ĉije vrednosti nisu bile u normalnoj raspodeli. Vrednosti fenotipskih varijabli predstavljene su kao brojevi i procenti, ili kao srednja vrednost sa standardnom devijacijom (±SD). UtvrĊivanje asocijacije genotipova sa fenotipom raĊeno je regresionom analizom. Mera asocijacije genotipova sa fenotipom od interesa izraţena je kao odnos šansi, OR (engl. Odds Ratio), sa intervalom pouzdanosti 95% (±95% CI, engl. Confidence Interval). U svim statistiĉkim testovima, vrednost verovatnoće p<0,05 smatrana je znaĉajnom. Sve 84 statistiĉke analize genotipskih podataka i analize asocijacije genotip-fenotip uraĊene su korišćenjem programa Statistica 8.0 Software. Genski lokusi ĉiji su aleli u meĊusobnoj korelaciji su nestohastiĉki asocirani usled smanjene uĉestalosti rekombinacija u regionu u kome se lokusi nalaze, a statistiĉka mera njihove asocijacije je tzv. neravnoteţa vezanosti (LD, skr. od engl. Linkage Disequilibrium). LD se odreĊuje za populaciju koja je u HW ravnoteţi. LD se izraĉunava na osnovu odstupanja procenjenih relativnih frekvencija haplotipova od njihovih oĉekivanih teorijskih vrednosti (kada se pretpostavlja da su aleli nezavisni), što se predstavlja vrednostima statistiĉkog parametra D’, koeficijenta korelacije r2 i empirijske verovatnoće (P) asocijacije parova SNPs, koje su izvedene iz višestrukih permutacija genotipskih podataka (Devlin i sar., 1995). Vrednost D’=1 pokazuje apsolutnu statistiĉku asocijaciju ispitivanih alela, tj. apsolutni LD. Za analizu LD polimorfizama V249I i T280M gena za CX3CR1 i I123T i A181V gena za CXCL16, korišćen je kompjuterski program JLIN (Carter i sar., 2006), baziran na algoritmu makismalnog predviĊanja tzv. EM (skr. od engl. Expectation Maximization) algoritmu koji omogućava razlaganje dvostrukih heterozigota na haplotipove (Excoffier, 1995) i izraĉunavanje dvostrukih LD izmeĊu markera (Devlin i sar., 1995). Haplotip predstavlja specifiĉnu kombinaciju alela koji su u LD. Za analizu haplotipova polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 korišćen je kompjuterski program Thesias (v3.1), baziran na SEM (skr. od engl. Stochastic Expectation Maximization) algoritmu (Tregouet i sar., 2004). Thesias omogućava procenu frekvencija haplotipova kod individua na osnovu genotipova dvoalelskih SNPs i analizu asocijacije haplotipova sa fenotipovima i ishodima od interesa. Mogu se analizirati razliĉiti modeli definisani izborom ishoda od interesa, kao i efekti svih ili pojedinaĉnih haplotipova, uz ukljuĉivanje kovarijata kao faktora u odnosu na koje treba korigovati dobijeni rezultat. Analiza asocijacije haplotipova sa fenotipom postiţe se regresionom analizom. Testiranje efekata haplotipova (ĉija je uĉestalost veća od 5%) na fenotip od interesa determiniše efekat pojedinaĉnih reĊih haplotipova u odnosu na najĉešći haplotip. Mera asocijacije haplotipa sa fenotipom od interesa izraţena je kao odnos šansi (OR) sa intervalom pouzdanosti 95% (±95% CI). PredviĊanje efekata koje polimorfizmi u CX3CR1 (V249I i T280M) i CXCL16 (I123T i A181V) mogu imati na interakciju CX3CL1-CX3CR1 odnosno CXCL16- 85 CXCR6, uraĊeno je bioinformatiĉkom analizom zasnovanom na metodi informacionih spektara (engl. Information Spectrum Method, skr. ISM) (Veljković i sar., 2007). Da bi se dobio informacioni spektar (IS) za svaki od analiziranih proteina, aminokiselinska sekvenca proteina je prvo transformisana u numeriĉki niz. Pritom, svaka aminokiselina je predstavljena preko vrednosti potencijala interakcije elektron-jon (engl. Electron-Ion Interaction Potential, skr. EIIP), koja odgovara srednjem energetskom stanju svih valentnih elektrona u toj aminokiselini. Vrednost EIIP za svaku aminokiselinu je izraĉunata po generalnom modelu pseudopotencijala: ‹k + q|w|k› = 0.25Zsin(π1,04Z) / (2π), gde je q promena momenta delokalizovanog elektrona koji interaguje sa potencijalom w, a Z=(ΣZi)/n gde je Zi broj valentnih elektrona i-tog atoma aminokiseline, dok n predstavlja ukupan broj atoma aminokiseline. Primenom diskretne Furijeove transformacije numeriĉki niz aminokiselina svakog proteina je pretvoren u frekvencijski domen, kako bi se kreirao IS. Diskretna Furijeova transformacija je definisana kao: X(n) = Σx(m)e-j(2/N)nm, n = 1, 2, ..., N/2, gde je x(m) m-ti ĉlan datog numeriĉkog niza, N je ukupan broj ĉlanova niza, a X(n) predstavlja koeficijente transformacije. Koeficijenti diskretne Furijeove transformacije opisuju amplitudu, fazu i frekvenciju sinusoida originalnih signala. Apsolutna vrednost kompleksne Furijeove transformacije definiše spektre amplitude i faze u kojima je sadrţana kompletna informacija o originalnoj sekvenci. Prilikom analize proteinske sekvence, relevantnu informaciju obezbeĊuje spektar energetske gustine definisan kao: S(n) = X(n)X(n) = |X(n)| 2, n = 1, 2, ..., N/2. Na ovaj naĉin pojedinaĉne sekvence su posmatrane kao diskretni signali. Pošto je rastojanje izmeĊu aminokiselinskih rezidua u polipeptidnom lancu konstantno i iznosi oko 3,8°A, pretpostavljeno je da su taĉke unutar numeriĉkog niza na jednakom rastojanju. To rastojanje (d) je arbitrarno odreĊeno da bude 1, pa maksimalna frekvencija u spektru iznosi F = 1/2 d = 0,5. U cilju izdvajanja zajedniĉkih spektralnih karakteristika dve sekvence, matematiĉko filtriranje je uraĊeno mnoţenjem kompleksne Furijeove transformacije Furijeovom transformacijom ciljnog signala: C(n) = S1(n)S2(n), n = 1, 2, ..., N/2. Rezultat je „kros-spektralna” (engl. Cross-Spectrum, skr. CS) funkcija. Najviši pik u CS funkciji oznaĉava zajedniĉku frekvencijsku komponentu analiziranih proteina. Prema konceptu ISM analize, aminokiselinske varijante u sekvenci proteina koje dovode do promene amplitude na toj karakteristiĉnoj zajedniĉkoj frekvenciji utiĉu na efikasnost interakcije analiziranih proteina. 86 Izbor optimalne endogene kontrole za normalizaciju rezultata relativne ekspresije gena za hemokine i njihove receptore postignut je uz pomoć analize profila amplifikacije i primene kompjuterskog programa NormFinder v19 (Excel add-in NormFinder.xla) (Jensen i sar., 2009). NormFinder je algoritam baziran na matematiĉkom modelu genske ekspresije, koji koristi statistiĉki pristup za procenu variranja ekspresije ispitivanih endogenih kontrola unutar svake pojedinaĉne grupe uzoraka (npr. samo pacijenata, tj. samo kontrola), kao i izmeĊu ciljnih grupa uzoraka (npr. pacijenata i kontrola) (Andersen i sar., 2004). Ct vrednosti ekspresije endogenih kontrola, koje su dobijene u Real-time PCR, treba transformisati u linearni opseg kvantiteta metodom standardne krive ili ΔCt metodom, pošto program zahteva da ulazni podaci budu u linearnom opsegu. Primenjeni matematiĉki model zahteva da u analizu bude ukljuĉeno najmanje tri gena i dva uzorka, po grupi. Rezultati analize u programu NormFinder odreĊuju stabilnost ekspresije gena na osnovu vrednosti za stabilnost (engl. stability value). Najmanja „stability value“ odgovara najmanjoj vrednosti varijanse (unutargrupne i meĊugrupne) i njome je definisan najstabilnije eksprimirani gen kao optimalna endogena kontrola i najstabilnije eksprimirani par gena kao optimalna kombinacija endogenih kontrola, unutar svake pojedinaĉne grupe uzoraka i izmeĊu grupa. Naime, najstabilniju gensku ekspresiju definišu najmanje i meĊusobno najpribliţnije vrednosti proseĉne unutargrupne varijanse (proseĉna vrednost dobijena na osnovu varijansi svih anliziranih pojedinaĉnih grupa) i meĊugrupne varijanse, za odgovarajući gen odnosno par gena. Za odreĊivanje nivoa relativne ekspresije gena za hemokine i njihove receptore, u odgovarajućoj ciljnoj grupi u odnosu na kontrolnu, primenjene su formule iz Zimmermann i sar., 2003: MNE = (Eendogena kontrola) srCt endogena kontrola / (Eciljni gen) srCt ciljni gen , pri ĉemu MNE (skr. od engl. Mean Normalized Expression) predstavlja srednju normalizovanu ekspresiju ciljnog gena u pojedinaĉnom uzorku, E je efikasnost PCR amplifikacije endogene kontrole/ciljnog gena, srCt je srednja vrednost Ct duplikata pojedinaĉnog uzorka pri amplifikaciji endogene kontrole/ciljnog gena; SEMNE = MNE * [(lnEendogena kontrola * SEsrCt endogena kontrola) 2 + (lnEciljni gen * SEsrCt ciljni gen) 2 ] 1/2 , 87 pri ĉemu SEMNE (skr. od engl. Standard Error of Mean Normalized Expression) predstavlja standardnu grešku srednje normalizovane ekspresije ciljnog gena u pojedinaĉnom uzorku, MNE (skr. od engl. Mean Normalized Expression) predstavlja srednju normalizovanu ekspresiju ciljnog gena u pojedinaĉnom uzorku, E je efikasnost PCR amplifikacije endogene kontrole/ciljnog gena, SEsrCt je standardna greška srednje vrednosti Ct duplikata pojedinaĉnog uzorka pri amplifikaciji endogene kontrole/ciljnog gena. Pošto TaqMan® eseji za gensku ekspresiju imaju efikasnost amplifikacije od 100% tj. Eendogena kontrola= Eciljni gen= 2 (Applied Biosystems, 2004), gore navedene formule postaju: MNE = 2 srCt endogena kontrola / 2 srCt ciljni gen = 2 (srCt endogena kontrola − srCt ciljni gen) = = 2 − (srCt ciljni gen − srCt endogena kontrola) = 2 −ΔCt , SEMNE = MNE * [(ln2 * SEsrCt endogena kontrola) 2 + (ln2 * SEsrCt ciljni gen) 2 ] 1/2 . Izraĉunate vrednosti MNE uzoraka uporeĊene su izmeĊu analiziranih grupa, primenom Mann-Whitney U testa. U ovom testu vrednosti p<0,05 predstavljale su statistiĉki znaĉajnu razliku relativne ekspresije ciljnog gena u ispitivanoj grupi uzoraka, u odnosu na kontrolnu grupu. Dobijeni rezultati relativne genske ekspresije su provereni u kompjuterskom programu REST08 (Relative Expression Software Tool 2008) v 2.0.7 (Pfaffl i sar., 2002), na osnovu odgovarajućih ulaznih vrednosti: Ct i efikasnosti PCR amplifikacije za svaki ispitivani gen i endogenu kontrolu u okviru ispitivanih grupa uzoraka. Cilj primene programa REST08 je da se utvrdi da li postoji znaĉajna razlika u ekspresiji odgovarajućeg gena izmeĊu grupe ispitivanih uzoraka i grupe kontrola, uzimajući u obzir efikasnost reakcije i normalizaciju na referentni gen-endogenu kontrolu. Rezultati statistiĉke analize u ovom programu su relativni nivoi ekspresije gena prikazani tabelarno i grafiĉki kao srednje vrednosti sa dva intervala standardne greške i njima odgovarajućim intervalom pouzdanosti 95% (95% CI). Testiranjem hipoteze provereno je da li je rezultat statistiĉki znaĉajan, na osnovu vrednosti p (p<0,05 predstavlja znaĉajnu razliku). 88 4. REZULTATI 4.1. Asocijacija polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 sa nastankom i progresijom multiple skleroze 4.1.1. Detekcija genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 a) 89 b) Slika R1. Prikaz rezultata metode za detekciju polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 zasnovane na PIRA PCR-RFLP analizi: determinacija genotipova oba polimorfizma na 8% poliakrilamidnom gelu obojenom srebronitratom (a), prema oĉekivanoj duţini restrikcionih fragmenata (b). OdreĊivanje genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na 8% poliakrilamidnom gelu obojenom srebronitratom, prema oĉekivanoj duţini restrikcionih fragmenata, prikazana je na slici R1, a) i b). Metoda za detekciju ovih polimorfizama, koja je zasnovana na PIRA PCR-RFLP analizi, detaljno je opisana u poglavlju: 3.2.7. Genotipovi polimorfizama V249I i T280M Dužine restrikcionih fragmenata (PCR-RFLP), bp II / MM (PCR produkt) 294 II / TM 294 + 270 II / TT 270 VV / TT 175 + 95 VV / TM 175 + 119 + 95 VV / MM 175 + 119 VI / MM 294 + 175 + 119 VI / TT 270 + 175 + 95 VI / TM 294 + 270 + 175 + 119 + 95 90 4.1.2. Analiza efekata genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na nastanak i progresiju multiple skleroze Tabela R1. Opis ciljne grupe kontrola i pacijenata. Vrednosti kontinualnih parametara su predstavljene kao srednja vrednost  standardna devijacija (SD); n-ukupan broj kontrola/pacijenata, RR MS - pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP MS - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom, PP MS - pacijenti sa primarno-progresivnim tokom multiple skleroze. U tabeli R1 su prikazani relevantni parametri za kontrolnu grupu (pol, starost) i grupu pacijenata sa multiplom sklerozom (pol, starost, starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS), u okviru kojih su odreĊeni genotipovi polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1. Srednja vrednost godina starosti kontrola i pacijenata iznosi oko 40. U grupi pacijenata broj ţena je oko 1,6 puta veći nego muškaraca, što potvrĊuje opšti trend veće uĉestalosti bolesti u ţenskom polu. U statistiĉku analizu efekata alela, genotipova i haplotipova genskih polimorfizama nisu ukljuĉeni pacijenti sa PP tokom bolesti, zbog njihove male brojnosti (n=12). Parametar Kontrole (n =278) RR MS (n = 319) SP MS (n =66) PP MS (n =12) RR+SP MS (n =385) Pol (žene/muškarci) 147/131 204/115 39/27 6/6 243/142 Starost (godine) 40,9  15,0 35,1  9,3 42,4  10,5 46,3  8,1 36,4  9,9 Starost na poĉetku bolesti (godine) - 28,5  8,2 29,9  9,2 43,2  8,3 28,7  8,4 Trajanje bolesti (godine) - 6,7  5,5 12,7  6,7 3,1  2,2 7,8  6,2 EDSS - 2,6  1,2 5,9  1,7 3,4  1,7 3,1  1,8 MSSS - 4,8  2,3 7,0  2,6 6,7  2,1 5,2  2,5 91 Tabela R2. Frekvencije genotipova i alela polimorfizama u genu za CX3CR1 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom, i vrednosti kliniĉkih parametara kod pacijenata nosilaca razliĉitih genotipova ispitivanih polimorfizama: a) distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom Genotipovi polimorfizma Kontrole n (%) Pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p (2) V249I 278 385 VV 134 (48,2) 174 (45,2) referentni genotip VI 125 (45,0) 176 (45,7) 1,08 (0,78-1,49) 0,65 0,25 II 19 (6,8) 35 (9,1) 1,42 (0,78-2,59) Alel I 0,29 0,32 1,14 (0,89-1,46) 0,30 T280M 278 385 TT 186 (66,9) 239 (62,1) referentni genotip TM 78 (28,1) 129 (33,5) 1,28 (0,91-1,79) 0,16 0,88 MM 14 (5,0) 17 (4,4) 0,94 (0,45-1,97) Alel M 0,19 0,21 1,13 (0,86-1,48) 0,37 n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata, RR - pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti, OR - “odds ratio” (odnos šansi), CI - “confidence interval” (interval pouzdanosti); 92 b) distribucija vrednosti kliniĉkih parametara (starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS) kod pacijenata (RR i SP) nosilaca odgovarajućih genotipova polimorfizama V249I i T280M Genotipovi polimorfizma V249I Starost na poĉetku bolesti (godine) Trajanje bolesti (godine) EDSS MSSS VV 29,9 ± 8,8 7,4 ± 6,3 3,2 ± 1,7 5,4 ± 2,5 VI 28,7 ± 9,1 7,8 ± 5,4 3,2 ± 1,9 5,3 ± 2,4 II 29,8 ± 8,1 6,9 ± 4,9 2,8 ± 1,9 4,9 ± 2,9 p (Kruskal-Wallis ANOVA) 0,43 0,35 0,44 0,76 Genotipovi polimorfizma T280M Starost na poĉetku bolesti (godine) Trajanje bolesti (godine) EDSS MSSS TT 29,6 ± 8,8 7,4 ± 6,3 3,1 ± 1,8 5,3 ± 2,6 TM 28,6 ± 8,8 7,7 ± 4,8 3,2 ± 2,0 5,2 ± 2,4 MM 31,5 ± 9,7 8,2 ± 5,2 3,5 ± 2,1 6,0 ± 2,7 p (Kruskal-Wallis ANOVA) 0,54 0,27 0,85 0,69 vrednosti kliniĉkih parametara su predstavljene kao srednja vrednost  standardna devijacija; 93 c) distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama V249I i T280M kod pacijenata sa RR i SP tokom multiple skleroze Genotipovi polimorfizma Pacijenti RR n (%) Pacijenti SP n (%) OR (±95%CI) p (2) V249I 319 66 VV 144 (45,3) 36 (54,0) referentni genotip VI 140 (43,8) 28 (42,9) 0,80 (0,46-1,38) 0,42 0,05 II 35 (10,9) 2 (3,1) 0,23 (0,05-0,99) Alel I 0,33 0,24 0,65 (0,42-1,00) 0,05 T280M 319 66 TT 201(62,9) 42 (63,5) referentni genotip TM 102 (31,6) 23 (34,9) 1,08 (0,61-1,89) 0,79 0,25 MM 16 (5,5) 1 (1,6) 0,30 (0,04-2,32) Alel M 0,21 0,19 0,88 (0,55-1,41) 0,60 n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata, RR - pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti, OR- “odds ratio” (odnos šansi), CI - “confidence interval” (interval pouzdanosti). Na osnovu rezultata 2 testa utvrĊeno je da se frekvencije genotipova i alela polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 ne razlikuju znaĉajno izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa multiplom sklerozom (p>0,05) (tabela R2 a)), tj. da ova dva polimorfizma nisu genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze. Nema odstupanja od ravnoteţe po Hardy-Weinberg-u za analizirane polimorfizme (2, p>0,05). Nema znaĉajnih razlika u frekvencijama genotipova i alela ovih polimorfizama prema polu - niti izmeĊu ţena i muškaraca kontrola, odnosno pacijenata, niti unutar svakog pojedinaĉnog pola izmeĊu kontrola i pacijenata (2, p>0,05) (rezultati nisu prikazani). U analiziranoj grupi pacijenata srednje vrednosti kliniĉkih parametara, kao što su: starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS, ne razlikuju se znaĉajno izmeĊu nosilaca razliĉitih genotipova polimorfizama V249I i T280M (Kruskal-Wallis ANOVA, p>0,05) (tabela R2 b)). Nema znaĉajne razlike uĉestalosti 94 genotipova i alela polimorfizama V249I i T280M izmeĊu pacijenata sa relapsno- remitentnim (RR) i sekundarno-progresivnim (SP) tokom multiple skleroze (tabela R2 c)), mada postoji trend da pacijenti nosioci genotipa II (u odnosu na nosioce ĉešćeg homozigota, VV, kao referentnog) tj. nosioci alela I (u odnosu na nosioce ĉešćeg alela, V) imaju manju šansu za progresiju RR u SP formu multiple skleroze (2, p=0,05; OR±95%CI ≤ 1) (tabela R2 c)). 4.1.3. Analiza efekata haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na nastanak i progresiju multiple skleroze Tabela R3. Procena distribucije haplotipova polimorfizama u genu za CX3CR1 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom: a) distribucija haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom n (%)- ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata, RR-pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP-pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti, OR-“odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti); Haplotipovi polimorfizama Kontrole n (%) Pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p ( 2 ) V249I i T280M 278 385 V249T280 195 (70,09) 260 (67,61) referentni haplotip I249M280 50 (18,48) 80 (20,73) 1,16 (0,88-1,54) 0,29 I249T280 31 (10,84) 43 (11,22) 1,09 (0,76-1,58) 0,64 V249M280 2 (0,59) 2 (0,44) - - 95 b) distribucija haplotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 kod pacijenata sa multiplom sklerozom, u odnosu na tok bolesti n (%)- ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata, RR-pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP-pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti, OR-“odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti). Asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost, kada je p<0,05. Izraţen “linkage disequilibrium” postoji izmeĊu polimorfizama V249I i T280M, što je pokazano na osnovu vrednosti statistiĉkog parametra D’ koje su bliske vrednosti 1, a iznose 0,96 u kontrolnoj grupi i 0,97 u grupi pacijenata. Shodno tome, u obe grupe je procenjeno prisustvo tri dominantna haplotipa: V249T280, I249M280, I249T280, i jednog retkog haplotipa, V249M280 (tabela R3 a)). Haplotip V249M280 nije ukljuĉen u analizu, zbog izrazito niske frekvencije (<1%). Efekti haplotipova I249M280 i I249T280 na rizik za nastanak multiple skleroze i sekundarnu progresiju bolesti su procenjeni u odnosu na najĉešći haplotip, V249T280, kao referentni. Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika uĉestalosti ovih haplotipova izmeĊu grupa kontrola i pacijenata (2, p>0,05) (tabela R3 a)), što ukazuje da analizirani haplotipovi polimorfizama V249I i T280M nisu genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze. Haplotip I249T280 ima znaĉajno veću uĉestalost kod pacijenata sa RR tokom bolesti, u odnosu na pacijente sa SP tokom, što znaĉi da pacijenti RR toka koji su nosioci ovog haplotipa (u odnosu na nosioce referentnog haplotipa, V249T280) imaju znaĉajno manju šansu za progresiju bolesti u SP formu (2, p=0,03; OR Haplotipovi polimorfizama Pacijenti RR n (%) Pacijenti SP n (%) OR (±95%CI) p ( 2 ) V249I i T280M 319 66 V249T280 213 (66,74) 49 (74,96) referentni haplotip I249M280 65 (20,28) 13 (19,49) 0,85 (0,50-1,44) 0,54 I249T280 39 (12,37) 4 (5,55) 0,39 (0,17-0,92) 0,03* V249M280 2 (0,61) 0 (0,00) - - 96 (±95%CI)=0,39(0,17-0,92)) (tabela R3 b)). Ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika vrednosti ispitivanih kliniĉkih parametara izmeĊu pacijenata nosilaca razliĉitih haplotipova (rezultati nisu prikazani). 4.1.4. Bioinformatiĉka analiza predviĊanja efekata polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 na interakciju CX3CR1-CX3CL1 Slika R2. Analiza informacionih spektara CX3CR1 i CX3CL1. a) Informacioni spektar (IS) za CX3CR1. b) IS za CX3CL1. c) “Kros-spektralna” (CS) analiza CX3CR1 i CX3CL1: dominantna zajedniĉka frekvencija iznosi 0,037. Vrednosti frekvencije dobijene Furijeovom transformacijom 97 numeriĉkog niza potencijala interakcije elektron-jon (EIIP), koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci proteina, su prikazane na apscisi. Najniţa frekvencija je 0,00, a najviša je 0,50. Vrednosti amplitude su izraţene u arbitrarnim jedinicama koje odgovaraju frekvencijskim komponentama informacionog spektra i prikazane su na ordinati. d) Relativna promena amplitude (ΔA) pri karakteristiĉnoj frekvenciji od 0,037 u informacionim spektrima tri polimorfne varijante CX3CR1, u odnosu na najĉešću varijantu (V249T280). Informacioni spektri (IS) CX3CR1 i CX3CL1 su odreĊeni (slika R2 a) i b)) i, nakon “kros-spektralnog” filtriranja, identifikovana je zajedniĉka Furijeova frekvencija od 0,037 koja je karakteristiĉna za interakciju receptora i liganda (slika R2 c)). OdreĊene su vrednosti amplitude pri karakteristiĉnoj zajedniĉkoj frekvenciji (0,037) za ĉetiri proteinske varijante CX3CR1 koje su kodirane od strane ĉetiri odgovarajuća haplotipa. Nije detektovana znaĉajna promena amplitude (ΔA) na frekvenciji 0,037 za proteinsku varijantu I249M280, u odnosu na najĉešću izoformu V249T280 (ΔA~0,00) (slika R2 d)). Vrednosti ΔA (0,037) za preostale dve varijante, I249T280 i V249M280, se znaĉajno razlikuju u odnosu na V249T280. Najveća promena amplitude je detektovana za I249T280 varijantu CX3CR1 (ΔA = -0,47%) (slika R2 d)). Ovi rezultati ukazuju da potencijalno najjaĉe efekte na interakciju CX3CR1-CX3CL1 imaju varijante CX3CR1 kodirane haplotipovima koji su sastavljeni od po jednog ĉešćeg i jednog reĊeg alela polimorfizama V249I i T280M. 98 4.1.5. Detekcija genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 a) 99 b) Slika R3. Prikaz odreĊivanja genotipova polimorfizama: (a) I123T i (b) A181V, u genu za CXCL16, primenom TaqMan® SNP eseja za genotipizaciju (7500 Real-time PCR system, Applied Biosystems). Prikaz oĉitavanja genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 dat je na slici R3, a) i b). Detaljni opis metode za detekciju ovih polimorfizama, koja je zasnovana na primeni TaqMan® eseja za genotipizaciju, nalazi se u poglavlju: 3.2.9. 100 4.1.6. Analiza efekata genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na nastanak i progresiju multiple skleroze Tabela R4. Opis ciljne grupe kontrola i pacijenata. n - ukupan broj kontrola/pacijenata; RR MS - pacijenti sa relapsno-remitentnim tokom, SP MS - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom, PP MS - pacijenti sa primarno- progresivnim tokom multiple skleroze; vrednosti kontinualnih parametara su predstavljene kao srednja vrednost  standardna devijacija (SD). U tabeli R4 su prikazani relevantni parametri za kontrolnu grupu (pol, starost) i grupu pacijenata sa multiplom sklerozom (pol, starost, starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS, MSSS), u okviru kojih je uraĊena determinacija genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16. Srednja vrednost godina starosti kontrola i pacijenata iznosi oko 40. U grupi pacijenata broj ţena je oko 1,6 puta veći nego muškaraca, što potvrĊuje opšti trend veće uĉestalosti bolesti u ţenskom polu. U statistiĉku analizu efekata alela, genotipova i haplotipova genskih polimorfizama nisu ukljuĉeni pacijenti sa PP tokom bolesti, zbog njihove male brojnosti (n=12). Parametar Kontrole (n =275) RR MS (n =303) SP MS (n =77) PP MS (n =12) RR+SP MS (n =380) Pol (žene/muškarci) 148/150 191/112 48/29 7/5 239/141 Starost (godine) 39,6  10,7 36,4  9,6 43,1  10,4 46,5  9,6 39,7  10,0 Starost na poĉetku bolesti (godine) - 29,5  8,9 29,7  8,7 43,0  10,4 29,6  8,8 Trajanje bolesti (godine) - 7,0  5,5 13,4  7,2 3,5  2,3 10,2  6,3 EDSS - 2,6  1,2 5,8  1,6 3,7  1,7 4,2  1,4 MSSS - 4,2  2,3 6,9  2,1 7,0  2,0 5,5  2,2 101 Tabela R5. Frekvencije genotipova i alela polimorfizama u genu za CXCL16 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom, i vrednosti kliniĉkih parametara kod pacijenata nosilaca odgovarajućih genotipova ispitivanih polimorfizama: a) distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom Genotipovi polimorfizma Kontrole n (%) Pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p (2) I123T 298 380 II 102 (34,2) 100 (26,3) referentni genotip IT 143 (48,0) 199 (52,4) 1,42 (1,00-2,01) 0,049* TT 53 (17,8) 81 (21,3) 1,56 (1,00-2,43) 0,049* Alel T 0,42 0,47 1,26 (1,02-1,56) 0,04* A181V 298 380 AA 102 (34,2) 100 (26,3) referentni genotip AV 144 (48,3) 199 (52,4) 1,41 (0,99-2,00) 0,05 VV 52 (17,5) 81 (21,3) 1,59 (1,02-2,47) 0,04* Alel V 0,42 0,47 1,27 (1,02-1,58) 0,04* n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata; RR - pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti; OR- “odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti); asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost, kada je p<0,05; 102 b) distribucija vrednosti kliniĉkih parametara (starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS) kod pacijenata (RR i SP) nosilaca odgovarajućih genotipova polimorfizama I123T i A181V Genotipovi polimorfizma I123T Starost na poĉetku bolesti (godine) Trajanje bolesti (godine) EDSS MSSS II 30,5 ± 8,9 7,9 ± 5,9 3,2 ± 1,8 5,0 ± 2,6 IT 28,9 ± 8,9 8,4 ± 6,8 3,3 ± 1,9 4,8 ± 2,5 TT 30,2 ± 8,7 8,3 ± 5,8 3,1 ± 1,7 4,5 ± 2,3 p (Kruskal-Wallis ANOVA) 0,27 0,76 0,94 0,46 Genotipovi polimorfizma A181V Starost na poĉetku bolesti (godine) Trajanje bolesti (godine) EDSS MSSS AA 30,5 ± 8,9 7,9 ± 5,9 3,2 ± 1,8 5,0 ± 2,6 AV 28,9 ± 8,9 8,4 ± 6,8 3,3 ± 1,9 4,8 ± 2,5 VV 30,2 ± 8,7 8,3 ± 5,8 3,1 ± 1,7 4,5 ± 2,3 p (Kruskal-Wallis ANOVA) 0,27 0,76 0,94 0,46 vrednosti kliniĉkih parametara su predstavljene kao srednja vrednost  standardna devijacija; 103 c) distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V kod pacijenata sa RR i SP tokom multiple skleroze Genotipovi polimorfizma Pacijenti RR n (%) Pacijenti SP n (%) OR (±95%CI) p (2) I123T 303 77 II 80 (26,4) 20 (26,0) referentni genotip IT 156 (51,5) 43 (55,8) 1,10 (0,61-2,00) 0,75 TT 67 (22,1) 14 (18,2) 0,84 (0,39-1,78) 0,64 Alel T 0,48 0,46 0,93 (0,65-1,33) 0,70 A181V 303 77 AA 80 (26,4) 20 (26,0) referentni genotip AV 156 (51,5) 43 (55,8) 1,10 (0,61-2,00) 0,75 VV 67 (22,1) 14 (18,2) 0,84 (0,39-1,78) 0,64 Alel V 0,48 0,46 0,93 (0,65-1,33) 0,70 n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata; RR - pacijenti sa relapsno- remitentnim tokom, SP - pacijenti sa sekundarno-progresivnim tokom bolesti; OR - “odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti). Frekvencije genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 se znaĉajno razlikuju izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa multiplom sklerozom, što ĉini ova dva polimorfizma genetskim faktorima rizika za nastanak multiple skleroze. Uĉestalosti reĊih alela oba polimorfizma, T i V, kao i genotipova koji ih sadrţe, znaĉajno su veće kod pacijenata u odnosu na kontrole (2, p<0,05), te nosioci navedenih alela i genotipova imaju znaĉajno veću šansu da obole od multiple skleroze (OR±95%CI ≥1) (tabela R5 a)). Nema odstupanja od ravnoteţe po Hardy-Weinberg-u za analizirane polimorfizme (2, p>0,05). U grupi pacijenata (RR i SP) srednje vrednosti kliniĉkih parametara (starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS) se ne razlikuju znaĉajno izmeĊu nosilaca razliĉitih genotipova polimorfizama I123T i A181V (Kruskal-Wallis ANOVA, p>0,05) (tabela R5 b)). Nema znaĉajne razlike uĉestalosti genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V izmeĊu pacijenata 104 sa relapsno-remitentnim (RR) i sekundarno-progresivnim (SP) tokom multiple skleroze (2, p>0,05) (tabela R5 c)). Tabela R6. Frekvencije genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 kod ţena kontrola i ţena pacijenata (RR+SP). Genotipovi Polimorfizma Žene kontrole n (%) Žene pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p (2) I123T 148 239 II 56 (37,8) 57 (23,8) referentni genotip IT 62 (41,9) 135 (56,5) 2,14 (1,33-3,44) 0,002** TT 30 (20,3) 47 (19,7) 0,95 (0,56-1,61) 0,15 IT+TT 92 (62,2) 182 (76,2) 1,94 (1,24-3,04) 0,003** Alel T 0,41 0,48 1,31 (0,98-1,76) 0,07 A181V 148 239 AA 57 (38,5) 57 (23,8) referentni genotip AV 62 (41,9) 135 (56,5) 2,18 (1,35-3,50) 0,001** VV 29 (19,6) 47 (19,7) 1,62 (0,90-2,93) 0,11 AV+VV 91 (61,5) 182 (76,2) 2,00 (1,28-3,12) 0,002** Alel V 0,40 0,48 1,35 (1,01-1,81) 0,045* n (%) - ukupan broj (procenat) ţena kontrola/pacijenata; OR - “odds ratio” (odnos šansi), CI - “confidence interval” (interval pouzdanosti); asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,05, dvostruki asterisk (**) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,01. OdreĊene su frekvencije genotipova i alela polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 kod ţena kontrola i pacijenata (tabela R6) i muškaraca kontrola i pacijenata (rezultati nisu prikazani). Detektovana je znaĉajno veća uĉestalost (2, p<0,05) genotipova koji nose reĊe alele (IT+TT i AV+VV), odnosno heterozigota IT i AV kod ţena pacijenata u odnosu na ţene kontrole. To znaĉi da ţene nosioci ovih 105 genotipova imaju oko dva puta veću šansu (OR~2) da obole od multiple skleroze u odnosu na ţene nosioce referentnih genotipova II i AA (tabela R6). Nema znaĉajnih razlika u srednjim vrednostima kliniĉkih parametara izmeĊu pacijenata nosilaca razliĉitih genotipova polimorfizama I123T i A181V u grupi ţena (rezultati nisu prikazani). U grupi muškaraca pacijenata utvrĊene su veće uĉestalosti genotipova TT i VV u odnosu na grupu muškaraca kontrola, ali nema znaĉajne asocijacije polimorfizama sa nastankom niti sa progresijom multiple skleroze (rezultati nisu prikazani). 4.1.7. Analiza efekata haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na nastanak i progresiju multiple skleroze Tabela R7. Haplotipovi polimorfizama u genu za CXCL16 kod kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom: a) procena distribucije haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 kod kontrola i pacijenata (RR+SP) n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata; OR - “odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti); asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost, kada je p<0,05; Haplotipovi polimorfizama Kontrole n (%) Pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p ( 2 ) I123T i A181V 298 380 I123A181 173 (58,1) 199 (52,5) referentni haplotip T123V181 123 (41,4) 181 (47,5) 1,29 (1,03-1,60) 0,03* T123A181 1 (0,3) 0 (0,0) - - I123V181 1 (0,2) 0 (0,0) - - 106 b) procena distribucije haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 kod ţena n (%) - ukupan broj (procenat) kontrola/pacijenata; OR - “odds ratio” (odnos šansi), CI- “confidence interval” (interval pouzdanosti); asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost, kada je p<0,05. Polimorfizmi I123T i A181V su u apsolutnom “linkage disequilibrium”-u, s obzirom da vrednosti statistiĉkog parametra D’ iznose pribliţno 1, tj. 0,99 u kontrolnoj grupi i 1,00 u grupi pacijenata (rezultati nisu prikazani). Stoga, u obe grupe je procenjeno prisustvo samo dva dominantna haplotipa, I123A181 i T123V181, koji su ukljuĉeni u analizu (tabela R7). Efektat haplotipa T123V181 na rizik za nastanak multiple skleroze je procenjen u odnosu na najĉešći haplotip, I123A181, kao referentni. U odnosu na kontrole, pacijenti imaju znaĉajno veću uĉestalost haplotipa T123V181, što ĉini ovaj haplotip znaĉajnim faktorom rizika za nastanak multiple skleroze. Nosioci haplotipa T123V181 imaju znaĉajno veću šansu da obole, u odnosu na nosioce referentnog haplotipa I123A181 ( 2 , p=0,03; OR(±95%CI)=1,29(1,03-1,60)) (tabela R7 a)). U grupi ţena dobijen je sliĉan rezultat. Ţene nosioci haplotipa T123V181 imaju znaĉajno veću šansu da obole, u poreĊenju sa ţenama nosiocima haplotipa I123A181 ( 2 , p=0,04; OR(±95%CI)=1,36(1,02-1,82)) (tabela R7 b)). U grupi muškaraca pacijenata naĊena je veća uĉestalost haplotipa T123V181 u odnosu na grupu muškaraca kontrola, ali nema znaĉajne asocijacije sa nastankom multiple skleroze (rezultati nisu prikazani). Ne postoji statistiĉki znaĉajna razlika u srednjim vrednostima kliniĉkih parametara izmeĊu Haplotipovi polimorfizama Žene kontrole n (%) Žene pacijenti RR+SP n (%) OR (±95%CI) p ( 2 ) I123T i A181V 148 239 I123A181 87 (58,8) 125 (52,1) referentni haplotip T123V181 60 (40,5) 114 (47,9) 1,36 (1,02-1,82) 0,04* T123A181 1 (0,7) 0 (0,0) - - I123V181 0 (0,0) 0 (0,0) - - 107 nosilaca dvaju razliĉitih haplotipova u okviru cele grupe pacijenata, niti u okviru podgrupa pacijenata ţenskog odnosno muškog pola (rezultati nisu prikazani). 4.1.8. Bioinformatiĉka analiza predviĊanja efekata polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 na interakciju CXCL16-CXCR6 a) b) Slika R4. Analiza informacionih spektara membranskog CXCL16 i CXCR6. CXCL16 varijanta ∆A (0,429) I123A181 0,00 % I123V181 5,37 % T123A181 -13,10 % T123V181 -7,10 % 108 a) “Kros-spektralna” (CS) analiza CXCL16 i CXCR6: dominantna zajedniĉka frekvencija iznosi 0,429. Vrednosti frekvencije dobijene Furijeovom transformacijom numeriĉkog niza potencijala interakcije elektron-jon (EIIP), koji odgovara aminokiselinskoj sekvenci proteina, su prikazane na apscisi u opsegu od 0,0 do 0,5. Vrednosti amplitude su izraţene u arbitrarnim jedinicama koje odgovaraju frekvencijskim komponentama informacionog spektra i prikazane su na ordinati. b) Relativna promena amplitude (ΔA) pri karakteristiĉnoj frekvenciji od 0,429, u informacionim spektrima ĉetiri polimorfne varijante CXCL16. Informacioni spektri membranskog CXCL16 i CXCR6 su odreĊeni, i “kros- spektralnim” filtriranjem je identifikovana zajedniĉka Furijeova frekvencija od 0,429, koja je karakteristiĉna za interakciju liganda i receptora (slika R4 a)). OdreĊene su vrednosti amplitude pri karakteristiĉnoj zajedniĉkoj frekvenciji (0,429) za ĉetiri proteinske varijante CXCL16 koje su kodirane od strane ĉetiri odgovarajuća haplotipa. U odnosu na najĉešću izoformu, I123A181, detektovane su znaĉajne promene amplitude (ΔA) na frekvenciji 0,429 za preostale tri proteinske varijante CXCL16: I123V181, T123A181 i T123V181 (slika R4 b)). 109 4.2. Ekspresija gena za CX3CL1, CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima, u patogenezi multiple skleroze 4.2.1. Izbor optimalne endogene kontrole za normalizaciju rezultata ekspresije ispitivanih ciljnih gena Slika R5. Prikaz amplifikacija iRNK (cDNK) testiranih endogenih kontrola u perifernim mononuklearnim leukocitima, metodom Real-time PCR: GAPDH (ljubiĉasto), CYCLA/PPIA (crno) i 18S rRNK (plavo). 110 Na slici R5 dat je logaritamski prikaz amplifikacije iRNK (cDNK), kao zavisnost delta Rn od broja ciklusa PCR, gena za: GAPDH (ljubiĉasto), CYCLA/PPIA (crno) i 18S rRNK (plavo), u mononuklearnim leukocitima periferne krvi kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, SDS software v1.4). a) 111 b) c) 112 Slika R6. Prikaz amplifikacija iRNK (cDNK) ispitivanih ciljnih gena u mononuklearnim leukocitima periferne krvi, metodom Real-time PCR: a) CX3CR1, b) CXCL16 i c) CXCR6. Na slici R6 prikazani su profili amplifikacije iRNK (cDNK) ciljnih gena za: a) CX3CR1, b) CXCL16 i c) CXCR6, u mononuklearnim leukocitima periferne krvi kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom. Na graficima je logaritamski prikaz amplifikacije, kao zavisnost delta Rn od broja ciklusa PCR. Zelena horizontalna linija predstavlja automatski podešen ”treshold”. Presek ”treshold” linije sa eksponencijalnom fazom krive amplifikacije ciljne sekvence u analiziranom uzorku definiše vrednost Ct (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, SDS software v1.4). Slika R5 i slika R6 prikazuju profile amplifikacije iRNK (cDNK) testiranih endogenih kontrola (GAPDH, CYCLA i 18S rRNK) i ciljnih gena (CX3CR1, CXCL16 i CXCR6), dobijene metodom Real-time PCR, u uzorcima mononuklearnih leukocita periferne krvi kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom. U ispitanim uzorcima je detektovana amplifikacija iRNK svih ciljnih gena, osim gena za CX3CL1. Ispravnost eseja za kvantifikaciju ekspresije gena za CX3CL1 potvrĊena je putem detekcije amplifikacije CX3CL1 iRNK u endotelnim ćelijama iz kulture, pošto je poznato da endotelne ćelije tipiĉno eksprimiraju CX3CL1. Amplifikacija ciljnih iRNK je prikazana kao logaritamska zavisnost delta Rn od broja ciklusa PCR. Rn je “normalizovani reporter”, koji predstavlja intenzitet fluorescentnog signala reporterske boje (kojom je obeleţen 5’ kraj TaqMan® probe) podeljen signalom pasivne referentne boje (ROX). Delta Rn predstavlja razliku Rn vrednosti eksperimentalne reakcije amplifikacije i Rn vrednosti bazalnog signala (engl. baseline) koji generiše instrument. 113 Tabela R8. Izbor optimalne endogene kontrole za normalizaciju rezultata ekspresije ciljnih gena: a) odreĊivanje vrednosti relativne ekspresije (2-ΔCt) gena za GAPDH, u uzorcima perifernih mononuklearnih leukocita, u grupama od po 8 kontrola i pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze; Uzorak Sr. Ct GAPDH ΔCt (sr. Ct − − sr. Ct min. u grupi) 2 -ΔCt GAPDH kontrola 1 21,742 1,982 0,253139 kontrola 2 21,574 1,814 0,284401 kontrola 3 19,871 0,111 0,925946 kontrola 4 20,076 0,316 0,803294 kontrola 5 19,76 0 1 kontrola 6 20,838 1,078 0,473685 kontrola 7 20,094 0,334 0,793334 kontrola 8 20,173 0,413 0,75106 pacijent 1 22,681 1,681 0,311866 pacijent 2 21,798 0,798 0,575146 pacijent 3 21,444 0,444 0,735094 pacijent 4 21,451 0,451 0,731536 pacijent 5 21,356 0,356 0,781328 pacijent 6 21,388 0,388 0,764188 pacijent 7 21 0 1 pacijent 8 21,447 0,447 0,733567 114 b) odreĊivanje vrednosti relativne ekspresije (2-ΔCt) gena za CYCLA, u uzorcima perifernih mononuklearnih leukocita, u grupama od po 8 kontrola i pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze; Uzorak Sr. Ct CYCLA ΔCt (sr. Ct − − sr. Ct min. u grupi) 2 -ΔCt CYCLA kontrola 1 21,403 1,322 0,39998 kontrola 2 21,464 1,383 0,383421 kontrola 3 20,744 0,663 0,631564 kontrola 4 20,39 0,309 0,807201 kontrola 5 20,081 0 1 kontrola 6 20,81 0,729 0,603322 kontrola 7 21,862 1,781 0,290982 kontrola 8 20,631 0,55 0,68302 pacijent 1 22,189 1,189 0,438607 pacijent 2 21,151 0,151 0,900626 pacijent 3 21,403 0,403 0,756284 pacijent 4 21,861 0,861 0,550571 pacijent 5 21,486 0,486 0,714002 pacijent 6 21 0 1 pacijent 7 21,267 0,267 0,831046 pacijent 8 21,272 0,272 0,828171 115 c) odreĊivanje vrednosti relativne ekspresije (2-ΔCt) gena za 18S, u uzorcima perifernih mononuklearnih leukocita, u grupama od po 8 kontrola i pacijenata sa relapsno- remitentnom formom multiple skleroze; Uzorak Sr. Ct 18S ΔCt (sr. Ct − − sr. Ct min. u grupi) 2 -ΔCt 18S kontrola 1 13,683 1,885 0,270744 kontrola 2 11,798 0 1 kontrola 3 13,311 1,513 0,350382 kontrola 4 13,769 1,971 0,255076 kontrola 5 12,49 0,692 0,618995 kontrola 6 13,779 1,981 0,253314 kontrola 7 13,863 2,065 0,238986 kontrola 8 13,933 2,135 0,227667 pacijent 1 14,429 2,619 0,162781 pacijent 2 14,123 2,313 0,201242 pacijent 3 13,521 1,711 0,305448 pacijent 4 13,611 1,801 0,286976 pacijent 5 11,81 0 1 pacijent 6 13,571 1,761 0,295044 pacijent 7 12,303 0,493 0,710546 pacijent 8 12,759 0,949 0,517991 116 d) odreĊivanje vrednosti parametra “stability value”, koji odraţava variranje genske ekspresije GAPDH, CYCLA i 18S unutar i izmeĊu analiziranih grupa uzoraka, na osnovu dobijenih vrednosti 2 -ΔCt za analizirane uzorke (korišćenjem programa NormFinder). Unutargrupno MeĊugrupno Gen variranje ekspresije variranje ekspresije “Stability value” kontrole pacijenti kontrole pacijenti (NormFinder) GAPDH 0,057 0,008 0,016 -0,016 0,058 CYCLA 0,013 0,042 -0,038 0,038 0,056 18S 0,140 0,061 0,022 -0,022 0,110 Postupak za izbor optimalne endogene kontrole za normalizaciju rezultata ekspresije ciljnih gena je prikazan u tabeli R8. Vrednosti Ct su dobijene reakcijom amplifikacije cDNK endogenih kontrola, metodom Real-time PCR, u uzorcima perifernih mononukleara 8 zdravih kontrola i 8 pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze. Vrednosti nivoa relativne ekspresije svake od tri testirane endogene kontrole (GAPDH, CYCLA i 18S) u svakom uzorku su odreĊene kao 2-ΔCt, pri ĉemu je ΔCt razlika srednje vrednosti Ct (aritmetiĉka sredina vrednosti Ct duplikata) pojedinaĉnog uzorka i minimalne srednje vrednosti Ct koju ima referentni uzorak, u datoj grupi kontrola tj. pacijenata (tabela R8 a)-c)). Na osnovu vrednosti 2 -ΔCt za GAPDH, CYCLA i 18S u dve analizirane grupe, kontrola i pacijenata, u programu NormFinder su odreĊene vrednosti parametra “stability value” koji odraţava stabilnost odnosno variranje ekspresije ispitivanog gena unutar grupa i izmeĊu grupa analiziranih uzoraka (tabela R8 d)). Najmanje i meĊusobno najpribliţnije vrednosti unutargrupne i meĊugrupne varijanse definišu najmanju “stability value” koja je, prema tome, karakteristiĉna za najstabilnije eksprimirani gen kao optimalnu endogenu kontrolu (tabela R8 d)). Na osnovu vrednosti parametra “stability value” dobijenih u programu NormFinder (tabela R8 d)) i na osnovu poreĊenja profila amplifikacije testiranih 117 endogenih kontrola sa profilima amplifikacije ciljnih gena (slika R5, slika R6), ustanovljeno je da je CYCLA optimalna endogena kontrola za normalizaciju rezultata ekspresije ciljnih gena. 4.2.2. OdreĊivanje relativne ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze Tabela R9. Osnovni demografski i kliniĉki parametri grupa kontrola i pacijenata sa relapsno-remitentnom (RR) formom multiple skleroze. n - ukupan broj kontrola/pacijenata; vrednosti kontinualnih parametara su predstavljene kao srednja vrednost  standardna devijacija (SD). Parametar Kontrole (n = 24) Pacijenti, svi RR (n = 53) Pacijenti u fazi relapsa (n=25) Pacijenti u fazi remisije (n=28) Pol (žene/muškarci) 19/5 31/22 17/8 14/14 Starost (godine) 34,9  10,0 34,1  6,9 33,8  8,2 34,3  5,7 Starost na poĉetku bolesti (godine) - 29,2  7,6 30,4  7,9 28,3  7,4 Trajanje bolesti (godine) - 5,0  5,6 3,9  3,9 5,9  6,5 EDSS - 2,1  1,0 1,8  0,8 2,4  1,1 MSSS - 4,2  2,1 3,7  2,0 4,5  2,1 Uĉestalost relapsa (broj relapsa/trajanje bolesti) - 0,9  0,6 0,9  0,5 1,0  0,7 118 U tabeli R9 su prikazani relevantni parametri za kontrolnu grupu (pol, starost) i grupu pacijenata sa relapsno-remitentnom formom multiple skleroze (pol, starost, starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS, MSSS, uĉestalost relapsa), u okviru kojih je uraĊena analiza relativne ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6. Srednja vrednost godina starosti kontrola i pacijenata iznosi pribliţno 34 godine. U celokupnoj grupi pacijenata (kao i u grupi kontrola) odnos broja ţena i muškaraca je preko 1,4, što je u skladu sa ĉinjenicom da je multipla skleroza ĉešća kod ţena. Tabela R10. Relativna ekspresija ciljnih gena u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata sa multiplom sklerozom: a) vrednosti nivoa ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, normalizovanih na endogenu kontrolu (CYCLA), u grupama zdravih kontrola i pacijenata sa RR formom multiple skleroze vrednosti ekspresije svakog gena su prikazane kao: srednja vrednost svih uzoraka grupe (sr 2 -ΔCt ), standardna devijacija srednje vrednosti svih uzoraka grupe (stdev 2 -ΔCt ) i standardna greška srednje vrednosti svih uzoraka grupe (stgr 2-ΔCt); za svaki uzorak se Genska ekspresija Kontrole (n=24) Pacijenti, svi RR (n=53) Pacijenti u fazi relapsa (n=25) Pacijenti u fazi remisije (n=28) Sr 2 -ΔCt CX3CR1 0,07121 0,09589 0,10325 0,08932 Stdev 2 -ΔCt CX3CR1 0,03301 0,03948 0,04366 0,03482 Stgr 2 -ΔCt CX3CR1 0,00674 0,00542 0,00873 0,00658 Sr 2 -ΔCt CXCL16 0,01457 0,02012 0,01710 0,02282 Stdev 2 -ΔCt CXCL16 0,00940 0,01046 0,01032 0,00999 Stgr 2 -ΔCt CXCL16 0,00192 0,00144 0,00206 0,00189 Sr 2 -ΔCt CXCR6 0,00261 0,00260 0,00310 0,00216 Stdev 2 -ΔCt CXCR6 0,00151 0,00113 0,00112 0,00096 Stgr 2 -ΔCt CXCR6 0,00031 0,00016 0,00022 0,00018 119 odreĊuju: 2-ΔCt (pri ĉemu ΔCt = srCt(ciljni gen) – srCt(endogena kontrola)), standardna devijacija za 2 -ΔCt i standardna greška za 2-ΔCt; n - broj kontrola/pacijenata; b) statistiĉka analiza rezultata relativne genske ekspresije: poreĊenje vrednosti nivoa ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 izmeĊu odgovarajućih ciljnih grupa p (Mann-Whitney U test) Sr 2 -ΔCt CX3CR1 Sr 2 -ΔCt CXCL16 Sr 2 -ΔCt CXCR6 Kontrole / pacijenti svi (u relapsu i remisiji) 0,0042 ** 0,0094 ** 0,6402 Kontrole / pacijenti u relapsu 0,0038 ** 0,4009 0,0873 Kontrole / pacijenti u remisiji 0,0332 * 0,0004 *** 0,4299 Pacijenti u relapsu / pacijenti u remisiji 0,2027 0,0182 * 0,0017 ** statistiĉki znaĉajnu razliku odreĊuju vrednosti p (Mann-Whitney U test) <0,05; asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,05, dvostruki asterisk (**) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,01, trostruki asterisk (***) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,001. Nakon kvantifikacije genske ekspresije, dobijene vrednosti su uporeĊene izmeĊu odgovarajućih ciljnih grupa uzoraka i utvrĊeno je da postoje znaĉajne razlike relativnih nivoa ekspresije gena za: - CX3CR1 izmeĊu kontrola i cele analizirane grupe pacijenata (u relapsu i remisiji), izmeĊu kontrola i pacijenata u relapsu i izmeĊu kontrola i pacijenata u remisiji; - CXCL16 izmeĊu kontrola i pacijenata u remisiji i izmeĊu pacijenata u relapsu i pacijenata u remisiji; - CXCR6 izmeĊu pacijenata u relapsu i pacijenata u remisiji (Mann-Whitney U test, p<0,05) (tabela R10). Rezultati sa stitistiĉki znaĉajnom razlikom, u okviru analiziranih grupa uzoraka, su grafiĉki prikazani (prikazane su srednje vrednosti 2 -ΔCt sa opsegom standardne greške, za svaku analiziranu grupu); u opisu svakog grafika navedeni su statistiĉki parametar p (Mann- Whitney U test) i razlika srednjih vrednosti genske ekspresije izmeĊu grupa, koja pokazuje koliko je puta ekspresija ispitivanog gena viša/niţa u ciljnoj grupi u odnosu na referentnu grupu uzoraka - engl. fold change (slika R7). 120 a) ko nt ro le ** p ac ije nt i 0.00 0.05 0.10 0.15 2 - C t C X 3 C R 1 b) ko nt ro le ** p ac ije nt i u r el ap su 0.00 0.05 0.10 0.15 2 - C t C X 3 C R 1 121 c) ko nt ro le * pa ci je nt i u r em is iji 0.00 0.05 0.10 0.15 2 - C t C X 3 C R 1 d) ko nt ro le ** p ac ije nt i 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 2 - C t C X C L 1 6 122 e) ko nt ro le ** * pa ci je nt i u r em is iji 0.00 0.01 0.02 0.03 2 - C t C X C L 1 6 f) pa ci je nt i u r el ap su * pa ci je nt i u r em is iji 0.00 0.01 0.02 0.03 2 - C t C X C L 1 6 123 g) pa ci je nt i u r el ap su ** p ac ije nt i u r em is iji 0.000 0.001 0.002 0.003 0.004 2 - C t C X C R 6 Slika R7. Prikaz statistiĉki znaĉajnih rezultata kvantifikacije ekspresije ispitanih gena: a) nivo ekspresije gena za CX3CR1 je 1,3 puta viši u celoj grupi pacijenata (u relapsu i remisiji) u odnosu na kontrolnu grupu (p= 0,0042**, “fold change”= +1,3 puta); b) nivo ekspresije gena za CX3CR1 je 1,4 puta viši u grupi pacijenata u relapsu u odnosu na kontrolnu grupu (p= 0,0038**, “fold change”= +1,4 puta); c) nivo ekspresije gena za CX3CR1 je 1,2 puta viši u grupi pacijenata u remisiji u odnosu na kontrolnu grupu (p= 0,0332*, “fold change”= +1,2 puta); d) nivo ekspresije gena za CXCL16 je 1,4 puta viši u celoj grupi pacijenata (u relapsu i remisiji) u odnosu na kontrolnu grupu (p= 0,0094**, “fold change”= +1,4 puta); e) nivo ekspresije gena za CXCL16 je 1,6 puta viši u grupi pacijenata u remisiji u odnosu na kontrolnu grupu (p= 0,0004***, “fold change”= +1,6 puta); f) nivo ekspresije gena za CXCL16 je 1,3 puta viši u grupi pacijenata u remisiji u odnosu na grupu pacijenata u relapsu (p= 0,0182*, “fold change”= +1,3 puta); g) nivo ekspresije gena za CXCR6 je 1,4 puta niţi u grupi pacijenata u remisiji u odnosu na grupu pacijenata u relapsu (p= 0,0017**, “fold change”= −1,4 puta); 124 asterisk (*) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,05, dvostruki asterisk (**) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,01, trostruki asterisk (***) predstavlja statistiĉku znaĉajnost kada je p<0,001. Nisu utvrĊene znaĉajne korelacije izmeĊu vrednosti kliniĉkih parametara (EDSS, MSSS, uĉestalost relapsa) i nivoa ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, kod pacijenata u relapsu odnosno remisiji (Product-moment and partial correlations, p>0,05) (rezultati nisu prikazani). U podgrupama pacijenata u relapsu i pacijenata u remisiji, nivoi relativne ekspresije gena za CX3CR1 se ne razlikuju znaĉajno u odnosu na genotipove polimorfizama V249I i T280M, niti ima znaĉajnih razlika u nivoima ekspresije gena za CXCL16 u odnosu na genotipove polimorfizama I123T i A181V (Kruskal-Wallis ANOVA, p>0,05) (rezultati nisu prikazani). Svi prikazani rezultati odreĊivanja nivoa relativne ekspresije ciljnih gena naknadno su provereni i potvrĊeni analizom u kompjuterskom programu REST08. 125 5. DISKUSIJA 5.1. Polimorfizmi u genima za CX3CR1 i CXCL16 u nastanku i progresiji multiple skleroze 5.1.1. Polimorfizmi V249I i T280M u genu za CX3CR1 Polimorfizmi V249I i T280M u ĉetvrtom egzonu gena za CX3CR1 su asocirani sa nastankom i/ili progresijom hroniĉnih inflamatornih bolesti kao što su ateroskleroza, Kronova bolest i hroniĉna insuficijencija bubrega (Apostolakis i sar., 2007; Zhao i sar., 2010; Debette i sar., 2009; McDermott i sar., 2001; Moatti i sar., 2001; Apostolakis i sar., 2009; Sabate i sar., 2008; Borkar i sar., 2011). Rezultati navedenih studija nisu konzistentni u pogledu efekata pojedinaĉnih alela/genotipova/haplotipova ovih polimorfizama na nastanak i kliniĉki tok izuĉavanih bolesti. Pored naše studije (Stojković i sar., 2012), uloga polimorfizama V249I i T280M u patogenezi multipe skleroze do sada je analizirana samo u još jednoj studiji gena kandidata (Arli i sar., 2013) i jednoj studiji GWAS (IMSGC & VTCCC2, 2011). Sliĉno rezultatima preostale dve studije, nismo pronašli asocijaciju genotipova niti alela dvaju polimorfizama u genu za CX3CR1 sa rizikom za nastanak multiple skleroze. U studiji GWAS nije utvrĊena asocijacija ovih polimorfizama ni sa kliniĉkim tokom multiple skleroze (IMSGC & VTCCC2, 2011). U našoj studiji srednje vrednosti kliniĉkih parametara (starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS) nisu znaĉajno razliĉite izmeĊu nosilaca razliĉitih genotipova polimorfizama V249I i T280M u analiziranoj grupi pacijenata. TakoĊe, nema znaĉajne razlike uĉestalosti genotipova i alela polimorfizama V249I i T280M izmeĊu podgrupe pacijenata sa relapsno-remitentnom i podgrupe sa sekundarno-progresivnom formom multiple skleroze. Postoji nešto veća uĉestalost alela I kod RR u odnosu na SP pacijente i statistiĉki trend da pacijenti nosioci alela I (u odnosu na nosioce ĉešćeg alela, V) imaju manju šansu za progresiju RR u SP formu multiple skleroze. U analizi polimorfizma V249I, Arli i sar. su 126 detektovali znaĉajno veću uĉestalost genotipa VI nego II kod RR pacijenata, dok su SP pacijenti imali veću uĉestalost genotipa VV nego VI. U analiziranoj grupi zdravih kontrolnih ispitanika iz Srbije uĉestalosti alela polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 su pribliţne vrednostima dobijenim u drugim kavkazijanskim populacijama (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3732379,http://www.ncbi.n lm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3732378). U srpskoj populaciji je detektovan izraţeni “linkage disequilibrium” (skr. LD) (neravnoteţa vezanosti) izmeĊu V249I i T280M polimorfizama, što je u skladu sa rezultatima prethodnih studija (Faure i sar., 2000). Regioni sa visokim LD potencijalno olakšavaju nalaţenje asocijacije gena (alela) sa patogenezom poligenskih bolesti. Shodno postojanju znaĉajnog LD izmeĊu polimorfizama V249I i T280M, u analiziranim grupama kontrola i pacijenata je procenjeno prisustvo tri dominantna haplotipa: V249T280, I249M280, I249T280, i jednog retkog haplotipa, V249M280 (haplotip V249M280 nije statistiĉki analiziran zbog niske frekvencije, <1%). Efekti haplotipova I249M280 i I249T280 na nastanak i progresiju multiple skleroze su analizirani u odnosu na najĉešći haplotip, V249T280 (saĉinjen od ĉešćih alela oba polimorfizma). Nijedan od haplotipova nije asociran sa rizikom za nastanak multiple skleroze. U poreĊenju sa studijama vezanim za druge hroniĉne inflamatorne bolesti, naš rezultat je saglasan sa rezultatom haplotipske analize u studiji u kojoj je izuĉavana koronarna bolest (Matzhold i sar., 2009). U izvesnim studijama je pokazan protektivni uticaj haplotipa I249M280. Tako je u meta-analizi utvrĊena znaĉajno veća uĉestalost I249M280 kod kontrola u odnosu na pacijente sa koronarnom bolešću (Apostolakis i sar., 2009). U drugoj studiji, samo nosioci haplotipa I249M280 su imali smanjeni rizik za rekurentne glavobolje koje su posledica neuroinflamacije i oštećenja vaskularne funkcije (Combadiere i sar., 2008). U okviru naše studije, haplotipskom analizom utvrĊena je znaĉajno niţa frekvencija haplotipa I249T280 kod SP pacijenata u odnosu na RR pacijente, što znaĉi da RR pacijenti nosioci ovog haplotipa imaju znaĉajno manju šansu za progresiju u SP formu bolesti. Dakle, naši rezultati ukazuju na zaštitni efekat haplotipa I249T280 na prelazak iz RR forme u SP fazu multiple skleroze. Haplotipovi ne utiĉu na brzinu kontinuirane progresije bolesti, jer nisu znaĉajno asocirani sa vrednostima kliniĉkih parametara pacijenata, kao što je MSSS. 127 Strukturna analiza je pokazala da polimorfizmi V249I i T280M indukuju detektabilne konformacione promene u receptorskim domenima TM6 i TM7 u kojima se nalaze, kao i trećoj vanćelijskoj petlji koja spaja TM6 i TM7 (Darbandi-Tehrani i sar., 2010). Uzimajući u obzir ovu ĉinjenicu i podatak da aminokiseline koje ulaze u sastav treće vanćelijske petlje receptora utiĉu na afinitet vezivanja CX3CL1 (Chen i sar., 2006), u našoj studiji je od znaĉaja i bioinformatiĉka analiza predviĊanja efekata polimorfizama V249I i T280M na interakciju CX3CR1-CX3CL1. Dobijeni rezultati analize informacionih spektara predviĊaju da polimorfne varijante I249T280 i V249M280 CX3CR1 (kodirane od strane haplotipova I249T280 i V249M280) mogu najviše menjati interakciju CX3CR1-CX3CL1 i da su njihovi efekti suprotni, s obzirom da vrednosti ΔA(0,037) za I249T280 i V249M280 imaju suprotan predznak. Pošto haplotip V249M280 praktiĉno ne postoji u populaciji (njegova uĉestalost je manja od 1%), sledi da haplotip I249T280, preko proteinske varijante CX3CR1 koju kodira, znaĉajno menja interakciju CX3CR1-CX3CL1, u odnosu na najĉešću izoformu tj. haplotip V249T280 CX3CR1. Ovaj rezultat se moţe povezati sa utvrĊenim efektom haplotipa I249T280 na tok multiple skleroze. Rezultati naše analize informacionih spektara sugerišu da izmeĊu varijante I249M280 i najĉešće izoforme CX3CR1, V249T280, ne postoji znaĉajna razlika u uspostavljanju interakcije sa ligandom. U skladu sa ovim je i rezultat funkcionalne studije koja je pokazala da V249T280 i I249M280 varijante CX3CR1 imaju podjednak kapacitet vezivanja solubilnog CX3CL1 (Daoudi i sar., 2004). Izvesne studije pokazuju da haplotip I249M280 ima protektivnu ulogu u pogledu rizika za nastanak odreĊenih hroniĉnih inflamatornih bolesti (Apostolakis i sar., 2009). Rezultati naše i prethodnih studija (Combadiere i sar., 2008; Apostolakis i sar., 2009) sugerišu moguću zaštitnu ulogu alela I polimorfizma V249I u nastanku i progresiji inflamatornih bolesti, koja zavisi od haplotipske pozadine ovog alela. U ovoj studiji, detektovali smo trend smanjene frekvencije alela I kod SP u odnosu na RR pacijente. U haplotipskoj analizi ovaj alel ima znaĉajno drugaĉiji efekat na prelazak RR u SP formu bolesti, u zavisnosti od haplotipske pozadine. U haplotipskoj pozadini sa alelom T280, alel I249 je pokazao znaĉajan zaštitni uticaj na prelazak u SP formu bolesti u odnosu na alel V249. U studiji Arli i sar., takoĊe je sugerisana potencijalna zaštitna uloga alela I u sekundarnoj progresiji bolesti, kada je u heterozigotnom obliku, VI. Naime, u okviru ciljne grupe od 92 pacijenta sa multiplom 128 sklerozom detektovana je predominantna uĉestalost genotipa VI kod RR pacijenata, dok su SP pacijenti imali veću uĉestalost genotipa VV u odnosu na VI (Arli i sar., 2013). Zaštitni efekti alela I mogu biti povezani sa strukturno-funkcionalnim promenama ili promenama nivoa ekspresije CX3CR1, koje mogu da utiĉu na progresiju inflamatornog procesa. Znaĉajno manja gustina vezivnih mesta za CX3CL1 je uoĉena na perifernim mononuklearnim leukocitima osoba nosilaca alela I u heterozigotnom obliku, kao kombinacije genotipova VI-TT ili VI-TM, u odnosu na leukocite nosilaca genotipova VV i TT. Na ovaj naĉin se moţda smanjuje CX3CR1-posredovana adhezija monocita za aktivirane endotelne ćelije koje eksprimiraju CX3CL1, pa je ovo jedan od potencijalnih mehanizama koji dovode do smanjenja progresije inflamacije (Moatti i sar., 2001). Leukociti homozigota MM koji su istovremeno nosioci genotipa VI ili II, imaju defektnu hemotaksiju u odgovoru na solubilni CX3CL1 (McDermott i sar., 2003), što takoĊe moţe uticati na smanjenje intenziteta inflamacije. MeĊutim, sliĉno rezultatima genetskih studija asocijacije, i rezultati studija o funkcionalnim efektima polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 su nekonzistentni (Moatti i sar., 2001; McDermott i sar., 2003; Daoudi i sar., 2004), te su dalja istraţivanja neophodna. 5.1.2. Polimorfizmi I123T i A181V u genu za CXCL16 U našoj studiji polimorfizmi I123T i A181V u ĉetvrtom egzonu gena za CXCL16 su prvi put analizirani u asocijaciji sa multiplom sklerozom. U ukupnoj grupi kontrola detektovana je veća uĉestalost homozigota za ĉešće alele oba polimorfizma (II i AA), nego u ukupnoj grupi pacijenata. Uĉestalosti genotipova koji sadrţe reĊe alele ovih polimorfizama, T i V, su znaĉajno veće kod pacijenata u odnosu na kontrole. Zdravi nosioci alela T (tj. genotipova IT i TT) i alela V (prevashodno u homozigotnom obliku, VV) imaju znaĉajno veću šansu za oboljevanje od multiple skleroze, u odnosu na osobe koje nisu nosioci navedenih alela (genotipova). Shodno tome, polimorfizmi I123T i A181V u genu za CXCL16 su odreĊeni kao genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze. U ukupnoj grupi pacijenata srednje vrednosti kliniĉkih parametara (starost na poĉetku bolesti, trajanje bolesti, EDSS i MSSS) nisu znaĉajno asocirane sa genotipovima polimorfizama I123T i A181V, niti postoji znaĉajna razlika u distribuciji genotipova izmeĊu pacijenata sa RR i SP formom multiple skleroze. Ovi rezultati 129 ukazuju na to da genski polimorfizmi I123T i A181V nisu faktori rizika za progresiju multiple skleroze. U dosadašnjim istraţivanjima u oblasti patogeneze hroniĉnih inflamatornih bolesti analizirani su efekti polimorfizma A181V na nastanak i progresiju ateroskleroze i Kronove bolesti. U ovim studijama, za razliku od naše, nije utvrĊena asocijacija reĊeg alela V tj. homozigota VV sa nastankom bolesti, ali jeste sa progresijom bolesti (Petit i sar., 2011; Lundberg i sar., 2005; Wang i sar., 2010; Seiderer i sar., 2008). Pacijenti sa koronarnom bolešću koji su nosioci alela V imali su povećan stepen stenoze koronarnih arterija (Lundberg i sar., 2005), dok je genotip VV bio asociran sa teţom kliniĉkom slikom Kronove bolesti (Seiderer i sar., 2008). Funkcionalni efekti zamene A181V nisu u potpunosti rasvetljeni. S obzirom da u strukturi transmembranskog CXCL16 ovaj polimorfizam rezultuje zamenom aminokiseline locirane u blizini ćelijske membrane (Petit i sar., 2011), postoji mogućnost da on utiĉe na proteolitiĉko seĉenje CXCL16 i, samim tim, na odnos nivoa solubilne i transmembranske forme hemokina. Poznato je da solubilni CXCL16 stimuliše inflamatorni proces putem stimulacije regrutovanja leukocita u tkiva (Galkina i sar., 2007; Fukumoto i sar., 2004), te da povišeni nivo solubilnog CXCL16 moţe biti pokazatelj inflamatornog procesa u patogenezi odreĊenih bolesti meĊu kojima je i multipla skleroza (Yi i sar., 2008; Ueland i sar., 2012; van der Voort i sar., 2005; le Blanc i sar., 2006). U ciljnoj grupi kontrolnih ispitanika iz Srbije uĉestalosti alela polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 su pribliţne vrednostima u drugim kavkazijanskim populacijama(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1050998,http:/ /www.ncbi.nlm.nni.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2277680). HapMap podaci pokazuju da su polimorfizmi I123T i A181V u apsolutnom LD (International HapMap Consortium, 2003). I za srpsku populaciju se moţe reći da su ovi polimorfizmi u apsolutnom LD, pošto vrednosti statistiĉkog parametra D’ dobijene u ovoj studiji iznose pribliţno 1. Zato je u analiziranim grupama ispitanika procenjeno prisustvo samo dva predominantna haplotipa, I123A181 i T123V181, koji su statistiĉki analizirani (frekvencije preostala dva, T123A181 i I123V181, iznose 0-1%). TakoĊe, preko apsolutnog LD se objašnjava i specifiĉna distribucija genotipova i alela oba polimorfizma unutar svake pojedinaĉne grupe/podgrupe kontrola/pacijenata: pribliţno ili potpuno identiĉne uĉestalosti imaju parovi genotipova II i AA, IT i AV, TT i VV, kao i parovi alela I i A, 130 T i V. Efekti haplotipa T123V181 na rizik za nastanak multiple skleroze i njenu progresiju su procenjeni u odnosu na najĉešći haplotip, I123A181, kao referentni. U odnosu na kontrole, kod kojih je uĉestaliji haplotip I123A181, pacijenti imaju znaĉajno veću uĉestalost haplotipa T123V181. To znaĉi da je haplotip T123V181 faktor rizika za nastanak multiple skleroze tj. da zdravi nosioci haplotipa T123V181 imaju znaĉajno veću šansu da obole, u odnosu na nosioce referentnog haplotipa I123A181. Haplotipovi polimorfizama I123T i A181V nisu povezani sa rizikom za progresiju multiple skleroze, jer unutar cele grupe pacijenata vrednosti kliniĉkih parametara nisu znaĉajno razliĉite izmeĊu nosilaca razliĉitih haplotipova, niti postoji znaĉajna razlika u distribuciji haplotipova izmeĊu pacijenata sa RR i SP formom bolesti. Rezultati haplotipske analize su, naravno, u skladu sa analizom genotipova i alela, u kojoj su aleli T i V definisani kao faktori rizika za nastanak multiple skleroze. Efekti genotipova, alela i haplotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 su analizirani i u odnosu na pol. Ţene sa multiplom sklerozom imaju znaĉajno veće frekvencije heterozigota oba polimorfizma, IT i AV. Zdrave ţene koje nose reĊe alele oba polimorfizma u heterozigotnom obliku imaju oko dva puta veću šansu da obole od multiple skleroze, u odnosu na ţene nosioce referentnih homozigotnih genotipova, II i AA. Nije utvrĊena polno zavisna asocijacija genotipova, ni sa progresijom bolesti ni sa njenim tokom. Zdrave ţene nosioci haplotipa T123V181 imaju znaĉajno veću šansu da obole od multiple skleroze, u odnosu na one koje nose referentni haplotip I123A181. Ovaj rezultat je saglasan sa rezultatom analize haplotipova u celom uzorku kontrola i pacijenata u ovoj studiji. Haplotip T123V181 je faktor rizika za nastanak multiple skleroze, kako u ĉitavoj analiziranoj grupi uzoraka, tako i u izdvojenoj grupi ispitanika ţenskog pola. U celoj grupi pacijenata porast uĉestalosti haplotipa T123V181 je rezultat većeg broja nosilaca homozigota TT i VV, u odnosu na kontrolne subjekte. MeĊutim, kod ţena porast uĉestalosti haplotipa T123V181 je preteţno posledica velikog broja pacijentkinja nosilaca oba heterozigotna genotipa, IT i AV, u odnosu na ţene kontrole. Poznato je da se interakcija CXCL16-CXCR6 ostvaruje preko hemokinskog domena CXCL16 (Liu i sar., 2011). S obzirom da se polimorfizmi I123T i A181V nalaze na suprotnim krajevima mucinskog domena CXCL16 i da je utvrĊeno da upravo struktura mucinskog domena utiĉe na konformaciju hemokinskog domena CXCL16 131 (Petit i sar., 2008), u našoj studiji je od znaĉaja bioinformatiĉka analiza predviĊanja mogućih efekata polimorfizama I123T i A181V na interakciju transmembranske forme CXCL16 sa CXCR6. Rezultati analize informacionih spektara predviĊaju da polimorfna varijanta T123V181 CXCL16 (kodirana od strane haplotipa T123V181) znaĉajno menja interakciju CXCL16-CXCR6, u odnosu na najĉešću izoformu I123A181 tj. haplotip I123A181 CXCL16. Naši rezultati bioinformatiĉke analize se mogu dovesti u vezu sa procenjenim uticajem haplotipa T123V181 na rizik za nastanak multiple skleroze, preko do sada poznatih funkcionalnih efekata polimorfizama I123T i A181V. U jednoj studiji je uraĊena in vitro i ex vivo funkcionalna analiza koja je otkrila da najĉešća izoforma CXCL16, I123A181, poseduje sve tri funkcionalne karakteristike- funkciju receptora “ĉistaĉa” za oxLDL i sposobnosti da indukuje hemotaksiju i adheziju CXCR6+ ćelija (Petit i sar., 2011). Razlika izmeĊu I123A181 i T123V181 CXCL16 je nedostatak adhezivnog svojstva, pripisan varijanti T123V181. U ovoj funkcionalnoj studiji je pokazano da prisustvo V na poziciji 181, bilo u T123V181 ili I123V181 konstruktu, rezultuje gubitkom svojstva adhezije (Petit i sar., 2011). Pošto je u našoj studiji utvrĊeno da su aleli T i V i haplotip T123V181 asocirani sa povećanim rizikom za nastanak multiple skleroze u analiziranoj grupi pacijenata, a zna se da varijantu T123V181 CXCL16 odlikuje odsustvo svojstva adhezije (Petit i sar., 2011), verovatno je da potencijalno izmenjena funkcija hemotaksije i/ili funkcija CXCL16 kao receptora “ĉistaĉa” doprinosi patogenezi multiple skleroze. U skladu sa ovom pretpostavkom su i rezultati funkcionalne studije koji pokazuju da u patogenezi eksperimentalnog modela multiple skleroze CXCL16 ima vaţnu ulogu da stimuliše hemotaksiju i regrutovanje mononuklearnih leukocita u CNS (Fukumoto i sar., 2004). U odnosu na celokupnu grupu pacijenata, kod kojih postoji znaĉajno veći broj nosilaca haplotipa T123V181 u dve kopije, u izdvojenoj grupi ţena pacijenata je prisutno više nosilaca oba haplotipa, I123A181 i T123V181. Uzimajući u obzir navedena funkcionalna svojstva I123A181 i T123V181 varijanti CXCL16 (Petit i sar., 2011) postoji mogućnost da u ţenskom polu, osim svojstva hemotaksije (koje odlikuje obe varijante), i svojstvo adhezije (koje ima samo varijanta I123A181) takoĊe doprinosi riziku za nastanak multiple skleroze. U jednoj studiji je pokazano da meĊu polnim hormonima iskljuĉivo ţenski (estradiol i progesteron) imaju uticaj na stimulaciju adhezije mononuklearnih leukocita za endotelne ćelije stimulisane sa TNF-alfa i IFN- 132 gama (Cid i sar., 1994), a u kojima se inducibilno eksprimira i CXCL16 (Wuttge i sar., 2004; Hofnagel i sar., 2002). U svetlu ove ĉinjenice se moţe posmatrati potencijalni znaĉaj adhezije posredovane preko CXCL16 u patogenezi multiple skleroze kod ţena, koji smo pretpostavili na osnovu rezultata naše studije. Dodatno, funkcionalna studija je otkrila da, u poreĊenju sa I123A181, varijanta T123V181 moţe pokazivati trend ka niţim nivoima njene transmembranske forme koji istovremeno korelišu sa povišenim nivoima njene solubilne forme (Petit i sar., 2011). To sugeriše na mogućnost efikasnije hemotaksije posredovane varijantom T123V181 nego varijantom I123A181 CXCL16. Stoga je moguće da postoji sinergizam izmeĊu adhezije leukocita za aktivirani endotel posredovane preko I123A181 CXCL16 (koja kod ţena moţe biti pojaĉana dejstvom estradiola (Cid i sar., 1994)) i efikasne hemotaksije leukocita posredovane solubilnom T123V181 varijantom CXCL16. U mehanizmu inflamacije, ovaj pretpostavljeni sinergizam mogao bi da doprinosi većoj infiltraciji leukocita iz krvi u ciljno tkivo (CNS) kod ţena nosilaca heterozigota IT i AV, pošto su one nosioci oba haplotipa (I123A181 i T123V181) tj. obe varijante CXCL16 (I123A181 i T123V181), u poreĊenju sa ţenama nosiocima homozigota II i AA tj. samo haplotipa I123A181 (varijante I123A181) CXCL16. Ovo moţe biti jedno od potencijalnih objašnjenja zašto smo našli znaĉajno veću uĉestalost heterozigota IT i AV kod ţena pacijenata, odnosno definisali ove genotipove polimorfizama I123T i A181V gena za CXCL16 kao faktore rizika za nastanak multiple skleroze kod ţena. Ovo je prva studija koja je ispitala efekte alela, genotipova i haplotipova polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 na patogenezu multiple skleroze. Naši rezultati analize polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 sugerišu na moguće zaštitno dejstvo alela I na sekundarnu progresiju RR forme multiple skleroze, samo kada je povezan sa alelom T u haplotipu I249T280. Analiza polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 pokazuje asocijaciju haplotipa T123V181 sa povećanim rizikom za nastanak multiple skleroze. Replikacija i validacija rezultata u grupama ispitanika iz razliĉitih populacija i dodatne funkcionalne studije su neophodne pre nego što se izvede konaĉni zakljuĉak o efektima ciljnih polimorfizama u genima za CX3CR1 i CXCL16 na patogenezu multiple skleroze. 133 5.2. Relativna ekspresija gena za CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore, CX3CR1 i CXCR6, u patogenezi relapsno- remitentne forme multiple skleroze Za razliku od tkiva humanog CNS-a, koje ima veoma ograniĉenu dostupnost, periferna krv je lako dostupna i predstavlja izvor potencijalnih sistemskih markera. Zbog toga, jedan od glavnih ciljeva u izuĉavanju molekularne patogeneze multiple skleroze, kao inflamatorne i autoimunske bolesti, jeste identifikacija promena genske ekspresije u imunskom sistemu, koje se detektuju u ćelijama periferne krvi, a odraţavaju patološke promene u ciljnom tkivu CNS-a kod obolelih. S obzirom da monociti/makrofazi i limfociti igraju kljuĉnu ulogu u patogenezi multiple skleroze, cilj u našoj studiji je bila analiza relativne ekspresije gena za hemokine CX3CL1 i CXCL16 i njihove receptore, CX3CR1 i CXCR6, u uzorcima mononuklearnih leukocita periferne krvi zdravih kontrolnih subjekata i pacijenata sa RR formom multiple skleroze. 5.2.1. Relativna ekspresija gena za CX3CL1 i CX3CR1 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata Dosadašnji rezultati studija ukazuju da, za razliku od većine drugih hemokina, CX3CL1 generalno nije prisutan u leukocitima periferne krvi zdravih osoba (Bazan i sar., 1997). MeĊutim, njegova ekspresija u leukocitima moţe biti specifiĉna za odreĊena stanja, odnosno patogenezu nekih bolesti. Tako je metodom protoĉne citometrije utvrĊeno da izvestan broj CD4+ i CD8+ T-limfocita eksprimira CX3CL1 kod pacijenata sa reumatoidnim artritisom. CX3CL1 je bio predominantno eksprimiran u CD4+ Th1 limfocitima, što sugeriše na njegovu ulogu u inflamatornom procesu tokom patogeneze reumatoidnog artritisa (Blaschke i sar., 2003). U navedenoj studiji (Blaschke i sar., 2003) ekspresija CX3CL1 je ipak bila ograniĉena na relativno mali broj T-limfocita. U našoj studiji nije detektovana ekspresija CX3CL1 iRNK u uzorcima ukupnih perifernih mononuklearnih leukocita, ni pacijenata sa RR formom multiple skleroze ni kontrola. U CNS-u CX3CL1 se konstitutivno eksprimira u neuronima (Harrison i sar., 1998), dok je 134 njegova inducibilna ekspresija pod delovanjem proinflamatornih citokina otkrivena u vaskularnim endotelnim ćelijama mozga (Hurst i sar., 2009). U koronarnim i moţdanim krvnim sudovima CX3CL1 je detektovan iskljuĉivo na luminalnoj površini endotela (Harrison i sar., 1999; Pan i sar., 1997), odakle solubilni hemokinski domen CX3CL1 moţe biti iseĉen delovanjem metaloproteinaza ADAM10 i ADAM17 (Hundhausen i sar., 2003; Garton i sar., 2001). Pokazana je povišena ekspresija CX3CL1 na vaskularnim endotelnim ćelijama mozga tokom eksperimentalnog autoimunskog encefalomijelitisa (EAE) (Pan i sar., 1997; Fischer i sar., 2000). To je u saglasnosti sa analizom in vitro koja je pokazala inducibilnu ekspresiju i proteolitiĉko seĉenje CX3CL1 sa površine endotelnih ćelija u odgovoru na medijatore inflamacije (IL-1, TNFA, IFNG) tokom patogeneze inflamatornih bolesti CNS-a (Fraticelli i sar., 2001). Kod pacijenata sa RR formom multiple skleroze koji su u fazi relapsa (tj. pogoršanja neuroloških simptoma) detektovan je znaĉajan porast nivoa solubilnog CX3CL1 u cirkulaciji, u odnosu na kontrole (Kastenbauer i sar., 2003). Metaloproteinaza ADAM17 stimuliše proteolitiĉko oslobaĊanje solubilnog CX3CL1 sa endotelnih ćelija koje su aktivirane posredstvom TNFA i drugih proinflamatornih citokina. Pošto u lezijama CNS-a pacijenata sa multiplom sklerozom aktivirana mikroglija intenzivno produkuje TNFA (Benveniste, 1997), a ADAM17 deluje i kao TNFA-konvertujući enzim (Garton i sar., 2001; Tsou i sar., 2001), uloga ovog enzima sugeriše na vezu izmeĊu lokalne tkivne produkcije proinflamatornog citokina i proteolitiĉkog seĉenja CX3CL1 na površini aktiviranih endotelnih ćelija. Ovo inducibilno proteolitiĉko seĉenje moţe biti glavni uzrok porasta solubilnog CX3CL1 u cirkulaciji tokom subakutne i hroniĉne inflamacije u CNS-u, koja je karakteristiĉna za multiplu sklerozu. U tom pogledu CX3CL1 moţe biti vaţan stimulator ekstravazacije leukocita (posredstvom aktivacije leukocitnog CX3CR1) iz krvi u tkivo CNS-a zahvaćeno inflamacijom (Sunnemark i sar., 2005). U studiji na modelu EAE-a indukovanog MOG-om detektovana je akumulacija mikroglijalnih i drugih ćelija koje eksprimiraju CX3CR1, preteţno makrofaga i NK- ćelija, u inflamatornim lezijama mozga pacova (Sunnemark i sar., 2005). Ovo ukazuje na ulogu solubilnog CX3CL1 u stimulisanju migracije perifernih mononuklearnih leukocita u tkivo mozga tokom patogeneze eksperimentalnog modela multiple skleroze. U našoj studiji detektovan je znaĉajno viši nivo ekspresije gena za CX3CR1 u 135 mononuklearnim leukocitima periferne krvi pacijenata sa RR formom multiple skleroze, u odnosu na zdrave kontrole. Znaĉajna razlika je bila veća kada je podgrupa pacijenata u relapsu uporeĊena sa kontrolama, nego kada je podgrupa pacijenata u remisiji (tj. fazi izmeĊu dva relapsa, tokom koje dolazi do potpunog ili delimiĉnog oporavka od posledica relapsa) uporeĊena sa kontrolama (na osnovu vrednosti statistiĉkih parametara p i “fold change”). U prethodnoj studiji primenom genskog ĉipa je identifikovano 16 gena koji su bili razliĉito eksprimirani kod 10 pacijenata sa RR formom multiple skleroze, u odnosu na 12 zdravih kontrola. MeĊu ovim genima je i gen za CX3CR1, ĉija je ekspresija bila znaĉajno niţa kod pacijenata. U cilju provere rezultata, u istoj studiji je analizirana relativna ekspresija gena za CX3CR1 metodom Real-time PCR na uzorcima perifernih mononuklearnih leukocita 28 zdravih kontrola i 25 pacijenata sa RR formom multiple skleroze (Infante-Duarte i sar., 2005). Nasuprot rezultatu naše studije, studija Infante-Duarte i sar. je pokazala da je u ukupnoj grupi pacijenata nivo CX3CR1 iRNK znaĉajno niţi, u odnosu na kontrolnu grupu. Ovaj rezultat je korelisao sa nivoom CX3CR1 proteina: metodom protoĉne citometrije je utvrĊeno da periferni mononukleari pacijenata u znaĉajno manjoj meri eksprimiraju receptor, nego mononukleari zdravih kontrola (Infante-Duarte i sar., 2005). Zatim je analizirano prisustvo CX3CR1 na površini razliĉitih mononuklearnih leukocita kao što su NK-ćelije, citotoksiĉni CD8+ T- limfociti i CD4+ Th1 limfociti, koji eksprimiraju ovaj receptor. UtvrĊeno je da znaĉajno smanjenje ekspresije CX3CR1 kod pacijenata potiĉe od redukovane ekspresije receptora na NK-ćelijama tj. od redukovanog broja CX3CR1+ NK-ćelija. Broj citotoksiĉnih CD8+ T-limfocita koji eksprimiraju CX3CR1 je bio veći kod pacijenata u odnosu na kontrole ali nije dostignuta statistiĉka znaĉajnost, dok je broj CD4+ CX3CR1+ T- limfocita bio vrlo nizak i kod pacijenata i kod kontrola (Infante-Duarte i sar., 2005). Kada su analizirane dve podgrupe pacijenata, naĊeno je da postoji znaĉajno veći broj CX3CR1+ NK-ćelija kod pacijenata u relapsu nego kod pacijenata u remisiji (Infante- Duarte i sar., 2005). U istoj studiji je pokazano da CX3CR1+ NK-ćelije imaju veću citotoksiĉnu aktivnost nego CX3CR1− NK-ćelije. Zbog toga znaĉajan porast broja NK- ćelija koje eksprimiraju CX3CR1 kod pacijenata koji su u relapsu, u odnosu na one u remisiji, ukazuje na potencijalnu ulogu subpopulacije CX3CR1+ NK-ćelija u egzacerbaciji bolesti (Infante-Duarte i sar., 2005). Za razliku od studije Infante-Duarte i sar., u našoj studiji je detektovan znaĉajno viši nivo CX3CR1 iRNK u perifernim 136 mononuklearima kod pacijenata u relapsu u odnosu na kontrole i kod pacijenata u remisiji u odnosu na kontrole, dok nije bilo znaĉajne razlike kada su uporeĊene podgrupe pacijenata u relapsu i remisiji. Poznato je da CX3CR1+ NK-ćelije imaju veću citotoksiĉnu aktivnost nego CX3CR1− NK-ćelije (Infante-Duarte i sar., 2005). TakoĊe je otkriveno da u krvi pacijenata sa multiplom sklerozom dolazi do ekspanzije citotoksiĉnih CD4+ CD28− CX3CR1+ T-limfocita, pri ĉemu CX3CR1 (u prisustvu gradijenta solubilnog CX3CL1) posreduje u regrutovanju ovih ćelija u moţdano tkivo gde one ostvaruju svoje citotoksiĉno dejstvo (Broux i sar., 2012). Pod pretpostavkom da postoji pozitivna korelacija izmeĊu nivoa iRNK kvantifikovanih u našoj studiji i nivoa proteina CX3CR1 (kao što je pozitivna korelacija potvrĊena u prethodnoj studiji Infante-Duarte i sar.) i uzimajući u obzir citotoksiĉnost subpopulacija CX3CR1+ mononuklearnih leukocita (Infante-Duarte i sar., 2005; Broux i sar., 2012), naši rezultati sugerišu na postojanje moguće veze izmeĊu povišene ekspresije gena za CX3CR1 u mononuklearnim leukocitima pacijenata sa RR formom multiple skleroze i citotoksiĉnog dejstva CX3CR1+ leukocita putem kojeg bi ove ćelije doprinosile procesu inflamacije u CNS-u tokom patogeneze bolesti. Citotoksiĉni efekti ovih subpopulacija CX3CR1+ mononuklearnih leukocita bi se ostvarivali i u fazi relapsa i u fazi remisije, a bili bi naroĉito izraţeni u toku faze relapsa. Jedan od mogućih razloga neslaganja rezultata ekspresije gena za CX3CR1, dobijenih u našoj i prethodnoj studiji (Infante- Duarte i sar., 2005), je izostavljanje izvesnih kliniĉkih parametara prilikom analize rezultata. Bez analize tih parametara ne moţemo znati u kolikoj meri su ove dve studije uporedive. Tako je npr. veći deo pacijenata u relapsu ukljuĉen u našu studiju u relativno kratkom vremenskom periodu nakon postavljanja dijagnoze multiple skleroze, dok su pacijenti u remisiji u trenutku ukljuĉivanja u studiju imali nešto duţe trajanje bolesti (razlika postoji, mada nije statistiĉki znaĉajna). Dakle, prilikom analize genske ekspresije, pored osnovnih kriterijuma za uporeĊivanje uzoraka koji se tiĉu odsustva/prisustva bolesti, forme i faze bolesti (ovde RR forma multiple skleroze u kojoj su analizirane faze relapsa i remisije), treba uzeti u obzir i dodatne kliniĉke parametre kao što je trajanje bolesti, i dr. 137 5.2.2. Relativna ekspresija gena za CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima kontrola i pacijenata Hemokin CXCL16 i njegov receptor, CXCR6, su tipiĉno eksprimirani u perifernim mononuklearnim leukocitima. U našoj studiji detektovan je znaĉajno viši nivo ekspresije gena za CXCL16 u mononuklearnim leukocitima periferne krvi pacijenata sa RR formom multiple skleroze, u odnosu na zdrave kontrole. Kada je podgrupa pacijenata u fazi relapsa, tj. u fazi remisije, uporeĊena sa kontrolama, ustanovljeno je da znaĉajni porast ekspresije gena za CXCL16 odlikuje pacijente u remisiji (kada se uporede sa kontrolama). Ekspresija gena za CXCR6 u mononuklearnim leukocitima nije znaĉajno razliĉita izmeĊu pacijenata sa RR formom multiple skleroze i zdravih kontrola. Kada smo uporedili podgrupe pacijenata utvrdili smo da je nivo ekspresije gena za CXCL16 znaĉajno viši, a za CXCR6 znaĉajno niţi, kod pacijenata u fazi remisije u odnosu na pacijente u fazi relapsa. CXCL16 je eksprimiran predominantno u monocitima/makrofazima (Shimaoka i sar., 2000; Minami i sar., 2001; Tabata i sar., 2005). Proinflamatorni citokini (produkovani od strane CD4+ Th1 limfocita), IFNG i TNFA, indukuju ekspresiju CXCL16 u monocitima in vitro (Wuttge i sar., 2004), dok sam CXCL16 stimuliše produkciju proinflamatornih citokina (Gursel i sar., 2006). Ovi podaci ukazuju na ulogu CXCL16 kao proinflamatornog hemokina. Analiza moţdanog tkiva obolelih od multiple skleroze pokazala je povišene nivoe CXCL16 iRNK i proteina duţ oboda i oko hroniĉnih aktivnih plakova. Porast ekspresije CXCL16 u lezijama mozga je detektovan u “penastim” makrofazima na obodu hroniĉnih aktivnih plakova i u aktiviranim mikroglijalnim ćelijama koje okruţuju ove plakove (Hendrickx i sar., 2013). Ovi podaci ukazuju na to da je CXCL16, kao receptor „ĉistaĉ“, ukljuĉen u degradaciju mijelinskog omotaĉa i prezentovanje mijelinskih antigena od strane antigen-prezentujućih ćelija, te da je porast nivoa CXCL16 u aktiviranoj mikrogliji jedan od prvih dogaĊaja tokom iniciranja fagocitoze mijelina. Pojaĉana sinteza i proteolitiĉko seĉenje membranskog CXCL16 od strane mikroglijalnih ćelija i makrofaga u CNS-u moţe biti glavni uzrok znaĉajnog porasta nivoa solubilnog CXCL16 koji je detektovan u uzorcima likvora pacijenata sa multiplom sklerozom, u odnosu na uzorke seruma ovih osoba (le Blanc i sar., 2006). U poreĊenju sa kontrolnim subjektima, nivoi solubilnog CXCL16 su bili 138 znaĉajno viši i u likvoru i u serumu pacijenata sa multiplom sklerozom (le Blanc i sar., 2006). U toku neuroinflamacije, narušavanje krvno-moţdane barijere i povišeni nivo CXCL16 u serumu mogu da olakšaju prodiranje aktiviranih mijelin-specifiĉnih CXCR6+ T-limfocita u tkivo CNS-a, što dovodi do pojaĉanog autoimunskog odgovora i oštećenja tkiva. Porast nivoa serumskog CXCL16 ukazuje na mogućnost povećane produkcije CXCL16 od strane monocita periferne krvi pacijenata. U našoj studiji detektovan je znaĉajno viši nivo ekspresije gena za CXCL16 u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata sa RR formom multiple skleroze, u odnosu na zdrave kontrole. Pritom smo ustanovili da ova razlika potiĉe od znaĉajnog porasta ekspresije CXCL16 samo u podgrupi pacijenata u remisiji kada se uporede sa kontrolama. CXCR6 je eksprimiran na NK-ćelijama, CD8+ T-limfocitima i CD4+ Th1 limfocitima (Fukumoto i sar., 2004; Matloubian i sar., 2000; Kim i sar., 2001). Poznato je da CXCL16 stimuliše hemotaksiju aktiviranih T-limfocita posredstvom aktivacije CXCR6 na njima (Matloubian i sar., 2000; Shimaoka i sar., 2003). Eksperimentalni autoimunski encefalomijelitis, kao eksperimentalni model multiple skleroze, smatra se Th1-posredovanom autoimunskom bolešću (Steinman, 1996; Hemmer i sar., 2002). Sugerisano je da CXCL16, koji je eksprimiran u monocitima infiltriranim u tkivo CNS- a, indukuje hemotaksiju i akumulaciju MOG-specifiĉnih aktiviranih CD4+ CXCR6+ Th1 limfocita u CNS tokom patogeneze EAE-a (Fukumoto i sar., 2004). Shodno tome, teţina kliniĉke slike akutnog EAE-a indukovanog MOG-om pozitivno je korelisala sa nivoima CXCL16 i CXCR6 u kiĉmenoj moţdini miševa (Fukumoto i sar., 2004). U skladu sa ovim rezultatom dobijenim na eksperimentalnom modelu multiple skleroze i ĉinjenicom da monociti eksprimiraju CXCL16, a CD4+ Th1 limfociti eksprimiraju CXCR6, oĉekivano bi bilo da ovi leukociti prisutni u perifernoj krvi obolelih od multiple skleroze pokazuju povišene nivoe ekspresije gena za CXCL16 i CXCR6. To bi se naroĉito odnosilo na pacijente koji su u fazi relapsa, s obzirom da akutni (monofazni) EAE odgovara fazi akutnog relapsa u RR formi multiple skleroze. U našoj studiji nije detektovana znaĉajna razlika nivoa iRNK za CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearima, izmeĊu kontrola i pacijenata u fazi relapsa. MeĊutim, pacijenti u fazi remisije imaju znaĉajno viši nivo CXCL16 iRNK u odnosu na kontrole. Utvrdili smo i to da se podgrupa pacijenata u remisiji razlikuje od podgrupe u relapsu takoĊe po 139 znaĉajnom porastu ekspresije gena za CXCL16, ali je to praćeno i znaĉajnim smanjenjem ekspresije CXCR6. Prisustvo CXCR6 je znaĉajan pokazatelj produkcije IFNG, pošto unutarćelijska sinteza IFNG znaĉajno pozitivno koreliše sa ekspresijom CXCR6 na površini MBP-reaktivnih CD4+ Th1 limfocita (Calabresi i sar., 2002). Dakle, posredstvom aktivacije CXCR6, CXCL16 stimuliše produkciju proinflamatornog citokina IFNG u autoreaktivnim Th1 limfocitima (Calabresi i sar., 2002), a sam IFNG indukuje ekspresiju CXCL16 u monocitima (Wuttge i sar., 2004). S obzirom na ovu ĉinjenicu, oĉekivano je bilo da teţina kliniĉke slike u eksperimentalnom modelu multiple skleroze pozitivno koreliše sa nivoima CXCL16 i CXCR6 u CNS-u tokom akutnog relapsa (Fukumoto i sar., 2004). Sa druge strane, u našoj studiji je pokazan znaĉajan porast nivoa ekspresije gena za CXCL16 uz znaĉajno sniţenje ekspresije gena za CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata u fazi remisije, u odnosu na pacijente u fazi relapsa. Ovo ukazuje na negativnu spregu koja bi mogla da smanji CXCL16-posredovanu produkciju IFNG i na taj naĉin umanji inflamatorne efekte CXCL16 u toku faze remisije. Naši rezultati sugerišu da je ekspresija gena za CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata sa RR formom multiple skleroze specifiĉna za fazu bolesti (relaps/remisija). Multipla skleroza je inflamatorna i autoimunska bolest, te analiza ekspresije gena u leukocitima periferne krvi predstavlja vaţan pristup za izuĉavanje imunološkog aspekta patogeneze ove bolesti. U ovoj studiji detektovali smo statistiĉki znaĉajne razlike u nivoima relativne ekspresije ispitivanih gena u uzorcima mononuklearnih leukocita periferne krvi, izmeĊu zdravih kontrola i pacijenata sa RR formom multiple skleroze, kao i izmeĊu podgrupa pacijenata u fazi relapsa i fazi remisije. Prethodne studije u kojima su ispitivani profili genske ekspresije ukazuju da, zajedno sa vrednošću parametra p kojim je definisana statistiĉka znaĉajnost razlike, treba uzimati u obzir i vrednost parametra “fold change” kada se analizira biološki smisao diferencijalne ekspresije gena. Autori navode da, u biološkom smislu, diferencijalna ekspresija gena postoji ukoliko je istovremeno p<0,05 i “fold change”≥1,5 (Peart i sar., 2005; Raouf i sar., 2008), ili p<0,02 i “fold change”≥1,3 (Huggins i sar., 2008). Na osnovu ovog kriterijuma (Huggins i sar., 2008) zakljuĉujemo da naši rezultati imaju biološki znaĉaj, tj. da se detektovane razlike na nivou genske ekspresije najverovatnije odraţavaju i na 140 nivou sinteze proteina. Dobijena statistiĉki znaĉajna razlika ukazuje da ekspresija gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 na nivou njihovih iRNK moţe biti pokazatelj nastanka i kliniĉkog toka RR forme multiple skleroze. Zbog toga su potrebne replikacija i validacija rezultata genske ekspresije u većem broju studija, kako bi se molekuli iRNK (i proteina) koje kodiraju navedeni ciljni geni konaĉno mogli definisati kao molekularni markeri u patogenezi multiple skleroze. 141 6. ZAKLJUĈCI 1. UtvrĊeno je da se frekvencije alela i genotipova polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1 ne razlikuju znaĉajno izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa multiplom sklerozom, tj. da ispitivani polimorfizmi nisu genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze. 2. UtvrĊeno je da postoji izraţen “linkage disequilibrium” izmeĊu polimorfizama V249I i T280M u genu za CX3CR1. Shodno tome, u grupama kontrola i pacijenata procenjeno je prisustvo tri dominantna haplotipa: V249T280, I249M280 i I249T280. Analizirani haplotipovi polimorfizama V249I i T280M nisu genetski faktori rizika za nastanak multiple skleroze. 3. Haplotip I249T280 u genu za CX3CR1 je znaĉajan protektivni faktor za kliniĉki tok multiple skleroze, koji odreĊuje 2,6 puta manji odnos šansi za progresiju relapsno- remitentne (RR) u sekundarno-progresivnu (SP) formu bolesti. 4. U bioinformatiĉkoj analizi informacionih spektara CX3CL1 i CX3CR1 utvrĊeno je da haplotip I249T280, znaĉajno asociran sa kliniĉkim tokom bolesti, kodira varijantu proteina CX3CR1 koja moţe znaĉajno da menja interakciju sa CX3CL1, u odnosu na najĉešću varijantu (V249T280) CX3CR1. 5. UtvrĊeno je da se frekvencije alela i genotipova polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 znaĉajno razlikuju izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa multiplom sklerozom. Pokazano je da se polimorfizmi I123T i A181V nalaze u apsolutnom “linkage disequilibrium”-u. Haplotip T123V181 predstavlja znaĉajan genetski faktor rizika za nastanak multiple skleroze, povećavajući njegovim nosiocima šansu za oboljevanje za 1,3 puta. 6. Detektovana je polno zavisna asocijacija polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 sa nastankom multiple skleroze. Ţene nosioci haplotipa T123V181 imaju 1,4 puta znaĉajno veću šansu da obole, u poreĊenju sa ţenama nosiocima najĉešćeg haplotipa, I123A181. Haplotip T123V181 nije genetski faktor rizika za nastanak multiple skleroze kod muškaraca. 7. Nije utvrĊena asocijacija polimorfizama I123T i A181V u genu za CXCL16 sa kliniĉkim tokom i progresijom multiple skleroze. 142 8. U bioinformatiĉkoj analizi informacionih spektara CXCL16 i CXCR6 utvrĊeno je da haplotip T123V181, koji je genetski faktor rizika za nastanak multiple skleroze, kodira varijantu CXCL16 koja moţe znaĉajno menjati interakciju sa CXCR6, u odnosu na najĉešću varijantu (I123A181) CXCL16. 9. U uzorcima mononuklearnih leukocita periferne krvi zdravih kontrola i pacijenata sa RR formom multiple skleroze detektovana je i kvantifikovana ekspresija gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6, na nivou njihovih iRNK. Ekspresija gena za CX3CL1 nije detektovana u ispitivanim uzorcima. 10. UtvrĊeno je da postoji znaĉajno povišena (za 1,3 puta) ekspresija gena za CX3CR1 u perifernim mononuklearnim leukocitima svih pacijenata sa RR formom multiple skleroze, kao i podgrupa pacijenata u fazi relapsa i remisije, u odnosu na grupu zdravih kontrola. Prema tome, znaĉajno povišen nivo CX3CR1 iRNK u perifernim mononuklearnim leukocitima moţe biti molekularni marker nastanka RR forme multiple skleroze. 11. Detektovana je znaĉajno povišena (za 1,4 puta) ekspresija gena za CXCL16 u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata sa RR formom multiple skleroze, u poreĊenju sa grupom zdravih kontrola. Znaĉajno povišena ekspresija ovog gena je utvrĊena i u podgrupi pacijenata u fazi remisije, u odnosu na podgrupu u fazi relapsa (za 1,3 puta) i u odnosu na kontrolnu grupu (za 1,6 puta). Rezultat ukazuje da povećanje nivoa CXCL16 iRNK u perifernim mononuklearnim leukocitima moţe biti molekularni marker za fazu remisije u RR formi multiple skleroze. 12. UtvrĊeno je da ne postoje znaĉajne razlike u nivoima ekspresije gena za CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima izmeĊu grupe pacijenata sa RR formom multiple skleroze i grupe kontrola. Pacijenti u fazi remisije imaju znaĉajno niţu (za 1,4 puta) ekspresiju gena za CXCR6, u odnosu na pacijente u fazi relapsa. Dakle, smanjenje nivoa CXCR6 iRNK u perifernim mononuklearnim leukocitima moţe biti molekularni marker za fazu remisije u RR formi multiple skleroze. 13. Ne postoje znaĉajne korelacije izmeĊu vrednosti kliniĉkih parametara i nivoa ekspresije gena za CX3CR1, CXCL16 i CXCR6 u perifernim mononuklearnim leukocitima pacijenata sa RR formom multiple skleroze. 143 7. LITERATURA Abbas AK, Lichtman AH. Osnovna imunologija, drugo obnovljeno izdanje. Data status 2006. Abbott NJ, Ronnback L, Hansson E. Astrocyte–endothelial interactions at the blood– brain barrier. Nat Rev Neurosci 2006;7:41-53. Abel S, Hundhausen C, Mentlein R, Schulte A, Berkhout TA, Broadway N, Hartmann D, Sedlacek R, Dietrich S, Muetze B, Schuster B, Kallen KJ, Saftig P, Rose- John S, Ludwig A. The transmembrane CXC chemokine ligand 16 is induced by IFN-gamma and TNF-alpha and shed by the activity of the disintegrin-like metalloproteinase ADAM10. J Immunol 2004;172:6362-6372. Achiron A, Gurevich M, Friedman N, Kaminski N, Mandel M. Blood transcriptional signatures of multiple sclerosis: unique gene expression of disease activity. Ann Neurol 2004;55:410-417. Alonso A, Hernan MA. Temporal trends in the incidence of multiple sclerosis: a systematic review. Neurol 2008;71:129-135. Ambrosini E, Aloisi F. Chemokines and glial cells: a complex network in the central nervous system. Neurochem Res 2004;29(5):1017-1038. Ancuta P, Rao R, Moses A, Mehle A, Shaw SK, Luscinskas FW, Gabuzda D. Fractalkine preferentially mediates arrest and migration of CD16+ monocytes. J Exp Med 2003;197:1701-1707. Andersen CL, Jensen JL, Ørntoft TF. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res 2004;64(15):5245-5250. Ando DG, Clayton J, Kono D, Urban JL, Sercarz EE. Encephalitogenic T cells in the B10. PL model of experimental allergic encephalomyelitis (EAE) are of the Th- 1 lymphokine subtype. Cell Immunol 1989;124:132-143. ANZgene. Genome-wide association study identifies new multiple sclerosis susceptibility loci on chromosomes 12 and 20. Nat Genet 2009;41:824-828. 144 Apostolakis S, Amanatidou V, Papadakis EG, Spandidos DA. Genetic diversity of CX3CR1 gene and coronary artery disease: new insights through a meta- analysis. Atherosclerosis 2009;207:8-15. Apostolakis S, Baritaki S, Kochiadakis GE, Igoumenidis NE, Panutsopulos D, Spandidos DA. Effects of polymorphisms in chemokine ligands and receptors on susceptibility to coronary artery disease. Thromb Res 2007;119:63-71. Applied Biosystems. Guide to performing relative quantitation of gene expression using Real-time quantitative PCR. 2004;7:34. Arli B, Irkec C, Menevse S, Yilmaz A, Alp E. Fractalkine gene receptor polymorphism in patients with multiple sclerosis. Int J Neurosci 2013;123(1):31-37. Arthur AT, Armati PJ, Bye C. Southern MS Genetics Consortium. Genes implicated in multiple sclerosis pathogenesis from consilience of genotyping and expression profiles in relapse and remission. BMC Med Genet 2008;9:17. Ascherio A, Munger KL. Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part II: noninfectious factors. Ann Neurol 2007;61:504-513. Ascherio A, Munger KL. Environmental risk factors for multiple sclerosis. Part I: the role of infection. Ann Neurol 2007;61(4):288-299. Aslanian AM, Charo IF. Targeted disruption of the scavenger receptor and chemokine CXCL16 accelerates atherosclerosis. Circulat 2006;114:583-590. Baeke F, Korf H, Overbergh L, Verstuyf A, Thorrez L, Van Lommel L, Waer M, Schuit F, Gysemans C, Mathieu C. The vitamin D analog, TX527, promotes a human CD4+CD25highCD127low regulatory T cell profile and induces a migratory signature specific for homing to sites of inflammation. J Immunol 2011;186(1):132-142. Bajetto A, Bonavia R, Barbero S, Schettini G. Characterization of chemokines and their receptors in the central nervous system: physiopathological implications. J Neurochem 2002;82:1311-1329. Balashov KE, Rottman JB, Weiner HL, Hancock WW. CCR5(+) and CXCR3(+) T cells are increased in multiple sclerosis and their ligands MIP-1alpha and IP-10 are expressed in demyelinating brain lesions. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:6873-6878. 145 Ban M, Goris A, Lorentzen AR, Baker A, Mihalova T, Ingram G, Booth DR, Heard RN, Stewart GJ, Bogaert E, Dubois B, Harbo HF, Celius EG, Spurkland A, Strange R, Hawkins C, Robertson NP, Dudbridge F, Wason J, De Jager PL, Hafler D, Rioux JD, Ivinson AJ, McCauley JL, Pericak-Vance M, Oksenberg JR, Hauser SL, Sexton D, Haines J, Sawcer S; Wellcome Trust Case-Control Consortium (WTCCC), Compston A. Replication analysis identifies TYK2 as a multiple sclerosis susceptibility factor. Eur J Hum Genet 2009;17:1309-1313. Baranzini SE, Wang J, Gibson RA, Galwey N, Naegelin Y, Barkhof F, Radue EW, Lindberg RL, Uitdehaag BM, Johnson MR, Angelakopoulou A, Hall L, Richardson JC, Prinjha RK, Gass A, Geurts JJ, Kragt J, Sombekke M, Vrenken H, Qualley P, Lincoln RR, Gomez R, Caillier SJ, George MF, Mousavi H, Guerrero R, Okuda DT, Cree BA, Green AJ, Waubant E, Goodin DS, Pelletier D, Matthews PM, Hauser SL, Kappos L, Polman CH, Oksenberg JR. Genome- wide association analysis of susceptibility and clinical phenotype in multiple sclerosis. Hum Mol Genet 2009;18:767-778. Baranzini SE. Revealing the genetic basis of multiple sclerosis: are we there yet? Curr Opin Genet Develop 2011;21:317-324. Barlic J, McDermott DH, Merrell MN, Gonzales J, Via LE, Murphy PM. Interleukin (IL)-15 and IL-2 reciprocally regulate expression of the chemokine receptor CX3CR1 through selective NFAT1- and NFAT2-dependent mechanisms. J Biol Chem 2004;279(47):48520-48534. Barlic J, Sechler JM, Murphy PM. IL-15 and IL-2 oppositely regulate expression of the chemokine receptor CX3CR1. Blood 2003;102:3494-3503. Bartholomaus I, Kawakami N, Odoardi F, Schlager C, Miljkovic D, Ellwart JW, Klinkert WE, Flugel-Koch C, Issekutz TB, Wekerle H, Flugel A. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nat 2009;462:94-98. Bazan JF, Bacon KB, Hardiman G, Wang W, Soo K, Rossi D, Greaves DR, Zlotnik A, Schall TJ. A new class of membrane-bound chemokine with a CX3C motif. Nat 1997;385:640-644. Benveniste EN. Role of macrophages/microglia in multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. J Mol Med 1997;75:165-173. 146 Bergamaschi R. Prognostic factors in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol 2007;79:423-447. Bhavsar PK, Sukkar MB, Khorasani N, Lee KY, Chung KF. Glucocorticoid suppression of CX3CL1 (fractalkine) by reduced gene promoter recruitment of NF-kappaB. FASEB J 2008;22(6):1807-1816. Birnbaum G, Kotilinek L. Heat shock or stress proteins and their role as autoantigens in multiple sclerosis. Ann NY Acad Sci 1997;835:157-167. Blaschke S, Koziolek M, Schwarz A, Benöhr P, Middel P, Schwarz G, Hummel KM, Müller GA. Proinflammatory role of fractalkine (CX3CL1) in rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2003;30(9):1918-1927. Boehme SA, Lio FM, Maciejewski-Lenoir D, Bacon KB, Conlon PJ. The chemokine fractalkine inhibits Fas-mediated cell death of brain microglia. J Immunol 2000;165:397-403. Bomprezzi R, Ringnér M, Kim S, Bittner ML, Khan J, Chen Y, Elkahloun A, Yu A, Bielekova B, Meltzer PS, Martin R, McFarland HF, Trent JM. Gene expression profile in multiple sclerosis patients and healthy controls: identifying pathways relevant to disease. Hum Mol Genet 2003;12:2191-2199. Borkar M, Tripathi G, Sharma RK, Sankhwar SN, Agrawal S. Chemokine (CCR) and fractalkine (CX3CR) receptors and end stage renal disease. Inflamm Res 2011;60(4):399-407. Broux B, Pannemans K, Zhang X, Markovic-Plese S, Broekmans T, Eijnde BO, Van Wijmeersch B, Somers V, Geusens P, van der Pol S, van Horssen J, Stinissen P, Hellings N. CX(3)CR1 drives cytotoxic CD4(+)CD28(-) T cells into the brain of multiple sclerosis patients. J Autoimmun 2012;38(1):10-19. Burton JM, Kimball S, Vieth R, Bar-Or A, Dosch HM, Cheung R, Gagne D, D'Souza C, Ursell M, O'Connor P. A phase I/II dose-escalation trial of vitamin D3 and calcium in multiple sclerosis. Neurol 2010;74:1852-1859. Burton JM, O'Connor PW, Hohol M, Beyene J. Oral versus intravenous steroids for treatment of relapses in multiple sclerosis. Cochrane Database Syst Rev 2009;(3):CD006921. 147 Calabresi PA, Yun SH, Allie R, Whartenby KA. Chemokine receptor expression on MBP-reactive T cells: CXCR6 is a marker of IFNgamma-producing effector cells. J Neuroimmunol 2002;127(1-2):96-105. Cantorna MT. Vitamin D and multiple sclerosis: an update. Nutr Rev 2008;66(10 Suppl.2):S135-138. Carlson T, Kroenke M, Rao P, Lane TE, Segal B. The Th17-ELR+ CXC chemokine pathway is essential for the development of central nervous system autoimmune disease. J Exp Med 2008;205:811-823. Carter KW, McCaskie PA, Palmer LJ. JLIN: A Java based Linkage Disequilibrium plotter. BMC Bioinformatics 2006;7:60. Carter KW, McCaskie PA, Palmer LJ. SimHap GUI: An intuitive graphical user interface for genetic association analysis. BMC Bioinformatics 2008;9:557. Chandrasekar B, Bysani S, Mummidi S. CXCL16 signals via Gi, phosphatidylinositol 3-kinase, Akt, I kappa B kinase, and nuclear factor-kappaBand induces cell–cell adhesion and aortic smooth muscle cell proliferation. J Biol Chem 2004;279:3188-3196. Chandrasekar B, Mummidi S, Valente AJ, Patel DN, Bailey SR, Freeman GL, Hatano M, Tokuhisa T, Jensen LE. The pro-atherogenic cytokine interleukin-18 induces CXCL16 expression in rat aortic smooth muscle cells via MyD88, interleukin-1 receptor-associated kinase, tumor necrosis factor receptor-associated factor 6, c- Src, phosphatidylinositol 3-kinase, Akt, c-Jun N-terminal kinase, and activator protein-1 signaling. J Biol Chem 2005;280(28):26263-26277. Chapman GA, Moores K, Harrison D, Campbell CA, Stewart BR, Strijbos PJ. Fractalkine cleavage from neuronal membranes represents an acute event in the inflammatory response to excitotoxic brain damage. J Neurosci 2000;20:RC87. Charcot J. Histologie de la sclérose en plaque. Gazette des Hôpitaux 1868;41:554-566. Charo IF, Ransohoff RM. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med 2006;354:610-621. Chen S, Luo D, Streit WJ, Harrison JK. TGF-beta1 upregulates CX3CR1 expression and inhibits fractalkine-stimulated signaling in rat microglia. J Neuroimmunol 2002;133:46-55. 148 Chen Y, Green SR, Almazan F, Quehenberger O. The amino terminus and the third extracellular loop of CX3CR1 contain determinants critical for distinct receptor functions. Mol Pharmacol 2006;69(3):857-865. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 1987;162(1):156-159. Cid MC, Kleinman HK, Grant DS, Schnaper HW, Fauci AS, Hoffman GS. Estradiol enhances leukocyte binding to tumor necrosis factor (TNF)-stimulated endothelial cells via an increase in TNF-induced adhesion molecules E-selectin, intercellular adhesion molecule type 1, and vascular cell adhesion molecule type 1. J Clin Invest 1994;93(1):17-25. Clark AK, Yip PK, Malcangio M. The liberation of fractalkine in the dorsal horn requires microglial cathepsin S. J Neurosci 2009;29:6945-6954. Cockwell P, Chakravorty SJ, Girdlestone J, Savage CO. Fractalkine expression in human renal inflammation. J Pathol 2002;196:85-90. Colobran R, Pujol-Borrell R, Armengol MP, Juan M. The chemokine network. II. On how polymorphisms and alternative splicing increase the number of molecular species and configure intricate patterns of disease susceptibility. Clin Exp Immunol 2007;150:1-12. Columba-Cabezas S, Serafini B, Ambrosini E, Sanchez M, Penna G, Adorini L, Aloisi F. Induction of macrophage-derived chemokine/CCL22 expression in experimental autoimmune encephalomyelitis and cultured microglia: implications for disease regulation. J. Neuroimmunol. 2002;130:10-21. Comabella M, Craig DW, Camina-Tato M, Morcillo C, Lopez C, Navarro A, Rio J, Montalban X, Martin R. Identification of a novel risk locus for multiple sclerosis at 13q31.3 by a pooled genome-wide scan of 500,000 single nucleotide polymorphisms. PLoS ONE 2008;3:e3490 Combadière C, Godin O, Vidal C, Cangialosi A, Proust C, Tzourio C. Common CX3CR1 alleles are associated with a reduced risk of headaches. Headache 2008;48:1061-1066. Combadière C, Potteaux S, Gao JL, Esposito B, Casanova S, Lee EJ, Debré P, Tedgui A, Murphy PM, Mallat Z. Decreased atherosclerotic lesion formation in CX3CR1/apolipoprotein E double knockout mice. Circulat 2003;107:1009-1016. 149 Combadière C, Salzwedel K, Smith ED, Tiffany HL, Berger EA, Murphy PM. Identification of CX3CR1. A chemotactic receptor for the human CX3C chemokine fractalkine and a fusion coreceptor for HIV-1. J Biol Chem 1998;273:23799-23804. Compston A, Coles A. Multiple sclerosis. Lancet 2002;359:1221-1231. Compston A. The genetic epidemiology of multiple sclerosis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1999;354:1623-1634. Confavreux C, Vukusic S. Age at disability milestones in multiple sclerosis. Brain 2006;129:595-605. Confavreux C, Vukusic S. Natural history of multiple sclerosis: implications for counselling and therapy. Curr Opin Neurol 2002;15(3):257-266. Confavreux C, Vukusic S. The clinical epidemiology of multiple sclerosis. Neuroimaging Clin N Am 2008;18(4):589-622. Crawford MP, Yan SX, Ortega SB, Mehta RS, Hewitt RE, Price DA, Stastny P, Douek DC, Koup RA, Racke MK, Karandikar NJ. High prevalence of autoreactive, neuroantigen-specific CD8+ T cells in multiple sclerosis revealed by novel flow cytometric assay. Blood 2004;103:4222-4231. Cross AK, Woodroofe MN. Chemokine modulation of matrix metalloproteinase and TIMP production in adult rat brain microglia and a human microglial cell line in vitro. Glia 1999;28:183-189. D’Netto MJ, Ward H, Morrison KM, Ramagopalan SV, Dyment DA, DeLuca GC, Handunnetthi L, Sadovnick AD, Ebers GC. Risk alleles for multiple sclerosis in multiplex families. Neurol 2009;72:1984-1988. Damas JK, Boullier A, Waehre T, Smith C, Sandberg WJ, Green S, Aukrust P, Quehenberger O. Expression of fractalkine (CX3CL1) and its receptor, CX3CR1, is elevated in coronary artery disease and is reduced during statin therapy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:2567-2572. Daoudi M, Lavergne E, Garin A, Tarantino N, Debre P, Pincet F, Combadiere C, Deterre P. Enhanced adhesive capacities of the naturally occurring Ile249- Met280 variant of the chemokine receptor CX3CR1. J Biol Chem 2004;279:19649-19657. 150 Darbandi-Tehrani K, Hermand P, Carvalho S, Dorgham K, Couvineau A, Lacapère JJ, Combadière C, Deterre P. Subtle conformational changes between CX3CR1 genetic variants as revealed by resonance energy transfer assays. FASEB J 2010;24(11):4585-4598. De Jager PL, Jia X, Wang J, de Bakker PI, Ottoboni L, Aggarwal NT, Piccio L, Raychaudhuri S, Tran D, Aubin C, Briskin R, Romano S; International MS Genetics Consortium, Baranzini SE, McCauley JL, Pericak-Vance MA, Haines JL, Gibson RA, Naeglin Y, Uitdehaag B, Matthews PM, Kappos L, Polman C, McArdle WL, Strachan DP, Evans D, Cross AH, Daly MJ, Compston A, Sawcer SJ, Weiner HL, Hauser SL, Hafler DA, Oksenberg JR. Meta-analysis of genome scans and replication identify CD6, IRF8 and TNFRSF1A as new multiple sclerosis susceptibility loci. Nat Genet 2009;41:776-782. Debette S, Bevan S, Dartigues JF, Sitzer M, Lorenz M, Ducimetière P, Amouyel P, Markus HS. Fractalkine receptor/ligand genetic variants and carotid intima- media thickness. Stroke 2009;40(6):2212-2214. Deng HK, Unutmaz D, KewalRamani VN, Littman DR. Expression cloning of new receptors used by simian and human immunodeficiency viruses. Nat 1997;388(6639):296-300. Devlin B, Risch N. A comparison of linkage disequilibrium measures for fine-scale mapping. Genomics 1995;29(2):311-322. Duggal P, An P, Beaty TH, Strathdee SA, Farzadegan H, Markham RB, Johnson L, O'Brien SJ, Vlahov D, Winkler CA. Genetic influence of CXCR6 chemokine receptor alleles on PCP-mediated AIDS progression among African Americans. Genes Immun 2003;4(4):245-250. Duthey B, Hubner A, Diehl S, Boehncke S, Pfeffer J, Boehncke WH. Anti- inflammatory effects of the GABA(B) receptor agonist baclofen in allergic contact dermatitis. Exp Dermatol 2010;19:661-666. Dutta R, McDonough J, Chang A, Swamy L, Siu A, Kidd GJ, Rudick R, Mirnics K, Trapp BD. Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signaling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients. Brain 2007;130:2566- 2576. 151 Dutta R, McDonough J, Yin X, Peterson J, Chang A, Torres T, Gudz T, Macklin WB, Lewis DA, Fox RJ, Rudick R, Mirnics K, Trapp BD. Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients. Ann Neurol 2006;59:478-489. Ebers GC. Environmental factors and multiple sclerosis. Lancet Neurol 2008;7(3):268– 77. Epstein MA, Crawford DH. Gammaherpesviruses: Epstein-Barr virus. In: Maxy BWJ, Collier L. Topley and Wilson’s microbiology and microbial infections. 9th ed London: Arnold 1999;p351-366. Excoffier L, Slatkin M. Maximum-likelihood estimation of molecular haplotype frequencies in a diploid population. Mol Biol Evol 1995;12:921-927. Faure S, Meyer L, Costagliola D, Vaneensberghe C, Genin E, Autran B, Delfraissy JF, McDermott DH, Murphy PM, Debré P, Théodorou I, Combadière C. Rapid progression to AIDS in HIV+ individuals with a structural variant of the chemokine receptor CX3CR1. Science 2000;287:2274-2277. Filippi M, Paty DW, Kappos L, Barkhof F, Compston DA, Thompson AJ, Zhao GJ, Wiles CM, McDonald WI, Miller DH. Correlations between changes in disability and T2-weighted brain MRI activity in multiple sclerosis: a follow-up study. Neurol 1995;45:255-260. Fischer FR, Santambrogio L, Luo Y, Berman MA, Hancock WW, Dorf ME. Modulation of experimental autoimmune encephalomyelitis: effect of altered peptide ligand on chemokine and chemokine receptor expression. J Neuroimmunol 2000;110(1-2):195-208. Flower DR. Modelling G-protein-coupled receptors for drug design. Biochim Biophys Acta 1999;1422:207-234. Franciotta D, Salvetti M, Lolli F, Serafini B, Aloisi F. B cells and multiple sclerosis. Lancet Neurol 2008;7:852-858. Fraticelli P, Sironi M, Bianchi G, D'Ambrosio D, Albanesi C, Stoppacciaro A, Chieppa M, Allavena P, Ruco L, Girolomoni G, Sinigaglia F, Vecchi A, Mantovani A. Fractalkine (CX3CL1) as an amplification circuit of polarized Th1 responses. J Clin Invest 2001;107:1173-1181. 152 Frohman EM, Racke MK, Raine CS. Multiple sclerosis- the plaque and its pathogenesis. N Engl J Med 2006;354:942-955. Fujimoto K, Imaizumi T, Yoshida H, Takanashi S, Okumura K, Satoh K. Interferon-γ stimulates fractalkine expression in human bronchial epithelial cells and regulates mononuclear cell adherence. Am J Respir Cell Mol Biol 2001;25:233- 238. Fukumoto N, Shimaoka T, Fujimura H, Sakoda S, Tanaka M, Kita T, Yonehara S. Critical roles of CXC chemokine ligand 16/scavenger receptor that binds phosphatidylserine and oxidized lipoprotein in the pathogenesis of both acute and adoptive transfer experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2004;173(3):1620-1627. Furuichi K, Gao JL, Murphy PM. Chemokine receptor CX3CR1 regulates renal interstitial fibrosis after ischemia-reperfusion injury. Am J Pathol 2006;169:372- 387. Galkina E, Harry BL, Ludwig A, Liehn EA, Sanders JM, Bruce A, Weber C, Ley K. CXCR6 promotes atherosclerosis by supporting T-cell homing, interferon- gamma production, and macrophage accumulation in the aortic wall. Circulation 2007;116:1801-1811. Garcia GE, Xia Y, Chen S, Wang Y, Ye RD, Harrison JK, Bacon KB, Zerwes HG, Feng L. NF-kappaB-dependent fractalkine induction in rat aortic endothelial cells stimulated by IL-1beta, TNF-alpha, and LPS. J Leukoc Biol 2000;67:577-584. Garin A, Pellet P, Deterre P, Debre P, Combadiere C. Cloning and functional characterization of the human fractalkine receptor promoter regions. Biochem J 2002;368:753-760. Garton KJ, Gough PJ, Blobel CP, Murphy G, Greaves DR, Dempsey PJ, Raines EW. Tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17) mediates the cleavage and shedding of fractalkine (CX3CL1). J Biol Chem 2001;276:37993- 38001. Garton KJ, Gough PJ, Raines EW. Emerging roles for ectodomain shedding in the regulation of inflammatory responses. J Leukoc Biol 2006;79:1105-1116. Ge S, Song L, Pachter JS. Where is the blood–brain barrier…really? J Neurosci Res 2005;79:421-427. 153 Geissmann F, Jung S, Littman DR. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity 2003;19:71-82. Genain CP, Nguyen MH, Letvin NL, Pearl R, Davis RL, Adelman M, Lees MB, Linington C, Hauser SL. Antibody facilitation of multiple sclerosis-like lesions in a nonhuman primate. J Clin Invest 1995;96:2966-2974. Gerard C, Rollins BJ. Chemokines and disease. Nat Immunol 2001;2:108-115. Glad SB, Nyland HI, Aarseth JH, Riise T, Myhr K. Long-termfollow-upofbenign multiple sclerosis in Hordaland County, Western Norway. Mult Scler 2009;15:942-950. Gough PJ, Garton KJ, Wille PT, Rychlewski M, Dempsey PJ, Raines EW. A disintegrin and metalloproteinase 10-mediated cleavage and shedding regulates the cell surface expression of CXC chemokine ligand 16. J Immunol 2004;172:3678- 3685. Graumann U, Reynolds R, Steck AJ, Schaeren-Wiemers N. Molecular changes in normal appearing white matter in multiple sclerosis are characteristic of neuroprotective mechanisms against hypoxic insult. Brain Pathol 2003;13:554- 573. Greaves DR, Hakkinen T, Lucas AD, Liddiard K, Jones E, Quinn CM, Senaratne J, Green FR, Tyson K, Boyle J, Shanahan C, Weissberg PL, Gordon S, Ylä- Hertualla S. Linked chromosome 16q13 chemokines, macrophage-derived chemokine, fractalkine, and thymus- and activationregulated chemokine, are expressed in human atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:923-929. Greer JM, McCombe PA. Role of gender in multiple sclerosis: Clinical effects and potential molecular mechanisms. J Neuroimmunol 2011;234:7-18. Gursel M, Gursel I, Mostowski HS, Klinman DM. CXCL16 influences the nature and specificity of CpG-induced immune activation. J Immunol 2006;177:1575-1580. Haas J, Hug A, Viehöver A, Fritzsching B, Falk CS, Filser A, Vetter T, Milkova L, Korporal M, Fritz B, Storch-Hagenlocher B, Krammer PH, Suri-Payer E, Wildemann B. Reduced suppressive effect of CD4+CD25high regulatory T cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol 2005;35:3343-3352. 154 Hafler DA, Compston A, Sawcer S, Lander ES, Daly MJ, De Jager PL, de Bakker PI, Gabriel SB, Mirel DB, Ivinson AJ, Pericak-Vance MA, Gregory SG, Rioux JD, McCauley JL, Haines JL, Barcellos LF, Cree B, Oksenberg JR, Hauser SL. Risk alleles for multiple sclerosis identified by a genomewide study. N Engl J Med 2007;357:851-862. Hafler JP, Maier LM, Cooper JD, Plagnol V, Hinks A, Simmonds MJ, Stevens HE, Walker NM, Healy B, Howson JM, Maisuria M, Duley S, Coleman G, Gough SC; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Worthington J, Kuchroo VK, Wicker LS, Todd JA. CD226 Gly307Ser association with multiple autoimmune diseases. Genes Immun 2009;10:5-10. Haines JL, Terwedow HA, Burgess K, Pericak-Vance MA, Rimmler JB, Martin ER, Oksenberg JR, Lincoln R, Zhang DY, Banatao DR, Gatto N, Goodkin DE, Hauser SL. Linkage of the MHC to familial multiple sclerosis suggests genetic heterogeneity. The Multiple Sclerosis Genetics Group. Hum Mol Genet 1998;7:1229-1234. Haliassos A, Chomel JC, Grandjouan S, Kruh J, Kaplan JC, Kitzis A. Detection of minority point mutations by modified PCR technique: a new approach for a sensitive diagnosis of tumor-progression markers. Nucleic Acids Res 1989;17(20):8093-8099. Hara T, Katakai T, Lee JH, Nambu Y, Nakajima-Nagata N, Gonda H, Sugai M, Shimizu A. A transmembrane chemokine, CXC chemokine ligand 16, expressed by lymph node fibroblastic reticular cells has the potential to regulate T cell migration and adhesion. Int Immunol 2006;18:301-311. Harrison JK, Fong AM, Swain PAW, Chen S, Yu YRA, Salafranca MN, Greenleaf WB, Imai T, Patel DD. Mutational analysis of the fractalkine chemokine domain: basic amino acid residues differentially contribute to CX3CR1 binding, signaling and cell adhesion. J Biol Chem 2001;276(24):21632-21641. Harrison JK, Jiang Y, Chen S, Xia Y, Maciejewski D, McNamara RK, Streit WJ, Salafranca MN, Adhikari S, Thompson DA, Botti P, Bacon KB, Feng L. Role for neuronally derived fractalkine in mediating interactions between neurons and CX3CR1-expressing microglia. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:10896-10901. 155 Harrison JK, Jiang Y, Wees EA, Salafranca MN, Liang HX, Feng L, Belardinelli L. Inflammatory agents regulate in vivo expression of fractalkine in endothelial cells of the rat heart. J Leukoc Biol 1999;66(6):937-944. Hase K, Murakami T, Takatsu H, Shimaoka T, Iimura M, Hamura K, Kawano K, Ohshima S, Chihara R, Itoh K, Yonehara S, Ohno H. The membrane-bound chemokine CXCL16 expressed on follicle-associated epithelium and M cells mediates lympho-epithelial interaction in GALT. J Immunol 2006;176:43-51. Haskell CA, Cleary MD, Charo IF. Unique role of the chemokine domain of fractalkine in cell capture. Kinetics of receptor dissociation correlate with cell adhesion. J Biol Chem 2000;275:34183-34189. Hatori K, Nagai A, Heisel R, Ryu JK, Kim SU. Fractalkine and fractalkine receptors in human neurons and glial cells. J Neurosci Res 2002;69:418-426. Hattermann K, Ludwig A, Gieselmann V, Held-Feindt J, Mentlein R. The chemokine CXCL16 induces migration and invasion of glial precursor cells via its receptor CXCR6. Mol Cell Neurosci 2008;39(1):133-141. Hattori H, Ito D, Tanahashi N, Murata M, Saito I, Watanabe K, Suzuki N. T280M and V249I polymorphisms of fractalkine receptor CX3CR1 and ischemic cerebrovascular disease. Neurosci Lett 2005;374:132-135. Hauser SL, Goodkin DE. Multiple sclerosis and other demyelinating diseases. In: Fauci AD, Braunwald E, Isselbacher JD, Martin JB, Kasper DL, Hauser SL, et al., editors. Harrison’s principle of internal medicine. New York: McGraw Hill 1998;p2409-2419. Hauser SL, Goodkin SL. Multiple sclerosis and other demyelinating diseases. Harrison’s Principles in Internal Medicine 2001;2452-2461. Hemmer B, Cepok S, Nessler S, Sommer N. Pathogenesis of multiple sclerosis: an update on immunology. Curr Opin Neurol 2002;15(3):227-231. Hendrickx DA, Koning N, Schuurman KG, van Strien ME, van Eden CG, Hamann J, Huitinga I. Selective upregulation of scavenger receptors in and around demyelinating areas in multiple sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 2013;72(2):106-118. Hewison M. Vitamin D and the immune system: new perspectives on an old theme. Endocrinol Metab Clin North Am 2010;39(2):365-379. 156 Hofnagel O, Luechtenborg B, Plenz G, Robenek H. Expression of the novel scavenger receptor SR-PSOX in cultured aortic smooth muscle cells and umbilical endothelial cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:710-711. Hohlfeld R, Wekerle H. Immunological update on multiple sclerosis. Curr Opin Neurol 2001;14:299-304. Hohol MJ, Olek MJ, Orav EJ, Stazzone L, Hafler DA, Khoury SJ, Dawson DM, Weiner HL. Treatment of progressive multiple sclerosis with pulse cyclophosphamide/methylprednisolone: response to therapy is linked to the duration of progressive disease. Mult Scler 1999;5:403-409. Holick MF. Sunlight and vitamin D for bone health and prevention of autoimmune diseases, cancers, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 2004;80(6 Suppl):1678S-1688S. Holman DW, Klein RS, Ransohoff RM. The blood–brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta 2011;1812:220-230. Hoppenbrouwers IA, Aulchenko YS, Ebers GC, Ramagopalan SV, Oostra BA, van Duijn CM, Hintzen RQ. EVI5 is a risk gene for multiple sclerosis. Genes Immun 2008;9:334-337. Hoppenbrouwers IA, Aulchenko YS, Janssens AC, Ramagopalan SV, Broer L, Kayser M, Ebers GC, Oostra BA, van Duijn CM, Hintzen RQ. Replication of CD58 and CLEC16A as genome-wide significant risk genes for multiple sclerosis. J Hum Genet 2009;54(11):676-680. Hoppenbrouwers IA, Hintzen RQ. Genetics of multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta 2011;1812:194-201. Hori S, Haury M, Coutinho A, Demengeot J. Specificity requirements for selection and effector functions of CD25+4+ regulatory T cells in anti-myelin basic protein T cell receptor transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA 2002;99:8213-8218. http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CX3CR1%20homo%20sapiens http://cedar.genetics.soton.ac.uk/publichtml/primer1.html http://cedar.genetics.soton.ac.uk/publichtml/primer2.html http://perlprimer.sourceforge.net http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10663 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1524 157 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58191 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6376 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/68348719 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1050998 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3732378 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=3732379 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CX3CL1%20homo%20sapiens http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CXCL16%20homo%20sapiens http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp?term=CXCR6%20homo%20sapiens http://www.ncbi.nlm.nni.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=2277680 Huang D, Shi FD, Jung S, Pien GC, Wang J, Salazar-Mather TP, He TT, Weaver JT, Ljunggren HG, Biron CA, Littman DR, Ransohoff RM. The neuronal chemokine CX3CL1/fractalkine selectively recruits NK cells that modify experimental autoimmune encephalomyelitis within the central nervous system. FASEB J 2006;20(7):896-905. Huang M, Han Y, Zhang X, Pei F, Deng J, Kang J, Yan C. An intron polymorphism in the CXCL16 gene is associated with increased risk of coronary artery disease in Chinese Han population: a large angiography-based study. Atherosclerosis 2010;210(1):160-165. Hug A, Korporal M, Schröder I, Haas J, Glatz K, Storch-Hagenlocher B, Wildemann B. Thymic export function and T cell homeostasis in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. J Immunol 2003;171:432-437. Huggins CE, Domenighetti AA, Ritchie ME, Khalil N, Favaloro JM, Proietto J, Smyth GK, Pepe S, Delbridge LM. Functional and metabolic remodelling in GLUT4- deficient hearts confers hyper-responsiveness to substrate intervention. J Mol Cell Cardiol 2008;44(2):270-280. Hughes PM, Botham MS, Frentzel S, Mir A, Perry VH. Expression of fractalkine (CX3CL1) and its receptor, CX3CR1, during acute and chronic inflammation in the rodent CNS. Glia 2002;37:314-327. Hulkower K, Brosnan CF, Aquino DA, Cammer W, Kulshrestha S, Guida MP, Rapoport DA, Berman JW. Expression of CSF-1, c-fms, and MCP-1 in the 158 central nervous system of rats with experimental allergic encephalomyelitis. J Immunol 1993;150:2525-2533. Hulshof S, van Haastert ES, Kuipers HF, van den Elsen PJ, De Groot CJ, van der Valk P, Ravid R, Biber K. CX3CL1 and CX3CR1 expression in human brain tissue: noninflammatory control versus multiple sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol 2003;62:899-907. Hundhausen C, Misztela D, Berkhout TA, Broadway N, Saftig P, Reiss K, Hartmann D, Fahrenholz F, Postina R, Matthews V, Kallen KJ, Rose-John S, Ludwig A. The disintegrin-like metalloproteinase ADAM10 is involved in constitutive cleavage of CX3CL1 (fractalkine) and regulates CX3CL1-mediated cell-cell adhesion. Blood 2003;102:1186-1195. Hundhausen C, Schulte A, Schulz B, Andrzejewski MG, Schwarz N, von Hundelshausen P, Winter U, Paliga K, Reiss K, Saftig P, Weber C, Ludwig A. Regulated shedding of transmembrane chemokines by the disintegrin and metalloproteinase 10 facilitates detachment of adherent leukocytes. J Immunol 2007;178:8064-8072. Hurst LA, Bunning RA, Couraud PO, Romero IA, Weksler BB, Sharrack B, Woodroofe MN. Expression of ADAM-17, TIMP-3 and fractalkine in the human adult brain endothelial cell line, hCMEC/D3, following pro-inflammatory cytokine treatment. J Neuroimmunol 2009;210(1-2):108-112. Huseby ES, Liggitt D, Brabb T, Schnabel B, Ohlen C, Goverman J. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp Med 2001;194:669-676. Ignatius R, Wei Y, Beaulieu S, Gettie A, Steinman RM, Pope M, Mojsov S. The immunodeficiency virus coreceptor, Bonzo/STRL33/TYMSTR, is expressed by macaque and human skin- and blood-derived dendritic cells. AIDS Res Hum Retroviruses 2000;16:1055-1059. Imai T, Hieshima K, Haskell C, Baba M, Nagira M, Nishimura M, Kakizaki M, Takagi S, Nomiyama H, Schall TJ, Yoshie O. Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion. Cell 1997;91:521-530. 159 Imaizumi T, Matsumiya T, Fujimoto K, Okamoto K, Cui XF, Ohtaki U, Yoshida H, Satoh K. Interferon-γ stimulates the expression of CX3CL1/fractalkine in cultured human endothelial cells. Tohoku J Exp Med 2000;192:127-139. Imaizumi T, Yoshida H, Satoh K. Regulation of CX3CL1/fractalkine expression in endothelial cells. J Atheroscler Thromb 2004;11:15-21. IMSGC. Comprehensive follow-up of the first genome-wide association study of multiple sclerosis identifies KIF21B and TMEM39A as susceptibility loci. Hum Mol Genet 2010;19(5):953-962. IMSGC. Refining genetic associations in multiple sclerosis. Lancet Neurol 2008;7:567- 569. IMSGC. The expanding genetic overlap between multiple sclerosis and type I diabetes. Genes Immun 2009;10(1):11-14. IMSGC; Wellcome Trust Case Control Consortium. Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis. Nat 2011;476:214-219. in SJL/J mice after in vitro activation of lymph node cells by myelin basic protein: requirement for Lyt 1+ 2- T lymphocytes. J Immunol 1981;127:1420- 1423. Infante-Duarte C, Weber A, Kratzschmar J, Prozorovski T, Pikol S, Hamann I, Bellmann-Strobl J, Aktas O, Dörr J, Wuerfel J, Stürzebecher CS, Zipp F. Frequency of blood CX3CR1-positive natural killer cells correlates with disease activity in multiple sclerosis patients. FASEB J 2005; express article 10.1096/fj.05-3832fje. Inoue A, Hasegawa H, Kohno M, Ito MR, Terada M, Imai T, Yoshie O, Nose M, Fujita S. Antagonist of fractalkine (CX3CL1) delays the initiation and ameliorates the progression of lupus nephritis in MRL/lpr mice. Arthritis Rheum 2005;52:1522- 1533. International HapMap Consortium. The International HapMap Project. Nat 2003;426:789-796. Isozaki T, Otsuka K, Sato M, Takahashi R, Wakabayashi K, Yajima N, Miwa Y, Kasama T. Synergistic induction of CX3CL1 by interleukin-1β and interferon-γ in human lung fibroblasts: involvement of signal transducer and activator of transcription 1 signaling pathways. Transl Res 2011;157(2):64-70. 160 IUIS/WHO Subcommittee on Chemokine Nomenclature. Chemokine/chemokine receptor nomenclature. J Interferon Cytokine Res 2002;22(10):1067-1068. Izquierdo MC, Sanz AB, Mezzano S, Blanco J, Carrasco S, Sanchez-Niño MD, Benito- Martín A, Ruiz-Ortega M, Egido J, Ortiz A. TWEAK (tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis) activates CXCL16 expression during renal tubulointerstitial inflammation. Kidney Int 2012;81(11):1098-1107. Jakkula E, Leppa V, Sulonen AM, Varilo T, Kallio S, Kemppinen A, Purcell S, Koivisto K, Tienari P, Sumelahti ML, Elovaara I, Pirttilä T, Reunanen M, Aromaa A, Oturai AB, Søndergaard HB, Harbo HF, Mero IL, Gabriel SB, Mirel DB, Hauser SL, Kappos L, Polman C, De Jager PL, Hafler DA, Daly MJ, Palotie A, Saarela J, Peltonen L. Genome-wide association study in a high-risk isolate for multiple sclerosis reveals associated variants in STAT3 gene. Am J Hum Genet 2010;86:285-291. Janes PW, Saha N, Barton WA, Kolev MV, Wimmer-Kleikamp SH, Nievergall E, Blobel CP, Himanen JP, Lackmann M, Nikolov DB. Adam meets Eph: an ADAM substrate recognition module acts as a molecular switch for ephrin cleavage in trans. Cell 2005;123:291-304. Jersild C, Svejgaard A, Fog T. HL-A antigens and multiple sclerosis. Lancet 1972;1(7762):1240-1241. Johanson CE, Duncan III JA, Klinge PM, Brinker T, Stopa EG, Silverberg GD. Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: new challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Res 2008;5:10. Johnson KP. Control of multiple sclerosis relapses with immunomodulating agents. J Neurol Sci 2007;256(Suppl 1):S23–S28. Johnston B, Kim CH, Soler D, Emoto M, Butcher EC. Differential chemokine responses and homing patterns of murine TCRalphabeta NKT cell subsets. J Immunol 2003;171:2960–2969. Jones BA, Beamer M, Ahmed S. Fractalkine/CX3CL1: a potential new target for inflammatory diseases. Mol Interv 2010;10(5):263-270. Jung S, Aliberti J, Graemmel P, Sunshine MJ, Kreutzberg GW, Sher A, Littman DR. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and 161 green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol 2000;20:4106- 4114. Kabat EA, Glusman M, Knaub V. Quantitative estimation of the albumin and gamma globulin in normal and pathologic cerebrospinal fluid by immunochemical methods. Am J Med 1948;4:653-662. Kantarci O, Wingerchuk D. Epidemiology and natural history of multiple sclerosis: new insights. Curr Opin Neurol 2006;19(3):248-254. Kastenbauer S, Koedel U, Wick M, Kieseier BC, Hartung HP, Pfister HW. CSF and serum levels of soluble fractalkine (CX3CL1) in inflammatory diseases of the nervous system. J Neuroimmunol 2003;137:210-217. Ke X, Collins A, Ye S. PIRA PCR designer for restriction analysis of single nucleotide polymorphisms. Bioinformatics 2001;17:838-839. Kemppinen AK, Kaprio J, Palotie A, Saarela J. Systematic review of genome-wide expression studies in multiple sclerosis. BMJ Open 2011;1:e000053. Khoury SJ, Guttmann CR, Orav EJ, Hohol MJ, Ahn SS, Hsu L, Kikinis R, Mackin GA, Jolesz FA, Weiner HL. Longitudinal MRI imaging in multiple sclerosis: correlation between disability and lesion burden. Neurol 1994;44:2120-2124. Kim CH, Johnston B, Butcher EC. Trafficking machinery of NKT cells: shared and differential chemokine receptor expression among V alpha 24(+)V beta 11(+) NKT cell subsets with distinct cytokine-producing capacity. Blood 2002;100:11- 16. Kim CH, Kunkel EJ, Boisvert J, Johnston B, Campbell JJ, Genovese MC, Greenberg HB, Butcher EC. Bonzo/CXCR6 expression defines type 1-polarized T-cell subsets with extralymphoid tissue homing potential. J Clin Invest 2001;107(5):595-601. Kivisakk P, Imitola J, Rasmussen S, Elyaman W, Zhu B, Ransohoff RM, Khoury SJ. Localizing central nervous system immune surveillance: meningeal antigen- presenting cells activate T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis. Ann Neurol 2009;65:457-469. Kivisakk P, Mahad DJ, Callahan MK, Trebst C, Tucky B, Wei T, Wu L, Baekkevold ES, Lassmann H, Staugaitis SM, Campbell JJ, Ransohoff RM. Human cerebrospinal fluid central memory CD4+ T cells: evidence for trafficking 162 through choroid plexus and meninges via P-selectin. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:8389-8394. Klein M, Paul R, Angele B, Popp B, Pfister HW, Koedel U. Protein expression pattern in experimental pneumococcal meningitis. Microbes Infect 2006;8(4):974-983. Koch M, Kingwell E, Rieckmann P, Tremlett H. The natural history of secondary progressive multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010;81:1039- 1043. Komiyama Y, Nakae S, Matsuki T, Nambu A, Ishigame H, Kakuta S, Sudo K, Iwakura Y. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2006;177:566-573. Koutsis G, Evangelopoulos ME, Andreadou E, Mandellos D, Karachalios G, Potagas C, Karantoni E, Karouli M, Chrysovitsanou C, Vassilopoulos D, Sfagos C. The onset of multiple sclerosis in Greece: a single-center study of 1,034 consecutive patients. Eur Neurol 2010;63:350-356. Kriegova E, Fillerova R, Tomankova T, Hutyrova B, Mrazek F, Tichy T, Kolek V, du Bois RM, Petrek M. T-helper cell type-1 transcription factor T-bet is upregulated in pulmonary sarcoidosis. Eur Respir J 2011;38(5):1136-1144. Krumbholz M, Theil D, Cepok S, Hemmer B, Kivisakk P, Ransohoff RM, Hofbauer M, Farina C, Derfuss T, Hartle C, Newcombe J, Hohlfeld R, Meinl E. Chemokines in multiple sclerosis: CXCL12 and CXCL13 up-regulation is differentially linked to CNS immune cell recruitment. Brain 2006;129:200-211. Kumar M, Putzki N, Limmroth V, Remus R, Lindemann M, Knop D, Mueller N, Hardt C, Kreuzfelder E, Grosse-Wilde H. CD4+CD25+FoxP3+ T lymphocytes fail to suppress myelin basic protein induced proliferation in patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol 2006;180:178-184. Kunkel LM, Smith KD, Boyer SH, Borgaonkar DS, Wachtel SS, Miller OJ, Breg WR. Analysis of human Y chromosome specific reiterated DNA in chromosome variants. Proc Natl Acad Sci USA 1977;74:1245-1249. Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurol 1983;33(11):1444-1452. Lalive PH. Autoantibodies in inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Swiss Med Wkly 2008;138:692-707. 163 Lavergne E, Labreuche J, Daoudi M, Debre P, Cambien F, Deterre P, Amarenco P, Combadiere C. Adverse associations between CX3CR1 polymorphisms and risk of cardiovascular or cerebrovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:847-853. le Blanc LM, van Lieshout AW, Adema GJ, van Riel PL, Verbeek MM, Radstake TR. CXCL16 is elevated in the cerebrospinal fluid versus serum and in inflammatory conditions with suspected and proved central nervous system involvement. Neurosci Lett 2006;397(1-2):145-148. Lee SJ, Namkoong S, Kim YM, Kim CK, Lee H, Ha KS, Chung HT, Kwon YG, Kim YM. Fractalkine stimulates angiogenesis by activating the Raf-1/MEK/ERK- and PI3K/Akt/eNOS-dependent signal pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006;291:H2836-H2846. Li DK, Zhao GJ, Paty DW. Randomized controlled trial of interferon-beta-1a in secondary progressive MS: MRI results. Neurol 2001;56:1505-1513. Liao F, Alkhatib G, Peden KW, Sharma G, Berger EA, Farber JM. STRL33, A novel chemokine receptor-like protein, functions as a fusion cofactor for both macrophage-tropic and T cell line-tropic HIV-1. J Exp Med 1997;185(11):2015- 2023. Libbey JE, McCoy LL, Fujinami RS. Molecular mimicry in multiple sclerosis. Int Rev Neurobiol 2007;79:127-147. Limou S, Coulonges C, Herbeck JT, van Manen D, An P, Le Clerc S, Delaneau O, Diop G, Taing L, Montes M, van't Wout AB, Gottlieb GS, Therwath A, Rouzioux C, Delfraissy JF, Lelièvre JD, Lévy Y, Hercberg S, Dina C, Phair J, Donfield S, Goedert JJ, Buchbinder S, Estaquier J, Schächter F, Gut I, Froguel P, Mullins JI, Schuitemaker H, Winkler C, Zagury JF. Multiple-cohort genetic association study reveals CXCR6 as a new chemokine receptor involved in long-term nonprogression to AIDS. J Infect Dis 2010;202(6):908-915. Lin Z, Gong Q, Zhou Z, Zhang W, Liao S, Liu Y, Yan X, Pan X, Lin S, Li X. Increased plasma CXCL16 levels in patients with chronic kidney diseases. Eur J Clin Invest 2011;41(8):836-845. Lindberg RL, De Groot CJ, Certa U, Ravid R, Hoffmann F, Kappos L, Leppert D. Multiple sclerosis as a generalized CNS disease-comparative microarray 164 analysis of normal appearing white matter and lesions in secondary progressive MS. J Neuroimmunol 2004;152:154-167. Lindia JA, McGowan E, Jochnowitz N, Abbadie C. Induction of CX3CL1 expression in astrocytes and CX3CR1 in microglia in the spinal cord of a rat model of neuropathic pain. J Pain 2005;6:434-438. Link H, Sun JB, Wang Z, Xu Z, Löve A, Fredrikson S, Olsson T. Virus-reactive and autoreactive T cells are accumulated in cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. J Neuroimmunol 1992;38:63-73. Liu W, Yin L, Chen C, Dai Y. Function modification of SR-PSOX by point mutations of basic amino acids. Lipids Health Dis 2011;10:59. Lock C, Hermans G, Pedotti R, Brendolan A, Schadt E, Garren H, Langer-Gould A, Strober S, Cannella B, Allard J, Klonowski P, Austin A, Lad N, Kaminski N, Galli SJ, Oksenberg JR, Raine CS, Heller R, Steinman L. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat Med 2002;8:500-508. Lublin FD, Reingold SC. Defining the clinical course of multiple sclerosis: results of an international survey. National Multiple Sclerosis Society (USA) Advisory Committee on Clinical Trials of New Agents in Multiple Sclerosis. Neurol 1996;46(4):907-911. Lucas AD, Bursill C, Guzik TJ, Sadowski J, Channon KM, Greaves DR. Smooth muscle cells in human atherosclerotic plaques express the fractalkine receptor CX3CR1 and undergo chemotaxis to the CX3C chemokine fractalkine (CX3CL1). Circulat 2003;108:2498-2504. Lucchinetti C, Brück W, Parisi J, Scheithauer B, Rodriguez M, Lassmann H. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol 2000;47:707-717. Ludwig A, Berkhout T, Moores K, Groot P, Chapman G. Fractalkine is expressed by smooth muscle cells in response to IFNgamma and TNF-alpha and is modulated by metalloproteinase activity. J Immunol 2002;168:604-612. Ludwig A, Weber C. Transmembrane chemokines: versatile 'special agents' in vascular inflammation. Thromb Haemost 2007;97(5):694-703. 165 Ludwig a A, Hundhausen C, Lambert MH, Broadway N, Andrews RC, Bickett DM, Leesnitzer MA, Becherer JD. Metalloproteinase inhibitors for the disintegrin- like metalloproteinases ADAM10 and ADAM17 that differentially block constitutive and phorbol esterinducible shedding of cell surface molecules. Comb Chem High Throughput Screen 2005;8:161-171. Ludwig b A, Schulte A, Schnack C, Hundhausen C, Reiss K, Brodway N, Held-Feindt J, Mentlein R. Enhanced expression and shedding of the transmembrane chemokine CXCL16 by reactive astrocytes and glioma cells. J Neurochem 2005;93(5):1293-1303. Lundberg GA, Kellin A, Samnegård A, Lundman P, Tornvall P, Dimmeler S, Zeiher AM, Hamsten A, Hansson GK, Eriksson P. Severity of coronary artery stenosis is associated with a polymorphism in the CXCL16/SR-PSOX gene. J Intern Med 2005;257(5):415-422. Luo Y, Berman MA, Zhai Q, Fischer FR, Abromson-Leeman SR, Zhang Y, Kuziel WA, Gerard C, Dorf ME. RANTES stimulates inflammatory cascades and receptor modulation in murine astrocytes. Glia 2002;39:19-30. Maciejewski-Lenoir D, Chen S, Feng L, Maki R, Bacon KB. Characterization of fractalkine in rat brain cells: migratory and activation signals for CX3CR1- expressing microglia. J Immunol 1999;163:1628-1635. Maghazachi AA. G protein-coupled receptors in natural killer cells. J Leukoc Biol 2003;74:16-24. Mahad D, Callahan MK, Williams KA, Ubogu EE, Kivisakk P, Tucky B, Kidd G, Kingsbury GA, Chang A, Fox RJ, Mack M, Sniderman MB, Ravid R, Staugaitis SM, Stins MF, Ransohoff RM. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood–brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain 2006;129:212-223. Mahad DJ, Lawry J, Howell SJ, Woodroofe MN. Longitudinal study of chemokine receptor expression on peripheral lymphocytes in multiple sclerosis: CXCR3 upregulation is associated with relapse. Mult Scler 2003;9(2):189-198. Mandel M, Gurevich M, Pauzner R, Kaminski N, Achiron A. Autoimmunity gene expression portrait: specific signature that intersects or differentiates between multiple sclerosis and systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol 2004;138:164-170. 166 Mantovani A. The chemokine system: redundancy for robust outputs. Immunol Today 1999;20:254-257. Matloubian M, David A, Engel S, Ryan JE, Cyster JG. A transmembrane CXC chemokine is a ligand for HIV-coreceptor Bonzo. Nat Immunol 2000;1:298-304. Matsumiya T, Imaizumi T, Fujimoto K, Cui X, Shibata T, Tamo W, Kumagai M, Tanji K, Yoshida H, Kimura H, Satoh K. Soluble interleukin-6 receptor alpha inhibits the cytokine- Induced fractalkine/CX3CL1 expression in human vascular endothelial cells in culture. Exp Cell Res 2001;269:35-41. Matsumiya T, Ota K, Imaizumi T, Yoshida H, Kimura H, Satoh K. Characterization of synergistic induction of CX3CL1/fractalkine by TNF-alpha and IFN-gamma in vascular endothelial cells: an essential role for TNF-alpha in post-transcriptional regulation of CX3CL1. J Immunol 2010;184(8):4205-4214. Matzhold EM, Trummer O, Grünbacher G, Zulus B, Boehm BO, März W, Renner W. Association of polymorphisms in the chemokine receptor CX3CR1 gene with coronary artery disease. Cytokine 2009;47:224-227. Mayne M, Moffatt T, Kong H, McLaren PJ, Fowke KR, Becker KG, Namaka M, Schenck A, Bardoni B, Bernstein CN, Melanson M. CYFIP2 is highly abundant in CD4+ cells from multiple sclerosis patients and is involved in T cell adhesion. Eur J Immunol 2004;34:1217-1227. McCandless EE, Budde M, Lees JR, Dorsey D, Lyng E, Klein RS. IL-1R signaling within the central nervous system regulates CXCL12 expression at the blood– brain barrier and disease severity during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2009;183:613–620. McCandless EE, Piccio L, Woerner BM, Schmidt RE, Rubin JB, Cross AH, Klein RS. Pathological expression of CXCL12 at the blood–brain barrier correlates with severity of multiple sclerosis. Am J Pathol 2008;172:799-808. McCandless EE, Wang Q, Woerner BM, Harper JM, Klein RS. CXCL12 limits inflammation by localizing mononuclear infiltrates to the perivascular space during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2006;177:8053- 8064. McDermott DH, Fong AM, Yang Q, Sechler JM, Cupples LA, Merrell MN, Wilson PW, D'Agostino RB, O'Donnell CJ, Patel DD, Murphy PM. Chemokine receptor 167 mutant CX3CR1–M280 has impaired adhesive function and correlates with protection from cardiovascular disease in humans. J Clin Invest 2003;111:1241- 1250. McDermott DH, Halcox JP, Schenke WH, Waclawiw MA, Merrell MN, Epstein N, Quyyumi AA, Murphy PM. Association between polymorphism in the chemokine receptor CX3CR1 and coronary vascular endothelial dysfunction and atherosclerosis. Circ Res 2001;89:401-407. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD, McFarland HF, Paty DW, Polman CH, Reingold SC, Sandberg-Wollheim M, Sibley W, Thompson A, van den Noort S, Weinshenker BY, Wolinsky JS. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann Neurol 2001;50:121-127. McFarland HF, Martin R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol 2007;8:913-919. McGeachy MJ, Stephens LA, Anderton SM. Natural recovery and protection from autoimmune encephalomyelitis: contribution of CD4+CD25+ regulatory cells within the central nervous system. J Immunol 2005;175:3025-3032. Meucci O, Fatatis A, Simen AA, Miller RJ. Expression of CX3CR1 chemokine receptors on neurons and their role in neuronal survival. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:8075-8080. Minami M, Kume N, Shimaoka T, Kataoka H, Hayashida K, Akiyama Y, Nagata I, Ando K, Nobuyoshi M, Hanyuu M, Komeda M, Yonehara S, Kita T. Expression of SR-PSOX, a novel cell-surface scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized LDL in human atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001;21:1796-1800. Misko TP, Trotter JL, Cross AH. Mediation of inflammation by encephalitogenic cells: interferon gamma induction of nitric oxide synthase and cyclooxygenase 2. J Neuroimmunol 1995;61:195-204. Mizuno T, Kawanokuchi J, Numata K, Suzumura A. Production and neuroprotective functions of fractalkine in the central nervous system. Brain Res 2003;979:65- 70. 168 Moatti D, Faure S, Fumeron F, Amara MW, Seknadji P, McDermott DH, Debré P, Aumont MC, Murphy PM, de Prost D, Combadière C. Polymorphism in the fractalkine receptor CX3CR1 as a genetic risk factor for coronary artery disease. Blood 2001;97:1925-1928. Mortier A, Gouwy M, Van Damme J, Proost P. Effect of posttranslational processing on the in vitro and in vivo activity of chemokines. Exp Cell Res 2011;317:642-654. Mortier A, Van Damme J, Proost P. Regulation of chemokine activity by posttranslational modification. Pharmacol Ther 2008;120:197-217. Muehlhoefer A, Saubermann LJ, Gu X, Luedtke-Heckenkamp K, Xavier R, Blumberg RS, Podolsky DK, MacDermott RP, Reinecker HC. Fractalkine is an epithelial and endothelial cell-derived chemoattractant for intraepithelial lymphocytes in the small intestinal mucosa. J Immunol 2000;164:3368-3376. Munger KL, Levin LI, Hollis BW, Howard NS, Ascherio A. Serum 25 hydroxyvitamin D levels and risk of multiple sclerosis. JAMA 2006;296:2832-2838. Munger KL, Zhang SM, O’Reilly E, Herna´n MA, Olek MJ, Willett WC, Ascherio A. Vitamin D intake and incidence of multiple sclerosis. Neurol 2004;62:60-65. Murdoch C, Finn A. Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood 2000;95:3032-3043. Mycko MP, Papoian R, Boschert U, Raine CS, Selmaj KW. cDNA microarray analysis in multiple sclerosis lesions: detection of genes associated with disease activity. Brain 2003;126:1048-1057. Mycko MP, Papoian R, Boschert U, Raine CS, Selmaj KW. Microarray gene expression profiling of chronic active and inactive lesions in multiple sclerosis. Clin Neurol Neurosurg 2004;106:223-229. Nagy Z, Peters H, Huttner I. Fracture faces of cell junctions in cerebral endothelium during normal and hyperosmotic conditions. Lab Invest 1984;50:313-322. Naito S, Namerow N, Mickey MR, Terasaki PI. Multiple sclerosis: association with HL- A3. Tissue Antigens 1972;2(1):1-4. Nakajima H, Fukuda K, Doi Y, Sugino M, Kimura F, Hanafusa T, Ikemoto T, Shimizu A. Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis. Eur Neurol 2004;52(3):162-168. 169 Nakayama T, Hieshima K, Izawa D, Tatsumi Y, Kanamaru A, Yoshie O. Cutting edge: profile of chemokine receptor expression on human plasma cells accounts for their efficient recruitment to target tissues. J Immunol 2003;170:1136-1140. Navikas V, Link H. Review: cytokines and the pathogenesis of multiple sclerosis. J Neurosci Res 1996;45:322-333. Neves SR, Ram PT, Iyengar R. G protein pathways. Science 2002;296:1636-1639. Newton CR, Heptinstall LE, Summers C, Super M, Schwarz M, Anwar R, Graham A, Smith JC, Markham AF. Amplification refractory mutation system for prenatal diagnosis and carrier assessment in cystic fibrosis. Lancet 1989;2(8678- 8679):1481-1483. Nielsen TR, Rostgaard K, Nielsen NM, Koch-Henriksen N, Haahr S, Sorensen PS, Hjalgrim H. Multiple sclerosis after infectious mononucleosis. Arch Neurol 2007;64 (1):72-75. Niess JH, Brand S, Gu X, Landsman L, Jung S, McCormick BA, Vyas JM, Boes M, Ploegh HL, Fox JG, Littman DR, Reinecker HC. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science 2005;307:254-258. Nischwitz S, Cepok S, Kroner A, Wolf C, Knop M, Muller-Sarnowski F, Pfister H, Roeske D, Rieckmann P, Hemmer B, Ising M, Uhr M, Bettecken T, Holsboer F, Müller-Myhsok B, Weber F. Evidence for VAV2 and ZNF433 as susceptibility genes for multiple sclerosis. J Neuroimmunol 2010;227:162-166. Nishimura M, Umehara H, Nakayama T, Yoneda O, Hieshima K, Kakizaki M, Dohmae N, Yoshie O, Imai T. Dual functions of fractalkine/CX3C ligand 1 in trafficking of perforin+/granzyme B+ cytotoxic effector lymphocytes that are defined by CX3CR1 expression. J Immunol 2002;168:6173–6180. Nishiyori A, Minami M, Ohtani Y, Takami S, Yamamoto J, Kawaguchi N, Kume T, Akaike A, Satoh M. Localization of fractalkine and CX3CR1 mRNAs in rat brain: does fractalkine play a role in signaling from neuron to microglia? FEBS Lett 1998;429:167-172. Nomiyama H, Imai T, Kusuda J, Miura R, Callen DF, Yoshie O. Human chemokines fractalkine (SCYD1), MDC (SCYA22) and TARC (SCYA17) are clustered on chromosome 16q13. Cytogenet Cell Genet 1998;81:10-11. 170 Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. Multiple sclerosis. N Engl J Med 2000;343(13):938-952. O’Connor RA, Prendergast CT, Sabatos CA, Lau CW, Leech MD, Wraith DC, Anderton SM. Cutting edge: Th1 cells facilitate the entry of Th17 cells to the central nervous system during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 2008; 181:3750-3754. Oksenberg JR, Baranzini SE, Sawcer S, Hauser SL. The genetics of multiple sclerosis: SNPs to pathways to pathogenesis. Nat Rev 2008;9:516-526. Olsson T, Zhi WW, Höjeberg B, Kostulas V, Jiang YP, Anderson G, Ekre HP, Link H. Autoreactive T lymphocytes in multiple sclerosis determined by antigen-induced secretion of interferon-gamma. J Clin Invest 1990;86:981-985. Owens GP, Ritchie AM, Burgoon MP, Williamson RA, Corboy JR, Gilden DH. Single- cell repertoire analysis demonstrates that clonal expansion is a prominent feature of the B cell response in multiple sclerosis cerebrospinal fluid. J Immunol 2003;171:2725-2733. Owens T, Bechmann I, Engelhardt B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. J Neuropathol Exp Neurol 2008;67:1113-1121. Pan Y, Lloyd C, Zhou H, Dolich S, Deeds J, Gonzalo JA, Vath J, Gosselin M, Ma J, Dussault B, Woolf E, Alperin G, Culpepper J, Gutierrez-Ramos JC, Gearing D. Neurotactin, a membrane-anchored chemokine upregulated in brain inflammation. Nat 1997;387(6633):611-617. Parczewski M, Leszczyszyn-Pynka M, Kaczmarczyk M, Adler G, Binczak-Kuleta A, Loniewska B, Boron-Kaczmarska A, Ciechanowicz A. Sequence variants of chemokine receptor genes and susceptibility to HIV-1 infection. J Appl Genet 2009;50(2):159-166. Patel DN, Bailey SR, Gresham JK, Schuchman DB, Shelhamer JH, Goldstein BJ, Foxwell BM, Stemerman MB, Maranchie JK, Valente AJ, Mummidi S, Chandrasekar B. TLR4-NOX4-AP-1 signaling mediates lipopolysaccharide- induced CXCR6 expression in human aortic smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun 2006;347(4):1113-1120. Peart MJ, Smyth GK, van Laar RK, Bowtell DD, Richon VM, Marks PA, Holloway AJ, Johnstone RW. Identification and functional significance of genes regulated by 171 structurally different histone deacetylase inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102(10):3697-3702. Peraire J, Vidal F, Plana M, Domingo P, Coll B, Viladés C, Garcia F, Veloso S, Gatell JM, Broch M. Polymorphisms in the 3' untranslated region of the fractalkine (CX3CL1) gene and the risk of HIV-1 infection and disease progression. AIDS 2007;21(7):891-893. Petit SJ, Chayen NE, Pease JE. Site-directed mutagenesis of the chemokine receptor CXCR6 suggests a novel paradigm for interactions with the ligand CXCL16. Eur J Immunol 2008;38(8):2337-2350. Petit SJ, Wise EL, Chambers JC, Sehmi J, Chayen NE, Kooner JS, Pease JE. The CXCL16 A181V mutation selectively inhibits monocyte adhesion to CXCR6 but is not associated with human coronary heart disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011;31(4):914-920. Pettinelli CB, McFarlin DE. Adoptive transfer of experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice after in vitro activation of lymph node cells by myelin basic protein: requirement for Lyt 1+ 2- T lymphocytes. J Immunol 1981;127(4):1420-1423. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res 2002;30(9):e36. Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3:639-650. Plant D, Young HS, Watson RE, Worthington J, Griffiths CE. The CX3CL1-CX3CR1 system and psoriasis. Exp Dermatol 2006;15(11):900-903. Proost P, Loos T, Mortier A, Schutyser E, Gouwy M, Noppen S, Dillen C, Ronsse I, Conings R, Struyf S, Opdenakker G, Maudgal PC, Van Damme J. Citrullination of CXCL8 by peptidylarginine deiminase alters receptor usage, prevents proteolysis, and dampens tissue inflammation. J Exp Med 2008;205:2085-2097. Qin Y, Duquette P, Zhang Y, Talbot P, Poole R, Antel J. Clonal expansion and somatic hypermutation of V (H) genes of B cells from cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. J Clin Invest 1998;102:1045-1050. 172 Raine CS. The Dale E. McFarlin Memorial Lecture: the immunology of the multiple sclerosis lesion. Ann Neurol 1994;36:Suppl:S61-S72. Ramagopalan SV, Anderson C, Sadovnick AD, Ebers GE. Genome wide study of multiple sclerosis. N Engl J Med 2007;357:2199-2200. Ramagopalan SV, Maugeri NJ, Handunnetthi L, Lincoln MR, Orton SM, Dyment DA, Deluca GC, Herrera BM, Chao MJ, Sadovnick AD, Ebers GC, Knight JC. Expression of the multiple sclerosis-associated MHC class II Allele HLA- DRB1*1501 is regulated by vitamin D. PLoS Genet 2009;5(2):e1000369. Ramanathan M, Weinstock-Guttman B, Nguyen LT, Badgett D, Miller C, Patrick K, Brownscheidle C, Jacobs L. In vivo gene expression revealed by cDNA arrays: the pattern in relapsing-remitting multiple sclerosis patients compared with normal subjects. J Neuroimmunol 2001;116:213-219. Ransohoff RM, Hamilton TA, Tani M, Stoler MH, Shick HE, Major JA, Estes ML, Thomas DM, Tuohy VK. Astrocyte expression of mRNA encoding cytokines IP-10 and JE/MCP-1 in experimental autoimmune encephalomyelitis. FASEB J 1993;7:592-600. Ransohoff RM, Kivisakk P, Kidd G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol 2003;3:569-581. Ransohoff RM. Immunology: in the beginning. Nat 2009;462:41-42. Raouf A, Zhao Y, To K, Stingl J, Delaney A, Barbara M, Iscove N, Jones S, McKinney S, Emerman J, Aparicio S, Marra M, Eaves C. Transcriptome analysis of the normal human mammary cell commitment and differentiation process. Cell Stem Cell 2008;3(1):109-118. Reiss K, Ludwig A, Saftig P. Breaking up the tie: Disintegrin-like metalloproteinases as regulators of cell migration in inflammation and invasion. Pharmacol Ther 2006;111:985-1006. Rimaniol AC, Till SJ, Garcia G, Capel F, Godot V, Balabanian K, Durand-Gasselin I, Varga EM, Simonneau G, Emilie D, Durham SR, Humbert M. The CX3C chemokine fractalkine in allergic asthma and rhinitis. J Allergy Clin Immunol 2003;112:1139-1146. Rollins BJ. Chemokines. Blood 1997;90:909-928. 173 Rossi D, Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol 2000;18:217-242. Roxburgh RH, Seaman SR, Masterman T, Hensiek AE, Sawcer SJ, Vukusic S, Achiti I, Confavreux C, Coustans M, le Page E, Edan G, McDonnell GV, Hawkins S, Trojano M, Liguori M, Cocco E, Marrosu MG, Tesser F, Leone MA, Weber A, Zipp F, Miterski B, Epplen JT, Oturai A, Sørensen PS, Celius EG, Lara NT, Montalban X, Villoslada P, Silva AM, Marta M, Leite I, Dubois B, Rubio J, Butzkueven H, Kilpatrick T, Mycko MP, Selmaj KW, Rio ME, Sá M, Salemi G, Savettieri G, Hillert J, Compston DA. Multiple Sclerosis Severity Score: using disability and disease duration to rate disease severity. Neurol 2005;64(7):1144- 1151. Rubio JP, Stankovich J, Field J, Tubridy N, Marriott M, Chapman C, Bahlo M, Perera D, Johnson LJ, Tait BD, Varney MD, Speed TP, Taylor BV, Foote SJ, Butzkueven H, Kilpatrick TJ. Replication of KIAA0350, IL2RA, RPL5 and CD58 as multiple sclerosis susceptibility genes in Australians. Genes Immun 2008;9:624-630. Rusić-Stojiljković M. Osnovni principi molekularne neurobiologije. Nova prosveta 1998; 10:169-178. Ruth JH, Volin MV, Haines GK, 3rd, Woodruff DC, Katschke KJ, Jr., Woods JM, Park CC, Morel JC, Koch AE. Fractalkine, a novel chemokine in rheumatoid arthritis and in rat adjuvant-induced arthritis. Arthritis Rheum 2001;44:1568-1581. Sabate JM, Ameziane N, Lamoril J, Jouet P, Farmachidi JP, Soule JC, Harnois F, Sobhani I, Jian R, Deybach JC, de Prost D, Coffin B. The V249I polymorphism of the CX3CR1 gene is associated with fibrostenotic disease behavior in patients with Crohn’s disease. Eur J Gastroenterol Hepatol 2008;20:748-755. Sanna S, Pitzalis M, Zoledziewska M, Zara I, Sidore C, Murru R, Whalen MB, Busonero F, Maschio A, Costa G, Melis MC, Deidda F, Poddie F, Morelli L, Farina G, Li Y, Dei M, Lai S, Mulas A, Cuccuru G, Porcu E, Liang L, Zavattari P, Moi L, Deriu E, Urru MF, Bajorek M, Satta MA, Cocco E, Ferrigno P, Sotgiu S, Pugliatti M, Traccis S, Angius A, Melis M, Rosati G, Abecasis GR, Uda M, Marrosu MG, Schlessinger D, Cucca F. Variants within the immunoregulatory CBLB gene are associated with multiple sclerosis. Nat Genet 2010;42:495-497. 174 Sato T, Thorlacius H, Johnston B, Staton TL, Xiang W, Littman DR, Butcher EC. Role for CXCR6 in recruitment of activated CD8+ lymphocytes to inflamed liver. J Immunol 2005;174:277-283. Satoh J, Nakanishi M, Koike F, Miyake S, Yamamoto T, Kawai M, Kikuchi S, Nomura K, Yokoyama K, Ota K, Kanda T, Fukazawa T, Yamamura T. Microarray analysis identifies an aberrant expression of apoptosis and DNA damageregulatory genes in multiple sclerosis. Neurobiol Dis 2005;18:537-550. Satoh J, Nakanishi M, Koike F, Onoue H, Aranami T, Yamamoto T, Kawai M, Kikuchi S, Nomura K, Yokoyama K, Ota K, Saito T, Ohta M, Miyake S, Kanda T, Fukazawa T, Yamamura T. T cell gene expression profiling identifies distinct subgroups of Japanese multiple sclerosis patients. J Neuroimmunol 2006;174:108-118. Sawcer S, Ban M, Maranian M, Yeo TW, Compston A, Kirby A, Daly MJ, De Jager PL, Walsh E, Lander ES, Rioux JD, Hafler DA, Ivinson A, Rimmler J, Gregory SG, Schmidt S, Pericak-Vance MA, Akesson E, Hillert J, Datta P, Oturai A, Ryder LP, Harbo HF, Spurkland A, Myhr KM, Laaksonen M, Booth D, Heard R, Stewart G, Lincoln R, Barcellos LF, Hauser SL, Oksenberg JR, Kenealy SJ, Haines JL; International Multiple Sclerosis Genetics Consortium. A high-density screen for linkage in multiple sclerosis. Am J Hum Genet 2005;77:454-467. Schafer A, Schulz C, Eigenthaler M, Fraccarollo D, Kobsar A, Gawaz M, Ertl G, Walter U, Bauersachs J. Novel role of the membrane-bound chemokine fractalkine in platelet activation and adhesion. Blood 2004;103:407-412. Schafer A, Schulz C, Fraccarollo D, Tas P, Leutke M, Eigenthaler M, Seidl S, Heider P, Ertl G, Massberg S, Bauersachs J. The CX3C chemokine fractalkine induces vascular dysfunction by generation of superoxide anions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2007;27:55-62. Seiderer J, Dambacher J, Leistner D, Tillack C, Glas J, Niess JH, Pfennig S, Jürgens M, Müller-Myhsok B, Göke B, Ochsenkühn T, Lohse P, Reinecker HC, Brand S. Genotype-phenotype analysis of the CXCL16 p.Ala181Val polymorphism in inflammatory bowel disease. Clin Immunol 2008;127(1):49-55. 175 Serafini B, Rosicarelli B, Magliozzi R, Stigliano E, Aloisi F. Detection of ectopic B-cell follicles with germinal centers in the meninges of patients with secondary progressive multiple sclerosis. Brain Pathol 2004;14:164-174. Sharron M, Pohlmann S, Price K, Lolis E, Tsang M, Kirchhoff F, Doms RW, Lee B. Expression and coreceptor activity of STRL33/Bonzo on primary peripheral blood lymphocytes. Blood 2000;96:41-49. Shashkin P, Simpson D, Mishin V, Chesnutt B, Ley K. Expression of CXCL16 in human T cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23:148-149. Shiina T, Inoko H, Kulski JK. An update of the HLA genomic region, locus information and disease associations: 2004. Tissue Antigens 2004;64:631-649. Shimaoka T, Kume N, Minami M, Hayashida K, Kataoka H, Kita T, Yonehara S. Molecular cloning of a novel scavenger receptor for oxidized low density lipoprotein, SR-PSOX, on macrophages. J Biol Chem 2000;275:40663-40666. Shimaoka T, Nakayama T, Kume N, Takahashi S, Yamaguchi J, Minami M, Hayashida K, Kita T, Ohsumi J, Yoshie O, Yonehara S. Cutting edge: SR-PSOX/CXC chemokine ligand 16 mediates bacterial phagocytosis by APCs through its chemokine domain. J Immunol 2003;171:1647-1651. Shimaoka a T, Nakayama T, Hieshima K, Kume N, Fukumoto N, Minami M, Hayashida K, Kita T, Yoshie O, Yonehara S. Chemokines generally exhibit scavenger receptor activity through their receptor-binding domain. J Biol Chem 2004;279(26):26807-26810. Shimaoka b T, Nakayama T, Fukumoto N, Kume N, Takahashi S, Yamaguchi J, Minami M, Hayashida K, Kita T, Ohsumi J, Yoshie O, Yonehara S. Cell surface- anchored SR-PSOX/CXC chemokine ligand 16 mediates firm adhesion of CXC chemokine receptor 6-expressing cells. J Leukoc Biol 2004;75:267-274. Simpson a JE, Newcombe J, Cuzner ML, Woodroofe MN. Expression of the interferon- gamma-inducible chemokines IP-10 and Mig and their receptor, CXCR3, in multiple sclerosis lesions. Neuropathol Appl Neurobiol 2000;26:133-142. Simpson b J, Rezaie P, Newcombe J, Cuzner ML, Male D, Woodroofe MN. Expression of the beta-chemokine receptors CCR2, CCR3 and CCR5 in multiple sclerosis central nervous system tissue. J Neuroimmunol 2000;108(1–2):192-200. 176 Sloka JS. The mechanism of action of methylprednisolone in the treatment of multiple sclerosis. Mult Scler 2005;11:425-432. Sodhi A, Montaner S, Gutkind JS. Viral hijacking of G-protein-coupledreceptor signalling networks. Nat Rev Mol Cell Biol 2004;5:998-1012. Sorensen TL, Tani M, Jensen J, Pierce V, Lucchinetti C, Folcik VA, Qin S, Rottman J, Sellebjerg F, Strieter RM, Frederiksen JL, Ransohoff RM. Expression of specific chemokines and chemokine receptors in the central nervous system of multiple sclerosis patients. J Clin Invest 1999;103:807-815. Soriano SG, Amaravadi LS, Wang YF, Zhou H, Yu GX, Tonra JR, Fairchild-Huntress V, Fang Q, Dunmore JH, Huszar D, Pan Y. Mice deficient in fractalkine are less susceptible to cerebral ischemia-reperfusion injury. J Neuroimmunol 2002;125:59-65. Sospedra M, Martin R. Immunology of multiple sclerosis. Annu Rev Immunol 2005;23:683-747. Sporer B, Kastenbauer S, Koedel U, Arendt G, Pfister HW. Increased intrathecal release of soluble fractalkine in HIV-infected patients. AIDS Res Hum Retrovir 2003;19:111-116. Stefferl A, Storch MK, Linington C, Stadelmann C, Lassmann H, Pohl T, Holsboer F, Tilders FJ, Reul JM. Disease progression in chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis is associated with reduced inflammation-driven production of corticosterone. Endocrinology 1991;142:3612-3616. Steinman L. Multiple sclerosis: a coordinated immunological attack against myelin in the central nervous system. Cell 1996;85(3):299-302. Stojković L, Djurić T, Stanković A, Dinĉić E, Stanĉić O, Veljković N, Alavantić D, Zivković M. The association of V249I and T280M fractalkine receptor haplotypes with disease course of multiple sclerosis. J Neuroimmunol 2012;245(1-2):87-92. Strader CD, Fong TM, Tota MR, Underwood D, Dixon RA. Structure and function of G protein-coupled receptors. Annu Rev Biochem 1994;63:101-132. Sun Y, Chang Z, Zhang S. Increased serum CXCL16 level is a marker for acute coronary syndromes. Arch Med Res 2008;39(3):332-337. 177 Sundqvist E, Baarnhielm M, Alfredsson L, Hillert J, Olsson T, Kockum I. Confirmation of association between multiple sclerosis and CYP27B1. Eur J Hum Genet 2010;18(12):1349-1352. Sunnemark D, Eltayeb S, Nilsson M, Wallstrom E, Lassmann H, Olsson T, Berg AL, Ericsson-Dahlstrand A. CX3CL1 (fractalkine) and CX3CR1 expression in myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis: kinetics and cellular origin. J Neuroinflammation 2005;2:17. t Hart BA, Laman JD, Bauer J, Blezer E, van Kooyk Y, Hintzen RQ. Modelling of multiple sclerosis: lessons learned in a non-human primate. Lancet Neurol 2004;3(10):588-597. t Hart BA, Massacesi L. Clinical, pathological, and immunologic aspects of the multiple sclerosis model in common marmosets (Callithrix jacchus). J Neuropathol Exp Neurol 2009;68:341-355. Tabata S, Kadowaki N, Kitawaki T, Shimaoka T, Yonehara S, Yoshie O, Uchiyama T. Distribution and kinetics of SR-PSOX/CXCL16 and CXCR6 expression on human dendritic cell subsets and CD4+ T cells. J Leukoc Biol 2005;77:777-786. Tajouri L, Mellick AS, Ashton KJ, Tannenberg AE, Nagra RM, Tourtellotte WW, Griffiths LR. Quantitative and qualitative changes in gene expression patterns characterize the activity of plaques in multiple sclerosis. Brain Res Mol Brain Res 2003;119:170-183. Takeda S, Kadowaki S, Haga T, Takaesu H, Mitaku S. Identification of G protein- coupled receptor genes from the human genome sequence. FEBS Lett 2002;520:97-101. Tarozzo G, Bortolazzi S, Crochemore C, Chen SC, Lira AS, Abrams JS, Beltramo M. Fractalkine protein localization and gene expression in mouse brain. J Neurosci Res 2003;73:81-88. Teupser D, Pavlides S, Tan M, Gutierrez-Ramos JC, Kolbeck R, Breslow JL. Major reduction of atherosclerosis in fractalkine (CX3CL1)-deficient mice is at the brachiocephalic artery, not the aortic root. Proc Natl Acad Sci USA 2004;101:17795-17800. Thelen M. Dancing to the tune of chemokines. Nat Immunol 2001;2:129-134. 178 Thomas SY, Hou R, Boyson JE, Means TK, Hess C, Olson DP, Strominger JL, Brenner MB, Gumperz JE, Wilson SB, Luster AD. CD1d-restricted NKT cells express a chemokine receptor profile indicative of Th1-type inflammatory homing cells. J Immunol 2003;171:2571-2580. Traugott U, Lebon P. Multiple sclerosis: involvement of interferons in lesion pathogenesis. Ann Neurol 1988;24:243-251. Tregouet DA, Escolano S, Tiret L, Mallet A, Golmard JL. A new maximum likelihood algorithm for haplotype-based association analysis: the SEM algorithm. Ann Hum Genet 2004;68:165-177. Tremblay K, Lemire M, Provost V, Pastinen T, Renaud Y, Sandford AJ, Laviolette M, Hudson TJ, Laprise C. Association study between the CX3CR1 gene and asthma. Genes Immun 2006;7:632-639. Tremlett H, Paty D, Devonshire V. Disability progression in multiple sclerosis is slower than previously reported. Neurol 2006;66:172-177. Trojano M, Pellegrini F, Paolicelli D, Fuiani A, Zimatore GB, Tortorella C, Simone IL, Patti F, Ghezzi A, Portaccio E, Rossi P, Pozzilli C, Salemi G, Lugaresi A, Bergamaschi R, Millefiorini E, Clerico M, Lus G, Vianello M, Avolio C, Cavalla P, Iaffaldano P, Direnzo V, D'Onghia M, Lepore V, Livrea P, Comi G, Amato MP. Post-marketing of disease modifying drugs in multiple sclerosis: an exploratory analysis of gender effect in interferon beta treatment. J Neurol Sci 2009;286:109-113. Tsou CL, Haskell CA, Charo IF. Tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme mediates the inducible cleavage of fractalkine. J Biol Chem 2001;276(48):44622-44626. Ueland T, Smedbakken LM, Hallén J, Atar D, Januzzi JL, Halvorsen B, Jensen JK, Aukrust P. Soluble CXCL16 and long-term outcome in acute ischemic stroke. Atherosclerosis 2012;220(1):244-249. Umehara H, Bloom ET, Okazaki T, Nagano Y, Yoshie O, Imai T. Fractalkine in vascular biology: From basic research to clinical disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:34-40. Unutmaz D, Xiang W, Sunshine MJ, Campbell J, Butcher E, Littman DR. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its 179 expression pattern is conserved between human and mouse. J Immunol 2000;165(6):3284-3292. Uzawa A, Mori M, Hayakawa S, Masuda S, Nomura F, Kuwabara S. Expression of chemokine receptors on peripheral blood lymphocytes in multiple sclerosis and neuromyelitis optica. BMC Neurol 2010;10:113. van der Voort R, van Lieshout AW, Toonen LW, Slöetjes AW, van den Berg WB, Figdor CG, Radstake TR, Adema GJ. Elevated CXCL16 expression by synovial macrophages recruits memory T cells into rheumatoid joints. Arthritis Rheum 2005;52(5):1381-1391. Vartanian T, Li Y, Zhao M, Stefansson K. Interferon-gamma-induced oligodendrocyte cell death: implications for the pathogenesis of multiple sclerosis. Mol Med 1975;1:732-743. Veljković V, Veljković N, Esté JA, Hüther A, Dietrich U. Application of the EIIP/ISM bioinformatics concept in development of new drugs. Curr Med Chem 2007;14:441-453. Verge GM, Milligan ED, Maier SF, Watkins LR, Naeve GS, Foster AC. Fractalkine (CX3CL1) and fractalkine receptor (CX3CR1) distribution in spinal cord and dorsal root ganglia under basal and neuropathic pain conditions. Eur J Neurosci 2004;20:1150-1160. Viglietta V, Baecher-Allan C, Weiner HL, Hafler DA. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. J Exp Med 2004;199:971-979. Virgintino D, Robertson D, Errede M, Benagiano V, Girolamo F, Maiorano E, Roncali L, Bertossi M. Expression of P-glycoprotein in human cerebral cortex microvessels. J Histochem Cytochem 2002;50:1671-1676. Vyshkina T, Kalman B. Autoantibodies and neurodegeneration in multiple sclerosis. Lab Invest 2008;88:796-807. Wagsater D, Olofsson PS, Norgren L, Stenberg B, Sirsjo A. The chemokine and scavenger receptor CXCL16/SR-PSOX is expressed in human vascular smooth muscle cells and is induced by interferongamma. Biochem Biophys Res Commun 2004;325:1187-1193. 180 Wan Y, Evans RM. Rosiglitazone activation of PPARgamma suppresses fractalkine signaling. J Mol Endocrinol 2010;44:135-142. Wang KD, Liu ZZ, Wang RM, Wang YJ, Zhang GJ, Su JR, Kang XX. Chemokine CXC Ligand 16 serum concentration but not A181V genotype is associated with atherosclerotic stroke. Clin Chim Acta 2010;411(19-20):1447-1451. Watts C. The exogenous pathway for antigen presentation on major histocompatibility complex class II and CD1 molecules. Nat Immunol 2004;5(7):685-692. Waxman SG, Craner MJ, Black JA. Sodium channel expression along axons in multiple sclerosis and its models. Trends Pharmacol Sci 2004;25:584-591. Weinshenker BG. Natural history of multiple sclerosis. Ann Neurol 1994;36(Suppl):S6- S11. Whitney LW, Becker KG, Tresser NJ, Caballero-Ramos CI, Munson PJ, Prabhu VV, Trent JM, McFarland HF, Biddison WE. Analysis of gene expression in mutiple sclerosis lesions using cDNA microarrays. Ann Neurol 1999;46:425-428. Whitney LW, Ludwin SK, McFarland HF, Biddison WE. Microarray analysis of gene expression in multiple sclerosis and EAE identifies 5-lipoxygenase as a component of inflammatory lesions. J Neuroimmunol 2001;121:40-48. Wilbanks A, Zondlo SC, Murphy K, Mak S, Soler D, Langdon P, Andrew DP, Wu L, Briskin M. Expression cloning of the STRL33/BONZO/TYMSTR ligand reveals elements of CC, CXC, and CX3C chemokines. J Immunol 2001;166:5145-5154. Wuttge DM, Zhou X, Sheikine Y, Wågsäter D, Stemme V, Hedin U, Stemme S, Hansson GK, Sirsjö A. CXCL16/SR-PSOX is an interferon-gamma-regulated chemokine and scavenger receptor expressed in atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004;24:750-755. Yajima N, Kasama T, Isozaki T, Odai T, Matsunawa M, Negishi M, Ide H, Kameoka Y, Hirohata S, Adachi M. Elevated levels of soluble fractalkine in active systemic lupus erythematosus: potential involvement in neuropsychiatric manifestations. Arthritis Rheum 2005;52:1670-1675. Yang Q, Khoury MJ, Friedman J, Little J, Flanders WD. How many genes underlie the occurrence of common complex diseases in the population? Int J Epidemiol 2005;34(5):1129-1137. 181 Ye S, Dhillon S, Ke X, Collins AR, Day INM. An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res 2001;29:E88-8. Yi GW, Zeng QT. Circulating CXCL16 is related to the severity of coronary artery stenosis. Arch Med Res 2008;39(5):531-535. Yoneda O, Imai T, Goda S, Inoue H, Yamauchi A, Okazaki T, Imai H, Yoshie O, Bloom ET, Domae N, Umehara H. Fractalkine-mediated endothelial cell injury by NK cells. J Immunol 2000;164:4055-4062. Yoneda O, Imai T, Nishimura M, Miyaji M, Mimori T, Okazaki T, Domae N, Fujimoto H, Minami Y, Kono T, Bloom ET, Umehara H. Membranebound form of fractalkine induces IFN-gamma production by NK cells. Eur J Immunol 2003;33:53-58. Yoshida H, Imaizumi T, Fujimoto K, Matsuo N, Kimura K, Cui X, Matsumiya T, Tanji K, Shibata T, Tamo W, Kumagai M, Satoh K. Synergistic stimulation, by tumor necrosis factor-alpha and interferon gamma, of fractalkine expression in human astrocytes. Neurosci Lett 2001;303:132-136. Yu P, Gregg RK, Bell JJ, Ellis JS, Divekar R, Lee HH, Jain R, Waldner H, Hardaway JC, Collins M, Kuchroo VK, Zaghouani H. Specific T regulatory cells display broad suppressive functions against experimental allergic encephalomyelitis upon activation with cognate antigen. J Immunol 2005;174:6772-6780. Zamvil SS, Steinman L. Diverse targets for intervention during inflammatory and neurodegenerative phases of multiple sclerosis. Neuron 2003;38:685-688. Zeis T, Graumann U, Reynolds R, Schaeren-Wiemers N. Normal-appearing white matter in multiple sclerosis is in a subtle balance between inflammation and neuroprotection. Brain 2008;131(Pt1):288-303. Zeis T, Schaeren-Wiemers N. Lame ducks or fierce creatures? The role of oligodendrocytes in multiple sclerosis. J Mol Neuroscience 2008;35:91-100. Zhang D, Stumpo DJ, Graves JP, DeGraff LM, Grissom SF, Collins JB, Li L, Zeldin DC, Blackshear PJ. Identification of potential target genes for RFX4_v3, a transcription factor critical for brain development. J Neurochem 2006;98(3):860- 875. Zhang X, Koldzic DN, Izikson L, Reddy J, Nazareno RF, Sakaguchi S, Kuchroo VK, Weiner HL. IL-10 is involved in the suppression of experimental autoimmune 182 encephalomyelitis by CD25+CD4+ regulatory T cells. Int Immunol 2004;16:249-256. Zhao R, Wang Y, Shen R, Sun Y. Relationship between CX3CR1 genetic polymorphism and carotid atherosclerosis. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2010;38(1):19-23. Zhuge X, Murayama T, Arai H, Yamauchi R, Tanaka M, Shimaoka T, Yonehara S, Kume N, Yokode M, Kita T. CXCL16 is a novel angiogenic factor for human umbilical vein endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2005;331:1295-1300. Zimmermann AK, Simon P, Seeburger J, Hoffmann J, Ziemer G, Aebert H, Wendel HP. Cytokine gene expression in monocytes of patients undergoing cardiopulmonary bypass surgery evaluated by real-time PCR. J Cell Mol Med 2003;7(2):146-156. Zlotnik A, Yoshie O. Chemokines: A new classification system and their role in immunity. Immunity 2000;12:121-127. Zujovic V, Benavides J, Vige X, Carter C, Taupin V. Fractalkine modulates TNF-alpha secretion and neurotoxicity induced by microglial activation. Glia 2000;29:305- 315. Zuvich RL, McCauley JL, Pericak-Vance MA, Haines JL. Genetics and pathogenesis of multiple sclerosis. Semin Immunol 2009;(21):328-333. Ţivković M, Stanković A, Dincić E, Popović M, Popović S, Raicević R, Alavantić D. The tag SNP for HLA-DRB1*1501, rs3135388, is significantly associated with multiple sclerosis susceptibility: cost-effective high-throughput detection by real-time PCR. Clin Chim Acta 2009;406(1-2):27-30. STRUĈNA BIOGRAFIJA Ljiljana Stojković je roĊena 05.07.1979. godine u Beogradu. Osnovno i srednje obrazovanje stekla je u Smederevskoj Palanci. Diplomirala je 20.12.2007. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu (studijska grupa Molekularna biologija i fiziologija) sa proseĉnom ocenom 8,92 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Diplomski rad, pod naslovom „Polimorfizam DNK -174 G/C u humanom genu za IL-6 kao faktor rizika za inflamaciju i nastanak oţiljnih promena na bubrezima u akutnom pijelonefritisu“, uradila je u Laboratoriji za radiobiologiju i molekularnu genetiku Instituta za nuklearne nauke „Vinĉa“, pod rukovodstvom mentora dr Maje Ţivković. Školske 2007/2008. godine upisala je doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, studijski program Molekularna biologija. Od 26.12.2007. godine zaposlena je u Laboratoriji za radiobiologiju i molekularnu genetiku Instituta za nuklearne nauke „Vinĉa“. U zvanje istraţivaĉ saradnik je izabrana 2009. godine. Do sada je publikovala 4 rada iz uţe nauĉne oblasti u ĉasopisima meĊunarodnog znaĉaja i 11 kongresnih saopštenja iz uţe nauĉne oblasti na skupovima meĊunarodnog znaĉaja. Trenutno je angaţovana na projektima: Genetska osnova humanih vaskularnih i inflamatornih bolesti (OI 175085) i Integralna studija identifikacije regionalnih genetskih faktora rizika i faktora rizika ţivotne sredine za masovne nezarazne bolesti humane populacije u Srbiji (III 41028), Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Љиљана Стојковић број уписа _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Улога полиморфизама и експресије гена за хемокине CX3C лиганд 1 и CXC лиганд 16 и њихове рецепторе у настанку и прогресији мултипле склерозе у Србији  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, _25.06.2013._ ________________________ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора _ Љиљана Стојковић _________________________ Број уписа __________________________________________________________ Студијски програм _ ________________ Наслов рада Улога полиморфизама и експресије гена за хемокине CX3C лиганд 1 и CXC лиганд 16 и њихове рецепторе у настанку и прогресији мултипле склерозе у Србији Ментор др Маја Живковић, виши научни сарадник Институтa за нуклеарне науке “Винча” др Душанка Савић Павићевић, ванредни професор Биолошког факултета Универзитета у Београду Потписани Љиљана Стојковић изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, _25.06.2013._ _____________________ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Улога полиморфизама и експресије гена за хемокине CX3C лиганд 1 и CXC лиганд 16 и њихове рецепторе у настанку и прогресији мултипле склерозе у Србији која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, _25.06.2013._ _______________________ 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.