UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOSКI F AКUL ТЕТ Мr Branka В. Janac UTICAJ PROMENLЛVOG МAGNETNOG POLJA NA MOTORNO PONASANJE PACOVA U LAВORATORIJSКIM USLOVIМA -doktorska disertacija- Beograd, 2007. УНИВЕРЗИТFТrр ,. · ~ "140ТЕКА "СВЕТОЗАР ~ · ОГРАД ..9[:__ и. БрЈ~ ~ wi-- Mentori: Dr Lidija Radenovic, Vanredni profesor Вioloskogfakulteta Univerziteta и Beogradи, Visi naиcni saradnik IBISS-a Dr Zlatko Prolic, ViSi naиcni saradnik IBISS-a Clanovi komisije: Dr Lidija Radenovic, Vanredni profesor Вioloskogfakulteta Univerziteta и Beogradи, ViSi naиcni saradnik IBISS-a Dr Zlatko Prolic, Visi naиcni saradnik IBISS-a Dr Mirko Tomic, Docent Вioloskogfakulteta Univerziteta и Beogradи, ViSi naиcni saradnik IBISS-a Ova doktorska disertacija је иrаdепа и okvirи projekta «Иticaj magnetnih polja kao eko.fizioloskog faktora па razlicite bloloske sisteme i moguca primeпa и blomediciпi», .fiпansiraпom od straпe Miпistarstva za паиkи i zaftitи iivotne srediпe RepиЬlike Srbije. Ovom prilikom ielim da se zahvalim meпtorima i claпovima komisije dr Lidiji Radeпovic, dr Zlatku Prolicи i dr Mirku Tomicи па velikoj pomof:i, zпacajпim i zaпimljivim diskusijama i korisпim savetima koji sи omogucili da ova disertacija dobije kопаспи formи. Njihova podrska i razиmevaпje и svakoj fazi izrade ovog rada za тепе sи bili od izuzetnog zпасаја. Kolegiпici dr Slavici Ristic veliko hvala па podrsci, prakticпim savetima i dragoceпoj pomof:i и toku izvodenja eksperimeпtalпog dela ove disertacije. Veliku zahvalпost dиgujem dr Мilапи Jokaпovicи па иkazaпom poverenjи i spremпosti da pomogne и realizaciji doktorske disertacije. Gordaпi Tovilovic i Vladi Апtопiси hvala па пеsеЬlспој pomof:i и eksperimeпtalпom radи. Najiskreпije se zahvaljиjem Dajaпi Todorovic па podrsci и oblikovanjи i kопаспој izradi ovograda. Veri Tиcovic dиgujem veliku zahvalпost па pomof:i и radи sa iivotinjama. Dr Gordaпi Karteliji, dr Miodragu Nedeljkovicи, Ljiljaпi Nikolic i Sпeiaпi RaиS hvala па prijatnoj i ориStајисој atmosferi и treпиcima predaha. Saietak Uticaj promenljivog magnetnog polja па motorno ponasanje pacova u laboratorijskim uslovima Promenljiva magnetna polja (МР) sirokog spektra frekvencija i intenziteta predmet su mnogobrojnih studija koje se bave ispitivanjem efekata ovih polja, kao ekofizioloskog faktora, na zive sisteme. lako su brojne studije pokazale da promenljiva МР ekstremno niskih frekvencija (ENF) uticu na strukturu i funkciju centralnog nervnog sistema eksperimentalnih zivotinja i ljudi, mehanizmi veze izmedu promena u putevima signalne transdukcije neurotransmiterskih sistema odgovornih za kontrolu motome aktivnosti i promena u pona8anju jos uvek nisu u potpunosti razja8njena. Cilj ovih istraZivanja је ispitivanje efekata akutnog (1, 3 i 7 dana) i hronicnog (tokom celog zivota, od zaceca do starosti od oko 3 meseca) izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na razlicite parametre motomog pona8anja (lokomocija, stereotipija, uspravljanje, rotacije i vreme mirovanja) pacova Wistar soja. Motoma aktivnost Zivotinja је automatski registrovana, neposredno nakon prestanka izlaganja МР, uredajem Columbus Auto-Track Sistem ( «open field» test). Da Ьi se promene u motomoj aktivnosti izazvane МР ucinile uocljivijim, pracen је i efekat ENF-МP na motorni odgovor zivotinja izazvan primenom neuroaktivne supstance i dopaminergickog agor.d.ste amfetamina (АМРН, 1.5 mg/kg, i.p.). S obzirom na ulogu dopamina i serotonina u kontroli motomog pona8anja, analizirana је aktivnost receptora za dopamin (D1 i D2) u strijatumu i serotonin (5-НТ2л) u prefrontalnoj kori velikog mozga eksperimentalnih zivotinja izlaganih akutno i hronicno ENF-МP, metodom in vitro vezivanja radioaktivnog liganda za receptor. Pored toga, primenom НРLС metode odredena је koncentracija nukleotida (IМР, сАМР, АТР i GTP), koji na direktan i/ili indirektan nacin ucestvuju u signalnoj transdukciji, u kori velikog mozga i strijatumu Zivotinja akutno i hronicno izlaganih ENF-МP. Rezultati na8ih eksperimenata su pokazali da akutno izlaganje ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) u trajanju od jednog dana povecava lokomociju i stereotipiju i smanjuje uspravljanje i vreme mirovanja, dok tretman МР u trajanju od tri i sedam dana smanjuje uspravljanje eksperimentalnih zivotinja. S druge strane, hronicno izlaganje ENF-МP povecava motomu aktivnost i smanjuje vreme mirovanja eksperimentalnih zivotinja, ukazujuci · na generalno ekscitatorni efekat МР na centralni nervni sistem. Akutni tretman ENF-MP smanjuje efikasnost АМРН da poveea lokomotorni i stereotipni odgovor nakon izlaganja tri i sedam dana, kao i rotacije nakon tretmana u trajanju od 7 dana, dok hronicno izlaganje МР smanjuje samo uspravljanje Zivotinja izazvano primenom АМРН. Afinitet 5-НТ2д receptora se smanjuje i Saietak njihova gustina povecava и prefrontalnoj kori velikog mozga eksperimentalnih Zivotinja pod иticajem akutnog tretmana ENF-МP. Нronicno izlaganje ENF-МP povecava afinitet D1 receptora и strijatumи i smanjиje afinitet S-НТ2л receptora и prefrontalnoj kori velikog mozga eksperimentalnih zivotinja. Odredivanjem koncentracije nukleotida је pokazano da se sadrZaj сАМР smanjиje nakon akutnog izlaganja ENF-МP З i 7 dana, kao i sadrZaj 1МР nakon tretmana МР 7 dana и kori velikog mozga eksperimentalnih zivotinja. Pored toga, akutni tretman МР и trajanjи od 1 i З dana stimulise stvaranje АТР и kori velikog mozga Zivotinja. Za razliku od akutnog tretmana, hronicno izlaganje ENF-МP povecava koncentracijи сАМР и kori velikog mozga i strijatumи eksperimentalnih zivotinja. Na osnovu doЬijenih rezultata mozemo zakljиciti da spolja8nja ENF-МP modиlisи motomo pona8anje eksperimentalnih Zivotinja posredstvom direktnog i/ili indirektnog иticaja na sinapticku neurotransmisijи и kori velikog mozga i strijatumu, pri сети karakter ovih promena zavisi od duZine izlaganja МР. Kljucne reci: promenljiva МР; motorno ponasanje; АМРН, dopaminski D1 i D2 receptori; serotoninski 5-НТ2А receptori;, /МР; сАМР; АТР; GTP Abstract Effect of an alternating magnetic field on motor behaviour of rats in laboratory conditions Altemating magnetic fields (МF) of а broad spectrum of frequencies and intensities are the subject of many studies that investigate the effects of these fields as an ecophysiological factor on living systems. Although а great number of studies have shown that altemating МF of extremely low frequency (ELF) affect structure and function of the central nervous system of experimental animals and humans, mechanisms that connect the changes in signal transduction pathways of neurotransmitter systems involved in motor activity control and the changes in behaviour are not yet completely explained. The purpose of the present studies is to examine the effects of acute (1, З, and 7 days) and chronic (life-long, from conception to about З months old) exposure to ELF-MF (50 Нz, 0.5 mT) on different parameters of motor behaviour (locomotion, stereotypy, rearing, rotation, and resting time) of Wistar rats. Motor activity of animals is automatically registered, immediately after MF disappearance, Ьу а Columbus Auto-Track System device ("open field" test). In order to make MF-induced changes in motor activity more obvious, the effect of ELF-MF on motor response of animals induced Ьу application of neuroactive substance and dopaminergic agonist amphetamine (АМРН, 1.5 mglk:g, i.p.) is monitored. Having in mind the role of dopamine and serotonin in the control of motor behaviour, the activity of dopamine receptors CDt and D2) in striatum, as well as serotonin receptors (5-НТ2л) in the prefrontal cortex of experimental animals acutely and chronically exposed to ELF-МF, are analysed Ьу the in vitro radioligand receptor binding assay. In addition, concentrations of nucleotides (IМР, сАМР, АТР, and GТР) which directly and/or indirectly affect signal transduction, are determined Ьу НРLС in the cortex and striatum ofthe animals acutely and chronically exposed to ELF-MF. The results of our experiments have shown that acute exposure to ELF-MF (50 Hz, 0.5 mT) during one day increases locomotion and stereotypy, and decreases rearing and resting time, while an МF treatment of З and 7 days reduces rearing of experimental animals. On the other hand, chronic exposure to ELF-MF enhances motor activity and decreases resting time of the experimental animals, indicating а general excitatory effect of the MF on the central nervous system. Acute treatment with ELF -МF decreases the АМРН efficacy to increase locomotor and stereotypic response after the exposure of З and 7 days, as well as rotation after а 7 day treatment. Chronic exposure to МF decreases only the AМPH-induced rearing of animals. The affmity of 5-НТ2л receptors decreases and their density increases in the prefrontal cortex of Abstract experimental animals under acute ELF-МF treatment. Chronic exposure to ELF-МF increases affinity of D1 receptors in the striatum and decreases the affinity of the 5-НТ 2л receptor in the prefrontal cortex. Ву determining the nucleotide concentration it was shown that the сАМР content is reduced after acute exposure to ELF-МF for З and 7 days, as well as the 1МР content in the cortex of experimental animals after а 7 day MF treatment. In addition, an acute MF treatment of 1 and З days stimulates production of А ТР in the cortex of the animals. In contrast to the acute treatment, chronic exposure to ELF-МF increases сАМР concentrations both in the cortex and striatum of experimental animals. lt can Ье concluded that an extemal ELF-МF modulates motor activity of experimental animals Ьу exerting direct and/or indirect influence on synaptic neurotransmission in the cortex and striatum, with the character of these changes Ьeing dependent of the duration of МF exposure. Keywords: a/ternating MF; motor behaviour; АМРН; dopamine Dz and D2 receptors; serotonin 5-ЈП'2А receptors; /МР; сАМР; АТР; GTP Sadrza · v SADRZAJ 1. UVOD 1 1.1. lzvori i karakteristike spoljasnjih magnetnih polja 1 1.1.1. Principi magnetorecepcije 6 1.2. Uticaj spoljasnjih magnetnih polja na orijentaciju i motorno ponasanje bloloskih sistema razlicitog nivoa organizacije 1 О 1.2.1. Evolutivno nii i Ыoloski sistemi 10 1.2.2. Evolutivno viSi Ыoloski sistemi 12 1.3. Motorno ponasanje 14 1. 3.1. Anatomsko-funkcionalna osnova motornog ponasanja 15 1.3.2. Osnovni oblici motornogponasanja 19 1.3.3. Primena magnetnih polja и terapiji motornih poremecaja kod ljudi 21 2. CILJEVI RADA 23 3. МATERIJAL 1 METODE 24 3.1. Eksperimentalne zivotinje 24 3.2. Sistem za izlaganje promenljivom magnetnom polju 24 3.3. Registracija motorne aktivnosti 25 З. 3.1. Eksperimentalna procedura 26 3.4. Metoda vezivanja radioaktivnog liganda do zasicenja receptora (saturaciono vezivanje) 27 3.4.1. Analiza aktivnosti centralnih receptora za dopamin i serotonin 28 3.5. Odredivanje koncentracije nukleotida u izolovanim regionima mozga 30 3.5.1. Hromatografska metoda i uslovi hromatografisanja 31 3.6. Statisticka analiza podataka 32 4. REZUL TATI 34 4.1. Efekti promenljivog magnetnog polja na motorno ponasanje 34 4.2. Efekti promenljivog magnetnog polja na motorni odgovor izazvan primenom amfetamina (1.5 mglkg, i.p.) 38 4.3. Efekti promenljivog magnetnog polja na aktivnost centralnih dopaminskih Dt i D2 i serotoninskih S-HT2A receptora 44 4.4. Efekti promenljivog magnetnog polja na koncentraciju nukleotida 1МР, сАМР, АТР i GTP 47 4.5. Efekti hronicnog tretmana promenljivim magnetnim poljem na telesnu masu 53 5. DISКUSIJA 54 6. ZAКLJUCCI 67 7. LITERAТURA 69 SКRACENICE АМР АМРН АТР сАМР CNS ENF GАВА GP GPs GPu GTP НРLС i.p. 1МР МLR МР PLS PPN rTMS SLR SN SNc SNr TMS VA VL VТА Adenozin 5'-monofosfat Amfetamin Adenozin 5'-trifosfat Ciklicni adenozin 5'-monofosfat Centralni nervni sistem Ekstremno niska frekvencija y-aminobutema kiselina Globus palidus ili palidum SpoljзSnji ili lateralni palidum UnutrзSnji segment ili medijalni palidum Guanozin 5'-trifosfat Нigh Performance Liquid Chromatography Intraperitonealno Inozin 5'-monofosfat Mezencefalicni lokomotorni region Magnetno polje Pontomedularni lokomotorni snop Pedunkulopontinsko tegmentalno jedro Repetitivna transkranijalna magnetna stimulacija Subtalamicni lokomotorni region Supstancija nigra Supstancija nigra pars kompakta Supstancija nigra pars retikulata Transkranijalna magnetna stimulacija Ventralno prednje jedro talamusa Ventralno lateralno jedro talamusa Ventralna tegmentalna oЬlast Skracenice Uvod 1. UVOD Magnetna polja (МР) razlicitih karakteristika stalno su prisutna u sredini u kojoj zivimo i radimo, ра se moze pretpostaviti da kao takva i uticu na sve Ьioloske sisteme. Pored prirodnih МР, u Cijem prisustvu se razvio zivi svet, poslednjih godina se susrecemo sa proЬlemom sve cesce pojave «vestackih» МР. Medu njima su i promenljiva МР ekstremno niske frekvencije (ENF) poreklom od kucnih aparata, elektricnih vodova, saobracajnih sredstava do razlicitih industrijskih tehnologija. Zbog toga је pafuja velikog broja istrafivaca usmerena na ispitivanje Ьioloskih efekata ovih polja, i to njihovih stetnih uticaja kao sredinskog faktora, ali i mogucih korisnih svojstava koja Ьi mogla imati u medicini i Ьiologiji. l.l.lzvori i karakteristike spoljasnjih magnetnih polja Elektromagnetni spektar obuhvata frekvencije od ekstremno niskih (О- 300 Нz) do gama zraka (tabela 1). Kategorija polja Ultra visoko trekventno Super visoko frekventno Ekstremno visoko frekventno Tabela 1. Prikaz elektromagnetnog spektra Frekvencija (v) Talasna duzina (Л) (l1z) (rn) о 30 1 х 107 300 1 х 106 3 х 103 1 х 105 30 х 103 1 х 104 300 х 103 1 х 103 3 х 106 1 х 102 30 х 106 1 х 101 WF ---i 300 х 1 06 UVF---1 9 1 х 10'1 SVF 1 3 х 10 1 х 10'2 ___, 30 х 109 EVF ---i 300 х 109 1 х 10·3 ЈС 300х 10 12 1 х 10·6 3 х 1015 1 х 10'7 30 х 1015 1 х 10·8 300 х \0 15 Ј х 10'9 3 х 1018 1 Х 10·I O 30 х 1018 1 х 10' 11 300 х 1018 1 х 10'12 Energija (Е) (еУ) (Ј) 1 .24х \0' 13 1.99 х 10·32 1.24 х 1о·' 2 1.99 Х 10'31 1.24 х Io-'' 1.99 х I0-30 1.24 х Io-' 0 1.99 х 10'29 1.24 х 10"9 1.99 х Io-28 1.24 х 10·8 1.99 х 10·27 1.24 х 10·7 1.99 х 10"26 1.24 х 10·6 1.99 х 10·25 1.24 х 10·5 1.99 х 10"24 1.24 х 10-4 1.99 х 10·23 1.24 х 10·3 1.99 х Io-22 1.24 1.99х 10.19 1.24 х \01 1.99 х Io-' 8 1.24 х 102 1.99 х 1о· ' 7 1.24 х 103 1.99 х 1о·' 6 1.24 х 104 1.99 х 10·' 5 1.24 х 105 1.99 х to· '4 1.24 х 106 1.99 х Io-' 3 Као sto se moze videti iz tabele 1., sa povecanjem frekvencije povecava se i energija emitujuceg zracenja, sto је u skladu sa relacijom: E=hv(J) Uvod Energija (Е) se izra2ava u dfulima (Ј) ili elektronVoltima (eV), pri cemuje 1 Ј= 6.24 х 1018 eV, h oznacava Plankovu konstantu koja iznosi 6.624 х 10-34 Jsec, а v :&ekvenciju u hercima (Нz). Elektromagnetni talasi veoma velike energije, oznaceni i kao jonizujuce zracenje, imaju dovoljno energije da prouzrokuju promene na nivou molekula izazivajuci jonizaciju. Ostali oЬlici elektromagnetnih talasa (ENF-МP) nemaju dovoljno energije da Ьi prouzrokovali stvaranje jona ра se cesto zovu nejonizujuce zracenje. U delu spektra iznad 1 ОО kНz, efekti elektricnih i magnetnih polja se oblcno analiziraju zajedno kao elektromagnetna polja i u skladu sa osnovnom Maksvelovom jednacinom propagirajuceg polja (slika 1 ). Medutim, u delu spektra ispod 1 ОО kНz, elektricna i magnetna polja se posmatraju kao odvojena i spora vremenski - varirajuca polja (Deno i Carpenter, 1994). magnetnog praznjenje polja elektricnog polja eem = 1/2[eE/ins+ џH/ms] eem- gustina energije (J/m3) Е- dielektricna konstanta 1.1 - magnetni permeaЬilitet (2) Е EmiS- prosecni intenzitet elektricnog polja (V/m) z Hffi!S - prosecni intenzitet magnetnog polja (A/m) Л - talasna duzina ( m) Slika 1. Prostiranje elektromagnetnog talasa (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java!oolarizedlight/emwaveD Uvodenjem koncepta linija sile, Faradej је uspeo vizuelno da opise МР i njegove osobine. U slucaju magnetne sipke, sa severnim polom na jednom kraju i juZnim na drugom, linije sile pocinju iz sevemog pola magneta i prateCi manje ili vise zakrivljeni put vracaju se u jиZni pol (slika 2А). Kada је u pitanju naelektrisanje u kretanju ili provodnik u kojem tece elektricna struja, linije sile zatvaraju krugove sa naelektrisanjem ili provodnikom kao centrom (slika 2В). А в Provodnik Slika 2. OЬlici linija sile МР А- magnetna ~ipka (http://www.gcsechemistry.com/Мagnetic-Field-Bar-Magnet.gif) В- provodnik (http://www.gcsechemistry.com/Мagnetic-Field-Current-Wire.gif) 2 Uvod Pored prirodnih magneta, koji su rezultat posebno uredenih atoma u strukturi materije, postoje i vestacki magneti. Magnetna polja mogu Ьiti konstantna i promenljiva, u zavisnosti da li nastaju pod dejstvom jednosmeme struje ili struje promenljivog smera. Velicine koje ih definisu navedene su u tabeli 2. Tabela 2. Veli~ine koje opisuju МР i njihove jedinice. * - jedinice koje nisu ро SI sistemu ili medunarodnom sistemu jedinica. Jedinica za magnetnu indukciju tesla (Т) је progla5ena 27. juna 1956. godine od strane Medunarodne elektrotehni~ke komisije. Ime је dobila u ~ast Nikole Tesle, nau~nika ~iji је rad na elektromagnetnoj indukciji doveo do stvaranja prvih generatora i motora koji koriste naizmeni~nu ili promenljivu struju. VELICINA OZNAКA JEDINICA Gaus (G)* о Magnetna indukcija в о JG = J(J4 T о Tesla (I) о о Intenzitet МР н Amper/metar (А/т) :Ј А/т= О.ОЈ256 Ое Et·sted (Ое)* о о о Мagnetni fluks VеЬег (Wb) о Ј WЪ= Тх т1 ф о о о Hem·i/metш· (Н/т) о Magnetna propustljivost о Ј Н/т = Ј NIA2 Ј.1 Njutn/Ampe1; (NIA2) о о Hel"c (Нz) о о Ј Hz = Ј sec·' FrekvencUa v Sekuncta·1 (sec-1) о о о Medusobni odnosi ovih velicina dati su sledecim relacijama: В=џН(Т) (З) Ф=SВ(WЬ) (4) gde S oznacava jedinicu povrsine u m2• Apsolutna magnetna propustljivost (f.!) је osoЬina materijala i u opstem slucaju iznosi: џ = Џо (1 + х"Ј (Шт) (5) Konstantna J.to predstavlja propustljivost vakuma i njena vrednost iznosi J.to = 4n х 10-7 Н/m. Magnetna osetljivost materijala (Xm) је pokazatelj stepena magnetizacije materijala u odgovoru naMP. U literaturi se oЬicno navodi vrednost relativne magnetne propustljivosti (f.!r), koja predstavlja odnos apsolutne magnetne propustljivosti i propustljivosti vakuma, i u slucaju vakuma iznosi f.!r = 1. Na osnovu vrednosti relativne magnetne propustljivosti, materije se mogu svrstati u jednu od tri osnovne kategorije: dijamagnetne, paramagnetne i feromagnetne supstance. Dijamagnetne supstance, kao sto је vecina organskih i neorganskih jedinjenja osim slobodnih radikala i jedinjenja prelaznih elemenata, imaju relativnu magnetnu propustljivost з Uvod neznatno nifu od jedinice. Za razliku od njih, paramagnetne supstance, kao sto su soli, slobodni radikali i izvesni kompleksi prelaznih elemenata, imaju relativnu magnetnu propustljivost neznatno visu od jedinice. Feromagnetne supstance, u koje spadaju gvozde, kobalt, nikl, i neke legure, su posebne u smislu da njihova relativna magnetna propustljivost moze dostici vrednosti do 25.000. Magnetno svojstvo Zemlje kao planete potice od dinamicnih procesa jonizovanih delova jezgra i prisutno је u evoluciji Zemlje od samog njenog nastanka. Geomagnetno polje је orijentisano kao magnetna sipka sa dva pola, mada polovi ne odgovaraju geografskom sevemom i jиZnom polu. Ovo polje је relativno konstantno i krece se u opsegu od 20 - 50 !Ј.Т, а na polovima i do 70 !Ј. Т (slika 3). Pulsni magneti Superprovodljivi solenoidi NМR magneti МР elektrona Magneti u domacinstvu МР protona, kompas Geomagnetno polje Vecina eksperimenata u magnetoЬiologiji Magnetne oluje Rezidencijalna МР Dnevne geomagnetne varijacije Fluktuacije geomagnetnog polja МР galaksije МР kardioritmickih struja МР mozdanih struja SQUID magпetometar lf lp ln IJl lm lk - - - ,_ - - - - - - - - - ....... - - - - МР, Tesla: 10-15 10- 12 10·9 10·6 10-3 10° 103 Slika 3. Nivo geomagnetnog polja u odnosu na razlicite izvore prirodnog i vestackog porekla (Binhi, 2002) Geomagnetno polje је pod direktnim uticajem kosmickih polja, koja prvenstveno poticu od Sunca, i koja modulisu prirodnu geomagnetnu aktivnost posebno za vreme Suncevih oluja. Poznato је da је u toku proteklih 70 miliona godina МР Zemlje okrenulo polaritet najmanje 1 О puta. U toku ovog perioda, intenzitet geomagnetnog polja se menjao periodicno tj. pravilno Ш nepravilno, kao rezultat interakcije unutraSnjih promena u Zemljinom jezgru i Sunceve aktivnosti (Deno i Carpenter, 1994). Pravilne promene geomagnetnog polja koje zovemo varijacije mogu Ьiti dnevne, godisnje, 11-to godisnje i vekovne, i u pogledu frekvencija nalaze se na samom dnu elektromagnetnog spektra. Dnevne varijacije su u vezi sa dnevnim prividnim kretanjem Sunca i 4 Uvod ova kolebanja su veca leti nego zimi. Jedanaestogodisnja periodicnost pokazuje vezu sa pojavom periodicnosti Suncevih pega, koja dostize maksimum svakih 11.8 godina. Nepravilne promene geomagnetnog polja ili magnetne perturbacije se desavaju iznenada kao posledica poremecaja Sunceve aktivnosti, vulkanskih erupcija ili zemljotresa. Ove promene su cesto visih frekvencija sve do nivoa mili- i mikrosekundi, i intenziteta koji karakterisu mirnu, odnosno burnu geomagnetnu aktivnost. Pored prirodnih МР, na koje organizmi postaju prilagodeni tokom svoje evolucije, danas evoluciju zivog sveta opterecuje prisustvo dodatnih МР poreklom od izvora koje је stvorio covek i ciji је intenzitet znatno veCi u odnosu na polja prirodnog porekla (slika 4). kilometar metar miliшetar tnikron nanometar Talasna duzina u mctrima 106 10 10 1о-~ 1о-~ 1 о-ь 10-• 10-10 10-•2 10-1" шik:ro- ·;;: UNF radio i tclcvizija IC uv Х zraci gama talasi ::;:; zraci ·;;: 102 104 106 108 1010 1012 10'4 1016 1018 l 020 1022 Frekvencija u Hz radio moЬiloi telefon Slika 4. Tip talasa, frekvencija i talasna du.Zina razlicitih izvora http://science.uniserve.edu.au/school/cuпic/stage6/phys/communicates/Student section/student physics/physics spectruml.htm Prisustvo ovih polja utice na vrednost specificne apsorbovane doze elektromagnetnog zracenja (SAR), koja predstavlja kolicinu apsorbovane energije od strane Ьioloskog sistema ро jedinici mase. СнАТ SAR =4186 ---,1,.---(Wikg) (6) Сн је specificni toplotni kapacitet tkiva (kcallkg°C), 4186 је konverzioni faktor kcal u Ј, дТ је povecanje temperature u ос i t је vreme izlaganja u sec. 5 Uvod 1.1.1. Principi magnetorecepcije Eksperimenti u kojima se prati pona.Sanje Zivotinja pokazali su da razliCite vrste organizama koriste МР Zemlje kao nacin za prostornu orijentaciju u toku migriranja, povratka na staniste ili kretanja oko svojih stanista, sto је od posebnog znacaja u uslovima smanjene vidljivosti (Wiltschko i Wiltschko, 1995а). Relativno malo se zna о :fizioloskim mehanizmima koji su u osnovi ove senzorne sposobnosti. Do sada su iznete brojne hipoteze о mogucim mehanizmima magnetorecepcije medu kojima su i one bazirane na elektromagnetnoj indukciji (Kalmijn, 1974; RosenЬlum i sar., 1985; Paulin, 1995), hemijskim reakcijama (Schulten i Windemuth, 1986; Ritz i sar., 2000), postojanju magnetita ili magnetoreceptora (Кirschvink i Gould, 1981; Кirschvink i sar., 1985; Shcherbakov i Winklhofer, 1999). Medutim, jos uvek ima malo direktnih neuroЬioloskih i anatomskih dokaza koji Ьi podrZali Ьilo koji od predlozenih mehanizama. Cinjenica је da МР slobodno prolaze kroz Ьiolosko tkivo, tako da magnetoreceptori ne moraju Ьiti u kontaktu sa spolja.Snjom sredinom, vec Ьilo gde unutar tela Zivotinje. Pored toga, magnetoreceptori mogu Ьiti sicusni i razbacani unutar velike zapremine tkiva (Кirschvink, 1982) ili se proces prenosa informacije о МР sastoji od niza hemijskih reakcija (Schulten i Windemuth, 1986), ра nema potrebe za postojanjem jasne strukture ili organa odgovornog za magnetorecepciju. Princip poznat kao elektromagnetna indukcija iskoriscen је za obja.Snjenje sposobnosti vrlo aktivnih vrsta kao sto su ajkule i rafe da osete МР Zemlje (Кalmijn, 1974). U skladu sa ovom hipotezom, strukture ribe poznate kao ampule Lorencini funkcionisu kao provodljiva tela, а okolna morska voda kao nepokretna provodljiva sredina. Visoko otporni i osetljivi elektroreceptori koji postoje kod ovih riba registruju promenu napona indukovane struje. Iako ova hipoteza nije direktno dokazana, za rafe i ajkule је vec pokazano da poseduju visoko osetljivi elektricni organ kojim otkrivaju slaba elektricna polja poreklom od tkiva plena (Кalmijn, 1971). Osetljivost ovog elektrosenzornog sistemaje dovoljna da omoguCi osecanje МР Zemlje (Кalmijn, 1988). Posto vazduh nije visoko provodljiva sredina kao morska voda, ptice i druge kopnene zivotinje ne mogu ostvariti magnetorecepciju putem indukcije na nacin koji је predlozen kod morskih riba. Drugi moguci mehanizam magnetorecepcije predvida hemijske reakcije koje su modulisane МР jacine kao sto је Zemljino. Model parova radikala koji su predlozili Schulten i Windemuth (1986), а kasnije do detalja razradili Ritz i sar. (2000), pretpostavlja «hemijski kompas» zasnovan na speci:ficnoj interakciji parova radikala sa okolnim МР. Smatra se da u 6 Uvod ovim procesima va.Znu ulogu imaju fotopigmenti, а dokazi о vezi izmedu magnetorecepcije i vizuelnog sistema doЬijeni su kod ptica i vodozemaca (Phillips i Borland, 1992а,Ь; Phillips i sar., 2001; Wiltschko i Wiltschko, 2001). Elektrofizioloski zapisi registrovani kod golubova ukazuju da se informacija о МР obraduje u delovima vizuelnog sistema (Semm i sar., 1984; Semm i Demaine, 1986). Rezultati su u skladu sa pretpostavkama modela posto su zapaZeni samo u prisustvu svetlosti i izgleda da vode poreklo iz retine, jer zahtevaju neostecenu retinu i opticki nerv. Interesantan nalaz nedavnih istraZivanja da је magnetorecepcija kod ptica ogranicena na desno oko ukazuje da se, zbog veoma malo veza izmedu dve hemisfere mozga, informacija о МР obraduje iskljuCivo u levoj hemisferi mozga (Wiltschko i sar., 2002, 2003). Kod daZdevnjaka је pokazano da su receptori za МР smesteni u pinealnoj Zlezdi, starom trecem oku kicmenjaka, koja је direktno osetljiva na svetlost (Deutscblander i sar., 1999Ь; Phillips i sar., 2001). Jos od ranije је poznata veza izmedu magnetorecepcije i pinealne Zlezde kod razliCitih zivotinja, kao i da izlaganje razlicitim tipovima МР modifikuje stvaranje melatonina (Semm i sar., 1980; Demaine i Semm, 1985; Reiter, 1993; Deutscblander i sar., 1999а). Osetljivost pinealne zlezde sisara na vestacko МР је pokazana kod zamorca cije pinealocite menjaju stopu «aktiviranja» kada se poremeti vestaeko МР kojem su izlozene (Semm i sar., 1980). Elektrofizioloski zapisi doЬijeni iz pinealnih celija goluЬova takode su otkrili celije koje odgovaraju na postepene promene МР jacine kao sto је Zemljino (Demaine i Semm, 1985). Ovi odgovori su smanjeni, ali ne i ukinuti kada su opticki nervi i drugi izvori ulaza и pinealnu zlezdu osteceni. Reuss i sar. (1983) su na8li da se i elektricna aktivnost celija pinealne zlezde pacova menja kadaje obrnuta horizontalna komponenta okolnog МР. U isto vreme su se pojavila i prva dva saopstenja koja su pokazala da cirkadijalno stvaranje melatonina od strane pinealne zlezde pacova moze biti spreceno izlaganjem Zivotinja izmenjenom geomagnetnom polju (Semm, 1983; Welker i sar., 1983). Otkrice da su kristali magnetita (Fез04) odgovorni za sposobnost magnetotakticnih bakterija da plivaju du:l 1inija МР (Вlakemore i Frankel, 1981 ), navelo је istraZivace na traZenje Ьiogenih magnetita kod razlicitih zivotinja. Pored bakterija, Ьiogeni magnetiti su otkriveni kod medonosnih pcela, morskih kornjaca, ptica i brojnih drugih vrsta koje se orijentisu uz pomoc МР Zemlje (Кirschvink i sar., 1985). Vecina magnetita izolovanih iz Zivotinja Ьila је kao kod magnetotakticnih bakterija u oЬliku kristala pojedinacnog domena (Кirschvink i Gould, 1981 ). Magnetni kristali pojedinacnog domena pona8aju se kao stalno namagnetisani magnetni Stapovi i postavljaju se u liniju sa МР Zemlje, ako im је dopиSteno da slobodno rotiraju. Ovi kristali Ьi Uvod nacina (Presti i Pettigrew, 1980; Кirschvink i Gould, 1981 ). Jedna mogucnost је da kristali vrse pritisak na sekundarne receptore, kao sto su elasticne celije, celije dlake ili mehanoreceptori, posto pokusavaju da se postave u pravu liniju sa geomagnetnim poljem. Drugi nacin је da kretanje unutarcelijskih kristala dovodi do direktnog otvaranja jonskih kanala ako npr. filamenti citoskeleta povezuju kristale sa kanalima. Kod nekih zivotinja kristali magnetita su u oЬliku superparamagnetnih cestica, koje su manje u odnosu na cestice pojedinacnog domena i imaju razlicite magnetne osoЬine (Кirschvink i Gould, 1981; Shcherbakov i Winklhofer, 1999). Da Ьi funkcionisali kao magnetoreceptori, kristali magnetita moraju Ьiti u vezi sa nervnim sistemom. Istrafivanja Walker i sar. (1997) su pokazala da celije u mirisnom organu pastrmke koje sadrZe magnetit funkcionisu kao magnetoreceptori i da salju informaciju о МР u mozak posredstvom trigeminalnog nerva. Do slicnih rezultata doslo se i u eksperimentima sa pticama. Kod njih је magnetni materijal koji se smatra magnetitom otkriven u gomjem kljunu (Вeason i Nichols, 1984; Beason i Brennan, 1986), а region koji sadrzi magnetit inervise oftalamicna grana trigeminalnog nerva (slika 5; Semm i Beason, 1990). /f,7\~\ в 1 .. • Slika 5. Shematska rekonstrukcija struktura nadenih и gomjem kljunu goluЬova (Fleissner i sar., 2003) А- terminalni region nerva koji sadrZi osnovu od plotica gvoZda i brojne sferule superparamagnetnih cestica magnetita В - sferule superparamagnetnih cestica i strukture koje ih okruZuju Dodatni dokazi о ulozi magnetita u magnetorecepciji poticu iz eksperimenata sa pulsnom magnetizacijom, u kojima se snamo МР veoma kratkog trajanja koristi za promenu pravca magnetizacije magnetnih cestica pojedinacnog domena (Кalmijn i Blakemore, 1978). Ova procedшa moze da promeni ili unisti magnetorecepciju zasnovanu na magnetitima i na taj nacin promeni pona8anje zivotinja koje koriste ove receptore da Ьi od geomagnetnog polja doЬile informaciju о smeru ili poziciji (Wiltschko i sar., 1994; Wiltschko i Wiltschko, 1995Ь; Beason i sar., 1997). Bio1oski smisao postojanja vise mehanizama magnetorecepcije је u prikupljanju razlicitih tipova informacija. Osnovna razlika izmedu navedenih mehanizama је u osetJjivosti na promene МР Zemlje. Za razliku od elektromagnetne indukcije i hemijskih reakcija, receptori bazirani na magnetitima su najosetljiviji i reaguju na izuzetno male promene МР (Yorke, 1981). Tako npr. ptice posredstvom ovih receptora smestenih u gomjem kljunu registruju razlike u intenzitetu МР, 8 Uvod dok mehanizam parova radikala u desnom oku daje informaciju о pravcu МР. ZЬog toga se za ptice kaZe da imaju kompas u oku i magnetometar u kljunu. IstraZivanja kod glodara, u kojima је imunocitohemijski oЬelefuvan transkripcioni regulatorni protein c-Fos, su identifikovala superior kolikule ili gomje mezencefalicne kvrZice kao mesto neuronalne aktivnosti izazvane magnetnom stimulacijom (slika б; Nemec i sar., 2001). Poreklo ove aktivnosti је nepoznato, ali izgleda da ukljucuje receptore bazirane na magnetitu, sto је i pokazano posredstvom pulsnog efekta. Superior kolikuli su poznati senzomotorni integratori koji imaju vaZnu ulogu u orijentaciji na razlicite stimuluse (Dean i sar., 1989; Stein, 1998). Jedinstvena unutraSnja kбla superior kolikula mogu da slиZe integraciji magnetne informacije sa multimodalnom senzomom i motomom informacijom. Na taj naein, magnetni stimulusi mogu direktno izazvati orijentacioni odgovor putem pokretanja aktivnosti premotomih eferentnih kolikularnih puteva. а Prirodno (konstantno) МР ь Eksperiшentalпo МР .... (МР kојешје periodicno menjan pravac) с ~.~ .. / _,{~~}"·~ Zasticena oblast и kojoj ј е jacina МР Zemlje smanjena oko 150 puta SC slojevi: 8 InGo InGi DpG п с sc OЬiast aktivacije ~\: Aktivirani neuroni Slika 6. lmunocitohemijsko obelefavanje transkripcionog regulatomog proteina c-Fos и sиperior kolikulima (SC) glodara (Cryptomys anseЉ) kao odgovor na prisustvo «magnetnog kompasa>> (Nemec i sar., 2005). Shematski prikazi (а- с) pokazujи ekspresijи c-Fos proteina и SC glodara koji se gnezde и nefamilijarnoj sredini izlozenoj razli6tim eksperimentalnim иslovima. Na levoj strani sи prikazane oblasti aktivacije odredene posredstvom obelefavanja c-Fos proteina i relativna jacina c-Fos oЬelefavanja (Ьrој c-Fos pozitivnih neurona). U sredini је prikazana ekspresija c-Fos proteina videna na presecima kroz rostralni SC. Na desnoj strani је shema koja pokazuje polofaj SC и mozgu glodara. DpG - dиboki sivi sloj, /С - inferior kolikuli, InGi - unи~nji podsloj intermedijemog sivog sloja i InGo - spolja5nji podsloj intermedijemog sivog sloja. Glodari koji sи koristili МР za odredivanje poloZзja gnezda и novoj sredini imali sи povecanи ekspresUи c-Fos proteina и specifiCnim regionima SC и odnosи na glodare koji sи izvclavali isti zadatak и za5ticenoj sredini и kojoj је jacina МР Zemlje smanjena oko 150 риtа. Pored toga, ekspresija c-Fos proteina и SC је bila vi~e lokalizovana kod glodara koji sи pravili gnezda и konstantnom МР, и odnosи na one koji sи tokom pravljenja gnezda bili izloreni promenljivom МР jaeine kao ~to је Zemljino i cijije pravac vi~e риtа okrenиt za 120° (magnetni sever је pomeran od 360° do 240° i nazad). 9 Uvod Rezultati studija koje su uradili Кirschvink i sar. (1992) i nesto kasnije Schultheiss-Grassi i Dobson (1999) pokazali su prisustvo feromagnetnog materijala u razlicitim tkivima mozga ljudi. Identifikovani su minerali iz familije magnetit (Fe304) - maghemit (Fe20 3) , cija је morfologija i struktura kristala slicna mineralima nadenim kod magnetotakticnih bakterija i riba. Koriscenjem razlicitih tehnika procenjeno је prisustvo minimum 5 miliona kristala pojedinacnog domena ро gramu za vecinu mozdanog tkiva i > 1 оо miliona kristala ро gramu za mozdane ovojnice (pia i dura mater), rasporedenih u grupama od 50 do 100 cestica (Кirschvink i sar., 1992). Iako su kod veCine organizama ove magnetne cestice odgovome za magnetorecepciju, Ьiogeni magnetit ilili maghemit prisutan u mozgu ljudi verovatno nije povezan samo sa sposobnoscu da osete geomagnetno polje (Schultheiss-Grassi i Dobson, 1999). 1.2. Uticaj spoljasnjih magnetnih polja па orijentaciju i motorno ponasanje bioloskih sistema razlicitog nivoa organizacije Svi organizmi su izlofeni geomagnetnom polju i verovatno postoji adaptacija na geomagnetno okruZenje tokom evolucije. Jedan od prvih dokaza interakcije МР Zemlje i zivih organizama do8ao је iz studija u kojima se pratila orijentacija ili kretanje Zivotinja u prostoru. 1.2.1. Evolutivno niZi Ьioloski sistemi NajЬolji dokaz za uticaj МР na smer kretanja zivotinja potice od bakterija. Frankel i Blakemore (1989) su pokazali da se bakterije orijentisu i migriraju dиZ linija МР Zemlje, kao i da vestacka МР menjaju njihovu orijentaciju. Ovi magnetotakticni odgovori bazirani su na unutarcelijskim feromagnetnim materijalima sastavljenim od 20-25 pojedinacnih kristala Fe30 4 nazvanih magnetozomi, koji cine celiju stalnim magnetnim dipolom i pasivno је dovode u isti pravac sa smerom МР Zemlje. Pored bakterija, razliciti tipovi elektromagnetnih polja uticu na fiziologiju, pona8anje i lokomotomu aktivnost protozoa. Rosen i Rosen (1990) su pokazali da izlaganje paramecUuma (Paramecium) relativno jakom konstantnom МР (0.126 Т) dovodi do smanjenja i narиSavanja · kretanja, koje је posledica promena u jonskoj ravnoteZi. Pored toga, slabo (0.5 mT) horizontalno МР remeti pokretljivost i prostomu orijentaciju flagelata Volvox aureus (Palmer, 1963). U seriji studUa, Brown (1962, 1966, 1971) i Brown i Park (1965а,Ь) su ispitivali efekte МР na orijentaciju negativno fototaksicnih planarija (Dugesia dortocephala) od izvora svetlosti. Pokazano је da planarije odgovaraju na horizontalnu komponentu МР, pri cemu ponistavanje i 10 Uvod menjanje МР (0.005 - 0.4 mT) menja smer kojim se planarija krece od izvora svetlosti. Takode, ocigledan је i kasniji efekat МР na orijentaciju prisutan u toku 20 - 30 min nakon sto је stimulus uklonjen. Pored toga, Brown i Park (1965а,Ь) su pokazali da postoje mesecne i sezonske promene odgovora planarije na МР. Za kisne gliste (Lumbricus terrestris) је pokazano da ispoljavaju relativno dobro definisane ritmicne aktivnosti i reflekse sklanjanja od svetlosti. Кisne gliste odrZavane u prisustvu МР Zemlje pokazuju dnevnu ritmicnu osetljivost na svetlost, sklanjajuCi se b!Ze nocu nego u toku dana (Bennett i Huguenin, 1969). Medutim, ovaj odgovor izostaje kada se neutralizuje МР Zemlje. RaCic Talitrus sa/tator se orijentise u potpunom mraku uz pomoc МР Zemlje, skakanjem u smeru koji је paralelan liniji obale iz koje dolaze (Arendse, 1978). Ponistavanje lokalnog geomagnetnog polja primenom Helmholcovih kalemova ima za posledicu nasumicnu orijentaciju ovih rakova. Medutim, kada је prirodno polje kompenzovano i pomereno, zivotinje su se orijentisale prema vestackom polju (Arendse i Кruyswijk, 1981 ). Slicni odgovori u pogledu orijentacije na prirodna i izmenjena МР nadeni su kod nocne amfipode ( Orchestia cavimana) i morskog raka (Panulirus argus) (Arendse i Barendregt, 1981; Lohmann, 1985). Efekti МР na pona8anje pokazani su u mnogo vise detalja kod medonosne pcele (Apis mellifera) nego kod Ьilo koje druge vrste (Towne i Gould, 1985). Za peele је poznato da koriste male pravilne dnevne cikluse u jacini МР Zemlje za orijentaciju u vremenu. Na osnovu toga, one mogu Ьiti obucene da dodu do izvora hrane u odredeno vreme. Martin i Lindauer (1977) su na8li da stavljanje kosnice u polje koje је 1 О puta јаее od normalnog eliminise ovaj osecaj kod peela. U seriji eksperimenata Walker i Bitterman (1985, 1989а,Ь,с) su demonstrirali sposobnost peela da osete i odgovore na ekstremno male promene intenziteta МР, za sta је neophodno da se krecu (Walker i sar., 1989). Pored pcela, i kod drugih vrsta insekataje pokazan uticaj МР na pona8anje i orijentaciju (Picton, 1966; Baker i Mather, 1982; Baker, 1987; Rickli i Leuthold, 1988). U laboratorijskim uslovima, Prolic i sar. (2003) su pokazali da izlaganje ENF-МP (50 Нz, 2 mT) utice na motomu aktivnost mU.Zjaka i zenki striZibube (Morimus funereus). Veliki broj podataka ukazuje da gastropode koriste geomagnetno polje za orijentaciju. Tako su Brown i Webb (1960) i Brown i sar. (1960) pokazali da pU.Z (Nassarius obso/etus) pravi razliku izmedu dva slaba МР, ali i da pokazuje dnevne i mesecne ritmove orijentacije. Rezultati na mesecne promene u efektima МР (0.025 - 1 Uvod Caldwell, 1967). Lohmann i Willows (1987) su pokazali da morski mekusac (Tritonia diomedea) pokazuje ciljanu orijentaciju tela kada se testira u uslovima МР Zemlje, а da ponistavanje horizontalne komponente geomagnetnog polja ima za posledicu njegovu nasumicnu orijentaciju. 1.2.2. Evolutivno visi Ьioloski sistemi Nalazi do kojih se doslo u mnogim studija nedvosmisleno ukazuju na sposobnost riba da osete i odgovore na magnetne stimuluse. Tako se aktivnost evropskihjegulja (Anguilla anguilla) i atlantskog lososa (Salmo salar) povecava kao odgovor na povecanje МР (Branover i sar., 1971; Varanelli i McCleave, 1974; Smith, 1985). U drugim studijama, tune (Тhunnus a/Ьacares) se pojedinacno obucavaju da prave razliku izmedu dva intenziteta geomagnetnog poUa (Walker, 1984). Za razliku od ovih pozitivnih rezultata, dnevno-nocni ritmovi lokomotome aktivnosti odraslih jedinki atlantskog lososa (Salmo salar) i americkih jegulja (Anguil/a rostrata) nisu podloZni promenama pod uticajem slabih МР (Richardson i sar., 1976). lako su raniji nalazi ukazali na osetljivost zlatnih riЬica (Carassius auratus) na МР, Walker i Bitterman (1986) nisu Ьili u mogucnosti da poka.Zu Ьilo kakav odgovor ovih riba na МР. Vodozemci su takode osetljivi na magnetne stimuluse i mogu koristiti МР Zemlje kao signal za orijentaciju i navigaciju. Prvi neposredni dokaz orijentacije vodozemaca uz pomoc МР Zemlje doЬijen је od pecinskog daidevnjaka (Eurycea lucifuga) (Pblllips, 1977). Ovaj daidevnjak, koji zivi u neosvetljenim pecinskim sredinama, oseea МР Zemlje i pokazuje nauceni usmereni odgovor koristeci geomagnetno polje kao signal za orijentaciju. Najdetaljnija informacija о ulozi МР u procesima orijentacije i navigacije vodozemaca potice iz istraiivanja daidevnjaka koji naseljava istocne oЬlasti Amerike (Notophthalmus viridescens) (Pblllips, 1986, 1987; Phillips i Borland, 1992Ь). Za razliku od vodozemaca, mali broj studija posveeen је uticaju МР na gmizavce. Kopnena komjaca (Terrapene carolina) koristi МР Zemlje za orijentaciju i moze se obuCiti da se orijentise u pravcu istok - zapad, pri cemu pricvrscivanje magneta na njen oklop ponistava ovu sposobnost (Мatbls i Moore, 1988). Morska komjaea (Caretta caretta) i aligatori (Alligator mississippiensis) su takode sposobni da se orijentisu uz pomoc МР Zemlje (Rodda, 1984; Lohmann, 1991; Rodda i Pblllips, 1992), dok za zmije jos uvek nisu uradena ova istraZivanja. lako vecina rezultata koji ukazuju na koriscenje magnetne informacije za orijentaciju ptica potice od vrsta koje migriraju nocu, nekoliko dnevnih migratomih vrsta takode odgovara na МР Zemlje (Southem, 1978). Jedina vrsta koja ne migrira i ciji је odgovor na МР dobro ispitan 12 Uvod је golub (Columbla livia). Poznato је da golubovi koriste geomagnetno polje za orijentaciju u prostoru i da na ovu sposobnost uticu prirodne promene МР Zemlje (Walcott, 1978; Kowalski i sar., 1988; Lednor i Walcott, 1988), kao i magneti eksperimentalno postavUeni na njihova tela (Кeeton, 1971; Walcott i Green, 1974; Larkin i Keeton, 1978), sto posebno dolazi do i:zraZaja kada је oЬlacno vreme. Burda i sar. (1990), а kasnije Кimchi i Terkel (2001) su u svojim istraZivanjima ukazali na sposobnost slepog kuceta (Spalax ehrenbergi) da oseti i koristi МР Zemlje za orijentaciju u prostoru. Za razliku od vodozemaca i ptica, ovaj odgovor ne zavisi od stimulacUe svetlom. Slicni rezultati su doЬijeni kod miseva Apodemus sylvaticus i Peromyscus leucopus (Мather i Baker, 1981; August i sar., 1989). Magnetna oseЩivost је takode zapa.Zena kod kitova i delfina, а dovodi se u vezu sa magnetnim materijalom nadenim u glavi ovih zivotinja (Zoeger i sar., 1981; Fuller i sar., 1985; Юinowska, 1985; Кirschvink i sar., 1986; Walker i sar., 1992). Kod njih је jedino magnetorecepcija posredstvom magnetnih cestica pojedinacnog domena dovoljno osetljiva da registruje male promene МР Zemlje (Кirschvink i Gould, 1981; Yorke, 1981). Od davnina је poznato da moreplovci koriste orijentaciju sever - jug prirodnog geomagnetnog polja za navigaciju. Pretpostavljeni su razliciti mehanizmi koji Ьi mogli Ьiti u osnovi ove sposobnosti ljudi, а jedan od njih је i uticaj geomagnetnog polja na vizuelni sistem, za koji је jos ranije pokazano da ima ulogu u magnetnoj orijentaciji nekih vrsta zivotinja (Phillips i Borland, 1992а; Phillips i Sayed, 1993; Wiltschko i Wiltschko, 2001). U seriji eksperimenata koji su usledili poslednjih godina, registrovan је uticaj promene pravca i jacine geomagnetnog polja na osetljivost vizuelnog sistema ljudi (Тhoss i sar., 1999, 2002; Тhoss i Bartsch, 2003). Potvrda da su zapa.Zeni efekti specificni za vizuelni sistem је izostanak uticaja geomagnetnog polja na osetljivost slusnog sistema ljudi u identicnim uslovima. Legros i Beuter (2005) i Legros i sar. (2006) su ispitivali uticaj МР od 50 Нz na motomo pona8anje i motomu kontrolu kod ljudi. Rezultati njihovih istra.Zivanja ukazuju da МР mogu imati zakasneli efekat na pona8anje ljudi koji oCigledno nije patoloski. Pored toga, relaksirajuCi efekat ENF-МP na motomu kontrolu ima za posledicu smanjenje intenziteta posturalnog tremora. Pored eksperimenata u kojima se prati uticaj МР na orijentacUu glodara u prostoru, veliki broj studija је posvecen ispitivanju efekata МР razlicitih karakteristika na motomo pona5anje ovih zivotinja u laboratorijskim uslovima, sto је Ьilo i predmet na8ih istraZivanja. Jos ranije su Persinger i sar. (1972) pokazali znaeajno povecanje aktivnosti pacova koji su Ьili izlozeni МР (0.5 Нz, 0.3- З mT). Kasnije su Ossenkopp i Ossenkopp (1983) na51i da izlaganje МР (0.5 Нz, 13 Uvod 0.05 - З mT) povecava aktivnost samo mladih mиZjaka pacova, ali ne i mladih zenki pacova. Rudolph i sar. (1985) su prateci efekte МР (50 Нz, 0.04 mT) uocili povecano uspinjanje i u manjoj meri kretanje pacova u tok:u dana, dok је nocu efekat izostao. Za razlik:u od ovih istraiivanja, druge studije su pokazale da izlaganje miseva pulsnom ENF-МP i rotirajucem МР (0.5 Hz, 0.15 - 9 mT, ЗО min) smanjuje eksploratomo pona8anje, odnosno lokomotomu hiperaktivnost izazvanu stresom (Kavaliers i Ossenkopp, 1986; Choleris i sar., 2001). U slicnim eksperimentima, Persinger (1969) је izlagao polju (50 Нz, 0.3 -З mT) skotne zenke pacova i na8ao smanjenu aktivnost potomstva koje је Ьilo staro 27 dana u poredenju sa kontrolnim zivotinjama. U literaturi postoje dokazi i о izostanku efekta МР na pona8anje glodara. Tako su studUe Davis i sar. (1984) otkrile odsustvo promena u pona8anju miseva izlaganih konstantnom (1.5 Т, 72 h) i promenljivom (60 Нz, 1.65 mT, 72 h) МР, kao i istraiivanja Trzeciak i sar. (1993) u kojima nisu registrovane promene u pona8anju pacova nakon dugotrajnog izlaganja elektromagnetnom (50 Нz, 18 mT) i snamom konstantnom polju (0.49 Т). Pesic i sar. (2004) su pokazali da izlaganje ENF-МP (50 Нz, 6 mT, 15 min) nema uticaja na motomu aktivnost, ali da modifik:uje lokomotorni odgovor izazvan primenom psihostimulansa amfetamina (АМРН). 1.3. Motorno ponasanje Motomo pona8anje sloienih organizama је posledica uskladene i integrisane aktivnosti vise mozdanih struktura (slika 7, Ghez i sar., 1991). U hijerarhiji struktura koje kontrolisu motomu funkciju, na najvisem nivou se nalazi kora velikog mozga. SledeCi niZi nivo kontrole је mozdano staЬio koje obuhvata prodиZenu mozdinu, pons i srednji mozak, а najnizi kicmena mozdina, koja ima fundamentalnu ulogu predstavlja mesto konacne odluke voljnih 1 refleksnih radnji. Dve subkortikalne strukture, bazalne ganglije i mali mozak, takode imaju vamu ulogu u oblikovanju i finaliziranju motomog odgovora. Nijedna od ovih struktura ne salje aksone direktno u kicmenu mozdinu, vec svoj uticaj ostvaruju putem veza sa motomim oЬlastima kore velikog mozga i uskladivanja aktivnosti mozdanog staЬla i kortikospinalnog sistema. Slika 7. Nivoi kontrole motomog pon~anja http://web.lemoyne.edu/-hevern!psy340/grapblcs/tracts.ventromedial.2.jpg 14 Uvod 1.3.1. Anatomsko-funkcionalna osnova motornog ponasanja Opsti plan grade centralnog nervnog sistema (CNS) је и osnovi isti kod svih sisara. Motorni korteks је izraz za regione kore velikog mozga koji imajи иlogu и planiranjи, kontroli i izvodenjи voljnih motornih pokreta. Motome oЬlasti sи smestene и оЬе hemisfere kore velikog mozga, pri сеmи motome oЬlasti desne hemisfere kontrolisи levu stranи tela i obmиto. OЬlasti kore velikog mozga koje se oЬicno smatrajи motomim sи primarni motorni korteks, suplementarna motorna oЬiast i premotorni korteks (slika 8). Pored njih, motome fimkcije se pripisиjи i posteriornom parijetalnom i dorzolateralnom prefrontalnom korteksu. Primarni motorni korteks је smesten и frontalnom lobusи dиZ precentralnog girusa i ima ulogu и stvaranjи nervnih impulsa koji kontrolisи izvodenje pokreta. Premotorni korteks se takode nalazi и frontalnom 1оЬиsи mozga neposredno ispred primamog motomog korteksa i ukljиcen је и planiranje pokreta zasnovanih na spolja8njim (posebno vizuelnim) znacima. Sиplementama motorna oЬlast koja se nalazi iznad premotome oЬlasti је odgovoma za planiranje 1 koordinacijи slozenih pokreta kao sto sи oni koji zahtevajи оЬе ruke. ОЬе ove oЬlasti saljи informacije na primarni motorni korteks i na motome regione mozdanog staЬla. Posteriorni parijetalni korteks Је ukljиcen и pretvaranje vizuelne informacije u motome komande, а dorzolateralni prefrontalni korteks u donosenje odluke Suplementami motomi korteks Prefrontalni korteks Primaшi motomi korteks Centralni sulk:us · Posteriomi parijetalni korteks koji се se voljni pokreti izvrsiti и skladи Slika 8. Motome oЬlasti kore velikog mozga coveka http://cti.itc.virginia.edu/-psyc220/kalat/JК237.fig8.8.principle area.jpg sa instrukcijama visih mozdanih centara. Iz motornih oЬlasti kore velikog mozga informacija se salje direktno na kicmenи mozdinи ili na bazalne ganglije i mali mozak, odakle se ponovo vraca na koru velikog mozga posredstvom talamиsa. Vlakna kortikospinalnog (piramidalnog) trakta predstavljajи glavni риt za kontrolи voljnih pokreta kod ljиdi. Ova vlakna poticи od neurona primamog motomog korteksa, sиplementame motome oЬlasti i premotomog korteksa i spиStajи se celom dиZinom mozdanog staЬla. Vecina njih (85%) na granici izmedи prodиZene i kicmene mozdine prelazi na sиprotnи stranи tela i nastavlja da se spиsta kontralateralno kao lateralni kortikospinalni trakt do а motoneurona. Preostala vlakna (15%) nastavljajи da se spиStajи ipsilateralno kao ventralni 15 Uvod kortikospinalni trakt. Pored piramidalnog postoje i ekstrapiramidalni putevi koji polaze od subkortikalnih jedara kao sto su kaudalno jedro, putamen, globus palidus (GP), supstancija nigra (SN), talamus, crveno i subtalamicno jedro. Njihova osnovna funkcija је kontrola polozaja i ravnoteze, grubih pokreta proksimalnih misica i koordinacija pokreta glave, vrata i ociju u odgovoru na vizuelne znake. Bazalne ganglije su glavna subkortikalna jedra koja klasicno ukljucuju kaudalno jedro i putamen, koji se zajedno nazivaju ~:;~~"--Kaudalnojedro strijatum 1 jednu od glavnih -+ ........ --Talamus projekcionih oЬlasti strijatuma, globus ~---.!~ f.tiii!~.,._--Subtalamicnojedro palidus ili palidum (slika 9). Kod Supstancija nigra primata, palidum је podeljen na spoljasnji ili lateralni palidum (GPs), koji odgovara GP kod pacova i unutrasnji segment ili medijalni palidum (GPu), koji odgovara Slika 9. Struktura bazaJnih ganglija coveka http:/ /cti.itc. virginia.edu/-psyc220/kalat/JК246.fig8.15.basa1 ganglia.jpg entopedunkularnom ј edru pacova. Centralna komponenta је strijatum. Dorzalni deo strijatuma, koji zauzimaju kaudalno jedro i putamen, ima aferentnu ulogu u bazalnim ganglijama. Ventralni deo strijatumaje povezan sa limЬickim strukturama, а cine ga nukleus akumbens i ventromedijalni deo kaudalnog jedra i putamena. Zbog Ьliske anatomske i funkcionalne veze sa strijatumom i GP, supstancija nigra i suЬtalamicno jedro se takode smatraju integralnim delom bazalnih ganglija. Supstancija nigra, koja morfoloski pripada srednjem mozgu, а funkcionalno bazalnim ganglijama, је podeljena na dve zone: ventralna Ьleda zona- pars retikulata (SNr) i dorzalna pigmentisana zona- pars kompakta (SNc), koja sadrzi dopaminergicke neurone cija tela sintetisu melanin. Posto imaju identicnu citolosku gradu, GPu i SNr se mogu smatrati jednom strukturom arЬitrarno podeljenom unutra8njom kapsulom, sa koje potice najveci broj eferentnih projekcija bazalnih ganglija. Neuroni strijatuma primaju mnogobrojne sinapticke ulaze poreklom od razlicitih izvora (slika 1 0). Aferentne glutamatergicke projekcije iz gotovo svih oЬlasti kore velikog mozga i intralaminarnih jedara talamusa predstavljaju najvaZniji izvor ekscitatornih aminokiselina, dok nigrostrijatalni dopaminergicki put i unutraSnja kбla snabdevaju strijatum dopaminom, acetilholinom, y-aminobutemom kiselinom (GАВА), azot oksidom i adenozinom (GrayЬiel, 16 Uvod 1990; Wichmann i DeLong, 1996). Pored toga, projekcije iz dorzalnog jedra rafe, koje se nalazi u retikularnoj formaciji mozdanog staЬla, oЬezbeduju serotonergicku inervaciju strijatuma (Вonvento i sar., 1992). Zajednickim delovanjem navedenih neurotransmiterskih sistema regulise se sinapticka transmisija unutar ovog jedra i odreduje izlazni signal iz strijatuma na druge strukture bazalnih ganglija. Gu STRIJAТUМ Кicmena mozdina KORTEКS Glu striozom matriks GАВА Supstanca Р lu а ~.шЈ А GPu/SN, ' GАВА Ј Slika 10. Shematski prikaz aferentno- eferentnih projekcija razlicitih struktura bazalnih ganglija. Сео sistem је organizovan ро principu "levka", gde је korteks ulazna struktura, strijatum srednja, а GPu, GPs, ventralni palidum i SNr izlazne strukture (Кеmр i Powell, 1970). Striozom i matriks su odeljci strijatuma kod pacova, koji se mogu razlikovati primenom Ьiohemijskih markera. Legenda: ACh - acetilholin; DA - dopamin; D1 i D2 - tipovi receptora za dopamin; GАВА - y-aminobutema kiselina; Glu - glutamat; GPs- spoljмnji segment globus palidusa; GPu - unutrМnji segment globus palidusa; М1 i Мt - tipovi muskarinskih receptora za acetilliolin; SNc- supstancija nigra pars kompakta; SNr- supstancUa nigra pars retikulata; SТN - subtalamicno jedro http:l/edoc.hu-berlin.de/dissertationen/pruess- harald-2004-03 15/НTМL/Pruess html 5afaeaef.jpg Od svih neurona u strijatumu pacova, vise od 90% predstavljaju trnoliki neuroni srednje velicine (Кawaguchi i sar., 1995), koji koriste GAВA-u kao neurotransmiter i projektuju se na izlazne strukture bazalnih ganglija, GPu i SNr (Wilson i Groves, 1980; Kawaguchi i sar., 1990). Ovi neuroni se mogu podeliti u dve jednake podgrupe na osnovu peptida koje sadr:Ze i oЬlasti na koju se projektuju (Kawaguchi i sar., 1990; Gerfen, 1992). Pored GАВА-е, jedna polovina izlaznih neurona sadr:Zi supstancu Р i dinorfin i projektuje se direktno na izlazne strukture, а druga polovina izlaznih neurona sadr:Zi enkefalin i projektuje se indirektno na ove strukture preko GPs i subtalamicnog jedra (slika 10). Gerfen i sar. (1990) su pokazali da vecina neurona direktnog puta (strijatonigralni - strijatoentopedunkularni) eksprimira dopaminske Dt, а veCina neurona indirektnog puta (strijatopalidalni) dopaminske D2 receptore. Preostali neuroni strijatuma su veliki holinergicki interneuroni i netrnoliki GAВAergicki neuroni srednje velicine (Кawaguchi i sar., 1995). Holinergicki interneuroni su glavni izvor acetilholina u strijatumu i 17 Uvod imaju ulogu u prenosu informacija od dopaminergickih aferenata na trnolike GAВAergicke neurone. Izlazne strukture bazalnih ganglija (GPu i SNr) salju eferentne GAВAergicke projekcije na talamus, sa kojeg se zatim glutamatergicki neuroni projektuju na koru velikog mozga (slika 1 0). Na ovaj nacin se talamus umece u kruZni sistem veza koje postoje izmedu kore velikog mozga i bazalnih ganglija. Do sada је opisano pet kruZnih puteva koji pocinju iz nekoliko odvojenih ali funkcionalno srodnih oЬlasti kore velikog mozga, prelaze specificne delove bazalnih ganglija i talamusa i projektuju se nazad na jednu od oЬlasti kore velikog mozga (Alexander i sar., 1986). NajЬolje opisani kruZni put povezuje senzorimotome i premotome oЬlasti korteksa sa motomim, premotornim i suplementamim motomim korteksom posredstvom ventralnih prednjih (V А) i ventralnih lateralnih (VL) jedara talamusa. Aktivacija direktnog puta ima za posledicu ekscitaciju talamokortikalnih kбla i olakSaпo kortikalno otpocinjanje pokreta, dok aktivacija indirektnog puta dovodi do inhibicije talamokortikalnih kбla. Uticaj nigrostrijatalnih dopaminergickih aferenata је da pojacaju transmisiju kroz direktni put i suprimiraju istu kroz indirektni put. Stoga је efekat dopamina da ројаеа pozitivnu povratnu spregu na motome oЬlasti kore velikog mozga i olaksa voljne pokrete. Bazalne ganglije uspostavljaju eferentne veze i sa SN, koja se takode projektuje na talamus, ali i na superior kolikule. Vlakna koja poticu iz malog mozga projektuju se na crveno jedro, а zatim na talamus i to na ista onajedra (V А i VL) na koja se projektuju i eferentni GAВAergicki neuroni GPu i SNr (Sakai i sar., 1996). Pretpostavka је da se u talamusu, odnosno u tim jedrima, na osnovu nervnih impulsa koji poticu iz bazalnih ganglija i malog mozga vrse integracioni procesi vezani za motoriku. Bazalne ganglije uspostavljaju veze i sa strukturama mozdanog staЬla i blpotalamusa, cija stimulacija dovodi do posturalnih promena i lokomotornih pokreta (slika 11). Slika 11. Lokomotorni regioni moZdanog staЬla i blpotalamusa ma~ke. Legenda: CFN - kuneiformno jedro; IC - inferior kolikuli; LНА lateralna oЬlast blpotalamusa; МLR - mezencefali~ni lokomotorni region; NRGC gigantocelularno retikularno jedro; NRМC - magnocelularno retikularno jedro; NRTP - tegmentalno pontinsko retikularno jedro; PLS - pontomedularni lokomotomi snop; PPN - pedunkulopontinsko tegmentalno jedro; RN - crveno jedro; SC - superior kolikuli; SLR - subtalami~ni lokomotomi region; SN- supstancija nigra httj:J ://www.nada.kth.se/-jeanette/КТН-2006-handouts-locomotion.pdf 18 Uvod Povezanost bazalnih ganglija i mezencefalicnog lokomotornog regiona (МLR), koji se nalazi u zadnjem delu srednjeg mozga, doprinosi obja5njenju izvesnih fizioloskih i patoloskih fenomena pona5anja. Dva jedra srednjeg mozga, za koja se smatra da su glavne komponente МLR, su kuneiformno jedro i pedunkulopontinsko tegmentalno jedro (PPN). Radovi na intak:tnim mackama su pokazali da elektricna stimulacija kuneiformnog jedra znacajno povecava lokomotomu brzinu (Мori i sar., 1989), dok је uloga PPN u inicijaciji lokomocije pretpostavljena na osnovu njegovih veza sa limЬickim strukturama i bazalnim ganglijama (Skinner i Garcia-Rill, 1990, Garcia-Rill, 1991; Mogenson i sar., 1993; Skinner i Garcia-Rill, 1993; Inglis i Winn, 1995). Na neurone PPN stifu projekcije iz motome kore, subtalamicnog jedra i centralnog medijalnog jedra talamusa, sto ga prema shvatanju Garcia-Rill i Skinner (1985) stavlja u strategijski polofaj iz koga utice na ulazne projekcije u strijatum i tako V!Si ulogu znacajnog regulatora jedra u koordinaciji lokomotomih funkcija bazalnih ganglija. Nishodna vlakna МLRJPPN se zavrsavaju na retikularnim jedrima produiene mozdine i na rafe jedrima ponsa, na neuronima koji cine pontomedularni lokomotorni snop (PLS) koji se spиSta u kicmenu mozdinu. Pored МLRJPPN, postoji i direktna projekcija od lateralnog hipotalamusa na retikulospinalni sistem iz oЬlasti oznacene kao suЬtalamicni lokomotorni region (SLR) (Sinnamon i Stopford, 1987). Aksonski snopovi koji poticu iz ove oЬlasti krecu se kroz ventralni deo srednjeg mozga i odvojeni su od МLR sistema. Ventralni tegmentum ili ventralna tegmentalna oblast (VTA) nalazi se u srednjem mozgu Ьlizu SN i crvenog jedra i predstavlja jos jednu oЬlast mozdanog staЬla cija stimulacija dovodi do lokomotomih pokreta. Ova oЬlast је bogata dopaminergickim i serotonergickim neuronima i deo је dva glavna dopaminergicka puta: mezolimЬickog koji povezuje VTA sa nukleus akumbensom i mezokortikalnog koji povezuje VTA sa kortikalnim oЬlastima u frontalnim lobusima. 1.3.2. Osnovni oblici motornog ponasanja Spontana lokomotorna aktivnost је primer jednostavnog, centralno posredovanog pona5anja, koje је podlo:lno farmakoloskoj manipulaciji. ZЬog toga је procena lokomotome sposobnosti zivotinja va:lna komponenta mnogih studija u kojima se prati motomo pona5anje. Ovo se posebno odnosi na istra:livanja u kojima se koriste animalni modeli bolesti kao sto su ostecenje kicmenog stuba i mo:ldani udar, gde је oporavak lokomocije osnovna svrha eksperimentalne terapije (Goldstein, 2003; Jolkkonen i sar., 2003; Ballermann i sar., 2006). Pored toga, izvrsenje mnogih komplikovanijih zadataka u laboratorijskim uslovima zavisi od 19 Uvod kretanja pacova ро povrsini podloge i njegove sposobnosti da koristi ekstremitete. Za produkcUu funkcionalne lokomocije, lokomotoma kбla u kicmenoj mozdini zahtevaju dovode iz dva vaina izvora. Prvi izvor је segmentalna aferentna povratna sprega poreklom od nekoliko receptora rasporedenih celom duZinom ekstremiteta, а drugi supraspinalni dovodi iz mozdanog staЬla i kore velikog mozga. Spontano podizanje na zadnje noge Ш uspravljanje predstavlja motomo ponaSaпje koje se cesto moze videti kod zivotinja kao odgovor na izlaganje novoj sredini (Semenova i sar., 2001; Wesierska i sar., 2003; Christensson i Garwicz, 2005; Anderson i sar., 2006). Za ovo ponasanje se smatra da је odraz motome aktivnosti i eksploratomog pona8anja (Archer, 1973; Rotta i sar., 1988; Mohammed i sar., 1990; Crusio, 2001). Studije sa lezijama su pokazale daje hipokampus Ьitna komponenta nervnog sistema odgovoma za kontrolu uspravljanja u novoj sredini (Lever i sar., 2006). ZЬog toga је uspravljanje jedan od nekoliko parametara koji se koristi za procenu ucenja i pamcenja u studijama poпaSanja. Stereotipno ponasanje ili stereotipija predstavlja motomo pona8anje koje se ponavlja bez ocigledne svrhe Ш funkcije (Powell i sar., 1999). Cesto se moze videti kod Zivotinja zatvorenih u malom prostoru koji im ne omogucava normalno ponaSaпje, ра se i opisuje kao «pona8anje koje nagovestava neprirodnu sredinu» pre nego kao neprirodno pona8anje. Ovi oЬlici ponaSaпja se nekada mogu smanjiti Ш ukloniti oЬogacivanjem sredine u kojoj se Zivotinja nalazi ili drZanjem socijalnih Zivotinja kao Sto su primati sa drugim clanovima njihovih vrsta. Pored spontane stereotipije, postoje i stereotipna pona8anja izazvana klinicki i eksperimentalno putem nekog farmakoloskog sredstva ili lezije (Lyon i Robbins, 1975; Owens i sar., 1982; Јоусе i lversen, 1984; Albin i sar., 1989; Tumer, 1997). Ona su posledica disfunkcije bazalnih ganglija, taCnije izmenjene funkcije dorzalnog strijatuma koja је uzrok smanjene inhiЬicije ponaSaпja. Prirodno biScenje glodara se sastoji od slozenih nizova pokreta koji ukljucuju timarenje, oЬlizivanje i cesanje, а u cilju ciseenja i odrZavanja krzna i koze tela. Lako se uocava s obzirom da pacovi u budnom stanju provode i do polovine svog vremena u Ьiscenju (Вolles, 1960). Pored toga, moze se i izazvati kod laboratorijskih glodara u uslovima izlaganja novoj sredini i tada se opisuje kao stereotipija. Biscenje је model pona8anja pogodan za procenu funkcionalne organizacUe i neuronalnih mehanizama sekvenci kretanja. Berridge i sar. (1987) su pokazali da kljucnu ulogu u obavljanju ovih motomih sekvenci imaju bazalne ganglije. Mada se jos uvek ne znaju tacni mehanizmi i neuronalni putevi koji su odgovorni za rotaciono ponasanje, smatra se da је ono odraz disbalansa dopaminergickih mehanizama 20 Uvod (Costall i sar., 1976). Rotacije u pravcu lezirane strane su glavna karakteristika Zivotinja sa unilateralnim ostecenjem nigrostrijatalnog sistema i nepovredenih zivotinja sa ociglednom razlikom u kolicini dopamina izmedu dve hemisfere mozga. Kod zivotinja se rotaciono pona8anje moze farmakoloski izazvati primenom razlicitih supstanci koje modulisu dopaminergicku neurotransmisiju, kao sto su 6-hidroksidopamin koji prouzrokuje lezije dopaminergickih neurona u SN i1i apomorfin koji је agonist dopaminskih D2 receptora (Ungerstedt i Arbuthnott, 1970; Ungerstedt, 1971а; Ungerstedt, 1971Ь). Dominantno rotaciono kretanje eksperimentalnih Zivotinja se moze izazvati i unilateralnom intranigralnom injekcijom GАВА-е i1i GАВА agoniste muscimola (Кaakkola i Kaariainen, 1980) i unilateralnom aplikacijom karbahola (agonist acetilholinskih receptora) u nukleus akumbens (Мoribe i sar., 2005). U оЬа ova slucaja se uoceni efekti pripisuju GAВAergickoj odnosno holinergickoj modifikaciji dopaminergicke neurotransmisije koja је u vezi sa rotacionim pona8anjem. Imobilnost Ш nepokretnost је privremeno stanje potpune motome inhiЬicije. U prirodi, imoЬilnost је deo antipredatorskog pona8anja i poslednje pomoeno sredstvo koje plen koristi da Ьi smanjio verovatnocu daljeg napada predatora (Кlemm, 1971; Monassi i sar., 1999). U laЬoratorijskim uslovima, imoЬilnost Zivotinja se moze izazvati razlicitim eksperimentalnim manipulacijama (De la Cruz i sar., 1990; Pellis i sar., 1990) i koristiti kao jedan od parametara u studijama pona8anja. Мnogi regioni mozdanog staЬla i bazalnog prednjeg mozga su umeSani u kontrolu imoЬilnosti. Jedan deo neuronalnih mehanizama ukljucuje nishodnu motomu inhiЬicjju, za koju је poznato da potice iz medijalne retikulame formacije. Modulatorni uticaji na ovu formaciju dolaze iz drugih delova mozga, pri cemu su najznaeajniji iz limЬickog sistema (strah potencira imoЬilni odgovor), neokorteksa (inhibira imoЬilni odgovor) i bazalnih ganglija (dopaminergicka Ьlokada u strijatumu doprinosi imoЬilnom odgovoru) (Кlemm, 2001). 1.3.3. Primena magnetnih polja u terapiji motomih poremeeaja kod ljudi Jedan od mnogobrojnih fizickih faktora koji se poslednjih godina koristi u terapijske svrhe је i magnetno polje. Barker i saradnici su 1985. godine razvШ neinvazivnu i Ьezbolnu metodu transkranijalne magnetne stimulacije (TMS) i na taj naein otvorili novo polje u istraZivanju motome kontrole i funkcije kore velikog mozga (Barker i sar., 1985). Ova metoda је zasnovana na principu da promenljivo МР indukuje elektricnu struju unutar prostora kroz koji prolazi. Efekti ТМS zavise od nacina stimulacije koji moze Ьiti pojedinacnim stimulusima, parovima stimulusa razdvojenih razlicitim intervalima (na istu ili nekoliko oЬlasti mozga) ili nizovima ponovljenih stimulusa razliCite frekvencije (repetitivna ТМS Ш rTMS). Pojedinaeni 21 Uvod stimulusi prouzrokuju izazvane motome potencijale koji imaju klinicki znacaj i slиZe u dijagnosticke svrhe. Sa druge strane, rTMS koja је prvoЬitno razvijena za mapiranje i merenje funkcionalnosti mozga, sve vise se koristi kao pomocno sredstvo u terapijske svrhe. Slika 12. Primena TMS Elektromagneti se putem jake elektricne struje pulsno pale i gase neposredno iznad glave (slika 12). Kada ciljano МР izazvano rTMS prolazi kroz mozak, ono utice na nadrailjivost neurona kore velikog mozga u odredenim oЬlastima. Medutim, uoceni efekat nije ogranicen samo na koru velikog mozga nego se siri i na susedne subkortikalne strukture. Ovaj nalaz је dao osnovu za terapijsku primenu rTMS u slucЩevima patoloskog smanjenja ili povecanja kortikalne nadrailjivosti. http://www.tinnitusfonnula.com/infocenter/rtms head.gif Veliki broj klinickih studija ukazuje na mogucu primenu rTMS u terapUi razlicitih psihijatrijskih oboljenja kao sto su depresija (George i sar., 1999), manija (Grisaru i sar., 1998), post-traumatsko stresno oЬoljenje (Cohen i sar., 2004) i shizofrenija (Hoffman i sar., 2000). Do sada је glavni fokus istraiivanja rTMS u psihijatriji Ьiо ispitivanje terapijskih efekata stimulacije prefrontalnog regiona velikog mozga na simptome depresije (George i sar., 1999; Kahkonen i sar., 2005). Pored toga, poslednjih godina sve vise nalaza ukazuje na poboljsanje stanja pacijenata koji pate od Parkinsonove bolesti nakon tretmana rTMS (Мally i Stone, 1999; Siebner i sar., 2000). Postoje dve primene ovog metoda u Parkinsonovoj bolesti: povecanje kortikalne nadrailjivosti talamokortikalnog puta i modiftkacija subkortikalnog metabolizma kateholamina putem stimulacije kore velikog mozga. Neki istraiivaCi su pokuSali da koriste niskofrekventnu rTMS za lecenje epilepsije i drugih manifestacija kortikalne hiperekscitaЬilnosti, ali su uoceni efekti Ьili prolazni i kontradiktorni (Tergau i sar., 1999; Menkes i Gruenthal, 2000). Primena rTMS se pokazala korisnom i kod rehaЬilitacije pacijenata koji su doziveli mozdani udar, omogucavajuci im pobo]jsanje i brii oporavak motornih funkcija (Кim i sar., 2006). 22 CЩevi rada 2. CILJEVI RADA Na osnovu iznetih podatak:a о uticaju spolja.Snjih МР na Ьioloske sisteme postavljeni su sledeci ciljevi ovog eksperimentalnog rada: ~ Ispitati da li postoje znaeajni efekti promenljivog МР, u opsegu «komercijalnog» * dela spektra (ENF, 50 Нz, 0.5 mT), na razliCite parametre motomog pona.Sanja eksperimentalnih zivotinja nakon akutnog (1, з i 7 dana) i hronicnog (tokom celog zivota) izlaganja. ~ Ispitati da li izlaganje ENF-МP modulise motorni odgovor eksperimentalnih zivotinja izazvan primenom psihomotomog stimulansa i dopaminergickog agoniste amfetamina (1.5 mg!kg, i.p.) i ustanoviti karakter promena u zavisnosti od dиZine izlaganja. ~ S obzirom na ulogu dopamina i serotonina u kontroli motomog odgovora, analizirati aktivnost centralnih receptora za dopamin (Dt i D2) i serotonin (5-НТ2А) kod eksperimentalnih zivotinja akutno (1, З i 7 dana) i hronicno izlaganih ENF-МP. ~ Odrediti koncentraciju nukleotida (inozin 5'-monofosfat - IМР, ciklicni adenozin 5'- monofosfat- сАМР, adenozin 5'-trifosfat- АТР i guanozin 5'-trifosfat- GTP), koji na direktan ilili indirektan naein ucestvuju u signalnoj transdukciji, u odredenim regionima mozga eksperimentalnih zivotinja akutno (1, З i 7 dana) i hronicno izlaganih ENF-МP. •«komercijalni» deo elektromagnetnog spektra obuhvata ENF-МP koja su u ~irokoj primeni u domacinstvu, industriji i saobracaju i odnose se na frekvencije od 50 Нz u Evropi i 60 Нz u sevemoj Americi. 2З Materijal i metode 3. МATERIJAL 1 METODE 3.1. Eksperimentalne zivotinje U eksperimentima su korisceni mиZjaci pacova Wistar soja starosti 2.5 - 3.5 meseca i prosecne tezine od 250 do 350 grama, poreklom iz vivarijuma Instituta za Ьioloska istraZivanja «Sinisa Stankovic» u Beogradu. Zivotinje su gajene u grupama od 4 do 5 jedinki ро kavezu u standardnim uslovima (temperatura sobe 23 ± 2°С, relativna vlafuost 60 - 70%, cirkadijalni svetlosni rezim od ро 12 casova, hrana i voda ad libltum), koji su u skladu sa principima izlozenim u Vodicu za brigu i koriscenje eksperimentalnih iivotirifa, Nlli puЬlikacUa No 85-23. Na osnovu resenja Etickog komiteta Instituta za Ьioloska istraiivanja «Sinisa StankoviC>>, zivotinje su Ьile izlozene eksperimentalnom protokolu koji је u skladu sa propisanim etickim normama. 3.2. Sistem za izlaganje promenljivom magnetnom polju Promenljivo МР је generisano koriscenjem elektromagneta sa jezgrom od metalnih transformatorskih ploCica i precnikom od 9.5 cm. Elektromagnet је napajan sinusoidalnom strujom (50 Нz, 40 V, 4.5 А) i stvarao је homogeno ENF-МP sa gradijentom magnetne indukcije (slika IЗА). Maksimalna vrednost magnetne indukcije В = 8.9 mT је izmerena na polovima elektromagneta uz pomoc GM05 gausmetra (Нirsst) sa РТ2837 sondom. Frekvencija od 50 Hz је izabrana zato sto је u Evropi elektricno napajanje kucnih i drugih aparata sa ovom frekvencijom (dok u severnoj Americi elektricni aparati rade na frekvenciji od 60 Нz). А 10,----------------------------. р9 Е 8 '-" ~ 7 ....... ] 6 ::s "О 5 ·= ~ 4 s;:: ~ 3 s;:: ~ 2 ~ 1 o.g ~=:;:::::::;::::::=:;:=:;:::::::;::::::;:::::::i:::~IC2:::2::Q::!Q::I:I:::::Q:~ о 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 Rastojanje od pola e\ektromagneta (cm) в 2 3 2 4 Slika 13. Promene gradijenta magnetne indukcije (А) i shematski prikaz sistema za izlaganje ENF-МP (В) 1 - kavezi sa ~ivotinjama; 2 - polovi magneta sa magnetnim jezgrom od gvobla; 3 - namotaji; 4 - linije magnetnih sila. Crvena strelica pokazuje vrednost magnetne indukcije (В = 0.5 mT) na udaljenosti 20 cm od polova elektromagneta, koja odgovara rastojanju sredi~njih delova kaveza sa zivotinjama. 24 Materijal i metode Linije magnetnih sila su zaklapale ugao od 11 о istocno u odnosu na pravac sever-jug horizontalne komponente lokalnog geomagnetnog polja. U toku eksperimenata, vrednosti geomagnetnog polja u oЬlasti gde su radena ispitivanja (44°38' sevemo, 20°46' istocno) su Ьile uglavnom u okviru prosecnih vrednosti (GSM 10 proton magnetometar, Geomagnetski institut, Beograd). AmЬijentalno МР nije prelazilo vrednost od 10"5 mT. Tokom izlaganja ENF-МP zivotinje su Ьile u kavezima standardnih dimenzija (26 cm sirina х 43 cm dиZina х 15 cm visina), fiksiranim na polistirenskom postolju da Ьi se iskljuCio kontakt sa metalnim delovima sistema. Temperatura prostorije је Ьila 23 ± 2°С, relativna vlafuost oko 60%, intenzitet vestackog osvetljenja oko 1 ОО luxa i cirkadijalni svetlosni reZim od ро 12 casova. U sistem za izlaganje ENF-МP istovremeno su stavljana dva kaveza, ро jedan sa leve i desne strane elektromagneta (slika IЗВ). Centar svakog kaveza је Ьiо 20 cm od polova elektromagneta, sto је Ьilo dovoljno da se izbegne kontakt spolja8njih ivica kaveza sa elektromagnetom i samim tim eventualne viЬracije. Sredisnji deo svakog kaveza је Ьiо izlozen ENF-MP prosecne magnetne indukcije В= 0.5 mT. Ova vrednost magnetne indukcije је Ьila maksimalna koja se mogla postici primenom elektromagneta datih karakteristika, а da se pri tome ne izazovu nezeljeni termicki efekti. 3.3. Registracija motorne aktivnosti Motoma aktivnost eksperimentalnih zivotinja Је registrovana u «open field»-u koriscenjem automatskog uredaja Columbus Auto-Track Sistem (Version 3.0 А, Columbus Institute, ОН, USA). Slika 14. Uredaj za registraciju motome aktivnosti Zivotinja Svaki od dva uredaja za registraciju (Opto- Varimex) se sastoji od cetvrtastog kaveza od pleksiglasa (44.2 cm х 43.2 cm х 20 cm) povezanog sa Auto-Track interfejsom (slika 14). Кavezi su ispresecani mrezom horizontalnih (15 х 15) i vertikalnih (dva nivoa) infracrvenih zraka. Razmak izmedu dva susedna zraka је 2.4 cm. Prekidanje zraka generise elektricni impuls koji se zatim obraduje i salje u kompjuter povezan sa Auto- Track interfejsom. Prikupljeni podaci se kontinuirano memorisu na disku kompjutera i nakon zavr8etka eksperimenta oCitavaju u zeljenim intervalima vremena. 25 Materijal i metode Opto-Varimex uredaji su smesteni u kuЩe, koje doprinose izolaciji od svetlosti i zvuka iz okoline, sa vestacki regulisanom ventilacijom i osvetljenjem (100 lx). Na ovaj nacin se eliminise eventualna reakcija zivotinje na stimuluse iz spoljaSnje sredine u toku merenja motome aktivnosti. Pre stavljanja nove zivotinje, pod svakog kaveza је opran vodom i osusen da Ьi se neutralisali mirisi od prethodne Zivotinje. Auto-Track sistem detektuje 11 parametara motomog ponaSanja ukljucujuci lokomotornu aktivnost (predeni put u cm), stereotipnu aktivnost (kao sto је Ьiscenje ( eng. self - grooming), njuskanje, oЬlizivanje, kruZni pokreti glave), vertikalnu aktivnost ili uspravljanje (podizanje оЬе prednje Sapice od poda), vreme mirovanja (vreme u toku kojeg izostaju Ьilo kakvi pokreti), rotacije u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu. Opisani parametri su defmisani u skladu sa Uputstvom za rukovanje Auto-Track sistemom (1990). Tip aktivnosti је odreden velicinom kvadrata, u naSem slucaju opisanog sa 5 infracrvenih zraka, koju odreduje sam eksperimentator u skladu sa dimenzijom Zivotinje koja se ispituje. То znaci da pacov mora da presece vise od 5 infracrvenih zraka da Ьi aktivnost Ьila klasifikovana kao lokomotoma. Кretanje unutar prostora defmisanog spoljaSnjim ivicama kvadrata formiranog uz pomoc horizontalnih zraka (oko 10 cm х 10 cm), se registruje kao stereotipna aktivnost. Vertikalna aktivnost predstavlja broj vertikalnih zraka koje zivotinja presece podizanjem na zadnje sapice. 3.3.1. Eksperimentalna procedura Motorni odgovor eksperimentalnih zivotinja је registrovan u periodu od 9 do 15 casova, zbog uticaja cirkadijalnog ritma na ponaSanje i fiziologUu pacova. Pre pocetka eksperimenta, zivotinje nisu Ьile izlozene Ьilo kakvoj eksperimentalnoj proceduri ukljucujuci «open field» test i testirane su samo jednom. U akutnom eksperimentu, u sistem za izlaganje МР su stavljani kavezi sa 3 - 4 jedinke starosti od oko 3 meseca. Zivotinje su Ьile kontinuirano izlozene ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) u toku 7 dana, izuzev 120-minutnog perioda kada је registrovana motoma aktivnost. Motomo ponaSanje ovih zivotinja је registrovano nakon prvog, treceg i sedmog dana izlaganja МР, uvek u isto doba dana, i uporedeno sa motomim odgovorom kontrolnih zivotinja. Као kontrola su koriscene tzv. sham Zivotinje koje su prosle istu eksperimentalnu proceduru, ali је u njihovom slucaju elektromagnet Ьiо iskljucen. Нronicni efekat promenljivog МР је ispitivan na zivotinjama koje su tokom celog zivota, od zaceca do starosti od oko 3 meseca, Ьile izlozene ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT). Na pocetku 26 Materijal i metode eksperimenta, u sistem za izlaganje ENF-МP prvo su stavljeni kavezi sa ро jednim mu.Zjakom (starosti oko 6 meseci) i tri zenke (starosti oko 4 meseca). Dve nedelje nakon sparivanja mu.Zjaci su odstranjeni iz eksperimenta. Skotne zenke su i dalje ostale pod uticajem ENF-МP datih karakteristika, da Ьi se 21. dana od zaceca okotile. lako је u daljim eksperimentima koriseeno samo musko potomstvo, сео okot је ostao sa majkama narednih 30 dana, da Ьi se izbegli efekti seksualne izolacije kod potomaka (De СаЬо i sar., 1993). Nakon ovog perioda, majke su uklonjene iz dalje eksperimentalne procedure. U isto vreme, musko potomstvo је odvojeno od zenskog, rasporedeno u grupe od 4- 5 jedinki ро kavezu i vraceno u sistem za izlaganje ENF- МP do starosti od oko 3 meseca. Motoma aktivnost ovih Zivotinja је registrovana neposredno nakon prestanka hronicnog izlaganja МР i uporedena sa motomim odgovorom kontrolnih zivotinja. Tokom hronicnog eksperimenta nismo Ьili u mogucnosti da pratimo tzv. sham efekat ENF-МP, odnosno efekat koji је posledica Ьoravka Zivotinja u Ьlizini iskljucenog elektromagneta. Razlog za ovo је Sto је period trajanja eksperimenta dug (oko 4 meseca), ра Ьi se u tom slucaju susreli sa proЬlemom razvica kontrolnih (sham) i tretiranih zivotinja u periodima razlicite geomagnetne aktivnosti. ZЬog toga su kontrolne Zivotinje Ьile istovremeno izlozene istoj eksperimentalnoj proceduri kao i tretirane, sa tom razlikom da su kavezi sa njima postavljeni na dovoljno velikoj udaljenosti od elektromagneta da se ne registruje njegov uticaj. U toku hronicnog eksperimenta pracena је i telesna masa kontrolnih i tretiranih jedinki. Pre razdvajanja muskog i zenskog potomstva merena је telesna masa okota unutar jednog kaveza, а nakon razdvajanja su pracene odvojeno telesne mase mиSkih i zenskih jedinki. U eksperimentima sa amfetaminom (АМРН), d-АМРН sulfat (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, USA) rastvaran је u fizioloskom rastvoru (1.5 mg АМРН u 1 ml 0.9% NaCl) i primenjivan intraperitonealno (i.p.) u zapremini od 1 ml/kg telesne mase. Zivotinje su injecirane АМРН neposredno nakon prestanka akutnog (1, 3 i 7 dana) i hronicnog izlaganja ENF-МP i stavljene u «open field» u toku 120 min. Dobljeni rezultati su uporedeni sa motomom aktivnoscu sham (akutni eksperiment) i kontrolnih (hronicni eksperiment) Zivotinja koje su tretirane istom dozom АМРН. Efekat samog АМРН na motomo pona8anje је procenjen u odnosu na sham, odnosno kontrolne zivotinje koje su injecirane fizioloskim rastvorom (1 ml/kg, i.p.). 3.4. Metoda vezivanja radioaktivnog liganda do zasicenja receptora (saturaciono vezivanje) Ova metoda koja se izvodi in vitro omogucava dobljanje dva parametra koji farmakoloski defшisu svojstva receptora. Konstanta disocijacije - Ксt је pokazatelj afiniteta vezivanja 27 Materijal i metode radioaktivno obelezenog liganda za receptor, i sto је veca to је afinitet manji. К vantitativno ~ odgovara onoj koncentraciji liganda pri kojoj је ~ od ukupnog broja receptorskih mesta popunjena ligandom. Maksimalni kapacitet vezivanja liganda i1i gustina receptora na celijskoj membrani - Bmax predstavlja ukupan broj aktivnih receptora, izraZen u molarnom oЬliku kroz jedinicu zapremine rastvora ili ukupnu masu proteina u rastvoru. Da Ьi se doЬili ovi parametri, u puferu se pripreme razlicite koncentracije obelezenog liganda koje se mesaju sa konstantnom koncentracijom receptora (tj. membranske frakcije). Reakcija se izvodi pri stalnoj temperaturi (najcesce 20, 25 ili 37°С), u rastvorima sa definisanim koncentracijama soli i рН vrednoscu, i za ono vreme koje је potrebno da se uspostavi ekviliЬrijum, tj. staЬilan ravnoteZni odnos izmedu procesa asocijacije i disocijacije liganda i receptora. Zatim se filtriranjem reakcionih smesa froz filtre i utvrdivanjem nivoa aktiviteta zaostalog na filtrima odreduje ona kolicina liganda koja је ostala vezana. Та vrednost predstavlja ukupno ili totalno vezivanje (Т) koje је dobrim delom nespecificno, jer se ligand vezuje i za druge molekule osim za specificni receptor. Da Ьi se doЬilo specificno vezivanje koristi se jos jedna serija koncentracija obelezenog liganda koja se mesa sa stalnom koncentracijom receptora, ali u prisustvu visoke koncentracije liganda koji nije radioaktivno obelezen i koji ima visoku specificnost i afmitet za ispitivani receptor. То podrazumeva da се vrednosti vezivanja obelezenog liganda u ovoj reakciji predstavljati nespecifi.cno vezivanje (N) za neku odredenu koncentraciju tog liganda, posto је receptor popunjen drugim neoЬelezenim ligandom. Razlika izmedu totalnog i nespecificnog vezivanja (Т - N) predstavlja specifi.cno vezivanje liganda (S), tj. kolicinu liganda vezanu za receptor pri nekoj koncentraciji liganda u rastvoru. Konstrukcijom krive pomocu tacaka koje daju odnos izmedu koncentracije liganda u rastvoru i specificnog vezivanja pri datim koncentracijama, doЬija se rektangularna hiperbola poznata kao Langmirova adsorpciona izoterma. Za upoznavanje i kvantifikovanje interakcija receptor - ligand u upotreЬi је najcesce Skacardova analiza ove krive ili preciznije receno njena transformacija u linearnu krivu, Ciji nagiЬ odreduje ~ prema formuli ~ = -1/ugao nagiЬa, а odsecak na Х osi predstavlja Bmax (Scatchard, 1949; Weder i sar., 1974; Zivin i Waud, 1982). 3.4.1. Analiza aktivnosti centralnih receptora za dopamin i serotonin Nakon zavrsetka akutnog (1, З i 7 dana) i hronicnog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) eksperimentalne Zivotinje su Zrtvovane dekapitacijom, izvadeni mozgovi stavljeni su na led. Odmah su izolovane mozdane strukture (prefrontalni korteks i strijatum), izmerene i zamrznute 28 Materija/ i metode na -70°С do analize. U cilju doЬijanja dovoljne kolicine polaznog materijala odabrani regioni mozga su pulovani od tri zivotinje (u proseku dva pula ро eksperimentalnoj grupi). Priprema strijatalnih i kortikalnih membrana pacova, kao i in vitro eksperimenti vezivanja su uradeni koriscenjem standardnih farmakoloskih procedura (V ogel, 2002). Тkivo (0.5 - З grama) је prvo homogenizovano uz pomoc rotacionog homogenizera sa teflonskim tuckom (6- 10 zaveslaja, 800 rpm) u 10 zapremina odgovarajuceg reakcionog pufera u odnosu na zapreminu pocetnog tkiva. Иomogenat је zatim centrifugiran 15 - 20 minuta (rotor Ti-50, 20000 rpm, 4 °С), а doЬijeni talog resuspendovan u 1 о zapremina istog pufera i ponovo centrifugiran kao sto је vec opisano. Talog doЬijen nakon drugog centrifugiranja је finalno resuspendovan u duplo vecoj zapremini pufera, naliven u mikrotube, zamrznut u tecnom azotu i cuvan na -70°С do analize. Za analizu aktivnosti centralnih receptora, sinaptozomalne membrane se odmrzavaju na sobnoj temperaturi, razЬlaZиju odgovarajucim puferom i nalivaju u mikrotuЬe. Zatim se dodaje radioligand i reakciona smesa stavlja u vodeno kupatilo da se inkuЬira 10 minuta na 37°С. Reakcija se prekida dodavanjem 1 ml bladnog pufera. Nakon vakum filtracije (Whatman GF/В filteri) i ispiranja 2 puta sa 3.5 m1 bladnog pufera, radioaktivnost preostala na filterima se meri u tecnom scintilacionom koktelu koji sadrZi РРО (2,5-difeniloksazol, Sigma Chemical, USA), РОРОР ([2,2'-p-fenilen-Ьis(5-feniloksazol)], Beckman) i toluen (Lach - Ner). Eksperimenti su uvek radeni u duplikatu, pri konstantnoj koncentraciji membranske frakcije i sa 5 ili 6 rastucih koncentracija odgovarajuceg radioliganda razЬla:Zenog u puferu, da Ьi imali sto vise tacaka za konstrukciju krive. Parametri aktivnosti dopaminskih D1 i D2 receptora su odredivani na sinaptozomalnim membranama doЬijenim iz strijatuma, а serotoninskih 5-ИТ zл receptora na membranskim preparatima poreklom iz korteksa. Za kortikalno tkivo se kao pufer koristi Tris-ИCl (ICN Pharmaceuticals, USA), рИ 7.7, а za strijatalno tkivo smesa sastavljena od 1 тМ MgClz (Мerck), 2 тМ СаС12 (Мerck), 5 тМ KCl (Alkaloid, Skoplje), 50 тМ Tris-ИCl i 120 тМ NaCl (Мerck), рИ 7.5. Za oЬelezavanje dopaminskih D1 receptora је koriscen visoko afinitetni antagonist еи]-SСН23390 (Amersham, USA, 91 Ci/mmol), dopaminskih Dz receptora antagonist eНJ-spiperon (Amersham, USA, 77.8 Ci/mmol), а serotoninskih 5-ИТ zл receptora antagonist eНJ-ketanserin (Perkin-Elmer, USA, 88 Cilmmol). Nespecificno vezivanje је odredeno u prisustvu bladnog liganda 1 џМ ( + )butaklamola (Sigma Chemical, USA) kada su ispitivani D1 i D2 receptori, odnosno bladnog liganda 1 џМ ketanserina (Sigma Chemical, USA) kada se radilo о 5-ИТ2л receptoru, za svaku koncentraciju radioliganda. Zbog visokog afiniteta 29 Materijal i metode eН]-spiperona za serotoninske receptore, и svaku koncentracijи ovog radioliganda је dodavan i 50 nМ ketanserin. Koncentracija proteina и uzorkи је odredena modifikovanom Lowry-evom metodom kоји sи opisali Markwell i sar. (1978), koja se zasniva na merenjи apsorpcije svetlosti od strane dva оЬојеnа kompleksa pri odredenoj talasnoj du.Zini. Za konstrukcijи standardne krive se koristi standardni rastvor poznate koncentracije proteina, и na.Sem slисаји 0.5 mg/ml govedeg seruma albumina (Sigma Chemical, USA - 96 - 99% albumina), pri сети se zapremine standarda uzimajи tako da koncentracija proteina Ьиdе и intervalи od 1 О - 1 ОО Jlg/ml. Razlicitim koncentracijama standarda, slepoj proЬi (samo d.Н2О) i uzorcima razЬlaienim 20 риtа d.Н20 dodaje se ро 600 Jll rastvora С. Ovaj rastvor se priprema pre иpotrebe mesanjem 1 ОО zapremina rastvora А (2% Nа2СОз (Sigma Chemical, USA), 0.4% NaOH (Lach- Ner), 0.16% Na-tartarat (Sigma Chemical, USA) i 1% Na-dodecilsulfat (SDS, Sigma Chemical, USA) i 1 zapremine rastvora В ( 4% СиSО4 х 5Н20 (ICN Pharmaceиticals, USA)). Nakon mesanja, reakcione smese se inkuЬirajи 15 minиta na sobnoj temperaturi (inkubaciono vreme moze Ьiti od 10-60 minиta). Zatim se dodaje ро 60 Jll Folin-Ciocalteи Fenol reagensa (Sigma Chemical, USA), koji se priprema pre иpotrebe mesanjem 1 zapremine Folin-Ciocalteи Fenol reagensa i 1 zapremine dH20. Reakcione smese se ponovo mesajи i inkuЬirajи 45 minиta na sobnoj temperaturi. Nakon toga se meri apsorbanca na 660 nm prema slepoj proЬi. 3.5. Odredivanje koncentracije nuk.leotida u izolovanim regionima mozga Tecna hromatografija visoke efikasnosti (НРLС - Шgh Performance Liquid Chromatography) је tehnika za kvalitativno i kvantitativno odredivanje sadrZaja organskih sиpstanci и razliCitim uzorcima. Ovom tehnikom se moze istovremeno odrediti vise sиpstanci, jer se hromatografsko razdvajanje zasniva na razlicitoj raspodeli sиpstanci izmedи dve faze: stacionarne i moЬilne. U zorci za НРLС analizu se pripremajи razlicitim postupcima и zavisnosti od porekla, nakon cega se vrsi njihova identifikacija i kvantifikacija. Za potrebe ovog eksperimenta koriscena је postojeca metoda za istovremeno odredivanje veceg broja nukleotida (Jackson i sar., 1977). Limiti detekcije i kvantifikacije sи izraieni и nanomolima sиpstance nanetim na hromatografsku kolonи. Izracunati sи matematickim pиtem i predstavljajи tri, odnosno deset риtа standardnи devijacijи signalnog suma и vremenskom intervalи и kome se eluira maksimum ispitivanog jedinjenja. 30 Materija/ i metode U cilju odredivanja koncentracija IМР, сАМР, АТР i GТР, eksperimentalne zivotinje su Zrtvovane dekapitacijom neposredno ро prestanku akutnog (1, З i 7 dana) i hronicnog izlaganja ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT). Mozgovi su izvadeni i stavljeni na led. Izolovani su regioni mozga (korteks i strijatum) i izmerene im mase za svaku zivotinju posebno. Izolovani regioni mozga su homogenizovani u 0.15 М KCI, рН 7.4 (Ultra-turax homogenizer max. brzina) 30 sekundi, pri cemu је na 100 mg tkiva dodavano 100 џl KCI. Uzorci su potom centrifugirani 5 minuta na 12000 obrtaja/min. Ро 100 џl supematanta је odvojeno od svakog uzorka i tretirano na sledeci nacin: - Supematantu је dodato 1 ОО џl 0.1 М rastvora HCI u metanolu, а zatim је uzorak ostavljen 5 minuta na -20°С; - Uzorkuje dodato ро 300 џl 0.3 М perblome kiseline i 100 џ11 mМ rastvora EDTA, uz mesanje; - Ovaj rastvor је zatim centrifugiran 5 minuta na 12000 obrtaja/min; - Вistar supematant је odvojen i neutralisan sa 50 џl 1.5 М rastvora К2СОз i ponovo centrifugiran 5 minuta na 12000 obrtaja/min; - Bistar supematant је odvojen i profiltriran kroz Sartorius filter 0.2 џт i injektovan direktno u tecni hromatograf ili cuvan na -20°С do analize. 3.5.1. Hromatografska metoda i uslovi hromatografisanja Нromatografska analiza је radena na tecnom hromatografu Hewlett Packard 11 ОО, sa binamom pumpom i diode-array detektorom. Identifikacija pikova је izvrsena na osnovu retencionog vremena i UV spektara, а kvantifikacija metodom ekstemog standarda. Uslovi hromatografisanja: Kolona: Whatman, Partisil10- SAX, 25 cm х 4.6 mm, 5 џт lnjekciona zapremina: 1 ОО џl Talasna dиZina: 254 nm Protok: 2 mlfmin Temperatura: 25°С Mobllna faza: Pufer Р1: 0.038 М КН2РО4, рН 3.7 31 Pufer Р2: 0.42 М КН2РО4, рН 3.7 Gradijent: О min- 0% В 5 min- O% B 8 min-100%B 35 min-100% В Ekvilibracija: 5 min. sa 100% pufera Р1. Materijal i metode Supstance koriscene za pripremu uzoraka i hromatografske analize, neorganske i organske soli, organski rastvaraci, kiseline i baze, nabavljene su od fmne Merck. Sve navedene hemikalije su Ьile р.а. i НРLС grade kvaliteta. 3.6. Statisticka analiza podataka Rezultati eksperimenata u kojima је praceno pona8anje su predstavljeni graficki kao srednja vrednost ± standardna greska svakog parametra motome aktivnosti registrovanog u toku 120 minuta, u intervalima od 30 minuta (n= 6- 7 zivotinja ро grupi). Za utvrdivanje razlika izmedu grupa koriscena је dvofaktorijalna ANOVA (tretman х 30-minutni interval) za ponovljena merenja, а za detaljna statisticka poredenja post hoc LSD test. Podaci koji nisu imali normalnu distribuciju pri proceni Kolmogorov-Smimov-im testom, pre analize su transformisani primenom standardnih matematickih procedura kao sto su logaritmovanje i kvadratni koren. Za procenu efekata hronicnog tretmana ENF-МP na telesnu masu Zivotinja, izracunate su prosecna telesna masa jedinke ро okotu pre razdvajanja muskog i zenskog potomstva svaki drugi dan i prosecna telesna masa mиSkih i zenskih jedinki nakon razdvajanja svakih 7 dana. Statisticka analiza podataka doЬijenih za kontrolne i tretirane zivotinje је шadena primenom Studentovog t testa. Parametri aktivnosti ispitivanih receptora (~ i Bmax) su doЬijeni koriscenjem nelineame regresione analize u GraphPadPrism 4.0 programu i izracunati za svaku eksperimentalnu grupu kao srednja vrednost ± standardna greska od tri nezavisna eksperimenta шadena u duplikatu. DoЬijene vrednosti su predstavljene graficki kao procentualna promena u odnosu na kontrolnu vrednost koja је uzimana kao 100%. Za utvrdivanje razlika izmedu grupa u akutnom eksperimentu је koriscena jednofaktorijalna ANOV А pracena post hoc LSD testom, а u hronicnom eksperimentu Studentov t test. 32 Materijal i metode Podaci doЬijeni НРLС analizom su prikazani tabelarno kao srednja vrednost ± standardna greska koncentracije nukleotida ро gramu tkiva ispitivanog regiona mozga (n = 4 - 5 zivotinja ро grupi) i procentualno u odnosu na vrednost sham zivotinja koja је uzimana kao 100%. Za statisticku analizu podataka doЬijenih nakon akutnog tretmana ENF-МP koriscena је jednofaktorijalna ANOV А pracena post hoc LSD testom, а nakon hronicnog izlaganja МР Studentov t test. Rezultati svih navedenih analiza su smatrani statisticki znacajnim kadaje Р< 0.05. 33 Rezultati 4. REZUL TATI 4.1. Efekti promenljivog magnetnog polja па motorno ponasanje ~ Akutno izlaganje Vremenski tok spontane motome aktivnosti tretiranih i kontrolnih zivotinja је Ьiо slican ( opadajuci) tokom celog perioda registrovanja, sa jasno izra.Zenom tendencijom usporavanja nakon izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) u tokujednog dana (slike 15- 17). Statisticka analiza doЬijenih podataka је pokazala znacajan efekat 30-minutnog intervala vremena za sve ispitivane parametre motomog pona8anja (24.30 ~ F{3,6З) ~ 81.61, Р < 0.001), dok su efekti tretmana i interakcije (tretman х 30-minutni interval) Ьili bez statisticke znaeajnosti (podaci nisu pokazani). Detaljna poredenja su otkrila da izlaganje ENF-МP jedan dan povecava spontani lokomotomi i stereotipni odgovor eksperimentalnih zivotinja u toku celog perioda registrovanja u odnosu na kontrolne jedinke, sa statistickom znacajnoscu u intervalu od 30. do 90. minuta za lokomociju, odnosno 60. do 90. minuta za stereotipiju (slika 15). U periodu od 60. do 90. minuta registrovanja znacajna razlika је Ьila i u odnosu na Zivotinje izlagane МР tri i sedam dana, Cije su vrednosti lokomotomog i stereotipnog odgovora na nivou kontrolnih jedinki. 5000г-----------------------------, с;- 1800г-------------------------., Е' ~ 4000 - "' о t:: ·Е зооо ..::<: <'1:1 <'1:1 Е 2ооо з о s ~ 1000 о _Ј о L...l.....L.0-....13 ...... 0 * oSham о ENF-MP 1 dan О ENF-MP 3 dana 8ENF-MP 7 dana ] о 1500 0.. Ђ' Ј5 1200 "-" - VJ g 900 > ~ <'1:1 600 <'1:1 t:: 0.. ·g 300 ~ 20 о ;.::;> ... > "§ С\1 15 .... ~ с. "' Е ;:Ј 100 ~ 10 .... > 5 о '-'--'-0~-3-:-0 30-60 60-90 о 0-30 30-60 60-90 90-120 Vreme (min) Vreme (min) Slika 17. Uticaj akutnog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mТ) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na uspravljanje i vreme mirovanja eksperimentalnih zivotinja u «open field» testu. Rezultati su izra:Zeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. *р< 0.05 i ••р < 0.01 ukazuju na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na sham Z:ivotinje ... р< 0.01 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na zivotinje izlagane ENF- МP jedan dan (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). Као posledica povecane lokomotome i stereotipne aktivnosti, vreme mirovanja eksperimentalnih zivotinja izlaganih ENF-МP u trajanju od jednog dana је smanjeno od 30. 35 Rezultati minuta do kraja perioda registrovanja u odnosu na ostale eksperimentalne grupe, pri cemu је ova razlika statisticki znacajna u intervalu od 60. do 90. minuta (slika 17). Za razliku od ovih zivotinja, tretman МР З i 7 dana ne utice na vreme koje jedinke provode u stanju mirovanja. Vremenski profili svih parametara motomog pona8anja sham zivotinja su slicni bez obzira da li su boravile u Ьlizini iskljucenog elektromagneta jedan, tri ili sedam dana (podaci nisu prikazani). Zbog toga pri proceni efekata ENF-MP razlicitog trajanja nije Ьilo potreЬe za preciznim navodenjem koje sham izlaganje је u pitanju. Vrednosti motomog odgovora ovih Zivotinja se nisu razlikovale i u odnosu na kontrolne jedinke, koje su Ьile na dovoljno velikoj udaljenosti da ne osete Ьilo kakav uticaj МР. ~ Hronicno izlaganje Za sve ispitivane parametre motomog pona8anja, primena statisticke analize је pokazala znacajan efekat tretmana (rotacije: 5.29 ~ F(l,I2) ~ 5.99, Р < 0.05; lokomocija, stereotipija i uspravljanje: 9.37 ~ F(l,I2) ~ 13.29, Р< 0.01; vreme mirovanja: F(l ,I2) = 24.20, Р< 0.001), 30- minutnog intervala vremena (39.64 ~ F(з,з6) ~ 77.71, Р < 0.001) i interakcije (tretman х 30- minutni interval) (lokomocija, stereotipija, uspravljanje i rotacije: 3.17 ~ F(з,Зб) ~ 3.99, Р< 0.05; vreme mirovanja: F(з,Зб) = 4.84, Р< 0.01). Post hoc poredenja su otkrila da hronicni tretman ENF-МP (50 Нz, 0.5 mТ) povecava lokomociju i stereotipiju eksperimentalnih Zivotinja u prvih 90 minuta registrovanja u odnosu na kontrolne jedinke (slika 18). Do kraja registrovanja vrednosti lokomotomog i stereotipnog odgovora tretiranih Zivotinja se izjednaeavaju i cak padaju ispod kontrolnog nivoa. 5000 --;;- 1800 oKontrola - Q) ,--.._ D ENF-МP hronicno .... Е ...><: 1500 ~ 4000 о *** о. - "' " О' о ..Б 1200 *** ::::: oKontrola • ENF-МP hronicno .::: 3000 '-' -~ "' о "' ::::: "' ;:. ::::: 2000 ·,:;;; .... о ...><: - "' о "' Е ::::: о 1000 о. ...><: ·,:;;; о о ~ Q) .... Q) ...... о С/Ј Slika 18. Uticaj hronicnog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na lokomotomu i stereotipnu aktivnost eksperimentalnih Zivotinja u «open field» testu. Rezultati su i.zraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •р < 0.05, ••р < 0.01 i •••р < 0.001 ukazuju na statisticki znacajne razlike u odnosu na kontrolne Zivotinje ( dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). 36 Rezultati Rotaciono ponasanje zivotinja hronicno izlaganih ENF-МP је takode povecano u odnosu na kontrolne jedinke sa statisticki znacajnom razlikom u prvih 30 minuta registrovanja motorne aktivnosti (slika 19). I u ovom slucaju nisu registrovane razlike u broju rotacija u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu medu jedinkama kontrolne i tretirane grupe. 70г-------------------------------. ,.--.._ 60 " О' 2 .Б 50 С!) '-' Е .а "-' о;: 40 ;::s "-' С!) о;: ::::;>с 30 () С!) о;: .:,е. ..... . _, 0 са 20 t:=::: N о;: .:;,(. 10 oKontrola 111 ENF-MP hronicno *** 70г-------------------------------~ oKontrola о ENF-MP hronicno o~~0-~30~---L3~o~-6~o~--~6o~-9~o-L--~~-L~ Vreme (min) Vreme (min) Slika 19. Uticaj hroni~nog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na rotacije eksperimentalnih Zivotinja u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu u «open field» testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta .... р < 0.001 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne zivotinje (dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). Vertikalna aktivnost ili uspravljanje eksperimentalnih zivotinja se povecava nakon hronicnog izlaganja ENF-МP sve do 90. minuta registrovanja motorne aktivnosti, ali statisticki znacajno samo u prvih 60 minuta u odnosu na kontrolne jedinke (slika 20). 400 oKontrola о ENF-МP hronicno ~ 300 .... .D '-' С!) *** -~ 200 ;.:::;> > о;: .... ~ * ;:::::> !ОО о 0-30 40г-------------------------------~ 35 ---- .5 30 Е '-' о;: 25 ";::' о;: > 20 е .Е 15 С!) Е ~ 10 > 5 oKontrola • ENF-MP hronicno 0-30 30-60 60-90 Vreme (min) Slika 20. Uticaj hroni~nog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na uspravljanje i vreme mirovanja eksperimentalnih zivotinja u «open field» testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~a za intervale od 30 minuta. •р < 0.05 i •••р < 0.001 ukazuju na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne zivotinje (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). Као posledica povecanih vrednosti svih parametara motornog pona5anja, vreme mirovanja eksperimentalnih zivotinja hronicno izlaganih ENF-МP је znacajno smanjeno u toku prvih 90 minuta registrovanja motorne aktivnosti u odnosu na kontrolne jedinke, sto se poklapa 37 Rezultati sa periodom intenzivne motome hiperaktivnosti (slika 20). U poslednjih 30 minuta registrovanja vreme koje kontrolne i tretirane Zivotinje provode u stanju mirovanja је priЬliZn.o isto. 4.2. Efekti promenljivog magnetnog polja na motorni odgovor izazvan primenom amfetamina (1.5 mglkg, i.p.) Psihomotorni stimulans АМРН је poznati aktivator dopaminergickog sistema prednjeg mozga. Njegova primena u kombinaciji sa ENF-МP na indirektan nacin otkriva moguca mesta interakcije spolja8njeg МР i Ьioloskog sistema. Analiza varijanse za ponovljena merenja pokazala је za sve ispitivane parametre motomog pona8anja statisticki znacajan efekat АМРН (41.60 ~ F(l,ll} ~ 209.40, Р< 0.001), 30- minutnog intervala vremena (11.99 ~ F(з,зз) ~ 41 .23, Р < 0.001) i interakcije (АМРН х 30- minutni interval) (lokomocija, uspravljanje, rotacije i vreme mirovanja: 3.20 ~ F(з,зз) ~ 4.20, Р< 0.05; stereotipija: F(з,зз) = 5.69, Р< 0.01). Detaljna poredenja su pokazala da aplikacija АМРН (1.5 mg/kg, i.p.) statisticki znacajno povecava sve ispitivane parametre motomog pona8anja eksperimentalnih zivotinja tokom celog perioda registrovanja u odnosu na sham/kontrolne jedinke injeciranje fizioloskim rastvorom (slike 21 - 29). Ova motoma hiperaktivnost је koriscena za procenu efekata akutnog i hronicnog pretretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT). )о- Akutno izlaganje U eksperimentima sa akutnim izlaganjem ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) i primenom АМРН (1.5 mg/kg, i.p.), za sve ispitivane parametre motomog pona8anja analiza varijanse је pokazala statisticki znacajan efekat tretmana (6.18 ~ F(4,2б) ~ 38.47, Р < 0.001) i 30-minutnog intervala vremena (43.93 ~ F(з,7s) ~ 136.50, Р < 0.001), dok је efekat interakcije (tretman х 30-minutni interval) Ьiо bez statisticke znacajnosti (podaci nisu pokazani). Post hoc analiza је pokazala da izlaganje eksperimentalnih zivotinja ENF-МP u trajanju od sedam dana znacajno smanjuje efikasnost АМРН da poveca lokomotomu aktivnost tokom celog perioda registrovanja u poredenju sa kontrolnimjedinkama tretiranim АМРН. Isti efekatje zabelezen i u odnosu na jedinke injecirane АМРН nakon tretmana МР jedan i tri dana u prvih 60 minuta registrovanja motome aktivnosti (slika 21). U intervalu od 30. do 60. minuta је registrovano znacajno smanjenje АМРН odgovora Zivotinja prethodno tretiranih МР u trajanju od tri dana u odnosu na kontrolne jedinke. Efekat izlaganja МР u toku jednog dana, iako se pokazao inhiЬitomim na АМРН lokomotorni odgovor, nije Ьiо statisticki znacajan. 38 sосю ~------------------------------------------, ,-... Е ~ 4000 -"' о 5: ~ «:1 «:1 1:: ..... о о Е о ~ о ,.Ј *** # DSham + fizioloski rastvor 8Siшm + АМРН О ENF-МP 1 dan + АМРН О ENF-MP З dana + АМРН 8ENF-MP 7 dana + АМРН 0-30 30-60 60-90 90-120 Vreme (min) Rezultati Slika 21. Uticaj ak:utnog tretmana ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na lokomotomu aktivnost eksperimentalnih zivotinja izazvanu primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «open field>> testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •••р < 0.001 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na sham Zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 ml/kg, i.p.). #р< 0.05, ##р < 0.01 i ###р < 0.001 predstavljaju statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na sham zivotinje tretirane istom dozom АМРН. •р < 0.05 i *р < 0.05 ukazuju na statisti~ki zn~ajne razlike u odnosu na Zivotinje injecirane АМРН nakon izlaganja ENF-МP jedan dan, odnosno tri dana ( dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). Poredenjem slika 21. i 22. moze se uociti slicnost u dinamici promena stereotipne 1 lokomotome aktivnosti za svaku ispitivanu grupu. 1800 ~-------------------------------------------, ~ Q) ~ 1500 Р. "5' Js 1200 .._, - "' о1:: 900 > ·.::::: ~ «:1 «:1 600 = Р. ·g 300 ~ /1) й о *** 0-30 OSiшm + fizioloski rastvor 8S/шm + AMPH О ENF-MP 1 dan + АМРН ENF-МP З dana + АМРН 8 Е F-МР 7 dana + АМРН 30-60 60-90 90- 120 Vreme (min) Slika 22. Uticaj ak:utnog tretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na stereotipnu aktivnost eksperimentalnih zivotinja izazvanu primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «open field>> testu. Rezultati su izrafeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •••р < 0.001 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na sham Zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 mVkg, i.p.). #р < 0.05, ##р < 0.01 i ###р < 0.001 predstavljaju statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na sham zivotinje tretirane istom dozom АМРН. •р < 0.05 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na Zivotinje injecirane АМРН nakon izlaganja ENF-МP jedan dan (dvofaktorijalna ANOVA za ponovђena merenja, LSD test). Izlaganje eksperimentalnih zivotinja ENF-МP u toku 7 dana statisticki znacajno smanjuje eflkasnost АМРН da stimulise stereotipnu aktivnost od 30. do 120. minuta u poredenju sa kontrolnim jedinkama tretiranim АМРН i u periodu od 90. do 120. minuta registrovanja u 39 Rezultati odnosu na zivotinje injecirane АМРН nakon izlaganja МР 1 dan (slika 22). Tretman ENF-МP u trajanju od З dana takode znacajno smanjuje stereotipiju zivotinja izazvanu primenom АМРН u poslednjih 30 minuta registrovanja, dokje efekat ENF-МP u trajanju odjednog dana izostao. Rotacije eksperimentalnih zivotinja u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu izazvane АМРН se statisticki znacajno smanjuju pod uticajem ENF-МP u trajanju od 7 dana i to u drugom, odnosno prvom satu registrovanja u poredenju sa kontrolnom grupom (slike 23 - 24). 7о г-------------------------------------------, 60 *** 0-30 DSham + fi zioloski rastvor 8S/шm+AMPH DENF-MP 1 dan + АМРН lil ENF-MP 3 dana + АМРН 8 ENF-MP 7 dana + АМРН *** 30-60 60-90 90- 120 Vreme (min) Slika 23. Uticaj akutnog tretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na rotacije eksperimentalnih Zivotinja u smeru kazaljke na satu izazvane primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «open field)) testu. Rezultati su izra.Zeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •••р < 0.001 ukazuje na statisti<:ki znacajne razlike u odnosu na sham zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 ml/kg, i.p.). #р < 0.05 predstavlja statisticki znacajne razlike u odnosu na sham Zivotinje tretirane istom dozom АМРН. •р < 0.05 i *р< 0.05 ukazuju na statisticki znacajne razlike u odnosu na zivotinje injecirane АМРН nakon izlaganja ENF-МP jedan dan, odnosno tri dana (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). 70 г-------------------------------------------, *** о 0-30 *** DSham + fizioloski rastvor 8Silam + АМРН DENF-МP 1 dan + АМРН О ENF-MP 3 dana + АМРН 11 ENF-МP 7 dana + АМРН 30-60 60-90 90- 120 Vreme (min) Slika 24. Uticaj akutnog tretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na rotacije eksperimentalnih zivotinja suprotno od smera kazaljke na satu izazvane primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «Open field)) testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~a za intervale od 30 minuta .... р < 0.001 ukazuje na statisticki znacajne razlike u odnosu na sham Zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 mllkg, i.p.). ##р< 0.01 i ###р < 0.001 predstavljaju statisticki znacajne razlike u odnosu na sham zivotinje tretirane istom dozom АМРН (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). 40 Rezultati Znacajno smanjenje rotacija izazvanih АМРН u smeru kazaljke na satu nakon tretmana МР 7 dana је uoceno i u odnosu na Zivotinje izlagane МР 1 i З dana od 60. do 90. minuta. Bitno zapa.Zanje је da ni kod jedne od ispitivanih grupa nije nadena razlika u broju rotacija koje jedinke naprave u toku odgovarajuceg intervala vremena u smeru i sнprotno od smera kazaljke na satu. Uspravljanje eksperimentalnih Zivotinja izazvano primenom АМРН se ne menja kao rezultat akutnog tretmana ENF-МP, iako postoji tendencija povecanja u prvih 30 minнta registrovanja motomog pona5anja u odnosu na kontrolne jedinke (slika 25). 400 .------------------------------------------, ,-.... 300 .ё' е. Q) .§' 200 ~ fЗ 0.. "' ~ 100 о 0-30 OSћam + fizioloski rastvor IIS/шm + AMPH О ENF-MP 1 dan + АМРН O ENF-МP 3 dana + АМРН 11 ENF-MP 7 dana + АМРН 30-60 60-90 90-1 20 Vreme (min) Slika 25. Uticaj akutnog tretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na uspravljanje eksperimentalnih Zivotinja izazvano primenom АМРН (1 .5 mg!kg, i.p.) u «Open field» testu. Rezultati su izгaZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta .... р< 0.001 ukazuje na statistitki znatajne razlike u odnosu na sham zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 mllkg, i.p.) (dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). 40.-------------------------------------------; OS/юm + fizioloski rastvor 35 IIS/шm + АМРН ,-.... .S 30 Е ...._, . :з., 25 = (1:1 > е 20 . Е Q) 15 Е е 10 ;> 5 О ENF-MP 1 dan + АМРН II ENF-MP 3 dana + АМРН 11 ENF-MP 7 dana + АМРН 0-30 30-60 60-90 Vreme (min) 90-1 20 Slika 26. Uticaj akutnog tretmana ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) u trajanju od jednog, tri i sedam dana na vreme mirovanja eksperimentalnih Zivotinja izazvano primenom АМРН (1.5 mg!kg, i.p.) u «open field» testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~a za intervale od 30 minuta . ... р< 0.001 ukazuje na statistitki znacajne razlike u odnosu na sham zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 ml/kg, i.p.). #р < 0.05, ##р < 0.01 i ###р < 0.001 predstavljaju statistitki znatajne razlike u odnosu na sham zivotinje tretirane istom dozom АМРН. •р < 0.05 ukazuje na statisticki znatajne razlike u odnosu na zivotinje injecirane АМРН nakon izlaganja ENF-МP jedan dan (dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). 41 Rezultati S obzirom na pretefuo inhiЬitorni uticaj akutnog tretmana ENF-МP na motomu aktivnost izazvanu primenom АМРН, vreme mirovanja eksperimentalnih Zivotinja је povecano u prvih 60 i 90 minuta nakon tretmana ENF-МP jedan i tri dana, odnosno tokom celog perioda registrovanja nakon izlaganja ENF-МP sedam dana, u poredenju sa kontrolnim jedinkama tretiranim АМРН (slika 26). Pored toga, u prvih 30 minuta registrovanja motome aktivnosti uocenaje razlika izmedujedinki tretiranih ENF-МP u tokujednog i sedam dana u vremenu koje provode u stanju mirovanja nakon primene АМРН. ~ Hronicno iz/aganje Statisticka analiza podata doЬijenih u eksperimentima sa hronicnim izlaganjem ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) i primenom АМРН pokazalaje za sve ispitivane parametre motomog pona.Sanja znacajan efekat tretmana (15.54 ~ F(2,I6) ~ 85.76, Р < 0.001), 30-minutnog interva/a vremena (21.59 ~ F(з,48) ~ 68.98, Р < 0.001) i interakcije (tretman х 30-minutni interval) (lokomocija, uspravljanje, rotacije i vreme mirovanja: 2.74 ~ F(6,48) ~ 3.12, Р< 0.05; stereotipija: F(6,48)= 4.20, р< 0.01). Као sto se i vidi sa slika 27. i 28., nakon hronicnog izlaganja ENF-МP vremenski profili lokomotornog, stereotipnog i rotacionog odgovora (u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu) eksperimentalnih Zivotinja izazvanog i.p. primenom АМРН u dozi od 1.5 mglkg su slicni kontrolnim jedinkama tretiranim istom dozom АМРН. Kod оЬе grupe odgovor је najintenzivniji u prvih 30 minuta, neposredno nakon stavljanja Zivotinja u novu sredinu, nakon cega se smanjuje do kraja registrovanja motome aktivnosti. sосю~----------------------------~ 'Е ~ 4000 ..... V':J о с: ·Е 3осю ~ ~ ~ g 2000 о Е ] IOCIO о ...Ј 0-30 o Fizioloski rastvor 8АМРН о ENF-MP hronicno + АМРН 30-60 60-90 90-120 Vreme (min) '2' \800.---------------------------------, ..... ~ Ђ 1soo 0.. Ђ' .Б 1200 '-" t; g 900 .::: ..... ~ ~ 600 ~ с: 0.. -~ 300 ~ в rл о *** 0-30 oFizioloski rastvor 8АМРН ENF-МP hronicno + АМРН 30-60 60-90 90-1 20 Vreme (min) Slika 27. Uticaj hronicnog tretmana ENF-МP (50 Hz, 0.5 mT) na lokomotomu i stereotipnu aktivnost eksperimentalnih zivotinja izazvanu primenom АМРН (1.5 mglk:g, i.p.) u «open field» testu. Rezultati su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •••р < 0.001 ukazuje na statisticki znacajne razlike u odnosu na kontrolne Zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 m1/kg, i.p.) ( dvofaktorijalna ANOV А za ponovljena merenja, LSD test). 42 70,--------------------------------. 60 """' "ё' 2 .D 50 Q) '-' Е .а С/Ј <1:1 40 ;::1 С/Ј Q) <1:1 : :>с 30 t) Q) <1:1 ..:.0:: ..... . _, о <;; 20 ~ N <1:1 ..:.:: 10 0-30 ofizioloski rastvor 8АМРН 30-60 60-90 Vreme (min) 90-120 Rezultati 70 ,---------------------------------. *** ofizioloski rastvor •АМРН *** О ENF-MP hronicno + АМРН Slika 28. Uticaj hroni~nog tretmana ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na rotacije eksperimentalnih zivotinja u smeru i suprotno od smera kazaljke na satu izazvane primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «open field» testu. Rezultati su izra.Zeni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta. •••р < 0.001 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne Zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 mllkg, i.p.) (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). Medutim, hronicni tretman ENF-МP statisticki znacajno smanjuje efikasnost АМРН da poveca vertikalnu aktivnost ili uspravljanje Zivotinja tokom ukupnog perioda registrovanja motome aktivnosti u odnosu na kontrolne jedinke tretirane АМРН (slika 29). 400 ~ 300 .... .D '-' Q) -~ 200 ;..:> > <1:1 .... 0.. С/Ј :Ј 100 о *** 0-30 o fizioloski rastvor 8АМРН *** D ENF-МP hronicno + АМРН 30-60 60-90 90- 120 Vreme (min) 40 .---------------------------------, о Fizioloski rastvor """' 35 8АМРН с 8 ENF-МP hronicno + АМРН ·е 30 '-' -~ 25 с <1:1 > е 20 · е 15 Q) Е (!) 10 ... > 0-30 30-60 60-90 Vreme (min) 90-120 Slika 29. Uticaj hroni~nog tretmana ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na uspravljanje i vreme mirovanja eksperimentalnih Zivotinja izazvano primenom АМРН (1.5 mglkg, i.p.) u «open field» testu. Rezultati su izraieni kao srednja vrednost ± standardna gre~ka za intervale od 30 minuta .... р < 0.001 ukazuke na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne zivotinje injecirane fiziolo~kim rastvorom (1 mllkg, i.p.). Р < 0.01 i ###р < 0.001 ukazuju na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne zivotinje tretirane istom dozom АМРН (dvofaktorijalna ANOVA za ponovljena merenja, LSD test). Bez obzira na uoceni efekat na uspravljanje, vreme mirovanja Zivotinja hronicno tretiranih ENF-МP nakon i.p. primene АМРН se ne razlikuje u odnosu na kontrolne jedinke tretirane АМРН (slika 29). 43 Rezultati 4.3. Efekti promenljivog magnetnog polja па aktivnost centralnih dopaminskih D1 i D2 i serotoninskih 5-НТ2А receptora )- Akutno izlaganje Akutno izlaganje ENF-МP u trajanju od jednog, tri i sedam dana ne utice na aktivnost dopaminskih Dt receptora u strijatumu eksperimentalnih zivotinja (slika 30). Vrednosti I«J (afiniteta vezivanja liganda za receptor) i Brnax (gustine receptora na celijskoj membrani) su bez obzira na dиZinu akutnog izlaganja МР uglavnom na nivou kontrolnih vrednosti. 350г----------------, oSham 300 О ENF-MP 1 dan "..... Е: DENF-МP З dana fЗ ~ 250 8 ENF-MP 7 dana о "' .... <:<ј [;- !: 200 u ::s ~ ~ 150 6.€ ~ ~ 100 'cf( '-" 50 350г----------------, oS/шm 300 DENF-МP 1 dan "..... ~ Е ENF-МP З dana В ~ 250 8 ENF-МP 7 dana O..ct~ ~ t: 200 g...., Hronicno izlaganje Нronicni tretman eksperimentalnih Zivotinja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT), od zaceca do starosti od oko З meseca, statisticki znacajno smanjuje К! (t = 4.29, d.f. = 4, Р < 0.05), odnosno povecava afinitet dopaminskih Dt receptora u strijatumu u odnosu na kontrolnu grupu (slika 33). Za razliku od К!, gustina Dt receptora na membranama strijatuma (Bmax) eksperimentalnih zivotinja i pored pokazane tendencije smanjenja pod uticajem hronicnog izlaganja МР, nije se znacajno menjala u poredenju sa kontrolnimjedinkama (slika 33). 350.-----------------------------~ 350 .-------------------------------, o Kontrola oKontrola ';' 300 о ENF-MP hronicno ';' 300 о ENF-MP hronicno ё ~] ~- 250 250 ;... с ;... с о о з о о.~ 200 е-~ 200 (1) ~ (.) ~ (.) с (1) с (1) :::3 ;... ;... - :::3 rn 150 Q rn 150 б~ о • с Е "О :Ј о 100 ~ о 100 :::3 * :::3 'CF- '-' 50 'CF-'-' 50 о~--~----~------- Slika 33. Uticaj hroni~nog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na 1<.! i Bmax dopaminskih D1 receptora u strijatumu eksperimentalnih zivotinja. Podaci su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre§ka od tri nezavisna eksperimenta uradena u duplikatu. Rezultati su eredstavljeni procentualno u odnosu na vrednosti 1<.! i Bmax kontrolnih Zivotinja koje su uzimane kao 100%. Р < 0.05 ukazuje na statisti~ki zna~ajne razlike u odnosu na kontrolne zivotinje (Studentov t test). Dopaminski D2 receptori u strijatumu eksperimentalnih zivotinja pokazuju trend smanjenja К! na 56% od kontrolne vrednosti kod jedinki hronicno izlaganih ENF-МP, ali za razliku od Dt receptora bez statisticke znacajnosti (slika 34). Vrednost Bmax za ovaj tip dopaminskog receptoraje nakon hronicnog tretmana МР gotovo ista kao kontrolna (slika 34). 350 350 oKontrola oKontrola ';' 300 I!I ENF-MP hronicno ';' 300 о ENF-МP hronicno о ~ё ~.!:: 250 ;... ..... 250 ;... с о с о о ..... о -~ е-~ о.~ 200 200 ~ с (.) ~ (1) с (1) :::3 ;... ;... N :::3 rn 150 Q ~ 150 N о Q с • с :Ј] ~ -о 100 ~ о 100 :::3 :::3 ~ 50 0 ~----L----L------~ Slika 34. Uticaj hroni~nog izlaganja ENF-МP (50 Нz, 0.5 mT) na 1<.! i Bmax dopaminskih D2 receptora u strijatumu eksperimentalnih Zivotinja. Podaci su izraZeni kao srednja vrednost ± standardna gre§ka od tri nezavisna eksperimenta uradena u duplikatu. Rezultati su predstavljeni procentualno u odnosu na vrednosti 1<.! i Bmax kontrolnih zivotinja koje su uzimane kao 100%. 46 Rezultati Za razliku od dopaminskih receptora u strijatumu, aktivnost serotoninskih 5-НТ2л receptora u prefrontalnoj kori velikog mozga eksperimentalnih Zivotinja је podlofua promenama pod uticajem hronicnog izlaganja ENF-МP (slika 35). Statisticka analiza doЬijenih podataka је pokazala da se К(.)